(57)【要約】  本発明は、新規なＧＯＡＴ阻害剤およびそれらの塩およびそれらの医薬組成物を提供する。2016537371.tif 000028【選択図】なし
2016537371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2016537371.tif 000025
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式：
【化２】
2016537371.tif 000026
の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式：
【化３】
2016537371.tif 000027
の請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項５】
１つまたは複数のその他の治療薬を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、体重増加を低減する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、体重再増加を低減する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、肥満を治療する方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、２型糖尿病を治療する方法。
【請求項１０】
治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
体重増加を低減することにおける使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
体重再増加を低減することにおける使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
肥満を治療することにおける使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
２型糖尿病を治療することにおける使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
体重増加を低減することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１６】
体重再増加を低減することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１７】
２型糖尿病を治療することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１８】
肥満を治療することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グレリンＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＯＡＴ）を阻害するために有用な化合物、ＧＯＡＴ活性に関連する疾患を治療するための医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＯＡＴは、膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）ファミリーの酵素に属する。ＧＯＡＴは、デスアシル−グレリン（非アシル化グレリンまたはＵＡＧとしても知られる）を、脂肪酸をデスアシルグレリンペプチドのＳｅｒ３残基へと移すことにより、生物学的に活性な形態である、アシル−グレリン（ＡＧ）へと変換する。アシル−グレリンはヒトおよび齧歯類において食物摂取量を増加させ、体脂肪蓄積を増加させることが示されている。ヒトにおけるＡＧの注入はまた、グルコース誘導性インスリン分泌を抑制することが示されている。グレリン遺伝子の除去は、高脂肪食を与えられたｏｂ／ｏｂマウスにおいて、インスリン放出を増強して、グルコース不耐性を予防するか、または寛解させることが示されている。
【０００３】
肥満および糖尿病の蔓延は、肥満および糖尿病のための現在の治療の有効性およびかかる現在の治療に対する応答が変わりやすいことと相まって、患者が利用できるより多くの治療選択肢を必要とする。ＧＯＡＴ阻害剤は、肥満の治療において有用な薬剤と考えられている。さらに、ＧＯＡＴ阻害剤はまた、食事および／または運動、体重増加の低減または肥満の治療のために計画されたその他の治療用医薬または手技に対する補助剤として、体重増加または体重再増加を低減することにおいて有用である可能性があると考えられている。同様に、ＧＯＡＴ阻害剤は、単独で、またはその他の２型糖尿病のための治療と組み合わせて、２型糖尿病を治療することにおいて有用である可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＧＯＡＴ阻害剤である化合物を提供する。特に、本発明は、式：
【化１】
2016537371.tif 000003
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００５】
本発明はさらに、式：
【化２】
2016537371.tif 000004
のＧＯＡＴ阻害剤である化合物を提供する。
【０００６】
本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、本発明の化合物および１つまたは複数のその他の治療薬を含む、医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、体重増加もしくは体重再増加を低減する、または２型糖尿病もしくは肥満を治療する、方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、治療における使用のための、特に、体重増加もしくは体重再増加を低減するための、または２型糖尿病もしくは肥満を治療するための、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらに、本発明は、体重増加もしくは体重再増加を低減するための、または２型糖尿病もしくは肥満を治療するための、医薬の製造における、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の化合物は、一般に広範な用量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの用量は、約０．０３ｍｇ／Ｋｇ体重〜約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重の範囲内である。ある場合には、上記範囲の下限を下回る用量レベルが十二分に適切であることがあるが、他の場合には、好ましいベネフィット／リスクプロファイルを維持しつつさらにより大きい用量が用いられることもあり、それゆえ上記用量範囲は、本発明の範囲をいかなるようにも限定する意図ではない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の１つまたは複数の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況を考慮して、医師によって決定されることが理解されよう。
【００１０】
本明細書において用いられる場合、「治療すること」（または「治療する」または「治療」）という用語は、現存する症状、状態または障害の、進行または重症度を、抑制すること、遅くすること、止めること、または逆にすることをいう。
【００１１】
本明細書において用いられる場合、「体重増加を低減すること」という用語は、患者の体重の増加を小さくすることをいう。「体重再増加を低減すること」という用語は、体重減少の後に体重のリバウンドを経験している患者の体重の増加を小さくすることをいう。体重再増加は、食事、運動、行動修正、または認可された治療法を介して達成された体重減少の休止の後のリバウンド効果に起因する可能性がある。疑義を回避するためであるが、本明細書において用いられる場合、体重増加または体重再増加は、食物摂取量または食生活によって誘導される体重増加または体重再増加をいい、水分貯留、筋腫瘤、または炎症に起因する、体液、体重の蓄積などの食物に関連のない体重増加のことをいうものではない。
【００１２】
本発明の化合物は、反応して薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，２ｎｄ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２０１１）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７を参照されたい。
【００１３】
当業者であれば、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、少なくとも１つのキラル中心を含有する母核（ｃｏｒｅ）から構成されることを認識するであろう：
【化３】
2016537371.tif 000005
【００１４】
本発明はすべての個々のエナンチオマー、およびラセミ化合物を含む該化合物のエナンチオマーの混合物を考慮するが、本発明の好ましい化合物は、式：
【化４】
2016537371.tif 000006
によって表されるか、またはその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される医薬組成物として処方される。かかる医薬組成物およびそれを調製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２００５）を参照されたい。より特に好ましくは、式：
【化５】
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によって表される本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物である。
【００１６】
単一エナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラルな試薬から出発して、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術によって、調製することができる。あるいは、単一エナンチオマーまたはジアステレオマーは、本発明の化合物の合成におけるいずれかの都合のよい点において、標準的キラルクロマトグラフィーまたは結晶化技術によって、混合物から単離することができる。本発明の化合物の単一エナンチオマーおよびジアステレオマーは、本発明の好ましい実施形態である。
【００１７】
糖尿病および／または肥満の治療薬は、糖尿病および／または肥満のその他の治療薬と組み合わせることができることが当該技術分野において周知である。本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、同時にまたは順次に、糖尿病または肥満のその他の有効処置と共投与することができる。本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、単独でまたはその他の有効処置と組み合わせて、同時にまたは順次に、肥満外科手術、例えば、胃バイパス手術または調節性胃バンディング術などの認可された医療手技に続いて、投与することができる。
【００１８】
本発明はまた、本発明の化合物の合成に有用な中間体および方法も包含する。
【００１９】
さらに、以下のスキームに記載される中間体は、いくつかの窒素保護基を含有する場合がある。可変性の保護基は、特定の反応条件および行われる特定の変換に応じて、生じる毎に同一であっても異なっていてもよい。保護および脱保護条件は、当業者に周知である。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｗｕｔｓ，ｅｄｓ．，２ｄ  ｅｄ．１９９１）を参照されたい。
【実施例】
【００２０】
調製例および実施例
以下の調製例および実施例は本発明をさらに説明し、本発明の化合物の典型的な合成を表す。試薬および出発物質は、容易に入手可能であるか、または当業者により容易に合成することができるものである。調製例および実施例は、例示のために示されるものであって、限定のためのものではなく、様々な改変が当業者によってなされ得ることを理解すべきである。
【００２１】
本発明の化合物のＲまたはＳ立体配置は、Ｘ線解析およびキラル−ＨＰＬＣ保持時間との相関などの標準的技術によって決定することができる。以下の調製例および実施例の命名は一般に、ＭＤＬ  Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）Ｄｒａｗ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．ＮＥＴにおけるＩＵＰＡＣ命名特徴を用いて行われる。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、以下の用語は、以下に示される意味を有する：「ＡＣＮ」は、アセトニトリルをいう；「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンをいう；「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンをいう；「ＤＩＰＥＡ」は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンをいう；「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドをいう；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドをいう；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸をいう；「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルをいう；「ＥｔＯＨ」は、エタノールをいう；「ＦＢＳ」は、ウシ胎仔血清をいう；「ＨＲＰ」は、西洋ワサビペルオキシダーゼをいう；「ＩＣ５０」は、最大応答の５０％を引き起こす薬剤の濃度をいう；「ＩＰＡ」は、イソプロピルアルコールをいう；「ＭｅＯＨ」は、メタノールをいう；「ＭＴＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルをいう；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水をいう；「ＲＴ」は、室温をいう；「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンをいう；「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸をいう；「ＴＲ」は、保持時間をいう；「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランをいう；「ＴＭＢ」は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンをいう。
【００２３】
ＬＣ−ＭＳ条件（低ｐＨ）：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸ  Ｃ１８  ２．１×５０ｍｍ  ３．０ｍ；グラジエント：５〜１００％  Ｂ、３分、次いで１００％  Ｂ、０．７５分；カラム温度：５０℃＋／−１０℃；流速：１ｍＬ／分；溶媒Ａ：０．１％ギ酸を含む脱イオン水；溶媒Ｂ：０．１％ギ酸を含むＡＣＮ。
【００２４】
調製例１
６−クロロ−２−メチルピリミジン−４−アミン
【化６】
2016537371.tif 000008
５Ｌの鋼製圧力容器（オートクレーブ）に４，６−ジクロロ−２−メチルピリミジン（４００ｇ、２．４５ｍｏｌ）および水酸化アンモニウム（２．８Ｌ）をＲＴで充填する。反応を９０℃に５時間加熱する。反応混合物をＲＴに冷却し、次いで、ブフナー漏斗で固体をろ過する。ろ過ケークを水（２００ｍＬ）およびヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空下で乾燥させて、標題化合物を白色固体（２９０ｇ、８２％）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １４４．０（Ｍ＋１）。
【００２５】
調製例２
６−クロロ−５−ヨード−２−メチルピリミジン−４−アミン
【化７】
2016537371.tif 000009
６−クロロ−２−メチルピリミジン−４−アミン（７０８ｇ、４．９３ｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（７．０８Ｌ）を、機械的撹拌機を備えた２０Ｌの丸底フラスコ中で合わせる。０〜５℃に冷却する。ＭｅＯＨ（６Ｌ）に溶解した一塩化ヨウ素（４．８０６ｋｇ、２９．６ｍｏｌ）を、添加漏斗を用いて１時間かけて添加する。反応混合物をＲＴに温め、ＲＴで１６時間撹拌する。反応混合物を０〜５℃に冷却し、亜硫酸ナトリウム（４６Ｌ、２０％水溶液）を添加する。結果として生じる固体をろ過し、水（２Ｌ）、次いで、ヘキサン（３Ｌ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、標題化合物を白色固体（１０６１ｇ、８０％）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２６９．９（Ｍ＋１）。
【００２６】
調製例３
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチニル］ピペリジン−１−カルボキシラート
【化８】
2016537371.tif 000010
６−クロロ−５−ヨード−２−メチル−ピリミジン−４−アミン（２０ｇ、７４．２２ｍｍｏｌ）、４−エチニル−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１８．６４ｇ、８９．０６ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルアミン（１０．４４ｍＬ、７４．２２ｍｍｏｌ）を、三ツ口フラスコ中のＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解する。交互に３回、排気し、フラスコに窒素を充填する。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（２．６３ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（Ｉ）（０．７１３ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）を溶液に添加する。混合物を５０℃〜５５℃に１６時間加熱する。混合物をＲＴに冷却し、さらなるビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（１．３１ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．３５６ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）および４−エチニル−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．５５ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を６０℃に３．５時間加熱する。混合物をＲＴに冷却し、減圧下で濃縮する。物質をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、および塩化ナトリウム飽和水溶液（１００ｍＬ）で洗浄する。溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮する。ヘキサン中の２０％〜１００％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー（８００ｇシリカゲルカラム）を用いて残渣を精製する。精製画分を濃縮して標題化合物をペールオレンジ粉末（２２．６ｇ、８６％）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３５１．２／３５３．１（Ｍ＋１）。
【００２７】
調製例４
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］ピペリジン−１−カルボキシラート
【化９】
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ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチニル］ピペリジン−１−カルボキシラート（４．３０ｇ、１２．２６ｍｍｏｌ）および酸化白金（ＩＶ）（０．１３９ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（８１ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）中で合わせる。交互に、排気し、水素バルーンを用いてフラスコに水素を充填し、ＲＴで８時間撹拌する。分子中のクロリドの除去に起因する潜在的な副生成物を避けるように反応を注意深くモニターする。生成物は開始アルキンよりも溶媒混合物中でより可溶性であることに注意する。混合物を珪藻土でろ過し、ＭｅＯＨですすぐ。溶液を減圧下で濃縮する。フラスコに、シリカ、１−プロパンチオール（４ｇ、ローディング＝１．２８ｍｍｏｌ／ｇ、ＳＩＬＩＣＹＣＬＥ（登録商標）からのＳＩＬＩＡＢＯＮＤ（登録商標）Ｔｈｉｏｌ）（前のカップリング反応からの剰余のパラジウムを除去するため）およびＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を添加する。物質をＲＴで３日間撹拌する。固体をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮する。結果として生じる残渣に対して水素付加を以下のようにして繰り返す。残渣を含有するフラスコに酸化白金（ＩＶ）（０．１３９ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（８１ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）を充填する。交互に、排気し、水素バルーンを用いてフラスコに水素を充填し、ＲＴで８時間撹拌する。珪藻土でろ過し、ＭｅＯＨですすぎ、ろ液を減圧下で濃縮する。結果として生じる残渣に対して水素付加を以下のようにして繰り返す。残渣を含有するフラスコに酸化白金（ＩＶ）（０．１３９ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（８１ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）を充填する。交互に、排気し、水素バルーンを用いてフラスコに水素を充填し、ＲＴで８時間撹拌する。珪藻土でろ過し、ＭｅＯＨですすぐ。ろ液を減圧下でシリカゲル（２０ｇ）上に濃縮する。ヘキサン中の７０％〜１００％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇカラム）を用いて物質を精製する。精製画分を合わせ、減圧下で濃縮する。残渣をＤＣＭおよびヘキサンで希釈し、減圧下で３回濃縮する。物質を真空下に置き、標題化合物を白色固体（３．２０ｇ、７３％）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３５５．２／３５７．２（Ｍ＋１）。
【００２８】
調製例５
６−クロロ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−アミン、塩酸塩
【化１０】
2016537371.tif 000012
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］ピペリジン−１−カルボキシラート（２９．００ｇ、８１．７２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１４５ｍＬ）に溶解し、１，４−ジオキサン中の４Ｍ塩化水素（２０４．２ｍＬ、８１７．１ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を１８時間ＲＴで撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）中でスラリーにし、ろ過し、結果として生じる固体を真空下で乾燥させ、標題化合物を粗白色固体（２９ｇ）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２５５．２／２５７．２（Ｍ＋１）。
【００２９】
６−クロロ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−アミンのための代替経路（調製例６〜１０）
【００３０】
調製例６
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−メチルスルホニルオキシエチル）ピペリジン−１−カルボキシラート
【化１１】
2016537371.tif 000013
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（４．７２０ｋｇ、２０．６ｍｏｌ）とＤＣＭ（４０Ｌ）およびＴＥＡ（３０２０ｍＬ、２１．６３ｍｏｌ）とを５０Ｌ反応器中で窒素雰囲気下で合わせる。溶液を約０℃に冷却し、反応温度を１０℃より低く維持しつつ、ＤＣＭ（５Ｌ）中のメタンスルホニルクロリド（２．４７８ｋｇ、２１．６３ｍｏｌ）をゆっくりと添加する。添加が完了した後、混合物を１８時間１５℃で撹拌し、その時点でＴＬＣ（１：１、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）は出発物質が残存していないことを示す。混合物を水（３０Ｌ）で洗浄し、相を分離させる。有機相を濃縮して固体にする。固体をＭＴＢＥ（６Ｌ）中でスラリーにし、ろ過により収集し、真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、標題化合物を白色固体（５．６７ｋｇ、９１％）として供給する。
【００３１】
調製例７
ｔｅｒｔ−ブチル４−（３−シアノ−４−エトキシ−４−オキソ−ブチル）ピペリジン−１−カルボキシラート
【化１２】
2016537371.tif 000014
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−メチルスルホニルオキシエチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（５．２６ｋｇ、１７．１ｍｏｌ）、シアノ酢酸エチル（７ｋｇ、６２ｍｏｌ）、ＥｔＯＨ中の２１％ナトリウムエトキシド（８．２５Ｌ、２４．７５ｍｏｌ）およびＥｔＯＨ（３５Ｌ）を５０Ｌ反応器中で窒素雰囲気下で合わせる。混合物を３５〜４０℃で１８時間加熱し、その時点でＮＭＲ分析は２０％のメシレートの残存を示す。混合物の３５〜４０℃での加熱を２４時間継続し、その時点でＮＭＲ分析は少量のみのメシレートを示す。ゆっくりと反応をＲＴに冷却し、氷酢酸（１４２２ｍＬ、２２．６８ｍｏｌ）を３０分間かけて添加する。混合物を減圧蒸留を用いて濃縮し、次いで、水（２５Ｌ）とＥｔＯＡｃ（３５Ｌ）とに分配する。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）で抽出する。有機部分を合わせ、塩水（１５Ｌ）で洗浄し、濃縮して赤色油とする。油を、ヘキサン（４０Ｌ）、次いで、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー（７５ｋｇシリカゲル、６５〜２５０メッシュ）を用いて精製し、３０％のシアノ酢酸エチル／７０％の所望の生成物である画分（７．８ｋｇ）を供給する。物質を、１００℃で２１０ｍｔｏｒｒ真空度のワイプフィルム蒸留により濃縮し、不揮発性画分を収集し、標題化合物（４．５４ｋｇ、８２％）を供給する。
【００３２】
調製例８
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］ピペリジン−１−カルボキシラート
【化１３】
2016537371.tif 000015
ｔｅｒｔ−ブチル４−（３−シアノ−４−エトキシ−４−オキソ−ブチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（２．１８ｋｇ、６．７３ｍｏｌ）、アセトアミジン塩酸塩（１．２７ｋｇ、１３．４６ｍｏｌ、９５％アッセイ）［注意：トルエン（１０Ｌ）中で２回スラリーにし、次いで、真空下で取り除いて（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）乾固させることによって、アセトアミジン塩酸塩を予備乾燥させる］、ＥｔＯＨ中の２１％ナトリウムエトキシド（６．７３Ｌ、２０．１９ｍｏｌ）およびＥｔＯＨ（１０Ｌ）を２２Ｌ反応器中で窒素雰囲気下で合わせる。４２時間還流させながら反応を加熱する。反応を約ｐＨ＝５に氷酢酸（１．２Ｌ、２０．８６ｍｏｌ）によって調整する。ＥｔＯＨをロータリーエバポレーターでの減圧蒸留によって除去する。結果として生じる固体を水（６Ｌ）中のスラリーにし、次いで、固体をろ過により収集し、さらなる水（２Ｌ）によって洗浄する。固体を真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、標題化合物（１．７２ｋｇ、７６％）を供給する。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ４．８３（ｓ、３Ｈ）；４．０５（ｄ、２Ｈ）、２．７５（ｂｓ、２Ｈ）、２．３９（ｍ、２Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７８（ｄ、２Ｈ）、１．４３（ｍ、１Ｈ）  １．４２（ｓ、９Ｈ）、１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．３８（ｍ、２Ｈ）。本質的に記載されているように、方法をｔｅｒｔ−ブチル４−（３−シアノ−４−エトキシ−４−オキソ−ブチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（２．３６ｋｇ）を用いて繰り返し、標題化合物（２．０１ｋｇ、８２％）を得る。
【００３３】
調製例９
６−アミノ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−オール、二塩酸塩
【化１４】
2016537371.tif 000016
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−（４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］ピペリジン−１−カルボキシラート（３．７３ｋｇ、１１．０９ｍｏｌ）およびＩＰＡを５０Ｌ反応器中で窒素雰囲気下で合わせる。１２Ｎ塩酸（３．０５Ｌ、３６．６ｍｏｌ）を撹拌しながら３時間かけて添加する。混合物を５０℃で１６時間加熱すると、濃厚なスラリーが形成する。その時にＮＭＲ分析はＢＯＣ基が残存しないことを示す。反応混合物を２０〜２５℃に冷却し、ＴＨＦ（１２Ｌ）で希釈する。固体をろ過により収集する。ろ過は時間がかかり、完了するのに２４時間以上かかる場合がある。ＩＰＡ（２×１０Ｌ）で洗浄する。物質を真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、標題化合物（３．１１７ｋｇ、９１％）を供給する。
【００３４】
調製例１０
６−クロロ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−アミン、二塩酸塩
【化１５】
2016537371.tif 000017
６−アミノ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−オール、二塩酸塩（３．１６７ｋｇ、１０．２ｍｏｌ）およびオキシ塩化リン（３０Ｌ、３００ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で腐食性（１０％ＮａＯＨ）スクラバーにより通気されている５０Ｌ反応器中で合わせる。撹拌したスラリーに、８５％リン酸（１Ｌ、８．５ｍｏｌ）を添加する。混合物をゆっくりと７５℃の反応器ジャケット温度を用いて加熱する。約５５℃にて、オフガスが起こる時に、スクラバーを氷水浴中で冷却する。オフガスが遅い場合、混合物を９０〜９５℃で５０時間加熱し、その時点でＴＬＣおよびＮＭＲ分析は、反応が完了していることを示す。過剰のオキシ塩化リンのバルクを減圧蒸留（２２Ｈｇ真空度および６０℃内部温度）により除去して、留出物中に２０Ｌを回収する。混合物を２０〜２５℃に冷却し、次いで、トルエン（１０Ｌ）で希釈する。混合物を１５℃を下回るようさらに冷却し、温度を３０℃を下回るように維持しつつ水（１Ｌ）でゆっくりとクエンチする。トルエンの添加の後、混合物は非常に濃厚になり、撹拌するのが困難となり、生成物相は粘稠性半固体として反応器の底面に残存する。あらゆる混合を達成するために撹拌翼を上げる。ＥｔＯＨ（１０Ｌ）を混合物に添加し、約１８時間２５℃で撹拌する。この時点で、粘稠性半固体はまだ完全には温浸していないが、軟化しているため、手作業で探索することができる。さらに４〜５時間激しく撹拌して完全に温浸する。結果として生じるスラリーを５〜１０℃に冷却し、固体をろ過により収集し、ＭＴＢＥ（８Ｌ）で洗浄して、湿った生成物（約６ｋｇ）を得る。
【００３５】
粗生成物を、ウエットケーキをＭｅＯＨ（３５Ｌ）に４０℃で溶解することにより再結晶する（Ｒｅｃｒｙｓｔｉｌｌｉｚｅ）。溶液を減圧蒸留により濃縮し、１５Ｌの溶媒を除去する。ＩＰＡ（３５Ｌ）を添加し、スラリーを減圧蒸留により濃縮し、１３Ｌの溶媒を除去する。スラリーを５〜１０℃に冷却し、次いで、固体をろ過し、ＩＰＡ（２Ｌ）、次いで、ＭＴＢＥ（８Ｌ）で洗浄する。固体を真空オーブン中で５５℃で乾燥させ、標題化合物をオフホワイト固体（２．７７ｋｇ、８２％）として供給する。Ｃ１２Ｈ２１Ｃｌ３Ｎ４についての解析計算：Ｃ、４３．９８；Ｈ、６．４６；Ｃｌ、３２．４６；Ｎ、１７．１０。実測：Ｃ、４３．６３；Ｈ、６．５３；Ｃｌ、３２．１６；Ｎ、１６．８６。
【００３６】
調製例１１
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート
【化１６】
2016537371.tif 000018
２つの丸底フラスコのそれぞれに、６−クロロ−２−メチル−５−［２−（４−ピペリジル）エチル］ピリミジン−４−アミンヒドロクロリド（１２．５０ｇ、４２．９２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２２．４６ｍＬ、１２８．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１００ｍＬ）を添加する。２つの混合物を冷水浴中で冷却し、５分間撹拌する。混合物のそれぞれに、［ジメチルアミノ（トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メチレン］−ジメチル−アンモニウムヘキサフルオロホスフェート（１７．９５ｇ、４７．２１ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（８．９３ｇ、４７．２１ｍｍｏｌ）を一度に添加する。混合物をＲＴで９０分間撹拌する。混合物を別々の分液漏斗に水（３００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）とともに注ぎ、振盪し、分配する。水層をＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出し、それぞれの有機層を水（４×２５０ｍＬ）、ＮａＣｌ飽和水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮する。合わせた物質をヘキサン中７０％〜１００％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。精製画分を減圧下で合わせて濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）およびＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）で洗浄する。有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮し、標題化合物を白色固体（２８．００ｇ、７６％）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）４２６．２／４２８．２（Ｍ＋１）。
【００３７】
調製例１２
（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン
【化１７】
2016537371.tif 000019
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（１５．７８ｇ、３７．０５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１８５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（１８５ｍＬ）を滴下するようにして３分間かけて添加し、一晩撹拌する。ＬＣＭＳ（低ｐＨ）により反応が完全な変換を示すことを分析する。ＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を、発熱性混合であるためにゆっくりと添加する。３本のＳＣＸカラム（５０ｇ）を水（２０ｍＬ）、次いで、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で予洗する。反応混合物を３つの等部分に分け、等しくＳＣＸカラムにローディングする。各カラムを水（４０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（４０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液を真空フラスコ中に収集する。所望の物質をＳＣＸカラムからＭｅＯＨ中の２Ｎアンモニア（６０ｍＬ）を用いて清潔な容器へと溶出する。溶液を含有する生成物を合わせ、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ−ヘキサン（１：１）と３回共沸させ、真空下に置き、標題化合物を白色泡状物質（１０．２９ｇ、８４％）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３２６．２／３２８．２（Ｍ＋１）。
【００３８】
調製例１３
（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン塩酸塩
【化１８】
2016537371.tif 000020
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（２８．７５ｇ、６７．４９ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１４３．７ｍＬ）に添加する。次いで１，４−ジオキサン中の４Ｍ塩化水素（１６８．７ｍＬ、６７４．９ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌する。ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を添加し、混合物を激しく撹拌しながら３時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、固体をジエチルエーテル（２００ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌する。物質をろ過し、ジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）ですすぐ。物質を吸引により１５分間乾燥させ、次いで真空下に１時間４５℃で置き、標題化合物を粗白色粉末（２７．７ｇ）として得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３２６．１／３２８．２（Ｍ＋１）。
【００３９】
調製例１４
（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン、二塩酸塩
【化１９】
2016537371.tif 000021
ＩＰＡ（１５４ｍＬ）を５０℃に加熱し、塩化アセチル（１９．３ｍＬ、２７１ｍｍｏｌ）を、発熱性反応であるためにゆっくりと添加する。反応を５０℃で１０分間撹拌し、次いで、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（１Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］−１−メチル−２−オキソ−エチル］カルバメート（２１．０ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）を添加する。反応を２時間撹拌し、ＬＣＭＳ（低ｐＨ）によりモニターする。反応をＲＴに冷却し、ジエチルエーテル（３８６ｍＬ）を添加する。スラリーを１５分間撹拌する。固体をろ過し、物質が吸湿性であるためにジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）で速く洗浄する。物質をろ過し、ろ過により１分間、次いで真空乾燥オーブン中で５０℃で一晩乾燥させ、標題化合物を白色粉末（１８．４ｇ）として供給する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３２６．１／３２８．２（Ｍ＋１）。イオンクロマトグラフィーによる対イオン分析は、二塩酸塩と一致する。
【００４０】
実施例１
Ｎ−［（１Ｓ）−２−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］−１−メチル−２−オキソ−エチル］シクロプロパンカルボキサミド
【化２０】
2016537371.tif 000022
１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（２８１ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（４３０ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（１２ｍＬ）中のシクロプロパンカルボン酸（１６１μＬ、２．０３ｍｍｏｌ）、（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン（６００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）のスラリーに添加する。次いで、ＴＥＡ（７７０μＬ、５．５２ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じる混合物をＲＴで１２時間撹拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、珪藻土でろ過し、ろ液を真空中で濃縮する。結果として生じる残渣を質量ガイドＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１２００ＬＣＭＳおよびＭＳＤ質量分析計、７５×３０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ（登録商標）、１０×２０ｍｍガードを備える５μ粒径カラム、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液中１２〜４６％ＡＣＮ、ｐＨ１０、９分間にわたるグラジエント）により精製し、標題化合物を無色ガラス状物質（５７２ｍｇ、７８％）として得る。ＬＣ−ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３９４．２／３９６．２（Ｍ＋Ｈ）。
【００４１】
１−プロパンホスホニックアンハイドライド（１−ｐｒｏｐａｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を用いる代替手順
ＤＣＭ（５８４ｍＬ）中の（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン、二塩酸塩（１０７．４ｇ、１８３．１５ｍｍｏｌ）の混合物をＤＩＰＥＡ（１２８ｍＬ、７３２．５９ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を氷浴中で０℃に冷却し、シクロプロパンカルボン酸（２１．８ｍＬ、２７４．７２ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、１−プロパンホスホニックアンハイドライドの溶液（ＥｔＯＡｃ中５０％溶液、１７４．８ｇ、２７４．７２ｍｍｏｌ）、次いで、さらなるＤＩＰＥＡ（４０ｍＬ）を添加し、反応混合物を塩基性にする。ＲＴで一晩撹拌する。反応混合物を水（１Ｌ）で洗浄し、層を分離する。有機部分をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮して、粗生成物をオフホワイト泡状物質として得る。シリカゲルでのクロマトグラフィー（８００ｇ、ＥｔＯＡｃ中０〜１０％ＭｅＯＨ）により物質を精製する。適切な画分を、（２Ｓ）−２−アミノ−１−［４−［２−（４−アミノ−６−クロロ−２−メチル−ピリミジン−５−イル）エチル］−１−ピペリジル］プロパン−１−オン、二塩酸塩（７７．９ｇ、１５０．４２ｍｍｏｌ）を用いて同じ手順に本質的にしたがって得られるもう１つのバッチの生成物（５１ｇ）と合わせた。合わせたロットを真空中で濃縮して白色固体（１１４ｇ）を得た。生成物は濃縮中に結晶化し始めた。物質を熱ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で粉砕し、冷却し、ろ過して、標題化合物（１１１ｇ、８４％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３９４．０／３９６．０（Ｍ＋１）。キラル分析（ＯＤ−Ｈカラム、２５％ＭｅＯＨ／ｉＰｒＮＨ２、５．０ｍＬ／分、１００ｂａｒ、３５℃、２２０ｎｍ）＞９９．９％  ｅｅ；ＴＲ＝１．１５分。
【００４２】
ＧＯＡＴはＵＡＧをＡＧに変換する主要な酵素である。ＧＯＡＴおよびグレリンの役割の総説については、以下を参照されたい：Ｋｒｉｓｔｙ  Ｍ．Ｈｅｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ｇｈｒｅｌｉｎ  Ｏ−ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｇｈｒｅｌｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ＆Ｏｂｅｓｉｔｙ  ２０１１，１８：５０−５５；Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ａ．Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｇｈｒｅｌｉｎ  ＯＡｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １７；３３０（６０１１）：１６８９−１６９２．  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１９６１５４，Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｈ．Ｔｓｃｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｏ−ａｃｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  Ａｐｒｉｌ  ２９；１０５（１７）：６２１３−６２１４、およびＪｅｓｕｓ  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｏｃｔａｎｏｙｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｏｒｐｈａｎ  ｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２００８  Ａｐｒｉｌ  ２９，１０５（１７）：６３２０−６３２５。
【００４３】
ＧＯＡＴの役割は、ＧＯＡＴ遺伝子を欠くマウスにおいて観察される表現型によって支持されている。それゆえ、ＧＯＡＴの阻害は、循環しているＡＧを低下させ、循環しているＵＡＧを上昇させることが期待される。したがって、総グレリン（ＵＡＧ＋ＡＧ）に対するＡＧの比は、ＧＯＡＴ阻害剤処理の後に下がる。
【００４４】
インビトロ無細胞ヒトＧＯＡＴ酵素アッセイ
ヒトＧＯＡＴ遺伝子（受入番号：ＮＭ＿００１１００９１６）をｐＡＮ５１バキュロウイルス発現ベクターにサブクローニングする。バキュロウイルスストックを、売主である、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡによって提供されているＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌにしたがって調製する。５ｍｌのヒトＧＯＡＴバキュロウイルスストックを、２Ｌ三角フラスコ中の５００ｍＬのＨｙＱ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ（商標）培地（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２７８．０２）中のＳｆ９細胞に１ｍｌ当たり１×１０６細胞の密度で添加する。ヒトＧＯＡＴ遺伝子が感染したＳｆ９細胞を有するフラスコを１２０ｒｐｍで２８℃で４８時間板状振盪機上に置く。４８時間のインキュベーションの後、細胞を１，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。細胞ペレットを収集し、さらなる処理の準備ができるまで冷凍庫中で−８０℃で保管する。
【００４５】
酵素アッセイのためのＧＯＡＴ酵素のミクロソーム膜の調製：
１ｇの細胞ペレットを９ｍＬの冷却ホモジナイゼーションバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ７．５に調整し、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで除菌ろ過）に懸濁する。細胞懸濁液をＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーに移す。細胞ペレットを氷上で４０ストロークホモジナイズする。ホモジネートを３，０００ｒｐｍでＢｅｃｋｍａｎスイングバケットローター中で４℃で１０分間遠心分離し、壊れていない細胞を除去する。上清を収集し、４０，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離する。結果として生じる膜ペレットをＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションバッファー中に懸濁し、アッセイのために冷凍庫中で−２０℃で保管する。ヒトＧＯＡＴ酵素膜調製物の長期保管には、懸濁した膜を−８０℃の冷凍庫中で保管する。
【００４６】
ヒトＧＯＡＴ酵素アッセイプロトコール：
ＤＭＳＯ中に被験化合物を調製し、０．２ｍＭストック溶液を用意する。ＤＭＳＯ中のストック溶液を段階希釈し、９６−ウェル丸底プレート中に、１０μＭ〜０．５ｎＭの範囲の最終化合物濃度を有する１０点希釈曲線を得る。アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ（商標）−２０、ｐＨ７．５／２５０ｍＭスクロース／１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に酵素および基質溶液を調製する。希釈した化合物（１μＬ）を対応する低タンパク質結合３８４ウェルプレートのローＡからＮの各ウェルに添加する。ヒトデスアシル−グレリン−ビオチン（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、最終６．０μＭ）、オクタノイル−ＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ、最終６０μＭ）およびＡＧ特異的抗体（ＷＯ２００６／０９１３８１）（最終１．０μｇ／ｍＬ）からなるヒトＧＯＡＴ基質混合物（１０μＬ）を、化合物に添加する。アッセイバッファー（９μＬ）中に調製しておいたＧＯＡＴ−Ｈｉｓ／ｓｆ９酵素調製物を、基質および被験化合物を含有するプレートの各ウェルに添加し、その結果、終濃度を０．０１μｇ／ｍＬとして、反応を開始させる。混合物を１時間ＲＴで穏やかに回転するオシレーター上でインキュベートする。４Ｍ塩酸グアニジン（２０μＬ）をすべてのウェルに添加し、混合し、３時間インキュベートして反応を停止させる。
【００４７】
ＥＬＩＳＡプレート（ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ  ＳＰＥＣＴＲＡＰＬＡＴＥ（商標）３８４、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を、ＰＢＳ中の２％Ｈｅａｔ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳ（４０μＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ブロッキングバッファーで３時間ブロッキングすることによって調製する。ブロッキングバッファーをＥＬＩＳＡプレートから吸引し、ブロッキングバッファー（２３μＬ）を、カラム１〜２４、ローＡ〜Ｎに添加する。ローＯおよびＰはアシルグレリン標準曲線用に取っておく。反応混合物（２μＬ）をＥＬＩＳＡプレートに添加する。１０点標準曲線（ビオチン−標識化オクタノイル−グレリン）を２．５ｐＭから開始して、０．２Ｍ塩酸グアニジンを含有するブロッキングバッファー中の段階２×希釈により調製する。反応混合物またはビオチン−標識化ＡＧ標準をＥＬＩＳＡプレート中で一晩４℃でインキュベートする。翌日、プレートを３回洗浄バッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−２０／ＰＢＳ、各洗浄サイクルにつき、１ウェル当たり１００μＬ）で洗浄する。ＡＧ特異的抗体（ＷＯ２００６／０９１３８１）（２５μＬの、ブロッキングバッファー中０．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。前の工程と同様にして、プレートを３回洗浄バッファーで洗浄する。ブロッキングバッファー中３，０００×に希釈したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ＨＲＰ（２５μＬ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、１時間ＲＴでインキュベートする。前の工程におけるようにして、後者（ｔｈｅ  ｌａｔｅ）を３回洗浄バッファーで洗浄する。ＴＭＢ試薬（２５μＬ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、２０分間発展させ、１Ｍリン酸（１ウェル当たり２５μＬ）で停止させる。プレートを４５０ｎｍでＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダーを用いて読み取る。ＡＧレベルを近似標準曲線に対して算出し、パーセント阻害を算出する。１０点阻害曲線をプロットし、４パラメーターロジスティック方程式に当てはめて、Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｂａｓｅ（ｖｅｒ．７．３．２．１）を用いてＩＣ５０値を得る。
【００４８】
本質的に上記のプロトコールにしたがって、実施例１の化合物は約１９２ｎＭ±７３、（ｎ＝５）のＩＣ５０を示す。データは、実施例１の化合物が精製ＧＯＡＴ酵素活性をインビトロで阻害することを実証する。
【００４９】
化合物処理群におけるＡＧの総グレリンに対する比の変化と、媒体処理群でのものとを比較すると、ＵＡＧのＡＧへのＧＯＡＴ酵素による動的プロセシングに起因する、インビボでのＧＯＡＴ酵素阻害の程度を反映している。本明細書におけるインビボ薬物動力学研究において、媒体処理群および化合物処理群における血漿および胃中のＡＧおよびＵＡＧのレベルはこれら２つの分析物に対して特異的にＥＬＩＳＡによって測定する。各サンプルの総グレリンレベルはこれらＥＬＩＳＡ測定によるＡＧとＵＡＧとの和として計算する。ＡＧの総グレリンに対する比は各サンプル中のＡＧのレベルを同じサンプル中の総グレリンのレベルで割ることによって規定する。媒体処理群におけるＡＧ、ＵＡＧおよびＡＧの総グレリンに対する比のレベルは計算して１００％として設定する。化合物処理群におけるこれらのパラメーターの相対変化は、次いで被験化合物の有効性を決定するために計算する。
【００５０】
ＧＯＡＴ阻害剤についてのインビボ用量依存３日間ＢＩＤ研究：
動物および処理：
Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から９週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入する。マウスを個々に温度管理した（２４℃）施設中に１２時間の明暗周期（２２００時に照明）で収容し、標準齧歯類固形飼料（食餌２０１４、Ｈａｒｌａｎ）および水を自由に摂取させる。典型的には、マウスを研究の時に１０〜１３週齢である際に使用する。実験の０日目に、マウスを処理群（Ｎ＝７／群）へと無作為化し、各群が同様の平均体重を有するようにする。１日目および２日目に、動物を、媒体（１％ヒドロキシエチルセルロース、０．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％消泡剤）または媒体中に様々な用量での懸濁液として調製した被験化合物で、７ａｍおよび７ｐｍに経口経管栄養により処理する。３日目に、動物を絶食させ、清潔なケージに移動させ、媒体または被験化合物を経口経管栄養により再度８ａｍに投与する。その日の１ｐｍに、動物を断頭により殺し、血液を収集する。血液収集および血漿処理の詳細については、以下の血液収集および血漿からのグレリン抽出のセクションを参照されたい。
【００５１】
血液収集：
およそ６００μＬの血液を、６００μＬ（Ｖ保存料として規定する）の新たに調製した保存料（４ｍＭ  ＰＥＦＡＢＬＯＣ（登録商標）［フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩］、７２ｍＭ  ＮａＣｌ、５８ｍＭ  ＮａＦ、０．０３２Ｎ塩酸、ｐＨ３．０）を含有する予め秤量したＥＤＴＡチューブに収集し、直ちに混合する。チューブを再度秤量し、氷上で維持する。この血液収集手順を用いて各サンプルの正確な血液容量を正確に決定するために、各マウスについて、血液の重量を下記式を用いて計算する：
血液重量＝（血液＋保存料を含有するチューブの重量）―（保存料を含有するチューブの重量）
血液容量（Ｖ血液）＝（血液重量）／１．０６
齧歯類血液の比重を１．０６ｇ／ｍＬと仮定していることに注意する。
【００５２】
血液収集後１５分間以内に、サンプルを５０００ｒｐｍで４℃で８分間遠心分離する。血漿（６５０μＬ）を、１Ｎ塩酸（６５μＬ）を含有する５ｍＬガラスチューブに取り出し、混合し、氷上で維持する。
【００５３】
ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）カラムによるグレリン抽出：
ＥＬＩＳＡを行う前に干渉を除去するためにＡＧおよびＵＡＧをＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）＿Ｃ１８カラムを用いて血漿から抽出する。ＡＧおよびＵＡＧペプチドのＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）＿Ｃ１８カラムによる固相抽出は、真空マニフォールド（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ）上で、またはぜん動ポンプを用いて行うことができる。サンプルのＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）＿カラム抽出手順は、各個々のマウスから得た血漿サンプルに対して独立して適用する。一般的な抽出プロトコールを以下に記載する。
【００５４】
ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）カラム抽出の全プロトコールに用いるすべての溶液は氷冷状態でなければならない。ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）＿カラム（ＷＡＴ０５４９６０、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を９９．９％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１ｍＬの、１００ｍＬ  ＡＣＮ／０．１ｍＬ  ＴＦＡ溶液）で湿らせる。流速を約１ｍＬ／分に調整するよう圧力をかけて液体をカラムベッドから除去するが、あらゆる点でカラムを乾かしてしまわない。いったん液体をカラムから除去すると、圧力を停止する。カラムを３％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１ｍＬの、９７ｍＬ水、３ｍＬ  ＡＣＮ、０．１ｍＬ  ＴＦＡ）で平衡化する。流速を約１ｍＬ／分に調整するよう圧力をかけて液体をカラムベッドから除去するが、カラムを乾かしてしまわない。およそ６５０μＬの酸性化した血漿（Ｖカラムに添加した血漿として規定する）を１．４ｍＬ氷冷０．１％ＴＦＡへと希釈する。前の工程からのすべての希釈し、酸性化した血漿をカラムにローディングする。流速を約０．５ｍＬ／分に調整するよう圧力をかけて、サンプルにカラムを通過させ、グレリンペプチドをカラムの樹脂に吸収させる。カラムを乾かしてしまわない。３％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ（０．９ｍＬの、９７ｍＬ水、３ｍＬ  ＡＣＮ、０．１ｍＬ  ＴＦＡ）で洗浄する。流速を約１ｍＬ／分に調整するよう圧力をかけて液体をカラムベッドから除去するが、カラムを乾かしてしまわない。洗浄をさらに２回繰り返す。６０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１ｍＬの、４０ｍＬ水、６０ｍＬ  ＡＣＮ、０．１ｍＬ  ＴＦＡ）で溶出する。収集チューブを各カラムの下に置き、流速を約０．５ｍＬ／分に調整するよう圧力をかけ、液体がカラムを通るよう押し出し、溶出液を収集チューブに収集する。サンプルをドライアイス上で直ちに凍結する。サンプルをｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（Ｍｏｄｅｌ＃ＳＣ１１０Ａ、Ｓａｖａｎｔ）で凍結乾燥し、ＥＬＩＳＡアッセイを行うまで−２０℃で保管する。
【００５５】
グレリンについてのＥＬＩＳＡアッセイ：
９６−ウェルＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）ＭＳＤ（登録商標）プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ、カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３）を、１００μＬの、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのアシルおよび非アシル化形態のグレリンの両方の中央ドメインを認識する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＷＯ２００５／０２６２１１およびＷＯ２００６／０１９５７７）でコーティングする。プレートの側面を軽くたたいてウェルの被覆を確実にし、接着性プレートシーラーで密封し、一晩ＲＴでインキュベートする。内容物を捨て、ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎ（２５μＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、カタログ番号３７５２８）を各ウェルに添加する。プレートを再度密封し、板状振盪機上にＲＴで１時間置く。
【００５６】
ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）Ｃ１８カラム抽出からの、凍結乾燥し、保存しておいた血漿サンプルをＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎ（各サンプルに対して４００μＬ、この容積をＶ再構成として規定する）中に再構成し、ボルテックスミキサーでよく混合し、氷上で４５〜６０分間インキュベートする。内容物をプレートから捨て、２５μＬの再構成した血漿サンプルを各ウェルに添加する。アシルグレリンおよび非アシル化グレリン標準曲線を、８０００ｐｇ／ｍＬから開始して、全部で８濃度について段階１：４希釈を行って、調製する。調製した標準を２連で、各ウェル中に２５μＬを有するブロッキングしたプレートに添加する。プレートを密封し、ＲＴで板状振盪機上で２時間インキュベートする。
【００５７】
プレート内容物を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含むＰＢＳ（１５０μＬ）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄する。ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で標識化したアシルグレリン特異的抗体（ＷＯ２００６／０９１３８１）または非アシル化グレリン特異的抗体（ＷＯ２００６／０５５３４７）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有する０．２×Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ中に０．０５μｇ／ｍＬに希釈し、二次抗体溶液と名付ける。最終洗浄液を除去し、ＡＧまたはＵＡＧを特異的に認識する二次抗体溶液（各ウェルに対して２５μＬ）を添加する。プレートを再度密封し、１時間ＲＴで板状振盪機上でインキュベートし、その後、最終的に再度ＰＢＳ−Ｔ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄する。
【００５８】
最終洗浄液を捨て、１×ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（１５０μＬ／ウェル）と置換する。ＭＳＤ（登録商標）ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００分析計（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてプレート上の電極に結合したＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）標識の活性化により生じた電気化学発光シグナルを読み取る。ＭＳＤ（登録商標）ソフトウェアによって作成したそれぞれの標準曲線に基づいて、アシルグレリンまたは非アシル化グレリンの濃度を算出する。アシルグレリンまたは非アシル化グレリンの測定レベルに希釈係数をかけることによって、各サンプルについての実際の血漿濃度を決定する。各血漿サンプルについての希釈係数は下記式を用いて計算する。
【００５９】
【数１】
2016537371.tif 000023
【００６０】
結果：
実施例２の化合物の３日間の投与は、それぞれ０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇにて、血漿ＡＧを−１％、５％、４５％、および４８％低下させ、ＵＡＧを２．２４、２．８２、２．５３、および２．８９倍増加させる（以下の表にまとめる結果）。０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇでの投与は、媒体−処理対照動物と比較した場合、ＡＧの総グレリンに対する比におけるそれぞれ３９、５４、７１および７７％の低下をもたらす。これらの結果は、ＧＯＡＴ欠損マウスにおいて、インビボで示したように、実施例１の化合物がＡＧ生成を抑制し、循環中のＵＡＧを上昇させることを実証する。
【００６１】
【表１】
2016537371.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月16日(2016.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2016537371.tif 000029
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式：
【化２】
2016537371.tif 000030
である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式：
【化３】
2016537371.tif 000031
である、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項５】
１つまたは複数のその他の治療薬を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
体重増加を低減するための、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
体重再増加を低減するための、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
肥満を治療するための、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
２型糖尿病を治療するための、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
体重増加を低減することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１１】
体重再増加を低減することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１２】
２型糖尿病を治療することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１３】
肥満を治療することのための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【国際調査報告】
2016537371.tif 000032
2016537371.tif 000033