(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、約２８ｋＤａの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示す、セリンエンドプロテアーゼを含む調製物であって、該調製物は、
ａ）最少容量の水にサケ卵を懸濁する工程；
ｂ）該サケ卵の同期化した迅速な孵化を誘導する工程；
ｃ）孵化したサケ卵をろ過して孵化液を得る工程；
ｄ）該孵化液に固体尿素を添加してサケ卵殻断片を解離させ、該液を低速遠心分離に供する工程；
ｅ）遠心分離上清をゲルろ過に供することによって、セリンエンドプロテアーゼをさらに精製する工程；および
ｆ）ベンズアミジン修飾カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによってセリンエンドプロテアーゼをさらに精製する工程であって、該アフィニティークロマトグラフィーが、クロマトグラフィーマトリクスまたは巨大分子構造に結合したセリンエンドプロテアーゼを抽出するために、濃縮塩洗浄、続いて、濃縮塩溶液中のジオキサンでの溶出、を実施することによって行われる、工程；
を含む方法によって得られ、該セリンエンドプロテアーゼは以下の特徴を有する：
ａ）Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ−ノルロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニン−４−ニトラニリド−アセテートを切断する；
ｂ）ベンズアミジンによって阻害される；
ｃ）アルギニンとのペプチド結合を切断する；
ｄ）８Ｍ尿素、６Ｍの塩、蒸留水および有機溶媒の存在下で活性なままである；かつ
ｅ）室温で５０日間溶液中で酵素活性を保持する。
【請求項２】
有機溶媒が、ジオキサンまたはプロパノールである、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
ゲルろ過が、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＳＲ−２００（登録商標）で実施される、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
アフィニティークロマトグラフィーが、ベンズアミジン修飾Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６Ｂ（登録商標）カラムで実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項５】
前記方法がイオン交換クロマトグラフィーの工程をさらに含み、前記調製物がシークエンスグレードの純度のものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項６】
イオン交換クロマトグラフィーが、ＰＢＥ９４（登録商標）カラムで実施される、請求項５に記載の調製物。
【請求項７】
孵化液が、−８０℃で何年もの間、または室温で何ヶ月もの間、使用前に保存される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項８】
セリンエンドプロテアーゼを含む調製物を調製する方法であって、
ａ）最少容量の水にサケ卵を懸濁する工程；
ｂ）該サケ卵の同期化した迅速な孵化を誘導する工程；
ｃ）孵化したサケ卵をろ過して孵化液を得る工程；
ｄ）該孵化液に固体尿素を添加してサケ卵殻断片を解離させ、該液を低速遠心分離に供する工程；
ｅ）遠心分離上清をゲルろ過に供することによって、セリンエンドプロテアーゼをさらに精製する工程；および
ｆ）アフィニティークロマトグラフィーによってセリンエンドプロテアーゼをさらに精製する工程であって、該アフィニティークロマトグラフィーが、クロマトグラフィーマトリクスまたは巨大分子構造に結合したセリンエンドプロテアーゼを抽出するために、濃縮塩洗浄、続いて、濃縮塩溶液中の有機溶媒での溶出、を実施することによって行われる、工程；
を含む、方法。
【請求項９】
アフィニティークロマトグラフィーが、ベンズアミジン修飾Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６Ｂ（登録商標）カラムで実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒がジオキサンである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ろ過がＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ＳＲ−２００（登録商標）で実施される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
イオン交換クロマトグラフィーの工程をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
イオン交換クロマトグラフィーがＰＢＥ９４（登録商標）カラムで実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
孵化液が、−８０℃で何年もの間、または室温で何ヶ月もの間、使用前に保存される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
セリンエンドプロテアーゼ調製物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約２８ｋＤａの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示し、かつセリンエンドプロテアーゼが請求項１または２に規定される特徴を有する、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製物中のサケセリンエンドプロテアーゼによるタンパク質分解を阻害する方法であって、少量のβ−メルカプトエタノールの使用と、エバポレーションによるインヒビターの除去とを含む、方法。
【請求項１７】
純水または非水性有機溶媒中でのタンパク質分解またはタンパク質の合成のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ  ｓａｌｍｏｎ）幼生を生産する孵化場からの排水中のエンドタンパク質分解性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）孵化酵素（ゾナーゼ（ｚｏｎａｓｅ））を抽出するための方法に関し、そしてさらに、本発明は、シークエンスグレード（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒａｄｅ）の純度までのこの特殊なエンドプロテアーゼを得るための簡単な方法を確立するが、このエンドプロテアーゼは、かなり独特のタンパク質分解特性を有することが分かっている。
【０００２】
精製した状態のプロテアーゼは、研究において、実験室および臨床の分析において、ならびに食品製造工程において、使用されることが多くなってきている。特に、特定の用途に釣り合う特性を有する酵素に対する要求は増加している。このことは、安全で、継続的で、そして経済的な様式の産生を可能にする、新規なプロテアーゼ源への探求を刺激している。
【０００３】
本明細書で、本発明者らは、タイセイヨウサケの水産養殖に関連したエンドプロテアーゼの新規で豊富な供給源を開拓する。この産業の必須の局面は、発生過程の卵（これが孵化して幼生を生じる）を孵化場で生産することである。孵化は、胚がエンドプロテアーゼを産生し、このエンドプロテアーゼが分泌されると、幼生が泳ぎ出て自分自身で生活を始め得るように、卵殻を効果的におよび特異的に裂けて開くことによって、達成される（参考文献：Ｙａｍａｇａｍｉ  １９８８；Ｗａｌｔｈｅｒ  １９９３）。
【０００４】
魚類の孵化の背後にあるこの決定的な酵素は、数種の魚類において特徴がわかっているのみであり、そしてほとんど全ての場合、これらのゾナーゼは、メタロプロテアーゼであると解釈されている（参考文献：Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ  １９７４；ＯｈｚｕおよびＫａｓｕｙａ  １９７９；ＳｃｈｏｏｔｓおよびＤｅｎｕｃｅ  １９８１；ＤｉＭｉｃｈｅｌｅら  １９８１；Ｙａｓｕｍａｓｕら  １９８９ａ，ｂ；ＡｒａｋｉおよびＯｎｏｚａｔｏ  １９９０；Ｈｕｎｇら  １９９７）。いくつかのゾナーゼ型酵素の遺伝子構造が、ほんの最近わかっただけである（参考文献：Ｙａｓｕｍａｓｕら  １９９２）。
【０００５】
孵化酵素と推定される酵素はまた、無脊椎動物において報告されており、ここでもまた、ほとんどのこのような酵素はメタロプロテアーゼであると解釈されている（例えば、ＢａｒｒｅｔｔおよびＥｄｗａｒｄ  １９７６；ＬｅｐａｇｅおよびＧａｃｈｅ  １９８９；ＲｏｅおよびＬｅｎｎａｒｚ  １９９０）。しかし、セリンプロテアーゼ様ゾナーゼと思われる確実な事例が二、三報告されている（例えば、Ｐｏｓｔら  １９８８）。逆に、魚類よりも高等な脊椎動物間でも、孵化酵素と推定される酵素はまた報告されている。例えば、ＵｒｃｈおよびＨｅｄｒｉｃｋ（１９８１；両生類に関する）ならびにＹａｍａｚａｋｉら（１９９４；マウスに関する）の両方は、セリンプロテアーゼであると思われるゾナーゼを報告した。孵化動物間にみられる２つの異なる型のゾナーゼの背後にある生物学的および生化学的理論付けは、現在のところ完全には理解されていない。
【０００６】
タイセイヨウサケにおいて、本発明者らは、主なゾナーゼがセリンプロテアーゼであることを見出した。これは、サケ卵の排水および孵化液（ｈａｔｃｈｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ）中に大量に存在する。この粗水性状態においては、従来の技術を用いて精製するために、サケゾナーゼを、効果的に準備することができる。ゾナーゼのこの供給源は、全胚からの酵素の単離に比較して大きな利点を提供する。なぜならば、無関係の生体物質（卵殻、胚、および幼生）由来の複合物を効果的に除去するからである。従って、酵素精製は非常に簡単になる。
【０００７】
さらなる利点は、発生段階のサケ卵が孵化前に最少容量の水に移され得ることである。昇温（または室温）により、または脱酸素化（Ｏｐｐｅｎ−Ｂｅｒｎｔｓｅｎら  １９９０）により、高度に同期化した孵化が誘導される場合、これによって、粗ゾナーゼの少量の高度に濃縮された調製物を作ることができる。
【０００８】
この方法のさらにきわめて重要な局面は、タンパク質分解性ゾナーゼの濃度の増加にもかかわらず、その内在するゾナーゼの安定性は損なわれないままであることが観察されたことである。さらに、この方法では、ほぼ純粋な水の媒体（多くて１ｍＭのＮａＣｌを含む）中でゾナーゼ酵素を得るが、それにもかかわらず、この媒体中で、ゾナーゼは、長時間にわたり酵素的に完全な状態にあって、その状態が維持されるということは重要な事である。この調製物は、それゆえ、引き続いて様々な程度に精製した（シークエンスグレードの純度まで）タンパク質分解性ゾナーゼを調製するための、有益な出発物質なのである。
【０００９】
（実施例１：タイセイヨウサケからの粗ゾナーゼの濃縮調製物）
ゾナーゼの最初の精製は、チーズクロスを通しての孵化したサケ卵のろ過のみである。そのようなろ液は、顕著なゾナーゼ分解なしに何年間も冷凍され得、その後解凍され、そしてさらなるゾナーゼ精製に用いられる。この事実は、サケゾナーゼを精製するための出発材料の生産を非常に簡単にする。
【００１０】
次の工程は、「ゾナーゼ粗製物」を通常４Ｍの尿素濃度に調節する工程を含み、この工程は、サケ卵殻の断片を解離させ、そして、低速遠心分離（１５，０００ｇ；２×１５分）により、無関係な破片と共にサケ卵殻の断片を除去することを可能にする。この材料は、カラムを詰まらせる兆候を示さないが、カラムが詰まることが、上記とは違う方法で調製した粗材料の特徴である。従って、従来のクロマトグラフィー技術による精製に適切な「ゾナーゼ粗製物」が、入手できたことになる。サケゾナーゼが４Ｍの尿素濃度、または８Ｍの尿素濃度においてさえ、安定であり、そして触媒的に活性であることには注目すべきである。さらに、サケゾナーゼのこの調製物は、セリンプロテアーゼ型のプロテアーゼのインヒビターによってのみ効果的に阻害される。
【００１１】
（実施例２：タイセイヨウサケからの精製ゾナーゼ）
「ゾナーゼ粗製物」から抽出した産物は、いろいろな精製段階で選択してもよい。しかし、すでに１回のゲルろ過の後、ゾナーゼは、ろ液中のより大きな分子成分から分離され、１２倍に精製され、５０％より良好な収率で得られる。「ゾナーゼ粗製物」に存在するより大きな成分は、そのほとんどの部分が卵殻の可溶性断片であるようであり、この断片にいくらかのゾナーゼがしっかりと結合されている。高分子量混入物は精製のこの初期段階で捨てる必要がある。なぜならば、さもなければ、その存在は、引き続く精製工程の成功に悪影響を与え、そして妨害するからである。言い換えれば、従来の精製法を行う一連の手順が、本プロセスの必須の局面である。
【００１２】
利用されるマトリクスは様々であり得るが、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＳＲ−２００を通常選択する。緩衝液は、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０もしくはｐＨ８．５（０．０５Ｍ））またはトリス−酢酸（０．０２５Ｍ、同様のｐＨ）であった。ゲルろ過法の後で得られるゾナーゼは、「ゾナーゼ粗製物」中の主なゾナーゼ部分を占め、そしてその酵素活性はベンズアミジンによって触媒的に阻害された。
【００１３】
タンパク質の点では、ゾナーゼは、すでにこの段階で、材料の約１０％を占める。この部分的に精製されたサケゾナーゼは、ここでもセリンプロテアーゼ型インヒビターによってのみ阻害される。
【００１４】
（実施例３：均一なタンパク質産物としてのゾナーゼ）
ベンズアミジンによるゾナーゼ阻害により、ゲルろ過カラムに留まる酵素画分は、さらに市販のベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ−カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。この工程により、７．５倍に精製され、「ゾナーゼ粗製物」に対して総精製工程では全体として９４倍に精製され、活性の収率は３７％である。
【００１５】
（２５または１２５ｍｌ容量のカラムで）用いた特定の条件は、再び、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８または８．５）であり、これは、カラムに非特異的に結合した物質を除去するために、１Ｍ  ＮａＣｌに調整された。ゾナーゼはカラムにしっかりと結合されたままであるので、この工程によっては除去されない。この工程は、同様のトリス−ＨＣｌ緩衝液において、１Ｍ  ＮａＣｌ中１０〜３３％のジオキサン勾配を用いて、カラムからゾナーゼを溶出することで決定的に成功するのである。この方法は、有機溶媒中でサケゾナーゼが特異な安定性を持つことによっている。
【００１６】
アフィニティー精製後、ゾナーゼ調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、約２８ｋＤａの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示す。ゾナーゼのこの部分は、抗原性が高く、サケゾナーゼを特異的に認識するがサケトリプシン等の他のサケセリンプロテアーゼは認識しないポリクローナル抗体の産生を可能にする。逆に、サケトリプシンに対するポリクローナル抗体は、サケゾナーゼを認識せず、このことは、胚のサケの別個の産物としてサケゾナーゼを確立させる。しかし、このゾナーゼ産物は、Ｅｄｍａｎ法によりそのＮ末端配列が明らかにされるように、シークエンスグレードの純度を有さない。しかし、最初の１２個のＮ末端の配列決定の工程を超えると、このタンパク質の全体のアミノ酸配列は、純粋なゾナーゼと類似していることが示された。この高度に精製されたサケゾナーゼ調製物はまた、セリンプロテアーゼ型インヒビターによってのみ、特異的に阻害される。
【００１７】
（実施例４：シークエンスグレードの純度を有して調製されたゾナーゼ）
ゲルろ過精製しかつアフィニティー精製したサケゾナーゼは、１つの最終クロマトグラフィー工程により、シークエンスグレードの純度まで、さらに精製され得る。この工程は、トリス−酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）とともに、ＰＢＥ９４カラムを用い、ここで、引き続く溶出には、この緩衝液中、塩勾配（１Ｍ  ＮａＣｌ塩まで）を用いた。この工程自体は、ゾナーゼの触媒活性を、さらに７．６倍増加し、精製工程全体では７１４倍に精製し、そして出発物質からの収率は２８％である。この精製工程では、ゾナーゼのタンパク質の正体は２８ｋＤａ部分のままである。よって、この工程では、実施例２および３に示されるように、タンパク質精製に慣例であるようには、無関係な主要なタンパク質混入物はゾナーゼ調製物から除去されない。精製したゾナーゼの分子量は、孵化液および「ゾナーゼ粗製物」に存在するゾナーゼ部分に対するウエスタンブロッティング法によって観察されるものと同一である。
【００１８】
第３および最終クロマトグラフィー工程において起こっているらしいことは、混入している小さなペプチドの除去である。これらのペプチドは、卵殻および／またはサケ胚に由来する可能性が最も高い、約１２残基を有するオリゴペプチドであると思われる。これらのペプチド混入物は、除去するとゾナーゼの触媒活性が増強されるので、ゾナーゼ触媒に対して阻害効果を発揮すると思われる。また、これらのペプチドの存在は、このゾナーゼ産物のＥｄｍａｎ配列決定における第１工程に干渉する。この第３の精製工程において見られるゾナーゼの２つの形態は、カラムマトリクスにいくらか異なって結合する。しかし、両方の形態は、そのＮ末端部分において類似のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
ＣＮＢｒ産生ペプチド由来の部分アミノ酸配列は、ゾナーゼを別個のタンパク質として確立させた。ゾナーゼが別個の触媒ドメインおよび基質結合ドメインを有し得、このことが、巨大分子（生理学的）基質に作用する（結合は阻害され、よって、触媒作用が間接的に阻害される）場合のカルシウムキレート剤に対するその感受性、また小さな基質に作用する（触媒作用が直接阻害される）場合のセリンプロテアーゼインヒビターに対する感受性を説明し得るという示唆が構造分析によって得られた。
【００２０】
（実施例５：サケゾナーゼの化学特性）
ゾナーゼの触媒作用は、モル濃度の塩の存在により影響されない（６Ｍの塩においても蒸留水中でもほぼ同程度に効果的である）。この酵素は、ｐＨ７とｐＨ９との間で実質的に等しく活性である。しかし、ゾナーゼは、ｐＨ４未満で不活化され、そしてｐＨ６では弱い活性しかない。ゾナーゼは、８Ｍの尿素の存在により影響されない。ゾナーゼは室温で、（尿素ありおよび尿素なしで）、最小の酵素活性の損失のみで、５０日間保存され得る。酵素活性はまた、４０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（ジオキサンまたはプロパノール等）によってさえ、妨害されない。反対に、この酵素は、１０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールによって容易に不活化される（２−メルカプトエタノールは引き続いて、５０℃でのエバポレーションによって除去され得る）。触媒作用は４２℃で最大であり（市販の基質ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  Ｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒから）を使用して）、わずかだが有意な触媒作用が、６５℃を超えて、または５分間９０℃まで加熱した後、引き続いて冷却し、室温でアッセイしたときに観察された。
【００２１】
（実施例６：サケゾナーゼの触媒特性）
問題のサケゾナーゼは、ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ基質全シリーズを切断し、塩基性アミノ酸（好ましくはアルギニン）とのペプチド結合で、最大親和力を示す。これらの小さな人工基質の場合、ゾナーゼは、他のセリンプロテアーゼと同程度に活性であるが、ＫM＝１４μＭはそれらより低い。Ｖｍａｘは１．３μＭ／分に等しく、そしてウシおよびブタ（カチオン性）トリプシンの場合の約１の値と比較して、５７（／ｍＭ秒）のＫｃａｔ／ＫMである。トリプシン等の他のセリンプロテアーゼと比較した、ペプチド結合の切断に関する高度の特異性が、基質として卵殻ｚｒタンパク質（Ｗａｌｔｈｅｒ  １９９３を参照のこと）を用いて示される。トリプシンは、これらのタンパク質を多くの小さな断片に切断し、一方、ゾナーゼは、その生理学的基質であるものをほとんど分解しないことが観察されている。
【００２２】
サケゾナーゼ作用の観察された特異性は、もちろん、ゾナーゼの必要とするものを正確に反映する。このような酵素は、胚が卵から出ることができるように、卵殻タンパク質の機械的に完全な状態を迅速に破壊しなければならないが、その化学的に完全な状態は破壊してはならない。非常に大量の卵殻基質の存在下で迅速にそうするためには、最小数のペプチド結合のみを特異的に攻撃する必要がある。しかし、その基質に長時間さらされると、ゾナーゼは、他のペプチド結合もまた最終的に切断する。タンパク質分解におけるこの配列特異性は観察はされたが、まだ化学的に詳細には説明されていない。しかし、ゾナーゼは、（他の）部位特異的特性を有する酵素の市販の酵素調製物（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒの製品、Ａｓｐ−ＮおよびＧｌｕ−Ｃ）を使用して現在達成されるような、特異的切断を様々な候補タンパク質において達成するという点で、優れた見込みを有するようである。従って、ゾナーゼは、配列決定されるべき大きなタンパク質から定義されたペプチドを産生するということで、タンパク質の配列決定（ｓｅｑｕｅｎａｔｉｏｎ）の分析学的研究の準備に用いられている市販の酵素と並んで格付けされる。従って、純粋なサケゾナーゼの酵素学的なこの特性は、商業的に有益である。
【００２３】
【表１】
0004378052.tif 000002