(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＷＡＫ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７５）を栄養源含有培地に接種・培養し、その培養物から採取した式（Ｉ）
【化１】
0004390259.tif 000008
［式中、Ｇａｌｐは、ガラクトピラノース残基を表し、Ｇｌｃｐはグルコピラノース残基を表す］で示される構成単位を有する硫酸多糖類またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分とする乳癌、中枢神経癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、腎癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選ばれた癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項２】
上記硫酸多糖類が、分子量が約３８０，０００である請求項１に記載の癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
上記の癌細胞がヒト細胞である請求項１または２に記載の癌細胞の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、硫酸多糖類、その製造方法、それを有効成分とする物質、特に抗腫瘍剤、ならびその利用方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
特許文献１、２および非特許文献１によると、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＷＡＫ−１菌株は、海洋に生息するワカメ藻体の表面より分離された海洋細菌である。その分類学的特性は非特許文献１に記載されており、本菌株（ＷＡＫ−１菌株）は、平成１４年８月２８日に寄託機関に寄託されるまでは、香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室、引き続き香川大学農学部生命機能科学科岡崎研究室に分譲可能な状態で保存されており、現在も保存されている。
特許文献１には、これを寒天平板培地で培養することにより、２種の多糖類すなわち酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類が同時に生産されると報告されているが、その後の研究で、特許文献１、２に開示した硫酸多糖類は構造式等に誤りがあり未同定であることが明らかとなった。
酸性ムコ多糖類はコンドロイチン様構造を有し、強い粘稠性があり、また非特許文献２によると、硫酸多糖類には、抗ウイルス作用のあることが示されており、両多糖類は共に医薬品や機能性食品等としての有用性が期待されるところである。
【０００３】
また、抗がん活性を有する多糖類には、これまで種々の起源のものが報告されており、コフキサルノコシカケ、メシマコブなどの担子菌類、ジュンサイ、コンブなどの多糖類を主要成分とする天然物質が知られている。
また近年、非特許文献３〜６にあるように、乳酸菌をはじめとする微生物が生産する多糖類は、生体内において免疫機能を強化する作用を有し、抗がん活性などの効果を示すことが明らかになっており、さらに海藻、微細藻類の多糖類、特に硫酸多糖類の抗がん活性が注目されている。
しかしながら、がん化学療法の分野においては、溶連菌製剤ＯＫ−４３２（ピシバニール）、シイタケ由来のレンチナン、スエヒロタケ由来のシゾフィランなどが実用化されているに過ぎず、これらも様々な種類の腫瘍に対してその効果は必ずしも満足しうるものではない。がん治療の分野においては生体内において免疫機能を強化する作用を有し、抗がん活性などの効果を示す微生物由来の多糖類の開発が求められて、特に新規の抗がん物質の開発が求められている。
【特許文献１】
特公開２００２−６５２９２号公報
【特許文献２】
特公開２００２−１７９５７９号公報
【非特許文献１】
Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，５８，１７３５−１７４１（１９９２）
【非特許文献２】
Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，６８−７３（１９９９）
【非特許文献３】
Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．第３０巻、８７−９２頁
【非特許文献４】
Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第１６巻、１２１３−１２１８頁、
【非特許文献５】
Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．第１６巻、５４１−５５０頁
【非特許文献６】
Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．第６５巻、５２７−５３１頁
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な硫酸多糖類、その製造方法、それを有効成分とする物質、特に抗腫瘍剤、ならびその生理活性作用の利用方法の提供を目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、既に海洋微生物培養物からアルコールなどの有機溶媒で処理して得られる沈殿画分（これは後に構造不明の物質であることがわかった）が、ある種のヒト科培養がん細胞に対して、アポトーシス誘導作用を有することを知見しており（文献２）、アポトーシス誘導に基づく抗がん作用が期待されている。
このような事情に鑑み本発明者等は、海洋微生物が生産する多糖類について鋭意検討を重ねた結果、微生物シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＷＡＫ−１菌株を栄養源含有培地に接種・培養し、その培養物からアルコールなどの有機溶媒で処理し沈殿画分として得られる、式（Ｉ）で示される構成単位を有する硫酸多糖類に、抗がん活性があることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、微生物シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＷＡＫ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７５）を栄養源含有培地に接種・培養し、その培養物から採取した式（Ｉ）
【化２】
0004390259.tif 000002
［式中、Ｇａｌｐは、ガラクトピラノース残基を表し、Ｇｌｃｐはグルコピラノース残基を表す］で示される構成単位を有する硫酸多糖類またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分とする乳癌、中枢神経癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、腎癌、胃癌および前立腺癌からなる群から選ばれた癌細胞の増殖抑制剤を要旨としている。
【０００７】
また、式（Ｉ）で表される硫酸多糖類は、好ましくは分子量が約３８０，０００である。  
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の対象である硫酸多糖類を製造するためには、微生物としてシュードモナス属の新種に属する微生物、すなわちシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のＷＡＫ−１菌株の属する新種に属する微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＡＫ−１）が使用される。この新種に属するＷＡＫ−１菌株は、上記の文献３「Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，５８，１７３５−１７４１（１９９２）」に記載された菌株である。
この菌株は、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＡＫ−１」と表示して、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託し、平成１４年８月２８日 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８８として受託書が発行された。その後、原寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８８）を上記の原寄託をした国際寄託当局に移管請求をし、平成１５年１月１６日に該国際寄託当局より原寄託についての受託証（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７５）が発行された。
本発明においては菌株として表示する場合はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＷＡＫ−１菌株と「菌株」を付けて表示し、シュードモナス属の新種に属する微生物はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＡＫ−１と表示し、区別している。
【００１３】
ＷＡＫ−１菌株の分類学的特性は非特許文献１に記載されており、以下のとおりである。
（１）ＷＡＫ−１菌株の分離
１９９０年７月に瀬戸内海引田沿岸で、採取したワカメ（Ｕｎｄａｒｌａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）の海藻切片を３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地に入れ、室温で１週間培養後、培養液が白濁し粘稠を帯びたものを白金耳で３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ寒天培地上に塗布し、室温で４日間培養した。寒天培地上に十数個の細菌コロニーが生育したプレートの中で粘稠性を示した細菌を３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ寒天平板培地上で継代培養を行い、ＷＡＫ−１菌株を分離した。
（２）ＷＡＫ−１菌株の形態学的および生理・生化学的性状
培養方法：ＷＡＫ−１菌株をペプトン（Ｍｉｋｕｎｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．）５ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｃｏ．）１ｇ、海水１ｌ、寒天（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１５ｇからなるＺｏＢｅｌｌ改変培地（ｐＨ８．０、以下これをＺｏＢｅｌｌ培地と呼ぶ）を基礎培地として以下の実験を行った。
細菌の形態、運動性、およびグラム染色性の観察：ＷＡＫ−１菌株をＺｏＢｅｌｌ寒天斜面培地を用いて２５℃で１２時間培養した。培養菌株は懸滴法による運動性の有無の確認、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ試薬（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）による鞭毛染色、Ａｎｉｌｉｎ Ｖｉｏｌｅｔ試薬（Ｎａｋａｒａｉ Ｃｏ．）によるグラム染色で光学顕微鏡観察を行った。本菌株をＺｏＢｅｌｌ寒天および液体培地を用いて２５℃で２日間、培養を行い、それぞれ生育の性状について肉眼観察を行った（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９７１；Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７６）。
透過型電子顕微鏡：本菌株を３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ寒天斜面培地に接種し、２５℃で１２時間培養した。培養菌株をイオン交換水に懸濁後、コロジオン膜メッシュ（１５０ｍｅｓｈ、Ｎｉｓｓｉｎ ＥＭ Ｃｏ．）上に塗布し、４０℃で乾燥した。乾燥後、白金−パラジュウムでシャドーイング（Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＵＳ−５ＢＳ、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏ．）し、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＵ−１２Ａ、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏ．）で菌体観察を行った（Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ １９７１）。
ＮａＣｌ濃度生育範囲：３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地をそれぞれ０、２．０、４．８、６．０、６．８、９．１、および１０．７％ＮａＣｌ濃度（ｗ／ｗ）に調製し、２５℃で５日間培養し、菌の生育の有無を培養液の混濁の有無から観察した。
温度生育範囲：３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地を用いてそれぞれ４、１０、１５、２０、２５、３０、および４０℃で５日間培養し、菌の生育の有無を培養液の混濁の有無から観察した。
ｐＨ生育範囲：３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地をそれぞれ０．１Ｍ ＮａＯＨおよびＨＣｌ溶液でｐＨ２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０、および１２．０に調製し、２５℃で５日間培養し、菌の生育の有無を培養液の混濁の有無から観察した。
生化学的性状：ＣＶＴおよびＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用いて２５℃で３日間培養し、生育状態および培地色の変化を観察した。Ｋｉｎｇ ＡおよびＢ培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用いて２５℃で３日間培養し、それぞれの培地中の水溶性色素を観察した。
ゼラチンの液化：１２％ゼラチン添加ＺｏＢｅｌｌ培地を用いて室温で５日間培養し、４℃で冷却を行い、ゼラチンの液化の有無を観察した（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６）。
Ｔｗｅｅｎ８０、カゼイン、およびデンプン加水分解：３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地を２５℃で２日間振とう培養した菌株を１％Ｔｗｅｅｎ８０、１０％カゼイン（０．４４％クエン酸ナトリウム、０．０５％塩化カルシウムを含む）、および１％デンプン添加ＺｏＢｅｌｌ寒天平板培地上に培養し、２５℃で１週間培養を行い、菌体の生育の性状を観察した。１％デンプン添加培地ではＬｕｇｏｌ染色液（０．５％ヨウ素と１％ヨウ素カリウム水溶液）で染色を行い、菌体の生育の性状を観察した。これらの培地上の生育菌株の周辺の培地が透明になっているものを加水分解されたものとした（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６）。
インドールの生産：０．１％トリプトファン添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地を用いて２５℃で１週間培養した後、Ｋａｖａｃｓインドール試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇ、イソアミルアルコール１５ｍｌおよび濃硫酸５ｍｌ混合溶液）を滴下し、赤色に変化したものを陽性とした。
各種Ｌ−アミノ酸脱炭酸試験：５％アミノ酸（Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、およびＬ−リジン塩酸塩）および１％グルコース添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地を用いて２５℃で１週間培養を行った後、フェノール指示薬を添加して赤色になったものを陽性とした（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６）。
オキシダーゼ試験：ＺｏＢｅｌｌ寒天斜面培地で培養後、菌体をかきとりチトクロームオキシダーゼ試験用ろ紙（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）により判定を行った（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９７２）。
カタラーゼ試験：３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ寒天斜面培地を用いて２５℃で週間培養し、生育コロニー上に過酸化水素水を滴下し、気泡が発生したものを陽性とした（Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７６）。
脱窒素作用：ダーラム管を入れた０．１％硝酸添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地を用いて２５℃で１週間培養した後、ＧＲ試薬（酒石酸８．９ｇ、α−ナフトリアミン１００ｇ、およびスルファニル酸１ｇ混合粉体）を少量添加し、赤色に変化したものを硝酸還元陽性、さらにダーラム管中に気泡が発生したものを脱窒素陽性とした。
硫化水素の生産：酢酸鉛含有の乾燥ろ紙を試験管内側に挟んだＺｏＢｅｌｌ培地を用いて２５℃で１週間培養した後、ろ紙が黒変したものを陽性とした（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６）。
酒石酸、クエン酸、およびマロン酸の利用能：本株を以下の培地を用いて２５℃で１週間培養して有機酸の利用能を調べた。Ｄ−酒石酸の酸生産はジョルダン培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用い、培地が赤色から黄色になるものを陽性とした。クエン酸利用能は、ＳＣ培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用い、培地が青色に変化したものを陽性とした。マロン酸利用能はフェニルアラニンマロン酸塩培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用い、培地が青色に変化したものを陽性とした。
ＯＮＰＧ試験：本株のβ−ガラクトシダーゼ活性を調べるため、ＯＮＰＧディスク（Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．）を用いて２５℃で１週間培養を行い、ディスクが黄色になったものを陽性とした。
糖類の分解：１％各種糖類添加ＺｏＢｅｌｌ培地（０．１％寒天およびＢＴＢ指示薬添加、ｐＨ８．０）を用いて２５℃で２週間培養し、培地が黄緑色から黄色の酸性に変化したものを陽性とした。糖類は、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、ソルボース、Ｄ−フコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、イヌリン、ｍ−エリスリトール、ズルシトール、ニュトロース、マンニトール、メンソール、ｍ−イノシトール、シュークロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびラフィノースを使用した。また、Ｄ−グルコース添加ＺｏＢｅｌｌ培地に本菌株を接種後、培地表面の流動パラフィンの有無による酸産生の状態からＯ／Ｆ試験を行った（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６；Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ １９８４）。
（３）ＷＡＫ−１菌株のＧＣ比
ＷＡＫ−１菌株のＤＮＡの抽出および精製：ＷＡＫ−１菌株を３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ液体培地の試験管に接種した後（１０ｍｌ）、２０℃で３日間振とう培養した。これを種菌として３％ショ糖添加ＺｏＢｅｌｌ寒天平板培地上で２５℃で３日間培養した。培地上に生じた粘質物を１％フェノール溶液を噴霧し、培地表面の粘質物をかきとった後、１％フェノール溶液を懸濁後、遠心（８，０００ｒｐｍ、１時間）して菌体を分離した。
菌体をＥＤＴＡ−ＮａＣｌ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ混合溶液、ｐＨ８．０、４００ｍｌ）で懸濁した後、遠心（６，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体の洗浄を２回繰り返し行った。これをＥＤＴＡ溶液（２００ｍｌ）および２５％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（１６ｍｌ）に懸濁した後、６０℃で１０分間インキュベートして溶菌処理を行った。冷却後、５ｍＭ過塩素酸ナトリウム（５０ｍｌ）を加えた後、クロロホルム−イソアミルアルコール混合溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１、２７０ｍｌ）を加えて撹拌し、溶液中のタンパク質を変性させた。遠心（６，０００ｒｐｍ、２０分間）して、クロロホルム、変性タンパク質、および水層に分けた後、水層に分取し、２倍量のＥｔＯＨで沈殿を行った。得られた沈殿物をクエン酸−ＮａＣｌ溶液（０．１５Ｍクエン酸３ナトリウム／１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ７．０、４０ｍｌ）を加えて撹拌し、前述と同様の方法で除タンパクを２回繰り返し、粗ＤＮＡを得た。
粗ＤＮＡを１０倍希釈クエン酸−ＮａＣｌ溶液（２０ｍｌ）で溶解し、更に１０倍濃縮クエン酸−ＮａＣｌ溶液（２ｍｌ）を加えて粗ＤＮＡ溶液を調整した。これにＲＮａｓｅ溶液（０．７ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートして溶液中の混在するＲＮＡを分解した。ＲＮａｓｅ溶液はリポヌクレアーゼＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ由来、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ５．０）で２％に調整後、８０℃、１０分間加熱して混在するＤＮａｓｅを失活させたものを用いた。前述と同様に除タンパクを行い、得られたＥｔＯＨ沈殿物を１０倍希釈クエン酸−ＮａＣｌ溶液（４ｍｌ）に溶解後、酢酸−ＥＤＴＡ混合溶液（３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．００１ Ｍ ＥＤＴＡ混合溶液、ｐＨ７．０、３６ｍｌ）を加えて撹拌した。これにイソプロピルアルコールを滴下しながらガラス棒で撹拌し、ＤＮＡをガラス棒に巻き付けた。得られたＤＮＡを７０、８０、９０、９９％ＥｔＯＨの順に脱水を行い、デシケーター内で乾燥を行い、精製ＤＮＡとした（５．２ｍｇ）（Ｍａｒｍｕｒ １９６１）。
精製ＤＮＡを水に溶解（２ｍｇ／ｍｌ）後、１００℃で５分間加熱し、変性ＤＮＡとした。この変性ＤＮＡ溶液にヌクレアーゼＰ１溶液（１００ｍｌ）を添加し、５０℃で１時間インキュベートして５′−デオキシリボ核酸−１−リン酸（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）に分解した（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９７２）。ヌクレアーゼＰ１溶液はヌクレアーゼＰ１（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ由来、Ｙａｍａｓａ Ｓｈｙｏｙｕ Ｃｏ．）をイオン交換水に溶解し、８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌに調製したものを用いた。
核酸塩基分解：分解された細菌のＧＣ比〔ＧＣ／ＡＴＧＣ（％）〕をＵｎｉｓｉｌ Ｐａｋカラム（直径４×長さ１５ｃｍ、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．）でカラム濃度３０℃、移動相に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ）、ＵＶ検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ、検出波長２１０ｎｍ）、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＰ ６ＡポンプおよびＳｈｉｍａｄｚｕ ＣＲ ６Ａ記録計を用いて核酸塩基分析を行った。標準品として５′−ＴＭＰ−２Ｎａ、５′−ＣＭＰ−ｆｒｅｅ、５′−ＡＭＰ−２Ｎａ、５′−ＴＭＰ−２Ｎａ（Ｙａｍａｓａ Ｓｈｙｏｙｕ Ｃｏ．、０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
【００１４】
実験結果および考察
ＷＡＫ−１菌株の形態および生理・生化学的性状を表１および２に示した。本菌株はグラム陰性菌と認められ、透過型電子顕微鏡観察で菌体は幅０．５−０．７μｍ、長さ１．３−１．９μｍの短桿菌で単極鞭毛を有しており、光学顕微鏡観察で運動性が認められた。本菌株の生育ｐＨ範囲はｐＨ６．０−１２．０、生育食塩濃度は２．０−１０．７％、また生育温度範囲は１０−３０℃と認められた。このように本菌株は塩化ナトリウム無添加や酸性領域では生育できず、海水で調製した培地に良く生育することから、海洋性細菌と考えられた。
ＷＡＫ−１菌株はオキシダーゼテスト、カタラーゼテスト、β−ガラクトシダーゼテスト陽性、Ｏ／Ｆテストで酸化型を示し、Ｄ−グルコースから酸を産生し、Ｌ−アルギニン分解、硝酸塩還元能で陰性を示した。また、ＤＮＡのＧＣ比は５９．７％であり、これらの性状はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の特徴と一致した（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｉｔｒｕｋａ １９７６；Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ １９８４）。
以上の実験結果より本菌株はその他の生理・生化学的性状と合わせ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属と考えられた（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９７２）。
本菌株の生化学的性状はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａに類似しているが（ＺｏＢｅｌｌ ａｎｄ Ｕｐｈａｍ １９４４）、Ｐ．ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａは、現在Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＺｏＢｅｌｌ ｓｔｒａｉｎと称されており、ＷＡＫ−１菌株の特徴とは硝酸塩還元作用の有無で異なっている（Ｄｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７）。しかし、硝酸塩還元能陰性の種も報告されており、ＷＡＫ−１菌株との相違については結論を出すに至っていない（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９８３）。
また、Ｐ．ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａには菌体の両極に単または複数の鞭毛を有していると記載されている点でＷＡＫ−１菌株とは異なっているが、Ｐ．ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａの標準株は運動性が無いと記載されている（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９８３）。また、Ｄｏｈｌｅｒらは後になってこの菌には鞭毛がないと報告している（Ｄｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７）。しかしながら一方ではＺｏＢｅｌｌらの記載と同様Ｄｏｈｌｅｒらも半流動性寒天培地上の培養でコロニーの広がりを認め、運動性を否定できない（Ｄｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７；ＺｏＢｅｌｌ ａｎｄ Ｕｐｈａｍ １９４４）。海洋性ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓとしてＢａｕｍａｎｎらが記載している他のものは、グルコース、マルトース利用性がなく、一方、ＷＡＫ−１菌株はＭａｒｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｌｅｙａ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓには適合しない。これらのことから、ＷＡＫ−１菌株はこれまでに報告のあるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの中の種に適合するものはみあたらなく、新種の可能性がある。
【００１５】
まとめ
瀬戸内海でワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）葉体表面より分離されたＷＡＫ−１菌株は各種の菌学的性状を文献に記載の海洋性細菌と比較検討した結果、海洋性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属と同定されたが、これまでに海洋性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓとして記載されているものの中には該当する種はみあたらないため、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＡＫ−１菌株と称し、以後の実験に供した。
【００１６】
【表１】
0004390259.tif 000003
【００１７】
【表２】
0004390259.tif 000004
【００１８】
本発明の硫酸多糖類を合成するには、海洋性シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の菌株を栄養源含有培地に接種して発育させる方法が好適である。培地は前記微生物を資化しうる炭素源、窒素源及び生育に必要な各種無機塩等の栄養源を含む液体培地が好ましい。
具体的には、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュクロース等が挙げられ、これらは単独または混合物として用いられる。窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、その他の有機物あるいは無機物等が挙げられ、単独または混合物として用いられる。
【００１９】
無機塩としては、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたは各種リン酸塩等を使用することができる。その他必要に応じて、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト等の重金属塩を微量添加することができる。
培地を調製する際には海水の使用が好ましいけれども、人工海水、食塩水（２−３重量％）等を使用しても良い。
【００２０】
培養方法としては、一般の微生物の代謝産物生産方法と同様にすれば良い。固体培養でも液体培養でも良いが液体培養がより好ましい。液体培養の場合は、撹拌培養、振とう培養または通気培養等のいずれを実施しても良いが、実質的に振とうの条件で培養すれば、培養物中に本発明で使用する硫酸多糖類が選択的に生成し蓄積する。なお、この際に発泡が激しい場合には、消泡剤として大豆油等の植物油、オクタデカノール等の高次アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜添加しても良い。
【００２１】
培養は通常ｐＨ６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５の範囲、温度は１５〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃が適当である。培養時間は本発明で用いる多糖類の生産が最大に達する期間で選ばれるが、通常は４８〜１４４時間、好ましくは７２〜９６時間である。
【００２２】
このようにして得られた培養物中には、本発明に係る多糖類が含まれている。該多糖類は菌体外に存在するので、その採取に当たっては、予め培養物中の菌体や他の固形成分を除去したのち、通常の分離手段、例えば溶媒沈殿法、イオン交換樹脂法または吸着もしくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法、透析、凍結乾燥法など多糖類を不純物から回収するために通常使用されている手段を単独にあるいは適宜に組み合わせることによって分離精製できる。
【００２３】
その一例を示すと、上記固形分を除去して得られる溶液に、エタノール等の溶剤を添加して多糖類を沈殿させ、得られた該多糖類を水に溶解して、これに第四級アンモニウム塩（例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液）を加えて、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させ、塩化ナトリウムを含む水に溶解させたのち、エタノールによる沈殿を行い、沈殿物を水に溶解させたのち、透析、凍結乾燥することにより、目的とする多糖類（ナトリウム塩型）を得ることができる。また沈殿させた多糖類を塩化カリウム水溶液（約４モル濃度）に溶かし、同様に処理するとカリウム塩型が得られる。これらは必要に応じてＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフなどを用いて精製することができる。
【００２４】
本発明に係る多糖類の分子量、構成糖の種類、構成比、結合様式などは、各種のクロマトグラフィー、メチル化分析、核磁気共鳴分析などにより特定が可能である。
以下、これらの測定方法について具体的に説明する。
【００２５】
＜分子量の測定＞
サイズ排除クロマトグラフィー［アサヒパックＧＦＡ−７Ｍカラム７．６×５００ｍｍ（旭化成製）］を用い、０．１Ｍ塩化ナトリウムを移動相として、流速０．６ｍｌ／分で溶出される多糖類のピークを示差屈折計で検出し、各種分子量サイズのプルランを基準として算出した。
【００２６】
＜構成糖及びその構成比の測定＞
多糖類に対して２Ｍのトリフルオロ酢酸を使用し、１００℃、１２時間の条件下で酸加水分解を行い、和光純薬製のワコーパックＷＢＴ−１３０Ｅカラム（７．８×３００ｍｍ）により測定した。すなわち、水を移動相として流速０．５ｍｌ／分で溶出される糖のピークを示差屈折計で検出する。またアルジトールアセテート誘導体として、ガスクロマトグラフィー分析を行った。
【００２７】
＜核磁気共鳴分析＞
核磁気共鳴分析は、試料をＤ２Ｏに溶解して４００ＭＨｚ、７５℃で１Ｈ−ＮＭＲ、１００ＭＨｚで１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＡｌｐａ４００スペクトロメーター（日本電子製）を用いて測定した。
【００２８】
また前記以外の分析法については、Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第５８巻、１７３５−１７４１頁の記載に従って実施した。
【００２９】
硫酸多糖類の生理活性作用感受性細胞とは、硫酸多糖類を作用させて当該細胞の機能を変化させることができる細胞であれば特に限定されない。硫酸多糖類の生理活性作用は、細胞を用いた予備実験により予想することができ、本実験により確認することができる。細胞は好ましくはヒト細胞であるが、ヒト以外の細胞も包含する。細胞の形態は生体の臓器、培養細胞のいかんを問わない。
硫酸多糖類を生理活性作用感受性細胞に取り込ませて当該細胞の機能を変化させる作用を発揮させるためには、細胞に硫酸多糖類を作用させることにより行う。硫酸多糖類を作用させる態様には制限はなく、その用途などのより適宜有効な手段を採用することができる。硫酸多糖類およびその医薬的に許容し得る塩を有効成分とするの物質の形態で用いて、細胞に硫酸多糖類を作用させることが好ましい。硫酸多糖類およびその医薬的に許容し得る塩として、硫酸多糖類を生理活性作用感受性細胞の機能を変化させる作用の有効成分として配合した物質はいかなる形態のものも包含する。
【００３０】
硫酸多糖類の生理活性について説明する。
本発明者らは、本発明の硫酸多糖類が癌細胞の増殖を抑制する性質を有することを見いだした。本発明は、硫酸多糖類を有効成分とする癌細胞増殖抑制剤を提供することができる。
すなわち、ヒトがん由来の株化細胞を用いたがん細胞の増殖に対する効果を調べた。がん細胞はシャーレに撒いておき、十分な栄養と酸素を与えるとどんどん増殖する。ここに本発明の硫酸多糖類を添加すると増殖を非常に強力に押えるという効果があることが分かった。この効果は複数種のがんの細胞においても同様に認められた。硫酸多糖類を有効成分とする癌細胞増殖抑制剤は、用法としては経口投与でもよく、また、静脈注射、動脈注射、リンパ管内注射および疾患部位への直接投与でもよい。この場合、硫酸多糖類は単独で、又は硫酸多糖類の薬効に悪い影響を与えない他の薬剤（薬理活性成分）と併用して用いることもできる。
本発明の硫酸多糖類は、その抗がん活性が実験的に証明されたことにより、生体内において免疫機能を強化する作用を有し、抗がん活性などの効果を示す微生物産生多糖類であることが証明された。
【００３１】
このように、硫酸多糖類が生理活性を持つということが次々と分かってきた。硫酸多糖類を細胞の外に投与した場合、（１）輸送体を通って細胞の中に入ってくる可能性、（２）受容体に結合する可能性、あるいは、（３）細胞内の代謝を硫酸多糖類が存在することで変える可能性、などが考えられる。それらいずれの経路でも、恐らく情報は核に伝わり核のＤＮＡの転写に変化が起こり、蛋白の発現に変化が生じ、その結果、細胞機能が変化するのではないかと考えている。
硫酸多糖類の作用メカニズムについては、これまでほとんど行われておらず、そのような場合においてメカニズムを探るためには、硫酸多糖類を処理した細胞あるいは臓器での情報経路を網羅的に解析する手法を取らなければならないと考えている。
以上、医薬品としての応用を例に示したが、その他にも、免疫抑制作用など、さまざまな生理活性効果の可能性が出てきている。また、硫酸多糖類の用途としては医薬品以外の可能性については、食品、飲料、特に機能性食品、化粧品、飼料が例示される。
【００３２】
食品、飲料または化粧品、あるいは飼料における配合量は特に制限されないが０．０１〜１０重量％程度が好ましい。医薬品の場合、カプセルや粉末、錠剤などとして経口投与することができ、水に溶けることから経口投与以外に静脈注射、筋肉注射などの投与方法を採用することが可能である。投与量は例えば糖尿病の症状の度合いや体重、年齢、性別などにより異なるものであり、使用に際して適当な量を症状に応じて決めることが望ましい。医薬品における配合量は特に制限はされないが、体重１ｋｇあたり、経口投与の場合０．０１〜２，０００ｍｇ、静脈注射投与の場合０．０１〜１，０００ｍｇ、筋肉注射投与の場合０．０１〜１，０００ｍｇ程度が好ましい。
また本発明の硫酸多糖類は食品素材に微量に存在し、安全性が高く、大量生産技術が開発されればコスト面でも利用価値は高いものである。なお急性経口毒性試験では５，０００ｍｇ／ｋｇ以上であった。
【００３３】
本発明の機能性食品は、特定の疾病などを予防する健康食品、予防医薬品の分野の利用に適している。特定の疾病を予防する健康食品においては、必須成分である硫酸多糖類の他に、任意的成分として、通常食品に添加されるビタミン類、炭水化物、色素、香料など適宜配合することができる。食品は液状または固形の任意の形態で食することができる。ゼラチンなどで外包してカプセル化した軟カプセル剤として食することができる。カプセルは、例えば、原料ゼラチンに水を加えて溶解し、これに可塑剤（グリセリン、Ｄ−ソルビトールなどを加えることにより調製したゼラチン皮膜でつくられる。
【００３４】
本発明の薬剤においては、有効成分である硫酸多糖類はそれ自体のみならずそれの薬剤として許容される塩として使用される。該薬剤は、硫酸多糖類を単独で製剤として用いることができるほか、製薬上使用できる担体もしくは希釈剤を加えた製剤組成物に加工したものを用いることもできる。このような製剤または薬剤組成物は、経口または非経口の経路で投与することができる。例えば、経口投与用の固体または流体（ゲルおよび液体）の製剤または薬剤組成物は、タブレット、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、顆粒もしくはゲル調製品の形態をとる。製剤または薬剤組成物の正確な投与量は、その目的とする使用形態および処置時間により変化するため、担当の医師または獣医が適当であると考える量になる。
服用および投与用量は製剤形態によって適宜調整できる。錠剤などの経口固形製剤、経口液剤などとして１日服用量を１回ないし数回に分けて服用してもよい。また、例えばシロップやトローチ、チュアブル錠などの幼児頓服して、局所で作用させるとともに内服による全身性作用をも発揮させる製剤形態では１日服用量の１／２〜１／１０を１回量として配合し服用すればよく、この場合全服用量が１日量に満たなくてもよい。逆に、製剤形態からみて無理な服用容量とならなければ１日服用量に相当する量を１回分として配合してもよい。製剤の調製にあたっては、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、コーティング剤、徐放化剤など、希釈剤や賦形剤を用いることができる。この他、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、吸着剤、香料、着色剤、矯味剤、抗酸化剤、保湿剤、遮光剤、光沢剤、帯電防止剤などを使用することができる。
【００３５】
本発明は、硫酸多糖類の抗炎症作用を利用する皮膚外用剤、すなわち治療薬、皮膚外用剤、化粧料等が知られている肌荒れ、荒れ性に対して改善・予防効果を有する皮膚外用剤を提供することができる。本発明の皮膚外用剤には、硫酸多糖類を必須成分とし、それ以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、トラネキサム酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、グルコース、フルクトース、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。本発明の皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いられるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
【００３６】
［作用］
この発明は、海洋細菌の培養物から分離精製した新規硫酸多糖類に関するもので、本発明の硫酸多糖類は、ヒト培養がん細胞に対する強い増殖阻害作用を呈するものであって、がん治療における抗がん剤として有用なものと認められる。本発明の硫酸多糖類は、その抗がん活性が実験的に証明されたことにより、生体内において免疫機能を強化する作用を有し、抗がん活性などの効果を示す微生物産生多糖類であることが証明された。医薬品としての応用の他にも、免疫抑制作用など、さまざまな生理活性効果の可能性が出てきている。したがって、硫酸多糖類の用途としては医薬品、それ以外にも、食品、飲料、特に機能性食品、化粧品、飼料が挙げられる。
【００３７】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％の組成を有する海水から調製した培地を、温度を１２１℃としたオートクレーブ中で２０分間滅菌し、シュードモナスｓｐ．ＷＡＫ−１菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＷＡＫ−１菌株、香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保存菌株）の保存用斜面培養から、１白金耳を試験管中の滅菌培地（１０ｍｌ）に接種し、２８℃の温度で７２時間振とう培養を行い、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に、３％のショ糖を加えた滅菌培地に接種し、２８℃の温度で７２時間振とう培養を行った。培養後、培養終了液を遠心分離して菌体を除いた上澄液に、２倍量のエタノールを加え白色沈殿を得た。
なお、上記のＷＡＫ−１株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、平成１４年８月２８日 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８８として受託された。
【００３９】
この沈殿物を採取して水２００ｍｌ中に溶解し、沈殿が新たに生じなくなるまで、５％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド水溶液を徐々に加え、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として、多糖類を沈殿させた。この複合体を水で洗浄して過剰のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを除いたのち、４モルの塩化ナトリウム水溶液２００ｍｌ中に複合体を溶解し、この溶液に２倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた。
【００４０】
得られた沈殿物を水に溶解したのち、セルロースチューブに入れ流水中で透析後、凍結乾燥を行い、酸性多糖類約０．１ｇを得た。本多糖類をさらに精製するため、次にこの多糖類１０２ｍｇを０．０１モルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに溶解し、０．０１モルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡させたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（２．３×２２．５ｃｍ）に充填した。０．０１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の０．６モル塩化ナトリウムで溶出させる画分を除いたのち、０．８モルの塩化ナトリウムで溶出される画分を集めて透析し、次いで凍結乾燥して多糖類５３ｍｇを得た。
【００４１】
このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成分析、硫酸基含量分析及び核磁気共鳴分析等により、式（１）で示される構成単位を有する多糖類であることを確認した。
【００４２】
【化３】
0004390259.tif 000005
【００４３】
前述の分析方法によって調べた本多糖類の化学的特性は、以下のとおりである。
（１） 分子量 ：約３８０，０００
（２） 比旋光度 ：＋１１．７度［ｃ０．３、水］
（３） 硫酸基 ：１．５％塩酸メタノールにより、２５℃、４８時間のメタノリシスで硫酸基を遊離することから、硫酸基がエステル結合しているものと認められる。
（４） 第１図に示したＣ−Ｈ相関ＮＭＲスペクトル図から、本品はβ−結合における３糖残基の繰り返し構造からなるものと認められる。
（５） 構成成分：本品を加水分解して定量分析を行った結果、Ｄ−Ｇｌｃ、Ｄ−Ｇａｌ及び硫酸基が、１：２：２のモル比で構成されているものと認められる。
【００４４】
本発明多糖類の結合様式を知るために、箱守法とパーデイ法を組み合わせてメチル化分析を行い、部分的にメチル化した単糖はアルディトールアセテートとし、３％ＳＰ−２３４０または３％ＯＶ−２２５のガラスカラム（０．３×２００ｃｍ）を用いて、ガスクロマト分析（１９０℃〜２５０℃、４℃／ｍｉｎ）を行った。
【００４５】
各ピークの同定は、ＧＣ−ＭＳと標準サンプルとの保持時間の比較によって行った。その結果、本多糖類は２，３，４，６−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃ：３，６−Ｏ−Ｍｅ−Ｇａｌ：２−Ｏ−Ｍｅ−Ｇａｌのモル比が、１：１：１であるのに対して、これを脱硫酸すると２，３，４，６−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃ：３，４，６−Ｏ−Ｍｅ−Ｇａｌ：２，３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇａｌのモル比が１：１：１に変わっている事実が認められ、これらの知見から硫酸基は、−２Ｇａｌ１−、糖残基の４位及び−４，６Ｇａｌｌ−糖残基の３位にそれぞれ結合していることが判明した。
【００４６】
また本多糖類を過ヨウ素酸酸化−スミス分解させることにより、グリセロールが遊離しＧａｌ残基のみから構成される多糖が残り、これを脱硫酸したのちＮＭＲ分析すると、第２図に示したように、β−結合の２糖残基の繰り返し構造よりなることが分かった。
本多糖類は、これらの試験結果に基づいて解析した結果、式（Ｉ）［式中、Ｇａｌｐは、ガラクトピラノース残基を表し、Ｇｌｃｐはグルコピラノース残基を表す］で示される構成単位を特徴とする新規な硫酸多糖類と認められる。
【００４７】
【化４】
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【００４８】
実施例２
前培養までは実施例１と同様に処理し、前記実施例１で述べた本培養培地を用い、これに１．５％寒天を添加した寒天平板培地（１８×２６ｃｍ）に広げて前培養液を塗沫し、２５〜２８℃の温度で７２時間培養を行ったのち、寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、１％フェノール液に懸濁させ、実施例１と同じ方法で菌体を遠心分離により除いて同様の処理をした。
前記処理において得られた本発明の多糖類を試験試料として、ヒト培養がん細胞３９系を用いて、細胞増殖阻害効果から抗がん活性を以下のような方法を用いて試験した。
【００４９】
試験例
ヒト培養がん細胞３９系に対する前記試験で得た本発明多糖類の抗がん効果を試験した。
ヒト培養がん細胞には、乳がん５系（ＨＢＣ−４，ＢＳＹ−１，ＨＢＣ−５，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、中枢神経がん６系（Ｕ２５１，ＳＦ−２６８，ＳＦ−２９５，ＳＦ−５３９，ＳＮＢ−７５，ＳＮＢ−７８）、大腸がん５系（ＨＣＣ２９９８，ＫＭ−１２，ＨＴ−２９，ＨＣＴ−１５，ＨＣＴ−１１６）、肺がん７系（ＮＣＩ−Ｈ２３，ＮＣＩ−Ｈ２２６，ＮＣＩ−Ｈ５２２，ＮＣＩ−Ｈ４６０，Ａ５４９，ＤＭＳ２７３，ＤＭＳ１１４）、メラノーマ１系（ＬＯＸ−ＩＭＶＩ）、卵巣がん５系（ＯＶＣＡＲ−３，ＯＶＣＡＲ−４，ＯＶＣＡＲ−５，ＯＶＣＡＲ−８，ＳＫ−ＯＶ−３）、腎がん２系（ＲＸＦ−６３１Ｌ，ＡＣＨＮ）、胃がん６系（Ｓｔ−４，ＭＫＮ１，ＭＫＮ７，ＭＫＮ２８，ＭＫＮ４５，ＭＫＮ７４）及び前立腺がん２系（ＤＵ−１４５，ＰＣ−３）を用いた。
【００５０】
培地は牛胎児血清（ＦＢＳ）１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。本発明多糖類を同培地に溶解後、逐次１０倍希釈し検液とした。
培養がん細胞増殖阻害の検定は、１×１０６個の培養がん細胞を含む細胞培養用の培地１００μｌを９６穴マイクロプレートに分注し、３７℃で２４時間、５％炭酸ガス下で培養したのち、各ウエルに上記検液５μｌを同最終濃度が１００，１０，１，０．１，０．０１μｇ／ｍｌになるように加え、さらに４８時間培養後、５０μｌの５０％トリクロル酢酸で細胞を固定し、０．４％スルホローダミンＢ（１０％酢酸溶液）で染色後、１０ｍＭトリス液を用いて細胞から色素を抽出し、５５０ｎｍにおける吸光度を測定して、対照群と比較した。
【００５１】
これらの試験結果（５０％阻害濃度値を検液ウエルでの増殖と対照ウエルにおける増殖とを比較測定したもの）は、表３に示したとおりであり、本発明多糖類は、ヒト培養がん細胞に対して顕著な増殖阻害活性を示すものと認められる。
【００５２】
【表３】
0004390259.tif 000007
表中、ＣＣ５０とは、細胞毒性５０％の略で、５０％の培養細胞（がん細胞）が死滅する濃度を表わす。
【００５３】
【発明の効果】
生体内において免疫機能を強化する作用を有し、抗がん活性などの効果を示す微生物産生の新規な硫酸多糖類、その製造方法、それを有効成分とする物質、特に抗腫瘍剤、ならびその生理活性作用の利用方法を提供することができる。この発明の硫酸多糖類は、海洋細菌の培養物から分離精製した新規な化合物であり、ヒト培養がん細胞に対して強い増殖抑制効果を示すことから、医薬分野で癌の治療剤としての用途が期待される。それ以外にも、食品、飲料、特に機能性食品、化粧品、飼料の用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本明発の硫酸多糖類における１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲのＣ−Ｈ相関スペクトルを示したものである。
【図２】  本発明の硫酸多糖類における１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示したものである。
【図１】
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【図２】
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