(57)【要約】  下式の重水素化されたヌクレオシドアナログ2016518359.tif 000053およびその薬学的に許容可能な塩が、本開示によって提供される。本開示は、この式の化合物または塩と担体とを含む医薬組成物も含む。この式の化合物および塩は、ＨＣＶ感染を含め、ウイルス感染を治療するのに有用である。ヌクレオシドまたはヌクレオチドの５’位に、少なくとも５０％の濃縮度を有する重水素を含む有効な治療量のヌクレオシドまたはヌクレオチドを投与することを含む、Ｃ型肝炎または他の障害に罹患した宿主を治療するための方法も提示される。
2016518359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉが下記である、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１】
2016518359.tif 000040
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素またはＤであり；Ｄとして表されるそれぞれの位置は、少なくとも５０％の重水素濃縮を有する）。
【請求項２】
下記式の請求項１に記載の化合物または塩：
【化２】
2016518359.tif 000041
【請求項３】
下記式の請求項２に記載の化合物または塩：
【化３】
2016518359.tif 000042
【請求項４】
下記式の請求項２に記載の化合物または塩：
【化４】
2016518359.tif 000043
【請求項５】
Ｄとして表されるそれぞれの位置が、少なくとも９０％の重水素濃縮を有する、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項６】
Ｄとして表されるそれぞれの位置が、少なくとも９５％の重水素濃縮を有する、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項７】
混合物が下記を含む、請求項２の化合物の立体異性体の５０／５０混合物：
【化５】
2016518359.tif 000044
【請求項８】
請求項２に記載の化合物または塩である活性薬剤を含み、さらに、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
１つ以上のさらなる活性薬剤を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
１つ以上のさらなる活性薬剤が、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤、または前記の組み合わせである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
１つ以上のさらなる活性薬剤が、ＮＳ５Ａ阻害剤、ならびに、ソバプレビルおよびＡＣＨ−２６８４の少なくとも１つである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療に有効な量の請求項２に記載の化合物または塩を患者に投与することを含む、患者のＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１３】
治療に有効な量の請求項８に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者のＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１４】
治療に有効な量の第１の活性薬剤および治療に有効な量の１つ以上のさらなる活性薬剤を患者に投与することを含み、第１の活性薬剤が、請求項１に記載の化合物または塩であり、１つ以上のさらなる活性薬剤が、ＮＳ３阻害剤およびＮＳ５Ａ阻害剤から選択される、患者のＨＣＶ感染を治療する方法。
【請求項１５】
治療に有効な量の請求項２に記載の化合物または塩を患者に投与することを含む、患者のＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅウイルス感染を治療する方法であって、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅウイルス感染は、デング熱、ウエストナイルウイルス感染、黄熱、または牛ウイルス性下痢ウイルス感染から選択される、方法。
【請求項１６】
下記式の化合物の製造方法であって、
【化６】
2016518359.tif 000045
（ｉ）Ｌ−アラニンイソプロピルエステルであるアミノエステル（１００）と、ジクロロホスフェート（２００）
【化７】
2016518359.tif 000046
とを反応させて反応混合物を形成すること、
（ｉｉ）（ｉ）の反応混合物に、Ｒ−ＬＨ（式中、Ｌは、ＳまたはＯであり、Ｒは、置換されていてもよいアリール基、ヘテロアリール基またはヘテロシクロアルキル基である）、またはＲ−ＬＨ（Ｒ−ＬＨは、Ｎ−ヒドロキシイミドである）を加え、中間体（３００）：
【化８】
2016518359.tif 000047
を形成すること、かつ
（ｉｉｉ）中間体（３００）とヌクレオシド（４００）
【化９】
2016518359.tif 000048
とを反応させ、
【化１０】
2016518359.tif 000049
を形成することを含み、ここで、Ｄとして表されるそれぞれのＤ位置は、少なくとも５０％の重水素濃縮を有する、方法。
【請求項１７】
下記式の化合物を製造するための請求項１６に記載の方法であって、
【化１１】
2016518359.tif 000050
中間体３００は、以下の構造
【化１２】
2016518359.tif 000051
を有する、方法。
【請求項１８】
アミノエステル（１００）と、ジクロロホスフェート（２００）とを−２０℃未満の温度で混合し、
Ｒ−ＬＨは下記から選択される、
【化１３】
2016518359.tif 000052
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アミノエステル（１００）と、ジクロロホスフェート（２００）とを−４０℃〜約−６０℃の温度で混合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
アミノエステル（１００）とジクロロホスフェート（２００）との混合物に塩基を加える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
塩基がトリエチルアミンであり、混合物への塩基の添加が、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、またはテトラヒドロフランから選択される有機溶媒中で行われる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月１２日に出願された米国仮出願第６１／８１１，４６４号の利益を主張するものであり、この出願の全開示内容は引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
概算で世界の人口の３％がＣ型肝炎ウイルスに感染している。世界保健機関は、世界中で１億５千万人が慢性的に感染していると概算している。ＨＣＶに曝露しているものの中で、８０％〜８５％は、慢性的に感染するようになり、少なくとも３０％に肝硬変が進行し、１〜４％に肝細胞癌が進行する。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、米国における慢性肝疾患の最も多い原因の１つであり、報告によると、急性ウイルス性肝炎の約１５％、慢性肝炎の６０〜７０％、肝硬変、末期の肝疾患および肝癌の５０％までを占めている。慢性ＨＣＶ感染は、米国、オーストラリアおよび欧州の大部分における肝臓移植の最も一般的な原因である。Ｃ型肝炎は、米国において１年に１０，０００〜１２，０００人が死亡すると概算される。ＨＣＶ感染の急性段階は、通常は、穏やかな症状に関係があるが、いくつかの証拠は、感染した人々の約１５〜２０％しか、自然にＨＣＶを排泄しないことを示唆している。
【０００３】
ＨＣＶは、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属として分類される。ＨＣＶの少なくとも４種類の株ＧＴ−１〜ＧＴ−４が特性決定されている。ＨＣＶの生活環は、宿主細胞への侵入；ＨＣＶゲノムの翻訳、ポリタンパク質の処理およびレプリカーゼ複合体の集合；ＲＮＡの複製；ビリオンの集合および放出を含む。ＲＮＡ複製プロセスにおいて、ゲノムＲＮＡの相補性のネガティブ鎖コピーが作られる。ネガティブ鎖コピーは、さらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡを合成するためのテンプレートとして使用され、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡは、翻訳、複製、パッケージング、またはこれらの組み合わせに関与し、前駆体ウイルスを生成する可能性がある。
【０００４】
Ｃ型肝炎には、薬物治療の標的とされてきたいくつかのタンパク質が存在する。ＮＳ５Ａは、亜鉛結合性のプロリンが豊富な親水性ホスホタンパク質であり、固有の酵素活性を有さず、特定の非ヌクレオチド化合物を用いて阻害することができる。ＮＳ５Ｂは、テンプレートとしてウイルス性ポジティブＲＮＡ鎖を用いてＨＣＶウイルス性ＲＮＡを複製するときに主要な役割を果たす鍵となる酵素であり、合成ヌクレオシド誘導体を用いて阻害されてきた。ＮＳ２−３プロテアーゼは、非構造的なタンパク質であるＮＳ２とＮＳ３のタンパク質分解性開裂を担う酵素である。ＮＳ３プロテアーゼは、下流にある非構造的なタンパク質の開裂を担う。ＲＮＡヘリカーゼは、ＡＴＰ加水分解によってＲＮＡをほどく。
【０００５】
ソホスブビル（ソバルディ、以下の構造を参照）は、ヌクレオシドホスホルアミデートＮＳ５Ｂ阻害剤であり、ＨＣＶ治療について２０１３年１２月に承認されている。承認されたラベリングは、以下の用法を推奨している。（ｉ）遺伝子型２および３に対して、リバビリンと組み合わせて、１日に１回、４００ｍｇの経口錠剤、（ｉｉ）遺伝子型１および４に対して、リバビリンおよびペグ化インターフェロンと共に、１日に１回、４００ｍｇの経口錠剤（三重の組み合わせ治療）。ソホスブビルによる治療は、遺伝子型１、２および４では１２週間続き、遺伝子型３では２４週間続く。肝臓移植を待つ肝細胞癌を有する慢性Ｃ型肝炎患者の治療に対し、ソホスブビルをリバビリンと共に４８週まで、または移植後ＨＣＶ感染を防ぐための肝臓移植まで使用することもできる。ＦＤＡは、試験参加者の５０〜９０％において、１２週間のウイルス持続陰性化（ＳＶＲ）を示すいくつかの大きな臨床試験からのデータに基づき、ソバルディ優先審査および画期的な治療の指定が付与された。「ＳＶＲ１２」を達成する患者は、通常、治癒したとみなされる。
【化１】
2016518359.tif 000003
【０００６】
Ａｌｉｏｓ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．は、２０１１年６月に、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．に対し、Ｃ型肝炎治療のためのＡＬＳ−２２００のライセンスを付与した。ＡＬＳ−２２００は、キラルリン立体中心でのジアステレオマー混合物である。１種類のジアステレオマーＶＸ−１３５は、Ｖｅｒｔｅｘによって開発され、現在、第ＩＩ相の臨床試験中である。この企業は、ＶＸ−１３５の化学構造を開示していないが、ウリジンヌクレオチドアナログプロドラッグおよびＮＳ５Ｂ阻害剤であると言われている。２０１３年に、ＦＤＡは、高用量のＶＸ−１３５を摂取した３人の患者が肝毒性を示した後、ＶＸ−１３５を部分臨床差し止めとした。毒性を避けるためにヌクレオチド阻害剤の用量を下げると、効能を損なうか、または効能が下がることもある。Ｖｅｒｔｅｘは、２０１４年１月に、ダクラスタビル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  ＮＳ５Ａ阻害剤）と組み合わせたＶＸ−１３５が第２ａ相の治験を終了したことを発表した。ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ分析において、ダクラタスビルと組み合わせて２００ｍｇのＶＸ−１３５を摂取した、治療ナイーブの遺伝子型１に感染した個人において、治療終了から４週間のウイルス持続陰性化（ＳＶＲ４）は、８３％であった（１２人のうち１０人）。１人の患者は、嘔吐／吐き気の重篤な有害事象を示した。残りの１１人の患者は、１２週間の治療を終了し、治療終了率（ＳＶＲ４）は、９１％であった。
【０００７】
Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．は、ウリジンヌクレオチドプロドラッグＮＳ５Ｂ阻害剤であるＣ型肝炎治療のためのＩＤＸ２１４３７を開発中である。化学構造の詳細は、今日まで発表されていない。２０１４年４月には、Ｉｄｅｎｉｘは、１日に１回、３００ｍｇのＩＤＸ２１４３７を７日間投与することによって、１８人の遺伝子型１、２または３の治療ナイーブの患者において、４．２〜４．３  ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬのウイルス負荷の平均最大減少をもたらすことを発表した。
【０００８】
Ｃ型肝炎治療の領域の進行にかかわらず、多くの困難な失敗が生じてきた。ＢＭＳ−９８６０９４（Ｃ型肝炎のためのグアノシン系ホスホルアミデート）は、２０１２年８月に心不全に起因する患者の死後、臨床試験から除外された。その後、ＢＭＳは、２０１３年に、Ｃ型肝炎の研究分野から撤退することを発表した。ＢＭＳの断薬後、Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの同様のＮＳ５Ｂ阻害剤ＩＤＸ  １９３６８は、同じ活性代謝物ＢＭＳ−９８６０９４を共有し、臨床中断され、最終的に中止された。この結果は、同じ適応症のためのヌクレオチドプロドラッグＩＤＸ１８４の開発の以前の臨床中断および中止と同じであった。
【０００９】
Ｃ型肝炎に対する有効な治療は、単薬治療中のウイルス耐性の発生に起因して、組み合わせ治療を含むことが知られている。開発中の最適なＣ型肝炎薬剤の示されている課題と、複数の最適な薬剤が効果的な治療に必要であるという事実から、さらなるＣ型肝炎のための強い必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
驚くべきことに、水素に対する重水素の濃縮が少なくとも９０％であり、Ｒ１およびＲ２が、独立して、重水素または水素である、式Ｉの２’−メチル  ５’−重水素化されたウリジンホスホルアミデート（式ＩＩ、式ＩＩＡ、式ＩＩＢ、式ＩＩＩＡまたは式ＩＩＩＢを含む）、またはその薬学的に許容可能な塩が、Ｃ型肝炎の治療のための優れたＮＳ５Ｂ阻害剤であることが発見された。一実施態様において、Ｒ１は重水素であり、Ｒ２は水素である。
【化２】
2016518359.tif 000004
【００１１】
従って、一実施態様において、有効な量の式Ｉまたは式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、場合により薬学的に許容可能な担体で投与することを含む、Ｃ型肝炎または本明細書に記載する別の障害に感染した宿主を治療するための方法が提供される。
【００１２】
別の実施態様において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢのヌクレオシド誘導体は、リンのＲ立体異性体またはＳ立体異性体として投与され、少なくとも９０％が純粋な形態であり、典型的には、９５、９８または９９％が純粋な形態である。
【００１３】
一実施態様は、リンのＲ立体異性体またはＳ立体異性体の混合物、例えば、５０／５０混合物として投与される、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢのヌクレオシド誘導体も含む。例えば、式ＩＩＡおよびＩＩＢの混合物（例えば、５０／５０混合物）を投与してもよい。
【００１４】
別の実施態様において、有効な量の式ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、場合により、薬学的に許容可能な担体で、Ｃ型肝炎治療が必要な宿主に提供される。
【００１５】
宿主に投与すると、例えば、式ＩＩのホスホルアミデートは、一連の酵素工程によって、５’−ＯＨ，５’−Ｄ，Ｄ−モノホスフェート（式Ｖ）に代謝される。
【化３】
2016518359.tif 000005
【００１６】
例えば、式ＩＩは、ヌクレオシドモノホスフェート（式Ｖ）を介し、その活性種であるヌクレオシドトリホスフェート（式ＩＶ）に変換される。または、ヌクレオシドモノホスフェート（式Ｖ）は、脱ホスホリル化を受け、５’−重水素化された２’−Ｃ−メチルウリジン（式ＶＩ）になることができる。５’−重水素化されたヌクレオシドトリホスフェート（式ＩＶ）は、Ｃ型肝炎ウイルス複製を阻害する薬理学的活性な代謝物であり、一方、５’−重水素化された２’−Ｃ−メチルウリジン（式ＶＩ）は、ヌクレオシドモノホスフェートキナーゼのための良好な基質ではないため、ほとんど活性を示さない。
【００１７】
５’−重水素化されたヌクレオシドモノホスフェート（式Ｖ）は、ホスホリル化されると、５’−重水素化されたヌクレオシド（式ＶＩ）を生成し、重水素化されていないヌクレオシドモノホスフェート（式ＶＩＩＩ）は、重水素化されていない２’−Ｃ−メチルウリジン（式ＩＸ）を精製するだろう。
【化４】
2016518359.tif 000006
【００１８】
驚くべきことに、ヌクレオシドの５’位の重水素が、ヌクレオシド誘導体を望ましくない５’−ＯＨ、５’−重水素化された−ヌクレオシドへの脱ホスホリル化から安定化されることを発見した。このことは、重水素原子は、脱ホスホリル化中に開裂せず、脱ホスホリル化中に開裂した原子に結合しないため、驚くべきことである。本開示は、ありそうになく予想外に重要な第２の重水素同位体効果によって、代謝および効能に対する顕著な効果を発生させるための５’−重水素の使用を含む。５’位の脱モノホスフェート化に対するこのような重要な第２の重水素同位体効果は、以前に報告されていない。脱ホスホリル化に対するヌクレオシドの５’−モノホスフェートの安定性を高めることによって、ヌクレオシドの活性な５’−トリホスフェート保持量の増加を達成することができ、臨床において、所与の経口投薬量で効能を増加させることができるか、または低用量のヌクレオシドを用いて等しい効能を得ることができる。この薬物の半減期、従って、薬物動態に対する顕著な効果も有しているだろう。
【００１９】
従って、別の実施態様において、本開示は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドで治療可能な障害に罹患した宿主を治療するための方法を含み、改良点は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの５’位の水素の片方または両方を重水素で置換することを含み、プロチウムと比べ、濃縮が少なくとも９０％である（すなわち、１Ｈ水素が１０％未満）（および他の実施態様において、５０、９５、９８または９９％の濃縮）。活性代謝物が、ヌクレオシドの５’重水素化によるヌクレオシドのモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである場合、５’重水素化によって、ヌクレオシドモノホスフェートの保持量が増えるため、任意のヌクレオチドまたはヌクレオシドの治療効果を向上させることができる。ヌクレオシドモノホスフェートは、対応するヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、次いでヌクレオシドトリホスフェートキナーゼを用い、そのジホスフェート体および／またはトリホスフェート体に代謝される。この方法は、特に、簡単にモノホスホリル化されず、従って、脱ホスホリル化されたときにかなりの活性を失い、ヌクレオシドモノホスフェートキナーゼの作用によって簡単に回収することができないヌクレオシドに有用である。
【００２０】
一実施態様において、障害は、ウイルス性疾患である。別の実施態様において、障害は、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎である。さらに別の実施態様において、障害は、ＨＩＶである。別の実施態様において、障害は、異常な細胞増殖である。さらに別の実施態様において、障害は、腫瘍または癌である。この改良された方法で使用されるヌクレオシド誘導体は、例えば、ホスホルアミデート、または５’−モノホスフェートに代謝される他の安定化されたヌクレオチドプロドラッグであってもよく、または５’−モノホスフェート自体であってもよい。一実施態様において、ヌクレオシド誘導体は、２’−α−メチル、２’−β−ヒドロキシヌクレオシドを含む。さらに別の実施態様において、ヌクレオシド誘導体は、２’−α−メチル、２’−β−フルオロヌクレオシドを含む。任意の実施態様では、メチル基は、１つ以上のハロゲン、例えば、フッ素であってもよい。
【００２１】
ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）は、肝細胞におけるウイルス複製を阻害する活性種であり、そのレベルと固有の有効性によって、治療の有効性が引き起こされる。
【００２２】
５’重水素化の使用によって生じる臨界的なヌクレオシドトリホスフェートレベルの増加を示すことを、以下の実施例１３で提供する。この実施例では、式ＩＩの化合物および対応する重水素化されていない化合物（式ＶＩＩ）を、新鮮な肝細胞中で２４時間インキュベートした。このデータは、重水素化されていないホスホルアミデートと共にインキュベートしたサンプル中に、５’−重水素化されたホスホルアミデートを用いた場合よりも多くの脱ホスホリル化されたヌクレオチド（すなわち、望ましくない５’−ＯＨヌクレオシド）が存在することを示す。具体的には、２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない対応物である式ＶＩＩを用いると（０．６７百万の細胞／ウェルで２４時間接種した肝細胞を含む１２ウェルプレート（１ｍｌ））、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．９倍（培地、すなわち、細胞外濃度）および２．９倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化された２’−メチルウリジン（式ＩＸ）が得られる。２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない対応物（式ＶＩＩ）のインキュベーションの結果（１．７百万の細胞／ウェルで２４時間接種した肝細胞を含む６ウェルプレート（２ｍｌ））は、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．５倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内濃度）および２．８倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化された２’−メチルウリジン（式ＩＸ）が得られる。従って、平均で、肝細胞の脱ホスホリル化によって、５’−位置が重水素化されていない場合、ほぼ２倍の５’−ＯＨ−ヌクレオシドが生成する。５’−重水素化されたホスホルアミデートが使用される場合、トリホスフェートに対する活性化に利用可能な５’−モノホスフェート保持量のこの違い（例えば、重水素化されていない態様について式ＶＩＩＩ）は、薬物の効能、投薬量、毒性および／または薬物動態に顕著な効果を有するだろう。
【００２３】
実施例１４および図３にさらに記載されるような臨床試験候補物質との比較として、Ａｌｉｏｓ（ＥＡＳＬ  ２０１３）によって提示される広告 (poster)は、５０μＭのＶＸ−１３５と共に２４時間インキュベートした後のヒト肝細胞で測定されたＶＸ−１３５トリホスフェートのレベルは、１１７４ｐｍｏｌ／細胞１００万個であることを示す。対照的に、５μＭ（すなわち、低い方の濃度の１０倍）の式ＩＩと共にヒト肝細胞を２５時間インキュベートした後の式ＩＶのレベルは、４８６ｐｍｏｌ／細胞１００万個である。従って、式ＩＩのインキュベートによって作られるトリホスフェートの量は、ＶＸ−１３５によって作られるトリホスフェートの量よりも４倍大きい（用量が正規化された）。ＶＸ−１３５の正確な構造は現時点で知られていないが、ウリジンヌクレオチドアナログプロドラッグＮＳ５Ｂ阻害剤である。
【００２４】
それに加え、初代肝細胞において、５０ｎＭの式ＩＩを２４時間インキュベートした後、式ＩＶのレベルは、９．２〜１６．２ｐｍｏｌ／細胞１００万個の範囲であった。これらの濃度は、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞を５０ｎＭでインキュベートしたときに得られた値より５〜８倍大きい。式ＩＶが、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞中のＨＣＶレプリコンの複製を阻害する活性種であるため、ＨＣＶレプリコンが初代肝細胞で成長する場合、初代ヒト肝細胞中の式ＩＩの予想されたＥＣ５０は、６．２５〜１０ｎＭであると思われ、式ＩＩと式ＩＶの間に図４で得られる線形の関係がもっと低い濃度で続くことを推定している。
【００２５】
実施例１４および図５に詳細に示されるように、式ＩＶの半減期は、４種類の種からの肝細胞のソバルディトリホスフェートの半減期より大きい。最も長い半減期は、ヒト肝細胞であり、その後、イヌ、次いで、サル、次いで、ラットであった。半減期は、式ＩＶについて１０〜３０時間の範囲であり、ソバルディトリホスフェートについて８〜２３時間の範囲であった。
【００２６】
さらに、実施例１７および図６および７に記載されるように、４８時間、ヒト肝細胞で測定される場合、対応するソバルディトリホスフェート（ＧＳ−７９７７）への細胞内での変換は、式ＩＩ（すなわち、式ＩＶ）から誘導されるトリホスフェートの変換よりも２倍大きいが、式ＩＶの濃度は、４８時間目でもまだ増加しており、一方、ソバルディトリホスフェート代謝物は、２４時間から４８時間まで減少する。式ＩＶの濃度が増加すると、その半減期が２４時間を超えることと合わせて、繰り返し投薬で肝細胞中の式ＩＶ（式ＩＩのトリホスフェート）レベルの蓄積を示唆する。この傾向は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初期投薬から馴化まで量を上げていった後、ソバルディトリホスフェートよりも式ＩＩから誘導されるトリホスフェートについて、ｉｎ  ｖｉｖｏで式ＩＶの高い濃度での一定状態を生じさせることができる。それに加え、式ＩＶ（式ＩＩのトリホスフェート）の固有の有効性（ＮＳ５ＢのＲｄＲｐ活性に対する阻害効果）は、ソバルディトリホスフェートの固有な有効性より１．５倍高い。
【００２７】
本開示は、治療に有効な量の１つ以上の本明細書に記載される活性化合物を、場合により、患者に相加的または相乗的な効果を有する１つ以上の他の抗−ＨＣＶ活性薬剤または他の医学的治療との組み合わせまたは交互投与で与えることを含む、患者のＨＣＶ感染または関連する障害を治療する方法も含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ヒト肝細胞培地、および２０μＭの式ＶＩＩまたは式ＩＩと共にインキュベートした後の細胞抽出物における式ＩＸ（重水素化されていない５’−ＯＨ  ２’−メチルウリジン）および式ＶＩ（５’−重水素化された−５’−ＯＨ  ２’−メチルウリジン）の濃度を示す表である。具体的には、実施例１３に記載されるように、２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない式ＶＩＩの対応物（２４時間、０．６７百万細胞／ウェルで接種した肝細胞を含む１２ウェルプレート（１ｍｌ））によって、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．９倍（培地、すなわち、細胞外濃度）および２．９倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化２’−メチルウリジン（式ＩＸ）が得られる。
【図２】図２は、ヒト肝細胞培地、および２０μＭの式ＶＩＩまたは式ＩＩと共にインキュベートした後の細胞抽出物における式ＩＸ（重水素化されていない５’−ＯＨ  ２’−メチルウリジン）および式ＶＩ（５’−重水素化された−５’−ＯＨ  ２’−メチルウリジン）の濃度を示す表である。実施例１３に記載されるように、２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない式ＶＩＩの対応物（２４時間、１．７百万細胞／ウェルで接種した肝細胞を含む６ウェルプレート（２ｍｌ））によって、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．５倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内濃度）および２．８倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化２’−メチルウリジン（式ＩＸ）が得られる。
【図３】図３は、５μＭの式ＩＩと共にインキュベートしてから２、４、８、２５または４８時間目に、ヒト肝細胞で作られる式ＩＶ（式ＩＩの活性な重水素化されたトリホスフェート代謝物）の濃度（ｐｍｏｌ  式ＩＶ／細胞１００万個）を示す表である。それぞれの時間点について決定された平均および標準偏差と共に、３つの実験の結果が示される。式ＩＶのピークレベルは、ヒト肝細胞で４８時間を超えて得られた。ＶＸ−１３５から作られたＶＸ−１３５−ＴＰ（活性なトリホスフェート代謝物）の濃度は、２４時間目に示される。実施例１４に記載されるように、式ＩＩから作られるトリホスフェート（式ＩＶ）のレベルは、ＶＸ−１３５から作られるトリホスフェート（ＶＸ−１３５−ＴＰ）のレベルより４倍大きく、このことは、ＶＸ−１３５は、式ＩＩよりも効力が低いことを示唆している。
【図４】図４は、ヒト肝細胞における式ＩＶの濃度（ｎｇ／ｍｌ）  対  式ＩＩの濃度（μＭ）のグラフである。ヒト肝細胞における式ＩＶの濃度は、０．１５、０．４５および１．３５μＭの式ＩＩと共にインキュベートしてから２４時間後に決定された。
【図５】図５は、ヒト、イヌ、サルおよびラット肝細胞における活性なトリホスフェート（式ＩＶまたはＧＳ−７９７７−ＴＰ）の半減期を示す表である。式ＩＩまたはＧＳ−７９７７（ソバルディ）を、選択した濃度で肝細胞（ヒト、イヌ、サルおよびラット）に加え、３７℃でインキュベートした。式ＩＶまたはＧＳ−７９７７−ＴＰ（活性なトリホスフェート代謝物）の上澄み細胞抽出物を、タンデム質量分光検出を備える高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。実施例１５に記載されるように、トリホスフェートの半減期の値は、８〜３０時間の範囲であり、式ＩＶは、一般的に、試験したすべての種でＧＳ−７９７７−ＴＰより長い半減期を有していた。（ａ−カッコ内の値＝９５％信頼区間）。
【図６】図６は、５μＭの式ＩＩと共に４８時間インキュベートしている間のヒト肝細胞に作られた式ＩＶの濃度（式ＩＩの活性な重水素化されたトリホスフェート代謝物）のグラフである（ｐｍｏｌ  式ＩＶ／細胞１００万個）。濃度を所定の時間に測定し、ＡＵＣは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウエアを用いて計算された。実施例１６に記載されるように、式ＩＶのピークレベルは、ヒト肝細胞において、２４時間目に得られた。
【図７】図７は、５μＭのＧＳ−７９７７（ソバルディ）と共に４８時間インキュベートしている間のヒト肝細胞に作られたＧＳ−７９７７−ＴＰ（ソバルディの活性なトリホスフェート代謝物）の濃度のグラフである（ｐｍｏｌ  ＧＳ−７９７７−ＴＰ／細胞１００万個）。濃度を所定の時間に測定し、ＡＵＣは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウエアを用いて計算された。実施例１６に記載されるように、ＧＳ−７９７７（ソバルディの活性なトリホスフェート代謝物）のピークレベルは、ヒト肝細胞において、４８時間を超えて得られた。
【発明の具体的説明】
【００２９】
（化学的記載および用語）
化合物は、標準的な命名法を用いて記載される。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、量の限定を意味するものではなく、少なくとも１つの参照物の存在を示す。用語「または」は、「および／または」を意味する。オープンエンドの遷移句である「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、その中間的な遷移句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」およびクローズドエンドの句である「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を包含する。値の範囲の引用は、本明細書で特に示されない限り、単に、その範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に言及する短い方法として用いることを意図しており、それぞれの別個の値は、まるで本明細書に個々に引用されているように、引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。すべての範囲の終点は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。特に本明細書に別段の記載がない限り、または、本文と明確に矛盾しない限り、本明細書に記載されるすべての方法は、適切な順序で行うことができる。任意の例およびすべての例、または例示的な語句（例えば、「例えば」）の使用は、単に説明を意図しており、特に請求されていない限り、本発明の範囲に限定を与えない。明細書中のいかなる語句も、請求されていない要素が本発明の実施に不可欠な要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。
【００３１】
式Ｉの化合物は、式Ｉの範囲内である本明細書に開示される他の式を含む。これらとしては、例えば、式ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよび化合物２２の化合物が挙げられる。
【００３２】
式Ｉの化合物としては、任意の位置に同位体置換を有する、上記式の化合物が挙げられる。同位体としては、同じ原子数を有するが、異なる質量数を有する原子が挙げられる。一般的な例として、限定されないが、水素の同位体としては、トリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃが挙げられる。式Iの化合物は、同定された位置での重水素の濃縮も必要とする（水素原子を重水素と置換）。
【００３３】
「活性薬剤」は、患者に単独で、または別の化合物、元素または混合物と組み合わせて投与される場合、直接的または間接的に、患者に対する生理学的効果を与える化合物（本明細書に開示される化合物を含む）、元素または混合物である。間接的な生理学的効果は、代謝物または他の間接的な機構によって行われてもよい。
【００３４】
用語「置換された」は、本明細書で使用される場合、示されている原子の通常の価数を超えない限り、示されている原子または基の任意の１つ以上の水素を、所定の群からの選択肢と置き換えることを意味する。
【００３５】
「重水素化」および「重水素化された」は、特定の位置での水素が重水素と置き換わっていることを意味する。ある位置が重水素化された式Ｉの化合物のサンプルにおいて、式Ｉの化合物のある別個の分子は、所定の位置に重水素ではなく水素を有するようである。しかし、サンプル中、所定の位置に重水素を有する式Ｉの化合物の分子の割合は、天然に存在するよりもかなり多いだろう。重水素化された位置で、重水素が濃縮される。「濃縮された(enriched)」という用語は、本明細書で使用される場合、その位置での重水素種と他の水素種との割合を指す。一例として、式Ｉの化合物のある位置が、５０％の重水素濃縮(deuterium enrichment)を含むと言われる場合、所定の位置で水素以外の重水素含有量が５０％であることを意味する。明確さのために、「濃縮された(enriched)」という用語は、本明細書で使用される場合、割合が、天然存在量よりも濃縮されていることを意味しないことを確認する。一実施態様において、式Ｉの重水素化された化合物は、任意の重水素化された位置で少なくとも１０％の重水素濃縮を有するだろう。他の実施態様において、特定の重水素化された１つ以上の位置で、少なくとも５０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の重水素濃縮を有するだろう。「重水素化された置換基」は、特定の割合の濃縮で少なくとも１つの水素が重水素と置き換わった置換基である。「重水素化されていてもよい(optionally deuterated)」は、その位置が、水素であってもよく、その位置の重水素の量が、天然に存在する重水素のレベルしかないか、または、その位置が、天然に存在する重水素のレベルよりも多くなるように重水素が濃縮されていることを意味する。
【００３６】
「投薬形態」は、活性薬剤の投与単位を意味する。投薬形態の非限定的な例としては、錠剤、カプセル、注射、懸濁物、液体、静脈用液、エマルション、クリーム、軟膏、坐剤、吸入可能な形態、経皮形態などが挙げられる。
【００３７】
「アリール」は、１つ以上の芳香族環に炭素のみを含む芳香族基を示す。アリール基としては、例えば、フェニルおよびナフチル（１−ナフチルおよび２−ナフチルを含む）が挙げられる。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、所定の数の環原子を有し、１〜３個、またはある実施態様では、１〜２個のＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子を含み、残りの環原子が、炭素である安定な単環芳香族環、または１〜３個、またはある実施態様では、１〜２個のＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子を含み、残りの環原子が、炭素である少なくとも１つの５員環〜７員環の芳香族環を含む安定な二環系または三環系を示す。単環ヘテロアリール基は、典型的には、５〜７個の環原子である。ある実施態様では、二環ヘテロアリール基は、９員環〜１０員環のヘテロアリール基である。ヘテロアリール基のＳ原子およびＯ原子の合計数は、２以下であることが好ましい。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、ピリジル、ピリミジニルおよびピローリルが挙げられる。
【００３９】
「ヘテロシクロアルキル」は、１、２、３または４個のＮ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子を有し、残りの環原子が炭素である飽和環基である。単環ヘテロシクロアルキル基は、典型的には、４〜６個の環原子を有する。ヘテロシクロアルキル基の例としては、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニルおよびピロリニルが挙げられる。
【００４０】
「医薬組成物」は、少なくとも１つの活性薬剤、例えば、本明細書に開示される活性化合物の化合物または塩と、少なくとも１つの他の物質、例えば、担体とを含む組成物である。医薬組成物は、１つ以上のさらなる活性薬剤を含んでいてもよい。「医薬の組み合わせ」または「組み合わせ治療」は、場合により、活性薬剤を、障害、例えば、Ｃ型肝炎、またはＣ型肝炎と関連する障害、または本明細書に記載される別のウイルス感染を治療するために一緒に用いられる指示と共に、１つの投薬形態で合わせてもよく、または別個の投薬形態で一緒に与えられてもよい、少なくとも２つの活性薬剤の投与を指す。
【００４１】
「薬学的に許容可能な塩」は、元々の化合物が、その無機および有機の非毒性の酸付加塩または塩基付加塩を製造することによって改質される、開示された化合物の誘導体を含む。従来の化学方法によって、塩基性部分または酸性部分を含む元々の化合物から、元々の化合物の塩を合成することができる。一般的に、これらの化合物の遊離酸形態と、化学量論量の適切な塩基（例えば、Ｎａ、Ｃａ、ＭｇまたはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）とを反応させることによって、またはこれらの化合物の遊離塩基形態と、化学量論量の適切な酸とを反応させることによって、このような塩を製造することができる。このような反応は、典型的には、水中または有機溶媒中、または２種類の混合物中で行われる。薬学的に許容可能な塩は、純粋な結晶または単一の多型形態であってもよく、または非結晶性またはアモルファス製、ガラス状、または硝子質形態、またはこれらの混合物で使用してもよい。代替的な実施態様において、活性化合物は、溶媒和物の形態で与えられてもよい。
【００４２】
薬学的に許容可能な塩の例としては、限定されないが、塩基残基（例えば、アミン）の鉱物酸または有機酸の塩；酸性残基（例えば、カルボン酸）のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。薬学的に許容可能な塩としては、生成した元々の化合物の従来の非毒性の塩および四級アンモニウム塩、例えば、非毒性の無機酸または有機酸からの塩が挙げられる。例えば、従来の非毒性の酸塩としては、無機酸から誘導されるもの、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩など；および有機酸から製造された塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、パモ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、メシル酸塩、エシル酸塩、ベシル酸塩、スルファニル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、フマル酸塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、シュウ酸塩、イセチオン酸塩、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎが０〜４である）などが挙げられる。さらなる適切な塩のリストは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ｐ．１４１８（１９８５）中に見つかるだろう。
【００４３】
医薬組成物／組み合わせに適用される用語「担体」は、活性化合物が提供される希釈剤、賦形剤または補形薬（ビークル(vehicle)）を意味する。
【００４４】
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、一般的に安全であり、十分に非毒性であり、生理学的に、または他の様式で望ましくないわけではない医薬組成物／組み合わせを製造するときに有用な賦形剤を意味する。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本出願で使用される場合、このような１種類の賦形剤および１種類より多い賦形剤の両方を含む。
【００４５】
本発明の医薬組成物／組み合わせの「治療に有効な量」は、患者に投与される場合、医療の利益（例えば、症状の改善）を与えるのに有効な量、例えば、Ｃ型肝炎感染の症状を減らすのに有効な量を意味する。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者は、ＡＳＴおよびＡＬＴを含め、特定の高レベルの肝臓酵素が存在する場合がある。特定の実施態様において、従って、治療に有効な量は、増加したＡＳＴおよびＡＬＴのレベルの顕著な低下を与えるのに十分な量、またはＡＳＴおよびＡＬＴのレベルを正常な範囲内に戻すのに十分な量である。または、治療に有効な量は、患者の血液、血清または組織のウイルスまたはウイルス抗体の検出可能なレベルを顕著に増やすか、または顕著に減らすことを防ぐのに十分な量でもある。治療の効能を決定する１つの方法は、ウイルスＲＮＡレベルを決定するための従来の方法（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＴａｑＭａｎアッセイ）によってＨＣＶ  ＲＮＡレベルを測定することを含む。特定の好ましい実施態様では、治療は、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを、定量限界未満まで下げる（Ｒｏｃｈｅ  ＴａｑＭａｎ（Ｒ）アッセイで測定される場合、３０ＩＵ／ｍＬ）か、またはより好ましくは、検出限界まで下げる（１０ＩＵ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ  ＴａｑＭａｎ）。
【００４６】
「患者」または「宿主」は、医学的処置が必要なヒトまたは非ヒト動物である。医学的処置としては、既存の状態、例えば、疾患または障害の処置、予防的または抑止的な処置、または診断的処置が挙げられるだろう。特に述べられていない限り、患者または宿主は、ヒト患者である。
【００４７】
（高活性のヌクレオシド誘導体）
驚くべきことに、水素に対する重水素の濃縮が少なくとも９０％であり（すなわち、Ｈ１水素が１０％未満）、Ｒ１およびＲ２が、独立して、重水素または水素である、式Ｉの２’−メチル  ５’−重水素化されたウリジンホスホルアミデート（式ＩＩ、式ＩＩＡ、式ＩＩＢ、式ＩＩＩＡまたは式ＩＩＩＢを含む）、またはその薬学的に許容可能な塩が、Ｃ型肝炎または本明細書に開示される他の障害の治療のための優れたＮＳ５Ｂ阻害剤であることが発見された。一実施態様において、Ｒ１は重水素であり、Ｒ２は水素である。
【化５】
2016518359.tif 000007
【００４８】
式ＩＩは、立体異性体の混合物を含む。例えば、式ＩＩは、式ＩＩの立体異性体の５０／５０混合物を含み、混合物は、
【化６】
2016518359.tif 000008
を含む。
【００４９】
従って、一実施態様において、有効な量の式Ｉまたは式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、場合により薬学的に許容可能な担体で(in a pharmaceutically acceptable carrier)投与することを含む、Ｃ型肝炎または本明細書に記載する関連する障害に感染した宿主を治療するための方法が提供される。
【００５０】
代替的な実施態様において、５’−重水素の一方または両方は、独立して、少なくとも５０％の濃縮を表す。別の実施態様において、濃縮は、独立して、少なくとも７５％または８０％である。別の実施態様において、５’−重水素の片方または両方は、独立して、少なくとも９０％、９５％または９８％の濃縮を表す。
【００５１】
別の実施態様において、式ＩまたはＩＩのヌクレオシド誘導体は、リンのＲ立体異性体またはＳ立体異性体として投与され、少なくとも９０％が純粋な形態であり、典型的には、９５、９８または９９％が純粋な形態であるか、または、リンキラル中心立体異性体の混合物（例えば、リンキラル中心立体異性体の５０／５０混合物、またはリンキラル中心でのＲとＳの立体異性体の比率が１０：９０〜９０：１０または３０：７０〜７０：３０の混合物）として投与される。
【００５２】
別の実施態様において、有効な量の式ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、場合により薬学的に許容可能な担体で、Ｃ型肝炎の治療、または本明細書に開示されるような別の治療を必要とする宿主に提供される。
【化７】
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【００５３】
驚くべきことに、ヌクレオシドの５’位の重水素が、ヌクレオシド誘導体を望ましくない５’−ＯＨ、５’−重水素化された−ヌクレオシドへの脱ホスホリル化から安定化させることを発見した。このことは、重水素原子は、脱ホスホリル化中に開裂せず、脱ホスホリル化中に開裂した原子に結合しないため、驚くべきことである。従って、５’−重水素は、離れた予想外の重要な第２の重水素同位体効果によって、代謝および効能に対する顕著な効果を与えることができる。５’位の脱モノホスフェート化に対するこのような重要な第２の重水素同位体効果は、以前に文献で報告されていない。脱ホスホリル化に対するヌクレオシドの５’−モノホスフェートの安定性を高めることによって、ヌクレオシドの活性な５’−トリホスフェート保持量の増加が達成され、所与の経口投薬量で効能を増加させることができるか、または低用量のヌクレオシドを用いて等しい効能を得ることができる。この薬物の半減期、従って、薬物動態に対する顕著な効果も有しているだろう。
【００５４】
本開示は、ウイルス性疾患を治療するためのホスホロチオアミデートヌクレオシドを記載する、２０１２年３月２２日に公開され、Ａｌｉｏｓ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．に属する米国特許出願公開第２０１２／００７１４３４号；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／３６，４３５）に開示される化合物と比較して、顕著な向上を与える。ヌクレオシド  ５’−ホスフェートにおいて、酸素を硫黄と置き換えると、ヌクレオチダーゼまたは他の加水分解作用に対してホスフェートを安定化させることが知られており、このことは、１９８０年代に開発されたアンチセンスおよびアプタマーの安定化化学におけるホスホロチオエートおよび他のチオホスフェート誘導体の使用の基礎を成す。一般的に、他の参考文献の中で、Ｐｅａｒｓｏｎ、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅｓ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ−ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９８５）、２３０、５０３−５０７を参照。アリオス(Ａｌｉｏｓ)によって開示される化合物の１つは、以下である。
【化８】
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【００５５】
ホスホロチオアミデート６０３７の開裂から生じるモノチオホスフェート代謝物は、安定化する非天然の硫黄原子の存在に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、さらに、遊離５’−ヒドロキシヌクレオシドへの酵素による分解から安定化されるだろう。従って、５’位での重水素の安定化効果は、硫黄によって隠される。さらに、Ｈｉｎｔ１酵素（モノホスフェート式Ｖおよびモノチオホスフェートの、それぞれのプロドラッグからの生成も担う酵素）によって、ヌクレオシドモノチオホスフェートをヌクレオシドモノホスフェートに加水分解し、Ｈ２Ｓを放出することも知られており、生理学的効果および病的な効果を生じ得る（Ｏｚｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０、２８５、４０８０９を参照）。
【００５６】
本発明によって提供される顕著な改良は、驚くべきことに、毒性を最低限にし、天然の化合物をもっと密接に模倣する様式で、もっと多くの天然ホスホルアミデートを用い、すなわち、硫黄を用いずに５’重水素化すると、モノホスフェートから遊離ヒドロキシル基にさらに分解されるのを防止するという発見である。これが自明でない発明であるという事実は、ゾバルディを開発した企業であるＰｈａｒｍａｓｓｅｔ，Ｉｎｃ．に属する米国公開第２０１１／０２５１１５２号（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．  １３／０７６，５５２）のレビューに顕著に強調されている。この刊行物の１６ページに、このヌクレオシドに対する経験を積んだ企業が、ゾバルディの６種類の異なる種の重水素化の使用を記載しているが、現在、最も重要な位置であると決定された５’位に重水素を配置することは考えていなかった。
【００５７】
（治療方法）
本開示は、薬学的に許容可能な塩として、有効な量の式Ｉの高活性のヌクレオシド誘導体の１つを、場合により薬学的に許容可能な塩として、場合により薬学的に許容可能な担体中に含む、Ｃ型肝炎または本明細書に記載される別の障害に感染した宿主（典型的には、ヒト）を治療する方法を提供する。
【００５８】
別の実施態様において、場合により薬学的に許容可能な塩として、場合により薬学的に許容可能な担体中の有効な量の本明細書に記載される高活性のヌクレオシド誘導体の１つを使用し、限定されないが、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に以下に記載される障害を含め、Ｃ型肝炎と関連する二次的な状態を有する宿主（典型的には、ヒト）を治療してもよい。
【００５９】
本開示は、有効な量の式Ｉの化合物または薬学的に許容可能な塩をＣ型肝炎ウイルスに感染した患者に与えることによる、Ｃ型肝炎感染を含め、患者のウイルス感染を治療する方法を提供する。式Ｉの化合物または塩を唯一の活性薬剤として与えてもよく、または、１つ以上の別の活性薬剤と一緒に与えてもよい。特定の実施態様において、式Ｉの化合物または塩を、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、ＮＳ５Ａ阻害剤、ＮＳ５Ｂ阻害剤、または上の組み合わせと一緒に投与される。
【００６０】
有効な量の本開示の医薬組成物／組み合わせは、（ａ）Ｃ型肝炎の進行を阻害し；（ｂ）Ｃ型肝炎感染を回復させ；または（ｃ）ＨＣＶウイルスまたはＨＣＶ抗体が、以前に感染した患者の血液または血漿において検出することができないように、Ｃ型肝炎感染を治癒させるのに十分な量であってもよい。Ｃ型肝炎の進行を阻害するか、または回復させるのに有効な医薬組成物／組み合わせの量は、Ｃ型肝炎の症状の悪化を止め、またはＣ型肝炎ウイルスに感染した患者が経験した症状を減らすのに有効な量を含む。または、Ｃ型肝炎の進行を止めるか、または回復することは、この疾患のいくつかのマーカーのいずれかによって示されるだろう。例えば、Ｃ型肝炎のウイルス負荷の増加または減少がないこと、または患者の血液中に循環するＨＣＶ抗体の数の増加または減少がないことは、Ｃ型肝炎感染の進行を止めるか、または回復するマーカーである。他のＣ型肝炎疾患マーカーとしては、アミノトランスフェラーゼレベル、特に、肝臓酵素のＡＳＴおよびＡＬＴのレベルが挙げられる。ＡＳＴの正常なレベルは、５〜４０単位／血清（血液の液体部分）のリットル数であり、ＡＬＴの正常なレベルは、７〜５６単位／血清のリットル数である。これらのレベルは、典型的には、ＨＣＶ感染患者では高いだろう。疾患の回復は、通常は、ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルが正常な範囲に戻ることによって示される。
【００６１】
さらに別の実施態様において、有効な量の本明細書に記載される高活性のヌクレオシド誘導体の１つを、場合により薬学的に許容可能な塩として、場合により薬学的に許容可能な担体中で、Ｃ型肝炎と関連する二次的な状態をもたらすＣ型肝炎感染を有する宿主（典型的にはヒト）を撃退するか、または予防するための予防法として使用してもよい。代替的な実施態様において、場合により薬学的に許容可能な担体中にある、有効な量の本明細書に記載される高活性のヌクレオシド誘導体の１つを、場合により薬学的に許容可能な塩として、限定されないが、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に記載される障害を含め、Ｃ型肝炎と関連する二次的な状態を治療するために使用してもよい。
【００６２】
（ｉ）リンパ球のＣ型肝炎ウイルスの刺激に起因する、異常な抗体（低温型グロブリンと呼ばれる）を産生する低温型グロブリン血症。これらの抗体は、小さな血管に堆積し、皮膚、関節および腎臓（糸球体腎炎）を含む体中の組織の血管の炎症（脈管炎）を引き起こす場合がある。
【００６３】
（ｉｉ）Ｃ型肝炎と関連するＢ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂリンパ球のＣ型肝炎ウイルスによる過剰な刺激によって引き起こされると考えられ、リンパ球の異常な再生を生じる。
【００６４】
（ｉｉｉ）皮膚の状態、例えば、扁平苔癬および晩発性皮膚ポルフィリン症は、Ｃ型肝炎感染と関係がある。
【００６５】
（ｉｖ）正常な肝細胞が、瘢痕または異常な組織と置き換わる疾患である硬変。Ｃ型肝炎は、肝硬変の最も一般的な原因の１つである。
【００６６】
（ｖ）一般的に肝硬変によって引き起こされる腹腔内の流体の蓄積である腹水症であり、Ｃ型肝炎感染によって引き起こされることがある。
【００６７】
（ｖｉ）肝細胞癌、米国の症例の５０％が、現在、慢性Ｃ型肝炎感染によって引き起こされる。
【００６８】
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎に関連する黄疸、増加したビリルビンによって引き起こされる黄変である。
【００６９】
（ｖｉｉｉ）血小板減少症は、多くは、Ｃ型肝炎患者でみられ、骨髄の阻害、肝臓トロンボポエチン産生の減少および／または自己免疫機構の結果であろう。多くの患者において、Ｃ型肝炎が進行するにつれて、血小板数が低下し、骨髄のウイルス阻害および抗血小板抗体の増加が起こる。有効な量の本開示の医薬組成物／組み合わせによって治療可能なＣ型肝炎に関連する他の症状および障害としては、肝機能の低下、疲労、流感様の症状、熱、寒気、筋肉の痛み、関節痛および頭痛、吐き気、特定の食物に対する嫌悪感、説明できない体重減少、鬱病を含む精神障害、および腹部の圧痛が挙げられる。
【００７０】
本明細書に提示される活性化合物を使用し、例えば、Ｃ型肝炎に一般的に関連する肝機能を高めることもできる。合成機能としては、例えば、血清タンパク質（例えば、アルブミン、凝固因子、アルカリホスファターゼ、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパルテートトランスアミナーゼ）、５’−ヌクレオシダーゼ、グルタミニルトランスペプチダーゼなど）のタンパク質の合成、ビリルビンの合成、コレステロールの合成および胆汁酸の合成；炭水化物の代謝、アミノ酸およびアンモニアの代謝、ホルモン代謝および脂質代謝を含む、肝臓の代謝活性；外因性薬物の解毒；および内臓および門脈の血行を含む、血行機能が挙げられる。
【００７１】
本明細書に開示される医薬組成物／組み合わせは、患者のＣ型肝炎感染以外のウイルス感染を治療するのにも有用である。代替的な実施態様において、感染は、ＲＮＡウイルス感染、例えば、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、またはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅウイルス感染であってもよい。本開示は、有効な量の本明細書に開示される活性化合物の１つを、トガウイルス、ピコルナウイルス、コロナウイルスまたはフラビウイルスに感染した被検体に投与することによる、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、またはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅのウイルス感染を治療する方法を含む。Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅウイルス感染としては、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ、ＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓおよびＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属のウイルスによる感染が挙げられる。Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ感染としては、黄熱、デング熱、ウエストナイルウイルス、脳炎（セントルイス脳炎、日本Ｂ脳炎、カリフォルニア脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、ロシア春夏脳炎およびＭｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ脳炎、Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ疾患およびＰｏｗａｓｓａｎ疾患が挙げられる。Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ感染としては、主に、家畜の疾患が挙げられ、ブタのブタ熱、ウシのＢＶＤＶ（牛ウイルス性下痢ウイルス）およびＢｏｒｄｅｒ疾患ウイルス感染を含む。Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ感染としては、Ｃ型肝炎およびイヌＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓが挙げられる。トガウイルス感染としては、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ脳炎ウイルス、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ脳炎ウイルス、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ脳炎ウイルス、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒウイルス、Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇウイルス、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ  ＦｏｒｅｓｔウイルスおよびＲｕｂｅｌｌａウイルスが挙げられる。ピコルナウイルス感染としては、Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ、Ａｑｕａｍａｖｉｒｕｓ、Ａｖｉｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ、Ｃｏｓａｖｉｒｕｓ、Ｄｉｃｉｐｉｖｉｒｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｂｏｖｉｒｕｓ、Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ、Ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ、Ｍｅｇｒｉｖｉｒｕｓ、Ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ、Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ、Ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ、Ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ、ＴｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓおよびＴｒｅｍｏｖｉｒｕｓ属のウイルスでの感染が挙げられる。コロナウイルス感染としては、Ａｌｐｈａコロナウイルス、Ｂｅｔａコロナウイルス（重篤な急性呼吸器コロナウイルス（ＳＡＲＳ）を含む）、ＧａｍｍａコロナウイルスおよびＤｅｌｔａコロナウイルス属のウイルスによる感染が挙げられる。本開示は、特に、デング熱、ウェストナイル熱、黄熱またはＢＶＤＶ（牛ウイルス性下痢ウイルス）を治療するのに有用な本開示の化合物を含む組成物、およびウイルスに感染した患者に化合物を投与することによる、これらの感染を治療する方法を含む。
【００７２】
本開示は、以下の処置方法も含む。（ｉ）有効な治療量のヌクレオシドまたはヌクレオチドの５’位で少なくとも５０％濃縮された重水素を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドを投与することを含む、Ｃ型肝炎に罹患した宿主を治療するための方法。（ｉｉ）ヌクレオチドが、チオホスフェートまたはチオホスフェートプロドラッグでない、方法（ｉ）のような治療方法。（ｉｉｉ）改良点は、５’−重水素化されたヌクレオシドまたはヌクレオチドとしてヌクレオシドまたはヌクレオチドを投与することを含む、有効な量のヌクレオシドまたはヌクレオチドで治療可能な、障害に罹患した宿主の治療のための方法。（ｉｖ）ヌクレオチドが、チオホスフェートまたはチオホスフェートプロドラッグではない、（ｉ）の治療方法。（ｖ）濃縮が少なくとも９０％である、（ｉ）の治療方法。（ｖｉ）５’位に２個の重水素が存在する、（ｉ）の治療方法。（ｖｉｉ）ヌクレオチドが、チオホスフェートまたはチオホスフェートプロドラッグではない、（ｉｉｉ）の治療方法。（ｖｉｉｉ）濃縮が少なくとも９０％である、（ｉｉｉ）の治療方法。（ｖｉｉｉ）５’位に２個の重水素が存在する、請求項２３に記載の方法。
【００７３】
（組み合わせ治療）
本開示は、本明細書に記載される活性化合物と、少なくともさらなる活性薬剤とを含む医薬組成物および組み合わせ、およびＣ型肝炎または本明細書に記載される別の障害に感染した患者にこのような組成物を投与することを含む、治療法も含む。特定の実施態様において、さらなる活性薬剤は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤またはＨＣＶ  ＮＳ５Ａまたは別のＮＳ５Ｂ阻害剤である。
【００７４】
非限定的な実施態様において、本開示の活性なＨＣＶ化合物を、カスパーゼ阻害剤、シクロフィリン阻害剤、チトクロムＰ４５０モノオキシゲアーゼ阻害剤、エントリー阻害剤、グルココルチコイド、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ヘマトポエチン、ホメオパシー治療、免疫調整化合物、免疫抑制剤、インターロイキン、インターフェロンまたはインターフェロンエンハンサー、ＩＲＥＳ阻害剤、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログ、またはプロドラッグ、非ヌクレオシド阻害剤、ＮＳ４Ｂ阻害剤、ＮＳ５Ａ阻害剤、ＮＳ５Ｂ阻害剤、Ｐ７タンパク質阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡｉ化合物、治療ワクチン、ＴＮＦ  アゴニスト、チューブリン阻害剤、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体モジュレーター、またはＴＬＲアゴニストである活性化合物の１つ以上と組み合わせて、またはこれらと交互に投与してもよい。
【００７５】
これらのカテゴリーの活性薬剤の非限定的な例は、以下のとおりである。
カスパーゼ阻害剤：ＩＤＮ−６５５６（Ｉｄｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
【００７６】
シクロフィリン阻害剤：例えば、ＮＩＭ８１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＣＹ−６３５（Ｓｃｙｎｅｘｉｓ）およびＤＥＢＩＯ−０２５（Ｄｅｂｉｏｐｈａｒｍ）。
【００７７】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ阻害剤：リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、クロメチアゾール、シメチジン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、ネファドゾン、セルトラリン、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、サクイナビル、ロピナビル、デラビルジン、エリスロマイシンおよびＶＸ−４９７（Ｍｅｒｉｍｅｂｏｄｉｂ）。好ましいＣＹＰ阻害剤としては、リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリンおよびクロメチアゾールが挙げられる。
【００７８】
エントリー阻害剤：ＩＴＸ−５０６１（ｉＴｈｅｒＸ）。
【００７９】
グルココルチコイド：ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾンおよびデキサメタゾン。
【００８０】
ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤：例えば、ソバプレビルおよびＡＣＨ−２６８４。ＡＢＴ−４５０（Ａｂｂｏｔｔ）、ＡＣＬ−１８１およびＡＶＬ−１９２（Ａｖｉｌａ）、ＢＭＳ−０３２（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ（Ｍｅｒｃｋ）、ダノプレビル（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＳ−９２５６（Ｇｉｌｅａｄ）、ＧＳ−９４５１（Ｇｉｌｅａｄ）、Ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ（ＶＸ−９５０、Ｖｅｒｔｅｘ）、ＶＸ−９８５（Ｖｅｒｔｅｘ）、Ｓｉｍｅｐｒｅｖｉｒ（ＴＭＣ４３５、Ｔｉｂｏｔｅｃ）、Ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ（アンプレナビルのプロドラッグ、Ｇｌａｘｏ／Ｖｅｒｔｅｘ）、インジナビル（ＣＲＩＸＩＶＡＮ、Ｍｅｒｃｋ）、ＴＭＣ４３５３５０（Ｔｉｂｏｔｅｃ／Ｍｅｄｉｖｉｒ）、Ｆａｌｄａｐｒｅｖｉｒ（ＢＩ  ２０１３３５．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＰＨＸ−１７６６（Ｐｈｅｎｏｍｉｘ）、Ｖａｎｉｐｒｅｖｉｒ（ＭＫ−７００９、Ｍｅｒｃｋ）、ナラプレビル（ＳＣＨ９００５１８、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ＭＫ−５１７２  （Ｍｅｒｃｋ）。
【００８１】
ヘマトポエチン：ヘマトポエチン−１およびヘマトポエチン−２。ヘマトポエチンスーパーファミリーの他のメンバー、例えば、種々のコロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、ＥｐｏおよびＳＣＦ（幹細胞因子）。
【００８２】
ホメオパシー治療：ミルクシスル、シリビニン、チョウセンニンジン、グリチルリチン、カンゾウ根、マツブサ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチンおよびセレン。
【００８３】
免疫調節化合物：サリドマイド、ＩＬ−２、ヘマトポエチン、ＩＭＰＤＨ阻害剤、例えば、Ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、インターフェロン（天然インターフェロン（例えば、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ、ＶｉｒａｇｅｎおよびＳＵＭＩＦＥＲＯＮ、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、天然インターフェロンのブレンド）、天然インターフェロンα（ＡＬＦＥＲＯＮ、Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）、リンパ芽球細胞Ｂのインターフェロンα−ｎｌ（ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、経口αインターフェロン、Ｐｅｇ−インターフェロン、Ｐｅｇ−インターフェロンα２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ、Ｒｏｃｈｅ）、組み換えインターフェロンα２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ、Ｒｏｃｈｅ）、吸入されるインターフェロンα２ｂ（ＡＥＲＸ、Ａｒａｄｉｇｍ）、Ｐｅｇ−インターフェロンα２ｂ（ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、組み換えインターフェロンα２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ  Ａ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ペグ化インターフェロンα２ｂ（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ、ＶＩＲＡＦＥＲＯＮＰＥＧ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、インターフェロンβ−１ａ（ＲＥＢＩＦ、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ，Ｉｎｃ．およびＰｆｉｚｅｒ）、コンセンサスインターフェロンα（ＩＮＦＥＲＧＥＮ、Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ）、インターフェロンγ−１ｂ（ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ、Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、ペグ化されていないインターフェロンα、αインターフェロンおよびそのアナログおよび合成チモシンα１（ＺＡＤＡＸＩＮ、ＳｃｉＣｌｏｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）およびλインターフェロン（ＢＭＳ）。
【００８４】
免疫抑制剤：シロリムス（ＲＡＰＡＭＵＮＥ、Ｗｙｅｔｈ）。
【００８５】
インターロイキン：（ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α）および他の低分子量因子（例えば、ＡｃＳＤＫＰ、ｐＥＥＤＣＫ、胸腺ホルモンおよびミニサイトカイン）。
【００８６】
インターフェロンエンハンサー：ＥＭＺ７０２（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【００８７】
ＩＲＥＳ阻害剤：ＶＧＸ−４１０Ｃ（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａ）。
【００８８】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体：ＸＴＬ−６８６５（ＨＥＰＸ−Ｃ、ＸＴＬ）、ＨｕＭａｘ−ＨｅｐＣ（Ｇｅｎｍａｂ）、Ｃ型肝炎免疫グロブリン（ヒト）（ＣＩＶＡＣＩＲ、Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＸＴＬ−００２（ＸＴＬ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＩＤＥＣ）、ＧＳ−６６２４（Ｇｉｌｅａｄ）。
【００８９】
ヌクレオシドアナログ：ソホスブビル（ＰＳＩ−７９７７、Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ  ａｎｄ  Ｇｉｌｅａｄ）、ＰＳＩ−７８５１（Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ）、ＰＳＩ−７９７７（Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ）、Ｒ７１２８（メリシタビン、Ｒｏｃｈｅ）、Ｒ７３４８（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＭ２８３（バロピシタビン、Ｉｄｅｎｉｘ）、ＧＳ−６６２０（Ｇｉｌｅａｄ）、ＴＭＣ−６４９（Ｔｉｂｏｔｅｃ）、ＶＸ−１３５（Ｖｅｒｔｅｘ、Ａｌｉｏｓ）、ＡＬＳ−２２００（Ａｌｉｏｓ）、ＩＤＸ１８４（Ｉｄｅｎｉｘ）、ＩＤＸ２１４３７（Ｉｄｅｎｉｘ）、ＩＤＸ２１４５９（Ｉｄｅｎｉｘ）、Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ（ＥＰＩＶＩＲ、３ＴＣ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＭＫ−０６０８（Ｍｅｒｃｋ）、ザルシタビン（ＨＩＶＩＤ、Ｒｏｃｈｅ  ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、リバビリン（ＣＯＰＥＧＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＥＢＥＴＯＬ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ＶＩＬＯＮＡ（ＩＣＮ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＶＩＲＡＺＯＬＥ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを含む）、イサトリビン（Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＮＡ２４５（Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびビラミジン（ＩＣＮ）、リバビリンのアミジンプロドラッグ。ヌクレオシドアナログの組み合わせを使用してもよい。
【００９０】
非ヌクレオシド阻害剤：ＰＳＩ−６１３０（Ｒｏｃｈｅ／  Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ）、ＡＢＴ−３３３およびＡＢＴ−０７２（Ａｂｂｏｔｔ）、デラビルジン（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−８６８５５４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＧＳＫ−８５２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、セトロブビル（ＡＮＡ−５９８、Ａｎａｄｙｓ）、ＶＸ−２２２（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＢＩ−１２７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＢＭＳ−３２５（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ）。
【００９１】
ＮＳ４Ｂ阻害剤：クレミゾール（Ｅｉｇｅｒ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【００９２】
ＮＳ５Ａ阻害剤：ダクラタスビル（ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ）、ＡＺＤ−７２９（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＰＩ−４６１（Ｐｒｅｓｉｄｉｏ）、ＰＰＩ−６８８（Ｐｒｅｓｉｄｉｏ）、サマタスビル（ＩＤＸ７１９、Ｉｄｅｎｉｘ）、レジパスビル（ＧＳ−５８８５、Ｇｉｌｅａｄ）、ＧＳ−５８１６（Ｇｉｌｅａｄ）、オムビタスビル（ＡＢＴ−２６７、ＡｂｂＶｉｅ）、ＧＳＫ２３３６８０５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびエルバスビル（ＭＫ−８７４２、Ｍｅｒｃｋ）。
【００９３】
ＮＳ５Ｂ阻害剤：ＭＢＸ−７００（Ｍｉｃｒｏｂｏｔｉｘ／Ｍｅｒｃｋ）、ＲＧ−９１９０、ＶＸ−２２２（Ｖｅｒｔｅｘ）およびＢＭＳ−７９１３２５（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。
【００９４】
Ｐ７タンパク質阻害剤：アマンタジン（ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ、Ｅｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【００９５】
ポリメラーゼ阻害剤：ＡＮＡ５９８（Ａｎａｄｙｓ）、Ｔｅｇｏｂｕｖｉｒ（ＧＳ  ９１９０、Ｇｉｌｅａｄ）。
【００９６】
ＲＮＡ干渉：ＳＩＲＮＡ−０３４  ＲＮＡ（Ｓｉｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【００９７】
治療ワクチン：ＩＣ４１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ）、ＧＩ  ５００５（Ｇｌｏｂｅｉｍｍｕｎｅ）、Ｃｈｒｏｎｖａｃ−Ｃ（Ｔｒｉｐｅｐ／  Ｉｎｏｖｉｏ）。
【００９８】
ＴＮＦアゴニスト：アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ、Ａｂｂｏｔｔ）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ、Ａｍｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｙｅｔｈ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）。
【００９９】
チューブリン阻害剤：コルヒチン。
【０１００】
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体調節剤：ＦＴＹ７２０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【０１０１】
ＴＬＲ  アゴニスト：ＴＬＲ７アゴニスト（Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＰＧ１０１０１（Ｃｏｌｅｙ）、およびＣＰＧ  ７９０９（Ｃｏｌｅｙ）を含むＴＬＲ９アゴニスト。
【０１０２】
ワクチン：ＨＣＶ／ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＣ４１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ）。
【０１０３】
例えば、ある実施態様において、さらなる活性薬剤は、ソバプレビルまたはＡＣＨ−２６８４（ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤）および／またはＮＳ５Ａ阻害剤である。
【０１０４】
本開示は、さらなる活性薬剤が
【化９】
2016518359.tif 000011
である組成物を含む。
【０１０５】
本明細書に記載される医薬組成物および組み合わせに有用なＮＳ３プロテアーゼ阻害剤は、例えば、２０１１年３月１５日に発行された米国特許第７，９０６，６１９号にすでに開示されており、４−アミノ−４−オキソブタノイルペプチドに関する教示について、その全体が引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。６１９号特許は、本明細書に記載される式Ｉの化合物との組成物／組み合わせに有用な化合物を開示する、第５０欄に始まり、第８５欄に続く実施例の章が特に引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。
【０１０６】
２０１０年８月２６日に公開された米国特許出願第２０１０−０２１６７２５号は、４−アミノ−４−オキソブタノイルペプチドに関する教示について、その全体が引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。７２５号出願は、本明細書に記載される式Ｉの化合物との組成物／組み合わせに有用な化合物を開示する、２２ページに始まり、１００ページに続く実施例の章が特に引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。
【０１０７】
２０１０年６月１７日に公開された、公開された米国特許出願第２０１０−０１５２１０３号は、４−アミノ−４−オキソブタノイルペプチドの環状アナログに関する教示について、その全体が引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。１０３号出願は、本明細書に記載される式Ｉおよび式ＩＩの化合物との組成物／組み合わせに有用な化合物を開示する、１９ページに始まり、６０ページに続く実施例の章が特に引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。特に、本明細書に開示される式Ｉおよび式ＩＩの化合物を、以下に示す式のＮＳ３プロテアーゼ阻害剤との組み合わせで使用してもよい。
【０１０８】
本明細書に記載される医薬組成物および組み合わせに有用なＮＳ５Ａ阻害剤は、すでに開示されている。２０１２年１１月２９日に公開された米国特許公開第ＵＳ−２０１２−０３０２５２８号は、ＮＳ５Ａ阻害剤に関する教示について、その全体が引用することにより本願明細書の開示の一部とされる。
【０１０９】
特定の実施態様において、重水素化されたヌクレオシドプロドラッグは、
【化１０】
2016518359.tif 000012
である。
【０１１０】
ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤は、以下
【化１１】
2016518359.tif 000013
から選択される。
【０１１１】
ＮＳ５Ａ阻害剤は、以下
【化１２】
2016518359.tif 000014
から選択される。
【０１１２】
（医薬組成物）
本明細書に開示される化合物を、未希釈の化学物質として投与してもよいが、好ましくは、医薬組成物として投与される。従って、本開示は、本明細書に記載される活性化合物の化合物または薬学的に許容可能な塩を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物を提供する。医薬組成物／組み合わせは、本明細書に記載される任意の活性化合物の化合物または塩を唯一の活性薬剤として含んでいてもよいが、別の実施態様では、少なくとも１つのさらなる活性薬剤も含んでいてもよい。特定の実施態様において、さらなる活性薬剤がＮＳ３プロテアーゼ阻害剤またはＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ阻害剤であることが好ましい。特定の実施態様において、医薬組成物は、投薬形態に、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの式Ｉの化合物と、場合により、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇのさらなる活性薬剤を単位投薬形態で含む。特定の実施態様において、活性化合物は、有効な量、ある実施態様では、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ｍｇであってもよい経口投薬形態（例えば、丸薬、錠剤またはカプセル）で送達される。医薬組成物は、所定のモル比の式Ｉの化合物とさらなる活性薬剤を含んでいてもよい。例えば、医薬組成物は、モル比が約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１または約１．５：１〜約４：１であってもよく、他の活性薬剤は、例えば、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、ＮＳ５Ａ阻害剤または別のＮＳ５Ｂ阻害剤であってもよい。
【０１１３】
本明細書に開示する化合物を、経口、局所、非経口、吸入またはスプレーによる、舌下、経皮、口腔または経粘膜投与による、直腸、眼用溶液として、注射、他の手段によって、従来の薬学的に許容可能な担体を含む単位投薬製剤で、任意の適切な手段で投与してもよい。医薬組成物は、任意の医薬的に有用な形態として、例えば、エアロゾル、クリーム、ゲル、丸薬、カプセル、錠剤、シロップ、経皮パッチまたは眼用溶液として、配合されてもよい。ある投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）は、適切な量（例えば、望ましい目的を達成するのに有効な量）の活性な要素を含む適切な大きさの単位投薬量に分けられる。
【０１１４】
担体としては、賦形剤および希釈剤が挙げられ、治療される患者に投与するのに適するように十分に高い純度であり、十分に低い毒性であるべきである。担体は、不活性であってもよく、それ自体医薬的利点を与えることができる。化合物と組み合わせて使用される担体の量は、化合物の単位投薬量あたり、投与するための現実的な量の物質を与えるのに十分な量である。
【０１１５】
担体の種類としては、限定されないが、バインダー、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、香味剤、滑剤、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、錠剤化剤および湿潤剤が挙げられる。ある担体は、１種類より多い分類に列挙されていてもよく、例えば、植物油を、ある製剤で潤滑剤として使用されてもよく、他の製剤で希釈剤として使用されてもよい。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、糖、デンプン、セルロース、粉末状トラガカント、モルト、ゼラチン、タルクおよび植物油が挙げられる。任意要素の活性薬剤は、医薬組成物に含まれていてもよく、本開示の化合物の活性を実質的に妨害しない。
【０１１６】
医薬組成物／組み合わせを経口投与のために配合してもよい。これらの組成物は、０．１〜９９重量％（ｗｔ．％）の式Ｉの化合物、通常は、少なくとも約５ｗｔ．％の式の化合物を含む。ある実施態様は、約２５ｗｔ．％〜約５０ｗｔ．％、または約５ｗｔ．％〜約７５ｗｔ．％の式の化合物を含む。
【０１１７】
有効な量の本開示の医薬組成物／組み合わせは、（ａ）Ｃ型肝炎の進行を阻害し；（ｂ）Ｃ型肝炎感染を回復させ；または（ｃ）ＨＣＶウイルスまたはＨＣＶ抗体が、以前に感染した患者の血液または血漿において検出することができないように、Ｃ型肝炎感染を治癒させ、または（ｄ）ＨＣＶに関連する障害を治療するのに十分な量であってもよい。Ｃ型肝炎の進行を阻害するか、または回復させるのに有効な医薬組成物／組み合わせの量は、Ｃ型肝炎の症状の悪化を止め、またはＣ型肝炎ウイルスに感染した患者が経験した症状を減らすのに有効な量を含む。または、Ｃ型肝炎の進行を止めるか、または回復することは、この疾患のいくつかのマーカーのいずれかによって示されるだろう。例えば、Ｃ型肝炎のウイルス負荷の増加または減少がないこと、または患者の血液中に循環するＨＣＶ抗体の数の増加または減少がないことは、Ｃ型肝炎感染の進行を止めるか、または回復するマーカーである。他のＣ型肝炎疾患マーカーとしては、アミノトランスフェラーゼレベル、特に、肝臓酵素のＡＳＴおよびＡＬＴのレベルが挙げられる。これらのレベルは、典型的には、ＨＣＶ感染患者では高いだろう。疾患の回復は、通常は、ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルが正常な範囲に戻ることによって示される。
【０１１８】
式Ｉの化合物または薬学的に許容可能な塩と、少なくとも１つのさらなる活性薬剤は、（１）一緒に配合され、投与されるか、または組み合わされた製剤で同時に送達されてもよく、（２）別個の製剤として交互に、または並行して送達されてもよく、または（３）当該技術分野で既知の任意の他の組み合わせ治療用法によってもよい。交互投与治療で送達される場合、本開示の方法は、例えば、別個の溶液、エマルション、懸濁物、錠剤、丸薬またはカプセルによって、または別個のシリンジでの異なる注射によって、本明細書に記載される任意の活性化合物の化合物または塩と、さらなる活性薬剤とを逐次的に投与または送達してもよい。一般的に、交互投与治療中に、有効な量のそれぞれの活性成分を、逐次的に、すなわち、順次投与し、一方、同時治療において、２つ以上の活性成分の有効な投薬量を一緒に投与する。間欠的な組み合わせ治療の種々のシーケンスを使用してもよい。
【０１１９】
投薬頻度は、使用される化合物および治療される特定の疾患に依存して、さまざまであってもよい。しかし、最も感染性の高い障害の治療のために、１日に４回以下の投薬用法が好ましく、１日に１回または２回の投薬用法が特に好ましい。
【０１２０】
しかし、任意の特定の患者のための特定の投薬レベルは、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組み合わせおよび治療を受ける患者の特定の疾患の重篤度を含め、種々の因子によって変わり得ることが理解されるだろう。
【０１２１】
医薬品パッケージは、容器中に、本明細書に記載されるような活性化合物または塩を含んでいてもよく、Ｃ型肝炎感染を患う患者を治療するために化合物を用いるための指示がその中に含まれる。
【０１２２】
パッケージ化された医薬組成物／組み合わせも本発明に含まれる。このようなパッケージ化された組み合わせは、患者のウイルス感染（例えば、Ｃ型肝炎感染）を治療または予防するために、組み合わせを用いるための指示と共に、容器中に本明細書に記載される任意の活性化合物を含む。
【０１２３】
パッケージ化された医薬組成物／組み合わせは、１つ以上のさらなる活性薬剤を含んでいてもよい。特定の実施態様において、さらなる活性薬剤は、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、ＮＳ５Ａまたは別のＮＳ５Ｂ阻害剤である。
【０１２４】
パッケージ化された医薬の組み合わせは、本明細書に記載される両方の活性化合物と、さらなる活性薬剤が、患者の血流の中にある、単一の投与形態で同時に、別個の投与形態で同時に与えられるさらなる活性薬剤、または時間内に同じ時間によって分割される投与の別個の投薬形態で与えられる、本明細書に記載される活性化合物または本明細書に記載される活性化合物の薬学的に許容可能な塩を含んでいてもよい。
【０１２５】
パッケージ化された医薬の組み合わせは、患者のＨＣＶ感染を治療するための組み合わせを用いるための指示と共に、同じ容器または別個の容器に与えられるさらなる活性薬剤と共に容器内に提供される、本明細書に記載される活性化合物、または本明細書に記載される活性化合物の薬学的に許容可能な塩を含んでいてもよい。
【０１２６】
（省略語）
以下の省略語を、化学工程および実施例で使用する。
Ａｃ２Ｏ              無水酢酸
ＡｃＯＤ              重水素化された酢酸
Ａｑ．                水溶液
ＢｕＯＨ              ブタノール
ＤＣＭ                ジクロロメタン
ＥｔＯＡｃ            酢酸エチル
ＩＢＸ                ２−ヨードキシ安息香酸
ＭｅＯＨ              メタノール
ＭＴＢＥ              メチル  ｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＰＢＳ                リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤＣ                重クロム酸ピリジニウム
ＴＥＡ                トリエチルアミン
ＴＨＦ                テトラヒドロフラン
ｔＢｕＭｇＣｌ        ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリド
【０１２７】
（高活性のヌクレオシド誘導体の製造）
本明細書に開示される活性化合物を製造するための方法が提供される。一例として、式ＩＩ
【化１３】
2016518359.tif 000015
の化合物を、
（ｉ）Ｌ−アラニンイソプロピルエステルであるアミノエステル（１００）と、フェノキシジクロロホスフェートであるジクロロホスフェート（２００）
【化１４】
2016518359.tif 000016
とを反応させて反応混合物を形成することと、
（ｉｉ）（ｉ）の反応混合物に、アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリル、Ｒ−ＬＨ（式中、Ｌは、ＳまたはＯであり、Ｒは、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基、例えば、フェニル、ピロール、ピリジル、ピリジニルまたはインドールであるか、または、Ｒ−ＬＨは、Ｎ−ヒドロキシイミド、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシフタルイミドであり、特定の実施態様において、Ｒ−ＬＨは、
【化１５】
2016518359.tif 000017
である）を加え、中間体（３００）
【化１６】
2016518359.tif 000018
を形成することと、
（ｉｉｉ）中間体（３００）とヌクレオシド（４００）
【化１７】
2016518359.tif 000019
とを反応させ、
【化１８】
2016518359.tif 000020
を生成することとを含む方法によって製造することができる。
【０１２８】
特定の実施態様において、中間体（３００）は、以下の立体化学
【化１９】
2016518359.tif 000021
を有し、式ＩＩＡの生成物が作られる。
【化２０】
2016518359.tif 000022
【０１２９】
特定の実施態様において、アミノエステル（１００）とジクロロホスフェート（２００）とを−２０℃未満の温度、さらに好ましくは、約−４０℃〜約−６０℃の温度で混合される。
【０１３０】
特定の実施態様において、トリエチルアミンまたは他の塩基を、アミノエステル（１００）およびジクロロホスフェート（２００）の混合物に添加する。特定の実施態様において、この添加は、有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）または他の有機溶媒（例えば、２−メチルテトラヒドロフランまたはテトラヒドロフラン）中で起こる。
【０１３１】
アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルを、アミノエステル（１００）およびジクロロホスフェート（２００）の組み合わせによって作られる反応混合物に加える。特定の実施態様において、アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルは、トリクロロチオフェノールであるが、ニトロチオフェノール、ブロモチオフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ニトロヒドロキシピリジンのような他の基と置き換えてもよい。特定の実施態様において、アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルを、ジクロロメタン溶液として、または他の有機溶媒（例えば、１−プロパノール、２−メチルテトラヒドロフランまたはテトラヒドロフラン）の溶液として加える。特定の実施態様において、アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルを含有する溶液は、トリエチルアミンまたは他の塩基も含む。アリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルを、アミノエステル（１００）およびジクロロホスフェート（２００）の組み合わせによって作られる反応混合物に加えた後、得られた溶液を、０℃より高い、１５℃より高い、好ましくは、約２０℃〜約３５℃の温度まで加温してもよく、この温度で、約５時間〜約３０時間、さらに好ましくは、約１０時間〜約２０時間、または約１５時間の所定時間攪拌してもよい。
【０１３２】
アミノエステル（１００）およびジクロロホスフェート（２００）にアリールヒドロキシルまたはアリールスルフヒドリルを加えることによって作られる反応混合物を水で抽出してもよく、場合により、炭酸水素ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような塩で飽和されていてもよい。有機フラクションを乾燥させることによって得られる未精製中間体（３００）を、カラムクロマトグラフィー、再結晶化、または他の適切な精製方法によって精製してもよい。中間体を、好ましくは精製後に、酢酸エチル／ヘプタンまたは他の非極性／極性非プロトン性溶媒の混合物、例えば、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン（非極性溶媒）およびＴＨＦ、ＤＭＦまたはＤＣＭ（極性非プロトン性溶媒）の混合物に溶解し、この溶液に、少量の中間体（３００）の望ましい異性体を接種することによって、中間体（３００）の望ましい異性体を得てもよい（この接種の量の（３００）は、別の方法によって得られてもよい）。
【０１３３】
ヌクレオシド（４００）を、溶媒、好ましくは、非極性非プロトン性溶媒、例えば、ＴＨＦ、ＤＣＭまたはＤＭＦに懸濁させてもよい。ヌクレオシド（４００）の溶媒の懸濁物を０℃未満まで、好ましくは、−１０℃未満から約−４０℃まで、好ましくは、約−２０℃まで冷却してもよい。ヌクレオシド４００は、式ＶＩと示されており、明細書の他の箇所で化合物９と示されていることを注記しておく。簡便化のために、１００〜４００を合成方法のこの記載で使用する。
【０１３４】
ヌクレオシド（４００）の溶媒の懸濁物を、塩基、例えば、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルＭｇＣｌ、または他のハロゲン化アルキル金属に、０℃未満の温度で、好ましくは、−１０℃未満から約−４０℃まで、好ましくは、約−２０℃までの温度で加えてもよい。溶媒中のヌクレオシド（４００）と塩基の反応混合物を、０℃より高い温度まで、好ましくは、約２０℃〜約３０℃まで加熱し、約１〜約５時間、または好ましくは、約２〜約３時間攪拌する。次いで、反応混合物を、０℃より低い温度まで、好ましくは、−５℃未満から約−２０℃まで、好ましくは、約−１０℃の温度まで再び冷却してもよい。中間体（３００）（場合により光学的に純粋であってもよい）を、ヌクレオシド（４００）を含有する反応混合物に加える。中間体（３００）とヌクレオシド（４００）の反応混合物を、約０℃より高い温度まで、好ましくは、約２０℃〜約３０℃まで加熱し、少なくとも５時間、好ましくは、約１０〜約２０時間、または好ましくは約１５時間攪拌する。反応物を０℃まで冷却し、塩化アンモニウムまたは酸（例えば、ＨＣｌまたはｐＨを約１〜３、好ましくは、約２にすることができる他の酸）でクエンチしてもよい。次いで、得られる生成物である式Ｉの化合物を、有機相抽出、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、結晶化または任意の他の適切な精製方法によって精製してもよい。
【０１３５】
本開示の化合物を製造する方法に加え、本開示は、式Ｉの化合物を製造するのに有用な中間体（３００）も与え、
【化２１】
2016518359.tif 000023
式中、−Ｌ−Ｒは、上に定義される。
【０１３６】
特定の実施態様において、中間体は、
【化２２】
2016518359.tif 000024
である。
【０１３７】
他の実施態様において、中間体は、
【化２３】
2016518359.tif 000025
である。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（ペルフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物１））
【化２４】
2016518359.tif 000026
【０１３９】
５Ｌの４ッ口フラスコにメカニカルスターラー、サーモメータおよび滴下漏斗を取り付け、これにＬ−アラニンイソプロピルエステルＨＣｌ塩（１６０ｇ）を投入する。このフラスコに、ジクロロメタン（１Ｌ）を加え、懸濁物を−７０℃まで冷却し、その後、トリエチルアミン（２００ｇ、２７６ｍＬ）を４５分かけて加える。この混合物に、フェニルジクロロホスフェート（２００ｇ）のジクロロメタン（１Ｌ）溶液を２．５時間かけて加える。反応混合物をこの温度でさらに９０分間攪拌し、次いで、２時間かけて０℃まで加温し、０℃で２時間攪拌する。この混合物に、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノール（１７４．４ｇ）のジクロロメタン４００ｍＬ溶液と、トリエチルアミン（１０５．４ｇ）のジクロロメタン２００ｍＬ溶液とを１．２時間かけて同時に滴下する。この混合物を室温まで加温し、一晩加熱する。固体のトリエチルアミンＨＣｌ塩を濾別し、ケーキをジクロロメタンで洗浄する（１５０ｍＬ×３回）。濾液を減圧下で濃縮し、残渣をＭＴＢＥ（３．０Ｌ）で磨砕する。濾過によって白色固体を除去する。ケーキをＭＴＢＥで洗浄する（１５０ｍＬ×３回）。濾液を濃縮し、得られた未精製固体をヘキサン中の２０％酢酸エチル（２．０Ｌ）を用いて磨砕する。濾過によって固体を集め、水相がｐＨ７に達するまで１０％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで、固体を水で洗浄し、減圧下（５５℃）で２８時間乾燥させる。乾燥した固体をヘプタン−ＥｔＯＡｃ（５：１）５００ｍＬと混合し、１時間攪拌する。濾過によって固体を集め、ヘプタン−ＥｔＯＡｃで洗浄し（５：１、８０ｍＬ×２回）、９９％を超える単一の異性体を得る。固体を乾燥させ、化合物１を得る。
【０１４０】
代替的な作業手順において、反応混合物を濾過し、ＤＣＭ層を０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液、次いで、水で洗浄し、乾燥させ、乾燥するまで蒸発させる。残渣をヘプタン／ＥｔＯＡｃ（５：１）に懸濁させ、固体を濾過する。固体をヘプタン／トルエン（８５：１５）に再び懸濁させ、純粋な１種類の異性体を単離する。
【０１４１】
（実施例２．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｒ）−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）ジ重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物７）の製造）
【化２５】
2016518359.tif 000027
【０１４２】
アセトン（７００ｍＬ）中、２，２−ジメチルプロパン（１４０ｍＬ）を２’−Ｃ−メチルウリジン２（１００ｇ）に加える。得られた混合物を氷浴で３０分間冷却し、次いで、ｐ−トルエンスルホン酸（１１ｇ）を加え、反応混合物を室温で２４時間攪拌する。反応が終了した後（ＨＰＬＣによって監視される）、反応混合物を氷浴で３０分間冷却し、低温の炭酸カリウム（水１３ｍＬ中１２ｇ、ｐＨ７〜８）を用いて中和する。溶媒を減圧下で乾燥するまで除去する。ＴＨＦ（約５００ｍＬ）を残渣に加え、固体を濾過によって除去する。濾液をシリカゲルと一緒に蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（ＣＨＣｌ３中、５〜１５％  ＭｅＯＨ）、化合物３を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｋ）：δ  １．２２（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２．３Ｈｚ），６．０１（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），１１．３７（ｓ，１Ｈ）；ＬＣ−ＭＳ：２９９ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１４３】
化合物４を、Ｃｏｒｅｙら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８４、４９、４７３５）によって報告される手順に従って、以下に記載されるように改変しつつ製造する。ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中のアセトニド３（５０ｇ）に、室温でＰＤＣ（１２６．１ｇ）を加え、その後、Ａｃ２Ｏ（１７１ｇ）およびｔ−ＢｕＯＨ（２４８ｇ）を加える。試薬を加えている間、反応温度を３５℃未満に維持し、次いで、室温で５時間攪拌する。反応混合物をＫ２ＣＯ３水溶液（６００ｍＬ  Ｈ２Ｏ中、２５０ｇ）に注ぎ、有機層をＣｕＳＯ４で洗浄する（１Ｌ  Ｈ２Ｏ中、１００ｇ）。活性炭（１０ｇ）およびシリカゲル（１００ｇ）を有機層に加え、３０分間攪拌し、濾過する。濾液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（ＣＨＣｌ３中、０〜５０％  ＥｔＯＡｃ）、４を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｋ）：δ  １．２５（ｓ，３Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ），３．３１（ｓ，１Ｈ），４．６１（ｓ，１Ｈ），４．７９（ｓ，１Ｈ），５．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），１１．４１（ｓ，１Ｈ）；ＬＣ−ＭＳ：３６９ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１４４】
ＥｔＯＤ中、塩化リチウム（１．７６ｇ）をＮａＢＤ４（１．５８ｇ）と共に１時間攪拌する。化合物４（２．９７ｇ）をこの溶液に加え、室温で３時間攪拌し、酢酸−ｄでクエンチし、酢酸エチルで希釈し、食塩水を用いて洗浄し、乾燥するまで蒸発させる。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、５’−ジ重水素化された化合物５を得る。
【０１４５】
水存在下、化合物５（２．１ｇ）をトリフルオロ酢酸で処理し、５’−ジ重水素化されたヌクレオシド６を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１６（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，７３．４，８０．０，８３．８，９３．２，１０２．３，１４２．５，１５２．５，１６６．０（リボースＣ−５’は観察されない）。
【０１４６】
Ｒｏｓｓら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１、７６、８３１１）に記載される手順に従って、化合物６（１．０ｇ）をホスホルアミデート誘導体７に変換した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５３０ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１４７】
（実施例３．（Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５−重水素−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）ジ重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（式ＩＩＡ、化合物１０）の製造）
【化２６】
2016518359.tif 000028
【０１４８】
１Ｌフラスコ中、ＥｔＯＤ／Ｄ２Ｏ（３５０ｍＬ、９９％Ｄ）の冷却した（５℃）７０：３０（ｖ／ｖ）混合物にＮａＢＤ４（７．９６ｇ）を何回かに分けて加え、次いで、アセトニドエステル４（３５ｇ）を何回かに分けて加える（ゆっくりと泡立つ）。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌し、次いで、８０℃で１日間加熱する（１Ｈ  ＮＭＲ分光分析は、５−ウラシル位置への８５％を超える重水素の組み込みを示す）。反応混合物を濾過して固体を除去し、減圧下で濃縮し、ＥｔＯＤを除去する。さらなるＤ２Ｏを加え、得られた混合物を９５℃で再び加熱し、５位置での重水素組み込みが９８％より大きな値まで増加する（１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって監視されるＤ組み込み）。反応が終了した後、溶媒の半分を減圧下で除去し、混合物を氷浴で冷却し、ＡｃＯＤ（５９ｇ）を加え、得られた混合物を１５〜２０分間攪拌する。ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）を加え、有機層を分離し、水層を再びＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で抽出し、その後、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）によって抽出する。混合した有機層を濃縮し、得られた残渣を１０％  ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ３（３００ｍＬ）に溶解し、濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（ＩＳＣＯ、溶出液ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、重水素化されたアセトニド８を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｋ）：δ  １．２２（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，３Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），１１．３６（ｓ，１Ｈ）；ＬＣ−ＭＳ：３０２ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１４９】
重水素化されたアセトニド８（５０ｇ）を、冷却した（５℃）４Ｎ  ＨＣｌ（２５０ｍＬ）溶液に加え、室温で３時間攪拌し、この間に白色沈殿が生成する。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣に水（１００ｍＬ）を加え、攪拌する。懸濁物を５℃まで冷却し、１時間攪拌し、白色沈殿を濾過によって集める。固体を冷水（７５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、重水素化されたヌクレオシド９を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，７３．４，８０．０，８３．８，９３．２，１４２．４，１５２．５，１６６．０（リボースＣ−５’およびウラシルＣ−５は観察されない）；ＬＣ−ＭＳ：２６２ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１５０】
ＴＨＦ（７５０ｍＬ）中のヌクレオシド９（３７．３ｇ）を−５℃まで冷却する。ｔ−ＢｕＭｇＣｌ（ＴＨＦ中１Ｍ、４３０ｍＬ）を加え、混合物を同じ温度で３０分間攪拌する。反応混合物を室温でさらに３０分間攪拌し、次いで、−５℃まで再び冷却し、１（１２９．５ｇ）のＴＨＦ（６５０ｍＬ）溶液をゆっくりと加える。反応混合物を室温で２４時間攪拌し、−５℃まで冷却し、これに低温の２Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）を加え、次いで、１０分間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（約２５０ｍＬ、ｐＨ約８）および固体ＮａＣｌ（５０ｇ）を加える。得られた混合物を１時間攪拌し、有機層を分離する。水層をＴＨＦで抽出する（１５０ｍＬ×２回）。すべての有機層を混合し、乾燥するまで蒸発させる。残渣を短いシリカゲル（５００ｍＬ）カラム（ＣＨＣｌ３中、１０〜２０％  ＭｅＯＨ）で部分的に精製し、次いで、シリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製し（ＩＳＣＯ、４×３００ｇカートリッジ、ＣＨ２Ｃｌ２中、０〜１０％  ＭｅＯＨで溶出）、表題化合物１０を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５３１ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１５１】
（実施例４．式ＩＩＡ（化合物１０）の代替的な製造）
【化２７】
2016518359.tif 000029
【０１５２】
フェノキシジクロロホスフェート（１２．５８ｇ）を、低温の（−５０℃）Ｌ−アラニンイソプロピルエステルのＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液に加え、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（３６ｍＬ）中のトリエチルアミン（１８．３ｍＬ）を加え、温度を−４０℃未満に維持する。反応混合物を室温までゆっくりと加温し、２時間攪拌し、−５０℃まで再び冷却する。トリエチルアミン（９．１ｍＬ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に２，４，５−トリクロロチオフェノール（１２．７４ｇ）を溶かした溶液を加える。反応物を室温まで加温し、１５時間攪拌する。反応混合物を水（約３００ｍＬ）で洗浄し、その後、飽和水ＮａＨＣＯ３溶液（約３００ｍＬ）で洗浄する。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下、乾燥するまで蒸発させる。未精製物質を短いシリカカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ０：１（ｖ／ｖ）〜１：４（ｖ／ｖ））に通し、溶媒を蒸発させた後に生成物を集める。生成物を、ヘプタン中の２．５％のＥｔＯＡｃ  １００ｍＬに溶解し、この溶液に化合物１１（約１０ｍｇ）を接種し、室温で１時間攪拌する。沈殿を濾過によって集め、少量の上のＥｔＯＡｃ／ヘプタン溶媒混合物で洗浄し、乾燥させ、１１を単一の異性体として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３００Ｋ）：δ  １．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．４１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），３．９９−４．２１（ｍ，２Ｈ），５．０２（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１７−７．２４（ｍ，３Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，ＪＨ，Ｐ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３００Ｋ）：δ  ２１．１。
【０１５３】
９（１．０ｇ）のＴＨＦ懸濁物を−２０℃まで冷却し、混合物の温度を−２０℃未満に維持しつつ、ｔ−ＢｕＭｇＣｌ（１１．６ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）をゆっくりと加える。反応混合物を室温までゆっくりと加温し（約２時間）、２時間攪拌し、次いで、−１０℃まで冷却する。化合物１１（３．７４ｇ）を加え、反応混合物を室温まで加温し、攪拌する。１５時間後、反応混合物を０℃まで冷却し、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加え（ｐＨ約２になるまで）、溶液を０℃で３０分間攪拌する。ＮａＨＣＯ３水溶液を加え（ｐＨが約８になるまで）、その後、ＮａＣｌ（約３ｇ）を加え、混合物を３０分間攪拌する。有機層を分離し、乾燥させ、減圧下で蒸発させる。未精製物質をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％  ＭｅＯＨ）、純粋な１０を得る。
【０１５４】
化合物１１を濾過によって単離した後、リンについての他の立体異性体が濃縮された濾液を濃縮し、クロマトグラフィー技術によって精製してもよい。この１１の立体異性体をヌクレオシド９で処理し、実施例１２に記載される化合物３１を得る。
【０１５５】
（実施例５．  式ＩＩ（化合物１０）の代替的な製造）
【化２８】
2016518359.tif 000030
【０１５６】
化合物１２を、化合物１１について実施例４で上に記載したのと類似の様式で製造する。１２の分光データ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３００Ｋ）：δ  １．１９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），４．２５−４．３８（ｍ，２Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），９．１５（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３００Ｋ）：δ−３．４。
【０１５７】
実施例３に記載されるのと類似の様式で、ヌクレオシド９を化合物１２で処理し、化合物１０を与える。
【０１５８】
実施例４に記載されるのと類似の様式で、化合物１２の他の立体異性体を用い、実施例１２に記載される化合物３１を製造することができる。
【０１５９】
（実施例６．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５−重水素−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物１７）の製造）
【化２９】
2016518359.tif 000031
【０１６０】
Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕら、（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７、６２、１７５４）に記載される手順に従って、重水素化されていないウラシルを用い、１，２，３，５−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノース１３（２．４４ｇ）をウラシル−５−ｄ１  １４（１．０ｇ）で処理し、保護されたヌクレオシド１５を与える。化合物１５をＭｅＯＨ中のＮａＯＭｅで処理し、２’−Ｃ−メチルウリジン−５−ｄ１（１６）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１６（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ａｐｐ  ｔのｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，６０．５，７３．４，８０．０，８３．９，９３．１，１４２．４，１５２．５，１６６．０（ウラシルＣ−５は観察されない）。
【０１６１】
実施例３に記載されるのと類似の様式で、化合物１６（０．７ｇ）をホスホルアミデート誘導体１７に変換した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５２９ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１６２】
（実施例７．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−重水素−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物１８）の製造）
【化３０】
2016518359.tif 000032
【０１６３】
化合物１８を、化合物１７について実施例６で上に記載したのと類似の様式で、ウラシル−６−ｄ１を用いて製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｓ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５２９ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１６４】
（実施例８．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５，６−ジ重水素化−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物１９）の製造）。
【化３１】
2016518359.tif 000033
【０１６５】
化合物１９を、化合物１７について実施例６で上に記載したのと類似の様式で、ウラシル−５，６−ｄ２を用いて製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５３０ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１６６】
（実施例９．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５，６−ジ重水素化−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）ジ重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（式Ｉ、化合物２２）の製造）
【化３２】
2016518359.tif 000034
【０１６７】
ヌクレオシド２０を、化合物１６について実施例６で上に記載したのと類似の様式で、ウラシル−５，６−ｄ２を用いて製造した。実施例２および３の化合物８について記載されたのと類似の様式で、ヌクレオシド２０を、重水素化されたヌクレオシド２１に変換した。２１の分光データ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，７３．４，８０．０，８３．８，９３．１，１５２．５，１６６．０（リボースＣ−５’，ウラシルＣ−５およびウラシルＣ−６は、観察されない）。ヌクレオシド２１を、実施例３に記載されたのと類似の様式でホスホルアミデート誘導体２２に変換した。２２の分光データ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２１（２×ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝１０．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．８；ＬＣ−ＭＳ：５３２ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１６８】
（実施例１０．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（式ＩＩＩ、化合物２６）の製造）
【化３３】
2016518359.tif 000035
【０１６９】
市販の２−ヨードオキソ安息香酸（ＩＢＸ、３．５４ｇ）をアセトニトリル（３０ｍＬ×２回）、アセトン（２０ｍＬ×２回）およびＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で連続して洗浄し、次いで、使用前に減圧下で十分に乾燥させる。２（０．８９４ｇ）および洗浄したＩＢＸ（２．５２ｇ）の無水アセトニトリル（９０ｍＬ）中の混合物を２時間再び還流させる。混合物を冷却し、濾過して固体を除去する。濾液を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で処理する。固体を濾過によって再び除去し、濾液を減圧下で濃縮し、２３を無色泡状物として得る。
【０１７０】
化合物２３（１．１９ｇ）をＥｔＯＤ（１５ｍＬ）に溶解し、この濁った溶液に、０℃で、攪拌しつつ、ＮａＢＤ４（０．１６８ｇ）を０℃で何回かにわけて加える。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、飽和水ＮＨ４Ｃｌ溶液（１ｍＬ）を加える前に０℃まで冷却し、反応をクエンチする。塩水（３０ｍＬ）を加え、混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（３０ｍＬ×５回）。混合した有機抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させる。未精製物質をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ）、２４を得る。
【０１７１】
化合物２５を、実施例２および３の化合物８について記載したのと類似の様式で製造する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１６（ｓ，６Ｈ），３．７６（ｂｒ  ｄ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｄのｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），５．９６（ｓ，２Ｈ），８．１４（２×ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，６０．２（ｔ，ＪＨ，Ｄ＝２１．３Ｈｚ），７３．４，８０．０，８３．８，９３．１，１０２．３，１４２．５，１５２．５，１６６．０。
【０１７２】
ホスホルアミデート２６を、化合物１０について実施例３で上に記載したのと類似の様式で製造する。
【０１７３】
（実施例１１．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５−重水素−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（式ＩＩＩ、化合物２９）の製造）
【化３４】
2016518359.tif 000036
【０１７４】
化合物２７、２８および２９を、実施例３に記載したのと類似の方法を用いて製造する。２９の分光データ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１６（ｓ，６Ｈ），３．７６（ｂｒ  ｄ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｄのｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｓ，２Ｈ），８．１４（２×ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ２０．２，６０．２（ｔ，ＪＨ，Ｄ＝２１．４Ｈｚ），７３．４，８０．０，８３．８，９３．１，１４２．４，１５２．５，１６６．０（ウラシルＣ−５は観察されない）。
【０１７５】
（実施例１２．  （Ｓ）−イソプロピル  ２−（（（Ｓ）−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（５−重水素−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）ジ重水素化メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（化合物３１）の製造）
【化３５】
2016518359.tif 000037
【０１７６】
実施例１の化合物１の合成からの混合したＭＴＢＥおよびＥｔＯＡｃ／ヘキサン洗浄液を減圧下で濃縮し、３０と１の混合物を得る。実施例３に記載したのと同様の様式で、ヌクレオシド９をこの混合物で処理し、ホスホルアミデート誘導体３１および１０を得る。純粋な３１は、分取ＨＰＬＣによって単離される。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  １．１５（ｓ，３Ｈ），１．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３４（ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ），３．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄｑ，ＪＨ，Ｐ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＪＨ，Ｐ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），５．００（７重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，３００Ｋ）：δ  ３．９；ＬＣ−ＭＳ：５３１ａｍｕ（Ｍ＋１）。
【０１７７】
（実施例１３．  ヒト肝細胞におけるヌクレオシド濃度の決定）
参照を容易にするために、この実施例で以下の式が参照される。
【化３６】
2016518359.tif 000038
【０１７８】
（肝細胞の調製）
１２ウェルフォーマットまたは６ウェルフォーマットに接種した新鮮な肝細胞を受領した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＨＭＦＮ１２およびＨＭＮＦ０６）。受領したとき、運搬時の培地をすぐに除去し、１ｍＬまたは２ｍＬのあらかじめ加温した培地（改質されたＣｈｅｅ培地を追加；Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ、カタログ番号Ｋ２３００）をそれぞれ１２ウェルフォーマットおよび６ウェルフォーマットのために置き換えた。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、細胞を一晩慣れさせた。１２ウェルフォーマットおよび６ウェルフォーマットから培地を吸引し、それぞれ、２０μＭの式ＩＩ、２０μＭの式ＶＩＩ、または溶媒コントロール（０．０５％  ＤＭＳＯ）のいずれかを含む新鮮な培地１ｍＬまたは２ｍＬと交換した。サンプルを、それぞれのウェルフォーマットにおいて、式ＩＩについて２個ずつ、式ＶＩＩについて１個ずつ、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。細胞が存在しない状態での化合物の安定性もアッセイした。２４時間で、培地を除去し、凍結させた。細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄した。内部標準として式Ｘを含む７０％の低温のメタノール（それぞれ１２ウェルフォーマットおよび６ウェルフォーマットについて、０．７５ｍＬまたは１．５ｍＬ）をそれぞれのウェルに加え、プレートから掻き取ることによって穏やかに除去した。回収された細胞をメタノール溶液に懸濁させ、これをバイアルに吸引し、−８０℃で凍結させた。
【０１７９】
（肝細胞の抽出およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
７０％メタノール中、細胞溶液を−８０℃で一晩抽出し、冷凍庫から取り出し、解凍し、ボルテックスで攪拌した。４℃、３０００ｒｐｍで１５分間、管を遠心分離処理した。上澄みを除去し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。６種類の濃度の式ＩＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩまたは式ＩＸを、ＤＭＳＯで３倍連続希釈することによって製造した。特定の濃度の化合物の小分け分を、内部標準が入った７０％メタノールに入れた。化合物が存在しない状態でインキュベートした実験からの細胞溶液にも２種類の濃度を添加した。サンプルを−８０℃で一晩凍結させ、次いで、解凍し、ボルテックスで攪拌した。３０００ｒｐｍで１５分間、サンプルを遠心分離処理した。上澄みを除去し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。較正濃度は、５、１．６７、０．５５６、０．１８５、０．０６１７および０．０２０６μＭであった。装置応答を用いた較正標準値の線形回帰を用い、検体を定量した。使用した許容基準および較正標準濃度は、見かけ濃度の±３０％であった。特定の基準を満たさなかった較正標準は、較正曲線に使用しなかった。操作中の標準濃度の少なくとも６６％が見かけ値の３０％以内である場合、サンプル値を許容した。操作の許容に必要な「ｒ」値は、０．９８より大きかった。細胞からの内部標準の抽出効率がわずか８１％であることに起因して、内部標準を用いずに、細胞サンプルを分析し、一方、細胞を用いずに較正を行い、もっと正確な濃度の決定を得た。
【０１８０】
（肝細胞培地の抽出およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
肝細胞培地をインキュベートし、これを冷凍庫から取り出し、解凍し、ボルテックスで攪拌した。２部の肝細胞培地を、１部のアセトニトリルを含有する内部標準に対してインキュベートし、これを混合し、次いで、３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離処理した。上澄みを除去し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。６種類の濃度の式ＩＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩまたは式ＩＸを、ＤＭＳＯで３倍連続希釈することによって製造した。化合物の小分け分を新鮮な肝細胞培地に入れ、５、１．６７、０．５５６、０．１８５、０．０６１７および０．０２０６μＭの較正培地の濃度を得た。２部の較正培地を１部のアセトニトリルを含有する内部標準と混合し、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理した。上澄みを除去し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。装置応答を用いた較正標準値の線形回帰を用い、サンプル中の検体濃度を定量した。使用した許容基準および較正標準濃度は、見かけ濃度の±３０％であった。特定の基準を満たさなかった較正標準は、較正曲線に使用しなかった。操作中の標準濃度の少なくとも６６％が見かけ値の３０％以内である場合、サンプル値を許容した。操作の許容に必要な「ｒ」値は、０．９８より大きかった。
【０１８１】
データを図１および図２に示す場合、重水素化されていないホスホルアミデートと共にインキュベートしたサンプル中に、５’−重水素化されたホスホルアミデートを用いた場合よりも多くの脱ホスホリル化されたヌクレオチド（すなわち、望ましくない５’−ＯＨヌクレオシド）が存在する。具体的には、２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない対応物である式ＶＩＩを用いると（０．６７百万の細胞／ウェルで２４時間接種した肝細胞を含む１２ウェルプレート（１ｍｌ））、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．９倍（培地、すなわち、細胞外濃度）および２．９倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化された２’−メチルウリジン（式ＩＸ）が得られる。２０μＭの式ＩＩまたはその重水素化されていない対応物（式ＶＩＩ）のインキュベーションの結果（１．７百万の細胞／ウェルで２４時間接種した肝細胞を含む６ウェルプレート（２ｍｌ））は、５’−重水素化された形態（式ＶＩ）から得られるものと比較して、１．５倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内濃度）および２．８倍（細胞抽出物、すなわち、細胞内）高い濃度の重水素化されていない脱ホスホリル化された２’−メチルウリジン（式ＩＶ）が得られる。従って、平均で、肝細胞のヌクレオチダーゼ活性によって、５’−位置が重水素化されていない場合、ほぼ２倍の５’−ＯＨ−ヌクレオシドが生成する。５’−重水素化されたホスホルアミデートが使用される場合、トリホスフェートに対する活性化に利用可能な５’−モノホスフェート保持量のこの違いは、薬物の効能、投薬量、毒性および／または薬物動態に顕著な効果を有するだろう。
【０１８２】
（実施例１４．  ＶＸ−１３５−ＴＰのトリホスフェートのレベルと比較した、トリホスフェートのレベル（式ＩＶ））
ＶＸ−１３５トリホスフェートのレベルに対し、式ＩＶのトリホスフェートのレベルを比較した３つの実験の結果をこの実施例に記載する。実施例１３に記載した一般的な方法に従って、ヒト肝細胞を使用した。ヒト肝細胞で作られる式ＩＶの濃度（ｐｍｏｌ  式ＩＶ／細胞１００万個）を、５μＭの式ＩＩと共にインキュベートして２、４、８、２５または４８時間目に決定した。
【０１８３】
実施例１４および図３にさらに記載されるように臨床試験の候補物質の比較として、Ａｌｉｏｓ（ＥＡＳＬ  ２０１３）によって示される広告は、５０μＭのＶＸ−１３５と共にインキュベートして２４時間後のヒト肝細胞で測定したＶＸ−１３５トリホスフェートのレベルが、１１７４ｐｍｏｌ／細胞１００万個であることを示す。対照的に、５μＭ（すなわち、低い方の濃度の１０倍）の式ＩＩと共にヒト肝細胞を２５時間インキュベートした後の式ＩＶのレベルは、４８６ｐｍｏｌ／細胞１００万個である。従って、式ＩＩのインキュベートによって作られるトリホスフェートの量は、ＶＸ−１３５によって作られるトリホスフェートの量よりも４倍大きい（用量が正規化された）。ＶＸ−１３５の正確な構造は現時点で知られていないが、ウリジンヌクレオチドアナログプロドラッグＮＳ５Ｂ阻害剤である。
【０１８４】
（実施例１５．  式ＩＩの投薬からの式ＩＶ濃度の決定）
ヒト肝細胞における式ＩＩ（μＭ）の濃度の結果として、式ＩＶの濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関係を決定した。実施例１３の一般的な方法を使用し、化合物の濃度を決定した。０．１５、０．４５および１．３５μＭの式ＩＩと共にインキュベートして２４時間後に、ヒト肝細胞の式ＩＶの濃度を決定した。結果をプロットし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて線形回帰を計算した。図４に示されるように、式ＩＩの投薬量について試験された濃度と、活性なトリホスフェート化合物（式ＩＶ）の得られた濃度に線形の関係が存在する。
【０１８５】
さらに、初代肝細胞において、５０ｎＭの式ＩＩを２４時間インキュベートした後、式ＩＶのレベルは、９．２〜１６．２ｐｍｏｌ／細胞１００万個の範囲であった。これらの濃度は、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞を５０ｎＭの式ＩＩでインキュベートしたときに得られた値より５〜８倍大きい。式ＩＶが、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞中のＨＣＶレプリコンの複製を阻害する活性種であるため、初代ヒト肝細胞中の式ＩＩの予想されたＥＣ５０は、６．２５〜１０ｎＭであると思われ（初代肝細胞における推定ＨＣＶに対する）、式ＩＩと式ＩＶの間に図４で得られる線形の関係がもっと低い濃度で続くことを推定している。
【０１８６】
（実施例１６．  式ＩＶおよびＧＳ−７９７７−ＴＰの半減期の決定）
この実施例では、実施例１３の一般的な方法を用い、ヒト、イヌ、サルおよびラット肝細胞における活性なトリホスフェート（式ＩＶまたはＧＳ−７９７７−ＴＰ）の半減期を決定した。簡単にいうと、式ＩＩまたはＧＳ−７９７７（ソバルディ）を選択した濃度で肝細胞（ヒト、イヌ、サルおよびラット）に加え、３７℃でインキュベートした。式ＩＶまたはＧＳ−７９７７−ＴＰ（活性なトリホスフェート代謝物）の上澄み細胞抽出物を、タンデム質量分光検出を備える高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。半減期決定のために使用したヒト肝細胞は、ヒト肝細胞１２ウェルフォーマットの細胞であり、これを０．６７百万個の細胞／ウェルになるように接種した。半減期決定のために使用したイヌ肝細胞は、ビーグル犬肝臓の１２ウェルフォーマット細胞であり、これを０．６７百万個の細胞／ウェルになるように接種した。半減期決定のために使用したサル肝細胞は、カニクイザル肝細胞の１２ウェルフォーマット細胞であり、これを０．９百万個の細胞／ウェルになるように接種した。半減期決定のためのラット肝細胞は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット肝細胞の細胞であり、これを０．６７百万個の細胞／ウェルになるように接種した。すべての細胞をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。
【０１８７】
図５に示されるように、すべての４種からの肝細胞において、式ＩＶの半減期は、ソバルディのトリホスフェートの半減期より長い。最も長い半減期は、ヒト肝細胞であり、その後、イヌ、次いで、サル、次いで、ラットであった。半減期は、式ＩＶについて１０〜３０時間の範囲であり、ソバルディトリホスフェートについて８〜２３時間の範囲であった。
【０１８８】
（実施例１７．  ヒト肝細胞におけるトリホスフェートのレベル（式ＩＶおよびＧＳ−７９７７−ＴＰ））
この実施例では、式ＩＶおよびＧＳ−７９７７−ＴＰのトリホスフェートのレベルを、実施例１３に記載されるような一般的な方法を用いて決定した。図３の表に記載されるような式ＩＶのトリホスフェートのレベルを決定する３つの実験の結果を、図６にグラフによってプロットする。ソバルディ（ＧＳ−７９７７７）の対応するトリホスフェートのレベルも、比較のために決定し、図７に示される。簡単にいうと、５μＭの式ＩＩまたはＧＳ−７９７７（ソバルディ）と共にインキュベートしてからそれぞれ２、４、８、２５または４８時間目に、ヒト肝細胞で作られる式ＩＶまたはＧＳ−７９７７−ＴＰの濃度（ｐｍｏｌ／細胞１００万個）を決定した。
【０１８９】
さらに、実施例１７および図６および７に記載されるように、４８時間、ヒト肝細胞で測定される場合、対応するソバルディトリホスフェート（ＧＳ−７９７７）への細胞内での変換は、式ＩＩ（すなわち、式ＩＶ）から誘導されるトリホスフェートの変換よりも２倍大きいが、式ＩＶの濃度は、４８時間目でもまだ増加しており、一方、ソバルディトリホスフェート代謝物の濃度は、２４時間から４８時間まで減少する。式ＩＶの濃度が増加すると、その半減期が２４時間を超えることと合わせて、繰り返し投薬で肝細胞中の式ＩＶ（式ＩＩのトリホスフェート）のレベルの蓄積を示唆する。この傾向は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初期投薬から馴化まで量を上げていった後、ソバルディトリホスフェートよりも式ＩＩから誘導されるトリホスフェートについて、ｉｎ  ｖｉｖｏで式ＩＶの高い濃度での一定状態を生じさせることができる。それに加え、式ＩＶ（式ＩＩのトリホスフェート）の固有の有効性（ＮＳ５ＢのＲｄＲｐ活性に対する阻害効果）は、ソバルディトリホスフェートの固有な有効性より１．５倍高い。
【０１９０】
（実施例１８．  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼＩＣ５０の決定）
初期のＲＮＡへの［α-３２Ｐ］−ＣＴＰの組み込みによって、ＨＣＶ  ５’非翻訳領域（ＮＴＲ）から誘導され、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を含むネガティブ鎖ＲＮＡテンプレートから合成されるＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼ反応を監視した。
【０１９１】
ネガティブ鎖ＩＲＥＳ  ＲＮＡテンプレートを作成するために、プライマー５’−ＮＴＲ−１−２１（ＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣ）およびＴ７−５ＮＴＲ−３４１−３１７（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣ、下線部はＴ７プロモーター配列）を用い、二本鎖ＤＮＡ（ＮＴＲ塩基１−３４１）を、ＨＣＶ  ｐＦＫ−Ｉ３４１ＰＩ−Ｌｕｃ／ＮＳ３−３’／ＥＴプラスミドから増幅させた。ネガティブ鎖ＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、この二本鎖ＤＮＡから転写された。ＲＮＡは、反応要素（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から精製され、アガロースゲル電気泳動および光吸収から、その収率および純度を評価する。
【０１９２】
ＩＣ５０決定のためのＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼ反応を、アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ＋  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）、１Ｕ／μＬ  ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／μＬ  ＩＲＥＳ  ＲＮＡテンプレート、最終的な比活性が５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で［α-３２Ｐ］−ＣＴＰを含む１μＭのそれぞれのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０点の一連の半ｌｏｇ希釈での試験化合物およびＮＳ５Ｂポリメラーゼを含む２０μＬ反応物中、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。反応を２７℃で６０分間インキュベートし、１×停止溶液（最終濃度１４４ｍＭ  クエン酸Ｎａ＋、１．４４Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中、１００μＬまで希釈することによって停止させた。８０μＬの停止したサンプルを減圧によってナイロン膜フィルターマット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に適用し、６０ｍＭ  クエン酸Ｎａ＋で４回洗浄し、６００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、続けて、Ｈ２ＯおよびＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させ、シンチレーターカセット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えるＭｉｃｒｏＢｅｔａ２計測器で計算した。ＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性は、並行反応で線形範囲にあることが示された。化合物活性を、非線形回帰分析を用いたＳ字形のカーブフィッティング（Ｐｒｉｓｍソフトウエア、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって、５０％（ＩＣ５０）まで放射線標識組み込みが減少した濃度として表した。
【０１９３】
野生型ＮＳ５Ｂポリメラーゼに対するヌクレオシドトリホスフェート化合物（式ＩＶおよびＧＳ−７９７７−トリホスフェート）の阻害活性を表Ｉに示す。ＩＣ５０値は、野生型（ＷＴ）ＮＳ５Ｂポリメラーゼに対する化合物のＮ個の独立した実験から平均±標準偏差として表される。
【表１】
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【０１９４】
本明細書は、添付の実施例によって示される実施態様を参照しつつ記載されてきた。しかし、本発明は、異なる形態で具現化することができ、本明細書に記載する実施態様に限定されるものと解釈すべきではない。本明細書の教示によれば、当業者は、望ましい目的のために本発明を変えることができ、このような変形は、本開示の範囲内であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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