(57)【要約】  本発明は、表面（２）を官能化させる官能基（１）の定量方法に関する。第一に、当該方法は、官能基（１）により官能化されたマイクロメートルの寸法を有する微粒子上に構成される表面（２）を付与する工程を含む。当該方法は、表面（２）を溶液と接触させる工程を含み、溶液は、第一濃度で第一試薬（４）および第二濃度で第二試薬（５）を含んでおり、第一濃度と第二濃度との比は予め決定される。第一試薬（４）および第二試薬（５）は、それぞれの親和性で官能基（２）に選択的に連結するように設計されており、親和性の比は予め決定される。第一試薬（４）は蛍光を発するために標識され、第二試薬（５）は標識されていない。次いで、表面上の第一試薬（４）の蛍光を測定し、第一試薬の測定された蛍光と予め決定された比とを用いることによって、それから官能基（１）を定量する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面（２）を官能化させる官能基（１）を定量するための方法であって、
ｃ．少なくとも、マイクロメートルの寸法を有しかつ少なくとも官能基（１）により官能化された表面（２）を付与する工程、
ｄ．表面（２）を溶液と接触させる工程であって、
ｉｖ．前記溶液が、少なくとも、第一濃度の第一試薬（４）および第二濃度の第二試薬（５）を含み、第一濃度と第二濃度との比は予め決定され、
ｖ．前記第一試薬（４）および第二試薬（５）が、それぞれの親和性で少なくとも官能基（１）の１つに選択的に連結するように設計されており、前記親和性の比は予め決定され、
ｖｉ．前記第一試薬（４）が蛍光を発するために標識され、前記第二試薬（５）が標識されていない、
工程、
ｅ．前記表面（２）に連結された前記第一試薬（４）の蛍光を測定し、前記第一試薬の測定された蛍光と前記予め決定された比とを用いることによって、それから前記官能基（１）を定量する工程、
を連続して含む方法。
【請求項２】
工程ａ）の前に、前記表面（２）の前記官能基（１）を活性化する活性化工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化が、少なくとも化学反応により進行する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一濃度と前記第二濃度との比が、約１：９９〜約５０：５０、好ましくは約２：９８〜約２５：７５、より好ましくは約３：９７〜約１０：９０、およびより好ましくは約４：９６〜約７：９３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一試薬（４）および／または前記第二試薬（５）が、タンパク質、抗体、ペプチド、若しくは核酸、またはこれらの混合物から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記官能基（１）が、カルボン酸またはこれらの誘導体、ケトン、アルデヒドから選択されるカルボニル基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一試薬（４）および／または前記第二試薬（５）が、ペプチド結合により前記表面（２）の前記官能基（１）に連結される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第一試薬（４）および／または前記第二試薬（５）が、前記表面（２）の前記官能基（１）との前記連結に関与するアミン基を提示する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記表面（２）が、ガラス、シリコンまたはポリマー製である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一試薬（４）が、前記第二試薬（５）を標識することによって得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二試薬（５）がストレプトアビジンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一試薬（４）が、ＦＩＴＣ、ローダミン、シアニン３、シアニン５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６４７Ｎまたはこれらの混合物で標識される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレプトアビジンが、ＡＴＴＯ６４７Ｎで標識される、請求項１２に併用される請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも表面を官能化させる官能基を定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
官能化表面は、バイオセンシング技術にとって重要なツールである。故に、それら技術の信頼性を保証するために表面の官能化を評価する方法が必要とされ、効率や正確性が証明された技術を提供するためには品質管理方法が有用である。
【０００３】
生物学的材料を表面に結合させるのに効率のよい実体として様々な官能基が記載されている。このような材料は、例えば、アミン（−ＮＨ２）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）もしくはその誘導体、またはヒドロキシル基（−ＯＨ）を提示する表面にグラフトされ得る。それらの化学的官能基により、文献から確立された連結プロトコールを用いて広範な分子を表面上に共有結合させることができる。
【０００４】
製造の観点から、官能化表面上のある官能基（表面−ＣＯＯＨ基など）の検出および特徴付けはあまり確立されておらず、多くの通常の特徴付け技術は、正確かつ常套な利用に関していくつかの欠点を呈する。実際、第一に、赤外線分光法やＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）などのそれらの方法は、稼働するのが高価である。第二に、それらは、特定の官能基ではなく荷電表面を標的とするように設計されているため、特異性が低い場合が多い。よって、カルボン酸がグラフトされた表面に関し、それらの方法は、カルボン酸を他の酸素含有官能基と区別できない場合が多い。更に、小さな寸法の表面に関して言えば、上述の方法は、通常、情報を付与するのには適さない。
【０００５】
他の新たな技術がある。かかる１つの方法は、比色分析的に活性な分子または蛍光分子の荷電表面上への吸着／脱着に依存する。例えば、１つの方法は、ＷＡＮＧ，Ｙの論文（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒａｆｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＵ−８  ｆｏｒ  ｂｉｏ−ＭＥＭＳ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，ｖｏｌ．１７，ｐａｇｅｓ  １３７１，  １３８０）に言及されているように、負荷電を有する表面上への、正荷電を有するトルイジンブルーＯの吸着について記載するものである。一般的に、このような方法は、表面への吸着後にバルク溶液中に残存する分子を定量するか、または脱着後に表面から溶出された分子を定量することからなる。このような方法は、任意の荷電表面（低特異性）に適用可能であるが、定量工程は、比色分析的に活性な分子または蛍光分子の非特異的結合から特異的結合を正確に区別することができない。マイクロメートルの範囲またはそれより小さい表面については、空乏率が小さすぎて正確に評価できない。
【０００６】
表面種蛍光標識（ＦＬＯＳＳ）と呼ばれる方法は、カルボキシル誘導体表面官能基を特徴付けるための魅力的な代替法である。この点に関し、ＸＩＮＧ，Ｙ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ．  ２００７，  ｖｏｌ．  ２３，  ｐａｇｅｓ  ６８４，  ６８８は、非特異的結合（弱いイオン結合）を効率よく除去するための反応後クリーニング手順により、更にカルボン酸基を含む表面上のアルデヒド基を選択的に標識し、それにより、アミン修飾染料によるアルデヒド基の標識が−ＣＯＯＨ基の存在に影響を受けなくなる手順を開示している。−ＣＯＯＨ基の選択的な特徴付けに関して言えば、ＰＥＬＬＥＮＢＡＲＧ，Ｔ．（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｏｘｙｇｅｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  Ｃａｒｂｏｎ  ２０１０，  ｖｏｌ．４８，ｐａｇｅｓ  ４５２６，４２６７）は、共有結合の形成により表面を標識するための、−ＣＯＯＨ基に特異的に反応する蛍光分子について記載している。
【０００７】
次いで、標識された表面は、蛍光分光法によって特徴付けられる。ＦＬＯＳＳ法によって表面官能基密度を表面から直接測定することはできないが、比較的大きな表面（ミリメートルの範囲）の場合に限っては有用である。マイクロメートルの範囲またはそれより小さい表面について、我々は、当該方法が定量的なものではなく、所与の表面について、測定された蛍光が２つの官能基密度に相当し得ることを観察した。結果として、ＦＬＯＳＳ方法は、マイクロメートルの範囲またはそれより小さい表面には適用できない。マイクロメートルの範囲またはそれより小さい表面の特徴付けに関して言えば、それらの問題を解消する解決策は今のところ提案されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２００７，ｖｏｌ．１７，  ｐａｇｅｓ  １３７１，１３８０
【非特許文献２】Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００７，ｖｏｌ．２３，ｐａｇｅｓ  ６８４，  ６８８
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｎ  ２０１０，ｖｏｌ．４８，ｐａｇｅｓ  ４５２６，  ４２６７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述の欠点の全てまたは一部を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも表面を官能化させる官能基を定量するための方法を提供することによってこれらの目的を満たすものであり、当該方法は、
ａ．少なくとも、マイクロメートルの寸法を有しかつ少なくとも官能基により官能化された微粒子の表面を付与する工程、
ｂ．当該表面を溶液と接触させる工程であって、
ｉ．前記溶液が、少なくとも、第一濃度の第一試薬および第二濃度の第二試薬を含んでおり、第一濃度と第二濃度との比は予め決定され、
ｉｉ．前記第一試薬および第二試薬が、それぞれの親和性で少なくとも官能基の１つに選択的に連結するように設計されており、前記親和性の比は予め決定され、
ｉｉｉ．第一試薬が蛍光を発するために標識され、第二試薬が標識されていない、
工程、
当該表面に連結された前記第一試薬の蛍光を測定し、前記第一試薬の測定された蛍光と前記予め決定された比とを用いることによって、それから前記官能基を定量する工程、
を連続して含む方法である。
【００１１】
よって、本発明は、通常の方法で認められる自己クエンチング問題を回避することによって、第一濃度で標識された第一試薬と第二濃度で標識されていない第二試薬とを含む溶液と官能化表面を接触させることによって課題を解決する。実際、官能化表面を溶液と接触させる場合、第一試薬および第二試薬は表面にグラフトされた官能基と反応し、第一試薬および第二試薬それぞれの、官能基に対する親和性によって、連結反応が引き起こされる。その上、第一試薬は更に、蛍光を発するように設計された蛍光分子を含む。よって、表面の前記官能基は、第一試薬または第二試薬のいずれかと連結され、それにより、各官能基が第一試薬または第二の未標識試薬と連結される。よって、本発明の方法は、標的表面上に物理的に第一試薬を配置し、それにより、自己クエンチング現象を回避する。
【００１２】
本発明による方法はまた、表面上の官能基の定量を許容する。実際、第一に、第一試薬の濃度および第二試薬の濃度は予め決定されたパラメータである。第二に、上述の各親和性比は、第一試薬および第二試薬の、官能基に対する親和性についての情報を与える。故に、表面の蛍光を測定した後、濃度比ならびに第一試薬および第二試薬それぞれの、官能基に対する親和性比を考慮することによって、標的の官能基の存在を定量することができる。
【００１３】
本発明による方法はまた、表面にグラフトされた異なる官能基の定量を許容する。例えば、本発明による方法はまた、ヒドロキシル（−ＯＨ）およびアミン（−ＮＨ２）基で官能化された表面上にある全ての官能基を独立して定量することを許容する。異なる官能基が表面上に存在するとき、各官能基に対しては、前記官能基を特異的に標的とするべく、数種の第一試薬および第二試薬が選択される。第一試薬および第二試薬は、予め決定された濃度比であり、それぞれ予め決定された前記官能基に対する親和性を呈する。
【００１４】
ある実施形態によれば、当該方法は更に、工程ａ）の前に、表面の官能基を活性化する活性化工程を含む。この実施形態は、第一試薬および第二試薬と連結するように設計された官能基を調製することを目的とする。よって、表面にグラフトされた官能基の反応性は、この活性化工程によって誘発され得る。この活性化工程の後、第一試薬および／または第二試薬に対して不活性の官能基が、第一試薬および／または第二試薬と連結する準備ができた反応性官能基になることができる。
【００１５】
ある実施形態において、前記活性化は、少なくとも化学反応により進行する。よって、この化学反応は、第一試薬および第二試薬と官能基との連結を促進または誘発させる。このような化学的活性化は実施するのが容易である。
【００１６】
ある実施形態によれば、第一濃度と第二濃度との比は、約１：９９〜約５０：５０、好ましくは約２：９８〜約２５：７５、より好ましくは約３：９７〜約１０：９０、およびより好ましくは約４：９６〜約７：９３である。
【００１７】
ある実施形態によれば、表面は微粒子上に構成される。多数の微粒子を同時に測定して、単一微粒子上の官能基密度に関する情報を付与することができる。更に、当該方法により、１回の測定において、１つの特定の母集団または様々なコードを有する様々な母集団についての詳細な情報を得ることができる。
【００１８】
ある実施形態において、第一試薬および／または第二試薬は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸またはこれらの混合物から選択される。
【００１９】
ある実施形態によれば、官能基は、カルボン酸またはこれらの誘導体、ケトン、アルデヒドから選択されるカルボニル基である。よって、本実施形態では、少なくとも本実施形態による官能基と連結するように設計された任意の基を使用することによって、第一試薬および第二試薬を官能基に連結することができる。
【００２０】
ある実施形態において、第一試薬および／または第二試薬は、ペプチド結合により表面の官能基に連結される。
【００２１】
ある実施形態によれば、第一試薬および／または第二試薬は、表面の官能基との連結に関与するアミン基を提示する。よって、本実施形態によれば、官能基は、アミン基に連結するように設計された任意の官能基から選択することができる。
【００２２】
ある実施形態において、表面は、ガラス、シリコンまたはポリマー製である。
【００２３】
ある実施形態によれば、第一試薬は、第二試薬を標識することによって得られる。多くの蛍光をベースとする特徴付け方法では、特定の蛍光標識が検出のために開発されるが、一方、本発明による方法では、第二試薬に結合可能な任意の蛍光分子を使用することができる。
【００２４】
ある実施形態において、第二試薬はストレプトアビジンである。
【００２５】
ある実施形態によれば、第一試薬はＦＩＴＣ（ＣＡＳ番号３３２６−３２−７）、ローダミン（ＣＡＳ番号８１−８８−９）、シアニン３（ＣＡＳ番号６０５−９１−４）、シアニン５（ＣＡＳ番号１４１８７−３１−６）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（スイス）により市販されているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）染料）、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６４７Ｎ（ＡＴＴＯ―ＴＥＣ  ＧｍｂＨ（ドイツ）により市販されているＡＴＴＯ染料）またはこれらの混合物で標識される。
【００２６】
ある実施形態において、ストレプトアビジンは、ＡＴＴＯ６４７Ｎで標識される。１つの実施形態において、第一試薬および第二試薬はビオチン部分を含み、第一試薬は標識されたストレプトアビジンを更に含み、第二試薬は標識されていないストレプトアビジンを更に含む。
【００２７】
添付の図面を考慮して記載された以下の詳細な説明により本発明を更に例証する。図面は、少なくとも表面を官能化させる官能基を定量するための方法に関する例示的かつ説明的な実施形態を表す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】カルボン酸（ＣＯＯＨ）で官能化された表面を定量するための本発明による方法を例証する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明による、少なくとも表面（２）を官能化させる官能基（１）を定量するための方法において、前記表面（２）は、図１に示されるように、微粒子（３）上に構成され、かつ、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）で官能化される。
【００３０】
カルボン酸基である官能基（１）を定量するために、当該方法は、ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−塩酸エチルカルボジイミド）などのペプチド連結剤、ＨＣｌ（５ｍｇ）およびスルホ−ＮＨＳ（１２．５ｍｇ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩）を３．６ｍＬの活性化バッファ（１００ｍＭ、ＭＥＳ、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、ｐＨ２．３）に含む活性化溶液と表面（２）を接触させることからなる活性化工程から開始される。活性化工程において、微粒子（３）を、室温で約６０分間、活性化溶液に浸漬する。
【００３１】
活性化工程の後、洗浄バッファ（１０ｍＭのリン酸、２．７ｍＭの塩化カリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、０．３％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０、ｐＨ７．４）で微粒子（３）を洗い流して過剰な化学物質を除去する。
【００３２】
その後、第一試薬（４）および第二試薬（５）を含む溶液と表面（２）を接触させる。第二試薬（５）はストレプトアビジンであり、第一試薬（４）は、少なくとも蛍光体（６）としてＡＴＴＯ６４７Ｎ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ（ドイツ）により市販されている）を担持する標識ストレプトアビジンである。蛍光体（６）としてのＡＴＴＯ６４７Ｎは、少なくとも、リシン残基を少なくとも伴うペプチド結合によって第一試薬（４）に結合される。ストレプトアビジンからのアミン基（７）は、ペプチド結合により表面（２）のカルボキシル基に連結するように設計される。溶液中、第一試薬（４）は第一濃度Ｃ１で存在し、第二試薬（５）は第二濃度Ｃ２で存在し、第一濃度Ｃ１と第二濃度Ｃ２とのＣ１／Ｃ２比は予め決定される。実際、６０μｌの５％ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ストレプトアビジンおよび９５％ストレプトアビジンとリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（５００ｇ／ｍＬ）とを含有する溶液を、２．１ｍＬの連結バッファ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより市販；ＣＡＳ＃９００５−６４−５）、ｐＨ４．８）中で微粒子（３）に添加し、反応を室温で３０分間実施する。次いで、微粒子（３）を洗浄バッファで洗浄して過剰な試薬を除去する。
【００３３】
表面（２）上の官能基（１）の存在を定量するために、まず微粒子（３）を定量測定のために蛍光顕微鏡下に置く。次いで、第一濃度Ｃ１と第二濃度Ｃ２とのＣ１／Ｃ２比に関して測定された蛍光を考慮することによって、表面（２）上のカルボキシル基の存在を定量する。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、明細書を考慮し、本書に開示された発明を実施することによって当業者に明らかとなろう。明細書および実施例は単に例示的なものと考えられるに過ぎず、本発明の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
2016518603.tif 000003
【国際調査報告】
2016518603.tif 000004
2016518603.tif 000005
2016518603.tif 000006