(57)【要約】  幹細胞を含む骨移植片及び構築物が提供される。例示的な骨移植片は、骨伝導性皮質−海綿骨片及び／または骨誘導性脱灰骨の足場上に播種された骨形成幹細胞を含む。例示的な構築物は、合成足場上に細胞外基質を含み、このＥＣＭは、合成足場上に播種されたＭＳＣから分泌される。本骨移植片及び足場を作製する方法も提供される。骨治癒を促進する及び創傷治癒を処置する方法がさらに提供され、これは本骨移植片及び構築物を、それらを必要とする哺乳動物に投与することにより行われる。本骨移植片及び／もしくは構築物またはこれらの構成要素を含むキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨移植片であって、
骨誘導性脱灰骨、及び骨伝導性皮質−海綿骨片のうちの少なくとも１つを含む足場と、
骨形成幹細胞と、を含む、前記骨移植片。
【請求項２】
前記骨形成幹細胞が、少なくとも２０，０００細胞／ｃｃの量で前記骨移植片に存在する、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項３】
前記骨形成細胞が、大腿骨または脛骨からの海綿骨をコラゲナーゼで処理し、遠心分離により弱く接着した細胞を分離することによって得られる、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項４】
前記足場が、約１：１、１：２、または１：３の比率の脱灰骨基質と皮質−海綿骨片との混合物である、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項５】
前記骨形成細胞が、腸骨稜から採取された骨髄から単離された骨形成細胞を含む、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項６】
前記骨形成細胞が、脂肪組織から単離された骨形成細胞を含む、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項７】
前記足場が、約１：１、１：２、または１：３の比率の脱灰骨基質と皮質−海綿骨片との混合物である、請求項１に記載の前記骨移植片。
【請求項８】
構築物であって、前記構築物を形成するためにＥＣＭ堆積合成足場上に播種された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含み、前記細胞が、培地中で培養され、前記構築物が、ＰＢＳ中ですすがれ、ＤＮＡｓｅで処理され、風乾される、前記構築物。
【請求項９】
前記播種密度が、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２である、請求項８に記載の前記構築物。
【請求項１０】
前記ＭＳＣが、脂肪組織、骨髄、または骨から単離される、請求項８に記載の前記構築物。
【請求項１１】
前記合成足場が、コラーゲン−セラミック、コラーゲン−バイオガラス、またはＰＬＧＡを含む、請求項８に記載の前記構築物。
【請求項１２】
前記構築物が、パテ形態である、請求項８に記載の前記構築物。
【請求項１３】
構築物であって、前記構築物を形成するためにＥＣＭ堆積合成足場上に播種された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含み、前記細胞が、培地中で培養される、前記構築物。
【請求項１４】
前記合成足場が、コラーゲン−セラミック、コラーゲン−バイオガラス、またはＰＬＧＡを含む、請求項１３に記載の前記構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、幹細胞を含む骨移植片及び構築物を使用する骨及び創傷治癒に関する。本発明は、骨移植片及び構築物自体に関する。本発明は、本骨移植片及び構築物を作製する方法、ならびに本骨移植片及び／または構築物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物において骨または創傷治癒を促進する方法にも関する。本発明はさらに、本骨移植片もしくは構築物またはその構成要素のうちの１つ以上を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨移植は、欠損している骨を置換する、及び／または骨折を修復する外科手技である。骨は一般に、良好に再生する能力を有するが、そうするために足場を必要とする場合がある。骨移植片は、同種移植片（例えば骨バンクからの、死体骨）、自家性（すなわち、患者自身の身体から採取した、例えば、腸骨稜からの骨）、または合成であり得る。大半の骨移植片は、自然骨が時間と共に治癒するにつれて、再吸収及び置換されることが予想される。
【０００３】
成功する骨移植片は、骨伝導能（自然骨の修復成長を誘導する）、骨誘導能（未分化細胞が活性骨芽細胞となるのを促す）、及び骨形成能（骨リモデリングに寄与する移植片材料中の生存骨細胞）を含み得る。骨移植片は、それらが骨治癒に有利である骨再生ができる生細胞を含有する場合、骨形成性である。自家移植片の場合、骨形成が生じる。自家移植片は、それらが多数の骨形成細胞を含有するため、骨形成性と見なされる。しかしながら、署名（ａｕｔｏｇｒａｐｈ）は、署名（ａｕｔｏｇｒａｐｈ）の入手可能性が限定されるというある特定の欠点を有し、また署名（ａｕｔｏｇｒａｐｈ）は、ドナー部位の病的状態を引き起こし得る。
【発明の概要】
【０００４】
当該技術分野において、現在の署名（ａｕｔｏｇｒａｐｈ）製品の欠点がない骨形成性、骨誘導性、及び／または骨伝導性である骨移植片及び構築物の必要性がある。
【０００５】
本発明は、足場上に幹細胞を含有する好適な骨移植片または構築物の開発に関する。幹細胞に加えて、これらは、骨治癒を促進するために、例えば、骨誘導性脱灰骨と骨伝導性皮質−海綿骨片との混合物を含み得る。本発明の例は、骨形成性、骨誘導性、及び骨伝導性である骨移植片を提供する。加えて、非限定的な例示の実施形態によると、骨形成細胞は、腸骨稜から採取された骨髄から単離されるか、またはそれらは、脂肪組織から、もしくは大腿骨、脛骨、上腕骨などの長骨から単離され得る。例示の実施形態によると、最終製品である骨移植片製品は、ＤＢＭ（脱灰骨）、骨形成幹細胞、及び皮質−海綿骨片を含み得る。
【０００６】
本発明は、合成足場上に播種された幹細胞を含む構築物にも関する。幹細胞は次いで、化学的合図を使用して指図されて、骨形成分化を経る。これは、ＭＳＣに細胞外基質（ＥＣＭ）を分泌させる。細胞外基質（ＥＣＭ）は、細胞挙動の調節に重要な役割を果たす。脱細胞（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）組織基質は、自然組織に類似する複雑なＥＣＭベースの足場を提供する。現在の製品は、皮膚に由来する脱細胞基質を提供し、細胞接着のための足場としてこれを使用し、創傷治癒を促進するために使用される。しかしながら、合成足場上にＥＣＭを有することは、合成足場の性質とＥＣＭの独自の性質とを組み合わせて、一緒に治癒プロセスを調節する一助するのに役立つ。好適な合成足場上にＥＣＭを有することにより、自然組織に類似する合図を提供することに加えて、より良い機械的性質が提供される。
【０００７】
本発明者らは、足場と、細胞運命を導き、骨治癒を推進する骨誘導性及び骨伝導性細胞由来ＥＣＭとの性質を組み合わせる、独自の生体材料を開発した。
【０００８】
本骨移植片及び構築物を作製する方法、ならびにそのような骨移植片及び／または構築物を使用することによって骨及び創傷治癒を促進する方法も提供される。
【０００９】
本骨移植片及び／または構築物のうちの１つ以上を含むキット、ならびにそれを作製するための構成要素を含むキットがさらに提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は概して、幹細胞を含む骨移植片及び構築物に関する。本発明は、本骨移植片及び構築物を作製する方法、ならびに本骨移植片及び／または構築物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物において骨または創傷治癒を促進する方法にも関する。本発明はさらに、そのような骨移植片及び／もしくは構築物、またはそれらの構成要素を含むキットに関する。
【００１１】
本発明の例示の実施形態のさらなる態様、利点、及び／または他の特徴は、以下の発明を実施するための形態の観点から明らかとなろう。本明細書に提供される記載の実施形態は、単に例示及び例証であり、限定されないことは、当業者には明らかなはずである。これらの修正の多くの実施形態は、本開示及びその均等物の範囲内に入るものと想定される。
【００１２】
記載の例示の実施形態では、明確にするために特定の用語が採用される。しかしながら、実施形態は、この特定の用語に限定されないものとする。特に記述されない限り、専門用語は、従来の用法に従い使用される。
【００１３】
本明細書で使用される、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される、「別の」は、少なくとも２番目以降を意味し得る。特に文脈により必要とされない限り、本明細書で使用される、単数形の用語は複数形を含み、複数形は単数形を含む。
【００１４】
本明細書で使用される、「細胞外基質」または「ＥＣＭ」は、細胞によって分泌されるタンパク質及び多糖類の複雑なネットワークからなる細胞外構成要素であり、細胞−細胞シグナル伝達に重要な役割を果たす。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、それらが異なる細胞種において分化する際にインビボでＥＣＭを生成する。しかしながら、ＭＳＣは、ＭＳＣの分化を容易にするであろう化学的合図を提供することにより、ＥＣＭをエクスビボで分泌させる。
【００１５】
本明細書に示されるように、骨誘導性脱灰骨及び／または骨伝導性皮質−海綿骨片のうちの少なくとも１つを含む足場、ならびに骨形成幹細胞を含む骨移植片が、本明細書において提供される。より具体的で非限定的な例示の実施形態によると、骨治癒を促進するために、骨誘導性脱灰骨と骨伝導性皮質−海綿骨片との混合物中に骨形成幹細胞を含む骨移植片が提供される。
【００１６】
非限定的な例示の実施形態によると、本骨移植片は、骨形成細胞をフラスコなどの組織培養基材上に播種し、細胞を接着させることと、基材を洗浄して血液細胞を除去することと、基材から骨形成幹細胞を剥離することと、骨誘導性脱灰骨及び骨伝導性皮質−海綿骨片のうちの少なくとも１つを含む足場上に骨形成幹細胞を播種することとを含む方法により作製され得る。
【００１７】
非限定的な例示の実施形態によると、骨形成幹細胞は、例えば、大腿骨または脛骨からの海綿骨をコラゲナーゼで処理し、遠心分離により弱く接着した細胞を分離することによって得ることができる。
【００１８】
皮質−海綿骨片は、例えば、新鮮な凍結骨からの顆状突起から得ることができる。特に、顆状突起は、皮質骨幹から分離され、より小さい片に薄片化され得る。脱細胞顆状突起は、皮質−海綿骨片を形成するために粉砕され得る。
【００１９】
皮質骨は、粉砕され、脱灰骨（ＤＢＭ）を形成するためにＨＣｌ中で脱灰され得る。本明細書で使用される、用語「脱灰骨」、「脱灰骨基質」、及び「ＤＢＭ」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２０】
よって、例示の実施形態では、皮質骨は、ＤＢＭを形成するために処理され、加工され得る。ＤＢＭ及び／または皮質海綿骨片（例えば、顆状突起から得られた）は、足場を形成するために、個々に、または混合物として、または他の組み合わせで一緒に使用され得る。
【００２１】
皮質骨幹からの骨髄は、洗い流され、（例えば、海綿骨から得られた）遠心分離された幹細胞と混合され得る。細胞の混合物は、組織培養フラスコまたは他の組織培養基材上に播種され、それに接着させられ得る。
【００２２】
基材は次いで、いかなる血液細胞も除去するために洗浄され得、骨形成細胞は、例えば、トリプシンを使用して、剥離される。これらの細胞は次いで、皮質−海綿骨片、脱灰骨、またはそれらの混合物もしくは他の組み合わせの足場上に播種される。
【００２３】
代替の実施形態によると、（例えば、大腿骨または脛骨からの海綿骨をコラゲナーゼで処理した後に得られた）単離された骨形成幹細胞は、ＤＢＭ、ＣＣ、またはそれらの混合物もしくは他の組み合わせを含む足場上に直接播種され得る。
【００２４】
よって、本明細書において、骨形成細胞を足場上に播種することを含む、骨移植片を作製する方法が提供され、この足場は、骨誘導性脱灰骨及び／または骨伝導性皮質−海綿骨片を含む。非限定的な例示の実施形態によると、本方法は、不要な細胞、好ましくは全ての不要な細胞、またはできるだけ多くを除去するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で足場をすすぐことをさらに含み得る。
【００２５】
これらの実施形態のいずれかによると、骨形成細胞は、例えば、腸骨稜から採取された骨髄から、または大腿骨、脛骨、上腕骨などの長骨から単離された骨形成細胞を含み得る。よって、例示の実施形態は、ＣＣ、ＤＢＭ、またはこれらの混合物の足場上に直接播種される、腸骨稜から採取された骨髄から、または大腿骨、脛骨、上腕骨などの長骨から単離された骨形成細胞を含む骨移植片を含み得る。細胞接着後、足場は、不要な細胞を除去するために、例えば、ＰＢＳですすがれ得る。よって、これらの実施形態における幹細胞は、ＤＢＭ及びＣＣが得られたのと同じドナー由来であり得る。
【００２６】
他の非限定的な例示の実施形態によると、骨形成細胞は、例えば、脂肪組織から単離された骨形成細胞を含み得る。脂肪組織は、薄片化され、コラゲナーゼ酵素で処理され得る。次に、組織は、細胞分離を容易にするために遠心分離されるか、または組織からペトリ皿への細胞遊走を容易にするために、ペトリ皿中、３７℃でインキュベートされるかのいずれかであり得る。よって、例示の実施形態は、ＣＣ、ＤＢＭ、またはこれらの混合物の足場上に直接播種される、脂肪組織から単離された骨形成細胞を含む骨移植片を含み得る。細胞接着後、足場は、不要な細胞を除去するためにすすがれ得る。
【００２７】
非限定的な例示の実施形態によると、足場は、例えば、約１：１、１：２、または１：３の比率を含む、約１：１〜１：３、またはその間の任意の点の比率の脱灰骨基質と皮質−海綿骨片との混合物である。
【００２８】
さらなる例示の実施形態によると、骨形成幹細胞は、総骨移植片の少なくとも２０，０００細胞／ｃｃの量で骨移植片に存在し得る。骨移植片は、例えば、パテ様状態などの半固体状態であり得る。
【００２９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、最終製品は、−８０℃または−１８０℃で保管され得る。［本発明者は、これが正確であると確認したが、尚もそれらの間の温度を開示したい。
【００３０】
本明細書において、骨治癒を促進するための方法がさらに提供され、これは、骨形成幹細胞、ならびに骨誘導性脱灰骨及び／または骨伝導性皮質−海綿骨片を含む足場を含む、骨移植片を、それらを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【００３１】
非限定的な例示の実施形態によると、本明細書において、合成足場上にＥＣＭを含む構築物も提供される。これらの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、構築物を形成するために、合成足場上に播種される。幹細胞は次いで、骨形成分化を受ける化学的合図を使用して指図される。これは、ＭＳＣに細胞外基質を合成足場上に分泌させる。本明細書で使用される、用語「間葉系幹細胞」及び「ＭＳＣ」は、互換的に使用される。非限定的な例示の実施形態によると、ＭＳＣは、脂肪組織、骨髄、または骨から単離される。例示の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄または海綿骨に由来する。ＭＳＣは、ヒトまたはウシ由来であり得る。これらの構築物実施形態のＭＳＣは、購入されてもよい。
【００３２】
非限定的な例示の実施形態によると、合成足場は、コラーゲン−セラミック、コラーゲン−バイオガラス、またはＰＬＧＡのうちの少なくとも１つなど、天然または合成の材料を含み得る。非限定的な例示の実施形態として、足場は、コラーゲン−セラミック、コラーゲン−バイオガラス、またはＰＬＧＡベースの足場を含み得る。しかしながら、他の好適な生体適合性足場も想定される。
【００３３】
非限定的な例示の実施形態によると、本構築物は、細胞が上に播種される、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度の成長表面積を有し得る。
【００３４】
非限定的な例示の実施形態によると、構築物における間葉系幹細胞は培地中で培養され、構築物は、ＰＢＳ中ですすがれ、ＤＮＡｓｅで処理され、風乾される。
【００３５】
本明細書において、構築物を形成するために合成足場上に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を播種することと、補足培地中でＭＳＣを培養することと、ＰＢＳで構築物をすすぎ、ＤＮＡｓｅで処理することと、ＰＢＳで構築物をすすぎ、前試薬を除去することと、構築物を風乾することとを含む、構築物を作製する方法も含まれる。
【００３６】
培養は、例えば、補足培地中で５〜１５日間培養することを含み得、この補足培地は、例えば、α−ＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸）であり得る。培養培地は、２〜３日おきに新しい培地と交換され得る。
【００３７】
例示の実施形態によると、培養期間の終わりに、構築物はＰＢＳですすがれる。そのようなすすぎの後、構築物は、０．１〜２％トリトンＸ−１００及び１０〜４０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを含有するＰＢＳで５〜３０分間、または他の例示の実施形態によれば５〜１０分間、処理されてから、ＰＢＳでさらにすすがれ、ＤＮＡａｓｅで処理され得る。さらなる例示の実施形態によると、構築物は、０．３〜１％トリトンＸ−１００及び１０〜３０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを含有するＰＢＳで処理される。さらなる非限定的な例示の実施形態によると、構築物は、０．５％トリトンＸ−１００及び２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを含有するＰＢＳで処理される。
【００３８】
他の例示の実施形態によると、培養期間の終わりに、構築物は、ＰＢＳですすがれ、その後に、構築物は、２〜３回の凍結融解サイクルを通してさらに加工された後、ＰＢＳでさらにすすがれ、ＤＮＡａｓｅで処理され得る。
【００３９】
構築物のＤＮＡｓｅでの処理は、標準的な組織培養条件下で、１００〜３００単位／ｍｌ、または約１５０単位／ｍｌの濃度で、約（０〜６０分）間、約３７℃でのＤＮＡａｓｅの処理を含み得る。ＤＮＡｓｅでの処理は、続いて、前試薬、好ましくは全ての前試薬を除去するためにＰＢＳで２〜３回すすがれ得る。
【００４０】
例示の実施形態によると、構築物は次いで、風乾され、棚に保管され得る。
【００４１】
本明細書において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を合成足場上に播種することと、細胞培養培地中で細胞を培養することと、細胞培養培地を、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％）を含有する凍結培地と交換することと、凍結することとを含む、構築物を作製する方法も提供される。これらの実施形態では、構築物は、ヒトから単離された同種間葉系幹細胞で播種され得る。播種密度は、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２であり得る。細胞培養培地は、例えば、接着の約２４時間後に交換され得る。細胞ベースの構築物は、例えば、約−８０℃（例えば、約−７８℃〜−８２℃）、または気相液体窒素で保管され得る。
【００４２】
構築物は、例えば、固体またはパテ形態であり得る。
【００４３】
創傷治癒を治療する方法がさらに提供され、これは本構築物のいずれか、例えば、ＥＣＭを、それらを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【００４４】
非限定的な例示の実施形態は、本骨移植片及び／または構築物のうちの１つ以上、ならびに任意に、そのような構築物もしくは骨移植片を調製する、及び／または骨治癒もしくは創傷治癒のためにそれらを使用するための説明書を含むキットも含む。
【００４５】
さらなる例示の実施形態は、例えば、合成足場、細胞培養培地、ＰＢＳ、皮質−海綿骨片、脱灰骨、フラスコなどの組織培養基材、トリプシン、またはこれらの混合物もしくは他の組み合わせを含む、本骨移植片及び／または構築物を作製するための構成要素を含むキットを目的とする。さらなる構成要素、説明書、及び／または装置も含まれ得る。
【００４６】
以下の実施例は、様々な非限定的な実施形態及び技法をさらに例証するために提供される。しかしながら、これらの実施例は、例証であり、主張の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。当業者には明らかであろう、多くの変形及び修正が本発明の趣旨及び範囲内に包含されるものとする。
【実施例】
【００４７】
〔実施例１〕
本実施例では、骨移植片は、本発明により形成される。新鮮な凍結骨からの顆状突起は、皮質骨幹から単離され、より小さい片に薄片化され得る。本実施例の骨形成細胞は、大腿骨または脛骨からの海綿骨をコラゲナーゼで処理した後に得ることができる。弱く接着した細胞は次いで、遠心分離により分離され得る。脱細胞顆状突起は、皮質−海綿骨片（ＣＣ）を形成するために粉砕され得る。皮質骨幹からの骨髄は、洗い流され、遠心分離した細胞と混合され得る。
【００４８】
骨髄と骨形成細胞との混合物は、フラスコなどの組織培養基材上に播種され、接着され得る。基材は、いかなる血液細胞も除去するために洗浄され得、骨形成細胞は、トリプシンを使用して剥離される。
【００４９】
皮質骨は、ＤＢＭを形成するために、粉砕され、例えば、ＨＣｌ中で脱灰され得る。ＤＢＭは次いで、皮質−海綿骨片と混合され得る。細胞は次いで、骨移植片を形成するために、ＣＣ、ＤＢＭ、またはＣＣとＤＢＭとの混合物もしくは他の組み合わせであり得る足場上に播種され得る。
【００５０】
〔実施例２〕
本実施例において、（実施例１に記述されるように単離された）骨形成細胞は、ＤＢＭ、ＣＣ、またはＤＢＭとＣＣとの混合物であり得る足場上に直接播種され得る。骨形成細胞接着後、足場は、全ての不要な細胞を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすがれ得る。
【００５１】
〔実施例３〕
本実施例において、骨形成細胞は、腸骨稜から採取された骨髄から単離される。採取された骨髄は次いで、足場（ＣＣ、ＤＢＭ、またはＣＣとＤＢＭとの混合物）上に直接播種され得る。細胞接着後、足場は、不要な細胞を除去するために、すすがれ得る。
【００５２】
〔実施例４〕
本実施例では、骨形成細胞は、脂肪組織から単離される。脂肪組織は、薄片化され、コラゲナーゼ酵素で処理され得る。次に、組織は、細胞分離を容易にするために遠心分離されるか、または組織からペトリ皿への細胞遊走を容易にするために、ペトリ皿中で３７℃でインキュベートされるか、のいずれかであり得る。単離された細胞は次いで、足場（例えば、ＣＣチップ、ＤＢＭ、またはＣＣチップとＤＢＭとの混合物もしくは他の組み合わせ）上に播種され得る。
【００５３】
〔実施例５〕
本実施例では、本組成物の実施形態により調製される構築物が調製される。骨髄または海綿骨のいずれかに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、コラーゲン−セラミック足場上に播種される。ＭＳＣは、ヒトまたはウシ由来であり得る。播種密度は、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２であり得る。細胞は、補足培地（α−ＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸）中で５〜１５日間培養される。培養培地は、２〜３日おきに新しい培地と交換される。培養期間の終わりに、構築物は、ＰＢＳですすがれ、０．５％トリトン−１００及び２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを含有するＰＢＳで５〜１０分間処理され得る。処理の終わりに、構築物は、ＰＢＳですすがれ、ＤＮＡｓｅ（１５０単位／ｍｌ）で１時間、３７℃で処理される。この処理に続いて、全ての前試薬の完全な除去を確認するために、ＰＢＳ中で２〜３回すすがれる。構築物は次いで、風乾され、棚に保管され得る。
【００５４】
〔実施例６〕
本実施例において、骨髄または海綿骨のいずれかに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、コラーゲン−セラミック足場上に播種される。ＭＳＣは、ヒトまたはウシ由来であり得る。播種密度は、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２であり得る。細胞は、補足培地（α−ＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２リン酸）中で５〜１５日間培養される。培養培地は、２〜３日おきに新しい培地と交換され得る。培養期間の終わりに、構築物は、ＰＢＳですすがれ、２〜３回の凍結融解サイクルを通して加工される。凍結融解サイクルは、液体窒素中で３〜５分間構築物を凍結することと、３７℃の水浴で５分間融解することと、ＰＢＳ中で構築物をすすぐこととを含む。処理の終わりに、構築物は、ＰＢＳですすがれ、ＤＮＡｓｅ（１５０単位／ｍｌ）で１時間、３７℃で処理される。この処理に続いて、全ての前試薬の除去を確認するために、ＰＢＳ中で２〜３回すすがれる。構築物は次いで、風乾され、棚に保管され得る。
【００５５】
〔実施例７〕
本実施例では、実施例５及び６からの構築物は、ヒトから単離された同種間葉系幹細胞で播種され得る。播種密度は、２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２であり得る。接着の２４時間後、細胞培養培地は、１０％ＤＭＳＯを含有する凍結培地と交換され、凍結され得る。細胞ベースの構築物は、−８０℃または気相液体窒素で保管され得る。
【００５６】
本発明は、例示の実施形態において説明されてきたが、当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされ得ることを理解するであろう。したがって、本明細書における本発明は、具体的に記載される様態以外でも実践され得る。よって、本実施形態は、あらゆる点で、例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。したがって、そのような変更及び修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に入ることが意図される。
【国際調査報告】
2016537320.tif 000002
2016537320.tif 000003