(57)【要約】  本発明は、混合モードクロマトグラフィーを使用して多糖タンパク質抱合体を精製する方法を説明する。本発明の方法は、粗製多糖タンパク質抱合体を不活性多孔質シェルおよび活性化コアを含んでいる混合モード樹脂と、汚染物質と結合可能な低い伝導度の条件下で接触させ接触させること、およびフロースルーにおいて結合していない多糖タンパク質抱合体を収集することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖タンパク質抱合体を１つ以上の汚染物質から精製するプロセスであって、
ａ．粗製糖タンパク質抱合体を、不活性多孔質シェルおよび活性化コアを含んでいる混合モード樹脂と、上記汚染物質の結合が可能な低い伝導度の条件下で接触させる工程、および
ｂ．フロースルーにおいて結合していない糖タンパク質抱合体を収集する工程
を含んでいるプロセス。
【請求項２】
上記不活性多孔質シェルは、２０００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間の分子量カットオフを有する細孔を含んでいる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
上記分子量カットオフは、１０００ｋＤａ〜７００ｋＤａの間である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
上記活性化コアは、官能基を含むリガンドが固定化されている、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
上記固定化されたリガンドの上記官能基は、アルキル鎖およびアミノ基を含んでいる、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
上記アルキル鎖は４〜１４個の炭素を含んでいる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
上記アルキル鎖は疎水性相互作用により上記汚染物質と相互作用を及ぼす、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
上記アミノ基はイオン性相互作用により上記汚染物質と相互作用を及ぼす、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
上記汚染物質は遊離多糖を含んでいる、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
上記汚染物質は遊離タンパク質を含んでいる、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１１】
上記汚染物質は低分子量の抱合体を含んでいる、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１２】
上記汚染物質はリンカーまたはカップリング剤を含んでいる、請求項７または８に記載のプロセス。
【請求項１３】
上記多糖タンパク質抱合体の多糖の構成要素は、Haemophilus influenzaeｂ型、 Neisseria meningitidis、Streptococcus pneumoniae、Salmonella enterica serovar Typhi、Vibrio cholerae、またはShigella flexneri由来の多糖を含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
上記多糖タンパク質抱合体の担体タンパク質の構成要素は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、百日咳毒素（化学的または遺伝的に無毒化されている）、Neisseria meningitidesの膜外タンパク質Ｃ、Salmonellaの膜外タンパク質Ｃ、Streptococcus pneumoniaeの肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）もしくは肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、または組み換えPseudomonas aeruginosaエキソトキシンＡ（ｒＥＰＡ）からなる群より選択される、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
工程（ａ）は、上記多糖タンパク質抱合体を、上記汚染物質が結合可能な低伝導度の条件下で、不活性多孔質シェルおよび活性化コアを含んでいる混合モード樹脂を含んでいるクロマトグラフィーカラムに充填することにより実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
上記充填は流速２〜１２０ｃｍ／ｈで実施される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
上記流速は１０〜１２０ｃｍ／ｈ、２０〜１１０ｃｍ／ｈ、３０〜１００ｃｍ／ｈ、４０〜９０ｃｍ／ｈ、５０〜８０ｃｍ／ｈ、または６０〜７０ｃｍ／ｈの間である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
上記流速は、好ましくは１０〜８０ｃｍ／ｈの間である、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
上記低伝導度とは１０ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、または好ましくは３ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項２０】
上記伝導度はバッファーのイオン濃度を調整することで維持される、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
上記バッファーは、リン酸、トリス、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
上記バッファーはｐＨ５．０〜ｐＨ７．５の間である、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
上記バッファーは好ましくはリン酸バッファーである、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
上記バッファーの伝導度は５ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
工程（ａ）の前に任意に、希釈の工程および透析ろ過の工程を含んでいる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２６】
上記透析ろ過は、２０〜２５回連続的に実施される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
上記透析ろ過は、分子量カットオフが３０ｋＤａであるメンブレン上で実施される、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
多糖抱合体ワクチンを製造するためのプロセスであって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のプロセスにより実質的に精製された多糖タンパク質抱合体を生産すること、および上記実質的に精製された多糖タンパク質抱合体をコンビネーションワクチンの製造において使用することを含んでいるプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンとして使用するための多糖タンパク質抱合体の精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染は、特に発展途上国において、幼児および子供を苦しめる疾患の主要な原因の１つであり続けている（Osrin, David et al. (2004) Current Opinion in Infectious Diseases 17(3): 217-224; Thaver, Durrane, and Zaidi, Anita K.M. (2009) Pediatric Infectious Disease Journal 28(1): S3-S9; Saez-Llorens, Xavier et al. 2003 Lancet 361(9375): 2139-2148; Thapar, Nikhil et al. 2004 Lancet 363(9409): 641-653）。最も一般的な病原体はHaemophilus influenzae ｂ型、Streptococcus pneumoniae、Neisseria meningitidis (Pollard, Andrew J. et al. (2009) Nature Reviews Immunology 9(3): 213-220)、Staphylococcus aurous、Shigella、almonella、Vibrio cholerae等である。多数の子供が毎年上記の感染の結果死亡している。
【０００３】
多糖抗原は、Haemophilus influenzae、Neisseria meningitidis、Streptococcus pneumoniae (Larry K. Pickering et al. (1985) Infectious Diseases Newsletter 4(11): 84-87)、およびSalmonella enterica serovar Typhi (Hessel L et al. (1999) Eur J Clin Microbiol & Infect Dis., 18(9): 609-620)に関連する疾患を予防するために使用される細菌ワクチンの主要な構成要素の１つである。しかしながら、ほとんどの細菌の多糖は、記憶Ｂ細胞の発達を妨げ、２歳以下の子供および老人に対するそれらの抗原への弱い免疫反応の原因となる、Ｔ細胞独立抗原である。多糖抗原のタンパク質担体への共有結合による抱合により、体液性反応を引き起こす能力が加わり、またＴ細胞依存抗原としての能力が付加される。上記抱合体は細菌の病原体により引き起こされる疾患の予防において有効であることが証明されている。多糖抱合体ワクチンは、世界の多くの部分において２０年より長い期間にわたり使用が認可されている(Adams, William G. et al. (1993) JAMA 269(2): 221-226)。
【０００４】
多糖タンパク質抱合体の精製は常に困難なものであった。上記抱合体は、例えば未反応の多糖（遊離多糖）、未反応の担体タンパク質（遊離タンパク質）、低分子量の抱合体、および抱合体に影響を及ぼすリンカー、カップリング剤等のその他の化合物等の汚染物質を伴っていることが知られている。上記汚染物質は、ワクチンとしての使用を意図する生産物中において非常に望ましくない。例えば、大量の遊離多糖は、抱合体の免疫反応を妨げるおそれがあるため(Peeters, C.A.M. et al. (1992) Vaccine 10(12): 833-840)、ワクチン組成物中において望ましくない。汚染物質は、多くの場合分子量、イオン価および疎水性が異なるため、単回のクロマトグラフィーの工程を適用して、ワクチンとして使用するための望ましい純度を達成することは難しい。
【０００５】
多糖タンパク質抱合体は、多くの場合様々な標準的技術、例えば密度グラジエント遠心分離、硫酸アンモニウム分画法による限外ろ過(US 6,146,902)、エタノール沈殿、ゲルろ過もしくはサイズ除外クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって不純物または汚染物質から精製されている。
【０００６】
イオン交換クロマトグラフィーは多くの場合多糖の精製に適すると考えられているが、抱合体の精製、特に抱合体を大規模に精製する場合に適さないと考えられている。Simon, Raphael (WO2012061400)において、抱合体をイオン交換マトリクスと結合させること、および連続して溶出することで精製された抱合体を得ることによる、多糖タンパク質抱合体の精製のためのプロセスが説明されている。上記プロセスは、抱合体がしばしば遊離多糖と類似した電荷を示すために、遊離多糖の結合という結果を引き起こし、抱合体の精製は困難になる。
【０００７】
多糖タンパク質抱合体は、高濃度の塩を使用し、疎水性に基づく吸着法によっても精製され得る(Lees, Andrew et al. WO2011017101; Pawlowski, Andrzeg (2000) Vaccine 18: 1873-1885)。遊離多糖は疎水性がより低い傾向にあるため、この方法では、抱合体を吸着する一方、遊離多糖は吸着しない。上記精製は、主にタンパク質の非極性表面の比率および空間的広がりに影響される、タンパク質の疎水的な性質を利用して達成される。もし抱合したタンパク質がより低い疎水性であるならば、疎水性相互作用クロマトグラフィーは前記抱合体の精製の好ましい選択ではない。
【０００８】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、多糖タンパク質抱合体を精製するために最も一般的に使用されている(Lees, Andrew et al. (1996) Vaccine 14(3): 190-198; Libon, Christine (2002) Vaccine 20: 2174-2180; Jennings, H. J. and Lugowski, C. (1981) J. Immunology 127: 1011-1018)。しかしながら、前記技術はいくつかの制限が存在する。例えば、ゲルろ過による分子ふるいを使用した精製は、粗製抱合体の不十分な溶解のために収量を犠牲としなければ達成できない。分画の範囲が狭いために、所望の抱合体を含んでいる適切な分画をプールするには相当の技術が必要である。フラクションの収集におけるあらゆるエラーは、相当な量の抱合体の消失、または抱合体と汚染物質とが非常に狭い範囲で分離されているために、抱合体と汚染物質の結合のリスクの増大を引き起こしうる（図１ａ）。さらに、カラム充填に関わる困難に加え、大量のゲルろ過マトリクスが必要であり、プロセスの時間が相当に増大する。これらの全ての因子は生産コストの上昇を引き起こし、ワクチンの入手を不可能にし、ワクチン接種計画におけるその使用を制限する。
【０００９】
抱合プロセスに関連する複雑さは、通常は非常に異質な、多くの場合分子量、イオン価、疎水性等の物理的および化学的性質の異なる汚染物質の群という結果をもたらす。これらの因子のため、単一の原理のクロマトグラフィーに基づく分離は、ワクチンとして使用するための抱合体に必要とされる純度を達成するのには不適当である。それゆえ、しばしば２以上のクロマトグラフィーの工程が、多糖タンパク質抱合体の精製に使用される。Fattom, Ali et al. (Infection and Immunity (1988) 56(9): 2292-2298)は、複合体をゲルろ過マトリクスにより部分的に精製し、続いて疎水性媒体に捕捉し精製された抱合体を得る、２工程による多糖タンパク質抱合体の精製を説明する。前記の方法は、複数のクロマトグラフィー工程のために全体の収量が損なわれ、またプロセスの時間も増加する。
【００１０】
したがって、ワクチンに使用するための相当量の多糖タンパク質抱合体の生産は、従来技術の複雑さを原因とする収量の低さおよび生産コストの高さのため妨げられている。それゆえ、生産を容易にし、より時間がかからず、同一の時間で高い収量を提供する、多糖タンパク質抱合体の精製のための代替的な方法の開発が必要とされている。本発明は予想外に効率的な、混合モードクロマトグラフィー(Orlovsky, Vlad et al (2011) Chromatography Today, 4(3) 24-28; WO200508248; WO2009131526, WO2010005364)を適用し、多糖タンパク質抱合体から不純物または汚染物質を除去する方法を提供する。この驚くべき有効な方法は、多糖タンパク質抱合体の精製に使用される従来技術に関わる長年の問題に立ち向かうものである。本発明に係る方法は、操作が単純であり、容易に実施可能であり、より少ないリソースのみを必要とし、かつより多い収量および安定した品質を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明は、不純物または汚染物質の除去において驚くべき迅速かつ効率的である、混合モードクロマトグラフィーを使用した、多糖タンパク質重合体の精製の方法を教示する。発明者らは、混合モードクロマトグラフィーによる多糖タンパク質抱合体の精製は、プロセスの時間を単一化し短縮し、効率的に汚染物質を除去し、また容易に実施可能であることを発見した。
【００１２】
一実施形態において、粗製多糖タンパク質抱合体は、前記多糖タンパク質抱合体を混合モード樹脂に接触させること、およびフロースルーにおいて結合していない糖タンパク質抱合体を収集することにより、１つ以上の汚染物質から精製される。
【００１３】
一実施形態において、前記混合モード樹脂は不活性シェルおよび活性化コア、好ましくは不活性多孔質シェルおよび異なる官能基を保持する固定化されたリガンドを有する活性化コアを含んでいる。
【００１４】
一実施形態において、前記抱合体は、サイズに基づき前記抱合体の精製に作用し、１つ以上の汚染物質を荷電相互作用および／または疎水性相互作用により捕捉することにより、単一のクロマトグラフィー工程において精製される。
【００１５】
一実施形態における単一のクロマトグラフィー工程において、いくつかの不純物は、イオン交換器、特に正に荷電したイオン交換器（陰イオン交換器）に結合し、一方いくつかの不純物は疎水性相互作用により結合している。
【００１６】
一実施形態において、遊離多糖はイオン性相互作用により捕捉され、遊離タンパク質はイオン性または疎水性相互作用により捕捉され、一方抱合体は結合していないモードにおいて収集される。
【００１７】
一実施形態において、１つ以上の汚染物質は、前記汚染物質の結合を容易にする条件、好ましくは低伝導度の条件下で捕捉される。
【００１８】
一実施形態において、前記方法は粗製糖タンパク質抱合体を、不活性多孔質シェルおよび活性化コアを含んでいる混合モード樹脂と、上記汚染物質の結合が可能な低い伝導度の条件下で接触させること、およびフロースルーにおいて結合していない糖タンパク質抱合体を収集することを含む。
【００１９】
一実施形態において、本発明に係る方法で精製される抱合体は、Ｈｉｂ抱合体、髄膜炎菌抱合体、肺炎球菌抱合体、または腸チフス菌抱合体である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】実施例１のプロセスで精製された、所望の抱合体（Ｆ−２）および汚染物質（Ｆ−１、Ｆ３およびＦ４）を表す、Ｈｉｂ抱合体のゲルろ過クロマトグラフィーのプロファイル。
【図１ｂ】実施例２ａおよび実施例２ｂのプロセスで精製された、所望の抱合体（Ｉ）および汚染物質（ＩＩ）を表す、Ｈｉｂ抱合体の混合モードクロマトグラフィーのプロファイル。
【図２】混合モードクロマトグラフィーにより精製されたＨｉｂ抱合体の分子サイズの分布。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において使用されるとき、単数形の“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈による他の指示が無い限り、複数形の観点も包含する。同様に、本願明細書において使用される他のあらゆる単数形の用語もまた、文脈による他の指示が無い限り、複数形、または単数形をも意味する。
【００２２】
“含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”または“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”もしくは“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”等のその他の形、“有する（ｈａｖｉｎｇ）”または“ｈａｖｅ”もしくは“ｈａｓ”等のその他の形、“包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”または“ｉｎｃｌｕｄｅ”もしくは“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”等のその他の形、または“含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”または“ｃｏｎｔａｉｎ”もしくは“ｃｏｎｔａｉｎｓ”等の他の形は制限無く、また記載されていない要素または方法の工程を除外するものではないことに注意が必要である。
【００２３】
いかなる量または範囲が述べられていようとも、当業者は述べられた値の１０〜２０％以内の量または範囲もまた適切であると期待されることを認め得る。例えば２０％と述べられた場合には、１６〜１８％から２２〜２４％の範囲が含意され、適切とされ得る。
【００２４】
本明細書において使用されるとき、バッファーという用語は、溶液のｐＨを所望の範囲に維持する作用物質を包含する。一実施形態において、ｐＨのバッファーは約５．０〜７．５の間である。他の実施形態において、使用されるバッファーは、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＭＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファーもしくはこれらの組み合わせから選択され、またはより好ましくはリン酸バッファーである。
【００２５】
多糖とは、直線的に、または分岐して結合する多数の繰り返しユニットにより形成されたポリマーを意味する。本明細書において使用されるとき、多糖という用語は、互換的に糖またはオリゴ糖を意味するとして使用される。いくつかの実施形態において、多糖という用語は、少なくとも約１０個の繰り返しユニットを含んでいるポリマーを意味する。多糖は、当業者に既知の任意のプロセス、例えば酸または塩基加水分解、オゾン分解、ペプチド酸化、β脱離および酵素加水分解等により、特定の数の繰り返しユニットを含むよう解重合またはサイズ調整され得る。
【００２６】
荷電相互作用またはイオン性相互作用により、分離はイオン交換器、すなわち陽イオン交換器または陰イオン交換器に作用されることが含意される。陰イオン交換器は、負の電荷を有する化合物と結合する一方、正の電荷を有する化合物を残し、陽イオン交換器は、正の電荷を有する化合物と結合する一方、負の電荷を有する化合物を残す。
【００２７】
疎水性相互作用により、分離は生体分子の表面の疎水性の違いに作用されることが含意される。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、生体分子とＨＩＣ媒体の疎水性の表面との間の可逆的相互作用を利用し、生体分子を表面の疎水性の違いに従い分離する。非極性の表面および空間的配置が、生体分子の疎水性に影響する。
【００２８】
樹脂またはマトリクスまたは媒体という用語は、クロマトグラフィーの固定相を表すために互換的に使用される。「混合モード樹脂」または「混合モードマトリクス」または「混合モード媒体」という用語は、リガンドとして知られる官能基が固定化され、混合モード樹脂にいくつかの異なる方法で標的分子と相互作用する能力を付与する、クロマトグラフィーの樹脂またはマトリクスまたは媒体を表す。混合モード樹脂は、内部に固定化されたリガンドを有する多孔質シェルを有していてもよい。一実施形態において、混合モード樹脂は不活性多孔質シェルおよびリガンド活性化コアを含んでいる。混合モード樹脂は、多モード樹脂または多モードマトリクスまたは多モード媒体をも表し得る。
【００２９】
一実施形態において、いくつかの不純物および汚染物質は、リガンドの疎水性官能基性により相互作用する一方、他のいくつかの不純物および汚染物質は、リガンドのイオン性官能基性により相互作用し、それにより多糖タンパク質抱合体からの汚染物質の分離に作用する。
【００３０】
「非結合性モード」、「非結合モード」または「ネガティブクロマトグラフィー」は、所望の産物がクロマトグラフィーマトリクスに結合しない方法により精製される、すなわち所望の産物がクロマトグラフィーマトリクスの空隙を通過し、フロースルーまたは捕捉プールに収集されるクロマトグラフィーの技術を意味する。
【００３１】
多糖の担体タンパク質への抱合のプロセス中に、抱合体混合物中の全ての多糖およびタンパク質分子がカップリングし多糖タンパク質抱合体を形成するわけではない。その結果、抱合体は、抱合体を調製するために使用される抱合の化学反応のタイプによって、遊離多糖、遊離タンパク質、リンカーにより誘導体化された多糖、リンカーにより誘導体化された担体タンパク質、カップリング剤等の汚染物質を伴っている。例えば、上記抱合体が多糖を担体タンパク質と直接結合させることで調製されるならば、抱合体は遊離多糖、遊離した担体タンパク質、残留カップリング剤またはそれらの混合物を伴うことが予想される。抱合体が多糖またはタンパク質をリンカーで誘導体化することで調製される場合、抱合体は誘導体化していない多糖または誘導体化していない担体タンパク質またはそれらの混合物に加え、誘導体化した多糖または誘導体化した担体タンパク質を伴うことが予想される。
【００３２】
不純物または汚染物質という用語は、ワクチンとしての使用を意図される多糖タンパク質抱合体以外の任意の化学的または生物学的分子を表すために互換的に使用される。多糖タンパク質抱合体は通常、遊離多糖、遊離タンパク質、低分子量の抱合体、リンカー、カップリング剤またはそれらの混合物等の、しかしこれらに限定されない汚染物質を伴う。
【００３３】
粗製抱合体または粗製多糖タンパク質抱合体は、精製または部分的に精製されておらず、１つ以上の共存する汚染物質または不純物を除去されていない多糖タンパク質抱合体を意味する。上記粗製抱合体はしばしば、遊離多糖、遊離タンパク質、低分子量の抱合体、より高分子量の凝集体、残留量のリンカー、カップリング剤またはそれらの混合物等の、しかしこれらに限定されない不純物を含んでいる。本発明に係るプロセスは、任意の多糖タンパク質抱合体を、それに伴う１つ以上の汚染物質から精製するのに適する。
【００３４】
遊離多糖または誘導体化した多糖という用語は、担体タンパク質と抱合していない多糖抗原を意味するために互換的に使用される。それゆえ、遊離多糖という用語は、遊離多糖、リンカーにより誘導体化した多糖またはそれらの混合物を含んでいる。
【００３５】
遊離タンパク質または誘導体化したタンパク質という用語は、多糖抗原と抱合していない担体タンパク質を意味するために互換的に使用される。それゆえ、遊離した担体タンパク質という用語は、遊離した担体タンパク質、リンカーにより誘導体化した担体タンパク質またはそれらの混合物を含んでいる。
【００３６】
低分子量の抱合体は、その大きさのために不活性シェルを通過して混合モードマトリクスの活性化コアに入ることができる抱合体を意味する。一実施形態において、前記低分子量の抱合体は、２０００ｋＤａ未満、１８００ｋＤａ、１６００ｋＤａ未満、１４００ｋＤ未満、１２００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、９００ｋＤａ未満、８００ｋＤａ未満、７００ｋＤａ未満、６００ｋＤａ未満、５００ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満またはこれらの混合の分子量である。
【００３７】
「精製された多糖タンパク質抱合体」または「精製された抱合体」は、共存する汚染物質を除去され、汚染物質の量が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、または９５％以上減少した多糖タンパク質抱合体を意味する。一実施形態において、汚染物質の量は８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上減少する。「精製された抱合体」または「精製された多糖タンパク質抱合体」は共存する汚染物質を、特に遊離多糖および遊離タンパク質含有量について、薬局方の規定、または監督当局が規定する程度、または抱合体における適切な免疫学的な相関が立証する程度に除去した抱合体を意味するとも解される。例えば、破傷風トキソイドと抱合したＨｉｂ多糖の場合、遊離多糖の含有量は２０％未満でなければならず、遊離した破傷風トキソイドは１％未満でなければならず、かつ少なくとも６０％の抱合体は、セファロースＣＬ−４Ｂにおけるサイズ除外クロマトグラフィーで評価した際に０．２ＫＤ（分散係数）以内の分子量分布でなければならない(Haemophilus Type b Conjugate Vaccine, Indian Pharmacopoeia, 2010 Vol 3 pg 2395-2398)。分子量分布を計測する技術は当業者の間で公知である(WHO Technical Report Series, No. 897, 2000 pg 27-56; WHO Technical Report Series No. 658, 1981, Annex 6; McCauley, J. A. et al. J Biol Stand (1981) 9: 461-468; Parisi, L et al. (1999) J Chromatogr A 847: 209-211)。同様に、遊離多糖および遊離タンパク質の含有量は、当業者に知られている任意の定量技術により測定することができる(Tsai, C.M. et al. (1994) Vaccine 12(8): 700-706; Ashwell, G. Methods Enzymology, (1957) 3: 73-105; Guo, YY et al. (1998) Biologicals 26(1):33-38; Lei, QP et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264; Stoscheck, Christa M. (1990) Methods in Enzymology 182: 50-68)。多糖タンパク質ワクチンにおいて、汚染物質、特に遊離多糖（抱合体は貯蔵期間中に分解することがあり、ワクチン中の遊離多糖のレベルが上昇し、多糖タンパク質抱合体の免疫原性に有害な影響を与えうるため）のレベルは可能な限り低いことが好ましい。一実施形態において、遊離多糖の含有量は１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、または２％以下である。一実施形態において、遊離多糖の含有量は１０〜１５％の間、５〜１０％の間、または０〜５％の間である。
【００３８】
抱合体の生産に使用可能である多糖抗原は、当業者に既知の様々な細菌に含まれ得る。細菌の例にはHaemophilus influenzae ｂ型（例えばH. influenza莢膜多糖、リン酸ポリリボシルリビトール［ＰＲＰ］）、Neisseria meningitides（例えばN. meningitidis血清群Ａ莢膜多糖（ＭｅｎＡ）、N. meningitidis血清群Ｃ莢膜多糖（ＭｅｎＣ）、N. meningitidis血清群Ｙ莢膜多糖（ＭｅｎＹ）、N. meningitidis血清群Ｗ莢膜多糖（ＭｅｎＷ）、Streptococcus pneumoniae（例えば血清群１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）、Staphylococcus aureus、Salmonella enterica serovar Typhi、Vibrio cholerae、Shigella flexneri等が包含される。特に興味深い多糖抗原は、Haemophilus influenzae ｂ型、Neisseria meningitides、Streptococcus pneumoniae、およびSalmonella enterica serovar Typhiの莢膜多糖から得られるものである。
【００３９】
多糖に抱合するのに使用され得る担体タンパク質は当業者に既知である。抱合体を製造するのに一般的に使用される担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７等の無毒性ミュータント、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、Neisseria meningitidesの膜外タンパク質Ｃ、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、Streptococcus pneumoniaeの肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）または肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、組み換えPseudomonas aeruginosaエキソシンＡ（ｒＥＰＡ）等である。
【００４０】
多糖タンパク質抱合体ワクチンは、様々な化学的手法を用いて、タンパク質分子に精製された細菌の莢膜多糖を共有結合により結合させることで調製してもよい。例えば抱合体は、Schneerson, R. et al. (1980) J. Exp. Med. 152: 361-476; Chu, chiayung et al. (1983) Infection and Immunity 40(1): 245-256.に記載されるように調製することができる。多糖はまず臭化シアンの存在下で活性化され、シアン化エステルを生成する。次に活性化された多糖はアジピン酸、ジヒドラジン等のスペーサーに結合される（誘導体化される）。多糖の活性化をせずに直接スペーサーを結合させることも可能である。誘導体化された多糖（ＰＳ−ＡＨ）は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル（ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等のカルボジイミドを使用して担体タンパク質に抱合される。まずタンパク質を誘導体化することも可能であり、誘導体化されたタンパク質はLaferriere, Craig (2011) Glycoconjugate Journal 28: 463-472; Silveira, I.A. et al (2007) Vaccine 25: 7261-7270; US 4,496,538に記載されるように多糖に抱合させることができる。
【００４１】
多糖の活性化は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、およびｐ＿ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）等の有機シアニル化剤により、Lees, Andrew US5693326; Lees, Andrew et al. (1996) Vaccine 14(3): 190-198に記載のように達成してもよい。
【００４２】
代替的に、多糖またはその断片は、アルデヒドを導入することで選択的にその還元末端を活性化し、直接的または間接的に（リンカーまたはスペーサーを介して）担体タンパク質と還元的アミノ化によりカップリングさせることができる(Jennings, H. J. US4356170; P. W. Anderson, et al. (1986) J. Immunol. 137: 1181-1186; Gray GR. (1978) Methods Enzymology; 50: 155-160)。
【００４３】
本発明に係るプロセスにより精製されることが意図される多糖タンパク質抱合体は、好ましくはＨｉｂ抱合体、髄膜炎菌抱合体、肺炎球菌抱合体、および腸チフス菌抱合体である。
【００４４】
Haemophilus influenzae多糖タンパク質抱合体は、Haemophilus influenzae b型（Ｈｉｂ）から得られた莢膜多糖（ＰＲＰ）を抱合させて調製してもよい。ＰＲＰは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはその無毒性のミュータント、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Neisseria meningitidisの膜外タンパク質Ｃ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはｒＥＰＡ等の、しかしこれらに限定されない担体タンパク質とカップリングし得る、リン酸リボースリビトールのポリマーである。Ｈｉｂ抱合体を調製する方法は当業者の間で公知である(Chu, chiayung et al. (1983) Infection and Immunity 40(1): 245-256; US4,496,538; US4,459,286; US4,619,828)。
【００４５】
髄膜炎菌抱合体は、Neisseria meningitidisの莢膜多糖（例えばN. meningitidis血清群Ａ莢膜多糖（ＭｅｎＡ）、N. meningitidis血清群Ｃ莢膜多糖（ＭｅｎＣ）、N. meningitidis血清群Ｙ莢膜多糖（ＭｅｎＹ）、N. meningitidis血清群Ｗ莢膜多糖（ＭｅｎＷ）から、莢膜多糖を破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはその無毒性のミュータント、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Neisseria meningitidisの膜外タンパク質Ｃ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはｒＥＰＡ等の、しかしこれらに限定されない担体タンパク質と抱合させることで調製してもよい。髄膜炎菌抱合体を調製する方法は当業者の間で公知である(Silveira, I.A. et al (2007) Vaccine 25: 7261-7270; US4356170; WO2007000343)。
【００４６】
肺炎球菌抱合体は、Streptococcus pneumoniae血清群（例えば血清群１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）莢膜多糖から、莢膜多糖を破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはその無毒性のミュータント、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Neisseria meningitidisの膜外タンパク質Ｃ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはｒＥＰＡ等の、しかしこれらに限定されない担体タンパク質と抱合させることで調製してもよい。肺炎球菌抱合体の調製方法は当業者の間で公知である(Laferriere, Craig et al. (1997) Vaccine 15(2): 179-186; US4673574; WO2007000343)。
【００４７】
腸チフス菌抱合体は、Salmonella enterica serovar Typhiから得られた莢膜多糖（ｖｉ抗原  Ｃ−２でＮ−アセチル化されＣ−３でＯ−アセチル化されている、α−（１→４）−Ｄ−ガラクトースアミニュロミック酸のホモポリマー）を、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはその無毒性のミュータント、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Neisseria meningitidisの膜外タンパク質Ｃ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはｒＥＰＡ等の、しかしこれらに限定されない担体タンパク質と抱合させることで調製してもよい。腸チフス菌抱合体の調製法は当業者の間で公知である(Kossaczka et al. (1999) Infection & Immunity 67(11) 5806-5810; Micoli F.  et al. (2011) Vaccine 29(4): 712-720)。
【００４８】
本発明は、多糖を担体タンパク質と抱合するのに使用され得る任意のアプローチ、および多糖タンパク質抱合体を製造するための多糖または担体タンパク質のタイプのいずれにも限定されない。例えばJennings, Harold J. et al. (Bacterial polysaccharide vaccines: Glycoconjugates and peptide-mimetics in Microbial Glycobiology Structures, Relevance and Applications Academic Press, 2010, Pages 933-956)は多糖タンパク質抱合体を調製するために使用され得る様々なアプローチの一般的概要を提供する。当業者に既知の任意の方法で調製された抱合体は、本発明に係る方法で精製することができる。
【００４９】
（混合モードクロマトグラフィーを使用した抱合体の精製）
本発明は多糖タンパク質抱合体を汚染物質から精製するために混合モードクロマトグラフィー媒体を使用する。混合モードクロマトグラフィーにおいて、単一の工程で不純物から所望の分子の分離を達成するため、２つ以上のクロマトグラフィーの原理が適用される。
【００５０】
粗製抱合体を混合モードクロマトグラフィーマトリクスに充填する。充填する混合物は、混合モードクロマトグラフィーマトリクスに充填される前に、任意に、好ましくは透析ろ過により膜ろ過されてもよい。透析ろ過はバッチで（非連続的に）、または幅広い分子量カットオフ、例えば３０ｋＤａ〜１０００ｋＤａを有するメンブレンを使用し連続処理モードで実施してもよい。一実施形態において、メンブレンは３０ｋＤａ〜９００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜８００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜７００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜６００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜４００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜３００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、または３０ｋＤａ〜１００ｋＤａの間の分子量カットオフを有する。混合モードクロマトグラフィーマトリクスは不活性シェルおよび活性化コアを有するものである。不活性シェルはある大きさより小さい分子が通過し、活性化コアに進入することを可能にし、マトリクスにサイズ除外クロマトグラフィーの特性を付与する細孔を備え、一方活性化コアには異なる官能基を有するリガンドが固定化されている。典型的な混合モードマトリクスは不活性多孔質シェルおよびリガンド活性化コアを有する。
【００５１】
マトリクスの多孔性は、リガンド活性化コアへの進入から除外される分子の大きさを決定する。一実施形態において、不活性多孔質シェルの細孔の大きさは、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、約１２００ｋＤａ、約１４００ｋＤａ、約１６００ｋＤａ、約１８００ｋＤａ、または２０００ｋＤａの分子量カットオフを有し、分子量カットオフよりも大きな分子が進入しリガンド活性化コアに到達するのを妨げる。一実施形態において、不活性多孔質シェルの細孔の大きさは、約２００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜約１５００ｋＤａ、約６００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する。好ましい一実施形態において、不活性多孔質シェルは、７００ｋＤａより大きい分子が進入しリガンド活性化コアに到達するのを妨げる、約７００ｋＤａの分子量カットオフを有する。
【００５２】
それゆえ、所望の多孔性のマトリクスを使用することで、汚染物質がコアに進入しリガンドの官能基に捕捉される一方、精製された多糖タンパク質抱合体はフロースルーにおいて非結合モードで回収されることで、汚染物質から多糖タンパク質抱合体を分離することが可能となる。
【００５３】
リガンドは、標的分子に異なる数種類の方法で相互作用を及ぼすことができる異なる官能基、例えばオクチルアミン、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、メルカプト−ベンズイミダゾル−スルホン酸等を有するものである。例えばオクチルアミンリガンドは、アルキル鎖（８炭素オクチル鎖）およびアミノ基が存在するため、標的分子に対し疎水性およびイオン性相互作用の両方により相互作用を及ぼすことができる。同様に、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンにおいて、イオン性第４級アンモニウム基は疎水性フェニル基に補われ二重の官能基性を示す。メルカプト−ベンズイミダゾル−スルホン酸において、芳香環は疎水性相互作用の能力を付加し、一方ＳＯ３置換基はイオン性相互作用の能力を付加する。これらの官能基性を有するマトリクスはGE HealthCare、Pall Life Sciences等の様々な生産者から入手することができる。二重の官能基性を有する１種類のみのリガンドではなく、それぞれ単一の相互作用（すなわち疎水性またはイオン性）に寄与する２種類以上のリガンドをコアにおいて有することも可能である。一実施形態において、リガンド活性化コアはオクチルアミンリガンドにより官能基を付加される。
【００５４】
一実施形態において、プロセスは汚染物質を疎水性および／もしくはイオン性相互作用により捕捉すること、または抱合体を非結合モードで収集または回収することを含む。
【００５５】
一実施形態において、汚染物質または不純物は不活性シェルの細孔からリガンド活性化コアに侵入し、リガンドの疎水性およびイオン性の官能基性により相互作用する一方、抱合体は非結合モードで回収される。
【００５６】
一実施形態において、好ましくは多糖タンパク質抱合体を精製するのに使用される混合モードクロマトグラフィー媒体は、分子量カットオフが７００ｋＤａである不活性多孔質シェル、およびオクチルアミンリガンドを含む活性化コア（例えばCaptoTM Core ７００、GE Health Care）を有する。
【００５７】
一実施形態において、精製される多糖タンパク質抱合体は、Ｈｉｂ抱合体、髄膜炎菌抱合体、肺炎球菌抱合体もしくは腸チフス菌抱合体から選択され、またはより好ましくはＨｉｂ抱合体である。
【００５８】
カラムは充填前にバッファーで前もって平衡化される。当技術分野において既知の任意の適切なバッファー、トリス、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、またはこれらの組み合わせを使用してもよいが、これらに限定されない。ｐＨの範囲を少なくとも５．０〜７．５の範囲に保つのに適したバッファー作用物質を使用することが好ましい。
【００５９】
一実施形態において、バッファーのｐＨは、５.０〜７.５の間、５.０〜７.０の間、５.１〜６.９の間、５.２〜６.８の間、５.３〜６.７の間、５.４〜６.６の間、５.５〜６.５の間、５.６〜６.４の間、５.７〜６.３の間、５.８〜６.２の間、５.９〜６.０の間、またはｐＨ６．０である。ｐＨは必要に応じ酸／塩基を加えることで維持してもよい。
【００６０】
本発明に係る方法において使用され得るバッファーは、２０ｍＳ／ｃｍよりも低い、１５ｍＳ／ｃｍよりも低い、１０ｍＳ／ｃｍよりも低い、９ｍＳ／ｃｍよりも低い、８ｍＳ／ｃｍよりも低い、７ｍＳ／ｃｍよりも低い、６ｍＳ／ｃｍよりも低い、５ｍＳ／ｃｍよりも低い、４ｍＳ／ｃｍよりも低い、３ｍＳ／ｃｍよりも低い、２ｍＳ／ｃｍよりも低い、１ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.９ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.８ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.７ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.６ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.５ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.４ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.３ｍＳ／ｃｍよりも低い、０.２ｍＳ／ｃｍ、または０.１ｍＳ／ｃｍよりも低い伝導度を有する。本書において使用されるとき、伝導度は溶液、例えばバッファー溶液の、静電気的相互作用、例えば汚染物質のマトリクスへの結合または解離に影響を与える能力である。伝導度はバッファー組成物のイオン濃度を変化させることで調整してもよい。一般に、低い伝導度のバッファーが好ましい。低い伝導度とは、１０ｍＳ／ｃｍより低い、好ましくは５ｍＳ／ｃｍより低い、より好ましくは３ｍＳ／ｃｍより低い伝導度と解される。一実施形態において、バッファーの伝導度は約８ｍＳ／ｃｍ〜約０．５ｍＳ／ｃｍの間、５ｍＳ／ｃｍ〜約１ｍＳ／ｃｍの間、約４ｍＳ／ｃｍ〜約１.５ｍＳ／ｃｍの間、約３ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍである。
【００６１】
一実施形態において、典型的なバッファーは、１０ｍＭリン酸、ｐＨ５．８〜６．２、伝導度約２ｍＳ／ｃｍを含んでいる。
【００６２】
抱合体は２〜１２０ｃｍ／ｈｒの速度で充填される。速度は好ましくは１０〜１２０ｃｍ／ｈ、２０〜１１０ｃｍ／ｈ、３０〜１００ｃｍ／ｈ、４０〜９０ｃｍ／ｈ、５０〜８０ｃｍ／ｈ、または６０〜７０ｃｍ／ｈである。流速は汚染物質がマトリクスと相互作用するのに十分な時間を有するよう調節することができる。サンプルは１以上の繰り返し充填工程で、３００ｃｍ／ｈｒ以上の速度で充填してもよい。必要ならば、粗製抱合体をクロマトグラフィーカラムに充填する前に膜ろ過してもよい。所望の抱合体は混合モード樹脂の空隙を通過し、フロースルーにおいて回収される一方、不純物はリガンド活性化コア内に疎水性および／またはイオン性相互作用によって捕捉される。カラムをリン酸バッファー、ｐＨ５．８〜６．２を使用して洗浄し、残留する非特異的にマトリクスに付着した抱合体を回収する。精製された抱合体は高伝導度希釈バッファー、ｐＨ５．８〜６．２で希釈し、０，４５μおよび０．２２μフィルターでろ過する。
【００６３】
（表１−混合モードクロマトグラフィーによる多糖タンパク質抱合体（Ｈｉｂ抱合体）精製後の遊離多糖（ＰＲＰ）、遊離キャリアタンパク質（ＴＴ）およびＥＤＣの含量）
【表１】
2016526037.tif 000002
カラム（ａ）は、汚染物質を表している。
カラム（ｂ）は、混合モードクロマトグラフィーによる多糖タンパク質抱合体精製前の汚染物質の量を表している。
カラム（ｃ）は、混合モードクロマトグラフィーによる多糖タンパク質抱合体精製後の汚染物質の残量を表している。
カラム（ｄ）は、汚染物質の残量のパーセンテージ割合を表している。
カラム（ｅ）は、汚染物質のパーセンテージ減少を表している。
【００６４】
遊離ＰＲＰは、Tsai, C.M. et al. (1994) Vaccine 12(8): 700-706.に記載された方法により決定された。
【００６５】
多糖抱合体ワクチン中の遊離タンパク質は、当業者に知られた方法により決定され得る。Ｈｉｂ抱合体中の遊離破傷風トキソイド（遊離ＴＴ）の量（破傷風トキソイドに結合したＰＲＰ）は、蛍光検出器を使用した強陰イオン交換クロマトグラフィーにより決定された。弱いイオン相互作用を有する分子が最初に溶出され（遊離ＴＴ）、続いて、強いイオン相互作用を有する分子が溶出される（Ｈｉｂ抱合体）。遊離ＴＴは、移動相のｐＨを破傷風トキソイドのｐＩより低くすることで溶出された。遊離ＴＴの量は、サンプルのピークエリアを、破傷風トキソイドを用いて生成された濃度（μｇ／ｍＬ）に対してプロットされた標準曲線のピークエリアと比較することにより、定量された。
【００６６】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を定量するために、２００ｎｍのＵＶ吸収によるキャピラリー中での直接検出よるキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）が用いられた。サンプル中のＥＣＤ含量は、サンプルのピークエリアを、異なる量のＥＤＣを用いて生成された標準曲線のピークエリアと比較することにより定量された。
【００６７】
（表２−混合モードクロマトグラフィーにより精製されたＨｉｂ抱合体の分子サイズ分布）
【００６８】
【表２】
2016526037.tif 000003
精製Ｈｉｂ抱合体の分子サイズ分布は、セファロースＣＬ４Ｂクロマトグラフィー（WHO Technical Report Series, No. 897, 2000 pg 27-56）により、解析された。図２に示されるように、３つのサイズ分布範囲の画分、すなわち、＜０．２、０．２−０．５および０．５−１．０ＫＤが回収され、ＰＲＰ含量が解析された。結果は、抱合体の７９．４％が＜０．２ＫＤの分子量範囲に入っていることを示しており、これは、混合モードクロマトグラフィーが効率的に低分子量抱合体を除去していることを示している。
【００６９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例証される。実施例は本発明を例示するために提供されていることは理解されるべきである。説明および例証された実施形態および実施例から、当業者であれば本発明に対する種々の修飾または本発明への付加を行うことができる。このような修飾または付加は、本発明の精神の範囲内とみなされる。
【実施例】
【００７０】
（実施例１−ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたＨｉｂ抱合体の精製（３．０Ｌスケール））
セファロースＣＬ−２Ｂ（GE Healthcare）が充填されたクロマトグラフィーカラム（BPG, GE Healthcare）は、平衡化バッファー（０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む、１０ｍＭ  リン酸バッファー）により平衡化される。３０００ｍＬの粗Ｈｉｂ抱合体（破傷風トキソイドに結合したＨｉｂ多糖）は、平衡化される前のカラム上にロードされる。粗抱合体は、分配係数（Ｋｄ）に基づき分画され（画分１−画分４）、これにより、所望の抱合体（画分２）がフロースルー中にて回収される。残りの画分（画分１、画分２および画分３）は、汚染物質を含んでいる（図１ａ）。
【００７１】
（実施例２ａ−混合モードクロマトグラフィーを用いたＨｉｂ抱合体の精製（０．０８Ｌスケール））
８０ｍＬの粗Ｈｉｂ抱合体、すなわち、破傷風トキソイドに結合したＨｉｂ多糖（１０ｍｇ／ｍＬ濃度、ｐＨ５．８、および伝導度２０ｍＳ／ｃｍ）は、平衡化バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、および伝導度２ｍＳ／ｃｍ）を用いて１０回希釈され、１０００ｋＤａカセット（Millipore Biomax）を用いて、その容積のおよそ５倍に濃縮される。抱合体は、続けて、平衡化バッファーを用いて、約２０回透析濾過（diafilter）され（３０ｋＤａメンブレンを使用）、最初の容量に濃縮される。
【００７２】
ＢＰＧカラム（GE Healthcare）に充填された混合モードマトリックス（CaptoTM Core 700 matrix, GE Healthcare）は、平衡化バッファーにより平衡化され、抱合体が１０ｃｍ／ｈの速度でロードされる。未結合の抱合体が回収される。マトリックスに非特異的に結合している残りの抱合体を回収するために、平衡化バッファーを用いてカラムの洗浄を行う。回収された抱合体は、ｐＨ５．８−６．２のリン酸バッファーを用いて希釈され、０．４５μフィルターおよび０．２μフィルターを通して濾過される。
【００７３】
（実施例２ｂ−混合モードクロマトグラフィーを用いたＨｉｂ抱合体の精製（３．０Ｌスケール））
３０００ｍＬの粗Ｈｉｂ抱合体、すなわち、破傷風トキソイドに結合したＨｉｂ多糖（１０ｍｇ／ｍＬ濃度、ｐＨ５．８、および伝導度２０ｍＳ／ｃｍ）は、平衡化バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、および伝導度ｍＳ／ｃｍ）を用いて１０回希釈され、１０００ｋＤカセット（Millipore Biomax）を用いて、その容積のおよそ３倍に濃縮される。抱合体は、続けて、平衡化バッファーを用いて、約２５回透析濾過（diafilter）され（３０ｋＤａメンブレンを使用）、最初の容量に濃縮される。
【００７４】
Ａｘｉｃｈｒｏｍカラム（GE Healthcare）に充填された混合モードマトリックス（CaptoTM Core 700 matrix, GE Healthcare）は、平衡化バッファーにより平衡化され、抱合体が６０ｃｍ／ｈの速度でロードされる。未結合の抱合体が回収される。マトリックスに非特異的に結合している残りの抱合体を回収するために、平衡化バッファーを用いてカラムの洗浄を行う。抱合体は、ｐＨ５．８−６．２のリン酸バッファーを用いて希釈され、０．４５μフィルターおよび０．２μフィルターを通して濾過される。
【００７５】
（表３−抱合体精製における、混合モードクロマトグラフィーを用いた場合の、ゲル濾過クロマトグラフィーに対する利点）
【表３】
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【図１ａ】
2016526037.tif 000005
【図１ｂ】
2016526037.tif 000006
【図２】
2016526037.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月19日(2015.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
細菌感染は、特に発展途上国において、幼児および子供を苦しめる疾患の主要な原因の１つであり続けている（Osrin, David et al. (2004) Current Opinion in Infectious Diseases 17(3): 217-224; Thaver, Durrane, and Zaidi, Anita K.M. (2009) Pediatric Infectious Disease Journal 28(1): S3-S9; Saez-Llorens, Xavier et al. 2003 Lancet 361(9375): 2139-2148; Thapar, Nikhil et al. 2004 Lancet 363(9409): 641-653）。最も一般的な病原体はHaemophilus influenzae ｂ型、Streptococcus pneumoniae、Neisseria meningitidis (Pollard, Andrew J. et al. (2009) Nature Reviews Immunology 9(3): 213-220)、Staphylococcus aureus、Shigella、almonella、Vibrio cholerae等である。多数の子供が毎年上記の感染の結果死亡している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
したがって、ワクチンに使用するための相当量の多糖タンパク質抱合体の生産は、従来技術の複雑さを原因とする収量の低さおよび生産コストの高さのため妨げられている。それゆえ、生産を容易にし、より時間がかからず、同一の時間で高い収量を提供する、多糖タンパク質抱合体の精製のための代替的な方法の開発が必要とされている。本発明は予想外に効率的な、混合モードクロマトグラフィー(Orlovsky, Vlad et al (2011) Chromatography Today, 4(3) 24-28; WO2005082483; WO2009131526, WO2010005364)を適用し、多糖タンパク質抱合体から不純物または汚染物質を除去する方法を提供する。この驚くべき有効な方法は、多糖タンパク質抱合体の精製に使用される従来技術に関わる長年の問題に立ち向かうものである。本発明に係る方法は、操作が単純であり、容易に実施可能であり、より少ないリソースのみを必要とし、かつより多い収量および安定した品質を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
「精製された多糖タンパク質抱合体」または「精製された抱合体」は、共存する汚染物質を除去され、汚染物質の量が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、または９５％以上減少した多糖タンパク質抱合体を意味する。一実施形態において、汚染物質の量は８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上減少する。「精製された抱合体」または「精製された多糖タンパク質抱合体」は共存する汚染物質を、特に遊離多糖および遊離タンパク質含有量について、薬局方の規定、または監督当局が規定する程度、または抱合体における適切な免疫学的な相関が立証する程度に除去した抱合体を意味するとも解される。例えば、破傷風トキソイドと抱合したＨｉｂ多糖の場合、遊離多糖の含有量は２０％未満でなければならず、遊離した破傷風トキソイドは１％未満でなければならず、かつ少なくとも６０％の抱合体は、セファロースＣＬ−４Ｂにおけるサイズ除外クロマトグラフィーで評価した際に０．２ＫＤ（分散係数）以内の分子量分布でなければならない(Haemophilus Type b Conjugate Vaccine, Indian Pharmacopoeia, 2010 Vol 3 pg 2395-2398)。分子量分布を計測する技術は当業者の間で公知である(WHO Technical Report Series, No. 897, 2000 pg 27-56; WHO Technical Report Series No. 658, 1981, Annex 6; McCauley, J. A. et al. J Biol Stand (1981) 9: 461-468; Parisi, L et al. (1999) J Chromatogr A 847: 209-211)。同様に、遊離多糖および遊離タンパク質の含有量は、当業者に知られている任意の定量技術により測定することができる(Tsai, C.M. et al. (1994) Vaccine 12(8): 700-706; Ashwell, G. Methods Enzymology, (1957) 3: 73-105; Guo, YY et al. (1998) Biologicals 26(1):33-38; Lei, QP et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264; Stoscheck, Christa M. (1990) Methods in Enzymology 182: 50-68)。多糖タンパク質ワクチンにおいて、汚染物質、特に遊離多糖（抱合体は貯蔵期間中に分解することがあり、ワクチン中の遊離多糖のレベルが上昇し、多糖タンパク質抱合体の免疫原性に有害な影響を与えうるため）のレベルは可能な限り低いことが好ましい。一実施形態において、遊離多糖の含有量は１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、または２％以下である。一実施形態において、遊離多糖の含有量は１０〜１５％の間、５〜１０％の間、または０〜５％の間である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
抱合体の生産に使用可能である多糖抗原は、当業者に既知の様々な細菌に含まれ得る。細菌の例にはHaemophilus influenzae ｂ型（例えばH. influenza莢膜多糖、リン酸ポリリボシルリビトール［ＰＲＰ］）、Neisseria meningitidis（例えばN. meningitidis血清群Ａ莢膜多糖（ＭｅｎＡ）、N. meningitidis血清群Ｃ莢膜多糖（ＭｅｎＣ）、N. meningitidis血清群Ｙ莢膜多糖（ＭｅｎＹ）、N. meningitidis血清群Ｗ莢膜多糖（ＭｅｎＷ）、Streptococcus pneumoniae（例えば血清群１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）、Staphylococcus aureus、Salmonella enterica serovar Typhi、Vibrio cholerae、Shigella flexneri等が包含される。特に興味深い多糖抗原は、Haemophilus influenzae ｂ型、Neisseria meningitidis、Streptococcus pneumoniae、およびSalmonella enterica serovar Typhiの莢膜多糖から得られるものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
多糖に抱合するのに使用され得る担体タンパク質は当業者に既知である。抱合体を製造するのに一般的に使用される担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７等の無毒性ミュータント、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、Neisseria meningitidisの膜外タンパク質Ｃ、Haemophilus influenzaeのタンパク質Ｄ、Salmonella, pneumolysinの膜外タンパク質Ｃ（無毒化バリアントを含む）、Streptococcus pneumoniaeの肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）または肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、組み換えPseudomonas aeruginosaエキソシンＡ（ｒＥＰＡ）等である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
（実施例２ｂ−混合モードクロマトグラフィーを用いたＨｉｂ抱合体の精製（３．０Ｌスケール））
３０００ｍＬの粗Ｈｉｂ抱合体、すなわち、破傷風トキソイドに結合したＨｉｂ多糖（１０ｍｇ／ｍＬ濃度、ｐＨ５．８、および伝導度２０ｍＳ／ｃｍ）は、平衡化バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、および伝導度２ｍＳ／ｃｍ）を用いて１０回希釈され、１０００ｋＤａカセット（Millipore Biomax）を用いて、その容積のおよそ３倍に濃縮される。抱合体は、続けて、平衡化バッファーを用いて、約２５回透析濾過（diafilter）され（３０ｋＤａメンブレンを使用）、最初の容量に濃縮される。
【国際調査報告】
2016526037.tif 000008
2016526037.tif 000009