(57)【要約】  本発明は、熱安定性が向上したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサイコースエピマー化酵素変異体、前記変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクター及び前記変異体を含む微生物に関する。また、前記酵素変異体又は前記微生物を用いてサイコースを製造する方法に関する。
2016518135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸がプロリンに置換された、サイコースエピマー化酵素変異体。
【請求項２】
前記アミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンが、ロイシン、システイン及びバリンからなる群より選ばれた一つのアミノ酸に置換されるか、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインに置換された、請求項１に記載のサイコースエピマー化酵素変異体。
【請求項３】
前記アミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンがロイシンに置換され、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインに置換された、請求項１に記載のサイコースエピマー化酵素変異体。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項によるサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか１項によるサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項によるサイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた、微生物。
【請求項７】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
果糖に、請求項１〜請求項３のいずれか１項によるサイコースエピマー化酵素変異体、又は前記サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えされた微生物を提供し、酵素反応を起こす段階；及び
前記酵素反応物を精製することによってサイコースを収得する段階；を含む、サイコースの製造方法。
【請求項９】
前記酵素反応段階で金属イオンがさらに提供される、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記金属がマンガンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記金属イオンが０．０１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で追加される、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項３のいずれか１項によるサイコースエピマー化酵素変異体又は請求項６による微生物を固定化させた担体で充填したカラムを含む、サイコース生産用固定化反応器。
【請求項１３】
請求項１２による固定化反応器に果糖溶液を供給することによってサイコースを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイコースエピマー化酵素変異体、該変異体をコーディングコーディングする遺伝子を含む組換えベクター及び前記変異体を含む微生物に関する。また、前記酵素変異体又は前記微生物を用いてサイコースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ―サイコース（Ｄ―ｐｓｉｃｏｓｅ）は、天然物質内にほとんど存在しないか、又は少量のみが存在するため稀少糖（ｒａｒｅ  ｓｕｇａｒ）として知られている単糖類であって、超低熱量でありながらも砂糖と類似する程の甘味を有している機能性甘味料として知られている。
【０００３】
サイコースは、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）のエピマーであって、甘味の強度と種類は果糖と非常に類似するが、果糖とは異なり、体内でほとんど代謝されないので熱量がゼロに近く、脂質合成に関与する酵素の活性を抑制して腹部肥満を減少させる効能を有するので、ダイエット食品の有効成分として有用に使用することができる。また、砂糖代替甘味料として広く用いられているキシリトールなどの糖アルコール類の場合、一定量以上摂取すると下痢を誘発するなどの副作用を起こす一方、サイコースは副作用がほとんどないと知られている。
【０００４】
このような理由により、サイコースはダイエット甘味料として脚光を浴びており、食品産業分野においてサイコースを効率的に生産できる方法に対する開発の必要性が高まっている。このようにサイコース開発の必要性が台頭するにつれて、従来の生物学的な方法を用いて果糖からサイコースを生産する多様な研究が進められてきた。果糖をサイコースに転換させ得る酵素としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサイコースエピマー化酵素（Ｄ―ｐｓｉｃｏｓｅ  ３―ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＤＰＥ）及びシュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のタガトースエピマー化酵素が知られており、サイコースエピマー化酵素がタガトースエピマー化酵素に比べて高い活性を示すことで知られている。
【０００５】
サイコースの生産において、反応温度が高くなるほどサイコースの生産量が増加する傾向を示す。しかし、野生型サイコースエピマー化酵素を用いる場合は、反応温度が約５０℃以上になると酵素の変性が起こり、酵素活性が減少するようになり、その結果、サイコースの生産量が却って減少するという問題がある。したがって、活用価値の高いサイコースをより効率的に生産するために、耐熱性が強化されたサイコースエピマー化酵素変異体を開発することが要求されている実情にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、活性は高いが、熱安定性が非常に低いため活用度が低下する、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のサイコースエピマー化酵素の問題を発見した上で、今日の活用度の高い食品素材として関心度が高まっているサイコースを産業的に大量生産できるように、熱安定性を向上させたサイコースエピマー化酵素変異体を発明し、これを用いたサイコースの生産方法を発明するに至った。
【０００７】
具体的に、本発明は、アミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸を置換させることによって、熱安定性を向上させたサイコースエピマー化酵素変異体を提供しようとする。
【０００８】
また、本発明は、熱安定性が向上したサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを提供しようとする。
【０００９】
また、本発明は、サイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターを提供しようとする。
【００１０】
また、本発明は、サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物を提供しようとする。
【００１１】
また、本発明は、果糖から前記サイコースエピマー化酵素変異体又は前記変異体を生産するように組換えられた微生物を用いてサイコースを製造する方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸を置換させることによって、熱安定性が向上し、効率的にサイコースを生産できるサイコースエピマー化酵素変異体を提供しようとする。
【００１３】
具体的に、本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において、７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸がプロリンに置換されたサイコースエピマー化酵素変異体を提供する。
【００１４】
前記変異体は、前記野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンが、ロイシン、システイン及びバリンからなる群より選ばれた一つのアミノ酸にさらに置換されたり／置換され、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインにさらに置換されてもよい。
【００１５】
前記変異体は、前記野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンがロイシンにさらに置換され、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインにさらに置換された変異体であってもよい。
【００１６】
また、本発明は、本願に記載されたサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
また、本発明は、本願に記載されたサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターに関する。
【００１８】
また、本発明は、本願に記載されたサイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物に関する。
【００１９】
また、本発明は、果糖に、本願に記載されているサイコースエピマー化酵素変異体又は前記サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物を提供し、酵素反応を起こす段階；及び
【００２０】
前記酵素反応物を精製することによってサイコースを収得する段階；を含むサイコースの製造方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、
本願に記載されているエピマー化酵素変異体或いは前記変異体を生産するように組換えられた微生物を固定化させた担体で充填したカラムを含む、サイコース生産用固定化反応器に関する。
【００２２】
また、本発明は、前記固定化反応器に果糖溶液を供給することによってサイコースを生産する方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸を置換させ、酵素活性は低下しないと共に、熱安定性は著しく向上したサイコースエピマー化酵素変異体を提供することによって、今日の活用度の高い食品素材として脚光を浴びているサイコースをより効率的に大量に生産できるという効果を示す。
【００２４】
具体的に、本発明の一例に係るサイコースエピマー化酵素変異体は、野生型サイコースエピマー化酵素或いは従来の公知となったその変異体に比べて、酵素反応温度で遥かに延長された半減期を示すので、サイコースを生産するにおいて、一度製造されたサイコースエピマー化酵素をより長期間使用することができ、生産時間及び費用を節減させ、サイコースの生産効率を高めるという効果を示す。
【００２５】
本発明の更に他の一例は、前記サイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクター、或いは前記サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物を用いてサイコースを効率的に大量生産できる方法を提供するという効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の野生型サイコースエピマー化酵素の分析構造を示した図である。
【図２】比較例１の野生型サイコースエピマー化酵素に比べて、本発明に係る実施例１のサイコースエピマー化酵素変異体の熱安定性を示したグラフである。
【図３】比較例２の従来のサイコースエピマー化酵素変異体（１３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃ）と対比して、本発明に係る実施例２のサイコースエピマー化酵素変異体（１３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ）の熱安定性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明についてより詳細に説明する。本願明細書に記載されていない内容は、本発明の技術分野又は類似する分野で熟練した者であれば十分に認識して類推可能なものであるので、それについての説明は省略する。
【００２８】
本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において、７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸がプロリンに置換されたサイコースエピマー化酵素変異体（以下、これをＥ７７Ｐ変異体という。）に関する。前記酵素変異体のアミノ酸配列は、配列目録番号２の通りである。
【００２９】
前記アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、公知の菌株であって、より具体的に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ  ３３９７０であってもよい。
【００３０】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の野生型サイコースエピマー化酵素の構造は、２００６年度に明らかになり、現在、プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、以下、「ＰＤＢ」という。）に全ての構造的情報が公開されている。サイコースエピマー化酵素（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＨＫ１）は、３０９個のアミノ酸で構成されており、４個の単一体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が一つの複合体、テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成することが知られている。野生型サイコースエピマー化酵素は、α―ヘリックス（α―ｈｅｌｉｘ）とβ―ストランド（β―ｓｔｒａｎｄ）が繰り返してつながり、基質である果糖が結合できる活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）を形成する構造を有する。
【００３１】
前記アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列は、配列目録番号１の通りであり、その機能性断片を含む。前記「機能性断片」とは、配列目録番号１のアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換、挿入又は欠失などによって変異されたが、依然として果糖をサイコースに転換させる活性を有している各断片を意味する。
【００３２】
前記Ｅ７７Ｐ変異体は、前記野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンがロイシン、システイン及びバリンからなる群より選ばれた一つのアミノ酸にさらに置換されたり／置換され、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインにさらに置換されてもよい。
【００３３】
好ましくは、前記Ｅ７７Ｐ変異体は、前記野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンがロイシンにさらに置換され、前記アミノ酸配列において２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインにさらに置換された変異体（これをＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体という。）であってもよい。前記Ｉ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体のアミノ酸配列は、配列目録番号３の通りである。
【００３４】
前記のように、野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸、すなわち、７７番目のアミノ酸、さらに３３番目及び／又は２１３番目のアミノ酸を置換させることによって、野生型酵素又は従来の酵素変異体に比べて熱安定性が向上したサイコースエピマー化酵素変異体を製造することができ、これを用いてより効率的にサイコースを製造できるという利点がある。
【００３５】
また、本発明は、Ｅ７７Ｐ変異体をコーディングするポリヌクレオチドに関する。前記ポリヌクレオチドは、７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸がプロリンに置換されたこと以外に、３３番目のアミノ酸であるイソロイシンがロイシン、システイン及びバリンからなる群より選ばれた一つのアミノ酸にさらに置換されたり／置換され、２１３番目のアミノ酸であるセリンがシステインにさらに置換された変異体をコーディングするポリヌクレオチドであってもよい。前記ポリヌクレオチドは、Ｉ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体をコーディングするポリヌクレオチドであることがより好ましい。
【００３６】
本発明は、本願に開示されているサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターに関する。前記組換えベクターを製造するために使用されるベクターは、その種類が特に制限されることなく、当該技術分野で通常的に使用するベクターであってもよい。前記ベクターとして、プラスミドベクターを使用することが好ましく、前記プラスミドベクターの非制限的な一例として、ｐＵＣ系ベクターを使用することが好ましい。また、後述するように、大腸菌、組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウム属微生物を形質転換させるためには、前記のそれぞれの微生物から由来したシャトルベクターを使用してもよく、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウム属微生物から由来したシャトルベクターを使用することが好ましい。
【００３７】
また、本発明は、サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物に関する。前記組換え微生物は、例えば、本願に開示されているサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された微生物を含んでもよい。前記微生物の例として、大腸菌、組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウム属である微生物を挙げることができ、特に、本願では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を挙げることができる。
【００３８】
特に、コリネバクテリウム属菌株は、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）菌株であって、遺伝子操作及び大量培養に容易に使用されるという特性を有している菌株である。コリネバクテリウム属菌株は、多様な工程条件で高い安定性を有する菌株であって、他の細菌に比べて相対的に堅い細胞膜構造を有しており、高い糖濃度などによる高い浸透圧下でも菌体が安定的な状態で存在するという生物学的特性を有している。
【００３９】
また、本発明は、本発明に係るサイコースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ  ＫＹ（ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ）に関する。前記組換えられた菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ  ＫＹは、ブダペスト条約に従ってソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１３年３月２８日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１４０３Ｐとして寄託した。
【００４０】
また、本発明は、前記サイコースエピマー化酵素変異体又は前記微生物を用いて果糖からサイコースを製造する方法を提供する。
【００４１】
前記方法は、果糖に、本願に開示されているサイコースエピマー化酵素変異体又は前記サイコースエピマー化酵素変異体を生産するように組換えられた微生物を提供し、酵素反応を起こす段階；及び
前記酵素反応物を精製することによってサイコースを収得する段階；を含んでもよい。
【００４２】
前記サイコース製造方法において、使用するサイコースエピマー化酵素変異体又は微生物の濃度、反応温度、反応時間、ｐＨ、果糖の濃度などの反応条件は、その目的に応じて適宜調節することができる。
【００４３】
例えば、前記酵素反応の反応温度は２０℃〜６０℃、反応時間は１分〜２時間の範囲であってもよい。前記サイコースエピマー化酵素変異体又は微生物に対する前記果糖の重量比は約１：１０〜約１０：１の範囲であってもよい。前記反応温度は３０℃〜５５℃で、反応時間は１０分〜９０分の範囲で、前記重量比は約１：５〜約５：１の範囲であることが好ましい。
【００４４】
前記酵素反応段階で、金属イオンがさらに提供されてもよい。
【００４５】
具体的に、金属が存在する反応条件下で前記酵素反応を行ってもよい。サイコースエピマー化酵素は、金属イオンによって活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）であって、金属イオンの存在時に酵素活性が増加するという利点を有する。
【００４６】
前記金属の種類としては、マンガン、ニッケル、銅などを挙げることができるが、このうち、マンガンを使用することが好ましい。前記金属の濃度は、０．０１ｍＭ〜５ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭであることがさらに好ましい。前記範囲内で、本発明の前記サイコースエピマー化酵素変異体の活性を適宜調節し、サイコースの生産効率を向上させるという利点がある。
【００４７】
前記サイコース製造方法を行うにおいて、サイコースの生産効率を高めるための反応は、ｐＨが約５〜約９である条件で行うことが好ましい。
【００４８】
また、本発明は、本願に開示されているサイコースエピマー化酵素変異体或いは前記変異体を生産するように組換えられた微生物を固定化させた担体で充填したカラムを含むサイコース生産用固定化反応器に関する。本発明は、前記固定化反応器に果糖溶液を供給することによってサイコースを生産する方法に関する。
【００４９】
前記「固定化反応器」とは、サイコースを生産するための反応が、担体に固定化された菌株又は酵素によって、又は担体に固定化された菌株又は酵素が充填されたカラムを通じて起こる反応器を意味する。すなわち、固定化は、生物学的活性を提供する物質、この場合、サイコースエピマー化酵素又はこれを含む菌株が担体に固定化されたことを意味する。
【００５０】
前記酵素変異体又は微生物を固定化させた担体としては、本発明の技術分野又は類似する分野で酵素又は微生物の固定化用途で使用可能な担体であればどのようなものでも使用可能であり、アルギン酸ナトリウムを使用することが好ましい。
【００５１】
アルギン酸ナトリウムは、海藻の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であって、マンヌロン酸及びグルロン酸で構成されており、含量の面では無作為でベータ―１，４―結合をなして形成され、微生物や酵素が安定的に固定化され得る。
【００５２】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、これら実施例及び実験例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の内容がこれら実施例に限定されるわけではない。
【００５３】
実施例１
【００５４】
サイコースエピマー化酵素のＥ７７Ｐ変異体の製造
（１）置換させるアミノ酸配列位置の選定
【００５５】
通常的に使用されるタンパク質構造分析プログラムであるＰｙＭｏｌを用いて野生型サイコースエピマー化酵素の構造（図１）を分析した後、酵素活性に影響を与えないと共に、酵素の耐熱性を向上させ得るアミノ酸配列地点として７７番目のアミノ酸を選定した。
【００５６】
図１には、前記アミノ酸配列において７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸の位置が示されている。
【００５７】
（２）Ｅ７７Ｐ変異体の製造
【００５８】
位置選択的突然変異（ｓｉｔｅ―ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を通じてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ３３９７０由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において７７番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）をプロリンに置換した。前記置換されたサイコースエピマー化酵素変異体を過剰発現させるために酵素変異体をコーディングする遺伝子をｐＵＣ＿ＨＣＥベクターに挿入することによって組換えベクターを製作し、これを熱衝撃法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２Ｇに挿入した。
【００５９】
前記形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２Ｇを５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有しているＬＢ培地に接種し、３７℃で６時間培養した後、これを一部採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ―ｂｅｔａ―ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含んでいる培地に移して３７℃で６時間培養し、酵素変異体の発現を誘導した。その次に、前記培養液を６０℃で５分間熱処理し、最終濃度が１５ｍＭになるように果糖を入れて５０℃で３０分間反応させた後、通常的に使用される果糖分析キット（ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）を用いて残っている果糖の量を測定した。測定の結果、本発明の酵素変異体Ｅ７７Ｐが５５℃の反応温度で高い半減期を示すことを確認した。
【００６０】
前記「半減期」は、酵素又は酵素変異体の酵素反応初期の相対的活性を１００としたとき、前記相対的活性が５０になるまでにかかる期間を意味する。
【００６１】
実施例２
【００６２】
サイコースエピマー化酵素のＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ複合変異体の製造
【００６３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ３３９７０由来の野生型サイコースエピマー化酵素を過剰発現させるために該当酵素の遺伝子をｐＵＣ＿ＨＣＥベクターに挿入することによって組換えベクターを製作した後、位置選択的突然変異方法を通じてＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体を製造した。前記組換えベクターでＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２Ｇを形質転換させた後、前記菌株を培養することによって酵素変異体を過剰発現させた。
【００６４】
実施例３
【００６５】
サイコースエピマー化酵素のＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ複合変異体をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターの製造及びこれを用いたコリネバクテリウム属菌株の形質転換
【００６６】
（１）組換えベクターの製造及びこれを用いた菌株の形質転換
【００６７】
前記実施例２に係るＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体のＤＮＡを鋳型とし、それぞれＰｓｔＩとＸｂａＩ制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、重合連鎖反応を通じてサイコースエピマー化酵素をコーディングする遺伝子を増幅させた。前記増幅された遺伝子がコーディングしているサイコースエピマー化酵素を大量に発現するために、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物から由来したシャトルベクターｐＣＪ―１（２００４年１１月６日付けで国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託、受託番号ＫＣＣＭ―１０６１１）を制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩで切断し、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｌｙｓＣ（ＮＣｇｌ０２４７）プロモーターと前記増幅されたＰＣＲ産物を挿入することによって組換え発現ベクターを製作した。 前記組換え発現ベクターで電気穿孔を用いてコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２を形質転換させ、サイコースエピマー化酵素変異体（Ｉ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ）をコーディングする遺伝子を発現できる組換え菌株を製造した。前記組換えられた菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ  ＫＹは、ブダペスト条約に従ってソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１３年３月２８日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１４０３Ｐとして寄託した。
【００６８】
（２）形質転換された菌株の培養
【００６９】
前記（１）で得られた形質転換菌株をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度のカナマイシンを含むＭＢ培地（バクト―トリプトン（Ｂａｃｔｏ―ｔｒｙｐｔｏｎ）１０ｇ／ｌ、バクト―イースト抽出物（Ｂａｃｔｏ―ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）５ｇ／ｌ）に初期濃度ＯＤ６００＝０．１で接種し、３０℃で２４時間培養することによってサイコースエピマー化酵素変異体の発現を誘導した。前記で収得された培養液を１０μｇ／ｍｌ濃度のカナマイシンを含有した変異培地（ブドウ糖８ｇ／ｌ、ソイトン２０ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １．２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４  １．４ｇ／ｌ）を入れた発酵器にＯＤ６００＝０．６で接種し、３０℃で２０時間培養した。
【００７０】
比較例１
【００７１】
実施例１におけるＥ７７Ｐ変異体の代わりに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型サイコースエピマー化酵素発現遺伝子を使用したことを除いては、実施例１と同一に実施し、前記遺伝子を含むベクター及び前記ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム属菌株を製造した。
【００７２】
比較例２
【００７３】
実施例１における位置選択的突然変異（ｓｉｔｅ―ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を通じてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ３３９７０由来の野生型サイコースエピマー化酵素のアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸であるイソロイシンをロイシンに置換し、２１３番目のアミノ酸であるシステインをプロリンに置換した、酵素変異体をコーディングする遺伝子を使用したことを除いては、実施例１と同一に実施し、Ｉ３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃ変異体、前記変異体遺伝子を含むベクター及び前記ベクターを用いて組換えられたコリネバクテリウム属菌株を製造した。
【００７４】
実験例１
【００７５】
サイコースエピマー化酵素変異体の耐熱性及び酵素活性の評価
【００７６】
（１）熱処理
【００７７】
前記実施例１〜実施例３、比較例１及び比較例２で製造した形質転換されたそれぞれのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２Ｇ菌株をＬＢ培地５０ｍｌが入った２５０ｍｌのフラスコに接種し、３７℃の振蕩培養器で約１２時間培養した。前記培養が終了したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２Ｇ培養液を７，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離した後、５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０の緩衝溶液５ｍｌで懸濁した。その次に、前記懸濁液に対して氷の上で超音波粉砕機を用いて１０分間細胞を粉砕した後、１３，０００×ｇで４℃で４０分間遠心分離して出た上澄液を別途に保管した。
【００７８】
ブラッドフォードタンパク質定量法で前記上澄液のタンパク質濃度を測定した後、５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０の緩衝溶液を用いてタンパク質の総濃度を０．１ｍｇ／ｍｌにした。ＳＤＳ―ＰＡＧＥを通じてサイコースエピマー化酵素変異体の過剰発現を確認した後、恒温振蕩水槽で５０℃と５５℃でそれぞれ１時間、２時間、４時間熱処理した。
【００７９】
（２）果糖を基質としたサイコース生産反応を通じた酵素活性の測定
【００８０】
前記熱処理後、酵素変異体の酵素活性を測定するために、４０ｍＭの果糖が含有された５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０の緩衝溶液に前記熱処理した各タンパク質溶液を１：１で混合した後、５０℃で１０分間反応させた。その次に、１００℃で５分間加熱することによって前記反応を中止させ、反応液を１／４０に希釈し、ＨＰＬＣを用いて果糖から生成されたサイコースの量を測定した。
【００８１】
分析の結果、野生型サイコースエピマー化酵素（比較例１）に比べて、Ｅ７７Ｐ変異体（実施例１）が４℃以上向上した耐熱性を示した（図２参照）。
【００８２】
また、分析の結果、Ｉ３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃ変異体（比較例２）に比べて、Ｉ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体（実施例２）が５℃以上向上した耐熱性を示し、Ｉ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体の５５℃での半減期がＩ３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃ変異体の５０℃での半減期より増加したことが確認された（図３参照）。
【００８３】
前記酵素活性を測定した結果は、それぞれ図２及び図３に示した。具体的に、図２は、比較例１の野生型サイコースエピマー化酵素と実施例１のＥ７７Ｐ変異体のそれぞれを二つの温度条件（５０℃及び５５℃）で１時間、２時間及び４時間反応させた後、野生型酵素と酵素変異体の相対的な残留酵素活性を測定してグラフ化したものである。また、図３は、比較例２のＩ３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃ変異体と実施例２のＩ３３Ｌ／Ｅ７７Ｐ／Ｓ２１３Ｃ変異体のそれぞれを二つの温度条件（５０℃及び５５℃）で１時間、２時間及び４時間反応させた後、各酵素変異体の相対的な残留酵素活性を測定してグラフ化したものである。
【００８４】
図２及び図３から確認したように、本発明に係る酵素変異体は、従来の野生型菌株や従来の公知となった変異体であるＩ３３Ｌ／Ｓ２１３Ｃに比べて改善された熱安定性を示す。
【００８５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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