(57)【要約】  本発明は、従属栄養条件下で培養された微細藻類のバイオマスのカロテノイドおよびタンパク質を富化するためのプロセスであって、前記微細藻類がクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属する微細藻類であり、前記微細藻類を、好ましくは、酵母エキス、コーンスティープリカーおよびこれらの組合せからなる群から選択される有機形態の窒素源を補充した最少培地で培養するステップを含む、プロセスに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
従属栄養培養された微細藻類バイオマスをカロテノイド富化およびタンパク質富化するための方法であって、前記微細藻類を有機形態の窒素源を補充した最少培地で培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記微細藻類がクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属する微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類が、クロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびコレラ・ケスレリ（Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類がクロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記有機形態の窒素源が、酵母エキス、コーンスティープリカーおよびこれらの組合せからなる群からから選択されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機形態の窒素源が酵母エキスであることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機形態の窒素源がコーンスティープリカーであることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
有機形態の窒素源の添加量が、発酵培地に含まれる全窒素の１０％以下であることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記最少培地に酵母エキスが０．５〜３ｇ／Ｌ、好ましくは、酵母エキスが１〜２ｇ／Ｌ補充されることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
最少培地のみで培養されたバイオマス中のカロテノイド含有量と比較して、前記バイオマス中のカロテノイド含有量を、前記バイオマスの総重量の少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％に増加させることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
最少培地のみで培養されたバイオマス中のタンパク質含有量と比較して、前記バイオマス中のタンパク質含有量を、前記バイオマスの総重量の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％に増加させることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
取得される前記バイオマス中のカロテノイド含有量が、前記バイオマスの総重量の少なくとも０．３５％、好ましくは前記バイオマスの総重量の少なくとも０．４％であることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
取得される前記バイオマス中のタンパク質含有量が、前記バイオマスの総重量の少なくとも４５％、好ましくは、前記バイオマスの総重量の少なくとも５０％であることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微細藻類を最少培地で培養する第１ステップと、
酵母エキスまたはコーンスティープリカーを前記最少培地に添加する第２培養ステップと
を含むことを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
クロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）種の微細藻類を最少培地で増殖させる第１ステップと、
前記最少培地に酵母エキスを添加する第２培養ステップと
を含むことを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２ステップにおいて、前記微細藻類のグルコース消費能力よりも大幅に低い速度でグルコースを連続的に供給することを特徴とする、請求項１４および１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類、より詳細にはクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｇｅｎｕｓ）に属する微細藻類、より詳細にはクロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）種のバイオマスのカロテノイド富化およびタンパク質富化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大型藻類および微細藻類は特定の成分を豊富に含むが、その大部分は未開のままである。これらの食物、化学またはバイオエネルギー用途における利用はまだわずかである。それにもかかわらず、これらは高い価値を有する成分を含有している。
【０００３】
実際、微細藻類は、ビタミン類、脂質、タンパク質、糖、色素および抗酸化成分の供給源である。
【０００４】
したがって、藻類および微細藻類は、栄養補助食品、機能性食品、化粧品、医薬品の製造業および水産養殖業の各分野から注目されている。
【０００５】
微細藻類は、光が当たるあらゆる生息場所に最初に定着する光合成微生物である。
【０００６】
工業規模では、そのモノクローナル培養は光バイオリアクター内で行われる（独立栄養条件：光およびＣＯ２中）が、発酵槽内でも行われる場合がある（従属栄養条件：暗所、炭素源存在下）。
【０００７】
これは、微細藻類の一部の種、すなわちクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微細藻類が光の非存在下で増殖可能なためである。
【０００８】
さらに、従属栄養条件下での培養は光栄養条件下での培養に比べて費用が１０分の１になると見積もられている。その理由は、こうした従属栄養条件において当業者は：
細菌や酵母に使用されるものと同じ発酵槽が使用可能であるため、全ての培養パラメータを制御することができることに加えて、
光を基礎とする培養により得られるバイオマス生産量を大幅に上回る生産量が得られるためである。
【０００９】
一般に、微細藻類を有益に利用するためには、目的成分を蓄積させることができるように発酵条件を制御することが必要である。目的成分とは、例えば以下に示すものである：
色素（クロロフィルａ、ｂおよびｃ、β−カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、フィコシアニン、キサントフィル、フィコエリトリン等）：これらは顕著な抗酸化性を示すだけでなく、食品用の天然の着色料としても使用できることから、需要が高まりつつある。
タンパク質：栄養価を最適化するために使用される。または、
脂質：特に次の用途に使用するために、脂肪酸含有量が最適化される（固形分の６０重量％以下または８０重量％とする場合さえある）：
・バイオ燃料用途、加えて、
・食品または動物飼料用途（選択された微細藻類が「必須」（すなわち、ヒトまたは動物体内で天然に合成されないため、食事によって供給される）多価不飽和脂肪酸すなわちＰＵＦＡを産生する場合）。
【００１０】
上述の成果が得られるように、タンパク質または脂質の収率および生産性を最大限にすることを目的として、高い細胞密度（ＨＣＤ）を得ることが可能な第１の発酵方法については既に十分に検討されている。
【００１１】
これらのＨＣＤ培養の目的は、可能な最大濃度の所望の生産物を可能な最短時間で得ることにあった。
【００１２】
この原理は、例えば、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）によるアスタキサンチンの生合成によって証明されており、この微細藻類の増殖はアスタキサンチンの生産に直接の相関があることが証明されている（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｅｎｇ，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（９），１９１５−１９２２）。
【００１３】
しかしながら、増殖を最大速度（μ：単位ｈ−１）に維持することが、必ずしも所望の生産物の生産量を高くすることと相関している訳ではない。
【００１４】
実際、例えば微細藻類に多量の貯蔵脂質を生産させることが所望される場合は、微細藻類の増殖を制限する栄養的ストレスに晒すことが必要であることがすぐに当業者に明らかとなった。
【００１５】
したがって、発酵方法において、増殖および生産は切り離して考えられる。
【００１６】
例えば、国際公開第０１／５４５１０号パンフレットにおいては、多価不飽和脂肪酸（この例においてはドコサヘキサエン酸、すなわちＤＨＡ）の蓄積を促すために、多価不飽和脂肪酸の生産と細胞の増殖とを切り離して考えることが推奨されている。
【００１７】
つまり、微細藻類としてシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ２０８８８株を用いる場合は、第１増殖段階は高い細胞密度の達成を促すために酸素非制限下（１００ｇ／Ｌ超）にて行い、次いで第２段階においては、微細藻類にストレスを与えるように酸素の供給速度を徐々に遅くすることにより増殖速度を遅くして目的の脂肪酸の産生を誘発する。
【００１８】
微細藻類としてクリプテコディニウム・コニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）を用いる場合は、グルコース濃度を低く（５ｇ／Ｌ程度）、したがって増殖速度を遅くした場合にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、多価不飽和脂肪酸）が最大濃度で得られる（Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０００，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５（１０），１２０５−１２０９）。
【００１９】
これらの結果は、微細藻類の増殖は生産物の生産速度に対しプラスにもマイナスにも作用することができ、両方の作用が重なる場合さえあることの好例である。
【００２０】
つまり、高細胞増殖と生産物の生産が相関しない場合は、細胞増殖速度を制御することが賢明である。
【００２１】
一般に、当業者は、発酵条件（温度、ｐＨ）を制御するかまたは発酵培地への栄養分の供給を調整する（「流加培養」と称される半連続的条件）ことによって微細藻類の増殖を
制御することを選択する。
【００２２】
微細藻類の増殖を、炭素源を供給する従属栄養下に制御することを選択した場合、当業者は一般に、微細藻類（クリプテコディニウム・コニー（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）等）が生産する代謝産物（例えば、ＤＨＡ型の多価不飽和脂肪酸）に応じて炭素源（純グルコース、酢酸塩、エタノール等）を適合させることを選択する。
【００２３】
温度も重要なパラメータとなり得る。
例えば、微細藻類のいくつかの種における多価不飽和脂肪酸の合成（例えば、クロレラ・ミニツシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）によるＥＰＡの合成等）は、上記微細藻類の増殖に必要とされる至適温度よりも低い温度で促進されることが報告されている。
他方、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の従属栄養培養においては、生産温度を２４℃から３５℃に上げるとルテインの収率が増加する。
【００２４】
実際、クロレラ・プロトセコイデスは、最適な産油微細藻類の１種であることが知られている。
【００２５】
従属栄養条件下において、この微細藻類は炭水化物を速やかにトリグリセリドに変換する（その固形分の５０％超）。
【００２６】
このトリグリセリドの生産を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境を操作することによって、油の生産に向かう炭素流動を最適化するに至った。
【００２７】
このように、窒素欠乏条件下で炭素を十分に供給した場合に油が蓄積されることが知られている。
【００２８】
つまり、この場合はＣ／Ｎ比が決定要因となり、窒素含有量を直接操作することによって最良の結果が得られることが認められており、グルコース含有量は制限因子ではない。
【００２９】
当然のことながら、窒素欠乏は細胞増殖に影響を与え、窒素欠乏の結果として微細藻類の増殖速度が正常な増殖速度に比べて３０％遅くなる（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５４，ｐｐ．１００１−１０１１）。
【００３０】
この結果を説明するために、上述の論文においてＸｉｏｎｇらは実際に、クロレラバイオマスを５種類の主要な成分、すなわち炭水化物、脂質、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ（その固形分の８５％を占める）に分けた場合、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは炭水化物の含有量はＣ／Ｎ比に左右されないが、タンパク質および脂質の含有量に関してはＣ／Ｎ比が最も重要であることを実証している。
【００３１】
つまり、低いＣ／Ｎ比で培養されたクロレラ属細胞のタンパク質含有量は２５．８％、脂質含有量は２５．２３％であるが、高いＣ／Ｎ比においては、脂質を５３．８％、タンパク質を１０．５％、合成することが可能である。
【００３２】
したがって、油の生産を最適化するためには、当業者は、炭素流動がタンパク質生産を犠牲にして油の生産に向かうように操作することによって炭素流動を制御することが不可欠である。微細藻類を窒素欠乏培地に接種すると、炭素流動が再分配されて脂質貯蔵物質として蓄積される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
この教示を踏まえて、当業者は、タンパク質に富むバイオマスの生産を目的とする場合は、上述の代謝制御とは反対の制御を行う、すなわち、代わりに、低Ｃ／Ｎ比を促進することにより：
発酵培地においてタンパク質に変換される炭素源の添加量を一定に維持しながら多量の窒素源を供給し、かつ
微細藻類の増殖を刺激する
ように発酵条件を修正するに至った。
【００３４】
これに伴い、貯蔵脂質の生産を犠牲にしてタンパク質（したがってバイオマス）の生産に向かうように炭素流動が修正される。
【００３５】
本発明において、出願人は、当業者が従来から想定していた解決策の代替案を提案することにより、新たな経路を探索することを選択した。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
したがって、本発明は、従属栄養培養された微細藻類バイオマスのカロテノイドおよびタンパク質を富化するための方法であって、前記微細藻類はクロレラ属に属する微細藻類であり、より詳細には、クロレラ・ソロキニアーナであり、その従属栄養培養方法は、前記微細藻類を酵母エキス、コーンスティープリカーおよびこれらの組合せから選択される窒素源を補充した最少培地で培養することを含む、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明において、
カロテノイド「富化」とは、最少培地のみで培養したバイオマス中のカロテノイド含有量と比較して、バイオマス中のカロテノイド含有量をバイオマスの総重量の少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％増加させることを意味することを意図している。好ましくは、本発明による方法により得られるバイオマス中のカロテノイド含有量は、バイオマス総重量の少なくとも０．３５％であり、より詳細には、好ましくは、バイオマスの総重量の少なくとも０．４％である。
【００３８】
タンパク質「富化」とは、最少培地のみを用いて培養されたバイオマス中のタンパク質含有量と比較して、バイオマス中のタンパク質含有量をバイオマスの総重量の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％増加させることを意味することを意図している。好ましくは、本発明による方法により得られるバイオマス中のタンパク質含有量は、バイオマス総重量の少なくとも４５重量％であり、より詳細には、好ましくは、バイオマス総重量の少なくとも５０％である。
【００３９】
本発明において、「最少培地」とは、微細藻類の増殖に必須の化学元素のみを、特定の条件を必要とすることなく微細藻類が利用できる形態で含有する培地であると、従来より定義されている。
【００４０】
したがって最少培地は：
炭素源およびエネルギー源：一般にグルコース
カリウム源およびリン源：例えばＫ２ＨＰＯ４
窒素源および硫黄源：例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４
マグネシウム源：例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
カルシウム源：例えばＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
鉄源：例えばＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
微量元素源：Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｂ、Ｍｎ、Ｍｏの各塩
ビタミン源（チアミン、ビオチン、ビタミンＢ１２等）
を含む。
【００４１】
次いで出願人は、クロレラ属に属する微細藻類、より詳細にはクロレラ・ソロキニアーナを、この基本的に無機物質からなる最少培地で培養しても依然として多量のバイオマスを生産することが可能であったが、目的成分であるカロテノイドやタンパク質等を得るには不利であったことを見出した。
【００４２】
基本的に無機物質からなる培地においてバイオマスの増殖速度が高い（０．０５ｈ−１超）ことは、特に、その株が窒素に関し独立栄養であることを表している。
【００４３】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ここで出願人は、微細藻類を最少培地で培養することにより、貯蔵物質（多糖類系のもの）を生産する代謝経路が活性化されるという仮説を提案する。
【００４４】
ここで出願人は、少量の有機形態の窒素を含有する補充栄養源、すなわち酵母エキスまたはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）を供給する（好ましくは、供給される窒素の９０％超は無機物質のままである）と、このような特定の条件下（微細藻類が窒素に関し完全に独立栄養であるまま）において、前記多糖貯蔵物質の生産速度を遅らせ、カロテノイドおよびタンパク質を生産する代謝経路へ転換させることが可能であることを見出した。
【００４５】
したがって、このような形で発酵を行うと、カロテノイドおよびタンパク質の生産量を増加させる窒素を含有する補充栄養源の最少培地への添加を容易に管理することが可能になる。
【００４６】
つまりこの方策は、例えば、バイオマス中のタンパク質含有量を高めるためには、バイオマスを増加させる、したがって細胞増殖速度を高めるか、または発酵培地の窒素源を増量することが必要不可欠であるという技術的先入観に大きく反している。
【００４７】
実際、この場合、バイオマス量は一定に維持され、タンパク質の過剰生産を導くのは補充栄養源の添加（好ましくは、発酵培地に添加される全窒素の１０重量％未満）である。
【００４８】
したがって本発明は、従属栄養培養される微細藻類バイオマスのカロテノイドおよびタンパク質を富化するための方法であって、上記従属栄養培養方法は、有機形態にある窒素源を補充した最少培地で上記微細藻類を培養することを含む、方法に関する。
【００４９】
微細藻類は、好ましくは、クロレラ属に属する微細藻類、特に、クロレラ・ソロキニアーナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびコレラ・ケスレリ（Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）から選択される色素に富む微細藻類、より詳細には、好ましくはクロレラ・ソロキニアーナである。
【００５０】
好ましくは、有機形態の窒素源は、酵母エキス、コーンスティープリカーおよびこれらの組合せからなる群から選択される。より詳細には、好ましくは、有機形態の窒素源は酵母エキスである。好ましくは、酵母エキスは、サッカロミケス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られるものである。
【００５１】
有機形態の窒素源は、無機窒素源を含む最少培地に添加される。好ましくは、有機形態
の窒素源の供給量は、発酵培地に含まれる全窒素（無機源および有機源併せて）の１０％以下である。
【００５２】
最少培地の無機窒素源としては、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４またはＮＨ４Ｃｌを用いることができる。
【００５３】
最少培地には、酵母エキスを０．５〜３ｇ／Ｌ、好ましくは酵母エキスを１〜２ｇ／Ｌ補充することができる。より詳細には、好ましくは、最少培地には酵母エキスを約１ｇ／Ｌ補充することができる。本明細書において使用される「約」という語は、±２０％、１０％、５％または２％の値を指す。
【００５４】
最少培地はまた、コーンスティープリカーを１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは３〜５ｇ／Ｌ、特に好ましくはコーンスティープリカーを４ｇ／Ｌ補充することができる。
【００５５】
一実施形態によれば、本発明による方法により、最少培地のみで培養されたバイオマスのタンパク質含有量と比較して、バイオマスのタンパク質含有量をバイオマスの総重量の少なくとも５％増加させることが可能である。本発明による方法により、最少培地のみで培養されたバイオマスのタンパク質含有量と比較して、バイオマスのタンパク質含有量をバイオマスの総重量の少なくとも６、７、８、９または１０％増加させることも可能であろう。
【００５６】
好ましくは、本発明による方法により得られるバイオマス中のタンパク質含有量は、バイオマスの総重量の４５％超、５０％超または５５％超である。他の実施形態によれば、本発明による方法により、最少培地のみで培養されたバイオマス中のカロテノイド含有量と比較して、バイオマス中のカロテノイド含有量をバイオマスの総重量の少なくとも０．０５％増加させることが可能である。本発明による方法により、最少培地のみで培養されたバイオマスのカロテノイド含有量と比較して、バイオマス中のカロテノイド含有量をバイオマスの総重量の少なくとも０．１または０．２％増加させることも可能である。
【００５７】
好ましくは、本発明による方法により得られるバイオマスのカロテノイド含有量は、バイオマスの総重量の０．３５％超、０．４％超または０．５％超である。
【００５８】
他の態様によれば、本発明は、微細藻類を従属栄養培養するための方法であって：
微細藻類を最少培地で培養する第１ステップと、
酵母エキス、コーンスティープリカーおよびこれらの組合せからなる群から選択される有機形態の窒素源を上記最少培地に添加する第２培養ステップと
を含む方法にも関する。
【００５９】
第１ステップにより微細藻類を増殖させることができ、第２ステップにより、多糖貯蔵物質の蓄積を抑制すると共に、バイオマスのタンパク質およびカロテノイドの富化を可能にする。
【００６０】
一実施形態によれば、微細藻類はクロレラ属に属する微細藻類であり、好ましくは、クロレラ・ソロキニアーナ、クロレラ・ブルガリスおよびコレラ・ケスレリから選択され、好ましくはクロレラ・ソロキニアーナである。
【００６１】
第２培養ステップにおいて添加される有機形態の窒素源は、好ましくは酵母エキスである。
【００６２】
より詳細には、本発明は、上記微細藻類、特にクロレラ・ソロキニアーナを従属栄養培
養するための方法であって：
微細藻類を最少培地で増殖させる第１ステップと、
この最少培地に酵母エキスを添加する第２ステップと
を含む、方法に関する。
【００６３】
特定の一実施形態によれば、有機形態の窒素源の添加量は、発酵培地に含まれる全窒素の１０％以下である。具体的には、酵母エキスを最少培地に０．５〜３ｇ／Ｌ、好ましくは酵母エキスを１〜２ｇ／Ｌ補充することができる。
【００６４】
好ましくは、第２培養ステップにより：
最少培地のみで培養されたバイオマス中のカロテノイド含有量と比較して、バイオマス中のカロテノイド含有量をバイオマスの総重量の少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％増加させ、および／または
最少培地のみで培養されたバイオマス中のタンパク質含有量と比較して、バイオマス中のタンパク質含有量をバイオマスの総重量の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％増加させることができる。
【００６５】
好ましい一態様によれば、得られたバイオマスにおける：
カロテノイド含有量は、バイオマスの総重量の少なくとも０．３５％、好ましくは、バイオマスの総重量の少なくとも０．４％であり、および／または
タンパク質含有量は、バイオマス総重量の少なくとも４５％、好ましくは、バイオマス総重量の少なくとも５０％である。
【００６６】
任意選択により、また以下の実施例に示すように、第２ステップにおいてグルコースを微細藻類のグルコース消費能力を十分に下回る量で連続的に供給する。
【００６７】
微細藻類バイオマスのカロテノイドおよびタンパク質を富化するための方法に関する上述の実施形態はこの態様においても想定されている。
【００６８】
以下に示す例示を目的とする非限定的な実施例から本発明が一層明白になることが理解されるであろう。
【実施例】
【００６９】
クロレラ・ソロキニアーナの生産  −  酵母エキスの添加
クロレラ・ソロキニアーナＵＴＥＸ  １６６３株を使用する。
【００７０】
前培養：
２Ｌ容の三角フラスコに培地６００ｍＬを入れる。
培地組成を次に示す。
【００７１】
【表１】
2016537986.tif 000002
【００７２】
８ＮのＮａＯＨを加えてｐＨを７に調整した後、滅菌を行う。
【００７３】
次に示す条件で培養を行う：時間：７２時間；温度：２８℃；振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ社製Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ培養器）。
【００７４】
次いで、前培養物を３０Ｌ容のＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製発酵槽に移す。
【００７５】
バイオマス生産のための培養：
基本培地は、尿素をＮＨ４Ｃｌに置き換えたことを除いて前培養と同じ培地とする。
【００７６】
【表２】
2016537986.tif 000003
【００７７】
試験１（対照）：補充栄養源を添加しない。
試験２：酵母エキス１ｇ／Ｌを添加する。
【００７８】
接種後の発酵槽の初発液量（Ｖｉ）を１３．５Ｌに調整する。最終液量が１６〜２０Ｌになるようする。
【００７９】
発酵パラメータを次に示す。
【００８０】
【表３】
2016537986.tif 000004
【００８１】
最初に添加したグルコースが全て消費されたら、初期培地と類似の培地を、特にグルコースを５００ｇ／Ｌ含む濃縮液の形態で補充する。
【００８２】
次表にこの濃縮液１リットルの組成を示す。
【００８３】
【表４】
2016537986.tif 000005
【００８４】
グルコース以外の元素の濃度は、株の栄養要求よりも過剰になるように決定した。
【００８５】
この溶液を、株のグルコース消費能力を低い速度で連続的に補充する。こうすることにより、培地の残留グルコース含有量がゼロに維持される、すなわち、株の増殖がグルコース利用性により制限される（グルコース制限条件）。
【００８６】
この速度は、次式に従い、時間と共に指数関数的に増加させる：
Ｓ＝１２・ｅｘｐ（０．０７×ｔ）
（式中、Ｓはグルコース供給速度（ｇ／ｈ）であり、ｔは流加方式の継続時間（ｈ）である）。
【００８７】
過度の泡立ちを抑えるために、消泡剤であるＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７を必要に応じて添加する。
【００８８】
結果：酵母エキス添加による効果
得られたバイオマスの全窒素を測定することにより、タンパク質含有量を求める（Ｎ×６．２５として計算）。
【００８９】
【表５】
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【００９０】
これの結果から、補充栄養源を酵母エキスの形態で補充することにより、タンパク質含有量が５０％を超えるバイオマスを高濃度で得ることが可能になることが分かる。
【００９１】
カロテノイド含有量も同様に増加する。
【国際調査報告】
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