(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのアミノ酸配列に、野生型β−毒素には存在しない変異を有する、クロストリジゥムパーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）β−毒素の解毒された免疫原性誘導体であって、前記変異がペプチドリーダーメチオニンに対して６２、１８２もしくは１９７の位置、またはアミノ酸番号８０〜１０３、１４５〜１４７、２８１〜２９１、２９５〜２９９の間もしくはアミノ酸位置２９２の下流の領域の一つに位置することを特徴とする前記免疫原性誘導体。
【請求項２】
変異がアミノ酸番号８０〜８２、９５〜９７、１０１〜１０３または２８７〜２９１の間の領域の一つに位置することを特徴とする、請求項１に記載のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体。
【請求項３】
変異が置換変異であることを特徴とする、請求項１または２に記載のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体。
【請求項４】
変異が挿入および／または欠失であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体。
【請求項５】
変異がβ−毒素の中性部分と親水性部分との間の遷移ドメインに位置することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の解毒された免疫原性クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素をコードする変異されたＤＮＡを含むヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のヌクレオチドを含むクロストリジゥムパーフリンジェンス。
【請求項８】
グラム陽性細菌をベースとする発現系であって、該グラム陽性細菌はクロストリジゥムパーフリンジェンスではなく、該グラム陽性細菌が請求項６に記載のヌクレオチドを含む発現系。
【請求項９】
天然のコンホーメーションを有するクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の製造法であって、請求項６に記載のヌクレオチドがグラム陽性細菌で発現され、該グラム陽性細菌がクロストリジゥムでないことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のβ−毒素の誘導体をコードするＤＮＡを含むヌクレオチドがグラム陽性細菌で発現されることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体の製造法。
【請求項１１】
グラム陽性細菌がラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロストリジゥムパーフリンジェンス(Clostridium perfringens) β−毒素の解毒された免疫原性誘導体、該誘導体をコードするＤＮＡ、該誘導体をコードするＤＮＡを含むクロストリジゥムパーフリンジェンス、野生型β−毒素を発現するクロストリジゥムパーフリンジェンス以外をベースとするグラム陽性細菌発現系、それをベースとするクロストリジゥムパーフリンジェンスに対抗するためのワクチン、天然のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の製造法、クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の解毒された免疫原性誘導体の製造法およびクロストリジゥムパーフリンジェンスに対抗するためのワクチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロストリジゥムパーフリンジェンス［クロストリジゥムウェルシュ（C. welchii）としても知られる。］は、大きいクロストリジウム（Clostridium ）属の一種である。この属に属する細菌は全て、胞子形成嫌気性グラム陽性バシラスである。クロストリジゥムパーフリンジェンス種は、亜種に分けることができる。５つの亜種が記載されている。これらの亜種は、一般に、Ａ〜Ｅ「型」として知られている。全ての亜種はいくつかの毒素を産生し、主要毒素も非主要毒素もある。４個の主要毒素は、α、β、εおよびτ毒素である。全ての種類のクロストリジゥムパーフリンジェンスはα−毒素を産生する。β−毒素は、クロストリジゥムパーフリンジェンスＢ型およびＣ型によって産生される。また、広範囲の非主要毒素は、全ての型のクロストリジゥムパーフリンジェンスによって産生される。全てのクロストリジゥムパーフリンジェンス種が病原性であるのは、５種類のクロストリジゥムパーフリンジェンスにこれらの各種毒素の１以上が存在することが主な理由である。
【０００３】
Ａ型は、ヒトおよびブタの両方に対して病原性であることが知られている。Ｂ型は、主に子ヒツジ、ヒツジおよびヤギに対して病原性であり、「子ヒツジの赤痢」および出血性腸炎を引き起こす。Ｃ型は、ヒト、ヒツジ、子ウシ、子ヒツジ、ブタおよびトリに対して病原性である。それは、「ヒツジの腸毒血症」、出血性腸炎、壊疽性腸炎および腸性毒血性の原因である。
【０００４】
上記したように、クロストリジゥムパーフリンジェンスＢ型およびＣ型は共に、β−毒素を産生することが知られている。β−毒素は、ヒトおよび動物の壊疽性腸炎の病因において重要な役割を果たすことが知られている。ヒトの場合、この病気は、ピッグベルと呼ばれている(Johnsonら、Lancet ii, 496-500 (1987))。動物では、子ウシ、子ヒツジおよびブタでの壊疽性腸炎が記載されている(Hauschild, A.H.W. in S. Kadis, T.C. Montie （編）, Microbial toxins, p.159-188, Academic press, Inc., New York (1971)および Willis, T.A. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice, 第３版, Butterworths, London (1977))。
【０００５】
クロストリジゥムパーフリンジェンス由来のβ−毒素は、純粋な形で単離されている(Sakuraiら、Infect. & Immun. 18:741-745 (1977), Sakurai ら、Toxicon 25: 1301-1310 (1987)) 。毒素の生物物理学的特性についてはまだあまり知られておらず、従って、その作用の仕方についても知られていない。しかし、それが純粋な形で得られたという事実により、動物でのβ−毒素の毒性ははっきり示すことができた。例えばマウスおよびモルモットに対する精製したβ−毒素の致死毒性は、Sakurai らによって示された(Infect. & Immun. 21: 678-680 (1978), Sakurai ら、Toxicon 25: 1301-1310 (1987)) 。
【０００６】
最近、クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の核酸配列が Hunter らによって明らかにされた(Infect. & Immun. 61:3958-3965 (1993))。核酸配列から、β−毒素の大きさは約 35 kDであることが示された。
【０００７】
病原性においてＢ型およびＣ型由来のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の役割が最も重要であることから、クロストリジゥムパーフリンジェンスＢ型およびＣ型感染に対する免疫の開発においてかなりの努力が払われている。β−毒素に対して免疫を誘導する唯一の方法は、保護したい動物に毒素を投与することである。しかし、明らかなように、毒素は解毒した形で与えられなければならない。そうでないと、ワクチン接種した動物の重病または死を招くからである。
【０００８】
解毒したβ−毒素（β−トキソイドとも呼ばれる）をベースとするワクチンは、1960年頃にすでに利用されていた（例えば、英国特許第 901,433号および米国特許第 3,288,680号）。しかし、不活性化クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素をベースとする、現在利用されている全てのワクチンは、いくつかの重大な欠点を有する。
【０００９】
第一に、β−毒素をベースとする全てのワクチンは、化学的に解毒され、主にホルマリンで解毒されたβ−毒素を含み、これらの化学的解毒工程を規格化することは非常に困難であることが長年にわたって示された。タンパク質を解毒するための古典的な化学的方法は、タンパク質の構造全体をかなりでたらめに変えるという欠点を有する。その結果、化学的解毒の工程中にβ−毒素の免疫原性も急激に減少する。これは、例えば図５から分かり、図６では、所定の標準的条件下でβ−毒素を解毒するためには、ごく一般的に使用される不活性化化合物であるホルマリンを少なくとも１％必要とすることが示されている。しかし、図５および６からは、免疫原性の力価がホルマリンの量の増加とともに劇的に減少することが分かる。全力価は、解毒に必要なホルマリンの量が最も低くても（図６）力価が減少するので、決して得ることはできない。これは、解毒と適正な力価、すなわち免疫原性の両方を得ることができるのは、非常に狭い範囲のみであることを示している。この非常に狭い範囲ならびに少なくとも３つの変数、すなわち解毒時間、温度および正確なホルマリン濃度があることから、解毒したβ−毒素を再現性をもって産生することが非常に困難であることは明らかである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、β−毒素の別の解毒法が強く望まれている。現在まで、許容できる別法は見いだされていない。これは次の理由による。すなわち、解毒の十分なレベルと残存する免疫原性との間の微妙なバランスが、一方ではタンパク質の構造、他方では蛋白質の生物学的特性の間の密接なつながりを暗示しているからである。従って、同時にタンパク質の免疫原性をかなり損なうことなく、タンパク質の構造を変えることによりタンパク質の解毒が可能であるということは予期することができなかった。
【００１１】
本発明の利点の一つは、上記の問題を回避するための方法を初めて開示するということであり、遺伝子操作技術の使用により、驚くべきことに、変異を誘発すると、その必要な免疫原性をあまり損なうことなくβ−毒素の所望の非毒性誘導体を提供することができる、特異的で比較的大きいアミノ酸領域が見いだされた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
すなわち、一つの態様では、本発明は、そのアミノ酸配列に、野生型β−毒素には存在しない変異を少なくとも一つ有する、クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の解毒された免疫原性誘導体またはその免疫原性断片に関する。その免疫原性断片は、β−毒素の誘導体の全長のアミノ酸配列は含まないが、その誘導体の、宿主動物において保護的免疫応答を誘導することができる領域はなおも含む断片であると理解される。変異は、野生型β−毒素のアミノ酸配列と比較した、誘導体β−毒素のアミノ酸配列における変化であると理解される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
変異は、置換、欠失、挿入もしくは転位またはそれらの組み合わせである。変異は、例えば、β−毒素の１以上のアミノ酸が異なる特徴を有する他のアミノ酸で置き換わるようなものである。適切な置換は、例えば、アスパラギン酸のリシンによる置換など、負に帯電したアミノ酸の正に帯電したアミノ酸による置換である。別の適する置換は、芳香族アミノ酸の脂肪族アミノ酸による置換であり、例えば、トリプトファンのグリシンによる置換である。また、疎水正アミノ酸の親水性アミノ酸による置換、例えばイソロイシンのアスパラギン酸による置換なども適切である。
【００１４】
従って、本発明の好ましい形態は、少なくとも一つの変異が置換変異である、本発明に係るβ−毒素の誘導体に関する。明らかなように、置換の他に、β−毒素の非毒性誘導体を提供するが、免疫応答をなおも誘導することができる１以上のアミノ酸の挿入および／または欠失を含む変異も本発明の一部である。従って、同様に好ましい態様では、本発明は、少なくとも一つの変異が欠失または挿入である本発明に係るβ−毒素の誘導体に関する。２以上の変異を行う場合、置換および欠失／挿入変異の組み合わせが等しく可能である。β−毒素の誘導体は、マウスにおけるそのＬＤ５０（実験において全動物の５０％を死に至らしめる用量）が天然のβ−毒素のＬＤ５０より少なくとも１０倍高い場合に非毒性であるとする。天然のβ−毒素のＬＤ５０は約 0.15 μg/マウスである。
【００１５】
上記したように、本発明の利点の一つは、当技術分野で想定されていたことと反対に、非毒性であり、なおも免疫原性であるトキソイドが得られるようにβ−毒素のアミノ酸配列を遺伝子的に変えることができることが見いだされたことである。しかし、全ての変異が所望の非毒性でなおも免疫原性であるβ−毒素の誘導体をもたらすわけではない。従って、非毒性であり、なおも免疫原性であるβ−毒素の誘導体を産生する変異を迅速にスクリーニングし、選択するための試験が開発されている。この試験は、非毒性でなおも免疫原性であるβ−毒素の誘導体を産生する多数の変異体のスクリーニングを可能にする。この試験は下記で開示する。
【００１６】
また、好ましくはβ−毒素の中性および親水性部分の間の遷移ドメインを形成する領域が、所望の特性を有するβ−毒素の非毒性誘導体を与える変異を導入するための標的領域として適することが見いだされた。これらの領域は、β−毒素の配列に Hopp-Woods アルゴリズムを適用することにより容易に追跡できる(Hopp および Woods;Proc. Natl. Acad. Sci. 78:38248-3838 (1981)) 。従って、この態様のより好ましい形態では、本発明は、β−毒素の中性および親水性部分の間の遷移ドメインに位置する変異を有するβ−毒素の誘導体に関する。
【００１７】
変異に対する標的領域として非常に適する領域は、ペプチドリーダーのメチオニンに対して６２の位置、１８２の位置、１９７の位置、アミノ酸番号８０〜１０３、１４５〜１４７、２８１〜２９１、２９５〜２９９の間、ならびにアミノ酸位置２９２のユニークなシステインの下流領域に位置する。従って、さらに好ましい形態では、本発明は、変異がペプチドリーダーのメチオニンに対して６２、１８２、１９７の位置およびアミノ酸番号８０〜１０３、１４５〜１４７、２８１〜２９１、２９５〜２９９の間および／またはアミノ酸位置２９２の下流領域の少なくとも一つに位置するβ−毒素の誘導体に関する。さらに好ましい形態では、変異が６２の位置、８０〜８２の位置、９５〜９７の位置、１０１〜１０３の位置、１４５〜１４７の位置、１８２の位置、１９７の位置、２８７〜２９１の位置、２９５〜２９９の位置にある。
【００１８】
本発明に係るβ−毒素の非毒性免疫原性誘導体は、そのタンパク質中のアミノ酸を化学的に置換または修飾することにより作ることができる。それらはまた、β−毒素をコードする遺伝子に変異を導入することによっても作ることができる。ＤＮＡ断片に変異を導入する方法は、下記で説明する。変異したＤＮＡ断片は、次いで、例えば適する発現プラスミドなどのヌクレオチド配列でクローン化し、次いで発現させることができる。
【００１９】
従って、別の態様では、本発明は、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の遺伝子的に解毒した免疫原性誘導体またはその免疫原性断片をコードすることを特徴として有する変異したＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列に関する。
【００２０】
上記したように、この態様の好ましい形態では、本発明は、β−毒素の中性および親水性部分の間の遷移ドメインに位置する変異を有するβ−毒素の誘導体に関する。β−毒素のかかる誘導体は、β−毒素のかかる誘導体をコードするＤＮＡ断片を発現することにより作ることができる。従って、好ましい形態では、β毒素の誘導体をコードする変異したＤＮＡ断片が、ベータ−毒素の誘導体の中性および親水性部分の間の遷移ドメインをコードする少なくとも１つのＤＮＡ領域に変異を有する。
【００２１】
本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の解毒した免疫原性誘導体は、例えば、β−毒素をコードする遺伝子のランダムな変異誘発によって得ることかできる。ランダムな変異誘発を誘導する多くの方法が当技術分野で公知であり、例えば、変異誘発する化学物質を使用した化学的に誘導される変異誘発、ＵＶ照射もしくはγ−照射による変異誘発または組換えＤＮＡ技術を使用するランダム変異誘発などである。
【００２２】
また、ＤＮＡレベルでの変異は、特異的部位で行うことができる（部位特異的変異誘発）。これは、公知の遺伝子工学技術の助けを借りて行う。例えば、制限酵素を使用して標的領域にあるＤＮＡ断片または標的領域を包含するＤＮＡ断片を切り出し、これらの断片を変異した配列を有する合成断片で置き換えることができる。部位特異的変異誘発はまた、標的領域に変異を導入するための非常に便利な技術である。変異が置換変異に関する場合、リーディングフレームはもちろん不変のままである。欠失および／または挿入変異と置換変異との組み合わせも可能である。
【００２３】
上記したＤＮＡ変異技術は、当技術分野で周知であり、Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989) に記載されている。
【００２４】
本発明に係るβ−毒素の誘導体を発現するための適切な細菌発現系はクロストリジゥムパーフリンジェンス細菌自身である。天然のβ−毒素遺伝子は、相同組換えを使用して本発明に係るβ−毒素の誘導体をコードする変異したＤＮＡ断片で容易に置き換えることができる。相同組換えは当技術分野で周知の技術である。こうして得られた組換えクロストリジゥムパーフリンジェンスは、従って、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の遺伝子的に解毒した免疫原性誘導体を産生する。従って、さらに別の態様では、本発明は、上記したように変異したＤＮＡ断片を有するヌクレオチド配列を含むクロストリジゥムパーフリンジェンスに関する。
【００２５】
しかし、上記以外のいくつかの問題が、クロストリジゥムパーフリンジェンス由来のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の毒性および遺伝子的に変化した非毒性誘導体の単離の際に出合う。第一に、クロストリジウムは、研究者の健康面から見ると、増殖させるのが危険な細菌である。β−毒素の産生に対するクロストリジウム種の増殖は安全性の高い条件下で行なわなければならないが、その場合、大規模生産は困難である。第二に、前述したように、β−毒素とともに、他のいくつかの主要／非主要毒素が作られる。これらの他の毒素の中からβ−毒素を単離し精製することは、例えばワクチン製造の場合に必要であるが、困難であり、時間がかかる。第三に、クロストリジウム種は、胞子形成性の細菌である。β−毒素調製物から全ての胞子を除去し、同時にβ−毒素の免疫原性を保持することが必要であるが、困難である。なぜならば、これらの胞子は熱および化学薬品に対する耐性が高いからである。従って、他のクロストリジウム毒素がなく、クロストリジウム胞子のないβ−毒素を提供するための方法が明らかに必要とされる。
【００２６】
クロストリジウムβ−毒素を発現するための、グラム陰性細菌である大腸菌（E.coli）をベースとする非クロストリジウム発現系は以前に記載されている。大腸菌の系は、β−毒素遺伝子の発現に対して Hunter らが使用している(Infect. & Immun. 61:3958-3965 (1993))。予想される34 kD のタンパク質に対応する小さいバンドのみが認められ、β−毒素タンパク質のほとんどは、大きい118 kDの多重形態で確認された。Steinporsdottir ら(FEMS Microbiology Letters 130:273-278 (1995))は、β−毒素遺伝子を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに融合した融合タンパク質として大腸菌で発現させることを試みた。彼らも、Hunterのように、高分子量の天然以外のβ−毒素のみを確認した。この論文では、大腸菌で産生されるタンパク質は、天然のβ−毒素とは異なるコンホメーションを有するという結論で締めくくっている。従って、クロストリジウムによってコードされている他のタンパク質が、天然のβ−毒素のコンホメーションのフォールディングおよび分泌において更なる役割を果たしているように見える。この理由のため、上述したように、構造と免疫原性との間には微妙なバランスがあるので、クロストリジゥムパーフリンジェンス以外の源から得られ、従って天然形ではないβ−毒素は、使用する発現系に関係なく、ワクチンの有効なベースとなると予想することはできない。
【００２７】
驚いたことに、クロストリジゥムパーフリンジェンス以外のグラム陽性細菌での天然のβ−毒素遺伝子の発現により、クロストリジゥムパーフリンジェンスで産生される天然のβ−毒素の全ての生物学的および生物物理学的特性ならびに活性を有するが、クロストリジゥムパーフリンジェンスまたは大腸菌で産生されるβ−毒素よりもかなり望ましい利点をいくつか有する天然のβ−毒素が得られることが見いだされた。利点とは、すなわち、ａ）クロストリジゥムパーフリンジェンス胞子が混入していない、ｂ）リポ多糖が混入することなく産生される、ｃ）他の主要／非主要クロストリジウム毒素を含まないで産生される、およびｄ）コンホメーションが天然のものである。このようにして得られたβ−毒素は、クロストリジウムから得られるβ−毒素よりもホルマリンによってかなり有利に不活性化することができる。というのは、不活性化中に考慮すべき唯一の生物学的物質がβ−毒素自体であるからである。胞子、リポ多糖および他の大きい／小さいクロストリジウム毒素は、自体存在しないので、注意する必要がない。
【００２８】
従って、さらに別の態様では、本発明は、グラム陽性細菌がクロストリジゥムパーフリンジェンスでないグラム陽性細菌発現系に関し、該発現系は、野生型クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素をコードする遺伝子を含む。
【００２９】
β−毒素遺伝子は、その天然のプロモーターの制御下におくことができる。また、それは、異種プロモーターの制御下におくこともできる。そのようなプロモーターとしては、例えば Lac−プロモーター(Changら、Nature 275:615 (1978))または Trp−プロモーター(Goeddelら、N.A.R. 8:4057 (1980)) を挙げることができる。該プロモーターは、β−毒素の過発現を招く強いプロモーターであってもよく、または、誘導性プロモーターであってもよい。どちらのプロモーターも当技術分野で公知である。
【００３０】
グラム陽性細菌に対するいくつかの発現系が記載されており、いくつかのファミリーのグラム陽性細菌で使用するための多目的発現プラスミドは当技術分野で公知である。一例として、Simon および Chopin (Biochimie 70:559-567 (1988)) に記載の、エンテロコッカスグラム陽性細菌の宿主範囲の広いpAMβ1 のレプリコンをベースとする発現系が挙げられる。このプラスミドの誘導体は、例えばストレプトコッカス、ラクトバシラスおよびバシラス種での外来遺伝子の発現に使用できる。クロストリジウム以外のグラム陽性細菌群内では、ゲノムのＡＴ−含量が比較的高い細菌が、クロストリジウム属由来の遺伝子のクローニングおよび発現に対して非常に適する。従って、より好ましい形態では、天然のβ−毒素または本発明に係るβ−毒素の誘導体の製造に使用されるグラム陽性細菌は、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、エンテロコッカス（Enterocuccus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、バシラス（Bacillus）、サルシナ（Sarcina）、ルミノコッカス（Ruminococcus）またはリステリア（Listeria）の群から選択される。
【００３１】
もちろん、本発明に係る変異したβ−毒素遺伝子をクロストリジウム以外のグラム陽性細菌で発現することは、さらに有利である。その場合、ホルマリンによる解毒処理は完全に省略できる。そのようにして得られるβ−毒素の非毒性誘導体は、胞子がないこと、リポ多糖がないこと、他の主要／非主要クロストリジウム毒素がないこと、および天然形であることの他に、それ自体が非毒性であるという別の利点を有する。従って、より好ましい形態では、本発明は、グラム陽性細菌発現系に関し、該グラム陽性細菌は、クロストリジゥムパーフリンジェンスではなく、本発明に係る誘導体β−毒素遺伝子またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様は、クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の遺伝子的に解毒された免疫原性誘導体をベースとする、クロストリジゥムパーフリンジェンス感染に対抗するためのワクチンに関する。該ワクチンは、例えば、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の解毒された免疫原性誘導体の免疫学的に十分な量と生理学的に許容される担体とを混合することにより作ることができる。免疫学的に十分な量は、宿主動物において保護的免疫応答を誘導することができる解毒された免疫原性クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の量であると理解される。すなわち、本発明のさらに別の態様は、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体またはその免疫原性断片および生理学的に許容される担体を含む、クロストリジゥムパーフリンジェンス感染をなくすためのワクチンに関する。
【００３３】
生理学的に許容される担体は、例えば水または生理学的食塩水である。ワクチンは、例えば、分解しやすいポリペプチドが分解するのを保護し、ワクチンの貯蔵寿命を高め、または凍結乾燥の効率を改善するために、さらに安定剤と混合することが多い。有用な安定剤は、ＳＰＧＡ（Bovarnikら、J. Bacteriology 59: 509(1950))、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、ショ糖、デキストランまたはグルコース）、タンパク質（アルブミンもしくはカゼインまたはそれらの分解産物など）および緩衝剤（アルカリ金属リン酸塩など）である。言うまでもなく、化合物を添加することによりワクチンを安定化するための他の方法も本発明に含まれる。
【００３４】
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物をワクチンに添加してもよい。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激剤である。それらは、投与した免疫原に対する宿主の免疫応答を高める。従って、より好ましい形態では、本発明に係るワクチンは、アジュバントを含む。当技術分野で公知のアジュバントの例としては、フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えば欧州特許 EP 109942参照）、サポニン、鉱物油、植物油および Carbopol （ホモポリマー）が挙げられる。特に粘膜投与に適するアジュバントは、例えば、熱に対して不安定な大腸菌毒素（ＬＴ）またはコレラ毒素（ＣＴ）である。他の適するアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油−エマルジョン（例えば、Bayol F(R)または Marcol 52(R)）、サポニンまたはビタミンＥ溶解物である。
【００３５】
本発明に係るワクチンは、生ワクチンを保管するための当技術分野で公知の方法を使用して保管することができる。保管は、例えば０℃より下の温度で行うことができる。
【００３６】
凍結乾燥も公知であり、ワクチンの保存に対して適切な方法である。凍結乾燥は、ワクチンを非凍結乾燥ストックを保存するのに必要な温度よりも十分高い温度でストックしておくことができるように安定化させるという利点を有する。本発明に係るワクチンは、特にそれを上記したような安定剤と凍結乾燥の前に混合する場合は、非常に有効に凍結乾燥させることができる。
【００３７】
ワクチンは、クロストリジゥムパーフリンジェンスＢ型またはＣ型感染に対して敏感な全ての宿主、例えばヒト、子ヒツジ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、とりおよび子ウシなどに投与することができる。ワクチンは、生まれるとすぐに投与することができるが、より後の段階で投与することもできる。ワクチンの用量は、好ましくは、動物１匹に対して１〜１００μｇの誘導体であり、その動物の大きさにもよる。例えばブタの場合、非常に適する用量は２０〜８０μｇである。
【００３８】
原則的に一般的な全ての投与法を使用することができるが、ワクチンは、好ましくは腹腔内、鼻腔内、筋肉内、皮下、経口または皮内投与する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、クロストリジゥムパーフリンジェンス感染に対抗するためのワクチンの別の製造法に関する。クロストリジゥムパーフリンジェンスＢ型またはＣ型に対して敏感なヒトまたは動物を宿主とする弱毒化した、または非病原性の生きた細菌およびウイルスは、上述したように、本発明に係る変異したβ−毒素遺伝子の担体として使用することができる。これらのいわゆる生きた組換え担体ワクチンは、生理学的に許容される担体とともに宿主動物に安全に投与することができる。それらは、挙動が非病原性であり、β−毒素の非毒性誘導体を発現する。生きた組換え担体をベースとするワクチンは、宿主においてクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体を直接産生する、または提示するという利点を有する。
【００４０】
そのような組換え細菌またはウイルスを接種した動物は、ベクターの免疫原に対してのみでなく、その遺伝子コードが組換え担体でさらにクローン化されるポリペプチドの免疫原性部分に対しても免疫原性応答を生じる。これは、該組換え担体を投与することにより、２以上の病気に対する保護が得られるという利点を有する。
【００４１】
現在、多くの生きた組換え担体ウイルスおよび細菌が当技術分野で公知である。適切な生きた組換え担体細菌は、例えば、サルモネラ種および大腸菌種である。当技術分野で生きた組換え担体として頻繁に使用されるウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスである。また、特定の経口投与可能な担体ウイルスとして適切なのは、ブタパルボウイルスである。β−毒素をコードする遺伝子を運ぶための生きた組換え担体ウイルスとして有用な別のウイルスは、ヘルペスウイルス仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）（例えば、欧州特許第 606,437号に記載）である。β−毒素遺伝子を運ぶ該ＰＲＶは、ブタをＰＲＶおよびクロストリジゥムパーフリンジェンスＣ型の両方の感染に対して保護するであろう。
【００４２】
すなわち、本発明に係る変異したβ−毒素遺伝子を運ぶ生きた組換え担体生物を含む、クロストリジゥムパーフリンジェンス感染に対抗するためのワクチンも本発明の一部である。
【００４３】
明らかなように、天然のβ−毒素は、クロストリジゥムパーフリンジェンスにおける最も重要な毒性因子ではないとしても、重要である。従って、天然のβ−毒素遺伝子が上記した本発明に係る変異したβ−毒素遺伝子で置換されたクロストリジウム菌株は、重要な毒性因子を失っている。かかる菌株は、β−毒素がその毒性型ではなく、非毒性誘導体型で作られるので、弱毒化生ワクチンとして使用することができる。かかる弱毒化生ワクチンの利点は、それが、非毒性であるが、なおも免疫原性であるβ−毒素を産生し、さらに、天然のクロストリジゥムパーフリンジェンス株の他の全ての免疫原抗原を有するということである。
【００４４】
従って、天然のβ−毒素遺伝子が本発明に係る変異したβ−毒素遺伝子で置換された生きた弱毒化クロストリジゥムパーフリンジェンス株を含むワクチンも本発明に含まれる。
【００４５】
また、本発明に係るβ−毒素誘導体の他に、他の病原体由来の免疫原を含むワクチンも本発明に含まれる。これにより、一回のワクチン投与工程で、種々の病気に対するワクチン接種が可能である。この態様のより好ましい形態では、本発明に係るワクチンが、アクチノバシラスプリューロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エシエリヒアコリ（Escherichia coli）、エリシペロスリックスルシオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、パスッレラムルトシダ（Pasteurella multocida）、ボルデテラブロンチセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、サルモネラ(Salmonella)種、ミコプラズマニューモニエ（Mycoplasma hypopneumoniae）、ヘモフィラスパラスイス（Haemophilus parasuis）およびヘリコバクター（Helicobacter）様細菌から成る群から選択される他の病原体を含む。
【００４６】
本発明はまた、天然のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の製造法に関し、該方法は、該β−毒素をコードするＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列をクロストリジゥムパーフリンジェンス以外のグラム陽性細菌で発現させることを基本とする。
【００４７】
さらに、本発明は、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の非毒性誘導体の製造法を提示する。これらの方法は、β−毒素の誘導体をコードするＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列をグラム陽性細菌で発現させることを基本とする。
【００４８】
また、本発明は、クロストリジゥムパーフリンジェンス感染に対抗するためのワクチンの製造法を提供する。該方法は、例えば、本発明に係るクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素の誘導体および生理学的に許容される担体を混合することを含む。
【００４９】
【実施例】
実施例１
発現プラスミド pKS90、pTREX1A 、pTREX7および pTREX14の構築：
pKS90 プラスミドは、pTREX1プラスミドをベースとするコピー数の高い（40〜80コピー／細胞）θ−複製グラム陽性プラスミドであり、pTREX1プラスミド自体は、以前に公開された pIL253 プラスミドの誘導体である。pIL253は、pAMb1 の広いグラム陽性宿主範囲のレプリコンを組み入れ(Simon, D.および A. Chopin, 1988, ベクタープラスミドファミリーの構築およびその Streptococcus lactis での分子クローニングに対する用途、Biochimie, 70:59-567) 、L. lactis 性因子による移動性がない。pIL253はまた、pIL501を一例とする接合性の親プラスミドによる輸送または効果的な移動に必要な tra機能に欠ける。腸球菌 pAMb1レプリコンは、以前に、Streptococcus 、Lactobacillus および Bacillus 種ならびに Clostridium acetobutylicum などの種々の種に転移されており(Gibson, E.M., N.M. Chace, S.B. Londonおよび J. London, 1979, J. Bacteriol. 137:614-619; LeBlanc, D.J., R.J. Hawley, L.N. Lee および E.J. St. Martin, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3484-3487; Ouitram, J.D. および M. Young, 1985, FEMS Micro. Lett. 27:129-134)、これは、利用できる宿主の範囲が潜在的に広いことを示している。pTREX1（および pTREX1A）は、基本構成的転写ベクターを表しているが、誘導体 pKS90は、発現レベルを増加させるために、ラクトコッカス翻訳開始領域への翻訳共役を利用している。pKS90 およびその直接の親であるpTREX1の構築の詳細を下記に示す。
【００５０】
pTREX1:
推定上のＲＮＡ安定化配列、翻訳開始領域（ＴＩＲ）、標的遺伝子を挿入するための多重クローニング部位および転写ターミネーターを含む人工ＤＮＡ断片を、２個の相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Tfl ＤＮＡポリメラーゼで伸長することにより作製した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クローニングを容易にするために、各々それらの５’端にNheIおよびBamHI に対する認識部位を含めた。この断片は、pUC19 の誘導体である pUC19NT7 の XbaI および BamHI部位の間でクローン化した。pUC19 は、EcoRI および HindIII部位の間でクローン化した pLET1(Wells, J.M., P.W. Wilson および R.W.F. Le Page, 1993, J. Appl. Bact. 74:629-636) 由来のT7発現カセットを含む。得られた構築物は、pUCLEXと命名した。次いで、pUCLEXの完全な発現カセットを、HindIIで切断し、平滑にした後、EcoRI で切断して pIL253 の EcoRIおよび SacI （平滑）部位でクローン化することにより取り出し、ベクター pTREXを作製した。推定上のＲＮＡ安定化配列およびＴＩＲは、大腸菌Ｔ７バクテリオファージ配列から誘導し、一つのヌクレオチド位置で改変して、 Lactococcus lactis のリボソーム 16sＲＮＡに対するシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）モチーフの相補性を高めた。Ｐ１と命名した Lactococcus lactis MG1363染色体プロモーターを、発現カセットに存在する EcoRIおよび BglII部位の間でクローン化して、pTREX1を作製した。このプロモーターは、以前に、プロモータープローブベクター pSB292 を使用して単離され、プライマー伸長およびＤＮＡ配列分析により解析されている (Nick. R. Waterfield, R.W.F. Le Page, P.W. Wilsonおよび J.M. Wells, Gene, 165, 1995, 9-15) 。プロモーター断片は、VentＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ断片には、クローン化したプロモーターの上流の全てのＤＮＡ配列および３’から転写開始部位までの１５までの塩基を含めた。このプロモーターの転写開始部位の下流に存在するシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列は、発現カセットに示される開始コドン以外の部位での翻訳開始を回避するために、ＰＣＲ増幅したプロモーター断片から慎重に除いた。pTREX7および pTREX14と命名した同様の２つのベクターも、Ｐ１の代わりに EcoRIおよび BglII部位の間でクローン化した、より弱いＰ７およびＰ１４プロモーターを使用して作製した。これらのプロモーター断片を作製するために使用したＰＣＲプライマーを図１ｄに示す。pTREX1A プラスミドは、pTREX1に変わるものであり、XbaI結合発現カセットが、pET3A 由来の XbaI-SpeI T7-発現カセット断片で置き換わっている。従って、ＳＤ配列は、Lactococcus に対しては最適化されていない。完全な pTREX1A  配列および発現カセットを示す構成図を図１に示す。
【００５１】
pKS90:
pKS90 プラスミドは、pTREX1の誘導体であり、同じ転写プロモーターＰ１を使用するが、ＳＤおよびラクトコッカス染色体由来のリゾルベース遺伝子Ｐ１１(Nick. R. Waterfield, R.W.F. Le Page, P.W. Wilson および J.M. Wells, Gene, 165, 1995, 9-15) の最初の２０個のコドンを含む改変したＴＩＲを有する。これは、pTREX1の BglIIおよび BamHI部位の間で、新規ＴＩＲを含む人工ＤＮＡ配列をクローニングすることにより達成した。この方法で使用するオリゴヌクレオチド配列を図２に示す。ＰＣＲプライマー配列を慎重に選択することにより、ＰＣＲ誘導される標的遺伝子をこのＴＩＲに翻訳可能なように結合させることができ、これは、pTREX1親プラスミドから得たものと比較して、発現レベルを増加させることが分かった。完全なpKS90 配列および発現カセットを示す構成図を図２に示す。
【００５２】
活性β−毒素を分泌する Lactococcus lactis の組換え菌株の構築：
Hunterら(Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) によって発表された、β−毒素をコードする遺伝子を含む pJF2000ＤＮＡ（J. Frey, Institute for veterinary bacteriology, ベルン大学, CH-3012 Berne,スイス) を大腸菌 SURE にエレクトロポレーションにより導入した。独立した６個の形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、制限消化によって調べ、プールした。これらの菌株は、１５％グリセロール中、−７０℃で保管した。結合した翻訳開始領域（および上流のＲＮＡ安定化ステムループ）を有するｃｐｂ遺伝子を、XbaI/BamHIまたは SmaI/BamHI で消化することにより、このプールしたプラスミドＤＮＡ調製物から切り出した。精製したｃｐｂ遺伝子断片を、各々、構成的発現のレベルが高、中および低である発現ベクター pTREX1A、pTREX14 および pTREX7 の多重クローニング部位に連結した。XbaI/BamHIを末端とするｃｐｂ断片は、XbaI/BamHIで消化した pTREX1ANEW に連結し、SmaI/BamHIを末端とするｃｐｂ断片は、BamHI/BglII （平滑）pTREX14 および pTREX7 ＤＮＡに連結した。これらの構築物は、カゼインから遊離させたペプチドをその生物に利用させることができる、染色体にコードされたペプチダーゼ pep5 に欠けた、特別に無能力化した菌株 Lactococcus lactis pep5- acmA- にうまくエレクトロポレーション導入した。しかし、この目的には、他のどの Lactococcus lactis 菌株も適する。各種類の正しい単離物を、制限消化分析を使用して同定し、１５％グリセロール中、−７０℃で保管した。これらの種類の菌株は、L. lactis pep5- acmA- [pTREX1Acpb]、L. lactis pep5- acmA- [pTREX14cpb]および、L. lactis pep5- acmA- [pTREX7cpb] と命名した。さらに、ｃｐｂ遺伝子は、VentＤＮＡポリメラーゼおよびプラスミド pJF2000由来の BamHIを末端とするオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物は、ＴＩＲ結合ベクター pKS90の BamHI部位でクローン化した。
【００５３】
対数増殖中期細胞および上清から抽出した全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分解した後、ニトロセルロースフィルターに移した。これらのフィルターを、ＭＡＢ（モノクローナル抗体）精製したβ−毒素を対照として使用して、Ｃｐｂに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体でプローブした。正しい大きさ（約 30 kDA)の１個のタンパク質産物が、ウェスタンブロット法およびＳＤＳ−ゲルのクーマシーブルー染色によって、全部で４個の菌株の培養上清で検出された。各菌株によって分泌されるβ−毒素の量は、使用する発現ベクターのプロモーターの相対的強さと一致した。細胞内毒素は検出できなかった。これは、クロストリジウム輸出配列が Lactococcusで効果的に作用することを示唆している。pTREX1A 発現体 L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p3-1/5]および pKS90発現体 L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p5-123]の濾過した上清は、活性毒素を含むことが分かり、組換えβ−毒素に対する正の対照となる。
【００５４】
ｃｐｂ変異体遺伝子：
変異体ｃｐｂ遺伝子は、プラスミド pJF2000（J. Frey により提供された）に存在する元の鋳型ｃｐｂ遺伝子（クロストリジゥムパーフリンジェンスＣ型からクローン化した）から Vent ＤＮＡポリメラーゼによって増幅されるＰＣＲ断片を使用する in vitro 遺伝子構築によって作製した。この構築で使用したプライマーおよび使用した構築法の一例を図３に示す。これらの変異体は、末端ｃｐｂＦ２およびｃｐｂＲ  ＰＣＲプライマーの５’端に BamHI部位を含めることにより、pKS90 発現プラスミドの BamHI部位でクローン化することができた（上記参照）。ｃｐｂＡＴＧ開始コドンに対して適切に位置したBamHI 部位が導入されたＰＣＲプライマーを選択することにより、変異体ｃｐｂ遺伝子を pKS90のP11 TIR に翻訳可能なように結合させることができた。この方法を使用して、一連の変異体発現菌株を作製した。これらの変異体遺伝子の正確な配列（pKS90 でクローン化した後）は、３〜４倍の重複性で自動配列決定により決定し、遺伝子配列および発現プラスミドにおける位置を確認した。これらのベクターでの変異体遺伝子のクローン化は、天然のｃｐｂ  Ｎ−末端輸出リーダーによって培養上清への遺伝子産物の分泌を可能にした。培養上清はフィルター滅菌し、動物のバイオアッセイで直接使用した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
変異体発現菌株：
pKS90 をベースとするトキソイド発現プラスミドは、特別に無能力化した ラクトコッカス宿主菌株の L. lactis MG1363 pep5- acmA- 中で増殖するが、他のラクトコッカス菌株も使用することができる。この菌株は、プロファージおよびプラスミドを除去した菌株であり、かなり栄養要求性で、天然乳汁の環境では生存することができない。さらに、他のラクトコッカス菌株よりも増殖速度が遅い。上記したように構築した非毒性の発現菌株を表１に示す。この表では、どのアミノ酸が変異し、その変異がどこに位置するかを示す。
【００５７】
トキソイド発現菌株は、0.5% w/vのグルコースおよび 5 g/ml のエリスロマイシンを補充したＭ１７培地 (Difco 触媒番号 1856-17) で増殖させることができる。通気は必要でなく、それどころか無酸素条件が好ましいが、必須ではない。最適の増殖温度は３０℃である。これら全ての菌株によって産生される種々のトキソイドタンパク質は、培地で 5 g/ml 未満のレベルまで蓄積することが分かっている。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を使用したウェスタンブロット分析により、正しいサイズのタンパク質モノマーは、上記で挙げた、命名されている全ての発現菌株により、上清に分泌されることが確認された。変異体タンパク質の一例であるＭ４（４−３）のＮ−末端配列決定により、リーダーペプチドは、ラクトコッカス細胞質からの輸送中に正しく切断されることが確認された。
【００５８】
ｃｐｂ遺伝子のランダムな変異誘発に対するプロトコール：
典型的なＰＣＲ反応混合物は次のように作る。
【００５９】
10 mM のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ 8.7、２５℃）
50 mM のＫＣｌ、5 μg/mlのウシ血清アルブミン
0.5 μM の各ＰＣＲプライマー
（cpbg2: 5'-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3')
（cpbR:  5'-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3')
4 mMのＭｇＣｌ2
0.5 mMのＭｎＣｌ2
3.4 mMの強制ｄＮＴＰおよび 0.2 mM の他の３種類のｄＮＴＰ（ｄＮＴＰ濃度は、0.1 〜 10 mMの範囲にすることができる。）
600 pMの鋳型ＤＮＡ（pJF2000 cpb クローンまたは他の cpb誘導体）
2UのTaq ＤＮＡポリメラーゼ
加熱サイクル条件は次の通りだった。
【００６０】
（９４℃で３０秒、５０℃で６０秒、７２℃で１８０秒）を３０サイクル、次いで７２℃で６００秒のインキュベート。
【００６１】
この反応は、４種類のｄＮＴＰの各々を強制ヌクレオチドとして使用することにより行い、次いでプールした。こうして、置換の適切なランダム混合物が得られる。プールしたＰＣＲ断片は次いで、BamHI 消化し、BamHI 消化したpKS90 に連結した。この連結混合物を Lactococcus lactis MG1363に入れて形質転換した。形質転換体は液体培養で増殖させ、濾過した上清を、実施例３に記載した in vitro β−毒素アッセイで試験した。
【００６２】
実施例２
Lactococcus lactisの培養：
L. lactis 産生遺伝子で変性したβ−毒素を、0.5% w/vのグルコースおよび 5μg/mlのエリスロマイシンを補充したＭ１７培地（例えば、Difco 触媒 1856-17）で増殖させた。通気は必要でなく、無酸素条件が好ましいが、必須ではない。最適の増殖温度は３０℃である。対数増殖中はグルコースの添加が必要である。
【００６３】
抗原調製物：
培養上清を、遠心分離によって細胞から分離した。上清を滅菌濾過した後、誘導体を硫酸アンモニウム（0.3 g/g)で沈殿させた。沈殿物はＰＢＳに再懸濁した。あるいは、培養上清は、＜10,000 Da のフィルター上で濃縮させることができる。
【００６４】
マウスの致死性：
L. lactis中で産生したβ−毒素の誘導体は、最初に、滅菌濾過した培養上清を腹腔内注入（約20 g体重のNRMIマウスに0.5 ml）することにより試験した。誘導体 pM 6-1 、6-5 および6-7 は、天然毒素と同様のレベルの致死性であった。pM 6-1、6-5 および6-7 は、アミノ酸位置 Cys292→ Ala292で改変されている。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
次の実験では、誘導体を含む上清を硫酸アンモニウムで沈殿させた。各誘導体を含む沈殿物を 10 倍少ない体積のＰＢＳに再懸濁した。各誘導体を、マウスに腹腔内注入した。誘導体 pM 1-4 、pM 1-10 、pM 3-69 および pM 7-15は全て、野生型毒素の致死レベルでは非毒性である。それらは、非常に高い濃度（20〜40μg/ml）でのみ毒性になる。誘導体 pM 4-18および pM 6-16も、野生型毒素の致死レベルでは非毒性である。それらは、より高い濃度（30〜50μg/ml）ですら毒性でない。残り３個の誘導体 pM 2 、pM 3-3および pM 4-3 は、わずかに毒性であった（野生型毒素のＬＤ50は 0.15 μg/マウスである。）。表２も参照。
【００６７】
モルモットでの皮膚壊死性：
自家繁殖の白皮症モルモットの両側の４ｘ８ｃｍを脱毛した。0.2 mlの抽出物を動物の両側の各４箇所に皮内注入した。その動物を２４、４８および７２時間後に調べて、注入部位の病変に対して得点を付けた。注入部位に明らかな壊死（＋＋＋＋）、ひどい紅斑（＋＋＋）、紅斑（＋＋＋）、赤変（＋）、反応なし（０）。
【００６８】
誘導体 pM 4-1 、1-10、3-3 、4-3 、6-16および 7-15 は、非常に高い濃度ですら皮膚壊死性でない。誘導体 pM 6-1 、6-5 および 6-7は、5 μg/mlのレベルで皮膚壊死性であった。それらは、0.5 μg/mlでは皮膚壊死性でなかった。濃縮後、誘導体 pM 3-69は、6 μg/mlの用量で皮膚壊死性に変わった。これは、天然毒素より少なくとも60倍少ない皮膚壊死性であることに相当する。誘導体 pM 4-18は、天然毒素より15倍少ない皮膚壊死性を有する。誘導体 pM 2 は、各々1μg/mlおよび 2μg/mlの試験濃度では皮膚壊死性作用を何ら示していない。従って、pM 2は、毒性が天然毒素より少なくとも20倍小さい。表３も参照。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
ワクチン調製物：
抗原調製物にフロイントの不完全アジュバント（５０％）または Alhydrogen （２０％）を各々入れた。
【００７１】
ブタの免疫感作：
誘導体 pM 3-69を約 40 μg/mlの濃度で調製し、アジュバントを入れて最終濃度を20μg/mlとした。ブタに、２週間間隔で2 mlの筋肉内注入を行った。第一回目の接種の前、第二回目の接種の前および第二回目の接種の２週間後に血液サンプルを採取した。第一回目の接種の24時間後のブタの副作用を観察した。副作用は認められなかった。
【００７２】
実施例３：
ランダムに変異誘発したβ−毒素遺伝子から得られるβ−毒素の非毒性誘導体を検出するための迅速スクリーニング試験：
ＢＴ−細胞試験の手順：
５％の子ウシ血清を含むイーグル培地における、トリプシン処理したＢＴ（Bovine Turbinate細胞）細胞の 1.5 x 105細胞/ml の培養物を、９６−ウェルマイクロタイタープレートに移した（100 μl/ウェル）。プレートは、３７℃、３％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。試験したいβ−毒素のサンプルを、希釈プレートにおいて、２０℃のＰＢＳ（ｐＨ 7.0）で希釈した。培地を
細胞から注意深く捨てて、各ウェルに100 μl のβ−毒素希釈物を入れた。次いで、細胞を３７℃、３％ＣＯ2で３Ｏ分インキュベートした。サンプルを注意深く捨てて、３７℃に調節した５％の子ウシ血清を含む新しいイーグル培地を添加した。細胞は、上記と同様の条件下で３日間インキュベートした。次いで、培地をマイクロタイタープレートから捨て、ギムザ染色溶液（5μl/ウェル）を添加した。１０分後、染色剤を捨てて、プレートを水で３回洗浄し、少なくとも２０分放置して乾燥させた。全てのウェルの多核細胞の存在および単層の不規則性をチェックした。特定のウェルにこれらのサインがない場合は、そのウェルにβ−毒素の非毒性誘導体が存在することを示す。非毒性を示したそれらのβ−毒素誘導体は、以下に説明する半定量的ＥＬＩＳＡ試験で免疫原性の試験を行った。
【００７３】
半定量的ＥＬＩＳＡ：
ウサギにおいて、天然のクロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素に対して誘導された特異性の高い抗体をタンパク質Ａカラム上で精製し、ＥＬＩＳＡプレートに約2μg/mlのこれらの特異抗体を被覆した。β−毒素誘導体を含む上清を３倍に希釈してプレートに添加した。１時間インキュベートした後、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ複合ポリクローナルウサギ抗−クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素抗体を使用して検出を行った。それらのβ−毒素誘導体がＥＬＩＳＡにおいて反応して、天然のβ−毒素よりも１０００倍以上低い力価になれば、本発明に係るβ−毒素は所望する非毒性で、なおも免疫原性である誘導体であると見なした。
【００７４】
実施例４
ブタでのワクチン接種実験：
ワクチンの調製：
誘導体 pM 1-4 を Lactococcus lactis 菌株 pM 1-4 によって産生した。醗酵の後、細胞を遠心分離(100000 x g で３５分間）により除去した。次いで、上清1 g につき、0.31 gの硫酸アンモニウムを添加した。混合物を４℃で３時間放置して沈殿させた。100000 x gで４５分間遠心分離を行った後、沈殿物を最初の体積の１／３０に溶解し、ＰＢＳに対して透析した。誘導体 pM 1-4 の最終的な含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＢＳＡ規準に対して定量した。最後に、誘導体の溶液を Diluvac Forteと１：１の比で混合した。ワクチンにおける pM 1-4 の最終濃度は80μg/mlであった。
【００７５】
ワクチン接種：
５週齢のブタ５匹を使用した。０および２１日目に2mlをブタに筋肉内接種した。
【００７６】
観察：
動物の全身的状態を、ワクチン接種後の最初の３時間、次の評価に従って記録した。
【００７７】
０＝症状なし
１＝やや元気なし、粗い毛並（１時間未満）。
【００７８】
２＝元気なし、震え（１時間未満）。
【００７９】
３＝元気なし、震え、横たわる、および水の摂取が少ない（１時間未満）。
【００８０】
４＝嘔吐、全く元気なし（１時間未満）。
【００８１】
５＝１時間より長く元気なく、後に餌を食べない。
【００８２】
血液サンプリングおよび力価の測定：
血液のサンプリングを、１回目のワクチン接種の前（０日目）、２回目のワクチン接種の前（２１日目）および２回目のワクチン接種の２週間後（３５日目）に行い、競合ＥＬＩＳＡによって抗−β−毒素抗体を分析した。簡単に述べると、天然のβ−毒素に対して誘導されたモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートにおいて被覆した。血清の順次希釈物を、別のプレート上で固定濃度のβ−毒素と反応させた。毒素と血清を含む抗体との混合物をＭａｂ被覆プレートに写し、残っている天然β−毒素含量を測定した。力価を、ＷＨＯ抗毒素規準１９５９と比較して、未阻害β−毒素の５０％阻害として計算した。
【００８３】
結果：
観察：
ブタは、いずれのワクチン接種によっても、臨床反応を示さなかった。表４を参照。
【００８４】
血清学：
１頭のブタ（No.52 ）は、１回目のワクチン接種に対して応答した。２回目のワクチン接種後は、４頭全てのブタが血清変換を示し、平均の抗−β−毒素力価は、ＥＬＩＳＡでの測定で 66 i.u.であった。個々の力価は表４に示す。
【００８５】
【表４】
0004234232.tif 000005
【００８６】
結論：
全てのブタは、β−毒素を阻害する抗−β−毒素抗体を産生することにより、遺伝子的に改変したβ−毒素によるワクチン接種に対して応答した。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】プラスミド pTREX1ANEW の構成を示す図である。ＭＬＳ抗生物質耐性マーカーのコード配列は、影をつけた四角で示す。Ori pAMB1:プラスミド pAMB1由来の複製起点、ＭＬＳ：マクロライド、lincosamindes 、ストレプトグラミンＢ抗生物質耐性遺伝子。pIL253のEcoRI 部位および平滑化 SacI 部位の間でクローン化した発現カセットの構造を下に示す。カセットの種々の機能領域は、陰影をつけた四角で示す。ユニークな制限部位を示す。ＳＤ：L. lactis 16S ｒＲＮＡと相補的なシャイン・ダルガルノ配列。ＡＴＧ：ＳＤによって供給された翻訳開始コドン。
【図１ｂ】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−１】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−２】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−３】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−４】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−５】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−６】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｂ−７】制限酵素位置を含む、完全な pTREX1A配列を示す図である。
【図１ｃ】類似性の高い pTREX1 発現カセットの特徴を示す図である。
【図１ｄ】  pTREX7、-14 および -1Aで使用するＰＣＲ誘導プロモーター断片を作るために使用されるオリゴヌクレオチド（５’−３’を示す）を示す図である。
【図２ａ】ＴＩＲ結合ベクター pKS90を示す図であり、pKS90 発現カセットを模式図的に示す。
【図２ｂ】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−１】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−２】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−３】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−４】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−５】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−６】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−７】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｂ−８】制限酵素位置を含む、完全なpKS90 配列を示す図である。
【図２ｃ】  pKS90 のＴＩＲ領域を形成する人工ＤＮＡ配列を作るために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３ａ】  Cpβ−変異体の構築で使用されるプライマーを示す図である。
【図３ｂ】  CpβＭ１について使用する構築法の例を示す図である。
【図４】クロストリジゥムパーフリンジェンスβ−毒素のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】ホルマリン対力価のグラフを示す図である。
【図６】群における死亡動物（％）のグラフを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｂ−１】
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【図１ｂ−２】
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【図１ｂ−３】
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【図１ｂ−４】
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【図１ｂ−５】
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【図１ｂ−６】
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【図１ｂ−７】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｂ−１】
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【図２ｂ−２】
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【図２ｂ−３】
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【図２ｂ−４】
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【図２ｂ−５】
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【図２ｂ−６】
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【図２ｂ−７】
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【図２ｂ−８】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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