(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルプレートのウェルに適用される酵素の、ウェル中のＦＲＥＴ（組合せ蛍光共鳴エネルギー伝達）化合物混合物の一以上の化合物に対するタンパク質分解活性のスクリーニング方法であって、
前記ＦＲＥＴ化合物混合物は相互補完関係にある一対の化合物ライブラリーを規定し、
前記活性はウェルに適用されたタンパク質分解酵素と、ウェル中の混合物の一以上の化合物との相互作用であり、前記相互作用は、酵素による化合物の開裂を表し、
以下の式で示される、組合せＦＲＥＴ化合物を含む一連の化合物で構成される、相互補完関係にある一対の化合物ライブラリーＬ１及びＬ２を用いる方法：
Ａａ−Ｂｂ−Ｃｃ−Ｄｄ−ｎ（Ｅｅ）−Ｆｆ−Ｇｇ
式中、
ＡはＦにより内部消光される蛍光発光体を表し、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、天然あるいは非天然のアミノ酸残基であって、これらの基のいずれか二つの間の切れやすい結合がアミド結合であるような基を表し、
Ｆは蛍光発光体Ａを内部消光することができる消光体を表し、
任意に存在するＧは、化合物に溶解性を与える親水性基を表し；
かつ全ての化合物は水溶液中に存在し；
ｎは１〜４の整数を表し；
各ライブラリーにおいてａｘｂｘｃｘｄｘｅｘｆｘｇ＝Ｍｎ個の化合物が与えられ、各ライブラリーＬ１及びＬ２にはそれぞれ予め決められた数（Ｐ１，Ｐ２）の混合物が存在し、Ｐ１、Ｐ２はそれぞれ予め決められた数（Ｑ１，Ｑ２）の個々に同定可能な化合物からなり、またＬ１およびＬ２両者は同一のＭｎ個の化合物を含むが、Ｌ１の一つのＱ１化合物混合物中に一緒に見出される任意の２つの化合物は、Ｌ２のＰ２混合物の任意の一つ中に、一緒に見出されることはなく、
Ｌ１のＰ１混合物及びＬ２のＰ２混合物の夫々はウェルプレートの個々のウェルに別々に入れられており、ウェルプレートは、Ｌ１の一つのウェル及びＬ２の一つのウェル中のタンパク質分解活性の存在あるいは阻害から特異な活性化合物の式の演繹を可能にするのに適したフォーマットに配置されたウェルを有し、
前記フォーマットは一般のデコンボルーション式
（ｉ）          ｎｓ＝Ｒｐ・Ｃｐ／Ｒｓ・Ｃｓ）・ｎｐ
（ｉｉ）        ｋ＝ｂ・ｃ・ｄ・ｎｐ・ｅ
（ｉｉｉ）      ｋ＝Ｘ・Ｎ・ｎｐ
（ｉｖ）        Ｎ＝Ｒｐ・Ｃｐ
（ｖ）          ｋ＝Ｘ・Ｒｐ・Ｃｐ・ｎｐ
（ｖｉ）        ｂ・ｃ・ｄ・ｅ＝Ｘ・Ｒｐ・Ｃｐ
（ｖｉｉ）      Ｃｐ・ｅ＝Ｘ
（ｖｉｉｉ）    Ｒｐ・ｅ＝Ｘ，（Ｒｐ＝Ｃｐの場合）
（式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの種類の数を表し、
各ライブラリーにおける各記号は下記を表す、
ｎｐ＝一次プレートの数、
ｎｓ＝二次プレートの数、
Ｒｐ＝一次行の数、
Ｒｓ＝二次行の数、
Ｃｐ＝一次列の数、
Ｃｓ＝二次列の数、
ｋ＝化合物の組合せの数、
Ｎ＝プレートのウェルの数、かつ
Ｘ＝ウェル当たりの化合物の数）。
【請求項２】
ｎｐ＝４、ｎｓ＝１６、Ｒｐ＝８、Ｒｓ＝４、Ｃｐ＝１０、Ｃｓ＝５、ｋ＝６４００、Ｎ＝８０、Ｘ＝２０である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
相互補完関係にあるライブラリー対が、ＤとＥの間にアミド結合を有する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
Ａが、非置換または置換アンスラニル酸誘導体を表す、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｆが、非置換または置換３−ニトロチロシン誘導体を表す、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｇがアスパルチルアミド基を表す、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項７】
各相互補完関係にあるライブラリー対が、２０種の異なる同定可能な化合物の８０ｎ混合物として１６００ｎ化合物を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
更に、１又は複数の酵素阻害剤を同定する工程を含み、該工程において、請求項２に記載の方法により基質として同定されたＦＲＥＴ化合物を、酵素を用いる阻害アッセイにおいて候補阻害剤のパネルに対して別々に使用する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項９】
ライブラリー対の化合物が固相技術を使用して合成される請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１０】
該混合物内における酵素阻害剤の存在を同定する次の工程を更に含み、該相互補完関係にある一対のライブラリー対をウェルに適用後、各ウェル中に残留する酵素活性を定量することを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質分解酵素の基質または阻害剤としての化合物の分野、並びにタンパク質分解酵素の基質または阻害剤を同定するための装置および方法に関連するものである。
多くの治療上有用な薬物が、酵素阻害剤として作用する。特に、タンパク質分解酵素の阻害剤は、これらが多数の生体系において種々の役割を演じていることから、製薬工業において注目を集めている。これらのタンパク質分解活性は、幾つかの寄生性の生物に見られるように、転移性癌と関連する細胞侵襲から、免疫応答性の消失に及ぶ過程；生命維持から、ウイルスプロテアーゼおよび真核生物のホルモン−処理酵素のサイト特異的タンパク質分解までに及ぶ過程と関連している。しかし、タンパク分解酵素の阻害剤としての鉛分子の同定のための、伝統的なランダムスクリーニング法は、しばしば多大な労力を要し、かつ時間のかかるものである。従って、薬物発見法を高速化できる、新規かつ効率的な方法の開発が、望まれている。
我々は、プロテアーゼが、認識ポケット1（S1およびS2等）並びに（S1’およびS2’等）が、良好に占有されるにつれて、次第に活性化される傾向にある、活性な接触的サイトを含むものと考えた。従って、これらポケットに最も適合した該阻害剤のこれらの部分（P1P2）（P1’P2’）を、出来るかぎり迅速に同定して、新規なプロテアーゼ阻害剤を設計することが重要である。従って、我々は、種々のタンパク質分解酵素、例えばアスパルチルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびシステイニルプロテアーゼの阻害剤の合成を、著しく促進するであろう、これら結合モチーフを迅速に同定するための組み合わせ法を工夫した。
興味あるプロテアーゼは以下のものを含む（但し、これらに限定さない）。
1.  アスパルチルプロテアーゼ、例えばレニン、HIV、カテプシンＤおよびカテプシンＥ等；
2.  メタロプロテアーゼ、例えばECE、ゼラチナーゼＡおよびＢ、コラーゲナーゼ、ストロメライシン（stromolysins）等；
3.  システイニルプロテアーゼ、例えばアポパイン（apopain）、ICI、DerPI、カテプシンＢ、カテプシンＫ等；
4.  セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、第VIIa因子、第XA因子、エラスターゼ、トリプシン等；
5.  スレオニルプロテアーゼ、例えばプロテアソームＳ。
タンパク質分解酵素特異性の分析のための、蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）基質の使用は、最初にCarmel2により刊行された。その後酵素阻害を測定するための、多数の異なる消光蛍光助剤型基質（quenched fluorogenic substrates）が、文献4-11に記載されている。これらの基質は位置Ｐ（上記参照）に、蛍光発光団Ｆを含み、これはP’位置（上記参照）に存在するもう一つの基Ｑによって消光され、かつ切断容易な結合によって、Ｆと分離されている。これら残基ＦおよびＱを配置することの利点は、ペプチド結合の開裂が２つの天然の残基間に生じ、結果としてC-末端発色団の開裂および放出ではなく、寧ろより自然な加水分解事象を表すことにある。
例えば、Bratovanova & Petkov12は、ペプチド4-ニトロアニリドから、蛍光助剤型の基質を合成した。ペプチド4-ニトロアニリドのアミノベンゾイル（ABz）基によるN-アシル化は、該4-ニトロアニリド部分の存在によって内部的に消光される基質を生成した。該アミノアシル-4-ニトロアニリド結合の加水分解に際しては、高度に蛍光発光性のN-ABz基が放出され、アミノ酸またはペプチドの何れかに結合する。
基質がポリマーまたはバイオポリマー支持体に結合している、固定化ライブラリーも、プロテアーゼ結合サイトのマッピングのために利用されている13。Singh等は、リンカーを介して、調節された多孔質ガラスに結合した、38個の選択されたオクタペプチドの酵素基質活性が、溶液中の類似のペプチドと同様な活性をもつと予想されることを、最近報告している。しかしながら、これらの結果は、前置き的であり、かつ特定の例に関するものであるに過ぎない。従って、ポリマーに結合された固定化基質が、封鎖されたプロテアーゼ結合サイトをマッピングする上で、高信頼度で可溶性基質と置換できるか否かは、明確でない。というのは、特に該ポリマーの親水性または親油性並びに該ポリマー内部の間隙のサイズとが、共同して該酵素とその基質との間の反応に影響を与えるからである。
内部消光性の蛍光助剤型基質の混合物も、最近記載されており、そこでは該消光性の基Ｑは2,4-ジニトロフェニル（Dnp）であり、かつ切断容易な結合のＰ側に結合しており、一方で該蛍光助剤型基はN-メチルアンスラニル酸（Nma）であり、かつP’側に結合している14。
生物学的系に適用されている、その他のドナー−アクセプタ発色団対の例を以下の第１表に示す。
0004215822.tif 000002
ここで、ANAI：2-アンスラセンN-アセチルイミダゾール；BPE：B-フィコエリスリン；CF：カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル；CPM：7-ジエチルアミノ（doethylamino）-3-（4’-マレイミジルフェニル）-4-メチルクマリン；CY5：カルボキシメチルインドシアニン-N-ヒドロキシサクシンイミジルエステル；diI-C18：1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニン；DiO-C14：3,3’-ジテトラデシルオキサカルボシアニン；DABM：4-ジメチルアミノ（anini）フェニルアゾフェニル-4’-マレイミド；DACM；（7-（ジメチルアミノ）クマリン-4-イル）-アセチル；DANZ：ダンシルアジリジン；DDPM：N-（4-ジメチルアミノ-3,5-ジニトロフェニル）マレイミド；DACM：ジメチルアミノ-4-マレイミドスチルベン；DMSM：N-（2,5-ジメトキシスチルベン（stiben）-4-イル）-マレイミド；DNP：2,4-ジニトロフェニル；ε-A：1,N6-エテノアデノシン；EIA；5-（ヨードアセテートアミド）エオシン；EITC：エオシン-5-イソチオシアネート；ENAI：エオシンN-アセチルイミダゾール；EM：エオシンマレイミド；ErITC：エリスロシン-5’-イソチオシアネート；ETSC：エオシンチオセミカルバジド；F2DPB：1,5-ジフルオロ-2,4’-ジニトロベンゼン；F2DPS：4,4’-ジフルオロ-3,3’-ジニトロフェニルスルホン；FITC：フルオレセインN-アセチルイミダゾール；FTS：フルオレセインチオセミカルバジド；IAANS：2-（（4’-ヨードアセタミド）アニリノ）ナフタレン-6-スルホン酸；IAEDANS：5-（2-（（ヨードアセチル）アミノ）-ナフタレン-1-スルホン酸；IAF：5-ヨードアセタミドフルオレセイン；IANBD：N-（（2-（ヨードアセトキシ）エチル）-N-メチル）アミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール；IPM：3-（4-イソチオシアナトフェニル）-7-ジエチル-4-メチルクマリン；ISA：4-（ヨードアセタミド）サリチル酸；LRH：リサミネロ（lissaminerho）-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル；NCP：N-シクロヘキシル-N’-（1-ピレニル）カルボジイミド；ODR：オクタデシルローダミン；PM：N-（1-ピレン）-マレイミド；SRH：スルフローダミン；TMR：テトラメチルローダミン；TNR：トリニトロフェニル；TR：テキサスレッド。
出典：Wu, P. & Brand, L., Anal. Biochem., 1994,218:1-13
可溶性ペプチドライブラリーの特異性が、測定された15，16。Berman等16は、HPLCマススペクトル技術を記載し、そこでは128個のペプチドの６種の混合物を合成しており、該ペプチドをDnp基でN-末端標識して、該HPLC上でのUVによる追跡を可能とした。この方法の欠点は、蛍光助剤型の基質が明らかにされていないことから、各アッセイ混合物を個々に分析する必要があること、および各別々の成分の有効濃度が、全体としての溶解度因子のために、該混合物の大きさを制限してしまうことにある。
Drevin等17は、ランタニドイオンとキレートを形成する発色団を使用して、酵素活性を測定するための、別々に合成した蛍光助剤型の基質の利用を示唆している。Germann & Phillipsは、FRET基質の利用を示唆しており、そこでは該蛍光助剤型のおよび消光体の部分が、該ペプチドが合成された後に、チオールまたはアミノ官能基を介して結合されるが、これは、これらがライブラリー形状にはないこと、および該官能性のアミノおよびチオール基を、該ペプチドを合成した後に選択的に明らかにする必要があるという欠点を有する。Wang等は、タンパク質分解酵素用の基質の個々の合成のための、EDANSおよびDABCYL蛍光発光体（fluorescor）および消光体対の使用を示唆している。
特異的なプロテアーゼの回りの活性サイトのマッピングのために、FRET技術を使用している上記方法は、以下の諸欠点の１またはそれ以上を有している。
i.  一般的に水不溶性であるために、水性溶液中での高い処理率でのスクリーニングに適した形状で、化合物の混合物を生成しない。
ii. 該誘導体化された化合物は、固相技術を使用して、組み合わせライブラリー形状で調製することができない。
iii.使用されている該混合物8,9は、セルフ−デコーディング（self-decoding）ではなく、かつ該活性分子の同定のために、時間のかかるデコンボリューション性の再合成を必要としている。
図面の説明
第１〜14図は、ライブラリーマトリックスのプレート内の成分の分布を例示する図である。
第15図は、化合物No. 4: Boc-Val-Ala-Leu-Hの製造のための反応式を示し、ここでi.イソブチルクロロホルメート、N-メチルモルホリン、次いでN,O-ジメチルヒドロキシルアミンHCl、THF; ii. HCl、ジオキサン；iii．イソブチルクロロホルメート、N-メチルモルホリン、次いでBoc-Ala-OH、THF; iv. HCl、ジオキサン；v. Boc-Val-Osuc、N-メチルモルホリン、DMF; vi. LAH。
第16図は、Der PI活性の阻害剤を製造するための反応式を示す。
発明の簡単な説明
本発明は以下の分野に関連する。
i.  タンパク質分解酵素の基質または阻害剤としての化合物。
ii. タンパク質分解酵素の新規な阻害剤の発明を容易にする、自動−デコンボリューション性の組み合わせライブラリーを利用した、構造−活性の関連性の迅速な生成をもたらす装置および方法。
iii.分子の、組み合わせFRET（蛍光共鳴エネルギー伝達）ライブラリーを使用した、タンパク質分解酵素活性の検出および測定するための装置および方法。
iv. タンパク質分解酵素用の著しく活性な基質の迅速な発見を通して、タンパク質分解酵素用の生物学的アッセイの確立をもたらす装置および方法。
我々は、構造−活性の関連性（SAR）データの迅速な生成およびその結果としての任意のプロテアーゼの結合モチーフの特徴付けのために利用でき、従って以下のことを簡単化するであろう装置並びに方法をここに記載する。
i.  吟味中のタンパク質分解酵素用の蛍光助剤型の基質として、ライブラリー中の最良の化合物を使用することによる、高感度の酵素阻害アッセイの開発。
ii. 最良の結合モチーフの迅速な特徴付けによる、タンパク質分解酵素阻害剤としての新規な化合物の開発。
iii.公知の方法を使用した、有力な阻害剤の設計のための、コンピュータを利用したドラッグデザインおよび企業内で予備的に合成した化合物、または市場で入手可能なデータベースの、アッセイするための順位付け。
第一の局面において、本発明は式：A-B-C-D-nE-F［I］で表される新規化合物を提供する。該一般式において、ＡはＦにより内部的に消光された蛍光発光体を表し、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、これら基の任意の２つの間の切断容易な結合が、適当な結合であるような基を表し、Ｆは該蛍光発光体Ａを内部的に消光することのできる消光体を表し、またｎは１〜４（両端を含む）の範囲の整数を表す。
幾つかの態様において、該適当な結合は不飽和アミド結合（実施例１参照）であり、その他の態様において、該適当な結合はエステル結合（実施例２参照）である。
好ましい態様において、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、アミノ酸またはヒドロキシ酸である。これはアミノまたはヒドロキシ末端およびカルボン酸末端をもつ分子である。該アミノ／ヒドロキシ基は、同一の炭素原子上に位置していても、また幾つかの原子または原子型により分離されていてもよい。
これら分子は、環式または脂環式であり得る。これらは、同一の構造上で、線状または環状であり得、
0004215822.tif 000003
またはBCDEは（線状または環状の）中央の骨格上に存在でき、
0004215822.tif 000004
あるいは該残基の一つが主鎖であり得る。
0004215822.tif 000005
ここで、記号-B-C-D-E-または-B-C-D-nE-を使用した場合には、その定義内にこれらの線状および環状変形体の全てを包含するものと理解すべきである。
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ間の結合の少なくとも一つ（但し、全てではない）は、切断容易である必要がある。切断が容易でない結合は、スルホンアミド、尿素、アミノメチレン結合を包含する。
「足場型（scafford）」分子の幾つかの非限定的な例を、第２表に示す。第２表において、置換基R1-R4は可能な可変の基Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに対応する。
第二の局面において、本発明は式［I］の化合物の混合物を含む、FRET化合物の組み合わせライブラリーを提供する。
第三の局面において、本発明は、構造と活性との関連性（SAR）の迅速な生成をもたらす方法における、このような組み合わせFRETライブラリーの利用法を提供することにあり、該方法は組み合わせFRET（蛍光共鳴エネルギー伝達）分子のライブラリーを使用してアッセイを実施して、タンパク質分解酵素の基質（１または複数）を見出すことによる、該酵素の活性の検出および測定を含む。この方法によれば、同定した基質を合成し、タンパク質分解酵素に関する生物学的アッセイで使用することが可能となる。本発明の範囲には、新規な基質が含まれる。
第四の局面において、本発明は、このような組み合わせFRETライブラリーの、該ライブラリーの化合物に対する、タンパク質分解酵素活性を検出し、測定する方法における利用法を提供する。
第五の態様において、本発明は、酵素阻害剤（１または複数）の同定を含む方法を提供し、該方法では、基質として同定されているFRET化合物を、該酵素を可能な阻害剤のパネルに対して別々に使用した、阻害アッセイで使用する。
0004215822.tif 000006
第六の態様において、本発明は、一連の化合物を提供し、これらは２つの補足的なFRET化合物ライブラリーを含む。このような一連の化合物を、以下「装置」と呼ぶ。というのは、該一連の化合物は、タンパク質分解酵素の基質または阻害剤を同定するためのスクリーニングまたはアッセイ法の実施を可能とするからである。一装置を構成するこの一連の化合物は、以下に記載するように、自動−デコンボリューション性組み合わせライブラリーの提供を可能とする。
第七の局面において、本発明は、タンパク質分解酵素の阻害剤を同定し、かつ合成する方法を提供することにあり、該方法は、組み合わせFRET（蛍光共鳴エネルギー伝達）分子のライブラリーを使用してアッセイを実施し、該ライブラリーをデコンボリューションして、該酵素の基質（１または複数）を見出し、かつ該基質（１または複数）に基づいて阻害剤を合成することによる、タンパク質分解酵素活性を検出し、かつ測定する工程を含む。この方法の直接の生成物は、１種またはそれ以上の新規なタンパク質分解酵素阻害剤である。
第八の態様において、本発明は、該酵素に対する基質として同定されたFRET分子を使用する阻害アッセイを提供し、該アッセイでは、該分子が、可能な阻害剤のパネルに対して別々に、該酵素によりアッセイされる。
第九の態様において、本発明は、以下の式：
Aa-Bb-Cc-Dd-n（Ee）-Ff-Gg
で示される化合物を含む一連の化合物で構成される、化合物ライブラリーL1およびL2の相補的対を提供する。ここで、各ライブラリーにおいてaxbxcxdxexfxg=Mn個の化合物が与えられ、予め決められた数（P1，P2）の混合物が存在し、その各々は予め決められた数（Q1，Q2）の、各ライブラリー中の個々に同定可能な化合物からなり、またL1およびL2両者は同一のMn個の化合物を含むが、L1のQ1化合物の一混合物中に一緒に見出される任意の２つの化合物は、L2の該P2混合物の任意の一つ中に、一緒に見出されることはない。
第10の局面において、本発明は、上記のライブラリーL1およびL2を使用して、酵素活性につきスクリーニングにする方法を提供し、該方法において、L1の混合物P1およびL2の混合物P2は、ウエルプレートの個々のウエルに別々に配置され、該ウエルプレートは、L1中の１ウエルおよびL2中の１ウエルにおける活性の存在に基づいて、固有の活性化合物の式の演繹を可能とするのに適したフォーマットで配列されたウエルを有する。
本発明の装置は、好ましくは２種の相補的化合物ライブラリーL1およびL2を含み、その各々はnx1600個の、以下の型の本発明の化合物を含む：A-B1-10-C1-10-D1-8-n（E1-2）-F-G［II］。ここで、ＡはＦによって内部で消光される蛍光発光体であり、好ましくはアミド結合でＢに結合された、無置換または置換アンスラニル酸誘導体であり、
Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、適当な結合によって一緒に結合された、天然または非天然のアミノ酸残基であるが、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは任意の基の組であり得る。但し、D-E間の切断容易な結合は未置換の結合である。
Ｆは内部で該蛍光発光体Ａを消光することのできる消光体であり、好ましくは未置換または置換の3-ニトロチロシン誘導体である。
Ｇは場合により存在し、親水性部分であり、好ましくはアスパルチルアミド部分である。これが存在する場合には、Ｇは有利には該ライブラリー中の全ての化合物に、。水溶性を付与することを保証する。また、Ｇは任意の型の酵素の基質であってはならない。
ｎは１〜４の範囲（両端を含む）の任意の整数である。
別法において、該切断容易な結合はB-CまたはC-Dの間にあり得る。
（ここでは、ＡおよびＦは、一般的にまたそれぞれ上記の公知技術における部分ＦおよびＱに相当することに注意すべきである）。
残基Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに伴う下付番は、これら残基を選択する可能な数を意味する。かくして、一例として、A-B1-5-C-D-E1-2-F-Gは、以下の10個の化合物の混合物を表す。
0004215822.tif 000007
各ライブラリーに対する一般的組み合わせ式は、以下のように表すことができる：
A1-B10-C10-D8-n（E2）-F1-G1    ［III］
これは、1x10x10x8xnx2x1x1=1600n個の化合物を与える。
上記型の両化合物ライブラリーL1およびL2は、固相技術を利用し、マルチピン（Multipin）法24を使用し、各ライブラリーが1600ｎ個の化合物を、各20個の別々の同定可能な化合物を含む80ｎ個の混合物として含むように合成される。これら20個の成分を含む該混合物を、次に別々に96−ウエルプレートの80ウエルの各々に配置し（他の２つのレーンはコントロール実験のために使用する）、次いで既知量のプロテアーゼに対してスクリーニングする。
かくして、これら２つのライブラリーL1およびL2に含まれる化合物数とは無関係に（例えば、好ましい態様においては1600ｎ個（ここで、ｎは１〜４の整数である））、該ライブラリー自体が相補的であり、かつ再合成の実施なしにデコンボリューションを受け入れ得ることは、本発明の一つの重要な部分である。また、該ライブラリーマトリックスを特別にフォーマットし、結果としてタンパク質分解酵素に対して最も重要なサイト対P1およびP2の形成が、再合成の必要なしに、即座に同定できることも、本発明の重要な一つの部分である。
該プロテアーゼの良好な基質であるA-B-C-D-E-F-G型のこれら化合物は、開裂され、該蛍光発光体Ａが、その近接する因子Ｆから、容易に定量化できる時間依存様式で、開裂されるであろうことから、容易に同定できる。Ａの蛍光のＦによる消光は、これら２つが、通常30Å単位の範囲内の、近接状体にある場合においてのみ発生する。従って、切断容易な結合（例えば、切断容易性結合D-E）は、Ｆが更にＡから遠方に移動することを可能とし、結果として正確な波長の光により励起された場合に、Ａの蛍光発光を可能とする。
1.  このようにして、最も高活性な化合物を、更に合成し、かつデコンボリューションする必要なしに、迅速に同定することが可能となる。その上、蛍光の最も迅速な発生を示すウエルをも、マススペクトル法で解析することができる。というのは、元の混合物との比較により、最も効果的な基質の本質が、その２つの成分部分、例えばA-B-C-DおよびE-F-Gにおける消失により、見出し得るからである。
従って、ライブラリーデコンボリューションの問題を克服することができ、かつ該酵素に対して最も活性な基質を迅速に同定することができる。
更に、該ライブラリー混合物L1およびL2による該タンパク質分解酵素の最初の処理後に、各ウエル中に残留する酵素活性は、該16xn化合物ライブラリーにおいて見られる、該酵素に対して最も有力な蛍光助剤型基質S1の添加により、定量できる。このライブラリー設計の特徴のために、該ライブラリーは迅速に調製しかつ精製することができる。この既知の基質S1による高い蛍光の出現が見られなかった場合には、酵素阻害剤の存在を推定でき、これは更に再合成の必要なしに、迅速に同定することができる。
次に、該ライブラリーレイアウトの一般的な説明を、第１〜14図を参照しつつ記載する。
例えば、ｎ＝１であり、しかも該ライブラリーが1600個の化合物を、ライブラリーL1の第１のプレート（P1）における第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P1,L1と記載する）に含む場合（第１図）には、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２つのＥ成分（E1およびE2）が存在する（第２図）。該ライブラリーL1の第１のプレート（P1）の第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２つのＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。該ライブラリーL1の該第１のプレート（P1）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２つのＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。従って、全体で1600個の成分が１プレート中に存在する。というのは、80個のウエル各々が20個の成分を含むからである。
第二の相補ライブラリーを、以下（第３図）のように合成する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P1,L2とよぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P1,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第２の列（B1）の第１欄（以下、位置B1,P1,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第２の列（B10）の第10欄（B10,P1,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E2が存在する。従って、最初の二列のみが、全体として400個の化合物を蓄積するのに利用される。
該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第４図）。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第２の列（B1）の第１欄（以下、位置B1,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第２の列（B10）の第10欄（B10,P2,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E2が存在する。従って、最初の二列のみが、全体として400個の化合物を蓄積するのに利用される。
該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第５図）。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第２の列（B1）の第１欄（以下、位置B1,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第２の列（B10）の第10欄（B10,P3,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E2が存在する。従って、最初の二列のみが、全体として400個の化合物を蓄積するのに利用される。
該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第６図）。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第２の列（B1）の第１（以下、位置B1,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第２の列（B10）の第10欄（B10,P4,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E2が存在する。従って、最初の二列のみが、全体として400個の化合物を蓄積するのに利用される。
このようにして、２種の相補的ライブラリーL1およびL2を調製する。ライブラリーL1においては、ウエルの該80個の各々は、20成分づつの混合物を含み、スクリーニングのための1600個化合物を与える。ライブラリーL2においては、４個のプレートを使用し、そこでは最初の二列のみが使用され、ウエル当たりかつプレート当たり20成分を含む20個のウエルを与え、かつライブラリーL1に存在するのと同様に1600個の化合物を与えるが、ライブラリーL1中に２つの化合物が一緒に見出されないようなフォーマットにおいては、ライブラリーL2中に、一緒に見出されるであろう。
かくして、これら２つのライブラリーL1およびL2に含まれる該化合物が、ライブラリーL1中の同一の位置（例えば、A1P1L1）に、20成分の混合物中に一緒に見出される任意の２つの化合物が、該ライブラリーL2の任意の位置における該20成分の混合物の何れかに一緒に見出されることはないという点で、それ自体相補的である。
かくして、例えば第２図の第一のライブラリーP1L1、第３〜６図の第二のライブラリーP1L2、P2L2、P3L2およびP4L2を参照すると、以下の例示的配列：-B2-C3-D4-E1-をデコンボリューションすることが可能である。
この配列が基質である場合には、蛍光発光はC3D4におけるP1L1で起こるであろう。これは、該基質が-?-C3-D4-?-であるという情報を与える。
蛍光発光がB2E1においてP2L2内で生じた場合には、この事実は基質が-B2-?-?-E1-であることを示す。
該基質が-B2-C3-D4-E1-であるとの確認は、全て-B2-C3-X-E1-（ここで、ＸはＤ4ではない）を含むP1L2、P3L2およびP4L2の非−蛍光発光性により与えられるはずである。
実際には、１個を越える配列が基質中に存在するであろうと考えられる。-B-C-D-E-のどの位置が変化に対して敏感であるか（即ち、特異的な基を必要とするか）および全体配列内の何れが非感受性であるか（即ち、１を越える基の選択を許容できるか）についての情報は、価値あるSARデータを与え、該データを、関連化合物のモデル化および／または合成のために使用することができる。
それぞれｎ＝２、３または４である同様な実施例において、余分のプレートをライブラリーL1のフォーマットにて組み立てて、成分対それぞれE3とE4（n=2）、E5とE6（n=3）およびE7とE8（n=4）を蓄積する。この型、即ちL2のデコンボリューションライブラリー各々に対して、該プレートP1、P2、P3およびP4における各列は、それぞれ対形成した成分D1とD2、D3とD4、D5とD6およびD7とD8で徐々に満たされる。
例えば、n=3であり、かつ該ライブラリーが4800個の化合物を含む場合、該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。従って、1600個の成分が１個のプレートに存在する。というのは、該80個の各ウエルが20個の成分を含むからである。
該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう。従って、1600個の成分が、１個のプレートに存在する。というのは、該80個の各ウエルが20個の成分を含むからである。
該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＣ成分C8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう。従って、1600個の成分が、１個のプレートに存在する。というのは、該80個の各ウエルが20個の成分を含むからである。全体で３つのプレートP1、P2、P3中には、1600化合物／プレート、即ち全体で4800個の化合物が含まれる。
例えば、n=4であり、かつ該ライブラリーが6400個の化合物を含む場合、該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）（第７図）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第１プレート（P1）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P1,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E1およびE2）が存在するであろう。従って、1600個の成分が１個のプレートに存在する。というのは、該80個の各ウエルが20個の成分を含むからである。
該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう（第８図）。該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第２プレート（P2）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P2,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E3およびE4）が存在するであろう。
該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう（第９図）。該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第３プレート（P3）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P3,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E5およびE6）が存在するであろう。
該ライブラリーL1の第４プレート（P4）における第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P4,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C1、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E7およびE8）が存在するであろう（第10図）。同様に、該ライブラリーL1の第４プレート（P4）における第１列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P4,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D1、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E7およびE8）が存在するであろう。該ライブラリーL1の第４プレート（P4）における第８列（H10）の第10欄（以下、位置H10,P4,L1と呼ぶ）においては、１個のＣ成分C10、１個のＤ成分D8、10個のＢ成分および２個のＥ成分（E7およびE8）が存在するであろう。
第２の相補ライブラリーを、以下のようにして合成する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第１列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P1,L2とよぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1（第11図）が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第１の列（A10）の第10番目の欄（以下、位置A10,P1,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第８の列（H1）の第１番目の欄（以下、位置H1,P1,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E8が存在する。該ライブラリーL2の第１のプレート（P1）の第８の列（H10）の第10番目の欄（H10,P1,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D1およびD2）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E8が存在する。従って、全体として10個の欄および全体でとして８個の列を含むこのマトリックスを、全体として1600個の化合物を蓄積するのに利用する。
該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第１の列（A1）の第１の欄（以下、位置A1,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第12図）。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第１の列（A10）の第10番目の欄（以下、位置A10,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第２の列（B1）の第１番目の欄（以下、位置B1,P2,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第２のプレート（P2）の第８の列（H10）の第10番目の欄（H10,P2,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D3およびD4）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E8が存在する。
該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第13図）。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第２の列（B1）の第１欄（以下、位置B1,P3,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第３のプレート（P3）の第８の列（H10）の第10欄（H10,P3,L2）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D5およびD6）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E8が存在する。
該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第１の列（A1）の第１欄（以下、位置A1,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E1が存在する（第14図）。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第１の列（A10）の第10欄（以下、位置A10,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E1が存在する。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第２の列（B1）の第１欄（以下、位置B1,P4,L2と呼ぶ）においては、10個のＣ成分、２つのＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B1および１個のＥ成分E2が存在する。該ライブラリーL2の第４のプレート（P4）の第８の列（H10）の第10欄（H10,P4,L2）において、10個のＣ成分、２個のＤ成分（D7およびD8）、１個のＢ成分B10および１個のＥ成分E8が存在する。
当業者には、自動デコンボリューションのために２次元で指定された２種の相補的FRETライブラリーを与える、溶液中の２つの直交（orthogonal）混合物群の合成が、一般的に好まれる配列：-B1-10-C1-10-D1-8-E1-8-を必要としないことが明らかであろう。
２次元で指定された２種の直交混合物群の一般的な概念は、ウエル数の順列、プレートのレイアウト、混合物当たりの順列数等に対して適用することも可能でる。
数値的な相互関係は、以下のように定義できる：
一般的デコンボリューション式
-Bb-Cc-Dd-n（Ee）-      （I）
1）第一および第二プレートは、好ましくはウエル当たり同一の数の化合物［X］を有し、さもなくばそれぞれXpおよびXsを有する２つの値が存在する。
2）該第一ライブラリーは、［np］個のプレートを含む。
Rp・Cp=Rs・Csである場合には、該第二のライブラリーにおけるプレートの数も、［np］個である。そうでない場合には、該第二のライブラリーにおけるプレートの数［ns］はns=（Rp・Cp/Rs・Cs）・npである。例えば、np=4、Rp=8、Cp=10の第一のライブラリーは、Rs=4、Cs=5の第二ライブラリー内に配置でき、プレートの数は、ns=（8x10/4x5）・np=16プレートに等しい。
ウエル当たりの化合物数
−Bb-Cc-Dd-n（Ee）-      （1）
可能な組み合わせの数［k］は、以下の式（2）で与えられる。
k = b・c・d・np・e      （2）
１プレート上のウエルの数が［N］、ウエル当たりの化合物数が［X］およびプレートの数が［np］であるとすると、以下のようになる：
k = X・N・np      （3）
しかしながら、ウエルの数［N］も、列の数［Rp］と欄の数［Cp］によって規定されて、以下の式（4）が得られる：
N = Rp・CP      （4）
ここで、式（3）と（4）とを組み合わせると、以下の式（5）が得られる：
k = X・Rp・Cp・np      （5）
また、式（2）と（5）とを組み合わせると、以下の式（6）が得られる：
b・c・d・np・e = X・Rp・Cp・np      （6）
この式の両辺から［np］を除去すると、以下の式（7）を得る：
b・c・d・e = X・Rp・Cp      （7）
この式の左辺における変数の２つ（例えば、b・c）各々は、その数において、欄の数［Cp］に等しくなければならず、一方左辺における残りの変数（例えば、d）は、その数において、列の数［Rp］と等しくなければならない。従って、以下の式（8）が成立する：
［Cp］2・Rp・e = X・Rp・Cp      （8）
この式の両辺から［Cp］および［Rp］を削除すると、以下の式（9）を得る：
Cp・e = X      （9）
ここで、［e］は特定の列に沿った変数の数であり、またRp=Cpである場合には、Rp・e=Xである。
例えば、４つのプレートに渡る10 x 10 x 8 x 8フォーマットに対しては、np・e = 8 → e = 2; 10 x 2 = X; X = 20である。
上記の一般的なデコンボリューション式の理解から、当業者は、本発明による自己−デコンボリューションの有利な結果が、ウエルの多数の異なる配列、プレートレイアウト、混合物等を使用して得ることができ、また本明細書に例示した好ましい態様に関するこのような変形が本発明の範囲内に入るものであることを容易に理解するであろう。
このFRET法は、溶液中での２種の直交する混合物の組の合成に基づくものである。これら溶液の各々は二次元で指定される。従って、例えばプロテアーゼ走査により得られるデータは、解読または再合成の必要なしに、最も活性な化合物を同定する。サブ−ユニット（この場合はアミノ酸）の位置的な優越性が、同時に全ての他の異なる位置に関して最適化される。４つの位置全ての間の相乗的関係が実現され、しかも正の、即ち有利なおよび負の不活性化データ両者が生成される。これは基質とそのサブ−ユニット優越性の群（準−集団）に導く。これらデータを分子モデル化プログラムに組み込んで、薬作用発生団記述子を発生し、該記述子は、（正のデータからの）望ましい特徴を包含し、かつ（負のデータの組からの）望ましからぬ相互作用を示す。一次元の走査は、一度に一つの位置を「最も活性」なものとして示すだけであり、しかも位置間の相乗的な関係を探索することはない。
以下、本発明を下記の実施例を参照して説明する。
実施例１
本実施例においては、対象とするタンパク質分解酵素はDer P1であり、これは室内ほこりダニの排泄物中に見出される。本実施例は、上記適当な結合が不飽和アミド結合である、多数のFRET化合物の合成、Der P1の有力な基質に関するスクリーニングのためのライブラリーとしてのその利用、およびその後の該酵素の活性阻害剤の同定および合成を例示する。
Der P1の精製
粗製ダニ抽出物（〜100mg, SmithKline-Beecham, U.K.）を、150mMのNaClを含有する、５mlの燐酸緩衝塩水（PBS; 50mMの燐酸カリウム；pH7.4）に溶解し、Der P1を、4Cl抗体（Indoor Biotechnology, Deeside, U.K.）を使用したアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。この粗調製物を、約２mlのアフィニティー樹脂と２時間、４℃にて混合し、次いで２〜３容のPBSで洗浄した。結合したタンパク質の溶出を、５mMのグリシンを含有する、50%（v/v）エチレングリコールを使用して実施した。画分（2.2ml）を集め、0.8mlの0.2M燐酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で中和した。これら画分をプールし、４ｌのPBSに対して一夜透析し、次いで２ｌのPBSに対して２〜３時間第二の透析を行った。全タンパク質を、必要により限外濾過（マクロセップ（MacroSep）; Flowgen, U.K.）により濃縮した。
化合物の合成
該化合物を、Fmoc-Rink（マクロクラウン（Macro crowns）; Chiron Mitotypes Pty., Ltd., 11 Duerdin Street, Clayton Victoria 3168, Australia）を用い、７μＭの負荷にて、マルチピン法25，26を利用して合成した。
該化合物各々のアミノ酸残基を、アミド結合を利用して、適当な形状で結合した。使用したカップリング化学は、フルオレニルメトキシカルボニル保護アミノ酸および活性化ペンタフルオロフェニルエステルに関する文献27に報告されているものと類似しており、そこでは酸に対して不安定な当業者には公知の保護基、例えばBoc-（リジンの-NH2、アンスラニル酸およびグアニジノまたはアルギニンの-NH2に対する）保護基、tBU-（セリン、スレオニンおよびチロシンの-OHに対する）保護基、アスパラギン酸およびグルタミン酸の-COOH基に対するt-Bu保護基、Trityl-（アスパラギンおよびグルタミンのアミドに対する）保護基およびヒスチジンリングのアミノ官能基を使用して、側鎖を保護している。
該カップリングした残基の、該N-α−フルオレニルメトキシカルボニル保護基を、20%ピペリジンのジメチルホルムアミド（DMF）溶液を使用して、30分間20℃にて開裂した。遊離酸、例えばBoc-ABz-OH（Boc-2-アミノ安息香酸）およびFmoc-（3-ニトロ）チロシン-OHに対する該カップリング反応を、溶媒としてのジメチルホルムアミド（500μl）中の、該遊離酸（1eq.）: TBTU（0.98eq.）: HOBt（0.98eq.）:N-メチルモルホリン（1.96eq.）混合物10当量を使用して、５時間20℃にて実施した。他のアミノ酸を、そのペンタフルオロフェニルエステル26として、２〜６時間カップリングした。
従って、ペンタフルオロフェニルエステルとして、該誘導体化したアミノ酸の混合物中における各成分をほぼ等しい比率でカップリングするために、DMF（500μl）中の、アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル：HOBT（1eq.）混合物0.98当量の溶液を16時間20℃にてカップリングした。次いでこれらのピンをDMFで十分に洗浄し、次に同一の混合物を同一の条件下で使用して、再度カップリングした。（該クラウンのアミノ基担持量に対して）10当量のDMF中での２時間に渡る第三のカップリングは、１当量よりも僅かに少ない、該アミノ酸の該誘導化したペンタフルオロフェニルエステルの等量混合物について、このプロトコールを使用して実施し、該クラウンに対してほぼ等量の該カップリング生成物を得ることができる。このようにして、各クラウン上に存在する20個の化合物を有するライブラリーを構築する。これらの化合物を該クラウンから直接開裂して、所定の96ウエルプレートの該80個の指定されたウエルを得た。この開裂プロトコールにおいて、各クラウンを、トリフルオロ酢酸（95%）、トリエチルシラン（5%）を含む混合物（600μl）で、２時間20℃にて処理した。次いで、このクラウンをトリフルオロ酢酸（500μl）で洗浄し、これを次に該開裂溶液と併合した。
クラウン当たり７μモルの使用量のFmoc-Rinkアミドマクロクラウン（Chiron Mimotypes Pty., Ltd., 11 Duerdin Street, Clayton Victoria 3168, Australia）をDMF中0.14Mの濃度のHOBt（0.98当量）の存在下でTBTU（0.98当量）及びＮ−メチルモルホリン（1.96当量）を使用してL-Fmoc-Asp（O-t-Bu）-OH（１当量）を含む混合物10倍過剰とカップリングした。30分間にわたってFmoc基をDMF中20％のピペリジンで脱ブロックし、続いてDMF次いでメタノールで洗浄した後、溶媒としてのジメチルホルムアミド中0.14Mの濃度で５時間にわたって20℃でFmoc-（3-ニトロ）チロシン-OH（1当量）: TBTU（0.98当量）: HOBt（0.98当量）の混合物10当量を使用してFmoc-（3-ニトロ）チロシン-OHのカップリングを行った。Fmoc基を除去し（以下を参照のこと）、続いてアミノ酸の混合物を概説した比で記載された条件（以下を参照のこと）下でカップリングした。
特別な例において、基Ｂを含むアミノ酸はAla、Val、Leu、Ser、Asn、Gln、Glu、Lys、Phe、Proを含む。基Ｃを含むアミノ酸はAla、Val、Leu、Ser、Asn、Gln、Glu、Lys、Phe、Proを含む。基Ｄを含むアミノ酸はAla、Val、Ile、Leu、Nle、Ser、Glu、Pheを含む。ｎ＝４について、基Ｅを含むアミノ酸はAla、Val、Ile、Leu、Nle、Ser、Glu、Pheを含む。それ以外に、アミノ酸からのあらゆる選択がｎ＝１、２、または３についてなし得る。
次いで、合わされた開裂溶液を含むプレートを800rpmで１時間にわたって20℃で10-2mmHgの減圧で回転遠心分離機（“SPEEDVAC”、Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY）を使用して蒸発、乾燥して成分混合物を得た。次いでアセトニトリル：水：酢酸の（50％：45％：５％）混合物を使用して、夫々の成分を最終マザープレートに移した。次いで20℃で10-2mmHgの減圧で使用してプレートを凍結乾燥し、次いで-20℃で貯蔵した。この様式で、図２-14に示された型のライブラリーを調製した。
更に詳しくは、使用したマルチピンアプローチを以下に記載する。
Der pIの潜在的基質のマルチピン合成
“Chiron”マルチピンキットは“クラウン”が可逆的に付着される96“ピンステム”を含む通常の8 x 12のピンホルダーからなる。“クラウン”は、成長しているペプチドが固相ペプチド合成中に固定される反応性ポリマー表面を与える。夫々のクラウン（通常の固相合成におけるペプチド樹脂の当量）は工業規格96ウェルプレートの個々の１mLのウェル中で同時合成を行うことにより独立のリアクターであると考えられる。夫々のウェル、ひいては夫々のクラウンに夫々のクラウンに特異な配列を与える試薬の特異な組を仕込むことができる。普通の工程、例えば、Ｎα保護の洗浄または除去を同時に行うことができる。
合成はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）保護アミノ酸の使用に基いている。三官能アミノ酸の側鎖はトリチルまたはtert-ブチルの如き酸不安定基で保護される。成長しているペプチド鎖へのアミノ酸残基の付加、即ち、“カップリング”と称されるプロセスは、触媒としての三級塩基（NMM）及びHOBtの存在下で試薬HBTUまたはBOPを使用して、前生成されたペンタフルオロフェニル（pfp）エステルの利用または遊離酸の活性化により進行する。
使用した実験技術は充分に実証されており（Maeji,N.J. Bray,A.M. Valerio,R.M.及びWang,W., Peptide Research, 8（1）, 33-38, 1995及びValerio,R.M. Bray,A.M.及びMaeji,N.J. Int.J.Pept.Prot.Res, 44, 158-165, 1994）、主な工程は簡単に言えば以下のとおりである。
一般的な方法
マルチピンアッセンブリーの調製
通常のプラスチックグローブを着用して、Fmoc-Rinkアミド誘導体化マクロクラウンをステムに集合し（単にクリップし）、合成に所望のパターンで8 x 12のステムホルダーにスロットする。
Ｎα-Fmoc保護の除去
250mLの耐溶剤性浴に20％のピペリジン/DMF溶液200mlを仕込む。マルチピンアッセンブリーを添加し、脱保護を30分間進行させる。次いでアッセンブリーを除去し、過剰の溶媒を簡単な振とうにより除去する。次いでアッセンブリーを夫々200mLのDMF（5分間）及びMeOH（５分間、２分間、２分間）で連続して洗浄し、15分間にわたって空気乾燥させる。
Fmoc発色団放出の定性的UV測定
１cmの路長のUVセルに20％のピペリジン/DMF溶液1.2mLを仕込み、使用して290nmの波長でUVスペクトロメーターの吸光度をゼロにする。次いで20％のピペリジン/DMF溶液3.2mL中Fmoc-Asp（OBut）-ペプシンKA（0.08ミリモル/g）5.0mgからなるUV標準物質を調製する。この標準物質はAbs290=0.55-0.65（RTで）を与える。次いでマルチピン脱保護溶液のアリコートを適当に希釈して理論的Abs290=0.6を得、この値を先のカップリング反応の効率を示す実際に実験により測定した吸光度と比較する。
アミノ酸残基のカップリング
マルチピンアッセンブリーを乾燥している間に、カップリングの特別なラウンドに必要とされる適当なＮα-Fmocアミノ酸pfpエステル（夫々のクラウンの使用量から計算して10当量）及びHOBt（10当量）を好適な容器に正確に計量して入れる。また、適当なＮα-Fmocアミノ酸（夫々のクラウンの使用量から計算して10当量）、所望のカップリング剤、例えば、HBTU（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）及び活性化剤、例えば、HOBt（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）、NMM（夫々のクラウンの使用量から計算して19.9当量）を好適な容器に正確に計量して入れる。
次いで、保護され、また活性化されたFmocアミノ酸誘導体をDMFに溶解する（夫々のマクロクラウンについて500μl、例えば、20のマクロクラウンについて、20 x 10当量x 7ミリモルの誘導体がDMF 10000μLに溶解されるであろう）。次いで適当な誘導体を“カップリングサイクル”の開始に用意した適当なウェルに分配する。通常のように、カップリング反応を２−６時間進行させる（カップリングの性質に依存して、例えば、AlaからAlaには２時間、ValからLeuには６時間）。
Fmocアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをカップリングする場合、ブロモフェノールブルー原液（100μl）を含むDMF（400μl）中の誘導体10当量を夫々のマクロクラウンについて使用する。これは未反応のアミンの存在下でアシル化の完結後の淡黄色へのブロモフェノールブルーの濃青色の着色の消失によりアシル化反応の進行の監視を可能にする。
ブロモフェノールブルー原液の調製
ブロモフェノールブルー（20mg）をDMF（50mL）に溶解し、HOBt（10mg）を添加する。
カップリング後の洗浄
20％のピペリジン/DMF脱保護がカップリングサイクル直後に続いて行われる場合、マルチピンアッセンブリーを素早く振とうして過剰の溶媒を除去し、夫々200mLのMeOH（５分間）及びDMF（5分間）で連続して洗浄し、脱保護する（上記を参照のこと）。マルチピンアッセンブリーが貯蔵される場合、素早い振とう次いで夫々200mLのDMF（5分間）及びMeOH（５分間、２分間、２分間）による連続の洗浄からなる充分な洗浄サイクルが行われる。
ペプチド−ピンアッセンブリーのアシドリシス媒介開裂
酸媒介開裂プロトコルをヒュームフード中で厳密に行う。ポリスチレン96ウェルプレート（１mL／ウェル）を標識し、次いで風袋を最も近いmgまで測定する。次いで適当なウェルに開裂すべきマルチピンアッセンブリーのパターンに相当するパターンでトリフルオロ酢酸／トリエチルシラン（95:5、v/v、600μl）開裂溶液を仕込む。
マルチピンアッセンブリーを添加し、全構築物をスズ箔中に覆い、２時間放置する。次いでマルチピンアッセンブリーを５分間にわたってトリフルオロ酢酸／トリエチルシラン（95:5、v/v、600μl）（上記のとおり）を含む別のポリスチレン96ウェルプレート（１mL／ウェル）に添加する。
開裂されたアッセンブリーをDMF（200μL、５分間）、MeOH（200μL、５分間）で洗浄し、使用済のクラウンを除去し、捨て、ステムを除去し、メタノール中で音波処理により洗浄する（１時間、RT）。
開裂されたペプチドの処理
次いで一次ポリスチレン開裂プレート（２時間の開裂）及び二次ポリスチレンプレート（５分間洗浄）（上記を参照のこと）をSpeedVacに入れ、溶媒を90分間にわたって除去する（最小乾燥速度）。
アセトニトリル／水／酢酸（50:45:5、v/v/v）溶液（3 x 150μl）を使用して、二次ポリスチレンプレート（上記を参照のこと）の内容物を一次プレートのそれらの相当するウェルに移し、使用済の二次プレートを捨てる。
生成物の分析
夫々のウェル（上記を参照のこと）1.0μlを0.1％のTFA水溶液で400μlに希釈し、HPLC-MSにより分析する。カラムVydac C4（214TP52、狭い内腔、21 x 250mm）。溶離剤：溶媒Ａ＝0.1％のトリフルオロ酢酸水溶液、溶媒Ｂ＝アセトニトリル／10％のＡ。勾配：27分間にわたってＡ中10-90％のＢ、250ml／分、215nm UV検出。下記の個々の基質を上記方法により調製し、HPLC-MSにより正確な質量で>95％であることが示された。
ペプチドの最終凍結乾燥
一次ポリスチレンプレート（＋二次プレートからの洗浄液）をスズ箔で覆い、弾性バンドでプレートに保持する。ピンプリックを箔中に夫々のウェルの直接上に置き、プレートを-80℃で30分間配置する。次いでプレートを“Heto凍結乾燥機”で一夜凍結乾燥する。適当な場合、個々のペプチドをその後に計量し、生物学的スクリーニングの前にDMSO中10mMの原液に溶解した。また、20成分混合物を計量し、ペプチド／20成分比を計算する。
アミノ酸残基の更なるカップリングを上記マルチピンアプローチに従って行った。マルチピンアッセンブリーが乾燥している間に、適当なＮα-Fmocアミノ酸（夫々のクラウンの使用量から計算して10当量）、HATUカップリング剤（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）、HOAt触媒（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）及びDIPEA（夫々のクラウンの使用量から計算して19.9当量）を正確に計量して好適な容器に入れた。
次いで、保護されたＮα-Fmocアミノ酸及びカップリング剤をDMF（夫々のマクロクラウンについて500μl）に溶解し、DIPEAの添加により活性化した。次いで適当な誘導体をそれらの適当なウェルに分配し、通常のようにして夫々のマクロクラウンへのカップリングを２時間進行させた。
特にヒンダードアミノ酸残基、例えば、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸または格別のアミノ酸（そのカップリング効率が知られていない）をカップリングする場合、そのカップリング反応を更に２時間にわたって通常のようにして繰り返した。
Der pIの基質
上記一般的技術を使用して、下記の化合物を調製し、上記のようにして精製されたDer pIの潜在的基質として分析した。
0004215822.tif 000008
0004215822.tif 000009
0004215822.tif 000010
0004215822.tif 000011
NSは、ペプチドがDer pIにより加水分解されなかったことを示す。
NMは、ペプチドがDer pIの基質であるが、Ｋmが測定されなかったことを示す。
NMaは、ペプチドがDer pIの基質であり、その開裂に続いてHPLC-MSが行われて加水分解が-Nle-Ser-の間で起こることを示したことを示す。
開裂速度の順序のランク付け：-Bz > n-But > Piv > Bz（2-カルボキシ）>Abz
アミノ酸残基のカップリングを上記マルチピンアプローチに従って行った。マルチピンアッセンブリーが乾燥している間に、適当なＮα-Fmocアミノ酸（夫々のクラウンの使用量から計算して10当量）、HATUカップリング剤（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）、HOAt触媒（夫々のクラウンの使用量から計算して9.9当量）及びDIPEA（夫々のクラウンの使用量から計算して19.9当量）を正確に計量して好適な容器に入れた。
次いで、保護されたＮα-Fmocアミノ酸及びカップリング剤をDMF（夫々のマクロクラウンについて500μl）に溶解し、DIPEAの添加により活性化した。次いで適当な誘導体をそれらの適当なウェルに分配し、夫々のマクロクラウンへの通常のカップリングを２時間進行させた。
特にヒンダードアミノ酸残基、例えば、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸または格別のアミノ酸（そのカップリング効率が知られていない）をカップリングする場合、そのカップリング反応を更に２時間にわたって通常のようにして繰り返した。
下記の配列をこの方法で合成した。
ペプチド配列［配列番号77−85］測定Ｋm（μM）
0004215822.tif 000012
NS-Not基質：Der pIにより加水分解されたNot
測定されなかったNM-基質：測定されなかったDer pIの基質
アッセイ操作
本明細書に記載された装置のライブラリー中の20の化合物の夫々の混合物をシステイニルプロテアーゼDer pIに対するアッセイで化合物当たり1.0μMの濃度でスクリーニングした。最も活性なウェルを、サンプルを320nmで照射した時の420nmにおける蛍光の放出の速度により同定した。２種の相補ライブラリーの分析は、酵素の最良の基質が
Abz-B-C-D-E-Tyr（NO2）-Asp-NH2
（式中、
Ｂ＝バリン＞アラニン、グルタミン、ロイシン、フェニルアラニン
Ｃ＝アラニン＞＞グルタミン、またはロイシン
Ｄ＝ロイシン、ノルロイシンまたはアラニン＞セリン
Ｅ＝セリン）
であることを示した。
最良の基質は
［配列番号１］Abz-Val-Ala-Nle-Ser-Tyr（NO2）-Asp-NH2であった。
次いで本明細書に記載されたペプチド合成方法を使用して、この化合物を単一成分として再度合成した。Der pIアッセイにおける純粋な基質に関するｋcat/Ｋm値を3.5x104M-1s-1として測定し、Der pIのインヒビターの一般的なスクリーニングのための高処理量アッセイにおける使用について適当に高いと考えた。
高処理量アッセイ開発
夫々のウェル中で100μLのアッセイ容積当たりDer pI 0.1μgを使用し、基質20μMを使用して、プレートアッセイを96ウェルプレートフォーマットで行った。全てのアッセイをアッセイ緩衝液（AB；１mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）及び１mMのジチオスレイトール（DTT）を含む50mMのリン酸カリウム、pH8.25）中で行った。Der pI酵素をDTTの添加により前活性化し、これをアッセイの開始の前に５分間にわたって室温でインキュベートする。スクリーニング方法の例として、夫々のウェルはDMSO中試験化合物の20μMの溶液５μL、基質、２の200μMの水溶液10μLを含み、AB中のDer pI 85μLを添加して反応を開始する。Labsystems Fluroskan Ascent機械を使用して、励起について320nmを使用し、放出波長について420nmを使用して、酵素活性を蛍光により監視する。日立F-4500蛍光スペクトロフォトメーターを使用して、反応速度測定を行った。
Der pIのインヒビターの合成
上記の最良の基質は酵素／アッセイ溶液のHPLC-質量分光分析によりノルロイシン−セリンアミド結合間で開裂されることが示された。一連の誘導体（例えば、Boc-、ピバロイル、ベンゾイル、及び２−カルボキシ−ベンゾイル）による末端Abz基の置換はDer pI酵素の基質活性及び特異性に影響した。P1-P1’開裂部位のこの知識により、かつP4-P3-P2-P1モチーフについて、化合物Boc-Val-Ala-Leu-H、４をスキーム1a、図15に示されたようにして合成した。
モチーフへの好適なミカエルアクセプター、例えば、CH=CH-CO2Et、及び-CH=CH-SO2Phの付着（スキーム２、図16）は夫々50nM、1000nM及び100nMの見掛IC50値を有する酵素の活性インヒビターを与えた。
アシルオキシメチルケトン系列の調製
活性Der PIインヒビター活性を有する一連のアシルオキシメチルケトン化合物を下記の操作により調製した。
Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ノルロイシン
Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ノルロイシンを以下のようにして固相ベンゾイル化ペプチド合成により調製した。
樹脂装填（工程１）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（4.9g、1.05ミリモル/g、Novabiochem）をジクロロメタン（40ml）中で膨潤させ、Fmoc-L-ノルロイシンの懸濁液を添加し、５分間攪拌した。DCM中のジイソプロピルエチルアミンの溶液（10ml、30ml中57ミリモル）を５分間にわたって添加し、得られる混合物を室温で２時間攪拌した。メタノール（５ml）を添加し、反応混合物を更に10分間攪拌し、その後に樹脂を濾過し、3x DCM、2x DMF、2x２−プロパノール、2x DMF、2x２−プロパノール、メタノール、2xエーテルで洗浄し、24時間にわたって真空中で乾燥させた。
アミノ酸脱保護（工程２）
Fmoc-L-ノルロイシン装填樹脂を４時間にわたってDMF中20％のピペリジンによる処理により脱保護した。膨潤した樹脂を濾過し、5x DMF、2xエーテルで洗浄し、24時間にわたって真空中で乾燥させた。
ペプチド鎖延長（工程３）
Ｌ−ノルロイシン装填樹脂（５ミリモル）をDMF（20ml）中のFmoc-L-アラニン（6.23g、20ミリモル）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.0g、20ミリモル）、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（7.59g、20ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（6.97ml、40ミリモル）の溶液に添加し、軽く攪拌しながら４時間にわたって膨潤させた。樹脂を濾過し、4x DMF、2xエーテルで洗浄し、真空下で一夜乾燥させた。
Fmoc-L-アラニン及びＦmoc-L-バリンを用いて工程（2）及び（3）を繰り返して行って樹脂結合トリペプチドH-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンを得た。
ペプチド鎖ベンゾイル化（工程４）
L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン装填樹脂（1g、約１ミリモル）をDMF（５ml）中の安息香酸（0.488g、４ミリモル）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.6g、４ミリモル）、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（1.52g、４ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（1.40ml、８ミリモル）の溶液に添加し、軽く攪拌しながら６時間にわたって膨潤させた。樹脂を濾過し、4x DMF、2xエーテルで洗浄し、真空下で一夜乾燥させた。
樹脂開裂（工程５）
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン装填樹脂（1.0g、約１ミリモル）を１時間にわたってトリエチルシラン（320ml、２ミリモル）を含むジクロロメタン（20ml）中のトリフルオロ酢酸の１％溶液で処理した。樹脂を濾過により除去し、ジクロロメタン（3x10ml）で洗浄した。有機層を回収し、蒸発させ、エーテルで滴定してN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン（285mg）を得た。電気噴霧-MS m/z 407［MH+］。
ブロモメチルケトン生成（工程６）
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン（140mg、0.34ミリモル）を乾燥THF（3ml）中で懸濁させ、乾燥DMFを滴下して添加して均一性を得た。その反応混合物を-10℃に冷却し、イソブチルクロロホルメート（129ml、1.0ミリモル）及びＮ−メチルモルホリン（109ml、1.0ミリモル）をアルゴン雰囲気下で攪拌しながら添加した。その混合物を30分間攪拌し、その後にエーテル中のジアゾメタンの溶液（５ml、約２ミリモル）を添加した。その反応混合物を１時間にわたって室温に温め、その後に酢酸及び50％のHBrの1:1溶液（１ml、3.0ミリモルのHBr）を滴下して添加し、15分間攪拌した。有機相を酢酸エチル（40ml）で希釈し、水（10ml）、食塩水（10ml）及び重炭酸ナトリウム（2x10ml）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、溶媒を真空下で除去した。これはオフホワイトの固体（152mg）を与え、これは分取HPLCにより必要に応じて更に精製することができた。電気噴霧-MS m/z 482［MH+］及び484［MH+］。
アシルオキシメチルケトン生成（工程７）
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2,6-ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルオキシメチルケトン
乾燥DMF（500ml）中のフッ化カリウム（0.1ミリモル、6mg）及び２，６−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸（0.066ミリモル、17mg）の混合物を室温で５分間にわたってモレキュラーシーブ上で攪拌した。乾燥DMF（500ml）中のN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン（0.033ミリモル、16mg）の溶液を添加し、その反応混合物を１時間攪拌した。反応混合物を短いシリカプラグに通し、ジクロロメタン中５％のメタノールで洗浄した。溶媒を真空下で除去し、分取HPLCを使用して残渣を精製した。凍結乾燥して白色の凍結乾燥産物として得た（6.4mg）。電気噴霧-MS m/z 660［MH+］。
同様にして、下記の化合物を調製した。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び２，６−ジメチル安息香酸からN-ペンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2,6-ジメチルペンゾイルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 552［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び２−ヒドロキシ安息香酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2-ヒドロキシベンゾイルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 540［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び２，６−ジクロロ安息香酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2,6-ジクロロベンゾイルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 592［MH+］及び594［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び安息香酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンベンゾイルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 524［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び2,3,4,5,6-ペンタフルオロ安息香酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2,3,4,5,6-ペンタフルオロベンゾイルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 614［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び1,1-ジメチルプロパン酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン1,1-ジメチルプロピルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 504［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及びN-ベンジルオキシカルボニル-D-セリン-O-tert-ブチルエーテルからN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンN（-ベンジルオキシカルボニル）-D-セリニル-（O-tert-ブチル）オキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 697［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及びN-ベンジルオキシカルボニル-D-セリンからN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンN（-ベンジルオキシカルボニル）-D-セリンオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 641［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び2-フランカルボン酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2-フランオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 514［MH+］）。
N-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシンブロモメチルケトン及び2,6-ジクロロフェニル酢酸からN-ベンゾイル-L-バリル-L-アラニル-L-ノルロイシン2,6-ジクロロフェニルアシルオキシメチルケトン（電気噴霧-MS m/z 606［MH+］、608［MH+］）。
通常の分取HPLC条件は以下のとおりであった。30分間にわたって5-95％（90％のアセトニトリル（0.1％のTFA））の勾配で毎分10mlで溶離するC4分取HPLC系（Vy-dac、22x 250mm）。
下記の化合物を夫々の命名化合物の下に記載される技術及び操作により調製した。
エチル-（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノバリルアラニル）アミノ-6-メチル-ヘプタ-2-エノエートの調製
０℃に冷却した無水THF（4ml）中の水素化ナトリウム（46mg、1.9ミリモル）の懸濁液に、THF（2ml）中のトリエチルホスホノアセテート（420mg、1.9ミリモル）の溶液を５分間にわたって滴下して添加し、ガス発生が停止するまで混合物を攪拌した。その溶液を-10℃に冷却した乾燥THF中のBocVAL-CHO（600mg、1.56ミリモル）の溶液に滴下して添加した。その反応混合物を１時間攪拌し、飽和塩化アンモニウム（10ml）を添加した。白色の固体が沈殿し、これを濾過により除去し、濾液を酢酸エチルと水の間に分配した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて油を得、これをアセトニトリル水で結晶化して標題化合物を得た。640mg、91％。
MS（EI +ve）は（M+（C23H41N3O6）+1）=456を必要とした。実測値（M++H）=456、（（M+-tBOC）+1）=356（100％）。
（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノバリルアラニル）アミノ-6-メチル-ヘプタ-2-エン酸の調製
そのエチルエステル（455mg、１ミリモル）をジオキサン（10ml）に溶解し、水続いて水酸化リチウム（126mg、３ミリモル）を添加した。その溶液を３時間攪拌し、pHが中性に達するまで1MのHCl水溶液を添加した。ジオキサンを回転蒸発により除去し、pHを1MのHCl水溶液で４に調節した。標題化合物が沈殿し、濾過し、水洗して420mg、98％を得た。
MS（EI +ve）は（M+（C21H37N3O6）+1）=428を必要とした。実測値（M++H）=428（100％）。
1,1,1-トリフルオロエチル-（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノバリルアラニル）アミノ-6-メチル-ヘプタ-2-エノエートの調製
その酸（BocVAL-CO2H）（50mg、0.117ミリモル）及びジメチルアミノピリジン（29mg、0.24ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（1ml）に溶解し、０℃に冷却した。ジクロロメタン0.5ml中の水溶性カルボジイミド塩酸塩（26mg、0.13ミリモル）を添加し、その溶液を５分間攪拌した。ジクロロメタン0.5ml中の1,1,1-トリフルオロエタノール（0.017ml、0.23ミリモル）を添加し、その反応を１時間後に室温に温め、反応混合物を一夜攪拌した。その反応混合物を2x2mlの0.5Mのクエン酸溶液、1x2mlの水、1x2mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液、1x2mlの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発、乾燥させて標題化合物を得た。
MS（EI +ve）は（M+（C23H38N3O6F3）+1）=510を必要とした。実測値（M++H）=510、（（M+-tBOC）+1）=410、（（M+-tBu）+1）=454（100％）。
エチル-（S）-（E）-3-（N-ベンゾイルバリルアラニル）アミノ-6-メチル-ヘプタ-2-エノエートの調製
そのtert-ブトキシカルボニル保護エチルエステル（16.6mg、0.036ミリモル）をジオキサン（2ml）中の4.0MのHClに溶解し、室温で30分間攪拌し、蒸発、乾燥させた。残渣をDMF（0.5ml）に溶解し、N-メチルモルホリン（7.36mg、0.073ミリモル）続いてDMF 0.5ml中の塩化ベンゾイル（5.4mg、0.038ミリモル）を添加した。その反応を２時間攪拌し、0.1％のトリフルオロ酢酸溶液（4ml）及びアセトニトリル（2ml）で希釈し、C4分取HPLC系（22x250mm）に注入し、毎分10mlで溶離し、215nm及び25分間にわたって10-90％の系Ｂの勾配で監視し、15分間にわたって90％で保持した。系Ａ＝水中0.1％のTFA、系Ｂ＝90％のアセトニトリル、10％の系Ａ。26-28分で溶離するピークを回収し、白色の固体に凍結乾燥した。収量4.5mg、27％。
MS（EI +ve）による分析は（M+（C25H37N3O5）+1）=460を必要とした。実測値（M++H）=460。
ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネートの調製
I.Shahak及びJ.Almog.（Synthesis, 145, 1970）から採用した方法を使用してジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネートを調製した。
市販のジエチルフェニルチオメチルホスホネート（1.0ml、4.1ミリモル）をジクロロメタン（10ml）に溶解した。硫酸（10ml、25%）を添加し、その混合物を氷で冷却した。次いで攪拌しながら、固体の過マンガン酸カリウムを0.5gの三つのアリコートで添加した。添加後に、反応は完結していることが明らかであった。混合物が無色になるまで、固体のメタ重亜硫酸ナトリウムを徐々に添加した。次いでこれを酢酸エチル（x3）で抽出し、合わせた有機洗浄物を飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いて食塩水で洗浄し、その後に硫酸ナトリウムで乾燥させた。揮発物を真空除去した。残渣をシリカによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、最初に酢酸エチル／ヘキサン8/2、続いて純粋な酢酸エチルで溶離した。
この方法で、所望の生成物、ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート（1.0g、定量的）を無色の固体として得た。
生成物を質量分光分析（MS）（MALDI-TOF）により分析し、（M+（C11H171O5PS）+1）=292を必要とし、（M++1）=292を得た。
（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-1-フェニルスルホニル-5-メチル-1-ヘキセンの調製
ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート（38mg、129ミリモル）を乾燥THF（10ml）に溶解し、次いで窒素の雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム（油中60％の分散液8mg、200ミリモル）を添加し、その混合物を15分間攪拌した（発泡）。次いでアルデヒドtBoc-Val-Ala-Leu-CHO（50mg、129ミリモル）を得られる溶液に添加し、その混合物を60分間攪拌した。その反応を希塩酸（0.1M）の添加により停止し、続いて酢酸エチル（x3）で抽出した。分離した有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液及び食塩水で連続して洗浄し、その後に硫酸ナトリウムで乾燥させた。揮発物を真空除去した。残渣をシリカによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル／ヘキサン4/6で溶離した。未同定の副生物を最初に溶離し（12mg）、続いて所望の生成物（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-1-フェニルスルホニル-5-メチル-1-ヘキセン（22mg、32％）を固体として溶離した。
MS（電気噴霧）は（M+（C26H41O6N3S）+1）=523を必要とした。実測値（M++Na）=546、（（M-tBoc）+1）=424（100％）。
ジエチルメチルスルホニルメチルホスホネートの調製
I.Shahak及びJ.Almog（Synthesis, 171, 1969）の方法を使用して、市販のジエチルメチルチオメチルホスホネートを標題化合物に変換した。
（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-1-メチルスルホニル-5-メチル-L-ヘキセンの調製
ジエチルメチルスルホニルメチルホスホネート（30mg、130ミリモル）を乾燥THF（5ml）に溶解し、次いで窒素の雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム（油中60％の分散液7mg、175ミリモル）を添加し、その混合物を15分間攪拌した（発泡）。次いでアルデヒドtBoc-Val-Ala-Leu-CHO（50mg、129ミリモル）を得られる溶液に添加し、次いでその混合物を60分間攪拌した。その反応を希塩酸（0.1M）の添加により停止し、続いて酢酸エチル（x3）で抽出した。分離した有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液及び食塩水で連続して洗浄し、その後に硫酸ナトリウムで乾燥させた。揮発物を真空除去した。残渣をシリカによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル／ヘキサン8/2で溶離した。未同定の副生物を最初に溶離し（4mg）、続いて所望の生成物（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-メチルスルホニル-5-メチル-1-ヘキセン（24mg、40％）を固体として溶離した。
MS（電気噴霧）は（M+（C21H39O6N3S）+1）=462を必要とした。実測値（M++Na）=484、（（M-tBoc）+1）=362（100％）。
エチルジエチルホスホリルメチルスルホネートの調製
L.Ghosezら（Tetrahedron, 43, 5125, 1987）に記載された操作Ｂに従って調製した。
生成物をMS（電気噴霧）で分析し、（M+（C7H17O6PS）+1）=261を必要とした。実測値（M++H）=261、（M++Na）=283。
ジエチル（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-5-メチルヘキセニルスルホネートの調製
エチルジエチルホスホリルメタンスルホネート（36ml、約138ミリモル）を乾燥THF（5ml）に溶解し、次いで窒素の雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム（油中60％の分散液8mg、200ミリモル）を添加し、その混合物を15分間攪拌した（発泡）。次いでアルデヒドtBoc-Val-Ala-Leu-CHO（50mg、129ミリモル）を得られる溶液に添加し、その混合物を30分間攪拌した。その反応を希塩酸（0.1M）の添加により停止し、続いて酢酸エチル（x3）で抽出した。分離した有機相を重炭酸ナトリウム溶液及び食塩水で連続して洗浄し、その後に硫酸ナトリウムで乾燥させた。次いで揮発物を真空除去した。残渣をシリカによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル／ヘキサン1/1で溶離した。所望の生成物ジエチル（S）-（E）-3-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ-バリル）アラニル）アミノ-5-メチルヘキセニルスルホネート（22mg、35％）を固体として得た。
MS（電気噴霧）は（M+（C22H41O7N3S）+1）=492を必要とした。実測値（M++1）=492、（（M-tBoc）+1）=392（100％）。
実施例２：
デプシペプチドの設計
本発明の一般式（I）、（II）または（III）の化合物中の別の好適な結合はデプシペプチドを生成するためのエステル結合である。デプシペプチド基質のとり込みはウイルスセリンプロテアーゼの如き低反応性ウイルスプロテアーゼの基質の同定を助けた。
例えば、一般式
ｎ［Abz-B1-10-C1-10-D1-8y［COO］-E1-8-Tyr（NO2）-Asp-NH2］
の基質を生成した。
しかしながら、ウイルスプロテアーゼのかなりの部分が上記一般構造により表された基質配列より大きい基質配列のみを認識する。ウイルスプロテアーゼの作用の性質（機能は未熟ウイルスタンパク質を成熟ウイルスパッケージに開裂することである）により、天然基質部位に関するデータを自動的に受け取ることが良く知られている。こうして、上記一般構造は特別な固定アミノ酸を適当な部位に導入することにより延長し得る。論理的延長は既知のP1-P1’開裂部位をデプシペプチド結合として導入し、次いで通常のフォーマットに従って四つの変異体位置を導入することであろう。
こうして、
ｎ［Abz-B1-10-C1-10-D1-8-E1-8-P1 y［ＣＯＯ］-P1’-Tyr（NO2）-Asp-NH2］
更に、これらの基質が小さすぎると再度判明した場合、既知の基質配列を使用して追加の固定位置を導入し得る。例えば、肝炎NS3プロテアーゼでは、中性P6位置が保存酸性残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）であることが知られている。こうして上記構造を以下に詳述されるようにして延長し得る。
ｎ［Abz-P6-B1-10-C1-10-D1-8-E1-8-P1 y［ＣＯＯ］-P1’-Tyr（NO2）-Asp-NH2］
本明細書に記載された新規な方法は治療上有益なタンパク質分解酵素インヒビターの発明を大いに助成し、商業上利用できる。これは、タンパク質分解酵素の最良の基質モチーフが迅速に同定し得るからであり、また、特にアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及びシステイニルプロテアーゼについて、タンパク質分解酵素の活性部位と反応するモチーフを付着するための種々の方法が文献に存在するので、酵素インヒビターが容易に合成し得る。更に、アミド結合置換または遷移状態擬態が分子にとり込まれ、これらはアスパルチルプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼの抑制に特に有益であろう。
また、記載された方法は新規なプロテアーゼインヒビターに関するスクリーニングアッセイの迅速な開発を促進する。ライブラリースクリーニングにより発見された最も強力な蛍光原基質が続いて調査中の特別なタンパク質分解酵素のインヒビターの検出に使用し得る。
記載された化合物ライブラリー内のインヒビターの存在は最も活性な蛍光原基質とのアッセイ混合物の再処理により容易に検出され、この基質は残りのタンパク質分解酵素活性の即時の測定を可能にするであろう。
本発明は自己デコーディング、組み合わせ蛍光原ライブラリーを提供し、それは新規なプロテアーゼインヒビターの設計及び発明を大いに促進するであろう。その理由は以下のとおりである。
ｉ．ライブラリーのペプチドが同様のその他の蛍光原基及び消光体基を含むペプチドと較べて増大された水溶性を有し得る。
ii. ペプチドが汚染エキソペプチダーゼに対し安定である。
iii.記載された自己デコンボルーション方法は、基質開裂の速度データの連続分析と対になって、基質ライブラリー内に含まれる最も活性な結合モチーフの即時同定を可能にする。
iv. その方法は酵素インヒビターとして作用しているライブラリー中のあらゆる化合物に関する酵素アッセイ混合物の迅速な評価を可能にする。
略号
本明細書に使用した略号は以下のとおりである。
アミノ酸の略号及びペプチド構造の命名法はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（J.Biol.Chem, 247, 997, 1971）に示された推奨に従う。全てのキラルアミノ酸は特にことわらない限りＬ形態のものである。使用したその他の略号は以下のとおりである。
-Abu、b-アミノ酪酸：Abz、２−アミノベンゾイル：ACH、１−アミノ−１−カルボキシ−シクロヘキサン：ACP、１−アミノ−１−カルボキシ−シクロプロパン：Bip、ビフェニルアラニン：n-Bu、ｎ−ブロキシカルボニル：Bz、ベンゾイル：Bz（2-カルボキシ）、２−カルボキシベンゾイル：ButGly、tert-ブチルグリシル：BOP、ベンゾトリアゾイル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート：Cha、シクロヘキシルアラニン：Chex、１−カルボキシシクロヘキシル：eAHA、γアミノヘキサノイル：HBTU、Ｏ−ベンゾトリアゾイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート：HOBt、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール：Hyp、トランス−４−ヒドロキシプロリニル：hLeu、ホモロイシル：2Nal、２−ナフチルアラニン：NMM、Ｎ−メチルモルホリン：Piv、ピバロイル：3pyr、３−ピリジルアラニン：Tic、２−カルボキシテトラヒドロキノリル：Tyr（NO2）、３−ニトロチロシン。
DMF、ジメチルホルムアミド；Fmoc、フルオレニルメトキシカルボニル；HPLC、高速液体クロマトグラフィー；Pfp、ペンタフルオロフェニル；tBoc、tert-ブトキシカルボニル；tBu、tert-ブチル；TFA、トリフルオロ酢酸；Pmc、ペンタメチルクロマン；Pbf、ペンタメチルベンゾフラン；TBTU、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；Trt、トリチル。
p.Aba、４−アミノベンゾイル；Aib、アミノイソ酪酸；Bip、ビフェニルアラニン；n-Bu、ｎ−ブチル；Bz、ベンゾイル；Cmpi、カルボキシメチルピペラジン；Deg、ジエチルグリシン；DIPEA、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン；HATU、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；HOAT、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール；Naph、ナフチルアラニン；3.Pyr、３−ピリジルアラニン；Tyr（NO2）、３−ニトロチロシン。
引用文献
0004215822.tif 000013
0004215822.tif 000014
【図１】
0004215822.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004215822.tif 000019
【図６】
0004215822.tif 000020
【図７】
0004215822.tif 000021
【図８】
0004215822.tif 000022
【図９】
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【図１０】
0004215822.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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