(57)【要約】  質量分析イオン化パターンを使用して、真菌膜の脂質、例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールの分析によって真菌種を同定する方法を開示する。【選択図】図６
2016537964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の真菌を同定する方法であって、
（ａ）目的の真菌を含有する試料から（ｉ）真菌のグリセロリン脂質、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質、（ｉｉｉ）真菌のステロール、及び（ｉｖ）その前駆体分子の１種又は複数種の前駆体イオンの前駆体イオン質量分析（ＰＩＭＳ）データを取得することと、
（ｂ）前記ＰＩＭＳデータを、（ｉ）真菌のグリセロリン脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉｉ）真菌のステロールのＰＩＭＳデータ、及び／又は（ｉｖ）前駆体分子のＰＩＭＳデータの対応するデータベースと比較することと、
を含み、
前記比較を使用して前記試料中の真菌を同定する、方法。
【請求項２】
前記比較が、前駆体イオンのｍ／ｚ値及び前記前駆体イオンの相対的存在量を、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子のＰＩＭＳデータのデータベースと比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆体イオンの全て又は部分集合をフラグメント化し、多重化された一連のイオンを生成することと、前記多重化された一連のイオンの全て又は部分集合の質量スペクトル（多重化された質量スペクトルデータ）を取得することとを更に含み、前記比較が前記多重化された質量スペクトルデータを前記試料の真菌の同定に役立つ前記データベースの真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子の多重化された質量スペクトルデータの１つ又は複数と比較することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体イオンの全て又は部分集合をフラグメント化し、一連の誘導されたフラグメントイオンを生成することと、前記誘導されたフラグメントイオンの全て又は部分集合の質量スペクトル（ＭＳｎデータ）を取得することとを更に含み、前記比較が前記ＭＳｎデータを前記試料中の真菌の同定に役立つ前記データベースの真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子のＭＳｎデータの１つ又は複数と連続して比較することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び前駆体分子の特徴的なイオンのデータベースにおいて前記前駆体イオン及び／又はＭＳｎデータを検索し、該前駆体イオン及び／又はＭＳｎデータの特徴的なイオンを識別することを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）理論的ニュートラルロスデータベースにおける前記ＭＳｎデータの特徴的なイオンのニュートラルロスを検索し、解離式を同定することと、
（ｉｉ）前記ＭＳｎデータの前記解離式及び前記特徴的なイオンに基づいて前記試料中の真菌からグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール候補構造体を提示することと、
（ｉｉｉ）理論的ＭＳｎデータと獲得したＭＳｎデータとの間の相関に基づき、各グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール候補構造体にスコアを割り当てることと、
を更に含み、ユーザにより定義された閾値を満たす又は閾値を超える候補構造体が正確に割り当てられたものとして見なされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）が、
（Ａ）対応するＭＳｎ−１スペクトルのＭＳｎスペクトルの前駆体イオン毎のニュートラルロスを決定するとともに、前記理論的ニュートラルロスデータベースにおいて検索することと、
（Ｂ）ＭＳ１のレベルに達するまで工程（Ａ）を反復的に繰り返すことと、
を含み、
工程（ｉｉ）が各ＭＳｎレベルからの統合データに基づき前記試料中の前記真菌からグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール構造体を提示することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）が、
（Ａ）直接結合切断によって前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール候補構造体をフラグメント化し、フラグメントを生成することと、
（Ｂ）前記フラグメントを、前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール候補構造体の理論的解離を表す再構築された質量スペクトルに組み合せることと、
（Ｃ）理論的ＭＳｎスペクトルと前記再構築された質量スペクトルとの間の相関に基づき前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール候補構造体のそれぞれに前記スコアを割り当てることと、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）前記試料中の真菌タンパク質の前駆体イオンの質量スペクトルデータを取得することと、
（ｄ）タンパク質質量スペクトルデータを、真菌タンパク質の前駆体イオン質量スペクトルデータのデータベースと比較することと、
を更に含み、
前記比較を使用して、前記試料中の真菌の同定に役立てる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記真菌のグリセロリン脂質が真菌膜のグリセロリン脂質であり、前記真菌のスフィンゴ脂質が真菌膜のスフィンゴ脂質であり、前記真菌のステロールが真菌膜のステロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が単一の真菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が２種以上の真菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロール前駆体イオン並びに多重化された質量スペクトル及び／又はＭＳｎデータのライブラリを構築する方法であって、
（ａ）複数の様々な真菌から得られた（ｉ）真菌のグリセロリン脂質、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質、（ｉｉｉ）真菌のステロール、及び（ｉｖ）その前駆体分子の１つ又は複数の前駆体イオンのＰＩＭＳデータを取得することと、
（ｂ）前駆体イオンのｍ／ｚ値及び互いに対する前駆体イオンシグナルの相対比を決定することと、
（ｃ）前記前駆体イオンのｍ／ｚ値及び所与の真菌の互いに対する前記前駆体イオンシグナルの相対比についてのコンセンサス値を決定することと、
（ｄ）データベースの前記コンセンサス値を前記真菌の種類の特徴として記憶することと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記真菌のグリセロリン脂質が真菌膜のグリセロリン脂質であり、前記真菌のスフィンゴ脂質が真菌膜のスフィンゴ脂質であり、前記真菌のステロールが真菌膜のステロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記真菌が、カンジダ属、アスペルギルス属、リゾプス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスチス属、スタキボトリス属、スポロトリスク属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、ブラストミセス属、ケカビ亜門、コクシジオイデス属、エクセロヒルム属、クラドスポリウム属、コッコイデス属、エンセファリトゾーン属、エンセファリトゾーン属、フザリウム属、リヒテイミア属、モルチエレラ属、マラセジア属、プロトセカ属、フィチウム属、ロドトルラ属、フザリウム属、ティエラビオプシス属、ベルチシリウム属、マグナポルテ属、スクレロティニア属、ウスチラゴ属、リゾクトニア属、プッチニア属、アルミラリア属、ボトリチス属、ブルメリア属、ミコスフェレラ属、コレトトリカム属、メランプソラ属、サプロレグニアシス属、イクチオスポリジウム属、エキソフィアラ属、ブランチオミコシス属及びペニシリウム属からなる群から選択される真菌属である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記真菌が、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス・イミチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、マグナポルテ・グリセア、スクレロチニア・スクレロチオラム、ファコプソラ・パキリジ及びボトリチス・シネレアからなる群から選択される真菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記真菌が前記属の１つの真菌種である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記真菌が前記属の１つの真菌亜種である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
医学上の重要な微生物、例えば、真菌の迅速かつ正確な同定は、医師が適宜、生命の危険のある可能性がある感染症を含む感染症に対処し、対応するのに必要である。例えば、全身の真菌感染症は、免疫障害患者の罹患率及び死亡率の主な原因となっている。
【０００２】
現在、微生物の同定には、特定の大気、熱及び湿度条件下において、固体培地での培養又は液体培地での増殖の後に、診断分析を行う必要があり、特定の微生物産物を培養又は精製する際には更に複数回の複製を必要とすることもある。少なくとも、微生物の同定には多くの日数を要し、その間に疾病の原因物質を確定する間に、患者の健康状態の維持が困難となり、又は更に急速に悪化する恐れがある。したがって、微生物を同定する改良された方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、本発明は、試料中の真菌を同定する方法であって、
（ａ）目的の真菌を含有する試料から（ｉ）真菌のグリセロリン脂質、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質、（ｉｉｉ）真菌のステロール、及び（ｉｖ）その前駆体分子の１種又は複数種の前駆体イオンの前駆体イオン質量分析（ＰＩＭＳ）データを取得することと、
（ｂ）前記ＰＩＭＳデータを、（ｉ）真菌のグリセロリン脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉｉ）真菌のステロールのＰＩＭＳデータ、及び／又は（ｉｖ）前駆体分子のＰＩＭＳデータの対応するデータベースと比較することと、
を含み、
前記比較を使用して前記試料中の真菌を同定する、方法を提供する。
【０００４】
本明細書に開示されるように、特筆すべきことに、本発明者らは本発明の方法を使用することで、例えば、試料中の真菌を同定し、かつ同じ試料中の２種以上の真菌を判別することができることを発見した。そのため、本発明には、種々の診断及び研究応用における広範囲の利用が認められている。
【０００５】
一実施の形態では、前記方法は、前駆体イオンのｍ／ｚ値及び前記前駆体イオンの相対的存在量を、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子のＰＩＭＳデータのデータベースと比較することを含む。別の実施の形態では、前記方法は、前記前駆体イオンの全て又は部分集合をフラグメント化し、多重化された一連のイオンを生成することと、前記多重化された一連のイオンの全て又は部分集合の質量スペクトル（多重化された質量スペクトルデータ）を取得することとを更に含み、前記比較が前記多重化された質量スペクトルデータを前記試料の真菌の同定に役立つ前記データベースの真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子の多重化された質量スペクトルデータの１つ又は複数と比較することを更に含む。更なる実施の形態では、前記方法は、前記前駆体イオンの全て又は部分集合をフラグメント化し、一連の誘導されたフラグメントイオンを生成することと、前記誘導されたフラグメントイオンの全て又は部分集合の質量スペクトル（ＭＳｎデータ）を取得することとを更に含み、前記比較が前記ＭＳｎデータを前記試料中の真菌の同定に役立つ前記データベースのグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は前駆体分子のＭＳｎデータと比較することを更に含む。別の実施の形態では、前記方法は、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び前駆体分子の特徴的なイオンのデータベースにおいて前記前駆体イオン及び／又はＭＳｎデータを検索し、前駆体イオン及び／又はＭＳｎデータの特徴的なイオンを識別することを更に含む。
【０００６】
前記方法は、
（ｉ）理論的ニュートラルロスデータベースにおける前記ＭＳｎデータの特徴的なイオンのニュートラルロスを検索し、解離式を同定することと、
（ｉｉ）前記ＭＳｎデータの前記解離式及び前記特徴的なイオンに基づいて前記試料中の真菌からグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子候補構造体を提示することと、
（ｉｉｉ）理論的ＭＳｎデータと獲得したＭＳｎデータとの間の相関に基づき、各グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子候補構造体にスコアを割り当てることと、
を更に含むことができ、ユーザにより定義された閾値を満たす又は閾値を超える候補構造体が正確に割り当てられたものとして見なされる。
【０００７】
一実施の形態では、工程（ｉ）が、
（Ａ）前記対応するＭＳｎ−１スペクトルのＭＳｎスペクトルの前駆体イオン毎のニュートラルロスを決定するとともに、理論的ニュートラルロスデータベースにおいて検索することと、
（Ｂ）ＭＳ１のレベルに達するまで工程（Ａ）を反復的に繰り返すことと、
を含み、
工程（ｉｉ）が各ＭＳｎレベルからの前記統合データに基づき前記試料中の前記真菌からグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子構造体を提示することを含む。
【０００８】
別の実施の形態では、工程（ｉｉｉ）が、
（Ａ）直接結合切断によって前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子候補構造体をフラグメント化し、フラグメントを生成することと、
（Ｂ）前記フラグメントを、前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子候補構造体の前記理論的解離を表す再構築された質量スペクトルに組み合せることと、
（Ｃ）理論的ＭＳｎスペクトルと前記再構築された質量スペクトルとの間の相関に基づき前記グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子候補構造体のそれぞれに前記スコアを割り当てることと、
を含む。
【０００９】
第一の態様の一実施の形態では、前記方法は、
（ｃ）前記試料中の真菌タンパク質の前駆体イオンの質量スペクトルデータを取得することと、
（ｄ）前記タンパク質質量スペクトルデータを、真菌タンパク質の前駆体イオン質量スペクトルデータのデータベースと比較することと、
を更に含み、
前記比較を使用して、前記試料中の真菌の同定に役立てる。
【００１０】
第一の態様の実施の形態では、前記真菌のグリセロリン脂質が真菌膜のグリセロリン脂質であり、前記真菌のスフィンゴ脂質が真菌膜のスフィンゴ脂質であり、前記真菌のステロールが真菌膜のステロールである。
【００１１】
第一の態様の一実施の形態では、前記試料が単一の真菌種を含む。別の実施の形態では、前記試料が２種以上の真菌種を含む。
【００１２】
第二の態様では、本発明は、真菌のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、及び／又は前駆体分子前駆体イオン並びに多重化された質量スペクトル及び／又はＭＳｎデータのライブラリを構築する方法であって、
（ａ）複数の様々な真菌から得られた（ｉ）真菌のグリセロリン脂質、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質、（ｉｉｉ）真菌のステロール、及び（ｉｖ）その前駆体分子の１つ又は複数の前駆体イオンのＰＩＭＳデータを取得することと、
（ｂ）前駆体イオンのｍ／ｚ値及び互いに対する前駆体イオンシグナルの相対比を決定することと、
（ｃ）前記前駆体イオンのｍ／ｚ値及び所与の真菌の互いに対する前記前駆体イオンシグナルの相対比についてのコンセンサス値を決定することと、
（ｄ）データベースの前記コンセンサス値を前記真菌の種類の特徴として記憶することと、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
第二の態様の実施の形態では、前記真菌のグリセロリン脂質が真菌膜のグリセロリン脂質であり、前記真菌のスフィンゴ脂質が真菌膜のスフィンゴ脂質であり、前記真菌のステロールが真菌膜のステロールである。
【００１４】
この態様の実施の形態では、前記真菌が、カンジダ属、アスペルギルス属、リゾプス属（Rhizopus）、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスチス属、スタキボトリス属、スポロトリスク属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、ブラストミセス属、ケカビ亜門（Mucoromycotina）、コクシジオイデス属、エクセロヒルム属（Exserohilum）、クラドスポリウム属、コッコイデス属、エンセファリトゾーン属、エンセファリトゾーン属、フザリウム属、リヒテイミア属（Lichtheimia）、モルチエレラ属、マラセジア属、プロトセカ属、フィチウム属、ロドトルラ属、フザリウム属、ティエラビオプシス属（Thielaviopsis）、ベルチシリウム属、マグナポルテ属、スクレロティニア属、ウスチラゴ属、リゾクトニア属、プッチニア属、アルミラリア属、ボトリチス属、ブルメリア属（Blumeria）、ミコスフェレラ属、コレトトリカム属、メランプソラ属（Melampsora）、サプロレグニアシス属（Saprolegniasis）、イクチオスポリジウム属（Ichthyosporidium）、エキソフィアラ属、ブランチオミコシス属（Branchiomycosis）及びペニシリウム属からなる群から選択される真菌属である。
【００１５】
この態様の実施の形態では、前記真菌が、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea：イネいもち病菌）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum：菌核病菌）、ファコプソラ・パキリジ（Phakopsora pachyrhizi：ダイズさび病菌）及びボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea：灰色かび病菌）からなる群から選択される真菌種である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ネットワーク１０６を介して質量分析計１０２及びクライアントデバイス１０４ａ、１０４ｂと通信するよう構成されたスペクトル識別子１０８を示す図である。
【図２Ａ】実施形態例による計算デバイス（例えば、システム）のブロック図である。
【図２Ｂ】実施形態例によるクラウドベースサーバーシステムとして配置される計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０９ｃのネットワーク１０６を示す図である。
【図３Ａ】スペクトル識別のための方法例３００を示す図である。ブロック３１０にて、入力スペクトルを受信する。
【図３Ｂ】入力スペクトル例３６０（an example input spectrum 360）及び入力スペクトル３６０のピークの対応グラフ３６２を示す図である。
【図４】スペクトル識別のための別の方法例４００を示す図である。
【図５】代表的な真菌膜のグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールを示す図である。
【図６】真菌の代表的な質量スペクトルを示す図である。（Ａ）アスペルギルス属、（Ｂ）カンジダ属、及び（Ｃ）ペニシリウム属の一種を示す。脂質抽出物は小規模脂質抽出法を用いて生成され、質量スペクトルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Bruker Autoflex）のネガティブイオンモードにおいて記録された。
【図７】真菌脂質抽出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータから真菌同定を示すヒートマップを示す図である。真菌脂質抽出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ１スペクトルのドット積の比較によって、脂質が分析された種に固有のものであることが示される。ドット積のスコアを０：一致せず（濃灰色）〜１：完全に一致（黒色）の値に正規化した。その間にある陰影色は種が類似しているが、固有のものであることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
引用された全ての参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈上、他に明記されない限り複数の指示物を含む。本明細書において使用される「及び」は他に明記されない限り「又は」と同義として使用される。本発明の任意の態様の全ての実施形態を文脈上、他に明記されない限り組み合わせて使用することができる。
【００１８】
第一の態様では、本発明は、試料中の真菌を同定する方法であって、
（ａ）目的の真菌を含有する試料から（ｉ）真菌のグリセロリン脂質、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質、（ｉｉｉ）真菌のステロール、及び（ｉｖ）その前駆体分子の１種又は複数種の前駆体イオンの前駆体イオン質量分析（ＰＩＭＳ）データを取得することと、
（ｂ）前記ＰＩＭＳデータを、（ｉ）真菌のグリセロリン脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉ）真菌のスフィンゴ脂質のＰＩＭＳデータ、（ｉｉｉ）真菌のステロールのＰＩＭＳデータ、及び／又は（ｉｖ）前駆体分子のＰＩＭＳデータの対応するデータベースと比較することと、
を含み、
前記比較を使用して前記試料中の真菌を同定する、方法を提供する。
【００１９】
本明細書に開示されるように、特筆すべきことに、本発明者らは本発明の方法を使用することで、例えば、試料中の真菌を同定し、かつ試料中の２種以上の真菌を判別することができることを発見した。そのため、本発明には、種々の診断及び研究応用における広範囲の利用が認められている。
【００２０】
真菌の細胞壁の組成は個々の真菌種に固有の動的構造体であり、環境によるストレスの変化から細胞を保護するよう機能する。多くの真菌研究から、その細胞壁は、主に多糖からなることがわかっている。対照的に、原形質膜はステロール、スフィンゴ脂質、及びグリセロリン脂質を含む抽出可能な脂質を高い割合にて含有する（図５）。様々な真菌種が膜内の脂質の組成を変化させることにより環境によるストレス（浸透圧、温度、成長培地）に適応していることがわかっている。適切な膜流動性の維持に関与するいくつかの因子には、脂肪酸アシル鎖の種類（鎖長及び不飽和度）、ステロールの割合、及びより狭い範囲において、リン脂質極性頭部基（ホスホコリン、ホスホエタノールアミン）の性質がある。細菌脂質及び真菌脂質の修飾は必須であり、現在のタンパク質表現型の補足物として又はその代わりに、有機体の表現型（phenotype of the organisms）に使用され得る種特異的化学バーコードを表す。
【００２１】
真菌を含有すると思われる目的の任意の好適な試料において、真菌を同定及び識別することができる。真菌膜の脂質がかなり安定した状態であるとき、真菌は死滅しているか、又は生存している可能性がある。試料の非限定的な例として、水試料（池、小川、湖、大洋、海、排水、貯水池、飲料水、配水パイプライン等からの水試料を含むが、それらに限定されない）、体液試料（創部からの分泌物／剥離物、血液、尿、汗、唾液、膣分泌物、痰を含むが、それらに限定されない）、飲料水試料、液状薬剤試料、食品試料、環境試料（例えば、リネン、医療用器具等の医療施設由来のもの）、創薬施設（例えば、製造ライン又は加工ライン由来のもの）、食品生産施設、畜産施設、固形廃棄物試料、診断用試料、外気、空気フィルター、空気ダクト及び呼気試料があるが、それらに限定されない。
【００２２】
試料を得られたままの状態で使用することができ、又は本発明の方法で使用するのに好適な任意の方法において加工することができる。一実施形態において、本方法は、複合試料から直接（すなわち、試料中に存在する真菌を増幅させる必要なく）真菌を同定することを含む。別の実施形態において、真菌を例えば、固体培養培地にて画線培養することにより、又は液体培養培地に藩種することにより試料から単離した後、適切な期間成長させ、個々のコロニー又は少量を使用して、脂質を単離するか又は後に脂質単離を行うための大規模な培養（例えば、一晩の液体培養）を開始する。本明細書における教示に基づき、特定の使用のために試料を加工する適切な方法を決定することは当該技術分野における技能範囲内である。
【００２３】
本明細書において使用される「脂質」は、真菌由来の脂質、例えば、細胞壁の脂質及び細胞膜の脂質を意味する。これらの脂質はグリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールを含むが、それらに限定されない。したがって、本明細書において真菌のグリセロリン脂質に対する言及は真菌膜のグリセロリン脂質を含むが、それに限定されず、真菌のスフィンゴ脂質に対する言及は、真菌膜のスフィンゴ脂質を含むが、それに限定されず、真菌のステロールに対する言及は、真菌膜のステロールを含むが、それに限定されない。
【００２４】
一実施形態において、真菌細胞を、真菌脂質を精製することなく、質量分析計に入れ分析する。好ましい実施形態において、脂質（及びその前駆体）を、脂質構造体を維持するよう作用する任意の好適な方法を使用して試料内の真菌から単離することができる。本明細書において使用される「単離」は、脂質が正常な細胞環境から分離されることを意味する。本方法は、精製された脂質の使用を必要としない。好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される脂質は、ＭＳ分析を行う試料の少なくとも１０％まで、好ましくはＭＳ分析を行う試料の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％を構成する。このような単離技法は、以下に記載のように、種々の有機溶媒（例えば、フェノール、クロロホルム、メタノール、エタノール等）の使用、水酸化アンモニウム／イソ酪酸系プロトコル、及びマイクロ波酵素消化及び洗浄剤非含有弱加水分解を含むが、それらに限定されないものが当業者に知られている。例えば、抽出後、脂質を、過酷な酸処理に感受性を有する構造要素（例えば、リン酸基及び結合した炭水化物部分）が保存される、弱加水分解を使用してフェノール系調製物から単離することができ、又は脂質分子内のグリコシド結合を切断するときに水酸化アンモニウム／イソ酪酸に基づき直接単離することができる。
【００２５】
脂質及びその前駆体を単離する方法が様々な試料中の真菌に対して異なる可能性があり、つまり一部の真菌はコロニーの成長に更に成長時間を必要とすることもあり、所与の真菌の膜特性が抽出に影響を与えることが当業者であれば理解されるだろう。本明細書における教示に基づき、種々の脂質又は前駆体の抽出を行うための溶媒、洗浄剤、緩衝液、マイクロ波電力の設定、照射時間等の適切な使用を決定することは当該技術分野における技術範囲内である。
【００２６】
本発明の方法は前駆体イオン質量分析（ＰＩＭＳ）データを取得することを含む。当該技術分野において知られているように、質量分析（ＭＳ）は、荷電された粒子の質量電荷比を測定する分析技法であり、試料又は分子の要素の組成を決定し、分子の化学構造を解明するために使用することができる。ＭＳは荷電した分子又は分子フラグメントを生成するために化合物をイオン化し、その質量電荷比を測定することを含む。典型的なＭＳ方法では、（ａ）試料をＭＳ計測器に入れ、気化させ、（ｂ）試料の構成物質を種々の方法の１つによってイオン化することで、イオンを形成し、（ｃ）イオンを電場及び磁場により分析器内の質量電荷比に従い分離し、（ｄ）多くの場合、定量法によってイオンを検出し、（ｅ）イオンシグナルを質量スペクトルにプロセッシングする。このようなＭＳを行うための好適な計測器は典型的には、（ａ）気相の試料分子をイオンに変換させることができる（又はエレクトロスプレーイオン化の場合、溶液中に存在するイオンを気相に移動する）イオン源と、電磁場を加えることにより質量に対してイオンを選別する質量分析器と、（ｃ）指示物質の量の値を測定し、そうして存在する各イオンの存在量を算出するデータを提供する検出器とを含む。
【００２７】
フロアモデル型ＭＳ計測器、ベンチトップ型ＭＳ計測器、及び小型ＭＳ計測器を含むが、それらに限定されない任意の好適なＭＳ計測器を本発明の方法に使用することができる。適切なＭＳ計測器及びプロトコルの選択は、当業者であれば本明細書における教示に基づき行うことができる。本発明の任意の実施形態又は実施形態の組合せの方法を行うために使用することができる非限定的なＭＳ技法は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）プラットフォーム、タンデムＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ−ＭＳ、イオントラップに結合した注入型エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析（ＩＴＭＳｎ）、ＭＡＬＤＩ−ＩＴＭＳｎ、及び多くのいわゆる大気イオン化法、例えば、任意の質量分析器（例えば、四重極型ＴＯＦ−ＭＳ（ＱＴＯＦ）又はＳＡＷＮ−イオントラップ（ＩＴ）ＭＳ）における表面音波噴霧法（ＳＡＷＮ）含むＳＡＷＮ技術のいずれかを含むが、それらに限定されない。大気イオン化法の他の例として、ＤＥＳＩ及びＤＡＲＴ並びにその派生物、例えば、外科手術において使用されるＲＥＩＭＳを含むが、当業者が知るように利用可能なこのような方法は数多くある。
【００２８】
表面音波（ＳＡＷ）はレイリー波であり、圧電材料を介した電圧を加えることにより生成され、チップの最上層の機械的変位が生じ、これがウエハーの表面全体に「リップル（ripple）」として伝播する。適切な周波数にて表面音波を使用し、ニオブ酸リチウムウエハーの表面にピペットにより滴下した小滴を霧化することができる。これまで、ＳＡＷ噴霧型（ＳＡＷＮ）エアロゾルは、利用可能なＭＳ１スペクトル及びＭＳ２スペクトルを記録するＭＳによって採取することができる荷電分子を含有することが示されている（国際公開第２０１１／０６０３６９号）。実際に、ＳＡＷＮは、容易にＭＳｎを行うことができるＥＳＩのものと同様に多価イオンを生成する。ＭＡＬＤＩ及びＥＳＩに対するＳＡＷＮによる脂質分析の利点は以下の３点がある。１）イオン化がＭＡＬＤＩと同じく平面デバイスから生じ、毛細管の詰まりを回避するため、非熟練者によっても高い処理能力及び使用の容易さが得られやすく、２）ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩに比べエネルギーが少なく、測定しようとする天然の化学的特徴がＭＳに移る上で無傷である可能性が高く、かつ３）化学マトリクスをＭＡＬＤＩの場合のように必要とせず、そのためマトリクスに基づく化学ノイズのない質量スペクトルの生成が、本題の目的の脂質が検出される低ｍ／ｚ領域まで低下する。平面ＳＡＷＮデバイスは、ＭＡＬＤＩの使用を容易にし、すなわち、平面を含み、この場合、試料をピペットにより滴下するだけであるが、目的のイオンを不明確にし得るマトリクスを必要せず、これとＥＳＩの性能と、すなわち、以下に記載のように、例えば、階層型タンデム質量分析（ＭＳｎ）において使用することができる多価前駆体イオンとを結び付ける。
【００２９】
本明細書において使用される「前駆体イオン」は、ＭＳ中に生成される出発分子（脂質及び／又はその前駆体）のイオンである。このような前駆体イオンはＭＳ１イオンとも呼ばれ得る。当業者であれば理解されるように、ＭＳは所与の出発分子から多数の前駆体イオンを生じ得る。ＰＩＭＳデータの取得は、全てのＭＳ１イオンのＰＩＭＳデータの取得を必要としない。したがって、種々の実施形態において、ＰＩＭＳデータの取得は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上のＭＳ１イオンのＰＩＭＳデータの取得を含む。非限定的な例において、本方法は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上のＭＳ１イオン、例えば、最も主要なイオンのＰＩＭＳデータの取得を含む。別の実施形態において、本方法は、全てのＭＳ１イオンのＰＩＭＳデータの取得を含む。
【００３０】
ＰＩＭＳデータは、（ａ）試料中の真菌脂質（例えば、真菌膜の脂質）の「バーコード」を表す（又は読み取る）、生成された前駆体イオンのｍ／ｚ値、及び（ｂ）生成された前駆体イオンの相対的存在量の情報を提供する。本方法は更に、ＰＩＭＳデータを、真菌脂質の前駆体イオン質量スペクトルデータのデータベースと比較し、比較に基づき試料中に存在する真菌の同定を可能にする。例えば、真菌の同定は、各試料に対して測定された２つの構成物質の単純な表現型を読み取ることにより行うことができ、すなわち１）前駆体イオンのｍ／ｚ値（質量電荷比）を試料又は分子の要素組成を決定し、分子の化学構造を解明するために使用することができ、２）上記の前駆体イオンの正規化された相対的存在量により、真菌の特徴、例えば、環境因子のより微細な違いを表すことができ、３）全ての又は選択された一連のＰＩＭＳイオンの階層型タンデム質量スペクトルを行うことにより、ＭＳ１値が同じであるが、様々な化学構成を有する多数の実体（一般的に同重体と呼ばれる）全てからなるＭＳ１イオン下の違い及び複雑性を解明する。
【００３１】
真菌膜の脂質を含む精製された真菌脂質を使用する一実施形態において、前駆体イオンのＰＩＭＳデータの取得は、約１０００ｍ／ｚ〜約２２００ｍ／ｚ、他の実施形態において、約１１００ｍ／ｚ〜約２１００ｍ／ｚ、又は約１２００ｍ／ｚ〜約２０００ｍ／ｚのピークを選択することを含む。これらの実施形態は、分析に最も関連のある可能性のある質量電荷比を有するイオンの分析に焦点をあてている。当業者であれば理解されるように、ｍ／ｚの範囲は、所与のＭＳアッセイの全ての関連する因子（例えば、精製度、計測器等）に応じて上記の値より大きく又は小さく変化する可能性がある。未精製の脂質の試料を使用する実施形態において、ｍ／ｚの範囲は、上記の範囲よりおよそ１０倍高くなる可能性がある（すなわち、約１００００ｍ／ｚ〜約２２０００ｍ／ｚ）。
【００３２】
本方法は更に、本明細書における教示に基づき、当該技術分野の技能範囲内にあるデータプロセッシングの種々の技法を含むことができる。例えば、本方法は、任意の好適な技法を用いるスペクトルのピークの重み付け及び拡大縮小を含むことができる。別の非限定的な実施形態において、スペクトルのピークは、費用及び計算の必要性を削減する手段としてビン化する（binned：ビニングする）ことができる。
【００３３】
本発明の方法は、ＰＩＭＳデータを、真菌脂質の前駆体イオン質量スペクトルデータのデータベースと比較することを更に含み、この比較を使用して試料中の真菌を同定する。データベースは、所与の用途に好適な任意の種類のものであってよい。一実施形態において、データベースは、単一の真菌種から予め取得した真菌脂質の前駆体イオンのＭＳデータを含み、又はそれらのデータからなり得るが（種々の亜種の前駆体イオンのＭＳデータを含み得る）、本実施形態を、例えば、目的の特定の真菌が試料中に存在するかどうかを決定するために設計された方法において使用することができる。別の実施形態において、データベースは、複数の目的の真菌から予め得られた真菌脂質の前駆体イオンのＭＳデータを含み、又はそれらのデータからなり得る。このような一実施形態において、複数の真菌から予め得られた真菌脂質の前駆体イオンのＭＳデータを含む。別のこのような実施形態において、データベースは、抗真菌耐性を得たことが知られる１種又は複数種の真菌から予め取得した前駆体イオンの真菌脂質のＭＳデータを含み、又はそれらのデータからなり得るが、この場合、予め取得したＭＳデータ（previously obtained MS data）は、真菌の抗真菌耐性株及び非抗真菌耐性株からのデータを含む。当業者であれば理解されるように、本発明の方法に使用することができるこのようなデータベースの変形例が多くある。使用に好適なデータベースは、行われる方法の特異性に左右され、当業者であれば、本明細書における教示に基づき決定することができる。別の実施形態において、データベースは、本明細書に開示のデータベースライブラリのいずれかを含み、又はそのライブラリからなり得る。
【００３４】
別の実施形態では、データベースは重要な真菌属、その種又はその亜種の下記群の１つ又は複数（又は全て）から予め取得した真菌脂質の前駆体イオンのＭＳデータを含むか又はそれからなるものとすることができる。ヒト及び家畜の真菌病原体（Human and Livestock Fungal Pathogens）：カンジダ属、アスペルギルス属、リゾプス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスチス属、スタキボトリス属、スポロトリスク属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、ブラストミセス属、ケカビ亜門、コクシジオイデス属、エクセロヒルム属、クラドスポリウム属；家畜真菌病原体（Livestock Fungal Pathogens）：コッコイデス属、エンセファリトゾーン属、エンセファリトゾーン属、フザリウム属、リヒテイミア属、モルチエレラ属、マラセジア属、プロトセカ属、フィチウム属、ロドトルラ属；穀物真菌病原体（Crop Fungal Pathogens）：フザリウム属、ティエラビオプシス属、ベルチシリウム属、マグナポルテ属、スクレロティニア属、ウスチラゴ属、リゾクトニア属、プッチニア属、アルミラリア属、ボトリチス属、ブルメリア属、ミコスフェレラ属、コレトトリカム属、メランプソラ属；魚類真菌病原体（Fish Fungal Pathogens）：サプロレグニアシス属、イクチオスポリジウム属、エキソフィアラ属、ブランチオミコシス属；その他：ペニシリウム属。代表的な真菌種としては、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス・イミチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、マグナポルテ・グリセア、スクレロチニア・スクレロチオラム、ファコプソラ・パキリジ及びボトリチス・シネレアが挙げられる。
【００３５】
本発明の方法を使用し、試料中に存在する単一真菌細胞を検出することができる。種々の実施形態において、少なくとも１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、又は１０６個の真菌細胞が試料中に存在する。
【００３６】
データベースに含まれるデータは、データベースに表される真菌における真菌脂質分子に対する少なくとも前駆体イオンのｍ／ｚ値を含む。データはこれらの前駆体イオンの正規化された相対的存在量、及びデータを生成するために使用されるＭＳ技法に関するデータも含むことができる。好ましい実施形態において、試料からＰＩＭＳデータを生成するために使用されるＭＳ技法は、データベース内のデータを生成するために使用されるＭＳ技法と同じである。データは、全ての又は選択された一連のＰＩＭＳイオンにおける種の間の構造体を定義し、又は微妙な違いを定義するために使用される、限定的又は包括的階層型タンデム質量分析データ（J Am Soc Mass Spectrom. 22(5):856-66 (2011)に具体化されている）を含むことができる。データは更に、データベースに表された真菌又はその亜種に存在する脂質に対する構造体情報を含むことができる。
【００３７】
データベースは、単一のデータベース又は以下に詳細に記載されるように個別にアクセスして、統合することができる１つ又は複数のデータベースを含むことができる。
【００３８】
別の実施形態において、比較は、同定のためのスコアを提供する分類システムを含む。例えば、各データベースの入力は、確率に基づいたスコアを含むことができる。恐らくは他の情報を伴うこのスコアは、イオン、スペクトル、脂質、又は脂質前駆体を同定するために使用することができる。任意のこのような好適な分類システムを使用して、確率に基づいたスコア等のスコアを提供することができ、本明細書における教示に基づき、適切なシステムを決定することは十分に当業者の範囲内である。
【００３９】
任意の種類の、ＰＩＭＳデータとデータベースのＭＳデータとの比較を使用し、試料中の真菌を同定することができる。例えば、試料中の脂質及び／又は前駆体イオンのｍ／ｚ値を、データベースのｍ／ｚ値と比較する任意の手段を使用することができ、同様に、試料中の真菌脂質から生成されたこのような前駆体イオンの相対的存在量を、データベースのデータと比較する任意の手段を使用することができる。非限定的な一実施形態において、比較は、ｍ／ｚ値及び（場合により）それらの相対強度を組み込んでいるスペクトルのドット積の比較を含むことができる。別の実施形態において、ｍ／ｚ値及び（場合により）それらの相対強度を組み込んでいるスペクトルのヒートマップ比較を使用することができる。ヒートマップの一例を図７に示す。本明細書における教示に基づき、適切な比較技法を決定することは十分に当業者の範囲内である。
【００４０】
本発明の方法を使用し、試料中の任意の真菌種又は亜種を同定することができる。さらに、本方法を使用し、所与の試料から多数の真菌種及び／又は亜種を同定することができる。
【００４１】
様々な非限定的な実施形態では、本方法を用いて、下記の属を含むが、それらに限定されない真菌属、その種又はその亜種の１つ又は複数を同定することができる：カンジダ属、アスペルギルス属、リゾプス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスチス属、スタキボトリス属、スポロトリスク属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、ブラストミセス属、ケカビ亜門、コクシジオイデス属、エクセロヒルム属、クラドスポリウム属、コッコイデス属、エンセファリトゾーン属、エンセファリトゾーン属、フザリウム属、リヒテイミア属、モルチエレラ属、マラセジア属、プロトセカ属、フィチウム属、ロドトルラ属、フザリウム属、ティエラビオプシス属、ベルチシリウム属、マグナポルテ属、スクレロティニア属、ウスチラゴ属、リゾクトニア属、プッチニア属、アルミラリア属、ボトリチス属、ブルメリア属、ミコスフェレラ属、コレトトリカム属、メランプソラ属、サプロレグニアシス属、イクチオスポリジウム属、エキソフィアラ属、ブランチオミコシス属及びペニシリウム属。代表的な真菌種としては、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス・イミチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、マグナポルテ・グリセア、スクレロチニア・スクレロチオラム、ファコプソラ・パキリジ及びボトリチス・シネレアが挙げられる。
【００４２】
下記にある実施例に示されるように、ＭＳ１スペクトルの分析を使用し、真菌脂質のＭＳ１データによる、高い感受性、精度、及び特異性での真菌属間の判別能力について実証することができる。
【００４３】
別の実施形態において、本方法は、全ての又は部分集合の前駆体イオンをフラグメント化し、多重化された一連のイオンを生成し、全ての又は部分集合の多重化された一連のイオンの質量スペクトル（多重化された質量スペクトルデータ）を取得することを更に含み、この比較は、多重化された質量スペクトルデータを、試料中の真菌の同定に役立つデータベースの真菌脂質の多重化された質量スペクトルデータと比較することを更に含む。当業者であれば、本発明のこの実施形態とともに最も好適に使用される質量分析デバイスの種類が理解されるだろう。イオンをフラグメント化することができる任意のＭＳデバイスは多重化された質量スペクトルデータを生成することができる。例えば、ＭＳの最も単純な形態は、イオン化デバイス、並びに質量分析器及び検出器である。イオンがほとんど全てのＭＳ１イオンを記録する「ソフト」からほとんど全てのＭＳ１をフラグメント化する「ハード」に進み、多重化された質量スペクトルのスペクトルを生成するように改変することができる。別の実施形態において、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳデバイスを使用することができる（Proteomics 3:847-850 (2003)を参照のこと）。
【００４４】
本明細書において使用される「多重化質量スペクトル」は、全てのＭＳ１イオン又は部分集合のイオンのフラグメントを指す。例えば、Nature Methods 2004 Oct 1(1):39-45を参照されたい。例えば、ＭＳ１データが、試料中に存在する真菌を同定する際に不確定である場合及び真菌脂質の構造体の更なる情報を明らかにする多重アプローチを提供する場合、本実施形態を使用することができる。
【００４５】
種々の実施形態において、多重化質量スペクトルの取得は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上の多重化イオンに対する多重化質量スペクトルの取得を含む。非限定的な一例において、本方法は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上の最も存在量の多い多重化されたイオンに対する多重化された質量スペクトルの取得を含む。別の実施形態において、本方法は、全ての多重化されたイオンに対する多重化質量スペクトルの取得を含む。
【００４６】
多重化された質量スペクトルデータは、（ａ）評価された多重化イオンのｍ／ｚ値及び（ｂ）生成された多重化イオンの相対的存在量の情報を含むが、それらに限定されない前駆体イオンに対してＰＭＩＳを行ったときと同様の多重化されたイオンの情報を提供する。同様に、本実施形態において使用されるデータベース（複数の場合もあり）は更に、データベースに表される真菌中の真菌脂質分子に対する多重化されたイオンのｍ／ｚ値を含むが、それらに限定されないＰＩＭＳデータのデータベースに存在するものと同様の予め取得した多重化された質量スペクトルデータを含む。データはまた、これらの多重化されたイオンの正規化された相対的な存在量と、利用可能な場合、多重化されたイオンのスコア情報と、データを生成するために使用されるＭＳ技法に関するデータとを含むことができる。
【００４７】
一実施形態において、多重化イオンの多重化された質量スペクトルの取得は、約１０００ｍ／ｚ〜約２２００ｍ／ｚ、他の実施形態において、約１１００ｍ／ｚ〜約２１００ｍ／ｚ、又は約１２００ｍ／ｚ〜約２０００ｍ／ｚのピークの選択を含む。これらの実施形態は、分析に最も関連のある可能性がある質量電荷比を有する多重化されたイオンの分析に焦点をあてる。
【００４８】
別の実施形態において、本方法は、全ての又は部分集合の前駆体イオンをフラグメント化し、一連の誘導されたフラグメントイオンを生成することと、全ての又は部分集合の誘導されたフラグメントイオン（ＭＳｎデータ）を取得することとを更に含み、この比較はＭＳｎデータを、試料中の真菌の同定に役立つデータベースの真菌脂質のＭＳｎデータと連続して比較することを更に含む。例えば、ＰＭＩＳ及び／又は多重化された質量スペクトルデータが不確定な場合、又は関連の脂質種のより詳細な構造体情報が望まれる場合、この実施形態を使用することができる。例えば、この実施形態を使用し、新たな真菌脂質の構造体を決定することができる。したがって、この実施形態を使用し、例えば、特定の真菌の新たなバイオマーカー及び抗真菌耐性の真菌株のバイオマーカーを同定することができる。当業者であれば、本発明のこの実施形態とともに最も好適に使用される質量分析デバイスの種類が理解されるだろう。例えば、イオントラップを使用し、完全なＭＳｎスペクトルを取得することができ、同時に他のタンデム質量分析計（すなわち、三重の四重極ＭＳ、ＱＴＯＦ  ＭＳ、及びＱｔｒａｐ  ＭＳを含むが、それらに限定されない２つ以上の質量分析器を有するもの）は、典型的にＭＳ３スペクトルを取得することができる。
【００４９】
本明細書において使用される「誘導されたフラグメントイオン」は、前駆体イオンからフラグメント化されたイオンであり、例えば、上記のイオン（ＭＳ２）の第１の世代はＭＳ１イオンからフラグメント化され、上記の誘導されたフラグメントイオン（ＭＳ３）の第２の世代は、ＭＳ２イオンからフラグメント化される。この方法は繰り返され、ＭＳｎは世代数を表す。したがって、一実施形態において、ＭＳｎスペクトルデータは、誘導されたフラグメントイオンの少なくとも２つの世代、ＭＳ１及びＭＳ２に対して取得され、データベースの真菌脂質のＭＳ１スペクトル及びＭＳ２スペクトルと比較される。別の実施形態において、ＭＳｎスペクトルデータは、誘導されたフラグメントイオンの少なくとも、ＭＳ１、ＭＳ２、及びＭＳ３の世代に対して取得され、データベースの真菌脂質のＭＳ１スペクトル、ＭＳ２スペクトル、及びＭＳ３スペクトルと比較される。本方法を、生成されるフラグメントイオンの任意の所望の「ｎ」値（２、３、４、５、６等）まで繰り返すことができる。多重化された質量スペクトルの実施形態とは対照的に、単一の前駆体イオンから誘導された誘導フラグメントイオンの各連続した世代をデータベースにおいて比較することができるという点において、この実施形態は連続的であり、フラグメント化イオン（又はその部分集合）の全ての連続した世代を同時にデータベースにおいて比較する。例えば、一実施形態において、ＭＳ１スペクトルをデータベースと比較し、必要な場合（すなわち、差が認められず、又は十分な差ではない等）、ＭＳ２スペクトルをデータベースと比較する。同様に、ＭＳ３スペクトル及び更なるスペクトルを取得することができ、所望の端点（例えば、同じ構造体を有する全ての対象物（things）の（全てのスペクトルに存在するイオン強度値から）化学構造又は相対的存在量のいずれかに認められる差）が得られるまでデータベースと比較する。ＭＳｎデータの各レベルは、より精製された構造体を定義することができる脂質の新たな構造体の詳細を明らかにする。
【００５０】
種々の実施形態において、ＭＳｎデータの取得は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上のＭＳｎイオンのＭＳｎ質量スペクトルの取得を含み、その数は、所与の目的に好適であると思われる、誘導されたフラグメントイオンの１世代から別の世代まで様々であってよい。非限定的な一例において、本方法は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個以上の最も存在量の多いＭＳｎイオンのＭＳｎ質量スペクトルの取得を含む。別の実施形態において、本方法は、全てのＭＳｎイオンのＭＳｎ質量スペクトルの取得を含む。
【００５１】
ＭＳｎデータにより、（ａ）評価されたＭＳｎイオンのｍ／ｚ値及び（ｂ）生成されたＭＳｎイオンの相対的存在量の情報を含むが、それらに限定されない前駆体イオンのＰＭＩＳを行った時と同様のＭＳｎイオンの情報がもたらされる。同様に、本実施形態において使用されるデータベースは更に、データベースに表された真菌中の真菌脂質分子のＭＳｎイオンのｍ／ｚ値を含むが、それに限定されない、ＰＩＭＳデータのデータベースに存在するものと同様の予め取得しているＭＳｎデータを含む。データは、これらのＭＳｎイオンの正規化された相対的存在量及びデータを生成するために使用されるＭＳ技法に関するデータも含み得る。
【００５２】
本明細書における任意の実施形態又は実施形態の組合せと組み合わせることができる更なる実施形態において、本方法は、真菌脂質の特徴的なイオンのデータベースにおいて前駆体イオン及び／又はＭＳｎデータを検索し、前駆体イオン及び／又はＭＳｎスペクトルの特徴的なイオンを同定することを更に含む。本明細書において使用される「特徴的なイオン」は分子の構造の仮説に役立つ固有のイオンである。この実施形態において、データベースは、データベースに表される真菌の予め同定された特徴的なイオンの１つのデータベース及び前駆体イオン及び／又はＭＳｎイオン質量スペクトルデータを含む第２のデータベースを含むことができる。この非限定的な例において、真菌脂質に、ＭＳ１スキャンにおいて検出されたそれぞれの有意な前駆体イオンに対してＭＳ２及び高次のタンデム質量スペクトルを生成する階層型タンデム質量分析（ＭＳｎ）方法を行う。まず、理論的に特徴的なイオン（ＴＳＩ）データベースを検索し、特徴的なイオンを検出した後、予測された理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）のデータベースと比較することによってこれらのイオンを確定し、これより化学式及び構造を誘導する方法により、構造を割り当てる。
【００５３】
タンデム質量分析は、多数の質量分析選択の工程を含み、各工程間においていくつかのフラグメントの形態が生じる。本特許請求の範囲とともに使用されるのに好適なタンデムＭＳ技法の例として、Shaffer他、the Journal of the American Society for Mass Spectrometry (JASMS), June 2007, Vol. 18, No. 6, pp. 1080-1092に開示のものがあるが、それらに限定されない。
【００５４】
更なる実施形態では、比較は、
（ｉ）理論的ニュートラルロスデータベースにおける前記ＭＳｎデータの特徴的なイオンのニュートラルロスを検索し、解離式を同定することと、
（ｉｉ）前記ＭＳｎデータの前記解離式及び前記特徴的なイオンに基づいて前記試料中の真菌から真菌脂質の候補構造体を提示することと、
（ｉｉｉ）理論的ＭＳｎデータと獲得したＭＳｎデータとの間の相関に基づき、各真菌脂質の候補構造体にスコアを割り当てることと、
を含み、ユーザにより定義された閾値を満たす又は閾値を超える候補構造体が正確に割り当てられたものとして見なされる。
【００５５】
本明細書において使用される解離式は、前駆体イオンの解離の経路（複数の場合もあり）である。
【００５６】
この実施形態において、データベースは、例えば、リン酸パターン並びに脂肪酸及び単糖置換物を含む、タンデム質量スペクトルにおける真菌脂質フラグメント化の法則の解釈に基づいたデータベースを含む。真菌脂質構造体の直接結合切断は、フラグメント及び構造推論の一般的なテンプレートとして考えられ得る。更なる実施形態において、各データベースは、（１）理論的に特徴的なイオン（ＴＳＩ）及び（２）理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）についての２つの部分データベースを含むことができる（又は２つの個別であるが接続されたデータベースを含むことができる）。例えば、ステロールの保存された特徴から観察されるステロールの特徴的なイオンを決定することができ、当該技術分野において既知の命名法において命名した。ステロールの観測されるフラグメントテンプレートに基づき、特徴的なイオンを算出し、理論的に特徴的なイオン（ＴＳＩ）データベースと比較することができる。更なる実施形態において、任意の同定可能な特徴的なイオンを含まない任意の質量スペクトルをデータベースと比較する前に除外する。
【００５７】
ＴＳＩデータベースに表された真菌脂質の構造体の多様性を増大させるため、ユーザにより定義された脂肪酸の炭素範囲を適用することができる（例えば、１２：０〜２０：０の脂肪酸）。脂肪酸の側鎖長及び位置を体系的に変更させることにより、所望の場合、全ての考えられ得る特徴的なイオンを計算することができ、ＴＳＩデータベースに組み込むことができる。構造体の割り当てを容易にするため、特徴的なイオンのニュートラルロスを算出し、理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）のデータベースに加えることができる。さらに、特徴的なイオンの切断以外の、脂質の直接結合切断による一般に観測されるニュートラルロスもＴＮＬデータベースに組み込むことができる。同様に、ＴＮＬデータベースにより包含される構造体の多様性を増大させるため、ＴＮＬの脂肪酸組成をユーザにより定義された炭素範囲内にて体系的に変更させることができる。
【００５８】
この実施形態において、獲得したＭＳｎデータをＴＳＩデータベースにおいて検索し、考えられ得る特徴的なイオンを見つけることができ、任意の同定される特徴的なイオンを含まないスペクトルを除外することができる。任意の同定可能な特徴的なイオンは、選択された脂質の還元及び／又は非還元部分に対応する式を示唆する。特徴的なイオンの質量をその前駆体から減算することにより、次いで特徴的なイオンのニュートラルロスを算出することができ、ＴＮＬデータベースにおいて検索することができる。特徴的なイオンと、一致したニュートラルロスとの組合せを使用し、予備的な候補構造体を提供することができる。
【００５９】
更なる実施形態において、理論的ニュートラルロスのデータベースにおけるＭＳｎデータの特徴的なイオンのニュートラルロスを検索し、解離式を同定することは、
（Ａ）対応するＭＳｎ−１スペクトルのＭＳｎスペクトルの前駆体イオン毎のニュートラルロスを決定するとともに、理論的ニュートラルロスのデータベースにおいて検索することと、
（Ｂ）ＭＳ１レベルに達するまで工程（Ａ）を反復的に繰り返すことと、
を含み、
工程（ｉｉ）は各ＭＳｎレベルから統合するデータに基づいて、試料中の真菌から真菌脂質構造体を提供することを含む。
【００６０】
この実施形態において、各スペクトルのイオン全ての算出されたニュートラルロスもＴＮＬデータベースにおいて検索し、スペクトルアノテーション（すなわち、脂質−スペクトル一致（ＬＳＭ））の所望の情報を提供することができる。予備的な構造体を割り当てた後、１つ又は複数（又は全ての）ＭＳｎスペクトルの前駆体イオンのニュートラルロスを、対応するＭＳｎ−１スペクトルにおいて算出し、例えば、考えられ得る解離パターンを同定するため、再度ＴＮＬデータベースにおいて検索することができる。本方法は、ＭＳ１レベルに達するまで反復的に進めることができる。最終構造体を、例えば、様々なＭＳｎデータレベルから獲得した情報を統合することにより推論することができる。
【００６１】
別の実施形態において、理論的ＭＳｎスペクトルと獲得されたＭＳｎスペクトルとの間の相関に基づき、各真菌脂質の候補構造体へのスコアの割り当ては、
（Ａ）直接結合切断による真菌脂質の候補構造体をフラグメント化し、フラグメントを生成することと、
（Ｂ）フラグメントを真菌脂質の候補構造体の理論的解離を表す再構築された質量スペクトルに組み合わせることと、
（Ｃ）理論的ＭＳｎスペクトルと再構成された質量スペクトルとの相関に基づき、スコアを真菌脂質の候補構造体のそれぞれに割り当てることと、
を含む。
【００６２】
この実施形態において、ＬＳＭ毎に、仮説の真菌脂質構造体を、グリコシド結合切断（すなわち、Ａ／Ｘ、Ｂ／Ｙ、Ｃ／Ｚ型イオン）、Ｏ−及びＮ−結合型アシル鎖の消失、リン酸の消失、単糖の消失、及び消失の組合せを表す摂動を含む直接結合切断を主に基本として、コンピュータ上でフラグメント化することができる。フラグメントは次に、例えば、候補構造体の理論的解離を表す再構築された質量スペクトルと組み合わせることができる。
【００６３】
別の実施形態において、Ｘスコアを脂質−スペクトル一致（ＬＳＭ）に適用して、１つ又は複数の獲得したＭＳｎスペクトルと理論的タンデム質量スペクトルとの間の適合の近接性を評価することができる。それぞれの再構築された質量スペクトルのピーク強度を、例えば、１が例えば、上記のｍ／ｚ値のフラグメントの存在を表すブーリアン値に割り当てることができる。獲得した質量スペクトルと仮説の構造体の再構築された質量スペクトルとの間のＸスコアを、下記の実施例に開示されたものを含むが、それらに限定されない任意の好適なスコアスキームを使用して測定することができる。
【００６４】
一実施形態において、各Ｘスコアの算出は、再構築された質量スペクトルｘと、予備的にプロセッシングされ、獲得した質量スペクトルｙ’との間のスカラードット積となり、τは補正因子となる。
【００６５】
更なる実施形態において、本方法は、例えば、候補真菌脂質構造体をオンザフライにてシャッフリングすることによりデコイを生成し、同時に各ＭＳｎスペクトルを分析するターゲット−デコイ法の使用を含むことができる。一実施形態において、このようなシャッフリングは、真菌脂質の脂肪酸側鎖の位置及び長さに対してのみ行われる。このアプローチによって、全てのデコイ真菌脂質がターゲット（すなわち、候補）の真菌脂質構造体と同じ分子組成及び質量を正確に表すことが確実となる。次いで、候補及びデコイＬＳＭの両方のＸスコアを算出し、有意性の評価に役立てる。
【００６６】
本発明の任意の実施形態又は実施形態の組合せの方法を単独にて、又は他の真菌の同定方法、例えば、タンパク質のＭＳパターンに基づいたものと組み合わせて使用することができる。したがって、別の実施形態では、本方法は、前記試料中の真菌タンパク質の前駆体イオンの質量スペクトルデータを取得することと、前記タンパク質質量スペクトルデータを、真菌タンパク質の前駆体イオン質量スペクトルデータのデータベースと比較することとを含み、前記比較を使用して、前記試料中の真菌の同定に役立てる。更なる実施形態において、試料を加工し、真菌脂質の単離用の試料加工の一環として試料のｐＨを約４〜５、例えば、約４．５のｐＨに維持する標準的なプロトコルを使用してタンパク質とともに真菌脂質を得る。例示の一実施形態において、このような技法は真菌ペレットを酢酸ナトリウム（例えば、５ｍｌ〜２０ｍｌ）と接触させ、又は加熱し、若しくは加熱せずに試料のｐＨ約４．５を得る任意の他の好適な処理を行い、混合し、真菌を再懸濁させることを含む。次に、アセトニトリルを添加し（例えば、約５ｍｌ〜２０ｍｌ）、試料を混合した後、遠心分離し（例えば、約２５０００ｇにて、約２分間）、ＭＳ分析用の上清を得る。別の実施形態において、真菌の試料を２つの試料に分け、第１の試料をペレット化し、上記のように処理し、第２の試料は酢酸ナトリウムをギ酸と置き換えた以外は同様に処理する。この実施形態において、第１の試料を真菌脂質分析に使用することができ、第２の試料をタンパク質分析に使用することができる。更なる実施形態において、試料を酢酸ナトリウムの手法を介して処理し、試料の一部を真菌脂質分析に使用し、例えば試料の残りをタンパク質分析用にギ酸を用いて処理する。
【００６７】
この実施形態において、本発明の方法を、タンパク質のＭＳ分析と組合せて使用し、タンパク質のＭＳ分析の効率を向上させることができる。このようなタンパク質のＭＳ分析の一実施形態には、ブルカーＭＡＬＤＩバイオタイパー（商標）質量分析計プラットフォーム（Bruker Daltonics）がある。例えば、Sauer他、PLoS ONE 3(7): e2843. doi:10.1371/journal.pone.0002843を参照されたい。本発明の方法は、タンパク質系ＭＳ技法と比較して（又はタンパク質系ＭＳ技法と組み合わせて）、真菌の同定の精度を向上させる。
【００６８】
計算環境例
質量分析計又は類似のデバイスにより生成された１つ又は複数の入力スペクトルデータ（例えば、ＰＩＭＳ、多重化された質量スペクトル、ＭＳｎスペクトルデータ）と、１つ又は複数の記憶スペクトルデータ（例えば、データベース等に記憶スペクトルデータ）との間の比較の結果は、「スペクトル識別子」として作動する計算デバイスを使用して自動にて行うことができる。
【００６９】
完了時に、比較の結果に関連するコンテンツをスペクトル識別子により生成することができる。例えば、コンテンツには、好ましくはスペクトル識別子又はクライアントデバイスのいずれかのグラフィカルユーザインターフェースを介してユーザに表示される、グラフ、画像、英数字、及び／又はビデオコンテンツを含むことができる。
【００７０】
例えば、図１は、ネットワーク１０６を介して質量分析計１０２及びクライアントデバイス１０４ａ、１０４ｂと通信するよう構成されたスペクトル識別子１０８を示す。ネットワーク１０６は、ネットワーク型計算デバイス間の通信経路となるよう構成された、ＬＡＮ、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、企業内イントラネット、公共インターネット、又は任意の他の種類のネットワークに対応することができる。ネットワーク１０６はまた、１つ又は複数のＬＡＮ、ＷＡＮ、企業内イントラネット、及び／又は公共インターネットの組合せに対応することができる。
【００７１】
図１には２つのクライアントデバイスのみを示しているが、分配アプリケーションアーキテクチャは、数十、数百、又は数千のクライアントデバイスを使用することができる。さらに、クライアントデバイス１０４ａ及び１０４ｂ（又は任意の追加のクライアントデバイス）は、任意の種類の計算デバイス、例えば、一般的なラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ネットワーク端末、ワイヤレス通信デバイス（例えば、携帯電話又はスマートフォン）等であってよい。いくつかの実施形態において、クライアントデバイス１０４ａ及び１０４ｂは、ＭＳ及び／又は真菌検索専用であってよい。他の実施形態において、クライアントデバイス１０４ａ及び１０４ｂを、多くのタスクを行い、ＭＳ又は真菌検索専用とする必要のないよう構成された汎用コンピュータとして使用することができる。更に他の実施形態において、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０の機能性を、クライアントデバイス、例えば、クライアントデバイス１０４ａ及び／又は１０４ｂに組み込むことができる。更に他の実施形態において、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０の機能性を質量分析計１０２に組み込むことができる。
【００７２】
質量分析計１０２を入力材料、例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及び／又はステロールを受け取り、出力として１つ又は複数のスペクトルを生成するよう構成することができる。例えば、質量分析計１０２は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析計又はＳＡＷＮ系質量分析計又はＭＡＬＤＩ質量分析計であってよい。いくつかの実施形態において、出力スペクトルを、恐らくは入力としてデバイスに使用される別のデバイス、例えば、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０に提供することができる。他の実施形態において、出力スペクトルを質量分析計１０２、クライアントデバイス１０４ａ及び／又は１０４ｂ、及び／又はスペクトル識別子１０８に表示することができる。
【００７３】
スペクトル識別子１０８を、質量分析計１０２及び／又はクライアントデバイス（複数の場合もあり）１０４ａ及び／又は１０４ｂからネットワーク１０６を介して、入力として１つ又は複数のスペクトルを受信するよう構成することができる。いくつかの実施形態において、スペクトル識別子を、スペクトル識別子１０８へのキー入力、タッチパッド若しくは同様のデータ入力、質量分析計１０２及び／又はクライアントデバイス（複数の場合もあり）１０４ａ及び／又は１０４（ｂ）への有線接続（複数の場合もあり）、入力スペクトル（例えば、スペクトルデータベース１１０、フラッシュメディア、コンパクトディスク、フロッピーディスク、磁気テープ）を記憶するよう構成されたアクセス記憶媒体、及び／又はスペクトル識別子１０８に入力スペクトルを直接送る任意の他の技法を介して、入力スペクトルを直接受信するよう構成することができる。
【００７４】
１つ又は複数の入力スペクトルは、例えば、所与の入力材料からｎ個の関連スペクトルのＭＳｎ配列を含むことができる。ｎ個の関連スペクトルのそれぞれは、入力材料の１つ又は複数の異なるイオン及び／又は中性フラグメントに関連し得る。
【００７５】
スペクトル識別子１０８を、１つ又は複数の入力スペクトルを、記憶スペクトル１１２と比較することによりスペクトル識別の結果を生成するよう構成することができる。例えば、記憶スペクトル１１２は、既知の前駆体イオン質量スペクトル（ＰＩＭＳ）データ、多重化されたイオン質量分析スペクトルデータ、又はＭＳｎデータであってよい。図１に示されるように、記憶スペクトル１１２は、スペクトルデータベース１１０に属し得る。スペクトル識別を行うとき、スペクトル識別子１０８は、スペクトルデータベース１１０にアクセスし、及び／又はクエリし、記憶スペクトル１１２の一部又は全てを読み出すことができる。いくつかの実施形態において、スペクトル識別子１０８は、比較タスクを直接行うことができ、一方、他の実施形態において、スペクトル識別タスクの一部又は全ては、恐らくは記憶スペクトル１１２上にて１つ又は複数のクエリ言語コマンドを実行することによって、スペクトルデータベース１１０により行うことができる。
【００７６】
図１は、直接に接続されたスペクトル識別子１０８及びスペクトルデータベース１１０を示し、他の実施形態において、スペクトル識別子１０８は、記憶スペクトル１１２を記憶することを含む、スペクトルデータベース１１０の機能性を含むことができる。更に他の実施形態において、スペクトル識別子１０８及びスペクトルデータベース１１０を、ネットワーク１０６を介して接続することができる。
【００７７】
入力スペクトルを識別する上で、スペクトル識別子１０８を、クライアントデバイス１０４ａ及び／又は１０４ｂによりリクエストされたとき、スペクトル識別の結果に少なくとも関連するコンテンツを送るよう構成することができる。スペクトル識別の結果に関連したコンテンツは、ウェブページ、ハイパーテキスト、スクリプト、バイナリデータ、例えば、コンパイルソフトウェア、画像、オーディオ、及び／又はビデオを含むことができるが、それらに限定されない。コンテンツには、圧縮された及び／又は圧縮されていないコンテンツを含むことができる。コンテンツは、暗号化及び／又は非暗号化のものであってよい。他の種類のコンテンツも十分に可能である。
【００７８】
計算デバイスアーキテクチャ
図２Ａは実施形態例による計算デバイス（例えば、システム）のブロック図である。特に、図２Ａに示される計算デバイス２００を、質量分析計１０２、クライアントデバイス１０４ａ、１０４ｂ、ネットワーク１０６、スペクトル識別子１０８、スペクトルデータベース１１０、及び／又は記憶スペクトル１１２の１つ又は複数の機能を行うよう構成することができる。計算デバイス２００は、ユーザインターフェースモジュール２０１と、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２と、１つ又は複数のプロセッサ２０３と、データ記憶部２０４とを含むことができ、その全てがシステムバス、ネットワーク、又は他の接続機構２０５を介してともに接続することができる。
【００７９】
ユーザインターフェースモジュール２０１は、外部ユーザ入力／出力デバイスにデータを送信し、及び／又は外部ユーザ入力／出力デバイスからデータを受信するように動作可能とすることができる。例えば、ユーザインターフェースモジュール２０１を、ユーザ入力デバイス、例えば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、カメラ、音声認識モジュール、及び／又は他の類似のデバイスにデータを送信し、及び／又はこれらのデバイスからデータを受信するよう構成することができる。ユーザインターフェースモジュール２０１を、現在知られており、又は今後開発される、ユーザディスプレイデバイス、例えば、１つ又は複数の陰極線管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）技術を使用したディスプレイ、プリンター、白熱電球、及び／又は他の類似のデバイスに出力するようにも構成することができる。ユーザインターフェースモジュール２０１を、可聴出力（複数の場合もあり）、例えば、スピーカー、スピーカージャック、オーディオ出力ポート、オーディオ出力デバイス、イヤフォン、及び／又は他の類似のデバイスを生成するようにも構成することができる。
【００８０】
ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２は、ネットワーク、例えば、図１に示されるネットワーク１０６を介して通信するよう構成可能な、１つ若しくは複数の無線インターフェース２０７及び／又は１つ若しくは複数の有線インターフェース２０８を含むことができる。無線インターフェース２０７は、１つ又は複数の無線送信機、受信機、及び／または送受信機、例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ(登録商標)送受信機、Ｚｉｇｂｅｅ送受信機、Ｗｉ−Ｆｉ送受信機、ＷｉＭＡＸ送受信機、及び／又は無線ネットワーク介して通信するよう構成可能な他の類似の種類の無線送受信器を含むことができる。有線インターフェース２０８は、１つ又は複数の有線送信機、受信機、及び／又は送受信機、例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ送受信機、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）送受信機、又はツイストペア、１つ若しくは複数の配線、同軸ケーブル、光ファイバ接続、若しくは有線ネットワークへの類似の物理的接続を介して通信するよう構成可能な類似の送受信機を含むことができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２を、信頼性のある、安全な、及び／又は認証された通信を行うよう構成することができる。本明細書に記載の各通信に対して、信頼性のある通信を確実に行うための情報（すなわち、保証されたメッセージ配信）を、恐らくはメッセージヘッダー及び／又はフッター（例えば、パケット／メッセージ順序情報、カプセル化ヘッダー（複数の場合もあり）及び／又はフッター（複数の場合もあり）、サイズ／時間情報、及び送信照合情報、例えば、ＣＲＣ及び／又はパリティチェック値）の一部として送ることができる。通信は、例えば、ＤＥＳ、ＡＥＳ、ＲＳＡ、Ｄｉｆｆｉｅ−Ｈｅｌｌｍａｎ、及び／又はＤＳＡに限定されない１つ又は複数の暗号プロトコル及び／又はアルゴリズムを使用して、保護化（例えば、符号化又は暗号化）及び／又は解読／復号することができる。他の暗号プロトコル及び／又はアルゴリズムを十分に又は本明細書に記載のものに追加して、通信を保護化（及び後に解読／復号）することができる。
【００８２】
プロセッサ２０３は、１つ若しくは複数の汎用プロセッサ及び／又は１つ若しくは複数の特定用途のプロセッサ（例えば、デジタルシグナルプロセッサ、特定用途向け集積回路等）を含むことができる。プロセッサ２０３を、記憶部２０４及び／又は本明細書に記載の他の命令部に含まれるコンピュータ可読プログラム命令部２０６を実行するよう構成することができる。
【００８３】
データ記憶部２０４は、プロセッサ２０３の少なくとも１つにより読み取り及び／又はアクセスすることができる１つ又は複数のコンピュータ可読記憶媒体を含むことができる。１つ又は複数のコンピュータ可読記憶媒体は、揮発性及び／又は非揮発性記憶構成要素、例えば、光学、磁性、有機若しくは他のメモリ又はディスク記憶装置を含むことができ、これらの全体又は一部をプロセッサ２０３の少なくとも１つと統合させることができる。いくつかの実施形態において、データ記憶部２０４を、単体の物理的デバイス（例えば、１つの光学、磁性、有機若しくは他のメモリ又はディスク記憶装置）を使用して実行することができ、同時に、他の実施形態において、データ記憶部２０４を、２つ以上の物理的デバイスを使用して実行することができる。
【００８４】
データ記憶部２０４は、コンピュータ可読プログラム命令部２０６及び恐らくは追加のデータを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、データ記憶部２０４は、スペクトルデータベース及び／又は記憶スペクトル、例えば、スペクトルデータベース１１０及び／又は記憶スペクトル１１２それぞれの一部又は全てを記憶することができる。いくつかの実施形態において、データ記憶部２０４は更に、本明細書に記載の方法及び技法の少なくとも一部及び／又は本明細書に記載のデバイス及びネットワークの機能性の少なくとも一部を行うのに必要な記憶部を含むことができる。
【００８５】
図２Ｂは、実施形態例によるクラウドベースサーバーシステムとして配置された計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、２０９ｃのネットワーク１０６を示す。スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０は、クラウドベースアプリケーション及び／又はサービスのプログラムロジック及び／又はデータを記憶するクラウドベースデバイスであってよい。いくつかの実施形態において、スペクトル識別子１０８及びスペクトルデータベース１１０は、１つの計算センターにある単体の計算デバイスであってよい。他の実施形態において、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０は、１つの計算センターにある多重計算デバイス又は更には多様な地理的位置にある多重計算センターに位置する多重計算デバイスを含むことができる。例えば、図１は、異なる物理的位置にあるスペクトル識別子１０８及びスペクトルデータベース１１０のそれぞれを示す。
【００８６】
いくつかの実施形態において、スペクトル識別子１０８及びスペクトルデータベース１１０にてデータ及びサービスを、有形コンピュータ可読媒体（又はコンピュータ可読記憶媒体）に記憶され、クライアントデバイス１０４ａ及び１０４ｂ、及び／又は他の計算デバイスによりアクセス可能なコンピュータ可読情報として符号化することができる。いくつかの実施形態において、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０のデータを、単一のディスクドライブ又は他の有形記憶媒体に記憶することができ、又は１つ若しくは複数の多様な地理的位置に位置する多重ディスクドライブ若しくは他の有形記憶媒体上で実行することができる。
【００８７】
図２Ｂは、実施形態例によるクラウドベースサーバーシステムを示す。図２Ｂにおいて、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０の機能を３つの計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０８ｃの間で分配することができる。計算クラスタ２０９ａは、ローカルクラスタネットワーク２１２ａによって接続される１つ又は複数の計算デバイス２００ａ、クラスタ記憶アレイ２１０ａ、及びクラスタルーター２１１ａを含むことができる。同様に、計算クラスタ２０９ｂは、ローカルクラスタネットワーク２１２ｂによって接続される１つ又は複数の計算デバイス２００ｂ、クラスタ記憶アレイ２１０ｂ、及びクラスタルーター２１１ｂを含むことができる。同様に、計算クラスタ２０９ｃは、ローカルクラスタネットワーク２１２ｃによって接続される計算デバイス２００ｃ、クラスタ記憶アレイ２１０ｃ、及びクラスタルーター２１１ｃを含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０９ｃのそれぞれは、等しい数の計算デバイス、等しい数のクラスタ記憶アレイ、及び等しい数のクラスタルーターを有し得る。しかし、他の実施形態において、それぞれの計算クラスタは、様々な数の計算デバイス、様々な数のクラスタ記憶アレイ、及び様々な数のクラスタルーターを有し得る。各計算クラスタの計算デバイス、クラスタ記憶アレイ、及びクラスタルーターの数は、各計算クラスタに割り当てられた１つ又は複数の計算タスクに左右され得る。
【００８９】
計算クラスタ２０９ａにおいて、例えば、計算デバイス２００ａを、スペクトル識別子１０８の種々の計算タスクを行うように構成することができる。一実施形態において、スペクトル識別子１０８の種々の機能性を、計算デバイス２００ａ、２００ｂ、及び２００ｃの１つ又は複数の間にて分配することができる。計算クラスタ２０９ｂ及び２０９ｃの計算デバイス２００ｂ及び２００ｃを、計算クラスタ２０９ａの計算デバイス２００ａと同様に構成することができる。一方、いくつかの実施形態において、計算デバイス２００ａ、２００ｂ、及び２００ｃを、様々な機能を行うよう構成することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、サーバーデバイス１０８及び／又は１１０と関連した計算タスク及び記憶したデータを、スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０のプロセッシング要件、計算デバイス２００ａ、２００ｂ、及び２００ｃのプロセッシング能力、各計算クラスタの計算デバイス間及び計算クラスタそのものの間のネットワークリンクの待ち時間、及び／又は費用、速度、フォールトトレランス、回復力、効率、及び／又は全体のシステムアーキテクチャの他の設計目標に寄与することができる他の因子の少なくとも一部に基づき計算デバイス２００ａ、２００ｂ、及び２００ｃ全体に分配することができる。
【００９１】
計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０９ｃのクラスタ記憶アレイ２１０ａ、２１０ｂ、及び２１０ｃは、ハードディスクドライブのグループにアクセスする読み取り及び書き込みを管理するよう構成されたディスクアレイコントローラーを含むデータ記憶アレイであってよい。ディスクアレイコントローラーはまた、単独又は関連の計算デバイスと組み合わせ、クラスタ記憶アレイに記憶したデータのバックアップ又は冗長なコピーを管理し、ディスクドライブ又は１つ若しくは複数の計算デバイスが１つ若しくは複数のクラスタ記憶アレイにアクセスすることを妨げる他のクラスタ記憶アレイの故障及び／又はネットワークの故障に対して保護されるよう構成することができる。
【００９２】
スペクトル識別子１０８及び／又はスペクトルデータベース１１０の機能を計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０９ｃの計算デバイス２００ａ、２００ｂ、及び２００ｃ全体に分配することができることと同様に、これらの構成要素の種々のアクティブな部分及び／又はバックアップ部分を、クラスタ記憶アレイ２１０ａ、２１０ｂ、及び２１０ｃ全体に分配することができる。例えば、いくつかのクラスタ記憶アレイを、スペクトル識別子１０８のデータを記憶するよう構成することができ、一方、他のクラスタ記憶アレイは、スペクトルデータベース１１０のデータを記憶することができる。さらに、いくつかのクラスタ記憶アレイを、他のクラスタ記憶アレイに記憶したデータのバックアップバージョンを記憶するよう構成することができる。
【００９３】
計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、及び２０９ｃのクラスタルーター２１１ａ、２１１ｂ、及び２１１ｃは、計算クラスタの内部及び外部通信を行うよう構成されたネットワーク装置を含むことができる。例えば、計算クラスタ２０９ａのクラスタルーター２１１ａは、（ｉ）ローカルクラスタネットワーク２１２ａを介して計算デバイス２００ａとクラスタ記憶アレイ２０１ａとの間でのローカルエリアネットワーク通信及び（ｉｉ）広域ネットワーク接続２１３ａを介してネットワーク１０６にて計算クラスタ２０９ａと計算クラスタ２０９ｂ及び２０９ｃとの間での広域ネットワーク通信を行うよう構成される１つ又は複数のインターネット切り替えデバイス及びルーティングデバイスを含むことができる。クラスタルーター２１１ｂ及び２１１ｃは、クラスタルーター２１１ａに類似のネットワーク装置を含むことができ、クラスタルーター２１１ｂ及び２１１ｃは、クラスタルーター２１１ａが計算クラスタ２０９ａに対して行うものと類似の、計算クラスタ２０９ｂ及び２０９ｂに対するネットワーク機能を行うことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、クラスタルーター２１１ａ、２１１ｂ、及び２１１ｃの構成は、計算デバイス及びクラスタ記憶アレイのデータ通信要件、クラスタルーター２１１ａ、２１１ｂ、及び２１１ｃのネットワーク装置のデータ通信能力、ローカルネットワーク２１２ａ、２１２ｂ、２１２ｃの待ち時間及びスループット、広域ネットワークリンク２１３ａ、２１３ｂ、及び２１３ｃの待ち時間、スループット、及び費用、及び／又は費用、速度、フォールトトレランス、回復力、効率及び／又は減速システムアーキテクチャの他の設計目標に寄与することができる他の因子に少なくとも一部に基づくことができる。
【００９５】
スペクトル識別アルゴリズム例
図３Ａは、スペクトル識別のための方法例３００を示す。ブロック３１０にて、入力スペクトルを受信する。入力スペクトルは、例えば、未処理のデータフォーマット、ＪＣＡＭＰ−ＤＸ、ＡＮＤＩ−ＭＳ、ｍｚＸＭＬ、ｍｚＤａｔａ、及び／又はｍｚＭＬを利用することに限定されないスペクトル用の任意のフォーマットを利用することができる。他のフォーマットを同様に、又は代わりに使用することができる。
【００９６】
ブロック３２０にて、入力スペクトルの１つ又は複数のピークを識別する。ピークを上記のＭａｓｓＳｐｅｃＷａｖｅｌｅｔ技法を使用して、又は相対強度若しくは存在量により入力スペクトルを選別し、選別した入力スペクトルの点であるＴ＞０のＴの頂点を用いる等の他の技法を介して決定することができる。同様に他の技法を使用することができる。
【００９７】
図３Ｂは、入力スペクトル例３６０（正：an example input spectrum 360）及び入力スペクトル３６０のピークの対応グラフ３６２を示す。図３Ｂは特に、ピークグラフ３６２に表示されるように、入力スペクトル３６０の３つの最も大きなピーク、それぞれピーク３６４ａ、ピーク３６４ｂ、及びピーク３６４ｃを識別する。
【００９８】
図３Ａに戻り、ブロック３３０にて、入力スペクトルのピークと１つ又は複数の記憶スペクトルのピークとの間の比較を行う。記憶スペクトルを例えば、未処理のデータフォーマット、ＪＣＡＭＰ−ＤＸ、ＡＮＤＩ−ＭＳ、ｍｚＸＭＬ、ｍｚＤａｔａ、及び／又はｍｚＭＬ内への記憶に限定されないスペクトルの任意のフォーマットに記憶することができる。いくつかの実施形態において、入力スペクトル及び／又は記憶スペクトルの一部若しくは全てを比較前又は比較中にフォーマット間にて変換することができる。記憶スペクトルはまた、追加の情報、例えば、化合物、分子、構造体、物質、イオン、フラグメント、又はスペクトルを識別するために使用することができる他の識別子の名称を含むことができる。例えば、記憶スペクトルは、純水のスペクトルである場合、記憶スペクトルは、「水」又は「Ｈ２Ｏ」等の追加の情報を含むことができ、記憶スペクトルの識別に役立つ。
【００９９】
入力スペクトルのピークが１つ又は複数の記憶スペクトルのピークと一致する場合、方法３００はブロック３３４に進む。さもなければ、方法３００は、「一致せず」のディスプレイが生成され、表示されてブロック３３２に進む。ブロック３３２の手法を完了後に、方法３００はブロック３５０に進むことができる。
【０１００】
ブロック３３４にて、入力スペクトルを、ブロック３３０にて識別された、１つ又は複数の一致し、かつ記憶スペクトルのそれぞれと比較する。例えば、相対強度及び質量／電荷比の値を備えたスペクトルについて考慮する。入力スペクトル及び一致スペクトルのそれぞれに対して、相対的存在量及び質量／電荷値のドット積を用いて、重み付けされた平均質量／電荷値を決定することができる。次いで、入力スペクトルＡ（ＩＳ）の重み付けされた平均質量／電荷値を、一致スペクトルＡ（ＭＳｉ）（ｉ＝１）に対して一致スペクトルの数に重み付けされた平均質量／電荷値のそれぞれと比較することができる。スペクトルｊと、Ａ（ＩＳ）に最も近い重み付けされた平均質量／電荷値Ａ（ＭＳｊ）との一致は、最も良好な一致スペクトルであると見なすことができる。いくつかの実施形態において、Ａ（ＭＳｊ）とＡ（ＩＳ）との差を決定することができ、この差の絶対値が閾値より大きい場合、最も良好な一致スペクトルは、入力スペクトルと一致しないと見なすことができる。２つのスペクトルが一致すると見なされない場合、方法３００はブロック３３２に進むことができる（図３Ａに図示されない対照の移動）。
【０１０１】
ブロック３４０にて、一致が認められるとき、最も良好な一致のスペクトルに基づいた出力を生成することができる。例えば、記憶スペクトルに対する識別情報が保持される場合、出力は、一致スペクトルの固有性を示すことができる。加えて又は代わりに、入力スペクトル及び／又は一致スペクトルをディスプレイの一部として示すことができる。さらに、Ａ（ＭＳｊ）及びＡ（ＩＳ）は、同様にディスプレイの一部となり得る。他の情報は同様にディスプレイの一部となり得る。
【０１０２】
ユーザインターフェースモジュール、例えば、ユーザインターフェースモジュール２０１、及び／又はネットワーク通信インターフェースモジュール、例えば、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２の構成要素の一部又は全てを使用して出力することができる。例えば、出力をディスプレイに表示し、印刷し、１つ若しくは複数のスピーカーを使用して音声として放出し、及び／又はネットワーク通信インターフェースモジュールを使用して別のデバイスに送信することができる。同様に他の例も可能である。
【０１０３】
ブロック３５０にて、プロセッシングされる追加の入力スペクトルがあるかについて決定を行う。プロセッシングされる追加のスペクトルがある場合、方法３００はブロック３１０に進むことができ、さもなければ、方法３００はブロック３５２に進むことができ、この場合、方法３００は終了する。
【０１０４】
図４は、スペクトル識別に対する別の方法例４００を示す。
【０１０５】
方法４００のブロック４１０にて、材料構造体を初期化する。例えば、材料構造体を構造体なしに初期化することができ、又は、材料のクラスが既知の材料（例えば、脂質）を分析する場合、材料構造体を材料のクラスが既知の一般的な部材に初期化することができる。
【０１０６】
ブロック４２０にて、入力スペクトルを受信する。入力スペクトルは、例えば、未処理のデータフォーマット、ＪＣＡＭＰ−ＤＸ、ＡＮＤＩ−ＭＳ、ｍｚＸＭＬ、ｍｚＤａｔａ、又はｍｚＭＬに限定されないスペクトル用の任意のフォーマットで表すことができる。他のフォーマットを同様に、又は代わりに使用することができる。
【０１０７】
ブロック４３０にて、入力スペクトルの１つ又は複数のピークを識別する。ピークを上記のＭａｓｓＳｐｅｃＷａｖｅｌｅｔ技法を使用して、又は相対強度若しくは存在量により入力スペクトルを選別し、選別した入力スペクトルの点であるＴ＞０のＴの頂点を用いる等の他の技法を介して決定することができる。同様に他の技法を使用することができる。
【０１０８】
ブロック４４０にて、入力スペクトルに関連する任意の理論的に特徴のあるイオン（ＴＳＩ）があるかについて決定を行う。データベースクエリ又は理論的に特徴のあるイオンに対する記憶したデータと、入力スペクトルの識別されたピークとの間の他の比較を介して決定を行うことができる。いくつかの実施形態において、１種又は複数種の前駆体イオンに関するデータを記憶し、理論的に特徴のあるイオンと関連付けることができる。他の実施形態において、確率の情報、例えば、識別に対する分類スコアを生成し、データベースクエリの一部としてデータベースに移し、理論的に特徴的なイオンの識別を補助するのに使用することができる。
【０１０９】
１種又は複数種の理論的に特徴のあるイオンが入力スペクトルと関連付けられると認められる場合、方法４００をブロック４４４に進めることができる。
【０１１０】
しかし、理論的に特徴のあるイオンが入力スペクトルと関連付けられると認められない場合、方法４００をブロック４４２に進めることができ、終了する。
【０１１１】
ブロック４４４にて、入力スペクトルに対するニュートラルロスを決定することができる。例えば、特徴的なイオンの質量を算出し、入力スペクトルのニュートラルロスの値として使用することができる。多数の特徴的なイオンが入力スペクトルと関連付けられると決定される場合、それぞれの特徴的なイオンの質量をニュートラルロス値として使用することができる。別の例として、特徴的なイオンに対する記憶したデータは、１つ又は複数のニュートラルロス値を含むことができ、これを入力スペクトルのニュートラルロス値（複数の場合もあり）として使用することができる。
【０１１２】
ブロック４５０にて、候補構造体（複数の場合もあり）のニュートラルロスが入力スペクトルのニュートラルロスと一致することを認めることができる。例えば、１つ又は複数の理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）値を理論的ニュートラルロスデータベースに記憶することができる。いくつかの実施形態において、理論的ニュートラルロスデータベースは、１つ又は複数の記録であってよく、それぞれが、重要となるニュートラルロス値及び重要なニュートラルロス値に関連付けられる属性として１つ又は複数の候補構造体を有する。これらの実施形態において、理論的ニュートラルロスデータベースを、各ニュートラルロス値を用いてクエリすることができ、これらのクエリにより読み出した任意の構造体（複数の場合もあり）を候補構造体として取り扱うことができる。
【０１１３】
ブロック４６０にて、各候補構造体のＸスコアを決定することができる。Ｘスコアを、以下の実施例に開示されたものを含むが、それらに限定されない任意の好適なスコアスキームを使用して所与の候補構造体と、入力スペクトルとの間にて決定することができる。例えば、Ｘスコアの算出は、追加された所与の候補構造体を含む材料構造体と、恐らくは補正因子にて調節される入力スペクトルの一部又は全てとの間のスカラードット積であってよい。
【０１１４】
ブロック４７０にて、最も良好なＸスコアを有する候補構造体を最も良好な候補構造体として選択することができる。
【０１１５】
ブロック４８０にて、材料構造体を、最も良好な候補構造体を含むよう更新することができる。
【０１１６】
ブロック４９０にて、プロセッシングされる追加の入力スペクトルがあるかについて決定を行う。プロセッシングされる追加のスペクトルがある場合、方法４００はブロック４２０に進むことができ、さもなければ、方法３００はブロック４９２に進むことができる。
【０１１７】
ブロック４９２にて、材料構造体に基づいた出力を生成することができる。出力は、材料構造体、入力スペクトル、候補構造体の一部若しくは全て、識別情報及び／又は他の情報を含むことができる。
【０１１８】
ユーザインターフェースモジュール、例えば、ユーザインターフェースモジュール２０１、及び／又はネットワーク通信インターフェースモジュール、例えば、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２の構成要素の一部又は全てを使用して出力することができる。例えば、出力をディスプレイに表示し、印刷し、１つ若しくは複数のスピーカーを使用して音声として放出し、及び／又はネットワーク通信インターフェースモジュールを使用して別のデバイスに送信することができる。同様に他の例も可能である。
【０１１９】
ブロック４９２の手法を完了後、方法４００を終了することができる。
【０１２０】
理論的に特徴のあるイオン及び理論的質量の生成
第２の態様において、本発明は、
（ａ）複数の様々な真菌から得られた、真菌脂質又はその前駆体分子の前駆体イオンのＰＩＭＳデータを取得することと、
（ｂ）前駆体イオンのｍ／ｚ値及び互いに対する前駆体イオンシグナルの相対比を決定することと、
（ｃ）前駆体イオンのｍ／ｚ値及び所与の真菌の互いに対する前駆体イオンシグナルの相対比についてのコンセンサス値を決定することと、
（ｄ）真菌の種類の特徴としてデータベースのコンセンサス値を記憶することと、
を含む、真菌脂質、例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールの前駆体イオン及び多重化された質量スペクトル及び／又はＭＳｎデータのライブラリを構築する方法を提供する。
【０１２１】
上記に開示されるように、本発明のライブラリを、例えば、真菌種の自動同定に使用することができる。ライブラリからアクセス可能な情報には、ｉ）真菌種、真菌のＭＳ１表現型と、ｉｉ）脂質階層型タンデム質量スペクトル（ＭＳ１〜ＭＳｎ）と、ｉｉｉ）アノテーション付きの脂質構造と、ｉｖ）各ＭＳ１データセットの主要な前駆体イオン種の理論的及び観測される同位体分布とがある。
【０１２２】
本発明の第１の態様の全ての実施形態及び実施形態の組合せを、文脈上他に明記されない限り、この第２の態様に使用することができる。したがって、真菌から真菌脂質の試料を抽出／単離する方法は、本明細書に開示の方法のいずれかを含むが、それらに限定されない。同様に、使用することができるＭＳデバイス／技法の全ての実施形態は、本態様において、ＰＩＭＳデータを取得し、前駆体イオンのｍ／ｚ値及び互いに対する前駆体イオンシグナルの相対比を決定する種々の実施形態と等しく適用可能である。一実施形態において、ポジティブイオンモード及びネガティブイオンモードの両方のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び／又はＳＡＷＮ−ＩＴＭＳｎデータを使用する。非限定的な一例において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ１データを（他のＭＳ計測器型からのデータとともに）使用し、ポジティブイオンモード及びネガティブイオンモードにおいて、前駆体イオン（すなわちＭＳ１）データをデータベースに追加する。これらのＭＳ１データは、数と、ｍ／ｚ値及び互いに対する相対強度の２つのカラムからなる。様々なプラットフォームのＭＳ１データの獲得により、各抽出物の技法的反復並びに計測器による差及び操作者による真菌同定に与える影響への理解が得られる。さらに、このデータの獲得により、ポジティブイオンモードにおいて脂質抽出物のみに良好なデータを得られることを断定することができた。
【０１２３】
例えば、２つの質量分析計ＭＳ１及びＭＳ２を使用し、データベースに記憶されるスペクトル及び／又は他の情報を生成すると仮定する。本実施例において、ＭＳ１がＪＣＡＭＰ−ＤＸフォーマットを使用してスペクトルを生成し、一方でＭＳ２がｍｚＸＭＬフォーマットを使用してスペクトルを生成すると仮定する。さらに、データベースが３つ目のフォーマットを使用してスペクトルを記憶すると仮定する。データベース及び／又は補助ソフトウェアは、ＪＣＡＭＰ−ＤＸ及びｍｚＸＭＬフォーマットされたスペクトルをデータベース記憶用の３つ目のフォーマットに変換することができる。次に、読み出し時に、データベース及び／又は補助ソフトウェアは、記憶した３つ目のフォーマットされたスペクトルを、出力用の、例えばＪＣＡＭＰ−ＤＸ又はｍｚＸＭＬに限定されない別のフォーマットに再変換することができる。
【０１２４】
本発明のこの態様の方法は、複数（２つ以上）の様々な真菌からの真菌脂質の試料を含む。得られた試料からの様々な真菌の数を、ユーザのニーズに基づき決定する。種々の実施形態において、ＰＩＭＳデータを、２種以上の様々な真菌の記憶したデータから得られることができ／データを生成することができる。本明細書において使用される「様々な真菌」は様々な真菌種、様々な亜種、及び／又はその同種／亜種であるが、一部が環境により変化したもの（例えば、抗真菌耐性の獲得）である。
【０１２５】
一実施形態では、ＰＩＭＳデータは、下記の真菌属、かかる属の種又はかかる属の亜種の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上（又は全て）から得ることができる：カンジダ属、アスペルギルス属、リゾプス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ニューモシスチス属、スタキボトリス属、スポロトリスク属、トリコフィトン属、ミクロスポルム属、ブラストミセス属、ケカビ亜門、コクシジオイデス属、エクセロヒルム属、クラドスポリウム属、コッコイデス属、エンセファリトゾーン属、エンセファリトゾーン属、フザリウム属、リヒテイミア属、モルチエレラ属、マラセジア属、プロトセカ属、フィチウム属、ロドトルラ属、フザリウム属、ティエラビオプシス属、ベルチシリウム属、マグナポルテ属、スクレロティニア属、ウスチラゴ属、リゾクトニア属、プッチニア属、アルミラリア属、ボトリチス属、ブルメリア属、ミコスフェレラ属、コレトトリカム属、メランプソラ属、サプロレグニアシス属、イクチオスポリジウム属、エキソフィアラ属、ブランチオミコシス属及びペニシリウム属。代表的な真菌種としては、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス・イミチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、マグナポルテ・グリセア、スクレロチニア・スクレロチオラム、ファコプソラ・パキリジ及びボトリチス・シネレアが挙げられる。
【０１２６】
別の実施形態において、本方法は、前駆体イオンの全て又は部分集合をフラグメント化し、一連の誘導されたフラグメントイオンを生成することと、誘導されたフラグメントイオン（ＭＳｎ又は多重化されたイオン）スペクトルの全て又は部分集合の質量スペクトルを取得することと、誘導されたフラグメントイオンのｍ／ｚ値及び所与の真菌の互いに対する誘導されたフラグメントイオンシグナルの相対比のコンセンサス値を決定することと、データベースの真菌の種類の特徴としてコンセンサス値を記憶することとを更に含む。「誘導されたフラグメントイオン」は上文に記載されており、本明細書におけるＭＳｎ及び／又は多重化されたイオンスペクトルを取得し、分析する全ての実施形態は、本発明のこの第３の態様に適用可能である。一実施形態において、例えば、ＭＳｎスペクトルデータを少なくとも２つの前駆体イオン（ＭＳ１）及び誘導されたフラグメントイオン（ＭＳ２）の世代ＭＳ１及びＭＳ２、別の実施形態において、少なくとも３つの前駆体イオン（ＭＳ１）及び誘導されたフラグメントイオン（ＭＳ２及びＭＳ３）の世代ＭＳ１、ＭＳ２、及びＭＳ３に対して取得する。
【０１２７】
非限定的な一例において、ＳＡＷＮ−ＩＴＭＳｎデータを取得する。環境圧により生じた株の変動の詳細は、ＭＳ１同重体のシグナル下に隠されている可能性がある。ＭＳｎアプローチの使用は、単一のｍ／ｚ種としてのＭＳ１データ内の不明瞭な非常に類似した上記の同重体を含む閾値を超える全ての脂質構造体を分離するのに役立つ。一実施形態において、閾値は予め設定された閾値である。任意の好適な閾値を使用することができ、本明細書における教示に基づき、好適な閾値を確立することは当業者の範囲内である。非限定的な一実施形態において、閾値は、２：１の最小シグナル／ノイズ比を必要とする。例えば、Anal. Chem. 81:6481-8 (2009)を参照されたい。脂質構造体の定義として、ＳＡＷＮ−ＩＴＭＳｎプラットフォームを使用し、ポジティブ−及びネガティブ−イオンＭＳ１及びＭＳｎデータを獲得することができる。ＭＳｎデータを各ＭＳ１スペクトルの最も存在量の多いイオン種（およそ５種〜７種）に対して生成することができ、その構造体を上文に詳細に記載されたＭＳｎの方法を使用して決定する。構造体及び全てのＳＡＷＮ−ＩＴＭＳ１及びＳＡＷＮ−ＩＴＭＳｎデータをＭＳＧＳライブラリに記録し、真菌を単独又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ１データと組み合わせて同定することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、本方法は、真菌の種類の特徴として、特徴的なイオンの１つ又は複数及び脂質構造体（複数の場合もあり）をデータベースに記憶することを更に含む。特徴的なイオンを、本明細書における教示に基づき、標準的なＭＳ技法を介して決定することができる。既知である一部の真菌脂質に対する特徴的なイオンを、例えば、手動にて、又は他のデータベースに自動的にアクセスしてデータベースに入力することができる。同様に、真菌脂質構造体を、本発明の方法を使用して決定することができ、予め同定された真菌脂質構造体も、例えば、手動にて、又は他のデータベースに自動的にアクセスしてデータベースに入力することができる。
【０１２９】
別の実施形態において、本方法は、理論的ニュートラルロスデータベースにおいて、前駆体イオン及び誘導されたフラグメントイオンのｍ／ｚ値並びに所与の真菌の互いに対する前駆体イオン及び誘導されたフラグメントイオンシグナルの相対比のコンセンサス値を記憶することを含み、コンセンサス値を使用し、様々な真菌の種類の真菌脂質に対して解離式を割り当てる。本明細書において使用される解離式は、前駆体イオンの解離の経路（複数の場合もあり）となる。この実施形態において、本方法は、例えば、リン酸パターン並びに脂肪酸及び単糖置換物を含む、タンデム質量スペクトルにける真菌脂質フラグメント化の法則の解釈に基づくデータベースを含むデータベースとなる。真菌脂質構造体の直接結合切断を、フラグメント及び構造推論の一般的なテンプレートとして見なすことができる。更なる実施形態において、各データベースは、（１）理論的に特徴のあるイオン（ＴＳＩ）及び（２）理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）のための、２つの部分データベースを含むことができる（又は２つの個別であるが接続されたデータベースを含むことができる）。
【０１３０】
ＴＳＩデータベースに表される真菌脂質の構造体の多様性を増大させるために、ユーザにより定義された脂肪酸の炭素範囲を適用することができる（例えば、１２：０〜２０：０の脂肪酸）。脂肪酸の側鎖長及び位置を体系的に変更させることにより、全ての考えられ得る特徴的なイオンを、所望の場合、計算することができ、ＴＳＩデータベースに組み込むことができる。構造体の割り当てを容易にするため、特徴的なイオンのニュートラルロスを算出し、理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）データベースに入力することができる。さらに、特徴的なイオンの切断以外の、真菌脂質の直接結合切断による一般に観測されるニュートラルロスも、ＴＮＬデータベースに含むことができる。同様に、ＴＮＬデータベースにより変換される構造体の多様性を増大させるために、ＴＮＬの脂肪酸組成を、ユーザにより定義された炭素範囲内にて体系的に変更することができる。
【０１３１】
この実施形態において、未知の真菌に対して獲得したＭＳｎデータをＴＳＩデータベースにおいて検索し、考えられ得る特徴的なイオンを見つけることができる。任意の同定された特徴的なイオンは、脂質の還元部分及び／又は非還元部分に対応する式を示唆する。特徴的なイオンの質量をその前駆体から減算することにより、次に特徴的なイオンのニュートラルロスを算出し、ＴＮＬデータベースにおいて検索することができる。特徴的なイオンと、一致するニュートラルロスとの組合せを使用し、予備的な候補構造体を提供することができる。
【０１３２】
ライブラリ構造及び読み取りソフトウェアは、任意の好適な種類のものであってよい。非限定的な一実施形態において、ライブラリ構造ソフトウェアは、例えば、関係データベースシステム（ＭｙＳＱＬ）を基本とすることができ、読み取りソフトウェアは、グラフィカルユーザインターフェース、例えば、ウェブ型ユーザインターフェースであってよい。ライブラリは、所望のセキュアサーバをホストとしたＭｙＳＱＬデータベースにおいて記憶することができる。観測されるデータと、予め記録したデータとの比較のためのクエリをプロセッシングすることによって、ライブラリ構造ソフトウェアを真菌同定のためのライブラリからの抽出情報に連動させる。他の実施形態において、ライブラリ構造ソフトウェアは、理論的に特徴のあるイオン（ＴＳＩ）及び／又は理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）データベースに記憶させた一部又は全てのデータを、データベースクエリを使用することなくプロセッシングするためのアプリケーションプログラムに与えることができる。オープンソースソフトウェアＭｙＳＱＬ概念の情報に関しては、ウェブサイトdev.mysql.com/tech-resources/articles/に記載される記事を参照されたい。
【実施例】
【０１３３】
抽出プロトコル
グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロール（図５）を含む真菌膜脂質を、公開されている単離方法（J. Lipid Res. 46: 1773-1778, (2005)）を使用して調製した。つまり、選択された株の固体培地（例えば、適切な寒天プレート）にて一晩成長させた培養物由来のおよそ０．１ｍｇ〜１０ｍｇの材料を１．５ｍｌのねじキャップ試験管内の４００μｌのイソ酪酸及び１Ｍの水酸化アンモニウム（５：３  ｖ：ｖ）に再懸濁させ、高頻度のボルテックスにて３０分〜１時間、１００℃にてインキュベートした。個々の試料を氷水中にて冷却させ、２０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清を回収し、エンドトキシン非含有水を用いて１：１（ｖ：ｖ）に希釈した。続いて試料を凍結させ、一晩凍結乾燥させた。得られた粉末の材料を１ｍｌのメタノールを用いて２回洗浄し、不溶性の真菌脂質を、出発量に応じて、クロロホルム、メタノール、及び水（３：１：０．２５  ｖ：ｖ：ｖ）の混合物１００μｌ〜２００μｌに抽出した。
【０１３４】
質量分析の手法
ネガティブイオンマトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間タンデム質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）実験を行った（Glycoconjugate J. 5:397-409 (1988); Mol Microbiol 52(5):1363-73 (2004)）。つまり、真菌脂質をクロロホルム、メタノール、及び水（３：１：０．２５  ｖ：ｖ：ｖ）の混合物２００μｌに可溶化させ、ＭＡＬＤＩ試料プレートにそのまま滴下（１μＬ）した後、クロロホルム／メタノール／水（３：１．５：０．２５、ｖ／ｖ／ｖ）に溶解させた１μＬの１００ｍｇ／ｍＬノルハルマンＭＡＬＤＩマトリクスを滴下した。全ての実験をブルカーのＡｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker Daltonics Inc.、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して行った。各スペクトルは３００回〜５００回のショット及び５０％〜７５％のレーザー出力の平均であった。
【０１３５】
ＭＳ／ＭＳ分析において、前駆体イオンを選択し、ブルカーの標準ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロトコルに従い、ネガティブイオンモードにおいてＬＩＦＴ  ＴＯＦ／ＴＯＦ獲得に供した。ＥＳ  Ｔｕｎｉｎｇ  Ｍｉｘ（Agilent、米国カリフォルニア州パロアルト）を較正標準物質として使用した。
【０１３６】
真菌脂質抽出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル
ＭＳ１スペクトルを収集し、以下のように予備プロセッシングを行った。未処理のデータファイルをｍｚＸＭＬデータフォーマットに変換した。バイオコンダクターによって提供されたウェーブレット型質量スペクトルプロセッシングソフトウェアである、ＭａｓｓＳｐｅｃＷａｖｅｌｅｔ（Bioinformatics 22(17):2059-2065 (2006)）を使用してピークリスト情報を検出した。スペクトル対の類似性をそのドット積を算出することにより決定した。
【０１３７】
図６に示されるスペクトルは、３つの真菌のバッググラウンドに対する代表的な例である。これらの脂質抽出及びＭＳ分析の方法を使用して、３つの真菌種からの結果を使用し、脂質表現型のヒートマップ表示を生成した（図７）。
【０１３８】
このデータは、真菌脂質のＭＳ１データが様々な病因となり、かつ環境による真菌種を判別することができることを明らかに示している。図７の対角線の黒色の一連の四角により示したように、全てのデータセットは、そのものである種と最も緊密に一致し、他のデータとは一致していない。黒色の四角は、正規化スコアが１．０、又は完全な一致を表し、一方、濃灰色の四角は、正規化スコアスキームの反対側の端のスコア０を表し、又は一致しないことを表す。中間色の灰色（図示せず）では、類似性は高いが、他とは異なるものとしてこれらのデータを判別するＭＳの特徴を残していることを示している。直接の真菌のバッググラウンドの化学種分析は、バイオタイパーのタンパク質表現型が失われた場合、このアプローチが成功することを示している。
【０１３９】
このデータセットは、真菌を脂質抽出物のＭＳ１プロファイルによって同定することができることを示している。このアプローチの値をより客観的に証明するために、感受性（１００％）、精度（９６％）、及び特異性（９６％）を、標準的な受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線及び６点結果評定（データは図示せず）を使用して算出した。
【０１４０】
真菌脂質の手動による構造分析
真菌脂質の構造体の多様性は、一部において、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、及びステロールを含むが、それらに限定されない、膜に存在する脂質の複雑性に反映される。このような脂質のクラス内において、複雑性は、脂肪酸（数及び種類）、既存の頭部基（ホスホコリン、ホスホエタノールアミン）、及び脂質の塩基分子に結合した単純又は複雑な炭水化物残基の存在の種々の組合せにおいて認められる。抽出可能な脂質の有意な複雑性は、図５に示されるペニシリウム、カンジダ、及びアスペルギルスに対して抽出された真菌脂質において認められる。ペニシリウムにおけるΔｍ／ｚが１６２の観測される周期性は、６つの炭素糖部分の添加を示唆し、一方、アスペルギルスにおける違いは、既存の脂肪酸の数及び脂肪酸の長さ（Δｍ／ｚが２８  Ｃ２Ｈ４）の両方の異質性を表す。最後に、カンジダでは、複雑性は低いが、脂質分子はどの真菌種よりも有意に小さいものであることが示された。
【０１４１】
理論的データベースの構築
理論的データベース構築プログラムをｘ８６＿６４−Ｌｉｎｕｘ(登録商標)プラットフォーム用に構築されたＰｅｒｌ  ｖ５．８．８（http://www.perl.org）を用いて作成する。種特異的理論的データベースを、リン酸パターン並びに脂肪酸及び単糖置換物を含む、タンデム質量スペクトルにおける脂質フラグメント化の法則のマニュアル解説を基本に構築する。脂質構造体の直接結合切断は、フラグメント及び構造推論における一般的なテンプレートとして見なされる。
【０１４２】
種特異的理論的データベースはそれぞれ、１）理論的に特徴のあるイオン（ＴＳＩ）及び２）理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）の２つの部分データベースを含む。観測される特徴的なイオンは、分子構造体の仮説に役立つ固有のイオンである。観測される真菌脂質の特徴的なイオンは、通常脂質の保存された特徴から決定され、Domon及びCostelloによって報告されている命名法に従い命名される（Glycoconjugate J. 5:397-409 (1988)）。脂質の観測されるフラグメントテンプレートに基づき、特徴的なイオンを算出し、理論的に特徴のあるイオン（ＴＳＩ）データベースに入力する。ＴＳＩデータベースに表される脂質の構造体の多様性を増大させるため、ユーザにより定義された脂肪酸の炭素範囲を適用する（すなわち、１２：０〜２０：０の脂肪酸）。脂肪酸の側鎖長及び位置を体系的に変更させることにより、全ての考えられ得る特徴的なイオンが計算され、ＴＳＩデータベースに組み込まれる。構造体の割り当てを容易にするため、特徴的なイオンのニュートラルロスを算出し、理論的ニュートラルロス（ＴＮＬ）データベースに入力する。さらに、特徴的なイオンの切断以外の、脂質の直接結合切断による通常観測されるニュートラルロスもＴＮＬデータベースに含まれる。同様に、ＴＮＬデータベースによって変換された構造体の多様性を増大させるため、ＴＮＬの脂肪酸組成を、ユーザにより定義された炭素範囲内にて体系的に変更させる。
【０１４３】
デルタ質量
デルタ質量は、理論的なイオンと観測されるイオンとの許容可能な質量差を表すために使用される質量許容量を定義するユーザにより割り当てられたＨｉＴＭＳパラメータである。デルタ質量を、獲得したデータの質量精度と一致する値を使用してＴＳＩ及びＴＮＬのデータベースにおける全ての検索に適用する。
【０１４４】
データプロセッシング
未処理のデータファイルを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Thermo Scientific）において利用可能なＲｅＡｄＷによってｍｚＸＭＬデータフォーマットに変換する。次いで、個々の質量スペクトル又は平均化された質量スペクトルのいずれかによるピーク情報を、バイオコンダクタープロジェクト（http://www.bioconductor.org/）（Bioinformatics 22 (17):2059-65 (2006)）によって提供されたウェーブレット変換型ピーク検出ソフトウェアであるＭａｓｓＳｐｅｃＷａｖｅｌｅｔを使用して抽出する。各ＭＳｎタンデム質量スペクトルの得られたピーク情報をピークリストファイルに記録する（以後、ＭＳｎスペクトルと称する）。
【０１４５】
階層型タンデム質量分析（ＨｉＴＭＳ）アルゴリズム
ＨｉＴＭＳをＰｅｒｌ  ｖ５．８．８（http://www.perl.org）にて実行し、６４ビットのＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ(登録商標)プラットフォームにて稼働させる。獲得したＭＳｎスペクトルをＴＳＩデータベースにおいて検索し、考えられ得る特徴的なイオンを見つけ、任意の同定可能な特徴的なイオンを含まないスペクトルを排除する。任意の同定された特徴的なイオンは、真菌脂質の還元及び／又は非還元部分に対応する式を示唆する。特徴的なイオンの質量をその前駆体から減算することにより、次いで特徴的なイオンのニュートラルロスを算出し、ＴＮＬデータベースにおいて検索する。特徴的なイオンと、一致したニュートラルロスとの組合せにより、予備的な候補構造体が提供される。各スペクトルの全てのイオンの算出されたニュートラルロスもＴＮＬデータベースにおいて検索し、スペクトルアノテーションに必要な情報が提供される。各脂質−スペクトル一致（ＬＳＭ）に対して、Ｘスコアを適用し、全てのＭＳｎスペクトルとその予備的候補構造体との適合の近接性を評価する（相互相関を参照のこと）。予備的構造体を割り当てた後、全てのＭＳｎスペクトルの前駆体イオンのニュートラルロスを対応するＭＳｎ−１スペクトルにおいて算出し、再度、ＴＮＬデータベースにおいて検索し、考えられ得る解離パターンを同定する。ＨｉＴＭＳは、ＭＳ１レベルに達するまで反復して上記の手法を継続する。最終構造体を、ＭＳｎデータの様々なレベルから得られた情報を統合することによって推論する。
【０１４６】
相互相関（Ｘスコア）
Ｘスコアは、ＳＥＱＵＥＳＴ  ｘｃｏｒｒ（J Am Soc Mass Spectrom 5(11): 976-989 (1994); J Proteome Res 7(10):4598-602 (2008)）と同様に獲得したタンデム質量スペクトルと理論的タンデム質量スペクトルとの間の適合測定の近接性を使用する。全てのＬＳＭ毎に、仮説の脂質構造体を、グリコシド結合切断（すなわち、Ａ／Ｘ、Ｂ／Ｙ、Ｃ／Ｚ型のイオン）、Ｏ−結合型及びＮ−結合型アシル鎖の消失、リン酸の消失、単糖の消失及び混合型の消失を表す摂動を含む、上記の直接結合切断を主に基本として、コンピュータ上においてフラグメント化する。次いで、フラグメントを、候補構造体の理論的解離を表す再構築された質量スペクトルに組み合わせる。各再構築された質量スペクトルのピーク強度を、１が上記のｍ／ｚ値のフラグメントの存在を表すブーリアン値に割り当てる。獲得した質量スペクトルと、仮説の構造体の再構築された質量スペクトルとのＸスコアを以下のように測定する。
【数１】
2016537964.tif 000003
【０１４７】
各Ｘスコアの算出は、これまでの刊行物（J Am Soc Mass Spectrom 5(11): 976-989 (1994); J Proteome Res 7(10):4598-602 (2008)）に記載のように、再構築された質量スペクトルｘと、予備的にプロセッシングされ、獲得した質量スペクトルｙ’との間のスカラードット積となり、τは補正因子である。デルタ質量をビンサイズとして使用し、質量スペクトルをベクターに変換する。ＨｉＴＭＳにてＸスコアを使用し、全てのＬＳＭの適合の近接性を測定する。
【０１４８】
オンザフライのデコイ生成
プロテオミクスの世界では、デコイのデータベースを多くの場合、ペプチドスペクトル一致の有意性の評価に役立てるために使用する。デコイのデータベースは、事前の所与のターゲットデータベース又はオンザフライから生成した、シャッフリング又は反転させているタンパク質配列を含む（J Am Soc Mass Spectrom 13(4):378-86 (2002); J Proteome Res 5(3):695-700 (2006); J Proteome Res 7(7):3022-7 (2008)）。ＨｉＴＭＳは、候補脂質構造体をオンザフライにてシャッフリングし、同時に各ＭＳｎスペクトルを分析することによってデコイを生成する、ターゲット−デコイ方法を使用する。脂質の生化学的性質の破壊を回避するために、シャッフリングは、脂肪酸側鎖の位置及び長さにのみ行われる。このアプローチによって、全てのデコイ脂質がターゲット（すなわち、候補）脂質構造体と同じ分子組成及び質量を正確に示すことが確実となる。次いで、候補及びデコイＬＳＭの両方のＸスコアを算出し、有意性を評価するために役立てる。
【図６】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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