(57)【要約】  本発明は、凝固活性を有する修飾されたヒト凝固VII因子ポリペプチド、特に、野生型FVIIaと比較して、活性化されるとより高いタンパク質分解活性及び低下したアンチトロンビン反応性(アンチトロンビンによる不活化に対する増加した耐性)を有するバリアントに関する。バリアントは、L288、W201及び/又はK337の特定の置換と組み合わせて成熟ヒトFVIIのT293位にある特定の置換を有する。特許請求の範囲は、前記第VII因子ポリペプチドの医薬組成物及び医学的使用にも関する。
2016537321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含み、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)若しくはTrp Wにより置換され、及び/又はW201がArg(R)、Met(M)若しくはLys(K)により置換され、及び/又はK337がAla(A)若しくはGly(G)により置換されている第VII因子ポリペプチド。
【請求項２】
T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp(W)により置換されている、請求項1に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項３】
T293がLys(K)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、請求項1又は2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項４】
T293がLys(K)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、請求項1又は2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項５】
T293がArg(R)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、請求項1又は2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項６】
T293がArg(R)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、請求項1又は2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項７】
K337がAla(A)により置換されている、請求項1から6のいずれか一項に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項８】
T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又がPhe(F)により置換され、及びW201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている、請求項1に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項９】
T293がLys(K)により置換され、及びW201がArg(R)により置換されている、請求項8に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項１０】
第VII因子ポリペプチドが少なくとも1つの半減期延長部分と結合されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項１１】
半減期延長部分が、生体適合性脂肪酸及びこの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(Hydroxy Alkyl Starch:HAS)、例えばヒドロキシエチルデンプン(Hydroxy Ethyl Starch:HES)、ポリエチレングリコール(Poly Ethylene Glycol:PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid:HA)、ヘパロサンポリマー(Heparosan polymers:HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(Phosphorylcholine-based polymer:PCポリマー)、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸(Poly-sialic acid:PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド(Elastin like peptide:ELP)、XTENポリマー、PASポリマー、PAポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチド、FcRn結合ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項10に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項１２】
半減期延長部分がヘパロサンポリマーである、請求項11に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項１３】
可溶性組織因子の非存在下、インビトロでのタンパク質分解アッセイで測定された野生型ヒト第VIIa因子(配列番号1)のタンパク質分解活性の少なくとも110%であるタンパク質分解活性を有し、低分子量ヘパリンの存在下及び可溶性組織因子の非存在下、アンチトロンビン阻害アッセイで測定された野生型ヒト第VIIa因子と比較して、20%未満のアンチトロンビン反応性を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の第FVII因子ポリペプチド。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の第VII因子ポリペプチド。
【請求項１５】
凝固障害の治療において医薬品として使用するための、請求項14に記載の第VII因子ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロコアグラント活性を有する凝固因子VII(第VII因子)ポリペプチドに関する。本発明はまた、このようなポリペプチドを含む医薬組成物、このようなポリペプチドの治療方法及び使用にも関する。
【０００２】
配列リスト
配列番号1:野生型ヒト凝固因子VII
配列番号2:ヒト凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号3:ヒト族(チンパンジー)凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号4:イヌ(canine)[イヌ(dog)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号5:ブタ(porcine)[ブタ(pig)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号6:ウシ(bovine)[ウシ(cattle)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号7:マウス(murine)[マウス(mouse)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号8:マウス(murine)[ラット(rat)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
配列番号9:ウサギ(lapine)[ウサギ(rabbit)]凝固因子VIIのプロテアーゼドメイン
【背景技術】
【０００３】
血管への損傷は、細胞成分と分子成分の間の複雑な相互作用を伴う止血系を活性化する。出血を最終的に止めさせる過程は、止血として知られている。止血の重要な部分は、血液の凝固及び損傷部位での血餅の形成である。凝固過程は、幾つかのタンパク質分子の機能に高度に依存する。これらは凝固因子として知られている。凝固因子の幾つかは、不活性のチモーゲン又は酵素的に活性な形態で存在し得るプロテアーゼである。チモーゲン形態は、別のタンパク質分解的に活性な凝固因子により触媒されたポリペプチド鎖の特異的切断により、酵素的に活性な形態に変換され得る。
【０００４】
第VII因子は、肝臓で合成され、1本鎖糖タンパク質として血液に分泌されるビタミンK依存性血漿タンパク質である。第VII因子チモーゲンは、特異的タンパク質分解切断により単一の部位、すなわち配列番号1のR152とI153の間で活性形態(第VIIa因子)に変換され、単一のジスルフィド結合により連結された2つの鎖分子をもたらす。第VIIa因子における2つのポリペプチド鎖は、それぞれ配列番号1(野生型ヒト凝固因子VII)の残基1〜152及び153〜406に対応する軽鎖及び重鎖と呼ばれる。第VII因子は主にチモーゲンとして循環するが、わずかな画分は活性形態(第VIIa因子)にある。
【０００５】
血液凝固過程は3期、すなわち、開始、増幅及び伝播に分けることができる。開始期及び伝播期は、止血において多くの重要な機能を有する凝固因子であるトロンビンの形成に寄与する。凝固カスケードは、血管の内部表面を裏打ちする内皮細胞の単層バリアが損傷を受けると開始する。これは、内皮下細胞及び血管外マトリックスタンパク質を露出し、これに血中の血小板が張り付く。これが起こると、内皮下細胞の表面に存在する組織因子(TF)が、血中を循環する第VIIa因子に曝されるようになる。TFは膜結合タンパク質であり、第VIIa因子の受容体として機能する。第VIIa因子は、本質的に活性が低い酵素、セリンプロテアーゼである。しかし、第VIIa因子がTFに結合されると、この活性は大幅に増加する。TFとの第VIIa因子相互作用はまた、TF担持細胞のリン脂質表面に第VIIa因子を局在化させ、第Xa因子へ第X因子を活性化するために第VIIa因子を最適に配置する。これが起こると、第Xa因子は、第Va因子と結合してTF担持細胞の表面でいわゆる「プロトロンビナーゼ」複合体を形成することができる。プロトロンビナーゼ複合体は、次いで、プロトロンビンの切断によりトロンビンを生成する。循環第VIIa因子へのTFの曝露により活性化されトロンビンの最初の生成をもたらす経路は、TF経路として知られる。TF:第VIIa因子複合体はまた、第IXa因子への第IX因子の活性化も触媒する。次いで、活性化された第IXa因子は、損傷部位に張り付き活性化した血小板の表面に拡散し得る。これは、第IXa因子がFVIIIaと結合して、活性化血小板の表面で「テナーゼ」複合体を形成できるようにする。この複合体は、第Xa因子への第X因子の活性化における著しい効率性により、伝播期において重要な役割を果たす。第Xa因子活性の効率的テナーゼ触媒生成は、今度は、プロトロンビナーゼ複合体により触媒されたトロンビンへのプロトロンビンの効率的切断をもたらす。
【０００６】
第IX因子又は第VIII因子のどちらかに何らかの欠損があれば、これは重要なテナーゼ活性を損ない、凝固に必要なトロンビンの産生を低下させる。TF経路により最初に形成されるトロンビンは、損傷部位で血小板の動員、活性化、及び凝集を促すプロコアグラントシグナルとして機能する。これは、血小板の緩い一次血栓の形成をもたらす。しかし、この血小板の一次血栓は不安定であり、止血を持続するのに補強を必要とする。血栓の安定化は、フィブリン線維の網に血小板を固定し、絡ませることを必要とする。
【０００７】
強い安定な血餅の形成は、局所トロンビン活性の頑強なバーストの生成に依存する。故に、血管損傷後のトロンビン生成に至る過程における欠損は、出血障害、例えば血友病A及びBをもたらす可能性がある。血友病A及びBを有する人は、それぞれ機能的第VIIIa因子又は第IXa因子を欠く。伝播期でのトロンビン生成は、テナーゼ活性に非常に依存し、すなわち第VIIIa因子及び第FIXa因子の両方を必要とする。したがって、血友病A又はBを有する人では、一次血小板血栓の適切な凝固がなく、出血が持続する。
【０００８】
補充療法は血友病A及びBに対する伝統的な治療であり、第VIII因子又は第IX因子の静脈内投与を必要とする。しかし、多くの場合、患者は、注入されたタンパク質に対する抗体(インヒビターとしても知られる)を発生させ、該抗体は治療の有効性を低下させ、又は無効にする。組換え第VIIa因子[Novoseven(登録商標)]は、インヒビターを有する血友病A又はB患者の治療に対して認可されており、また、出血エピソードを停止させ、又は外傷及び/若しくは手術に伴う出血を防ぐのにも使用される。組換え第VIIa因子はまた、先天性第VII因子欠乏症患者の治療に対しても認可されている。組換えFVIIaは、TF非依存的機構を通じて作用することが提案されている。このモデルによれば、組換えFVIIaは、このGlaドメインにより活性化血小板の表面に向けられ、該表面で次いでタンパク質分解的に第X因子を第Xa因子に活性化し、故に機能的テナーゼ複合体の必要性を回避する。TFの非存在下のFVIIaの低酵素活性及び膜に対するGlaドメインの低親和性は、血友病を有する人において止血を達成するのに必要とされる循環FVIIaの超生理学的レベルの必要性を説明し得る。
【０００９】
組換え第VIIa因子は、2〜3時間のインビボでの機能的半減期(functional half-life)を有し、患者における出血を解決するために頻回投与を必要とする場合がある。更に、患者は多くの場合、予防策としてではなく出血が始まった後に第VIIa因子療法を受けるのみであり、これは多くの場合、患者の全般的な生活の質に影響を与える。インビボでの機能的半減期がより長い組換え第VIIa因子バリアントは、必要な投与回数を減少させ、より頻度の少ない投与を支持することになり、故に患者及び介護者の利益に対する第VIIa因子療法の大幅な改善が期待できる。
【００１０】
WO02/22776は、野生型FVIIaと比べてタンパク質分解活性が増大した第VIIa因子バリアントを開示している。WO02/22776に開示された置換を含む第VII因子ポリペプチドは、タンパク質分解活性が増大したバリアントの有効性に関して好ましい臨床転帰を示すことが臨床試験で示されている(de Paulaら(2012) J Thromb Haemost、10:81〜89頁)。
【００１１】
WO2007/031559は、アンチトロンビンによる阻害に対する感受性が低下した第VII因子バリアントを開示している。
【００１２】
WO2009/126307は、プロコアグラント活性が変化した修飾第VII因子ポリペプチドを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO02/22776
【特許文献２】WO2007031559
【特許文献３】WO2009126307
【特許文献４】WO2002077218
【特許文献５】米国特許第4784950号
【特許文献６】WO03/027147
【特許文献７】WO2007115953
【特許文献８】WO2014/060397
【特許文献９】WO03031464
【特許文献１０】US 2010/0036001
【特許文献１１】US 2008/0109236
【特許文献１２】WO07056191
【特許文献１３】WO2011101267
【特許文献１４】WO2006094810
【特許文献１５】国際出願WO92/16640
【特許文献１６】WO2007/031559
【特許文献１７】U.S. 4,784,950
【特許文献１８】US 4,683,202
【特許文献１９】Levinson及びSimonsen、U.S. 4,713,339
【特許文献２０】WO 88/00239
【特許文献２１】U.S. 5,304,489
【特許文献２２】WO 89/01343
【特許文献２３】WO 91/02318
【特許文献２４】Meadeら、U.S. 4,873,316
【特許文献２５】米国特許第4,873,191号
【特許文献２６】WO 90/05188
【特許文献２７】WO 92/11757
【特許文献２８】GB 87/00458
【特許文献２９】Thomas、米国特許第4,456,591号
【特許文献３０】WO2014/057069
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】de Paulaら(2012) J Thromb Haemost、10:81〜89頁
【非特許文献２】「Summary Basis for Approval for NovoSeven(著作権)」、FDA参照番号96 0597
【非特許文献３】Introduction to Pharmacokinetics and Pharmacodynamics: The Quantitative Basis of Drug Therapy (Thomas N. Tozer、Malcolm Rowland)
【非特許文献４】Agersoら(2011)J Thromb Haemost、9、333〜338頁
【非特許文献５】Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 309頁
【非特許文献６】Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁
【非特許文献７】JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008 July; 19(7): 1485〜1490頁
【非特許文献８】Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557頁
【非特許文献９】Kanamoriら、J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819頁(1990)
【非特許文献１０】Zoller及びSmith(DNA 3:479〜488頁、1984)
【非特許文献１１】「Splicing by extension overlap」、Hortonら、Gene 77、1989、61〜68頁
【非特許文献１２】PCR Protocols、1990、Academic Press、San Diego、California、USA
【非特許文献１３】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版  Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献１４】Beaucage及びCaruthers、Tetrahedron Letters 22(1981)、1859〜1869頁
【非特許文献１５】Saikiら、Science 239(1988)、487〜491頁
【非特許文献１６】Subramaniら、Mol. Cell Biol. 1(1981)、854〜864頁
【非特許文献１７】Palmiterら、Science 222(1983)、809〜814頁
【非特許文献１８】Boshartら、Cell 41:521〜530頁、1985
【非特許文献１９】Kaufman及びSharp、Mol. Cell. Biol、2:1304〜1319頁、1982
【非特許文献２０】Palmiterら、Science 222、1983、809〜814頁
【非特許文献２１】Alber及びKawasaki、J. Mol. Appl. Gen. 1、1982、419〜434頁
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【非特許文献２３】DeNotoら  Nucl. Acids Res. 9:3719〜3730頁、1981
【非特許文献２４】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献２５】Alber及びKawasaki、J. Mol. Appl. Gen. 1(1982)、419〜434頁
【非特許文献２６】Southern及びBerg、J. Mol. Appl.Genet. 1(1982)、327〜341頁
【非特許文献２７】Loyterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982)、422〜426頁
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【非特許文献２９】Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7(1981)、603頁
【非特許文献３０】Graham及びvan der Eb、Virology 52(1973)、456頁
【非特許文献３１】Neumannら、EMBO J. 1(1982)、841〜845頁
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【非特許文献３３】Whitelawら、Biochem. J. 286: 31〜39頁(1992)
【非特許文献３４】Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836〜840頁(1988)
【非特許文献３５】Palmiterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478〜482頁(1991)
【非特許文献３６】Whitelawら、Transgenic Res. 1: 3〜13頁(1991)
【非特許文献３７】von Heijne、Nucl. Acids Res. 14: 4683〜4690頁(1986)
【非特許文献３８】Jaenisch、Science 240: 1468〜1474頁(1988)
【非特許文献３９】Bradleyら、Bio/Technology 10: 534〜539頁(1992)
【非特許文献４０】Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1986
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【非特許文献４９】Palmiter及びBrinster、Cell 41: 343〜345頁(1985)
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【非特許文献５３】Thimら、Biochemistry 27: 7785〜7793頁、(1988)
【非特許文献５４】Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.、1982
【非特許文献５５】Osterudら、Biochemistry 11:2853〜2857頁(1972)
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【非特許文献６４】Kabsch, W.、Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography、(2010)、Vol. 66、125〜132頁
【非特許文献６５】Karplus, P. A.ら、Science (New York、N.Y.)、(2012)、Vol. 336、1030〜1033頁
【非特許文献６６】Berman, H. M.ら、Nucleic Acids Res.、(2000)、Vol. 28、235〜242頁
【非特許文献６７】Mccoy, A. J.ら、J.Appl.Crystallogr.、(2007)、Vol. 40、658〜674頁
【非特許文献６８】Adams, P. D.ら、Acta Cryst.D、(2010)、Vol. 66、213〜221頁
【非特許文献６９】Afonine, P. V.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2012)、Vol. 68、352〜367頁
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【非特許文献７１】Krissinel, E.、Journal of Molecular Biochemistry、(2012)、Vol. 1、76〜85頁
【非特許文献７２】Collaborative Computational Project、N. Acta Crystallographica、Section D、Biological crystallography、1994、50、760〜763頁
【非特許文献７３】Johnson. D. J. D.ら、Embo J.、2006、25、2029〜2037頁
【非特許文献７４】Emsley, P.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2010)、Vol. 66、486〜501頁
【非特許文献７５】Lovell, S. C.ら、Proteins、(2000)、Vol. 40、389〜408頁
【非特許文献７６】Bailey, S.、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(1994)、Vol. 50、760〜763頁
【非特許文献７７】Nano Letters (2007)、7(8)、2207〜2210頁
【非特許文献７８】Fujiwara, K.ら(1988)、J. Imm unol. Meth. 112、77〜83頁
【非特許文献７９】Thim, Lら  Biochemistry (1988) 27、7785〜779頁
【非特許文献８０】Viuff, E.ら、Thrombosis Research、(2010)、Vol. 126、144〜149頁
【非特許文献８１】Nicolaisenら、FEBS、1993、317:245〜249頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
一般に、凝固障害を有する人には多くの満たされていない医学的必要性がある。血餅形成を促進する組換え第VIIa因子の使用は、治療剤としての増大する重要性を明確に示す。しかし、組換え第VIIa因子療法は、重大な満されていない医学的必要性を依然として残しており、改善された医薬的特性(例えば増加したインビボでの機能的半減期及び増大した活性又はより高い活性)を有する組換え第VIIa因子ポリペプチドはこれらの必要性の一部を満たすであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、医薬的特性を有するように設計された修飾第VII因子ポリペプチドを提供する。1つの広範な態様において、本発明は、ヒト野生型第VIIa因子と比較してインビボでの機能的半減期の増大を示す第VII因子ポリペプチドに関する。別の広範な態様において、本発明は、ヒト野生型第VIIa因子と比較して活性が増大した第VII因子ポリペプチドに関する。さらなる広範な態様において、本発明は、ヒト野生型第VIIa因子と比較して内因性血漿インヒビター、特にアンチトロンビンによる不活化に対する耐性の増加を示す第VII因子ポリペプチドに関する。
【００１７】
本明細書で提供されるのは、アンチトロンビン不活化に対する耐性をもたらし、タンパク質分解活性を増大させる又はタンパク質分解活性の喪失をほとんど若しくは全くもたらさない変異の組み合わせを含む、インビボでの機能的半減期が増加した第VII因子ポリペプチドである。本発明の特に興味深い態様において第VII因子ポリペプチドは、1つ又は複数の「半減期延長部分」にカップリングされてインビボでの機能的半減期を増大する。
【００１８】
1つの態様において、本発明は、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、若しくはAla(A)により置換され、及び/又はW201がArg(R)、Met(M)若しくはLys(K)により置換され、及び/又はK337がAla(A)若しくはGly(G)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチドに関する。
【００１９】
本発明の第VII因子ポリペプチドは、Lys(K)によるT293の置換及びPhe(F)によるL288の置換を含んでもよい。第VII因子ポリペプチドは、Lys(K)によるT293の置換及びTyr(Y)によるL288の置換を含んでもよい。第VII因子ポリペプチドは、Arg(R)によるT293の置換及びPhe(F)によるL288の置換を含んでもよい。第VII因子ポリペプチドは、Arg(R)によるT293の置換及びTyr(Y)によるL288の置換を含んでもよい。第VII因子ポリペプチドは、Ala(A)によるK337の置換を含んでもよく、又はAla(A)によるK337の置換を更に含んでもよい。第VII因子ポリペプチドは、Lys(K)によるT293の置換及びArg(R)によるW201の置換を含んでもよい。
【００２０】
興味深い実施形態において本発明は、少なくとも1つの半減期延長部分とカップリングされている第VII因子ポリペプチドに関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明の第VII因子ポリペプチドを産生する方法に関する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の第VII因子ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明の一般的な目的は、凝固障害を有する人における現在利用可能な治療選択肢を改善し、治療的有用性が改善された第VII因子ポリペプチドを得ることである。
【００２４】
本発明が有する1つの目的は、医薬的に許容されるタンパク質分解活性を維持しながら、インビボでの機能的半減期が延長された第VII因子ポリペプチドを得ることである。これを達成するために、本発明の第VII因子ポリペプチドは、タンパク質分解活性を実質的に保存しながら、血漿インヒビターアンチトロンビンによる不活化に対する感受性の低下をもたらす変異の組み合わせを含む。本発明の特に興味深い実施形態において、第VII因子ポリペプチドはまた、1つ又は複数の「半減期延長部分」にカップリングされる。
【００２５】
本発明の修飾第VII因子ポリペプチドによる医学的治療は、注射と注射の間のより長い期間、より低い投与量、より便利な投与、及び注射と注射の間の潜在的に改善された止血防御等、現在利用可能な治療計画に対して幾つかの利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】異なる種由来のFVIIaプロテアーゼドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図２】インビトロでのアンチトロンビン反応性とFVIIa-アンチトロンビン複合体のインビボ蓄積との相関を示す図である。
【図３】FVIIa WTにおける201位のトリプトファンのコンフォメーションと比べた、FVIIaバリアントW201R T293Y二重変異体における201位のアルギニンのコンフォメーションを示す図である。
【図４】FVIIaバリアントW201R T293Y二重変異体由来の293位のチロシンとアンチトロンビンとの相互作用の仮説モデルを示す図である。これは、スティック表示で示されたアンチトロンビンとFVIIaバリアントW201R T293Y二重変異体の複合体の理論モデルに基づく。アンチトロンビンアミノ酸は接頭語「AT」で示されるが、FVIIaアミノ酸は接頭語「FVIIa」で示される。
【図５Ａ】(A)ヘパロサンの構造を示す図である。
【図５Ｂ】(B)還元末端にマレイミド官能基を有するヘパロサンポリマーの構造を示す図である。
【図６Ａ】SDS-PAGEによるコンジュゲート純度の評価を示す図である。(A)最終FVIIaコンジュゲートのSDS-PAGE分析。ゲルにHiMark HMW標準(レーン1)、FVIIa(レーン2)、13k-HEP-[C]-FVIIa(レーン3)、27k-HEP-[C]-FVIIa(レーン4)、40k-HEP-[C]-FVIIa(レーン5)、52k-HEP-[C]-FVIIa(レーン6)、60k-HEP-[C]-FVIIa(レーン7)、65k-HEP-[C]-FVIIa(レーン8)、108k-HEP-[C]-FVIIa(レーン9)及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C(レーン10)が添加された。
【図６Ｂ】SDS-PAGEによるコンジュゲート純度の評価を示す図である。(B)糖コンジュゲート52k-HEP-[N]-FVIIaのSDS-PAGE。ゲルにHiMark HMW標準(レーン1)、ST3Gal3(レーン2)、FVIIa(レーン3)、アシアロFVIIa(レーン4)、及び52k-HEP-[N]-FVIIa(レーン5)が添加された。[N]-は、ヘパロサンがN-グリカンに結合した因子コンジュゲートを意味する。[C]-は、ヘパロサンがシステイン残基に結合した因子コンジュゲートを意味する。
【図７】ヘパロサンコンジュゲート及びグリコペグ化FVIIa参照のFVIIa凝固活性レベルの分析を示す図である。
【図８】ヘパロサンコンジュゲート及びグリコペグ化FVIIa参照のタンパク質分解活性を示す図である。
【図９】Sprague DawleyラットにおけるPK結果(LOCI)を示す図である。非修飾FVIIa(2試験)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖コンジュゲート52k-HEP-[N]-FVIIa、並びに参照分子{40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2試験)及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C}の比較。データは、片対数プロットにおける平均±SD(n=3〜6)として示されている。[N]-は、ヘパロサンがN-グリカンに結合した因子コンジュゲートを意味する。[C]-は、ヘパロサンがシステイン残基に結合した因子コンジュゲートを意味する。
【図１０】Sprague DawleyラットにおけるPK結果(凝固活性)を示す図である。非修飾FVIIa(2試験)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖コンジュゲート52k-HEP-[N]-FVIIa、並びに参照分子{40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2試験)及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C}の比較。データは片対数プロットで示されている。[N]は、ヘパロサンがN-グリカンに結合した因子コンジュゲートを意味する。[C]-は、ヘパロサンがシステイン残基に結合し因子コンジュゲートを意味する。
【図１１】幾つかのHEP-[C]-FVIIa407Cコンジュゲートに関するHEPサイズと平均滞留時間(MRT)の関係を示す図である。PK試験からのMRT値は、コンジュゲートのヘパロサンポリマーサイズに対してプロットされている。プロットは、非コンジュゲートFVIIa、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407Cの値を表す。MRT(LOCI)は、Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation社)を用いて非コンパートメント法により計算された。[N]-は、ヘパロサンがN-グリカンに結合した因子コンジュゲートを意味する。[C]-は、ヘパロサンがシステイン残基に結合した因子コンジュゲートを意味する。
【図１２】ベンズアルデヒド基を含むグリシルシアル酸シチジン一リン酸(glycylsialic acid cytidine monophosphate)(GSC)の官能化を示す図である。GSCは4-ホルミル安息香酸でアシル化され、その後還元的アミノ化反応によりヘパロサン(HEP)-アミンと反応させる。
【図１３】ベンズアルデヒド基を含むヘパロサン(HEP)ポリマーの官能化、及び還元的アミノ化反応におけるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)とのその後の反応を示す図である。
【図１４】チオ基を含むグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の官能化、及びマレイミド官能化ヘパロサン(HEP)ポリマーとのその後の反応を示す図である。
【図１５】ヘパロサン(HEP)-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を示す図である。
【図１６】Sprague DawleyラットにおけるPK結果(LOCI)を示す図である。片対数プロットにおける2×20K-HEP-[N]-FVIIa、1×40K-HEP-[N]-FVIIa及び1×40k-PEG-[N]-FVIIaの比較。データは、平均±SD(n=3〜6)として示されている。
【図１７】Sprague DawleyラットにおけるPK結果(凝固活性)を示す図である。片対数プロットにおける2×20K-HEP-[N]-FVIIa、1×40K-HEP-[N]-FVIIa及び1×40k-PEG-[N]-FVIIaの比較。
【図１８】アシアロFVIIa糖タンパク質がST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼの存在下でHEP-GSCと反応する反応スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、改善された医薬的特性を示す第VII因子ポリペプチドの設計及び使用に関する。
【００２８】
1つの態様において、本発明は、増加したインビボでの機能的半減期、血漿インヒビターアンチトロンビンによる不活化に対する低下した感受性、及び増大した又は保存されたタンパク質分解活性を示す第VII因子ポリペプチドの設計及び使用に関する。半減期延長部分へのコンジュゲーションと組み合わせたヒト第VII因子における変異の特定の組み合わせは、上述の特性をもたらすことが本発明の発明者らにより見出された。本発明の第VII因子ポリペプチドは、より長く続くプロコアグラント活性が望まれる状況において治療的に有用な血中での延長された機能的半減期を有する。このような第VII因子ポリペプチドは、Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)によるT293の置換を含む。この態様において、本発明は、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp(W)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチドに関する。本発明はまた、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びW201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチドにも関する。更に、本発明は、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びK337がAla(A)又はGly(G)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチドに関する。場合により、本発明の第VII因子ポリペプチドは更に、Lys(K)、Arg(R)又はAsn(N)によるQ176の置換を含んでもよい。場合により、本発明の第VII因子ポリペプチドは更に、Asn(N)によるQ286の置換を含んでもよい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、増大したタンパク質分解活性を示す第VII因子ポリペプチドの設計及び使用に関する。L288位及び/又はW201位でのヒト第VII因子における特定の変異は、第VII因子ポリペプチドにタンパク質分解活性の増大をもたらすことが本発明の発明者らにより見出された。この態様において、本発明は、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて1つ又は複数の置換を含み、L288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp(W)により置換され、但し、ポリペプチドが以下の置換対:L288N/R290S又はL288N/R290Tを有さない第VII因子ポリペプチドに関する。更に本態様によれば、本発明は、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて1つ又は複数の置換を含み、1つの置換が、W201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている場所にあることを特徴とする第VII因子ポリペプチドに関する。
【００３０】
第VII因子
凝固因子VII(第VII因子)は、肝臓で主に産生される糖タンパク質である。該成熟タンパク質は、配列番号1により定義された406個のアミノ酸残基から成り(例えば、米国特許第4784950号にも開示されている)、4つのドメインから構成される。N末端ガンマカルボキシグルタミン酸(Gla)リッチドメインと、これに続く2つの表皮成長因子(EGF)様ドメイン、及びC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインがある。第VII因子は、主に1本鎖分子として血漿中に循環する。第VII因子は、残基Arg152とIle153の間の切断により第VIIa因子に活性化されて、ジスルフィド結合により結合された2本鎖タンパク質をもたらす。軽鎖はGla及びEGF様ドメインを含有するが、重鎖はプロテアーゼドメインである。第VII因子における配列番号1による特異的Glu(E)残基、すなわちE6、E7、E14、E16、E19、E20、E25、E26、E29、及びE35は、翻訳後にガンマカルボキシル化され得る。Glaドメイン中のガンマカルボキシグルタミン酸残基は、リン脂質膜との相互作用を仲介するコンフォメーションにおいてGlaドメインを維持する幾つかのカルシウムイオンの調整を必要とされる。
【００３１】
用語FVII及び「第VII因子」は本明細書において、未切断1本鎖チモーゲン、第VII因子、及び切断された2本鎖ひいては活性化されたプロテアーゼ、第VIIa因子を指す。「第VII因子」には、個々に存在し得、個々に異なり得る第VII因子の天然対立遺伝子バリアントが含まれる。ヒト野生型第VII因子配列は、配列番号1に示されている。用語「第VII因子ポリペプチド」は本明細書において、第VII因子の未切断1本鎖チモーゲンポリペプチドバリアント(本明細書に記載されているような)、及び切断された2本鎖ひいては活性化されたプロテアーゼを指す。
【００３２】
第VII因子及び第VII因子ポリペプチドは、血漿由来であってもよく、又は産生及び精製のよく知られた方法を用いて組換え的に産生されてもよい。グリコシル化、ガンマカルボキシル化、及び他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及びこの増殖条件によって異なり得る。
【００３３】
第VII因子ポリペプチド
用語「第VII因子」又は「FVII」は、第VII因子ポリペプチドを意味する。
【００３４】
用語「第VII因子ポリペプチド」は、野生型第VII因子分子のほか、第VII因子バリアント、第VII因子コンジュゲート及び化学的に修飾されている第VII因子を包含する。このようなバリアント、コンジュゲート及び化学的に修飾された第VII因子は、野生型ヒト第VIIa因子と比べて実質的に同じ、又は改善された活性を示すことができる。
【００３５】
用語、第VII因子ポリペプチドの「活性」は本明細書で使用されるとき、野生型ヒト第VII因子により示される任意の活性を指し、凝固(coagulation)又は凝固(coagulant)活性、プロコアグラント活性、第X因子活性化又は第IX因子活性化に影響を与えるようなタンパク質分解活性又は触媒活性; TF、第X因子又は第IX因子を結合する能力;及び/又はリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない。これらの活性は、一般に認められているアッセイを用いて、例えば、インビトロ又はインビボで凝固を測定して、インビトロ又はインビボで評価することができる。このようなアッセイの結果は、ポリペプチドがインビボでの該ポリペプチドの活性と相関している可能性がある活性を示すことを示し、インビボ活性は生物活性と呼ばれてもよい。第VII因子ポリペプチドの活性を決定するためのアッセイは、当業者に知られている。FVIIポリペプチドの活性を評価するための例示的アッセイには、以下の実施例に記載されているようなインビトロタンパク質分解アッセイが含まれる。
【００３６】
用語「増大した又は保存された活性」は本明細書で使用されるとき、野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じ又は増加した活性、例えばi)組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、TFの存在下及び/又は非存在下で実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を示す第VIIa因子ポリペプチド; ii)組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、TF親和性が実質的に同じ又は増加した第VII因子ポリペプチド; iii)活性化血小板に対する親和性が実質的に同じ又は増加した第VII因子ポリペプチド;又はiv)組換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、第X因子若しくは第IX因子に結合する親和性/能力が実質的に同じ若しくは増加した第VII因子ポリペプチドを指す。例えば、保存された活性は、保持された活性量が、野生型ヒト第VIIa因子と比較して活性の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%以上、又は約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%以上であることを意味する。例えば増大した活性は、保持された活性量が、野生型ヒト第VIIa因子と比較して活性の110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、1000%、3000%、5000%、10000%、30000%以上、又は約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約160%、約170%、約180%、約190%、約200%、約300%、約400%、約500%、約1000%、約3000%、約5000%、約10000%、約30000%以上であることを意味する。
【００３７】
用語「第VII因子バリアント」は本明細書で使用されるとき、親タンパク質の1つ又は複数のアミノ酸が別の自然発生のアミノ酸で置換されている、及び/又は親タンパク質の1つ又は複数のアミノ酸が欠失されている、及び/又は1つ又は複数のアミノ酸が該タンパク質に挿入されている、及び/又は1つ又は複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている、配列番号1の配列を有する第VII因子を表すことが意図される。このような付加は、親タンパク質のN末端若しくはC末端のどちらか、又は両方で生じ得る。1つの実施形態においてバリアントは、配列番号1の配列と少なくとも95%同一である。別の実施形態においてバリアントは、配列番号1の配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である。本明細書で使用されるとき、特定の位置への任意の言及は、配列番号1の対応する位置を指す。
【００３８】
幾つかの実施形態において、本発明の第VII因子バリアントは、野生型ヒト第VIIa因子と比較して増大した又は保存された活性を有する。
【００３９】
本明細書で使用されるアミノ酸置換に対する用語は、次の通りである。最初の文字は、配列番号1の位置に自然に存在するアミノ酸を表す。次の数字は、配列番号1における位置を表す。2番目の文字は、天然のアミノ酸を置換する異なるアミノ酸を表す。一例は、配列番号1の197位のリジンがアラニンにより置換されているK197A第VII因子である。
【００４０】
本文脈においてアミノ酸の3文字又は1文字の略号は、以下で示された従来の意味で使用されている。明確に示されない限り、本明細書で言及されるアミノ酸はL-アミノ酸である。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
用語「第VII因子コンジュゲート」は本明細書で使用されるとき、1つ又は複数のアミノ酸及び/又は1つ又は複数の結合したグリカン部分が、アルキル化、グリコシル化、アシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、又はアミド形成による等、化学的及び/又は酵素的に修飾されている第VII因子ポリペプチドを表すことが意図される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明の第VII因子コンジュゲートは、野生型第VII因子と比べて実質的に同じ又は増大した生物活性を示す。
【００４４】
増大したタンパク質分解活性
残基L288及びW201のある特定の変異を有する第VII因子ポリペプチドは、驚くべきことに、増大したタンパク質分解活性を示すことが本発明者らにより示された。
【００４５】
WO02/22776に記載された第VII因子バリアントK337Aは、増大したタンパク質分解活性を有することが記載されている。WO03/027147に記載された第VII因子バリアントL305V及びL305Iも、より高い内因性活性を有することが記載されている。
【００４６】
タンパク質分解活性は、以下で更に論じられるように当技術分野で知られた任意の適切な方法により決定することができる。
【００４７】
例えば増大したタンパク質分解活性は、保持された活性量が、野生型ヒト第VIIa因子と比較して活性の110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、1000%、3000%、5000%、10000%、30000%以上、又は約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約160%、約170%、約180%、約190%、約200%、約300%、約400%、約500%、約1000%、約3000%、約5000%、約10000%、約30000%以上であることを意味する。
【００４８】
半減期-血漿インヒビターによる不活化に対する耐性
インビボでのクリアランスに加えて、インビボでの機能的半減期もまた、化合物が体内で「治療的に利用可能」である期間にとって重要である。組換えヒト野生型第VIIa因子の循環半減期は、約2.3時間である(「Summary Basis for Approval for NovoSeven(著作権)」、FDA参照番号96 0597)。
【００４９】
用語「インビボでの機能的半減期」は、この通常の意味で使用され、すなわち、体内/標的器官に残っている第VII因子ポリペプチドの生物活性を低下させる(終末相で50%)のに必要とされる時間、又は第VII因子ポリペプチドの活性が初期値の50%となる時間である。インビボ半減期に対する代替用語には、終末半減期、血漿半減期、循環(circulating)半減期、循環(circulatory)半減期、及びクリアランス半減期が含まれる。半減期は、実施例17に記載された方法、及びIntroduction to Pharmacokinetics and Pharmacodynamics: The Quantitative Basis of Drug Therapy (Thomas N. Tozer、Malcolm Rowland)に記載された方法等の、当技術分野で知られた適切な方法により決定することができる。
【００５０】
用語「増大した」はインビボでの機能的半減期又は血漿半減期について使用されるとき、同等の条件下で決定された野生型ヒト第VIIa因子等の参照分子の半減期と比べて、ポリペプチドの関連半減期が増大されることを示すのに使用される。
【００５１】
幾つかの実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、野生型ヒト第VIIa因子と比べて増大したインビボでの機能的半減期を示す。例えば関連半減期は、少なくとも約50%(例えば少なくとも約100%、150%、200%、約500%、約1000%、約3000%、約5000%、約10000%、約30000%以上)等少なくとも約25%増大され得る。
【００５２】
凝固カスケードの生化学及び病態生理学に関する詳細な理解にもかかわらず、循環からの個々の凝固因子のクリアランスに関する機構原理は、大部分が不明のままである。他のビタミンK依存性タンパク質のチモーゲン及び酵素形態と比較した、第VII因子及びこの活性形態第VIIa因子の循環半減期における著しい違いは、第VIIa因子の特異的及び異なるクリアランス機構の存在を示唆している。2つのタイプの経路が、第VIIa因子のクリアランスにおいて作動可能であるらしい  -  一方はインタクトなタンパク質の排除をもたらし、他方は血漿インヒビターにより仲介され、タンパク質分解不活化をもたらす。
【００５３】
アンチトロンビンIII(アンチトロンビン、AT)は豊富な血漿インヒビターであり、第VIIa因子を含む凝固系のほとんどのプロテアーゼを標的にする。アンチトロンビンIIIは、血漿中にマイクロモル濃度で存在し、自殺基質機構により標的プロテアーゼを不可逆的に結合し不活化するセリンプロテアーゼインヒビターのセルピンファミリーに属する。アンチトロンビンによる阻害は、静脈内投与後、インビボで組換え第VIIa因子の優勢なクリアランス経路となるらしい。血友病患者における組換え第VIIa因子薬物動態に関する最近の研究において、総クリアランスの約60%が、この経路に起因している可能性があった(Agersoら(2011)J Thromb Haemost、9、333〜338頁)。
【００５４】
幾つかの実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、野生型ヒト第VIIa因子と比べて、内因性血漿インヒビター、特にアンチトロンビンによる不活化に対する耐性の増加を示す。
【００５５】
上述の変異の2つの群、すなわちAT耐性の増加をもたらす変異及びタンパク質分解活性の増大をもたらす変異を組み合わせることにより、増加した又は保存された活性は、インヒビター不活化に対する高い耐性を維持しながら達成されることが本発明の発明者らにより見出された。すなわち、変異の組み合わせを含む本発明の第VII因子ポリペプチドは、アンチトロンビン不活化に対する耐性の増加、及び実質的に保存されたタンパク質分解活性を示す。本発明の第VII因子ポリペプチドが、1つ又は複数の半減期延長部分とコンジュゲートされる場合、半減期延長に対する驚くほど改善された効果が得られる。これらの特性を考慮すると、本発明のこのようなコンジュゲートされた第VII因子ポリペプチドは、医薬的に許容されるタンパク質分解活性を維持しながら改善された循環半減期を示す。その結果、作用部位で機能的に適切な濃度を得るのにより低用量のこのようなコンジュゲートされた第VII因子ポリペプチドが必要とされ得るので、出血エピソードを有する又は正常な止血系の増強を必要とする対象に対し、より低用量を及び/又はより低頻度で投与することが可能となろう。
【００５６】
追加の修飾
本発明の第VII因子ポリペプチドは、さらなる修飾、特に、追加の有利な特性を第VII因子ポリペプチドにもたらすさらなる修飾を含んでもよい。故に、上述のアミノ酸置換に加えて、本発明の第VII因子ポリペプチドは、例えば、更なるアミノ酸修飾、例えば1つの更なるアミノ酸置換を含んでもよい。1つのこのような実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、例えばWO2002077218に記載された基R396C、Q250C、及び407Cから選択される追加の変異又は付加を有する。
【００５７】
本発明の第VII因子ポリペプチドは、第VII因子ポリペプチドの一次配列中にある又はない追加の修飾を含んでもよい。追加の修飾には、糖質部分の付加、半減期延長部分の付加、例えばPEG部分、Fcドメインの付加等が含まれるが、これらに限定されない。例えば、このような追加の修飾は、第VII因子ポリペプチドの安定性又は半減期を増大させるように行うことができる。
【００５８】
半減期延長部分又は基
用語「半減期延長部分」は、本明細書において互換的に使用され、-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2等の1つ又は複数のアミノ酸側鎖官能基、並びに/又は1つ又は複数のN-及び/若しくはO-グリカン構造に結合した1つ又は複数の化学基であって、タンパク質/ポリペプチドのインビボでの機能的半減期を、これらのタンパク質/ポリペプチドにコンジュゲート/結合された場合に増大することができる1つ又は複数の化学基を指すと理解される。
【００５９】
インビボでの機能的半減期は、以下(実施例17)で更に論じられるように、当技術分野で知られた任意の適切な方法により決定することができる。
【００６０】
半減期延長部分の例には、生体適合性脂肪酸及びこの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(Hydroxy Alkyl Starch:HAS)、例えばヒドロキシエチルデンプン(Hydroxy Ethyl Starch:HES)、ポリエチレングリコール(Poly Ethylen Glycol:PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(Hyaluronic acid:HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、フレキシマー(Fleximer)、デキストラン、ポリシアル酸(Poly-sialic acid:PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド(Elastin like (ELP) peptide:ELP)、XTENポリマー、PASポリマー、PAポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチド、FcRn結合ペプチド、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００６１】
特に興味深い実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、1つ又は複数の半減期延長部分とカップリングされる。
【００６２】
1つの実施形態において本発明のシステインコンジュゲート第VII因子ポリペプチドは、第VII因子ポリペプチドに導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされた1つ又は複数の疎水性半減期延長部分を有する。本発明のシステインコンジュゲート第VII因子ポリペプチドは、更に、半減期延長部分を他のアミノ酸残基に連結させることが可能である。
【００６３】
1つの実施形態において本発明の第VII因子ポリペプチドは、例えばWO2007115953に記載されているように、組織因子にジスルフィド連結される。
【００６４】
別の実施形態において本発明の第VII因子ポリペプチドは、血小板親和性が増加した第VIIa因子バリアントである。
【００６５】
ヘパロサンコンジュゲート
本発明による第VII因子ポリペプチドヘパロサンコンジュゲートは、第VII因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖質部分を含むFVIIポリペプチドの任意の部分に付加された、1つ又は複数のヘパロサンポリマー(HEP)分子を有することができる。このようなコンジュゲートの例は、参照により本明細書に組み込まれるWO2014/060397に示されている。化学的及び/又は酵素的方法が、HEPを第VII因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートするのに使用され得る。酵素的コンジュゲーション過程の例は、例えばWO03031464に記載されている。グリカンは自然発生的であってもよく、又は例えば、当技術分野でよく知られた方法を用いて、N-グリコシル化モチーフ(NXT/S、Xは任意の自然発生のアミノ酸)を第VII因子のアミノ酸配列に導入して改変されてもよい。
【００６６】
本発明による「システイン-HEP第VII因子ポリペプチドコンジュゲート」は、FVIIポリペプチドに存在する又はFVIIポリペプチドに導入されたシステイン残基のスルフヒドリル基にコンジュゲートされた1つ又は複数のHEP分子を有する。
【００６７】
本発明の1つの興味深い実施形態において、第VII因子ポリペプチドはHEPポリマーにカップリングされる。1つの実施形態において第VII因子ポリペプチドに結合されたHEPポリマーは、13〜65kDa、13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa、36〜44kDa及び38〜42kDaから選択される範囲の分子量、又は40kDaの分子量を有する。
【００６８】
本発明の1つの興味深い実施形態において、第VII因子ポリペプチドは第VII因子ポリペプチドのN-グリカン上のHEPポリマーに結合される。
【００６９】
本発明の更なる実施形態において、2つのHEPポリマーが同じ第VII因子ポリペプチドにN-グリカンを介して結合される。この実施形態において第VII因子ポリペプチドに結合された各HEPポリマーは、13〜65kDa、13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa、36〜44kDa及び38〜42kDaから選択される範囲の分子量、又は40kDaの分子量を有する。好ましくは、ポリマーは同一の分子量を有する。
【００７０】
特定の実施形態において、2つの20kDa-HEPポリマーが同じ第VII因子ポリペプチドにこのN-グリカンを介して結合される。
【００７１】
特定の実施形態において、2つの30kDa-HEPポリマーが同じ第VII因子ポリペプチドにこのN-グリカンを介して結合される。
【００７２】
特定の実施形態において、2つの40kDa-HEPポリマーが同じ第VII因子ポリペプチドにこのN-グリカンを介して結合される。
【００７３】
ヘパロサンポリマー
ヘパロサン(HEP)は、(-GlcUA-ベータ1,4-GlcNAc-アルファ1,4-)リピートを含む天然の糖ポリマーである(図5A参照)。ヘパロサンはグリコサミノグリカン多糖ファミリーに属し、生理的pHで負に帯電したポリマーである。ヘパロンサンはある特定の細菌の莢膜に見出すことができるが、高等脊椎動物においても見出され、天然ポリマーヘパリン及びヘパラン硫酸の前駆体として機能する。詳細に証明されていないが、ヘパロサンはリソソームにおいて分解されると考えられている。Bolton-Hunter試薬で標識された100kDaヘパロサンポリマーの注入は、ヘパロサンがより小さな断片として体液/老廃物中に分泌されることを示した(US 2010/0036001)。
【００７４】
ヘパロサンポリマー及びこのようなポリマーの作成方法は、US 2010/0036001に記載されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明によれば、ヘパロサンポリマーは、US 2010/0036001に記載又は開示された任意のヘパロサンポリマーであってもよい。
【００７５】
本発明において使用するため、ヘパロサンポリマーは、US 2010/0036001又はUS 2008/0109236に記載された方法のいずれか等の任意の適切な方法により生成することができる。ヘパロサンは、細菌由来酵素を用いて生成することができる。例えば、パスツレラ・ムルトシダD型のヘパロサンシンターゼPmHS1は、GlcUA及びGlcNAcの両方を転移させてヘパロサン糖鎖を重合させる。大腸菌(Escherichia coli)K5酵素KfiA(アルファGlcNAcトランスフェラーゼ)及びKfiC(ベータGlcUAトランスフェラーゼ)も一緒に、ヘパロサンの二糖リピートを形成することができる。
【００７６】
本発明において使用するためのヘパロサンポリマーは、典型的には式(-GlcUA-ベータ1,4-GlcNAc-アルファ1,4-)nのポリマーである。
【００７７】
ヘパロサンポリマーのサイズは、この式のリピート数nにより定義され得る。前記リピート数nは、例えば2から約5000であってもよい。リピート数は、例えば50から2000単位、100から1000単位又は200から700単位であってもよい。リピート数は、200から250単位、500から550単位又は350から400単位であってもよい。ヘパロサンポリマーにおける適切な範囲の単位数を形成するために、これらの範囲の下限のいずれかがこれらの範囲の任意のより高い上限と組み合わされてもよい。
【００７８】
ヘパロサンポリマーのサイズは、この分子量により定義され得る。分子量は、質量平均分子量等のヘパロサンポリマー分子の集団に対する平均分子量であってもよい。
【００７９】
ヘパロサンポリマーのサイズに関連して本明細書に記載された分子量値は、実際、正確には列挙されているサイズでなくてもよい。ヘパロサンポリマー生成中のバッチ間変動のため、幾らかの変動が予想される。バッチ間変動を包含するために、従って、標的HEPポリマーサイズの前後に約+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%の変動が予想されるべきであることが理解される。例えば40kDaのHEPポリマーサイズは40kDa+/-10%を意味し、例えば40kDaは、例えば実際には38.8kDa、41.5kDa又は43.8kDaを意味し得る。
【００８０】
ヘパロサンポリマーは、例えば、500Daから1,000kDaの分子量を有し得る。該ポリマーの分子量は、500Daから650kDa、5kDaから750kDa、10kDaから500kDa、15kDaから550kDa又は25kDaから250kDaであってもよい。
【００８１】
分子量は、第VII因子ポリペプチドの活性とコンジュゲートの半減期又は平均滞留時間の間の適切なバランスを達成するために、これらの範囲内の特定のレベルで選択されてもよい。例えば、ポリマーの分子量は、15〜25kDa、25〜35kDa、35〜45kDa、45〜55kDa、55〜65kDa又は65〜75kDaから選択される範囲にあってもよい。
【００８２】
より特定の範囲の分子量が選択されてもよい。例えば、分子量は、20kDaから35kDa、例えば22kDaから32kDa、例えば25kDaから30kDa、例えば約27kDaであってもよい。分子量は、35から65kDa、例えば40kDaから60kDa、例えば47kDaから57kDa、例えば50kDaから55kDa、例えば約52kDaであってもよい。分子量は、50から75kDa、例えば60から70kDa、例えば63から67kDa、例えば約65kDaであってもよい。
【００８３】
特に興味深い実施形態において、本発明の第VII因子コンジュゲートのヘパロサンポリマーは、13〜65kDa、13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa及び38〜42kDaから選択される範囲のサイズを有する。
【００８４】
分子量のこれらの範囲の下限のいずれかは、本発明によるヘパロサンポリマーの分子量にとって適切な範囲を形成するために、これらの範囲からの任意のより高い上限と組み合わされてもよい。
【００８５】
ヘパロサンポリマーは、狭いサイズ分布(すなわち単分散)又は広いサイズ分布(すなわち多分散)を有し得る。多分散性(PDI)のレベルは、式Mw/Mn(Mw=質量平均分子量、及びMn=数平均分子量)に基づき数値的に表すことができる。理想的な単分散ポリマーについてこの方程式を用いた多分散性値は、1である。好ましくは、本発明において使用するためのヘパロサンポリマーは単分散である。ポリマーは従って、約1の多分散性を有してもよく、多分散性は1.25未満、好ましくは1.20未満、好ましくは1.15未満、好ましくは1.10未満、好ましくは1.09未満、好ましくは1.08未満、好ましくは1.07未満、好ましくは1.06未満、好ましくは1.05未満であってもよい。
【００８６】
ヘパロサンの分子量サイズ分布は、アガロースゲル上で実行され得る単分散サイズスタンダード(HA Lo-Ladder、Hyalose LLC社)との比較により測定することができる。
【００８７】
或いは、ヘパロサンポリマーのサイズ分布は、高性能サイズ除外クロマトグラフィー-多角度レーザー光散乱(SEC-MALLS)により決定することができる。このような方法は、ヘパロサンポリマーの分子量及び多分散性を評価するのに使用することができる。
【００８８】
ポリマーサイズは、酵素的生成方法において調節され得る。ヘパロサンアクセプター鎖対UDP糖のモル比を制御することにより、所望される最終ヘパロサンポリマーサイズを選択することができる。
【００８９】
ヘパロサンポリマーは更に、第VII因子ポリペプチドへのこの結合を可能にする反応基を含んでもよい。適切な反応基は、例えば、アルデヒド、アルキン、ケトン、マレイミド、チオール、アジド、アミノ、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、炭酸エステル、キレート剤又はこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。例えば、図5Bは、マレイミド基を含むヘパロサンポリマーを図示している。
【００９０】
実施例に記載されているように、規定サイズのマレイミド又はアルデヒド官能化ヘパロサンポリマーは、2つの糖ヌクレオチド、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを等モル量で用いる酵素(PmHS1)重合反応により調製することができる。プライミング三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2が反応を開始するために使用されてもよく、重合は糖ヌクレオチド構成単位が枯渇するまで行われる。末端アミン(プライマーに由来)が次いで、アミノ基に還元的アミノ化するために遊離システイン又はアルデヒドにコンジュゲートするためのマレイミド官能基等の、上記に記載された反応基等の適切な反応基により官能化され得る。ヘパロサンポリマーのサイズは、糖ヌクレオチド:プライマー化学量論のバリエーションにより予め決定することができる。該手法は、US 2010/0036001に詳細に記載されている。
【００９１】
反応基は、還元又は非還元末端に又は糖鎖全体を通して存在してもよい。ただ1つのこのような反応基の存在は、ヘパロサンポリマーを該ポリペプチドにコンジュゲートする場合に好ましい。
【００９２】
FVII-HEPコンジュゲートを調製する方法
例えば、WO 03/031464は、第VII因子又は第VIIa因子ポリペプチド等のポリペプチドのグリカン構造をリモデリングする方法、及び水溶性ポリマー等の修飾基をこのようなポリペプチドに付加する方法を記載している。このような方法は、ヘパロサンポリマーを本発明による第VII因子ポリペプチドに結合するのに使用することができる。
【００９３】
実施例に記載されているように、第VII因子ポリペプチドは、このグリカン部分にシアリルトランスフェラーゼを用いてコンジュゲートされてもよい。このアプローチを実施可能にするには、HEPポリマーが最初にシアル酸シチジン一リン酸に結合される必要がある。グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)はこのような化学の適切な起点であるが、他のシアル酸シチジン一リン酸又はこの断片が使用されてもよい。実施例は、HEPポリマーをGSC分子に共有結合する方法を記載している。共有結合により、FVIIaのグリカン部分に転移され得るHEP-GSC(HEPコンジュゲートグリシルシアル酸シチジン一リン酸)分子が作られる。
【００９４】
第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートは、ひとたび生成されれば精製することができる。例えば、精製は、FVIIa上の石灰化glaドメインに対するmAb等の、第VII因子ポリペプチドに対する固定化mAbを用いた親和性クロマトグラフィーを含んでもよい。このような親和性クロマトグラフィー方法において、非コンジュゲートHEP-ポリマーは、カラムの広範囲な洗浄により除去され得る。FVIIは、抗体からFVIIを放出してカラムから放出され得る。例えば、抗体が石灰化glaドメインに特異的である場合、カラムからの放出は、EDTAを含む緩衝液で洗浄して達成することができる。
【００９５】
非コンジュゲート第VII因子から第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートを分離するには、サイズ排除クロマトグラフィーが使用され得る。
【００９６】
純粋なコンジュゲートは、限外濾過により濃縮され得る。
【００９７】
生成の過程から得られる第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートの最終濃度は、例えば、FVII軽鎖のHPLC定量等のHPLC定量により決定することができる。
【００９８】
本発明と関連して、HEP等の炭水化物ポリマーをマレイミド基を介してチオ修飾GSC分子に結合させ、該試薬を糖タンパク質上のインタクトなグリコシル基にシアリルトランスフェラーゼを用いて転移させ、これにより環状スクシンイミド基を含有する結合を作ることができることが示されている。
【００９９】
しかし、スクシンイミドベースの結合は、コンジュゲートが水溶液中で長期間保管される場合、加水分解的開環を受ける可能性があり(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 309頁)、結合はインタクトなままであり得るが、開環反応が最終コンジュゲートに位置異性体及び立体異性体の形態で望ましくない不均一性を加えるであろう。
【０１００】
上記のことから、1)糖タンパク質のグリカン残基がインタクトな形態で保存され、及び2)インタクトなグリコシル残基と半減期延長部分の間のリンカー部分に不均一性が存在しないような方法で、半減期延長部分を糖タンパク質に結合することが好ましいことになる。
【０１０１】
安定で異性体のないコンジュゲートが得られるように化合物が結合される、2つの化合物(タンパク質又はタンパク質グリカンに対するHEP等の半減期延長部分等)をコンジュゲートする方法が当技術分野において必要である。
【０１０２】
1つの態様において本発明は、グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)ベースの、FVIIへのHEPのコンジュゲーションにおいて使用するための安定で異性体のないリンカーを提供する。本発明において使用されるGSC出発材料は、化学的に合成されてもよく(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁)、又はWO07056191に開示されている化学酵素的経路により得られてもよい。GSC構造が以下に示される:
【０１０３】
【化１】
2016537321.tif 000004
【０１０４】
1つの実施形態において本発明によるコンジュゲートは、
以下の様式:
【０１０５】
【化２】
2016537321.tif 000005
【０１０６】
の1つにおいてHEP-アミン及びGSCを結合する、サブリンカー又はサブ結合(sublinkage)とも呼ばれる以下の構造:
【０１０７】
【化３】
2016537321.tif 000006
【０１０８】
を含むリンカーを含む。
【０１０９】
強調された4-メチルベンゾイルサブリンカーは故に、半減期延長部分を標的タンパク質に結合させる完全な結合構造の一部を構成する。該サブリンカーは、スクシンイミドベースのリンカー(スルフヒドリル基とのマレイミド反応から調製)等の代替物と比較してそれ自体安定な構造である。この理由は、コンジュゲートが水溶液中で長期間保管される場合、後者のタイプの環状結合は加水分解的開環を受ける傾向があるためである(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 309頁)。この場合(例えば糖タンパク質におけるHEPとシアル酸の間)の結合がインタクトなままであり得ても、開環反応が最終コンジュゲート組成物に位置異性体及び立体異性体の形態で不均一性を加えるであろう。
【０１１０】
本発明によるコンジュゲートに伴う1つの利点は、故に均一な組成物が得られること、すなわちリンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が著しく減少することである。別の利点は、本発明によるリンカー及びコンジュゲートが単純な過程、好ましくは一段階過程で生成できることである。
【０１１１】
異性体は、これらがヒトにおいて不均一の産物をもたらし不要な免疫応答のリスクを高め得るため、望ましくない。
【０１１２】
HEPとGSCの間の本発明で使用される4-メチルベンゾイルサブ結合は、立体異性体又は位置異性体を形成することができない。HEPポリマーは、前述のように同期酵素重合反応により調製することができる(US 20100036001)。この方法は、マルトース結合タンパク質融合構築物として大腸菌で発現され得る、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)由来のヘパラン合成酵素I(PmHS1)を用いる。精製MBP-PmHS1は、糖ヌクレオチド(GlcNAc-UDP及びGlcUA-UDP)の等モル混合物に添加されると、同期した化学量論的に制御された反応において単分散ポリマーを生成することができる。三糖開始剤(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)が反応を刺激するのに使用され、ポリマー長がプライマー:糖ヌクレオチド比により決定される。重合反応は、糖ヌクレオチドの約90%が消費されるまで続く。ポリマーは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより反応混合物から単離され、その後安定な粉末に凍結乾燥される。
【０１１３】
官能性HEPポリマーを調製する過程は、例えばアルデヒド、アミン及びマレイミド官能化HEP試薬を列挙するUS 20100036001に記載されている。US 20100036001は、本明細書に完全に記載されているかのようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。一連の他の機能的に修飾されたHEP誘導体は、類似の化学を用いて入手可能である。本発明のある特定の実施形態において使用されるHEPポリマーは、US20100036001に記載された方法により還元末端で1級アミンハンドルにより最初に生成される。
【０１１４】
US20100036001により調製されたアミン官能化HEPポリマー(すなわちアミンハンドルを有するHEP)は、N-スクシンイミジル  4-ホルミルベンゾエートとの反応によりHEP-ベンズアルデヒドに変換され得、その後還元的アミノ化反応によりGSCのグリシルアミノ基に結合され得る。得られたHEP-GSC産物は、その後シアリルトランスフェラーゼを用いて糖タンパク質に酵素的にコンジュゲートされ得る。
【０１１５】
例えば、HEP上の前記アミンハンドルは、以下のスキーム:
【０１１６】
【化４】
2016537321.tif 000007
【０１１７】
によるN-スクシンイミジル  4-ホルミルベンゾエートとの反応により、ベンズアルデヒド官能基に変換され得る。
【０１１８】
上記のスキームにおける4-ホルミルベンズアミド化合物(2)へのHEPアミン(1)の変換は、4-ホルミル安息香酸のアシル活性化形態との反応により実行されてもよい。
【０１１９】
N-スクシンイミジルがアシル活性化基として選択されてもよいが、幾つかの他のアシル活性化基が当業者に知られている。非限定的な例には、ペプチド化学から知られている1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールエステル、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾールエステル、ペンタフルオロフェニルエステルが含まれる。
【０１２０】
ベンズアルデヒド官能基で修飾されたHEP試薬は、乾燥形態で凍結保管(-80℃)される場合、長期間安定に保つことができる。或いは、ベンズアルデヒド部分がGSC化合物に結合されてもよく、これによりアミン官能化半減期延長部分へのコンジュゲーションに適したGSC-ベンズアルデヒド化合物をもたらすことができる。この合成経路は図12に示されている。
【０１２１】
例えば、GSCは、pH中性条件下でN-スクシンイミジル  4-ホルミルベンゾエートと反応して、反応性アルデヒド基を含有するGSC化合物を提供し得る(例えばWO2011101267参照)。アルデヒド誘導体化GSC化合物(GSC-ベンズアルデヒド)は、次いでHEP-アミン及び還元剤と反応してHEP-GSC試薬を形成し得る。
【０１２２】
上述の反応は逆にすることができ、そのためHEP-アミンをN-スクシンイミジル  4-ホルミルベンゾエートと最初に反応させてアルデヒド誘導体化HEP-ポリマーを形成し、その後該ポリマーを還元剤の存在下でGSCと直接反応させる。実際にこれは、単調なGSC-CHOのクロマトグラフィー操作を取り除く。この合成経路は図13に示されている。
【０１２３】
故に、本発明の1つの実施形態においてHEP-ベンズアルデヒドは、還元的アミノ化によりGSCに結合される。
【０１２４】
還元的アミノ化は次のように進む2段階反応である:最初にイミン(シッフ塩基としても知られている)がアルデヒド成分とアミン成分の間で形成される(本実施形態ではGSCのグリシルアミノ基)。イミンは次いで第2段階においてアミンに還元される。還元剤は、形成されたイミンをアミン誘導体に選択的に還元するように選択される。
【０１２５】
幾つかの適切な還元試薬が当業者に入手可能である。非限定的な例には、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ピリジンボラン錯体(BH3:Py)、ジメチルスルフィドボラン錯体(Me2S:BH3)及びピコリンボラン錯体が含まれる。
【０１２６】
炭水化物の還元末端に対する(例えばHEPポリマーの還元末端に対する)還元的アミノ化は可能であるが、一般的に遅く不十分な反応であると記載されている(JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008 July; 19(7): 1485〜1490頁)。最初に形成されたイミンがケトアミンへ転位するアマドリ反応等の副反応も起こり得、以前に論じられているように本文脈において望ましくない不均一性をもたらすことになる。
【０１２７】
ベンズアルデヒド誘導体等の芳香族アルデヒドは、イミンがエノール化できないことから、このような転位反応を形成することができず、また、典型的には炭水化物誘導イミンにおいて見出される必要な隣接ヒドロキシ基も欠く。従って、ベンズアルデヒド誘導体等の芳香族アルデヒドは、異性体のないHEP-GSC試薬を生成するための還元的アミノ化反応において特に有用である。
【０１２８】
還元的アミノ化化学を迅速に完了させるために、過剰なGSC及び還元試薬が場合により使用される。反応が完了すると、過剰な(未反応)GSC試薬及び過剰な還元試薬等の他の小分子成分は、その後、透析、接線流濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーにより除去することができる。
【０１２９】
シアリルトランスフェラーゼの天然基質、Sia-CMP、及びGSC誘導体は両方とも、帯電した高親水性の多機能性分子である。更にこれらは、特にpHが6.0より低い場合、長期間、溶液中で安定しない。このような低pHにおいて、基質転移に必要なCMP活性化基は、酸触媒リン酸ジエステル加水分解により失われる。CMP-加水分解を避けるために、GSC及びSia-CMP誘導体の選択的修飾及び単離は、故にpHの慎重な制御、及び迅速で効率的な単離方法を必要とする。
【０１３０】
本発明において大きな半減期延長部分が、還元的アミノ化化学を用いてGSCにコンジュゲートされる。ベンズアルデヒド修飾半減期延長部分等のアリールアルデヒドは、還元的アミノ化条件下でGSCと効率的に反応できるためこのタイプの修飾に最適であることが見出されている。
【０１３１】
GSCは酸性媒体中で加水分解を受け得ることから、HEP-ベンズアルデヒドへの結合中に中性に近い又はやや塩基性の環境を維持することが重要である。HEPポリマー及びGSCは両方とも高水溶性であり、従って水性緩衝液系が、pHを中性に近いレベルに維持するのに好ましい。幾つかの有機及び無機緩衝液の両方が使用され得るが、緩衝液成分は還元的アミノ化条件下で好ましくは反応性であるべきでない。これは例えば、1級及び程度が下がっても2級アミノ基を含有する有機緩衝液系を排除する。当業者であれば、どの緩衝液が適切であり適切でないかがわかるであろう。適切な緩衝液の幾つかの例が以下のTable 1(表2)に示されている。
【０１３２】
【表２】
2016537321.tif 000008
【０１３３】
この方法を適用することにより、異性体のない安定な結合を有する、半減期延長部分で修飾されたGSC試薬は効率的に調製され得、CMP活性化基の加水分解の機会を最小化する単純な過程において単離され得る。
【０１３４】
前記化合物のどちらかを互いに反応させることにより、4-メチルベンゾイルサブリンカー部分を含むHEP-GSCコンジュゲートを作り得る。
【０１３５】
GSCはまたチオブチロラクトンとも反応し得、これによりチオール修飾GSC分子(GSC-SH)をもたらし得る。本発明で実証されているように、このような試薬を、マレイミド官能化HEPポリマーと反応させてHEP-GSC試薬を形成することができる。この合成経路は図15に示されている。得られた産物は、スクシンイミドを含む結合構造を有する。
【０１３６】
【化５】
2016537321.tif 000009
【０１３７】
しかし、スクシンイミドベースの(サブ)結合は、特に修飾GSC試薬が水溶液中で長期間保管される場合、加水分解的開環を受ける可能性があり、結合はインタクトなままであり得るが、開環反応が位置異性体及び立体異性体の形態で望ましくない不均一性を加えるであろう。
【０１３８】
糖コンジュゲーション方法
HEP-GSCコンジュゲートと(ポリ)ペプチドとのコンジュゲーションは、(ポリ)ペプチド骨格中の残基に存在するグリカンを介して実行され得る。コンジュゲーションのこの形態は、糖コンジュゲーションとも呼ばれる。
【０１３９】
シアリルトランスフェラーゼに基づく方法は、凝固因子FVII等の血液凝固因子上のN-グリカン又はO-グリカンを修飾するのに穏やかで高選択性であることが長年にわたって証明されている。
【０１４０】
システインアルキル化、リジンアシル化及びタンパク質骨格中のアミノ酸を必要とする類似のコンジュゲーションに基づくコンジュゲーション方法とは対照的に、グリカンを介したコンジュゲーションは、生物活性の妨害を少なくしてタンパク質/ペプチド断片のポリマー等のより大きな構造を生物活性タンパク質に結合する魅力的な方法である。これは、高親水性であるグリカンは一般的にタンパク質表面から離れ溶液中に出て配向される傾向があり、タンパク質活性に重要な結合表面を自由にするためである。
【０１４１】
グリカンは天然に存在し得、又は例えば、当技術分野でよく知られている方法を用いたN-結合グリカンの挿入を介して挿入され得る。
【０１４２】
GSCは、シアリルトランスフェラーゼを用いて糖タンパク質に転移させることができるシアル酸誘導体である。GSCは、グリシルアミノ基上のPEG等の置換基で選択的に修飾され得、シアリルトランスフェラーゼを用いて糖タンパク質に酵素的に依然として転移され得る。GSCは、大規模な酵素的過程により効率的に調製することができる(WO07056191)。
【０１４３】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を天然活性化シアル酸(Sia)−CMP(シチジン一リン酸)化合物から、例えばタンパク質上のガラクトシル部分に転移させるグリコシルトランスフェラーゼの一クラスである。多くのシアリルトランスフェラーゼ(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)は、特に40kDa PEG等の大きな基を有する、C5アセトアミド基で修飾されたシアル酸−CMP(Sia-CMP)誘導体を転移させることができる(WO03031464)。本発明により使用され得る当該シアリルトランスフェラーゼの広範であるが非限定的なリストは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2006094810に開示されている。
【０１４４】
本発明の1つの態様において、アシアロ糖タンパク質を提供するために、糖タンパク質上の末端シアル酸がシアリダーゼ処理により除去され得る。アシアロ糖タンパク質及び半減期延長部分で修飾されたGSCは一緒に、シアリルトランスフェラーゼの基質として作用することになる。該反応の産物は、インタクトなグリコシル連結基(この場合、インタクトなシアル酸リンカー基)を介して連結された半減期延長部分を有する糖タンパク質コンジュゲートである。アシアロFVIIa糖タンパク質をシアリルトランスフェラーゼの存在下でHEP-GSCと反応させる反応スキームは、図18に示されている。
【０１４５】
用語「シアル酸」は、9炭素カルボキシル化糖のファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース(galactononulopyranos)-1-オン酸(しばしばNeu5Ac、NeuAc、NeuNAc、又はNANAと略される)である。該ファミリーの第2のメンバーは、NeuNAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されたN-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)である。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)である(Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557頁; Kanamoriら、J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819頁(1990))。また、9-O-ラクチル-Neu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acのような9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac等の9-置換シアル酸も含まれる。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、1992年10月1日に公開された国際出願WO92/16640に開示されている。
【０１４６】
用語「シアル酸誘導体」は、1つ又は複数の化学部分で修飾された上記に定義されているシアル酸を指す。修飾基は、例えば、メチル基等のアルキル基、アジド基及びフルオロ基、又は他の化学部分を結合するハンドルとして機能することができるアミノ基若しくはチオール基等の官能基であってもよい。例には、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acが含まれる。該用語はまた、カルボキシル基又は1つ又は複数のヒドロキシル基等の1つ又は複数の官能基を欠くシアル酸も包含する。カルボキシル基がカルボキサミド基又はエステル基と置換された誘導体も、該用語により包含される。該用語はまた、1つ又は複数のヒドロキシル基がカルボニル基に酸化されているシアル酸も指す。更に該用語は、例えば過ヨウ素酸塩による酸化処理後にC9炭素原子又はC9〜C8炭素鎖の両方を欠くシアル酸も指す。
【０１４７】
グリシルシアル酸は、NeuNAcのN-アセチル基がアミノアセチル基としても知られるグリシル基と置換された、上記の定義によるシアル酸誘導体である。グリシルシアル酸は、以下の構造:
【０１４８】
【化６】
2016537321.tif 000010
【０１４９】
で表すことができる。
【０１５０】
用語「CMP活性化」シアル酸又はシアル酸誘導体は、シアル酸部分及びシチジン一リン酸(CMP)を含有する糖ヌクレオチドを指す。
【０１５１】
本記載において、用語「グリシルシアル酸シチジン一リン酸」はGSCを記載するために使用され、同じCMP活性化グリシルシアル酸の代替呼称と同義語である。代替呼称には、CMP-5'-グリシルシアル酸、シチジン-5′-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸、シチジン-5′-モノホスホ-N-グリシルシアル酸が含まれる。
【０１５２】
用語「インタクトなグリコシル連結基」は、ポリペプチドとHEP部分の間に置かれ、ポリペプチド及びHEP部分に共有結合されたサッカリドモノマーが、例えば、コンジュゲート形成中にメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより、分解(例えば酸化)されないグリコシル部分から得られる連結基を指す。「インタクトなグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加又は親サッカリド構造からの1つ又は複数のグリコシル単位の除去により天然に存在するオリゴサッカリドから得ることができる。
【０１５３】
用語「アシアロ糖タンパク質」は、1つ又は複数の末端シアル酸残基が、例えばシアリダーゼによる処理又は化学的処理により除去され、少なくとも1つのガラクトース又はN-アセチルガラクトースアミン残基を、ガラクトース又はN-アセチルガラクトースアミンの下にある「層」から露出させている(「露出ガラクトース残基」)糖タンパク質を含むことが意図される。
【０１５４】
構造式中の点線は、オープン原子価(open valence)結合(すなわち構造を他の化学部分につなげる結合)を意味する。
【０１５５】
PEG化誘導体
本発明による「PEG化第VII因子ポリペプチドバリアント/誘導体」は、第VII因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は炭水化物部分を含むFVIIポリペプチドの任意の部分に結合された、1つ又は複数のポリエチレングリコール(PEG)分子を有してもよい。化学的方法及び/又は酵素的方法が、PEG又は他の半減期延長部分を第VII因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートするのに使用され得る。酵素的コンジュゲーション過程の例は、例えばWO03031464に記載されている。グリカンは天然に存在してもよく、又はグリカンはHEPコンジュゲートに関して上記に記載されているように改変されてもよい。本発明による「システイン-PEG化第VII因子ポリペプチドバリアント」は、FVIIポリペプチドに存在する又はFVIIポリペプチドに導入されたシステイン残基のスルフヒドリル基にコンジュゲートされた1つ又は複数のPEG分子を有する。
【０１５６】
融合タンパク質
融合タンパク質は、もともと別個のタンパク質若しくはペプチド又はこの断片をコードする2つ以上のDNA配列のインフレーム結合を通じて作り出されたタンパク質である。融合タンパク質DNA配列の翻訳は、もともとの各タンパク質又はペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有し得る、単一のタンパク質配列をもたらすであろう。融合タンパク質をコードするDNA配列は、オーバーラップPCR又はDNAライゲーション等の標準的な分子生物学方法により人工的に作り出すことができ、アセンブリは、最初の5'末端DNA配列中の終止コドンを排除する一方、3'末端DNA配列中の終止コドンを保持して行われる。得られた融合タンパク質DNA配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等の標準的宿主生物における異種融合タンパク質発現を支持する適切な発現ベクターに挿入することができる。
【０１５７】
融合タンパク質は、リンカー、又は融合タンパク質を規定するタンパク質若しくはペプチド部分を分離するスペーサーペプチド配列を含有することができる。
【０１５８】
本発明の1つの興味深い実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、第VII因子ポリペプチド及び融合パートナータンパク質/ペプチド、例えばFcドメイン又はアルブミンを含む融合タンパク質である。
【０１５９】
Fc融合タンパク質
用語「Fc融合タンパク質」は、本明細書において、任意の抗体アイソタイプに由来し得るFcドメインに融合された本発明の第VII因子ポリペプチドを包含することが意味される。IgG Fcドメインは、IgG抗体の比較的長い循環半減期のため、多くの場合好ましいであろう。Fcドメインは、例えば補体結合及び/又はある特定のFc受容体への結合等のある特定のエフェクター機能を調節するために、更に修飾されてもよい。FcRn受容体に結合する能力を有するFcドメインとのFVIIポリペプチドの融合は、一般的に、wt FVIIポリペプチドの半減期と比較して、融合タンパク質の循環半減期の延長をもたらすであろう。IgG Fcドメインにおける234、235及び237位の変異は、一般的に、FcγRI受容体、並びに恐らく同様にFcγRIIa及びFcγRIII受容体への結合の減少をもたらすであろう。これらの変異は、エンドサイトーシスリサイクリング経路により長い循環半減期を促進するFcRn受容体への結合を変化させない。好ましくは、本発明による融合タンパク質の修飾IgG Fcドメインは、1つ又は複数の以下の変異を含み、該変異はそれぞれ、ある特定のFc受容体に対する親和性の減少(L234A、L235E、及びG237A)、及びC1q媒介補体固定の低下(A330S及びP331S)をもたらすであろう。或いは、Fcドメインは、好ましくはS241P/S228P変異を含む、IgG4 Fcドメインであってもよい。
【０１６０】
第VII因子ポリペプチドの産生
本発明の第VII因子ポリペプチドは、産生及び精製のよく知られた方法を用いて組換え的に産生することができる。これらの方法の幾つかの例が以下に記載されている。産生及び精製の方法の更なる例は、特にWO2007/031559に記載されている。
【０１６１】
1つの態様において、本発明は、第VII因子ポリペプチドを産生する方法に関する。本明細書に記載された第VII因子ポリペプチドは、組換え核酸法により産生することができる。一般に、クローン化ヒト野生型第VII因子核酸配列は、所望のタンパク質をコードするように修飾される。この修飾配列は、次いで発現ベクターに挿入され、今度は宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされる。より高等な真核細胞、特に培養哺乳動物細胞が、宿主細胞として好ましい。
【０１６２】
さらなる態様において、本発明は、該ポリヌクレオチド構築物を含有及び発現するトランスジェニック動物に関する。
【０１６３】
ヒト野生型第VII因子に関する完全なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が知られている(組換えヒト第VII因子のクローニング及び発現が記載されているU.S. 4,784,950参照)。
【０１６４】
アミノ酸配列変異は、様々な既知の手法により達成され得る。部位特異的変異誘発の手法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Zoller及びSmith(DNA 3:479〜488頁、1984)又は「Splicing by extension overlap」、Hortonら、Gene 77、1989、61〜68頁に記載されている。故に、第VII因子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を用いて、選択した変異を導入することができる。同様に、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてDNA構築物を調製する手順は、当業者によく知られている(PCR Protocols、1990、Academic Press、San Diego、California、USA参照)。
【０１６５】
本発明の第VII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は適切には、ゲノム起源又はcDNA起源であり得、第VII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物はまた、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers、Tetrahedron Letters 22(1981)、1859〜1869頁により記載されたホスホラミダイト方法により合成的に調製することもできる。ヒト第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、例えばUS 4,683,202、Saikiら、Science 239(1988)、487〜491頁、又はSambrookら(上記参照)に記載されているように、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により調製することもできる。
【０１６６】
更に、核酸構築物は、標準的な手法に従って、合成起源、ゲノム起源又はcDNA起源(適宜)の断片(全核酸構築物の様々な部分に対応する断片)をライゲートして調製された、合成起源及びゲノム起源の混合、合成起源及びcDNA起源の混合、又はゲノム起源及びcDNA起源の混合であってもよい。
【０１６７】
核酸構築物は、好ましくはDNA構築物である。本発明による第VII因子ポリペプチドの産生において使用するDNA配列は、適切な翻訳後プロセシング(例えばグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化)及び宿主細胞からの分泌を得るために、第VII因子のアミノ末端にプレプロポリペプチドを典型的にはコードするであろう。プレプロポリペプチドは、第VII因子、又は第IX因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインC若しくはプロテインS等の別のビタミンK依存性血漿タンパク質のプレプロポリペプチドであってもよい。当業者により理解されるように、追加の修飾は、これらの修飾が、凝固剤として作用するタンパク質の能力を大幅に損なわない第VII因子ポリペプチドのアミノ酸配列において行われ得る。
【０１６８】
ヒト第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列は、好都合には組換えDNA手順に供することができる任意のベクターであり得る組換えベクターに通常は挿入され、ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に多くの場合依存するであろう。故に、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、複製が染色体複製から独立している染色体外実体、例えばプラスミドとして存在するベクターであってもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【０１６９】
ベクターは好ましくは、ヒト第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列が、DNAの転写に必要とされる追加のセグメントに作動可能に連結される発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミド若しくはウイルスDNAに由来し、又は両方のエレメントを含有してもよい。用語「作動可能に連結される」は、セグメントが、意図された目的に対して協調して機能する(例えば転写がプロモーターにおいて開始し、ポリペプチドをコードするDNA配列を通って進む)ように整列されることを示す。
【０１７０】
第VIIa因子ポリペプチドバリアントの発現に使用する発現ベクターは、クローン化遺伝子又はcDNAの転写を指示することができるプロモーターを含むであろう。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示し、及び宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る、任意のDNA配列であってもよい。
【０１７１】
哺乳動物細胞においてヒト第VII因子ポリペプチドをコードするDNAの転写を指示する適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター(Subramaniら、Mol. Cell Biol. 1(1981)、854〜864頁)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター[Palmiterら、Science 222(1983)、809〜814頁]、CMVプロモーター(Boshartら、Cell 41:521〜530頁、1985)、又はアデノウイルス2型主要後期プロモーター(Kaufman及びSharp、Mol. Cell. Biol、2:1304〜1319頁、1982)である。
【０１７２】
第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、必要であれば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiterら、Science 222、1983、809〜814頁)、又はTPI1(Alber及びKawasaki、J. Mol. Appl. Gen. 1、1982、419〜434頁)若しくはADH3(McKnightら、The EMBO J. 4、1985、2093〜2099頁)ターミネーター等の適切なターミネーターに作動可能に結合することもできる。発現ベクターはまた、プロモーターから下流、及び第VII因子配列自体の挿入部位から上流に位置する一連のRNAスプライス部位を含有することもできる。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルス遺伝子及び/又は免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。同様に発現ベクターに含有されるのは、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、SV40由来の初期又は後期ポリアデニル化シグナル(Kaufman及びSharp、同上)、アデノウイルス5 Elb領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNotoら  Nucl. Acids Res. 9:3719〜3730頁、1981)、又はヒト第VII因子遺伝子若しくはウシ第VII因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが含まれる。発現ベクターは、プロモーターとRNAスプライス部の間に位置するアデノウイルス2型三連リーダー(tripartite leader)等の非コードウイルスリーダー配列、及びSV40エンハンサー等のエンハンサー配列も含むことができる。
【０１７３】
本発明の第VII因子ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる)が組換えベクター中に提供されてもよい。分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレームにヒト第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列に結合される。分泌シグナル配列は通常、ペプチドをコードするDNA配列の5'に位置する。分泌シグナル配列は普通、タンパク質と関連するものであってもよく、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来であってもよい。
【０１７４】
第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列、プロモーター配列、並びに場合によりターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲートし、複製に必要な情報を含有する適切なベクターにこれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989参照)。
【０１７５】
哺乳動物細胞をトランスフェクトし、細胞に導入されたDNA配列を発現させる方法は、例えば、Kaufman及びSharp、J. Mol. Biol. 159(1982)、601〜621頁; Southern及びBerg、J. Mol. Appl.Genet. 1(1982)、327〜341頁; Loyterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982)、422〜426頁; Wiglerら、Cell 14(1978)、725頁; Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7(1981)、603頁、Graham及びvan der Eb、Virology 52(1973)、456頁;及びNeumannら、EMBO J. 1(1982)、841〜845頁に記載されている。
【０１７６】
クローン化DNA配列は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション(Wiglerら、Cell 14:725〜732頁、1978; Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7:603〜616頁、1981; Graham及びVan der Eb、Virology 52d:456〜467頁、1973)、又はエレクトロポレーション(Neumannら、EMBO J. 1:841〜845頁、1982)により培養哺乳動物細胞に導入される。外因性DNAを発現する細胞を同定及び選択するために、選択可能な表現型をもたらす遺伝子(選択可能なマーカー)が、一般的に、目的とする遺伝子又はcDNAに沿って細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキサート等の薬剤に対する耐性をもたらす遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)配列である。選択可能なマーカーは、目的とする遺伝子と同時に別個のプラスミド上で細胞に導入されてもよく、又は選択可能なマーカーは、同じプラスミド上で導入されてもよい。同じプラスミド上であるならば、選択可能なマーカー及び目的とする遺伝子は、異なるプロモーター又は同じプロモーターの制御下にあってもよく、後者の配置はジシストロニックなメッセージを生成する。このタイプの構築物は、当技術分野で知られている(例えば、Levinson及びSimonsen、U.S. 4,713,339)。細胞に導入された混合物に、「担体DNA」として知られる追加のDNAを付加することもまた有利であり得る。
【０１７７】
細胞が該DNAを取り込んだ後、細胞は、適切な増殖培地で典型的には1〜2日増殖されて、目的とする遺伝子を発現し始める。本明細書で使用されるとき、用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖及び目的とする第VII因子ポリペプチドの発現に必要とされる栄養素及び他の成分を含有する培地を意味する。培地は一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質、及び増殖因子を含む。ガンマカルボキシル化タンパク質を産生するために、培地は、ビタミンKを好ましくは約0.1μg/mlから約5μg/mlの濃度で含有するであろう。薬剤選択は、次いで、選択可能なマーカーを安定な様式で発現している細胞の増殖を選択するために適用される。増幅可能な選択可能なマーカーをトランスフェクトされた細胞に関して、増加したコピー数のクローン化配列を選択するために薬剤濃度が増加され得、これにより発現レベルを増加させることができる。安定にトランスフェクトされた細胞のクローンは、次いで目的とするヒト第VII因子ポリペプチドの発現についてスクリーニングされる。
【０１７８】
第VII因子ポリペプチドをコードするDNA配列が導入される宿主細胞は、翻訳後修飾されたヒト第VII因子ポリペプチドを産生することができ、並びに酵母、真菌、及びより高等な真核細胞を含むいずれの細胞であってもよい。
【０１７９】
本発明において使用するための哺乳動物細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばATCC CCL 61)、CHO DUKX細胞(Urlaub及びChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220頁、1980)、ベビーハムスター腎臓(BHK)、及び293(ATCC CRL 1573; Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59〜72頁、1977)細胞系である。
【０１８０】
上記の形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は、次いで、第VII因子ポリペプチドの発現を可能にする条件下、適切な栄養培地で培養され、この後、得られたペプチドの全部又は一部が培養から回収され得る。細胞を培養するのに使用される培地は、適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地等の、宿主細胞を増殖させるのに適切な任意の従来の培地であってもよい。適切な培地は、商業的供給者から入手可能であり、又は公開されたレシピ(例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ中の)により調製することができる。細胞により産生された第VII因子ポリペプチドは、次いで、遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩(例えば硫酸アンモニウム)による上清又は濾液のタンパク質性成分の沈殿、様々なクロマトグラフィー手順(例えば当該ポリペプチドのタイプに依存したイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等)による精製を含む従来の手順により、培養培地から回収することができる。
【０１８１】
トランスジェニック動物技術が、本発明の第VII因子ポリペプチドを産生するのに使用されてもよい。宿主メス哺乳動物の乳腺内でタンパク質を産生することが好ましい。乳腺での発現、及びこの後の乳汁への目的とするタンパク質の分泌は、他の供給源からのタンパク質の単離において遭遇する多くの問題を克服する。乳汁は容易に採取され、大量に入手可能であり、生化学的に十分に特徴付けられている。更に、主な乳タンパク質は、高濃度(典型的には約1〜15g/l)で乳汁に存在する。
【０１８２】
商業的観点から、大きな乳収量を有する種を宿主として使用することが明らかに好ましい。マウス及びラット等のより小型の動物が使用され得る(原理段階の証明では好ましい)が、ブタ、ヤギ、ヒツジ及びウシを含むがこれらに限定されない家畜哺乳動物を使用することが好ましい。ヒツジは、この種における遺伝子導入の前歴、乳収量、コスト、及びヒツジ乳を採取する装置の入手しやすさといった要因のため、特に好ましい(例えば、宿主種の選択に影響を与える要因の比較にはWO 88/00239参照)。イーストフリースランドシープ(East Friesland sheep)等の酪農用に育種された宿主動物の品種を選択すること、又は後日、トランスジェニック系の交配により酪農家畜を導入することが、一般的に望ましい。いずれの場合も、既知の良好な健康状態の動物が使用されるべきである。
【０１８３】
乳腺での発現を得るために、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモーターが使用される。乳タンパク質遺伝子には、カゼイン(U.S. 5,304,489参照)、ベータ-ラクトグロブリン、a-ラクトアルブミン、及び乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ベータ-ラクトグロブリン(BLG)プロモーターが好ましい。ヒツジベータ-ラクトグロブリン遺伝子の場合では、遺伝子の5'フランキング配列の少なくとも近位406bpの領域が一般的に使用されるであろうが、ベータ-ラクトグロブリン遺伝子の5'フランキングプロモーター及び非コード部分を包含する約4.25kbp DNAセグメント等の、5'フランキング配列のより大きい部分(最大約5kbp)が好ましい[Whitelawら、Biochem. J. 286: 31〜39頁(1992)参照]。他の種由来のプロモーターDNAの類似の断片もまた適切である。
【０１８４】
ベータ-ラクトグロブリン遺伝子の他の領域もまた、発現される遺伝子のゲノムの領域と同様に構築物に組み込まれてよい。イントロンを欠く構築物は、例えば、このようなDNA配列を含有する構築物と比較して、十分に発現されないことが当技術分野で一般的に認められている[Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836〜840頁(1988); Palmiterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478〜482頁(1991); Whitelawら、Transgenic Res. 1: 3〜13頁(1991); WO 89/01343;及びWO 91/02318参照。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれている]。この点に関して、可能であれば、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の天然イントロンの全て又は幾つかを含有するゲノムの配列を使用することが一般的に好ましく、故に、例えばベータ-ラクトグロブリン遺伝子由来の、少なくとも幾つかのイントロンを更に含むことが好ましい。1つのこのような領域は、ヒツジベータ-ラクトグロブリン遺伝子の3'非コード領域由来の、イントロンスプライシング及びRNAポリアデニル化をもたらすDNAセグメントである。遺伝子の天然3'非コード配列が置換される場合、このヒツジベータ-ラクトグロブリンセグメントは、目的とするタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを増大させることも安定化させることもできる。他の実施形態において、バリアント第VII因子配列の開始ATGを囲む領域は、乳特異的タンパク質遺伝子由来の対応する配列と置換される。このような置換は、発現を増大させる推定上の組織特異的開始環境をもたらす。バリアント第VII因子プレプロ配列全体及び5'非コード配列を、例えばBLG遺伝子のものと置換することが好都合であるが、より小さい領域が置換されてもよい。
【０１８５】
トランスジェニック動物における第VII因子ポリペプチドの発現のために、バリアント第VII因子をコードするDNAセグメントが、この発現に必要とされる追加のDNAセグメントに作動可能に連結されて、発現ユニットを生成する。このような追加のセグメントは、上述のプロモーター、並びにmRNAの転写及びポリアデニル化の停止をもたらす配列を含む。発現ユニットは、修飾第VII因子をコードするセグメントに作動可能に連結された分泌シグナル配列をコードするDNAセグメントを更に含むであろう。分泌シグナル配列は、天然第VII因子分泌シグナル配列であってもよく、又は乳タンパク質等の別のタンパク質のものであってもよい(例えば、参照により本明細書に組み込まれているvon Heijne、Nucl. Acids Res. 14: 4683〜4690頁(1986);及びMeadeら、U.S. 4,873,316参照)。
【０１８６】
トランスジェニック動物において使用するための発現ユニットの構築は、好都合には、追加のDNAセグメントを含有するプラスミド又はファージベクターにバリアント第VII因子配列を挿入して実施されるが、発現ユニットは、ライゲーションの本質的に任意の配列により構築することができる。乳タンパク質をコードするDNAセグメントを含有するベクターを提供すること、及び乳タンパク質のコード配列を第VII因子バリアントのものと置換し、これにより乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合を作り出すことが特に好都合である。いずれの場合も、プラスミド又は他のベクターへの発現ユニットのクローニングは、バリアント第VII因子配列の増幅を促進する。増幅は、好都合には細菌[例えば大腸菌(E. coli)]宿主細胞で実施され、故にベクターは典型的には、複製起源及び細菌宿主細胞において機能的な選択可能なマーカーを含むであろう。発現ユニットは次いで、選択された宿主種の受精卵(初期の胚を含む)に導入される。異種DNAの導入は、マイクロインジェクション[例えば米国特許第4,873,191号)、レトロウイルス感染(Jaenisch、Science 240: 1468〜1474頁(1988)]、又は胚性幹(ES)細胞を用いる部位特異的組み込み(Bradleyら、Bio/Technology 10: 534〜539頁(1992)によりレビューされている)を含む、幾つかの経路の1つにより達成することができる。受精卵は次いで、偽妊娠したメスの卵管又は子宮に移植され、出産まで発育させられる。導入されたDNAを生殖細胞系に担持する子は、この子孫に正常なメンデル様式でDNAを伝えることができ、トランスジェニック集団の発生を可能にする。トランスジェニック動物を作製する一般的な手順は、当技術分野で知られている(例えば、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1986; Simonsら、Bio/Technology 6: 179〜183頁(1988); Wallら、Biol. Reprod. 32: 645〜651頁(1985); Buhlerら、Bio/Technology 8: 140〜143頁(1990); Ebertら、Bio/Technology 9: 835〜838頁(1991); Krimpenfortら、Bio/Technology 9: 844〜847頁(1991); Wallら、J. Cell. Biochem. 49: 113〜120頁(1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239、WO 90/05188、WO 92/11757;及びGB 87/00458参照)。外来DNA配列を哺乳動物及びこの生殖細胞に導入する手法は、もともとマウスにおいて開発された(例えば、Gordonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380〜7384頁(1980); Gordon及びRuddle、Science 214: 1244〜1246頁(1981); Palmiter及びBrinster、Cell 41: 343〜345頁(1985); Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438〜4442頁(1985);並びにHoganら(同上)参照)。これらの手法は、この後、家畜種を含むより大型の動物で使用するために適合された[例えば、WO 88/00239、WO 90/05188、及びWO 92/11757;並びにSimonsら、Bio/Technology 6: 179〜183頁(1988)参照]。要約すると、トランスジェニックマウス又は家畜の発生において今日までに使用された最も効率的な経路において、確立された手法により、目的とするDNAの数百の直鎖状分子が受精卵の前核の1つに注入される。接合子の細胞質へのDNAの注入も使用することができる。
【０１８７】
精製
本発明の第VII因子ポリペプチドは、細胞培養培地から回収される。本発明の第VII因子ポリペプチドは、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動手順[例えば、分取等電点電気泳動(IEF)]、示差溶解度(例えば、硫安塩析)、又は抽出を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られた様々な手順により精製することができる(例えば、Protein Purification、J.-C. Janson及びLars Ryden編者、VCH Publishers、New York、1989参照)。好ましくは、第VII因子ポリペプチドは、抗第VII因子抗体カラム上で親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。Wakabayashiら、J. Biol. Chem. 261:11097〜11108頁、(1986)、及びThimら、Biochemistry 27: 7785〜7793頁、(1988)に記載されているようなカルシウム依存性モノクローナル抗体の使用が特に好ましい。さらなる精製は、高速液体クロマトグラフィー等の従来の化学的精製手段により達成することができる。クエン酸バリウム沈殿を含む精製の他の方法が当技術分野で知られており、本明細書に記載された新規の第VII因子ポリペプチドの精製に適用されてもよい(例えば、Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.、1982参照)。
【０１８８】
治療目的には、本発明の第VII因子ポリペプチドは、実質的に純粋であることが好ましい。故に、本発明の好ましい実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、少なくとも約90から95%均一性、好ましくは少なくとも約98%均一性まで精製される。純度は、当技術分野で知られた幾つかの方法、例えばHPLC、ゲル電気泳動及びアミノ末端アミノ酸配列決定により評価することができる。
【０１８９】
第VII因子ポリペプチドは、この2本鎖形態に変換するためにこの活性化部位で切断される。活性化は、Osterudら、Biochemistry 11:2853〜2857頁(1972); Thomas、米国特許第4,456,591号; Hedner及びKisiel、J. Clin. Invest. 71:1836〜1841頁(1983);又はKisiel及びFujikawa、Behring Inst. Mitt. 73:29〜42頁(1983)により開示されたもの等、当技術分野で知られた手順により実施することができる。或いは、Bjoernら(Research Disclosure、269 September 1986、564〜565頁)により記載されているように、第VII因子は、Mono Q(登録商標)(Pharmacia fine Chemicals社)等のイオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて活性化されてもよい。得られた活性化第VII因子バリアントは次いで、以下に記載されているように製剤化及び投与することができる。
【０１９０】
アッセイ
本明細書において提供されるのは、本発明による好ましい第VII因子ポリペプチドを選択するための適切なインビトロでのタンパク質分解アッセイ及びアンチトロンビン反応性アッセイである。このようなアッセイは、実施例5に詳細に記載されている。簡単には、アッセイは、次のような単純な予備的インビトロテストとして行うことができる。
【０１９１】
FVIIaポリペプチドのタンパク質分解活性は、カルシウム並びに反応を支持するホスファチジルコリン(PC)及びホスファチジルセリン(PS)から成るベシクルの存在下、生理的pHで生理的基質血漿由来因子X(X)を基質として用いて測定することができる。アッセイは、反応のKm未満の基質濃度で、及び20%未満のFXの変換を保ちながら測定可能な量のFXaの生成を可能にする十分な期間、FVIIaをFXとインキュベートして行われる。生成されたFXaは、S-2765等の適切な発色基質の添加後に定量化され、テストされるFVIIaバリアントの濃度による正規化後に野生型FVIIaのものと比べて報告される。
【０１９２】
FVIIaポリペプチドのアンチトロンビン反応性は、過剰血漿由来アンチトロンビン、低分子量(LMW)ヘパリン及びカルシウムの存在下で擬一次条件(pseudo-first order condition)下、生理的pHで測定することができる。残留FVIIa活性は、S-2288等の発色基質を用いて阻害反応の時間経過を通して不連続的に測定される。阻害の速度は、単一の指数関数的減衰関数へのデータの非線形最小二乗フィッティングにより得られ、使用されるアンチトロンビン濃度による阻害速度の正規化後に野生型FVIIaのものと比べて報告される。アンチトロンビンによる血液凝固プロテイナーゼのヘパリン触媒及び非触媒阻害の動力学的特性化は、Olsonら(1993)、Methods Enzymol. 222、525〜559頁に記載されている。
【０１９３】
医薬組成物
1つの態様において、本発明は、本発明の第VII因子ポリペプチドを含む組成物及び製剤に関する。例えば、本発明は、医薬的に許容される担体と一緒に製剤化される本発明の第VII因子ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０１９４】
したがって、本発明の1つの目的は、0.25mg/mlから100mg/mlの濃度で存在する第VII因子ポリペプチドを含む医薬製剤であって、pH2.0から10.0を有する製剤を提供することである。製剤は更に、1つ又は複数の緩衝系、保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤、抗酸化剤、又は界面活性剤、及び様々なこれらの組み合わせを含んでもよい。医薬組成物における保存料、等張剤、キレート剤、安定剤、抗酸化剤、及び界面活性剤の使用は、当業者に十分に知られている。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995を参照することができる。
【０１９５】
1つの実施形態において、医薬製剤は水性製剤である。このような製剤は、典型的には溶液又は懸濁液であるが、コロイド、分散剤、エマルジョン、及び多相材料を含むこともできる。用語「水性製剤」は、少なくとも50%w/w水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも50%w/w水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも50%w/w水を含む懸濁液として定義される。
【０１９６】
別の実施形態において、医薬製剤は、医師又は患者が使用前に溶媒及び/又は希釈剤を添加する凍結乾燥製剤である。
【０１９７】
さらなる態様において、医薬製剤は、第VII因子ポリペプチドの水性溶液及び、該ポリペプチドが1mg/ml以上からの濃度で存在し、前記製剤が約2.0から約10.0のpHを有する緩衝液を含む。
【０１９８】
更なる態様において、医薬製剤は、参照により本明細書に組み込まれるWO2014/057069に開示された医薬製剤のいずれか1つであってもよく、又は医薬製剤は実施例18に記載された製剤であってもよい。
【０１９９】
本発明の第VII因子ポリペプチドは、静脈内、筋肉内、皮下等、非経口的に投与することができる。或いは、本発明のFVIIポリペプチドは、経口的又は局所的に等、非経口でない経路を介して投与することができる。本発明のポリペプチドは予防的に投与することができる。本発明のポリペプチドは、(要求に応じて)治療的に投与することができる。
【０２００】
治療的使用
広範な態様において、本発明の第VII因子ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬製剤は、医薬品として使用することができる。
【０２０１】
1つの態様において、本発明の第VII因子ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬製剤は、凝固障害を有する対象を治療するのに使用することができる。
【０２０２】
別の態様において、本発明の第VII因子ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬製剤は、出血障害若しくは出血エピソードを治療するための医薬品の調製、又は正常な止血系の増強に使用することができる。
【０２０３】
さらなる態様において、本発明の第VII因子ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬製剤は、血友病A、血友病B、又は後天性インヒビターを有する血友病A若しくはBの治療に使用することができる。
【０２０４】
別の態様において、本発明の第VII因子ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬製剤は、対象における出血障害若しくは出血エピソードを治療するための、又は正常な止血系の増強のための方法であって、本発明の第VII因子ポリペプチドの治療的又は予防的に有効な量をこれを必要とする対象に投与する工程を含む方法において使用することができる。
【０２０５】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」には、任意のヒト患者、又はヒト以外の脊椎動物が含まれる。
【０２０６】
用語「治療」は本明細書で使用されるとき、これを必要とする任意のヒト又は他の脊椎動物対象の薬物療法を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト又は他の脊椎動物の健康に有益であることを示す暫定又は確定診断を与えた医師、又は獣医師による身体検査を受けていることが期待される。前記治療のタイミング及び目的は、対象の健康の現状により1人1人異なる可能性がある。故に、前記治療は、予防的、緩和的、対症的及び/又は根治的であり得る。本発明に関して、予防的、緩和的、対症的及び/又は根治的治療は、本発明の別の態様となり得る。
【０２０７】
用語「凝固障害」は本明細書で使用されるとき、正常な凝固カスケードのいずれかのプロコアグラント成分のいずれかの質的若しくは量的欠乏、又は線維素溶解のいずれかの上方制御に起因し得る出血傾向の増加を指す。このような凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性であり得、当業者により同定される。先天性凝固低下障害(hypocoagulopathy)の非限定例は、血友病A、血友病B、第VII因子欠乏症、第X因子欠乏症、第XI因子欠乏症、フォンヴィルブランド病、並びにグランツマン血小板無力症及びベルナールスーリエ症候群等の血小板減少症である。血友病A又はBの臨床的重症度は、血中のFIX/第VIII因子の機能的ユニットの濃度により決定され、軽度、中等度、又は重度に分類される。重度の血友病は、正常レベルの<1%に相当する<0.01U/mlの凝固因子レベルにより定義されるが、中等度及び軽度血友病を有する人は、それぞれ1〜5%及び>5%のレベルを有する。「インヒビター」(すなわち、第VIII因子に対する同種抗体)を有する血友病A、及び「インヒビター」(すなわち、第IX因子に対する同種抗体)を有する血友病Bは、一部は先天性であり一部は後天性である凝固障害の非限定例である。
【０２０８】
後天性凝固障害の非限定例は、ビタミンK欠乏症に起因するセリンプロテアーゼ欠乏症である。このようなビタミンK欠乏症は、ワルファリン等のビタミンKアンタゴニストの投与に起因し得る。後天性凝固障害はまた、広範な外傷後にも生じ得る。別名「外傷死の3徴」として知られるこの場合において、後天性凝固障害は、血液希釈(希釈性血小板減少症及び凝固因子の希釈)、低体温、凝固因子の消費、及び代謝異常(アシドーシス)を特徴とする。輸液療法及び線維素溶解の増加は、この状況を悪化させ得る。前記出血は、身体のいずれの部分からもあり得る。
【０２０９】
医原性凝固障害の非限定例は、血栓塞栓症を治療するために処方され得るヘパリン、アスピリン、ワルファリン、及び他の血小板凝集阻害剤等の抗凝固剤の過剰投与である。医原性凝固障害の第2の非限定例は、輸血により誘発され得るもの等、過剰な及び/又は不適切な輸液療法により誘発されるものである。
【０２１０】
本発明の1つの実施形態において、出血は血友病A又はBと関連する。別の実施形態において、出血は後天性インヒビターを有する血友病A又はBと関連する。別の実施形態において、出血は血小板減少症と関連する。別の実施形態において、出血はフォンヴィルブランド病と関連する。別の実施形態において、出血は重度組織損傷と関連する。別の実施形態において、出血は重度外傷と関連する。別の実施形態において、出血は手術と関連する。別の実施形態において、出血は出血性胃炎及び/又は腸炎と関連する。別の実施形態において、出血は胎盤早期剥離における等の大量子宮出血である。別の実施形態において、出血は、頭蓋内、耳内(intraaurally)、又は眼内等の機械的止血の可能性が限られた器官で生じる。別の実施形態において、出血は抗凝固剤療法と関連する。
【０２１１】
本発明は、実施形態の以下の非限定的なリストにより更に記載される。
【０２１２】
実施形態1: T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)若しくはTrp(W)により置換され、及び/又はW201がArg(R)、Met(M)若しくはLys(K)により置換され、及び/又はK337がAla(A)若しくはGly(G)により置換され、場合により、Q176がLys(K)、Arg(R)若しくはAsn(N)により置換され、又はQ286がAsn(N)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチド。
【０２１３】
実施形態1 (i): T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)若しくはTrp(W)により置換され、及び/又はW201がArg(R)、Met(M)若しくはLys(K)により置換され、及び/又はK337がAla(A)若しくはGly(G)により置換されている、実施形態1による第VII因子ポリペプチド。
【０２１４】
実施形態1 (ii):L288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)又はAla(A)により置換されている、実施形態1による第VII因子ポリペプチド。
【０２１５】
実施形態1 (iii): W201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている、実施形態1による第VII因子ポリペプチド。
【０２１６】
実施形態1 (iv): K337がAla(A)又はGly(G)により置換されている、実施形態1による第VII因子ポリペプチド。
【０２１７】
実施形態2: T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換されている、実施形態1による第VII因子ポリペプチド。
【０２１８】
実施形態2 (i): T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp(W)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２１９】
実施形態2 (ii): T293がLys(K)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２０】
実施形態2 (iii): T293がLys(K)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２１】
実施形態2 (iv): T293がLys(K)により置換され、及びL288がAsn(N)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２２】
実施形態2 (v): T293がLys(K)により置換され、及びL288がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２３】
実施形態2 (vi): T293がLys(K)により置換され、及びL288がTrp(W)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２４】
実施形態2 (vii): T293がArg(R)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２５】
実施形態2 (viii): T293がArg(R)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２６】
実施形態2 (ix): T293がArg(R)により置換され、及びL288がAsn(N)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２７】
実施形態2 (x): T293がArg(R)により置換され、及びL288がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２８】
実施形態2 (xi): T293がArg(R)により置換され、及びL288がTrp(W)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２２９】
実施形態2 (xii): T293がTyr(Y)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３０】
実施形態2 (xiii): T293がTyr(Y)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３１】
実施形態2 (xiv): T293がTyr(Y)により置換され、及びL288がAsn(N)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３２】
実施形態2 (xv): T293がTyr(Y)により置換され、及びL288がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３３】
実施形態2 (xvi): T293がTyr(Y)により置換され、及びL288がTrp(W)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３４】
実施形態2 (xvii): T293がPhe(F)により置換され、及びL288がPhe(F)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３５】
実施形態2 (xviii): T293がPhe(F)により置換され、及びL288がTyr(Y)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３６】
実施形態2 (xix): T293がPhe(F)により置換され、及びL288がAsn(N)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３７】
実施形態2 (xx): T293がPhe(F)により置換され、及びL288がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３８】
実施形態2 (xxi): T293がPhe(F)により置換され、及びL288がTrp(W)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２３９】
実施形態2 (xxii): T293がLys(K)により置換され、及びK337がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４０】
実施形態2 (xxiii): T293がArg(R)により置換され、及びK337がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４１】
実施形態2 (xxiv): T293がTyr(Y)により置換され、及びK337がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４２】
実施形態2 (xxv): T293がPhe(F)により置換され、及びK337がAla(A)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４３】
実施形態2 (xxvi): T293がLys(K)により置換され、及びK337がGly(G)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４４】
実施形態2 (xxvii): T293がArg(R)により置換され、及びK337がGly(G)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４５】
実施形態2 (xxviii): T293がTyr(Y)により置換され、及びK337がGly(G)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４６】
実施形態2 (xxix): T293がPhe(F)により置換され、及びK337がGly(G)により置換されている、実施形態1〜2のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４７】
実施形態2 (xxx): K337がAla(A)により置換されている、実施形態2(ii)〜2(xxii)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４８】
実施形態3:  ポリペプチドが置換の以下の群: L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293K/L305V、L288F/T293K/L305I、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288F/T293R/L305V、L288F/T293R/L305I、L288F/T293Y、L288F/T293Y/K337A、L288F/T293Y/L305V、L288F/T293Y/L305I、L288F/T293F、L288F/T293F/K337A、L288F/T293F/L305V、L288F/T293F/L305I、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293K/L305V、L288Y/T293K/L305I、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288Y/T293R/L305V、L288Y/T293R/L305I、L288Y/T293Y、L288Y/T293Y/K337A、L288Y/T293Y/L305V、L288Y/T293Y/L305I、L288Y/T293F、L288Y/T293F/K337A、L288Y/T293F/L305V、L288Y/T293F/L305I、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T293K/L305V、L288N/T293K/L305I、L288N/T293R、L288N/T293R/K337A、L288N/T293R/L305V、L288N/T293R/L305I、L288N/T293Y、L288N/T293Y/K337A、L288N/T293Y/L305V、L288N/T293Y/L305I、L288N/T293F、L288N/T293F/K337A、L288N/T293F/L305V、L288N/T293F/L305I、L288A/T293K、L288A/T293K/K337A、L288A/T293K/L305V、L288A/T293K/L305I、L288A/T293R、L288A/T293R/K337A、L288A/T293R/L305V、L288A/T293R/L305I、L288A/T293Y、L288A/T293Y/K337A、L288A/T293Y/L305V、L288A/T293Y/L305I、L288A/T293F、L288A/T293F/K337A、L288A/T293F/L305V又はL288A/T293F/L305Iの1つを含む、実施形態2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２４９】
実施形態4:  ポリペプチドが以下の置換: L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T293R又はL288N/T293R/K337Aを有する、実施形態2に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５０】
実施形態5: Q176がLys(K)、Arg(R)、又はAsn(N)により置換されている、実施形態1に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５１】
実施形態6:  ポリペプチドが置換の以下の群: L288F/Q176K/K337A、L288Y/Q176K/K337A、L288N/Q176K/K337A又はL288A/Q176K/K337Aの1つを含む、実施形態5に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５２】
実施形態7: Q286がAsn(N)により置換されている、実施形態1に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５３】
実施形態8: 1つの置換が、L288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)又はAla(A)により置換されている所にあり、但し、該ポリペプチドが以下の置換対、L288N/R290S又はL288N/R290Tを持たないことを特徴とする、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて、1つ又は複数の置換を含む第VII因子ポリペプチド。
【０２５４】
実施形態9:  第VII因子ポリペプチドが1つ又は複数の以下の置換、L305I、L305V又はK337Aを更に含む、実施形態1〜2 (xxx)、5及び7〜8のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５５】
実施形態10: W201がArg(R)、Met(M)、若しくはLys(K)により置換され、及びT293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、Q176がLys(K)、Arg(R)若しくはAsn(N)により置換され、又はQ286がAsn(N)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチド。
【０２５６】
実施形態10 (i): T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びW201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている、実施形態1〜1(ii)又は10のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５７】
実施形態11: T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換されている、実施形態10に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５８】
実施形態11 (i): T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)により置換され、及びW201がArg(R)、Met(M)又はLys(K)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２５９】
実施形態11 (ii): T293がLys(K)により置換され、及びW201がArg(R)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６０】
実施形態11 (iii): T293がLys(K)により置換され、及びW201がMet(M)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６１】
実施形態11 (iv): T293がLys(K)により置換され、及びW201がLys(K)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６２】
実施形態11 (v): T293がArg(R)により置換され、及びW201がArg(R)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６３】
実施形態11 (vi): T293がArg(R)により置換され、及びW201がMet(M)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６４】
実施形態11 (vii): T293がArg(R)により置換され、及びW201がLys(K)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６５】
実施形態11 (viii): T293がTyr(Y)により置換され、及びW201がArg(R)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６６】
実施形態11 (ix): T293がTyr(Y)により置換され、及びW201がMet(M)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６７】
実施形態11 (x): T293がTyr(Y)により置換され、及びW201がLys(K)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６８】
実施形態11 (xi): T293がPhe(F)により置換され、及びW201がArg(R)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２６９】
実施形態11 (xii): T293がPhe(F)により置換され、及びW201がMet(M)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７０】
実施形態11 (xiii): T293がPhe(F)により置換され、及びW201がLys(K)により置換されている、実施形態1〜2、10又は11のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７１】
実施形態12:  ポリペプチドが置換の以下の群: W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293K/L305V、W201R/T293K/L305I、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293R/L305V、W201R/T293R/L305I、W201R/T293Y、W201R/T293Y/K337A、W201R/T293Y/L305V、W201R/T293Y/L305I、W201R/T293F、W201R/T293F/K337A、W201R/T293F/L305V、W201R/T293F/L305I、W201K/T293K、W201K/T293K/K337A、W201K/T293K/L305V、W201K/T293K/L305I、W201K/T293R、W201K/T293R/K337A、W201K/T293R/L305V、W201K/T293R/L305I、W201K/T293Y、W201K/T293Y/K337A、W201K/T293Y/L305V、W201K/T293Y/L305I、W201K/T293F、W201K/T293F/K337A、W201K/T293F/L305V、W201K/T293F/L305I、W201M/T293K、W201M/T293K/K337A、W201M/T293K/L305V、W201M/T293K/L305I、W201M/T293R、W201M/T293R/K337A、W201M/T293R/L305V、W201M/T293R/L305I、W201M/T293Y、W201M/T293Y/K337A、W201M/T293Y/L305V、W201M/T293Y/L305I、W201M/T293F、W201M/T293F/K337A、W201M/T293F/L305V又はW201M/T293F/L305Iの1つを含む、実施形態11に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７２】
実施形態13:  ポリペプチドが以下の置換: W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293Y、W201R/T293F、W201K/T293K又はW201M/T293Kを有する、実施形態11に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７３】
実施形態14: Q176がLys(K)、Arg(R)、又はAsn(N)により置換されている、実施形態10に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７４】
実施形態15:  ポリペプチドが置換の以下の群、W201R/Q176K、W201R/Q176R、W201K/Q176K、W201K/Q176R、W201M/Q176K、又はW201M/Q176Rの1つを含む、実施形態14に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７５】
実施形態16: Q286がAsn(N)により置換されている、実施形態10に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７６】
実施形態17:  第VII因子ポリペプチドが1つ又は複数の以下の置換、L305I、L305V又はK337Aを更に含む、実施形態10〜11、14及び16のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２７７】
実施形態18: 1つの置換が、W201がArg(R)、Met(M)、又はLys(K)により置換されている所にあることを特徴とする、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて1つ又は複数の置換を含む第VII因子ポリペプチド。
【０２７８】
実施形態19: L288がPhe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、又はAla(A)により置換され、W201がArg(R)、Met(M)、若しくはLys(K)により置換され、場合により、T293がLys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)若しくはPhe(F)により置換され、Q176がLys(K)、Arg(R)若しくはAsn(N)により置換され、又はQ286がAsn(N)により置換されている、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチド。
【０２７９】
実施形態20 :  ポリペプチドが置換の以下の群、L288F/W201K、L288F/W201R、L288F/W201M、L288N/W201K、L288N/W201R、L288N/W201M、L288Y/W201K、L288Y/W201R、L288Y/W201M、L288A/W201K、L288A/W201R、L288A/W201M、L288F/W201K/T293K、L288F/W201K/T293Y、L288F/W201R/T293K、L288F/W201R/T293Y、L288F/W201M/T293K、L288F/W201M/T293Y、L288N/W201K/T293K、L288N/W201K/T293Y、L288N/W201R/T293K、L288N/W201R/T293Y、L288N/W201M/T293K、L288N/W201M/T293Y、L288A/W201K/T293K、L288A/W201K/T293Y、L288A/W201R/T293K、L288A/W201R/T293Y、L288A/W201M/T293K、L288A/W201M/T293Y、L288Y/W201K/T293K、L288Y/W201K/T293Y、L288Y/W201R/T293K、L288Y/W201R/T293Y、L288Y/W201M/T293K又はL288Y/W201M/T293Yの1つを含む、実施形態19に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８０】
実施形態21:  第VII因子ポリペプチドが1つ又は複数の以下の置換、R396C、Q250C、又は407Cを更に含む、実施形態1〜20のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８１】
実施形態22:  前記第VII因子ポリペプチドが切断された2本鎖第VIIa因子ポリペプチドである、実施形態1〜21のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８２】
実施形態22(i):  ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて2つのアミノ酸置換を含む、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８３】
実施形態22(ii):  ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて3つのアミノ酸置換を含む、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８４】
実施形態22(iii):  ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて4つのアミノ酸置換を含む、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８５】
実施形態22(iv):  ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて5つのアミノ酸置換を含む、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８６】
実施形態22(v):  ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列番号1)と比べて多くても10個のアミノ酸置換を含む、実施形態22(i)〜(iv)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８７】
実施形態22(vi):  可溶性組織因子の非存在下、インビトロでのタンパク質分解アッセイで測定された野生型ヒト第VIIa因子のタンパク質分解活性の少なくとも110%、例えば少なくとも120%、例えば少なくとも130%、例えば少なくとも140%、例えば少なくとも150%、例えば少なくとも160%、例えば少なくとも170%、例えば少なくとも180%、例えば少なくとも190%、例えば少なくとも200%、例えば少なくとも300%、例えば少なくとも400%、例えば少なくとも500%、例えば少なくとも1000%、例えば少なくとも3000%、例えば少なくとも5000%、例えば少なくとも10000%、例えば少なくとも30000%であるタンパク質分解活性を有する、実施形態1〜22(v)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８８】
実施形態22(vii):  低分子量ヘパリンの存在下及び可溶性組織因子の非存在下、アンチトロンビン阻害アッセイで測定された野生型ヒト第VIIa因子(配列番号1)のものと比較して、20%未満、例えば19%未満、例えば18%未満、例えば17%未満、例えば16%未満、例えば15%未満、例えば14%未満、例えば13%未満、例えば12%未満、例えば11%未満、例えば10%未満、例えば9%未満、例えば8%未満、例えば7%未満、例えば6%未満、例えば5%未満のアンチトロンビン反応性を有する、実施形態1〜22(vi)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２８９】
実施形態23:  第VII因子ポリペプチドが少なくとも1つの半減期延長部分と結合している、実施形態1〜22(vii)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９０】
実施形態24:  半減期延長部分が、生体適合性脂肪酸及びこの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えばヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様(ELP)ペプチド、XTENポリマー、PASポリマー、PAポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチド、FcRn結合ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態23に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９１】
実施形態25:  半減期延長部分がヘパロサンポリマーである、実施形態24に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９２】
実施形態26:  ヘパロサンポリマーが、13〜65kDa、13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa及び38〜42kDaから選択される範囲の分子量、又は40kDaの分子量を有する、実施形態25に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９３】
実施形態26(i) :  式I
【０２９４】
【化７】
2016537321.tif 000011
【０２９５】
(式中、nは95〜115の整数である)
に示された構造断片を含む、実施形態25〜26のいずれか1つに記載のFVIIポリペプチド。
【０２９６】
実施形態26(ii):  野生型ヒト第VIIa因子(配列番号1)と比較して少なくとも100%増加した半減期を有する、実施形態1〜26(i)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９７】
実施形態27:  前記第VII因子ポリペプチドが組織因子に連結されたジスルフィドである、実施形態1〜26(ii)のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９８】
実施形態28:前記ポリペプチドが、ポリペプチドの血小板親和性を増加させる更なるアミノ酸修飾を有する、実施形態1〜27のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０２９９】
実施形態29:  前記ポリペプチドが、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド、及び融合パートナータンパク質/ペプチド、例えばFcドメイン又はアルブミンを含む融合タンパク質である、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の第VII因子ポリペプチド。
【０３００】
実施形態30:  実施形態1〜22及び28〜29のいずれか1つに定義された第VII因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０３０１】
実施形態31:  実施形態30に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【０３０２】
実施形態32:  実施形態1〜22及び28〜29のいずれかに定義された第VII因子ポリペプチドを産生する方法であって、ポリヌクレオチド構築物の発現を可能にする条件下で適切な培地で細胞を培養する工程と、得られたポリペプチドを培地から回収する工程とを含む方法。
【０３０３】
実施形態33:  実施形態1〜29のいずれかに定義された第VII因子ポリペプチドと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【０３０４】
実施形態34:  対象における出血障害若しくは出血エピソードの治療、又は正常な止血系の増強のための方法であって、実施形態1〜29のいずれかに定義された第VII因子ポリペプチドの治療的又は予防的に有効な量をこれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【０３０５】
実施形態35:  医薬品として使用するための、実施形態1〜26のいずれかに定義された第VII因子ポリペプチド。
【０３０６】
実施形態35(i):  凝固障害の治療において使用するための、実施形態1〜26のいずれか1つに定義された第VII因子ポリペプチド。
【０３０７】
実施形態36:  血友病A又はBの治療において医薬品として使用するための、実施形態35(i)に記載の第VII因子ポリペプチド。
【０３０８】
本発明は、以下の例により更に例証されるが、これらは保護の範囲を制限すると見なされるべきではない。前述の記載及び以下の例に開示された特徴は、個別に及びこれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をこの多様な形態で実現する材料となり得る。
【実施例】
【０３０９】
タンパク質
ヒト血漿由来第X因子(FX)及び第Xa因子(FXa)は、Enzyme Research Laboratories Inc.社(サウスベンド、IN)から入手した。可溶性組織因子1-219(sTF)又は1-209は、公開されている手順(Freskgardら、1996)により調製した。組換え野生型FVIIaの発現及び精製は、以前に記載されているように行った(Thimら、1988; Persson及びNielsen、1996)。ヒト血漿由来アンチトロンビン(Baxter社)は、公開されている手順(Olsonら、1993)によりヘパリンセファロースクロマトグラフィー(GE Healthcare社)により再精製した。ウシ血清アルブミン(BSA)は、Sigma Aldrich社(セントルイス、MO)から入手した。
【０３１０】
(実施例1)−FVIIaバリアント設計
FXに対するタンパク質分解活性がより高いFVIIaバリアントを基質として設計するために、両面戦略を用いた。活性部位領域周辺のFVIIaループ及び単一アミノ酸を、種々の種由来の対応するFVIIアミノ酸との交換及び点変異誘発のためにそれぞれ選択した(図1)。FVIIaタンパク質分解活性を、実施例5に概説されているように測定した。3つのループ交換FVIIaバリアントに関するタンパク質分解活性をTable 1(表3)に示す。Table 1(表3)において、287及び289位の残基はそれぞれスレオニン及びグルタミン酸に変異し、一方288位のアミノ酸を変えている。287及び289位で同じアミノ酸を維持する一方、288位の変化は、タンパク質分解活性に劇的な影響を与えることが観察された。ラット及びウサギFVIIにより担持されたロイシン、又はウシFVIIにより担持されたアルギニンのどちらかへの201位のアミノ酸の置換は、タンパク質分解活性に影響を与えることも観察された。更に、ウマにより担持されたグルタミン又はアラニン等のあまり大きくないアミノ酸のどちらかへの337位のアミノ酸の置換は、タンパク質分解活性に影響を与えることが観察された(Table 1)(表3)。これらの観察は、288位及び201位のアミノ酸がFX認識及び活性化に関与し得ることを示唆している。従って、288位及び201位を飽和変異誘発により更に調べ、代表的な結果をTable 2(表4)に概説する。
【０３１１】
【表３】
2016537321.tif 000012
【０３１２】
(実施例2)−FVIIaバリアントのクローニング
Novagen社製KOD Xtreme(商標)Hot Start DNAポリメラーゼ、又はStratagene社製QuickChange(登録商標)部位特異的変異誘発キットを用いる部位特異的変異誘発PCRベースの方法を用いて、FVII cDNAをコードする哺乳動物発現ベクターに変異を導入した。Icosagen Cell Factory社(エストニア)製pQMCF発現ベクター及びCHOEBNALT85を発現系として使用した。所望の変異の導入は、DNA配列決定(MWG Biotech社、ドイツ)により検証した。
【０３１３】
(実施例3)−FVIIa発現
FVIIバリアントは、Icosagen Cell Factory社(エストニア)製CHOEBNALT85細胞で発現させた。簡単には、CHOEBNALT85懸濁細胞をエレクトロポレーション(Gene Pulse Xcell、Biorad社、コペンハーゲン、DK)により一過性トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を700μg/l Geneticin(登録商標)(Gibco by Life Technologies社)により選択し、増殖させて合計300mlから10リットルの上清を得た。細胞を、5mg/lビタミンK1(Sigma-Aldrich社)を補充した培地で製造者の指示に従って培養した。規模に応じて、細胞を振盪フラスコ(37℃、5〜8% CO2及び85〜125rpm)、又はロッキング培養バッグ(37℃、5% CO2及び30rpm)で培養した。小規模な上清を遠心分離により回収し、この後、0.22μm PESフィルター(Corning社; Fisher Scientific Biotech社、スランゲルプ、DK)により濾過し、より大容量を深層濾過とこれに続く0.22μm絶対濾過(3μm Clarigard、Opticap XL10; 0.22μm Durapore、Opticap XL10、Merck Millipore社、ヘルレプ、DK)により回収した。
【０３１４】
(実施例4)−FVIIa精製及び濃度決定
FVIIバリアントを、他で本質的に記載されているように(Thimら  1988)、Glaドメイン特異的抗体親和性クロマトグラフィーにより精製した。簡単には、プロトコルは3工程を含んだ。工程1では、5m MCaCl2を馴化培地に添加し、試料を親和性カラムに充填した。10mM His、2M NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.0による広範囲な洗浄後、結合タンパク質を50mM His、15mM EDTA、0.005% Tween80、pH6.0で、(工程2)アニオン交換カラム(Source 15Q、GE Healthcare社)に溶出した。20mM HEPES、20mM NaCl、0.005% Tween80、pH8.0による洗浄後、結合タンパク質を、20mM HEPES、135mM NaCl、10mM CaCl2、0.005% Tween80、pH8.0で、(工程3)ヒト血漿由来FXaが製造者の指示に従って1mg/mlの密度でカップリングされたCNBr-Sepharose Fast Flowカラム(GE Healthcare社)に溶出した。流速を最適化して、活性形態への精製チモーゲンバリアントの完全活性化を本質的に確保した。馴化培地又はアニオン交換カラムにおいて自己活性化することができる増強した活性を有するFVIIaバリアントについては、タンパク質分解変性を防ぐために工程2及び/又は工程3を省略した。精製タンパク質は-80℃で保管した。タンパク質の品質をSDS-PAGE分析により評価し、活性部位滴定又は以下に記載されたrpHPLCによる軽鎖含量の定量化により、機能的分子の濃度を測定した。
【０３１５】
活性部位滴定によるFVIIaバリアント濃度の測定
精製調製物中の機能的分子の濃度は、他で本質的に記載されているように(Bock P.E、1992. J. Biol. Chem. 267. 14963-14973)、準化学量論的レベルのd-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン(FFR-cmk; Bachem社)で滴定した時のアミド分解活性の不可逆的喪失から、活性部位滴定により決定した。簡単には、全てのタンパク質をアッセイ緩衝液[50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、及び0.1%w/vPEG8000]に希釈した。最終濃度の150nM FVIIaバリアントを、500nMの可溶性組織因子(sTF)と10分間プレインキュベートし、この後、96ウェルプレートにおいて100μLの総反応容量中0〜300nMの最終濃度でFFR-cmkを添加した(n=2)。反応物を室温で一晩インキュベートした。別の96ウェルプレートにおいて、20μLの各反応物を、1mM S-2288(Chromogenix社、ミラノ、イタリア)を含有するアッセイ緩衝液に10倍希釈した。吸光度増加は、SOFTmax PROソフトウェアを備えたSpectramax 190マイクロプレート分光光度計において、405nMで連続的に10分間測定した。アミド分解活性は、ブランク減算後の線形プログレス曲線の傾斜として報告した。活性部位濃度は、アミド分解活性を完全に消失させるのに必要とされるFFR-cmkの最小濃度として外挿により決定した。
【０３１６】
逆相HPLCを用いた軽鎖含量からのFVIIaバリアント濃度の測定-  代替のアプローチにおいて、精製調製物中の機能的FVIIa分子の濃度は、逆相HPLC(rpHPLC)によるFVIIa軽鎖(LC)含量の定量化により決定した。野生型FVIIaによる検量線を、0から3μMの範囲のFVIIa濃度を用いて作成する一方、未知濃度の試料は、1.5μMの推定濃度で調製した(n=2)。全ての試料を、20%(v/v)の濃度まで試料に添加した0.5Mトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP; Calbiochem/Merck KGaA社、ダルムシュタット、ドイツ)及びギ酸の1:1混合物を用いて還元し、この後、試料を70℃で10分間加熱した。還元FVIIaバリアントを、30℃に維持したC4カラム(Vydac社、300Å、粒径5μM、4.6mm、250mm)に充填した。移動相は、0.09% TFA水溶液(溶媒A)及び0.085% TFAアセトニトリル溶液(溶媒B)から成った。80μL試料を注入後、システムを4分間、25%溶媒Bで均一濃度、この後、10分にわたり25から46% Bの直線勾配で実行した。ピークは、それぞれ280及び348nmの励起及び発光波長を用いて、蛍光により検出した。軽鎖定量化はピーク積分により行い、FVIIaバリアントの相対量を野生型FVIIa標準曲線に基づき計算した。
【０３１７】
(実施例5)−活性の増加をもたらす変異のスクリーニング
実施例1、Table 1(表2)に概説されているように、並びに201位及び288位のFVIIaアミノ酸の役割を評価するために、これらの位置を厳密な部位特異的飽和変異誘発に供した。増大したタンパク質分解活性を有するFVIIaバリアントを更に同定するために、他のアミノ酸の305位及び337位も飽和変異誘発のために選択した。簡単には、活性を、リン脂質ベシクルの存在下、巨大分子基質第X因子をタンパク質分解的に活性化する各バリアントの能力として測定した(インビトロタンパク質分解アッセイ)。組換えFVIIaの、可能性のあるTF依存性及び非依存性作用機構を模倣するために、各反応は、補因子である組織因子(sTF)の存在下又は非存在下で行った。更に、アンチトロンビンによるFVIIa阻害に対するこれらの置換の役割を理解するために、アンチトロンビン阻害を、インビボでの反応を加速させる内因性ヘパリン様グリコサミノグリカン(GAG)の能力を模倣するための低分子量ヘパリンの存在下、擬一次条件下で定量化した。これらの結果をTable 2(表4)にまとめる。図2に示されているように、測定したインビトロでのアンチトロンビン反応性は、FVIIa-アンチトロンビン複合体のインビボ蓄積と相関することが見出され、故にインビトロスクリーニング手順の予測性を確証した。
【０３１８】
【表４Ａ】
2016537321.tif 000013
【０３１９】
【表４Ｂ】
2016537321.tif 000014
【０３２０】
201位にグルタミン、チロシン、メチオニン、リジン、及びアルギニンを含むアミノ酸は、リン脂質の存在下、基質としてのFXに対するタンパク質分解活性を得るのに必要とされる。W201Rは、リン脂質の存在下及びsTFの非存在下又は存在下、タンパク質分解活性の最大の増加をもたらす。一方で、フェニルアラニン、ロイシン、及びアスパラギンを含むアミノ酸は、FVIIa WTと比較してタンパク質分解活性を減少させる。288位の場合、アラニン、アスパラギン、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン、及びチロシンは、リン脂質の存在下、基質としてのFXに対するタンパク質分解活性の増加をもたらす。L288F及びL288Yは、リン脂質の存在下、タンパク質分解活性の最大の増加をもたらす。Table 2(表4)に示されたデータは、タンパク質分解活性及びアンチトロンビン反応性を事前に予測する上での課題を示している。飽和変異誘発を用いる本発明者らのアプローチは、従って、種々のアミノ酸がFVIIaバリアントにもたらす活性における影響の全レパートリーを調べるのに理に適っている。 
【０３２１】
第X因子を基質として用いるタンパク質分解活性の測定(インビトロタンパク質分解アッセイ)-  FVIIaバリアントのタンパク質分解活性を、血漿由来第X因子(FX)を基質として用いて推定した。全てのタンパク質を、50mM HEPESpH7.4、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、及び0.1%w/vPEG8000に希釈した。相対的タンパク質分解活性を、96ウェルプレートにおいて100μLの総反応容量中、25μmM 75:25ホスファチジルコリン:ホスファチジルセリン(PC:PS)リン脂質(Haematologic technologies社、バーモント、USA)の存在下、1から10nMの各FVIIaコンジュゲートを40nM FXと室温で30分間インキュベートして決定した(n=2)。sTFの存在下のFX活性化は、100μLの総反応容量中、25μM PC:PSリン脂質の存在下、5pMの各FVIIaコンジュゲートを30nM FXと室温で20分間インキュベートして決定した(n=2)。インキュベーション後、100μL 1mM S-2765(Chromogenix社、ミラノ、イタリア)を停止緩衝液(50mM HEPESpH7.4、100mM NaCl、80mM EDTA)に添加して反応を停止させた。停止直後に、吸光度増加を、Envisionマイクロプレートリーダー(PerkinElmer社、ウォルサム、MA)において405nMで連続的に測定した。全ての添加、インキュベーション、及びプレート移動は、Envisionマイクロプレートリーダーにカップリングしたライン上のHamilton Microlab Starロボット(Hamilton社、ボナドゥウ、スイス)により行った。見かけの触媒速度値(kcat/Km)を、線形回帰を用いてミカエリスメンテンの式(v=kcat*[S]*[E]/Km)の単純化形式にデータをフィットさせて推定した。この理由は、FX基質濃度([S])が活性化反応に関してKmを下回るためである。生成されたFXaの量を、同一条件下のヒト血漿由来FXaで作成した標準曲線から推定した。推定kcat/Km値は、使用したFVIIaバリアントの濃度に従ってFXa生成の測定された速度を正規化した後、野生型FVIIaのものと比べて報告した。結果をTable 1(表2)、Table2(表4)、Table 3(表5)及びTable 7(表9)に示す。
【０３２２】
アンチトロンビンによるFVIIa阻害の測定-   不連続方法を使用して、低分子量(LMW)ヘパリン(Calbiochem/Merck KGaA社、ダルムシュタット、ドイツ)の存在下、擬一次条件下でヒト血漿由来アンチトロンビン(AT)による阻害のインビトロ速度を測定した。アッセイは、200μLの総反応容量中、50mM HEPESpH7.4、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、及び0.1%w/vPEG8000を含有するアッセイ緩衝液を用いて、96ウェルプレートで行った。200nM FVIIa及び12μM LMWヘパリンの混合物に対し、100μLの最終反応容量中5μMアンチトロンビンを添加した。種々の時間で、180μLのsTF(200nM)、ポリブレン(0.5mg/mL;臭化ヘキサジメトリン、Sigma-Aldrich社)、及びS-2288(1mM)を含有する別のマイクロタイタープレートに、20μLの反応混合物を移して反応を停止させた。種々の時間で移した直後に、基質切断をEnvisionマイクロプレートリーダーにおいて405nmで10分間モニタリングした。擬一次速度定数(kobs)は、指数関数的減衰関数へのデータの非線形最小二乗フィッティングにより得、及び二次速度定数(k)は、以下の関係k=kobs/[AT]から得た。全ての添加、インキュベーション及びプレートの移動は、エンヴィジョンマイクロプレートリーダー(PerkinElmer社、ウォルサム、MA)に結合したライン上のHamilton Microlab Starロボット(Hamilton社、ボナドゥウ、スイス)により行った。阻害の速度は、野生型FVIIaのものと比べて報告した。結果をTable 2(表4)、Table 3(表5)及びTable 7(表9)に示す。
【０３２３】
(実施例6)−活性及びアンチトロンビン耐性の増加をもたらすFVIIa変異の組み合わせ
高いタンパク質分解活性及びアンチトロンビン耐性を有するFVIIaバリアントを設計するために、同定したFVIIaタンパク質分解活性増大バリアントのセレクションを、アンチトロンビン耐性をもたらすFVIIaバリアントと組み合わせた。具体的には、FVIIa組み合わせバリアントを293位及び201位、288位、305位、337位、176位及び/又は286位で置換して作成した。実施例5に記載されたインビトロでのタンパク質分解及びアンチトロンビン阻害アッセイを用いる、組み合わせFVIIa精製タンパク質調製物の特徴付けをTable 3(表5)にまとめる。
【０３２４】
Table 3(表5)は、幾つかの組み合わせが望ましい高活性を示し、同時に望ましい低アンチトロンビン反応性を有するFVIIaバリアントをもたらしたことを示している。例えば、FVIIaバリアントL288F T293Kは野生型FVIIaと比較して、リン脂質の存在下600%のタンパク質分解活性を、及び低分子量ヘパリンの存在下わずか6%のアンチトロンビン反応性を示した。同様に、FVIIaバリアントL288Y T293Kは野生型FVIIaと比較して、リン脂質の存在下447.8%のタンパク質分解活性を、及び低分子量ヘパリンの存在下わずか5.8%のアンチトロンビン反応性を示す。更に、W201R T293Kは野生型FVIIaと比較して、リン脂質の存在下609%のタンパク質分解活性を、及び低分子量ヘパリンの存在下わずか9%のアンチトロンビン反応性を示した。
【０３２５】
興味深いことに、2つのFVIIa変異L288F及びK337Aの組み合わせは大幅に増大した活性をもたらし、野生型FVIIaと比較してタンパク質分解活性の2646%増加が測定された。変異T293Kを更に共導入すると、低アンチトロンビン反応性が達成されながら、増大した活性は保持される。このバリアントは野生型FVIIaと比較して、リン脂質の存在下1310%のタンパク質分解活性を、及び低分子量ヘパリンの存在下わずか17%のアンチトロンビン反応性を示す。
【０３２６】
要するに、T293K、T293R、及びT293Y変異はW201R又はL288Fと組み合わせた場合、野生型FVIIaと比較してアンチトロンビン反応性を効果的に低下させるが、野生型FVIIaと比較してより高いタンパク質分解活性をもたらすと結論付けることができる。
【０３２７】
【表５Ａ】
2016537321.tif 000015
【０３２８】
【表５Ｂ】
2016537321.tif 000016
【０３２９】
(実施例7)−FVIIa効力(potency)及び血漿レベルの推定
効力は、市販のFVIIa特異的凝固アッセイ、Diagnostica Stago社製STACLOT(登録商標)VIIa-rTFを用いて推定した。アッセイは、J. H. Morrisseyら、Blood. 81:734〜744頁(1993)により公開されている方法に基づいた。これは、リン脂質の存在下、FVII欠乏血漿におけるフィブリン血栓形成までのsTF開始FVIIa活性依存的時間(sTF initiated FVIIa activity-dependent time)を測定するものである。凝固時間は、ACL9000(ILS社)凝固計器で測定し、結果は、FVIIa検量線に基づく両対数関数的(bilogarithmic)スケールで線形回帰を用いて計算した。同じアッセイを、動物PK試験からの血漿試料におけるFVIIa凝固活性の測定に使用した。血漿中の定量下限(LLOQ)は0.25U/mlと推定した。血漿活性レベルを特異的活性を用いてnMに変換した。
【０３３０】
(実施例8)−FVIIaバリアントの結晶学的分析
同定した置換がタンパク質分解活性及びアンチトロンビン認識に影響を与える機構を調べるために、代表的なFVIIaバリアントL288Y T293K、L288F T293K、W201R T293K、W201R T293Y及びL288F T293K K337Aの結晶構造を決定した。
【０３３１】
構造を3次元レベルで比較する場合、可溶性組織因子と複合した野生型(WT)FVIIaの1DAN構造[Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]は、配列番号1のナンバリングスキームに従ってFVIIaの重鎖残基の番号を付け替えられた。
【０３３２】
可溶性組織因子(断片1-219)と複合体した精製H-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン(FFR-cmk; Bachem社、スイス)活性部位阻害FVIIaバリアントは、[Kirchhofer, Dら、Proteins Structure Function and Genetics、(1995)、Vol. 22、419〜425頁]に従って懸滴方法を用いて結晶化させた。タンパク質緩衝液溶液は、10mM  トリス、pH7.5、25℃、100mM NaCl、15mM CaCl2の混合物であった。FVIIaバリアントに関する沈殿剤溶液と一緒のタンパク質濃度及び混合条件をTable 4(表6)に示す。24ウェルVDXプレート及び1.0mlのウェル溶液を用いた懸滴方法を利用した。液滴は、1.5μlのタンパク質溶液及び0.5μlのウェル溶液の混合物によりセットした。核生成を初期化するのにストリークシーディングを使用した。
【０３３３】
凍結条件をTable 4(表6)に示す。結晶を凍結溶液に約30秒間浸したままにし、この後、結晶を液体窒素に移し、液体窒素中で急速冷凍した。結晶学的データをKarplusら[Karplus, P. A.ら、Science (New York、N.Y.)、(2012)、Vol. 336、1030〜1033頁]に記載されている分解能カットオフを用いて、XDSデータ整理ソフトウェア[Kabsch, W.、Acta  Crystallographica Section D Biological Crystallography、(2010)、Vol. 66、125〜132頁]により処理した。
【０３３４】
【表６】
2016537321.tif 000017
【０３３５】
Protein Data Bank (PDB) [Berman, H. M.ら、Nucleic Acids Res.、(2000)、Vol. 28、235〜242頁]からの1DANエントリーの結晶座標[Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]に基づく自家生成座標(非公開)を、phenix.phaser [Mccoy, A. J.ら、J.Appl.Crystallogr.、(2007)、Vol. 40、658〜674頁]での分子置換計算、又はPHENIXソフトウェアパッケージ[Adams, P. D.ら、Acta Cryst.D、(2010)、Vol. 66、213〜221頁]のphenix.refineソフトウェア[Afonine, P. V.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2012)、Vol. 68、352〜367頁]を用いた直接精密化のどちらかの開始モデルとして使用した。精密化に続いて、コンピュータグラフィックスソフトウェアCOOT [Emsley, P.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2010)、Vol. 66、486〜501頁]で双方向モデル補正を行った。5つのFVIIaバリアントに関する結晶学的データ、精密化統計値及びモデル統計値をTable 5(表7)に示す。
【０３３６】
【表７Ａ】
2016537321.tif 000018
【０３３７】
【表７Ｂ】
2016537321.tif 000019
【０３３８】
3次元構造解析
一般的に、野生型(WT) FVIIa分子1DAN構造[Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]とFVIIaバリアントの構造の間に大きな違いはない。1DAN FVIIa重鎖とL288Y T293K、L288F T293K、W201R T293K、W201R T293Y及びL288F T293K K337A FVIIaバリアントの間のgesamt [Krissinel, E.、Journal of Molecular Biochemistry、(2012)、Vol. 1、76〜85頁]により計算した全平均二乗偏差(RMSD)は、それぞれ0.424、0.365、0.451、0.342及び0.289  Åであった。計算に使用したCα原子対の数は、それぞれ254、254、251、254及び254であった。
【０３３９】
W201R T293Y FVIIaバリアント
変異FVIIa W201R:
詳細なレベルにおいて二重変異体の重鎖FVIIa Arg201残基は、「60-ループ」(キモトリプシンナンバリング)に位置する。尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフでは、Arg201残基(野生型FVIIaにおけるTrp残基)の側鎖、及び前後の残基(それぞれAsn及びArg残基)の側鎖に対しては見ることができない主鎖ループ伸長の兆候がある。これは、これらの側鎖の高い柔軟性を示すものである。構造解釈を助けるために、差電子密度マップをCCP4ソフトウェアプログラムパッケージからのソフトウェア[Collaborative Computational Project、N. Acta Crystallographica、Section D、Biological crystallography、1994、50、760〜763頁]を用いて、自家野生型タンパク質結晶からの観察された構造因子とFVIIa二重変異体からの観察された構造因子[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]の間で計算した。野生型データ又は二重変異体データからのフェーズの使用は、類似の差マップをもたらした。差マップの正の側に、野生型FVIIa由来のTrp残基の側鎖をはっきりと見ることができる(野生型データからのフェーズを用いて5.6σレベルでの最大ピーク)が、差マップの負の側にArg側鎖の明らかな兆候はない。これはまた、Arg残基が野生型タンパク質のTrp残基より柔軟であるとも言える。しかし、Trp残基の前後の側鎖はどちらも、尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップを用いた1DAN構造において、はっきりと観察することができないことは注目されるべきである。これは、FVIIa W201R T293Y/sTF結晶構造からの結果に類似しているが、Trp201の位置はFVIIa WT構造において間違いなく見られる。
【０３４０】
試験したループの主鎖配向に関して、尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ及びphenix.refine精密化は、公開されている1DAN構造[Banner. D. W.ら、Nature、1996、380、41〜46頁]と比べて、200、201及び202残基を、置換Trp側鎖残基の位置のより近くに置く。特に残基Asn200が移動しており、このCα位置は野生型構造のCαの位置から3.1Å離れている(図3)。また、記載されている[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]差マップに、残基Asn200のこのような動きを示すピークがある。1つは、野生型ループコンフォメーションの位置に近い5.7σの正のピークであり、もう1つは、精密化二重変異体コンフォメーションのやや内側の4.3σの負のピークである。これは、主鎖がWT Trp側鎖の位置のより近く、FVIIa重鎖の相対的により中心に移動したことを支持するものである。
【０３４１】
重鎖FVIIaの残基200、201及び202について、野生型構造と二重変異タンパク質の間に見られる構造差は、WT構造において内側に向いているTrp201残基側鎖による安定化におそらく依存する。これは、FVIIaタンパク質中の主に疎水性容量を増やし、これにより野生型構造におけるループを支える。FVIIa W201R T293Yにおける対応する残基Argの側鎖は、しっかり結合した側鎖を有する同じ強固な構造を形成しないが、より柔軟であり、従ってWT FVIIa構造と同じようにはループを固定しない。
【０３４２】
図3は、2つの結晶構造の比較のスティック表示を示す: 1)薄い色の炭素原子を有する結晶構造。PDB構造1DAN [Banner. D. W.ら、Nature、1996、380、41〜46頁]と同じタイプの結晶からの自家データセットを用いた、組織因子と複合したFVIIa野生型タンパク質。及び2)濃い色の炭素原子を有する結晶構造。組織因子と複合したFVIIa二重変異体W201R T293Y。残基の幾つかは、アミノ酸1文字表記により標識され、1)及び2)についてそれぞれ「-wt」又は「-m」で終わっている。幾つかの側鎖は、尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップがこれらの側鎖に対していずれの電子密度も示さなかったことから、切断されている(Cβの外側の原子が除去されている)。例えば、FVIIa二重変異体W201R T293Yの残基N200、R201及びR202は全てこの理由のため切断されている。図は、分子グラフィックスソフトウェアPyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System.バージョン1.6.0.0 Schrodinger、LLC]により作成した。
【０３４３】
変異FVIIa T293Y:  
重鎖FVIIa Tyr293残基は活性化ループ1に位置する。尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフは、精密化構造におけるTyr残基の主鎖及び側鎖をはっきりと示す。Tyr側鎖原子Cβ〜Cγは、野生型Thr残基におけるCβ〜Cγ2原子と同じ方向をたどる。C-Cα-Cβ-Cγ及びC-Cα-Cβ-Cγ2二面角は、二重変異体及びWT形態のFVIIa残基293についてそれぞれ165及び173°である。これにより、二重変異体のTyr293残基は、この側鎖を触媒ドメインの方向、及びFFR-cmk結合阻害剤の結合部位の方へ向ける。計算された[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]差マップは、Tyr環系に負のピーク(4.7σ高さ)、及び欠けているThr Oγ1原子に正のピーク(4.2σ高さ)を有するTyr側鎖の配向を確認するものである。
【０３４４】
アンチトロンビンとFVIIa変異T293Y分子の間の可能性のある相互作用を試験するために、アンチトロンビンとの第Xa因子分子複合体、PDBコード2GD4 [Johnson. D. J. D.ら、Embo J.、2006、25、2029〜2037頁]の重ね合わせをFVIIa二重変異体に対して行った。分子グラフィックスソフトウェアPyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System、バージョン1.6.0.0 Schrodinger、LLC]がFXa及びFVIIa分子の重ね合わせに使用され、1194個の原子に対して0.769ÅのRMSDをもたらした。ライディング(riding)アンチトロンビン分子モデルから、生成された理論的分子複合体(FVIIa W201R T293Y/アンチトロンビンIII)におけるFVIIa W201R T293Y変異体のTyr293残基は、特にアンチトロンビン分子の残基Leu395と、またArg399とも空間的重複を形成することが次いで明らかである(図4)。これは、CCP4プログラムスイートのコンタクトソフトウェアで行う、FVIIa二重変異体のTyr293とライディングアンチトロンビン分子の間の距離計算により確認する。3.5Åのカットオフ距離を、変異体FVIIa分子におけるTyr293残基とアンチトロンビン分子の間に用いた。結果をTable 6 (表8)に示す。FXa複合体をFVIIa変異体(W201R T293Y)/sTF構造に重ね合わせた後の、FVIIa (W201R T293Y)及びFXaを共通分子として用いた、FVIIa W201R T293Y二重変異体の残基Tyr293とアンチトロンビン-S195A FXa-五糖類複合体、PDB:2GD4、[Johnson. D. J. D.ら、Embo J.、2006、25、2029〜2037頁]由来のアンチトロンビンの間の全ての距離(3.5Å以下の)を、Table 6(表8)にまとめる。空間的重複は、アンチトロンビンがこの反応中心ループ(RCL)をFVIIaの活性部位に置く可能性にほぼ確実にマイナスの影響を与えるであろう。これによりT293Y変異FVIIa分子は、アンチトロンビンによる阻害の影響を受けにくくなるであろう。これは、アンチトロンビンによる不活化に対する耐性の増加及び半減期の延長を示す実験的に観察されたものと一致しており、これに説明を与えるものである。
【０３４５】
図4は、アンチトロンビン(色が薄い炭素原子で示された)とFVIIa W201R T293Y二重変異体(色が濃い炭素原子で示された)の複合体の理論モデルのスティック表示である。FVIIa変異体W201R T293Yの残基Tyr293、Gln 255、Lys 341、Gln 286の相対的位置、及びアンチトロンビン分子については残基Leu 395、Arg 399、Glu 295、Tyr 253及びV317が示され、標識されている。モデルはアンチトロンビン/FXa複合体[Johnson. D. J. D.ら、Embo J.、2006、25、2029〜2037頁]、PDBコード2GD4の構造に基づき構築し、アンチトロンビンをライディングにして、FXa分子をFVIIa W201R T293Yバリアント分子の重鎖に重ね合わせた。FVIIa W201R T293Yの残基及びアンチトロンビンは、それぞれ「FVIIa」及び「AT」の接頭語と、これに続く1文字のアミノ酸コード及び残基数を有する。図は、分子グラフィックスソフトウェアPyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System、バージョン1.6.0.0 Schrodinger、LLC]により作成した。
【０３４６】
【表８】
2016537321.tif 000020
【０３４７】
W201R T293K FVIIaバリアント
FVIIaの残基201周辺の領域:詳細なレベルにおいて二重変異体の重鎖FVIIa Arg201残基は、「60-ループ」(キモトリプシンナンバリング)に位置する。尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフでは、主鎖ループ伸長がはっきりと見られる。Arg201残基(野生型FVIIaにおけるTrp残基)の側鎖もはっきりと観察される。しかし、Arg202残基の外側部分、グアニジニウム基は、尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ及び選択されたカットオフにおいて電子密度が欠けており、より高い運動性又は乱れを示している。試験したループ(「60-ループ」)の主鎖配向に関して、これはW201R T293Kと1DAN構造[Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]の間の形質転換を示す。2つの構造を重ね合わせた後、残基197から203へのポリペプチドに沿って移動すると、等価Cα位置にそれぞれ0.64、2.48、3.63、6.41、4.15及び0.81Åの違いがあることがわかる。ループの主鎖は、1DAN WT Trp側鎖残基[Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]の位置の方へより近づいており、またFVIIa重鎖、触媒ドメインの中心の方へも移動していた。W201R T293K FVIIaのArg201残基は重ね合わせ構造において、公開されている1DAN構造の置換WT Trp側鎖残基の位置の方へ置かれる。
【０３４８】
重鎖「60-ループ」の野生型構造とW201R T293K FVIIaバリアントの間に見られる構造差は、WT構造において内側に向いているTrp201残基側鎖による安定化におそらく依存する。これは、FVIIaタンパク質中の主に疎水性容量をふくらませ、これにより野生型構造におけるループを支える。FVIIa W201R T293Kにおける対応するより小さな残基Argの側鎖は、WT FVIIa構造のTrpと同じようにはループを固定しない。
【０３４９】
FVIIaの残基293周辺の領域:重鎖FVIIa Lys293残基は活性化ループ1に位置する。尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフは、精密化構造におけるLys残基の主鎖及び側鎖をはっきりと示す。Lys側鎖原子Cβ〜Cγは、野生型Thr残基におけるCβ〜Cγ2原子と同じ方向をたどる。C-Cα-Cβ-Cγ及びC-Cα-Cβ-Cγ2二面角は、二重変異体及びWT形態のFVIIa残基293についてそれぞれ169及び173°である。Lys293は、コンピュータグラフィックスソフトウェアCOOT [Emsley, P.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2010)、Vol. 66、486〜501頁]により見られる、Lysの最も一般的な回転異性体配向、「mttt」回転異性体配向を示す[Lovell, S. C.ら、Proteins、(2000)、Vol. 40、389〜408頁]。更に、W201R T293K FVIIaバリアントのLys293残基Nζ原子は、2.68Åの距離で残基Gln176 Oε1原子と強い水素結合を作り、これにより2つの側鎖を安定化する。従って、WT FVIIa 1DAN構造と比較してGln176残基は、側鎖コンフォメーションを変えてW201R T293K FVIIaバリアントにおいてLys293残基と作る水素結合を最適化していた。該回転異性体は、WT構造の「tt0°」コンフォメーションから[Lovell, S. C.ら、Proteins、(2000)、Vol. 40、389〜408頁]に記載された標準的なコンフォメーションにはない回転異性体コンフォメーションとなる。これにより、二重変異体のLys293残基は、この側鎖を触媒ドメインの方向、及びFFR-cmk結合阻害剤の結合部位の方へ向け、FVIIa活性部位溝のプライム部位をふくらませる。
【０３５０】
L288Y T293K FVIIaバリアント
FVIIaの残基288周辺の領域:
該領域は、結晶構造尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフにはっきりと見られる。FVIIa L288Y T293K FVIIaバリアントの重鎖においてTyr288残基、残基289から292をたどるループ中の残基は、残基Arg290に最大差を有する主鎖コンフォメーションの変化を示し、Cα原子は、FVIIa L288Y T293K FVIIaバリアントとFVIIaのWT構造、1DAN [Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]の重ね合わせ分子間で2.87Å異なる。Tyr288残基のCα原子は、重ね合わせたWT FVIIaにおけるLeu288残基の等価原子と0.80Åの差を示す。FVIIa L288Y T293K FVIIaバリアントにおけるTyr288の側鎖回転異性体は「p90°」であるが、WT FVIIa 1DAN構造のLey側鎖回転異性体のこれは「mt」回転異性体を示す[Lovell, S. C.ら、Proteins、(2000)、Vol. 40、389〜408頁]。これは、2つの等しい側鎖が、C-Cα-Cβ-Cγ二面角の違い(L288Y T293K FVIIaバリアント及びWT FVIIaについてそれぞれ-69°及び157°)に見られる異なる方向を指し示す結果となる。L288Y T293K FVIIaバリアントにおけるTyr288側鎖のヒドロキシル基は結晶構造中に秩序正しく並ぶ周囲の水分子と有利に相互作用し、側鎖はFVIIa L288Y T293KバリアントのTyr288をたどるループの上に折り畳まれる。残基288をたどるループの構造主鎖の変化及び残基288自体の変異は、このFVIIaバリアントで見られる活性改善を少なくとも部分的に説明し得る。
【０３５１】
FVIIaの残基293周辺の領域:  
この残基及びこれと接触している他の残基の3D構造は、W201R T293K FVIIaバリアントに関して記載されているものと極めて類似している。従って、このバリアントのT293K変異について導かれる全ての結論は、L288Y T293K FVIIaバリアントのT293K変異にも当てはまる。
【０３５２】
L288F T293K FVIIaバリアント
FVIIaの残基288周辺の領域:
該領域は、結晶構造尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフにはっきりと見られる。この領域の3D構造は、L288F T293K FVIIaバリアントと極めて類似している。例えば2つのバリアントは同じ主鎖配向を共有している。2つのFVIIaバリアント間で異なる1つのことは、Phe288側鎖がこの側鎖にとって別の好ましい、WT FVIIaのLeu288側鎖と同じ配向を実際に指す回転異性体(「m-85°」)を有することである。L288F T293K FVIIaバリアントのPhe288側鎖の独自の特性は、Phe残基に関して、これが周囲の溶媒に異常に暴露されることである(CCP4結晶学プログラムスイートのAREAIMOLによる計算によれば145Å2 [Bailey, S.、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(1994)、Vol. 50、760〜763頁])。
【０３５３】
FVIIaの残基293周辺の領域:
この残基及びこれと接触している他の残基の3D構造は、W201R T293K FVIIaバリアントに関して記載されているものと極めて類似している。従って、このバリアントのT293K変異について導かれる全ての結論は、L288F T293K FVIIaバリアントのT293K変異にも当てはまる。
【０３５４】
L288F T293K K337A FVIIaバリアント
FVIIaの残基288周辺の領域:
該領域は、結晶構造尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフにはっきりと見られる。この領域の3D構造は、L288F T293K FVIIaバリアントと極めて類似している。例えば2つのバリアントは同じ主鎖配向を共有している。2つのFVIIaバリアント間で異なる1つのことは、Phe288側鎖がこの側鎖にとって別の好ましい、WT FVIIaのLeu288側鎖及びL288F T293K FVIIaバリアントと同じ配向を実際に指す回転異性体(「m-85°」)を有することである。従って、このバリアントのL288F変異について導かれる全ての結論は、L288F T293K K337A FVIIaバリアントのL288F変異にも当てはまる。
【０３５５】
FVIIaの残基293周辺の領域:
この残基及びこれと接触している他の残基の3D構造は、W201R T293K FVIIaバリアントに関して記載されているものと極めて類似している。従って、このバリアントのT293K変異について導かれる全ての結論は、L288F T293K K337A FVIIaバリアントのT293K変異にも当てはまる。
【０３５６】
FVIIaの残基337周辺の領域:
該領域は、結晶構造尤度重み付け2mFo-DFc電子密度マップ、1.0σカットオフにはっきりと見られる。この領域の3D構造は、FVIIaのWT構造、1DAN [Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]、及びこの実施例の他のFVIIaバリアントと類似している。全体の主鎖配向及び側鎖配向は、WT FVIIa 1DAN構造及び他のFVIIaバリアント構造に近い。しかし、phenix.refineによる、結晶構造の0.40Åの座標誤差の最大尤度ベースの計算よりわずかに大きいという、小さな違いがある。残基337の等価Cβ原子は、FVIIaのWT構造、1DAN及びL288F T293K K337A FVIIaバリアントにおいて0.8Å離れている。同じ残基のCα原子は0.4Å離れている。残基336の等価Cα原子は、重ね合わせたFVIIaのWT構造、1DAN及びL288F T293K K337A FVIIaバリアントにおいて0.6Å離れている。Phe332残基に関して、側鎖は、FVIIaのWT構造、1DAN [Banner, D. W.ら、Nature、(1996)、Vol. 380、41〜46頁]と比較して、L288F T293K K337A FVIIaバリアントのAla337残基の方へ約0.5Åシフトしている。この実施例の他のFVIIaバリアントは、L288F T293K K337A FVIIaバリアントへのFVIIaのWT構造、1DANとほぼ同じ偏位を示すと結論することもできる。更に、他のFVIIaバリアントは、L288F T293K K337A FVIIaバリアントよりWT FVIIa 1DAN構造のはるかに近くに密集している。これは、このバリアントの特性の変化を少なくとも部分的に説明し得る。
【０３５７】
(実施例9〜14)−FVIIaバリアントの化学修飾
実施例9〜14で使用される略語:
AUS:          アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)シアリダーゼ
CMP-NAN:        シチジン-5'-一リン酸-N-アセチルノイラミン酸
CV:              カラム容量
GlcUA:          グルクロン酸
GlcNAc:          N-アセチルグルコースアミン
GSC:              5'-グリシルシアル酸シチジン一リン酸
GSC-SH:          5'-[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸
HEP:              ヘパロサンポリマー
HEP-GSC:        GSC-官能化ヘパロサンポリマー
HEP-[N]-FVIIa:  N-グリカンを介してFVIIaにコンジュゲートされたヘパロサン
HEPES:          2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸  
His:              ヒスチジン
PABA:            p-アミノベンズアミジン
ST3GalIII        N-グリカン特異的a2,3-シアリルトランスフェラーゼ
TCEP:            トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
UDP:            ウリジン二リン酸
【０３５８】
実施例9〜14で使用される定量化方法:
本発明のコンジュゲートをHPLCにより純度について分析した。HPLCは、FVIIa参照分子に基づく単離したコンジュゲートの量の定量化にも使用した。試料は、非還元又は還元形態のいずれかで分析した。Zorbax 300SB-C3カラム(4.6×50mm; 3.5μm Agilent社、カタログ番号:865973-909)を使用した。カラムは30℃で操作した。5μg試料を注入し、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水(A)-アセトニトリル(B)溶媒系でカラムを溶出した。勾配プログラムは次の通りであった: 0分(25% B); 4分(25% B); 14分(46% B); 35分(52% B); 40分(90% B); 40.1分(25% B)。10μl TCEP/ギ酸溶液(70mM  トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン及び10%ギ酸水溶液)を25μl/30μg FVIIa(又はコンジュゲート)に添加して、還元試料を調製した。反応物を10分間、70℃で放置した後、HPLCで分析した(5μl注入)。
【０３５９】
実施例9〜14で使用される出発材料:
HEP-マレイミド及びHEP-ベンズアルデヒドポリマー
規定サイズのマレイミド及びアルデヒド官能化HEPポリマーを、US 2010/0036001に記載されている酵素的重合反応により調製した。反応を開始させるのに2つの糖ヌクレオチド(UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA)及びプライミング三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2を使用し、重合は糖ヌクレオチド構成単位が枯渇するまで行う。該過程は、単一の末端アミノ基を有するHEPポリマーをもたらした。HEPポリマーのサイズを糖ヌクレオチド対プライマー比により決定する。末端アミン(プライマーに由来)を次いで、GSC-SHにコンジュゲーションするためのマレイミド官能基、又はGSCのグリシル末端に対する還元的アミノ化化学のためのベンズアルデヒド官能基のどちらかで官能化する。
【０３６０】
HEP-ベンズアルデヒドは、アミン官能化HEPポリマーを過剰なN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸(Nano Letters (2007)、7(8)、2207〜2210頁)と水性中性溶液中で反応させて調製することができる。ベンズアルデヒド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離することができる。HEP-マレイミドは、アミン官能化HEPポリマーを過剰なN-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS社; Fujiwara, K.ら(1988)、J. Immunol. Meth. 112、77〜83頁)と反応させて調製することができる。
【０３６１】
ベンズアルデヒド又はマレイミド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離することができる。末端1級アミン官能基(HEP-NH2)により官能化した任意のHEPポリマーを本実施例において使用することができる。2つの選択肢を以下に示す。
【０３６２】
【化８】
2016537321.tif 000021
【０３６３】
該多糖の非還元末端における末端糖残基は、N-アセチルグルコースアミン又はグルクロン酸のどちらかであってもよい(グルクロン酸が上記に描かれている)。等モル量のUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAが重合反応に使用されたならば、典型的には両方の糖残基の混合物が非還元末端に予想される。
【０３６４】
5'-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC):
本発明において使用されるGSC出発材料は、化学的に合成されてもよく(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁)、又はWO07056191に開示されている化学酵素的経路により得られてもよい。GSC構造を以下に示す:
【０３６５】
【化９】
2016537321.tif 000022
【０３６６】
(実施例9)- 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの調製
工程1: [(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸(GSC-SH)の合成
【０３６７】
【化１０】
2016537321.tif 000023
【０３６８】
グリシルシアル酸シチジン一リン酸(200mg; 0.318mmol)を水(2ml)に溶解し、チオブチロラクトン(325mg; 3.18mmol)を添加した。2つの相溶液を室温で21時間、穏やかに混合した。反応混合物を次いで水(10ml)で希釈し、逆相HPLCカラム(C18、50mm×200mm)に適用した。カラムを水(A)、アセトニトリル(B)、及び250mM炭酸水素アンモニウム(C)の勾配系、流速50ml/分で次のように溶出した: 0分(A: 90%、B: 0%、C:10%); 12分(A: 90%、B: 0%、C:10%); 48分(A: 70%、B: 20%、C:10%)。画分(20mlサイズ)を回収し、LC-MSにより分析した。純粋な画分をプールし、ナトリウム型のDowex 50W×2 (100〜200メッシュ)樹脂の短いパッドにゆっくり通した後、乾燥粉末に凍結乾燥させた。凍結乾燥粉末中の標題の材料の含量を次いで260nmの吸光度、及びグリシルシアル酸シチジン一リン酸を参照材料として用いてHPLCにより決定した。HPLC分析には、Waters社X-Bridgeフェニルカラム(5μm 4.6mm×250mm)及び水アセトニトリル系(30分間の0.1%リン酸を含有する0から85%のアセトニトリルの直線勾配)を使用した。収量: 61.6mg (26%)。LCMS: 732.18 (MH+); 427.14 (MH+-CMP)。化合物は-80℃で保管した場合、長期間(>12ヶ月)安定であった。
【０３６９】
工程2:スクシンイミド結合による38.8kDa HEP-GSC試薬の合成
【０３７０】
【化１１】
2016537321.tif 000024
【０３７１】
HEP-GSC試薬は、工程1からのGSC-SH {[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸}をHEP-マレイミドと1:1モル比で結合させて次のように調製した: 50mM Hepesに溶解したGSC-SH (0.68mg)、100mM NaCl、pH7.0 (50μl)を、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0 (1.35ml)に溶解した38.8k-HEP-マレイミド35mgに添加した。透明な溶液を25℃で2時間放置した。未反応GSC-SHを、10kDのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて透析により除去した。透析緩衝液は、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0であった。反応混合物は2.5時間で2回透析した。GSC-SHとHEP-マレイミド間の定量的反応を想定し、回収した材料を以下の工程4等で使用した。この手順により作成したHEP-GSC試薬は、スクシンイミド結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合したHEPポリマーを含有することになる。
【０３７２】
工程3: FVIIa L288F T293Kの脱シアル化
FVIIa L288F T293K (30mg)に10mM His、100mM NaCl、60mM CaCl2、10mM PABA pH5.9 (10ml)中でシアリダーゼ(AUS、100ul、20U)を添加し、室温で1時間放置した。反応混合物を次いで50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、pH7.0 (30ml)で希釈し、氷上で冷却した。250mM EDTA溶液(2.6ml)を少量ずつ添加し、水酸化ナトリウムの添加によりpHを中性に保った。EDTA処理試料を次いで2×5ml HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare社)に適用し、50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、pH7.0で平衡化した。非結合タンパク質を50mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA、pH7.0 (4CV)と、続いて50mM HEPES、150mM NaCl、pH7.0 (8CV)で溶出した後、アシアロFVIIa L288F T293Kを50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0 (20 CV)で溶出した。アシアロFVIIa L288F T293Kを50mM HEPES、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中に単離した。収量(19.15mg)は、逆相HPLCを用いたトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン還元後に、FVIIa標準に対するFVIIa L288F T293K軽鎖含量を定量化して決定した。
【０３７３】
工程4:スクシンイミド結合による38.8kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの合成
50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、10mM PABA、pH7.0 (18.0ml)中アシアロFVIIa L288F T293K (19.2mg)に、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0 (2.3ml)中38.8kDa-HEP-GSC (工程2からの35mg)、20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0 (7.2ml)中ラットST3GalIII酵素(5mg; 1.1単位/mg)を添加した。反応混合物を低速回転下で一晩、32℃でインキュベートした。次いで、反応混合物をGlaドメイン特異的抗体で修飾したFVIIa特異的親和性カラム(CV=24ml)に適用し、最初は2カラム容量の緩衝液A (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)、次いで2カラム容量の緩衝液B (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM EDTA、pH7.4)でステップ溶出した。方法は基本的にThim, Lら Biochemistry (1988) 27、7785〜779頁による原理に従っている。折り畳まれていないGlaドメインを含む産物を回収し、2×5ml HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare社)に直接適用した。カラムを10mM His、100mM NaCl、0.01% Tween80、pH7.5 (3カラム容量)、及び10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH7.5 (3.5カラム容量に対して)で洗浄した。pHを次いで10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH6.0 (3カラム容量)により6.0まで低下させ、HEP化材料を60%緩衝液A (10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH6.0)及び40%緩衝液B (10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH6.0)から成る5カラム容量の緩衝液混合物で溶出した。回収したアシアロFVIIa L288F T293K (非修飾)を再利用、すなわち工程4に記載されているようにもう1回HEP化し、まさに記載されているのと同じように精製した。2回のHEP化ランからの混合画分をプールし、限外濾過(Millipore Amicon Ultra、カットオフ10kD)により濃縮した。
【０３７４】
工程5:単糖コンジュゲートヘパロサン38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kのキャッピング
38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの非シアル化N-グリカンは、最後にST3GalIII酵素及びCMP-NANで次のようにキャッピング(すなわちシアル化)した: 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K (5.85mg)を、8.4mlの10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH6.0中、ST3GalIII (0.18mg/ml); CMP-NAN (4.98mM)と32℃で1時間インキュベートした。次いで、反応混合物をGlaドメイン特異的抗体で修飾したFVIIa特異的親和性カラムに適用し、最初は2カラム容量の緩衝液A (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)、次いで2カラム容量の緩衝液B (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM EDTA、pH7.4)でステップ溶出した。38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kを含有するプールした画分を合わせ、10kDのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて透析した。透析緩衝液は、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80、pH6.0であった。タンパク質濃度はTCEP還元後に軽鎖HPLC分析により決定した。38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの全収量は、2.46mg (13%)であった。
【０３７５】
(実施例10)-41.5kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337Aの調製
工程1: 4-メチルベンゾイル結合による41.5kDa HEP-GSC試薬の合成
【０３７６】
【化１２】
2016537321.tif 000025
【０３７７】
5.0ml 50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液、pH7.0中グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC) (20mg; 32μmol)に、41.5kDa HEP-ベンズアルデヒド(99.7mg; 2.5μmol)を添加した。HEP-ベンズアルデヒドが全て溶解するまで混合物を穏やかに回転させた。次の2時間の間に、MilliQ水中1M溶液のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、48mMの最終濃度に達するまで少量ずつ(5×50μl)添加した。反応混合物を室温で一晩放置した。次いで、過剰なGSCを透析により次のように除去した:総反応容量(5250μl)を透析カセット(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette、Thermo Scientific社製品番号66810、カットオフ10kDa、容積: 3〜12ml)に移した。溶液を2000mlの25mM Hepes緩衝液(pH7.2)に対して2時間、2000mlの25mM Hepes緩衝液(pH7.2)に対してもう1回、17時間透析した。内部チャンバからの過剰なGSCの完全な除去は、Waters社X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)、及びGSCを参照として用いる水アセトニトリル系(30分間の0.1%リン酸を含有する0から85%のアセトニトリルの直線勾配)でのHPLCにより検証した。内部チャンバ材料を回収し、凍結乾燥して白い粉末としての41.5kDa HEP-GSCを得た。HEP-GSC試薬をNMRにより及びSECクロマトグラフィーで分析した。この手順により作成したHEP-GSC試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合したHEPポリマーを含有する。
【０３７８】
工程2: FVIIa L288F T293K K337Aの脱シアル化:
21mlの10mM His、100mM NaCl、60mM CaCl2、10mM PABA、pH6.7緩衝液中FVIIa L288F T293K K337A (43.5mg)の溶液に、シアリダーゼ(アルスロバクター・ウレアファシエンス、9単位/ml)を添加した。反応混合物を室温で1時間インキュベートした。反応混合物を次いで氷上で冷却し、14mlの10mM His、100mM NaCl pH7.7を添加した。次いで50mlの100mM EDTA溶液を中性pHを維持しながら添加した。反応混合物を次いで50mlのMilliQ水で希釈し、50mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0中で平衡化した4×5ml相互接続HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare社)に適用した。シアリダーゼを含む非結合タンパク質を5CVの50mM HEPES、150mM NaCl、pH7.0で溶出した。脱シアル化タンパク質を、12CVの50mM HEPES、150mM NaCl、30mM CaCl2、pH7.0で溶出した。タンパク質を含有する画分を合わせ、10mMの最終濃度に達するまで0.5M PABAを添加した。タンパク質収量は、上記に記載された逆相HPLCを用いたトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン還元後に、FVIIa標準に対するFVIIa L288F T293K K337A軽鎖を定量化して決定した。32.5mgアシアロFVIIa L288F T293K K337A (2.83mg/ml)を、11.5mlの50mM Hepes、150mM NaCl、30mM CaCl2、10mM PABA、pH7.0中でこのように単離した。
【０３７９】
5.75mlの50mM Hepes、150mM NaCl、30mM CaCl2、10mM PABA、pH7.0中のアシアロFVIIa L288F T293K K337A (16.3mg)に、4.2mlの20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0中41.5kDa HEP-GSC (3等量、41.5mg)及びラットST3GalIII酵素(2.93mg; 1.1単位/mg)を添加した。PABA濃度を次いで0.5M水性PABA溶液で10mMに調整し、pHを1N NaOHで6.7に調整した。反応混合物を低速撹拌下、32℃で一晩インキュベートした。50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0 (356μl)中の溶液157mm CMP-NANを次いで添加し、反応物を32℃で更に1時間インキュベートした。HPLC分析は、未反応FVIIa L288F T293K K337A (68%)、モノHEP化FVIIa (25%)及び様々なポリHEP化形態(7%)を含有する産物分布を示した。
【０３８０】
次いで、全反応混合物をGlaドメイン特異的抗体で修飾したFVIIa特異的親和性カラム(CV=24ml)に適用し、最初は2カラム容量の緩衝液A (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)、次いで2カラム容量の緩衝液B (50mM Hepes、100mM NaCl、10mM EDTA、pH7.4)でステップ溶出した。方法は基本的にThim, Lら、Biochemistry (1988) 27、7785〜779頁により記載された原理に従っている。
【０３８１】
折り畳まれていないGlaドメインを含む産物を回収し、10mM His、100mM NaCl、pH6.0を含有する緩衝液で平衡化した3×5ml相互接続HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare社)に直接適用した。カラムを4カラム容量の10mM His、100mM NaCl、pH6.0で洗浄した。非修飾FVIIa L288F T293K K337Aを、12CVの10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0 (溶出緩衝液A)で溶出した。41.5kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337Aを次いで、15CVの10mM His、325mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0で溶出した。純粋な画分を合わせ、タンパク質濃度を以前に記載されたHPLC定量方法により決定した。3.42mg (21%)純粋41.5kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337Aを単離した。
【０３８２】
41.5kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337Aを含有する混合画分を、最後に、10kDのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6. 0に対して透析し、透析緩衝液を添加して濃度を(0.40mg/ml)に調整した。
【０３８３】
(実施例11)- 41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293Kの調製
この材料は基本的に、実施例10に記載されているように調製した。FVIIa W201R T293K (40mg)を最初に脱シアル化し、アシアロFVIIa W201R T293K (27.2mg)をGla特異的イオン交換方法により単離した。脱シアル化アナログを次いで41.5kDa HEP-GSC (実施例10に記載されているように生成)及びST3GalIIIとインキュベートした。コンジュゲーション産物を次いでイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。最終緩衝液交換は、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0中2.9mg (7.5%)の41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293Kをもたらした。
【０３８４】
(実施例12)- 41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293Kの調製
この材料は基本的に、実施例10に記載されているように調製した。FVIIa L288Y T293K (19.9mg)を最初に脱シアル化し、アシアロFVIIa L288Y T293K (16.9mg)をGla特異的イオン交換方法により単離した。脱シアル化アナログを次いで41.5kDa HEP-GSC (実施例10に記載されているように生成)及びST3GalIIIとインキュベートした。コンジュゲーション産物を次いでイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。最終緩衝液交換は、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0中1.95mg (11.5%)の41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293Kをもたらした。
【０３８５】
(実施例13)-41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293Rの調製
この材料は基本的に、実施例10に記載されているように調製した。脱シアル化後、アシアロFVIIa L288Y T293R (30mg)を、41.5kDa HEP-GSC (実施例10に記載されているように生成)及びST3GalIIIと反応させた。コンジュゲーション産物を次いでイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。最終緩衝液交換は、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0中4.33mg (14.4%)の41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293Rをもたらした。
【０３８６】
(実施例14)-41.5kDa HEP-[N]-FVIIa T293K K337Aの調製
この材料は基本的に、実施例10に記載されているように調製した。脱シアル化後、アシアロFVIIa L288Y T293R (8mg)を、41.5kDa HEP-GSC (実施例10に記載されているように生成)及びST3GalIIIと反応させた。コンジュゲーション産物をイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。最終緩衝液交換は、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0中1.72mg (15%)の41.5kDa HEP-[N]-FVIIa T293K K337Aをもたらした。
【０３８７】
(実施例15)−修飾された組み合わせFVIIaバリアントの機能特性
実施例9〜14に記載されたPEG又はヘパロサン(HEP)のどちらかに糖コンジュゲートしたFVIIa組み合わせバリアントを、実施例5に記載されたタンパク質分解活性及びアンチトロンビン反応性について特徴付けした。結果をTable 7(表9)にまとめる。これらのデータは、FVIIaの化学修飾はPEG又はHEPを用いる場合FVIIaバリアントタンパク質分解活性を減少させるが、幾つかのバリアントに関しては野生型FVIIaより高いタンパク質分解活性を保持させ、更にアンチトロンビン耐性を保持させることを示している。
【０３８８】
【表９】
2016537321.tif 000026
【０３８９】
(実施例16)-血友病A様全血トロンボエラストグラフィーにおける評価
FVIIaとの比較による血友病A様全血におけるFVIIaバリアントの活性を評価するために、トロンボエラストグラフィー(TEG)アッセイを選択した。TEGアッセイは、全凝固過程のプロファイル-開始、増幅及び最終血餅強度測定値を提供する。血流中の剪断力及び血管系の起こり得る影響とは別に、TEGアッセイは、該方法が凝固全血の粘弾特性を測定することから、凝固のインビボ条件を模倣する(Viuff, E.ら、Thrombosis Research、(2010)、Vol. 126、144〜149頁)。各TEGアッセイはカオリンを用いて開始し、TEGパラメータ凝固時間(R)及び最大血栓生成速度(MTG)を記録し、Table 8(表10)に報告した。凝固時間(R)は、試料カップに血液を入れてから血餅が形成し始めるまでの待ち時間を意味し(2mm振幅)、一方、最大血栓生成(MTG)は血餅形成速度を意味する。凝固時間(R)(秒)は標準TEGソフトウェアを用いて決定し、一方、MTGは100を乗じたTEGトラックの一次導関数として計算する(100×mm/秒)。
【０３９０】
血液試料はDanish National Corps of Voluntary Blood Donorsのメンバーであり、血液提供の基準を満たす正常で健康なドナーから得た。血液を3.2%クエン酸塩バキュテイナ(Vacuette ref. 455322、Greiner bio-one社、Lot A020601 2007-02)に採取し、60分以内でアッセイした。血友病A様血液は、抗ヒトFVIII (ヒツジ抗ヒトFVIII、Lot AA11-01、Haematologic Technologies社、VT、USA)抗体を1mlあたり10ベセスダ単位(BU)(最終0.1mg/ml)の最終濃度まで添加して、正常なヒト全血から調製し、2rpm/分、室温で30分間穏やかに回転させた。テスト化合物は、0.069、0.69、6.9、17.3nMでテストしたFVIIa L288Y T293K、及び0.076、0.76、7.6、19.1nMでテストしたFVIIa W201R T293Kを除いて0.1、1、10及び25nM最終濃度で添加した。
【０３９１】
カオリン誘導TEGからのデータは、血友病A様血液における全化合物の凝固時間(R時間)が用量依存的に減少し、最大血栓生成(MTG)が増加することを示した[Table 8(表10)]。全ての40k-HEP-[N]-FVIIa-バリアントは、最高テスト濃度で評価した場合、FVIIaと比較してより短い又は類似の凝固時間を示した。また、バリアントの最大血栓生成もFVIIaと比べて類似又は増加した。更にデータは、対応するFVIIaバリアントと比較した場合(40k-HEP化なし)、FVIIaバリアントの40k-HEP化は40k-HEP化化合物の活性を低下させることを示した。
【０３９２】
Table 8(表10)は、血友病A様全血中のカオリン誘導TEGにおけるテスト化合物のR時間(凝固時間)及びMTG (最大血栓生成)を示す。テスト化合物の最高濃度は、17.3nMでテストしたFVIIa L288Y T293K及び19.1nMでテストしたFVIIa W201R T293Kを除いて、25nMであった。FVIIa、40k-PEG-[N]-FVIIa及び40k-HEP-[N]-FVIIaは4人のドナー(n=4)でテストしたのに対し、残りの化合物は2人のドナー(n=2)でテストした。角括弧中のデータは、4人のドナーからのパラメータの範囲を示す。
【０３９３】
【表１０】
2016537321.tif 000027
【０３９４】
(実施例17)−ラットにおけるPKの評価
同定した非修飾形態のFVIIaバリアント、又はPEG若しくはヘパロサン(HEP)のどちらかと糖コンジュゲートしたFVIIaバリアントの薬物動態分析をラットで行って、FVIIaのインビボ生存率に対するこの影響を評価した。Sprague Dawleyラット(1群あたり3匹)を静脈内投与した。Stabylite(商標)(TriniLize Stabylite試験管; Tcoag Ireland Ltd社、アイルランド)安定化血漿試料を適切な時点で完全なプロファイルとして収集し、さらなる分析まで凍結させた。凝固活性(実施例7に記載されている)について、及びFVIIa-アンチトロンビン複合体を定量化するELISAにより、血漿試料を分析した。薬物動態分析は、Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation社)を用いた非コンパートメント方法により実施した。以下のパラメータを推定した: FVIIa-アンチトロンビン複合体のCmax(最大濃度)、凝固活性のT1/2(機能的終末半減期)及びMRT(機能的平均滞留時間)。
【０３９５】
簡単には、FVIIa-アンチトロンビン複合体は、酵素免疫アッセイ(EIA)を使用して測定した。EGFドメインのN末端に結合し、アンチトロンビン結合をブロックしないモノクローナル抗FVIIa抗体を、複合体の捕捉に使用した(Dako Denmark A/S社、グロストルップ;製品コードO9572)。ポリクローナル抗ヒトAT抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートを検出に使用した(Siemens Healthcare Diagnostics ApS社、バレルプ/デンマーク;製品コードOWMG15)。ヒト野生型又はバリアントFVIIa及び血漿由来ヒトアンチトロンビンの予め形成した精製複合体を、EIA検量線を構築するための基準として使用した。血漿試料を希釈し、分析し、二重の測定の平均濃度を計算した。EIAのアッセイ内精度は、1〜8%の間であった。
【０３９６】
薬物動態推定パラメータをTable 9(表11)に列挙する。野生型FVIIaと比べて、テストバリアントはFVIIa-アンチトロンビン複合体(ラットAT複合体)の蓄積の減少を示し、血漿レベルは検出レベルに近かった。更に、40k-PEG-[N]-FVIIa (ラットで7.4時間)と比較して、40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの著しく延長した官能性半減期(ラットで18.4時間)が観察された。
【０３９７】
結論として、293位のLysの存在は、ラットにおけるT1/2を増加させ、FVIIa-アンチトロンビン複合体形成を低下させる。更に、糖コンジュゲートヘパロサンの導入は、ラットにおけるT1/2を実質的に改善する。
【０３９８】
【表１１】
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【０３９９】
(実施例18)−活性部位安定化によるFVIIa L288Y T293Kの液剤
溶液中のFVIIaの安定性は、自己タンパク質分解、酸化、脱アミド、異性化等の結果生じるポリペプチド鎖への幾つかの修飾により限定される。以前の試験は、自己タンパク質分解攻撃に感受性である重鎖上の3つの部位を同定した。これらはArg290-Gly291、Arg315-Lys316、及びLys316-Val317である(Nicolaisenら、FEBS、1993、317:245〜249頁)。無カルシウム条件は更に、γ-カルボキシグルタミン酸(Gla)ドメインを包含する軽鎖の最初の38残基のタンパク質分解放出を促進する。
【０４００】
ここで本発明者らは、非共有相互作用を通じてFVIIaの活性部位を安定化し、液剤中の重鎖の自己タンパク質分解を防ぐための小分子、PCI-27483-S (2-{2-[5-(6-カルバミミドイル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6,2'-ジヒドロキシ-5'-スルファモイル-ビフェニル-3-イル]-アセチルアミノ}-コハク酸)を使用した(PCI-27483-Sの更なる詳細はWO2014/057069参照)。
【０４０１】
重鎖切断の定量化は、逆相HPLC (RP-HPLC)による還元FVIIa L288Y T293Kの分析により評価した。アッセイ溶液は127mmジチオスレイトール(DTT)及び3Mグアニジニウム塩酸塩に還元し、これを60℃、15分間インキュベートし、この後、1μL濃縮酢酸を添加し(最初のアッセイ溶液50μLあたり)、25℃で冷却した。25μg還元FVIIa L288Y T293Kを次いでACE 3μM C4カラム(300Å、4.6×100mm; Advanced Chromatography Technologies LTD社、スコットランド)に注入し、これを40℃で温度平衡した。タンパク質断片を、水中0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)から成る移動相Aを有し、80%アセトニトリル中0.045% TFAから成る移動相Bの35から80%の直線勾配で分離した。勾配時間は0.7ml/分の流速で30分であり、ピーク溶出は、215nmの吸光度で検出した。
【０４０２】
FVIIa L288Y T293Kの製剤は、1.47mg/mL CaCl2、7.5mg/mL NaCl、1.55mg/mL L-ヒスチジン、1.32mg/mLグリシルグリシン、0.5mg/mL L-メチオニン、0.07mg/mLポリソルベート80、0.021mg/ml PCI-27483-S、1mg/mlタンパク質濃度(すなわち1:1.75のタンパク質阻害剤モル比)、及び6.8の最終pHにより作成した。溶液を休眠条件下で光から離して30℃、1ヵ月間インキュベートした。Table 10(表12)に見られるように、PCI-27483-Sの存在がFVIIa L288Y T293Kの重鎖切断のほぼ完全な阻害をもたらしたのに対し、PCI-27483-Sの添加なしは、315〜316位及び290〜291位における切断の顕著な増加をもたらした。
【０４０３】
【表１２】
2016537321.tif 000029
【０４０４】
（実施例19）−免疫原性リスクのインシリコ評価
インシリコ試験は、FVIIaアナログを生成するためのタンパク質改変から生じる新規ペプチド配列が、ヒトにおいてHLA-IIとしても知られる主要組織適合複合体クラスII (MHC-II)に結合することができるペプチド配列をもたらし得るかを調査した。このような結合は、T細胞エピトープの存在の前提条件である。この試験で使用したペプチド/HLA-II結合予測ソフトウェアは、2つのアルゴリズム、HLA-DR予測を行うNetMHCIIpan 2.1 (Nielsenら 2010)、及びHLA-DP/DQ予測を行うNetMHCII 2.2 (Nielsenら 2009)に基づいた。
【０４０５】
免疫原性リスク潜在性に関して種々のFVIIaアナログを比較できるようにするために、免疫原性リスクスコア(IRS)を計算した。計算は次のように行った: FVIIa野生型を参照として使用し、参照(FVIIa野生型)にない、予測ランク10以下を有する予測15merのみを分析に含めた。HLA-II対立遺伝子を3つのクラスに分類した: 質量が2のクラス1 (ランク≦1)、質量が0.5のクラス2 (1>ランク≦3)、及び質量が0.2のクラス3 (3>ランク≦10)。クラス質量(2. 0.5又は0.2)に対立遺伝子頻度(集団ごとの)を乗じてIRSを得た。IRSの合計を集団ごと及び各HLA-IIについて計算した(DRB1、DP及びDQ)。
【０４０６】
選択した単一及び組み合わせバリアントについて計算したリスクスコアをTable 11(表13)に示す。特に好ましい組み合わせには、高いタンパク質分解活性、及びアンチトロンビンによる阻害に対する感受性の低下を同時に示すL288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288Y/T293K及びL288Y/T293K/K337Aが含まれる。
【０４０７】
【表１３】
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【図１】
2016537321.tif 000031
【図３】
2016537321.tif 000032
【図４】
2016537321.tif 000033
【図５ａ】
2016537321.tif 000034
【図５ｂ】
2016537321.tif 000035
【図６ａ】
2016537321.tif 000036
【図６ｂ】
2016537321.tif 000037
【図１２】
2016537321.tif 000038
【図１３】
2016537321.tif 000039
【図１４】
2016537321.tif 000040
【図１５】
2016537321.tif 000041
【図１８】
2016537321.tif 000042
【図２】
2016537321.tif 000043
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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