(57)【要約】  本発明は、ポリフェノール、特に、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン類、およびクマリン誘導体のグリコシル化を触媒する酵素に関する。１つの態様において、本発明は、ポリフェノールのグリコシル化を触媒する酵素を提供し、本酵素は、ａ）配列番号７〜１２の配列の１つに記載のアミノ酸配列を含むか、またはｂ）配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、またはｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で定義される酵素の１つと相同であるか、またはｄ）ストリンジェントな条件下、配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む配列と相補的な核酸とハイブリダイズする核酸によりコードされる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールのグリコシル化を触媒する酵素であって、該酵素は、
ａ）配列番号７〜１２の配列の１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または
ｂ）配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、または
ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で定義される該酵素の１つと相同であるか、または
ｄ）ストリンジェントな条件下、配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む配列と相補的な核酸とハイブリダイズする核酸によりコードされる
ものである、酵素。
【請求項２】
前記酵素は、前記（ａ）または（ｂ）で定義される前記酵素と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％または８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または９９．５％相同である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
配列番号７に記載の前記アミノ酸配列を有するか、または配列番号１に記載の前記ヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるか、あるいは配列番号７に記載の前記アミノ酸配列を有するかまたは配列番号１に記載の前記ヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされる酵素と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％または８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％９９％、９９．２％、または９９．５％相同な酵素である、請求項１または２に記載の酵素。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素の断片であって、該断片は、該酵素の保存的アミノ酸を、少なくとも６０、好ましくは少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、または少なくとも１２０含み、かつ該断片は、ポリフェノールの該グリコシル化を触媒するものである、断片。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素、または請求項４に記載の断片をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸であって、該核酸は、
ａ）配列番号１〜６に記載の配列の１つのヌクレオチド配列、またはその断片を含むか、または
ｃ）上記の（ａ）で定義される該核酸の１つと相同であるか、または
ｄ）ストリンジェントな条件下、上記の（ａ）で定義される該核酸と相補的な核酸とハイブリダイズする
ものである、酵素。
【請求項７】
ポリフェノール、好ましくはフェノール酸誘導体、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン類、およびクマリン誘導体をグリコシル化するための、請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素または請求項４に記載のその断片、の使用。
【請求項８】
ポリフェノールのグリコシドを調製する方法であって、該ポリフェノールおよびグリコシルドナーを、該グリコシルドナーが該ポリフェノールのヒドロキシル基または他の官能基に転移する酵素反応に適切な条件下、請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素または請求項４に記載のその断片で反応させる工程を含む、方法。
【請求項９】
前記ポリフェノールは、フェノール酸誘導体、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン、またはクマリン誘導体である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール、特にフラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン類、およびクマリン誘導体のグリコシル化を触媒する酵素に関する。
【０００２】
ポリフェノールは、シキミ酸およびフェニルプロパノイド経路を介して生合成される、植物の二次代謝産物である。それらは、その環系にヒドロキシル基を有する芳香族化合物、またはその誘導体である。フラボノイドおよび安息香酸誘導体は、ポリフェノールの例である。環系のヒドロキシル基の二次修飾を介して、これらの化合物の多種多様な天然の誘導体が形成される。糖修飾は自然界でよく起こるが、それは、糖修飾により化合物の溶解性および機能に大きな影響を及ぼすことが可能だからである。ポリフェノール化合物は、果物および野菜という形で私たちの毎日の栄養の一部分となっており、ヒトの健康にプラスの影響を及ぼすことが知られている。ポリフェノール化合物は、抗酸化およびラジカル消去機能の他に、例えば抗アレルギー源性、抗細菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、抗炎症、鎮痛性、およびさらには癌防御としても作用し得る（非特許文献２１）。こうした幅広い効果のため、化粧品、製薬業、および機能性食品産業において、ポリフェノール（例えば特定フラボノイド）に対する需要は高まっている（非特許文献２２〜２４）。この需要を満たすにしては、入手できるポリフェノールが限られているために、大きな問題が生じる。例えば、フラボノイドは、植物において少量でしか産生されない。ポリフェノールの抽出は、大量の溶媒の使用と結びついており、しかもポリフェノールの構造が複雑なために化学修飾は容易ではない（非特許文献２５）。
【０００３】
フラボノイドなどのポリフェノールの位置特異的修飾は、方向性を持った化学修飾が大抵失敗するとおり、依然として困難である。このため、酵素が注目を集めるようになった。というのも、酵素は、ポリフェノールの位置および立体の化学修飾を仲介することが可能だからである（非特許文献２６）。詳細には、研究の注目は、ポリフェノール（例えば、フラボノイドなど）の水溶性および生体利用能に影響する修飾として特定のグリコシル化に集まっている（非特許文献２７、２８）。この反応を触媒する酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）である。一般に、ＧＴは、ドナー基質からアクセプター分子への糖残基の移動を仲介する。ＧＴは、それらの配列類似性に基づいて、現在、９４のファミリーに分類されている（非特許文献２９）。ＧＴファミリー１（ＧＴ１）は、親油性小分子のグリコシル化を触媒する酵素で構成される（非特許文献３０）。ヌクレオチド活性化ドナーを使用するこれらの酵素（ＥＣ２．４．１．ｘ）は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）スーパーファミリーに属し、ルロワール酵素とも称する（非特許文献３１、３２）。フラボノイドに作用するグリコシルトランスフェラーゼも、ＧＴ１に属する（非特許文献３３）。ＧＴ１の酵素は、ＧＴ−Ｂ折り畳み構造を有し、転移した糖部分の結合に関する反転反応機構を表す（非特許文献３４）。欧州特許第２１２８２６５号明細書（特許文献１）は、フラボノイドをグリコシル化するための、真菌、すなわちトリコデルマ属起原のグリコシルトランスフェラーゼを記載する。欧州特許第１９８５７０４号明細書（特許文献２）は、同じくフラボノイドに作用するバラ植物由来のグリコシルトランスフェラーゼを開示する。これまで、原核生物起原のフラボノイド作用ＧＴ１は、極わずかしか、同定も詳細な特性決定もされてきていない。現在既知であるグラム陽性細菌由来のフラボノイド作用ＵＧＴは全て、マクロシド（ｍａｃｒｏｓｉｄｅ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＭＧＴ）サブファミリーに属し、バチルス属およびストレプトマイセス科を起原とする（非特許文献３５〜３７；欧州特許第１８６７７２９号明細書および国際公開第２００９／０１５２６８号明細書（特許文献３および４）も参照）。さらに、グラム陰性菌ザントモナス・カンペストリス由来のフラボノイド作用ＵＧＴが１種類、既知である（非特許文献３８）。
【０００４】
その結果、フラボノイド、クロモン類などのポリフェノールを修飾する手段が依然として必要とされている。したがって、本発明の目的は、そのような手段を提供することである。本目的は、独立請求項の主題により達成される。本発明の有利な実施形態は、従属項で指定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第２１２８２６５号明細書
【特許文献２】欧州特許第１９８５７０４号明細書
【特許文献３】欧州特許第１８６７７２９号明細書
【特許文献４】国際公開第２００９／０１５２６８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１９】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．，  Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９０）  "Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．"  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０
【非特許文献２０】Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．，  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎ  Ｍ．Ｒ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１２
【非特許文献２】ＩＵＰＡＣ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（いわゆる「Ｇｏｌｄ  Ｂｏｏｋ」）。Ａ．Ｄ．ＭｃＮａｕｇｈｔおよびＡ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによる編纂。Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９７）。ＸＭＬオンライン改訂版：  ｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ  （２００６−）、Ｍ．  Ｎｉｃ，  Ｊ．  Ｊｉｒａｔ，  Ｂ．  Ｋｏｓａｔａにより作成；  Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓにより更新が編纂される。ＩＳＢＮ  ０−９６７８５５０−９−８．  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ。更新最終日：  ２０１４−０２−２４；  最新版：  ２．３．３；  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．Ｃ００８２０．
【非特許文献２１】Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ，  Ｆ．，  Ｔｒａｎｔａｓ，  Ｅ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ，  Ｃ．，  Ｖｏｌｌｍｅｒ，  Ｇ．，  Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎ．  ２００７．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｐａｒｔ  ＩＩ：  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ２：１２３５−１２４９．
【非特許文献２２】Ｓｃｈuｔｚ，  Ｋ．，  Ｍｕｋｓ，  Ｅ．，  Ｃａｒｌｅ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ２００６．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ａｒｔｉｃｈｏｋｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５４：８８１２−８８１７．
【非特許文献２３】Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｅ．，  Ｙａｎ，  Ｙ．，  Ｆｏｗｌｅｒ，  Ｚ．  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｚ．，  Ｌｉｍ，  Ｃ．  Ｇ．，  Ｌｉｍ，  Ｋ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｋｏｆｆａｓ，  Ｍ．  Ａ．  ２００８．  Ｓｔｒａｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ５：２５７−２６５．
【非特許文献２４】Ｗａｎｇ，  Ｃ．，  Ｍｅｅｋ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｐａｎｃｈａｌ，  Ｐ．，  Ｂｏｒｕｖｋａ，  Ｎ．，  Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，  Ｆ．  Ｓ．，  Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，  Ｂ．  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ，  Ｔ．  Ｃ．  ２００６．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：３８４−３９１．
【非特許文献２５】Ｍａｎａｃｈ，  Ｃ．，  Ｓｃａｌｂｅｒｔ，  Ａ．，  Ｍｏｒａｎｄ，  Ｃ．，  Ｒｅｍｅｓｙ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，  Ｌ．  ２００４．  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ：  ｆｏｏｄ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．    Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ７９：７２７−７４７．
【非特許文献２６】Ｄａｓ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓａｚｚａ，  Ｊ．  Ｐ．  ２００６．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．  Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ６９：４９９−５０８．
【非特許文献２７】Ｇｒａｅｆｅ，  Ｅ．  Ｕ．，  Ｗｉｔｔｉｇ，  Ｊ．，  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｒｉｅｔｈｌｉｎｇ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｕｅｈｌｅｋｅ，  Ｂ．，  Ｄｒｅｗｅｌｏｗ，  Ｂ．，  Ｐｆｏｒｔｅ，  Ｈ．，  Ｊａｃｏｂａｓｃｈ，  Ｇ．，  Ｄｅｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｖｅｉｔ，  Ｍ．  ２００１．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４１：４９２−４９９．
【非特許文献２８】Ｋｒｅｎ，  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｋｏｖａ，  Ｌ．  ２００１．  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８：１３０３−２８．
【非特許文献２９】Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｄｅｌｅｕｒｙ，  Ｅ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．  ２００３．  Ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２８：３０７−３１７．
【非特許文献３０】Ｂｏｗｌｅｓ，  Ｄ．，  Ｌｉｍ，  Ｅ．  Ｋ．，  Ｐｏｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｖａｉｓｔｉｊ，  Ｆ．  Ｅ．  ２００６．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５７：５６７−５９７．
【非特許文献３１】Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，  Ｐ．  Ｉ．，  Ｏｗｅｎｓ，  Ｉ．  Ｓ．，  Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，  Ｂ．，  Ｂｏｃｋ，  Ｋ．  Ｗ．，  Ｂａｉｒｏｃｈ，  Ａ．，  Ｂｅｌａｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｆｏｕｒｎｅｌ−Ｇｉｇｌｅｕｘ，  Ｓ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．，  Ｈｕｍ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｉｙａｎａｇｉ，  Ｔ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  Ｄ．，  Ｌｏｕｉｓｏｔ，  Ｐ．，  Ｍａｇｄａｌｏｕ，  Ｊ．，  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｒｉｔｔｅｒ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｔｅｐｈｌｙ，  Ｔ．  Ｒ．，  Ｔｉｐｔｏｎ，  Ｋ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｎｅｂｅｒｔ，  Ｄ．  Ｗ．  １９９７．  Ｔｈｅ  ＵＤＰ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｕｐｄａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：２５５−２６９．
【非特許文献３２】Ｌａｉｒｓｏｎ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗｉｔｈｅｒｓ，  Ｓ．  Ｇ．  ２００８．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７７：５２１−５５５．
【非特許文献３３】Ｏｓｍａｎｉ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｂａｋ，  Ｓ．  ｒ．，  ａｎｄ  Ｍoｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．  ２００９．  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ＵＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０：３２５−３４７．
【非特許文献３４】Ｂｒｅｔｏｎ，  Ｃ．，  Ｓｎａｊｄｒｏｖａ，  Ｌ．，  Ｊｅａｎｎｅａｕ，  Ｃ．，  Ｋｏｃａ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｉｍｂｅｒｔｙ，  Ａ．  ２００６．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６：２９Ｒ−３７．
【非特許文献３５】Ｙａｎｇ，  Ｍ．，  Ｐｒｏｃｔｏｒ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｂｏｌａｍ，  Ｄ．  Ｎ．，  Ｅｒｒｅｙ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｈ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，  Ｂ．  Ｇ．  ２００５．  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｄｔｈ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２７：９３３６−９３３７．
【非特許文献３６】Ｊｅｏｎ，  Ｙ．，  Ｋｉｍ，  Ｂ．，  Ｋｉｍ，  Ｊ．，  Ｃｈｅｏｎｇ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｈｎ，  Ｊ．−Ｈ．  ２００９．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＢｓＧＴ−３．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ５２：９８−１０１．
【非特許文献３７】Ｒａｏ，  Ｋ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｎｅｒ，  Ｎ．  Ｔ．  １９８１．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：４５０−４５２．
【非特許文献３８】Ｋｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｐａｒｋ，  Ｙ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｌｉｍ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｈｎ，  Ｊ．  Ｈ．  ２００７．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：５３９−５４２．
【非特許文献３９】Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  Ｂｒｕｎｓ，  Ｍ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｉｅｄｊｅ，  Ｊ．  Ｍ．  １９９６．  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６２：３１６−３２２．
【非特許文献４０】Ｉｌｍｂｅｒｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｍｅｓｋｅ，  Ｄ．，  Ｊｕｅｒｇｅｎｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｓｃｈｕｌｔｅ，  Ｍ．，  Ｂａｒｔｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｒａｂａｕｓｃｈ，  Ｕ．，  Ａｎｇｅｌｏｖ，  Ａ．，  Ｍｉｅｎｔｕｓ，  Ｍ．，  Ｌｉｅｂｌ，  Ｗ．，  Ｓｃｈｍｉｔｚ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｉｔ，  Ｗ．  Ｒ．  ２０１２．  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄｓ−−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９５：１３５−１４６．
【非特許文献４１】Ｗａｇｎｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｌａｄｔ，  Ｓ．，  Ｚｇａｉｎｓｋｉ，  Ｅ．  Ｍ．  １９８３．  Ｄｒｏｇｅｎａｎａｌｙｓｅ，  Ｄuｎｎｓｃｈｉｃｈｔｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｓｃｈｅ  Ａｎａｌｙｓｅ  ｖｏｎ  Ａｒｚｎｅｉｄｒｏｇｅｎ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
【非特許文献４２】Ｎｅｕ，  Ｒ．  １９５７．  Ｃｈｅｌａｔｅ  ｖｏｎ  Ｄｉａｒｙｌｂｏｒｓaｕｒｅｎ  ｍｉｔ  ａｌｉｐｈａｔｉｓｃｈｅｎ  Ｏｘｙａｌｋｙｌａｍｉｎｅｎ  ａｌｓ  Ｒｅａｇｅｎｚｉｅｎ  ｆuｒ  ｄｅｎ  Ｎａｃｈｗｅｉｓ  ｖｏｎ  Ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｎｚｏ−γ−ｐｙｒｏｎｅｎ．  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ４４：１８１−１８２．
【非特許文献４３】Ｔｏｕｒａｓｓｅ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｈｅｌｇａｓｏｎ，  Ｅ．，  oｋｓｔａｄ，  Ｏ．  Ａ．，  Ｈｅｇｎａ，  Ｉ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｋｏｌｓｔo，  Ａ．  Ｂ．  ２００６．  Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ｇｒｏｕｐ：  ｎｏｖｅｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０１：５７９−５９３．
【非特許文献４４】Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｎ，  Ｓｔｅｃｈｅｒ  Ｇ，  Ｎｅｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ  Ｓ．  ２０１１．  ＭＥＧＡ５：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２８：２７３１−２７３９．
【非特許文献４５】Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｍｏｄｏｌｏ，  Ｌ．  Ｖ．，  Ｅｓｃａｍｉｌｌａ−Ｔｒｅｖｉｎｏ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ａｃｈｎｉｎｅ，  Ｌ．，  Ｄｉｘｏｎ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｘ．  ２００７．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＵＧＴ８５Ｈ２−−ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  （ｉｓｏ）ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７０：９５１−９６３．
【非特許文献４６】Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．，  Ｍｅｓｓｎｅｒ，  Ｂ．，  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｊ．−Ｉ．，  Ｓｃｈaｆｆｎｅｒ，  Ａ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，  Ｋ．  ２００３．  ＵＧＴ７３Ｃ６  ａｎｄ  ＵＧＴ７８Ｄ１，  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｆｌａｖｏｎｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：４３９１０−４３９１８．
【非特許文献４７】Ｋｏ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｇｙｕ  Ｋｉｍ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｊｏｏｎｇ−Ｈｏｏｎ，  Ａ．  ２００６．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２５８：２６３−２６８．
【非特許文献４８】Ｊｕｎｇ，  Ｎ．  Ｒ．，  Ｊｏｅ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ａｈｎ，  Ｂ．  Ｃ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｃｈｏｎｇ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｈｎ，  Ｊ．  Ｈ．  ２０１０．  Ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｏ−ｔｒｉｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｔｏ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｏ−ｍｏｎｏｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１３９３−１３９６．
【非特許文献４９】Ａｈｎ，  Ｂ．  Ｃ．，  Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｊｅｏｎ，  Ｙ．  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｌｉｍ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｈｎ，  Ｊ．  Ｈ．  ２００９．  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌａｖｏｎｅ  Ｄｉ−Ｏ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：３８７−３９０．
【非特許文献５０】Ｃｈｏｉ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｒｙｕ，  Ｍ．，  Ｙｏｏｎ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｅ．  Ｙ．  ２０１２．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ  ｉｎ  ｂａｔｃｈ  ａｎｄ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｍｏｄｅｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３４：４９９−５０５．
【非特許文献５１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ２００７．  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：６５７−６６２．
【非特許文献５２】Ｈｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｓ．  ２００２．  Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ９：１２８７−１２９６．
【非特許文献５３】Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｍ．  Ａ．  １９９４．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｓｓａｖａ  （Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ  Ｃｒａｎｔｚ）  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ５：４１  −  ４９．
【非特許文献５４】Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  Ｓ．，  Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂａｋ，  Ｓ．  ２００３．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｙ  １  ｐｌａｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６２：３９９−４１３．
【非特許文献５５】Ｂｏｌａｍ，  Ｄ．  Ｎ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｓ．，  Ｐｒｏｃｔｏｒ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｔｕｒｋｅｎｂｕｒｇ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｄｏｄｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｌｅｉｔｅｓ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｍ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｈ．  Ｊ．  ２００７．  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ  ｆｏｒ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４：５３３６−５３４１．
【非特許文献５６】Ｏｆｆｅｎ，  Ｗ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｌｅｉｔｅｓ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｍ．，  Ｋｉａｔ−Ｌｉｍ，  Ｅ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｔａｒｌｉｎｇ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｆｏｒｄ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｂｏｗｌｅｓ，  Ｄ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｇ．  Ｊ．  ２００６．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２５：１３９６−１４０５．
【非特許文献５７】Ｍｕｌｉｃｈａｋ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｌｕ，  Ｗ．，  Ｌｏｓｅｙ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｗａｌｓｈ，  Ｃ．  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｇａｒａｖｉｔｏ，  Ｒ．  Ｍ．  ２００４．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＧｔｆＤ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５１７０−５１８０．
【非特許文献５８】Ｌｉｍ，  Ｅ．−Ｋ．，  Ａｓｈｆｏｒｄ，  Ｄ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｏｗｌｅｓ，  Ｄ．  Ｊ．  ２００６．  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｈａｍｎｏｓｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  Ｗｈｏｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ７：１１８１−１１８５．
【非特許文献５９】Ｍａｂｒｙ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｍａｒｋｈａｍ，  Ｋ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｍ．  Ｂ．  １９７０．  Ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．
【非特許文献６０】Ｇａｎｔｔ，  Ｒ．  Ｗ．，  Ｇｏｆｆ，  Ｒ．  Ｄ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ２００８．  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｇｌｙｃｏｎ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４７：８８８９−８８９２．
【非特許文献６１】Ｖｏｇｔ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．  ２０００．  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｐｅｒｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ５：３８０−３８６．
【非特許文献６２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｇａｎｔｔ，  Ｒ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ２００８．  Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｐｏｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｇｌｙｃｏｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １２：５５６−５６４．
【非特許文献６３】Ｙｏｏｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｌｅｅ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｌｉｍ，  Ｙ．，  Ｃｈｏｎｇ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｈｎ，  Ｊ．  Ｈ．  ２０１２．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７８：４２５６−４２６２．
【非特許文献６４】Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ，  Ｍ．，  Ｋａｅｃｈ，  Ａ．，  Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｕ．，  ａｎｄ  Ｂａｇｈｅｒｉ，  Ｈ．  Ｃ．  ２０１１．  Ｆｉｂｒｉｓｏｍａ  ｌｉｍｉ  ｇｅｎ．  ｎｏｖ．，  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｉｄａｌ  ｆｌａｔｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：１４１８−１４２４．
【非特許文献６５】Ｌａｉｌ，  Ｋ．，  Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，  Ｊ．，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｅ．，  Ｌａｐｉｄｕｓ，  Ａ．，  Ｇｌａｖｉｎａ  Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，  Ｔ．，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，  Ａ．，  Ｔｉｃｅ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｌｕｃａｓ，  Ｓ．，  Ｎｏｌａｎ，  Ｍ．，  Ｂｒｕｃｅ，  Ｄ．，  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｌ．，  Ｐｉｔｌｕｃｋ，  Ｓ．，  Ｉｖａｎｏｖａ，  Ｎ．，  Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓ，  Ｋ．，  Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖａ，  Ｇ．，  Ｐａｔｉ，  Ａ．，  Ｃｈｅｎ，  Ａ．，  Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，  Ｋ．，  Ｌａｎｄ，  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｌ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｃ．  Ｄ．，  Ｃｈａｉｎ，  Ｐ．，  Ｂｒｅｔｔｉｎ，  Ｔ．，  Ｄｅｔｔｅｒ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｓｃｈｕｔｚｅ，  Ａ．，  Ｒｏｈｄｅ，  Ｍ．，  Ｔｉｎｄａｌｌ，  Ｂ．  Ｊ．，  Ｇｏｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｂｒｉｓｔｏｗ，  Ｊ．，  Ｅｉｓｅｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，  Ｖ．，  Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ，  Ｐ．，  Ｋｙｒｐｉｄｅｓ，  Ｎ．  Ｃ．，  Ｋｌｅｎｋ，  Ｈ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｆ．  ２０１０．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ  ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ  （１）．  Ｓｔａｎｄ  Ｇｅｎｏｍ  Ｓｃｉ  ２：１７６−１８５．
【非特許文献６６】Ｌａｎｇ，  Ｅ．，  Ｌａｐｉｄｕｓ，  Ａ．，  Ｃｈｅｒｔｋｏｖ，  Ｏ．，  Ｂｒｅｔｔｉｎ，  Ｔ．，  Ｄｅｔｔｅｒ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｈａｎ，  Ｃ．，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，  Ａ．，  Ｇｌａｖｉｎａ  Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，  Ｔ．，  Ｎｏｌａｎ，  Ｍ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｆ．，  Ｌｕｃａｓ，  Ｓ．，  Ｔｉｃｅ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｌａｎｄ，  Ｍ．，  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｌ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｃ．  Ｄ．，  Ｋｏｐｉｔｚ，  Ｍ．，  Ｂｒｕｃｅ，  Ｄ．，  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｌ．，  Ｐｉｔｌｕｃｋ，  Ｓ．，  Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖａ，  Ｇ．，  Ｐａｔｉ，  Ａ．，  Ｉｖａｎｏｖａ，  Ｎ．，  Ｍａｖｒｏｍｍａｔｉｓ，  Ｋ．，  Ｃｈｅｎ，  Ａ．，  Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，  Ｋ．，  Ｃｈａｉｎ，  Ｐ．，  Ｂｒｉｓｔｏｗ，  Ｊ．，  Ｅｉｓｅｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，  Ｖ．，  Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ，  Ｐ．，  Ｇｏｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｒｏｈｄｅ，  Ｍ．，  Ｋｙｒｐｉｄｅｓ，  Ｎ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋｌｅｎｋ，  Ｈ．  Ｐ．  ２００９．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ  （ＮＳ１１４）．  Ｓｔａｎｄ  Ｇｅｎｏｍ  Ｓｃｉ  １：１３３−１４０．
【非特許文献６７】Ｃｈｅｌｉｕｓ，  Ｍ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｔｒｉｐｌｅｔｔ，  Ｅ．  Ｗ．  ２０００．  Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｇｅｎ．  ｎｏｖ．，  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｓｔｅｍｓ．  ＩｎｔＪ  Ｓｙｓ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５０：７５１−７５８．
【非特許文献６８】Ｆｉｎｓｔｅｒ，  Ｋ．  Ｗ．，  Ｈｅｒｂｅｒｔ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｌｏｍｓｔｅｉｎ，  Ｂ．  Ａ．  ２００９．  Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｓｐｉｔｓｂｅｒｇｅｎｓｅ  ｓｐ．  ｎｏｖ．  ａｎｄ  Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｕｔｅｕｍ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｉｇｈ  Ａｒｃｔｉｃ  ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔ  ｓｏｉｌ，  ａｎｄ  ｅｍｅｎｄｅｄ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：８３９−８４４．
【非特許文献６９】Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ，  Ｍ．，  Ｓｖｅｒｃｅｌ，  Ｍ．，  Ｌａｃｚｋｏ，  Ｅ．，  Ｋａｅｃｈ，  Ａ．，  Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｕ．，  ａｎｄ  Ｂａｇｈｅｒｉ，  Ｈ．  Ｃ．  ２０１１．  Ｆｉｂｒｅｌｌａ  ａｅｓｔｕａｒｉｎａ  ｇｅｎ．  ｎｏｖ．，  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｉｄａｌ  ｆｌａｔ，  ａｎｄ  ｅｍｅｎｄｅｄ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｒｕｄａｎｅｌｌａ  Ｗｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：１８４−１８９．
【非特許文献７０】Ｈａ，  Ｓ．，  Ｇｒｏｓｓ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｓ．  ２００１．  Ｅ．  Ｃｏｌｉ  ＭｕｒＧ：  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １：２０１−２１３．
【非特許文献７１】Ｓａｍｕｅｌ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｒｅｅｖｅｓ，  Ｐ．  ２００３．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ：  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｇａｒ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３３８：２５０３−２５１９．
【非特許文献７２】Ｇｉｒａｕｄ，  Ｍ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｎａｉｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｈ．  ２０００．  Ｔｈｅ  ｒｈａｍｎｏｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０：６８７−６９６．
【非特許文献７３】Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｆ．  Ｗ．，  Ｄａｅｇｅｌｅｎ，  Ｐ．，  Ｌｅｎｓｋｉ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｍａｓｌｏｖ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｆ．  ２００９．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ＲＥＬ６０６  ａｎｄ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｋ−１２  Ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９４：６５３−６８０．
【非特許文献７４】Ｌａｒｂｉｇ，  Ｋ．  Ｄ．，  Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，  Ａ．，  Ｊｏｈａｎｎ，  Ａ．，  Ｋｌｏｃｋｇｅｔｈｅｒ，  Ｊ．，  Ｈａｒｔｓｃｈ，  Ｔ．，  Ｍｅｒｋｌ，  Ｒ．，  Ｗｉｅｈｌｍａｎｎ，  Ｌ．，  Ｆｒｉｔｚ，  Ｈ．−Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔuｍｍｌｅｒ，  Ｂ．  ２００２．  Ｇｅｎｅ  Ｉｓｌａｎｄｓ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔＲＮＡＧｌｙ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｎ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｃｌｏｎｅ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：６６６５−６６８０．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、ポリフェノール（例えば、フェノール酸誘導体、カルコノイド、クロモン類、クマリン誘導体、フラボノイド、およびスチルベノイドなど）のグリコシル化を触媒する酵素を提供し、この酵素は、
ａ）配列番号７〜１２の配列の１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または
ｂ）配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、または
ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で定義される酵素の１つと相同であるか、または
ｄ）ストリンジェントな条件下、配列番号１〜６の配列の１つのヌクレオチド配列を含む配列と相補的な核酸とハイブリダイズする核酸によりコードされる。
【０００８】
本明細書中記載される新規酵素は、ＧｔｆＣ、ＭｇｔＢ、ＭｇｔＣ、ＭｇｔＳ、ＭｇｔＴ、およびＭｇｔＷと命名するが、ＧＴファミリー１に属し、フラボノイドおよび同様な分子のようなポリフェノールに対して高い活性を有する。
【０００９】
「含む」という用語は、本明細書使用される場合、「有する」という用語を包含する。すなわち、ある実施形態において、明確に言及されている要素に加えて、さらなる要素が必ず存在しなければならないことを意味するとは解釈されない。例えば、「配列番号Ｘに記載のアミノ酸配列を含む酵素」という語句は、配列番号Ｘに記載のアミノ酸配列を有する酵素も包含し、この文脈において「有する」は、配列番号Ｘのアミノ酸のみで構成されることを意味する。
【００１０】
「相同である」という用語は、本明細書中、核酸、タンパク質、またはペプチドに関して使用される場合、核酸が、そのヌクレオチド配列において、別の核酸と本質的に同一または類似であるか、あるいはタンパク質またはペプチドが、そのアミノ酸配列において、別のタンパク質またはペプチドと本質的に同一または類似であるが、比較対象の核酸またはタンパク質またはペプチドに対して完全に同一ではないことを意味する。２つの核酸またはタンパク質またはペプチドの間に相同性が存在することは、第一の配列のある位置を第二の配列の該当する位置と比較して、その位置に同一または類似の残基が存在するかどうかを決定することにより、決定することができる。比較された２つの配列は、同一または類似のヌクレオチドまたはアミノ酸が、ある最低パーセンテージで存在する場合に、相同である。同一性は、２つの配列を等価な位置で比較した場合に、同じヌクレオチドまたはアミノ酸が存在することを意味する。比較は、場合によっては、可能な最適配列比較を行う目的で配列ギャップを考慮に入れる必要があるかもしれない。類似アミノ酸は、同じまたは等価な化学的および、または物理的性質のいずれかを持つが同一ではないアミノ酸である。あるアミノ酸を、同じまたは等価な化学的および、または物理的性質のいずれかを持つ別のアミノ酸に置き換えることは、「保存的置換」と称される。アミノ酸の物理化学的性質の例は、疎水性または電荷である。核酸に関しては、コード配列中、コドン内のヌクレオチドが別のヌクレオチドに置き換えられ、それでも新しいコドンが、例えば遺伝暗号の縮重度故に、依然として同じまたは類似のアミノ酸をコードする場合、類似ヌクレオチドまたは保存的置換と称する。当業者なら、どのヌクレオチドまたはアミノ酸置換が保存的置換であるかわかる。２つの核酸の類似性または同一性の度合いを決定するために、各ヌクレオチド配列中の、最短でも６０ヌクレオチド長または塩基対の長さを、より好ましくは、最短でも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、もしくは４００ヌクレオチド長または塩基対の長さを、あるいはヌクレオチドの少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または９９．５％を比較することが好ましい。タンパク質／ペプチドについては、比較される各アミノ酸配列中の、最短でも２０アミノ酸長、好ましくは最短でも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、８０、もしくは１００アミノ酸長、より好ましくは最短でも１２０、１４０、１６０、１８０、もしくは２００アミノ酸長を、または最短でも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、もしくは９９．５％のアミノ酸長を比較することが好ましい。特に好ましくは、各タンパク質または核酸の全長を、比較に用いる。２つの配列の類似性または同一性の度合いは、例えば、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（非特許文献１９）（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）に標準パラメーターを用いて決定することができる。相同性の決定は、比較する配列の長さに依存する。本発明の目的に関しては、短い方でも少なくとも１００ヌクレオチドを含む２つの核酸について、ヌクレオチドの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、または９９．５％が同一および、または類似（ＢＬＡＳＴによれば「同一」または「陽性」）のいずれか、好ましくは同一である場合に、２つの核酸は相同であると見なされる。配列の長さが５０〜９９ヌクレオチドの場合、２つの核酸は、ヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％が同一および、または類似のいずれかである場合に、相同であると見なされる。配列の長さが１５〜４９ヌクレオチドの場合、２つの核酸は、ヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または９９．５％が同一および、または類似のいずれかである場合に、相同であると見なされる。タンパク質またはペプチドをコードする核酸の場合、翻訳されたアミノ酸配列が相同であるならば、相同性が存在するとされる。アミノ酸、特に非同一アミノ酸で、コンピュータープログラム「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（塩基配列局所整列検索プログラム）」、略してＢＬＡＳＴ（非特許文献１９）（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）に基づいて、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ａｍｉｎｏ  Ａｄｉｃ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．  Ｐｒｏｃ   Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２）（非特許文献２０）を用いて、「陽性」と指定される、すなわちＢＬＯＳＵＭ６２置換行列で正のスコアを有するものも、同様に見なされる。本発明の目的に関して、２つのアミノ酸の少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、または少なくとも９９．５％が同一または類似である、好ましくは同一である場合に、２つのアミノ酸配列間に相同性が存在するとされる。詳細には、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（非特許文献１９）（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）に標準パラメーターおよびＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（非特許文献２０）を用いて、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９���％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、または少なくとも９９．５％の同一性または類似性（「陽性」）、好ましくは同一性が得られる場合に、２つの配列間に相同性があるとされる。当業者なら、その専門知識を用いて、利用可能なＢＬＡＳＴプラグラム、例えばＢＬＡＳＴｐとＰＬＡＳＴｎのどちらが相同性を決定するのに適しているか、容易に決めることができる。また、当業者なら、相同性を査定するさらなるプログラムがあることも承知しており、必要があればそれを使うこともできる。そのようなプログラムは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．ｈｔｍｌを参照）のウェブサイトで入手可能である。「〜とｘ％相同である」または「ｘ％の相同性」のような用語は、本明細書中使用される場合、２つのタンパク質または核酸が、相同であり、ｘ％（例えば８０％）の配列類似性または同一性、好ましくは同一性を有すると見なされるものとする。
【００１１】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書中、相補的核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の度合い、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの核酸のＴｍ（「融点」）、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因により影響される。
【００１２】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う条件が、ストリンジェンシーの高い、すなわち温度、イオン強度、および他の化合物（有機溶媒など）の存在に関してストリンジェンシーの高い条件であることを示す。「ストリンジェンシーの高い」条件を用いると、核酸塩基対形成は、高い頻度で相補的塩基配列を有する核酸間でしか起こらなくなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知である（例えば、Ｇｒｅｅｎ  Ｍ．Ｒ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１２（非特許文献１）を参照）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4Ｈ2Ｏ、および１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、続いて、４２℃で０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液で洗浄することが挙げられる。
【００１３】
「グリコシル化」という用語は、グリコシルドナーとしての含水炭素が、別の分子（グリコシルアクセプター）のヒドロキシルまたは他の官能基に結合する反応を示す。
【００１４】
「グリコシルドナー」という用語は、適切なアクセプター化合物と反応して新たなグリコシド結合を形成する含水炭素（例えば、単糖、二糖、または少糖など）を示す。
【００１５】
「含水炭素」という用語は、炭素の水和物、すなわち化学量論式Ｃn（Ｈ2Ｏ）nを有する化合物を含む。一般名称として、単糖類、少糖類、および多糖類、ならびに単糖類の、カルボニル基還元に由来する物質（アルジトール）、カルボン酸の１つまたは複数の末端基の酸化に由来する物質、あるいは１つまたは複数のヒドロキシ基の水素原子、アミノ基、チオール基、または同様な基による置換に由来する物質が挙げられる。ＩＵＰＡＣ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（いわゆる「Ｇｏｌｄ  Ｂｏｏｋ」）。Ａ．Ｄ．ＭｃＮａｕｇｈｔおよびＡ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによる編纂。Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９７）。ＸＭＬオンライン改訂版：  ｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ  （２００６−）、Ｍ．  Ｎｉｃ，  Ｊ．  Ｊｉｒａｔ，  Ｂ．  Ｋｏｓａｔａにより作成；  Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓにより更新が編纂される。ＩＳＢＮ  ０−９６７８５５０−９−８．  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ。更新最終日：  ２０１４−０２−２４；  最新版：  ２．３．３；  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．Ｃ００８２０（非特許文献２）を参照。
【００１６】
「ポリフェノール」という用語は、シキミ酸およびフェニルプロパノイド経路を介して生合成される、１つ、または２つ以上のヒドロキシル基が環系に直接結合した芳香族化合物である、植物の二次代謝産物または、その誘導体を示す。ポリフェノールの例として、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコン類、クロモン類、およびクマリン誘導体がある。
【００１７】
「フラボノイド」という用語は、２−フェニルクロメン−４−オン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）に由来するフラボン（例えばケルセチン、ルチン）、３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）に由来するイソフラボノイド、および４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）に由来するネオフラボノイドを含む化合物の群を示す。この用語は、例えば、フラボン（例えばルテオリン、アピゲニン）、フラバノン（例えばヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール）、フラボノール（例えばモリン、ケルセチン、ルチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フィセチン）、フラバノール（例えば、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン）、フラバノノール（例えばタクシフォリン）、カルコン類（カルコン誘導体、例えばイソリキリチゲニン、フロレチン、キサントフモール）、イソフラボン（例えばゲニステイン、ダイゼイン、リコリシジン）、クロモン類、すなわちクロモン（１，４−ベンゾピロン、クロメン−４−オン）の誘導体、詳細にはヒドロキシル化クロモン誘導体（例えばノルオイゲニン）、アントシアニジン（例えばシアニジン、デルピニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン）、およびオーロン類（例えばオーロイシジン）、ならびに上記クラスの化合物のアシル化、グリコシル化、メトキシ化、およびスルホニル化誘導体。ＩＵＰＡＣ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（いわゆる「Ｇｏｌｄ  Ｂｏｏｋ」）。Ａ．Ｄ．ＭｃＮａｕｇｈｔおよびＡ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによる編纂。Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９７）。ＸＭＬオンライン改訂版：  ｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ  （２００６−）、Ｍ．  Ｎｉｃ，  Ｊ．  Ｊｉｒａｔ，  Ｂ．  Ｋｏｓａｔａにより作成；  Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓにより更新が編纂される。ＩＳＢＮ  ０−９６７８５５０−９−８．  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ。更新最終日：  ２０１４−０２−２４；  最新版：  ２．３．３；  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．Ｆ０２４２４（非特許文献２）も参照。
【００１８】
「スチルベノイド」という用語は、スチルベンのヒドロキシル化誘導体、およびその誘導体を示し、例としてレスベラトロールがある。
【００１９】
「クマリン類」という用語は、クマリン（２Ｈ−クロメン−２−オン、１−ベンゾピラン−２−オン）の誘導体、詳細にはヒドロキシル化誘導体、例えば７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（４−ＭＵ、４−メチルウンベリフェロン）を示す。ＩＵＰＡＣ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（いわゆる「Ｇｏｌｄ  Ｂｏｏｋ」）。Ａ．Ｄ．ＭｃＮａｕｇｈｔおよびＡ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによる編纂。Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９７）。ＸＭＬオンライン改訂版：  ｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ  （２００６−）、Ｍ．  Ｎｉｃ，  Ｊ．  Ｊｉｒａｔ，  Ｂ．  Ｋｏｓａｔａにより作成；  Ａ．Ｊｅｎｋｉｎｓにより更新が編纂される。ＩＳＢＮ  ０−９６７８５５０−９−８．  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ。更新最終日：  ２０１４−０２−２４；  最新版：  ２．３．３；  ｄｏｉ：１０．１３５１／ｇｏｌｄｂｏｏｋ．Ｃ０１３６９（非特許文献２）も参照。
【００２０】
「安息香酸誘導体」という用語は、安息香酸の誘導体、詳細にはヒドロキシル化誘導体を示す。
【００２１】
好適な実施形態において、本発明の酵素と相同である酵素は、上記ａ）またはｂ）で定義される酵素と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％または８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または少なくとも９９．５％相同である。
【００２２】
特に好適な実施形態において、本発明の酵素は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むもしくは有するか、あるいは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むもしくは有する核酸によりコードされるか、あるいは配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むもしくは有するかまたは配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むもしくは有する核酸によりコードされる酵素と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％または８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％相同である酵素である。
【００２３】
第二の態様において、本発明は、第一の態様による酵素の断片にも関し、この断片は、この酵素の保存アミノ酸を少なくとも６０、好ましくは少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、または少なくとも１２０含み、かつこの断片は、ポリフェノールのグリコシル化を触媒する。
【００２４】
第三の態様において、本発明は、本発明の第一の態様による酵素または本発明の第二の態様による断片をコードする核酸に関連する。好ましくは、核酸は、
ａ）配列番号１〜６に記載のヌクレオチド配列の１つ、またはその断片を含むか、または
ｂ）上記ａ）で定義される核酸の１つと相同であるか、または
ｃ）上記ａ）で定義される核酸と相補的な核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２５】
本発明が核酸の断片または酵素の断片に関連する場合、当然のことながら、断片は、核酸の場合は、ポリフェノールのグリコシル化を触媒するペプチドをコードし、ペプチドの場合は、ポリフェノールのグリコシル化を触媒する。
【００２６】
核酸、またはその断片は、核酸を宿主細胞（例えば、真菌細胞、細菌細胞、または植物細胞）に導入する手段としてのベクター（プラスミドなど）に組み込むことができる。細胞中で、核酸、またはその断片の発現を達成する目的で、核酸を、適切なプロモーターおよび、または他の制御配列のいずれかと機能的に連結させることができる。そのようなベクターを宿主細胞に導入するベクターおよび方法として適切なものは多種多様に存在し、それらは当業者に既知である。
【００２７】
第四の態様において、本発明は、ポリフェノール、好ましくはフェノール酸誘導体、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン類、およびクマリン誘導体をグリコシル化するための、本発明の第一の態様による酵素または本発明の第二の態様による断片の使用に関する。
【００２８】
第五の態様において、本発明は、ポリフェノール、好ましくは、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン、またはクマリン誘導体のグリコシドを調製する方法に関し、本方法は、酵素反応に適切な条件下、請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素または請求項４に記載の酵素断片を用いて、ポリフェノールとグリコシルドナーを反応させて、グリコシルドナーをポリフェノールのヒドロキシル基または他の官能基に移動させる工程を含む。
【００２９】
酵素的グリコシル化反応に適切な条件は、当業者に周知であるし、以下の実施例および本明細書中参照される先行技術文献に由来するものも可能である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ここから、以下の実施例を用いて、あくまでも例示を目的として本発明を説明する。
【００３１】
細菌株、プラスミド、および化学試薬
本研究で用いられる細菌株およびプラスミドを以下の表１に、プライマーを表２に列挙する。
【００３２】
（表１）
2016518849.tif 000002
2016518849.tif 000003
【００３３】
（表２）
表２  遺伝子増幅および配列分析のために用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマー。制限エンドヌクレアーゼの認識部位は下線が付してある（ＩＤ＝配列番号。
2016518849.tif 000004
【００３４】
他に特に記載がないかぎり、エシェリヒア・コリは、適切な抗生物質を補充したＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母菌抽出物、０．５％ＮａＣｌ）中、３７℃で増殖させた。バチルス単離菌は、同一の培地で、３０℃で増殖させた。使用した化学試薬は全て、分析実験用純度のものであった。ポリフェノール物質は、ドイツにある以下の企業から購入した：Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット；Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、カールスルーエ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ハイデルベルグ、およびＡｐｐｌｉｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ、ダルムシュタット。さらなるフラボノイドは、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（リヨン、フランス）に注文した。ポリフェノールの貯蔵原液は、ＤＭＳＯで１００ｍＭ濃度において調製した。
【００３５】
ＤＮＡの単離およびフォスミドライブラリー構築
バチルス種の株ＨＨ１５００は、最初に、ハンブルグ大学の植物園の土壌試料から単離された。バチルス種ＨＨ１５００のＤＮＡは、ｐｅｑＧＯＬＤ細菌ＤＮＡキット（ＰＥＱＬＡＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、エアランゲン、ドイツ）を用いて、取扱説明書に従って単離された。象の便のライブラリーを構築するための試料は、ハーゲンベック動物園（ハンブルク、ドイツ）から入手した。Ｋａｎｄｙという名前の健康な６歳のメスのアジアゾウ（Ｅｌｅｐｈａｓ  ｍａｘｉｍｕｓ）の新鮮な便を採取し、ＤＮＡ抽出するまで、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール含有ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）に入れて−２０℃で貯蔵した。ＤＮＡ抽出のため、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いた。キットは、取扱説明書に従って用いた。推奨されるとおり、ＡＳＬ緩衝液中でのインキュベーション温度は９５℃に上げた。エルベ川堆積物からのＤＮＡ単離は、干潮時にグリュックシュタット（ドイツ）近くのエルベ川の干潟域（５３°４４’４０’’Ｎ、００９°，２６’１４’’Ｅ）から採取した堆積物試料で行った。土壌ＤＮＡは、Ｚｈｏｕおよび共同研究者が発表（非特許文献３９）した、ＳＤＳを利用したＤＮＡ抽出方法を用いて抽出した。
【００３６】
フォスミドｐＣＣ１ＦＯＳを持つ大腸菌ＥＰＩ３００細胞のゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーの構築は、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ（登録商標）フォスミドライブラリー制作キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マディソン、ＵＳＡ）を用いて、既に報告されているとおりの多少の変更（非特許文献４０）を取扱説明書に加えて達成した。クローンを、クロラムフェニコールを１２．５μｇ／ｍＬ含む液状ＬＢ培地１５０μＬが入った９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、一晩増殖させた。各マイクロタイターウェルに８６％グリセロール１００μＬを添加した後、ライブラリーを−７０℃で貯蔵した。バチルス種ＨＨ１５００のゲノムフォスミドライブラリーは、１，９２０のクローンを含み；エルベ川堆積物ライブラリーについては合計で３５，０００のクローンが得られ、象の便ライブラリーは、合計で２０，０００のクローンを含んだ。全てのライブラリーが、フォスミドを平均挿入断片サイズ３５ｋｂで含有していた。
【００３７】
分子クローニング戦略
ｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドの断片を、フォスミドクローンであるｐＦＯＳ４Ｂ２およびｐＦＯＳ１４４Ｃ１１の制限に従って、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ベクターに導入してサブクローン化した。得られるプラスミドは、それぞれ、ｐＳＫ４Ｂ２およびｐＳＫ１４４Ｃ１１と名付けた。ｐＳＫ１４４Ｃ１１由来の断片のさらなるサブクローン化を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて、ｐＴＺ１９Ｒ−Ｃｍで行った。得られるクローンは、それぞれ、ｐＴＺ１４４ＥおよびｐＴＺ１４４Ｐと名付けた。大腸菌ＤＨ５αに熱ショックを与えてプラスミドで形質転換し、サブクローンを保有するプラスミドを、一晩増殖後、１０μＭの５−ブロモ−４−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）および４００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ寒天板で青白スクリーニングすることにより同定した。異なるクローンを、プラスミド精製、続いて酵素消化およびアガロースゲル電気泳動および／またはＤＮＡ配列決定により分析した。
【００３８】
翻訳領域（ＯＲＦ）のＰＣＲ増幅を、テンプレートとしてフォスミドＤＮＡを用いて行った。反応は、３０サイクル行った。ｍｇｔＢを増幅するため、プライマーｍｇｔ１−ＸｈｏＩ−ｆｏｒおよびｍｇｔ１−ＸｈｏＩ−ｒｅｖを用い、ＯＲＦの５’末端および３’末端ＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位を挿入した（表２を参照）。ｇｔｆＣをクローニングするため、プライマー対ｇｔｆ−Ｎｄｅ−ｆｏｒおよびｇｔｆ−Ｂａｍ−ｒｅｖを用い、ＯＲＦの５’末端開始コドンおよび３’末端ＢａｍＨＩ部位を含むＮｄｅＩ部位を挿入した（表２）。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲクローニングキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて、ｐＤｒｉｖｅに結合させ、大腸菌ＤＨ５αに導入してクローン化した。得られるクローンは、それぞれｐＤｍｇｔＢおよびｐＤｇｔｆＣと名付け、生体内変換における活性について分析するとともに、正しい挿入断片をＤＮＡ配列決定により分析した。ｍｇｔＢおよびｇｔｆＣを発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）に結合させるのは、各ＯＲＦの挿入されたエンドヌクレアーゼ制限部位を用いて行った。正しい挿入断片を含有するプラスミドを、それぞれ、ｐＥＴ１９ｍｇｔＢおよびｐＥＴ１９ｇｔｆＣ、と名付けた。所望のプラスミドを持つ大腸菌ＤＨ５αクローンを、それぞれ、ｍｇｔＢを確認するためにＴ７ターミネータープライマーおよびｍｇｔ１−ＸｈｏＩ−ｆｏｒを用いて、ならびにｇｔｆＣを確認するためにＴ７ターミネータープライマーおよびｇｔｆ−Ｎｄｅ−ｆｏｒを用いて、直接コロニーＰＣＲにより検出した。さらに、ｐＥＴ１９ｍｇｔＢおよびｐＥＴ１９ｇｔｆＣの挿入断片を、Ｔ７プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）およびＴ７ターミネータープライマー（表２）を用いて配列決定することにより、構築物を確認した。
【００３９】
酵素の過剰産生および精製
デカヒスチジン（Ｈｉｓ10−）タグ付きタンパク質を過剰産生させるため、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴ１９ｂ構築物で形質転換した。一晩培養してから培養物を遠心により収穫し、１％を用いて発現培地に播種した。ｐＥＴ１９ｍｇｔＢを保有する細胞を、０．７ＯＤ６００になるまで、２２℃で増殖させた。培養物を１７℃に移し、１００μＭのＩＰＴＧで誘導した。１６時間後、培養物を、４℃で、７．５００ｇで遠心することにより収穫した。細胞を、０．３ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させ、ＵＰ２００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ、テルトウ、ドイツ）にて、サイクル目盛り０．５および振幅目盛り７５％で、Ｓ２振動棒（ｓｏｎｏｔｒｏｄｅ）を用いて超音波処理することにより破壊した。
【００４０】
デカヒスチジンタグ付きＧｔｆＣの過剰産生を、３７℃で０．６のＯＤ600の状態で、１００μＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで細胞を４時間インキュベートし、収穫し、ＭｇｔＢについて上記に記載したとおりに溶解させた。
【００４１】
粗細胞抽出物を、１５．０００ｇおよび４℃で遠心して、細胞片を沈降させた。清澄抽出物を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅプラスシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  Ｃｒｕｄｅカラムに添加した。使用説明書に従ってヒスチジンタグ付きタンパク質を徐々に溶出させることにより、酵素を精製した。溶出したタンパク質溶液は、０．３ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１，０００倍体積で用いて、それに対する透析を４℃で２回行った。精製は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質の濃度は、Ｒｏｔｉ−Ｑｕａｎｔ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツ）を用いて、ブラッドフォード法により測定した。
【００４２】
生体内変換および生体内触媒作用
細菌におけるフラボノイド修飾を検出するため、生体内変換アプローチを用いた。培養物は、適切な抗生物質を含むＬＢ培地で一晩増殖させた。酵素を過剰産生させるため、発現培地を上記のとおり調製した。細胞を、４，５００ｇで遠心することにより沈降させ、１％（ｗ／ｖ）のα−Ｄ−グルコースを補充した５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に再懸濁させた。１００ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵原液から最終濃度１００μＭで接種されたフラボノイド（すなわち０．１％）の生体内変換系を、三角フラスコ中３０℃および１７５ｒｐｍで最長２４時間までインキュベートした。４ｍＬの試料を採取し、酢酸エチル２ｍＬで抽出するために、１ＭのＨ3ＰＯ4水溶液１００μＬで酸性にした。試料を１分間震盪撹拌し、２，０００ｇおよび４℃で遠心することにより相を分離させた。上清でＴＬＣ分析を行った。定量するため、１００μＬの試料を用いて、３：１の酢酸エチル／酢酸に、１／１０で溶解させた。これらの酸性にした酢酸エチル試料を、１０，０００ｇで遠心した。上清を用いて、以下に記載するとおりの定量ＴＬＣ分析を行った。
【００４３】
フォスミドクローンを、９６ディープウェルプレートで一晩増殖させた。クローンは、１プールあたり、９６、４８、８、または６つのクローンにまとめた。プールしたものを４，５００ｇで遠心することにより収穫し、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ（登録商標）自己誘導溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ＷＩ）（アラビノース最終濃度５ｍＭ）および生体内変換用のフラボノイド１００μＭを含有するＬＢ培地５０ｍＬに再懸濁させた。ディープウェルプレートの代わりとして、クローンを寒天板で前培養した。一晩インキュベーション後、コロニーを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗い落とし、遠心により収穫し、上記に要約するとおり再懸濁させた。生体内変換系を３００ｍＬ三角フラスコに入れ、１７５ｒｐｍで震盪撹拌しながら３０℃でインキュベートした。各単独クローンを、同様に、ただし５ｍＬのＬＢで前培養し１００ｍＬフラスコ中で２０ｍＬ生体内変換培地に再懸濁させて、試験した。１６、２４、４８時間後に反応系から４ｍＬの試料を採取し、ＨＣｌ水溶液４０μＬで酸性にし、上記のとおりＴＬＣ分析用に調製した。陽性のプールを、２回目の生体内変換で確認し、次いで系統的に縮小していって、該当する単独のクローンが同定されるまで、プールを小さくしては該当するヒットを検出した。
【００４４】
生体内触媒反応系１ｍＬは、精製したＨｉｓタグ付き酵素５μｇを含有しており、生体内触媒反応は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中３７℃で行った。ＵＤＰ−α−Ｄ−グルコースまたはＵＤＰ−α−Ｄ−ガラクトースを、ドナー物質として、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中５０ｍＭの貯蔵原液から、最終濃度５００μＭで加えた。アクセプター基質は、１００μＭ濃度で用い、１００ｍＭのＤＭＳＯ溶液から加えて、反応混合物中の最終含量を０．１％とした。反応混合物１００μＬを３：１の酢酸エチル／酢酸に１／１０で溶解させることにより、反応を停止させた。これらの試料を直接用いて、定量ＴＬＣ分析を行った。
【００４５】
ＴＬＣ分析
上清は、ＨＰＬＣ用平底バイアルに移してＴＬＣ分析に使用した。試料２０μＬを、２０×１０ｃｍ2の（ＨＰ）ＴＬＣシリカ６０Ｆ254プレート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）に添加し、比較対象として参照フラボノイド２００ｐｍｏｌを用いた。物質の持ち越し汚染を回避するため、すなわち偽陽性を防ぐため、試料の斑点を付けるごとに、ＡＴＳ４でシリンジを２回すすいだ。試料を添加したＴＬＣプレートを、１００：１１：１１：２７の酢酸エチル／酢酸／ギ酸／水（万能植物展開液(Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｆｌａｎｚｅｎｌａｕｆｍｉｔｔｅｌ)）で展開した（非特許文献４１）。分離後、ＴＬＣプレートをオーブンに入れて８０℃で５分間乾燥させた。分離したバンドの吸光度を、ＴＬＣスキャナー３（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）で重水素放電管を用いて、２８５〜３７０ｎｍでの添加した分離物質の最大吸光度に応じた濃度測定で決定した。続いて、展開したＴＬＣプレートを、クロマトグラム浸漬装置（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）を用いて１％（ｗ／ｖ）ジフェニルホウ酸β−アミノエチルエステル（ＤＰＢＡ）のメタノール溶液（非特許文献４２）に１秒間浸漬し、続いてファンで熱風を送ってＴＬＣプレートを乾燥させることにより、プレート上の物質を誘導体化した。２分後、ＵＶハンドランプを用いて３６５ｎｍでバンドを視認できるようにして、写真撮影した。あるいは、バンドの蛍光を、ＴＬＣスキャナー３により、３２０〜３７０ｎｍでの添加した物質の最大吸光度に応じた濃度測定で測定した。
【００４６】
ＴＬＣによるフラボノイドの定量
生体内変換および生体内触媒作用反応におけるフラボノイドを定量するため、試料を３：１の酢酸エチル／酢酸で１／１０に希釈して、反応を止めた。試料２０μＬを、ＡＴＳ４（ＣＡＭＡＧ、ムッテンツ、スイス）により、ＨＰＴＬＣシリカ６０Ｆ254プレート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）に吹き付け、比較対象として様々な量のそれぞれの標準分離物質および生成物質を用いた。ＴＬＣプレートを、上記のとおり、展開し、乾燥させ、誘導体化し、分析した。添加した参照物質のピーク面積から回帰曲線を計算して、生成フラボノイドおよび残存フラボノイドの量を求めた。
【００４７】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析
ＨＰＬＣは、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｔａｒ  ＲＰ−１８ｅ  １２５−４カラム（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）、粒子径３μｍに、Ｒｈｅｏｓ  ２０００ポンプ（Ｆｌｕｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スイス）を用い、圧力限度を最小０ｂａｒおよび最大４００ｂａｒに設定して行った。注入体積１０μＬの試料を、溶媒Ａ（水に０．１％ＴＦＡ添加）；および溶媒Ｂ（アセトニトリルに０．１％ＴＦＡ添加）を用いて、以下のＨＰＬＣ勾配条件で分離させた：０分から、０．６ｍＬ／分で９０％Ａ、１０％Ｂ；１４分から、０．６ｍＬ／分で７５％Ａ、２５％Ｂ；１８分から、０．６ｍＬ／分で５％Ａ、Ｂ＝９５％；２２分から、０．６ｍＬ／分で５％Ａ、９５％Ｂ；２２．１分から、０．６ｍＬ／分で、９０％Ａ、１０％Ｂ；そして２８．１分から、０．６ｍＬ／分で９０％Ａ、１０％Ｂ。溶出は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＰＤＡ検出器で監視し、画分をＨＴＣ  ＰＡＬ自動回収装置（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）で収集した。ポジティブイオン化モードのＥＳＩインターフェースを備えるＴｈｅｒｍｏ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  Ｐｌｕｓで、質量分析（ＭＳ）を行った。
【００４８】
配列分析およびＧｅｎｂａｎｋ登録
ＡＢＩ３７７および染色ターミネーター化学反応を用い、使用説明書に従って小さい挿入プラスミドの自動ＤＮＡ配列決定を行った。大きいフォスミド配列は、４５４シークエンステクノロジーにより確立させた。配列を、Ｇａｐ４ソフトウェアを用いて復元した。Ｃｌｏｎｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ９  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェアを用いて、ＯＲＦを見つけた。本明細書に記載される配列は全て、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたが、優先日以前には公開されていなかった。バチルス種ＨＨ１５００の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ１４５７２９を有する。サブクローンｐＳＫ４Ｂ２で同定された、バチルス種ＨＨ１５００からのフォスミド由来遺伝子は、ｂｓｐＡ（ＪＸ１５７８８５）、ｍｇｔＢ（ＪＸ１５７８８６、配列番号２）、およびｂｓｐＣ（ＪＸ１５７８８７）である。エルベ川堆積物メタゲノムに由来するフォスミドサブクローンｐＳＫ１４４Ｃ１１は、遺伝子ｅｓｍＡ（ＪＸ１５７６２６）、ｇｔｆＣ（ＡＧＨ１８１３９、配列番号１）、ｅｓｍＢ（ＪＸ１５７６２８）、およびｅｓｍＣ（ＪＸ１５７６２９）を含んだ。
【００４９】
結果
スクリーニング方法：フラボノイド修飾酵素クローンを検出するための、ＴＬＣを利用したスクリーニング方法の設定
「天然物試薬Ａ（Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆｒｅａｇｅｎｚ  Ａ）」。Ｂ．セレウスおよびＢ．スブチリスは、フラボノイドのグルコシル化を仲介するグリコシルトランスフェラーゼをコードする（非特許文献３６）ことが既知であることから、出願人の株コレクションから複数の単独細菌の単離菌を、フラボノイド修飾活性に関して最初に試験した。野生型単離菌の全細胞を用いた生体内変換により、株の１種にフラボノイド修飾酵素が存在することが確認された。この株は、最初に、Ｈａｍｂｕｒｇの植物園の土壌試料から単離されたもので、バチルス種ＨＨ１５００と名付けられた。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ１４５７２９）の配列分析は、Ｂ．セレウス群に属する菌と１００％の同一性を示した（データは示さず）。この株を陽性対照として用いる目的で、そのゲノムＤＮＡを含むｐＣＣ１ＦＯＳのフォスミドライブラリーを構築した。得られるライブラリーには、１，９２０のクローンが含まれ、平均挿入サイズは３５ｋｂであった。すなわち、このライブラリーは、約６７Ｍｂのクローン化ｇＤＮＡを包含し、したがって、約１０倍、Ｂ．セレウス群に属する菌由来のゲノムの平均の大きさを範囲に含める（非特許文献４３）。さらに、（ＨＰ）ＴＬＣに基づくアッセイの感度を、イソケルシトリン（ケルセチンの３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド）の系列希釈を利用して、０．７８μＭから最高１００μＭまでの濃度のイソケルシトリン１０μＬをＴＬＣプレートに吹き付け、３６５ｎｍでの吸光度を測定することにより、確認した（表３）。また、他のグリコシル化フラボノイド１０μＬを、１０μＭ濃度で試験したところ、吸光度クロマトグラムで明白なピークとして検出することができた（表３、データは示さず）。
【００５０】
観測された感度に基づき、体系的スクリニーングスキームを計画した。最初に９６のフォスミドクローンを、ディープウェルマイクロタイタープレート中、３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物をプールし、この工程に続いて、細胞を遠心により沈降させて、適切な抗生物質およびアクセプター物質としてケルセチン１００μＭを含有する新鮮なＬＢ培地に再懸濁させた。３０℃で、１６、２４、および４８時間インキュベーション後、プールした培養物の試料４ｍＬを採取し、半量の酢酸エチルで抽出した。これらの抽出物のうち、２０μＬをＴＬＣシリカプレートに添加し、溶媒として「万能植物展開液」を用いて分離させた。展開した試料の各レーンの吸光度を、３６５ｎｍで濃度測定により求めた。さらに、基質および修飾されたフラボノイドのバンドを、「天然物試薬Ａ」（非特許文献４２）で染色して視認できるようにした。天然物試薬Ａは、１％のジフェニルホウ酸−β−アミノエチルエステルを含むメタノール溶液；および５％のポリエチレングリコール４０００を含むエタノール溶液を含有する（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツから入手）。本発明者らによる場合では、試験の感度は、９６のクローンの混合物の中から単独のフラボノイド修飾酵素クローンを検出するのに十分なほど高かった。陽性シグナルを検出した後、９６のフォスミドクローンを４８のクローンからなるプールに分割して、マイクロタイタープレート半分のプール２つとし、そのうちの片方において同じピークを見つけた。この手順に続いて、４８のクローンを６プール×プールあたり８つのクローンに分割し、最終的に、８つの個別のクローンを分析した。この戦略を用いて、２０枚のマイクロタイタープレート全てで合計１，９２０のクローンを試験して、バチルス種ＨＨ１５００フォスミドライブラリー中の重複する陽性クローン６つを同定するのに成功した。
【００５１】
これらの６つのフォスミドクローンのうち、約４６ｋｂの１つのクローンｐＦＯＳ４Ｂ２を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いて、サブクローン化した。得られるサブクローンを、上記のＴＬＣスクリーニング技法を用いて分析した。それにより、ｐＳＫ４Ｂ２と名付けた陽性サブクローンが同定され、その配列が完全に決定された（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ１５７８８５−ＪＸ１５７８８７）。サブクローンｐＳＫ４Ｂ２は、３，２２５ｂｐの挿入断片を保有し、４０２ａａのタンパク質をコードする遺伝子（ｍｇｔＢｔと名付けた）をコードした。同定されたＯＲＦをサブクローン化して、プラスミドｐＤｍｇｔＢを作り、再度活性を試験した。ＴＬＣ分析から、この構築物でも同様に、ＭｇｔＢ酵素のグリコシル活性が明白に確認された。ＭｇｔＢの推定アミノ酸配列（配列番号８）は、予測されるＢ．チューリンゲンシスマクロシドグリコシルトランスフェラーゼとの類似性が高かった（表３）。
【００５２】
（表３）
表３：サブクローン類、活性バチルス種ＨＨ１５００フォスミドクローン由来のｐＳＫ４Ｂ２およびエルベ川堆積物活性フォスミドクローン由来のｐＳＫ１４４Ｃ１１で同定された翻訳領域（ＯＲＦ）。
2016518849.tif 000005
【００５３】
プラスミドｐＳＫ４Ｂ２のｍｇｔＢ周囲のＤＮＡ配列は、２つの切断型遺伝子となっており、それらは一貫してＢ．チューリンゲンシスの遺伝子とほとんど同一であった（表３）。この系統発生学的関連性は、バチルス種ＨＨ１５００の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子で行った先行配列分析と一致していた（上記参照）。
【００５４】
これらの試験は、スクリーニング手順が、巨大な挿入断片メタゲノムライブラリーを機能的にスクリーニングするのに適切であったことを示した。メタゲノムの機能に基づくスクリーニングとして、この方法論を、ＭＥＴＡ（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＴＬＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（メタゲノム抽出物ＴＬＣ分析））と名付けた。ＭＥＴＡは、完全自動化高処理スクリーニング（ＨＴＳ）技術ではないものの、これは、前培養、生体内変換、および分析を行う４８時間という時間内に、ＴＬＣプレート１枚あたり約１，２００のクローンをスクリーニングすることができる。クローンのこの個数は、一人の人間によりスクリーニングが行われる場合に実現可能な個数であるようだった。概して、ＡＴＳ４による１時間あたり約１枚のＴＬＣプレートのサンプリングが、この方法の律速段階となっている。しかし、それでもこの方法は、１日で複数のプレートをプールしてスクリーニングすることを可能にし、したがってＭＥＴＡにより１日で何千ものクローンを処理することを可能にする。
【００５５】
メタゲノムライブラリーからの新規グリコシルトランスフェラーゼの同定
メタゲノムライブラリーで酵素を発見するのにこのスクリーニング法をさらに適用するため、２つのフォスミドライブラリーを出願人らの研究室で構築して試験した。一方のライブラリーは、エルベ川堆積物から単離されたＤＮＡで構築され、他方は、新鮮な象の便から取り出した単離ＤＮＡで構築された。全体で、両方のライブラリーで約５０，０００のクローンが包含され、挿入断片の平均サイズは３５ｋｂであった。両方のライブラリーを、基質としてケルセチンを用いてスクリーニングした。記載される戦略を用いて、エルベ川堆積物ライブラリーから１つの陽性マイクロタイタープレートプールを見つけ出した。このプールをさらにスクリーニングした結果、単独の陽性フォスミドクローンが同定され、これをｐＦＯＳ１４４Ｃ１１と名付けた。４８のクローンプールを用いてケルセチン（Ｑ）を生体内変換すると、ＴＬＣ分離により、Ｒｆ値がケルシトリン、すなわちケルセチン−３−Ｏ−β−Ｌ−ラムノシドのＲｆ値に相当する１つの生成物ピーク（Ｐ２）が示された。入手可能な参照ケルセチングリコン類よりも高いＲＦ値を持つ第二ピーク（Ｐ３）が、６つのクローンからなるプールおよび単独フォスミドクローン、それぞれを用いた変換で観測された。クローンｐＦＯＳ１４４Ｃ１１は、約４０ｋｂのフォスミドを保有していた。続いて、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋に導入しサブクローン化したところ、陽性大腸菌ＤＨ５αサブクローンｐＳＫ１４４Ｃ１１を同定することができた。しかしながら、ｐＳＫ１４４Ｃ１１での生体内変換は、２つの生成物ピークを示し、大きいピーク（Ｐ２）はＲｆ値がケルシトリンのものに相当し、小さいピーク（Ｐ１）はイソケルシトリンと同様であった。サブクローンｐＳＫ１４４Ｃ１１は依然として約８．５ｋｂの大きさの挿入断片を有していた。ｐＳＫ１４４Ｃ１１でさらなる配列決定およびサブクローン化を行ったところ、修飾を担っていると推定される遺伝子が最終的に同定され、これをｇｔｆＣと名付けた。該当する酵素の切断型４５９アミノ酸配列（配列番号７を参照）は、ＵＤＰ−グルクロノシル／ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼとのモチーフ類似性を明らかにした。ＧｔｆＣ（配列番号７）は、タンパク質の９２％を範囲に含めるグラム陰性細菌フィブリソマ・リミの推定上グリコシルトランスフェラーゼと７１％の類似性を示した（表３）。ｇｔｆＣのＯＲＦをｐＤｒｉｖｅベクターに導入してさらにクローン化し、個々の構築物ｐＤｇｔｆＣを保有する大腸菌ＤＨ５αで生体内変換を行ったところ、ＧｔｆＣのフラボノイド修飾活性が確認された。
【００５６】
まとめると、これらの結果は、開発したスクリーニング手順ＭＥＴＡの感度が、個々の細菌ゲノム（すなわちバチルス種ＨＨ１５００）およびフラボノイド修飾活性を示す複雑なメタゲノムライブラリー（すなわちエルベ川堆積物ライブラリー）から、巨大な挿入断片クローンを同定することを可能にするのに十分であることを実証した。
【００５７】
ＭｇｔＢおよびＧｔｆＣの配列に基づく分類
ＭｇｔＢおよびＧｔｆＣの所属を分析するため、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェア（非特許文献４４）を用いて系統発生樹を計算した。ＭｇｔＢのアミノ酸（ａａ）配列（配列番号８）およびＧｔｆＣのアミノ酸（ａａ）配列（配列番号７）、ならびにｐＢｌａｓｔにより求めた、それらに最も近い、配列に基づく近縁種を、ＣｌｕｓｔａｌＷにより整列させた。さらに、実際に公表されている原核生物フラボノイド活性ＧＴの配列を整列させ、および最終的に、外部群として２種の真核生物酵素、タルウマゴヤシのフラボノイドグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴ８５Ｈ２およびシロイヌナズナのフラボノイドラムノシルトランスフェラーゼＵＧＴ７８Ｄ１（非特許文献４５〜４６、５３）の配列を整列させた。それらから、１００ブートストラップを用いて近隣結合樹をコンピューター計算した。予想どおり、バチルス種ＨＨ１５００のＭｇｔＢは、Ｂ．セレウス群の他のＭＧＴとクラスターを形成した。記載時点では、Ｂ．チューリンゲンシスＩＢＬ２００のＭＧＴおよびＢ．セレウスＧ９８４２のＭＧＴが、ＭｇｔＢに対するａａ同一性がそれぞれ９８％という最も近い近縁種であることがわかった。なお、これらのnＭＧＴは両方とも、推定上の酵素と注釈が付けられており、基質データは手に入らなかった。ＭＧＴクラスターの、５種の他の酵素は既に、フラボノイドのグルコシル化を仲介することが報告された。それらのうちの３種、ＢｃＧＴ−１はフラボノイド活性があると報告されている最も近い近縁種であり、ＢｃＧＴ−４、およびＢｃＧＴ−３と合わせて３種ともＢ．セレウスＡＴＣＣ１０９８７を起原とする（非特許文献４７〜４９）。別のフラボノイド活性なＭＧＴは、ＢｓＧＴ−３と名付けられており、Ｂ．スブチリス株１６８を起原とする（非特許文献３６）。残る１つのフラボノイド活性ＭＧＴは、ストレプトマイセス・アンチビオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）のよく研究されたＯｌｅＤである（非特許文献５０、５１）。ＧｔｆＣは、別個のＵＧＴクラスターに位置しており、ディアドバクター・フェルメンタンス（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）およびフィブリソマ・リミがそうであるように、サイトファーガ科細菌の仮定上の酵素と幾分関連しているらしかった。このクラスター内では、ＵＧＴ  ＸｃＧＴ−２だけが、フラボノイド基質を受け入れることが知られている（非特許文献３８）。興味深いことに、バクテロイド種１１６のＢＳＩＧ  ４７４８およびマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）のＲｔｆＡのようなラムノシルトランスフェラーゼも、系統発生的にはこのクラスターに所属することを示すが、別の部門を形成する。
【００５８】
同定されたメタゲノム由来ＧＴをさらに特性決定するため、Ｃ末端ドナー結合領域のａａ残基を、最も近い近縁種および既知のフラボノイド活性ＧＴのモチーフと比較した。ここに、ＵＧＴの保存されたドナー結合領域であるロスマン折り畳みα／β／αサブドメインが位置する（非特許文献５２）。ＵＧＴ８５Ｈ２およびＵＧＴ７８Ｄ１のような植物ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、この領域で高度に保存されたモチーフを示し、このモチーフは、（Ｐｌａｎｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（植物二次産物グリコシルトランスフェラーゼ））ＰＳＰＧモチーフと名付けられている（非特許文献４５、５３、および５４）。整列させることで、ＮＤＰ−糖結合に重要であることが知られている鍵ａａを同定することができる。ＭｇｔＢは、リボース結合用の高度に保存されたＧｌｎ２８９およびＧｌｕ３１０残基ならびに保存されたＤＱからなる明白なＵＤＰヘキソース結合モチーフを明らかにしたものの、ＧｔｆＣは、このモチーフが欠けていた（非特許文献４５、５５、および５６）。その代わり、ＧｔｆＣは、デオキシリボースヌクレオチドを利用するための典型的な残基Ｐｈｅ３３６およびＬｅｕ３５７を示した（非特許文献５７）。その上、ＭｇｔＢのａａ配列のピロリン酸結合部位を同定することができた。しかしながら、ＧｔｆＣは、これらの保存されたリン酸結合残基を保有せず、このことはＧｔｆＣおよび関連酵素が別のドナー結合様式を有することを示唆する。この文脈において、ＧｔｆＣは、新規酵素クラスに属するようであり、配列相同性の低さを強調した。
【００５９】
ＭｇｔＢおよびＧｔｆＣの過剰発現およびグリコシル化パターン
新規酵素をさらに特性決定し、それらの機能を確認するため、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）でＨｉｓタグ付きタンパク質として、ＭｇｔＢおよびＧｔｆＣを過剰発現させて精製した。ｍｇｔＢおよびｇｔｆＣの遺伝子両方を、発現ベクターｐＥＴ１９ｂに導入して結合した。Ｎ末端Ｈｉｓ10タグを有する組換え酵素を、未変性条件および勾配溶出で、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＭｇｔＢは、５ｍｇ／ｇ超の細胞ペレットで精製することができた（湿潤重量）。ＧｔｆＣの最大収量は、３ｍｇ／ｇの細胞ペレットであった。レムリ法による変性条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質の分子量を確認した。クーマシー染色後、Ｈｉｓ10−ＭｇｔＢは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ＭＷ約５０ｋＤａの単独バンドとして視認できるようになった。これは、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含めて計算した分子量（ＭＷ）である５１．２ｋＤａと一致した。Ｈｉｓ10−ＧｔｆＣは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約５５ＫＤａのＭＷであることを明らかにし、これは、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含めて計算したＭＷである５４．７ｋＤａとよく一致した。精製した組換えＭｇｔＢタンパク質ではＳＤＳ−ＰＡＧＥで視認できるさらなるバンドは事実上なかったものの、精製ＧｔｆＣを添加したＳＤＳ−ＰＡＧＥではいくつかの薄い不純物バンドが依然として視認できた。まとめると、タンパク質は両方とも、さらなる生化学特性決定が可能なぐらい精製することができた。
【００６０】
精製したＨｉｓ10−ＭｇｔＢタンパク質は、ドナー基質としてＵＤＰ−α−Ｄ−グルコースを使用することができた。組換え酵素は、α−Ｄ−グルコース残基が様々なポリフェノールに転移するのを触媒した。生体内触媒作用反応は、ドナーとしてＵＤＰ−α−Ｄ−グルコース５００μＭおよびアクセプター基質１００μＭを用いて行った。以下のフラボノイドをアクセプター基質として用いたところ、高い収率で修飾された：ルテオリン、ケルセチン、ケンフェロール、チリロシド、ナリンゲニン、ゲニステイン（表４）。
【００６１】
（表４）
表４：バイオアッセイにおいて組換えＭｇｔＢで変換されたフラボノイド基質。ＵＤＰ−グルコース５００μＭ、個々のフラボノイド１００μＭ、および精製した組換えＭｇｔＢを５μｇ／ｍＬ含む１ｍＬでの反応を、３つ組で、３７℃で２時間行った。
2016518849.tif 000006
【００６２】
以上により、フラボノールは最良のアクセプター分子であることがわかった。概して、２時間のアッセイ中の変換は、範囲が、ナリンゲニンの５２％からケルセチンおよびケンフェロールの約１００％までであった。興味深いことに、ケルセチンおよびケンフェロールの存在下では、残存遊離物は、ＨＰＴＬＣ分析で観測されなかった。生体内触媒作用反応の特定の遊離物およびそれらから観測されるグリコンを、個々のＲｆ値と合わせて表４にまとめる。ＭｇｔＢは、アグリコンフラボノールであるケルセチンおよびケンフェロールでそうであるように、Ｃ３ヒドロキシ基に近づくことが可能な場合は、Ｃ３ヒドロキシ基でのグリコシル化を優先した。さらに、Ｃ７−ＯＨが、酵素により攻撃されてグルコシル化されるが、これは、フラボンルテオリンについてだけでなく、フラバノンナリンゲニンおよびイソフラボンゲニステインでも見ることができた（表４）。ＭｇｔＢは、Ｃ７−ＯＨが既にグルコシル化されていた場合は、ルテオリンをＣ３’ヒドロキシ基でもグルコシル化して、ルテオリンの３’，７−ジ−Ｏ−グルコシドを形成した。ＭｇｔＢは、ケンフェロール誘導体チリロシド、ケンフェロール−３−Ｏ−６’’−クマロイル−グルコシドの変換も触媒した。Ｒｆ値が０．５４の１種のグルコシル化生成物が検出された。カルコンキサントフモールおよびスチルベンｔ−レスベラトロールを、ｍｇｔＢを発現する大腸菌での生体内変換反応で試験したが、変換を定量することはできなかった（データは示さず）。キサントフモールは検出可能な生成物を３種もたらしたが、ｔ−レスベラトロールの生体内変換は、吸光度で観測して１種類の生成物をもたらした。
【００６３】
ＴＬＣ分析。
ＵＤＰ−α−Ｄ−グルコースおよびＵＤＰ−α−Ｄ−ガラクトースならびにアクセプター分子としてケルセチンを用いた、精製した組換えＧｔｆＣでの試験は、ｄＴＤＰ−活性化糖部分が、この酵素により転移することを示唆した。この知見は、生体内変換試験のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により確認された（以下の段落を参照）。残念ながら、デオキシリボースヌクレオチド活性化ヘキソース、例えばｄＴＤＰ−ラムノシドは、市販されていなかっため、得られる反応生成物をより詳細にさらに分析することができなかった（非特許文献５８）。
【００６４】
基質として様々なポリフェノールを用いた、ＧｔｆＣを発現する大腸菌株での生体内変換は、キサントフモールで５２％から最大では試験したフラボノールの大部分において約１００％の代謝回転率の範囲で変換をもたらした（表５）。
【００６５】
（表５）
表５：組換えＧｔｆＣを用いた生体内変換試験のフラボノイド基質および生成物。反応の定量は、本明細書中記載されるとおりに行った。１％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２００μＭのフラボノイドを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．０）５０ｍＬでの反応を３つ組で、３０℃で行った。
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【００６６】
ケルセチンは、生体内変換を４時間行うとほぼ完全に変換されて、３種の検出可能な生成物をもたらす（Ｐ１〜Ｐ３）。これらの生成物をさらに特性決定するため、ＵＶ吸収スペクトルを記録して、ケルセチン、イソケルシトリン、およびケルシトリンという参照グリコンと比較した（非特許文献５９）。Ｐ１は、Ｒｆ値がイソケルシトリンの値と同一であることを示した。さらに、Ｐ１のＵＶ吸収スペクトルは、イソケルシトリンのスペクトルと一致した。Ｐ２は、Ｒｆ値がケルシトリンの値として知られるものと同一であることを示した。Ｐ２はまた、ケルシトリンと同じＵＶ吸収スペクトルも示した。Ｐ３は、０．８２というＲｆ値を示し、既知の入手可能なケルセチングリコン類のＲＦ値とは明らかに異なっていた。イソケルシトリンと比較して、Ｐ３は、バンドＩでλmax３６３ｎｍへの同様な浅色シフトを示した；しかしながら、Ｐ３は、バンドＩＩでは、２７２ｎｍへと５ｎｍしか浅色シフトせず、２８０ｎｍに肩を示した。さらに注目すべきことに、ケルセチンの生体内変換生成物のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析も、一致して、３種の個別の反応生成物を同定した。Ｐ１は、ＨＰＬＣ分析で１７．９３分のＲＴを有し、分子質量が４６４ｕであることを示したが、これはイソケルシトリンに等しい。Ｐ２は、ＲＴが１８．０６分であることを示し、４４８ｕの分子質量を有した。この質量は、ケルシトリンの分子質量と良く一致する。最後に、ＲＴが１８．３１分のＰ３は、分子質量がｆ４４６ｕであることを示し、このことは、新規の、ただし、さらなる特性決定はされていないケルセチングリコシドが形成されたことを示唆する。
【００６７】
ケルセチンでのＧｔｆＣのグリコシル化パターンは、Ｃ３のヒドロキシ基で優先的に作用して異なる糖残基の転移を仲介することを示唆した。しかしながら、Ｃ３のＯＨ基が利用できない場合、ＧｔｆＣは他の位置のグリコシル化を効率的に触媒した。Ｃ３にヒドロキシ官能基が存在しないフラボンは、他のヒドロキシ基が利用できるかどうかに応じて変換された。単独の遊離Ｃ７−ヒドロキシ基のみを保持するプラトールは、わずかに変換されて、単独の検出可能な生成物をもたらした。さらに、３’，４’−ジヒドロキシフラボンの生体内変換は、３種の検出可能なグリコンをもたらし、また５−メトキシオイパトリンは、２種の生成物をもたらした（データは示さず）；モノ４’−ヒドロキシフラバノンの生体内変換は、１種類のグリコシル化生成物をもたらし、ナリンゲニンのグリコシル化は２種の生成物をもたらした。ナリンゲニンの生体内変換の主生成物は、プルニン、すなわちナリンゲニン−７−Ｏ−グルコシドと同じＲｆ値および吸収スペクトルを示した（表５）。２種類目のナリンゲニングリコンは、市販の参照物質がないため、それ以上特定することができなかった。つまり、これらの結果は、ＧｔｆＣが、フラボノイド骨格のＣ３、Ｃ３’、Ｃ４’、およびＣ７ヒドロキシ基で作用することを示唆した。
【００６８】
まとめると、これらのデータは、ＭｇｔＢおよびＧｔｆＣが興味深い生体内触媒作用性質を保持することを実証した。ＭｇｔＢはグルコース残基の転移を特異的に仲介するが、ＧｔｆＣは、様々なヘキソース部分を転移させた。ＭｇｔＢは、既にグリコシル化されたフラボノイドをグルコシル化してジ−グリコシドを形成すること（例えば、ルテオリン−３’，７−ジ−Ｏ−グルコシドの形成）、およびチリロシドでさえもグルコシル化して天然資源から得ることができない新規グルコシドを生成することを触媒することができた。対照的に、ＧｔｆＣのグリコシル化パターンは、単独糖残基をアグリコンフラボノイド型にのみ転移させることを示唆した。興味深いことに、ＧｔｆＣは、その活性に関して、フラボノイド骨格の様々な位置において非常に変化しやすいようであった。このことは、天然には得られない本当に新規のフラボノイドの形成を導く可能性がある。したがって、酵素は両方とも、新規天然化合物の生成に有用である可能性がある。
【００６９】
新規スクリーニング技術を用いて、土壌単離菌（すなわちバチルス種ＨＨ１５００）からマクロシドグリコシルトランスフェラーゼＭｇｔＢが同定された。この株は、最近、地元の植物園から単離されたばかりであるが、この株のＤＮＡで確立されたフォスミドライブラリーは、最初は、概要を説明したスクリーニング技術を開発して検証するのに用いられ；そしてこの新規スクリーニング技術を用いて、約２，０００のクローンを含むプールからＭｇｔＢを迅速に同定することができた。組換えＭｇｔＢの単離および精製は、新規ＭＧＴを明らかにした。ＭｇｔＢは、フラボノイドに作用することが公表されている最も近い近縁種であるＢ．セレウスＡＴＣＣ１０９８７のＢｃＧＴ−１と８９％のａａ同一性を共有する。ＢｃＧＴ−１は、フラボン、フラボノール、フラバノン、およびイソフラボンのグルコシル化を触媒することが報告されている（非特許文献４７）。フラボノールにおいて、ＢｃＧＴ−１は、Ｃ３、Ｃ７およびＣ４’ヒドロキシ基に作用して、ケンフェロールのトリグルコシドを作る（非特許文献４８）。対照的に、ＭｇｔＢでのケンフェロールの生体内触媒作用は、検出可能なグルコシル化生成物を２種だけもたらした。その代わりに、ケルセチンとの反応は、３種の検出可能なグリコンをもたらした。これらのデータは、ＭｇｔＢがＣ３’ＯＨ基で作用したことを示唆した。この仮説は、組換えＭｇｔＢがルテオリンを副生成物としてルテオリン−３’，７−ジ−Ｏ−グルコシドに変換したという観測によっても支持された。これらの結果は、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１０９８７のさらに別のＭＧＴであるＢｃＧＴ−３のグルコシル化パターンと一致した（非特許文献４９）。興味深いことに、ＢｃＧＴ−３はＭｇｔＢと４０％しかａａ同一性を共有しないが、両方の酵素が同じフラボノイドに作用して、フラボンおよびフラボノールから同じ部位でのジグルコシドを形成し、ナリンゲニンからはモノグルコシドのみを形成する。ＭｇｔＢで観測された最も注目すべき変換は、チリロシドの変換であった。生成物は、ＭｇｔＢのグリコシル化パターンを考慮すると、７−Ｏ−グルコシド体であるらしい。チリロシドグリコシドは、科学文献においてまったく報告されたことがなかった。これにより、新世代天然化合物の可能性が出てくる。バチルスＭＧＴの天然の基質は、依然として報告されていない。ＯｌｅＤのような他のＭＧＴは、通常、マクロシド抗生物質を解毒するが、広範なアクセプター許容度を保持することが多い（非特許文献３５、６０）。
【００７０】
メタゲノム由来ＧｔｆＣは、完全に新規の酵素であることがわかった。フラボノイド活性ＵＧＴは、今までのところ、５種の異なる原核生物を起原とする７種類しか報告されていなかった（非特許文献３５、３６、３８、４７、４９）。グラム陰性菌Ｘ．カンペストリスＡＴＣＣ３３９１３のＸｃＧＴ−２を除いて、残りの全ては、グラム陽性菌バチルス属およびストレプトマイセス属のＭＧＴ酵素である。ＭＧＴは、原核生物の生体異物防御機構において重要な役割を果たし、したがって、広範なアクセプター特異性を示す（非特許文献５５、６０）。このことは、真核生物ＵＧＴについても当てはまり、解毒作用の生物学的原則を提示する（非特許文献６１）。本発明者が知る限り、ＧｔｆＣは、初めてのフラボノイドに作用するメタゲノム由来ＧＴである。その上、ＧｔｆＣは、Ｇｔｆのような通常の厳密なドナー特異性とは対照的に（非特許文献５７）、様々なｄＴＤＰ活性化ヘキソース糖をポリフェノールに転移させることが報告された初めての細菌酵素である（以下参照）。原核生物における多くのＮＤＰ−糖が、ｄＴＤＰ活性化であってＵＤＰ活性化ではないという見解に関して、ＧｔｆＣは、糖多様化（ｇｌｙｃｏｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）アプローチにおける有望な生体触媒になる可能性がある（非特許文献５８、６２、６３）。ＧｔｆＣは、サイトファーガ科細菌の予測ＧＴと類似である（非特許文献６４〜６６）。これらのグラム陰性細菌は、広範な二次代謝経路を示唆する巨大なゲノムを有し、トリメトプリムおよびバンコマイシンなどの抗生物質に対して耐性機構を有することが良く知られている（非特許文献６７、６８）。一般によく知られるとおり、生体異物のグリコシル化は、生命界の全てに偏在する解毒課程である。系統発生的に多様なメンバーからなるサイトファーガ科は、最近になってやっと、研究対象になったところであり、このファミリーの系統発生的幅広さについての具体的な推定および正確な分類学的順位付けは依然として不明である（非特許文献６５、６９）。したがって、メタゲノム由来ＧｔｆＣの同定およびその部分的特性決定は、この微生物群が恐らく新規ＧＴおよびまた他の酵素の非常に有望な供給源となることを示唆する。
【００７１】
ＧｔｆＣのドナー結合領域のＣｌｕｓｔａｌＷ整列は、活性化ドナー基質がデオキシチミジンヌクレオシド起原のものであることを示唆した。ＧｔｆＣは、典型的なａａ残基として、チミン塩基スタッキング用のＰｈｅ３３６およびデオキシリボースフィッティング用の疎水性Ｌｅｕ３５７を保持する（非特許文献５７）。ＧＴのドナー結合に関して、ＧｔｆＣは、ピロリン酸結合用の既知のａａ残基を示さないようである。ＧｔｆＣは、最新の解析されたタンパク質構造において、保存された残基Ｈｉｓ／Ａｒｇの代わりに、ａａ位置３４９にＡｓｎを有する（非特許文献５２、７０）。このことは、最も近いＧｔｆＣ近縁種である、Ｄｆｅｒ１９４０、Ｆ．リミ（Ｆ．ｌｉｍｉ）ＢＵＺ３のＵＧＴ、およびＳｌｉｎ３９７０、ならびにＮＧＴ類のＲｅｂＧおよびＢＳＩＧ４７４８にも当てはまる。さらに、ＧｔｆＣは、α−リン酸結合を担う保存されたＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を示さない。その代わり、ＯｌｅＤトランスフェラーゼと同様に、Ｇｌｙ３５４が、α−リン酸結合に重要であるらしい（非特許文献５５）。
【００７２】
ｄＴＤＰが、ＧｔｆＣにより利用される補助基質を活性化したという仮定は、無傷の大腸菌細胞を用いた生体内変換において、グルコース、ラムノース、および分子量が４４６である第三の糖残基が、ＧｔｆＣにより転移されるという観測により支持された。その上、精製ＧｔｆＣおよびドナー基質としてＵＤＰ−α−Ｄ−グルコースまたは−ガラクトースいずれかを用いた生体内触媒作用アプローチは失敗した。細菌において、活性化糖である、ｄＴＤＰ−α−Ｄ−グルコース、−４−ケト−６−デオキシ−α−Ｄ−グルコースまたは−４−ケト−β−Ｌ−ラムノース、および−β−Ｌ−ラムノースは、ｄＴＤＰ−糖生合成経路の一部分であり、大腸菌に存在する（非特許文献７１）。その上、ｄＴＤＰ−糖類のレベルは、ＲｍｌＡの活性をつうじて、ｄＴＤＰ−ラムノースレベルによりアロステリックに調節されている（非特許文献７２）。
【００７３】
４種のさらなるグリコシルトランスフェラーゼを同定して、ＭｇｔＴ、ＭｇｔＣ、ＭｇｔＳ、およびＭｇｔＷと名付けた。
【００７４】
ＭｇｔＴ：
３９７ａａ（配列番号１１）、遺伝子は１１９４ｂｐ（配列番号５）、バチルス種ＢＣＨＨ１５００由来；
Ｂ．セレウスＢ４２６４（ＹＰ００２３６７５１２）のＭＧＴに対して９９％ａａ同一性
大腸菌ＤＨ５α  ｐＤｒｉｖｅ：：ｍｇｔＴを用いた生体内変換（全細胞触媒作用）で反応を示したものは、例えば４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン）、フロレチン、ホモエリオジクチオール、ナリンゲニンなど。
【００７５】
ＭｇｔＣ：
４０２ａａ（配列番号９）、遺伝子は１２０９ｂｐ（配列番号３）、バチルス種ＢＣＧ＋１由来；
Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１０９８７（ＮＰ９７８４８１）のＭＧＴに対して９５％ａａ同一性
大腸菌ＤＨ５α  ｐＤｒｉｖｅ：：ｍｇｔＣを用いた生体内変換（全細胞触媒作用）で反応を示したものは、アピゲニン、ルテオリン；ケルセチン、ナリンゲニン、ホモエリオジクチオール、フロレチン、ノルオイゲニンなど。
反応スキームの例：
ＵＤＰ−α−Ｄ−グルコース＋フラボノイド−＞フラボノイド−β−Ｄ−グルコシド＋ＵＤＰ
【００７６】
ＭｇｔＳ：
３９２ａａ（配列番号１０）、遺伝子は１１７９ｂｐ（配列番号４）、バチルス・スブチリスＢＳＨＨ１４由来
Ｂ．スブチリス（ＹＰ００７５３３１６１）のＭＧＴ  ＹｊｉＣに対して９９％ａａ同一性
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＥＴ１９ｂ：：ｍｇｔＳを用いた生体内変換（全細胞触媒作用）および酵素を用いた生体内触媒作用で反応を示したものは、フロレチン、ホモエリオジクチオール、ナリンゲニン、アピゲニン、ルテオリン；ケルセチン、４−メチルウンベリフェロン、ノルオイゲニンなど。
反応スキームの例：
ＵＤＰ−α−Ｄ−グルコース＋ポリフェノール−＞ポリフェノール−β−Ｄ−グルコシド＋ＵＤＰ
【００７７】
ＭｇｔＷ：
４０２ａａ（配列番号１２）、遺伝子は１２０９ｂｐ（配列番号６）、バチルス種ＢＣＨＨ０３由来
Ｂ．ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４（ＹＰ００１６４４７９４）のＭＧＴに対して９９％ａａ同一性
大腸菌ＤＨ５α  ｐＤｒｉｖｅ：：ｍｇｔＷを用いた生体内変換（全細胞触媒作用）で反応を示したものは、ケルセチン、フロレチン、ホモエリオジクチオールなど。
反応スキームの例：
ＵＤＰ−α−Ｄ−グルコース＋ケルセチン−＞ケルセチン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド＋ＵＤＰ
【００７８】
（表６）
配列の総覧（ａａ＝アミノ酸の個数、ｂｐ＝塩基対の個数、ＰＲＴ＝タンパク質、ｎｔ＝ヌクレオチドの個数）：
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【配列表】
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【国際調査報告】
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