(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体からなる群から選択される、遊離のε−アミノ基と遊離のα−アミノ基の両方を有するタンパク質のε−アミノ基を１ステップで選択的にアシル化する方法であって、ε−アミノ基と活性化脂肪酸又は活性化脂肪酸エステルとを、水性溶媒又は半−水性溶媒中、ｐＨ９.０〜１２.０において反応させるか、または極性非水性有機溶媒中、塩基的に、水中におけるｐＫａ値１０.７５と同等又はそれ以上に匹敵する塩基の存在下で反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
水性溶媒又は半−水性溶媒中でのアシル化におけるｐＨが９.５〜１０．５である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
半−水性溶媒がアセトニトリルと水からなる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
半−水性溶媒が５０％アセトニトリルである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
タンパク質がヒトインシュリン、インシュリン類似体又はLysB28ProB29−ヒトインシュリンである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｂ３０位のアミノ酸残基がThr、Alaであるか、欠失している、請求項５記載の方法。
【請求項７】
インシュリン類似体がdes（Ｂ30）−ヒトインシュリンであり、活性化脂肪酸が活性化ミリスチン酸である、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質のアシル化に関する。更に詳しくは、本発明は、プロインシュリン、インシュリン、またはインシュリン類似体のε−アミノ基を遊離のα−アミノ基の存在下、１ステップでアシル化する方法に関する。
アミノ基のアシル化は、タンパク質の化学的な修飾に使われる最も一般的な方法の内の１つである。アシル化の一般的な方法は、Methods of Enzymology 25, 494-499（1972）に記載されており、活性化エステル、酸ハライド，または酸無水物の使用を含む。活性化エステル、特に脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用は、脂肪酸を用いて遊離のアミノ酸をアシル化するのに、特に有利な方法である。Lapidotら（J.of Lipid.Res.8: 142-145（1967）。Lapidotらは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造、及びＮ−ラウロイル−グリシン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリン、及びＮ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸の製造におけるその使用について記載している。
LindsayらはBiochem.J.121: 737-745（1971）に、インシュリンのアミノ基の選択的アシル化の初期の研究を記載した。Lindsayらは、低い試薬濃度、中性付近のｐＨにおいて、インシュリンとＮ−スクシンイミジルアセテートとが反応性を示し、２つのモノ置換生成物、PheB1-アセチル-インシュリン及びGlyA1アセチルインシュリンを生成することを記載している。ｐＨ８.５で、PheB1-アセチル-インシュリンの生成量は低くなり、LysB29アセチルインシュリンも生成された。そこで、Lindsayら（前掲）は、反応性の順序は、ｐＨ６.９では、グリシン（Ａ１）≒フェニルアラニン（Ｂ１）>>リジン（Ｂ２９）であり、ｐＨ８.５では、グリシン（Ａ１）＞フェニルアラニン（Ｂ１）≒リジン（Ｂ２９）であると結論した。
Lindsayら（U.S.Patent 3,869,437）は、最高７つまでの炭素原子を含むアシル基と、所望により、Ａ1−及び／又はＢ29アミノ基を４つまでの炭素原子を含むアシル基で保護した、Ｂ1アミノ酸のアシル化を開示した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類は、特に有利なアシル化剤であると記載されている。Ｂ1アシル基がアシル化されたインシュリンを最大の収量（収率）で得るためには、アシル化剤の割合を比較的低く（アシル化剤を１〜２モル当量）する。さらに、モノ置換Ｂ1生成物の最大収量はｐＨ７又はその近辺で得られる。ｐＨ８.５〜９.０では、Ａ1及びＢ29位における余分な置換が有利となり、所望のＢ1アシル化生成物の収率はかなり低下した。
D.G.Smyth（U.S.特許3,868,356）及びSmythら（U.S.特許3,868,357）は、Ａ1、Ｂ1又はＢ29アミノ酸アミノ基の少なくとも１個が、保護アミノ基に変換されたＮ−アシル化、Ｏ−置換インシュリン誘導体を記載している。アシル化は比較的少ない過剰のアシル化剤、例えば、アミノ基当たり２〜３molのアシル化剤を用いて、中性または僅かにアルカリ性のｐＨ、例えば７−８で行われる。反応はＡ1−及びＢ1−アミノ基の反応による２−置換誘導体の形成を伴い、非常に高収率で進む。過剰のアシル化剤（例えば、１０モルまで）の存在下、反応はさらにＢ29−アミノ基にまで進み、３−置換誘導体を形成する。
ムラニシ及びキソ（特願平１−２５４,６９９）は、インシュリンを選択的にアシル化するために、脂肪酸インシュリン誘導体の調製のための５段階合成を開示した。ステップ１：活性化された脂肪酸エステルの調製；ステップ２：インシュリンのアミノ基のｐ−メトキシベンゾキシカルボニルアジド（pMZ）による保護；ステップ３：インシュリン−pMZの脂肪酸エステルとの反応；ステップ４：アシル化インシュリンの脱保護；ステップ５：アシル化インシュリンの単離、精製。最も注目すべきは、１つのアミノ基の選択的なアシル化は、他のアミノ基を保護するためにpMZ保護基を使用することによってのみ達成されるということである。この方法を用いてムラニシ及びキソは以下の化合物を製造する：LysB29−パルミトイルインシュリン（ε−アミノ基がアシル化）、PheB1−パルミトイルインシュリン（Ｂ鎖のＮ−末端α−アミノ基がアシル化）、及びPheB1，LysB29−ジパルミトイルインシュリン（ε−アミノ基とＮ−末端α−アミノ基の両方がアシル化）。
同様に、ハシモトら（Phrmaceutical Research 6: 171-176（1989））は、Ｎ−パルミトイルインシュリンの４段階合成を教示した。合成は、Ｎ−末端Ａ1−グリシン及びＢ29−リジンのε−アミノ基のpMZによる保護、脱保護を含む。参考文献に記載された条件の下では、２つの主要なアシル化生成物、Ｂ1−モノパルミトイルインシュリン及びＢ1,Ｂ29ジパルミトイルインシュリン、が製造される。
従って、本発明以前には、インシュリンのＢ29−Ｎε−アミノ基の選択的アシル化は、α−アミノ基の保護及び脱保護によって行われていた。
本発明は、プロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体のε−アミノ基をアシル化するための、選択的な１−ステップ合成法を提供するものである。本発明により、１ステップ工程で高収率に、ε−アミノ基を選択的にアシル化することができるということは、全く驚異的である。かくして本発明は、タンパク質中の他のアミノ基の保護及びその後の脱保護の必要性を解消したのである。本発明は、より効率的でより安価なε−アミノアシル化インシュリン誘導体の製造法を提供するものである。
本発明は、遊離のε−アミノ基及び遊離のα−アミノ基を有するプロインシュリン、インシュリンまたはインシュリン類似体の、脂肪酸による選択的なアシル化法であって、ε−アミノ基と可溶性の活性化脂肪酸エステルとを、極性溶媒中、塩基性条件下で反応させることを含む方法を提供する。
発明の開示において用いられるアミノ酸の略語は全て、37 C.F.R.§ 1.822（B）（2）に記載のごとく、米国特許商標局に許容されたものである。
上記のごとく、本発明はプロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体のε−アミノ基の、高度に選択的な１ステップアシル化を提供する。本発明は、α−アミノ基よりもε−アミノ基を優先的にアシル化する条件を指定する。一般に、モノ−アシル化α−アミノ基の生成は、収率５％以下である。
本明細書中、「インシュリン」という語句は、ヒトインシュリン、ブタインシュリン、又はウシインシュリンを指す。インシュリンは３つの遊離のアミノ基を有する：Ｂ1−フェニルアラニン、Ａ1−グリシン、及びＢ29−リジン。Ａ1及びＢ1位の遊離のアミノ基はα−アミノ基である。Ｂ２９位の遊離のアミノ基はε−アミノ基である。
本明細書中、「プロインシュリン」という語句は、式：
Ｂ−Ｃ−Ａ
（式中、ＡはインシュリンＡ鎖又はその機能的な誘導体；
Ｂはε−アミノ基を有するインシュリンＢ鎖又はその機能的な誘導体；そして
Ｃはプロインシュリンの連結ペプチドを表す）
で示される適切に交差結合したタンパク質を示す。
好ましいプロインシュリンは、ＡがヒトインシュリンのＡ鎖、ＢがヒトインシュリンのＢ鎖、そしてＣが天然の連結ペプチドであるものである。プロインシュリンが天然配列であるとき、プロインシュリンは３つの遊離のアミノ基：Ｂ1−フェニルアラニン（α−アミノ基）、Ｃ64−リジン（ε−アミノ基）及びＢ29−リジン（ε−アミノ基）を有する。
「インシュリン類似体」という語句は、式：
Ａ−Ｂ
（式中、ＡはインシュリンＡ鎖の機能的な誘導体；そして
Ｂはε−アミノ基を有するインシュリンＢ鎖の機能的な誘導体を表す）
で示される適切に交差結合したタンパク質を示す。
好ましいインシュリン類似体は、Ｂ28位のアミノ酸残基がAsp、Lys、Leu、Val又はAla；
Ｂ29位のアミノ酸残基がLys又はPro；
Ｂ10位のアミノ酸残基がHis又はAsp；
Ｂ1位のアミノ酸残基がPhe、Aspであるか、又は単独で欠失しているか、Ｂ2位の残基の欠失と同時に欠失している；
Ｂ30位のアミノ酸残基がThr、Alaであるか、欠失している；そして
Ｂ9位のアミノ酸残基がSer又はAsp；
ただし、Ｂ28又はＢ29のいずれかがLysであることを条件とする。
当業者に既知の標準的な生物化学的な語句で言えば、好ましいインシュリン類似体はLysB28ProB29-ヒトインシュリン（Ｂ28はLys、Ｂ29はPro）；AspB28-ヒトインシュリン（Ｂ28はAsp）；AspB1−ヒトインシュリン、ArgB31 B32−ヒトインシュリン、AspB10−ヒトインシュリン、ArgA0−ヒトインシュリン、AspB1,GluB13-ヒトインシュリン、AlaB26−ヒトインシュリン、des（B30）−ヒトインシュリン、及びGlyA21−ヒトインシュリンである。
「アシル化」という語句は、タンパク質の遊離アミノ基に共有結合的に結合した１又はそれ以上のアシル基を導入することである。
「選択的なアシル化」という語句は、α−アミノ基に対して、ε−アミノ基を優先的にアシル化することを意味する。一般に、選択的アシル化により、モノアシル化ε−アミノ基生成物の量の、モノ−アシル化α−アミノ基生成物の量に対する比率は、約５以上になる。好ましくは、その比率は約１０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。
「脂肪酸」という語句は、飽和又は不飽和のＣ6−Ｃ21脂肪酸を指す。「活性化脂肪酸エステル」という語句は、Methods of Enzymology 25, 494-499（1972）及びLapidotら（J.of Lipid.Res.8: 142-145（1967））に記載された一般的手法を用いて活性化された脂肪酸を意味する。好ましい脂肪酸は、飽和脂肪酸であり、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）、及びステアリン酸（Ｃ１８）である。最も好ましい脂肪酸はパルミチン酸である。活性化脂肪酸エステルには、ヒドロキシベンゾトリアジド（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びその誘導体のような試薬の誘導体が含まれる。好ましい活性化脂肪酸エステルは、Ｎ−スクシンイミジルパルミテートである。
「可溶性」という語句は、液相に、インシュリン、インシュリン類似体又はプロインシュリンのアシル化に十分な量のエステルが存在することを意味する。液相にインシュリン１モル当たり、約１から４モル当量の活性化エステルが存在することが好ましい。
本明細書中、「塩基性条件下」という語句は、反応の塩基性度を指す。反応は、全ての遊離アミノ基が実質上、脱プロトン化して行われる必要がある。水性溶媒又は半（セミ）−水性溶媒混合物中、塩基性条件とは、ｐＨ９.０以上で反応させることを意味する。非水性有機溶媒中では、塩基的に、水中におけるｐＫａ値１０.７５と同等又はそれ以上に匹敵する塩基の存在下で反応を行う。
「交差結合」という語句は、システイン残基間のジスルフィド結合の形成を意味する。適切に交差結合したプロインシュリン、インシュリン又はインシュリン類似体は３つのジスルフィド架橋結合を有する。第１のジスルフィド架橋はＡ鎖の６位と１１位のシステイン残基間に形成される。第２のジスルフィド架橋はＡ鎖の７位システイン残基とＢ鎖の７位システイン残基の間を結合している。第３のジスルフィド架橋はＡ鎖の２０位システイン残基とＢ鎖の１９位システイン残基の間を結合している。
本発明以前には、当業者は複数ステップ合成において、保護基を用い、ε−アミノ基を選択的にアシル化していた。ムラニシ及びキソ（特願平１−２５４,６９９）は、アシル化インシュリンの合成のための５−ステップ合成を開示している。同様に、ハシモトら（Phrmaceutical Research 6: 171-176（1989））は、Ｎ−パルミトイルインシュリンの４段階合成を教示している。いずれの参考文献も、インシュリンのアシル化には、ｐＭＺ保護基の使用を教示している。
本発明では、１ステップ合成により、高収率でＮε−アシル化されたプロインシュリン、インシュリン又はインシュリン類似体を製造する。反応により、アミノ保護基を用いることなくＮε−アシル化タンパク質を製造することができる。アシル化は、極性溶媒中で、塩基性条件下、活性化脂肪酸エステルとタンパク質のε−アミノ基とを反応させることにより、行われる。弱い塩基性条件下では、全ての遊離のアミノ基が脱プロトン化される訳でなく、Ｎ−末端アミノ基が有意にアシル化される。水性溶媒又は半−水性溶媒混合物中では、塩基性条件とは、反応をｐＨ９.０以上で行うことを意味する。タンパク質の分解はｐＨ１２.０以上の範囲で起こるので、反応混合物のｐＨは好ましくはｐＨ９.５から１１.５、最も好ましくは、１０.５である。有機及び水性溶媒を混合した反応混合物のｐＨ測定値は混合する前の水相のｐＨ値である。
表１のデータは、反応の選択性に対するアルカリ性度の影響を示す。表１のデータは、２モル当量のＮ−スクシンイミジルパルミテートを５０％ＣＨ3ＣＮ／水中でヒトインシュリンをアシル化して得られた。
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表１は、ε−アミノ基のアシル化が反応の塩基性度に依存することを示している。ｐＨ９.０以上では、反応は、Ｂ２９−リジンのε−アミノ基を選択的にアシル化する。
非−水性溶媒中では、ε−アミノ基（群）を十分に脱プロトン化するために、塩基的に、水中におけるｐＫａ値１０.７５と同等又はそれ以上に匹敵する塩基の存在下で反応を行う。即ち、塩基は少なくとも、トリエチルアミンと同様に強塩基でなければならない。好ましい塩基はテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、ジイソプロピルエチルアミン、又はテトラブチルアンモニウムヒドロキシドである。
極性溶媒の選択は、プロインシュリン、インシュリン又はインシュリン類似体及び脂肪酸エステルの溶解性に大いに依存する。最も重要なのは、溶媒が全て有機溶媒である。一般に許容される有機溶媒には、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等がある。水性溶媒及び水性及び有機溶媒の混合物でも操作できる。極性溶媒の選択は試薬の溶解性によってのみ制限される。好ましい溶媒及び溶媒系は、ＤＭＳＯ；ＤＭＦ；アセトニトリル及び水；アセトン及び水；エタノール及び水；イソプロピルアルコール及び水；イソプロピルアルコール、エタノール及び水；及びエタノール、プロパノール及び水である。好ましくは、溶媒はアセトニトリル及び水、最も好ましくは、５０％アセトニトリルである。当業者は他の極性溶媒も使用可能であることを認識するであろう。
反応物の比率は、重要でない。一般に活性化脂肪酸エステルが過剰モル存在することが好ましい。好ましくは、１〜４モル当量、最も好ましくは１〜２モル当量のエステルを用いて反応を行う。しかしながら、当業者は、活性化エステル濃度が極めて高いと、有意量のビス又はトリ−アシル化生成物が生成されることを認めるであろう。
反応温度は、重要でない。反応は０〜４０℃の間で行い、一般に１５分から２４時間で完了する。
アシル化後、反応を止め、生成物を逆相又は疎水性クロマトグラフィー等の標準的な手法で精製する。その後、凍結乾燥又は結晶化等の標準的な手法で生成物を回収する。
プロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体は、古典的な方法（溶液法）、固相法、半−合成法、及びより最近では、組換えＤＮＡ法を含む、既知の様々なペプチド合成法の内、任意の方法で調製しうる。例えば、Chanceら（U.S.特許出願07/388,201，EPO公開383 472）、Brangeら（EPO 214 826）及びBelagajeら（U.S.特許5,304,473）には、様々なプロインシュリン及びインシュリン類似体の製造が開示されており、それらは本明細書に引用して組み込まれる。本発明のインシュリン類似体のＡ鎖及びＢ鎖も、組換えＤＮＡ法を用い、プロインシュリン様前駆体分子を経て調製される。Frankら、Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc.Seventh Am.Pept.Symp., D.Rich及びE.Gross編（1981）（引用して本明細書に組み込まれる）参照。
以下の実施例は、本発明の更なる例示を与えるにすぎない。本発明の範囲は以下の実施例のみからなるものではない。
実施例１
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるＤＭＳＯ中でのインシュリンのアシル化
生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（７１.９mg）をＤＭＳＯ ６.５８mlに溶解した。肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、室温で溶液を撹拌した。固体の活性化したエステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２０mgをＤＭＳＯ２mlに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で溶液になるまで、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）溶液を調製した。その時点で、ＢＨＩ溶液５mlに、１,１,３,３−テトラメチルグアニジン（２６.８μl）を加え、ＤＭＳＯ（９４.４ml）と先に調製した活性化エステル溶液（４００μl）を加えた。室温（２０〜２５℃）で約６０分間、反応を進行させた。試料を１５分後に除去し、１Ｎ酢酸で２０倍希釈し、ＨＰＬＣで分析した。反応を止めた試料中のＢ29−Ｎε−パルミトイルヒトインシュリンの量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、６７.１％であった。
実施例２
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル及び水中でのインシュリンのアシル化
生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（１９９.５mg）をｐＨ２.５で、５０mＭ硼酸溶液２０Ｌに溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５に再調節し肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。出発物質の試料を除去し、２７６nmでの吸収を測定した結果、１０.５５であった。固体の活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２４gを約５０℃に予熱しておいたアセトニトリル２.４Ｌに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で溶液になるまで、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）溶液を調製した。その時点で、ＢＨＩ溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.２２に調節した。ｐＨ調節ＢＨＩ溶液にアセトニトリル（１８Ｌ）を加えた。室温（２０〜２５℃）で１１０分間、反応を進行させた後、水（１２３Ｌ）を加えて反応を止め、得られた希釈液のｐＨを１０％ＨＣｌ及び１０％ＮａＯＨを用いて２.０１に調節した。反応を止めた反応液中のＢ29−Ｎε−パルミトイルヒトインシュリンの量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、７３％であった。
実施例３
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル及び水中でのLysB28ProB29−ヒトインシュリンのアシル化
LysB28ProB29−ヒトインシュリン結晶（２.２２g）をｐＨ２.５で、５０mＭ硼酸溶液１００mlに溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５に再調節し肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。固体の活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２７０mgを約５０℃に予熱しておいたアセトニトリル２７mlに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で溶液になるまで、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）溶液を調製した。溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.２２に調節し、溶液を４℃で１５分間撹拌した。ｐＨ調節溶液にアセトニトリル（７３ml）を加え、先に調製した活性化エステル溶液を加えた。４℃で８５分間反応を進行させ、１Ｎ酢酸（６００ml）を加えて反応を止めた（最終ｐＨ２.８５）。反応を止めた反応液中のＢ２８−Ｎε−パルミトイルLysB28ProB29−ヒトインシュリンの量をLysB28ProB29−ヒトインシュリンの初期値で割ることにより計算した反応収率は、７２.５％であった。
実施例４
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル及び水中でのＢＨＩのアシル化
生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（３g）をｐＨ２.５で、５０mＭ硼酸溶液３００mlに溶解した。必要に応じて、溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５に再調節し、肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。固体の活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）４００mgをアセトニトリル４０mlに加え、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）溶液を調製した。その時点で、ＢＨＩ結晶溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.２に調節した。次いで、ＢＨＩ溶液にアセトニトリル（２４０ml）を加え、予め調製した活性化エステル溶液を加えた。室温（２０〜２５℃）で約９０分間、反応を進行させた後、水（１８００ml）を加えて反応を止め、得られた希釈液のｐＨを１０％ＨＣｌを用いて約２.５に調節した。反応を止めた反応液中のＢ29−Ｎε−パルミトイルヒトインシュリンの量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、７５.７％であった。
実施例５
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル及び水中でのプロインシュリンのアシル化
ヒトプロインシュリン（ＨＰＩ）水溶液（２８.２mg／ml）を、最終的に１６.２mg／mlＨＰＩで、１００mlとなるよう、５０mＭ硼酸溶液で希釈した。同時に、固体のＮ−スクシンイミジルパルミテート１５０mgを、急速に撹拌しながらアセトニトリル（ＡＣＮ）１５mlに加えることにより、活性化エステル溶液を調製した。次いで、ＨＰＩ溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨを加えて１０.２に調節した後、ＡＣＮ８８mlを加えた。活性化エステル溶液１２ml（ＨＰＩの２倍モル過剰）を加えて反応を開始した。最終的な反応液の容量は２００mlで、５０％水性ＡＣＮ中、ＨＰＩを８mg／ml含有していた。室温（２０〜２５℃）で約６０分間、反応を進行させた後、等量（２００ml）の５０mＭグリシン、ｐＨ１０.０を加えて反応を止めた。
α−アミノアシル化種に対するε−アミノアシル化種の正確な割合は計算されていないが、任意の特定の時点での、クロマトグラムにおける、全てのε−アミノアシル化種の総和は全面積の８７−９０％であるが、全関連物質（恐らく、α−アミノアシル化種をも含む）の総和は全面積の７％未満（＜７％）であった。
実施例６
ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるArgB31ArgB32−ヒトインシュリンのアシル化
ArgB31ArgB32−ヒトインシュリン（１.３mg）をｐＨ１０.４で、２００mＭ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）緩衝液２００μlに溶解した。次いで、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０.３μＭ）を加え、溶解するまで撹拌した。反応混合物を室温（２０〜２５℃）で約４時間、撹拌した後、０.１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを約２.５に調節して反応を止めた。ＨＰＬＣ分析の前に混合物を０.４５ミクロンのフィルターに通してゼラチン様粒子を除去した。出発物質からの表題の化合物の分離は、Ｃ４逆相アナリティカルＨＰＬＣカラムを用いて達成された。反応を止めた反応液中のＢ２９−Ｎε−ヘキサノイル−ArgB31,ArgB32−ヒトインシュリンを、ArgB31ArgB32−ヒトインシュリンの初期値で割ることにより計算した反応収率は、６９.４％であった。
実施例７
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるＤＭＳＯ中でのLeuB26ヒトインシュリンのアシル化
LeuB26−ヒトインシュリン（１.０mg）を１mlの９５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％トリエチルアミン（ＴＥＡ）に溶解した。次いで、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮ−スクシンイミジルパルミテート（０.７μＭ）を加え、溶解するまで撹拌した。反応混合物を室温（２０〜２５℃）で約９０分間、撹拌した後、試料を０.１Ｎ  ＨＣｌを用いて０.２mg／mlまで希釈することで反応を止めた。ＨＰＬＣ分析の前に混合物を０.４５ミクロンのフィルターに通してゼラチン様粒子を除去した。出発物質からの表題の化合物の分離は、Ｃ４逆相アナリティカルＨＰＬＣカラムを用いて達成された。反応を止めた反応液中のＮε−パルミトイル−LeuB26−ヒトインシュリンを、LeuB26−ヒトインシュリンの初期値で割ることにより計算した反応収率は、３６.４％であった。
実施例８
Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でのヒトインシュリンのアシル化
生合成ヒトインシュリン結晶（１mg、０.１７mmol）を２０mlのＤＭＳＯに室温で完全に溶解することにより、インシュリン溶液を調節した。同時に、５０℃において、Ｎ−スクシンイミジルパルミテート（０.０８１７ｇ、０.２３mmol）を３mlのＤＭＳＯに溶解することにより、活性化エステルの溶液を調節した。激しく撹拌されたインシュリン溶液に、まず、１,１,３,３−テトラメチルグアニジン（０.４３２ml、３.４mmol）を加え、次いで、活性化エステルの全溶液を加えた。３０分後、予め０℃に冷却しておいた０.０５Ｍ  ＨＣｌ（１２０ml）を加えて反応を止めた。混合物のｐＨは約１.８であった。反応を止めた混合物の逆相ＨＰＬＣ分析により、Ｂ29−Ｎε−パルミトイルインシュリンは、溶出した全タンパク質の７２.２％であり、全モノ−アシル化インシュリンの９５％を表していた。
全反応混合物を、水中に０.１％トリフルオロ酢酸及び２０％アセトニトリルを含有する溶媒で予め平衡化しておいたVydac C4分離用逆相カラム（5x25cm）に負荷した。負荷後、カラムを、まず同じ溶媒５００mlで洗浄した後、０.１％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル及び水からなる溶媒系（９Ｌ中、アセトニトリル濃度勾配２０→８０％）を用いて流速４ml／分で溶離した。アセトニトリル濃度約５３％からなる溶媒系でＢ29−Ｎε−パルミトイルインシュリンは溶出した。凍結乾燥して溶媒を除去した後、Ｎε−パルミトイルインシュリンの収量は４１４mg（０.０６８４mmol）又は出発物質からの収率は４０.２％であった。
実施例９
１−オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるLysB28ProB29−ヒトインシュリンのアシル化
Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインシュリン（ＫＰＢ）結晶（２.０g）を５０mＭ硼酸緩衝液２００mlにｐＨ２.５で溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５に再調節し、肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。固体の活性化エステル（１−オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）１７５mgをアセトニトリル２５.６２mlに加え、肉眼観察で全活性化エステル粒子が溶液になるまで激しく撹拌して活性化エステル溶液を調製した。ＫＰＢ溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.４に調節し、溶液を室温で約５分間撹拌した。ｐＨを調節したＫＰＢ溶液にアセトニトリル（１７６ml）を加え、予め調製した活性化エステル溶液を加えた。室温で約９０分間、反応を進行させた後、１０％ＨＣｌ（２.７５v/v％）５.５mlと３倍容量（１２００ml）の冷ｄＨ2Ｏを加えて反応を止めた（最終ｐＨ２.７０）。反応を止めた反応液中のＬysＢ２９（Ｃ８）ＫＰＢの量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、７５.７％であった。疎水性クロマトグラフィー（ＳＰ２０ＳＳ）による精製のために溶液を８００mlづつに２分した。カラムクロマトグラフィーの後、限外ろ過及び凍結乾燥を行った。
表２のデータは、インシュリン、インシュリン類似体及びプロインシュリンの選択的アシル化を証明している。脂肪酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを用いて室温で実験を行った。以下の表において、ＴＭＧ及びＴＥＡは、それぞれ、テトラメチルグアニジン及びトリエチルアミンを表す。ＮＤはなんらのデータも得られなかったことを意味する。