(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼの活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号３のヌクレオチド配列から成る請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたＤＮＡを含んでなるクローニングベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のクローニングベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
ＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造法であって、請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を前記エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養することを含んでなる製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、AgeI制限エンドヌクレアーゼおよびAgeIメチルトランスフェラーゼをコードする組換えDNA、ならびに該組換えDNAを含有する大腸菌（E. coli）細胞によるAgeI制限エンドヌクレアーゼの産生に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
II型制限エンドヌクレアーゼは、細菌内で天然に存在する酵素のクラスである。それらが他の細菌タンパク質から精製されている場合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのためにDNA分子を小さな断片に切断するために制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認識しそれに結合することにより作用する。それらは、一旦結合すると、該認識配列の内部、片側または両側で該分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられている数百の細菌種において、特有の特異性を有する211個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている（RobertsおよびMacelis, Nucl. Acids Res. 24:223-235 (1996)）。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基づき命名される。例えば、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）なる種は、例えば、Dral、DraIIおよびDraIIIと称される3つの異なる制限エンドヌクレアーゼを産生する。これらの酵素は、それぞれ配列5’TTTAAA3’、5’PuGGNCCPy3’および5’CACNNNGTG3’を認識し切断する。一方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列5’GAATTC3’を認識する酵素EcoRIを唯一産生する。
【０００５】
細菌の制限−修飾（R-M）系のもう1つの成分は、修飾メチラーゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを保護しそれを外来感染性DNAから識別するのを可能にする手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識しそれに結合するが、該DNAを切断することはなく、メチル基の付加により該配列内の或る特定のヌクレオチドを化学修飾する（C5メチルシトシン、N4メチルシトシンまたはN6メチルアデニン）。メチル化後にはもはや、該認識配列は同族制限エンドヌクレアーゼに切断されない。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾される。したがって、それは、内在性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に不感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であり従って識別されうる外来DNAだけである。
【０００６】
組換えDNA技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングしたり、該酵素を大量に過剰産生させることが、現在では可能となっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該クローンを、それが10-3~10-4の頻度でしか存在しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存するように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００７】
II型制限−修飾系は、頻度の増加を伴いながらクローニングされている。クローニングされた最初の系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（EcoRII: Kosykhら, Mol. Gen. Genet. 178:717-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージによる感染に抵抗することができるため、クローン化制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリーからの生存体として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、限られた価値しか有していないことが判明している。特に、クローン化制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明している。
【０００８】
クローニングのためのもう１つのアプローチは、プラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nucl. Acids. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: GingerasおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)）。
【０００９】
現在、ますます多数のR-M系のクローニングに用いられているもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によりクローニングするものである（米国特許第5,200,333号 (1993)およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acids. Res. 13:6403-6421 (1985)）。R-M遺伝子は、しばしば、密接に連鎖しているため、両遺伝子を同時にクローニングできることが多い。しかしながら、この選択は、完全な制限系を常に与えるわけではなく、メチラーゼ遺伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, Gene 10:219-225 (1980); Bcn I: Janulaitisら, Gene 20:197-204 (1982); BsuRI: KissおよびBaldauf, Gene 21:111-119 (1983);およびMsp I: Walderら, J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)）。
【００１０】
より最近の方法（「エンドブルー（endoblue）」法）は、dinD::lacZ融合体を含有する大腸菌（E. coli）の指示株に基づく大腸菌（E. coli）における制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングに関して記載されている（Fomenkovら, 米国特許第5,498,535号 (1996); Fomenkovら, Nucl. Acids Res. 22:2399-2403 (1994)）。この方法は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアーゼが引き起こすDNA損傷の後の大腸菌（E. coli）のSOS応答を利用する。多数の耐熱性ヌクレアーゼ遺伝子（Tth111I、BsoBI、Tfヌクレアーゼ）が、この方法によりクローニングされている（米国特許第5,498,535号 (1996)）。
【００１１】
精製された制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ（これはより低度である）は、実験室内で組換え分子を創製するための有用な手段であるため、これらの酵素を大量に産生する細菌株を組換えDNA技術により入手することが商業的に要請されている。また、そのような過剰発現株は、酵素精製の労力を軽減するであろう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
AgeIは、パリンドロームヘキサヌクレオチド配列ACCGGTを認識し、そのAとCとの間を切断し、5’付着テトラヌクレオチド伸長を形成する制限エンドヌクレアーゼである（Yamadaら, Agric. Biol. Chem., 53:1747-1749 (1989)およびMizunoら, Agric. Biol. Chem., 54:1797-1802 (1990)）。Suzukiらは、AgeIメチラーゼ遺伝子の配列を公開している（Biosci. Biotech. Biochem., 60:444-447 (1996)）。また、彼らは、ageIR遺伝子の一部であるageIM遺伝子の下流の〜150bpの配列を公開している。本発明において本発明者らは、それらの配列がageIR遺伝子内に13bpの欠失を含有することを確認した。該欠失突然変異体が大腸菌（E. coli）内で発現されれば、この欠失は不活性なAgeIエンドヌクレアーゼを与えるであろう。Suzukiら（前掲）は、1kb下流配列のクローニングがAgeIエンドヌクレアーゼ活性を与えなかったことを報告している。実際に、彼らは、上流と下流の両方向でヌクレオチド配列を分析しているが、オープンリーディングフレームを見出していない。
【００１３】
本発明では、該メチラーゼ選択方法を用いて、アグロバクテリウム・ゲラチノボルム（Agrobacterium gelatinovorum）（ATCC 25655）からAgeIメチラーゼ遺伝子（ageIM）をクローニングした。Sau3AI部分ライブラリーにおいて、2つのAgeIメチラーゼ陽性（M+）クローンを同定した。AgeI M+クローンからの全挿入断片（〜5400bp）を完全に配列決定した。保存されたC5シトシンメチラーゼモチーフを含有する1個のオープンリーディングフレームを同定し、この遺伝子をageIM遺伝子と特定した。しかしながら、このクローンは、AgeI制限エンドヌクレアーゼを産生しなかった。Sau3AI部分消化の性質のために、該AgeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、おそらく、M+クローンにおいてトランケート化されていると結論した。メチラーゼ遺伝子および制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は、典型的には、ある特定の制限−修飾系内に互いに接近して位置するため、ageIMの上流および下流のDNA配列を逆PCRにより増幅しクローニングするよう努めた。4ラウンドの逆PCR反応の後、1つのオープンリーディングフレーム（ORF1）がageIM遺伝子の上流で見出され、もう1つのオープンリーディングフレーム（ORF2）がageIM遺伝子の下流で見出された。T7発現ベクターにおけるORF1の発現は、AgeI制限エンドヌクレアーゼ活性を全く与えなかった。大腸菌（E. coli）における第2ORF（ORF2）の発現は、AgeIエンドヌクレアーゼ活性を与えた。したがって、ORF2をageIR遺伝子と特定した。該ageIR遺伝子は、31,035ダルトンの推定分子量を有するタンパク質をコードする852bpである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
AgeIメチラーゼ遺伝子およびAgeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を好ましくはクローニングし大腸菌（E. coli）内で発現させる本明細書に記載の方法では、以下の工程を行なう。
【００１５】
1．Sau3AI部分ゲノムDNAライブラリーの構築
アグロバクテリウム・ゲラチノボルム（Agrobacterium gelatinovorum）（ATCC 25655）ゲノムDNAをSau3AIで消化して、所望の部分消化を行なった。0.5〜20kbの該Sau3AI部分消化ゲノムDNAを、BamHIで切断されCIPで処理されたベクターpAge-2（2個のAgeI部位を有するpUC19誘導体）中に16℃で一晩連結した。RR1コンピテント細胞および連結DNAを使用して、形質転換を行なった。該形質転換体をプールし、増幅した。一晩の細胞培養物からプラスミドDNAを調製した。
【００１６】
2．AgeI消化によるSau3AI部分ライブラリーDNAの攻撃およびAgeIメチラーゼ遺伝子（ageIM）のクローニング
該Sau3AI部分ライブラリーDNAを、AgeIで37℃で一晩消化した。該消化DNAを使用して、RR1コンピテント細胞を再形質転換した。すべての形質転換体の細胞培養からプラスミドDNAを単離した。個々のプラスミドDNAをAgeIで消化して、消化に対する抵抗性を検出した。単離した2個のプラスミド（#1および#26）は、AgeI消化に対する抵抗性を示した。AgeI消化に対する抵抗性の程度は完全なものであり、このことは、該クローンがAgeIメチラーゼ遺伝子を含有し大腸菌（E. coli）内で発現されたことを示唆している。
【００１７】
3．AgeIメチラーゼ遺伝子を保持する挿入断片の配列決定
2個のM+クローン（#1および#26）を、プライマー歩行によるDNA配列決定に付した。#26の全挿入断片を配列決定したところ、それは#1と完全に重複することが判明した。#26の挿入断片は、部分的および完全なオープンリーディングフレームを有する5356bpのDNAを有する。しかしながら、1つの大きなORFを、blastxを用いてGenBank内のその他の遺伝子と比較すると、それは公知C5シトシンメチラーゼに対する相同性を示す。この遺伝子をageIM遺伝子と特定した。ageIM遺伝子の上流には3576bpのDNAが、そしてageIM遺伝子の下流には491bpのDNAが存在する。該配列のいくつかは、ライブラリー構築中にSau3AI断片のランダム連結により誘導することができる（後の実験において、ageIR遺伝子はageIM遺伝子の下流に位置することが判明した。図1を参照されたい）。
【００１８】
4．大腸菌（E. coli）におけるAgeIメチラーゼ遺伝子の発現
Vent（登録商標） DNAポリメラーゼおよび2個のプライマーを使用しPCRにより、全AgeIメチラーゼ遺伝子（1290bp）をゲノムDNAから増幅した。該PCR産物（ageIM遺伝子）をBamHIで消化し、ゲル精製し、pACYC184中にクローニングした。4個のプラスミド単離体がAgeI消化に対する完全な抵抗性を示し、このことは、AgeIメチラーゼ遺伝子の挿入および発現を介したインビボにおけるAgeI部位の修飾を示している。
【００１９】
5．AgeIM上流配列のクローニングおよび発現
もとのM+クローン中のageIM遺伝子の上流には3576bpのDNAが存在するが、このクローンはAgeIエンドヌクレアーゼ活性を与えない。その3576bpのDNAの一部または全部はランダム連結に由来するものであると推論した。逆PCRを用いて、ageIM遺伝子の上流の連続的なDNAを増幅しクローニングした。2ラウンドの逆PCRの後、681bpの1つのオープンリーディングフレーム（ORF1）が見出された（図2）。ORF1をPCRにより増幅し、T7発現ベクターpAII17（pET11由来）中にクローニングし、AgeIメチラーゼで予め修飾された宿主中に形質転換した。大腸菌（E. coli）細胞をIPTGで誘導し、細胞抽出物をAgeI活性に関してアッセイした。AgeI活性は全く検出されなかった。
【００２０】
6．AgeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
制限および修飾遺伝子は、典型的には、互いに非常に接近して位置するため、ageIR遺伝子は下流に位置すると結論した。逆PCRを用いて、ageIM遺伝子の下流のDNAを増幅した。2ラウンドの逆PCRの後、852bpの1つのオープンリーディングフレーム（ORF2）が見出された。ORF2は、ageIM遺伝子に対して逆配向である（AgeI R-M遺伝子の構成に関しては、図1を参照されたい）。ORF2をPCRにより増幅し、T7発現ベクターpAII17中にクローニングし、AgeIメチラーゼで予め修飾された細胞中に形質転換した。大腸菌（E. coli）細胞をIPTGで3時間誘導し、細胞抽出物を調製し、AgeI活性に関してアッセイした。8個の細胞抽出物をアッセイし、それらのすべてがAgeI活性を示した。したがって、ORF2をageIR遺伝子と特定した（図4）。
【００２１】
【実施例】
つぎに実施例により本発明を更に詳しく説明する。この実施例は、本発明の理解を助けるために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
【００２２】
前記および後記で引用されている参照文献は、参考として本明細書に組入れるものとする。
【００２３】
実施例1
大腸菌（E. coli）におけるAgeI制限−修飾系のクローニング
アグロバクテリウム・ゲラチノボルム（Agrobacterium gelatinovorum）（ATCC 25655）（この株は、New England Biolabsのコレクション（NEB #552, Beverly, Massachusetts）中に存在する）からゲノムDNAを調製した（Yamadaら, Agric. Biol. Chem. 53:1747-1749 (1989)）。
【００２４】
1．Sau3AI部分ゲノムDNAライブラリーの構築
4μgのアグロバクテリウム・ゲラチノボルム（Agrobacterium gelatinovorum）ゲノムDNAを、0.5、0.25および0.125、0.0625、0.03、0.015、0.0078、0.0039単位のSau3AIで37℃で15分間消化した。全部で8本の消化用チューブを、部分消化プールとして一緒にした。Sau3AIで部分消化したそのゲノムDNAは0.5〜20kbであった。Sau3AIで部分消化したそのゲノムDNAを、BamHIで切断されCIPで処理されたベクターpAge-2（2個のAgeI部位を有するpUC19誘導体）（Skoglundら, Gene, 88:1-5 (1990)）中に16℃で一晩連結した。
【００２５】
pAge-2は、pUC19（Yanisch-Perronら, Gene, 33:103-119 (1985)）中のβ-ラムタマーゼ遺伝子とpUC19の起点との間の2つの異なる部位（一方はSspI部位、もう一方はDraI部位）にAgeIリンカー（5’d(pGACCGGTC)3’ 8マー）を含有する。該連結反応の後、RR1（TonA−、DnaseI−）コンピテント細胞および該連結DNAを標準的な方法で混合することにより形質転換を行なった。形質転換体を、Amp（100μg/ml）を含有するLB寒天上にプレーティングした。形質転換において、約10,000個のコロニーを得た。コロニー数を増加させるために、RR1（TonA−、DnaseI−）細胞および該連結DNAを使用して更に5×形質転換を行なった。約50,000個の形質転換体を得た。該形質転換体のすべてをプールし、Ampを含有する0.5リットルのLBブロス中に接種し、37℃で一晩インキュベートした。その一晩の細胞から、CsCl勾配によりプラスミドDNAを調製した。
【００２６】
2．AgeI消化によるSau3AI部分ライブラリーDNAの攻撃およびAgeIメチラーゼ遺伝子（ageIM）のクローニング
2μgの該Sau3AI部分ライブラリーDNAを、12単位のAgeIで37℃で一晩消化した。該消化DNAを使用して、RR1（TonA−、DnaseI−）コンピテント細胞を再形質転換した。48個の生存体を得た。プラスミドDNAのミニプレパレーション（mini-preparation）を28個の形質転換体の細胞培養10mlから単離した。個々のプラスミドDNAをAgeIで消化して、消化に対する抵抗性を検出した。単離した2個のプラスミド（#1および#26）が、AgeI消化に対する抵抗性を示した。AgeI消化に対する抵抗性の程度は完全なものであり、このことは、該クローン化AgeIメチラーゼ遺伝子が完全なものであり、大腸菌（E. coli）内で発現されたことを示唆している（該挿入断片の配列決定から、全AgeIメチラーゼ遺伝子がクローニングされていることが確認された）。
【００２７】
AatIIおよびSau3AIでの#1および#26プラスミドDNAの制限消化は、重複DNAを示した。#1は、約5.4kbのDNAの部分Sau3AI挿入断片を含有する#26と完全に重複している1.8kbの部分Sau3AI断片を含有していた。
【００２８】
3．AgeIメチラーゼ遺伝子を保持する挿入断片の配列決定
#1および#26プラスミドDNAを、AmpliTaq DNAポリメラーゼ色素デオキシターミネーターシークエンシングキットとABI373A自動DNAシークエンサーとを使用するジデオキシターミネーション法を用いるプライマー歩行により配列決定した。非重複領域の配列決定または公知配列の相補鎖の確認のために、プライマーを合成した。#26の全挿入断片を配列決定したところ、それは、いくつかの部分的または完全なオープンリーディングフレームをコードする5356bpの部分Sau3AI断片を含有することが判明した。その大きなORFを、blastxを用いてGenBank内の公知遺伝子と比較すると、1つのorfが公知C5シトシンメチラーゼに対する相同性を示す。ageIM遺伝子の上流の1つのorfは、公知トランスポゼース（Tpase D78259）に対する弱い相同性を示す。下流の部分orfは、GenBank内のいずれの遺伝子に対する相同性も全く示さなかった。AgeIメチラーゼ遺伝子のnt 3577-4866は、DNAの1290bp上にコードされており、コドンATG（Met）から出発し、TAGコドンで停止する。
【００２９】
4．大腸菌（E. coli）におけるageIM遺伝子の発現
ageIM遺伝子を増幅するためにPCRを行なった。BamHI部位を、2個のプライマー179-36および179-37の5’末端に設けた。0.2μgのゲノムDNA、10μlの10×Thermopol緩衝液、0.27mMの濃度のdNTP、79μlのH2O、0.12μgのプライマー179-36、0.12μgのプライマー179-37、2単位のVent（登録商標） DNAポリメラーゼを使用して、10個のPCR反応を行なった。
5’ AACGGATCCGGAGGTTTAAAAATGAAGACGATCGATCTATTTTGC 3’
(179-36)（配列番号4）
5’ CAAGGATCCTAACTGATCGCAACCTTTATTGTTTCA 3’
(179-37)（配列番号5）
得られたDNAを低融点アガロースゲル上で精製し、該DNAバンドを切り出し、等量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、80μlのTE緩衝液に再懸濁した。ついで該PCR DNA（約4μg）を200単位のBamHI、10μlの10×BamHI緩衝液で消化し、37℃で3時間インキュベートした。BamHIで消化されたそのDNAをゲル精製し、β-アガラーゼで処理し、等量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、50μlのTE緩衝液に再懸濁した。精製したそのDNAをpACYC184中に挿入した。プラスミドDNAの14個のミニプレパレーションを作製した。そのうちの11個が、メチラーゼ遺伝子挿入断片を含有していた。AgeIでの6個のプラスミドの消化は、4個の単離体（#1、#3、#4、#6）がAgeI消化に対して抵抗性であることを示した。T7発現宿主ER2566を形質転換して染色体DNAを予め修飾するために、#1単離体を使用した。
【００３０】
5．ageIM遺伝子の上流のDNAのクローニング
17個の反応において、10μgのゲノムDNAをAatII、ApoI、BanI、BsaHI、EaeI、Eco47III、HaeII、HincII、HpaI、MluI、MspI、NlaIII、PvuI、SacI、TaqI、Tsp509IおよびXmnIで消化した。ついで、得られたDNAを等容量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、TE緩衝液に再懸濁した。2μgの該DNAをT4 DNAリガーゼで自己連結し、ついでフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させた。逆PCRプライマーのセットを合成した。
5’ AAGGGTGCTGAAGTACCCAAACGCCGG 3’
(178-44)（配列番号6）
5’ GCGGAGAACAGCCGCCACAGATGCGAC 3’
(178-45)（配列番号7）
プライマー178-44および178-45と前記のDNA鋳型とを用いて、逆PCRを行なった。AatII、HincII、PvuI、TaqI、Tsp509IおよびXmnIで消化され自己連結されたDNA中で、逆PCR産物が見出された。これらの6個の反応において逆PCRを繰返し、該産物をゲル精製し、プライマー178-44および178-45を使用して直接配列決定した。該AatII断片は、449bpのDNA配列を与えた。
【００３１】
逆PCRプライマーのもう１つのセットを合成した。
5’ TCGGGAAGCTGGGACCTTGCGAGC 3’
(178-122)（配列番号8）
5’ ACCACCTATATCGCCACCGCACCT 3’
(178-123)（配列番号9）
10μgのゲノムDNAを、AatII、ApoI、AvaI、ApaLI、BsaHI、BstUI、HaeII、PvuI、Sau3AI、StyIおよびTaqIで消化した。ついで、得られたDNAを等容量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、TE緩衝液に再懸濁した。2μgの該DNAをT4 DNAリガーゼで自己連結し、ついでフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させた。プライマー178-122および178-123と前記のDNA鋳型とを用いて、逆PCRを行なった。BsaHIおよびTaqI鋳型中で、PCR産物が見出された。3本の各チューブで該逆PCR DNAを繰返し、該産物を低融点アガロースゲル中でゲル精製した。プライマー178-122および178-123を使用して該DNAを直接配列決定した。681bpの1つのオープンリーディングフレームが見出された。このORFをORF1と称することにした。
【００３２】
6．T7発現ベクターにおけるORF1の発現
PCRプライマーのセットを合成した。
5’ CTTCCCGACCATATGGGGCCATCAACGCTGAAAAGGAGA 3’
(181-184)（配列番号10）
5’ GCTGGATCCTCAGCGAGGATATTTGCAGACACCATA 3’
(179-100)（配列番号11）
95℃で30秒間、55℃で1分間および72℃で1分間ならびに２単位のVent（登録商標）DNAポリメラーゼで20サイクルのPCR条件下、プライマー181-184および179-100を使用するPCRにより、AgeIゲノムDNAからORF1を増幅した。該PCR産物をNdeIおよびBamHIで消化し、T7発現ベクターpAII17中にクローニングした。該連結DNAをT7発現宿主ER2566[pACYC-AgeIM+]中に形質転換した。プラスミドDNAを20個の形質転換体から単離し、NdeIおよびBamHIで消化して、挿入断片に関してスクリーニングした。20個のうちの10個が該挿入断片を含有していた。挿入断片を有する7個のクローンをIPTGで2時間誘導した。細胞抽出物を調製し、AgeI制限エンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。全7個の抽出物において、活性は検出されなかった。ORF1はAgeIエンドヌクレアーゼ遺伝子ではないと結論した。AgeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、該メチラーゼ遺伝子の下流に存在するにちがいない。
【００３３】
7．逆PCRによる下流DNAの増幅
AgeIメチラーゼ遺伝子の直下流の配列に基づく1セットのPCRプライマーを合成した。
5’ AACTCGTCGTCCTGACCAGAGAAG 3’
(182-159)（配列番号12）
5’ CGACTACTTAGTCGCCCAACTGGC 3’
(182-160)（配列番号13）
AgeIメチラーゼ遺伝子の165bp下流のPCRプライマーのもう１つのセットを合成した。
5’ TAATTCCTCTTGTCCGAGGGCCGG 3’
(182-161)（配列番号14）
5’ ATTGAGGGACACGGGGATTTCTCG 3’
(182-162)（配列番号15）
10μgのゲノムDNAを、AvaII、BsrBI、ClaI、DdeI、EcoRI、HhaI、NciI、TseIおよびNruIで消化した。ついで、得られたDNAを等容量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、TE緩衝液に再懸濁した。2μgの該DNAをT4 DNAリガーゼで自己連結し、ついでフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させた。プライマー182-161および182-162を用いて、逆PCRを行なった。HhaIおよびTseI DNA中で、逆PCR産物が見出された。これらの2つのPCR反応を4本の各チューブで繰返した。該PCR DNAを低融点アガロースゲルからゲル精製し、プライマー182-161および182-162を使用して該DNAを直接配列決定した。該HhaI断片は341bpの新規配列を与えた。逆PCRプライマーのセットを合成した：
5’ CCCATGTCGGGCCAGCACTGGATT 3’
(183-88)（配列番号16）
5’ ATCAGGTTGACCGCCTTATTCAAG 3’
(183-89)（配列番号17）
10μgのゲノムDNAを、AatII、AlfIII、AluI、ApaLI、AvaI、BarBI、BfaI、BsaAI、BsaWI、BsiEI、BspEI、BspHI、BstUI、DdeI、HinfI、HpaII、MluI、MspI、StyI、TaiI、TfiIおよびTsp509Iで消化した。ついで、得られたDNAを等容量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、TE緩衝液に再懸濁した。2μgの該DNAをT4 DNAリガーゼで自己連結し、ついでフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させた。BsaWIおよびTaiIで消化され自己連結したDNAにおいて、PCR産物が見出された。前記のPCR反応を、BsaWIおよびTaiIで繰返した。約50ngの鋳型DNAを、68μlのH2O、10μlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液、5.4μlの5mM dNTP（最終濃度0.27mM）、0.12μgのプライマー183-88、0.12μgのプライマー183-89、2.5単位のTaq DNAポリメラーゼと一緒にした。
5’ CCCATGTCGGGCCAGCACTGGATT 3’
(183-88)（配列番号16）
5’ ATCAGGTTGACCGCCTTATTCAAG 3’
(183-89)（配列番号17）
95℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル（該サイクルの完了後に5分間の休止）で該PCR反応を行ない、ついで配列決定を行なった。該BsaWI IPCR産物は約300bpであり、該TaiI産物は170bpであり、それらの2つの産物を低融点アガロースゲル上で精製した。また、AflIII、AluI、BfaI、BsaAI、BsiEI、BspEI、BspHI、BsrBI、BstUI、DdeI、HinfI、HpaII、StyI、TfiIおよびTsp509Iで消化され自己連結したDNA鋳型上で、IPCRを繰返した。約50ngの鋳型DNAを、68μlのH2O、10μlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液、0.27mMの濃度のdNTP、0.12μgのプライマー183-88、0.12μgのプライマー183-89、2.5単位のTaq DNAポリメラーゼと一緒にした。該反応は、95℃の予備加熱、それに続く95℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル（該サイクルの完了後に72℃で5分間の休止）で行なった。該AflIII、AluI、BspEI、HpaIIおよびTsp509I鋳型は、約300〜600bpのPCR産物を与えた。これらの5個の鋳型に関して3本の各チューブで該実験を繰返し、ついでゲル精製および配列決定を行なった。該AflIII産物は578bpを有し最も長く、371bp下流の該相補鎖上にTGA停止コドンを含有していた。
【００３４】
曖昧な配列を明らかにするために、プライマー182-159および183-89、プライマー182-161および183-89、2つの異なる濃度のMgCl2（1.5および3.0mM）、1μgのゲノムDNA、70μlのH2O、10μlの10×アッセイ緩衝液A、5.4mMの濃度のdNTP、0.12μgの各プライマー、および2.5単位のTaq DNAポリメラーゼを使用して、PCRおよびDNA配列決定を行なった。
5’ AACTCGTCGTCCTGACCAGAGAAG 3’
(182-159)（配列番号12）
5’ TAATTCCTCTTGTCCGAGGGCCGG 3’
(182-161)（配列番号14）
94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間、そして最後に72℃で2分間の休止の30サイクルで、該PCR反応を行なった。得られたDNAを低融点アガロースゲル上で電気泳動に付し、該DNAバンドを切り出し、β-アガラーゼで消化し、等容量のイソプロパノールで沈殿させ、乾燥させ、TEに再懸濁した。プライマー182-159、182-161および183-89を使用して、該PCR DNAを直接配列決定した。該ageIR遺伝子は852bpであり、ageIM遺伝子とは反対の方向に走っている。
【００３５】
8．大腸菌（E. coli）におけるageIR遺伝子の発現
BamHIおよびNdeI部位を5’末端に設けた2個のプライマーを構築した。1μgのゲノムDNA、0.12μgのプライマー184-53（該NdeI部位を含有）、0.12μgのプライマー184-54（該BamHI部位を含有）、70μlのH2O、10μlの10×Themopol緩衝液、0.27mMの濃度のdNTP、2単位のVent（登録商標） DNAポリメラーゼ、ならびに0、2、4、6および8μlの100mM MgSO4（2、4、6、8および10mMの最終濃度のMgSO4の場合）を使用する5個の反応において、PCRを完了した。
5’ ATTTGCCCCCATATGTGGTGTAATTATGAAGGCGGGGGA 3’
(184-53)（配列番号18）
5’ CGCGGATCCGAAACGCAGTCCCACCGTTGCTAC 3’
(184-54)（配列番号19）
94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間（最後に72℃で2分間休止）の20サイクルを完了した。2mMの濃度のMgSO4が最善の結果を与え、該反応を10本のチューブで繰返した。得られたDNAを低融点ゲルから精製し、β-アガラーゼで消化した。ついで該DNAを等容量のイソプロパノールで沈殿させ、乾燥させ、TEに再懸濁した。ついで約4μgの該沈殿DNAを、22μlの10×NEB緩衝液3中の200単位のNdeI、100単位のBamHIで消化した。該DNAを等容量のフェノール-CHCl3およびCHCl3で抽出し、冷エタノールで沈殿させ、乾燥し、50μlのTE緩衝液に再懸濁した。ついで、得られたDNAを、それぞれ0.1μgおよび0.2μgのPCR DNA（ageIR遺伝子）、2μlの10×T4連結緩衝液、800単位のT4 DNAリガーゼを使用して、100ngのベクターpAII17中に2つの反応で連結し、16℃で一晩インキュベートした。ついで該連結由来の組換えDNAのすべてを、4℃で30分間、37℃で3分間および25℃で5分間により150μlのコンピテントER2566細胞中に形質転換した。170μlのSOBブロスを加え、37℃で1時間インキュベートした後、該細胞／DNA混合物を、100μg/mlのアンピシリン（Ap）および33μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。増殖した12個のApおよびCm耐性形質転換体を拾い、2mlのLB+Ap+Cmに接種し、37℃で一晩振とうした。Qiagenミニプレパレーション精製によりプラスミドDNAを作製するために、1.5mlの細胞を遠心分離した。25μl（〜200ng）の得られた精製プラスミドDNAを、3μlの10×NEB緩衝液3中の20単位のBamHI、20単位のNdeIで消化し、37℃で1時間インキュベートした。12個のうち8個がAgeIR遺伝子挿入断片を示した。挿入断片を有する8個のクローンを10mlのLB+Ap+Cm中で後期対数期まで培養し、50μlの100mM IPTGを加え、37℃で一晩インキュベートした。IPTGで誘導された細胞を収穫し、1mlの超音波処理緩衝液に再懸濁し、それぞれ3×20秒間超音波処理し、ついで4℃で15分間遠心分離した。3μlの10×NEB緩衝液1中のそれぞれ1μlおよび5μlの細胞抽出物で1μgのλDNAを消化することにより該細胞抽出物を制限エンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイし、25℃で1時間インキュベートした。全8個のサンプルがAgeI活性を示した。ER2566［pACYC-AgeIM+、pAII17-AgeIR+］株は、American Type Culture Collectionに1998年4月1日に寄託され、ATCC受託第209730号を受けている。
【００３６】
9．AgeI制限エンドヌクレアーゼの精製
AgeIの精製には、2つのプロトコールを用いることができる。
プロトコール1：ヘパリンSepharose（登録商標）カラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、モノSカラム、tskヘパリンカラム。
プロトコール2：ヘパリンSepharose（登録商標）カラム、DEAE Sepharose（登録商標）カラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、フェニルSepharose（登録商標）カラム。
【００３７】
【配列表】
【００３８】
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【化１】
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【００３９】
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【化２】
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【００４０】
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【化３】
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【００４１】
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【化４】
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【００４２】
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【化５】
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【００４３】
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【化６】
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【００４４】
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【化７】
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【００４５】
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【化８】
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【００４６】
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【化９】
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【００４７】
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【化１０】
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【００４８】
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【化１１】
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【００４９】
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【化１２】
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【００５０】
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【化１３】
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【００５１】
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【化１４】
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【００５２】
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【化１５】
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【００５３】
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【化１６】
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【００５４】
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【化１７】
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【００５５】
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【化１８】
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【００５６】
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【化１９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  AgeI制限−修飾系の遺伝子構成を示す。
【図２】  ORF1 DNA配列およびそのコードされるアミノ酸配列（配列番号1）である。
【図３】  ageIM遺伝子のDNA配列およびそのコードされるアミノ酸配列（配列番号2）である。
【図４】  ageIR遺伝子のDNA配列およびそのコードされるアミノ酸配列（配列番号3）である。
【図５】  AgeI制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌（E. coli）細胞抽出物を使用した制限消化を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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