(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２，４，６，８，１０，及び１２で示される塩基配列からなる、イコサペンタエン酸生合成酵素群をコードする遺伝子群を、広域宿主ベクターにクローニングして得られるプラスミド。
【請求項２】
配列番号３，５，７，９，１１，及び１３で示されるアミノ酸配列からなるイコサペンタエン酸生合成酵素群をコードする遺伝子群を、広域宿主ベクターにクローニングして得られるプラスミド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプラスミドを導入して得られるイコサペンタエン酸を産生するラン藻。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イコサペンタエン酸（以下EPAと称する）産生菌から得られたEPA生合成遺伝子群を含有するプラスミド及び当該プラスミドを導入して作製されるイコサペンタエン酸を産生する形質転換体ラン藻に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イコサペンタエン酸・ドコサヘキサエン酸に代表されるn-3系列高度不飽和脂肪酸は、細胞膜の構成脂肪酸であり循環系・脳神経系の正常な機能の発現に重要な役割を果たしていることが知られている。しかし、人間はこれらを生合成することができないため主に魚介類からの摂取に頼っている。また、慣習的に魚介類を摂取しない民族も多く存在している。そのためn-3系列高度不飽和脂肪酸は、生活習慣病の治療や予防のため医薬品・健康食品として広く販売されている。さらに、粉ミルク等の乳幼児向けの食品や養殖魚の稚魚の必須栄養として飼料に添加するかたちでも用いられている。
【０００３】
現在n-3系列高度不飽和脂肪酸の原料としては、主としてマグロ・イワシなどの魚類が用いられている。これらの魚類は自ら高度不飽和脂肪酸を生合成するのではなく餌として取り込んだものを蓄積している。n-3系列高度不飽和脂肪酸を生合成できる生物として知られているのは主に海洋細菌や海洋微細藻類等の海における食物連鎖の低次生産者となる海洋微生物であるが、海洋ラン藻でこれを産生するものは知られていない。
【０００４】
海洋ラン藻に遺伝子組換え技術を用いてn-3系列高度不飽和脂肪酸の生合成遺伝群を導入した例として、海洋細菌由来のEPA生合成遺伝子群をシネココッカス(Synechoccus)sp.NKBG042902に導入した竹山らの報告（H. Takeyama et al., Microbiolgy,143,2725-2731(1997)）が有る。しかし、導入したプラスミドが約50kbと巨大なものであったため複製の際問題が生じて安定なEPA生産はみられなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
海洋ラン藻は地球レベルでの酸素の生産者として重要であり、その物質生産能力を利用することにより二酸化炭素の削減にも寄与できる。また、ラン藻は光合成による独立栄養生物であるため、培養には安価な無機培地を用いることができ照明以外には特殊な設備を要さない点で産業レベルに載せやすいと考えられる。さらに、ラン藻は原核生物であるため菌体全体を物質生産の原料として用いることにより廃棄物の量を低く押さえることができるのも有利な点である。このような性質を持ったラン藻に有用物質であるn-3系列高度不飽和脂肪酸を生産させることは非常に意義のあることと考えられる。本発明は、実用化のためにn-3系列高度不飽和脂肪酸、とくにＥＰＡの産生能の向上と導入するプラスミドの安定化を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を広範な細菌で発現するプラスミド及び該プラスミドを導入し高度不飽和脂肪酸を安定に効率よく産生する形質転換体ラン藻を提供する。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号２，４，６，８，１０，及び１２で示される塩基配列からなる、イコサペンタエン酸生合成酵素群をコードする遺伝子群を、広域宿主ベクターにクローニングして得られるプラスミド。
（２）配列番号３，５，７，９，１１，及び１３で示されるアミノ酸配列からなるイコサペンタエン酸生合成酵素群をコードする遺伝子群を、広域宿主ベクターにクローニングして得られるプラスミド。
（３）上記（１）又は（２）に記載のプラスミドを導入して得られるイコサペンタエン酸を産生するラン藻。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられるＥＰＡ生合成酵素群をコードする遺伝子群は、例えば実施例１あるいは特開平８−２４２８６７号に記載の方法により単離することができる。なお、本発明において、ＥＰＡ生合成酵素群をコードする遺伝子群は、配列番号２，４，６，８，１０，及び１２で示される塩基配列によってコードされるものとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものを包含する。
【０００８】
ＥＰＡ生合成酵素群をコードする遺伝子群を他の生物に導入するためには、これらの遺伝子を運んで発現させる部品を備えたベクターが必要である。原核生物に上述の遺伝子群を導入する際は、多くの場合にはそのままのプロモーター/ターミネーターが使用できるので、それぞれの微生物で複製のできる複製開始点を有したベクターを用いることができる。一般的な広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215（Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987)）及びpBBR1MCSシリーズ（Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995)）等を例示することができる。これらのベクターへの上述の遺伝子群のクローニングは、すべての遺伝子群を含むＤＮＡ断片あるいはすべての遺伝子群を含むことになる複数のＤＮＡ断片を用いて、慣用の方法で行うことができる。
【０００９】
一般的にベクターにクローニングした遺伝子をそれぞれの原核生物に導入する方法としては、形質転換法・接合法・エレクトロポーレーション法が挙げられる。細胞内への遺伝子の導入を確認する方法としては、直接的には、その発現の結果である生産物、高度不飽和脂肪酸を検出する。上述のように作製されたプラスミドを導入した生物から有機溶媒抽出を行うことによりEPA等の高度不飽和脂肪酸を得ることができる。間接的には、導入した遺伝子の一部をプローブやプライマーとしたハイブリダイゼーションやPCRにより遺伝子が導入されたことを確認することが可能である。
【００１０】
本発明の上記プラスミドをラン藻に導入する際にも、上記の方法を適用して行うことができる。用いられるラン藻としては、特に制限はないが、例えばシネココッカスsp.NKBG15041c、シネココッカスsp.NKBG042902等を挙げることができる。上記プラスミドを導入したイコサペンタエン酸を産生するラン藻として、平成11年11月9日に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17634として寄託された、15041c/pJRDEPA-Sが挙げられる。
【００１１】
【発明の効果】
本発明では、高度不飽和脂肪酸の生合成に必須でないORF及び遺伝子をコードしていていない部分を可能な限り取り除いて短縮化することにより、他の生物に導入した場合に細胞分裂に伴う脱落を防ぎ遺伝子群の安定で効率良い発現が達成される。
【００１２】
【実施例】
次に、実施例及び参考例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１３】
実施例１  小型化プラスミドの作製
特開平8-242867に記載のプラスミドpEPAに挿入されたEPA生合成遺伝子群のうち、EPA生合成に必須であるORF3、5、6、7、8および9のサブクローニングを行った。ORF5、6、7、8および9については、クローニングベクターpBSIIKS(+)（Stratagene社製）のXbaI-SpeI部位にXbaI-SpeI断片（23,045-31,443）、XbaI部位にXbaI-XbaI断片（12,314-23,045）SpeI部位にSpeI-NheI断片（31,443-32,514）を順次サブクローニングを行いΔX4XbNh/pBS を作製した。ΔX4XbNh/pBS をNotIで処理したものをT4DNAポリメラーゼにより平滑末端を作り、それをXhoIで処理して DNA断片Aを得た。また、ORF3については、R/pSTV28（HpaI断片7,951-9,129を宝酒造製ベクターpSTV28のSmaI部位に挿入したもの）をEcoRI及びPstIで処理して切り出した断片をpBSIIKS(+)のEcoRI-PstI部位に挿入してR/pBSを作製した。R/pBSをPstIで処理後T4DNAポリメラーゼにより平滑末端を作りXhoIリンカーを導入してからXhoIでORF3を含む断片を切り出しDNA断片Bを得た。広域宿主ベクターであるpJRD215（カナマイシン及びストレプトマイシン耐性)のXhoI-StuI部位に断片AをパッカジンラムダDNAパケージングシステム（Promega社製）により導入した後に、XhoI部位に断片BをDNA ライゲーションキット （宝酒造製）を用いて導入しプラスミドを完成させた。これをpJRDEPA-Sと命名した（図1）。
【００１４】
参考例１ ｐJRDEPA-Sを導入した大腸菌でのEPA生産
pJRDEPA-Sを用いて大腸菌K12/JM109を常法により形質転換した。50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地（トリプトン1％、酵母エキス0.5％、NaCl 1％、寒天1.5％）を用いて選別を行いJM109/pJRDEPA-Sのコロニーを得た。このコロニーを50μg/mlのカナマイシンを含む2mlLB液体培地に接種し25℃で24時間培養した。これを遠心分離して菌体を集め培地を除いた後、10mMトリス塩酸緩衝液 pH7.5を加えて懸濁し再度遠心分離を行って洗浄した。洗浄菌体に少量の10mMトリス塩酸緩衝液 pH7.5を加えて再懸濁し凍結乾燥をした。乾燥菌体に5％塩化水素を含むメタノルーを1ml加え80℃1時間処理して脂肪酸のメチルエステル化を行った。冷却後同量のn-ヘキサンで3回抽出しn-ヘキサン層を減圧乾固して20μlのメタノールに溶解し試料とした。この試料の一部をガスクロマトグラフィー（以下GLCと略す）により分析した。その結果、標品のEPAメチルエステルと同様の保持時間にピークが検出された。そのピークの面積比から算出される総脂肪酸に対する割合は5.7％であった。また、このピークはガスクロマトグラフィー質量スペクトル（以下GC-MSと略す）分析により親イオン(M) m/z316、ベースピークm/z79でありEPAメチルエステル標品と一致した。
【００１５】
実施例２−１  ラン藻のトランスコンジュゲーション
ラン藻シネココッカス(Synechococcus) sp. NKBG15041c（K.Sode et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37,369-373 (1992)）を3％NaClを含むBG11（表1）液体培地（BG11M）1,000-1,500 Luxの光照射下23℃で  4-5日間静置培養を行い（A550＜1）、室温で3,000rpm20分間遠心して集め、BG11M液体培地に懸濁して3回洗った。このラン藻の濃度を分光光度計でA550＝1に合わせた。上記pJRDEPA-Sでトランスコンジュゲーション用大腸菌S-17（Simon et al., Bio/Technolgy,118,640-659(1983) ）を形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に37℃一晩培養して生育したコロニーをBG11Mに懸濁したものを分光光度計で濃度を測定しA650＝10に合わせた。以上のように調製したラン藻と大腸菌を等量ずつラン藻A550＝1に対し大腸菌A650＝10になるように混合した。この菌液を遠心後元の10分の1になるように懸濁したものをBG11に15mMNaClを加えた1.2％寒天培地に50μlずつスポットし、照明下24〜48時間23℃で培養した。寒天培地上にできた緑色のコロニーをメスで切り出して1mlBG11Mに懸濁し75μg/mlカナマイシンを含むBG11M液体培地に50分の1の濃度になるように加え照明下23℃で培養した。
【００１６】
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【００１７】
実施例２−２  ラン藻のシングルコロニーアイソレーション
pJRDEPA-Sを有するラン藻をA730=3-4に生育させ、10-4-10-5希釈したものを75μg/mlカナマイシンを含むBG11Mの寒天培地に塗布し23℃照明下約1ヶ月培養してシングルコロニーを形成させた。このコロニーを75μg/mlカナマイシンを含むBG11M液体培地に移して培養した。得られた組換え体ラン藻を15041c/pJRDEPA-Sと命名した（受託番号FERM P-17634）。
【００１８】
実施例２−３  ラン藻の菌体脂質の調製及び分析
pJRDEPA-S を有するラン藻及び非組換え体のラン藻を培養しその菌体を実施例1-2と同様に遠心分離で集め洗浄後凍結乾燥を行った。乾燥菌体に実施例1-2と同様の脂肪酸のメチルエステル化を行いn-ヘキサン抽出し減圧乾固後メタノールに溶解して粗試料とした。この粗試料をシリカゲル薄層プレートにスポットしn-ヘキサン：エチルエーテル（4：1、v/v）で展開してメチルエステルを分離した。プリムリン発色により検出したメチルエステル画分を掻き取り、メタノール：10％食塩（9：1、v/v）1ml及び水1mlを加えたものから上述と同様にn-ヘキサン抽出を行い試料を調製した。この試料の一部をGLCにかけて分析した。標品のEPAメチルエステルと保持時間が一致するピーク及びその約1分前にもほぼ同じ高さのピークが検出された。2本ののピークはその面積比から求めた総脂肪酸に対する割合はそれぞれ3.8％及び2.6％であった。主な脂肪酸の総脂質に占める割合を表2に示す。残りの試料を硝酸銀シリカゲル薄層プレートにスポットしn-ヘキサン：エチルエーテル（85：15、v/v）で3回展開して2',7'-ジクロロフルオレセイン発色により検出した多価不飽和脂肪酸画分を掻き取り上述と同様な方法で GC-MS分析用試料を調製した。GC-MS分析により、EPAメチルエステルと保持時間が一致するピークの分子量は316でEPAと一致した。また、その前のピークは分子量318で20：4であるが、アラキドン酸メチルエステル（20：4（n-6））のガスクロマトグラフィーの保持時間とは異なっていた。このピークは、標品の20：4（n-3）メチルエステルの保持時間及びGC-MSのの解裂パターンと一致しており、20：4（n-3）メチルエステルと同定された。
【００１９】
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【００２０】
実施例3.  プラスミドの比較
pJRDEPA-Sと同時にpJRDEPA（H. Takeyama et al., Microbiolgy,143,2725-2731(1997)）を実施例2-1と同様にシネココッカスsp.NKBG15041cに導入して75μg/mlのカナマイシンを加えたBG11M液体培地1ｌで培養を行った。実施例2-3と同様に脂肪酸メチルエステルを調製しGLCで分析を行った。その結果を表3に示す。
【００２１】
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このようにpJRDEPA-Sを導入したNKBG15041cでは、pJRDEPAを導入したものに比較して飛躍的にEPA生産能が増加した。
【００２２】
参考例2  ラン藻の培養条件
pJRDEPA-S を有するラン藻を通常（23℃、1,000Lux、静置）、低温（18℃、800Lux、振とう）及び弱照明（23℃、40Lux、静置）の3条件で培養し、それぞれの脂肪酸組成を実施例2-3を同様の方法でGLCにより分析した結果を表3に示す。EPA及び20：4（n-3）の総脂肪酸に対する割合は、通常に比べ生育を抑制した場合（低温及び弱照明）の方が高く、それぞれ3.8％・2.6％に対し、6.0％・5.7％及び5.2％・6.6％であった。
【００２３】
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【００２４】
参考例３
pJRDEPAに関しては、ラン藻を継代すると、ラン藻の分裂にプラスミドの複製が間に合わなくなりプラスミドが失われていったとの報告がある（H. Takeyama et al., Microbiolgy,143,2725-2731(1997)）。しかし、 pJRDEPA-Sを有するラン藻ではそのような現象は観察されず、カナマイシンの存在下で継代を繰り返すことができた。
【００２５】
【配列表】
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【００２６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のプラスミドの一態様であるｐＪＲＤＥＰＡ−Ｓの構造を示す。
【図１】
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