(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0004226681.tif 000018
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表される化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化２】
0004226681.tif 000019
で表されるピリジニウム化合物の製造方法。
【請求項２】
式（１）
【化３】
0004226681.tif 000020
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表される化合物を加水分解して、式（３）
【化４】
0004226681.tif 000021
で表される化合物を得、更にこの化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化５】
0004226681.tif 000022
で表されるピリジニウム化合物の製造方法。
【請求項３】
式（３）で表される化合物を単離せずに行う請求項２に記載のピリジニウム化合物の製造方法。
【請求項４】
式（４）
【化６】
0004226681.tif 000023
で表される化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化７】
0004226681.tif 000024
で表されるピリジニウム化合物の製造方法。
【請求項５】
式（１）
【化８】
0004226681.tif 000025
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表されることを特徴とする、ピリジニウム化合物の製造のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピリジニウム化合物の製造方法及びそのための化合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、糖と蛋白アミンとのメイラード反応については、まずそれら糖と蛋白アミンとの非酵素的反応（グリケーション）によってシッフ塩基が形成され、このシッフ塩基からアマドリ転位反応により比較的短期間にメイラード反応前期生成物であるケトアミンが形成され、更に種々の段階をへてメイラード反応後期生成物が産生される。
【０００３】
このメイラード反応前期生成物としては、臨床的には糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）や糖化アルブミン（フルクトサミン）が、血糖コントロールの指標として利用されている。
【０００４】
一方、メイラード反応後期生成物は、コラーゲン、神経ミエリンや水晶体等生体の代謝回転の遅い蛋白で生成され、長期高血糖状態（糖尿病）により増加することも知られており、糖尿病において最も特徴的変化である持続性高血糖状態が、なぜ糖尿病に特異的である慢性合併症を引き起こすかを説明する仮説として、このメイラード反応後期生成物がその成因して注目されると共に、その産生を阻害することによって合併症の発症や進展を阻止し得る可能性が示唆されてきた。
【０００５】
又、メイラード反応後期生成物の血中、尿中や組織中の濃度を測定することによる、合併症の診断への可能性が期待されている。
【０００６】
しかしながら、これまでに開発されたメイラード反応後期生成物測定法より得られた知見は、生体内メイラード反応後期生成物の増量と各種組織障害との間には密接な因果関係があることを強く示唆しているが、未だ生体内の主要メイラード反応後期生成物の化学構造は不明である。
【０００７】
本発明の発明者の一部は、上記のようなメイラード反応後期生成物の現状に鑑み、各種組織障害との間に密接な因果関係を有する生体内メイラード反応後期生成物の構造を特定することを目的として研究を続けた結果、新規な生体内メイラード反応後期生成物を発見し、更に研究を続行して当該化合物が式、
【化９】
0004226681.tif 000002
で表される構造を有するピリジニウム化合物であることを確認し、更にこのピリジニウム化合物が糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬として有用であるとの知見を得、特許出願をした。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、式（２）で表されるピリジニウム化合物が、糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬として有用である以上、所定の量の当該化合物を効率的に生産することが必要となるが、従来は式（２）で表されるピリジニウム化合物のかかる製造方法は知られていなかった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記のような従来技術の現状に鑑みてなされたもので、本発明はまず、式（１）
【化１０】
0004226681.tif 000003
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表される化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化１１】
0004226681.tif 000004
で表されるピリジニウム化合物の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明は又、式（１）
【化１２】
0004226681.tif 000005
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表される化合物を加水分解して、式（３）
【化１３】
0004226681.tif 000006
で表される化合物を得、更にこの化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化１４】
0004226681.tif 000007
で表されるピリジニウム化合物の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明は更に、式（４）
【化１５】
0004226681.tif 000008
で表される化合物を加水分解することを特徴とする、式（２）
【化１６】
0004226681.tif 000009
で表されるピリジニウム化合物の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に又、式（１）
【化１７】
0004226681.tif 000010
（式中、Ａｃはアシル基を、Ｒは低級アルキル基をそれぞれ表す。）
で表されることを特徴とする、ピリジニウム化合物の製造のための化合物を提供する。
【００１３】
【発明の実施の態様】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の製造方法の目的化合物である上記ピリジニウム化合物（２）は、一種のメイラード反応後期生成物であり、例えば、アルブミン、リゾチーム、カゼイン、リボヌクレアーゼやグロブリン等の蛋白質と、グルコース、ダイアセチル、グリオキザールやフルクトース等のカルボニル化合物との、非酵素的反応によって産生されるものである。
【００１５】
上記ピリジニウム化合物（２）は、ウサギ赤血球とグルコースとを３７℃で２週間反応させた系の反応液を４８時間透析して加水分解した後、ＯＤＳ−５カラムによる高速液体クロマトグラフィーにより、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４０２ｎｍにより検出され、その生成量はグルコースの濃度と反応時間並びに反応液の褐変化に比例して増加し、その生成はメイラード反応阻害物質であるアミノグアニジンによって阻害され、又、ウシ血清アルブミンとグルコースとの系においても、同様に生成するものである。
【００１６】
上記ピリジニウム化合物（２）の構造は、ウシ血清アルブミンとグルコースの反応で生成したメイラード反応後期生成物を加水分解した後、蛍光波長を利用した高速液体クロマトグラフィーにより分取した後、グリセロールとニトロベンジルアルコールとの混合物をマトリクスとしたＦＡＢ−マススペクトルを用いて測定することにより、まずその分子量が２１２と決定された。
【００１７】
次いで、高分解能マススペクトルを利用することにより、上記ピリジニウム化合物（２）の組成式がＣ9Ｈ10Ｏ3Ｎ1Ｓ1と決定され、更に二次元を含むＮＭＲ解析の結果、上記メイラード反応後期生成物は、式
【化１８】
0004226681.tif 000011
で表される８−ヒドロキシ−５−メチルジヒドロチアゾロ［３，２−ａ］ピリジニウム−３−カルボキシレートと決定された。
【００１８】
尚、上記ピリジニウム化合物（２）は、牛の肝臓より蛍光を有する加水分解物としてすでに単離されているものである。
【００１９】
而して、本発明は上記ピリジニウム化合物（２）を以下のようにして製造するものである。
【００２０】
即ち、本発明の製造方法では、式（１）
【化１９】
0004226681.tif 000012
で表される本発明の化合物を使用する。
【００２１】
上記式（１）中、Ａｃはアセチル基等のアシル基を、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基やブチル基等の低級アルキル基をそれぞれ表している。
【００２２】
上記本発明の化合物は、Elofsson, M; Walse B, ; Kihlberg, J. Tetrahedron Lett, 1991, 32, 7613に記載の方法に準じ、グルコースペンタアセテートと、式（５）
【化２０】
0004226681.tif 000013
で表されるシステイン誘導体とを、四塩化錫の存在下で反応させて式（６）
【化２１】
0004226681.tif 000014
で表されるグルコース−システイン誘導体を得、その後にこのグルコース−システイン誘導体におけるＦｍｏｃ保護基を脱離させることにより、得ることができる。
【００２３】
尚、上記式（５）の化合物におけるＦｍｏｃは、以下のような構造の保護基を表している。
【化２２】
0004226681.tif 000015
【００２４】
本発明の製造方法では、上記化合物（１）を加水分解することにより、上記ピリジニウム化合物（２）を得るものであるが、この加水分解は、例えば６Ｎ塩酸等による酸性条件下、必要に応じて加熱することにより行うことができる。
【００２５】
尚、上記ピリジニウム化合物（２）の製造方法としては、Acta, Chem, Scand., 23, 371, 1969にも報告があるが、比較的長い工程によるもので、本発明の製造方法のように１工程で上記ピリジニウム化合物（２）を製造する方法は知られていない。
【００２６】
又、上記ピリジニウム化合物（２）は、上記式（１）で表される化合物を加水分解して、一旦、式（３）
【化２３】
0004226681.tif 000016
で表される化合物を得、更にこの化合物（３）を加水分解することによっても得ることができる。
【００２７】
上記の方法において、前者の加水分解は、例えばメタノール等の溶媒中で、リジウムメトキシド等によるアルカリ性条件下で行うことができ、後者の加水分解は、例えば６Ｎ塩酸等による酸性条件下、必要に応じて加熱することにより行うことができる。
【００２８】
更に、上記ピリジニウム化合物（２）は、式（４）
【化２４】
0004226681.tif 000017
で表される化合物を加水分解することによっても得ることができる。
【００２９】
上記の方法における加水分解は、例えば６Ｎ塩酸等による酸性条件下、必要に応じて加熱することにより行うことができる。
【００３０】
上記式（４）で表される化合物は、H. Masaki, A. Imahoriの方法(JP. 09067226 A2)によって合成することができ、この式（４）で表される化合物は、上記式（３）で表される化合物における糖部分をガラクトースに変更したものである。
【００３１】
尚、本発明の製造方法により得られた上記ピリジニウム化合物（２）の物理化学的データは、文献記載の値と一致した。
【００３２】
本発明の製造方法により得られた上記ピリジニウム化合物（２）は、糖尿病病態において大量に産生して腎、腱、皮膚、神経等の組織に沈着すると共に、腎機能の低下に伴い尿中に大量に排泄されてくることから、糖尿病病態のバイオマーカ一として適用することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００３４】
実施例１
N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-triphenylmethyl-L-cysteine methyl esterの合成
メタノール９ｍｌとベンゼン３０ｍｌの混合液に、１．７７ｇ（３ｍｍｏｌ）のN-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-triphenylmethyl-L-cysteineを溶解し、この溶液にトリメチルシリルジアゾメタン５．５ｍｌ（４．８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１５分間撹拌した。反応溶液より溶媒を減圧で留去することにより、粗メチルエステルが得られ、これを精製することなく使用した。
1ＨＭＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ）：δ２．６６（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、４．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．３０〜４．３９（ｍ，３Ｈ）、５．２３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８〜７．３２（ｍ，１１Ｈ）、７．３８〜７．４１（ｍ，８Ｈ）、７．６０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、７，７６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）
【００３５】
N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-cysteine methyl ester［式（５）においてR=CH3の化合物］の合成
ジクロロメタン１．５ｍｌ中に粗N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-triphenylmethyl-L-cysteine methyl esterを溶解した溶液に、４１９ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）のトリエチルシランと１．５ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、混合溶液を室温で１時間撹拌し、溶媒を留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィによりヘキサン／酢酸エチル＝４：１→２：１で精製し、１．０４ｇ（９７％）の目的化合物を得た。
1ＨＭＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ）：δ１．３６（ｔ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）、２．９８〜３．０２（ｍ，２Ｈ）、３．８０（ｓ，３Ｈ）、４．２４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．４４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．６７（ｄｔ，Ｊ＝７．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．６８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．２８〜７．４４（ｍ，４Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）
13ＣＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ２７．０，４７．１，５２．８，５５．２，６７．０，１２０．０，１２４．９８，１２５．０１，１２７．０，１２７．７，１４１．３，１４３．６，１４３．７，１５５．６，１７０．４
【００３６】
N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine methyl ester［式（６）においてAc=COCH3、R=CH3の化合物］の合成
1,2,3,4,6-penta-O-acetyl-b-D-glucopyranose１．５６ｇ（４ｍｍｏｌ）とN-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-cysteine methyl ester［式（５）においてR=CH3の化合物］１．００ｇ（２．８ｍｍｏｌ）との２０ｍｌジクロルメタン溶液に、四塩化スズ０．４８ｍｌ（４．１ｍｍｏｌ）を添加した。混合溶液を室温で１時間撹拌し、更に1,2,3,4,6-penta-O-acetyl-b-D-glucopyranose１．５６ｇ（４ｍｍｏｌ）と四塩化スズ０．４８ｍｌ（４．１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸、水及び塩水で水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル＝３：２）で製精し、１．６９ｇ（８８％）の目的化合物を得た。
1ＨＭＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ）：δ２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｓ，６Ｈ）、２．０４（ｓ，３Ｈ）、２．９９（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，６．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．２６（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，４．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．６７（ｄｔ，Ｊ＝９．９，４．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ），４．０９〜４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．２４（ｂｔ，Ｊ＝９．９，９．４，１Ｈ）、４．３６〜４．６１（ｍ，４Ｈ）、５．０１（ｄｄ，Ｊ＝９．９，９．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．０６（ｄｄ，Ｊ＝９．９，９．４，１Ｈ）、５．２３（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）、５，９３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．２８〜７．３４（ｍ，４Ｈ）、７．５９〜７．６１（ｍ，２Ｈ）、７．７６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）
13ＣＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ２０．４，２０．５，３１．８，４７．０，５２．６，５３．８，６１．９，６６．８，６８．１，６９．５，７４．３，７５．９，８２．９，１１９．９，１２４．８５，１２４．９１，１２７．０，１２７．６，１４１．１，１４３．５８，１４３．６１，１５５．７，１６９．２，１６９．３，１６９．９，１７０．４，１７０．７
【００３７】
S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine methyl ester［式（１）においてAc=COCH3、R=CH3の化合物］の合成
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中、N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine methyl ester３９０ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）を、２０％ピペリジンで１時間、室温下に処理した。混合溶液から減圧で溶媒を留去した後、酢酸エチルとエーテル１：１の混合溶液で希釈した。水と塩水で水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール＝４０：１）製精し、２４３ｍｇ（９１％）の目的化合物を得た。
1ＨＭＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ）：δ１．７７（ｂｓ，２Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．８３（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，７．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．１７（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，４．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．６９〜３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ）、４．１６（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．２４（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，４．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．０４（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）、５，０９（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．２３（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ）
13ＣＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ２０．５，２０．６，３４．８，５２．３，５４．７，６１．９，６８．１，６９．６，７３．７，７５．９，８３．５，１６９．４，１７０．１，１７０．６，１７３．９
【００３８】
8-hydroxy-5-methyldihydrothiazolo[3,2-a]pyridinium-3-carboxylate［化合物（２）］の合成
ミクロチューブにS-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine methyl ester［式（１）においてAc=COCH3、R=CH3の化合物］１．５ｍｇを入れ、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間の気相加水分解を行った後、フィルター処理し、ＯＤＳ−ＨＧ−５カラムを用い、３％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を流速２ｍｌ／ｍｉｎで流し、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４０２ｎｍにて高速液体クロマトグラフィーにおいて、目的化合物に相当する溶出時間１０分のピークを分取した。これを繰り返した結果、S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl-L-cysteine methyl ester［式（１）においてAc=COCH3、R=CH3の化合物］２２．５ｍｇから、精製された化合物（２）０．９ｍｇ（収率４．３５％）を得た。
【００３９】
実施例２
3-S-(b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine ［化合物（３）］の合成
２００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のS-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine methyl ester［式（１）においてAc=COCH3、R=CH3の化合物］の１ｍｌメタノール溶液に、メタノール０．４ｍｌ中の０．１Ｎナトリウムメトキシドを４℃で滴下し、同温度で４８時間撹拌した。アンバーリスト１５を加えて中和し、次いで濾過して濾液を濃縮した。９３ｍｇの残渣を少量のメタノールに溶解し、塩化メチレンを加えることにより固体１２ｍｇを得た。母液を濃縮し、再度メタノール−塩化メチレンで処理することにより、２７ｍｇの固定を得た。両固体を合わせることにより、３９ｍｇの目的化合物を２８％の収率で得た。得られた目的化合物の1ＨＭＭＲは文献（Monsigny, M.L.P.; Delay, D.; Vaculik, M. Carbohydr. Res. 1977, 59, 589）記載の値と一致した。
【００４０】
3-S-(b-D-glucopyranosyl)-L-cysteine ［化合物（３）］１．５ｍｇを、実施例１と同様に加水分解、後処理して、化合物（３）３０ｍｇから、精製された化合物（２）２．５ｍｇ（収率１１．２３％）を得た。
【００４１】
実施例３
S-D-galactopyranosyl-L-cysteine ［化合物（４）］１．５ｍｇを、実施例１と同様に加水分解、後処理して、化合物（３）３０ｍｇから、精製された化合物（２）２．４ｍｇ（収率１０．８２％）を得た。尚、化合物（４）は上記文献に記載の方法に準じて合成した。