(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗α５β１インテグリン抗体および前記抗体のα５β１インテグリン結合断片からなる群より選択されるα５β１拮抗剤を含む、組織における血管新生を低減させまたは阻害するための医薬品であって、
組織中のα５β１インテグリンを、前記α５β１拮抗剤と接触させることによって、前記組織における血管新生を低減させまたは阻害し、
前記α５β１拮抗剤が、成長因子刺激内皮細胞のアポトーシスを誘導し、前記組織において発現するリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害し、それによって前記組織における血管新生を低減させまたは阻害する、
前記医薬品。
【請求項２】
抗α５β１インテグリン抗体および前記抗体のα５β１インテグリン結合断片からなる群より選択されるα５β１拮抗剤を含む、個体の組織における血管新生を低減させまたは阻害するための医薬品であって、
前記α５β１拮抗剤が、成長因子刺激内皮細胞のアポトーシスを誘導し、前記組織中で発現するリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害し、それによって前記個体の前記組織における血管新生を低減させまたは阻害する、
前記医薬品。
【請求項３】
抗α５β１インテグリン抗体および前記抗体のα５β１インテグリン結合断片からなる群より選択されるα５β１拮抗剤を含む、血管新生に関連する病理状態を有する個体において血管新生を低減させまたは阻害するための医薬品であって、
前記α５β１拮抗剤が、成長因子刺激内皮細胞のアポトーシスを誘導し、前記病理状態に関連する組織においてリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害し、それによって前記個体における血管新生を低減させまたは阻害する、
前記医薬品。
【請求項４】
前記リガンドがフィブロネクチンである、請求項１に記載の医薬品。
【請求項５】
前記組織が眼組織である請求項１に記載の医薬品。
【請求項６】
前記眼組織が網膜、網膜黄斑、および角膜からなる群より選択される請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
前記組織が新生物である請求項１に記載の医薬品。
【請求項８】
前記新生物が悪性新生物である請求項７に記載の医薬品。
【請求項９】
前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項８に記載の医薬品。
【請求項１０】
前記悪性新生物が癌腫である請求項８に記載の医薬品。
【請求項１１】
前記拮抗剤が細胞毒に連結される請求項１に記載の医薬品。
【請求項１２】
前記細胞毒が癌化学療法薬である請求項１１に記載の医薬品。
【請求項１３】
前記個体がヒトである請求項２に記載の医薬品。
【請求項１４】
前記病理状態が新生物である請求項３に記載の医薬品。
【請求項１５】
前記新生物が悪性新生物である請求項１４に記載の医薬品。
【請求項１６】
前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項１５に記載の医薬品。
【請求項１７】
前記悪性新生物が癌腫である請求項１５に記載の医薬品。
【請求項１８】
前記癌腫が乳癌、結腸癌、卵巣癌、および膵臓癌からなる群より選択される請求項１７に記載の医薬品。
【請求項１９】
前記悪性新生物が肉腫、中皮腫、奇形癌、星状細胞腫、および膠芽細胞腫からなる群より選択される請求項１５に記載の医薬品。
【請求項２０】
前記個体がヒトである請求項３に記載の医薬品。
【請求項２１】
前記医薬品が静脈内投与用である、請求項３に記載の医薬品。
【請求項２２】
前記医薬品が経口投与用である、請求項３に記載の医薬品。
【請求項２３】
前記拮抗剤が新生物中への投与用として製剤化される、請求項１４に記載の医薬品。
【請求項２４】
前記病理状態が眼に関連する請求項３に記載の医薬品。
【請求項２５】
前記病理状態が、新血管新生による糖尿病性網膜症および黄斑変性症からなる群より選択される請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２６】
前記医薬品が点眼剤の形態である、請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２７】
前記医薬品が静脈内投与用である、請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２８】
前記医薬品が経口投与用である、請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２９】
前記拮抗剤を０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で含む、請求項３に記載の医薬品。
【請求項３０】
組織中のα５β１インテグリンと薬剤とを接触させることによって、前記組織における血管新生を低減させまたは阻害するための医薬品であって、
前記薬剤が、抗α５β１インテグリン抗体または前記抗体のα５β１インテグリン結合断片を含み、
前記薬剤が、前記組織において発現するフィブロネクチンへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害し、それによって前記組織における血管新生を低減させまたは阻害する、
前記医薬品。
【請求項３１】
前記組織が眼組織である請求項３０に記載の医薬品。
【請求項３２】
前記眼組織が網膜、網膜黄斑、および角膜からなる群より選択される請求項３１に記載の医薬品。
【請求項３３】
前記組織が新生物である請求項３０に記載の医薬品。
【請求項３４】
前記新生物が悪性新生物である請求項３３に記載の医薬品。
【請求項３５】
前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項３４に記載の医薬品。
【請求項３６】
前記悪性新生物が癌腫である請求項３４に記載の医薬品。
【請求項３７】
前記薬剤が前記抗体のα５β１インテグリン結合断片を含む、請求項３０に記載の医薬品。
【請求項３８】
前記薬剤が細胞毒に連結される請求項３０に記載の医薬品。
【請求項３９】
前記細胞毒が癌化学療法薬である請求項３８に記載の医薬品。
【請求項４０】
前記組織がヒトの組織である請求項３０に記載の医薬品。
【請求項４１】
前記悪性新生物が肉腫、中皮腫、奇形癌、星状細胞腫、および膠芽細胞腫からなる群より選択される請求項３４に記載の医薬品。
【請求項４２】
前記癌腫が乳癌、結腸癌、卵巣癌、および膵臓癌からなる群より選択される請求項３６に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９８年５月８日に提出され、血管新生を検出および阻害する新規な方法と題した、Ｊｕｄｉｔｈ  Ａ．Ｖａｒｎｅｒの米国仮特許出願番号第０６／０８４，８５０号に基づく優先権の利益を主張し、その全内容を参考として本明細書に取込む。
【０００２】
本発明は、国立癌研究所により与えられた付与番号Ｒ０１／ＣＡ７１６１９の下で一部政府の支援で実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、望ましくない血管新生を含む状態を検出および治療する方法、より詳細には、リガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害することにより血管新生を検出または阻害する方法に関する。
【０００４】
（背景の情報）
血管新生は、新血管が形成される過程である。血管新生は新血管新生とも呼ばれ、通常、胚形成中および発達中に起こり、完全に発達した生物では創傷治癒および胎盤発達の過程で起こる。さらに、血管新生は、新血管新生による糖尿病性網膜症および黄斑変性症などの眼疾病、関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの組織炎症に関連した病態、および、増殖している腫瘍の血管新生が酸素および栄養を腫瘍細胞に与え、並びに、腫瘍細胞が全身に転移する経路を与えている癌を含む様々な病理状態で起こる。世界中の多数の人々が、これらの疾病に苦しんでいるので、血管新生に関与する機序を解明するために、このような解明によりこのような望ましくない血管新生を検出および阻害する方法の開発が可能となることを願い、相当の努力がなされている。
【０００５】
血管新生は、１つ以上の既知の成長因子による刺激に応答して起こり、依然として同定されていないその他の因子も関与し得る。成熟血管を裏打ちする細胞である内皮細胞は通常増殖しない。しかし、適切な刺激に応答して、内皮細胞は活性化され、増殖して非血管新生化組織に移動し始め、新血管を形成する。前駆細胞が活性化されて内皮細胞に分化し、新血管を形成し得る場合もある。
【０００６】
血管は、細胞外マトリックスにより囲まれている。成長因子による刺激に加えて、血管新生は、細胞外マトリックスと内皮細胞の相互作用、並びに内皮細胞の互いの相互作用に依存する。成長因子による内皮細胞の活性化、細胞外マトリックスへの移動、ならびに細胞外マトリックスとの相互作用および内皮細胞の互いの相互作用は、内皮細胞により発現される細胞表面受容体に依存する。成長因子受容体およびインテグリンを含むこれらの細胞表面受容体は、特定の分子と特異的に相互作用する。
【０００７】
加齢に関連した黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの病理状態では、網膜の酸素利用能の低下により低酸素状態となり、これは血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生成長因子の分泌を刺激し、これは眼の組織への内皮細胞の異常な移動および増殖を誘導する。眼組織でのこのような血管新生は、角膜瘢痕、網膜剥離および脈絡膜での体液蓄積を誘導し得るものであり、その各々は、視覚に悪影響を与え、失明につながり得る。
【０００８】
血管新生は、乾癬、関節リウマチ、骨関節炎、並びに潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患を含む、炎症性疾病の進行および悪化にも関連する。例えば、炎症性関節炎疾病では、関節を囲む領域へのリンパ球の流入は、滑膜被覆の血管新生を刺激する。脈管構造の増加は、より大量の白血球が流入するための手段を与え、これにより関節での軟骨および骨の破壊は容易になる。炎症性腸疾患で起こる血管新生は、腸に同様の影響を及ぼす。
【０００９】
冠状動脈における毛細血管のアテローム硬化型プラークへの成長は、成長因子誘導血管新生に関連した別の病理状態を示す。新血管新生プラークへの過剰な血流により、血液充填プラークの破裂および出血が起こり、血塊を遊離し得るものであり、これは冠血栓症につながり得る。
【００１０】
癌、眼の疾病および炎症疾病などの多様な疾病に血管新生が関与することにより、これらの疾病を治療する手段として血管新生を特異的に阻害する方法を同定する努力がなされた。このような治療法は、癌患者に、患者の標的腫瘍細胞だけでなく、正常細胞、特に血液細胞、上皮細胞、および腸管内腔を裏打ちしている細胞などの増殖正常細胞までも殺滅または障害する化学療法などの現在使用されている方法に優る実質的な利点を与え得る。化学療法剤によるこのような非特異的殺滅により、副作用が生じ、これは最もよくても不快であり、しばしば許容不可能な患者の病的状態または死亡をもたらし得る。事実、癌治療法に関連した望ましくない副作用により、しばしば患者が受けることのできる治療は限定される。
【００１１】
糖尿病性網膜症などの異常血管新生に関連した他の病理状態には、網膜移植以外は効果的な治療法がない。しかし、網膜移植を実施したとしても、新しい網膜は、もともとの網膜症をもたらしたのと同じ条件に置かれる。従って、このような病理を診断および特異的に治療する方法を開発できるような、ある病理状態で起こる望ましくない血管新生に関与する分子相互作用を同定する必要がある。本発明は、この必要性を満たし、その上関連した利点も提供する。
【００１２】
（発明の要約）
本発明は、組織の血管に結合したα５β１インテグリンを、組織に発現されたリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する物質と接触させ、よって組織の血管新生を低減または阻害することにより、組織の血管新生を低減または阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、この物質は、α５β１拮抗剤であり、これはα５β１インテグリン以外のインテグリンのそのリガンドへの特異的結合、例えば、αＶβ３インテグリンのビトロネクチンへの結合は実質的に妨害しない。別の実施形態において、α５β１インテグリンリガンドはフィブロネクチンである。
【００１３】
本発明の方法は、例えば、網膜、網膜黄斑または角膜などの眼組織；皮膚；滑膜組織；腸組織；または骨における血管新生の低減または阻害に有用である。さらに、本発明の方法は、良性または悪性であり得、悪性である場合に転移性新生物であり得る、新生物の血管新生の低減または阻害に有用である。従って、本発明は、α５β１拮抗剤を含み、個体の血管新生の低減または阻害に有用な医薬を提供する。本発明の方法の実践に有用な物質は、ペプチド、例えば、アミノ酸配列ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）を含むペプチド；抗体、例えば、抗α５β１インテグリン抗体またはそのα５β１インテグリン結合断片；または非ペプチド有機低分子、例えば、（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸であり得る。α５β１拮抗剤として有用な物質は、細胞毒素、例えば、癌化学療法薬に連結できる。
【００１４】
本発明はまた、組織を、α５β１インテグリンと特異的に結合する物質と接触させ、組織の血管に結合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出することにより、組織の血管新生の存在を同定する方法を提供する。この物質は、ペプチド、抗体、または非ペプチド有機低分子であってよく、これは直接的に検出できるか、またはその存在を特定の試薬との相互作用により検出できる、検出標識に連結することができる。このような方法は、胚組織または胎盤組織などの正常組織、肉芽組織、または、新生物、網膜症などの病理状態、または関節炎状態または他の炎症状態に関与する組織を含む、様々な組織の血管新生の存在の同定に有用である。
【００１５】
本発明はさらに、個体の組織の血管新生を特徴とする病理状態を診断する方法を提供する。診断法は、例えば、個体から組織のサンプルを得（ここで、病理状態を有する個体の組織は血管新生を示す）；サンプルを、α５β１インテグリンに特異的に結合する物質と接触させ；組織の血管に結合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出し、よって個体の血管新生を特徴とする病理状態を診断することにより実施できる。病理状態は、眼、例えば、糖尿病性網膜症もしくは黄斑変性症；皮膚、例えば、血管腫もしくは乾癬；関節、例えば、関節リウマチもしくは骨関節炎；または腸、例えばクローン病もしくは潰瘍性大腸炎を含み得るか；または新生物であり得、これは良性または悪性であり得る。転移性であり得る悪性新生物は、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌、または膵臓癌であり得る。
【００１６】
個体の組織の血管新生を特徴とする病理状態を診断する方法はまた、病理状態を有することが疑われる個体に、α５β１インテグリンに特異的に結合する物質を投与し；組織の血管に結合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出することにより実施できる。この物質は、例えば、放射性核種、常磁性材料、またはＸ線減弱材料などの部分に連結させることにより、検出可能に標識できる。検出法は、放射性核種映像法、ポジトロン放出断層撮影法、コンピュータアクシャル断層撮影法、もしくは磁気共鳴映像法などのｉｎ  ｖｉｖｏ撮影法であり得るか、または、物質の投与後、組織のサンプルを個体から得、サンプル中の物質の特異的結合を検出するｅｘ  ｖｉｖｏ法であり得る。このサンプル中のα５β１インテグリンに特異的に結合する物質は、直接的に、例えば、この物質に連結した部分に起因する放射活性の検出により、または間接的に、特異的に結合した物質を、この物質またはこの部分と特異的に相互作用する試薬と接触させ、この物質またはこの部分と試薬の相互作用を検出することにより検出できる。
【００１７】
本発明はさらに、個体に、組織で発現されたリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する物質を投与し、よって個体の組織の血管新生を低減または阻害することにより、個体の組織の血管新生を低減または阻害する方法を提供する。また、個体に、病理状態に関連した組織のリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する物質を投与し、よって組織の血管新生を低減または阻害し、結果として、病理状態の重度を低減させることにより、個体の血管新生に関連した病理状態の重度を低減させる方法も提供される。病理状態は、悪性新生物、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌もしくは膵臓癌などの癌、または肉腫、中皮腫、奇形腫、星細胞腫、グリア芽腫であり得る新生物、または、転移性悪性新生物を含む他の新生物を含む、血管新生に関連した任意の病理状態であり得る。この物質は、様々な経路、例えば、静脈内、経口、または治療する領域に直接的に、例えば、新生物腫瘍に直接的に；病理状態が眼を含む場合、点眼により；または病理状態が関節を含む場合、滑液嚢内に投与できる。
【００１８】
本発明はまた、組織のα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を低減または阻害する物質を同定する方法を提供する。スクリーニングアッセイとして有用なこの方法は、α５β１インテグリン発現に関連した血管新生を示す組織を物質と接触させ、組織の血管新生の低減または阻害を検出することにより実施できる。組織と物質の接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施できる。この方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合、自動化ハイスループット・スクリーニングアッセイに容易に適合できる。この組織は、α５β１インテグリン発現と関連した血管新生を受ける任意の組織、例えば悪性新生物組織であり得、これは、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類または両生類を含む任意の個体由来であり得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、組織の血管のリガンドへのα５β１インテグリンの結合を同定することによる、組織の血管新生を検出する方法を提供する。個体の血管新生の存在を診断する方法も提供される。本発明はさらに、組織で発現されたリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害することによる、組織の血管新生を低減または阻害する方法を提供する。個体における病理状態に関連し得る血管新生を低減または阻害させる方法も提供される。
【００２０】
血管新生は、様々な成長因子と細胞接着事象の協同作用に依存する。αＶインテグリンが、血管新生に重要な役割を果たすことが示されたが、αＶインテグリンヌル変異マウスを使用した研究により、他の接着受容体およびそのリガンドも血管新生に関与し得ることが示唆された。本明細書に開示したように、インテグリンα５β１およびそのリガンドのフィブロネクチンは、成長因子刺激血管新生中において、およびヒト腫瘍生検に存在する血管上で協調的にアップレギュレーションされ、これらの分子の相互作用は、腫瘍増殖中に起こりｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を支持する血管新生に、並びに、様々な病理状態に関連した血管新生に必要である。
【００２１】
胚形成、または正常血管新生および病理血管新生中の血管網の発達は、成長因子により誘導された刺激（ＢｒｅｉｅｒおよびＲｉｓａｕ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：４５４−４５６（１９９６）；Ｂｒｅｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：６７８−６８３（１９９７）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２７−３１（１９９５）；Ｒｉｓａｕ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４（１９９７））および細胞外マトリックスとの細胞相互作用（ＳｔｒｏｍｂｌａｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：８８１−８８５（１９９６）；Ｖａｒｎｅｒ；Ｅｘｓ．７９：３６１−３９０（１９９７）；この開示に引用した各刊行物は参考として本明細書に取込む）に依存する。遺伝的および機能的解析により、細胞外成分および細胞表面受容体は、脈管形成および血管新生における内皮細胞の増殖、生存および分化を調節することが示される（Ｇｅｏｒｇｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１０７９−１０９１（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１０９３−１１０５（１９９３）；ＳｔｒｏｍｂｌａｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、上記、１９９６；Ｂｌｏｃｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：２６５−２７８（１９９７）；Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７；Ｒｉｓａｕ、上記、１９９７；Ｂａｄｅｒら、Ｃｅｌｌ  ９５：５０７−５１９（１９９８））。
【００２２】
血管は、胚形成中に、脈管形成および血管新生の２つの過程により生じ（Ｒｉｓａｕ、上記、１９９７）、両方の過程における成長因子の役割は、十分に確立されている。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２（１９９６））およびその受容体（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：９８９−９９１（１９９２）；Ｆｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：６６−７０（１９９５）；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７２：８３５−８４６（１９９３）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｃｅｌｌ  ８９：９８１−９９０（１９９７））、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；ＢａｓｉｌｉｃｏおよびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１１５−１６５（１９９２））は、初期の胚血管網の発達を促進し、発達、創傷治癒および女性生殖周期中の既存の血管からの新血管の形成に関与する。ＶＥＧＦ（Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７（１９９５）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：１４０１５−４０２３（１９９７）；Ｋｏｎｇら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：８２３−８３３（１９９８））、ｂＦＧＦ（Ｓｔａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８２：１０４４−１０５２（１９９５）；Ｃｈｏｐｒａら、Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２３：１６７−１７２（１９９７）；Ｃｚｕｂａｙｋｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：１１３７−１１４０（１９９７）；Ｙｏｓｈｉｄａら、上記、１９９７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８；Ａｒｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２７９２−２８０２（１９９６）；Ｌｕｃａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５１：１１０５−１１１３（１９９７）；Ｋｅａｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１４３７−４３（１９９７）；Ｙａｔｓｕｎａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１２０：１０１−１０８（１９９７）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：１０９７−１１０６（１９９８））、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα；Ｙｏｓｈｉｄａら、上記、１９９７）は、例えば、固体腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、および関節リウマチを含む、様々な病理状態に関連した血管新生における役割を有する成長因子である。
【００２３】
成長因子は新血管増殖を刺激するが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への接着は、新血管増殖中の、内皮細胞生存、増殖および運動性を調節する（ＳｔｒｏｍｂｌａｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、上記、１９９６；Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７）。特異的インテグリンまたはそのリガンドも、血管発達および血管新生に影響を及ぼす。例えば、αＶインテグリンは、活性化内皮細胞に生存シグナルを与えることにより、血管新生に関与する（Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０（１９９７）；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：５６９−５７１（１９９４ａ）；Ｃａｒｒｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１９３０−１９５５（１９９８）；Ｃｌａｒｋら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１４０７−１４２１（１９９７）；Ｄｒａｋｅら、Ｄｅｖｅｌ．Ｄｙｎ．１９３：８３−９１（１９９２）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２６５５−２６６１（１９９５）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５００−１５０２（１９９５））。しかし、血管新生のいくつかの態様は、αＶインテグリンの非存在下でも進行し得るものであり（Ｂａｄｅｒら、上記、１９９８）、これは、β１インテグリンファミリーを含む他の分子が、発達中に不在のαＶインテグリンを補い得ることを示唆する（Ｄｒａｋｅら、上記、１９９２；Ｂｌｏｃｈら、上記、１９９７；Ｓｅｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３６１２−１３６１７（１９９７）。
【００２４】
血管新生の促進におけるインテグリンの活性な機能は同定されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生に関与するインテグリンの同族ＥＣＭリガンドはあまり十分には記載されていない。１つのＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチンが仮血管マトリックスにおいて発現し、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症および高血圧において、増殖シグナルを血管細胞に与える（ＭａｇｎｕｓｓｏｎおよびＭｏｓｈｅｒ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１３６３−１３７０（１９９８））。フィブロネクチン発現は、創傷治癒中の肉芽組織の血管上でアップレギュレーションされ（Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７９：２６９−２７６（１９８２））、フィブロネクチンのアイソフォームであるＥＤ−Ｂスプライス変異体は、胎児および腫瘍組織の血管上には優先的に発現されるが、静止期の正常成人血液細胞には発現されない（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５９：６１２−６１８（１９９４）；Ｋａｃｚｍａｒｅｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８：１１−１６（１９９４）；Ｎｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２７１−１２７５（１９９７））。これらの観察により、フィブロネクチンが、血管新生に役割を果たし得ることが示唆される。さらに、フィブロネクチンを欠失した動物は、脊索および体節の欠失、並びに不適切に形成された脈管を含む多くの欠陥のために発生の初期に死亡する（Ｇｅｏｒｇｅら、上記、１９９３）。しかし、本開示前には、脈管形成または血管新生におけるフィブロネクチンの直接的な機能的役割は確立されていなかった。
【００２５】
数個のインテグリンがフィブロネクチンに結合し（Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ  ６９：１１−２５（１９９２））、インテグリンα５β１が、一般に、フィブロネクチンに選択的である（Ｐｙｔｅｌａら、Ｃｅｌｌ  ４０：１９１−９８（１９８５））。研究により、インテグリンα５サブユニットをコードしている遺伝子の欠失は、マウスの胚に致死的であり、完全な後体節の不在およびいくつかの血管および心臓の欠陥と関連のあることが実証された（Ｙａｎｇら、上記、１９９３；Ｇｏｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：４３０９−４３１９（１９９７））。しかし、インテグリンα５β１が血管発達の調節、または特に血管新生の調節に直接的な役割を有するかどうかは不明であった。
【００２６】
本明細書に開示したように、フィブロネクチンおよびその受容体のα５β１インテグリンの両方が、直接的に血管新生を調節する。さらに、フィブロネクチンとα５β１の特異的相互作用は、血管新生に対するこれらの２つの分子の寄与の中核を成す。インテグリンα５β１は、インテグリンαＶβ３の経路と同じであるが、αＶβ５に関与する経路とは異なる血管新生経路に関与する。α５β１とフィブロネクチンの特異的結合を妨害する物質は、成長因子刺激血管新生および腫瘍で起こる血管新生を低減または阻害でき、よって悪性新生物を含む様々な病理状態の治療に有用であり得ることが本明細書にさらに開示される。
【００２７】
フィブロネクチンの中心細胞結合ドメインおよびその受容体α５β１の血管新生における関与を本明細書に開示する。インテグリンα５β１およびフィブロネクチンの発現は両方共、ヒト腫瘍の血管上および成長因子刺激組織で有意に増強されたが、これらの分子は、正常ヒト血管および非刺激組織上では最小限に発現された（実施例Ｉ）。さらに、フィブロネクチンの中心細胞結合ドメインに結合する抗体拮抗剤および抗α５β１抗体、並びに２つの別のクラスのα５β１拮抗剤（ペプチドおよび非ペプチド有機低分子拮抗剤）が、ヒヨコ絨毛尿膜（ＣＡＭ；実施例ＩＩ）およびＳＣＩＤマウス上で増殖させたヒト皮膚（実施例ＩＩＩ）において成長因子刺激血管新生を遮断した。インテグリンα５β１の拮抗剤は、ｂＦＧＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ−８刺激血管新生を遮断したが、ＶＥＧＦ誘導血管新生には最小限の効果しかなかった。これらの各α５β１拮抗剤は、腫瘍血管新生を阻害し、動物モデル系で腫瘍は減退した（実施例ＩＶ）。フィブロネクチン機能の拮抗剤も、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ血管新生の両方を遮断し、これは、他のフィブロネクチン受容体がＶＥＧＦ媒介血管新生に関与していることを示唆する。
【００２８】
本明細書に開示した結果は、血管新生におけるインテグリンα５β１およびフィブロネクチンの発現は協調していることを実証する。各分子の発現が、非刺激静止血管上のように最少である場合、各分子の拮抗剤およびフィブロネクチンのニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）への添加は、血管新生にほとんど効果がなかった。これに対し、成長因子で刺激後、α５β１およびフィブロネクチンの発現は増強され、血管は、いずれかの分子の拮抗剤として作用する物質に対して、並びに外因的に加えたフィブロネクチンの作用に対して感受性になる。ＶＥＧＦ刺激はα５β１発現を増加させず、これは、ＶＥＧＦ血管新生はα５β１の拮抗剤に不応性であるという観察を支持する。この結果は、内皮細胞上でのインテグリンα５β１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が、ｂＦＧＦに応答してアップレギュレーションされ（ＣｏｌｌｏおよびＰｅｐｐｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１２：５６９−５７８（１９９９））、ＶＥＧＦはα５β１発現をアップレギュレーションできなかった（Ｓｅｎｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１−７（１９９６）；Ｓｅｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３６１２−１３６１７（１９９７））という報告により実証される。従って、血管新生におけるインテグリンα５β１およびフィブロネクチンの機能的役割は、その成長因子誘導発現の直接的な結果のようである。
【００２９】
ＲＧＤインテグリン結合部位を含む、フィブロネクチンの中心細胞結合断片に対して指向された抗体は、血管新生を阻害した（実施例ＩＩおよびＩＩＩ）。これらの抗体は、フィブロネクチンへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害し、結果として、潜在的な下流のシグナル伝達事象をｉｎ  ｖｉｖｏで妨害するようである。α５β１依存性のフィブロネクチンおよびその細胞結合ドメインによるｂＦＧＦ血管新生の刺激により、α５β１は血管新生においてフィブロネクチンのインテグリン受容体であることが示される。ＶＥＧＦ刺激血管新生におけるインテグリンα５β１発現の不在は、フィブロネクチンがＶＥＧＦ血管新生を増強できない原因であるようだが、フィブロネクチンの細胞結合ペプチドに対して指向された抗体はＶＥＧＦ血管新生を遮断した。本明細書に開示した結果は、血管新生におけるフィブロネクチンの直接的なｉｎ  ｖｉｖｏの役割の最初の実証である。
【００３０】
本明細書に開示した結果は、血管新生の促進における細胞外マトリックスタンパク質の役割を明確に同定した最初のものである。コラーゲンは、血管発達に役割を果たすことが示唆されたが、無傷コラーゲンは内皮細胞の伸長、生存または増殖を支持しない（ＩＪａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１：３６２１−３６３１（１９９８）；Ｉｓｉｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１７５：１４９−１５５（１９９９））。事実、コラーゲン受容体インテグリンα２β１およびα１β１の阻害は、大血管の形成を防ぎ、小血管の形成を促進した（Ｓｅｎｇｅｒら、上記、１９９７）。これらの結果は、α２β１、α１β１、およびそのリガンドのコラーゲンが、新血管の成長促進よりも、血管成熟に関与することが示唆される。
【００３１】
血管新生におけるインテグリンα５β１の機能的役割は、α５β１のそのリガンドへの結合に拮抗する物質が、成長因子により誘導された血管新生および腫瘍断片の血管新生を遮断することを実証することにより確立された（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）。α５β１と同様、αＶβ３は、フィブロネクチン受容体として作用し得るが（Ｃｈａｒｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：２７９５−８００（１９９０））、本明細書に開示されたように、内皮細胞は、両方のインテグリンが発現された場合、α５β１を主要なフィブロネクチン受容体として使用する。
【００３２】
α５β１およびαＶβ３の発現は、類似の成長因子により調節され、両方のインテグリンが、ｂＦＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−８および腫瘍誘導血管新生に有意な役割を有するが、ＶＥＧＦ誘導血管新生には有意な役割を有さない（実施例参照；また、Ｂｒｏｏｋｓら、上記、１９９４ａ；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ  ７９：１１５７−１１６４（１９９４ｂ）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、上記、１９９５参照）。血管新生動物モデルでのその拮抗剤の組合せが相加的でも相乗的でもないので、これらの２つのインテグリンは同じ血管新生経路に影響を及ぼすようである（実施例ＩＩ参照）。
【００３３】
インテグリンの細胞外マトリックスタンパク質への結合は、細胞の接着、移動、侵入、生存および増殖を促進し（Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７）、αＶβ３の拮抗剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで増殖内皮細胞のアポトーシスを誘導する（Ｂｒｏｏｋｓら、上記、１９９４ｂ；Ｓｔｒｏｍｂｌａｄら、上記、１９９６）。本明細書に開示したように、α５β１拮抗剤はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで成長因子刺激内皮細胞のアポトーシスを誘導する。
【００３４】
α５β１の拮抗剤は、腫瘍の血管新生および増殖を遮断し（実施例ＩＶ）、これはインテグリンαＶβ３の拮抗剤と類似している（Ｂｒｏｏｋｓら、上記、１９９４ｂ、１９９５）。ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍原性および血管新生についての研究（実施例ＩＶ）に使用した腫瘍細胞系は、腫瘍細胞に対する拮抗剤の任意の直接的効果を無視するためにインテグリンα５β１陰性であり；ＣＡＭ上でのその培養の経過を通じてα５β１陰性を維持した。ＨＴ２９腫瘍は、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦおよびＩＬ−８を含む様々な成長因子を発現するが；ＨＴ２９細胞がｂＦＧＦをも発現するかは不明である。ＶＥＧＦは最も一般的には低酸素状態の腫瘍中心部に結合し、低酸素症により転写的に調節されるが、ｂＦＧＦおよび他の因子は、腫瘍の増殖端と結合する（Ｓｈｗｅｉｋｉら、上記、１９９２；Ｋｕｍａｒら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１０：３０１−３１１（１９９８））。成長因子刺激ＣＡＭで観察されたように、α５β１拮抗剤は、移植腫瘍の根底にあるＣＡＭ上の既存の大血管には影響を与えなかった。これらの結果は、α５β１の、そのリガンド、特にフィブロネクチンへの特異的結合を妨害する物質は、血管新生を低減または阻害できることを実証する。それ故、この物質の使用は、癌患者を含む様々な病理状態に罹患する個体に臨床的利点を与えることができる。
【００３５】
本明細書で使用した用語「インテグリン」は、多種多様な細胞で発現され、細胞外マトリックスの特異的リガンドに結合する細胞外受容体を意味する。インテグリンが結合する特異的リガンドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）またはロイシン−アスパラギン酸−バリントリペプチドを含み得るものであり、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシン、およびフォンウィルブランド因子を含み得る。インテグリンは、αサブユニットとβサブユニットからなるヘテロダイマーのスーパーファミリーを含む。例えば、αＶ、α５等と称される多くのαサブユニット、並びに、例えばβ１、β２、β３、β５等と称される多くのβサブユニットが同定されており、α５β１、αＶβ３およびαＢβ５を含む様々なこれらのサブユニットの組合せが、インテグリンスーパーファミリーに提示される。インテグリンのスーパーファミリーは、例えば、αＶβ３およびαＶβ５を含むαＶ含有インテグリンとして、またはα５β１およびαＶβ１を含むβ１含有インテグリンとして、ファミリーに細分化できる。インテグリンは、線虫、ショウジョウバエ属、両生類、爬虫類、鳥類、並びにヒトを含む哺乳動物を含む広範囲の生物で発現される。
【００３６】
本明細書で開示したように、α５β１の、抗体、ペプチドおよび非ペプチド有機低分子拮抗剤は、血管組織において、α５β１インテグリンの、そのリガンド、特にフィブロネクチンとの特異的結合を妨害でき、血管新生を低減または阻害できる（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ参照）。α５β１とそのリガンドの特異的結合を妨害するこのような分子は、本明細書で一般に、「物質」、「物質拮抗剤」または「α５β１拮抗剤」と呼ぶ。本明細書に使用した「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、２つ以上の分子の相互作用に関して使用する場合、分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下、およびｉｎ  ｖｉｖｏ条件を擬似し得る適切な条件下でインキュベーションした場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で互いに結合できることを意味する。「特異的に相互作用する」および「特異的結合」という語も、特異的に結合する分子を意味するために使用される。
【００３７】
本発明の目的のために、互いに特異的に相互作用する分子は、一般に、例えば、インテグリンとその特定のリガンドまたはリガンド群、または抗体とその特定の抗原または抗原群を含む、受容体型分子とそのリガンドである。しかし、α５β１拮抗剤とα５β１インテグリンが相互作用し得るように、例えば、αインテグリンサブユニットとβインテグリンサブユニットなどの他の分子も、特異的に相互作用して、インテグリンヘテロダイマーを形成することが認識される。２つの分子が特異的に相互作用するかどうかを決定する方法が本明細書に開示され、結合親和性および特異性を決定する方法は当技術分野でよく知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、抗体：実験マニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、１９８８）；Ｆｒｉｅｆｅｌｄｅｒ、「物理生化学：生化学および分子生物学への適用」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよび共同研究者１９７６）参照）。
【００３８】
α５β１とフィブロネクチンの特異的結合を妨害する、抗体、ペプチドおよび非ペプチド有機低分子拮抗剤を例示する（実施例ＩＩ参照）。本明細書で使用した用語「妨害」は、受容体とそのリガンドの特異的相互作用に対する物質拮抗剤の作用に関して使用する場合、相互作用の親和性が、物質の非存在下で起こる結合レベル以下に減少したことを意味する。当業者は、受容体とそのリガンドの結合が、このような分子群の間で起こる動的関係であり、任意の特定の時間に一定比率の受容体とリガンドが結合することを認識する。受容体とそのリガンドの特異的相互作用を妨害する物質は、それ故、一定の時間に起こるこのような相互作用の相対数を減少させ、すべてのこのような結合を完全に阻害する場合もあり得る。
【００３９】
「拮抗剤」という用語は、本明細書において、受容体とそのリガンドの特異的相互作用を妨害し得る、抗体、ペプチドまたは非ペプチド有機低分子であり得る物質を意味するために使用される。α５β１とフィブロネクチンの結合を妨害でき、それによってα５β１インテグリンとフィブロネクチンの結合を低減または阻害する抗α５β１インテグリン抗体は、α５β１拮抗剤の一例である。拮抗剤は、α５β１のそのリガンドへの結合の競合的阻害剤または非競合的阻害剤として作用できる。
【００４０】
拮抗剤が、受容体とそのリガンドの結合を完全に阻害したか、または特定のアッセイの検出限界以下に結合を減少させたかを識別することは困難であり得る。従って、「妨害」という用語は、本明細書で広義に使用し、受容体とそのリガンドの特異的結合の低減または阻害を包含する。さらに、物質は、受容体とそのリガンドの特異的結合を、例えば、リガンド結合部位に結合してリガンド結合を妨害することによる場合；受容体のリガンド結合部位以外の部位に結合するが、受容体へのリガンドの結合を立体的に妨害することによる場合；受容体に結合し、コンフォメーションまたはその他の変化を受容体に引き起こし、リガンドの結合を妨害することによる場合；または他の機序による場合を含む、様々な機序により受容体とそのリガンドの特異的結合を妨害できる。同じように、物質は、リガンドと結合し、またはリガンドと相互作用して、受容体とのその特異的相互作用を妨害できる。α５β１インテグリンとそのリガンドの特異的相互作用を妨害する本明細書に開示した方法には、妨害が起こる機序の解明は必要ではなく、作用機序は全く提唱していない。
【００４１】
α５β１インテグリンのそのリガンドへの結合の拮抗剤として作用する物質は、抗体、特に抗α５β１抗体または抗フィブロネクチン抗体であり得る。本明細書で使用した用語「抗体」は、その広義の意味で使用し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにこれらの抗体の抗原結合断片を含む。抗インテグリン抗体、特に抗α５β１抗体に関して、用語「抗原」は、インテグリン、特にα５β１インテグリンタンパク質、ポリペプチド、またはそのペプチド部分を意味し、これはＲＧＤ結合ドメインの一部または全部を含んでも含んでいなくてもよい。抗α５β１抗体、またはその抗原結合断片は、α５β１インテグリンに少なくとも１×１０５Ｍ−１、一般的には少なくとも１×１０６Ｍ−１、特に少なくとも約１×１０７Ｍ−１の特異的結合活性を有することを特徴とする。α５β１インテグリンに特異的結合活性を保持する、抗α５β１抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄまたはＦｂ断片は抗体の定義内に含まれる。
【００４２】
本明細書に使用した用語「抗体」は、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、並びに、その抗原結合断片を含む、天然抗体並びに非天然抗体を包含する。このような非天然抗体は、固相ペプチド合成を使用して作成できるか、組換え産生できるか、または、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）（これは参考として本明細書に取込む）に記載のように、可変重鎖および可変軽鎖の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、単鎖抗体、および二機能性抗体を製造するこれらおよび他の方法は、当業者にはよく知られている（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄら、タンパク質工学：実践的なアプローチ（ＩＲＬ出版１９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、抗体工学、第２版（オックスフォード大学出版１９９５）；その各々を参考として本明細書に取込む）。
【００４３】
抗α５β１抗体を含む抗インテグリン抗体は、ケミコン社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）などの市販業者から購入できるか、または、天然源から調製するか、または組換え産生したヒトインテグリン、マウスインテグリン、または他の哺乳動物もしくは非哺乳動物インテグリンであり得る実質的に精製された全長インテグリン、あるいは、ＲＧＤ結合ドメインの一部を含み得るインテグリンのペプチド部分、例えば合成ペプチドを、免疫原として使用して産生できる。ヒトα５β１などのインテグリンの非免疫原性ペプチド部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリヤー分子にハプテンを結合させることにより、または、融合タンパク質としてペプチド部分を発現させることにより免疫原性にすることができる。様々な他のキャリヤー分子およびハプテンをキャリヤー分子に結合させる方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上記、１９８８）により記載されている。
【００４４】
本発明の方法の実施に特に有用な抗体は、α５β１インテグリンに特異的に結合する抗体である。このような抗体が、αＶβ３またはαＶβ５などの別のインテグリンに結合する親和性よりも少なくとも一次数高い親和性でα５β１に結合する場合、特に有用である。また、抗フィブロネクチン抗体、特に、α５β１インテグリンへのフィブロネクチンの結合は妨害するが、αＶβ３または他のインテグリンへの結合は妨害しない、抗フィブロネクチン抗体も本発明の方法に有用であり得る。
【００４５】
本明細書で開示したように、抗α５β１抗体を使用して、病理状態で起こる成長因子刺激血管新生の領域を検出した（実施例Ｉ参照）。α５β１インテグリン発現の存在または量は、例えば、少なくとも部分的に望ましくない血管新生を特徴とする病理を有することが疑われる個体の組織または器官から得られた組織切片であり得る、組織サンプルで同定できる。α５β１インテグリン発現の存在またはレベルの同定は、よく知られているイムノアッセイまたは免疫組織化学的方法を使用して実施できる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８）。抗α５β１抗体、特に、α５β１インテグリンへのリガンドの結合を防ぐ抗体も、スクリーニングアッセイに使用して、リガンドのインテグリンへの結合に競合する物質を同定できる。本明細書に開示したように、このような物質は、α５β１媒介血管新生の阻害に有用であり得る。
【００４６】
α５β１に特異的に結合するペプチドも、α５β１の、フィブロネクチンを含むそのリガンドへの結合の拮抗剤として有用である。抗α５β１抗体について議論したように、抗体がαＶβ３などの別のインテグリンに結合する特異性よりも少なくとも２倍高い特異性でα５β１に結合する、α５β１に特異的に結合するペプチドが、本発明の方法に有用であり得、α５β１に少なくとも約５倍高い特性を有する場合にはより有用であり、αＶβ３などのインテグリンよりもα５β１に少なくとも約一次数高い特異性を有する場合には特に有用である。従って、αＶβ３またはαＶβ５に対するその比較的高い結合親和性に基づいて同定された様々なＲＧＤおよびＲＬＤ含有ペプチド（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３５４２）は、本明細書に定義する、α５β１のリガンドに結合するα５β１のペプチド拮抗剤とは考えない。
【００４７】
用語「ペプチド」は、本明細書で広義に使用し、ペプチド結合またはペプチド結合に類似する結合により連結したアミノ酸またはアミノ酸類似体のオリゴマーおよびポリマーを含む。従って、用語「ペプチド」は、一般に約２〜約５０のアミノ酸を含むペプチド、一般に約２０〜約５０またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および、例えば翻訳後修飾されるペプチドまたはポリペプチドを含み得る一般的にタンパク質と呼ばれる分子を含む。従って、ペプチド拮抗剤は、２つ以上のアミノ酸を含み、これはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、化学修飾アミノ酸であってよく、これは天然もしくは非天然アミノ酸、またはアミノ酸類似体であり得る。血管新生を低減または阻害するα５β１拮抗剤として有用なペプチドは、よく知られている化学合成法（例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、上記１９９３、１９９４）を使用して調製できるかまたは市販業者から購入できる、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。
【００４８】
α５β１のそのリガンドへの結合を妨害する物質は、ペプチドの構造を擬似した有機分子であるペプチド擬似体を含む、非ペプチド有機低分子；またはビニル性ペプトイドなどのペプトイドであり得る。α５β１インテグリンの、リガンドのフィブロネクチンへの結合の特異的相互作用の拮抗剤として作用する非ペプチド有機低分子は、例えば、一般構造（Ｓ）−２−フェニルスルホニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピロ−｛４，５｝−デカ−２−エン−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸を有するヘテロ環であってよく、これは本明細書で構造：（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸（実施例ＩＩおよびＩＶ；米国特許第５，７６０，０２９号参照）を有するＳＪ７４９と称される分子により例示される。本明細書に開示したように、ＳＪ７４９は、α５β１のフィブロネクチンへの結合を妨害し、用量依存的に血管新生を低減または阻害した（図２参照）。本発明の方法に有用なさらなる非ペプチド有機低分子α５β１拮抗剤は、例えば、ＳＪ７４９の化学修飾誘導体を含む、上記に開示した構造を有するヘテロ環の化学修飾誘導体、または非ペプチド有機低分子の他のライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる（下記参照）。
【００４９】
本発明は、組織のα５β１インテグリンを、α５β１インテグリンの、組織で発現されたリガンドへの特異的結合を妨害する物質と接触させ、よって組織の血管新生を低減または阻害することにより、組織の血管新生を低減または阻害する方法を提供する。特に有用な物質拮抗剤は、α５β１のフィブロネクチンへの結合を妨害するが、α５β１インテグリン以外のインテグリンへのリガンドの特異的結合は実質的に妨害しない。本明細書で開示したように、α５β１インテグリンのそのリガンドへの結合を妨害する、抗α５β１抗体、ペプチドまたは非ペプチド有機低分子などの物質は、成長因子刺激血管新生および腫瘍増殖中に起こる血管新生を低減または阻害できる（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ参照）。
【００５０】
本明細書で使用した「低減または阻害」という語句は、血管新生に関して使用する場合、物質拮抗剤の存在下で起こる新血管新生の量が、外因的に加えた物質拮抗剤の非存在下で起こる血管新生の量以下に低減することを意味する。「低減」および「阻害」という用語は、血管新生の量が特定のアッセイ法により検出できるレベル以下に減少し得るものであり、その結果として血管新生が非常に低いレベルにまで減少したのか、または完全に阻害されたのかを決定することが不可能であり得るので、一緒に使用する。それにも関わらず、α５β１インテグリンのそのリガンドへの結合を妨害する物質に応答して、組織の血管新生が、対応する非治療組織の血管新生のレベル以下に低減することは、使用した特定のアッセイから明らかになる。本明細書に開示した免疫組織化学的方法を含む（実施例Ｉ）、組織の血管新生量を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００５１】
本発明の方法は、α５β１の、組織のフィブロネクチンなどのリガンドへの結合を妨害することにより、例えば、網膜、網膜黄斑または角膜などの眼組織；例えば乾癬が生じた皮膚；滑膜組織；骨；または腸組織における血管新生の低減または阻害に有用である。さらに、本発明の方法は、良性または悪性であり得、悪性である場合、転移性新生物であり得る、新生物の血管新生の低減または阻害に有用である。本発明の方法の実践に有用な物質は、ペプチド、例えば、アミノ酸配列ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）を含むペプチド；抗体、例えば、抗α５β１インテグリン抗体またはそのα５β１インテグリン結合断片；または非ペプチド有機低分子、例えば、（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸（ＳＪ７４９）であり得る。所望であれば、細胞毒素の連結が、物質のα５β１インテグリンへの特異的結合能を実質的に減少させず、α５β１のそのリガンドへの結合を妨害しない場合、リシンまたは化学療法薬などの細胞毒素に連結できる。
【００５２】
本発明はまた、組織を、α５β１インテグリンに特異的に結合する物質と接触させ、組織の血管と結合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出し、よって組織の血管新生の存在を同定することにより、組織の血管新生の存在を同定する方法も提供する。物質は、ペプチド、抗体、または非ペプチド有機低分子であってよく、これは直接的に検出できるか、またはその存在を特定の試薬との相互作用により検出できる、検出標識に連結できる。このような方法は、例えば、胚組織または胎盤組織などの正常組織、肉芽組織、および病理状態に関与する組織を含む、様々な組織における血管新生の存在の同定に有用である。従って、本発明はさらに、個体の組織のα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を特徴とする病理状態を診断する方法を提供する。
【００５３】
本明細書で広く用いられる「病状」という用語は、少なくともある程度、組織での新生血管新生におけるα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を特徴とする任意の病的な物理的症状または生理学的症状を意味する。このような病状としては、新生物（実施例Ｉを参照）、血管新生に関連する糖尿病網膜症および黄斑変性などの眼科疾患、乾癬および血管腫などの皮膚疾患、歯肉炎、慢性関節リウマチおよび骨関節炎などの関節炎症状、ならびに炎症性腸疾患などがあげられる。本発明の診断方法または他の方法を施すことが可能な他の病状は、実施例Ｉに記載されているような方法、あるいは当技術分野で知られている方法を使用することによって確認することができる。
【００５４】
本明細書で広く用いられる「新生物」という用語は、新たに生じたいかなる病的組織腫瘍をも意味する。本発明においては、新生物は腫瘍の形成を生じ、それは部分的に血管新生を特徴とする。新生物は、例えば、血管腫、神経膠腫、奇形腫等の良性、あるいは、例えば、癌腫、肉腫、膠細胞腫、星状膠細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫等の悪性新生物でありうる。「腫瘍」という用語は、一般に、良性新生物または悪性新生物を意味するために用いられる。また、「癌」という用語は、一般に、悪性新生物を意味するために用いられ、それは、転移性または非転移性であり得る。本発明の方法を使用により診断可能な悪性新生物には、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌および卵巣癌などの癌腫、並びに骨肉腫およびカポジ肉腫などの肉腫があるが、その場合、その新生物は、少なくとも、新たに血管を形成することによる、α５β１発現に関連した血管新生を特徴とする（実施例ＩおよびＩＩＩを参照）。
【００５５】
診断方法は、例えば、病状を有する個体から血管新生を示す組織の試料を入手し、α５β１インテグリンに特異的に結合する薬剤とその試料とを接触させ、組織の血管に関連するα５β１インテグリンに対するその薬剤の特異的結合を検出することによって実施することができる。本発明の方法を使用して診断される個体または治療される個体は、α５β１インテグリン発現に関連した血管新生を示す任意の個体であり、したがって、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシまたはヤギをはじめとする哺乳類、鳥類、あるいは他の動物などの脊椎動物、特に、商業上重要な動物または飼育された動物であってよい。
【００５６】
また、個体の組織における血管新生を特徴とする病状を診断する方法は、病状を有する可能性のある個体に、α５β１インテグリンに特異的に結合する薬剤を投与し、組織の血管に関連したα５β１インテグリンに対するその薬剤の特異的結合を検出することことにより実施することができる。その薬剤は、例えば、一成分に薬剤を結合することによって検出可能に標識化することができ、それは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤の特異的な結合が検出されるかどうか、あるいは、薬剤が結合している可能性がある組織が、例えば、生検によって取り出され、ｅｘ  ｖｉｖｏで試験されるかどうかに基づいて選択される。
【００５７】
薬剤拮抗剤を標識化するのに有効な成分は、放射性核種、常磁性物質、Ｘ線減衰物質、蛍光性分子、化学発光性分子もしくは発光性分子、ビオチンなどの分子、または、例えば、酵素に対する基質もしくは抗体に対するエピトープなど、特定の試薬との反応で視覚化することが可能な分子であってよい。その成分はよく知られた方法を使用して薬剤に結合させることができるが、それは、部分的に、その薬剤およびその成分の化学の性質に基づいて選択される。例えば、成分がヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）配列などのアミノ酸配列であり、かつ、薬剤がペプチドである場合、Ｈｉｓ６配列はペプチドの一部として合成され、Ｈｉｓ６成分へのニッケルイオン試薬の結合によってＨｉｓ６標識化薬剤を確認することができる。さらに、成分を薬剤に化学的に結合する方法も利用可能である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）を参照、なお、本文献は引用により本明細書に援用する。）。
【００５８】
特異的に結合する薬剤は、放射性核種画像診断、陽電子射出断層撮影法、コンピュータ断層撮影法または磁気共鳴画像方法などのｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断方法の使用により個体中で検出することができる。また、特異的結合薬剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法の使用によって検出することも可能である。この場合、投与後、個体から組織の試料を得て、試料中の薬剤の特異的結合を検出する。試料中のα５β１インテグリンに特異的に結合している薬剤は、例えば、放射性核種成分によって放出された放射能の検出などにより薬剤を検出することによって、あるいは、成分の存在を検出することによって、直接検出することが可能である。また、特異的結合薬剤は、さらにそれを薬剤と特異的に相互作用する試薬と接触させるか、または薬剤に結合する成分と接触させて、その薬剤と試薬との相互作用または標識を検出することにより間接的に検出することができる。例えば、特に成分が薬剤に結合する場合、特異的に成分に結合する抗体との接触によってその成分を検出することが可能である。その成分は、例えば基質であってよく、それは、その存在が検出され得る成分と相互に作用し変化する酵素と接触させる。アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ等などの酵素の使用をはじめとするこのような間接的検出システムは、特定の種類の薬剤に対して特異的成分を取り込む方法または結合する方法として、当技術分野でよく知られており、かつ購入可能である。
【００５９】
また、本発明は、組織で発現されるリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を阻害する薬剤を個体に投与し、それにより個体の組織における血管新生を低減または阻害する、個体の組織における血管新生の低減方法ならびに阻害方法を提供する。同様に、本発明は、個体における血管新生に関連した、病状に関連した組織におけるリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を阻害する薬剤を個体に投与し、それによって組織における血管新生を低減または阻害し、結果的に病状の重症度を低減することによる、病状の重症度を低減する方法を提供する。
【００６０】
本明細書では、「病状の重症度の低減」という用語は、病状に関連した好ましくない臨床上の徴候または症状を改善することを意味する。病状の重症度の減少は、適当な酵素量またはサーキュレーティング抗原もしくは抗体を測定するために用いることができる血液検査、新生物の増殖速度または大きさの減少を測定するために用いることができる画像診断検査、あるいは、糖尿病患者における網膜の血管数の減少を確認するために用いることができる眼科的方法などのルーチンの臨床試験を含む様々な方法によって検出可能である。このような臨床試験は、治療されている特定の病状に基づいて選択される。さらには、治療を受けている患者が述べたコメント、例えば、関節炎を患っている患者が疼痛をあまり感じないか、またはより大きな関節可動性を有するというコメント、あるいは、糖尿病網膜症または血管新生による黄斑変性を患っている患者がよりはっきりと見ることができるというコメントなどに基づいて、病状の重症度の減少を確認することができる。
【００６１】
例えば、診断方法または治療方法において、α５β１インテグリンのそのリガンドへの特異的結合を阻害する薬剤を生物個体に投与する場合、その薬剤は、一般に、一種または複数の薬剤および薬学的に許容し得る担体である医薬組成物の形態である。薬学的に許容し得る担体は当該技術分野で公知であり、生理的緩衝食塩水または他の緩衝液または溶媒などの水溶液、あるいはグリコール、グリセリン、オリーブオイルなどのオイル、または注射用有機エステルのような媒介物がある。薬学的に許容し得る担体は、ある程度、例えば、薬剤が、抗体、ペプチドまたは非ペプチド、有機低分子であるか否かなどの薬剤の化学的性質により選択される。
【００６２】
薬学的に許容し得る担体は、例えば、薬剤を安定化するか、もしくはその吸収を増加させるように作用する生理学的に許容し得る化合物、または、所望の他の賦形剤である。生理学的に許容し得る化合物には、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート化剤、低分子量タンパク質、あるいは他の安定化剤または賦形剤がある。生理学的に許容し得る化合物を含む薬学的に許容し得る担体は、例えば、薬剤の投与経路によって、また、薬剤の特定の理学療法化学的特性によって選択することは当業者には知られている。
【００６３】
α５β１インテグリン発現に関連した血管新生は、例えば、糖尿病網膜症を患っている個体の網膜に局所的に生じ、また、例えば、慢性関節リウマチまたは転移性悪性新生物を患っている個体ではさらに全身的に生じ得る。このような血管新生の領域は局在し得るか、またはより全身的に分散し得るので、当業者は、ある程度この因子に基づいて、α５β１インテグリンとそのリガンド（例えば、フィブロネクチン）との結合を阻害する薬剤の投与のために特定の経路および方法を選択する。例えば糖尿病網膜症を患っている個体においては、α５β１インテグリン発現に関連した血管新生が網膜に局在している場合、薬剤は点眼液としての使用に便利な医薬組成物に製剤化することができ、それを直接眼に投与することが可能である。それに対し、転移性癌を患っている個体においては、医薬組成物中の薬剤を、静脈内投与、経口的投与、または薬剤を全身的に循環する他の方法によって投与することができる。したがって、薬剤拮抗剤は、様々な経路、例えば、治療されるべき領域への静脈内投与、経口的投与、または直接投与、例えば、新生物の腫瘍への直接投与、眼に病状がある場合の点眼薬による投与、あるいは、関節に症状がある場合の滑液内投与によって投与することができる。
【００６４】
個体に投与されるα５β１薬剤拮抗剤の量は、その薬剤を診断目的で投与するか、治療目的で投与するかによってある程度決まる。診断方法または治療方法において投与する薬剤の有効量を決定する方法は当技術分野でよく知られており、フェーズＩ、フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ臨床試験が含まれる。薬剤は有効量で投与するが、それは、個体でのα５β１インテグリンのその特異的リガンドに対する特異的結合を阻害するのに十分な量である。一般に、薬剤拮抗剤は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与する。
【００６５】
本明細書に示されたように、ニワトリ胚の２ｍｌ血液容量当たり５μｇの抗α５β１抗体を全身性投与した場合、成長因子刺激血管新生は５０％阻害された（実施例ＩＩ）。同様に、２ｍｌの血液容量当たり１２０ピコモルのＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）を投与した場合、および、２ｍｌの血液容量当たり１５ピコモルのＳＪ７４９を投与した場合には、血管新生は５０％まで阻害された。これらの結果に基づいて、当業者は、ヒトなどの個体における組織の血管新生を効果的に阻害するのに必要とされるこのような薬剤の量を推定することができ、また、最適の投薬量を決定するためにルーチン臨床試験を用いることができる。例えば、ヒトが約６リットルの血液容量を有していると仮定した場合、ヒトに投与する薬剤の量を決定するにあたり、臨床試験で約１５ミリグラム未満の、またはその数値付近の一連の量の抗α５β１抗体が使用可能であることは、当業者には理解される。例えば、薬剤を局所的に投与する場合、投与される推定量は適宜調節することができる。
【００６６】
比較的短期間にわたって、ボーラスまたは静脈内注入のいずれかにより、被検者に薬剤拮抗剤の総量を一回投与として投与することができる。あるいは、分割した治療手順を使用して投与することができ、複数回投与をさらに長期間にわたって行う。個体でのα５β１インテグリン発現に関連した血管新生の単一領域または複数領域に有効量を提供するのに必要とされる特定の薬剤の濃度が、多くの因子に依存することは、当業者に知られており、それらの因子には、被検者の年齢および全体的な健康状態、並びに、投与経路、投与治療回数、ならびに、薬剤が抗体、ペプチドまたは非ペプチド有機低分子であるかどうかを含む薬剤の性質がある。当業者は、これらの因子を考慮して、α５β１インテグリンとそのリガンドとの結合を効果的に阻害するのに有効な量を得るために特定の投与量を調節し、それによって、診断目的においてα５β１インテグリン発現に関連した血管新生の領域において薬剤を検出することができるか、あるいは、治療目的においてこのような血管新生を低減または阻害することができる。
【００６７】
α５β１インテグリン発現に関連した血管新生を検出、低減もしくは阻害するのに有用な薬剤、またはそれらの薬剤を含有する医薬組成物は、少なくともある程度このような血管新生を特徴とする、すべての病状を治療するために用いることができる。様々な経路によって薬剤を投与することは当業者には知られており、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、 関節内投与、滑液内投与、腹腔内投与、あるいは、例えば、皮膚パッチ法もしくは経皮的イオン浸透療法を用いた皮膚を介する受動的吸収または促進性吸収を含む非経口投与がある。さらに、薬剤は、注射による投与、挿管法による投与、坐剤を用いた投与、経口的投与、局所的投与を行うことができ、後者は、例えば、薬剤を含有する軟膏または粉薬を直接適用することによって受動的に吸収される。また、例えば、鼻内噴霧あるいは吸入剤を使用により、促進的吸収を行うことができる。さらに、所望の場合、局所用スプレーとして薬剤を投与することができ、その場合には、組成物の一構成成分は好適な高圧ガスである。また、所望の場合、リポソーム、微小球、または他のポリマーマトリックスにその医薬組成物を取り込むことができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９８４）。なお、この文献は引用により本明細書に組み込む。）例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、調製して投与するのが比較的簡単な、無毒で生理学的に許容し得る代謝可能な担体である。
【００６８】
本明細書に記載したように、α５β１インテグリンとそのリガンドとの結合を阻害する薬剤は、α５β１発現に関連した血管新生を低減、または阻害し得る。例示した薬剤拮抗剤に加えて、他のこのような薬剤も、α５β１インテグリンとそのリガンドとの結合を阻害する薬剤の検出によりを確認することができる。したがって、本発明はスクリーニングアッセイを提供するものであり、それは、組織におけるα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を低減、または阻害する薬剤を確認するのに有用である。
【００６９】
本発明のスクリーニングアッセイは、薬剤とα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を示す組織とを接触させ、組織における血管新生の低減または阻害を検出し、それによって、組織におけるα５β１インテグリン発現に関連した血管新生を低減または阻害する薬剤を確認することによって実施することができる。組織は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｅｘ  ｖｉｖｏで薬剤と接触させることができる（例えば、米国特許第５，６２２，６９９号を参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のスクリーニング法を実施する場合、自動化方法を適応することができ、したがって、α５β１発現に関連した血管新生を低減または阻害し得る潜在的α５β１拮抗剤を確認する分子のライブラリーの試験においてハイスループット・スクリーニングアッセイが可能である。組織は、α５β１インテグリン発現に関連した血管新生が生じるすべての組織であってよく、例えば、悪性新生物組織がある。
【００７０】
分子のライブラリーを調製する方法は、α５β１発現に関連した血管新生を低減または阻害するα５β１拮抗剤を確認する本発明の方法を使用してスクリーニングすることができ、例えば、オリゴヌクレオチドライブラリー（Ｇｏｌｄら、米国特許第５，２７０，１６３号）；ペプチドライブラリー（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、上掲、１９９３，１９９４）；擬似ペプチドライブラリー（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１４：８３−９２（１９９５）；オリゴ糖ライブラリー（Ｙｏｒｋら、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．，２８５：９９−１２８，（１９９６）；Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２，（１９９６）；および、Ｄｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３７６：２６１−２６９，（１９９５）；リポタンパク質ライブラリー（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３９９：２３２−２３６，（１９９６））；糖タンパク質もしくは糖脂質ライブラリー（Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３０：５６７−５７７（１９９５））；または、例えば、一般的構造（Ｓ）−２−フェニルスルフォニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノオメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピロ−｛４，５｝−デカ−２−エン−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸を有する複素環（米国特許第５，７６０，０２９号）を含む、薬剤または他の医薬製剤（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：３５１−３６０（１９９５））を含む化学ライブラリーがある。さらに、種々の分子のライブラリーは、市販で入手することができる。
【００７１】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００７２】
（実施例Ｉ）  血管新生時のα５β１インテグリン発現
本実施例は、α５β１が、ヒトおよびハツカネズミの様々な腫瘍で新たに形成された血管に関連して発現するという免疫組織化学的証明を提供するものである。
【００７３】
６週齢ＣＢ１７雌ＳＣＩＤマウスにおけるヒト正常胸部およびヒト正常結腸、結腸癌腫、乳癌、ヒト腫瘍の異種移植片の５μｍ凍結切片（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）、並びにＭｔａｇマウスからの乳房腫瘍の凍結切片をアセトン中で１分間固定し、風乾し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中で５分間再水和した。これらの切片は、ＰＢＳに溶解した８％正常ヤギ血清中で２時間ブロッキングし、室温（ＲＴ）で２時間、ＰＢＳに溶解した２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、１）５μｇ／ｍｌの抗α５β１細胞質テールポリクローナル抗体（ＡＢ１９２８Ｐ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、および５μｇ／ｍｌのネズミ抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体（ＰＥＣＡＭ；ＭＡ−３１００；Ｅｎｄｏｇｅｎ）；２）５μｇ／ｍｌの抗α５β１モノクローナル抗体、および５μｇ／ｍｌのウサギ抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体（０１６Ｐ；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ；Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ  ＣＡ）；または、３）５μｇ／ｍｌの抗フィブロネクチン細胞結合ペプチドモノクローナル抗体（７８４Ａ２Ａ６；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．；Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）、および５μｇ／ｍｌの抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体（０１６Ｐ）とインキュベーションした。
【００７４】
６回新たに入れ替えた新しいＰＢＳ中に切片を浸漬することによって洗浄し、１：４００〜１：６００希釈のヤギ抗ウサギＦＩＴＣ、および１：４００〜１：６００のヤギ抗マウスローダミン中で一時間室温にてインキュベーションした（交差吸着第２抗体；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ  ＣＡ）。スライドを洗浄し、一滴のフルオロマウントＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＡＬ）にカバーガラスをマウントし、過冷却ＣＣＤカメラ使用の蛍光性照度下のデジタル画像分析を行った。
【００７５】
２色免疫組織化学による内皮細胞マーカーＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）およびインテグリンα５β１の発現に関するヒト結腸癌腫および乳癌の凍結切片の分析は、ＣＤ３１陽性腫瘍血管（赤色に染色）は、さらにインテグリンα５β１発現（緑色に染色）に対しても陽性であることを示し、両方分子に対して陽性の血管は顕微鏡写真撮影によって黄色に見えた。内腔を有する大きな血管、並びに、明らかに内腔を有さない小さな血管も、インテグリンα５β１およびＣＤ３１に対してはっきりと染色された。卵巣癌および膵臓癌の切片は、血管におけるインテグリンα５β１発現の類似パターンを示した。対照的に、正常ヒト結腸および胸部切断中に存在するＣＤ３１陽性血管は、皮膚を含む他の正常成体組織中の血管と同じく、インテグリンα５β１に対して陰性であった。これらの結果は、インテグリンα５β１発現が腫瘍血管においてアップレギュレーションされること、および、これらの腫瘍切片中の大多数の血管はα５β１発現に対して陽性であることを示している。さらに、これらの結果は、α５β１が、正常成体組織の血管においては有意に発現しないことを示唆している。
【００７６】
また、別の血管マーカーである、フィブロネクチン（赤色に染色）およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（緑色に染色）に対して方向性を有する抗体で腫瘍組織を染色した。乳癌および結腸癌腫、並びに正常ヒト胸部および結腸の凍結切片の試験は、腫瘍血管を囲む細胞外マトリックスは、フィブロネクチン発現に対して陽性であることを示した。対照的に、正常組織中の血管は、もしあったとしても、フィブロネクチンをほとんど発現しなかった。卵巣癌および膵臓癌の切片は、血管におけるフィブロネクチン発現の類似パターンを示した。
【００７７】
特に、インテグリンα５β１およびそのリガンドのフィブロネクチンの発現は、ヒト腫瘍切片内の多数の同じ血管において協調してアップレギュレーションされた。ヒト腫瘍組織中のこれら分子の協調発現は、これらのタンパク質間の機能的相互作用の可能性を示している。また、インテグリンα５β１およびフィブロネクチンの発現を、ＳＣＩＤマウスのヒトＭ２１Ｌ黒色腫腫瘍異種移植片およびＰｙＶマウスの自発性乳癌を含む、異常増殖動物モデルの腫瘍血管構造において確認した（ＰｙＶマウスモデルに関しては、Ｇｕｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：９５４−９６１（１９９２）を参照、また、これを引用により本明細書に援用する）。したがって、明らかなインテグリンα５β１およびフィブロネクチンの高発現は、自発性腫瘍の血管構造に関係しており、実験誘発性ヒト腫瘍およびマウス腫瘍を正常組織と比較した。
【００７８】
（実施例ＩＩ）  α５β１およびフィブロネクチンは血管新生に必須である
本実施例は、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンレセプターインテグリンα５β１が腫瘍の血管新生、および成長因子刺激血管新生に関係することを示す。
【００７９】
Ａ．方法
１．細胞接着アッセイ
ＨＴ２９インテグリンα５β１＋細胞、インテグリンα５β１−結腸癌細胞（Ｖａｒｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：７２５−７４０（１９９５））、およびニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ高グルコース中に保持した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ヘパリン、血管内皮細胞増殖補充、２０％ＦＢＳおよびゲンタマイシン含有のＭ１９９培地に保持した。培養培地および試薬は、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）からのものである。
【００８０】
４８ウェル培養容器（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のウェルは、１μｇ／ｍｌのビトロネクチン、２μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ニワトリ胚線維芽細胞およびＨＷＥＣ）、または１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ＨＴ２９−α５＋細胞）で、３７℃において１時間コーティングし、次いで、１時間、ＰＢＳに溶解した２％加熱変性ＢＳＡでブロッキングした。接着緩衝液（１％ＢＳＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２および０．２ｍＭのＭｎＣｌ２を含有した、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハンクス平衡塩類溶液、ＨＢＳＳ）中に、５０μｇ／ｍｌの抗α５β１機能遮断抗体（ＮＫＩ−ＳＡＭ−１，ＪＢＳ５またはＩＩＡ１）溶液２５０μｌ、５０μｇ／ｍｌの抗α５β１非機能遮断抗体（ＨＡ５またはＶＣ５；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、１０μＭの環状ペプチド（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０２０５−２０２１０（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２４：３７３３８０（１９９４））、０〜１０μＭのＳＪ７４９（（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ））））ピロリン酸））、５０μｇ／ｍｌのＬＭ６０９、抗αＶβ３機能遮断抗体、５０μｇ／ｍｌのＰ４Ｃ１０、抗β１機能遮断抗体、５０μｇ／ｍｌの抗フィブロネクチン細胞結合ドメインモノクローナル抗体、または、５０μｇ／ｍｌの抗フィブロネクチンＮ末端モノクローナル抗体を含む３連のウェルに、接着緩衝液２５０μｌ中の細胞５万個を加えた。
【００８１】
３７℃、２０分間で、細胞を容器に付着させた。未付着の細胞は、５００μｌの温めた接着緩衝液で各ウェルを４回洗浄することにより除去した。その後、３．７％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で１５分間その接着細胞を固定し、２％クリスタルバイオレット溶液で染色した。充分に水で洗浄することによって過剰のクリスタルバイオレットを除去した後、プレートを一晩乾燥させた。１０％酢酸中で１５分間インキュベーションすることによってクリスタルバイオレットを抽出し、多数の結合した細胞の指標として５６２ｎｍにおける吸光度を検出した。各実験は、１つの条件当たり３つの試料を用い、３連で実施した。データは、接着のパーセントとして、正の対照（接着培養基単独）±測定の標準誤差、により示した。
【００８２】
２．細胞移動アッセイ
８μｍ孔トランスウェルインサート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）の下部側を２μｇ／ｍｌのフィブロネクチン、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；  Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）または非タンパク質で１時間コーティングし、次いで、ＰＢＳ溶解２％ＢＳＡ溶液で１時間ブロッキングした。その後、下部チャンバー中の５００μｌ移動緩衝液を含有する２４ウェル容器へそのインサートを置いた。移動緩衝液（１％ＢＳＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、および０．２ｍＭのＭｎＣｌ２を含有するＨＥＰＥＳ緩衝化Ｍ１９９培養培地）５０μｌ中の２万５０００のＨＵＶＥＣは、移動緩衝液中に５０μｇ／ｍｌの抗α５β１機能遮断抗体（ＮＫＩ−ＳＡＭ−１、ＪＢＳ５またはＩＩＡ１）溶液５０μｌ、５０μｇ／ｍｌの抗α５β１非機能遮断抗体（ＨＡ５またはＶＣ５）、または、５０μｇ／ｍｌのＬＭ６０９（抗αＶβ３機能遮断抗体）を含むか、あるいは移動緩衝液のみを含む上部チャンバーの２連のインサートに加えた。
【００８３】
３７℃、４時間で、細胞を上部チャンバーから下部チャンバーへ移動させた。非移動性細胞は、吸収チップで上部側を拭きとることによって上部表面から除去した。また、トランスウェルインサートの下部側に移動した細胞をＰＢＳ溶解３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、２％クリスタルバイオレット溶液で染色した。充分に水で洗浄することによって過剰のクリスタルバイオレットを除去した後、移動した細胞数は、１つのインサート当たり３つの代表的な強拡大視野(high power fields)（２００×）で計測した。データは、移動細胞の数±測定の標準誤差として示した。
【００８４】
３．卵におけるニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）血管新生アッセイ
殻下の血管を照らすために１０日齢の有胚鶏卵（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  Ｐｏｕｌｔｒｙ；Ｒａｍｏｎａ  ＣＡ）を灯に透かして調べ、極小の小血管が存在する領域を確認した。ミネラル化殻に小さな空孔をあけ、下部の内殻膜に圧力を加えることによって、ＣＡＭをこの領域の卵殻から下方に遠ざけた。この方法により、エアポケットを卵の広端部から確認された領域へと移動させ、直径約２ｃｍのＣＡＭの環状領域を殻から取り除いた。卵殻に開口部を開け、１μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−８（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、または生理的食塩水で飽和させた直径５ｍｍのコルチゾン酢酸塩の事前処理フィルターディスクをＣＡＭ上に置いた。殻の開口部を接着テープで封じ、その卵を４日間培養した。
【００８５】
２５μｌ中０〜２５μｇの範囲の機能遮断抗α５β１または対照の非機能遮断抗α５β１、２５μｌ中０〜２５μＭの環状ペプチド（ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ；配列番号１）またはスクランブル対照ペプチド（ＣＡＴＡＥＲＷＲＣ；配列番号２；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０２０５−２０２１０（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２４：３７３３８０（１９９４））、２５μｌ中０〜２５μＭのＳＪ７４９、不活性対照低分子、または２５μｌの生理食塩水を、２４時間後に、成長因子飽和フィルターに供した。さらに、抗フィブロネクチン抗体（２５μｌ中２５μｇ）を局所的にＣＡＭに供した。
【００８６】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン断片（最終用量２５μｌ中５９ピコモル）を誘導ＣＡＭまたは非誘導ＣＡＭに供した。また、２４時間後に、α５β１のペプチドまたは低分子の拮抗剤を（最終血清濃度０〜２５μＭで）そのニワトリの血管に静注した。誘導４日目にＣＡＭを回収した。成長因子に応じた血管新生のサイズに無関係な定量指標として、５ｍｍフィルターディスク領域内の血管分岐点を盲検法で３０×の倍率で計測した。血管新生は、成長因子に応じた新しい血管の形成を特徴とする。したがって、血管分岐点の計測は、血管新生指標を得る有用な定量手段である（Ｂｒｏｏｋｓら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）に記載）。一投与群当たり、少なくとも１０個の胚を使用した。各実験は、最低３回実施した。
【００８７】
データは、投与群当たりの血管分岐点の平均数±測定の標準誤差に関して評価した。統計分析は、スチューデントｔ検定を使用して実施した。各投与群の代表的ＣＡＭを１０×倍率で撮影した。いくつかの事例では、卵から切除したＣＡＭ組織を液体窒素中のＯＣＴ（Ｂａｘｔｅｒ；ＭｃＧｒａｗ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）で凍結し、５μｍ切片にカットし、風乾し、固定を除くこと以外は実施例Ｉに記述したように、免疫組織化学的アッセイ用に処理した。
【００８８】
４．インテグリンレセプターリガンド結合アッセイ
ヒト胎盤から精製したインテグリンαＶβ３およびα５β１レセプターは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。血小板インテグリンαＩＩｂβ３は、確立されている方法に従って血小板から精製した。レセプターは、Ｃｏｓｔａｒ（３５９０）高キャパシティー結合プレート上で４℃において一晩コーティングした（１００μｌ／ウェル）。コーティング溶液は廃棄し、プレートは、遮断／結合（Ｂ／Ｂ）緩衝液（５０ｍＭトリス  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２および１％のＢＳＡ）で一回洗浄した。
【００８９】
１１０マイクロリットルのＢ／Ｂ緩衝液を室温にて６０分間加えた。３０μｌのビオチン化細胞外マトリックスタンパク質リガンド（インテグリンα５β１に対するフィブロネクチン、インテグリンαＶβ３に対するビトロネクチン、およびインテグリンαＩＩｂβ３に対するフィブリノーゲン）にＢ／Ｂ緩衝液に溶解したＳＪ７４９またはＢ／Ｂ緩衝液のみのいずれか５０μｌを加えたものを各ウェルに添加し、室温にて２５分間インキュベーションした。Ｂ／Ｂ緩衝液でプレートを２回洗浄し、Ｂ／Ｂ緩衝液に溶解した抗ビオチンアルカリホスファターゼ（１００μｌ／ウェル）を加えて室温で１時間インキュベーションした。最後に、Ｂ／Ｂを用いてプレートをさらに２回洗浄し、続いてホスファターゼ基質（１．５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加した。２ＮのＮａＯＨ（２５μｌ／ウェル）を添加して反応を中止し、４０５ｎｍでの発色色調を記録した。
【００９０】
Ｂ．結果
１．フィブロネクチンの細胞結合ドメインに対する特定の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてフィブロネクチンに対するα５β１インテグリンを発現する細胞の接着および移動を阻害するとともに、ＣＡＭのｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生を阻害する。
腫瘍および成長因子処理組織のα５β１−発現血管にフィブロネクチンが局在化したので、血管新生におけるフィブロネクチンの作用、および機能遮断抗フィブロネクチン抗体の作用を評価した。
【００９１】
まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞接着アッセイを用いて、中央細胞結合ドメインペプチドに対して方向性を有する抗体（抗−ＣＢＰ抗体）であるか、またはフィブロネクチンへの細胞接着を阻害するヒトおよびニワトリのフィブロネクチンのフィブロネクチンＮ−末端ペプチドに対する抗体（抗−ＮＴ抗体）であるかを検出した。抗−ＣＢＰ抗体は、α５β１＋  ＨＴ２９結腸癌細胞、ＣＥＦおよびＨＵＶＥＣを含む、インテグリンα５β１陽性細胞のフィブロネクチンへの接着を著しく阻害した。ＨＵＶＥＣ接着は、抗−ＣＢＰ抗体によって７０±３％阻害された。対照的に、抗−ＮＴ抗体はフィブロネクチンへの細胞接着の阻害について効果がなかった。これらの結果は、α５β１インテグリンを発現する細胞の接着にはフィブロネクチンのＣＢＰドメインが必要であることを示唆している。
【００９２】
インテグリンα５β１の機能遮断モノクローナル抗体拮抗剤（しかし、対照（非機能遮断）抗α５β１インテグリンモノクローナル抗体ではない）は、フィブロネクチンへのＨＴ２９  α５＋（１００±６％）、ＣＥＦ（８９．７±３．４％）、およびＨＵＶＥＣ（７２±２．５％）接着を選択的に阻害したが、ビトロネクチンへの結合は阻害しなかった。しかしながら、ＬＭ６０９、抗αＶβ３特異的抗体は、ビトロネクチンへの細胞の接着を阻害した。これらの結果は、フィブロネクチンへのα５β１発現細胞の接着には、フィブロネクチンに結合するα５β１が必要であることを示唆している。
【００９３】
血管新生が部分的に内皮細胞移動および侵入によるので、ＨＵＶＥＣ移動を遮断する抗α５β１抗体の能力がさらに評価された。インテグリンα５β１に対して誘導された機能遮断抗体は、フィブロネクチン上のＨＵＶＥＣの移動を著しく阻害したが（８７±２％）、この抗体はコラーゲンを含む他のマトリックスタンパク質上の内皮細胞移動には影響を与えなかった。これらの結果は、α５β１インテグリンがフィブロネクチン媒介細胞移動にも関係していることを示唆している。
【００９４】
血管新生に関するフィブロネクチンの機能およびα５β１の機能をＣＡＭアッセイの使用によりｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生時のフィブロネクチン機能を評価するために、１０日齢胚のＣＡＭをｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで刺激した。２４時間後、抗フィブロネクチン抗体をＣＡＭに直接供し、２日後、ＣＡＭを切除し、血管分岐点を計測することにより血管を定量した。
【００９５】
抗−ＣＢＰ抗体は、ｂＦＧＦによって誘導された新しい血管の成長を７５±１０％（ｐ＝０．００２）まで阻害したが、抗−ＮＴ抗体はわずかに最小限の効果しかなかった（３４±１５％阻害、ｐ＝０．０２）。さらに、抗−ＣＢＰ抗体は、ＶＥＧＦ血管新生を７１±７％（ｐ＝０．０２）まで阻害し、抗−ＮＴ抗体も同様に阻害した（８９±１７％阻害、ｐ＝０．０３５）。抗フィブロネクチン抗体とは対照的に、ビトロネクチンに対して誘導される機能遮断抗体は、血管新生に有意な効果はなかった。これらの結果は、フィブロネクチンの細胞結合ドメインが血管新生で重要な機能を果たし、さらに、フィブロネクチンのＮ−末端ドメインが血管新生にある程度寄与している可能性があることを示唆している。
【００９６】
また、フィブロネクチンと血管新生刺激の間の特異的な機能上の関連を示すために、成長因子の存在下または非存在下において、１０日齢胚のＣＡＭにフィブロネクチンおよびビトロネクチンを直接供した。成長因子添加がない場合では、フィブロネクチンもビトロネクチンも血管新生を促進することはなかった。等モル量の無傷ヒトフィブロネクチン、細胞結合ドメインを含むＲＧＤを有するフィブロネクチンの１２０ｋＤ断片、または、細胞結合ドメインを含むＲＧＤを欠失している４０ｋＤのＣ末端キモトリプシンフィブロネクチン断片（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）をｂＦＧＦ刺激ＣＡＭに加え、血管新生を試験した。
【００９７】
無傷フィブロネクチンは、成長因子刺激血管新生を少なくとも４６±１１％（ｐ＝０．０４）促進した。また、フィブロネクチンの１２０ｋＤ細胞結合断片は、血管新生を著しく増強した（６５±２０％；ｐ＝０．０５）。対照的に、フィブロネクチンの４０ｋＤ断片には有意な効果はなかった。さらに、抗−α５β１インテグリン抗体はこのプロセスを逆転させるが、これは、フィブロネクチン増強血管新生がインテグリンα５β１活性に依存していたことを示している（以下を参照）。ｂＦＧＦ刺激ＣＡＭへのビトロネクチンの添加は血管数に関して効果はなかった。ＶＥＧＦ刺激ＣＡＭに対するフィブロネクチンまたはビトロネクチンの添加もまたＶＥＧＦの血管新生効果を高めるものではなかった。これらの結果は、フィブロネクチンおよび内皮細胞インテグリンα５β１が、成長因子誘導血管新生において機能的役割を担っていることを示唆している。
【００９８】
また、ヒヨコＣＡＭにおける成長因子誘導血管新生に影響を与える抗α５β１抗体の能力についても試験を行った。ｂＦＧＦによる血管新生刺激から２４時間後、成長因子飽和フィルターディスクに直接抗α５β１抗体を添加するか、または胚循環に静脈内注射した。インテグリンα５β１の抗体拮抗剤は、ＣＡＭ上のｂＦＧＦ誘導血管新生を少なくとも８８±６％（ｐ＝０．０１）まで遮断したが、対照の非機能遮断抗α５β１抗体には有意な効果はなかった。刺激ＣＡＭへ機能遮断または対照抗α５β１抗体を添加した場合、適用領域内に存在する血管の数または完全性において効果は得られなかった。同様に、抗αＶβ３抗体もまた、ｂＦＧＦによって誘導された血管新生を６５±１０％（ｐ＝０．００８）まで阻害した。
【００９９】
別の成長因子は、別のインテグリンを活性化または利用する血管新生の選択的経路を誘導し得る。例えば、インテグリンαＶβ３は血管新生のｂＦＧＦおよびＴＮＦαの経路に関係しているが、αＶβ５はＶＥＧＦおよびＴＧＦαの経路に関係している。したがって、成長因子誘導血管新生における他のインテグリンの機能をさらに試験した。
【０１００】
ＴＮＦαまたはＩＬ−８で血管新生を刺激した場合、抗α５β１抗体は、各々、平均値７０．４±１２％（ｐ＝０．０４）および８５±４．８％（ｐ〈０．０００１）まで血管新生を阻害し、一部の実験では、抗α５β１抗体は、９９±５％（ｐ＝０．００５）までＴＮＦαおよびＩＬ−８血管新生を阻害した。同様に、インテグリンαＶβ３の抗体拮抗剤は、ＴＮＦαおよびＩＬ−８血管新生を各々９３．６±６．２％（ｐ＝０．００４）および７７±５．２％（ｐ＝０．０００１）まで阻害した。しかしながら、血管新生がＶＥＧＦで誘導される場合、インテグリンα５β１の抗体拮抗剤は血管新生を阻害しなかったが、抗αＶβ５抗体は９９±０．１％（ｐ＝０．００４）までＶＥＧＦ誘導血管新生を阻害した。抗α５β１インテグリンおよび抗αＶβ３インテグリン抗体を併用してｂＦＧＦ刺激ＣＡＭに加えた場合、付加的阻害作用または相乗的な阻害作用は確認されず、これらのインテグリンが同じ血管新生の経路に関係していることがわかった。
【０１０１】
これらの結果は、フィブロネクチンの細胞結合ドメインとα５β１インテグリンとの相互作用が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの成長因子誘導血管新生に関係し、かつ、抗α５β１抗体がこのような血管新生を阻害し得ることを示している。さらに、これらの結果は、インテグリンα５β１が、αＶβ３が調節するのと同様に血管新生の同一経路を調節し、この経路はαＶβ５によって調節された経路とは異なることを示唆している。
【０１０２】
２．ペプチドおよび非ペプチド有機低分子α５β１拮抗剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでα５β１インテグリン発現細胞のフィブロネクチンへの付着および遊走を阻害し、ＣＡＭにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を阻害する。
α５β１インテグリンのペプチドおよび非ペプチド有機低分子拮抗剤の、フィブロネクチンとの細胞相互作用を妨害する能力および成長因子誘発血管新生を妨害する能力も調べた。
【０１０３】
インテグリンα５β１の非抗体拮抗剤はフィブロネクチンへの細胞接着を強力に阻害した。インテグリンα５β１の選択的環状ペプチド拮抗剤ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）は、α５＋  ＨＴ２９結腸癌細胞、ＣＥＦおよびＨＵＶＥＣのフィブロネクチンへの接着を有意に阻害したが、ビトロネクチンへの接着は阻害せず、一方、「スクランブル（アミノ酸の順序を変えた）」対照ペプチド（ＣＡＴＡＥＲＷＲＣ；配列番号２）はフィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する細胞接着にほとんど影響しなかった。ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）はフィブロネクチンへの内皮細胞の遊走を妨害した（対照ペプチドは妨害しなかった）が、コラーゲンなどの他のマトリックスタンパク質への内皮細胞の遊走は妨害しなかった。α５β１の上記環状ペプチド拮抗剤はｂＦＧＦ誘発血管新生も有意に遮断したが（９０±６％；ｐ＜０．０００１）、対照ペプチドは血管新生を阻害しなかった。インテグリンα５β１のペプチド拮抗剤はＶＥＧＦ血管新生を遮断できなかった。
【０１０４】
α５β１選択的非ペプチド有機低分子拮抗剤ＳＪ７４９は、これらの細胞のフィブロネクチンへの接着を用量依存的に遮断したが（α５＋  ＨＴ２９細胞の場合、半最大阻害濃度は０．８μＭ；図１）、ビトロネクチンまたは他の細胞外マトリックスへの細胞接着を遮断する効果はなかった。ＳＪ７４９はα５β１へのリガンドの結合も選択的に阻害し、αｖβ３および他のインテグリンへのリガンド結合を遮断する効力はかなり低かった。インテグリンα５β１の非ペプチド有機低分子拮抗剤は、フィブロネクチンへの内皮細胞遊走も極めて効果的に遮断したが、コラーゲンなどの他のマトリックスへの遊走は効果的に遮断しなかった。またＳＪ７４９は、局所的または全身的に適用すると、ヒヨコＣＡＭでのｂＦＧＦ誘発血管新生を用量依存的に遮断したが（図２）、対照非ペプチド分子は試験した最高用量でも血管新生を阻害しなかった。他のα５β１拮抗剤と同様にＳＪ７４９もＶＥＧＦ血管新生を遮断しなかった。
【０１０５】
これらの結果は、α５β１のペプチドおよび非ペプチド有機低分子拮抗剤が、抗α５β１抗体と同様に、ヒトおよびヒヨコα５β１の機能を有意にかつ選択的に妨害することを実証している。より具体的に述べると、抗体、ペプチドおよび非ペプチド低分子拮抗剤の全身投与により、成長因子誘発血管新生が、ニワトリ胚の血液量２ｍｌにつきそれぞれ約５μｇ、１２０ピコモルおよび１５ピコモルのＩＣ５０で阻害された。これらの結果は、フィブロネクチンレセプターインテグリンα５β１がＣＡＭでの成長因子血管新生の一因になることも裏付けている。
【０１０６】
（実施例ＩＩＩ）  α５β１拮抗剤はＳＣＩＤマウス中のヒト皮膚における成長因子により誘発される血管新生を阻害する
この実施例ではα５β１拮抗剤がＳＣＩＤマウス中のヒト皮膚における血管新生を阻害することを実証する。
【０１０７】
ＳＣＩＤマウスへのヒト皮膚の移植は既に記載したように行った（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９６：１８１５−１８２２（１９９５））。ＳＣＩＤマウスに、ヒト新生児包皮の８ｍｍ×１３ｍｍ片を移植した。新鮮なヒト新生児包皮は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のコオペラティブ・ヒューマン・ティシュー・ネットワーク（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）から入手し、２％ウシ胎仔血清および１％ゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中に保存した。
【０１０８】
移植の４週間後、皮膚が完全に治癒した後に、１μｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、２５μｇ／ｍｌの抗α５β１機能遮断性モノクローナル抗体を含有する１μｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、または２５μｇ／ｍｌの非機能遮断性抗α５β１モノクローナル抗体を含有する１μｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを使って再構成した５０μｌの成長因子枯渇マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社，マサチューセッツ州ベッドフォード）を、移植された各皮膚片の中心部に、皮内注射した。ヒト皮膚は無毛のピンク色であり、マウスは白い柔毛に覆われているので、境界は容易に確認できた。それらのヒト皮膚を凍結培地に包埋し、凍結し、切片を作成した。血管密度の免疫組織化学的分析の項で説明したように、抗ＣＤ３１を使ってヒト血管の存在がわかるように切片を染色した。データを倍率１００倍の顕微鏡視野あたりの平均ＣＤ３１陽性血管数±測定の標準誤差として表した。統計分析はスチューデントのｔ検定を使って行った。
【０１０９】
ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト新生児包皮に、機能遮断性抗α５β１抗体および対照抗α５β１抗体の存在下または不在下で、ｂＦＧＦを含浸させた成長因子枯渇基底膜を皮内注射した。３日後のヒト皮膚をヒトＣＤ３１陽性血管の存在について分析した。機能遮断性α５β１抗体の添加により、上記成長因子によって誘発される血管新生が選択的に遮断され、高倍率視野あたりのＣＤ３１陽性血管数は９４±４．７％減少した（Ｐ＝０．００６）。
【０１１０】
これらの結果は、成長因子に対するヒト血管の血管新生反応にインテグリンα５β１が機能的な役割を果たすこと、および、α５β１結合の拮抗剤が、成長因子によって刺激されるヒト皮膚での血管新生を減少または阻害し得ることを実証している。
【０１１１】
（実施例ＩＶ）  α５β１拮抗剤は腫瘍増殖を阻害する
この実施例ではα５β１拮抗剤がＣＡＭモデル系でヒト腫瘍における血管新生を阻害することを実証する。
【０１１２】
１０００万個の腫瘍細胞をＣＡＭの表面に載せ、その細胞を１週間培養することによって、ヒヨコＣＡＭ腫瘍アッセイを行った。その結果生じた腫瘍を切除し、各５０ｍｇの断片に切断した。これらの断片を新たなＣＡＭに載せ、翌日に２５μｌ中２５μｇの抗α５β１もしくは対照非機能遮断性抗α５β１で局所的に処置するか、または最終血清濃度が２５μＭの環状ペプチドもしくは２５μＭのＳＪ７５４９および２５μＭのスクランブル対照ペプチドもしくは２５μＭの不活性低分子もしくは２５μｌの食塩水を静脈内注射することによって全身的に処置した（ニワトリ胚の血液量は約２ｍｌである）。４８時間後に、ＣＡＭを卵から切除し、腫瘍に入る血管の数を（血管分岐点として）数えた。
【０１１３】
データを処置群ごとの平均血管数（±測定の標準誤差）として表した。各処置群には１実験につき少なくとも１０個の腫瘍が含まれるようにした。代表的な腫瘍を１０倍の倍率で写真撮影した。腫瘍を卵から切除し、各腫瘍について腫瘍重量を測定した。データを処置群ごとの平均腫瘍重量（±測定の標準誤差）として表した。統計分析はスチューデントのｔ検定を使って行った。
【０１１４】
α５β１発現を欠くＨＴ２９結腸癌細胞を１０日齢胚のＣＡＭで培養した。これらの腫瘍細胞はＶＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＮＦαおよびＩＬ−８を含むいくつかの血管新生性成長因子を分泌する（Ａｎｚａｎｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４９：２８９８−２９０４（１９８９）；Ｖａｒｎｅｒら，前掲，１９９５；Ｅｌｌｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３：１０５２−１０５７（１９９８））。潜在的な抗腫瘍効果をインテグリンα５β１拮抗剤の抗脈管構造効果と区別するために、インテグリンα５β１陰性腫瘍細胞を使用した。
【０１１５】
機能遮断抗体による処置は腫瘍関連血管数を有意に減少させた（７０±１０％、ｐ＝０．０２）が、対照抗体による処置では腫瘍血管数は有意に減少しなかった。食塩水処置腫瘍と対照抗体処置腫瘍の間、またはそれらの関連する血管の間に、有意な形態学的または量的相違は観察されなかった。また、機能遮断性抗α５β１抗体による処置は、腫瘍の後退をもたらした。抗α５β１処置腫瘍は、対照処置腫瘍より３２％小さかった（ｐ＝０．０２）。
【０１１６】
インテグリンα５β１の環状ペプチド阻害剤およびインテグリンα５β１の非ペプチド低分子阻害剤の静脈内投与もＣＡＭ上の腫瘍の後退をもたらしたのに対し、対照ペプチドまたは対照非ペプチドで処置した腫瘍のサイズは増加しつづけた。ペプチドおよび非ペプチド阻害剤で処置した腫瘍は、対照処置した腫瘍よりもそれぞれ３１％および５１％小さかった（ｐ＝０．００３）。腫瘍細胞は、実験中は常にインテグリンα５β１陰性のままであったことから、上記の抗腫瘍効果が腫瘍関連血管の標的化に基づくことが示された。
【０１１７】
α５β１＋  Ｈｅｐ３扁平上皮癌細胞での腫瘍血管新生に対するα５β１拮抗剤の効果も調べた。機能遮断性抗α５β１による腫瘍の処置は腫瘍の後退をもたらし、腫瘍は対照腫瘍より４５％小さくなった（ｐ＝０．０４６）。食塩水処置腫瘍と対照抗体処置腫瘍の間に有意な形態学的または量的相違は観察されなかった。
【０１１８】
これらの結果は、血管細胞インテグリンα５β１の標的化によって腫瘍血管新生および腫瘍増殖が阻害されること、および、インテグリンα５β１の拮抗剤が腫瘍増殖および腫瘍誘発血管新生の強力な阻害剤であることを実証している。
【０１１９】
上記の実施例に関して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更を加えることができると理解すべきである。したがって本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、非ペプチド有機低分子ＳＪ７４９の、フィブロネクチンへのα５＋ＨＴ２９腫瘍細胞の接着に対する阻害効果を示す。α５＋ＨＴ２９腫瘍細胞は、α５＋ｃＤＮＡでＨＴ２９細胞を形質移入することにより産生した。
【図２】図２は、ＳＪ７４９の、絨毛尿膜（ＣＡＭ）の血管分枝点形成に対する用量依存的阻害効果を示す。血管新生は、ＣＡＭを塩基性線維芽細胞成長因子で処理することにより刺激した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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