(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液又は血漿を循環させるように意図された第１の区画室の方を向いた表面を持つ半透膜によって分離された２つの区画室を備えた、体外循環により血液又は血漿を処置するための交換器の凝塊形成特性を低減させるための方法において、次の連続的諸段階：
（ａ）  アニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルの溶液から、平膜の形態又は中空繊維の束の形態の半透膜を調製する段階；
（ｂ）  前記交換器の種々の部品を組み立てる段階；
（ｃ）  ポリアクリロニトリルのアニオン基又はアニオン化可能な基とイオン結合を形成することのできるカチオン基を持ち、ポリマー鎖の大きさは、それらポリマー鎖が前記半透膜を通過しないためには十分である複数のポリマー鎖のみを有する少なくとも１種のカチオンポリマーを含有する溶液を調製し；そして、前記の血液又は血漿と接触した状態で配置されるように意図された前記半透膜の前記表面にこの溶液を接触させる段階であって、段階（ｂ）の前又は後に段階（ｃ）を実施することが可能である該段階；
（ｄ）  段階（ｂ）に続いて段階（ｃ）が実施される場合には、前記交換器から前記カチオンポリマーを含有する溶液をパージングする段階；
（ｅ）  前記カチオンポリマーのカチオン基とイオン結合を形成することのできるアニオン基を持つ少なくとも１種の抗凝血剤を、溶解した状態で含有する溶液を調製し、前記血液と接触した状態で配置されるように意図された前記半透膜の前記表面とこの溶液とを接触させる段階であって、段階（ｅ）は段階（ｃ）の後であるが、段階（ｂ）の前又は後に実施する該段階；
（ｆ）  段階（ｅ）を段階（ｂ）に続けて実施する場合は、前記交換器から前記抗凝血剤を含有する前記溶液をパージングする段階；
（ｇ）  アニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルをベースとする半透膜を前記カチオンポリマー及び前記抗凝血剤で被覆した後に交換器を殺菌する段階；
を含む、上記方法。
【請求項２】
（ｂ）前記交換器の種々の部品を組み立てる段階が、前記半透膜又は中空繊維の束をケースに取り付ける段階である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）を段階（ｂ）の前に実施するときの段階（ｃ）の後か、又は段階（ｄ）の後に、半透膜を洗浄して、結合されていない過剰のカチオンポリマーを除去する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
段階（ｅ）を段階（ｂ）の前に実施するときの段階（ｅ）の後か、又は段階（ｆ）の後に、半透膜を洗浄して、結合されていない過剰の抗凝血剤を除去する、請求項１〜３いずれか一項記載の方法。
【請求項５】
半透性支持膜を通過することのできるカチオンポリマー鎖を排除するために、半透性支持膜と同一の半透膜、又は該半透性支持膜のカットオフしきい値以上の大きさのカットオフしきい値を有する半透膜を用いた限外濾過によって、カチオンポリマーを調製する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
カチオンポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１〜５いずれか一項記載の方法。
【請求項７】
堆積されているポリエチレンイミンの量が、膜１ｍ２当り端点を含んで約１ｍｇ〜約３０ｍｇである、請求項１〜６いずれか一項記載の方法。
【請求項８】
アニオン基を持つ抗凝血剤が、抗凝血活性を有するグリコアミノグリカン類に属している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗凝血剤がヘパリンから本質的に成る請求項８記載の方法。
【請求項１０】
堆積されている抗凝血剤の量が、膜１ｍ２当り端点を含んで約２００ＩＵ〜約２０，０００ＩＵである、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、体外循環［とりわけ、透析、血液濾過及び血漿浄化（plasmapheresis，プラスマフェレーシス）］による血液及び血漿の処置法の分野に関する。本発明は、抗血液凝固剤で被覆された半透性支持膜から成る複合半透膜であって、支持体の凝塊形成性を低減させる該複合半透膜に関する。
【０００２】
本発明はまた、体外循環によって血液又は血漿を処置するための、この複合半透膜を備えた諸交換器、及びこれら交換器の製法にも関する。
【０００３】
本明細書を通して、用語「半透膜（semipermeable membrane）」は、平べったい半透膜、又は半透性の中空繊維（hollow fibres）の束を示すのに使用する。また、本明細書を通して、用語「交換器（exchanger）」は、体外循環によって血液又は血漿を処置するための、通常、半透膜によって分離された２つの区画室を有する交換器であって、各々区画室が２つのアクセス（accesses，入口）を備えており、第１の区画室は患者の血液又は血漿を循環させるように意図されており、第２の区画室は使用液体を循環させるように意図されている該交換器を示すのに使用する。
【０００４】
尿毒症患者の血液又は血漿を処置するためには、交換器に接続された体外血液回路を使用する必要がある。血液は、その体外回路中で、重大な血栓性の危険にさらされる。この血栓性の危険は、有効な抗凝血剤によって防ぐ必要がある。このことは、なぜ、たとえ交換器を製造するのに使用する諸材料ができるだけ生物親和性であるように選ばれて、とりわけ、凝血反応が生じないようにされるか又は比較的温和な水準で生じるようにされたとしても、抗凝血剤（通常、分画済みヘパリン又は分画されていないヘパリン）が習慣的に患者の血液中に注入されるかに対する理由である。
【０００５】
従来、患者の中に注入されるヘパリンの量は、１つの処置治療当り７５００国際単位（ＩＵ）から１１，０００ＩＵまで様々であり、或いは、場合によってはそれ以上の量である。
【０００６】
常識的には、血液の抗凝血剤はたまにしか問題を生じない。しかし、患者によっては、ヘパリンが望ましくない二次反応（とりわけ、大出血性の）を引き起こすことがある。文献に報告されている他の副作用は、血小板減少症（血小板の数が低下する）、アレルギー、骨粗しょう症（長期ヘパリン投与の場合に見られる）であり、トランスアミナーゼ（肝性酵素）及び脂肪過剰血が増加する。ヘパリン感受性は患者によって変化し、また、所定の患者に対する時間の関数として変化する。
【０００７】
大出血性の高い危険性を持つ患者のためには、抗凝血剤を用いないで体外血液処置を行う方法がある。この方法は、その回路及び透析器を生理的食塩水で頻繁に洗浄して、そこから、形成されている血栓を洗い流すことによって、体外循環回路中及び透析器中の血液の血栓症を防ぐことにある。この方法は、患者には必ずしも耐えられない、速い血液循環速度を伴う。
【０００８】
更に、抗凝血剤を用いないこの治療は、技術的に困難であり、看護職員を特別に訓練し、操作プロトコル（操作計画）を厳格に遵守し、偶発的出来事を防ぐために透析を厳しくモニタリングし、しかも、偶発的出来事を早期に検知してそれら偶発的出来事に対処することができるようにする必要がある。
【０００９】
体外血液回路中へ抗凝血剤を注入するのを避けることを目的として、血液と接触させた状態で配置されるように意図されている半透膜の表面に、イオン結合又は共有結合によりヘパリンを結合させることによって、半透膜の血液適合性（haemocompatibility，血液融和性）を改善するために、多くの研究が始められてきた［J. Pelissi&eacute;「表面のヘパリン化（surface heparinization）」，ＲＭＢ（１９９４）１６，７，第２９０頁〜２９１頁］。
【００１０】
ヘパリンのイオン結合について記述されている技術は、処置されるべき半透膜の表面に第四級アミン基を作ることを狙いとしている。ヘパリンが硫酸化されていて且つカルボキシル基を持つために、ヘパリンは負に帯電していて、第四級アミン基と反応することができる。しかし、分子間結合が弱いために、ヘパリンが迅速に放出されるのが観察された。この迅速な放出によって、血液と接触しているように意図された表面の非凝塊形成（非トロンボゲニック、antithrombogenic）特性が低下するという不利益、及びヘパリンの放出によって望ましくない副作用の出現が促進されるという不利益が生じる。ヘパリンが連続的に放出されるのを補償するために、多量の抗凝血剤を膜に結合させなければならない。そうすれば、患者の血液の抗凝固を抑制するのが困難となり、コストが増大する。
【００１１】
共有結合について記述されている技術には、血液と接触した状態で配置されるように意図された諸材料の表面にヘパリンを付着させる特別で複雑な化学反応が含まれる。しかし、これらの技術によって、それらの材料の化学的性質が実質的に変成されるのであるから、これらの技術は、一般的に、半透膜にとっては適切でない。なぜなら、これらの技術がこれらの半透膜の基本的特性［例えば、拡散性及び対流性の輸送能力、並びに、望ましくない物質を吸着する能力］を著しく低下させる危険性があるからである。更に、ヘパリンの不活性化によって、非凝塊形成性を低下させる危険性がある。
【００１２】
これまでに市販された唯一の交換器であって、凝塊形成性を低下させるために抗凝血剤で処置した半透膜を備えた該交換器は、バクスター（BAXTER）社製の商品名「DURAFLO」の血液フィルターである。この半透膜は、ポリスルホンをベースとする。
【００１３】
アクリロニトリルと、オレフィンのように不飽和である、少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成るある種の半透膜［例えば、ホスパル（HOSPAL）によって製造された商品名「ＡＮ６９」のコポリマー］は、セルロースでできた膜よりもかなり劣っているものと認識されている。しかし、これらの膜を用いたヘパリンなしの透析を実施するには、大きい血液循環速度［ロバート（Robert）Ｈ．バース（Barth）等による論文「ポリアクリロニトリル膜を用いたヘパリンなし血液透析（Heparin-free hemodialysis with a polyacrylonitrile membrane）」，第XXXV巻  Trans Am Soc Artif Intern Organs（1989）によると、少なくとも４００ｍｌ／分］が必要である。しかし、全ての患者がこれに必ずしも耐えられる訳ではない。
【００１４】
本発明の第１の目的は、アクリロニトリルと、少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成る半透膜に抗凝血剤を結合させ、同時に、これらの膜の他の基本的諸特性［即ち、それらの膜の拡散及び対流移動能力（透水性、アルブミンの重量平均分子量より小さい重量平均分子量を持つ分子に対する選択透過性）；望ましくない物質を吸着するそれらの膜の容量；並びに、それらの膜の機械的諸特性］を許容できる水準に維持することによって、アクリロニトリルと、少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成る半透膜の凝塊形成特性を低下させることにある。
【００１５】
本発明の第２の目的は、体外循環によって処置している間に血液又は血漿の中に迅速に溶出し放出されることなくその抗凝血活性を発揮することのできる抗凝血剤を、アクリロニトリルと少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成る半透膜の表面に、安定的に結合させることにある。
【００１６】
本発明の第３の目的は、アクリロニトリルと少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成る半透膜を備えた交換器によって行われる体外血液処置治療の間、患者に注入される抗凝血剤の量を減少させることにある。ここに、抗凝血剤は半透膜に結合する。
【００１７】
これらの目的を達成すべく、本発明は、半透性の支持膜と、体外循環によって血液及び血漿を処置するのに適した抗凝血剤とを含む半透性複合膜において、
−  前記半透性支持膜が、アニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルから本質的に成り、
−  血液又は血漿と接触した状態で配置されるように意図されている前記半透性支持膜の表面が、
・  前記ポリアクリロニトリルのアニオン基又はアニオン化可能な基とイオン結合を形成することのできるカチオン基を持ち、複数の鎖を有するカチオンポリマーであって、それらの鎖の大きさは、それらの鎖が前記半透性支持膜を通過しないためには十分である該カチオンポリマー；及び
・  前記カチオンポリマーのカチオン基とイオン結合を形成することのできるアニオン基を持つ抗凝血剤；
で連続的に被覆されていることを特徴とする、上記半透性複合膜を提供する。
【００１８】
本発明によると、場合によっては、アクリロニトリルと少なくとも１種のアニオンモノマー又はアニオン化可能なモノマーとのコポリマーから本質的に成る半透膜を備えた交換器によって、体外血液処置治療を実施するのに必要な、結合済み抗凝血剤又は結合していない抗凝血剤の全量を低減することが更に可能となる。ここに、抗凝血剤は半透膜に結合しており、それ故に、体外血液処置治療のコストが低減し、抗凝血剤の望ましくない副作用が減少する。
【００１９】
本発明によると、カチオンポリマーの複数の鎖は、それらの鎖が半透性支持膜を通過しないような十分大きな立体障害を有する。この立体障害によって、これらの鎖が、イオン結合により半透性支持膜の表面に本質的に結合されるのを可能にする。その結果、半透性支持膜を処置するのに必要なカチオンポリマーの量は、適度である。なぜなら、孔の中にカチオンポリマーを貫通させることによる、半透性支持膜のバルク処置（bulk treatment）は必要でないからである。
【００２０】
半透性支持膜を通過することのできるカチオンポリマー鎖を排除するために、半透性支持膜と同一の半透膜、又は該半透性支持膜のカットオフしきい値以上の大きさのカットオフしきい値を有する半透膜を用いた限外濾過によって、カチオンポリマーを調製するのが好ましい。
【００２１】
本発明による半透性複合膜には、三つの主要な利点がある：
−  第１に、イオン結合による抗凝血剤の結合が、ほとんど半透膜の表面においてのみ生じる。結合済み抗凝血剤は、凝固タンパクに接近しやすく、体外循環によって、血液及び血漿を処置している期間の間、有効な抗凝血活性を発揮することができる。
−  第２に、半透性複合膜の助けにより精製された血液又は血漿の凝血時間（ＫＣＴ、活性化されたセファリン時間）は、抗凝血剤を補足しなかった標準の血液又は血漿の凝血時間にかなり近いか、又は同等である。
−  第３に、半透性複合膜の凝塊形成特性を、半透性複合膜が有している半透性支持膜の凝塊形成特性と比べたとき、半透性複合膜の凝塊形成特性は極めて著しく減少する。
【００２２】
本発明の１つの別形によると、カチオンポリマーは、好ましくは親水性であり、且つ、第一級、第二級、第三級又は第四級アミン基を持つポリアミンである。カチオンポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であるのが好ましい。堆積され結合されるＰＥＩの量は、膜１ｍ2当り約１ｍｇ〜約３０ｍｇ（端点を含む）の間で変動し得る。
本発明に適した抗凝血剤には、毒性があってはならない。
【００２３】
本発明のもう１つの別形によると、アニオン基を持つ抗凝血剤は、抗凝血活性を有するグリコアミノグリカン類に属する。この抗凝血剤は、（分画されたか又は分画されていない）ヘパリンから本質的に成る。堆積され結合されたヘパリンの量は、膜１ｍ2当り約２００ＩＵ〜約２０，０００ＩＵ（端点を含む）の間［好ましくは、膜１ｍ2当り約５００ＩＵ〜約１０，０００ＩＵ（端点を含む）の間］で変動し得る。結合されたヘパリンの量は、交換器が意図されている処置の種類：
−  慢性若しくは急性の腎不全を患っている患者に対する間欠的処置（３〜６時間の治療期間）、又は急性腎不全を患っている患者に対する連続的処置（１２〜９６時間）；
−  患者の血管回路に抗凝血剤が全く注入されていない処置；
によって選定される。
【００２４】
結合されたヘパリンの量は、従来の処置の間に患者に注入されるヘパリンの量［この量は、７５００〜１１，０００ＩＵの程度、或いは、体外回路に血液を循環させる前に膜をヘパリン溶液で洗浄する場合は、それ以上の量］より少ない。
【００２５】
本発明は、スルホン酸基、ホスホン酸基、カルボン酸基、硫酸基、リン酸基、及び塩に変えられた対応の基から選ばれるアニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルから本質的に成る半透性の支持膜から半透性の複合膜を調製するのに適している。
【００２６】
ポリアクリロニトリルのアニオン基又はアニオン化可能な基は、酸性スルホン酸基、又は塩に変えられたスルホン酸基であるのが好ましい。
半透性支持膜は、アクリロニトリルとメタリルスルホン酸ナトリウムとのコポリマー［例えば、ホスパル（HOSPAL）製の商品名「ＡＮ６９」を用いたコポリマー］から本質的に成るのが好都合であり、これを用いれば、最高の性能が達成される。
【００２７】
本発明はまた、血液又は血漿を循環させるように意図された第１の区画室の方を向いた表面を持つ半透膜によって分離された２つの区画室を備えた、体外循環により血液又は血漿を処置するための交換器において、第１区画室の方を向いた半透膜の前記表面が、カチオンポリマーとカチオン抗凝血剤とで連続的に被覆されていることを特徴とする、上記交換器にも関する。
【００２８】
半透性複合膜は、平べったい膜の形態であってもよいし、中空繊維の束の形態であってもよい。
本発明による半透性複合膜を備えた交換器は、殺菌して使用できる状態にしておくのが好ましい。それ故に、その交換器の使用者が、いかなる特別な操作を行う必要もない。
【００２９】
本発明はまた、血液又は血漿を循環させるように意図された第１の区画室の方を向いた表面を持つ半透膜によって分離された２つの区画室を備えた、体外循環により血液又は血漿を処置するための交換器の凝塊形成特性を低減させるための方法において、次の連続的諸段階：
（ａ）  アニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルの溶液から、平べったい膜の形態又は中空繊維の束の形態の半透膜を調製する段階；
（ｂ）  前記交換器の種々の部品を組み立てる段階、とりわけ、前記半透膜、又は中空繊維の束をケースに取り付ける段階；
【００３０】
（ｃ）  ポリアクリロニトリルのアニオン基又はアニオン化可能な基とイオン結合を形成することのできるカチオン基を持ち、複数のポリマー鎖のみを有する少なくとも１種のカチオンポリマーを含有する溶液を調製し、しかも、前記ポリマー鎖の大きさは、それらポリマー鎖が前記半透膜を通過しないためには十分であり；そして、前記の血液又は血漿と接触した状態で置かれるように意図された前記半透膜の前記表面にこの溶液を接触させる；段階であって、段階（ｂ）の前又は後に段階（ｃ）を実施することが可能である該段階；
【００３１】
（ｄ）  段階（ｂ）に続いて段階（ｃ）が実施される場合には、前記交換器から前記カチオンポリマーを含有する溶液をパージングする段階；
（ｅ）  前記カチオンポリマーのカチオン基とイオン結合を形成することのできるアニオン基を持つ少なくとも１種の抗凝血剤を、溶解した状態で含有する溶液を調製し、前記血液と接触した状態で置かれるように意図された前記半透膜の前記表面とこの溶液とを接触させる段階であって、段階（ｅ）は段階（ｃ）の後であるが、段階（ｂ）の前又は後に実施する該段階；
（ｆ）  段階（ｅ）を段階（ｂ）に続けて実施する場合は、前記交換器から前記抗凝血剤を含有する前記溶液をパージングする段階；
を含む、上記方法にも関する。
【００３２】
カチオンポリマーがＰＥＩである場合、前述の段階（ｃ）は、次の諸条件：
−  ＰＥＩ濃度：  ０．０４〜２０ｇ／リットル、
−  媒体：  水；グリセリン処置した水；塩分含有の緩衝液、
−  ｐＨ：  ５〜１２、
−  処置速度（機器での循環によって膜を処置する場合）：  ５０〜５００ｍｌ／分、
−  期間：  １〜３０分間、
−  開回路又は閉回路、
−  これらの条件下で、表面のＰＥＩ濃度は１〜３０ｍｇ／ｍ2である、
に従って実施することができる。
【００３３】
抗凝血剤がヘパリンである場合、前述の段階（ｅ）は、次の諸条件：
−  ヘパリン濃度：  １〜１００ＩＵ／ミリリットル、
−  媒体：  水；グリセリン処置した水；塩分含有の緩衝液；塩水、
−  ｐＨ：  ５〜１０、
−  処置速度（機器での循環によって膜を処置する場合）：  ５０〜５００ｍｌ／分、
−  期間：  １〜３０分間、
−  開回路又は閉回路、
−  これらの条件下で、表面のヘパリン濃度は２００〜２０，０００ＩＵ／ｍ2（５００〜１０，０００ＩＵ／ｍ2）である、
に従って実施することができる。
【００３４】
随意的に、平べったい膜又は中空繊維の束は、段階（ａ）の終りでグリセリン処置する。そのため、前述の段階（ｃ）を始める前にグリセリンを除去する。
随意的に、段階（ｃ）を段階（ｂ）の前に実施するときの段階（ｃ）の後か、又は段階（ｄ）の後に、半透膜を洗浄して、結合された過剰のカチオンポリマーを除去する。
【００３５】
随意的に、段階（ｅ）を段階（ｂ）の前に実施するときの段階（ｅ）の後か、又は段階（ｆ）の後に、半透膜を洗浄して、結合されていない過剰の抗凝血剤を除去する。
場合により、随意的に、段階（ｅ）又は段階（ｆ）の終わりであって、随意的洗浄段階の後に、半透膜を再びグリセリン処置する。
【００３６】
本発明の範囲における、交換器の殺菌は、半透性複合膜に重大な影響を及ぼさない、照射、とりわけ、ガンマ線照射による殺菌、又は二酸化エチレンによる殺菌であることもある。その交換器の殺菌は、交換器を製造する間の特別な２つのときに実施することができる。
【００３７】
第１の別形によると、カチオン基又はカチオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルをベースとする半透膜を、前述のカチオンポリマーで被覆し、次いで、少なくとも１種の抗凝血剤を含有する溶液を用いる処置をその場で（extemporaneously）実施するときに、交換器を殺菌する。
第２の別形によると、アニオン基又はアニオン化可能な基を持つポリアクリロニトリルをベースとする半透膜を、前述のカチオンポリマーと前述の抗凝血剤とで被覆するときに、交換器を殺菌する。
【００３８】
本発明の他の特徴及び諸利点は、次の諸例を読むことによって明らかになる。添付の諸図面にも言及すると、
−  図１は、限外濾過によって、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオンポリマーを調製するための手順を示す。
−  図２は、限外濾過における、ＰＥＩ濃度の変化を示す。
−  図３は、「ＰＥＩ  Ｐ」で示される、分画されなかったＰＥＩ（ＢＡＳＦ製のＬＵＰＡＳＯＬ  Ｐ）と、分画されたＰＥＩとの重量−平均分子量を示す。
−  図４は、分画されたＰＥＩで処置し、ガンマ線で殺菌し、次いで、ヘパリンでその場で処置した、平べったい「ＡＮ６９」膜を備えた透析器を用いて体外循環を行ったヒツジ血液の凝固時間（ＫＣＴ）の変化を示す。
−  図５は、分画されたＰＥＩで処置し、次いで、ヘパリン化し、次いで、使用する前に最終的にガンマ線で殺菌した、中空の「ＡＮ６９」繊維を備えた透析器を用いて体外循環を行ったヒツジ血液の凝固時間（ＫＣＴ）の変化を示す。
【００３９】
記述してきた諸半透膜を評価するのに用いた分析方法は、次の通りである。
分析前の血液試料の処置
次の諸例の透析期間の間、透析器を出るときに試料抽出した血液は、直ちに、クエン酸ナトリウムの存在するところに置く。クエン酸ナトリウムは、カルシウムイオンのキレート化によってあらゆる凝固活性を停止させる。次いで、試料は室温で３０００回転／分で１５分間、遠心分離機にかける。上澄み血漿を採取し、分析を行うまで−２０°Ｃで保存する。
【００４０】
凝固時間［ＫＣＴ、カオリン−セファリン時間（kaolin-cephalin time）］の決定
ＫＣＴの決定は、DIAGNOSTICA STAGO社の商品名「Ｃ．Ｋ．  ＰＲＥＳＴ（登録商標）」で市販されている分析キットを用いて行う。
ＫＣＴを用いれば、ある種の凝固因子の欠損によるか又はヘパリン等の抗凝血剤の存在によって、クエン酸塩を添加した血漿の凝固時間が延長されることを評価するのが可能になる。後者の場合、凝固時間の延長は、存在するヘパリンの量に比例する。それ故に、ＫＣＴの決定によって、血液の抗凝固レベルを評価することが可能となる。この（秒で表わした）凝固時間を測定する方法は既知であり、この測定は、カルシウム再沈着の後及び活性剤の添加の後に行う。
【００４１】
非血漿媒質中のヘパリン分析
ヘパリンは、アズールＡ（６３０ｎｍで最大吸収）と複合体を形成した後、簡単な媒質（水及び電解質）中で分光測光によって決定する。
【００４２】
ヒツジによる体外循環の試験
諸試料の試験を行う透析器は、（ヘパリン化するか又はヘパリン化していない）生理食塩水を血液区画室に循環させて（２００ｍｌ／分で２リットル）洗浄する。血液透析液区画室は、限外濾過液で満たされる。場合によっては、ヒツジ血液は、開始する前に、けい静脈の中にヘパリンを５分間注入することによって、凝血防止を行う。体外血液循環は、「ＨＯＳＰＡＬ  ＢＳＭ２２」ポンプ（けい動脈アクセス及びけい静脈戻り）を用いて、２００ｍｌ／分の速度で行う。入口側圧力と出口側圧力とを記録する。透析器の入口で血圧が５００ｍｍＨｇを超えるとき、その循環を停止させて、血液回路に凝血があった証拠とする。
【００４３】
例１
この例では、カチオンポリマー［この場合は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）］の製法を記述する。この例は、処置すべき半透膜の孔を透過してその膜を通過することのできる、（立体障害をほとんど持たない）最も小さい鎖を、分画によって除去することを狙いとしている。
【００４４】
図１は、ＰＥＩを調製するための手順を示す。この手順は次の諸段階：
（ａ）  貯槽１中で、平均分子量７５０キロドルトンの重量を持つＰＥＩ（ＢＡＳＦ製のＬＵＰＡＳＯＬ  Ｐ）の、蒸留水１リットル当り５０ｇを含有する溶液１．５リットルを調製する段階;
（ｂ）  閉回路中で、透析器２の血液区画室内の溶液を３００ｍｌ／分の速度で循環させる段階であって、透析器２が、ＡＮ６９（アクリロニトリルとメタリルスルホン酸ナトリウムとのコポリマー）で造った膜（１．６ｍ2の作業面）を有する中空繊維［フランスのホスパル・インダストリー（HOSPAL INDUSTRIE）社製の商品名「FILTRAL 16」］を備えている該段階；
（ｃ）  段階（ｂ）と同時に、貯槽１の中に６０ｍｌ／分の速度で水を追加しながら、同一速度で限外濾過を行う段階；
を含む。
【００４５】
調製時間は、１５６分である。
限外濾過液中に存在するＰＥＩの分析は、チオシアン酸コバルト（II）（３０４ｎｍで最大吸収）を有する着色した複合体が形成した後、水に入れて分光測光によって決定する。
図２に、限外濾過液中のＰＥＩ濃度の変化を示す。
【００４６】
前記方法の条件で、限外濾過によって除去されるＰＥＩの量は３２ｇであり、これは初期ＰＥＩの４３％に相当する。
（「ＰＥＩ  Ｐ」で示す）分画しなかったＰＥＩ、及び分画したＰＥＩの分子量（Ｍｗ）の分布は、排除クロマトグラフィ［ウォーターズ（WATERS）社製の超ヒドロゲル］によって決定し、図３にこの分布を示す。図３は、分画したＰＥＩの最も小さい鎖のモル質量が１００００ｇ／モル程度であることを示す。
【００４７】
例２
参考例２ａ
１．５ｍ2の作業面（working area，作業領域）を有し、ガンマ線照射によって滅菌したＡＮ６９［フランスのホスパル・インダストリー社製の商品名「CRYSTAL 4000」］で造った平べったい（フラットな）膜を備えた透析器は、血液区画室に、分画しなかったヘパリン５０００ＩＵを含有する生理的食塩水２リットルを循環させることによって洗浄する。
【００４８】
次いで、透析器を含む体外血液回路は、ヒツジの血管回路に接続した。ヒツジ血液中に、抗凝血剤は全く注入しない。
図４の曲線１は、３０分間の血液循環の間のＫＣＴの変化を示す。凝血は３０分の終わりに生じた。
【００４９】
本発明の例２ｂ
本発明による透析器は、ホスパル・インダストリー社（フランス）によって製造された。１．５ｍ2の作業面を有する、ＡＮ６９で造った平べったい（フラットな）膜の一方の面は、重量で４０／６０の水／グリセロールの混合物中の５ｇ／ｋｇの濃度の分画済みＰＥＩ（例１を参照）を吹き付けることによって処置する。堆積した分画済みＰＥＩの量は、１０ｍｇ／ｍ2である。
【００５０】
この膜は、処置した面が透析器の血液区画室の方を向くように、透析器にはめ込む。
次いで、透析器はガンマ線照射（３６Ｋ  Ｇｙ）によって殺菌する。
殺菌した透析器は、これを使用する直前に、参考例２ａに示す通り、生理的食塩水と分画しなかったヘパリンとの溶液を用いて洗浄する。
【００５１】
次いで、その透析器を備えた体外血液回路は、ヒツジの血管回路の中に接続する。ヒツジ血液の中に抗凝血剤は全く注入しない。
【００５２】
ヒツジ血液は、凝血を生じさせないで、体外回路を６時間の間、循環させることができた（６時間後の終了は、自発的なものであり、回路が凝血したものではない）。図４の曲線２は、循環中のＫＣＴレベルを示す。このＫＣＴは正規のレベルのままであり、これは、ヘパリンが放出されないことを意味するが、１００秒を超えるＫＣＴは、慣例的に、体外循環回路において血液処置の訂正動作を行うことが必要である。
【００５３】
例３
参考例３ａ
酸化エチレンを用いて殺菌した、２ｍ2の作業面を有する、中空のＡＮ６９繊維の束を備えた透析器［フランスのホスパル・インダストリー社製の商品名「FILTRAL 20」］は、血液区画室中に、分画しなかったヘパリン１０，０００ＩＵを含有する生理的食塩水２リットルを循環させることによって洗浄した。
【００５４】
次いで、分画しなかったヘパリン５０００ＩＵを事前にヒツジに注入した後、その透析器を備えた体外血液回路はヒツジの血管回路に接続する。
【００５５】
その体外回路中の血液の凝固は、血液が２時間の間、その中を循環した後に生じた。
図５の曲線１に、ＫＣＴレベルの変化を示す。
【００５６】
本発明の例３ｂ
３ｍ2の作業面を有する、中空のＡＮ６９繊維の束を備えた透析器［フランスのホスパル・インダストリー（HOSPAL INDUSTRIE）製の商品名「NEPHRAL 300」］は、血液区画室に、例１の通りに調製した分画済みＰＥＩの溶液を循環させることによって処置する［水リットル当り１ｇ；２００ｍリットルの閉回路；２００ｍｌ／分で５分間］。この透析器は、同じ区画室に、分画しなかったヘパリンの溶液を循環させることによって、第２の処置を行う［リン酸塩溶液（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4）中５ＩＵ／ｍｌ；３リットルの閉回路；２００ｍｌ／分で５分間又は３０分間］。次いで、透析器は、空気（０．３バールで３０秒間）で浄化する。これらの条件下、束ねたＰＥＩの量は１５ｍｇ／ｍ2程度であり、結合したヘパリンの量は２５００ＩＵ／ｍ2及び６８００ＩＵ／ｍ2である（これらは、非血漿性媒質中のヘパリンの分析方法に従って測定する）。
【００５７】
この透析器は、ガンマ照射によって殺菌する。
この透析器を使用する直前に、透析器を洗浄するために、生理的食塩水２リットルを血液区画室に循環させる。次いで、この透析器を備えた体外血液回路は、ヒツジの血管回路に接続する。ヒツジ血液中に、抗凝血剤は全く注入しない。
【００５８】
３時間及び６時間の間、その体外回路の中にヘパリンを注入しないで、凝血を起こさず、その体外回路で血液循環を維持することが可能であった。図５の曲線２及び３は、ＫＣＴレベルが正規のままであったことを示す。
【００５９】
例４
例４は、本発明による透析器と、本発明によらない透析器とを用いて実施した一連の臨床試験に相当する。
【００６０】
比較例４ａ及び４ｂ
（４ａ）次の諸条件で行う一連の臨床試験には、処置しなかった複数の透析器［商品名「NEPHRAL 300」］を使用する：
・  患者数  ６；
・  ヘパリンを添加して４時間続行する血液透析治療  １０８；
・  各々血液透析治療の前に、ヘパリン５０００ＩＵを含有する生理的食塩水溶液１リットルを、透析器の血液区画室に循環させることによって、その透析器を洗浄する；
・  各々血液透析治療の終わりに、生理的食塩水溶液１リットルを用いて透析器の血液区画室を洗浄することによって、血液は患者に戻す。
【００６１】
（４ｂ）複数の透析器［商品名「NEPHRAL 300」］は、次のやり方で連続的に処置した：
・  中空繊維の中に存在するグリセリンを除去するために、透析器の血液区画室に、水を２００ｍｌ／分の流速で循環させる；
・  ７５０キロドルトンの重量平均分子量を有する、分画していないＰＥＩの溶液［BASF製のLUPASOL］１リットルを、透析器の血液区画室に循環させる；
・  空気でパージングする；
・  ガンマ線照射によって殺菌する；
・  各々血液透析治療の前に、ヘパリン５０００ＩＵを含有する生理的食塩水溶液１リットルを、透析器の血液区画室に循環させることによって、その透析器を洗浄する；
・  各々血液透析治療の終わりに、生理的食塩水１リットルを用いて透析器の血液区画室を洗浄することによって、血液は患者に戻す。
これらの透析器を使用して、一連の２７種の臨床試験治療を実施する。
【００６２】
一連の臨床試験（４ａ）及び（４ｂ）の結果
血液を戻した後、それら透析器は、視覚によって１〜４の段階で評価する：
−  評点１（不良）：透析器全体の色が、赤であり、半透膜中に血液の著しい凝固を示す；
−  評点２（中程度）：透析器の約半分の色が赤である；
−  評点３（良好）：透析器中に、ほんのわずかな赤い痕跡がある；
−  評点４（優秀）：透析器は赤くない。
【００６３】
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（＊）分画していないＰＥＩの結合量は１００ｍｇ／ｍ2程度であり、透析器洗浄時のヘパリンの結合量は、膜１ｍ2当り２０００ＩＵ程度である。
（＊＊）添加ヘパリンの量によって、ＫＣＴを９０〜１２０秒に維持することが可能となる。
【００６４】
結論
分画しなかったＰＥＩを用いて治療すれば、ヘパリンが著しく消耗（吸着）することとなる。更に、例（４ｂ）で処置した複数の透析器は凝血の問題を生じることになるので、吸着したヘパリンは活性でない。
【００６５】
本発明の例４ｃ
ＡＮ６９で造った平べったい（フラットな）膜は、上記例１で述べた条件で調製した分画済みＰＥＩを、膜１ｍ2当り１０ｍｇの割合で吹き付けることによって処置する。
CRYSTAL型の透析器にはこの膜［１つの透析器当り１．２５ｍ2の膜作業面］を取り付ける。
【００６６】
次の諸条件下、これらの透析器を使用して一連の臨床試験を行う：
・  患者数  １３；
・  血液透析治療  ２５６；
・  各々血液透析治療の前に、１リットル当りヘパリン５０００ＩＵを含有する生理的食塩水溶液２リットルを、透析器の血液区画室に循環させることによって、その透析器を洗浄する；
・  ヘパリンを添加するか又は添加しないで４時間続行する複数の血液透析治療（表を参照）；
・  各々血液透析治療の終わりに、生理的食塩水溶液１リットルを用いて透析器の血液区画室を洗浄することによって、血液は患者に戻す。
【００６７】
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（＊）洗浄時に結合したヘパリン量は、膜１ｍ2当り１５００ＩＵ程度である。
【００６８】
結論
分画済みＰＥＩで処置し、次いで、ヘパリンで処置すれば、一層少ない量の抗凝血剤を患者に注入することによって、透析を実施することが可能になる。
【００６９】
解説
比較例（４ａ）及び（４ｂ）で、ＫＣＴは９０〜１２０秒間維持される。
例（４ｃ）で、０から６０００に固定されているのは、注入したヘパリン量であって、全ての場合、各々治療の終わりのＫＣＴは５０未満である。これは、患者にとって著しい利点である（透析の終わりにヘパリンはもはや循環しておらず、従って、もはや大出血する危険はない）。
【００７０】
血液が戻ってきた後、この一連の臨床試験の透析器は、例（４ａ）及び（４ｂ）のための上述の条件で、前の通りに評価する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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