(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）であって、このパッケージは組換え型ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を含有し、ここでキメラタンパクはヌクレオチド結合部分とターゲットペプチド部分とを有し、前記組換え型ポリヌクレオチドは特異的に前記ヌクレオチド結合部分によって結合されるヌクレオチド配列モチーフを含有し、ここで少なくともキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合されていない組換え型ポリヌクレオチドのキメラタンパクコード化部分が、ヌクレオチド配列に関係なくポリヌクレオチドと非特異的に結合する結合部分によって保護されているペプチド表示キャリアパッケージ。
【請求項２】
前記結合部分がタンパクである請求項１に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項３】
前記タンパクがウイルスコートタンパクである請求項２に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項４】
前記ターゲットペプチド部分がパッケージの外部に表示されている請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項５】
前記組換え型ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列を含有する請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項６】
前記組換え型ポリヌクレオチドが、それぞれキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合される、２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを有する請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項７】
前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域である請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項８】
前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一本鎖ＤＮＡとして結合する請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項９】
前記ターゲットペプチド部分がキメラタンパクのＮおよび／またはＣ末端に位置する請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項１０】
前記組換え型ポリヌクレオチドで形質変換することによってホスト細胞中で製造され、このホスト細胞の溶菌を行うことなくそこから排出される請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
【請求項１１】
ターゲットペプチド部分に操作によって結合されるヌクレオチド結合部分を有するキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有する組換え型ポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合され、さらにヌクレオチド配列に関係なくポリヌクレオチドと非特異的に結合する結合タンパクをコード化する特定のヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記結合タンパクがウイルスコートタンパクである請求項１１に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列を含有する請求項１１または請求項１２に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
それぞれ前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合される２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを有する請求項１１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域である請求項１１ないし請求項１４のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一本鎖ＤＮＡとして結合する請求項１１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ｉ）特異的配列モチーフを認識することができ、それに結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化する配列と、
ｉｉ）  ｉ）によってコード化されたヌクレオチド結合部分によって認識され、結合された配列モチーフと、
ｉｉｉ）  ポリヌクレオチドの挿入を行う制限酵素部位と、ここで前記部位は前記ポリヌクレオチドをヌクレオチド結合部分コード化配列に操作によって結合するよう設計されており、それによって操作によって結合されたポリヌクレオチド配列がキメラタンパクを製造し、さらに、
ｉｖ）  ヌクレオチド配列に関係なく非特異的にポリヌクレオチドへ結合する結合タンパクをコード化する配列と、
を含有する配列を有するポリヌクレオチドを集合的に含有する遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
【請求項１８】
ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とポリヌクレオチドの挿入を行う部位との間にリンカー配列が位置している請求項１７に記載の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
【請求項１９】
それぞれ番号ＮＣＩＭＢ４０９７０、ＮＣＩＭＢ４０９７１およびＮＣＩＭＢ４０９７２としてＮＣＩＭＢに預託されたベクターｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４あるいはｐＤＭ１６を含有する請求項１７または請求項１８に記載の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
【請求項２０】
遺伝子ライブラリを構築する方法であって、
ａ）  特異的配列モチーフを認識し、この配列モチーフと結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する組換え型ベクターの複数のコピーを構築し、
ｂ）  前記ベクターのそれぞれを、操作によって結合されたベクターの発現が前記ターゲットペプチドと前記ヌクレオチド結合部分を含有するキメラタンパクの発現をもたらすように、ターゲットポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドへ操作によって結合し、ここで前記操作により結合されるベクターの複数のコピーがターゲットペプチド部分のライブラリを集合的に表し、
ｃ）  ホスト細胞をステップｂ）のベクターによって形質変換し、
ｄ）  ステップｃ）のホスト細胞を前記キメラタンパクの発現に適した条件のもとで培養し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されるヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクへ露出してポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を生じさせ、さらに、
ｆ）  キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドの保護されていない部分にヌクレオチド配列に関係なく非特異的に結合することのできる結合部分の生産を生じさせてペプチド表示キャリアパッケージを形成するステップと、
を有する遺伝子ライブラリを構築する方法。
【請求項２１】
遺伝子ライブラリをスクリーニングする方法であって、
ａ）  前記ライブラリのポリヌクレオチドがそれぞれ前記遺伝子構成体の一つのコピーと結合し、組換え型ポリヌクレオチドのライブラリを形成する条件下で前記ライブラリのポリヌクレオチドメンバーを認識可能で特定の配列モチーフへ結合可能なヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列を含有する遺伝子構成体の複数のコピーに露出し、
ｂ）  前記組換え型ポリヌクレオチドをホスト細胞のポピュレーションに、前記ホスト細胞が前記組換え型ポリヌクレオチドにより形質変換されるのに適した条件下で露出し、
ｃ）  形質変換されたホスト細胞を選択し、
ｄ）  前記形質変換されたホスト細胞を前記組換え型ポリヌクレオチドが発現し、キメラタンパクを生じるのに適した条件に付し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されたヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクに露出し、ポリヌクレオチドキメラタンパク複合体を生じさせ、
ｆ）  ステップｅ）の複合体中のポリヌクレオチドの露出部分を保護してペプチド表示キャリアパッケージを形成し、さらに、
ｇ）  要求される特徴を持つターゲットペプチド部分を表示するパッケージのみを選択するために、前記ペプチド表示キャリアパッケージをスクリーニングするステップと、
を有する遺伝子ライブラリのスクリーニングを行う方法。
【請求項２２】
ペプチド表示キャリアパッケージがホスト細胞からその溶菌を行わずに排出される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１５または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
『発明の属する技術分野』
本発明は、一般に関心のあるペプチドをコード化する配列に関して、ヌクレオチドライブラリをスクリーニングする方法に関する。
【０００１】
『発明の背景および従来技術の説明』
組換え型ＤＮＡライブラリから所望のペプチドをコード化する未知の遺伝子を分離することは困難な作業であるといえる。ハイブリッド形成プローブを使用することにより、このプロセスを容易にすることができるかもしれないが、それを使用するには、一般的に少なくともこのタンパク質をコード化する遺伝子の配列の一部がわかっていなくてはならない。この配列が知られていない場合は、ＤＮＡライブラリを発現ベクター中に発現させ、抗体を使用して所望のタンパク抗原を示しているプラークあるいはコロニーを探してスクリーニングすることができる。この手順は小さなライブラリをスクリーニングするのには有用であるが、頻度の極めて低い配列、１０万個のクローンあたり約１個に満たない再現性（滅多に出現しないｃＤＮＡ分子あるいは合成ペプチドの場合のように）は見逃しやすく、１００万個のクローンを越える規模のライブラリのスクリーニングは骨の折れる困難な仕事となっている。さて、１００万個のクローンのライブラリをスクリーニングすることにより、この出現率の低い配列の分離に取り組むように設計された方法が開発された。この方法にはファージ表示方法およびＬａｃＩ融合ファージ表示とが含まれているが、詳しくは下記する。
【０００２】
ファージ表示法
糸状バクテリオファージｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩコートタンパクのＮ末端側に融合したＤＮＡライブラリのメンバーは発現ベクターから発現し、その結果ファージ粒子の表面で、ファージ粒子中にパッケージされた融合タンパクをコード化するＤＮＡと共に異種ペプチドを表示する(Smith G.P., 1985, Science 228:1315-1317)。この発現ベクターはバクテリオファージゲノム自身でもよく、またバクテリオファージコートタンパクがその中にクローン化されているところのファージミドベクターでもよい。後者の場合、成熟したファージ粒子を作り出すために必要なタンパクの完全な補体を提供するためには、ファージミドベクターを含有しているホストバクテリアを、自発的に複製しているバクテリオファージ(ヘルパーファージと呼ばれる)とともに共感染させなくてはならない。このヘルパーファージは通常複製の起点において遺伝子に欠陥があり、そのためファージミドゲノムの選択的なパッケージングが行われる。ヘルパーファージの感染に続く融合タンパクの発現により、集合中に融合タンパクと野生型コートタンパクとがファージ粒子中に取り込まれる。ファージ中に取り込まれた融合タンパクのライブラリからついで関心のあるターゲット(リガンド)に対し、結合メンバーを選択することができる。結合したファージにより、ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を再感染させ、増幅させ、さらにこの選択行程を繰り返して結合メンバーを増菌する(Parmley, S., F., & Smith, G. P. 1988., Gene 73 : 305-318 ; Barrett R. W. et al., 1992, Analytical Biochemistry 204 ; 357-364 Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 4141-4145; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222 : 581-597)。
【０００３】
いくつかの刊行物にこの方法が記載されている。例えば米国特許第５，４０３，４８４号には、興味あるウイルスコートタンパクとペプチドからキメラ結合タンパクを製造する方法が記載されている。この方法においては、ウイルスの外表面上にキメラタンパクあるいはその加工された形が表示されるために、少なくともウイルスコートタンパクの機能性部分が必要となる。さらに米国特許第５，５７１，６９８号には、結合タンパクをコード化する核酸を得るための方法が記載されているが、その重要な要素は、遺伝子的に決定される外表面タンパクを有する増幅可能な遺伝子パッケージのポピュレーションを準備し、この遺伝子パッケージの外表面上の潜在的な結合領域を表示させることである。この遺伝子パッケージは、細胞、胞子およびウイルスからなる群から選択される。例えば、この遺伝子パッケージがバクテリア細胞であると、外表面伝達信号はバクテリアの外表面タンパクから生じるが、遺伝子パッケージが糸状バクテリオファージであるときは、この外表面伝達信号は糸状ファージの遺伝子ｐＩＩＩ（マイナーコートタンパク）あるいはｐＶＩＩＩ（メジャーコートタンパク）によって提供される。
【０００４】
国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号および第ＷＯ−Ａ−９２／２０７９１号は、遺伝子ｐＩＩＩ  タンパクなどのウイルスコートタンパクに融合した第１のポリペプチド鎖を発現し、この多量体の第２のポリペプチド鎖を発現し、この二つの鎖がＲＧＤＰの一部として一緒に現れるようにすることによって、パッケージの表面でポリペプチドを表示する、分泌された複製可能な遺伝子表示パッケージ（ＲＧＤＰ）の多量体特異性結合ペアを製造する方法を記載している。
【０００５】
ＬａｃＩ融合プラスミド表示
この方法はラクトースリプレッサーのＤＮＡ結合能力に基づくものである。ランダムペプチドのライブラリはこのＬａｃＩリプレッサータンパク、通常そのＣ末端に、融合遺伝子運搬プラスミドベクターからの発現を通じて融合している。このＬａｃＩ−ペプチド融合のエンコーディングＤＮＡへの結合はプラスミド上のｌａｃ０配列を通じて生じ、安定なペプチド−ＬａｃＩ−ペプチド複合体を形成する。これらの複合体はそのホストバクテリアから溶菌によって放出され、関心のあるペプチドがアフィニティー精製によって固定化されたターゲット上に分離される。このように分離されたプラスミドは、ついで大腸菌の中にエレクトロポレーションによって再度導入され、さらに、スクリーニングを行うために選択されたポピュレーションを増幅する(Cull, M.G. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1865-1869)。
【０００６】
米国特許第５，４９８，５３０号には、適当なホスト細胞中のＤＮＡ結合タンパクへ融合されたランダムペプチドのライブラリを構築し、ホスト細胞の原形質中で、細胞内融合タンパク発現に適した条件下でホスト細胞を培養する方法が記載されている。この方法は、またランダムペプチドが融合タンパクのカルボキシ末端に位置しており、融合タンパク−ＤＮＡ複合体が溶菌によってホスト細胞から放出されることを教示している。この溶菌細胞から放出された後のＤＮＡを分解から守るための方法は何ら記載されていない。いくつかのＤＮＡ結合タンパクがクレームされているが、ｌａｃＩを除いて実例は示されていない。
【０００７】
前述した方法以外のペプチドライブラリを構築する方法が必要とされている。例えば、前述した方法では、遊離カルボキシル末端を持つ分泌されたペプチドの製造を行うことはできない。
【０００８】
『発明の概要』
本発明は、関心のあるペプチドをライブラリから分離する別の方法を述べるものであり、従来の方法に比べて大きな利点を有するものである。
【０００９】
大まかに言うと、本発明は関心のあるターゲットペプチドをコード化するヌクレオチド配列を求めてヌクレオチドライブラリ（通常ＤＮＡライブラリ）をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、ペプチドをコード化する特定のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドへ、それぞれのペプチドを物理的に結合することを含有する。ペプチドのそのコード化ヌクレオチド配列への結合はこのペプチドをヌクレオチド結合領域へと結合することによって達成される。ヌクレオチド結合領域を有する二官能性キメラタンパクとライブラリメンバーすなわちターゲットペプチド（好ましくは関心のある機能を有する）とはこのようにして得ることができる。関心のあるペプチドはキメラタンパクのヌクレオチド結合領域を通じてこのペプチドをコード化するポリヌクレオチドに結合される。
【００１０】
その後、このポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体はポリヌクレオチドをその後に生じる分解から保護するペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）内に、ターゲットペプチドの部分がペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の外表面上に表示されるようにして取り込まれる。
【００１１】
このように、１つの局面において、本発明は、つぎのようなペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）を提供する。このパッケージはポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を含有し、ここでキメラタンパクはヌクレオチド結合部分とターゲットペプチド領域とを有し、前記ポリヌクレオチドは特異的に前記ヌクレオチド結合部分によって特異的に結合されるヌクレオチド配列モチーフを含有し、ここで少なくともキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合されていないポリヌクレオチドのキメラタンパクコード化領域は保護されている。
【００１２】
１つの実施例において、このポリヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドに非特異的に結合するタンパクによって保護されている。例としてはウイルスコートタンパクをあげることができるが、その多くはすでに当該分野でよく知られている。選択されたウイルスコートタンパクが、ポリヌクレオチドへの一般的な結合を開始するための開始配列を必要とする場合、これはポリヌクレオチド上の適当な部位で提供することができる。好ましいコートタンパクはバクテリオファージ、特にＭ１３由来のコートタンパクである。
【００１３】
一般的には、キメラタンパクの核酸結合領域はキメラタンパクをコード化する組換え型ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド配列モチーフに対するその特異性によって選択される。
【００１４】
あるいは、ヌクレオチド配列モチーフはポリヌクレオチドのタンパクコード化領域全体であってもよい。別法として、さらにより一般的には、このモチーフはポリヌクレオチドの非コード化領域中に存在していてもよい。本発明の目的のために必要なことはキメラタンパクのヌクレオチド結合部分による認識と、結合が行えるように、このモチーフがポリヌクレオチド上に位置することである。ポリヌクレオチドーキメラタンパク複合体が少なくとも１時間の溶解定数を有することが望ましい。
【００１５】
あるいは、組換え型ポリヌクレオチドは、それぞれキメラタンパク分子と結合する、２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを含有してもよい。このモチーフは結合されたキメラタンパク同士の立体障害を避けるよう、ポリヌクレオチドの長さ方向に沿って位置していることが好ましい。
【００１６】
このヌクレオチド配列モチーフは、その５’および／または３’末端にさらにヌクレオチド配列（例えばコード化配列）が存在しても、影響されないことが好ましい。したがって、キメラ融合タンパクはそのＮ末端、そのＣ末端にターゲットペプチド部分を含有してもよく、あるいはヌクレオチド結合部分のそれぞれの端、すなわちキメラタンパクのＮ末端とＣ末端で２つのターゲットペプチド領域（同一であっても異なっていてもよい）を含んでいてもよい。例えば１つのターゲットペプチドが既知の特異性を有する抗体で、他のペプチドが重要である可能性のあるペプチドであってもよい。
【００１７】
キメラタンパクのターゲットペプチド部分がペプチド表示キャリアパッケージの外部に表示され、したがって、検知、反応および／または結合に利用できることが望ましい。
【００１８】
さらに詳しくは、このペプチド表示キャリアパッケージは二つの別個の要素から構成することができる。
【００１９】
ａ．  ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体。これは表示されたターゲットペプチド部分をそのペプチド部分をコード化するポリヌクレオチドへと特異的ポリヌクレオチド結合部分を通じて結合する。キメラタンパクをコード化するこのヌクレオチド配列およびキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって認識される特異的ヌクレオチド配列モチーフは、ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）に取り入れることのできる、ポリヌクレオチドのセグメント上に存在しなくてはならない；および、
ｂ．  保護コート。これは独立して存在する、複製可能キャリアーあるいはヘルパーパッケージによって提供される。あるいは、別法として、コートタンパクは本発明の組換え型ポリヌクレオチドによってコード化することもできる。このポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体用保護コートは、タンパクあるいは脂質などの生物材料から構成されていてもよいが、保護コートはターゲットペプチドをそのペプチドをコード化するポリヌクレオチドへ結合するために必要ではない。この保護コートはキメラタンパクのターゲットペプチド部分をその外部表面上に表示させなくてはならない。キャリアーあるいはヘルパーパッケージはまた無傷のペプチド表示キャリアパッケージを必要に応じてホスト細胞から放出する機構を提供する。例をあげると、バクテリオファージがこの複製可能なキャリアパッケージである場合、このバクテリオファージのタンパクコートがポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体の周りを取り囲んでペプチド表示キャリアパッケージを形成し、それが、その後ホストバクテリア細胞から排出される。
【００２０】
ここに記載する本発明では、ヌクレオチド結合領域に融合されたペプチドが、表示ペプチドをコード化するポリヌクレオチドに結合したままで、バクテリオファージキャリアパッケージタンパクコートを通してであっても、外面に表示され得ることを明らかにする。
【００２１】
本発明は、また、ターゲットペプチド部分に操作によって結合されるヌクレオチド結合部分を有するキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供する。ここで前記ポリヌクレオチドは前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合され、さらに配列非特異性ヌクレオチド結合タンパクをコード化する特定のヌクレオチド配列モチーフを含有する。
【００２２】
組換え型ポリヌクレオチドは、適当な環境、例えば適合性のホスト細胞に置かれると、キメラタンパクを発現することのできる組換え型発現システムであることが望ましい。発現の後、キメラタンパクはキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド中に存在する特定のヌクレオチド配列（モチーフ）と結合する。
【００２３】
あるいはヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とこの構成の制限酵素部位へ挿入されたポリヌクレオチドとの間にリンカー配列が存在してもよい。
【００２４】
このヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物であることが望ましい。このようなヌクレオチド結合部分をコード化する配列の例は、配列番号１１と配列番号１３に記載されている。
【００２５】
ここで「発現システム」とは、タンパクコード化領域を含む遺伝子配列のことを指称し、かかる領域の発現を達成するのに必要な遺伝信号すべてに対して操作によって結合される。あるいは別法として、この発現システムは、またタンパクコード化領域の転写および／または翻訳を増大する、あるいは発現を制御する、プロモータやエンハンサーなどの調整要素を含有してもよい。この調整要素はタンパクコード化領域の上流側あるいは下流側のどちらに位置してもよく、あるいはタンパクコード化領域そのものの中にあってもよい。２つ以上の別個のタンパクコード化領域が存在するとき、これらは共通の調整要素を使用してもよく、あるいは異なる調整要素を使用してもよい。
【００２６】
前述した組換え型ポリヌクレオチドは一般にはＤＮＡである。この発現システムがＭ１３ベクターに基づいているとき、通常発現されたキメラタンパクのポリヌクレオチド結合部分は一本鎖ＤＮＡである。しかしながら、その他のベクターシステムを使用してもよく、都合に応じてヌクレオチド結合部分が二本鎖ＤＮＡと、あるいは二本、または一本鎖ＲＮＡと選択的に結合するように選択することができる。
【００２７】
さらに、本発明は、かかる組換え型発現システムを含有するベクター、およびかかる組換え型発現システムにより形質変換されたホスト細胞を（オプションとしてベクターの形で）提供する。
【００２８】
前述した組換え型ポリヌクレオチドが本発明の重要な部分を形成する一方で、我々はまた遺伝子材料の大規模な（例えば少なくとも１０万以上のメンバー、例えば１００万、あるいは１０００万に達するメンバー）ライブラリをスクリーニングする能力にも関心を持っている。したがって、１つの主な考えは、前記組換え型ポリヌクレオチドを形成するために、前記ライブラリの各メンバーを個別に含有し、それによってコード化されたキメラタンパクが発現できるような組換え型遺伝子構成体を供給することである（そのターゲットペプチドはこの構成体に含められたヌクレオチドライブラリメンバーによってコード化される）。
【００２９】
したがって、さらにもう１つの局面から見ると、本発明は、
ｉ）  特異的配列モチーフを認識することができ、それに結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化する配列と、
ｉｉ）  ｉ）によってコード化されたヌクレオチド結合部分によって認識され、結合された配列モチーフと、
ｉｉｉ）  ポリヌクレオチドの挿入を行う制限酵素部位と、ここで前記部位は前記ポリヌクレオチドをヌクレオチド結合部分コード化配列に操作によって結合するよう設計されており、それによって操作によって結合されたポリヌクレオチド配列がキメラタンパクを製造し、さらに、
ｉｖ）  非特異的に裸のポリヌクレオチドへ結合するヌクレオチド結合タンパクをコード化する配列と、
を含有する配列を有するポリヌクレオチドを含有する遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセットを提供する。
【００３０】
オプションとして、構造体の制限酵素部位へと挿入されたライブラリからのポリヌクレオチドの配列とヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列が位置してもよい。
【００３１】
このヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物であることが望ましい。このようなヌクレオチド結合部分をコード化する配列の例は、配列番号：１１と１３に記載されている。
【００３２】
本発明において適当な遺伝子構成体としては、１９９８年８月２８日にＮＣＩＭＢにてそれぞれ番号ＮＣＩＭＢ  ４０９７０、ＮＣＩＭＢ  ４０９７１およびＮＣＩＭＢ  ４０９７２として供託されたｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４、およびｐＤＭ１６をあげることができる。
【００３３】
これまで製造された遺伝子ライブラリもまた前述した遺伝子構成体に付すことができるものと考えられる。したがって、遺伝子ライブラリの各個別のメンバーは別々に遺伝子構成体へ含められ、そして、このライブラリは（前述したように）各組換え型ポリヌクレオチドがライブラリメンバーとして含まれる組換え型ポリヌクレオチドのライブラリの形で、通常はベクターの形で提示される。
【００３４】
したがって、さらに別の局面から見ると、本発明は、組換え型ポリヌクレオチドのライブラリ（前述したように規定したとおり）を提供し、ここで各ポリヌクレオチドは遺伝子ライブラリから得られたポリヌクレオチドを含有し、さらにこのポリヌクレオチドが組換え型ポリヌクレオチドによって発現されるキメラタンパクのターゲットペプチド部分をコード化するものである。
【００３５】
オプションとして、キメラタンパクはさらに、ヌクレオチド結合部分とターゲットペプチド部分との間に位置するリンカー配列を含有してもよい。このリンカー配列はタンパクの２つの部分の間の立体障害を減少させる。このリンカー配列がある程度柔軟性をもつことが望ましい。
【００３６】
関心のあるペプチドの結合活性に基づくアフィニティー技法によって、ペプチド表示キャリアパッケージ粒子のライブラリを構築、スクリーニングし、多くの異なるペプチドを表示し、特定のペプチドの分離と同定を行うための方法がさらに開示されている。得られるポリヌクレオチド配列は、したがってより簡単に同定、再クローン化および発現を行うことができる。
【００３７】
ａ）  特異的配列モチーフを認識し、この配列モチーフと結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する組換え型ベクターの複数のコピーを構築し（およびオプションとしてこの特定の配列モチーフを含有し）、
ｂ）  前記ベクターそれぞれを下記の操作によって結合されたベクターの発現が前記ターゲットペプチドと前記ヌクレオチド結合部分とを含有するキメラタンパクの発現をもたらすように、ターゲットポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドへ操作によって結合し、ここで前記操作により結合されるベクターの前記複数コピーがターゲットペプチド部分のライブラリを表し、
ｃ）  ホスト細胞をステップｂ）のベクターによって形質変換し、
ｄ）  ステップｃ）のホスト細胞を前記のキメラタンパクの発現に適した条件のもとで培養し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されるヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクへ露出してポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を生じさせ、さらに、
ｆ）  キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドの保護されていない部分に結合することのできる配列非特異性部分の生産を生じさせて、ペプチド表示キャリアパッケージを形成するステップと、
を含有する遺伝子ライブラリを構築する方法。
【００３８】
本発明は、さらに、
ａ）  前記ライブラリのポリヌクレオチドメンバーを、前記ライブラリのポリヌクレオチドがそれぞれ前記遺伝子構成体の１つのコピーと結合し、組換え型ポリヌクレオチドのライブラリを形成するのに適した条件の下で、特定の配列モチーフを認識でき、この配列モチーフに結合できるヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列を含有する遺伝子構成体の複数のコピーに露出し、
ｂ）  前記組換え型ポリヌクレオチドを前記ホスト細胞が前記組換え型ポリヌクレオチドにより形質変換されるのに適した条件の下でホスト細胞のポピュレーションに露出し、
ｃ）  形質変換されたホスト細胞を選択し、
ｄ）  前記形質変換されたホスト細胞を前記組換え型ポリヌクレオチドが発現し、キメラタンパクを生じるのに適した条件に付し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されたヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクに露出し、ポリヌクレオチドキメラタンパク複合体を生じさせ、
ｆ）  ステップｅ）の複合体中のポリヌクレオチドの露出部分を保護してペプチド表示キャリアパッケージを形成し、
ｇ）  要求される特徴を有するターゲットペプチド部分を表示するパッケージのみを選択するために前記ペプチド表示キャリアパッケージをスクリーニングするステップと、
を含有する遺伝子ライブラリのスクリーニングを行う方法を提供する。
【００３９】
ステップａ）において前記の遺伝子構成体がｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４あるいはｐＤＭ１６であることが望ましい。
【００４０】
ステップｆ）において、ペプチド表示パッケージキャリアが形質変換されたホスト細胞からホスト細胞の溶菌を行わずに排出されることが望ましい。
【００４１】
一般に、形質変換されたホスト細胞は形質変換の後、キメラタンパクの発現に先立ち、培養などにより単一のコロニーへ分割される。
【００４２】
前述したステップｇ）のスクリーニングでは特定のターゲットペプチドを機能（例えば酵素活性）あるいは構造（例えば特定の抗体への結合性）に基づいて探すことができる。ひとたびペプチド表示キャリアパッケージが所望の特徴を有するターゲットペプチドを含有していることがわかれば、そのポリヌクレオチド部分（もちろんキメラタンパク自身をコード化する）を増幅し、クローン化し、あるいは標準的遺伝子工学技法を用いてその他の操作を行うことができる。
【００４３】
本発明は、米国特許第５，４０３，４８４号および米国特許第５，５７１，６９８号に開示されている従来技術の教示と異なり、ウイルス粒子あるいは遺伝子パッケージの外表面上にキメラ結合タンパクを表示するために外部表面伝達信号あるいはウイルスコートタンパクの機能性部分を必要としない。
【００４４】
本発明は、また国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号および第ＷＯ−Ａ−９２／２０７９１号の教示と異なり、ウイルス粒子の外表面上にターゲットペプチドを表示するために、分泌された複製可能な遺伝子表示パッケージの成分あるいはウイルスコートタンパクを必要としない。
【００４５】
本発明は、キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドに結合されたキメラタンパクの、ホスト細胞の原形質内ではなく、細胞外の表意が可能である点で米国特許第５，４９８，５３０号の教示と異なっている。本発明においてキメラタンパクは、キメラタンパクをコード化するＤＮＡを保護しているペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の外表面上に存在し、キメラタンパク−ＤＮＡ複合体を入手するのに溶菌を必要としない。最後に、本発明はキメラタンパク−ＤＮＡ複合体を形成するのに際しｌａｃＩ  ＤＮＡ結合タンパクに依存しない。
【００４６】
本発明の１つの実施例において、キメラタンパクのヌクレオチド結合部分は１つ以上のタンパクの核ステロイドレセプターファミリー由来のＤＮＡ結合領域、あるいはこのような領域の機能的等価物を含有する。特に例をあげると（これに限定するわけではないが）、エストロゲンレセプターあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物である。これらの領域は、二本鎖ＤＮＡとしてでも一本鎖ＤＮＡとしてでも結合できる、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）と名付けられた特定のＤＮＡ配列を認識することができる。このような核ステロイドレセプタータンパクのＤＮＡ結合領域が好ましい。
【００４７】
以下に例として特にエストロゲンレセプターをあげるが、これが好都合である理由はつぎのとおりである。
【００４８】
（ａ）  エストロゲンレセプターは５９５個のアミノ酸からなる大きな多機能ポリペプチドであり、真核細胞の原形質および核中で機能する(Green et al., 1986, Science 231 : 1150-1154)。最小高親和性ＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）がアミノ酸１７６と２８２の間に規定されている(Mader et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21 : 1125-1132)。この領域の機能（すなわちＤＮＡ結合）は全長タンパク中でこの領域のＮおよびＣ末端に非ＤＮＡ結合領域が存在することによって阻害されない。
【００４９】
（ｂ）  エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域断片（アミノ酸１７６−２８２）は大腸菌中で発現しており、親分子に類似の親和性（０．５ｎＭ）でダイマーとして特定の二本鎖ＤＮＡエストロゲンレセプターターゲットＨＲＥヌクレオチド配列へ結合することが示されている(Murdoch et al.1990, Biochemistry 29 : 8377-8385 ; Mader et al., 1993, Nucleic Acids Research 21 : 1125-1132)。ペプチド表示キャリアパッケージの表面でのＤＢＤダイマー化により１つの粒子あたり２つのペプチドが表示されることになる。この２価の表示は低親和性のペプチドならびに特定のターゲットに結合するために、あるいは、ターゲットレセプターを活性化するために２価の構造を形成するよう求められているペプチドの分離に役立つ。エストロゲンレセプターはその３８個の塩基対ターゲットＨＲＥ配列、コンセンサス配列：
１）  5’-TCAGGTCAGAGTGACCTGAGCTAAAATAACACATTCAG-3’ (マイナス鎖)配列番号：1、および、
２）  3’-AGTCCAGTCTCACTGGACTCGATTTTATTGTGTAAGTC-5’
(プラス鎖)  配列番号：2
に高親和力と特異性により、結合ペプチドを選択する際に通常必要とされる塩とｐＨ条件のもとで結合することができる。さらに結合親和力はＨＲＥヌクレオチド配列の一本鎖コード化、すなわち「プラス」鎖（すなわち、配列番号：２）においては特定のターゲットヌクレオチド配列の二本鎖形の６０倍に増加する(Peale et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1038-1042 ; Lannigan & Notides, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 863-867)。
【００５０】
ペプチド表示キャリアパッケージのＤＮＡ結合成分がエストロゲンレセプターである本発明の実施例においては、このヌクレオチド（ＤＮＡ）結合部分はエストロゲンレセプタータンパクのアミノ酸１７６−２８２の最小配列を含有する。さらに、このコンセンサスエストロゲンレセプターターゲットＨＲＥ配列はもし一本鎖ＤＮＡが製造できれば、エストロゲンレセプターＨＲＥヌクレオチド配列のコード化、すなわち「プラス」鎖が一本鎖ＤＮＡに取り込まれるようにしてクローン化される。この目的に適したベクターの例としては、ｐＵＣ１１９(Viera et al., Methods in Enzymology, Vol 153, pages 3-11, 1987参照)がある。
【００５１】
本発明の好ましい実施例において、ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）はバクテリアのホスト細胞がバクテリオファージベクター、前述したように組換え型ポリヌクレオチドを含有するベクターによって形質変換されるときに組み立てることができる。発現ベクターも、また、キメラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合することのできる特定のヌクレオチドモチーフを含有する。組換え型ポリヌクレオチドの発現により、ターゲットペプチドとヌクレオチド結合部分とを含有するキメラタンパクが製造される。ホスト細胞はキメラタンパク発現とバクテリオファージ粒子の構築、および発現ベクター内での特定のヌクレオチド配列とキメラタンパクとの結合に適した条件の下で増殖される。
【００５２】
この実施例においては、ベクターが、一本鎖ＤＮＡを製造するために複製するバクテリオファージであるので、ヌクレオチド結合領域は好ましくは一本鎖ＤＮＡへの親和性を有する。このベクター一本鎖ＤＮＡ−キメラタンパク複合体のバクテリオファージ粒子への取り込みによりペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の組立てが行われ、ＰＤＣＰの外表面上にターゲットペプチドが表示される。
【００５３】
本実施例においては、ペプチド表示キャリアパッケージを製造するために必要な要素の両方が同じベクター中に含有されている。ＤＮＡ−キメラタンパク複合体のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）への取り込みは、ＤＮＡの分解を防ぐことができ、１つのホスト細胞あたり多数のペプチド表示キャリアパッケージを製造でき、さらにペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）を溶菌に頼らずにホスト細胞から簡単に分離できるため好ましい。
【００５４】
より好ましい実施例において、ベクターはキメラタンパクの発現が誘導性プロモータによって制御されているファージミドベクター（例えばｐＵＣ１１９）である。この実施例において、ペプチド表示キャリアパッケージはホスト細胞のファージミドベクターとヘルパーファージ両方による感染の後でのみ構築できる。形質移入したホスト細胞はついでキメラタンパク発現とバクテリオファージ粒子の構築に適した条件の下で培養される。
【００５５】
この実施例において、ＰＤＣＰの要素は２つの別のベクターによって提供される。ファージミド派生ペプチド表示キャリアパッケージは、バクテリオファージコートタンパク融合タンパクを表示するパッケージの一部が融合タンパクＤＮＡ配列ではなく、ヘルパーファージＤＮＡを含有する国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号に開示されているファージミド派生表示パッケージよりも優れている。本発明において、ペプチド表示キャリアパッケージはこのパッケージがヌクレオチド結合部分によって認識される特定のヌクレオチドモチーフを含有するときにのみ、キメラ融合タンパクを表示することができる。殆どの実施例において、この配列は融合タンパクをコード化する同一のＤＮＡセグメント上に存在するであろう。さらに、従来技術により、突然変異型および野生型のタンパクがおなじバクテリア細胞中に共発現されるとき、この野生型タンパクが優先的に製造されることが認められている。したがって、野生型ヘルパーファージ、国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号のファージ表示システムが使用されている場合、野生型遺伝子ｐＩＩＩおよびターゲットペプチド−遺伝子ｐＩＩＩキメラタンパクの両者が同じ細胞中で製造される。この結果、野生型遺伝子ｐＩＩＩタンパクはバクテリオファージ粒子中にキメラタンパクよりも優先的にパッケージされる。本発明においては、パッケージングに際し、バクテリオファージコートタンパクとの競合はない。
【００５６】
ターゲットペプチドは、ペプチド表示キャリアパッケージ粒子が溶菌という手段を取ることなくホスト細胞から放出された後、ペプチド表示キャリアパッケージの外的環境へ露出される位置に表示されることが望ましい。このターゲットペプチドはついでリガンドと結合するために利用可能となる。したがって、ターゲットペプチドはヌクレオチド結合領域のＮ−末端あるいはＣ−末端、例えばエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその近くに位置することができる。
【００５７】
本発明は、また、生物学的活性を達成するため加工、折り曲げおよびペリプラスム間隙中で組み立てられている１つ以上のポリペプチド鎖を発現するＤＮＡライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。ペプチド表示キャリアパッケージは下記のステップによって構築することができる。
【００５８】
（ａ）        Ｎ−あるいはＣ−末端ＤＢＤ  キメラタンパク融合のファージミドベクターにおける構築。
【００５９】
（ｉ）ターゲットペプチドがヌクレオチド結合部分のＮ−末端に位置するとき、それぞれが潜在的ターゲットペプチドをコード化するＤＮＡ配列のライブラリが発現ベクターの適当な位置（すなわち適当なプロモーターおよび翻訳配列と下流の融合タンパクのペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流）であり、ヌクレオチド結合部分をコード化する配列の上流にクローン化される。好ましい実施例においては、関心のあるＤＮＡ配列を柔軟なアミノ酸リンカーをコード化するＤＮＡ領域によってエストロゲンレセプターＤＢＤの５’−末端へと連結する。
【００６０】
（ｉｉ）あるいは、別法としてターゲットペプチドがヌクレオチド結合領域のＣ−末端に位置しているとき、ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列がクローン化されたＤＮＡターゲットペプチドコード化配列の上流となり、前記のヌクレオチド結合部分が、適当なプロモータおよび翻訳配列ならびに下流の融合タンパクのペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流に位置するように、それぞれ潜在的ターゲットペプチドをコード化しているＤＮＡ配列のライブラリが発現ベクター内にクローン化される。好ましい実施例においては、柔軟なアミノ酸リンカーエストロゲンレセプターＤＢＤ  ＤＮＤ配列をコード化するＤＮＡの領域によって関心のあるＤＮＡ配列を結合する。
【００６１】
この発現ベクターの上に位置しているのはエストロゲンレセプターＤＢＤによって認識され結合された特定のＨＲＥヌクレオチド配列である。各ペプチド表示キャリアパッケージ粒子上に表示されるキメラタンパクの数を変えるために、この配列をベクター中で１つ以上のコピーとして存在させることができる。
【００６２】
（ｂ）ペプチド表示キャリアパッケージへの取り込み。非溶解性ヘルパーバクテリオファージは発現ベクターを含有するホスト細胞を感染させる。好ましいバクテリオファージの種類には糸状バクテリオファージｆｄ、ｆｌおよびＭ１３がある。より好ましい実施例において、バクテリオファージはＭ１３Ｋ０７である。
【００６３】
関心のあるタンパクは発現され、ペリプラスム間隙へと移送され、適切に構築されたタンパクは、ＤＢＤと一本鎖の型でファージ粒子中へ自然にパッケージされているファージミドベクターＤＮＡ上に存在する特定のターゲットヌクレオチド配列との間の高親和性相互作用によってペプチド表示キャリアパッケージ粒子の中に取り込まれる。このＤＢＤタンパクとその特異的ターゲットヌクレオチド配列間の高い親和性相互作用によりバクテリオファージコートタンパクによる置換が妨げられ、その結果、関心のあるタンパクが細胞から排出されると、それはペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の表面に取り込まれる。
【００６４】
（ｃ）関心のあるペプチドの選択。関心のあるペプチドを表示する粒子をついでアフィニティー増菌技法によって培養物から選び出す。これは関心のあるタンパクが抗体なら抗原など、関心のあるタンパクに対して特異的なリガンドを用いて行うことができる。このリガンドはＥＬＩＳＡプレートの表面などの固体表面上あるいは溶液中にあってよい。このアフィニティー選択技法を繰り返すことにより所望の配列をコード化するクローンは増菌され、ついで分離され、配列決定、さらなるクローン化および／または発現が行われる。
【００６５】
ＤＢＤ融合ペプチドの多種のライブラリが本実施例の下でスクリーンできる。それには下記のものが含まれる。
【００６６】
（ｉ）各種の長さの合成ＤＮＡによりコード化されたランダムペプチド配列。
【００６７】
（ｉｉ）一本鎖Ｆｖ抗体断片。これらは一本鎖抗原結合分子を形成するために、柔軟なリンカーペプチドによって連結された抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域からなる。
【００６８】
（ｉｉｉ）関心のある活性を含有する細胞ポピュレーションから分離された天然産出タンパクのランダム断片。
【００６９】
他の実施例において、本発明は、例えばリガンド結合のための抗体Ｆａｂ断片によって求められるような、活性のために１つ以上の鎖が必要であるメンバーを持つＤＮＡライブラリをスクリーニングするための方法に関する。この実施例においてＨ鎖あるいはＬ鎖抗体ＤＮＡは、例えばファージミドベクター中でエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域をコード化するヌクレオチド配列へと連結されている。通常Ｈ鎖（ＶＨおよびＣＨ１）あるいはＬ鎖（ＶＬおよびＣＬ）遺伝子のためのこの抗体ＤＮＡライブラリ配列はエストロゲンレセプターＤＢＤ  ＤＮＡの５’領域中で、適当なプロモータと翻訳配列および下流の融合タンパクのペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流に挿入されている。
【００７０】
したがって、ＤＮＡライブラリメンバーコード化タンパクへ融合されたＤＢＤが製造されバクテリオファージによる感染の後ウイルス粒子へ組み込まれる。この第２のさらにその後の鎖は、別々に、
（ａ）ＤＢＤと第１のポリペプチド融合タンパクを含有している同じファージミドベクターから、または、
（ｂ）ペリプラスム間隙へと輸送され、そこで細胞中に存在するＤＢＤタンパクへ融合されるように第１の鎖とともに組み合わされるホスト細胞核、あるいは第１の発現ベクターと同じホスト細胞中で共存できるバクテリオファージ発現ベクター、プラスミド、あるいはファージミド上に存在するかもしれないＤＮＡの別の領域から発現される。関心のあるタンパクをコード化するペプチド表示キャリアパッケージを、その後このタンパクに対して特異的なリガンドによって選び出す。
【００７１】
さらにもう１つの実施例において、本発明は関心のある２つ以上の活性が各ペプチド表示キャリアパッケージ上に表示されている二官能性ペプチド表示キャリアパッケージのライブラリスクリーニング方法に関している。この実施例において第１のＤＮＡライブラリ配列は、第１のＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）  ＤＮＡ配列、例えばエストロゲンレセプターＤＢＤの隣に適当なベクター中で、適当なプロモータおよび翻訳配列、およびこの第１のキメラタンパクのペリプラスム間隙への輸送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流に挿入される。第２のキメラタンパクは第２のＤＮＡライブラリ配列を第１のＤＢＤ  ＤＮＡ配列とは異なる第２のＤＢＤ  ＤＮＡ配列、例えばプロゲステロンレセプターＤＢＤの隣に、適当なプロモータおよび翻訳配列、信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流に挿入することによって、同じあるいは別のベクターから製造される。この第１のあるいは唯一のベクターは、エストロゲンとプロゲステロンレセプターの両方に対し特異的ＨＲＥヌクレオチド配列を含有する。この２つのキメラタンパクの発現により表示された２つの異なるキメラタンパクをもつペプチド表示キャリアパッケージが生じる。例をあげると１つのキメラタンパクは関心のある特定のリガンドに対する結合活性を持ち、一方、第２のキメラタンパクは酵素活性を持つことができる。ペプチド表示キャリアパッケージによる第１のキメラタンパクのリガンドへの結合は、その後この第２のキメラタンパクに対する適当な基質で培養することによって検出することができる。別の実施例においては、二官能性ペプチド表示キャリアパッケージを１つのペプチドをＤＢＤの５’−端でクローン化し、第２のペプチドをＤＢＤの３’−端でクローン化することにより、１つのＤＢＤを用いて製造することができる。この１つの二官能性キメラタンパクの発現から、２つの異なる活性をもつペプチド表示キャリアパッケージが生じる。
【００７２】
我々は関心のある生物学活性を有する特定のペプチドに対し、ＤＮＡ結合領域へ融合し、表示パッケージの表面に表示されたペプチドのライブラリをスクリーニングし、その活性をコード化するＤＮＡを回収する可能性について研究した。驚くべきことに、エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をＭ１３バクテリオファージとともに操作することにより、生物学的に機能的な大分子を表示する新規の粒子が構築できた。それによって、この所望の特異性をもつ粒子を増菌することができる。
【００７３】
以上述べたことをまとめると、本発明は、下記１〜２３の発明を提供するものである。ここに記載する本発明は、ＤＮＡライブラリスクリーニング技法に飛躍的な進歩をもたらすものである。
１．  ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）であって、このパッケージは組換え型ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を含有し、ここでキメラタンパクはヌクレオチド結合部分とターゲットペプチド部分とを有し、前記組換え型ポリヌクレオチドは特異的に前記ヌクレオチド結合部分によって結合されるヌクレオチド配列モチーフを含有し、ここで少なくともキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合されていない組換え型ポリヌクレオチドのキメラタンパクコード化部分が、ヌクレオチド配列に関係なくポリヌクレオチドと非特異的に結合する結合部分によって保護されているペプチド表示キャリアパッケージ。
２．  前記結合部分がタンパクである１のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
３．  前記タンパクがウイルスコートタンパクである２のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
４．  前記ターゲットペプチド部分がパッケージの外部に表示されている１ないし３のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
５．  前記組換え型ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列を含有する１ないし４のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
６．  前記組換え型ポリヌクレオチドが、それぞれキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合される、２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを有する１ないし５のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
７．  前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域である１ないし６のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
８．  前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一本鎖ＤＮＡとして結合する１ないし７のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
９．  前記ターゲットペプチド部分がキメラタンパクのＮおよび／またはＣ末端に位置する１ないし８のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
１０．  前記組換え型ポリヌクレオチドで形質変換することによってホスト細胞中で製造され、このホスト細胞の溶菌を行うことなくそこから排出される１ないし９のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
１１．  ターゲットペプチド部分に操作によって結合されるヌクレオチド結合部分を有するキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有する組換え型ポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合され、さらにヌクレオチド配列に関係なくポリヌクレオチドと非特異的に結合する結合タンパクをコード化する特定のヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチド。
１２．  前記結合タンパクがウイルスコートタンパクである１１の組換え型ポリヌクレオチド。
１３．  ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列を含有する１１または１２の組換え型ポリヌクレオチド。
１４．  それぞれ前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合される２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを有する１１ないし１３の組換え型ポリヌクレオチド。
１５．  前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプターのＤＮＡ結合領域である１１ないし１４の組換え型ポリヌクレオチド。
１６．  前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一本鎖ＤＮＡとして結合する１１ないし１５の組換え型ポリヌクレオチド。
１７．  ｉ）特異的配列モチーフを認識することができ、それに結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化する配列と、
ｉｉ）  ｉ）によってコード化されたヌクレオチド結合部分によって認識され、結合された配列モチーフと、
ｉｉｉ）  ポリヌクレオチドの挿入を行う制限酵素部位と、ここで前記部位は前記ポリヌクレオチドをヌクレオチド結合部分コード化配列に操作によって結合するよう設計されており、それによって操作によって結合されたポリヌクレオチド配列がキメラタンパクを製造し、さらに、
ｉｖ）  ヌクレオチド配列に関係なく非特異的にポリヌクレオチドへ結合する結合タンパクをコード化する配列と、
を含有する配列を有するポリヌクレオチドを集合的に含有する遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
１８．  ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とポリヌクレオチドの挿入を行う部位との間にリンカー配列が位置している１７の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
１９．  それぞれ番号ＮＣＩＭＢ４０９７０、ＮＣＩＭＢ４０９７１およびＮＣＩＭＢ４０９７２としてＮＣＩＭＢに預託されたベクターｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４あるいはｐＤＭ１６を含有する１７または１８の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
２０．  遺伝子ライブラリを構築する方法であって、
ａ）  特異的配列モチーフを認識し、この配列モチーフと結合することのできるヌクレオチド結合部分をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する組換え型ベクターの複数のコピーを構築し、
ｂ）  前記ベクターのそれぞれを、操作によって結合されたベクターの発現が前記ターゲットペプチドと前記ヌクレオチド結合部分を含有するキメラタンパクの発現をもたらすように、ターゲットポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドへ操作によって結合し、ここで前記操作により結合されるベクターの複数のコピーがターゲットペプチド部分のライブラリを集合的に表し、
ｃ）  ホスト細胞をステップｂ）のベクターによって形質変換し、
ｄ）  ステップｃ）のホスト細胞を前記キメラタンパクの発現に適した条件のもとで培養し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されるヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクへ露出してポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を生じさせ、さらに、
ｆ）  キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドの保護されていない部分にヌクレオチド配列に関係なく非特異的に結合することのできる結合部分の生産を生じさせてペプチド表示キャリアパッケージを形成するステップと、
を有する遺伝子ライブラリを構築する方法。
２１．  遺伝子ライブラリをスクリーニングする方法であって、
ａ）  前記ライブラリのポリヌクレオチドがそれぞれ前記遺伝子構成体の一つのコピーと結合し、組換え型ポリヌクレオチドのライブラリを形成する条件下で前記ライブラリのポリヌクレオチドメンバーを認識可能で特定の配列モチーフへ結合可能なヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列を含有する遺伝子構成体の複数のコピーに露出し、
ｂ）  前記組換え型ポリヌクレオチドをホスト細胞のポピュレーションに、前記ホスト細胞が前記組換え型ポリヌクレオチドにより形質変換されるのに適した条件下で露出し、
ｃ）  形質変換されたホスト細胞を選択し、
ｄ）  前記形質変換されたホスト細胞を前記組換え型ポリヌクレオチドが発現し、キメラタンパクを生じるのに適した条件に付し、
ｅ）  ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されたヌクレオチド配列モチーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドをステップｄ）のキメラタンパクに露出し、ポリヌクレオチドキメラタンパク複合体を生じさせ、
ｆ）  ステップｅ）の複合体中のポリヌクレオチドの露出部分を保護してペプチド表示キャリアパッケージを形成し、さらに、
ｇ）  要求される特徴を持つターゲットペプチド部分を表示するパッケージのみを選択するために、前記ペプチド表示キャリアパッケージをスクリーニングするステップと、
を有する遺伝子ライブラリのスクリーニングを行う方法。
２２．  ペプチド表示キャリアパッケージがホスト細胞からその溶菌を行わずに排出される２１の方法。
２３．  配列番号１５または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド。
【００７４】
『好適な実施例の詳細な説明』
下記の非限定実施例ならびに図面を用いて本発明をさらに説明する。
【００７５】
物質と方法
本発明において使用した下記の手順は前述したSambrook, J., et al., 1989 に記載されている。すなわち、制限酵素の消化、連結、電気応答性細胞の調製、エレクトロポレーション，制限酵素消化生成物のアガロースゲル上での分析、フェノール／クロロホルムを用いたＤＮＡの精製、２ｘＴＹ培地とプレートの調製、アンピシリン、カナマイシン、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）原液の調製、さらにリン酸緩衝生理食塩水の調製である。
【００７６】
制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼおよびｃＤＮＡ合成試薬（スーパースクリプト  プラスミド  ｃＤＮＡ合成キット）をイギリス、スコットランドのペーズリーにあるライフ・テクノロジーズ・リミテッドから購入した。オリゴヌクレオチドはイギリス、スコットランドのグラスゴーにあるクルアケム・リミテッド、あるいはイギリス、ケンブリッジにあるゲノシス・バイオテクノロジーズ・リミテッドから入手した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ウイザードＳＶプラスミドＤＮＡ分離キット、ストレプタビジン被覆のマグネティックビーズならびにｍＲＮＡ分離試薬（ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  １０００）はイギリス、ハンプシャーのサザンプトンにあるプロメガ・リミテッドから入手した。Ｔａｑｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼはイギリス、ケンブリッジにあるストラータジーン・リミテッドから入手した。ＰＢＳ、ＢＳＡ、ストレプタビジン、物質Ｐおよび抗−ｐａｎｃａｄｈｅｒｉｎ抗体はイギリス、ドーセットのプールにあるシグマ・リミテッドより入手した。抗−Ｍ１３−ＨＲＰ結合抗体、カナマイシン耐性Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーバクテリオファージおよびＲＮＡｇｕａｒｄはイギリス、ハートフォードシアのセントオールバンズにあるファーマシア・リミテッドから入手し、抗ヒトＩｇｋ抗体はイギリス、レスターシアのラフバラにあるハーラン・セララボから入手した。ビオチン化物質Ｐおよびビオチン化カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）はイギリス、マージサイドのセントヘレンにあるペニンシュラ・ラボラトリーズから入手した。
【００７７】
本発明の特定の実施例を実施例１から９として下記する。
【００７８】
実施例１  Ｎ−末端ＰＤＣＰ表示ファージミドベクターｐＤＭ１２の構築
このｐＤＭ１２ベクターは適当なＰＣＲプライマーによって修飾したエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をファージミドベクターｐＤＭ６中に挿入することによって構築した。このｐＤＭ６ベクターはｐＵＣ１１９派生ファージ表示ベクターｐＨＥＮ１に基づいている(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19 : 4133-4137)。これは（Ｇｌｙ）4 Ｓｅｒ  リンカー、ファクターＸａ切断部位、全長遺伝子ＩＩＩおよびストレプタビジン標識ペプチド配列を含有し(Schmidt, T.G.およびSkerra, A., 1993, Protein Engineering 6 : 109-122)、それらすべてがＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化とアガロースゲル電気泳動によって、ｐｅｌＢリーダー配列、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位を、消化されたＮｏｔＩ部位の上流に残して除去することができる。このクローン化ＤＮＡ結合領域はｐＵＣ１１９中に見られるｌａｃプロモータにより制御されている。
【００７９】
ｐＤＭ６の調製
ｐＤＭ１２ベクターは適当なＰＣＲプライマーによって修飾したエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をファージミドベクターｐＤＭ６中に挿入することによって構築した。ｐＤＭ６ベクターはｐＩＩＩファージ表示ベクターｐＨＥＮ１に基づいており(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19 : 4133-4137)、これ自身ｐＵＣ１１９から派生する(Viera, J. and Messing, J., 1987, Methods in Enzymol. 153:3-11)。これはPIII遺伝子をｐＨＥＮ１中で２つのオリゴヌクレオチド、
PDM6BAK : 5 -TTT TCT GCA GTA ATA GGC GGC CGC AGG GGG AGG AGG GTC CAT CGA AGG TCG CGA AGC AGA GAC TGT TGA AAG T-3 (配列番号：19)
および
PDM6FOR : 5 - TTT TGA ATT CTT ATT AAC CAC CGA ACT GCG GGT GAC GCC AAG CGC TTG CGG CCG TTA AGA CTC CTT ATT ACG CAG-3 (配列番号：20)
により増幅し、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲ生成物を同様に消化したｐＨＥＮ１中へクローンｋし、それによってｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ配列とｓｕｐＥ  ＴＡＧコドンをｐＨＥＮ１から除去することによって構築された。このｐＤＭ６ベクターは（Ｇｌｙ）4 Ｓｅｒリンカー、ファクターＸａ切断部位、遺伝子ＩＩＩ全長およびストレプタビジン標識ペプチド配列を含有し(Schmidt, T.G.およびSkerra, A., 1993, Protein Engineering 6 : 109-122)、それらすべてがＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化とアガロースゲル電気泳動によって、ｐａｌＢリーダー配列、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位を、消化されたＮｏｔＩ部位の上流に残して除去することができる。このクローン化ＤＮＡ結合領域はｐＵＣ１１９中に見られるｌａｃプロモータにより制御されている。
【００８０】
エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域はヒト骨髄（米国、カリフォルニア州、パロアルトのクロンテク）から調製したｃＤＮＡより分離した。ｃＤＮＡは当業者によく知られているさまざまな方法で調整することができる。例をあげると、スーパースクリプトプラスミドｃＤＮＡ合成キットを用いた下記の方法を使用することができる。
【００８１】
（ａ）第１の鎖の合成
５μｌのＤＥＰＣ−処理水に５μｇの骨髄ｍＲＮＡを入れ氷の上で解凍し、２μｌ（５０ｐｍｏｌ）のｃＤＮＡ合成プライマー(5’-AAAAGCGGCCGCACTGGCCTGAGAGA(N)6 -3’)(配列番号：21)をｍＲＮＡに加えて、混合物を７０℃で１０分間加熱し、ついで氷上で急冷し、さっと回して内容物を管の底に集めた。下記のものをついでこの管へ加えた。
１０００ｕ／ｍｌ  ＲＮＡｇｕａｒｄ                      １μｌ
第１鎖バッファー（５ｘ）                                ４μｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                                        ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                      １μｌ
２００ｕ／μｌのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素        ５μｌ
この混合物をピペット操作でゆっくりと混合し、３７℃において１時間培養し、氷上においた。
【００８２】
（ｂ）第２の鎖の合成
下記の試薬を第１の鎖の反応液に加えた。
ＤＥＰＣ−処理水                                      ９３μｌ
第２鎖バッファー（５ｘ）                              ３０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                      ３μｌ
１０ｕ／μｌ  大腸菌ＤＮＡリガーゼ                      １μｌ
１０ｕ／μｌ  大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ                  ４μｌ
２ｕ／μｌ  大腸菌  ＲＮａｓｅ  Ｈ                      １μｌ
反応溶液はｖｏｒｔｅｘで攪拌し、１６℃において２時間保った。２μｌ（１０ｕ）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを加えさらに１６℃において５分保った。反応液を氷上におき、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えてフェノール−クロロフォルムにて抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。
【００８３】
(ｃ）Ｓａｌ  Ｉアダプター連結
ｃＤＮＡペレットを２５μｌのＤＥＰＣ−処理水に再懸濁させ、連結を下記のとおり設定した。
ｃＤＮＡ                                              ２５μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（５ｘ）          １０μｌ
１ｇ／μｌ  Ｓａｌ  Ｉアダプター＊                    １０μｌ
１ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ                      ５μｌ
＊Ｓａｌ  Ｉアダプター : TCGACCCACGCGTCCG-3’ (配列番号：22)
GGGTGCCGAGGC-5’ (配列番号：23)
この連結溶液はゆっくり混合し、１６℃において１６時間保ち、フェノール−クロロフォルムで抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。ｃＤＮＡ／アダプターペレットを４１μｌのＤＥＰＣ−処理水に再懸濁させ、３７℃において２時間６０ユニットのＮｏｔＩを用いて消化し、ついで、フェノール−クロロフォルムで抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。ｃＤＮＡペレットを１００μｌのＴＥＮバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再溶解し、連結されなかったアダプターとｃＤＮＡ小断片（＜４００ｂｐ）を製造者の指示に従って除去するためにセファクリルＳ−５００  ＨＲカラムを用いて粒径分画した。区分をアガロースゲル電気泳動によりチェックし、塩基対４００未満のｃＤＮＡを含有する画分は捨て、残りをプールした。
【００８４】
（ｄ）エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域のＰＣＲ増幅
０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，５ｍＭ  ＫＣｌ，０．０１  ％トリトンＸm−１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、サウサンプトンのプロメガ・リミテッド）を含有する２つの５０μｌの反応液中でそれぞれ２５ｐｍｏｌのプライマーｐＤＭ１２ＦＯＲ（配列番号：２４） (5’-AAAAGAATTCTGAATGTGTTATTTTAGCTCAGGTCACTCTGACCTGATTATCAAGACCCCACTTCACCCCCT)およびｐＤＭ１２ＢＡＫ（配列番号：２５） (5’-AAAAGCGGCCGCAGGGGGAGGAGGGTCCATGGAATCTGCCAAGGAG-3’) を用いて、５μｌ（１５０−２５０ｎｇ）の骨髄ｃＤＮＡからエストロゲンレセプターをＰＣＲ増幅した。このｐＤＭ１２ＦＯＲプライマーはエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域の３’−端にアニールし、２つの停止コドン、３８個の塩基対コンセンサスエストロゲンレセプターＨＲＥ配列およびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。ｐＤＭ１２ＢＡＫプライマーはエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域の５’−端にアニールし、（Ｇｌｙ）4 ＳｅｒリンカーとＮｏｔＩ制限部位を含有する。
【００８５】
反応溶液に鉱物油を重塁し、Ｔｅｃｈｎｅ  ＰＨＣ−３サーマルサイクラーで９４℃１分、６５℃１分、７２℃１分で３０サイクルＰＣＲを行った。反応生成物をアガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製した。
【００８６】
（ｅ）制限、消化および連結
このＰＣＲ反応によりＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位、（Ｇｌｙ）4 Ｓｅｒリンカー、停止コドンならびに３８個の塩基対エストロゲンレセプターターゲットＨＲＥヌクレオチド配列がエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域配列（図１参照）に付け加わった。このＤＮＡ  ＰＣＲ  断片およびターゲットｐＤＭ６ベクター（約５００ｎｇ）は１時間３７℃においてＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ消化され、アガロースゲル電気泳動とジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）抽出を用いてＤＮＡが精製された。このエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域カセットをＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＤＭ６  ベクター内へ１６℃において一晩連結され、フェノール／クロロフォルム抽出と沈殿形成の後、ＴＧ１  大腸菌（遺伝子型：Ｋ１２（Δｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ+Ｂ+，  ＬａｃＩ4，  ＬａｃＺΔ１５）中へエレクトロポレートされ１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレート上で培養した。コロニーを３７℃において一晩増殖させた。各コロニーを５ｍｌの１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹに入れ、３７℃において一晩増殖させた。二本鎖ファージミド  ＤＮＡはウイザードＳＶプラスミドＤＮＡ分離キットを用いて分離し、プリズム・ダイデオキシ・サイクル・配列決定キット（イギリス、ランカシア、ウォリントンのパーキン・エルマー製）によりＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６） (5’-GTAAAACGACGGCCAGT)およびＭ１３ＲＥＶ（配列番号：２７） (5’-GGATAACAATTTCACACAGG)オリゴヌクレオチドを用いて配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位間のｐＤＭ１２  ＰＤＣＰ表示ベクターＤＮＡ配列を図１に示す。
【００８７】
実施例２  ランダム感作ヒトリンパ球ｃＤＮＡをｐＤＭ１２へ挿入し、マスターＰＤＣＰストックを調製する。
【００８８】
ペプチドのライブラリは当業者に公知の様々な方法で構築することができる。この例では部分的に精製された細胞ポピュレーションから分離されたｍＲＮＡから調製されたランダム感作ｃＤＮＡからペプチドライブラリを構築する方法について述べる。
【００８９】
ｍＲＮＡはｐｏｌｙＡＴｒａｃｔ  １０００  ｍＲＮＡ分離キット（イギリス、サウサンプトンのプロメガ製）を用いて約１億個のヒト末梢血リンパ球から分離した。この細胞粒を４ｍｌの抽出バッファー（４Ｍ  グアニジンチオシアネート、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ７．１、２％β−メルカプトエタノール）に再懸濁した。８ｍｌのあらかじめ熱した（７０℃）希釈バッファー（６ｘＳＳＣ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール）をこのホモジネートへ添加し、逆さまにして十分に混合した。１０μｌのビオチン化オリゴ−ｄＴ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を加え、混合して混合物を７０℃において５分間保った。リンパ球細胞の溶解産物を２ｍｌの無菌チューブ６本に移し、マイクロ遠心器に入れて周囲温度において１０分間１３，０００ｒｐｍで回転させ透明な溶解産物を製造した。この遠心分離の間、ストレプタビジンでコートした磁気ビーズを再懸濁し、６ｍｌを無菌の５０ｍｌのファルコン管に移し、磁気スタンドの上にすべてのビーズが捕捉されるまで水平に置いた。上澄みを注意深く取り除き、ビーズを改めて６ｍｌの０．５ｘＳＳＣに懸濁し、捕捉を繰り返した。このようにして３回洗浄した後、ビーズを最終的に６ｍｌの０．５ｘＳＳＣに再懸濁した。透明化した溶解産物をこの洗浄したビーズに加え、逆さまにして混合し周囲温度にて２分間保ち、ついで磁気スタンドに水平に置いてビーズを捕捉した。ビーズをゆっくりと２ｍｌの０．５ｘＳＳＣに再懸濁し、無菌２ｍｌねじ蓋付きチューブへ移し、ふたたび垂直に置いてビーズを捕捉し、洗浄液を捨てた。さらに２回この洗浄を繰り返した。１ｍｌのＤＥＰＣ−処理水をビーズに加えてゆっくりと混合した。ビーズをもういちど捕捉し、溶出したｍＲＮＡを無菌チューブに移した。５０μｌを電気泳動してｍＲＮＡの質と量をチェックし、残りを１．５ｍｌの無菌ねじ蓋付きチューブに入れ、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと３体積の無水エタノールにより−８０℃において一晩沈殿させ、４アリコートとした。
【００９０】
二本鎖ｃＤＮＡを５μｇのリンパ球ｍＲＮＡをテンプレートとして用いて実施例１で記載したように合成した。このｃＤＮＡはすべての合成されたｃＤＮＡの３’−端に存在し、ＮｏｔＩ制限部位を取り込んでいる、実施例１に記載のｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドにアニールするオリゴヌクレオチド、ＣＤＮＡＰＣＲＦＯＲ  （配列番号：２８） (5’ -AAAGCGGCCGCACTGGCCTGAGAGA)とＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ１、ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２、およびＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ３の等モル混合物を用いてＰＣＲ増幅した。
ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ１：  （配列番号：２９）  5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGCCCACCACGCGTCCG,
ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２：  （配列番号：３０）  5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCCCACCACGCGTCCG,
ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ３：  （配列番号：３１）   5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTACCCACCACGCGTCCG,
これら３つすべてがｃＤＮＡの５’−端に見いだされるＳａｌＩアダプター配列にアニールし、このｃＤＮＡ  ５’−端でＳｆｉＩ制限部位を取り込んでいる。実施例１に記載のように１回の反応に２μｌのｃＤＮＡ（５０ｎｇ）を用いてＰＣＲ反応を９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の２５サイクルで１０回行った。反応物はプールし、２０μｌのアリコートをアガロースゲル電気泳動によりチェックし、残りをフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、１００μｌの無菌水に再懸濁した。５μｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡとリンパ球ｃＤＮＡ  ＰＣＲ生成物をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化し、フェノール／クロロフォルムで抽出し、クロマスピン１０００スピンカラム（アメリカ合衆国、カリフォルニア州パロ・アルトのクロンテク製）上で、７００ｇ室温において２分間遠心分離を行って分粒しＤＮＡ小断片を除去した。消化ｐＤＭ１２およびリンパ球ｃＤＮＡはエタノールで沈殿させ、１６℃において１６時間一緒に連結した。連結したＤＮＡを沈殿させＴＧ１大腸菌にエレクトロポレートした。細胞をキュベットあたり１ｍｌのＳＯＣ培地において３７℃において１時間増殖し、１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレート上で培養した。ライブラリサイズを評価するために、エレクトロポレートしたバクテリアを１０-4、１０-5、１０-6に希釈して培養した。コロニーは３０℃において一晩増殖した。２ｘ１０8 アンピシリン耐性のコロニーを寒天プレート上で回収した。バクテリアをついでプレートから削り取り、２０％グリセロール、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した４０ｍｌの２ｘＴＹブロスへと入れた。５ｍｌを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２０ｍｌの２ｘＴＹ培養ブロスに加え、１０11のカナマイシン耐性ユニット（ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを３７℃において３０分間振盪させずに感染させ、その後２００  ｒｐｍで３０分振盪した。感染バクテリアを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよび２０μＭのＩＰＴＧを追加した２００ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３７℃において２００ｒｐｍで振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌのファルコンチューブで２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、４０ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ６０００を２００ｍｌの粒子上澄みに加えて激しく混合し、氷上で１時間保ちＰＤＣＰ粒子を沈殿させた。粒子は２５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、その後ピペットでＰＥＧ／ＮａＣｌのすべての痕跡を取り除いた後、２ｍｌのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、マイクロ遠心器で１３５００ｒｐｍで５分間回転してバクテリアの破片を除去した。上澄みは０．４５μｍのポリサルホンシリンジフィルターで濾過し、−２０℃において保存した。
【００９１】
実施例３  抗ヒトカッパ抗体に対する選択を複数回繰り返すことによってヒト免疫グロブリンカッパＬ鎖を分離する。
【００９２】
ライブラリ選択の第一回目には、７０ｘ１１ｍｍのＮＵＮＣマキシソープイムノチューブ（イギリス、スコットランドのペーズリーにある、ライフ・テクノロジーズ製）にＰＢＳに溶かした１０μｇ／ｍｌの抗ヒトカッパ抗体（イギリス、サセックス、クローリーダウンにあるセララボ製）２．５ｍｌを、３７℃において２時間吸着させた。このチューブをＰＢＳで３回すすぎ（満たしてから空にする）３ｍｌのＰＢＳ／２％ＢＳＡで３７℃において２時間ブロックし、前回と同様に洗浄した。４ｘ１０13ａ．ｒ．ｕ．のＰＤＭ１２−リンパ球ｃＤＮＡ  ＰＤＣＰストックを２ｍｌの２％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に加え、３０分間血液ミキサー上で培養し、その後９０分間周囲温度に保った。このチューブをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄し、その後ＰＢＳのみを使用しさらに１０回洗浄した。結合した粒子を周囲温度において血液ミキサーの上で１ｍｌの新たに調製した０．１Ｍのトリエチルアミンに１０分間溶出した。溶離した粒子をｐＨ７．４の０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓへ加え、ｖｏｒｔｅｘで手早く攪拌し、氷上に移した。
【００９３】
中和した粒子を１０ｍｌの対数期ＴＧ１Ｅ大腸菌（吸光度：ＯＤ600nm  ０．３−０．５）に加え、３７℃において振盪させずに３０分間培養し、つづいて２００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染させた培養物の１０-3、１０-4、および１０-5希釈物を調製し、回収された粒子の数を推定し、残りは４０００ｒｐｍで１０分間回転させ、ペレットを３００μｌの２ｘＴＹ培地にｖｏｒｔｅｘで攪拌し再懸濁した。バクテリアを１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレートに置いた。コロニーを３０℃において一晩増殖した。
【００９４】
第１回の選択で回収したバクテリアから、実施例２に記載のように、１００ｍｌの一晩の培養物を用いてＰＤＣＰストックを調製した。２５０μｌの第１回増幅ＰＤＣＰストックをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１２回洗浄し、ついでＰＢＳのみで１２回洗浄したチューブを用いて、前述したように、抗ヒトカッパ抗体に対して選択した。
【００９５】
選択されたクローンを同定するために、第２回の選択から回収された８８の個々のクローンの抗ヒトカッパ抗体に対する結合をＥＬＩＳＡを用いて試験した。個々のクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１％のグルコースを追加した１００μｌの２ｘＴＹに入れ、９６穴のプレート（コスター）で３７℃において４時間２００ｒｐｍで振盪して培養した。それぞれの培養物２５μｌを、同じ培地に２５μｌ／ｗｅｌｌの１０7 ｋ．ｒ．ｕ  Ｍ１３Ｋ０７カナマイシン耐性ヘルパーファージを加えたものを入れた新しい９６穴プレートへ移し、３７℃において振盪させずに培養し、ついで３７℃においてさらに３０分２００ｒｐｍで振盪して培養した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２０μＭのＩＰＴＧを追加した１６０μｌの２ｘＴＹを各井戸に加え、３７℃において２００ｒｐｍで振盪しながら粒子の増幅を１６時間続けた。バクテリア培養物をマイクロタイタープレートキャリアーに入れ、ベンチトップ遠心器で２０００ｇで１０分間４℃において回転し、ＥＬＩＳＡに使用するバクテリアと培養上澄み液をペレット化した。
【００９６】
Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした２００ｎｇ／ｗｅｌｌの抗ヒトカッパ抗体を１時間の間３７℃において吸着させた。このプレートを２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄し、２００μｌ／ｗｅｌｌの２％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて３７℃において１時間ブロックし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄した。５０μｌのＰＤＣＰ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む各井戸に加え、周囲温度において１時間結合させた。このプレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤＣＰを１００μｌ／ｗｅｌｌの２％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ファーマシア）を用いて１時間周囲温度において検出し、プレートを上記のように６回洗浄した。このプレートを周囲温度において５分間、１００μｌ／ｗｅｌｌの新しく調製したＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質バッファー（０．００５％Ｈ2Ｏ2，２４ｍＭのクエン酸に溶解した０．１ｍｇ／ｍｌ  ＴＭＢ／５２ｍＭの燐酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で現像した。この反応を１００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％Ｈ2ＳＯ4を用いて停止し、４５０ｎｍで読みとった（結合クローンのＥＬＩＳＡデータは図２に示す）。
【００９７】
これらのクローンをついでＭ１３ＲＥＶプライマー（配列番号：２７）を用いて実施例１と同様に配列決定した。分離クローンのうちの２つの配列を図３に示す（配列番号：７〜１０）。
【００９８】
実施例４  ｐＤＭ１４  Ｎ−末端表示ベクターの構築
第２エストロゲンレセプターＨＲＥ配列などの第２のＤＢＤ結合配列を含むベクターを設計し、それによってＰＤＣＰあたりの表示ペプチドの数を増加させることは有用であろう。ピールその他(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1038-1042)は多数のエストロゲンレセプターＨＲＥ配列を記載している。これらの配列はｐＤＭ１２にクローンされたのとは異なる１つのＨＲＥ配列を規定するのに用いられた。それを第２Ｎ−末端表示ベクター（ｐＤＭ１４）を製造するのに使用した。オリゴヌクレオチド：5’-AAAAGAATTCGAGGTTACATTAACTTTGTTCCGGTCAGACTGACCCAAGTCGACCTGAATGTGTTATTTTAG-3’（配列番号：３２）を合成し、これを使用して、実施例１に記載のようにテンプレートとして１００ｎｇ  ｐＤＭ１２ベクターＤＮＡを使用し、ｐＤＭ１２をＰＣＲによってｐＤＭ１２ＢＡＫオリゴヌクレオチドで突然変異させた。その結果得られたエストロゲンレセプターＤＢＤおよびＳａｌＩ制限酵素部位で分離された２つのＨＲＥ配列を含有したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、実施例１に記載のように、ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＤＭ１２ベクターＤＮＡ中にクローン化し、ｐＤＭ１４を生成した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位間のｐＤＭ１４の配列をＤＮＡ塩基配列決定法によってチェックした。これら２つの部位間の最終的なベクター配列を図４に示す（配列番号：１１および１２参照）。
【００９９】
実施例５  ｐＤＭ１６  Ｃ−末端表示ベクターの構築
ＰＤＣＰ上のＤＢＤのＣ−末端へ融合したペプチドの表示を示すために、適当なベクターｐＤＭ１６を生成した。ＰＤＭ１６中で、このｐｅｌＢリーダーＤＮＡ配列は、ＨＲＥ  ＤＮＡ配列の上流のＤＢＤ配列のＣ−末端側に付属している、ｐＤＭ１２とｐＤＭ１４に見られる複数のクローン化部位およびＧｌｙ4Ｓｅｒ  リンカーＤＮＡ配列を除去し、直接エストロゲンレセプターＤＢＤ配列へと融合する。
【０１００】
このベクターを生成するには、Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーを用いて９４℃において１分、６０℃において１分、７２℃において１分の３０サイクルで２つの別々のＰＣＲ反応を行う。反応生成物はアガロースゲル上で電気泳動し、切除し、ＭｅｒｍａｉｄあるいはＧｅｎｅｃｌｅｎ  ＩＩキットをそれぞれ製造者の指示（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤにあるビオロール）にしたがって使用してゲルから精製した。
【０１０１】
第１の５’−未翻訳部分およびｐｅｌＢリーダーＤＮＡ配列をそれぞれ５０  ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドｐｅｌＢＦＯＲ（配列番号：３３）(5’-CCTTGGCAGATTCCATCTCGGCCATTGCCGGC-3’)およびＭ１３ＲＥＶ（配列番号：２７）（前記参照）を０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．２、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、ケンブリッジのストラータジーン・リミテッド）を含有する１００μｌの反応液を用いて１００ｎｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡから増幅した。
【０１０２】
第２の、ｐｅｌＢリーダー配列の３’−末端およびエストロゲンレセプターＤＢＤをそれぞれ５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドｐｅｌＢＢＡＫ（配列番号：３４） (5’-CCGGCAATGGCCGAGATGGAATCTGCCAAGG-3’)およびｐＤＭ１６ＦＯＲ（配列番号：３５）(5’-TTTTGTCGACTCAATCAGTTATGCGGCCGCCAGCTGCAGGAGGGCCGGCTGGGCCGACCCTCCTCCCCCAGACCCCACTTCACCCC-3’)を０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（イギリス、ケンブリッジのストラータジーン・リミテッド）を含有する１００μｌの反応液を用いて１００ｎｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡから増幅した。ゲル精製の後、両生成物を合わせ、前述した方法でこの２つの生成物を１つに結合するために０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘm  −１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）  （イギリス、サウサンプトンのプロメガ・リミテッド）を含有する１００μｌの反応液中で最後のＰＣＲ増幅を行った。
【０１０３】
得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ制限酵素消化し、実施例１に記載したようにＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化ｐＤＭ１４ベクターＤＮＡへクローン化し、ｐＤＭ１６を生成した。ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩ制限酵素部位間のｐＤＭ１６の配列をＤＮＡ塩基配列決定法でチェックした。これら２つの部位の間の最終ベクター配列を図５に示す（配列番号：１３および１４参照）。
【０１０４】
実施例６  ヒトＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−末端断片のＰＤＣＰ表面上の表示
ペプチドのｃＤＮＡライブラリは当業者に公知のさまざまな方法で構築することができる。ペプチドライブラリの構築によく使用される１つの方法は、ポリＡ＋  ｍＲＮＡから調製されるオリゴｄＴ  感作ｃＤＮＡを使用するものである。この方法においては、ｃＤＮＡのクローン化を容易にするために第１の鎖合成はＴn（ここでｎは通常１０から２０の塩基）およびＮｏｔＩなどの制限酵素部位を含有するｍＲＮＡの３’−端ポリＡ末端へアニールするオリゴヌクレオチドを用いて行われる。この方法によってクローン化されたｃＤＮＡ  は通常ポリＡ末端、３’−末端未翻訳部位、およびこのタンパクのＣ−末端コード化領域からなる。ペプチドのＰＤＣＰ上のＣ−末端表示の例として、前述した方法によって構築されたライブラリから分離されたヒトｃＤＮＡを示す。
【０１０５】
タンパクＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎは細胞−細胞接着に関与する細胞表面分子である。ヒトタンパクのＣ−末端細胞質領域（ゲンバンク、データベース、アクセス番号：Ｍ３４０６４）をニワトリＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−末端２３アミノ酸に対して製造された市販のモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ−１８２１）を用いて認識した。このＣ−末端９９アミノ酸、３’−未翻訳部位およびポリＡ末端（ポリＡ末端の３’−端に存在するＮｏｔＩ部位）をコード化する１．４ｋｂのヒトｃＤＮＡ断片を約２０ｎｇ  ｐＤＭ７−ＮＣＡＤ＃Ｃから、それぞれ２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）とＣＤＮＰＣＲＢＡＫ１（配列番号：２９）（前記参照）を用いて０．１ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓ  ＮＤＡポリメラーゼ、および１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．２、６０ｍＭ  ＫＣｌおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、ケンブリッジのストラータジーン・リミテッド）を含有する５０μｌの反応液中、Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分の３０サイクルで増幅した。ゲル精製とＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化の後、ＰＣＲ生成物を実施例１に記載したものと類似の手順によってｐＤＭ１６内にクローン化した。
【０１０６】
挿入部を含有したクローンは、実施例３に記載のように調製した９６の個々のＰＤＣＰ培養物によりＥＬＩＳＡで同定した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ４  ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに１：２５０で希釈した抗ｐａｎ  ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体を４℃において一晩吸着させた。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌ  ＰＢＳで洗浄し、１時間３７℃において２００μｌ／ｗｅｌｌの２％Ｍａｒｖｅｌ脱脂粉乳／ＰＢＳでブロックし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄した。５０μｌ  ＰＤＣＰ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳを含有する各井戸に加え、周囲温度で１時間結合させた。このプレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ついで２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤＣＰは２％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳに１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ファーマシア）１００μｌ／ｗｅｌｌで１時間周囲温度において検出し、このプレートを前述したのように６回洗浄した。プレートを１００μｌ／ｗｅｌｌの新しく調製したＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質バッファー（０．００５％のＨ2Ｏ2、２４ｍＭのクエン酸に溶かした０．１ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ／５２ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で１５分間周囲温度において現像した。反応を１００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％のＨ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍで読みとった。ＥＬＩＳＡ陽性クローン挿入部およびＤＢＤ結合のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）（実施例１参照）とＯＲＳＥＯＢＡＫ（配列番号：３６） (5’-TGTTGAAACACAAGCGCCAG-3’) を使用してＤＮＡ塩基配列決定法によりチェックした。
【０１０７】
５０倍に濃縮したＣ−末端Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ＰＤＣＰ粒子ストックを未感染ＴＧ１クローンを１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した１ｍｌの２ｘＴＹ培養物ブロスで５時間３７℃において２００ｒｐｍで振盪させつつ培養し、１０8カナマイシン耐性ユニット（ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージによる感染を３７℃において３０分間振盪させずに行ない、ついで３０分間２００ｒｐｍ振盪させることにより調製した。感染バクテリアを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよび２０μＭのＩＰＴＧを追加した２０ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３０℃において２００ｒｐｍで振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌのファルコンチューブで２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、４ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ６０００を２０ｍｌのＰＤＣＰ上澄みに加えて、激しく混合し、氷上で１時間保ち粒子を沈殿させた。
【０１０８】
粒子は５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、その後ピペットでＰＥＧ／ＮａＣｌのすべての痕跡を取り除いた後、ＰＢＳバッファー中に再懸濁し、マイクロ遠心器で１３５００ｒｐｍで５分間回転してバクテリアの破片を除去した。上澄みは０．４５μｍのポリサルホンシリンジフィルターで濾過した。濃縮されたストックは２倍階段希釈し、ＥＬＩＳＡにおいて前述したように抗ｐａｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を吸着したプレートに対して使用した（図６参照）。
【０１０９】
この実施例はＥＬＩＳＡにおいて検出可能なＣ−末端ＤＢＤ−ペプチド融合ＰＤＣＰが製造できるというＰＤＣＰを使用したＣ−末端表示の原理を示し、この方法によるオリゴｄＴ感作ｃＤＮＡライブラリの表示可能性を示す。
【０１１０】
実施例７  ＰＤＣＰ表面上のヒトプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのビオチン化Ｃ−末端領域のｉｎ  ｖｉｖｏ表示
実施例６はＣ−末端がＤＢＤと融合するのでヒトＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−末端領域がＰＤＣＰの表面に発現可能であることを示している。ここではもう１つのヒトタンパクプロピニルＣｏＡカルボキシラーゼα鎖Ｃ−末端領域（ゲンバンク、アクセス番号：Ｘ１４６０８）が同様に表示できることを示す。これによりこの方法の一般性が示唆される。
【０１１１】
プロピニルＣｏＡカルボキシラーゼα鎖（ＰＣＣ）のαサブユニットは７０３のアミノ酸を含有し通常ポジション６６９でビオチン化されている。このタンパクがバクテリア細胞中で発現するときに生じているように、このＰＤＣＰ上に表示されるＰＣＣペプチドがビオチン化されていることは実例で明らかにされている(Leon-Del-Rio & Gravel ; 1994, J. Biol. Chem. 3, 22964-22968)。
【０１１２】
Ｃ−末端９５アミノ酸、３’−未翻訳部分およびポリＡ末端（ポリＡ末端の３’−端に存在するＮｏｔＩ部位）をコード化するＰＣＣαの０．８ｋｂヒトｃＤＮＡ断片を増幅し、約２０ｎｇ  ｐＤＭ７−ＰＣＣ＃Ｃからそれぞれ２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）およびＣＤＮＰＣＲＢＡＫ１（配列番号：２９）を用いて実施例６に記載のように、ｐＤＭ１６内へクローン化した。
【０１１３】
挿入部を含有したクローンは、抗ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の代わりにストレプタビジンを２５０ｎｇ／ｗｅｌｌでＥＬＩＳＡプレートに吸着させたことを除き、実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡによって同定された。ＥＬＩＳＡ陽性クローン挿入部およびＤＢＤ結合のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）とＯＲＳＥＯＢＡＫ（配列番号：３６）（前記参照）を使用してＤＮＡ塩基配列決定法によりチェックした。５０倍に濃縮したＣ−末端ＰＣＣ  ＰＤＣＰ粒子ストックを調製し、実施例６に記載のようにストレプタビジンに対してＥＬＩＳＡで試験した（図７参照）。
【０１１４】
この実施例はペプチドがＰＤＣＰ上でＣ−末端融合として表示されうるのみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏ修飾ペプチドも表示されうることを示している。
【０１１５】
実施例８  ヒトｓｃＦｖ  ＰＣＤＰ表示ライブラリの構築
この実施例は免疫されていないヒトからのｓｃＦｖのヒト抗体ライブラリの作成を記載する。ＳｃＦｖ断片のＰＣＲアセンブリに対する全体的な戦略はMarks, J. D. et al. 1991, J. Mol. Biol. 222 : 581-597によって用いられたものと類似している。このライブラリを構築するのに使用された抗体遺伝子オリゴヌクレオチドはMarke et al.の論文およびＫａｂａｔデータベース(Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th edition. U.S. Department of Health and Human Services. 1987)から得た配列データを使用して得た。３つのリンカーオリゴヌクレオチドはZhou et al. (1994, Nucleic Acids Res., 22 :  888-889)に記載されており、ここで使用したすべてのオリゴヌクレオチドは表１に列挙した。
【０１１６】
まず、ｍＲＮＡを末梢血リンパ球から分離し、４つの別々のｃＤＮＡ合成プライマーを使用して４つの抗体遺伝子ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇκおよびＩｇλのレパートリーのためにｃＤＮＡを調整した。ＶＨ遺伝子をＩｇＤとＩｇＭ感作ｃＤＮＡから増幅し、ＶＬ遺伝子をＩｇκおよびＩｇλ感作ｃＤＮＡから増幅した。増幅Ｈ鎖ＤＮＡ、Ｌ鎖ＤＮＡそれぞれのセットの一部を１５アミノ酸（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3をコード化するリンカーＤＮＡの別の一片によってスプライスした(Huston, J.S. et al. 1989, Gene, 77 : 61)。リンカー配列がＪＨ，ＶκおよびＶλファミリープライマーセット（表１）に取り込まれる結果、このＶＨ  ＰＣＲ生成物の３’−末端とＶＬ  ＰＣＲ  生成物の５’−末端はリンカー配列に重なる。各ＶＨ−リンカーあるいはリンカー−ＶＬ  ＤＮＡ生成物をその後ＶＨあるいはＶＬ  ＤＮＡでスプライスし、ＶＨ−リンカー−ＶＬ構造の一次ｓｃＦｖ生成物を製造する。このｓｃＦｖ生成物をついで増幅し、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片としてｐＤＭ１２中にクローン化して、ＴＧ１にエレクトロポレートし濃縮ＰＤＣＰストックを調整した。
【０１１７】
ｍＲＮＡ分離とｃＤＮＡ合成
ヒトリンパ球ｍＲＮＡを実施例２に記載のように精製した。ｃＤＮＡ反応を別々にＩＧＤＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：３７）、ＩＧＭＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：３８）、ＩＧκＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：３９）およびＩＧλＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：４０）オリゴヌクレオチドを使用して行った。２０μｌのヌクレアーゼを含まない水に入れた約５μｇのｍＲＮＡに各プライマーを５０ｐｍｏｌずつ加え、７０℃において５分加熱し、急速に氷上において冷却し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰおよび２０００ユニットのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（イギリス、スコットランド、ペーズリーのライフ・テクノロジーズ）を含有する最終的に１００μｌの反応溶液を調製した。反応液を３７℃において２時間保ち、ついで９５℃において５分間熱した。
【０１１８】
一次ＰＣＲ
一次ＰＣＲ増幅においては、ＩｇＭとＩｇＤ  ｃＤＮＡのためのＪＨＦＯＲプライマーセット（配列番号：４１〜４４）の等モル混合物か、またはＩｇκあるいはＩｇλ  ｃＤＮＡのためのそれぞれＳＣＦＶκＦＯＲ（配列番号：５１）あるいはＳＣＦＶλＦＯＲ（配列番号５２）のいずれかにより、すなわちＶＨ１ＢＡＫとＪＨＦＯＲセット；Ｖκ２ＢＡＫ（配列番号：５４）とＳＣＦＶκＦＯＲ  （配列番号：５１）；Ｖλ３ａＢＡＫ（配列番号：６６）とＳＣＦＶλＦＯＲ  （配列番号：５２）など、ファミリー特異性プライマーごとに増幅は別途設定された。したがって、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇκ  ｃＤＮＡに対しては６つの異なる反応が設定され、Ｉｇλ  ｃＤＮＡに対しては７つの異なる反応が設定された。２μｌのｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの適当なＦＯＲおよびＢＡＫプライマー、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、さらに１ｘハイ・ソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．２、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、ケンブリッジのストラータージーン製）を含有する５０μｌの反応混合液を調製した。
【０１１９】
反応液はＴｅｃｈｎｅ  ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の３０サイクルに付しその後７２℃において１０分増幅した。全２５反応生成物のそれぞれ５０マイクロリットルをアガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製した。ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇκおよびＩｇλの反応生成物のすべてのセットをプールし、前記の４つのレパートリーのそれぞれに対するＶＨあるいはＶＬ  ＤＮＡセットを生成した。これらはついで約２０ｎｇ／μｌに調製した。
【０１２０】
リンカーの調製
リンカー生成物を５ｎｇのＬＩＮＫＡＭＰ３Ｔ（配列番号：７６）テンプレートオリゴヌクレオチド、５０ｐｍｏｌのＲＩＮＫＡＭＰ３（配列番号：７４）プライマーとＬＩＮＫＡＭＰ５（配列番号：７５）プライマー、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ユニットＴａｑｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．２、６０ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、ケンブリッジのストラータジーン・リミテッド製）を含有する８つの１００μｌ反応物から調製した。反応液はＴｅｃｈｎｅ  ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分の３０サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。全反応生成物は２％の低融点アガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いＭｅｒｍａｉｄキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製し５ｎｇ／μｌに調整した。
【０１２１】
一段目の結合
各レパートリー用に５ｎｇのリンカーＤＮＡと２０ｎｇのＶＨあるいはＶＬ  ＤＮＡをＩｇＭまたはＩｇＤＶＨ用には５０ｐｍｏｌのＬＩＮＫＡＭＰＦＯＲおよびＶＨ１−６ＢＡＫセットあるいは、５０ｐｍｏｌのＬＩＮＫＡＭＰＢＡＫ、Ｉｇκ用のＳＣＦＶκＦＯＲ、あるいはＩｇλ用のＳＣＦＶλＦＯＲのいずれかを含む、０．１ｍＭｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘＰＣＲ  反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５  ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘm  −１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリスのサウサンプトンのプロメガ・リミテッド製）を含有する１００μｌの反応混合液中で４つの結合反応を行った。反応液はＴｅｃｈｎｅ  ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の３０サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。全反応生成物はアガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製し、２０ｎｇ／μｌに調製した。
【０１２２】
最終結合および再増幅
最終ｓｃＦｖ  ＤＮＡ生成物を調製するために、前記の４つの最終レパートリー（ＩｇＭ  ＶＨ−Ｖκ，ＶＨ−Ｖλ；ＩｇＤ  ＶＨ−Ｖκ，ＶＨ−Ｖλ）のそれぞれのために、ＶＨ−リンカー  プラスＶＬ  ＤＮＡ用には５つの１００μｌの反応液、ＶＨプラスリンカー−ＶＬ  ＤＮＡ用には５つの１００μｌの反応液を前記ステップ（ｄ）に記載のように、各構成要素のＤＮＡ２０ｎｇをテンプレートとして用いて、反応させた。反応生成物はアガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製し、２０ｎｇ／μｌに調整した。４つのレパートリーのそれぞれをついでそれぞれ２ｎｇの結合生成物を、５０ｐｍｏｌ  ＶＨＢＡＫ１−６（配列番号：５３〜５８）とＪＫＦＯＲ（配列番号：６６〜７０）またはＪλＦＯＲ（配列番号：７１〜７３）プライマーセットのいずれかを含有し、さらに０．１ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０，５ｍＭ  ＫＣｌ，０．０１％トリトンＸm  −１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）（イギリス、サウサンプトンのプロメガ・リミテッド）を含有する１００μｌの反応溶液中で再増幅した。レパートリーごとに３０の反応を行い、クローニングに十分なＤＮＡを生成した。反応液はＴｅｃｈｎｅ  ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６５℃１分、７２℃２分の２５サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。反応生成物をフェノール−クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、真空中で乾燥し、８０μｌのヌクレアーゼを含有しない水に再懸濁した。
【０１２３】
ｐＤＭ１２へのクローン化
４つのレパートリーのそれぞれをＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製した。４つのレパートリーのそれぞれを、実施例２に記載のように調整した１０μｇのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＤＭ１２と、１２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（イギリス、スコットランドのペーズリーにあるライフ・テクノロジーズ製）を含む１４０μｌ中で一晩１６℃において連結を行った。インキュベーションの後、連結反応物をヌクレアーゼを含有しない水で２００μｌに調整し、ＤＮＡを１μｌ  ２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンで沈殿させた。１００μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムと９００μｌの氷冷（−２０℃）無水エタノールをｖｏｒｔｅｘで攪拌して混合し、マイクロ遠心器中で１３，０００ｒｐｍで２０分間回転してＤＮＡをペレット化した。このペレットを５００μｌの氷冷７０％エタノール中で１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して洗浄し、ついで真空乾燥し、１０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。各レパートリーの１μｌアリコートを、８０μｌの大腸菌（ＴＧ１）中へエレクトロポレートした。細胞をキュベットあたり１ｍｌのＳＯＣ培地中で３７℃において１時間培養し、１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレート上で培養した。ライブラリサイズを評価するためにエレクトロポレートしたバクテリアをさらに１０-1、１０-5 および１０-6に希釈して培養した。コロニーは３０℃において一晩増殖した。ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＤＭ１２へのクローン化により１．１６ｘ１０9クローンのＩｇＭ−κ／λレパートリー、および１．２１ｘ１０9クローンのＩｇＤ−κ／λレパートリーが得られた。
【０１２４】
ＰＤＣＰストックの調整
別のＰＤＣＰストックを各レパートリーライブラリのために調製した。バクテリアをプレートからこすりとり、２０％のグリセロール、１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した３０ｍｌの２ｘＴＹブロスに入れた。３ｍｌを１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した５０ｍｌの２ｘＴＹ培養ブロスに加え、１０11のカナマイシン耐性ユニット（ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで３７℃において３０分間振盪せずに感染させ、ついで２００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染バクテリアを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよび２０μＭのＩＰＴＧを追加した５００ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３０℃において２００ｒｐｍで振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌのファルコンチューブで２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、８０ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ  ６０００を４００ｍｌの粒子上澄みに加えて、激しく混合し、氷上で１時間保ちＰＤＣＰ粒子を沈殿させた。粒子は２５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃において１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、その後４０ｍｌの水に再懸濁し、８ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０％  ＰＥＧ  ６０００を加えて粒子を再度沈殿させ、氷上で２０分間保った。粒子を再度５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃において１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、５ｍｌのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、その後ピペットでＰＥＧ／ＮａＣｌのすべての痕跡を取り除いた。バクテリアの破片はマイクロ遠心器で１３５００ｒｐｍで５分間回転して除去した。上澄みは０．４５μｍのポリサルホンシリンジフィルターで濾過し、２０％のグリセロールに調整し、−７０℃で保存した。
【０１２５】
実施例９  ヒトｓｃＦｖのＮ−末端表示ＰＤＣＰライブラリから結合活性を分離する
ヒト抗体ライブラリから関心のあるターゲットへの結合活性を選択できることは、治療に役立つヒト抗体を製造する可能性という観点から重要である。さらに、このようなライブラリにより、これまでの抗体製造方法には毒性、低免疫抗原性、あるいは倫理的配慮から使用できなかったターゲットに対する抗体の分離を行うことができる。この例では我々は免疫されていないヒトからのｓｃＦｖのＰＤＣＰライブラリから、ペプチド抗体に対する特定の結合活性をどのように分離するかを示す。
【０１２６】
本実施例において結合活性の分離に使用するライブラリの製造方法は実施例８に記載されている。
【０１２７】
物質Ｐは生体での炎症および疼痛反応に関与する１１個のアミノ酸ニューロペプチドである。これはまた、とりわけ乾癬や喘息など、様々な疾患に関係している(Misery, L. 1997, Br. J. Dertmatol., 137 : 843-850; Maggi, C. A. 1997, Regul. Pept. 70 : 75-90 ; Choi, D. C. & Kwon, O.J., 1998, Curr. Opin.  Pulm. Med., 4: 16-24)。このペプチドを中和するヒト抗体は、したがっていくらかの潜在的な治療可能性を持つ。このペプチドは小さすぎて実施例３に記載のようにチューブ上に有効に吸着できないので、結合活性の選択は溶液中でＮ−末端ビオチン化物質Ｐを用いて、結合したＰＤＣＰ粒子をストレプタビジン−コートのマグネティックビーズを用いて行った。
【０１２８】
物質Ｐ結合ＰＤＣＰ粒子の増菌
約１０13ａ．ｒ．ｕ．ＩｇＭおよびＩｇＤ  ｓｃＦｖライブラリストックのアリコートを８００μｌ  ４％  ＢＳＡ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳに溶かした１μｇビオチン化物質Ｐと混合し、周囲温度で２時間結合させた。結合したＰＤＣＰをついで１ｍｌのＢＳＡブロックストレプタビジンコートマグネティックビーズの上に１０分間周囲温度で捕捉した。このビーズをマグネット（プロメガ）を用いてチューブの側面にて捕捉し、未結合物質を捨てた。ビーズを１ｍｌのＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／１０μｇ／ｍｌストレプタビジンにて８回、１ｍｌのＰＢＳで２回、磁気的捕捉によって洗浄し、洗浄バッファーを除去した。最終的に洗浄した後、結合ＰＤＣＰを１ｍｌの新しく調整した０．１Ｍのトリエチルアミンで１０分間溶出し、ビーズを捕捉し、溶出した粒子を０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４へ移した。中和された粒子を１０ｍｌの対数期のＴＧ１大腸菌バクテリアに加え、３７℃において振盪せずに３０分間培養し、ついで２００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染させた培養物の１０-3、１０-4、および１０-5希釈物を調製し、回収された粒子の数を推定し、残りは４０００ｒｐｍで１０分間回転させ、ペレットを３００μｌの２ｘＴＹ培地にｖｏｒｔｅｘで攪拌して再懸濁した。バクテリアを１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレートで培養した。コロニーを３０℃で一晩増殖した。前述のようにして、これらのバクテリアの２００ｍｌ増幅培養物から１００倍に濃縮したＰＤＣＰストックを調整し、０．５ｍｌを選択の第２回目として５００ｎｇのビオチン化物質Ｐとともに使用した。この回では１００μｇ／ｍｌのストレプタビジンが洗浄バッファーに含有された。
【０１２９】
結合クローンのＥＬＩＳＡ同定
実施例３に記載のように調製した９６の個々のＰＤＣＰ培養物によりＥＬＩＳＡで第２回目の選択が終了した後、回収されたコロニーから結合クローンを同定した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＥＬＩＳＡプレートに１００  μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした２００ｎｇ／ｗｅｌｌのストレプタビジンを３７℃で一時間吸着した。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした１０ｎｇ／ｗｅｌｌのビオチン化物質Ｐで３０分間３７℃で培養した。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄し、１時間３７℃において２００μｌ／ｗｅｌｌの２％Ｍａｒｖｅｌ脱脂粉乳／ＰＢＳでブロックし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄した。５０μｌ  ＰＤＣＰ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳを含有する各井戸に加え、周囲温度で１時間結合させた。このプレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ついで２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤＣＰは２％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳに１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ファーマシア）１００μｌ／ｗｅｌｌで１時間周囲温度で検出し、このプレートを前述したように６回洗浄した。プレートを１００μｌ／ｗｅｌｌの新しく調製したＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質バッファー（０．００５％のＨ2Ｏ2、２４ｍＭのクエン酸に溶かした０．１ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ／５２ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で１０分間周囲温度で現像した。反応を１００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％のＨ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍで読みとった。試験した９６クローンのうち、１０個からバックグラウンドの２倍以上の信号（バックグラウンド＝０．０５）を得た。
【０１３０】
結合クローンの特性決定
前述したように、１００ｍｌのシングルＥＬＩＳＡ陽性クローンの増幅培養物から５０倍に濃縮したＰＤＣＰストックを調製した。前述したように１０μｌ／ｗｅｌｌのこのストックのストレプタビジン、ストレプタビジン−ビオチン化−物質Ｐおよびストレプタビジン−ビオチン化−ＣＧＲＰ（ビオチン化Ｎ−末端）への結合性をＥＬＩＳＡにて試験した。結合はストレプタビジン−ビオチン化−物質Ｐ吸着井戸においてのみ観察され、これにより結合が特異的であることが示された。さらに、ストレプタビジン−ビオチン化−物質Ｐへの結合はＰＤＣＰを１μｇ／ｍｌの遊離物質Ｐ（図８を参照）で培養することによって完全に阻害された。このｓｃＦｖ  ＶＨ（配列番号：１５および１６）およびＶＬ（配列番号：１７および１８）ＤＮＡおよびアミノ酸配列はＤＮＡ塩基配列決定法によりオリゴヌクレオチドＭ１３ＲＥＶ（配列番号：２７）とＯＲＳＥＱＦＯＲ（配列番号：３６）を用いて決定され、図９に示した。
【０１３１】
この結果からターゲット結合活性がヒトｓｃＦｖ断片のＰＤＣＰ表示ライブラリから分離可能であることが示された。
【０１３２】
実施例１０
もう１つの実施例において本発明は例えばリガンド結合のために抗体Ｆａｂ断片によって要求される、活性のために１つ以上の鎖を必要とするようなメンバーを持つＤＮＡライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。既知のＨ鎖およびＬ鎖配列の抗体の親和性を増加するためには、既知のＨ鎖と共発現している既知のＬ鎖のライブラリがより高い親和性の抗体に対してスクリーンされる。この既知のＨ鎖抗体ＤＮＡ配列はエストロゲンレセプターＨＲＥ配列を含有しないファージベクター中でエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をコード化するヌクレオチド配列に連結される。既知のＨ鎖のための抗体ＤＮＡ配列（ＶＨおよびＣＨ１）遺伝子はエストロゲンレセプターＤＢＤ  ＤＮＡの５’領域の中で適当なプロモーターと翻訳配列、およびペリプラスム間隙へ下流融合タンパクの移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化しうる配列の下流に挿入される。未知のＬ鎖のライブラリ（ＶＬおよびＣＬ）は、エストロゲンレセプターＨＲＥ配列を含有しているファージミド発現ベクターから別々に発現する。このように、Ｈ鎖とＬ鎖がともに、Ｈ鎖−ＤＢＤ融合を含有するファージによる感染のあとで、同じホスト細胞中に発現するとき、Ｌ鎖ファージミドベクターは、パッケージング過程の間にＨ鎖−ＤＢＤ融合タンパクによって結合される、一本鎖ＤＮＡとして成熟ファージ粒子中に優先的にパッケージされる。このＬ鎖タンパクはペリプラスムへ移送され、そこでＰＤＣＰ上の細胞を出てＤＢＤタンパクと融合するＨ鎖とともに組み立てられる。この実施例においてＤＢＤ融合タンパクおよびＨＲＥ  ＤＮＡ配列は同じベクター上にはコード化されておらず、未知のペプチド配列がＨＲＥ配列として同じベクター上に存在する。関心のあるタンパクをコード化するペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）はついで抗体のリガンド特異性によって選択される。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にある、ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含む複数のクローン化部位、フレキシブルな（グリシン）4−セリンリンカー配列（四角く囲んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２を含有するエストロゲンレセプター遺伝子断片（配列番号：４）、および３８塩基対コンセンサスエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域ＨＲＥ配列を含有する、ｐＤＭ１２  Ｎ末端融合エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図
【図２】  陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ファージ、および抗ヒト免疫グロブリンカッパ抗体に対するリンパ球ｃＤＮＡ−ｐＤＭ１２ライブラリの選択によって分離したシングル−クローンペプチド表示キャリアパッケージ表示培養物上澄み（＃１−４、実施例３参照）に対するＯＤ450nm ＥＬＩＳＡデータを示す図
【図３】  ヒト免疫グロブリンカッパ定数領域の部分ＤＮＡ（配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th edition. U.S. Department of Health and Human Services. 1987)および図２のＥＬＩＳＡ陽性クローン＃２（配列番号：７および８）と＃３（配列番号：９および１０）を示す図であり、これはヒトカッパ定数領域ＤＮＡがｐｅｌＢリーダー配列のフレーム内に存在することを確認する（ｐｅｌＢリーダー配列には下線が引かれてあり、このリーダー配列の切断部位は矢印で示されている）。５’−末端配列における差はこれらの２つのクローンがライブラリストックから独立して選択されたことを示している。ＰＣＲプライマー配列は太字で示されており、クローン＃２は当初ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ１で増幅され、クローン＃３はＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２で増幅されている図
【図４】  ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含む複数のクローン化部位、フレキシブルな（グリシン）4 −セリンリンカー配列（四角く囲んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２からなるエストロゲンレセプター遺伝子断片（配列番号：１２）、および２つの３８塩基対エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域ＨＲＥ配列（ＨＲＥ１とＨＲＥ２）を含有する、ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位間のｐＤＭ１４  Ｎ末端融合エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す図
【図５】  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にある、ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含む複数のクローン化部位、フレキシブルな（グリシン）4 −セリンリンカー配列（四角く囲んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２からなるエストロゲンレセプター遺伝子断片（配列番号：１４）、および３８塩基対エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域ＨＲＥ配列を含有する、ｐＤＭ１６  Ｃ末端融合エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す図
【図６】  アンピシリン耐性単位（ａ．ｒ．ｕ．）として連続希釈ＥＬＩＳＡ中のａｎｔｉ−ｐａｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体へのＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｐＤＭ１６  Ｃ−末端表示ペプチド表示キャリアパッケージの結合に対するＯＤ450nm ＥＬＩＳＡデータを示す。陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージのバックグラウンド結合もまた示す図
【図７】  アンピシリン耐性単位（ａ．ｒ．ｕ．）として連続希釈ＥＬＩＳＡ中のストレプタビジンへのビオチン化ＰＣＣ−ｐＤＭ１６  Ｃ−末端表示ペプチド表示キャリアパッケージの結合に対する生体内でのＯＤ450nm ＥＬＩＳＡデータを示す。陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージのバックグラウンド結合もまた示す図
【図８】  物質Ｐに対して選択されたヒトｓｃＦｖ  ペプチド表示キャリアパッケージ表示ライブラリから分離されたｓｃＦｖペプチド表示キャリアパッケージのＯＤ450nm ＥＬＩＳＡデータを示す図で、このペプチド表示キャリアパッケージはストレプタビジン（１）、ストレプタビジン−ビオチン化物質Ｐ（２）、およびストレプタビジン−ビオチン化ＣＧＲＰ（３）に対して、遊離の物質Ｐの存在下（Ｂ）および非存在下（Ａ）で試験されたもの
【図９】  物質Ｐに対して選択されたヒトｓｃＦｖ  ペプチド表示キャリアパッケージ表示ライブラリから分離された、物質Ｐ結合ｓｃＦｖのＤＮＡ（配列番号：１５および１７）とアミノ酸（配列番号：１６および１８）配列を示す図で、Ｈ鎖（配列番号：１５および１６）とＬ鎖（配列番号：１７および１８）可変領域配列がＣＤＲとともに下線を引き太字で強調されている図
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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