(57)【要約】  以下の工程：（ａ）薬学的組成物の治療有効量を個体の腹腔動脈に注入する工程を含む処置が記載され、該薬学的組成物が、発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を逆転させる。この処置に応答性となる個体を特定する方法もまた記載される。さらに、腹腔動脈への薬学的組成物の注入のための薬学的組成物を含有するデバイスが記載されている。
2016537403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）薬学的組成物の治療有効量を個体の腹腔動脈に注入する工程
を含む方法であって、
該薬学的組成物が、発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる、方法。
【請求項２】
薬学的組成物の前記治療有効量が、該薬学的組成物の１回投与量として、個体の腹腔動脈に注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬学的組成物が発症直後のＴ１Ｄを完全に逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬学的組成物が発症直後のＴ１Ｄを数ケ月から数年まで一過的に逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬学的組成物が、膵臓中のβ細胞によるインスリンの貯蔵、生産および放出を助ける、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）が少なくとも３分間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬学的組成物が神経ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬学的組成物がサブスタンスＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サブスタンスＰが前記薬学的組成物中の生理食塩水中に溶解されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体が、ＤＮＡ採取キットを用いて取得された唾液試料由来のＤＮＡに基づき、Ｔ１Ｄを有すると診断されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記個体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも１０ｎＭ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも５０ｎＭ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも１００ｎＭ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも２５０ｎＭ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
薬学的組成物を個体の腹腔動脈に注入するためのデバイスであって、該デバイスが、該薬学的組成物の治療有効量を含有し、かつ該薬学的組成物が発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる、デバイス。
【請求項１８】
前記デバイスがカテーテルを含み、かつ該カテーテルが前記薬学的組成物の前記治療有効量を含有する、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記薬学的組成物が発症直後のＴ１Ｄを完全に逆転させる、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記薬学的組成物が発症直後のＴ１Ｄを数ケ月から数年まで一過的に逆転させる、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記薬学的組成物が、膵臓中のβ細胞によるインスリンの貯蔵、生産および放出を助ける、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記薬学的組成物が神経ペプチドを含む、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記薬学的組成物がサブスタンスＰを含む、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２４】
サブスタンスＰが前記薬学的組成物中の生理食塩水中に溶解されている、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記個体が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有すると診断されている、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記個体がヒトである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも１０ｎＭ／ｋｇである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも５０ｎＭ／ｋｇである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも１００ｎＭ／ｋｇである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記薬学的組成物の前記治療有効量が少なくとも２５０ｎＭ／ｋｇである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記デバイスが、前記個体の前記腹腔動脈に挿入されている、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項３２】
以下の工程：
（ａ）発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する個体であって、該個体の腹腔動脈に薬学的組成物の治療有効量を注入することに対してポジティブな応答になる個体を特定する工程
を含む方法であって、
該薬学的組成物が、該個体において発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる、方法。
【請求項３３】
前記工程（ａ）における個体が、ＤＮＡ採取キットを用いて取得された該個体からの唾液試料中のＤＮＡに基づき特定される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の神経ペプチド療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療および管理の現在の方法には、インスリン補充療法、膵臓移植および膵島細胞移植が含まれる。インスリン補充療法は、副作用に悩まされる困難かつ不快な生涯にわたるプロセスであり、これはＴ１Ｄを治癒しない。臨床上の課題は、分刻みで変化する必要性の制御と共にインスリン放出を調整することが不可欠であることである。実施されているようなインスリン補充療法は命を救うが、慢性的に続く低血糖および高血糖の事象を防止し得ず、最終的に、微小血管および大血管の機能を劣化させ、組織損傷および神経障害を広範に進行させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
１つの広範な局面によれば、本発明は、以下の工程：（ａ）薬学的組成物の治療有効量を個体の腹腔動脈に注入する工程を含む方法であって、該薬学的組成物が、発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる（reverse）、方法を提供する。
【０００４】
第２の広範な局面によれば、本発明は、薬学的組成物を個体の腹腔動脈に注入するためのデバイスであって、該デバイスが、該薬学的組成物の治療有効量を含有し、かつ該薬学的組成物が発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる、デバイスを提供する。
【０００５】
第３の広範な局面によれば、本発明は、以下の工程：（ａ）発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する個体であって、該個体の腹腔動脈に薬学的組成物の治療有効量を注入することに対してポジティブな応答になる個体を特定する工程を含む方法であって、該薬学的組成物が、該個体において発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を少なくとも部分的に逆転させる、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の１つの実施形態による、個体の腹腔動脈に薬学的組成物を注入するカテーテルを示す図である。
【図２】発症直後の糖尿病のマウスにおいて、サブスタンスＰ（ｓＰ）を膵臓の動脈内注入をした後の血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。
【図３】糖尿病誘発Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を保有するトランスジェニック糖尿病マウスの膵臓リンパ節内部のＣＦＳＥ  Ｔ細胞増殖アッセイを示すグラフである。
【図４】発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）で動脈内膵臓サブスタンスＰ送達後の典型的な浸潤なしの膵島の画像である。
【図５】サブスタンスＰ＋エバンスブルー染料マーカーを動脈内で膵臓に注入した後のマウスにおける血管拡張した膵臓組織を示す画像である（観測：膵臓選択的な灰色がかった青色の着色）。
【図６】全体の研究計画の代替の結果モデルを示すグラフである。
【図７】本発明の１つの実施形態において用いられ得るＤＮＡ採取キットを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
添付の図面は、本明細書中に取り込まれかつその一部を構成するが、これは、本発明の例示の実施形態を図示し、上述の一般的な説明および下述の詳細な説明と共に、本発明の特徴を説明するためにある。
【０００８】
用語の定義が該用語の一般的に使用される意味から外れる場合は、出願人は、特に示さない限りは、以下に提供される定義を用いることを意図する。
【０００９】
本発明の目的のために、値、特性または他の因子を用いた数学的計算または論理的決定を行うことによって、その値、決定、または特性が引き出された場合、値、決定、または特性は、特定の値、データ、情報、特性、状態の充足、または他の因子に「基づく」。例えば、個体が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有することの決定は、該個体由来の唾液試料から取得したＤＮＡに基づく。
【００１０】
本発明の目的のために、用語「カテーテル」は、膵臓のアクセスを容易にする医療グレードの材料から押し出された薄いチューブをいう。
【００１１】
本発明の目的のために、用語「個体」は、哺乳動物をいう。例えば、用語「個体」はヒト個体をいい得る。
【００１２】
本発明の目的のために、用語「神経ペプチド」は、それらの神経支配された標的組織に伝達するよう求心性感覚ニューロンにより放出される小さなタンパク質様分子またはペプチドをいう。
【００１３】
本発明の目的のために、用語「発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）」は、逆転治療法（reversal therapy）前３０ケ月までに発症した臨床疾患をいう。
【００１４】
本発明の目的のために、用語「該個体の腹腔動脈に薬学的組成物の治療有効量を注入することに対してポジティブな応答になる」は、その薬学的組成物のこの注入が、該個体における発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の影響を少なくとも部分的に逆転させる個体をいう。
【００１５】
本発明の目的のために、用語「治療有効量」は、個体に投与されて、該個体における発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を完全にまたは少なくとも部分的に逆転させるのに有効であるサブスタンスＰの量をいう。
【００１６】
本発明の目的のために、用語「１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）」は、膵臓のインスリン産生β細胞の自己免疫破壊または脱分化から生じる糖尿病（diabetes mellitus）の形態をいう。
【００１７】
（説明）
一過性レセプター電位バニロイド１（Transient receptor potential Vanilloid-1）、ニューロンＣａ＋＋チャンネル、ＴＲＰＶ１は、求心性感覚または「痛覚」神経中の主要な熱感知タンパク質（major heat-sensing protein）である。活性化されたとき、これらの神経は、非常に小さな生物学的メディエーターの神経ペプチド（例えば、１１アミノ酸のサブスタンスＰ）を放出する。ｓＰは動脈を拡張し、そしてＴＲＰＶ１が活性化された領域中で免疫系の多くの要素を引き付ける。ＴＲＰＶ１が、仲介された熱感覚（mediated heat sensation）を生じることが知られている。活性化されたＴＲＰＶ１神経終末により放出されたｓＰにより生じた灼熱感（脳内で生じる）および局所血管拡張／充血（発赤）は、皮膚への熱侵襲（heat insult）（約４５℃）の感知を生じ、これは、何か「熱い」ものに遭遇した幼児が身に付けた「痛み」の応答（「ouch」response）である。
【００１８】
ｓＰ／ｓＰ−レセプター（ＮＫ１Ｒ−とも呼ばれる）経路は本質的に普遍的であり、多様な組織／器官区画において多重の全面的かつ組織特異的な役割を有する。本文書に際した作業において、独立した調査から、種々のインビボまたはインビトロの相互作用および効果に関してｓＰおよびその親類の（cousin）神経ペプチドのＣＧＲＰを使用、測定、マッピングしている３０，０００件より多くの科学文献が存在することが推定される。現在のＮＩＨ治験登録サイト（NIH trials.gov registration site）は、「サブスタンスＰ」で問い合わせた場合、ほぼ２０００の現存の臨床試験をリスト表示する。
【００１９】
ｓＰは、神経伝達物質として作用する。そしてｓＰ／ＮＫ１Ｒ経路に沿った中枢の神経伝達は、急性および慢性の疼痛、無痛覚、嘔吐におけるその早期に認識された役割を十分に超えて、多様な神経精神状態、不安神経症、抑うつ症、恐怖感（fear）、恐怖症（phobia）、片頭痛、および多様なストレス症候群の病態生理において重要な改変要因（critical modifier）としてより最近になって特定された−健康および病気におけるｓＰ／ｓＰレセプター軸を巻き込む過程のリストは今なお増え続けている（Hanedaら、200729；Michelgardら、200730）。 
【００２０】
ＴＲＰＶ様センサーのファミリーが存在し、ＴＲＰＶ１は、創始かつ最も広く表されているメンバーである（Dorfmanら、20104）。ＴＲＰＶ１は、脳に多重かつ多様な体のビットマップを組み込む。足指をくすぐる（tickle）、折る（break）、火傷する（burn）、または凍傷する（freeze）場合、知覚はＴＲＰＶ１ファミリーのメンバーによって感知され、関連した脳中枢にシグナル伝達されて、次いでくすぐりまたは痛みの知覚を自覚するようになる。しかし、足指は、小さな「神経ペプチド」（例えばｓＰ）の局所放出のために腫れる。それらは、組織損傷をシグナル伝達し、悪化および繰り返しの損傷／ストレスから足指をかばう回避応答を引き起こす。
【００２１】
数十年間にわたり糖尿病に関する研究を行っている１つの研究者グループが、ほぼ１０年前に膵臓ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞を研究した。これらの研究者は、これらの膵島の内側および外側の高密度の神経系要素が、消化酵素の多くを提供する外分泌膵臓組織の高密度で充填された塊中に浮遊して見られたことにより困惑した（Winerら、200320）。この神経回路網の一部において顕著であったのは、豊富なＴＲＰＶ１＋知覚神経であったが、その役割は直感に反するものであった。ＴＲＰＶ１熱センサーは膵臓中で機能すると考えられたものであるが、４５℃の膵臓温度は現実には寿命と適合しない。
【００２２】
実際、マウスモデルにおいて、動物は、機能的β細胞の進行的消失を介して糖尿病を発症することが見出された（Razaviら、20069）。これは、それらのＴＲＰＶ１遺伝子が、分泌欠陥を生じる２つのコドン変異を有し、神経ペプチド（ｓＰを含む）の５％未満のみを放出するものとなるためである（Razaviら、20069；Tsuiら、200812；Tsuiら、200715）。ｓＰは、β細胞についての増殖および生存因子である。局所制御回路が存在し、そこでは局所インスリンがＴＲＰＶ１末端のインスリンレセプターと結合し、チャネルを活性化し、脳への求心性シグナル伝達を生じることなく局所ｓＰを放出する。Ｔ１Ｄ傾向のマウスにおいて（およびまた、糖尿病患者において、以下参照）、β細胞は、しばらくの間、ｓＰ分泌欠陥を克服し、インスリンにより「それらの」ＴＲＰＶ１＋神経終末からのより多くのｓＰ放出を誘発する。しかし、過多のインスリン（インスリン過剰症と呼ばれる）は低血糖症（低血糖）を引き起こし、そして身体の他の部分がそれに対処し、インスリンに対する抵抗性を増大する−これは進行的に悪化するサイクルであり、それらの生存因子ｓＰが既に枯渇したβ細胞にストレスを与える。発症から十分に前のインスリン過剰症およびインスリン抵抗性は、１型糖尿病のリスクが高いマウスモデルおよびまた若年患者に典型的である（Tsuiら、201114）。実際、これは、２型糖尿病のリスクがある成人患者にも当てはまることが判明している（Winerら、201118；Winerら、200919）。
【００２３】
サブスタンスＰ（ｓＰ）の膵臓送達は、マウスにおいて数時間内に発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を逆転させる（Razaviら、Cell: 20069）。膵島におけるほぼ同時に起こるｓＰレセプター結合が調節回路をリセットし、そしてβ細胞ストレスを全体的に逆転させる。Ｔ１Ｄ患者におけるこの現在提唱されている初期転換研究（translational study）は、動脈内（ｉ．ａ．）膵臓ｓＰ注入が安全であるかどうか、そして関連の動物モデルと同様に、インスリン過剰症を逆転させてインスリン抵抗性およびグルコース耐性を標準化しかつ局所糖尿病自己免疫をダウンレギュレートする、β細胞の再分化およびβ細胞塊の機能の増強の永久的な保証を保有するかを決定することを目指している（Tsuiら、Diabetes Metab. Res. Rev: 201114）。
【００２４】
約８０年前に発見されたサブスタンスＰが、ヒト臨床研究で広く用いられており、これは最良には有害事象がまれであり、１分以下のその極度に短い組織半減期を部分的に反映している。ヒト臨床ｓＰ治験を用いた何十年もの経験が、それが毒性のないことを実証している。より最新の臨床ｓＰ治験の選択の刊行物、ならびにＴ１Ｄの寛解（「ハネムーン」）期の、Ｔ１Ｄのニューロン要素に関する分析テキスト、および膵炎におけるｓＰの役割への研究の概観が、カナダ保健省の臨床試験グループへのＣＴＡ提唱の治験薬概要書、モジュール１．２．３（Investigator’s Brochure, module 1.2.3 of the CTA proposal to Health Canada, Clinical Trials Group）に見出される。
【００２５】
ｓＰは、非毒性の１１マーの神経ペプチドであり、組織半減期が極度に短く、感覚求心性知覚神経によって主に放出される。www.trials.govはなお、ｓＰ、ｓＰのアゴニストおよび／またはアンタゴニストが関与する２０００近くの現在の治験をリスト表示し、目立ったことには、ｓＰに起因する副作用がそこにも、またより古い文献にも記されていない。臨床用途の他の神経ペプチド（例えば、ＬＨＲＨ、ＴＲＨ、ＣＲＨ、ＧＨＲＨ、ソマトスタチン）を用いて毒性がないことがこの局面で連想されるが、ｓＰの短い組織半減期のため、これまで臨床有用性が除外されてきた。ここに提唱する研究では、その短い半減期が利点になり、厳密に局所の膵臓薬物送達が可能になり、これは、全身の漏出がほとんどなく、しかも局所効力が優れる（Razaviら、Cell：20069；Tsuiら、Diabetes：200812；Tsuiら、Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery：Targeting Pain and Other Pathological Disorders：201013；Tsuiら、Diabetes Metab Res Rev：201114；Tsuiら、Ann. N. Y. Acad. Sci.：200816）。
【００２６】
これらの動物データは、糖尿病膵臓への１回のｓＰ送達が、炎症病変を迅速（一晩で）かつ永続的に除去することを実証しており、これは、下記の２つの相乗的機序を通じている：１．β細胞ストレスの即時緩和が生存中ずっと続き（Razaviら、Cell: 20069）、そして（おそらく）脱分化したかまたは静止しているβ細胞が再活性化される（Talchaiら、Nat. Genet.: 201210；Talchaiら、Cell: 201211）；２．膵臓および局所リンパ組織において活性化されたばかりの炎症病変が迅速にｓＰレセプターを仲介して選択的にアポトーシス除去される。ｓＰの動脈内膵臓注入は、全ての組織において同様に、短い（数分の）投与量依存性の充血を引き起こす。実験条件下、これは、セルレイン（強力な膵臓毒素である）の先の注入による一過性の膵炎様反応に拡張され得る（Kohら、J. Cell. Mol. Med.: 20117）。このような前処理がなければ、げっ歯類におけるｓＰの膵臓毒性は観察されず、そして大型動物（イヌ）の研究で、多くのｓＰ投与量でさえも膵臓毒性でなかったことが見出された。潜在毒性の知識を小児に拡張することが本研究の主要な目標である。
【００２７】
最近、このことが、本質的に最初に、動物モデルで達成された。これは、数千の以前のｓＰ治験に基づいて、全身毒性なく、この生理学的な治療戦略を患者に転換する強い原理および推進力を提供する。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、図１に示すように、薬学的組成物を含むカテーテル１１２が、薬学的組成物の治療有効量を個体の腹腔動脈１１４に注入するために用いられ、それにより、発症直後の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を部分的に逆転させる。カテーテル１１２が薬学的組成物の供給口（図１には示さず）に取り付けられる。図１には以下もまた示す：膵臓１２２、脾臓１２４、胃１２６、十二指腸１２８、脾動脈１４２、門脈１４４および脾静脈１４６。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、そのように注入される薬学的組成物は、発症直後のＴ１Ｄを完全に逆転させ得る。本発明の１つの実施形態では、組成物は、発症直後のＴ１Ｄを数ケ月から数年まで一過的に逆転させ得る。本発明の１つの実施形態では、薬学的組成物は、膵臓中のβ細胞によるインスリンの貯蔵、生産および放出を助ける。本発明の１つの実施形態では、薬学的組成物は、神経ペプチドを含む。本発明の１つの実施形態では、薬学的組成物は、サブスタンスＰを含む。本発明の１つの実施形態では、サブスタンスＰは、薬学的組成物中の生理食塩水中に溶解されている。
【００３０】
本発明の１つの実施形態では、図１に示すように処置される個体は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有すると診断されている。本発明の１つの実施形態では、個体はヒトである。１つの実施形態では、個体がヒトである場合、薬学的組成物の治療有効量は少なくとも１０ｎＭ／ｋｇである。１つの実施形態では、個体がヒトである場合、薬学的組成物の治療有効量は少なくとも５０ｎＭ／ｋｇである。１つの実施形態では、個体がヒトである場合、薬学的組成物の治療有効量は少なくとも１００ｎＭ／ｋｇである。１つの実施形態では、個体がヒトである場合、薬学的組成物の治療有効量は少なくとも２５０ｎＭ／ｋｇである。
【００３１】
糖尿病発症における予期せぬニューロン要素が見出されている（Tsuiら、Rev Endocr. Metab. Disord.: 2003；Winerら、Nat Med: 200317）。引き続き、Ｔ１Ｄ発症の重要な要素は、ＮＯＤマウスＴＲＰＶ１遺伝子の変異を反映して、膵臓ｓＰ不全であることが実証されている（Razaviら、Cell: 20069）。これらの変異は、機能低下／低分泌表現型を生じる（Tsuiら、Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery: Targeting Pain and Other Pathological Disorders: 201013；Tsuiら、Trends Mol. Med.: 200715）。
【００３２】
腹腔動脈を介した１回の膵臓ｓＰ注入が、ＮＯＤマウスにおいてインスリン療法を行わずに４〜６ケ月間（この期間は、ヒトの約６〜８年間にほぼ相当する）、発症直後のＴ１Ｄを逆転させた（Tsuiら、Diabetes: 200812）。
【００３３】
ヒトＴＲＰＶ１は非常に多型であり、コーカサス人およびアジア人では数千の異なる対立遺伝子組合せがあるが、他方、Ｔ１Ｄ発生率が低い領域（例えばアフリカ）では単型遺伝子である（Dorfmanら、Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery: Targeting Pain and Other Pathological Disorders: 20104）。８０００を超えるコーカサス人のＴ１Ｄ患者および対照者の配列決定は、ＴＲＰＶ１対立遺伝子選択に顕著なバイアスがあることを実証しており、これは、トランスフェクション研究で優性の機能低下表現型を共有する（未公開の中間結果、トロント−ピッツバーグ−ヘルシンキＴＲＰＶ１コンソーシアム（Toronto-Pittsburgh-Helsinki TRPV1 consortium））。
【００３４】
全身ｓＰ不全は、新規開発のＨＮＫ１Ｒ（ｓＰレセプター）結合アッセイにより、Ｔ１Ｄ患者の大部分で、かなり多くの一等親血縁者らが中間レベルにあることが見出されたことが直接的に実証されている（Cheung, R.K.ら、投稿準備中）。
【００３５】
以前に見出されたＴＲＰＶ１、β細胞および自己免疫間の基本的な関係はメタボリック・シンドロームおよび２型糖尿病にも及び、糖尿病内分泌におけるニューロン制御の基本的な役割を強調する（Tsuiら、Diabetes Metab Res Rev: 201114；Winerら、Nat Med: 201118；Winerら、Nat Med: 200919）。
【００３６】
イヌにおける大型動物研究が近年完了したが、これは、腹腔動脈を介するｓＰの膵臓注入後のｓＰ誘発膵臓毒性の証拠を求めたものである。研究に関連する投与量範囲にわたって、薬物誘発毒性は見られなかった。これは、広いスクリーンの反復生化学血液試験（＞１２００アッセイ）ならびに広範囲の組織病理学研究（提唱した治験と関係のない獣医病理学者によりトロント大学（University of Toronto Center for Phenogenomics）で盲検的に行った）を用いた。注入は、Sick Kidsの臨床画像化チーム（Sick Kids’clinical imaging team）によって行った。このVanilloidGeneticsがスポンサーの研究がそれだけで公開される見込みはないので、補遺プロトコル（Protocol Addendum）に抜粋の画像化データを提供する。これは、同時に注入した不活性な青色染料マーカーを用いて測定した膵臓選択的に迅速な一過性（約７分）のｓＰ効果を示す。短命の生理学的ｓＰ応答（充血→膵臓→選択的過潅流および溢出→正常膵臓出現）は、Ｔ１Ｄ患者で重なると予期される核となる効果を説明する。
【００３７】
研究は３つのステージ（Ａ、Ｂ、Ｃ）を有し、全ての患者が最終的に介入を受ける交差設計を適用する：ステージＡ、毒性およびｓＰ投与量発見、１２人の患者；ステージＢ、限定効力試験（limited efficacy test）、４０人の無作為化した患者、交差設計；ステージＣ、６ケ月までフォローアップ、全ての患者、可能であれば６ケ月フォローアップを延長。
【００３８】
ステージＡの第１の目標は、０．２ｐｍｏｌ／ｍＬ以上の基底Ｃペプチドレベルを有する発症直後（＜３０ケ月）の１型糖尿病患者でｓＰの膵臓送達による予期せぬ有害作用があるかどうかを決定することである。ステージＡの第２の目標は、１０、５０、１００または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷの投与量（１投与量につき３人の患者）でのｓＰ注入が、注入前と注入から２０〜２２日後との混合食事負荷試験（ＭＭＴＴ）データを比較して、インスリン必要量、かつ／またはＣペプチドの基底または刺激後レベルを改善するかを決定することである。１つまたはそれより多くのステージＡの患者が効果のない少ない投与量を最初に受けた場合、治験の終わりに向かって有効投与量が提示され得る。
【００３９】
ステージＢの第１の目標は、介入の３週間後、刺激後（ＭＭＴＴ）のＣペプチドレベルがベースラインを上回って顕著に上昇しているｓＰ処置患者（「応答者」）の有病率を決定することである。ステージＢの第２の目標は、介入の３週間後、応答者がインスリン必要量の低下、インスリン過剰症の改善、および血糖の改善／正常化を示すかどうかを決定することである（ＭＭＴＴデータ）。
【００４０】
ステージＣの第１の目標は、応答者が介入の６ヶ月後、またはそれより長く（既計画のＤＳＭＢ認可プロトコル変化を伴って、フォローアップを延ばした場合）、治療効果を持続するかどうかを決定することである。
【００４１】
これらの研究目標は、その臨床有用性の可能性を試験しようとするのにステップワイズアプローチを用いた初期転換努力の実態を認識し、予期せぬ毒性がないことを確認し、そしてヒトＴ１ＤはマウスＴ１Ｄと同様にｓＰに応答するか、およびこのような効果の考えられる寿命は何であるかという、２つの核となる基本の問いに対する暫定の回答を生じる。
【００４２】
本研究目標は、以前に公開された動物研究と可能な限り近くに平行している（Razaviら、Cell: 20069；Tsuiら、Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery: Targeting Pain and Other Pathological Disorders: 201013；Tsuiら、Trends Mol. Med.: 200715；Tsuiら、Ann N Y Acad. Sci.: 200816）。臨床的には、この発症後研究は、２０１２年の刊行物に基づく−Ｔ１Ｄ発症後の最初の２年のNIH-TrialNetメタ研究（Greenbaumら、Diabetes: 20125）および発症後に予想外に遅いβ細胞死／消失をまとめて示した研究報告（Talchaiら、Nat. Genet.: 201210；Talchaiら、Cell: 201211）。
【００４３】
ｓＰに関する種々の結論（Tsui, 201013；Tsuiら、200813）を確認するいくつかの方法の１つは、ｓＰを新規糖尿病マウスの膵臓に注入することであった。そしてそれは、やや良性の治療法である。ｓＰは、生理学的に非毒性の分子であって、非常に壊れやすく、そして専用の非特異的なタンパク質分解により、ならびに、組織中の共通のＮＫ１Ｒへの結合により、数秒以内に組織で不活性化されるためである。図２に示すように、ｓＰ注入した糖尿病マウスは、処置に対して迅速に応答し、血糖および急性糖尿病に典型的な他の代謝異常を正常化した。媒体（生理食塩水）のみを注入した対照動物は、糖尿病から早く死亡した。いくらかクラッシュしたコンピューターの再起動を連想させるように、ｓＰ注入は、数ヶ月間にわたる正常なインスリン制御を再確立する永続的な効果を有した。とはいえ、糖尿病は最終的に再発するが、１回ｓＰ注入に対して再度応答する。
【００４４】
これにおいて、ｓＰの作用はいくつかの局面を有し、著しくは、β細胞再生／再分化を促進するβ細胞生存因子としてなお作用する。しかし、予期せぬボーナスは、膵島およびβ細胞をターゲティングする造血細胞（自己反応性リンパ球を含む）が、活性化の間の短時間、ｓＰに対して非常に感受性であることであった。短時間のｓＰレセプターへの結合が死滅シグナルを設定し、このシグナルは、アポトーシスの形態を介してそれぞれのリンパ球を死滅させる（プログラムされた死応答）。実際、免疫系は、通常、毎日の免疫応答を終結させるためにｓＰを用いる。免疫応答を受けた炎症組織においては、そのプロセスを開始させるだけでなく限定することが重要である。図３は、膵臓リンパ節（自己免疫リンパ球の「増殖場所（breeding place）」）で起こるもののスナップショットである。これらの自己免疫Ｔ細胞のインビボでの増殖を、細胞分裂によるクローン増殖の波として測定した。図中のピークの各々は、膵臓リンパ節内部の１細胞分裂を表す。糖尿病対照（３１２）には多くの分裂が存在した。すなわち、それらは、インスリン分泌β細胞を死滅させ得るより自己免疫性のＴ細胞を、多量に迅速に生成する。図３に示すように、ｓＰ処置マウス（３１４）のほとんどのＴ細胞は全く分裂しなかった（ピンクの陰影部）（実際、それらは死滅する）。ｓＰレセプター（ＮＫ１Ｒ）アンタゴニストもまた受容したｓＰ処置マウス（３１６）は、病原性Ｔ細胞クローンの少なくとも３分の２の生存を示した。したがって、ｓＰ注入は、β細胞の生存、再生および再分化を促進し、一方、同時に、β細胞死および糖尿病を仲介する自己免疫細胞プールを選択的に排除する（Razaviら、20069；Tsuiら、200812；Tsuiら、200715）。
【００４５】
発症直後の糖尿病のマウスへの動脈内（腹腔動脈）ｓＰ注入の以前の研究（Razaviら、20069）において、膵炎と一致する膵臓の病態は、０．０１〜２５０ｎＭ  ｓＰ／ｋｇの投与量範囲で観察されなかった（標準投与量は１〜１０ｎＭ／ｋｇであった）。
【００４６】
図４は、発症直後の１型糖尿病のマウスからの膵島を示す。上部は、ｓＰ注入マウス（１ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ）のクリーンで、もはや炎症がない膵島を示す。図５は、媒体（生理食塩水）を注入した対照の糖尿病マウスからの浸潤した膵島を示す。両方の膵島とも、膵炎に典型的な病変がない正常な外分泌膵臓組織によって囲まれている。
【００４７】
近代的な膵炎診断法を用いたイヌにおける膵臓ｓＰ注入の大型動物研究が、現在実施されているところであり（Mansfieldら、201133）、潜在的な膵炎病変の検出のための組織病理である。データは、予定のＰｒｅ−ＣＴＡミーティングに間に合うように、この文書の約２週間以内に完了すると予期される。イヌは、大型動物実験モデルの合理的な選択である。これは、イヌは、膵炎を自然に発症し、実験膵炎の研究に首尾よく用いられており、かつ十分に試験された診断法があるからである（Trivediら、201134）。
【００４８】
膵炎誘発の典型的な（ほとんどがげっ歯類の）研究がｓＰの役割に着目しており、これらは薬物の血管拡張効果を実証し、実際、以前に公開されたｓＰ注入のデータは、一般に用いられているエバンスブルー染料追跡戦略を用いて同じことを文書に示している（Razaviら、20069）。図５参照。図５において、膵炎組織を矢印５１２により示す。
【００４９】
ｓＰ注入後の短時間の一過性（数分）の組織過潅流を越えると、この薬物は、組織損傷も膵炎様疾患も引き起こさない。疾患誘発のために、標準の実験膵炎モデルは、毒性の分泌促進剤セルレインの複数回の高投与量注入を採用する（Kohら、20117）。
【００５０】
このプロトコルは、自然発症膵炎の多くの局面と重なり、その局面には、膵腺房細胞（膵炎発症の活性部位）における内因性ｓＰおよびｓＰレセプターの両方の発現の増大が含まれる。外分泌膵臓では、ｓＰ／ｓＰレセプターの増大はＮＦκＢ炎症誘発性転写経路の一部であり、セルレインによる誘発から３〜４日後に疾患進行に関与し始める（ChanおよびLeung、201131；Haselら、200536；Wanら、200835）。
【００５１】
ｓＰは、炎症性膵炎病変を特徴づける多くの要素の１つであるが、それは、腺房細胞でこの転写経路の活性化を惹起しない。ｓＰは、長く、組織損傷により引き起こされる多分子応答プログラムの一員であったが、ｓＰのそのレセプターＮＫ１Ｒへの結合が、実際、強力な抗炎症性ネットシグナルを伝達し得、このネットシグナルは、ＮＫ１Ｒｎｕｌｌノックアウトマウスにおける組織損傷に対するいくつかの炎症応答の重篤度の増大を説明するものである（Dibら、200932）。
【００５２】
注入プロトコルは、以下のように記載される：リアルタイム画像化制御の下で腹腔動脈に対して大腿部カテーテルを留置した後、投与量発見ｓＰ量またはステージＢ研究介入投与量（１０、５０、１００または２５０ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ  ＢＷ（５または１０ｍＬ生理食塩水中に溶解）（上記参照）を３分間にわたって注入する。原理：全てのマウス研究で安定した速度の注入が用いられており、イヌ研究において代替の速度の注入のタイミングが匹敵され、いかなる差異も見出されなかった。
【００５３】
本発明の１つの実施形態では、患者に投与されるｓＰの量は、１０〜１００ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ  ＢＷ（５または１０ｍＬ生理食塩水中に溶解）であり得る。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、患者に投与されるｓＰの量は、１００〜２５０ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ  ＢＷ（５または１０ｍＬ生理食塩水中に溶解）であり得る。
【００５５】
図６に示すように、全体の研究計画は、介入がＮＯＤマウスにおいて見られたものに匹敵する効果を有する場合、これらは、その生態に少なくともある程度似ているとの前提に基づく。したがって、Ｔ１Ｄ内分泌に関する所望の効果は、以下であり得る：（１）短命のｓＰ（６１２）の注入後に迅速に生じる、および（２）Ｃペプチド（または他の測定物（図６の凡例参照））が、示される１つまたはそれ以上の可能性のある結果をたどり得る（６２２、６２４、６２６、および６２８）。
【００５６】
これらの結果は、介入後２０日目に混合食事負荷試験（ＭＭＴＴ）により測定される（６３２、６３４、６３６、および６３８）。Ａ、ＢまたはＣの線をたどると応答者と定義され、非応答者はＤの線である。次いで、全ての患者を、標準的なケアの下で（応答者の監視および治療は、彼らのＴ１Ｄ状況によって決定づけられるように変更しなければならないが）、６ケ月フォローアップ（ステージＣ）に入れる。
【００５７】
この研究は、非盲検で無作為の交差臨床試験として記載される。最小期間：最後に患者が介入を受けた後６ケ月；ステージＣの延長：処置の応答者が特定されれば、１２ケ月までのフォローアップが考慮され得る。
【００５８】
ステージＡは、投与量発見および毒性の研究である。このステージは、１０、５０、１００または２５０ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ  ＢＷの１回のｓＰ投与量が、（１）適格な治験患者において膵炎または他の臓器不全の生化学的兆候を生じるか；または（２）内分泌／代謝Ｔ１Ｄパラメーターを改善するかを決定する。これらの投与量は、げっ歯類およびイヌの研究で十分に容認されたものである（モジュール１．２．３．５）。これらの患者の各々は、介入を受ける７〜１４日前にＭＭＴＴを受ける。動物での経験から投与量範囲を選択した：５０〜２５０ｎｍｏｌ／ｋｇが同様に有効かつ持続的であったが、１０のより少ないものおよび１ｎｍｏｌも限界的である。各３人でなる４つの患者群が、各投与量群で、臨床試験グレードのｓＰを注入される。VanilloidGenetics Incは、カナダ保健省認可の商業ｃＧＭＰ施設において、臨床グレードの注入用物の小児用（ｓＰ−ｐｅｄ）および標準／青年用の注入用薬物製剤（ｓＰ−Ｒ／Ａ）を設計し、かつその製造および検証を外部委託している。
【００５９】
ステージＡの患者をまず採用し、無作為化し、その際に所与のｓＰ投与量への同意を得た（ＳＡＳＳ手順）−偽薬は存在しない。最も低い投与量から始めて３人の患者が１０ｎｍｏｌ  ｓＰ／ｋｇを受け、次の３人が５０ｎｍｏｌ  ｓＰ／ｋｇを受け、引き続き、続く２群のそれぞれは１００および２５０ｎｍｏｌ  ｓＰ／ｋｇを受ける。
【００６０】
ステージＢの患者を第１のまたは第２の処置群に無作為化する。動物データに基づき、５０〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇで最大応答が観察されると予期される。研究医は、ＩＧＴ血管造影チームと共に、臨床現場で、患者が５または１０ｍＬの生理食塩水溶液中でその介入を受けるかを決定する。群間で少なくとも２〜３日の観察が予定されるが、この期間は、臨床経験が進むにつれて研究管理によって変更され得る。膵臓および肝臓および腸の機能に関連する血液化学が、注入後モニタリングされる。患者は、インスリン必要量および正常血糖値についてモニタリングされる（以下参照、標準的なケア）。
【００６１】
ステージＡの背後の原理は、ステージＡが最初の患者データを生成することである。発症直後の糖尿病のマウスにおけるＴ１Ｄ逆転（T1D reversal）は、十分に理解されている機械的経路に沿って、数時間以内に生じる。β細胞におけるそのポジティブな生存効果および膵臓自己免疫浸潤物に対するそのネガティブな生存効果と共にｓＰ−レセプター結合の反応速度が速いことを考慮すると、ｓＰ効果は、患者においてもむしろ迅速であると予期される。ステージＡ戦略は、慎重な薬物投与量範囲を包含し、そしてそれは注意深く進行し（薬物毒性を予期する理由はないが）、そしてそれは、ステージＢに必要とされる経験およびステージＢで用いられる薬物投与量を生成する。ステージＡ戦略およびコホートサイズを議論し、カナダ保健省とのプレＣＴＡミーティングの最終議事録（final minutes）に組み入れた（治験薬概要書、モジュール１．２．３．１）。このプレＣＴＡミーティングでは、有効なｓＰ投与量がステージＡで出現した場合、より低い投与量を受けたステージＡ患者に、第２の注入がステージＢの終わりまで最適な投与量で提示され得ること（研究開始から約４週間後、スケジュールが許容する場合）を提示することが倫理的であろうということもまた議論された。これは、処置失敗後の繰り返し注入は、数年の範囲で予想される間隔ではあるが、最終的にフォローアップ計画の一部であるので、この研究ステージまたは研究全体から導き出される結論を脅かさない。
【００６２】
研究のステージＢは、介入ステージである。発症直後のＴ１Ｄを有する適格な患者４０人全体が、画像化のガイダンスの下での腹腔動脈のカニューレ挿入によって、選択したステージＡからのｓＰ投与量を受ける。原理：Ｔ１Ｄ逆転は、ｓＰ療法に対して本質的に２元（あり／なし）の初期応答である。ヒトＴ１Ｄ発症は、発症後の初年度においてある時点で始まり数週間から（時に）数ケ月続く一過性寛解フェーズ（「ハネムーン」、以下参照）の頻繁な（約７０％）発生によって、糖尿病傾向マウスとは異なる（モジュール１．２．３．３）。本研究では、疾患の寛解（インスリンなしで正常血糖（euglycemia off insulin））は、それが注入後の極めて接近した時期に顕在化すると予期されることを除いて、自然発生的なハネムーンから区別することが難しい。このフェーズ１研究は、顕著な効力データの生成を目指すことはできないが、対照コホート（１または複数）は、特に、患者の処置の応答もまた２元性であるか、およびｓＰ誘発の寛解がマウス治療の寿命（ヒトの６〜８年に相当する）付近の範囲を有するかについて、最終的に傾向を解明することを可能とし、特に、非侵襲的な薬物送達戦略（現在開発中）を適用に移行させることができれば、より一般的な再発および再注入が１年後であってもなお所望の効果を臨床的に表し得る。
【００６３】
研究の次のステージのステージＣは、無作為化である。２０人の適格患者を介入に対する無作為化のために採用し、２０人を初期介入期の対照コホートとして採用し、３週間後に各介入患者にＭＭＴＴを行って、介入期を終了する。よって、第１介入群における分析は、前処置および未処置の両方の対照データを有する。
【００６４】
最後の介入患者への注入から約１週間後、対照コホートは介入状態に転向し、介入前ＭＭＴＴを受け、約１週間後に介入を受ける。この第２介入期は、注入後２０日目のＭＭＴＴで終わる。この群の分析は、対照としての前処置データに依存する。原理：Ｔ１Ｄ逆転は、ｓＰ療法に対して本質的に２元（あり／なし）の初期応答である。
【００６５】
新たに１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）と診断された患者のおよそ７０％は、インスリン療法の開始後、様々な程度に内因性β細胞機能を一時的に回復する（Bowdenら、2008３）。この期間は、数通りに臨床的に定義されているが、最も一般的には、現在「ハネムーン」期と呼ばれ、毎日のインスリン投与量が１日に体重１ｋｇ当たり０．５単位（Ｕ／ｋｇ／ｄ）未満であることおよびＨｂＡｌｃが７．０％以下であることによって特徴づけられる（Bowdenら、20083）。ハネムーンの間、食事や運動に変動があるにもかかわらず、血中グルコース値は、正常で安定している場合が多く（通常、数週間、時には数ケ月間）、ほとんどまたはまったく外因性インスリンを必要とせず、そしてほぼ正常なＨｂＡｌｃを示す。しかし、非常に稀な場合を除き、発症６ケ月までにはほとんど全て、１２ケ月までには全ての患者が、ハネムーン前のインスリンが必要な状態になり、Ｔ１Ｄの完全な典型的臨床経過および兆候へと戻る（Abdul-Rasoulら、20061）。
【００６６】
この一過的に改善されたβ細胞機能を支配する機序は、いまだほとんど理解されていない。疾患発症時付近の高血糖はβ細胞ストレスが増加したことを示し、未だ生存している多くのβ細胞を機能的にサイレンス状態とし、インスリン療法は、そのストレスを相当な程度、β細胞が回復する（または再生／再分化さえし得る）のに十分な程度に軽減するはずであるとのいくらかの合意がある（van Belleら、201124）。疾患発症時付近のインスリン抵抗性の上昇の相当な正常化もハネムーンにおける代謝制御の改善に貢献し得る（Schoberら、198425）が、明白に自己攻撃性の免疫系がどのようにして一過的にその進行を「停止」することができるのかは未だ不明であり、残念ながら、関連するデータセットがほとんどなく、ハネムーンの動物モデルもない。にもかかわらず、ハネムーンが一般的であるという事実が、それが介入治療の最も有望な標的を表し得るという合意を生じた。新規発症例の約８５％はＴ１Ｄ家族歴がなく、発症は糖尿病の発病が初めてであり、糖尿病前は長年明らかな症状がない。
【００６７】
残念ながら、用語で適切に示されるように、ハネムーンは、程度および持続期間が非常に変わりやすく、数週間から数ケ月の範囲で続く。研究者らは、Ｔ１Ｄが安定する前に優に３０年以上続いたハネムーン様の再発寛解型Ｔ１Ｄという１つの非常に稀な症例を観察したが、この患者の３人の子のうち２人が、若くしてハネムーンのない完全型Ｔ１Ｄを発症した（Doschら、未発表）。非常に稀ではあるが、このような症例は、自己免疫の進行を抑制することが可能な生理学的機序が存在することを例証し、介入戦略の成功を最終的に達成可能な目標とする。
【００６８】
ハネムーン寛解フェーズは安定な代謝制御の期間であるので、Ｔ１Ｄにおいて臨床的な寛解の持続期間を制御する要因を特定することが、重要でありかつ有望である。年齢、性別、思春期の状態、発症時の代謝異常、ＨＬＡ遺伝子型、糖尿病関連自己抗体の存在を含むいくつかの要因は、全て、新規の糖尿病児たちにおける部分寛解または完全寛解の可能性に影響を与えるものとして認識されている（Buyukgebizら、200121）。発表された研究の考察から、このときの確固とした結論を妨げる年齢分類および定義の相違があることが明確になる。
【００６９】
ハネムーンフェーズは、インスリン療法開始から数日または数週間以内に始まることが多く、一般的に、数週間、稀に数ケ月続く。新たに診断された患者におけるインスリン療法開始後のハネムーン期の頻度と持続期間を決定するために、１２歳未満の１０３人の糖尿病児の群の前向き観察を行った。６９％に部分寛解が起こり、３人に完全寛解が起こった。寛解までの時間の長さは２８．６±１２日であり、ハネムーン持続期間は７．２±４．８ケ月であった（Abdul-Rasoulら、20061）。
【００７０】
１９９１年から１９９８年の間に、Ｔ１Ｄを有すると診断された１８歳未満の６２人の患者において後ろ向き研究が行われた（Bowdenら、20083）。３５人の患者（５６．５％）が部分寛解に入った。寛解までの時間の長さは１．３６±１．０３ケ月であり、病院からの退院時のインスリン要求とポジティブに相関した。
【００７１】
Ｔ１Ｄを有する就学前小児患者、学齢期小児患者、および青年患者において部分寛解の比率が異なるかどうかを決定するために、新たにＴ１Ｄと診断された１５２人の治療継続患者を２００４年に調査した（Bowdenら、20083）。患者らを３つの年齢群に分類した（１群（５歳未満）、２群（５〜１２歳）および３群（１２歳より年長））。診断時における臨床的な特徴、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）および毎日の総インスリン投与量（ＴＤＤ）を１年にわたり３ケ月おきに各年齢分類において分析した。部分寛解を、ＴＤＤ≦０．５単位／ｋｇ／ｄかつＨｂＡ１Ｃ＜８％と定義した。幼児（１群、２６．８％）および青年（３群、２９％）は、学齢期の小児（２群、５６％、ｐ＝０．００２）と比較して、部分寛解の比率が低かった。１２ケ月において、群の差異はなくなり、１群の１３％（５／３８）、２群の２０％（１１／５６）、および３群の１８％（８／４４）が部分寛解のままであった。
【００７２】
ハネムーン期はＴ１Ｄを有する各患者によって異なり、各経過を左右する変数は不明確のままであり、種々のより小規模な研究はかなり異なる結果をもたらし得る。１５７の小児センターで処置され、同センターで診断から始めて３６ケ月間観察された６，１２３人の小児Ｔ１Ｄ患者（１８歳未満）からデータセットを得た（Dostら、200722）。糖尿病児のこの大規模な多施設研究からの分析は、この研究においてその疾患の最初の３年間の間に生じた、必要とされたインスリン量および臨床上の疾患寛解を決定するのにはたす、疾患発症時の年齢、性別、および思春期の状態の役割を含んでいた。
【００７３】
複数の統計的分析を行い、ハネムーン持続期間に影響を与える要因を特定した。その結果、１９９２人の小児（３２．５％）において、ほとんどが診断後最初の３ケ月の間に部分寛解（インスリン＜０．５Ｕ／ｋｇ／ｄおよびＨｂＡ１ｃ＜７．０％）が生じたことが明らかになった。これらのうち、寛解に入った患者の２１％が疾患発症時に５歳未満で、３７％が５〜１０歳、３７％が１０〜１５歳、５％が１５〜１７歳の青年であった。これらの分析は、部分寛解の比率はより若い患者において高いという初期の報告を強化する。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
上記の表に示すように、寛解は平均０．７４±０．７７年（８．８ケ月）続き、Ｔ１Ｄ発症時に１０歳未満であった小児では、より後期に発症した患者と比較して顕著に短かった。年齢が低いほど短いハネムーンフェーズであることは、糖尿病発症時にケトアシドーシスがより高い比率であることおよび／または代謝状況がより異常であることに関連しているかもしれない。思春期糖尿病を発症した小児は、おそらく抗炎症性ホルモンテストステロン効果を反映して、より長い寛解フェーズを有した。これは、ハネムーン持続期間において、少年で寛解期がより長い（エストロゲンはより炎症誘発性である）という性差があったためである。しかし、この性別の効果は、性ホルモンレベルが低い１０歳未満の小児において主に観察され（ｐ＝０．００３９）、思春期中または思春期後に糖尿病を発症した患者において顕著な性差は見られなかった。よって、発症および発症後の寛解におけるホルモン効果の役割は、不明なままである。
【００７６】
疾患発症時の代謝不均衡の程度は、寛解の出現率および長さを決定する重要な要因のようである（Abdul-Rasoulら、20061）。診断時の代謝異常の重篤度、すなわち、処置前の比較的長い疾患持続期間、大きな血中グルコース値の上昇、高ＨｂＡ１Ｃ値、糖尿の持続期間、（インスリン抵抗性による）正常血糖を確立するための高インスリン要求は、Ｔ１Ｄを有する小児で臨床的寛解がより短いことと関係がある（Vetterら、198223）。
【００７７】
診断時の糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）はハネムーン出現率を低下させ、おそらく、インスリン療法開始後のβ細胞回復力の低下を反映している。ＤＫＡは、インスリン欠乏症の結果であり、これに伴って高血糖が生じかつ脂肪酸の燃焼による全身性ケトン体の蓄積を伴い、潜在的に致命的な代謝性アシドーシスを生じる。５歳未満の小児または１２歳より年上の小児は、５〜１２歳の小児よりもＤＫＡをより発症しやすいが、理由は不明である（Bowdenら、20083）。
【００７８】
Ｃペプチドを測定することにより、内因性インスリン分泌が評価される。インスリン遺伝子によってコードされる３１アミノ酸Ｃペプチドは、プロインスリンから切断され、両方が１対１のモル比で共分泌される。発症直後のＴ１Ｄを有する患者におけるベースラインＣペプチドおよび刺激後Ｃペプチド（グルコガンまたは混合食の後）の測定値を、残留した全体β細胞の機能または量の尺度として使用する。いくつかの研究は、Ｃペプチドレベルがより高いことはＴ１Ｄの最初の６ケ月間にハネムーンとポジティブに関連し、ＣペプチドレベルがＴ１Ｄの最初の１年の間のハネムーンの良好な予測因子であることを示した（Zmyslowskaら、200726）。
【００７９】
Ｔ１Ｄと診断されたばかりの２６８人の患者の研究において、患者は、性別、年齢、糖尿病発症時の時期によって層別化された（Agnerら、198727）。疾患の最初の３６ケ月間は、基底のＣペプチド、ＨｂＡ１ｃ，および１キログラム当たりのインスリン投与量につき評価を行った。全疾患寛解を、少なくとも１週間インスリン療法を完全に中断して安定した代謝制御を伴うと設定し、部分寛解は、インスリン必要量が病院からの退院時のインスリン投与量の５０％以下であると設定した。疾患の最初の１８ケ月間は、患者の１２．３％が中央値を６ケ月として全寛解を生じ、そして患者の１８．３％はこれもまた中央値を６ケ月として部分寛解を生じた。ハネムーンに入った患者は、入らなかった患者よりも顕著に高い基底Ｃペプチドレベルを有した。これらの残念ながらあまり一致しない研究から、一般的結論を導くことができる。つまり、ハネムーンおよびハネムーン持続期間を予測する既知の要因は、思春期前の発症、性別が男性であること、初期代謝異常が軽度であること、および明らかなケトアシドーシスがないことを含む。
【００８０】
全般に、Ｔ１Ｄハネムーンは、特に自己免疫の進行およびそのほとんど確実な（未証明であるが）一過性の抑制に関して、理解が不十分なままである。にもかかわらず、有用なデータおよび広範な合意が、ハネムーン期を、その治療上の進展を目指した介入治療の自然かつ有望な標的と特定する。Ｔ１Ｄ関連自己抗体によって判定されるように、膵島自己免疫はハネムーン中になくならないが、十分な内因性β細胞由来インスリン（およびＣペプチド）の生産があるので、明らかにその進行が欠如している。よって、ハネムーンプロセスは、自己免疫エフェクター機能をダウンレギュレートする制御性リンパ球の急性出現を反映しているにちがいないが、データはなく、それがなぜどのように起こり得るのかの手がかりさえない。発症直後のＴ１Ｄの患者における毒性免疫抑制治験の一貫的な失敗は、免疫抑制がエフェクター細胞だけでなく制御性リンパ球プールも死滅させるというその全体の結論を強調する。
【００８１】
まとめると、発症直後のＴ１Ｄの患者の大部分においてハネムーンを観察したことは、疾患の進行を中断するための生理学的機序が存在すること、およびこの間の有効な介入が、それらがハネムーン時に明白な疾患の進行から生理学的な回避を補助する場合、期待できることを示唆する。そのような介入は、自己免疫β細胞の破壊／脱分化の進行を遅くするか、または停止するかのどちらかに違いない。サブスタンスＰ膵臓注入治験は、Ｔ１Ｄにおいて、非毒性生理学的処置戦略を最初に用いたものであり、これは、動物モデルにおいてその標的プロフィールをちょうど達成するのに有効であるものである。それは、慢性神経ペプチドの欠乏を緩和し、これは、ＴＲＰＶ１変異型齧歯類における重要な遺伝的Ｔ１Ｄ感受性およびＴ１Ｄ感受性ヒトにおける機能不全ＴＲＰＶ１対立遺伝子の選択を特徴づける。この戦略は、ハネムーンを誘発し年単位で延長させる見込みがあり、反復注入が、同動物モデルにおいて有効である。特徴的なＴ１Ｄ治験、ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣは、限られた（数ケ月）期間の（ほぼ）正常なグルコース代謝でさえ、２０〜４０年後に重篤なＴ１Ｄ合併症へ大きく影響することを決定した。サブスタンスＰ治療は、Ｔ１Ｄの遺伝的基盤の治癒とはならないが、Ｔ１Ｄとともに生きる厳しい現実および長期合併症による年間数十億の膨大な費用に対し、大きくポジティブな長期的影響の見込みがある。
【００８２】
１つの実施形態において、個体に投与されるｓＰ量は、５０〜１００ｎＭ／ｋｇの範囲である。
【実施例】
【００８３】
実施例１
研究コホート−試料サイズ  Ｎ＝５２
適宜、説明に基づいた保護者の同意と患者の承諾とを得た５２人の適格な同意した１０〜１８歳の小児または青年を採用する。これらの患者は、３０ケ月以内にＴ１Ｄを有すると診断されており、募集時の基底Ｃペプチドレベルが０．２ｐｍｏｌ／ｍＬ以上である。
【００８４】
発症直後のＴ１Ｄを有する患者（ＣＤＡガイドライン  http://www.diabetes.ca/for-professionals/resources/2008-cpg/、下記参照）は、典型的な代謝機能不全のポジティブな尺度、インスリン補充必要性を有する。Ｔ１Ｄ関連Ｂ細胞およびＴ細胞自己免疫を、このＴ１Ｄ要素が直接的な治療標的の１つであるため加える。患者は、例えば、オンタリオ州トロント市のHospital For Sick Childrenで診断されるか、より大きなトロントエリアにある関連のSickKids Satellite Diabetes Centersの１つによって照会された。患者は、以下の条件であれば、治験に適格である：１．患者の年齢が１０〜１８歳であり、２．患者は、診断から３０ケ月以内であり、かつ処置された甲状腺機能低下症（Ｔ１Ｄにおいては珍しくない）以外の他の慢性疾患がなく、３．保護者／介護者が、および、彼らに同意できる場合は患者が、治験の口頭説明を受け、カナダ保健省が承認した糖尿病におけるｓＰ療法を説明する教育ビデオを鑑賞している。説明は、研究および処置上の血管造影に対する書面でインフォームドコンセントを提供する前に、内臓の血管造影、ｓＰの注入、麻酔、および（ヒトにおいて）試されていない介入失敗の可能性に関した潜在的危険に習熟することを含む。
【００８５】
ｓＰ処置は、ＴＲＰＶ１遺伝子型によって制御される正常なｓＰ分泌活性を有する患者には役立たないかもしれない。最も可能性の高い応答者についてこの小規模の初期研究にでコホートを層別化するために、そして応答者の見込みのない者の危険可能性を減らすために、患者は、Ｔ１Ｄ患者／家族において優勢な多型のＴ１Ｄ関連ＴＲＰＶ１対立遺伝子の少なくとも１つを保有すれば、介入に適格である。ヨーロッパおよび北アメリカにおける大規模なＴＲＰＶ１配列決定プログラムは来たる何年も未完了かもしれないので、未だ未分類のままである配列に遭遇する可能性がある。よって、リンパ球ＮＫ１Ｒ（ｓＰ結合後に迅速に内部移行する主要ｓＰレセプター）の占有状況を測定するバイオアッセイを開発した。ほとんどのＴ１Ｄ患者は非占有表面ＮＫ１Ｒを異常に高レベルで有し、これは低く安定した状態のｓＰレベルを反映しており、よって、介入の適格性を確認するためにこのアッセイを使うことができる。これらのデータは、ＨＣ治験薬概要書（HC Investigator Brochure）に記載され、考察される。
【００８６】
配列および機能データに基づいて、２０％もの多くの採用見込み者が、この最終の２重内包集合（これは、この研究を理論的に最も可能性のあるｓＰ応答集団に集中するように設計された）に落ちると予期される。より大規模なフォローアップ研究は、患者の部分集団を区別する力を持っていてもよく、また、これらの組み入れ基準を重視してもよく重視しなくてもよい。原理：Ｔ１Ｄ逆転は、ｓＰ療法に対する本質的に２元（あり／なし）の初期応答である。ヒトＴ１Ｄ発症は、発症後の初年度においてある時点で始まり数週間から数ケ月続く一過性の寛解フェーズ（「ハネムーン」）の頻繁な（約７０％）発生によって、糖尿病傾向マウスと異なる（モジュール１．２．３．３）。本研究において、疾患寛解（インスリンなしでの正常血糖）が誘発されると予期され、この寛解は、数日の期間にわたるよりむしろ注入後数時間から数日以内に迅速に顕在化することが予期されることを除いて、自然発生的なハネムーンと区別することが困難である。このフェーズ１研究は、顕著な効力データの生成を目指すことはできないが、対照コホート（１または複数）は、特に、患者の処置の応答も２元性であるか、およびｓＰ誘発寛解がマウス治療の寿命（ヒトでいえば約６年と同等）付近の範囲を有するかについて、最終的に傾向を解明することを可能とし、特に、開発中の非侵襲的な薬物送達戦略が開発することができれば、より一般的な再発および再注入が１年後であってもなお所望の効果を臨床的に表し得る。
【００８７】
いくつかの永久的、後天的、または先天的な条件、ならびに一過性の条件が、この研究への参加を妨げる：１．一般的な一過性寛解（「ハネムーン」、＜０．５Ｕインスリン／ｋｇ）の患者において、急激な尺度の薬物効果はなく、ｓＰ介入処置を疾患が再発するまで遅延させることがある（再発尺度として、インスリン必要量が１Ｕ／ｋｇ以上にまで増加することを用いる）。２．患者が既知の併存症を有し、この併存症には、ＡＣＥ阻害剤で処置される高血圧、および１つ以上の器官系に影響を与える染色体異常が含まれる。３８℃以上の発熱を伴う一般小児感染症は、リスケジューリングにつながり得る。３．妊娠。４．Ｘ線造影アレルギーが既知の患者。５．年齢別ＢＭＩが＞９０パーセンタイル値である過体重（ＢＭＩが８５〜９５パーセンタイル値）または肥満（年齢別ＢＭＩが＞９５パーセンタイル値）の患者は、この初期研究の適格者ではない（Ｃペプチドレベルは体重上昇によって変化するためである）。６．保護者が近いうちにトロントを離れる予定があり、フォローアップが保証できない。
【００８８】
前臨床の動物データ（Razaviら、20069）は、この処置が、ＴＲＰＶ１チャンネルの機能が低下した患者に役立つと最も考えられることを示している。よって、潜在的な候補者は、ＴＲＰＶ１遺伝子における少なくとも１つのＴ１Ｄ関連対立遺伝子（ｒｓ８０６５０８０  ｃ．１７５３Ａ＞Ｃ／Ｔ／Ｇ（ｐ．Ｉｌｅ５８５Ｌｅｕ／ｐ．Ｉｌｅ５８５Ｐｈｅ／ｐ．Ｉｌｅ５８５Ｖａｌ）、またはｒｓ２２４５３４  ｃ．１４０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４６９Ｉｌｅ）、またはｒｓ２２２７４９  ｃ．２７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ９１Ｓｅｒ）、またはｒｓ２２２７４７  ｃ．９４５Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｍｅｔ３１５Ｉｌｅ））のキャリアでなければならない。特定のＴＲＰＶ１ミスセンス変異体の増幅および配列決定のためのＰＣＲプライマーの配列リストを提供する（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８）。全てのＰＣＲ産物（５００〜６８８ｂｐ長）を、口腔スワブ試料から抽出したゲノムＤＮＡから増幅する。精製したＰＣＲ産物を、認可されたGenomics Quebec施設（certified Genomics Quebec facility）によって、両末端から再配列決定し、そしてコンセンサス遺伝子型を決定する。医師長にのみ患者の遺伝子型を連絡し、医師長が、助言者とともに、患者の遺伝子型に基づく治験のための適格性を確認する。
【００８９】
処置前に、全ての同意患者が、ＯｒａｇｅｎｅＴＭ  ＤＮＡ採取キットを用いて、ＤＮＡ解析用の口腔スワブ試料を提供する。そのＤＮＡを、ＴＲＰＶ１遺伝子の特定エクソンを増幅および配列決定するために用い、患者の遺伝子型を同定し、それを本研究のための適格性を決定するために用いる。野生型ＴＲＰＶ１遺伝子型を有する患者はこの治験の適格者ではない。彼らはこの処置からの恩恵が得られにくく、彼らのＴ１Ｄ疾患は代替の発症機序により発症したものであり得るためである。図７は、ＤＮＡ採取キット７０２を示し、これは、本発明の１つの実施形態においてＤＮＡ試料を採取するために用いられ得る。ＤＮＡ採取キット７０２は、スワブ７１２、チューブ７１４、チューブ７１４に螺合される漏斗７１６、可撓性ストラップ７２０によって漏斗７１６に接続される漏斗蓋７１８、およびチューブ７１４のための小キャップ７２２を備える。特定のＤＮＡ採取キットを図７に示すが、ＤＮＡ試料を採取するために、本発明の様々な実施形態において他の種類のＤＮＡ採取キットを用いてもよい。
【００９０】
実施例２
薬物処方物
注入用液：米国薬局方注入用０．９％の塩化ナトリウム中のサブスタンスＰ。Ｓｐ−Ｒ／ＡＴＭ：２ｍｇ ｓＰ／ｍＬおよびｓＰ−ＰｅｄＴＭ：０．５ｍｇ ｓＰ／ｍＬ、バイアル：各１ｍＬ。ｃＧＭＰグレード医薬有効成分、ＡＰＩ（カリフォルニア州サンディエゴ市のPolypeptide Inc.、９８％純度）、ｃＧＭＰ滅菌薬物製造をトロント市のDalton PharmaServicesに委託した。生産手順および検証を完了し、業界基準；製造データに従う。
【００９１】
実施例３
投与量レジメン
投与量発見および毒性研究−ステージＡ，１２人の患者を無作為化し、１０、５０、１００または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇを動脈内投与した（投与群あたり３人の患者）。処置投与量は、連続切片から得たマウスの膵臓組織１ｍｇあたりの細胞表面発現ｓＰレセプターＮＫ１Ｒの計数からまず算出し、器官全体にまで外挿した（これは、Ｔ１Ｄ患者において重ねられることができる手順ではない）。ｓＰ投与量を、表面レセプター当たり１００倍飽和を得るように算出し、２ｎＭ／２０ｇマウスにまで外挿し、組織内滞留時間および薬物半減期について調整した。この投与量は実に有効であった。新規発症マウスＴ１Ｄは大量のリンパ球浸潤を有し、膵臓表面ＮＫ１Ｒレセプターの多くがこれらの浸潤細胞によって実際に保有され、事実、これらの細胞のほとんどが正当でほぼ確実に必須のｓＰ療法標的であり、これは活性化したばかりのリンパ球において急速なリンパ球死を引き起こすためである（モジュール１．２．３．６）。これは、膵臓およびその関連リンパ節組織において、自己免疫エフェクター細胞を劇的に低減する。ヒトＴ１Ｄの新規発症膵臓炎症性病変はより低い密度であり得るが、入手可能なデータは正確な比較には不十分であり、そのようなデータを生成することは現在では可能でない。マウス実験において標準のｓＰ投与量は２ｎＭ／マウス（すなわち、１００ｎｍ ｓＰ／ｋｇ ＢＷ）であった（ここで、０．２ｎＭ／マウスの投与量は部分的効果しか有さなかった）。この背景において、ｓＰ療法応答性新規発症Ｔ１Ｄマウスにおいて達成されたように、１００ｎＭ／ｋｇ ＢＷの投与量がインサイチュで同程度の急性ＮＫ１Ｒ結合を提供し得ると推定される。
【００９２】
実施例４
ウォッシュアウト期間
プレＣＴＡミーティング（２０１２年５月）中の協定に基づいて、偽薬は使用せず、最終的に全ての患者がｓＰ注入を受ける。しかし、顕著な糖尿病逆転率（reversal rates）が保証される場合、効果のない低いｓＰ投与量を受けたステージＡ投与量発見群の患者に、介入期の終わりに向けて第２の注入を提示してもよい。３０秒未満という短さ（また、いくつかの場所では１分以下）の血管半減期によって、ｓＰのウォッシュアウト期間は非常に短くなる。
【００９３】
実施例５
研究前スクリーニングおよびベースライン評価
標準的な患者のケア（病院におけるＳＯＰ）は、いくつかの代謝変数の初期測定および反復測定を含むが、加えて、ｓＰ介入の１〜５週間前までに、１回のＭＭＴＴに加えて、Ｔ１Ｄ関連Ｂ細胞およびＴ細胞の自己反応性の少なくとも１度の測定が必要である。ＴＲＰＶ１対立遺伝子の配列多様性およびＮＫ１Ｒ（ｓＰレセプター）占有率のシークエンシングなどの追加の検査を、上記除外基準に記載し考察した。
【００９４】
実施例６
治療／査定訪問
介入および介入後のプロセスの詳細な記述を提供する。記載のように、それは、過度に慎重であり、介入自体のものより十分に重大であり得る患者のストレスを表し得る：通例の大腿部注入手順は、通常、外来患者ベースで行う。ステージＡの毒性および投与量発見期の終わりまでに、観察期間および集中監督をＤＳＭＢ協定により安全に減らすことができるかどうかを決定する。
【００９５】
研究関連のベースラインデータが重要である。原則として、新規発症データは、患者チャートで入手可能である。研究は次の血液検査を要し、これは採用および無作為化の１〜５週間前に採血する：ＨｂＡｌｃ、Ｔ１Ｄ関連Ｂ細胞およびＴ細胞の自己反応性、膵臓および肝臓機能検査、ならびに決定的にはＭＭＴＴであり、Ｃペプチド（基底、ピーク、ＡＵＣ）、空腹時および刺激後のインスリンレベルおよびグルコースレベルに関してデータを生成する。本研究は、１２人の患者が、インフォームドコンセントに署名している時または署名しようとしている時にステージＡ（投薬、毒性）を始めることを目指している。ステージＢ（介入）のための採用は、そこから継続する。
【００９６】
治験医および治験モニターによる通例的に密接な連携を通じて、標準的なケアのサンプリングとのサンプリングとの重複を回避する。研究薬局（Research Pharmacy）は、患者のスケジューリング（名前、ＨＳＣ  ＩＤ、予定の介入の１〜３週間前の体重（ｋｇ）を含む）を通知される。
【００９７】
典型的な（青年用）ｓＰ製剤であるｓＰ−Ｒ／ＡＴＭ（青ラベル）は、生理食塩水中に２ｍｇ ｓＰ／ｍＬを含有し、小児製剤であるｓＰ−ＰｅｄＴＭ（黄ラベル）は、０．５ｍｇ ｓＰ／ｍＬを含有する。両製剤とも−２０℃未満で冷凍保存する。
【００９８】
研究薬局は、患者ＩＤ、体重、およびスケジューリングを研究スタッフから受け取り、介入投与量および青バイアルまたは黄バイアルの適切な数の再計算および確認または訂正を行い、マイナス２日目までに治験医にＥメールで連絡する。VanilloidGenetics Incによって、エクセル（登録商標）に基づく自動計算器が開発されて検証されており、これを本研究チームに提供した。書面での処方指示には、患者名、ＩＤ、ＢＷ、および最終投与量、ならびに１０ｍＬ滅菌シリンジ中に合わせる青コードのｓＰ−Ｒ／Ａおよび／または黄コードのｓＰ−Ｐｅｄからの容量を記載する。介入の朝に、必要とされる薬物バイアルをその安全な冷たい貯蔵庫から取り出し、記名して貯蔵庫を出て、密閉された滅菌プラスチックの袋に入れ、室温で解凍し、治験スタッフ（この場合は医師長および治験モニター）に記名して渡すまで氷水上で保管する。すぐ使用可能なバイアルを、介入ＯＲに輸送し、注入を行うＩＧＴチームに届ける。
【００９９】
研究エントリーの朝（１日目）に、同意したＴ１Ｄ患者は、予定の空腹時の血中グルコース値測定を受ける。稀な例であるが最近のＭＭＴＴデータセットが入手可能ではない場合、このような患者はＭＭＴＴを受ける。ＭＭＴＴ後、もし必要であれば修正後のインスリン投与量を処方してもよく、そして患者は、これらの打ち合わせがすでに以前に結論づけられたのでない限り、次の日の介入について話し合うために麻酔およびＩＧＴの相談者と面談した後、解放され帰宅する。
【０１００】
次の朝、絶食中の介入患者は、午前８〜９時の間に病院に入院する。但し、介入薬物を薬局から受け取り手元にあるか確認された。患者は、腹腔動脈を介してｓＰの送達のための短い標準的な麻酔の準備がされ、そしてこれを受ける。ＩＧＴ画像化チームは、臨床業務で大腿血管造影を日常的におこなっており、さらに有害事象なくイヌの全身研究のためのｓＰ腹腔注入を行う。ステージＡ患者を４群（各群の患者が３人ずつ）の１つに無作為化し、各患者は１０、５０、１００、または２５０ｎｍｏｌ  ｓＰ／ｋｇを受ける。所定の投与量を注入し、患者はモニタリングフェーズに入り、ＯＲの入手性およびスケジューリングの制約によって許容されるように、最初は群同士の間に２日残す。ステージＡで生成したデータ、特に、改善した空腹時グルコースレベルおよびインスリン必要量の低下を、可能性のあるｓＰ投与量応答を特定するために使用する。全ての毎日の血糖計測定値を研究サイトに頻繁にアップロードする。ＰＩによって臨床の場で決定されたように、３〜４人の初期（ステージＡ）患者は一晩入院し、その後少なくとも最初の２日間、病院の近くに滞在する。ステージＡの結論は、１回のステージＢ介入投与量を特定すると予期され、このプロセスにはスタッフおよび研究の委員会が関与する。原理：ステージＡは第１の患者データを生成する。発症直後の糖尿病のマウスにおけるＴ１Ｄ逆転は、非常によく理解された機械的経路に沿って、数時間以内に生じる。β細胞におけるそのポジティブな生存効果および膵臓自己免疫浸潤物に対するそのネガティブな生存効果と共にｓＰ−レセプター結合の反応速度が速いことを考慮すると、ｓＰ効果は、患者においてもむしろ迅速であると予期される。ステージＡ戦略は、慎重な薬物投与量の範囲を包含し、そしてそれは注意深く進行し（薬物毒性を予期する理由はないが）、そしてそれは、ステージＢに必要とされる経験およびステージＢで用いられる薬物投与量を生成する。ステージＡ戦略およびコホートサイズを、で議論して認可し、そしてカナダ保健省とのプレＣＴＡミーティングの最終議事録に組み入れた（治験薬概要書、モジュール１．２．３．１）。このプレＣＴＡミーティングでは、有効なｓＰ投与量がステージＡで出現した場合、より低い投与量を受けたステージＡ患者に対し、ステージＢの終わりまで、研究開始約４週間後、かつスケジューリングが許すように、最適な投与量での第２の注入を提示することが倫理的であろうということも議論した。これは、処置失敗後の繰り返し注入は、数年の範囲で予想される間隔ではあるが、最終的にフォローアップ計画の一部であるので、この研究ステージまたは研究全体から導き出される結論を脅かさない。
【０１０１】
ステージＡの完了後、これらの患者は、最適以下の投与量を受けた患者にステージＢ投与量での第２の注入を提示することを決定しているのでない限り、ステージＣ（フォローアップ）に入る。このような患者は、ステージＢにおいて介入コホートに加えられ得る。ステージＡにおいて注入の完了中に、ステージＢのための採用は続き、介入および対照コホートに各５人の患者の群で、予め設定された無作為化を行う。ステージＢ介入は、１０人（対照５人、介入５人）の第１群が同意した時に始まり、それは、４０人が同意するまで続く（予期せぬ有害事象が研究の一時停止を引き起こしたり、またはＤＳＭＢ認可プロトコルが変わったりしない限り）。ＤＳＭＢは、米国から３人およびヨーロッパから１人の学術的にも評判の高い上級Ｔ１Ｄ医師で構成された。ＤＳＭＢは、研究チームと委員会としてＳｋｙｐｅを介して頻繁に連絡を取るようにする。ステージＢの毒性および投与量発見研究においてなされる全ての観察、ならびに介入に起因する有害事象を、ＤＳＭＢの諮問委員会に迅速に連絡し（Ｅメール、電話）、有害な特にｓＰ関連事象を、ＲＥＢに連絡する：現在は、カナダ保健省への有害事象のためのオンライン報告経路がある。ＤＳＭＢは、予期せぬ有害事象に直面した時に、治験を中止または変更する力を有し、義務を負う。介入に起因する有害事象がなければ、採用された４０人の適格患者は、その後、変更された交差研究設計において研究投与量を受ける：２０人の介入患者は、この時点で注入を受けていない２０人の対照患者を対照とし、これらの対照患者がまた介入患者に転向し、３週間前の自身の介入前データを対照とする。
【０１０２】
注入プロトコルを以下のように記載する：腹腔動脈へのカテーテル留置の後に、投与量発見ｓＰ量またはステージＢ研究介入投与量（１０、５０、１００、または２５０ｎＭ  ｓＰ／ｋｇ  ＢＷ（５または１０ｍＬ生理食塩水に溶解）（上記参照）を３分間にわたって注入する。原理：全てのマウス研究で安定した速度の注入が用いられており、イヌ研究において代替の速度の注入のタイミングが匹敵され、いかなる差異も見出されなかった。
【０１０３】
患者および保護者を研究へ紹介後、介入および／または対照群に参加することに興味があれば、その手順前に、病院のＩＧＴクリニック（Hospital IGT Clinic）で保護者および小児と会い、腹腔血管造影を詳細に説明する。危険を概説する。これらは、局所的な鼠径部の問題（出血および血腫、偽動脈瘤、動脈切開、動脈血栓症／狭窄症、動静脈瘻、疼痛）；腹腔領域における局所的問題（血栓症、痙攣、動脈切開、出血）；全身問題（造影剤アレルギー、Ｘ線被爆、空気塞栓症、脳卒中）；注入関連（膵炎、肝機能障害、胆嚢炎）；画期的薬物状況（ラベルオフ）を含む。保護者はインフォームドコンセントに署名し、適宜、患者は同意する。
【０１０４】
血液検査を処置の前日の間に行い（ＣＢＣおよび血液凝固（ＩＮＲ、ＰＴＴ）、ならびに０ユニットのための分類およびスクリーニングを含む）、これらの検査を上記のリストに加えるが、分類およびスクリーニングは、介入の数週間前に行うことができる。１２歳より年上の少女については最終月経期間の日付を調べ、現在の病院の方針に従って妊娠検査をする。膵臓、肝臓、胆嚢、および脾臓を詳しく検査するために、ベースラインの診断腹部超音波を準備する。介入前に、麻酔相談を行う。
【０１０５】
実施例７
併用医薬
腹腔血管造影およびｓＰ注入中の短い麻酔、標準的な回復、局所的な疼痛管理注入部位、頻繁な血中グルコース測定に基づくインスリン処方。
【０１０６】
実施例８
有効性変数および分析
主な測定は、３週間の介入後期間の前および後のＭＭＴＴ由来糖尿病関連変数であり、分析のためのコア変数は、Ｃペプチドである（基底、ピーク、およびＡＵＣ）。２次分析は、インスリン必要量、およびインスリン抵抗の推定値、空腹時および刺激後の血中グルコースを含み（臨床要件によって変更されない限り）、介入の前、その終わり、ならびにその６ケ月および可能であれば１２ケ月後にＭＭＴＴから全ての値を導き出す。
【０１０７】
実施例９
安全性変数および分析
通例の血液化学は、研究のステージＡ中の膵臓、肝臓、および腸マーカーの２つの測定を含む。異常値を観察しなかった場合、この数を介入の４〜７日後に１回の測定に低減する。
【０１０８】
本研究は、カナダ保健省ＩＣＨ  Ｅ２Ａ報告基準に従う。起こりうる有害事象を、治験スタッフおよびモニターによってモニタリングして記録する。２人の有資格の医師（本研究チームの一部ではない）がスタンバイＡＥチームを形成し、常に在宅待機しており、治験スタッフに呼び出しスケジュールを提示する。軽度のＡＥを２４時間以内に、重度／重篤ＡＥについてはほとんどが３時間以内で、考察および分析のために連絡する。SickKidsの有害事象フォーム（Study Protocol、２２頁）を用いて、全てのＡＥを研究および患者の記録に記載して入力し、研究関連／研究無関連、薬物治療関連／薬物治療無関連として特定する。重度／重篤ＡＥを、ＲＥＢ、ＨＣ、およびＤＳＭＢに書面で連絡する。
【０１０９】
実施例１０
統計分析
この研究は、臨床アッセイ戦略、統計的アプローチおよび解釈に関して、近年のＮＩＨ−ＴｒｉａｌＮｅｔ  Ｔ１Ｄメタ研究の推奨を実施する（Greenbaumら、Diabetes：20125；Lachinら、PLoS One：20118）。ステージＡ（毒性および投与量発見）のために、採用した最初の１２人の患者をそれぞれ、４つのｓＰ投与量（１０、５０、１００、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の１つに無作為化する（ＳＡＳ手順）。全患者は、介入前に介入前ＭＭＴＴを受け、低投与量を最初に、最高投与量を最後として毒性研究を構成する。この投与量増加プロセス中に薬物関連の予期せぬ有害事象がある場合、更なる投与量増加を継続すべきかどうか決定するためにＤＳＭＢにすぐに相談する。ステージＡは、最後のステージＡ患者が注入を受けてから３週間後かつステージＢ（介入）開始前、ＭＭＴＴで完了するが、採用、同意、および介入前ＭＭＴＴは、より早くに得られる。ステージＢ（効力傾向、ｎ＝４０）：この２順序（two-sequence）の２期間の１回処置の変更された交差研究において、４０人の患者を、初期処置または対照群（各ｎ＝２０）に無作為化する（ＳＡＳ手順）。処置群における患者は、介入の７〜３０日前にベースラインＭＭＴＴを受ける。
【０１１０】
その後、これらの患者は、ステージＡで選択されたｓＰ投与量で、１回注入研究介入を受ける。３週間後、処置された各患者はＭＭＴＴを受ける。これで、ある患者のステージＢは終わり、第１の研究目標のために当該患者の全データを提供する。これらのデータは、Ｃペプチド値および低下したインスリン必要量に基づいて応答者または非応答者としてその患者を分類し、最終のＭＭＴＴを介入前データおよび対照群からの関連データセットと比較する。その後、処置された患者はステージＣ（フォローアップ）に転向し、家でのグルコース測定値およびインスリン投与量を安全な研究ウェブサイトを通じて定期的に電子的にアップロードし、そのデータを分析に含める。研究チームと家族との間で毎週−毎月ごとに電話連絡する頻度と同様に、ＰＩによってグルコース測定の頻度を決めてもよい（例えば、毎週、毎月）。
【０１１１】
（今までのところ未処置の）対照群は、初期介入期間Ｉの後半中に初期ＭＭＴＴを受ける。この期間Ｉの完了後、対照患者は、対照から処置の状態に転向し、研究介入（期間ＩＩ）（各患者にとっての、最後の患者の注入から３週間後に終わる）を受ける予定であり、そしてＭＭＴＴで完了する：介入前データおよび介入後データを上記のように比較し、その後、患者は、ステージＣ（フォローアップ）に転向する。各患者は、１回注入だけを受けるので、２つの期間の間の「ウォッシュアウト」期間に関する典型的な懸念はない。加えて、介入（ｓＰ）は、極めて短い組織半減期を有する（＜１分）。ＧＥＥ（一般化推定方程式）アプローチを用いて正式なデータ分析を行い、集団平均限界モデルを構築する。このモデルは、同じ患者内における相関と時間的に変化する共変動（処置効果）を説明する。第１の尺度は、ともにＭＭＴＴにおいて測定した基底または刺激後のＣペプチド、および／または、インスリン必要量が大きく減ることもしくはなくなることである。第２の尺度は、インスリンレベル、血糖を含む。異なる相関構造を調べ、そして最も適切な相関行列を選択する。
【０１１２】
最終モデルは処置、期間、順序の効果、ならびに処置応答、年齢、発症時年齢、発症後の介入時間、性別間の関係を推定する。分析は、任意の１つのマーカーまたは組合せマーカーがｓＰ応答性／不応答性を予測するかどうかを判定する。測定される全身変化は即時代謝効果よりも出現が遅いので、Ｈｂ１ＡＣおよび自己免疫マーカーを、繰り返し測定ＡＮＯＶＡによって、介入前および研究の３ケ月と６ケ月目（および、延長の場合は１２ケ月目）に比較する。臨床チーム、諮問委員会およびＤＳＭＢの間に合意があれば、生成した研究の経験に基づくモニタリングアルゴリズムを用いて、フォローアップ期間を延長してもよい。研究は、最終のデータ分析のためのＭＭＴＴで終結すべきである。分析を通して、繰り返し記載されたＳＡＳ９．３およびＰＲＯＣ  ＧＥＭＯＤを用いる。
【０１１３】
この小規模な初期転換研究の統計的検出力は、いくつかの方法における分析を可能にする。いくつかの重要な疾患マーカーをモニタリングする科学的臨床的必要性は、適宜、ボンフェローニ補正を用いて組合せ比較における検出力を強化する。６ケ月研究の終了点において、せいぜい非常に少ないが、ハネムーンに対照者がいれば、３人のｓＰ応答者でも顕著な結果を生み出すであろう。ｓＰ療法が実際にハネムーンの形態を生じれば（ここで全寛解を＜０．５Ｕインスリン／ｋｇ／ｄとして定義する）、およそ同じ検出力を比例して適用する。本分野における以前の経験から（Heroldら、N. Engl. J. Med：20026）、２次的結果、特に、ＨｂＡ１ｃ、Ｃペプチド（ＡＵＣ、ピーク、空腹時）の分析は最も高感度であり得、各患者におけるいくつかの連続測定は、その小さなサイズにもかかわらず、統計的分析に相当の検出力および信頼度を加える（Greenbaumら、Diabetes：20125；Lachinら、PLoS One：20118）。
【０１１４】
投薬および介入ステージの短さ（３週間）ならびにフォローアップ（ステージＣ、血糖計データおよびインスリンデータのアップロード、２つの病院の訪問、初期の隔週ごとの電話）の非侵入性は、追跡不能者（loss-to-follow-up）（ＬＴＦ）を助長させないと考えられる。しかし、ＬＴＦは、非応答者においていくらか優先的に予想され得る。このシナリオが可能に見え始め（研究チームの余分な努力にもかかわらない）、本研究の統計的検出力を高め始めたら、標準的なケアの病院チャートデータを、本研究には関係ないが過去３０ケ月にわたって診断以来の病院で標準的なケアを伴った３０人までのＴ１Ｄ患者から集める。インスリン使用、発症時の年齢、空腹時グルコース、およびいくつかの経口ブドウ糖負荷試験（入手可能なら）に関する匿名扱いのデータセットを、学生の小さなチームが表にする（さもなければ本研究に関係しない）。
【０１１５】
参考文献
以下の参考文献は、上記に引用され、かつ／または本発明と共に用いられ得る技術を記載し、そして以下の参考文献の内容および開示は、参照によって本明細書中に援用される。
【０１１６】
１．Abdul-Rasoul, M., Habib, H.,およびAl-Khouly, M.「'The honeymoon phase' in children with type 1 diabetes mellitus: frequency, duration, and influential factors.」Pediatr. Diabetes 7, 101-107 (2006)。
【０１１７】
２．Akirav, E., Kushner, J.A.,およびHerold, K.C.「Beta-cell mass and type 1 diabetes: going, going, gone?」Diabetes 57, 2883-2888 (2008).
【０１１８】
３．Bowden, S.A., Duck, M.M.,およびHoffman, R.P.「Young children (<5 yr) and adolescents (>12 yr) with type 1 diabetes mellitus have low rate of partial remission: diabetic ketoacidosis is an important risk factor.」Pediatr. Diabetes 9, 197-201 (2008).
【０１１９】
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本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、添付の特許請求の範囲において定められるように、本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載の実施形態に対する多くの変形、改変および変更が可能である。したがって、本発明は、記載の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲の文言およびその等価物により規定される全ての範囲を有することが意図される。
【図１】
2016537403.tif 000004
【図２】
2016537403.tif 000005
【図３】
2016537403.tif 000006
【図４】
2016537403.tif 000007
【図５】
2016537403.tif 000008
【図６】
2016537403.tif 000009
【図７】
2016537403.tif 000010
【配列表】
2016537403000001.app
【国際調査報告】
2016537403.tif 000011