(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光線と、顕微鏡光学系と、第一波長の励起光線及び第一波長とは異なる第二波長の放出光線を生成する少なくとも１つの光源を有すると共に、  試料（被検物）内において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦され  かつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦されており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域において光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳しているＳＴＥＤ走査型顕微鏡であって、
前記励起光線（１９，６３）に対してのみ作用する光学的補正手段及び前記放出光線（２３，６９）に対してのみ作用する光学的補正手段の少なくとも１つが設けられていること、さらに
前記少なくとも１つの光学的補正手段は、前記第１，第２の２つの合焦領域が走査運動に依存することなく互いに相対的位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるように、前記励起光線（１９．６３）及び前記放出光線（２３，６９）の少なくとも１方に対して作用して２つの合焦領域を調整すること、
を特徴とするＳＴＥＤ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記励起光線（１９，６３）及び前記放出光線（２３，６９）に対して作用する光学的補正手段が設けられていることを特徴とする請求項１に記載のＳＴＥＤ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光学的補正手段は、走査モジュール（２９）に配された走査ミラー（３１）の位置に依存して制御される適応制御（補償）光学系（５３、５７）を含むこと、
を特徴とする請求項１又は２に記載のＳＴＥＤ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は走査型顕微鏡に関する。本発明は、特に、照明光線と、顕微鏡光学系と、第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦されかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦されており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域において光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域で誘導される放出（誘導放出）を惹き起こし、かつ、該第一及び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳している走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
走査型顕微鏡では、試料（ないし被検物）から放出される反射光又は蛍光を観察するために、試料は光線で照明される。照明光線の合焦スポットは、調節可能な光線偏向装置によって、一般的には２つのミラーの傾動によって、物体（被検物）面内で移動させられるが、偏向軸（複数）は、一方のミラーがＸ方向に、他方のミラーがＹ方向に偏向を行うように、大抵互いに直角に配されている。ミラーの傾動（運動）は、例えば、ガルバノメータ位置調節素子によって行われる。被検物から生じる光のパワーは、走査光線の位置に依存して測定される。実際のミラー位置を求めるために、通常、位置調節素子にはセンサ（複数）が設けられている。
【０００３】
特に共焦点走査型顕微鏡においては、被検物は、光線の合焦スポットにより三次元で走査される。
【０００４】
共焦点走査型顕微鏡は、一般に、光源と、光源の光をピンホール遮光器−所謂励起遮光器（絞り）−で合焦させる合焦光学系と、ビームスプリッタと、光線制御用の光線偏向装置と、顕微鏡光学系と、検出用遮光器（絞り）と、検出光ないし蛍光を検出するための検出器（複数）を有する。照明光線は、ビームスプリッタによって入射結合される。被検物から発する蛍光又は反射光は、逆戻りして光線偏向装置を介してビームスプリッタに到達し、これを通過し、そして検出用遮光器（この後方に検出器（複数）がある）で合焦される。合焦部位に直接的には由来しない検出光は、上記と異なる光線を辿り、従って検出用遮光器を通過しないので、被検物を連続的ないし順次的に走査することにより三次元像を形成する点情報が得られる。三次元像は、大抵、層状の画像データを取得することにより得られる。照明光線を光線偏向装置によって被検物上へないし被検物を通過するように案内する代わりに、照明光線を空間的に固定して被検物を移動させる構成もありうる。この２つの走査方法、即ち光線走査と物体走査は、既知でありかつ普及している。
【０００５】
被検物から発する光のパワーは、走査過程中一定の時間間隔で測定され、走査スポット毎に走査（ないし測定）される。測定データから画像を生成することができるように、その測定値は、それに属する走査位置に対し一義的に配属させられなければならない。そのために、光線偏向装置の調節素子の状態データを絶えず一緒に測定するか、或いは、多少正確さに欠けるものの、光線偏向装置の制御目標データを直接利用することが目的に適う。
【０００６】
透過光構成では、例えば、蛍光又は励起光の透過をコンデンサ側で検出することも可能である。この場合、検出光線は、走査ミラーを介さずに検出器へ到達する（非走査ミラー−検出器構成：Non descan Anordnung）。蛍光を検出するために、この透過光構成では、上述の走査ミラー−検出器構成（Descan-Anordnung）の場合のように、三次元の分解能を得るために、コンデンサ側に検出用遮光器が必要でもあろう。しかしながら、二光子励起の場合では、コンデンサ側の検出用遮光器は省略することができる。というのは、励起確率が光子密度（これは必然的に合焦スポットにおいて、その周辺領域においてより遥かに大きい）の２乗に依存している（〜強さ２）からである。検出されるべき蛍光は、それ故大きな確率でその殆んど全てが合焦部位に由来するので、遮光器を配置することにより合焦部位からの蛍光光子をその周辺領域からの蛍光光子から更に区別することは不必要になる。
【０００７】
走査型顕微鏡の分解能は、とりわけ照明光線の合焦領域の強度分布及び空間的広がりによって与えられる。蛍光を利用する場合の分解能を高めるための構成は、PCT/DE/95/00124から既知である。この構成は、第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する光源（この場合、試料（ないし被検物）中において、励起光線は第一合焦領域で合焦し、放出光線は第一合焦領域と部分的に重畳する第二合焦領域で合焦する）を有する。励起光線は、試料を第一合焦領域で光学的に励起し、他方放出光線は、第二合焦領域で誘導放出を惹き起こす。そして第一合焦領域の誘導放出が惹き起こされなかった部分から自然発生的に放出される光のみが検出され、そのため全体として分解能の改善が達成される。この方法には、STED（Stimulated Emission Depletion：誘導放出欠乏）という名称が与えられた。
【０００８】
これまでに、STED技術は更に発展し、放出光線の合焦領域が、その内部（領域）において消失した強度分布を有することにより、横方向にも軸方向にも分解能を高めることができるようになった。この合焦領域には、内部に言わば中空がはっきりと現れている。そのような強度分布は、例えば、放出光線の合焦領域に関するフーリエ面（Fourierebene）に配されたλ／２プレート（その直径は光線の直径より短く、従って（上から）覆われるように照明される）によって得ることができる。放出光線の合焦領域は、励起光線の合焦領域と一致していなければならない。そして、そのような構成においては、放出光線の合焦領域の強度分布が消失している部分から自然発生的に放出される光しか最早検出されない。理論的には、そのような構成によって、１００ｎｍより遥かに高い分解能（１００ｎｍ未満）が得られる。
【０００９】
決定的に重要なことは、放出光線の合焦領域と励起光線の合焦領域が適切に重畳されるということである。更に、この重畳は、試料を走査する場合にも維持されたままでいなければならない。この重畳は、この２つの光線相互の、走査過程によって変動されない空間的関係である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、高度に補正されたハイエンド光学素子でさえ残留収差（Restaberrationen）がある。この残留収差は、伝統的な顕微鏡では大抵問題にならないが、ここで問題となっている分解能領域では、大いに影響を及ぼす。とりわけ励起光線と放出光線の波長が互いに異なるので、残留色収差により、極めて重大な誤差が生じる。例えば、ハイエンド顕微鏡対物レンズ系の色縦誤差（Farblaengsfehler）だけで既に凡そ１５０ｎｍに達し、これは理論的にSTEDによって達成可能な分解能を越えている。光線走査システムでは、軸方向の収差の他に更に横方向の収差も加わり、そのため走査運動の間、重畳領域は、縦方向にも、横方向にも変化してしまう。
【００１１】
それ故、本発明の課題は、STED-顕微鏡のために必要な分解能を得ることができるように調整される光学的手段を有する走査型顕微鏡を創出することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この課題の解決のため、本発明の一視点によれば、照明光線と、顕微鏡光学系と、第一波長の励起光線及び第一波長とは異なる第二波長の放出光線を生成する少なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦されかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦されており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域において光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳しているＳＴＥＤ走査型顕微鏡が提供される。このＳＴＥＤ走査型顕微鏡は、照明光路に配される部材の光学的性質が、２つの合焦領域（第一及び第二合焦領域）が走査運動に依存することなく互いに位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるように、互いに調整される。
即ち、前記励起光線に対してのみ作用する光学的補正手段及び前記放出光線に対してのみ作用する光学的補正手段の少なくとも１つが設けられていること、さらに、
前記少なくとも１つの光学的補正手段は、前記第１，第２の２つの合焦領域が走査運動に依存することなく互いに相対的位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるように、前記励起光線及び前記放出光線の少なくとも一方に対して作用して２つの合焦領域を調整すること、
を特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の好ましい実施の形態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。
走査型顕微鏡は、更に、励起光線に対してのみ作用する光学的補正手段が設けられていることが好ましい。
走査型顕微鏡は、更に、放出光線に対してのみ作用する光学的補正手段が設けられていることが好ましい。
走査型顕微鏡は、更に、励起光線及び放出光線に対して作用する光学的補正手段が設けられていることが好ましい。
走査型顕微鏡は、更に、光学的補正手段が、レンズ、ドリフトレンジ（Driftstrecke）及び適応制御光学系（補償光学系：adaptive Optik）のうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００１４】
本発明は、STED-技術の理論的分解能が、物体（被検物）走査システムにおいても、光線走査システムにおいても達成されるという長所を有する。
【００１５】
本発明によれば、とりわけ色収差（例えば、色縦誤差、色倍率誤差、色横誤差（Farbquerfehler））が補正される。そのような補正は、とりわけ有利な方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過する、照明光路の分割（分岐）光路（Teilstrahlengaenge）中に配した付加的光学系によって達成される。これらの分割光路では、特に軸方向及び横断方向の光線の性質が影響を与えられうる。そして残りの色縦誤差は、例えば、励起光線と放出光線の合焦面−光源間において双方の光の経路の長さを異なるようにすることによって補正することができる。
【００１６】
球面収差、コマ収差、非点収差、像面弯曲、歪曲収差のような単色光の収差も、とりわけ有利な方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過する、照明光路の分割光路中の付加的光学系によって補正することができる。しかし、励起光線と放出光線が共通に通過する、照明光路の部分中に配した補正部材もまた有利である。補正部材には、レンズ、ドリフトレンジ（光が光学素子によって影響を受けずに伝搬する光路範囲）が含まれるが、適応制御光学系（補償光学系）又は活性光学系も含まれる。考えられるものとしては、例えば、変形可能ミラー、箔片（フォイル帯）式ミラー（Folienspiegel）、マイクロミラーアレイがあるが、これらは、走査運動中、その湾曲（ないし曲率）又は位置が変化するものである。適応制御光学系としては、照明光線中に、LCD-素子も、好ましくは合焦面に関するフーリエ面に設けることができる。LCD-素子は、励起光線若しくは放出光線の位相又は励起光線若しくは放出光線の（複数の）部分（一部）を変化させる。
【００１７】
【実施例】
本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は、発明の理解の容易化のためであり、本発明を図示の態様に限定することを意図しない。また、以下の実施例も、発明の理解の容易化のためであり、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な修正・変更を含むことも言うまでもない。
【００１８】
図１は、従来の光線走査システムにおける励起光線１と放出光線３の合焦領域の軌跡の推移を示す模式図である。励起光線１と放出光線３は、顕微鏡光学系５によって合焦する。励起光線１の合焦領域７は、実線で描かれている。この合焦領域７は、走査運動を実行するとき、ライン１１を辿る。放出光線３の合焦領域９は、破線で描かれている。この合焦領域９は、走査運動を実行するとき、ライン１３を辿る。重畳領域１５は、走査運動の実行時に、変化する。光軸の領域においてさえ、合焦領域７及び９は、色縦誤差のため一致しない。光軸から外れたところでは、この軸方向の収差に加えて、更に色横誤差、並びに歪曲収差及び像面弯曲が加わり、そのため合焦領域７及び９は、横方向にも、縦方向にも互いに位置がずらされてしまう。
【００１９】
図２には、共焦点走査型顕微鏡として構成されている本発明の走査型顕微鏡が示されている。パルスレーザとして構成されている第一光源１７は、励起光線１９を生成する。同様にパルスレーザとして構成されている第二光源２１は、放出光線２３を生成する。励起光線１９と放出光線２３は、ダイクロイック光線結合器２５によって結合され、ダイクロイックビームスプリッタ２７を介して、カルダン懸架式走査ミラー３１を有する走査モジュール２９に達し、走査ミラー３１によって、励起光線１９と放出光線２３は、走査光学系３３、光学系３５を介し、顕微鏡光学系３７を通過して、試料（被検物）３９上に案内されるか又は試料３９を通過させられる。試料３９は、Ｚ方向、即ち励起光線１９の（進行）方向での走査（位置調節）を可能にする顕微鏡ステージ（不図示）に配されている。試料３９の種々の(異なった)合焦面が励起光線１９と放出光線２３により順次走査される。励起光線１９と放出光線２３は、実線で描かれている照明光路４１を形成する。試料３９から射出する光（射出光）４３は、顕微鏡光学系３７を通過し、走査モジュール２９を介し、ビームスプリッタ２７に至りこれを通過し、光電子増倍管として構成されている検出器４５に入射する。射出光４３は、破線で描かれている。検出器４５では、射出光４３のパワーに比例する電気的検出信号が生成し、この信号は、処理ユニット（不図示）へ送信される。検出器４５には、放出光線２３の波長を有する光を遮光する帯域（通過）フィルタ４９が前置されている。共焦点走査型顕微鏡において通常設けられている照明用ピンホール（遮光器）５１と、検出用ピンホール（遮光器）４７は、完全を期するために模式的に描かれている。これに対し、光線案内及び形成用の幾つかの光学素子は、図を見やすくするために省略されている。これらの素子は、当業者には周知である。走査運動の実行中であっても励起光線１９と放出光線２３の合焦領域を互いに位置不変に留めておくことを実現するために、第一光源１７とダイクロイック光線結合器２５との間に、合焦光学系が設けられている。第一光源１７及び第二光源２１からダイクロイック光線結合器２５までの光の経路の長さの差違と共に、照明光路４１の残りの全ての光学系の色縦誤差の補正が行われる。横方向の収差を補償するために、第二光源２１とダイクロイックビームスプリッタとの間に、ＬＣＤ素子として構成されている適応制御光学系（補償光学系）５３が設けられている。これは、光線偏向装置（走査モジュール）２９内の走査ミラー３１の位置に依存して制御される。
【００２０】
図３には、多光子励起を伴う非DESCAN構成による本発明の走査型顕微鏡が示されている。この実施例では、検出はコンデンサ側で行われる。この構成では、照明用ピンホール（遮光器）と検出用ピンホール（遮光器）を排除することができる。試料３９から射出する光（射出光）７１は、コンデンサ光学系５５によって合焦され、ミラー７３を介し、光電子増倍管として構成されている検出器４５へ導かれる。検出器４５には、励起光線の波長を有する光と放出光線の波長を有する光を遮光するフィルタ７５が前置されている。励起光線６３は、チタンサファイア−パルスレーザとして構成されている第一光源によって生成される。放出光線６９は、光パラメトリック発信器を含む第二光源６７によって生成される。ダイクロイック光線結合器５９による結合後、試料の照明（照射）は、図２について記載された照明（照射）と同様にして行われる。走査運動の実行中であっても励起光線６３及び放出光線６９の合焦領域を互いに位置不変に留めたままにしておくことを実現するために、第一光源６１とダイクロイック光線結合器５９の間に、ディフォーカス（脱焦）用レンズ６５が設けられている。第一光源６１及び第二光源６７からダイクロイック光線結合器５９へ至るまでの光線の経路の長さの相違と共に、照明光線４１の残りの全ての光学系の色縦誤差の補正が行われる。横方向の収差を補償するために、励起光線６３と放出光線６９が共通に進行する照明光路の部分に、適応制御光学系（補償光学系）５７が設けられている。これは、光線偏向装置２９内の走査ミラー３１の位置に依存して制御される。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の独立請求項１により、所定の課題として掲げた効果が達成される。即ち、本発明の走査型顕微鏡により、調整可能な光学的手段を介し、STED-顕微鏡のために必要な（極めて小さい）分解能を得ることができる。
各従属請求項により、更に付加的な効果が、前述の通りそれぞれ達成される。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の（走査）システムの励起光線及び放出光線の合焦領域の軌跡の模式図。
【図２】本発明の走査型顕微鏡の模式図。
【図３】多光子励起を伴う非DESCAN構成による本発明の走査型顕微鏡の模式図。
【符号の説明】
１  励起光線
３  放出光線
５  顕微鏡光学系
７  励起光線の合焦領域
９  放出光線の合焦領域
１１  ライン
１３  ライン
１５  重畳領域
１７  第一光源
１９  励起光線
２１  第二光源
２３  放出光線
２５  ダイクロイック光線結合器
２７  ダイクロイックビームスプリッタ
２９  走査モジュール
３１  走査ミラー
３３  走査光学系
３５  光学系
３７  顕微鏡光学系
３９  試料（被検物）
４１  照明光路
４３  射出光
４５  検出器
４７  検出用ピンホール（遮光器）
４９  帯域（通過）フィルタ
５１  照明用ピンホール（遮光器）
５３  適応制御光学系（補償光学系）
５５  コンデンサ光学系
５７  適応制御光学系（補償光学系）
５９  ダイクロイック光線結合器
６１  第一光源
６３  励起光線
６５  レンズ
６７  第二光源
６９  放出光線
７１  射出光
７３  ミラー
７５  フィルタ
【図１】
0004312979.tif 000002
【図２】
0004312979.tif 000003
【図３】
0004312979.tif 000004