(57)【要約】本発明は、サイトカインストーム応答の刺激を検定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の：ａ．  ＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞を共培養して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト応答を表す系を提供するステップ、ならびにｂ．  共培養細胞系を試験作用物質に曝露するステップ、ｃ．  前記試験作用物質に共培養系を曝露後に放出される１つ以上のサイトカインの存在に関して系を分析するステップ、ならびにｄ．  任意に、１つ以上の対照作用物質に対する応答と比較した場合の試験作用物質に対する応答を評価するステップを包含する方法を開示する。【選択図】図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインストーム応答の刺激を検定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の：
ａ．  ＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞を共培養して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト応答を表す系を提供するステップ、ならびに
ｂ．  共培養細胞系を試験作用物質に曝露するステップ、
ｃ．  前記試験作用物質に共培養系を曝露後に放出される１つ以上のサイトカインの存在に関して系を分析するステップ、ならびに
ｄ．  任意に、１つ以上の対照作用物質に対する応答と比較した場合の試験作用物質に対する応答を評価するステップ
を包含する方法。
【請求項２】
内皮細胞が、ＰＢＭＣに対してＨＬＡ整合性、血液整合性および／または性別整合性である請求項１記載の方法。
【請求項３】
内皮細胞が、ＰＢＭＣに対してドナー整合性である請求項２記載の方法。
【請求項４】
内皮細胞が、内皮組織、例えば生検から得られる請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
内皮細胞が、血管内皮細胞に由来する請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
内皮細胞が、伸張され、一列に整列されたとして特性化される表現型を提供するために培養される請求項２、３または５に記載の方法。
【請求項７】
試験作用物質の応答が、１つ以上の対照作用物質との比較において評価される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対照作用物質が、ＴＧＮ１４２４抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ５２、例えばアレムツズマブからなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
測定されるサイトカインがＣＸＣＬ８である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）が共培養細胞系においてサイトカインストームを誘導する作用物質に系を曝露し、その後、誘導化応答の試験阻害物質に系を曝露することを包含する請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養細胞系におけるサイトカインストームの阻害物質を同定するさらなるステップを包含する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
整合分化血管内皮細胞を伴うＰＢＭＣと共培養されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１３】
請求項１２で定義された方法から得られるかまたは得ることができる細胞集団。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項で定義されるような整合生物検定に用いるための血管内皮細胞由来の内皮細胞集団。
【請求項１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトサイトカインストーム応答を表すＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞の共培養系を含むキット。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトサイトカインストーム応答を表すＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞の共培養系の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト患者における有害サイトカインおよび／またはサイトカインストーム応答（ＣＲＳとしても言及される）を引き起こす試験化合物、特に推定生物学的治療薬の潜在能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００６年３月、生物学的治療薬ＴＧＮ１４１２を伴うＮｏｒｔｈｗｉｃｋ  Ｐａｒｋ病院で行われた健常ヒト有志試験において、重度の有害事象が起きた。治療薬の投与後の有害事象のため、試験からの少なくとも６名の有志が入院したが、これらの多くは多臓器不全を有した。
【０００３】
サイトカイン放出症候群（サイトカインストームおよびサイトカイン放出症候群としても既知）を経験して、血管性浮腫、重症アレルギー反応における補体カスケードの作用と同種の皮膚および粘膜の腫脹を生じる、と有志は報告された。患者は、炎症を低減するためにコルチコステロイドで処置され、彼らの循環からＴＧＮ１４１２を除去しようとして血漿交換を施された。後に、有志はサイトカインストームに罹患していたこと、そして逆説的に、彼らの白血球は、ＴＧＮ１４１２の投与後数時間でほぼ完全に消滅していたことが確証された。
【０００４】
ＴＧＮ１４１２は、ヒトへの投与の前に動物で試験されていた。しかしながら、関連事項において、治療薬は、実験動物の場合とは異なるヒトにおける応答を引き出した、と考えられる。ヒトにおいて観察される反応は、メモリーＴ細胞を有する動物において起きたに過ぎない、と仮定された。動物は実験室条件「滅菌条件」で飼育される動物は本質的にメモリーＴ細胞を有さないが、したがって、同一応答を引き出さない。ここで、実験室試験に用いられる動物種は単に少数のメモリーＴ細胞を有し、したがって、同一応答を引き出さず、したがって、例えばマウスはサイトカインストーム反応を引き出さないように見える。ＴＧＮ１４１２は、単離ヒトＴ細胞および霊長類に関しても試験されたが、ヒトにおいてその後観察された問題についての示唆はなかった。しかしながら、免疫細胞を活性化するために、ＴＧＮ１４１２は内皮細胞（またはその他の）界面を必要とする、ということが目下判っている（以下参照）。
【０００５】
サイトカインストームは、免疫（およびその他の）細胞によるサイトカイン放出が過剰になり、組織および器官を損害する場合である。
【０００６】
すべての血管の管腔表面に一列に並ぶ内皮は、活性化循環白血球と接触する最初の細胞である。内皮と白血球との間の相互作用は、炎症性応答の顕著な拡大を生じ得る。ステッビングス等からの先駆的研究は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ＣＤ２８スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２に対するサイトカイン応答を観察するために、この現象が必要とされる、ということを示唆している。
【０００７】
目下、抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト、例えばＴＧＮ１４１２に対するサイトカイン応答を検出し得る限定数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定が存在する。これらの検定は、細胞構成成分、例えば：
・臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＰＢＭＣ、
・ＰＢＭＣに添加される前に、プラスチックプレートまたは合成ビーズ上に固定化される抗体（固定化：例えば抗体の水溶液を蒸発させて、表面構造に接着される抗体／薬剤を残すことにより）、あるいは
・ヒト全血の培養
の混合物を用いる。
【０００８】
ヒト組織生物検定は、ＴＧＮ１４１２および関連分子がＰＢＭＣまたはＨＵＶＥＣの単離調製物を活性化しないが、しかしＰＢＭＣおよびＨＵＶＥＣが一緒に培養される場合、ＴＧＮ１４１２は強力なサイトカイン応答を引き出す、という知見により立証されるように、細胞構成成分の混合物を必要とする、ということは明らかである。しかしながら、この型の生物検定、ならびに文献中で報告された他のものは、それらがあるドナーからの内皮細胞（ＨＵＶＥＣの場合；胎児細胞）と別のドナーからのＰＢＭＣの混合に頼っているため、基本的に欠点があった、と本発明人等は考える。さらに、慣用的混合組織生物検定は、いくつかの場合、重篤な、しかしより軽度で且つ管理可能な応答を生じるもの、例えばキャンパスからの顕著なサイトカインストーム作用を有するいくつかのサイトカイン抗体、例えばＴＧＮ１４１２に関して適切に叙述しない。したがって、当該技術分野の細胞ベースの検定で得られる結果は、同一治療薬に対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答で観察される同一傾向を適切に反映しない。
【０００９】
この問題は、フィンドレー等のかなり最近の論文で精査されており、「ＰＢＭＣ、ＨＵＶＥＣ共培養は報告されたｉｎ  ｖｉｖｏ測定またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの固定化ＴＧＮ１４１２刺激性放出を完全に反映したわけではなく、このことは、異なるサイトカインの放出を誘発する代替的刺激メカニズムが存在することを示している」（ページ１４２のカラム１の第一段落）、ということが記述されている。
【００１０】
フィンドレー等は、続けて、これは、以下のうちの１つ以上のためであり得る、と仮定している：
１．「ＨＵＶＥＣは老化に近く、低酸素血管から単離される。したがって、それらは、内皮相互作用に関する最良のモデルを提供し得ない。さらに、異なる器官および血管からの内皮細胞は、かなりの異質性を示し、最大共刺激のために必要とされるＨＵＶＥＣにより保有されない組織特異的特質、例えば高内皮細静脈が存在し、これはｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞の接着および移動を媒介する。
２．最大刺激のためには、ＨＵＶＥＣ培養中に存在するもののほかに、細胞型が必要とされる。
３．共培養中のＩＬ−２の低レベル産生は、Ｔ細胞増殖を駆動するための連続的消費を生じるが、一方、固定化検定では、より高いレベルの産生が飽和レベルおよび上清中の蓄積を生じる。
４．サイトカイン放出の異なるメカニズムは、共培養と比較して、固定化検定で起こり、おそらくは異なるＴ細胞サブセットを伴い、さらに、共培養において、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦアルファの放出は、ＩＬ−２およびＩＦＮガンマの放出とは異なるメカニズム、例えばＴＮＦアルファに対する応答におけるＨＵＶＥＣによるＩＬ−６産生を介して起こる。
【００１１】
ポイント２は、その後の論文で精査された。２００６年以来、当業者はこの問題に取り組もうとしてきたが、今日まで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結果を予測する一般的使用のための適切な標準検定は確認されていない。
【００１２】
これは、不都合のために治療薬を試験する能力に欠陥を残す。したがって、例えば、ＴＧＮ１４１２のような生物学的治療薬により誘導されるサイトカインストーム応答を予測するだろう適切なヒト組織試験検定を開発すること、および／または新規の薬剤および小分子、ならびに免疫経路と相互作用するタンパク質または幹細胞ベースの療法の開発における効力を試験することは、緊急であり且つ未だに対処されていないため、一般に必要とされている。
【００１３】
ヒトに投与されるＴＧＮ１４１２で観察されるものと同様の結果を提供し、それにより特に生物学的薬剤に関する安全性試験の領域における有意の未対処な要求を満たすと思われる改良された検定を、本発明人は見出した。本発明は、当該技術分野の検定の一般状態とは違って、ｉｎ  ｖｉｖｏ臨床状況に関連した細胞集団、すなわち患者標的群からの内皮およびＰＢＭＣの直接的試験も可能にする。
【００１４】
従来技術の検定がＴＧＮ１４１２に対するサイトカインシグナルを実証するために用いられ得る一方、従来技術の検定は非整合ドナーからの細胞を用いるため、それらは擬陽性および擬陰性応答を生じ易い、と本発明人により仮定される。後者は、非整合ドナーからの組織の混合に起因し、これは、各々個々のドナーに固有の免疫応答を活性化／抑制し得る。これは、本発明人からの最新データにより例証されており、全血／ＨＵＶＥＣ混合組織生物検定において、ドナーの少なくとも１０％の血液を用いて観察される顕著な炎症性活性化が存在した、ということを示している。
【００１５】
ＨＵＶＥＣ細胞を検定に用いられるＰＢＭＣのような他の組織と整合させることは実際的に可能でなく、したがって、代替的系が必要とされた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、サイトカインストーム応答の刺激を検定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の：
ａ．  ＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞を共培養して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト応答を表す系を提供するステップ、ならびに
ｂ．  共培養細胞系を試験作用物質に曝露するステップ、
ｃ．  前記試験作用物質に共培養系を曝露後に放出される１つ以上のサイトカインの存在に関して系を分析するステップ、ならびに
任意に、１つ以上の対照作用物質に対する応答と比較した場合の試験作用物質に対する応答を評価するステップを包含する方法を提供する。
【００１７】
ＢＯＥＣ（血管内皮細胞）は血液試料から調製され得るし、ＰＢＭＣも、例えば本明細書中に記載される検定に用いるために同一試料（または同一ドナーからの別の血液試料）から調製され得る、ということを本発明人は確立した。
【００１８】
この検定系はｉｎ  ｖｉｖｏ応答を予測し、研究および薬学的安全性評価における強力なツールであると思われる、ということを本発明人が見出したことは有益である。ＨＵＶＥＣおよびＰＢＭＣ共培養またはヒト全血（非整合せいである）を利用する最新産業標準検定との比較試験において、本発明の開示による検定はサイトカインストーム反応を引き起こすいくつかの薬剤の「順位」をより正確に予測する、ということを本発明人は見出した。
【００１９】
ＢＯＥＣと対比して、他の型の幹細胞由来の内皮細胞（すなわち、胚幹細胞由来の内皮細胞；ｈＥＳＣ−ＥＣ）は、根深い妥協免疫応答を有し、これが、それらを任意の型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースの検定におけるサイトカインストーム応答の不適切な予測因子にさせる、ということも本発明人は以前に示している。
【００２０】
本発明による生物検定（ＢＯＥＣ＋ＰＢＭＣ、しかしいずれかの細胞型単独ではない）は、患者に安全に投与され、サイトカインストームを誘導しない陰性対照抗体に関する陽性結果を検出しない、ということは重要である。
【００２１】
本明細書中に開示される検定は、サイトカイン応答の強度を調べるために用いられ得る、ということが有益である。従来技術の検定、例えばＨＵＶＥＣ共培養検定は、このように用いることはできない。
【００２２】
さらに、材料、例えばＢＯＥＣおよびＰＢＭＣが単一被験体、例えばヒト被験体から採取される場合、検定は、投与される治療薬または試験作用物質に対する個々人の応答を調べるために用いられ得る。
【００２３】
したがって、一実施形態では、本明細書中に開示される検定は、投与されるヒトに関する治療薬の適性を予測するために個別化医療状況で用いられ得る。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本明細書中で用いられるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ヒト組織および／または血液のような試料に一般的に由来する材料を用いて、ヒトまたは動物身体の完全に外側で実施される方法である。
【００２５】
本明細書中で用いられるようなサイトカインストーム（高サイトカイン血症としても言及される）は、サイトカインと免疫細胞との間の不適切な陽性シグナル伝達に起因し、最後にはサイトカインを放出する潜在的に致命的な免疫応答である。患者においては、これは、高熱、腫脹および発赤、極度の疲労、悪心をもたらし、そしていくつかの場合には致命的である。１５０より多い既知の炎症媒介物質が放出されると考えられ、一般的に本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定では、１つ以上の適切なサイトカイン、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のサイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｐ７０およびＧＭ−ＣＳＦから独立して選択されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−８）が測定される。
【００２６】
この検定に関する読取りはサイトカインに限定されないが、しかし細胞活性化を示す任意の放出される因子、および／または活性化および／または炎症を示す任意の細胞応答（例えば、増殖）であり得る。
【００２７】
１つだけのサイトカインが測定される場合、それは、検定においてサイトカインストームに関する陽性対照を共存的に含んで、応答に対する状況を提供するために特に適切であり得る。
【００２８】
したがって、一実施形態では、検定は、１つ以上の対照、例えば陽性および／または陰性対照、例えば陽性対照、特に抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト、例えばＴＧＮ１４１２またはＡＮＣ２８（例えばＴＧＮ１４１２）および／または抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブ（キャンパス）を含み、これは、ヒトにおけるサイトカイン応答を引き起こし、検定において細胞を活性化する。これに対比して、抗体、例えばＣＤ２０抗体アルゼラは、ヒトにおいて気まぐれに深刻なサイトカインストームを引き起こさず、あるいは検定において細胞の共培養を活性化する。
【００２９】
ＡＮＣ２８は、ＣＤ２８スーパーアゴニストおよびＴＧＮ１４１２に関する一モデルである。ＴＧＮ１４１２は、本発明による検定に用いられ得るし、得られる結果は、等しくＣＲＳ応答を予測する。
【００３０】
一実施形態では、検定は、用いられる所定のスーパーアゴニストに関して、おそらくは検定における対照として、最適化され得るし、例えばＡＮＣ２８は、本明細書中に記載される実施例に従って培地とともに用いられ得る。
【００３１】
ＴＧＮ１４１２は、約２％のヒト血清を含有する培地とともに用いられ得る。
【００３２】
当業者は、慣用的技法のみを用いて、培地および血清に関して所定の系のための条件を十分に微調整し、最適化し得る。
【００３３】
ＰＢＭＣは、有志により供与される血液から容易に得られる。
【００３４】
整合分化内皮細胞は、本明細書中で用いる場合、血液整合性、ＨＬＡ整合性、性別整合性であるし、あるいはＰＢＭＣと完全に整合される。完全に整合されるとは、本明細書中で用いる場合、自家、すなわちＰＢＭＣおよび内皮細胞が同一ドナーからであることを意味する。
【００３５】
一実施形態では、ＰＢＭＣおよび内皮細胞は、単一ドナーからの同一試料から得られる。
【００３６】
本明細書中で記載される分化内皮細胞は、重要な点は、成熟血管からの内皮細胞と同様に振る舞うことが、本発明人等により示されている。これらは、（ｉ）剪断応力の方向に整列すること、（ｉｉ）内皮細胞ホルモンであるエンドセリン−１の放出、ならびに（ｉｉｉ）内皮細胞マーカー（例えば、ＣＤＩＩＩ１およびＶＥ−カドヘリン）の発現を包含する。
【００３７】
したがって、「分化内皮細胞」は、本明細書中で用いる場合、１つ以上の重要な点で、成熟血管からの内皮細胞と同様に振る舞う細胞であり、例えば、剪断応力の方向に整列し、内皮細胞ホルモン、例えばエンドセリン−１を放出し、および／または１つ以上の内皮細胞マーカー、例えばＣＤ３１および／またはＶＥ−カドヘリンを発現する。
【００３８】
ＰＢＭＣは、本明細書中で用いる場合、末梢血単核細胞を指す。一実施形態では、本方法に用いられるＰＢＭＣは全血であり、すなわち、単離されない。一実施形態では、単離ＰＢＭＣが本方法で用いられる。
【００３９】
血管における内皮細胞は到達し難く、外科的に、または死後に除去される組織から獲得され得るだけである。したがって、一実施形態では、内皮細胞は、組織細胞、例えば生検からである。
【００４０】
しかしながら、便宜的には、前駆細胞から成長する内皮細胞（いわゆる血管内皮細胞；ＢＯＥＣ）が、本発明の検定に用いられ得る。これは、検定における細胞を便利で且つ簡単な方法で整合させるため、有益であり、これらの細胞は血液試料から生育され得るため、したがって死後組織および細胞バンク物質（例えばＨＵＶＥＣ）は必要でない。
【００４１】
ＢＯＥＣは、循環中で前駆細胞から生じると考えられるし、血管成長修復に関与し得る。それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長する場合、これらの細胞は明白な内皮細胞表現型を有し、患者からの内皮細胞を試験し、疾患に関する新しい情報を提供するために用いられ得るし、推定上、本発明の開示におけると同様に、自家ＰＢＭＣとの共培養中で成長される場合、患者は薬剤に対して応答する。
【００４２】
ＢＯＥＣは、本明細書中で用いる場合、ヒト血液中の集団またはその他の身体的供給源から培養される分化内皮細胞を指す。
【００４３】
多数のＢＯＥＣ培養方法が、当該技術分野で記載されている。培養の長さを含めてＢＯＥＣを培養する正確な方法は、変更され得るが、但し、分化内皮表現型は、検定で用いられる細胞により示される。この表現型の良好な視覚的指標は、以下で考察される、ならびに当業者が理解する玉石形／形態である。
【００４４】
内皮に関するさらなる適切な供給源としては、体細胞が挙げられる。
【００４５】
一実施形態では、内皮細胞は、多能性幹細胞から調製され、これは、内皮細胞に分化するよう誘導される。
【００４６】
本発明人等は、天然内皮の古典的ホールマークを有するとしてこれらの細胞を特性化し、そして重要なことは、概念実験の立証を実施したことで、これは、同一ドナーＰＢＭＣの存在下で、ＢＯＥＣが抗ＣＤ２８スーパーアゴニストに対して貪欲に応答することを示している。
【００４７】
一実施形態では、内皮細胞は、おそらくは品質対照ステップとして、例えばそれらの同一性を確証するために、伸張され、一列に整列されたとして特性化される表現型を提供するために培養され得る。この培養は、複合剪断条件下で実施される。
【００４８】
しかしながら、一般的に、本発明の検定に用いられる培養内皮細胞は、例えば図に示されるように、玉石として記載される外見を有する。これは、それらが「静的」培養条件下で培養されるためである。
【００４９】
一実施形態では、内皮細胞は、容器中で、例えばプラスチックプレートまたは実験室で用いられる容器中で、集密層として増殖される。
【００５０】
細胞の数は、状況によって、例えば容器中の空間が限定される場合、関連考慮要件であり得る。
【００５１】
一実施形態では、試験試料当たり（試験される治療薬当たり）５，０００〜５０，０００個、例えば１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００または４５，０００個の内皮細胞が用いられる。
【００５２】
共培養は、本明細書中で用いる場合、内皮細胞およびＰＢＭＣが、各々の存在下で、すなわち物理的に摂食して、一定期間培養されるものである。一実施形態では、ＰＢＭＣは、約２４時間の期間後に、内皮細胞の培養に添加される。
【００５３】
一実施形態では、共培養することは、自家血清、すなわち、ＰＢＭＣおよび任意に内皮細胞が得られた血液試料からの血清中で用いられ得る。
【００５４】
一実施形態では、細胞は、マトリクスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、マトリゲル、コラーゲン等の存在下で共培養される。
【００５５】
一実施形態では、共培養は、マトリクスタンパク質の非存在下で実施される。
【００５６】
一実施形態では、サイトカイン放出に関する分析は、試験作用物質の添加後１〜３６時間、例えば、試験作用物質の添加後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間に、１つ以上の時点で実施される。
【００５７】
一実施形態では、本発明による方法のステップｂ）は、さらに、共培養細胞系を、系においてサイトカインストームを誘導する作用物質に曝露し、その後、誘導応答の試験阻害剤に系を曝露することを包含する。サイトカインストームの既知の阻害剤としては、ＯＸ４０阻害剤が挙げられる。一実施形態では、検定は、対照阻害剤、例えばＯＸ４０阻害剤を含む。
【００５８】
したがって、一実施形態では、本発明の方法は、本明細書中に開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養細胞系におけるサイトカインストームの阻害剤を同定するというさらなるステップを包含し得る。当該方法はさらに、以下のステップのうちの１つ以上を包含する：前記化合物を開発することおよび試験すること、さらに、化合物を処方すること、薬学的使用のために化合物に関する規定認可を求めること、化合物を市場に出し、販売すること、そしてそれを必要とする患者にそれを投与すること。当該方法の直接的生成物、当該方法から同定されるサイトカインストームの阻害剤に広げられる。
【００５９】
本明細書中の開示は、本明細書中に記載される方法で生じるデータを用いて、規定付託事項、例えばＩＮＤまたはＮＤＡ付託事項、あるいは別の地域または国における等価のプロセスを支持することにも広がる。
【００６０】
一態様において、ＰＢＭＣを、整合分化ＢＯＥＣおよび獲得されるかまたはそれから獲得可能な細胞集団と共培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
【００６１】
一態様では、本発明による整合生物検定に用いるためのＢＯＥＣに由来する内皮細胞集団が提供される。
【００６２】
さらにまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトサイトカインストーム応答を表すＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞の共培養系を含むキットが提供される。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトサイトカインストーム応答を表すｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定生物検定に用いるのに適したＰＢＭＣおよび整合分化内皮細胞の共培養系の使用である。
【実施例】
【００６４】
抗ＣＤ２８は、本実施例で用いる場合、一般的にＡＮＣ２８を指している。後者は、市販抗体である。
【００６５】
本明細書中で提示されるいくつかの図は、分析中の試料は１０の希釈液中の１つであり、この「補正」はその状況において適切であるとして許容されるため、使用説明書の検出限界と等しい０の結果を示すよう調整された。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】コラーゲン被覆プレート上でのプレート化後５〜２０日目（Ａ；左）およびコロニーが出現した１６日目（Ａ；右）のＰＢＭＣ共培養から出現したＢＯＥＣコロニー。ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチン核を発現するＢＯＥＣを、ＤＡＰＩで染色し（ｂ、ｃ）、剪断応力下で４日間培養すると（Ｂ）、ウェルの縁に一列に整列され、この場合、流れは一方向／薄層性であり（Ｂ；縁）、しかし中央ではそうではなく、流れは非方向性／非薄層性である（ｂ；中央）。ＢＯＥＣは、静的条件下でも増殖され、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンを発現した（Ｃ）。ＢＯＥＣは、ＣＤ４５を発現しなかった（Ｄ）。ＢＯＥＣは、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２プラス１０％ＦＢＳとともに２４時間培養するとエンドセリン（ＥＴ）−１（Ｅ）を放出し、同様の条件でＨＵＶＥＣおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）と比較された。データは、平均±ＳＥＭ（ＢＯＥＣ；ｎ＝８）（ＨＭＶＥＣ；ｎ＝４）（ＨＵＶＥＣ；ｎ＝６）である。
【図１Ｂ】コラーゲン被覆プレート上でのプレート化後５〜２０日目（Ａ；左）およびコロニーが出現した１６日目（Ａ；右）のＰＢＭＣ共培養から出現したＢＯＥＣコロニー。ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチン核を発現するＢＯＥＣを、ＤＡＰＩで染色し（ｂ、ｃ）、剪断応力下で４日間培養すると（Ｂ）、ウェルの縁に一列に整列され、この場合、流れは一方向／薄層性であり（Ｂ；縁）、しかし中央ではそうではなく、流れは非方向性／非薄層性である（ｂ；中央）。ＢＯＥＣは、静的条件下でも増殖され、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンを発現した（Ｃ）。ＢＯＥＣは、ＣＤ４５を発現しなかった（Ｄ）。ＢＯＥＣは、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２プラス１０％ＦＢＳとともに２４時間培養するとエンドセリン（ＥＴ）−１（Ｅ）を放出し、同様の条件でＨＵＶＥＣおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）と比較された。データは、平均±ＳＥＭ（ＢＯＥＣ；ｎ＝８）（ＨＭＶＥＣ；ｎ＝４）（ＨＵＶＥＣ；ｎ＝６）である。
【図１Ｃ】コラーゲン被覆プレート上でのプレート化後５〜２０日目（Ａ；左）およびコロニーが出現した１６日目（Ａ；右）のＰＢＭＣ共培養から出現したＢＯＥＣコロニー。ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチン核を発現するＢＯＥＣを、ＤＡＰＩで染色し（ｂ、ｃ）、剪断応力下で４日間培養すると（Ｂ）、ウェルの縁に一列に整列され、この場合、流れは一方向／薄層性であり（Ｂ；縁）、しかし中央ではそうではなく、流れは非方向性／非薄層性である（ｂ；中央）。ＢＯＥＣは、静的条件下でも増殖され、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンを発現した（Ｃ）。ＢＯＥＣは、ＣＤ４５を発現しなかった（Ｄ）。ＢＯＥＣは、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２プラス１０％ＦＢＳとともに２４時間培養するとエンドセリン（ＥＴ）−１（Ｅ）を放出し、同様の条件でＨＵＶＥＣおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）と比較された。データは、平均±ＳＥＭ（ＢＯＥＣ；ｎ＝８）（ＨＭＶＥＣ；ｎ＝４）（ＨＵＶＥＣ；ｎ＝６）である。
【図１Ｄ】コラーゲン被覆プレート上でのプレート化後５〜２０日目（Ａ；左）およびコロニーが出現した１６日目（Ａ；右）のＰＢＭＣ共培養から出現したＢＯＥＣコロニー。ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチン核を発現するＢＯＥＣを、ＤＡＰＩで染色し（ｂ、ｃ）、剪断応力下で４日間培養すると（Ｂ）、ウェルの縁に一列に整列され、この場合、流れは一方向／薄層性であり（Ｂ；縁）、しかし中央ではそうではなく、流れは非方向性／非薄層性である（ｂ；中央）。ＢＯＥＣは、静的条件下でも増殖され、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンを発現した（Ｃ）。ＢＯＥＣは、ＣＤ４５を発現しなかった（Ｄ）。ＢＯＥＣは、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２プラス１０％ＦＢＳとともに２４時間培養するとエンドセリン（ＥＴ）−１（Ｅ）を放出し、同様の条件でＨＵＶＥＣおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）と比較された。データは、平均±ＳＥＭ（ＢＯＥＣ；ｎ＝８）（ＨＭＶＥＣ；ｎ＝４）（ＨＵＶＥＣ；ｎ＝６）である。
【図１Ｅ】コラーゲン被覆プレート上でのプレート化後５〜２０日目（Ａ；左）およびコロニーが出現した１６日目（Ａ；右）のＰＢＭＣ共培養から出現したＢＯＥＣコロニー。ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチン核を発現するＢＯＥＣを、ＤＡＰＩで染色し（ｂ、ｃ）、剪断応力下で４日間培養すると（Ｂ）、ウェルの縁に一列に整列され、この場合、流れは一方向／薄層性であり（Ｂ；縁）、しかし中央ではそうではなく、流れは非方向性／非薄層性である（ｂ；中央）。ＢＯＥＣは、静的条件下でも増殖され、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンを発現した（Ｃ）。ＢＯＥＣは、ＣＤ４５を発現しなかった（Ｄ）。ＢＯＥＣは、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２プラス１０％ＦＢＳとともに２４時間培養するとエンドセリン（ＥＴ）−１（Ｅ）を放出し、同様の条件でＨＵＶＥＣおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）と比較された。データは、平均±ＳＥＭ（ＢＯＥＣ；ｎ＝８）（ＨＭＶＥＣ；ｎ＝４）（ＨＵＶＥＣ；ｎ＝６）である。
【図２】ＢＯＥＣ＋ＰＢＭＣ単一および共培養生物検定データ。ＰＢＭＣを整合ＢＯＥＣに添加した。ＰＢＭＣを、２４時間後に整合ＢＯＥＣに添加した。単一培養に関しては、ビヒクル培地をＰＢＭＣのプレートに添加した。同時に、培養を＋／−ビヒクル、ＡＮＣ２８（ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０；ＴＧＮ様スーパーアゴニスト）（１０μｇ／ｍｌ）、キャンパス（１０μｇ／ｍｌ）、アバスチン（１０ｕｇ／ｍｌ）またはアルゼラ（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。データは、平均±ＳＥＭ（Ａ〜Ｃ；ｎ＝５、ＢＯＥＣおよびＰＢＭＣの５つのドナーから）である。（Ａ）平均化された全ドナーの応答との併合データを示す。（Ｂ）ＰＢＭＣおよびＢＯＥＣを同一個体からの共培養中で処理した実験からのデータを、図２Ｂにおいてドナーにより分けて示し、「ドナー」Ａ、ドナーＣ、ドナーＦ、ドナーＱおよびドナーＺに言及する。（Ｃ）全検定条件に関する個々のドナーに関するデータを、分かり易くするために別個のグラフで示している。処理間の統計学的有意は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニの多重比較試験により決定し（ｐ＜０．０５）（Ａ、Ｂに示されている）、単一／共培養は二元配置ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）とその後のボンフェローニ後試験により決定された。患者Ｃは、ＭＳＤ検定を用いてその後再試験されたが、ＣＤ−２８スーパーアゴニストへの曝露後、サイトカイン応答の徴候を示さなかった。すべてのドナーが、同程度にＣＤ−２８スーパーアゴニストに対して応答したわけではない、ということは注目すべきである。これは、検定を用いて、提唱療法に対する患者の反応の勢い／強さを査定し得ることを示している。データは２Ｃにも提示されており、ｎ＝８である（すなわち、多数の試料の分析ならびにドナーＣに関する新規の分析）。
【図３】Ａ−Ｂ。ＨＵＶＥＣ（Ａ）および混合ドナーＢＯＥＣ（Ｂ）＋ＰＢＭＣ単一および共培養生物検定データ。ＰＢＭＣを、２４時間後に、ＨＵＶＥＣ（Ａ）または異なるドナーからのＢＯＥＣ（Ｂ）に添加した。単一培養に関しては、ビヒクル培地を添加した。同時に、培養を＋／−ビヒクル、ＡＮＣ２８（ＴＧＮ１４１２様スーパーアゴニスト）（１０μｇ／ｍｌ）、キャンパス（１０μｇ／ｍｌ）、アバスチン（１０ｕｇ／ｍｌ）またはアルゼラ（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。データは、平均±ＳＥＭ（Ａ；ｎ＝３）、（Ｂ；ｎ＝３）である。処理間の統計学的有意は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニの多重比較試験により決定した（ｐ＜０．０５）。
【図４】非内皮細胞（ヒト肺繊維芽細胞（ＨＬＦ））：ＰＢＭＣ単一および共培養生物検体データ。ＰＢＭＣをＨＬＦに添加した。単一培養に関しては、ビヒクル培地を添加した。同時に、培養を、＋／−ビヒクル、抗ＣＤ２８（ＴＧＮ様薬剤ＡＮＣ２８）（１０μｇ／ｍｌ）、キャンパス（１０μｇ／ｍｌ）、アバスチン（１０ｕｇ／ｍｌ）またはアルゼラ（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝２、２つの単離からから）である。
【図５Ａ】ＭＳＤ分析からのサイトカイン放出データ。ＭＳＤ  １０−スポット９−プレックス前炎症検定を用いて、測定を実行した（方法参照）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５、整合５ドナーから）である。一元配置ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較試験により、統計学的試験を実行して、薬剤対それぞれの対照のみによる応答を比較した（ｐ＜０．０５）。
【図５Ｂ】ＭＳＤ分析からのサイトカイン放出データ。ＭＳＤ  １０−スポット９−プレックス前炎症検定を用いて、測定を実行した（方法参照）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５、整合５ドナーから）である。一元配置ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較試験により、統計学的試験を実行して、薬剤対それぞれの対照のみによる応答を比較した（ｐ＜０．０５）。
【図５Ｃ】ＭＳＤ分析からのサイトカイン放出データ。ＭＳＤ  １０−スポット９−プレックス前炎症検定を用いて、測定を実行した（方法参照）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５、整合５ドナーから）である。一元配置ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較試験により、統計学的試験を実行して、薬剤対それぞれの対照のみによる応答を比較した（ｐ＜０．０５）。
【００６７】
材料および方法：
培地および溶液：
Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ補足物および増殖因子をＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２基本培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に添加することにより、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２培地を調製した。「ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ補足物および増殖因子」における添加濃度の情報は利用可能でないが、しかしながら供給元情報は、以下のものが含まれると述べている：ｈＥＧＦ、ゲンタマイシン−アンフォテリシン−Ｂ１００、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、ヘパリン、ヒドロコルチゾン。供給元ＦＢＳを捨てて、５０ｍｌのＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＨＹＣ−００１−３３０Ｙ）に取り替えて、Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳを得ることにより培地調製物を改質した。全補足物は、別々に培地に添加した。培地を毎日の使用のためにアリコート化して、４℃で保存し、光源から離した。
【００６８】
１型ラット尾コラーゲン溶液を、５０ミクロンｇ／ｍｌの濃度で、メーカーの使用説明書に従って０．０２Ｎの氷酢酸中に調製した。ＢＯＥＣ単離および保持のために用いられるプレートおよびフラスコ表面を５．２μｇ／ｃｍ２のコラーゲン溶液で被覆し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄し、培地／細胞溶液／懸濁液を添加した。
【００６９】
血管内皮細胞の単離
ほかで公表されている方法に小変更を加えて、ＢＯＥＣを単離した。要するに、血液（４８ｍｌ）を健常有志から収集し（倫理コード：０８／Ｈ０７０８／６９）、ＰＢＭＣを調製した。試験管を８回反転して、最大加速および制動率で、室温で３０分間、１６００ＲＣＦで遠心分離した。次に試験管をさらに８回反転させて、バフィーコートおよび血漿／血清分画の混合を可能にした。８つの試験管からのこの混合分画を、次に注意深く５０ｍｌファルコン試験管中にプールし、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳを添加して、最終容積を５０ｍｌとした。次に細胞を、最大加速および中間制動を用いて１０分間、５２０ＲＣＦで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１０ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ中に再懸濁させた。このプロセスをさらに２回反復して、合計で３つの洗浄液を得た。最終遠心分離の前に、１０ｕｌの細胞懸濁液を計数のために血球計算器に添加した。最終洗浄後に、細胞をその後再懸濁して、１０％ＦＢＳを有するＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２中にウェル（４ｍｌ）あたり３〜５×１０７／細胞を得て、６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のコラーゲン（ＢＤ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）被覆ウェル（上記参照）に添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、培地を注意深く除去して、細胞をＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳで洗浄し、４ｍｌの新鮮なＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳを各ウェルに添加した。この工程を２４時間ごとに４日間反復し、次いで、２４時間ごとに、洗浄せずに７日目まで反復した。７日目の後に、コロニーが現れるまで、洗浄せずに隔日毎に培地を取り替えた。内皮細胞のコロニーは、典型的には、７〜２０日目に出現した。コロニーが一旦出現したら、それらを４日以下の間拡張させた。２ｍｌトリプシン／ウェルを用いて、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥ  １×）消化によりコロニーを取り出した。トリプシンを４ｍｌのＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳで中和し、６ｍｌの細胞／トリプシンミックスを５０ｍｌファルコン試験管中に収集し、最大加速および中間制動設定で室温で５分間、１９０ＲＣＦで遠心分離した。次に細胞をプレート化し、拡張して、上記のようにコラーゲンで前処理したＴ２５またはＴ７５培養フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に保持した。この試験に用いたヒト臍帯静脈内皮細胞は、ロンドンの王立獣医大学のキャロライン・ウィーラー・ジョーンズ博士から寄贈して頂いたものであった。
【００７０】
ヒト末梢血単核球の単離および培養
ＰＢＭＣの単離は標準実験室プロトコールであり、多数の変法を用いて実行し得る。ここでは、末梢血試料（２０ｍｌ）を健常有志から収集し、クエン酸ナトリウムを含有する遠心管中に入れた（クエン酸ナトリウム：血液比は１：９であった）。クエン酸化血液を、ＲＰＭＩ：Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２培地で、３７℃で１：１の比で希釈した。血液（６ｍｌ）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）（３ｍｌ）上に層化して、最大加速および最小制動設定で、室温で３０分間、４００ＲＣＦで遠心分離した。パスツールピペットを用いて、各試験管から末梢血細胞バフィーコートを注意深く取り出した。ＰＢＭＣを１５ｍｌ遠心管に移し（管当たり７ｍｌまで）、ＲＰＭＩ：Ｌｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳ（１：１）を用いて１４ｍｌまでにした。遠心管を室温で１５分間、２００ＲＣＦで遠心分離して、あらゆる残存Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを除去した。上清を各管から捨てた。細胞ペレットを、２０ｍｌの新鮮培地を有する５０ｍｌファルコン管中にプールし、最終洗浄のために同一条件で再び遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを１ｍｌの培地中に再懸濁し、血球計算器を用いて計数した。１×１０５細胞／ウェルで、７０〜８０％集密度での予備プレート化ＢＯＥＣ（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた場合と用いない場合とで、９６−ウェル中にＰＢＭＣを播種した。
【００７１】
ヒト肺繊維芽細胞の培養
ヒト肺繊維芽細胞は、アンドリュー・ソーリー博士からの寄贈によるもので、以下の補足物：ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００単位のペニシリンおよび１０ｍｇのストレプトマイシン／ｍｌを０．９％ＮａＣｌ中に含む）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）および１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に保持した。
【００７２】
二重細胞自家検定プロトコール：
二重細胞検定のために、ＢＯＥＣを、上記のように健常有志から単離した。一旦、継代３および集密で、細胞を１％ゼラチン被覆９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上に載せ、一晩接着させた。次いで、患者を再び呼んで、上記のようにＰＢＭＣを単離し、ＢＯＥＣに添加した。サイトカインストーム誘導薬剤ＴＧＮ様抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＡＮＣ２８．１．５Ｄ１０、ＡＮＣ２８としても言及される）（１０μｇ／ｍｌ）、ハーセプチン（抗ＥＧＦＲ２：トラスツズマブ）（１０μｇ／ｍｌ）およびキャンパス（抗ＣＤ５２：アレムツズマブ）（１０μｇ／ｍｌ）を次に０日目に添加した。アバスチン（抗ＶＥＧＦＡ：ベバシズマブ）（１０μｇ／ｍｌ）およびアルゼラ（抗ＣＤ２０：オファツムマブ）（１０μｇ／ｍｌ）を、サイトカイン放出誘導に関する陰性対照として包含した。次に、プレートを２４時間インキュベートした。上清を収集し、ＥＬＩＳＡのためのさらなる分析のために−２０℃で、ＭＳＤプラットフォーム分析のために−８０℃で保存した。
【００７３】
ＣＸＣＬ８の測定
メーカーの使用説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ  ＣＸＣＬ８キット、ＤＹ２０８Ｅ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ  ＵＫ）によりＣＸＣＬ８（ＩＬ８）を測定した。
【００７４】
ＭＳＤプラットフォームを用いるサイトカインアレイ
生物製剤ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＵＳＡ）による刺激後の整合ＢＯＥＣおよびＰＢＭＣ共培養ならびにそれぞれの単一培養により放出されるサイトカインをさらに分析するために、プラットフォーム分析を用いた。ヒト炎症誘発９−Ｐｌｅｘ  ＭＵＬＴＩＳＰＯＴ  ９６ウェル−１０スポットＭＳＤプレートは、ＭＳＤ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）（カタログ番号Ｎ０５００７Ａ−１）から購入した。試料をＬｏｎｚａ−ＥＧＭ２  １０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩミックス中で１：１０希釈し、ＭＳＤプレートに添加した。メーカーの使用説明書に従って、免疫検定を実行した。ＭＳＣ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００を用いてプレートを読み取り、ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを用いて分析した。分析したサイトカインは、ＩＬ−２、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＩＬ−１２ｑ７０、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦαであった。
【００７５】
統計学的分析
実験の前に、統計学的分析プロトコールを設計した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用いて、分析を実行した。特定の試験の詳細は、図とその説明文に提示されている。
【００７６】
結果
ＢＯＥＣの特性化：
ＢＯＥＣは、７〜２０日目の培養における健常有志のＰＢＭＣ単離から出現した。他の人々により示されたように、ＢＯＥＣは、静的培養中で典型的内皮細胞「玉石」形態（図１Ａ）を示し、不可欠な内皮細胞マーカー、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンを発現したが（図１Ｂ）、白血球共通抗原ＣＤ４５を発現しなかった（図１Ｄ）。血管からの内皮細胞は、剪断応力に対して典型的表現型応答を有する。内皮に典型的としてＢＯＥＣをさらに特性化するために、複合剪断パターン下でそれらを４日間増殖させた。方向性／薄層性剪断の領域におけるＢＯＥＣは、伸張され、一列に整列されているという典型的内皮細胞表現型を示した（図１Ｂ）が、一方、乱剪断領域において、または静的領域下で増殖したものは、典型的には玉石形であった（図１Ｃ〜Ｄ）。ＢＯＥＣは、臍帯静脈から（ＨＵＶＥＣ）または肺微小血管（ＨＭＶＥＣ）からの内皮細胞と同様のレベルで内皮ペプチドエンドセリン−１（ＥＴ−１）も放出した（図１Ｅ）。我々の試験におけるＢＯＥＣは、これらの典型的特徴を示した。
【００７７】
同一ドナーＢＯＥＣ：生物学的抗体を誘導するサイトカインストームを検出するためのＰＢＭＣ生物検定：
ＰＢＭＣは、対照培養条件下で低レベルのＣＸＣＬ８を放出した。同一ドナーからのＢＯＥＣは、ＰＢＭＣより相対的に多くのＣＸＣＬ８を放出した（図２）。同一ドナーＢＯＥＣおよびＰＢＭＣの共培養は、対照条件下でいずれかの細胞型単独により放出されるレベルと比較して、ＣＸＣＬ８放出に及ぼす識別可能な作用を有さなかった。有用であるべき我々の同一ドナー内皮細胞：ＰＢＭＣ生物検定に関しては、ヒトにおけるサイトカインストームを引き起こすことが既知である治療用抗体に対するサイトカイン放出を明示するはずであるが、しかし観察されるサイトカイン応答が一般的に軽度であり、人における療法の使用を限定しない場合の人で用いられるものに対しては明示しない。概念試験の我々の立証において、２つの陽性対照抗体、ＴＧＮ１４１２様抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＡＮＣ２８）およびＣＤ５２抗体アレムツズマブ（キャンパス）を試験した。治療的に用いられるが、しかしサイトカインストーム応答を生じない３つの陰性対照を試験したが、これらは、（ｉ）ハーセプチン（これはヒト上皮成長因子受容体２と結合する）；（ｉｉ）アバスチン（これは、血管内皮細胞成長因子Ａと結合する）；ならびに（ｉｉｉ）アルゼラ（これは、ＣＤ２０と結合する）であった。ＰＢＭしまたはＢＯＥＣ培養単独は、単一培養として処理される場合、試験した抗体のいずれにも応答しなかった。同様に、ＰＢＭＣおよびＢＯＥＣにハーセプチン、アバスチンまたはアルゼラを伴う共培養は、増大レベルのＣＸＣＬ８を放出しなかった。しかしながら、ＰＢＭＣおよびＢＯＥＣの共培養は、ＴＧＮ１４１２様抗ＣＤ２８スーパーアゴニストで、またはキャンパスで刺激した場合（ＴＧＮ１４１２＞キャンパス）、増大レベルのＣＸＣＬ８を放出した。これは、これらの薬剤に関するサイトカインストームの予測重症度と相関する（図２）。
【００７８】
ＨＵＶＥまたは混合ドナーＢＯＥＣ＋ＰＢＭＣ単一および共培養検定
我々の同一ドナー検定からのデータを、最新技術検定と比較するために、検出器内皮細胞モデルとしてＨＵＶＥＣを用いて、平行実験を進めた。ＰＢＭＣは、再び、試験した生物治療薬のいずれによっても増大されない低レベルのＣＸＣＬ８を放出した（図３Ａ）。得ＨＵＶＥＣは、抗ＣＤ２８スーパーアゴニストまたはキャンパスにより増大されない相対的の高い基本レベルのＣＸＣＬ８を放出した。ＨＵＶＥＣは、非サイトカインストーム誘導薬剤アバスチンおよびアルゼラに対して応答する傾向を有した（図３Ａ）。これらの異なる結果に関する基礎は、ＨＵＶＥＣドナーが、ＢＯＥＣと違って、容易に追跡されず、さらに試験され得ないので、さらに研究され得ない。同様の結果は、ＰＢＭＣが異なるドナーからのＢＯＥＣに添加された場合に見出された。ＨＵＶＥＣおよびＰＢＭＣ（２ドナーから）の共培養が、ＴＧＮ１４１２様スーパーアゴニスト（ＡＮＣ２８）およびキャンパスに対して応答した、ということは重要である。これは、この検定に関してすでに知られているものを十分に獲得するが、それは、ＴＧＮ１４１２相１試験以来、前臨床段階で生物治療薬を試験するための至適基準検定として用いられるようなものである。全血を用いて近年我々が示したように、最新研究において、１ドナーからの１つの反復実験に関して、ＨＵＶＥＣ単一層へのＰＢＭＣの添加は、ＣＸＣＬ８放出の活性化を生じたが、これは、系を最大に活性化して、サイトカインストームを検出できない検定を生じると思われる。対照または他の条件におけるこの免疫活性化応答は、異なるドナーからの組織の混合のためであると思われるし、ＨＵＶＥＣまたは他の類似の検定に関する重大な制限であるが、しかし、我々の「同一ドナー」検定により全体的に回避されるものである。
【００７９】
非内皮（ヒト肺繊維芽細胞）：ＰＢＭＣ検定
ＴＧＮ１４１２様抗ＣＤ２８スーパーアゴニストに対して応答する細胞間の相互作用は内皮細胞特異的であること、そして内皮細胞はこの種のこの検定のための理想的幹細胞子孫であることを例証するために、プラットフォームとしてヒト肺繊維芽細胞を用いて、同一検定を進めた。サイトカイン放出は、試験した生物製剤のいずれかによる処置に応答していずれかの細胞型において増大されることはなかった。一緒に培養した場合、ヒト肺繊維芽細胞およびＰＢＭＣは、最大限に活性化されてＣＸＣＬ８を放出するが、試験した生物製剤のいずれかに対する応答においてサイトカインストームを検出しない（図４）。
【００８０】
ＭＳＤ多重プラットフォームを用いるサイトカインストームのさらなる分析
サイトカインストーム反応を正確に検出するこの検定の能力をさらに査定するために、９つのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｑ７０、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦα）を測定し、このうちの７つ（ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｑ７０およびＴＮＦα）（図５Ａ〜Ｃ）は、２００６年にＴＧＮ１４１２を投与された場合に臨床的サイトカインストームを示している患者において測定した。我々の同一ドナーＢＯＥＣ：ＰＢＭＣ共培養検定において、すべてのサイトカイン許容ＩＬ−１２ｐ７０がＴＧＮ１４１２様抗ＣＤ２８スーパーアゴニストによる処置に応答して増大された。キャンパスも、整合ドナー共培養において放出ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦを高める傾向を示した。このデータは、ｉ）超感受性ＭＳＤプラットフォームを用いた我々の社内ＣＸＣＬ８データを実証するため、ならびにｉｉ）抗ＣＤ２８スーパーアゴニストに対するサイトカインストームを検出する整合ドナーＢＯＥＣ：ＰＢＭＣ共培養の力を例証し、低毒性薬、例えばキャンパスならびに陰性対照抗体、例えばアバスチンおよびアルゼラからのこの作用を叙述するために役立つ。
【００８１】
参考文献
１．  Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ  ，  Ｆｉｎｄｌａｙ  Ｌ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ”  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  
ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴＧＮ１４１２：  ｂｅｔｔｅｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  
ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；１７９：３３２５−３１．  
２．  Ｗａｌｋｅｒ  ＭＲ，  Ｍａｋｒｏｐｏｕｌｏｓ  ＤＡ，  Ａｃｈｕｔｈａｎａｎｄａｍ  Ｒ，  Ｖａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ  Ｓ，  Ｂｕｇｅｌｓｋｉ  ＰＪ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｓ  
ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１１；１１：１６９７−  ７０５．  
３．  Ｂａｉｌｅｙ  Ｌ，  Ｍｏｒｅｎｏ  Ｌ，  Ｍａｎｉｇｏｌｄ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８（ＳＡ）  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ５２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２．  
４．  Ｆｉｎｄｌａｙ  Ｌ，  Ｅａｓｔｗｏｏｄ  Ｄ，  Ｂａｌｌ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；３７１：１３４−４２．  
５．  Ｅａｓｔｗｏｏｄ  Ｄ，  Ｆｉｎｄｌａｙ  Ｌ，  Ｐｏｏｌｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴＧＮ１４１２  ｔｒｉａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＣＤ２８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ＣＤ４＋  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  
２０１０；１６１：５１２−２６．  
６．  Ｈｕｎｉｇ  Ｔ．  Ｔｈｅ  ｓｔｏｒｍ  ｈａｓ  ｃｌｅａｒｅｄ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＣＤ２８  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ＴＧＮ１４１２  ｔｒｉａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  
Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１２：３１７−８．  
７．  Ｆｉｎｃｏ  Ｄ，  Ｇｒｉｍａｌｄｉ  Ｃ，  Ｆｏｒｔ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．  
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０１４；６６：１４３−５５．  
８．  Ｆｏｌｄｅｓ  Ｇ，  Ｌｉｕ  Ａ，  Ｂａｄｉｇｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０；５：ｅｌ０５０１．  
９．  Ｙｏｄｅｒ  ＭＣ，  Ｍｅａｄ  ＬＥ，  Ｐｒａｔｅｒ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｃｌｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：１８０１−９．  
１０．  Ｉｎｇｒａｍ  ＤＡ，  Ｍｅａｄ  ＬＥ，  Ｔａｎａｋａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：２７５２−６０．  
１１．  Ｐａｓｃｈａｌａｋｉ  ＫＥ，  Ｓｔａｒｋｅ  ＲＤ，  Ｈｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｍｏｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１３；３１：２８１３−２６．  
１２．  Ｇｅｏｒｇｅ  ＰＭ，  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｅ，  Ｄｏｒｆｍｕｌｌｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０１３．  
１３．  Ｐｏｔｔｅｒ  ＣＭ，  Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ＭＨ，  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＬＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２０１１；３１：３８４−９１．  
１４．  Ｍａｒｔｉｎ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｊ，  Ｈｏｆｍａｎ  Ｍ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｉｇｇｅｌａａｒ  Ｍ，  Ｈｅｂｂｅｌ  ＲＰ，  Ｖｏｏｒｂｅｒｇ  Ｊ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２０１２；７：１７０９−１５．  
１５．  Ｔｈｉｌｌ  Ｍ，  Ｓｔｒｕｎｎｉｋｏｖａ  ＮＶ，  Ｂｅｒｎａ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００８；４９：２６９６−７０８．  
１６．  Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ  Ｇ，  Ｐｅｒｒｙ  ＭＲ，  Ｗａｒｄ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ  ｉｎ  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴＧＮ１４１２．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；３５５：１０１８−２８．  
１７．  Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ  Ｒ，  Ｅａｓｔｗｏｏｄ  Ｄ，  Ｐｏｏｌｅ  Ｓ，  Ｔｈｏｒｐｅ  Ｒ．  Ａｆｔｅｒ  ＴＧＮ１４１２：  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１２．  
１８．  Ｄｈｉｒ  Ｖ，  Ｆｏｒｔ  Ｍ，  Ｍａｈｍｏｏｄ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＧＮ１４１２  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１２；９：３４−４２．
本研究を支持して下さったダニエル・リード博士に謝意を表する。
【図１Ａ】
2016518828.tif 000003
【図１Ｂ】
2016518828.tif 000004
【図１Ｃ】
2016518828.tif 000005
【図１Ｄ】
2016518828.tif 000006
【図１Ｅ】
2016518828.tif 000007
【図２】
2016518828.tif 000008
【図３】
2016518828.tif 000009
【図４】
2016518828.tif 000010
【図５Ａ】
2016518828.tif 000011
【図５Ｂ】
2016518828.tif 000012
【図５Ｃ】
2016518828.tif 000013
【国際調査報告】
2016518828.tif 000014
2016518828.tif 000015
2016518828.tif 000016