(57)【要約】  チオ選択的放射活標識化剤は、下記一般式：*Ｒ−Ｌ−ＶＳを有し、式中、前記*Ｒは放射性同位体であり、Ｌは連結基であり、ＶＳはビニルスルホン官能基であり、前記標識化剤はチオール含有生体分子たとえばタンパク質またはペプチドに共有結合できる。ニューロテンシンおよびその変異体を標識化するための前記標識化剤の使用も開示している。【選択図】図１Ａ
2016518311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式を有する、チオ選択的放射性標識化剤。
*Ｒ−Ｌ−ＶＳ
式中、前記*Ｒは放射性同位体であり、Ｌは連結基であり、ＶＳはビニルスルホン官能基である。
【請求項２】
下記一般式を有する、請求項１に記載のチオ選択的放射性標識化剤。
【化１】
2016518311.tif 000016
式中、*Ｒは放射性同位体であり、
ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５であり、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ1およびＲ3は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように任意に置換されていてもよく、前記選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよく、
Ｒ5、Ｒ6は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ5およびＲ6は、任意に置換されていてもよい。
【請求項３】
下記一般式を有する、請求項２に記載のチオ選択的放射性標識化剤。
【化２】
2016518311.tif 000017
式中、*Ｒは放射性同位体であり、
ｎは、両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５である。
【請求項４】
*Ｒは18Ｆであり、ＬはトリペプチドＤＥＧである、請求項１に記載のチオ選択的放射性標識化剤。
【請求項５】
生物学的または生理学的に活性なリガンドに作用可能に付着した請求項１に記載の放射性標識化剤を含むイメージングトレーサー。
【請求項６】
下記式を有する、請求項５に記載のイメージングトレーサー。
【化３】
2016518311.tif 000018
式中、*Ｒは放射性同位体であり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロゲンおよびアリールからなる群より選択されてもよく、これらの各々は任意に置換されていてもよく、
Ａ1は、タンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびリガンドからなる群より選択され；
Ａ2は、Ｈ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびリガンドからなる群より選択され、
ここで、Ａ1およびＡ2はまとめて、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、または環状ポリペプチドを任意に形成していてもよい。
【請求項７】
Ａ1、Ａ2またはまとまったＡ1とＡ2のうち少なくとも１つが、ニューロテンシン、ニューロテンシン変異体、チオール化ニューロテンシンまたはチオール化ニューロテンシン変異体、他の安定化ニューロテンシン、多量体ニューロテンシン、ヘテロメリックニューロテンシンを含む、請求項６に記載のイメージングトレーサー。
【請求項８】
前記ニューロテンシン変異体が、ヘキサペプチド配列Ａｒｇ（８）−Ａｒｇ（９）−Ｐｒｏ（１０）−Ｔｙｒ（１１）−ＩＬＥ−（１２）−Ｌｅｕ（１３）と少なくとも５０％相同なペプチド配列を含み、さらに少なくとも１個の残基上に少なくとも１個のシステイン残基またはチオール基を含む、請求項７に記載のイメージングトレーサー。
【請求項９】
前記ニューロテンシン変異体がＣｙｓ−ｐｉｐＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐｉｐＡｍＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｔＢｕＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨであるか、または前記ニューロテンシン変異体と少なくとも５０％相同な配列である、請求項７に記載のイメージングトレーサー。
【請求項１０】
チオ選択的放射性標識化剤を調製するために有用な前駆体であって、下記一般式を有する前駆体。
【化４】
2016518311.tif 000019
式中、ＬＧは、放射性同位体、好ましくは18Ｆで選択的に置換されていてもよい官能基であり、
ｎは、両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５であり、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでさらに、Ｒ1およびＲ3は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように任意に置換されていてもよく、前記選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよく、
Ｒ5、Ｒ6は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ5およびＲ6は、任意に置換されていてもよい。
【請求項１１】
下記一般式を有する、請求項１０に記載の前駆体。
【化５】
2016518311.tif 000020
式中、ＬＧは、放射性同位体、好ましくは18Ｆで選択的に置換されていてもよい官能基であり、
ｎは、両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５であり、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立に、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでさらに、Ｒ1およびＲ3は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように任意に置換されていてもよく、前記選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよい。
【請求項１２】
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が水素であり、ｎ＝１である、請求項１１に記載の前駆体。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングの分野に関する。より具体的には、本発明はＰＥＴイメージングで使用するためのトレーサーおよび前記トレーサーを製造するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
陽電子放出体であるフッ素−１８は、その物理的特性および核特性により、低分子量の放射性トレーサーおよび放射性医薬品のための標識化生理活性ペプチドおよび低分子タンパク質の調製にとって理想的な放射性核種である。フッ素−１８は高い陽電子存在比で崩壊する（９９％）。炭素−１１、酸素−１５、および窒素−１３と比較すると、フッ素−１８の最も低い陽電子放出エネルギー（最大６３５ｋｅＶ）、組織中での最も短い陽電子直線飛程（２．３ｍｍ）はＰＥＴイメージングにおいて最も高い解像度を与える。その比較的長い半減期（１０９．８分）は多段階合成手法、数時間にわたる長時間のイメージングプロトコル、速度論研究および代謝産物解析を可能にする。
【０００３】
ほとんどすべての先行技術のフッ素−１８標識化試薬はアミノ官能基を介してペプチドまたはタンパク質にカップリングするように設計されている。たとえば、活性化エステルであるＮ−スクシンイミジル  ４−［18Ｆ］フルオロベンゾエート（18Ｆ−ＳＦＢ）は補欠分子族を導入してペプチドおよびタンパク質を標識化するための最も一般的な薬剤の１つである。これはアシル化反応によって行う（２−４）。18Ｆ−ＳＦＢに加えて、18Ｆで標識されたカルボン酸試薬およびアミノ試薬も知られている。しかし、これらは主に、ＰＥＴプローブの設計および合成においてではなく、対象の生体材料中のアミノ基およびカルボン酸基のコンジュゲーションに合わせて用いられている（５〜１０）。これらの先行技術の18Ｆ−標識化薬剤の主要な欠点の１つは、アミノ官能基およびカルボキシル官能基がタンパク質中のいたるところに存在し、それゆえ、選択的に標識化する可能性がないことである。
【０００４】
上記のことを考慮すると、対象のタンパク質またはペプチドを選択的に標識化することができる、新規な標識化方法および薬剤に対する必要性が依然として存在する。
【０００５】
発明の概要
したがって、本発明の１つの目的はＰＥＴトレーサーとして有用な化合物を放射性標識化するための化学選択的方法を提供することである。
【０００６】
また、本発明の目的はＰＥＴイメージングに使用するのに望ましい生理学的性質を有する新規なＰＥＴトレーサーを提供することである。
【０００７】
本発明の目的を考慮するに当たって、ほとんどのペプチドおよびタンパク質において、遊離チオール官能基はアミノおよびカルボン酸ほどありふれていないことが当技術分野で認識されている。したがって、チオール反応剤を用いて特定の部位でペプチドおよびタンパク質を修飾し、カルボキシレートおよびアミン反応性試薬と対照的に、高い化学選択性のある手段を提供してきた。１９８９年に、Ｓｈｉｕｅらは18Ｆ−標識化Ｎ−置換マレイミドをマイケル受容体として使用するチオール反応剤の開発を先導した。システインの位置でのＦａｂタンパク質（ウサギＩｇＧ由来）標識化のために、Ｎ−（ｐ−18Ｆ−フルオロフェニル）−マレイミドおよびｍ−マレイミド−Ｎ−（ｐ−18Ｆ−フルオロベンジル）−ベンズアミドが合成された（１１）。この研究に続いて、チオール選択的薬剤としての18Ｆ−標識化Ｎ−置換マレイミドに基づく３つの新規な手法が報告された。２００３年に、Ｔｏｙｏｋｕｎｉらはチオール反応剤としてＮ−［４−［（４−18Ｆ−フルオロベンジリデン）アミノオキシル］ブチル］マレイミド（18Ｆ−ＦＢＡＢＭ）（１２）（図１Ａ）を開発した。チオール含有トリペプチドであるグルタチオンを18Ｆ−ＦＢＡＢＭとコンジュゲートさせ、反応条件を最適化することなく、室温、１０分間で、約７０％の減衰補正した放射化学的収率（ＲＣＹ）をもたらした。２００５年に、ｄｅ  Ｂｒｕｉｎらは別の１８Ｆ−マレイミド剤、１−［３−（２−（18Ｆ−フルオロピリジン−３−イルオキシ）プロピル］ピロール−２，５−ジオン（18Ｆ−ＦｐｙＭＥ）（図１Ｂ）を報告した。18Ｆ−ＦｐｙＭＥ（１３）は［３−（３−Ｂｏｃ−アミノプロポキシ）ピリジン−２−イル］トリメチルアンモニウムトリフラートから出発する３連続工程で合成される。全反応時間は１１０分間以内であり、減衰補正したＲＣＹは２８〜３７％である。このチオール反応剤は２種の８ｋＤａのチオール含有タンパク質の標識化に応用され、６０〜７０％の単離収率（減衰補正なし）をもたらした。２００６年に、ＣａｉらはＮ−［２−（４−18Ｆ−フルオロベンズアミド）エチル］マレイミド（18Ｆ−ＦＢＥＭ）（図１Ｃ）を合成した。18Ｆ−ＦＢＥＭ（１４）は18Ｆ−ＳＦＢをＮ−（２−アミノエチル）マレイミドとカップリングさせることによって得られた。ＨＰＬＣ精製後に、このチオール反応剤をチオール含有ＲＧＤペプチドの単量体および二量体と室温で２０分間反応させた。ＲＧＤの単量体と二量体の両方について、減衰補正した総ＲＣＹは２０±４％（ｎ＝５）である。
【０００８】
上述した先行技術のチオール反応性標識化剤の当初の成功にもかかわらず、多段階標識化反応、複雑な手順、および比較的低い収率が、これらの薬剤の応用を制限してきた。よって、先行技術の放射性標識化チオール反応剤にはまだ大いに改善の余地がある。
【０００９】
先行技術の上記の難点を克服するために、本発明の発明者らは新規なタイプの試薬およびそれを製造する方法を含む、チオール反応剤を放射性標識化する新規な手法を発明した。
【００１０】
本発明の一態様はペプチドまたはタンパク質に存在するまたは導入した遊離チオール基を部位特異的に標識化するための18Ｆ標識化方法である。この新規な方法を使用してＮＴＲ１を標的とするＰＥＴイメージング剤を合成したところ、特異的な腫瘍集積および優れた腫瘍対バックグラウンドのコントラストを示した。高い腫瘍対主要臓器の集積比（腫瘍／腎臓を含む）は注射後早い時点で高コントラストのイメージをもたらす。正常組織における非常に低いバックグラウンドは、ＰＥＴイメージング18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴによる非常に小さい腫瘍（とりわけ腹部における）の検出を可能にするはずである。
【００１１】
よって、本発明の一態様は、標的化合物を化学選択的に標識化することができる、新規な種類の放射性標識化剤を対象とする。本発明のこの態様による放射性標識化剤は一般的に、ビニルスルホン官能基および放射性標識化同位体を含み、一般式*Ｒ−Ｌ−ＶＳを有する。式中、*Ｒは放射性同位体であり、Ｌは連結基であり、ＶＳはビニルスルホン官能基を表す。
【００１２】
*Ｒ放射性同位体はこの分野で公知の任意の好適な放射性同位体でよい。代表的な放射性同位体はＩ、Ｃ、Ｆ、Ｂｒであろうが、これらに限定されない。１つの好ましい実施形態において、放射性同位体は18Ｆである。この好ましい実施形態をここでは18Ｆビニルスルホンまたは18Ｆ−ＶＳともいう。
【００１３】
連結基Ｌはビニルスルホン官能基およびＲ*放射性標識化を受け入れることができる官能基部分を有する任意の好適な分子足場でよい。代表的な連結基は芳香族、脂肪族、ＰＥＧ、ヘテロ原子を含有するリンカーから選択してもよいが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明の別の態様はタンパク質またはペプチドを放射性標識で選択的に標識化する方法を対象とする。本発明のこの態様による方法は一般的に、標的タンパク質またはペプチドに上述したようにビニルスルホン放射性標識化剤を付着させる工程を含むものとする。いくつかの実施形態では、放射性標識化剤を準備するまたは合成する工程を付着工程の直前に行うであろう。当業者であれば準備するまたは合成する工程前の期間が使用する特定の*Ｒ標識の半減期によって制限されうることを容易に認識するであろう。より短い有用な半減期を有する放射性標識を用いれば、合成と*Ｒ−ＶＳ標識化剤の標的タンパク質／ペプチドへの付着およびその最終使用との間の時間差が短くなるであろう。このような例では、放射性基の付着を、標識化タンパク質／ペプチドの使用に先立つ短い時間内に行わなければならず、標識化方法を行うオンサイトシステムを必要とする。*Ｒ標識の半減期が長い他の例では、標的タンパク質／ペプチドの標識化を大量生産環境においてオフサイトで行い、得られた標識化タンパク質／ペプチドをパッケージした形式で運んでもよい。
【００１５】
上述したビニルスルホン標識化剤によって標識化するのに好適なタンパク質およびペプチドは一般的に、標識のビニルスルホン基と反応して安定な付着を形成することができる、少なくとも１個のシステイン残基または遊離チオ反応性官能基を含むものとする。いくつかの実施形態では、付着は共有結合性のチオ−エステル結合の形成による。他の実施形態では、付着は非共有結合によるであろう。好ましくは、標的タンパク質／ペプチドは１〜１０個の遊離チオール反応性基および／またはシステイン残基を有する。より好ましくは、標的タンパク質／ペプチドは、生物学的機能たとえば酵素の基質またはある種の発症経路に関与する構造要素も有する。好ましい実施形態では、標的タンパク質／ペプチドはニューロテンシンもしくはその変異体、またはチオール化ニューロテンシン変異体、他の安定化ニューロテンシン、多量体ニューロテンシン、他のリガンドを有するヘテロメリックニューロテンシンである。より好ましい実施形態では、標識化放射性同位体は18Ｆである。さらにより好ましくは、放射性標識化剤は18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳであり、標的とするペプチドはニューロテンシンである（すなわち、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ）。このような放射性標識化タンパク質またはペプチドはイメージング法たとえば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）におけるトレーサーとして有用であろう。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は上述した本発明の新規トレーサーを利用してＰＥＴイメージングを行う方法を対象とする。
【００１７】
本発明のこの態様による方法は一般的に、被験者に有効量の18Ｆ−ＶＳ標識化トレーサー化合物を投与する工程と、ＰＥＴイメージング機器を用いて対象の施設で被験者をイメージングする工程とを含むものとする。
【００１８】
トレーサー化合物を投与する方法はこの分野で一般に知られており、静脈注射、経口投与、またはこの分野で知られている任意の他の様式を含むであろうが、これらに限定されない。
【００１９】
18Ｆビニルスルホンは１８Ｆで標識されたマレイミドに優る、少なくとも以下の利点を有する。１）18Ｆビニルスルホンを得るための一段階18Ｆ−フッ素化前駆体；２）チオールのビニルスルホンとの反応の生成物は、２つの可能性のある立体異性体を生成するマレイミドとのコンジュゲーションと異なり、単一の立体異性体構造を与える；および３）これらのビニルスルホン基は、中性のｐＨで加水分解を受けない（１５）ので、水溶液中で長期間安定である。よって、これらは、水性緩衝液条件で使用したときであっても、チオールを含有するタンパク質または他の分子に対して優れた結合能を保持する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は上述した放射性トレーサーを利用して生物学的または生理学的プロセスをイメージングするためのシステムおよび装置を対象とする。図７は本発明のこの態様によるシステム／装置の代表的な概略図を示す。本発明のこの態様による実施形態は従来の自動化もしくは半自動化ボックス、マイクロ波反応器、またはマイクロ流体反応器、またはそれらの等価物を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および添付の図面から、ならびに添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１は本発明の実施形態による１８Ｆ標識化化合物の代表的な合成スキームおよびＨＰＬＣプロファイルを示す。（Ａ）Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの合成スキーム。
【図１Ｂ−１Ｃ】図１は本発明の実施形態による１８Ｆ標識化化合物の代表的な合成スキームおよびＨＰＬＣプロファイルを示す。（Ｂ）18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの粗反応のＨＰＬＣプロファイル。（Ｃ）濃縮した18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳのＨＰＬＣプロファイル。
【図２Ａ】（Ａ）Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）およびＦ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＫ）の化学構造。
【図２Ｂ】（Ｂ）19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）、19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＫ）、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳとｃ（ＲＧＤｙＣ）／ｃ（ＲＧＤｙＫ）（放射性）との粗反応のＨＰＬＣプロファイル、およびラジオＨＰＬＣ（ＵＶ）による標準の19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）。
【図３Ａ−３Ｂ】図３は本発明の実施形態による代表的な放射性合成スキームを示す。（Ａ）18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの放射性合成スキーム。（Ｂ）19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳとＮＴとの粗反応のＨＰＬＣプロファイル。
【図３Ｃ】図３は本発明の実施形態による代表的な放射性合成スキームを示す。（Ｃ）18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ（放射性）、19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ（ＵＶ）、および（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴ（ＵＶ）のＨＰＬＣプロファイル。
【図４】図４は本発明の実施形態による競合結合アッセイの代表的な結果を示す。ＨＴ−２９細胞における125Ｉ−ＮＴ（８〜１３）と19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴまたはＮＴ（８〜１３）との競合結合アッセイ。データは平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。Ｘ軸は非放射性標識競合物質の濃度を表す。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよびＮＴ（８〜１３）についてのＩＣ50値はそれぞれ、２．０３±０．２２、２．１２±０．２６ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【図５】（Ａ）非放射性標識ＮＴ（８〜１３）を含まない３．７ＭＢｑの18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの注射後（上）、非放射性標識ＮＴ（８〜１３）を含む３．７ＭＢｑの18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの注射後（中央）、および３．７ＭＢｑの18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの注射後（下）の、ＨＴ−２９異種移植片をもつマウスの代表的なコロナルマイクロＰＥＴイメージ；（Ｂ）ＨＴ−２９異種移植片をもつマウスにおける注射２時間後の18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの生体内分布。
【図６】図６は尿、腫瘍、腎臓、および肝臓中での18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの代謝安定性を示す。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの保持時間はそれぞれ、１８．５分および１９．０分であった。
【図７】図７は本発明のこの態様によるシステム／装置の代表的な概略図を示す。
【図８】１×ＰＢＳ中３７℃で５時間インキュベーション後の18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのラジオＨＰＬＣトレース。
【図９】18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ＮＴの放射性合成スキームおよび対応するラジオＨＰＬＣトレース。
【図１０】18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）標準および尿中での代謝安定性のラジオＨＰＬＣプロファイル。
【図１１】（Ａ）18Ｆ−ＦＢＥＭの放射性合成スキーム；（Ｂ）18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）および18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの化学構造。
【図１２】18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）標準および尿中での代謝安定性のラジオＨＰＬＣプロファイル。
【図１３】（Ａ）18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18ＦＢＥＭ−ＮＴの注射２時間後の、ＨＴ−２９腫瘍をもつマウスの２次元投影マイクロＰＥＴイメージ（矢印はＨＴ２９腫瘍を示す）；（Ｂ）18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18ＦＢＥＭ−ＮＴの注射後の、腫瘍、腎臓、肝臓、および筋肉の時間放射能曲線。
【００２３】
詳細な説明
定義
別段に定義しない限り、ここで使用するすべての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本文書が統制するものとする。ここで挙げたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照によりその全体が組み込まれている。ここで開示した材料、方法および例は例示に過ぎず、限定的であることを意図していない。
【００２４】
ここで使用する限り、用語「アミノ酸」は、１つ以上の開放原子価を有する、ＤまたはＬ型の天然アミノ酸残基（たとえば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）ならびに非天然アミノ酸（たとえば、ホスホセリン；ホスホスレオニン；ホスホチロシン；ヒドロキシプロリン；γ−カルボキシグルタマート；馬尿酸；オクタヒドロインドール−２−カルボン酸；スタチン；１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；ペニシラミン；オルニチン；シトルリン；ａ−メチル−アラニン；パラ−ベンゾイルフェニルアラニン；フェニルグリシン；プロパルギルグリシン；サルコシン；およびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）残基である。この用語はアミノ保護基（たとえば、アセチル、アシル、トリフルオロアセチル、またはベンジルオキシカルボニル）をもつ天然および非天然アミノ酸、ならびにカルボキシで保護基（たとえば、（Ｃ1  Ｃ6）アルキル、フェニルもしくはベンジルエステルまたはアミドのような）によって保護された天然および非天然アミノ酸も含む。他の好適なアミノおよびカルボキシ保護基は当業者に公知である（たとえば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｗｉｌｅｙ：ニューヨーク、１９８１；Ｄ．Ｖｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ：ニューヨーク、１９９０；Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（第３版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：ニューヨーク、１９７５；Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、（第２版）、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ：ニューヨーク、１９７７；Ｆ．ＣａｒｅｙおよびＲ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（第２版）、Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク、１９７７；およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい）。本発明によれば、アミノまたはカルボキシ保護基は放射性核種（たとえば、フッ素−１８、ヨウ素−１２３、またはヨウ素−１２４）を含んでいてもよい。
【００２５】
ここで使用する限り、用語「ペプチド」は２〜２５個のアミノ酸（たとえばここで上に定義したような）の配列または１つ以上の複数の開放原子価を有するペプチド残基である。配列は直鎖状であっても環状であってもよい。たとえば、環状ペプチドは配列中の２個のシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成によって調製することもできるし、または結果として生じてもよい。ペプチドはカルボキシ末端、アミノ末端を通して、または任意の他の好都合な付着点、たとえば、システインのイオウなどを通して連結することができる。ペプチド誘導体は米国特許第４，６１２，３０２号；第４，８５３，３７１号；および第４，６８４，６２０号に開示されるように調製することができる。ここに具体的に挙げたペプチド配列は、左側をミノ末端、右側をカルボキシ末端にして書いている。
【００２６】
用語「ポリペプチド」はペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の単一鎖からなる生体高分子化合物をいう。用語「タンパク質」は、ここで使用する限り、用語「ポリペプチド」と同義であっても、それに加えて２つ以上のポリペプチドの複合体をいうこともある。
【００２７】
「タンパク質」は１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は非ペプチド性構成成分、たとえば炭水化物基も含んでいてもよい。炭水化物および他の非ペプチド性置換基はタンパク質が産生される細胞によってそのタンパク質に付加されてもよく、それは細胞の種類によって変わるであろう。タンパク質はここではそのアミノ酸骨格構造によって定義する；置換基たとえば炭水化物基は一般的には特定しないが、にもかかわらず存在していてもよい。
【００２８】
用語「相同性（％）」はここでは用語「同一性（％）」と互換的に使用し、配列アラインメントプログラムを使用して整列させたときの、２つ以上の整列した配列間の、核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルをいう。たとえば、７０％相同性は定義されたアルゴリズムによって判定された７０％配列同一性と同じことを意味し、したがって所定の配列の同族体は所定の配列の全長にわたって８０％より大きい配列同一性を有する。代表的なレベルの配列同一性は、ここで記載する限り、所定の配列、たとえばラクトフェリンをコードする配列に対して、８０、８５、９０または９５％以上の配列同一性を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
ここで使用する限り、用語「アプタマー」は特異的な標的分子と結合するオリゴ核酸またはオリゴペプチド分子、たとえば、標的分子に特異的に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡアプタマーまたはＤＮＡアプタマーをいう。
【００３０】
ここで使用する限り、用語「オリゴヌクレオチド」は短い一本鎖のポリヌクレオチド鎖をいう。オリゴヌクレオチドは通常２００残基長未満（たとえば、１５〜１００）であるが、ここで使用する限り、この用語はより長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図している。オリゴヌクレオチドはその長さで呼ばれることが多い。たとえば２４残基のオリゴヌクレオチドは「２４−ｍｅｒ」という。オリゴヌクレオチドは自己ハイブリダイズするまたは他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって二次および三次構造を形成しうる。このような構造は二本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲型、および三本鎖を含むことができるが、これらに限定されない。
【００３１】
ここで使用する用語「アルキル」はＣ1〜Ｃ10の直鎖または分枝鎖アルキル、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ネオ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどを意味する。
【００３２】
用語「アルケニル」は少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する分枝または非分枝炭化水素をいう。用語「Ｃ２〜７−アルケニル」は２〜７個の炭素原子を有し少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素をいう。
【００３３】
ここで使用する用語「アリール」は単環または縮合環の芳香族炭化水素を意味する。アリールの例はフェニル、ナフチルなどである。
【００３４】
ここで使用する用語「ヘテロアリール」は、窒素、酸素およびイオウ原子からなる群より選択される１個以上のヘテロ原子を環中に含有し、炭素環または他の複素環と任意の可能な位置で縮合していてもよい、５〜６員の芳香族複素環基を意味する。
【００３５】
用語「シクロアルキル」はここではシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどによって代表されるＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをいう。
【００３６】
本発明の一態様は、標的化合物を化学選択的に標識化することができる、新規な種類の放射性標識化剤を対象とする。本発明のこの態様による放射性標識化剤は一般的に、ビニルスルホン官能基および標識化放射性同位体を含むものとし、下記一般式を有するように概略的に表されるであろう。
【００３７】
*Ｒ−Ｌ−ＶＳ
式中、*Ｒは放射性同位体、Ｌは連結基、およびＶＳはビニルスルホン官能基を表す。
【００３８】
*Ｒ放射性同位体はこの分野で公知の任意の好適な放射性同位体でよく、好ましくは医用イメージング用途に関連する有用な放射性同位体でよい。代表的な放射性同位体は、Ｉ、Ｃ、Ｆ、Ｂｒの放射性同位体を含むが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、放射性同位体は18Ｆである。この好ましい実施形態をここでは18Ｆビニルスルホンまたは18Ｆ−ＶＳともいう。
【００３９】
連結基Ｌはビニルスルホン官能基および*Ｒ放射性標識を受け入れることができる官能基部分を有する任意の好適な分子足場でよい。代表的な連結基は芳香族、脂肪族、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヘテロ原子を含有するリンカーからなる群より選択してもよいが、これらに限定されない。
【００４０】
好ましい実施形態では、連結基は下記一般式を有するＰＥＧをベースとする。
【化１】
2016518311.tif 000003
【００４１】
式中、ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５である。
【００４２】
本発明に関する連結基として有用なＰＥＧの具体例は以下である。
【化２】
2016518311.tif 000004
【００４３】
ここでジエチレングリコールをＤＥＧという。
【００４４】
連結基に使用する場合、ＰＥＧ化合物は、選択的に放射性標識されていてもよい官能基、ＬＧを含むように修飾され、下記一般式を有する。
【化３】
2016518311.tif 000005
【００４５】
式中、ＬＧは放射性同位体、好ましくは18Ｆで選択的に置換されていてもよい官能基であり、
式中、ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５である。
【００４６】
たとえば、選択したＰＥＧを４−ニトロベンゼンスルホニルクロリドと反応させて下記一般式の４−ニトロベンゼンスルホナートを生じさせてもよい。
【化４】
2016518311.tif 000006
【００４７】
式中、ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５である。
【００４８】
ここでは、選択した官能基ＬＧは４−ニトロベンゼンスルホニル基であるが、官能基ＬＧ１の同一性は特に限定されず、ここで開示した指針を使用して、選択した連結基および放射性標識に従って選択してもよい。
【００４９】
本発明に関連して有用な好適なビニルスルホンは下記一般構造を有する。
【化５】
2016518311.tif 000007
【００５０】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ1およびＲ2は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように、任意に置換されていてもよい。選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよい。
【００５１】
Ｒ4はアルケニル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択され、これらの各々は任意に置換されていてもよい。
【００５２】
さらに、Ｒ4およびＲ3は、３〜８員環（両端値を含む）を有するチオ複素環式環系を生成するために、任意に置換されていてもよい。
【００５３】
好ましい実施形態では、ビニルスルホンは下記の構造を有する。
【化６】
2016518311.tif 000008
【００５４】
式中、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ1およびＲ2は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように、任意に置換されていてもよく、
Ｒ5、Ｒ6は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ5およびＲ6は任意に置換されていてもよい。
【００５５】
より具体的には、好ましいビニルスルホンは下記の構造を有する。
【化７】
2016518311.tif 000009
【００５６】
本発明に関して有用な他の代表的なビニルスルホンは以下を含む。
【化８】
2016518311.tif 000010
【００５７】
次いで、一般的に官能基ＬＧ１を含むリンカーをコンジュゲートさせてＬ−ＶＳコンジュゲートを形成してもよい。Ｌ−ＶＳコンジュゲートの好ましい実施形態は、下記一般式を有する。
【化９】
2016518311.tif 000011
【００５８】
式中、ＬＧは放射性同位体、好ましくは18Ｆで選択的に置換されていてもよい官能基であり、
式中、ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５であり、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ1およびＲ3は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように、任意に置換されていてもよい。選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、
Ｒ5、Ｒ6は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ5およびＲ6は任意に置換されていてもよい。
【００５９】
続いて、Ｌ−ＶＳコンジュゲートを放射性標識化して下記一般式を有する組成物を得てもよい。
【化１０】
2016518311.tif 000012
【００６０】
式中、*Ｒは放射性同位体であり、
ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５であり、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ1およびＲ3は、Ｃ3〜Ｃ8環状不飽和環を形成するように、任意に置換されていてもよく、選択されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、
Ｒ5、Ｒ6は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。さらに、Ｒ5およびＲ6は任意に置換されていてもよい。
【００６１】
好ましい実施形態では、Ｒ5およびＲ6は水素である。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、およびＲ6はすべて水素である。
【００６３】
より好ましくは、Ｌ−ＶＳコンジュゲートは下記一般式を有する。
【化１１】
2016518311.tif 000013
【００６４】
式中、*Ｒは放射性同位体であり、
ｎは両端値を含む１〜２０、好ましくは両端値を含む１〜１０、より好ましくは両端値を含む１〜５である。
【００６５】
本発明の別の態様は、生体分子Ａ、たとえばタンパク質またはポリペプチドを放射性標識で選択的に標識化するための方法、ならびに得られた放射性標識生体分子を対象とする。得られた放射性標識生体分子の一般構造は下記一般式によって概略的に表すことができる。
【００６６】
*Ｒ−Ｌ−ＶＳ
式中、*Ｒ、Ｌ、およびＶＳは上で定義した通りであり、Ａはタンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、および他のリガンドからなる群より選択される。好適なタンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはリガンドは一般的に、標識のビニルスルホン基と反応して安定な付着を形成することができる少なくとも１個のシステイン残基または遊離チオ反応性官能基を含むまたは含むように修飾されているものとする。いくつかの実施形態では、付着は共有結合性のチオ−エステル結合の形成を介する。他の実施形態では、付着は非共有結合を介してもよい。好ましくは、生体分子Ａ、好ましくはタンパク質またはペプチドは１〜１０個の遊離チオール反応性基および／またはシステイン残基を有する。より好ましくは、標的タンパク質／ペプチドは生物学的機能たとえば酵素基質またはある種の発症経路に関与する構造要素も有する。
【００６７】
好ましい実施形態では、標的タンパク質／ペプチドはニューロテンシンもしくはその変異体、またはチオール化ニューロテンシン変異体、他の安定化ニューロテンシン、多量体ニューロテンシン、他のリガンドを有するヘテロメリックニューロテンシンである。ニューロテンシンは１３アミノ酸の神経ペプチドである。ヒトのニューロテンシンはアミノ酸配列ＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬを有する。Ｇタンパク質共役型受容体は同一のＣ末端を認識し、８〜１３番目のヘキサペプチド配列、Ａｒｇ（８）−Ａｒｇ（９）−Ｐｒｏ（１０）−Ｔｙｒ（１１）−ＩＬＥ−（１２）−Ｌｅｕ（１３）を認識することがわかっている。本発明のニューロテンシン変異体は一般的に、この８〜１３ヘキサペプチド配列を含むか、システイン残基もしくはチオール基を含むまたはシステイン／チオール残基を含むように修飾されたその変異体を含む。好ましいニューロテンシン類似体の１つは、Ｃｙｓ−ｐｉｐＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐｉｐＡｍＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｔＢｕＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨである。ニューロテンシン類似体の正確な配列は、それが十分なニューロテンシン活性を維持し、少なくとも１個のシステイン残基もしくは他のチオール含有基を含有するまたは含有するように修飾されている限り、特に限定されない。好ましくは、ニューロテンシン類似体は、あらゆる付加されたシステイン残基を除外し、８〜１３ヘキサペプチド配列Ａｒｇ（８）−Ａｒｇ（９）−Ｐｒｏ（１０）−Ｔｙｒ（１１）−ＩＬＥ−（１２）−Ｌｅｕ（１３）と少なくとも５０％相同である。
【００６８】
好ましい実施形態では、*Ｒ−ＰＥＧ−ＶＳ−Ａ化合物は下記式の構造を有する。
【化１２】
2016518311.tif 000014
【００６９】
式中、*Ｒは放射性核種であり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9は独立にＨ、アルキル、シクロアルキル、ハロゲンおよびアリールからなる群より選択されてもよく、これらの各々は任意に置換されていてもよく、
Ａ１はタンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびリガンドからなる群より選択され；
Ａ2はＨ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびリガンドからなる群より選択され、
ここで、Ａ1およびＡ2はまとめて、ポリペプチドまたは環状ポリペプチドを任意に形成していてもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、標識化放射性同位体、*Ｒは18Ｆであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9はすべて水素であり、まとまったＡ2およびＡ1はニューロテンシンまたはニューロテンシン変異体である。
【００７１】
さらにより好ましくは、放射性標識化剤は18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳであり、標的とするペプチドはニューロテンシンである（すなわち、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ）。このような放射性標識化タンパク質またはペプチドは、イメージング法たとえば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）におけるトレーサーとして有用であろう。
【００７２】
本発明のこの態様による方法は一般的に、標的タンパク質またはペプチドを、上で述べたビニルスルホン放射性標識化剤により付着させる工程を含むものとする。いくつかの実施形態では、放射性標識化剤を用意するまたは合成する工程を付着工程の直前に行ってもよい。当業者であれば、用意するまたは合成する工程前の期間が、使用される特定の*Ｒ標識の半減期によって制限されるかもしれないことを容易に認識するであろう。有用な半減期がより短い放射性標識を用いれば、合成と、*Ｒ−ＶＳ標識化剤の標的タンパク質／ペプチドへの付着およびその最終使用との間の時間差が短くなり得る。このような場合には、放射性基の付着は標識化タンパク質／ペプチドの使用に先立つ短い時間内に行わなければならず、標識化方法を行うオンサイトシステムが必要になる。*Ｒ標識の半減期が長い他の場合には、標的タンパク質／ペプチドの標識化を大量生産状態においてオフサイトで行い、得られた標識化タンパク質／ペプチドをパッケージした形態で輸送してもよい。
【００７３】
本発明のさらに別の態様は上で述べた本発明の新規トレーサーを利用してＰＥＴイメージングを行う方法を対象とする。
【００７４】
本発明のこの態様による方法は一般的に、被験体に有効量の18Ｆ−ＶＳ標識化トレーサー化合物を投与する工程と；ＰＥＴイメージング機器を用いて目的の場所で被験体をイメージングする工程とを含むものとする。
【００７５】
トレーサー化合物を投与する方法はこの分野で一般に知られており、静脈注射、経口投与、またはこの分野で知られている任意の他の投与形態を含みうるが、これらに限定されない。
【００７６】
18Ｆビニルスルホンは１８Ｆ標識化マレイミドに優る、少なくとも以下の利点を有する：１）一段階18Ｆ−フッ素化前駆体で18Ｆビニルスルホンを実現する；２）２種の可能な立体異性体を生成するマレイミドとの接合と異なり、チオールのビニルスルホンとの反応の生成物は単一の立体異性体構造を生じる；および３）これらのビニルスルホン基は中性のｐＨで加水分解を受けないので、水溶液中において長期間安定である（１５）。よって、これらは、水性緩衝液条件で使用した場合でも、チオール含有タンパク質または他の分子に対して優れた結合能を保持する。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、上で述べた放射性トレーサーを利用することによって、生物学的または生理学的プロセスをイメージングするためのシステムおよび装置を対象とする。図７は本発明のこの態様によるシステム／装置の代表的な概略図を示す。本発明のこの態様による実施形態は従来の自動化もしくは半自動化ボックス、マイクロ波反応器、またはマイクロ流体反応器、またはそれらの等価物を含んでいてもよい。
【００７８】
いくつかの結果の簡単な説明
化学合成
図１に示すように、Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ前駆体、［２−（２−（２−（ビニルスルホニル）エトキシ）エトキシ）エチル４−ニトロベンゼンスルホナート（２）］を９５％超の収率で合成し、ＴＢＡＦとの反応によって19Ｆ−フッ素化した。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳを反応条件および18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳコンジュゲートのＨＰＬＣ位置の化学標準として使用した。
【００７９】
我々はまず、19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳとｃＲＧＤｙＣ（遊離ＳＨ基を有する）およびｃＲＧＤｙＫ（遊離−ＮＨ2基を有する）ペプチドとの低温反応を評価した（図２Ａ参照）。ｃＲＧＤｙＣとｃＲＧＤｙＫは両方とも19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳと反応したが、ｃＲＧＤｙＣの場合のｐＨ７．０および３０分のインキュベーションと比較して、ｃＲＧＤｙＫは一晩インキュベートした後、８．５より高いｐＨでのみ反応した（図２Ｂ）。
【００８０】
チオール化ＮＴも19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳと効率的に反応した。しかし、高いｐＨ（たとえば、ｐＨ９．０）で反応を行った場合には、我々のＮＴ類似体に存在する１個のチオール基および１個のアミン基との反応のために、２種の生成物［19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴ］（図３Ａおよび３Ｂ）が得られた。
【００８１】
放射化学
ＶＳ−シントンの18Ｆ標識化を種々の溶媒、濃度および温度条件で試験した。代表的な結果を表１に示す。１０ｍｇの前駆体量では、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの放射性標識化収率は、ＨＰＬＣの積分値に基づいて９０％収率と計算された。前駆体量のさらなる増加は収率を９５％までわずかに増加させたにすぎない（表１参照）。粗標識化反応物の代表的なラジオＨＰＬＣトレースを図１Ｂに示す。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳは良好なｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示し、放射化学的純度はＰＢＳ中でのインキュベーション後の４時間の後ＨＰＬＣ精製でも依然として９９％より高かった（図２Ｃ）。
【００８２】
18Ｆ-反応について、我々は等モル量のｃＲＧＤｙＣおよびｃＲＧＤｙＫを18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳとともに同一の反応器内でインキュベートした。この場合、我々はｃＲＧＤｙＣと18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳとの生成物を観察したにすぎない（図２Ｂ）。ｃＲＧＤｙＫ／18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳからの生成物が存在しないことは、この反応のアミノ基よりもチオール基への選択性を示していた。このように高いｐＨであっても、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳは遊離アミノ基の存在下でチオール基を選択的に標識化した。
【００８３】
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳはチオール化ＮＴとも効率的に反応した。19Ｆ−合成で見られた（Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴ副生成物は、ＨＬＰＣによって示されるように、放射性標識化反応では観察されなかった（図３Ｃ）。１８Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの放射化学的純度はＰＢＳ中でのインキュベーション後の５時間の後ＨＰＬＣ精製でも依然として９５％より高かった。１８Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳをチオール特異的マレイミド系試薬と比較するために、１８Ｆ−ＦＢＥＭも調製し、ｃ（ＲＧＤｙＣ）およびチオール化ＮＴとそれぞれ効率的に反応することを示した（図１１）。
【００８４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合親和性
我々は、競合細胞結合アッセイを使用して、19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの受容体−結合親和性をＮＴ（８〜１３）のそれと比較した（図４）。両方のペプチドとも125Ｉ−ＮＴ（８〜１３）のＮＴＲ１陽性ＨＴ−２９細胞への結合を用量依存的に抑制した。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのＩＣ50値（２．０３±０．２２ｎｍｏｌ／Ｌ）はＮＴ（８〜１３）のそれ（２．１２±０．２６ｎｍｏｌ／Ｌ）に匹敵していた。この結果は、Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴが、ＮＴ（８〜１３）に類似した、ＮＴＲ１へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体−結合親和性を有することをはっきりと示していた。
【００８５】
生体内分布およびマイクロＰＥＴイメージング
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのニューロテンシン受容体１（ＮＴＲ１）標的化効力を、ＨＴ−２９異種移植片（ＮＴＲ１陽性）において、複数の時点で（注射０．５、１、および２時間後）マイクロＰＥＴにより評価した。図５Ａに示した通りである。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの場合、ＨＴ−２９腫瘍は高い腫瘍対バックグラウンドのコントラストで明瞭に可視化され、腫瘍集積は、それぞれ注射０．５、１、および２時間後で、１．３０±０．１７、０．９６±０．２９、および０．６３±０．２０％ＩＤ／ｇであった。比較すると、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴも顕著な腫瘍集積を示したが（０．１３±０．０８％ＩＤ／ｇ）、注射２時間後に18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの場合に観察されたより優位に（ｐ＝０．０１７）低かった。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの肝臓および腎臓集積は、注射２時間後でそれぞれ、０．２８±０．０３％ＩＤ／ｇおよび０．６４±０．０２％ＩＤ／ｇであった。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴと比較すると、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは優れた腫瘍対バックグラウンドのコントラストおよび低い腹部バックグラウンドを示した（図１３）。
【００８６】
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのＮＴＲ１特異性を、放射性トレーサーを過剰な非標識ＮＴ（８〜１３）と混注する阻止試験によって確認した。図５Ａからわかるように、非標識ＮＴ（８〜１３）の存在下で、ＮＴＲ１腫瘍集積（それぞれ、注射０．５、１、および２時間後に０．４７、０．１５および０．０４％ＩＤ／ｇ）は、すべての時点で、ＮＴ（８〜１３）阻止がない場合よりも有意に（ｐ＜０．０１）低かった。腎臓集積は、注射０．５時間後での６．８２±２．９０％ＩＤ／ｇから注射２時間後での０．１７±０．０１％ＩＤ／ｇへ急速に減少した。イメージング解析に基づくと、腫瘍対腎臓比、腫瘍対肝臓比、および腫瘍対筋肉比は、それぞれ、注射２時間後で３．６９±１．５０、１０．３３±４．０１、および２７．１２±５．４６であった。注射２時間後に、腫瘍は、腎臓、肝臓および筋肉でのものより有意に高い集積を示した。心臓および肺を含む他の臓器は、注射２時間後まで実質的にバックグラウンドレベルにあった。
【００８７】
マイクロＰＥＴ試験に加えて、我々は、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの注射２時間後の、別の群のＨＴ−２９腫瘍保有マウスを使用して生体内分布試験も行った。図５Ｂに示す通りである。腫瘍および腎臓集積はそれぞれ、０．８６±０．０９％ＩＤ／ｇおよび０．４６±０．０５％ＩＤ／ｇであった。注射２時間後に、腫瘍は腎臓、肝臓および筋肉でのものより有意に高い集積を示した（図５Ｂ）。心臓および肺を含む他の臓器は、注射２時間後まで実質的にバックグラウンドレベルにあった。
【００８８】
代謝安定性試験
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの代謝安定性を、注射１時間後に、マウスの尿、ならびに肝臓、腎臓、およびＨＴ−２９腫瘍ホモジネートで判定した。ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。無処理の18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの保持時間は１８．５０分であった。腫瘍の場合には主代謝産物のピークが約２０分に見出され、尿、腎臓および肝臓試料の場合には２種の主代謝産物のピークが１３〜１５分および１７分に見出された。試験を通して有意な脱フッ素は観察されなかった。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの代謝安定性も試験した。無処理の18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの保持時間は１９．０２分であった。腫瘍、腎臓および肝臓の場合、１５から２１分の間の複数のピークのほかに、約５分に大きなピークがあった。我々は18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）および18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）も合成し、それらの尿代謝産物を解析した。不安定なＮＴペプチドとは異なり、ｃ（ＲＧＤｙＣ）はｉｎ  ｖｉｖｏで安定である。したがって、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）は、尿中に排出された無処理の標識化ペプチドに対応する単一のピークを示した（図１０）。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）も大きいピーク、および別のピークを示した（図１２）。
【００８９】
本発明のいくつかの態様の簡単な検討
累積的な証拠が、ニューロテンシン受容体は癌の増殖および生存に重要な役割を果たしていることを示唆している（１６、１９）。実際に、ＮＴＲはヒトの膵癌、乳癌、頭頚部癌、前立腺癌および非小細胞肺癌に対する有望なマーカーとして提案されてきた（１９〜２８）。
【００９０】
したがって、個々の腫瘍のＮＴＲ発現プロファイルすなわち「フィンガープリント」を得る造影剤の開発は、癌患者に対して効率的な早期診断およびカスタマイズされた治療オプションをもたらし得るであろう。ニューロテンシン、ＮＴＲに対するトリデカペプチドリガンドは、内在性ペプチダーゼによって血漿中で速やかに代謝される。ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を向上させるために、種々のＮＴ類似体が開発されてきた。たとえば、ニューロテンシン受容体陽性腫瘍のイメージングと療法の両方にとって貴重なツールとして、多くの放射性標識ニューロテンシン類似体が最近開発された（２９〜３５）。これらの初期の研究において有望な結果が得られているけれども、比較的高い腎臓集積および最適以下の腫瘍対組織のコントラストが、とりわけ放射性標識の選択におけるこれらの薬剤のさらなる改善を正当化している。以前、我々は64Ｃｕを18Ｆに置換することによってペプチド系ＰＥＴプローブの薬物動態が有意に改善したことを示した（３６、３７）。実際に、汎用のＰＥＴ放射性同位体の１つとして、18Ｆは医療用サイクロトロンにおいて多量に容易に生成することもでき、イメージング用途に理想的な１１０分の半減期を伴う（１）。したがって、我々は多大な努力を充てて、ＮＴＲ標的イメージングのための18Ｆ−標識化ＰＥＴプローブを開発した。
【００９１】
ペプチドおよびタンパク質中においてシステインはリジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基よりはるかに豊富でないため、これらの生体分子を部位選択的に修飾するためにチオール反応剤を用いてきた。以前に、いくつかのチオール反応性18Ｆ−シントンが報告されており、そのうちのほとんどが温和な条件下でのチオールのコンジュゲート付加のためにマレイミド基をもつ。しかし、ほとんどのチオール反応性シントンは多段階反応を必要とし、これは時間がかかり労働集約的になるであろう。
【００９２】
上の問題点を認めて、我々はビニルスルホンのマイケル付加反応性に基づくプラットフォーム技術の開発に着手した。ビニルスルホンの化学的性質は温和な条件下でのシステイン残基の選択的修飾に適していることが示されている（１５）。ビニルスルホン基の水安定性、副生成物の不在、チオールとの反応のほぼ定量的な収率、および形成されたチオエーテル結合の化学的安定性は、この反応を18Ｆ標識化のための魅力的な手法にする。
【００９３】
我々のＶＳ系補欠分子族は、親水性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの用途にとって非常に望ましい属性となるように設計された。標識化操作を単純化するために、初期の労力をＶＳの一段階放射性フッ素化に集中させた。放射性フッ素化反応を共沸的に乾燥させた［18Ｆ］−ＴＢＡＦを用いてＭｅＣＮ／ＤＭＳＯ中で行った。ＶＳ−シントンから対応する［18Ｆ］−ＤＥＧ−ＶＳへの転化はＶＳ−シントンの反応濃度および温度に強く依存することが見出された。最適化した条件下で、１５分以内に＞９０％の標識化収率を得ることができた。単離収率は３５±６％と確認された。
【００９４】
ＶＳは高いｐＨでは第一級アミンとも反応することがある（１５）ので、我々は温和な条件下でＶＳ−シントンの反応の選択性を調査することにした。ｃＲＧＤｙＫおよびｃＲＧＤｙＣは両方とも19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ試薬と効率的に反応するけれども、ｃＲＧＤｙＫははるかに反応性が低く、ｃＲＧＤｙＣの場合の３０分間のインキュベーションと比較して、一晩のインキュベーションおよびより高いｐＨを要した。しかし、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ試薬を使用すると、ｃＲＧＤｙＫとｃＲＧＤｙＣとの等モルの混合物中でｃＲＧＤｙＣのみが反応した。この結果は、ＳＨ官能基に対する18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの化学選択性をはっきりと示していた。
【００９５】
効率的な18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ標識化方法を確立した後、チオール化ニューロテンシンペプチドの18Ｆ標識化を行った。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは３５分間以内に９５％超の収率で得られ、放射化学的純度は９９％より高かった。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの比放射能を文献方法（３８）に基づいて判定し、その方法では最終生成物のＵＶ積分値を標準滴定曲線と比較し、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴについて１９．２±４．３ＴＢｑ／ｍｍｏｌの比放射能を得た。
【００９６】
ペプチドの化学修飾は受容体結合親和性を有意に減少させることがあるので、19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび非修飾ＮＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイを行った。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび非修飾ＮＴ（８〜１３）と類似のＩＣ50によって支持されているように、ＶＳ−シントンのコンジュゲーションによって誘導される親和性の減少は無視できた。ＮＴＲ１を高発現するようによく確立されている（１６）ＨＴ−２９異種移植モデルを使用して18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのイメージング品質をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは迅速な腎クリアランスを有していた。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは、注射３０分後に主として腎臓に蓄積し（６．８２±２．９０％ＩＤ／ｇ）、注射１時間後に１．１９±０．４９％ＩＤ／ｇ、注射２時間後に０．１７±０．０１％ＩＤ／ｇまで急速に減少した。すべての主要臓器で活性が速やかに低下したので、腫瘍／筋肉（２７．１２±４．５６）、腫瘍／肝臓（１０．３３±４．０１）および腫瘍／腎臓（３．６９±１．５０）を含む高い腫瘍対臓器比が注射２時間後に得られた。阻止試験では、非放射性ＮＴペプチドが18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの腫瘍集積をすべての時点で有意に（ｐ＜０．０１）抑制し（図５Ａ）、これはこの造影剤の受容体特異性をはっきりと示した。トレーサーの腹部への集積は極めて低いので、我々は生体内分布試験も行って、肝臓、腎臓、小腸、脾臓、胃および他の臓器または組織における集積をより正確に測定した。図５Ｂに示したように、これらの臓器における集積はバックグラウンドレベルに近く、これはマイクロＰＥＴスキャンから得た高コントラストの腫瘍イメージとよく相関している。すべての主要臓器で活性が速やかに低下したので、生体内分布試験によって計算された、腫瘍／筋肉（３０．６５±２２．３１）、腫瘍／肝臓（１１．８６±１．９８）および腫瘍／腎臓（１．９１±０．４３）を含む、注射２時間後の高い腫瘍対臓器比が得られた。ＮＴペプチドは２つの可能な反応部位を有するので、（Ａｃ）−ＮＴも合成し、これを18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳで効率的に標識化することができた。この新規薬剤が18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴに類似した腫瘍標的化能力を有するどうかを決定することが依然として必要である。
【００９７】
本発明の一態様は、ペプチドに対する新規なチオール特異的18Ｆ−放射性標識化方法および組成物の開発ならびにＰＥＴイメージングによるその評価であるが、新規に開発した標識化戦略の潜在的利点を示すために、既存のマレイミド系試薬との直接ｉｎ  ｖｉｖｏ比較を行った。したがって、イメージング品質および代謝安定性の直接比較のために、マレイミド系試薬、すなわち18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴも合成した。図１２に示したように、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴは５工程すなわちフッ素化、加水分解、カルボキシル基の活性化、マレイミド誘導体との反応、およびＣｙｓ−ＮＴとのコンジュゲーションを含む、より複雑な合成であった。それと比較して、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの合成は２工程すなわちシントンのフッ素化およびＣｙｓ−ＮＴへのコンジュゲーションを含むにすぎない。ＰＥＴイメージングに関して重要なことであるが、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴは18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴと比較して有意に高いバックグラウンドおよび低いコントラストを示した。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴと比較して、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴについて観察される低い腹部バックグラウンドおよび高い腫瘍集積が代謝の相違に起因するのかどうかを決定するために、代謝安定性試験を行った。図６に示したように、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴは両方ともｉｎ  ｖｉｖｏでいくつかの代謝産物を呈した。しかし、約５分における主代謝産物のピークは、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの場合ではなく、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの場合に見出された。それでも、人間および齧歯動物におけるＮＴの短い半減期のために（３９、４０）、上の実験のみに基づいて結論を導くことはできない。さらなる手法において、我々は、代謝的により安定なｃ（ＲＧＤｙＣ）ペプチドを両方のシントンでコンジュゲートし、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）および18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の尿代謝を試験した。図１０および１２に示したように、18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）は18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の場合には見られない尿中の別の代謝産物を有する。この実験は、我々のＶＳ系シントンがマレイミド系シントンよりもｉｎ  ｖｉｖｏでより安定であることを示唆している。よって、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ試験において観察された代謝産物は、シントン自体の分解ではなく、主にＮＴペプチドの分解によって生じたものであり得る。18Ｆ−ＦＢＥＭのようなマレイミド系シントンは文献の報告に基づくと不安定であると予想されるが、18Ｆイメージング試験のタイムスケール内では依然として良好に働くであろう。我々は、動物モデルにおいて18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴと比較して18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの優れたコントラストが観察されたが、ヒトでのＮＴＲ標的イメージングにこの薬剤を臨床転換を検討することを正当化する。
【００９８】
以下、添付の図面で図示した特定の代表的な実施形態を参照することによって、本発明を詳細に説明する。
【００９９】
例１
この実例において、我々はここで開示した特定の１８Ｆ−標識剤の１つ、１８Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳをどのようにして作製し使用するかを記載する。我々はバイオリガンドであるニューロテンシン（ＮＴ）中のフリーなチオール基への１８Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳのコンジュゲーションを示す。累積的な証拠が、ニューロテンシンレセプター（ＮＴＲ）は癌の増殖および生存に重要な役割を果たしていることを示唆しているので（１６，１７）、我々はチオール化ＮＴペプチドを用いてペプチド標識剤としての１８Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの可能性を示した。得られた１８Ｆ標識ＮＴ誘導体を、ＮＴＲ１陽性腫瘍をもつ齧歯動物モデルでのＰＥＴによってさらに評価した。
【０１００】
１．材料および方法
一般的事項
すべての市販の化学試薬はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、さらなる精製なしに使用した。ｃＲＧＤｙＣおよびｃＲＧＤｙＫはＰｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ（ルイビル、ＫＹ）から購入した。チオール化ニューロテンシンペプチド類似体はＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅペプチド合成コアによって標準的なＦＭＯＣ化学を使用して合成した。担体無添加18Ｆ−フッ化物は、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＲＤＳ−１１２陰イオンサイクロトロンを使用して、同位体的に濃縮された［18Ｏ］水ターゲット（濃縮度９５％、Ｉｓｏｎｉｃｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ）の１１−ＭｅＶ陽子によるボンバードメントによる18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆ反応を介して生成した。
【０１０１】
すべてのＨＰＬＣ条件はグラジエントである。ＨＰＬＣ法１：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５ミクロン）；流量１ｍＬ／分；ならびに溶出液グラジエント：０〜２分９５％溶媒Ａ［０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水］および５％溶媒Ｂ［０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ＭｅＣＮ）］；２〜７分９５〜８５％溶媒Ａおよび５〜１５％溶媒Ｂ；７〜２７分８５〜７０％溶媒Ａおよび１５〜３０％溶媒Ｂ。ＨＰＬＣ法２：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５ミクロン）；流量１ｍＬ／分；ならびに溶出液グラジエント：０〜２分９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂ；２〜２２分９５〜５％溶媒Ａおよび５〜９５％溶媒Ｂ。ＨＰＬＣ法３：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５ミクロン）；流量１ｍＬ／分；ならびに段階的グラジエントで溶出：０〜２分、９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂ；２〜３２分９５〜６５％溶媒Ａおよび５〜３５％溶媒Ｂ。すべての1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ）、室温で記録した。直径５ｍｍのチューブ内のＣＤＣｌ3、Ｄ2Ｏ溶液でスペクトルを得て、ＣＤＣｌ3（δＨ７．２６ｐｐｍ、またはδＣ７７．２ｐｐｍ）またはＤ2Ｏ（δＨ４．６５ｐｐｍ）の残留信号に対して、化学シフトをｐｐｍで見積もった。1ＨＮＭＲスペクトルにおける多重度は：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂ＝ブロードとして記載する。すべての生成物はＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ＬＴＱ−ＦＴ質量分析計での質量分析によって特性分析した。
【０１０２】
化学合成
２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル  ４−ニトロベンゼンスルホナート（化合物１）の合成。４−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（１２．５ｇ、５６．６ｍｍｏｌ）をジエチレングリコール（５ｇ、４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９ｍｌ、６６ｍｍｏｌ）を含む１５０ｍＬのジクロロメタンの溶液に添加した（図１Ａ）。反応混合物を室温で一晩撹拌し、水および塩水で洗浄した。溶媒を蒸発させた後、残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／エーテル、９：１）によって精製し、（１）（収率：２５〜３０％）を無色の固体として得た。1H-NMR(CDCl3):δ8.42(d, 2H), 8.15(d, 2H), 4.34(t, 2H), 3.75(t, 2H), 3.70(t, 2H), 5.56(t, 2H). 13C-NMR(CDCl3): 150.5(s), 141.9(s), 129.3(d), 124.5(d), 72.6(t), 70.3(t), 68.5(t), 61.7(t)。
【０１０３】
２−（２−（２−（ビニルスルホニル）エトキシ）エトキシ）エチル  ４−ニトロベンゼンスルホナート（化合物２）の合成。ｔ−ＢｕＯＫ（５０μＬ、５０％  ＭｅＯＨ中）を（１）（１ｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびジビニルスルホン（２．２ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を含む溶液に添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／エーテル、９：１）によって精製し、（２）（収率：７０〜８０％）を無色の固体として得た。1H-NMR(CDCl3):δ8.41(d, 2H), 8.13(d, 2H), 6.78(d, 1H), 6.41(d, 1H), 6.11(d, 1H), 4.29(t, 2H), 3.88(t, 2H), 3.72(t, 2H), 3.58(s, 4H), 3.24(t, 2H). 13C-NMR(CDCl3): 150.8(S), 141.8(S), 137.9(d), 129.3(d), 129.0(t), 124.5(d), 70.4(t), 68.5(t), 64.6(t), 54.9(t)。
【０１０４】
（２−（２−（２−フルオロエトキシ）エトキシ）エチルスルホニル）エタン（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ、化合物３）の合成。２−（２−（２−（ビニルスルホニル）エトキシ）エトキシ）エチル  ４−ニトロベンゼンスルホナート（１２ｍｇ、４１．２μｍｏｌ）を含む５０μＬのＤＭＳＯに３０μＬのＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ  ＴＢＡＦ）を添加し、７８℃で一晩反応させた。反応混合物をＨＰＬＣのＣ１８カラムで精製し、２．８ｍｇの（３）（収率：４１．３％）を黄色がかった液体として得た。生成物をＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＦＴ質量分析計によって特性分析した（［ＭＨ］+、Ｃ8Ｈ15ＦＯ4Ｓのｍ／ｚ  ２２７．０７、計算［ＭＨ］+  ２２７．０７）。1H-NMR(D2O):δ6.79(q, 1H), 6.32(d, 1H), 6.20(d, 1H), 4.57(t, 1H), 4.45(t, 1H), 3.84(t, 2H), 3.72( t, 1H), 3.61(m, 5H), 3.42(t, 2H)。
【０１０５】
19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＣの合成。ｃＲＧＤｙＣ（１ｍｇ（１．６８μｍｏｌ）を含む１００μのＬＨ2Ｏ）および19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（５００μｇ（２．２μｍｏｌ）を含む５μＬのＭｅＣＮおよび４５μＬのＨ2Ｏ）を９００μＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ条件：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム；流量を１ｍＬ／分に設定した；ならびに溶出液グラジエント：０〜２分９５％溶媒Ａ［０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水］および５％溶媒Ｂ［０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ＭｅＣＮ）］；２〜７分９５〜８５％溶媒Ａおよび５〜１５％溶媒Ｂ；７〜２７分８５〜７０％溶媒Ａおよび１５〜３０％溶媒Ｂ。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＣの保持時間は１７．２分であった。最終生成物は凍結乾燥後に白色の固体であった。生成物をＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＦＴ質量分析計によって特性分析した（［ＭＨ］+、Ｃ32Ｈ49ＦＮ8Ｏ12Ｓ2のｍ／ｚ  ８２１．２９、計算［ＭＨ］+  ８２１．２９）。
【０１０６】
19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＫの合成。ｃＲＧＤｙＫ（１ｍｇ（１．６１μｍｏｌ）を含む１００μＬのＨ2Ｏ）および19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（５００μｇ（２．２μｍｏｌ）を含む５μＬのＭｅＣＮおよび４５μＬのＨ2Ｏ）を９００μＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）に添加した。反応混合物を室温で一晩インキュベートし、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ条件はｃＲＧＤｙＫの精製と同じであった。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＫの保持時間は１３．１分であった。最終生成物は凍結乾燥後に白色の固体であった。生成物をＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＦＴ質量分析計によって特性分析した（［ＭＨ］+、Ｃ32Ｈ49ＦＮ8Ｏ12Ｓ2のｍ／ｚ  ８４６．３８、計算［ＭＨ］+  ８４６．３８）。
【０１０７】
19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ニューロテンシンおよび19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ニューロテンシンの合成。ニューロテンシン類似体（ＮＴ、Ｃｙｓ−ｐｉｐＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐｉｐＡｍＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｔＢｕＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、３００μｇ（０．２５μｍｏｌ）を含む３０μＬのＨ2Ｏ）または（Ａｃ）−ＮＴおよび19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（５００μｇ、２．２μｍｏｌ、５μＬのＭｅＣＮおよび４５μＬのＨ2Ｏ）を９００μＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、方法１を用いてＨＰＬＣによって精製した。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴの保持時間は、それぞれ２０．０８分および２３．０９分であった。最終生成物は凍結乾燥後に白色の固体であった。生成物を質量分析計によって特性分析した（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴ：［ＭＨ］+、Ｃ63Ｈ105ＦＮ16Ｏ15Ｓ2のｍ／ｚ  １，４０９．７５、計算［ＭＨ］+  １，４０９．７４；（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴ：［ＭＨ］+、Ｃ71Ｈ120Ｆ2Ｎ16Ｏ19Ｓ3のｍ／ｚ  １，６３５．８２、計算［ＭＨ］+  １，６３５．８０）。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ＮＴの保持時間はラジオＨＰＬＣで２８．１８分であった。最終生成物を質量分析によって確認した（19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ＮＴ：［ＭＨ］+、Ｃ65Ｈ108ＦＮ16Ｏ16Ｓ2のｍ／ｚ  １，４５１．７６、計算［ＭＨ］+  １，４５１．７５。
【０１０８】
19Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の合成。以前に記載された通りに（１２）ＦＢＥＭを合成した。ＦＢＥＭ（４２０μｇ、１．６μｍｏｌ、５０μＬのＨ2Ｏ）およびｃ（ＲＧＤｙＣ）（５００μｇ、０．８μｍｏｌ、５０μＬのＨ2Ｏ）を２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、方法３を用いてＨＰＬＣによって精製した。19Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の保持時間は１８．２分であった。最終生成物を質量分析によって確認した（19Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）：［ＭＨ］+、Ｃ37Ｈ45ＦＮ10Ｏ11Ｓのｍ／ｚ  ８５７．３０、計算［ＭＨ］+  ８５７．３１。
【０１０９】
19Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの合成。ＦＢＥＭ（１３０μｇ、０．５μｍｏｌ、５０μＬのＨ2Ｏ）およびＮＴ（３００μｇ、０．２５μｍｏｌ、５０μＬのＨ2Ｏ）を２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、方法３を用いてＨＰＬＣによって精製した。19Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの保持時間は１８．９分であった。最終生成物を質量分析によって確認した（19Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴ：［ＭＨ］+、Ｃ68Ｈ101ＦＮ18Ｏ14Ｓのｍ／ｚ  １４４５．７４、計算［ＭＨ］+  １４４５．７６。
【０１１０】
放射化学
18Ｆ−（２−（２−（２−フルオロエトキシ）エトキシ）エチルスルホニル）エタン（18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ、18Ｆ−３）の合成。18Ｆ−フッ化物（２００ｍＣｉ）をＳｅｐ−Ｐａｋ  ＱＭＡカートリッジ上にトラップした。炭酸水素テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）溶液（４００μＬのＨ2Ｏ）を使用して、18Ｆ−フッ化物をＱＭＡカートリッジから乾燥ｖ−バイアルに溶出させた。得られた溶液を、９０℃での連続的なＭｅＣＮ蒸発により共沸乾燥させた。（２）（１０ｍｇを含む５０μＬの無水ＤＭＳＯ）の溶液を反応器に添加し、８０℃で１０〜１５分間加熱した。酢酸（５％、８００μＬ）を添加し、反応を停止した。次いで、粗混合物をＨＰＬＣによって精製し（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム：１ｍＬ／分、ならびに溶出液グラジエント：０〜２分９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂ；２〜７分９５〜８５％溶媒Ａおよび５〜１５％溶媒Ｂ；７〜２７分８５〜６５％溶媒Ａおよび１５〜３５％溶媒Ｂ。19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの保持時間は１２．２分であった。収集した18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳをＮａＯＨ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）で中和した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳの単離放射化学的収率はＨＰＬＣ（減衰補正なし）に基づいて９０％超であった。
【０１１１】
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＣの合成。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（１００μＬ、１ｍＣｉ）およびｃＲＧＤｙＣ（１００μｇ）を３０μＬのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に添加し、反応混合物を室温で５〜１０分間インキュベートした。反応を酢酸（５％、６００μＬ）によって停止し、生成物をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム：１ｍＬ／分、ならびに溶出液グラジエント：０〜２分９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂ；２〜２２分９５〜５％溶媒Ａおよび５〜９５％溶媒Ｂ）によって精製した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＣの保持時間は２１．５分である。
【０１１２】
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃＲＧＤｙＫの合成。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（１００μＬ、１ｍＣｉ）および１００μＬのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）をｃＲＧＤｙＫ（１００μｇ）に添加し、反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。反応を酢酸（５％、６００μＬ）によって停止し、生成物をＨＰＬＣによって精製した。
【０１１３】
選択性試験：ｃＲＧＤｙＫおよびｃＲＧＤｙＣ。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（１００μＬ、１ｍＣｉ）および５０μＬのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）をｃＲＧＤｙＣ（２０μｇ）およびｃＲＧＤｙＫ（２０μｇ）に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。反応を酢酸（５％、６００μＬ）によって停止し、生成物をＨＰＬＣによって精製した。
【０１１４】
18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ＮＴの合成。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ（１００μＬ、１ｍＣｉ）および３０μＬのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）をニューロテンシン（１００μｇ、０．０８４μｍｏｌ）または（Ａｃ）−ＮＴに添加し、反応混合物を室温で５〜１０分間インキュベートした。反応を酢酸（５％、６００μＬ）によって停止し、方法１を用いてラジオＨＰＬＣによって生成物を精製した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの保持時間は２５．６分であり、（18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ）2−ＮＴは観察されなかった。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの安定性を試験するために、最終生成物を１×ＰＢＳとともに３７℃で５時間インキュベートした。次いで、一定分量の溶液をラジオＨＰＬＣによって分析して放射化学的純度を判定した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−（Ａｃ）−ＮＴの保持時間は２８．４分であった。
【０１１５】
18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の合成。18Ｆ−ＦＢＥＭ（１００μＬ、１ｍＣｉ）および３０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）を１００μｇのｃ（ＲＧＤｙＣ）（０．１６μｍｏｌ）を含むバイアルに添加した。反応混合物を室温で１５分間インキュベートした。反応を酢酸溶液（５％、６００μＬ）によって停止し、方法３を用いてラジオＨＰＬＣによって生成物を精製した。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）の保持時間は１８．４分であった。
【０１１６】
18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの合成。18Ｆ−ＦＢＥＭ（１００μＬ、１ｍＣｉ）および３０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）を１００μｇのニューロテンシンペプチド（０．０８４μｍｏｌ）を含むバイアルに添加した。反応混合物を室温で１５分間インキュベートした。反応を酢酸溶液（５％、６００μＬ）によって停止し、方法３を用いてラジオＨＰＬＣによって生成物を精製した。18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴの保持時間は１９．０分であった。
【０１１７】
細胞
ヒト結腸腺癌細胞ＨＴ２９をアメリカ培養細胞系統保存機関から得て、３７℃で、５％ＣＯ2を含む加湿大気中、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中に維持した。
【０１１８】
動物
南カリフォルニア大学動物実験委員会によって承認されているプロトコルに従って動物の処理手順を行った。この処理手順において、生後４〜６週間、２０〜３０ｇ、オスの胸腺欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）に、ＨＴ−２９ヒト結腸腺癌細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関）を１×１０６細胞／０．１ｍＬの濃度で肩に皮下注射し、十分な時間をかけて少なくとも直径３ｍｍまで腫瘍を増殖させた。
【０１１９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイ
19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよびＮＴ（８〜１３）のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＴＲ１−結合親和性および特異性を、以前に記載された通りに（１８）、125Ｉ−ＮＴ（８〜１３）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）を用いて競合細胞結合アッセイによって評価した。詳細には、ＨＴ−２９細胞を４８−ウェルのプレート（百万個／０．４ｍＬ／ウェル）に入れ、一晩インキュベートした。細胞を結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．５ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｇ／ＬのＢＳＡ、２ｍｇ／Ｌのキモスタチン、１００ｍｇ／Ｌの大豆トリプシン抑制因子、５０ｍｇ／Ｌのバシトラシン、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＨＴ−２９細胞を２５０００ｃｐｍの125Ｉ−ＮＴ（８〜１３）ならびに種々の濃度（０．００１〜１０００ｎＭ）の19Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよびＮＴ（８〜１３）とともに３７℃で１時間、三組でインキュベートした。洗浄後、細胞を３７℃で１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨにより可溶化させ、ガンマ線計数器を使用して放射能を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用い、非線形回帰によりデータをフィッティングさせることによって、ＨＴ−２９細胞の最良適合５０％抑制濃度（ＩＣ50）値を計算した。実験は三組の試料で行った。
【０１２０】
２  マウスにおける生体内分布およびＨＴ−２９腫瘍異種移植片のマイクロＰＥＴイメージング
ＨＴ−２９結腸異種移植片をもつヌードマウスのマイクロＰＥＴイメージングを、３．７ＭＢｑの18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴまたは18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴを尾静脈に注射した後に行った（それぞれ、ｎ＝３）。阻止試験のために、ＮＴ（８〜１３）（１００μｇ）を18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴと混注した（ｎ＝３）。ｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｒ４スキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ノックスビル、ＴＮ；体軸方向視野８ｃｍ、空間分解能２．０ｍｍ）を用いて、連続イメージング（注射０．５、１、および２時間後；スキャン時間はそれぞれ５、５、および１０分）を行った。
【０１２１】
ｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ノックスビル、ＴＮ）を用い、ＭＡＰ反復アルゴリズムでイメージを再構成し、次いでそのイメージをＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｉｎｏｇｒａｍ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＡＳＩＰｒｏ）ソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ノックスビル、ＴＮ）を用いて解析した。肝臓中の平均放射能蓄積をＰＥＴ肝臓イメージの中心部内に描画された３次元対象領域（ＲＯＩ）から得た。既知の放射能濃度の18Ｆで充填した円柱ファントムをスキャンすることによって得られた校正係数を用いて、イメージ強度を放射能濃度の単位（Ｂｑ／ｃｍ3）に変換した。組織密度を１ｇ／ｍＬと仮定し、測定した組織放射能濃度をＢｑ／ｇの単位に変換し、次いで１００を乗じ、投与量で除算して、イメージ導出パーセント投与量／グラム組織（％ＩＤ／ｇ）を得た。
【０１２２】
ＨＴ−２９結腸異種移植片をもつヌードマウスで生体内分布を行った。３．７ＭＢｑの18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの注射２時間後に吸入麻酔下で動物を屠殺した。対象の組織および臓器を切除して計量した。ガンマ線計数器を用いて切除した各検体中の放射能を測定した。放射能集積を％ＩＤ／ｇとして表した。平均集積（％ＩＤ／ｇ）および対応する標準偏差を動物群毎に計算した。
【０１２３】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ代謝安定性
ＨＴ−２９腫瘍を有するヌードマウスで18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴおよび18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝安定性を評価した。７．４ＭＢｑの18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴまたは18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴを静脈注射した３０分後にマウスを屠殺した。尿を収集して１ｍＬのＰＢＳで希釈した。血液を５分間１４，０００ｒｐｍで遠心した。肝臓、腎臓、および腫瘍を回収し、ホモジナイザーを用いて均質化し、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液中に懸濁させ、次いで１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。各試料について、上清を除去した後、５０％のＴＦＡを含む１００μＬのＰＢＳにこの溶液を添加し、続いて混合し５分間遠心した。次いで、上方の溶液を取って、ＨＰＬＣ解析のために注入した（ＨＰＬＣ法３）。溶出液をフラクションコレクターで収集し（１．０分／画分）、各画分の放射能をガンマ線計数器で測定した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）および18Ｆ−ＦＢＥＭ−ｃ（ＲＧＤｙＣ）について、尿の試料を収集しＨＰＬＣによって解析した。
【０１２４】
３．統計解析
定量データを平均±ＳＤとして表した。平均を一元配置分散分析およびスチューデントのｔ検定を用いて比較した。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であるとみなした。
【０１２５】
例２
ニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）の過剰発現は、前立腺癌の進行と成長および増殖の増大の両方に関連している。本研究は前立腺癌のＮＴＲ１標的イメージング用のＰＥＴ剤、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴを評価することを目的とする。
【０１２６】
遊離チオール基を用いて１３−アミノ酸のＮＴペプチドをアミノ末端で操作した（ＮＴ−ＳＨ）。スルフヒドリル特異的18Ｆ−ビニルスルホン（18Ｆ−ＶＳ）をＮＴ−ＳＨとのコンジュゲーションのために開発した。ヒト前立腺腺癌ＰＣ３細胞株を使用して、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（受容体結合アッセイ、細胞集積、および流出アッセイを含む）を行った。ＰＣ３異種移植片をもつヌードマウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴおよび生体内分布試験も行った。
【０１２７】
共沸的に乾燥させた18Ｆ−フッ化物から出発して、18Ｆ−ＶＳを一段階で、生産規模にて２４．３％の減衰補正した収率で合成した。ＮＴ−ＳＨと18Ｆ−ＶＳとのコンジュゲーションにより、室温にて３０．５％の単離収率で18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴを得た。低温のＮＴペプチドの存在下で、ＰＣ３細胞中の18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴの集積を良好に阻止した。ＰＥＴイメージング解析はＰＣ３腫瘍モデルでの高い腫瘍集積および低いバックグラウンド集積を示した。注射３時間後に生体内分布試験を行い、これは腫瘍対筋肉、肝臓、および腎臓の比が、それぞれ１９．４±５．５、１５．６±４．１、および３．０±０．３であることを示した。
【０１２８】
マイクロＰＥＴイメージに示されるように、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは高いＰＣ３腫瘍集積および正常組織における低いバックグラウンドを示した。18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴはＮＴＲ１を標的とすることによる前立腺癌診断用の有望なＰＥＴ剤である。
【０１２９】
例３
我々の新規に開発した18Ｆ−ビニルスルホン（18Ｆ−ＶＳ）に基づいて、ニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）標的イメージングのために18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴを開発した。本研究において、我々はこのチオ反応性シントンがよく確立された18Ｆ−ＦＢＥＭ標識化方法と比較して利点を示すかどうかを調べる。
【０１３０】
よく確立された18Ｆ−ＦＢＥＭおよび我々の新規に開発した18Ｆ−ビニルスルホンに基づいて、ＮＴＲ１標的イメージング用に18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴおよび18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴを合成した。ＨＴ２９異種移植片をもつヌードマウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴ試験および代謝安定性試験を行った。
【０１３１】
18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴおよび18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴをＨＰＬＣ積分に基づき９０％の収率で得た。両方の薬剤はＰＢＳ溶液中で良好な安定性を示した。しかし、代謝安定性試験は、これらの薬剤がｉｎ  ｖｉｖｏでいくつかの代謝産物を生じさせることを示し、これはニューロテンシン類似体の非常に短い半減期に起因するかもしれない。イメージング試験では明白な骨集積が観察されず、ｉｎ  ｖｉｖｏ脱フッ素が無視できることを示していた。両方のトレーサーは安定性試験では有意差を示さなかったが、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴと比較して低い腹部バックグラウンドおよび高い腫瘍集積を示した。
【０１３２】
18Ｆ−ＦＢＥＭ−ＮＴと比較して、18Ｆ−ＤＥＧ−ＶＳ−ＮＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験において、より良好なイメージング品質およびコントラストを示した。
【０１３３】
例４
ニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）は癌の増殖および生存に重要な役割を果たしていることが示唆されている。本研究は種々の癌型のＮＴＲ１標的イメージング用に18Ｆ標識されたＰＥＴ剤を開発することを目的とする。
【０１３４】
アセタートをＣｙｓＮＴペプチドのアミノ末端に導入し、次いでこれを18Ｆ−ビニルスルホン（18Ｆ−ＶＳ）と反応させた。ＨＴ２９、ＢＸＰＣ３およびＣｏｌｏ２０５異種移植片をもつヌードマウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴイメージングを行った。
【０１３５】
（Ａｃ）ＣｙｓＮＴは18Ｆ−ＶＳと効率的に反応でき、ＨＰＬＣ積分に基づいて９０％超の収率であった。18Ｆ−ＶＳ−（Ａｃ）ＮＴの放射化学的純度は９８％超であった。非侵襲的なマイクロＰＥＴは、皮下のＨＴ−２９、ＢＸＰＣ３、およびＣｏｌｏ２０５において18Ｆ−ＶＳ−（Ａｃ）ＮＴがＮＴＲ特異的腫瘍集積を持つことを示した。受容体特異性は阻止試験によって良好に示された。
【０１３６】
18Ｆ−ＶＳ−（Ａｃ）ＮＴは、直腸癌および膵臓癌のモデルにおいて、特異的な腫瘍集積および良好な腫瘍対バックグラウンドのコントラストを示した。18Ｆ−ＶＳ−（Ａｃ）ＮＴはＮＴＲ１標的ＰＥＴイメージング用の有望な薬剤である。
【０１３７】
本発明を特定の代表的な実施形態および例に関して説明してきたけれども、ここに開示した実施形態は例示を目的とするにすぎず、当業者であれば以下の特許請求の範囲に記述した本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の修正および改変をなしうることを理解するものとする。
【表１】
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【０１３８】
参考文献
以下の参考文献は各々依拠され、その全体がここに組み込まれている。
【０１３９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016518311.tif 000031
【図９】
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【図１０】
2016518311.tif 000033
【図１１】
2016518311.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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