【手続補正書】
【提出日】平成25年1月29日(2013.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクスを提供する段階と、
上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む単離組織断片を、細胞外マトリクスと一緒に恒温放置する段階と、
動物またはヒト細胞用の基本培地であって、
骨形成タンパク質（BMP）阻害剤、および
5〜500ナノグラム/mlの分裂促進増殖因子、ならびに
任意で、Wntアゴニスト
が添加された前記基本培地を含む細胞培養培地の存在下で、該上皮幹細胞、または単離組織断片を培養する段階と
を含む、上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む単離組織断片を培養するための方法。
【請求項２】
上皮幹細胞が、正常上皮細胞または腺腫上皮細胞であり、かつ正常上皮細胞が培養される場合に、Wntアゴニストが添加される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記BMP阻害剤が、ノギン、DAN、ならびにサーベラス（Cerberus）およびグレムリン（Gremlin）を含むDAN様タンパク質から選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記Wntアゴニストが、Wnt、R-スポンジン1〜4のいずれか、ノリン（Norrin）、およびGSK-阻害剤の一又は複数から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記Wntアゴニストが、R-スポンジン1〜4のいずれか、および／またはWnt-3aを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
分裂促進増殖因子が、EGF、TGF-α、FGF、BDNF およびKGFからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
分裂促進増殖因子が、EGFである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
BMP阻害剤がノギンであり、分裂促進増殖因子が上皮成長因子であり、かつWntアゴニストが、R-スポンジン1〜4のいずれかである、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、Y-27632、ファスジル、およびH-1152から任意で選択されるRock（Rho-キナーゼ）阻害剤をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地がnotchアゴニストをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
骨形成タンパク質（BMP）阻害剤、および
例えば5〜500ナノグラム/mlの、分裂促進増殖因子
が添加されている動物またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培養培地。
【請求項１２】
分裂促進増殖因子が、上皮増殖因子（EGF）、形質転換増殖因子-α（TGF-α）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）およびケラチン生成細胞増殖因子（KGF）からなる群にある一又は複数の分裂促進増殖因子から選択され、例えば、分裂促進増殖因子がEGFである、請求項11記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
Wntアゴニスト、例えばR-スポンジン1〜4のいずれかを付加的に含む、および／またはBMP阻害剤がノギンであり、かつB27、N2およびN-アセチルシステインの少なくとも一つが任意に補充される、請求項11または12記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
BMP阻害剤がノギンであり、分裂促進増殖因子がEGFであり、かつWntアゴニストがR-スポンジン1〜4のいずれかである、請求項13記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
細胞外マトリクス、例えばコラーゲンおよびラミニンを含む細胞外マトリクス、例えばマトリゲル（商標）と組み合わせた、請求項11〜14のいずれか一項記載の細胞培養培地。
【請求項１６】
細胞外マトリクスに添加される、または包埋される、請求項15記載の細胞培養培地。
【請求項１７】
細胞外マトリクス上で、または細胞外マトリクス中で、上皮幹細胞、単離組織断片、または単離オルガノイド構造を培養するための、請求項11〜16のいずれか一項記載の培養培地の使用。
【請求項１８】
上皮幹細胞が、正常上皮細胞または腺腫上皮細胞である、請求項17記載の使用。
【請求項１９】
請求項11〜16のいずれか一項記載の培養培地において、三次元組織オルガノイドを培養する段階を含む、細胞外マトリクス存在下で、三次元組織オルガノイドを培養するための方法。
【請求項２０】
三次元組織オルガノイドが、ノギン、EGF、ならびに任意でWntアゴニストとしてR-スポンジン1および／またはWnt-3aを含む培地中で培養される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
結腸もしくは小腸上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む組織断片、たとえば単離結腸陰窩または小腸陰窩を、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法を用いて培養することにより、オルガノイドを得るための方法であって、
例えば、培養段階が、結腸もしくは小腸上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む組織断片、たとえば単離結腸陰窩または小腸陰窩を、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、ノギン、EGF、ならびにWntアゴニストとしてR-スポンジン1および／またはWnt-3aを含む培地中で、細胞外マトリクスと接触させて培養することを含む、
前記方法。
【請求項２２】
膵臓上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む組織断片を、請求項1〜10のいずれかに一項記載の方法を用いて培養することにより、膵臓オルガノイドを得るための方法であって、
例えば、培養段階が、膵臓上皮幹細胞又は該上皮幹細胞を含む組織断片を、
第一段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGF、KGFもしくはFGF、およびR-スポンジン1をWntアゴニストとしてを含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGF、ならびにR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で
細胞外マトリクスと接触させて培養することを含む、
前記方法。
【請求項２３】
胃上皮幹細胞、または該上皮幹細胞を含む組織断片を、請求項1〜10のいずれかに一項記載の方法を用いて培養することにより、胃オルガノイドを得るための方法であって、
例えば、培養段階が、胃上皮幹細胞又は該上皮幹細胞を含む組織断片を、
第一段階でノギンをBMP阻害剤として、上皮増殖因子およびFGF10を分裂促進増殖因子として、R-スポンジン1およびWnt-3aをWntアゴニストとして含み、さらにB27、N2、N-アセチルシステインを含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、上皮増殖因子、およびWntアゴニストとしてR-スポンジン1およびWnt-3a、ノギンならびにFGF10を含む培地であって、第二段階でのWnt-3aの濃度が、第一段階で与えられるWnt-3a濃度と比較して低い、前記培地中で、
細胞外マトリクスと接触させて培養することを含む、
前記方法。
【請求項２４】
請求項1〜10または請求項19〜23のいずれか一項記載の方法により取得できる三次元オルガノイド。
【請求項２５】
腸上皮幹細胞、膵臓上皮幹細胞、又は胃上皮幹細胞由来である、請求項24記載の三次元オルガノイド。
【請求項２６】
非上皮細胞がない、例えば請求項24または請求項25の、三次元オルガノイド。
【請求項２７】
中心内腔を含む、例えば請求項24〜26のいずれか一項に記載の、三次元オルガノイド。
【請求項２８】
絨毛様上皮ドメインにより内面が覆われている中心内腔を取り囲み、分化した細胞型を含む上皮ドメインである陰窩様ドメインを含む、例えば請求項24〜27のいずれか一項記載の、三次元オルガノイドであって、非上皮細胞が該オルガノイドにない、前記三次元オルガノイド。
【請求項２９】
分化した細胞型を含む上皮ドメインである、膵島様構造を含む、例えば請求項24〜26のいずれか一項記載の、三次元オルガノイドであって、非上皮細胞が該オルガノイドにない、前記三次元オルガノイド。
【請求項３０】
一又は複数の腺腫細胞に由来し、細胞が末梢または中心内腔のいずれかに不規則に向かう空胞様構造を有する、請求項24〜27のいずれか一項に記載の三次元オルガノイド。
【請求項３１】
薬物探索スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、請求項24〜30のいずれか一項記載のオルガノイドの使用。
【請求項３２】
請求項11〜16のいずれか一項に記載の培養培地を使って培養された細胞またはオルガノイドの子孫。
【請求項３３】
以下において使用するための、請求項32記載の子孫：
a) 毒性アッセイまたは再生医療、および／または
b) 癌細胞の復帰を含め、上皮腺腫細胞または正常上皮細胞と比較して、上皮癌細胞を特異的に標的にする薬剤の特定、および／または
c) 候補薬物のインビトロでの代謝安定性および代謝プロファイルの決定。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
[本発明1001]
絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドにより内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩−絨毛オルガノイド。
[本発明1002]
細胞外マトリクスを提供する段階と、
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと一緒に恒温放置する段階と、
動物またはヒト細胞用の基本培地であって、
骨形成タンパク質（BMP）阻害剤、
5〜500ナノグラム/mlの分裂促進増殖因子、
が添加され、
上皮幹細胞および単離組織断片を培養する場合はWntアゴニストが添加される前記基本培地を含む細胞培養培地の存在下で、該幹細胞、単離組織断片、または腺腫細胞を培養する段階と
を含む、上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を培養するための方法。
[本発明1003]
前記BMP阻害剤がノギン（Noggin）であり、前記分裂促進増殖因子が上皮増殖因子およびケラチン生成細胞増殖因子であり、かつ前記WntアゴニストがR-スポンジン1である、本発明1002記載の方法。
[本発明1004]
前記BMP阻害剤が、ノギン、DAN、およびサーベラス（Cerberus）およびグレムリン（Gremlin）を含むDAN様タンパク質から選択される、本発明1002記載の方法。
[本発明1005]
前記Wntアゴニストが、Wnt、R-スポンジン1〜4、ノリン（Norrin）、およびGSK-阻害剤の1以上から選択される、本発明1002または本発明1004記載の方法。
[本発明1006]
前記Wntアゴニストが、R-スポンジン1およびWnt-3aを含み、かつ／または分裂促進増殖因子がEGFである、本発明1002および本発明1003〜1005記載の方法。
[本発明1007]
前記培養培地が、Y-27632、ファスジル、およびH-1152から選択されるRock（Rho-キナーゼ）阻害剤をさらに含む、本発明1002〜1006のいずれか一項記載の方法。
[本発明1008]
前記培養培地がnotchアゴニストをさらに含む、本発明1002〜1007のいずれか一項記載の方法。
[本発明1009]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、ノギン、EGF、ならびにWntアゴニストとしてR-スポンジン1および／またはWnt-3を含む培地中で、細胞外マトリクスと接触させて培養する、好ましくは本発明1002〜1008のいずれか一項記載の、結腸陰窩を取得および／または培養するための方法。
[本発明1010]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGF、KGFもしくはFGF、およびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGFおよびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で
培養する段階を含む、膵臓オルガノイドを取得および／または培養するための、好ましくは本発明1002〜1008のいずれか一項記載の方法。
[本発明1011]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞が、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階でノギンをBMP阻害剤として、上皮増殖因子およびFGF10を分裂促進増殖因子として、R-スポンジン1およびWnt-3aをWntアゴニストとして含み、さらにB27、N2、N-アセチルシステインを含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、上皮増殖因子、およびWntアゴニストとしてR-スポンジン1およびWnt-3a、ノギンならびにFGF10を含む培地であって、第二段階でのWnt-3の濃度が、第一段階で与えられるWnt-3a濃度と比較して低い、前記培地中で、
培養する段階を含む、好ましくは本発明1002〜1008のいずれか一項記載の、胃断片を取得および／または培養するための方法。
[本発明1012]
骨形成タンパク質（BMP）阻害剤、
Wntアゴニスト、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子（EGF）
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培養培地。
[本発明1013]
細胞外マトリクス上で上皮幹細胞または単離組織断片を培養するための、本発明1012記載の培養培地の使用。
[本発明1014]
本発明1002〜1009記載の方法により取得可能な絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドによって内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩-絨毛オルガノイド。
[本発明1015]
好ましくは本発明1002〜1008または本発明1010記載の方法により取得可能な、膵島様構造を含む、膵臓オルガノイド。
[本発明1016]
好ましくは本発明1002〜1008または本発明1011記載の方法により取得可能な、中心内腔を含む、胃オルガノイド。
[本発明1017]
薬物探索スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、本発明1001または本発明1014記載の陰窩-絨毛オルガノイドまたは結腸陰窩、本発明1015記載の膵臓オルガノイドまたは本発明1016記載の胃オルガノイドの使用。
[本発明1018]
骨形成タンパク質（BMP）阻害剤、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子（EGF）、
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の、腺腫細胞を培養するための使用。
以下の実施例は、単なる例示目的のために与えられるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。