(57)【要約】本明細書において栄養性ポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドをコードする核酸、上記ポリペプチドを作製する組み換え微生物、上記ポリペプチドを発現するためのベクター、組み換え微生物を使用して上記ポリペプチドを作製する方法、上記ポリペプチドを含む組成物および配合物、ならびに、上記ポリペプチド、組成物、および配合物を使用する方法を含む他の様々な実施形態を提供する。【選択図】図７７【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象の筋肉量および／または筋肉の機能の喪失を予防または低減する方法であって、
ｉ）癌を罹患している、または罹患するリスクのあるヒト対象を同定するステップと、
ｉｉ）筋肉量および／または筋肉の機能の喪失を予防または低減するために十分な量の栄養配合物を前記ヒト対象に投与するステップと
を含み、
前記栄養配合物が、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、前記配合物が、前記栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含み、前記配合物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体、もしくは半固体として存在し、かつ前記配合物が、食用でない生成物を実質的に含まない、
方法。
【請求項２】
前記ヒト対象が、癌を罹患しており、１つまたは複数の用量の医薬組成物を投与されており、前記医薬組成物の投与により、筋肉量および／または筋肉の機能が喪失するリスクが増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト対象が、癌を罹患しており、１つまたは複数の用量の医薬組成物を投与されており、ｉ）前記疾患、障害、もしくは病態、もしくはｉｉ）前記医薬組成物の投与、またはｉ）およびｉｉ）の両方により、筋肉量および／または筋肉の機能が喪失するリスクが増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌を罹患しているヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態を処置する方法であって、当該筋消耗性の疾患、障害、または病態を処置するために十分な量の栄養配合物を前記ヒト対象に投与するステップを含み、前記栄養配合物が、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、前記配合物が、前記栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含み、前記方法が、任意に、前記癌および／または前記筋肉耗性疾患が処置されるように、一定期間前記対象に前記栄養配合物を投与した後、前記癌および／または前記筋消耗性の疾患、障害、もしくは病態を診断するステップをさらに含む、方法。
【請求項５】
前記配合物を、農業由来の食品を前記対象が消費していない中で、前記ヒト対象に実質的なタンパク質栄養を提供するために十分な用量スケジュールで投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質の栄養不良を特徴とする、またはタンパク質の栄養不良により悪化する、疾患、障害、または病態を発症するヒト対象のリスクを低減する方法であって、
（ｉ）癌を罹患しており、かつ前記疾患、障害、または病態を発症するリスクがあると前記ヒト対象を同定するステップと、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む、１つまたは複数の用量の栄養配合物を投与するステップと
を含み、
前記配合物が、前記栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含む、
方法。
【請求項７】
前記ヒト対象が、栄養障害またはタンパク質の栄養障害を発症するリスクがある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト対象が、サルコペニアおよび／またはカヘキシーを呈する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト対象が、炎症反応または自己免疫障害を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト対象が、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、中皮腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌（肺の大細胞癌、腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、消化器または胃の癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌または腎性癌、前立腺癌、子宮頸癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節性メラノーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；または移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を含む）を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト対象が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、または結核から選択される感染性疾患を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト対象が、外科手技を受けている、または外傷性の損傷を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
転移性癌を罹患していると前記ヒト対象を同定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養配合物を、外科治療、放射線治療、ホルモン治療、癌細胞標的化治療、または化学療法抗癌治療から選択される少なくとも１つの治療と併用して投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
運動療法と併用して、前記栄養配合物を投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養配合物を、放射線治療の組成物または化学療法の医薬組成物の投与の補助として投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記栄養性ポリペプチドが、肝機能、血清アルブミンのレベル、および／または血清血餅因子のレベルを増大または維持するために有効な量で前記配合物に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
癌を罹患しているヒト対象の筋肉の同化を増加させる方法であって、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む、１つまたは複数の用量の栄養配合物をヒト対象に投与することを含み、前記配合物が前記栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含み、前記栄養配合物が、それらの投与の後に前記対象の筋肉の同化を増加させるために十分な頻度で前記ヒト対象に投与される、
方法。
【請求項１９】
ヒト対象の処置に使用するための栄養性生成物を配合する方法であって、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む栄養性組成物を、癌を罹患しているヒト対象に提供するステップと、許容可能な賦形剤と前記栄養性ポリペプチドを配合するステップとを含み、前記単離型栄養性ポリペプチドが、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解度を有し、前記単離型栄養性ポリペプチドが、３０分未満の胃消化シミュレーション半減期を有する、方法。
【請求項２０】
味物質、栄養上の炭水化物、および栄養上の脂質のうちの少なくとも１つと前記栄養性組成物を組み合わせることをさらに含み、前記生成物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生成物が、食用でない生成物を実質的に含まない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、前記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患しているヒト対象の処置での使用に適しており、前記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）関心対象の少なくとも１つのアミノ酸を含む１つまたは複数のアミノ酸配列を前記ライブラリーで同定することと、ｉｉｉ）前記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することとを含む、方法。
【請求項２３】
栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、前記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患しているヒト対象の処置での使用に適しており、前記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）総アミノ酸残基に対する関心対象の少なくとも１つのアミノ酸残基の比率が選択した比率以上である、１つまたは複数のアミノ酸配列を前記ライブラリーで同定することと、ｉｉｉ）前記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することと
を含む、方法。
【請求項２４】
栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、前記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患しているヒト対象の処置での使用に適しており、前記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）総アミノ酸残基に対する関心対象の少なくとも１つのアミノ酸残基が選択した比率以下である、１つまたは複数のアミノ酸配列を前記ライブラリーで同定することと、ｉｉｉ）前記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することと
を含む、方法。
【請求項２５】
癌を罹患しているヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態の処置または予防のための栄養配合物であって、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、前記栄養性ポリペプチドが、タンパク質吸収能が低下した、または低下するリスクのあるヒト対象に栄養上の利点を提供するために十分な量で存在する、栄養配合物。
【請求項２６】
前記ポリペプチド配列が、少なくとも３４％である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含み、前記ポリペプチド配列が、前記ポリペプチド配列が任意にメチオニンを含まない、またはメチオニンが減少していることを除き、栄養上完全である、請求項２５に記載の配合物。
【請求項２７】
前記栄養性ポリペプチドに存在する必須アミノ酸が、実質的に生物学的に利用可能である、請求項２５に記載の配合物。
【請求項２８】
前記単離型栄養性ポリペプチドが、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解度を有する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項２９】
前記単離型栄養性ポリペプチドが、３０分未満の胃消化シミュレーション半減期を有する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３０】
前記栄養性ポリペプチドを、薬学的に許容可能なキャリアーの中に配合する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３１】
前記栄養性ポリペプチドを、食品もしくは食品の成分に配合し、または食品もしくは食品の成分として配合する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３２】
前記栄養性ポリペプチドを、飲料もしくは飲料の成分に配合し、または飲料もしくは飲料の成分として配合する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列が、主要な活性を有する酵素をコードし、前記栄養性ポリペプチドが、前記主要な活性を実質的に欠いている、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３４】
前記配合物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３５】
前記栄養性ポリペプチドが、少なくとも長さが５０個のアミノ酸の、食用に適した種のポリペプチドまたはそのフラグメントに対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、既知のアレルゲンに対して、少なくとも２５個のアミノ酸にわたり約５０％未満の同一性を有する、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３６】
味物質、タンパク質混合物、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂質、ミネラルまたはミネラル供給源、ビタミン、サプリメント、生物、医薬品、および賦形剤から選択される成分をさらに含む、請求項２５に記載の配合物
【請求項３７】
前記ヒト対象が、癌を罹患している、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３８】
前記アミノ酸配列が、おおよそ、完全長の参照栄養性ポリペプチドまたは参照ポリペプチド含有混合物に存在する必須アミノ酸の密度以上である密度の、必須アミノ酸を含む、請求項２５に記載の配合物。
【請求項３９】
前記アミノ酸配列が、おおよそ、完全長の参照栄養性ポリペプチドまたは参照ポリペプチド含有混合物に存在する前記選択したアミノ酸の密度以上である密度の、ロイシン、アルギニン、およびグルタミンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項２５に記載の配合物。
【請求項４０】
微生物から分泌できる食用に適した種のポリペプチドに対して少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの栄養性ポリペプチドを含む配合物であって、前記栄養性ポリペプチドが、タンパク質の参照１日摂取量の少なくとも約２％以上の栄養上の利点を提供するために十分な量で前記配合物に存在する、配合物。
【請求項４１】
癌を罹患しているヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態の処置または予防のための栄養配合物であって、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列のアミノ酸の比率に対して、少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列の比率を含む、複数の遊離アミノ酸を含む栄養性アミノ酸組成物を含み、前記栄養性アミノ酸組成物が栄養上完全であり、前記栄養性アミノ酸組成物が、タンパク質吸収能が低下したヒト対象に栄養上の利点を提供するために十分な量で存在する、栄養配合物。
【請求項４２】
前記配合物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する、請求項４０または４１に記載の配合物。
【請求項４３】
前記栄養性ポリペプチドが、前記配合物を経口投与する必要のあるヒト対象の肝機能、肺性機能、および／または腎機能を増大または維持するために十分な量で前記配合物に存在する、請求項４０または４１に記載の配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２１１号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２１４号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２１９号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２２０号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２２５号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２２９号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２３２号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２３４号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２３５号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２４０号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，１２９号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２４３号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２４６号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２５０号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２５４号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２６０号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２６４号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２６７号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２７１号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２７４号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，１８０号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，１８９号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，１９８号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２１２号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２２２号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，３００号、２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，２９５号、および２０１３年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６１／８８２，３０５号の優先権を主張するものであり；これら開示の全体は参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
食事性タンパク質は、ヒトの健康および成長に必須の栄養素である。世界保健機関は、エネルギー収支および体重の安定のためには、エネルギー摂取の約１０〜１５％を食事性タンパク質からとることを勧告している。様々な国の平均的な１日タンパク質摂取は、これらの勧告が、世界中で消費されているタンパク質の量と一致することを示している。タンパク質由来の平均２０〜３０％のエネルギーを含む食事は、エネルギー収支で消費する場合高タンパク質食を表す。身体は、健康および成長のために必要な特定のアミノ酸を合成することができず、その代わりにこれらを食物から入手しなければならない。これらのアミノ酸は、「必須アミノ酸」と呼ばれ、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、およびバリン（Ｖ）である。すべての必須アミノ酸を提供する食事性タンパク質の供給源を、「高品質」タンパク質と呼ぶ。肉、魚、家禽、卵、および乳製品などの動物性食品は、概して、良好な収支の必須アミノ酸を提供する高品質のタンパク質供給源とされる。カゼイン（哺乳動物の乳汁で一般的に見出されており、牛乳のタンパク質の最大８０％を構成するタンパク質）および乳清（乳汁を凝乳し、濾した後に残る液体の中のタンパク質）は、高品質の食事性タンパク質の主要な供給源である。良好な収支の必須アミノ酸を提供しない食品を、「低品質」タンパク質供給源と呼ぶ。大部分の果実および野菜は、不十分なタンパク質の供給源である。豆類、エンドウマメ、ヒラマメ、ナッツ類、および穀類（小麦など）を含む一部の植物性食品は、良好なタンパク質の供給源であるが、アレルゲン性の問題を有する場合がある。ダイズは、ダイズマメから製造される植物性タンパク質であり、高品質タンパク質であると考える人もいる。体重減少に関する高タンパク質食の試験は、タンパク質がエネルギー消費量および除脂肪体重に明確に影響を与えることを示している。さらなる試験では、過食を行っても、タンパク質由来の少なくとも５％のエネルギーを含む食事において体重増加が著しく少なく、かつ高タンパク質食がエネルギー摂取を減少させることが示されている。食品に共通して見出されるタンパク質は、ヒトなどの哺乳動物のアミノ酸の必要条件を効率的に満たすアミノ酸組成物を必ずしも提供するものではない。この結果から、それぞれの必須アミノ酸の最小必要条件を得るためには、食事性タンパク質の質が高い場合に必要とされる量よりも、より大量の総タンパク質を、食事で消費しなければならない。食事中のタンパク質の質を増大させることにより、低品質のタンパク質を含む食事と比較して消費しなければならないタンパク質の総量を低下させることが可能である。従来より、必須アミノ酸を含む混合物などの、望ましいアミノ酸の混合物が、乳清タンパク質などの、相対的に高いレベルの必須アミノ酸を含むタンパク質を加水分解することにより、および／または乳清などの加水分解したタンパク質を任意で含む混合物中に遊離アミノ酸を組み合わせることにより、提供されている。この種類の混合物は、味が苦く、食感が望ましくなく、可溶性が不十分であり、特定の用途にとっては不適切または望ましくないとされる場合がある。結果として、このような混合物は、場合によっては、遊離アミノ酸および／または加水分解したタンパク質の味を紛らわすために香味料を含む。場合によって、アミノ酸含有量の一部がポリペプチドまたはタンパク質により提供される組成物は、遊離アミノ酸および／または特定の加水分解タンパク質として提供される総アミノ酸の比率が高い組成物よりも苦い味を有することがわかっている。栄養配合物は従来より、乳汁から単離した乳清またはダイズから単離したダイズタンパク質などの、天然の食品から単離したタンパク質から作製されているため、このような組成物の有用性は限定されている。これらタンパク質のアミノ酸プロファイルは、哺乳動物のアミノ酸の必要条件と必ずしも一致するものではない。さらに商品としてのタンパク質は、概して、タンパク質組成が変動し得るタンパク質および／またはタンパク質の加水分解物の混合物からなり、よって、栄養上の価値に関して予測することが困難となる。さらに、このような高品質のタンパク質の供給には数に限りがあることは、タンパク質の形態で摂取するために利用できるのはアミノ酸の特定の組み合わせのみであることを意味する。カゼインおよび乳清、卵、および肉などの高品質の動物性タンパク質、ならびにダイズなどの植物性タンパク質を供給するために必要な農業上の方法もまた、莫大なエネルギーの投入を必要とし、かつ潜在的に有害な環境上の影響を有する。
【０００３】
よって、哺乳動物の消費用のタンパク質を供給する代替的な供給源および方法を有することは、特定の状況で有益である。栄養性タンパク質の有用性を高めることのできる１つの特徴が、タンパク質の溶解度である。溶解度が高い栄養性タンパク質は、安定性の増加、凝集への抵抗性、および望ましい味プロファイルなどの望ましい特徴を呈することができる。たとえば、高い溶解度を呈する栄養性タンパク質は、相対的に少ない容量の溶液に高濃度の栄養性タンパク質を含む飲料または液体配合物に配合でき、よって、単位容量あたり高い用量のタンパク質栄養素を送達することができる。可溶性の栄養性タンパク質はユーザ（たとえばアスリート）が、身体活動の前、最中、または後に栄養性タンパク質を摂取すること望む際などでの、スポーツドリンクまたはリカバリードリンク（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｄｒｉｎｋ）において有用であり得る。高い溶解度を呈する栄養性タンパク質はまた、対象（たとえば患者または高齢者）がタンパク質栄養素が必要とするが、固形の食品または大量の液体を消費することができない臨床状況で特に有用であり得る。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本発明は、ヒト対象の筋肉量および／または筋肉の機能の喪失を予防または低減する方法であって、ｉ）癌を罹患している、または罹患するリスクのあるヒト対象を同定するステップと、ｉｉ）筋肉量および／または筋肉の機能の喪失を予防または低減するために十分な量の栄養配合物を上記ヒト対象に投与するステップとを含み、上記栄養配合物が、ＳＥＱＩＤ００００１〜０３９０９からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、上記配合物が、上記栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含み、上記配合物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または、総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在し、上記配合物が、食用でない生成物を実質的に含まない、方法を提供する。一実施形態では、ヒト対象は、癌を罹患しており、１つまたは複数の用量の医薬組成物を投与されており、医薬組成物の投与が、筋肉量および／または筋肉の機能の喪失のリスクを増大させている。一実施形態では、ヒト対象は、癌を罹患しており、１つまたは複数の用量の医薬組成物を投与されており、ｉ）上記疾患、障害、もしくは病態、またはｉｉ）医薬組成物の投与、またはｉ）およびｉｉ）の両方が、筋肉量および／または筋肉の機能の喪失のリスクを増大させている。
【０００５】
別の態様では、本発明は、癌を罹患しているヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態を処置する方法であって、当該筋消耗性の疾患、障害、または病態を処置するために十分な量の栄養配合物を上記ヒト対象に投与するステップを含む方法であって、上記栄養配合物は、本明細書中に提供されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、上記配合物が、栄養性ポリペプチドを少なくとも約１．０ｇ含む、方法を提供する。一実施形態では、配合物は、農業由来の食品を消費していないヒト対象に、実質的なタンパク質の栄養を提供するために十分な用量スケジュールで投与する。
【０００６】
別の態様では、本発明はタンパク質の栄養不良により特徴付けられ、または悪化した、疾患、障害、または病態を発症するヒト対象のリスクを低減する方法であって、（ｉ）癌を罹患しており、かつ上記疾患、障害、または病態を発症するリスクのあるヒト対象を同定するステップと、（ｉｉ）本明細書中に提供されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む栄養配合物を、１つまたは複数の用量で投与するステップとを含む方法であって、上記配合物が、栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含む、方法を提供する。一実施形態では、ヒト対象は、栄養障害またはタンパク質の栄養障害を発症するリスクがある。一実施形態では、ヒト対象はサルコペニアおよび／またはカヘキシーを呈する。一実施形態では、ヒト対象は、炎症反応または自己免疫障害を有する。一実施形態では、ヒト対象は、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、中皮腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌（肺の大細胞癌、腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、消化器または胃の癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌または腎性癌、前立腺癌、子宮頸癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節性メラノーマ、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；または移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を含む）を有する。一実施形態では、ヒト対象は感染性疾患を有する。一実施形態では、ヒト対象は外科手技を受けている。一実施形態では、転移性癌を罹患しているとヒト対象を同定することを含む。一実施形態では、栄養配合物を、外科治療、放射線治療、ホルモン治療、癌細胞標的化治療、または化学療法抗癌治療から選択される少なくとも１つの治療と併用して投与する。一実施形態では、栄養配合物を、運動療法と併用して投与する。一実施形態では、放射線治療用の組成物または化学療法上の医薬組成物の投与の補助として投与する。一実施形態では、ヒト対象は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ（ＨＣＶ？  ＴＢ？）を有する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、癌を罹患しているヒト対象の筋肉の同化を増加させる方法であって、本明細書中で提供されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり、少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む栄養配合物を１つまたは複数の用量でヒト対象に投与することを含む、方法であって、上記配合物が栄養性ポリペプチドを少なくとも１．０ｇ含み、上記栄養配合物を、この投与後に対象の筋肉の同化を増加させるために十分な頻度で投与する、方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ヒト対象を処置する際に使用するための栄養性生成物を配合する方法であって、本明細書中に提供されるポリペプチドに対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含む栄養組成物を、癌を罹患するヒト対象に提供するステップと、許容可能な賦形剤と上記栄養性ポリペプチドを配合するステップとを含む、方法であって、上記単離型栄養性ポリペプチドが、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解度を有し、上記単離型栄養性ポリペプチドが、３０分未満の胃消化シミュレーション半減期を有する、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、味物質、栄養上の炭水化物、および栄養上の脂質と栄養性組成物を組み合わせることを含み、上記生成物が、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する。一実施形態では、生成物は、食用でない生成物を実質的に含まない。
【０００９】
別の態様では、本発明は、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、上記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患しているヒト対象を処置する際の使用に適しており、上記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）対象の少なくとも１つのアミノ酸を含む１つまたは複数のアミノ酸配列を、上記ライブラリーにおいて同定することと、ｉｉｉ）上記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することとを含む、方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、上記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患しているヒト対象を処置する際の使用に適しており、上記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）総アミノ酸残基に対する関心対象の少なくとも１つのアミノ酸残基の比率が、選択した比率以上である１つまたは複数のアミノ酸配列を上記ライブラリーにおいて同定することと、ｉｉｉ）上記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することとを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択する方法であって、上記栄養性ポリペプチドが、癌を罹患するヒト対象を処置する際の使用に適しており、上記方法が、ｉ）複数のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のライブラリーを提供することと、ｉｉ）総アミノ酸残基に対する対象の少なくとも１つのアミノ酸残基の比率が選択した比率以下である１つまたは複数のアミノ酸配列を上記ライブラリーにおいて同定することと、ｉｉｉ）上記１つまたは複数の同定したアミノ酸配列を選択することにより、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を選択することとを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、癌を罹患するヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態の処置または予防のための栄養配合物（ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）であって、本明細書中に提供されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約５０個のアミノ酸にわたり少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離型栄養性ポリペプチドを含み、上記栄養性ポリペプチドが、タンパク質吸収能が低下した、または低下するリスクのあるヒト対象に栄養上の利点を提供するために十分な量で存在する、栄養配合物を提供する。一実施形態では、ポリペプチド配列は、少なくとも３４％の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含み、ポリペプチド配列は、上記ポリペプチドが任意にメチオニンを含まない、またはメチオニンが少ないことを除き栄養上完全である。一実施形態では、栄養性ポリペプチドに存在する必須アミノ酸は、実質的に生物学的に利用可能である。一実施形態では、単離栄養性ポリペプチドは、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶性を有する。一実施形態では、単離型栄養性ポリペプチドは、３０分未満の胃消化シミュレーション半減期を有する。一実施形態では、栄養性ポリペプチドは、薬学的に許容可能なキャリアー中で配合される。一実施形態では、栄養性ポリペプチドは、食品もしくは食品成分の中に、または食品もしくは食品成分として配合される。一実施形態では、栄養性ポリペプチドは、飲料もしくは飲料の成分の中に、または飲料もしくは飲料の成分として配合される。一実施形態では、アミノ酸配列は、主活性を有する酵素をコードし、栄養性ポリペプチドは、実質的にこの主活性を欠いている。一実施形態では、本配合物は、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する。一実施形態では、栄養性ポリペプチドは、少なくとも約５０個の長さのアミノ酸の、食用に適した種のポリペプチドまたはそのフラグメントに対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記アミノ酸配列は、既知のアレルゲンに対して、少なくとも２５個のアミノ酸にわたり約５０％未満の同一性を有する。一実施形態では、味物質、タンパク質混合物、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂質、ミネラルまたはミネラル供給源、ビタミン、サプリメント、生物、医薬品、および賦形剤から選択される成分をさらに含む。一実施形態では、ヒト対象は、癌を罹患している。一実施形態では、アミノ酸配列は、おおよそ、完全長の参照栄養性ポリペプチドまたは参照ポリペプチド含有混合物に存在する必須アミノ酸の密度以上の密度の必須アミノ酸を含む。一実施形態では、アミノ酸配列は、おおよそ、完全長の参照栄養性ポリペプチドまたは参照栄養性ポリペプチド含有混合物に存在する必須アミノ酸の密度以上の密度の、ロイシン、アルギン、およびグルタミンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、微生物から分泌され得る食用に適した種のポリペプチドと少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの栄養性ポリペプチドを含む配合物であって、上記栄養性ポリペプチドが、タンパク質の参照１日摂取値の少なくとも約２％以上の栄養上の利点を提供するために十分な量で上記配合物に存在する、配合物を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、癌を罹患するヒト対象の筋消耗性の疾患、障害、または病態の処置または予防のための栄養配合物であって、本明細書中に提供されるポリペプチド配列のアミノ酸比率と少なくとも約９０％同一のアミノ酸比率を含む複数の遊離アミノ酸を含む栄養性アミノ酸組成物を含み、上記栄養性アミノ酸組成物が、栄養上完全であり、上記栄養性アミノ酸組成物が、タンパク質吸収能が低下したヒト対象に対して栄養上の利点を提供するために十分な量で存在する、栄養配合物を提供する。一実施形態では、本配合物は、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または総質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付図面を参照して良好に理解されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＩＭＡＣによるＳＥＱＩＤ−００１０５の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す画像である。
【図２】陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれかに結合すると予測される栄養性ポリペプチドに関するｐＨの関数としてアミノ酸あたりの実効電荷を示すチャートである。（１）ＳＥＱＩＤ−００１０５、（２）ＳＥＱＩＤ−００００８、（３）ＳＥＱＩＤ−００００９、（４）ＳＥＱＩＤ−００４７５、（５）ＳＥＱＩＤ−００４７２、（６）ＳＥＱＩＤ−００６４０、（７）ＳＥＱＩＤ−０００１９。
【図３】例示的な栄養性ポリペプチドに関する、ある範囲のｐＨにわたるアミノ酸あたりの総電荷を示すチャートである。（１）ＳＥＱＩＤ−００４７５、（２）ＳＥＱＩＤ−００００９、（３）ＳＥＱＩＤ−００４７８、（４）ＳＥＱＩＤ−００４３３、（５）ＳＥＱＩＤ−００４７２。
【図４】硫酸アンモニウムの濃度の関数としてＳＥＱＩＤ−００００９の純度を示すチャートである。
【図５】天然のシグナルペプチドと比較した、新規のシグナルペプチドを伴うＳＥＱＩＤ−００４０９（左）およびＳＥＱＩＤ−００４２０（右）の分泌を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す画像である。
【図６】刺激後の上清で検出された上清中のＧＬＰ−１（７−３６）濃度を示すチャートである。エラーバーは、技術的反復実験の標準偏差である。
【図７】ビヒクルＳＥＱＩＤ−００１０５、アルギニン、およびＳＥＱＩＤ−００３３８のＯＧＴＴの際の経時的な平均血中グルコース値を示すチャートである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図８】ＳＥＱＩＤ−００１０５、アルギニン、およびＳＥＱＩＤ−００３３８の短期投与後の０〜１２０分（左）および０〜６０分（右）で積分した血中グルコースの曲線下面積を示すチャートである。
【図９】処置群あたりｎ＝６のラットに関する経時的な平均血漿中インスリン濃度を示すチャートである。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図１０】すべての処置群に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した血漿中インスリンの曲線下面積を示すチャートである。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図１１】処置群あたりｎ＝６のラットに関する経時的な平均血漿中ＧＬＰ−１の濃度を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【図１２】経時的な平均血中グルコース値を示すチャートである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図１３】各処置群に関して、グルコースチャレンジ（０分）から６０分までのあいだ、および０分から１２０分までのあいだで積分したＡＵＣを示すチャートである。示されるエラーバーは平均値の標準誤差である。
【図１４】実験の過程全体での、ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００１０５の処置グループあたりｎ＝６のラット、及びＳＥＱＩＤ−００３３８の場合での処置グループあたりｎ＝５のラットの平均血漿中インスリン濃度を示すチャートである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図１５】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００１０５、およびＳＥＱＩＤ−００３３８に関する、０〜９０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【図１６】実験の過程全体での、ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して処置グループあたりｎ＝６のラット、及びＳＥＱＩＤ−００３３８に関してｎ＝５のラットの平均血漿中ＧＬＰ−１の濃度を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【図１７】各処置群に関して、０〜９０分および０〜６０分で積分したＧＬＰ−１（７−３６）の曲線下面積を示すチャートである。
【図１８】処置群あたりｎ＝６のラットでの、ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００１０５、アログリプチン、およびその組み合わせのＯＧＴＴの際の平均血中グルコース値を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【図１９】３つの異なる用量で投与したビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００１０５の経時的なＡｌｐｈａＬＩＳＡでの血漿中インスリンを示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２０】ビヒクル、およびＳＥＱＩＤ−００４２６、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４１に関する、経時的なＡｌｐｈａＬＩＳＡでの血漿中インスリンを示すチャートである。
【図２１】３つの用量のＳＥＱＩＤ−００１０５の血漿中インスリン濃度に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２２】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００４２６、ＳＥＱＩＤ−００３３８、およびＳＥＱＩＤ−００３４１の血漿中インスリン濃度に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２３】ＳＥＱＩＤ−００４２３、ＳＥＱＩＤ−００５８７、ＳＥＱＩＤ−００１０５に関する経時的なＡｌｐｈａＬＩＳＡでの血漿中インスリンを示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２４】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４２５、およびＳＥＱＩＤ−００４２９に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡでの経時的な血漿中インスリンを示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２５】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００４２３、ＳＥＱＩＤ−００５８７、およびＳＥＱＩＤ−００１０５の血漿中インスリン濃度に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２６】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４２５、およびＳＥＱＩＤ−００４２９の血漿中インスリン濃度に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２７】ビヒクル、およびＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２４０、およびＳＥＱＩＤ−００５５９に関するＥＬＩＳＡでの経時的な血漿中インスリンを示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２８】ビヒクル、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２４０、およびＳＥＱＩＤ−００５５９の血漿インスリン濃度に関する、０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示すチャートである。ここで示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図２９】ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００２４０に関してそれぞれｎ＝４およびｎ＝５のラットでの、４時間の時間経過にわたるＧＬＰ−２の濃度を示すチャートである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図３０】最初の１時間および全４時間で積分したＧＬＰ−２の曲線下面積を示すチャートである。示されるエラーバーは、９５％の信頼区間である。
【図３１】経時的な、すべての対象のＳＥＱＩＤ−００１０５に対する平均血漿中インスリン応答を示すチャートである。
【図３２】ベースラインと比較した、ＳＥＱＩＤ−００１０５に対する平均血漿中インスリン応答倍率を示すチャートである。
【図３３】経時的な、すべての対象のＳＥＱＩＤ−００４２６に対する平均血漿中インスリン応答を示すチャートである。
【図３４】ベースラインと比較した、ＳＥＱＩＤ−００４２６に対する平均血漿中インスリン応答倍率を示すチャートである。
【図３５】ＳＥＱＩＤ−００４２６に関するすべての患者の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の総反応の平均値を示すチャートである。
【図３６】ＳＥＱＩＤ−００４２６に関するすべての患者の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の反応倍率を示すチャートである。
【図３７】異なるロイシン濃度で測定したアルファスクリーンシグナル（ｙ軸）を示すチャートである。示されるエラーバーは、反復実験の標準偏差である。
【図３８】原発性ＲＳＫＭＣでの最小アミノ酸培地におけるロイシンの用量反応を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図３９】単離したヒラメ筋におけるｒｐｓ６のリン酸化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロイシンの用量反応を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４０】単離した腓腹筋におけるｒｐｓ６のリン酸化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロイシンの用量反応を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４１】単離した長指伸筋におけるｒｐｓ６のリン酸化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロイシンの用量反応を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４２】ＲＰＳ６のリン酸化に関するＬｅｕ／Ｔｙｒ／Ａｒｇの複合活性を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４３】Ｌｅｕ／ＴｙｒバックグラウンドにおけるＲＰＳ６のアルギニン刺激を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４４】Ａｒｇ／ＴｙｒバックグラウンドにおけるＲＰＳ６のロイシン刺激を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４５】Ａｒｇ／ＬｅｕバックグラウンドにおけるＲＰＳ６のチロシン刺激を示すチャートである。示されるエラーバーは、標準偏差である。
【図４６】ＳＥＱＩＤ−００１０５のパンクレアチンでの消化の際の遊離Ｌｅｕの放出の時間経過を示すチャートである。
【図４７】あるタンパク質濃度範囲での、４Ｃ（●）および２５Ｃ（○）のＳＥＱＩＤ−００１０５、ならびに４Ｃ（■）、および２５Ｃ（□）の乳清に関して、センチポアズで測定した粘度を示すチャートである。
【図４８】ＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、温度範囲にわたる所定の波長での（左）最初および最後（９０℃に加熱し、次に２０℃に冷却した後）のタンパク質の円二色性スペクトルと、（右）楕円率の変化とを示すチャートである。
【図４９】マンノース含有グリカンのウェスタンブロットを示す画像である。Ａ）クマシー染色したゲル。Ｂ）ＧＮＡでブロッティングしたメンブレン。両方のパネルにおいて、レーンは、以下のとおりである：１）前染色したタンパク質のラダー、２）Ａ．ｎｉｇｅｒ由来のＳＥＱＩＤ−００３６３（５μｇ）、３）ＳＥＱＩＤ−００３６３をコードする発現ベクターで形質転換した大腸菌由来の全細胞抽出物（５μｇ）、４）ＧＮＡの陽性対照のカルボキシペプチダーゼ（５μｇ）、５）ＳＥＱＩＤ−００３６３をコードする発現ベクターで形質転換した大腸菌由来の可溶性ライセート（５μｇ）。
【図５０】Ｎｅｕ５Ｇｃのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ａ）クマシー染色したゲル。Ｂ）抗Ｎｅｕ５Ｇｃプローブしたメンブレン。両方のパネルにおいて、レーンは、以下のとおりである：１および１０）前染色したタンパク質のラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、２および１１）、ウシ抽出物（３０μｇ）、３）ブタ抽出物（３０μｇ）、４）シカ抽出物（３０μｇ）、５）子ヒツジ抽出物（３０μｇ）、６）シチメンチョウ抽出物（３０μｇ）、７）ニワトリ抽出物（３０μｇ）、８）タラ抽出物（３０μｇ）、９）タンパク質混合物１（１０μｇ）、１２〜１５）１２）大腸菌（ＩＭＡＣ精製ライセート）、１３）Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（上清）、１４）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ライセート）、１５）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＭＡＣ精製ライセート）で発現させた栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリー（３０μｇ）、１６〜２０）１６）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＰＨ９５１  Ｇｒａｃライセート）、１７）大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ可溶性ライセート）、１８）大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａの全細胞）、１９）大腸菌（ＧａｍｉＢのライセート）、および２０）大腸菌（Ｇａｍｉ２のライセート）で発現させたｃＤＮＡライブラリー（３０μｇ）。
【図５１】キシロースおよびフコースのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ａ）クマシー染色したゲル。Ｂ）抗Ｎｅｕ５Ｇプローブしたメンブレン。ウェスタンブロット解析では、タンパク質試料を、植物および真菌から抽出したか、または大腸菌およびＡ．ｎｉｇｅｒにより組み換え発現した。Ａ）クマシー染色したゲル、Ｂ）抗Ｎｅｕ５Ｇプローブしたメンブレンにおけるキシロースおよびフコース含有グリカン。両方のパネルにいおいて、レーンは、以下のとおりである：１及び１１）前染色したタンパク質のラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、２）酵母抽出物（３０μｇ）、３）亜麻仁抽出物（３０μｇ）、４）ニワトリ抽出物（３０μｇ）、５）トウモロコシ抽出物（３０μｇ）、６）ジャガイモ抽出物（３０μｇ）、７）マッシュルーム抽出物（３０μｇ）、８）タンパク質混合物２（３０μｇ）、９）ＨＲＰ（２μｇ）、１０）フェチュイン（２μｇ）、１２）ダイズ抽出物（３０μｇ）、１３）コメ抽出物（３０μｇ）、１４）ブロッコリー抽出物（３０μｇ）、１５）トマト抽出物（３０μｇ）、１６）ブルーベリー抽出物（３０μｇ）、１７）ブドウ抽出物（３０μｇ）、１８）タンパク質混合物２（３０μｇ）、１９）ＨＲＰ（２μｇ）、２０）フェチュイン（２μｇ）である。
【図５２】表Ｅ３３Ａに列挙される用量の表記の栄養性ポリペプチドの経口投与後４時間にわたりラット（ｎ＝２〜４）から採取した血液試料で測定した血漿中アミノ酸濃度（μＭ・時間）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）（±ＳＤ）の変化を示す一連のチャートである。ＢＣＡＡ：分枝鎖アミノ酸、ＥＡＡ：必須アミノ酸。
【図５３】２．８５ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５を経口投与したラット（ｎ＝４）に関する平均血漿中アミノ酸濃度（±ＳＤ）‐時間曲線を示す一連のチャートである。ＢＣＡＡ：分枝鎖アミノ酸、ＥＡＡ：必須アミノ酸。
【図５４】ＳＥＱＩＤ−００１０５の用量反応作用を示す一連のチャートである。表Ｅ３３Ａに列挙される用量のＳＥＱＩＤ−００１０５の経口投与後４時間にわたりラット（ｎ＝４）から回収した血液試料で測定した（左）平均血漿Ｌｅｕ濃度（±ＳＤ）‐時間曲線、（右）血漿中アミノ酸濃度（μＭ・時間）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）（±ＳＤ）。
【図５５】ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型のラットの薬物動態試験の際の血漿中アミノ酸濃度を示す一連のチャートである。生理食塩水（丸（●）、実線）（ｎ＝４）、天然のＳＥＱＩＤ−００３６３（四角（■）、実線）（ｎ＝４）、脱グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３（白丸（○）、破線）（ｎ＝２）、および加水分解したＳＥＱＩＤ−００３６３（白四角（□）、破線）（ｎ＝４）の経口投与後の、必須アミノ酸（ＥＡＡ）（Ａ）、ロイシン（Ｂ）、セリン（Ｃ）、およびスレオニン（Ｄ）の血漿中アミノ酸プロファイル。データは、上述するようにＮ＝２〜４のラットに関する平均値±平均値の標準偏差を表す。
【図５６】ＷＰＩ、ＳＥＱＩＤ−００１０５、およびＳＥＱＩＤ３６３に関する平均ＦＳＲの変化を示す一連のチャートである。
【図５７】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図５８】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図５９】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図６０】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸および凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図６１】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図６２】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図６３】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図６４】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図６５】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図６６】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図６７】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸および凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）のヒト血漿中の経時的変化を示す一連のチャートである。
【図６８】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図６９】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、測定したアミノ酸の積分した面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図７０】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関して、凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示すチャートである。
【図７１】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００３６３に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７２】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００３６３に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７３】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００３６３に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７４】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ３６３に関して、測定したアミノ酸および凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡＡ）のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７５】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００４２６に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７６】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００４２６に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７７】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００４２６に関して、測定したアミノ酸のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【図７８】ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−００４２６に関して、測定したアミノ酸および凝集体、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）のヒト血漿中の時間経過を示す一連のチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
特許請求の範囲および本明細書で使用される用語は、特段他の記載がない限り以下に記載する通りに定義するものである。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示すものでない限り複数形を含むことに留意すべきである。
【００１９】
定義
「農業由来の食品」は、土壌での栽培または動物の飼育から生じる食品である。
【００２０】
用語「改善」は、疾患状態の処置、たとえばその予防、重症度もしくは進行の低減、寛解、または治癒を含む疾患状態の処置における任意の治療上有益な結果を指す。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、用語「有機栄養性」は、光（光合成による）または無機化学反応（化学合成）由来のエネルギーを使用する、単純な無機分子から複雑な有機化合物（炭水化物、脂肪、およびタンパク質など）を産生する生物を指す。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「肥満度指数」または「ＢＭＩ」または「ケトレー指数」は、メートルでの対象の身長の２乗により除算したキログラムでの対象の体重（ｋｇ／ｍ２）である。成年では、ＢＭＩを頻繁に使用することは、個体の体重が、彼または彼女の身長にとって標準または望ましい値からどの程度逸脱しているかを評価するためである。筋肉質などの他の要因もまたＢＭＩに著しく影響を与えるものであるが、体重の過剰または不足は、部分的に体脂肪が原因とされる場合がある。世界保健機関は、１８．５未満のＢＭＩは低体重、場合によっては栄養障害、摂食障害、または他の健康上の問題があると見なし、これに対してＢＭＩが２５超である場合は過体重とし、３０超を肥満としている（世界保健機関  ＢＭＩ分類）。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、「分枝鎖アミノ酸」は、ロイシン、イソロイシン、およびバリンから選択されるアミノ酸である。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、「カヘキシー」は、筋肉の消耗および体重減少をもたらす多面的な臨床症候群を指す。タンパク質の異化がタンパク質の同化を超える複雑な状態では、筋肉の消耗が、この状態の主な特徴となる。タンパク質の代謝における代謝の乱れに加えて、カヘキシーは食欲不振および炎症をも特徴とする。これらの乱れプラスタンパク質の代謝不全は、様々な度合いで栄養療法に応答性である。
【００２５】
本明細書中で使用されるように、「カロリーコントロール」および「カロリー制限」は、対象の従来のカロリー摂取と比較、または適切なカロリー摂取の基準と比較して、食品からの対象のカロリー摂取を低減する工程を指す。
【００２６】
一般的に、用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」および「癌の（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」は、概して制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的な状態を指す、または説明する。より具体的には、本明細書中に提供される方法に関連して、１つまたは複数のチロシンキナーゼ阻害剤、受容体またはそのリガンドを遮断する他の薬剤、またはそれらの変異体を使用して処置される癌として、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、中皮腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌（大細胞癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）（胃腸癌および消化管癌を含む）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）、前立腺癌、子宮頸癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；または移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）；ならびに母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫など）、およびメグズ症候群が挙げられる。
【００２７】
「食用生成物」は、食用に適した生成物であり、対して「非食用生成物」は、概して食用でない生成物であり、または食用でない生成物を含む。「食用でない生成物を実質的に含まない」は、組成物が、意図する消費者による消費にとって食用ではなく、危険、またはそれ以外で不適合となるために十分な量またはレベルの食用でない生成物を有していないことを意味する。あるいは、ポリペプチドは、食用でない生成物を実質的に含まず、このことは、ポリペプチドを含む組成物が意図する消費者にとって食用ではなく、危険、または有害となるために十分な量またはレベルの食用でない生成物を、ポリペプチドが含まず、またはそれに関連していないことを意味する。好ましい実施形態では、食用でない生成物を実質的に含まない生成物は、このような消費からの有害事象を受けない、または受けるリスクが増加しない栄養上の量で、意図する消費者により消費され得る。たとえば、鉛および他の金属のレベルは、食品、特に、鉛および／または他の金属で汚染された土壌で生育した農業由来の生成物を含む食品に存在する場合、ヒトに対する毒性を含む顕著なリスクを有することが十分に実証されている。よって、一定の百万分率（ｐｐｍ）を超える上記の金属含有量を有する工業的に生成したポリペプチドを含む食品、飲料、および化合物などの生成物は、食用でない生成物と考えられ、このような金属含有量は、当技術分野において認識されるように金属に依存する。たとえば哺乳動物が消費する場合に鉛が有害な生物学的な作用を有するようなレベルで、工業的に生成したポリペプチド中に鉛またはカドミウムが含まれると、工業的に生成したポリペプチドを含む組成物は食用ではなくなる。上記のとおりではあるが、一部のポリペプチドでは、一定量の金属（鉄、亜鉛、カルシウム、およびマグネシウムなど）がポリペプチドの中で錯体を形成するか、または組み込まれており、このような金属は、必ずしもポリペプチドを食用でないようにするものではない。
【００２８】
用語「制御配列」は、その存在が発現に必須である最小限の任意の成分を含み、かつ、その存在が有益であるさらなる成分、たとえば、リーダー配列および融合パートナー配列といった追加的な成分を包含し得ると意図される。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、患者は、内科的疾患のために肥満度指数および筋肉量のうちの少なくとも１つの変化（たとえば筋肉減少症）を経験している場合、患者は「臨床医学的に病気」である。一部の実施形態では、患者は、起床時間の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のあいだ、安静臥床状態である。一部の実施形態では、患者は意識不明である。一部の実施形態では、患者は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、１０週間、またはそれ以上のあいだ、この段落に記載されるように安静臥床状態であった。
【００３０】
本明細書で使用されるように、参照核酸配列の「縮重変異体」との文言は、標準的な遺伝子コードに従って翻訳されて、参照核酸配列から翻訳したものと同一のアミノ酸配列を提供することのできる核酸配列を包含する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」は、配列が必ずしも同一ではないが、１つまたは複数の特定のセグメントの中で互いに相同である標的核酸配列とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、「望ましい肥満度指数」は、約１８．５〜約２５の肥満度指数である。よって、対象が約１８．５未満のＢＭＩを有する場合、対象のＢＭＩを増加させることにより、対象のＢＭＩの望ましさが増加する。これに対し、対象が約２５超のＢＭＩを有している場合では、対象のＢＭＩを減少させることにより、対象のＢＭＩの望ましさが増加する。
【００３２】
本明細書中で使用されるように、用語「糖尿病」は、任意または十分な量のインスリンを産生できず、または血糖値を調節できない、任意の代謝性疾患を含む。用語「糖尿病前症」は「空腹時血糖異常」とも呼ばれ、空腹時血糖が許容される正常値の限界を超える状態を含む。
【００３３】
本明細書中で使用されるように、「高齢の」哺乳動物は、肥満度指数および筋肉量のうち少なくとも１つの加齢関連の変化（たとえば加齢関連の筋肉減少症）を経験している哺乳動物である。一部の実施形態では、「高齢の」ヒトは、少なくとも５０歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、少なくとも８５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、または少なくとも１００歳である。一部の実施形態では、高齢の動物、哺乳動物、またはヒトは、一生涯のピーク時筋肉量からの筋肉量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％の喪失を経験したヒトである。肥満度指数および筋肉量の少なくとも１つの加齢関連の変化は、年齢の上昇と関連することが知られているため、一部の実施形態では、高齢の哺乳動物は、年齢に基づき単純に同定または定義されている。よって、一部の実施形態では、「高齢の」ヒトは、肥満度指数および筋肉量の少なくとも１つの測定を根拠とすることなく、年齢が、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、少なくとも８５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、または少なくとも１００歳であるという事実によって単純に同定または定義される。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「必須アミノ酸」は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、およびバリンから選択されるアミノ酸である。しかしながら、「必須アミノ酸」は、典型的な生涯のあいだに変動し得ると理解すべきであり、たとえば、システイン、チロシン、およびアルギニンは、ヒト幼児の必須アミノ酸とされている（Ｉｍｕｒａ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ａ  （１９９８）．  ‘‘Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ’’．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １４  （１）：１４３−８）。さらに、アミノ酸のアルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシンは、成年にとって「条件的に必須」であり、これは、通常食事では必要とされていないが、適切な量でそれらを合成しない特定の集団では外から供給しなければならないことを意味する（Ｆｕｒｓｔ  Ｐ，  Ｓｔｅｈｌｅ  Ｐ  （１  Ｊｕｎｅ  ２００４）．  ‘‘Ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ？’’．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３４  （６  Ｓｕｐｐｌ）：  １５５８Ｓ−１５６５Ｓ；  ａｎｄ  Ｒｅｅｄｓ  ＰＪ  （１  Ｊｕｌｙ  ２０００）．  ‘‘Ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎｓ’’．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３０  （７）：１８３５Ｓ−４０Ｓ）。
【００３５】
本明細書中で使用されるように、「運動」は、体力ならびに全体の健康およびウェルネスを高めるまたは維持する、最も広い範囲での何等かの身体活動である。運動は、筋肉および心血管系の強化、運動スキルの研磨、体重の減少または維持、ならびに楽しみのための目的を含む、様々な理由のため実施される。
【００３６】
本明細書中で使用されるように、「運動療法」は、健康の促進、または疾患の処置もしくは予防のための何等かの運動課程を含む。
【００３７】
本明細書中で使用されるように、「発現制御配列」は、機能的に連結されたコード配列の発現に影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列として、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列、およびエンハーサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率（たとえばリボソーム結合部位）を高める配列；タンパク質の安定性を高める配列；望ましい場合、タンパク質の分泌を高める配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような制御配列として、一般的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位配列、および転写終止配列が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、「機能」および「機能的な能力」は、日常活動を模倣する機能試験を指す。「筋肉の機能」または「機能的な能力」は、タイムドステップ試験（ｔｉｍｅｄ−ｓｔｅｐ  ｔｅｓｔ）（４インチのベンチを可能な限り早く５回昇り降りすること）、タイムド床移動試験（ｔｉｍｅｄ  ｆｌｏｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｅｓｔ）（可能な限り早く一度、床の上で座位から仰臥位になり、その後再度立位になる）、および身体能力バッテリー試験（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｂａｔｔｅｒｙ  ｔｅｓｔ）（静止バランステスト、椅子のテスト、および歩行テスト（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍａｓｓ，  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ，’’    Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００８；２７：１８９−１９５）を含む、いずれかの適切な容認されたテストにより測定される。本明細書中で使用されるように、組織の損傷または組織の障害などの「能力に関連した」損傷または障害は、身体能力または運動能力などの機能的な活動が原因で起こる。
【００３９】
用語「融合タンパク質」は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質由来であり得る２つ以上の望ましい機能的要素を含むように構築できるため、有用である。融合タンパク質は、関心対象のポリペプチド由来の少なくとも１０個の連続アミノ酸、または少なくとも２０もしくは３０個のアミノ酸、または少なくとも４０、５０、もしくは６０個のアミノ酸、または少なくとも７５、１００、もしくは１２５個のアミノ酸を含む。融合タンパク質の中に含まれる異種ポリペプチドは、通常、長さが少なくとも６個のアミノ酸、または長さが少なくとも８個のアミノ酸、または長さが少なくとも１５、２０、もしくは２５個のアミノ酸である。ＩｇＧ  Ｆｃ領域などの大きなポリペプチド、およびさらには、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質などのタンパク質全体を含む融合は、特定の有用性を有する。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームで構築し、次いで融合タンパク質を発現させることにより、組み換えにより産生できる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを別のタンパク質に架橋することにより化学的に産生できる。
【００４０】
ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性のパーセントとも呼ばれ、典型的に配列解析ソフトウェアを使用して測定する。たとえば、ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  ウィスコンシン州マディソンｓ．  ５３７０５を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の改変に割り付けされる相同性の測定を使用して、類似の配列をマッチさせる。たとえば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプロフラムを含み、これらは、デフォルトのパラメータを用いて、異なる生物種由来の相同なポリペプチドなどの近縁のポリペプチドのあいだ、または野生型のポリペプチドとその変異タンパク質とのあいだの配列相同性または配列同一性を決定することができる。たとえば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６を参照されたい。特定のポリペプチド配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する例示的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）；  Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６−２７２  （１９９３）；  Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１  （１９９６）；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７）；  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９−６５６  （１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７））である。
【００４１】
本明細書中で使用されるように、「胃腸障害」または「胃腸疾患」は、消化管またはそれらの領域、すなわち食道、胃、小腸、大腸、または直腸、ならびに消化に関連する臓器および組織、たとえば膵臓、胆嚢、および肝臓を巻き込む任意の障害または疾患を含む。
【００４２】
本明細書中で使用されるように、用語「有機栄養性」は、炭素を固定できず、生育ために有機炭素を使用する生物を指す。
【００４３】
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列が、第２のポリペプチドをコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、このポリペプチドは第２のポリペプチドとの相同性を有する、または相同である。あるいは、２つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有する場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドに対して相同性を有する（よって、用語「相同ポリペプチド」は、２つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。「相同」がポリペプチドまたはペプチドに関連して使用される場合、同一ではない残基の位置が、しばしば保存的アミノ酸置換により異なると理解されている。「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸が、類似の化学特性（たとえば電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの機能的な特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合では、パーセント配列同一性または相同性の度合いは、置換の保存的性質に関して補正するために上方に調節することができる。この調節を行う方法は、当業者に良く知られている。たとえば、Ｐｅａｒｓｏｎ，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１  ａｎｄ  ２５：３６５−８９を参照されたい。以下の６つの群：１）セリン、スレオニン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン；４）アルギニン、リジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、および６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ポリマー分子（たとえばポリペプチド配列または核酸配列）は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である場合、互いに相同であるとされる。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％類似である場合、互いに相同であるとされる。用語「相同な」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）のあいだの比較を指す。一部の実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、または５０個超のアミノ酸の少なくとも１つの区間に関して、少なくとも約５０％同一、少なくと���約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約９０％同一である場合相同であるとされる。一部の実施形態では、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の独自の特定のアミノ酸の区間をコードできることを特徴とする。ヌクレオチド配列が相同であると考えられるためには、これらのアミノ酸の同一性および互いに対するおおよその間隔の両方を考慮しなければならない。６０ヌクレオチド未満の長さのヌクレオチド配列の一部の実施形態では、相同性は、少なくとも４〜５個の独自の特定のアミノ酸の区間をコードできることにより決定される。一部の実施形態では、２つのポリペプチド配列は、ポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの区画で、少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約９０％同一である場合に相同であるとされる。他の実施形態では、２つのポリペプチド配列は、ポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの区画で、少なくとも約５０％類似、少なくとも約６０％類似、少なくとも約７０％類似、少なくとも約８０％類似、または少なくとも９０％類似、または少なくとも約９５％類似である場合に相同であるとされる。一部の実施形態では、類似性は、アミノ酸の変化をもたらす少ない数のヌクレオチドの変化により例証される（たとえば、たとえ両方の変化によって同一のアミノ酸置換が起こる場合であっても、単一のヌクレオチドの変化を有する核酸配列は、２つのヌクレオチドの変化を有する核酸配列よりも、参照配列に類似している）。
【００４４】
用語「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、生きている生物から分離されて生育する、たとえば組織培養で生育する、生存細胞中で起こる工程を指す。
【００４５】
本明細書中で使用されるように、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、生物内（たとえば動物、植物、または微生物）ではなく、たとえば試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などの人工的な環境で起こる事象を指す。本明細書中で使用されるように、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、生物の外の環境の組織の中または組織上で行われる実験を指す。
【００４６】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、生きている生物で起こる工程を指す。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「修飾された誘導体」は、参照ポリペプチド配列に対して、一次構造配列が実質的に相同であるが、たとえばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的もしくは生化学的な修飾を含む、または参照ポリペプチドに見出されないアミノ酸配列が組み入れられているポリペプチドまたはそのフラグメントを指す。このような修飾は、たとえば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、たとえば放射線核種での標識、および当業者に容易に理解される様々な酵素修飾を含む。ポリペプチドを標識する様々な方法、およびこのような目的に有用な置換基または標識は、当技術分野において周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの放射性同位元素、標識した抗リガンド（たとえば抗体）と結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識したリガンドに対する特異的結合対のメンバーとして作用できる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要とされる感受性、プライマーとの結合の簡便性、安定性の必要条件、および利用可能な計測手段に依存する。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２，  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）を参照されたい。
【００４８】
本明細書中で使用されるように、「筋力」は、筋肉が１回で最大効果を生ずることのできる力の量を指す。２種類の筋力、静的筋力および動的筋力がある。静的筋力は、筋力の等尺性収縮を指し、この場合、筋肉の長さが一定のままであり、かつ／または関節の動きがない場合に筋肉が力を生み出す。例として、物体の保持または運搬、または壁を押すことが挙げられる。動的筋力は、それによって運動が起こる筋肉が生成する力を指す。動的筋力は、等張性収縮とすることができ、この場合、筋肉は、一定の負荷または等運動性収縮の下短くなり、筋肉は、一定の速度で収縮して短くなる。さらに、用語「筋力」は、用語「最大挙上重量」（１ＲＭ）により記載される動的筋力の最大値を指す。これは、機能不全または損傷がない状態で、１回で完全に移動させる（持ち上げる、押す、または引く）ことができる最大限の負荷（キログラム）の測定である。この値は、直接測定することができるが、対象が、完了まで活動を実行することができなくなるまで重量を増加させることが必要である。あるいは、１ＲＭは、対象が運動できる最大量よりも少ない負荷を使用して対象が行うことのできる運動の反復の最大回数を計測することにより評価される。脚の伸長および脚の屈曲は、しばしば臨床試験で測定されている（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍａｓｓ，  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ，’’    Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００８；２７：１８９−１９５；  Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ‘‘Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ２８  ｄａｙｓ  ｂｅｄ  ｒｅｓｔ，’’    Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４；８９：４３５１−４３５８）。
【００４９】
本明細書中で使用されるように、「筋肉量」は、対象の身体における筋肉の重量を指す。同様に、「筋肉の同化」は、筋タンパク質の合成を含み、かつ筋肉量が増加する工程の構成要素である。筋肉量は、骨格筋、平滑筋（心筋および消化管の筋（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ）など）およびこれら筋肉に含まれる水を含む。特定の筋肉の筋肉量は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）を使用して決定できる（Ｐａｄｄｅｎ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。総除脂肪体重（−脂肪）、総体重、および骨塩量も同様にＤＥＸＡにより測定できる。一部の実施形態では、対象の特定の筋肉の筋肉量の変化は、たとえば、ＤＥＸＡにより決定され、この変化は、対象の筋肉量の変化の合計に関する代用として使用される。よって、たとえば、対象が、本明細書中に開示される栄養性タンパク質を消費し、特定の筋肉または筋肉群の筋肉量を一定期間にわたり増加させる場合、対象は、筋肉量の増加を経験したと結論付けることができる。筋肉量の変化は、タンパク質の合成、タンパク質合成速度、およびｍＴｏｒ／ｍＴｏｒｃなどの特定の鍵となる活性を含む様々な方法で測定できる。一般的に、「除脂肪筋肉量」は、脂肪などの他の組織を含まない筋肉組織の質量を指す。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「核酸フラグメント」は、完全長の参照ヌクレオチド配列と比較して、欠失、たとえば５’末端または３’末端の欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では、核酸フラグメントは、フラグメントのヌクレオチド配列が天然に存在する配列の対応する位置と同一である連続した配列である。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも１０、１５、２０、または２５個の長さのヌクレオチド、または少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０個の長さのヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸配列のフラグメントは、オープンリーディングフレーム配列のフラグメントである。一部の実施形態では、このようなフラグメントは、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のポリペプチドフラグメント（本明細書中で定義される）をコードする。
【００５１】
意図する消費者にとって適切な量の栄養物を提供する場合、組成物、配合物、または生成物は、「栄養性」または「栄養上」であり、消費者が、組成物または配合物のすべてまたは一部を細胞、臓器、および／または組織に同化することを意味する。一般的に、細胞、臓器、および／または組織へのこのような同化は、たとえば、当該細胞、臓器、および／または組織の健康および／または本来の機能を維持または改善することにより、消費者に利点または有用性を提供する。本明細書中に記載されるように同化される栄養上の組成物または配合物は、「栄養物（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」と呼ばれる。非限定的な例として、意図する消費者にとって適切な量のポリペプチド栄養物を提供する場合、ポリペプチドは栄養性であり、消費者は、典型的にタンパク質の全てまたは一部を、単一のアミノ酸または小ペプチドの形態で、細胞、臓器、および／または組織に同化することを意味する。また、「栄養物」は、ヒトまたは他の哺乳動物などの対象に、栄養性の組成物、配合物、生成物、または他の材料を提供する工程をも意味する。栄養性生成物は、「栄養上完全」である必要はなく、このことは、十分な量が消費されれば、この生成物が、消費者の健康に必要なすべての炭水化物、脂質、必須脂肪酸、必須アミノ酸、条件的必須アミノ酸、ビタミン、およびミネラルを提供することを意味する。さらに、「栄養上完全なタンパク質」は、必要とされるすべてのタンパク質栄養素（生物による生物学的な健常に必要な量を意味する）を含むが、ビタミンおよびミネラルなどの微量栄養素、炭水化物または脂質を必ずしも含むものではない。
【００５２】
好ましい実施形態では、組成物または配合物は、「栄養上の利点」を提供するために十分な量の単一のアミノ酸および／または小ペプチド（たとえば２つのアミノ酸、３個のアミノ酸、または４個のアミノ酸、可能な場合は最大１０個のアミノ酸）へと分解（すなわちペプチド結合の切断、しばしばタンパク質の消化と呼ばれる）することのできるポリペプチドを提供するという点で、栄養性である。さらに、特定の実施形態では、小ペプチド（単一のアミノ酸よりは大きいが、約１０個のアミノ酸よりは小さい）、またはより大きなペプチド、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチド（たとえば１１超のアミノ酸）として、胃腸壁を通して通過し、かつ血流の中に吸収される栄養性ポリペプチドを提供する。ポリペプチド含有組成物の栄養上の利点は、多くの測定法により例証でき、任意に定量化できる。たとえば、栄養上の利点は、タンパク質の参照１日摂取値の少なくとも約０．５％以上、例えば参照１日摂取値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または約１００％以上の、消費する生物に対する利益である。あるいは、栄養上の利点は、消費者による満腹感および／または満腹の認識により例証される。他の実施形態では、栄養上の利点は、消費者の細胞、臓器、および／または組織の中に組成物または配合物のポリペプチド成分の実質的な量が取り込まれることによって例証され、このような取り込みは、一般的に、単一のアミノ酸または短いペプチドが、細胞内で新規にポリペプチドを産生するために使用されることを意味する。「消費者」または「消費生物」は、栄養上の利点を有する生成物を摂取することのできる任意の動物を意味する。典型的に、消費者は、健康なヒト、たとえば、健康な幼児、小児、成年、またはより老人などの哺乳動物である。あるいは、消費者は、（ｉ）適切な栄養素の欠損、および／または（ｉｉ）本発明の栄養生成物によるこの欠損の軽減、を特徴とする、疾患、障害、または病態を発症または罹患するリスクのあるヒト（たとえば幼児、小児、成年、または老人）などの哺乳動物である。「幼児」は、一般的に約１歳または２歳未満のヒトであり、「小児」は、一般的に約１８歳未満のヒトであり、「老人」または「高齢者」のヒトは、約６５歳以上のヒトである。
【００５３】
他の好ましい実施形態では、組成物または配合物は、意図する消費者が加水分解できる炭水化物（「栄養上の炭水化物」と呼ばれる）を供給するという点で栄養性である。炭水化物含有組成物の栄養上の利点は、多くの計測法により例証でき、任意に定量化できる。たとえば、栄養上の利点は、炭水化物の参照１日摂取値の少なくとも約２％以上の、消費生物に対する利益である。
【００５４】
本明細書中で使用されるポリペプチド「栄養性ドメイン」は、栄養素を提供できる任意のポリペプチドのドメインを意味する。好ましくは、ポリペプチドの栄養性ドメインは、栄養性ドメインが完全長のポリペプチドよりも多くの栄養素を提供することなどの、栄養性ドメインを含む完全長のポリペプチドと比較して１つまたは複数の利点を提供する。たとえば、ポリペプチド栄養性ドメインは、（ｉ）参照ポリペプチもしくは参照ポリペプチド含有混合物もしくは組成物、（ｉｉ）農業由来の食品に存在するタンパク質もしくはポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）哺乳動物対象の食事に存在するタンパク質もしくはポリペプチド産物と比較して、より高濃度の望ましいアミノ酸を有し、より低濃度の望ましくないアミノ酸を有し、消化プロテアーゼによる切断部位を含み、消化が容易で、かつ／またはより大きなポリペプチドの消化から容易に産生され、改善された保存特徴を有し、またはこれらおよび／または他の要因の組み合わせを有する。ポリペプチドの栄養性ドメインの他の利点は、完全長のポリペプチドと比較して、より容易かつ／もしくは効率的な産生、異なるもしくはより有益な物理化学的特性を含み、ならびに／または異なるもしくはより有益な安全上特性（たとえば１つ以上のアレルギードメインの除去）を有する。参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは組み換えにより産生されたポリペプチドであり得て、すなわち天然に存在するポリペプチドと同一または異なるアミノ酸配列を有し得る。また、参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドに存在しないコンセンサスアミノ酸配列であってもよい。さらに、参照ポリペプチド含有混合物または組成物は、乳汁もしくは乳清などの乳製品に存在するポリペプチド混合物などの天然に存在する混合物であり得て、またはポリペプチドの合成混合物であり得る（すなわち、天然に存在するポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得る）。特定の実施形態では、栄養性ドメインは、完全長の分泌ポリペプチドなどの参照分泌ポリペプチドのＮ末端アミノ酸および／またはＣ末端アミノ酸とは異なるＮ末端アミノ酸および／またはＣ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、栄養性ドメインは、栄養性ドメインを含む、より大きい分泌ポリペプチド内部のアミノ酸配列に対応するＮ末端アミノ酸配列を有する。栄養性ドメインは、より大きい分泌ポリペプチドのシグナル配列を含んでもよく、または除外してもよい。本明細書中で使用されるように、ポリペプチド栄養性ドメインを「含む」ポリペプチドは、ポリペプチド栄養性ドメイン全体、ならびにポリペプチド栄養性ドメインのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに少なくとも１つの追加のアミノ酸を含む。一般的に、ポリペプチド栄養性ドメインは、栄養性ドメインをコードする核酸を含む細胞または生物から分泌され、「分泌型ポリペプチド栄養性ドメイン」と呼ばれ、栄養性ドメインは、単細胞（または１つの細胞）の生物から分泌される場合、「単細胞分泌ポリペプチド栄養性ドメイン」と呼ばれる。
【００５５】
他の好ましい実施形態では、組成物または配合物は、意図する消費者による消化、取り込み、転換、または他の細胞での使用を行うことができる脂質（「栄養上の脂質」と呼ばれる）を供給するという点で栄養性である。脂質含有組成物の栄養上の利点は、多くの計測法により例証でき、任意に定量化できる。たとえば、栄養上の利点は、脂質（すなわち脂肪）の参照１日摂取値の少なくとも約２％以上の、消費生物に対する利益である。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、「肥満」の対象は、過度のレベルの体脂肪を有する対象であり、心疾患、ＩＩ型糖尿病、骨粗しょう症および変形性関節症、ならびに癌を含む疾患を罹患する可能性が増加しているが、「過体重」の対象は、正常、許容可能、または望ましいと認識されている体重を超えているが、肥満ではない。西側諸国では、３０を超えるＢＭＩ値を有する対象を肥満とし、２５〜３０のＢＭＩ値を有する対象を過体重としている。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、「機能的に連結された」または「機能的に連結」した発現制御配列は、発現制御配列が関心対象の遺伝子を制御するために関心対象となる遺伝子に近接して結合していること、ならびに関心対象の遺伝子を制御するためにトランスで、またはある距離で作用する発現制御配列を指す。
【００５８】
核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」または「同一である」は、最大に対応するよう整列させた場合に同一である２つの配列の残基を指す。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当技術分野において公知の多くの異なるアルゴリズムが存在する。たとえば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができ、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  ウィスコンシン州マディソン）のプログラムである。ＦＡＳＴＡは、クエリおよび検索配列のあいだの最も良好に重なりあう領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：６３−９８  （１９９０））。
【００５９】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」、または「核酸配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）、ならびに非天然のヌクレオチド類似体、非天然のヌクレオシド間結合、またはその両方を含むＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。核酸は、任意の位相幾何学的な立体構造の核酸であり得る。たとえば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的に二本鎖、分枝、ヘアピン、環状であり得て、または南京錠型の立体構造の核酸であり得る。「合成」のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーは、たとえば化学合成されたものなど、細胞の外で作製したものである。本明細書中で使用される用語「核酸フラグメント」は、欠失、たとえば完全長の参照ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの５’末端または３’末端の欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では、核酸フラグメントは、フラグメントのヌクレオチド配列が、天然に存在する配列の対応する位置と同一である連続配列である。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも１０、１５、２０、もしくは２５個の長さのヌクレオチド、または少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００個、または１８００個より長い長さのヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸配列のフラグメントは、オープンリーディングフレーム配列のフラグメントである。一部の実施形態では、このようなフラグメントは、オープンリーディングフレームヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのポリペプチドフラグメント（本明細書中に定義）をコードする。
【００６０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換可能とすることができ、これらの用語は、天然に存在するポリペプチドおよび天然に存在しないポリペプチドの両方、ならびに、本明細書に提供されているか、または当技術分野で一般的に公知の、それらのフラグメント、変異体、誘導体、および類似体を含む。ポリペプチドは、一本鎖を有することを意味する単量体であり得て、または共有的もしくは非共有的に会合することができる２つ以上の鎖から構成されることを意味する多量体であり得る。さらに、ポリペプチドは、それぞれが１つまたは複数の異なる活性を有する多くの異なるドメインを含み得る。紛らわしさを避けるために、ポリペプチドは、２個より長い、または２個に等しい任意の長さのアミノ酸であり得る。用語「単離型ポリペプチド」は、その誘導の起源または供給源により、（１）その任意の天然の状態で付随する天然に会合する成分と会合していない、（２）他の細胞材料の存在に関して与えることができる、天然で見出されない純度で存在する（たとえば、同じ種、またはポリペプチドが産生される宿主種由来の他のポリペプチドを含んでいない）、（３）異なる種由来の細胞により発現される、（４）細胞により組み換え的に発現された（たとえば、ポリペプチドが、宿主細胞に存在する組み換え型核酸から産生されて、産生する宿主細胞から分離されている場合、このポリペプチドは「単離ポリペプチド」である）、（５）天然で存在しない（たとえば、天然で見出されていないポリペプチドのドメインもしくは他のフラグメントである、または天然で見いだされないアミノ酸類似体もしくは誘導体である、または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）、または（６）ヒトの手によりそれ以外の方法で産生、調製、および／もしくは製造されている、ポリペプチドである。よって、「単離型ポリペプチド」は、宿主細胞が、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを天然に産生するかどうかに関わらず、組み換え型核酸（ベクターなど）から宿主細胞において産生されるポリペプチドを含む。「ポリペプチド」は、たとえば、変化させたプロモーターが存在しない中で、宿主細胞の正常な発現レベルを超えるレベルまで発現を増加させるようにポリペプチドのプロモーターを変更することなどにより、宿主細胞由来のポリペプチド相同性の過剰発現といった、過剰発現を介して宿主細胞により産生されるポリペプチドを含む。化学合成された、または天然に起源とする細胞とは異なる細胞株で合成されたポリペプチドは、その天然に会合する成分から「単離」されている。ポリペプチドはまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離により天然に会合する成分を実質的に含まないようにされ得る。このように定義された、「単離」は、記載されるタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、それが合成された細胞から物理的に除去されていることを必ずしも必要とするわけではない。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、用語「ポリペプチドフラグメント」または「タンパク質フラグメント」は、参照ポリペプチド、たとえば完全長のポリペプチドまたは天然に存在するタンパク質のポリペプチドドメインと比較して少ないアミノ酸を有するポリペプチドまたはそのドメインを指す。「天然に存在するタンパク質」または「天然に存在するポリペプチド」は、非組み換え細胞または生物により産生されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、フラグメントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列の対応する位置と同一である連続配列である。フラグメントは、典型的に少なくとも５、６、７、８、９、もしくは１０個の長さのアミノ酸、または少なくとも１２、１４、１６、もしくは１８個の長さのアミノ酸、または少なくとも２０個の長さのアミノ酸、または少なくとも２５、３０、３５、４０、もしくは４５個のアミノ酸、または少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個の長さのアミノ酸、または少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００の長さのアミノ酸、または２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００個、もしくは６００個超の長さのアミノ酸である。フラグメントは、細胞の中または外で消化された大きなポリペプチド配列の一部であり得る。よって、５０個の長さのアミノ酸であるポリペプチドは細胞内で産生できるが、５０個未満のアミノ酸の長さのポリペプチドを産生するためには、細胞の中または外でタンパク分解することができる。このことは、組み換えにより産生する、または組み換えにより産生した後に精製することが、大きいポリペプチドより難しくなり得る約２５個のアミノ酸より短いポリペプチドにとって特に重要である。本明細書中で使用される用語「ペプチド」は、約５０個未満のアミノ酸、より典型的には約３０個未満のアミノ酸、より典型的には約１０、９、８、７、６、５、４、または３個未満のアミノ酸などの、約１５個未満のアミノ酸を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドといった、短いポリペプチドまたはオリゴペプチドを指す。本明細書で使用される用語は、類似体、及び構造を模倣し、それにより生物学的な機能を模倣する模倣体を包含する。
【００６２】
本明細書中で使用されるように、「ポリペプチド変異体」または「変異タンパク質」は、配列が、天然または野生型のタンパク質などの参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配置、または置換を含むポリペプチドを指す。変異タンパク質は、ある位置の１つのアミノ酸が、別のアミノ酸に変化している、１つまたは複数のアミノ酸点置換を有してもよく、１つまたは複数のアミノ酸が、参照タンパク質の配列において、それぞれ挿入もしくは欠失されている１つまたは複数の挿入および／もしくは欠失を有してもよく、および／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかまたは両方でアミノ酸配列のトランケーションを有していてもよい。変異タンパク質は、参照タンパク質と比較して同じまたは異なる生物活性を有し得る。一部の実施形態では、変異タンパク質は、たとえば、対応する参照タンパク質と全体で少なくとも８５％の配列相同性を有する。一部の実施形態では、変異タンパク質は、野生型タンパク質に対して全体で少なくとも９０％の配列相同性を有する。他の実施形態では、変異タンパク質は、全体で少なくとも９５％の配列同一性、または９８％、または９９％、または９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する。
【００６３】
本明細書中で使用されるように、「アフィニティ精製のためのポリペプチドタグ」は、第１の「タグ」ポリペプチドに融合した関心対象の第２のタンパク質またはポリペプチド配列を単離または精製するために使用できる結合パートナーを有する任意のポリペプチドである。いくつかの例が当技術分野において周知であり、この例として、Ｈｉｓ−６タグ、ＦＬＡＧ  エピトープ、ｃ−ｍｙｃ  エピトープ、Ｓｔｒｅｐ−ＴＡＧＩＩ、ビオチンタグ、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、または金属親和性タグが挙げられる。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、「タンパク質エネルギー栄養障害」は、タンパク質の摂取が不適切である栄養障害の形態を指す。クワシオルコル（主にタンパク質の栄養障害）、マラスムス（カロリーおよびタンパク質栄養素の両方の欠乏）、および消耗性クワシオルコル（顕著なタンパク質の欠乏および顕著なカロリー不足の兆候があり、時に最も重篤な形態の栄養障害とも呼ばれる）といった種類が挙げられる。「栄養不良」および「栄養障害」は、本明細書中同等に使用されている。
【００６５】
用語「純度」、「精製する」、および「精製された」は、最初に生成（天然または実験状況でのいずれか）されたとき、または最初の生成後のいずれかの時点で会合した成分の少なくとも一部から分離されている物質（または実体、組成物、生成物、または材料）を指す。栄養性ポリペプチドなどの物質は、生成時、または最終生成物までのおよび最終生成物を含む任意のレベルもしくは段階で単離されている場合、精製されたと見なされるが、、最終的な生成物は、最大約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％超の他の材料を含んでもよく、それでもなお「単離された」と考えられる。精製された物質または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離することができる。一部の実施形態では、精製物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書中に提供されるポリペプチドおよび他のポリペプチドの例では、このようなポリペプチドは、ポリペプチドを分泌する単細胞生物から分泌されることのできる１つまたは複数の他のポリペプチドから精製できる。本明細書中に使用されるように、ポリペプチド物質は、他の成分または他のポリペプチド成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
【００６６】
本明細書中で使用されるように、「組み換え体」は、（１）天然に存在する環境から取り出されているおり、（２）遺伝子が天然に見出されているポリヌクレオチドの全てまたは一部と会合していない、（３）天然に結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結された、または（４）天然に存在していない生体分子、たとえば遺伝子またはポリペプチドを指す。また、「組み換え体」は、組み換え型生体分子または非組み換え型生体分子であり得る生体分子を含み、産生し、かつ／または分泌する、単細胞生物などの細胞もしくは生物を指し、これらは本明細書中では、「組み換え型単細胞生物」、「組み換え型宿主」、または「組み換え型細胞」と呼ばれる。たとえば、組み換え型単細胞生物は、組み換え型ポリペプチドまたは非組み換え型ポリペプチドの産生および／または分泌を高めるために提供される組み換え核酸をみ得る。組み換え型の細胞または生物はまた、組み換えベクターなどの組み換え型核酸が導入されている細胞を指すと意図される。「組み換え型単細胞生物」は組み換え型微生物宿主細胞を含み、特定の対象細胞のみならず、当該細胞の子孫も指す。変異または環境上の影響のいずれかにより、後の世代で特定の修飾が起こりうることから、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでもなお本明細書中の用語の範囲内に含まれる。用語「組み換え体」は、クローニングしたＤＮＡ単離物、化学合成したポリヌクレオチド類似体、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにこのような核酸によりコードされるポリペプチドおよび／またはｍＲＮＡに関連して使用できる。よって、たとえば、微生物により合成されたポリペプチドは、それが細胞に存在する組み換え遺伝子または他の核酸配列から転写されたｍＲＮＡから産生される場合、組み換え体である。
【００６７】
本明細書中で使用されるように、生物のゲノム中の内在性核酸配列（または当該配列のコードされたポリペプチド産物）は、この内在性核酸配列の発現が変化するように、異種配列が内在性核酸配列に隣接して配置される場合、本明細書中で「組み換え体」とされる。この文脈では、異種配列は、異種配列自体が内在性（同じ宿主細胞またはその子孫を起源とする）または外来性（異なる宿主細胞またはその子孫を起源とする）であるかどうかに関わらず、本来、内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列を、宿主細胞のゲノムにおける遺伝子の天然のプロモーターに置換（たとえば相同組み換えにより）することにより、この遺伝子は、変化した発現パターンを有することができる。この遺伝子は、それが本来隣接する配列の少なくとも一部から分離されているため、新たに「組み換え体」となっている。また核酸は、ゲノム中の対応する核酸に対して、本来起こらないいずれかの修飾を含む場合、「組み換え体」とされる。たとえば、内在性コード配列は、それがたとえばヒトの介入により人為的に導入された挿入、欠失、または点変異を含む場合、「組み換え体」とされる。「組み換え核酸」はまた、宿主染色体の異種部位に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物も含む。
【００６８】
本明細書中で使用されるように、用語「組み換え型宿主細胞」（または単純に「組み換え型細胞」または「宿主細胞」）は、組み換えベクターなどの組み換え核酸が導入されている細胞を指すと意図される。一部の例では、用語「細胞」は、細胞の種類を特定する名称により置き換えられている。たとえば、「組み換え微生物」は、微生物宿主細胞である組み換え型宿主細胞であり、「組み換えシアノバクテリア」は、シアノバクテリア宿主細胞である組み換え型宿主細胞である。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、当該細胞の子孫も指すと意図されると理解される。特定の修飾が、変異または環境上の影響のいずれかにより後の世代で起こり得ることから、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、それでもなお本明細書中で使用されている用語「組み換え型宿主細胞」、「組み換え型細胞」、および「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組み換え型宿主細胞は、培養で生育させた、単離した細胞もしくは細胞株であり得て、または生きている組織もしくは生物中に存在する細胞であり得る。
【００６９】
本明細書中で使用されるように、「サルコペニア」は、骨格筋の量、質および強度の老化に関連した変性性の喪失（典型的に、２５歳を過ぎた後では、１年あたり０．５〜１％の喪失）を指す。サルコペニアは、虚弱症候群の成分である。ＥＷＧＳＯＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐｅｏｐｌｅ）は、加齢に関連したサルコペニアの実用的な臨床上の定義およびコンセンサス診断基準を開発した。サルコペニアの診断のために、このワーキンググループは、低い筋肉量および低お筋肉機能（力または能力）の両方の存在を使用することを提案した。サルコペニアは、まず、筋線維と脂肪との置き換え、線維症の増加、筋肉代謝の変化、酸化ストレス、および神経筋接合部の変性などの要因により引き起こされる、筋組織の「質」の低下と共に、筋萎縮症（筋肉の大きさの減少）を特徴とする。まとめると、これらの変化により、進行性の筋肉の機能の喪失が起こり、結果的に筋虚弱となる。筋虚弱は、高齢者の健康および機能が破局的に低下するリスクが上がることを示す、一般的な老人性症候群である。筋虚弱の原因として、サルコペニア、骨粗しょう症、および筋力低下が挙げられる。筋肉疲労としても知られている筋力低下（または「筋力の欠如」）は、骨格筋を用いて力を発揮することができないことを指す。多くの場合、筋力低下は、しばしば疾病の結果としての長期臥床の後などの、筋委縮および活動の減少の後起こる。また、サルコペニアの結果として筋力低下が徐々に発症することもある。よって、サルコペニアは、筋消耗に関連した例示的な状態である。
【００７０】
本明細書中で使用されるように、「飽食」は、食事の最中に満腹になる行為、または食事への欲求の低下を指す。これは食べることをやめさせ、または減少させる。
【００７１】
本明細書中で使用されるように、「満腹」は、食後の、食べていない期間として表される、食後で満腹感が続く行為である。
【００７２】
本明細書中で使用されるように、「分泌する」、「分泌」、および「分泌された」は全て、ポリペプチドが、多細胞性生物または単細胞生物の細胞の細胞質から、その細胞外環境の中へと再配置される行為または工程を指す。本明細書中に提供されるように、このような分泌は、能動的または受動的に起こり得る。さらに、用語「排出する」、「排出」、および「排出した」は、一般的に、細胞または単細胞生物から材料を受動的に除去することを指すが、適宜、このような用語は、細胞または単細胞生物から外向きの材料の産生および移行に関連することができる。
【００７３】
一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の組の条件下で特異的ＤＮＡハイブリッドのために、熱融解点（Ｔｍ）より低い約２５℃で実施する。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の組の条件下で特異的ＤＮＡハイブリッドのために、Ｔｍより約５℃低い温度で実施する。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ｐａｇｅ  ９．５１を参照されたい。この文献は参照として本明細書中に援用される。本明細書中の目的に関して、「ストリンジェントな条件」は、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０ＭのＮａＣｌおよび０．３Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）、１％のＳＤＳにおける６５℃、８〜１２時間での水性ハイブリダイゼーション（すなわちホルムアミドを含まない）としての溶液相のハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５℃、２０分間の２回の洗浄として定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしている配列の長さおよびパーセント同一性を含む多くの要因に応じて異なる速度で起こることが当業者に理解されている。
【００７４】
核酸またはそのフラグメントを指す場合の用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、適宜、適切なヌクレオチド挿入または欠失を別の核酸（または相補鎖）と整列させて、上述のＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなどの、周知の任意の配列同一性アルゴリズムにより測定する場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７６％、８０％、８５％、もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％にヌクレオチド配列同一性が存在することを示している。
【００７５】
用語「十分な量」は、たとえば細胞の中のタンパク質凝集を調節するために十分な量といった、望ましい効果を生み出すために十分な量を意味する。
【００７６】
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーは、細胞の外側で作製したもの、たとえば化学合成されたものである。
【００７７】
用語「治療的有効量」は、疾患の症状を改善するために有効な量である。治療的有効量は、予防を治療と考えることができる場合「予防的有効量」であり得る。
【００７８】
本明細書中で使用されるように、「熱産生」は、哺乳動物の熱の産生工程である。熱産生は、エネルギー消費の増加により起こる。具体的には、熱産生は、食品の成分（タンパク質など）の代謝の後のエネルギーの燃焼である。また熱産生は、食物による産熱効果とも呼ばれ得る。個体による総エネルギー消費量は、安静時エネルギー消費量（基礎代謝を支えるための空腹状態で安静時に消費されるエネルギー）、食物による産熱効果、および身体活動に関連するエネルギー消費量の合計に等しい。安静時エネルギー消費量は、ヒトの総エネルギー消費量の約６５〜７５％を占める。筋肉量および活動は、安静時エネルギー消費の影響の１つである。筋肉を支えるための適切なタンパク質の消費もまた、安静時エネルギー消費量に影響する。タンパク質の摂取は、食後のエネルギー消費量を増加させる傾向があり、これが食物による産熱効果である。食物による産熱効果は、ヒトの総エネルギー消費量の約１０％を占める。これは、総エネルギー消費量の小さい割合であるが、この値の小さい増加であっても体重に影響を及ぼし得る。タンパク質は、脂肪または炭水化物よりも高い産熱効果を有し、タンパク質の他の代謝的な影響に加えてこの効果により、タンパク質は体重管理、糖尿病管理、および他の状態にとって有益な基礎となる。
【００７９】
本明細書中で使用されるように、「ベクター」は、連結している別の核酸を運搬することのできる核酸分子を指す。ベクターの１種が「プラスミド」であり、これは一般的に、追加のＤＮＡセグメントがライゲートできる環状の二本鎖ＤＮＡループを指すが、ベクターには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から、または環状プラスミドを制限酵素で処置することから得られる分子などの、直線状の二重鎖分子も含まれる。他のベクターとして、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートできる、ウイルスベクターである（以下により詳細に記載）。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞において自律増殖することができる（たとえば、宿主細胞の中で機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞の中への導入の後、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製することができる。さらに、特定のベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書中で「組み換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００８０】
栄養性ポリペプチドおよびアミノ酸配列
食品の供給源に存在するタンパク質は、栄養価が大きく変動し得る。そのアミノ酸含有量および消化性により、栄養価、ならびに生理学的および薬理学的な作用が強化された栄養性ポリペプチドを提供する。ヒトにおける必須アミノ酸の利用率が不十分であると、細胞機能のネットワークが乱されることにより全身健康および生理機能に負の影響を与え、なおかつ幅広い健康の上の問題および疾患に関連するため、必須アミノ酸レベルが強化された栄養性ポリペプチドを提供する。同様に、罹患した対象の食事において、そのようなアミノ酸が存在または過剰であることにより有病率または死亡率が増加することから、特定のアミノ酸のレベルを低下させ栄養性ポリペプチドも提供する。
【００８１】
従来より、栄養学者および健康の研究者は、特定の供給源の成分（たとえば乳清タンパク質、卵白、ダイズ）または分画および単離物（たとえばダイズタンパク質単離物）を利用して、特定のアミノ酸構成成分を調節することなく、食事中の総タンパク質の相対濃度を調節している。
【００８２】
本明細書中で、健康を変化させることができ、アミノ酸の病理生理学に関連する多数の疾患、障害、および状態を処置、予防、及び減少させることができる栄養性ポリペプチドが提供されるが、それらは、健康を改善し、消化管の吸収不良、筋消耗、糖尿病又は糖尿病前症、肥満、腫瘍学、代謝疾患、並びに他の細胞性及び全身疾患を含む、多くの栄養に関連する状態に対処するために特定の生理的恩典があるために選択されている。。また、食品、飲料、医療用食品、サプリメント、および医薬品として栄養性ポリペプチドを含む組成物および配合物も提供される。
【００８３】
本明細書中で、栄養性ポリペプチドのゲノミクス、プロテオミクス、タンパク質の特徴付け、および産生において重要な解明を提供する。本発明は、本明細書中で記述される、ａ）食用に適した種‐ヒトの食物供給源の生物のゲノミクスおよびヒトのゲノミクスと、ｂ）食品タンパク質および食品核酸のライブラリーにおけるタンパク質同定および定量の実質的な進展と、ｃ）タンパク質の物理化学、溶解度、構造‐消化性の関係、ならびに動物およびヒトにおけるアミノ酸の吸収および代謝のあいだの新規の相関性と、ｄ）栄養性ポリペプチドの成分であるアミノ酸が、タンパク質の栄養障害、慢性疾患、急性損傷に対する反応、および老化にどのような影響を与えるかについての生理学的および病理生理学的情報と、ｅ）系統学的に広いスペクトルの宿主生物を利用した組み換え栄養性ポリペプチドの産生と、ｆ）経口的に消費した栄養性ポリペプチドのヒトの安全性を評価するための、アレルゲン性および毒素産生性の定性化、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験の、相乗的進歩を利用する。
【００８４】
栄養性ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の同定および選択
最も広い意味において、栄養性ポリペプチドは、このような消費から利益を得る意図する消費者に対してアミノ酸およびペプチド栄養素を送達できるポリペプチドを包含する。各栄養性ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、本発明は、当該アミノ酸配列を有する栄養性ポリペプチドを産生、配合、および投与するために、アミノ酸を同定および利用する方法を提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドアミノ酸配列の供給源は、たとえば、ヒトまたは他の生物、特に哺乳動物に有害な影響を与えることなく、食べられることがわかっているまたはそうでなければ消費に適していると考えられている任意のタンパク質含有材料、例えば食品、飲料、組成物、または他の生成物を包含する。
【００８６】
食用に適した種に由来する栄養性ポリペプチドアミノ酸配列
一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、食品などの食用に適した生成物、または食品に使用されるもしくは食品として使用される生物材料を産生する生物の中で天然に存在する、タンパク質またはタンパク質のフラグメントを含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、「食用に適した種」は、有害な効果を有することなく、ヒトが食することのできるタンパク質を産生することが知られている種である。食用に適した種に存在する、または食用に適した種に存在する核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドは、「食用に適した種のタンパク質」または「食用に適した種のポリペプチド」と呼ばれ、または食用に適した種が、ヒトにより消費される種の場合、用語「天然に存在するヒトの食物タンパク質」は、本明細書中で互換可能に使用される。一部の食用に適した生成物は希少であるが、限定された地域にいる種の哺乳動物のごく小さい集団の食事の既知の成分でもあり、他の食用に適した生成物は、世界の多くで主食の生成物である。他の実施形態では、食用に適した生成物は、いかなる哺乳動物によってもこれまで食べられていないことがわかっているが、生成物、または生成物に含まれる１つもしくは複数のタンパク質を試験または解析することにより、食用に適していると例証された生成物である。
【００８７】
食用生物は、限定するものではないが、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２３２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２１８０号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２２５号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１８号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２０６号、および２０１３年４月２９日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８６８２号に開示されている食用に適した種の生物、およびいずれかの系統学的に関連する生物を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドアミノ酸配列は、食品もしくはその誘導体もしくは変異タンパク質中の豊富なタンパク質などの食品供給源に存在する、または食品もしくはその誘導体もしくは変異タンパク質中のタンパク質のアミノ酸配列のフラグメントであるタンパク質において同定される。豊富なタンパク質は、食品に存在する他のタンパク質と比較して、食品中に高濃度で存在するタンパク質である。あるいは、栄養性ポリペプチドアミノ酸配列は、量が相対的に少ないアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する食用に適した種から同定されるが、タンパク質は、食用に適した種、または食用に適した種から産生される生物材料に由来する食品生成物において検出可能である。一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸は、食用に適した種に由来する食品生成物中で検出可能であり、または核酸は、食用に適した種により産生された生物材料から検出可能である。食用に適した種は、限定された地域にいる種類の哺乳動物のごく小さい集団の食事、または世界の多くの地域で主食の既知の成分である食品を生成できる。
【００８９】
例示的な食用に適した種として、ヤギ、ウシ、ニワトリ、ブタ、および魚などの動物が挙げられる。一部の実施形態では、食品中の豊富なタンパク質は、卵白アルブミン、オボトランスフェリン、およびオボムコイドなどのニワトリの卵のタンパク質；ミオシン、アクチン、トロポミオシン、コラーゲン、およびトロポニンなどの肉のタンパク質；カゼイン、α１カゼイン、α２カゼイン、βカゼイン、κカゼイン、βラクトグロブリン、αラクトアルブミン、グリシニン、βコングリシニン、グルテリン、プロラミン、グリアジン、グルテニン、アルブミン、グロブリンなどの穀類のタンパク質；アルブミン、エノラーゼ、クレアチンキナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アポリポタンパク質、オボトランスフェリン、ホスホグルコムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘモグロビン、コフィリン、グリコーゲンホスホリラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、アクチン、ミオシン、トロポミオシンα鎖、カゼインキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、アルドラーゼ、チューブリン、ビメンチン、エンドプラスミン、乳酸デヒドロゲナーゼ、デストリン、トランスチレチン、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、炭酸脱水酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アネキシン、アデノシルホモシステイナーゼなどのニワトリの筋肉のタンパク質；アクチン、ミオシン、エノラーゼ、タイチン、コフィリン、ホスホグリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ミオキナーゼなどのブタの筋肉のタンパク質；ならびにパルブアルブミン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、デスミン、およびトリオースリン酸イソメラーゼなどの魚のタンパク質から選択される。
【００９０】
栄養性ポリペプチドは、食用に適した種のポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、食用に適した種由来の生物材料は、生物材料中に含まれるタンパク質含有量を決定するために解析される。例示的な解析方法は、以下の実施例に提供されるように、生物学的な物質の質量分析の解析を使用することである。別の例示的な解析方法は、以下の実施例に提供されるように、食用に適した種のｃＤＮＡのライブラリーを作製するために、生物材料のｃＤＮＡライブラリーを作製してし、次いで、適切な組み換え発現宿主においてｃＤＮＡライブラリーを発現させることである。別の例示的な解析方法は、以下の実施例に提供されるクエリの核酸および／またはタンパク質の配列データベースである。
【００９１】
栄養性ポリペプチドのアミノ酸の比率よびアミノ酸の密度の決定
本明細書中の一部の例では、ポリペプチド、タンパク質、または組成物の中の特定の種類のアミノ酸の一部は、当該ポリペプチド、タンパク質、または組成物に存在するアミノ酸の総重量に対する、この種類のアミノ酸の重量比に基づき定量されている。この値は、ポリペプチド、タンパク質、または組成物中の特定のアミノ酸の重量を、ポリペプチド、タンパク質、または組成物に存在するすべてのアミノ酸の重量により除算することにより計算される。
【００９２】
他の例では、当該ポリペプチドまたはタンパク質中に存在するアミノ酸の総数に対するポリペプチドまたはタンパク質に存在する特定の種類のアミノ酸残基の比率を使用する。この値は、ポリペプチドまたはタンパク質の各分子に存在するアミノ酸残基の総数により、ポチペプチドまたはタンパク質の各分子に存在する当該アミノ酸の数を除算することにより計算する。当業者は、これら２つの方法が互換可能であり、ポリペプチドまたはタンパク質に存在するある種類のアミノ酸の重量比は、特定の種類のアミノ酸残基の比率に変換でき、かつ逆も可能であることを理解するものである。
【００９３】
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、望ましい密度の１つまたは複数の必須アミノ酸（ＥＡＡ）を有するように選択される。必須アミノ酸の欠乏は、対象の食事に存在しないかまたは不十分な量で存在する１つまたは複数の必須アミノ酸の有効な投与により処置または予防できる。たとえば、ＥＡＡの密度は、おおよそ、ウシのラクトグロブリン、ウシのβカゼイン、またはウシのＩ型コラーゲンなどの完全長の参照栄養性ポリペプチドに存在する必須アミノ酸の密度以上であり、たとえば、栄養性ポリペプチド中のＥＡＡの密度は、参照栄養性ポリペプチドまたは農業由来の食品に存在するポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％または５００％超高い。
【００９４】
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、望ましい密度の芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、およびチロキシンを含む「ＡＡＡ」）を有するように選択される。ＡＡＡは、たとえば、運動から誘導される疲労の神経性の発生および予防において、有益である。たとえば、ＡＡＡの密度は、おおよそ、ウシのラクトグロブリン、ウシのβカゼイン、またはウシのＩ型コラーゲンなどの完全長の参照栄養性ポリペプチドに存在する必須アミノ酸の密度以上である。たとえば、栄養性ポリペプチド中のＡＡＡの密度は、参照栄養性ポリペプチドまたは農業由来の食品に存在するポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％または５００％超高い。
【００９５】
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、望ましい密度の分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を有するように選択される。たとえば、ＢＣＡＡの密度、個々のＢＣＡＡまたは総ＢＣＡＡのいずれかの含有量は、おおよそ、ウシのラクトグロブリン、ウシのβカゼイン、またはウシのＩ型コラーゲンなどの完全長の参照栄養性ポリペプチドに存在する分枝鎖アミノ酸の密度以上であり、たとえば、栄養性ポリペプチド中のＢＣＡＡの密度は、参照栄養性ポリペプチドまたは農業由来の食品に存在するポリペプチドより、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％または５００％超高い。栄養性ポリペプチド中のＢＣＡＡの密度は、ＥＡＡの密度などの１つまたは複数の特質と組み合わせて選択され得る。
【００９６】
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、望ましい密度のアミノ酸である、アルギニン、グルタミン、および／またはロイシン（ＲＱＬアミノ酸）を有するよう選択される。たとえば、ＲＱＬアミノ酸の密度は、おおよそ、ウシのラクトグロブリン、ウシのβカゼイン、またはウシのＩ型コラーゲンなどの完全長の参照栄養性ポリペプチドに存在する必須アミノ酸の密度以上であり、たとえば、栄養性ポリペプチド中のＲＱＬアミノ酸の密度は、参照栄養性ポリペプチドまたは農業由来の食品に存在するポリペプチドより、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％または５００％超高い。
【００９７】
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、望ましい密度または分布の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を有するように選択される。たとえば、ＰＴＭとして、ビオチン化、ペグ化、アシル化、アルキル化、ブチリル化（ｂｕｔｙｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、プロピオニル化、マロニル化（ｍａｌｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、サクシニル化、セレニル化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化の付加、除去、または再分布、およびグリピエーションの除去、またはジスルフィド架橋の再分布が挙げられる。
【００９８】
本明細書中の特定の実施形態では、乳清、卵、またはダイズ中の分枝鎖アミノ酸のロイシン、および／または必須アミノ酸の重量比を、ポリペプチド、タンパク質、またはポリペプチドおよびタンパク質の少なくとも１つを含む組成物のアミノ酸の組成を測定するためのベンチマークとして使用する。このような実施形態では、２つの測定値は完全に等価ではないが、測定値から、この目的に使用するために十分類似の測定値がもたらされることも理解される。たとえば、関心対象のタンパク質は、２４％以上（乳清に存在する分枝鎖アミノ酸残基の重量比）である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率を含むことを特徴とする場合、これは、タンパク質の分枝鎖アミノ酸含有量の正確な記載である。同時に、そのタンパク質に存在する分枝鎖アミノ酸の重量比は、必ずしも２４％に等しいわけではない。たとえそうであっても、これが有益な比較であることを当業者は理解するものである。関心対象のタンパク質に存在するアミノ酸残基の総数が提供されれば、当業者は、関心対象のタンパク質中の分枝鎖アミノ酸残基の重量比を決定することもできる。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、食用に適した種のポリペプチドのフラグメントを含む第１のポリペプチド配列を含む。栄養性タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、第１のポリペプチド配列からなる。栄養性タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、食用に適した種のポリペプチドのフラグメントからなる。
【０１００】
一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。よって、このような実施形態では、タンパク質は、２４％、２０％、および１８％から選択される比率以上である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率を含む第１のポリペプチド配列を含む。他の実施形態では、タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％から選択されるパーセンテージの比率以上である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対するＬ残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。他の実施形態では、タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％、または３０％超から選択されるパーセンテージの比率以上である、総アミノ酸残基に対するロイシン残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。他の実施形態では、タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％から選択されるパーセンテージの比率以上である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、タンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含み、かつ／または乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対するＬ残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含み、かつ／または乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、タンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率を含む第１のポリペプチド配列を含み、かつ、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、２４％以上の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、および４９％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、２０％以上の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、および５１％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、１８％以上の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、および４０％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、タンパク質は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対するＬ残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含み、かつ、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質の少なくとも１つに存在する総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率以上である、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、１１％以上の、総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）残基の比率、および４９％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、９％以上の、総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）アミノ酸残基の比率、および５１％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、８％以上の、総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）アミノ酸残基の比率、および４０％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。タンパク質の一部の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、２４％以上の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、１１％以上の、総アミノ酸残基に対するＬ（ロイシン）残基の比率を含み、かつ、すべての必須アミノ酸のうち少なくとも１つを含む。タンパク質の一部の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、２４％以上の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、および４９％以上の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率を含む、第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０６】
栄養上完全である栄養性ポリペプチドを提供する。タンパク質の一部の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、すべての必須アミノ酸の少なくとも１つを含む第１のポリペプチド配列を含む。
【０１０７】
調節されたグリコシル化を伴う栄養性糖タンパク質および栄養性ポリペプチド
用語「グリカン」または「グリコイル（ｇｌｙｃｏｙｌ）」は、ポリペプチド、脂質、またはプロテオグリカンに結合し得る多糖またはオリゴ糖を指す。一部の実施形態では、グリカンは、共有的にまたは非共有的にポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、結合は、グリコシド結合を介して起こる。一部の実施形態では、結合は、グリカン（またはグリコイル）とポリペプチドとのあいだの直接結合であるか、または中間分子を介したものである。一部の実施形態では、グリコシド結合は、Ｎ−結合またはＯ−結合である。用語「多糖」または「オリゴ糖」は、グリコシド結合により共に結合した１つまたは複数の単糖単位を指す。一部の実施形態では、多糖またはオリゴ糖は、直線状または分枝状の構造である。一部の実施形態では、単糖単位は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、フルクトース、マンノース、フコース、グルコース、キシロース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｏ−ラクチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはＯ−メチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸を含む。一部の実施形態では、単糖は、リン酸塩基、硫酸塩基、または酢酸塩基により修飾される。用語「グリコシル化アクセプター部位」は、天然の組成物中でグリカンまたはグリコイルを保有するポリペプチドに沿ったアミノ酸を指す。一部の実施形態では、アクセプター部位は、グリコシド結合の求核性アクセプターからなる。一部の実施形態では、求核性アクセプター部位は、アミノ基からなる。一部の実施形態では、アミノ酸は、アスパラギン、アルギニン、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、トリプトファン、ホスホスレオニン、セリン、またはホスホセリンからなる。用語「外来性グリコシル化アクセプター部位」は、天然のポリペプチドの組成物に存在しないグリコシル化アクセプター部位を指す。一部の実施形態では、外来性グリコシル化アクセプター部位のアミノ酸は、天然の組成物中で、グリカンまたはグリコイルを保有しなかった。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然の組成物中のポリペプチドの一次配列には存在しない。用語「外来性グリカン」または「外来性グリコイル」は、同じグリコシル化アクセプター部位上の天然の組成物に存在しなかったグリコシル化アクセプター部位を占有する、グリカンまたはグリコイルを指す。一部の実施形態では、グリコシル化アクセプター部位は、外来性のグリコシル化部位または天然のグリコシル化部位である。用語「糖タンパク質」は、少なくとも１つのグリカンまたはグリコイルに結合したポリペプチドを指す。
【０１０８】
本明細書中で、栄養性ポリペプチドのアミノ酸に存在する少なくとも１つの外来性グリコシル化アクセプター部位で、単離型栄養性ポリペプチドを含む配合物を開示する。一部の態様では、少なくとも１つの外来性グリコシル化アクセプター部位は、外来性グリコイルまたはグリカンにより占有されており、またあるいは、本来占有しないグリコールまたはグリカンにより占有されていないか、または占有されている。一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９およびＳＥＱＩＤ−０４１２９〜４４４８３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、または少なくとも約５０個の長さのアミノ酸の、食用に適した種のポリペプチド配列もしくはそのフラグメントであるか、またはグリコシル化アクセプター部位が存在しないもしくは占有されていない場合に実質的な免疫原性を有するポリペプチドである。栄養性ポリペプチドは、栄養性ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する参照配列よりも熱安定性であり、消化可能であり、および／または凝集スコアが低いが、グリコシル化アクセプター部位は、参照ポリペプチドに存在しない、または占有されていない。たとえば、外来性グリコシル化アクセプター部位を含む、アスパラギン、アルギニン、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、およびヒドロキシリジンといったアミノ酸は、タンパク質分解に抵抗性である。例示的なグリカンは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、フルクトース、マンノース、フコース、グルコース、キシロース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｏ−ラクチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸、およびＯ−メチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸である。
【０１０９】
一部の実施形態では、参照の食用に適した種の糖タンパク質中のポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるが、栄養性ポリペプチドの炭水化物成分が、参照の食用に適した種の糖タンパク質の炭水化物成分と異なる、栄養性ポリペプチドを含む配合物を提供する。栄養性ポリペプチドは、たとえば、アスペルギルス、バチルス、サッカロミセス、または哺乳動物の細胞などの非天然の宿主中で、参照糖タンパク質のポリペプチドを発現させることにより産生される。同様に、変異体栄養性ポリペプチドであって、アミノ酸配列が、参照糖タンパク質におけるポリペプチドのアミノ酸配列と、＜１％、＜５％、＜１０％、または１０％超異なり、栄養性ポリペプチドの炭水化物成分の質量が、参照糖タンパク質の炭水化物成分の質量と異なる、変異体栄養性ポリペプチドを提供する。栄養性ポリペプチドの変異体は、参照糖タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または交換により作製される。好ましくは、栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質と区別可能な、化学的、生化学的、生物物理学的、生物学的、または免疫学的特性を有する。たとえば、栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも吸湿性であり、親水性であり、水溶液中に可溶である。あるいは、栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも吸湿性が低く、親水性が低く、水溶液中に可溶ではない。
【０１１０】
別の例では、栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも抗原性が高く、免疫原性が高く、もしくはアレルゲン性が高く、またはあるいは、栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも抗原性が低く、免疫原性が低く、もしくはアレルゲン性が低い。栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも安定であるか、もしくは酵素による分解に抵抗性であり、または栄養性ポリペプチドは、参照糖タンパク質よりも不安定であるか、もしくは酵素による分解に対して感受性がある。栄養性ポリペプチドの炭水化物成分は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を実質的に含まず、または参照糖タンパク質と比較してＮ−グリコリルノイラミン酸が少ない。あるいは、栄養性ポリペプチドの炭水化物成分は、参照糖タンパク質と比較して、Ｎ−グリコリルノイラミン酸が増加している。
【０１１１】
同様に、栄養性ポリペプチドのアミノ酸に存在する少なくとも１つの外来性グリコシル化アクセプター部位を有する栄養性ポリペプチドを提供し、少なくとも１つの外来性グリコシル化アクセプター部位は、外来性のグリコイルまたはグリカンにより占有されており、栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００００１〜０３９０９およびＳＥＱＩＤ−０４１２９〜４４４８３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、栄養性ポリペプチドは、質量に基づき少なくとも１０％の濃度で少なくとも０．５ｇ中に存在し、配合物は、食用ではない生成物を実質的に含まない。
【０１１２】
参照栄養性ポリペプチドおよび参照栄養性ポリペプチド混合物
高品質アミノ酸の良好な供給源であると一般に認識されているタンパク質の３つの天然の供給源は、乳清タンパク質、卵のタンパク質、およびダイズのタンパク質である。各供給源は複数のタンパク質を含む。表ＲＮＰ１は、パーセンテージで表される、タンパク質の供給源における各アミノ酸の重量比率の表示を提示する（ｇＡＡ／ｇタンパク質）。
【表１】
2016537402.tif 000002
【０１１３】
表ＲＮＰ２は、必須アミノ酸、分枝鎖アミノ酸（Ｌ、Ｉ、およびＶ）、およびロイシン（Ｌ）（単独）である各タンパク質の供給源の重量比率を提示する。
【表２】
2016537402.tif 000003
【０１１４】
乳清のアミノ酸含有量を決定するために使用した供給源は、Ｂｅｌｉｔｚ  ＨＤ．，  Ｇｒｏｓｃｈ  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｂｅｒｌｅ  Ｐ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  Ｅｄ）．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００９；  ｇｎｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｐｒｏｄｕｃｔＩｄ＝２９８６０２７；  ｎｕｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｗｈｅｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ．ｈｔｍ；およびｎｕｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｗｈｅｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｓｏｌａｔｅ．ｈｔｍである。これら供給源からのアミノ酸含有値を平均して、表ＲＮＰ１およびＲＮＰ２に提示した数値を得た。ダイズタンパク質の供給源は、Ｅｇｇ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２４  （ｎｄｂ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｎｄｂ／ｆｏｏｄｓ／ｌｉｓｔ）である。ダイズタンパク質の供給源は、Ｓｅｌｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  （ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｄａｔａ．ｓｅｌｆ．ｃｏｍ／ｆａｃｔｓ／ｌｅｇｕｍｅｓ−ａｎｄ−ｌｅｇｕｍｅ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ／４３８９／２）である。
【０１１５】
ＵＳＤＡ栄養データベースによると、乳清は、様々な非タンパク質成分：水、脂質（脂肪酸およびコレステロールなど）、炭水化物および糖、ミネラル（Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、およびＺｎなど）、およびビタミン（ビタミンＣ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸塩、ビタミンＢ１２、およびビタミンＡなど）を含むことができる。ＵＳＤＡ栄養データベースによると、卵白は、様々な非タンパク質成分：水、脂質、炭水化物、ミネラル（Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、およびＺｎなど）、およびビタミン（チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸塩、およびビタミンＢ１２など）を含むことができる。ＵＳＤＡ栄養データベースによると、ダイズは、様々な非タンパク質成分：水、脂質（脂肪酸など）、炭水化物、ミネラル（Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、およびＺｎなど）、およびビタミン（チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸塩など）を含むことができる。
【０１１６】
改変栄養性ポリペプチド
一部の実施形態では、タンパク質は、食用に適した種のタンパク質または食品生成物に天然に存在するタンパク質の誘導体、またはタンパク質の変異タンパク質、またはフラグメントを含む、またはからなる。このようなタンパク質は、「改変タンパク質」を指すことができる。このような実施形態では、天然のタンパク質またはフラグメントは、「参照」タンパク質またはポリペプチドであり、改変タンパク質またはその第１のポリペプチド配列は、参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して少なくとも１つの配列修飾を含む。たとえば、一部の実施形態では、改変タンパク質またはその第１のポリペプチド配列は、少なくとも１つの参照タンパク質アミノ酸配列と、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である。典型的に、改変タンパク質またはその第１のポリペプチド配列に存在する、アミノ酸残基の合計に対する分枝鎖アミノ酸残基、アミノ酸残基の合計に対する必須アミノ酸残基、およびアミノ酸残基の合計に対するロイシン残基のうちの少なくとも１つの比率は、参照タンパク質またはポリペプチドに存在する、アミノ酸残基の合計に対する分枝鎖アミノ酸残基、アミノ酸残基の合計に対する必須アミノ酸残基、およびアミノ酸残基の合計に対するロイシン残基のうちの少なくとも１つの対応する比率よりも高い。
【０１１７】
栄養性ポリペプチド−オルソログおよびホモログ
別の態様では、任意に単細胞生物から分泌およびそれらから精製された、食用に適した種のポリペプチドと相同のアミノ酸配列を含む栄養性ポリペプチドを提供する。このような相同ポリペプチドは、食用に適した種のポリペプチドと、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％超類似であり得るか、または７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％超同一であり得る。このような栄養性ポリペプチドは、宿主細胞に対して内在性または外来性であり得て、宿主細胞の中で自然に分泌することができ、またはその両方とすることもでき、かつ分泌のために改変することができる。
【０１１８】
また、栄養性ポリペプチドのオルソログを提供する。栄養性ポリペプチド配列の開示は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％超類似、または７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％超同一など、栄養性ポリペプチドと相同である系統学的に関連する生物由来、またあるいは系統学的に多様な生物由来の、当該栄養性ポリペプチド配列の全てのオルソログの開示を包有する。
【０１１９】
栄養性ポリペプチドのフラグメント、栄養性ポリペプチドの長さ
本明細書中一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、食用に適した種のポリペプチドのフラグメントを含む。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも２５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、フラグメントは少なくとも２５個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、フラグメントは少なくとも５０個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、単離型組み換えタンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、第１のポリペプチド配列を含み、第１のポリペプチド配列は、食用に適した種のタンパク質の少なくとも２５または少なくとも５０個のアミノ酸のフラグメントを含む。一部の実施形態では、タンパク質は単離されている。一部の実施形態では、タンパク質は組み換え型である。一部の実施形態では、タンパク質は、食用に適した種のタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸のフラグメントを含む第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、単離型組み換えタンパク質である。一部の実施形態では、本明細書中に開示される単離型組み換えタンパク質は、非単離型および／または非組み換え型の形態で提供される。
【０１２０】
一部の実施形態では、タンパク質は、１０〜５，０００個のアミノ酸、２０〜２，０００個のアミノ酸、２０〜１，０００個のアミノ酸、２０〜５００個のアミノ酸、２０〜２５０個のアミノ酸、２０〜２００個のアミノ酸、２０〜１５０個のアミノ酸、２０〜１００個のアミノ酸、２０〜４０個のアミノ酸、３０〜５０個のアミノ酸、４０〜６０個のアミノ酸、５０〜７０個のアミノ酸、６０〜８０個のアミノ酸、７０〜９０個のアミノ酸、８０〜１００個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも１７個のアミノ酸、少なくとも１８個のアミノ酸、少なくとも１９個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２１個のアミノ酸、少なくとも２２個のアミノ酸、少なくとも２３個のアミノ酸、少なくとも２４個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも４５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも５５個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも６５個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも８５個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも９５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１０５個のアミノ酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくとも１１５個のアミノ酸、少なくとも１２０個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なくとも１３５個のアミノ酸、少なくとも１４０個のアミノ酸、少なくとも１４５個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１５５個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１６５個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸、少なくとも１７５個のアミノ酸、少なくとも１８０個のアミノ酸、少なくとも１８５個のアミノ酸、少なくとも１９０個のアミノ酸、少なくとも１９５個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２０５個のアミノ酸、少なくとも２１０個のアミノ酸、少なくとも２１５個のアミノ酸、少なくとも２２０個のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ酸、少なくとも２３０個のアミノ酸、少なくとも２３５個のアミノ酸、少なくとも２４０個のアミノ酸、少なくとも２４５個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸を含む。一部個の実施形態では、タンパク質は、２０〜５，０００個のアミノ酸、２０〜２，０００個のアミノ酸、２０〜１，０００個のアミノ酸、２０〜５００個のアミノ酸、２０〜２５０個のアミノ酸、２０〜２００個のアミノ酸、２０〜１５０個のアミノ酸、２０〜１００個のアミノ酸、２０〜４０個のアミノ酸、３０〜５０個のアミノ酸、４０〜６０個のアミノ酸、５０〜７０個のアミノ酸、６０〜８０個のアミノ酸、７０〜９０個のアミノ酸、８０〜１００個のアミノ酸、 少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４��個のアミノ酸、少なくとも２４５５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも５５個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも６５個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも８５個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも９５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１０５個のアミノ酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくとも１１５個のアミノ酸、少なくとも１２０個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なくとも１３５個のアミノ酸、少なくとも１４０個のアミノ酸、少なくとも１４５個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１５５個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１６５個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸、少なくとも１７５個のアミノ酸、少なくとも１８０個のアミノ酸、少なくとも１８５個のアミノ酸、少なくとも１９０個のアミノ酸、少なくとも１９５個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２０５個のアミノ酸、少なくとも２１０個のアミノ酸、少なくとも２１５個のアミノ酸、少なくとも２２０個のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ酸、少なくとも２３０個のアミノ酸、少なくとも２３５個のアミノ酸、少なくとも２４０個のアミノ酸、少なくとも２４５個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸からなる。一部の態様では、タンパク質またはそのフラグメントは、少なくとも２つのドメイン：第１のドメインおよび第２のドメインを含む。２つのドメインのうちの１つは、必要に応じて除去することができるタグドメインを含むことができる。各ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、または２５個超の長さのアミノ酸であり得る。たとえば、第１のドメインは、１８個の長さのアミノ酸である関心対象のポリペプチドであり得て、第２のドメインは、７個の長さのアミノ酸であるタグドメインであり得る。別の例として、第１のドメインは、１７個の長さのアミノ酸である関心対象のポリペプチドであり得て、第２のドメインは、８個の長さのアミノ酸であるタグドメインであり得る。
【０１２１】
本明細書中の一部の実施形態では、食用に適した種のポリペプチドのフラグメントが選択され、任意に単離される。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも２５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも２５個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、単離型組み換えタンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、第１のポリペプチド配列を含み、第１のポリペプチド配列は、食用に適した種のタンパク質の少なくとも２５または少なくとも５０個のアミノ酸のフラグメントを含む。一部の実施形態では、タンパク質は単離されている。一部の実施形態では、タンパク質は組み換え型である。一部の実施形態では、タンパク質は、食用に適した種のタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸のフラグメントを含む、第１のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、単離型組み換えタンパク質である。一部の実施形態では、本明細書中に開示される単離型栄養性ポリペプチドは、非単離型および／または非組み換え型の形態で提供される。
【０１２２】
栄養性ポリペプチドの物理化学的特性
消化性
一部の態様では、栄養性ポリペプチドは、哺乳動物対象による消費で実質的に消化可能である。好ましくは、栄養性ポリペプチドは、少なくとも参照ポリペプチドもしくは参照ポリペプチド混合物または対象の食事を消費する際の他のポリペプチドの一部よりも、消化が容易である。本明細書中で使用されるように、「実質的に消化可能である」は、消費の際の栄養性ポリペプチドの半減期を測定することにより例証できる。たとえば、栄養性ポリペプチドが、ヒト対象の胃腸管において６０分未満、または５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、４分未満、３分未満、２分未満、もしくは１分未満の半減期を有する場合、消化は容易である。特定の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、強化された消化を提供する配合物中に提供され、たとえば他のポリペプチドまたは他の物質を含まない栄養性ポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、１つまたは複数のエンドペプチダーゼの１つまたは複数の認識部位を含む。特定の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、分泌リーダー（分泌型リーダー）配列を含み、これは、その後栄養性ポリペプチドから切断される。本明細書中で提供されるように、栄養性ポリペプチドは、シグナルペプチドおよび／または分泌型リーダー配列を含むまたは含まないポリペプチドを含む。一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、１つまたは複数のエキソペプチダーゼによる切断に感受性がある。
【０１２３】
消化アッセイ
消化性は、タンパク質の利益および有用性に関連するパラメータである。消化の相対的完全性に関連する情報は、ペプチドの生物学的利用率の予測因子として役立ちうる（Ｄａｎｉｅｌ，  Ｈ．，  ２００３．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６６，  ｐｐ．  ３６１−３８４）。一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質の消化性を評価するためにタンパク質をクリーニングする。タンパク質の消化性は、当技術分野で公知である任意の適切な方法によって評価できる。一部の実施形態では、消化性は、タンパク質消化、胃消化シミュレーション、腸消化シミュレーションの１つまたは組み合わせたフェーズを含む、生理学的に関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化反応により評価される（たとえば、Ｍｏｒｅｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．    Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｂｒａｚｉｌ  ｎｕｔ  ２Ｓ  ａｌｂｕｍｉｎ  （Ｂｅｒ  ｅ  １）  ｔｏ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｐｐ．  ３４１−３５２；  Ｍａｒｔｏｓ，  Ｇ．，  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，  Ｐ．，  Ｍｏｌｉｎａ，  Ｅ．  ＆  Ｌｏｐｅｚ−Ｆａｎｄｉｎｏ，  Ｒ．，  ２０１０．  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐｐ．  ５６４０−５６４８；  Ｍｏｒｅｎｏ，  Ｆ．  Ｊ．，  Ｍａｃｋｉｅ，  Ａ．  Ｒ．  ＆  Ｃｌａｒｅ  Ｍｉｌｌｓ，  Ｅ．  Ｎ．，  ２００５参照）。リン脂質相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化の際のタンパク質分解から、ミルクのアレルゲンのαラクトアルブミンを保護する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐｐ．  ９８１０−９８１６）。手短に述べると、試験タンパク質を、模擬胃液（ＳＧＦ）に１２０分間（液体食の９０％が胃から小腸まで通過するのに要する時間の長さ、たとえばＫｏｎｇ，  Ｆ．  ＆  Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．  Ｐ．，  ２００８．  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｏｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｏｍａｃｈ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｐｐ．  ６７−８０参照）連続的に曝露し、次いで、模擬十二指腸液（ＳＤＦ）へ移し、さらに１２０分間消化させた。異なる消化段階（たとえば、２分、５分、１５分、３０分、６０分、および１２０分）の試料を、電気泳動（たとえばチップ電気泳動またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析して、未変化の完全なタンパク質、および任意の大きな消化フラグメント（たとえば４ｋＤａ超）の大きさおよび量をモニターする。経時的なタンパク質の消失から、タンパク質がこのアッセイで消化される速度が示される。経時的に観察した完全な未変化のタンパク質の量をモニターすることにより、消化の半減期（τ１／２）をＳＧＦに関して計算し、完全な未変化のタンパク質がＳＧＦでの処置後に検出される場合、消化のτ１／２を、ＳＩＦに関して計算する。このアッセイを使用して、比較による消化性（すなわち、乳清などのベンチマークタンパク質に対する）を評価、または絶対的な消化性を評価することができる。一部の実施形態では、タンパク質の消化性は、乳清タンパク質よりもより高い（すなわちＳＧＦτ１／２および／またはＳＩＦτ１／２が短い）。一部の実施形態では、タンパク質は、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、または１分以下のＳＧＦのτ１／２を有する。一部の実施形態では、タンパク質は、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、または３分以下、２分以下、または１分以下のＳＩＦτ１／２を有する。一部の実施形態では、ＳＧＦおよびＳＩＦのアッセイの１つまたは両方で、２分間、５分間、１５分間、３０分間、６０分間、または１２０分間、タンパク質を検出することができない。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳＧＦおよびＳＩＦの１つまたは両方において、一定の速度および／または制御された速度で消化される。このような実施形態では、タンパク質の消化速度は、起こり得る最高消化速度で最適化されていなくてもよい。このような実施形態では、哺乳動物による摂取後のタンパク質の吸収速度をより遅くすることが可能であり、摂取後に吸収が起こる時間の合計を、ＳＧＦおよびＳＩＦの１つまたは両方においてより速い初期速度で消化される類似のアミノ酸組成物のタンパク質よりも長くすることが可能である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳＧＦで完全にまたは実質的に消化されている。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳＧＦにより実質的に消化されず、または消化されておらず、このような実施形態のほとんどでは、タンパク質はＳＩＦにより消化されている。
【０１２４】
タンパク質の消化性を評価することは、消化性プロテアーゼに抵抗性であるタンパク質またはタンパク質のフラグメントは、アレルゲン性反応を引き起こす高いリスクを有し得るため、タンパク質の潜在的アレルゲン性に関する洞察を提供することができる（Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８．  Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｒｏｐｓ  −  ｗｈａｔ  ｍａｋｅｓ  ｓｅｎｓｅ？    Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ７３−８１）。チップ電気泳動解析にとって小さすぎるペプチドを検出および同定する場合には、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を使用することができる。ＳＧＦの試料では、ペプチドは、ＬＣ／ＭＳにより直接検出かおよび同定することができる。ＳＩＦタンパク質の消化は、ＬＣ／ＭＳによる検出および同定の前に胆汁酸を除去するための精製を必要とし得る。
【０１２５】
一部の実施形態では、タンパク質の消化性は、タンパク質のアミノ酸配列における消化性プロテアーゼ認識部位の同定および定量化により評価される。一部の実施形態では、タンパク質は、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、およびキモトリプシン認識部位から選択される、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。
【０１２６】
本明細書中で使用されるように、「ペプシン認識部位」は、ペプシンにより切断されることが実験的に示されている、ポリペプチド配列中のいずれかの部位である。一部の実施形態では、ペプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎから選択されるアミノ酸残基の後の（すなわち下流の）ペプチド結合であるが、但し後に続く残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＶａｌから選択されるアミノ酸残基ではない。
【０１２７】
本明細書中で使用されるように、「トリプシン認識部位」は、トリプシンにより切断されることが実験的に示されている、ポリペプチド配列中のいずれかの部位である。一部の実施形態では、トリプシン認識部位は、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択されるアミノ酸残基の後のペプチド結合であるが、但し後に続く残基はプロリンではない。
【０１２８】
本明細書中で使用されるように、「キモトリプシン認識部位」は、キモトリプシンにより切断されることが実験的に示されている、ポリペプチド配列中のいずれかの部位である。一部の実施形態では、キモトリプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕから選択されるアミノ酸残基の後のペプチド結合である。
【０１２９】
タンパク質中のジスルフィド結合したシステイン残基は、ジスルフィド結合が存在しないタンパク質と比較して、タンパク質の消化速度を減少させる傾向がある。たとえば、タンパク質のｂラクトグロブリンのジスルフィド架橋が切断されると、ｂラクトグロブリンの消化速度が増加することが示されている（Ｉ．  Ｍ．  Ｒｅｄｄｙ，  Ｎ．  Ｋ．  Ｄ．  Ｋｅｌｌａ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｅ．  Ｋｉｎｓｅｌｌａ．  ‘‘Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂ−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ’’．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  １９８８，  ３６，  ７３７−７４１）。したがって、ジスルフィド結合が少ないタンパク質の消化性は、多くのジスルフィド結合を有する比較可能なタンパク質よりも高い傾向がある。一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質をスクリーニングして、それぞれに存在するシステイン残基の数を同定すると、比較的少数のシステイン残基を含むタンパク質を選択することができる。たとえば、システイン残基を含まない、または、１０個以下のＣｙｓ残基、９個以下のＣｙｓ残基、８個以下のＣｙｓ残基、７個以下のＣｙｓ残基、６個以下のＣｙｓ残基、５個以下のＣｙｓ残基、４個以下のＣｙｓ残基、３個以下のＣｙｓ残基、２個以下のＣｙｓ残基、１個のＣｙｓ残基、またはＣｙｓ残基を含まないなどの、比較的少数のＣｙｓ残基を含む食用に適した種のタンパク質またはフラグメントを同定できる。一部の実施形態では、食用に適した種のタンパク質またはそのフラグメント中の１つまたは複数のＣｙｓ残基は、欠失、および／または別のアミノ酸との置換により除去される。一部の実施形態では、１個のＣｙｓ残基が欠失または置換され、１個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、２個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、３個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、４個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、５個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、６個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、７個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、８個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、９個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換され、または１０個以上のＣｙｓ残基が欠失または置換される。一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の、アミノ酸残基の合計に対するＣｙｓ残基の比率を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、１０個以下のＣｙｓ残基、９個以下のＣｙｓ残基、８個以下のＣｙｓ残基、７個以下のＣｙｓ残基、６個以下のＣｙｓ残基、５個以下のＣｙｓ残基、４個以下のＣｙｓ残基、３個以下のＣｙｓ残基、２個以下のＣｙｓ残基、１個以下のＣｙｓ残基を含み、またはＣｙｓ残基を含まない。一部の実施形態では、タンパク質は１個以下のＣｙｓ残基を含む。一部の実施形態では、タンパク質はＣｙｓ残基を含まない。
【０１３０】
あるいはまたはさらに、タンパク質中に存在するまたは存在し得るジスルフィド結合を除去することができる。ジスルフィドは、βメルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤によってジスルフィドを２つのチオール基に還元することによる化学的方法を使用して除去することができる。次いで、チオールを、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド、または亜硫酸ナトリウムなどの試薬で、共有的に修飾または「キャッピング」することができる（たとえば、Ｃｒａｎｋｓｈａｗ，  Ｍ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ，  Ｇ．  Ａ．  ２００１．  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １５．１．１−１５．１．１８参照）。
【０１３１】
粘度を調節した、栄養性ポリペプチドおよび栄養性ポリペプチド配合物
本明細書中、粘度を調節した栄養性ポリペプチドを含む、組成物、配合物、および食品生成物を開示する。一態様では、栄養量で存在する栄養性ポリペプチドを含む、食用でない生成物を実質的に含まない配合物を提供し、この栄養性ポリペプチドは、食品生成物の粘度を低下させる。一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、約１０ｇ／ｌで存在し、配合物の粘度は、２５℃で、約１，０００ｍＰａｓ〜約１０，０００ｍＰａｓ、たとえば２，５００ｍＰａｓ〜約５，０００ｍＰａｓである。
【０１３２】
配合物は、栄養性ポリペプチドを欠く類似の食品生成物をと比較して利点を有する食品生成物の中に組み込まれ、または配合物は、飲料生成物もしくは動物飼料生成物などの他の生成物の中に組み込まれる。たとえば、食品生成物は、栄養性ポリペプチドを有さない食品生成物と比較して、脂肪含有量が少なく、糖含有量が少なく、かつ／またはカロリー含有量が少ない。好ましくは、栄養性ポリペプチドは、食品生成物の栄養量の消費が十分に満足であるように、食品生成物中に存在する。本発明の一実施形態では、ゼラチンといった、動物由来の材料を、１つまたは複数の栄養性ポリペプチドを含む非動物由来の生成物と置き換える。典型的に、栄養性ポリペプチドは、生成物中のゼラチンを置き換えるために有効な量で存在する。ゼラチンの置き換えは、食品生成物、飲料生成物、または動物の飼料の中に組み込まれ、配合物は、食用でない生成物を実質的に含まない。
【０１３３】
また、栄養性ポリペプチドを欠く類似の食品生成物と比較して利点を有する食品生成物の中に組み込まれた、粘度が増加した栄養性ポリペプチドを含む配合物などの、食品または飲料生成物の粘度を増加させる、機能的および／または栄養上の量で存在する栄養性ポリペプチドを含む配合物を提供する。たとえば、食品生成物は、栄養性ポリペプチドを有さない食品生成物と比較して、脂肪含有量が少なく、糖含有量が少なく、かつ／またはカロリー含有量が少ない。粘性栄養性ポリペプチドは、栄養学的に好ましい低カロリーの脂肪代用品として使用できる。さらにこれは、組成物および生成物に、１つもしくは複数の多糖、または乳化剤を添加することが望ましく、これにより、クリーム状の口あたりがさらに改善する。
【０１３４】
一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドを架橋する、または材料中に存在する他のタンパク質に栄養性ポリペプチドを架橋することにより、栄養性ポリペプチド含有材料の粘度を高める。有効な架橋剤の例として、トランスグルタミナーゼがあり、これは、リジン残基のεアミノ基と、グルタミン残基のγカルボキサミド基とのあいだでタンパク質を架橋し、安定した共有結合を形成する。本明細書中に記載されるように同定および生成した栄養性ポリペプチドの、結果として得られるゲルの強度およびエマルジョンの強度は、トランスグルタミナーゼが結合した栄養性タンパク質組成物を調製し、次いで、ゲルの強度およびエマルジョンの強度のアッセイを行うことにより試験する。米国特許第５，１５６，９５６号の教示による、微生物由来の適切なトランスグルタミナーゼが市販されている。これら市販のトランスグルタミナーゼは、典型的に、約１００単位の酵素活性を有する。単離型栄養性ポリペプチドに添加したトランスグルタミナーゼ（約１００単位の活性を有する）の量は、単離型栄養性ポリペプチド１００ｇあたりのトランスグルタミナーゼの単位であるトランスグルタミナーゼ濃度として表される。単離型栄養性ポリペプチドは、５〜９５％、好ましくは２０〜８０％、好ましくは５８〜７２％タンパク質を含み、同様に好ましくは、６２〜６８％タンパク質を含む。トランスグルタミナーゼ濃度は、グラムタンパク質あたり少なくとも０．１５単位、好ましくは０．２５単位、および最も好ましくは０．３０単位のトランスグルタミナーゼであり、最大、グラムタンパク質あたり０．８０単位および好ましくは０．６５単位のトランスグルタミナーゼである。この範囲外の量を使用してもよい。栄養性ポリペプチドを含む粘性溶液を作製するために、この酵素処置の後に、熱処置を行うこともできる。架橋を含む栄養性ポリペプチド試料を作製するために、試料を、酵素対タンパク質重量比が１：２５となるようにｐＨ７．０のトランスグルタミナーゼ溶液と混合する。酵素触媒架橋反応は、この実験のほとんどを４０℃で行う。
【０１３５】
振動せん断測定を使用して、栄養性ポリペプチドのレオロジー特性を調べることができる。同様に、栄養性ポリペプチド溶液の粘度およびゲルの粘弾性の決定を、動的振動レオメトリーにより調べる。栄養性ポリペプチド溶液またはトランスグルタミナーゼを含む栄養性ポリペプチド溶液の試料２ｍｌを、レオメータのクエット型の円筒形のセル（内径２．５ｃｍ、外径２．７５ｃｍ）に注ぎ、蒸発を防止するために低粘度のシリコーン油の薄層で被覆する。酵素が存在する試料では、ゲル化を、４０℃のインキュベーションによりｉｎ  ｓｉｔｕで誘導する。酵素を含まない栄養性ポリペプチドの試料では、ゲル化を、以下の熱処置工程：４０℃から９０℃へ２  Ｋ  ｍｉｎ−１の一定速度で温度を上げ、３０分間９０℃に保ち、９０から３０℃へ１Ｋ  ｍｉｎ−１で冷却し、１５分間３０℃に保つといった工程を試料に行うことにより誘導する。一部の試料で、酵素処置の後にこの熱処置を行う。小さな変形せん断レオロジー特性は、１Ｈｚの一定の周波数で貯蔵弾性率および損失弾性率（Ｇ’およびＧ’’）を測定する線形粘弾性レジーム（最大ゆがみ振幅  ０．５％）で大部分が決定される。さらに、一部の小さな変形は、たとえば２×１０−３〜２Ｈｚといった周波数の関数として測定され、一部の大きな変形は、最大１００％近くのひずみで測定される。
【０１３６】
癌処置のためおよび癌処置の最中の筋肉の質量、強度、および性能を維持かつ増大させるための、腫瘍形成、癌細胞の増殖、および浸潤の予防または低減のための栄養性ポリペプチド、ならびにその生成方法および使用方法
癌は、増殖促進（ｐｒｏｇｒｏｗｔｈ）および抗増殖因子の遺伝的な欠陥または不均衡による代謝上の変化を経た異常性細胞の制御されていない増殖を含む。癌は、世界的な問題であり；１３００万にわたる癌の事例が２０１２年に記録されており、これは世界的に見て主な死因であり、２０１２年では８２０万名の個体の死亡を引き起こしている（たとえば、ｄｅ  Ｍａｒｔｅｌ  Ｃ，  Ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ２００８：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２０１２）  １３：  ６０７−６１５）参照）。著しく致死性の形態の悪性腫瘍として、肺癌、肝臓癌、結腸癌、乳癌、および食道癌が挙げられる。
【０１３７】
癌は、遺伝的（遺伝子的）および外部の要因といった様々な要因により引き起こされ、一部の腫瘍なリスク因子として、たばこの使用、肥満、不十分な食事、あるコースの消費、特定の感染症（肝炎、ヒトパピローマウイルス）、汚染物質および電離放射線への曝露が挙げられる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ．  ２９７．  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１４）。腫瘍形成の間、これらの癌促進（ｐｒｏ−ｃａｎｃｅｒ）因子は、最終的には、制御されていない増殖および腫瘍の発達もたらすこれら要因に曝露されえた組織中の個々の細胞に遺伝的な変化をもたらす。
【０１３８】
細胞の代謝は、腫瘍形成および悪性腫瘍の増殖の間、実質的に変質する。一定した増殖および分割を支援するために、癌細胞は、栄養をさらなる細胞の物質の発生へとシャントし、癌細胞の増大したエネルギーの必要性を満たすために多くの代謝経路に依存する（たとえばＧａｌｌｕｚｚｉ，  （２０１３），  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  １２：  ８２９−４６参照）。多くの場合、これら経路は、健常な組織に対して癌に選択的に影響を与える手段を提供する当該経路を差次的に調節するために、非癌性細胞に対する癌性細胞、および特性に重要である。具体的には、特定の癌細胞の代謝上の栄養要求性は、代謝上の飢餓または過剰な曝露を介して開拓することができ、これにより腫瘍の増殖を遅延または予防することができる。
【０１３９】
癌の処置における、腫瘍形成、癌細胞の増殖、および浸潤の予防および低減に有益な、栄養性ポリペプチド、および栄養性ポリペプチドを含む配合物、ならびにその生成方法および使用方法を提供する。また、栄養性ポリペプチドは、対象、具体的には癌の処置を経た対象の筋肉量および筋肉の機能の処置および喪失予防にも有用である。さらに、化学療法および放射線療法などの癌処置のための治療または予防レジメンがが、対象に対するアミノ酸の利用率の低下をもたらし、さらには、筋肉量および筋肉機能の喪失を引き起こし得ることから、栄養性ポリペプチドは、このようなレジメンの副作用（通常、医薬品または医療上の処置の望ましくない副次効果を意味する）の低減または予防にさらに有用である。
【０１４０】
癌細胞および腫瘍細胞は、非癌細胞と比較して、特定のアミノ酸を不釣り合いに必要とする（Ｇａｌｌｕｚｚｉ，  （２０１３）  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  １２：  ８２９−４６）。たとえば、セリンおよびグリシンは、タンパク質の合成、ヌクレオチドの新規の合成、ＤＮＡのメチル化およびポリアミンの合成を含む哺乳類の代謝に必須の役割を果たす（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｏｃａｓａｌｅ  （２０１３）  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｃａｎｃｅｒ：  １３：  ５７２−８３）。特定の腫瘍細胞は、セリンおよびグリシンの代謝経路の遺伝子発現の増幅、欠失、多型、または変質により、生存および増殖に関してセリンおよびグリシンに依存しており、対して正常な細胞は、セリンおよびグリシンの飢餓への感受性がほとんどない（Ｊ．  Ｌｏｃａｓａｌｅ  ＆  Ｃａｎｔｌｅｙ，  ２０１１，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ：  １０：  ３８１２−３８１３）（Ｌａｂｕｓｃｈａｇｎｅ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，  Ｍａｃｋａｙ，  Ｖｏｕｓｄｅｎ，  ＆  Ｍａｄｄｏｃｋｓ，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ：  ７：  １２４８−５８）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ：  １４８：  ２５９−７２）。特定の腫瘍細胞は、メチオニンの新規のサルベージ経路における遺伝子発現の欠失、多型、または変質により、生存および増殖に関してメチオニンに依存しており（Ｃａｖｕｏｔｏ  ＆  Ｆｅｎｅｃｈ，  ２０１２，  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ：  ３８：  ７２６−３６）、対して正常な細胞は、メチオニンの飢餓への感受性がほとんどない（Ｋｒｅｉｓ  ＆  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８，  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ：  ３８：  ２２５９−２２６２）。特定の腫瘍細胞は、シトルリンおよびアルギノコハク酸塩の利用がないことにより、アルギニンに依存している（Ｃｕｒｒｉｅ  ａｎｄ  Ｂａｓｈａｍ  １９７８）（Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ２００３，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：  ８９：  ５７３−６）。特定の腫瘍細胞は、グルアミナーゼのアップレギュレーションにより、生存および増殖に関してグルタミンに依存している（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ａ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ｂ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  １０：  ７２８）。よって、タンパク質中食のセリン、グリシン、メチオニン、アルギニン、およびグルタミンを限定することにより、腫瘍細胞の増殖を限定することができる。
【０１４１】
セリンおよびグリシン依存性癌細胞の増殖の選択的な阻害は、セリンおよびグリシンが欠損した培地を使用して例証されており（Ｍａｄｄｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ：  ４９３：  ５４２−６）、セリンおよびグリシンを限定した食事を利用した動物試験から、癌の増殖の阻害および寿命の延長が示される（Ｌａｂｕｓｃｈａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ：  ７：  １２４８−５８）。正常な細胞と共培養しているメチオニン依存性癌細胞の選択的な殺傷は、メチオニンが欠損した培地を使用して例証されており、メチオニンを限定した食事を利用した動物試験から、癌の増殖の阻害および寿命の延長が示されている（Ｃａｖｕｏｔｏ  ＆  Ｆｅｎｅｃｈ，  ２０１２，  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ：  ３８：  ７２６−３６）。さらに、ホモシステインの補充は、腫瘍細胞がホモシステインを利用せず、メチオニンに密に依存していることから、メチオニンの飢餓の毒性から正常な細胞を選択的に救助する。（Ｋｒｅｉｓ  ＆  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８，  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ：  ３８：  ２２５９−２２６２）。グルタミンは、ＴＣＡ回路に必要な鍵となるミトコンドリアの基質であり、臨床試験で癌のグルタミン依存性を標的とするいくつかの手法が取られている（Ｗｉｓｅ  ＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ２０１０，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ３５：  ４２７−４３３）。これら手法のうちの１つは、アスパラギンおよびグルタミンの両方を分解するＬ−アスパラギナーゼを使用することによるグルタミンの欠失である（Ａｖｒａｍｉｓ  ＆  Ｐａｎｏｓｙａｎ，  ２００５，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：  ４４：  ３６７−３９３）。アルギナーゼまたはアルギニンデアミナーゼによるアルギニンの欠失は、臨床試験で見込みのある抗癌作用を示す（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｓｈｅａｆｆ，  ＆  Ｓｚｌｏｓａｒｅｋ，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ：  ４５：  ２５１−２６２）
【０１４２】
アミノ酸の薬理学
アミノ酸は、アミノ基および酸性基の両方を含む有機分子である。すべてのアミノ酸は、グリシンを除き不斉炭素を有し、プロリンを除くすべてのタンパク質のアミノ酸は、カルボキシル基および一級アミノ基に結合したα炭素を有する。
【０１４３】
アミノ酸は、側鎖が多様であることにより、多様な範囲の生化学特性および生物機能を呈する。これらは、グルタミンおよびシステインを除き、生理的ｐＨの溶液中で安定である。一部のタンパク質では、宿主および翻訳の機構を条件として、アミノ酸に翻訳後修飾を行うことができる。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の生物学的利用率、代謝機能、および生物活性に大きな影響を与えることができる。翻訳後にタンパク質に付加された糖部分は、アミノ酸および埋め込まれたペプチドの胃腸管での放出に影響を与えることにより、栄養タンパク質の有用性を低下させ得る。同じタンパク質のグリコシル化型と非グリコシル化型の消化を比較すると、非グリコシル化型は、グリコシル化型よりも早く消化されることが示されている（本出願人のデータ）。
【０１４４】
３００種を超えるアミノ酸が天然に存在するにもかかわらず、タンパク質において構築ブロックとして作用するのは２０種のアミノ酸である。非タンパク質α‐ＡＡおよび非α‐ＡＡは、これら２０種のタンパク質アミノ酸の直接産物であり、細胞の代謝において重要な役割を果たす。アミノ酸のあいだの相互変換を駆動するアミノ酸異化の代謝反応により、２０種の標準的なタンパク質のアミノ酸のうち１１のサブセット：アラニン；アルギニン；アスパラギン；アスパラギン酸；システイン；グルタミン酸；グルタミン；グリシン；プロリン；セリン；およびチロシンは、体内の他の代謝物（アミノ酸、ケトンなど）から合成可能であるため、ヒトにとって必須ではないとされている。
【０１４５】
アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシンは、食事で通常使用されておらず、利用速度が合成速度よりも大きい特定の集団において最適な必要性を満たすために適切な量で合成されないことから、条件的に必須であるとされている。しかしながら、アミノ酸が、集団において、真に必須ではない、または条件的に必須であり得るか否かを考慮する場合、生殖、疾患の予防、または代謝異常などの機能的な必要性を考慮することができる。他の９種のアミノ酸：ヒスチジン；イソロイシン；ロイシン；リジン；メチオニン；フェニルアラニン；スレオニン；トリプトファン；およびバリンは、最適な代謝の必要条件を満たすために、体内でこの炭素骨格を合成しないため、食品として摂取されている。
【０１４６】
２０種すべてのアミノ酸（および非タンパク質代謝物）は、正常に細胞が機能するために使用され、単一のアミノ酸の利用率を変えることにより駆動される代謝の変化は、全身のホメオスタシスおよび成長に影響を与えることができる。さらに、アミノ酸は、維持、成長、生殖、免疫に使用される鍵となる代謝経路のシグナリング分子および制御因子として機能する。
【０１４７】
体内では、骨格筋は、体重に占める割合が大きい（４０〜４５％前後）ことにより遊離アミノ酸およびタンパク質結合アミノ酸の最大の貯蔵部位を表す。小腸は、アミノ酸の異化にとって別の重要な部位であり、初回通過代謝および食事性アミノ酸の門脈および末梢血漿中への流入を支配る。食事中のＥＡＡの３０〜５０％は、初回通過代謝において小腸により異化され得る。腸粘膜におけるＢＣＡＡのトランスアミナーゼの活性が高いことにより、ＢＣＡＡが分枝鎖αケト酸へと変換されて、骨格筋で行われるものと類似する、腸細胞用のエネルギーを提供する。筋肉および小腸の代謝の生理的状態に差があることは、ヒトの組織を通して全身のアミノ酸生物学に関して大きな意味を有する。
【０１４８】
アミノ酸は、グリシン（非キラル）を除き、Ｌ−アイソフォームおよびＤ‐アイソフォームの両方で存在できる。タンパク質中のほぼすべてのアミノ酸は、酵素的に翻訳後修飾される場合、または保存もしくは調理の目的ために化学的に処理される場合を除き、側鎖の第２の位置の硫黄原子によるシステイン（Ｄ−シス）を除き、Ｌ−アイソフォームで存在する。Ｄ−ａｒｇ、Ｄ−ｃｙｓ、Ｄ−ｈｉｓ、Ｄ−ｌｙｓ、およびＤ−ｔｈｒを除くほとんどのＤ‐アミノ酸は、Ｄ−ＡＡオキシダーゼおよびトランスアミナーゼによりＬキラリティーに変換できる。異化されるためには、これらＤ‐エナンチオマーは、血漿および他の生体膜を通して運搬され、Ｄ−酸化を受け、アミノ酸を脱アミノして、そのαケト酸に変換し、またはラセミ化を受けてＤ−ＡＡをＬ−アイソフォームに変換する。Ｄ−アイソマーの運搬は、Ｄ‐ＡＡに対するＬ−ＡＡトランスポーターの親和性が低いことにより限定される。この理由のため、Ｄ‐ＡＡの利用効率は、Ｌ−アイソマーのモル濃度に基づき、アミノ酸およびその種に応じて２０〜１００％の範囲となり得る。
【０１４９】
アラニン
アラニンは、グルコース−アラニンサイクルの一部として、ＢＣＡＡおよびピルビン酸塩から筋細胞中で合成することができるため、グルコース生成非必須アミノ酸である。これは、肝臓外細胞（免疫細胞を含む）および組織が使用するために、遠位の肝臓でグルコースを産生するためにタンパク質貯蔵部位からからエネルギーを遊離させる、厳密に制御された工程を伴う。この結果としての糖新生の刺激により、絶食時にグルコースの形態でエネルギー供給源が提供される。アラニンは、肝臓での糖新生を通してタンパク質による利用可能なエネルギーの産生および生成のため、筋肉でのＢＣＡＡの利用の均衡を保つための非常に感受性のある中間体となる。さらに、アラニンによる糖新生の誘導は、筋肉、肝臓、および免疫細胞に限定されることなく、多くの組織の機能を支援するために不可欠である。しかしながら、単純な中間体として作用するのみならず、アラニンは、このエネルギー収支において鍵となる酵素、ピルビン酸塩キナーゼの活性をも直接調節する。アラニンは、糖新生を開始するため、そのリン酸化を促進し、解糖を遅らせ、かつホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）へのピルビン酸塩の逆反応を駆動することにより、ピルビン酸塩キナーゼの阻害能を有する。
【０１５０】
高アラニン
絶食状態で起こるＡＴＰ産生基質の欠乏は、エネルギー供給源を提供するために、リソソーム中の細胞内タンパク質のオートファジーおよび代謝回転をもたらし得る。アラニンを含む低レベルの糖原性アミノ酸は、肝臓のオートファジーを刺激することにより、肝機能の低下をもたらし得る。
【０１５１】
β細胞は、高脂肪食を供給する場合、血漿中グルコース濃度を上昇させるように身体が反応する際のインスリン産生およびタンパク質の代謝回転の需要の増加に対する応答としてオートファジーの増加を示す。肥満においてこのようにインスリン産生の増加へと向かって進むことは、糖尿病前症の初期マーカーであり、インスリン抵抗性の指標であり、最終的に過体重の個体において糖尿病の発症をもたらす島β細胞の機能性を悪化させるリスク因子である。栄養素を介してアラニンレベルを調節できることは、過体重の個体のインスリン代謝障害を乱すよう、肝臓およびβ細胞のオートファジーをシフトさせるための強力なレバーを提供し得る。
【０１５２】
アラニンは、直接βアラニンを生成し、これは、パントテン酸（ビタミンｂ５）、コエンザイムＡ、およびカルノシン（またはその律速前駆体）の生合成にとって重要である。カルノシン、ならびに他のβアラニン由来のジペプチド（タンパク質に組み込まれていない）カルシニン、アンセリン、およびバレニンは、筋組織で抗酸化剤の緩衝剤として作用し、Ｉ型およびＩＩ型筋線維において最大２０％の緩衝能を構成する。この緩衝作用は、グリコーゲンが乳酸に分解される際のあいだ、筋肉中の組織ｐＨを維持するために重要である。大学の運動選手での体重の減少／増加の試験で、βアラニンの補給が、体重減少の際の除脂肪量の喪失を防止することが示され、プラセボと比較して体重増加の際に除脂肪量が大きく増加する。またβアラニンは、疲労の減少および筋肉の作業量の増加にも関与している。
【０１５３】
カルノシンは、抗酸化剤および遷移金属イオン封鎖剤である。これは、終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成を阻害することにより抗糖化剤として作用する。ＡＧＥは、糖尿病性の脈管構造に多く存在し、粥状動脈硬化の発症の原因である。様々な細胞タイプでのＡＧＥの存在は、細胞外および細胞内両方の構造および機能に影響を与える（Ｇｏｌｄｅｎ，  Ａ．  ｅｔ．  ａｌ．    Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００６）。同様に、脳でのＡＧＥの蓄積は、老化および退化、特にアルツハイマー病の特徴である。ＡＧＥの蓄積は、タンパク質の架橋、酸化ストレス、および神経細胞死などのアルツハイマー病の多くの神経病理学的および生化学的な特徴を説明するものである。抗酸化および抗糖化の特性が組み合わさっているため、カルノシンは、細胞の酸化ストレスを減少させ、かつ活性酸素種および活性窒素種の細胞内形成を阻害することができる。
【０１５４】
低アラニン
肥満および糖尿病の状態で、動物は、肝臓のオートファジーの低減を示し、これによりインスリン抵抗性が増加することが示されている。オートファジーは、ＥＲおよび細胞のホメオスタシスの維持に重要であり、ストレスがかかるとインスリン感受性の低下を引き起こし得る。動物モデルで高脂肪食を与えることにより、ＥＲにストレスがかかり、ｍＴＯＲＣ１の過剰刺激を介して肝臓のオートファジーが減少し、糖尿病におけるインスリン感受性低下β細胞機能に向かう進行を強化する。全身性アラニンのレベルの低下は、ｍＴＯＲＣ１活性を低下させて、オートファジーの健常なレベルを回復させるための機会を提供する。
【０１５５】
アルギニン
アルギニンは、グルコース生成性の非必須アミノ酸であり、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン、およびプロリンを介して合成できる。アルギニンは、グルタミン酸塩、グルタミン、およびアスパラギン酸塩の酸化を介して哺乳動物の小腸により産生され、オルニチン、シトルリン、アルギニン、およびアラニンを生成する、またアルギニンは、腸細胞でのプロリンの活性分解からプロリンオキシダーゼ経路を介して産生される（オルニチンおよびシトルリンと共に）。アルギニンは、腎臓における腸細胞および一部の内皮細胞（白血球および平滑筋）により血中に放出されたシトルリンから変換される。新生児は、全身性の放出よりもアルギニンの合成のために小腸で遊離シトルリンの大部分を局所的に利用する。アルギニンおよびプロリンの酸化は、他の組織を超えたピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼの活性の低下により、粘膜に限定される。
【０１５６】
高アルギニン
シトルリンは、ＮＯＳファミリーにより触媒される反応の副産物としてアルギニンから産生される。アルギニンまたはシトルリンの栄養補助食品は、メタボリックシンドロームのリスク因子である、グルコース、ホモシステイン、および非対称性ジメチルアルギニンの血漿中レベルを低下することが知られている。Ｌ−シトルリンは、おそらくは血管の緊張および内皮機能に及ぼす影響により、筋肉からの乳酸の除去を促進する。また近年の研究から、スイカの果汁由来のＬ−シトルリンは、運動からの回復の度合いを大きくし、翌日の苦痛を少なくすることが示されている。また、Ｌ−シトルリンを遊離型で送達すると、スイカの果汁（高レベルのＬ−シトルリンを含む）よりも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞中への取り込みが少なくなるように思われる。これは、改善した効率で、内皮膜でｅＮＯＳによってシトルリンに変換するために筋肉組織の中へアルギニンを輸送できる、ペプチド用量を送達する機会を示唆するものである。
【０１５７】
アルギニンは、多くのシグナリング経路に関与し、一酸化窒素（ＮＯ）の直接的な前駆体としての機能性の高いアミノ酸であり、組織間の全身性のシグナリングならびに栄養素の代謝および免疫機能の調節のあいだを促進する。ＮＯは、正常な内皮の機能、および心血管の健康（血管緊張、血行動態、および血管新生を含む）にとって重要である。アルギニンは、β細胞の形質膜を直接脱分極することによってインスリン分泌を刺激し、Ｃａ２＋の流入およびその後のインスリンのエキソサイトーシスをもたらす。
【０１５８】
アルギニンの補給は、Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病モデルの心血管機能の指標である、内皮依存的な弛緩を改善することが示された。注目すべきことに、アルギニンの補給により、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病ラットおよび食事性肥満ラットにおいて、白色脂肪組織が減少するが、褐色脂肪量が増加した。アルギニンおよび／またはその代謝物は、褐色脂肪細胞の増殖、分化、および機能を増強し得る。さらに、骨格筋の質量および全身のインスリン感受性の両方が、筋肉でのｍＴＯＲおよびＮＯのシグナリングの増加を含む機構を介して、アルギニンの補給に応答して高まった。驚くべきことに、アルギニンの長期間の経口投与により、ＩＩ型糖尿病の肥満のヒトの成年で脂肪量が減少した（Ｌｕｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。さらに、従来のトウモロコシおよびダイズが主成分の飼料にアルギニンを補給することにより、肥育豚の全身の脂肪沈着が低減し、タンパク質沈着が促進した。ヒトの小規模のパイロット試験のデータから、肥満およびインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）におけるインスリン媒介性血管拡張の欠損が、静脈内のＬアルギニンにより正常化でき、またＬアルギニンは、健常な対象、肥満患者、およびＮＩＤＤＭの患者のインスリン感受性をも改善することが示され、このことはインスリン媒介性血管拡張の回復とは異なる潜在的な機構を示唆している。さらに、Ｌアルギニンの長期的な投与は、ＩＩ型糖尿病患者におけるグルコースのレベル、インスリン誘導性の肝臓でのグルコースの産生、およびインスリン感受性を改善した（Ｐｉａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。アルギニンを多く含むペプチドは、今まで単離されておらず、試験されていない。
【０１５９】
高用量のアミノ酸の投与（食事中で利用できる量の１０×２０倍、または１〜３ｇ／ｋｇ体重で静脈内投与または経口経路を介して２０分かけて投与）は、内分泌細胞を介して腸からのホルモン分泌を刺激することができる。アルギニンは、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、グルカゴン、プロゲステロン、および胎盤性ラクトゲンの全身性の放出を刺激できる、十分に研究された分泌促進物質である。この生物学は、消化の生物学および腸管に存在する栄養素の吸収の両方に影響を与え、ならびに内分泌ホルモンにより媒介される満腹シグナルの引き金となることによりエネルギー収支に影響を与える。これらのホルモンの調節能は、肥満などの代謝性障害でカロリー摂取を減少させるため、またあるいは筋消耗性のサルコペニアおよびカヘキシーにおいて食欲を引き起こすため、ならびに糖尿病の発症においてインスリン感受性をシフトさせることによる、治療機会を提供する。
【０１６０】
アルギニンは、細胞特異的にｍＴＯＲ１のリン酸化を刺激する重要なシグナリング分子である。これは、細胞タンパク質の代謝回転（オートファジー）を調節し、インスリン様増殖シグナルを、組織を全体のタンパク質合成開始と統合する。この生物学は、骨格筋の除脂肪組織量の生合成、病的状態の肥満およびインスリン抵抗性における代謝シフト、ならびに老化に直接関連している。またこれは、急速に生育する癌細胞が増殖するために乗っ取ることができる中心的なシグナリング経路でもある。
【０１６１】
アルギニンに関して、ウイルス感染症および栄養障害などの異化状態の下で小腸におけるタンパク質合成レベルを増加させるという証拠があり、この場合アミノ酸のレベルは、正常な吸収後の状態から著しくシフトしている。さらに、アルギニンによる腸上皮細胞でのｍＴＯＲの活性化が証明されたことは、タンパク質合成および細胞増殖を刺激することにより腸上皮を修復する機構を提供する。類似の同化シグナリングが、アルギニンの血漿中レベルの上昇に応答して筋細胞で観察されており、これにより全身および骨格筋のタンパク質合成が上昇する。アルギニンは、ＥＡＡの同化作用を支持するために十分なレベルで維持されるアミノ酸である。リジン、メチオニン、スレオニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンは、これを１２．７％の粗タンパク質食に添加しても、タンパク質合成および全身の成長の増加を支持することができないことが示されており、このことは、アルギニンを含む、同化媒介性の非必須アミノ酸の欠損を示唆するものである。
【０１６２】
また、アルギニンは、脂肪酸貯蔵の代謝を刺激し、かつ脂肪組織量を減少させる、ミトコンドリアでの生合成および基質酸化に関連するタンパク質および酵素をアップレギュレートする。食事性アルギニンの補給は、カロリー摂取の増加によるインスリン抵抗性を罹患する肥満および前糖尿病性の集団に治療上の利点を提供する。同様に、ミトコンドリアでの生合成の刺激能は、老化、および機能的タンパク質の再生能、および酸化ストレスを受ける健常な細胞に直接的な関わりを有する。
【０１６３】
食事性のタンパク質の欠乏は、必須と考えられていないにも関わらずアルギニンを含む大部分のアミノ酸の利用率を低減させることが確立されている。アルギニンの欠乏により、９日後に精子数が９０％減少し、非運動性の精子の比率が１０増加することが知られている。アルギニンの補給は、精液の中のアルギニン、プロリン、オルニチン、およびポリアミンなどの他のアルギニン代謝物のレベルを増加させ、精子の数および精子の運動性の増加に対応することが動物で例証されている。同様に、ＮＯの合成およびポリアミン（を介する）の変化は、胎盤の成長速度がピークとなる妊娠中に観察され、これは、妊娠中の胎児発達におけるアルギニンの役割を示唆するものである。妊娠初期のあいだの子宮体液では、アルギニンのレベルも、胎児における特異的アミノ酸輸送体の発現に応答して減少する。妊娠初期のあいだの動物の食事へのアルギニンの補給により、胚生存および同腹仔の大きさの増加が示され、これにより、妊娠中の高レベルアルギニンの送達に重要な可能性があることが示される。
【０１６４】
アルギニンは、ＮＯ産生（貪食細胞の殺傷能力を増強できる）、ホルモンの分泌促進活性、およびｍＴＯＲの刺激に対する直接的な作用に基づき、免疫機能の増強に関する効果が広く研究されている。プロリンオキシダーゼによるプロリンの異化は、哺乳動物の胎盤および小腸で高レベルの活性を有することが知られている。この活性は、腸および胎盤の免疫においてアルギニンが重要な役割を果たすことを指摘さしており、この役割はいずれも、病原菌に細胞傷害性であるＨ２Ｏ２の生成、およびアルギニンの合成を介する。重篤に損傷を受けた患者において、白血球数が、６日間のアルギニンを多く含む食事の後に急速に正常化し、１０日後には正常なＴＮＦ応答に回復する（１００％の改善）。アルギニンを多く含む（１２．５ｇ／Ｌのアルギニン）配合物対経腸製剤を試験した２９６名の外科手術、外傷、または敗血症の患者での臨床試験から、入院日数が著しく減少し（８〜１０日）、主に後天性感染症の頻度が減少したことが示されている。アルギニンを多く含む（１２．５ｇ／Ｌのアルギニン）対経腸製剤を与えた１８１名の敗血症患者の別の臨床試験では、菌血症（８％対２２％）、院内感染（６％ｖｓ２０％）が著しく減少したことが示される。
【０１６５】
またアルギニンは、コラーゲンの合成の鍵となる基質でもある。アルギニンの経口補給により、健常な対象の創傷治癒およびリンパ球の免疫応答が高まる。対照に対してリンパ球の増殖が増加したことに加えて、２．４倍のコラーゲン沈着の増加が創傷部位で観察された（２４ｎｍｏｌ／ｃｍ対１０．１ｎｍｏｌ／ｃｍ）。
【０１６６】
アルギニンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼのアロステリック性活性因子であり、この酵素は、グルタミン酸塩およびアセチルＣｏＡをミトコンドリア中でＮ−アセチルグルタミン酸塩に変換する酵素である。これにより、肝臓の尿素回路はアンモニアの解毒に有用な活性状態へと向かう。このことは、アルギニンを低用量で含む栄養素の食事による送達は、血液循環から尿素を排出することが難しい腎臓疾患の観点から有用であり得ることを意味する。組織の異化を防止するためのタンパク質摂取制限を維持することが可能でありつつ、利用可能な窒素供給源からの尿毒症を制限するためにアルギニンを除去することは、腎臓疾患の破壊的な栄養上の結末に対する新規の戦略である。
【０１６７】
アルギニンは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩの活性、ＮＯ合成のためのテトラヒドロビオプテリン（ＴＨＢ）の遊離、および芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（ＡＡＡＨ）による芳香族アミノ酸（ＡｒＡＡ）のヒドロキシル化をアップレギュレートする。この理由のため、ＴＨＢの細胞レベルを上昇させるための高レベルのアルギニンの送達は、ＣＮＳの毛細血管内皮細胞における多くの神経伝達物質の生合成を刺激する。ＡｒＡＡは、メラトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、およびエピネフリン（アドレナリン）を含む、モノアミン神経伝達物質の生合成の前駆体として作用する。
【０１６８】
低アルギニン
過度のアルギニン摂取は、血中の高レベルのＮＯ産生を刺激し、細胞の酸化損傷およびアポトーシスを引き起こし得る。
【０１６９】
アルギニンの過剰および欠乏は、哺乳動物の肝細胞での全体的な遺伝子発現に影響を与える。欠乏により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルを使用して１４１９個の遺伝子の発現が有意に（ｐ＜０．０５）変化し、、このうち５６個の遺伝子が、９元配置バイオインフォマティクス解析（９−ｗａｙ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して少なくとも２倍の変動を示した。多数の生育、生存、ならびにＧＡＤＤ４５、ＴＡ１／ＬＡＴ１、およびカスパーゼ１１および１２などのストレス関連遺伝子を含む、その大部分は発現が増加する。多くが、管腔のＥＲのストレス応答に関連する。ＬＤＬｒは、コレステロールおよびステロイドの生合成の制御因子であり、同様にアルギニンの欠乏に応答して調節された。遺伝子発現に影響を与えるアルギニンと一致して、食事性アルギニンの補給は、脂肪組織および小腸組織において、抗酸化性遺伝子をアップレギュレートし、炎症誘発性の遺伝子の発現を低下させる。
【０１７０】
低レベルのアルギニンにより、神経伝達物質の生合成が阻害され、これは躁病、パーキンソン、およびジスキネジアなどの適応において臨床的な有効性を示している。
【０１７１】
アスパラギン
アスパラギンは、グルコース生成型の非必須アミノ酸であり、この前駆体はオキザロ酢酸塩（ＯＡＡ）であり、トランスアミナーゼ酵素によりグルタミンおよびアスパラギン酸塩を介して合成される。アスパラギンは、リンパ芽球などの一部の腫瘍細胞の機能に使用されている。
【０１７２】
アスパラギンは、典型的に、タンパク質のαへリックスの末端に位置しており、炭水化物の鎖を付加するための重要なＮ結合グリコシル化部位を提供し、これにより、アミノ酸摂取に対する免疫応答に影響を与える。
【０１７３】
アクリルアミド（Ａｃｙｒｌａｍｉｄｅ）は、アスパラギンと、多くの植物由来の食品中のグルコースおよびフルクトースのカルボニル基とのあいだの熱誘導反応により形成される。アクリルアミドは、細胞傷害性であり得て、遺伝子変異を引き起こし、一般的に食品の品質に影響を及ぼし得る酸化剤である。低レベルのアスパラギンを含む組成物は、調理または非冷蔵の保存条件に供され得る食品生成物をより安全にするために有用である。
【０１７４】
アスパラギン酸塩
アスパラギン酸塩は、トランスアミナーゼ酵素により、オキザロ酢酸塩（ＯＡＡ）前駆体を介して合成されるグルコース生成型非必須アミノ酸である。尿素回路の一部として、アスパラギン酸塩は、放出したフマル酸塩がリンゴ酸塩に変換され、その後ＯＡＡに再循環するように、オルニチンおよびシトルリン（またはアルギニン）から産生することもできる。アスパラギン酸塩は、イノシンの合成において、プリン生合成の前駆体である窒素原子を提供する。またアスパラギン酸塩は、βアラニンの合成にも関与している。アスパラギン酸塩は、小腸の腸細胞で酸化し、窒素系産物のオルニチン、シトルリン、アルギニン、およびアラニンをもたらす。
【０１７５】
アスパラギン酸塩は、ＮＭＤＡ受容体（グルタミン酸塩受容体）のアゴニストであり、多くの細胞シグナリング経路のセカンドメッセンジャーとしてＣａ２＋を放出する。統合失調症に関わるドーパミン作動神経およびグルタミン作動神経の異常が存在し、ここでは、ＮＭＤＡアンタゴニストは、統合失調症のいくつかの陽性および陰性の症状を模倣しつつ、ドーパミンアゴニストよりも脳損傷のリスクが低い。ケタミンおよびＰＣＰは、たとえば、統合失調症で観察されるものと類似の表現型を生じ、ＰＣＰは、あまり代表的でない症状を示すが、それでもなお類似の脳構造の変化を示す。グルタミン酸塩受容体は、統合失調症の発症に関与する機能を増加させている。シナプス前グルタミン酸塩受容体に対するシナプス後グルタミン酸塩受容体の比率の増加により、グルタミン酸塩のシグナリングの増加がもたらされる。ＮＭＤＡ受容体の刺激および拮抗はいずれも、ＭＯＡおよび受容体の特異性に応じて、アルツハイマー型認知症を処置する際に一部で有益であることが示されている。よって、ＮＭＤＡアゴニスト活性としての、高レベルまたは低レベルのアスパラギン酸塩を含むタンパク質の送達は、この患者集団のための治療となり得る。低レベルのアスパラギン酸塩を含むタンパク質は、メマンチンなどのＮＭＤＡアンタゴニストと共に相乗的な利点を提供する可能性がある。同様に、ＬＹ２１４００２３の臨床試験は、グルタミン酸塩に基づく処置を、キセノケミカル抗精神病薬（ｘｅｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｔｉ−ｐｓｙｃｈｏｔｉｃｓ）で見られる副作用がなく、統合失調症を処置する可能性を有することを証明した。抗精神病薬とコアゴニストのグリシンを組み合わせた類似の試験では、症状の改善が示され、高用量のアスパラギン酸塩の送達、同様にＮＭＤＡのアゴニストの送達は、この患者集団に類似の治療上の利益をもたらすことが示された。
【０１７６】
アスパラギン酸塩は、３．９の低いｐＫａを有する酸性アミノ酸である。メチルエステルを介したフェニルアラニンとのジペプチド型のアスパラギン酸塩は、アスパルテームをもたらし、これは市販の人口甘味料として使用されている。
【０１７７】
システイン：
システインは非必須アミノ酸であり、ホモシステインから合成され、これはメチオニンの代謝物からそれ自体が合成される。セリンは、ホモシステインと縮合してシスタチオニンを形成することによってシステインの合成に関与する。次いで、シスタチオニンが脱アミノ化および加水分解されて、システインおよびαケト酪酸塩を形成する。システインの硫黄はホモシステインに由来するが、この分子の残りは、最初のセリン残基に由来する。システインの生合成は、植物および原核生物では異なる機構を介して起こる。システインは、タンパク質のフォールディングにおいて重要な役割を担うことから、重要なアミノ酸である。システイン残基のあいだに形成されるジスルフィド結合は、タンパク質の３次構造および４次構造を安定化させるのに役立ち、これらのジスルフィド結合は、タンパク質が細胞の内部で見出されるより酸化的条件に曝露される分泌タンパク質では最も一般的である。ホモシステインは有益であるにも関わらず、全身性のレベルが高いホモシステインは、心血管疾患を発症するリスク因子である。ホモシステインの増加は、シスタチオニンβシンターゼの遺伝的な欠損により引き起こされる場合があり、過剰なメチオニン摂取でも引き起こされる場合がある。食品中のメチオニンの摂取の制御、ならびに葉酸およびビタミンＢ１２の補給の制御は、ホモシステインのレベルを低下させるために使用されている。さらに、システインの利用率は、グルタチオニンの合成を限定する鍵となる要因であるため、システインの前駆体である、Ｎ−アセチル−システインを食事に補給することは、幅広い範囲の疾患状態において免疫を高めるために非常に有効である。
【０１７８】
システインは、迅速な酸化を受けてシスチンとなる。これは、グルタチオニンの生合成を促進し、活性酸素種（ＲＯＳ）、フリーラジカルなどの不安定な分子に還元当量を供与できる強力な抗酸化剤である。酸化種を還元した後、別の活性グルタチオニンを含むグルタチオニンスルフィドを形成でき、これは細胞から酸化ストレス誘導分子を枯渇させる機構を提供できる（肝臓は、最大５ｍＭの濃度を維持できる）。グルタチオニンは、肝臓の中の毒素の強力な中和剤であり、毒素の損傷作用から肝臓を保護するために役立つ。さらに、この解毒能は、筋力虚弱を減少させるために役立ち、髪の脆弱化を予防し、かつこれらの毒素に関連する照射から保護する。結果として、グルタチオンは、化学物質アレルギーを罹患しているか、高レベルの大気汚染に曝露されている対象に有益である。グルタチオニンはまた、ｉＮＯＣの補因子であり、ａｒｇ−ＮＯ経路でのＮＯの合成を最大にする。ＮＯは、正常な内皮の機能および心臓血管の健康（血管緊張、血行動態、血管新生）にとって重要である。
【０１７９】
グルタチオニン（ｇｌｕｔａｔｉｔｈｉｏｎｉｎｅ）の前駆体であることに加えて、システインは、Ｈ２Ｓの前駆体であり、これは内皮依存性の弛緩を誘導でき、システインスルフィン酸へとさらに変換できる。システインスルフィン酸（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｕｌｆｕｎａｔｅ）は、タウリンに変換することができ、これは、メチオニンの取り込みを減少させる能力を有する。メチオニンが過剰になると、ホモシステインはメチオニンとシステインとのあいだの中間体であるため、高ホモシステイン血症を誘導することによりアテローム性動脈硬化症の発症リスクが増大する。しかしながら、システインが、直接、またはメチオニンの減少を介して、ホモシステインを減少させるか否かはわかっていない（Ｓｅｂａｓｔｉａａｎ  Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ２００９；  ５３：  ９０９−９１１）。
【０１８０】
さらに、システインは、アルギニン−ＮＯ経路を調節するタウリンの前駆体である。タウリンは、いくつかの潜在的な保護作用を有する。第１に、タウリンは、次亜塩素酸塩に結合することにより酸化ストレスを低減する能力を有する。タウリンは、ミトコンドリア転位ＲＮＡに接合し、その際、ミトコンドリアのスーパーオキシドの形成を防止するとの仮説がある。さらに、タウリンは、血管平滑筋細胞の小胞体のホモシステイン誘導ストレスを阻害し、よって、細胞外のスーパーオキシドジスムターゼの発現および分泌を回復する。
【０１８１】
グルタミン酸塩
グルタミン酸塩は、小腸の腸細胞で酸化して、窒素生成物の、オルニチン、シトルリン、アルギニン、およびアラニンを生成する。またグルタミン酸塩は、アルギニン−ＮＯ経路を調節する。ＮＯは、正常な内皮の機能および心血管の健康（血管緊張、血行動態、血管新生を含む）にとって重要である。
【０１８２】
高グルタミン酸塩
絶食状態で起こる、ＡＴＰ産生基質の欠乏は、リソソーム内の細胞内タンパク質のオートファジーおよび代謝回転を引き起こして、エネルギー供給源を提供できる。グルタミン酸塩を含む、低レベルの糖原性アミノ酸は、肝臓のオートファジーを刺激し、それによって肝機能の分解を引き起こし得る。
【０１８３】
シトルリンは、ＮＯＳファミリーにより触媒される反応の副産物として、グルタミン酸塩から産生される。シトルリンの食事性栄養補助食品は、メタボリックシンドロームのリスク因子である、グルコース、ホモシステイン、および非対称性ジメチルアルギニンの血漿中レベルを低下させることが知られている。Ｌ−シトルリンは、おそらくは血管緊張および内皮機能に関する作用により、筋肉からの乳酸の除去を促進する。また近年の研究では、スイカの果汁由来のＬ−シトルリンにより、運動からの回復が顕著になり、翌日の痛みが少なくなることが示されている。また、遊離型としてＬ−シトルリンを送達すると、スイカの果汁（高レベルのＬシトルリンを含む）よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞内への取り込みがより少ないように思われる。これは、改善された効率で、内皮膜でｅＮＯＳによってシトルリンに変換するため、筋組織の中にアルギニンを輸送することのできるペプチド用量を送達する機会を示唆するものである。
【０１８４】
グルタミン酸塩は、グルタチオンの生合成を促進し、これは、活性酸素種（ＲＯＳ）およびフリーラジカルなどの不安定な分子に還元当量を供与できる。酸化種を還元させた後、これは、別の反応性グルタチオンとグルタチオンジスルフィドを形成することにより、細胞から酸化ストレス誘導分子を除去する機構を提供できる（肝臓で最大５ｍＭの高濃度を維持する）。グルタチオンはまた、ｉＮＯＳの補因子でもあり、ａｒｇ−ＮＯ経路においてＮＯの合成を最大にする。
【０１８５】
コアゴニストのグリシンまたはセリンと共にグルタミン酸塩は、ＮＭＤＡ受容体のアゴニストであり、多くの細胞シグナリング経路のセカンドメッセンジャーとしてＣａ２＋を放出する。統合失調症に関わるドーパミン作動神経およびグルタミン作動神経の異常が存在し、ＮＭＤＡアンタゴニストは、統合失調症のいくつかの陽性および陰性の症状を模倣しつつ、ドーパミンアゴニストよりも脳損傷のリスクが低い。統合失調症に関わるドーパミン作動性およびグルタミン作動性の異常が存在し、ここでは、ＮＭＤＡアンタゴニストは、統合失調症のいくつかの陽性および陰性の症状を模倣しつつ、ドーパミンアゴニストよりも低い脳損傷のリスクを保有する。ケタミンおよびＰＣＰは、たとえば、統合失調症で観察されるものと類似の表現型を産生し、ＰＣＰは、あまり代表的でない症状を示すが、それでもなお類似の脳構造の変化を示す。グルタミン酸塩受容体は、統合失調症の発症に起因する機能を増加させる。シナプス前グルタミン酸塩受容体に対するシナプス後グルタミン酸塩受容体の比率の増加により、グルタミン酸塩のシグナリングの増加がもたらされる。ＮＭＤＡ受容体の刺激および拮抗はいずれも、ＭＯＡおよび受容体の特異性に応じて、アルツハイマー型認知症を処置する際に何らかの利益があることが示されている。よって、ＮＭＤＡアゴニスト活性としての、高レベルまたは低レベルのグルタミン酸塩を含むタンパク質の送達は、この患者集団のための治療であり得る。低レベルのグルタミン酸塩を含むタンパク質は、メマンチンなどのＮＭＤＡアンタゴニストと共に相乗的な利点を提供する可能性がある。同様に、ＬＹ２１４００２３の臨床試験は、グルタミン酸に基づく処置を、キセノケミカル抗精神病薬（ｘｅｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｔｉ−ｐｓｙｃｈｏｔｉｃｓ）で見られる副作用がなく、統合失調症を処置する可能性を有することを証明した。抗精神病薬とコアゴニストのグリシンを組み合わせた類似の試験では、症状の改善が示され、高用量のアスパラギン酸塩の送達、同様にＮＭＤＡのアゴニストの送達は、この患者集団に類似の治療上の利益をもたらすことが示唆される。
【０１８６】
低グルタミン酸塩
グルタミン酸塩およびアセチルＣｏＡは、ミトコンドリアの中でＮ−アセチルグルタミン酸塩に変換される。これにより、肝臓の尿素回路は、アンモニアの解毒に有効な活性状態に向かう。このことは、低用量のグルタミン酸塩を含む栄養素を食事によって送達することが、患者が血液循環から尿素を排出することが困難である腎疾患において有用であり得ることを意味する。組織の異化を防止するためにタンパク質摂取制限を維持することが可能でありながら、利用可能な窒素供給源から尿毒症を制限するためにグルタミン酸塩を除去することは、腎疾患の破壊的な栄養上の結末に対する新規の戦略である。
【０１８７】
グルタミン
グルタミンは、小腸の腸細胞の中で酸化し、窒素生成物のオルニチン、シトルリン、アルギニン、およびアラニンをもたらす。
【０１８８】
シトルリンは、ＮＯＳファミリーにより触媒される反応の副産物としてグルタミンから産生される。シトルリンの食事性栄養補助食品は、メタボリックシンドロームのリスク因子である、グルコース、ホモシステイン、および非対称性ジメチルアルギニンの血漿中レベルを低下させることが知られている。Ｌ−シトルリンは、おそらくは血管緊張および内皮機能への影響により、筋肉からの乳酸の除去を促進させる。また近年の研究では、スイカの果汁由来のＬ―シトルリンが、運動からの回復を顕著なものにし、翌日の痛みを軽減することも示されている。また、遊離型としてＬ−シトルリンを送達すると、スイカの果汁（高レベルのＬ−シトルリンを含む）よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への取り込みが少ないように思われる。このことは、改善された効率で、内皮膜でｅＮＯＳによるシトルリンへの変換のために、筋肉組織の中へアルギニンを輸送できるペプチド用量を送達する機会を示唆している。
【０１８９】
高グルタミン
グルタミンは、β細胞、成長ホルモン、プロラクチン、グルカゴン、プロゲステロン、および胎盤性ラクトゲン由来のインスリンの全身への放出を刺激することができる、十分に研究された分泌促進物質である。またグルタミンは、循環中のグルココルチコイドおよびストレスホルモンを減少させることも示されている。この生物学は、腸に存在する栄養素の消化生物学および吸収の両方に直接関係しており、ならびに内分泌ホルモンにより媒介される満腹シグナルの引き金となることによりエネルギー収支に影響を与える。これらホルモンの調節能は、肥満などの代謝性障害においてカロリー摂取を減少させ、またはあるいは、筋肉の消耗、筋肉減少症、およびカヘキシーにおいて食欲の引き金となり、ならびに糖尿病の発症においてインスリン感受性をシフトさせることによってため治療機会を提供する。
【０１９０】
食事性グルタミンの補給は、脂肪組織および小腸組織において、抗酸化性遺伝子をアップレギュレートし、炎症誘発性遺伝子の発現を低下させる。
【０１９１】
グルタミンは、細胞特異的にｍＴＯＲ１のリン酸化を刺激するための重要なシグナリング分子である。これは、細胞タンパク質の代謝回転（オートファジー）を調節し、インスリン様成長シグナルを組織全体のタンパク質合成開始と統合する。この生物学は、骨格筋の除脂肪組織量の生合成、病的状態の肥満およびインスリン抵抗性における代謝のシフト、ならびに老化に直接関連している。
【０１９２】
グルタミンは、ＥＡＡの同化作用を支援するために十分なレベルで維持されているアミノ酸である。リジン、メチオニン、スレオニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンは、これを１２．７％の粗タンパク質食に添加しても、タンパク質の合成および全身の成長の増加を支持することができないことが示されており、このことは、グルタミンを含む、同化媒介非必須アミノ酸の欠乏を示している。
【０１９３】
グルタミンは、ピログルタミン酸塩にゆっくりと環化される。グルタミンは、腸細胞、リンパ球、マクロファージ、および腫瘍を含む、迅速に分裂する細胞のための好ましい燃料供給源である。食事へのグルタミンの補給は、外科手術、重症疾患、熱傷、および感染症における腸の完全性および免疫機能において顕著に証明された利益を有する。１２日間のグルタミンの補給（０．３５ｇ／ｋｇ）の熱傷損傷試験から、腸の透過性の低減、内毒素レベルの低下、および入院日数の短縮が示された。これは、ラクツロース／マンニトールの比率の、８．８倍の減少対５．５倍の減少をもたらし、それによって入院日数が３日および６日間短縮した。外科手術を待っている栄養不良患者の、２週間のグルタミンの完全非経口栄養（ＴＰＮ）（０．２３ｇ／ｋｇ）対グルタミンを含まないＴＰＮ試験は、グルタミンを含まない群で、腸の透過性が増加したことを示した。これは、２週間後のラクツロース／マンニトールの比率の３．６倍対０．８１倍の増加をもたらした。これらの改善は、腸の免疫を改善し、菌血症を低減させるために、診療所で高レベルのグルタミンを送達する機会を指摘するものである。
【０１９４】
またこれは、入院のあいだに、全身的にリンパ球数を改善し、感染性の合併症を低減する。重篤な熱傷を有する患者にグルタミンを補給（退院まで２６ｇ／日）する試験は、標準的な完全経腸栄養（ＴＥＮ）対グルタミンを多く含む栄養において、３倍以上の高頻度の血液培養陽性を示し、死亡率を有意に減少させることを示している。さらに、グルタミンを補給することにより、リンパ球の数および機能の増加、ＨＧＨの増加、感染性合併症の減少、入院日数の減少、有病率の減少、死亡率の減少、および腸透過性の減少が示される。
【０１９５】
グルタミンの筋肉内レベルは、ストレス、熱傷、損傷、および敗血症などの異化状態の下で減少する。この減少は、除脂肪組織中の正味の負電荷タンパク質をもたらす。骨格筋へのグルタミンの投与は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分解を阻害しつつ、タンパク質の合成を増加させることが示されている。さらに生理学的な濃度（１ｍＭのグルタミン）から最大１５倍高い濃度までの用量依存性が骨格筋で観察されている。この作用は、小腸から採取した粘膜の細胞でさらに例証された。
【０１９６】
分枝鎖アミノ酸はすべて、グルタミン合成のための代謝基質であり、胎児のグルタミンの供給源を提供し、胎盤および胎児の成長を増強し、このことは、哺乳動物の同化に関する作用の媒介におけるグルタミンの役割を示唆するものである。さらに、グルタミンのレベルおよび血漿からの利用時期は、ロイシンの細胞の取り込み、およびその後のｍＴＯＲ活性化のプロファイルに影響を与えることが示されている。細胞内のグルタミンの増大は、グルタミン／ロイシンのアンチポーター、ＳＬＣ７Ａ５を介したロイシンの取り込みに使用されている。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロイシンと等しい比率でグルタミンを投与すると、ｍＴＯＲを介したタンパク質合成をより持続して刺激することになり、これにより、ロイシン投与前にグルタミンで細胞をプライミングすると、より迅速で、なおかつ一過性のｍＴＯＲの活性化をもたらす（Ｎｉｃｋｌｉｎ，  Ｐ．  ｅｔ．  ａｌ．    Ｃｅｌｌ  ２００９）。
【０１９７】
絶食状態で起こる、ＡＴＰ産生基質の欠乏は、リソソームの中の細胞内タンパク質のオートファジーおよび代謝回転を引き起こして、エネルギー供給源を提供することができる。グルタミンを含む低レベルの糖原性アミノ酸は、肝臓のオートファジーを刺激することにより、肝機能の分解を引き起こし得る。
【０１９８】
低グルタミン
ｍＴＯＲは、腫瘍形成性細胞がグルタミンを選択的に取り込むことによって、急速に生育する癌細胞が増殖するために乗っ取ることができる中心的なシグナリング経路であり、発癌性の細胞の好ましいグルタミンの取り込みにより明らかとなっている。
【０１９９】
グリシン
絶食状態で起こるＡＴＰ産生基質の欠乏により、リソソーム中の細胞内タンパク質のオートファジーおよび代謝回転をもたらすことによりエネルギー供給源を提供することができる。グリシンを含む低レベルの糖原性アミノ酸は、肝臓のオートファジーを刺激し、肝機能の分解を引き起こし得る。
【０２００】
グリシンは、活性酸素種（ＲＯＳ）およびフリーラジカルなどの不安定な分子に還元当量を供与することができる、グルタチオンの生合成を促進する。酸化種の還元後、グリシンは、別の反応性グルタチオンとグルタチオンジスルフィドを形成でき、これにより、細胞から酸化ストレス誘導分子を除去する機構を提供する（肝臓で最大５ｍＭの高濃度を維持する）。またグルタチオンは、ｉＮＯＳの補因子でもあり、ａｒｇ−ＮＯ経路のＮＯの合成を最大にする。
【０２０１】
ヒスチジン
ヒスチジンは、必須アミノ酸であり、カルノシンの前駆体である。カルノシンは、抗酸化剤であり、かつ遷移金属イオン封鎖剤である。これは、終末糖化産物（ＡＧＥ）の形成を阻害することにより抗糖化剤として作用する。ＡＧＥは、糖尿病性の脈管構造で多く存在し、アテローム性動脈硬化症の発症の原因となる。様々な細胞タイプにＡＧＥが存在することは、細胞外および細胞内の構造および機能に影響を与える（Ｇｏｌｄｅｎ，  Ａ．  ｅｔ．  ａｌ．    Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００６）。脳でのＡＧＥの蓄積は、老化および退化の特徴、特にアルツハイマー病の特徴である。ＡＧＥの蓄積は、タンパク質の架橋、酸化ストレス、および神経細胞死などのアルツハイマー病の多くの神経病理学的および生化学的な特性を説明している。抗酸化および抗糖化の特性が組み合わさっているため、カルノシンは、細胞の酸化ストレスを減少させることができ、活性酸素種および活性窒素種の細胞内形成を阻害することができる。
【０２０２】
ヒスチジンは、抗酸化性、抗炎症性、および抗分泌性の特性を有する。ヒスチジンのイミダゾール環は、急性炎症性応答の際に細胞により生成される活性酸素種（ＲＯＳ）の除去能を有する。ヒスチジンの投与は、細胞および組織の損傷に関与するサイトカインおよび増殖因子を阻害する。ヒスチジンの投与は、関節リウマチの処置に有益であり、重篤な関節リウマチの患者を有効に処置するために４．５ｇの毎日投与が用いられている。関節リウマチの患者は、血液からのヒスチジン除去が非常に迅速であることにより、血清中のヒスチジンのレベルが低いことが発見されている。また血漿中のヒスチジンの低いレベルは、慢性腎不全患者、肥満女性（酸化ストレスおよび炎症にも負の影響を与えている）、肺炎の小児患者、および喘息患者でも見出されている。ヒスチジンを補給することにより、インスリン抵抗性が減少し、ＢＭＩおよび脂肪量が低下することが示されている。ヒスチジンは、メタボリックシンドロームを伴う肥満の対象の炎症および酸化ストレスを抑制する。最後に、ヒスタミンの前駆体として、ヒスチジンは、血液および脳のヒスタミンのレベルを増加させる。低い血中ヒスタミンは、一部の躁病、統合失調症、銅の濃度が高くかつ機能亢進性のグループの精神病患者で見出されている。
【０２０３】
転写調節に関与しているタンパク質の翻訳後修飾は、遺伝子を調節するために使用される機構である。この修飾は、特定の方法でタンパク質の機能を変化させることができる。修飾の一形態は、タンパク質のメチル化であり、これは最も多く起こるタンパク質の修飾のうちの１つである。タンパク質のメチル化は、遺伝子調節およびシグナル伝達を含む重要な生物学的機能を有している。ヒスチジンは、タンパク質の修飾、および究極的にはタンパク質メチルトランスフェラーゼによりＳ−アデノシルメチオニンから転移したメチル基を受容する、という点で遺伝子制御において役割を果たす（Ｙｏｕｎｇ−Ｈｏ  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．  Ｓｔａｌｌｃｕｐ，  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２００９  Ａｐｒｉｌ；  ２３（４）：  ４２５−４３３）。
【０２０４】
ヒスチジンの補給は、アルツハイマー病、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、女性のメタボリックシンドローム、関節リウマチ、および様々な精神病態（躁病、統合失調症、銅の濃度が高い、機能亢進性のグループ）を含む、複数の疾患の処置に有益となり得る。さらに、タンパク質修飾におけるその役割により、ヒスチジンは、癌を含む遺伝子の調節解除からもたらされる疾患に立ち向かう手段を提供する。
【０２０５】
低ヒスチジン
非荷電ｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生合成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。必須アミノ酸を欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングを顕著に誘発する（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連した遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが知られている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。ヒスチジンを欠いているバランスの取れていない食事は、ヒスチジンを欠く１〜５．４％のアミノ酸混合物を補充された基本のカゼイン食を与えたラットにおいてＧＣＮ２をシグナリングすることが示されている。ヒスチジンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を及ぼし、肝臓（および脂肪肝表現型）の重量、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物摂取に関する生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪の質量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２０６】
イソロイシン
イソロイシンはＥＡＡであり、またＢＣＡＡでもある。イソロイシンは、肝疾患を罹患している患者の栄養状態を改善するために他のＢＣＡＡと併用して使用される。イソロイシンを含むＢＣＡＡは、代謝ストレスのあいだのあいだ、骨格筋の燃料供給源として作用し、タンパク質の合成を促進し、タンパク質の異化を抑制し、かつ、糖新生の基質として作用する。ＢＣＡＡ、具体的にはイソロイシンは、骨格筋で異化されており、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミンの産生を刺激する。
【０２０７】
ＢＣＡＡは、安静時のヒトの筋肉において、タンパク質合成速度を増加させ、かつタンパク質分解速度を減少させることにより、タンパク質代謝に関して同化作用を有することが示されている。さらに、ＢＣＡＡは、持久性運動後の回復時にヒトの筋肉において同化作用を有することが示されている。これらの作用は、ｍＴＯＲのリン酸化、ならびに７０ｋＤ  Ｓ６タンパク質キナーゼ（ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６）および真核生物性開始因子４Ｅ−結合タンパク質１の連続的活性化を介して媒介されている。Ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６は、細胞周期の進行、細胞の大きさ、および細胞の生存を調節する役割で知られている。マイトジェンの刺激に応答したＰ７０−ｋＤ  Ｓ６の活性化は、リボソームの生合成をアップレギュレートし、細胞の翻訳能を高める（Ｗ−Ｌ    Ａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３  Ａｕｇｕｓｔ；  １６３（２）：  ５９１−６０７；  Ｅ．  Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６  １３６：  ２６９Ｓ−２７３Ｓ）。真核生物の開始因子の４Ｅ結合タンパク質１は、ｍＲＮＡの５’末端へ４０Ｓリボソームサブユニットを動員する複数のサブユニット複合体の制限性の構成要素である。ｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性化、およびその後のリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化は、特定のｍＲＮＡの翻訳の亢進と関連している。
【０２０８】
１セッションの四頭筋抵抗運動の際および運動後の対象にＢＣＡＡを投与すると、ｍＴＯＲ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの増加を示し、Ｓ６のリン酸化が、運動後の回復期間で見出された。しかしながら、Ａｋｔまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）に関するこのようなＢＣＡＡの作用は認められなかった。ＢＣＡＡを摂取することなく運動すると、酵素を活性化させずにｐ７０  Ｓ６キナーゼの部分的なリン酸化がもたらされ、Ａｋｔリン酸化が減少し、およびＧＳＫ−３は変化しないままである。ＢＣＡＡの注入はまた、安静時の対象で、Ａｋｔ非依存的にｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化を増加させる。このｍＴＯＲ活性は、細胞タンパク質の代謝回転（オートファジー）を調節し、組織全体のタンパク質合成開始に対するインスリン様成長シグナルを統合する。この生物学は、骨格筋の除脂肪組織の生合成、病的状態の肥満およびインスリン抵抗性における代謝シフト、ならびに老化に直接関連している。
【０２０９】
イソロイシンの補給を用いて、運動能力および筋肉の形成を改善し、老化に伴う筋肉の喪失を予防し、肝疾患を罹患している患者を支援し、小児の身体の成長を支援し、かつ、飢えている人々へ供給する食物の栄養の質を改善することができる。さらに、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミンの前駆体として、イソロイシンは、顕著な代謝性シグナリング活性を媒介する。
【０２１０】
低イソロイシン
肥満および糖尿病の状態では、動物は、肝臓のオートファジーの低減を呈し、これによりインスリン抵抗性が増加することが示されている。オートファジーは、ＥＲおよび細胞のホメオスタシスの維持に重要であり、ストレスがかかる場合にインスリン感受性の低下を引き起こし得る。動物モデルで高脂肪食を与えることにより、ＥＲにストレスがかかり、ｍＴＯＲＣ１の過剰刺激を介して肝臓のオートファジーが減少し、糖尿病におけるインスリン感受性低下β細胞機能に向かう進行を強化する。全身性イソロイシンのレベルの低下は、ｍＴＯＲＣ１活性を低下させて、オートファジーの健常なレベルを回復させるための機会を提供する。
【０２１１】
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生合成およびタンパク質の合成に関連した下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングを顕著に誘発する（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に関して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。イソロイシンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに関して作用を有し、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物の摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪の質量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療の機会を提供する。
【０２１２】
ロイシン
ロイシンは、必須アミノ酸であり、分枝鎖アミノ酸である。ロイシンを含む分枝鎖アミノ酸は、代謝ストレスの際の骨格筋の燃料供給源として作用し、タンパク質の合成を促進し、タンパク質の異化を抑制し、糖新生の基質として作用する。ロイシンを含むＢＣＡＡは、骨格筋で異化され、Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミンの産生を刺激する。ロイシンは、細胞のｍＴＯＲシグナリングを介したタンパク質の代謝回転の調節および遺伝子発現において直接的な役割を果たし、ならびに、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを活性化するために作用する。
【０２１３】
ＢＣＡＡは、安静時のヒトの筋肉において、タンパク質合成速度を増加させ、タンパク質分解速度を減少させることによりタンパク質の代謝に関して同化作用を有することが示されている。さらに、ＢＣＡＡは、持久性運動後の回復時にヒトの筋肉で同化作用を有することが示されている。これらの影響は、ｍＴＯＲのリン酸化、ならびに７０ｋＤ  Ｓ６タンパク質キナーゼ（ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６）および真核生物性開始因子４Ｅ結合タンパク質１の連続的活性化を介して媒介される。Ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６は、細胞周期の進行、細胞の大きさ、および細胞の生存を調節する役割で知られている。マイトジェンの刺激に応答したｐ７０−ｋＤ  Ｓ６の活性化は、リボソームの生合成をアップレギュレートし、細胞の翻訳能を亢進する（Ｗ−Ｌ    Ａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３  Ａｕｇｕｓｔ；  １６３（２）：５９１−６０７；  Ｅ．  Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６  １３６：  ２６９Ｓ−２７３Ｓ）。真核生物性開始因子４Ｅ−結合タンパク質１は、ｍＲＮＡの５’末端に４０Ｓリボソームサブユニットを動員する複数のサブユニットの複合体の制限性の構成要素である。ｐ７０Ｓ  ６キナーゼの活性化、およびその後のリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化は、特定のｍＲＮＡの翻訳の亢進と関連している。
【０２１４】
１セッションの四頭筋抵抗運動の際および後にＢＣＡＡを対象に提供すると、ｍＴＯＲ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの増加を示し、Ｓ６のリン酸化は、運動後の回復期間で見出された。Ａｋｔまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）に関してＢＣＡＡのこのような作用は存在しなかった。ＢＣＡＡの摂取を用いない運動は、酵素を活性化させずにｐ７０  Ｓ６キナーゼを部分的にリン酸化し、Ａｋｔのリン酸化を減少させ、ＧＳＫ−３は変化させない。またＢＣＡＡの注入は、安静時の対象においてＡｋｔ非依存的にｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化を増加させる。さらにロイシンは、細胞特異的にｍＴＯＲ１のリン酸化を刺激するための主なシグナリング分子であると知られている。これは、細胞のタンパク質の代謝回転（オートファジー）を制御し、インスリン様成長シグナルを組織全体のタンパク質合成開始にと統合する。この生物学は、骨格筋の除脂肪組織量の生合成、病的状態の肥満およびインスリン抵抗性における代謝のシフト、ならびに老化に直接関連している。
【０２１５】
ロイシンは、β細胞、成長ホルモン、プロラクチン、グルカゴン、プロゲステロン、および胎盤性ラクトゲン由来のインスリンの全身への放出を刺激できる十分に研究された分泌促進物質である。この生物学は、消化生物学および腸に存在する栄養の吸収の両方に関連しており、ならびに内分泌ホルモンにより媒介される満腹シグナルを誘発することによってエネルギー収支に影響する。これらのホルモンの調節能は、肥満などの代謝障害におけるカロリー摂取を減少させる、またはあるいは、筋消耗、サルコペニア、およびカヘキシーにおいて食欲を誘発する、ならびに糖尿病の発症におけるインスリン感受性をシフトさせるための治療機会を提供する。
【０２１６】
ロイシンは、グルタミン酸塩と、αケトグルタル酸塩と、アンモニアとのあいだの可逆的な相互変換を触媒する酵素であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼを活性化する。哺乳動物では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、肝臓、腎臓、脳、および膵臓での活性レベルが高い。肝臓では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、門脈周囲の肝細胞での尿素合成のためのアンモニアおよびアミノ酸の適切な比率を提供し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの反応は、平衡に近い状態であると思われる。さらに、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、中心静脈周囲の肝細胞の小さい辺縁部でのグルタミン合成のためにグルタミン酸塩を産生し、これにより、アンモニアまたはアンモニアスカベンジャーのためのいずれかの供給源として作用することが可能となることが示されている。腎臓では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、アシドーシスを制御するためにグルタミン酸塩からアンモニアを産生するよう機能する（Ｃ．  Ｓｐａｎａｋｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｌａｉｔａｋｉｓ，  Ｎｅｕｒｏｔｏｘ  Ｒｅｓ．  ２０１２  Ｊａｎ；  ２１（１）：１１７−２７）。
【０２１７】
ロイシンの補給を使用して、運動能力および筋肉の形成を改善し、老化に付随する筋肉の喪失を予防し、肝疾患を罹患している患者を支援し、小児の身体の成長を支援し、および飢餓集団に提供する食物の栄養の質を改善することができる。さらに、ロイシンは、肝細胞での尿素の合成に重要な役割を果たしており、高アンモニア血漿を引き起こし得る状態を罹患する患者を処置するために投与され得る。最後に、ロイシンはアシドーシスを処置するために使用され得る。
【０２１８】
低ロイシン
肥満および糖尿病の状態では、動物は、肝臓のオートファジーの減少を示し、それによってインスリン抵抗性が増加することが示されている。オートファジーはＥＲおよび細胞のホメオスタシスの維持に重要であり、ストレスがかかると、インスリン感受性が低下し得る。動物モデルに高脂肪食を供給すると、ＥＲにストレスがかかり、ｍＴＯＲＣ１の過剰刺激を介して肝臓のオートファジーが減少し、糖尿病におけるインスリン感受性低下β細胞機能に向かう進行が強化される。ロイシンの全身性レベルを低下することは、ｍＴＯＲＣ１の活性を低下させ、健常なレベルのオートファジーを回復する機会を提供する。
【０２１９】
ｍＴＯＲは、急速に生育する癌細胞が増殖するために乗っ取ることができる中心的なシグナリング経路である。ロイシンの欠乏は、急速に生育する細胞が構成的なｍＴＯＲの活性化を維持する能力を低減させ得る。
【０２２０】
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生合成およびタンパク質の合成に関連した下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連した遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に関して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝表現型の生成能をもたらす特性、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。ロイシンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を及ぼし、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２２１】
さらに、ロイシンの欠乏は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）でのＵＣＰ１のアップレギュレーション、熱産生の直接的な測定、エネルギー消費量の増大（恐らくはＢＡＴの熱産生での増大による）、および白色脂肪組織（ＷＡＴ）の脂肪分解の刺激による脂肪の質量の対応する減少を、直接示している。ＵＣＰ１のアップレギュレーションは、食物の摂取、体重、腹部脂肪量、脂肪量の減少、および除脂肪量の維持をもたらす（Ｇｕｏ，  Ｆ．  Ｔｈｅ  ＧＣＮ２  ｅＩＦ２ａｌｐｈａ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．    Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．，  ２００７）。
【０２２２】
リジン
リジンは、適切な成長に重要であるＥＡＡであり、カルニチンの産生に重要な役割を果たす。カルニチンは、心筋におけるエネルギーの産生に重要な役割を果たす４級アミンである。カルニチンは、ミトコンドリアへと遊離脂肪酸を運搬し、その際、心臓の酸化的代謝にとって好ましい基質を増加させる。さらに、カルニチンは、心室性不整脈をもたらし得る、虚血事象の際に起こる脂肪酸の蓄積を予防する。心筋のカルニチンのレベルは、虚血事象の際に迅速に減少し、カルニチンを外部から補給すると、不足している心筋のカルニチンのレベルを補充し、心臓の代謝機能および左心式の機能を改善する。さらに、４つの試験解析から、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の後のＬ−カルニチンの補給が、プラセボと比較して、ＡＭＩ後最初の１年での左心室の拡張を有意に低減させることが証明された。これは、ＡＭＩ後の左心室の拡張の予防および心機能の保存が、心不全および死亡への進行の強力な予測因子となるため、重要である。さらに、カルニチンは、コレステロールの低下を支援し、これによりさらに心臓の健康状態を支援し、急性心筋梗塞の予防を支援する（Ｊａｍｅｓ  Ｊ．  ＤｉＮｉｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，  ２０１３；  ８８，  ５４４−５５１）。
【０２２３】
リジンの補給は、心臓の健康状態を支援するため、および虚血事象の際に心室性不整脈を予防するために有益である。さらに、リジンの補給は、心臓発作の患者が効果的に回復するのを支援し、左心室拡張を伴う患者の心臓発作の予防を支援する。同様に、リジンは、コレステロールのレベルが高い患者のコレステロールレベルを減少させるために使用できる。
【０２２４】
リジンは、身体が、カルシウムを吸収し、尿で失われるカルシウムの量を減少するのを支援するために役立つ。骨の健康状態におけるカルシウムの役割により、リジンの補給は、骨粗しょう症に関連している骨喪失の予防に有益である。さらに、Ｌ−アルギニンおよびリジンの組み合わせは、骨形成細胞をより活性にし、皮膚、腱、および軟骨を含む骨および結合組織にとって重要な物質であるコラーゲンの産生を高める。
【０２２５】
リジンの補給は、骨粗しょう症を罹患している患者、および骨粗しょう症を発症するリスクのある患者（高齢者、閉経後の女性、成長期の小児）に有益であり、コラーゲン産生に関するリジンの役割により化粧品に有益であり、かつ、運動選手の靭帯の完全性の改善に有益である。
【０２２６】
リジンの欠乏は、疲労、悪心、眩暈、食欲喪失、激越、目の充血、成長の遅延、貧血、および生殖障害を引き起こす。
【０２２７】
リジンは、定期的に摂取すると、口唇ヘルペスおよび性器ヘルペスの発生を予防かつ抑制するのを支援する。頻繁に再発するヘルペス感染症を伴う４５名の患者に３１２〜１２００ｍｇのリジンを１回または複数回に分けて毎日投与すると、感染症から回復することおよび再発が抑制されることが証明された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １９７８；１５６：２５７−２６７）。これは、リジンが抗ウイルス作用を有し、アルギニンの活性を遮断することにより作用し、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の複製を促進することによるものである。組織培養試験では、ヘルペスウイルスの複製は、アルギニン／リジン比のアルギニンが高い場合、亢進される。しかしながら、、アルギニン／リジン比のリジンが高い場合、ウイルスの複製が抑制され、ＨＳＶの細胞病原性が阻害される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １９７８；１５６：２５７−２６７）。リジンの経口投与は、ウイルス疾患発生の重症度および持続時間を減少させるよりも、発生を予防するために有効である。
【０２２８】
ＨＳＶに感染した患者のために食事にリジンを補給することは、口唇ヘルペスおよび性器疣贅の発生を抑制し、定期的に積極的に摂取する場合、発生の予防に非常に有益である。
【０２２９】
リジンは、アルギニン−ＮＯ経路を調節する。ＮＯは、正常な内皮の機能および心血管の健康（血管緊張、血行動態、血管新生を含む）にとって重要である。リジンは、Ｌ−アルギニン輸送の天然の阻害剤であり、哺乳動物の細胞において陽イオン性アミノ酸の主な運搬系である系ｙ＋を介しての取り込みに関してＬ−アルギニンと競合する。過剰な一酸化窒素は、敗血症に関連する難治性低血圧の原因となり、ＮＯ合成の重要な成分であるアルギニンを阻害することからＬ−リジンの投与を妨害する可能性がある（Ｋ．  Ｇ．  Ａｌｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  （１９９８）８１：１８８−１９２）。さらに、過剰なＮＯは、神経変性にとって重要な領域である、大脳の脈管構造、脳組織、および、神経終末からのＮＯの放出により、疾患をもたらし得る。過剰なＮＯは、片頭痛、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患をもたらす可能性のある細胞損傷をもたらす場合がある。さらに、膵臓により産生されるＮＯは、１型糖尿病で起こるようにβ細胞を損傷し得る。
【０２３０】
リジンの補給は、血管の拡張を予防することにより敗血症に関連した低血圧の予防に有用である。さらに、リジンを使用して、片頭痛を予防／処置し、かつ、ＡＤ、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の進行を予防／遅延させてもよい。
【０２３１】
低リジン
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生合成およびタンパク質の合成に関連した下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に関して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。リジンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介してＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を与え、かつ、肝臓の重量（および脂肪肝表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物の摂取を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２３２】
メチオニン
メチオニンは必須アミノ酸であり、本質的にすべての真核生物のタンパク質の合成における開始アミノ酸である。メチオニンは最も疎水性のＡＡの１つである。球状タンパク質のメチオニン残基の大部分は、疎水性コアの内部で見出すことができる。メチオニンは、しばしば膜貫通タンパク質ドメインの脂質二重層と相互作用することが見出されている。メチオニンの位置および強力な抗酸化特性により、メチオニンは、タンパク質の内在性抗酸化剤と考えられている（Ｊｏｈｎ  Ｔ．  Ｂｒｏｓｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｅ．  Ｂｒｏｓｎａｎ，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｊｕｎｅ  ２００６  ｖｏｌ．  １３６  ｎｏ．  ６  １６３６Ｓ−１６４０Ｓ）。メチオニン残基は、オキシダーゼ、オゾン、過酸化水素、スーパーオキシド、γ線照射、金属触媒型酸化、電子伝達鎖からの「漏出」、およびフラビンまたは生体異物の自己酸化による酸化に対して、高い感受性を有する。一旦酸化されると、メチオニン残基は、メチオニンスルホキシドに変換され、これはメチオニンスルホキシドレダクターゼを介して元のメチオニンに変換することができる（Ｒｏｄｎｅｙ  Ｌ．  Ｌｅｖｉｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９６  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２４；  ９３（２６）：  １５０３６−１５０４０）。抗酸化剤として、メチオニンの補給は、癌、変性疾患、心疾患、肝臓および腎臓の病態の予防を支援することができる。また、皮膚へのＵＶ線の損傷を妨害するため化粧品に使用することもできる。
【０２３３】
メチオニンは、脂向性ＡＡであり、肝臓の脂質処理を支援し、それにより、肝臓、ならびに最終的に脳、心臓、および腎臓への血流の閉塞をもたらし得る動脈での脂肪の集積の予防を支援する。さらに、肝臓での脂肪の集積は、脂肪肝として知られている病態をもたらし、最終的には肝硬変をもたらす場合がある。薬物の解毒を行っている個体にメチオニンを補給すると、毒性の副作用を有する薬物を摂取する個体と同様に、この工程を改善し得る。
【０２３４】
さらに、脂向性性ＡＡであることにより、メチオニンは、肝臓でのレシチンの産生を増加させることにより心臓の健康状態を促進させる。レシチンは、コレステロールのレベルの減少を支援することが知られている。メチオニンの補給は、肝硬変に脂肪が沈着するのを防止することができる。さらにメチオニンは、脂肪の動脈への沈着を防止し、これにより、潜在的な心筋梗塞および脳卒中を予防することにより心血管の健康を促進させることができる。さらに、コレステロールレベルの高い人のコレステロールを低くすることを支援することにより、心血管疾患のリスクを改善し得る。
【０２３５】
メチオニンは、高いレベルのメチオニンが、免疫機能の改善を支援する、タウリン、ホモシステイン、およびグルタチオンのレベルを増大させるという点で、免疫系が適切に機能することを支援する。免疫機能のための根底となる機構は、ｍＴＯＲの活性化、ＮＯおよびグルタチオニンの合成、Ｈ２Ｓシグナリング、および細胞のレドックス状態を含み得る。メチオニンは、アルギニン−ＮＯ経路を調節するタウリンの前駆体である。ＮＯは、内皮の正常な機能および心血管の健康（血管緊張、血行動態、血管新生を含む）にとって重要である。
【０２３６】
またメチオニンは、グルタチオニンの前駆体であるシステインへと変換される。グルタチオニンは、肝臓における毒素の強力な中和剤であり、毒素の損傷作用から肝臓の保護を支援する。さらに、この解毒能は、筋虚弱の低減を支援し、髪の脆弱性を予防し、これらの毒素に関連する照射に対して保護する。結果として、化学アレルギーを罹患している個体、または高レベルの大気汚染に曝露されている個体に有益である。メチオニンは、ＡＩＤＳ患者および癌患者などの免疫系の不全を有する患者に有益とすることができる。同様に、インフルエンザの季節のあいだ、特に高齢者、小児、および妊娠中の女性を含む最も感受性のあるグループに対して、有益なサプリメントとすることができる。さらに、これは、地域感染症を発症しやすい国に旅行する者に対しても使用できる。メチオニンのレベルは、ＡＩＤＳを有する患者では低いことが観察されている。この減少したメチオニンレベルは、認知症などの症状をもたらし、記憶が減退する神経系の悪化に関連している。１日あたり６グラムのメチオニンの補給により、これらの患者の記憶を改善させることができる。同様に、メチオニンは、アルツハイマー病、ＡＬＳ、ＭＳ、およびハンチントン病を含む神経系の退化を伴う疾患を有する患者にも有益とすることができる。
【０２３７】
メチオニンは、１炭素単位代謝に関与していることにより、タンパク質およびＤＮＡのメチル化にも関与しており、これは、タンパク質の遺伝子発現および生物活性の調節を支援する。関連する遺伝的障害のリスクを有する個体へのメチオニン補給は、すべての個体で適切な遺伝子制御を促進するために用いることができる。
【０２３８】
低メチオニン
メチオニンは、毒性ホモシステインの前駆体であり、ＡＤＭＡを介して体内でＤＤＡＨをダウンレギュレートすることによりＡＤＭＡを代謝し、アルギニン−ＮＯ経路に干渉することができる。ＮＯは、正常な内皮の機能および心血管の健康（血管緊張、血行動態、血管新生を含む）に重要である。
【０２３９】
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＥＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。メチオニンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を与え、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物の摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２４０】
フェニルアラニン
フェニルアラニンはＥＥＡ、ＡｕＡＡ、および脳のノルエピネフリンの合成のための前駆体であり、ならびに、別の芳香族アミノ酸でありドーパミンの合成の前駆体である、チロシンの代謝上の前駆体である。
【０２４１】
ノルエピネフリン（ＮＥ）は、補因子のアスコルビン酸塩と共にβヒドロキシラーゼによるドーパミンのβ酸化により、副腎髄質および交感神経系の節後ニューロンで合成される。ノルエピネフリンは、シナプス間隙の中に分泌されることにより作用し、シナプス間隙でアドレナリン受容体を刺激した後、周囲の細胞により分解されるかまたは取り込まれる。カテコールアミンと同様に、ノルエピネフリンは血液脳関門を通過しない。
【０２４２】
ＮＥは、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、うつ病、および低血圧に対抗するために使用することができる。ＡＤＨＤのような注意障害に関して、処方される薬物は、ＮＥおよびドーパミンのレベルの増加を支援する傾向がある。さらに、うつ病は、典型的にセロトニンおよびＮＥの再取り込みを阻害する薬物で処置することにより、脳のシナプス後細胞で利用可能なセロトニンおよびＮＥの量を増加させる。近年の研究結果から、セロトニン‐ノルエピネフリンの再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）もまた、ノルエピネフリントランスポーターが通常、ドーパミンもリサイクルすれば、ＳＮＲＩもまたドーパミン作動性神経伝達を高めることから、ドーパミンの伝達が増加し得ることが示唆されている。結果として、抗うつ剤の作用はもまた、ＮＥレベルの増加に関連しており、これは、（特に脳の前頭前皮質での）ドーパミンの同時に起こる増加が部分的に原因である場合がある。
【０２４３】
ＮＥは、重篤な低血圧症を有する患者を処置するために使用される。ＮＥは、昇圧剤であり、血管収縮を引き起こすα１およびα２アドレナリン受容体の両方に作用することにより、血圧を上げる。
【０２４４】
ＮＥの前駆体として、フェニルアラニンは、ＡＤＨＤおよびＡＤＤのような注意障害を処置するために使用することができる。さらに、フェニルアラニンは、うつ病または外傷後ストレス障害を罹患した個体を処置するために使用することができる。またフェニルアラニンは、うつ病を処置するため、またはＳＳＲＩなどの神経伝達物質調節薬剤の機能を変化させるために使用することができる。さらに、血管緊張の増加を介してフェニルアラニンが血圧を上昇させることができることから、低血圧傾向のある個体を処置するために使用してもよい。さらに、フェニルアラニンを、チロシンレベル、これによりチロシンの機能の上流での制御因子として使用してもよい。
【０２４５】
チロシンの補給は、Ｌ−ＤＯＰＡおよびドーパミンの前駆体としての役割により、パーキンソン病の処置を支援することができる。さらに、チロシンを、うつ病などの情動／精神障害を有する個体の処置、および嗜癖の処置に使用できる。さらに、チロシンは、難解かつ複合的な概念または運動を学習する際の報酬／快楽の応答を増加させることにより学習を促進することができる。
【０２４６】
ドーパミンは、モノアミンカテコールアミンである神経伝達物質であり、免疫系を制御する役割を有する。特定の免疫エフェクター細胞に存在する特異的受容体と相互作用する神経伝達物質および神経ペプチドは、疾患および他の環境ストレスに対抗して宿主におけるこれら細胞の機能に影響するように免疫系により放出される。ドーパミンの免疫調節性作用は、標的細胞に存在する５つの異なるＧタンパク質結合型受容体を介して調節されることが示されている。これら受容体には２つの幅広い分類のＧ１およびＧ２が存在しており、これらは、様々なサブタイプを包含する。Ｄ１クラスの受容体はＤ２およびＤ５サブタイプを含み、活性化すると細胞内ｃＡＭＰを増加させる。Ｄ２クラスの受容体は、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４サブタイプからなり、刺激すると細胞内ｃＡＭＰを阻害することが報告されている。ドーパミン受容体は、正常なヒト白血球で見出されている。同様に、リンパ系組織は交感神経を介したドーパミン作動性神経支配を有しており、このことから、ドーパミンが免疫系エフェクター細胞を調節することができる場合があることが示唆される（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ，  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）。
【０２４７】
ドーパミンは、休止期のＴ細胞を活性化し、刺激したＴ細胞の活性化を阻害することによりＴ細胞に影響を与える。正常な休止期の末梢ヒトＴリンパ球では、ドーパミンは、Ｄ２およびＤ３サブクラスの受容体を活性化し、次にインテグリン（α４β１およびα５β１）を活性化する。これらのインテグリンは、細胞外のマトリックス成分のフィブロネクチンに細胞を付着させるヘテロ二量体の膜貫通型糖タンパク質である。フィブロネクチンは、組織障壁および血管を超えるＴ細胞の輸送および漏出に使用される。さらに、ドーパミンはＤ３受容体を介して作用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の遊走およびホーミングを選択的に誘導する。さらに、ドーパミンは、Ｔ細胞によるサイトカインの分泌に影響を与えることによりＴ細胞に影響する。ドーパミンがＤ３およびＤ１／Ｄ５受容体を刺激する場合、ＴＮＦ−α（多面発現炎症性サイトカイン）の分泌が増加する。Ｄ２受容体が刺激される場合、ＩＬ−１０（抗炎症性サイトカイン）の分泌が誘導される。しかしながら、ドーパミンは、活性化Ｔ細胞受容体誘導細胞増殖と、ＴＣＲの活性化の開始に重要なチロシンキナーゼである、非受容体チロシンキナーゼｌｃｋおよびｆｙｎの発現のダウンレギュレーションを介するＩｌ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４などの多くのサイトカインの分泌とを阻害することができる（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）
【０２４８】
Ｂ細胞は、ドーパミンＤ２、Ｄ３、およびＤ５の受容体の発現が非常に高い。ドーパミンは、休止期および悪性のＢリンパ球の増殖の阻害能を有する。ドーパミンは、酸化ストレスを介して循環中のＢ細胞のアポトーシスを促進することにより作用する。しかしながら、このドーパミン作動性の作用は休止期リンパ球では観察されず、よってこのことから、癌の予防における役割が示唆されている（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ，    Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）。
【０２４９】
ドーパミンの前駆体としてのチロシンは、免疫応答を改善し、かつ免疫系全体の機能性を改善するように使用できる。これは、高齢者、妊娠中の女性、小児、およびＡＩＤＳ患者などの免疫機能不全を有する患者、および癌患者に利点を提供することができる。またチロシンは、教師、旅行者、および頻繁に細菌に曝露される人々にも利点を与えることができる。
【０２５０】
エピネフリンは、アドレナリンとして一般に知られており、副腎髄質により分泌されるホルモンである。エピネフリンは、心拍数、筋力、血圧、および糖の代謝の増大を引き起こす恐れまたは怒りなどの強い感情に応答して放出される。エピネフリンは、身体に困難または過激な活動の準備をさせる逃走または闘争反応の原因である。エピネフリンは、心停止の際の刺激薬、血圧を上げるためのショック時の血管収縮薬、および気管支喘息の気管支拡張薬および鎮痙薬として使用される。エピネフリンは、身体で大量に見出されるものではないが、ストレス下で組織へ血液をそらすことができるために心血管のホメオスタシスの維持に非常に重要である。エピネフリンは、筋肉の収縮に影響を与えることによりこの作用を有する。筋肉の収縮は、濃度が、細胞中の正常値の１０倍高いカルシウムイオンへのカルモジュリンの結合を介して起こる。次いでカルシウム−カルモジュリン複合体は、ミオシン軽鎖キナーゼを活性化し続けて、次いでＬＣ２をリン酸化して収縮を引き起こす。エピネフリンは、エピネフリン受容体と結合してアデニリルシクラーゼを活性化し、ＡＴＰからサイクリックＡＭＰを産生する。ｃＡＭＰは、タンパク質キナーゼを活性化して、これによりミオシン軽鎖キナーゼをリン酸化する。このリン酸化されたミオシン軽鎖キナーゼは、カルシウム−カルモジュリン複合体との親和性が低く、よって不活性である。このため、平滑筋組織は弛緩する。これは、喘息、心停止、およびアナフィラキシーショックを処置する際に非常に有益となるエピネフリンの作用である。エピネフリンの前駆体としてのチロシンは、心停止のリスクのある患者、喘息を罹患している患者、およびアナフィラキシーショックのリスクのある患者に使用できる。
【０２５１】
エピネフリンは、肝臓細胞外部の受容体に結合することによりグリコーゲンを分解する２つの主なホルモンのうちの１つである。この結合は、立体構造の変化を引き起こすことにより、Ｇタンパク質との結合を可能にし、活性となる。Ｇタンパク質結合型受容体の活性化は、分子上の立体構造の変化を引き起こし、これにアデニル酸シクラーゼが結合する。アデニル酸シクラーゼが複合体と結合すると、アデニル酸シクラーゼは、ＡＴＰをｃＡＭＰに分解し、この工程でセカンドメッセンジャータンパク質となり、タンパク質キナーゼを活性化する。活性化したタンパク質キナーゼは、グリコーゲンのグルコースへの分解を触媒する酵素であるホスホリラーゼを活性化する。エピネフリンの前駆体としてのチロシンは、運動に燃料を供給するためにグルコースを容易に利用可能にすることにより運動能力を改善するために使用することができる。
【０２５２】
メラニンは、チロシンの代謝物であり、強力な抗酸化剤である。さらに、これは、炎症性サイトカインおよびスーパーオキシドの産生の阻害に影響を与える。炎症誘発性サイトカインが過剰産生される場合、関節リウマチ、移植片対宿主病、カヘキシー、および敗血症症候群などの病態において炎症が損傷を与える作用を媒介する。メラニンは、進行中のサイトカイン合成を阻害することが見出されており、このことは炎症誘発性サイトカインを含む病態を重ねて治療するためにメラニンが有益であり得ることが強く示唆されている（Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｐｏｕｒ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００  Ｊａｎ  １０；１９９（１）：２５−３６）。
【０２５３】
チロシンは、関節リウマチ、カヘキシー、敗血症症候群、自己免疫障害に関連した炎症を伴う患者、および他の病態の炎症性の後遺症の処置に使用できる。
【０２５４】
フェニルアラニンは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩの活性、ＮＯ合成のためのスルテトラヒドロビオプテリン（ＴＨＢ）の遊離、および芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（ＡＡＡＨ）によるＡｒＡＡのヒドロキシル化をアップレギュレートする。この理由のため、ＴＨＢの細胞のレベルを上げるために高レベルのフェニルアラニンを送達すると、ＣＮＳの毛細管内皮細胞において多くの神経伝達物質の生合成が直接刺激される。ＡｒＡＡは、メラトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、およびエピネフリン（アドレナリン）を含む、モノアミン神経伝達物質の生合成の前駆体として作用する。ＮＯ合成を促進する際、フェニルアラニンは、高血圧を処置するため、血圧を低下させるために使用することができ、ダイビングの状況、または血管拡張を増大させる高地へ旅行する際に使用してもよい。
【０２５５】
低フェニルアラニン
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが知られている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。フェニルアラニンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃへの作用を有しており、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物の摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する．
【０２５６】
プロリン
シトルリンは、ＮＯＳファミリーにより触媒される反応の副産物としてグルタミンから産生される。シトルリンの栄養補助食品は、メタボリックシンドロームのリスク因子である、グルコース、ホモシステイン、および非対称性ジメチルアルギニンの血漿レベルを低下させることが知られている。Ｌ−シトルリンは、恐らくは血管緊張および内皮機能に関する作用により、筋肉からの乳酸の除去を促進させる。また近年の研究では、スイカの果汁由来のＬ−シトルリンが、運動からの回復を良好にし、翌日の痛みを少なくすることも知られている。また、遊離型でＬ−シトルリンを送達すると、スイカの果汁（高レベルのＬ−シトルリンを含む）よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への取り込みが少ないと思われる。このことから、改善された効力で、内皮膜でｅＮＯＳによってシトルリンに変換するため、筋肉組織にアルギニンを輸送することができるペプチド用量を送達する機会が示唆される。
【０２５７】
ＮＯ合成およびポリアミン（プロリンを介した）の変化は、胎盤の成長速度がピークとなる妊娠中に観察され、これは、妊娠中の胎児発達におけるアルギニンの役割を示唆するものである。
【０２５８】
セリン
セリンは非必須アミノ酸であり、３‐ホスホグリセリン酸を介して解糖から生合成される。セリンは、細菌におけるリン脂質、スフィンゴ脂質、およびシステインの生合成、ならびにトリプトファンの合成に貢献するという点で、中間代謝において重要な役割を果たし、かつグリシンの主な供給源である。身体は、恐らくは食事による摂取量を１０〜５０倍超えるグリシンを必要とする。この需要は、タンパク質、特にコラーゲンの合成のためだけでなく、グリシンが、５つの主な代謝生合成経路：クレアチン、ポルフィリン、プリン、胆汁酸、およびグルタチオンの前駆体であることによる。さらに、グリシン産生におけるセリンの役割により、セリンは、プリンおよび２’−デオキシチミジン  ５’−モノホスフェートの生合成、ならびにホモシステインのメチオニンへの再メチル化に使用される葉酸塩結合１炭素単位の主な供与体でもある。セリン由来のあらゆるグリシン分子に関して、１炭素単位が形成されることに留意することが重要である（Ｃｏｏｋ，  Ｒ．  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ  ｓｈｕｆｆｌｅ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１’２；  Ａｍ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ；    ２０００）。
【０２５９】
１炭素代謝では、生合成のための１炭素単位は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）ポリグルタミン酸塩と呼ばれる補因子ファミリーにより行われ、化学的に活性化される。ＴＨＦ−媒介型の１炭素代謝は、細胞質、ミトコンドリア、および核で区分けされた相互依存的な生合成経路の代謝系である。細胞質では、１炭素代謝は、プリンおよびチミジル酸の合成、ならびにホモシステインのメチオニンへの再メチル化に使用される（ホモシステインの過剰量は身体にとって有害である場合がある）。ミトコンドリアでは、１炭素代謝は、ホルミル化メチオニル‐ｔＲＮＡの合成、コリン、プリン、およびヒスチジンの異化、ならびにセリンおよびグリシンの相互変換に使用される。さらに、ミトコンドリアは、細胞質代謝の１炭素単位の主な供給源である。葉酸塩媒介型１炭素代謝の障害は、多くの病態および発生異常に関連している（Ｊ．  Ｔ．  Ｆｏｘ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｊ．  Ｓｔｏｖｅｒ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １，  Ｆｏｌａｔｅ‐Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｎｅ‐Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ｉｎ：  Ｇｅｒａｌｄ  Ｌｉｔｗａｃｋ，  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ），  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ＆  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００８，  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９，  Ｐａｇｅｓ  １−４４）。
【０２６０】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）は、葉酸塩およびピリドキサール５‐リン酸塩の両方に依存性である反応でのセリンおよびグリシンの自由な可逆的相互変換を触媒する。セリンのグリシンへの変換は、Ｃ−３セリンの除去および５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸の形成を伴い、これは葉酸塩依存性１炭素代謝に利用でき、または１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ｆｏｒｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を介して二酸化炭素へと酸化できる（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ  Ｃｏｏｋ，  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０００  ｖｏｌ．  ７２  ｎｏ．  ６  １４１９−１４２０）。
【０２６１】
セリンは、システインの前駆体である。システインは、それ自体がメチオニンの代謝物から合成されるホモシステインから合成される。セリンは、ホモシステインと縮合してシスタチオニンを形成することによりシステインの合成に関与する。次いで、シスタチオニンは、脱アミノ化および加水分解され、システインおよびαケト酪酸塩を形成する。システインの硫黄はホモシステイン由来であるが、残りの分子は、最初のセリン残基に由来する。システインの生合成は、植物および原核生物の異なる機構を介して起こる。システインは、タンパク質のフォールディングに重要な役割を果たすため重要なアミノ酸である。システイン残基のあいだに形成されるジスルフィド結合は、タンパク質の３次および４次構造の安定化を支援し、これらのジスルフィド結合は、タンパク質が、細胞内部で見いだされる条件より酸性の条件に曝露される、分泌型タンパク質では最も一般的である。ホモシステインには利点があるにも関わらず、レベルが高いと、心血管疾患を発症するリスク因子となる可能性がある。ホモシステインの増加は、シスタチオニンβシンターゼの遺伝的欠損により引き起こされることがあり、過剰なメチオニンの摂取によっても起こり得る。食事におけるメチオニン摂取の制御ならびに葉酸およびビタミンＢ１２の補給は、ホモシステインのレベルを低くするために使用されている。同様に、ホモシステインのシステインへの変換を支援するためにセリンレベルを上げることが有益であり得る。
【０２６２】
Ｎ−メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）は、脳における最も基本的な神経伝達物質のうちの１つである。これは、グルタミン酸塩受容体であり、シナプス可塑性および記憶機能の制御に重要な分子デバイスである。この受容体はグルタミン酸塩のイオンチャネル型受容体であり、グルタミン酸塩に対する高い親和性、高いコンダクタンス単位、高いカルシウム透過性、およびマグネシウムイオンによる電圧依存性の阻害を特徴とする。ＮＭＤＡ受容体を開口させるために、受容体をグルタミン酸塩およびグリシンまたはＤ―セリンに結合させる。Ｄ−セリンは神経伝達物質であり、かつＬ−セリンからセリンラセマーゼにより脳で生合成されるグリオトランスミッターである。これは、ＮＭＤＡ受容体結合部位のグリシンに対する強力なまたは効能の高いアゴニストである（Ｊｅａｎ−Ｐｉｅｒｒｅ  Ｍｏｔｈｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２０００，  ９７  （９）  ４９２６−４９３１；  Ｚｉｔｏ  Ｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｕｓｓ  Ｖ．  （２００９）  ＮＭＤＡ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．  Ｉｎ：  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｓｑｕｉｒｅ  ＬＲ，  ｅｄ），  ｖｏｌｕｍｅ  ６，  ｐｐ．  １１５７−１１６４．  Ｏｘｆｏｒｄ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０２６３】
セリンは、学習およびシナプスの可塑性に重要な役割を果たし、結果として、セリンの補給は、高齢者、成長期の幼児、学齢期の小児、および学習困難を有する人に有用であり得る。さらに、楽器などの新規の作業を学習しようとしている対象、または新規の運動および動きを改善または学習しようとしている運動選手／ダンサーに投与することもできる。さらに、システインの前駆体としての役割により、セリンは、システインの作用の上流の制御因子として提供されてもよい。グリシンの合成の前駆体として、セリンは、コラーゲン合成におけるその役割のため、老化に対抗しかつ適切な生育を促進するように化粧品に使用してもよい。さらにセリンは、クレアチン生合成経路での役割のために、運動能力を改善するために使用することができる。セリンはさらに、グルタチオニン代謝経路での役割のため、解毒および免疫の健康に非常に有用であり得る。
【０２６４】
スレオニン
スレオニンはＥＡＡであり、トランスアミナーゼおよびｄ−ＡＡオキシダーゼを介してＬ−アイソマーに変換されない数少ないＡＡのうちの１つである。スレオニンは、腸の完全性および機能を維持するために使用されるムチンタンパク質の合成に使用される。粘液は、水に懸濁したムチンおよび無機塩から構成されており、胃酸および喫煙などの侵害性の物質との接触に対する拡散障壁として作用する。また粘液は、せん断応力を最小限にする潤滑剤としても作用する（Ｇ．  Ｋ．  Ｌａｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９２：Ｇ１２９３−Ｇ１３０１，  ２００７）。
【０２６５】
食事性スレオニンの９０％は、粘液合成のため腸で使用される。ムチンは絶えず合成されており、腸のタンパク質分解に非常に抵抗性であり、よって、非常に簡単に再利用されるわけではない。このように、スレオニンの実質的かつ一定した供給は、腸の機能および構造を効率的に維持するために使用される。結果として、腸の癌、潰瘍などを生じ得る粘液の産生の減少を予防するために、食事はスレオニンを多く含むことが重要である（Ｇ．  Ｋ．  Ｌａｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９２：Ｇ１２９３−Ｇ１３０１，  ２００７；  Ａ．  Ｈａｍａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２１，  Ｉｓｓｕｅ  １０，  Ｐａｇｅｓ  ９１４−９２１）。腸の完全性および構造に対する粘液の重要性により、スレオニンの補給は、癌、潰瘍、感染症、およびびらんを含む腸障害の予防に有用とすることができる。
【０２６６】
スレオニンは、血液中でＢリンパ球により分泌される免疫グロブリンの主成分であるため、液性免疫で鍵となる役割を果たす。免疫グロブリンは、いったん放出されると、感染部位に達し、その抗原を認識し、結合し、不活性化させる。免疫グロブリンのスレオニン含有量が高いため、スレオニンの欠乏は、免疫グロブリンの産生に負の影響を与えることにより、免疫応答が減少し得る。スレオニンの補給は免疫応答でのその役割にとって必須であり、白血病患者、ＡＩＤＳ患者、および免疫不全を有する個体を支援することができる。さらにこれは、高齢者および小児などのインフルエンザ流行期のあいだに感染症に罹りやすい人、ならびに１年を通して免疫応答を強化する必要がある人を支援することができる。
【０２６７】
低スレオニン
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。スレオニンを欠いたバランスの取れていない食事は、スレオニンを欠く１〜５．４％のアミノ酸混合物を補給した基本カゼイン食を与えたラットのＧＣＮ２をシグナリングすることが示されている。スレオニンの欠乏は、ＧＣＮ２に対する作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を与え、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、食物摂取の生理学的な測定値が減少する。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２６８】
トリプトファン
トリプトファンは、免疫機能において重要な役割を果たすＥＡＡである。たとえば、トリプトファンの濃度は、慢性的な肺の炎症により進行的に減少する。このことから、インドールアミン２，３‐ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を介したトリプトファンの異化が、マクロファージおよびリンパ球の機能にとって非常に重要であると思われることが示唆される。よって、アントラニル酸（ＡＮＳ）は、炎症誘発性Ｔヘルパー１サイトカインの産生を阻害し、かつ、自己免疫性の神経炎症を予防する。トリプトファンは、関節炎および喘息または他の自己免疫疾患を含む特定の疾患の炎症作用を処置するために使用することができる。
【０２６９】
またトリプトファンは、食欲、睡眠に影響を与え、かつうつ病の発症に広く関与している神経伝達物質のセロトニン（５‐ＨＴ）の合成の前駆体でもある。うつ病が回復した患者での５‐ＨＴ活性の異常（ＳＳＲＩまたは他の神経伝達物質の再取り込阻害剤に関して）は、血流中の低レベルトリプトファンに対する短期的な感受性をもたらす。遊離のトリプトファンを経口摂取により、５‐ＨＴの産生は２倍増加するさせる場合があり、このことから、うつ病へのトリプトファンの投与への役割が示唆される。さらにトリプトファンは、患者の転帰の改善のために５‐ＨＴの利用に明らかに依存することにより、ＳＳＲＩの作用を増強することができる。
【０２７０】
さらにトリプトファンは、体重の減少／維持を支援するのに使用することができ、これは、うつ病またはＰＭＳの作用のような気分障害を罹患する患者に加え、旅行および時差ボケからの回復時の睡眠障害を罹患する患者に利益を与えることができる。
【０２７１】
低トリプトファン
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。トリプトファンの欠乏は、ＧＣＮ２に対するその作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに影響を与え、かつ、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２７２】
チロシン
チロシンは、フェニルアラニンから合成される非必須アミノ酸である。チロシンは、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびドーパミンを含む多くの重要な神経伝達物質の前駆体として使用される。チロシンは、メラニンの産生を支援し、かつ、副腎、甲状腺、および脳下垂体などの、ホルモンを作製し調節する臓器を支援する。さらにチロシンは、身体のほぼすべてのタンパク質の構造に関わっている。
【０２７３】
チロシンヒドロキシラーゼは、補因子としてテトラヒドロプテリジンを使用して、またはチロシナーゼにより、Ｌ−チロシンをレボドパへと変換する。チロシナーゼにより媒介される変換は、レボドパをドーパキノンへと特異的に酸化し、さらにレボドパはＤＯＰＡデカルボキシラーゼによりドーパミンへと脱炭酸される。ドーパミンは、非常に重要なホルモンかつ神経伝達物質であり、精神および身体の健康の両方に重要な役割を果たしている。ドーパミンは、脳の報酬系および快楽の中心の制御を支援し、動きおよび情動の応答の調節を支援し、かつ、人に報酬を認識させ、その報酬に向けて行動をとらせることができる。ドーパミンを含むニューロンは、中脳の黒質と呼ばれる領域に集まっている。パーキンソン病を罹患している患者では、この領域でドーパミンを伝達するニューロンが死滅しており、身体の動きを制御することができなくなっている。パーキンソン病の症状を軽減するために、ドーパミンへと変換することができるＬ−ドーパが患者に投与されている。
【０２７４】
チロシンの補給は、Ｌ−ＤＯＰＡおよびドーパミンの前駆体としての役割によりパーキンソン病の処置を支援することができる。さらにこれは、うつ病のような情動／精神障害を有する患者の処置、および嗜癖の処置に使用できる。さらにこれは、難解なまたは複合的な概念または動きを学習する際の報酬／快楽の応答を増大させることにより学習を促進させることができる。
【０２７５】
ドーパミンは、免疫系において制御的役割を果たす、モノアミンのカテコールアミン神経伝達物質である。特定の免疫エフェクター細胞に存在する特異的な受容体と相互作用する神経伝達物質および神経ペプチドは、免疫系により放出されて、疾患および他の環境ストレスに対抗するように宿主中のこれら細胞の機能に影響を与える。ドーパミンの免疫調節性作用は、標的細胞に存在する５つの異なるＧタンパク質結合型受容体を介して調節されることが示されている。これらの受容体には、様々なサブタイプを包含する２つの広いクラス：Ｇ１およびＧ２が存在する。Ｄ１クラスの受容体は、Ｄ２およびＤ５サブタイプを含み、活性化すると細胞内のｃＡＭＰを増加させる。Ｄ２クラスの受容体は、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４サブタイプからなり、刺激すると細胞内ｃＡＭＰを阻害することが報告されている。ドーパミン受容体は、正常なヒトの白血球で見出されている。同様に、リンパ系組織は、交換神経を介してドーパミン作動性神経支配を有しており、このことから、ドーパミンは免疫系のエフェクター細胞を調節することが可能であり得ることが示唆されている（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ，Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）。
【０２７６】
ドーパミンは、休止期Ｔ細胞を活性化し、かつ刺激されたＴ細胞の活性化を阻害することによりＴ細胞に影響を与える。正常な休止期末梢性ヒトＴリンパ球では、ドーパミンは、Ｄ２およびＤ３サブクラスの受容体を活性化し、次にインテグリン（α４β１およびα５β１）を活性化する。これらのインテグリンは、細胞外マトリックス構成成分のフィブロネクチンに細胞を付着させるヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質である。フィブロネクチンは、組織の障壁および血管を通したＴ細胞の輸送および血管外漏出に使用される。さらに、ドーパミンは、Ｄ３受容体を介して作用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の遊走およびホーミングを選択的に誘導する。さらに、ドーパミンは、Ｔ細胞によるサイトカインの分泌に影響することによりＴ細胞に影響する。ドーパミンは、Ｄ３およびＤ１／Ｄ５受容体を刺激する場合、ＴＮＦ−α（多面発現性炎症性サイトカイン）の分泌が増加する。Ｄ２受容体が刺激される場合、ＩＬ−１０（抗炎症性サイトカイン）の分泌が誘導される。しかしながらドーパミンは、活性化Ｔ細胞受容体誘導型の細胞増殖と、ＴＣＲの活性化の開始に重要なチロシンキナーゼである非受容体チロシンキナーゼｌｃｋおよびｆｙｎの発現のダウンレギュレーションを介するＩｌ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−４などの多くのサイトカインの分泌とを阻害する（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）。
【０２７７】
Ｂ細胞は、ドーパミンＤ２、Ｄ３、およびＤ５受容体の非常に高い発現を有する。ドーパミンは、休止期および悪性のＢリンパ球の増殖の阻害能を有する。ドーパミンは、酸化ストレスを介して循環中のＢ細胞においてアポトーシスを促進することにより作用する。しかしながら、このドーパミン作動神経の作用は、休止期リンパ球では観察されず、よって、癌の予防における役割が示唆されている（Ｂａｓｕ，  Ｓｕｊｉｔ  ＆  Ｓａｒｋａｒ，  Ｃｈａｎｄｒａｎｉ，    Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＳｃｉＴｏｐｉｃｓ  ２０１０）。
【０２７８】
ドーパミンの前駆体としてのチロシンを使用して、免疫応答を改善でき、全体の免疫系の機能性を改善できる。チロシンは、高齢者、妊娠中の女性、小児、ならびにＡＩＤＳ患者および癌患者のような免疫機能障害を有する患者に利益を提供できる。またチロシンは、教師、旅行者、および細菌に頻繁に曝露される個体に利益を与えることができる。
【０２７９】
ＮＥは、補因子のアスコルビン酸塩に加えて、βヒドロキシラーゼによるドーパミンのβ酸化により、副腎髄質および交感神経系の節後ニューロンで合成されている。これは、シナプス間隙に分泌されることにより作用し、シナプス間隙でアドレナリン受容体を刺激し、次いで、周辺細胞により分解されるかまたは取り込まれる。カテコールアミンと同様に、ＮＥは、血液脳関門を通過しない。
【０２８０】
ＮＥは、ＡＤＨＤ、うつ病、および低血圧に対抗するために使用することができる。ＡＤＨＤのような注意障害の観点から、処方される薬物は、ＮＥおよびドーパミンのレベルを増加させる傾向がある。さらに、うつ病は、典型的に、セロトニンおよびＮＥの再取り込みを阻害する薬物で処置されることにより、脳のシナプス後細胞で利用可能なセロトニンおよびＮＥの量を増加させる。近年の研究結果から、ノルエピネフリントランスポーターが通常、ドーパミンもリサイクルすれば、ＳＮＲＩもまたドーパミン作動性神経伝達を高めるため、ＳＮＲＩもドーパミン伝達を増加させ得ることが示唆されている。結果として、抗うつ剤の作用もまた、ＮＥレベルの増加に関連しており、これは、（特に脳の前頭前皮質での）ドーパミンの増加が同時に起こることが部分的に原因である場合がある。
【０２８１】
ＮＥは、重篤な低血圧の患者を処置するために使用される。ＮＥは昇圧剤であり、α１およびα２アドレナリン受容体の両方に作用して血管収縮を引き起こすことにより、血圧を上げる。
【０２８２】
ＮＥの前駆体として、チロシンは、ＡＤＨＤおよびＡＤＤのような注意障害を処置するために使用することができる。さらに、チロシンは、うつ病、外傷後ストレス障害を罹患している患者および急激に血圧が低下した患者を処置するために使用することができる。
【０２８３】
エピネフリンは、アドレナリンとして一般に知られており、副腎髄質により分泌されるホルモンである。エピネフリンは、恐れまたは怒りなどの強力な感情に応答して放出され、心拍数、筋力、血圧、および糖代謝の増加を引き起こす。これは、身体に困難なまたは過剰な活動の準備をさせる逃走または闘争の原因となる。エピネフリンは、心停止の際の刺激薬として、血圧を上げるためにショック時の血管収縮薬として、気管支喘息の気管支拡張薬および鎮痙薬として使用される。エピネフリンは、身体で大量に見出されているわけではないが、ストレス下で組織に血液をそらせることができることから、心血管のホメオスタシスの維持に非常に重要である。エピネフリンは、筋肉の収縮に影響を与えることによりこの作用を有する。筋肉の収縮は、濃度が、細胞中の正常値より１０倍高いカルシウムイオンへのカルモジュリンの結合を介して起こる。次いで、カルシウム−カルモジュリン複合体は、ミオシン軽鎖キナーゼを活性化し続けて、次いで、収縮を引き起こすＬＣ２をリン酸化する。エピネフリンは、エピネフリン受容体と結合して、アデニルシクラーゼを活性化し、ＡＴＰからサイクリックＡＭＰを産生する。ｃＡＭＰは、タンパク質キナーゼを活性化して、これによりミオシン軽鎖キナーゼをリン酸化する。リン酸化されたミオシン軽鎖キナーゼは、カルシウム−カルモジュリン複合体に対して低い親和性を有し、よって不活性となる。このように平滑筋組織は弛緩する。このエピネフリンの作用は、喘息、心停止、およびアナフィラキシーショックを処置する際に非常に有用となる。エピネフリンの前駆体としてチロシンは、心停止のリスクのある患者、喘息を罹患している患者、およびアナフィラキシーショックのリスクのある患者に使用できる。
【０２８４】
エピネフリンは、肝細胞の外部の受容体に結合することによりグリコーゲンを分解する２つの主なホルモンのうちの１つである。この結合は、立体構造の変化を引き起こすことにより、Ｇタンパク質との結合を可能にし、活性となる。Ｇタンパク質結合型受容体の活性化は、分子上の立体構造の変化を引き起こし、これにアデニル酸シクラーゼを結合させる。アデニル酸シクラーゼが複合体と結合すると、アデニル酸シクラーゼは、ＡＴＰをｃＡＭＰに分解し、この工程でセカンドメッセンジャータンパク質となり、タンパク質キナーゼを活性化する。活性化したタンパク質キナーゼは、グリコーゲンのグルコースへの分解を触媒する酵素であるホスホリラーゼを活性化する。エピネフリンの前駆体としてのチロシンは、運動に燃料を提供するためにグルコースを容易に利用可能にことにより運動能力を改善するために使用することができる。
【０２８５】
メラニンは、チロシンの代謝物であり、強力な抗酸化剤である。さらに、これは、炎症性サイトカインおよびスーパーオキシドの産生の阻害に影響する。炎症誘発性サイトカインが過剰産生される場合、関節リウマチ、移植片対宿主病、カヘキシー、および敗血症症候群などの病態において炎症が損傷を与える作用を媒介する。メラニンは、進行中のサイトカイン合成を阻害することが見出されており、これにより炎症誘発性サイトカインを含む病態を重ねて治療するためにメラニンが有用であり得ることが強く示唆されている（Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｐｏｕｒ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００  Ｊａｎ  １０；１９９（１）：２５−３６）。
【０２８６】
チロシンは、関節リウマチ、カヘキシー、敗血症症候群、自己免疫障害に関連する炎症を伴う患者、および他の病態の炎症性の後遺症の処置に使用できる。
【０２８７】
バリン
バリンはＥＡＡであり、ＢＣＡＡでもある。バリンを含むＢＣＡＡは、タンパク質合成を促進し、タンパク質の異化を抑制し、かつ糖新生のための基質として作用することにより、代謝性ストレスのあいだ骨格筋の燃料供給源として作用する。バリンを含むＢＣＡＡは、動物組織のグルタミン合成の基質であり、グルタミンが、動物のＢＣＡＡの同化作用の媒介の際に役割を果たし得ることが示されている。このような作用は、授乳中の乳腺が動脈血から採取したものよりも多くのグルタミンを産生するため、授乳中の乳腺に関して重要である可能性がある。胎盤でのＢＣＡＡの異化によって、グルタミン合成およびその胎児血液循環への放出が起こり、これは胎児の血中のグルタミンの主な供給源である。このことから、食事にバリンおよび他のＢＣＡＡ、またはその組み合わせを補給することは、哺乳動物の胎児の成長を増大させ得ることが示唆されている。さらに、バリンは、アラニンの合成に直接的な役割を果たしており、よってアラニンに関する制御機能を有している。
【０２８８】
ＢＣＡＡは、安静時のヒト筋肉でのタンパク質合成速度を増加させ、かつタンパク質分解速度を減少させることによりタンパク質の代謝に関する同化作用を有していることが示されている。さらに、ＢＣＡＡは、持久性運動後回復の際にヒトの筋肉で同化作用を有することが示されている。これらの作用は、ｍＴＯＲのリン酸化、およびその後の７０ｋＤＳ６タンパク質キナーゼ（ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６）および真核生物性開始因子４Ｅ結合タンパク質１の活性化を介して媒介される。Ｐ７０−ｋＤ  Ｓ６は、細胞周期の進行、細胞の大きさ、および細胞の生存を調節する役割があると知られている。マイトジェンの刺激に応答したＰ７０−ｋＤ  Ｓ６の活性化は、リボソーム生合成をアップレギュレートし、細胞の翻訳能力を高める（Ｗ−Ｌ    Ａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３  Ａｕｇｕｓｔ；  １６３（２）：  ５９１−６０７；  Ｅ．  Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６  １３６：  ２６９Ｓ−２７３Ｓ）。真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１は、ｍＲＮＡの５’末端に４０Ｓ  リボソームサブユニットを動員する複数のサブユニットの複合体の制限性の構成成分である。ｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性化はおよびその後のリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化は、特定のｍＲＮＡの翻訳の亢進と関連している。
【０２８９】
１セッションの四頭筋抵抗運動の際および運動後の対象にＢＣＡＡを投与すると、ｍＴＯＲ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼの増加を示し、Ｓ６のリン酸化が、運動後の回復期間で見出された。しかしながら、ＢＣＡＡは、Ａｋｔまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）に関しては、そのような作用を示さなかった。ＢＣＡＡを摂取することなく運動を行った場合、酵素を活性化させることなくｐ７０Ｓ６キナーゼの部分的なリン酸化がもたらされ、ＡＫＴのリン酸化が減少するが、ＧＳＫ−３に変化はなかった。ＢＣＡＡの注入もまた、安静時の対象においてＡｋｔ非依存的にｐ７０  Ｓ６キナーゼリン酸化を増加させる。このｍＴＯＲ活性は、細胞のタンパク質代謝回転（オートファジー）を調節し、組織全体のタンパク質合成開始に対するインスリン様成長シグナルを統合する。この生物学は、骨格筋の除脂肪組織の生合成、病的状態の肥満およびインスリン抵抗性における代謝のシフト、インスリン抵抗性、およびに老化と直接関連している。
【０２９０】
バリンは、身体における筋肉の代謝、組織の修復、および適切な窒素バランスの維持において鍵となる役割を果たす。３つのＢＣＡＡのうちの１つとして、バリンは、筋肉組織によるエネルギー供給源として利用することができる。バリンは、グルコース生成ＡＡであり、よってグルコースを提供する。バリンは、肝臓疾患および胆嚢疾患の処置に有用であり得る。さらに、バリンは、薬物嗜癖により引き起こされる重篤な型のＡＡ欠乏症の矯正に有用であり得る。さらにバリンは、精神的な活力、筋肉の協調、および穏やかな感情を促進することが見いだされている。また、バリンは、高地での筋肉の喪失を予防するために使用されてもよい。
【０２９１】
バリンの補給は、運動能力および筋肉の形成を改善し、薬物嗜癖のリハビリを支援し、高齢者および成長期の小児の精神的な活力を高め、老化に付随する筋肉の喪失を予防し、肝疾患を罹患する患者を支援し、成長する小児の身体を支援し、胆嚢疾患および肝臓疾患の治療として働き、哺乳動物の授乳を増加させ、哺乳動物の胎児の成長を増大させ、かつ、飢餓集団へ供給する食物の栄養の質を高めるために使用することができる。
【０２９２】
低バリン
肥満および糖尿病の状態では、動物は、肝臓のオートファジーの低下を示すことにより、インスリン抵抗性の増大がもたらされることが示されている。オートファジーは、ＥＲおよび細胞のホメオスタシスの維持に重要であり、ストレスがかかると、インスリン感受性が低下し得る。動物モデルに高脂肪食を供給するとＥＲにストレスがかかり、ｍＴＯＲＣ１の過剰刺激を介して肝臓のオートファジーが減少し、糖尿病におけるインスリン感受性障害β細胞機能に向かう進行が強化される。全身性のバリンのレベルの低下は、ｍＴＯＲＣ１の活性を低下させ、かつ健康なレベルのオートファジーを回復するための機会を提供する。
【０２９３】
非荷電のｔＲＮＡが、どのようにＧＣＮ２をアロステリックに活性化し、真核生物の多くの生合成経路と共に、脂質生成およびタンパク質の合成に関連する下流の転写因子（以下に記載のＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、およびＧＣＮ４ｐ）のリン酸化をもたらすかに関する機構は理解されている。ＥＡＡを欠いている食事は、食事の導入から数分以内にこのシグナリングの著しい引き金となる（Ｈａｏ  ｅｔ．  Ａｌ．，  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５）。ＳＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナリングは、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより、脂質貯蔵物の動員に対して劇的な効果を有することがｉｎ  ｖｉｖｏで示されている。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓の脂質合成、および脂肪肝の表現型の生成能、ならびに内臓脂肪量の増加に対して特異的に作用することが知られている（Ｋｎｅｂｅｌ，  Ｂ．  ｅｔ．  Ａｌ．    Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｆａｔ  Ｍａｓｓ．    ＰＬｏＳ，  ２０１２）。バリンの欠乏は、ＧＣＮ２に対する作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃに対して作用を有し、肝臓の重量（および脂肪肝の表現型）、脂肪組織の重量、コレステロール／トリグリセリドの含有量、および食物摂取の生理学的な測定値を減少させる。除脂肪量を維持しながら脂肪量を減少させることは、肥満、糖尿病、および心血管の健康などの分野に治療機会を提供する。
【０２９４】
アミノ酸薬理学のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの解析
本明細書中に提供するように、アミノ酸は、新規タンパク質の合成に必要な基質として挙動し、同様にシグナリング分子としても作用する。所定のアミノ酸の薬理学的特性の解析は、利用する細胞株およびモデルシステムに依存している。たとえば、アミノ酸のロイシンは、ラパマイシン複合体Ｉの哺乳動物標的および骨格筋細胞の同化に関与する下流の標的のリン酸化を増加させることが示されている（Ｇｒａｎ  Ｐ  ＆  Ｄ  Ｃａｍｅｒｏｎ−Ｓｍｉｔｈ．  ２０１１．  Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｏｎ  ｍＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｔｕｂｅｓ．  ＢＭＣ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１：１０）。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノ酸薬理学アッセイは、特定の種類の癌の栄養要求性を明らかにすることができる。メチオニンに対する栄養要求性が、複数の不死化癌細胞株で報告されている（Ｃａｖｕｏｔｏ  Ｐ  ＆  ＭＦ  Ｆｅｎｅｃｈ．  ２０１２．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｌｉｆｅ−ｓｐａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．  ３８：  ７２６−７３６）。
【０２９５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイは、関連する細胞株を同定した後の独立変数または操作変数としてのアミノ酸、タンパク質消化物、またはジおよびトリペプチドを利用して設計され得る。適切な細胞株は、細胞工程のモデルとしてその関連性に基づき選択される。たとえばＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７７２）は、筋線維へと分化し、かつ骨格筋繊維の分化および発達のモデルとして使用される、マウスの筋芽細胞細胞株である。細胞を、必要な増殖因子ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された最大１０％のウシ胎児血清を補充した完全培地で維持する。接着細胞株は、濾過した気体交換用のフェノール性キャップを備えたＴ７５フラスコ中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２の加湿環境でインキュベートする。表ＡＡは、アミノ酸薬理学のアッセイに使用される細胞株を列挙する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイでは、細胞を、Ｔ７５フラスコ、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートに、経験的に決定される適切な細胞密度で播種する。インキュベーションの後、完全増殖培地を、試験物質を含んでいない培地と交換する。培地を枯渇させた後、試験物質を適切な培地に添加する。処置期間の後、関連する従属変数を測定する。
【表３】
2016537402.tif 000004
【０２９６】
たとえば、Ｗｕ，  Ｇ．    Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ：  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．    Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３７（１）：１−１７  （２００９）；  Ｗｕ，  Ｇ．    Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈ．    Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４５（３）：４０７−１１  （２０１３）；  Ｓｃｈｗｏｒｅｒ，  Ｃ．    Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ：  Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．    ＰＮＡＳ  ７６（７）：３１６９−７３  （１９７９）；  Ｃｏｄｏｎｇｏ，  Ｐ．    Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：  Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．    Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ    １１（６）：４４９−５１  （２０１０）；  Ｌｅｏｎｇ，  Ｈ  ｅｔ．  ａｌ．    Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．    Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３：３７  （２００６）；  Ｈａｒｂｒｅｃｈｔ，  Ｂ．Ｇ．    Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．    Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２２５（１）：  ７６−８７  （１９９７）；  Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ  ｊｕｉｃｅ：    ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｎｋ  ｆｏｒ  ｓｏｒｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｌｉｅｆ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．    Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ６１（３１）：７５２２−８  （２０１３）を参照されたい。
【０２９７】
分泌型栄養性ポリペプチド
別の態様では、食用に適した種のポリペプチドのアミノ酸配列を含む栄養性ポリペプチドであって、単細胞生物から分泌、かつ単細胞生物から精製されるよう改変されている、栄養性ポリペプチドを提供する。このような栄養性ポリペプチドは、宿主細胞に対して内在性または外来性であり得て、ポリペプチドまたは宿主細胞のいずれか、または両方で天然に分泌することができ、栄養性ポリペプチドが分泌されるように改変される。
【０２９８】
栄養性ポリペプチドの有益な特性として、宿主細胞での発現および分泌能、幅広い範囲の溶媒での溶解性、および意図する対象により消費される場合の栄養上の利点、アレルゲン性または非アレルゲン性の低下、毒性の欠如、および消化性が挙げられる。このような特性は、意図する消費者および栄養性ポリペプチドの消費理由（たとえば全身健康、筋肉の同化、免疫の健康、または疾患、障害、もしくは病態の処置もしくは予防のため）に少なくとも部分的に応じて重み付けすることができる。１つまたは複数の栄養上の基準は、たとえば、一次配列に基いてすべての関連するアミノ酸の質量分画を計算することにより満たされる。
【０２９９】
非限定的な例として、本発明のポリペプチドを表１に提供する。予測されるリーダーカラムは、予測されるリーダーの配列指数を示す（リーダーが存在する場合）。フラグメントの指数カラムはフラグメント配列の配列指数を示す。ＤＢＩＤカラムは、２０１４年９月２４日現在で入手可能な各配列のＵｎｉＰｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号のいずれかを列挙し、これはそれぞれ、参照により本明細書中に援用される。数字のみを含むＤＢＩＤは、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースに由来しており、アルファベットと数字が混在したＤＢＩＤは、ＵｎｉＰｒｏｔのデータベースに由来する。
【０３００】
核酸
本明細書中、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸も提供する。一部の実施形態では、核酸は単離されている。一部の実施形態では、核酸は精製されている。
【０３０１】
核酸の一部の実施形態では、核酸は、本明細書中に開示される第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。核酸の一部の実施形態では、核酸は、本明細書中に開示される第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列からなる。核酸の一部の実施形態では、核酸は、本明細書中に開示されるタンパク質をコードする核酸配列を含む。核酸の一部の実施形態では、核酸は、本明細書中に開示されるタンパク質をコードする核酸配列からなる。核酸の一部の実施形態では、第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列は、少なくとも１つの発現制御配列に機能的に連結される。たとえば、核酸の一部の実施形態では、第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列は、本明細書中に記載されるプロモーターとなどのプロモーターに機能的に連結される。
【０３０２】
したがって、一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、それ自体がポリペプチドまたはタンパク質であるポリペプチドまたはタンパク質をコードする。このような核酸分子は、「核酸」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、核酸は、それ自体が、a)少なくとも２４％の、総アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の比率、ｂ）少なくとも１１％の、総アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の比率、およびｃ）少なくとも４９％の、総アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の比率のうち、少なくとも１つを含むポリペプチドまたはタンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも３０個のヌクレオチド、少なくとも４０個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも７０個のヌクレオチド、少なくとも８０個のヌクレオチド、少なくとも９０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、少なくとも４００個のヌクレオチド、少なくとも５００個のヌクレオチド、少なくとも６００個のヌクレオチド、少なくとも７００個のヌクレオチド、少なくとも８００個のヌクレオチド、少なくとも９００個のヌクレオチド、少なくとも１，０００個のヌクレオチドを含む。一部個の実施形態では、栄養性核酸は、１０〜１００個のヌクレオチド、２０〜１００個のヌクレオチド、１０〜５０個のヌクレオチド、または２０〜４０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸は、食用に適した種のポリペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの全てまたは一部を含む。一部の実施形態では、核酸は、食用に適した種のタンパク質のフラグメントをコードするオープンリーティングフレームからなり、上記オープンリーディングフレームは、完全な、食用に適した種のタンパク質をコードするものではない。
【０３０３】
一部の実施形態では、核酸はｃＤＮＡである。
【０３０４】
一部の実施形態では、食用に適した種の核酸と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一である配列を含む核酸分子が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つの参照核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下ハイブリダイズする核酸が提供される。
【０３０５】
本開示に提供される核酸およびフラグメントは、様々なシステムおよび方法で有用性を示す。たとえば、フラグメントは、様々なダイブリダイゼーション技術のプローブとして使用できる。方法に応じて、標的核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。標的核酸配列は、ハイブリダイゼーションの前に分画（たとえばゲル電気泳動により）することができ、またはハイブリダイゼーションは、ｉｎ  ｓｉｔｕで試料に行うことができる。当業者は、既知の配列の核酸プローブが、染色体構造の決定（たとえばサザンブロッティングにより）、および遺伝子発現の測定（たとえばノーザンブロティングにより）に有用性があることを理解するものである。このような実験では、配列フラグメントは、好ましくは検出可能に標識されることにより、標的配列に対する特異的なハイブリダイゼーションを検出でき、任意に定量化できる。当業者は、本開示の核酸フラグメントが、本明細書中で具体的に記載されていない幅広いブロッティング技術に使用できることを理解するものである。
【０３０６】
また、本明細書中に開示される核酸配列フラグメントは、マイクロアレイに固定化する場合、プローブとしての有用性が見出されていることも明らかである。支持基板上に核酸を沈着および固定することによりマイクロアレイを作製する方法は当技術分野において周知である。ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｓｃｈｅｎａ  （ｅｄ．），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）  （ＩＳＢＮ：  ０１９９６３７７６８）；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２１（１）（ｓｕｐｐｌ）：１−６０  （１９９９）；  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｃｈｅｎａ  （ｅｄ．），  Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （２０００）（ＩＳＢＮ：  １８８１２９９３７６）の総説は、本明細書中参照により援用される。たとえば、本明細書中に開示される核酸配列フラグメントなどの、核酸配列フラグメントを含むマイクロアレイを使用した遺伝子発現の解析は、細胞生物学および分子生物学の分野の配列フラグメントにとって良好に確立された有用性がある。マイクロアレイに固定化した配列フラグメントの他の用途は、Ｇｅｒｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２４：１６８−１７３  （１９９９）  ａｎｄ  Ｚｗｅｉｇｅｒ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：４２９−４３６  （１９９９）；  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｓｃｈｅｎａ  （ｅｄ．），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）  （ＩＳＢＮ：  ０１９９６３７７６８）；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２１（１）（ｓｕｐｐｌ）：１−６０  （１９９９）；  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｃｈｅｎａ  （ｅｄ．），  Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （２０００）（ＩＳＢＮ：  １８８１２９９３７６）に記載されている。
【０３０７】
発現
ベクター
本明細書中にさらに記載されるように、本明細書中に開示される核酸分子の少なくとも１つを含む発現ベクターを含む、１つまたは複数のベクターも提供される。一部の実施形態では、ベクターは、本明細書中に開示されるタンパク質をコードする少なくとも１つの単離核酸分子を含む。代替的な実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された当該核酸分子を含む。よって、ベクターを用いて、組み換え微生物宿主細胞において少なくとも１つの組み換えタンパク質を発現させることができる。一部の態様では、ベクターまたはベクターのセットは、たとえば、本明細書中に開示されるタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。シグナルペプチドおよび分泌に関するさらなる論述は以下を参照されたい。
【０３０８】
微生物での核酸の発現に適したベクターは、当業者に良く知られている。シアノバクテリアでの使用に適したベクターは、たとえば、Ｈｅｉｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ‘‘Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，’’  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ４９７，  Ｃｈ．  ２４  （２０１１）に記載されている。本明細書中に開示のシアノバクテリアの改変に使用できる例示的な複製ベクターとして、ｐＰＭＱＡＫ１、ｐＳＬ１２１１、ｐＦＣ１、ｐＳＢ２Ａ、ｐＳＣＲ１１９／２０２、ｐＳＵＮ１１９／２０２、ｐＲＬ２６９７、ｐＲＬ２５Ｃ、ｐＲＬ１０５０、ｐＳＧ１１１Ｍ、およびｐＰＢＨ２０１が挙げられる。
【０３０９】
本明細書中に開示の核酸配列を受容することのできるｐＪＢ１６１などの他のベクターもまた使用してもよい。ｐＪＢ１６１などのベクターは、特定の光合成微生物に対して内在性のプラスミドに存在する配列と相同である配列を含む（たとえば特定のシネココッカス種のプラスミドｐＡＱ１、ｐＡＱ３、およびｐＡＱ４）。このようなベクターの例および使用方法は当業者に知られており、たとえばＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ‘‘Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７００２，’’  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１  ｉｎ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ  （ｅｄ．），  ‘‘Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，’’  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６８４，  ２０１１に提供されている。この文献は参照により本明細書中に援用される。ｐＪＢ１６１と内在性プラスミドとのあいだのｉｎ  ｖｉｖｏでの組み換えは、内在性プラスミドから関心対象遺伝子を発現する改変微生物を得る。あるいは、ベクターを、宿主細胞の染色体と組み換えるように改変することができ、またはベクターを、宿主細胞の染色体または宿主細胞の内在性プラスミドのいずれとも無関係に、関心対象の遺伝子を複製および発現するように改変することができる。
【０３１０】
組み換えタンパク質の産生に適したベクターのさらなる例は、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））である。この系は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）および他の微生物で使用することを広く特徴とする。この系では、標的遺伝子は、強力なバクテリオファージＴ７転写および（任意に）翻訳シグナルの制御下でｐＥＴプラスミドの中にクローニングされる。発現は、宿主細胞にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供給源を提供することにより誘導される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、選択的かつ活性であるため、完全に誘導される場合、ほぼすべての微生物の供給源が標的遺伝子発現に変換され、所望の産物は、導入から数時間で、全細胞タンパク質の５０％超を含むことができる。また、単に、誘導物質の濃度を低下させることによって発現レベルを減弱させることも可能である。発現レベルを減少させることは、一部の標的タンパク質の可溶性型の収率を高め得る。一部の実施形態では、この系は、転写的にサイレントな非誘導状態での標的遺伝子の維持をも可能にする。
【０３１１】
この系を使用する一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含まない宿主を使用してクローニングすることによって、宿主細胞に対して潜在的に毒性であるタンパク質の産生によるプラスミドの不安定性に関連する潜在的な問題を軽減する。非発現宿主に確立されると、標的タンパク質の発現は、λｐＬおよびｐＩプロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するファージであるλＣＥ６を宿主に感染させるか、またはｌａｃ  ＵＶ５制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む発現宿主の中にプラスミドを導入することにより、開始させることができる。第２の場合、ＩＰＴＧもしくはラクトースを細菌培養物に添加するか、または自己誘導培地を使用することにより、発現を誘導する。Ｌａｃオペレーターにより制御されるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要とせず、大腸菌の天然のＲＮＡポリメラーゼに依存する他のプラスミドシステムとして、ｐＴｒｃ  プラスミドスイート（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥプラスミドスイート（ＱＩＡＧＥＮ）が挙げられる。
【０３１２】
他の実施形態では、発現宿主の中への直接クローニングが可能である。２種類のＴ７プロモーターおよび基礎発現レベルを抑制するそのストリンジェンシーが異なるいくつかの宿主が利用可能であり、幅広い範囲の標的遺伝子発現を最適化するために非常に高い柔軟性および能力を提供する。
【０３１３】
哺乳動物細胞の核酸発現に適したベクターは、典型的にウイルス調節エレメントにより提供される制御機能を含む。たとえば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、またはシミアンウイルス４０に由来する。
【０３１４】
プロモーター
本明細書中に記載される組み換え遺伝子の発現に有用なプロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導型／抑制性プロモーターを含む。誘導型／抑制性プロモーターの例として、ニッケル誘導性プロモーター（たとえばＰｎｒｓＡ、ＰｎｒｓＢ；たとえばＬｏｐｅｚ−Ｍａｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （２００２）  ｖ．４３：  ２４７−２５６参照）およびＰｎｉｒＡなどの抑制性プロモーター（たとえばＱｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２００５）  ｖ．７１：  ５６７８−５６８４に記載）が挙げられる。誘導型／抑制性プロモーターの追加的な例として、ＰｎｉｒＡ（ｎｉｒＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーターであり、硝酸塩により誘導され、尿素により抑制される）、およびＰｓｕｆ（ｓｕｆＢ遺伝子の発現を駆動するプロモーターであり、イオンストレスにより誘導される）が挙げられる。構成的プロモーターの例として、Ｐｃｐｃ（ｃｐｃオペロンの発現を駆動するプロモーター）、Ｐｒｂｃ（ルビスコの発現を駆動するプロモーター）、ＰｐｓｂＡＩＩ（ＰｐｓｂＡＩＩの発現を駆動するプロモーター）、Ｐｃｒｏ（ｃｒｏの発現を駆動するλファージプロモーター）が挙げられる。他の実施形態では、ＰａｐｈＩｌおよび／またはｌａｃｌｑ−Ｐｔｒｃプロモーターを使用して発現を制御できる。複数の組み換え遺伝子を、改変微生物で発現させる場合、異なる遺伝子を、異なるプロモーターで、もしくは別々のオペロンにおける同一のプロモーターにより制御でき、または２つ以上の遺伝子の発現を、オペロンの一部としての単一のプロモーターにより制御できる。
【０３１５】
誘導型プロモーターのさらなる非限定的な例として、限定するものではないが、外来性タンパク質（たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）の発現、小分子（たとえばＩＰＴＧ、ガラクトース、テトラサイクリン、ステロイドホルモン、アブシジン酸）の存在、小分子（たとえばＣＯ２、鉄、窒素）の非存在、金属または金属イオン（たとえば銅、亜鉛、カドミウム、ニッケル）、および環境要因（たとえば熱、低温、ストレス、光、暗所）、および増殖相により誘導されるプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、誘導が存在しなければ、転写がプロモーターを介して実質的に開始されないように厳密に調節されている。一部の実施形態では、プロモーターの誘導は、他のプロモーターを介する転写を実質的に変化させない。また、一般的に、誘導型プロモーターを誘導する化合物または条件は、発現が求められる生物または環境に天然に存在するものでない。
【０３１６】
一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、シアノバクテリア培養物へのＣＯ２供給を限定することにより誘導される。非限定的な例として、誘導型プロモーターは、ｃｍｐ遺伝子、ｎｔｐ遺伝子、ｎｄｈ遺伝子、ｓｂｔ遺伝子、ｃｈｐ遺伝子、およびｒｂｃ遺伝子またはそれらの変異体もしくはフラグメントなどの、ＣＯ２限定条件下でアップレギュレートされたシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ  ６８０３のプロモーター配列とすることができる。
【０３１７】
一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、鉄飢餓または静止増殖期に入ることにより誘導される。一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、ｉｓｉＡなどのＦｅ飢餓条件下、またはｉｓｉＡ、ｐｈｒＡ、ｓｉｇＣ、ｓｉｇＢ、およびｓｉｇＨ遺伝子、またはそれらの変異体もしくはフラグメントなどの、培養が静止増殖期に入る場合にアップレギュレートされるシアノバクテリア遺伝子のプロモーター配列の変異体配列とすることができる。
【０３１８】
一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、金属または金属イオンにより誘導される。非限定的な例として、誘導型プロモーターは、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、ニッケル、金、銀、コバルト、およびビスマス、またはそれらのイオンにより誘導できる。一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、ニッケルまたはニッケルイオンにより誘導される。一部の実施形態では、誘導型プロモーターは、Ｎｉ２＋などのニッケルイオンにより誘導される。別の例示的な実施形態では、誘導型プロモーターは、シネコシスティスＰＣＣ  ６８０３由来のニッケル誘導型プロモーターである。別の実施形態では、誘導型プロモーターは、銅または銅イオンにより誘導できる。さらなる別の実施形態では、誘導型プロモーターは、亜鉛または亜鉛イオンにより誘導できる。さらなる別の実施形態では、誘導型プロモーターは、カドミウムまたはカドミウムイオンにより誘導できる。さらなる別の実施形態では、誘導型プロモーターは、水銀または水銀イオンにより誘導できる。代替的な実施形態では、誘導型プロモーターは、金または金イオンにより誘導できる。別の代替的な実施形態では、誘導型プロモーターは、銀または銀イオンにより誘導できる。さらなる別の実施形態では、誘導型プロモーターは、コバルトまたはコバルトイオンにより誘導できる。さらなる別の代替的な実施形態では、誘導型プロモーターは、ビスマスまたはビスマスイオンにより誘導できる。
【０３１９】
一部の実施形態では、プロモーターは、金属または金属イオンに誘導型プロモーターを含む細胞を曝露することにより誘導される。細胞は、微生物増殖培地に金属を添加することにより金属または金属イオンに曝露され得る。特定の実施形態では、微生物増殖培地に添加した金属または金属イオンは、培地から効率良く回収できる。他の実施形態では、回収後培地に残る金属または金属イオンは、培地のその後の処理または細菌遺伝子産物を実質的に妨害するものではない。
【０３２０】
構成的プロモーターのさらなる非限定的な例として、グラム陰性菌またはグラム陰性菌で増殖するバクテリオファージ由来の構成的プロモーターが挙げられる。たとえば、Ｌｐｐ、ＯｍｐＡ、ｒＲＮＡ、およびリボソームタンパク質のプロモーターなどの、高度に発現されるグラム陰性遺伝子産物をコードする遺伝子のプロモーターを使用できる。あるいは、調節可能なプロモーターを、プロモーターのための制御タンパク質を欠いた株で使用することができる。たとえば、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、およびＰｔｒｃは、Ｌａｃｌを欠いた株の構成的プロモーターとして使用できる。同様に、Ｐ２２ＰＲおよびＰＬは、λＣ２リプレッサータンパク質を欠いた株で使用でき、λＰＲおよびＰＬは、λＣ１リプレッサータンパク質を欠いた株で使用できる。一実施形態では、構成的プロモーターはバクテリオファージ由来である。別の実施形態では、構成的プロモーターは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）バクテリオファージ由来である。さらなる別の実施形態では、構成的プロモーターは、シアノファージ由来である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）プロモーターである。たとえば、構成的プロモーターは、ＰｐｓｂＡｌｌプロモーターまたはその変異配列、Ｐｒｂｃプロモーターまたはその変異体配列、Ｐｃｐｃプロモーターまたはその変異配列、およびＰｒｎｐＢプロモーターまたはその変異配列とすることができる。
【０３２１】
宿主
同様に、本明細書中に開示される核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞をも提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は微生物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ベクター上に核酸配列を有しており、ここで、ベクターを自由に複製してもよいが必ずしも複製する必要はない。他の実施形態では、核酸は、宿主細胞のゲノムおよび／または宿主細胞の内在性プラスミドの中に組み込まれている。形質転換宿主細胞は、たとえば本明細書中に開示される組み換えタンパク質の産生において有用である。
【０３２２】
様々な宿主微生物を、本明細書中に開示される核酸配列で形質転換でき、かつ一部の実施形態では、本明細書中に開示される組み換えタンパク質を産生するために使用できる。適切な宿主微生物として、独立栄養性微生物および従属栄養性微生物が挙げられる。一部の使用では、独立栄養性微生物は、宿主微生物の中に導入される組み換え核酸配列によりコードされるタンパク質を作製するために必要とされる化石燃料および／または電気量の減少を可能にする。これは、言い換えると、一部の応用では、タンパク質を産生する費用および／または環境上の影響を減少させ、かつ／または乳清、卵、およびダイズなどの代替的なタンパク質を製造する費用および／または環境上の影響と比較して、費用および／または環境上の影響を減少させる。たとえば、本明細書中に開示される宿主微生物を使用して本明細書中に開示されるタンパク質を作製する費用および／または環境上の影響は、一部の実施形態では、牛乳の処理によるヒトの消費に適した形態の乳清タンパク質を作製する費用および／または環境上の影響よりも少ない。
【０３２３】
従属栄養生物の非限定的な例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖａｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｌｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｆｕｓｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓが挙げられる。
【０３２４】
光独立栄養性微生物として、真核生物藻類、ならびに原核生物性シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、および紅色非硫黄細菌が挙げられる。好極限性細菌もまた、適切な生物と考えられている。このような生物は、たとえば、混合栄養の微生物に提供されている。混合栄養の微生物もまた適切な生物である。藻類およびシアノバクテリアは、適切な生物と考えられている。たとえば、２０１３年３月１５日に出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２３２号、２０１３年３月１５日に出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２１８０号、２０１３年３月１５日に出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２２５号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１８号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２０６号、および２０１３年４月２９日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８６８２号に開示された生物を参照されたい。
【０３２５】
なおさらなる他の適切な生物として、Ｖｅｎｔｅｒらの米国特許出願公開第２００７／０２６４６８８に記載の合成ゲノムにより産生される合成細胞、ならびにＧｌａｓｓらの米国特許出願公開第２００７／０２６９８６２号に記載の細胞様の系または合成細胞が挙げられる。
【０３２６】
さらなる他の適切な生物として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓなどの酵母および真菌が挙げられる。一部の実施形態では、これら微生物は、二酸化炭素を固定するように改変されるが、他の実施形態では、改変されない。
【０３２７】
一部の実施形態では、昆虫細胞またはヒト細胞などの哺乳動物の細胞などの真核生物の細胞を、宿主細胞として使用する。そのような細胞に関するベクターならびにプロモーターおよびエンハーサーを含む発現制御配列は周知である。この目的に有用な哺乳動物の宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換したサルの腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎細胞株（２９３細胞、または浮遊培養で生育させるためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９  （１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトの肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）である。
【０３２８】
トランスフェクション
タンパク質は、たとえば、当技術分野で周知である組み換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して宿主細胞で産生できる（たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。タンパク質の発現に関して、タンパク質をコードする発現ベクターを、標準的な技術により宿主細胞へトランスフェクトする。この用語トランスフェクションの様々な形態は、たとえば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどといった、原核生物または真核生物の宿主細胞の中への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用できる様々な技術を包含すると意図される。
【０３２９】
産生
当業者は、本明細書中に開示されるタンパク質を産生（かつ任意に分泌）するよう組み換え型細胞を培養するため、ならびに発現したタンパク質の精製および／または単離のために利用可能な多くの適切な方法を認識している。タンパク質精製のために選択される方法は、細胞、ベクター、宿主株のバックグラウンドの中の、関心対象タンパク質の特性、位置および形態、ならびに発現したタンパク質の意図される用途を含む、多くの変数に依存する。培養条件もまた、所定の標的タンパク質の溶解度および局在に影響を及ぼし得る。限定するものではないが、イオン交換およびゲル濾過を含む多くの手法を使用して、本明細書に開示される組み換え微生物細胞に発現する標的タンパク質を精製できる。
【０３３０】
一部の実施形態では、ペプチド融合タグを組み換えタンパク質に添加して、ペプチド融合タグを利用する様々なアフィニティ精製方法を可能にする。一部の実施形態では、アフィニティ方法の使用は、１ステップでほぼ均一となるまで標的タンパク質の精製を可能にする。精製は、たとえば、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、またはＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによる融合タグの一部または全ての切断を含んでもよい。一部の実施形態では、発現した標的タンパク質の精製または活性測定の前に、標的タンパク質の発現レベル、細胞局在、および溶解度に関する予備解析を行う。標的タンパク質は、以下の分画、すなわち可溶性または不溶性の細胞質分画、細胞周辺質、または培地のいずれかまたは全てで見出すことができる。意図する応用に応じて、封入体、培地、または細胞周囲腔に選択的に局在することは、一部の実施形態で、比較的簡単な手法により迅速に精製するために有益とすることができる。
【０３３１】
大腸菌は、異種性タンパク質を発現させるためのロバストな宿主として広く考えられているが、同様に、この宿主中の多くの過剰発現するタンパク質が、不溶性の封入体の形態で凝集する傾向があることも広く知られている。封入体の形成を救出する、またはタンパク質自体の力価を改善するための最も一般に使用されている方法の１つは、アミノ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（Ａｕｓｔｉｎ  ＢＰ，  Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ  Ｓ，  Ｗａｕｇｈ  ＤＳ．  Ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；４９８：１５７−７２）、または低分子ユビキチン関連修飾因子（Ｓａｉｔｏｈ  Ｈ，  Ｕｗａｄａ  Ｊ，  Ａｚｕｓａ  Ｋ．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＵＭＯ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；４９７：２１１−２１；  Ｍａｌａｋｈｏｖ  ＭＰ，  Ｍａｔｔｅｒｎ  ＭＲ，  Ｍａｌａｋｈｏｖａ  ＯＡ，  Ｄｒｉｎｋｅｒ  Ｍ，  Ｗｅｅｋｓ  ＳＤ，  Ｂｕｔｔ  ＴＲ．  ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＳＵＭＯ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００４；５（１−２）：７５−８６；  Ｐａｎａｖａｓ  Ｔ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃ，  Ｂｕｔｔ  ＴＲ．  ＳＵＭＯ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；４９７：３０３−１７）の、関心対象タンパク質との融合体を含めることである。これら２つのタンパク質は、きわめて良好に発現され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて可溶型であることにより、関心対象タンパク質は可溶型で効率良く産生される。関心対象タンパク質は、関心対象タンパク質と融合タンパク質とのあいだに部位特異的プロテアーゼ認識配列（タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテーゼなど）を設計することにより切断できる。一部の実施形態では、関心対象タンパク質は、封入体に存在できる。一部の態様では、封入体は、対象に送達するために配合できる。配合物は、以下にさらに詳細に論述される。
【０３３２】
一部の実施形態では、当初、タンパク質は正確にフォールディングされず、または不溶性である。不溶性のタンパク質をリフォールディングするための様々な方法が良く知られている。ほとんどのプロトコルが、遠心後に変性条件下での可溶化による不溶性封入体の単離を含む。次いでタンパク質を透析し、非変性バッファーに希釈すると、リフォールディングが起こる。すべてのタンパク質は、固有のフォールディング特性を有しているため、任意の所定のタンパク質に最適なリフォールディングプロトコルが、当業者により経験的に決定できる。最適なリフォールディング条件は、たとえば、タンパク質の濃度、還元剤、レドックス処理、二価カチオンなどの変数を試験するマトリックス手法により、小規模で迅速に決定できる。最適な濃度が見いだされれば、それらの濃度を、標的タンパク質の大規模での可溶化およびリフォールディングに使用できる。
【０３３３】
一部の実施形態では、タンパク質は、三次構造を構成しない。一部の実施形態では、三次構造に関与するのは、タンパク質のアミノ酸の半分未満である。一部の実施形態では、タンパク質は２次構造を構成しない。一部の実施形態では、二次構造に関与するのは、タンパク質のアミノ酸の半分未満である。組み換えタンパク質は、これら構造特性の１つまたは複数を含む状態でこれらタンパク質を発現する細胞の培養物から単離できる。一部の実施形態では、組み換えタンパク質の三次構造を、このタンパク質を産生する培養物から単離した後に減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、組み換えタンパク質の二次構造を、このタンパク質を産生する培養物から単離された後に減少させるかまたは除去する。
【０３３４】
一部の実施形態では、Ｎ−ラウロイルサルコシンと共にアルカリｐＨのＣＡＰＳバッファーを使用して、封入体の溶解を得た後、ＤＴＴの存在下で透析を行うことにより、リフォールディングを促進させる。標的タンパク質、発現条件、および意図する応用に応じて、洗浄した封入体から可溶化したタンパク質は、９０％超均一であり、さらに精製する必要はなくてもよい。完全な変性条件での精製（リフォールディング前）は、Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）融合タンパク質およびＨｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（Ｎｏｖｏｇｅｎ（登録商標））を使用することが可能である。さらに６Ｍの尿素を使用して封入体から可溶化したＳ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７・Ｔａｇ（登録商標）、およびＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ融合タンパク質は、適切な樹脂上でのクロマトグラフィーの前に、２Ｍ尿素（Ｓ・ＴａｇおよびＴ７・Ｔａｇ）または１Ｍの尿素（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ  ＩＩ）への希釈により部分的な変性条件下で精製できる。リフォールディングした融合タンパク質は、Ｈｉｓ・Ｔａｇ、Ｓ・Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ  ＩＩ、および他の適切なアフィニティタグ（ＧＳＴ・Ｔａｇ（商標）およびＴ７・Ｔａｇ）（Ｎｏｖｏｇｅｎ（登録商標））を使用して、天然の条件下でアフィニティ精製できる。
【０３３５】
一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞の内在性タンパク質である。すなわち、宿主細胞の細胞ゲノムは、組み換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、タンパク質の発現を増加させるために十分な調節配列を、宿主細胞のゲノムの中へ挿入して、調節配列が組み換え核酸由来の組み換えタンパク質の過剰発現を駆動するように内在性オープンリーディングフレームに機能的に連結させる。一部の実施形態では、異種性核酸配列を、タンパク質の内在性オープンリーディングフレームに融合して、オルガネラまたは分泌経路にこのタンパク質を配向するなど、組み換えタンパク質の細胞輸送を変化させる異種アミノ酸配列を含むタンパク質を合成させる。一部の実施形態では、内在性宿主細胞タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームに機能的に連結される調節配列をさらに含むプラスミド上で宿主細胞に導入する。一部の実施形態では、組み換え型宿主細胞は、類似する条件下で生育させた類似の宿主細胞により産生されるタンパク質の量の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上多い組み換えタンパク質を発現する。
【０３３６】
植物中の組み換えタンパク質の産生
栄養性ポリペプチドは、植物から組み換えにより産生でき、限定するものではないが、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２３２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２１８０号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２２５号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１８号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２０６号、および２０１３年４月２９日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８６８２号に開示される生物および産生方法を含む。
【０３３７】
精製
分泌
一般的に、ほぼすべての分泌される細菌のタンパク質および他の単細胞宿主由来のタンパク質は、シグナルペプチドとして知られているＮ末端配列を含むプレタンパク質として合成される。これらのシグナルペプチドは、タンパク質の最終目的、および輸送機構に影響を与える。ほとんどのシグナルペプチドは、転座機構（たとえばＳｅｃまたはＴａｔ媒介など）およびプレタンパク質からシグナルペプチドを切断するために使用されるシグナルペプチダーゼの種類に基づき、４つのグループの１つに分類できる。同様に、リポタンパク質シグナルペプチドを含むＮ末端シグナルペプチドも提供する。この種のシグナルを有するタンパク質は、Ｓｅｃトランスロカーゼを介して輸送されるが、これらのペプチドシグナルは、正常のＳｅｃシグナルよりも短い傾向があり、−３〜＋１の位置のリポボックス（Ｌ（ＡＳ）（ＧＡ）Ｃ）として知られているＣドメインに別の配列モチーフを含む。＋１位置のシステインは、転座の後に脂質修飾され、シグナル配列は、ＩＩ型シグナルペプチダーゼにより切断される。また、ＩＶ型またはプレピリンシグナルペプチドが提供され、ＩＶ型ペプチダーゼ切断ドメインは、他のシグナルペプチドに共通するＣドメインではなく、ＮドメインとＨドメインとのあいだに局在する。
【０３３８】
本明細書中に提供されるように、シグナルペプチドは、組み換え栄養性ポリペプチド配列を作製するために、栄養性ポリペプチドを含む異種ポリペプチド配列（すなわち、このタンパク質と異なるシグナルペプチドに由来する、または異なるシグナルペプチドから得られる）に結合させることができる。あるいは、栄養性ポリペプチドが宿主生物で天然に分泌される場合、これは、分泌を指示する天然のシグナル配列または様々なシグナル配列を使用するために十分とすることができる。栄養性ポリペプチドの一部の実施形態では、シグナルペプチドのカルボキシル末端に結合した異種栄養性ポリペプチドは、食用に適した種の真核生物タンパク質、その変異タンパク質もしくは誘導体、またはポリペプチド栄養性ドメインである。ポリペプチドの他の実施形態では、シグナルペプチドのカルボキシル末端に結合した異種栄養性ポリペプチドは、食用に適した種の細胞内タンパク質、その変異タンパク質もしくは誘導体、またはポリペプチド栄養性ドメインである。
【０３３９】
栄養性ポリペプチドの精製
同様に、培養培地から分泌栄養性ポリペプチドを回収する方法も提供する。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、指数増殖期の最中または指数増殖期の後（たとえばプレ定常期または定常期）に、培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、定常期の最中に培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、第１の時点で培養培地から回収され、培養は、微生物による組み換え栄養性ポリペプチドの産生および分泌に十分な条件下で継続され、組み換え栄養性ポリペプチドが、第２の時点で培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌栄養性ポリペプチドは、連続工程により培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、バッチ工程により培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、半連続工程により培養培地から回収される。一部の実施形態では、分泌型栄養性ポリペプチドは、流加培養工程により培養培地から回収される。当業者は、本明細書に開示される組み換え型栄養性ポリペプチドを産生（および任意に分泌）するための組み換え型細胞の培養、ならびに発現した組み換えポリペプチドの精製および／または単離に利用可能な多くの適切な方法を認識するものである。ポリペプチド精製に選択される方法は、関心対象ポリペプチドの特性を含む多くの変数に依存する。ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｉｔｒａｔｉｏｎ）、沈殿、およびクロマトグラフィーを含む様々な精製技術が当技術分野において公知である。
【０３４０】
非分泌
一部の態様では、タンパク質は、分泌されずに単離できる。たとえば、タンパク質を有する細胞（細胞表面または細胞内）を、溶解して、タンパク質を、ライセートからのタンパク質のクロマトグラフィーまたは抗体ベースの単離などの標準的な方法を使用して精製できる。一部の態様では、細胞の表面に発現したタンパク質を、表面から酵素により切断できる。
【０３４１】
食用に適した種由来の生物材料からの栄養性ポリペプチドの単離
一部の実施形態では、望ましいアミノ酸配列に任意に存在する望ましいアミノ酸または複数のアミノ酸を有する栄養性ポリペプチドを、食用に適した種由来の食物供給源または生物材料から単離または精製する。たとえば、植物の生物材料として、ナッツ、種、葉、および根が挙げられ、哺乳動物の生物材料として、乳汁、筋肉、血清、および肝臓が挙げられる。単離方法として、可溶化、クロマトグラフィー、および沈殿が挙げられる。
【０３４２】
栄養性ポリペプチドは、標的化した栄養性ポリペプチドの特異的な可溶化により生物学的物質から単離される。この生物材料を可溶化溶液に懸濁し、ホモジナイズする。この可溶化溶液は、栄養性ポリペプチドの生理化学的な特性に基づき選択される。可溶化溶液の組成物は、水、洗浄剤、塩、ｐＨ、カオトロープ、コスモトロープ（ｃｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）、および／または有機溶媒の混合物である。例として、プロリンを多く含むタンパク質は、エタノール溶液に可溶性であることが知られている（Ｄｉｃｋｅｙ，  Ｌ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  １０．２  （１９９９）：  １３７−１４３．）。高いプロリン含有量の栄養性ポリペプチドは、液体対生物材料の比率（ｗ／ｗ）が１：１、２：１、３：１、４：１または当技術分野において認識される他の比率のでエタノールに生物材料を懸濁することにより、選択および単離される。この懸濁物を混合し、不溶性材料を遠心沈降により除去する。エタノール可溶性の栄養性ポリペプチドは、エタノール分画に可溶な状態で精製される。
【０３４３】
栄養性ポリペプチドは、標的化栄養性ポリペプチドの沈殿、または他のタンパク質の沈殿により生物材料から単離される。沈殿剤は、塩、ｐＨ、加熱、凝集剤、カオトロープ、コスモトロープ、および有機溶媒を含む。沈殿形態は、タンパク質の生理学的特性に基づき所定の栄養ポリペプチドに関して選択される。例として、栄養性ポリペプチドは、本明細書中に記載される低い溶媒和スコアおよび低い凝集スコアによりｐＨ７で熱的に安定であるよう選択される。このタンパク質を精製するために、生物材料を中性ｐＨの水溶液に懸濁し、ホモジナイズする。不溶性の物質を、遠心沈降により溶液から除去する。他のタンパク質から栄養性ポリペプチドを精製するために、上清を９０℃に１０分間加熱する。不溶性材料を遠心沈降により除去する。３ｋＤａのメンブレンを使用して透析することにより、低分子を懸濁物から除去すると、純粋な栄養性ポリペプチドが得られる。
【０３４４】
栄養性ポリペプチドは、様々なクロマトグラフィーの方法により生物材料から単離される。使用するため選択されるクロマトグラフィーの形式は、標的栄養性ポリペプチドの物理化学特性に依存する。荷電栄養性ポリペプチドは、静電相互作用を介してイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合する。疎水性栄養性ポリペプチドは、疎水性の会合を介した疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合する。混合型のクロマトグラフィーは、様々な栄養性ポリペプチドに使用でき、様々な相互作用を介して作用できる。金属アフィニティクロマトグラフィーは、金属イオンに結合する栄養性ポリペプチドに使用できる。例として、栄養性ポリペプチドは、陽イオン交換樹脂と強固に結合するように、ｐＨ４でアミノ酸あたり高い電荷を有するように選択される。生物材料を、低いイオン強度のｐＨ４の水溶液に添加し、ホモジナイズする。不溶性材料を遠心沈降により除去する。可溶性材料を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎなどの陽イオン交換樹脂に添加し、低イオン強度ｐＨ４溶液で洗浄する。栄養性ポリペプチドを、高イオン強度（たとえば５００ｍＭのＮａＣｌ）ｐＨ４溶液を添加することにより樹脂から溶出し、精製した栄養性ポリペプチドをもたらす。
【０３４５】
合成栄養性ポリペプチドアミノ酸組成物
一部の実施形態では、本開示の組成物は、選択した栄養性ポリペプチドに存在する複数のアミノ酸のモル比を表す複数の遊離アミノ酸を含み、本明細書中では、これは「栄養性ポリペプチド混合物」と呼ばれる。本組成物は、特定の実施形態では、遊離アミノ酸および栄養性ポリペプチドの両方を含む。本明細書中で使用されるように、これらの実施形態では、栄養性ポリペプチド、ならびに栄養性ポリペプチドを含む組成物および配合物の開示は、栄養性ポリペプチド混合物、および栄養性ポリペプチド混合物を含む組成物および配合物、ならびに第１の量のアミノ酸が栄養性ポリペプチドの形態で存在し、第２の量のアミノ酸が遊離アミノ酸の形態で存在する組成物の開示を含む。
【０３４６】
生成するための合成方法
一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、組み換え産生システムを使用することなく化学的に合成される。タンパク質の合成は、当技術分野で公知の技術を使用して、液相系または固相系で実行できる（たとえばＡｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｒ．Ｃ．  （１９８９）．  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ：  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｊ．Ｄ．  （１９８４）．  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （２ｎｄ  ｅｄ．）．  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ：  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照）。
【０３４７】
ペプチドの化学および合成方法は当技術分野で周知であり、本開示のタンパク質は当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して作製できる。このような方法の非限定的な例として、樹脂結合ペプチドの合成（アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製方法を含む）がある。
【０３４８】
たとえば、ペプチドを合成するために使用できるＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（たとえば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏＣｈｅｍから供給）が、標準的な推奨である。樹脂結合型ペプチド合成は、たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰｒｅｌｕｄｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｔｕｃｓｏｎ，  Ａｒｉｚ．  ８５７１４  Ｕ．Ｓ．Ａ．）に関するＦｍｏｃに基づく化学技術を使用して実施される。Ｃ末端カルボン酸の調製に適した樹脂は、ＮｏｖａｂｉｏＣｈｅｍから入手可能な、充填済みの低充填Ｗａｎｇ樹脂（たとえば低充填ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂、ＬＬ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）である。Ｃ末端アミドを有するペプチドの合成に適した樹脂は、Ｍａｔｒｉｘ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎから入手可能なＰＡＬ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂である。Ｎ末端αアミノ基は、Ｂｏｃで保護される。
【０３４９】
Ｆｍｏｃ−脱保護は、２×３分間、ＮＭＰ中２０％のピぺリジンを用いて達成できる。カップリングの化学は、ＮＭＰ中のＤＩＣ／ＨＯＡｔ／コリジンである。アミノ酸／ＨＯＡｔ溶液（３〜１０倍のモル過剰でＮＭＰ中０．３Ｍ／０．３Ｍ）を樹脂に添加し、次いで、等モル当量のＤＩＣ（ＮＭＰ中で３Ｍ）、次いでコリジン（ＮＭＰ中で３Ｍ）を添加する。たとえば、以下のスケールの反応に関してカップリングあたり、以下の量の０．３Ｍのアミノ酸／ＨＯＡｔ溶液を使用する：スケール／ｍｌ、０．０５ｍｍｏｌ／１．５ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ／３．０ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ／７．５ｍＬ。カップリング時間は、２×３０分または１×２４０分のいずれかである。合成の後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、ペプチドは、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５）での２〜３時間の処理により樹脂から切断し、次いでジエチルエーテルで沈殿させる。この沈殿物を、ジエチルエーテルで洗浄する。この粗製ペプチドを、水／ＭｅＣＮ（４：１）などの水およびＭｅＣＮの適切な混合物に溶解し、Ｃ１８シリカゲルを含むカラム上で分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａｐｒｅｐ  ４０００またはＧｉｌｓｏｎ）により精製する。溶出を、０．１％ＴＦＡを含む水中のＭｅＣＮの勾配を増大させて行う。関連する分画を、分析的ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣにより確認する。純粋な標的ペプチドを含む画分を混合し、減圧下で濃縮する。結果として得られる溶液を解析（ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ）し、生成物を化学発光窒素特異的ＨＰＬＣ検出器（Ａｎｔｅｋ  ８０６０  ＨＰＬＣ−ＣＬＮＤ）を使用するか、または２８０ｎｍでのＵＶ吸光を測定することにより定量する。生成物を、ガラスのバイアルの中に分配する。このバイアルを、ミリポアのガラス線維のプレフィルターでキャッピングする。凍結乾燥すると、ペプチドトリフルオロ酢酸塩が白色固体として得られる。結果として得られるペプチドは、たとえば当技術分野で公知の標準的な方法を使用するＬＣＭＳおよび／またはＵＰＬＣを使用して検出かつ特徴付けることができる。ＬＣＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムおよびＭｉｃｒｏｍａｓｓのＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ質量分析計からなるセットアップで実施できる。ＵＰＬＣポンプは、Ａ）水中０．１％のギ酸、およびＢ）アセトニトリル中０．１％のギ酸を含む２つの溶出リザーバーに接続される。この解析は、カラム上に適切な量の試料（好ましくは２〜１０μｌ）を注入してＡおよびＢの勾配で溶出することにより室温で実施される。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、および質量分析計の設定は以下の通りである。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍである。勾配：０．４ｍｌ／分で４．０分（あるいは８．０分）のあいだの５％〜９５％アセトニトリルの直線勾配。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶからのアナログ出力（Ｔｕｎａｂｌｅ  ＵＶ検出器）。ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳスキャン：１００〜２０００ａｍｕ（あるいは５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。ＵＰＬＣ法は良く知られている。使用できる方法の非限定的な例は、たとえば、２０１３年２月２８に公開された米国特許出願公開第２０１３／００５３３１０Ａ１号の１６〜１７ページに記載されている。
【０３５０】
酵素活性の不活性化
一部の態様では、タンパク質は酵素であるか、または酵素活性を有する。一部の実施形態では、タンパク質は、酵素の酵素活性を不活性化または低減することが望ましい場合がある。加熱の使用、１つまたは複数の洗浄剤の使用、１つまたは複数の金属キレーターの使用、還元、酸化、１つまたは複数のカオトロープの使用、共有結合修飾、たとえば酵素的または化学的な変更を介した、翻訳後修飾の変更、ｐＨ（酸性および塩基性）の変更、または塩濃度の変更を含む、酵素の不活性化のための様々な方法が当業者に知られている。たとえば、熱不活性化は、典型的に、特定の期間、特定の温度で実行される。たとえば、ほとんどのエンドヌクレアーゼは、２０分間６５℃でのインキュベーションにより不活性化される。一部の態様では、酵素は、たとえば、酵素をミスフォールドさせることにより、酵素の活性を除去または低減させるよう変異させることができる。さらに、高圧の二酸化炭素（ＨＰＣＤ）は、酵素を不活性化するために有効な非熱的処理であることが例証されている。Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；  Ｖｏｌｕｍｅ  ５２，  Ｉｓｓｕｅ  ２，  ２０１３を参照されたい。酵素不活性化の様々な他の形態が当業者に知られており、よってこれらのパラメータは、酵素の活性を変化させるために必要に応じて調節できる。酵素不活性化のための様々な方法は、酸化、たとえば漂白剤、Ｈ２Ｏ２、およびエチレンオキシドといった賦形剤；たとえばＤＴＴ、ＢＭＥ、およびＴＣＥＰといったジスルフィドの還元；Ｎａ２ＣＯ３、トリス塩基、またはＮａ２ＨＰＯ４を使用した高いｐＨ；クエン酸、ホウ酸、酢酸、またはトリスＨＣｌを使用した低ｐＨ；ある期間にわたる３０℃〜１００℃の温度を使用した加熱；チオシアン酸塩、尿素、グアニジンＨＣｌ、またはＣａＣｌ２などのカオトロープによるタンパク質のアンフォールディング；ＭＰＤ、トリトン（非イオン性）、ＣＨＡＰＳ（双性イオン）、またはＴｗｅｅｎ（非イオン性）などの界面活性剤（たとえば、洗浄剤）を用いるか、またはＥＤＴＡもしくはクエン酸塩などのキレート塩を用いるタンパク質のアンフォールディングである。
【０３５１】
細胞増殖アッセイ
タンパク質またはその一部の増殖工程に対する相対的な重要性を測定するために、タンパク質増殖アッセイを用いることができる。一部の態様では、細胞増殖は、タンパク質または対象の存在下または非存在下で、飢餓条件下で測定できる。たとえば、ある一定期間（たとえば４８時間）にわたり、組織培養インキュベーター中で、それぞれの関心対象タンパク質を有するか、または欠いている培地を用いて、細胞を飢餓状態にすることができる。インキュベーション後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅなどの検出剤を添加し、蛍光を、増殖に関する出力として測定できる。一部の態様では、細胞の増殖は、関心対象タンパク質に対する用量反応の一部として測定できる。たとえば、細胞は、組織培養インキュベーター中で、それぞれの関心対象タンパク質を有するかまたは欠いている培地で飢餓状態にできる。飢餓させた後、次いで細胞を、それぞれのタンパク質を欠いている同じ供給源培地中で、初回培養液中で欠如していた、種々の濃度のタンパク質（たとえば０、２０、１００、または１０００μＭで処置できる。次いでこの細胞を、組織培養インキュベーターで再度インキュベートできる。インキュベーションの後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅなどの検出剤を添加し、蛍光を読み取る。
【０３５２】
アレルゲン性アッセイ
一部の実施形態のため、タンパク質は、高いアレルゲン性を不適切に呈しないことが好ましい。よって、一部の実施形態では、タンパク質の潜在的アレルゲン性が評価される。これは、当技術分野において公知のいずれかの適切な方法により行うことができる。一部の実施形態では、アレルゲン性のスコアを計算する。アレルゲン性スコアは、タンパク質が任意の公知のアレルゲンに対してどれほど類似しているかを評価するための、ＷＨＯの推奨に基づく一次配列ベースの測定基準（ｆａｏ．ｏｒｇ／ａｇ／ａｇｎ／ｆｏｏｄ／ｐｄｆ／ａｌｌｅｒｇｙｇｍ．ｐｄｆ）であり、標的と既知のアレルゲンとのあいだで高いパーセント同一性は、交差反応性を示す可能性があると主に予測される。所定のタンパク質では、アレルギー応答を誘発する可能性は、無料の配列相同性ベースの試験ペアの１つまたは複数を介して評価できる。第１の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用した、既知のアレルゲンのデータベースに対するグローバル−グローバル配列アライメントを介して、配列全体にわたるタンパク質のパーセント同一性を決定する。５０％未満の全体的相同性を有するタンパク質は、アレルゲン性である可能性が低いことが示唆されている（Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｒｏｐｓ−ｗｈａｔ  ｍａｋｅｓ  ｓｅｎｓｅ？  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２６，  ７３−８１  （２００８）；  Ａａｌｂｅｒｓｅ  Ｒ．  Ｃ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０６，  ２２８−２３８  （２０００））。
【０３５３】
タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、解析に使用されているデータベースの既知のいずれかのアレルゲンに対して５０％未満の全体的相同性を有する。一部の実施形態では、４０％未満の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３０％未満の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２０％未満の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１０％未満のカットオフを使用する。一部の実施形態では、４０％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３０％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２０％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１０％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、０％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、解析に使用されるデータベース中の既知のいずれかのアレルゲンに対して５０％超の全体的相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５０％〜６０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５０％〜７０％を使用する。一部の実施形態では、５０％〜８０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５０％〜９０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５５％〜６０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、６５％〜７０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、７０％〜７５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、７５％〜８０％のカットオフを使用する。
【０３５４】
第２の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用した、既知のアレルゲンのデータベースに対する各フラグメントのグローバル−ローカル配列アライメントを介して全ての可能性のある連続８０個のアミノ酸フラグメントの局所的アレルゲン性を決定することにより、タンパク質配列に沿って局所的アレルゲン性を評価する。任意のアレルゲンとの、任意のアミノ酸８０個のウインドウの最も高いパーセント同一性を、関心対象タンパク質の最終的なスコアとして採用する。ＷＨＯのガイドラインは、このフラグメントの試験で３５％の同一性カットオフを使用することを示唆している。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質のすべての可能性のあるフラグメントは、この試験を使用する解析のために使用されるデータベース中の既知のいずれかのアレルゲンに対して３５％未満の局所的相同性を有する。一部の実施形態では、３０％未満の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３０％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２５％〜３０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２０％〜２５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１５％〜２０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１０％〜１５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５％〜１０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、０％〜５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％超の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜４０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、４０％〜４５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、４５％〜５０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５０％〜５５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５５％〜６０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、６５％〜７０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、７０％〜７５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、７５％〜８０％の相同性のカットオフを使用する。
【０３５５】
当業者は、この目的のため既知のアレルゲンの適切なデータベースを同定かつ使用することができる。一部の実施形態では、データベースは、１超のデータベースの供給源からタンパク質を選択することによるカスタムメイドである。一部の実施形態では、カスタムデータベースは、食品アレルギーの研究および供給源プログラム（Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／）、ＵＮＩＰＲＯＴの注釈（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ａｌｌｅｒｇｅｎ）、およびアレルギータンパク質の構造上のデータベース（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＳＤＡＰ，  ｆｅｒｍｉ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ＳＤＡＰ／ｓｄａｐ＿ｌｎｋ．ｈｔｍｌ）により収集されたプールされたアレルゲンのリストを含む。このデータベースは、ＩＵＩＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｉｔｉｅｓ）（ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ／）によって現在認識されている全てのアレルゲン、ならびに公称のない多数の追加的なアレルゲンを含む。一部の実施形態では、データベースは、既知のデータベースで入手可能な既知のアレルゲンタンパク質のサブセットを含み、すなわちこのデータベースは、既知のアレルゲンタンパク質のうちカスタム選択したサブセットである。一部の実施形態では、既知のアレルゲンのデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少なくとも１，１００個のタンパク質、少なくとも１，２００個のタンパク質、少なくとも１，３００個のタンパク質、少なくとも１，４００個のタンパク質、少なくとも１，５００個のタンパク質、少なくとも１，６００個のタンパク質、少なくとも１，７００個のタンパク質、少なくとも１，８００個のタンパク質、少なくとも１，９００個のタンパク質、または少なくとも２，０００個のタンパク質を含む。一部個の実施形態では、既知個のアレルゲン個のデータベースは、１００〜５００個のタンパク質、２００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、または１，０００〜２，０００個のタンパク質を含む。
【０３５６】
一部の実施形態では、タンパク質の異なる長さの連続アミノ酸ウインドウ（たとえば、アミノ酸７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、８、または６個のウインドウ）のすべて（または選択したサブセット）を、アレルゲンデータベースに対して試験して、１００％の同一性、９５％以上の同一性、９０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８０％以上の同一性、７５％以上の同一性、７０％以上の同一性、６５％以上の同一性、６０％以上の同一性、５５％以上の同一性、または５０％以上の同一性マッチを有するペプチド配列を、潜在的アレルゲン性のさらなる試験のために同定する。
【０３５７】
タンパク質のアレルゲン性を予測する別の方法は、ヒト由来のタンパク質に対するタンパク質の相同性を評価することである。ヒトの免疫系は、定期的に、アレルゲン性の可能性がある多数のタンパク質に曝露されており、宿主の身体のタンパク質と外来性タンパク質とのあいだを区別する内在的な能力を有する。この能力の正確な性質はすべて明らかになっているわけではないが、身体が自己と非自己とを区別できない結果として生じる多くの疾患（たとえば関節炎）が存在する。しかしながら、基本的な解析は、ヒトのタンパク質に対してある度合いの配列相同性を共有するタンパク質が、免疫応答を誘発しにくいという点である。特に、既知のアレルゲン性メンバー（トロポミオシン、パルブアルブミン、カゼイン）を含む一部のタンパク質ファミリーでは、既知のアレルゲン性タンパク質と比較してヒトの対応物に対してより多くの配列相同性を有するタンパク質は、アレルゲン性ではないと考えられることが示されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍｃａｌ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２０  （２００７）：  １３９９−１４０５）。所定のタンパク質に関して、ヒトの相同性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用したグローバル―ローカルアライメントから、ヒトタンパク質のデータベース（たとえばＵＮＩＰＲＯＴデータベース）に対するタンパク質の最大のパーセント同一性を決定することにより、測定できる。Ｊｅｎｋｉｎｓら（Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２０  （２００７）：  １３９９−１４０５）によると、ヒトタンパク質に対して約６２％超の配列同一性を有するタンパク質はアレルゲン性である可能性は低い。当業者は、たとえば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索することにより、この目的に関して既知のヒトタンパク質の適切なデータベースを同定かつ使用することができる。一部の実施形態では、データベースは、１つ超のデータベース供給源からタンパク質を選択することによるカスタムメイドである。当然データベースは、必ずしも包括的である必要はない。一部の実施形態では、データベースはヒトタンパク質のサブセットを含み、すなわち、データベースは、ヒトタンパク質のカスタム選択したサブセットである。一部の実施形態では、ヒトのタンパク質のデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４０���個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少なくとも２，０００個のタンパク質、少なくとも３，０００個のタンパク質、少なくとも４，０００個のタンパク質、少なくとも５，０００個のタンパク質、少なくとも６，０００個のタンパク質、少なくとも７，０００個のタンパク質、少なくとも８，０００個のタンパク質、少なくとも９，０００個のタンパク質、または少なくとも１０，０００個のタンパク質を含む。一部個の実施形態では、データベースは、１００〜５００個のタンパク質、２００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、１，０００〜２，０００個のタンパク質、１，０００〜５，０００個のタンパク質、または５，０００〜１０，０００個のタンパク質を含む。一部の実施形態では、データベースは、全ての既知のヒトタンパク質の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％を含む
【０３５８】
タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトのタンパク質と少なくとも２０％相同である。一部の実施形態では、少なくとも３０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも４０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも５０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも６０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも７０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも８０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも６２％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも２０％の相同性から少なくとも３０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも３０％の相同性から少なくとも４０％の相動性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも５０％の相同性から少なくとも６０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも６０％の相同性から少なくとも７０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、少なくとも７０％の相同性から少なくとも８０％の相同性のカットオフを使用する。
【０３５９】
熱安定性アッセイ
本明細書中で使用されるように、「安定な」タンパク質は、関心対象タンパク質の生物物理学的（たとえば溶解度）、生物学的（たとえば消化性）、または組成上（たとえばロイシンアミノ酸の比率）の性質を変化させる変化（たとえばアンフォールディング、酸化、凝集、加水分解など）に抵抗性であるタンパク質である。
【０３６０】
タンパク質の安定性は当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して測定でき、本明細書中に開示され、閾値を超える安定性を有するタンパク質を選択できる。一部の実施形態では、タンパク質は、乳清タンパク質の安定性と比較可能か、またはそれより良好な熱安定性を示すように選択される。熱安定性は、タンパク質の有効期間の予測を支援できる特性である。アッセイの一部の実施形態では、タンパク質試料の安定性は、極端な温度に曝露した後の凝集形成を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してモニターすることにより決定される。試験されるタンパク質の水性試料を、９０℃の加熱ブロックに配置し、試料を、ＳＥＣ解析のため、０分後、１分後、５分後、１０分後、３０分後、および６０分後に採取する。タンパク質を、２１４ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより検出し、凝集物を、関心対象タンパク質より早く溶出するピークとして特徴づける。ピーク領域に全体的な変化がなければ、加熱処理の際のタンパク質の沈殿がないことを示す。乳清タンパク質を、このようなアッセイで９０℃に曝露した場合、〜８０％の凝集物を休息に形成することが示されている。
【０３６１】
一部の実施形態では、タンパク質の熱安定性は、温度を増加させてタンパク質が変性する際に形成される凝集タンパク質と結合する疎水性色素（たとえばＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）熱シフト安定性アッセイキット、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、２５℃〜９５℃でゆっくりと試料を加熱することにより決定する（Ｎｉｅｓｅｎ，  Ｆ．  Ｈ．，  Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，  Ｈ．  ＆  Ｖａｄａｄｉ，  Ｍ．，  ２００７    Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｐｐ．  ２２１２−２２２１）。結合すると、色素の蛍光が顕著に増加し、これを、ｒｔＰＣＲ機器により記録して、タンパク質の融解曲線として表す（Ｌａｖｉｎｄｅｒ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｈａｒｉ，  Ｓ．  Ｂ．，  Ｓｕｉｌｌｉｖａｎ，  Ｂ．  Ｊ．  ＆  Ｍａｇｉｌｅｒｙ，  Ｔ．  Ｊ．，  ２００９．  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ：  Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ，  Ｒａｐｉｄ  Ｄｙｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ｐｐ．  ３７９４−３７９５）。熱シフトが完全となった後、試料を、不溶性沈殿物に関して試験し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに解析する
【０３６２】
溶解度のアッセイ
本明細書中に開示されるタンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は可溶性である。溶解度は、当技術分野で公知のいずれかの方法により測定できる。一部の実施形態では、溶解度は、遠心濃縮、次いでタンパク質濃縮アッセイを行うことにより実験される。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中のタンパク質試料を、２つの方法、すなわちＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（ブラッドフォード）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびビシンコニン酸（ＢＣＡ］タンパク質アッセイ（ＳｉｇｍａｄＡｌｄｒｉｃｈ）を使用するプロトコルに従ってタンパク質濃度に関して試験する。これらの測定に基づき、１０ｍｇのタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３ｋＤａの遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加する。試料を、３０分間１０，０００×ｇの遠心により濃縮する。最終的な濃縮した試料を、沈殿したタンパク質に関して試験し、次いで、２つの方法、ブラッドフォードおよびＢＣＡを使用して上記のようにタンパク質濃度に関して試験する。
【０３６３】
一部の実施形態では、タンパク質は、生理的ｐＨで、少なくとも５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌの最終的な溶解限度を有する。一部の実施形態では、タンパク質は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％様、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、または９９．５％超可溶であり、生理的ｐＨで５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ、または３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ超の濃度で沈殿したタンパク質は観察されない。一部の実施形態では、タンパク質の溶解度は、乳清（１２．５  ｇ／Ｌ；  Ｐｅｌｅｇｒｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ．  Ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３８  （２００５）  ７７−８０）およびダイズ（１０  ｇ／Ｌ；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＯＣＳ  ８０（１）（２００３）  ８５−９０）の溶解限度を実験する試験で典型的に報告される溶解度よりも高い。
【０３６４】
真核生物タンパク質は、しばしばグリコシル化されており、タンパク質に付着している炭水化物鎖は、様々な機能を有している。Ｎ結合型およびＯ結合型グリコシル化は、タンパク質で起こるグリコシル化のうち最も一般的な２つの形態である。Ｎ結合型グリコシル化は、タンパク質のアミノ酸残基の窒素原子に対する糖分子の結合である。Ｎ結合型グリコシル化は、アスパラギンおよびアルギニンの残基で起こる。Ｏ結合型グリコシル化は、タンパク質のアミノ酸残基の酸素原子に対する糖分子の結合である。Ｏ結合型グリコシル化は、スレオニンおよびセリンの残基で起こる。
【０３６５】
グリコシル化タンパク質は、しばしば、その非グリコシル化型よりも可溶性である。タンパク質薬剤の観点から、適切なグリコシル化は、通常、高い活性、適切な抗原結合性、血液中での良好な安定性などをもたらす。しかしながら、グリコシル化は必然的に、タンパク質が糖部位を「有する」ことを意味する。このような糖部分は、組み換えタンパク質を含む本開示のタンパク質の有用性を低下させ得る。たとえば、実施例に示されるように、同一のタンパク質のグリコシル化型と非グリコシル化型の消化の比較から、非グリコシル化型が、グリコシル化型より迅速に消化されることが示される。これらの理由のため、一部の実施形態では、本開示に係る栄養性タンパク質は、グリコシル化が少ないか、またはグリコシル化を全く含まない。たとえば、一部の実施形態では、タンパク質は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、総アミノ酸残基に対する非グリコシル化アミノ酸の比率を含む。一部の実施形態では、タンパク質はグリコシル化を全く含まない。
【０３６６】
一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、産生または単離された後に脱グリコシル化される。グリコシル化の少ないまたは全くグリコシル化のないタンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法により作製できる。たとえば、酵素的および／または化学的な方法を使用できる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （２００３）  ３７６，  ｐ３３９−３５０．）。酵素は、Ｎ結合型およびＯ結合型のオリゴ糖の除去のため、研究用に商業的に産生される。化学的な方法は、Ｎ結合型およびＯ結合型のペプチド−糖類結合を選択的に切断するためのトリフルオロメタンスルホン酸の使用を含む。この方法は、しばしば、酵素的方法を使用するよりも完全な脱グリコシル化をもたらす。
【０３６７】
他の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、宿主生物によるグリコシル化が少ない、または全くないように産生される。ほとんどの細菌および他の原核生物は、タンパク質、特に異種タンパク質をグリコシル化する能力が非常に限定的である。よって、本開示の一部の実施形態では、タンパク質は、組み換えタンパク質のグリコシル化レベルが低いか、または全くないように微生物中で組み換えにより作製される。一部の実施形態では、組み換えタンパク質のグリコシル化レベルは、それが由来する生物中で起こるタンパク質のグリコシル化レベルよりも低い。タンパク質のグリコシル化は、宿主生物に基づき変動でき、言い換えると、一部の宿主は、１つまたは複数の他の宿主と比較してより多くのグリコシル化を産生し、対して他の宿主は、１つまたは複数の他の宿主と比較して少ないグリコシル化を産生する。グリコシル化の量の差異は、たとえば、存在するグリコシル化の質量、および／または存在するグリコシル化部位の総数に基づき測定できる。
【０３６８】
毒性および抗栄養性（Ｎｕｔｒｉｃｉｔｙ）アッセイ
ほとんどの実施形態では、タンパク質が不適切に高い毒性を示さないことが好ましい。よって、一部の実施形態では、タンパク質の潜在的な毒性が評価される。これは、当技術分野で公知のいずれかの適切な方法により行うことができる。一部の実施形態では、毒性スコアは、既知の毒性タンパク質（たとえばＵＮＩＰＲＯＴデータベースから同定した毒性タンパク質）のデータベースに対するタンパク質のパーセント同一性を決定することにより計算する。既知の毒素のデータベースに対する対象のタンパク質のグローバル−グローバルアライメントは、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して実施される。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、既知の毒素と３５％未満相同である。一部の実施形態では、３５％未満の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３０％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２５％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２０％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１５％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１０％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、０％〜３５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％超の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜４０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜４５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜５０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜５５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜６０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜７０％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜７５％の相同性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜８０％の相同性のカットオフを使用する。当業者は、たとえばＵＮＩＰＲＯＴデータベース（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索することにより、この目的のため既知の毒素の適切なデータベースを同定かつ使用することができる。一部の実施形態では、このデータベースは、１超のデータベース供給源由来の毒素として同定されたタンパク質を選択することによるカスタムメイドである。一部の実施形態では、データベースは、既知の毒性タンパク質のサブセットを含み、すなわちデータベースは、既知の毒性タンパク質のカスタム選択されたサブセットである。一部の実施形態では、毒性タンパク質のデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少なくとも２，０００個のタンパク質、少なくとも３，０００個のタンパク質、少なくとも４，０００個のタンパク質、少なくとも５，０００個のタンパク質、少なくとも６，０００個のタンパク質、少なくとも７，０００個のタンパク質、少なくとも８，０００個のタンパク質、少なくとも９，０００個のタンパク質、または少なくとも１０，０００個のタンパク質を含む。一部個の実施形態では、データベースは、１００〜５００個のタンパク質、２００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、１，０００〜２，０００個のタンパク質、１，０００〜５，０００個のタンパク質、または５，０００〜１０，０００個のタンパク質を含む。
【０３６９】
抗栄養性および抗栄養素
一部の実施形態では、タンパク質は、抗栄養性活性（「抗栄養性」）を示さない、すなわち食物からの栄養素の吸収を妨害する可能性を有するタンパク質でないことが好ましい。このような抗栄養性を引き起こす抗栄養性配列の例として、プロテアーゼ阻害剤があり、これは、腸でトリプシン、ペプシン、および他のプロテアーゼの作用を阻害し、タンパク質の消化およびその後の吸収を防止する。
【０３７０】
本明細書中、抗栄養性配列を実質的に含まない単離型栄養性ポリペプチドを含む配合物を開示する。一部の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、約１未満、約０．５未満、または約０．１未満の抗栄養性類似性スコアを有する。栄養性ポリペプチドは、約１０ｇ超の量で配合物に存在し、配合物は、抗栄養性因子を実質的に含まない。配合物は、体積が約５００ｍｌ以下の液体、半液体、もしくはゲル、または質量が約２００ｇ以下の固体もしくは半固体として存在する。栄養性ポリペプチドは、たとえば、９０％未満の同一性、または８５％未満、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは５％未満同一などの、セルピンファミリーポリペプチドのメンバーなどのプロテアーゼ阻害剤と低い相同性を有し得る。
【０３７１】
よって、一部の実施形態では、タンパク質の潜在的な抗栄養性を評価する。これは、当技術分野で公知であるいずれかの適切な方法で行うことができる。一部の実施形態では、抗栄養性スコアは、既知のプロテアーゼ阻害剤（たとえばＵＮＩＰＲＯＴデータベースから同定したプロテアーゼ阻害剤）のデータベースに対するタンパク質のパーセント同一性を決定することにより計算される。既知のプロテアーゼ阻害剤のデータベースに対する対象のタンパク質のグローバル‐グローバルアライメントは、タンパク質が既知の抗タンパク質と相同であるかどうかを同定するために、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して実施される。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、解析のために使用されるデータベース中の既知のいずれかの抗タンパク質（たとえば既知のいずれかのプロテアーゼ阻害剤）と３５％未満の全体的相同性を有する。一部の実施形態では、３５％未満の同一性のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３０％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２５％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、２０％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１５％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、１０％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、５％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、０％〜３５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％超のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜４０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜４５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜５０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜５５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜６０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜７０％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜７５％のカットオフを使用する。一部の実施形態では、３５％〜８０％のカットオフを使用する。当業者は、たとえば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索することにより、この目的のための既知のプロテアーゼ阻害剤の適切なデータベースを同定かつ使用することができる。一部の実施形態では、データベースは、１超のデータベースの供給源からプロテアーゼ阻害剤として同定されたタンパク質を選択することによるカスタムメイドである。一部の実施形態では、データベースは、データベースで入手可能な既知のプロテアーゼ阻害剤のサブセットを含み、すなわちデータベースは、既知のプロテアーゼ阻害剤のカスタム選択したサブセットである。一部の実施形態では、既知のプロテアーゼ阻害剤のデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少なくとも１，１００個のタンパク質、少なくとも１，２００個のタンパク質、少なくとも１，３００個のタンパク質、少なくとも１，４００個のタンパク質、少なくとも１，５００個のタンパク質、少なくとも１，６００個のタンパク質、少なくとも１，７００個のタンパク質、少なくとも１，８００個のタンパク質、少なくとも１，９００個のタンパク質、または少なくとも２，０００個のタンパク質を含む。一部個の実施形態では、既知個のプロテアーゼ阻害剤タンパク質個のデータベースは、１００〜５００個のタンパク質、２００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、５００〜１，０００個のタンパク質、または１，０００〜２，０００個のタンパク質、または２，０００〜３，０００個のタンパク質を含む。
【０３７２】
他の実施形態では、いくらかの度合いのプロテアーゼ阻害活性を示すンパク質を使用する。たとえば、一部の実施形態では、このようなタンパク質は、栄養性タンパク質を、タンパク質がＧＩ管内のより長い距離を移動後に消化されるように消費する場合、プロテアーゼ消化を遅らせ、このように吸収を遅らせることから有用であり得る。たとえば、一部の実施形態では、タンパク質は胃の消化を阻害するが、腸の消化を阻害するものではない。Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｂら（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｆｏｏｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ４６  （２００８：  Ｓ７１−Ｓ９７））は、可能性がある食品タンパク質の安全性を評価する際に、既知の毒性および抗タンパク質の両方を回避すべきことを示唆している。タンパク質の一部の実施形態では、好ましくは、タンパク質は、本明細書中に定義されるように、既知の毒性タンパク質のデータベースに対して好ましい低レベルの全体的相同性、および／または既知の抗栄養性タンパク質（たとえばプロテアーゼ阻害剤）のデータベースに対して好ましい低レベルの全体的相同性を有する。
【０３７３】
栄養阻害物質
栄養阻害物質（１つまたは複数）を欠いた栄養組成物を提供する。栄養阻害物質は通常、タンパク質以外の化合物であり、典型的に植物系の食品で見出され、有害作用および一部の状況では特定の健康上の利点の両方を有することが見出されている。たとえば、フィチン酸、レクチン、フェノール類化合物、サポニン、および酵素阻害剤は、栄養素の利用率を低減し、増殖の阻害を引き起こすことが示されており、フィトエストロゲンおよびリグナンは、不妊症の問題と関連している。他方で、フィチン酸、レクチン、フェノール類化合物、アミラーゼ阻害剤、およびサポニンは、血中グルコースを低下させ、デンプン食品および／または血漿コレステロールおよびトリグリセリドに対するインスリン応答を減少させることが示されている。さらに、フィチン酸、フェノール類、サポニン、プロテアーゼ阻害剤、フィトエストロゲン、およびリグナンは、癌のリスクの減少に関連している。
【０３７４】
少なくとも１分間９０℃超の温度を有する蒸気または熱気を含む熱処理で食品生成物を処理することと、処理した食品生成物を、単離型栄養性ポリペプチドを含む組成物と組み合わせることとにより、食品生成物中の抗栄養性因子の量を減少させる方法を提供する。任意に、熱処理のステップは、サポニン、レクチン、およびプロラミン、プロテアーゼ阻害剤、またはフィチン酸などの少なくとも１つの抗栄養性因子を分解する。
【０３７５】
抗栄養性因子は、以下のタンパク質組成物で検出されている。フィチン酸：ＷｈｅｅｌｅｒおよびＦｅｒｒｅｌ（Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｅ．  Ｌ．，  Ｆｅｒｒｅｌ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  １９７１，  ４８，  ３１２）の手順は、３％のトリクロロ酢酸に抽出されたフィチン酸の決定に使用される。ラフィノースファミリーオリゴ糖：タンパク質の試料を、６〜８時間、ソックスレー装置を使用して７０％エタノールで抽出し、Ｔａｎａｋａら（Ｔａｎａｋａ，  Ｍ．，  Ｔｈａｎａｎｕｎｋｕｌ，  Ｄ．，  Ｌｅｅ，  Ｔ．  Ｃ．，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｃ．  Ｏ．，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  １９７５，  ４０，  １０８７−１０８８）の手順に従って抽出物中のラフィノースおよびスタキオースの定量的決定のために薄膜クロマトグラフィーを使用する。トリプシン阻害剤：Ｋａｋａｄｅらの方法（Ｋａｋａｄｅ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｒａｃｋｉｓ，  Ｊ．  Ｊ．，  ＭｃＧｈｅｅ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｐｕｓｋｉ，  Ｇ．，  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  １９７４，  ５１，  ３７６−８２）は、未加工の試料および処置済みの試料のトリプシン阻害剤活性の決定に使用される。１トリプシン阻害剤単位（ＴＩＵ）は、１０分間での４１０ｎｍの吸光度の０．０１の減少として定義され、データは、ＴＩＵ＊ｍｇ−１として表される。アミラーゼ阻害剤：阻害剤は、Ｂａｋｅｒらの手順（Ｂａｋｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｗｏｏ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｔｈｒｏｎｅ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｆｉｎｎｙ，  Ｐ．  Ｌ．，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  １９９１，  ２０，  ５３±６０）に従って０．１５ｍのＢａＣｌで抽出され、Ｈｕｅｓｉｎｇらの方法（Ｈｕｅｓｉｎｇ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｓｈａｄｅ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｍｕｒｄｏｋ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９９１，  ９６，  ９９３±９９６）によりアッセイされる。１アミラーゼ阻害剤単位（ＡＩＵ）は、１分あたり１ｍｇのマルトース一水和物を生成するアミラーゼの一部の５０％の阻害を得る量として定義される。Ｐａｒｅｄｅｓ−Ｌｏｐｅｚらの手順（Ｐａｒｅｄｅｓ−Ｌｏｐｅｚ，  Ｏ．，  Ｓｃｈｅｖｅｎｉｎ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｇｕｅｖａｒａ−Ｌａｒａ，  Ｆ．，  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  １９８９，  ３１，  １２９−１３７）は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用するレクチンの抽出物に適用される。試料抽出物中のレクチンのヘマグルニチン活性（ＨＡ）は、Ｋｏｒｔｔ（Ｋｏｒｔｔ，  Ａ．  Ａ．  （Ｅｄ．），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８４，  １３８，  ５１９）に従って決定される。トリプシン処理したヒトの赤血球細胞（Ａ、Ｂ、およびＯ）懸濁物は、ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ（Ｌｉｓ，  Ｈ．，  Ｓｈａｒｏｎ，  Ｎ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９７２，  ２８，  ３６０±３６８）に従って調製される。ＨＡは、凝集陽性を与える最も高い希釈の逆数として表される。タンニン：タンニン含有量は、ＡＯＡＣの手順（Ｈｅｌｒｉｃｈ，  Ｋ．  （Ｅｄ．），  ＡＯＡＣ，  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＶＡ  ���９９０）に従ってＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ試薬によりタンニン酸として決定される。
【０３７６】
電荷アッセイおよび溶媒和のスコアリング
タンパク質の有用性を高めることのできる１つの特性は、その電荷（またはアミノ酸あたりの電荷）である。より高い電荷を有するタンパク質は、一部の実施形態では、高い溶解度、高い安定性、凝集への抵抗性、および望ましい味プロファイルなどの望ましい特徴を有する。たとえば、高い溶解度を示す荷電タンパク質は、比較的低い容量の溶液中高い濃度のタンパク質を含むことによって、単位容量あたり大量のタンパク質栄養素を送達する飲料または液体配合物に配合できる。高い溶解度を示す荷電タンパク質は、たとえば、ユーザ（たとえば運動選手）が身体活動の前、最中、または後にタンパク質の摂取を欲するスポーツドリンクまたはリカバリードリンクに有用とすることができる。高い溶解度を示す荷電タンパク質はまた、対象（たとえば患者または高齢者）が、タンパク質栄養を必要としているが、固形食品または大量の液体を摂取することができない臨床状況に特に有用とすることができる。
【０３７７】
たとえば、ｐＨ７でポリペプチドの実効電荷（電荷Ｐ）は、以下の式
電荷Ｐ＝−０．００２−（Ｃ）（０．０４５）−（Ｄ）（０．９９９）−（Ｅ）（０．９９８）＋（Ｈ）（０．０９１）＋（Ｋ）（１．０）＋（Ｒ）（１．０）−（Ｙ）（−０．００１）
であって、式中、ポリペプチドにおいて、Ｃが、システイン残基の数であり、Ｄが、アスパラギン酸残基の数であり、Ｅが、グルタミン酸残基の数であり、Ｈが、ヒスチジン残基の数であり、Ｋがリジン残基の数であり、Ｒが、アルギニン残基の数であり、およびＹが、チロシン残基の数である、式を使用して計算できる。ポリペプチドのアミノ酸あたりの酸の電荷（電荷Ａ）は、アミノ酸残基（Ｎ）の数により実効電荷（電荷Ｐ）を除算することにより、すなわち電荷Ａ＝電荷Ｐ／Ｎにより計算できる（Ｂａｓｓｉ  Ｓ  （２００７），  ‘‘Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  Ｐｙｔｈｏｎ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．’’  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ３（１１）：  ｅ１９９．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００３０１９９参照）。
【０３７８】
所定のタンパク質の親水性および潜在的な溶解度を評価する１つの計量は、溶媒和スコアである。溶媒和スコアは、各残基が独立して溶媒和する場合の、配列中の残基総数により正規化された、すべてのアミノ酸側鎖の溶媒和の総自由エネルギー（すなわち気相から希釈溶液までの移行に関連する自由エネルギーの変化）として定義される。側鎖の溶媒和自由エネルギーは、１の真空誘電率と８０の水誘電率とのあいだの静電エネルギーの差（ポアソン＝ボルツマン方程式を解くことによる）、ならびに線形溶媒近接可能表面積モデル（ｌｉｎｅａｒ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｍｏｄｅｌ）（Ｄ．  Ｓｉｔｋｏｆｆ，  Ｋ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ，  Ｂ．  Ｈｏｎｉｇ．  ‘‘Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｓ’’．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  ９８，  １９９４）を使用して非極性のファンデルワールスエネルギーをコンピューターによって計算することにより見出される。イオン化可能な側鎖（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＴｙｒ）を有するアミノ酸では、平均溶媒和自由エネルギーは、特定のｐＨでのそれぞれのイオン化状態の相対的確率に基づき使用される。溶媒和スコアは０で始まり、負の値であり続け、溶媒和スコアが負であればあるほど、タンパク質はより親水性で潜在的に可溶性となると予測される。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、少なくとも（ｌｅｓｓ  ａｔ）ｐＨ７で−１０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−１５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−２０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−２５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−３０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−３５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７で−４０以下の溶媒和スコアを有する。
【０３７９】
溶媒和スコアは、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式
【数１】
2016537402.tif 000005
により定義される共役塩基（［Ａ−］）に対する非解離の弱酸（［ＨＡ］）のモル比率のｐＨ依存性によりｐＨの関数である。
【０３８０】
すべての弱酸は、共役塩基と比較して異なる溶媒和自由エネルギーを有し、所定のＰＨで溶媒和スコアを計算する場合、所定の残基に使用される溶媒和自由エネルギーは、これら２つの値の加重平均である。
【０３８１】
よって、タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−１０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−１５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−２０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−２５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−３０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−３５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、酸性ｐＨで−４０以下の溶媒和スコアを有する。
【０３８２】
よって、タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−１０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−１５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−２０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−２５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−３０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−３５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、塩基性ｐＨで−４０以下の溶媒和スコアを有する。
【０３８３】
よって、タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−１０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−１５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−２０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−２５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−３０以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−３５以下の溶媒和スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、２−３、３−４、４−５、５−６、６−７、７−８、８−９、９−１０、１０−１１、および１１−１２から選択される範囲のｐＨで−４０以下の溶媒和スコアを有する。
【０３８４】
凝集アッセイおよび凝集のスコアリング
一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、凝集への抵抗性を示し、たとえば高温（たとえば５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃）で８０％未満の凝集、１０％の凝集を示し、または検出可能な凝集を示さない。
【０３８５】
本明細書中に開示される安定なタンパク質の１つの利点は、使用前に長期間、一部の例では、冷蔵または冷却する必要がなく、保存することができることである。一部の実施形態では、タンパク質は乾燥型へと処理される（たとえば凍結乾燥により）。一部の実施形態では、タンパク質は凍結乾燥時に安定である。一部の実施形態では、このような凍結乾燥したタンパク質は、再構成の際に安定性を維持する（たとえば液体配合物）。
【０３８６】
凝集スコアは、所定のタンパク質の疎水性および凝集の可能性を評価するための一次配列に基づく測定基準である。疎水性残基に正の値および親水性残基に負の値を与えるＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性スケール（Ｋｙｔｅ  Ｊ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ  （Ｍａｙ  １９８２）．  ‘‘Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ’’．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７  （１）：  １０５−３２）を使用して、タンパク質配列の平均疎水性を、５個の残基の移動平均を使用して計算する。凝集スコアは、０超の値に対する曲線下の面積を決定し、タンパク質の全長により正規化することにより、得られたプロットから導きだされる。下部の図は、凝集が、水を排除して表面曝露を低減させるために２つ以上の疎水性区画が集合した結果であり、タンパク質が凝集する可能性は、その疎水性（すなわち凝集傾向）の残基がどのように密に詰め込まれるかの関数である。凝集スコアは０で始まり、正の値であり続け、凝集スコアが小さくなると疎水性が少なくなり、タンパク質が凝集する傾向が潜在的に少なくなると予測される。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は２以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は１．５以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は１以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．９以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．８以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．７以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．６以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．５以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．４以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．３以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．２以下の凝集スコアを有する。タンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は０．１以下の凝集スコアを有する。
【０３８７】
場合によって、可溶性の発現は、タンパク質の量および／または収率を増大させることができ、タンパク質の単離および精製の１つまたは複数を促進させることができるため、望ましい。一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、宿主生物で可溶性に発現されている。溶媒和スコアおよび凝集スコアを使用して、宿主生物の組み換えタンパク質の可溶性発現を予測できる。実施例８に示されるように、本開示は、−２０以下の溶媒和スコアおよび０．７５以下の凝集スコアを有するタンパク質は、特定の大腸菌発現系で組み換え的に発現される可能性がより高いことを示唆する証拠を提供する。さらに、このデータはまた、−２０以下の溶媒和スコアおよび０．５以下の凝集スコアを有するタンパク質が、この系で可溶性に発現される可能性がより高いことを示唆する。よって、一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、−２０以下の溶媒和スコアを有する。一部の実施形態では、栄養性タンパク質は、０．７５以下の凝集スコアを有する。一部の実施形態では、栄養性タンパク質は、０．５以下の凝集スコアを有する。一部の実施形態では、タンパク質は、−２０以下の溶媒和スコアおよび０．７５以下の凝集スコアを有する。一部の実施形態では、タンパク質は、−２０以下の溶媒和スコアおよび０．５以下の凝集スコアを有する。
【０３８８】
味および口あたりの特徴
特定の遊離アミノ酸および遊離アミノ酸の混合物は、苦いまたは他の望ましくない味を有することが知られている。さらに、一般的なタンパク質（たとえば乳清およびダイズ）の加水分解物は、しばしば苦くまたは望ましくない味を有する。一部の実施形態では、本明細書中に開示かつ記載されるタンパク質は、苦いまたは望ましくない味を有するものではない。一部の実施形態では、本明細書中に開示かつ記載されるタンパク質は、遊離アミノ酸、遊離アミノ酸の混合物、および／またはタンパク質加水分解物の少なくとも１つと比較して許容可能な味を有する。一部の実施形態では、本明細書中に開示かつ記載されるタンパク質は、少なくとも１つの乳清タンパク質と等しい、またはそれを超える味を有する。
【０３８９】
タンパク質は、５つの確立された味の様式：甘味、酸味、苦み、塩味、および旨味全体に及ぶ味を有することが知られている。脂肪は、６番目のでがあると考えることができる。特定のタンパク質（またはそれが不足したもの）の味は、タンパク質の一次構造、荷電側鎖の存在、ならびに電子および立体構造の特性を含むいくつかの要因に起因し得る。一部の実施形態では、本明細書中に開示かつ記載されるタンパク質は、望ましい味（たとえば甘味、塩味、旨味）を有し、かつ／または望ましくない味（たとえば苦味、酸味）を有さないように設計される。この観点から、「設計」は、たとえば、望ましい味の特性を得る特性を具体化する食用に適した種のタンパク質を選択することと、望ましい味特性を有する食用に適した種のポリペプチドの変異タンパク質を作製することとを含む。たとえば、タンパク質は、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２−Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー）または旨味受容体（Ｔ１Ｒ１−Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー、ｍＧｌｕＲ４、および／またはｍＧｌｕＲ１）などの特定の味受容体と相互作用するように設計できる。さらに、タンパク質は、苦味受容体（Ｔ２Ｒ受容体）などの他の味受容体と相互作用しないように、またはこの相互作用を減らすように設計できる。
【０３９０】
本明細書中に開示かつ記載されるタンパク質はまた、摂取する際に口で異なる物理的な感覚も誘発する場合があり、これは場合によって「口あたり」と呼ばれる。タンパク質の口あたりは、タンパク質の一次構造、荷電側鎖の存在、ならびに電子および立体構造の特性を含む１つまたは複数の要因によるものとすることができる。一部の実施形態では、タンパク質は、摂取する際に、バターまたは脂肪のような口あたりを誘発する。
【０３９１】
栄養組成物および配合物
本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質は、少なくとも１つの第２の成分と組み合わせて組成物を形成することができる。一部の実施形態では、組成物中のアミノ酸の供給源のみが、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質である。このような実施形態では、組成物のアミノ酸組成は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質のアミノ酸組成と同じである。一部の実施形態では、組成物は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質および少なくとも１つの第２のタンパク質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの第２のタンパク質は、本明細書中に開示される第２のタンパク質であり、他の実施形態では、少なくとも１つの第２のタンパク質は、本明細書中に開示されるタンパク質ではない。一部の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の本明細書中に開示のタンパク質を含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書中に開示のタンパク質ではない、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のタンパク質を含む。一部の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のタンパク質を含み、かつ組成物が、本明細書中に開示されるタンパク質ではない、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のタンパク質を含む。
【０３９２】
同様に、本明細書中に記載される栄養性ポリペプチドを含む配合物を提供する。一態様では、単細胞生物分泌型ポリペプチド栄養性ドメインを含む配合物を提供する。たとえば、ポリペプチド栄養性ドメインは、ポリペプチド栄養性メインを含む単細胞生物分泌ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸に対応しないＮ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単細胞生物分泌型ポリペプチドを含むアミノ酸配列は、食用に適した種のポリペプチド配列であり、Ｎ末端アミノ酸は、一般的な食用に適した種のアミノ酸である。さらにまたはあるいは、ポリペプチド栄養性ドメインは、ポリペプチド栄養性ドメインを含む単細胞生物分泌型ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸に対応しないＣ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単細胞生物分泌型ポリペプチドを含むアミノ酸配列は、食用に適した種のポリペプチド配列であり、Ｃ末端アミノ酸は、一般的な食用に適した種のアミノ酸である。よって、一部の実施形態では、分泌ポリペプチドの栄養性ドメインは、相同な食用に適した種のポリペプチドよりもアミノ酸少なくとも１個ぶん短い。栄養性ドメインは、相同な食用に適した種のペプチドの約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または５％未満の長さとすることができる。他の実施形態では、ポリペプチド栄養性ドメインは、ポリペプチド栄養性ドメインを含む単細胞生物分泌型ポリペプチドの約１％〜約９９％からなる。本明細書中に記載されるように、ポリペプチド栄養性ドメインは、一般的に、ポリペプチド栄養性ドメインを含むより大きなポリペプチドが好ましい。ポリペプチド栄養性ドメインは、質量に基づき、ポリペプチドを含む大きなポリペプチドより多くの栄養素を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチド栄養性ドメインは、溶解度の増加および良好な有効期間の安定性など、ポリペプチドを含む大きなポリペプチドと比較して望ましい特性を提供し得る。
【０３９３】
一部の実施形態では、先の段落に記載される組成物は、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、および少なくとも１つの遊離アミノ酸のうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのポリペプチドおよび少なくとも１つのペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は少なくとも１つのポリペプチドおよび少なくとも１つの遊離アミノ酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの遊離アミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、および／または少なくとも１つの遊離アミノ酸は、１）分枝鎖アミノ酸、２）ロイシン、および３）必須アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、および／または少なくとも１つのアミノ酸は、１）分枝鎖アミノ酸、２）ロイシン、および３）必須アミノ酸から選択されるアミノ酸からなる。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾されたアミノ酸または非標準的なアミノ酸を含む。修飾されたアミノ酸は、カルボキシ末端、アミノ末端、および／または側鎖の１つまたは複数に対する修飾を有するアミノ酸を含む。非標準的なアミノ酸は、たとえばカルボキシル化グルタミン酸塩、ヒドロキシプロリン、またはハイプシンといった、タンパク質の翻訳後修飾により形成されるアミノ酸から選択される。他の非標準的なアミノ酸は、タンパク質で見出されていない。例として、ランチオニン、２‐アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、γ−アミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリンが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤアミノ酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＬアミノ酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤアミノ酸と１つまたは複数のＬアミノ酸との混合物を含む。
【０３９４】
ポリペプチド、ペプチド、および遊離アミノ酸のうちの少なくとも１つを組成物に添加することにより、組成物に存在するアミノ酸の合計に対する分枝鎖アミノ酸、ロイシン、および必須アミノ酸のうちの少なくとも１つの比率を、増加させることができる。
【０３９５】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの炭水化物を含む。「炭水化物」は、糖または糖のポリマーを指す。用語「糖」、「多糖」、「炭水化物」、および「オリゴ糖」は互換可能に使用できる。ほとんどの炭水化物は、通常、分子の各炭素原子に１つ存在する、多くのヒドロキシル基を有するアルデヒドまたはケトンである。炭水化物は、一般的に、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、または多糖とすることができる。最も基本的な炭水化物は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、およびフルクトースなどの単糖である。二糖は、２つが結合した単糖である。例示的な二糖として、スクロース、マルトース、セロビオース、およびラクトースが挙げられる。典型的に、オリゴ糖は、３〜６個の単糖単位を含み（たとえばラフィノース、スタキオース）、多糖は、６個以上の単糖単位を含む。例示的な多糖は、デンプン、グリコーゲン、およびセルロースを含む。炭水化物は、ヒドロキシル基が除去された２’デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素と置換された２’フルオロリボース、またはＮ−アセチルグルコサミン、グルコースの窒素含有形態（たとえば２’‐フルオロリボース、デオキシリボース、およびヘキソース）などの修飾された糖単位を含み得る。炭水化物は、たとえば、立体構造異性体、環状型、非環状型、立体異性体、互変異性体、アノマー、およびアイソマーといった多くの異なる形態で存在してもよい。
【０３９６】
一部の実施形態では、組成物は少なくとも１つの脂質を含む。本明細書中で使用されるように、「脂質」は、脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、遊離の脂肪酸を含む任意の形態の脂肪酸を含む。脂肪、油、および脂肪酸は、飽和型、不飽和型（シスまたはトランス）、または部分的不飽和型（シスまたはトランス）とすることができる。一部の実施形態では、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、およびテトラコサン酸（２４：０）から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、たとえば、調理により変性した脂質といった、少なくとも１つの変性した脂質を含む。
【０３９７】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの補助的なミネラルまたはミネラル供給源を含む。ミネラルの例として、限定するものではないが、塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、およびセレンが挙げられる。上述のミネラルのいずれかの適切な形態として、可溶性ミネラル塩、わずかに可溶性のミネラル塩、不溶性のミネラル塩、キレート化ミネラル、ミネラル複合体、カルボニルミネラルなどの非反応性ミネラル、および還元型ミネラル、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【０３９８】
一部の実施形態では、組成物は少なくとも１つの補助的なビタミンを含む。少なくとも１つのビタミンは、脂溶性または水溶性のビタミンである。適切なビタミンとして、限定するものではないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、およびビオチンが挙げられる。上述のいずれかの適切な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンと同じまたは類似の活性を有する化合物、およびビタミンの代謝物である。
【０３９９】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの生物を含む。適切な生物の例は当業者に良く知られており、プロバイオティクス（たとえばラクトバチルス種またはビフィドバクテリウム種など）、スピルリナ属、クロレラ属、およびポルフィラ属が挙げられる。
【０４００】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの食事性栄養補助食品を含む。適切な例は当技術分野において周知であり、ハーブ、植物、および特定のホルモンを含む。非限定的な例として、イチョウ、ニンジン、およびメラトニンが挙げられる。
【０４０１】
一部の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。賦形剤の非限定的な例として、味物質、風味剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、分散促進剤、崩壊剤、香味料、甘味剤、着色剤が挙げられる。
【０４０２】
一部の実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定的な例として、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および重炭酸カルシウムが挙げられる。
【０４０３】
一部の実施形態では、賦形剤は保存剤である。適切な保存剤の非限定的な例として、αトコフェロールおよびアスコルビン酸塩などの抗酸化剤、ならびにパラベン、クロロブタノール、およびフェノールなどの抗菌剤が挙げられる。
【０４０４】
一部の実施形態では、組成物は、賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定的な例として、スターチ、α化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオクソアゾリドン（ｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０４０５】
一部の実施形態では、組成物は、賦形剤として潤滑剤を含む。適切な潤滑剤の非限定的な例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水素付加した植物油、ｓｔｅｒｏｔｅｘ、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽油が挙げられる。
【０４０６】
一部の実施形態では、組成物は、賦形剤として分散促進剤を含む。適切な分散剤の例として、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、同形のケイ酸塩、および高ＨＬＢ乳化剤の界面活性剤としての結晶セルロースが挙げられる。
【０４０７】
一部の実施形態では、組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。一部の実施形態では、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤である。適切な非発泡性崩壊剤の例として、コーンスターチ、ポテトスターチ、それらのα化スターチおよび改変したスターチなどのスターチ、甘味剤、ベントナイトなどの粘土、結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、およびトラガントなどのガム類が挙げられる。一部の実施形態では、崩壊剤は発泡性崩壊剤である。適切な発泡性崩壊剤の非限定的な例として、クエン酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウム、および酒石酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
【０４０８】
一部の実施形態では、賦形剤は香味料を含む。外層に組み込まれる香味料は、合成香味油および風味づけ芳香油：天然の油：植物、葉、花、および果実由来の抽出物；ならびにそれらの組み合わせから選択できる。一部の実施形態では、香味料は、シナモン油；ウィンターグリーン油；ペパーミント油；クローバー油；乾草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；レモン油、オレンジ油、グレープおよびグレープフルーツ油などの柑橘系の油；ならびにリンゴ、モモ、ナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、およびアンズなどの果実のエッセンスから選択される。
【０４０９】
一部の実施形態では、賦形剤は甘味剤を含む。甘味剤の非限定的な例として、グルコース（コーンシロップ）、ブドウ糖、転化糖、フルクトース、およびそれらの混合物（キャリアーとして使用されない場合）；サッカリンおよびナトリウム塩などのその様々な塩；アスパルテームなどのジペプチド甘味剤；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリジン；ステビア（ステビオシド）；スクラロースなどのスクロースのクロロ誘導体；ならびにソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）などの糖アルコールなどが挙げられる。同様に、水素付加したデンプン加水分解物、ならびに合成甘味料の３，６−ジヒドロ−６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４−オン−２，２−ジオキシド、特にそのカリウム塩（アセスルファムＫ）およびナトリウム塩およびカルシウム塩も企図される。
【０４１０】
一部の実施形態では、組成物は着色剤を含む。適切な着色剤の非限定的な例として、食品、薬剤、および化粧品の着色料（ＦＤ＆Ｃ）、薬剤および化粧品の着色料（Ｄ＆Ｃ）、ならびに外用薬および化粧品の着色料（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色剤は、色素または対応するレーキとして使用できる。
【０４１１】
配合物中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分画は、通常、組成物中のアミノ酸の総重量の約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下である。
【０４１２】
本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、様々な形態に配合でき、かつ異なる多くの方法で投与できる。組成物は、従来より許容可能なキャリアー、アジュバント、および望ましい場合はビヒクルを含む配合物で、経口投与、直腸投与、または非経口投与することができる。本明細書中で使用される用語「非経口」は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射および注入技術を含む。例示的な実施形態では、タンパク質または組成物は経口投与される。
【０４１３】
経口投与のための固体投与剤形は、カプセル、錠剤、カプレット、ピル、トローチ、薬用キャンディー、粉剤、および顆粒剤を含む。カプセルは、典型的に、タンパク質または組成物を含むコア材料、およびコア材料を囲むシェル壁を含む。一部の実施形態では、コア物質は、固体、液体、およびエマルジョンのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、シェル壁材料は、軟ゼラチン、硬ゼラチン、およびポリマーのうちの少なくとも１つを含む。適切なポリマーとして、限定するものではないが、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、トリメリット酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロースコハク酸塩およびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロースポリマー；アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アミニオアクリル酸メチル（ａｍｍｏｎｉｏ  ｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよび／またはメタクリル酸エチル（たとえば商標名「Ｅｕｄｒａｇｉｔ」の下販売されるコポリマー）などのアクリル酸ポリマーおよびコポリマー；ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、酢酸ビニルクロトン酸コポリマー、およびエチレン‐酢酸ビニルコポリマーなどのビニルポリマーおよびコポリマー；ならびにシェラック（精製したｌａｃ）が挙げられる。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリマーは、味遮蔽剤として機能する。
【０４１４】
錠剤、ピルなどは圧縮でき、複数回圧縮でき、複数の層状にでき、かつ／またはコーティングできる。このコーティングは単一または複数とすることができる。一実施形態では、コーティング物質は、植物、真菌、および微生物のうちの少なくとも１つから抽出した糖、多糖、および糖タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。非限定的な例として、コーンスターチ、コムギスターチ、ポテトスターチ、タピオカスターチ、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン、アラビアゴム、イナゴマメガム、メスキートガム、グアーガム、カラヤガム、ｇｈａｔｔｉガム（ｇｕｍ  ｇｈａｔｔｉ）、トラガントガム、フノリ、カラゲナン、カンテン、アルギン酸塩、キトサン、またはゲランガムが挙げられる。一部の実施形態では、コーティング材料はタンパク質を含む。一部の実施形態では、コーティング材料は、少なくとも１つの脂肪および油を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの脂肪および油は高温融解する。一部の実施形態では、少なくとも１つの脂肪および油は、水素付加または部分的に水素付加されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの脂肪および油は、植物由来である。一部の実施形態では、少なくとも１つの脂肪および油は、グリセリド、遊離脂肪酸、および脂肪酸エステルのうち少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、コーティング材料は、少なくとも１つの食用に適したワックスを含む。食用に適したワックスは、動物、昆虫、または植物由来とすることができる。非限定的な例として、蜜ろう、ラノリン、ヤマモモのろう、カルナウバロウ、および米ぬかのろうが挙げられる。錠剤およびピルは、腸溶コーティングでさらに調製できる。
【０４１５】
あるいは、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物を使用する粉剤または顆粒は、食品生成物に組み込むことができる。一部の実施形態では、食品生成物は、経口投与用の飲料である。適切な飲料の非限定的な例として、フルーツジュース、フルーツ飲料、および人工的に風味をつけた飲料、人工的に甘味をつけた飲料、炭酸飲料、スポーツドリンク、液体食品、シェーク、アルコール飲料、カフェイン添加飲料、乳児配合物などが挙げられる。経口投与に適した他の手段は、水性溶液および非水性溶液、クリーム、ペースト、エマルジョン、懸濁物、およびスラリーを含み、それぞれは、適切な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味剤、着色剤、味物質、風味剤、および香味料のうちの少なくとも１つを任意に含んでもよい。
【０４１６】
一部の実施形態では、食品生成物は、固形食品である。固形食品の適切な例は、限定するものではないが、食品のバー、スナックバー、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッカー、ビスキュイ、クリームまたはペースト、アイスクリームバー、凍結ヨーグルトバーなどが挙げられる。
【０４１７】
一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、治療用の食品に組み込まれる。一部の実施形態では、治療用の食品は、一部またはすべての必須の主要栄養素および微量栄養素を任意に含む、すぐに食べられる食品である。一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、既存の食事に混合されるよう設計された栄養補助食品に組み込まれる。一部の実施形態では、栄養補助食品は、一部またはすべての必須の主要栄養素および微量栄養素を含む。一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、食品のタンパク質栄養素の栄養価を高めるために、既存の食品に混合、または食品に添加される。例として、主食（穀物、塩、糖、調理油、マーガリン）、飲料（コーヒー、茶、ソーダ、ビール、リカー、スポーツドリンク）、スナック、お菓子、および他の食品が挙げられる。
【０４１８】
本明細書中に開示される組成物は、たとえば筋肉量、力、および身体的な機能、熱産生、代謝の支出、満腹、ミトコンドリアでの生成、体重減少または脂肪の喪失、および除脂肪組成のうちの少なくとも１つを増加させる方法に利用できる。
【０４１９】
配合物は、配合物中１００キロカロリーあたり最大約２５ｇ（２５ｇ／１００ｋｃａｌ）の栄養性ポリペプチドを含むことができ、これは、配合物に存在するエネルギーのすべてまたはほぼ全てが、栄養性ポリペプチドの形態にあることを意味する。より典型的には、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または５％未満の配合物中に存在するエネルギーが、栄養性ポリペプチドの形態である。他の配合物では、栄養性ポリペプチドは、ポリペプチドの参照１日摂取量の少なくとも約０．１％以上の栄養上の利点を提供するために十分な量で存在する。タンパク質の参照１日摂取量の値は当技術分野ににおいて周知である。たとえば、Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔａｋｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｅｒｇｙ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ，  Ｆｉｂｅｒ，  Ｆａｔ，  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ，  ２００５，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣを参照されたい。タンパク質の参照１日摂取量の値は、１日の摂取カロリーの１０〜３５％がタンパク質および単離型アミノ酸により提供される範囲である。年齢に基づく別の参照１日摂取量の値は、１日あたりのｇタンパク質で提供され、１〜３歳の小児：１３ｇ、４〜８歳の小児：１９ｇ、９〜１３歳の小児：３４ｇ、１４〜１８歳の少女：４６、１４〜１８歳の少年：５２、１９〜７０歳超の女性：４６、および１９〜７０歳超の男性：５６である。他の配合物では、栄養性ポリペプチドは、タンパク質の栄養障害または、タンパク質の栄養障害を特徴とする疾患、障害、もしくは病態を罹患しているヒト対象に栄養上の利点を提供するよう十分な量で存在する。タンパク質の栄養障害は、一般的に出生前または小児の病態である。適切なエネルギー摂取を伴うタンパク質の栄養障害はクワシオルコルまたは低アルブミン血症栄養障害と呼ばれ、不適切なタンパク質摂取を含むすべての形態の不適切なエネルギー摂取はマラスムスと呼ばれる。適切に栄養を与えた個体は、タンパク質の消費がほとんどない、または栄養性アミノ酸が欠如したタンパク質の消費から、サルコペニアを発症する可能性がある。出生前のタンパク質の栄養障害は、妊娠中の母体に本明細書中に記載の栄養性ポリペプチドを投与することにより予防、処置、または低減でき、新生児のタンパク質の栄養障害、は、授乳する母体に本明細書中に記載の栄養性ポリペプチドを投与することにより、予防、処置、または低減できる。成年では、タンパク質の栄養障害は、一般に、癌、慢性腎疾患に対する二次的な発症であり、および高齢者に起こる。さらに、タンパク質の栄養障害は、慢性または急性とすることができる。急性のタンパク質栄養障害の例は、敗血症などの急性疾病もしくは疾患の際に、または外科手術などの外傷性の損傷、熱傷などの熱損傷、または実質的な組織のリモデリングをもたらす類似の事象からの回復時に起こる。本明細書中に記載される方法および組成物により処置可能な他の急性疾病として、サルコペニア、カヘキシー、糖尿病、インスリン抵抗性、および肥満が挙げられる。
【０４２０】
配合物は、ヒト対象が消費する際に満腹感を提供するために十分な量の栄養性ポリペプチドを含み、このことは対象が空腹であるまたは食べたいとあまり感じない、または感じないことを意味する。このような配合物は、一般的に等価のカロリーに基づき炭水化物を多く含む食品よりも高い満腹指数を有する。
【０４２１】
配合物は、、栄養性ポリペプチドの濃度に基づいて（たとえば、重量対重量に基づく）、配合物の重量の最大１００％を占める量の栄養性ポリペプチドを含むことができ、このことは、配合物に存在する物質の全てまたは本質的に全てが、栄養性ポリペプチドの形態であることを意味する。より典型的には、配合物に存在する重量の９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または５％未満は、栄養性ポリペプチドの形態である。一部の実施形態では、配合物は、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、６０ｇ、７０ｇ、８０ｇ、９０ｇ、１００ｇ、または１００ｇ超の栄養性ポリペプチドを含む。
【０４２２】
好ましくは、本明細書中に提供される配合物は、食用でない生成物を実質的に含まない。食用でない生成物は、酵母、細菌、藻類、昆虫、哺乳動物、または他の発現系から産生される、従来技術の組み換えタンパク質の調製でしばしば見出される。例示的な食用でない生成物は、界面活性剤、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、食用でないポリ酸またはポリオール、脂肪アルコール、アルキルベンジルスルホン酸塩、アルキルグルコシド、またはメチルパラベンが挙げられる。
【０４２３】
態様では、提供される配合物は、味物質、栄養上の炭水化物、および／または栄養上の脂質などの他の物質を含む。さらに、配合物は、充填剤、品質改良剤、および増量剤を含んでもよい。
【０４２４】
好ましい実施形態では、本明細書中に提供される栄養性ポリペプチドは、単離、かつ／または実質的に精製されている。本明細書中で提供される栄養性ポリペプチドおよび組成物および配合物は、非タンパク質成分を実質的に含まない、このような非タンパク質成分は、概して、乳清、カゼイン、卵、およびダイズの調製物などのタンパク質調製物に存在し、これらは、ポリペプチドと複合体を形成し、胃腸管中のタンパク質消化物の遅延および不完全さをもたらす炭水化物および脂質の実質量を含む。このような非タンパク質成分はＤＮＡも含むことができる。よって、栄養性ポリペプチド、組成物、および配合物は、食品由来のポリペプチドおよびポリペプチド混合物と比較して、改善した消化性、減少したアレルゲン性を特徴とする。さらに、配合物および組成物は、ある時間からのより再現可能な消化性、および／または所定の単位時間に基づく消化生成物を特徴とする。特定の実施形態では、栄養性ポリペプチドは、参照ポリペプチドまたは参照ポリペプチド混合物と比較して、脂質、および／または炭水化物が少なくとも１０％減少し、任意に、消化性を減少させ、かつ／またはアレルゲン性を増加させる１つまたは複数の他の物質が、たとえば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％超減少する。特定の実施形態では、栄養配合物は、栄養上の炭水化物、および／または栄養上の脂質を含み、これらは、消化性およびアレルゲン性の低下に関して選択されてよい。
【０４２５】
使用方法
一部の実施形態では、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、患者またはユーザ（場合によっては集合的に「対象」と呼ぶ）に投与される。本明細書中に使用されるように、「投与する」および「投与」は、１人の人物が別の人物に、特定の方法および／または特定の目的でタンパク質または組成物を消費するように指示する実施形態、ならびに、ユーザーが、第２の人物から受けた指示とは無関係にまたはそれと異なるように、特定の方法および／または特定の目的のためにタンパク質または組成物を使用する状況を含む。１人の人物が別の人物に特定の方法および／または特定の目的のためにタンパク質または組成物を消費するよう指示する実施形態の非限定的な例には、医師が、患者に対して一連の行為および／または処置を処方する場合、トレーナーがユーザー（運動選手など）に、特定の一連の行為および／または処置に従うよう助言する場合、および製造者、供給者、または販売者が、たとえば、広告、またはパッケージ上のラベル、または生成物の販売もしくはマーケティングに関連して提供される他の材料を介してエンドユーザーに使用条件を推奨する場合が挙げられる。
【０４２６】
一部の実施形態では、タンパク質または組成物は投与剤形で提供される。一部の実施形態では、投与剤形は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質を投与するために設計され、投与されるタンパク質の総量は、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ〜５ｇ、２ｇ〜１０ｇ、５ｇ〜１５ｇ、１０ｇ〜２０ｇ、１５ｇ〜２５ｇ、２０ｇ〜４０ｇ、２５〜５０ｇ、および３０〜６０ｇから選択される。一部の実施形態では、投与剤形は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質を投与するために設計され、投与されるタンパク質の総量は、０．１ｇ、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、および１００ｇから選択される。
【０４２７】
一部の実施形態では、投与剤形は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質を投与するために設計され、投与される必須アミノ酸の総量は、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ〜５ｇ、２ｇ〜１０ｇ、５ｇ〜１５ｇ、１０ｇ〜２０ｇ、および１〜３０ｇである。一部の実施形態では、投与剤形は、本明細書中に開示される少なくとも１つのタンパク質を投与するために設計され、投与されるタンパク質の総量は、約０．１ｇ、０．１〜１ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、および１００ｇから選択される。
【０４２８】
一部の実施形態では、タンパク質または組成物は、０．１ｇ〜１ｇ／日、１ｇ〜５ｇ／日、２ｇ〜１０ｇ／日、５ｇ〜１５ｇ／日、１０ｇ〜２０ｇ／日、１５ｇ〜３０ｇ／日、２０ｇ〜４０ｇ／日、２５ｇ〜５０ｇ／日、４０ｇ〜８０ｇ／日、５０ｇ〜１００ｇ／日、またはそれ以上の割合で消費される。
【０４２９】
一部の実施形態では、対象による総タンパク質摂取量のうち、食事の期間で対象が摂取した総タンパク質の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％が、本開示に係る少なくとも１つのタンパク質から作製される。一部の実施形態では、対象による総タンパク質摂取量のうち、食事の期間で、対象が摂取した総タンパク質の５％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜９０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜８０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜７０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜６０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜５０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜４０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜３０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜２０％、対象が摂取した総タンパク質の５％〜１０％、対象が摂取した総タンパク質の１０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の１０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の２０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の３０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の４０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の５０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の６０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の７０％〜１００％、対象が摂取した総タンパク質の８０％〜１００％、または対象が摂取した総タンパク質の９０％〜１００％が、本開示に係る少なくとも１つのタンパク質から作製される。一部の実施形態では、本開示の少なくとも１つのタンパク質は、食事期間での対象のカロリー摂取の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を占める。
【０４３０】
一部の実施形態では、本開示に係る少なくとも１つのタンパク質は、本開示の少なくとも２個のタンパク質、本開示の少なくとも３個のタンパク質、本開示の少なくとも４個のタンパク質、本開示の少なくとも５個のタンパク質、本開示の少なくとも６個のタンパク質、本開示の少なくとも７個のタンパク質、本開示の少なくとも８個のタンパク質、開示の少なくとも９個のタンパク質、本開示の少なくとも１０個のタンパク質、またはそれ以上を含む。
【０４３１】
一部の実施形態では、食事の期間は、１回の食事、２回の食事、３回の食事、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３か月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５か月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年である。一部の実施形態では、食事の期間は、１日〜１週間、１週間〜４週間、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、または６ヶ月〜１年である。
【０４３２】
臨床試験から、不動または長期の安静臥床に由来するなどの、老化または不使用による筋肉の喪失をタンパク質が防止するとの証拠が提供されている。特に、試験から、タンパク質の補給が、長期の安静臥床の際の筋タンパク質合成速度（ＦＳＲ）を増加させ、長期の安静臥床の際の脚の質量および強度を維持し、除脂肪体重を増加させ、歩行およびバランスの機能的測定値を改善し、不動または長期の安静臥床によりサルコペニアのリスクのある個体にとって重要な治療介入として作用し得ることが示されている。たとえば、Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４，  ８９：４３５１−４３５８；  Ｆｅｒｒａｎｄｏ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２００９  １−６；  Ｋａｔｓａｎｏｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．    Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００６，  ２９１：  ３８１−３８７を参照されたい。
【０４３３】
運動選手の筋タンパク質の同化を増加させる試験から、タンパク質を運動後に提供すると、運動のみで得られるものよりも大きい度合いで筋肉の肥大を促進することが示されている。同様に、タンパク質を運動後に提供すると、タンパク質の分解が増加することなくタンパク質の合成を支援し、真の陽性のタンパク質バランスおよび筋肉量の増大をもたらすことも示されている。筋タンパク質の合成は、必須アミノ酸の補給に用量依存的に反応するように思われるが、全てのタンパク質が、筋肉の構築に等価であるわけではない。たとえば、アミノ酸のロイシンは、筋タンパク質合成の刺激に重要な因子である。たとえば、Ｂｏｒｓｃｈｅｉｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００２，  ２８３：  Ｅ６４８−Ｅ６５７；  Ｂｏｒｓｈｅｉｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．  ２００８，  ２７：  １８９−９５；  Ｅｓｍａｒｃｋ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１，  ５３５：  ３０１−３１１；  Ｍｏｏｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００９，  ８９：  １６１−８）を参照されたい。
【０４３４】
別の態様では、本開示は、対象の筋肉量、筋力、および機能的な能力のうちの少なくとも１つを維持または増加せる方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量を対象に提供することを含む。一部の実施形態では、対象は、高齢者、医学的に重篤な状態を有する人、およびタンパク質エネルギー栄養障害を罹患する人の少なくともいずれかである。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により対象により消費される。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物は、経口経路により対象により消費される。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物は、経腸経路により対象により消費される。
【０４３５】
別の態様では、本開示は、対象の望ましい肥満指数を維持または達成する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量を対象に提供することを含む。一部の実施形態では、対象は、高齢者、医学的に重篤な状態を有する人、またはタンパク質エネルギー栄養障害を罹患している人の少なくともいずれかである。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により消費される。
【０４３６】
別の態様では、本開示は、タンパク質エネルギー栄養障害を有する対象にタンパク質を提供する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量を対象に提供することを含む。一部の実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により、対象により消費される。
【０４３７】
必須アミノ酸の補給の必要性は、癌患者、ならびに筋肉の消耗およびカヘキシーを罹患している他の患者に提案されている。マウスの食事の試験は、必須アミノ酸の食事性介入による、カヘキシーを有するマウスに生存および機能的な利点を示している。癌以外に、必須アミノ酸の補給はまた、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、ＨＩＶ、および他の疾患状態などの、運動が困難であり、よって筋肉が劣化する他の疾患を罹患する患者に、筋肉の機能の改善および筋肉の増加などの利点が示されている。
【０４３８】
特定のアミノ酸が、カヘキシーの管理に有益であることが試験から示されている。食事中のＢＣＡＡおよびＬｅｕ含有量が比較的高いと、翻訳の増加を伝達し、インスリンの放出を高め、タンパク質分解を阻害することにより、総タンパク質合成を促進することによって、カヘキシーに対して積極的な作用を有すると考えられる。よって、一般的に食事性ＢＣＡＡおよび／または特にＬｅｕの消費が増加することは、カヘキシーの作用を積極的に低減または逆転させる一因となる。窒素のバランスは、カヘキシーの根底となる原因に対向するために重要であるため、食事性グルタミンおよび／またはアルギニンの消費を増加することは、カヘキシーの作用を積極的に低減または逆転させる一因となると考えられる。たとえば、Ｏｐ  ｄｅｎ  Ｋａｍｐ  Ｃ，  Ｌａｎｇｅｎ  Ｒ，  Ｈａｅｇｅｎｓ  Ａ，  Ｓｃｈｏｌｓ  Ａ．  ‘‘Ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｃａｃｈｅｘｉａ：  ｃａｎ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｉｐ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ？’’    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｃａｒｅ  ２００９，  １２：６１１−６１６；  Ｐｏｏｎ  ＲＴ−Ｐ，  Ｙｕ  Ｗ−Ｃ，  Ｆａｎ  Ｓ−Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｒａｌ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ．’’  Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００４；  １９：７７９−７８８；  Ｔａｙｅｋ  ＪＡ，  Ｂｉｓｔｒｉａｎ  ＢＲ，  Ｈｅｈｉｒ  ＤＪ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，  Ｍｏｌｄａｗｅｒ  ＬＬ，  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＧＬ．  ‘‘Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｃｈｅｘｉａ．’’  Ｃａｎｃｅｒ．  １９８６；５８：１４７−５７；  Ｘｉ  Ｐ，  Ｊｉａｎｇ  Ｚ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｃ，  Ｌｉｎ  Ｙ，  Ｗｕ  Ｇ  ‘‘Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈ．’’  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２０１１  Ｊａｎ  １；１６：５７８−９７を参照されたい。
【０４３９】
よって、本明細書中、対象のカヘキシーを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、カヘキシーを有する対象に関して、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量は、この人物により摂取される本開示のタンパク質の量が、代謝的な必要性（しばしば上昇している）と一致するかまたはそれを超える量である。１．５ｇ／ｋｇ体重／日のタンパク質摂取、または総カロリー摂取の１５〜２０％が、カヘキシーを有する人にとって適切な目標であるように思われる。一部の実施形態では、対象により消費されるタンパク質のすべてが、本開示に係るタンパク質である。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、対象の総タンパク質摂取を提供するため、他の供給源のタンパク質および／または遊離アミノ酸と組み合わせる。一部の実施形態では、対象は、高齢者、医学的に重篤な状態を有する人、およびタンパク質エネルギー栄養障害を罹患している人の少なくともいずれかである。一部の実施形態では、対象は、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、ＨＩＶ、癌、および他の疾患状態などの、運動が困難となり、よって筋肉が劣化する疾患を罹患している。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により対象により消費される。
【０４４０】
サルコペニアは、骨格筋の量（典型的に、２５歳以降の年齢で１年あたり０．５〜１％の喪失）、質、および強度の老化に関連した変性性の喪失である。サルコペニアは、虚弱症候群の一因である。ＥＷＧＳＯＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐｅｏｐｌｅ）は、加齢関連サルコペニアの実務的な臨床定義およびコンセンサス診断基準を開発した。サルコペニアの診断に関して、ワーキンググループは、低い筋肉量および低い筋肉機能（力または能力）の両方の存在を使用することを提案した。サルコペニアは、第一に筋肉の萎縮（筋肉の大きさの減少）を特徴とし、これに、脂肪による筋線維の置換、線維症の増加、筋代謝の変化、酸化ストレス、および神経筋接合部の変性などの要因により引き起こされる筋肉組織の「質」の低下が加わる。これらが組み合わさると、これらの変化は、筋肉機能の進行性の喪失を引き起こし、結果として筋虚弱に至る、筋虚弱は、高齢者の健康および機能が破局的に低下するリスクが上がることを示す一般的な老人性の症候群である。虚弱の一因として、サルコペニア、骨粗しょう症、および筋力低下を挙げることができる。筋力低下は、筋肉疲労（または「強度の喪失」）としても知られており、骨格筋で力を発揮することができないことを指す。虚弱は、しばしば、筋萎縮の後に、および疾病の結果としての長期の安静臥床後などの活動の低下後に起こる。同様に、サルコペニアの結果として徐々に筋力低下が起こる。
【０４４１】
本開示のタンパク質は、対象に発症したサルコペニアもしくは筋虚弱を処置するため、または有リスクグループの一員である対象でのサルコペニアもしくは筋虚弱の発症を予防するために有用である。一部の実施形態では、対象により消費されるすべてのタンパク質が、本開示に係るタンパク質である。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質は、対象の総タンパク質摂取量を提供するために、タンパク質の他の供給源および／または遊離アミノ酸と組み合わせる。一部の実施形態では、対象は、高齢者、医学的に重篤な状態を有する人、およびタンパク質エネルギー栄養障害を罹患している人の少なくともいずれかである。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により消費される。
【０４４２】
肥満は、高血圧、２型糖尿病、脂質異常症、冠血管心疾患、脳卒中、癌（たとえば子宮内膜、脳、および結腸）、変形性関節症、睡眠時無呼吸、および呼吸系の問題を含む多数の合併症に関連した複数要因の障害である。３０ｋｇ／ｍ２超の肥満指数として定義される肥満の発生率は、米国で、１５％（１９７６〜１９８０）から３３％（２００３〜２００４）へと著しく増加しており、増加し続けている、肥満の原因となる機構は複合的であり、行動学的要素と、ホルモン、遺伝子、および代謝の工程との相互作用を伴うが、肥満は、２つの主な原因：過剰なエネルギー摂取と不十分な身体活動を有するライフスタイルに依存する状態であると主に考えられている。エネルギー摂取に関して、総エネルギー摂取を制御しつつ、食事中のタンパク質の比率を適度に増加させることは、身体の組成を改善し、脂肪の減少を促進し、かつ、体重減少の後の体重の維持を改善し得ることが証明されている。食事性タンパク質の増加に関連する陽性の転帰は、主にエネルギー摂取を低下させることにより、満腹の増加、エネルギー効率の低減、および／または熱産生の増加、身体組成に及ぼす積極的な作用（特に除脂肪筋肉量）、および血糖制御の強化に関連すると考えられている。
【０４４３】
食事性タンパク質は、炭水化物または脂肪の等カロリー摂取よりも摂食後のエネルギー消費量を増加させるために有効である（たとえばＤａｕｎｃｅｙ  Ｍ，  Ｂｉｎｇｈａｍ  Ｓ．    ‘‘Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ２４  ｈ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ  ｉｎ  ｍａｎ  ｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｉｎｔａｋｅ．’’    Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９８３，  ５０：  １−１３；  Ｋａｒｓｔ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｎ：  ｔｈｅｒｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｆａｔｓ  ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ａｍｏｕｎｔ．’’    Ａｎｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ．１９８４，  ２８：  ２４５−５２；  Ｔａｐｐｙ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ  ‘‘Ｔｈｅｒｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｆｕｓｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．’’    Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  １９９３，  ５７  （６）：  ９１２−６参照）。他の特性（満腹の誘導、除脂肪体重の保持）に加えてこの特性により、タンパク質は、体重管理を目的とする食事の魅力的な成分となる。このような食事により引き起こされるエネルギー消費量の増加は、タンパク質を消化および代謝するエネルギー費用が、他のカロリー供給源よりも高いという事実に部分的によるものであり得る。タンパク質合成を含むタンパク質の代謝回転は、エネルギー消費工程である。さらに、高タンパク質食は、肝臓および褐色脂肪での脱共役タンパク質をアップレギュレートすることができ、これは、エネルギー消費量の増加と正比例する。異なるタンパク質は、エネルギー消費量に独自の効果を有し得るという理論が立てられている。
【０４４４】
試験から、タンパク質、特に高いＥＡＡおよび／またはＢＣＡＡ含有量を有するタンパク質の摂取は、熱産生およびエネルギー消費量に関して別々の作用をもたらすことが示唆される（たとえばＭｉｋｋｅｌｓｅｎ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ｄｉｅｔｓ  ｏｎ  ２４  ｈ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．’’  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０００，  ７２：１１３５−４１；  Ａｃｈｅｓｏｎ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｉｃｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．’’  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１１，  ９３：５２５−３４；    Ａｌｆｅｎａｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｎ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ’’    Ａｒｇ  Ｂｒａｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂｏｌ  ２０１０，  ５４  （１）：  ４５−５１；    Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．’’  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１２  ６６  （５）：  ６２２−７参照）。さらに、Ｌチロシンは、熱産生に役割を果たすアミノ酸として同定されている（たとえばＢｅｌｚａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ  ｐａｒｔｌｙ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｆｏｏｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．’’  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２００９，  ５８  （８）：１１３７−４４参照）。さらなる試験から、ロイシンおよびアルギニンの補給は、脂肪組織よりも除脂肪体重へと基質を配向することによりエネルギーの代謝を変化させるように思われる（Ｄｕｌｌｏｏ  Ａ．    ‘‘Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：  ｆｒｏｍ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｏｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．’’    Ｏｂｅｓ  Ｒｅｖ  ２０１１  １２：  ８６６−８３）。
【０４４５】
文献から集合的に、異なる種類のタンパク質は、熱産生に対して別々の作用をもたらすことが示唆されている。ＥＡＡ、ＢＣＡＡを多く含むタンパク質またはペプチド、および／または少なくとも１つのＴｙｒ、Ａｒｇ、およびＬｅｕが熱産生に対して刺激作用を有すると考えられており、熱産生の刺激は、体重の管理に積極的な効果をもたらすと考えられているため、本開示はまた、熱産生を刺激し、および／または一般的に、体重の管理に積極的な効果をもたらすため有用な生成物および方法も提供する。
【０４４６】
より具体的には、本開示は、対象の熱産生を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量を対象に提供することを含む。一部の実施形態では、対象は肥満である。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、経口投与、経腸経路、または非経口経路により、対象により消費される。
【０４４７】
基本的なレベルで、過体重状態の発症の理由は、エネルギー摂取とエネルギー消費量とのあいだのアンバランスによるものである。任意の特定の状況（心的飽和）で、および食事の状況（満腹）を通して食物を低減させる試みは、近年の研究の主要な焦点とされている。食事中の満足感、および食後の満腹感の結果としてのカロリー摂取の減少は、内部および外部のシグナルの複合的な相互作用からもたらされる。様々な栄養学の試験から、エネルギーの密度、含有量、食感、および味などの食品の特性を変化させると、心的飽和および満腹の両方に影響することが示されている。
【０４４８】
脂肪、炭水化物、およびタンパク質といった、エネルギーを送達する３つの主要栄養素が存在する。タンパク質または炭水化物１ｇは４カロリーを提供するのに対し、脂肪１ｇは９カロリーを提供する。一般的に、タンパク質は、炭水化物または脂肪よりも高い度合いで満腹を増大させ、よって、カロリー摂取の減少を促進させ得る。しかしながら、満腹を誘導するタンパク質物質の種類を示唆するかなりの証拠が存在する（たとえばＷ．Ｌ．  Ｈａｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｃａｓｅｉｎ  ａｎｄ  ｗｈｅｙ  ｅｘｅｒｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ，  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｅｔｉｔｅ．’’  Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．  ２００３  Ｆｅｂ，  ８９（２）：２３９−４８；  Ｒ．  Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｎ  ｓａｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｓａｔｉｅｔｙ  ｗｈｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｅｄ  ａｓ  ａ  ｓｔａｒｔｅｒ．’’  Ｎｕｔｒ  Ｊ．  ２０１１  Ｄｅｃ  ２３，  １０：１３９；  Ｔ．  Ａｋｈａｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅｍｅａｌ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｏｎ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｍｅａｌ  ｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔｓ．’’  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．  ２０１０  Ａｐｒ，  ９１（４）：９６６−７５，  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｆｅｂ  １７；  ＭＡ  Ｖｅｌｄｈｏｒｓｔ  ‘‘Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓａｔｉａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｗｈｅｙ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｃａｓｅｉｎ  ｏｒ  ｓｏｙ’’  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ．  ２００９  Ｍａｒ  ２３，  ９６（４−５）：６７５−８２）参照）。これらの証拠から、ロイシンを多く含むタンパク質は、満腹の誘導に特に効果が高い（たとえばＦｒｏｍｅｎｔｉｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ  ‘‘Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｂｙ  ｄｉｅｔａｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．’’    Ｎｕｔｒ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２０１２  ２５：  ２９−３９参照）。
【０４４９】
一部の実施形態では、本開示のタンパク質は、少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物と同時に対象によって消費される。一部の実施形態では、タンパク質および少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物の有益な作用は、相加作用を有し、一部の実施形態では、タンパク質および少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物の有益な作用は、相乗作用を有する。本開示のタンパク質と共に投与できる医薬品または生物学的な薬剤生成物の例は、当技術分野で周知である。たとえば、本開示のタンパク質を、対象の筋肉量、筋力、および機能的な特性のうちの少なくとも１つを維持または増加させるために使用する場合、タンパク質は、同化ステロイドなどの、対象の筋肉量、筋力、および機能的な能力うちの少なくとも１つを維持または増加させるために適応される少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物の治療上の投与レジメンと同時に対象により消費され得る。本開示のタンパク質を、対象の望ましい肥満指数を維持または達成するために使用する場合、タンパク質は、オルリスタット、ロルカセリン、シブトラミン、リモナバン、メトホルミン、エキセナチド、またはプラムリンチドなどの、対象の望ましい肥満指数を維持または達成するために適応される少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物の治療投与レジメンと同時に対象により消費され得る。本開示のタンパク質が、対象の心的飽和応答および満腹応答のうちの少なくとも１つを誘導するように使用される場合、タンパク質は、リモナバン、エキセナチド、またはプラムリンチドなどの、対象の心的飽和応答および満腹応答のうちの少なくとも１つを誘導するために適応される少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤の治療上の投与レジメンと同時に対象により消費され得る。本開示のタンパク質が、対象のカヘキシー、サルコペニア、および筋虚弱のうちの少なくとも１つを処置するように使用される場合、タンパク質は、ω３脂肪酸または同化ステロイドなどの、カヘキシー、サルコペニア、および筋虚弱のうちの少なくとも１つを処置するために適応される少なくとも１つの医薬品または生物学的な薬剤生成物の治療上の投与レジメンと同時に対象により消費され得る。心的飽和および満腹を誘導する食事性タンパク質の役割のため、本明細書中に開示されるタンパク質および組成物は、対象の心的飽和応答および満腹応答のうちの少なくとも１つを誘導するために使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、本開示のタンパク質、本開示の組成物、または本開示の方法により作製される組成物の十分な量を対象に提供することを含む。一部の実施形態では、対象は肥満である。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、本開示に係る方法により作製される組成物は、運動の実施と協調して対象により消費される。一部の実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、または本開示に係る方法により作製される組成物は、経口経路、経腸経路、または非経口経路により、対象により消費される。
【０４５０】
一部の実施形態では、本開示の少なくとも１つのタンパク質または組成物を、対象の食事の中に組み込むことは、食後の満腹（空腹を抑制することを含む）、熱産生の誘導、血糖の応答の低減、エネルギー消費量への積極的な影響、除脂肪体重への積極的な影響、過食によって引き起こされる体重増加の減少、およびエネルギー摂取の減少から選択される少なくとも１つの作用を有する。一部の実施形態では、本開示の少なくとも１つのタンパク質または組成物を対象の食事に組み込むことは、対象の体脂肪の喪失、除脂肪組織喪失の低減、脂質プロファイルの改善、ならびに耐糖能およびインスリン感受性の改善から選択される少なくとも１つの作用を有する。
【０４５１】
本明細書中に記載される技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  （ｅｄ），  １９８０で見出すことができる。
【０４５２】
実施例
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。本実施例は、例示的な目的のみを提供し、いかなる場合も本発明の範囲を限定する意図を有しない。使用される数（たとえば量、温度など）に関する正確性を確実にするための試みはなされているが、何らかの実験誤差および偏差は当然考慮されるべきである。
【０４５３】
本発明の実務は、特段記載のない限り、当業者の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来の方法を使用するものである。このような技術は文献に完全に説明されている。たとえば、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；  Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０）；  Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０４５４】
実施例１．質量分析の解析を使用した、食用に適した種の栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の同定および選択
ポリペプチドまたは核酸ライブラリー、または関連するタンパク質配列データベースなどから、１つまたは複数の栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を提供する。ここでは、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を、食用に適した種から抽出かつ精製したタンパク質の質量分析の解析により同定した。
【０４５５】
質量分析のためのタンパク質の単離
タンパク質を、固体の食用に適した供給源から抽出した。以下の種：Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ  ｖａｒ．  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍａｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ、Ｏｄｏｃｏｉｌｅｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｓ、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｔｈｙｎｎｕｓ、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、およびＺｅａ  ｍａｙｓ由来の試料を解析に含めた。各試料を、まず−８０℃で凍結し、次いで、乳鉢および乳棒を使用してすりつぶした後、５０ｍｇの材料を秤量して微量遠心管の中に入れた。次いで、５０ｍｇの試料を、１ｍＬの抽出バッファー（８．３Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、１％ｗ／ｖのＤＴＴ）で再度懸濁し、３０分間撹拌した。１００μｍのジルコニウムビーズ（Ｏｐｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）５００μＬを添加し、次いでさらに３０分間撹拌し続けた。試料を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）上で３分間、３０Ｈｚで溶解させ、ベンチトップ型の微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で、２１，１３０ｇで１０分間遠心分離した。上清を清浄な微量遠心管に移し、５０μｌの一定分量でアリコートし、−８０℃で保存した。抽出した可溶性タンパク質の量を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。２０μｇのタンパク質を、１０％１０−レーンＢｉｓＴｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動させ、次いで、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる解析のため切除した。
【０４５６】
またタンパク質を、以下の食用に適した種：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの液体培養物から単離した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびｂａｃｉｌｌｕｓの生物は、本明細書中に記載するように培養した１０分間培養物を遠心分離（１０，０００×ｇ）し、次いで、０．２μＭのフィルターを使用して上清を濾過することにより、浄化した上清を単離した。浄化した上清中の可溶性タンパク質の量を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。タンパク質の試料（２０μｇ）を、製造社のプロトコルに従って１０％のＰｒｅｃａｓｔ  ＢｉｓＴｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で泳動させた。
【０４５７】
質量分析
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析では、各ゲルを、５つの等しい大きさの断片に切断した。トリプシン消化を、以下のプロトコル（２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム、次いでアセトニトリルでの洗浄、６０℃、１０ｍＭのジチオスレイトールでの還元、次いで室温、５０ｍＭのヨードアセトアミドでのアルキル化、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）での３７℃、４時間での消化）でロボット（ＰｒｏＧｅｓｔ，  ＤｉｇｉＬａｂ）を使用して実施し、ギ酸でクエンチし、上清をさらに処理することなく直接解析した。各試料のゲル消化物をプールして、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムでのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラム上にロードし、３５０ｎＬ／分で７５μｍの解析カラムから溶出させた。両方のカラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ  樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で充填した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、ここでＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、７０，０００ＦＷＨＭおよび１７，５００ＦＷＨＭの分解能でそれぞれ実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳで選択した。結果として得られたデータを、以下のパラメータ：酵素‐トリプシン／Ｐ、固定した修飾‐カルバミドメチル（Ｃ）可変修飾‐酸化（Ｍ）、アセチル（タンパク質Ｎ末端）、Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ（Ｎ末端Ｑ）、脱アミド（ＮＱ）、質量値‐モノアイソトピック、ペプチド質量許容差‐１０ｐｐｍ、フラグメントの質量許容差‐０．０１５Ｄａ、最大誤切断‐２で、Ｍａｓｃｏｔを使用して、対応する生物由来のＵｎｉｐｒｏｔおよび／またはＮＣＢＩタンパク質のデータベースに対して検索した。Ｍａｓｃｏｔ  ＤＡＴのファイルを、検証およびフィルタリングのため、および試料あたりの重複しないリストを作成するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ソフトウェアで解析した。データを、９０％の最小タンパク質の値、５０％の最小ペプチドの値（Ｐｒｏｐｈｅｔスコア）を使用し、タンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要としながらフィルタリングを行った。検出したタンパク質の相対量を、各タンパク質に関して獲得されたスペクトルの数である、スペクトルカウントにより決定した。スペクトルカウントは、タンパク質量解析の分野で一般的に使用される非標識定量化方法である（Ｌｉｕ，  Ｈｏｎｇｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６．１４  （２００４）：  ４１９３−４２０１）。タンパク質単離物中の各タンパク質の相対量を計算するために、タンパク質のスペクトルカウントの数を、総タンパク質のスペクトルカウントにより除算する。ＳＥＱＩＤ８９４〜３４１５は、この方法を使用して同定した。
【０４５８】
相同体の発見
記載するように、同定された栄養性ポリペプチド配列に関して、この方法を使用して同定した、類似の配列ＳＥＱＩＤ−０００９３を、他の種から同定し、本明細書中に記載のコンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して相同体の検索に使用した。このようにして同定された食用に適したデータベース由来の栄養性ポリペプチドの相同体の例を表Ｅ１Ａに示す。このようにして同定された、発現配列データベース由来の例となる栄養性ポリペプチド相同体を表Ｅ１Ｂに示す。
【表４】
2016537402.tif 000006
【表５】
2016537402.tif 000007
【０４５９】
実施例２：ｃＤＮＡライブラリーを使用した、食用に適した種の栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の同定および選択
本実施例において、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列を、食用に適した種から抽出かつ精製した核酸配列から産生したタンパク質の解析により同定した。
【０４６０】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
１２の食用に適した種由来のｃＤＮＡのライブラリーを構築した。１２の食用に適した種を、ＲＮＡ抽出のため５つのカテゴリーに分割した。すりつぶしたウシ、ブタ、コヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、およびティラピアの一部を含む動物の組織を、各食用に適した種由来の試料５０ｍｇと組み合わせた。皮および果実の両方を含むブドウおよびトマト由来の果実組織をすりつぶし、各種由来の試料２．５ｇと組み合わせた。コメおよびダイズの種を、各種由来の試料１ｇと組み合わせ、粉末にすりつぶした。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１２ｍｌを、一晩生育させ、遠心沈降させて、１１０ｍｇの湿潤細胞重量の酵母を得た。１ｇのマッシュルームの菌糸をすりつぶし、真菌ＲＮＡ抽出プロトコルを用いて処理した。５つのカテゴリーすべての試料を、液体窒素を用いて迅速に凍結させ、カテゴリーに特異的なＲＮＡ抽出プロトコルを使用して解凍かつ溶解した。異なる食品カテゴリー由来のＲＮＡを抽出し、１つの収集した試料として組み合わせた。組み合わせたＲＮＡの集合を、プライマーとしてのオリゴ‐ｄＴを使用してｃＤＮＡへと逆転写させ、５００ｂｐ〜４ｋｂの長さのｃＤＮＡを得た。アダプターを、ｃＤＮＡのそれぞれの末端にライゲートさせて、ｃＤＮＡライブラリーの増幅用のＰＣＲプライマーとして使用した。またこれは、発現ベクターにライブラリーをクローニングするためのＳｆｉＩ制限消化部位を含んだ。ｃＤＮＡライブラリーを変性させ、再度アニーリングし、ゲル電気泳動を使用して、一本鎖のＤＮＡを選択した。この処理で、大量に存在するＲＮＡ種から余分なｃＤＮＡを除去して標準化したｃＤＮＡライブラリーを得た。標準化したｃＤＮＡライブラリーを、エタノール沈殿を使用した沈殿させた後、ＰＣＲ増幅を行い、発現ベクターにクローニングした。
【表６】
2016537402.tif 000008
【０４６１】
タンパク質発現のための、大腸菌へのｃＤＮＡライブラリーのクローニング
ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＥＴ１５ｂ骨格のベクターの中にクローニングし、対応するＳｆｉＩ制限部位を含むオーバーハングを有するプライマー（フォワードプライマーオーバーハング：ＴＡＣＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣ；リバースプライマーオーバーハング：ＴＡＣＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣ）で増幅させた。ｐＥＴ１５ｂは、ｐＢＲ３２２複製開始点、ｌａｃ制御Ｔ７プロモーター、およびカルベニシリン耐性を与えるｂｌａ遺伝子を含む。ｃＤＮＡライブラリーおよびＰＣＡ増幅した骨格の両方を、ＳｆｉＩで切断し、ＰＣＲ増幅し、結合した。このライゲーション反応物により、１０−Ｂｅｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  コンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換し、形質転換した細胞を、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含む４つのＬＢ寒天プレート上で平板培養した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーが増殖した後、液体ＬＢ培地２ｍｌを各プレートに添加した。細胞を、剥がして液体に入れ、共に混合し、懸濁物を、プラスミド抽出のため調製して、マルチプレックスｃＤＮＡライブラリーを形成した。
【０４６２】
大腸菌のｃＤＮＡマルチプレックスの発現方法
４つの細胞株：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ；ならびにＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＲｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）を、使用してｃＤＮＡライブラリーを発現させた。Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓは、ｌａｃオペロンでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むが、ＬｏｎおよびＯｍＴプロテアーゼを欠損するエンハンスドＢＬ２１誘導体である。Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓの遺伝子型は、ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２［ｄｃｍ］Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ｅｎｄＡ１Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０である。Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）は、７つの希少なコドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、ＧＧＡ、ＣＣＣ、ＣＧＧ）のｔＲＮＡを供給するＢＬ２１誘導体である。この細胞株は、λＤＥ３の溶原菌であり、ｌａｃＵＶ５プロモーター下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持する。Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）の遺伝子型は、Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２（ＣａｍＲ）である。Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）と同じ特性を有するが、細胞質中のタンパク質ジスルフィド結合の形成を高める特徴を含む。Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）の遺伝子型は、Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）  ｇａｌ  ｄｃｍ  ｌａｃＹ１  ａｈｐＣ（ＤＥ３）ｇｏｒ５２２：：Ｔｎ１０  ｔｒｘＢｐＲＡＲＥ（ＣａｍＲ、ＫａｎＲ、ＴｅｔＲ）である。Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）と同様に、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）は、コドンバイアスを軽減し、ジスルフィド結合の形成を高め、染色体中のｌａｃＵＶ５のプロモーター下のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する。Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）の遺伝子型は、Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ΔｌａｃＸ７４  ΔｐｈｏＡ  ＰｖｕＩＩ  ｐｈｏＲ  ａｒａＤ１３９  ａｈｐＣ  ｇａｌＥ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＤＥ３）  Ｆ′［ｌａｃ＋  ｌａｃＩｑ  ｐｒｏ］  ｇｏｒ５２２：：Ｔｎ１０  ｔｒｘＢ  ｐＲＡＲＥ２（ＣａｍＲ、ＳｔｒＲ、ＴｅｔＲ）である。
【０４６３】
おおよそ２００ｎｇの調製したｃＤＮＡライブラリーにより、４つの骨格の細胞株：Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した。形質転換後、各細胞株１００μＬを、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む４つのＬＢ（１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１０ｇ／ｌのトリプトン、および５ｇ／ｌの酵母抽出物）の１．５％寒天プレート上で平板培養し、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地２ｍｌを、数千個の形質転換体を含む各プレートの表面に添加し、細胞スプレッダーで剥がし、混合することにより表面培地中に細胞を懸濁した。各バックグラウンドに関して４枚の反復実験プレートからの懸濁細胞を合わせて、発現実験のための接種前培養物を形成した。
【０４６４】
再懸濁した細胞から作製した接種前培養物のＯＤ６００を、プレートリーダーを使用して測定したところ、３５〜４０（Ｔ７，  Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）または１５〜２０（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）および２（ＤＥ３））であった。４つのバックグラウンド細胞株に関して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地１０ｍＬを含む１２５ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｓｈａｋｅ  ｆｌａｓｋ）に、ＯＤ６００が０．２となるよう培養物を接種して、接種培養物を形成し、おおよそ６時間２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００を測定し、接種培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、６００ｍＵ／Ｌのグルコアミラーゼ、および０．０１％の消泡剤  ２０４を含むＢｉｏＳｉｌｔａ  Ｅｎｂａｓｅ培地２５０ｍＬを含む２Ｌバッフル付き振盪フラスコ中に、発現培養物を、ＯＤ６００＝０．１となるように接種した。培養物を１８時間、３０℃および２５０ｒｐｍで振盪し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、追加的なＥｎＢａｓｅ培地成分および別の６００ｍＵ／Ｌのグルコアミラーゼで補充した。異種性の発現を、３０℃および２５０ｒｐｍで２４時間実行し、この時点で培養を終了させた。最終的な細胞密度を測定し、細胞を遠心沈降（５０００×ｇ、１０分、ＲＴ）により収集した。細胞を、−８０℃で保存した後、製造社のプロトコルに従ってＢ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解させた。細胞の溶解後、細胞ライセート全体を解析のため採取した。Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞株では、細胞ライセート全体を遠心分離（３０００×ｇ、１０分、ＲＴ）し、上清を、ライセートの可溶性分画として回収した。細胞ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で泳動させ、１０個の分画に分離し、ＭＳ／ＭＳを使用して解析した。
【０４６５】
タンパク質の分泌のための、ｃＤＮＡライブラリーのバチルスへのクローニング
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでのタンパク質分泌アッセイのため、ｐＨＴ４３ベクターにクローニングした。ＭｏＢｉＴｅｃ由来の非改変ｐＨＴ４３ベクターは、Ｐｇｒａｃプロモーター、ＳａｍｙＱシグナルペプチド、ＡｍｐおよびＣｍ耐性遺伝子、ｌａｃＩ領域、ｒｅｐＡ領域、およびＣｏｌＲ１複製開始点を含む。ＳａｍｙＱシグナルペプチドを除去した。シグナルペプチドのないｐＨＴ４３骨格ベクター、ならびにｇｒａｃプロモーターをａｐｒＥプロモーターに置換して、かつｌａｃＩ領域が除去された改変版を、対応するＳｆｉＩ制限部位を含むオーバーハングを有するプライマー（フォワードプライマーオーバーハング：ＴＡＣＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣ；リバースプライマーオーバーハング：ＴＡＣＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣ）によって増幅させた。ｃＤＮＡライブラリーおよび２つのＰＣＲ増幅した骨格の両方を、ＳｆｉＩで切断し、ＰＣＲ精製した。ｃＤＮＡライブラリー挿入物を、各骨格に結合した。ライゲーション反応物により、１０−Ｂｅｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換し、各ライゲーション由来の細胞を、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む４つのＬＢ寒天プレート上で平板培養した。プレートを、一晩３７℃でインキュベートした。コロニーが増殖した後、２ｍＬの液体ＬＢ培地を各プレートに添加した。各ライゲーションに関して、細胞を剥がして液体に入れ、共に混合し、懸濁物を、プラスミド抽出のため調製してマルチプレックスｃＤＮＡプラスミドライブラーを形成した（以下マルチプレックスＧｒａｃ−ｃＤＮＡおよびＡｐｒＥ−ｃＤＮＡライブラリーと呼ぶ）。
【０４６６】
この発現実験に使用した発現細胞株は、ＷＢ８００Ｎ株（ＭｏＢｉＴｅｃ）を基にする。ＷＢ８００Ｎ株は、以下の遺伝子型：ｎｐｒＥ  ａｐｒＥ  ｅｐｒ  ｂｐｒ  ｍｐｒ：：ｂｌｅ  ｎｐｒＢ：：ｂｓｒ  ｖｐｒ  ｗｐｒＡ：：ｈｙｇ  ｃｍ：：ｎｅｏ；ＮｅｏＲを有する。細胞株ｃＤＮＡ−１は、ｐａｐｒＥプロモーターと協調する変異を含み、ＷＢ８００Ｎの遺伝子型に加えてこれらの変化：ｐＸｙｌＡ−ｃｏｍＫ：：Ｅｒｍ、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）、ｓｉｇＦ：：Ｓｔｒを含む。細胞株ｃＤＮＡ−２は、ＷＢ８００Ｎに加えてこれらの変化：ｐＸｙｌＡ−ｃｏｍＫ：：Ｅｒｍを含む。
【０４６７】
おおよそ１μｇのマルチプレックスＧｒａｃ−ｃＤＮＡライブラリーにより、細胞株ｃＤＮＡ−１および細胞株ｃＤＮＡ−２の両方を形質転換し、１μｇのマルチプレックスＡｐｒＥ−ｃＤＮＡライブラリーにより、細胞株ｃＤＮＡ−１を形質転換した。形質転換した後、各細胞株１００μＬを、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む、４つのＬＢ（１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１０ｇ／ｌのトリプトンおよび５ｇ／ｌ酵母抽出物）１．５％寒天プレート上で平板培養し、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベートした後、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２ｍＬを、数千個の形質転換体を含む各プレートの表面に添加し、細胞を、細胞スプレッダーで剥がして、混合することにより表面培地に懸濁した。各形質転換由来の４枚の反復実験プレートからの懸濁細胞を合わせて、発現実験のために接種前培養物を形成した。
【０４６８】
再度懸濁した細胞から作製した接種前培養物のＯＤ６００を、プレートリーダーを使用して測定したところ、おおよそ２０〜２５であった。３つの細胞株（細胞株ｃＤＮＡ−１＋マルチプレックスＧｒａｃ−ｃＤＮＡ、細胞株ｃＤＮＡ−１＋マルチプレックスＡｐｒＥ−ｃＤＮＡ、細胞株ｃＤＮＡ−２＋Ｇｒａｃ−ｃＤＮＡ）に、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む、５０ｍＬの２×Ｍａｌ培地（２０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ＬのＤ−マルトース）を含む、５００ｍＬのバッフル付き振盪フラスコに、ＯＤ６００≒０．２となるように培養物を接種して、接種培養物を形成し、おおよそ６時間、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００を測定し、接種培養物を使用して、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１×Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌｓ、および０．０１％の消泡剤２０４を含む２×Ｍａｌ培地を含む２Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中で、ＯＤ６００が０．１となるように発現培養物を接種した。細胞株ｃＤＮＡ−１＋マルチプレックスＡｐｒＥ  ｃＤＮＡ培養物を、１８時間、３０℃、および２５０ｒｐｍで振盪し、この時点で培養物を収集した。最終的な細胞密度を測定し、細胞を、遠心沈降（５０００×ｇ、３０分、ＲＴ）により収集した。細胞株ｃＤＮＡ−１＋マルチプレックスＧｒａｃ−ｃＤＮＡおよび細胞株ｃＤＮＡ−２＋マルチプレックスＧｒａｃ−ｃＤＮＡ培養物を、４時間３７℃および２５０ｒｐｍで振盪し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。異種発現を、３７℃および２５０ｒｐｍで４時間行い、この時点で培養物を回収した。再度、最終的な細胞密度を測定し、細胞を、遠心沈降（５０００×ｇ、３０分、ＲＴ）により収集した。上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの中で泳動させ、１０個の分画に分離し、次いでＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して解析して、分泌したタンパク質を同定した。
【０４６９】
質量分析の解析
全ての細胞ライセートおよび可溶性ライセートの試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してタンパク質発現に関して解析した。試料を解析するために、試料１０μｇを、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、約５ｃｍ離してロードした。ゲルを、１０個の区画に切断し、ゲル切片を、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム、次いでアセトニトリルで洗浄することにより処理した。次いで、ゲルの切片を、６０℃の１０ｍＭのジチオスレイトールで還元し、室温の５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。最終的に試料を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で４時間消化し、次いで、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅとインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムによるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムに充填し、３５０ｎＬ／分で、７５μｍの解析カラムから溶出させた。両カラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ  樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。１時間の勾配を使用した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、７０，０００ＦＷＨＭの分解能および１７，５００ＦＷＨＭの分解能でそれぞれ、ＯｒｂｉｔｒａｐでＭＳおよびＭＳ／ＭＳを実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳに関して選択した。データを、Ｍａｓｃｏｔを使用してデータベースに対して検索して、ペプチドを同定した。データベースは、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｓｉｃｕｍ、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ  ｖａｒ．  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＭｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏを含む１２すべての種からの完全なプロテオーム配列を組み合わせることにより構築した。ＭａｓｃｏｔＤＡＴファイルを、検証、フィルタリングのため、および試料あたり重複しないリストを作成するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェアで解析した。データを、１％のタンパク質、およびタンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要とするペプチドの偽陽性率（ＦＤＲ）でフィルタリングした。
【０４７０】
同定した発現タンパク質
質量分析の解析から、発現細胞株を通して合計１２５個のタンパク質を同定した。スペクトルカウントは、タンパク質の存在量に関係しており、これは、タンパク質の発現または分泌を確認するために記録される。５３個のタンパク質を、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞株の全細胞ライセートで同定し、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）の可溶性画分で４６個のタンパク質、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）で３６個のタンパク質、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）で１０個のタンパク質、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの分泌上清で１５個のタンパク質を同定した。
【０４７１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの分泌上清で検出した栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７６２、ＳＥＱＩＤ−００７６３、ＳＥＱＩＤ−００７６４、ＳＥＱＩＤ−００７６５、ＳＥＱＩＤ−００７６６、ＳＥＱＩＤ−００７６７、ＳＥＱＩＤ−００７６８、ＳＥＱＩＤ−００７６９、ＳＥＱＩＤ−００７７０、ＳＥＱＩＤ−００７７１、ＳＥＱＩＤ−００７７２、ＳＥＱＩＤ−００７７３、ＳＥＱＩＤ−００７７４、ＳＥＱＩＤ−００７７５である。
【０４７２】
大腸菌のＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞株の全細胞ライセートで検出した栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７２０、ＳＥＱＩＤ−００７２３、ＳＥＱＩＤ−００７２４、ＳＥＱＩＤ−００７２５、ＳＥＱＩＤ−００７２９、ＳＥＱＩＤ−００７３２、ＳＥＱＩＤ−００７３７、ＳＥＱＩＤ−００７５１、ＳＥＱＩＤ−００７７６、ＳＥＱＩＤ−００７９０、ＳＥＱＩＤ−００７９７、ＳＥＱＩＤ−００７９８、ＳＥＱＩＤ−００７９９、ＳＥＱＩＤ−００８００、ＳＥＱＩＤ−００８０１、ＳＥＱＩＤ−００８０２、ＳＥＱＩＤ−００８０３、ＳＥＱＩＤ−００８０４、ＳＥＱＩＤ−００８０５、ＳＥＱＩＤ−００８０６、ＳＥＱＩＤ−００８０７、ＳＥＱＩＤ−００８０８、ＳＥＱＩＤ−００８０９、ＳＥＱＩＤ−００８１０、ＳＥＱＩＤ−００８１１、ＳＥＱＩＤ−００８１２、ＳＥＱＩＤ−００８１３、ＳＥＱＩＤ−００８１４、ＳＥＱＩＤ−００８１５、ＳＥＱＩＤ−００８１６、ＳＥＱＩＤ−００８１７、ＳＥＱＩＤ−００８１８、ＳＥＱＩＤ−００８１９、ＳＥＱＩＤ−００８２０、ＳＥＱＩＤ−００８２１、ＳＥＱＩＤ−００８２２、ＳＥＱＩＤ−００８２３、ＳＥＱＩＤ−００８２４、ＳＥＱＩＤ−００８２５、ＳＥＱＩＤ−００８２６、ＳＥＱＩＤ−００８２７、ＳＥＱＩＤ−００８２８、ＳＥＱＩＤ−００８２９、ＳＥＱＩＤ−００８３０、ＳＥＱＩＤ−００８３１、ＳＥＱＩＤ−００８３２、ＳＥＱＩＤ−００８３３、ＳＥＱＩＤ−００８３４、ＳＥＱＩＤ−００８３５、ＳＥＱＩＤ−００８３６、ＳＥＱＩＤ−００８３７である。
【０４７３】
大腸菌のＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞株の可溶性ライセートで検出した栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７１７、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７１９、ＳＥＱＩＤ−００７２０、ＳＥＱＩＤ−００７２１、ＳＥＱＩＤ−００７２２、ＳＥＱＩＤ−００７２４、ＳＥＱＩＤ−００７２５、ＳＥＱＩＤ−００７２６、ＳＥＱＩＤ−００７２７、ＳＥＱＩＤ−００７２８、ＳＥＱＩＤ−００７２９、ＳＥＱＩＤ−００７３０、ＳＥＱＩＤ−００７３１、ＳＥＱＩＤ−００７３２、ＳＥＱＩＤ−００７３３、ＳＥＱＩＤ−００７３４、ＳＥＱＩＤ−００７３５、ＳＥＱＩＤ−００７３６、ＳＥＱＩＤ−００７３７、ＳＥＱＩＤ−００７３８、ＳＥＱＩＤ−００７３９、ＳＥＱＩＤ−００７４０、ＳＥＱＩＤ−００７４１、ＳＥＱＩＤ−００７４２、ＳＥＱＩＤ−００７４３、ＳＥＱＩＤ−００７４４、ＳＥＱＩＤ−００７４５、ＳＥＱＩＤ−００７４６、ＳＥＱＩＤ−００７４７、ＳＥＱＩＤ−００７４８、ＳＥＱＩＤ−００７４９、ＳＥＱＩＤ−００７５０、ＳＥＱＩＤ−００７５１、ＳＥＱＩＤ−００７５２、ＳＥＱＩＤ−００７５３、ＳＥＱＩＤ−００７５４、ＳＥＱＩＤ−００７５５、ＳＥＱＩＤ−００７５６、ＳＥＱＩＤ−００７５７、ＳＥＱＩＤ−００７５８、ＳＥＱＩＤ−００７５９、ＳＥＱＩＤ−００７６０、ＳＥＱＩＤ−００７６１である。
【０４７４】
大腸菌のＲｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞株で検出した栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００００３、ＳＥＱＩＤ−００００４、ＳＥＱＩＤ−００００５、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７１９、ＳＥＱＩＤ−００７２０、ＳＥＱＩＤ−００７２９、ＳＥＱＩＤ−００７３０、ＳＥＱＩＤ−００７３１、ＳＥＱＩＤ−００７３２、ＳＥＱＩＤ−００７３４、ＳＥＱＩＤ−００７３６、ＳＥＱＩＤ−００７４０、ＳＥＱＩＤ−００７４３、ＳＥＱＩＤ−００７５２、ＳＥＱＩＤ−００７６０、ＳＥＱＩＤ−００７６３、ＳＥＱＩＤ−００７６４、ＳＥＱＩＤ−００７７６、ＳＥＱＩＤ−００７７７、ＳＥＱＩＤ−００７７８、ＳＥＱＩＤ−００７７９、ＳＥＱＩＤ−００７８０、ＳＥＱＩＤ−００７８１、ＳＥＱＩＤ−００７８２、ＳＥＱＩＤ−００７８３、ＳＥＱＩＤ−００７８４、ＳＥＱＩＤ−００７８５、ＳＥＱＩＤ−００７８６、ＳＥＱＩＤ−００７８７、ＳＥＱＩＤ−００７８８、ＳＥＱＩＤ−００７８９、ＳＥＱＩＤ−００７９０、ＳＥＱＩＤ−００７９１、ＳＥＱＩＤ−００７９２である。
【０４７５】
大腸菌のＲｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）細胞株で検出した栄養性ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７３７、ＳＥＱＩＤ−００７４７、ＳＥＱＩＤ−００７６３、ＳＥＱＩＤ−００７８９、ＳＥＱＩＤ−００７９０、ＳＥＱＩＤ−００７９３、ＳＥＱＩＤ−００７９４、ＳＥＱＩＤ−００７９５、ＳＥＱＩＤ−００７９６である。
【０４７６】
実施例３：注釈をつけたタンパク質配列のデータベースを使用した、食用に適した種の栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の同定および選択
タンパク質のデータベースの構築
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）とスイスバイオインフォマティクス研究所（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ）とのあいだ共同開発）は、手作業で精選され、吟味されたタンパク質のデータベースであり、これを、タンパク質データベースを構築するための開始点として使用した。食用に適した種のタンパク質のデータベースを構築するために、たとえば、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２３２号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２１８０号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２２５号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１８号、２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１２号、および２０１３年３月１５日に出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２０６号に開示される食用に適した種由来のタンパク質に関して、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースで検索を実施した。微生物から分泌されたタンパク質を同定するために、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースを、本明細書中に開示される微生物由来の種、ならびに分泌、細胞外、細胞壁、および外膜を含むキーワードまたは注釈で注釈付けされたタンパク質に関して検索した。ヒトの食事に多く含まれるタンパク質を同定するために、食用に適した種の参照プロテオームを、ゲノムデータベースから集めた。本明細書中に提供されるように、それぞれの食用に適した種から抽出したタンパク質に関して質量分析を実施した。質量分析により同定したペプチドを、参照プロテオームに対してマッピングし、参照タンパク質配列に関連するペプチドのスペクトルカウント、食品中の対応するタンパク質の存在量に関する測定値に変換した。信頼値の高いカットオフスペクトルカウントを超えて検出されたタンパク質全てを、データベースにまとめた。これらのデータベースは、分泌され、かつ／またはヒトの食事に多く含まれる食用に適した種に由来するタンパク質を同定するために使用する。
【０４７７】
アミノ酸配列の選択の処理
タンパク質またはタンパク質のグループを選別するための工程は、検索されるタンパク質のデータベースからのその発見に関心があるタンパク質のクラスを定義する一連の制約を同定することと、、実際の検索を行うこととを含むことができる。
【０４７８】
タンパク質クラスの基準は、栄養学の文献（すなわち、従来より有効と同定）、望ましい生理化学的形質（たとえば発現可能、可溶性、非アレルゲン性、非毒性、消化可能性など）、および他の特徴により定義することができる。検索目的のために使用できる関連するタンパク質データベースは、本明細書中に開示される配列に由来することができる。
【０４７９】
検索可能なタンパク質の一例は、筋肉の同化／免疫の健康／糖尿病の処置のための、可溶性の高いクラスのタンパク質である。これらのタンパク質は、一般的に可溶性に発現可能であり、精製／単離の際に可溶性が高く、非アレルゲン性、非毒性であり、かつ、一部の基本的な栄養上の基準（たとえば［ＥＡＡ］＞０．３、［ＢＣＡＡ］＞０．１５、［ロイシンまたはグルタミンまたはアルギニン］＞０．０８、ＥＡＡは完全）を満たす。
【０４８０】
タンパク質配列の親水性および疎水性に関連する２つのパラメータ：溶媒和スコアおよび凝集スコア（これら２つの計測基準およびこのモデルの効力の測定に関する様々な記載に関しては以下の例を参照）に基づくバイナリー分類モデルを使用して、発現可能な可溶性タンパク質の検索を行う。あるいは、アミノ酸あたりの負電荷または正電荷が真に過剰であることを表す、アミノ酸あたりの実効電荷が高い（または低い）高荷電のタンパク質に関する検索を行うことができる（さらなる記載は以下の例を参照）。
【０４８１】
栄養上の基準は、一次配列に基づきすべての関連するアミノ酸の質量分画をコンピュータ処理することにより満たされる。既知の臨床的に有効なアミノ酸混合物とマッチすることが望ましい場合では、重み付けユークリッド距離方法を使用できる（以下の実施例を参照）。
【０４８２】
本明細書中で提供されるように、アレルゲン性／毒性／非アレルゲン性／抗栄養性の基準を、各候補配列を既知のアレルゲン、毒素、非アレルゲン、または抗栄養（たとえばプロテアーゼ阻害性）タンパク質のライブラリーと比較する、配列ベースの相同性評価を使用して探索する（本明細書中の実施例を参照）。一般的に、＜５０％の全体的または＜３５％の局所的（任意の所定のアミノ酸８０個のウインドウにわたり）相同性（パーセントＩＤ）のカットオフを、アレルゲン性のスクリーニングのために使用でき、毒性および抗栄養性のスクリーニングでは、＜３５％の全体的相同性のカットオフを使用できる。すべての場合で、値が小さいと、アレルゲン性／毒性／抗栄養性が低いことが示される。非アレルゲン性のスクリーニングは、典型的に、カットオフとしてあまり使用されないが、＞６２％は、カットオフとして使用することができる（値が大きいと、非アレルゲン性が高いことを示す）。これらのスクリーニングにより、リストは、関心対象の基準を多く満たすタンパク質のより小さなサブセットへと縮小する。次いでこのリストを、様々な線形化加重和法を使用してランク付けし、このランクを整理したリストから選択を行う。
【０４８３】
実施例４：栄養性ポリペプチドのアミノ酸の薬理学を例証するアミノ酸配列の選択
サルコペニアの処置のための、ロイシンおよび必須アミノ酸を多く含むタンパク質の同定
本明細書中で記載されるように、サルコペニアは、骨格筋の量（典型的に、２５歳を過ぎてから１年あたり０．５〜１％の喪失）、質、および強度の老化に関連した変性性の喪失である。サルコペニアは、第一に、筋肉の萎縮（筋肉の大きさの減少）を特徴とし、これに脂肪による筋線維の置換、線維症の増加、筋代謝の変化、酸化ストレス、および神経筋接合部の変性などの要因により引き起こされる筋組織の「質」の低下が加わる。まとめると、これらの変化は、筋肉機能の進行性の喪失をもたらし、結果的に筋虚弱となる。サルコペニアの高齢者に必須アミノ酸を補給することは、筋肉量に対して同化作用および／または温存作用を有し得ることが示されている。さらに、この補給はまた、患者の筋力および筋肉の質の改善と言い換えることができる。たとえば、Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４，  ８９：４３５１−４３５８；  Ｆｅｒｒａｎｄｏ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２００９  １−６；  Ｋａｔｓａｎｏｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．    Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００６，  ２９１：  ３８１−３８７を参照されたい。また、必須アミノ酸のロイシンも、筋肉のタンパク質合成の刺激に特に重要な因子であることが示されている。たとえば、Ｂｏｒｓｃｈｅｉｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００２，  ２８３：  Ｅ６４８−Ｅ６５７；  Ｂｏｒｓｈｅｉｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．  ２００８，  ２７：  １８９−９５；  Ｅｓｍａｒｃｋ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１，  ５３５：  ３０１−３１１；  Ｍｏｏｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００９，  ８９：  １６１−８）を参照されたい。ロイシンおよび他の必須アミノ酸の量を増加させたタンパク質を選択することにより、サルコペニアを罹患している個体にとって有益な栄養性ポリペプチドを同定することができる。
【０４８４】
本明細書中に記載される食用に適した種由来のすべてのタンパク質配列のデータベースを使用して、ロイシン（≧１５質量％）および必須アミノ酸（≧４０質量％）を多く含む候補配列を同定し、総アミノ酸量に対するロイシン＋必須アミノ酸の量の合計によりランクを付けた。これらのタンパク質が可溶性に発現され、凝集傾向が低下してｐＨ７で可溶性が高い確率を上げるために、上限−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ＡＡおよび０．５の溶媒和スコアおよび凝集スコアを適用した。これらのタンパク質が、アレルゲン性応答を誘発する可能性を低下させるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性スコアに関してそれぞれ、５０％および３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が摂取の際に毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して、３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して、３５％の上限を設定した。
【０４８５】
ロイシン（≧１５％質量％）および必須アミノ酸（≧４０％）を多く含み、かつ溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす、トップ１０の栄養性ポリペプチド配列の例示的なリストを表Ｅ４Ａに示す。
【表７】
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【０４８６】
ロイシン（≧１５質量％）および必須アミノ酸（≧４０質量％）を多く含む、発現されたタンパク質のデータベースからのトップ１０の栄養性ポリペプチド配列の例示的なリストを表Ｅ４Ｂに示す。
【表８】
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【０４８７】
実施例５：必須アミノ酸を多く含み、かつ関心対象の様々な個々のアミノ酸を多く含むまたは少なく含む、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択
本明細書中に記載される食用に適した種に由来するすべてのタンパク質配列のデータベースを使用して、必須アミノ酸を多く含み、各アミノ酸の量を多く含むまたは少なく含む候補配列を同定した。これらのタンパク質が可溶性に発現され、かつ凝集傾向が低下してｐＨ７で可溶性が高い確率を上げるために、上限−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ＡＡおよび０．５の溶媒和スコアおよび凝集スコアを適用した。これらのタンパク質がアレルゲン性の応答を誘発する可能性を下げるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性のスコアに関してそれぞれ、５０％および３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、摂取される際に毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して、３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して、３５％の上限を設定した。所定のアミノ酸を多く含む、または少なく含むタンパク質を検索する際に、上述のカットオフを適用し、タンパク質を、所望のアミノ酸の計算されたアミノ酸質量分画、次いでそれらの必須アミノ酸の含有量によりランク付けした。
【０４８８】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、アラニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ａに示す。アラニンが少ない栄養性ポリペプチドのトップ１０を、表Ｅ５Ｂに示す。
【表９】
2016537402.tif 000011
【表１０】
2016537402.tif 000012
【０４８９】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、アルギニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｃに示す。アルギニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５Ｄに示す。
【表１１】
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【表１２】
2016537402.tif 000014
【０４９０】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、アスパラギンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｅに示す。アスパラギンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５Ｆに示す。
【表１３】
2016537402.tif 000015
【表１４】
2016537402.tif 000016
【０４９１】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、アスパラギン酸を多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを表Ｅ５Ｇに示す。アスパラギン酸が少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｈに示す。
【表１５】
2016537402.tif 000017
【表１６】
2016537402.tif 000018
【０４９２】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、システインを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｉに示す。システインが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｊに示す。
【表１７】
2016537402.tif 000019
【表１８】
2016537402.tif 000020
【０４９３】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、グルタミンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｋに示す。グルタミンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｌに示す。
【表１９】
2016537402.tif 000021
【表２０】
2016537402.tif 000022
【０４９４】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、ヒスチジンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｍに示す。ヒスチジンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｎに示す。
【表２１】
2016537402.tif 000023
【表２２】
2016537402.tif 000024
【０４９５】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、イソロイシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｏに示す。イソロイシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｐに示す。
【表２３】
2016537402.tif 000025
【表２４】
2016537402.tif 000026
【０４９６】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、ロイシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｑに示す。ロイシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｒに示す。
【表２５】
2016537402.tif 000027
【表２６】
2016537402.tif 000028
【０４９７】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、リジンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｓに示す。リジンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｔに示す。
【表２７】
2016537402.tif 000029
【表２８】
2016537402.tif 000030
【０４９８】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、メチオニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｕに示す。リジンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｖに示す。
【表２９】
2016537402.tif 000031
【表３０】
2016537402.tif 000032
【０４９９】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、フェニルアラニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｗに示す。フェニルアラニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｘに示す。
【表３１】
2016537402.tif 000033
【表３２】
2016537402.tif 000034
【０５００】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、プロリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５Ｙに示す。プロリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５Ｚに示す。
【表３３】
2016537402.tif 000035
【表３４】
2016537402.tif 000036
【０５０１】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、セリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＡに示す。セリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５ＡＢに示す。
【表３５】
2016537402.tif 000037
【表３６】
2016537402.tif 000038
【０５０２】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、スレオニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＣに示す。スレオニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５ＡＤに示す。
【表３７】
2016537402.tif 000039
【表３８】
2016537402.tif 000040
【０５０３】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、トリプトファンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＥに示す。トリプトファンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５ＡＦに示す。
【表３９】
2016537402.tif 000041
【表４０】
2016537402.tif 000042
【０５０４】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、チロシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＧに示す。チロシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５ＡＨに示す。
【表４１】
2016537402.tif 000043
【表４２】
2016537402.tif 000044
【０５０５】
溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上記のカットオフを満たす、バリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＩに示す。バリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を表Ｅ５ＡＪに示す。
【表４３】
2016537402.tif 000045
【表４４】
2016537402.tif 000046
【０５０６】
必須アミノ酸を多く含み、かつ様々な個々のアミノ酸を多く含むまたは少なく含む、発現されたタンパク質の選択
本明細書中に記載されるすべての発現されたタンパク質の配列のデータベースを使用して、各アミノ酸の量が増加または減少し、必須アミノ酸を多く含む候補配列を同定した。所定のアミノ酸を多く含むまたは少なく含むタンパク質を検索する際に、タンパク質は、望ましいアミノ酸に関して計算されたアミノ酸質量分画、次いで必須アミノ酸の含有量によりランク付けした。
【０５０７】
アラニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＫに示す。アラニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＬに示す。
【表４５】
2016537402.tif 000047
【表４６】
2016537402.tif 000048
【０５０８】
アルギニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＭに示す。アルギニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＮに示す。
【表４７】
2016537402.tif 000049
【表４８】
2016537402.tif 000050
【０５０９】
アスパラギンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＯに示す。アスパラギンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＰに示す。
【表４９】
2016537402.tif 000051
【表５０】
2016537402.tif 000052
【０５１０】
アスパラギン酸を多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＱに示す。アスパラギン酸が少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＲに示す。
【表５１】
2016537402.tif 000053
【表５２】
2016537402.tif 000054
【０５１１】
システインを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＳに示す。システインが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＴに示す。
【表５３】
2016537402.tif 000055
【表５４】
2016537402.tif 000056
【０５１２】
グルタミンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＵに示す。グルタミンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＶに示す。
【表５５】
2016537402.tif 000057
【表５６】
2016537402.tif 000058
【０５１３】
ヒスチジンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＷに示す。ヒスチジンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＸに示す。
【表５７】
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【表５８】
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【０５１４】
イソロイシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＡＹに示す。イソロイシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＡＺに示す。
【表５９】
2016537402.tif 000061
【表６０】
2016537402.tif 000062
【０５１５】
ロイシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＡに示す。ロイシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＢに示す。
【表６１】
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【表６２】
2016537402.tif 000064
【０５１６】
リジンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＣに示す。リジンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＤに示す。
【表６３】
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【表６４】
2016537402.tif 000066
【０５１７】
メチオニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＥに示す。アルギニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＦに示す。
【表６５】
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【表６６】
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【０５１８】
フェニルアラニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＧに示す。フェニルアラニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＨに示す。
【表６７】
2016537402.tif 000069
【表６８】
2016537402.tif 000070
【０５１９】
プロリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＩに示す。プロリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＪに示す。
【表６９】
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【表７０】
2016537402.tif 000072
【０５２０】
セリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＫに示す。セリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＬに示す。
【表７１】
2016537402.tif 000073
【表７２】
2016537402.tif 000074
【０５２１】
スレオニンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＭに示す。スレオニンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＮに示す。
【表７３】
2016537402.tif 000075
【表７４】
2016537402.tif 000076
【０５２２】
トリプトファンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＭに示す。トリプトファンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＮに示す。
【表７５】
2016537402.tif 000077
【表７６】
2016537402.tif 000078
【０５２３】
チロシンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＯに示す。チロシンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＰに示す。
【表７７】
2016537402.tif 000079
【表７８】
2016537402.tif 000080
【０５２４】
バリンを多く含む栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ５ＢＱに示す。バリンが少ない栄養性ポリペプチド配列のトップ１０を、表Ｅ５ＢＲに示す。
【表７９】
2016537402.tif 000081
【表８０】
2016537402.tif 000082
【０５２５】
実施例６：タンパク質栄養素を提供するため、およびタンパク質の栄養障害を処置するための、必須アミノ酸を多く含む栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択
ヒトは、天然に存在する２０種のアミノ酸のうち９種：ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、リジン、およびトリプトファンを内在的に合成できないことが示されている（Ｙｏｕｎｇ，  Ｖ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｔｈａｒａｋａｎ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．  Ｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｙｎｏｂｅｒ，  Ｌ．  Ａ．  Ｅｄ．；  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００４；  ｐｐ  ４３９−４７０）。このように、タンパク質の栄養障害およびこの状態からもたらされる有害な健康作用を回避するために、これら９種の必須アミノ酸の十分な量の摂取が必要とされている。必須アミノ酸の量を多く含み、各非必須アミノ酸のゼロでない量を含む（すなわち栄養性ポリペプチド配列は、必須アミノ酸が完全である）タンパク質を選択することにより、健康または栄養不良の個体のいずれかにおけるこれら必須アミノ酸の必要条件を満たすために有用有益である、栄養性ポリペプチドを同定する。
【０５２６】
本明細書中に記載される食用に適した種由来のすべてのタンパク質配列のデータベースを使用して、必須アミノ酸が完全であり、かつ必須アミノ酸を多く含む候補配列を同定した。これらのタンパク質が可溶性に発現され、凝集特性が低下してｐＨ７で可溶性が高い確率を上げるために、上限−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ＡＡおよび０．５の溶媒和スコアおよび凝集スコアを適用した。これらタンパク質がアレルゲン性の応答を誘発する可能性を下げるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性のスコアに関してそれぞれ、５０％および３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、摂取する際に毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して３５％の上限を設定した。
【０５２７】
必須アミノ酸が完全で、必須アミノ酸を多く含み、かつ、溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす、栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ６Ａに示す。
【表８１】
2016537402.tif 000083
【０５２８】
必須アミノ酸が完全で、必須アミノ酸を多く含む、発現されたタンパク質データベース由来の栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ６Ｂに示す。
【表８２】
2016537402.tif 000084
【０５２９】
実施例７：筋肉の健康のための、分枝鎖を多く含む栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択、ならびに糖尿病、心血管疾患、慢性腎疾患、および脳卒中の処置のための、分枝鎖が少ない栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択
肝疾患および／または腎疾患の処置のための、分枝鎖アミノ酸を多く含むタンパク質の同定
本明細書中に記載される食用に適した種由来のすべてのタンパク質配列のデータベースを使用して、分枝鎖アミノ酸を多く含む、または少なく含む候補配列を同定した。これらタンパク質が可溶性に発現され、かつ凝集傾向が低下してｐＨ７での可溶性が高い確率を上げるために、上限−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ＡＡおよび０．５の溶媒和スコアおよび凝集スコアを適用した。これらのタンパク質が、アレルゲン性応答を誘発する可能性を下げるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性のスコアに関してそれぞれ、５０％および３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、摂取の際に毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して３５％の上限を設定した。
【０５３０】
分枝鎖アミノ酸を多く含み、溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを表Ｅ７Ａに示す。
【表８３】
2016537402.tif 000085
【０５３１】
分枝鎖アミノ酸を多く含む発現されたタンパク質のデータベース由来の栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ７Ｂに示す。
【表８４】
2016537402.tif 000086
【０５３２】
分枝鎖アミノ酸を少なく含み、かつ溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ７Ｃに示す。
【表８５】
2016537402.tif 000087
【０５３３】
分枝鎖アミノ酸を少なく含む発現されたタンパク質データベース由来の栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ７Ｄに示す。
【表８６】
2016537402.tif 000088
【０５３４】
実施例８：フェニルケトン尿症の処置または予防のための、フェニルアラニンが少なく、または存在せず、かつチロシンおよび他のすべての必須アミノ酸を多く含む、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を罹患する個体は、アミノ酸のフェニルアラニンを処理することができず、かつ、しばしば肝臓の酵素のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌｎｉｎｅ）ヒドロキシラーゼの機能不全によりフェニルアラニンのチロシンへの変換を触媒することができない（ＭａｃＬｅｏｄ  Ｅ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｎｅｙ  Ｄ．  Ｍ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ａｎｎａｌｅｓ  Ｎｅｓｔｌｅ．  （２０１０）  ６８：５８−６９）。これら個体では、アミノ酸のフェニルアラニンを含むタンパク質を摂取すると、フェニルアラニンが血液中に蓄積する。無処置のＰＫＵは、学業の低下、実行機能の低下、および長期間の知的障害を含む、重篤で有害な健康作用を有する（Ｍａｔａｌｏｎ，  Ｒ．，  Ｍｉｃｈａｌｓ−Ｍａｔａｌｏｎ，  Ｋ．，  Ｂｈａｔｉａ，  Ｇ．，  Ｇｒｅｃｈａｎｉｎａ，  Ｅ．，  Ｎｏｖｉｋｏｖ，  Ｐ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｒａｄｙ，  Ｊ．，    Ｔｙｒｉｎｇ，  Ｓ．  Ｋ．，  Ｇｕｔｔｌｅｒ，  Ｆ．  Ｌａｒｇｅ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．  Ｊ．  Ｉｎｈｅｒｉｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓ．  （２００６）  ２９：  ７３２−７３８）。フェニルアラニンの血液レベルを、神経学的効果を回避するために低く維持することができる１つの方法は、フェニルアラニン含有タンパク質の摂取を回避すること、かつ／またはフェニルアラニンが少ないタンパク質供給源のみを消費することである。他のすべてのアミノ酸の基本的なタンパク質の栄養上の必要条件も同様に満たさなければならないことから、他の必須アミノ酸（ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、スレオニン、リジン、およびトリプトファン）、ならびにこれら個体において条件的に必須であるチロシンの十分な摂取が必要とされる。フェニルアラニンが少なく、または存在せず、かつチロシンおよび他の必須アミノ酸の量を多く含むタンパク質を選択することにより、フェニルケトン尿症を罹患する個体に有益な栄養性ポリペプチドを同定することができる。
【０５３５】
本明細書中に記載される食用に適した種由来のすべてのタンパク質配列のデータベースを使用して、フェニルアラニンの量が少ない、または存在せず、必須アミノ酸およびチロシンが完全であり（フェニルアラニンを除く）、チロシンおよび必須アミノ酸を多く含む候補配列を同定し、まずフェニルアラニンの質量分画、次いでチロシン＋必須アミノ酸の質量分画の合計によりランク付けした。これらのタンパク質が可溶性に発現され、かつ凝集傾向が減少してｐＨ７で可溶性が高い確率を上げるために、上限−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ＡＡおよび０．５の溶媒和スコアおよび凝集スコアを適用した。これらのタンパク質が、アレルゲン性応答を誘発する可能性を下げるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性スコアに関してそれぞれ、５０％および３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が摂取の際に毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が、消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して３５％の上限を設定した。
【０５３６】
フェニルアラニンの量が少ない、または存在せず、必須アミノ酸およびチロシンが完全であり（フェニルアラニンを除く）、チロシンおよび必須アミノ酸を多く含み、溶媒和スコア、凝集スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす、栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ８Ａに示す。
【表８７】
2016537402.tif 000089
【０５３７】
フェニルアラニンの量が少ない、または存在せず、必須アミノ酸およびチロシンが完全であり（フェニルアラニンを除く）、かつチロシンおよび必須アミノ酸を多く含む、発現されたタンパク質データベース由来の栄養性ポリペプチド配列のトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ８Ｂに示す。
【表８８】
2016537402.tif 000090
【０５３８】
実施例９：天然に存在するタンパク質配列のフラグメントまたは領域を含む栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択：ロイシンおよびすべての必須アミノ酸を多く含む栄養性ポリペプチドフラグメント
場合によっては、本明細書中に記載されるデータベースから同定した完全長のタンパク質は、１つまたは複数の重要なパラメータにより定義される１つまたは複数の選択要件の観点から特に有益ではなく、または栄養性ポリペプチドの全量と比較して１つまたは複数の特定のアミノ酸の十分量を提供しない。これらの場合では、データベースで同定される栄養性ポリペプチドの１つまたは複数のフラグメント（本明細書中「領域」とも呼ばれる）は、望ましい検索基準を満たすことができる。可能性がある栄養性ポリペプチドのフラグメントを含むデータベースを、データベース中の各完全長の配列を得て、それらに含まれる、長さがアミノ酸少なくとも２５個の起こり得る全ての小配列を試験することにより、作製して検索する。たとえば、可溶性発現の可能性が増大するよう、約０．２超のロイシン質量分画および高荷電の栄養性ポリペプチド配列を発見することが望まれた。本明細書中に記載される食用種のタンパク質データベースを、−３０未満の溶媒和スコアカットオフを使用して検索し、これらのタンパク質がアレルゲン性の応答を誘発する可能性を下げるために、アレルゲンとの全体的相同性およびアレルゲン性スコアに関して、５０％の上限を設定した。これらのタンパク質が、摂取後毒性作用を有する可能性を下げるために、毒性スコアに関して３５％の上限を設定した。これらのタンパク質が消化性プロテアーゼの阻害剤として作用する可能性を下げるために、抗栄養性スコアに関して３５％の上限を設定した。
【０５３９】
ロイシンを多く含み（≧２０質量％超）、かつ溶媒和スコア、アレルゲンとの全体的相同性、アレルゲン性スコア、毒性スコア、および抗栄養性スコアの上述のカットオフを満たす栄養性ポリペプチドフラグメントのトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ９Ａに示す。
【表８９】
2016537402.tif 000091
【０５４０】
ロイシンを多く含む（≧２０質量％）、発現されたタンパク質データベース由来の栄養性ポリペプチドフラグメントのトップ１０の例示的なリストを、表Ｅ９Ｂに示す。
【表９０】
2016537402.tif 000092
【０５４１】
実施例１０：栄養性ポリペプチドの精製
未加工の食品、細胞、塩、小分子、宿主細胞のタンパク質、および脂質などの他の材料から、または材料を取り除いて栄養性ポリペプチドを単離するために、様々な精製方法が使用されている。これらの方法として、ダイアフィルトレーション、沈殿、凝結、水性二相抽出、およびクロマトグラフィーが挙げられる。
【０５４２】
抗ＦＬＡＧアフィニティクロマトグラフィーによる精製
抗ＦＬＡＧの精製は、低力価の発現系または類似に荷電した宿主細胞のタンパク質から栄養性ポリペプチドを精製する方法を提供する。栄養性ポリペプチドを、タンパク質のＣ末端に付加した単一のＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）または三重のタンデムＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＤＹＫＤＤＤＤＫＤＹＫＤＤＤＤＫ）のいずれかを含むように改変した。抗ＦＬＡＧアフィニティ精製は、非変性工程条件および９５％超の溶出純度を提供する単一ステップの精製工程を提供する（Ｅｉｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。
【０５４３】
栄養性ポリペプチドを、抗ＦＬＡＧＭ２アフィニティアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して精製した。Ｍ２アフィニティ樹脂は、特に、Ｃ末端のＦＬＡＧのエピトープでの使用のために設計されている。Ｎ末端に付加したＦＬＡＧエピトープを精製するために、Ｍ１アフィニティアガロースゲルを使用した。Ｍ２アフィニティアガロースゲル（樹脂）は、樹脂１ｍＬあたり約０．５ｍｇの栄養性ポリペプチドの提示された静的結合容量（ＳＢＣ）を有する。
【０５４４】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ分泌培地およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ分泌培地からの栄養性ポリペプチドの精製を、抗ＦＬＡＧ樹脂２０〜４０ｍＬを使用して実施した。精製の前に、分泌培地を、１５０ｍＭのＮａＣｌでｐＨ７．４に調節した。過剰量の１×トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４±０．１）で培地をすすぎ、かつ０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）真空フィルターを介してこれを回収することにより樹脂を平衡化した。次いで、平衡化した樹脂をバッチモードで分泌培地と混合し、室温で１時間混合させた。非結合材料を、０．２μｍのＰＥＳ真空フィルターを介して混合物全体を通すことにより樹脂から除去した。この樹脂を、フィルターの表面で物理的に回収し、その後樹脂容積の２０倍のＴＢＳ（ｐＨ７．４±０．１）で洗浄して、０、２μｍのＰＥＳ真空フィルターを介して非結合材料をさらに除去した。洗浄した樹脂を、滴下カラム（各１０ｍｌ）に移し、結合したポリペプチドを、カラム容積（ＣＶ）の２倍の０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出したポリペプチドを滴下カラムから、１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）を含んだコニカルチューブへと直接流した。この戦略を使用して、溶出したポリペプチド溶液のｐＨを可能な限り早く中和した。樹脂を、３ＣＶの０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を使用して再生した。短期間の保存では、樹脂を、４℃の１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に保存し、長期間の保存では、樹脂を、０．５×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、５０％のグリセロール中−２０℃で保存した。
【０５４５】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳＥＱＩＤ−００１０５の例示的な抗ＦＬＡＧ精製により、４．３ｍｌの溶出液中でタンパク質４．０ｍｇを回収した。この試料を、感受性を増加させるために、３つの異なる希釈度でポリアクリルアミドゲルにロードしたところ、ＳＥＱＩＤ−００１０５は、９５％純粋であることが見出された。Ａ．ｎｉｇｅｒ由来のＳＥＱＩＤ−００２９８の例示的な抗ＦＬＡＧ精製を、同じ手順によって実施した。溶出分画を、記載するように中和し、本明細書中に記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびブラッドフォードアッセイにより解析した。溶出物のメインバンドは、９５％純粋であることが見出された。溶出物のメインバンドを同じゲルのＭＷラダーと比較したところ、ＳＥＱＩＤ−００２９８の予測分子量とマッチする。抗ＦＬＡＧ樹脂４０ｍＬは材料４．０ｍｇを捕捉し、これにより樹脂の推定交換容量は０．１０ｍｇ／ｍＬであった。
【０５４６】
５ｍｌの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製
本明細書中に記載されるように、ＨＩＳ８タグを有する個々の栄養性ポリペプチドを標的化発現させた大腸菌を、振とうフラスコでの発酵により生育させた。細胞を、バケット型の遠心沈降により各振とうフラスコから収集した。上清を廃棄し、細胞を３０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で、２０％ｗ／ｖの湿潤細胞重量（ＷＣＷ）濃度で懸濁した。次いで、懸濁した細胞を、８７μｍの相互作用チャンバーを介して２０，０００ｐｓｉのＭ１１０−Ｐマイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  マサチューセッツ州  ウェストウッド）に２回通過させることにより溶解した。溶解した細胞を、１２０分間、１５，０００相対遠心力（ＲＣＦ）で遠心分離し、次にデカントした。細胞のデブリを廃棄し、上清を、０．２μｍのフィルターでろ過した。次に、これらの濾過したタンパク質溶液を、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ニュージャージー州  ピスカタウェイ）での固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。栄養性ポリペプチドを、５ｍＬ（直径１．６ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）のＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ニュージャージー州  ピスカタウェイ）で精製した。
【０５４７】
ＩＭＡＣ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）に、０．２ＮｉＳＯ４を使用してニッケルをチャージし、５００ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）、を使用して洗浄し、次いで、３０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した。各タンパク質のロード溶液５０ｍＬを、５ｍＬのＩＭＡＣカラムに適用し、追加的な平衡溶液で洗浄して結合していない不純物を除去した。次に、関心対象タンパク質を、ＩＭＡＣ溶出溶液、０．２５Ｍのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）１５ｍｌで溶出した。すべてのカラムブロックを、１５０ｃｍ／時間の線流速で実施した。各ＩＭＡＣ溶出分画を、透析により中性のｐＨ処方溶液にバッファー交換した。精製したタンパク質を、キャピラリー電気泳動および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより濃度および純度に関して解析した。また濃度を、ブラッドフォードおよびＡ２８０の測定により、本明細書中に記載されるように試験した。表Ｅ９Ａは、５ｍＬのスケールでのＩＭＡＣにより精製した栄養性ポリペプチドのリストを示す。
【表９１】
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【０５４８】
固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製
本明細書中に記載されるように、ＨＩＳ８タグを有する個々の栄養性ポリペプチドを標的化発現させた大腸菌を、２０Ｌの発酵中で生育させた。細胞を、発酵槽から収集し、Ｓｈａｒｐｌｅｓ  ＡＳ−１６Ｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用して遠心沈降させて、湿潤細胞塊を回収した。その後、２０％ｗ／ｖの湿潤細胞重量（ＷＣＷ）の濃度で、３０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に再度懸濁した。次に、細胞懸濁物を、１２，５００〜１５，０００ｐｓｉの作動圧力および１Ｌ／分の流速でＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉホモジナイザー（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ，  イタリアパルマ）の中に４回通過させることにより溶解した。このライセートを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−ＨＣ  ｂｕｃｋｅｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，カリフォルニア州ブレア）を使用して１３，７００×ｇで１時間浄化した。細胞のデブリを廃棄し、上清を、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ＩＩ  ＸＬＧ  ０．８／０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ，  ニューヨーク州 ボヒミア）を通して３０ｌ／ｍ２／時間で濾過した。濾過したライセートを、０．９Ｌのカラム（直径９ｃｍ×高さ１３．８ｃｍ）に充填したＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂を使用してＩＭＡＣにより精製した。
【０５４９】
ＩＭＡＣ樹脂を、３００ｃｍ／時間の線流速で本明細書中に記載されるように平衡化した。平衡化した後、濾過したライセート全体を、１５０ｃｍ／時間の線流速でカラムを通過させた。充填容積は、カラム容積の６〜１０倍の範囲であった。充填した後、未結合材料をカラムから洗い落とし、標的タンパク質を溶出した。溶出物のプールを、室温、４℃、または凍結して輸送した。この判断は、溶出溶液中の栄養性ポリペプチドの安定性に依存した。表Ｅ９Ｂは、１ＬのカラムスケールでのＩＭＡＣにより精製した多数の栄養性ポリペプチドを要約する。
【表９２】
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【０５５０】
栄養性ポリペプチドを、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ＩＩ  ＸＬＧ  ０．８／０．２  ｍフィルターを介して濾過し、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の単位操作へと直接充填した。膜領域および名目上の分子量のカットオフを、個々の栄養性ポリペプチドに適切であるように選択した。栄養性ポリペプチドを、１２Ｌ／ｍ２／分のクロスフローおよび２５ｐｓｉのＴＭＰ目標で限外濾過した。栄養性ポリペプチドを、Ｈｙｄｒｏｓａｒ限外濾過カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ，  ニューヨーク州 ボヒミア）で約１０倍に濃縮し、栄養性ポリペプチドに特異的な処方バッファーに、７ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）でダイアフィルトレーションを行った。限外濾過透過液を廃棄した。ダイアフィルトレーションを行い、濃縮された残余分を回収し、０．２２μｍメンブレンフィルターを介して濾過し、−８０℃で凍結した。
【０５５１】
場合によって、凍結したタンパク質濃縮物を、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，  ミズーリ州カンザスシティ）を使用して凍結乾燥を行った。このケーキの残存水分含有量を、カール・フィッシャー法を介して解析した。
【０５５２】
１０Ｌの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製
本明細書中に記載されるように、ＨＩＳ８タグを有する個々の栄養性ポリペプチドを標的化発現させた大腸菌を、２５０Ｌの発酵中で生育させた。細胞を、２５０Ｌの発酵槽から回収し、Ｓｈａｒｐｌｅｓ  ＡＳ−１６Ｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用して遠心沈降させ、湿潤細胞塊を回収した。その後、細胞を、３０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に、２０％ｗ／ｖのＷＣＷ濃度で再度懸濁した。次に、細胞懸濁物を、１２、５００〜１５，０００ｐｓｉの作動圧力および１Ｌ／分の流速で、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉホモジナイザー（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ，  イタリアパルマ）の中に４回通過させることにより溶解した。浄化したライセートを、０．５Ｌ／分で作動させる１５，０００ｒｐｍのＳｈａｒｐｌｅｓ  ＡＳ−１６Ｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅの中に４回通過させることにより作製した。細胞のデブリを廃棄し、上清を、一連のフィルターを介して濾過した。浄化したライセートを、ＳａｒｔｏＰｕｒｅ  ＧＦ＋  ０．６５μｍ、ＳａｒｔｏＧｕａｒｄ  ＰＥＳ  １．２／０．２μｍおよびＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ＩＩ  ＸＬＧ  ０．８／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ，  ニューヨーク州 ボヒミア）の中に連続的に通過させた。濾過したライセートを、８．５カラム（直径２０ｃｍ×高さ２７．１ｃｍ）に充填したＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂を使用したＩＭＡＣにより精製した。
【０５５３】
ＩＭＡＣ樹脂を、１５０ｃｍ／時間の線流速で記載されるように平衡化た。平衡化した後、濾過したライセートを、１５０ｃｍ／時間の線流速でカラムを通過させた。充填容量は、３．８〜５．０ＣＶの範囲にあった。充填後、未結合材料を、さらに平衡化してカラムから洗い落した。１０ＬのＩＭＡＣスケールで製造した栄養性ポリペプチドを、２ＣＶの１０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ；３ＣＶの０．５％ｗ／ｖのデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ；および５ＣＶの１０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌによる追加の洗浄セットに供した。洗浄後、標的ポリペプチドを記載するように溶出した。溶出したプールを室温で保存した。
【０５５４】
複数の栄養性ポリペプチドを、１０ＬのカラムスケールでのＩＭＡＣクロマトグラフィーにより精製した。表Ｅ９Ｃは、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８の精製をまとめている。図１は、ＳＥＱＩＤ−００１０５の精製物の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を提供する。
【表９３】
2016537402.tif 000095
【０５５５】
１０ＬのカラムスケールでのＩＭＡＣ精製の後、栄養性ポリペプチドを、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ＩＩ  ＸＬＧ  ０．８／０．２μｍを介して濾過し、限界濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の単位操作に直接充填した。膜領域および名目上の分子量カットオフを、各栄養性ポリペプチドに適切であるように選択した。栄養性ポリペプチドを、１２Ｌ／ｍ２／分のクロスフローおよび２５ｐｓｉのＴＭＰ目標で限外濾過した。栄養性ポリペプチドを、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、ニューヨーク州ボヒミア）で約１０倍に濃縮し、４ダイア容量の１０％のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ８．７）、次いで２ダイア容量の２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム（Ｎａ４ＥＤＴＡ）、次いで７ダイア容量の１０％ＰＢＳ（ｐＨ８．７）に、連続的にダイアフィルトレーションを行った。Ｎａ４ＥＤＴＡへの中間ダイアフィルトレーションを、ＩＭＡＣ樹脂から浸出したニッケル（ＩＩ）をキレート化するために行った。限外濾過透過液を廃棄し、ダイアフィルトレーションを行い、濃縮された残余分を、０．２μｍのメンブレンフィルターを介して濾過し、−８０℃で凍結した。
【０５５６】
限外濾過プールを、バイオバーデンを低減する目的で、滅菌グレートフィルターでろ過した。エタノールですすいだガラストレイの中へと栄養性ポリペプチドを濾過した。その後、充填したガラストレイを、−８０℃で凍結した。次いで、凍結した材料を、Ｌａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥ユニットＬａｂｃｏｎｃｏ，  ミズーリ州カンザスシティ）を使用してドライケーキへと凍結乾燥した。トレイの中のタンパク質の質量を、完全に乾燥したと考えられる定常状態となるまで、時間と共にモニターした。乾燥したタンパク質のケーキを、トレイの蓋により密封し、プラスチックバッグでの真空封入によりさらにその上からパッケージングした。パッケージ全体を、−８０℃で保存した。
【０５５７】
イオン交換クロマトグラフィー
栄養性ポリペプチドを精製する適切な方法の選択は、工程の開発の速度、製造の費用、最終的な純度、および精製のロバスト性と密接な関係を有する。栄養性ポリペプチドは、様々なクロマトグラフィーの方法により単離されている。使用するために選択したクロマトグラフィーの形式は、標的栄養性ポリペプチドの物理化学的な特性に依存する。荷電した栄養性ポリペプチドは、静電相互作用を介してイオン交換クロマトグラフィー樹脂と結合する。
【０５５８】
本願では、本出願人は、イオン交換樹脂との結合能に関してランク付けするためにポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする２つの方法を定義した。１つの方法は、本明細書中に記載されるように、ポリペプチドの一次配列を使用してｐＨの範囲でのタンパク質の実効電荷の計算に基づくｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの予測である。第２の方法は、本明細書中に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマルチプレックス精製のスクリーニングである。この２つの方法は、互いに独立して成功裏に使用されてきており、これらは、本明細書中に記載されるように、裏付けとなるデータを伴って１６８個の栄養性ポリペプチドの同じ組について共に使用されている。
【０５５９】
イオン交換精製のランクを予測するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの方法は、一次配列に基づいてｐＨの範囲で、栄養性ポリペプチドの実効電荷を計算することに基づく。栄養性ポリペプチドの一次配列を使用して、宿主細胞のタンパク質および他の不純物から栄養性ポリペプチドを成功裏に単離する可能性が最も高いクロマトグラフィーの形式を予測する。高荷電の栄養性ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー樹脂に強固に結合する可能性があるい。最も強固な結合は、正または負のいずれかの優勢な１つの電荷を有する栄養性ポリペプチドで得られる。正電荷および負電荷の混合物を有する栄養性ポリペプチドがイオン交換樹脂と強固に結合することは起こり得るが、同様に、それらの電荷が互いに反対に作用することも起こり得る。同様に、その表面に正に帯電した部分と負に帯電した部分が交互に現れる栄養性ポリペプチドは、その表面の主な部分が１つの単一の電荷であるポリペプチドほど強固に結合しない場合がある。同様に、正または負に強く帯電した末端、テール、タグ、またはリンカー配列を有する栄養性ポリペプチドは、その高荷電の基を効果的に提示して、非常に強固な結合を可能する。
【０５６０】
たとえば、ポリペプチド中のヒスチジン、アルギニン、およびリジンといった１つまたは複数の特定のアミノ酸が多く存在すると、タンパク質溶媒のｐＨが、１つまたは複数のアミノ酸のｐＫaより低い場合、正電荷がこのポリペプチドまたはその一部に与えられる。ポリペプチドの電荷は、タンパク質の総電荷、実効電荷、またはポチペプチドの一部の電荷を含む。ポリペプチドまたはその一部が陽性荷電である実施形態では、陽イオン交換樹脂を使用する。
【０５６１】
たとえば、ポリペプチド中のグルタミン酸およびアスパラギン酸といった、１つまたは複数の特定のアミノ酸が多く存在すると、タンパク質溶媒のｐＨが１つまたは複数のアミノ酸のｐＫaより高い場合、負電荷がこのポリペプチドまたはその一部に与えられる。ポリペプチドの電荷は、タンパク質の総電荷、実効電荷、またはポリペプチドの一部の電荷を含む。ポリペプチドまたはその一部が陰性荷電である実施形態では、陰イオン交換樹脂を使用する。
【０５６２】
ポリペプチド電荷の実効電荷は、Ｉタンパク質溶媒のｐＨの関数として変化する。正電荷および負電荷の数は、ポリペプチドの一次配列に基づいて任意のｐＨで計算できる。いずれか１つのｐＨでの正電荷と負電荷の合計が、計算された実効電荷となる。ポリペプチドの等電点（ｐＩ）は、計算された実効電荷が０であるｐＨである。比較するために、配列の実効電荷を、配列中のアミノ酸の数によって正規化すると、ｐパラメータ「アミノ酸あたりの実効電荷」は、クロマトグラフィー性能を予測するために使用される配列間の新規比較器となる。
【０５６３】
栄養性ポリペプチド配列を、あらゆるｐＨ（１〜１４）での各ポリペプチドのアミノ酸あたりの実効電荷を計算することによって評価してきた。さらに、各ポリペプチドのｐＩを計算した。栄養性ポリペプチドを、ｐＩおよびアミノ酸あたりの実効電荷によりランク付けした。ｐＩが低く、幅広い範囲のｐＨを通してアミノ酸あたりの実効電荷が非常に陰性であるポリペプチドは、高い親和性で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と結合することが予測される。ｐＩが高く、幅広い範囲のｐＨを通してアミノ酸あたりの実効電荷が非常に陽性であるポリペプチドは、高い親和性で陽イオン交換クロマトグラフィーと結合することが予測される。本明細書中の一部の実施形態では、ポリペプチドの一部分のみが帯電され（末端、テール、タグ、またはリンカーで）、ｐIおよびポリペプチドの実効電荷は多様であり得ると認識され、クロマトグラフィー樹脂に対する当該ポリペプチドの結合親和性を予測するために、他の要因または経験による測定が有用であり得る。
【０５６４】
図２は、一次配列に基づき、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれかと結合することが予測される、栄養性ポリペプチドの例を実証する。幅広い範囲のｐＨを通して、＜４．０のｐＩおよびアミノ酸あたりの実効電荷が陰性である栄養性ポリペプチドは、高い親和性で陰イオン交換樹脂と結合することが予測される（（１）ＳＥＱＩＤ−００１０５、（２）ＳＥＱＩＤ−００００８、（３）ＳＥＱＩＤ−００００９、（４）ＳＥＱＩＤ−００４７５）。幅広い範囲のｐＨを通して、＞１０．０のｐＩおよびアミノ酸あたりの実効電荷が陽性である栄養性ポリペプチドは、高い親和性で陽イオン交換樹脂と結合することが予測される（（５）ＳＥＱＩＤ−００４７２、（６）ＳＥＱＩＤ−００６４０、（７）ＳＥＱＩＤ−０００１９）。
【０５６５】
本明細書中に提示される一次配列の解析から、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−０００９は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と高い親和性で結合する可能性があり、ＳＥＱＩＤ−００６４０は、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂と高い親和性で結合する可能性があることが示される。これらの予測を試験したところ、微生物細胞の培養の後、以下のポリペプチド精製の４つの例で実証されるように、あてはまることが証明された。第１の例では、ＳＥＱＩＤ−００００９は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、溶解した大腸菌の細胞から９９％の純度まで直接精製された。第２の例ではＳＥＱＩＤ−００１０５を、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの上清から単離した。第３の例では、大腸菌の細胞内で発現されたＳＥＱＩＤ−００１０５を、ＩＭＡＣクロマトグラフィーにより最初に精製した後、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して１００％の純度に精製した。第４の例では、ＳＥＱＩＤ−００６４０を、陽イオン交換クロマトグラフィーによりｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの上清から単離した。
【０５６６】
ＳＥＱＩＤ−０００９を、本明細書中に記載されるように大腸菌の細胞内で発現させた。この細胞を溶液中に懸濁し、破壊した。３つの溶液を試験した（０．１ＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ１１．４）、０．１  Ｍのｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ４．１）、および０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．０））。これら溶解した溶液を、遠心分離により浄化し、結合のため陰イオン交換樹脂と混合した。２つの樹脂を試験した（（ＥＭＤ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍ）およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｄ  ５０μｍ）。これら６つの結合条件を、バッチモードで実施し、樹脂を、適切な溶解バッファーで洗浄して未結合のタンパク質を除去した。次に、最大限結合した湿った樹脂を小さな滴下カラムに移した。次いで、各滴下カラムを、最大６回の、増加するＮａＣｌ濃度の連続的な洗浄で溶出した（各ＮａＣｌ洗浄溶液は、適切な溶解バッファーで緩衝した）。ＳＥＱＩＤ−００００９を、本明細書中に記載されるように、これら分画の中に溶出し、収集し、かつチップ電気泳動により解析した。ＳＥＱＩＤ−００００９を、予測した分子量で溶出するバンドとして同定した。どの場合でも、ＳＥＱＩＤ−００００９は、充填純度よりも高い純度で滴下カラムから溶出した。この観察から、ＳＥＱＩＤ−００００９は、予測されるように陰イオン交換樹脂に実際に結合して、この精製が達成されたことが示される。得られた最大純度は９９％であった。どの場合もＳＥＱＩＤ−００００９は、樹脂から溶出される最後のタンパク質のうちの１つであり、このことは、ある範囲のｐＨで２つの樹脂に対するＳＥＱＩＤ−００００９の結合親和性が、大腸菌由来のいずれかの宿主細胞タンパク質の結合親和性よりも一般的に高いことを示している。
【０５６７】
ＳＥＱＩＤ−００１０５を発現して発酵培地の中へ分泌する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの微生物細胞の培養を、本明細書中に記載されるように行った。この細胞を遠心により除去し、上清を、膜濾過によりさらに浄化した。浄化した上清を、限外濾過により濃縮して、陰イオン交換カラム上でのロード時間を減少させ、溶液を、ｐＨ６．０で緩衝した低塩溶液に交換した。この溶液を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＱ  Ｓｔｒｏｎｇ  陰イオン交換樹脂を含むクロマトグラフィーカラム（直径１ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に通過させた。未結合のタンパク質を、２０ｍＭのＢｉｓｔｒｉｓ（ｐＨ６．３）を用いで樹脂からすすいだ。次に、結合したタンパク質を、３０カラム容積の勾配を使用して、４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＢｉｓｔｒｉｓ（ｐＨ６．３）に溶出した。カラムの溶出液を、連続分画に収集し、本明細書中に記載されるように、チップ電気泳動により解析した。ＳＥＱＩＤ−００１０５を、予測した分子量の溶出バンドとして同定した。１つの画分で得た最大純度は１００％であった。
【０５６８】
ＳＥＱＩＤ−００１０５を、本明細書中に記載されるように、大腸菌の細胞内で発現させた。この細胞を破壊し、ＳＥＱＩＤ−００１０５を、本明細書中に記載される手順に従ってＩＭＡＣクロマトグラフィーにより精製した。ＩＭＡＣ溶出のプールを、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して１００％の純度にさらに精製した。ＩＭＡＣ溶出のプールを濃縮し、次いで５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）に希釈した。次に、この溶液を、陰イオン交換樹脂：ＥＭＤ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍ）を充填したカラム（直径１．６ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に通過させた。結合したタンパク質を、平衡溶液ですすぎ、次に、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で溶出した。この手法を、複数回繰り返し、すべての試料を、本明細書中に記載されるようにチップ電気泳動により解析した。溶出試料は、７９％〜９９％の純度の範囲であった。
【０５６９】
ＳＥＱＩＤ−００６４０を発現して発酵培地の中に分泌するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの微生物細胞の培養を、本明細書中に記載されるように実施した。この細胞を遠心分離により除去し、上清を、膜ろ過によりさらに浄化した。浄化した上清を、脱イオン水で１：２に希釈し、１Ｍの酢酸でｐＨ５に滴定した。得られた液を膜ろ過した後、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ  Ｓｔｒｏｎｇ陽イオン交換樹脂を充填した陽イオン交換カラム（直径１．２ｃｍ、高さ１０ｃｍ）にロードした。結合した樹脂を、５０ｍＭの酢酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）溶液で流した。次に、タンパク質を、２０ＣＶの勾配で、１．０５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶出した。溶出分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色により解析した。ピークの試料は、１００％の純度を示し、この勾配で後に溶出した不純物がないことが示され、これにより、ＳＥＱＩＤ−００６４０のポリペプチドは、いずれかの宿主細胞タンパク質よりも高い親和性で陽イオン交換樹脂と結合したことが示された。
【０５７０】
沈殿による精製
タンパク質の沈殿は、ポリペプチドの精製で良く知られた方法である（Ｓｃｏｐｅｓ  Ｒ．  １９８７．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。多くのポリペプチドは塩濃度が増加するにつれて沈殿し、これは塩析として知られている現象である。塩の種類は、タンパク質を塩析する異なる能力に関するホフマイスターシリーズで、ランク付けされて体系付けされている（Ｆ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ  Ａｒｃｈ．  Ｅｘｐ．  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４，（１８８８）  ２４７−２６０）。またタンパク質は、その物理化学的特性に基づいて高い塩濃度により沈殿する異なる傾向を有しているが、この特徴に関してタンパク質をランク付けするための万能の測定基準は確立されていない。その精製される能力に関して栄養性ポリペプチドを選択するためにそのようなランク付け測定基準を使用することは、工程の開発の速度、製造の費用、最終的な純度、および精製のロバスト性に密接な関係を有する。
【０５７１】
ポリペプチドの沈殿による精製のほとんどの工業的な用法では、関心対象ポリペプチドを選択的に沈殿させ、次に不純物を固体の沈殿物からすすぎ流す。特定の実施形態では、ポリペプチドは、高レベルの塩によって沈殿せず、精製は、不純物を沈殿させることにより行われる。本願では、本出願人は、厳しい沈殿条件を介して可溶性のままである能力に関してこれらをランク付けするために、ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする２つの方法を定義した。１つの方法は、本明細書中に記載されるようにポリペプチドの一次配列を使用してある範囲のｐＨを通してタンパク質の総電荷の計算に基づく、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの予測である。第２の方法は、本明細書中に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマルチプレックスの精製スクリーニングである。この２つの方法は、互いに独立して成功裏に使用されており、本明細書中に記載されるように、裏付けとなるデータを伴って１６８個の栄養性ポリペプチドの同じセットについて共に使用されている。
【０５７２】
ポリペプチドの溶解度は、表面電荷の存量と直接相関している（Ｊｉｍ  Ｋｌｉｎｇ，  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ２０１４．）。表面電荷は、ポリペプチドに物理的な特徴を与えることができる（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｋ．  Ｊ．，  ＆  Ｌｉｕ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００７）．  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｎ  ｉｍｐａｒｔ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １２９（３３），  １０１１０−２．  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０７１６４１ｙ）。
【０５７３】
溶解度のランキングを予測するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの方法は、一次配列に基づくある範囲のｐＨでの栄養性ポリペプチドの電荷の総数の計算に基づく。
【０５７４】
たとえば、ポリペプチド中のヒスチジン、アルギニン、およびリジンといった、１つまたは複数の特定のアミノ酸が多く存在すると、タンパク質の溶媒のｐＨが、１つまたは複数のアミノ酸のｐＫａより低い場合、そのポリペプチドまたはその一部に正電荷を与える。たとえばポリペプチド中のグルタミン酸およびアスパラギン酸といった、１つまたは複数の特定のアミノ酸が多く存在すると、タンパク質溶媒のｐＨが、１つまたは複数のアミノ酸のｐＫａより高い場合、そのポリペプチドまたはその一部に負電荷を与える。
【０５７５】
ポリペプチドの電荷の総数は、タンパク質の溶媒のｐＨの関数として変化する。陽電荷および陰電荷の数は、本明細書中に記載されるように、ポリペプチドの一次配列に基づく任意のｐＨで計算できる。いずれか１つのｐＨでの陽電荷および陰電荷の合計は、計算された実効電荷をもたらす。ポリペプチドの等電点（ｐＩ）は、計算された実効電荷が０であるｐＨである。栄養性ポリペプチド間の比較を行うために、正電荷の総数は、負電荷の総数（絶対値）に加えて、この総電荷を、配列中のアミノ酸数で正規化すると、パラメータ「アミノ酸あたりの総電荷」は、沈殿に対するポリペプチドの抵抗性を予測するために使用される、配列間の新規比較器となる。ポリペプチドの抵抗性が高くなると、不純物を沈殿させて除去することにより高い度合いまで精製できる可能性が高くなる。クロマトグラフィーの特性の予測とは異なり、溶解度は、電荷の極性に影響されない。しばしば、ポリペプチドは配列のｐＩでその最低溶解度となるのは事実であるが、一部のポリペプチドは、総電荷が高く、本明細書中に示されるように、そのｐＩにおいてもなおも極めて可溶性である。
【０５７６】
栄養性ポリペプチド配列を、ある範囲のｐＨ（１〜１４）で各ポリペプチドのアミノ酸あたりの総電荷を計算することにより評価してきた。栄養性ポリペプチドを、アミノ酸あたりの総電荷によりランク付けした。ｐＩが低く、幅広い範囲のｐＨを通してアミノ酸あたりの実効電荷が非常に陰性であるポリペプチド、およびｐＩが高く、幅広い範囲のｐＨを通してアミノ酸あたりの実効電荷が非常に陽性であるポリペプチドは、このランキングによりすべて等しく良好なスコアを得ることが予測される。両方の電荷を多く含むポリペプチドが最も良好スコアを得る。
【０５７７】
図３は、一次配列に基づき、溶解度が非常に高いことが予測される栄養性ポリペプチドの例を実証する。このセットは、ｐＩが低く（＜４）、幅広い範囲を通して実効電荷が非常に陰性であるポリペプチドを含む（（１）ＳＥＱＩＤ−００４７５、（２）ＳＥＱＩＤ−００００９））。このセットは、ｐＩが高く（＞１０）、幅広い範囲のｐＨを通してアミノ酸あたりの実効電荷が非常に陽性であるポリペプチドを含む（（４）ＳＥＱＩＤ−００４３３、（５）ＳＥＱＩＤ−００４７２）。このセットは、ｐＩがより中性であるポリペプチドを含む（（３）ＳＥＱＩＤ−００４７８）。ここで示されるポリペプチドの多くは、＜４および＞１２などの極端なｐＨでさえも高い電荷を示す。このセット全体は、幅広い範囲のｐＨを通して可溶性が非常に高く、かつ沈殿に対して抵抗性があることが予測される。
【０５７８】
この例証では、大腸菌細胞を、遠心沈降により振盪フラスコの発酵物から収集し、細胞全体を、チューブに分配した（チューブあたり１ｇの細胞）。各チューブに、４ｍＬの溶解液を添加し、細胞を、７５Ａｍｐで３０分間超音波処理により溶解した。溶解溶液は、水、８Ｍの尿素  ０．１Ｍのトリス  ０．１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍの酢酸塩  １０％のｇｌｙ  ０．１％のＴｗｅｅｎ−８０  ０．３ＭのＡｒｇ  ０．３ＭのＮａＣｌ  １０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ５．０）、０．１Ｍの酢酸塩  １０％のｇｌｙ  ０．１％のＴｗｅｅｎ−８０  ０．３ＭのＡｒｇ  ０．３ＭのＮａＣｌ  １０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．０）、１００  ＮａＣｌ  １００  Ｈｅｐｅｓ  １０  イミダゾール（ｐＨ７．５）、５００ＮａＣｌ  １００  Ｈｅｐｅｓ  １０  イミダゾール（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＰｈｏｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ  ０．１ＭのＨｅｐｅｓ  １０ｍＭのイミダゾール  ５０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＨｅｐｅｓ  ３．５ＭのＡｍ硫酸塩（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＨｅｐｅｓ  ２  Ｍ  Ａｍ硫酸塩（ｐＨ７．５）、０．１  ＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＴｒｉｓ  ０．５のＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  １０ｍＭの酢酸塩  １５ｍＭのイミダゾール（ｐＨ６．０４）、および５００ｍＭのＮａＣｌ  １００ｍＭの酢酸塩  １５ｍＭのイミダゾール（ｐＨ６．０４）を含んだ。このライセートを、遠心分離および０．２μｍの濾過により浄化した。浄化した上清を、本明細書中に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ブルー染色）により解析した。ＳＥＱＩＤ−００００９は、これら条件のそれぞれの溶解度を例証した。大腸菌宿主細胞のタンパク質は、一般的に１つの例外はあるが、同様にこれら条件における溶解性を実証した。３．５Ｍの硫酸アンモニウムの存在下で、宿主細胞のタンパク質の大部分が有効に沈殿し、工程の細胞収集段階の後、８５％精製されたＳＥＱＩＤ−００００９をもたらした。この結果から、ＳＥＱＩＤ−００００９は、ほとんどの大腸菌の宿主細胞のタンパク質よりも可溶性であり、沈殿は、低コストの単離方法の一部として使用できることが示される。これは、ＳＥＱＩＤ−００００９の総電荷が高いことと相関しており、予測が正確であることの裏付けとなる。さらに、ＳＥＱＩＤ−００００９よりも荷電したポリペプチドはさらにより可溶性で、ＳＥＱＩＤ−００００９の高いポリペプチド収率よりも有益性を得ることができると予測される。
【０５７９】
その後の実験で、ＳＥＱＩＤ−００００９を、一段階の硫酸アンモニウムの沈殿で９９％の純度まで精製した。この例証では、大腸菌細胞を、遠心により振盪フラスコの発酵物から収集し、細胞全体を、０．１Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０に懸濁した（溶液４ｍＬ中に１ｇの細胞）。この細胞を、超音波処理（８０Ａｍｐ、２分間）により溶解した。ライセートを遠心分離および０．２μｍの膜ろ過により浄化した。浄化した上清を、一連の３ｍＬの分画に分割し、この分画に、４Ｍの硫酸アンモニウムの保存液（ｐＨ９．８）を添加した。硫酸アンモニウムの濃度範囲が得られるように、様々な量の保存液を添加した。この試料を室温で１０分間混合し、遠心分離および０．２μｍの膜ろ過により浄化した。浄化した上清を、本明細書中に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ブルー染色）により解析した。図４は、硫酸アンモニウム濃度の関数としてＳＥＱＩＤ−００００９の純度を示す。
【０５８０】
マルチプレックス精製：イオン交換クロマトグラフィー
場合によって、タンパク質のライブラリー全体を、マルチプレックススクリーニングの実験プラットフォームにおいて試験する。１６８個の栄養性ポリペプチドを、単一の増殖条件を使用して単一容器中で各ポリペプチドを産生するマルチプレックス発現系において、トランスフェクトさせて発現させた。このマルチプレックス発現系では、任意のセットのポリペプチド配列を、試験されるセットのポリペプチドをランク付けするためにその各々を使用することができる幅広い範囲の製造性パラメータに関して同時に試験することができる。１セットの製造性パラメータには、発現レベル、ポリペプチドの溶解度、クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製できること、熱変性の抵抗能、ポリペプチドの消化能、厳しい処置に抵抗することによりポリペプチドを精製できることが含まれる。
【０５８１】
このセットの１６８個のポリペプチドを、大腸菌の細胞内発現に関して試験した。可溶性に発現されたポリペプチドを、グループとして前処置し、一連の精製条件に供することにより、このセットを複数の方法による精製の容易さの観点からランク付けすることができる。本明細書中に記載されるように、一次配列の解析、特にアミノ酸あたりの実効電荷に基づいてクロマトグラフィーの特定の形態と結合する同じサブセットのタンパク質が、各発現系から同定されることが予測される。
【０５８２】
大腸菌をマルチプレックス精製するために、栄養性ポリペプチド配列のセットをＨＩＳ８でタグ付けした。この細胞を、本明細書中で記載されるように培養し、破壊し、溶液を本明細書中で記載されるように浄化した。この産生により、発現され、かつ可溶性であるセット由来のポリペプチドすべてを含む溶液が得られた。このセットの可溶性ポリペプチドを、５ｍｌのＩＭＡＣカラムに通過させ、本明細書中に記載されるように溶出した。このＩＭＡＣ精製は、大腸菌宿主細胞タンパク質の大部分を除去することにより、１セットとして可溶性に発現された栄養性ポリペプチドを効率的に単離した。溶出分画を濃縮し、中性に近いｐＨで緩衝させた低塩溶液にバッファー交換した後、様々な精製方法を試験した。試験した方法として、陰イオンクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および不純物が沈殿し、可溶性のままであるポリペプチドが最も高いとランク付けされるネガティブな沈殿が挙げられる。この場合、不純物が除去されていることにより、ポリペプチドは互いの中でランク付けされる。さらに、タンパク質のセットを、加熱による熱安定性に関して試験し、この場合、加熱後に可溶性のままであるポリペプチドは、沈殿するポリペプチドよりも熱に安定である。
【０５８３】
このポリペプチドの混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂との結合能に関してランク付けした。４つのクロマトグラフィーの樹脂を試験した。そのうち２つは、陰イオン交換樹脂：ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥおよびＥＭＤ製のＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｑ  Ｒｅｓｉｎであり、２つは陽イオン交換樹脂：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ＲｅｓｉｎおよびＥＭＤ製のＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓ  Ｒｅｓｉｎであった。各樹脂を、以下のように８つの異なる緩衝条件で試験した（陰イオンｗｘ交換に使用したバッファー：水（バッファーなし）（ｐＨ７）；１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．７）；３０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．０）；１５ｍＭのトリス塩基（ｐＨ９．６）；３０ｍＭのトリス塩基（ｐＨ１０．０）；３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ１１．２）；２５ｍＭアルギニン（ｐＨ１０．１）。陽イオン交換に使用したバッファー：水（バッファーなし）（ｐＨ７）；１５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．２）；３０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．５）；１５ｍＭのトリス酸（ｐＨ４．９）；３０ｍＭのトリス酸（ｐＨ４．７）；１５ｍＭのＭＥＳ酸（ｐＨ３．９）；２５ｍＭのＭＥＳ酸（ｐＨ４．１））。
【０５８４】
樹脂を、９６ウェルのフィルタープレート（ウェルあたり２０μｌの樹脂）に分配し、それぞれを３回平衡化した。タンパク質のセットを平衡バッファーと混合し、樹脂と結合させた。溶液中の未結合のタンパク質を、以下の９６ウェルプレートでの回収のためにフィルタープレートを通して液体を遠心分離することにより樹脂から分離した。残りの未結合のタンパク質を、平衡バッファーの洗浄液により樹脂からさらにすすぎ流した。次いで、結合したタンパク質を、３つの段階の増加する塩濃度（上記の適切なセットのバッファーで緩衝した５０、２５０、１５００ｍＭのＮａＣｌ）で連続的に溶出した。ゆるく結合したタンパク質が最初に除去され、最終的な溶出条件で除去されたタンパク質は、樹脂としっかりと結合したものであった。よって、タンパク質１６８個のライブラリーは、大腸菌で発現され、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に対する結合親和性に関してランク付けられたものであった。
【０５８５】
本明細書中に記載される実験により、１６０個の試料（４つの樹脂、８つのバッファー、５つの回収）を精製した。５つの回収段階は、フロースルー分画、洗浄分画、５０ｍＭのＮａＣｌの溶出、２５０ｍＭのＮａＣｌの溶出、および１５００ｍＭのＮａＣｌの溶出を含む。１６０個の試料全てを、２８０ｎｍでのＵＶ−可視光吸光度、ブラッドフォード総タンパク質アッセイ、チップ電気泳動により解析し、選択した試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。すべての解析アッセイは、本明細書中に記載されている。
【０５８６】
アッセイから、一部のタンパク質が樹脂の中を通過して、結合しなかったことが示された。多くの場合、洗浄分画は、顕著な量のタンパク質を溶出しなかったことから、このことから、溶出するなんらかのさらなるタンパク質が、実際に樹脂と結合していたことが示される。ＮａＣｌの濃度が増加すると、除去される総タンパク質も増加し、このことから、ほぼすべての条件での結合および溶出が成功していることが示された。１５００ｍＭのＮａＣｌの溶出条件で電気泳動により検出されたタンパク質は、２５０ｍＭのＮａＣｌの洗浄状態でも結合されたままであり、このことから結合性が強いことが示される。選択条件を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに関して選択した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を、３０ｍＭのトリス塩基緩衝条件での陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ）からの１５００ｍＭのＮａＣｌの溶出試料で実施した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果を、ライブラリーにおいて当初発現された１６８個すべての栄養性ポリペプチドの配列に対して検索した。８個の固有のポリペプチドが、この条件でこの陰イオン交換樹脂に対して高い結合親和性を有すると同定された（ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３４６、ＳＥＱＩＤ−００４９７、ＳＥＱＩＤ−００５２５、ＳＥＱＩＤ−００５５５、ＳＥＱＩＤ−００６０５、ＳＥＱＩＤ−００６０６、ＳＥＱＩＤ−００６１０）。このセットの各ポリペプチド配列において、アミノ酸あたりの実効電荷を、試験したｐＨの範囲を通して一次配列に基づき計算した。本明細書中に記載されるように、陰イオン交換樹脂にしっかりと結合するポリペプチドは、ｐＨ範囲を通して０未満の、アミノ酸あたりの実効電荷を有することが予測され、これは、一つの例外を伴うがあてはまることが例証されている。いずれかの例外は、配列の長さを通して電荷の不均一性が存在し、記載されるようにアミノ酸あたりの実効電荷が必ずしもこれを捉えていないという事実によるものであると予測される。このマルチプレックスのスクリーニングから、陰イオン交換樹脂との結合に対するその親和性に基づきより大きなライブラリーから１セットのポリペプチドが同定されたが、この結果は、本明細書中に記載されるように、一次配列に基づき予測できる。
【０５８７】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を、１５ｍＭのトリス酸緩衝条件での陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ）から、１５００ｍＭのＮａＣｌの溶出試料で実施した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果を、ライブラリーで当初発現された１６８個すべての栄養性ポリペプチドの配列に対して検索した。８つの固有のポリペプチドが、この条件でこの陽イオン交換樹脂に対して高い結合親和性を有するとして同定した（ＳＥＱＩＤ−００３０２、ＳＥＱＩＤ−４９５、ＳＥＱＩＤ−００５２２、ＳＥＱＩＤ−００５３７、ＳＥＱＩＤ−００５４６、ＳＥＱＩＤ−００５４７、ＳＥＱＩＤ−００５６０、ＳＥＱＩＤ−００５９８）。このセットの各ポリペプチド配列に関して、アミノ酸あたりの実効電荷を、試験したｐＨの範囲を通して一次配列に基づき計算した。本明細書中に記載されるように、陽イオン交換樹脂に対してしっかりと結合するポリペプチドは、ｐＨの範囲を通して０を超えるアミノ酸あたりの実効電荷を有することが予測され、これは、少数の例外を伴うがあてはまることが例証される。何らかの例外は、配列の長さを通して電荷の不均一性が存在し、記載されるようにアミノ酸あたりの実効電荷が必ずしもこれを捉えていないという事実によるものであると予測される。このマルチプレックスのスクリーニングにより、陽イオン交換樹脂との結合に対するその親和性に基づき大きなライブラリーから１セットのポリペプチドが同定され、この結果は、本明細書中に記載されるように、一次配列の解析に基づき予測できる。
【０５８８】
マルチプレックス精製のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの例では、ポリペプチド配列のセットは、いずれの種類の精製タグも用いることなく発現した。細胞を、本明細書中に記載されるようにフラスコで培養し、ポリペプチドを発現し、増殖培地中に分泌した。この細胞を遠心沈降により除去し、溶液を、本明細書中に記載されるように膜ろ過によりさらに浄化した。この産生工程により、発現されて可溶性に分泌されたセット由来のポリペプチドすべてを含む溶液が得られた。このセットの可溶性ポリペプチドを濃縮し、ｐＨ７のリン酸塩溶液にバッファー交換した後、様々な精製方法を試験した。試験した方法として、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および、不純物が沈殿し、かつ、可溶性のままであるポリペプチドが最も高いとランク付けされるネガティブな沈殿が挙げられる。これらのマルチプレックス精製試験では、ポリペプチドは、それら自体をランク付けするために、互いからおよび宿主細胞タンパク質から精製された。
【０５８９】
このポリペプチドの混合物を、陰イオン交換および陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂との結合能に関してランク付けした。４つのクロマトグラフィー樹脂を試験した。（２つの陰イオン交換樹脂：ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥおよびＥＭＤ製のＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｑ樹脂。２つの陽イオン交換樹脂：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ＲｅｓｉｎおよびＥＭＤ製のＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓ  Ｒｅｓｉｎ）。各樹脂を、８つの異なる緩衝条件で試験した。陰イオン交換に使用したバッファー：１８ｍＭのＢＩＳ−ＴＲＩＳ（ｐＨ６．５）；１３ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；１８ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；１６ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）；３２ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．５）；８８ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ９．０）；１３ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）；２０ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．０）。陽イオン交換に使用したバッファー：１９ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ３．０）；１３ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ３．５）；４９ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．０）；２２ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）；１４ｍＭの酢酸塩（ｐＨの５．０）；１０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５．５）；２４ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）；１５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５））。
【０５９０】
樹脂を、９６ウェルのフィルタープレート（ウェルあたり５０μｌの樹脂）に分配し、それぞれを３回平衡化した。このタンパク質のセットを平衡化バッファーと混合して、樹脂と結合させた。溶液中の未結合のタンパク質を、以下の９６ウェルプレートでの回収のためフィルタープレートを通して液体を遠心分離することにより樹脂から分離した。残りの未結合のタンパク質を、２回の平衡化バッファーでの洗浄サイクルを用いて樹脂からさらにすすぎ流した。次に結合したタンパク質を、塩濃度を増加させて（２５０、５００、１０００ｍＭ、２０００ｍＭのＮａＣｌ）で連続的に溶出した。各塩溶液を、陰イオン交換樹脂に対してｐＨ６．０のＭＥＳ、および陽イオン交換樹脂に対してｐＨ８．０のトリスで緩衝した２０００ｍＭのＮａＣｌ溶液を除き、適切な平衡化バッファーで緩衝した。ゆるく結合したタンパク質は最初に除去され、最終的な溶出条件で除去したタンパク質は、しっかりと樹脂に結合したタンパク質であった。このように、タンパク質のライブラリーを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓで発現させ、陰イオン交換および陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に対するその結合親和性に関してランク付けした。
【０５９１】
本明細書中に記載される実験から、１９２個の試料（４つの樹脂、８つのバッファー、６つの回収）が生成された。６つの回収段階は、フロースルー分画、洗浄分画、２５０ｍＭのＮａＣｌの溶出、５００ｍＭのＮａＣｌの溶出、１０００ｍＭのＮａＣｌの溶出、および２０００ｍＭのＮａＣｌの溶出を含む。１９２個すべての試料を、チップ電気泳動により解析した。選択した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。選択した試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。すべての解析アッセイは、本明細書中に記載されている。強力に結合したタンパク質の同定は、チップ電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳの組み合わせにより実施する。
【０５９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、ポリペプチドの大部分がこれら樹脂に結合せず、実際にこれらがフロースルー分画に見出されることを実証する。よって、樹脂と結合するポリペプチドは、他のポリペプチドの大部分から精製される能力に関して固有である。様々な溶出分画中のポリペプチドのセットは、精製工程の特性に基づきより大きなセットから単離されており、このことは、製造、費用、開発期間、およびこれらポリペプチドの最終的な純度と密接な関係を有する。さらに、樹脂と結合するポリペプチドの中で、これらを、増加濃度のＮａＣｌによる厳しい洗浄条件でも樹脂に結合したままである能力によりランク付けすることができる。２０００ｍＭのＮａＣｌの洗浄試料で見出されるこれらポリペプチドは、１０００ｍＭのＮａＣｌの洗浄条件でも結合したままであることが可能であった。５００ｍＭ超のＮａＣｌ洗浄条件で陰イオン交換樹脂と結合したままとすることのできる任意のポリペプチドは、この樹脂との親和性が非常に高いとされる。バンドのパターンは２つの陽イオン交換樹脂のあいだで類似しており、これは提案した機構の裏付けとなる。同様に、バンドのパターンは、２つの陰イオン交換樹脂のあいだで類似しており、陽イオン交換により同定されるものと異なる試料セットを表す。任意のサブセットで同定した個々のポリペプチドをランク付けするために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを利用する。
【０５９３】
例示的なデータセットとして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、ｐＨ７．５のＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂と結合するとして以下のポリペプチド：Ｐ３９６４５、Ｐ３７８６９、Ｐ８０６９８、Ｐ８０８６８、Ｐ２１８８０、Ｐ８０２３９、Ｐ５０８４９、Ｐ１２４２５、Ｏ３４６６９、Ｐ３９１３８、Ｐ３７８７１、Ｐ１９６６９、Ｐ２９７２７、Ｐ８０６４３、Ｏ３４９８１、Ｐ８０８７９、Ｐ５４７１６、Ｐ３７４７７を同定した。例示的なデータセットとして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、ｐＨ４．０のＰｏｒｏｓ  ＸＳ陽イオン交換樹脂に結合するとして以下のポリペプチド：Ｏ３４６６９、Ｐ１９４０５、Ｏ３１８０３、Ｏ０５４１１、Ｏ３１９７３、Ｏ３１６４３、Ｐ８０２３９、Ｐ２６９０１、Ｐ０８８２１、Ｐ８０２４０、Ｐ４９８１４、Ｏ３４３１０、Ｐ０ＣＩ７８、Ｏ３１９２５、Ｐ７１０１４、Ｐ４２１１１を同定した。
【０５９４】
高い結合親和性を有すると同定されたこれらポリペプチドを、一次配列に基づく物理化学的な特性に関して解析した。アミノ酸あたりの実効電荷を、試験したｐＨの範囲を通して一次配列に基づき計算した。本明細書中に記載されるように、陰イオン交換樹脂としっかりと結合するポリペプチドは、ｐＨの範囲を通して０未満のアミノ酸あたりの実効電荷を有することが予測され、これは一般にあてはまることが証明された。本明細書中で記載されるように、陽イオン交換樹脂としっかりと結合するポリペプチドは、ｐＨの範囲を通して０を超えるアミノ酸あたりの実効電荷を有することが予測され、これは一般的にあてはまることが証明された。何らかの例外は、配列の長さにわたって電荷の不均一性が存在し、記載されるように、アミノ酸あたりの実効電荷が必ずしもこれを捉えていないという事実によるものであることが予測される。このマルチプレックススクリーニングは、陰イオン交換樹脂との結合に対するその親和性に基づき大きなライブラリーから１セットのポリペプチドを同定し、この結果は、本明細書中に記載されるように、一次配列に解析に基づき予測できる。
【０５９５】
マルチプレックス精製のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの例では、１６８個の栄養性ポリペプチド配列のセットを、いずれの種類の精製タグを用いることなく発現させた。この細胞を、本明細書中で記載されるようにフラスコで培養し、ポリペプチドを発現させ、増殖培地の中に分泌させた。試験した方法は、不純物が沈殿し、可溶性のままであるポリペプチドが最も高いとランク付けされる、ネガティブな凝結／沈殿を含むものであった。これらのマルチプレックス精製試験では、不純物は、可溶性の不純物（たとえば宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ、リン脂質、およびアイソフォームまたは凝集した種などの生成物関連の不純物）、不溶性不純物、細胞、または細胞のデブリ（たとえば膜のフラグメント）の形態で存在する。ネガティブな沈殿は、不溶性の不純物、細胞、および細胞のデブリの遠心、および膜ろ過によるさらなる浄化の前後に実施した。
【０５９６】
細胞の懸濁物（遠心および膜ろ過の前）、および浄化した上清（遠心および膜ろ過の後）の中で可溶性に発現されて分泌されたポリペプチドのセットを、凝集剤との会合能に関してランク付けした。さらに、凝集剤を、不純物との会合能に関してランク付けした。以下の４８個の凝集剤：炭酸水素アンモニウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；塩化マンガン（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硫酸ニッケル（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；クエン酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；酢酸リチウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；プロピレングリコール（１０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ）；硝酸アンモニウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；塩化カリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硫酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；モリブデン酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；酢酸（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；キトサン  ＭＭＷ（０．１％ｗ／ｖ、０．２％ｗ／ｖ）；硫酸アンモニウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；塩化ナトリウム（０．５Ｍ、１．０Ｍ）；硫酸亜鉛（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硝酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；クエン酸（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；グアニジンＨＣｌ（０．６Ｍ、１．２Ｍ）；塩化アンモニウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；塩化亜鉛（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；炭酸カリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；塩酸（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；ＰＥＧ１０００（５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ）；塩化カルシウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；クエン酸鉄（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硝酸カリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；プロピオン酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；水酸化カリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；ＰＥＧ４０００（５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ）；塩化コリン（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硫酸銅（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；リン酸カリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；コハク酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；水酸化ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；トリトンＸ−１００（０．５％ｗ／ｖ、１．０％ｗ／ｖ）；塩化鉄（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硫酸鉄（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；デオキシコール酸（０．５％ｗ／ｖ、１．０％ｗ／ｖ）；チオシアン酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；エタノール（１０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ）；Ｔｗｅｅｎ８０（０．５％ｗ／ｖ、１．０％ｗ／ｖ）；塩化マグネシウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；硫酸マグネシウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；炭酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；チオ硫酸ナトリウム（１００ｍＭ、２００ｍＭ）；イソプロパノール（１０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ）；尿素（０．８Ｍ、１．６Ｍ）を、２つの異なる濃度で試験した。
【０５９７】
細胞懸濁物（遠心沈降および膜ろ過の前）および浄化した上清（遠心分離および膜ろ過の後）を、９６ウェルフィルタープレートに分配した（凝集剤の低濃度ではウェルあたり３００μＬおよび凝集剤の高濃度では２６７μｌ）。濃縮凝集剤溶液を、それぞれ３３μＬまたは６７μＬ添加することにより、これらの分配物を０．１倍または０．２倍に希釈した。得られた溶液を、室温で１時間混合した。混合した後、残っている可溶性物質を、以下の９６ウェルプレート中で回収するためにフィルタープレートを通して液体を遠心分離することにより不溶性材料から分離した。１９２個すべての試料を、チップ電気泳動により解析した。選択した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。選択した試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。すべての解析アッセイは、本明細書中に記載されている。
【０５９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、一部の条件が多くのポリペプチドを効率的に沈殿したことが実証され、これらの条件における可溶性のポリペプチドが、むしろ可溶性であり、これらの条件で単離できることが示される。様々な沈殿条件で可溶性であったポリペプチドが、精製工程でその特性に基づきより大きなセットから単離されたが、このことは、これらペプチドの製造、費用、開発時間、および最終的な純度と密接な関係を有する。一部のポリペプチドは、本明細書に記載される機構によればその高い電荷により、ある範囲の条件を通して広く可溶性である。任意のサブセットで同定した個々のポリペプチドをランク付けるために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを利用する。
【０５９９】
例示的なデータセットとして、ＬＳ／ＭＳ／ＭＳの結果から、以下のポリペプチド：Ｏ３４６６９、Ｐ５４４２３、Ｐ２１８７９、Ｐ１０４７５、Ｐ２８５９８、Ｏ３１８０３、Ｐ４０７６７、Ｐ１７８８９、Ｏ３４９１８、Ｑ０８３５２、Ｐ２４３２７、Ｐ３７８７１、Ｏ３１９７３、Ｐ８１１０１、Ｐ５０８４９、Ｐ２６９０１、Ｐ８０７００、Ｏ３４３８５、Ｐ７０９６０、Ｐ４２１１１、Ｐ２１８８０、Ｐ２７８７６、Ｐ８０８６８、Ｐ５４７１６、Ｏ３４３１３、Ｏ０７６０３、Ｏ０５４１１、Ｐ５４５３１、Ｏ０５４９７、Ｐ１２４２５、Ｏ０７９２１、Ｐ１９４０５、Ｑ０６７９７、Ｐ０２３９４、Ｐ２４１４１、Ｐ０９３３９、Ｐ３７９６５、Ｐ０７３４３、Ｐ３７８０９、Ｐ０ＣＩ７８、Ｐ３９８２４、Ｐ４９８１４、Ｐ３９６３２、Ｐ３９７７３、Ｐ５１７７７、Ｐ２１８８３、Ｏ０６９８９、Ｐ２５１５２、Ｐ７０９６１、Ｏ０７５９３、Ｏ３４３１０、Ｐ８０８６０、Ｐ３７４３７、Ｐ８０６９８、Ｐ１３２４３、Ｐ３８４９４、Ｐ３９６４５、Ｐ３９１４８、Ｏ３１３９８、Ｐ０８８２１、Ｐ０８８７７、Ｏ０５２６８、Ｐ０４９５７、Ｐ２８３６６、Ｐ３１１０３、Ｐ９４４２１、Ｐ１４９４９、Ｐ８０８６４、Ｐ３７８６９、Ｐ８０２４０、Ｐ８０８５９、Ｏ０６９９３、Ｏ３４６６６、Ｏ３４７１４、Ｐ３７５４６、Ｑ９ＫＷＵ４、Ｏ３１６０５、Ｐ１６６１６、Ｐ８０２３９、Ｏ３４７８８、Ｐ７１０１４、Ｐ３７５７１、Ｐ０９１２４、Ｐ４２９７１、Ｏ３１９２５、Ｐ３９７９３、Ｐ１７８６５、Ｐ１６２６３、Ｐ１８４２９、Ｐ０５６５３、Ｐ２６９０８、Ｐ３３１６６、Ｏ３４４９９、Ｐ０８７５０、Ｐ５４６０２、Ｑ４５０７１、Ｐ１２０４７、Ｐ４２９１９、Ｏ３４３３４、Ｏ３４３５８、Ｐ３９１２０、Ｐ３９１２６、Ｐ００６９１、Ｐ１４１９２、Ｐ２２２５０、Ｐ３７８７０、Ｐ３９１１６、Ｐ５４４８４、Ｐ５４４８８、Ｐ５４５４７、Ｐ５６８４９、Ｏ３１５７９、Ｏ３４６２９、Ｐ３０９４９、Ｐ５４４２２、Ｐ５４５３０、Ｐ５４５４２、Ｐ９６７３９が、１００ｍＭの酢酸（ｐＨ５．１８）でのその持続的な溶解性により単離されたことが実証された。
【０６００】
例示的なデータセットとして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、以下のポリペプチド：Ｏ３４６６９、Ｐ５４４２３、Ｐ２１８７９、Ｐ２４３２７、Ｐ４０７６７、Ｐ１７８８９、Ｏ３１９７３、Ｐ１０４７５、Ｐ２８５９８、Ｐ８０７００、Ｐ３７８７１、Ｐ８０８６８、Ｏ３１８０３、Ｐ８１１０１、Ｐ７０９６０、Ｐ２７８７６、Ｐ１９４０５、Ｐ２８３６６、Ｐ７１０１４、Ｐ２６９０１、Ｏ３４３８５、Ｐ２１８８０、Ｑ０６７９７、Ｐ２４１４１、Ｐ０７３４３、Ｐ８０６９８、Ｐ１３２４３、Ｐ４２９７１、Ｐ３９７９３、Ｏ３１６４３、Ｐ３９０７１、Ｏ３２２１０、Ｐ２１４６８、Ｐ４２１９９、Ｐ５４５３１、Ｐ３７９６５、Ｐ３７８０９、Ｐ２１８８３、Ｐ３８４９４、Ｐ３９１４８、Ｐ０８８７７、Ｐ０９１２４、Ｐ１７８６５、Ｐ１６２６３、Ｐ５４６０２、Ｐ４６９０６、Ｏ３４９１８、Ｑ０８３５２、Ｐ４２１１１、Ｏ０５４１１、Ｏ０５４９７、Ｏ０７９２１、Ｐ０２３９４、Ｐ０９３３９、Ｐ４９８１４、Ｐ３９６３２、Ｐ３７４３７、Ｐ３９６４５、Ｐ０８８２１、Ｐ０４９５７、Ｐ３１１０３、Ｑ９ＫＷＵ４、Ｐ８０２３９、Ｏ３４７８８、Ｐ１８４２９、Ｐ０５６５３、Ｐ２６９０８、Ｏ３４４９９、Ｐ０８７５０、Ｐ１２０４７、Ｐ３７８７０、Ｐ５４５４７、Ｑ０６７９６、Ｑ４５４７７、Ｐ２５１４４、Ｐ４６８９８、Ｐ４０８７１、Ｏ３１５０１、Ｐ２１４６４、Ｐ２１４６５、Ｐ４０４０９が、１００ｍＭの炭酸カリウム（ｐＨ９．６６）でのその持続的な溶解性により単離されたことが実証された。
【０６０１】
例示的なデータセットとして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、以下のポリペプチド：Ｏ３４６６９、Ｐ５４４２３、Ｐ２１８７９、Ｏ３４９１８、Ｏ３１８０３、Ｐ１０４７５、Ｐ２８５９８、Ｐ２４３２７、Ｐ４０７６７、Ｐ８０７００、Ｐ２７８７６、Ｐ３７８７１、Ｏ３４３８５、Ｐ１３２４３、Ｑ０８３５２、Ｏ０７９２１、Ｐ１７８８９、Ｏ３１９７３、Ｐ８０８６８、Ｐ２６９０１、Ｐ２４１４１、Ｐ８０６９８、Ｐ０２３９４、Ｑ０６７９７、Ｐ３９１４８、Ｐ１９４０５、Ｐ５４５３１、Ｐ３７９６５、Ｐ０９３３９、Ｐ３９６４５、Ｏ３４７８８、Ｐ３７５７１、Ｏ０７９０９、Ｐ７０９６０、Ｐ２１８８０、Ｐ４２９７１、Ｐ３７８０９、Ｐ８０２３９、Ｑ４５４７７、Ｐ９４４２１、Ｐ８１１０１、Ｐ０７３４３、Ｐ３９７９３、Ｐ３９０７１、Ｐ３８４９４、Ｐ１７８６５、Ｐ４２１１１、Ｐ１２４２５、Ｐ３９７７３、Ｏ０６９８９、Ｐ８０８６４、Ｏ０５４１１、Ｏ０５４９７、Ｐ２５１４４、Ｐ０ＣＩ７８、Ｐ３９８２４、Ｐ２５１５２、Ｐ７０９６１、Ｏ３１３９８、Ｏ０５２６８、Ｐ３７８６９、Ｐ８０８５９、Ｏ３２１５０、Ｐ３９１３８、Ｏ３１６４３、Ｐ２１４６８、Ｐ４２１９９、Ｐ２１８８３、Ｐ０９１２４、Ｐ４９８１４、Ｐ０５６５３、Ｑ０６７９６、Ｏ３４３１３、Ｐ５１７７７、Ｏ３４３１０、Ｏ０６９９３、Ｏ３４６６６、Ｏ３１９２５、Ｐ３３１６６、Ｐ３９６３４、Ｐ３７８０８、Ｐ３９７７９、Ｐ２８３６６、Ｐ０８８７７、Ｐ１６２６３、Ｐ３９６３２、Ｐ０８８２１、Ｐ０４９５７、Ｏ３４４９９、Ｐ０８７５０、Ｐ４６８９８、Ｐ５０８４９、Ｐ５４７１６、Ｐ８０８６０、Ｐ１４９４９、Ｐ８０２４０、Ｑ４５０７１、Ｏ３４３３４、Ｏ３４３５８、Ｐ３９１２０、Ｐ３９１２６、Ｐ２０２７８、Ｐ５３００１、Ｐ５４３７５、Ｏ０６００６、Ｏ０６９８８、Ｏ３４６６７、Ｏ３４９８１、Ｐ０８１６４、Ｐ１９６６９、Ｐ３０９５０、Ｐ３７４８７、Ｐ４５６９４、Ｐ８１１０２、Ｐ７１０１４、Ｐ５４６０２、Ｐ４６９０６、Ｐ３１１０３、Ｐ１８４２９、Ｐ２６９０８、Ｐ１２０４７、Ｐ４０８７１、Ｏ０７６０３、Ｏ３４７１４、Ｐ３７５４６、Ｐ４２９１９、Ｐ００６９１、Ｐ２２２５０、Ｐ３９１１６、Ｐ５４４８８、Ｐ４０９２４、Ｃ０ＳＰ９３、Ｏ３１７６０、Ｏ３２０２３、Ｏ３２１０６、Ｏ３２１６７、Ｏ３４９６２、Ｐ１２０４８、Ｐ２５９９５、Ｐ２８０１５、Ｐ２８５９９、Ｐ３４９５７、Ｐ３５１３７、Ｐ３７２５３、Ｐ３７４７７、Ｐ３７８１２、Ｐ３７９４０、Ｐ４６３５４、Ｐ４９７７８、Ｐ５４１６９、Ｐ５４４１８、Ｐ５４５５０、Ｐ５４９４１、Ｐ８０８８５、Ｐ９４５７６、Ｑ０４７９６、Ｑ０６００４、Ｑ０７８６８、Ｑ９Ｒ９Ｉ１が、１００ｍＭの塩化カルシウム（ｐＨ７．５０）でのその持続的な溶解性により単離されたことが実証された。
【０６０２】
例示的なデータセットとして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果から、以下のポリペプチド：Ｐ２６９０１、Ｏ３４６６９、Ｏ３４９１８、Ｐ５４４２３、Ｏ３１８０３、Ｐ９６６５７、Ｏ３１９７３、Ｐ３７８７１、Ｏ０７９２１、Ｏ３１６４３、Ｑ０６７９６、Ｐ１７８８９、Ｐ８０６９８、Ｐ８０２３９、Ｏ０５４１１、Ｏ０７９０９、Ｏ３１９２５、Ｐ２０２７８、Ｐ７１０１４、Ｐ２１８７９、Ｐ１０４７５、Ｐ８０７００、Ｐ２７８７６、Ｑ０８３５２、Ｐ８１１０１、Ｐ４２１１１、Ｐ０ＣＩ７８、Ｐ３９８２４、Ｏ３２２１０、Ｐ２８５９８、Ｐ２４３２７、Ｏ３４３８５、Ｑ０６７９７、Ｐ１９４０５、Ｐ３７５７１、Ｐ３８４９４、Ｏ３１３９８、Ｐ０９１２４、Ｐ５１７７７、Ｐ０８８２１、Ｐ１８４２９、Ｏ０７５９３、Ｐ８０８６８、Ｐ０９３３９、Ｐ３９６４５、Ｏ３４７８８、Ｏ０５２６８、Ｐ４９８１４、Ｐ０８８７７、Ｐ３９６３２、Ｐ０４９５７、Ｐ１４９４９、Ｐ３１１０３、Ｏ０６７４６、Ｏ０７５５５、Ｐ４０７６７、Ｐ０２３９４、Ｐ５４５３１、Ｐ３７９６５、Ｐ７０９６０、Ｐ３７８０９、Ｐ０７３４３、Ｐ３９７７３、Ｐ３３１６６、Ｐ３９６３４、Ｐ１６２６３、Ｐ４６８９８、Ｐ５０８４９、Ｐ５４７１６、Ｐ８０２４０、Ｑ４５０７１、Ｐ５３００１、Ｐ５４３７５、Ｐ２６９０８、Ｐ４２９１９、Ｐ４０９２４、Ｐ１４１９２、Ｐ５４４８４、Ｐ５６８４９、Ｏ０６７４８、Ｐ１２８７８、Ｐ２１４７７、Ｐ３２０８１、Ｐ４６８９９、Ｐ５０６２０、Ｐ５４４６４が、１００ｍＭの塩化鉄（ｐＨ４．５４）でのその持続的な溶解性により単離されたことが実証された。
【０６０３】
高い溶解度を有するとして同定したこれらのポリペプチドを、一次配列に基づく物理化学的特性について解析した。アミノ酸あたりの総電荷を、試験したｐＨの範囲を通して一次配列に基づき計算した。本明細書中に記載されるように、最も可溶性のポリペプチドはアミノ酸あたり高い総電荷を有することが予測され、これは一般的にあてはまることが例証された。このマルチプレックススクリーニングは、陰イオン交換樹脂との結合に対するその親和性に基づいてより大きなライブラリーからポリペプチドのセットを同定し、この結果は、本明細書中に記載されるように一次配列に基づき予測できる。
【０６０４】
マルチプレックス精製：沈殿および凝結
細胞および細胞のデブリを除去するために使用される従来のバイオ医薬品のタンパク質精製方法は、遠心分離、精密ろ過法、およびデプスフィルターを含む。珪藻土などのフィルター補助物質を使用して、これらのステップの性能を高めることができるが、このような方法は常に有効であるわけではなく、場合によっては関心対象生成物と顕著に結合する。これらの使用はまた、固体または均一な懸濁物の添加を必要とし得るが、このことは大規模なバイオ医薬品の製造作業の一部として難題となり得る。
【０６０５】
ポリマー凝集剤を使用して、哺乳動物細胞培養工程の流れの浄化を支援できるが、それらは限界を有し得る。たとえば、典型的に加工助剤として使用される硫酸プロタミンは、関心対象タンパク質の不活性化に関する懸念による用途、または沈殿による生成物の喪失により、応用は限定される（Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃａｎｔｏｒ  ｅｄｓ．  ２２−４３；１７１  （１９９４））。
【０６０６】
医療用用途のために販売される試薬などの高品質の試薬は、高価である場合がある。特定の例では、患者で有害効果が起こらないことを保証するためには、非常に低レベルまで除去することが必要である。たとえば、キトサンは、良好に定義された試薬ではなく、清澄用途で日常的に使用する場合にはその性能が一貫しているかに関して懸念が存在する。ＤＥＡＥデキストラン、廃水の処置（ＮＡＬＣＯ  Ｗａｔｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ｉｍｐｕｒｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００９）にしばしば使用されるアクリルアミドベースのポリマー、およびポリエチレンアミン（ＰＥＩ）などの高荷電ポリマーは、浄化の用途のために使用されると考えられている。後者の２種類のポリマーに関して、アクリルアミドの試薬は、毒性の試薬およびポリエチレンアミンが混入する可能性があり、効率が高い浄化試薬は、しばしば、発癌物質であると疑われるエチレンイミンモノマーが様々な量で混入している（Ｓｃａｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ，  Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｄｓ．：１５−５３  （１９８５））。さらに、ＰＥＩを含むこれらのポリマーの多くは、多くのクロマトグラフィー樹脂とほぼ非可逆的に結合する傾向があり、これにより、その後の処理の選択肢が限定される。これらポリマーに関連した制御性の原材料の再利用の懸念から、その応用は主に学究的な研究に限定されている。
【０６０７】
ミョウバンおよび鉄塩などの非ポリマー系凝集剤は、廃水処理産業で利用されている（ＮＡＬＣＯ  Ｗａｔｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ｉｍｐｕｒｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００９）。これらの物質は、タンパク質生成物と結合し得る、または化学反応を触媒し得ることにより、安全性または有効性に影響を及ぼし得るタンパク質の修飾をもたらし得るため、タンパク質生成物を処理する際に有益ではなように思われ得る。
【０６０８】
場合によって、タンパク質のライブラリー全体を、マルチプレックススクリーニングの実験プラットフォームで試験する。栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーを、単一増殖条件を使用して単一容器中で各ポリペプチドを産生するマルチプレックス発現系で、トランスフェクトさせて発現させた。このマルチプレックス発現系は、ポリペプチド配列の任意のセットを、試験されるポリペプチドのセットをランク付けするためにその各々を使用することができる幅広い範囲の製造性パラメータに関して同時に試験することができる。製造性パラメータのセットは、発現レベル、ポリペプチドの溶解度、クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製できること、熱変性の抵抗能、ポリペプチドの消化能、厳しい処理に抵抗することによりポリペプチドを精製できることを含む。
【０６０９】
沈殿によって大腸菌をマルチプレックス精製するために、栄養性ポリペプチド配列１６８個のセットをＨＩＳ８タグ付けした。これらの細胞を、本明細書中に記載されるように培養し、破壊し、この溶液を本明細書中に記載されるように浄化した。この産生によって、発現されかつ可溶性であるセット由来のすべてのポリペプチドを含む溶液が得られた。可溶性ポリペプチドのセットを、ＩＭＡＣカラムに通過させ、本明細書中に記載されるように溶出した。このＩＭＡＣ精製により、大腸菌宿主細胞タンパク質の大部分を除去することにより、可溶性に発現された栄養性ポリペプチドがセットとして効果的に単離された。この溶出分画を濃縮し、ほぼ中性のｐＨで緩衝した低塩溶液にバッファー交換して、様々な精製方法を試験した。試験した方法として、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および不純物が沈殿し、可溶性のままであるポリペプチドが最も高くランク付けされるネガティブな沈殿が挙げられる。この場合、不純物が除去されていることにより、ポリペプチドは互いに対してランク付けされる。さらに、タンパク質のセットを、加熱することにより熱安定性に関して試験し、この際、加熱後も可溶性のままであるポリペプチドは、沈殿したポリペプチドよりも熱に安定である。
【０６１０】
大腸菌に発現させたポリペプチドの前処置群を、９６ウェルプレートのうち３２ウェルに分配した（総タンパク質濃度４３ｇ／Ｌでウェルあたり４．７μＬのタンパク質保存液）。保存液を各ウェルに添加して、以下の条件を作製した：対照（添加剤なし）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ７．１）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ６．５）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ６．０）、４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ５．６）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ５．０）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ４．６）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ４．３）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ３．９）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ３．７）；４２ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩（ｐＨ２．８）；７５ｍＭのトリス塩基；５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３；５０ｍＭのピぺラジン塩基；１００ｍＭのリン酸ナトリウム（二塩基性）；５０ｍＭのエタノールアミン；１００ｍＭのリン酸ナトリウム（一塩基性）；１００ｍＭのＭＥＳ酸；１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．１）；１００ｍＭのＭＯＰＳ酸；１００ｍＭのトリスＨＣｌ；２５ｍＭの酢酸；２５ｍＭのホウ酸；２５ｍＭのクエン酸；５０ｍＭのＰＩＰＥＳ酸；５０ｍＭのコハク酸；１．２Ｍの亜硫酸ナトリウム；１．５Ｍの亜硫酸ナトリウム；２．５Ｍの硫酸アンモニウム；３．５Ｍの硫酸アンモニウム；２００ｍＭのＣａＣｌ２；６０％のメタノール。各ウェルが、５ｇ／Ｌの溶液を全体で４０μＬ含むように水を添加した。プレートを、室温で３０分間混合し、次いで３，０００ＲＣＦで１０分間遠心沈降させ、いずれかの沈殿タンパク質をペレット状にした。試料を、解析のため各ウェルから採取した。次いで、９６ウェルプレートを、９５℃で２分間加熱した。このプレートを、３，０００ＲＣＦで１０分間再度遠心沈降させて、何等かの沈殿したタンパク質をペレット状にし、試料を解析のため各ウェルから採取した。６４個の試料すべてを、ブラッドフォード法により解析し、選択した試料を、チップ電気泳動、次いでＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。すべての解析アッセイは本明細書中に記載されている。溶液中に残る総タンパク質の測定から、多くの条件がポリペプチドの沈殿を引き起こしたことが例証され、試験した条件の一部が、過酷な厳しい条件であったことが示される。
【０６１１】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を、表Ｅ９Ｄに示されるように、４つの選択した試料で実施した。可溶性分画の栄養性ポリペプチドの検出は、Ｘと表される。
【表９４】
2016537402.tif 000096
2016537402.tif 000097
【０６１２】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのデータにより、各条件で多くの可溶性ポリペプチドが同定された。スクリーニングを通して試験した異なる条件は、異なる多くの沈殿機構が存在することを表し、これらの異なる条件により、異なる物理化学的特性に基づきポリペプチドの異なるセットを同定することが可能であった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより試験した条件の、可溶性のままであるポリペプチドの数に基づき、最も厳しい条件は、室温で２．５Ｍの硫酸アンモニウムの条件である。この条件で可溶性であるポリペプチドは、一般的に、数例の例外を除き、試験した他の３つすべての条件で可溶性であった。多くのポリペプチドは、２分間９５℃に加熱した後に可溶性であると同定された。この実験では、栄養性ポリペプチドのライブラリーを、幅広い様々な条件を通して溶解性に関して物理的にスクリーニングして、可溶性ペプチドのサブセットを、各条件の中で同定した。
【０６１３】
実施例１１：溶媒和スコア、および凝集スコア、および他の配列ベースの解析に基づくアミノ酸配列ライブラリーからの栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列の選択
溶媒和スコア
溶媒和スコアは、所定のタンパク質の親水性および潜在的溶解性を評価するための一次配列に基づく測定基準である。これは、それぞれのアミノ酸残基が独立して溶媒和されると仮定して、配列中の残基総数により正規化された、すべてのアミノ酸側鎖に関する溶媒和の総自由エネルギー（すなわち、気相から希釈液への移行に関連する自由エネルギーの変化）として定義される。側鎖の溶媒和自由エネルギーは、１の真空誘電率と８０の水誘電率とのあいだの静電エネルギーの差（ポアソン＝ボルツマン方程式を解くことによる）、ならびに線形溶媒近接可能表面積モデルを使用して非極性のファンデルワールスエネルギーをコンピューターによって計算することにより見出された（Ｄ．  Ｓｉｔｋｏｆｆ，  Ｋ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ，  Ｂ．  Ｈｏｎｉｇ．  ‘‘Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｓ’’．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  ９８，  １９９４）。これらの溶媒和自由エネルギーは、実験上の測定と良好に相関している。イオン化可能な側鎖（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＴｙｒ）を有するアミノ酸では、平均溶媒和自由エネルギーは、特定のｐＨでの各イオン化状態の相対的確率に基づく。溶媒和スコアは、、フォールディングの際に、すべての極性残基が溶媒に曝露され、かつ非極性残基が除去されると仮定した、溶媒和自由エネルギーの効果的な測定である。
【０６１４】
凝集スコア
凝集スコアは、所定のタンパク質の疎水性および凝集の可能性を評価するための一次配列に基づく測定基準である。疎水性残基に正の値を与え、親水性残基に負の値を与える、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性スケール（Ｋｙｔｅ  Ｊ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ（Ｍａｙ  １９８２）’’Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ’’  Ｊ．  ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−３２）を使用して、配列の位置の関数としての有効な疎水性を、各残基周辺に集まる５残基の移動平均を使用して計算する。凝集スコアは、０より大きいそれらの平均疎水性の値をすべて加算し、タンパク質の全長により正規化することにより見出される。根底となる理解は、凝集が、水を排除して表面曝露を低減するために、２つ以上の疎水性区画が集合した結果であるということであり、タンパク質が凝集する可能性は、疎水性（すなわち凝集傾向がある）の残基がどのように密に詰め込まれるかの関数である。
【０６１５】
電荷含有量
アミノ酸あたりの絶対電荷または実効電荷は、ｐＨの関数として、残基のタンパク質中の位置とは無関係に計算される。滴定可能な残基のｐＨ値およびｐＫａが与えられれば、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式を解くことにより、各滴定状態の相対的な濃度が決定される（たとえば酸性残基のグルタミン酸塩では−１または０）。
【数２】
2016537402.tif 000098
【０６１６】
ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式
滴定可能な残基の電荷の平均値は、これらの相対的な濃度を、帯電する有効確率に変換し、そのアミノ酸の電荷および実体数を乗算することにより見出される。この手順から見出される実効電荷または絶対電荷を、次いで、アミノ酸値あたりの値を得るためにアミノ酸の数により除算する。
【０６１７】
以下の表Ｅ１１Ａに示した残基の種類を、対応するｐＫａ値および関連する滴定状態とともに使用する。これらのｐＫａ値は、ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ）（Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  Ｌｏｎｇｄｅｎ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，  Ａ．  ＥＭＢＯＳＳ：  Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６，  ２０００）に提供されるｐＫａの表に由来する。
【表９５】
2016537402.tif 000099
【０６１８】
重み付けしたユークリッド距離
類似のアミノ酸が既知の臨床的に効果的な混合物に分解された候補タンパク質を同定するために、重み付けしたユークリッド距離に基づく検索方法を使用する。原則的に、これは、以下の式
【数３】
2016537402.tif 000100
であって、式中、ＡＡは、標的分布のすべてのアミノ酸のセットであり、
【数４】
2016537402.tif 000101
は、候補となるタンパク質配列中のアミノ酸
【数５】
2016537402.tif 000102
の重量分画であり、
【数６】
2016537402.tif 000103
は、標的アミノ酸分布中のアミノ酸
【数７】
2016537402.tif 000104
の重量分画であり、
【数８】
2016537402.tif 000105
は、アミノ酸
【数９】
2016537402.tif 000106
に関連した相対重量である、
式により定義されるように、標的アミノ酸分布に対する各アミノ酸の重み付けしたパーセント差異をコンピュータにより計測することを意味する。相対重量を使用して、最も重要なアミノ酸からの大きな偏差が適宜、確実にペナルティを課せられるようにした。
【０６１９】
例として、サルコペニアの処置、運動の支援、および熱産生アミノ酸混合物の刺激（ロイシンおよび他の２つの分枝鎖アミノ酸、イソロイシンおよびバリンの所定の相対的な重要性を考慮して）のために、ロイシン、バリン、およびイソロイシンに関して３：２：２の相対重量を使用した。他の全てのアミノ酸には、相対重量１を与えた。
【０６２０】
アレルゲン性
アレルゲン性スコアは、タンパク質が任意の既知のアレルゲンとどれほど類似しているかを評価するための、のあいだ、ＷＨＯの推奨に基づく一次配列に基づく測定基準であり（ｆａｏ．ｏｒｇ／ａｇ／ａｇｎ／ｆｏｏｄ／ｐｄｆ／ａｌｌｅｒｇｙｇｍ．ｐｄｆ）、標的と既知のアレルゲンとのあいだの高いパーセント同一性が交差反応性を示す可能性があると主に理解されている。所定のタンパク質に関して、アレルギー応答を誘発する可能性は、無料の配列相同性ベースの試験ペアを通して評価される。第１の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用した既知のアレルゲンのデータベースに対するグローバル−ローカル配列アライメントを介して、配列全体にわたるタンパク質のパーセント同一性を決定する。両配列を通して全体的相同性が５０％未満であるタンパク質は、アレルゲン性である可能性が低いことが示唆される（Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｒｏｐｓ−ｗｈａｔ  ｍａｋｅｓ  ｓｅｎｓｅ？  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２６，  ７３−８１  （２００８）．；  Ａａｌｂｅｒｓｅ  Ｒ．  Ｃ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０６，  ２２８−２３８（２０００）．）。第２の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用した既知のアレルゲンのデータベースに対する各フラグメントのグローバル−ローカル配列アライメントを介した起こり得る連続するアミノ酸８０個のフラグメントすべての局所的アレルゲン性を決定することにより、タンパク質の配列に沿って局所的なアレルゲン性を評価する。任意のアミノ酸８０個のウインドウと任意のアレルゲンとの最高のパーセント同一性を、関心対象タンパク質の最終的なスコアとする。ＷＨＯのガイドラインは、３５％の同一性カットオフを使用することを示唆している。カスタムデータベースは、食品アレルギー研究および資源のプログラム（Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／），  ＵＮＩＰＲＯＴ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ  （ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ａｌｌｅｒｇｅｎ）、およびアレルゲン性タンパク質の構造上のデータベース（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＳＤＡＰ，  ｆｅｒｍｉ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ＳＤＡＰ／ｓｄａｐ＿ｌｎｋ．ｈｔｍｌ）により回収されたプールされたアレルゲンのリストを含む。このデータベースは、ＩＵＩＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｉｔｉｅｓ  ）（ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ／）により現在認識されているすべてのアレルゲンおよびまだ正式な名称のない多数の追加的なアレルゲンを含むものである。
【０６２１】
毒性／非アレルゲン性／抗栄養性
タンパク質の毒性、非アレルゲン性、および抗栄養性は全て、それぞれ、既知の毒性タンパク質、非アレルゲン性タンパク質、およびプロテアーゼ阻害性タンパク質のデータベースに対するタンパク質のパーセント同一性を決定することにより、同様に評価される。毒性および抗栄養性の性質は、その毒性および阻害性の作用機構がしばしば本質的に構造に由来するため、タンパク質全体の機能であると考えられる（すなわち、既知の毒性タンパク質のフラグメントは毒性ではない）（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｊ，  Ｒｅａｄ  Ｒ，  Ｃａｒｒｅｌｌ  Ｒ．  ‘‘Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｐｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｈｏｗｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ’’．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７  （２０００）：  ９２３−６；  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  Ｈ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｓｃｉｃｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｔｏ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４  （１９９５）：  ７０３−７１５．；  ａｎｄ  Ｈａｒｅｌ  Ｍ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ−ｆａｓｃｉｃｕｌｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  ３  （１９９５）：  １３５５−１３６６．）。タンパク質の構造がタンパク質の配列全体の機能であると仮定して、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、２つのそれぞれのデータベースに対して、関心対象タンパク質のグローバル−グローバルアライメントを行う。３５％のカットオフを使用できる。毒性／抗栄養性ポリペプチドを回避する方法の具体的な説明を提供するものではないが、参考文献Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ４６（２００８：  Ｓ７１−Ｓ９７は、可能性がある食品タンパク質の安全性を評価する際に既知の毒性および抗栄養性ポリペプチドの両方を回避すべきことを示唆している。
【０６２２】
タンパク質の非アレルゲン性は、曝露されるとアレルゲン性の応答（アレルゲン性と類似であるが反対の）を誘発するその可能性に関連する。具体的には、ヒトの免疫系は、可能性があるアレルゲン性のタンパク質に定期的に何度も曝露され、自己と非自己とを区別する能力を本来有する。この能力の正確な性質は、必ずしも明確ではないが、身体が自己と非自己を区別できない結果として起こる多くの疾患が存在する（たとえば関節炎）。にもかかわらず、非アレルゲン性（すなわちヒト）のタンパク質のように多く見出される（すなわち、大きな度合いの配列相同性を共有する）タンパク質は、免疫応答を誘発しにくいと理解される。特に、既知のアレルゲン性メンバー（トロポミオシン、パルブアルブミン、カゼイン）を有する一部のタンパク質ファミリーでは、既知のアレルゲン性タンパク質と比較してそのヒトの対応物とより多くの配列相同性を有するタンパク質は、アレルゲン性ではないと考えらることが示されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍｃａｌ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２０  （２００７）：  １３９９−１４０５．）。所定のタンパク質では、非アレルゲン性のスコアは、ＢＬＯＳＵＭ５０置換行列、１０のギャップ開口ペナルティ、および２のギャップ伸長ペナルティでＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、グローバル−ローカルアライメントからヒトのタンパク質のデータベースに対するタンパク質の最大パーセント同一性を決定することにより測定される。カットオフは変動できる。たとえば、Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｊ．  Ａら（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍｃａｌ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２０  （２００７）：  １３９９−１４０５）は、ヒトタンパク質に対して約６２％超の配列同一性を有するタンパク質は、アレルゲン性である可能性が低いと主張している。
【０６２３】
実施例１２．栄養性ポリペプチドの発現
以下のリストは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、および哺乳動物の細胞で発現させたすべての栄養性タンパク質の配列を含む。大腸菌では、タンパク質は、全細胞ライセートまたは細胞ライセートの可溶性分画のいずれかで検出された。Ｂａｃｉｌｌｕｓでは、発現は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの細胞ライセートまたは分泌上清のいずれかで検出された。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒでは、タンパク質は、真菌から分泌されて上清で検出された。哺乳動物細胞で発現させたタンパク質では、タンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣Ｓ細胞株（ＣＨＯ−Ｓ）またはヒトの胎児腎臓２９３Ｆ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ）のいずれかで発現させた。発現は、以下の計測基準：プールしたライブラリーにおけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳから得たタンパク質発現データに関する質量分析スペクトルカウント、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、チップ電気泳動、ドットブロット、ウェスタンブロット、および上述の個々のタンパク質の発現に関するＥＬＩＳＡにより測定した。
【０６２４】
以下の栄養性ポリペプチド：ＳＥＱＩＤ−００００１、ＳＥＱＩＤ−００００２、ＳＥＱＩＤ−００００３、ＳＥＱＩＤ−００００４、ＳＥＱＩＤ−００００５、ＳＥＱＩＤ−００００７、ＳＥＱＩＤ−００００８、ＳＥＱＩＤ−００００９、ＳＥＱＩＤ−０００１１、ＳＥＱＩＤ−０００１２、ＳＥＱＩＤ−０００１３、ＳＥＱＩＤ−０００１４、ＳＥＱＩＤ−０００１５、ＳＥＱＩＤ−０００１６、ＳＥＱＩＤ−０００２０、ＳＥＱＩＤ−０００２１、ＳＥＱＩＤ−０００２４、ＳＥＱＩＤ−０００２５、ＳＥＱＩＤ−０００２７、ＳＥＱＩＤ−０００２８、ＳＥＱＩＤ−０００２９、ＳＥＱＩＤ−０００３０、ＳＥＱＩＤ−０００３１、ＳＥＱＩＤ−０００３３、ＳＥＱＩＤ−０００４３、ＳＥＱＩＤ−０００４９、ＳＥＱＩＤ−０００５１、ＳＥＱＩＤ−０００５２、ＳＥＱＩＤ−０００５３、ＳＥＱＩＤ−０００５４、ＳＥＱＩＤ−０００５５、ＳＥＱＩＤ−０００５７、ＳＥＱＩＤ−０００５９、ＳＥＱＩＤ−０００６０、ＳＥＱＩＤ−０００６１、ＳＥＱＩＤ−０００６８、ＳＥＱＩＤ−０００７０、ＳＥＱＩＤ−０００７１、ＳＥＱＩＤ−０００７３、ＳＥＱＩＤ−０００７４、ＳＥＱＩＤ−０００７５、ＳＥＱＩＤ−０００７６、ＳＥＱＩＤ−０００７７、ＳＥＱＩＤ−０００７８、ＳＥＱＩＤ−０００８３、ＳＥＱＩＤ−０００８４、ＳＥＱＩＤ−０００８５、ＳＥＱＩＤ−０００８６、ＳＥＱＩＤ−０００８７、ＳＥＱＩＤ−０００８８、ＳＥＱＩＤ−０００９０、ＳＥＱＩＤ−０００９１、ＳＥＱＩＤ−０００９２、ＳＥＱＩＤ−０００９３、ＳＥＱＩＤ−０００９８、ＳＥＱＩＤ−０００９９、ＳＥＱＩＤ−００１００、ＳＥＱＩＤ−００１０１、ＳＥＱＩＤ−００１０２、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０４、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００１０６、ＳＥＱＩＤ−００１０７、ＳＥＱＩＤ−００１０８、ＳＥＱＩＤ−００１１０、ＳＥＱＩＤ−００１１２、ＳＥＱＩＤ−００１１３、ＳＥＱＩＤ−００１１５、ＳＥＱＩＤ−００１１６、ＳＥＱＩＤ−００１１７、ＳＥＱＩＤ−００１１８、ＳＥＱＩＤ−００１２３、ＳＥＱＩＤ−００１２４、ＳＥＱＩＤ−００１２８、ＳＥＱＩＤ−００１３０、ＳＥＱＩＤ−００１３１、ＳＥＱＩＤ−００１３２、ＳＥＱＩＤ−００１３４、ＳＥＱＩＤ−００１３７、ＳＥＱＩＤ−００１３９、ＳＥＱＩＤ−００１４０、ＳＥＱＩＤ−００１４１、ＳＥＱＩＤ−００１４２、ＳＥＱＩＤ−００１４３、ＳＥＱＩＤ−００１４５、ＳＥＱＩＤ−００１４６、ＳＥＱＩＤ−００１４８、ＳＥＱＩＤ−００１５０、ＳＥＱＩＤ−００１５１、ＳＥＱＩＤ−００１５２、ＳＥＱＩＤ−００１５３、ＳＥＱＩＤ−００１５４、ＳＥＱＩＤ−００１５５、ＳＥＱＩＤ−００１５７、ＳＥＱＩＤ−００１５８、ＳＥＱＩＤ−００１５９、ＳＥＱＩＤ−００１６２、ＳＥＱＩＤ−００１６６、ＳＥＱＩＤ−００１６９、ＳＥＱＩＤ−００１７５、ＳＥＱＩＤ−００１９３、ＳＥＱＩＤ−００１９４、ＳＥＱＩＤ−００１９５、ＳＥＱＩＤ−００１９６、ＳＥＱＩＤ−００１９７、ＳＥＱＩＤ−００１９８、ＳＥＱＩＤ−００１９９、ＳＥＱＩＤ−００２００、ＳＥＱＩＤ−００２０１、ＳＥＱＩＤ−００２０２、ＳＥＱＩＤ−００２０３、ＳＥＱＩＤ−００２０４、ＳＥＱＩＤ−００２０５、ＳＥＱＩＤ−００２１１、ＳＥＱＩＤ−００２１２、ＳＥＱＩＤ−００２１３、ＳＥＱＩＤ−００２１４、ＳＥＱＩＤ−００２１５、ＳＥＱＩＤ−００２１６、ＳＥＱＩＤ−００２１８、ＳＥＱＩＤ−００２１９、ＳＥＱＩＤ−００２２０、ＳＥＱＩＤ−００２２１、ＳＥＱＩＤ−００２２３、ＳＥＱＩＤ−００２２４、ＳＥＱＩＤ−００２２５、ＳＥＱＩＤ−００２２６、ＳＥＱＩＤ−００２２７、ＳＥＱＩＤ−００２２８、ＳＥＱＩＤ−００２３０、ＳＥＱＩＤ−００２３２、ＳＥＱＩＤ−００２３３、ＳＥＱＩＤ−００２３４、ＳＥＱＩＤ−００２３５、ＳＥＱＩＤ−００２３６、ＳＥＱＩＤ−００２３７、ＳＥＱＩＤ−００２３９、ＳＥＱＩＤ−００２４０、ＳＥＱＩＤ−００２４１、ＳＥＱＩＤ−００２６４、ＳＥＱＩＤ−００２６５、ＳＥＱＩＤ−００２６６、ＳＥＱＩＤ−００２６７、ＳＥＱＩＤ−００２６８、ＳＥＱＩＤ−００２６９、ＳＥＱＩＤ−００２７０、ＳＥＱＩＤ−００２７１、ＳＥＱＩＤ−００２７３、ＳＥＱＩＤ−００２７４、ＳＥＱＩＤ−００２７５、ＳＥＱＩＤ−００２７６、ＳＥＱＩＤ−００２８４、ＳＥＱＩＤ−００２８７、ＳＥＱＩＤ−００２９７、ＳＥＱＩＤ−００２９８、ＳＥＱＩＤ−００２９９、ＳＥＱＩＤ−００３０２、ＳＥＱＩＤ−００３０３、ＳＥＱＩＤ−００３０４、ＳＥＱＩＤ−００３０５、ＳＥＱＩＤ−００３０６、ＳＥＱＩＤ−００３０７、ＳＥＱＩＤ−００３０９、ＳＥＱＩＤ−００３１８、ＳＥＱＩＤ−００３２２、ＳＥＱＩＤ−００３２５、ＳＥＱＩＤ−００３２６、ＳＥＱＩＤ−００３２７、ＳＥＱＩＤ−００３２８、ＳＥＱＩＤ−００３２９、ＳＥＱＩＤ−００３３２、ＳＥＱＩＤ−００３３５、ＳＥＱＩＤ−００３３６、ＳＥＱＩＤ−００３３７、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３４３、ＳＥＱＩＤ−００３４４、ＳＥＱＩＤ−００３４５、ＳＥＱＩＤ−００３４６、ＳＥＱＩＤ−００３４９、ＳＥＱＩＤ−００３５０、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３５３、ＳＥＱＩＤ−００３５４、ＳＥＱＩＤ−００３５５、ＳＥＱＩＤ−００３５６、ＳＥＱＩＤ−００３５７、ＳＥＱＩＤ−００３５８、ＳＥＱＩＤ−００３５９、ＳＥＱＩＤ−００３６０、ＳＥＱＩＤ−００３６２、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００４０８、ＳＥＱＩＤ−００４０９、ＳＥＱＩＤ−００４１５、ＳＥＱＩＤ−００４１６、ＳＥＱＩＤ−００４１８、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４８１、ＳＥＱＩＤ−００４８２、ＳＥＱＩＤ−００４８３、ＳＥＱＩＤ−００４８４、ＳＥＱＩＤ−００４８５、ＳＥＱＩＤ−００４８６、ＳＥＱＩＤ−００４８７、ＳＥＱＩＤ−００４８８、ＳＥＱＩＤ−００４８９、ＳＥＱＩＤ−００４９０、ＳＥＱＩＤ−００４９１、ＳＥＱＩＤ−００４９２、ＳＥＱＩＤ−００４９３、ＳＥＱＩＤ−００４９４、ＳＥＱＩＤ−００４９５、ＳＥＱＩＤ−００４９６、ＳＥＱＩＤ−００４９７、ＳＥＱＩＤ−００４９８、ＳＥＱＩＤ−００４９９、ＳＥＱＩＤ−００５００、ＳＥＱＩＤ−００５０１、ＳＥＱＩＤ−００５０２、ＳＥＱＩＤ−００５０３、ＳＥＱＩＤ−００５０４、ＳＥＱＩＤ−００５０５、ＳＥＱＩＤ−００５０６、ＳＥＱＩＤ−００５０７、ＳＥＱＩＤ−００５０８、ＳＥＱＩＤ−００５０９、ＳＥＱＩＤ−００５１０、ＳＥＱＩＤ−００５１１、ＳＥＱＩＤ−００５１２、ＳＥＱＩＤ−００５１３、ＳＥＱＩＤ−００５１４、ＳＥＱＩＤ−００５１５、ＳＥＱＩＤ−００５１６、ＳＥＱＩＤ−００５１７、ＳＥＱＩＤ−００５１８、ＳＥＱＩＤ−００５１９、ＳＥＱＩＤ−００５２０、ＳＥＱＩＤ−００５２１、ＳＥＱＩＤ−００５２２、ＳＥＱＩＤ−００５２３、ＳＥＱＩＤ−００５２４、ＳＥＱＩＤ−００５２５、ＳＥＱＩＤ−００５２６、ＳＥＱＩＤ−００５２７、ＳＥＱＩＤ−００５２８、ＳＥＱＩＤ−００５２９、ＳＥＱＩＤ−００５３０、ＳＥＱＩＤ−００５３１、ＳＥＱＩＤ−００５３２、ＳＥＱＩＤ−００５３３、ＳＥＱＩＤ−００５３４、ＳＥＱＩＤ−００５３５、ＳＥＱＩＤ−００５３６、ＳＥＱＩＤ−００５３７、ＳＥＱＩＤ−００５３８、ＳＥＱＩＤ−００５３９、ＳＥＱＩＤ−００５４０、ＳＥＱＩＤ−００５４１、ＳＥＱＩＤ−００５４２、ＳＥＱＩＤ−００５４３、ＳＥＱＩＤ−００５４４、ＳＥＱＩＤ−００５４５、ＳＥＱＩＤ−００５４６、ＳＥＱＩＤ−００５４７、ＳＥＱＩＤ−００５４８、ＳＥＱＩＤ−００５４９、ＳＥＱＩＤ−００５５０、ＳＥＱＩＤ−００５５１、ＳＥＱＩＤ−００５５２、ＳＥＱＩＤ−００５５３、ＳＥＱＩＤ−００５５４、ＳＥＱＩＤ−００５５５、ＳＥＱＩＤ−００５５６、ＳＥＱＩＤ−００５５７、ＳＥＱＩＤ−００５５８、ＳＥＱＩＤ−００５５９、ＳＥＱＩＤ−００５６０、ＳＥＱＩＤ−００５６１、ＳＥＱＩＤ−００５６２、ＳＥＱＩＤ−００５６３、ＳＥＱＩＤ−００５６４、ＳＥＱＩＤ−００５６５、ＳＥＱＩＤ−００５６６、ＳＥＱＩＤ−００５６７、ＳＥＱＩＤ−００５６８、ＳＥＱＩＤ−００５６９、ＳＥＱＩＤ−００５７０、ＳＥＱＩＤ−００５７１、ＳＥＱＩＤ−００５７２、ＳＥＱＩＤ−００５７３、ＳＥＱＩＤ−００５７４、ＳＥＱＩＤ−００５７５、ＳＥＱＩＤ−００５７６、ＳＥＱＩＤ−００５７７、ＳＥＱＩＤ−００５７８、ＳＥＱＩＤ−００５７９、ＳＥＱＩＤ−００５８０、ＳＥＱＩＤ−００５８１、ＳＥＱＩＤ−００５８２、ＳＥＱＩＤ−００５８３、ＳＥＱＩＤ−００５８４、ＳＥＱＩＤ−００５８５、ＳＥＱＩＤ−００５８６、ＳＥＱＩＤ−００５８７、ＳＥＱＩＤ−００５８８、ＳＥＱＩＤ−００５８９、ＳＥＱＩＤ−００５９０、ＳＥＱＩＤ−００５９１、ＳＥＱＩＤ−００５９２、ＳＥＱＩＤ−００５９３、ＳＥＱＩＤ−００５９４、ＳＥＱＩＤ−００５９５、ＳＥＱＩＤ−００５９６、ＳＥＱＩＤ−００５９７、ＳＥＱＩＤ−００５９８、ＳＥＱＩＤ−００５９９、ＳＥＱＩＤ−００６００、ＳＥＱＩＤ−００６０１、ＳＥＱＩＤ−００６０２、ＳＥＱＩＤ−００６０３、ＳＥＱＩＤ−００６０４、ＳＥＱＩＤ−００６０５、ＳＥＱＩＤ−００６０６、ＳＥＱＩＤ−００６０７、ＳＥＱＩＤ−００６０８、ＳＥＱＩＤ−００６０９、ＳＥＱＩＤ−００６１０、ＳＥＱＩＤ−００６１１、ＳＥＱＩＤ−００６１２、ＳＥＱＩＤ−００６１３、ＳＥＱＩＤ−００６１４、ＳＥＱＩＤ−００６１５、ＳＥＱＩＤ−００６１６、ＳＥＱＩＤ−００６１７、ＳＥＱＩＤ−００６１８、ＳＥＱＩＤ−００６１９、ＳＥＱＩＤ−００６２０、ＳＥＱＩＤ−００６２１、ＳＥＱＩＤ−００６２２、ＳＥＱＩＤ−００６２３、ＳＥＱＩＤ−００６２４、ＳＥＱＩＤ−００６２５、ＳＥＱＩＤ−００６２６、ＳＥＱＩＤ−００６２７、ＳＥＱＩＤ−００６２８、ＳＥＱＩＤ−００６２９、ＳＥＱＩＤ−００６３０、ＳＥＱＩＤ−００６３１、ＳＥＱＩＤ−００６３２、ＳＥＱＩＤ−００６３３、ＳＥＱＩＤ−００６３４、ＳＥＱＩＤ−００６３５、ＳＥＱＩＤ−００６３６、ＳＥＱＩＤ−００６３７、ＳＥＱＩＤ−００６３８、ＳＥＱＩＤ−００６３９、ＳＥＱＩＤ−００６４０、ＳＥＱＩＤ−００６４１、ＳＥＱＩＤ−００６４２、ＳＥＱＩＤ−００６４３、ＳＥＱＩＤ−００６４４、ＳＥＱＩＤ−００６４５、ＳＥＱＩＤ−００６４６、ＳＥＱＩＤ−００６４７、ＳＥＱＩＤ−００６４８、ＳＥＱＩＤ−００６６９、ＳＥＱＩＤ−００６７０、ＳＥＱＩＤ−００６７１、ＳＥＱＩＤ−００６７２、ＳＥＱＩＤ−００６７３、ＳＥＱＩＤ−００６７４、ＳＥＱＩＤ−００６７５、ＳＥＱＩＤ−００６７６、ＳＥＱＩＤ−００６７７、ＳＥＱＩＤ−００６７８、ＳＥＱＩＤ−００６７９、ＳＥＱＩＤ−００６８０、ＳＥＱＩＤ−００６８１、ＳＥＱＩＤ−００６８２、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７１７、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７１９、ＳＥＱＩＤ−００７２０、ＳＥＱＩＤ−００７２３、ＳＥＱＩＤ−００７２４、ＳＥＱＩＤ−００７２５、ＳＥＱＩＤ−００７２６、ＳＥＱＩＤ−００７２７、ＳＥＱＩＤ−００７２８、ＳＥＱＩＤ−００７２９、ＳＥＱＩＤ−００７３０、ＳＥＱＩＤ−００７３１、ＳＥＱＩＤ−００７３２、ＳＥＱＩＤ−００７３４、ＳＥＱＩＤ−００７３５、ＳＥＱＩＤ−００７３６、ＳＥＱＩＤ−００７３７、ＳＥＱＩＤ−００７３８、ＳＥＱＩＤ−００７３９、ＳＥＱＩＤ−００７４０、ＳＥＱＩＤ−００７４１、ＳＥＱＩＤ−００７４２、ＳＥＱＩＤ−００７４３、ＳＥＱＩＤ−００７４４、ＳＥＱＩＤ−００７４５、ＳＥＱＩＤ−００７４６、ＳＥＱＩＤ−００７４７、ＳＥＱＩＤ−００７４８、ＳＥＱＩＤ−００７４９、ＳＥＱＩＤ−００７５０、ＳＥＱＩＤ−００７５１、ＳＥＱＩＤ−００７５２、ＳＥＱＩＤ−００７５３、ＳＥＱＩＤ−００７５４、ＳＥＱＩＤ−００７５５、ＳＥＱＩＤ−００７５６、ＳＥＱＩＤ−００７５７、ＳＥＱＩＤ−００７５８、ＳＥＱＩＤ−００７５９、ＳＥＱＩＤ−００７６０、ＳＥＱＩＤ−００７６１、ＳＥＱＩＤ−０
０７６３、ＳＥＱＩＤ−００７６５、ＳＥＱＩＤ−００７６６、ＳＥＱＩＤ−００７６７、ＳＥＱＩＤ−００７６８、ＳＥＱＩＤ−００７６９、ＳＥＱＩＤ−００７７０、ＳＥＱＩＤ−００７７１、ＳＥＱＩＤ−００７７２、ＳＥＱＩＤ−００７７３、ＳＥＱＩＤ−００７７４、ＳＥＱＩＤ−００７７５、ＳＥＱＩＤ−００７７７、ＳＥＱＩＤ−００７７８、ＳＥＱＩＤ−００７８０、ＳＥＱＩＤ−００７８１、ＳＥＱＩＤ−００７８２、ＳＥＱＩＤ−００７８３、ＳＥＱＩＤ−００７８４、ＳＥＱＩＤ−００７８５、ＳＥＱＩＤ−００７８６、ＳＥＱＩＤ−００７８７、ＳＥＱＩＤ−００７８８、ＳＥＱＩＤ−００７８９、ＳＥＱＩＤ−００７９０、ＳＥＱＩＤ−００７９１、ＳＥＱＩＤ−００７９２、ＳＥＱＩＤ−００７９３、ＳＥＱＩＤ−００７９４、ＳＥＱＩＤ−００７９５、ＳＥＱＩＤ−００７９６、ＳＥＱＩＤ−００７９７、ＳＥＱＩＤ−００７９８、ＳＥＱＩＤ−００７９９、ＳＥＱＩＤ−００８０１、ＳＥＱＩＤ−００８０２、ＳＥＱＩＤ−００８０３、ＳＥＱＩＤ−００８０４、ＳＥＱＩＤ−００８０５、ＳＥＱＩＤ−００８０６、ＳＥＱＩＤ−００８０７、ＳＥＱＩＤ−００８０８、ＳＥＱＩＤ−００８０９、ＳＥＱＩＤ−００８１０、ＳＥＱＩＤ−００８１１、ＳＥＱＩＤ−００８１２、ＳＥＱＩＤ−００８１３、ＳＥＱＩＤ−００８１４、ＳＥＱＩＤ−００８１５、ＳＥＱＩＤ−００８１６、ＳＥＱＩＤ−００８１７、ＳＥＱＩＤ−００８１８、ＳＥＱＩＤ−００８１９、ＳＥＱＩＤ−００８２０、ＳＥＱＩＤ−００８２１、ＳＥＱＩＤ−００８２２、ＳＥＱＩＤ−００８２３、ＳＥＱＩＤ−００８２４、ＳＥＱＩＤ−００８２５、ＳＥＱＩＤ−００８２６、ＳＥＱＩＤ−００８２７、ＳＥＱＩＤ−００８２８、ＳＥＱＩＤ−００８２９、ＳＥＱＩＤ−００８３０、ＳＥＱＩＤ−００８３１、ＳＥＱＩＤ−００８３２、ＳＥＱＩＤ−００８３３、ＳＥＱＩＤ−００８３４、ＳＥＱＩＤ−００８３５、ＳＥＱＩＤ−００８３６、ＳＥＱＩＤ−００８３７が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの全細胞ライセートまたは細胞ライセートの可溶性分画のいずれかで検出された。
【０６２５】
以下の栄養性ポリペプチド：ＳＥＱＩＤ−００００３、ＳＥＱＩＤ−００００４、ＳＥＱＩＤ−００００５、ＳＥＱＩＤ−０００８７、ＳＥＱＩＤ−０００９９、ＳＥＱＩＤ−００１０２、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００１１５、ＳＥＱＩＤ−００２１８、ＳＥＱＩＤ−００２２０、ＳＥＱＩＤ−００２２３、ＳＥＱＩＤ−００２２６、ＳＥＱＩＤ−００２３６、ＳＥＱＩＤ−００２４０、ＳＥＱＩＤ−００２６７、ＳＥＱＩＤ−００２７１、ＳＥＱＩＤ−００２７６、ＳＥＱＩＤ−００２９７、ＳＥＱＩＤ−００２９８、ＳＥＱＩＤ−００２９９、ＳＥＱＩＤ−００３０２、ＳＥＱＩＤ−００３０３、ＳＥＱＩＤ−００３０４、ＳＥＱＩＤ−００３０５、ＳＥＱＩＤ−００３０６、ＳＥＱＩＤ−００３０７、ＳＥＱＩＤ−００３０９、ＳＥＱＩＤ−００３１８、ＳＥＱＩＤ−００３２２、ＳＥＱＩＤ−００３２５、ＳＥＱＩＤ−００３２６、ＳＥＱＩＤ−００３２７、ＳＥＱＩＤ−００３２８、ＳＥＱＩＤ−００３２９、ＳＥＱＩＤ−００３３０、ＳＥＱＩＤ−００３３２、ＳＥＱＩＤ−００３３５、ＳＥＱＩＤ−００３３６、ＳＥＱＩＤ−００３３７、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４０、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３４３、ＳＥＱＩＤ−００３４４、ＳＥＱＩＤ−００３４５、ＳＥＱＩＤ−００３４６、ＳＥＱＩＤ−００３４９、ＳＥＱＩＤ−００３５０、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３５３、ＳＥＱＩＤ−００３５４、ＳＥＱＩＤ−００３５５、ＳＥＱＩＤ−００３５６、ＳＥＱＩＤ−００３５７、ＳＥＱＩＤ−００３５８、ＳＥＱＩＤ−００３５９、ＳＥＱＩＤ−００３６０、ＳＥＱＩＤ−００３６１、ＳＥＱＩＤ−００３６２、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００３７４、ＳＥＱＩＤ−００３８９、ＳＥＱＩＤ−００３９８、ＳＥＱＩＤ−００４０３、ＳＥＱＩＤ−００４０４、ＳＥＱＩＤ−００４０５、ＳＥＱＩＤ−００４０７、ＳＥＱＩＤ−００４０９、ＳＥＱＩＤ−００４１５、ＳＥＱＩＤ−００４１６、ＳＥＱＩＤ−００４１７、ＳＥＱＩＤ−００４１８、ＳＥＱＩＤ−００４１９、ＳＥＱＩＤ−００４２０、ＳＥＱＩＤ−００４２１、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４８１、ＳＥＱＩＤ−００４８２、ＳＥＱＩＤ−００４８３、ＳＥＱＩＤ−００４８４、ＳＥＱＩＤ−００４８５、ＳＥＱＩＤ−００４８６、ＳＥＱＩＤ−００４８７、ＳＥＱＩＤ−００４８８、ＳＥＱＩＤ−００４８９、ＳＥＱＩＤ−００４９０、ＳＥＱＩＤ−００４９１、ＳＥＱＩＤ−００４９２、ＳＥＱＩＤ−００４９３、ＳＥＱＩＤ−００４９４、ＳＥＱＩＤ−００４９５、ＳＥＱＩＤ−００４９６、ＳＥＱＩＤ−００４９７、ＳＥＱＩＤ−００４９８、ＳＥＱＩＤ−００４９９、ＳＥＱＩＤ−００５００、ＳＥＱＩＤ−００５０１、ＳＥＱＩＤ−００５０２、ＳＥＱＩＤ−００５０３、ＳＥＱＩＤ−００５０４、ＳＥＱＩＤ−００５０５、ＳＥＱＩＤ−００５０６、ＳＥＱＩＤ−００５０７、ＳＥＱＩＤ−００５０８、ＳＥＱＩＤ−００５０９、ＳＥＱＩＤ−００５１０、ＳＥＱＩＤ−００５１１、ＳＥＱＩＤ−００５１２、ＳＥＱＩＤ−００５１３、ＳＥＱＩＤ−００５１４、ＳＥＱＩＤ−００５１５、ＳＥＱＩＤ−００５１６、ＳＥＱＩＤ−００５１７、ＳＥＱＩＤ−００５１８、ＳＥＱＩＤ−００５１９、ＳＥＱＩＤ−００５２０、ＳＥＱＩＤ−００５２１、ＳＥＱＩＤ−００５２２、ＳＥＱＩＤ−００５２３、ＳＥＱＩＤ−００５２４、ＳＥＱＩＤ−００５２５、ＳＥＱＩＤ−００５２６、ＳＥＱＩＤ−００５２７、ＳＥＱＩＤ−００５２８、ＳＥＱＩＤ−００５２９、ＳＥＱＩＤ−００５３０、ＳＥＱＩＤ−００５３１、ＳＥＱＩＤ−００５３２、ＳＥＱＩＤ−００５３３、ＳＥＱＩＤ−００５３４、ＳＥＱＩＤ−００５３５、ＳＥＱＩＤ−００５３６、ＳＥＱＩＤ−００５３７、ＳＥＱＩＤ−００５３８、ＳＥＱＩＤ−００５３９、ＳＥＱＩＤ−００５４０、ＳＥＱＩＤ−００５４１、ＳＥＱＩＤ−００５４２、ＳＥＱＩＤ−００５４３、ＳＥＱＩＤ−００５４４、ＳＥＱＩＤ−００５４５、ＳＥＱＩＤ−００５４６、ＳＥＱＩＤ−００５４７、ＳＥＱＩＤ−００５４８、ＳＥＱＩＤ−００５４９、ＳＥＱＩＤ−００５５０、ＳＥＱＩＤ−００５５１、ＳＥＱＩＤ−００５５２、ＳＥＱＩＤ−００５５３、ＳＥＱＩＤ−００５５４、ＳＥＱＩＤ−００５５５、ＳＥＱＩＤ−００５５６、ＳＥＱＩＤ−００５５７、ＳＥＱＩＤ−００５５８、ＳＥＱＩＤ−００５５９、ＳＥＱＩＤ−００５６０、ＳＥＱＩＤ−００５６１、ＳＥＱＩＤ−００５６２、ＳＥＱＩＤ−００５６３、ＳＥＱＩＤ−００５６４、ＳＥＱＩＤ−００５６５、ＳＥＱＩＤ−００５６６、ＳＥＱＩＤ−００５６７、ＳＥＱＩＤ−００５６８、ＳＥＱＩＤ−００５６９、ＳＥＱＩＤ−００５７０、ＳＥＱＩＤ−００５７１、ＳＥＱＩＤ−００５７２、ＳＥＱＩＤ−００５７３、ＳＥＱＩＤ−００５７４、ＳＥＱＩＤ−００５７５、ＳＥＱＩＤ−００５７６、ＳＥＱＩＤ−００５７７、ＳＥＱＩＤ−００５７８、ＳＥＱＩＤ−００５７９、ＳＥＱＩＤ−００５８０、ＳＥＱＩＤ−００５８１、ＳＥＱＩＤ−００５８２、ＳＥＱＩＤ−００５８３、ＳＥＱＩＤ−００５８４、ＳＥＱＩＤ−００５８５、ＳＥＱＩＤ−００５８６、ＳＥＱＩＤ−００５８７、ＳＥＱＩＤ−００５８８、ＳＥＱＩＤ−００５８９、ＳＥＱＩＤ−００５９０、ＳＥＱＩＤ−００５９１、ＳＥＱＩＤ−００５９２、ＳＥＱＩＤ−００５９３、ＳＥＱＩＤ−００５９４、ＳＥＱＩＤ−００５９５、ＳＥＱＩＤ−００５９６、ＳＥＱＩＤ−００５９７、ＳＥＱＩＤ−００５９８、ＳＥＱＩＤ−００５９９、ＳＥＱＩＤ−００６００、ＳＥＱＩＤ−００６０１、ＳＥＱＩＤ−００６０２、ＳＥＱＩＤ−００６０３、ＳＥＱＩＤ−００６０４、ＳＥＱＩＤ−００６０５、ＳＥＱＩＤ−００６０６、ＳＥＱＩＤ−００６０７、ＳＥＱＩＤ−００６０８、ＳＥＱＩＤ−００６０９、ＳＥＱＩＤ−００６１０、ＳＥＱＩＤ−００６１１、ＳＥＱＩＤ−００６１２、ＳＥＱＩＤ−００６１３、ＳＥＱＩＤ−００６１４、ＳＥＱＩＤ−００６１５、ＳＥＱＩＤ−００６１６、ＳＥＱＩＤ−００６１７、ＳＥＱＩＤ−００６１８、ＳＥＱＩＤ−００６１９、ＳＥＱＩＤ−００６２０、ＳＥＱＩＤ−００６２１、ＳＥＱＩＤ−００６２２、ＳＥＱＩＤ−００６２３、ＳＥＱＩＤ−００６２４、ＳＥＱＩＤ−００６２５、ＳＥＱＩＤ−００６２６、ＳＥＱＩＤ−００６２７、ＳＥＱＩＤ−００６２８、ＳＥＱＩＤ−００６２９、ＳＥＱＩＤ−００６３０、ＳＥＱＩＤ−００６３１、ＳＥＱＩＤ−００６３２、ＳＥＱＩＤ−００６３３、ＳＥＱＩＤ−００６３４、ＳＥＱＩＤ−００６３５、ＳＥＱＩＤ−００６３６、ＳＥＱＩＤ−００６３７、ＳＥＱＩＤ−００６３８、ＳＥＱＩＤ−００６３９、ＳＥＱＩＤ−００６４０、ＳＥＱＩＤ−００６４１、ＳＥＱＩＤ−００６４２、ＳＥＱＩＤ−００６４３、ＳＥＱＩＤ−００６４４、ＳＥＱＩＤ−００６４５、ＳＥＱＩＤ−００６４６、ＳＥＱＩＤ−００６４７、ＳＥＱＩＤ−００６４８、ＳＥＱＩＤ−００６５３、ＳＥＱＩＤ−００６５４、ＳＥＱＩＤ−００６５５、ＳＥＱＩＤ−００６５６、ＳＥＱＩＤ−００６５７、ＳＥＱＩＤ−００６５９、ＳＥＱＩＤ−００６６０、ＳＥＱＩＤ−００６６４、ＳＥＱＩＤ−００６６８、ＳＥＱＩＤ−００６７０、ＳＥＱＩＤ−００６７１、ＳＥＱＩＤ−００６７２、ＳＥＱＩＤ−００６７３、ＳＥＱＩＤ−００６７４、ＳＥＱＩＤ−００６７５、ＳＥＱＩＤ−００６７６、ＳＥＱＩＤ−００６７８、ＳＥＱＩＤ−００６７９、ＳＥＱＩＤ−００６８０、ＳＥＱＩＤ−００６８１、ＳＥＱＩＤ−００６８２、ＳＥＱＩＤ−００６９０、ＳＥＱＩＤ−００７１０、ＳＥＱＩＤ−００７１１、ＳＥＱＩＤ−００７１２、ＳＥＱＩＤ−００７１３、ＳＥＱＩＤ−００７１４、ＳＥＱＩＤ−００７１５、ＳＥＱＩＤ−００７１６、ＳＥＱＩＤ−００７１７、ＳＥＱＩＤ−００７１８、ＳＥＱＩＤ−００７１９、ＳＥＱＩＤ−００７２０、ＳＥＱＩＤ−００７２３、ＳＥＱＩＤ−００７２４、ＳＥＱＩＤ−００７２５、ＳＥＱＩＤ−００７２６、ＳＥＱＩＤ−００７２７、ＳＥＱＩＤ−００７２８、ＳＥＱＩＤ−００７２９、ＳＥＱＩＤ−００７３０、ＳＥＱＩＤ−００７３１、ＳＥＱＩＤ−００７３４、ＳＥＱＩＤ−００７３５、ＳＥＱＩＤ−００７３６、ＳＥＱＩＤ−００７３７、ＳＥＱＩＤ−００７３８、ＳＥＱＩＤ−００７３９、ＳＥＱＩＤ−００７４０、ＳＥＱＩＤ−００７４１、ＳＥＱＩＤ−００７４２、ＳＥＱＩＤ−００７４３、ＳＥＱＩＤ−００７４４、ＳＥＱＩＤ−００７４５、ＳＥＱＩＤ−００７４６、ＳＥＱＩＤ−００７４７、ＳＥＱＩＤ−００７４８、ＳＥＱＩＤ−００７４９、ＳＥＱＩＤ−００７５０、ＳＥＱＩＤ−００７５１、ＳＥＱＩＤ−００７５２、ＳＥＱＩＤ−００７５３、ＳＥＱＩＤ−００７５４、ＳＥＱＩＤ−００７５５、ＳＥＱＩＤ−００７５６、ＳＥＱＩＤ−００７５７、ＳＥＱＩＤ−００７５８、ＳＥＱＩＤ−００７５９、ＳＥＱＩＤ−００７６０、ＳＥＱＩＤ−００７６１、ＳＥＱＩＤ−００７６３、ＳＥＱＩＤ−００７６５、ＳＥＱＩＤ−００７６６、ＳＥＱＩＤ−００７６７、ＳＥＱＩＤ−００７６８、ＳＥＱＩＤ−００７６９、ＳＥＱＩＤ−００７７０、ＳＥＱＩＤ−００７７１、ＳＥＱＩＤ−００７７２、ＳＥＱＩＤ−００７７３、ＳＥＱＩＤ−００７７４、ＳＥＱＩＤ−００７７５、ＳＥＱＩＤ−００７７７、ＳＥＱＩＤ−００７７８、ＳＥＱＩＤ−００７８０、ＳＥＱＩＤ−００７８１、ＳＥＱＩＤ−００７８２、ＳＥＱＩＤ−００７８３、ＳＥＱＩＤ−００７８４、ＳＥＱＩＤ−００７８５、ＳＥＱＩＤ−００７８６、ＳＥＱＩＤ−００７８７、ＳＥＱＩＤ−００７８８、ＳＥＱＩＤ−００７８９、ＳＥＱＩＤ−００７９０、ＳＥＱＩＤ−００７９１、ＳＥＱＩＤ−００７９２、ＳＥＱＩＤ−００７９３、ＳＥＱＩＤ−００７９４、ＳＥＱＩＤ−００７９５、ＳＥＱＩＤ−００７９６、ＳＥＱＩＤ−００７９７、ＳＥＱＩＤ−００７９８、ＳＥＱＩＤ−００７９９、ＳＥＱＩＤ−００８００、ＳＥＱＩＤ−００８０１、ＳＥＱＩＤ−００８０２、ＳＥＱＩＤ−００８０３、ＳＥＱＩＤ−００８０４、ＳＥＱＩＤ−００８０５、ＳＥＱＩＤ−００８０６、ＳＥＱＩＤ−００８０７、ＳＥＱＩＤ−００８０８、ＳＥＱＩＤ−００８０９、ＳＥＱＩＤ−００８１０、ＳＥＱＩＤ−００８１１、ＳＥＱＩＤ−００８１２、ＳＥＱＩＤ−００８１３、ＳＥＱＩＤ−００８１４、ＳＥＱＩＤ−００８１５、ＳＥＱＩＤ−００８１６、ＳＥＱＩＤ−００８１７、ＳＥＱＩＤ−００８１８、ＳＥＱＩＤ−００８１９、ＳＥＱＩＤ−００８２０、ＳＥＱＩＤ−００８２１、ＳＥＱＩＤ−００８２２、ＳＥＱＩＤ−００８２３、ＳＥＱＩＤ−００８２４、ＳＥＱＩＤ−００８２５、ＳＥＱＩＤ−００８２６、ＳＥＱＩＤ−００８２７、ＳＥＱＩＤ−００８２８、ＳＥＱＩＤ−００８２９、ＳＥＱＩＤ−００８３０、ＳＥＱＩＤ−００８３１、ＳＥＱＩＤ−００８３２、ＳＥＱＩＤ−００８３３、ＳＥＱＩＤ−００８３４、ＳＥＱＩＤ−００８３５、ＳＥＱＩＤ−００８３６、ＳＥＱＩＤ−００８３７が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの細胞ライセートまたは分泌上清のいずれかで検出された。
【０６２６】
以下の栄養性ポリペプチド：ＳＥＱＩＤ−０００８７、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００１１２、ＳＥＱＩＤ−００１１５、ＳＥＱＩＤ−００２１８、ＳＥＱＩＤ−００２９８、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３５４、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００４０６、ＳＥＱＩＤ−００４０９、ＳＥＱＩＤ−００４１５、ＳＥＱＩＤ−００４１６、ＳＥＱＩＤ−００４１７、ＳＥＱＩＤ−００４１８、ＳＥＱＩＤ−００４１９、ＳＥＱＩＤ−００４２０、ＳＥＱＩＤ−００４２１、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００５５２、ＳＥＱＩＤ−００５５４が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの分泌上清から検出された。
【０６２７】
以下の栄養性ポリペプチド：ＳＥＱＩＤ−００００１、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２９８が、哺乳動物細胞株のチャイニーズハムスター卵巣Ｓ細胞株（ＣＨＯ−Ｓ）またはヒト胎児腎臓２９３Ｆ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現した。
【０６２８】
実施例１３：大腸菌の細菌での栄養性ポリペプチドの発現
栄養性ポリペプチド配列ライブラリーを、食用に適した種から作製し、スクリーニングして大腸菌での栄養性ポリペプチドの発現を実証した。
【０６２９】
遺伝子合成およびプラスミドの構築
すべての遺伝子を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｅｎｅＡｒｔまたはＤＮＡ２．０のいずれかにより合成して作製し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発現に関して最適化した。この遺伝子を、マルチクローニングサイトの中のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限部位（よって、アミノ末端ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨタグを含む）を使用してｐＥＴ１５ｂ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、またはＭＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨまたはＭＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨＳＥＮＬＹＦＱＧを含むアミノ末端タグを含むようにプライマーを使用してＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした（よってプラスミド上のアミノ末端タグを除去した）。ｐＥＴ１５ｂは、ｐＢＲ３２２複製開始点、ｌａｃ制御Ｔ７プロモーター、およびカルベニシリンへの耐性を与えるｂｌａ遺伝子を含む。手動でクローニングしたフラグメントでは、インサートを、Ｔ７プロモーターのプライマーおよびＴ７ターミネータープライマーの両方を使用してサンガーシークエンシングにより検証した。分泌構築物に関して、遺伝子を、Ｃ末端ＨＨＨＨＨＨＨＨタグおよびＮ末端のＤｓｂＡシグナルペプチド（ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＣＧ）と共にＴ５ターミネーターの上流でｐＪ４４４ベクター（ＤＮＡ  ２．０，  ＵＳＡ）にクローニングした。
【０６３０】
細胞株の構築
Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓのコンピテント大腸菌を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、親細胞株として使用した。Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓは、ＬａｃオペロンでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むが、ＬｏｎおよびＯｍｐＴプロテアーゼをなおも欠損している改変型ＢＬ２１誘導体である。Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓの遺伝子型は、ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２［ｄｃｍ］  Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）  ｅｎｄＡ１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０である。分泌構築物では、ＣＧＳＣ  ５６１０  （Ｙａｌｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ，  ＵＳＡ）を、試験に使用した。ＣＧＳＣ  ５６１０の遺伝子型は、Ｆ−、ｌａｃＹ１またはΔ（ｃｏｄ−ｌａｃＩ）６、ｇｌｎＶ４４（ＡＳ）、ｇａｌＫ２（Ｏｃ）、ｇａｌＴ２２、λ−、ｅ１４−、ｍｃｒＡ０、ｒｆｂＣ１、ｍｅｔＢ１、ｍｃｒＢ１、ｈｓｄＲ２である。上述したおおよそ１ｎｇの精製プラスミドＤＮＡを使用して化学的にコンピテントなＴ７Ｅｘｐｒｅｓｓを形質転換し、おおよそ１６時間、３７℃でインキュベーションした後、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレートで単一のコロニーを選択した。単一のコロニーを、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む液体ＬＢの中へ接種し、ＯＤ６００ｎｍ≒０．６の細胞密度まで生育させた。この時点でグリセロールを１０％（ｖ／Ｃ）で培地に補充し、−８０℃で凍結バイアル中で保存するため、アリコートを採取した。
【０６３１】
発現試験
発現培養物を、ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１０ｇ／ｌのトリプトン、および５ｇ／ｌの酵母抽出物）またはＢｉｏＳｉｌｔａ  ＥｎＢａｓｅ培地で生育させ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ＬＢ培地での発現試験では、コロニーまたはグリセロール保存液からの穿刺を、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンで補充したＬＢ３ｍｌに播種し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩（おおよそ１６時間）生育させた。翌日の朝、細胞の密度（ＯＤ６００ｎｍで分光光度的に）を測定し、カルベニシリンを補充したＬＢ培地３ｍｌにＯＤ６００ｎｍ＝０．０５となるように希釈し、３７℃および２５０ｒｐｍで生育させた。ＯＤ６００ｎｍ≒０．８±０．２で、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。異種性発現を、３７℃および２５０ｒｐｍで２時間進行させ、この時点で培養を終了させた。最終的な細胞密度を測定した。Ｅｎｂａｓｅ培地での発現では、コロニーまたはグリセロール保存液からの穿刺を、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＬＢ３ｍｌに接種し、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび６００ｍＵ／ｌのグルコアミラーゼを含むＥｎｂａｓｅ培地にＯＤ６００＝０．１で移し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩生育させ、翌日１ｍＭのＩＰＴＧで誘導させた。異種性発現を、３７℃および２５０ｒｐｍで２４時間行い、この時点で培養を終了させた。最終的な細胞密度を測定し、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。細胞内の産生を決定するために、細胞を、製造社のプロトコルに従ってＢ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解させ、次いで、関心対象タンパク質（ＰＯＩ）を測定するためにアッセイした。分泌タンパク質のレベルを決定するために、培養上清の０〜５ｍｌのアリコートを、０．２２μｍのフィルターにより濾過した。次いで、濾液を、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定するためにアッセイした。
【０６３２】
発酵
細胞内の可溶性タンパク質：ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２４０、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００４２３、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４２５、ＳＥＱＩＤ−００４２６、ＳＥＱＩＤ−００４２９、ＳＥＱＩＤ−００５５９、およびＳＥＱＩＤ−００５８７を、２０および／または２５０Ｌの発酵物中の大腸菌宿主細胞ＮＥＢ  Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で発現させた。酵母抽出物、ダイズの加水分解物、グリセロール、グルコース、およびラクトースを含む、炭素および窒素を多く含む培地で発酵を行った。発酵を３０℃で行い、培地に存在するグルコースが消費され、ラクトースが、一時的な炭素供給糖となった際に、誘導を行った。発酵工程の時間は、一般的に２４〜２６時間持続した。発酵作動パラメータを、ｐＨ６．９、３０℃の温度、および３５％のパーセント溶解酸素で制御した。この培養物に、培養期間の後の段階でグリセロールベースの供給物質を補充した。細胞が定常期に入り、３５％の設定点を維持するために酸素の供給をもはや必要としなくなった際に収集を行った。
【０６３３】
栄養性ポリペプチドライブラリー遺伝子の合成およびプラスミドの構築
１６８個の異なる食用に適した種のポリペプチド配列をコードする遺伝子を、直線状のフラグメントとして作製し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現させるためにコドンを選択した。場合によっては単一の直線状のフラグメントは、隣接する５’ＮｄｅＩ制限部位および３’ＢａｍＨＩ制限部位を有する２つ以上の別々のポリペプチド配列をコードする２つ以上の核酸配列を含むものであった。すべての直線状のフラグメントを、等モル濃度で混合した。直線状のフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、消化した混合物を、ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨを含むアミノ末端タグおよびＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限部位を含むようにプライマーを使用してｐＥＴ１５ｂ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ｐＥＴ１５ｂは、ｐＢＲ３２２複製開始点、ｌａｃ制御Ｔ７プロモーター、およびカルベニシリンに抵抗性を提供するｂｌａ遺伝子を含む。クローン化したフラグメントでは、インサート
を、Ｔ７プロモータープライマーおよびＴ７ターミネータープライマーの両方を使用してサンガーシークエンシングにより検証した。
【０６３４】
栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーの細胞株の構築
Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓコンピテント大腸菌（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、親細胞株として使用した。Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓは、ｌａｃオペロンでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むが、ＬｏｎおよびＯｍｐＴプロテアーゼを欠損している改変ＢＬ２１誘導体である。Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓの遺伝子型は、ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１  ［ｌｏｎ］  ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２  ［ｄｃｍ］  Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）  ｅｎｄＡ１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０である。分泌構築物では、ＣＧＳＣ  ５６１０（Ｙａｌｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ，  ＵＳＡ）を使用した。ＣＧＳＣ  ５６１０の遺伝子型は、Ｆ−，  ｌａｃＹ１  ｏｒ  Δ（ｃｏｄ−ｌａｃＩ）  ６，    ｇｌｎＶ４４（ＡＳ），  ｇａｌＫ２（Ｏｃ），  ｇａｌＴ２２，  λ−，  ｅ１４−，  ｍｃｒＡ０，  ｒｆｂＣ１，  ｍｅｔＢ１，  ｍｃｒＢ１，  ｈｓｄＲ２である。おおよそ１０ｎｇのライゲートしたＤＮＡ混合物により、化学的にコンピテントなＴ７Ｅｘｐｒｅｓｓを形質転換し、単一のコロニーを、３７℃でおおよそ１６時間インキュベートした後に、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。複数の形質転換を行い、おおよそ１０００個のコロニーを、共にプールして、ＬＢ培地に懸濁した。作製したライブラリーの多様性を決定するために、５０〜１００個のコロニー由来のＤＮＡをシークエンシングした。
【０６３５】
栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーの発現試験
ＬＢ培地で再度懸濁したコロニー混合物を、まず、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１０ｇ／ｌのトリプトン、および５ｇ／ｌの酵母抽出物）３ｍｌで生育させ、次いで、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび６００ｍＵ／ｌのグルコアミラーゼを含む、ＢｉｏＳｉｌｔａ  Ｅｎｂａｓｅ培地にＯＤ６００＝０．１となるように移して、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩生育させ、翌日に１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。異種性発現を、３７℃および２５０ｒｐｍで２４時間行い、この時点で培養を終了させた。最終的な細胞密度を測定し、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。細胞内の産生を決定するために、細胞を、マイクロフルイダイザーを使用して溶解し、可溶性分画を、製造社のプロトコルに従って５ｍｌのニッケルアフィニティカラムで精製し、次いで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してアッセイして、以下に記載されるように発現したタンパク質を同定した。１６８個中１１４個の異なるタンパク質が、ＭＳスペクトルカウントに基づき大腸菌で首尾よく可溶性に発現した。この結果に基づき、特定の遺伝子を、個々にクローン化し、大腸菌での細胞内の可溶性発現に関して試験した。
【０６３６】
大腸菌細胞株のバックグラウンドで発現した真菌栄養性ポリペプチド
４つの細胞株：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ製のＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７、およびＳｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ；およびＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）を、真菌栄養性ポリペプチドを発現させるために使用した。
【０６３７】
Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓは、ｌａｃオペロンでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含むが、ＬｏｎおよびＯｍｐＴプロテアーゼを欠損している改変ＢＬ２１誘導体である。Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓの遺伝子型は、ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１  ［ｌｏｎ］  ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２  ［ｄｃｍ］  Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）  ｅｎｄＡ１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０である。
【０６３８】
Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７は、細胞質のジスルフィド結合の形成を促進し、Ｔ７  ＲＮＡＰの染色体コピーを発現するＫ１２誘導体細胞株である。Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７の遺伝子型は、Ｆ’  ｌａｃ，  ｐｒｏ，  ｌａｃＩＱ  ／  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ａｒａＤ１３９  ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１  Δ（ｐｈｏＡ）ＰｖｕＩＩ  ｐｈｏＲ  ａｈｐＣ＊  ｇａｌＥ  （ｏｒ  Ｕ）  ｇａｌＫ  λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３−ｒ１−ｃＤｓｂＣ  （ＳｐｅｃＲ，  ｌａｃＩｑ）  ΔｔｒｘＢ  ｒｐｓＬ１５０（ＳｔｒＲ）  Δｇｏｒ  Δ（ｍａｌＦ）３である。
【０６３９】
Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓは、細胞質のジスルフィド結合の形成を促進し、Ｔ７ＲＮＡＰの染色体コピーを発現するＢＬ２１誘導体細胞株である。Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓの遺伝子型は、ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１  ［ｌｏｎ］  ｏｍｐＴ  ａｈｐＣ  ｇａｌ  λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３−ｒ１−ｃＤｓｂＣ  （ＳｐｅｃＲ，  ｌａｃＩｑ）  ΔｔｒｘＢ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２  ［ｄｃｍ］  Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０  −−ＴｅｔＳ）  ｅｎｄＡ１  Δｇｏｒ  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０である。
【０６４０】
Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、細胞質でのジスルフィド結合の形成を促進するｔｒｘＢおよびｇｏｒに変異を含むＢＬ２１誘導体である。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）の遺伝子型は、Ｆ−  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｌａｃＹ１  ａｈｐＣ  （ＤＥ３）  ｇｏｒ５２２：：  Ｔｎ１０  ｔｒｘＢ  （ＫａｎＲ，  ＴｅｔＲ）である。
【０６４１】
これらの細胞株の発現のスクリーニングを、大腸菌に関して記載されるように完了した。
【０６４２】
実施例１４：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細菌での栄養性ポリペプチドの発現
遺伝子の合成およびプラスミドの構築
関心対象タンパク質（ＰＯＩ）をコードするすべての遺伝子を、ＰＣＲによりクローニングした。これらの遺伝子のＰＣＲ増幅のテンプレートは、大腸菌での発現のために作製した合成遺伝子（上記参照）、または供給生物（たとえばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のゲノムＤＮＡのいずれかであった。合成遺伝子は、大腸菌での発現のためにコドンを最適化した。遺伝子のすべてを、終止コドンの直前の３’末端にインフレームで融合した１Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ａ．ａ．＝ＤＹＫＤＤＤＫ）をコードする配列と共にクローニングした。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでの発現では、遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）およびクローニング宿主大腸菌Ｔｕｒｂｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、製造社の指示に従ってＭｏＢｉＴｅｃ（ドイツゲッティンゲン）発現ベクターｐＨＴ４３にクローニングした。遺伝子を、分泌発現構築物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のαアミラーゼシグナルペプチド（ＳａｍｙＱ）をコードするＤＮＡとインフレームで融合した遺伝子）として、または細胞内発現構築物（リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）のすぐ下流に挿入し、ＳａｍｙＱ配列を除去した遺伝子）のいずれかとしてｐＨＴ４３にクローニングした。大腸菌を形質転換した後、組み換えプラスミドを含む細胞を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｃｂ１００）を含むＬＢ寒天プレートで選択した。組み換えプラスミドを、大腸菌から単離し、このＤＮＡ配列を、サンガーシークエンシングにより検証した後、このＤＮＡ配列によりＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現宿主を形質転換した。
【０６４３】
細胞株の構築
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株ＷＢ８００Ｎを、ＭｏＢｉＴｅｃ（ドイツゲッティンゲン）から購入し、発現宿主として使用した。ＷＢ８００Ｎは、良好に試験された細胞株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８）の誘導体であり、８つの細胞外プロテアーゼ（ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ、およびｗｐｒＡ）をコードする遺伝子の欠失により分泌タンパク質のタンパク質分解を低減するよう改変されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉの形質転換を、製造社の指示に従って実施した。おおよそ１μｇの各発現構築物により、ＷＢ８００Ｎを形質転換し、単一のコロニーを、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天にプレーティングすることにより、３７℃で選択した。個々の形質転換体を、対数期に達するまでＣｍ５を含むＬＢブロスで生育させた。これら培養物のアリコートをグリセロール（最終濃度２０％）と混合し、−８０℃で保存した。
【０６４４】
発現試験
凍結したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現細胞株のグリセロール保存液を使用して、Ｃｍ５を含む２×ＭＡＬ培地 （２０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、および１０ｇ／ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ｌのマルトース）１ｍｌを、ディープウェルブロック（四角の９６ウェル）に接種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、マイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で、３７℃および８８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩の培養物を使用して、新鮮な２×ＭＡＬ、Ｃｍ５培養物を、ディープウェルブロックに、開始ＯＤ６００＝０．１となるよう接種した。これらの発現培養物を、ＯＤ６００＝１．０となるまで（約４時間）３７℃、８８０ｒｐｍでインキュベートし、この時点で、イソプロピルβ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、０．１Ｍの最終濃度で添加して、４時間インキュベートし続けることにより誘導した。４時間後、各培養物の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。遠心沈降後、培養物の上清を注意深く除去し、新規のブロックに移し、細胞のペレットを−８０℃で凍結した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、培養物の上清の０．５ｍｌのアリコートを、まず０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次にこの濾過物をアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。
【０６４５】
細胞内で産生されたＰＯＩのレベルを決定するために、凍結した細胞ペレットを解凍し、０．１ｍｍのジルコニウムビーズ０．５ｇを各試料に添加し、次に、０．５ｍｌのＰＢＳを添加した。細胞を、９６ウェルプレートのアダプターを備えたＱｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ， ドイツヒルデン）での５分間のｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇにより氷冷した室内（４℃）で溶解した。細胞のライセートを、３０００ｒｐｍで１０分間遠心沈降し、上清を除去し、以下に記載されるようにＰＯＩ濃度に関して解析した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、培養上清の０．５ｍｌのアリコートを、０．２２μｍのフィルターにより濾過した。次にこの濾液をアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。
【０６４６】
振盪フラスコでの発現
単一のコロニーを、各ＳＥＱＩＤの寒天プレートから採取し、２×Ｍａｌ培地５ｍｌに接種した。これらの浸透フラスコ接種物を、３０℃の振盪インキュベーターで一晩生育させた。一晩の培養物５ｍｌを使用して、２×Ｍａｌ  ２５０ｍｌを接種した。培養物を３０℃で４時間生育させ、次に、３０℃で４時間誘導した。培養物を、遠心沈降により収集した。各ＳＥＱＩＤの遠心分離した上清を、滅菌濾過し、−８０℃で凍結した。
【０６４７】
発酵発現
ＳＥＱＩＤ−００１０５の可溶性タンパク質は、エピソームのまたは組み込み型のプラスミドを含む改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株から分泌されている。発酵は、ファイトンペプトン、酵母抽出物、およびグルコースを含む炭素および窒素を多く含む培地中４Ｌの容量で行った。発酵培養物を、ｐＨ７．０、３０℃、および４０％のパーセント溶解酸素で、生育させた。ＩＰＴＧの添加による誘導を、５．０（±１．０）のＯＤ６００ｎｍで行った。誘導後に、培養物にグルコースベースの供給物質を補充した。培養物を、誘導から５〜８時間後に収集した。次にバイオマスを、遠心分離により除去し、上清を、濾過を通して浄化し、処理まで４℃で保存した。
【０６４８】
栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーの遺伝子の合成およびプラスミドの構築
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発現では、使用したベクターは、シグナルペプチドがなく、ｇｒａｃプロモーターがａｐｒプロモーターに置換され、ｌａｃＩ発現カセットが除去されたｐＨＴ４３骨格ベクター（ＭｏＢｉＴｅｃ  ドイツゲッティンゲン）に由来した。上記で同定した１６８個の異なるタンパク質配列をコードする１６８個の遺伝子を、直線状のフラグメントとしてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｅｎｅＡｒｔにより合成して作製し、大腸菌での発現のため選択した。多くの場合、２つの遺伝子を、隣接する５’ＮｄｅＩ制限部位および３’ＢａｍＨＩ制限部位を有する単一の直線状フラグメントにまとめて合成した。すべての直線状のフラグメントを、等モル濃度でともに混合した。次に、直線状のフラグメント混合物を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化した混合物を、分泌発現構築物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のリパーゼシグナルペプチド（ＬｉｐＡｓｐ）をコードするＤＮＡとインフレームで融合した遺伝子）として、または細胞内発現構築物（ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＨを含むＮ末端タグを含む、または含まない、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）のすぐ下流に挿入した遺伝子）のいずれかとしてベクターにクローニングした。遺伝子のライブラリーを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用してベクターＰＣＲ産物にライゲートした。ライゲーション産物により、クローニング宿主のＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｒｂｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造社の指示に従って形質転換した。５０〜１００個のコロニーをシークエンシングしてリーダーペプチドライブラリーの多様性を判定した。次に、寒天プレート上のコロニーをＬＢ培地に懸濁し、プラスミド精製のために収集した。
【０６４９】
栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーの細胞株の構築
ＷＢ８００Ｎは、十分に研究された細胞株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８）の誘導体であり、８つの細胞外プロテアーゼ（ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ、およびｗｐｒＡ）をコードする遺伝子の欠失により、分泌タンパク質のタンパク質分解を低減するよう改変されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ株ＷＢ８００Ｎは、ＭｏＢｉＴｅｃ（ドイツゲッティンゲン）から購入し、以下の変異ＷＢ８００Ｎ：ｐＸｙｌＡ−ｃｏｍＫ：：Ｅｒｍ、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）、ΔｓｉｇＦを有するように改変した。この新規の細胞株を、発現宿主として使用した。大腸菌から精製したプラスミド混合物おおよそ１μｇにより、発現細胞株を形質転換した。形質転換後、培養物１００μｌを、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む４枚のＬＢ１．５％寒天プレート上で平板培養し、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベートした後、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２ｍＬを、数千個の形質転換体を含む各プレートの表面に添加し、細胞を、細胞スプレッダーで剥がして混合することにより表面培地に懸濁した。４つの反復実験からの懸濁細胞をプールして、発現実験用の接種前培養物を形成した。
【０６５０】
１６８個の栄養性ポリペプチドの発現試験
再懸濁した細胞から作製した接種前培養物のＯＤ６００を、プレートリーダーを使用して測定したところ、おおよそ２０〜２５であった。５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む２×Ｍａｌ培地（２０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ＬのＤ−マルトース）５０ｍＬを含む５００ｍＬのバッフル付き振盪フラスコを、ＯＤ６００≒０．２となるように接種し、接種培養物を形成させ、振盪させながら、３０℃、２５０ｒｐｍでおおよそ６時間インキュベートした。ＯＤ６００を測定し、接種培養物を使用して、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１Ｘ  Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌｓ、および０．０１％の消泡剤２０４を伴う２×Ｍａｌ培地２５０ｍｌを含む２Ｌのバッフル付振盪フラスコで発現培養物を、ＯＤ６００が０．１となるように接種した。培養物を、３０℃および２５０ｒｐｍで１８時間振盪し、この時点で培養物を収集した。分泌タンパク質ライブラリーの構築物に関して、最終的な細胞密度を測定し、上清を、遠心分離（５０００×ｇ、３０分、室温）により収集し、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過した。細胞内タンパク質ライブラリー構築物では、最終的な細胞密度を測定し、細胞を、遠心沈降（５０００×ｇ、３０分、室温）により収集した。次に、細胞を、マイクロフルイダイザーを使用して溶解し、構築物ライブラリーがＮ末端Ｈｉｓタグを有する場合、ニッケルアフィニティカラムを使用して可溶性分画を精製した。それ以外では、可溶性分画をさらなる解析のために使用した。すべての試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの中で泳動させ、１０個の分画に分離し、次に、以下に記載するように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して解析した。１６８個中４０個のタンパク質が首尾よく分泌され、１６８個中１０個のタンパク質が、Ｈｉｓタグを用いることなく細胞内で首尾よく産生され、１６８個中２８個のタンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓで５’８ＸＨＩＳタグを伴い細胞内で首尾よく産生された。この結果に基づき、特定の遺伝子を個々にクローニングし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの個々の分泌に関して試験した。
【０６５１】
分泌型栄養性ポリペプチドのプラスミド構築
この試験では、シグナルペプチドを含まないｐＨＴ４３骨格ベクターを、天然のシグナルペプチドの分泌を誘導するＳａｍｙＱシグナルペプチドを除去し、ｇｒａｃプロモーターをａｐｒＥプロモーターに置換し、ｌａｃＩ領域を除去し、かつターミネーター領域の前に１ｘＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を添加することにより改変した。ＭｏＢｉＴｅｃ製の非改変ｐＨＴ４３ベクターは、Ｐｇｒａｃプロモーター、ＳａｍｙＱシグナルペプチド、ＡｍｐおよびＣｍ耐性遺伝子、ｌａｃＩ領域、ｒｅｐＡ領域、およびＣｏｌＥ１複製開始点を含む。関心対象遺伝子を増幅させるために、ゲノムＤＮＡ調製物を、野生型バチルス株から作製した。天然のシグナルペプチドコード領域を含む分泌型栄養性ポリペプチド遺伝子を、ＰＨＴ４３骨格に対して２５ｂｐの相同性領域を含むテールを有するＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅させ、１％のアガロースＴＡＥゲル中で泳動させ、インサートの大きさが正確かどうかを確認した。各ＰＣＲからの１０μＬを単一のインサートライブラリーにプールして、混合物を、ｐＨＴ４３骨格ベクターにギブソンアセンブリによりライゲートした。ライゲーションにより、１０−βエレクトロコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換し、形質転換した細胞を、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む４枚のＬＢ寒天プレート上に１０倍希釈で平板培養した。１枚のプレートを、プロモーター領域に結合するフォワードプライマーおよびターミネーター領域に結合するリバースプライマーを使用してシークエンシングした。１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地２ｍｌを、残りの３枚のプレートに添加した。細胞を採取し、ＬＢ培地に懸濁し、プラスミドを細胞懸濁物から抽出して、発現細胞株を形質転換するマルチプレックスプラスミド混合物を形成した。分泌型ポリペプチドライブラリーの細胞株の構築および発現を、栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーの細胞株の構築および発現試験と同様に行った。
【０６５２】
分泌リーダーペプチドライブラリーの構築
分泌シグナルペプチドライブラリーは、任意の所定の関心対象タンパク質の分泌を促進させる。分泌を高める１つの手法として、関心対象タンパク質にシグナルペプチド配列のライブラリーを融合させ、最も高いレベルの分泌をもたらすものをスクリーニングすることである。本明細書中に記載されるシグナルペプチドライブラリーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの天然のＳｅｃ媒介分泌型タンパク質に関連していると同定された１７３個のシグナルペプチドからなる（Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６）。Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ（ＳａｍｙＱ）由来のシグナルペプチドと融合したＳＥＱＩＤ−４３１３６を有するプラスミドｐＥＳ１２０７から開始して、ＳＥＱＩＤ−４３１３６に関するシグナルペプチドライブラリーを作製した。ｐＥＳ１２０７を、ＳａｍｙＱ配列を除くプラスミド全体を増幅するプライマーのＰｆｗｄおよびＰｒｅｖを用いるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＰｆｗｄおよびＰｒｅｖは、ＡａｒＩ制限部位を有するテールを有しており、ＰＣＲ産物を精製し、ＡａｒＩで切断した。次に、フラグメントを、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して脱リン酸化した。個々のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、各シグナルペプチドのフォワード鎖およびリバース鎖を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドを二重にすることにより構築した。一本鎖のテールが、二重鎖分子の５’末端で形成されるようにオリゴヌクレオチドを設計した。これらは、ベクターＰＣＲフラグメントのＡａｒＩ消化により生成されたオーバーハングと相補的である。オリゴヌクレオチドを二重にするために、配向鎖およびリバース鎖のオリゴヌクレオチドをまとめて混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用してリン酸化し、アニーリングした。アニーリング後、シグナルペプチドＤＮＡ配列を１本の試験管に等しい比率で混合した。シグナルペプチドのライブラリーを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用してベクターＰＣＲ産物にライゲートした。ライゲーション産物により、製造社の指示に従って、クローニング宿主のＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｒｂｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換した。５０〜１００個のコロニーをシークエンシングしてＳＥＱＩＤ−００２９８およびＳＥＱＩＤ−００３３８のリーダーペプチドライブラリーの多様性を決定した。次に、寒天プレート上のコロニーを、ＬＢ培地に懸濁し、プラスミド精製のために収集した。
【０６５３】
分泌リーダーペプチドライブラリーの細胞株の構築
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株  ＷＢ８００Ｎ（ＭｏＢｉＴｅｃ、ドイツゲッティンゲン）を、発現宿主として使用した。特定のタンパク質の構築物のシグナルペプチドライブラリーのおよそ１０μｇにより、ＷＢ８００Ｎを形質転換し、単一のコロニーを、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天上で平板培養することにより３７℃で選択した。ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００１０３に関するリーダーペプチドライブラリーのスクリーニングを、ｓｉｇＦ胞子形成因子に変異を有するように改変されており、細胞内セリンプロテアーゼ（ｉｓｐＡ）も抗生物質マーカーで破壊されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＢ８００Ｎで行った、。またこの細胞株は、形質転換効率をより高めるために、染色体に組み込まれる誘導性ｃｏｍＫ（コンピテンスイニシエーション転写因子）を有していた。
【０６５４】
分泌リーダーペプチドライブラリー発現のスクリーニング
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのシグナルペプチドライブラリーの４００〜５００個の個々の形質転換体を使用して、Ｃｍ５を含む２×Ｍａｌ培地（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、および１０ｇ／ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ｌのマルトース）の１ｍｌの培養物を、ディープウェルブロック（９６平方ウェル）を個々に接種した。シグナルペプチドライブラリーの細胞株に加えて、関心対象タンパク質およびＳａｍｙＱリーダーペプチドを有するプラスミドを含む細胞株を、対照として接種した。培養ブロックを多孔性の接着プレートシールで被覆し、３７℃および８００ｒｐｍのマイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で一晩インキュベートした。一晩培養物を使用して、新鮮な２×Ｍａｌ、Ｃｍ５培養物をディープウェルブロックに、開始密度ＯＤ６００＝０．１５で播種した。
【０６５５】
発現培養物を、ＯＤ６００＝１．０（約４時間）となるまで３７℃、８８０ｒｐｍでインキュベートし、この時点で、イソプロピルβ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で添加し、４時間インキュベーションを継続することにより誘導した。４時間後、各培養物の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。遠心後、培養の上清を注意深く除去し、新規のブロックに移し、細胞のペレットを−８０℃で凍結した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、培養物の上清の０．５ｍｌのアリコートを、まず０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次に濾液を本明細書中に記載されるようにチップ電気泳動によりアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定し、基本構築物の分泌レベルと比較した。
【０６５６】
希釈した一晩培養物を、Ｃｍ５を含むＬＢブロス培養物の接種物として使用した。これらの培養物を、対数期に達するまで３７Ｃで生育させた。これらの培養物のアリコートを、グリセロール（最終濃度２０％）と混合し、−８０℃で凍結した。トップ１０〜１５のヒットを、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）を使用して精製し、シグナルペプチド周辺を増幅し、シークエンシングのために送り、シグナルペプチド配列を同定した。
【表９６】
2016537402.tif 000107
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2016537402.tif 000109
【０６５７】
実施例１５：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ真菌での栄養性ポリペプチドの発現
遺伝子の合成およびプラスミドの構築
天然に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノム配列から設計したプライマーを使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６４９７４からＰＣＲ増幅した。一例では、遺伝子は、天然の５’分泌配列を含み、Ｃ末端３Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターの制御の下で、遺伝子を直接発現ベクターｐＡＮ５６−１（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｚ３２７００．１）にクローニングした。別の例では、遺伝子は、異種性５’分泌シグナルを付加した成熟ペプチドのみを含んだ。プラスミドを、ギブソンアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して構築した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主の形質転換を行った。
【０６５８】
ｐＦＧＬＡＨＩＬ６Ｔを、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｇｈｅｎｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。プラスミドを、ギブソンアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して構築した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主の形質転換を行った。
【０６５９】
ｐｙｒＡ栄養性マーカーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  １０１５のゲノム配列から設計したプライマーを使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６４９７４からＰＣＲ増幅した。ｐｙｒＡ  ＰＣＲフラグメントを、ＸｂａＩによって消化し、ｐＣＳＮ４４のＸｂａＩフラグメントにライゲートして（Ｓｔａｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）ｐＥＳ１９４７を構築した。ｐＣＳＮ４４を、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｇｈｅｎｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主の形質転換を行った。
【０６６０】
細胞株の構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６２５９０のプロテアーゼ欠損派生株を、発現宿主として使用した。発現ベクターにより、Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，  ４４７−４５７に記載されるプロトプラスト法を使用してｐＥＳ１９４７を同時に形質転換した。各プラスミド約５μｇにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのプロトプラストを形質転換した。形質転換体は、１．２Ｍのソルビトールおよび１．５％のｂａｃｔｏａｇａｒ（１０ｇ／ｌのグルコース、４ｇ／ｌの硝酸ナトリウム、２０ｍｌ／ｌの塩溶液（２６．２ｇ／ｌの塩化カリウム、および７４．８ｇ／ｌのリン酸カリウム（一塩基性）（ｐＨ５．５））、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液（１００ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、１５０ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、７５０ｍｇ／ｌの４‐アミノ安息香酸、２．５ｇ／ｌのニコチン酸、２．５ｇ／ｌのリボフラビン、２０ｇ／ｌの塩化コリン、および３０ｍｇ／ｌのビオチン）、および１ｍｇ／ｌの金属溶液（２０ｇ／ｌの硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１１ｇ／ｌのホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、５ｇ／ｌの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ）、５ｇ／ｌの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１．７ｇ／ｌの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）、１．６ｇ／ｌの硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ）、１．５ｇ／ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物（ＮａＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ）、および５．０ｇ／ｌのＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ−２Ｈ２Ｏ）（ｐＨ６．５）を含む）を補充した最小培地で選択した。個々の形質転換体を最小培地プレート上で単離し、胞子形成するまで３０Ｃで生育させた。胞子を、水中で収集し、４Ｃで保存した。
【０６６１】
発現試験
２４ウェル角底ディープウェルブロックにおいて、４０ｍＭのＭＥＳおよびＳｉｇｍａＦａｓｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（１  ｔａｂ／１００ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でｐＨ７に調節したＣＭ（ＮＭ＋５．０ｇ／ｌの酵母抽出物、２．０ｇ／ｌのカザミノ酸）２ｍｌに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株の奉仕保存液を、１０６胞子／ｍＬで播種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、３０℃、６００ｒｐｍのマイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で４８時間インキュベートした。生育期間の後、培養物上清の０．５ｍｌのアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段フィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次に濾液をアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。
【表９７】
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【０６６２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒシグナルペプチドライブラリーの構築
どの分泌シグナルペプチドが、任意の所定の関心対象タンパク質の分泌を最善に促進するかを予測するのは困難である。よって、分泌を最適化する１つの手法は、タンパク質にシグナルペプチド配列のライブラリーを融合し、最も高い分泌レベルをもたらすものをスクリーニングすることである。本出願人は、ＳＥＱＩＤ−００４０９およびＳＥＱＩＤ−００４２０のシグナルペプチドライブラリーを構築した。表Ｅ１５Ａは、ＳＥＱＩＤ−００４０９およびＳＥＱＩＤ−００４２０と融合したシグナルペプチドを示す。個々のシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、各シグナルペプチド配列のフォワード鎖およびリバース鎖を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドを二重にすることにより構築した。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖のテールが二重鎖分子の５’末端に形成されるように設計した。天然に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子のＳＥＱＩＤ−００４０９およびＳＥＱＩＤ−００４２０を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノム配列から設計したプライマーを使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６４９７４からＰＣＲ増幅した。遺伝子は、天然の５’分泌配列を含み、Ｃ−末端の３Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｇｐｄＡプロモーターの制御下で、発現ベクターｐＡＮ５６−１（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｚ３２７００．１）に直接クローニングした。次にベクターを、天然のシグナルペプチドを用いることなく増幅し、異なるシグナルペプチドを含むプラスミドを、ギブソンアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して二重鎖シグナルペプチド配列によって再構築した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの宿主の形質転換を行った。
【０６６３】
ｐｙｒＡ栄養性マーカーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  １０１５のゲノム配列から設計したプライマーを使用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６４９７４からＰＣＲ増幅した。ｐｙｒＡ  ＰＣＲフラグメントを、ＸｂａＩで消化し、ｐＣＳＮ４４のＸｂａＩフラグメントにライゲートして（Ｓｔａｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）ｐＥＳ１９４７を構築した。ｐＣＳＮ４４を、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｇｈｅｎｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主の形質転換を行った。
【０６６４】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのシグナルペプチドライブラリー細胞株の構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ６２５９０のプロテアーゼ欠損派生株を、発現宿主として使用した。各シグナルペプチド−遺伝子の組み合わせのベクターを、Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２に記載されるプロトプラスト法を使用して栄養性マーカーｐｙｒＧを含むプラスミドと同時形質転換した。各プラスミド約５μｇにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒプロトプラストを形質転換した。形質転換体を、１．２Ｍのソルビトールおよび１．５％のｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（１０ｇ／ｌのグルコース、４ｇ／ｌの硝酸ナトリウム、２０ｍｌ／ｌの塩溶液（２６．２ｇ／ｌの塩化カリウムおよび７４．８ｇ／ｌのリン酸カリウム（一塩基性）（ｐＨ５．５））、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液（１００ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、１５０ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、７５０ｍｇ／ｌの４‐アミノ安息香酸、２．５ｇ／ｌのニコチン酸、２．５ｇ／ｌのリボフラビン、２０ｇ／ｌの塩化コリン、および３０ｍｇ／ｌのビオチンを含む）、および１ｍｌ／ｌの金属溶液（２０ｇ／ｌの硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１１ｇ／ｌのホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、５ｇ／ｌの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ）、５ｇ／ｌの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１．７ｇ／ｌの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）、１．６ｇ／ｌの硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ）、１．５ｇ／ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物（ＮａＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ）、および５．０ｇ／ｌのＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ−２Ｈ２Ｏ）（ｐＨ６．５）を含む）を補充した最小培地で選択した。個々の形質転換体を最小培地のプレート上で単離し、胞子を形成するまで３０Ｃで生育させた。
【０６６５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのシグナルペプチドライブラリーの発現試験
各構築物から、６つの異なる一次形質転換体を、９６ディープウェル培養ブロック中に１６０ｍＭのＭＥＳでｐＨ７に調節した、５．０ｇ／ｌの酵母抽出物、２．０ｇ／ｌのカザミノ酸を補充した上記に定義した最小培地１ｍｌに接種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、３３℃、８００ｒｐｍのマイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で４８時間インキュベートした。生育期間の後、培養上清の０．５ｍｌのアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段フィルター、次に０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次に濾過した上清を、以下に記載のチップ電気泳動、または以下に記載の抗ＦＬＡＧ  ＤＯＴ−ＢＬＯＴおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解析した。これらの結果に基づき、天然のシグナルペプチドよりも分泌が多いことが例証された一次形質転換体を、最小培地プレート上で単離し、胞子形成まで３０℃で生育させた。
【０６６６】
ｐｇｐｄＡプロモーター、ならびにＳＥＱＩＤ−００４０９およびＳＥＱＩＤ−００４２４の天然のシグナルペプチドの発現構築物を含む対照のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株と共に、上記のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株の胞子保存液を、１２５ｍｌのプラスチックフラスコに、１６０ｍＭのＭＥＳでｐＨ７に調節した、５．０ｇ／ｌの酵母抽出物、２．０ｇ／ｌのカザミノ酸を補充した上記に定義した最小培地１０ｍＬに、１０６胞子／ｍＬで接種した。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの胞子を、１５０ＲＰＭで２日間３０℃で生育させた。生育期間の後、培養上清のアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段、次に０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次に、この濾液を、本明細書中に記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解析した。
【０６６７】
図５は、天然のシグナルペプチドと比較して新規のシグナルペプチドを含むＳＥＱＩＤ−００４０９（左）およびＳＥＱＩＤ−００４２０（右）の分泌を例証する。
【０６６８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの異種性栄養性ポリペプチド遺伝子の合成およびプラスミドの構築
栄養性ポリペプチドをコードする遺伝子を合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。遺伝子を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒでの発現のためにコドンを最適化した。合成した遺伝子をＰＣＲ増幅し、のあいだＣ末端３Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ）およびグルコアミラーゼ遺伝子と関心対象遺伝子とのあいだでＫｅｘｉｎプロテアーゼ部位（ＮＶＩＳＫＲ）が付加され、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのｇｐｄＡプロモーターの制御下で、その天然のリーダー配列を有するグルコアミラーゼに融合した発現ベクターｐＡＮ５６−１（Ｇｅｎｂａｎｋ：  Ｚ３２７００．１）にクローニングした。プラスミドを、ギブソンアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して構築した。組み換えプラスミドの配列を検証した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主の形質転換を行った。
【０６６９】
ＳＥＱＩＤ−０００８７、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００１１５、ＳＥＱＩＤ−００２１８、ＳＥＱＩＤ−００２９８、ＳＥＱＩＤ−００３０２、ＳＥＱＩＤ−００３４１、ＳＥＱＩＤ−００３５２、ＳＥＱＩＤ−００３５４の遺伝子を利用した。
【０６７０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ異種性栄養性ポリペプチド細胞株の構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｄ１５＃２６のプロテアーゼ欠損誘導体（Ｅ．  Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，  ６：３４）を、発現宿主として使用した。発現ベクター１０μｇを、Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，  ４４７−４５７に記載されるプロトプラスト法を使用して、ｐｙｒＧ選択マーカーを含む１μｇのプラスミドと同時形質転換した。形質転換体を、１０ｇ／ｌのグルコース、６ｇ／ｌの硝酸ナトリウム、２０ｍｌ／ｌの塩溶液（２６ｇ／ｌの塩化カリウムおよび７６ｇ／ｌのリン酸カリウム（一塩基性）（ｐＨ５．５）を含む）、２ｍＭの硫酸マグネシウム、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液（１００ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、１５０ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、７５０ｍｇ／ｌの４−アミノ安息香酸、２．５ｇ／ｌのニコチン酸、２．５ｇ／ｌのリボフラビン、２０ｇ／ｌの塩化コリン、および３０ｍｇ／ｌのビオチンを含む）、および１ｍｌ／ｌの金属溶液（２０ｇ／ｌ硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１１ｇ／ｌのホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、５ｇ／ｌの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ）、５ｇ／ｌの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、１．７ｇ／ｌの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）、１．６ｇ／ｌの硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ）、１．５ｇ／ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物（ＮａＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ）、および５．０ｇ／ｌのＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ−２Ｈ２Ｏ）（ｐＨ６．５）を含む）を含み、かつ１、２Ｍのソルビトールおよび１．５％のｂａｃｔｏ  ａｇａｒを補充した最小培地で選択した。個々の形質転換体を、最小培地プレート上で単離し、胞子が形成されるまで３０Ｃで生育させた。胞子を、水中で収集し、４Ｃで保存した。
【０６７１】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ異種性栄養性ポリペプチドの発現試験
各構築物由来の９０個の異なる一次形質転換体を、９６ディープウェルプレートの培養ブロック中に、１ｇ／ｌのカザミノ酸を補充した上記に定義した最小培地１ｍｌで接種した（１の回目ＭＴＰ）。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、マイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）において、３３℃、８００ｒｐｍで７２時間インキュベートした。生育期間の後、培養上清の０．５ｍｌのアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段フィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次に濾液を、本明細書に記載されるように抗ＦＬＡＧ  ＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。ＳＥＱＩＤ−００３０２を除く９個の発現構築物からの少なくとも５個のコロニーが、表Ｅ１５Ｂに記録するように抗フラグＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを生じた。抗ＦＬＡＧ  ＥＬＩＳＡアッセイで陽性シグナルを示した９個の発現細胞株のそれぞれからの少なくとも５個の一次形質転換体もまた、単胞子精製のために新しい最小培地寒天プレート上で画線培養して、確認のため再度試験した（２回目のＭＴＰ）。
【０６７２】
胞子を、プレートから収集し、新鮮な胞子を用いて約１Ｅ９胞子／ｍｌの密度で接種を行った。これらの胞子収集物１０μｌを最小培地１０ｍｌに添加して、１Ｅ６胞子／ｍｌの開始密度を得た。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの胞子を１５０ｒｐｍで３日間、３３Ｃで生育させた。生育期間の後、培養物上清のアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段フィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次にこの濾液を、以下に記載の抗ＦＬＡＧ  ＥＬＩＳＡ、抗フラグウェスタンブロット、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解析した。
【０６７３】
異なる発現構築物由来の特定のクローンを、新鮮な胞子収集物を使用して、１リットルの最小培地中約１Ｅ６胞子／ｍｌの最終密度で生育させた。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの胞子を、１５０ＲＰＭで３日間、３３Ｃで生育させた。生育期間の後、培養上清のアリコートを、まず２５μｍ／０．４５μｍの二段フィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次にこの濾液を、以下に記載の抗ＦＬＡＧ  ＥＬＩＳＡ、抗ｆｌａｇウェスタンブロット、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解析した。抗ｆｌａｇ  ＥＬＩＳＡにおいて１リットルの振盪フラスコから３９ｍｇ／ｌを超える任意の分泌タンパク質が、抗ＦＬＡＧウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された。
【表９８】
2016537402.tif 000112
【０６７４】
実施例１６：培養哺乳動物細胞における栄養性ポリペプチドの発現
遺伝子合成およびプラスミドの構築
すべての遺伝子を合成により作製し（ＧｅｎｅＡｒｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒトでの発現のために最適化した。ＳＥＱＩＤ−００００１、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２９８、およびＳＥＱＩＤ−００３６３をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞の分泌に関して選択した。すべての遺伝子に、Ｉｇ−ｋａｐｐａタンパク質（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ）の５’末端シグナルペプチド配列および３’末端でのＨＨＨＨＨＨＨＨタグを融合した。すべての遺伝子構築物を、ｐＣＭＶプロモーターの下流にＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩのマルチクローニングサイトを有するｐｃＤＮＡ  ３．１（＋）ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。すべての遺伝子配列は、開始コドンの上流にＧＣＣ配列を含み、ＧＣＣＡＴＧＧ  Ｋｏｚａｋ配列を生成した。すべてのプラスミドにより、大腸菌を形質転換し、配列を検証し、各プラスミド１０ｍｇを、哺乳動物細胞へのトランスフェクションのため精製した。
【０６７５】
細胞株の構築
実験のために選択した細胞株は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＰＮ  ５１−４４４８）およびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ  ２９３Ｆ細胞（ＰＮ  ５１−００２９）の２つの一過性発現細胞株である。細胞株を、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎから受け取り、継代培養を開始するまで液体窒素中で保存した。トランスフェクションの前の継代培養では、細胞を特定の培地に融解した：ＣＨＯ−Ｓ細胞は、８ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ３５０５０−０６１）および１Ｘ  ＨＴ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ１１０６７−０３０）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ  ＣＨＯ  発現培地（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  １２６５１−０１４）３０ｍｌ中で融解した。２９３Ｆ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  １２３３８−０１８）３０ｍｌ中で融解した。細胞を、８０％の湿度、８％の二酸化炭素、３６．５℃、１分あたり１１０の回転での振盪を行いながら、７２時間浮遊培養で回復させた。細胞を、２．０×１０６細胞／ｍｌを超えない生存可能な細胞密度（ＶＣＤ）から０．２×１０６細胞／ｍｌとなるように継代した。継代培養を、トランスフェクションの前に、５回続けて行った。
【０６７６】
トランスフェクションの２６時間前に、培養物を、６０ｍｌの容量に生存細胞０．６×１０６個／ｍｌとなるように継代した。各栄養性ポリペプチドを２回の反復実験でトランスフェクトし、２つのモックトランスフェクションを各細胞株の対照として行った。トランスフェクションを行った日に、細胞を計数し、生存率９８％超の細胞が１．１×１０６個／ｍｌであると決定された。
【０６７７】
トランスフェクションの手順
合計１２０ｍｌの容量（６０ｍｌ／２５０ｍｌの振盪フラスコ）のトランスフェクションのためのＤＮＡ−脂質複合体の調製。
【０６７８】
以下の手順をクリーンベンチ（Ｌａｍｉｎａｒ  Ｆｌｏｗ  Ｈｏｏｄ）で実施した。１５０μｇのプラスミドＤＮＡを、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ  ＳＦＭ低血清培地（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ：１２３０７−０５０）に、全量２．４ｍｌとなるように希釈した。この溶液をゆっくりと混合し、０．２μｍのフィルターで滅菌した。ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ  ＳＦＭ低血清培地中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ  ＭＡＸ試薬（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  １６４４７−１００）１５０μｌを、全量２．４ｍＬとなるように希釈し、ゆっくりと混合し、室温で５分間インキュベートした。５分間インキュベートした後、希釈したＤＮＡ２．４ｍｌを希釈した試薬２．４ｍｌに添加し、ゆっくりと混合し、室温で２０分間インキュベートして、ＤＮＡ−脂質複合体を形成した。２０分間のインキュベートの後、複合体２．４ｍｌをそれぞれ１試料当たり２個ずつフラスコに添加した。対照のフラスコには、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ  ＳＦＭ低血清培地２．４ｍｌを添加した。トランスフェクトしたフラスコを、８０％の湿度、８％の二酸化炭素、３６．５℃、１分あたり１１０回転で振盪するインキュベートシェーカーに戻した。培養物を、％生存率およびＶＣＤに関してモニターした。すべてのフラスコに、各細胞株に特異的な培地中で作製した２０％のファイトンペプトン供給物質を３日目に補充した。フラスコ中のファイトンペプトンの最終濃度は、２％に等しかった。培養物を、遠心沈降により４日目に収集し、上清を、０．２μｍで濾過した。上清を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１２％ビス‐トリスゲルの中に泳動させて、栄養性ポリペプチドの発現を分子量で確認した。ＳＥＱＩＤ−００００１、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、およびＳＥＱＩＤ−００２９８は、２９３Ｆ細胞から発現したことが確認されたが、ＣＨＯ−Ｓではいずれの培養物でも可視化できるバンドは検出できなかった。ＳＥＱＩＤ−００３６３は、２９３ＦまたはＣＨＯＳ培養物由来のゲル上で可視化できなかった。ＳＥＱＩＤ−００００１、ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２９８、およびＳＥＱＩＤ−００３６３の２９３Ｆ培養物由来の上清、ならびにＳＥＱＩＤ−００１０３およびＳＥＱＩＤ−００１０５のＣＨＯ‐Ｓの上清を、ＩＭＡＣにより精製した。ＳＥＱＩＤ−００１０３、ＳＥＱＩＤ−００１０５、およびＳＥＱＩＤ−００２９８を、２９３Ｆ細胞を使用して１Ｌの振盪フラスコ中に１９０ｍｌのトランスフェクション容量までスケールアップした。また、トランスフェクションの手順をこれに伴い拡大した。ＳＥＱＩＤ−００１０３およびＳＥＱＩＤ−００１０５の両方の４×１９０ｍｌの培養物、およびＳＥＱＩＤ−００２９８の２×１９０ｍｌの培養物を泳動させた。２日目に、これらの培養物に、２０％のファイトンペプトン供給物質を培養物中２％の最終濃度となるように供給し、５日目に収集した。
【０６７９】
実施例１７：栄養性ポリペプチドの発現解析
細胞内で発現されかつ／または分泌された栄養性ポリペプチドを、様々な方法を使用して検出した。これらの方法は、電気泳動、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、および定量ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを含む。
【０６８０】
電気泳動解析
細胞外および／または細胞内で発現したタンパク質を、チップ電気泳動（Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸＩＩ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により解析して発現レベルを評価した。
【０６８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、５％のβ−メルカプトエタノールと混合したＩｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎのＬＤＳの試料バッファー中の１０μｌの試料を煮沸し、１）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または２）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１６％のトリシンゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかにロードし、標準的な製造社のプロトコルを使用して泳動させた。ゲルを、標準的な製造社のプロトコルを使用してＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して撮像した。過剰発現した異種性タンパク質を、分子量マーカーおよび対照培養物との比較により同定した。
【０６８２】
チップ電気泳動（Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸ  ＩＩ）では、試料を、７μｌの試料バッファーに２μｌの試料を添加することによりＨＴ  Ｌｏｗ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（製造社のプロトコルにしたがう）を使用して解析した。分子量の決定および定量化（ｋＤａでの分子量）のために、タンパク質のラダーを１２試料ごとにロードした。
【０６８３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
細胞全体、細胞ライセート、および分泌された試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してタンパク質発現のために解析することができる。試料を解析するために、１０μｇの試料を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、約２ｃｍ離してロードした。このゲルを、１０個の区分に切り取り、ゲルの切片を、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム、次いでアセトニトリルで洗浄することにより処理した。次にゲルの切片を、１０ｍＭのジチオスレイトールにより６０℃で還元し、次に室温で５０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。最終的に試料を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃で４時間消化し、消化物を、ギ酸を添加してクエンチした。次に上清の試料を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムを用いるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムにロードし、３５０ｎＬ／分で、７５μｍの解析カラムから溶出させた。両方のカラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。１時間の勾配を使用した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳをＯｒｂｉｔｒａｐで、７０，０００ＦＷＨＭの分解能および１７，５００ＦＷＨＭの分解能でそれぞれ実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳのために選択した。データを、Ｍａｓｃｏｔを使用して適切なデータベースに対して検索して、ペプチドを同定した。Ｍａｓｃｏｔ  ＤＡＴファイルを、検証、フィルタリングのため、および試料あたりの重複しないリストを作成するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェアで解析した。データを、１％のタンパク質、およびタンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要とするペプチドの偽陽性率（ＦＤＲ）でフィルタリングした。
【０６８４】
抗ＦＬＡＧウェスタンブロット
細胞外および／または細胞内タンパク質を、ウェスタンブロットを使用して解析して発現レベルを評価した。
【０６８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、５％のβメルカプトエタノールと混合したＩｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎのＬＤＳサンプルバッファー中の試料１０μｌを煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。標準物質では、アミノ末端ＦＬＡＧ−ＢＡＰ（商標）融合タンパク質（Ｓｉｇｍａ）０．５μｇ〜２μｇを、陽性対照としてロードした。ゲルの電気泳動を、製造社のプロトコルに従って実施した。泳動させた後、ゲルを、ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｍｉｎｉ  トランスファースタックニトロセルロース（メンブレンの孔の大きさ：０．２μｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、製造社のプロトコルに従って転写した。次に、ニトロセルロースメンブレンスタックから除去し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．（登録商標）２．０タンパク質検出装置の中に集めた。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＢｌｏｋ  ＣＨノイズ除去試薬３０ｍｌを、集めたリザーバートレイに入れ、減圧した。ＳｉｇｍａモノクローナルＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２−ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体２μｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｌｏｋ  ＣＨノイズ除去試薬３ｍｌに希釈することにより、３ｍｌの抗体溶液を調製した。抗体溶液をリザーバートレイに添加し、減圧することなく１０分間インキュベートした。インキュベートの後、リザーバートレイを、９０ｍｌの１×ＰＢＳ＋０．１％のＴＷＥＥＮ２０で満たし、最終洗浄ステップとして減圧した。洗浄の後、ニトロセルロースメンブレンを除去し、試薬トレイに配置した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｃｌａｓｓｉｃｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ基質２０ｍｌを添加し、１分間インキュベートした。インキュベートした後、メンブレンを、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）のイメージングトレイに置き、化学発光プロトコルを使用して撮像した。
【０６８６】
抗ＦＬＡＧドットブロット
細胞外および／または細胞内タンパク質を、ドットブロットを使用して解析して発現レベルを評価した。
【０６８７】
０．２μｍフィルターで濾過した試料１１０μｌを、８．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（変性バッファー）と混合して、さらにタンパク質を結合させた。アミノ末端ＦＬＡＧ−ＢＡＰ（商標）融合タンパク質（Ｓｉｇｍａ）の検量線を、試料１１０μｌと同じ基質中で、２μｇで開始し、０．０３１３μｇまで連続２倍希釈して作製した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎの０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンを、５分間１×ＰＢＳバッファーで予め湿潤させ、次に、ＢＩＯ‐ＲＡＤドットブロット装置上にロードした。ＰＢＳ３００μｌを、減圧処理し、さらにメンブレンを湿潤させた。試料：変性バッファーの１：１の混合物２００μｌを、各ウェルにロードし、３０分間の勾配によりドットブロット装置を介して排出させた。次に、３００μｌのＰＢＳによる洗浄を、減圧によってすべてのウェルに行い、次に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｌｏｋ  ＣＨのノイズ除去試薬３００μｌをロードし、６０分間インキュベートした。ブロッキングした後、メンブレンを、３００μｌの１×ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した。次に、Ｓｉｇｍａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２−ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体２．４μｌをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｌｏｋ  ＣＨノイズ除去試薬１２ｍｌに添加することにより（１：５０００の希釈）、抗体溶液を調製した。得られた抗体溶液１００μｌを、各ウェルに添加し、重力により３０分間インキュベートした。抗体のインキュベーションの後、３回の最終的な洗浄を、減圧により、３００μｌの１Ｘ  ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を用いて実施した。洗浄の後、ニトロセルロースのメンブレンを取り出して、試薬トレイに配置した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｃｌａｓｓｉｃｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ基質２０ｍｌを添加し、１分間インキュベートした。インキュベートした後、メンブレンを、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）のイメージングトレイに配置し、化学発光プロトコルを用いて撮像した。
【０６８８】
抗ＦＬＡＧ  ＥＬＩＳＡ
タンパク質の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した直接的なＥＬＩＳＡにより検出した。簡潔に述べると、ＦＬＡＧ融合タンパク質（Ｓｉｇｍａ）の連続希釈液（０．００５〜１０μｇ／ｍｌ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）中でに調製した。また、ＦＬＡＧ融合タンパク質の連続希釈液（０．０１〜２０μｇ／ｍｌ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）中で１０倍希釈した空の真菌培養物の消費培地中で調製した。実験培養培地の試料を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）中で１０倍希釈した。ＦＬＡＧ融合タンパク質の連続希釈液と実験試料を、Ｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）９６ウェルプレートのウェルに移し（０．２ｍｌ）、２〜８℃で一晩インキュベートして、タンパク質の吸着を促進させた。翌朝、プレートを、０．０５％のＴＷＥＥＮ８０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳＴ）で３回すすいだ。ＴＢＳＴ中に溶解した１％の脱脂乾燥乳０．２ｍｌと共に室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的なタンパク質の結合からウェルをブロックした。このプレートを、ＴＢＳＴでさらに３回すすぎ、次にブロッキングバッファーで１：２０００に希釈したモノクローナル抗体抗ＦＬＡＧＭ２−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）０．２ｍｌと共に室温で１時間インキュベートした。プレートを再びＴＢＳＴでさらに３回すすいだ後、０．２ｍｌ／ウェルのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ）と共に室温で３０分間インキュベートした。０．０５ｍｌ／ウェルの１ＭのＨＣｌを添加して、反応を終了させ、試料の吸光度を、プレートリーダーを備えた分光光度計で４９２ｎｍで測定した。
【０６８９】
実施例１８：栄養性ポリペプチドの治療用液体配合物
栄養性ポリペプチド配列を、様々な液体配合物で治療目的のため投与した。たとえば、利用される配合物は、タンパク質の濃度、溶液のｐＨ、微粒子、ミネラル、味物質、および／または賦形剤の添加剤の有無により異なる。治療用液体配合物では、タンパク質の濃度は、溶液中０．１重量％〜６０重量％の範囲である。特定の例では、より低い濃度が好ましい。たとえば、ＳＥＱＩＤ−００１０５は、１０％もの低い量で投与されている。場合によっては、高い濃度が好ましい。たとえば、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３６３は、３５％の溶液として投与された。場合によっては、栄養性ポリペプチド配列は、その最大溶解度で投与され、これは、タンパク質により変動し、概して０．１重量％〜６０重量％の範囲にある。ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３６３は、５０重量％の溶液中で可溶性の液体であることが示された。治療用液体配合物では、溶液のｐＨは、概して２〜１１の範囲にある。タンパク質の溶解度は、溶液のｐＨの強力な関数であることが知られている（Ｃ．  Ｔａｎｆｏｒｄ，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ｐ．  ２４２，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６１．）。多くの場合、栄養性ポリペプチド配列は、その等電点（ｐＩ）で少なくとも可溶性であり、よって、溶液のｐＨはしばしば栄養性ポリペプチド配列のｐＩより上またはｐＩより下となるように調節される。このｐＨの調節により、タンパク質の溶解度を制御することができる。たとえば、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３６３は、４付近の等電点を有する。これらの栄養性ポリペプチド配列は、ｐＨ８〜９で意図的に配合されており、これはｐＩより上であろう。たとえば、ＳＥＱＩＤ−００５８７は、９．７のｐＩを有し、ｐＨがそのｐＩより低くなるように、ｐＨ７で意図的に配合された。そのｐＩで可溶性である栄養性ポリペプチドは、液体配合物が溶液のｐＨを維持するためにさらなる種類の緩衝剤を必要とすることのないように、そのｐＩで配合することができる。この場合、タンパク質自体は、自身のアミノ酸がプロトン化し、脱保護されるため、溶液のｐＨを緩衝するように作用する。タンパク質のｐＩで配合したタンパク質溶液は、酸または塩基を添加した場合のｐＨの変化に対して抵抗性を示し、このことは、実際に溶液がタンパク質自体により緩衝されていることを示している。いくつかの治療上の液体配合物では、栄養性ポリペプチドは微粒子物質を含む。微粒子物質は肉眼で確認できる、および／または肉眼では見ることのできない微粒子（例は可溶性凝集物）を含む。微粒子物質は、生成物に関連しており、および／または外来性である。微粒子物質は、懸濁して、スラリーとして存在し、および／または溶液の底部に沈殿する。一部の実施形態では、微粒子物質は、胃の中で消化されないか、またはゆっくりと消化可能であるため、腸へ栄養性ポリペプチドを送達するキャリアーとして作用することから、望ましい。一部の実施形態では、微粒子物質は、その溶解度の限界を超えて栄養性ポリペプチドを投与することができるため、液体配合物において望ましい。ＳＥＱＩＤ−００１０５の場合、��に見える微粒子物質は存在しない。ＳＥＱＩＤ−００４２４は、懸濁した微粒子物質と共に投与された。
【０６９０】
治療用液体配合物では、栄養性ポリペプチド配列は、典型的に、配合物に溶解した１つまたは複数の賦形剤と共に配合される。各賦形剤は、特定の目的のため含まれている。緩衝剤（たとえばトリス、リン酸塩、炭酸水素アンモニウム、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン）は、溶液のｐＨを制御するために添加される。糖は、凝集および溶解度を制御するために添加される（例：トレハロース、グルコース、スクロース、およびマンニトール）。洗浄剤は、溶解度および凝集を制御するために添加される（たとえばｔｗｅｅｎ、トリトン、ＣＨＡＰＳ、およびデオキシコール酸塩）を制御するために添加される。ポリアルコールは、溶解度および凝集を制御するために添加される（グリセロール、ＰＥＧ）。カオトロープは、タンパク質の溶解度を上げるために添加される（たとえばチオシアン酸塩および尿素）。抗酸化剤は、タンパク質の酸化を防止するために添加される（たとえばアスコルビン酸およびメチオニン）。塩は、タンパク質の溶解度を上げるために添加され、および／または望ましい浸透圧を得るために添加される（たとえば塩化ナトリウム）。ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００４２６を、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム中で配合し、経口投与した。ＳＥＱＩＤ−００５８７およびＳＥＱＩＤ−００５５９を、炭酸水素アンモニウム中で配合し、経口投与した。ＳＥＱＩＤ−００２４０を炭酸ナトリウム中で配合し、経口投与した。味物質は、結果を成功させつつユーザーの味覚経験を改善するために栄養性ポリペプチドに添加され、好結果をもたらした。バニラ抽出物を、Ｔａｎｇら（Ｔａｎｇ  ＪＥ，  Ｍｏｏｒｅ  ＤＲ，  Ｋｕｊｂｉｄａ  ＧＷ，  Ｔａｒｎｏｐｏｌｓｋｙ  ＭＡ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＳＭ．  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （１９８５）．  ２００９  Ｓｅｐ；１０７（３）：９８７−９２）に従って、スクラロースと共に添加した。風味の改善という質利益は、ユーザーの「非常に好ましい」という表現によって証明された。
【０６９１】
２つの表Ｅ１８Ａおよび表Ｅ１８Ｂは、ヒトおよびラットへの栄養性ポリペプチドの多くの投与をまとめている。
【表９９】
2016537402.tif 000113
【表１００】
2016537402.tif 000114
【０６９２】
実施例１９：栄養性ポリペプチドの治療用配合物
可溶性の均質な液体配合物の代わりに、栄養性ポリペプチドを代替的に調製できる。この例として、スラリー、ゲル、錠剤、および食品の成分などの代替的な栄養性ポリペプチド配合物が挙げられる。
【０６９３】
スラリー配合物
スラリーは、可溶性物質と、溶液中の微細な顆粒として一般的に現れる不溶性物質の両方を含む半液体混合物である。栄養性ポリペプチドのスラリーは、栄養性ポリペプチドがその最大溶解度を超えて濃縮される場合、または栄養性ポリペプチドの凍結乾燥またはフリーズドライ調製物がその最大溶解度を超えて懸濁される場合に調製される。任意に、ダイズのレシチンなどの乳化剤を、０．１〜１％の濃度で添加すると、スラリーの均質性を安定化する（ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｙｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｅｕｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．  ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．）
【０６９４】
ゲル配合物
あるいは、栄養性ポリペプチドは、ゲルとして配合される。ゲルは、一般的に分子架橋を介して形成される固体のゼリー状の配合物である。栄養性ポリペプチドは、トランスグルタミナーゼ（ＥＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２．３．２．１３）による処置を通してゲルとして配合される。トランスグルタミナーゼは、グルタミン残基と結合したペプチドのｇ−カルボキシアミド基と、リジン残基と結合した栄養性ポリペプチドのｅ−アミノ基とのあいだの栄養性ポリペプチドの架橋を触媒できる。ｇ−グルタミル‐ｅ−リジンの形成は、溶液中のタンパク質を架橋し、よって、ゲルの形成を促進する。
【０６９５】
ヒトのトランスグルタミナーゼは、０．３〜３μＭの範囲のカルシウムのＫｄを有する、カルシウム（Ｃａ２＋）依存性酵素である（Ａｈｖａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。栄養性ポリペプチドの調製におけるカルシウムの沈殿作用により、カルシウム非依存的に作用するトランスグルタミナーゼの微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）オルソログが同定されている（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９  Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）。栄養性ポリペプチドのゼラチン様調製物を調製するために、栄養性ポリペプチドを、中性ｐＨで２５０ｇ／ｌで可溶性に配合する。トランスグルタミナーゼを、栄養性ポリペプチド１ｇあたり１０ＥＵで調製物に添加して、適切なゲル形成が起こるまで３５℃で反応させる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）。
【０６９６】
錠剤の配合物
栄養性ポリペプチドの固体の錠剤の調製を、Ｓａｋａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）に従って行う。錠剤は、栄養性ポリペプチド、賦形剤、および結合剤の混合物として配合される。錠剤は、５０重量％の栄養性ポリペプチド、２６重量％の結晶セルロース、７．５重量％の炭酸水素ナトリウム‐クエン酸混合物（７０：３０）、６．５重量％のラクトース、５．５重量％のステアリン酸マグネシウムから構成され、イソプロパノール中の４．５重量％のポリビニルピロリドン溶液により結合される。錠剤は、除湿され、顆粒化された後、１００ｍｇの錠剤に圧縮される。錠剤は、ジクロロメタンおよび可塑剤としてのフタル酸ジエチル中の１２．５重量％のエチルセルロース溶液でコーティングされる。
【０６９７】
吸入可能な乾燥粉末
栄養性ポリペプチドは、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓに記載されるように吸入可能な乾燥粉末として投与されるように配合される。栄養性タンパク質を、モデルタンパク質粒子を生成するために噴霧乾燥によりマルトデキストリンと同時処理する。次に、αラクトース一水和物（６３〜９０μｍ）、または２．５〜１０重量％の微粒子ラクトース（ＦＰＬ）もしくは微粒子化したポリエチレングリコール６０００を含む修飾型ラクトースと、タンパク質の粉末を転がすように混合して調製する。次に粉体の混合物を、粒径の分布、形態、および粉体流の観点から特徴付ける。
【０６９８】
従来の食物配合物
栄養性ポリペプチドを、食物成分として、乾燥した固体配合物として配合する。たとえば、栄養性ポリペプチドを、乾燥した栄養性ポリペプチド配合物を、水、デュラム・セモリナ、アラビアガム、モノおよびジグリセリド、繊維、酵母、およびクエン酸と混合することによりパスタ生地に組み込まれる。生地を切断して、成形、乾燥、および包装する。
【０６９９】
実施例２０：ＧＬＰ−１産生のためのアミノ酸および栄養性ポリペプチドのＩｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、複数の栄養素の刺激に応答した腸のＬ細胞により産生されるペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１は、膵臓からのインスリン放出を増加させることにより血糖値を減少させるインクレチンである。ＧＬＰ−１は、他の抹消組織に作用して、骨格筋および脂肪組織でのグルコースの取り込みおよび貯蔵を増加させ、胃内容排出速度を減少させ、肝臓のグルコース産生を減少させる（Ｂａｇｇｉｏ  ＬＬ  ＆  ＤＪ  Ｄｒｕｃｋｅｒ．  ２００７．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅｔｉｎｓ：  ＧＬＰ−１  ａｎｄ  ＧＩＰ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  １３２：２１３１−２１５７）。ＧＬＰ−１は、プログルカゴンの翻訳後の切断の産物で、これにより活性ＧＬＰ−１（７−３６）を生成する。これは、分泌後にジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって急速に分解されて、ＧＬＰ−１（９−３６）となる。
【０７００】
いくつかの哺乳動物の消化管の細胞株が、ＧＬＰ−１のＬ細胞分泌モデルとして使用されている（ラット由来のＩＥＣ−６、ヒト由来のＮＣＩ−Ｈ７１６およびＦＨｓ７４Ｉｎｔ、ならびにマウス由来のＳＴＣ−１およびＧＬＵＴａｇ）。これらの実験の目的は、アミノ酸の組み合わせ、栄養性タンパク質の消化、および／または完全長の栄養性タンパク質のいずれが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＬＰ−１の分泌を誘導するかを決定することである。
【０７０１】
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（カタログ番号  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２５１（商標）、バージニア州マナサス）から入手する。ＲＰＭＩ−１６４０  ダルベッコ変法イーグル培地  （ＤＭＥＭ）およびダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号：それぞれ１１８７５、１１９６５、および１４１９０；カリフォルニア州カールスバッド）から入手する。ペニシリン‐ストレプトマイシン溶液を、ＡＴＣＣ（カタログ番号  ３０−２３００、バージニア州マナサス）から入手する。抗生物質−抗真菌剤溶液（１００×）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号  Ａ５９５５、ミズーリ州セントルイス）から入手する。ウシ胎児血清を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号  ＳＨ３００７１０３ＨＩ，  マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手する。ウシ血清アルブミンを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号  ＢＰ１６００−１００、ペンシルバニア州ピッツバーグ）から入手する。脂肪酸フリーウシ血清アルブミンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号  Ａ７０３０、ミズーリ州セントルイス）から入手する。プロテアーゼ阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号  ３６９７８、マサチューセッツ州ウォルサム）から入手し、ＤＰＰＩＶ阻害剤であるジプロチンＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号  Ｉ９７５９、ミズーリ州セントルイス）から入手する。組織からのタンパク質抽出試薬（Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔ−ＰＥＲ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号  ７８５１０、マサチューセッツ州ウォルサム）から入手する。活性ＧＬＰ−１の濃度を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＧＬＰ−１（７−３６  アミド）イムノアッセイ研究キット（カタログ番号  ＡＬ２１５，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して決定し、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）上で読み取る。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）およびウィンドウズのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析する。クレブス・リンゲルバッファー（ＫＲＢ）を調製し、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＧＬＰ−１（７−３６  アミド）イムノアッセイ研究キットを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（カタログ番号  ＡＬ２１５、マサチューセッツ州ウォルサム）から入手する。
【０７０２】
９６ウェルプレートを、ＭａｔｒｉＧｅｌでプレコーティングする。ＭａｔｒｉＧｅｌ８０μｌを、グルコースを含まないダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）５ｍｌに添加する。ウェルあたり５０μｌを添加し、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で３０分間インキュベートする。ＭａｔｒｉＧｅｌ溶液を吸引後、細胞を添加する。
【０７０３】
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の抗生物質‐抗真菌剤溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持し、Ｔ−７５組織培養フラスコ中３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。細胞を、２〜３日ごとに、１：３または１：６に継代する。
【０７０４】
細胞を、０．２５％のトリプシン‐ＥＤＴＡと共に３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートして剥離させ、７５０ｒｐｍで１０分間遠心沈降させて細胞をペレット状にする。細胞のペレットを、１％のＦＢＳを補充した１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、７５０ｒｐｍで１０分間遠心沈降させて細胞をペレット状にする。細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再度懸濁し、血球計算盤で計数する。細胞を、１．８×１０６個／ｍｌに希釈し、Ｍａｔｒｉ−Ｇｅｌでプレコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルに２００μＬを添加する。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で２日間インキュベートする。
【０７０５】
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞でのアミノ酸処置に対するＧＬＰ−１の分泌のスクリーニング
２日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、スタベーションバッファー（すなわち、５０μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、３４μｇ／ｍｌのジプロチンＡ、および０．２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むクレブス・リンゲルバッファー）２００μｌと交換し、３７℃、５％のＣＯ２で３０分間インキュベートした。次にスタベーションバッファーを吸引し、スタベーションバッファー中の処置物品１００μｌ／ウェルと交換した、細胞を、処置物質で２時間刺激し、次に培地を除去し、−８０℃で凍結した。処置物質は、個々のアミノ酸、アミノ酸混合物、栄養性タンパク質の消化物、および／または完全長の栄養性タンパク質を含む。
【０７０６】
上清からの活性ＧＬＰ−の濃度の決定
上清を、製造社の指示に従ってＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＧＬＰ−１（７−３６  アミド）イムノアッセイ研究キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  ＡＬ２１５）を使用してＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の活性型に関してアッセイする。標準物質を、スタベーションバッファーの等濃度に補充したアッセイバッファーでアッセイする。あるいは、ＧＬＰ−１の活性型を、本明細書中に記載されるように、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＧＬＰ−１（７−３６  アミド）イムノアッセイまたはＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡからの発光データを、マイクロソフトのエクセルおよびグラフパッドプリズムで解析する。
【０７０７】
２回の反復実験試料の濃度を、グラフパッドプリズム６において活性ＧＬＰ−１の濃度のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後の標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して非線形回帰により決定する。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６で行う。
【０７０８】
ビヒクル対照の処置の後に回収した試料に対して試験物質の処置後に回収した試料からのＧＬＰ−１含有量を比較すると、試験物質によるＧＬＰ−１の経時的な分泌の度合いを説明する。処置全体でこの差を比較すると、各アミノ酸、アミノ酸混合物、栄養性タンパク質の消化物、および栄養性タンパク質の処置が他と比較して異なる効果を有することを説明し、かつこれらの有効性をランク付けする手段を提供する。
【０７０９】
アミノ酸によるＧＬＰ−１の分泌
本明細書中に記載されるように細胞を、アミノ酸を欠乏させ、ＤＭＥ／Ｆ１２培地中でそれらの濃度で２時間、刺激バッファー単独、１９種のアミノ酸、１７種のアミノ酸（ロイシン、イソロイシン、またはバリンを含まない）、２０種のアミノ酸、またはロイシン単独で刺激した（表Ｅ２０Ｃ参照）。上清を収集し、−８０℃で凍結した。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの濃度を次にアッセイした。図６は、刺激後の上清で検出したＧＬＰ−１（７−３６）の上清中濃度を示す。エラーバーは、技術的反復実験の標準偏差である。１４個の組成物は、高いほうのバッファーのみの刺激で観察されたものよりも１０％超ＧＬＰ−１の濃度を増加させた（これらは、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＶａｌを欠いている）。２つの組成物、すなわちＡｒｇおよびＬｅｕのみを欠いたアミノ酸の処置は、低いほうのバッファーのみの刺激よりも１０％より低くＧＬＰ−１（７−３６）の濃度を減少させたことが示された。
【表１０１】
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【０７１０】
実施例２１：健康な絶食ラットの血糖制御を改善するための栄養性ポリペプチドの使用
耐糖能試験は、臨床状況および前臨床状況の両方での血糖制御を測定する一般的な方法である。試験において、大量のグルコースを投与して、血液試料をその後の時点で採取して、血糖値がそれほど速やかに正常化するかを決定する。経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）では、ある用量のグルコースを口から摂取する。このような試験は、グルコース制御が不良な個体を同定するために臨床で用いられ（Ｃｏｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、抗糖尿病薬の治療上的有効性を評価するために前臨床で（Ｗａｇｍａｎ  ＆  Ｎｕｓｓ，  ２００１）（Ｍｏｌｌｅｒ，  ２００１）使用される。グルコースレベルを直接および間接的に調節する、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）、およびグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）を含む多くの異なる消化管ホルモンにより、グルコースレベルが調節される。グルコースおよび消化管ホルモンの測定の組み合わを使用して、グルコースの不耐性、インスリン抵抗性、および代謝性疾患の重症度を評価する（Ｆｅｒｒａｎｎｉｎｉ  ＆  Ｍａｒｉ，  ２０１４）。
【０７１１】
ＯＧＴＴを、頸静脈留置カテーテル（ＪＶＣ）を用いて２５匹の健康な絶食したオスのスプラーグドーリーラットで実施して、血糖制御ならびにインスリンおよびＧＬＰ−１のレベルに及ぼす栄養性ポリペプチド投与の短期的作用を評価した。
【０７１２】
経口耐糖能試験
すべての齧歯類は、約１０〜１２週齢、約３５０ｇの平均重量であり、試験の前に４日間環境に馴化させた。動物を、寝床に個別に収容し、通常の齧歯類飼料（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  ５００１）を試験の前に与えた。ケージの温度を２２±２℃に、湿度は５０±２０％に保ち、１２時間／１２時間の明暗サイクルで実施した。空気の循環を、１００％の新鮮な空気による１時間あたり１０回以上の換気により行った。処置の前に、すべてのラットを、１４時間にわたり一晩絶食させた。絶食した動物を、水に溶解した栄養性ポリペプチドの配合物の強制経口投与で処置し（表Ｅ２１Ａ参照）、次に処置投与から１５分後に、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を、強制経口投与によりチャレンジした。血中グルコースを測定し、血液を７つの時点（グルコースの試験に対して−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分）で採取した。血液を、血漿安定化剤（ｓｔａｂｌｉｚｅｒ）（ＤＰＰ４阻害剤およびプロテアーゼカクテル阻害剤）を含むＥＤＴＡ採血管に採取した。解析の標準物質のための未処置の血液を提供するために、１匹の追加のラットを屠殺して出血させた。グルコースを、血糖測定器（ＡｌｐｈａＴｒａｋ  ２，  Ａｂｂｏｔｔ）を使用してＪＶＣにより採取した血液の少量の液滴を使用して測定した。
【表１０２】
2016537402.tif 000116
【０７１３】
約３００μｌの血液を、６つの時点（−１５分、０分、１５分、３０分、および１２０分）で、１〜４群の全てのラットのＪＶＣから採取した。グルコースの強制経口投与および採血は、試料採取時間が各動物に対して正確となるように動物あたり同じ量の時間を要するように時間を設定した。すべての時点で、目標時間の５％以内に採取した。採取前に１：１００で試験管に添加したプロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号  Ｄ８３４０，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）およびＤＰＰＩＶ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州ビレリカ）を含む、予め冷却した（０〜４℃）Ｋ２ＥＤＴＡ採血管に血液を採取した。採血の後、血液試料を、冷却して維持し（２〜６℃）、３０分間遠心分離した。回収した血漿を、試料チューブに入れて、直ちに−８０℃に保存した。
【０７１４】
イムノアッセイ解析の前に、試料を１時間氷中で解凍し、ピペットにより十分に混合し、９６ウェルマイクロプレートに再度配置した。別々のアリコートを、インスリンイムノアッセイおよびＧＬＰ−１イムノアッセイのために調製した。マスタープレートおよびアリコートを、−８０℃で凍結保存した。
【０７１５】
図７は、本明細書中に記載されるＯＧＴＴのあいだの平均血糖値を示す。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。すべての群は、グルコースチャレンジ後ｔ＝１５およびｔ＝３０分の時点で、絶食時から血糖の顕著な差異を示した（ｐ＜０．０５、ダネットの多重比較検定）。ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８を投与した群は、グルコースチャレンジからｔ＝１５およびｔ＝３０の時点でビヒクルと比較して顕著な血糖の差を示した（ｐ＜０．０５、テューキー＝クレーマーの多重比較検定、各時点で互いに処置群を比較する）。これらのデータから、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８の短期摂取は、非近交系のオスのスプラーグドーリーラットでのグルコースチャレンジの後、血糖の制御を著しく改善できることが示唆される。
【０７１６】
血糖の曲線下の面積を、マイクロソフトのエクセルでの線形‐対数トラぺゾイダル法を使用して計算し、統計解析を、グラフパッドプリズム６で解析した。
【０７１７】
０〜１２０分および０〜６０分（図８）から積分した血糖の曲線下面積から、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８の短期投与が、経口耐糖能試験の状況で血糖変動を低下させることにより血糖の制御を改善することが示される。０〜６０分で、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８は、ビヒクルと比較して有意に小さな血糖の変化を有する（ｐ＜０．０５、ダネットの多重比較検定）。
【０７１８】
ラットのインスリンの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットを、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ．（カタログ番号  ９００６０，  イリノイ州ダウナーズグローヴ）から入手した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ５０マイクロプレートストリップウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）を使用して洗浄した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘモノクロメーターベースのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）で読み取った。データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）およびウィンドウズのグラフパッドプリズム  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析した。
【０７１９】
ＥＬＩＳＡキットを３０分間室温まであらかじめ温めた後、アッセイのセットアップを開始した。検量線の希釈物を、Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅフォーマットでアッセイを行うために製造社の指示に従って調製した。
【０７２０】
未処置の群由来および試料の血漿由来の血漿マトリックスを氷中で融解し、次に約１０００×ｒｃｆで１０分間、４℃で遠心分離してなんらかの不溶性材料を沈降させた。
【０７２１】
インスリン標準物質を試験するためのマトリックスアッセイバッファーを、未処置群由来の血漿マトリックスを使用して、９５μｌ中で５．２６％の濃度となるように調製した。アッセイバッファー９５μＬをすべての試料ウェルに添加し、マトリックスアッセイバッファー９５μＬをすべての標準物質ウェルに添加した、各試料および標準物質５μＬを２回の反復実験で添加した。プレートを、４℃で２時間インキュベートした。次にプレートを、３００μｌ／ウェルの１×洗浄バッファーで５回洗浄した。プレートを、ペーパータオル上に数回素早くたたいて、残りの洗浄バッファーを除去した。
【０７２２】
抗インスリン酵素コンジュゲート作業溶液を、１容量の酵素コンジュゲート希釈液と２容量の抗インスリン酵素コンジュゲート保存液を組み合わせ、かつ上下にピペッティングし、ボルテックスミキサーで軽く撹拌して混合することにより調製した。１００μＬ／ウェルの抗インスリン酵素コンジュゲート作業溶液をすべてのウェルに添加した。このプレートを密封し、室温で３０分間インキュベートし、次に、３００μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで７回洗浄した。プレートを、ペーパータオル上に数回素早くたたいて、残りのウォッシュバッファーを除去した。次に、１００μＬ／ウェルの酵素基質溶液を各ウェルに添加し、室温の暗所で４０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルのストップ溶液をすべてのウェルに添加した。
【０７２３】
吸光度を、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでシナジー Ｍｘプレートリーダーで読み取った。入手した最終的な値は、Ａ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値であった。
【０７２４】
インスリンの検量線を、エクセルにおいて、標準物質ウェルのＡ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値のそれぞれから０ｎｇ／ｍｌのインスリン標準物質の平均値を減算することによりインスリンのマトリックス濃度に関して補正した。２回の反復実験の試料濃度を、グラフパットプリズム６において、インスリン濃度のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後に、バックウラウンド補正標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して、非線形回帰により決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６で行った。曲線下面積を、マイクロソフトのエクセルでの線形‐対数トラペゾイダル法を使用して積分し、事後検定をグラフパッドで行った。
【０７２５】
図９は、実験全体を通しての、処置群あたりｎ＝６のラットの平均血漿中インスリン濃度を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。すべての処置群は、グルコースチャレンジ後１５分、３０分、および６０分で、処置またはビヒクルの強制経口投与と比較して血漿中インスリンが統計的に有意に増加した（ダネットの多重比較検定）。ＳＥＱＩＤ−００１０５では唯一、処置の強制経口投与時の血漿インスリンと比較して、グルコースチャレンジの時点（０）で血漿中インスリン濃度が統計的に有意に増加した（Ｐ＜０．０００１、ダネットの多重比較検定）。ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３７は、グルコースチャレンジ後１２０分で、統計的に有意に高い多くのインスリン濃度を有した（それぞれｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１。ダネットの多重比較検定）。
【０７２６】
ビヒクルとの比較では、ＳＥＱＩＤ−００１０５のみが、グルコースチャレンジ時の血漿中インスリン濃度の統計的に有意な多くの増加を示した（Ｐ＜０．００１、ダネットの多重比較検定）。
【０７２７】
これらのデータから、ＳＥＱＩＤ−００１０５の短期摂取は、非近交系の雄性スプラーグドーリーラットにおいて摂取から１５分以内にインスリンの放出を刺激できることが示された。
【０７２８】
図１０は、すべての処置群に関して０〜２４０分および０〜６０分で積分した曲線下面積を示す。ビヒクルより統計的に有意に高い処置群はなかった。
【０７２９】
総ＧＬＰ−１の酵素免疫結合吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ラットのＧＬＰ−１ＥＬＩＳＡキットを、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ．（カタログ番号  ８１５０７、イリノイ州ダウナーズグローヴ）から入手した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ５０  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｓｔｒｉｐ  ｗａｓｈｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）を使用して洗浄した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーターベースのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）上で読み取った。データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）およびウィンドウズのグラフパッドプリズム  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析した。
【０７３０】
ＥＬＩＳＡキットを３０分間室温で予め温めた後、アッセイのセットアップを開示した。検量線の希釈液を、製造社の指示に従って調製した。
【０７３１】
グループ５および試料の血漿からの血漿マトリックスを氷中で融解し、次に４℃で１０分間約１０００×ｒｃｆで遠心分離して、任意の不溶性材料を沈降させた。
【０７３２】
ＧＬＰ−１の標準物質を試験するためのマトリックスアッセイバッファーを、未処置群由来の血漿マトリックスを使用して、１００μＬ中で２５％の濃度に調製した。ＥＬＩＳＡのマイクロプレートを、３５０μｌ／ウェルの１×洗浄バッファーを使用して３回洗浄し、ペーパータオル上ですばやくたたいて、残りの洗浄バッファーを除去した。１００μＬのアッセイバッファーをすべての試料ウェルに添加し、１００μＬのマトリックスアッセイバッファーをすべての標準物質のウェルに添加した。各試料および標準物質２５μｌを２回の反復実験で添加した。ウェルをピペッティングにより混合した。プレートを、接着ホイルで被覆し、１００ｒｐｍの水平プレート振盪機上で、室温で１８時間インキュベートした。次にプレートを、３５０μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで３回洗浄し、次に、ペーパータオル上で数回すばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。１００μＬ／ウェルのビオチン標識抗体溶液をすべてのウェルに添加した。次に、プレートを密封し、１００ｒｐｍの水平のプレート振盪機上で、１時間室温でインキュベートした。次に、プレートを、３５０μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで３回洗浄し、次に、ペーパータオル上ですばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。１００μＬ／ウェルのＳＡ−ＨＲＰ溶液をすべてのウェルに添加した。次にプレートを密封し、１００ｒｐｍの水平のプレート振盪機上で、室温で３０分間インキュベートした。次にプレートを、３５０μｌ／ウェルの１×洗浄バッファーで３回洗浄し、次にペーパータオル上ですばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。１００μＬ／ウェルの酵素基質溶液をすべてのウェルに添加した。次に、プレートを密封し、振盪することなく、室温で、３０分間暗所でインキュベートした。基質のインキュベートの後、１００μＬの反応停止溶液をすべてのウェルに添加した。
【０７３３】
吸光度の値を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダー上４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで読み取った。入手した最終的な値は、Ａ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値であった。
【０７３４】
検量線を、エクセルにおいて標準物質のウェルのＡ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値のそれぞれから、０ｐＭのＧＬＰ−１標準物質の平均値を減算することにより総ＧＬＰ−１のマトリックス濃度について補正した。２回の反復実験試料の濃度を、ＧＬＰ−１濃度のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後のバックグラウンド補正標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して非線形回帰により決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６を使用して行った。曲線下面積を、マイクロソフトのエクセル上での線形‐対数トラペゾイダル法を使用して積分し、事後検定をグラフパッドで行った。
【０７３５】
図１１は、実験の過程全体での、処置群あたりｎ＝６のラットの平均血漿中ＧＬＰ−１の濃度を示す。示されるエラーバーは、ここでは平均値の標準誤差に対応する。ＳＥＱＩＤ−００３３８処置群は、グルコースチャレンジの時点で、ビヒクルより統計的に有意に高いＧＬＰ−１濃度を示す（ｐ＜０．０００５、ダネットの多重比較検定）。
【０７３６】
実施例２２：Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ（ｆａ／ｆａ）ラットの血糖制御を改善するための栄養性ポリペプチドの使用
ＯＧＴＴを、留置頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）を用いて、１８匹の絶食した雄性Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙラットで実施して、血糖制御ならびにインスリンおよびＧＬＰ−１のレベルに及ぼす栄養性ポリペプチド投与の短期的な効果を評価した。
【０７３７】
経口耐糖能試験
すべての齧歯類は、約１０〜１１週齢、平均体重約４５０ｇであり、試験前に４日間環境に馴化させた。動物を、寝床に１匹ずつ収容し、通常の齧歯類固形飼料（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  ５００１）を試験前に与えた。ケージの温度を２２±２℃、湿度を５０±２０％に保ち、１２時間／１２時間の明暗サイクルを実施した。空気の循環は、１００％の新鮮な空気による１時間あたり１０回以上の換気により行った。処置前に、すべてのラットを、１４時間にわたって一晩絶食させた。絶食させた動物を、水に溶解した栄養性ポリペプチド配合物の強制経口投与によって処置し（表Ｅ２２Ａ参照）、次に、処置投与から１５分後に、グルコースの強制経口投与（５ｇ／ｋｇ）をチャレンジした。血糖を測定し、血液を７つの時点（グルコースチャレンジと比較して−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分）で採取した。血液は、血漿安定化剤（ＤＰＰ４阻害剤およびプロテアーゼカクテル阻害剤）を含むＥＤＴＡ採血管に採取した。。解析の標準物質のために未処置の血液を提供するために、１匹の追加的なラットを屠殺して出血させた。グルコースを、血糖測定器（ＡｌｐｈａＴｒａｋ  ２，  Ａｂｂｏｔｔ）を使用してＪＶＣにより採取した少量の血液の液滴を使用して測定した。
【表１０３】
2016537402.tif 000117
【０７３８】
約３００μＬの血液を、６つの時点（−１５分、０分、１５分、６０分、９０分、および１２０分）で１〜３群のすべてのラットのＪＶＣから採取した。グルコースの強制経口投与および採血は、試料採取時間が各動物に対して正確となるように、動物あたり同じ量の時間を要するように時間を設定した。すべての時点で、目標時間の５％以内に採取した。血液を、採取前に１：１００でチューブに添加したプロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号  Ｄ８３４０，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）およびＤＰＰＩＶ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州ビレリカ）を含む予め冷却した（０〜４℃）のＫ２ＥＤＴＡ採血管に採取した。血液を採取した後、血液試料を、冷却して維持し（２〜６℃）、３０分以内に遠心分離した。回収した血漿を、試料チューブに入れ、直ちに−８０℃に保存した。
【０７３９】
イムノアッセイの解析の前に、試料を氷中で１時間融解し、ピペットにより全体を混合し、９６ウェルマイクロプレートに再度配置した。別々のアリコートを、インスリンイムノアッセイおよびＧＬＰ−１イムノアッセイのために調製した。マスタープレートおよびアリコートを、−８０℃で凍結保存した。
【０７４０】
図１２は、本明細書中に記載されるＯＧＴＴの際の平均血糖値を示す。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【０７４１】
積分された曲線下面積（ＡＵＣ）を、線形‐対数トラペゾイダル法を使用してマイクロソフトのエクセルで計算し、統計的な検定を、グラフパッドプリズム６．０３で行った。
【０７４２】
図１３は、各処置群に関して、グルコースチャレンジ（０分）〜６０分、および０分〜１２０分のあいだで積分したＡＵＣを示す。０〜６０分のあいだでビヒクルと統計学的有意差を示した処置はなかった。０〜１２０分では、ＳＥＱＩＤ−００１０５は、ビヒクルと比較して積分した曲線下面積の統計学的に有意な減少を示すが、ＳＥＱＩＤ−００３３８は示さない（ｐ＜０．００５、ダネットの多重比較検定）。これらのデータから、ＳＥＱＩＤ−００１０５の短期投与は、Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ（ｆａ／ｆａ）モデルの齧歯類モデルでの経口グルコースチャレンジによるグルコースの変動を低減できることが示される。
【０７４３】
ラットのインスリンの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットを、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ．（カタログ番号  ９００６０，  イリノイ州ダウナーズグローヴ）から入手した、プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ５０マイクロプレートストリップウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）を使用して洗浄した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーターベースのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）で読み取った。データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）およびウィンドウズのグラフパッドプリズム  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析した。
【０７４４】
ＥＬＩＳＡキットを３０分間室温に予め温めた後、アッセイのセットアップを開始した。検量線の希釈液を、ワイドレンジフォーマットでアッセイを行うために製造社の指示に従って調製した。
【０７４５】
未処置の群および試料の血漿由来の血漿マトリックスを、氷中で融解し、約１０００×ｒｃｆで１０分間、４℃で遠心分離して、なんらかの不溶性材料を沈降させた。
【０７４６】
インスリン標準物質を試験するためのマトリックスアッセイバッファーを、未処置の群由来の血漿マトリックスを使用して、９５μＬ中で５．２６％の濃度に調製した。アッセイバッファー９５μＬを、すべての試料ウェルに添加し、マトリックスアッセイバッファー９５μＬをすべての標準物質ウェルに添加した。各試料および標準物質５μＬを、２回の反復実験で添加した。プレートを、４℃で２時間インキュベートした。次に、プレートを、３００μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで５回洗浄した。プレートを、ペーパータオルで数回すばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。
【０７４７】
抗インスリン酵素コンジュゲート作業溶液を、１容量の酵素コンジュゲート希釈液と２容量の抗インスリン酵素コンジュゲートス保存液を組み合わせ、上下にピペッティングし、ボルテックスミキサーで軽く撹拌して混合することにより調製した。抗インスリン酵素コンジュゲート作業溶液１００μＬ／ウェルを、すべてのウェルに添加した。プレートを密封し、室温で３０分間インキュベートし、次に、３００μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで７回洗浄した。プレートをペーパータオルで数回すばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。次に、１００μＬ／ウェルの酵素基質溶液を各ウェルに添加し、室温の暗所で４０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの反応停止溶液を、全てのウェルに添加した。
【０７４８】
吸光度を、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダー上で読み取った。得られた最終的な値は、Ａ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値であった。値が検量線を超える試料を、２．５％のマトリックス標準物質に対して１：１の希釈で再試験した。
【０７４９】
インスリンの検量線を、エクセルにおいて標準物質のウェルのＡ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍのそれぞれから０ｎｇ／ｍＬのインスリン標準物質の平均値を減算することにより、インスリンのマトリックス濃度に関して補正した。２回の反復実験の試料濃度を、グラフパッドプリズム６において、インスリン濃度のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後のバックグラウンド補正標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して非線形回帰により決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６で行った。曲線下面積を、マイクロソフトのエクセル上での線形‐対数トラペゾイダル法を使用して積分し、事後検定をグラフパッドで行った。
【０７５０】
図１４は、実験の過程全体での、ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００１０５の処置群あたりｎ＝６のラット、およびＳＥＱＩＤ−００３３８の場合では処置群あたりｎ＝５のラットに関する平均血漿中インスリン濃度を示す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、時点０での各処置のあいだでおよび同じ時点での処置とビヒクルのあいだで比較した。ビヒクルは、ビヒクルの強制経口投与の時点と比較して、血漿中インスリンに統計学的に有意な変化を示さなかった。ＳＥＱＩＤ−００１０５は、グルコースチャレンジの時点（時点０）、ならびにグルコースチャレンジ後１５分および９０分で、処置の強制経口投与（時点−１５）の時点と比較して、統計学的に有意に高い血漿中インスリンを有した（それぞれＰ＝０．０００２、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）。ＳＥＱＩＤ−００３３８は、その後に試料採取したすべての時点で、処置の強制経口投与の時点と比較して、統計学的に有意に高い血漿インスリン濃度を有した（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００５、Ｐ＜０．００５、およびＰ＝０．０００５）。
【０７５１】
処置を比較すると、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８は、処置またはビヒクルの強制経口投与の時点でビヒクルとの有意差はなかった。グルコースチャレンジの時点およびその後の試料採取時点（０分、１５分、３０分、６０分、および９０分）では、ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００３３８の両方が、ビヒクルよりも有意に高い血漿中インスリン濃度を有した。このことから、両処置が、Ｚｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ（ｆａ／ｆａ）モデルでインスリン分泌を刺激することが示される。
【０７５２】
図１５は、各群に関して積分した曲線下面積を示す。０〜９０分で積分したＳＥＱＩＤ−００３３８の処置のみが、ビヒクルよりも統計的に有意に高かった（ｐ＜０．００５）。
【０７５３】
活性ＧＬＰ−１の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ラットの活性ＧＬＰ−１のＥＬＩＳＡキットを、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号  ＧＰ１２１−Ｋ０１、ニューハンプシャー州ナシュア）から入手した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ５０マイクロプレートストリップウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）を使用して洗浄した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーターベースのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）で読み取った。データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）およびウィンドウズのグラフパッドプリズム  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析した。
【０７５４】
ＥＬＩＳＡキットを少なくとも３０分間、室温で予め温めた後、アッセイのセットアップを開始した。検量線の希釈液を、製造社の指示に従って調製した。
【０７５５】
５群由来および試料血漿由来の血漿マトリックスを、氷中で解凍し、次いで約１０００×ｒｃｆで１０分間、４℃で遠心分離して、なんらかの不溶性材料を沈降させた。
【０７５６】
活性ＧＬＰ−１標準物質を試験するためのマトリックスアッセイバッファーを、未処置の群から血漿マトリックスを使用して、試験試料１：１希釈で試験した試料では１００μＬ中１０％の濃度、または希釈せずに試験した試料では１００μＬ中で２０％の濃度となるように調製した。２０μＬの標準物質および試料を、予めコーティングしたマイクロプレートに添加し、１００μＬの適切なアッセイバッファーを、標準物質および試料のウェルに添加した。このプレートを接着ホイルで被覆し、遮光して４℃で２４時間インキュベートした。次にこのプレートを、３５０μＬ／ウェルの１×洗浄バッファーで５回洗浄し、次に、ペーパータオル上で数回すばやくたたいて、残りの洗浄バッファーを除去した。１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ  ＨＲＰ基質を、すべてのウェルに添加した。次にこのプレートを密封し、遮光して室温で２０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ反応停止溶液をすべてのウェルに添加し、ゆっくりと混合した。
【０７５７】
吸光度の値を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダー上で４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで読み取った。得られた最終的な値は、Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍの値であった。
【０７５８】
検量線を、エクセルにおいて標準物質のウェルのＡ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍの値のそれぞれから０ｐＭのＧＬＰ−１標準物質の平均値を減算することにより活性ＧＬＰ−１のマトリックス濃度に関して補正した。２回の反復実験の試料濃度を、ＧＬＰ−１のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後のバックグラウンド補正標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して非線形回帰により決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６を使用して行った。曲線下面積を、マイクロソフトのエクセル上の線形‐対数のトラペゾイダル法を使用して積分し、事後検定をグラフパッドで行った。
【０７５９】
図１６は、実験の過程全体での、ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−００１０５に関してｎ＝６のラット、ならびにＳＥＱＩＤ−００３３８の処置群に関してｎ＝５のラットの平均血漿中ＧＬＰ−１濃度を示す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、時点０での各処置のあいだでおよび同じ時点での処置とビヒクルのあいだでのあいだ比較した。ビヒクルは、ビヒクルの強制経口投与後のいずれの時点でもＧＬＰ−１（７＝３６）濃度に有意差を示さなかった。ＳＥＱＩＤ−００１０５は、グルコースチャレンジ後１５分および３０分で有意に高いＧＬＰ−１（７−３６）濃度を示した（それぞれＰ＜０．０００１およびＰ＜０．０５）。ＳＥＱＩＤ−００３３８は、グルコースチャレンジ後１５分で、有意に高いＧＬＰ−１濃度を有した（Ｐ＜０．００５）。
【０７６０】
各時点でビヒクルと比較する場合、グルコースチャレンジ後１５分でビヒクルよりも有意に高いＧＬＰ−１（７−３６）濃度を有したのは、ＳＥＱＩＤ−００１０５のみであった（Ｐ＜０．００５）。
【０７６１】
図１７は、０〜９０分、および０〜６０分で積分した各処置群に関するＧＬＰ−１（７−３６）の曲線下面積を示す。処置は、０〜９０分または０〜６０分のいずれにおいてもビヒクルと比較して有意に異なるＧＬＰ−１（７−３６）の積分ＡＵＣを有さなかった。
【０７６２】
別の実験では、ＯＧＴＴを、２４匹の絶食させた雄性Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙラットで、頸静脈留置カテーテル（ＪＶＣ）を用いて実施して、血糖制御、ならびにインスリンおよびＧＬＰ−１のレベルに及ぼす栄養性タンパク質投与の短期的な効果を評価した。ＳＥＱＩＤ−００１０５がグルコースの制御を改善する能力を、経口耐糖能試験の状況で、血糖変動を、ＳＥＱＩＤ−００１０５をアログリプチンと、ＳＥＱＩＤ−００１０５＋アログリプチンをビヒクルと比較することにより試験した。すべての齧歯類は、約１０〜１１週齢であり、平均体重は約４３０ｇであり、試験前に４〜５日間環境に馴化させた。処置の前に、すべてのラットを１４時間にわたり一晩絶食させた。絶食させたラットを、水に溶解した栄養性タンパク質配合物の強制経口投与により処置し（表Ｅ２２Ｂ参照）、処置投与の１５分後に、次にグルコースを強制経口投与（２ｇ／ｋｇ）によりチャレンジした。血糖を測定し、血液を、９つの時点（グルコースチャレンジと比較して、−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、および２４０分）で採取した。
【表１０４】
2016537402.tif 000118
【０７６３】
図１８は、本明細書中に記載されるようにＯＧＴＴの際の平均血糖値を示す。処置群あたりＮ＝６のラットである。示されるエラーバーは、平均値の標準誤差である。各群を、グラフパットプリズム６、二元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定で事後比較を行い、最初に空腹時血糖濃度に対して各群内で比較し、次にビヒクルと各時点の比較を行った。処置群の血糖は、グルコースチャレンジの時点で空腹時と有意差はなかった。
【０７６４】
グルコースチャレンジの時点での空腹時血糖および血糖は、各群とビヒクルとのあいだで有意差はなかった。グルコースチャレンジ後１５分で、ＳＥＱＩＤ−００１０５単独およびＳＥＱＩＤ−００１０５＋アログリプチンは、ビヒクルと比較して血糖が非常に低かった（それぞれＰ＝０．０００３およびＰ＜０．０００１）。グルコースチャレンジ後３０分では、アログリプチン単独およびＳＥＱＩＤ−００１０５＋アログリプチンは、ビヒクルよりも有意に低い血糖を有した（それぞれ、Ｐ＝０．０４２４およびＰ＝０．００２１）。グルコースチャレンジ後６０分では、アログリプチン単独のみが、ビヒクルよりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。６０分後では、ビヒクルと有意に異なる血糖を有した群はなかった。
【０７６５】
積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を、線形‐対数トラペゾイダル法を使用してマイクロソフトのエクセルで計算し、二元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定をグラフパッドプリズム６．０３で行った。処置は、０〜６０分のあいだでビヒクルと比較してグルコースＡＵＣに統計学的有意差を示さなかった。０〜１２０分、および０〜２４０分のあいだでは、アログリプチン単独の処置のみが、ビヒクルよりも有意に低かった（それぞれＰ＝０．００５１およびＰ＝０．００５４）。
【０７６６】
実施例２３：食事誘導型肥満マウスにおける血糖制御および空腹時血糖を改善するための栄養性ポリペプチドの使用
本明細書中に記載される治療上の栄養性ポリペプチドの長期投与の作用を、食事誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスでの経口耐糖能試験により評価する。具体的には、この代謝性疾患の動物モデルにおける長期投与は、血糖制御、インスリン抵抗性、空腹時血糖、およびインスリンのレベルに影響を与えることができ、毎日の投与期間の前後のＯＧＴＴの際の空腹時血糖レベルならびにグルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）は、化合物の有効性の測定値を提供する。
【０７６７】
１０匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６のマウスの４つ群に、自由に１４時間高脂肪食を与えて、空腹時血糖レベルの上昇（高血糖）、空腹時インスリンレベルの上昇（高インスリン血症）、およびグルコースの制御不全を確実に発症させた（Ｘｕ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆａｔ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （２００３）  １１２：  １８２１−１８３０）。１０匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１つの群（群１）に、同じ週齢、操作、および収容条件で、ＨＦＤの処置アームを比較するために通常飼料を与えた。全てのマウスを収容し、試験開始前の３日間環境に馴化させた。
【０７６８】
ＯＧＴＴの処置の前に、すべてのマウスを１４時間にわたり一晩絶食させ、血液試料を、空腹時血糖およびホルモンレベルの解析のために、試験日の朝、投与前に血液試料を採取した。絶食した動物を、グルコースチャレンジの１５分前に、提供された栄養性ポリペプチド配合物の強制経口投与で処置する。グルコース（２ｇ／ｋｇ）を０時点で経口投与する。血糖を、７つの時点（−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分）で測定する。通常の飼料を与えた週齢をマッチさせた正常なマウスを、解析のため内部標準として使用する。群２〜５では、マウスに、提供された治療上栄養性ポリペプチド（２．８５ｇ／ｋｇ）（群４および５）またはビヒクルの対照（群２および３）を、毎日の強制経口投与または固形飼料への配合により、１５〜３０日間毎日投与する。すべての血液を、血漿安定化剤（ＤＰＰ４阻害剤およびプロテアーゼカクテル阻害剤）を含むＥＤＴＡ採血管に採取し、血漿を得るために処理し、−８０℃で凍結保存する。
【０７６９】
上述するようなＯＧＴＴを、ビヒクル（群２および４）または試験物質（群１、３、および５）のいずれかに関して試験の最終日に再び実施した。最後の試験物質またはビヒクル投与の前に、血液試料を、空腹時血糖およびホルモンのレベルの解析のため採取する。最後のＯＧＴＴの完了時に、すべてのマウスを屠殺し、全血液量を、心穿刺を介して回収する。インスリンレベルの解析を、本明細書中に記載されるようにＥＬＩＳＡ法を使用して実施する。
【０７７０】
群２および４のあいだでの試験終了時のＯＧＴＴグルコースＡＵＣの比較は、試験物質投与がＯＧＴＴに短期的な効果を及ぼすことなく試験物質の長期投与の効果を説明する。群３および５のあいだでの試験終了時のＯＧＴＴグルコースＡＵＣの比較は、試験物質長期投与の効果を説明し、かつ、ＯＧＴＴでの試験物質投与の短期的な効果を含むものである。群４または群５内での試験の開始時および終了時の空腹時血糖およびインスリンレベルの比較は、空腹時血糖およびインスリンレベルに及ぼす長期投与の効果を説明する。
【０７７１】
実施例２４：齧歯類でインスリン分泌を誘導するための栄養性ポリペプチドの使用
摂取したアミノ酸は、インスリン分泌誘導能を有することが示されている（Ｇａｎｎｏｎ  Ｍ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｆ．  Ｑ．  ２０１０．  Ｎｕｔｔａｌｌ．  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−−  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，  ６２（９）：  ６６０−６６８）。タンパク質の摂取は、グルコース単独の摂取と比較して血漿中インスリンを有意に増加させる（Ｎｕｔｔａｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８４．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｏａｄ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．  ７（５）：４６５−４７０）。摂取したタンパク質は、インクレチンホルモン、すなわち、管腔が栄養素に曝露されると内分泌細胞により分泌される、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）の作用を介して部分的にインスリンの分泌を増加させる（Ｂａｇｇｉｏ  ＬＬ  ＆  ＤＪ  Ｄｒｕｃｋｅｒ．  ２００７．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅｔｉｎｓ：  ＧＬＰ−１  ａｎｄ  ＧＩＰ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  １３２：２１３１−２１５７）。ロイシンおよびアルギニンなどのアミノ酸もまた、インスリン放出を直接刺激することが示されている（Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  （２００５）  １０８：  １８５−１９４）。これらの試験では、様々な栄養性タンパク質の短期投与後のインスリン応答を、齧歯類で測定する。
【０７７２】
本明細書中に記載される方法に係る齧歯類の薬物動態実験の一部として、動物に、様々な試験物質を処置し、または短期投与した。特段記載がない限り、すべての投与は、２．８５ｇ／ｋｇ体重であった。ｎ＝５のラットで行ったＳＥＱＩＤ−００２４０、およびｎ＝３で行ったＳＥＱＩＤ−００５８７を除き、すべての処置群はｎ＝４のラットを含むものであった。
【０７７３】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）インスリンイムノアッセイを使用した血漿中インスリンの定量
血漿試料を、氷中で融解して、１０分間１１０９×ｇで遠心分離して、不溶性材料を沈降させた。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）インスリンイムノアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  ＡＬ２０４Ｃ）を、４℃の冷却室から取り出し、氷中で保存しながらアッセイのセットアップを行った。１×アッセイバッファー、１０×アッセイバッファーをｍｉｌｌｉＱ水で希釈することにより調製した。
【０７７４】
インスリンの希釈のための標準的なバッファーを、１×アッセイバッファー中２５．９％の絶食ラット血漿で調製し、１６の測定点の検量線を調製するために使用した。血漿の試料は、９６ウェルのＰＣＲのマイクロプレート中１×アッセイバッファーで７：２０に希釈することにより調製した。
【０７７５】
アクセプタービーズ混合物を、１×アッセイバッファー中で、アクセプタービーズおよびビオチン化抗インスリン抗体を１／４００倍希釈することにより調製した。アクセプタービーズ混合物を、白色の不透明な３８４ウェルマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−３８４）に２０μＬ／ウェルでピペットにより添加して、この混合物に、絶食ラット血漿または試料ラット血漿中のインスリン標準物質１０μｌ／ウェルを２回の反復実験で添加した。このプレートをホイルプレートシールで密封し、約６００ｒｐｍ、室温で６０分間水平の振盪機でインキュベートした。
【０７７６】
ストレプトアビジンコーティングドナービーズは遮光する必要があった。そのため、暗室で、１×アッセイバッファー中でストレプトアビジンコーティングドナービーズを１／１２５倍希釈することにより、ドナービーズ混合物を調製する。第１のインキュベーションのステップの後、２０μＬ／ウェルのドナービーズの混合物を、標準物質および試料に添加した。アッセイプレートを密封して、約６００ｒｐｍで３０分間室温の水平の振盪機に戻した。ドナービーズのインキュベーションの後、発光を、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａプレートリーダーで読み取った。
【０７７７】
データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（３２−ｂｉｔ）およびグラフパッドプリズム  バージョン６．０３を用いて解析した。ｌｏｇ（インスリン（マイクロＩＵ））に対して検量線を作成した。ラットの血漿中インスリン濃度を、シグモイドの４パラメータロジスティック方程式を用いて補間した。各ラットの技術的反復実験におけるインスリンの２回反復実験の平均値を、時間に対してプロットした。曲線下面積を、マイクロソフトのエクセルでにおける線形‐対数線形法を使用して、０〜２４０分および０〜６０分で積分した。
【０７７８】
ラットインスリンの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した血漿中インスリンの定量
Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットを、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ（カタログ番号  ９００６０，  イリノイ州ダウナーズグローヴ）から入手した。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ５０マイクロプレートストリップウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）を使用して洗浄した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘモノクロメーターベースのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモンド州ウィヌースキー）で読み取った。データを、マイクロソフトのエクセル  バージョン１４．０．７１２８．５０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州レドモンド）、およびウィンドウズのグラフパッドプリズム  バージョン６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して解析した。
【０７７９】
ＥＬＩＳＡキットを、３０分間室温で予め温めた後、アッセイのセットアップを開始した。検量線の希釈液を、ワイドレンジフォーマットでアッセイを行うために製造社の指示に従って調製した。
【０７８０】
未処置の群由来および試料血漿由来の血漿マトリックスを氷中で融解し、次に約１０００×ｒｃｆで１０分間、４℃で遠心分離して、なんらかの不溶性材料を沈降させた。
【０７８１】
インスリン標準物質を試験するためのマトリックスアッセイバッファーを、未処置の群由来の血漿マトリックスを使用して、９５μＬ中５．２６％の濃度で調製した。９５μＬのアッセイバッファーをすべての試料ウェルに添加し、マトリックスアッセイバッファー９５μＬをすべての標準物質ウェルに添加した。それぞれの試料および標準物質５μＬを２回の反復実験で添加した。プレートを、４℃で２時間インキュベートした。次にプレートを、１×洗浄バッファー３００μＬ／ウェルで５回洗浄した。プレートをペーパータオル上で数回すばやくたたいて残りの洗浄バッファーを除去した。
【０７８２】
抗インスリン酵素コンジュゲート作用溶液を、２容量の抗インスリン酵素コンジュゲート保存液を、１容量の酵素のコンジュゲート希釈液で組み合わせ、上下にピペッティングおよびボルテックスミキサーで軽く撹拌して混合することにより、調製した。１００μＬ／ウェルの抗インスリン酵素コンジュゲート作用溶液を、すべてのウェルに添加した。このプレートを封入し、室温で３０分間インキュベートし、次に、３００μｌ／ウェルの１×洗浄バッファーで７回洗浄した。プレートをペーパータオル上ですばやくたたき、残りの洗浄バッファーを除去した。次に、１００μｌ／ウェルの酵素基質溶液を、各ウェルに添加し、室温の暗所で４０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの反応停止溶液をすべてのウェルに添加した。吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダーで４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで読み取った。得られた最終的な値は、Ａ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値であった。
【０７８３】
インスリンの検量線を、エクセルにおいて、標準物質ウェルのＡ４５０ｎｍ−Ａ６３０ｎｍの値のそれぞれから０ｎｇ／ｍｌのインスリン標準物質の平均値を減算することにより、インスリンのマトリックス濃度に関して補正した。２回の反復実験の試料濃度を、グラフパッドプリズム６において、インスリン濃度のｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換後のバックグラウンド補正標準物質の４パラメータロジスティックモデルを使用して非線形回帰により決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較検定を、グラフパッドプリズム６で行った。曲線下の面積を、マイクロソフトのエクセルにおいて線形‐対数の直線的な方法を使用して、０〜２４０分および０〜６０分で積分した。
【０７８４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの血漿中インスリン濃度
図１９および２０は、ビヒクル、および３つの異なる用量で投与したＳＥＱＩＤ−００１０５、および１つの用量で投与したＳＥＱＩＤ−００４２６、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４１の試験に関する生物学的な反復実験データをまとめたものを示し、血漿中インスリンは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡインスリンキットを使用して測定した。すべてのエラーバーは、平均値の標準誤差を表す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、０時点と各処置のあいだおよび同じ時点での処置とビヒクルのあいだを比較した。
【０７８５】
図１９では、２．８５ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５は、強制経口投与後１５分、３０分、および６０分で血漿中インスリン濃度を統計的に有意に増加させた（それぞれｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１、およびＰ＜０．０５）。１．７８ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５は、強制経口投与後１５分および３０分で血漿中インスリン濃度を統計学的に有意に増加しさせた（それぞれｐ＝０．０００５およびｐ＜０．０５）。最低用量のＳＥＱＩＤ−００１０５では、経時的な血漿中インスリン濃度は、時点０と有意差がなかった。各時点でのビヒクル対照の血漿中インスリン濃度と比較する場合、２．８５ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５は、強制経口投与後１５分および３０分でビヒクルよりも統計学的に有意に高い血漿中インスリンを示し（それぞれＰ＜０．０００１およびｐ＜０．００１）、１．７８ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５は、強制経口投与後１５分で血漿中インスリン濃度の統計学的に有意な増加を示した（Ｐ＝０．０００５）。図２０ではＳＥＱＩＤ−００３３８のみが、強制経口投与後１５分、および３０分で、血漿中インスリン濃度が時点０から統計学的に有意に増加した（それぞれＰ＝０．００５およびＰ＜０．０５）。ビヒクルと比較すると、ＳＥＱＩＤ−００３３８の各濃度での血漿中インスリン濃度は、強制経口投与後１５分で、ビヒクルよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。
【０７８６】
図２１および２２は、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００４２６、ＳＥＱＩＤ−００３３８、ＳＥＱＩＤ−００３４１のビヒクルに関して測定した血漿インスリン濃度の積分した曲線下面積を示し、エラーバーは平均値の標準誤差である。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ビヒクルに対するＡＵＣと比較した。２．８５ｇ／ｋｇのＳＥＱＩＤ−００１０５は、０〜２４０分および０〜６０分で積分した場合、ビヒクルより統計学的に有意に大きい血漿中インスリンＡＵＣを有した（それぞれＰ＝０．０００５およびＰ＜０．０５）。
【０７８７】
図２３および２４は、ビヒクル、ならびにＳＥＱＩＤ−００４２３、ＳＥＱＩＤ−００５８７、ＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００４２４、ＳＥＱＩＤ−００４２５、およびＳＥＱＩＤ−００４２９の試験に関する生物学的反復実験のデータをまとめたものを示し、血漿中インスリンは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡインスリンキットを使用して測定した。すべてのエラーバーは、平均値の標準誤差を表す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、０時点での各処置のあいだおよび同じ時点での処置とビヒクルのあいだを比較した。
【０７８８】
図２５および２６は、図２３および２４に示される血漿中インスリン濃度に関する積分した曲線下面積を示す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ビヒクルとＡＵＣを比較した。ＳＥＱＩＤ−００５８７は、０〜２４０分で積分した場合、有意に大きい血漿中インスリンＡＵＣを有した（ｐ＜０．００５）。
【０７８９】
図２７は、ビヒクル、ならびにＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００２４０、およびＳＥＱＩＤ−００５５９の試験に関する生物学的複製実験をまとめたものを示し、血漿中インスリンは、ラットインスリンのＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。すべてのエラーバーは、平均値の標準誤差を表す。ダネットの多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、０時点での各処置のあいだで比較した。ＳＥＱＩＤ−００１０５およびＳＥＱＩＤ−００５５９はいずれも、強制経口投与後１５分で、０時点と比較して血漿中インスリン濃度を統計学的に有意に増加させた（両方ともＰ＜０．０５）。ＳＥＱＩＤ−００２４０は、強制経口投与後１５分および３０分で、０時点と比較して血漿中インスリンを統計学的に有意に増加させた（それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。ビヒクルは、０時点と比較して血漿中インスリン濃度を統計学的に有意に変化させなかった。
【０７９０】
図２８は、各処置に関して強制経口投与後経管栄養から０〜２４０分、および０〜６０分で積分した曲線下面積を示し、エラーバーは、平均値の標準誤差である。ダネットの多重比較検定により、ビヒクルと比較して、０〜６０分、または０〜２４０分で有意に大きいＡＵＣを示した処置はなかった。
【０７９１】
実施例２５：健康な絶食ラットにおけるグルカゴン様ペプチド２分泌の栄養性ポリペプチドによる刺激
グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）は、プログルカゴンの翻訳後切断により産生されるアミノ酸３３個のペプチドである。ＧＬＰ−２は、腸管での栄養素の曝露に応答して、ＧＬＰ−１と共に、ヒトおよび齧歯類の腸内分泌Ｌ細胞により腸で分泌される。ＧＬＰ−２は、短腸症候群の処置において（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＡＳ，  Ｍｕｒａｌｉ  ＳＧ，  Ｈｉｔｔ  Ｓ，  Ｓｏｌｖｅｒｓｏｎ  ＰＭ，  Ｈｏｌｓｔ  ＪＪ，  Ｎｅｙ  ＤＭ．  ２０１２．  Ｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３０３（５）：Ｇ６１０−Ｇ６２２）、腸管の生育を支持することにより（Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｍｕｒａｌｉ  ＳＧ，  Ｈｏｌｓｔ  ＪＪ，  Ｎｅｙ  ＤＭ．  ２００８．  Ｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２９５（６）：Ｒ１７９４−Ｒ１８０２）転帰を改善することが従来より示されている。
【０７９２】
動物に、本明細書中に記載される方法に従う齧歯類の薬物動態実験の一部として試験物質を処置し、かつ短期的に投与した。この実験では、２つの試験物質を解析し、ビヒクルおよびＳＥＱＩＤ−２４０の栄養配合物を、１．５４ｇ／ｋｇで投与した。
【０７９３】
総ＧＬＰ−２の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
総ＧＬＰ−２を、総ＧＬＰ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＥＺＧＬＰ２−３７Ｋ）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡキットを３０分間室温で平衡化した後、アッセイを行った。キットのＧＬＰ−２の標準物質、クオリティコントロール１およびクオリティコントロール２を、５００μｌのｍｉｌｌｉＱ水で、５回上下させて溶解し、室温で５分間インキュベートし、次に、ボルテックスミキサーで軽く撹拌して混合した。検量線は、キットアッセイバッファーでＧＬＰ−２標準物質を１：１に連続希釈して、０ｎｇ／ｍＬのＧＬＰ−２を含む８つの測定点の検量線を生成することにより作成した。血漿試料を、氷中で融解し、約１１０９×ｒｃｆで１０分間遠心分離して不溶性材料を沈降させた。未処置の絶食ラット由来の絶食血漿マトリックスを、２０％（２×）で標準物質およびクオリティコントロールを２回の反復実験で試験するために調製した。
【０７９４】
１×洗浄バッファーを、４５０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水と５０ｍＬの１０×洗浄バッファーを混合することにより、清浄な５００ｍｌのガラスビンで調製した。条片を、３０〜３００μＬの８チャネルピペットを用いて適用した１×洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄することにより調製した。洗浄ごとに、洗浄バッファーを、廃棄容器にデカントし、積み重ねたペーパータオル上でプレートをすばやくたたいて残っている洗浄バッファーを除去した。
【０７９５】
第１の洗浄の後、アッセイバッファー９０μＬを、試料のウェルに添加し、アッセイバッファー中２０％のマトリックス５０μＬをすべての標準物質およびクオリティコントロールのウェルに添加した。試料１０μＬを各ウェルに添加し、標準物質およびクオリティコントロール５０μＬをマトリックス含有ウェルに添加した。試料、標準物質、およびクオリティコントロールは、４回の反復実験で試験した０ｎｇ／ｍｌのＧＬＰ−２の標準物質を除き、２回の反復実験で試験した。
【０７９６】
プレートを、プラスチックのプレートシールで密封し、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機上で、室温で２時間インキュベートした。第１のインキュベーションの後、プレートを、１×洗浄バッファーで３回洗浄し、洗浄容器にデカントし、重ねたペーパータオル上にすばやくプレートを反転させてたたいて、それぞれの洗浄後の過剰な洗浄バッファーを除去した。
【０７９７】
検出抗体１００μＬを各ウェルに添加し、プレートをプラスチックのプレートシールで密封し、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機で、室温で１時間インキュベートした。第２のインキュベーションの後、プレートを、１×洗浄バッファーで３回洗浄し、廃棄容器にデカントし、積み重ねたペーパータオル上にすばやくプレートを反転させてたたき、それぞれの洗浄後の過剰な洗浄バッファーを除去した。
【０７９８】
酵素溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを、プラスチックのプレートのシールで密封し、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機上で、室温で３０分間インキュベートした。第３のインキュベートの後、プレートを、１×洗浄バッファーで３回洗浄し、廃棄容器にデカントし、重ねたペーパータオル上にすばやくプレートを反転させてたたき、それぞれの洗浄の後の過剰な洗浄バッファーを除去した。
【０７９９】
基質１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを、プラスチックのプレートシールおよび不透明なホイルのシールで密封し、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機で、室温で２０分間インキュベートした。基質反応の後、反応停止溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートをゆっくりと振盪して混合した。
【０８００】
吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダーで４５０ｎｍおよび５９０ｎｍで測定した。測定した値は、４５０ｎｍと５９０ｎｍの吸光度の値の差であった。
【０８０１】
データを、グラフパッドプリズム６・０３を用いて解析した。検量線を、０ｎｇ／ｍｌのバックグラウンド値を減算した後にｌｏｇ（総ＧＬＰ−２（ｎｇ／ｍｌ））に対して作成した。ラット血漿中ＧＬＰ−２濃度を、シグモイドの４パラメータロジスティック方程式を使用して補間した。各ラットでの技術的な反復実験におけるＧＬＰ−２の２回の反復実験の濃度の平均値を時間に対してプロットした。積分した曲線下面積を、マイクロソフトのエクセルで計算し、各時点間の面積は、各生物学的反復実験に関して、線形‐対数のトラペゾイダル法を使用して面積の合計として計算した。
【０８０２】
図２９は、ＳＥＱＩＤ−００２４０およびビヒクル対照の４時間の過程にわたり計算した総ＧＬＰ−２濃度を示す。ビヒクルのＧＬＰ−２の濃度は、０時点と比較していずれの試料採取時点でも有意に変化しなかったのに対し、ＳＥＱＩＤ−００２４０は、ＳＥＱＩＤ−００２４０の強制経口投与後１５分（Ｐ＜０．００）、３０分（ｐ＜０．０００１）、および６０分（Ｐ＜０．００１）で、０時点と比較してＧＬＰ−２濃度の統計学的に有意な増加を示した（ダネットの多重比較検定）。ＳＥＱＩＤ−００２４０を、ダネットの多重比較検定の事後解析での通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより各時点でビヒクルと比較した。ＧＬＰ−２濃度は、０時点での処置のあいだでは有意差を示さなかった。ＧＬＰ−２濃度は、処置後１５分（ｐ＜０．００１）、３０分（ｐ＜０．０００１）、６０分（ｐ＜０．０００１）、および１２０分（ｐ＜０．０５）でビヒクルよりも統計学的に有意に高かった。これらのデータから、ＳＥＱＩＤ−００２４０の短期投与が、健康な絶食させた齧歯類においてＧＬＰ−２の分泌を誘導するが、ビヒクルは誘導しないことが示される。
【０８０３】
図３０は、最初の１時間および全４時間にわたり積分したＧＬＰ−２の曲線下面積を示す。ＧＬＰ−２の曲線下の面積は、０〜６０分、および０〜２４０分で積分した場合、ビヒクルと比較して、ＳＥＱＩＤ−００２４０処置では有意に大きかった（それぞれＰ＜０．００５およびｐ＜０．０１、対応のない両側スチューデントｔ検定）。このデータから、ＳＥＱＩＤ−００２４０の短期投与が、健康な絶食させた齧歯類において短期投与の最初の１時間以内でビヒクルと比較してＧＬＰ−２分泌を有意に刺激したことが示された。
【０８０４】
実施例２６：ヒトにおける血漿中インスリンおよびインクレチンのレベルに及ぼす経口送達した栄養性ポリペプチドの効果
タンパク質摂取に対するインスリンおよびインクレチンの応答は、アミノ酸の送達に基づいて予想される。この試験の目的は、２４０分の期間にわたり、ＳＥＱＩＤ−００４２６およびＳＥＱＩＤ−００１０５に応答した血漿中インスリン濃度の変化を試験することであった。１８〜５０才の４名の明らかに健常な対象の２つの群に、栄養性ポリペプチド配合物２０グラムを経口摂取させた。すべての対象を、試験を開始する前に一晩（＞８時間）絶食させた。静脈血試料を、栄養性ポリペプチドの経口摂取後の特定の時点（すなわち０分後、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、１５０分後、１８０分後、２１０分後、および２４０分後）で採取して、血漿中のインスリンおよびインクレチン濃度の変化を評価した。図３１は、ＳＥＱＩＤ−００１０５に対する対象全員のインスリン応答の平均値を示し、図３２は、本明細書中で記載されるように測定した、ベースライン（０分）からの反応倍率の平均値を示す。すべての数字に関するエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。第１相のインスリン応答は、０分〜９０分で起こる。第２相のインスリン応答は、９０分〜２１０分で起こる。すべての時間での一元配置ＡＮＯＶＡの比較から、血漿中インスリンが経時的に有意に変化する（ｐ＝０．００３）ことが示される。ダネットの多重比較検定から、１５分および３０分の時点のインスリンの値は、０分の時点と有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことが示される。
【０８０５】
図３３は、ＳＥＱＩＤ−００４２６に関するすべての患者の平均インスリン応答を示し、図３４は、本明細書中に記載されるように測定した、ベースライン（０分）からの応答倍率の平均値を示す。すべての数字のエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【０８０６】
図３５は、ＳＥＱＩＤ−００４２６に対するすべての患者の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の総反応の平均値を示し、図３６は、本明細書中に記載されるよう測定した、ベースライン（０分）からの反応倍率の平均値を示す。すべての数字のエラーバーは、平均値の標準誤差に対応する。
【０８０７】
実施例２７：チロシン、アルギニン、および／またはロイシンを含む栄養性ポリペプチドアミノ酸組成物を使用する骨格筋の細胞の生育およびシグナリングのＩｎ  ｖｉｔｒｏでの例証
ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳動物標的は、特にタンパク質合成を介した細胞生育の鍵となる制御因子であるタンパク質キナーゼである。ｍＴＯＲは、異なるキナーゼ特異性および別々のタンパク質のパートナーを有する２つの複合体のｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を核とする細胞代謝の主な制御因子として作用する（ＥＳＳ−０２０から引用）。
【０８０８】
ｍＴＯＲは、組織全体のタンパク質の合成を駆動する。増殖シグナリングに対するｍＴＯＲＣ１媒介応答は、アミノ酸により制御（ｇａｔｅ）される。リソソームに対する応答の局在化により、ｍＴＯＲ活性化は筋肉タンパク質の異化に関連する。ｍＴＯＲＣ１は、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、ロイシンおよびグルタミンにより制御できる。アミノ酸は、ｍＴＯＲＣ１を活性化させるための増殖因子を含むいずれかの上流のシグナルのため存在しなければならない（ＥＳＳ−０２０から引用）。
【０８０９】
これらの実験から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一のアミノ酸による刺激に応答したリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐｓ６）の下流のリン酸化を測定することにより、アルギニン、チロシン、およびロイシンがｍＴＯＲＣ１の活性化を調節できることが証明された。
【０８１０】
ラットの初代骨格筋細胞（ＲＳＫＭＣ）培養の培地を、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（カタログ番号：Ｒ１５０−５００，  カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。スタベーション培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２を、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号：  Ｄ９７８５，ミズーリ州セントルイス）から購入した。アミノ酸、フェノールレッド、またはフルコースを含まないカスタマイズしたスタベーション培地Ｍｏｄ．４を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号：１２５０００６２，ニューヨーク州 グランド・アイランド）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および他の増殖因子をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（カタログ番号：  Ｒ１５１−ＧＳ，カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。組織培養フラスコおよび透明底の９６ウェル組織培養プレートをＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（それぞれカタログ番号：  ４３０６４１および３５３０７２，ニューヨーク州コーニング）から購入した。トリプシン／ＥＤＴＡを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号：  ２５２００，  ニューヨーク州 グランド・アイランド）から入手した。ＤＰＢＳおよびＨＢＳＳもまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（それぞれ、カタログ番号：  １４１９０，  １４１７５）から購入した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）  ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）リボソームタンパク質  Ｓ６アッセイキットを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（カタログ番号：ＴＧＲＳ６Ｐ２Ｓ１０Ｋ）から入手した。
【０８１１】
ラットの初代骨格筋細胞（ＲＳＫＭＣ）培養
ＲＳＫＭＣを、本明細書中に記載されるプロトコルを使用して単離し、液体窒素中で凍結保存した。細胞を同様に、３７℃、５％のＣＯ２の組織培養インキュベーター（Ｍｏｄｅｌ  ３１１０，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、Ｔ７５組織フラスコ中のＲＳＫＭＣ培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）で維持した。細胞を、約９０％のコンフルエンシーに達する３日ごとに分割した。ＲＳＫＭＣ細胞を、Ｔ７５組織フラスコ中のＲＳＫＭＣ培地において１００％コンフルエンシーとなるまで培養した。培養培地を培養フラスコから吸引し、ＤＰＢＳ１０ｍｌで１回すすぎ、次に０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ１．５ｍｌを細胞に添加した。細胞をフラスコから剥離させた後、細胞培地１０ｍｌを添加した。培地を、１０ｍｌのピペットを用いて上下にピペッティングして、細胞をフラスコから剥離させた。次に、細胞を、ウェルあたり細胞５０，０００個の密度で、９６ウェル透明底組織培養プレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で一晩培養した後、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２の組織培養インキュベーターで、ＦＢＳおよびロイシンを含まないスタベーションＤＭＥ／Ｆ１２培地で４時間にわたり飢餓させて次に、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ緩衝塩類溶液）でさらに１時間インキュベートして飢餓させた。細胞を、スタベーション培地中の異なる濃度のロイシンにより１５分間および３０分間刺激した。また細胞を、５ｎＭのラパマイシン（Ｒ０３９５，Ｓｉｇｍａ）または１００ｎＭのインスリン（Ｉ９２７８，  Ｓｉｇｍａ）で、１５分間および３０分間処理した。細胞を、２０μＬの溶解バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中で、室温で１０分間、７２５ｒｐｍで振盪させて溶解した。細胞のライセートを、−８０℃で保存し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを、翌日に実施した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）リボソームタンパク質Ｓ６アッセイを、製造社のマニュアルに従って実施した。
【０８１２】
図３７は、異なるロイシンの濃度で測定した相対的なαスクリーンシグナル（ｙ軸）を示し、ロイシンが、初代培養ＲＳｋＭＣにおいてｒｐｓ６のリン酸化（ｐｈｏｒｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を用量依存的に刺激することを証明する。この刺激は、ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンにより用量依存的に阻害された。
【０８１３】
図３８は、ロイシンが、完全アミノ酸培地（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ  Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、およびそれぞれのＤＭＥ／Ｆ１２濃度で（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ）のみを含む最小限の１２種のアミノ酸混合物の両方において、初代培養ＲｓｋＭＣにおけるｒｐｓ６のリン酸化を用量依存的に刺激することを示す。（表Ｅ２７Ｂ参照）。
【０８１４】
初代培養骨格筋細胞を、２匹のスプラーグドーリーラットのヒラメ筋（Ｓｏｌ）、腓腹筋（ＧＳ）、および長指伸筋（ＥＤＬ）から入手した。図３９、４０、および４１は、ロイシンが、単離した初代培養細胞を使用してｍＴＯＲ  ＲＰＳ６経路を用量依存的に刺激することを示す。
【０８１５】
ｍＴＯＲ経路を完全に刺激するためには、アルギニン、チロシン、およびロイシンが必要である。細胞を、ウシ胎児血清を用いないＭｏｄ．４培地中で上述するように飢餓させ、次にそれぞれの１つのアミノ酸を欠いているＭｏｄ．４培地中で刺激した（Ｍｏｄ．４培地の組成およびＤＭＥ／１２アミノ酸レベルに関しては、それぞれ表Ｅ２７ＡおよびＥ２７Ｂ参照）。
【表１０５】
2016537402.tif 000119
【表１０６】
2016537402.tif 000120
【０８１６】
初代培養筋肉細胞を２時間飢餓させ、次に、０μＭまたは５００μＭの１つのアミノ酸によって、３７℃、５％のＣＯ２組織培養インキュベーター中で３０分間刺激した。この処置を、３回の反復実験で実施した。図４２は、ロイシン、アルギニン、およびチロシンの組み合わせが、そのＤＭＥ／Ｆ１２濃度で２０種のアミノ酸の全てが揃ったものと同じ度合いでＲＭＳＫＣのｍＴＯＲ経路を活性化するために必要かつ十分であること、およびＬｅｕ、Ａｒｇ、またはＴｙｒの個々の処置または２種類ずつの処置は、いずれも類似に応答できなかったことを証明する。
【０８１７】
図４３、４４、および４５は、ｒｐｓ６のリン酸化における他のすべての１９種のアミノ酸対他の２種のアミノ酸のバックグラウンド（たとえばＴｙｒおよびＬｅｕのバックグラウンドでのＡｒｇの用量反応）での、各アミノ酸（Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ）の用量反応の効果を示す。このデータは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、およびＴｙｒのあいだの相乗効果が用量依存的であることを示す。比較可能に高いＬｅｕおよびＴｙｒのバックグラウンドでの応答と、低用量のＡｒｇでの２０種のアミノ酸の応答を比較すると、他の１７種のアミノ酸により引き起こされる刺激の度合いが減少した。高用量のＡｒｇでは、両方のバックグラウンドでの応答が等しい。比較可能に高いＡｒｇおよびＴｙｒのバックグラウンドの応答と低用量のＬｅｕでの２０種のアミノ酸の応答を比較すると、ｒｐｓ６のリン酸化応答に差はない。比較可能に高いＬｅｕおよびＡｒｇのバックグラウンドでの応答と低用量のＴｙｒでの２０種のアミノ酸の応答を比較すると、他の１７種のアミノ酸は、ｍＴＯＲ応答をさらに増強できる。
【０８１８】
実施例２８：齧歯類による経口消費後のロイシンを多く含む栄養性ポリペプチドの安全性および毒性の欠如の決定
急性毒性試験を、齧歯類での栄養性ポリペプチドのＳＥＱＩＤ−００１０５、ＳＥＱＩＤ−００３６３、およびＳＥＱＩＤ−００４２６の予想安全性を確認するために実施した。
【０８１９】
各試験群は、５匹の雄性ラットおよび５匹の雌性ラット（１０匹のウィスター系、６〜７週齢、雄性：２２０〜２５０ｇ、雌性：１８０〜２００ｇ）を含んだ。試験配合物は、３５０ｇ／Ｌの栄養性ポリペプチドおよび対照としての水性バッファーであった。動物を、到着から１週間、環境に馴化させ、通常固形飼料を自由に与えた。投与前に、動物の体重を計測し、試験前血液を採取した。１０ｍｇ／ｌｇの１回投与を、強制経口投与により行った。２日目、６日目、および７日目に、体重および飼料重量を測定した。６日目に、動物をＥＤＴＡヘパリンナトリウム採血管に採血した。７日目に体重を採取し、動物を安楽死させ、直ちに剖検した。８つの臓器（心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、脳、膀胱、および小腸）を摘出し、重量を測定し、１０％のホルムアルデヒド中で保存した。試験の際に、ストレス、疼痛、および異常な活動の兆候に関する臨床上の観察を毎日行った。
【０８２０】
試験した３つすべての栄養性ポリペプチドに関して、動物においていかなる異常も認められなかったことから、タンパク質およびバッファーは良好に認容された。動物の活動は全て正常であり、疼痛または苦痛に関する他の兆候は観察されなかった。
【０８２１】
実施例２９：栄養性ポリペプチドの消化性の解析の例証
栄養性ポリペプチドの消化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化シミュレーションアッセイを介して解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化システムを使用して、胃および腸の中を通過する際にｉｎ  ｖｉｖｏで起こるような、生体近接可能な（ｂｉｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ペプチドおよびアミノ酸へのポリペプチドの分解をシミュレートした（Ｋｏｐｆ−Ｂｏｌａｎｚ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２０１２；１４２：  ２４５−２５０，    Ｈｕｒ，  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１；１２５：  １−１２）。胃腸消化シミュレーションはまた、消化に抵抗性のあるポリペプチドが吸収され、かつ感作を引き起こし得るため、潜在的なタンパク質のアレルゲン性を予測するものである（Ａｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１４：  １２６９−１２７３）。
【０８２２】
消化シミュレーションの際の栄養性ポリペプチドの半減期
未変化型からより小さなペプチドへのポリペプチドの分解を定量するための１つの測定基準として、未変化体の半減期がある。この実験では、栄養性ポリペプチドを、胃（ペプシン）および腸（トリプシンおよびキモトリプシン）で活性である一連のプロテアーゼに曝露し、未変化のタンパク質の存在を経時的に測定した。具体的には、栄養性ポリペプチドを、最初に２ｇ／ｌの濃度で、３７℃の模擬胃液（ＳＧＦ）（０．０３ＭのＮａＣｌ、ＨＣｌでｐＨ１．５に滴定、最終のぺプシン：ポリペプチド比率  １：２０ｗ／ｗ）で処置した。複数の時点で反応物からサンプリングを行い、０．２ＭのＮａ２ＣＯ３の添加によりクエンチした。ＳＧＦ中での１２０分後、残りの反応物を、模擬腸液（１８．４ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、最終トリプシン：キモトリプシン；基質の比率  １：４：４００ｗ／ｗ）と５０：５０で混合し、ＮａＯＨでｐＨ６．５に中和した。複数の時点で反応物からサンプリングし、２４０分までにトリプシン／キモトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）溶液の添加によりクエンチした。
【０８２３】
複数の時点での試料を、チップ電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウェスタンブロットにより未変化のタンパク質に関して解析した。チップ電気泳動（Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸ  ＩＩ）では、試料を、ＨＴ  ＬｏＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（製造社のプロトコルに従う）を使用して解析した。タンパク質のラダーを、分子量の決定（ｋＤＡ）および定量化のために１２個の試料ごとにロードした。ポリアクリルアミド電気泳動では、試料（１μｇ）を、製造社のプロトコルに従ってＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離した。このゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ）使用して撮像するか、またはｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｉＢｌｏｔ（登録商標）ウェスタン検出キット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造社のプロトコルに従って使用してニトロセルロース膜に転写した。タンパク質を、製造社のプロトコルに従ってＳＮＡＰ ｉ．ｄ．（登録商標）タンパク質検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ｂｌｏｋ（商標）‐ＰＯブロッキングバッファーで３：５０００に希釈した抗Ｈｉｓ［Ｃ−ｔｅｒｍ］−ＨＲＰ抗体でブロッティングすることにより検出した。ブロットを、製造社のプロトコルに従ってＬｕｍｉｎａｔａ  Ｃｌａｓｓｉｃｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での化学発光の検出を使用して撮像した。未変化のタンパク質の定量化を、ＩｍａｇｅＬａｂ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した密度測定により決定した。すべての解析方法に関して、各時点（検出される場合）のポリペプチドの相対濃度を経時的にプロットし、指数曲線とフィットさせて、未変化体の半減期を計算した。
【０８２４】
あるいは、試料を、１つの時点で残っている未変化のタンパク質のパーセンテージを決定することにより解析した（たとえば２分未満の半減期）。具体的には、ＳＧＦ消化物からのｔ＝０（酵素を含まない対照）およびｔ＝２分の試料を、チップ電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、および／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより記載されるように未変化のタンパク質に関して解析した。各時点でのポリペプチドの相対量を決定し、ｔ＝２で残っている未変化のタンパク質のパーセンテージを決定した。この方法を使用して決定した未変化体の半減期の値をそれぞれ、ｔ＝２で未変化で残っているタンパク質の５０％超または５０％未満を示すために、２分超または２分未満として記録する。いずれかの方法により決定した未変化のＳＧＦの半減期の結果を、表Ｅ２９Ａに記録する。
【表１０７】
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2016537402.tif 000122
【０８２５】
消化シミュレーションの際の栄養性ポリペプチドのアミノ酸の放出
ポリペプチドの消化物を定量化する追加的な方法は、消化シミュレーションシステムに曝露した後に存在する遊離アミノ酸の量を測定することである。この方法では、パンクレアチンといった酵素の混合物を、腸のプロテアーゼを刺激するために使用する。具体的には、ポリペプチドのアミノ酸への消化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのパンクレアチンベースの消化アッセイ、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用する遊離アミノ酸解析により解析した。栄養性ポリペプチドをＳＧＦ（０．９２ｇ／Ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ）、ＨＣｌでｐＨ１．５に滴定した０．０３ＭのＮａＣｌ）に、最終濃度４ｇ／Ｌで添加し、３７℃で１２０分間インキュベートした。１２０分後、Ｎａ２ＣＯ３を、１６ｍＭの最終濃度となるように添加して、ペプシン反応をクエンチした。得られた反応物を、２×濃縮ＳＩＦ（０．７８ｍｇ／ｍｌのブタのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、１８．４ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５））と５０：５０で混合し、２４０分間インキュベートした。複数の時点で反応物からサンプリングし、９５℃で５分間加熱することによりクエンチした。対照の試料はプロテアーゼフリーであった。
【０８２６】
複数の時点を、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （２０１０）に記載されるようなＲＰ−ＨＰＬＣアミノ酸解析を使用して、遊離アミノ酸に関して解析した。解析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。一次アミノ酸を、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を使用してオンライン上で、室温でプレカラムに誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ  ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）した。ＯＰＡ誘導体を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ−ＡＡＡ  ４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍのカラムを使用して４０℃で分離した。分離勾配は、１００％  ４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．８）から６５％のアセトニトリル／メタノール／水混合物（４５／４５／１０）まで変化した。解析物を、３４０ｎｍのＥｘ／４５０ｎｍＥｍでの蛍光により検出した。図４６は、ＳＥＱＩＤ−００１０５のパンクレアチン消化の際の遊離のＬｅｕ濃度の代表的な時間経過を示す。パンクレアチン消化の１２０分の時点での試料の遊離のＬｅｕ濃度を表２９Ｂにまとめる。
【表１０８】
2016537402.tif 000123
【０８２７】
消化シミュレーションの際の栄養性ポリペプチドのペプチドの放出
本明細書中に記載される、パンクレアチンベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化シミュレーションからの試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりペプチドに関して解析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のための試料を調製するために、試料のｐＨを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ３に調節し、ペプチドを、親水性‐親油性バランス（ＨＬＢ）固相抽出カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して抽出した。カートリッジを、アセトニトリル２ｍｌで活性化し、０．１％のＴＦＡ２ｍｌで平衡化した。試料をロードし、カートリッジを０．１％のＴＦＡ２ｍｌで洗浄し、７０％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡ１ｍｌで溶出した。溶出したペプチドを完全に乾燥させて、０．１％のＴＦＡ５０μＬ中に再構成した。溶出したペプチド（４μｌ）を、カラム上に充填し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムでのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを捕捉カラム上にロードし、３５０ｎＬ／分の７５μｍの解析カラム上で溶出させた。両方のカラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で充填した。１時間の勾配を使用した。質量分析計を、データ依存性モードで作動させ、ＭＳを、６０，０００ＦＷＨＭの分解能でＯｒｂｉｔｒａｐの質量分析計で行い、ＭＳ／ＭＳを、ＬＴＱリニアイオントラップ質量分析計で実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳのために選択した。データを、Ｍａｓｃｏｔを使用して適切なデータベースに対して検索してペプチドを同定した。ＭａｓｃｏｔＤＡＴファイルを、検証、フィルタリングのため、および試料あたり重複しないリストを作成するためにＳｃａｆｆｏｌｄソフトウェアで解析した。データを、９５％の最小タンパク質の値、および５０％の最小ペプチドの値を使用してフィルタリングした。
【０８２８】
固有のペプチドが、所定のＳＥＱＩＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるパンクレアチンの消化の２４０分の時点で検出された。ＳＥＱＩＤ−００１０５の試料で検出した固有のペプチドは、ＬＦＤＫＤＮＮＧＳＩＳ、ＦＤＫＤＮＮＧＳ、ＦＤＫＤＮＮＧＳＩＳ／ＦＤＫＤＮｎＧＳＩＳ、ＦＤＫＤＮＮＧＳＩＳＳ、ＦＤＫＤＮＮＧＳＩＳＳＳＥＬ、ＤＫＤＮＮＧＳＩ、ＤＫＤＮＮＧＳＩＳ、ＳＬＧＬＳＰＳＥ、ＮＥＩＤＶＤＧＮ、ＩＤＶＤＧＮＨ、ＩＤＶＤＧＮＨＱ、ＩＤＶＤＧＮＨＱＩＥ／ＩＤＶＤＧＮＨＱＩＥ、ＫＶＦＤＫＮＧＤＧ、ＶＦＤＫＮＧＤＧＬＩＳ、ＤＫＮＧＤＧＬ、ＫＬＴＤＡＥＶ、ＬＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮＩＱＱＦ、ＲＥＶＳＤＧＳＧ、ＲＥＶＳＤＧＳＧＥ、ＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩ、ＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮ／ＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮ、ＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮＩＱ、ＲＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮＩＱＱＦ、ＥＶＳＤＧＳＧＥＩ、ＥＶＳＤＧＳＧＥＩＮであった。ＳＥＱＩＤ−００４２６の試料に関して検出された固有のペプチドは、ＹＳＦＥＤＳＧＶＧＤＶＴ、ＹＳＦＥＤＳＧＶＧＤＶＴＧ、ＳＦＥＤＳＧＶＧＤＶＴＧ、ＦＥＤＳＧＶＧＤＶ、ＥＤＳＧＶＧＤＶＴ、ＥＤＳＧＶＧＤＶＴＧ、ＥＤＳＧＶＧＤＶＴＧＦ、ＤＳＧＶＧＤＶＴ、ＬＲＧｎＧＹＤ、ＬＲＧｎＧＹＤＩＤＶ、ＩＴＨＴＮＤＩＶＰＲ、ＨＴＮＤＩＶＰＲ、ＴＮＤＩＶＰＲ、ＮＤＩＶＰＲ、ＹＳＨＳＳＰＥ、ＤＩＶＫＩＥＧＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡＨＬ、ＫＩＥＧＩＤ、ＫＩＥＧＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＩＥＧＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＥＧＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＧＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤ、ＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰ、ＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰｎＩＰＤＩＰＡ、ＩＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡＨ、ＤＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＤＡＴＧＧＮＮｑＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤ、ＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰ、ＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＡＴＧＧＮＮｑＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＡＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡＨ、ＴＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰ／ＧＧＮｎＱＰＮＩＰＤＩＰ、ＧＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＧＧｎＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＧＧｎｎＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＧＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ／ＧＮＮｑＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＮＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＮＱＰＮＩＰＤＩＰＡ、ＰＮＩＰＤＩＰＡであった。
【０８２９】
複合体混合物中の未変化の栄養性ポリペプチドの半減期の決定
複合体混合物中の複数のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの未変化の半減期を、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胃消化シミュレーションを使用して決定した。簡潔に述べると、栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリーを、単一の混合物として１６８個のタンパク質をコードする遺伝子ライブラリーをクローニング、形質転換、かつ発現することにより本明細書中に記載されるように作製した。組み換え発現したタンパク質を、本明細書中に記載されるようにＩＭＡＣ精製により宿主細胞のタンパク質から精製した。
【０８３０】
タンパク質１６８個のライブラリーを、上述のようにＳＧＦで処理し、ｔ＝０およびｔ＝１０分の試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより未変化のタンパク質に関して解析した。はじめに、１０μｇの試料を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードし、ゲルの中を５ｃｍ泳動させた。このゲルを１００ｋＤから色素の先端まで１０個の分画に切断して、ゲルの切片を、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム、次いでアセトニトリルで洗浄することにより処置した。次にゲルの分画を、６０℃で１０ｍＭのジチオスレイトールで還元し、次に、５０ｍＭのヨードアセトアミドで、室温でアルキル化した。最終的に、試料を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３７℃で４時間消化し、ギ酸を添加することにより消化物をクエンチした。次に、試料を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェースで接続したＥａｓｙｎＬＣ  １０００  ＨＰＬＣシステムを使用してナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラム上にロードし、３５０ｎＬ／分で７５μｍの解析カラムから溶出させた。この両方のカラムに、ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８  ３μｍの樹脂（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ）を充填した。１時間の勾配を使用した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、それぞれ、Ｏｒｂｉｔｒａｐで７０，０００ＦＷＨＭの分解能および１７，５００ＦＷＨＭの分解能で実施した。最も多くに存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳで選択した。データを、Ｍａｓｃｏｔを使用して適切なデータベースに対して検索してペプチドを同定した。ＭａｓｃｏｔＤＡＴファイルを、検証、フィルタリングのため、および試料あたり重複しないリストを作成するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェアで解析した。データを、タンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要とする、１％のタンパク質およびペプチドの偽陽性率（ＦＤＲ）でフィルタリングした。検出したタンパク質およびそのスペクトルカウント（ＳｐＣ）の完全なリストを作成し、それぞれ回収したゲルの分画の関数として記録した。ＳｐＣは、所定のタンパク質に関して同定したスペクトルの数の計数であり、タンパク質の相対量の測定値として使用する（Ｌｉｕ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４，  ７６：  ４１９３−４２０１）。ＳＧＦの消化の１０分の時点で残っている未変化のタンパク質のパーセンテージを計算するために、ｔ＝１０分の試料中の未変化のペプチドを表すＳｐＣの数を、ｔ＝０分の試料中の未変化のペプチドを表すＳｐＣの数により除算した。未変化のペプチドを表すＳｐＣの数は、ｔ＝０分の試料中のそのタンパク質に割り当てた最も高いＳｐＣの数を有する分画および２つの隣接する分画のＳｐＣの合計として定義した。１０分での％未変化のタンパク質の結果を、表Ｅ２０Ｃに示す。チップ電気泳動により決定した、精製したタンパク質の無処理の半減期、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析により決定した、ＳＥＱＩＤ１６８個のライブラリーで検出したタンパク質に関して１０分で残っている未変化のパーセンテージを、表Ｅ２０Ｄにおいて１４のポリペプチドで比較する。ｔ＝１０分での残っている未変化のタンパク質のパーセンテージと半減期とのあいだの直線関係を解析し、Ｒ２値は、０．７２であると決定された
【表１０９】
2016537402.tif 000124
【表１１０】
2016537402.tif 000125
【０８３１】
実施例３０：栄養性ポリペプチドの粘度
強力な誘因性の自己会合相互作用の存在により、粘度の高い溶液が得られることが例証されている（Ｙａｄａｖ，  Ｓａｎｄｅｅｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９９．１２  （２０１０）：  ４８１２−４８２９．）。具体的には、反対荷電の残基の静電相互作用により、粘度の高い溶液が得られる（Ｌｉｕ，  Ｊｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９４．９  （２００５）：  １９２８−１９４０）。粘度の低い栄養性ポリペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸あたりの実効電荷または電荷の計算を使用することにより、および非常に高い正電荷または高い負電荷を有するタンパク質を選択することにより、選択することができる。この方法で選択したタンパク質は、相補的な静電相互作用が欠如しており、代わりに、自己会合能を限定する総合的な斥力を有することにより、溶液の粘度を下げる。
【０８３２】
栄養性ポリペプチド（ＳＥＱＩＤ−００１０５）および乳清の溶液を、相対粘度に関して測定した。両方のタンパク質を、解析にとって望ましい濃度で水に再懸濁した。粘度を、ＣＰＥ−４０スピンドルを有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＬＶＤＶ−ＩＩ＋ＰＲＯ  Ｃｏｎｅ／Ｐｌａｔｅを使用して測定した。全ての試験を、４Ｃおよび２５Ｃで実施した。試料の容量は、０．５ｍｌであった。温度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＴＣ−５５０ＡＰ−１１５  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｂａｔｈで維持した。すべての試料を、４Ｃで少なくとも２分間および２５Ｃで少なくとも１分間平衡化した。すべての読み取りを、１０％〜１００％のトルクで得た。図４７は、は４Ｃ（●）および２５Ｃ（○）でＳＥＱＩＤ−００１０５、ならびに４Ｃ（■）および２５Ｃ（□）の乳清に関してセンチポアズで測定した粘度を示す。
【０８３３】
ＳＥＱＩＤ−００１０５は、ある範囲のＰＨを通して負の実効電荷を有することが本明細書中で示されており、ＳＥＱＩＤ−００１０５は現在、複数の温度およびポリペプチド濃度で、ドミナントの単一電荷を含まないタンパク質の分散混合物である乳清よりも粘度が低いことが示されている。
【０８３４】
粘度が増加した溶液を作製するために、トランスグルタミナーゼを使用して、栄養性ポリペプチド間の酵素誘導型の永続的な共有結合架橋からなる網目構造を作製することにより、さらに粘性の溶液を作製できる。またこの酵素処理の後に熱処理を行って、栄養性ポリペプチドを含む粘性の溶液を作製することができる。粘度を増加させる架橋を含む栄養性ポリペプチド試料を作製するために、試料を、ｐＨ７．０でトランスグルタミナーゼ溶液と混合して、１：２５の、酵素対タンパク質重量比を得る。酵素触媒架橋反応では、実験のほとんどを４０℃で行う。
【０８３５】
実施例３１：栄養性ポリペプチドの溶解度および熱安定性の解析による証明
溶解度
タンパク質の溶解度を、再構成した凍結乾燥粉体の溶液、遠心濾過した溶液、および／または限外濾過した溶液のタンパク質の濃度を決定することにより評価した（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｌｙｏｐｈｏｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：  Ｔｈｅｏｒｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １０９−１３３；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ：  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ  （２００１）  ；  Ｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６９）  Ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｌｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １５（８）：  ６９９−７０７）。タンパク質の試料を、製造社の標準的なプロトコルを使用してＦｒｅｅＺｏｎｅ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）での凍結乾燥により乾燥させ、次に、バッファー中で所望の濃度に再度懸濁した。遠心限外濾過およびタンジェンシャル限外濾過を使用して、望ましい濃度に達するまでタンパク質の試料からバッファーを選択的に除去した。タンパク質溶液の遠心限外濾過は、望ましい濃度に達するまで、タンパク質の大きさに応じて、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤａの分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ  遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でタンパク質１０ｍｇを遠心分離（１０，０００×ｇ）することにより実施した。タンパク質溶液の限外濾過を、１２Ｌ／ｍ２／分のクロスフロー流速で、タンパク質の大きさに応じて、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤａの分子量のカットオフのＨｙｄｒｏｓａｒｔの限外濾過カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、ニューヨーク州ボヒミア）で実施した。ほとんどの処理では、経膜圧を２０ｐｓｉに維持し、望ましい濃度に達するまで実施した。
【０８３６】
上記の試料のタンパク質の濃度を、以下の方法：Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）、および総アミノ酸解析の１つまたはその組み合わせにより測定した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、製造社のプロトコルに従って実施した。２８０ｎｍでの吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で測定した。タンパク質の濃度を、Ａ２８０値と、ＰｒｏｔＰａｒａｍを使用して一次アミノ酸配列により計算したモル吸光係数とを使用して決定した（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，  Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００５．  ５７１−６０７．）。総アミノ酸を、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （２０１０）に記載されるように、酸加水分解の後にＨＰＬＣにより解析した。
【表１１１】
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【０８３７】
ｐＨ溶解度
タンパク質のｐＨ溶解度を、２．８〜７．１のｐＨ範囲にわたるクエン酸および二塩基性リン酸ナトリウムのバッファーカクテル中で決定した。ｐＨ溶液を、表Ｅ３１Ｂに概説されるように調製した。タンパク質を、凍結乾燥してバッファーカクテル混合物に再度懸濁するか、または濃縮して最終濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌでバッファーカクテル混合物中に入れた。対照として、タンパク質を８ｍＭの尿素溶液に溶解した。タンパク質溶液を室温で１０分間振盪した。タンパク質の濁度を、６５０ｎｍでのタンパク質溶液の吸光度を測定することにより決定した。次にタンパク質溶液を、１１００×ｇで１０分間遠心分離して、未溶解または沈殿したタンパク質を沈降させた。可溶性タンパク質分画（上清）を採取し、タンパク質濃度を、以下の方法：Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）、チップ電気泳動、ゲル電気泳動、および／または２８０ｎｍでの吸光度の１つまたは複数により測定した。ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＡ６５０により決定して、選択したタンパク質が８０％超可溶性のままであるｐＨ範囲を表Ｅ３１Ｃに記載する。
【表１１２】
2016537402.tif 000127
【表１１３】
2016537402.tif 000128
2016537402.tif 000129
【０８３８】
熱安定性
２．８〜７．１のｐＨ範囲にわたる、クエン酸および二塩基性リン酸ナトリウムのバッファーカクテル中のタンパク質の熱安定性（表Ｅ３１Ｂで上述されるように調製）を、製造社の標準的なプロトコルに従ってＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）熱安定性キット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して決定した。簡単に説明すると、１Ｘ  ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ  ＴＳ検出試薬を含むタンパク質溶液（約１０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄフィルターで蛍光をモニターしながら、プレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＭｘ，  Ｂｉｏｔｅｋ）を搭載したリアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して３０秒あたり０．５℃の割合で２５℃から９５℃に加熱した。凝集物の温度（Ｔａｇｇ）は、温度の関数として蛍光強度のトレースで最も険しい勾配が観察された温度として同定した。タンパク質のサブセットに関してｐＨ７．１での凝集物の温度を表Ｅ３１Ｄに記載する。タンパク質のサブセットに関するある範囲のＰＨでの凝集物の温度を、表Ｅ３１Ｅに記載する。
【表１１４】
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【表１１５】
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【０８３９】
熱によるアンフォールディング
タンパク質の熱によるアンフォールディングを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＣＳ／２  Ｃｈｉｒａｓｃａｎ分光光度計で円二色性によりモニターした。バッファー（２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中のタンパク質溶液（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）の遠紫外線の測定（２００〜２６０ｎｍ）を、光路長０．１ｃｍのセルを使用して、２０〜９０℃で５℃ごとに記録した。９０℃でのスペクトルを得た後、タンパク質の試料を直ちに２０℃まで冷却し、最終のスペクトルを記録した。融解温度（Ｔｍｅｌｔ）を、最も強力な勾配の温度として計算し、最終のスペクトルを最初の２０℃のスペクトルと比較して、タンパク質のアンフォールディングが可逆的であるか、または構造に永続的な変化が起こったかどうかを決定した。図４８は、ＳＥＱＩＤ−００１０５の代表的なＣＤスペクトルを示し、栄養性ポリペプチドが、９０℃であっても完全にはアンフォールドしておらず、２０℃に冷却すると本来のフォールディングに戻ることを証明している。
【０８４０】
実施例３２：栄養性ポリペプチドのグリコシル化
タンパク質に存在するグリカンは、溶解度、活性、および安定性などの特性にしばしば栄養を与える。栄養性ペプチドのグリコシル化のパターンを変化させることは、それらの生物学的な利用率、栄養上の品質、および産生配合物の特性にも影響を与えることができる。さらに、栄養性食品ペプチドの特定の糖のパターンは、ヒトのタンパク質の産生時のアミノ酸の吸収および外来性グリカンの組み込みの両方の動態に基づいて単離型栄養性食品ペプチドの摂取に対する代謝応答を増大させる。
【０８４１】
グリコシル化状態に関する宿主の選択
本明細書中に記載されるように、栄養性ポリペプチドを様々な宿主で産生した。宿主の選択は、生物物理学、消化、および免疫原性に関連を有する栄養性ポリペプチドのグリコシル化状態に影響を及ぼす。たとえば、発現用の宿主として、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）、およびチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる。大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびｐｉｃｈｉａなどの真核生物宿主と比較して非糖化（または最小限に糖化）した骨格を有するポリペプチドの産生能により発現宿主として使用される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒは、ポリペプチド骨格へのマンノースを多く含むグリカンの付加を駆動するその固有のグリコシル化機構により、タンパク質分泌宿主として選択される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓは、広範囲のオリゴマンノース多糖部位でグリカン構造の複雑性を減らす方向に宿主のグリコシル化の機構を改変できることが従来より証明されていることにより、タンパク質分泌宿主として選択される（Ｋａｉｎｚ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２００８）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ヒト細胞と類似するパターンでタンパク質をグリコリル化できるために発現宿主として選択される。その違いは、Ｇａｌ  α１−３  ＧａｌエピトープおよびＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ｇｃ）がいずれも、ＣＨＯ細胞により産生される糖タンパク質で見出されるが、正常なヒトグリカンでは見られない点である（Ｇａｌｉｌｉ，  Ｕｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３．３３  （１９８８）：  １７７５５−１７７６２）。同様に、ＣＨＯ細胞で産生された特定のタンパク質は、より酸性のアイソフォームを有しており、これは、シアル酸の高い含有量を示唆するものである。ヒトの胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３細胞）は、ヒトのタンパク質のグリコシル化能のため発現宿主として選択される。
【０８４２】
ゲルの電気泳動およびタンパク質の転写
グリコシル化を解析するために、ウェスタンブロットの解析を、真核生物および原核生物で産生されるタンパク質のグリコシル化プロファイルを評価して比較するために、特定のグリカン抗原を認識する抗体またはレクチンを用いて実施した。最初に、タンパク質の分離を、製造社のプロトコルに従って、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したゲル電気泳動により実施した。タンパク質を、製造社のプロトコルに従って、ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｉＢｌｏｔ（登録商標）ウェスタン検出キット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ゲルからニトロセルロースメンブレンへと転写した。タンパク質のバンド（ｂｒａｎｄ）を、製造社のプロトコルに従ってＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０  ｓｔａｉｎ  ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でポリアクリルアミドゲルを染色することにより可視化し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して撮像した。
【０８４３】
大腸菌およびＡ．ｎｉｇｅｒで発現したＳＥＱＩＤ−００３６３のグリコシル化プロファイル
タンパク質のマンノース含有量を、製造社の標準的なプロトコルに従って、糖タンパク質検出キット（ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｒｏｃｈｅ）を使用して試験した。はじめに、ＳＥＱＩＤ−００３６３（本明細書中に記載）、Ａ．ｎｉｇｅｒ（５μｇ）で発現させたＳＥＱＩＤ−００３６３の遺伝子をコードする発現ベクターと形質転換した大腸菌由来の全体の細胞抽出物（５μｇ）および可溶性の細胞ライセート（５μｇ）、ならびにＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの陽性対照のカルボキシペプチダーゼＹ（５μｇ）を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に充填した。タンパク質の分離および転写を、本明細書中に記載されるように行った。簡単に説明すると、ニトロセルロースメンブレンを、末端マンノース結合レクチンである、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｆｅｎｉｎ）（ＤＩＧ）標識ＧＮＡ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）とインキュベートした。次に膜を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ（ＡＰ）でインキュベートし、次に、ＡＰ基質溶液（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）と共にインキュベートした。ＡＰ染色の強度を、裸眼により定性的に可視化し、メンブレンを写真撮影した。図４９は、Ａ．ｎｉｇｅｒから単離したＳＥＱＩＤ−００３６３および大腸菌で組み換え発現させたＳＥＱＩＤ−００３６３の代表的なクマシー染色ゲル（パネルＡ）およびＧＮＡプローブしたウェスタンブロットのメンブレン（パネルＢ）を示す。レーン２では、１２０ｋＤａ周辺の突出したバンドは、グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３を表す。レーン３では、８０ｋＤ周辺のバンドは、非グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３を表す。これらの結果から、Ａ．ｎｉｇｅｒで発現したＳＥＱＩＤ−００３６３（図４９Ｂ、レーン２）は、末端マンノシル化タンパク質（図４９Ｂ、レーン３）であり、大腸菌で発現させたＳＥＱＩＤ−００３６３は、そのグリカンに末端マンノース残基を含まないことを証明する。
【０８４４】
グリカン解析のための食品からのタンパク質の抽出
亜麻仁（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｒｏｗｎ  Ｆｌａｘｓｅｅｄ、Ｆａｒｍｅｒｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｏｐ）、ヒヨコマメ（Ｇａｒｂａｎｚｏ  Ｂｅａｎｓ、３６５  Ｅｖｅｒｙｄａｙ  Ｖａｌｕｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ）、トウモロコシ（凍結したＳｕｐｅｒ  Ｓｗｅｅｔ  Ｂｉｃｏｌｏｒ  Ｃｏｒｎ、３６５  Ｅｖｅｒｙｄａｙ  Ｖａｌｕｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ）、ジャガイモ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｙｅｌｌｏｗ  ｐｏｔａｔｏ）、マッシュルーム（ｏｒｇａｎｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）、ブロッコリー（ｆｒｏｚｅｎ，  Ｂｒｏｃｃｏｌｉ  Ｆｌｏｒｔｅｓ，  ３６５  Ｅｖｅｒｙｄａｙ  Ｖａｌｕｅ）、トマト（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｒｏｍａ  ｔｏｍａｔｏ）、ブルーベリー（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｌｕｅｂｅｒｒｉｅｓ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｕｃｋ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、ブドウ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅｄ  Ｓｅｅｄｌｅｓｓ  Ｇｒａｐｅｓ，  Ａｎｔｈｏｎｙ’ｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ）、ウシ（８５％のウシのひき肉）、ニワトリ（骨や皮膚を含まないニワトリの太腿のひき肉，  Ａｉｒｃｈｉｌｌｅｄ）、ラム（ニュージーランドのラムのひき肉）、シチメンチョウ（シチメンチョウの大腿部分のひき肉）、タラ（Ｗｉｌｄ  Ｃｏｄ  Ｆｉｌｌｅｔ）、およびブタ（ブタひき肉）を、Ｗｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓから購入した。シカ肉を提供した。各食品供給源のアリコート（５０〜２，５００ｍｇ）を、−８０℃で凍結した。試料を乳鉢および乳棒で試料をすりつぶした後、１．０ｍｌの抽出バッファー（８．３Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、１％ｗ／ｖのＤＴＴ）を添加し、さらに乳棒ですりつぶすことにより、タンパク質を食物供給源から抽出した。試料を、微量遠心チューブに移し、室温で３０分間撹拌し、次に、５００μＬの１００μｍのジルコニウムビーズ（Ｏｐｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加して、さらに３０分間撹拌した。次に試料を、３０ＨｚのＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で３分間溶解し、２１，１３０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。酵母（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔ，  Ｗｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ）、ダイズのタンパク質単離物（Ｓｏｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ，  Ｗｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ）、およびコメのタンパク質の単離物（Ｓｏｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ，  Ｗｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ）を、抽出バッファーに溶解することにより調製した。試料の総タンパク質濃度を、製造社の標準的なプロトコルに従って、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。
【０８４５】
ウェスタンブロット解析によるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）の検出
Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）は、ほとんどの哺乳動物グリカンで見出されるが、ヒトタンパク質の糖タンパク質には存在していない。ヒトの生化学経路は、Ｎｅｕ５Ｇｃシアル酸を異物として認識せず、それによりゴルジ体への取り込みおよび新規に合成したタンパク質への組み込みの後で、ヒトの糖タンパク質で見出される量は微量である。しかしながら、生化学的に組み込まれるにも関わらず、免疫系は、外部由来のシアル酸を含む調節された表面の立体構造を外来種として認識する。ヒトの血漿中で検出されている抗−Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体は、Ｎｅｕ５Ｇ含有タンパク質供給源の摂取に応答して慢性炎症を引き起こす（Ｖａｒｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．  ‘‘Ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ’’，  ＰＮＡＳ  ２０１１）。Ｎｅｕ５Ｇｃの主な供給源として、ラム肉、牛肉、豚肉さらには乳製品が挙げられ、また魚でも微量見出される（Ｔａｎｇｖｏｒａｎｕｎｔａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＰＮＡＳ，  １００（２１）：  １２０４５−１２０５０）。
【０８４６】
ウェスタンブロット解析を抗Ｎｅｕ５Ｇｃを用いて実施して、食物から抽出したタンパク質、および細菌宿主により組み換え発現されたタンパク質のＮｅｕ５Ｇｃ含有量の特徴を調べた。タンパク質を、本明細書中に記載されるように肉の供給源から抽出した。同様にタンパク質を、本明細書中に記載されるように個々の発現ベクターでの形質転換、または本明細書中に記載されるように発現ベクターのライブラリーでの形質転換により、大腸菌および／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで組み換え発現させた。個々の発現ベクターを起源とするタンパク質、および場合によっては、発現ベクターのライブラリー由来のタンパク質を、本明細書中に記載されるようにＩＭＡＣ精製により精製した。大腸菌で組み換え発現させた精製タンパク質の混合物（タンパク質混合物１）を、約１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で各タンパク質を含むように調製した。この混合物およびそれが天然に産生される種に含まれるタンパク質は、ＳＥＱＩＤ−０００７６（ウシ）、ＳＥＱＩＤ−００２４０（ウシ）、ＳＥＱＩＤ−００２９８（ウシ）、ＳＥＱＩＤ−００３５９（ヒツジ）、およびＳＥＱＩＤ−００５１０（シチメンチョウ）である。
【０８４７】
それぞれの肉の抽出物（ウシ、ブタ、シカ、ラム、シチメンチョウ、ニワトリ、およびタラ）の試料、タンパク質混合物１、大腸菌（ＩＭＡＣ精製ライセート）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＭＡＣ精製ライセートおよび非精製の上清およびライセート）で発現させた栄養性ポリペプチド１６８個のライブラリー、ならびに大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ、ＧａｍｉＢ、およびＧａｍｉ２可溶性ライセートおよびＲｏｓｅｔｔａの全細胞）、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＰＨ９５１  Ｇｒａｃライセート）で発現させたｃＤＮＡライブラリーの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。本明細書中に記載されるようにタンパク質を分離し、転写した。Ｎｅｕ５Ｇｃを、ニワトリの抗−Ｎｅｕ５Ｇｃ（ＩｇＹ）一次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびヤギの抗ニワトリＩｇＹ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次抗体（両方ともｂｌｏｋ（商標）−ＰＯブロッキングバッファーで３：５，０００に希釈）を用いて、標準的な製造社のプロトコルに従ってＳＮＡＰ ｉ．ｄ．（登録商標）タンパク質検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。ブロットを、製造社のプロトコルに従って、Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｃｌａｓｓｉｃｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）での化学発光検出を使用して撮像した。図５０は、代表的なクマシー染色したゲル（パネルＡ）および抗Ｎｅｕ５Ｇｃプローブしたウェスタンブロットメンブレン（パネルＢ）を示す。この結果から、Ｎｅｕ５Ｇｃは、ウシ、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、およびニワトリの肉から抽出されるタンパク質には存在するが、大腸菌またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで組み換え発現されているこれら動物由来のタンパク質には存在しないことが証明された。
【０８４８】
ウェスタンブロット解析によるキシロースおよびフコースの検出
キシロースおよびフコースは、しばしば植物の糖タンパク質に存在する糖であり、ヒトに対して免疫原性である可能性がある糖である（Ｂａｒｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １３（６）：  ４２７−４３４）。食物供給源から抽出されたタンパク質および細菌宿主により組み換え発現されたタンパク質のキシロースおよびフコースの含有量を、抗キシロース抗体および抗フコース抗体を使用してウェスタンブロット解析により試験した。本明細書中に記載されるように、タンパク質試料を、食物供給源からの抽出、または購入したタンパク質の単離物の再構成のいずれかにより調製した。タンパク質を大腸菌で組み換え発現させ、本明細書中に記載されるようにＩＭＡＣ精製により精製した。大腸菌で組み換え発現させた精製タンパク質の混合物（タンパク質混合物２）を、約１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で各タンパク質を含むように調製した。この混合物およびそれが天然に産生される種に含まれるタンパク質は、ＳＥＱＩＤ−００１０３（コメ）、ＳＥＱＩＤ−００１０４（トウモロコシ）、ＳＥＱＩＤ−００３５２（トウモロコシ）、ＳＥＱＩＤ−００４８５（ヒヨコマメ）、ＳＥＱＩＤ−００５５９（コメ）、ＳＥＱＩＤ−００５９８（亜麻二）、ＳＥＱＩＤ−００６０５（マッシュルーム）である。
【０８４９】
各植物および真菌抽出物（酵母、亜麻二、ヒヨコマメ、トウモロコシ、ポテト、マッシュルーム、ダイズ、コメ、ブロッコリー、トマト、ブルーベリー、およびブドウ）の試料、タンパク質混合物２、西洋ワサビペルオキシダーゼ（陽性対照）およびフェチュイン（陰性対照）の試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。タンパク質の分離および移行を、本明細書中に記載されるように実施した。ウェスタンブロット解析を、標準的な製造社のプロトコルに従ってＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．（登録商標）タンパク質検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して実施した。キシロースを、それぞれ、ｂｌｏｋ（商標）−ＰＯブロッキングバッファーで３：５，０００および３：２，５００で希釈したウサギの抗キシロース一次抗体（Ａｇｒｉｓｅｒａ）およびロバの抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（ａｂｃａｍ）でブロッティングすることにより検出した。フコースを、それぞれｂｌｏｋ（商標）−ＰＯブロッキングバッファーで３：１０，０００および３：３，０００に希釈したウサギの抗フコース一次抗体（Ａｇｒｉｓｅｒａ）およびロバの抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（ａｂｃａｍ）でブロッティングすることにより検出した。ブロットを、製造社のプロトコルに従って、Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｃｌａｓｓｉｃｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で化学発光検出を使用して撮像した。図５１は、代表的なクマシー染色したゲル、抗キシロースでプローブしたウェスタンブロットメンブレン、および抗フコースでプローブしたウェスタンブロットメンブレンを示す。これらの結果から、キシロースおよびフコースはいずれも、亜麻二、ヒヨコマメ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、コメ、ブロッコリー、トマト、ブルーベリー、およびブドウから抽出した植物タンパク質に存在するが、大腸菌で組み換え発現させた植物および真菌供給源由来のタンパク質には存在しないことが証明される。
【０８５０】
栄養性ポリペプチドのグリコシル化を減少させるための、高いアスパラギン、セリン、および／またはスレオニンの質量組成を含むタンパク質の選択
栄養性ポリペプチドのグリコシル化状態は、グリコシル化部位の少ない配列を選択することにより減少できる。これらの部位は、Ｎ結合グリコシル化のためにアスパラギン、Ｏ結合グリコシル化のためにセリンおよびスレオニンを含む。これらの単離ポリペプチドは、ポリペプチドに沿って結合した多糖組成物のレベルの低下により、高いアミノ酸の質量パーセンテージを含み、これにより、栄養性ポリペプチドのグラムあたりの消化可能なアミノ酸量が多くなり、消費されると低い免疫活性を有する。栄養性ポリペプチドの骨格に沿って利用可能なグリカンのアクセプター部位のＮ結合グリコシル化は、アスパラギンのアミノ酸残基で主に起こる。アスパラギンが低レベルであることにより選択した異種性ポリペプチドの発現により、グリカン構造が減少したポリペプチドを単離することが可能である。栄養性ポリペプチドの骨格に沿って利用可能なグリカンのアクセプター部位のＯ結合グリコシル化は、セリンおよびスレオニンのアミノ酸残基で主に起こる。セリンまたはスレオニンが低レベルであることにより選択した異種性ポリペプチドの発現により、グリカン構造が減少したポリペプチドを単離することが可能である。
【０８５１】
栄養性ポリペプチドのグリコシル化を増加させるために高いアスパラギン、セリン、および／またはスレオニンの質量組成を有するタンパク質の選択
栄養性ポリペプチドのグリコシル化状態は、栄養性ポリペプチドのグリコシル化部位を多く含む配列を選択することにより増大させることができる。これらの部位は、Ｎ結合グリコシル化のためにアスパラギン、Ｏ結合グリコシル化のためにセリンおよびスレオニンを含む。グリコシル化の増加は、栄養性ポリペプチドの溶解度および熱安定性を増加させることができる。栄養性ポリペプチド骨格に沿って利用可能なグリカンアクセプター部位のＮ結合グリコシル化は、アスパラギンアミノ酸残基で主に起こる。アスパラギンが高レベルであることにより選択した異種性ポリペプチドの発現により、グリカン構造が増加したポリペプチドを単離することが可能である。栄養性ポリペプチドの骨格に沿って利用可能なグリカンアクセプター部位のＯ結合グリコシル化は、セリンおよびスレオニンのアミノ酸残基で主に起こる。セリンまたはスレオニンが高レベルであることにより選択した異種性ポリペプチドの発現により、グリカン構造が増加したポリペプチドを単離することが可能である。
【０８５２】
単離栄養性ポリペプチドからのグリカンの除去。
栄養性ポリペプチドのグリコシル化状態は、構造および物理的特性に影響を及ぼし得る。本明細書中に記載されるように、組み換え型宿主で発現させた栄養性ポリペプチドは、天然で起こるものとは異なるグリコシル化を有することができる。グリコシル化を有する栄養性ポリペプチドを産生する場合、グリカンを放出させて、化学的または酵素的な方法を使用して構造および物理的な特性を変化させることができる。一般的な科学的なグリカン放出方法は、ヒドラジン分解、およびアルカリ／還元状態（β脱離）である（Ｔａｋａｓａｋｉ，  Ｓｅｉｉｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ８３  （１９８１）：  ２６３−２６８．）。グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｆ２、ＰＮＧａｓｅＡ、もしくはＯ−グリカナーゼなどのエンドグリコシダーゼ、またはシアリダーゼ、αガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ガラクトサミニダーゼ、αマンノシダーゼ、βマンノシダーゼ、αフコシダーゼなどのエキソグリコシダーゼを使用してタンパク質から放出することができるが、具体的な酵素は、オリゴ糖の組成および結合に基づき選択される（Ｍｅｒｒｙ，  Ｔｏｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３．  ２７−４０．）。
【０８５３】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、糖タンパク質からほぼすべてのＮ結合オリゴ糖を除去する非常に有効な酵素的方法である。ＮＧａｓｅ  Ｆの消化は、アスパラギン残基をアスパラギン酸へ脱アミノ化し、オリゴ糖を未変化のままにする。エンドグリコシダーゼを使用してタンパク質を脱グリコシル化する場合、５００μｇの糖タンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）５０μｌに再度懸濁する。ＰＮＧａｓｅ  Ｆを、０．１Ｕ／ｍｌで添加し、溶液を３７Ｃで２４時間インキュベートする。反応が終了したか否かを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターする。
【０８５４】
グリカンによるＩｇＥ媒介型アレルギー応答のスクリーニング。
栄養性ポリペプチドに対するグリカン修飾の変化は、ＩｇＥ結合相互作用に影響を与える。アレルギー患者の約２０％以上が、しばしばＩｇＧを伴う、特異的な抗グリカンＩｇＥを生成する（Ａｌｔｍａｎｎ，  Ｆ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｙ，  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７）。ＩｇＥ媒介型免疫応答を誘導するポリペプチドでは、アレルゲンの場合と同様に、本明細書中に記載されるようにグリカンを修飾すれば、その本来の組成物と比較して単離ポリペプチドのアレルゲン性を低減し得る。この例では、ポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血清アッセイでのＩｇＥの結合性、および皮膚プリックテストによる反応性に関してスクリーニングする（Ｍａｒｉ，  Ａ  ｅｔ．  ａｌ．    ＩｇＥ  ｔｏ  Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ：    Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，  ２００２に記載）。
【０８５５】
グリカンによるアレルゲン性の応答（交差反応性の炭水化物の決定要因と呼ばれる）は、ＩｇＥ血清結合アッセイと皮膚のプリックテストの結果を比較することにより決定できる。アレルギー性疾患を示唆する呼吸器の症状を示す、選別していない一連の対象（アレルギーユニットと呼ばれる）を登録する。人口統計学および臨床データを、各患者に関して記録する。アナフィラキシーの臨床既往がある患者は、この試験から除外される。特異的免疫療法（ＳＩＴ）の過程をこれまでに受けたことがない患者は除外されない。処置患者全員に、単離型および未処置型の組成物の両方で、栄養性ポリペプチドのミョウバン吸着抽出物を投与した。統計学的目的のために、花粉のみで処置した患者を評価する。患者に、上述のアレルゲン性抽出物を使用して、標準的な手順および記録を行う皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）を受けさせる（Ｍａｒｉ，  Ａ．  ｅｔ．  ａｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ｔｏ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９）。ＳＰＴの後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断の手法用の採血に同意した患者から血清を得る。血清を必要があるまで−２０℃で保存する。皮膚の試験および採血に関するインフォームドコンセントは、アレルギーの診察の際に患者または介護者から入手する。
【０８５６】
全ての血清中の総ＩｇＥを決定する（Ｒａｄｉｍ，  Ｐｏｍｅｚｉａ，  Ｉｔａｌｙ）。アレルゲン特異的ＩｇＥを、製造社の指示に従ってＣＡＰシステムにより検出する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  スウェーデンウプサラ）。値６０．４  ｋＵＡ／ｌを、陽性とする。ＣＣＤ−ＩｇＥを検出するための単一の試験が存在しないため、ＩｇＥにより認識される炭水化物部分を有する栄養性ポリペプチドに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験が陽性であるが、同じ糖タンパク質に対してＳＰＴが陰性であるという結果の矛盾は、ＣＣＤ−ＩｇＥの存在を表すものと考えられる。ＩｇＥの検出は、同じアレルゲン性の抽出物に対してＳＰＴで陰性と記録された血清最も大きくランダムな試料で実施する。ＩｇＥとの結合を媒介するグリカン構造の修飾は、栄養性ポリペプチドの単離の際にＣＣＤ−ＩｇＥが検出される患者における分布のシフト、および変化したグリカン構造の確認により観察される。
【０８５７】
実施例３３：栄養性ポリペプチドのアミノ酸の薬物動態の動物での例証
薬物動態的（ＰＫ）試験は、栄養性ポリペプチド配合物の経口投与の後のアミノ酸の血漿中濃度を評価するために実施され得る。このような解析は、胃腸におけるタンパク質の消化の速度および度合い、ならびに消化の際に放出される遊離アミノ酸および／またはペプチドの生物学的利用率に関する情報を提供する。成年のヒトと類似する消化管通過時間（３〜４時間）を有する成長期のラットは、経口投与での薬物動態試験に適したモデルとして容認されている（ＤｅＳｅｓｓｏ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ（２００１）Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｒａｔｓ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ３９：  ２０９−２２８）。
【０８５８】
ラットの薬物動態試験
頸静脈留置カニューレ（ｊｃｖ）を有するオスのスプラーグドーリーラットを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始前に少なくとも２日間試験施設（Ａｇｉｌｕｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に馴化させた。用量投与前に、動物を、一晩（１１〜１３時間）絶食させて、試験が完了するまで絶食させたままにした。試験物質を、シリンジに取り付けた先端の丸い１８ゲージのステンレススチール製の経口針を介して経口投与した。投与した溶液量をより正確に決定するために投与の前後に、すべての投与シリンジの重量を記録した。一連の血液試料（〜３００μＬ）を、０時間（投与前）、ならびに投与後０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、および４時間でＪＶＣから回収した。血液試料を、抗血液凝固性Ｋ２ＥＤＴＡ、一般的なプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８３４０、全血中１：１００に希釈）、およびＤＰＰ  ＩＶ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＤＰＰ４、全血中１：１００に希釈）を含む採血管に採取した。採血の直後に、チューブをボルテックスミキサーで撹拌し、採取後１時間以内での遠心分離（３，５００ｒｐｍ、５℃）により血漿を処理するまで湿潤氷中で保存した。次に血漿試料を新しいチューブに移し、−８０℃で保存した。場合によっては、最後の採血後に、動物を安楽死させ、回腸末端およびその含有物を採取し、本明細書中に記載されるように解析した。
【０８５９】
血漿試料中のＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＬｙｓの濃度を、本明細書中に記載されるようにＨＰＬＣアミノ酸の解析により決定した。ＨＰＬＣアミノ酸解析の前に、不溶性の粒子を、１０分間の遠心分離（１１００×ｇ、４℃）により血漿試料から除去した。次に、可溶性分画の試料２５μＬを９６ウェルプレートに移し、一部の試料では、内部標準物質（ノルバリン、アジレント）を、最終濃度０．５ｍＭで各血漿試料に添加した。Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびサルコシン（Ｓａｒ）を含む、現在のＨＰＬＣアミノ酸解析では測定されないアミノ酸は、サプリメントアミノ酸キット（アジレント）で提供される個々の標準物質保存液を含む標準物質混合物を使用することと、試料のクロマトグラフィープロファイルを混合した標準物質のプロファイルと比較することとにより解析する。補助的な標準物質を含む溶液は室温で不安定であるため、補助的なアミノ酸の標準物質は、使用の直前に調製して、長くても２４時間以内に使用する。
【０８６０】
図５２は、表Ｅ３３Ａに列挙した用量での表記の栄養性ポリペプチドの経口投与後４時間にわたる、ラットから採取した血液試料中で測定した血漿中アミノ酸濃度（μｍ・時間）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）の変化（±ＳＤ）を示す。図５３は、ラットの血漿中のアミノ酸濃度を変化させる栄養性ポリペプチドの経口投与の一例としてのＳＥＱＩＤ−００１０５を示す。経口投与後にラットの血漿中で検出されるアミノ酸のプロファイルは、栄養性ポリペプチドのアミノ酸配列に依存した。たとえば、ポリペプチドＳＥＱＩＤ−００２４０、ＳＥＱＩＤ−００３３８、およびＳＥＱＩＤ−００３５２の経口投与は、血漿中のＬｙｓに関してＡＵＣ０〜４時間の変化を増加させたが、ＳＥＱＩＤ−００３６３、ＳＥＱＩＤ−００４２４、およびＳＥＱＩＤ−００４２６の投与は、血漿中のＬｙｓに関してＡＵＣ０〜４時間の変化を変えるものではなかった（図５２）。さらに、栄養性ポリペプチドＳＥＱＩＤ−００２４０は、血漿中のＰｈｅ濃度に変動を引き起こすことなく、必須アミノ酸（ＥＡＡ）を送達することができるポリペプチドの一例として作用する。図５４は、ラットへのＳＥＱＩＤ−００１０５（２．８５ｇ／ｋｇ）の経口投与に関する代表的な血漿中アミノ酸濃度対時間曲線を示す。図５４は、表Ｅ３３Ａに示される用量でのＳＥＱＩＤ−００１０５の経口投与後の血漿中Ｌｅｕの濃度の用量反応効果を示す。まとめると、これらの結果から、栄養性ポリペプチドの経口投与を使用して、ラットの全身循環に特定のアミノ酸プロファイルを送達できることが例証される。
【表１１６】
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【０８６１】
実施例３４：栄養性ポリペプチドの消化性の調節
複数のタンパク質修飾法を使用して、モデル栄養性ポリペプチドＳＥＱＩＤ−００３６３の構造を変化させた。これらの方法は、タンパク質の消化性および生物学的利用率における特定の構造特徴の関連性を評価した。これらの修飾として、グリカンの還元、タンパク質の加水分解、ジスルフィド結合の還元／アルキル化、およびタンパク質構造の熱変性が挙げられる。これらの修飾から得られる材料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化アッセイおよび場合によってはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを使用して消化の改善に関して評価した。これらの方法または類似の構造の変化を目的とする他の手段を、他の栄養性ポリペプチドに適用できる。
【０８６２】
酵素的脱グリコシル化
ＳＥＱＩＤ−００３６３は、高マンノースＯ結合型グリコシル化を含むことが予測される（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）。ＳＥＱＩＤ−００３６３の消化に及ぼすグリコシル化の作用を評価するために、マンノースのグリカンを、酵素により顕著に減少させた。非特異的なαマンノシダーゼ（Ｍ７２５７，  Ｌｏｔ  ＳＬＢＣ４３０３Ｖ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、Ｏ−グリカン内の全ての１‐３、１−４、および１−６グリコシド結合を切断した。このαマンノシダーゼは、いかなる非マンノースグリコシド結合も切断せず、この酵素は、Ｎ結合グリカンの放出に対して無効であると予測される。
【０８６３】
脱グリコシル化反応は、Ｊａｆａｒｉ−Ａｇｈｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａから変更を加えた。ＳＥＱＩＤ−００３６３のタンパク質保存液を凍結乾燥した粉末から、脱グリコシル化反応バッファー（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２ｍＭの塩化亜鉛、０．０１％の２−メルカプトエタノール（ｐＨ４．３））中で１００ｇ／Ｌの酵素濃度となるように再度懸濁した。試薬の保存液を脱グリコシル化反応液の中に最終容量０．５Ｌで希釈した。この反応を、１０ｇ／ＬのＳＥＱＩＤ−００３６３濃度およびＳＥＱＩＤ−００３６３  １ｍｇあたり０．５ＥＵのαマンノシダーゼ濃度で実施した。この反応物を、０．２μｍのフィルターを介して直接滅菌濾過して、脱グリコシル化反応バッファー２０Ｌ中の７×７０ｍｌ３．５ｋＤの透析カセットに直接加えた。この反応を、放出された糖（単糖／多糖）によるαマンノシダーゼの提唱されるフィードバック阻害を減少させるために、透析中で実施した。次に、この反応物を３７℃で６日間保存した。反応の過程において、ＳＥＱＩＤ−００３６３の約１０％が不溶性の凝集体形成により失われた。最後の（６日目）の時点で、反応物を透析から回収し、滅菌濾過し、濃縮し、１０％のリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）へのダイアフィルトレーションを行った。マンノースグリカンの還元の成功は、本明細書中に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＧＮＡウェスタンブロットで大きさが減少することによりモニターされた。脱グリコシル化したＳＥＱＩＤ−００３６３の高タンパク質濃縮配合物を作製するために、残りのプールを、最終濃度が約２５０ｇ／Ｌに達するまでＡｍｉｃｏｎのスピン濃縮器（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州ビレリカ）で濃縮した。高濃縮配合物は、４℃で可溶性のままであり、長期間この温度で保持された。
【０８６４】
タンパク質の加水分解
天然のタンパク質の調製物と比較して生物学的利用率を増加させる別の手法は、短いペプチドに加水分解することであった。乳清（Ｐｅｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）およびダイズ（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などの商品としてのタンパク質のタンパク質加水分解物は、サブチリシン媒介型のタンパク質分解を介して酵素を用いて作製される。
【０８６５】
サブチリシンは、ｐＨ８．５および５５℃で最も活性である（Ａｌｄｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ，  １９８６）。この実験の目的のために、モデルタンパク質酵素の凍結乾燥調製物を、得られたタンパク質溶液を約ｐＨ８にするために１００ｍＭの炭酸ナトリウムで２７５ｇ／Ｌに再懸濁した。サブチリシン（Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４Ｌ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を、モデルタンパク質酵素１ｍｇあたり５．９３ｘ１０−４  Ｕの濃度でタンパク質溶液に添加した。次に、反応物を、２５０ｇ／Ｌのモデルタンパク質酵素となるように希釈し、５５℃に２４時間移した。反応完了後、加水分解材料を４℃で保存した。
【０８６６】
反応の進行を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（５×１５０ｍｍ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  スウェーデンウプサラ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によりモニターした。
【０８６７】
タンパク質の還元およびアルキル化
ジスルフィド含有タンパク質を、ジスルフィド結合を分解し、かつ遊離チオールを安定化させるために還元かつアルキル化できる。この修飾は、すべてのジスルフィド架橋の構造を崩壊させ、さらに、ジスルフィド結合が分子内または分子外で再形成しないようにする。ＳＥＱＩＤ−００３６３は、ＳＣＲＡＴＣＨ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）により予測されるように、１０個のシステインおよび４個のジスルフィド結合を含む。
【０８６８】
ＳＥＱＩＤ−００３６３を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｒｅａｄｙ  Ｐｒｅｐ還元／アルキル化キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して６ｇ／Ｌの最終濃度で還元かつアルキル化する。還元／アルキル化反応を、製造社の指示により推奨されるように実施した。ＳＥＱＩＤ−０００３６３を、５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ８．０）中で還元かつアルキル化した。試料を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により解析した。
【０８６９】
熱誘導型タンパク質の不安定化
タンパク質の変性は、分子の規則正しい構造の破壊、すなわち、すべての四次構造、三次構造、および二次構造の一次構造への還元を含む。変性は、すべての非共有分子内相互作用、すなわち水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力相互作用、および疎水性相互作用を妨害する。加熱を使用して、これらの相互作用を妨害し、かつ天然のタンパク質を一次構造へと還元できる（ジスルフィド結合を除く）。
【０８７０】
ＳＥＱＩＤ−００３６３を、１０％ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３０ｇ／Ｌに希釈し、９５℃に迅速に加熱した。煮沸した後、タンパク質を熱処理から除去し、直ちに本明細書中に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化解析へと移行させた。
【０８７１】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾型のＩｎ  ｖｉｔｒｏでの消化性
天然のＳＥＱＩＤ−００３６３およびＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾型（すなわち、脱グリコシル化型、還元型およびアルキル化型、および熱変性型）の消化性を、本明細書中に記載される方法を使用して評価した。簡単に説明すると、ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型を、模擬胃液（ＳＧＦ）で処理し、様々な時点で残っている未変化のタンパク質の存在を、本明細書中に記載されるようにゲル電気泳動により解析した。さらに、パンクレアチンベースの消化システムシミュレーションに曝露後に存在する遊離アミノ酸の量を、本明細書中に記載されるように逆相ＨＰＬＣアミノ酸解析により解析した。ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型のＳＧＦでの消化の結果から、脱グリコシル化、還元およびアルキル化、および熱変性を介したＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾は、様々な度合いでタンパク質の消化性を高めることが例証される。ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型のパンクレアチンの消化の結果から、脱グリコシル化および熱変性を介したＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾が、消化の際に遊離のＬｅｕの放出を増強するが、還元およびアルキルを介した修飾は放出を増強しないが例証される。表Ｅ３４Ａは、１２０分の時点での指数関数減衰曲線および遊離のＬｅｕ（μｍ）から計算した半減期の値を示す。
【表１１７】
2016537402.tif 000133
【０８７２】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾型の生物学的利用率
ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型（すなわち脱グリコシル化型および加水分解型）の生物学的利用率を、本明細書中に記載される方法を使用して評価した。簡単に説明すると、ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型を、頸静脈にカニューレを留置したラットに経口投与し、４時間にわたり採取した血漿試料中の遊離アミノ酸の濃度を、ＨＰＬＣアミノ酸解析により決定した。ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型のラットの薬物動態試験で採取した血漿試料のアミノ酸解析を、図５５に示す。これらの結果から、ＳＥＱＩＤ−００３６３の加水分解により、ロイシン、セリン、スレオニン、および一般的には必須アミノ酸（ＥＡＡ）の生物学的利用率が増加したことが証明される。ＳＥＱＩＤ−００３６３の脱グリコシル化は、ロイシンまたはＥＡＡの生物学的利用率を増加させなかったが、セリンおよびスレオニンの生物学的利用率を増加させた。
【０８７３】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の修飾型の回腸での消化性
タンパク質の質は、アミノ酸の組成、消化性、および生物学的利用率の関数である。回腸の消化性アッセイを使用して、タンパク質摂取後の回腸末端におけるタンパク質の含有量（すなわちアミノ酸、窒素、乾燥物質重量）と、消化管内容物の含有量との差異を測定してもよい。回腸の消化性アッセイからの結果を使用して、アミノ酸、窒素、および乾燥物質の回腸の消化性の係数を計算でき、患者の消化性およびアミノ酸の生物学的利用率に関する知識を提供できる（Ｄａｒｒａｇｈ  ａｎｄ  Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ，  ２０００，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  １３０（７）：  １８５０Ｓ−１８５６Ｓ）。消化管全体にわたり決定した糞便の消化性係数は、大腸での微生物代謝により、アミノ酸の消化性および生物学的利用率を過剰評価する傾向がある。タンパク質の消化およびアミノ酸の吸収は、上部小腸で主に起こり、回腸の末端で事実上終了することから、回腸の消化性アッセイは、現在、単胃の哺乳動物におけるタンパク質およびアミノ酸の消化性を決定するための選択方法として容認されている。成年のヒトと類似の消化管通過時間（３〜４時間）を有する成長期のラットは、回腸の消化性アッセイに適したモデルとして容認されている（Ａｍｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ３８（５）：  ３６３−３６８）。
【０８７４】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の天然型および修飾型の経口投与でのラットの薬物動態試験を、本明細書中に記載されるように実施した。不消化性マーカーであるコバルトＥＤＴＡを、投与されるタンパク質溶液中で５０ｍｇ／Ｌで配合して、処置群と個々のラットとのあいだの消化管通過時間の差をモニターした。最後の採血後（ｔ＝４時間）、ラットを安楽死させ、回腸末端（盲腸の前の２０ｃｍの小腸）およびその含有物（消化管内容物）を、予め重量を測定した試験管に回収した。回腸に生理食塩水を流し、消化管内容物を集めた。消化管内容物のｐＨを、ＨＣｌで〜３．０に調節することにより、すべての酵素を不活性化させた。回腸の試料を、別々の予め重量を測定した１５ｍＬのコニカルチューブに入れた。全ての試料を、液体窒素で急速凍結し、さらに解析するまで−８０℃に保存した。個々の回腸および回腸の含有物の重量を計算し、各試料ごとに記録した。
【０８７５】
不溶性粒子を含む不均一な溶液として存在する消化内容物の試料を、本明細書中に記載されるようにＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイで使用して、タンパク質濃度を決定した。ビヒクル、天然のＳＥＱＩＤ−００３６３、脱グリコシル化したＳＥＱＩＤ００３６３６、および加水分解ＳＥＱＩＤ−００３６３を投与したラットから収集した消化内容物の試料中の平均総タンパク質濃度は、それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、および０．３ｍｇ／ｍｌであった。回収した消化管内容物の体積に基づき、ビヒクル、天然のＳＥＱＩＤ−００３６３、脱グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３、および加水分解ＳＥＱＩＤ−００３６３を投与したラットから収集した消化管内容物試料中の総タンパク質の質量は、それぞれ１．２ｍｇ、６．９ｍｇ、７．７ｍｇ、および２．２ｍｇであった。これらの結果から、タンパク質の濃度および総質量が、ビヒクルまたは加水分解ＳＥＱＩＤ−００３６３のいずれかを投与したラットでよりも、天然のおよび脱グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３を投与したラットの消化内容物中で高いことが証明される。これらの結果をまとめると、加水分解ＳＥＱＩＤ−００３６３は、天然または脱グリコシル化ＳＥＱＩＤ−００３６３よりもラットの胃腸系でより完全に消化されることが示唆される。
【０８７６】
回腸の消化性係数を決定するために、投与試料および回腸の消化内容物の試料のアリコートを、逆相ＨＰＬＣアミノ酸解析（Ｌｏｏｋｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，  １９８５，  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ６２（２）：９７−１０２）により総アミノ酸含有量、Ｋｊｅｌｄｈａｌ解析（Ｌｙｎｃｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｎｏ，  １９９９，  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，  ８２（６）：  １３８９−１３９８）により総窒素含有量、および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）（Ｔａｙｌｏｒ，  Ｈ．Ｅ．，  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）によりコバルト含有量に関して解析して、回腸のアミノ酸および窒素の消化性係数を決定する。
【０８７７】
実施例３５：活性を低下させるための栄養性ポリペプチドの処置
酵素的に活性の栄養性ポリペプチドの修飾は、タンパク質の酵素活性および構造上の安定性の両方を変化させることができる。経口投与した栄養性ポリペプチドが、アミノ酸の栄養素の送達に必要ではない活性を欠いていることは有益であり得る。さらに、非活性化は、その天然の対応物よりも消化可能であり、生物学的に利用可能とすることのできる不安定化を表す。酵素の修飾は、化学的処理または熱処理のいずれかを介して達成した。酵素活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイを介して測定した。
【０８７８】
活性アッセイ
ＳＥＱＩＤ−００３６３の不活性化を、グルコアミラーゼ活性アッセイにより試験した。グルコアミラーゼは、ｐ−ニトロフェニル‐α‐Ｄ‐グルコピラノシドをｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）およびグルコースへと加水分解するように作用する。１ｍＬあたりユニット（Ｕ）での酵素の活性を、４００ｎｍでのＰＮＰ放出（グルコアミラーゼ活性アッセイから改作した方法（Ｕ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｄｅｘ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；  ２０１２：１３１４−１３１５．））の吸光度を測定することにより決定した。０．３Ｍの炭酸ナトリウム中０．１２μｍｏｌ／ｍｌ、０．０６μｍｏｌ／ｍｌ、０．０３μｍｏｌ／ｍｌ、０．０１５、および０．００７５μｍｏｌ／ｍｌのＰＮＰ標準物質を使用して、以下の式ε＝Ａ４００ｎｍ／Ｃであって、式中、平均値が考慮されており、Ａ４００ｎｍが１０ｍｍの光路を備える分光光度計を使用して測定した４００ｎｍでの吸光度であり、Ｃが、μｍｏｌ／ｍｌでの標準濃度である、式を使用してミリモル吸光係数（ε）を決定した。試料を、標準物質の吸光度の範囲にある０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈して作製した。試料１００μｌを５０℃で５分間インキュベートした後、少なくとも１５分間５０℃で平衡化したＰＮＰＧ溶液（１００ｍｇのＰＮＰＧ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で１００ｍｌに希釈）を添加した。次に、この試料を、５０℃でインキュベートし、ＰＮＰＧを添加した１０分後に、０．３Ｍの炭酸ナトリウム１００μｌを添加して反応を終了させた。次に、４００ｎｍでの吸光度を測定し、以下：活性＝［（Ａ試料−Ａブランク）×０．３ｍＬ×希釈因子］／ε×１０分×０．１０μｍｏｌ／分／ユニット×０．１ｍＬであって、式中、Ａ試料は、４００ｎｍでの試料の吸光度であり、Ａブランクは、４００ｎｍでのブランクの吸光度であり、０．３ｍｌは、反応物の体積であり、１０分は反応時間であり、０．１０μｍｏｌ／ｍｌは、酵素の単位あたり切断したＰＮＰの量であり、０、１ｍｌは試料のアリコードである、式としてＵ／ｍｌで活性を計算した。１：１：１の０．１Ｍの酢酸溶液（ｐＨ４．５）：０．３Ｍの炭酸ナトリウム：ＰＮＰＧ溶液をブランクとして使用した。活性を、比活性（Ｕ／ｍｌまたはＵ／ｍｇ）または相対活性（すなわち対照タンパク質と比較）として記録する。
【０８７９】
非活性化に関するタンパク質の修飾
タンパク質酵素を、分子の酵素活性部位の化学誘導型の不安定化を介して不活性化することができる。酸化（漂白剤、Ｈ２Ｏ２、エチレンオキシド）；還元（ＤＴＴ、ｂＭＥ、ＴＣＥＰ）；カオトロープ（ＣａＣｌ２、尿素、Ｇｎｄ  ＨＣｌ、ＮａＳＣＮ）；高いｐＨ（Ｎａ２ＣＯ３、トリス塩基、Ｎａ２ＨＰＯ４）；低いｐＨ：（Ｎａ３クエン酸塩、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、酢酸、ホウ酸）；中性のｐＨ（Ｎａ−クエン酸塩、ＭＯＰ酸、ＭＥＳ酸、Ｎａ−酢酸塩）；界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ、ＭＰＤ）；キレート化（ＥＤＴＡ、クエン酸塩）を含む異なる化学分類および作用機構を示す試薬のサブセットをスクリーニングする実験を行った。
【０８８０】
ＳＥＱＩＤ−００３６３を、水中に３００ｇ／ｌで配合し、化学的な非活性化条件のアレイに１０倍で希釈した（最終濃度＝３０ｇ／Ｌ）。その後ＳＥＱＩＤ−００３６３を、非活性化から１０分後および非活性化から４日後に酵素活性に関してアッセイした（表Ｅ３５Ａ）。
【表１１８】
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【０８８１】
水の非活性化陰性対照と比較して、ＳＥＱＩＤ−００３６３は、６Ｍ  Ｇｎｄ・ＨＣｌおよび４Ｍの尿素などの強力なカオトロープ；炭酸ナトリウムの高ｐＨ配合物；および強力な酸化剤である次亜塩素酸ナトリウム（家庭用漂白剤）において、最も強い非活性化を示した。ｔ＝４日目では、これらの条件はすべて、処理の４日後に２０％未満の相対酵素活性を示した。強い酸化剤および強力なカオトロープの消費に関連した健康上のリスクにより、ｐＨの高いＳＥＱＩＤ−００３６３による処理は、酵素を非活性化する最良の条件として同定された。１０分の時点と比較して、４日目の時点で採取した試料から、室温での化学的な非活性化は、作用の速やかな工程ではないことが示唆される。非活性化の動態は、多くのアッセイの条件において非常に速いわけではないと思われる。
【０８８２】
複数のバッファー条件での加熱により実験で測定したＳＥＱＩＤ−００３６３の非活性化を試験した。ＳＥＱＩＤ−００３６３を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ９）、２０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１）、および水で、３ｇ／ｌに希釈した。次に、試料１００μＬを、周囲温度、６０℃、７０℃、８０℃、および９０℃で、ＰＣＲサーモサイクラーで５分間、各バッファーに関して処理した。各酵素の活性を、グルコアミラーゼ活性アッセイにより試験し、各活性を、周囲温度での水（対照）の活性に対して正規化した。この結果を以下の表Ｅ３５Ｂに示す。
【表１１９】
2016537402.tif 000135
【０８８３】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の酵素活性について様々な曝露時間での温度およびｐＨの作用をアッセイする、追加的な他因子性の実験を行った。ＳＥＱＩＤ−００３６３を、１００ｇ／Ｌに配合し、高いｐＨのスパイク、または高ｐＨバッファーへのダイアフィルトレーションの作用を、０時間から２４時間の時間経過で２５℃〜７０℃の温度の勾配に対して試験した。解析した後、試料を、１ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーのスパイクを使用して〜ｐＨ７に中和した。
【０８８４】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の実験の概略および設計は以下の通りである。ＳＥＱＩＤ−００３６３を１００ｇ／ｌに再懸濁し、０、２５Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ１０）を添加するか、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１０）へのダイアフィルトレーションで処理するか、または１０％のリン酸緩衝食塩水（ｐＨ９．０）へのダイアフィルトレーションで処理を行った。試料を、ｔ＝０時間、１時間、２時間、４時間、および２４時間での試料採取時点を含む時間経過にわたり、４０℃、５０℃、６０℃、または７０℃でインキュベートした。
【０８８５】
ＳＥＱＩＤ−００３６３の不活性化を、本明細書中に記載されるように活性アッセイを使用してアッセイした。試料を、比活性（Ｕ／ｍｇ）および肉眼での溶解度により、ゲル、粘体、または流体として解析した。この試験は、ＳＥＱＩＤ−００３６３が、温度およびｐＨの両方により酵素的に不活性化されることを見出した。一部の処置は、栄養性ポリペプチドの非可逆的な凝集およびゲル形成を引き起こし、これらの試料では、酵素活性を解析しなかった。この実験の結果からＳＥＱＩＤ−００３６３が、ｐＨ１０、２５℃で可溶性の状態で不活性化できることが示唆される。反応温度が上昇すると、タンパク質は不活性化のままであるが、不溶性となる。
【０８８６】
よって、ｐＨは、ＳＥＱＩＤ−００３６３の非活性化に関する重要な工程の変数として定義された。次に、室温でのｐＨの関数としてＳＥＱＩＤ−００３６３の不活性化を調べる試験を実施した。室温で実施できる工程は、加熱工程よりも費用が安く、スケールアップが容易である。ＳＥＱＩＤ−００３６３を、ｐＨ３．６で１００ｇ／Ｌに配合し、限外濾過膜を使用して、バッファーを、一連の炭酸ナトリウムバッファーへと交換した。ＳＥＱＩＤ−００３６３の溶液のｐＨは、バッファー交換過程で３．６から１１．０に上昇した。タンパク質の試料を、バッファー交換過程で、計画的に限外濾過システムから採取し、ｐＨの範囲を通して試料のセットを得た。これらの試料を室温で保持し、各試料を半分に分けた。各試料の半分を、２〜５時間後に酢酸ナトリウムバッファーで中和した。次に中和した試料を、記載されるように酵素活性に関してアッセイした。結果を表Ｅ３５Ｃにまとめる。
【表１２０】
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【０８８７】
同様に、ＳＥＱＩＤ−００３６３の加水分解による非活性化を、グルコアミラーゼ活性アッセイにより試験した。タンパク質の加水分解の工程は本明細書中に記載されている。加水分解が、対照と比較して７％まで活性を減少させることが見出された。
【０８８８】
他のアミラーゼ栄養性ポリペプチドの非活性化も試験した。ＳＥＱＩＤ−００４２４の非活性化を、本明細書中に記載されるようにグルコアミラーゼ活性アッセイにより試験したが、ここでは代わりに、ｐＨ５．０の酢酸塩バッファー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来の酵素に関して推奨される）を利用した。試料を、本明細書中に記載されるように、加水分解または煮沸により非活性化した。煮沸は、対照と比較して０％まで活性を減少させ、加水分解は５１％まで活性を減少させた。
【０８８９】
実施例３６：栄養性ポリペプチドの酵素活性の破壊
変異体タンパク質の構築
複数の変異を、酵素活性を有すると知られているモデルタンパク質（ＳＥＱＩＤ−００３３８，  ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０７１７０）に関してなし得る酵素的不活性化の度合いを決定するために試験した。このタンパク質では、基質結合部位は、４２位、１３４位、１６７位、および１７８位を含む。さらに、９１位にマグネシウムイオン結合部位が存在する。１アミノ酸変異を、いくつかの基質結合位置で作製した。変異体を発現させ、酵素活性について試験した。
【０８９０】
１アミノ酸変異体タンパク質を、２つの断片のＰＣＲ増幅により構築した。第１のフラグメントを、Ｈｉｓタグと適合性のオーバーハングを伴う遺伝子（ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＴＡＴＧ）の５’末端に結合するフォワードプライマーと、大腸菌中の標的アミノ酸に関して最も一般的なコドンを含むリバースプライマー（表Ｅ３６Ａ）と、変異の上流および下流での２０ｂｐの隣接領域とを使用して、増幅した。第２の断片は、変異の位置に特異的なフォワードプライマー（表Ｅ３６Ａ）と、遺伝子（ＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣ）の３’末端に結合するリバースプライマーとを使用して、変異部位の直後のタンパク質の３’末端を増幅する。標準的なＰＣＲ反応の条件をすべての断片で使用し、これは、０．５μＭのフォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、１Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１〜１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを、最終容量５０μｌで含む。サーモサイクル条件は、９８℃で３０秒間の初回変性後、９８℃で１０秒間の変性温度、５５〜６０℃で１５秒間の温度でのアニーリング、７２℃の温度での産物１ｋｂあたり１５秒間の伸長を３０サイクルである。１μｌのＤｐｎ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および５μｌの１０×ＣｕｔＳｍａｒバッファーを添加し、かつ３７℃で１時間インキュベートすることにより、テンプレートＤＮＡを最終産物から除去する。各ＰＣＲ産物を清浄にし、ゲル回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って濃縮し、２０μｌの滅菌水に溶出した後、次のアセンブリステップへの処理を行う。
【表１２１】
2016537402.tif 000137
【０８９１】
変異を、一文字略語での元のアミノ酸の後に、位置、および一文字略語での最終的なアミノ酸の順で明記する
【０８９２】
ＰＣＲで増幅した断片を、ギブソンアセンブリにより発現プラスミドへ挿入し、発現のためＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）細胞を形質転換させた。Ｔ７プロモーター、８×Ｈｉｓタグ、および終止コドンを含む発現プラスミドｐＥＴ１５ｂを、各ＰＣＲの断片のあいだに２０ｂｐのオーバーラップが存在し、ギブソンアセンブリにより適切にアセンブリされるように、プライマーＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＧＣＣおよびＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣを使用してＰＣＲにより増幅した。ギブソンアセンブリでは、各ＰＣＲ断片１μｌを、１Ｘ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、１０μｌの最終容量で混合し、５０℃で１時間インキュベートする。アセンブリの反応混合物を、２０μｌの水を添加することにより３倍希釈した。希釈した混合物３μｌによって、３０μｌのＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）細胞を形質転換した。単一のコロニーを採取し、プラスミドを抽出し、発現試験に移す前に配列を確認した。
【０８９３】
変異タンパク質の発現および精製
単一のコロニーを使用して、各ウェル中１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地１ｍｌを含む２ｍｌのディープウェルブロックに接種した。培養物を、３７℃および９００ｒｐｍで一晩、ディープウェルブロック振盪機で振盪した。ディープウェルブロックを使用して、６００ｍＵ／Ｌのグルコアミラーゼを含むＢｉｏＳｉｌｔａ  Ｅｎｂａｓｅ培地１ｍｌを含む別のディープウェルブロックに、０．１のＯＤ６００で接種した。培養物を１６時間、３７℃および９００ｒｐｍで振盪し、この時点で１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、培養物を誘導し、追加的なＥｎｂａｓｅ補助培地および別の６００ｍＵ／Ｌのグルコアミラーゼを、培養物を補充するために添加した。発現を、さらに６時間、３７℃および９００ｒｐｍで実行した。培養物を、室温で１０分間、３，０００×ｇでディープウェルブロックをスピンすることにより収集した。遠心沈降後、上清を注意深く除去し、細胞のペレットを−２０℃で凍結した。凍結した細胞のペレットを融解し、０．１ｍｍのジルコニウムビーズ０．３ｇを各試料に添加した後、０．５ｍｌのＰＢＳを添加した。細胞を、９６ウェルプレートアダプターを備えたＱｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，  ドイツヒルデン）で５分間ビーズを撹拌することにより、氷冷した室内（４℃）で溶解した。細胞のライセートを、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り出し、試料を採取して、チップ電気泳動によりタンパク質の濃度に関して解析した。試料は、２μｌの試料を７μｌのサンプルバッファーに添加し、９５Ｃで５分間加熱し、次に３５μｌの水を添加することにより調製した。解析を、ＨＴ  Ｌｏｗ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットまたはＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットを使用して完了した（製造社のプロトコルに従う）。タンパク質のラダーを、分子量の決定（ｋＤａ）および定量化（ｎｇ／μｌ）のために１２個の試料ごとに作製した。
【０８９４】
変異タンパク質を、製造社のプロトコルに従って、Ｈｉｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用して精製した。タンパク質の濃度を、クマシーブルーにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２８０ｎｍの吸光度により測定した。タンパク質を、キナーゼ活性アッセイのために４０ｍＭのトリスバッファーで希釈した。
【０８９５】
ＳＥＱＩＤ−００３３８のキナーゼ活性の決定
ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｍａｘアッセイを、Ｐｒｏｍｅｇａ（カタログ番号  Ｖ７００１，  ウィスコンシン州マディソン）から入手した。アデノシン一リン酸を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号  Ａ１７５２、ミズーリ州セントルイス）から入手した。５×キナーゼバッファーを、１．２１１ｇのトリス塩基（カタログ番号  ＢＰ１５２−２，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，  ペンシルバニア州ピッツバーグ）、６９２μＬ  １２％の塩酸溶液（カタログ番号  ＢＤＨ３０２６−５００ＭＬＰ，  ＶＷＲ，  Ｒａｄｎｏｒ，  ＰＡ）、１０．０ｍＬ  ５００ｍＭの塩化マグネシウム（カタログ番号  ＢＰ２１４−５００，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，  ペンシルバニア州ピッツバーグ）で調製し、全量をＭｉｌｌｉＱ水で５０ｍＬにし、０．２２μｍのＰＥＳフィルター（カタログ番号ＣＧＰ００５２５，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州ビレリカ）を介して滅菌した５０ｍｌのチューブへと濾過した。
【０８９６】
トリスバッファー中で３５μｇ／ｍｌの、１２個のＨｉｓタグ精製変異体タンパク質および野生型のタンパク質を、７．０μｇ／ｍｌおよび１．４μｇ／ｍｌに連続希釈した。ＭｉｌｌｉＱ水中の１０ｍＭのＡＭＰおよび１０ｍＭのＡＴＰの適量で５×キナーゼバッファーを希釈することにより、活性を試験するための０．５ｍＭのＡＭＰ／０．５ｍＭのＡＴＰ、およびバックグラウンド活性をアッセイするための０ｍＭのＡＭＰ／０ｍＭのＡＴＰのキナーゼ反応ミクスを調製した。２回の反復実験の反応を、希釈したＳＥＱＩＤ−００３３８６μｌと反応混合物９μｌを混合し、ピペッティングにより上下に混合し、３８４ウェルの白色ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）に分配することにより調製した。ＡＤＰの検量線は、ＭｉｌｌｉＱ水中で４ｍＭのＡＤＰを連続希釈し、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、および４ｍＭのＡＤＰの標準物質に関して１倍でキナーゼバッファーを添加することにより調製した。プレートを、ホイルプレートシールで被覆し、３０℃で３０分インキュベートした。キナーゼ反応の後、ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬５μｌを各ウェルに添加した。プレートを、ホイルプレートシールで密封し、室温で２時間、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機上に配置した。プレートを、プレートの振盪機から外し、室温で４０分間インキュベートした。次にプレートを、１５秒間、１１０９×ｒｃｆで遠心分離し、１０μｌのＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｍａｘ検出試薬を添加した。プレートを、ホイルプレートシールで密封し、室温で２時間、４５０ｒｐｍの水平のプレート振盪機で振盪した。次にプレートを、プレート振盪機から外し、室温で６０分間インキュベートした。プレートを、１５秒間１１０９×ｒｃｆで遠心分離し、発光を、ＥｎｓｐｉｒｅＡｌｐｈａプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で読み取った。
【０８９７】
ＡＤＰの検量線を使用して、基質の存在下または非存在下で試料ウェル中のＡＤＰの濃度を決定した。濃度を、Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）変換したＡＤＰ標準物質の発光値に非線形の４パラメータロジスティックを実施することにより決定した。バックグラウンドＡＤＰは、ほとんどの試料で検出限界未満であることが見出された。基質の非存在下でのＡＤＰのバックグラウンド濃度が計算可能である場合、これらの値の平均値を、基質をインキュベートしたウェルで計算されたＡＤＰ濃度から減算した。活性のノックアウトを、同じ濃度の精製野生型タンパク質と比較した活性のパーセンテージを出すことにより計算した。
【０８９８】
表Ｅ３６Ｂは、精製野生型のタンパク質と比較した変異体の平均パーセント活性を列挙する。すべての変異体は、野生型のタンパク質と比較して活性が減少している。キナーゼの変異体は、７μｇ／ｍｌで活性の差を示した。
【表１２２】
2016537402.tif 000138
【０８９９】
実施例３７：酵素活性を低下させるための分泌ポリペプチドの改変
変異タンパク質を、栄養性ポリペプチドの酵素活性を低減するために構築した。ＳＥＱＩＤ―００４０７の活性部位は、触媒ドメインの中心にある酸性残基である残基Ｄ２１７およびＥ２４９であると予測される。酵素活性がなく、かつ栄養素および健康にとって重要なアミノ酸を多く含むポリペプチドを産生するために、本出願人は、ＳＥＱＩＤ−００４０７の触媒活性を破壊するためにそれら２つの部位を変異させた。ＳＥＱＩＤ−００４０７のＤ２１７およびＥ２４９は、求核剤およびプロトンドナーまたはアクセプターとして作用して、これらのリガンドと水素結合を形成する。
【０９００】
ＳＥＱＩＤ−００４０７から酵素活性を除去するために、本出願人は、グルタミン酸からフェニルアラニンに変化する、Ｅ２４９での１アミノ酸変異を伴うタンパク質を作出した。この変異体は、２つのＰＣＲフラグメントをアセンブルすることにより構築した。第１のフラグメントは、変異部位の最大２０ｂｐ下流の酵素の５’末端を含む。第２のフラグメントは、変異部位の直後に始まる酵素の３’末端を含む。第１のＰＣＲフラグメントでは、特異的なＰＣＲプライマーを、標的変異部位と結合し、望ましい変異体アミノ酸のコドンを組み込むように設計した。ＴＴＴコドンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるフェニルアラニンに関して最も多く使用されるため、ＴＴＴコドンを使用した。２つのＰＣＲフラグメントをアセンブルし、ギブソンアセンブリ法（ＮＥＢ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）を使用して、５０℃で１時間プラスミドベクターに挿入した。この構築物を大腸菌の中に構築し、ＤＮＡシークエンシングにより確認した後、分泌および酵素活性のアッセイのために、この構築物によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換した。
【０９０１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の栄養性ポリペプチドの分泌
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発現細胞株の３つの別々のコロニーを使用して、ディープウェルブロック（９６平方ウェル）中に、Ｃｍ５を含む２ｘＬ−Ｍａｌ培地（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ｌのマルトース）１ｍｌを接種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、マイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で、３７℃および８８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩の培養物を使用して、新鮮な、２ｘＬ−Ｍａｌ、Ｃｍ５培養物を、初回密度ＯＤ６００＝０．１でディープウェルブロック中に接種した。これらの発現培養物を、ＯＤ６００＝１．０となるまで（約４時間）３７℃、８８０ｒｐｍでインキュベートし、この時点で、イソプロピルβ‐Ｄ−１オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１Ｍの最終濃度で添加し、４時間インキュベーションを継続することにより誘導した。４時間後、各培養物の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。遠心沈降の後、培養物の上清を、注意深く除去し、新規のブロックに移し、細胞のペレットを−８０℃で凍結した。分泌したタンパク質のレベルを決定するために、上清をアッセイして、チップ電気泳動により関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。簡単に説明すると、２μｌの試料を７μｌのサンプルバッファーに添加し、９５Ｃで５分間加熱し、次に、３５μｌの水を添加することにより、試料を調製した。解析を、ＨＴ  Ｌｏｗ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットまたはＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットを使用して完了した（製造社のプロトコルに従う）。タンパク質のラダーを、分子量の決定（ｋＤａ）および定量化（ｎｇ／μｌ）のために１２個の試料ごとに作製した。
【０９０２】
アミラーゼ活性アッセイ
ＳＥＱＩＤ−００４０７は、デンプンなどの多糖を単糖または二糖に分解する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるαアミラーゼである。特定の変異体から酵素活性が除去されたことを例証するために、酵素を分泌するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを、デンプンを含む寒天プレートで平板培養した。酵素活性が存在する場合、分泌された酵素はデンプンを分解し、ヨウ素により染色されると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーの周辺にハローが存在する。１％のデンプンプレートは、２５ｇのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ−Ｍｉｌｌｅｒ、１０ｇのデンプン、１５ｇの細菌用寒天、および１Ｌの水を混合することにより作製した。寒天が固化した後、１０ｍＭのＩＰＴＧをデンプンプレートに添加した。変異体ポリペプチドを発現するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株の単一のコロニーを、３７℃で４時間、５ｍｌのＬＢに接種し、液体培養物５０μｌを、デンプンプレートの中心にスポットした。２０時間生育させ、分泌を誘導した後、１０％のヨウ素をデンプンプレートに添加して、デンプンを染色した。野生型酵素が分泌されれば、細胞の周辺に大きいハローが作製される。しかしながら、改変酵素が分泌されれば、酵素を有しない空のベクターを発現する陰性対照細胞株と類似して、ハローの面積は減少する。表Ｅ３７Ａは、細胞の面積と比較したハローの面積を定量化する。ハローと細胞とのあいだの面積の差は、改変した変異体よりも野生型で大きいことが示される。示されるデータから、本出願人は、酵素活性が低下した分泌型栄養性ポリペプチドの改変を証明した。
【表１２３】
2016537402.tif 000139
【０９０３】
実施例３８：ポリペプチドの活性を調節し、かつ必須アミノ酸含有量を多くするための栄養性ポリペプチドアミノ酸含有量の改変
アミノ酸含有量の多い分泌ポリペプチドの改変を例証するために、本出願人は、高レベルでタンパク質を分泌することが知られている微生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを選択した。ＳＥＱＩＤ−００４０７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける主要な分泌タンパク質として同定された。ＳＥＱＩＤ−００４０７に関する配列の保存および結晶構造のデータを使用して、本出願人は、タンパク質の構造上の安定性および／またはタンパク質を分泌する宿主生物の能力に負の影響を与えることなく変異に対して寛容であると予測される連続領域を各タンパク質内で同定した。
【０９０４】
本出願人は、構造タンパク質のデータバンクエントリー１ＵＡ７に記録されるＳＥＱＩＤ−００４０７の二次構造を解析した。本出願人は、αへリックスまたはβシートの一部ではないタンパク質の配列の中に１９個のループ領域を同定した。これらのループ領域は、以下のアミノ酸残基：７３−７６、１３０−１３３、１４７−１５２、１５７−１６１、１８９−１９２、２２２−２２７、２３９−２４４、２８３−２８６、２９１−２９８、３０５−３０８、３１８−３２３、３３６−３４０、３５６−３６０、３６５−３６８、３８７−３９２、４１７−４２１、４２８−４３２、４３７−４４２、および４６４−４６６により定義される。長さがアミノ酸４個未満のループ領域は、変異として考慮しなかった。
【０９０５】
進化上の配列空間での配列の保存もまた、構造上の安定性および分泌の適格性を維持しながらの改変の影響を受けやすい位置を同定するために考慮した。相同配列のファミリーの中であまり保存されない位置は、本質的に可変であり、活性に影響を及ぼすことなくより変異の影響を受けやすく、本質的に構造と関連している。あまり保存されない位置を発見するために、本出願人は、ＮＣＢＩの保存ドメインデータベースから、ＳＥＱＩＤ−００４０７の触媒ドメインを含む３１個のタンパク質配列を含むｐｆａｍ００１２８のアライメントをダウンロードした（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  Ａ．，  Ｚｈｅｎｇ  Ｃ．，  Ｃｈｉｔｓａｚ  Ｆ．，  Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  Ｍ．  Ｋ．，  Ｇｅｅｒ  Ｌ．  Ｙ．，  Ｇｅｅｒ  Ｒ．  Ｃ．，  Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｎ．  Ｒ．，  Ｇｗａｄｚ  Ｍ．，  Ｈｕｒｗｉｔｚ  Ｄ．  Ｉ．，  Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ  Ｃ．  Ｊ．，  Ｌｕ  Ｆ．，  Ｌｕ  Ｓ．，  Ｍａｒｃｈｌｅｒ  Ｇ．  Ｈ．，  Ｓｏｎｇ  Ｊ．  Ｓ．，  Ｔｈａｎｋｉ  Ｎ．，  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｒ．  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈ．  Ｂｒｙａｎｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （２０１３）  ４１：Ｄ３４８−５２）。また本出願人は、ＳＥＱＩＤ−００４０７を使用してＮＣＢＩのタンパク質の参照配列データベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索を実施し（Ｐｒｕｉｔｔ  Ｋ．  Ｄ．，  Ｔａｔｕｓｏｖａ  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｍａｇｌｏｔｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ核酸ｓ  Ｒｅｓ．  （２００５）  ３３：Ｄ５０１−５０４）、ＳＥＱＩＤ−００４０７と相同の５００個の配列を得た。両方の場合で、ＢＬＯＳＵＭ６２位置に特異的なスコア行列、−１１のギャップペナルティ、−１のギャップ伸長ペナルティ、および０．００５のアライメント包有ｅ値カットオフを使用して、ｉｔｅｒａｔｉｏｎ１を実施した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ    Ｓ．  Ｆ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９７）  ２５：３３８９−３４０２）。すべてのタンパク質配列のアライメントを使用して、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索の一部として各クエリ配列に特異的な位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）を作製した。ＰＳＳＭから、本出願人は、各ループ内の各位置での陽性ＰＳＳＭスコアに関連する異なるアミノ酸の数、ならびに各位置での必須アミノ酸置換に関するＰＳＳＭスコアの合計および平均値を計数することにより、変異に対して寛容であると予測される領域を同定した。さらに、各ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索から得た複数の配列アライメントから、本出願人は、
【数１０】
2016537402.tif 000140
（式中、Ｓｊは、位置ｊでのエントロピーであり、ｐｉは、位置ｊでアミノ酸ｉを観察する確率である）により定義されるように、各位置のアミノ酸のエントロピーを計算した。
【０９０６】
これらの変異に対する寛容の測定値を使用して、本出願人は、必須アミノ酸への変異に対して寛容であると予測される４つのループ領域を同定した。同定した領域が必須アミノ酸を多く含むように、本出願人は、選択された任意の位置が、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、もしくはＭ（Ｚを意味する）、またはＲ、Ｋ、Ｔ、Ｉ、もしくはＭ（Ｘを意味する）のいずれかであり得るコンビナトリアルコドンライブラリーを使用した。必須アミノ酸への変異に関して選択したそれぞれのループ領域では、それぞれの可変の位置に、疎水性残基のその相対的な寛容性に応じてＺまたはＸを割付した（そのそれぞれのＰＳＳＭ値に基づく）。疎水性残基に寛容である位置に、Ｚを割付し、コドンＮＴＮを使用して遺伝的にコードした。親水性残基により寛容である位置に、Ｘを割付し、コドンＡＮＲを使用して遺伝的にコードした。本出願人は、ＳＥＱＩＤ−００４０７の同定された可変領域の１つ（１４７〜１５３）において、グリシン残基を、この領域の立体構造の柔軟性を高める試みでループの中心に挿入したことに注目する。ＳＥＱＩＤ−００４０７に関して、同定された領域の配列を表Ｅ３８Ａにまとめる。
【表１２４】
2016537402.tif 000141
【０９０７】
ライブラリーの設計および構築
可変領域の同定に基づき、本出願人は、本明細書中で説明されるように各可変領域を増幅できるプライマーを設計した。たとえば、４つの可変領域が存在する場合、本出願人は、４つの可変フラグメントを作製するために４対のプライマーを必要とする。ステップ１で、本出願人は、Ｎ末端ＡｍｙＱシグナルペプチドおよびｐＧｒａｃプロモーターの下流と融合したＳＥＱＩＤ−００４０７を含むｐＥＳ１２０５をテンプレートとして使用した。ｐＥＳ１２０５は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のａｍｙＥ遺伝子（ＡｍｙＥシグナルペプチドをコードする最初の９３ｂｐを含まない）に加えてＣ末端の１×ＦＬＡＧタグをコードする１９０５ｂｐのＤＮＡフラグメントを含む、ベクターのｐＨＴ４３（ＭｏＢｉＴｅｃ）の誘導体である。ａｍｙＥ：：１ＸＦＬ：ＡＧ配列を、ｐＨＴ４３上でコードされるＳａｍｙＱ配列とインフレームでクローニングした。フラグメント１、２、３、４では、フォワードＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５３、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５４、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５５、およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５６は、可変領域の前に２５塩基の定常配列、次に、可変領域を表す縮重配列、および可変領域の下流で２５塩基の定常配列を含む。フラグメント１、２、３では、リバースプライマーＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６１、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２、およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６３は、それぞれ次の可変領域の上流２５塩基の逆相補的配列を含む。フラグメント４では、リバースプライマーＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４は、可変領域４とは任意に離れた距離で２５塩基の逆相補性配列を含む。４つの別々のＰＣＲ増幅を、ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、および製造社により推奨される反応パラメータを使用して行った。別々の反応として、４つの野生型のフラグメントＷＴ−ｆｒａｇ−１、ＷＴ−ｆｒａｇ−２、ＷＴ−ｆｒａｇ−３およびＷＴ−ｆｒａｇ−４を、テンプレートとしてのＰＥＳ１２０５、ならびにそれぞれのプライマー対ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６１、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５８＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５９＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６３、およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６０＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４を使用して作製した。すべてのＰＣＲフラグメントを、ゲル精製した。ステップ２で、２つの別々のＰＣＲ反応を設定した。第１のＰＣＲ反応は、テンプレートとして等モル比のフラグメント１および２と、プライマーとしてのＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２を含む。第２のＰＣＲ反応は、等モル比率のフラグメント３および４と、プライマーとしてのＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５９およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４とを含む。両方の反応において、各野生型のフラグメントを、各可変フラグメントに存在するライブラリーメンバーのモル比で添加した。フラグメント５および６を、ゲル精製し、かつステップ３で、等モル比のテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応で使用するプライマーは、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５��６４を含む。ベクターＰＣＲ産物を、ｐＥＳ１２０５と、プライマー対ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６５およびＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６６とを使用して作製した。フラグメント７およびベクターＰＣＲ産物の両方をゲル精製し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して共にクローニングし、クローニングした宿主の大腸菌Ｔｕｒｂｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造社の指示に従って形質転換した。５０個のコロニーをシークエンシングして、ライブラリーの多様性を決定した。次に、寒天プレート上のコロニーをＬＢ培地に懸濁し、プラスミド精製のために収集した。同様に、本出願人は、変異体の設計で同定された、すべての可変位置で９個の特異的なアミノ酸Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｗに変化させたＳＥＱＩＤ−００４０７の９個の特異的な変異体を作製した。特異的な変異体プライマーは、名称の一文字アミノ酸略語により記載する。全てのプライマーを表Ｅ３８Ｂに列挙する。
【表１２５】
2016537402.tif 000142
2016537402.tif 000143
【０９０８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株の構築
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞株（ＭｏＢｉＴｅｃ，  ドイツゲッティンゲン）を発現宿主として使用した。ＷＢ８００Ｎは、十分に研究された細胞株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８）の派生株であり、８つの細胞外プロテアーゼ（ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ、およびｗｐｒＡ）をコードする遺伝子を欠失により、分泌タンパク質のプロテアーゼ分解を低減するように改変されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの形質転換を、製造社の指示に従って実施した。ＳＥＱＩＤ−００４０７の変異体構築物のライブラリー約５μｇによって、ＷＢ８００Ｎを形質転換し、単一のコロニーを、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天上で平板培養することにより３７℃で選択した。９個の特異的な変異体に関して、特異的なＳＥＱＩＤ−００４０７変異体１μｇによってＷＢ８００Ｎを形質転換し、単一のコロニーを、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天上で平板培養することにより３７℃で選択した。
【０９０９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのライブラリーのスクリーニング
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳＥＱＩＤ−００４０７ライブラリーの約８００個の個々の形質転換体を使用して、ディープウェルブロック（９６平方ウェル）中、Ｃｍ５を含む２×Ｍａｌ培地（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、および１０ｇ／ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ｌのマルトース）の培養物１ｍｌに個々に接種した。ライブラリー細胞株に加えて、ＡｍｙＥおよびＳａｍｙＱリーダーペプチドを伴うプラスミドを含む細胞株を陽性対照として接種し、関心対象遺伝子を伴わないプラスミドを含む細胞株を陰性対照として接種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、マイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）内で、３７℃および８８０ｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を使用して、ディープウェルブロック中新鮮な２×Ｍａｌ、Ｃｍ５培養物に、開始密度ＯＤ６００＝０．１で接種した。
【０９１０】
発現培養物を、ＯＤ６００＝１．０となるまで（約４時間）、３７℃、８８０ｒｐｍでインキュベートした。この時点で、β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、最終濃度１ｍＭで添加し、４時間インキュベーションを継続することにより誘導した。４時間後、各培養物の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。遠心沈降の後、細胞の上清を、注意深く除去し、新規のブロックへ移し、細胞のペレットを−８０℃に凍結した。分泌されたタンパク質のレベルを決定するために、培養上清の０．５ｍｌのアリコートをまず０．４５μｍのフィルター、次に０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次のこの濾液を、チップ電気泳動システムによりアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定し、ベース構築物の分泌レベルと比較した。簡単に説明するとを、サンプルバッファー７μｌに試料２μｌを添加し、９５Ｃで５分間加熱し、次に３５μｌの水を添加することにより、試料を調製した。ＨＴ  Ｌｏｗ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットまたはＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（製造社のプロトコルにしたがう）を使用して、解析を行った。タンパク質のラダーを、分子量の決定（ｋＤａ）および定量化（ｎｇ／μｌ）のために１２個の試料ごとに作製した。
【０９１１】
ＳＥＱＩＤ−００６９０およびＳＥＱＩＤ−００７０２を、関心対象のゲルバンドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確認した。選択したヒットを、５％のβメルカプトエタノールを含むＩｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。泳動後、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色し、望ましいバンドを切断し、解析のため提出した。ゲルバンドを洗浄し、還元し、アルキル化し、次にトリプシンで４時間消化させ、次に、ギ酸でクエンチした。次に消化物を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムでのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを捕捉カラムにロードし、７５μｍの解析カラムから３５０ｎｌ／分で溶出させた。両方のカラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、ここでＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、７０，０００ＦＷＨＭの分解能および１７，５００ＦＷＨＭの分解能でそれぞれ実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳに関して選択した。得られたペプチドのデータを、付属の関連する変異体タンパク質配列を含む関連する宿主のデータベースに対してＭａｓｃｏｔを使用して検索した。
【０９１２】
希釈した一晩の培養物を、Ｃｍ５を含むＬＢブロス培養物の接種物として使用した。これらの培養物を、対数期に入るまで３７Ｃで生育させた。これらの培養物のアリコートを、グリセロール（２０％の最終濃度）と混合し、−８０℃で凍結した。次に、トップ３０のヒットを、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ，  ＵＳＡ）を使用して精製し、ＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣおよびＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣを使用して増幅させ、じのプライマーを使用してシークエンシングしてＳＥＱＩＤ−００４０７の変異体配列を同定した。
【０９１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ分泌ライブラリーの解析
ＳＥＱＩＤ−００４０７のすべての分泌された変異体（ＳＥＱＩＤ４５００２−４５０２８）を解析して、最初の遺伝子ライブラリーに存在する予測位置特異的バイアスと比較して、分泌された変異体に存在するアミノ酸における任意の位置特異的バイアスが存在するかどうかを判定した。この目的のため、観察された各アミノ酸の数が、偶然に予測されるより有意（ｐ＜０．０５）に多いまたは少ない可能性を決定するために、各位置の各アミノ酸に関して、正確二項検定を実施した。表Ｅ３８Ｃは、この片側検定のｐ値を示し、強調された要素は、ｐ値＜０．０５を有する。すべてが予測値よりも有意に高い野生型の値を除き、他の全ての有意に異なるアミノ酸の頻度は、予測した値よりも低かったことに留意されたい。予測位置特異的なアミノ酸バイアスを、表Ｅ３８Ｄに示し、これはライブラリーを構築し、大腸菌を形質転換した後に４７個のランダムに選択した変異体をシークエンシングすることにより見出された。Ｘであると設計されたすべての位置は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、およびＭのコドンの同じ分布から効果的にサンプリングされた（すなわち、すべてのＸの位置に関して、位置特異的アミノ酸バイアスが存在しなかった）と仮定した。このように、各アミノ酸に関して観察された計数を、位置を超えて集めて、すべてのＸの位置に対する予測アミノ酸の可能性を決定した。同様の前提を、Ｚであると設計したすべての位置に対して行った。表Ｅ３８Ｃで見ることができるように、各位置での野生型配列に対する強いバイアスに加えて、異なる多くのアミノ酸が、予測したものよりも有意に少なく観察され、これは、分泌したライブラリーにおけるその位置でのそれらのアミノ酸からのバイアスを示す。このデータは、各位置で特異的変異を有する特定の合理的に設計された変異体の設計に関して追加的な情報を提供するものである。例として、分泌変異体のロイシンの量を多くするために、位置２４１および２９１は、望ましくない選択であってよい。あるいは、分泌変異体のバリンの量を多くするために、位置１４９、２４１、２４２、２９１、２９４、２９５、および３８９は、望ましくない選択であってよい。
【表１２６】
2016537402.tif 000144
【表１２７】
2016537402.tif 000145
【０９１４】
特定の変異体のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの発現試験
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発現細胞株の３つの別々のコロニーを使用して、ディープブロックウェル（９６平方ウェル）中、Ｃｍ５を伴う２×Ｍａｌ培地（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、および１０ｇ／ｌの酵母抽出物、７５ｇ／ｌのマルトース）１ｍｌに接種した。培養ブロックを、多孔性接着プレートシールで被覆し、マイクロ発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、イリノイ州テレホート）で、３７℃および８８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を使用して、ディープウェルブロック中、開始密度ＯＤ６００＝０．１で、新鮮な２×Ｘ−ＭＡＬ  Ｃｍ５培養物に接種した。これらの発現培養物を、ＯＤ６００＝１．０となるまで（約４時間）３７℃、８８０ｒｐｍで播種した。この時点で、イソプロピルβ‐Ｄ−１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、最終濃度０．１Ｍで添加し、４時間インキュベーションを継続することにより誘導した。４時間後、各培養物の細胞密度を測定（ＯＤ６００）し、細胞を、遠心沈降（３０００ｒｐｍ、１０分、室温）により収集した。遠心沈降後、培養物の上清を注意深く除去し、新規のブロックに移し、細胞のペレットを−８０℃に凍結した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、培養物の上清０．５ｍｌのアリコートをまず０．４５μｍのフィルター、次に０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次にこの濾液を、チップ電気泳動によりアッセイして、関心対象の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。簡単に説明すると、サンプルバッファー７μｌに試料２μｌを添加し、９５Ｃで５分間加熱し、次に水３５μｌを添加することにより、試料を調製した。ＨＴ  Ｌｏｗ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットまたはＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（製造社のプロトコルに従う）を使用して解析を行った。タンパク質のラダーを、分子量の決定（ｋＤａ）および定量化（ｎｇ／μｌ）のために１２個の試料ごとに作製した。
【０９１５】
ＳＥＱＩＤ−４５０２５、ＳＥＱＩＤ−４５０２６、ＳＥＱＩＤ−４５０２７、およびＳＥＱＩＤ−４５０２８を、関心対象のゲルバンドＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確認した。選択したヒットを、５％のβ‐メルカプトエタノールを含むＩｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＤＳ  サンプルバッファーと混合し、煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。泳動後、ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色し、望ましいバンドを切断し、解析のために提出した。ゲルのバンドを洗浄し、還元し、アルキル化し、次にトリプシンで４時間消化し、次にギ酸でクエンチした。次に消化物を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣでのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムにロードし、３５０ｎｌ／分で７５μｍの解析カラム上から溶出させた。両方のカラムに、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。質量分析計を、データ依存モードで作動させ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳをＯｒｂｉｔｒａｐで、それぞれ７０，０００ＦＷＨＭの分解能および１７，５００ＦＷＨＭの分解能で実施した。最も多く存在する１５種のイオンを、ＭＳ／ＭＳで選択した。得られたペプチドのデータを、付属する関連する変異体タンパク質の配列を伴う関連する宿主のデータベースに対してＭａｓｃｏｔを使用して検索した。
【０９１６】
改変ポリペプチドのアミラーゼ活性アッセイ
改変ポリペプチドの１つを試験して、酵素活性を証明した。ＳＥＱＩＤ−００４０７は、デンプンなどの多糖類を単糖または二糖に分解する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のαアミラーゼである。ＳＥＱＩＤ−００６９０が酵素的な活性を保持していることを例証するために、酵素をスクリーニングするＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを、デンプンを含む寒天プレート上にプレーティングした。酵素活性が存在すれば、分泌された酵素はデンプンを分解し、ヨウ素により染色されると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーの周辺にハローが存在する。１％デンプンのプレートは、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ−Ｍｉｌｌｅｒ２５ｇ、デンプン１０ｇ、細菌用寒天１５ｇ、および１Ｌの水を混合することにより作製した。寒天が固化した後に、１０ｍＭのＩＰＴＧをデンプンプレートに添加した。変異体ポリペプチドを発現するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの単一のコロニーを、３７℃で４時間、５ｍｌのＬＢに接種し、液体培養物５０μｌをデンプンプレートの中心にスポットした。２０時間生育および分泌を誘導した後、１０％のヨウ素をデンプンプレートに添加して、デンプンを染色した。ＳＥＱＩＤ−００６９０がデンプンプレート上に存在する場合、酵素が分泌され、野生型と同様に、酵素を有しない空のベクターを発現する陰性対照よりも著しく大きく、細胞の周りに大きいハローを形成する。表Ｅ３８Ｅは、細胞の面積と比較したハローの面積を定量化する。示されるデータから、本出願人は、分泌型栄養性ポリペプチドの改変が、酵素活性を保持する必須アミノ酸を多く含んだことを証明した。
【表１２８】
2016537402.tif 000146
【０９１７】
実施例３９：ロイシンを多く含む栄養性ポリペプチドの経口消費の後の、ヒト対象における筋肉タンパク質合成速度の決定
ロイシンまたはロイシン含有タンパク質の経口摂取は、筋肉タンパク質の合成を刺激する（Ｌａｙｍａｎ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，  ２００６，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ：  １３６：  ３１９−３２３）。本明細書中に記載されるロイシンを多く含む栄養性ポリペプチドの多くは、著しく水に可溶であり、ヒト対象において容易に消化かつ吸収される。栄養性ポリペプチドを介して送達されるアミノ酸の薬物動態および筋肉タンパク質の合成に及ぼすその作用を、本明細書中に記載する。
【０９１８】
筋肉タンパク質の合成に及ぼす、ロイシンを多く含む栄養性ポリペプチドの効果を、明らかに健康な対象で測定した。５０〜７０歳の１２名（１２）の明らかに健康な対象（平均身長：１．７ｍ、体重：７８．５ｋｇ、年齢：５６．２歳、およびＢＭＩ：２６．８）を、処置配列に単盲検で無作為割付した。１群６名に、ＳＥＱＩＤ１０５および９０％の乳清タンパク質単離体（ＷＰＩ）の配合物を投与し、他の群にＳＥＱＩＤ３６３および９０％の乳清タンパク質単離体対照を投与した。各個体に、最初の配合物の洗い流しを可能にするために別々の日に（２〜３日あけて）各栄養性ポリペプチド配合物３５グラムを投与するように、処置をずらした。各対象は、対象内クロスオーバー比較において自身の対照としての役割を有した。
【０９１９】
対象を、以下の除外基準：糖尿病の病歴、過去６か月間の悪性腫瘍の病歴、胃腸のバイパス手術の経験（Ｌａｐｂａｎｄなど）、慢性炎症状態または疾患（狼瘡、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなど）、乳清タンパク質、カビ胞子、もしくは真菌に対する既知の感受性またはアレルギー、この試験参加時動物性タンパク質の摂取を控えない、この試験参加時にタンパク質またはアミノ酸のサプリメントの消費を控えることできなう、試験期間の最中、レジスタンストレーニングを控えることができない、治験薬による別の臨床試験に現在参加している、スクリーニング受診でヘモグロビンが９．５ｍｇ／ｄｌ未満である、副腎皮質ステロイドまたはテストステロン補充療法（摂取、注射、または経皮投与）の同時使用、医療スタッフの判断で、参加すれば対象に害を与えるリスクが増加すると判断された他の任意の疾患もしくは状態、のいずれかを満たす場合、この試験から除外した。
【０９２０】
すべての対象に、試験中、現在の食習慣を維持し、日常活動を維持し、かついかなるレジスタンスエクササイズにも参加しないように求めた。
【０９２１】
栄養配合物の同化作用を、筋肉のタンパク質合成速度（ＦＳＲ）（Ｓｍｉｔｈ，  Ｖｉｌｌａｒｅａｌ，  ＆  Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆｅｒ，  ２００７，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  −  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ２９３：  Ｅ６６６−Ｅ６７１）を使用して測定した。研究の手順は、Ｌ−［ｒｉｎｇ−ｄ５］−フェニルアラニンのｐｒｉｍｅｄ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ法による注射時の静脈血の採取および外側広筋の生検を含んだ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  マサチューセッツ州 トゥックズベリー）。筋肉タンパク質合成速度（ＦＳＲ）は、Ｌ−［ｒｉｎｇ−ｄ５］−フェニルアラニンのｐｒｉｍｅｄ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎのあいだの筋生検により測定した。具体的には、筋肉タンパク質合成速度（ＦＳＲ）を、安定同位体トレーサーの注入開始から２時間後、４時間後、および７時間後に実施した外側広筋の生検から、安定同位体トレーサー取り込み技術を使用して、一晩（＞８時間）絶食後の絶食したヒト対象で測定した。また血液の試料を、安定同位体トレーサーー注入の開始後特定の時点（すなわち２時間、３時間、４＋３０時間、５時間、５＋３０時間、６時間、６＋３０時間、および７時間）後で回収して、アミノ酸の濃度の変化を評価した。
【０９２２】
各対象に関して、一晩絶食（８時間の）後の試験の朝に、１８〜２２ゲージポリエチレンカテーテルを各腕に挿入した。１つのカテーテルを、加温採血のため遠位静脈に挿入して、バックグラウンドの血液試料（５ｍｌ）を得て、別のカテーテルを、安定同位体トレーサーの注入のため前腕に挿入した。末梢性カテーテルの挿入の後、安定な同位体（ＧＲＡＳ基質）環状‐ｄ５‐フェニルアラニンのプライミングした（５．０４μｍｏｌ／ｋｇ）、一定の（０．０８４μｍｏｌ／ｋｇ／分）の注入を開始した。安定な同位体を、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （マサチューセッツ州 トゥックズベリー）から入手し、無菌性および発熱性に関して試験した（ＣＩＬおよび調剤薬局が行う−ＰｈａｒｍａＣａｒｅにより）。注入の前に、トレーサーを、滅菌生理食塩水で再構成した。安定同位体は、注入ラインに配置した滅菌性０、２２ミクロン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のフィルターを通して注入時に濾過した。
【０９２３】
血液試料（５ｍｌ）を、同位体注入の開始から特定の時点（２時間、３時間、４時間、４＋３０時間、５時間、５＋３０時間、６時間、６＋３０時間、および７時間）で血清分離チューブに回収した。試験全体で約６０ｍｌの血液を採取し、この容量を、安定同位体トレーサーを注入した生理食塩水と交換した。
【０９２４】
外側広筋由来の筋肉の生検を、トレーサー注入の２時間目、４時間目、および７時間目で実施した。４時間目の生検の後、栄養性タンパク質配合物を経口投与した。すべての筋肉の生検を、通常の疼痛管理および厳密な無菌的手順のため局所麻酔下（１％の無菌リドカインを使用、エピネフリンは使用しない）で実施した。各筋生検の前に、皮膚を、滅菌皮膚調製キット（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）で洗浄し、疼痛を最小限にするために、皮膚および下の組織に局所麻酔（リドカイン）を注射した。
【０９２５】
小さな切開部（約１ｃｍ）を介して、５ｍｍのＢｅｒｇｓｔｒｏｍ  ｎｅｅｄｌｅ‘‘Ｏ’’を、筋肉内に進めて、吸引を行った。次に筋肉片を針から除去した（約５０〜１００ｍｇ）。次に皮膚を洗浄し、１／４インチ×１．５インチの接着性Ｓｔｅｒｉ−ｓｔｒｉｐｓで端を近づけ、透明な通気性のあるフィルムドレッシング材（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）をこの部位に使用した。強い圧力を、この部位での出血が止まるまで維持した。感染症および挫傷のリスクを最小限にするために、抗菌性の軟膏および加圧ドレッシング（自己粘着性弾性包帯）を医療スタッフが適用した後、対象を解放した。
【０９２６】
（％／ｈｒ）で測定されたＦＳＲを、以下の通り計算した。
【数１１】
2016537402.tif 000147
ここで、式中、エンリッチメント（ＥＰ１、ＥＰ２、およびＥｍ）は、モルパーセント過剰（ｍｏｌｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｘｃｅｓｓ）（ＭＰＥ）として表され、トレーサー濃度が平衡に達した後の、非標識フェニルアラニントレーシー（ＴＴＲ）に対する標識フェニルアラニントレーサーの比率として計算した。ＥＰ１およびＥＰ２は、それぞれ第１の生検および第２の生検（または第２および第３の生検）での結合した環状‐２Ｈ５フェニルアラニンのエンリッチメントであり、Ｅｍは、細胞内プールにおける環状‐２Ｈ５‐フェニルアラニンのエンリッチメントの平均値である。「ｔ」は、第１および第２の筋肉の生検のあいだ（または第２および第３の生検のあいだ）に経過した分での時間である。６０分／時間および１００の一定の変換係数を使用して、ＦＳＲを１時間あたりのパーセントで表記した。結果の変数（筋肉タンパク質の合成および血液のアミノ酸の濃度）を、両側のｔ検定により解析した。統計学的有意性は、事前検定でｐ＜０．０５で確立され、傾向を、０．０５１＜Ｐ＜０．１０として容認した。
【０９２７】
表Ｅ３９Ａ−Ｃは、各栄養性タンパク質配合物の短期経口投与の前後での各対象に関して計算したＦＳＲデータを示し、図５６は、平均ＦＳＲの変化を示す。示されるデータは、平均値±平均値の標準誤差である。ＷＰＩ群での対象３由来の絶食したＦＳＲ値は、ＦＳＲが、非常に上昇しており、正常な値とは一致せず、ｚ値が２．８５であったことに留意されたい。両側のｇｒｕｂｂのはずれ値検定はにより、それが有意な（ｐ＜０．０５）のはずれ値であることが示されたことから、図５６に示されるように平均値および標準誤差を計算する場合ば除去した。
【表１２９】
2016537402.tif 000148
【表１３０】
2016537402.tif 000149
【表１３１】
2016537402.tif 000150
【０９２８】
各群の絶食時の応答と投与時の応答を比較した両側ｔ検定は、ＷＰＩで処置した対象での投与時の応答が、対象３を除くと、絶食時の応答とは有意に異なることを示す（ｐ＝０．００７）。これは、ＷＰＩに対するＦＳＲの応答を試験した以前の研究と一致する（Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ−Ｍｏｏｒｅ，  Ｍ．，  Ｋａｔｓａｎｏｓ  Ｃ．  Ｓ．，  Ｘｉａｏ−Ｊｕｎ  Ｚ．，  Ｗｏｌｆｅ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｈｕｍａｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｓｏｃａｌｏｒｉｃ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｒ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  （２００６）  ４１：  ２１５−２１９）。対象３を含めると、差は、有意性を失う（ｐ＝０．４５）。ＳＥＱＩＤ−１０５を投与した群における絶食時と投与後のＦＳＲ応答は、有意に異なる（ｐ＝０．０４）であるが、ＳＥＱＩＤ３６３を投与した群における絶食時と投与後のＦＳＲ応答は、有意差はない（ｐ＝０．６８）。
【０９２９】
実施例４０：栄養性ポリペプチドを含む配合物の経口での薬物動態
タンパク質摂取に対する同化応答は、必須アミノ酸の送達に基づいて予測される。この試験の目的は、２４０分の期間にわたり様々なタンパク質に応答した血漿中アミノ酸濃度の変化を試験することであった。年齢１８〜５０歳の明らかに健康な４名の対象を、処置配列に二重盲検で無作為割付して、１７０ｍｌの容量で経口的に乳清タンパク質単離体またはＳＥＱＩＤ−１０５のいずれか２０グラムを投与した。対象を経口薬物動態試験の前、一晩（＞８時間）絶食させた。血漿中のアミノ酸濃度の変化を評価するために、栄養性ポリペプチドの経口摂取後の特定の時点（すなわち０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、および２４０分）で、静脈血試料を採取した。血漿中アミノ酸濃度を、アメリカのＱｕｅｓｔ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓまたはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより定量化した。
【０９３０】
図５７〜６０は、ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ１０５に関して、それぞれ測定されたアミノ酸および凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の血漿中の経時的変化を示す。
【０９３１】
測定される時点全体での血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、ＷＰＩでは、これらのデータは、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＴＡＡで経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９３２】
測定される時点全体での血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、ＳＥＱＩＤ−１０５の栄養配合物では、これらのデータは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＴＡＡで経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９３３】
図６１〜６３は、ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ１０５に関して、それぞれ測定されたアミノ酸、ならびに凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【０９３４】
ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−１０５のあいだで各アミノ酸およびアミノ酸群のＡＵＣを比較するためにｔ検定を使用すると、Ａｓｐ（ｐ＝０．０１）、Ｈｉｓ（ｐ＝０．０４）、Ｌｅｕ（０．０２３）、Ｍｅｔ（０．００２）、Ｐｈｅ（０．０４）、Ｐｒｏ（ｐ＜０．０１）、Ｓｅｒ（ｐ＝０．０３）、およびＴｒｐ（ｐ＝０．００２）の応答に有意差が存在する。
【０９３５】
別の試験では、３５グラム用量のＳＥＱＩＤ−１０５およびＷＰＩを、１８〜５０歳の明らかに健康な６名の対象にそれぞれ、１００ｍｌおよび１１５１ｍｌを経口投与した。図６４〜６７は、ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−１０５に関して、それぞれ測定されたアミノ酸および凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の血漿中の経時的変化を示す。
【０９３６】
ＷＰＩに関して測定された、時点全体の血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、これらのデータは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＴＡＡに関して経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９３７】
ＳＥＱＩＤ−１０５の栄養配合物に関して測定される、時点全体での血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、これらのデータは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｙ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＴＡＡに関して経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９３８】
図６８〜７０は、３５ｇで投与したＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−１０５に関して、それぞれ測定したアミノ酸ならびに凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の積分した曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【０９３９】
ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−１０５のあいだで各アミノ酸またはアミノ酸群のＡＵＣを比較するために両側の不等分散ｔ検定を使用すると、Ａｓｎ（ｐ＝０．００６）、Ｈｉｓ（ｐ＝０．０１）、Ｉｌｅ（ｐ＝０．０３）、Ｌｙｓ（ｐ＝０．０２）、Ｍｅｔ（ｐ＜０．００１）、Ｐｈｅ（ｐ＜０．００１）、Ｐｒｏ（ｐ＝０．００２）、Ｓｅｒ（ｐ＝０．００５）、Ｔｈｒ（ｐ＝０．００４）、Ｔｒｐ（ｐ＜０．００１）、Ｔｙｒ（ｐ＝０．００３）、およびＶａｌ（ｐ＝０．０１２）の応答に有意差が存在する。
【０９４０】
栄養性ポリペプチドを介したアミノ酸送達の薬物動態を試験する別の試験では、１８〜５０歳の明らかに健康な３名の対象を、処置配列に対して二重盲検で無作為割付して、乳清タンパク質単離体またはＳＥＱＩＤ−３６３のいずれか２０グラムを経口投与した。対象を経口薬物動態試験の前に一晩（＞８時間）絶食させた。栄養性ポリペプチドの経口摂取後の特定の時点（すなわち０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、および２４０分）で静脈血試料を採取して、血漿中アミノ酸濃度の変化を評価した。血漿アミノ酸の濃度を、米国のＱｕｅｓｔ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓまたはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより評価した。
【０９４１】
図７１〜７４は、ＷＰＩおよびＳＥＱＩＤ−３６３に関して、それぞれ測定されたアミノ酸および凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の血漿中の経時的変化を示す。
【０９４２】
ＷＰＩに関して測定される時点全体の血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、これらのデータは、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＴＡＡに関して経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９４３】
ＳＥＱＩＤ−３６３に関して測定される時点全体の血漿中アミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、これらのデータは、経時的な有意差が存在しないことを示す（ｐ＜０．０５）。
【０９４４】
実施例４１：虚弱な高齢者対象のサルコペニアおよび身体機能の喪失の栄養性ポリペプチドを使用した長期的な処置
ロイシンまたはロイシン含有タンパク質の補給は、運動後の筋肉量の増大を改善し、長期の不使用時の骨格筋量を維持する（Ｌａｙｍａｎ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，  ２００６，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ：  １３６：  ３１９−３２３）。ロイシンおよび必須アミノ酸を多く含む栄養性ポリペプチドは本明細書中に記載されている。虚弱な高齢者対象を、特定の処置群、すなわち等カロリーの対照食を投与される対照群、または１５グラム、３０グラム、もしくは４０グラムの用量の栄養性ポリペプチド配合物を３０日間１日に３回投与されるた３用量に及ぶ処置アームへと、二重盲検で無作為割付した。登録した対象へは、個々の肥満度指数（ＢＭＩ）および身体的な活動に基づき、試用期間に対照食が提供される。食物およびカロリー摂取を記録する。登録した対象は、その通常の日常活動を維持する。毎日の身体活動およびカロリー消費を、身体活動追跡装置（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｔｒａｃｋｅｒ）（ＦｉｔＢｉｔ  Ｆｌｅｘ  ｗｒｉｓｔ  ｂａｎｄ）により測定する。除脂肪体重をＭＲＩ（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ．’’  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  （２０１４））または二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ；  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐａｌｌｅ  Ｋｊｒｅｒｕｌｆｆ，  Ｊｏｒｇｅｎ  Ｌａｄｅｆｏｇｅｄ，  ａｎｄ  Ｋｌａｕｓ  Ｏｌｇａａｒｄ．  ‘‘Ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｂｙ  Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  （ＤＥＸＡ）、ａｎｄ  ｂｙ  ｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｉａｌｙｓａｔｅ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ＣＡＰＤ  ａｎｄ  ｐｒｅ−ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．’’  Ａｄｖ  Ｐｅｒｉｔ  Ｄｉａｌ  １０  （１９９４）：  ９９−１０３．）により、１日目（栄養性ポリペプチド投与より前）、および骨格筋の量の変化を評価するために処置が終了する３１日目に測定する。また身体機能を、簡易身体能力バッテリースコア（Ｖｏｌｐａｔｏ，  Ｓｔｅｆａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｂａｔｔｅｒｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．’’  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６６．１  （２０１１）：  ８９−９６．）、歩行速度の測定、６分間の歩行試験（６ＭＷＴ）、およびＴＵＧテスト（ｔｉｍｅｄ  ｕｐ  ａｎｄ  ｇｏ  ｔｅｓｔ  ：ＴＵＧＳ；  Ｐｏｄｓｉａｄｌｏ，  Ｄ；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｓ．  ‘‘Ｔｈｅ  ｔｉｍｅｄ  ‘Ｕｐ  ＆  Ｇｏ’：  Ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｆｒａｉｌ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｒｓｏｎｓ’’．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍ���ｒｉｃａｎ  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （１９９１）  ３９：  １４２−８）を使用して処置期間の開始時と最後に評価した。ベースラインからの、除脂肪体重、ならびにＳＰＰＢスコア、歩行速度、６ＭＷＴ、およびＴＵＧＳの絶対値およびパーセントでの変化を、処置の有効性を評価するために処置アーム全体でおよび対照と比較した。
【０９４５】
実施例４２：メチオニンを欠如する栄養性ポリペプチドを含む配合物の経口薬物動態
この試験の目的は、２４０分の期間にわたり、メチオニン欠如栄養性タンパク質に応答した血漿中アミノ酸濃度の変化を試験することであった。４名の明らかに健康な１８〜５０才の対象を、処置配列に二重盲検で無作為割付し、１７０ｍｌの容量で、ＳＥＱＩＤ−４２６を２０ｇ経口投与した。対象を、一晩（＞８時間）絶食させ、翌朝栄養性ポリペプチドの経口摂取後の特定の時点（すなわち０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、および２４０分）で静脈血試料を採取して、血漿中アミノ酸濃度の変化を評価した。血漿中アミノ酸濃度を、米国のＱｕｅｓｔ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓまたはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより定量化した。
【０９４６】
図７５〜７８は、ＳＥＱＩＤ−４２６に関して、それぞれ測定されたアミノ酸および凝集体群、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、および総アミノ酸（ＴＡＡ）の血漿での時間経過を示す。
【０９４７】
ＳＥＱＩＤ−４２６に関して、測定された時点全体での血漿中のアミノ酸レベルの有意差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、これらのデータは、ＧｌｕおよびＥＡＡに関して経時的に有意差が存在することを示す（ｐ＜０．０５）。血漿中のＥＡＡの経時的変化を試験するダネットの多重比較検定は、３０分および６０分での時点での血漿中ＥＡＡレベルが、０分の時点でのベースとなるレベルと有意に異なることをさらに示す。メチオニンは、有意な経時的変化を示さない。
【０９４８】
実施例４３：癌治療のための栄養性ポリペプチドの分泌および配合
癌および腫瘍細胞は、非癌細胞よりも特定のアミノ酸を不均衡に必要とする（Ｇａｌｌｕｚｚｉ，  Ｋｅｐｐ，  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，  ＆  Ｋｒｏｅｍｅｒ，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  １２：  ８２９−４６）。たとえば、セリンおよびグリシンは、タンパク質合成、ヌクレオチドの新規合成、ＤＮＡのメチル化およびポリアミンの合成を含む、哺乳類の代謝に必須の役割を果たしている（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｏｃａｓａｌｅ，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｃａｎｃｅｒ：  １３：  ５７２−８３）。特定の腫瘍細胞は、セリンおよびグリシンの代謝経路における遺伝子発現の増幅、欠失、多型、または変質により、生存および増殖に関してセリンおよびグリシンに依存しているが、対して正常な細胞は、セリンおよびグリシンの飢餓への感受性がほとんどない（Ｊ．  Ｌｏｃａｓａｌｅ  ＆  Ｃａｎｔｌｅｙ，  ２０１１，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ：  １０：  ３８１２−３８１３）（Ｌａｂｕｓｃｈａｇｎｅ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，  Ｍａｃｋａｙ，  Ｖｏｕｓｄｅｎ，  ＆  Ｍａｄｄｏｃｋｓ，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ：  ７：  １２４８−５８）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ：  １４８：  ２５９−７２）特定の腫瘍細胞は、メチオニンの新規のサルベージ経路における遺伝子発現の欠失、多型、または変質により、生存および増殖に関してメチオニンに依存しており（Ｃａｖｕｏｔｏ  ＆  Ｆｅｎｅｃｈ，  ２０１２，  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ：  ３８：  ７２６−３６）、対して正常な細胞は、メチオニンの飢餓への感受性がほとんどない（Ｋｒｅｉｓ  ＆  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８，  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ：  ３８：  ２２５９−２２６２）。特定の腫瘍細胞は、シトルリンおよびアルギノコハク酸塩の利用がないことにより、アルギニンに依存している（Ｃｕｒｒｉｅ  ａｎｄ  Ｂａｓｈａｍ  １９７８）（Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ２００３，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：  ８９：  ５７３−６）。特定の腫瘍細胞は、グルアミナーゼのアップレギュレーションにより、生存および増殖に関してグルタミンに依存している（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ａ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ｂ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  １０：  ７２８）。よって、タンパク質中食のセリン、グリシン、メチオニン、アルギニン、およびグルタミンを限定することにより、腫瘍細胞の増殖を限定することができる。
【０９４９】
セリンおよびグリシン依存性癌細胞の増殖の選択的な阻害は、セリンおよびグリシンが欠損した培地を使用して例証されており（Ｍａｄｄｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ：  ４９３：  ５４２−６）、セリンおよびグリシンを限定した食事を利用した動物試験から、癌の増殖の阻害および寿命の延長が示される（Ｌａｂｕｓｃｈａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ：  ７：  １２４８−５８）。正常な細胞と共培養しているメチオニン依存性癌細胞の選択的な殺傷は、メチオニンが欠損した培地を使用して例証されており、メチオニンを限定した食事を利用した動物試験から、癌の増殖の阻害および寿命の延長が示されている（Ｃａｖｕｏｔｏ  ＆  Ｆｅｎｅｃｈ，  ２０１２，  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ：  ３８：  ７２６−３６）。さらに、ホモシステインの補充は、腫瘍細胞がホモシステインを利用せず、メチオニンに密に依存していることから、メチオニンの飢餓の毒性から正常な細胞を選択的に救助する。（Ｋｒｅｉｓ  ＆  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８，  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ：  ３８：  ２２５９−２２６２）。グルタミンは、ＴＣＡ回路に必要な鍵となるミトコンドリアの基質であり、臨床試験で癌のグルタミン依存性を標的とするいくつかの手法が取られている（Ｗｉｓｅ  ＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ２０１０，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ３５：  ４２７−４３３）。これら手法のうちの１つは、アスパラギンおよびグルタミンの両方を分解するＬ−アスパラギナーゼを使用することによるグルタミンの欠失である（Ａｖｒａｍｉｓ  ＆  Ｐａｎｏｓｙａｎ，  ２００５，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：  ４４：  ３６７−３９３）。アルギナーゼまたはアルギニンデアミナーゼによるアルギニンの欠失は、臨床試験で見込みのある抗癌作用を示す（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｓｈｅａｆｆ，  ＆  Ｓｚｌｏｓａｒｅｋ，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ：  ４５：  ２５１−２６２）
【０９５０】
実施例４４：アミノ酸の依存性および栄養要求性に関する癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング
アミノ酸に関する癌細胞の依存性を評価するために、１つまたは複数のアミノ酸を欠損した化学的に定義した細胞培養培地を使用し、細胞増殖および細胞死をモニタリングする（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ｂ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ：  １４８：  ２５９−７２）（Ｍａｄｄｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ：  ４９３：  ５４２−６）。１つの実験では、表Ｅ４０Ａから選択した個々のＮＣＩ６０ヒト腫瘍細胞株を、１つまたは複数のアミノ酸が欠損した培養培地中で２４〜７２時間、プレーティングした（２，０００／９６ウェル）。比較可能な非癌性細胞株を対照として使用する。癌細胞および対照細胞の健常に関する定義した培地の作用を、細胞増殖（数）、ヌクレオチドの組み込み、および細胞死により解析する（ＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶアッセイ）（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  ２０１３ｂ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  １２３：  ３６７８−３６８４）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ：  １４８：  ２５９−７２）（Ｍａｄｄｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ：  ４９３：  ５４２−６）
【表１３２】
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【０９５１】
別の実験では、栄養性ポリペプチド（バックグラウンドのアミノ酸レベルを考慮するための基底の血漿アミノ酸の補充を含むまたは含まない）で見出されるものと等価のモルアミノ酸比率のアミノ酸混合物を含む培地を、表Ｅ４０Ａの細胞株の１つと組み合わせて使用して、栄養性ポリペプチド由来のアミノ酸混合物の有効性を評価する。別の実験では、本明細書中に定義されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化を経験した栄養性ポリペプチド（バックグラウンドのアミノ酸レベルを考慮するための基底の血漿アミノ酸の補充を含むまたは含まない）を含む培地を使用する。別の実験では、バックグラウンドのアミノ酸レベルを考慮するための基底の血漿アミノ酸補充を含むまたは含まない栄養性ポリペプチドを含む培地を使用する。
【０９５２】
癌幹細胞（または腫瘍惹起細胞）に関するポリペプチドの作用もまたｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する。癌幹細胞は、抗癌療法に耐性があり、かつ薬剤耐性、再発、浸潤、腫瘍発生、および転移の原因となる癌細胞のサブセットである（Ｃｈａｆｆｅｒ  ＆  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２０１１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）：  ３３１：  １５５９−１５６４）。癌幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの足場非依存性増殖を行うことができる。癌幹細胞のアミノ酸の依存性を特徴付けるために、癌細胞を、上述のように化学的に定義した細胞培養培地中の単層接着培養物で３日間増殖させる。培養培地由来の癌細胞のバルクにおける癌幹細胞の頻度を、処置した細胞を足場非依存性培養物にｉｎ  ｖｉｔｒｏでプレーティングすることにより判定する。足場非依存性培養のための培養プレートを、１％の寒天を含む完全培養培地で密閉し、０．４％の寒天を含む完全培養培地に、細胞の種類に応じて２１〜３５日間懸濁した単一の細胞を上に播く。細胞に、０．３％の寒天を含む完全培養培地を毎週与える。足場非依存性培養物中の細胞のコロニーを、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（０．２％）で染色し、細胞コロニーの数を計測する。
【０９５３】
癌幹細胞の頻度を計算するための式は、
【数１２】
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である。
【０９５４】
完全アミノ酸培地における対照増殖と比較して低い癌幹細胞の頻度は、供給した培地中で欠損したアミノ酸に対する感受性を示す。またこれらのデータを、同一の細胞または組織の型の主要な非癌性細胞株と比較して、特定のアミノ酸を欠損したアミノ酸環境に対する非癌性細胞の感受性を判定する。
【０９５５】
癌細胞の生存および増殖を支援し、かつ細胞のアポトーシス、オートファジー、細胞死、およびネクローシスを防止するために必要とされる、セリン、グリシン、メチオニン、アルギニン、グルタミン、および他のアミノ酸をも欠損する、本明細書中に記載されるように可溶性、凝集、耐性、および発現の簡易性に関して選択した食用に適した種のタンパク質データベース由来の代表的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４４Ｂ、表Ｅ４４Ｃ、表Ｅ４４Ｄ、表Ｅ４４Ｅ、表Ｅ４４Ｆ、および表Ｅ４４Ｇに提供する。
【表１３３】
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【表１３４】
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【表１３５】
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【表１３６】
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【表１３７】
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【表１３８】
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【０９５６】
同様に、上に略述したアミノ酸が欠損し、発現した代表的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４４Ｈ、表Ｅ４４Ｉ、表Ｅ４４Ｊ、表Ｅ４４Ｋ、表Ｅ４４Ｌ、および表Ｅ４４Ｍに示す。
【表１３９】
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【表１４０】
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【表１４１】
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【表１４２】
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【表１４３】
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【表１４４】
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【０９５７】
実施例４５：化学療法レジメンとの栄養性ポリペプチドの共投与を介した癌治療の改善
栄養性ポリペプチドの投与と併用した、癌および他の腫瘍性疾患の化学療法の処置を提供する。特に、セリン、グリシン、メチオニン、アルギニン、グルタミン、および／または他のアミノ酸を有さない、またはこれらの低いレベルを有する栄養性ポリペプチドを、化学療法の処置を受けたヒト対象に提供する。これら栄養性ポリペプチドを含む配合物は、腫瘍により選択的に必要とされるセリン、グリシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、および／または他のアミノ酸を選択的に限定しながら、正常な代謝の支援に必要な必須アミノ酸を提供する。
【０９５８】
栄養性ポリペプチドおよび化学療法のレジメンの共投与のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性を、本明細書中に記載されるようにＮＣＩ−６０ヒト腫瘍で判定する。比較可能な非癌性細胞株を対照として使用する。このような化学療法のレジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。癌細胞を、基本的なアミノ酸、栄養性ポリペプチド由来のアミノ酸混合物、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで消化した栄養性ポリペプチド、または未処置の栄養性ポリペプチドを含む化学的に定義した細胞培養物中に２４時間プレーティングする（２，０００／９６ウェル）。次に化学療法レジメンを細胞に添加する。対照と比較した、細胞増殖の抑制および細胞死の誘導に関するポリペプチドおよび化学療法のレジメンの共投与の有効性を、細胞の数、ヌクレオチドの組み込み、および細胞死により判定する（ＴＵＮＥＬおよびアネキシン  Ｖアッセイ）。このような化学療法と栄養性ポリペプチドの共投与は、癌細胞の生存に必要なアミノ酸を枯渇させることにより、化学療法単独と比較した場合に細胞増殖の減少および細胞死の増大を含む癌の治療の改善を提供する。
【０９５９】
実施例４６：栄養性ポリペプチドでの前臨床動物における癌の抑制
生存に関してセリン、グリシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、および／または他のいずれかのアミノ酸に対して依存性を呈する腫瘍は、これら特定のアミノ酸に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの依存性を例証する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ：  １４８：  ２５９−７２）（Ｍａｄｄｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ：  ４９３：  ５４２−６）（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  １３：  ８９０−９０１）。このｉｎ  ｖｉｖｏでの作用を評価するために、特定のアミノ酸を欠失した栄養性ポリペプチドを、動物試験の食事または水と混合する。ヒトの癌細胞を、１００  １のＰＢＳバッファーで再懸濁し、指定された位置に注入することにより易感染性マウスに注入する（表Ｅ４６Ａ）。癌細胞の注入の直後にマウスを、対照、または栄養性ポリペプチドを補充した試験食もしくは水のいずれかにランダムに分ける。腫瘍を有するマウスの生存および寿命延長を記録する。腫瘍の増殖（体積）を経時的に測定する。細胞の増殖（Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ標識）およびアポトーシス（ＴＵＮＥＬアッセイ）を、腫瘍で定量化する。
【表１４５】
2016537402.tif 000165
【０９６０】
実施例４７：前臨床動物モデルにおける化学療法レジメンとの共投与を介した癌治療の改善
【０９６１】
栄養性ポリペプチドおよび化学療法レジメンの共投与の有効性を、易感染性マウスにおけるヒトの癌異種移植片で判定する。ヒトの癌細胞を、本明細書中に記載されるように易感染性マウスへと注入する。癌細胞注入の直後にマウスを、対照、またはセリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、メチオニン、および／もしくは他のいずれかのアミノ酸が欠損した栄養性ポリペプチドを補充した試験食もしくは水のいずれかにランダムにわけた。化学療法レジメンを、腫瘍を有するマウスに毎日注入する。腫瘍を有するマウスの生存および寿命延長を記録する。腫瘍の増殖（体積）を経時的に測定する。細胞の増殖（Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ標識）およびアポトーシス（ＴＵＮＥＬアッセイ）を腫瘍で定量化する。このような化学療法レジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような化学療法と栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独または栄養性ポリペプチドの投与の単独と比較する場合に、腫瘍増殖の低減および細胞死の増大を含む利点を提供する。
【０９６２】
実施例４８：栄養性ポリペプチドでのヒトの癌治療の改善
本明細書中に記載される栄養性ポリペプチドの投与と併用した癌および他の腫瘍性疾患のための化学療法の処置を提供する。乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、ＣＮＳ癌、肺癌、卵巣癌、または消化管癌を有するヒトでは、たとえば、一日用量１０〜３０グラムの栄養性ポリペプチドの配合物を、化学療法レジメンに付随して患者に経口投与する。提供される栄養性ポリペプチドは、処置されるヒト対象のアミノ酸の主な／唯一の食事性の供給源である。このような化学療法レジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような、化学療法と、セリン、グリシン、グルタミン、メチオニン、アルギニン、および他のアミノ酸が欠損した栄養性ポリペプチドの共投与は、生存および腫瘍のクリアランスに必要な生命の機能を支援することにより、化学療法単独と比較する際に腫瘍を有さない患者の生存の改善を含む利点を提供する。
【０９６３】
具体的には、セリンおよびグリシンが欠損した栄養性ポリペプチドを提供する。本明細書中に記載されるように、ヒト対象に対して、セリンおよびグリシンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドを、アミノ酸の主要な食事性供給源として１日用量１０〜３０グラムで化学療法レジメンと共投与する。セリンおよびグリシンが欠損した提供されるポリペプチドおよび化学療法レジメンの共投与は、付加的な／相乗的な治療上の有効性を有する。
【０９６４】
追加的な特定の実施形態では、メチオニンが欠損した栄養性ポリペプチドを提供する。本明細書中に記載されるように、ヒト対象に対して、メチオニンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドを、アミノ酸の主要な食事性供給源として１日用量１０〜３０グラムで、化学療法レジメンと共投与する。併用して、腫瘍がメチオニンに密に依存している選択された患者において、メチオニン欠損の毒性から正常な細胞を救出するために、食事性ホモシステインを、１日用量１グラムで補充する（Ｋｒｅｉｓ  ＆  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８，  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ：  ３８：  ２２５９−２２６２）。メチオニンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドおよび化学療法レジメンの共投与は、付加的／相乗的な治療上の有効性を有する。
【０９６５】
具体的には、グルタミンが欠損した栄養性ポリペプチドを提供する。本明細書中に記載されるように、ヒト対象に対して、グルタミンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドを、アミノ酸の主要な食事性供給源として１日用量１０〜３０グラムで、化学療法レジメンと共投与する。グルタミンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドおよび化学療法レジメンの共投与は、付加的／相乗的な治療上の有効性を有する。
【０９６６】
具体的には、アルギニンが欠損した栄養性ポリペプチドを提供する。本明細書中に記載されるように、ヒト対象に対して、アルギニンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドを、アミノ酸の主な食事性供給源として１日用量１０〜３０グラムで、化学療法レジメンと共投与する。併用して、食事性シトルリンまたはアルギノコハク酸塩を、腫瘍がアルギニンに対して密に依存する選択した患者でのアルギニン欠損の毒性から正常な細胞を救出するために、１日用量１グラムで補充する（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ：  ４５：  ２５１−２６２）。アルギニンが欠損した提供される栄養性ポリペプチドおよび化学療法上のレジメンの共投与は、付加的／相乗的な治療有効性を有する。
【０９６７】
実施例４９：ヒトの癌の化学療法に関する有害作用の改善
癌および他の腫瘍性疾患のための化学療法は、患者が直接生命の危険のある可能性があり、かつ腫瘍の除去および癌のない生存のための最適な投与を提供するための特性を限定する可能性のある、病的状態および副作用を誘導する（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  （Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ）：  ２７：  ７９３−９）。これらは、貧血、食欲の喪失、疲労、挫傷、出血、および感染症の増大、悪心、嘔吐、神経の損傷、骨格筋の質量の損失、および筋肉の損傷を含む。一般的に、このような病的状態および副作用の原因は、各化学療法のレジメンの機構による健常細胞への望ましくない損傷である。このような正常細胞は、最も一般的には、骨髄の中の血液形成細胞；毛包、口、消化管、および生殖器系の細胞を含む。一部の化学療法レジメンは、心臓、腎臓、膀胱、肺、および神経系の細胞をも損傷する。正常な細胞へ栄養上の支援を提供することは、化学療法の抗腫瘍性作用に緩衝することなく、各機構を軽減するために必要とされる特定のアミノ酸の補充を介して動物およびヒトにおけるこれらの副作用の一部を軽減することが示されている（Ｍｕｓｃａｒｉｔｏｌｉ  Ｍ，  Ｃｏｓｔｅｌｌｉ  Ｐ，  Ａｖｅｒｓａ  Ｚ，  Ｂｏｎｅｔｔｏ  Ａ，  Ｂａｃｃｉｎｏ  ＦＭ，  ２００８，  Ａｓｉａ  Ｐａｃ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ：  １７：  ３８７−９０）  （Ｄｕｒｈａｍ，  Ｄｉｌｌｏｎ，  ＆  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ−Ｍｏｏｒｅ，  ２００９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｅ：  １２：  ７２−７）。
【０９６８】
このような化学療法の病的状態および副作用を特に寛解させる栄養上の支援を提供するように選択された栄養性ポリペプチドの投与と併用した、癌および他の腫瘍性疾患のための追加的な化学療法の処置を提供する。
【０９６９】
具体的には、他のポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較してロイシンおよび他のアミノ酸のレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する（Ｏｐ  ｄｅｎ  Ｋａｍｐ，  Ｌａｎｇｅｎ，  Ｈａｅｇｅｎｓ，  ＆  Ｓｃｈｏｌｓ，  ２００９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｅ：  １２：  ６１１−６）。高レベルのロイシンを含む必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ａおよび表Ｅ４９Ｂに提供し、それぞれ、食用に適しており、発現した栄養性タンパク質のデータベースで同定した。
【表１４６】
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【表１４７】
2016537402.tif 000167
【０９７０】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、化学療法により誘導される、カヘキシー、骨格筋の質量の喪失、および末梢神経障害などの副作用を寛解するためにロイシンレベルを選択的に増加させながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する。乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、ＣＮＳの癌、白血病、卵巣癌、または消化管癌を有するヒトでは、初期用量１０〜３０グラムの栄養性ポリペプチドを、化学療法レジメンと同時に患者に経口投与する。このような化学療法レジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような、ロイシンを多く含む栄養性ポリペプチドおよび化学療法の共投与は、正常な細胞の生存および機能に必要な生命の機能を支援することにより、化学療法単独と比較して、カヘキシー、骨格筋の質量の損失、および末梢神経障害の発生および重症度の低下を含む利点を提供する。
【０９７１】
さらなる具体的な実施形態では、他のポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較して分枝鎖アミノ酸のレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する。分枝鎖アミノ酸のレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９ＣおよびＥ４９Ｄに提供し、食用に適しており、発現した栄養性タンパク質データベースでそれぞれ同定する。
【表１４８】
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【表１４９】
2016537402.tif 000169
【０９７２】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、化学療法により誘導されるカヘキシーおよび骨格筋の質量の喪失などの副作用を寛解させるために分枝鎖アミノ酸のレベルを選択的に増大させながら、生命に必須の代謝的な支援を提供する（Ｌａｖｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｅ：  ８：  ４０８−４１４）。乳癌、前立腺癌、メラノーマ、ＣＮＳの癌、白血病、卵巣癌、消化管癌を有するヒトでは、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、化学療法のレジメンと併用して患者に経口投与する。このような化学療法のレジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスアミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような化学療法と分枝鎖アミノ酸を多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、正常な細胞の生存および機能に必要な生命の機能を支援することにより、化学療法単独と比較して、カヘキシーおよび骨格筋の質量の損失の発生および重症度の減少を含む利点を提供する。
【０９７３】
追加的な特定の実施形態では、ポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較してアスパラギン酸塩のレベルが増加した栄養性ポリペプチドを提供する。アスパラギン酸塩のレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ｅおよび表Ｅ４０Ｆに提供し、それぞれ食用に適しており、発現したタンパク質のデータベースで同定した。
【表１５０】
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【表１５１】
2016537402.tif 000171
【０９７４】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、尿素生成を刺激し、化学療法により引き起こされる過剰なアンモニアを除去するアスパラギン酸塩のレベルを選択的に増大させながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する（Ｋｌｅｅｆ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，  １９９９，  Ｆｏｒｓｃｈｅｎｄｅ  Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄｉｚｉｎ：  ６：  ２１６）。乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、ＣＮＳの癌、白血病、卵巣、または消化管の癌を有するヒトでは、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、化学療法レジメンと併用して患者に経口投与する。このような化学療法のレジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような、化学療法と、アスパラギン酸塩を多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独と比較して、錯乱、疲労、および悪心の発生および重症度の減少を含む利点を提供する。
【０９７５】
追加的な特定の実施形態では、他のポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較して、グリシンのレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する。グリシンのレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ｇおよび表Ｅ４９Ｈに提供し、それぞれ食用に適しており、発現した栄養性タンパク質のデータベースで同定した。
【表１５２】
2016537402.tif 000172
【表１５３】
2016537402.tif 000173
【０９７６】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、略称ＦＯＬＦＯＸ（ＦＯＬ−フォリン酸、Ｆ−フルオロウラシル、ＯＸ−オキサリプラチン）により一般的に表されるものなどの化学療法レジメンでの処置の後の肝毒性から保護するためグリシンのレベルを選択的に上げながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ：  ４５：  ４６３−７７）。たとえば、結腸癌を有するヒトでは、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、ＦＯＬＦＯＸ化学療法レジメンと併用して患者に経口投与する。このような、化学療法とグリシンを多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独と比較して、肝毒性の発生および重症度の減少を含む利点を提供する。
【０９７７】
さらに具体的には、他のポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較して、リジンのレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する。リジンのレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ｉおよび表Ｅ４９Ｊに提供し、それぞれ、食用に適しており、発現した栄養性タンパク質のデータベースで同定した。
【表１５４】
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【表１５５】
2016537402.tif 000175
【０９７８】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、頭頸部の癌のための化学療法の後の口腔粘膜炎を防止するためにリジンのレベルを選択的に上げながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する。たとえば、頭頸部の癌を有するヒトでは、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、化学療法のレジメンと併用して患者に経口投与する（Ｃｏｌｅｌｌａ  Ｇ，  Ｃａｎｎａｖａｌｅ  Ｒ，  Ｖｉｃｉｄｏｍｉｎｉ  Ａ，  Ｒｉｎａｌｄｉ  Ｇ，  Ｃｏｍｐｉｌａｔｏ  Ｄ，  ２０１０，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ：  ２３：  １４３−５１）（Ｂｌｏｕｎｔ，  Ｗａｎｇ，  Ｌｉｍ，  Ｓｕｄａｒｓａｎ，  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，  ２００７，  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  ３：  ４４−９）。このような化学療法とリジンを多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独と比較して、口腔粘膜炎の発生および重症度の減少を含む利点を提供する。
【０９７９】
さらなる具体的な実施形態では、他のポリペプチド、特に化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較して、ヒスチジンのレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する。ヒスチジンのレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ｋおよび表Ｅ３４９Ｌに提供し、それぞれ、食用に適しており、発現した栄養性タンパク質で同定した。
【表１５６】
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【表１５７】
2016537402.tif 000177
【０９８０】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、化学療法により引き起こされる出血性膀胱炎を低減させるためにヒスチジンのレベルを選択的に上げながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する（Ｆａｒｓｈｉｄ，  Ｔａｍａｄｄｏｎｆａｒｄ，  ＆  Ｒａｎｊｂａｒ，  ２０１３，  Ｉｎｄｉａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：  ４５：  １２６−９）。乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、ＣＮＳの癌、白血病、卵巣癌、または消化管の癌を有するヒトでは、たとえば、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、化学療法のレジメンと併用して患者に経口投与する。このような化学療法のレジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような、化学療法とヒスチジンを多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独と比較して、出血性膀胱炎の発生および頻度の減少を含む利点を提供する。
【０９８１】
追加的な特定の実施形態では、他のポリペプチド、特に、化学療法の処置を経験したヒト対象に一般的に提供される食品に存在するポリペプチドと比較して、アルギニンのレベルが高い栄養性ポリペプチドを提供する。アルギニンのレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドを、表Ｅ４９Ｍおよび表Ｅ４９Ｎに提供し、それぞれ、食用に適しており、発現した栄養性タンパク質のデータベースで同定した。
【表１５８】
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【表１５９】
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【０９８２】
栄養性ポリペプチドを含む配合物は、化学療法により引き起こされる熱傷および癌を有する患者の術後感染症に対して、アルギニンのレベルを選択的に上げながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する（Ｈｅｙｌａｎｄ  ＤＫ，  Ｃｏｏｋ  ＤＪ，  １９９４，  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ：  ２２：  １１９２−２０２）。乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、ＣＮＳの癌、白血病、卵巣癌、または消化管癌を有するヒトでは、たとえば、初期用量１０〜３０グラムの当該栄養性ポリペプチドを、化学療法のレジメンと併用して患者に経口投与する。このような化学療法のレジメンに使用される薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、およびメトトレキサートが挙げられる。このような化学療法とヒスチジンを多く含む栄養性ポリペプチドの共投与は、化学療法単独と比較して術後感染症の発生の減少を含む利点を提供する。
【０９８３】
実施例５０：肝疾患および肝細胞癌用の栄養性ポリペプチドの選択
予後が不十分であり、治療上の選択が限定されている疾患である、肝細胞癌（ＨＣＣ）の原因は、宿主の遺伝性の要因、ウイルス性の要因（Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれＨＢＶおよびＨＶＣ）、栄養上の要因（脂質、分枝鎖アミノ酸、アルコール）、代謝上の要因（真正糖尿病（ＤＭ）、代謝上の症候群）を含む他因子性である（Ｍｉｃｈｅｌｏｔｔｉ，  Ｍａｃｈａｄｏ，  ＆  Ｄｉｅｈｌ，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：  １０：  ６５６−６５）。ＨＣＣの資源経過は、肝臓の炎症、肝硬変、および癌から進行する。これらＨＣＣの原因の中で、栄養上および代謝上の要因は、ＨＣＣの進行の惹起および促進に重要な役割を果たしている。非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、ＨＣＣへと進行し得る肝硬変を引き起こす。ＨＢＶ−、ＨＣＶ−、アルコール媒介型肝硬変などの肝硬変を引き起こす他の疾患と同様に、ＮＡＦＬＤは、ＨＣＣのリスクをさらに増大させる（Ｍｉｃｈｅｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：  １０：  ６５６−６５）。さらに、ＨＣＣおよび肝内胆管癌の発生もまた増えており、ＨＣＣは、現在、米国の中年男性の肥満関連の癌の死亡の主な原因である（Ｍｉｃｈｅｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：  １０：  ６５６−６５）。分枝鎖アミノ酸の食事性の補給は、動物（Ｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ：  ８）（Ｔｅｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ３３：  ２４９９−２５０６）およびヒト（Ｙｏｓｈｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ：  ３０：  ５４５−５５２）（Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ４７：  ３５９−３６６）での肝硬変を寛解し、ＨＣＣのリスクを低下させる。分枝鎖アミノ酸の食事性の補給は、主なＨＣＣおよびＨＣＣの処置後の再発の発生を減少させる（Ｙｏｓｈｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ：  ３０：  ５４５−５５２）（Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ４７：  ３５９−３６６）（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。分枝鎖アミノ酸の食事性の補給は、ＤＭおよびインスリン耐性において再発性のＨＣＣを減少させる（Ｙｏｓｈｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ：  ３０：  ５４５−５５２）。さらに、末期の肝疾患および肝硬変を有する多くの患者は、タンパク質栄養不良である（Ｍｏｒｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ３５  Ｓｕｐｐｌ  １：  １３−１７）。分枝鎖アミノ酸の補充は、慢性肝不全および肝性脳症（ＨＥ）を軽減し、タンパク質の栄養状態を改善し、その後生存時��を延長する（Ｍｏｒｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ３５  Ｓｕｐｐｌ  １：  １３−１７）。
【０９８４】
ＮＡＦＬＤ、ＨＡＳＨ、ＨＢＶ−およびＨＣＶ媒介型肝硬変、末期の肝疾患、慢性肝不全、ＨＥ、およびＨＣＣの病的状態および死亡率を特に寛解するために栄養上の支援を提供するために選択された栄養性ポリペプチドの投与を用いて、これら肝疾患のための処置を提供する。
【０９８５】
具体的には、他のポリペプチドと比較して、分枝鎖アミノ酸および他のアミノ酸のレベルが高い栄養性ポリペプチドを、ＨＡＦＬＤ、ＨＡＳＨ、およびＨＣＣのＳＴＡＭマウスモデルに提供する（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ：  ４６：  １４１−１５２）（図１）。ＳＴＡＭマウスは、高脂肪食誘導型ＨＡＦＬＤ、ＨＡＳＨ、およびＨＣＣを発達させる（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ：  ４６：  １４１−１５２）。分枝鎖アミノ酸のレベルが高い必須アミノ酸である例示的な栄養性ポリペプチドは、本明細書中に記載されている。
【０９８６】
実施例５１：前臨床動物モデルにおけるＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびＨＣＣの改善
マウスの固形飼料と混合した栄養性ポリペプチドの配合物を、ＳＴＡＭマウスに６週齢から開始して提供する。動物を、９週齢、１２週齢、１５週齢、および１８週齢で安楽死させる。通常の固形試料を使用して同一の対照グループを処置する。ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびＨＣＣの疾患重症度を、各処置グループ内での組織学的解析により定量化し、同一量の時間処置した対照の動物と比較する。
【０９８７】
実施例５２：ヒトにおけるＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびＨＣＣの改善
追加的な特定の実施形態では、分枝鎖アミノ酸のレベルが高い栄養性ポリペプチドを、ＮＡＦＬＤ、ＨＡＳＨ、ＨＢＶ−およびＨＣＶ媒介型肝硬変、末期の肝疾患、慢性肝不全、ＨＥ、およびＨＣＣなどの肝疾患を有するヒト対象に、経口用量１０〜３０グラムで提供する（Ｙｏｓｈｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ：  ３０：  ５４５−５５２）（Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ４７：  ３５９−３６６）（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）（Ｍｏｒｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：  ３５  Ｓｕｐｐｌ  １：  １３−１７）。高いレベルの分枝鎖アミノ酸を含む例示的な栄養性ポリペプチドは本明細書中に提供されている。栄養性ポリペプチドを含む配合物は、分枝鎖アミノ酸のレベルを選択的に上げながら、生命に必須の代謝上の支援を提供する。
【０９８８】
本発明は、好ましい実施形態および様々な代替的な実施形態を参照して特に示されかつ記載されているが、形態および詳細の様々な変化が、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなくこれらから作製できることは、関連する分野の当業者に理解されるものである。
【０９８９】
本明細書中に引用されたすべての参照文献、発行済みの特許、および特許出願は、すべての目的のため本明細書中に参照として全体的に援用されている。
【表１６０】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図１】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図７０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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