(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上の断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記２個以上の断片の再構成が各断片に融合された分子の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である分子の別個の断片を再構成することを含む分子相互作用を検出するための分子断片相補性アッセイであって、前記断片の再構成の検出が付加的な内因性因子を必要とせず、前記分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素であることを特徴とする分子断片相補性アッセイ。
【請求項２】
ａ）
ｉ）第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された第２分子と第３分子の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の第１断片と、
ｉｉ）前記第１分子に相違するか若しくは同一である第２分子、
を含む第１融合産物を生成するステップと、
ｂ）
ｉ）前記第１分子の第２断片と、
ｉｉ）前記第１分子若しくは第２分子に相違するか若しくは同一である第３分子と、
を含む第２融合産物を生成するステップと、
ｃ）第１及び第２融合産物を相互に接触させるようにするステップと、
ｄ）第１分子の再結合した断片の会合によって再獲得された活性について試験するステップであって、前記活性の試験が付加的な内因性因子を必要とせず、前記再会合が第２及び第３分子の相互作用によって仲介されるステップと
を含んでなる生体分子相互作用を試験するための方法であって、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である方法。
【請求項３】
前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つがタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つが酵素であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つが核酸であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化タンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された他の分子間の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の第１断片が第２分子に融合しており、前記第１分子の第１断片と第２断片の会合が、第１分子の活性の再形成によって検出されるアッセイであって、前記断片の会合の検出が付加的な内因性因子を必要とせず、前記アッセイが蛍光産生シグナルを検出することを含む、前記第２分子と分子相互作用する分子を検出するためのアッセイを含む方法であって、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である方法。
【請求項７】
（ａ）
１）第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された第２分子と第３分子の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の第１断片であって、前記第１分子の第２断片と連合しているときに付加的な内因性因子を必要せずに検出可能な活性を提示できる第１分子の第１断片と、
２）（ａ）の１）の第１断片に結合できる第２分子とを含む第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と
２）（ｂ）の（１）の第２断片に結合できる第３分子と
を含む第２融合生成物と
を含み、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である組成物。
【請求項８】
２個以上の相補的断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記断片の再構成が断片に融合された第２分子と第３分子との相互作用を通してのみ行われ、前記断片の再構成の検出が付加的な内因性因子を必要としないタンパク質である第１分子の相補的断片であって、別個の分子である第２分子又は第３分子に各々が融合している第１分子の相補的断片を含む組成物であって、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である組成物。
【請求項９】
第２及び第３分子が相互に結合できることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
（ａ）
１）第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された第２分子と第３分子の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の断片であって、第１分子の第２断片と連合しているときに付加的な内因性因子を必要せずに検出可能な活性を提示できる前記第１分子の第１断片と、
２）第１分子の第１断片に融合している第２分子と
を含む第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と、
２）第２若しくは第３分子と
を含む第２融合産物と
をコードする配列を含む、融合生成物をコードする核酸分子を含んでなる組成物であって、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である組成物。
【請求項１１】
請求項８若しくは請求項１０のいずれかに記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項８若しくは請求項１０のいずれかに記載の組成物の使用又は請求項１１に記載の宿主細胞の使用を含むアッセイ。
【請求項１３】
（ａ）第１断片と、第１断片に相補的な第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された第２分子と第３分子の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の断片であって、前記第１断片と第２断片が連合しているときに付加的な内因性因子を必要とせずに検出可能な活性を提示できる前記第１分子の相補的断片に関連する生体分子相互作用、又は（ｂ）第２若しくは第３分子からの２つのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインの結合に関連する生体分子相互作用についての試験方法であって、前記方法が
１）
（ａ）前記第１分子の第１断片であって、第１分子の第２断片と連合しているときに検出可能な活性を提示できる前記第１分子の第１断片と、
（ｂ）第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
の融合を生成するステップ、
２）
（ａ）前記第１分子の第２断片と、
（ｂ）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
の融合を生成するステップと、
３）１）及び２）の融合を相互に接触させるようにするステップと、
４）前記活性について試験するステップと
を含んでなる方法であって、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である方法。
【請求項１４】
（ａ）
１）第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された他の分子間の相互作用を通してのみ行われるタンパク質である第１分子の第１断片であって、第１分子の第２断片と連合しているときに付加的な内因性因子を必要せずに検出可能な活性を提示できる前記第１分子の第１断片と、
２）第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と、
２）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第２融合生成物と
を含み、前記第１分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である組成物。
【請求項１５】
（ａ）
１）第１断片と第２断片に断片化可能なタンパク質であって、前記断片化がタンパク質の機能を可逆的に消失させ、前記第１断片と第２断片の再構成が断片に融合された他の分子間の相互作用を通じてのみ行われるタンパク質である分子の第１断片であって、前記分子の第２断片と連合しているときに付加的な内因性因子を必要せずに検出可能な活性を提示できる前記分子の第１断片と、
２）第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第１融合生成合産物と、
（ｂ）
１）前記分子の第２断片と、
２）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第２融合生成物と
をコードする配列を含む、融合生成物をコードする核酸分子を含んでなる組成物であって、前記分子がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である組成物。
【請求項１６】
請求項１４又は請求項１５のいずれかに記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４又は請求項１５に記載のいずれかの組成物又は請求項１６に記載の宿主細胞の使用を含むアッセイ。
【請求項１８】
マウスジヒドロ葉酸還元酵素に基づくＰＣＡを実行することを含むタンパク質アッセンブリーの動態を検出する方法であって、前記ＰＣＡが付加的な内因性因子を必要としない方法。
【請求項１９】
請求項１、２、６又は１３のいずれか１つに記載の方法を含む、タンパク質アッセンブリーの動態を検出する方法。
【請求項２０】
マウスジヒドロ葉酸還元酵素に基づくＰＣＡを実行することを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法であって、前記ＰＣＡが付加的な内因性因子を必要としない方法。
【請求項２１】
請求項１、２、６又は１３のいずれか１つに記載の方法を含む、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするする方法。
【請求項２２】
蛍光産生シグナルを発生させることを特徴とする請求項１、２、１３、２０又は２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１、２、６、１３、２０又は２１のいずれか１つに記載の任意のアッセイを実行することを含む、分子複合体が２以上の相互作用ドメインを含んでいるかどうかを決定する方法。
【請求項２４】
前記第２及び第３分子の相互作用を誘発する他の少なくとも１つの分子が存在することを特徴とする請求項１、２、６、１３、２０又は２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
相互作用を仲介する少なくとも１つの他の分子の存在のために第１又は第２分子の部分間での相互作用が存在することを特徴とする請求項２０又は２１のどちらかに記載の方法。
【請求項２６】
化合物に対して、前記化合物の存在下でマウスジヒドロ葉酸還元酵素に基づくＰＣＡを実行すること及び任意の阻害と前記（化合物の）存在を相関させることを含むＰＣＡにおける分子相互作用を阻害する可能性をテストする方法であって、前記ＰＣＡが付加的な内因性因子を必要としない方法。
【請求項２７】
（ａ）２個以上の断片に断片化可能な酵素であって、前記断片化が酵素の活性を可逆的に消失させ、前記断片の再構成が断片に融合された他の分子間のタンパク質−タンパク質相互作用を通してのみ行われ、前記断片に融合された分子間のタンパク質−タンパク質相互作用を通して再構成された断片を含む微生物及び／又は細胞を選択的に生存させる特性を持つ酵素をコードする遺伝子を少なくとも２個の断片に分けることによって、プローブタンパク質断片を合成するステップと、
（ｂ）相互作用について試験される１以上の分子との融合タンパク質を構成するステップと、
（ｃ）（ｂ）で入手したタンパク質を１以上のプローブ断片と融合させるステップと、
（ｄ）融合タンパク質を共発現させるステップと、
（ｅ）前記相互作用について試験される分子の相互作用を通して行われる酵素活性の再構成を検出するステップであって、前記再構成の検出が前記酵素の微生物及び／又は細胞を選択的に生存させる特性を使用して行われ、付加的な内因性因子を必要としないステップと
を含んでなる、生きている微生物及び／又は細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法であって、前記酵素がマウスジヒドロ葉酸還元酵素である方法。
【請求項２８】
融合タンパク質が前記マウスジヒドロ葉酸還元酵素のＮとＣ末端断片を含むペプチドを有しており、ＧＣＮ４ロイシンジッパー配列に融合されていることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
相補的融合タンパク質の再構成が試験タンパク質の相互への結合によって触媒されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
新規薬物標的を同定するために請求項２７に記載の方法を利用することを特徴とする、タンパク質−タンパク質相互作用を誘発若しくは阻害する化合物のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニング又はハイスループットスクリーニングする方法であって、前記スクリーニングが付加的な内因性因子を必要としない方法。
【請求項３１】
標的が生物学的に活性なタンパク質である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的に活性なタンパク質がレセプター、阻害剤、酵素又はイオンチャネルを含む群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規な遺伝子産物の機能のアッセイに関する。本発明はさらに、タンパク質断片相補性アッセイ（PCA:Protein fragment Complementation Assays）に関する。PCAは、多種多様なタンパク質−タンパク質、タンパク質−RNA、タンパク質−DNA、タンパク質−炭水化物又はタンパク質−有機小分子間の相互作用を、そうした相互作用の研究に適した様々な細胞状況において検出できるようにする。
発明の背景
転写、翻訳、及び代謝若しくはシグナル形質導入経路を含む生物学における数多くのプロセスは非共有的に結合した多酵素複合体によって媒介されている1,101。複数タンパク質又はタンパク質−核酸複合体の形成は最も効率的な化学機構を作り出す。現代の生物学的研究の多くは、細胞プロセスに含まれるタンパク質を同定することと、それらの機能を決定することと、そしてそれらがどのように、いつ、そしてどこで特異的経路に含まれている他のタンパク質と相互作用するのかに関心を持っている。さらに、ゲノム・シークエンシング・プロジェクトにおける急速な進歩に伴って、タンパク質の機能的アッセンブリーを作り上げるタンパク質相互作用の詳細な明細目録である「タンパク質連鎖地図（protein linkage map）」を定義するための方法の開発が必要である2,3。生物学的プロセスにおけるタンパク質アッセンブリーを理解することが重要であるにもかかわらず、in vivoでのタンパク質−タンパク質相互作用を調べるための便利な方法は少ない4,5。そのためのアプローチには、化学的架橋結合試薬と染料結合タンパク質間の共鳴エネルギー移動の使用を含む102,103。強力で一般的に使用されている方法である酵母の二ハイブリッドシステム（two-hybrid system）は、新規のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するためと、特異的タンパク質相互作用のアミノ酸決定因子を調べるために使用されている4,6-8。このアプローチを使用すると、cDNAライブラリーを含む極めて多数のクローンを迅速にスクリーニングすることができる。だがこの方法には、相互作用が特異的な環境（S.Cerevisiae「サッカロミセス・セレビシエ」の核）下で行われなければならないという限界を含んでいるので、一般には誘導した対構成性相互作用を識別するために使用することはできない。
近年、Johnsson and Varshavsky108によってユビキチン・ベースド分断タンパク質センサー（USPS）9と呼ばれるタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための新規な方法が証明された。この方法は、ユビキチンの三次構造を認識するサイトゾルプロテアーゼ（ユビキチナーゼ）によるユビキチンへのN末端融合を伴うタンパク質の開裂に基づいている。この方法は、相補的なN及びC末端断片からのタンパク質ユビキチンの三次構造の再構成に加え、さらに重要なのは、これらの断片に融合したオリゴマー化ドメインによりこの再構成を強化することに依存している。再構成は、サイトゾルプロテアーゼ（ユビキチナーゼ）による構成した生成物の特異的タンパク質分解として検出される。この著者らは、リポータータンパク質−ユビキチンC末端断片の融合は、C末端断片に相補的であるユビキチンのN末端断片と共発現させた場合にのみ、ユビキチナーゼによって同様に開裂させられることを証明した。観察可能なユビキチナーゼ活性の再構成は、N及びC末端断片がGCN4ロイシンジッパーを通して結合している場合にしか発生しなかった109,110。そこでこの著者らは、この「分断遺伝子」方法をタンパク質−タンパク質相互作用に対するin vivoアッセイと細胞内のタンパク質アッセンブリー動態の解析法としての使用を提案した。残念ながら、この方法を行うには付加的な細胞因子（この場合にはユビキチナーゼ）が必要とされるので、この検出法はcDNAライブラリーの高速なスクリーニングには役立たなかった。
Rossi,F.,C.A.CharltonとH.M.Blau（1997）（Proc.Nat.Acad.Sci.（USA）94,8405-8410）は、ｂ−ガラクトシダーゼ（b-gal）のaとw断片の古典的相補性と、形質導入されたC2C12菌芽細胞系中におけるラパマイシンによるタンパク質FKBP12とラパマイシンの哺乳類標的の誘導オリゴマー化による相補性の誘導とに基づいたアッセイについて報告している。b-gal活性の再構成は、数種の蛍光検出アッセイを使用して、基質蛍光のジ-b-D-ガラクトピラノシドを用いて検出される。このアッセイは本発明と一部の類似性を有しているが、幾つかの重大かつ明確な相違点がある。第１に、この特定相補性アプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用の検出を含む広範囲の応用において30年間以上に渡って使用されてきた。Krevolin,M.and D.Kates（1993）（米国特許出願第5,362,625号）は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためにこの相補性検定を使用することを開示している。さらに哺乳類細胞におけるb-gal相補性の達成も又以前に報告されている（Moosmann,P.and S.Rusconi（1996）Nucl.Acids Res.24,1171-1172）。だがここに提示する個々独立のPCAは完全に新規にデザインされた相互作用検出アッセイであって、出願人の研究所から発表された出版物以外には出願前にいかなる方法でも記載されていない。第２に、本出願には、全てが新規にデザインされたアッセイであって、極めて多数の酵素若しくはタンパク質検出体からの分子相互作用アッセイを開発するための一般的な方法を記載しているに対し、b-galアッセイは新規ではなく、また、いままでよく記録された応用に一般的な方法として採用されていなく進歩も与えられていない。
USPSと同様に、酵母の二ハイブリッド方法も、検出のために特異的細胞コンパートメントにしか存在しない付加的な細胞機構を必要とする。従って、活性を検出するために他のタンパク質を必要とせずに、アッセイ自体として、断片からの特異的酵素活性の再構成を使用する検出システムが必要とされている。好ましくは、このアッセイはそれらの活性を検出するために他のタンパク質を必要としない単量体又は多量体酵素の断片のオリゴマー化支持相補性を含むのであろう。さらにその上、酵素の構造が既知である場合は、再構成断片が活性であることを確保するため、そして再構成の検出のストリンジェンシーを変化させる目的で突然変異を誘発するために酵素の断片をデザインすることが可能であろう。しかし、下記で説明するように、構造に関するの知識は相補的断片のデザインにとっての前提条件ではない。このようなアプローチのデザインにおいて許される柔軟性は、他の検出システムではおそらく適しないであろう環境下でも適するであろう。
ヒトゲノム研究における近年の進歩は、新規遺伝子の同定に急速の進歩をもたらしてきた。生物学的と製薬学的研究の応用においては、例えば、疾患表現型に含まれていることが証明されている遺伝子に対して、新規遺伝子産物の機能を決定することに関する差し迫った必要性がある。それはゲノムを基礎とする製薬学的研究の動きが停滞する問題の解決において、単純かつ自動化可能な機能アッセイの開発が前進する必要があるからである。新規遺伝子の機能を定義する際の第１のステップは、適切な環境において他の遺伝子産物との相互作用を決定することであり、つまり、タンパク質が機能的アッセンブリーの一部として他のタンパク質若しくは他の生体高分子と特異的に相互作用するので、新規遺伝子の機能を調査するための適切な方法は、他の遺伝子産物との物理的関係を調べることである。
酵母の「二ハイブリッドシステム」のようなタンパク質相互作用についてのスクリーニング法は、分子生物学を変化させてきたが、狭く限定された細胞とコンパートメント状況と複雑な細胞機構（転写）の働きが必要な状況において、構成的に相互作用するタンパク質の特異的なタイプ若しくはタンパク質と他の分子との相互作用を研究するためにしか使用できない。特異的な問題の状況下でのタンパク質相互作用に対し合理的にスクリーニングするためには、もっと柔軟なアプローチが必要とされている。特に、分子相互作用を検出するだけでなく、これらの相互作用を特異的に及び生物学的に重要であると検証するためにも必要な基準を満たすアッセイが必要である。
そうした基準を満たすアッセイの特徴を下記にのリストした。
１）in vivo又はin vitroでのタンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA/RNA又はタンパク質−薬物相互作用の検出ができるようにすること。
２）例えば特異的生物、細胞の種類、細胞コンパートメント又はオルガネラ（細胞小器官）内のような適切な状況におけるこれらの相互作用の検出ができるようにすること。
３）誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用（細胞増殖又は阻害因子によるような）の検出ができるようにすること。
４）アッセイの感受性を調節することによって、非特異的タンパク質−タンパク質相互作用に対する特異性を識別できること。
５）細胞内におけるタンパク質アッセンブリーの動態の検出ができるようにすること。
６）分子相互作用についてcDNA、有機小分子、又はDNA若しくはRNAライブラリーをスクリーニングできるようにすること。
発明の概要
本発明は、先行技術においてほとんど研究されていない上記の必要性を満たすことを目的とする。本発明は、他のタンパク質を含む他のバイオポリマー、核酸、炭水化物とのタンパク質相互作用を検出するための、または、潜在的な治療的価値を持つ化合物についての小分子ライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、それらの活性を検出するために他のタンパク質を必要としない単量体酵素断片のオリゴマー化により支援された相補性あるいは相補化（oligomerization-assisted complementation）を提供することを試みる。そうした実施態様の１つでは、本発明によってE.coli中に定義された酵素断片の相補性によるジヒドロ葉酸還元酵素活性の再構成に基づくタンパク質断片相補性アッセイ（PCA）が提供される。このアッセイは特異的タンパク質−タンパク質相互作用（つまり、ロイシンジッパーの相互作用）を検出するために付加的な内因性因子を必要とせず、分子間相互作用についてcDNA、核酸、小分子若しくはタンパク質デザインライブラリーをスクリーニングするために便利に拡張することができる。さらに、本アッセイはあらゆる細胞環境若しくはコンパートメントにおけるタンパク質相互作用の検出に適したものであり、さらに原核系及び真核系の両方において、誘導（induced）タンパク質相互作用と構成性（constituitive）タンパク質相互作用とを識別するために使用することができる。
タンパク質相補性アッセイ（PCA）をデザインするための１つの特定方法は、下記の特徴の利用に基づいている。すなわち、１）比較的に小さく単量体であるタンパク質若しくは酵素であること、２）その構造と機能の情報に関して非常に多くの文献があること、３）それについて、in vivoとin vitroの両方において、タンパク質の再構成若しくは酵素の活性について単純なアッセイ法が存在すること、４）それについて、真核と原核細胞における過剰発現が証明されていることである。これらの基準が満たされれば、酵素の構造は下記の基準に基づいて遺伝子を２つに分断するためのポリペプチド鎖における最良の位置を決定するのに使用される。すなわち、１）断片が連続ポリペプチドのサブドメインに存在する結果になければならなく、つまり、結果としての断片はタンパク質のサブドメイン構造を破壊しないこと、２）１つの断片内に触媒性とコファクター結合部位全部が含まれていなければならないこと、及び３）結果として生じる新しいＮ及びＣ末端は、長いペプチドリンカーの必要を回避するため、そしてタンパク質結合の方向依存性についての試験ができるように、タンパク質の同一面上になければならないことである。
本発明を適正に実施するのに上記の基準全てが満たされる必要はないことが理解されなければならない。酵素は、小さく、好ましくは10-40kDaであることが好ましい。単量体酵素が好ましいが、多量体酵素も本発明の範囲内に含まれると考えられる。本アッセイでは、二量体タンパク質チロシナーゼを使用することができる。PCAをデザインする上で、酵素の構造に関する情報は付加的な長所であるが、必ずしも必要とはされない。実際に、酵素アミノグリコシドキナーゼへの応用においてエキソヌクレアーゼ分解生成タンパク質断片（exomuclease digestion-generated protein）の組合せとそれに続く方向性タンパク質の展開に基づくPCAを開発するための付加的な方法が役立っている。原核細胞における過剰発現が生じることが好ましいが、これは必要条件ではない。当業者であれば、（選択された酵素の）酵素触媒部位が同一分子上で絶対的には必要とされないことを理解できるであろう。
本特許出願は、PCAにおいて特定酵素を使用するための合理的理由及び基準を説明している。図１は、PCAの一般的説明を示している。タンパク質若しくは酵素に対する遺伝子は、合理的に２個以上の断片に分割される。分子生物学的技術を用いて、選択された断片がサブクローニングされ、さらに各々の5’末端へ、相互作用することが既知であるか相互作用すると思われるタンパク質を融合させる。その後、これらのDNA構造体の細胞内へのコトランスフェクション若しくは形質転換が実行される。この断片からのプローブタンパク質若しくは酵素の再構成は、テストタンパク質の相互への結合によって触媒され、再構成は幾つかのアッセイを用いて観察される。これらのアッセイは、融合した相互作用するタンパク質が酵素の再構成を触媒した場合にしか働かないであろうことを理解することが重要である。つまり、再構成された酵素活性が観察されることは融合したタンパク質の相互作用の尺度でなければならない。
本発明の好ましい実施態様は、酵素のジヒドロ葉酸還元酵素に基づくPCAに焦点を当てている。真核細胞におけるアッセイ、ライブラリースクリーニング、及びシグナル導入経路のような統合的な生化学的経路の研究に関する問題への特異的適用を含むように、この方法が拡張できることが提示されている。優性若しくは劣性の薬物選択又は代謝サルベージ経路としての機能ができる酵素に基づくものを含む付加的なアッセイが開示されている。さらに、着色若しくは蛍光産物を産生する酵素類に基づくPCAも又開示されている。本発明は、新規な遺伝子の機能テスト、薬理学的活性についての天然産物若しくは化合物ライブラリーのスクリーニング、及びDNA、RNA若しくは炭水化物と相互作用する新規な遺伝子産物の同定のためのPCA方法をどのようにして一般化かつ自動化にするかを開示している。本発明はさらに、そうした分子相互作用を阻害若しくは活性化できる潜在的な治療的価値を有する化合物ライブラリーから天然産物若しくは小分子を同定するためにPCA法をどのように適用するか、そして酵素基質及び酵素の小分子の阻害剤をどのように同定するかについても開示する。最後に、本発明は、産業上利用できる酵素若しくは生物学的活性を備えたペプチドのデザインを通してタンパク質工学の実験を行うために、どのようにPCA法を使用できるかについて開示する。
ここでは、in vivoでのタンパク質相互作用を検出するためのアッセイをデザイン及び実行するための単純な方法が開示されている。我々は、最少培地で増殖したE.coliにおいて共発現させたときに２個の断片を発現するクローンの生存ができるようにする、天然mDHFR（murine dihydrofolate reductase）の相補的断片をデザインしたが、この場合に内因性細菌DHFR（dihydrofolate reductase）の基礎活性は競合的阻害であるトリメトプリムによって阻害される（図３）。活性の再構成はDHFRのN及びC末端断片の両方がGCN4ロイシンジッパー配列へのC末端融合として共発現させられたときにしか発生しなかったが、これは断片の再構成にはN及びC末端融合ペプチド間でのロイシンジッパーの形成が必要であることを示している。アッセンブリー界面（Ile114からVal、Ala若しくはGlyへ）における不安定化突然変異から生じた細胞倍増時間の連続的な増加は、選択的条件下で観察された細胞生存が、Z-F[3]とZ-F[1,2]との非特異的相互作用とは反対に、mDHFR断片[1,2]と断片[3]との間の特異的なロイシンジッパーにより支援された会合の結果であることを証明している。下記に幾つかの詳細な、そして多数の追加の実施例を示す。
以前にユビキチン・ベースド分断タンパク質センサー（USPS）9を用いて証明されているように、タンパク質−断片相補性法はin vivoでのタンパク質−タンパク質相互作用の平衡及び動態の状況を研究するために使用できる。しかし、DHFR及びその他のPCAはより単純なアッセイである。それらは完全システムであり、付加的な内因性因子を必要とせず、相補性の結果はそれ以上の操作を必要とせずに直接的に観察される。このため、ここに記載されたE.coli細胞生存アッセイは、タンパク質−タンパク質相互作用についてcDNAライブラリーをスクリーニングするために特に有用である。細胞中におけるmDHFR発現はDHFRに対する蛍光高親和性基質の類似体との結合によって監視できる26。
PCAにはさらに、in vivoでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するための他の全ての方法（USPSを除く）から区別する幾つかの特徴がある。我々は、アッセイのストリンジェンシーの調節をできるようにし、２つのタンパク質の会合に対して動態及び平衡状態定数の推定値を入手するために使用できるであろう酵素の相補的断片をデザインした。例えば、DHFRにおいて野生型酵素Ile114からVal、Ala若しくはGlyへの点突然変異（point mutations）はDHFR活性の再構成のストリンジェンシーを変化させる。特異的なタンパク質−タンパク質相互作用についての平衡状態及び動態パラメーターの推定値を定めるには、野生型若しくは不安定化突然変異体のDHFR断片を用いて、既知の親和性で相互作用する２つのタンパク質を用いた一連のDHFRのPCA実験を実行できるであろう。DHFRのPCAに対して、未知の相互作用を使用した比率とこのモデルシステムでの細胞増殖率との比較で、未知の相互作用の強度推定値が得られるのであろう。
これは、本発明のタンパク質相補性アッセイはこれらの実施態様に限られないので、本発明がここに提示されたDHFR又は他のPCAに限定すべきではないと理解されなければならない。さらに、PCAはそれらを使用できる状況に限定されるべきではない。シグナル発生ペプチド配列を添加することによって細胞中の特異的コンパートメントへのPCA融合に標的を定めるように構造体をデザインできるであろう27,28。構成性タンパク質−タンパク質相互作用に対する誘導は、生化学的イベントによって誘発される相互作用の場合に、PCAの真核バージョンによって識別できよう。同様に、このシステムは標的タンパク質と発現ライブラリーと間の新規な誘導性タンパク質−分子会合をスクリーニングするのに使用するために適するであろう。
本発明はさらに、下記のステップを含む生体分子相互作用を検出するための方法に関する。
（ａ）適切なリポーター分子を選択するステップと、
（ｂ）断片化がリポーター機能の可逆的な消失を生じさせるように前記リポーター分子の前記断片化を実行するステップと、
（ｃ）前記リポーター分子の断片を他の分子へ個別に融合若しくは付着させるステップと、次いで、
（ｄ）前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片を再会合させるステップ。
本発明はさらに、分子の別個の断片の再構成を含む分子相互作用を検出するための分子断片相補性アッセイを提供するが、前記断片の再構成は他の分子プロセスから独立して、前記分子の各断片に融合した分子ドメインの相互作用によって行われる。
別の態様では、本発明は下記のステップを含む生体分子相互作用をテストする方法に関する。
ａ）
ｉ）第１分子の第１断片と、
ｉｉ）前記第１分子とは相違若しくは同一の第２分子、
を含む第１融合産物を生成するステップと、
ｂ）
ｉ）前記第１分子の第２断片と、
ｉｉ）前記第１分子若しくは第２分子とは相違若しくは同一の第３分子、
を含む第２融合産物を生成するステップと、
ｃ）第１及び第２融合産物を相互に接触させるようにするステップと、
ｄ）第１分子の再結合した断片の会合によって再獲得された活性について試験するステップであって、前記再会合が第２及び第３分子の相互作用によって仲介されるステップ。
別の新規特徴では、本発明は、第１分子の断片が第２分子へ融合させられ、そして断片の連合が第１分子の活性の再構成によって検出されるアッセイを含む方法に関する。
本発明はさらに、下記を含むグループから選択された生成物を含む組成物を提供する。
（ａ）
１）連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の第１断片と、
２）（ａ）の（１）の断片に結合できる第２分子と
を含む第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と
２）（ｂ）の（１）の断片に結合できる第３分子と
を含む第２融合生成物と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方。
本発明はさらに、各々が第２分子の別個の断片に融合されている、第１分子の相補的断片を含む組成物を提供する。
本主題の発明者らはさらに、ある融合生成物をコードする核酸分子を含む組成物を提供するが、その分子は下記の生成物を含むグループから選択された生成物をコードする配列を含んでいる。
（ａ）
１）連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の断片と、
２）第１分子の断片に融合している第２分子と
を含む第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と、
２）第２若しくは第３分子と
を含む第２融合産物と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方。
本発明はさらに、（ａ）連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の相補的断片、又は（ｂ）第２若しくは第３分子からの２つのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインの結合と連合した生体分子相互作用についての試験方法であって、前記方法が下記ステップを含んでなる方法に関する。
１）
（ａ）連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の第１断片と、
（ｂ）第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
の融合を生成するステップ、
２）
（ａ）前記第１分子の第２断片と、
（ｂ）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
の融合を生成するステップと、
３）１）及び２）の融合を相互に接触させるようにするステップと、
４）前記活性について試験するステップ。
本発明はさらに、下記生成物を含むグループから選択された生成物を含む組成物を提供する。
（ａ）
１）連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる（第１）分子の第１断片と、
２）第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第１融合生成物と、
（ｂ）
１）前記第１分子の第２断片と、
２）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第２融合生成物と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方。
本発明は又、ある融合生成物をコードする核酸分子を含む組成物に関し、その分子は下記のいずれかをコードする配列を含んでいる。
（ａ）
１）連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる分子の第１断片と、
２）第１タンパク質-タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第１融合生成合産物、或いは、
（ｂ）
１）前記分子の第２断片と、
２）前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと
を含んでなる第２融合生成物、或いは、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方。
本発明はさらに又、タンパク質アッセンブリーの動態を検出して、PCAを実行することを含むcDNAライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
別の実施態様では、本発明はさらに化合物に対して、前記化合物の存在下でＰＣＡを実行すること及び任意の阻害と前記（化合物の）存在を相関させることを含むＰＣＡにおける分子相互作用を阻害する可能性をテストする方法を提供する。
又別の実施態様では、本発明は生きている生物及び／又は細胞内におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法を提供するが、その方法は、
（ａ）酵素をコードする遺伝子を少なくとも２個の断片に分けることによって優性選択を可能にする酵素からプローブタンパク質断片を合成するステップと、
（ｂ）相互作用について試験される１以上の分子との融合タンパク質を構成するステップと、
（ｃ）（ｂ）で入手したタンパク質を１以上のプローブ断片と融合させるステップと、
（ｄ）融合タンパク質を共発現させるステップと、
（ｅ）酵素活性の再構成を検出するステップと
を含むものである。
本発明はさらに、
（ａ）適切なリポーター分子を選択するステップと、
（ｂ）前記リポーター分子の断片化を実行するステップと、
（ｃ）前記リポーター分子の断片を他の分子へ個別に融合若しくは付着させるステップと、次いで、
（ｄ）前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片を再会合させるステップと
を含んでなる生体分子相互作用の検出方法を提供する。
最後に、本発明はさらに上記アッセイと組成物を提供するステップを含む、遺伝子療法に影響を及ぼす新規方法を提供する。
本発明は、ハイレベルの単純性及び適用範囲の広さを示している初めてのタンパク質相補性アッセイであり、先駆的である。例として示されている実施態様は、mDHFRに基づくタンパク質−断片相補性アッセイ（PCA）であり、このときロイシンジッパーがDHFR活性の再構成を引き起こす。この活性は、実際的かつ安価であるE.coliの生存アッセイによって検出される。このシステムは、ロイシンジッパー二量体形成の検出におけるmDHFR断片相補性の使用を具体的に示しているが、in vivoでの未知の特異的タンパク質−分子相互作用の検出にも適するであろう。
本発明は、本発明の内容に従って数多くの他の酵素類を選択して使用できるので、ここに提示されているPCAに限定されないと理解されなければならない。そうしたマーカーの例は、Kaufman（1987 Genenetic Eng.9:155-198）及びその中に所見される引用文献並びに本出願の表１に見出すことができる。
当業者には、本発明には２つの相互作用する分子としてのロイシンジッパーの使用に限定されないことは明白なはずである。事実上、数多くの他の種類のタンパク質−分子相互作用を使用することができ、それらは本発明の内容に従って同定することができる。タンパク質−分子相互作用に含まれる既知の種類のモチーフは当分野においてよく知られている。
本出願は数多くの先行技術文書に関しており、ここではその全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本発明のその他の特徴と長所は、下記の好ましい実施態様の説明と添付された実施例と請求項から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、PCAの一般的説明を示している。分子生物学の技術を用いて、選択された酵素（をコードする遺伝子）の断片がサブクローニングされ、さらに各々の5’末端に相互作用することが既知であるか、相互作用すると思われるタンパク質を融合させる。その後細胞内へのこれらのDNA構造体のコトランスフェクション又は形質転換を実行し、数種のアッセイを用いて再構成が観察される。
図２は、本発明の実施態様の１つにおいて使用される融合構造体のスキームである。ヘキサヒスチジンペプチド（6His）、ホモ二量体形成GCN4ロイシンジッパー（Zipper）及びmDHFR断片（１、２及び３）が示されている。構造体のラベルは、DNA構造体及びこれらの構造体から発現されたタンパク質の両方を同定するために使用されている。
図３の（Ａ）は、最少培地プレート上のE.coli生存アッセイを示している。コントロールはプレートの左側でpQE-30を含んでいるE.coli（挿入図なし）。右列は天然mDHFRをコードするpQE-16を含んでいるE.coliである。パネルＩの各プレートの左側が構造体Z-F[1,2]を用いての形質転換で、各プレートの右側が構造体Z-F[3]を用いての形質転換である。パネルＩＩは構造体Z-F[1,2]とZ-F[3]を用いての形質転換である。パネルＩＩＩは構造体コントロール−F[1,2]とZ-F[3]を用いての形質転換である。全プレートは0.5mg/mlのトリメトロプリムを含有している。ＩからＩＩＩのパネルにおいて、右側のプレートは1mMのIPTGを含有している。
（Ｂ）は、不安定化したDHFR突然変異体を用いるE.coliの生存アッセイである。パネルＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Ille 114Val]を用いてのE.coliの形質転換である。パネルＩＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Ille 114Ala]を用いての形質転換である。挿入図は、右側プレートの５倍の拡大図である。パネルＩＩＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Ille 114Gly]を用いての形質転換である。全プレートは0.5mg/mlのトリメトロプリムを含有している。右側のプレートは1mMのIPTGを含有している。
図４は、mDHFR断片の共発現を描出している。（Ａ）は、プラスミドDNAのHincII分解から生じた制限パターンのアガロースゲル解析である。レーン１は構造体F[1,2]とZ-F[3]を用いてコトランスフォームされたE.coliから単離されたDNAを含有している。レーン２と３は各々構造体Z-F[3]と構造体F[1,2]を用いてコトランスフォームされたE.coliから単離されたDNAを含有している。フラグメント移動（単位：bp）は右側に示されている。
（Ｂ）は、mDHFR断片発現のSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアミドゲル電気泳動法）解析である。レーン１から５は、形質転換されていないE.coli（レーン１）の粗溶解液、Z-F[1,2]を発現しているE.coli（20.8kDa、レーン２）、Z-F[3]（18.4kD、レーン３）、コントロールのF[1,2]（14.2kDa、レーン４）、及びZ-F[1,2]＋Z-F[3]（レーン５）を示している。レーン６は2mlの共精製されたF[1,2]とZ-F[3]を除いた40mLを示している。矢印は重要なタンパク質を指している。分子量マーカーの移動（単位：kDa）は右側に示されている。
図５は、DHFRのPCAのような生存アッセイに基づくPCAの一般的特徴を例示している。このアッセイは細菌又は哺乳類細胞環境で使用できる。挿入された標的DNAは、重要なタンパク質（若しくはタンパク質ドメイン）をコードする既知の配列であっても、又はcDNAライブラリーであってもよい。
図６は、30分間の35S-Met-Cysパルス標識化後のCOS細胞溶解液のオートラジオグラフを表している。発現パターンは本質的にE.coliにおいて観察される発現パターンと同一である（図４参照）。細胞内に形質転換（若しくはコトランスフェクト）されたDNAは各レーンの上に示されている。
図７は、mDHFR細菌PCAのタンパク質工学への応用の結果を示している。２つのセミ−ランダムロイシンジッパーライブラリーが創製され（本文で説明されているように）、各々がmDHFR断片の１つのN末端へ挿入された。E.coliにおいて結果として生じたジッパー−DHFR断片ライブラリーのコトランスフォーメーション及び選択的培地上でのプレーティングが、良好に相互作用するロイシンジッパーを含むクローンの生存をできるようにした。14個のクローンが単離され、ジッパーがシークエンシングされ、
0004262778.tif 000002
位置での残基が同定された。
0004262778.tif 000003
対は、誘引対合（電荷：電荷、電荷：中性極若しくは中性極：中性極）又は反発対合（電荷：電荷）を有していることについて各クローンに対してスコア付けされた各タイプの相互作用の数に従って分類された。各クローンに対する相互作用の総数は６であり、相互作用はヒストグラム上に総計されている。
本発明に含まれるその他の目的、長所及び特徴は、下記の一例と見なして本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない添付の図面を、参照しながら好ましい実施態様の非制限的説明を読めばより明白になるであろう。
好ましい実施態様の説明
PCAのためのmDHFRの選択
タンパク質−断片相補性検定（PCA）をデザインする際に、我々は下記が当てはまる酵素を同定することを試みた。１）相当に小さく単量体であること、２）それに対して構造及び機能の情報が存在すること、３）それに対してin vivo及びin vitro測定の両方について単純なアッセイが存在すること、及び４）それに対して真核及び原核細胞における過剰発現が証明されている酵素であること。マウスDHFR（mDHFR）は上記に列挙したPCAに対する基準全てを満たす。原核及び真核のDHFRは、細胞１炭素代謝にとっての中心（酵素）であり、原核生物及び真核生物の両方において細胞生存のために絶対的に必要とされる。詳細には、それはセリン、メチオニン、プリン類及びチミジレートの生合成のために必要とされる１炭素単位のトランスファーにおいて使用するためにジヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸への還元を触媒する。DHFRは小さな（17kD〜21kD）単量体タンパク質である。種々の細菌及び真核生物起源からのDHFRの結晶構造は既知であり、基質結合部位及び活性部位残基は決定されており111-114、タンパク質断片の合理的デザインができる。数多くのDHFRのフォールディング（折り畳み）、触媒作用及び動態は広範に調査されている115-119。酵素活性は、in vitroでは単純な分光光度アッセイ120によって、若しくはin vivoでは最終産物DHFRの不在で増殖した細胞中の細胞生存によって監視することができる。DHFRは特に抗葉酸薬であるトリメトプリムによって阻害される。哺乳類のDHFRは細菌のDHFRに比較して、トリメトプリムに対する親和性が12,000分の１の低さであるので121、細菌にとって致死的レベルのトリメトプリムの存在下でも、mDHFRを発現ができる細菌の増殖は、活性酵素内としてのmDHFR断片の再構成を選択するための有効な手段である。mDHFRのハイレベルの発現はトランスフォームされた原核細胞又はトランスフェクトされた真核細胞において証明されている122-126。
デザインに関する考察
mDHFRはヒトDHFR（hDHFR）配列とは高度の配列同一性を共有しており（91％同一性）、E.coli酵素とは高度に同族であるので（29％同一性、68％相同）、これらの配列は視覚的にスーパーインポーズ可能な三次構造を共有している111。mDHFRとhDHFRの結晶構造の比較は、それらの活性部位が本質的に同一であることを示唆している127,128。DHFRは、アデニン結合部位（残基47〜105＝断片[2]）及び不連続ドメイン（残基１〜46＝断片[1]及び106〜186[3]；数字はマウス配列順序に従っている）の２つのドメイン129,130を形成している、３つの構造断片から形成されていると説明されてきた。葉酸結合ポケット及びNADPH結合溝は、主として断片[1]及び[2]に属する残基によって形成されている。断片[3]は触媒作用には直接的に関係しない。
断片[2]及び断片[3]の接合部位でのhDHFRの101から108の残基は、タンパク質の両末端と同一面上に存在する不規則なループを形成している。我々は、活性部位とNADPHコファクター結合部位の最小の破壊を引き起こすように、断片[1,2]と[3]の間の残基107でmDHFRを開裂させることを選択した。mDHFRの天然N末端と開裂によって創製された新規N末端は酵素の同一面上で発生し112,128、これにより本試験で使用されたロイシンジッパーのような会合断片への各断片のN末端の容易な共有付着が可能になった。このシステムを用いることにより、我々は活性酵素としてのmDHFR断片のロイシンジッパー支持アッセンブリーを入手した。
実施例１
実験プロトコール
DNA構造体
変異原性及びシークエンシングオリゴヌクレオチド類をギブコ社（Gibco BRL）から購入した。制限エンドヌクレアーゼ類及びDNA修飾酵素類をファルマシア社（Pharmacia）及びニューイングランド・バイオラブ（New England Biolabs）から入手した。独自のフレーム内停止コドンを持っているmDHFR断片を、ヘキサヒスチジンペプチド及びGCN4ロイシンジッパーを用いてフレームから下流及びフレーム内でpQE-32（Qiagen製）内にサブクローニングした（図１、図２）。全ての最終構造体は、誘導プロモーター−オペレーターエレメント（tac）、コンセンサスリボソーム結合部位、開始コドン及びヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド類を含有しているQiagen製pQEシリーズのベクターに基づいていた。全長mDHFRはpQE-16（Qiagen製）から発現される。
GCN4ロイシンジッパーを含んでいる発現ベクター
GCN4ロイシンジッパーの235から281の残基（Sall/BamHI 254bpフラグメント）を酵母発現プラスミドpRS169から入手した。BamHI部位での凹み末端（recessed terminus）にはクレノウポリメラーゼ（Klenow polymerase）（のコード遺伝子）を挿入し、断片はSalI/HindIII（filled-in）を用いて線形化されたpQE-32へ連結された。その産物である構造体Zは、GCN4ロイシンジッパー残基に先行するヘキサヒスチジンtag及び13個の残基がその後に続いている配列Met-Arg-Gly-Serをコードしているオープンリーディングフレームを持っている。
DHFR断片の精製
真核細胞の一時的の発現ベクターのpMT3（pMT2に由来）16を、断片[1,2]及び断片[3]のサブクローニング及び個別発現を許容する特徴を含んでいるmDHFRのPCR生成を行うための鋳型として使用した。全長590bpの産物を生成するためにPCR突然変異誘発のメガプライマー法29を使用した。mDHFRのN及びC末端をコードしており、さらにコーディング配列外で新規BspE1部位を含有しているヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド類を使用し、並びに断片[1,2]の後に新規停止コドンを創製するためにオリゴヌクレオチドを使用し、その後に断片[3]をサブクローニングするのに使用するために新規SpeI部位が続いた。
新規の複数クローニング領域の構築及びDHFR断片[1,2]及び[3]のサブクローニング
新規制限部位のSnaBI、NheI、SpeI及びBspEIを含有する相補的オリゴヌクレオチド類は一緒にハイブリダイズされてEcoRIに相補的な5’及び3’オーバーハングを生じ、ユニークなEcoRI部位でpMT3内に挿入された。590bpのPCR産物（上記）をBspEIを用いて分解し、BspEIで線形化されたpMT3内へ挿入し、構造体[1,2,3]を産生した。610bpのBspEI/EcoNI断片（DHFR断片[1,2]をコードしており、新規停止（コドン）及びEcoNIまで断片[3]が続く）をEcoNIで挿入し、BspEIl/HpaIを用いて開かれたpMT3内へサブクローニングして構造体F[1,2]を産生した。DHFR断片[3]（in-frame停止コドンなし）をコードする構造体[1,2,3]の250bpのSpeI/BspEI断片を同一酵素を用いて開かれたpMT3内へサブクローニングした。pMT3における断片[3]から下流の野生型DHFR配列の停止コドンを次のように挿入した。インサートされた断片[3]及び野生型断片[3]の両方に存在するEcoNIを用いての開裂、683bp介在配列の除去及びベクターの再連結は断片[3]と野生型停止コドンとの構造体である構造体F[3]を産生した。
発現構造体の精製
構造体F[1,2]及びF[3]各々の1051bp及び958bpのSnaBI/XbaI断片をBgIII（filled-in）/NheIを用いて開かれた構造体Z内へサブクローンニングし、構造体Z-F[1,2]及びZ-F[3]が産生した（図２）。コントロール発現構造体については、ジッパーをコードする180bpのXmaI/BspEI断片が構造体Z-F[1,2]から取り除かれ、構造体コントロール−F[1,2]が産生した（図２）。
安定性ミュータントの精製
Ile114（野生型mDHFRの番号）でミュータントを生じさせるために部位指向性突然変異誘発30を実施した。突然変異誘発反応を、新規BamHI部位を産生するサイレント突然変異をコードするオリゴヌクレオチド類を用いて、pBluescript SK＋（Stratagene）内へサブクローニングされた構造体Z-F[3]のKpnI/BamHI断片上で実施した。制限酵素によって同定された推定ミュータントの206bpのNheI/EcoNI断片をZ-F[3]内へ逆にサブクローニングした。突然変異をDNAシークエンシングによって確認した。
E.coli生存アッセイ
プラスミドpRep4（lacレプレッサーの構成性発現のために、Qiagenから）を含んでいるE.coli株BL21は反応力を持たされ、適切なDNA構造体を用いてトランスフォームされ、50mg/mlカナマイシン、100mg/mlアンピシリン及び0.5mg/mlトリメトプリムを含有する最少培地プレート上でプレーティングする前に最少培地を用いて２回洗浄された。各形質転換混合液の半分が1mMのIPTGの不在下で、そして残り半分が存在下でプレーティングされた。全プレートは66時間に渡り37℃に置かれた。
E.coli増殖曲線
コトランスフォーメーションから入手したコロニーを増殖させ、アンピシリン、カナマイシン並びに指示された場合はIPTG（1mM）及びトリメトプリム（1mg/ml）を補給された最少培地10mlに接種するために使用された。L−アーガー（＋カナマイシン及びアンピシリン）上でトランスフォーメーション混合液をプレーティングし、制限解析によって２種の構造体の存在をスクリーニングすることによって、Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Gly]のコトランスフォーマント（共形質転換体）を非選択的条件下で入手した。全増殖曲線の入手を３回実施した。高額密度を測定するためにアリコートを定期的に抜き出した。倍増時間は早期対数増殖について計算された（0.02と0.2の間のOD600）。
タンパク質過剰発現及び精製
細菌は約1.0のOD600に対する適切な抗生物質の存在下でTerrific Broth31中で増殖させられた。発現を、1mMのIPTGの添加及びさらに３時間のインキュベーションによって誘発した。粗抽出物の解析のため、誘導細胞150mlからのペレットが負荷染料中で煮沸させることによって溶解させられた。溶解液は微小遠心分離によって明澄化され、SDS-PAGE32によって解析された。タンパク質精製のために、構造体Z-F[1,2]及びZ-F[3]を用いてコトランスフォームされた50mlの誘導E.coliからの細胞ペレットを超音波処理で溶解させ、不溶性ペレットの変性精製を製造業者の説明の通りにNi-NTA（Qiagen）を用いて行った。タンパク質を段階的イミダゾール勾配を用いて溶出した。生じた分画をSDS-PAGEによって解析した。
結果
PCAのためのmDHFR断片のデザイン
mDHFRは、ヒトDHFR（hDHFR）配列と高度の配列同一性を共有している。マウス結晶構造の座標は入手できなかったので、我々はhDHFR構造についてのデザイン考察を基礎に置いた。DHFRは、アデニン結合ドメイン（F[2]）及び不連続ドメイン（F[1]及びF[3]）の２つのドメインを形成している３つの構造断片を含んでいると説明されている13,18。葉酸結合ポケット及びNADPH結合溝は、主としてF[1]及びF[2]に属する残基によって形成されている。hDHFRの残基101から108は、両方の末端とタンパク質の同一面に存在する不規則なループを形成している。このループはF[2]とF[3]の間の接合部で発生する。残基107でmDHFRを開裂させることにより、我々はF[1,2]及びF[3]を創製し、従って活性部位及び基質結合部位の最小の破壊を引き起こした。mDHFRの天然N末端及び開裂によって創製された新規N末端はGCN4ロイシンジッパーのC末端へ共有的に付着させられた（図１）。
E.coli生存アッセイ
図２は、発現された構造体の一般的機能及び本試験で使用された術語を示している。図３（パネルＡ）は、トリメトプリムの存在下での細菌とZ-F[1,2]及びZ-F[3]をコードする構造体とのコトランスフォーメーションの結果を示しており、明らかに選択的環境下でのコロニー増殖がmDHFRの両方の断片を発現する細胞においてしか可能でないことを証明している。Z-F[1,2]若しくはZ-F[3]のいずれか単独の存在下では増殖は見られない。コロニー増殖にとってIPTGを用いてのタンパク質発現の誘導は必須である（図３Ａ）。mDHFRの両方の断片上におけるロイシンジッパーの存在は、唯一ロイシンジッパーを持っているmDHFR断片をコードする両方のベクターとの細菌のコトランスフォーメーションによって例示されるように不可欠である（図３Ａ）。全長mDHFRを用いて形質転換されたコントロールE.coliの増殖は非誘導細胞中では発現のレベルが低いためにIPTGの不在下で可能であることに注目しなければならない。
トリメトプリムと一緒に増殖できる細菌中に両方のプラスミドが存在することの確認を、単離されたコロニーから精製されたプラスミドDNAの制限解析から行った。図４（Ａ）は、構造体Z-F[1,2]からの1200bpのHinclI制限断片並びに構造体Z-F[3]からの599bpのHinclI制限断片の存在を明らかにしている。同様に存在するのはpRep4の935bpのHinclI断片である。融合タンパク質の過剰発現は図４（Ｂ）に示されている。全部の場合において、予想分子量のタンパク質の過剰発現は粗溶解液のSDS-PAGE上で明白である。変性条件下で共発現されたタンパク質の精製は、Coomassie染色SDS-PAGEによる解析で明白になる均質性の２本のバンドを生じさせた（図４Ｂ）。
突然変異体の安定性
出願人らは、断片アッセンブリーによるmDHFR活性の再構成が特異的であるかどうかを試験するためにF[3]の突然変異体を生成した。タンパク質安定性は、タンパク質の疎水性コア中の側鎖量を変化させることによって低下させることができる9,22-25。mDHFRの残基Ile114は、活性部位から単離されたF[1,2]とF[3]の界面でのコアb-ストランドにおいて発生する。Ile114は、F[1,2]ではIle51及びLeu93とファンデルワールス接触している。我々はIle114をVal、Ala又はGlyへ突然変異させた。図３（パネルＢ）は、E.coliと構造体Z-F[1,2]及び突然変異Z-F[3]構造体とのコトランスフォーメーションの結果を示している。Z-F[3:Ile114Ala]とのコトランスフォーメーションから入手したコロニーはZ-F[3]若しくはZ-F[3:Ile114Val]とコトランスフォームしたコロニーより緩徐に増殖した。入手した形質転換体の数は、コロニーが観察された場合には統計的有意に相違していなかったが、これはZ-F[1,2]及びZ-F[3]、Z-F[3:Ile114Val]若しくはZ-F[3:Ile114Ala]のいずれかと一緒にコトランスフォームされた細胞が等価の生存率を有していることを意味している。突然変異体Z=F[3:Ile114X]の過剰発現は、クーマシー（Coomassie）染色SDS-PAGEによって測定されたように、Z-F[3]と同一範囲内であった（データは示されていない）。
我々はさらに液体培地中のコトランスフォーマントの倍増時間を測定することによってmDHFR断片の再構成の相対効率を比較した。最少培地中の倍増時間は全ての形質転換体について一定であった（データは示されていない）。IPTGの不在下でのトリメトプリムによる選択的環境は、非誘導細胞中での発現レベルが低いために全長DHFRをコードするpQE-16を用いて形質転換された場合を除いてE.coliの増殖を防止した。IPTGを用いてのmDHFR断片発現の誘導はコトランスフォームされた細胞の生存を許容したが（Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Gly]の場合を除いて）、倍増時間はトリメトプリムの不在下での増殖に比較して統計的無視できないように増加した。Z-F[1,2]＋Z-F[3]、Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Val]及びZ-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Ala]を発現する細胞について測定された倍増時間は、トリメトプリム及びIPTGの不在下でpQE-16を発現するE.coliの倍増時間に比較して各々1.6倍、1.9倍及び4.1倍高かった。IPTGの存在は、全長MDHFRを用いて形質転換されたE.coliの増殖を予想外に妨害した。増殖は葉酸代謝最終産物であるチミン、アデニン、パントテン酸塩、グリシン及びメチオニンの添加によって部分的に回復した（データは示されていない）。これは、mDHFRの誘導過剰発現は、酵素へ結合することによる葉酸プールの欠失の結果として最少培地で増殖させたときにE.coliにとって致死性であることを示唆している。
別の実施態様では、出願人はそれに対して直接平衡及び動態パラメーターが既知であるZ-F[1,2]及びZ-F[3]のGCN4ロイシンジッパーにおいてこれらの既知の数値をPCAから誘導されたパラメーターと相関させることによって転突然変異を発生させる（Pelletier and Michnick、準備中）。このモデルシステムにおける細胞増殖率と未知のものを使用したDHFRのPCAについての増殖率とを比較すると、未知の相互作用の強度に関する推定値が得られるであろう。これは、特異的タンパク質−タンパク質相互作用に対する平衡及び動態パラメーターの推定値の決定を可能にするはずである。
本発明は、mDHFRに基づくタンパク質−断片相補性アッセイ（PCA）を具体的に説明しているが、このときロイシンジッパーはDHFR活性の再構成を指示する。活性は実際的かつ安価であるE.coli生存アッセイによって検出された。このシステムは、ロイシンジッパー二量体形成の検出におけるmDHFR断片相補性の使用を例示しており、in vivoでの未知の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用の検出に適用できるであろう。
E.coliアミノグリコシドキナーゼ：エキソヌクレアーゼ−分子進化方法を用いたPCAの最適化及びデザイン
出願人らは、相補的酵素断片を産生するために上記で説明した工学技術／デザイン方法を使用できることを証明したが、そうした断片が溶解性、フォールディング能（迅速なフォールディング）、プロテアーゼ耐性、若しくは酵素活性を含む最高の物理的特性を持つことが期待されるような方法でタンパク質が進化しなかったことは明白である。工学技術／デザイン方法の好ましい実施態様は、エンドヌクレアーゼ／進化アプローチである。この方法はそれだけで使用することも、若しくは工学技術／デザイン方法と結合して使用することもできる。このアプローチの長所は、原則として、タンパク質構造に関する事前の知識は必要ではないこと、PCAにとって最適な断片が選択されること、そしてこれらの断片も又最適な特徴を持っていることにある。最適な相補的断片の選択後、これらの断片は複数回の無作為突然変異誘発に暴露される。突然変異誘発は、化学的突然変異誘発と結合した準最適のPCR若しくはDNAシャッフリングによって達成される（Stemmer,W.P.C.（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,10747-10751）。下記では、E.coliのような原核細胞又は酵母若しくは哺乳類細胞系のような真核細胞の優性選択のために使用できる抗生物質耐性マーカーの例であるアミノグリコシドキナーゼ（AK）の場合の総合的な方法について記載する。AKの構造は既によく知られておいるので、方法（１）は可能であろうが、しかし我々は上記でDHFRについて定義された方法（１）を方法（２）と結合することを選択した。
実験プロトコール
最適化／選択方法は次の通りである。
エキソヌクレアーゼ分解産物に基づくAK断片のライブラリーの生成
欠失の組み重ねセットをAK遺伝子の5’及び3’端で精製しる。一方向欠失を精製するためには、AK遺伝子の隣に位置する領域にユニークな制限部位を導入する。5’及び3’末端では、PCRによって突起状の3’末端を備えた「外側の」付着部位（各々、SphI及びKpnI）及び凹み状の3’末端を備えた「内側の」付着部位（各々、BglII及びSalI）が付加される。SphI及びBglII（又はKpnI及びSalI）での開裂はフランキング配列へ戻させる突起状の末端及びAK遺伝子内に導く凹み状の末端の精製を生じさせる。E.coliエキソヌクレアーゼIII及びS1ヌクレアーゼを用いての分解（Henikoff,S.（1987）Methods in Enzymology 155,156-165）は、凹み状の末端だけからの１セットの組み重ねの欠失を産生する。従って、10mgのDNAをSphI及びBglII（又はKpnI及びSalI）を用いて分解し、フェノール−クロロホルムで抽出し、12.5UのエキソヌクレアーゼIIIが添加する。10分間に渡って30sec間隔でアリコートを採取し、２UのS1ヌクレアーゼを含む溶液内に入れる。新たに精製された末端にT4のDNAポリメラーゼ（１サンプル当たり0.1U）を添加し、ベクターのセットを平滑末端連結（１サンプル当たり10Uのリガーゼ）によって再び閉鎖する。各時点での欠失の平均長をセットの制限解析によって決定する。これは5’若しくは3’末端から欠失したAK遺伝子のセットを生じさせる。この操作は、活性スクリーニングにおいて産物を直接に使用できるように、pQE-32−ジッパー構造体において直接に行われる。
AK活性についてのスクリーニング
断片相補性の要件を決定するときの第１ステップとして、我々は単独で活性であるAKの最小のN末端及びC末端断片を決定しなければならない。欠失のセットは個々にE.coliのBL21細胞内に個別に形質転換され、AK断片の発現はIPTGによって誘導される。G418の存在下で有意な数のコロニーが現れるセットは、活性を保持しているN及びC末端AK断片の適切な長さを示すのに役立つ。このため断片相補性はこれらの限度内から採取された断片を用いて行われなければならない。ジッパー指向性断片相補性は次のように検出される。適切な欠失のセット、若しくはセットのプールがBL21内にコトランスフォームされ、IPTGを用いて発現が誘導され、相違する濃度のG418の存在下における増殖が監視される。最も効果的な相補的産物を生じさせるので、高濃度のG418の存在下で増殖する大きなコロニーが選択される。
「DNAシャッフリング」を用いた最適AK断片の指向性進化
最適な断片が選択された後、個々の断片は5’及び3’定常部プライミング領域がAKのN若しくはC末端相補的断片の隣に位置することを許容するSphI及びKpnIでの制限分解によって取り除かれる。これらのオリゴヌクレオチド類（2-4mg）をDnase I（0.005units/uL、100uL）を用いて分解し、10〜50ヌクレオチドの断片を低融点アガロースから抽出する。その後PCRが、0.2mM dNTP、2.2mM Mg2Cl（若しくは最適以下PCRのためには0mM）、50mM KCl、10mMトリスHCl、pH9.0、0.1％ TritonX-100を含有するPCR混合液中のTaqポリメラーゼ（2.5units/ul）を使用して、断片化されたDNAを用いて実施される。PCR計画は94C/60秒、94C/30秒、55C/30秒、72C/30秒、30〜50回、72C  5分である。サンプルは、アガロースゲル上で再構成された完全断片の外観を監視するために、25サイクル後に５サイクル毎に採取される。プライマーレスPCR生成物をその後1：40若しくは1：60に希釈し、さらに20サイクルに対するプライマーとしての5’及び3’相補的定常部領域オリゴと一緒にPCRのための鋳型として使用する。最終生成物をSphI及びKpnIを用いて制限分解し、発現プラスミドの最終ライブラリーを生じさせるために産物をpQE32−ジッパー内へ逆にサブクローニングする。以前と同様に、E.coli BL21細胞は連続的に109の推定効率でC末端若しくはN末端相補的断片発現ベクターを用いて連続的にトランスフォームされ、最終的に細胞は相補的断片を用いてコトランスフォームされる。E.coliは1mg/mlのG418を含むアガロースプレート上で増殖させられ、16時間後に最大コロニーが選択され、G418の濃度を上昇させて液体培地中で増殖させられる。G418への最大耐性を示しているクローンがその後選択され、最大耐性以上に達すると進化が終了される。さもなければDNAシャッフリング法が繰り返される。最後に、最適断片がシークエンシングされ、物理的特性及び酵素活性が評価される。この最適化AKのPCAはこれで酵母及び哺乳類細胞系を含むあらゆる他の細胞種類において優性選択について試験する準備が整う。この方法は、薬物若しくは毒素又は着色若しくは蛍光産物を生じさせる酵素に優性若しくは劣性選択を与える酵素に基づく何らかのPCAを開発するために使用することができる。後者の２つの場合には、進化プロセスのエンドポイントは少なくとも、無傷の野生型酵素に対するシグナルの再達成又はシグナルの増強である。この方法は酵素が単量体、二量体若しくは多量体構造であるかどうかという酵素構造の知識が欠如している場合にも使用することができる。しかし、酵素構造の知識は、下記に記載するのと同様にこの方法を適用することを妨害はしない。
認識できるように、酵素構造の知識はPCAをデザインするために分子の進化を使用する方法をより効果的にするために使用できる。この場合には、酵素構造はDHFRについて実施されたように、問題のタンパク質の最小ドメインを定義するために使用される。N若しくはC末端断片に対して完全に無作為の長さの断片を発生させる代わりに、我々はエキソヌクレアーゼ期中に少なくとも２つのドメイン中１つをコードする断片を選択する。例えば、AKの場合は、２つの明らかにに定義されたドメインをN末端における1〜94残基及びC末端における95〜267残基を含んでいる構造において認識することができる。エンドヌクレアーゼ分解は上記と同様に実施されるが、少なくとも２つのドメイン中１つをコードする反応産物が選択される。これらはその後、上記で説明したように断片選択及び進化サイクルの開始点となる。
ヘテロマー酵素PCA
本発明のさらに別の実施態様は、全ての触媒機構が１つの独立したフォールディングサブユニット内に含まれており、他のサブユニットがその酵素的サブユニットに安定性及び／又はコファクターを提供するヘテロ二量体若しくはヘテロ多量体酵素を用いることに基づくPCAに関する。このPCAの実施態様では、調節サブユニットが相補的断片に分裂し、相互作用するタンパク質に融合させられる。これらの断片は酵素サブユニットと一緒に細胞内へコトランスフォーム／トランスフェクトされる。DHFR及びAKについて記載された単一酵素PCAを用いる場合と同様に、酵素活性の再構成及び検出はその天然トポロジー内への調節サブユニットの再構成内へのオリゴマー化ドメイン−支持再構成に依存している。しかし、再構成されたサブユニットはその後無傷酵素サブユニットと相互作用して活性を産生する。このアプローチは、この場合には酵素が構成性細胞酵素ではなく、むしろ外因性遺伝子産物であるという長所を持っていることを除けば、USPSシステムを思い出させる。宿主細胞からのバックグラウンド活性について問題がないものとして、この酵素は天然遺伝子より高いレベルで発現させることができ、さらに特異的細胞下のコンパートメントへ向けるように修飾することができる（酵素のN若しくはC末端及びサブユニット断片上へコンパートメント特異的シグナルペプチドをサブクローニングすることによって）。このアプローチの特別な利点は、単一酵素の方法は準最適の酵素活性をもたらすことがあるが、このアプローチでは酵素は独立してフォールディングし、実際にそのリフォールディングを助けるように断片化された調節サブユニットへのシャペロンとして機能する可能性がある。さらに、断片のフォールディングは酵素の調節を与えるために完全である必要はないかも知れない。このアプローチは、我々がStreptomyces tyrosinase（ストレプトマイセス・チロシナーゼ）に基づいて開発した比色／蛍光光度法アッセイによって実現される。この酵素はチロシンからデオキシフェニルアラニン（DOPA）への転換を触媒する。この反応はフルオロシニル−チロシンからDOPA形への転換によって測定できる。この活性酵素は、触媒ドメイン（Melc2）と銅結合ドメイン（Melc1）の２つのサブユニットから構築される。Melc1はMelc2活性のために絶対的に必要とされる14kDの小さなタンパク質である。我々が開発中のアッセイでは、Melc1タンパク質はPCAの相補性部分として役立つ２個の断片に分割させられる。オリゴマー化ドメインに融合しているこれらの断片はMelc2を用いて共発現させられ、さらにこのアッセイの基礎はMelc2活性がMelc1断片の相補性に依存していることにある。タンパク質複合体の化学量論も又下記のように取り扱うことができる（つまり、複合体が２若しくは３個のタンパク質から構成されているかどうか）。２個のタンパク質を２個のMelc1断片に、３個目は無傷Melc2へ融合させる。従って、チロシナーゼの最小相補的活性複合体は、全３つのコンパートメントを要求する、従って三量体が必要であることを証明できる。このアプローチの重要な態様は、過剰発現したMelc1断片−タンパク質融合のバックグラウンドにおいてそれを過小発現させることにより他のコンポーネントに依存している１つのコンポーネント、特にタンパク質−Melc2融合触媒サブユニットを作ることによって我々が容易に特異的相互作用を証明できることである。
多量体分裂に基づくPCA
出願人らはPCAを構成するものとして無傷タンパク質、タンパク質ドメイン又はサブユニットの断片相補性だけを説明してきたが、好ましい実施態様は、例えば触媒活性のためにサブユニットの安定性連結を必要とする二量体酵素間の界面の分裂に基づくPCAに関する。そうした場合には、サブユニット界面での選択的又は無作為突然変異誘発は相互作用を中断させるであろう、そしてこのアッセイの基礎は、サブユニットへ融合したオリゴマー化ドメインが機能的酵素内へサブユニットを一緒に持ち込むために必要な結合エネルギーを提供することにあるであろう。
PCAへ適用するときのベクターのデザイン
従ってこれまでに列挙したPCA方法は相補的断片を発現させるために２プラスミド形質転換方法を使用してきた。このアプローチは、例えば形質添加若しくはトランスフェクトされた細胞中での遺伝子の最適取り込み又は細菌内への相補的プラスミドの最適形質転換及び種々のプロモーターを用いてのPCA断片の発現レベルの制御に対して選択するために種々の薬物耐性マーカーを使用することのような幾つかの長所を持っている。しかし、単一プラスミド方法には形質転換／トランスフォーメーションに関して長所がある。タンパク質発現レベルは種々の方法で制御できるが、薬物選択は２つの方法のうち１つで達成できる。例えばAKのようにそれ自体が薬物耐性マーカーである酵素を用いる生存アッセイに基づくPCAの場合、又は例えばDHFRのような酵素が代謝経路を補足する場合には、発現プラスミドにおいて追加の薬物耐性遺伝子が取り込まれる必要はない。しかしPCAが着色若しくは蛍光産物を産生する酵素に基づいている場合は、プラスミドから追加の薬物耐性遺伝子が発現されなければならない。PCA相補的断片及び融合cDNAライブラリー／標的遺伝子の発現は個別誘導性若しくは構成性プロモーターの制御下で個別オペロンとしての単一プラスミド上で構築することができる、又は多シストロン性に発現させることができる。E.coliでは多シストロン性発現は既知のインターコーティング領域配列を用いて達成できるので、我々が例えば強力な（tac）プロモーターの制御下でE.coliにおいてハイレベルで発現することを証明したチロシナーゼmelc1-melc2遺伝子をそこから引き出したmelオペロンにおける領域を使用する。遺伝子はさらに又tac及びアラビノースのような独立プロモーターから発現及び誘導することができよう。哺乳類発現システムに対しては、単一プラスミドシステムは一過性又は安定性両方の細胞系発現のため及び構成性若しくは誘導性発現のために使用できる。さらに、相補的断片融合の１つ、通常はbait融合断片の発現の弁別コントロールは、発現を最小限に抑えるようにコントロールすることができる。これはバックグラウンドの非特異的相互作用を減少させるときに重要であろう。相補的断片発現の弁別コントロールの例には下記の方法が含まれる。
i）一過性若しくは安定性の多シストロン性発現において、第２遺伝子の発現は必ずより有効性が低くなり、その結果これ自体が相補的断片の１つの量を制限するのに役立つであろう。或いは又、上流ドナー／スプライス部位の突然変異によって第１遺伝子産物を発現において制限でき、他方第２遺伝子は発現を強化するためのECMVのようにレトロウイルス内部開始部位の制御下に置くことができる。
ii）個々の相補的断片融合対も又、Tet−反応性PhCMV*-1プロモーター、及び／又はステロイド受容体反応エレメントに基づくものを含む全て市販で入手できる誘導性プロモーターのコントロール下に置くことができる。そうしたシステムでは、２個の相補的断片遺伝子を刺激することができ、発現レベルはこれらの場合にはテトラサイクリン及びステロイドホルモンであるインデューサーを用いて用量依存性発現によってコントロールできる。
実施例２
生化学的経路における新規遺伝子産物を検出し、そうした経路をマッピングするためのPCA方法の適用
他の分子と相互作用のスクリーニング法より優れているPCAの長所の中でも最大の長所は、それらがin vivo及びあらゆる種類の細胞の両方で実施できるようにデザインされる点である。この特徴は、この方法を適用する目標がライブラリーから新規相互作用を同定すること、そして同時に観察されたその相互作用が生物学的に重要かどうかを決定できることである場合は極めて重要である。下記に示す詳細な実施例及び本章の最後に記載されているもう１つの実施例は、PCAを用いての相互作用の検証がどのように可能であるかを具体的に説明している。基本的に、これは下記のように達成される。ホルモンレセプター媒介性シグナル発生のような生化学的経路においては、酵素媒介化学反応のカスケードは、膜表面レセプターへのホルモン結合によるような幾つかの分子イベントによって誘発される。その後に、タンパク質性基質との酵素相互作用及び酵素修飾基質とのタンパク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸相互作用が発生する。そうした生化学的シグナル発生カスケードは、これらのプロセスを試験するためには特異的な細胞種類及びモデル細胞系でしか発生しない。このため、まだ同定されていないタンパク質を含む経路における既知のタンパク質とのような誘導性相互作用を検出するためには、明らかに適切なモデル細胞系及び正しい細胞コンパートメントにおいてそうしたスクリーニングを実施する必要がある。これを行う一般的方法において使用できるのはPCA方法だけである。酵母の二−又は三−ハイブリッド法のようなタンパク質−分子相互作用法は、酵母における核相互作用若しくは誘発されない相互作用の限定された場合を除いて、そうしたイベントが発生する状況において実施することはできない。誘発されたタンパク質相互作用を検出することができるかも知れない哺乳類の二−ハイブリッド法が存在はするが、これも同様に関係しているタンパク質を同時に活性化し、核に輸送し、それらのパートナーと相互作用させることができる場合にしか可能ではない。PCAには、特異的コンパートメントでしか利用できない追加の細胞機構を必要としないので、これらの制限を受けない。もう１つのポイントは、適切なモデルの細胞種類においてPCA方法を実施することによって、特定経路を試験するために適切な陽性及び陰性コントロールを導入することもできる点である。例えば、ホルモンシグナル発生経路については、おそらくホルモンシグナル発生アゴニスト及びアンタゴニスト又はシグナル発生カスケードタンパク質の優性−陰性突然変異体は既知であり、上流にある、又はPCAで試験されているイベントの平行して機能すると思われる。これらの試薬はPCAによって検出された新規相互作用が生物学的に重要であるかどうかを決定するために使用できよう。一般に、ホルモンが導入された場合にだけ検出され、アンタゴニストが同時に導入された場合には所見されない相互作用は試験下のプロセスにとって重要な相互作用を表していると仮説を立てることができよう。
下記ではこれらのポイントを具体的に説明しているDHFR適用の詳細な説明並びにPCA方法を使用できる別の例を記載する。
成長因子媒介性シグナルトランスダクション経路のマッピングへのDHFRのPCAの適用
成長因子活性化細胞増殖において最も早期に検出できるイベントの１つは、40SリボソームサブユニットのS6タンパク質のセリンリン酸化である。特異的にS6をリン酸化するセリン／トレオニンキナーゼの発見は、新規マイトジェン媒介性シグナルトランスダクション経路を同定することに相当に大きく役立ってきた。セリン／トレオニンキナーゼp70S6kは特異的S6ホスホリラーゼであると同定されている131-136。p70S6kは、血清飢餓細胞中の血清、インスリン及びPDSFを含む成長因子、及びホルボールエステルのようなマイトジェンを含む数種のマイトジェンシグナルに反応して特異的部位でセリン及びトレオニンリン酸化によって活性化される。最近５年間に渡って、p70/p85S6kがマイトジェンに反応してどのように活性化されるかを決定するために相当に大きな努力が払われてきた。p70S6k活性化には、１つはホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（Pl（3）k）と関連しており、もう１つはPl（3）k同族mTORと関連している２つのレセプター媒介性経路が結び付けられてきた133-144。この提案を理解するための鍵は、p70S6kの活性化においてこれらの酵素が果たす役割がリン酸化及び酵素活性に２種の天然産物が及ぼす作用によって決定されたという事実にある。これは、間接的にmTOR活性を阻害するラパマイシン、及びPl（3）k活性を直接的に阻害するワートマニンである。現在までにp70S6kの直接的上流にあるキナーゼ類又は他の調節タンパク質類が同定されていないということに注目することも又重要である。
p70S6kとその既知の基質S6との相互作用は、E.coli及び哺乳類細胞系におけるDHFRのPCAに対するテストシステムとして研究することができる。さらにこの重要な酵素がどのように調節されるかについての新規の洞察をもたらすであろうこの酵素との新規相互作用を同定することを試みることもできる。さらに、この酵素の活性化は特異的薬物を用いて選択的に阻害できる複数の経路によって媒介されるので、これは誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用を同定するための方法としてPCAを研究するための理想的なシステムである。
ａ）E.coli生存アッセイの試験：p70S6kとS6との相互作用
この試験は、S6タンパク質に対するp70S6kの見掛けのKm（＝250nM）145が我々のテストシステムで使用したGCN4からのロイシンジッパー形成ペプチドに対するKdとほぼ同一であるので理想的である。しかし、我々のテストのためにはこの酵素の構成的に活性な形を使用しなければならないであろう。酵素D77-p70S6kのN末端の断端形は構成的に活性であり、これらの試験に使用されるであろう147。方法としては、D77-p70S6k-F[1,2]融合及びD77-p70S6k-F[3]融合、又はF[1,2]及びD77-p70S6k-F[3]融合（コントロールとして）をE.coli内へコトランスフォームし、細胞をトリメトプリムの存在下で最少培地中で増殖させる。40Sリボソームサブユニットに対するキナーゼ活性の解析及び２種のタンパク質を共発現させるためにコロニーが選択され、拡大させられる。
ｂ）ライブラリースクリーニングのための細菌生存アッセイの修飾：新規相互作用タンパク質の同定
下記のステップが含まれていれば、特定標的（この場合にはp70S6k-D77）との相互作用について発現ライブラリーをスクリーニングすることは、このテストシステムでは簡単であろう。これは、１−mDHFR断片[3]との融合としての融合−発現ライブラリーの構築と、２−pRep4を含んでいるE.coli BL21におけるライブラリーの形質転換（lacレプレッサーの構成性発現のため、これはタンパク質産物が細胞にとって毒性の場合に必要とされる）及び融合、p70S6k-D77-[1,2]をコードするプラスミド、３−トリメトプリム及びIPTGの存在下における最少培地上でのプレーティング、４−増殖するあらゆるコロニーの選択、プラスミドDNAの増殖及び単離、その後にDNAインサートのシークエンシング、５−HexaHis-tagによる未知の融合産物の生成及びSDS-PAGE上でのサイジングである。
方法：
総合方法は図５に具体的に示されている。１−指向性融合−発現ライブラリーの構築、ｉ−cDNA産生であり、poly（A）＋RNAをBA/F3細胞（B-リンパ球）から単離することはできるが、これはこれらの細胞がラパマイシン感受性p70S6k活性化カスケードの試験において使用されて良好な結果が得られているためである139。全長のｍRNAを強化するためには、我々はCAPture法148による5’キャップ構造を通してmRNAをアフィニティー精製する。逆転写を「リンカープライマー」によって開始する。リンカープライマーはpoly（A）mRNAテールから開始するためにpoly（T）テールを持っており、断片の指向性サブクローニングにおいて後で使用するためにXhoI部位を持っている。第１鎖はその後メチル化される。第２鎖合成及び産物の平滑化の後、「EcoRIアダプター」が付加され、EcoRI及びXhoIを用いてのリンカーの産生分解（インサートはメチル化によって保護される）はEcoRI及びXhoIを用いて開かれたベクターにおける指向性挿入に準備の整った全長のcDNAを産生する。ライブラリースクリーニングの成功は産生したcDNAの質に大きく左右されるので、一貫して高品質のcDNAライブラリーを産生することが証明されているので我々は上記の方法を使用するであろう。ii−ベクター内へのcDNAの挿入であり、我々がBL21細胞においてこのベクターからmDHFR融合のハイレベルの発現を入手しているので、ライブラリーはベクターpQE-32（Qiagen）内でmDHFR F[3]へのC末端融合として構築されるであろう。我々が工学的に作り出した新規ポリクローニング部位（先に方法の腔の下で記載されている）である3’末端で相違しており、追加の０、１、若しくは２個のヌクレオチドいずれかを持っているそうした３種のベクターが作り出されるであろう。これは全３つの翻訳リーディングフレームにおけるライブラリー断片内へのF[3]からのリードスルーを可能にする。cDNA断片は一度に全３つのベクターにおいてEcoRI及びChoI部位で指向性に挿入されるであろう。２、３、４及び５−ライブラリー挿入のベクター配列フランキング部位に特異的なシークエンシングプライマーを使用して同定されたクローンの最終シークエンシングを行うことを除いて、これらのステップは結果の項で以前に説明されている。タンパク質精製についても又、Ni-NTA（Qiagen）上での１ステップ精製によって以前に記載されている。産物のサイズがDHFRコンポーネント（450bp以上のcDNAインサートと等価）の分子量より15kDA以上大きい場合は、我々はシェルドン・バイオテクノロジーセンター（Sheldon Biotechnology Center：McGill大学）でインサートをシークエンシングしてもらうであろう。
ｃ）真核細胞アッセイの開発
上述の系のトランスフォーメーションは、真核細胞において使用するために等価のアッセイを作り出すために有用である。このアッセイの基本原理は同一である。即ち、mDHFRの断片が会合ドメインに融合させられ、ドメイン会合が真核細胞中のDHFR活性の再構成によって検出される（図５）。
・発現構造体の精製：GCN4−ジッパー−mDHFR断片融合をコードするDNA断片は真核過渡発現ベクター126であるpMT3内に１ピースとして挿入された。COS細胞中の融合タンパク質の発現は35[S]Metラベリング後にはSDS-PAGE上で明白であった。
・真核細胞内での生存アッセイ：mDHRF再構成の検出には２つの系を平行して使用できる。即ち、i−CHO-DUKXのB11細胞（DHRF活性が不足しているチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系）はGCN4−ジッパー−mDHFR断片融合を用いてコトランスフェクトされる。細胞はヌクレオチドの不在下で増殖し、再構成されたDHFRを持っている細胞だけが正常な細胞分割及びコロニー形成を受けるであろう。ii−COS及び293細胞のような構成性DHFR活性を有している細胞をトランスフェクトすることを目標に、mDHFRのメトトレキセート（MTX）耐性突然変異体を精製する。我々は、有意にKi（MTX）を増加させる５回の突然変異各々を、一度に１つ取り込むためにF[1,2]を突然変異させた。それは、Gly15Trp、Leu22Phe、Leu22Arg、Phe31Ser及びPhe34Ser（ナンバリングは野生型mDHFR配列に従っている）である。これらの突然変異は活性部位及びF[3]に比較して相違する位置で発生し、それらが存在した全長の哺乳類酵素のKm（DHF）、Km（NADPH）及びVmax上に相違する作用をもたらす。突然変異体Z-F[1,2:Leu22Phe]、Z-F[1,2:Leu22Arg]及びZ-F[1,2:Phe31Ser]は全部Z-F[3]を用いてコトランスフォームされたときに高い成長率で細菌生存を許容した（結果は示されていない）。５つの突然変異体は、天然酵素の活性のためにバックグラウンドを排除するであろうMTXの選択的環境を受けながらCOS若しくは293細胞増殖を維持できる酵素を産生するために真核細胞においてmDHFR断片の再構成で試験されるであろう。突然変異は活性酵素の再構成に関する明白な短所を提示せずに、選択における長所を提供する。生存アッセイのいずれかにおいて産生する再構成されたmDHFRが野生型酵素を用いた場合の増殖より無視できないように緩徐な真核細胞増殖を許容する場合は、ヌクレオチドの欠如によって提供される選択的環境を部分的に緩和するために増殖培地にチミジレートが添加されるであろう。
ｄ）真核細胞生存アッセイの試験
まず最初に、p70S6kとの誘導相互作用を検出できるかどうかを試験することが必要である。E.coli試験系について上記で説明したものと同一の試験系を使用できる。それは、p70S6kとS6タンパク質の会合の誘導である。
方法：
mDHFRのLeu22Phe突然変異体S6-F[1,2]及びp70S6k-F[3]、若しくはF[1,2]及びp70S6k-F[3]（コントロールとして）がCOS細胞内にコトランスフェクトされ、細胞は48時間に渡って血清飢餓にされ、その後血清及びMTX中において低密度で細胞のリプレーティングが行われる。40Sリボソームサブユニットに対するキナーゼ活性の解析及び２種のタンパク質の共発現のためにコロニーが選択されて拡大させられる。ワートマニン及びラパマイシンとのタンパク質会合の阻害についてさらにコントロール試験が実行される。
ｅ）ライブラリースクリーニングための真核細胞生存アッセイの修飾
Stratagen製「cDNA合成キット」によって産生するEcoRI/XhoI指向性cDNAはStratagene Zap Expressベクター内に指向性で直接にインサートできるので、真核細胞において使用するためのライブラリーを創製するときに必要とされる仕事の重要な部分は既に遂行されているであろう。
方法：
ステップ１から５は、細菌ライブラリースクリーニング（上記）のステップと同様である。即ち、１−同様に、ライブラリーがmDHFRのF[3]へのC末端融合として構築される。F[3]（停止コドンなし）はZap Expressにおいてフレーム内に挿入され、その後に全て３つのリーディングフレーム（上記）における挿入の発現を許容する新規ポリリンカーの挿入、及びEcoRI/XhoI指向性cDNAが続く。このバクテリオファージライブラリーは、融合インサートを持っている真核発現ファージミドベクター（pBK-CMV）を働かせるStratagene製ヘルパーファージを用いて増殖及び処理されるであろう。２−真核細胞におけるライブラリーとp70S6k-F[1,2]構造体のコトランスフェクション、つまり、我々はこのスクリーニングをCOS又は293細胞において実施するが、それはこれらがp70S6kシグナル発生経路を活性化するときに血清に応答性であるからである。選択実験は上記でS6試験系について記載された通りに実施される。３−挿入DNAの増殖、単離及びシークエンシングが行われる。４−クローンされた融合タンパク質は35S-Met/Cysラベリングの後に直接視認によってSDS-PAGE上で、又は市販のmDHFRへのポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロッティングによってサイジングされる。
方法の一般化：タンパク質p70S6kに対するパートナーを検出するためのスキームは、あらゆる生きている生物におけるあらゆる生化学的経路の試験に適用できる。そうした経路は又疾患プロセスに関連している可能性がある。疾患関連経路は、病理がそこから発生している細胞の、例えば遺伝子の突然変異、欠失又は過小若しくは過剰発現のような内因性プロセスである可能性がある。或いは又、生化学的経路は病原微生物又は宿主侵襲のメカニズムに特異的な経路の場合がある。この場合、そうしたプロセスのコンポーネントタンパク質は、病原微生物に特異的な生化学的経路における微生物若しくはコンポーネント酵素による侵襲を阻害する薬物の開発のような、治療方法の目標となることがある。
これら両方の例に関係する適切な例は炎症性疾患である。炎症性組織への白血球の付着を媒介するタンパク質−タンパク質相互作用が、血管細胞付着分子−１（VCAM-1）のようなタンパク質、及び炎症中に産生するIL-6及びIL-8のような一定のサイトカイン類を含んでいることは知られている。しかし、炎症性反応の開始に関係するタンパク質の多くは依然として不明である。さらに、細胞外会合によって誘発される細胞内シグナル発生経路はほとんど理解されていない。PCAは、炎症の開始並びにそれに引き続くシグナル発生下のメカニズムを説明するときに使用することができよう。例えば、IL-1、IL-6、IL-8及び腫瘍壊死によって媒介されるような炎症に関連するシグナル発生経路は幾らか詳細に試験されており、多くの直接的及び下流レギュレーターは知られている。これらのレギュレーターは薬物開発のための標的でもある他のシグナル発生若しくは調節タンパク質を同定するためのためのPCAスクリーニングにおいて起点標的として使用できる。
現在は、特発性腸疾患を特徴付ける腸炎症の発生において腸内病原菌による感染症の高いリスクが存在する。この場合により明らかに理解する必要のある、そしてPCAによって取り扱うことのできる２つのメカニズムがある。
まず、i−上記のような炎症の細胞機構、及びii−病原微生物が認識してそれと会合する特異的細胞表面リガンドの発見である。病原菌によって産生する分泌タンパク質は、上皮細胞の基底側部膜へ結合できる（エルシニア偽結核菌[Yersinia pseudotuberculosis]感染症における場合のように）又は腸上皮細胞内へトランスロケートさせられ（サルモネラ[Salmonella]感染症）、感染性及び／又は感染症への生理学的応答を促進する。しかし、ほとんどの場合、病原タンパク質と上皮細胞との相互作用は知られていない。
次に、細胞付着及び神経系の再生である。つまり、細胞付着に関連する例には、神経系の発達及び再生に関係するプロセスが含まれる。
カドヘレンは、カルシウム依存性細胞−細胞付着をメディエートする膜タンパク質である。そのように行うためには、カテニンと呼ばれる他のクラスの細胞質タンパク質を必要とする。それらはカドヘリンと細胞骨格との間に橋を作り出す。カテニンは又、分化特異的遺伝子を制御する調節遺伝子でもある。例えば、タンパク質B−カテニンは一定の状況において転写因子（lef-1）と相互作用してlef-1によってトランス活性化される多数の遺伝子を抑制する核内にトランスロケートさせられる（分化）。このプロセスは、APC（細胞質アダプタータンパク質）の不活化の後に変性を許容するGSK3Bの不活化によって、Wntシグナル発生経路（ショウジョウバエ[drosophila]におけるwingless経路と相同）によって調節される。PCA方法はこれらのプロセスの調節に含まれる新規タンパク質を同定するために使用できよう。
ウイルス統合プロセスに含まれるタンパク質は、PCA方法を使用してインヒビターについて試験できる標的の例である。HIVウイルスについての例は下記を含んでいる。
i）インテグラーゼ又は統合前複合体：タンパク質Ma若しくはvprの輸送の阻害、
ii）断片化の誘導を引き起こすvprによるG2における細胞周期の阻害（サイクリンBによる相互作用）、
iii）フリンを用いてのgp160（膜タンパク質の前駆体）の相互作用の阻害
治療標的としてのHIVのアクセサリータンパク質：
i）Vpr：核局在配列（標的）：vprとホスファターゼAとの相互作用部位、
ii）vif：ビメンチン（細胞骨格会合タンパク質）との相互作用、
ii）Vpu：Vpuの細胞質テールによりメディエートされたREにおけるCd4の変性、
iii）nef：Nefのミリストイル化シグナル。
実施例３
その他のタンパク質断片相補性検定の実施例
その他のアッセイの実施例をここで具体的に示す。これらのアッセイを作り出す理由は、アッセンブリーの平衡若しくは動態の側面を試験するような特異的タンパク質会合問題に適切と思われる代替PCA方法を提供することにある。さらに、一定の状況（例えば、特異的な細胞種類）又は一定の適用のためには、特異的PCAは機能しないが、代替法が機能することがあり得る。下記では、その他のPCAの実施態様１つ１つについて簡略に説明する。
１）グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）：偏虫Schistosomajaponicum（日本住血吸虫）からのGSTは、原核細胞及び真核細胞の両方で発現され得る小さな（28kD）、単量体の可溶性タンパク質である。高分解能結晶構造が解明されており、PCAをデザインするための開始点として役立つ。GST活性についての単純かつ安価な比色アッセイは、光り輝く黄色産物である1−クロロ−2,4−ジニトロベンジン（CNDB）との還元グルタチオンの還元共役を含めて開発されてきた。我々は、オリゴマー化ドメインとしてGCN4ロイシンジッパーを使用してDHFRのPCAを開発するために類似の構造的基準に基づいてPCAをデザインした。ジッパー−GST−断片融合のコトランスフォーマントがアーガープレート上のE.coli中で発現させられ、コロニーはニトロセルロース・ペーパーへ移される。断片相補性の検出は、グルタチオンーCDNB反応混合液がニトロセルロース上にエーロゾルとして塗布されるアッセイで検出され、GSTの共発現断片を発現しているコロニーが黄色イメージとして検出される。
２）緑色蛍光タンパク質（GFP）：発光オワンクラゲ（Aequoreavictoria）からのGFPは遺伝子発現のための最もポピュラーなタンパク質マーカーの１つになりつつある。これは、この小さな単量体の238アミノ酸長のタンパク質が残基Ser65とGly67の間のポリペプチドバックボーンの自己触媒性環化及びTyr66の結合の酸化の結果として生じる内部発色団が存在するために内因性蛍光性であるためである。GFP発色団は395nmで最高に光を吸収するが、さらに470nmでも第２吸収極大を有している。この２相の特異的吸収は、その相対集団が発色団の局所環境に依存する発色団の２つの低エネルギーコンフォーマー（配座異性体）が存在することを示唆している。異性化（488nmでの単一吸収極大）を排除する突然変異体Ser65Thrは野生型に比べて４〜６倍強力な蛍光を生じさせる。最近、GFPの構造は２つの研究グループによって解明され、現在では我々が開発し始めた構造に基づくPCAデザインの候補になりつつある。GSTアッセイを用いた場合と同様に、我々はオリゴマー化ドメインとしてのGCN4ロイシンジッパー形成配列を用いてE.coliにおける我々の初期の開発全てを実施している。広範囲UV光線下での視覚的観察による蛍光の直接検出が使用されるであろう。我々はさらに、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を用いてコトランスフェクタントに対して選択することにより、COS細胞においてこの試験系を試験するであろう。
３）ホタル（Firefly）ルシフェラーゼ：ホタルルシフェラーゼは、ヘテロサイクルルシフェリンの酸化を触媒する62kDaのタンパク質である。この産物は生物発光反応に対する最高量子収率の１つを有している。酸化されたルシフェリン分子１つに対して１個の光子が放出される。ルシフェラーゼの構造は最近解明され、PCAの構造に基づく開発が可能になった。我々のGSTアッセイを用いた場合と同様に、細胞はニトロセルロース基質上で増殖させられる。ニトロセルロースの表面でのルシフェリンの付着は、細胞質膜全体への拡散を許容し、ホトルミネセンス反応を誘発する。検出は写真フィルム上で即時に行われる。ルシフェラーゼはPCAにとって理想的候補であり、検出アッセイは、迅速、安価、極めて高感受性であり、さらに市販で入手できる非放射性基質を利用する。ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンは細胞質膜全体に拡散でき（酸性pH下で）、無傷細胞中のルシフェラーゼの検出を可能にする。この酵素は、現在は様々な発現系におけるリポーター遺伝子として利用されている。このタンパク質の発現は細菌、哺乳類細胞及び植物細胞において著明に特徴付けられているが、これは可転性PCAを提供することを示唆している。
４）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）。E.coli酵素XGPRTはキサンチンをGMPの前駆体であるキサンチンモノホスフェート（XMP）へ転換させる。哺乳類酵素であるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）は基質としてヒポキサンチン及びグアニンしか使用できないので、キサンチンの存在下での細胞増殖のためにPCAにとっての優性選択アッセイとして細菌XGPRTを使用することができる。XGPRTを発現するベクターは、アデニン、キサンチン及びミコフェノール酸を含有する選択的培地中で哺乳類細胞が増殖する能力を授ける。ミコフェノール酸の機能は、IMPからXMPへの転換を遮断することによってGMPの新規合成を阻害することである（Chapman A.B.,（1983）Molec.&Cellul.Biol.3,1421-1429）。その後産生する唯一のGMPは、細菌XGPRTによって触媒されてキサンチンからXMPへの転換から生じる。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを用いた場合と同様に、XGPRTの断片は試験オリゴマー化ドメインとしてGCN4ロイシンジッパーへ融合された断片を用いる上記で説明したデザイン進化方法を用いて既知の構造（表１参照）に基づいて生成させることができる。相補的融合はコトランスフェクトされ、COS-7細胞中で一過性に発現した、若しくはCHO細胞中で安定性に発現したタンパク質は選択培地で増殖させられる。CHO細胞の場合は、コロニーが収集され、高濃度で融合を効果的に発現する細胞集団を強化するために選択的化合物の濃度を上昇させながら連続的に再培養される。
５）アデノシンデアミナーゼ：アデノシンデアミナーゼ（ADA）は、全ての哺乳類細胞中において実質的に痕跡量で存在する。細胞成長のための必須酵素ではないが、ADAは優先選択的アッセイにおいて使用できる。細胞が生存するためにADAを必要とする成長条件を確定することは可能である。ADAは細胞毒性アデニンヌクレオシド類からそれらの各自に非毒性イノシン類似体への比可逆性転換を触媒する。細胞毒性濃度のアデノシン若しくは9−b−D−キシリフラノシルアデニンのような細胞毒性アデノシン類似体を細胞に添加することにより、ADAは細胞毒性剤を解毒するために細胞成長にとって必要とされる。その後、ADA遺伝子を取り込んでいる細胞をADAのタイト結合過渡状態類似体インヒビターである低濃度の
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デオキシコホルマイシンの存在下で増幅させるために選択することができる。ADAはその後、細胞生存に基づくPCAのために使用できる（Kaufman,R.J.Et al.（1986）Proc.Of the Nat.Acad.Sci.（USA）83,3136-3140）。上記で説明した他の試験系を用いた場合と同様に、テストオリゴマー化ドメインとしてのGCN4ロイシンジッパーに融合した断片を用いて上記で説明したデザイン進化方法を使用して、既知の構造（表１参照）に基づいてADAの断片を生成させることができる。相補的融合はコトランスフェクトされ、タンパク質はCOS-7細胞内で一過性に発現させられる、又は
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デオキシコホルマイシンを含有する選択的培地で増殖したCHO細胞中で安定性に発現させられる。CHO細胞の場合は、コロニーが収集され、高濃度で融合を効果的に発現する細胞集団のために強化するために
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デオキシコホルマイシンの濃度を上昇させながら連続的に再培養される。
６）ブレオマイシン結合タンパク質（ゼオシン耐性遺伝子）：抗生物質のブレオマイシン／フレオマイシンファミリーの一員であるゼオシンは、細菌、真菌、植物及び哺乳類細胞にとって毒性である。ゼオシン耐性遺伝子の発現はブレオマイシン／ゼオシンへの耐性を授ける。このタンパク質は、薬物に結合してこれを分離する、従ってDNAの会合及び加水分解を防止することによって耐性を授ける（Berdy,J.（1980）In Amino Acid and Peptide Antibiotics,J.Berdy,ed.（Boca Raton,FL:CRC Press）,pp.459-497;Mulsant,P.,Tiraby,G.,Kallerhoff,J.,and Perret,J.（1988 Somat.Cell.Mol.Genet.14,243-252））。ブレオマイシン結合タンパク質（BBP）はその後細胞生存に基づくPCAのために使用できよう。上記で説明した他の試験系を用いた場合と同様に、試験オリゴマー化ドメインとしてのGCN4ロイシンジッパーに融合した断片を用いて上記で説明したデザイン進化方法を使用して、既知の構造（表１参照）に基づいてADAの断片を生成させることができる。BBPは、サブユニットインターフェース結合部位を通して薬物に結合する小さな（8kD）二量体である。このため、デザインは最初のものとは幾分相違したものになり、二量体の単一鎖形は２個のサブユニット間で導入された単純なポリペプチドリンカーをコードする短い配列を持つ２個のBBP遺伝子を融合させることによって生成されるであろう。この場合の断片はサブユニットモジュールの１つの短い配列に基づくであろうが、もう１つの断片はサブユニットの残りの配列に他のサブユニットをプラスしたものから構成されるであろう。相補性及び選択実験は、選択的薬物としてブレオマイシン又はゼオシンを使用した上記の実施例について説明した通りに実施されるであろう。
７）ヒグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ：抗生物質であるヒグロマイシンBはトランスロケーションを中断させてミスリーディング（誤読）を促進することによってタンパク質合成を阻害するアミノシクリトールである。E.coli酵素であるヒグロマイシンB−ホスホトランスフェラーゼはヒグロマイシンBをリン酸化することによって細胞を解毒する。哺乳類細胞中で発現すると、ヒグロマイシンB−ホスホトランスフェラーゼはヒグロマイシンBへ耐性を授けることができる（Grits,L.,and Davies,J.（1983）Gene 25,179-188）。この酵素は優性選択性マーカーであり、細胞生存に基づくPCAのために使用できよう。この酵素の構造はまだ分かっていないが、この酵素はアミノグリコシドキナーゼと相同であることが疑われている（Shaw,et a.,（1993）Microbiol.Rev.57,138-163）。このため、この酵素を用いてPCAを作製し、ヒグロマイシンBの濃度を増加させながらの選択を用いて哺乳類細胞中での優性選択を実行する結合デザイン／進化方法を使用することが可能である。
８）L−ヒスチジノールNAD+オキシドレダクターゼ：ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のHisのD遺伝子は、ヒスチジノールをヒスチジンへ転換するL−ヒスチジノールNAD+オキシドレダクターゼをコードする。ヒスチジンは欠如するがヒスチジノールを含有している培地中で増殖した哺乳類細胞は、HisのD遺伝子の発現について選択することができる（Hartman,S.C.,R.C.Mulligan（1988）Proc.Of the Nat.Acad.Sci.（USA）85,8047-8051）。優性選択においてHisのD遺伝子を使用するもう１つの利点は、ヒスチジノール自体が毒性であり、内因性ヒスチジル−tRNAシンテターゼの活性を阻害することにある。ヒスチジノールは安価でもあり、容易に細胞内に浸透する。L−ヒスチジノールNAD+オキシドレダクターゼの構造は未知であり、従ってこの酵素に基づくPCAの開発は完全にエキソヌクレアーゼ断片／進化方法に基づいている。
下記の表では他のPCAリポーターを使用した代替実施態様が列挙されている。表中の略語の種類において、Ｄは優性選択マーカーで、Ｒが劣性選択マーカーである。構造において４文字のコード＝タンパク質データ銀行（PDB）登録記号で、Ｋが既知であるがPDBには保管されていない、Ｕが不明である。モノ／オリゴにおいて、Ｍが単量体で、Ｄが二量体で、tetraが四量体である。
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実施例４
複数のタンパク質／タンパク質-DNA/タンパク質−RNA/タンパク質−薬物複合体を検出するためのPCAの変種の実施例
現在まで、タンパク質対相互作用へのPCAの適用については特殊な例しか作製されていなかった。しかし、PCAはマルチタンパク質、タンパク質−RNA、タンパク質−DNA又はタンパク質−小分子相互作用に適用することができる。そうしたシステムを達成するためには２つの一般的スキームがある。マルチ−サブユニットPCA：PCAシグナルが観察されるために２つのタンパク質が相互作用する必要はなく、パートナータンパク質又はタンパク質複合体が２つのタンパク質に同時に結合すれば、そうした３タンパク質複合体を検出することが可能である。マルチサブユニットPCAは、40kDのホモ二量体である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）の例を用いて考案されている。この考案では、TK構造はアルファ/ベータ（残基1〜223）とアルファ−ヘリカルドメイン（224〜374）から構成され、明らかに定義された２つのドメインを含んでいる。テストシステムとして、我々は４ヘリックス束ホモ二量体であるRop1二量体を使用する。TKの２個の断片はPCRによって抽出されて過渡トランスフェクションベクターpMT3内に、第１の断片は第１ATGへの３分節系リーダー3’であるアデノウイルス主要後期プロモーターへ縦列で、そして第２断片はECMV内部開始部位の下流にサブクローニングされる。第１及び最終ATGの間に以前に導入された制限部位は、２つのATGの下流のBamHI/KpnI及びPstI/EcoRIクローニング部位内へサブクローニングされる。これらは２種の相違するベクター内へRop1サブユニットのPCR生成断片をサブクローニングするために使用される。引き続いて、Ltk−細胞が２個のプラスミドとのリポフェクションによってコトランスフェクトされ、生存している細胞のコロニーが濃度を上昇させながらHAT（ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン）を含有している培地中で連続的に選択される。４つのRop1へ融合したTKの相補的断片を発現する細胞はこの選択的環境下で増殖するか、さもなければ死ぬ。この考案を使用する特殊な例は、細胞内で一過性又は構成的に形成されるマルチタンパク質複合体の構成成分を決定することであろう。
PCAの利用はタンパク質−タンパク質相互作用を検出することに限定されておらず、タンパク質とDNA、RNA又は小分子との相互作用を検出することにも適用できる。この考案では、２種のタンパク質はPCA相補的断片に融合されるが、これら２種のタンパク質は相互には相互作用しない。相互作用は、パートナーの一方若しくは両方におけるコンフォメーションの変化を惹起することによって２個のタンパク質に同時に結合する若しくは２個のタンパク質間の相互作用を誘導する何らかの分子であり得る第３の実体によって誘発されなければならない。我々の研究所では、E.coliにおいてmDHFRのPCAを用いて２つの実施例が証明されている。第１の場合には、天然産物である免疫抑制薬ラパマイシンが、レセプターFKBP12とパートナータンパク質mTOR（ラパマイシンの哺乳類ターゲット）の間の相互作用を誘導するために使用される。我々はこれをトリメトプリム（上記に説明）及びラパマイシン（0〜10nM）の存在下又は不在下で増殖させたE.coli内へのFKBP若しくはmTORへ融合させたDHFR断片のコトランスフォーメーションによって検出する。我々は、コロニー形成によって検出される成長の支援が完全にラパマイシンの添加に依存していることを証明したが、これはmDHFRのPCAがFKBP12−mTORのラパマイシン誘導性アッセンブリー及び引き続いてのDHFR活性の再構成を検出することを示唆している。これはタンパク質間の相互作用を誘導できる小分子についてテストするためのPCA方法の使用例の１つである。一般的適用は、タンパク質間の相互作用を誘導する、いずれか若しくは両方のタンパク質の活性を阻害できる、又は成長因子媒介性レセプター二量体形成のような他のイベントによって媒介される特異的細胞プロセスを活性化させる分子についての小分子結合化合物ライブラリーをスクリーニングする形で治療的開発を行うことであろう。そうした小分子の発見は広範囲のヒトの疾患を治療するために経口投与可能な薬物の開発をもたらすことができよう。
我々がDHFRのPCAを用いて試験してきた誘導相互作用のもう１つの例は、発癌遺伝子GTPaseのp21 rasとその直接下流標的であるセリン／トレオニンキナーゼrafの相互作用である。この相互作用は、GTPaseがGTP結合形である場合にのみ発生するが、GTPからGDPへのターンオーバー（転換）は複合体の放出をもたらす。FKBP-mTOR複合体の場合と同様に、我々はこのE.coli.のPCAにおける誘導相互作用をそうした誘導相互作用をテストするため、そして病理的状態でこれらの相互作用を放出若しくは防止する化合物をスクリーニングするために一般的な方法で使用できることを証明している。ras-raf相互作用自体が治療的介入の標的であろう。rasの発癌遺伝子形はGTPを転換させることのできない突然変異体から構成されているので、持続的に活性化されたrasと会合したままでいる。これは一部では発癌を生じさせる構成性に制御されない増殖シグナルを生じさせる。このプロセスを阻害する化合物をPCAによって同定することはガンの広範な治療において重要であろう。PCAの多分子適用のその他の例には新規DNA若しくはRNA結合タンパク質の同定が含まれるであろう。この極めて単純な考案において、我々は既知のDNA若しくはRNA結合モチーフ、例えば各々レチノン酸レセプター亜鉛フィンガー、若しくはIF-1のような単純なRNA結合タンパク質を使用する。PCAの半分は、PCA断片の１つ（コントロール断片）に融合したDNA若しくはRNAタンパク質結合ドメインから構成される。相補的断片はcDNAライブラリーに融合している。第３の実体であるコントロールタンパク質及びそれから第２の推定上若しくは既知の調節エレメントに結合することが分かっているエレメントを含有している配列をコードする遺伝子はこの配列後にコードされる。テストシステムは、HIV遺伝子の転写／翻訳において伸長を制御するtat/tarエレメントから構成される。適用例は、真核細胞ゲノム内に存在すると提案されており、HIV遺伝子と同一若しくは類似の方法で遺伝子を調節する可能性のあるtat結合エレメントの同定であろう（SenGupta D.J.Et al.（1996）Proc.Natl.Acad.USA 6,8496-8501）。
実施例５
薬物スクリーニングへのPCA適用例：タンパク質−タンパク質／タンパク質−RNA／タンパク質−DNA複合体を阻害若しくは誘導する薬物についての化合物のスクリーニング結合ライブラリー
Ａ）薬物スクリーニング
タンパク質−タンパク質／タンパク質−RNA／タンパク質−DNA複合体を阻害若しくは誘導する薬物についての化合物のスクリーニング結合ライブラリー。PCA方法は、有機分子の結合ライブラリーに含まれる潜在的治療分子を同定するために直接的に適用できる。タンパク質−タンパク質相互作用若しくはタンパク質−DNA/RNA相互作用を阻害若しくは誘導する化合物についてスクリーンするためにそうしたライブラリーのハイスループット・スクリーニングを実行することが可能である（上記で考案したように）。さらに又、基質が下記で考案するように他のタンパク質、DNA、RNA若しくは炭水化物である酵素を阻害する化合物についてスクリーニングすることも可能である。この適用では、タンパク質／タンパク質性基質対と相互作用する、若しくはPCA相補的断片及びこれらの対を含んでいるプラスミドへ融合されているDNA/RNA結合タンパク質−酵素対を制御するタンパク質は、そのケースの必要に応じて第３のDNA若しくはRNAエレメントと一緒に細胞内へトランスフォーム／トランスフェクトされる。トランスフォーム／トランスフェクトされた細胞は、各ウェルに一連の結合的に合成された化合物からの単一化合物が接種されているマルチウェルプレート内の液体培地中で増殖させられる。反応の解読は、化合物の作用に依存する。化合物がタンパク質相互作用を阻害する場合は、陰性反応が存在する（PCAシグナルが発生しない場合は陽性反応である）。化合物の非特異的作用についてのコントロールには下記が含まれる。つまり、１）その化合物がPCA酵素自体に影響を及ぼさない（PCAプローブとして使用された野生型無傷酵素を用いてトランスフェクトされた細胞に対する試験）、そして細胞生存アッセイの場合にはその化合物がトランスフォーム／トランスフェクトされていない細胞に対して非毒性であるという証明。化合物の生物学的活性に対するハイスループットアッセイを提供すると同時に、PCAはさらに活性化合物の細胞膜透過性についての試験であるというin vitroアッセイより優れた長所を提供する。我々の研究所で薬物スクリーニングのために特異的に証明されたPCAの例には、治療的に重要な標的を阻害する化合物を検出することへのE.coliにおけるDHFRのPCAの適用が含まれる。これらにはBax/BCl2 fkbp12/torras/raf、HIV-1カプシドタンパク質のカルボキシル末端二量体化ドメイン、IkBキナーゼIKK-1及びIKK-2二量体化ドメイン（ロイシンジッパー及びヘリックス−ロープ−ヘリックスドメイン）が含まれる。各ケースにおいて、２個のタンパク質は上記の通りにF[1,2]又はF[3]のいずれかの5’上流でサブクローニングされる。相補的断片を含んでいるプラスミドはBL21細胞内にコトランスフォームされる。IPTG及びトリメトプリムを含有する最少培地プレートからのコロニーが採取され、同一選択条件下の液体培地で増殖させられ、冷凍ストックが作製される。単一スクリーニングサイクルのためには、LB培地中で冷凍ストックから急速一夜培養（priming overnight culture）が増殖させられる。トリメトプリム、アンピシリン、IPTGを含有している選択的最少培地が384ウェルプレートの各ウェル内へ25mlずつのアリコートとして充填される。各ウェルはその後最終濃度10μMを生じさせるために化合物アレイ（ArQule Inc.）からの個別サンプル1μLが接種される。各ウェルにはその後2mLの一夜培養が接種され、プレートは37℃で特別に適合した振とう浴中でインキュベートされる。２時間間隔で、プレートは８時間に渡ってPC及び600nmでのスプレッドシートソフトウエア（散乱）へ結合された光吸収分光分析プレートリーダー上を読み取られる。増殖率は各ウェルに対する個々の時間示度から計算され、標準曲線と比較される。「ヒット」は、個々の化合物が増殖率を試験プレート内の全ウェルで観察された増殖率についての標準偏差に基づく95％信頼区間より下に減少した場合であると定義されている。「ニアヒット」は、増殖率が95％信頼区間の範囲内にある場合であると定義されている。ヒット若しくはニアヒットの各々について、下記のコントロールがその後実施される。つまり、空ベクター（及びトリメトプリムなし）、全長mDHFR遺伝子を含んでいるベクター、又はタンパク質発現がIPTGによって誘導されない場合はコトランスフェクトされた細胞を用いてトランスフォームされているBL21細胞を用いて同一実験が実施される。これら全ての場合において化合物が作用を全く有していない場合は、それは試験されているタンパク質−タンパク質相互作用を特別に破壊していると結論付けることができる。このように妥当性が確認されたヒット若しくはニアヒットはその後個々の化合物について1pMから1mMまでの10桁相違する濃度を用いて用量反応曲線を確定するために再試験される。化合物スクリーニングのためのPCA方法は上記の通りに多タンパク質のタンパク質−RNA/DNAの場合に適用することができ、さらにE.coliにおけるDHFR若しくはその他のPCA又は同一PCAの酵母バージョンに容易に適合させることができる。そうしたスクリーニングは標的が既知の酵素／基質対に対する他のタンパク質若しくは核酸である酵素へ、又は下記で説明するように同定された新規酵素基質対へも又適用できる。
ウイルス統合プロセスに含まれるタンパク質は、PCA方法を用いてインヒビターに対して試験できる標的の例である。HIVウイルスに対する例には下記が含まれる。
i）インテグラーゼ又は統合前複合体：タンパク質Ma若しくはvprの輸送の阻害と、
ii）断片化の誘導を引き起こすvprによるG2における細胞周期の阻害（サイタリンBによる相互作用）と、
iii）フリンを用いてのgp160（膜タンパク質の前駆体）の相互作用の阻害。
治療標的としてのHIVのアクセサリータンパク質には下記が含まれる。
i）Vpr：核局在配列（ターゲット）：vprとホスファターゼAとの相互作用部位と、
ii）vif：ビメンチン（細胞骨格会合タンパク質）との相互作用と、
ii）Vpu：Vpuの細胞質テールによりメディエートされたREにおけるCd4の変性と、
iii）nef：Nefのミリストイル化シグナル。
その他の薬物スクリーニングに対する一般的標的には、アルファ−シヌクレインに対するようなタンパク質連関性神経変性疾患が含まれるであろう。このタンパク質はパーキンソン病の早期開始と連関しており、アルツハイマー病に関係している。さらに、アルツハイマー病に連関しているb−アミロイドタンパク質も存在する。
薬物スクリーニングの標的であろうタンパク質−炭水化物相互作用の例には、一般に炎症に関係しているセレクチン類が含まれる。これらの細胞表面グリコプロテイン類は血管外遊出に直接的に含まれている。
作用がタンパク質−タンパク質相互作用によって媒介される数多くの主要サプレッサー遺伝子は潜在的抗癌化合物のためにスクリーニングできるであろう。これらには、harmatomasの形成に直接関係している主要サプレッサーであるPTENが含まれる。さらにこれは遺伝性乳癌及び甲状腺癌にも関係している。その他の興味深い腫瘍サプレッサー遺伝子にはp53、Rb及びBARC1が含まれる。
実施例６
酵素／基質相互作用を検出するためのPCA方法の適用例
上記の実施例は、単に相互に結合する分子を含む新規分子相互作用を同定するために使用される。しかし、下記に示すように酵素の基質を検出することも又、PCA方法と完全に適合する。
i）タンパク質性基質と一緒にタイトな複合体を形成する、又は効果的なPCA断片アッセンブリーを誘導する酵素、又は
ii）突然変異残基が求核攻撃及び／又は産物放出に関係しているために、基質にタイトに結合するが産物放出は行わないミュータント酵素（基質のトラッピング）。
酵素はそれらの基質とのタイトな複合体を形成することがある（Kd〜1−10mM）。これらの場合、PCAはそうした相互作用を検出するために十分に効果的であろう。しかし、これが当てはまらない場合でさえ、PCAはもっと弱い相互作用を検出するために働く可能性がある。一般に、触媒作用及び産物放出の速度がPCA相補的断片のフォールディング再構成の速度より緩徐な場合は、PCAリポーター活性の効果的に不可逆性のフォールディング及び再構成が発生していたであろう。このため、たとえ酵素及び基質がもはや相互作用しない場合でさえ、PCAシグナルは検出される。従って、PCAを用いた新規酵素基質の検出は、有効な基質のKd又は産物放出の速度とは無関係に可能な場合がある。産物の放出がPCA断片アッセンブリー／フォールディングよりはるかに速い場合は、試験酵素の「基質トラッピング」突然変異体を発生させることによって好ましいアプローチが提供される。このアプローチの１例はタンパク質チロシンホスファターゼPTP1Bへ適用されたが、この場合は酵素を触媒的には死んでいるが既知の基質、EGFレセプター及び他の未知のタンパク質とのタイトな複合体を形成できるようにさせて求核アスパラギン酸181をアラニンへ突然変異させることによって基質トラッピングミュータントが発生されられている（Flint,A.J.Et al.（1996）Proc.Natl.Acad.USA 941680-1685）。PTP1Bの相互作用パートナーについてスクリーニングするためにPCAを使用する適用を下記に示す。我々は過剰的にトランスフェクトされたCOS又は293細胞においてアミノグリコシドキナーゼ（AK）に基づくPCAを使用する。PTP1Bの基質トラップ突然変異体触媒性ドメインはAKのN末端相補的断片に融合させられ、他のAK断片のC末端はcDNAライブラリーへ融合させられる。細胞は相補的AK対を用いてコトランスフェクトされ、選択的濃度のG418中で増殖させられる。72時間後、生存している細胞のコロニーが採取され、cDNAコーディング領域の3’及び5’フランキング領域へアニールするようにデザインされたプライマーを用いてin situのPCRが実施される。その後、PCR増幅産物は遺伝子を同定するために5’シークエンシングされる。
下記のいずれかを用いて酵素−PROTEIN基質複合体を阻害するものについての化合物の酵素インヒビター・スクリーニング結合ライブラリー、
i）タンパク質性基質とタイトな複合体を形成する酵素、又は、
ii）基質にタイトに結合するが、突然変異のために産物放出を行わない突然変異体酵素。
実施例７
タンパク質の工学的作製／進化に対するPCA方法の適用
現在はファージディスプレイテクノロジーを用いて行われているのと同様に、PCA方法は治療的価値を持っている可能性のある新規結合特性を備えたペプチド又はタンパク質を生成するために使用できる。さらに又、工業用酵素開発のために新規基質若しくは物理的特性を備えた酵素を開発することも可能である。これらの最終目的にPCA方法を適用した２つの詳細な実施例を下記に記載し、さらに追加の適用を挙げる。
１）高親和性のヘテロ二量体形成ロイシンジッパー配列の選択（J.Pelletier,K.Amdt,A.Pluechthun and S.Michnick,manuscript in preparation）
上記のmDHFR PCAが、効果的にヘテロ二量体形成しているようにデザインされたロイシンジッパーを選択するためのスキームで使用された。相補的
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位置での正及び負に荷電した残基間の塩橋の形成はロイシンジッパー形成を安定化させるために重要であると提案されているが、この見解には異議が唱えられている。e及びg位置での塩橋形成の重要性を定義するのに役立つように、２つのロイシンジッパーライブラリーが作られた。どちらもGCN4ロイシンジッパー配列に基づいているが、ヘテロ二量体形成対を創製するためにJun若しくはFosジッパーのいずれかに特異的な配列情報を含んでいる。同様に、各ライブラリーにおけるe-1からe-4及びg-1からg-4の位置は正若しくは負に荷電している残基、又は中性極残基をコードするように無作為化された。これらのライブラリーはPCRによって増幅され、GCN4ジッパー配列が取り除かれているZ-F[1,2]若しくはZ-F[3]構造体（上記）内へサブクローニングされた。細菌mDHFRのPCA選択は先に述べたように選択的固形培地上で実施された。コロニーが採取され、シークエンシングされた。配列順序解析は、e-g対での荷電若しくは中性残基の分布は無作為ではなく、同一荷電対合よりむしろ反対荷電の対合に向かって、又は荷電残基と中性残基の対合に向かって偏っていることを明らかにしている（図７参照）。我々はより優れたジッパー対合はDHFR−断片相補性の効率における上昇をもたらし、その結果としてより速い細菌倍加時間が生じるのであると理由付けし（mDHFRPCAの説明における表１参照）、下記の通りにGCN4に比較して新規ジッパーの選択／増強を行った。DHFRF[1,2]若しくはF[3:l114A]へのN末端融合として発現したデザインされたジッパーライブラリーはコトランスフォームされ、クローンが採取され、増殖させられ、選択的液体培地中で混合され、その混合物はZ-F[1,2]＋Z-F[3:l114A]（オリジナルのGCN4ロイシンジッパー）をクローニングするために1：1,000,000の比で添加された。この混合物が複数継代に渡って選択的液体培地中で増殖された。制限解析は、４継代内で、GCN4−発現細菌の集団が新規ジッパー配列に比較して減少していることを示しており（データは示されていない）、これはデザインされたジッパーを含有するクローンの一部がGCN4を含有するクローンより高速で増殖することを示唆している。後期継代からの細菌が選択的培地上でプレーティングされ、最も良好な結果が得られるデザインされたジッパー対の同一性を解明するために個々のクローンがシークエンシングされた（データは示されていない）。
２）酵素の機能及びデザインへのPCAの適用
PCAの開発、つまり、アデノシンデアミナーゼ（ADA）は上記に列挙したPCAにとっての基準全てを満たしている。ADAは小さく（〜40kD）、容易に精製される単量体亜鉛金属酵素であり、マウスADAの構造は解明されている。UV分光光度法及びストップトフロー蛍光光度法を含む数種のin vitroでのADA活性アッセイが開発されている。E.coli ADAは、細胞毒性アデニンヌクレオシドから非毒性イノシンへの不可逆的転換を触媒する。
細胞毒性濃度のアデノシン又はアデノシン類似体の存在下で増殖した真核又は原核細胞は、これらの化合物を除毒するためにADAを必要とする。これが哺乳類細胞において特異的遺伝子を発現する細胞を選択するために使用される優性選択方法の基礎である。ADA遺伝子は、さらに内因性ADAをコードする遺伝子の欠如したSF3834 E.coli細胞において発現させられている。ADAをコードする遺伝子がADA−細菌DNA内に導入されると、ADAを発現する細胞は高濃度のアデノシンが添加されても生存でき、発現しない細胞は死ぬ。これがin vivoでのADA活性アッセイの基礎を成している。
我々がADAを選択したのは、特に遺伝子が破壊されてしまっている哺乳類及び再菌細胞における優性選択的マーカーとして使用できるためである。我々が優性選択的遺伝子を選択した理由は、新規タンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングするときに、特に数百万個の独立遺伝子のライブラリーに対して既知のタンパク質の相互作用を試験するときに、選択が特異的タンパク質−タンパク質相互作用と何の関係もない理由から陽性反応を示す可能性のある細胞を濾過するために役立つからである。我々は、ロイシンジッパー形成配列、タンパク質rafとp21及び誘導オリゴマー化システム含む相互作用するタンパク質、FK506結合タンパク質（FKBP）及び大環状免疫抑制性化合物であるラパマイシンを通して相互作用するmTORの３つのテストシステムを使用するであろう。これらの試験系全部に対して、我々はE.coli及び哺乳類過渡トランスフェクションプラスミドを構築し、テスト用タンパク質をADA相補的断片への融合としてサブクローニングするであろう。主要アッセイは、毒性濃度のアデノシンの存在下において試験オリゴマー化タンパク質へ融合した相補的ADA断片を用いて形質転換されているSF3834のE.coli細胞の生存であろう。我々はその後下記で説明するようにコロニーから融合タンパク質を精製してADA活性のin vitroアッセイを実施するであろう。試験物質と相互作用する新規タンパク質を同定するための方法としてのADAのPCAの有益性は、ADA断片の１つに融合したFKBP及び106個の独立遺伝子を含有する正常ヒト脾臓からのcDNAライブラリーに融合したもう１つの断片を用いて過渡的にトランスフェクトされた哺乳類COS-7及びHEK-293T細胞において発揮されるであろう。E.coliアッセイを用いた場合と同様に、毒性濃度のADAを含有する培地中で生存している細胞が採取され、単離されたプラスミドがPCR増幅及び連鎖増殖−停止法によって相互作用するタンパク質について遺伝子を同定するために試験されるであろう。
タンパク質機能のために必要とされる構造的モチーフ
ADAの酵素機能のために必要とされる構造的エレメントの決定は、酵素断片の構造の変化を通して調査される。まず最初に、ADAは２つの別個のドメインに切断される。つまり、１つは基質結合（残基1〜210）を担い、もう１つは触媒作用を担う（残基211〜352）。これらの別個のピースはロイシンジッパー（上記の実施例１参照）のような既知のアッセンブリードメインに付着させられる。再構成は、酵素反応を観察するためにUV分光光度法及びストップトフロー蛍光光度法を使用して、再構成された酵素の結合及び触媒作用の詳細なin vitro導体解析を通して評価される活性を回復するであろう。この試験系は酵素機構研究のための強力なツールを提供する酵素活性の操作にもう１つの手がかりを提供する。例えば、基質の存在下で再構成された酵素と比較して（結合ドメインによって既に基質が結合されている場合）基質との混合で再構成された酵素の動態学的行動における相違は触媒作用に及ぼす結合エネルギーの重要性に関するハイレベルの洗練された試験を可能にする。タンパク質の機能的若しくはアッセンブリードメインへの引き続いての点突然変異はその後、極めて僅かな摂動及び結合エネルギーと触媒作用の関連の詳細な定量化を許容するであろう。酵素の別個の機能的ドメインの構造及びアッセンブリーに渡るこの精密な制御は、極めて洗練された酵素構造機能試験、構造的モチーフの定義及び触媒作用においてそれらが果たす役割の理解を許容するであろう。
新規タンパク質触媒デザイン：触媒作用についての構造的必要条件の測定を通して得られた酵素機構に関する詳細な知識は、その後これらの機能的
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（建築用ブロック）
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と他の酵素における基質結合及び触媒作用に対して責任を負っている機能的モチーフとの結合を通して開発され、新規タンパク質触媒の生成が可能になる。例えば、ADAからの触媒モチーフはサイチジン結合モチーフへ修飾され、潜在的に有用な触媒特性を備えた新規酵素が精製される。これらの新規酵素の活性はPCAシステムに類似のin vivoアッセイ法を通して、又はin vitro活性アッセイを通して容易に評価できる。さらに、このシステムを用いて可能な結果として生じる酵素の詳細な機構的調査は各々の引き続いての合理的デザインの触媒を生成することを許容するであろう。
実施例８
全ての生物中の分子相互作用を検出するためのPCA方法の適用例
それは、上記のPCA適用の説明を例えばショウジョウバエ（drosophila）、ネマトデス（nematodes）、ゼブラフィッシュ（zebrafish）及びパファーフィッシュ（puffer fish）のような全てのモデル生物におけるこれらの技術の有益性へ論理的に拡大したものである。
列挙した他の実施例との唯一の相違は、使用されるベクターが相違していなければならないこと（例えばレトロウイルスベクター）、及びPCAによって必要とされるあらゆる基質が生体内利用性である必要がある、又は検出がin situで実施される必要がある点である。
実施例９
遺伝子療法へのPCA方法の適用例
本発明のもう１つの重要な実施態様は、哺乳類疾患に対する遺伝子療法のための手段及び方法を提供することである。特に興味深いのは、癌治療に対するPCAの治療的使用である。前記PCA遺伝子療法の１つの実施態様では、PCAは例えばシュードモナス内毒素、ジフテリア毒素及び植物毒素ゲロニンのようなタンパク質毒素又はその他の同様の分子に由来する断片（基本タンパク質単位）を使用して開発される。例えば乳癌治療のためには、まず最初にerbB2発癌遺伝子発現に対するプロモーターの制御下で選択された毒素の１断片を導入する哺乳類、レトロウイルス、アデノウイルス若しくは真核細胞人工染色体（EAC）の遺伝構造体が調製される。erbB2発癌遺伝子が乳癌及び腺癌細胞中で過剰発現することはよく知られている（D.J.Slamon et.Al.,Science,1989,244,707）。HER2/neu（c-erB2）癌原遺伝子は、サブクラス１の185kDaトランスメンブランタンパク質チロシンキナーゼ成長因子レセプターp185HER2をコードする。さらに、ヒトerbB2癌遺伝子は17番染色体、q21領域に位置して4,480塩基対を含んでおり、p185HER2はヒト乳癌細胞系によって分泌された30kDaグリコプロテイン成長因子に対するレセプターとして役立つ（R.Lupu et al.,Science,1990,249,1152）。
トランス遺伝子は、例えばレトロウイルス、アデノウイルス若しくはEACによって重要な座位内にトランス遺伝子を挿入するための相同組換えのような当業者に既知の方法を使用してターゲット細胞内に「in vivo」若しくは「ex vivo」で導入される。本発明において記載されているPCAプロセスによって発見されたerbB2発癌遺伝子と相互作用する相互作用タンパク質及び毒素分子の「第２」断片をコードするターゲットDNAを含んでいる融合遺伝子から構成される第２遺伝構造体。この構造体は参照してその全体の内容がここに組み込まれる米国特許第5,399,346号及び第5,585,237号に示されているように、技術において知られている方法によって患者に送達される。記載されたerbB2発癌遺伝子−毒素断片のトランス遺伝子発現は、現在では構成性発癌遺伝子プロモーターの制御下にあるであろう。従って腫瘍細胞を増殖させるとerbB2発癌遺伝子への融合として付着した１ピースの毒素を産生するであろう。PCAによって発見された相互作用するerbB2発癌遺伝子を発現する第２遺伝構造体の存在下では、「相互作用するタンパク質−毒素断片」構造体それから、erbB2発癌遺伝子−毒素断片A、相互作用するタンパク質−毒素断片Bが創製され、タンパク質断片相補性を通して活性毒素の創製を通して標的腫瘍細胞の死を誘発し、さらに従って前記疾患の有効かつ効率的治療法を提供するであろう。
これは本発明で記載かつ具体化された技術を使用して他の疾患及び他の毒素に拡大することができる。
実施例10
In vitroにおける分子相互作用を検出するためのPCA方法の適用例
上記で説明したPCA方法はいずれもin vitro検出に適合させることができよう。しかし、in vivo PCAとは相違して、検出は精製されたPCA断片−融合タンパク質を用いて実施されるであろう。PCAのそうした使用は診断用キットにおいて使用できる可能性がある。例えば相互作用するドメインがFKBP12とTORである上記に説明した試験DHFRアッセイは、ラパマイシンを用いて治療される患者において用量を監視するときに使用するための薬剤濃度の診断試験として使用できよう。
上記で示されたように、本発明は下記を提供する。
１）in vivo又はin vitroでのタンパク質−タンパク質相互作用の検出を許容することと、
２）特異的生物、細胞種類、細胞コンパートメント又はオルガネラ内のような適切な状況でのタンパク質−タンパク質相互作用の検出を許容することと、
３）誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用（例えば細胞増殖又は阻害因子によってのような）の検出を許容することと、
４）アッセイの感受性を制御することによって特異的体非特異的タンパク質−タンパク質相互作用を区別することができることと、
５）細胞内のタンパク質アッセンブリーの動態検出を許容することと、
６）タンパク質−タンパク質相互作用に対するcDNAライブラリーのスクリーニングを許容することである。
本発明のさらに別の態様は、酵素p70S6kの調節及び別個のシグナル発生カスケードがこの酵素にどのように集中するのかを測定するために、この酵素との新規相互作用を同定することによって証明できる。
PCA法は、細胞内のタンパク質アッセンブリーの動態を検出するために特に有用である。タンパク質アッセンブリーの動態は蛍光タンパク質システムを用いて測定できる。
本発明のさらに別の実施態様では、PCAは薬物スクリーニングのために使用できる。PCAの技術は、有用な薬理学的特性を有している製品を同定するための注意深く目標を定めて制御された方法を許容することによって、細胞内の特異的生化学的経路を遮断する薬物をスクリーニングするために使用される。
本発明は上記に好ましい実施態様を用いて記載されてはいるが、添付の請求の範囲に定義されている通りに本発明の技術的思想及び性質から逸脱することなく修飾することができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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