【手続補正書】
【提出日】平成25年2月20日(2013.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜７＞ 前記メラニン産生抑制剤の起源が、ショウガ科ショウガ属に属する植物より得られる植物抽出物であることを特徴とする、＜１＞〜＜６＞に記載のメラニン産生抑制剤。
＜８＞ 前記ショウガ科ショウガ属に属する植物が、ショウガ科ショウガ属ショウガであることを特徴とする、＜７＞に記載のメラニン産生抑制剤。
＜９＞ ＜１＞〜＜８＞に記載のメラニン産生抑制剤を含有することを特徴とする、組成物。
＜１０＞ ＜１＞〜＜８＞に記載のメラニン産生抑制剤を組成物全量に対し０．０００００１質量％〜２０質量％含有することを特徴とする、＜９＞に記載の組成物。
＜１１＞ 色素沈着予防又は改善用であることを特徴とする、＜９＞又は＜１０＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１２＞ 食品、医薬品又は化粧料であることを特徴とする、＜９＞〜＜１１＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１３＞ 皮膚外用剤であることを特徴とする、＜９＞〜＜１２＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１４＞ 下記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ここで前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に付いて述べれば、式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を表し、具体例を挙げれば、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基が好適に例示出来、より好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基が好適に例示出来る。また、前記nは、０〜２の整数を表し、より好ましくは、ｎ＝１である。前記一般式（１）に表される化合物及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩の内、より好ましいものとしては、前記一般式（２）又は（４）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が好適に例示出来る。さらに、前記一般式（２）に表される化合物の内、より好ましいものとしては、前記一般式（３）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が好適に例示出来、前記一般式（４）に表される化合物の内、より好ましいものとしては、前記一般式（５）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が好適に例示出来る。ここで前記一般式（１）に表される化合物の内、前記一般式（２）〜（５）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に含まれない化合物に関し、具体例を挙げれば、３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（３、４−ジメトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（３，４−ジメトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（４−エトキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（４−エトキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩等が好適に例示出来る。前記一般式（１）に表される化合物及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩の内、特に好ましい化合物を挙げれば、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が好適に例示出来る。かかる化合物は、優れたメラニン産生抑制作用を有する。また、製剤化に使用される極性又は非極性溶媒への溶解性、製剤中の安定性に優れ、製剤化が容易であるほか、皮膚貯留性に優れ、色素沈着予防又は改善等の美白作用を発揮する。さらに、天然物中に存在し、安全性にも優れる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
ここで前記一般式（２）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に付いて述べれば、式中、Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を表し、具体例を挙げれば、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が好適に例示出来、より好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基が好適に例示出来る。前記nは、０〜２の整数を表し、n＝１が、特に好ましい。前記一般式（２）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩の内、前記一般式（３）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に含まれない化合物を具体的に挙げれば、３−（３−エトキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（４−エトキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（３−ブチルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（３−ブチルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ブチルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、３−（３−ヘキシルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３−メチル−２−ブテニルエステル、３−（３−ヘキシルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ヘキシルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，６，９−トリメチルデカ−２，５，８−トリエニルエステル、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩等が好適に例示出来る。前記一般式（２）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩の内、好ましい化合物としては、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）、その異性体及び／又はそれらの薬理学��に許容される塩が好適に例示出来る。かかる化合物は、優れたメラニン産生抑制作用を有する。また、製剤化に使用される極性又は非極性溶媒への溶解性、製剤中の安定性に優れ、製剤化が容易であるほか、皮膚貯留性に優れ、色素沈着予防又は改善等の美白作用を発揮する。さらに、天然物中に存在し、安全性にも優れる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ここで前記一般式（４）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に付いて述べれば、式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を表す。具体例を挙げれば、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が好適に例示出来、より好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基が好適に例示出来る。前記一般式（４）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩の内、前記一般式（５）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に属さない化合物に関し、具体例を挙げれば、３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ヒドロキシ−４−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−エトキシ−３−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ブチルオキシ−３−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ヒドロキシ−４−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチル−２，６−ジエチルエステル、３−（４−ヘキシルオキシ−３−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチル−２，６−ジエルエステル、３−（３，４−ジメトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−メトキシ−４−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ブチルオキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−メトキシ−４−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヘキシルオキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３，４−ジエトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ブチルオキシ−３−エトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−エトキシ−４−ヘキシルオキシフェニル）アクリリックアシッド、３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−エトキシ−３−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ブチルオキシ−４−エトキシフェ��ル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−エトキシ−３−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−エトキシ−３−ヘキシルオキシフェニル）アクリリックアシッド、３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩等が好適に例示出来、より好ましくは、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が、特に好ましい。かかる化合物は、優れたメラニン産生抑制作用を有する。また、製剤化に使用される極性又は非極性溶媒への溶解性、製剤中の安定性に優れ、製剤化が容易であるほか、皮膚貯留性に優れ、色素沈着予防又は改善等の美白作用を発揮する。さらに、天然物中に存在し、安全性にも優れる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ここで前記一般式（５）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に付いて述べれば、式中、Ｒ６は、水素原子、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を表す。具体例を挙げれば、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が好適に例示出来、より好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基が好ましい。前記一般式（５）に表される化合物及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩に関し、具体例を挙げれば、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）、３−（３−エトキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−プロピルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ブチルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（４−ヒドロキシ−３−ペンチルオキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、３−（３−ヘキシルオキシ−４−ヒドロキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩等が好適に例示出来、より好ましくは、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が、特に好ましい。かかる化合物は、優れたメラニン産生抑制作用を有する。また、製剤化に使用される極性又は非極性溶媒への溶解性、製剤中の安定性に優れ、製剤化が容易であるほか、皮膚貯留性に優れ、色素沈着予防又は改善等の美白作用を発揮する。さらに、天然物中に存在し、安全性にも優れる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩は、新規化合物である。また、本発明の前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩よりなるメラニン産生抑制剤としては、単純な化学物質、又は、前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する植物由来の抽出物等の形態が好適に例示出来、かかる化合物又は植物抽出物を唯１種のみ含有することも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。ここで、植物由来の抽出物とは、植物抽出物自体、植物抽出物を分画、精製した分画、植物抽出物又は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。かかる植物抽出物の内、好ましいものとしては、ショウガ科ショウガ属に属する植物より得られる植物抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、ショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。ショウガ科ショウガ属ショウガは、熱帯アジア原産の世界中で栽培される多年草であり、日本においては、静岡、愛知、岡山等で食用又は生薬等として生産されており、生薬又は抽出物等の形態で市販されている。また、根茎は、ショウキョウと呼ばれ、生薬等に利用されている。このため、前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有するショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、日本において生育し、販売されているショウガの根茎（ショウキョウ）を溶媒抽出により得ることも出来る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
＜製造例１： 本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物の製造方法＞
本発明のショウガ科ショウガ属ショウガ（ショウキョウ）より得られる植物抽出物の製造方法を示す。本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、ショウガZingiber officinale Roscoe（Zingiberaceae)の根茎をエタノ−ルに浸漬し製造した。具体的には、ショウガ科ショウガ属ショウガ（ショウキョウ）を粗末にしたもの２００ｇに、希釈したエタノ−ル（３７〜５０vol％）約６００ｍLを加え、時々かき混ぜながら可溶性成分が充分に溶けるまで放置し、布ごしし、残留物を希釈したエタノ−ル（３７〜５０vol％）少量で洗い、圧搾し、浸出液及び洗液をあわせ、２日間放置し、濾過し、さらに希釈したエタノ−ル（３７〜５０vol％）を加え、本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物
全量１０００ｍLを製造した。本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、上記の製造例に記載の方法に準じ製造することも出来るし、丸善株式会社、一丸ファルコス株式会社、株式会社ウチダ和漢薬などにより市販されている抽出物を購入し、使用することも出来る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
前記抽出溶媒としては、ショウガ科に属する植物に含有される脂溶性成分を溶解することが出来る溶媒であれば、特段の限定なく適応することが出来、特に好ましくは、脂質可溶性溶媒である、メタノ−ル、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ルなどのアルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエ−テル類、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素類等から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などが好適に例示出来、日常的に摂取出来ることから、食品、化粧品などに適応することが好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与の何れもが可能であり、解毒（デトックス）の目的では、関連臓器への到達効率のよい経口投与を採用し、食品などの経口投与組成物の形態を採用することが好ましい。また、かかる成分が連続投与される場合、さらには安全性を考慮した場合、経皮的に投与されることが好ましい。皮膚に外用で適応されるものであれば特段の限定なく応用出来、例えば、医薬部外品を含む化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨等が好ましく例示できる。本発明の皮膚外用剤としては、皮膚に外用で適用されるものであれば、特段の限定無く使用することができ、例えば、化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨などが好適に例示でき、化粧料に適用することが特に好ましい。これは本発明の皮膚外用剤が、比類無き使用感の良さを有しているため、使用感が重要な化粧料に特に好適であるためである。化粧料としては、特段の限定はなく、例えば、エッセンス、乳液、クリ−ム等の基礎化粧料、アンダ−メ−クアップ、ファンデ−ション、チ−クカラ−、マスカラ、アイライナ−などのメークアップ化粧料、ヘアクリ−ムなどの毛髪化粧料などが好適に例示できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
＜製造例１： 本発明の前記一般式（１）に表される化合物（化合物１）の単離精製＞
市販のショウキョウ（乾燥品、刻み、株式会社ウチダ和漢薬）１．８（ｋｇ）を９（Ｌ）のメタノ−ル中で２時間加熱還流抽出を２回行い、濾過後２回分の濾液をあわせたものを、減圧下濃縮・乾燥し、ショウキョウメタノ−ルエキス１５９ｇを得た。ショウキョウメタノ−ルエキス１５９（ｇ）を１０％の水を含んだメタノ−ル溶液に溶解させ、ｎ−ヘキサンで液液分配抽出を行い、得られたｎ−ヘキサン画分を減圧下濃縮・乾燥し、ｎ−ヘキサンエキス６１．８（ｇ）を得た。ショウキョウｎ−ヘキサンエキス６１．８（ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（シリカゲル：Fuji Silysia PSQ１００Ｂ、６００ｇ）に付し、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液の比率を変えながら溶出させ、２８のフラクションに分画した。この内、２０番目のフラクション４（ｇ）をさらにTSK-gel ODS-80Ts（東ソ−株式会社製）カラムを装着した分取ＨＰＬＣにて分画精製を行い、化合物１（２６ｍｇ）を得た。化合物１の化学構造は、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲを測定した後、得られたNMRスペクトルデ−タの解析を行い、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリリックアシッド ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルエステル（化合物１）であることを確認した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
＜試験例１： メラニン産生抑制作用評価＞
本発明の化合物１及びショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。同時に、陽性対象としてハイドロキノンを用い、メラニン産生抑制作用を評価した。化合物１は、実施例１に記載の方法により単離精製した化合物１を、ショウガ科ショウガ属ショウガより得られた植物抽出物は、製造例１に記載の方法により製造した植物抽出物を使用した。２４穴プレ−トにヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を２２５００（cells/ｃｍ２）播種する。翌日、評価物質を含有する培地 ０．５（mL／well）に交換し、０．２５（μCi）２−[２−１４C]チオウラシル（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を添加し培養を継続した。播種４日後、培地を除去しPBSで１回プレ−トを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、３時間呈色反応を行った。反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−Benchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用い測定した。コントロ−ルとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する評価物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで１回プレ−トを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水を加え溶液をバイアルに移した。氷上に放置後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに１０％ＴＣＡ  ５００（μＬ）を添加し、氷上１５分間放置した。１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾ−ル−２（パ−キンエルマ−社）  １（ｍＬ）を添加し、液体シンチレ−ションカウンタ−  ＬＳＣ−６１００（アロカ社製）にて放射線量を測定した。コントロ−ルとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量（％）とした。メラニン産生量の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は、細胞毒性の認められない範囲でＳＡＳ software version 9.1.3（SAS Institute Inc.）を用い算出した。結果を表１及び表２に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
＜製造例２： 本発明のメラニン産生抑制剤を含有する皮膚外用剤の製造例１＞
下記の表３に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である、エッセンス化粧料を作製した。即ち、イ、ロ及びハの成分をそれぞれ７５℃に加熱し、イにロを徐々に加え乳化し、更に、ハを加え中和、増粘させ、攪拌冷却してエッセンスエマルション（化粧料１）を得た。また、表３の処方成分中、「本発明のメラニン産生抑制剤（化合物１）」を、「本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物」に置換した化粧料２、「本発明のメラニン産生抑制剤（化合物１）」を「アルブチン」に置換した比較例１、「本発明のメラニン産生抑制剤（化合物１）」を水に置換した比較例２を作製した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
＜製造例３： 本発明の皮膚外用剤の製造例２＞
表４に示した処方に従い、ロ−ション剤形の化粧料３を作製した。また、表４の処方成分中、「本発明のメラニン産生抑制剤（化合物１）」を、「本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物」に置換した化粧料４も作製した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
＜試験例２： ヒトにおける紫外線による色素沈着抑制効果＞
前記実施例に従い製造された化粧料１、化粧料２、比較例１及び比較例２の化粧料を用いて、色素沈着抑制効果を調べた。自由意思で参加したパネラーの上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を上下２段に分け、３ヶ所ずつ合計６ヶ所設け、最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を１日１回、３日連続して３回照射した。照射終了後１日より、１日１回２８日連続してサンプル５０μLを塗布した。１部位は無処置部位とした。塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ-３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、無処置部位のＬ値に対するΔＬ＊値を算出した。Ｌ＊値は、色素沈着の程度が強いほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きい程、色素沈着が抑制されたと判断することができる。結果を表５に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤である化粧料１及び化粧料２、比較例１は色素沈着抑制効果を示すことが分かる。また、化粧料１及び化粧料２の色素沈着抑制効果は、アルブチンを配合した比較例１に比べ優れていた。これは、化粧料１又は化粧料２に含有される前記化合物１又はショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物のメラニン産生抑制作用によると考えられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
＜製造例４： 本発明のメラニン産生抑制剤を含有する健康食品の製造＞
表６に示す処方に従い、健康食品１を作製した。即ち、処方成分を１０重量部の水と共に転動相造粒（不二パウダル株式会社製「ニュ−マルメライザ−」）し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。尚、表中の数値の単位は、重量部を表す。本健康食品は、優れたメラニン産生抑制効果を示していた。
【表６】
2011178762.tif 000001