(57)【要約】  式1の化合物を作製する方法及びそのプロセスに関与する特定の中間体を本明細書に提供する。【選択図】図１
2016518339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式1の化合物を作製する方法であって、
【化１】
2016518339.tif 000037
(a)式2の化合物を反応させて、
【化２】
2016518339.tif 000038
式3の化合物を生成するステップ
【化３】
2016518339.tif 000039
並びに
(b)式3の化合物を反応させて、式5の化合物を得るステップ
【化４】
2016518339.tif 000040
並びに
(c)式5の化合物を溶解し、トリフルオロ酢酸(TFA)と混合して、式6の化合物を得るステップ
【化５】
2016518339.tif 000041
並びに
(d)ジメチルホルムアミド(DMF)、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)及び12-ADT-TFAの混合物中で、式6の化合物を式7の化合物と反応させるステップ
【化６】
2016518339.tif 000042
並びに
(e)ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)及び(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)を加えて、式8の化合物を生成するステップ
【化７】
2016518339.tif 000043
並びに
(e)式8の化合物を反応させて、式9の化合物を生成するステップ
【化８】
2016518339.tif 000044
並びに
(f)式9の化合物を精製して、式1の化合物を製造するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ(a)がエタノール中でナトリウムエトキシドを使用して実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ(b)が4-ジメチルアミノピリジン(4-DMAP)、式4の化合物、ジクロロメタン及びジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して実施される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(c)における溶解がジクロロメタン(CH2Cl2)を使用して実施される、請求項1、2又は3に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(e)がジクロロメタン、トリエチルシラン(Et3SiH)及びトリフルオロ酢酸を使用して実施される、請求項1、2、3又は4に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(f)がC18逆相クロマトグラフィーを使用して実施される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ(f)が濃縮カラムを使用することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
下記のスキームを含む、式4の化合物を作製する方法。
【化９】
2016518339.tif 000045
【請求項９】
請求項8の方法を使用して、式Boc-(CH2)n-NH2(式中、nは2より大きい整数である)を有する化合物を作製する方法であって、そのような方法用の出発材料は式(CH2)n-NH2(式中、nは2より大きい整数である)を有する化合物である、方法。
【請求項１０】
式1、式2、式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11又は式12の式のうちのいずれかを有する化合物。
【請求項１１】
請求項8又は9に記載の化合物のうちのいずれかの式を有する化合物。
【請求項１２】
式Boc-(CH2)n-NH2(式中、nは2より大きい整数である)を有する化合物。
【請求項１３】
請求項1又は9に記載の方法により製造される化合物。
【請求項１４】
式6の化合物を作製する方法であって、
【化１０】
2016518339.tif 000046
(a)式2の化合物を反応させて、
【化１１】
2016518339.tif 000047
式3の化合物を生成するステップ
【化１２】
2016518339.tif 000048
並びに
(b)式3の化合物を反応させて、式5の化合物を得るステップ
【化１３】
2016518339.tif 000049
並びに
(c)式5の化合物を溶解し、トリフルオロ酢酸(TFA)と混合して、式6の化合物を得るステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ(a)がエタノール中でナトリウムエトキシドを使用して実施される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(b)が4-ジメチルアミノピリジン(4-DMAP)、式4の化合物、ジクロロメタン及びジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して実施される、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(c)における溶解がジクロロメタン(CH2Cl2)を使用して実施される、請求項14、15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項14に記載の方法により製造される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる2013年3月15日に出願された米国特許仮出願番号61/791,909に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、癌に対して有効なプロドラッグ化合物を作製する方法に関する。1つの実施例において、本発明は、Asp-Glu*Glu*Glu*Glu配列(式中、*で指定された結合の少なくとも1つがガンマカルボキシ結合である)を有するペプチドのアスパラギン酸に連結したタプシガルジン誘導体、8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイルタプシガルジン(12ADT)を含み、式1:
【０００３】
【化１】
2016518339.tif 000003
の化学式を有するプロドラッグを作製する方法及びその特定の中間体を作製する方法に関する。本発明はまた、本明細書に記載されたプロセスにより得られる化合物及び中間体に関する。
【背景技術】
【０００４】
G-202と同定され、Asp-Glu*Glu*Glu*Glu配列(式中、*で指定された結合の少なくとも1つがガンマカルボキシ結合である)を有するペプチドのアスパラギン酸に連結したタプシガルジン誘導体、8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイルタプシガルジン(12ADT)を含み、構造式:
【０００５】
【化２】
2016518339.tif 000004
(式1)を有する、ペプチドプロドラッグ化合物が、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許番号7,767,648及び7,468,354に記載され、説明されている。G-202を含む注射用癌組成物及びG-202を使用する肝細胞癌腫を治療する方法及び組成物も、その全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願番号61/714,662及び61/693,273に開示されている。
【０００６】
G-202を製造するプロセスの大きな課題は中間体又は最終医薬品有効成分(API)のいずれかの結晶性の欠如に起因する。これは、合成におけるいかなる点での不純物を除去するための結晶化の活用を不可能にする。この制約により、反応が高度に効率的で、不純物をほとんど又は全然生成しないということが必須となる。さらに、この結晶性の欠如が水抽出、極性/非極性有機分配、沈澱、粉砕、効率的なクロマトグラフィー精製などの代替精製プロセスの価値を増加させる。本明細書に開示されたこのプロセスは、効果的な合成戦略と純粋なG-202を生成するこれらの精製技術のすべてを首尾よく組み入れている。
【発明の概要】
【０００７】
1つの態様において、本発明は、化学名、8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイル-タプシガルジン)アスパルテート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-グルタメートOHを有する、式1の化合物を作製する方法であって、
【０００８】
【化３】
2016518339.tif 000005
(a)タプシガルジン(Tg)(式2)を修飾して、
【０００９】
【化４】
2016518339.tif 000006
化合物、8-O-デブタノイル-タプシガルジン(DBTg)(式3)を得るステップ
【００１０】
【化５】
2016518339.tif 000007
並びに
(b)ジメチルアミノピリジン（DMAP）、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)及びCH2Cl2の存在下で、化合物Boc-12-AD(式4)を加えて、
【００１１】
【化６】
2016518339.tif 000008
Boc-12ADT(式5)を得るステップ
【００１２】
【化７】
2016518339.tif 000009
並びに
(c)BOC-12ADTを脱保護して、12-ADT(式6)を得るステップ
【００１３】
【化８】
2016518339.tif 000010
並びに
(d)エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及びジメチルホルムアミド(DMF)の存在下で、12-ADTをBoc-Asp-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OtBu(式7)と結合させて、
【００１４】
【化９】
2016518339.tif 000011
PG-202(式8)を得るステップ
【００１５】
【化１０】
2016518339.tif 000012
並びに
(e)PG-202を反応させて、化合物、粗製G-202(式9)を得るステップ
【００１６】
【化１１】
2016518339.tif 000013
並びに
(f)その後、粗製G-202を式1の化合物に変換するステップ
【００１７】
【化１２】
2016518339.tif 000014
を含む、方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の実施態様において、化合物、BOC-12-AD(式4)を作製する方法であって、
【００１９】
【化１３】
2016518339.tif 000015
(i)塩化アセチル(AcCl)の存在下で、化合物12-AD(式10)をメタノール(MeOH)と反応させて、
【００２０】
【化１４】
2016518339.tif 000016
式11の化合物を得るステップ
【００２１】
【化１５】
2016518339.tif 000017
並びに
(ii)4-ジメチルアミノピリジン(4-DMAP)及び第三級アミン塩基R3Nの存在下で、式11の化合物を二炭酸ジ-tert-ブチル(Boc2O)と反応させて、式12の化合物を得るステップ
【００２２】
【化１６】
2016518339.tif 000018
であり、
ここで、第三級アミンが、トリエチルアミン(Et3N)、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt)又はN-メチルピペリジンであることが可能であるが、それらに限定されないステップ、
並びに
(iii)式12の化合物を反応させて、式4(Boc-12-AD)の化合物を製造するステップ
を含む、方法が提供される。
【００２３】
本発明は、その変種及び誘導体を含む式1から式12までの新規化合物、本明細書で開示された方法により製造された、その変種及び誘導体を含む式1から式12までの化合物、及び本明細書に提供された方法を使用して製造又は生成できる他の化合物を対象とする。
【００２４】
本発明は、以下で説明される、上記化合物及び他の重要な目的を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】G-202を製造するための全体的反応の概略図である。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−３のつづきである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
長年の特許法協約に従い、用語、「1つの」及び「その」は、特許請求の範囲を含め、本出願で使用される場合、「1つ以上」を参照する。従って、「1つの対象」への言及は、文脈が明確にそれとは反対(例えば、複数の対象)、等でない限り、複数の対象を含む。
【００２７】
本明細書及び添付された特許請求の範囲のために、別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、大きさ、寸法、比率、形状、処方、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、数量、特性及び他の数値を表すすべての数は、用語「約」が値、量又は範囲で明確に示されないことがあっても、すべての例において用語「約」によって修正して理解すべきである。
【００２８】
別途規定されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同類又は同等の機械類、材料及び方法が本発明を実施又は試験するのに使用できるが、好ましい機械類、材料及び方法をここで記載する。本明細書で言及するすべての出版物は、その出版物で報告され、本発明の種々の実施形態に関連して使用される可能性のある、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターを説明し開示するため引用される。本明細書において、本発明が先行発明という理由でそのような開示に先行する権利を有しないことを認めたものと見なされるべきではない。
【００２９】
本明細書で使用される用語「G-202」は、式1の化学構造を有する、8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイル-タプシガルジン)アスパルテート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-グルタメートOHを指す。
【００３０】
G-202は、腫瘍部位でのタンパク質切断まで生物活性を妨げるマスキングペプチドと結合したタプシガルジンの細胞毒性類似体を含むタプシガルジンプロドラッグである。タプシガルジン自体は天然物であり、8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイル-タプシガルジン)(12ADT)に化学的に修飾される。このタプシガルジン類似体はマスキングペプチドAsp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGluのN末端のAspのベータカルボキシルに結合してプロドラッグ(12ADT)-Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGluOH(G-202)を生成する。
【００３１】
G-20の化学名は(8-O-(12-アミノドデカノイル)-8-O-デブタノイル-タプシガルジン)アスパルテート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-γ-グルタメート-グルタメートOHである。これは(12ADT)Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOHという略称で呼ばれることがあり、ここで、12ADTはタプシガルジン誘導体を示し、Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOHはPSMAで切断可能な(PSMA-cleavable)マスキングペプチドを示す。G-202は分子量が1409.52の黄褐色から白色の固体である。
【００３２】
G-202は天然物のタプシガルジンの強細胞毒性類似体に結合したPSMA選択的5アミノ酸ペプチド基質からなる。例えば、Denmeade, S.R., et al., J. Natl. Cancer Inst. 2003; 9: 990-1000及び米国特許第7,767,648号及び第7,468,354号を参照のこと。タプシガルジンは地中海沿岸地方全体に雑草として成長する植物サプシアガルガニカ(Thapsia garganica)の種子から単離される。例えば、Rasmussen, U., et al., Acta Pharm. Suec. 1978; 15: 133-140を参照のこと。タプシガルジンは重要な細胞内タンパク質である筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ(SERCA)ポンプを強く阻害することにより作用し、この筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ(SERCA)ポンプの正常な作用はすべての細胞型において細胞内カルシウム恒常性を維持することである。SERCAポンプの適切な機能はすべての細胞型の生存能に必要である。従って、SERCAポンプのタプシガルジンによる阻害は、正常及び悪性ともに、試験されたすべての細胞型の死をもたらす。例えば、Thastrup, O.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2466-2470; Denmeade, S.R., Cancer Biol. Ther. 2005; 4: 14-22を参照のこと。
【００３３】
これに基づき、G-202は、前立腺癌の部位内の前立腺癌上皮細胞及び他の癌細胞型の腫瘍血管内皮細胞、例えば、肝細胞癌腫によりつくられるPSMAによる選択的活性化作用の特殊なメカニズムを用い、この強力な細胞毒を目的とするように設計された。特定の理論には拘束されないが、PSMAは、G-202から酸性アミノ酸を連続して開裂させ、結果としてタプシガルジンの細胞毒性類似体を遊離させる細胞外カルボキシペプチダーゼであると考えられている。例えば、Pinto, J.T., et al., Clin. Cancer Res. 1996;2:1445-1451; Carter, R.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1996; 93: 749-753; Mhaka, A., et al., Cancer Biol Ther. 2004; 3: 551-558を参照のこと。12ADT-Aspと呼ばれるこの高親油性類似体は、その水溶性ペプチドキャリアから放出されると、周囲の細胞膜中に急速に分配される。例えば、Jakobsen, C.M., et al., J. Med. Chem. 2001; 44: 4696-4703を参照のこと。その後、この類似体は、SERCAポンプに結合し、細胞内カルシウムを持続的に上昇させ、アポトーシスの活性化をもたらす(例えば、図1; Denmeade, S.R., et al. J. Natl. Cancer Inst. 2003; 9: 990-1000; Singh, P., et al., J. Med. Chem. 48, 3005-3014 (2005)を参照のこと)。12ADT-Asp類似体は細胞外で腫瘍微小環境中へ放出されるので、すべての細胞が、PSMAを産生して、プロドラッグの活性化により死滅される必要はない。実質的なバイスタンダー効果が、腫瘍微小環境中への活性薬物の放出により達成される。
【００３４】
G-202の前臨床試験により、このプロドラッグがPSMAによりインビトロで選択的に活性化され、PSMA発現腫瘍細胞に対して、PSMA非発現腫瘍細胞と比較して、60倍以上の毒性があることが実証された。PSMAは、宿主動物に対して最小毒性用量で、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、肝癌及び膀胱癌のパネルに対してインビボで著しい増殖阻害を示す。例えば、Denmeade, S., et al., www.ScienceTranslational Medicine.org, Vol. 4, Issue 140: 1-12 (2012)を参照のこと。
【００３５】
1つの実施態様において、本発明は、G-202(式1)、粗製G-202(式9)及び特定の中間体の製造方法を提供する。粗製G-202の全体的反応スキームを、図1に示すように、要約し、説明する。
【００３６】
従って、1つの実施態様において、化合物(式2)
【００３７】
【化１７】
2016518339.tif 000019
が出発材料として使用される。この化合物を-15±5℃の温度でエタノール中でナトリウムエトキシドと反応させて、
【００３８】
【化１８】
2016518339.tif 000020
(式3)を生成する。次に、本化合物(8-O-デブタノイルタプシガルジン(DBTg))を均一な溶液が得られるまで4-ジメチルアミノピリジン（4-DMAP）、12-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ドデカン酸(12-Boc-AD)及びジクロロメタンと反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)をこの溶液に加えて、
【００３９】
【化１９】
2016518339.tif 000021
(式5)(Boc-12ADT又は12-Boc-ADT)を得る。
Boc-12ADTをジクロロメタン(CH2Cl2)に溶解し、トリフルオロ酢酸(TFA)と混合し、
【００４０】
【化２０】
2016518339.tif 000022
(式6)(12-ADT)を得る。その後、ジメチルホルムアミド(DMF)とヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)の混合物中で、この化合物12-ADTを精製ペプチド
【００４１】
【化２１】
2016518339.tif 000023
(式7)と反応させる。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)をこの混合物に加え、その後、(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)を加えて、
【００４２】
【化２２】
2016518339.tif 000024
(式8)(PG-202)を生成する。次に、この化合物をジクロロメタン、トリエチルシラン(Et3SiH)及びトリフルオロ酢酸と反応させ、
【００４３】
【化２３】
2016518339.tif 000025
(式9)(粗製G-202)を生成する。
その後、粗製G-202を精製して、式1の化合物を製造する。
【００４４】
上記反応スキームに示すように、本発明はまた、粗製G-202(式9)の生成に使用される反応物Boc-12-AD(式4)の製造方法を提供する。Boc-12-ADの全体的な反応スキームを、下記のように、要約し、説明することができる。
【００４５】
【化２４】
2016518339.tif 000026
【００４６】
これまでは、Boc-12-ADは、水酸化ナトリウムの存在下で過剰の二炭酸ジ-tert-ブチルで処理して12-アミノドデカン酸から1つのステップで作成された(スキーム1)。ヘプタンから再結晶した後、所望の生成物が優れた収率と純度で得られることが報告された。しかし、HPLC分析での非常にわずかなUV吸収のために、Boc-12-ADの純度はNMRで測定した。
【００４７】
【化２５】
2016518339.tif 000027
【００４８】
12-アミノドデカン酸を1.9等量のBoc2O及び0.98等量のNaOH(5M)を用いて40℃でt-ブタノール中で処理し、続いて、後処理及びヘプタンからの再結晶化を行うと、純粋なBoc-12-ADが製造されることが予想される。しかし、この方法で製造される物質は、真っ白く、結晶性であるが、lc/msによる分析では、以下に示しように、かなりの量の3つの化合物を含んでいることが判明した(スキーム2)。かなりのシグナル重複のために、これらの不純物はNMRで同定できない可能性が高い。
【００４９】
【化２６】
2016518339.tif 000028
【００５０】
従って、スキーム1で生成された成分の1つは必要なBoc-12-ADであるが、他の2つ成分は出発材料の二量体である。lc/msのみに基づく構造帰属から、不純物1は遊離酸と考えられ、不純物2はt-ブチル無水物と考えられる。ヘプタンからの最初の再結晶化の前後の物質の分析で、これらの不純物の除去が効果的ではないことが判明した。ヘプタンからの第2の結晶化では不純物2の量が減少することが分かったが、不純物1は減少しなかった。この物質はまた、良好な回収率で、酢酸エチル、又はメチルtert-ブチルエーテル(MTBE)とヘプタンの混合物から再結晶化できる。しかし、両システムは不純物2を減少させるが、不純物1の量にほとんど影響しない。反応物に残したままにしておくと、不純物1はDBTgと反応し、残りの合成の間に、除去が非常に困難な不純物を作り出すことになる。
【００５１】
従って、本明細書は現在の合成で生成される不純物を本質的に除去する新規方法を提供する。この方法は下記スキーム3に示される3段階ルートによるBoc-12-ADの生成を含む。
【００５２】
【化２７】
2016518339.tif 000029
12-アミノドデカン酸の酸触媒エステル化により、メチルエステル塩酸塩が生成される。この反応に続いて、t-ブチルカルバメートとして窒素を保護し、最後に加水分解を行い、所望の生成物を得る。
【００５３】
このルートは長い(１ステップに対して3ステップ)が、非常に高収率(各ステップそれぞれ、96%、97%及び98%)で、二量体不純物の形成を本質的に除去する。さらに、DBTgからBoc-12-ADTへ変換する反応に関して、副産物ジイソプロピル尿素(DIU)はMTBE/ヘプタンからの沈澱により除去され、未反応DICは新規のACN/ヘプタン分配により除去され、12-ADT-TFAのシリカゲル精製が開発された。
【００５４】
スキーム3はまたBoc-12-ADの変種、例えば、式Boc-(CH2)n-NH2(式中、nは2を超える整数である)を有する化合物を生成するのに使用できる。このような化合物について、出発材料は式(CH2)n-NH2(式中、nは2を超える整数である)を有する(式13)。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、その変種及び誘導体を含む、式1から式12の化合物及びそれらの使用方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書で開示された方法により作製された、その変種及び誘導体を含む、式1から式12の化合物を提供する。
【００５６】
[実施例]
本発明は、下記の制限のない実施例を参照してより詳細に記載する。
【００５７】
[実施例1]
8-O-デブタノイルタプシガルジン(DBTg)の調製
【００５８】
【化２８】
2016518339.tif 000030
22Lの丸底フラスコ(RBF)に、タプシガルジン709g(水と溶剤に対して補正された重量は693g)を入れ、続いてエタノール4.6Lを入れた。機械撹拌器を始動し；材料を均一になるまで撹拌し、その後、75/25のメタノール/水/ドライアイスバスで-15 ± 5 ℃まで冷却した。温度を-15 ±5℃に保ちながら、20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液(445ml)をゆっくり加えた。20分での工程内反応検査は完全な反応(1%  Tg)を示し、氷酢酸(85ml)を素早く加え、反応物を急冷した。急冷後、反応物を温め、ロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノールの大部分を除去した。得られた濃厚なオイルをメチルt-ブチルエーテル(MTBE)に溶解し、脱イオン水、飽和重炭酸ナトリウム、脱イオン水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。MTBE(2x)で共蒸留したのち、得られた非晶質乾燥泡/固体を真空オーブンに入れ、15時間56分間加熱せずに乾燥した。DBTgの重量は、HPLC面積による純度97%で613g(回収率95%)であり、エタノールは検出されなかった。この物質はすべての仕様に合格し、次のプロセスに引き渡された。
【００５９】
[実施例2]
12-ADT-TFAの調製
【００６０】
【化２９】
2016518339.tif 000031
12リットルの丸底フラスコに、8-O-デブタノイルタプシガルジン(DBTg) 607グラム、4-ジメチルアミノピリジン(4-DMAP) 139グラム、12-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ドデカン酸(12-Boc-AD) 342グラム及びジクロロメタン2050mlを入れた。均一な溶液が得られるまで、フラスコの内容物を撹拌し、続いて、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、192ml)を加えた。3時間での反応検査に合格したのち、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターで濃縮して除去し、続いて、MTBEで除去した。試薬副産物のジイソプロピル尿素(DIU)をMTBE及びヘプタンから沈澱により除去し、続いて、ろ過した。有機母液を分液漏斗に移し、その物質を0.5M  HCl(2x)、0.6M  重炭酸ナトリウム(2x)及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留試薬DICを除去するために、その物質をアセトニトリル(ACN)に溶解し、n-ヘプタンで洗浄した。ACN層をロータリーエバポレーターに移し、濃縮し、その後、MTBEで共蒸留してACNを除去した。得られた12-Boc-ADTをジクロロメタンに溶解し、22L丸底フラスコに移し、10℃未満の温度まで冷却した。15℃未満温度を保ちながら、トリフルオロ酢酸を添加漏斗により加えた。30分での工程内反応検査は出発材料が残っていないことを示した。反応溶液をロータリーエバポレーターに移し、濃縮し、ジクロロメタン(2x)で共蒸留した。その物質はさらにシリカゲルによるプラグろ過によって精製された。その物質をジクロロメタンと共にシリカベッド上に載せ、ジクロロメタン(4カラム容積  CVs)、10%アセトン/90%ジクロロメタン(8  CVs)及びアセトン(20  CVs)で溶出し、面積による純度98%、ジクロロメタン0.12%及びアセトン1.6%で、12-ADT-TFA 658グラム(2つのステップの収率71%)を得た。
【００６１】
[実施例3]
PG-202の調製
【００６２】
【化３０】
2016518339.tif 000032
ペプチドをMTBEに溶解し、0.5M  HCl、脱イオン水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄して、残留酢酸アンモニウムをペプチド(774g)から除去した。得られた有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。これに続いて、MTBEへの溶解とヘプタンとの共沸蒸留を行った。精製ペプチドを12L  RBFに入れ、続いて、DMF(1.3L)、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(242g)、12-ADT-TFA(644g)及び追加のDMF  1.8Lを入れた。次に、DIPEA(153ml)を加え、続いてEDC-HClを加えた。6時間5分での最初の反応検査により、かなりの出発材料が残存していることが判明した(12-ADT-TFA  22.6%)。12時間24分での第2の反応検査により、反応が失速していたことが判明した(12-ADT-TFA  22%)。従って、13時間6分後に、追加のEDC-HClを加えた(48g、0.35等量)。反応物を一晩中撹拌し、24時間40分での工程内検査は、反応が進行していたことを示したが、12-ADT-TFA  18%がまだ残存していた。25時間16分で、追加のDIPEAを加えた(153ml、1.22等量)。次の反応検査(26時間17分)は10%残存12-ADT-TFAを示した。このことは追加の塩基が反応を推進させることを示した。28時間15分での別のDIPEA投入(158ml、1.26等量)は反応を95%完了(30時間20分)まで推し進めた。反応混合物をMTBE中に希釈し、0.5M  HCl(2x)、脱イオン水(2x)、飽和重炭酸ナトリウム及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。PG-202はジクロロメタンに溶解し、シリカ10kg上に置き、55%n-ヘプタン：45%アセトンの6カラム容量で溶出した。溶出物をロータリーエバポレーターで濃縮し、MTBEと共沸させ、すべての仕様に合格したオフホワイト粉末として、PG-202  1048.7g(収率72%)を得た。その純度は89%であり、その物質はMTBE 2.9%、n-ヘプタン 0.76%及びDMF 0.049%を含んでいた。
【００６３】
[実施例4]
粗製G-202の調製
【００６４】
【化３１】
2016518339.tif 000033
22L丸底フラスコに、PG-202(500グラム)、ジクロロメタン  2.8リットル、及びトリエチルシラン  360mlを入れた。この材料は均一になるまで撹拌し、10℃以下に冷却した。温度を10℃以下に保ちながら、トリフルオロ酢酸(2.8L)を加えた(31分)。反応物を10℃以下で34分間撹拌し、冷却槽を取り外し、反応物を室温まで温めた。16時間52分での反応検査で、反応が完了していることが判明した。反応混合物をロータリーエバポレーターに移し、オイルになるまで濃縮した。これに続いてDCM(4 x 5.5L)で共蒸留し、固体を得て、この固体を40℃以下の真空オーブン中で12時間6分間乾燥し、オフホワイトの粉末として粗製G-202(収率68.5%)  513グラムを得た。HPLC面積%による純度は79%であり、50.5重量%であった。この物質はすべての仕様に合格し、次のプロセスに引き渡された。
【００６５】
この粗製G-202をC18逆相クロマトグラフィー、続いて、凍結乾燥前の水分量を減少させた濃縮カラムで精製し、TFA塩を遊離塩基に変換した。このG-202を数回の操作で精製したが、その1つの実施例を下記に説明する。
【００６６】
[実施例5]
逆相クロマトグラフィー精製Biotage 150L KP-C18-HS Column-操作1
最初の操作の充填物は粗製G-202(HCN  5541-08411-A)であり、これは0.1%  TFAを有する50%  ACN/WFI  2.64Lに溶解し、WFIで35%まで希釈し、一昼夜環境温度で保存した。充填溶液は焼結ガラスフィルター(4-5.5μm)でろ過し、カラム上に充填した。カラムを0.1%  TFAを有する35%、次に40%、続いて45%アセトニトリル/WFIで溶出した。溶出物を235nmのUVでモニターした。予想通り、G-202が0.1%  TFAを有する45%アセトニトリル/WFI中で溶出した。G-202がカラムから溶出したとき、1ガロンの画分を捕集し、短時間HPLC法(P/N  5300.000)で分析した。HPLCクロマトグラフィー純度に基づき、HPLC(P/N  5289)で分析した、面積%が95%を超える分画を合わせて、2つのミニプール(45%  F3-F18及び45%  F4-F17)を作製した。両ミニプールとも98%を超えるクロマトグラフィー純度を示した。従って、45%  F3-F18を組み合わせて、標準品としてG-202  TFA塩(2695-64-15)を使用するHPLCで測定すると、G-202  95.7gを含むG-202生成物プール(54L)を得た。
【００６７】
[実施例6]
濃縮-精製カラム操作1
操作1によるG-202生成物プール(54L)を一定容量の水で希釈して25% can/WFI溶液を作製し、25%  ACN/WFI(20L)で平衡化されたBiotage 150M KP-C4-WPカラム上に再充填した。このカラムを、25%  ACN/WFIで洗浄してTFAを除去し、40%  ACN/WFIで洗浄してRRT0.65の不純物を除去した。40%  ACN/WFI溶出の最後に、G-202が溶出し始めた。C4-WPカラムを90%  ACN/WFIで溶出し続けた。G-202を約4Lの40%  ACN/WFI及び15Lの90%  ACN/WFI中で濃縮した。
【００６８】
[実施例7]
t-ブチルカルメート(butylcarmate)保護リンカー(BOC-12-AD)(式4)の合成
BOC-12-ADは下記のスキームにより合成された。
【００６９】
【化３２】
2016518339.tif 000034
【００７０】
22Lの3N  RBFをN2で充満させ、N2送入下に置いた。このフラスコに、MeOH  14Lを入れ、続いて、約45分かけて添加漏斗により塩化アセチル825mL(2.5等量)を加えた。添加中、約10℃の発熱がある。得られた溶液を25℃未満まで冷却し、1.0Kg(1.0等量)の(1、上記スキームに示す)を室温で一度に加えた。反応混合物を室温で約1.5時間撹拌し、LC/MSに基づいて完了したものと考えた。反応混合物を総容積約4.5Lまで濃縮し、大部分のMeOH除いて、濃厚白色スラリーを形成した。このスラリーに、MTBE  5.5Lを室温で加え、得られた懸濁液を約1時間で10℃未満まで冷却した。生成物をろ過により単離し、冷たい約3LのMTBEで3回洗浄した。この生成物（2、上記スキームに示す）をフィルター上で短時間乾燥し、乾燥トレイに移し、さらに約45℃の真空オーブン中で一昼夜乾燥して、97%回収率で白色結晶性固体として(2)  1197gを得た。
【００７１】
【化３３】
2016518339.tif 000035
【００７２】
22Lの3N  RBFをN2で充満させ、N2送入下に置いた。このフラスコに、(2）525g(1.0等量)、CH2Cl2  6.0L、DMAP  24.1g(0.1等量)及びBoc2O  451g(1,05等量)を入れた。上記材料を追加のCH2Cl2  2.0Lで洗浄した。次に、トリエチルアミン577mL(2.1等量)を添加漏斗により20〜25分かけて滴下した。添加中、わずかな発熱と中程度のガスの発生があった。明琥珀色の溶液が添加中に形成された。反応混合物を室温で約1時間撹拌し、TLCで完了したと判断された。反応混合物をCH2Cl2  3.0Lで希釈し、1M  HCl  3.0Lを加えた後に約10分間撹拌した。層を分離し、有機層を飽和NaHCO3  1  x  3.0Lで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、総容量約1.0から1.4 Lまで濃縮し、非常に淡い懸濁液が形成された。乾燥塩を合計1.0LのMTBEで3回洗浄した。このMTBEを総容量約1.0Lまでのロータリーエバポレーターで濃縮して除去し、残留CH2Cl2を除去した。形成された淡い懸濁液をさらにMTBE  1.5Lで希釈し、一昼夜撹拌した。不溶性尿素不純物をろ過により除去し、固体を少量のMTBEで3回洗浄した。生成物を含むろ液を第2の操作(同一スケール)からのろ液と合わせ、合わせたろ液を容量約1〜1.4Lまで濃縮し、濃厚な薄緑色の透明オイルを得た。このオイルを撹拌しながら室温まで冷却した。冷却プロセス中、生成物は結晶化し始めた。撹拌中の懸濁液に、ヘプタン3.0Lを室温で加え、さらに懸濁液を10℃未満まで冷却した。ろ過による単離の前に、懸濁液を10℃未満で約1.5時間保持した。生成物(3)を合計2.0Lの冷ヘプタンで3回洗浄し、漏斗上で短時間乾燥し、乾燥トレイに移した。この生成物を室温で完全な真空下で一昼夜乾燥し、96%回収率で白色結晶性固体として(3)  1247gを得た。
【００７３】
【化３４】
2016518339.tif 000036
【００７４】
22Lの3N  RBFをN2で充満させ、N2送入下に置いた。このフラスコに、MeOH  5.3Ｌを入れ、攪拌を開始した。次に、(3)  550g(1.0等量)を加え、追加のMeOH 2.0Lで洗浄した。撹拌溶液に、1M  NaOH(2.5等量)  4.17Lを添加漏斗により約30〜40分かけて加えた。得られたスラリーを約50℃まで加熱し、30分後にTLCにより完了した。加熱中、溶液が形成された。この溶液を30℃未満温度まで冷却し、30分かけて6M  HCl  1.0Lでクエンチし(pH〜3)、白色スラリーを形成させた。このスラリーを室温で約1時間撹拌し、生成物(4)をろ過により単離した。この生成物を1.0から1.5Lの脱イオン水で洗浄してフラスコから取り出し、生成物を2つの部分で水1.0Lで洗浄し、フィルター上で短時間乾燥し、空の乾燥トレイに移した。生成物をさらに完全な真空下で約40℃で週末にわたって乾燥し、97%回収率で白色固体として(4)  508.5gを得た。第2バッチ(同一スケール)をバッチ1と同様に処理し、収率98%で(4)  513.7gを製造した。
【００７５】
本明細書中に記載又は引用した、論文、特許及び特許出願書、並びに他のすべての文書及び電子的に入手可能な情報の内容は、参照により組み込むために個々の各出版物が具体的且つ個別に示される場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願者は、このような論文、特許、特許出願書、又は他の文書からのあらゆる資料及び情報を本出願書に物理的に組み込む権利を留保する。
【００７６】
本明細書中に例示的に記載する本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない、どんな1つ又は複数の要素、1つ又は複数の制限がないときに、適切に実施することができる。従って、例えば、「備える」、「含む」、「含有する」などの用語は、制限なしに広く解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用する用語及び表現は、制限ではなく、説明の用語として使用されている。このような用語及び表現を使用する際、図示及び記載の特徴又はその部分のどんな等価物も除外する意図はないが、特許請求する本発明の範囲内で様々な変形が可能であることが認められる。例えば、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、それにおいて実施され本明細書中に開示される本発明の変更及び変形は、当業者が利用することができ、このような変更及び変形が、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内にあると見なされることを理解すべきである。
【００７７】
本発明は、本明細書で広く一般的に記載されている。一般的開示の範囲に入るより狭い種及び包括的な分類もそれぞれ、本発明の一部を形成する。これは、削除した材料が本明細書中で具体的に引用されているかどうかを問わず、どんな主題も属から排除されるという条件又は消極的な限定を伴って、本発明の一般的な記述を含む。
【００７８】
本明細書で開示され、特許請求の範囲に記載されたすべての組成物及び方法は、本発明の開示に照らして、過度の実験を実施することなく作製及び実施できる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態について説明しているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、変更が本明細書に記載されている組成物及び方法に並びに方法の一連のステップにおいて適用できることが当業者には明らかである。より詳細には、化学的に及び生理学的にも関連するある薬剤が、本明細書に記載された薬剤と置き換えられ、そのうえ、同じ又は同様の結果を達成できるということが明らかである。当業者にとって明らかなこのようなすべての代替物及び変更は、添付請求範囲で定義されているように、概念、精神及び範囲内であると見なされるべきである。
【００７９】
他の実施形態は下記の特許請求の範囲の中で説明される。
【図１−１】
2016518339.tif 000050
【図１−２】
2016518339.tif 000051
【図１−３】
2016518339.tif 000052
【図１−４】
2016518339.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月28日(2015.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016518339000001.app
【国際調査報告】
2016518339.tif 000054
2016518339.tif 000055