(57)【要約】  本発明は、血液中に存在するルテリアルの形態学的特性を用いた疾病の診断方法に関する。本発明によれば、疾病の種類および進行程度によって、ルテリアルの数、サイズや形状などの形態学的特性および動き（ナノトラッキング速度）が変わるため、このような血液中のルテリアルの特性を観察および測定することで、疾病（特に、癌）の診断および予後を効果的に判断することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項２】
前記体液は血液であることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項３】
前記（ａ）ステップはルテリアルをローダミン１２３、ミトトラッカー、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ及びヤーヌスグリーンＢからなる群より選択される一つ以上の染料で染色し発色させて、測定することを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項４】
前記ルテリアルは血液から血清を分離するステップと、前記分離した血清から、１００ｎｍ〜２ｍｍの直径の空隙を備えたフィルターを通過していない沈殿物を分離するステップと、前記分離した沈殿物を洗浄するステップと、を含む方法により分離されることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項５】
前記（ｂ）ステップで測定されたルテリアルの直径が赤血球の直径の８〜３０倍、または測定されたルテリアルの面積が赤血球の面積の８〜３０倍である場合、疾病を癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項６】
前記（ｂ）ステップで測定されたルテリアルの数が健常人の２０％以下であり、長径が２０μｍ以上である場合に、癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項７】
前記（ｂ）ステップはルテリアルの外部に被膜が形成されている場合、癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項８】
前記（ｂ）ステップにおいて、ルテリアルの形態は、正常形、外部に鞭毛が備えられた鞭毛形、マス（Ｍ）形、ロッド（Ｌ）形、および複合形を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項９】
前記正常形は、ルテリアルの長径と短径との比が１：１〜３：１であり、前記マス形は、長径と短径との比が３：１〜５：１であり、前記ロッド形は、長径と短径との比が５：１〜１２：１であり、前記複合形は、ロッド形とマス形の融合形態、またはロッド形とロッド形の融合形態であることを特徴とする請求項８に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）ステップでは、測定されたルテリアルの形態が（ｉ）ロッド形である場合、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、胸膜中皮腫、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、前立腺癌、またはリンパ性血液癌の発生状態に決定し、（ｉｉ）マス形である場合、肝癌、肝血管肉腫、大腸癌、子宮癌、消化器癌（胃癌）、腎臓癌、直腸癌、または骨髄性血液癌の発生状態に決定し、（ｉｉｉ）複合形である場合、重度の血液癌または転移癌が疑われる状態に決定し、（ｉｖ）鞭毛形が表れる場合、末期腫瘍が疑われる状態に決定することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）ステップで、観察または撮影により測定されたルテリアルのナノトラッキング速度が８．０〜１１ｎｍ／ｓｅｃである場合には１期癌が疑われる状態、２．５〜８．０ｎｍ／ｓｅｃである場合には２期癌が疑われる状態、０．５〜２．５ｎｍ／ｓｅｃである場合には３期癌が疑われる状態、０．５ｎｍ／ｓｅｃ未満の場合には４期癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１２】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群より選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１３】
前記体液は血液であることを特徴とする請求項１２に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１４】
前記ルテリアルをローダミン１２３、ミトトラッカー、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ及びヤーヌスグリーンＢからなる群より選択される一つ以上の染料で染色し発色が確認され、電子顕微鏡上で二重膜およびクリステ構造が確認されることを特徴とする請求項１２に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１５】
前記（ｃ）ステップは、前記測定されたルテリアルの形態が単一形の形態と８０〜１００％一致する場合、正常であると決定し、融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、疾病が疑われる状態であると決定し、多重融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、腫瘍が疑われる状態であると決定し、膜が裂けた融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、重度の腫瘍が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態学的特性を用いた疾病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中における微小胞などの微細物質は、かつては、特別な機能を持っていない物質として認識されてきた。しかし、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）も様々な生物活性を有するということが、種々の実験データにより明らかになっている。例えば、血小板由来の微小胞は、小胞状の表面タンパク質を介して特定細胞を刺激する機能をするということが明らかになっており（ＣＤ１５４，ＲＡＮＴＥＳ  および／または  ＰＦ−４；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９）８２：７９４，または  Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：７５４５）、血小板の微小胞における生理活性脂質（例えば、ＨＴＥＴまたはアラキドン酸）が特定の標的細胞に対して特定効果を示すことが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６；１９６７２；またはＣａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（２００１）４９（５）：８８を参照）。このように、生物学的試料中に存在する小嚢などの物質の特徴（例えば、サイズ、表面抗原、起源細胞の決定、ペイロッド）は、疾病の診断、予後または治療診断に関する情報を提供することができるため、疾患を探索して治療するのに用いられることができる生物学的指標を確認することに対する必要性が求められている。
【０００３】
一方、産業化された大部分の国で、癌（ｃａｎｃｅｒ）は、今でも死亡率第１位の難治性疾患である。癌の治癒率は依然として低く、癌による死亡者が増加しつつあるため、家計負担および国の医療費負担も多く増加している。癌は、細胞が無限に増殖して正常な細胞の機能を妨害する疾病であり、肺癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、ＧＣ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ、ＢＲＣ）、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）などが代表的であるが、実質的には何れの組織でも発生し得る。
【０００４】
初期の癌の診断は、癌細胞の成長による生体組織の外的変化に基づいて行われたが、近年、血液、糖鎖（ｇｌｙｃｏ  ｃｈａｉｎ）、ＤＮＡなどの生物の組織または細胞に存在する微量の生体分子を用いた診断および検出が試されている。しかし、最も一般的に用いられる癌の診断方法は、生体組織検査により得られた組織サンプルを用いるか、映像を用いた診断である。このうち生体組織検査は、患者に大きい苦痛を与え、費用が高いだけでなく、診断まで長時間がかかるという欠点がある。また、患者が実際に癌にかかった場合、生体組織検査の過程中に癌の転移が誘発される恐れがあり、生体組織検査により組織サンプルが得られない部位の場合、疑われる組織を外科的な手術で摘出しないと、疾病の診断が不可能であるという欠点がある。また、映像を用いた診断では、エックス線（Ｘ−ｒａｙ）映像、疾病標的物質が付着された造影剤を用いて得た核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＮＭＲ）映像などに基づいて癌を判定していた。しかし、かかる映像による診断は、臨床医または読影医の熟練度によって誤診の可能性があり、映像を得る機器の精度に大きく依存するという欠点がある。さらに、最も高精度の機器であるとしても、数ｍｍ以下の腫瘍は検出が不可能であり、初期段階では癌の検出が難しいという欠点がある。また、映像を得るためには、患者または疾病保有可能者が、遺伝子の変異が誘発し得る高エネルギーの電磁気波に露出されるため、さらに他の疾病を引き起こす恐れがあるだけでなく、映像を用いた診断の回数が制限されるという欠点がある。
【０００５】
すなわち、癌の診断のための生体組織検査は、多くの時間、費用、不便さ、苦痛などが伴われるため、不要な生体組織検査の対象者数を著しく減少させることができる方法、癌を早期に診断できる方法が求められている。
【０００６】
このような背景下で、本発明者らは、患者から既に排出された体液中に存在する微細物質であるルテリアル（Ｌｕｔｅｒｉａｌ）の形態学的特性を観察することで、疾病を診断および予測することができることを見出し、本発明を成すに至った。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態学的特性を用いた疾病の診断方法を提供することにある。
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群から選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断または予後の予測方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群から選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断または予後の予測方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の特徴および具現例は、次の詳細な説明および添付の特許請求の範囲によりさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ルテリアルのライフサイクルを概略的に示したものである。
【図２ａ】非小細胞性肺癌末期患者の血液由来のルテリアルを走査型共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図２ｂ】非小細胞性肺癌末期患者の血液由来のルテリオンをローダミン１２３で蛍光染色した後に撮影した走査型共焦点レーザー顕微鏡写真を示したものである。
【図２ｃ】非小細胞性肺癌末期患者の血液由来のルテリオンを電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３】血液由来のルテリアルを電子顕微鏡で撮影し、１００〜１０００ｎｍ以上まで、直径の順に配列した写真を示したものである。
【図４ａ】健常人の血液のルテリアル（１ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｂ】健常人の血液のルテリアル（２ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｃ】健常人の血液のルテリアル（３ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｄ】メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）異常を有する患者の血液のルテリアル（４ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｅ】遺伝子変異を有する患者の血液のルテリアル（５ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｆ】遺伝子変異を有する患者の血液のルテリアル（６ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｇ】腫瘍関連遺伝子変異を有する患者の血液のルテリアル（７ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｈ】腫瘍関連遺伝子複合変異を有する患者の血液のルテリアル（８ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図４ｉ】末期癌患者由来の血液のルテリアル（９ステップ）を暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図５】マス形のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図６】ロッド形のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図７ａ】肺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（初期）。
【図７ｂ】肺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（２〜３期）。
【図７ｃ】肺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（２〜３期）。
【図７ｄ】肺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（２〜３期）。
【図７ｅ】肺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（２〜３期）。
【図８ａ】乳癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（初期）。
【図８ｂ】乳癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（初期）。
【図８ｃ】乳癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図８ｄ】乳癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図８ｅ】乳癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（リンパ、腹膜、および心膜へ転移）。
【図９ａ】膵臓癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（初期）。
【図９ｂ】膵臓癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図９ｃ】膵臓癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図９ｄ】膵臓癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１０】胆管癌（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｂｉｌｅ  Ｄｕｃｔ  Ｃａｎｃｅｒ）の骨／肺への転移患者由来のルテリアルを走査型共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１１】胸膜中皮腫（Ｐｌｅｕｒａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１２】甲状腺癌（中期）患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１３ａ】卵巣癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１３ｂ】卵巣癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１４】胆道癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１５】前立腺癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１６ａ】急性リンパ性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１６ｂ】急性リンパ性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（ロッド−マス複合進行形）。
【図１７ａ】肝癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（初期）。
【図１７ｂ】肝癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１７ｃ】肝癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図１７ｄ】肺へ転移された肝癌患者由来のルテリアルを走査型共焦点レーザー顕微鏡撮影した写真を示したものである。
【図１８】肝血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ）患者由来のルテリアルを走査型共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１９ａ】大腸癌および胃癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１９ｂ】大腸癌および胃癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図１９ｃ】大腸癌および胃癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図２０】子宮癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図２１】胃癌初期患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図２２ａ】直腸癌初期患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（マス−ロッド進行形）。
【図２２ｂ】直腸癌初期患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（マス形）。
【図２３ａ】急性骨髄性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（マス−ロッド進行形）。
【図２３ｂ】急性骨髄性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図２３ｃ】急性骨髄性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（中期）。
【図２４】急性骨髄性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである（マス−ロッド進行形）。
【図２５ａ】肝へ転移された胃癌患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２５ｂ】腹膜へ転移された胃癌患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２５ｃ】腹膜および肝へ転移された胃癌患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２６】骨および肺へ転移された直腸癌患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２７】骨へ転移された前立腺癌患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２８】リンパへ転移された非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者由来のルテリアルを示したものである。
【図２９】骨へ転移された腎臓癌患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３０】急性リンパ性白血病患者由来のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３１】ナノトラッカーを用いてルテリアルの移動速度（ナノトラッキング速度）を測定した写真を示したものである。
【図３２ａ】膜が裂けた融合形の形態を順に電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３２ｂ】膜が裂けた融合形の形態を順に電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３２ｃ】膜が裂けた融合形の形態を順に電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
他に定義されない限り、この明細書において用いられた全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した当業者により通常的に理解されるものと同一の意味を有する。通常、この明細書において用いられた命名法は、本技術分野において公知の、通常的に用いられるものである。
【００１５】
本発明で用いる用語「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」は、全ての動物に存在する生命因子（ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）であって、ウイルスに近似な程度から約５００ｎｍまで（正常フィッションステップ５０〜５００ｎｍ／非正常フュージョンステップ８００ｎｍ以上）のサイズを有する微細物質を本発明者が命名したものである。前記ルテリアルは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み、付着性と運動性を有する点でエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）や微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）と区別される。
【００１６】
ヒトを含む動物の場合、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、骨髓に存在し、「ルテリアル」と称される。尚、植物に存在する物質は「ルテリオン（Ｌｕｔｅｒｉｏｎ）」と称され、血液などで発見されるルテリアルの起源は、植物由来のルテリオンであると推定される（図１）。
【００１７】
ミトコンドリアは、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）および蛍光染色のローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、およびＤＡＰＩにより発色が確認されるが、前記ルテリアルもミトコンドリアと同一の染料により発色が確認され、ミトコンドリアと類似の二重膜の膜構造であって、内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造が完成されていない状態の構造を有し、ミトコンドリアと同一のレーザー波長範囲で観察されるという点で、「類似ミトコンドリア」、「ミトコンドリア類似体」、または「ミトコンドリア前駆体（ｐｒｏｔｏ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」と称することもできる。
【００１８】
ルテリアルは、ヒトを含む動物の場合、血液、唾液、リンパ管、精液・膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、骨髓に存在する。その他に、角を有する動物の場合、角中にもルテリアルが存在する。
【００１９】
前記ルテリアルは、また、シグナリング、細胞分化、アポトーシスだけでなく、細胞サイクルおよび細胞成長の調節にも関連すると予想されるが、本発明者は、中でもルテリアルが癌の診断に密接な関連を有することを見出した。
【００２０】
正常なルテリアル（ｎｏｒｍａｌ  ｌｕｔｅｒｉａｌ）は、癌細胞の成長を抑え、細胞を健康な免疫体系に戻す役割をすると予想されるが、その役割は、遺伝子を正常化させる可能性を有するＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）により行われる。このように、健康な人や動物由来のルテリアルの場合、ＲＮＡ中における情報体系が正常軌道を外れて、異常疾患を誘発するタンパク質を生産するように指示する場合、これを人為的に干渉することで癌などの疾病の発生を抑えるように作用し、サイズが２００〜５００ｎｍ以上に成熟した時にはエネルギー代謝にも関与する。そのため、かかるルテリアルが正常な役割を行うことができない場合、恒常性およびＡＴＰ生産において決定的障害を誘発し、呼吸およびエネルギー代謝の両方において疾病を招く恐れがある。
【００２１】
このように、役割を正常に果たすことができない変異ルテリアルは、正常なルテリアルとは生態および特性が異なって、そのサイズや形態が多様である。具体的に、正常なルテリアルは、二重胞子（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｐｏｒｅ）を形成した後にはそれ以上増殖しないが、癌患者や晩成疾病を有する患者の血液で発見される変異ルテリアルは、幹細胞と類似に無限に増殖する特性を有するため、６００〜８００ｎｍ以上のサイズを有し、２００μｍ（２００，０００ｎｍ）以上のサイズを有するものもある。また、ウイルスと類似に、赤血球、白血球、血小板などに侵入して生長したり、他のルテリアルと凝集したりする特性を示す。
【００２２】
一方、ルテリアルは、個体の疾病有無に応じて、その数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度が異なり、前記特性の１つまたは２つ以上を組み合わせることで、疾病の診断や予後の予測が可能である。これは、疾病のない健常人由来のルテリアルと、疾病のあるヒト由来のルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、ナノトラッキング速度などが異なることから分かる。かかる差は、ルテリアルの変異有無に起因したものであって、疾病のあるヒト由来のルテリアルを、健常人由来の正常なルテリアルから区分するために「変異ルテリアル（ｍｕｔａｎｔ  ｌｕｔｅｒｉａｌ）」と命名した。
【００２３】
結局、患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数と形態学的特性または生化学的特性を観察することで、疾病の診断および予後の予測が可能である。
【００２４】
より具体的に、患者の場合、ルテリアルの数、特に４，０００ｎｍ以下のサイズのルテリアル数が健常人に比べ少なくなる特性があり、重度患者の場合は２０〜８０％に少なくなる。したがって、ルテリアルの数が健常人の２０％以下である場合には、腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。
【００２５】
尚、ルテリアルのサイズ（長径）が２０μｍである変異ルテリアルが発見される場合、腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。特に、ルテリアルの長径が２０μｍ以下であるとしても、変異ルテリアルの外部に被膜が形成されている場合には、悪性腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。但し、変異ルテリアルの長径が２０μｍ以上であるとしても、被膜が完成されていない場合には、良性腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。
【００２６】
また、患者由来のルテリアルは、その動きが健常人由来のルテリアルに比べ著しく減少する。このようなルテリアルの動きは、ナノトラッキング速度により定量することができる。
【００２７】
したがって、一観点による本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法に関する。
【００２８】
他の観点による本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断または予後の予測方法に関する。
【００２９】
本発明で観察されるルテリアルは、患者から既に排出された体液から分離されることができる。本発明における「患者から既に排出された体液」は、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、脊髄、または骨髓であることができるが、これに制限されるものではない。最も好ましくは、血液由来のルテリアルを用いることができる。具体的に、採取された血液サンプル中に存在するルテリアルまたは血液から分離されたルテリアルを顕微鏡で観察することで、疾病を診断し、予後を予測することができる。
【００３０】
本発明の一実施例では、血液から血清を分離する第１の分離ステップと、前記分離した血清から、１００ｎｍ〜２ｍｍの直径の空隙を備えたフィルターを通過していない沈殿物を分離する第２の分離ステップと、前記分離した沈殿物を洗浄するステップと、を含む工程によりルテリアルを得た。
【００３１】
より詳細には、前記第１の分離ステップは、患者から血液を採取し、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１５分間遠心分離するステップを含むことができる。前記第２の分離ステップは、血清から、遠心分離などによりエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）などの一般微小胞を除去して上清を得るステップと、前記得られた上清を、１００ｎｍ〜２ｍｍの直径の空隙を備えたフィルターに通過させ、これを通過していない沈殿物を分離するステップと、を含むことができる。エキソソームを除去するためにＥｘｏＱｕｉｃｋ）が使用できるが、これに制限されるものではない。前記洗浄するステップは、前記沈殿物が分離された血清（これはエキソソームであることができる）を生理食塩水（Ｎｏｒｍａｌ  Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄するステップを含むことができる。前記洗浄するステップの後に、アイシング（４℃以下）を維持するステップをさらに含むことができる。
【００３２】
前記（ｂ）ステップで観察または撮影されたルテリアルの長径が赤血球の直径の８〜３０倍、または観察または撮影されたルテリアルの面積が赤血球の面積の８〜３０倍である場合、疾病が癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００３３】
ルテリアルのサイズを観察または撮影して測定する場合、健常人のルテリアルは１００〜２５０ｎｍであるが、疲労症候群のある場合には２５０〜８００ｎｍ、疾病のある場合には８００ｎｍ以上、最大数百μｍ（約２００μｍ）のサイズを有する。
【００３４】
前記（ｂ）ステップで観察または撮影されたルテリアルの数が健常人の２０％以下であり、サイズ（直径）が０．８〜１μｍである場合には、疾病発生が疑われる状態であると決定し、２０μｍである場合には、癌が疑われる状態であると決定することができる。変異ルテリアルの外部に被膜が形成されている場合には、そのサイズを問わずに癌の標識因子に決定することができる。特に、被膜が形成されており、鞭毛（触手）が観察されると、悪性腫瘍の重度因子に決定することができる。被膜形成有無は、暗視野顕微鏡や電子顕微鏡で観察可能である。
【００３５】
前記（ａ）ステップでは、ルテリアルの形態を観察または撮影し、前記（ｂ）ステップでは、観察または撮影されたルテリアルの形態に応じて疾病を決定することができる。
【００３６】
前記（ｂ）ステップにおいて、ルテリアルの形態は、正常形、外部に鞭毛が備えられた鞭毛形、マス（Ｍａｓｓ：Ｍ）形、ロッド（Ｒｏｄ：Ｌ）形、および複合形を含む群から選択されることができる。
【００３７】
前記正常形は、ルテリアルの長径と短径との比が１：１〜３：１であることができる。
【００３８】
前記マス（Ｍａｓｓ）形は、丸やかな形状に密集されており、大多数の膜が開口された構造であって、長径と短径との比が３：１〜５：１であることができる。
【００３９】
前記ロッド（Ｒｏｄ）形は、尖って且つ角状の形状を有しており、大多数の膜が閉塞された構造であって、長径と短径との比が５：１〜１２：１であることができる。
【００４０】
前記ロッド（Ｒｏｄ）形は、円形または楕円形の単一鎖からなるロッド１形、または２つ以上の単一鎖が結合してなるロッド２形であることができる。
【００４１】
前記複合形は、ロッド形とマス形の融合形態、ロッド形とロッド形の融合形態、またはマス形とマス形の融合形態であることができる。
【００４２】
前記（ｂ）ステップでは、観察または撮影により測定されたルテリアルの形態がロッド形である場合、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、胸膜中皮腫、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、前立腺癌、またはリンパ性血液癌の発生標識因子に決定し、マス形である場合、肝癌、肝血管肉腫、大腸癌、子宮癌、消化器癌（胃癌）、腎臓癌、直腸癌、または骨髄性血液癌の発生標識因子に決定し、複合形である場合、重度の血液癌または転移癌が疑われる状態の標識因子に決定し、鞭毛形が表れる場合、末期腫瘍が疑われる標識因子に決定することを特徴とする。
【００４３】
このような変異ルテリアルの形態により、発生部位を追跡することもできる。ロッド形の場合、癌の発生部位を肺、乳、膵臓、胆管、甲状腺、卵巣、胆道、前立腺、またはリンパ性血液に決定することができ、マス形の場合、癌の発生部位を肝、大腸、子宮、消化器（胃）、腎臓、直腸、または骨髄性血液に決定することができる。尚、ロッド形からマス形へ複合形に進行中である場合、癌の元発生部位はロッド形と同一であり、マス形からロッド形へ複合形に進行中である場合には、癌の元発生部位はマス形と同一である。
【００４４】
また、本発明は、ルテリアルの運動性を意味するナノトラッキング速度を測定し、その速度に応じて、１期癌〜４期癌が疑われる状態であると決定することができる。前記（ｂ）ステップで、観察または撮影により測定されたルテリアルのナノトラッキング速度が８．０〜１１ｎｍ／ｓｅｃである場合には１期癌が疑われる状態、２．５〜８．０ｎｍ／ｓｅｃである場合には２期癌が疑われる状態、０．５〜２．５ｎｍ／ｓｅｃである場合には３期癌が疑われる状態、０．５ｎｍ／ｓｅｃ未満の場合には４期癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００４５】
さらに他の観点による本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群から選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法に関する。
【００４６】
さらに他の観点による本発明は、（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群から選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断または予後の予測方法に関する。
【００４７】
前記血液由来のルテリアルは、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）からなる群から選択される１つ以上の染料で染色することで発色が確認され、電子顕微鏡上で二重膜およびクリステ構造が確認されることを特徴とする。
【００４８】
前記（ｃ）ステップは、前記観察または撮影により測定されたルテリアルの形態が単一形の形態と８０〜１００％一致する場合、正常であると決定し、融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、疾病が疑われる状態であると決定し、多重融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、腫瘍が疑われる状態であると決定し、膜が裂けた融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、重度の腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。
【００４９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５０】
≪実施例１：血液由来のルテリアルの分離≫
非小細胞性肺癌末期患者から採取された血液２５０μＬを１６００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで、血清を分離した。この血清にＳＢＩ社製のＥｘｏＱｕｉｃｋを６３μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、さらに１５分間維持させてから、ＥｘｏＱｕｉｃｋと反応していない上層部を分離した。分離された上層部（上清）を１００ｎｍのマイクロフィルターでフィルタリングし、通過していない沈殿物を分離した。これを生理食塩水で複数回洗浄した後、アイシング（４℃以下）を維持して、微細物質であるルテリアルを分離した。
【００５１】
≪実施例２：顕微鏡観察およびルテリアルの確認≫
実施例１で分離されたルテリアルは、走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することができた（図２ａ）。これをローダミン１２３で染色した後、走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて確認し（図２ｂ）、ヤーヌスグリーンＢで染色されたルテリアルの陽性反応を光学顕微鏡で確認した。
【００５２】
尚、前記分離されたルテリアルを電子顕微鏡サンプルにして観察した（図２ｃ）。血球をＭＩＣＡで固定させた後、膜をプローブ（Ｐｒｏｂｅ）で剥がしてＤＮＡとＲＮＡを確認した（原子間力顕微鏡を利用）。ＭＩＣＡに代えて、固定液のＣｅｌｌ−Ｔａｃｋ  ＢＤ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、またはＧｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ／ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを使用してもよい。暗視野顕微鏡で、ローダミン１２３蛍光染色試薬を塗布して５分後に洗浄した後、オレンジフィルター（５０６ｎｍ〜５２０ｎｍ帯波長フィルター）で観察したところ、緑色が観察されることを確認した。
【００５３】
図２ａから図２ｃは、実施例１で分離されたルテリアルを撮影した写真であり、図２ｂに示すように、前記ルテリアルをローダミン１２３で蛍光染色すると特異的に染色され、これは走査型共焦点レーザー顕微鏡で観察される。前記ルテリアルは、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で特異的に染色され、光学顕微鏡で観察可能である。蛍光染色試薬であるミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、およびＤＡＰＩによっても発色を確認することができる。
【００５４】
図２ａに示したルテリアルは、最大７１８ｎｍ、すなわち０．７１８μｍの直径を有し、図２ｃに示すように、外部に被膜が形成されていることが確認された。実際に、実験群の患者は非小細胞性肺癌末期であると診断された。したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルの直径が０．５μｍ以上であり、外部に被膜が形成されている場合、癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００５５】
図２ｃは、前記ルテリアルの電子顕微鏡写真であり、本発明による疾病の診断および予後の予測方法に用いられるルテリアルは、外部に被膜が形成されている二重膜の膜構造であって、完成されていない内部クリステ構造を有することを確認することができる。
【００５６】
≪実施例３：多様な被験者由来のルテリアルの直径測定（電子顕微鏡）≫
健常人を始め、末期癌患者を含む多様な被験者３０人の血液から実施例１と同様の方法でルテリアルを分離した後、電子顕微鏡を用いてルテリアルの直径を測定した。
【００５７】
図３は、観察されたルテリアルを１００ｎｍから１μｍまで直径の順に配列したものである。融合または変異されたルテリアルは、直径４５０ｎｍ以上で発見され（大体８００ｎｍ以上で発見）、このうち大多数は、疾病が診断された。したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、ルテリアルの直径を顕微鏡で観察または撮影し、観察または撮影されたルテリアルの直径が８００ｎｍ、すなわち０．８μｍ以上である場合、疾病の発生が疑われる状態であると決定することができる（電子顕微鏡または原子間力顕微鏡では０．４５μｍでも観察可能である）。顕微鏡で観察された最大サイズは２００μｍであったが、最大値は患者によって増加し得る。
【００５８】
図３の８００ｎｍ（０．８μｍ）の被膜が形成されたルテリアルは、癌患者由来の血液で多数発見された。したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、ルテリアルの直径を顕微鏡で観察または撮影し、観察または撮影されたルテリアルの直径が０．８μｍ以上であり、被膜が形成されている場合、疾病が癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００５９】
≪実施例４：健常人の血液由来のルテリアルの顕微鏡観察≫
疾病の兆候が全くない健常人から採取した血液をスライドガラスに付け、カバーグラスで覆った後、暗視野用オイルを一滴加え、暗視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｎｉ（１０００倍））を用いて１０００倍率で観察した。
【００６０】
その結果、図４ａに示したように、瞬く点としてみえるルテリアルが観察された。円形の物質は赤血球であり、健常人由来のルテリアルは赤血球より非常に小さく観察される。
【００６１】
≪実施例５：ルテリアルの直径に応じた疾病の診断および予後の予測≫
１期癌、２期癌、３期癌、および４期癌の患者（それぞれ１５人）から採取した血液から、実施例１と同様の方法でルテリアルを分離した。
【００６２】
分離されたルテリアルをバッファ溶液に入れ、ローダミン１２３で染色した後、走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いてその直径を測定した。２μｍ以上のルテリアル変異体、すなわち変異ルテリアルの観測割合は次のとおりである。
【００６３】
【表１】
2016526688.tif 000003
【００６４】
早期癌から末期癌に進むに従って、直径２μｍ以上の変異ルテリアルが増加した。４期癌では、約９４％の患者で直径２μｍ以上の変異ルテリアルが発見され、観測された最大サイズは２００μｍ以上であった。また、１期〜３期癌患者で、直径０．５〜５μｍの変異ルテリアルの観測割合が高かった。また、末期癌である４期癌患者の場合、５μｍ以上の変異ルテリアルの観測割合が高かった。
【００６５】
したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、ルテリアルの直径を顕微鏡で観察または撮影し、観察または撮影されたルテリアルの直径が１．０〜２００μｍである場合、癌が疑われる状態であると決定し、２０μｍ以上で、且つ被膜が形成されている時に、癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００６６】
≪実施例６：ルテリアルの形態に応じた疾病の診断および予後の予測≫
健常人、染色体メチル化異常を有する患者、遺伝子変異を有する患者、腫瘍関連遺伝子変異を有する患者、腫瘍関連遺伝子複合変異を有する患者（前立腺癌末期患者）の血液をスライドガラスに付け、カバーグラスで覆った後、暗視野用オイルを一滴加え、暗視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｎｉ（１０００倍））を用いて１０００倍率で観察した。
【００６７】
また、前記実験群の患者のうち、１期癌、２期癌、３期癌、および４期癌患者を対象として、ルテリアルの形態が鞭毛形に観察される割合を計算した。
【００６８】
【表２】
2016526688.tif 000004
【００６９】
図４ｂから図４ｉは、実施例６により撮影されたルテリアルの形態を、疾病の軽重順に２ステップから９ステップに分類して示したものであり、１ステップは図４ａに示した。
【００７０】
図４ｂおよび図４ｃは健常人の血液由来のルテリアル（２ステップおよび３ステップ）、図４ｄはメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）異常を有する患者の血液由来のルテリアル（４ステップ）、図４ｅおよび図４ｆは遺伝子変異を有する患者由来のルテリアル（５ステップおよび６ステップ）、図４ｇは腫瘍関連遺伝子変異を有する患者由来のルテリアル（７ステップ）、図４ｈは腫瘍関連遺伝子複合変異を有する患者由来のルテリアル（８ステップ）、図４ｉは腫瘍関連遺伝子複合変異を有する患者（末期前立腺癌）由来のルテリアル（９ステップ）を撮影したものである。図４ｂから図４ｉにおいて、円形の物質は赤血球または白血球である。
【００７１】
先ず、図４ｂおよび図４ｃにおいて、円形の物質の他に、瞬く銀色の微細物質がルテリアルである。健常人由来のルテリアルでは、赤血球よりサイズが小さく、融合または変形された群集形態が発見されなかった。
【００７２】
図４ｄは、染色体メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）異常を有する患者の血液由来のルテリアルを撮影したものであって、図４ｃの分類３ステップと比較するとそのサイズが大きくなったが、まだ変形された群集形態が発見されなかった。
【００７３】
図４ｅおよび図４ｆは、遺伝子変異を有する患者の血液由来のルテリアルを撮影したものであって、特に図４ｆの分類６ステップの場合、図４ｄの分類４ステップと比較すると、ルテリアル同士の融合が進行されたことが分かる。図４ｅおよび図４ｆの遺伝子変異を有する患者は、まだ腫瘍関連遺伝子の変異が起こっていない。
【００７４】
図４ｇは、腫瘍関連遺伝子の一部に変異が発生した患者の血液由来のルテリアルを撮影したものであって（分類７ステップ）、図４ｅおよび図４ｆに比べ、赤血球のサイズの２０倍以上の、極めて大きい変異ルテリアル（マス形）群集が観察された（中央の銀色物質）。
【００７５】
図４ｈは、腫瘍関連遺伝子に複合変異が発生した患者の血液由来のルテリアルを撮影したものであって（分類８ステップ）、分類７ステップに比べてサイズが著しく大きくなっており、ロッド形に観察された。
【００７６】
図４ｉは、末期癌患者の血液由来のルテリアル（９ステップ）を撮影したものであって、８ステップと異なって鞭毛形に観察された。鞭毛が形成された変異ルテリアルが観察された患者は末期癌患者に区分され、鞭毛形ルテリアルを有する癌患者の生存期間は１〜４ヶ月であった。また、図４ｉに示すように、３００ｎｍ以上の鞭毛が放出される場合、生存期間が２ヶ月以内であった。
【００７７】
実施例６による顕微鏡観察結果、血液由来のルテリアルの形態は、正常形、鞭毛形、マス（Ｍａｓｓ）形、ロッド（Ｒｏｄ）形、および複合形に示されることを確認することができた。
【００７８】
正常形とは、観察または撮影されたルテリアルが、別の融合やバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）などの変形を起こすことなく、長径と短径との比が１：１〜３：１の形態であって、顕微鏡観察時に小さい点として示される。図４ａから図４ｃに示された形態が正常形のルテリアルである。本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルの形態が正常形の形態と８０〜１００％一致する場合、正常であると決定することができる。
【００７９】
鞭毛形とは、観察または撮影されたルテリアルが、変形または融合を起こして外部に鞭毛が備えられた形態であって、図４ｉで、鞭毛形のルテリアルが観察された。末期癌に進むに従って、鞭毛形が観察される割合が急激に増加し、４期癌では９９．１％と、略大部分の４期癌患者で鞭毛形のルテリアルが観察された。本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルの形態が鞭毛形の形態と８０〜１００％一致する場合、末期腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。前記末期腫瘍であると診断された患者の生存期間は１〜４ヶ月であり得る。特に、鞭毛形の場合、長期生存が不可能である。
【００８０】
マス形（Ｍ）とは、観察または撮影されたルテリアルが、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）または融合を起こしてサイズおよび形態が正常形から変形されたものであって、長径と短径の差が大きくない不規則的な体積形態であって、好ましくは、長径と短径との比が３：１〜５：１であることができる。図４ｇおよび図５は、実施例６によってマス形のルテリアルを暗視野顕微鏡で撮影した写真を示したものであって、多様な形態のマス形が観察される。これを対照群として、観察または撮影されたルテリアルの形態を比較することで疾病を決定することができる。
【００８１】
ロッド形（Ｌ）は、観察または撮影されたルテリアルが、バースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）、変形、または融合を起こして棒（Ｒｏｄ）の形態を呈するものであって、短径と長径との長さ差がマス形より大きい。好ましくは、長径と短径との比が５：１〜１２：１であることができる。ロッド形は、図６に示すように多様な形態に観察される。ロッド形は、円形または楕円形の単一鎖からなるロッド１形、および２つ以上の単一鎖が結合してなるロッド２形を含むことができる。前記ロッド１形は、単一のルテリアルが棒の形態となったものであって、これはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）および／または変形によるものであることができる。前記ロッド２形は、２つ以上のルテリアルが結合して棒の形態となったものであって、これはバースティング（Ｂｕｒｓｔｉｎｇ）、変形、および融合の１つ以上によるものであることができる。
【００８２】
鞭毛形は、その形状から、大きい範疇でロッド形に含まれることができるが、鞭毛が突出している点で異なる。したがって、ロッド形であるかを先に判断してから、鞭毛形であるかを判断することができる。
【００８３】
複合形は、ロッド形とマス形の融合形態であることができる。一体に形成されたルテリアルの一部がロッド形であり、一部がマス形である形態を複合形と称することができる。
【００８４】
≪実施例７：種々の種類の癌患者由来のルテリアルの形態に応じた疾病の診断および予後の予測≫
種々の癌が診断された患者（表３）から採取された血液または実施例１と同様の方法で前記血液からルテリアルを得て観察した。
【００８５】
前記血液サンプルまたはルテリアルをバッファ溶液に入れ、スライドガラスに付けてカバーグラスで覆った後、暗視野用オイルを一滴加え、暗視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｎｉ（１０００倍））および共焦点走査型顕微鏡を用いて観察した。
【００８６】
その結果、表４に示したように、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、胸膜中皮腫、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、前立腺癌、および急性リンパ性白血病の場合、ロッド形（Ｌ）のルテリアルが観察された。
【００８７】
また、肝癌、肝血管肉腫、大腸癌、子宮癌、消化器癌（胃癌）、直腸癌、および急性骨髄性白血病の場合、マス形（Ｍ）のルテリアルが観察された。
【００８８】
転移癌患者の場合、マス形とロッド形が複合された複合形のルテリアルが発見され、末期癌患者の場合、図４ｉに示したように、鞭毛形のルテリアルが観察された。
【００８９】
ロッド形からロッド−マス形に進む場合（Ｌ−Ｍ）、癌の発生部位はＬ形と同一であるが、転移が進んでいると判断することができる。尚、マス形からマス−ロッド形に進む場合（Ｍ−Ｌ）、癌の発生部位はＭ形と同一であるが、転移が進んでいると判断することができる。
【００９０】
【表３】
2016526688.tif 000005
【００９１】
この結果から明らかなように、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルの形態がロッド形である場合、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、胸膜中皮腫、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、前立腺癌、またはリンパ性血液癌の発生状態であると決定することができる。
【００９２】
また、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルの形態がマス形である場合、肝癌、肝血管肉腫、大腸癌、子宮癌、消化器癌（胃癌）、直腸癌、腎臓癌、または骨髄性血液癌の発生状態であると決定することができる。
【００９３】
尚、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、ルテリアルの形態が複合形である場合、重度の血液癌または転移癌が疑われる状態であると決定することができ、鞭毛形が検出される場合、末期癌が疑われる状態であると決定することができる。
【００９４】
実施例８：ルテリアルのナノトラッキング速度に応じた疾病の診断および予後の予測
１期癌、２期癌、３期癌、および４期癌の患者（それぞれ１５人）の血液から、実施例１と同様の方法でルテリアルを得た。前記ルテリアルをバッファ溶液に入れ、ヤーヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で染色した後、光学顕微鏡で観察した。
【００９５】
運動性の基準として、２００ｎｍのルテリアルおよびナノトラッキング（３ｉ社製、米国）を用いてルテリアルのナノトラッキング速度を測定した。具体的に、ルテリアルを明視野顕微鏡で観察した後、ルテリアルの中心にトラッキングを設定し、ナノラッキングを作動すると、ルテリアルの移動とともにリアルタイムで移動軌跡を表記し、毎秒当りの速度を計算した（図３１）。
【００９６】
【表４】
2016526688.tif 000006
【００９７】
本実施例による癌患者由来のルテリアルのナノトラッキング速度は、ルテリアルの運動性を示す。健常人の場合１２μｍ／ｓｅｃ以上であるが、早期癌である１期癌から末期癌である４期癌に進むに従って運動性が減少し、４期癌では運動性が殆どないと観察された。したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、観察または撮影されたルテリアルのナノトラッキング速度が８．０〜１１μｍ／ｓｅｃである場合には１期癌、２．５〜８．０μｍ／ｓｅｃである場合には２期癌、０．５〜２．５μｍ／ｓｅｃである場合には３期癌、０〜０．５μｍ／ｓｅｃである場合には４期癌であると決定することができる。
【００９８】
≪実施例９：電子顕微鏡を用いたルテリアルの形態に応じた疾病の診断および予後の予測≫
ルテリアルは、電子顕微鏡で観察したときに、単一形、融合形、多重融合形、または膜が裂けた融合形の形態を示し、これを基準に疾病の診断および予後の予測が可能である。
【００９９】
単一形は、単一のルテリアルが観察される形態であり、融合形は、２〜４つのルテリアル群集が融合されて観察される形態であり、多重融合形は、前記融合形のルテリアル群集が幾重に重なって融合されて観察される形態であり、膜が裂けた融合形は、前記融合形のルテリアルの膜が裂けて内部物質が放出された形態である。
【０１００】
健常人を始め、末期癌患者を含む多様な被験者（３０人）の血液から、実施例１と同様の方法でルテリアルを得た。得られたルテリアルをスライドガラスに固定させ、電子顕微鏡を用いてその形態を観察または撮影した。
【０１０１】
その結果、健常人の場合、単一形のルテリアルが観察された。また、癌以外の疾病を有する患者の場合、融合形のルテリアルが観察された。したがって、融合形のルテリアルは、疾病が疑われる状態の標識因子であると判断することができる。
【０１０２】
多重融合形のルテリアルが発見された多数の患者で腫瘍が発見された。したがって、多重融合形のルテリアルは、腫瘍が疑われる状態の標識因子であると判断することができる。
【０１０３】
図３２ａ〜図３２ｃは、膜が裂けた融合形の形態を順に電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。膜を形成したルテリアル群集（図３２ａ）が益々増殖し（図３２ｂ）、最後には膜が裂けて内部の変形された粒子が放出された（図３２ｃ）。このように膜が裂けた融合形のルテリアルが発見された多数の患者で、重度癌が発見された。したがって、膜が裂けた融合形のルテリアルは、重度癌が疑われる状態の標識因子であると判断することができる。
【０１０４】
したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、血液中に存在し、電子顕微鏡上で二重膜およびクリステ構造が確認されるルテリアルの形態と比較して、単一形の形態と８０〜１００％一致する場合には正常であると決定し、融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、疾病が疑われる状態であると決定し、多重融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、腫瘍が疑われる状態であると決定し、膜が裂けた融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、重度の腫瘍が疑われる状態であると決定することができる。
【０１０５】
したがって、本発明による疾病の診断および予後の予測方法は、ルテリアルを疾病の診断および予後の予測のマーカーとして活用することで、特に、癌患者の診断、治療法の効果有無、治療前後の比較、および治療を受けた患者の長期生存有無を判断するにあたり効果的に用いることができる。
【０１０６】
以上、本発明の内容を詳細に記述したが、当業界において通常の知識を有する者において、このような具体的技術は好ましい実施形態にすぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によれば、患者から既に排出された体液中に存在する微細物質であるルテリアルを疾病の診断および予後の予測のマーカーとして活用することで、特に、癌患者の診断、手術法および治療法の効果有無、治療前後の比較、および治療を受けた患者の長期生存有無を判断するにあたり効果的に用いることができる。特に、癌の種類をとわず、癌細胞組織のサイズが５ｍｍ以下であるとしても、癌疾患の現在の状態、再発可能性、長期生存可能性に対する判断が可能であるという利点がある。
【０１０８】
また、別の遺伝子分析、高価の装置を用いることなく、顕微鏡で観察するだけで自動で疾病の診断および予後の予測が可能であるため、生体組織検査または高価の映像診断が不要であって、経済的であるという利点がある。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３２ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月11日(2016.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項２】
前記体液は血液であることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項３】
前記（ａ）ステップはルテリアルをローダミン１２３、ミトトラッカー、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ及びヤーヌスグリーンＢからなる群より選択される一つ以上の染料で染色し発色させて、測定することを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項４】
前記ルテリアルは血液から血清を分離するステップと、前記分離した血清から、１００ｎｍ〜２ｍｍの直径の空隙を備えたフィルターを通過していない沈殿物を分離するステップと、前記分離した沈殿物を洗浄するステップと、を含む方法により分離されることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項５】
前記（ｂ）ステップで測定されたルテリアルの直径が赤血球の直径の８〜３０倍、または測定されたルテリアルの面積が赤血球の面積の８〜３０倍である場合、疾病を癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項６】
前記（ｂ）ステップで測定されたルテリアルの数が健常人の２０％以下であり、長径が２０μｍ以上である場合に、癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項７】
前記（ｂ）ステップはルテリアルの外部に被膜が形成されている場合、癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項８】
前記（ｂ）ステップにおいて、ルテリアルの形態は、正常形、外部に鞭毛が備えられた鞭毛形、マス（Ｍ）形、ロッド（Ｌ）形、および複合形を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項９】
前記正常形は、ルテリアルの長径と短径との比が１：１〜３：１であり、前記マス形は、長径と短径との比が３：１〜５：１であり、前記ロッド形は、長径と短径との比が５：１〜１２：１であり、前記複合形は、ロッド形とマス形の融合形態、またはロッド形とロッド形の融合形態であることを特徴とする請求項８に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）ステップでは、測定されたルテリアルの形態が（ｉ）ロッド形である場合、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、胸膜中皮腫、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、前立腺癌、またはリンパ性血液癌の発生状態に決定し、（ｉｉ）マス形である場合、肝癌、肝血管肉腫、大腸癌、子宮癌、消化器癌（胃癌）、腎臓癌、直腸癌、または骨髄性血液癌の発生状態に決定し、（ｉｉｉ）複合形である場合、重度の血液癌または転移癌が疑われる状態に決定し、（ｉｖ）鞭毛形が表れる場合、末期腫瘍が疑われる状態に決定することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）ステップで、観察または撮影により測定されたルテリアルのナノトラッキング速度が８．０〜１１ｎｍ／ｓｅｃである場合には１期癌が疑われる状態、２．５〜８．０ｎｍ／ｓｅｃである場合には２期癌が疑われる状態、０．５〜２．５ｎｍ／ｓｅｃである場合には３期癌が疑われる状態、０．５ｎｍ／ｓｅｃ未満の場合には４期癌が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１２】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群より選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１３】
前記体液は血液であることを特徴とする請求項１２に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１４】
前記ルテリアルをローダミン１２３、ミトトラッカー、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ及びヤーヌスグリーンＢからなる群より選択される一つ以上の染料で染色し発色が確認され、電子顕微鏡上で二重膜およびクリステ構造が確認されることを特徴とする請求項１２に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１５】
前記（ｃ）ステップは、前記測定されたルテリアルの形態が単一形の形態と８０〜１００％一致する場合、正常であると決定し、融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、疾病が疑われる状態であると決定し、多重融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、腫瘍が疑われる状態であると決定し、膜が裂けた融合形の形態と８０〜１００％一致する場合には、重度の腫瘍が疑われる状態であると決定することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の疾病の診断および予後の予測のための情報を提供する方法。
【請求項１６】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を顕微鏡を用いて測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの数、サイズ（直径または面積）、形態、被膜形成有無、およびナノトラッキング速度の中１つ以上を健常人のルテリアル、正常なルテリアル、または赤血球と比較するステップと、を含む、疾病の診断および予後予測の補助のための方法。
【請求項１７】
（ａ）患者から既に排出された体液中に存在するルテリアルの形態を電子顕微鏡で測定するステップと、（ｂ）前記測定されたルテリアルの形態を、単一形、融合形、多重融合形、および膜が裂けた融合形からなる群より選択される形態に決定するステップと、（ｃ）前記決定された形態を基準に疾病の状態を決定するステップと、を含む、疾病の診断および予後予測の補助のための方法。
【国際調査報告】
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