(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の化合物がＧｑタンパク質に結合するレセプターのアゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）該化合物を、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現しかつ該レセプターを発現する培養細胞と接触させる工程であって、該レセプターは、通常は該細胞により発現されないものであり、該細胞は、ｕ−ＰＡ活性のＧｓシグナル伝達を阻害している、工程；および
（ｂ）工程（ａ）における培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、
を包含し、
該上清における該ｕ−ＰＡ活性が、該化合物とは接触していない該培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性と比較して増加することは、該化合物が該レセプターのアゴニストであることを示す、
方法。
【請求項２】
前記Ｇｑタンパク質に結合可能なレセプターが、さらに、Ｇｓタンパク質にも結合可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞株がＬＬＣ−ＰＫ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レセプターが、ヒトＰＴＨＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターが、ヒトＰＴＨＲである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
目的の化合物がＧｑタンパク質に結合するレセプターのアンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）該レセプターの既知アゴニストおよび該化合物を、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現しかつ該レセプターを発現する培養細胞と接触させる工程であって、該レセプターは、通常は該細胞により発現されないものであり、該細胞は、ｕ−ＰＡ活性のＧｓシグナル伝達を阻害している、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）における培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、
を包含し、
該上清における該ｕ−ＰＡ活性が、該アゴニストと接触したが該化合物とは接触していない該培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性と比較して減少することは、該化合物が該レセプターのアンタゴニストであることを示す、
方法。
【請求項７】
前記Ｇｑタンパク質に結合可能なレセプターが、さらに、Ｇｓタンパク質にも結合可能である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞株がＬＬＣ−ＰＫ１である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記レセプターが、ヒトＰＴＨＲである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記レセプターが、ヒトＰＴＨＲである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
目的の化合物が、Ｇｑタンパク質に結合するがＧｓタンパク質には結合しないレセプターのアゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）該化合物を、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現しかつ該レセプターを発現する培養細胞と接触させる工程であって、該レセプターは、通常は該細胞により発現されないものである、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）における培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、
を包含し、
該上清における該ｕ−ＰＡ活性が、該化合物とは接触していない培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性と比較して増加することは、該化合物が該レセプターのアゴニストであることを示す、
方法。
【請求項１２】
前記細胞株がＬＬＣ−ＰＫ１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的の化合物が、Ｇｑタンパク質に結合するがＧｓタンパク質には結合しないレセプターのアンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）該レセプターの既知アゴニストおよび該化合物を、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現しかつ該レセプターを発現する培養細胞と接触させる工程であって、該レセプターは、通常は該細胞により発現されないものであり、該細胞は、ｕ−ＰＡ活性のＧｓシグナル伝達を阻害している、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）における培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、
を包含し、
該上清における該ｕ−ＰＡ活性が、該アゴニストと接触したが該化合物とは接触していない培養細胞の上清のｕ−ＰＡ活性と比較して減少することは、該化合物が該レセプターのアンタゴニストであることを示す、
方法。
【請求項１４】
前記細胞株がＬＬＣ−ＰＫ１である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（合衆国支援の研究開発のもとで行われた発明の権利についての陳述）
本発明の開発中に行われた研究の一部は、米国政府資金を利用した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｇタンパク質結合レセプターに関する。より詳細には、ＧｓおよびＧｑタンパク質結合レセプターアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイが提供される。安定にトランスフェクトされた細胞株も提供される。
【０００３】
（関連技術）
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨代謝回転の主要な全身性レギュレーターであり、そして成人および胎児組織で広く発現される密接に関連するペプチド、ＰＴＨｒＰは、特に発育中の軟骨および骨において重要なパラクリン作用を及ぼすと考えられる（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３）；Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：６６３−６６６（１９９６）；Ｌｅｅ，Ｋ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：５１０９−５１１８（１９９６）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４））。外因性の投与されたＰＴＨは、インビボで骨量における著しい効果を及ぼし、その性質は、ＰＴＨの用量および循環ペプチドの濃度の得られる一時的プロファイルに非常に依存する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３））。したがって、高いＰＴＨ濃度への連続的曝露は、正味の骨吸収および骨減少症を導くが、低用量の間欠的投与は、正味の骨形成の増加を導く−これは、骨量を増加させるためおよび骨粗鬆症を含む代謝的骨疾患を予防または処置するためのアナボリック薬剤としての、ＰＴＨまたはＰＴＨアナログの潜在的使用において大いに興味をたきつける所見である（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３）、Ｗｈｉｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５））。
【０００４】
ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方とも、単一のレセプター、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＰＴＨＲ）を活性化し得、これは、ラット、フクロネズミ、マウス、ブタ、およびヒトを含むいくつかの種からクローニングされており、そして骨の細胞で発現されることが示されている（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２７３２−２７３６（１９９２）；Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２４−１０２６（１９９１）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４６：１４９−１５５（１９９３）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：１７１３−１７１６（１９９４））。骨芽細胞におけるＰＴＨＲの活性化は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、および細胞質ゾルの遊離カルシウムトランジエントの活性化を含む、複数の平行シグナル伝達事象を引き起こす（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｕｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２７３２−２７３６（１９９２）、Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２４−１０２６（１９９１）、Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））。これらの個々のシグナル伝達事象のそれぞれと、全体の骨量の変化のようなＰＴＨに対する最終的に統合した組織応答との間の連結は、非常に不確定のままである。ＡＣを選択的に活性化するようであるＰＴＨアナログが、インビボでの間欠的投与後に骨に対する完全なアナボリック効果（ａｎａｂｏｌｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を生じ得ることが報告されている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ５８：８１−８７（１９９６））。このような観察は、個々のＰＴＨ第２メッセンジャーが、特定の組織応答に実際に連結され得、したがってＰＴＨＲシグナル伝達事象のパターン、ならびにその強度が、骨における応答の定性および定量局面の両方を示し得ることを示唆している。この結果は、骨において、成熟破骨細胞がＰＴＨＲを発現しないと考えられ、したがって、これらのレセプターを発現する骨芽細胞または骨髄間質細胞のような隣接細胞によって生成される応答によって、間接的にのみＰＴＨのこれらの影響を経験しなければならないという事実によって悪化する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１��９３）、ＭｃＳｈｅｅｈｙ，Ｐ．およびＣｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１８：８２４−８２８（１９８６））。このような骨芽または間質ＰＴＨ標的細胞が、破骨細胞系統の近隣細胞に、一時的に微細な差を反映する複雑な情報およびＰＴＨ曝露の濃度プロファイルを伝達し得る方法は、不明瞭なままである。
【０００５】
ＰＴＨＲの著しい脱感作およびダウンレギュレーションは、高濃度のリガンドへの曝露後に記載されており（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ−Ｂら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：２５４７−２５５４（１９９１）；Ｍｉｔｏｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２６：２６５０−２６６０（１９９０）；Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３１：１７５７−１７６９（１９９２））、そして最近、ラットＰＴＨＲによって生成されるシグナル伝達事象のパターンが、細胞表面におけるその発現のレベルによって強く影響されることが報告された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。詳細には、ＰＬＣ応答の程度が、最大ＡＣ応答に影響を及ぼさない発現の範囲（細胞当たり４０，０００〜３００，０００レセプター）にわたる安定にトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞の表面上の利用可能なＰＴＨＲの密度に直接的に関連することが見いだされている（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。
【０００６】
ヒトＰＴＨＲは、培養した細胞でこれまでに発現されているが（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：１７１３−１７１６（１９９４）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５１：２８１−２８５（１９９４）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６））、そのシグナル伝達特性は、まだ十分に解明されていない。特に、シグナル伝達応答の特徴に対するヒトＰＴＨＲ発現の変化の効果は、組織的に分析されていない。ＰＴＨ（３−３４）、ＰＴＨ（７−３４）、およびＰＴＨ（１−３１）のような特定のアミノまたはカルボキシル末端短縮型ＰＴＨアナログは、通常のＰＴＨＲ第２メッセンジャーのサブセットのみの選択的活性化を示すことがこれまでに見いだされている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：３０８２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２５８８−２５９４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｅｅｆｉｅｓｔ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７１：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：７１３−７１９（１９９３））。ｈＰＴＨ（１−３１）アナログは、ＰＫＣではなくＡＣを活性化し、さらに卵巣摘出したラットにおいて著しいアナボリック効果を保持することが報告された（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４））。ヒトＰＴＨＲによるこのような選択的シグナル伝達の確認は、臨床使用のためのこれらのシグナル特異的ＰＴＨペプチドの開発のための重要な追加の理論を提供する。したがって、ＰＴＨＲによって媒介される応答の特徴づけについて、当該技術分野で必要性がある。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明者らは、安定にトランスフェクトしたヒトＰＴＨＲの広い範囲を集合的に発現する十分に特徴づけられた腎臓上皮ＬＬＣ−ＰＫ１細胞株の多くのサブクローンを単離しそして特徴づけた。ラットＰＴＨＲについて、ヒトレセプターが、ＰＬＣ活性化について必要とされるよりもかなり低いレセプター発現のレベルでＡＣを最大に活性化することを見いだした。さらに、これらの細胞におけるＰＬＣ活性化の一時的パターンおよび程度は、最大ＡＣ活性化を誘起することを越える発現の範囲にわたる細胞表面ヒトＰＴＨＲの密度に強く依存的である。驚くべきことに、ｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）が、ヒトＰＴＨＲによってＰＬＣおよび細胞質ゾルの遊離カルシウムトランジエントを等価に活性化し、そしてさらにｈＰＴＨ（１−３１）が、ｃＡＭＰ非依存的シグナル伝達経路に依存するこれらの細胞におけるＰＴＨに対する他のより遅延した生物学的応答を完全に誘導することも見いだした。これらの所見は、骨または腎臓のような組織における統合された細胞応答を形作ることにおけるＰＴＨＲ調節および示差シグナル伝達の潜在的な生理学的役割を指摘し、そしてこれらは、ヒトＰＴＨＲのリガンド選択性が、ＰＴＨＲの他の種のリガンド選択性とは異なり得ることを示す。
【０００８】
本発明者らはまた、これらの細胞においてヒトＰＴＨＲによってＡＣまたはＰＬＣのいずれかの活性化に対して応答する便利および感度のある分光光度的バイオアッセイを開発し、そしてラット細胞においてシグナル感受性アゴニストであることが既に見いだされているＰＴＨ（３−３４）およびＰＴＨ（１−３１）のようなアナログが、ヒトＰＴＨＲによる生物学的活性の異なるスペクトルを示し得ることを示すために、他の測定とともに、これを用いている。
【０００９】
したがって、本発明は、ＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を含む安定にトランスフェクトされた細胞株を提供する。
【００１０】
本発明はまた、目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するための方法を提供し、上記方法は
（ａ）ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現する細胞株を提供する工程；
（ｂ）ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する工程であって、このレセプターが、工程（ａ）のこの細胞株で通常では発現されない、工程；
（ｃ）この細胞株にこの発現ベクターを導入し、それによって安定にトランスフェクトした細胞を提供する工程；
（ｄ）この安定にトランスフェクトした細胞をこの目的の化合物と接触させる工程；および
（ｅ）工程（ｄ）のこの細胞の細胞培養上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、を包含する。
【００１１】
本発明は、さらに、上記の方法においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を使用して、目的の化合物がＧｓまたはＧｑカップリングレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法を包含する。本発明は、さらに、上記の方法を使用して、目的の化合物がヒトＰＴＨＲのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法を提供する。
【００１２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明者らは、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞株を開発した。安定にトランスフェクトしたヒトＰＴＨＲの発現の広い範囲に集合的に及ぶクローンＬＬＣ−ＰＫ１細胞株の本研究は、ホルモンに対する細胞応答の特徴ならびに程度を調節することにおけるヒトレセプター発現の調節について重要な役割を示す、ｈＰＴＨシグナル伝達と生物学的活性とのレセプター密度依存的な差を証明した。
【００１３】
本発明の１つの実施態様では、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を含む安定にトランスフェクトした細胞株が提供される。細胞株は、培養物中で不確定に生存し得る同じ型の細胞の集団である。「安定にトランスフェクトした細胞株」とは、細胞株が、通常では発現しないポリペプチドを発現するためのいくつかの方法で変化されていることを意味する。「発現する」とは、構造遺伝子が、ｍＲＮＡに転写され、そしてこのようなｍＲＮＡがポリペプチドを産生するように翻訳されることを意味する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、カルシトニンおよびバゾプレシンレセプターを発現するが、通常ではＰＴＨＲを発現しない、ブタ腎臓上皮細胞であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬ−１０１から入手可能である。ヒトＰＴＨＲは、ヒトＰＴＨおよびヒトＰＴＨｒＰの両方に結合するレセプターである。ヒトＰＴＨＲは、既にクローニングされている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４６：１４９−１５５（１９９３）；Ａｄａｍｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５５３−１０５５９（１９９５））。したがって、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、「安定にトランスフェクトされた」といわれる。
【００１４】
ｕ−ＰＡが、カルシトニンによるＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方の活性化に対する応答においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞によって分泌されることが、既に示されている（Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．およびＨｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０５：１２７−１３１（１９８６））。本発明者らは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において、ＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方とも、ｕ−ＰＡ産生に連結することを再確認した。本発明者らは、これらの細胞におけるｕ−ＰＡ産生、およびこのようなＰＫＡまたはＰＫＣ活性化を測定する分光光学的バイオアッセイを開発した。ＧｓおよびＧｑタンパク質は、ＰＫＣ経路を活性化し、それによってＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｕ−ＰＡ産生を増加させる。ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニストは、ｕ−ＰＡを発現する細胞におけるｕ−ＰＡ産生を増加させる。ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアンタゴニストは、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターアゴニストの活性を阻害し、それによって単独で投与されたアゴニストに対してｕ−ＰＡを発現する細胞においてｕ−ＰＡ産生を減少させる。
【００１５】
ＬＬＣ−ＰＫ１以外の細胞株は、ｕ−ＰＡを発現する。これらの細胞株は、化合物が、本発明の方法を使用してＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために使用され得る。ｕ−ＰＡを発現する細胞株の例には、ＨＥ−ＬＵ（Ｒｉｆｋｉｎ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−７７１７）；ＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−７）；ＮＭＵ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １７４３）；ＬＬＣ−ＲＫ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１０６）；およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＣＲＬ−１４２０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
したがって、本発明のさらなる実施態様は、目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑタンパク質カップリングレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法を包含し、（ａ）ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）を発現する細胞株を提供する工程；（ｂ）ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する工程であって、このレセプターが、工程（ａ）のこの細胞株で通常では発現されない、工程；（ｃ）この細胞株に該発現ベクターを導入し、それによって安定にトランスフェクトした細胞を提供する工程；（ｄ）この安定にトランスフェクトした細胞をこの目的の化合物と接触させる工程；および（ｅ）工程（ｄ）のこの細胞の細胞培養上清のｕ−ＰＡ活性を測定する工程、を包含する。本発明の好ましい実施態様は、上記の方法を使用して、目的の化合物が、Ｇｓタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法である。本発明の他の好ましい実施態様は、上記の方法を使用して、目的の化合物が、Ｇｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法である。本発明の特に好ましい実施態様は、上記の方法においてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を使用して、目的の化合物が、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法である。本発明の他の特に好ましい実施態様は、上記の方法を使用して、目的の化合物が、ヒトＰＴＨＲのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する方法である。
【００１７】
「目的の化合物」は、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、有機天然分子、または合成分子であり得る。ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の例は、ホルモン、ホルモンアナログ、および抗体である。
【００１８】
「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニスト」は、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターと相互作用しそしてＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターを活性化する化合物である。「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアンタゴニスト」は、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターのアゴニスト誘導した活性化を阻害する化合物である。
【００１９】
「ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプター」は、適切なリガンドに結合した場合、ＧｓまたはＧｑタンパク質を活性化するレセプターである。いくつかのレセプターは、ＧｓおよびＧｑタンパク質の両方を活性化し得るが、いくつかは、ＧｓまたはＧｑタンパク質のいずれかのみを活性化する。好ましくは、本発明で使用されるＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターは、本発明の方法で使用される細胞のＧｓまたはＧｑタンパク質を活性化し得るべきである。Ｇｓタンパク質結合レセプターの例には、β−アドレナリン作用性、グルカゴン、ＡＤＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、およびＶＩＰレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｑタンパク質結合レセプターの例には、ＴＲＨ、トロンビン、およびＰＧＦ2αレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。ＧｓおよびＧｑタンパク質の両方を活性化するレセプターの１つの例は、カルシトニンレセプターである。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現ベクターが適切な宿主細胞に安定にトランスフェクトされる場合、構造遺伝子が発現され得るように、発現制御配列に作動可能に連結された構造遺伝子を含むベクターである。２つのＤＮＡ配列は、２つの核酸分子間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）プロモーター領域配列が所望の配列の転写を指示する能力を妨害しないか、または（３）所望の配列がプロモーター領域配列によって転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に連結される」という。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが、核酸配列の転写をもたらし得た場合、所望の核酸配列に作動可能に連結される。好ましいプロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））、またはＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））が挙げられる。
【００２１】
細胞におけるＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターの発現は、発現ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加し得る。エンハンサーは、プロモーターの転写活性を増加させるように作用する、一般に約１０〜３００ｂｐのサイズの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーの代表的例には、ｂｐ１００〜２７０に複製起点の後期部位に位置するＳＶ４０エンハンサー；サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー；複製起点の後期部位におけるポリオーマエンハンサー；およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
発現ベクターは、核酸配列の誘導性発現を提供し得る。このようなベクターの中で好ましいものは、温度および栄養添加物のような、操作することが容易になる環境因子によって誘導可能である発現について提供するベクターである。
【００２３】
発現ベクターはまた、安定にトランスフェクトした細胞における増殖についての選択マーカーを含み得る。選択マーカーの代表的例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンまたはネオマイシン耐性が挙げられる。
【００２４】
発現ベクターは、市販で提供され得るか、または当該技術分野で周知のクローニングの任意の方法によって構築され得る。好ましい発現ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｓＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡＩｎｅｏが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００２５】
発現ベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換を含む、任意の適切な方法によって、宿主細胞に導入され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような、多くの標準的実験室マニュアルに記載される。
【００２６】
「細胞株で通常では発現しない」とは、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターが、本発明の方法で使用される細胞株において検出可能レベルで発現されないことを意味する。
【００２７】
「安定にトランスフェクトした細胞を目的の化合物と接触させる」とは、目的の化合物が、任意の適切な方法によって安定にトランスフェクトした細胞に投与されることを意味する。これは、化合物をインビトロまたはインビボで外因的に投与する工程、またはさらに化合物を発現させるために細胞をトランスフェクトする工程を包含し得る。化合物を外因的に投与する場合、キャリアが使用され得る。キャリアは、細胞生存性と適合性であるべきである。キャリアの例には、ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＨ、水、Ｔｒｉｓ、およびＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
目的の化合物は、高度に精製されるか、部分精製されるか、または未精製であり得る。目的の化合物は、単独または組み合わせて安定にトランスフェクトした細胞に投与され得る。組み合わせて化合物を投与することによって、ＧｓまたはＧｑタンパク質結合レセプターにおける相乗効果が決定され得る。
【００２９】
「ｕ−ＰＡ活性を測定すること」とは、直接的（すなわち、絶対ｕ−ＰＡ活性を決定または評価することによって）または相対的（すなわち、目的の化合物と接触していないコントロールの安定にトランスフェクトした細胞株に対して、目的の化合物と接触している安定にトランスフェクトした細胞株のｕ−ＰＡ活性を比較することによって）のいずれかで、ｕ−ＰＡ活性のレベルを定性的または定量的に測定または評価することを意図する。好ましくは、目的の化合物と接触している安定にトランスフェクトした細胞株におけるｕ−ＰＡ活性は、目的の化合物と接触されていない安定にトランスフェクトした細胞株または目的の同じ化合物と接触されているトランスフェクトしていない細胞株のいずれか、あるいは両方のｕ−ＰＡ活性に対して比較される。
【００３０】
ｕ−ＰＡ活性を測定する１つの好ましい方法を、以下の実施例３に記載する。簡単にいえば、安定にトランスフェクトした細胞からの上清のアリコートを、クリーンなマイクロプレートに移す。「上清」は、細胞から取り出された液体培地である。ｕ−ＰＡ活性をアッセイするための緩衝液を添加する。マイクロプレートを適切な量の時間インキュベートし、そして反応を、終結緩衝液で停止する。比色産物の吸光度を測定する。
【００３１】
好ましくは、目的の化合物がアゴニストであるかどうかを決定する場合、化合物を、安定にトランスフェクトした細胞に投与し、そしてｕ−ＰＡ活性のレベルを測定または評価し、そして目的の化合物と接触していない安定にトランスフェクトした細胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルと比較する。
【００３２】
目的の化合物がアンタゴニストであるかどうかを決定する場合、目的の化合物と公知のアゴニストの両方が、安定にトランスフェクトした細胞に投与されるべきである。アゴニストおよび潜在的アンタゴニストは、任意の順で（すなわち、最初にアゴニスト、次いで潜在的アンタゴニストを、または最初に潜在的アンタゴニスト、次いでアゴニストを）、ならびに同時に投与され得る。細胞をアゴニストおよび目的の化合物の両方と接触させた後、安定にトランスフェクトした細胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルを測定または評価し、そしてアゴニスト単独と接触している安定にトランスフェクトした細胞におけるｕ−ＰＡ活性のレベルに対して比較する。
【００３３】
本発明の一般的に記載したので、本発明が以下の実施例を参照してより容易に理解される。実施例は、例示のみによって提供され、そして本発明の限定を意図するものではない。
【００３４】
【実施例】
（実施例１）プラスミドトランスフェクションおよびクローンの単離
クローン化されたブタ腎臓由来細胞株、ＬＬＣ−ＰＫ１（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））およびヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターｃＤＮＡでの安定なトランスフェクション後に単離されたサブクローンを、空気中５％ＣＯ2下で、１０００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むまたは含まない７％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（すべてＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから）中で維持した。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを安定に発現する細胞株を調製するために、細胞のコンフルエント単層を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）中に構築した全長ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターｃＤＮＡでトランスフェクトした（Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：９８−１００（１９９５））。いくつかの場合には、細胞を、レセプターｃＤＮＡおよび優勢ネガティブＰＫＡ調節サブユニット変異体「ＲＥＶ  ＡＢ」をコードするプラスミドで同時トランスフェクトした（Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７））。トランスフェクションを、既述のようにリン酸カルシウム沈降技法を使用して行った（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。
【００３５】
１１のクローン細胞株を、広範囲のレセプター発現を提供するために１００以上の独立したサブクローンの合計の中から選択した（表１）。
【００３６】
表１。クローンＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター発現およびシグナル伝達
ｈＰＴＨＲ  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞のサブクローンを、競合放射性リガンド（スキャッチャード）結合分析によって、およびｈＰＴＨ（１−３４）（１０００ｎＭ）に対する最大シグナル伝達応答（基準の倍数またはパーセントの平均±ＳＤ）について分析した。すべての値を、３つ組で行った少なくとも２または３実験から得た。コントロールにおけるサイクリックＡＭＰ蓄積およびＩＰ3形成は、それぞれ３〜１０ｐｍｏｌ／ウェルおよび１，０００〜１，５００ｃｐｍ／ウェルの範囲であった。
【００３７】
【表１】
0004261766.tif 000002
【００３８】
（実施例２）放射性リガンド
ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターに対する特異的結合を、いくつかの改変とともに既述（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））のように測定した。簡単にいえば、細胞を、２．５×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、そして研究前にさらに２日間培養した。細胞層を、氷冷緩衝液Ａ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．７）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％  ＦＢＳ、および５％熱非働化ウマ血清］でリンスし、次いで０．５ｍｌの緩衝液Ａ中、非標識ペプチドを含むまたは含まない、125Ｉ標識した［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ウシ（ｂ）ＰＴＨ（１−３４）（１×１０5ｃｐｍ／ウェル）と、冷室温（２〜８℃）で６時間インキュベートした。結合反応を、インキュベーション混合物を吸引することによって終結し、その後、細胞を０．５ｍｌの氷冷緩衝液Ａで２回洗浄した。０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で細胞を可溶化した後、放射活性およびタンパク質の測定を、既述のように、スキャッチャード分析によって細胞当たりのレセプター数を算出して行った（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。他に記載がなければ、すべての試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得、そしてすべての同位体をＤｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（１−３４）を、クロラミンＴ方法によって放射性ヨウ素化（ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅ）し、そして既述のように精製した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。
【００３９】
それぞれ細胞当たり９５０，０００および２８０，０００ｈＰＴＨＲを発現する２つの代表的細胞株ＨＫＲＫ  Ｂ７およびＨＫＲＫ  Ｂ２８についての放射性リガンド競合アッセイおよびスキャッチャード分析を、図１に示す。選択された細胞株のすべてのスキャッチャード分析は、１〜７ｎＭの見かけのＫdを有する、細胞当たり９０，０００〜１，０００，０００部位からのＰＴＨＲ発現の範囲を示した（表１）。それぞれの場合、スキャッチャード分析は、高親和性結合部位の単一のクラスに一致して直線であった。以下の記載のその後の実施例を、２つの細胞株で行い、これを、それぞれ高（ＨＫＲＫ  Ｂ７）および低（ＨＫＲＫ  Ｂ２８）密度のｈＰＴＨＲを発現するものの代表として選択した。
【００４０】
（実施例３）ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲシグナル伝達
（方法）
（ペプチドおよび他の試薬）
他に指示がなければ、すべての試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得、そしてすべての同位体をＤｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（１−３４）、［Ｔｙｒ34］ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３１）、ｈＰＴＨ（３−３４）、ｈＰＴＨ（７−３４）、およびｈＰＴＨｒｐ（１−３６）を、カルボキシ末端アミド基で合成した。［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（１−３４）を、クロラミンＴ方法によって放射性ヨウ素化し、そして既述のように精製した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。
【００４１】
（細胞性ｃＡＭＰ蓄積）
細胞を、２．５×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、そして研究の前にさらに２日間培養した。細胞を、１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した０．５ｍｌの氷冷緩衝液Ｂ［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１．２ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５ｍＭグルコース、および０．１％熱非働化ＢＳＡ］で１回リンスし、氷上においた。処理を、ＩＢＭＸを補充した緩衝液Ｂの０．２５ｍｌ中で各ウェルに添加し、その後プレートを３７℃にて１５分間インキュベートした。次いで、緩衝液を迅速に吸引し、プレートを液体窒素上に迅速に移し、そしてその後凍結した単層を０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＨＣｌ中に直接的に融解した。次いで、抽出したｃＡＭＰを、市販のＲＩＡキット（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して測定した。結果を、基準の倍数として表し、ここでベースのレベルは、３８〜１２８ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質／１５分の範囲であった。天然のままのＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄積のベースのレベルは、野生型ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターを発現するサブクローンにおいて一貫して変化しなかった。
【００４２】
（イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）産生）
細胞を、２．５×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、そして研究前にさらに２日間培養した。細胞を、アッセイ培地（０．１％ＢＳＡを補充した無血清およびイノシトールを含まないＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で３ｕＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］ｍｙｏ−イノシトールでアッセイ前に１６時間３７℃にて標識した。３０ｍＭ  ＬｉＣｌを含む予め温めたアッセイ培地で細胞を洗浄した後、３０ｍＭ  ＬｉＣｌおよび刺激剤（またはビヒクル）を含む０．２５ｍｌのアッセイ培地とともに３７℃にて種々の間隔（１〜３０分）でインキュベートした。ＩＰ3形成を、吸引および０．５ｍｌの氷冷５％ＴＣＡの直接添加によって停止した。次いで、酸抽出物を、２容量の水飽和したエーテルで２回抽出し、そして既述のように（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））、ＡＧ  １Ｘ８陰イオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）でのクロマトグラフィーの前に濃縮ＮａＯＨおよびＴｒｉｓ塩（最終濃度＝１０ｍＭ）でｐＨ  ７．４に調整した。他の画分（遊離の［3Ｈ］ｍｙｏ−イノシトール、グリセロホスフェートイノシトール、ＩＰ1、およびＩＰ2）を溶出した後に、ＩＰ3画分を収集し、そして放射活性のその含量を、液体シンチレーション分光測定法（Ｂｅｃｋｍａｎ，モデルＬＳ  ６０００ＩＣ）によって決定した。
【００４３】
（細胞質ゾルの遊離カルシウムの測定）
細胞質ゾルの遊離カルシウムを、Ｃａ2+感受性細胞内プローブｆｕｒａ−２を加えた細胞における二重蛍光によって測定した。細胞を、４０，０００〜６００，０００／ｃｍ2の密度でガラスカバースリップ上に播種し、そして上記のように２日間インキュベートした。カバースリップを、室温（２２℃）にて３０分間４ｕＭのｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含むリン酸を含まない緩衝液Ｂ中に加える前にＰＢＳで２回洗浄した。ｆｕｒａ−２を含まない緩衝液Ｂで２回洗浄した後、カバースリップを、３７℃にて２ｍｌのリン酸を含まない緩衝液Ｂを含むキュベットに載せ、そして３４０および３８０ｎｍでの交互の励起に対する５１０ｎｍでの発光を、２ｎｍの励起および発光バンド幅で比測定（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）ＰＴＩ  Ｄｅｌｔａｓｃａｎ蛍光スペクトロメーターを使用してモニターした。安定なベースラインを得た後、アゴニストを、２ｍｌの新しい緩衝液への交換によって導入し、それに１０〜２０ｕｌの濃縮したアゴニストストック（またはビヒクル単独）を添加した。ペプチドストックを、０．１％トリフルオロ酢酸中で調製し、イオノマイシンおよびホルボールエステルを、ジメチルスルホキシドに溶解し、そして他の添加物を、水中で調製した。最大および最小蛍光シグナルを、それぞれカルシウムの名目上の不在下で１ｕＭイオノマイシン＋２０ｍＭカルシウムまたは２ｍＭ  ＥＧＴＡを含む改変した緩衝液への曝露によって得、そして自己蛍光をイオノマイシン＋２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下で得たシグナルから見積もった。次いで、細胞質ゾルの遊離カルシウムを、既述のように決定した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３））。
【００４４】
（ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ））
細胞を、６×１０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、そして翌日使用した。細胞を、０．２ｍｌで１回洗浄し、次いで０．０５％ＢＳＡを含む０．１ｍｌの予め温めたＤＭＥＭを再供給した。各刺激剤を添加した後、プレートを、３７℃にて１６時間インキュベーター中に戻した。次いで、馴化培地（５ｕｌ）を、各ウェルからクリーンなマイクロプレートへ移した。反応を、５０ｕｌのｕ−ＰＡアッセイ緩衝液［９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）、０．４５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１４ｕｇ／ｍｌ  ヒトプラスミノーゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｓ−２２５１プラスミン基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ−Ｎｐ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］の添加によって開始した。プレートを、最初は３７℃にて１５分間、次いで室温（２２℃）にて３０分間インキュベートした。反応を、１０ｕｌの氷冷２５％酢酸の添加によって停止した。比色産物の吸光度を、１時間以内に４０５ｎｍで測定した。活性を、標準として精製したヒトウロキナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、Ｐｌｏｕｇ単位／ウェルで表した。
【００４５】
（細胞リン酸取り込み）
細胞を、２．５×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、そして研究前にさらに２日間培養した。アッセイの２４時間前、細胞に、０．１％ＢＳＡを含む０．５ｍｌのＤＭＥＭに再供給した。翌日、細胞に、薬物またはペプチドを含む無血清培地（ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ）を再供給し、そしてインキュベーションを、空気中５％ＣＯ2下で３７℃にてさらに６時間続けた。次いで、細胞を、ＢＳＡおよびＮａ2ＨＰＯ4を含まない予め温めた緩衝液Ｂで洗浄し、次いで［32Ｐ］オルトリン酸（４μＣｉ／ｍｌ）および０．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4を含む０．２５ｍｌの同じ緩衝液で３７℃にて５分間インキュベートした。リン酸取り込みを、１ｍｌの氷冷ナトリウムを含まない「停止緩衝液」［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１４０ｍＭ  塩化コリン、および５ｍＭヒ酸ナトリウム］を添加することによって停止し、次いで同じ緩衝液でさらに２回洗浄した。次いで、排出した細胞層を、０．５ｍｌの溶解緩衝液で可溶化し、そして細胞関連放射活性を、既述のように、Ｃｅｒｅｎｋｏｖカウンティングによって決定した（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。
【００４６】
（結果）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞で安定に発現したヒトＰＴＨＲの特性の研究は、２つの重要な観察をもたらした。第１は、ヒトＰＴＨＲの細胞表面密度が、リガンド濃度に関係なく、ＰＴＨに対する個々のシグナル伝達応答の程度の重要な決定基であり、そしてこれらの変化が、全く異なる、本質的に重複しない、レセプター密度の範囲にわたって生じるという所見である。これらの研究の過程において、ＰＬＣ応答の一時的プロファイルにおけるｈＰＴＨＲ密度依存的な差もまた観察し、そしてこれらの細胞においてＰＴＨによって誘起された最初の細胞質ゾルカルシウムシグナルを持続することにおけるＰＫＡの役割の証拠を検出した。第２の主要な所見は、ＰＬＣ活性化能力が、ラットＰＴＨＲを発現する細胞において幾分減少したとしても、推定シグナル選択的ＰＴＨアナログｈＰＴＨ（１−３１）が、ヒトＰＴＨＲを有する細胞において必ずしもシグナル選択的ではないことである。これらの結果は、ＰＴＨＲのヒトと他の種との間のリガンド−レセプター相互作用における微細な差を指摘し、そしてラットモデルに由来する結果が、ヒトＰＴＨＲを発現する系へ注意して外挿すべきであることを示唆する。
【００４７】
（発現したｈＰＴＨＲのシグナル伝達特性における細胞表面密度の影響）
最大ＰＴＨ依存的ｃＡＭＰ蓄積を、ｈＰＴＨ（１−３４）の高濃度（１０００ｎＭ）との１５分間のインキュベーション後、ヒトＰＴＨＲトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１サブクローンでアッセイした（表１）。ラットＰＴＨＲを安定に発現したＬＬＣ−ＰＫ１細胞について既に報告されたように（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））、最大アデニリルシクラーゼ応答は、（ＰＬＣ活性化について必要とされる閾値に対して−以下を参照のこと）比較的低い閾値以上のヒトＰＴＨＲの表面密度とは比較的独立していた。しかし、ヒトＰＴＨＲの場合、最大ＡＣ活性化の飽和についてのこの閾値は、１２０，０００と２８０，０００との間にあるようであり（表１）、これは、ラットＰＴＨＲについてこれまでに観察されたものよりも少なくとも６〜１０倍高い（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。予測のとおり、ｈＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）によるＡＣの活性化は、濃度依存的であり、そして図２Ａに示すように、ＥＣ５０（約１ｎＭ）および最大応答は、細胞株ＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７において同一であった。
【００４８】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラットＰＴＨＲの発現を含むこれまでの研究において、３０分で放出された総ＩＰ3として測定される、ＰＴＨによる最大ＰＬＣ活性化を、最大ＡＣ活性化の飽和に必要とされるレセプター密度の閾値を明らかに超える広範囲の発現（すなわち、２０，０００〜４００，０００レセプター／細胞）にわたるラットＰＴＨＲの密度に密接に関連することが見いだされた（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。同様に、図３および表１に示すように、最大ＰＬＣ活性化は、ヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１サブクローン中のＰＴＨＲ密度に強く既存的であった。ＡＣ活性化の場合のように、ヒトＰＴＨＲがこれらの細胞においてＰＬＣ結合相対効率は、ラットレセプターよりも約３〜５倍低かった。−すなわち、ラットレセプターよりもほぼ３〜５倍以上のヒトレセプターを、ＰＬＣの等価活性化に必要とした。
【００４９】
ＰＴＨＲのより低い数を発現するいくつかのＰＴＨ応答性細胞株−すなわち、ＵＭＲ  １０６細胞（約７０，０００レセプター／細胞）において、非常に迅速であるが一時的なＰＬＣ活性化のパターンが記載されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））。このような一時的パターンが４００，０００より少ないヒトＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞において持続したＰＬＣ活性化の不在の基準となり得るかどうかを決定しようとして、予備研究を行い、ＨＫＲＫ  Ｃ５３、ＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｃ１０１細胞（それぞれ、１２０，０００、２８０，０００、および３３０，０００ＰＴＨＲ／細胞）においてより早い時間（４分）に増加したＩＰ3を示したが、ＨＫＲＫ  Ｂ６４細胞（９０，０００部位／細胞）では示さなかった（データを示さず）。次いで、ＰＬＣ活性化の時間経過を、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞においてより詳細に研究し、そしてＨＫＲＫ  Ｂ７細胞と比較した。図４Ａに示すように、一時的にＰＴＨ刺激したＩＰ3形成を、ＰＴＨ曝露の最初の数分以内にＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞で観察した。この応答は４分でピークとなり、次いで１０分までに基準レベルまでの迅速な低下が起こった。逆に、３００，０００ラットＰＴＨＲ／細胞を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞について既に報告されたように（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞におけるＩＰ3形成は、１０分と３０分との間増加し続けたが、より迅速な開始期もまた、これらの細胞で明らかであった。
【００５０】
ＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７細胞で観察されたＰＴＨ誘導したＰＬＣ活性化の種々の一時的パターンは、より広範な脱感作を含むいくつかの可能性を示唆し、これは、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるより弱いＰＬＣ応答、または、より高いレセプター発現による、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞におけるＩＰ3形成のより弱くカップリングするが異なるメカニズムの可能性のある補充を、より迅速に失わせ得る。これらを区別するための努力において、他の系において報告されたように（Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ．ら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：７２７−７３３（１９９１））、濃度依存性が、それぞれＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７細胞における迅速（すなわち、４分）対持続性（すなわち、３０分）ＰＬＣ応答について異なり得るかどうかを評価した。しかし、図４Ｂに示すように、ＨＫＲＫ  Ｂ２８において４分でおよびＨＫＲＫ  Ｂ７において３０分での最大応答の程度は非常に異なるが、２つの応答のＥＣ50は、これらの細胞においてラットＰＴＨＲについて既に報告されたものと同一（約２０〜３０ｎＭ）および類似であった（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。さらに、表２に示すように、２つの応答のリガンド特異性も類似であり、その点で、ｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨｒＰ（１−３６）によるＰＬＣ活性化は、各細胞株内で等価であり、そしてｈＰＴＨ（３−３４）もｈＰＴＨ（７−３４）もそれぞれの場合においてなんら一貫した検出可能な活性を示さなかった。全体で、これらの結果は、ＨＫＲＫ  Ｂ２８における一時的ＰＬＣ応答とＨＫＲＫ  Ｂ７における持続した応答との間のリガンド−レセプターカップリングまたは選択性の重要な差を示唆しなかった。
【００５１】
表２。ＨＫＲＫ  Ｂ７およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるＰＴＨまたはＰＴＨｒＰペプチドによるホスホリパーゼＣの活性化。
【００５２】
［3Ｈ］ｍｙｏ−イノシトールで既に負荷をかけた、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞を、それぞれ３０分または４分間各ペプチド（１０００ｎＭ）とともにインキュベートした。ＩＰ3の形成を、ビヒクル処理コントロールにおいて測定した量のパーセントとして表す。示した値は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭである。
【００５３】
【表２】
0004261766.tif 000003
【００５４】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲを介するＰＬＣ活性化の予測された結果は、とりわけ細胞内貯蔵からの隔離されたカルシウムの放出である（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２００９８（１９９３）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７７１１−７７１８（１９８７）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６））。したがって、細胞質ゾルの遊離カルシウムを、ｈＰＴＨ（１−３４）への曝露後のＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７細胞において測定した。図５に示すように、Ｆｕｒａ  ２ＡＭ負荷をかけた細胞の単層へのｈＰＴＨ（１−３４）（１００ｎＭ）の添加は、２０秒以内に４００〜６００ｎＭでピークになりそしてその後ゆっくり減少する細胞質ゾルの遊離カルシウムの迅速な上昇を引き起こした。この応答において、程度または時間経過の有意な差は、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞におけるより大きなＩＰ3応答（図４Ａ）にもかかわらず、ＨＫＲＫ  Ｂ７とＨＫＲＫ  Ｂ２８との間で観察されなかった（図５Ａおよび５Ｃを参照のこと）。
【００５５】
ｃＡＭＰ経路の活性化が、これらの細胞においてＰＴＨに対する細胞質ゾルの遊離カルシウム応答の原因であり得る可能性を試験するために、ＡＢ４５細胞を研究し、この細胞においてヒトＰＴＨＲ（３７０，０００／細胞）を、基準およびホルモン刺激したプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の両方の優勢なネガティブインヒビターであるＲＥＶ  ＡＢとともに同時発現させた（Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７）、Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：１８５１−１８５８（１９９４））。図５Ｄに示すように、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する強い細胞質ゾルカルシウム応答をまだ、これらのｃＡＭＰ耐性細胞において観察し、そしてｈＰＴＨＲの類似の数を発現するｃＡＭＰ応答性ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞において観察されるものに匹敵する程度であった。したがって、これらの細胞におけるｈＰＴＨの活性化によって引き起こされる細胞質ゾルの遊離カルシウムにおける迅速な増加は、明らかに、ｃＡＭＰによって媒介されない。しかし、興味深いことに、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるよりもｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞においてより迅速に減少したカルシウム移動が、ほんの２〜３分以内に基準レベルに近づくことを観察した（図５Ｄ）。これは、ＡＢ４５細胞におけるＩＰ3形成の程度および一時的パターンが、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるものとほぼ同一であるという事実にもかかわらず生じた（データを示さず）。８ＢｒｃＡＭＰ（１ｍＭ）も活性なホルボールエステルＴＰＡ（１００ｎＭ）も、迅速なカルシウム応答を引き起こさなかった（示さず）。これらの結果は、最初の細胞質ゾルの遊離カルシウム応答の程度がＰＬＣ活性化に最も密接に関連するが、応答の期間が、おそらく細胞外カルシウム侵入の増強によるＰＫＡ経路の活性化によって優勢に影響を及ぼし得ることを意味した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））。
【００５６】
（ＰＴＨによる生物学的応答の調節）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるヒトＰＴＨＲ発現の種々のレベルで観察されたシグナル伝達効率および選択性の変化が、ＰＴＨに対する完全な遠位の生物学的応答の変化を生じ得るかどうかを決定するために、これらの細胞における２つの十分に特徴づけられたホルモン応答（ｕ−ＰＡの分泌および無機リン酸のナトリウム依存的能動輸送）を研究した。
【００５７】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞によるウロキナーゼ型のプラスミノゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）の分泌は、カルシトニンによってＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方の活性化に応じるものがすでに報告されている（Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．およびＨｅｍｍｉｕｇｓ，Ｂ．Ａ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０５：１２７−１３１（１９８６））。このアッセイを、これらの細胞においてヒトＰＴＨＲによるＡＣまたはＰＬＣの活性化を報告する従来の分光光度バイオアッセイを提供するように適合した。図６に示すように、ｈＰＴＨ（１−３４）との１６時間のインキュベーションは、ＨＫＲＫ  Ｂ７およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞の両方からのｕ−ＰＡ分泌における用量依存的増加を誘起した。８ＢｒｃＡＭＰおよびＴＰＡの両方の細胞株において、ＰＫＡおよびＰＫＣの薬理学的アクチベーターはまた、それぞれこの活性を著しく誘導し、ＰＫＡおよびＰＫＣ経路の両方ともｕ−ＰＡ産生に連結することを確認した。ｈＰＴＨ（１−３４）に応じたＨＫＲＫ  Ｂ７によるｕ−ＰＡの最大産生は、絶対量で、およびカルシトニンまたは８ＢｒｃＡＭＰのような他のアゴニストとの相対量での両方で、ＨＫＲＫ  Ｂ２８におけるものよりも大きかった（図６）。
【００５８】
これらの２つの細胞株におけるＰＴＨへのｃＡＭＰ応答の感度および程度が同一であったので、ＨＫＲＫ  Ｂ７対ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞で観察されるＰＴＨへのより大きい最大ｕ−ＰＡ応答が、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞においてのみ見られるＰＬＣの持続活性化を反映し得る可能性があるようであった。さらに、ｈＰＴＨ（１−３４）によるｕ−ＰＡ産生の刺激についてのＥＣ50（１０〜２０ｎＭ）は、特にＨＫＲＫ  Ｂ７細胞において、ｃＡＭＰ蓄積（１ｎＭ）についてよりもＩＰ3形成の活性化（２０〜３０ｎＭ）についてより類似していた。また、ＰＴＨに対する最大ｕ−ＰＡ応答は、これらの細胞におけるより豊富なｈＰＴＨＲによる、さらなるＰＫＡ非依存的メカニズムの活性化に一致して、ＨＫＲＫ  Ｂ７における（しかし、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞においてではない）８ＢｒｃＡＭＰの応答よりも高かった。これらの細胞においてＰＴＨ誘導したｕ−ＰＡ分泌のｃＡＭＰ非依存的（おそらくＰＫＣ依存的）メカニズムの関連についてのさらなる証拠を、ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞を使用して得た（図７）。予測したとおり、８ＢｒｃＡＭＰに対するｕ−ＰＡ応答は、これらの細胞においてほぼなくなったが、ホルボールエステルに対する応答は十分に維持した。カルシトニンと同様にＰＴＨ応答は、劇的に減弱したが、８ＢｒｃＡＭＰの最大濃度で達成したよりも顕著に大きく保持した。この結果は、これらの細胞においてＰＴＨ刺激したｕ−ＰＡ分泌を媒介することにおけるＰＫＡとは独立したメカニズムの役割をさらに支持する。
【００５９】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラットＰＴＨＲの活性化後のナトリウム依存的リン酸取り込みの刺激が、主としてＰＬＣ／ＰＫＣ経路によって媒介されることは既に報告された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。類似の検察は、ＣＨＯ細胞において他者によって報告されている（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０４：２１−２７（１９９４））。したがって、ヒトＰＴＨＲを発現するＨＫＲＫ  Ｂ７およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるＰＴＨによるこの応答の調節を試験した。図８に示すように、リン酸取り込みを、これらの細胞においてｈＰＴＨ（１−３４）によって顕著に刺激した。ＰＴＨ（１−３４）のこのＰＫＣ依存的作用を、ＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７細胞の両方において観察し、これは、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞で観察した一時的ＰＬＣ応答が、このより持続した生物学的応答を誘導するために十分であることを示唆した。この結果は、リン酸取り込みも、ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞においてＰＴＨ（１−３４）によって２倍以上刺激し（データを示さず）、ここで、上記のように、唯一の測定可能なＰＴＨＲシグナルが、ＰＬＣの一時的刺激でありそして細胞質ゾルの遊離カルシウムにおける増加が伴ったという観察によって、さらに支持された。
【００６０】
ＡＣおよびＰＬＣエフェクターのリガンド依存的活性化におけるＰＴＨＲ密度の変化の効果は、インビトロで非相同モデル系を使用して得たが、重要な生理学的関連を有し得たことを観察した。特に骨芽または骨髄間質細胞において、ＰＴＨＲ活性化によって生成した細胞内第２メッセンジャーシグナルの特定のパターンおよび相対強度の差は、最終的に骨における大いに異なる効果を有し得る循環するＰＴＨの種々の一時的パターンおよび濃度プロフィールについての破骨細胞系情報の直近の標的細胞および近隣細胞の両方に伝達することに重要であり得る（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３））。したがって、このような示差シグナル伝達の潜在的メカニズムへの洞察は、インビボで骨におけるＰＴＨのアナボリックおよびカタボリック効果にあるに違いない別個のメカニズムを理解するために重要であり得る。ＰＴＨＲの「シグナル伝達表現型」におけるレセプター発現の影響はまた、発育中の骨においてＰＴＨｒＰの高い局所濃度に対する軟骨細胞の応答を調節することに重要であり得た（Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：６６３−６６６（１９９６）、Ｌｅｅ，Ｋ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：５１０９−５１１８（１９９６））。
【００６１】
細胞外リガンド濃度の変化に単に基づく、このような示差シグナル伝達についての１つのメカニズムは、ＰＴＨに対するＡＣおよびＰＬＣ応答のリガンド感度（ＥＣ50）の実質的な差が、ＰＴＨに対する未刺激（ｎａｉｖｅ）の細胞の最初の曝露で観察されているこれまでの研究から明らかである（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４６：１４９−１５５（１９９３）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：１７１３−１７１６（１９９４）、Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５）、Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６）、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０４：２１−２７（１９９４））。本発明者らは、ｈＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＰＴＨに対するＡＣおよびＰＬＣ応答の感度の同様に顕著な差を報告し−すなわち、ＡＣの活性について観察されたＥＣ50は、ＰＬＣ刺激についてのものより１０〜１００倍低かった。
【００６２】
示差シグナル伝達のもう１つのメカニズムは、次のリガンドへの曝露前の異なるＧタンパク質へのＰＴＨＲカップリングの不均一化脱感作に関連し得る。ＰＴＨＲシグナル伝達の脱感作は、広く記載されており（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２６：２６５０−２６６０（１９９０）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２５８８−２５９４（１９９４）、Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：１８５１−１８５８（１９９４）、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：１２０８−１２１７（１９８８）、Ｆｒｅｙａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６２：Ｅ８７−Ｅ９５（１９９２））、そしてこれらの脱感作事象の一時的パターンおよび程度に関しての種々の伝達経路の中に認められる差も、各経路に沿ったその後のシグナル伝達の相対強度を調節し得た。
【００６３】
示差シグナル伝達を生じるための第３のメカニズムは、最大ＡＣおよびＰＬＣシグナルの相対程度が、細胞表面上で発現したラットＰＴＨＲの数に依存して、顕著に異なるというこれまでの所見によって示唆された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５）））。したがって、任意の所定の細胞外リガンド濃度について、細胞表面ｒＰＴＨＲの数の変動は、所定の細胞内シグナルの程度のみならず、他のシグナルに対するその強度にも影響を及ぼし、それによってリガンド濃度の変化とは独立して細胞内シグナル伝達のパターンを変更した。本研究は、ＡＣ対ＰＬＣシグナル伝達効率におけるレセプター発現のこの示差影響が、ヒトＰＴＨＲにさらに適用し得、そして個々の応答のＥＣ50においてなんら変化なく生じ得ることを示す。類似の結果は、ヒトＰＴＨＲの異なる数を発現するＨＥＫ−２９３ヒト腎臓細胞におけるＡＣおよび細胞質ゾルの遊離カルシウムシグナル伝達の比較について、最近報告された（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６））。Ｇタンパク質および／またはエフェクターカップリングの効率の変化からのリガンド感度の変化のこの解離は、アゴニスト認識および活性化に関連するＰＴＨＲの構造決定基が、Ｇタンパク質／エフェクター相互作用に関連するものとは比較的独立して操作し得ることを示唆する。これらの観察の生理学的関連は、骨の細胞であるいはインビトロまたはインビボでの繰り返したＰＴＨ曝露中に生じることが公知のＰＴＨＲの発現の実質的変化によって支持される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＧｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２６：２６５０−２６６０（１９９０）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２５８８−２５９４（１９９４）、Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：１８５１−１８５８（１９９４）、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：１２０８−１２１７（１９８８）；Ｆｒｅｙａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６２：Ｅ８７−Ｅ９５（１９９２）；Ｆｏｒｔｅ，Ｌ．ら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４２：Ｅ１５４−Ｅ１６３（１９８２）；Ｂｅｌｌｏｒｉｎ，Ｆ．Ｅ．ら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４７：３８−４４（１９９５））。さらに、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞で研究された範囲内の内因性ＰＴＨＲ発現の変動は、内因性ＰＴＨＲ遺伝子が発現される他の細胞系で記載されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：１２０８−１２１７（１９８８）、Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ，Ｃ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：４５７−４６８（１９９６））。
【００６４】
ここで観察されたｈＰＴＨＲのシグナル伝達特性のいくつかの追加の局面は、コメントする価値がある。第１に、ヒトＰＴＨＲがＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてＡＣおよびＰＬＣ応答にカップリングする効率が、ラットＰＴＨＲを発現する細胞における対応する応答について比較した場合、実質的および同等に減少したことは、興味深い。これは、図３で非常に明らかであり、例えば、ラットよりもほぼ３〜５倍多いヒトＰＴＨＲは、ＰＬＣの匹敵する最大活性化を達成するために必要とされた。ＡＣカップリングの効率の類似の差は、これらの細胞においてラットＰＴＨＲについて既に報告された結果と、表１におけるｈＰＴＨＲについてのデータとを比較することによって示唆される（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。全体のシグナル伝達効率とレセプター密度との間の関連のこの「右側シフト」は、ヒトＰＴＨＲの本質的特性、あるいは、ヒトレセプターとここで使用されるブタ細胞によって発現される細胞内シグナルトランスデューサーとの間の相対的種不適合性を反映し得る。ＰＬＣまたは細胞質ゾルカルシウムシグナル伝達に対するトランスフェクトしたヒトＰＴＨＲのより効率的なカップリングは、霊長類またはヒト起源の細胞で観察されている（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６）、Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：９８−１００（１９９５））。より広範な種に由来する細胞におけるトランスフェクトしたラットおよびヒトＰＴＨＲの機能の直接比較は、この問題を明らかにするために必要とされる。
【００６５】
第２に、ＩＰ3応答（リガンドの最大濃度で）の程度だけでなく一時的プロファイルが、レセプター密度に関連することを見いだした。詳細には、ＰＴＨＲ発現のより低いレベルでのＰＬＣ応答は、一時的であり、１０分未満持続するが、より高い密度のＰＴＨＲで引き起こされる応答は、かなり永く持続した。この差についての説明は、直ちには明らかではない。多くのレセプター応答の代表である、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞で観察された、測定したＩＰ3のピークからの迅速な低下のメカニズム（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．およびＩｒｖｉｎｅ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１９７−２０５（１９８９））は、おそらく複雑であり、そして（ａ）最初の刺激の終結（レセプター脱感作またはインターナリゼーションを介する）、（ｂ）ＰＴＨＲに接近可能な膜ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート基質の限定されたプールの枯渇（特に、リチウムの存在下で（Ｎａｈｏｒｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １２：２９７−３０３（１９９１）））、または（ｃ）ＰＫＣの活性化によって一部媒介され得る、イノシトールポリリン酸−顕著にはイノシトール１，４，５−三リン酸−５−ホスファターゼを代謝する酵素の迅速な誘導（Ｎａｈｏｒｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １２：２９７−３０３（１９９１）、Ｓｈｅａｒｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６０：３１３−３２４（１９８９））を含み得る。基質枯渇は、４分での基質加水分解およびＩＰ3形成のピーク速度が、より長期の応答を有するＨＫＲＫ  Ｂ７細胞で実際により大きいので、この系においてありそうにない説明のようである。しかし、発現したＰＴＨＲの分布が、研究されたｈＰＴＨＲ発現のすべてのレベルでこれらの極性化した上皮細胞の膜全体を通して均一であるかどうかは、まだ公知ではない。例えば、ＰＴＨＲ分布が、レセプター合成のより低い速度でより制限され得、これが、このような細胞においてレセプターに利用可能な基質プールのサイズを限定し、そして「局所」基質枯渇させ得ることが可能である。ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞におけるより長期のＰＬＣ応答が、ＩＰ3を代謝することに関連したホスファターゼをほぼ飽和するために十分である、これらの細胞において活性な立体配置で保持される占有されたレセプターの非常に大きな数により持続される、酵素のより激しくかつ延長した活性化のみによるものであり得ると考えられた（Ｓｈｅａｒｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６０：３１３−３２４（１９８９））。差が４分対３０分で測定した応答のＥＣ50で検出され得ず、また２つの異なるメカニズムに指摘され得たリガンド選択性で検出される明らかな差がなかったので、結果は、この可能性に最も一致するようである。ＰＬＣ応答におけるこれらの差とは逆に、ＰＴＨによるＡＣの活性化は、両方の細胞株において最初の１５分にわたって同一に行われたようである。さらに、示していない実験では、１０００ｎＭ  ｈＰＴＨ（１−３４）の添加後２４時間までの間隔で酵素活性の直接測定によって、これが、さらにこれらの細胞においてより持続したＰＫＡ応答に当てはまることも確認した。
【００６６】
これらの細胞におけるｈＰＴＨＲシグナル伝達の第３の興味深い特徴は、観察された細胞質ゾルカルシウム応答に関与する。ＨＫＲＫ  Ｂ２８とＨＫＲＫ  Ｂ７細胞との間のＰＬＣ活性化プロファイルにおける上記の差があれば、ＩＰ3が、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化中の細胞内貯蔵からのカルシウム放出の主要な決定基であるという広く受け入れられた見解（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３１５−３２５（１９９３））、およびヒトＰＴＨＲを発現する浸透可能なＨＥＫ−２９３細胞において、ＰＴＨおよびＩＰ3が、カルシウムの同じ細胞内プールからの放出に競合するようであるという最近の証明（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６））、これらの２つの細胞株においてＰＴＨによって引き起こされる細胞質ゾルの遊離カルシウム移動が、時間および程度の両方において実質的に同一であることは、おそらく驚くべきことである。ｃＡＭＰ耐性ＡＢ４５細胞での結果は、細胞質ゾルの遊離カルシウム上昇の持続した期が、おそらく細胞外カルシウムの侵入を促進することによって、ＰＫＡの活性化に関連し得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：７７１１−７７１８（１９８７））が、カルシウム応答の最初の期が、ＰＫＡに非依存的なようであることを示唆した。さらに、フォルスコリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびホルボールエステルもまたカルシウム応答を誘起できない他の実験は、この応答を誘起することにおけるＰＫＡまたはＰＫＣの直接的関連についての証拠を提供しなかった。ＰＴＨへの迅速な細胞質ゾルカルシウム応答が、これらの細胞におけるＩＰ3の最初の増加に最も密接に関連し、そしてさらに、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞で急に生成したＩＰ3の量（ただし、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞で産生したより少ないＩＰ3の量で）が、ＩＰ3感受性細胞内プールからのカルシウムの最大放出を達成するために十分あるに違いないと、結論づけた。
【００６７】
（ｈＰＴＨアナログのシグナル伝達および生物学的活性）
いくつかのＰＴＨアナログは、非ヒト起源のＰＴＨ応答性細胞におけるシグナル選択性を示すことが報告された。これらには、ＰＫＣおよび／または細胞質ゾルカルシウム移動を選択的に活性化することがいくつかの系で示されているＰＴＨ（３−３４）およびＰＴＨ（７−３４）（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２５８８−２５９４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７１：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：７１３−７１９（１９９３））、ならびにラット骨肉腫細胞および初代ラット脾臓細胞においてＡＣを活性化するがＰＫＣを活性化しないことが報告されているＰＴＨ（１−３１）（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：５３−６０（１９９２））が挙げられる。このようなフラグメントが、臨床使用のための候補と考えられているので（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５））、これらのアナログが、ヒトＰＴＨＲによる予測されたシグナル選択性を提示するかどうかを決定した。
【００６８】
図２Ｂに示すように、ＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるＡＣの活性化は、１０ｎＭ以上の濃度でのｈＰＴＨ（３−３４）によって顕著に刺激されたが、このペプチドの１０００ｎＭに対する応答は、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する最大応答の１６％のみであった。ヒトＰＴＨ（７−３４）は、テストしたすべての濃度でＡＣを活性できなかったが、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）およびｈＰＴＨ（１−３１）に対する応答は、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する応答とは区別不可能であった。同様の結果を、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞での実験で得た（データを示さず）。
【００６９】
１０００ｎＭの濃度でテストした場合、ｈＰＴＨ（３−３４）もｈＰＴＨ（７−３４）も、細胞当たりほぼ百万レセプターを発現したＨＫＲＫ  Ｂ７細胞においてでさえ、ＰＬＣを顕著に活性化しなかった（表２）。逆に、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）および予期せぬことにｈＰＴＨ（１−３１）の両方とも、ＨＫＲＫ  Ｂ２８（４分で）およびＨＫＲＫ  Ｂ７（３０分で）の両方においてｈＰＴＨ（１−３４）と等価にＰＬＣを刺激した。ヒトＰＴＨ（１−３１）（１００ｎＭ）はまたＨＫＲＫ  Ｂ７細胞において細胞質ゾルの遊離カルシウムトランジエントを十分に活性化したが（図５Ｂ）、ｈＰＴＨ（３−３４）もｈＰＴＨ（７−３４）（１００ｎＭ）のいずれも、この応答を誘導しなかった（示さず）。
【００７０】
ＰＫＡ活性化に主として依存的であるがまたＰＫＡ非依存的シグナル伝達を反映するｕ−ＰＡバイオアッセイにおいて（上記のように）、ｈＰＴＨ（３−３４）、ｈＰＴＨ（７−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の活性は、それらのシグナル伝達特性と調和した。したがって、ｈＰＴＨ（３−３４）は、部分的に活性であったが（ｈＰＴＨ（１−３４）に対する最大応答の５０〜６０％）、ｈＰＴＨ（７−３４）は不活性であり、そしてｈＰＴＨ（１−３１）は十分に活性であった（表３、図９）。顕著なことに、ｈＰＴＨ（１−３１）によるｕ−ＰＡ分泌の最大活性化は、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞においてでさえ、ｈＰＴＨ（１−３４）の活性化と同一であり（図９、表３）、ここで、最大ＰＴＨ活性は、８ＢｒｃＡＭＰで、およびＡＢ４５細胞で、ＰＫＡの最大薬理学的活性化で達成された活性を超え（図７）、ここで、ＰＫＡ（および８ＢｒｃＡＭＰの作用）は、ほとんど完全にブロックされ、そしてＰＴＨの残りの活性は、おそらく、ＰＫＡ非依存的シグナルによってほぼ完全に媒介される。同様に、ＨＫＲＫ  Ｂ２８およびＨＫＲＫ  Ｂ７細胞の両方において、ｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）（ならびにｈＰＴＨｒＰ（１−３６））は、リン酸取り込みのかなりの最大活性化を示し、これは、これらの細胞においてＰＫＣ依存的であるが（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））、ｈＰＴＨ（３−３４）およびｈＰＴＨ（７−３４）は、予測されたように不活性であった（図８）。
【００７１】
表３。ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるｈＰＴＨ／ＰＴＨｒｐペプチドによるｕ−ＰＡ分泌の刺激
細胞を、培地中に存在する分泌されたｕ−ＰＡの測定前に１６時間所定のペプチド（１０００ｎＭ）とインキュベートし、これをビヒクル処理コントロールで測定した活性のパーセントとして表した。示される値は、３つ組の実験の平均±ＳＥＭである。
【００７２】
【表３】
0004261766.tif 000004
【００７３】
これらのＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてトランスフェクトされたヒトＰＴＨＲによって観察されたｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）のシグナル伝達および生物学的特性の完全な等価物は、このアナログが、ラット系においてＡＣの刺激に関しての完全な効力にもかかわらず、ＰＫＣ活性化の細胞バイオアッセイにおいて活性が欠如していることが報告されているので（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：５３−６０（１９９２）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：８８３５−８８４２（１９９５））、全く予測できなかった。本発明者らの所見とこれまでの報告との間の見かけの不一致が、レセプター種における差に関連し得るかどうかを決定した。したがって、ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞（ＥＷ５）におけるｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の効果を比較した。両方のペプチドとも、ＥＷ５細胞においてＡＣを等価に活性化した（図１０）。表４に示すように、ＥＷ５細胞において（および３つの他のｒＰＴＨＲ発現細胞株において）ラットＰＴＨＲを介するｈＰＴＨ（１−３１）による最大ＩＰ3生成は、ｈＰＴＨ（１−３４）による生成の約７０％の大きさであるが、１６時間でのｕ−ＰＡの生成は、１００ｎＭのいずれかのペプチドに対する応答において同一であった。２つのペプチドによるリン酸取り込みの刺激も同一であった。したがって、ｈＰＴＨ（１−３１）がＰＬＣを活性化する能力およびＰＴＨＲを介する他のｃＡＭＰ非依存的応答は、ヒトレセプターに対して制限されなかったが、組換えラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞でも見られた。ｈＰＴＨ（１−３１）に対するＰＬＣ応答は、ラットＰＴＨＲを介してｈＰＴＨ（１−３４）に対して中程度に損なわれたが、ヒトレセプターは、これらの２つのリガンド間を識別できないようである。
【００７４】
表４。ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の比較。
【００７５】
ｈＰＴＨ（１−３４）またはｈＰＴＨ（１−３１）に対する応答を、１細胞当たり３２０，０００のラットＰＴＨＲを発現するＥＷ５細胞で測定した。各値は、３つ組で行った代表的実験の平均±ＳＥＭである。同様の結果を、少なくとも３つの個々の実験で得た。ｈＰＴＨ（１−３４）に対するｈＰＴＨＲ（１−３１）で観察されたＩＰ3形成における中程度の減少を、ラットＰＴＨＲを発現する３つの他のＬＬＣ−ＰＫ１細胞株（すなわち、ＥＷ２９、ＡＲ−Ｃ３８、およびＡＲ−Ｂ４４、これらは、それぞれ１９０，０００、６３０，０００、および８００、０００のＰＴＨＲ／細胞を発現する）で確認し、ここで、ｈＰＴＨ（１−３１）後の最大ＩＰ3形成は（ｈＰＴＨ（１−３４）効果の％として）、それぞれ７５％、７７％、および６４％であった。
【００７６】
【表４】
0004261766.tif 000005
【００７７】
特定のＰＴＨＲ生成した第２のメッセンジャーシグナルと、骨または腎臓のようなホルモンのある生物学的作用との間の広く仮定された連結を考慮して（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １４：６９０−７０９（１９９３）、Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋａ，Ｋ．，Ａｍ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５８：Ｆ２２３−２３１（１９９０）、Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：７１３−７１９（１９９３））、ヒトＰＴＨＲを発現する細胞においていくつかの短縮型ｈＰＴＨ（１−３４）アナログの特性を検査することは、非常に興味深かった。
【００７８】
ｈＰＴＨ（３−３４）によるＡＣ（およびｕ−ＰＡ分泌）の弱いが顕著な活性化を観察したが、ＰＬＣまたは細胞質ゾルカルシウム刺激活性はなかった。これらの結果は、主として齧歯類モデルに基づく他の報告とは反対であり、ここで、ＰＴＨ（３−３４）ペプチドは、一般に、ＰＬＣ／ＰＫＣまたはカルシウム刺激活性の相対的保存でのＡＣ活性化の損失を示した（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：３０３２−３０３９（１９９１）、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２５８８−２５９４（１９９４）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７１：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：２９−３６（１９９２）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：５３−６０（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：７１３−７１９（１９９３）、Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２３１６６−２３１７２（１９９５））。１細胞当たり４００，０００のヒトＰＴＨＲを発現するトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３細胞において、Ｐｉｎｅｓらは、１０ｎＭ［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（３−３４）アミドに応じてＡＣおよび細胞質ゾルの遊離カルシウムの両方においてわずかであるが顕著な増加を観察したが（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ  １８：３８１−３８９（１９９６））、１００ｎＭでのｈＰＴＨ（３−３４）アミドに対するＰＬＣまたはカルシウム応答は観察されなかった。一方、他者はまた、ラットおよび他の非ヒト細胞系においてＰＴＨ（３−３４）ペプチドの活性化を検出できなかった（Ｒｅｉｄ，Ｉ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５２：Ｅ４５−Ｅ５１（１９８７）；Ｃｉｖｉｔｅｌｌｉ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２５：１２０４−１２１０（１９８９）；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １５９：１３５２−１３５８（１９８９））。したがって、これらの不均一が、実験系の差、あるいは関連のＰＴＨＲまたは用いられる特定のＰＴＨ（３−３４）ペプチドの種および構造の差によるものであり得るようである。
【００７９】
ｈＰＴＨ（１−３１）が、ＡＣ、ＰＬＣ、細胞質ゾルカルシウム移動の活性化、ｈＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｕ−ＰＡ分泌およびリン酸取り込みに関して、ｈＰＴＨ（１−３４）と完全に等価であるという所見は、より驚くことであった。これまで、ｈＰＴＨ（１−３１）は、ＡＣ活性を保持するが、ＰＫＣ刺激活性が欠如することが報告されている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：８８３５−８８４２（１９９５））。これらの観察は、領域ｈＰＴＨ（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４）；Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：９８−１００（１９９５）；Ｃｌｅｇｇ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：１３１１１−１３１１９（１９８７）；Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ．ら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：７２７−７３３（１９９１）；Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：１８５１−１８５８（１９９４））が、ＰＴＨＲを介するＰＫＣの活性化のためのコアドメインを含むという提案の基準を形成した（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−３８６（１９９５）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４））。したがって、 ｈＰＴＨ（１−３１）の毎日の注射を受けた卵巣摘出したラットが、ｈＰＴＨ（１−３４）で見られるものに匹敵する骨量の増加を示す実験は、骨におけるＰＴＨのアナボリック効果におけるｃＡＭＰ／ＰＫＡカスケードについての一時的役割の証拠として広く解釈されている（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ５８：８１−８７（１９９６））。ＰＫＣは、ｃＡＭＰアナログによって模倣され得ないｈＰＴＨ（１−３１）に対する細胞質ゾルカルシウム応答、およびさらにリン酸取り込みの激しい刺激の両方を直接的に測定しないが、これらの細胞におけるＰＫＣの活性化に主として連結されることがこれまでに示された生物学的応答が観察された（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。したがって、ｈＰＴＨＲを介するｈＰＴＨ（１−３１）によるＰＬＣ活性化の直接的証明は顕著であり、そしてヒトＰＴＨＲのリガンド選択性が、ラットＰＴＨＲの選択性とは実質的に異なり得る重要な可能性を上昇する（すべてのこれまでの研究がラット系で行われているならば）。このような結果は、ラットにおけるバイオアッセイの基準において臨床的に有用なシグナル選択的ＰＴＨアナログを開発することをねらった努力についての重要な関連を有する（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３８２−���８６（１９９５））。
【００８０】
この問題をさらに検討するために、ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３１）の活性を比較した。驚くべきことに、２つのペプチドの活性が、この系でさらにほぼ認識不可能であるが、ｈＰＴＨ（１−３１）による最大ＰＬＣ活性化が、ｈＰＴＨ（１−３４）に対する最大応答の６０％まで、顕著に減少することを見いだした。これらの所見は、ラット細胞におけるｃＡＭＰ選択的アナログとしてのｈＰＴＨ（１−３１）のこれまでの特徴づけと一致せず、そしてＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてｈＰＴＨＲを介して観察されたｈＰＴＨ（１−３１）のｃＡＭＰ非依存的活性の全範囲が、ヒトＰＴＨＲに全体的には独特ではないことを示す。したがって、ＰＴＨＲ種それ自体の差は、ＨＫＲＫ細胞における本所見とラット細胞を使用する他者によってこれまでに報告された所見（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：８８３５−８８４２（１９９５））との不均一を説明しないようである。
【００８１】
本所見とｈＰＴＨ（１−３１）ペプチドのこれまでの研究からの所見との間の見かけの差についていくつかの可能性のある説明がある。第１に、異なる応答が測定されている。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＰＬＣ／ＰＫＣ活性化に連結することが公知のＰＬＣ、細胞質ゾルの遊離カルシウム、およびある遠位生物学的効果が測定されるが、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅらは、抽出されていない膜においてＰＫＣを測定したが、ＰＬＣまたは細胞質ゾルの遊離カルシウムでは測定しなかった（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４））。ＰＫＣが、ＰＬＣ以外の上流のエフェクターによって調節され得ることが公知である（Ｅｘｔｏｎ，Ｊ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１−４（１９９０））。第２に、これまでの研究は、ＲＯＳ  １７／２骨肉腫細胞、またはトランスフェクトされたよりもむしろ内因性のラットＰＴＨレセプター遺伝子を発現するラット脾臓リンパ球の初代培養を使用して行った（Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１１７９−１１８９（１９９４）、Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ９：９４３−９４９（１９９４））。ＲＯＳ  １７／２細胞は、ｒＰＴＨＲ  ｃＤＮＡがもともとクローニングされ、次いで実験で使用したｒＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を生成するために使用されるＲＯＳ  １７／２．８サブクローンの供給源であるので、ほとんど確実にここで研究されたものと同じｒＰＴＨＲを発現する（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２７３２−２７３６（１９９２）、Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２：２０９０−２０９８（１９９３）、Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３８８４−３８９１（１９９５））。一方、ＲＯＳ  １７／２細胞および脾臓細胞が、これらの細胞においてｈＰＴＨ（１−３１）に対する応答に影響を与え得るＰＴＨについてのレセプターの代替の種を発現することの可能性は高い。例えば、見かけのＣ末端特異性を有するが未だ十分に特徴づけられていないＰＴＨレセプターは、ＲＯＳ  １７／２．８細胞において記載されている（Ｉｎｏｍａｔａ，Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：４７３２−４７４０）。第３に、ＲＯＳ  １７／２およびラット脾臓細胞系は、研究されたｒＰＴＨＲトランスフェクトしたＬＬＣ−ＰＫ１細胞とは他の方法で異なる：（ａ）ＰＴＨＲの表面発現は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞で使用されるものより低いことが公知であるかまたはおそらく低く、（ｂ）ｒＰＴＨＲは、ブタＧタンパク質よりもむしろラットにカップリングされ、そして（ｃ）発現されたＧタンパク質およびエフェクター酵素の種々のサブタイプの相対量が非常に異なり得た。より低いＰＴＨＲ発現の問題は、特に重要であり得る。データは、ラットＰＴＨＲを介するＰＬＣ／ＰＫＣ活性化のためのｈＰＴＨ（１−３１）ペプチドの効力が、ｈＰＴＨ（１−３４）に対して中程度減少する（４０％）ことを示唆す���。ＰＬＣシグナル伝達においてレセプター密度の重要な影響が記載されたならば、ｈＰＴＨ（１−３４）とｈＰＴＨ（１−３１）との間のＰＬＣについての効力におけるこの差が、ここで使用されるＬＬＣ−ＰＫ１細胞よりも少ないｒＰＴＨＲを発現する細胞において増幅され得たことが可能なようである。一方、ｈＰＴＨ（１−３１）に対してヒトＰＴＨＲを介するＰＬＣを刺激する効力の損失は、ヒトＰＴＨＲ表面密度がこのシグナルを検出するために必要とされる最小に近づく細胞（ＨＫＲＫ  Ｂ２８）においてでさえも見いだされなかった。
【００８２】
本明細書に記載のすべての参考文献は、開示において参考として援用される。明確さおよび理解の目的のための例示および実施例によって本発明を現在完全に記載すると、一定の変化および改変が開示された実施態様で行われ得、そしてこのような改変が本発明の範囲内にあることを意図することが、当業者に明らかである。実施例として、好ましい実施態様は、本発明を行うことの１つの形態のみを構成する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において安定に発現されるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターへの競合放射性リガンド結合。９５０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ  Ｂ７）（図１Ａ）または２８０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ  Ｂ２８）（図１Ｂ）を安定に発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、漸増濃度の非放射性リガンドの存在または不在下で、結合緩衝液中で125Ｉ−［Ｎｌｅ8,18Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（１−３４）とともに１５℃にて６時間インキュベートした。スキャッチャードプロットを、挿入図に示す。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを示す。結合した総放射性リガンドは、１５，０００〜３０，０００ｃｐｍ／ウェルの範囲であり、そして非特異的結合は、総結合の２〜５％であった。
【図１Ｂ】  ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において安定に発現されるヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターへの競合放射性リガンド結合。９５０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ  Ｂ７）（図１Ａ）または２８０，０００レセプター／細胞（ＨＫＲＫ  Ｂ２８）（図１Ｂ）を安定に発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、漸増濃度の非放射性リガンドの存在または不在下で、結合緩衝液中で125Ｉ−［Ｎｌｅ8,18Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ（１−３４）とともに１５℃にて６時間インキュベートした。スキャッチャードプロットを、挿入図に示す。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを示す。結合した総放射性リガンドは、１５，０００〜３０，０００ｃｐｍ／ウェルの範囲であり、そして非特異的結合は、総結合の２〜５％であった。
【図２】  図２Ａ〜２Ｂ。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激。サイクリックＡＭＰを、所定のペプチドの添加および３７℃にて２０分間のインキュベーションの後に調製された細胞の酸抽出物中で測定した。図２Ａは、ＨＫＲＫＢ７細胞（黒丸；細胞当たり９５０，０００レセプター）およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞（白丸；細胞当たり２８０，０００レセプター）において、所定の濃度でのｈＰＴＨ（１−３４）に対する応答を示す。図２Ｂは、ｈＰＴＨ（１−３４）（白丸）、ｈＰＴＨ（１−３１）（白三角）、ｈＰＴＨ（３−３４）（黒三角）、ｈＰＴＨ（７−３４）（白四角）、ｈＰＴＨｒｐ（１−３６）（黒菱形）、およびｓＣＴ（白三角）に対するＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞における応答を示す。結果を、基準の倍数（ｆｏｌｄ  ｂａｓａｌ）として表した。各点は、３つ組の決定の平均±ＳＥＭを表す。
【図３】  ヒトレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてＰＴＨによるＰＬＣの最大活性化におけるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター密度の影響。基準のパーセントとして表した、ＩＰ3産生に対する最大増加は、ヒト（黒四角）およびラット（白四角）ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターの異なる密度を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞について示される。細胞を、この応答の最大活性を誘起する、１０００ｎＭの濃度でｈＰＴＨ（１−３４）で３０分間刺激した（図４Ｂを参照のこと）。各点は、３つ組で行った３実験の平均±ＳＥＭを示す。ＰＬＣ活性とレセプター発現との間の関連は、ラット（左）およびヒト（右）レセプターについて破線によって図示される。
【図４】  図４Ａ〜４Ｂ。ＨＫＲＫ  Ｂ７とＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞との間のＩＰ3産生の時間および用量依存性の比較。図４Ａは、所定の時間についてｈＰＴＨ（１−３４）（１０００ｎＭ）で刺激されたＨＫＲＫ  Ｂ７細胞（黒丸）およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞（白丸）を示す。図４Ｂは、３０分（ＨＫＲＫ  Ｂ７）または４分（ＨＫＲＫ  Ｂ２８）について所定の濃度でｈＰＴＨ（１−３４）で刺激した細胞を示す。結果は、基準のパーセントとして表され、そして各点は、３つ組で行われる３実験の平均±ＳＥＭである。
【図５】  図５Ａ〜５Ｄ。ヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒｐレセプターを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨに対する細胞質ゾルの遊離カルシウム応答。細胞質ゾルの遊離カルシウムを、細胞のｆｕｒａ  ２ＡＭロードしたコンフルエント単層で測定した。応答を、ｈＰＴＨ（１−３４）（図５Ａ）またはｈＰＴＨ（１−３１）（図５Ｂ）の添加後のＨＫＲＫ  Ｂ７細胞において；ｈＰＴＨ（１−３４）後のＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞（図５Ｃ）において；ならびにｈＰＴＨ（１−３４）後のＡＢ４５細胞（図５Ｄ）において測定した。基準の細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度およびこれらの細胞株におけるｓＣＴの添加後の濃度は、実質的には同一−すなわち、それぞれ２０〜５０ｎＭおよび４００〜５００ｎＭであった。示されたこれらの結果は、各細胞株での少なくとも５つの独立した実験の代表例である。
【図６】  図６Ａ〜６Ｂ。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞によるウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）分泌の刺激。ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーター活性を、ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞（図６Ａ）またはＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞（図６Ｂ）の馴化培地中で、以下のようなアゴニストの添加の１６時間後に測定した：ｈＰＴＨ（１−３４）（ｎＭで示される濃度）、８ＢｒｃＡＭＰ（１ｍＭ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、またはｓＣＴ（１０００ｎＭ）。結果は、標準として精製したヒトウロキナーゼを使用するＰｌｏｕｇ単位／ウェルで表される。各バーは、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を、１０以上の個々の実験で得た。
【図７】  プロテインキナーゼＡの優勢なネガティブ阻害を発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｕ−ＰＡ活性の刺激。ｕ−ＰＡの分泌を、ヒトＰＴＨＲおよびＲＥＶ  ＡＢ（ＰＫＡの優勢なネガティブインヒビター）を同時発現する、ＡＢ４５細胞へのアゴニストの添加の１６時間後に測定した。結果は、標準として精製したヒトウロキナーゼを使用するＰｌｏｕｇ単位／ウェルで表される。各点は、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を、少なくとも５実験から得た。
【図８】  ＨＫＲＫ  Ｂ７およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞におけるＰＴＨによるリン酸取り込みの調節。リン酸取り込みを、ビヒクル、ｈＰＴＨ／ＰＴＨｒｐペプチド（１０００ｎＭ）、８ＢｒｃＡＭＰ（１ｍＭ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、またはｓＣＴ（１０００ｎＭ）を含む無血清培地中での６時間のインキュベーション後にＨＫＲＫ  Ｂ７細胞（黒棒）およびＨＫＲＫ  Ｂ２８細胞（白棒）で測定した。予備実験（示さず）は、１０００ｎＭ以上の濃度でのｈＰＴＨ／ＰＴＨｒｐペプチドに対する最大応答を示した。結果は、基準のパーセントとして表され、そして各棒は、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭを示す。同様の結果を、少なくとも５つの個々の実験から得た。
【図９】  ＨＫＲＫ  Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）によるｕ−ＰＡ分泌の刺激。ウロキナーゼ型のＰＡ活性を、所定の濃度でのｈＰＴＨ（１−３４）（黒丸）またはｈＰＴＨ（１−３１）（白三角）の添加の１６時間後に測定し、そして、標準として、精製したヒトウロキナーゼを使用するＰｌｏｕｇ単位／ウェルで表した。各点は、３つ組みで行われた代表的実験の平均±ＳＥＭである。同様の結果を、少なくとも６つの個々の実験で得た。
【図１０】  ラットＰＴＨＲを発現するＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｈＰＴＨ（１−３１）およびｈＰＴＨ（１−３４）によるサイクリックＡＭＰ蓄積の刺激。サイクリックＡＭＰ蓄積を、細胞当たり３２０，０００ラットＰＴＨＲを発現するＥＷ５細胞におけるｈＰＴＨ（１−３４）（黒丸）またはｈＰＴＨ（１−３１）（白三角）に対する応答で測定した。結果は、基準の倍数として表される。
【図１Ａ】
0004261766.tif 000006
【図１Ｂ】
0004261766.tif 000007
【図２】
0004261766.tif 000008
【図３】
0004261766.tif 000009
【図４】
0004261766.tif 000010
【図５】
0004261766.tif 000011
【図６】
0004261766.tif 000012
【図７】
0004261766.tif 000013
【図８】
0004261766.tif 000014
【図９】
0004261766.tif 000015
【図１０】
0004261766.tif 000016