【手続補正書】
【提出日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルに含まれる目的の個々の細胞内に存在する、第２のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントに対して、第１のマーカーにより規定される細胞内コンパートメント内の特定のバイオマーカーを位置決定および定量する、コンピュータにより実装される方法であって、
ａ）該組織サンプルを、該第１のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントを特異的に標識する第１の色素、該第２のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントを特異的に標識する第２の色素、および該バイオマーカーを特異的に標識する第３の色素と一緒にインキュベートする工程；
ｂ）光学的イメージングデバイスを使用して、
ｉ）該第１のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントの第１の画像；
ｉｉ）該第２のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントの第２の画像；および
ｉｉｉ）該バイオマーカーの第３の画像、
を得るように、該組織サンプル中の第１、第２および第３の色素の各々の高解像度の画像を得る工程；
ｃ）該第１および該第２の画像中のピクセル位置を、該ピクセル位置における第２の色素に対する前記第１の色素の強度値に基づいて、該第１もしくは該第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てるか、またはいずれの細胞内コンパートメントにも割り当てないように、該第１および該第２の画像中の該ピクセル位置を分析する工程；
ｄ）該第３の色素の存在を示す強度値を有するピクセル位置を同定するように、工程（ｃ）において該第１または該第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てられたピクセル位置を、該第３の画像において分析し、このようなピクセル位置において、第３の色素の合計強度値を決定する工程、
を包含し、
これによって、該第２の細胞内コンパートメントに対する該第１の細胞内コンパートメント中のバイオマーカーを位置決定および定量する、方法。
【請求項２】
工程（ｃ）において前記分析が、そのピクセル位置における前記第２の色素に対する前記第１の色素の強度値の比に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において前記第１および第２の画像中のピクセル位置の分析が、
そのピクセル位置における前記第２の色素に対する前記第１の色素の強度値に基づいて、このようなピクセル位置の割り当てに関して９５％の精度が達成される場合は、このような各ピクセル位置を前記第１もしくは前記第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てるか、またはこのようなピクセル位置の割り当てに関して９５％未満の精度が達成される場合は、このような各ピクセル位置をいずれの細胞内コンパートメントにも割り当てないことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において前記第１および第２の画像中の各ピクセル位置の分析が、そのピクセル位置における前記第２の色素に対する前記第１の色素の強度値の比に基づいて、このようなピクセル位置の割り当てに関して９５％の精度が達成される場合は、このような各ピクセル位置を前記第１もしくは前記第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てるか、またはこのようなピクセル位置の割り当てに関して９５％未満の精度が達成される場合は、このような各ピクセル位置をいずれの細胞内コンパートメントにも割り当てないことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１、前記第２および前記第３の色素の各々が、発蛍光団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１または前記第２の細胞内コンパートメント内に存在するバイオマーカーの定量が、このような細胞内コンパートメント内のピクセル位置における第３の色素の強度値を合計する工程、およびこのような細胞内コンパートメント内のピクセル数で該合計を除算する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の細胞内コンパートメントにも前記第２の細胞内コンパートメントにも割り当てられないピクセル位置が、第３の細胞内コンパートメントに割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組織が、約５ミクロンの厚さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２のマーカーにより規定される細胞内コンパートメントの各々が、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム、およびリソソームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の細胞内コンパートメントが、細胞膜であり、前記第２の細胞内コンパートメントが、細胞核である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織サンプルが、固定された組織切片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１または前記第２の色素が、サイトケラチン、β−カテニン、α−カテニンおよびビメンチンからなる群から選択されるマーカーと反応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１、前記第２、または前記第３の色素のうちの少なくとも１つが、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、Ｃｙ３およびＣｙ５−チラミドからなる群から選択される発蛍光団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプターおよび上皮増殖因子レセプターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）の後であって工程（ｃ）の前に、偽逆重畳工程を実施する工程を包含し、該偽逆重畳工程は、
１）前記組織サンプルにおける第１、前記第２、および前記第３の色素の各々の焦点外画像を得る工程であって、各画像が、各ピクセル位置についての焦点外強度値を有する、工程；ならびに
２）各ピクセル位置についての前記焦点外強度値を、工程（ｂ）の前記第１、前記第２、および前記第３の画像中のこのようなピクセル位置における強度値から減算する工程、
を包含し、これによって、バックグラウンドについて補正された、処理された画像または各色素を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１、前記第２、および前記第３の画像にマスクが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）において前記分析が、前記第１および前記第２の画像中の前記ピクセル位置のサブセットを分析する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
組織サンプル内に存在する特定のバイオマーカーを位置決定および定量するためのシステムであって、
該組織サンプルの高解像度の画像を得るように構成された、高解像度の光学的イメージングデバイスであって、該顕微鏡は、
ｉ）該サンプルを保持するように構成されたステージ；
ｉｉ）該ステージに向かう方向で第１の光線を発光するように構成された蛍光光源；
ｉｉｉ）該蛍光光源のためのハウジング；
ｉｖ）該光源と該サンプルステージとの間に位置決めされた第１のセットのフィルタ；
ｖ）該第１のセットのフィルタのうちの１つが該第１の光線の経路に入るように選択的に位置決めするための第１の位置決め手段であって、該第１の光線の経路内の選択されたフィルタが該第１の光線をフィルタに通して、望ましい照明スペクトルの第２の光線を出力する、第１の位置決め手段；
ｖｉ）該サンプルを前記第２の光線の経路内に配置するために該ステージを位置決めするための第２の位置決め手段であって、該第２の光線は、該サンプルに入射して、該サンプルに蛍光を透過させる第２の位置決め手段；
ｖｉｉ）該サンプルステージとデジタルカメラとの間に位置決めされた第２のセットのフィルタ；
ｖｉｉｉ）該サンプルから発光された蛍光の一部をフィルタに通し、フィルタに通された望ましいスペクトルシグネチャーの光の通過を可能にするために、各フィルタを該第２のセットのフィルタと選択的に位置合わせするための第３の位置決め手段；
ｉｘ）該サンプルから発光された蛍光をフィルタに通すことにより生じるフィルタに通された光のデジタル画像を捕捉するためのデジタルカメラ、
を備える、光学的イメージングデバイス、ならびに
該デジタルカメラから該デジタル画像を獲得するように該顕微鏡に結合されたコンピュータであって、
ｉ）
ａ）第１の色素の第１の画像；
ｂ）第２の色素の第２の画像；および
ｃ）第３の色素の第３の画像、
を得るように、該組織サンプル中の第１、第２、および第３の色素の各々の画像を得る工程と、
ｉｉ）該第１および該第２の画像中のピクセル位置を、該ピクセル位置における第２の色素に対する第１の色素の強度値に基づいて、第１もしくは第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てるか、または該コンパートメントのいずれにも割り当てないように、該第１および該第２の画像中のピクセル位置を分析する工程；
ｉｉｉ）該第３の色素の存在を示す強度値を有するピクセル位置を同定するように、工程ｉｉ）において該第１または該第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てられたピクセル位置を、該第３の画像において分析し、このようなピクセル位置において、第３の色素の合計強度値を決定する工程、
を包含する方法を実施するための、プロセッサー、データ保存システム、入力デバイス、および出力デバイスを備えるコンピュータ、
を備え、
これによって、該組織サンプル中に存在するバイオマーカーを位置決定および定量する、システム。
【請求項１９】
前記サンプルが、組織マイクロアレイである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
組織サンプル内に存在する特定のバイオマーカーを位置決定および定量するためのシステムであって、
ｉ）該組織サンプルの拡大図を得るための、高解像度の光学的イメージングデバイス；
ｉｉ）該組織サンプルの拡大図のデジタル画像を捕捉するために顕微鏡に結合されたデジタルカメラ；
ｉｉｉ）該デジタル画像を獲得するように該カメラに結合されたコンピュータであって、
ｉ）該組織サンプル中の第１の色素の第１の画像を得る工程；
ｉｉ）該組織サンプル中の第２の色素の第２の画像を得る工程；および
ｉｉｉ）該組織サンプル中の第３の色素の第３の画像を得る工程、
を包含し、各画像が複数のピクセル位置を含み、
ｉ）該第１および該第２の画像中のピクセル位置を、該ピクセル位置における第２の色素に対する該第１の色素の強度値に基づいて、第１もしくは第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てるか、または該コンパートメントのいずれにも割り当てないように、該第１および該第２の画像中のピクセル位置を分析する工程；
ｉｉ）該第３の色素の存在を示す強度値を有するピクセル位置を同定するように、該第１または該第２の細胞内コンパートメントに対して割り当てられたピクセル位置を、該第３の画像において分析し、このようなピクセル位置において、第３の色素の合計強度値を決定する工程、
を包含し、該第３の色素は、該バイオマーカーに対して特異的である、方法を実施するための指示を有するコンピュータ読み出し可能保存媒体を備えるコンピュータ、
を備え、
これによって、該組織サンプル中に存在するバイオマーカーを位置決定および定量する、システム。