(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列からなる、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチド。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【請求項２】
以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【請求項３】
粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）を、タンパク質分解酵素を用いて、以下の５つのうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分として含有する高血圧予防用食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤又は高血圧予防用食品の有効成分として有用なポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は主にヒトの血管の内皮細胞、肺、腎臓及び脳に存在する。この酵素は、アンギオテンシンIに作用して、Ｃ末端から２つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することにより、強力な血圧上昇作用を有するアンギオテンシンIIに変換する。また、この酵素は、降圧作用のあるブラジキニンの分解にも関与している。
【０００３】
従って、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧が低下し、高血圧の予防乃至治療に効果を奏すると考えられる。
【０００４】
これまでにも、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質が見出されている。
【０００５】
例えば、牛乳等に含まれるカゼインやアサリ肉のタンパク質の分解物などが検討されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。しかし、これらは豚肉や牛肉などの畜肉に多く含まれる筋タンパク質を利用したものではない。
【０００６】
また、畜肉由来のタンパク質の分解物も報告されている（非特許文献１参照）。しかし、十分なＡＣＥ阻害作用を有するためには、ペプチドの付加等の修飾工程が必要であり、修飾工程等を伴わない天然由来のタンパク質で、満足のいく活性を有するものは未だ見出されていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１０６７００
【０００８】
【特許文献２】
特開平７−１０１９８５号公報
【０００９】
【非特許文献１】
有原ら、「ミートサイエンス（meat science）」, 57, 319-324, (2001)
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、顕著なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、天然物から得られ、毒性が低く安全性の高い物質を提供することを主な課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有する物質を見出すことを目的として鋭意検討を重ねた。その結果、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）の酵素分解物に、顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質が存在することを見出し、更に検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は次の事項に係る。
【００１３】
本発明の第１項は、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００１４】
好ましくは、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１５】
より好ましくは、８〜１０個のアミノ酸残基からなり、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有する、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチド、
又は、７〜９個のアミノ酸残基からなり、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅのいずれかのアミノ酸配列を有する、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１６】
更に具体的には、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなり、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチド、
或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、
或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなる、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１７】
本発明の第２項は、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【００１８】
好ましくは、以下の５つのポリペプチド；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなるポリペプチド、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎからなるポリペプチド、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎからなるポリペプチド、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなるポリペプチド、又は、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒからなるポリペプチド
の１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
【００１９】
より好ましくは、以下のポリペプチド；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなるミオシン由来のポリペプチド、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎからなるミオシン由来のポリペプチド、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＧｌｎからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド、又は、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＴｙｒからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド
の１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
【００２０】
本発明の第３項は、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）を、タンパク質分解酵素を用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００２１】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）におけるミオシンを、タンパク質分解酵素を用いて、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなるポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２２】
または、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）におけるトロポニンＴを、タンパク質分解酵素を用いて、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなるポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２３】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）を、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンを用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
を有するポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２４】
本発明の第４項は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤が、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有している、項３に記載の製造法に係る。
【００２５】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）を、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンを用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
を有するポリペプチドに加水分解する工程を含む、
５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有しているアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２６】
本発明の第５項は、項１に記載のポリペプチド又は項２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２７】
好ましくは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなる、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２８】
または、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなる、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３０】
ポリペプチド
本発明におけるポリペプチドは、７〜１０個からなるアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちいずれか１つの骨格を有し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドである。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、具体的には、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドである。
【００３２】
上記骨格を有するポリペプチドが、優れたアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有することが今回明らかとなった。
【００３３】
ここで、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（VKKVLGNP）は、ミオシン軽鎖（Davoli et al. Animal Biotechnology, 8: 179-185, 1997）４７位から５４位由来のペプチドである。ミオシン由来のペプチドの中で、該ペプチドのように優れたアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するものはこれまで知られていなかった。
【００３４】
また、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（EKERERQ）及びＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ（KRQKYDI）は、トロポニンＴ（Moir et al. Biochemical Journal, 161: 371-382, 1977）由来のペプチドと考えられる。
【００３５】
トロポニンＴ由来のペプチドでアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するものはこれまで知られていなかった。
【００３６】
上記本発明のポリペプチドは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）をタンパク質分解酵素で加水分解することによって得られる。粗精製トロポニンとしては、ウサギ、ウシ、ブタ等に由来するタンパク質から抽出したものを用いることができる。
【００３７】
粗精製トロポニンは、具体的には、以下のような精製を行うことにより得られる。低塩濃度水溶液で洗浄したひき肉をアセトンパウダーにし、そこから高塩濃度バッファーで抽出する。抽出液に塩酸を加えpHを4.6とした後、遠心して得られた上清のpHをさらに水酸化カリウムで7.0に調整する。次いで、硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム濃度40%から60%の間で沈殿してくる画分を集める。この沈殿を、バッファーを用いて透析することで、粗精製トロポニンを得る。
【００３８】
タンパク質分解酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等が挙げられる。
【００３９】
タンパク質分解酵素による加水分解の条件は、適宜設定し得るが、トリプシン、キモトリプシンはｐＨ７．０〜８．５、ペプシンはｐＨ１〜３、また温度はいずれも２５〜３７℃とすることが一般的である。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）をタンパク質加水分解酵素で加水分解した後、生成物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相HPLCなどを適宜組み合わせて精製することにより得られる。
【００４１】
また本発明のポリペプチドは、Fmoc固相合成などの公知の方法で合成してもよい。
【００４２】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、上記アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを１種または２種以上有効成分として含有することにより得られる。具体的には、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちいずれか１つの骨格を有するポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤である。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００４３】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤においては、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；又は
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅのいずれかの骨格に適当なアミノ酸残基が付加したものやアミノ酸残基が欠如したものであって、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドを有効成分として用いる。
【００４４】
例えば、本発明には、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つの骨格を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤が含まれる。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【００４５】
ここで、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（VKKVLGNPSN）は、VKKVLGNPに２個のアミノ残基が付加したものであり、ミオシン軽鎖の４７位から５６位に相当する。
【００４６】
また、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（KRQKY）は、KRQKYDIから２個のアミノ酸残基が欠如したものである。
【００４７】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、上記に例示したポリペプチドをそのまま又は適当な担体と共に適宜製剤化することによって得ることができる。
【００４８】
担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のポリペプチドと反応しない物質を用いることができる。
【００４９】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、テンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げられる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、ポリペプチドを水、生理食塩水あるいはブドウ糖溶液等に溶解させてもよい。また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００５０】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤における、上記ポリペプチドの含有量は所望に応じて適宜設定し得るが、０．０００１〜１００％程度、好ましくは０．０１〜１０％程度の割合で含有する。
【００５１】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤には、降圧作用を有する他の成分や各種の添加剤を含有させてもよい。
【００５２】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を奏し得ることから、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防乃至治療剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等として用いることができる。
【００５３】
高血圧予防用食品
本発明の高血圧予防用食品は、上記本発明のポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤を適当な食材に含有させることにより得ることができる。
【００５４】
食材としては、例えば、豚肉、牛肉、家兎肉（ウサギ）、羊肉、山羊肉、馬肉、鶏肉、七面鳥肉、ウズラ肉、鯨肉、サメ肉、タラやサケといった魚肉類等が挙げられる。
【００５５】
食品の形態としては、ソーセージ、ハム、ハンバーグ、ミートボールなどの畜肉加工品、カレー、コロッケ、鶏肉唐揚げ、春巻き、ロールキャベツなどの惣菜類、スープ類、栄養ドリンク類、ゼリー、アイスクリームなどのデザート類、スナック・菓子類、錠剤タイプの栄養機能食品類、唐揚げ粉などの混合調味料類、粉末調味料類等が挙げられる。
【００５６】
本発明の食品においては、上記ポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、いずれかのアミノ酸骨格を有するものを、１種単独で、又は２種以上を併用して用いることができる。
【００５７】
本発明の食品におけるポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤の含有量は、所望に応じて適宜設定し得るが、ポリペプチドとして０．０００１〜９９％程度、好ましくは０．０１〜１０％程度である。
【００５８】
本発明の食品には、降圧作用を有する他の成分や食品に一般に用いられる添加剤、例えばソルビン酸などの保存料、リン酸塩などの結着補強剤、カラギーナンなどの増粘剤、ビタミンＣなどの強化剤、亜硝酸ナトリウムなどの発色剤、安定剤、酸化防止剤、固結防止剤等を適宜含有していてもよい。
【００５９】
本発明の食品は、上記ポリペプチド及び該ポリペプチドを含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤を含んでいることから、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、強力な血圧上昇作用を有するアンギオテンシンIIの変換阻害作用や降圧作用のあるブラジキニンの分解阻害作用に基づく血圧降下作用を奏する。
【００６０】
このような性質から、本発明は、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防用食品として、好適に用いることができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
国産の豚ロース肉から抽出した粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１
kDa）をペプシンで加水分解した。粗精製トロポニンは、以下のような精製を行うことにより得た。低塩濃度水溶液（1% トライトン X-100, 50 mM 塩化カリウム, 5 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン, pH 8.0）で洗浄したひき肉をアセトンパウダーにし、そこから高塩濃度バッファー（1 M塩化カリウム, 25 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン, 0.1 mM 塩化カルシウム, 0.1 mM ジチオトレイトール, 1 mM アジ化ナトリウム, pH 8.0）の溶液で抽出した。抽出液に塩酸を加えpHを4.6とした後、遠心して得られた上清のpHをさらに水酸化カリウムで7.0に調整して硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム濃度40%から60%の間で沈殿してくる画分を集めた。この沈殿をバッファー(2 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン, 0.5 mMジチオトレイトール, 2 mM アジ化ナトリウム, pH 7.5)に透析することで、粗精製トロポニンを得た。
【００６３】
なお、この粗精製トロポニンにはミオシン軽鎖（分子量約１５〜２６kDa）が含まれていることが、ポリアクリルアミド電気泳動により確認された。この粗精製トロポニンのペプシン加水分解物のウシ肺由来のACEに対する50％阻害活性（IC50）は225 mg/mlであった。未加水分解トロポニンにはACE阻害活性が認められなかったことから、活性の発現はペプシン分解で生じたペプチドに由来することが推定された。
【００６４】
以下、実施例１において、アンギオテンシン変換酵素（ACE）に対する５０％阻害活性（IC50）は、ウシ肺由来ACEを用いて、Cushman- Cheungの方法（Biochemical Pharmacology, 20: 1637-1648, 1971）で測定した。
【００６５】
該加水分解物をまず、DE53カラム(Whatman International Ltd., Kent, UK) (16 x 150 mm)を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。すなわち、20 mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（酢酸でpH 7.5に調整したもの）で該加水分解物をアプライし、同バッファーを含むNaCl水溶液によるグラジェント(0-300 mM)溶出を行った。流速は1.13 ml/分とし、7分毎(7.91 ml)に分画したのち、215 nmと280 nmの吸光度を測定した(図１)。得られた画分をSEP-PAK Plus C18カートリッジ(Waters Co., Milford, MA, USA)を用いて脱塩し、吸着画分を50%アセトニトリルで溶出させて得られた画分を濃縮して、その活性を測定した。特に強い活性が認められたのは、初期に溶出した画分(IC50 = 201 mg/ml)であった。この活性画分をコスモシール5C18 AR-II (4.5 x 150 mm) (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan)を用いる逆相(RP)-HPLCに供し、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含むアセトニトリルの1-80%のグラジェント溶出(流速0.5 ml/分)で分画し、215 nmの吸光度をモニターした(図２)。以降の精製過程でも215 nmの吸光度を測定した。
【００６６】
次に、図２のフラクション5 (IC50 = 138 mg/ml)をコスモシール5C18 AR-II (4.5 x 150 mm) (Nacalai Tesque)を用いるRP-HPLCに供し、0.1% TFAを含む12% CH3CNでイソクラティック溶出(流速0.5 ml/min)した(図３)。ここで得られた活性画分AおよびBをTSK-gel G2000SWXL (7.8 x 300 mm) (Tosoh Co., Tokyo, Japan)を用いるゲルろ過HPLCにそれぞれ供して、20 mMリン酸ナトリウム(pH 7.0)でイソクラティック溶出(流速0.5 ml/min)した(図４)。ここで得られた活性の強い画分(A由来: IC50 = 119 mg/ml, B由来: IC50 = 27 mg/ml)をコスモシール5PE-MS (4.6 x 250 mm) (Nacalai Tesque)を用いるRP-HPLCに供し、0.1% TFAを含む12% CH3CNでイソクラティック溶出(流速1 ml/min)した。同カラムでさらに二回繰り返し精製(12%および14% CH3CN)することで単一と認められるピークをそれぞれ得た(図５)。
【００６７】
さらに、図２のフラクション7 (IC50 = 114 mg/ml)をコスモシール5C18 AR-II (4.5 x 150 mm) (Nacalai Tesque)を用いるRP-HPLCに供し、0.1% TFAを含む16% CH3CNでイソクラティック溶出(流速0.5 ml/min)した(図６)。ここで得られた活性画分LをTSK-gel G2000SWXL (7.8 x 300 mm) (Tosoh)を用いるゲルろ過HPLCに供して、20 mMリン酸ナトリウム(pH 7.0)でイソクラティック溶出(流速0.5 ml/min)した(図７)。ここで得られた活性の強い画分(L由来: IC50 = 57 mg/ml)をコスモシール 5PE-MS (4.6 x 250 mm) (Nacalai Tesque)を用いるRP-HPLCに供し、0.1% TFAを含む15% CH3CNでイソクラティック溶出(流速1 ml/min)した。同カラムでさらに二回繰り返し精製(12% CH3CNを二回)することで単一と認められるピークを得た(図８)。
【００６８】
精製で得られた画分のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーProcise 492 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)でシーケンス解析した。その結果、画分Aから得られたペプチドはVKKVLGNP、画分Bから得られたペプチドはEKERERQ、画分Lから得られたペプチドはKRQKYDIであると認められた。これらのペプチドはこれまでに報告のない、新規なACE阻害ペプチドであった。
これらのアミノ酸配列をデータベースSwissProt （EMBL Outstation- European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）で検索した結果、VKKVLGNPは豚のミオシン軽鎖の４７位から５４位に一致し、材料として使用した粗精製トロポニンに含まれていたミオシン軽鎖（分子量約１５〜２６kDa）由来と認められた。EKERERQおよびKRQKYDIは、ウサギ、ウシ、ラット、ヒト、マウスの骨格筋トロポニンＴに含まれるペプチドと一致した。
【００６９】
本発明で利用した粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１kDa、ミオシン軽鎖を含む）は豚骨格筋由来のものであるが、豚トロポニンの配列はトロポニンＣ、トロポニンＩ、トロポニンＴとも、未だ確定していない。データベースには豚トロポニンＣのアミノ酸配列が一応登録されてはいるものの、トロポニンＩおよびトロポニンＴのアミノ酸配列は登録されておらず、本発明のペプチドと完全に一致する配列は見出せなかった。しかし、豚以外の動物のトロポニンのアミノ酸配列がデータベースに登録されているため、本研究で得られたペプチドがこれらのトロポニン中に存在するかどうかを検索した。その結果、EKERERQは、ウサギ（１２０〜１２６残基目）、ウシ（１２０〜１２６残基目）、ラット（１０２〜１０８残基目）、ヒト（１１２〜１１８残基目）、マウス（１０４〜１１０残基目）のトロポニンＴに存在していた。また、KRQKYDIはウサギ（２３０〜２３６残基目）、ウシ（２３０〜２３６残基目）、ラット（２１２〜２１８残基目）、ヒト（２２２〜２２８残基目）、マウス（２１４〜２２０残基目）のトロポニンＴに存在していた。これらのことから豚のトロポニンＴにも同じ配列のペプチドが存在している可能性が認められ、本研究で見出したペプチドは豚肉を材料として得られたものであるため、トロポニンＴ由来であると推定された。
【００７０】
実施例２
実施例１で同定したACE阻害ペプチド３種類と、その関連ペプチドであるVKKVLGNPSN（豚ミオシン軽鎖の４７位から５６位に相当）とKRQKY（ウサギトロポニンＴの２３０位から２３４位に相当）をFmoc固相合成法で合成した。
【００７１】
ACE阻害活性の評価
実施例２で作成したペプチドのIC50、分子量、及びRP-HPLC（(TSKgel ODS-80TS、 4.5 x 250 mm、Tosoh)で0.1% TFAを含むアセトニトリルの5-55% (20分)のグラジェント溶出(流速1 ml/min)）の保持時間（RT）を表１に示す。
【００７２】
実施例２において、ACEに対する５０％阻害活性（IC50）は、ウサギ肺由来のACEを用いて、Cushman- Cheungの方法（Biochemical Pharmacology, 20: 1637-1648, 1971）で測定した。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
【発明の効果】
本発明は、豚肉や牛肉に多く含まれる筋タンパク質であるトロポニンやミオシンから得られる、新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有するポリペプチドを提供するものである。
【００７５】
本発明のポリペプチド乃至アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するだけでなく、天然の食肉由来のタンパク質を生体内にも存在する消化酵素を用いて分解して得られることから、安全性が高く、毒性も低い。
【００７６】
このような特性により、本発明のポリペプチド乃至アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、医薬用の薬理成分として有用であるばかりでなく、血圧降下作用等を有する高血圧予防用食品等の付加価値の高い機能性食品を作る素材としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、粗精製トロポニンのペプシン加水分解物を試料とする陰イオン交換クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】図２は、図１に示される活性画分をコスモシール（Cosmosil）5C18 AR-IIを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は、図２に示される活性画分５を再度コスモシール5C18 AR-IIを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、図３に示される活性画分ＡおよびＢをそれぞれTSK-gel G2000SWXLを用いるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、図４に示されるふたつの活性画分（画分ＡおよびＢ由来）をそれぞれコスモシール 5PE-MSを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は、図２に示される活性画分７を再度コスモシール5C18 AR-IIを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７は、図６に示される活性画分ＬをTSK-gel G2000SWXLを用いるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図８】図８は、図７に示される活性画分（画分Ｌ由来）をコスモシール 5PE-MSを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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