【手続補正書】
【提出日】平成25年6月7日(2013.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ核酸分子であって、
領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化１】
2013138681.tif 000001
前記式中、
Ｃ＝Ｘ１およびＣ＝Ｘ２は、それぞれ独立して、ＣＨ２、ＣＯ、ＣＳまたはＣＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【請求項３】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）または式（５）の条件を満たす、請求項１または２記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【請求項４】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項３記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０  ・・・（１１）
【請求項５】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項３または４記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
【請求項６】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項７】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項８】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記式（Ｉ）の構造との結合が、下記（１）または（３）の条件を満たす、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【請求項９】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項２から８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１の原子個数（ｎ）とＬ２の原子個数（ｍ）との合計（ｍ＋ｎ）が、０〜３０の範囲である、請求項２から９のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）の構造が、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）のいずれか一つであり、下記式において、ｎは、０〜３０の整数、ｍは、０〜３０の整数、ｑは、０〜１０の整数である、請求項２から１０のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化３】
2013138681.tif 000002
【請求項１２】
前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４である、請求項１１記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１３】
前記式（Ｉ−４）が、下記式（Ｉ−４ａ）であり、前記式（Ｉ−８）が、下記式（Ｉ−８ａ）である、請求項１２記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【化４】
2013138681.tif 000003
【請求項１４】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１５】
標識物質を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１６】
安定同位体を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１７】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子において、塩基数の合計が、５０塩基以上である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１８】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１９】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２１】
炎症治療用である、請求項２０記載の薬学組成物。
【請求項２２】
非ヒト動物において、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２３】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項２２記載の発現抑制方法。
【請求項２４】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項２３記載の発現抑制方法。
【請求項２５】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２７】
非ヒト動物において、標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする誘導方法。
【請求項２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする誘導方法。
【請求項２９】
非ヒト動物の疾患の治療方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例における安定性を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例におけるｓｓＲＮＡに対するダイサータンパク質の反応性を示す電気泳動の結果である。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例における２９３細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１４】図１４（Ａ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１４（Ｂ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるリボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるＳ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図１７】図１７は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図１８】図１８は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１９】図１９は、参考例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２０】図２０は、参考例におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、参考例におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２２】図２２は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２３】図２３は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
本発明の組成物において、前記ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を効率よくデリバリーできる。前記ｓｓＰＮ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。