(57)【要約】  活性医薬成分（ＡＰＩ）又はその中間体を生成するための生体触媒プロセスであって、前記ＡＰＩ又はその中間体は、式（Ｉ）のヌクレオシドアナログ（ＮＡ）であり、該ＮＡは、ラクトバチルス由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いて、薬学的に関連する抗ウイルス薬及び抗癌薬、その中間体又はプロドラッグとして活性である。2016518838.tif 000026【選択図】なし
2016518838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性医薬成分（ＡＰＩ）又はその中間体を生成する生体触媒プロセスであって、ＡＰＩ又はその中間体は、式Ｉのヌクレオシドアナログ（ＮＡ）、Ｄ異性体であり：
【化１】
2016518838.tif 000016
式中、
Ｚ１はＯ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１から独立して、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（ＲＳ２）、又はＮ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【化２】
2016518838.tif 000017
から選択された水素、メチル、ＯＨ、それらのエーテル又はエステルであり；
ｎは０又は１であり、Ｍは、水素、或いは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、又はアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ハロゲン、好ましくはＦ、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、デオキシリボヌクレオシドに由来するＮＡの場合には水素であり、或いは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来する場合は、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン（好ましくはＦ）、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２、又はハロゲン（好ましくはＦ）であり、
但し、ＲＳ１とＲＳ４がＯＨのエーテル又はエステルである場合にその両方は異なることを前提とし；
ＲＳ５は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２又はハロゲン、好ましくはＦであり；
リボース部分に結合した塩基は、式Ａ−Ｈ、又は、それらの互変異性体及びその位置異性体から選択され：
【化３】
2016518838.tif 000018
式中、
Ｒ１は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ３は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ４は、水素、メチル、随意に置換したにアルキル鎖、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＣＨ２−複素環であり；
Ｒ５は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、随意に置換したアルケニル鎖、随意に置換したアルキニル鎖、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４であり；
及び、独立して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の随意に置換した複素環又は随意に置換したアリールは、
【化４】
2016518838.tif 000019
から選択され：
式中
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６は、水素、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ７は、水素、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ８は、ヒドロキシル又はアミノ、ＯＲ１３、ＯＳＯ２Ｒ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ９は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１０とＲ１１は互いに独立して、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ１２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１３とＲ１４は互いに独立して、水素、置換又は非置換のアルキル鎖、置換又は非置換のアルケニル鎖、置換又は非置換のアルキニル鎖、置換又は非置換のフェニル環、置換又は非置換の複素環であり；
前記プロセスは、好ましくはワンステップ／ワンポットの反応で行なわれ、ここで、該反応は、適切な反応水性媒体において、及び適切な反応条件下で、式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシド、Ｄ異性体を含む出発物質の混合物への、天然又は組み換え型のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＮＤＴ）活性を持つ酵素の追加を含み；
【化５】
2016518838.tif 000020
式中、
Ｚ１はＯ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１から独立して、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（ＲＳ２）、又はＮ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【化６】
2016518838.tif 000021
から選択された水素、メチル、ＯＨ、それらのエーテル又はエステルであり；
ｎは０又は１であり、Ｍは、水素、或いは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、又はアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ハロゲン、好ましくはＦ、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、デオキシリボヌクレオシドに由来するＮＡの場合には水素であり、或いは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来する場合は、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン（好ましくはＦ）、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２、又はハロゲン、好ましくはＦであり、
但し、ＲＳ１とＲＳ４がＯＨ残留物のエーテル又はエステルである場合にその両方は異なることを前提とし；
ＲＳ５は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２又はハロゲン、好ましくはＦであり；
リボース部分に結合した塩基は、任意の複素環から選択され；
及び、ＮＤＴ活性を持つ酵素により転写される、少なくとも遊離核酸塩基は、式Ａ’−Ｈ’、又はそれらの互変異性体及びその位置異性体から選択され：
【化７】
2016518838.tif 000022
式中、
Ｒ１は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ３は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ４は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＣＨ２−複素環であり；
Ｒ５は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、随意に置換したアルケニル鎖、随意に置換したアルキニル鎖、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４であり；
及び、独立して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の随意に置換した複素環又は随意に置換したアリールは、
【化８】
2016518838.tif 000023
から選択され：
式中
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６は、水素、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ７は、水素、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ８は、ヒドロキシル又はアミノ、ＯＲ１３、ＯＳＯ２Ｒ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ９は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１０とＲ１１は互いに独立して、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ１２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１３とＲ１４は互いに独立して、水素、置換又は非置換のアルキル鎖、置換又は非置換のアルケニル鎖、置換又は非置換のアルキニル鎖、置換又は非置換のフェニル環、置換又は非置換の複素環である
ことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
ＮＤＴ活性を持つ酵素によって転写される、遊離核酸塩基は、
【化９】
2016518838.tif 000024
【化１０】
2016518838.tif 000025
から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
生成されたＡＰＩ又はその中間体は、クロファラビン（Ｃｌ−Ｆ−ａｒａＡ）、デシタビン（ａｚａ−ｄＣｙｄ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、クラドリビン（Ｃｌ−ｄＡｄｏ）、フルダラビン（Ｆ−ａｒａＡ）、ネララビン（ＭＡＹ）、ジドブジン、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、β−チミジン、イドクスウリジン（ＩｄＵ）、トリフリジン（ＴＦＴ）、アセドゥリド（ＥｄＵ）、リバビリン、ジダノシン（ｄｄＩ）、及びペントスタチンから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
生成されたＡＰＩ又はその中間体は、クロファラビン、シタラビン、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン、ザルシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ジドブジン、フロクスウリジン、及びペントスタチンから選択される、ことを特徴とする請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
生成されたＡＰＩ又はその中間体は、クロファラビン、シタラビン、及びジドブジンから選択される、ことを特徴とする請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
生成されたＡＰＩ又はその中間体はクロファラビンである、ことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ＮＤＴ活性を持つ酵素は、ラクトバチルス・デルブリッキーから単離されたＮＤＴである、ことを特徴とする請求項１乃至６の何れか１つに記載のプロセス。
【請求項８】
ＮＤＴ活性を持つ酵素は、ラクトコッカス・ラクチスから単離されたＮＤＴである、ことを特徴とする請求項１乃至６の何れか１つに記載のプロセス。
【請求項９】
ＮＤＴが、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるラクトバチルス・デルブリッキーのヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の補体であるヌクレオチド配列；又は
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１により縮重しているヌクレオチド配列；又は
ｄ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１へと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の補体へと、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に由来するハイブリダイゼーションプローブへと、或いはそれらの補体へとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；又は
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１との少なくとも８０％の配列同一性があるヌクレオチド配列；又は
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１との少なくとも６５％の配列同一性があるヌクレオチド配列であって、前記配列は好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素又はその機能部分をコード化するか、又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列；又は
ｇ）ＮＤＴ活性を持つポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列
から得られる、ことを特徴とする請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
ＮＤＴが、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるラクトコッカス・ラクチスのヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体であるヌクレオチド配列；又は
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３により縮重しているヌクレオチド配列；又は
ｄ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３へと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体へと、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に由来するハイブリダイゼーションプローブへと、或いはそれらの補体へとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；又は
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも８０％の配列同一性があるヌクレオチド配列；又は
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも６５％の配列同一性があるヌクレオチド配列であって、前記配列は好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素又はその機能部分をコード化するか、又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列；又は
ｇ）ＮＤＴ活性を持つポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列
から得られる、ことを特徴とする請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１つに記載のプロセスに従う、ＡＰＩ又はその中間体の生成におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を持つ組み換え酵素の使用であって、ＡＰＩ又はその中間体は抗癌薬又は抗ウイルス薬として特に有用なヌクレオシドアナログ（ＮＡ）であり、前記組み換え酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列を含む核酸配列；
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体であるヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３により縮重しているヌクレオチド配列；又は
ｃ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３へと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体へと、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に由来するハイブリダイゼーションプローブへと、或いはそれらの補体へとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；又は
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも８０％の配列同一性があるヌクレオチド配列；又は
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも６５％の配列同一性があるヌクレオチド配列であって、前記配列は好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素又はその機能部分をコード化するか、又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列；又は
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列
によりコード化されることを特徴とする、使用。
【請求項１２】
組み換え発現ベクターであって、１以上の制御配列に操作自在に結合する天然又は組み換えのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）をコード化する配列を含み、前記制御配列は、適切な宿主において前記デオキシリボシルトランスフェラーゼの発現又は過剰発現を配向し、ここで、前記組み換え発現ベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される核酸配列：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体であるヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３により縮重しているヌクレオチド配列；又は
ｃ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３へと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の補体へと、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に由来するハイブリダイゼーションプローブへと、或いはそれらの補体へとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；又は
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも８０％の配列同一性があるヌクレオチド配列；又は
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との少なくとも６５％の配列同一性があるヌクレオチド配列であって、前記配列は好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素又はその機能部分をコード化するか、又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列；又は
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列
を運び、及び、それを発現又は過剰発現する
ことを特徴とする組み換え発現ベクター。
【請求項１３】
抗癌薬又は抗ウイルス薬として特に有用な活性医薬成分（ＡＰＩ）又はその中間体、ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）である、ＡＰＩ又はその中間体の生成のための、請求項１２に記載の組み換え発現ベクターの使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組み換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
ＮＤＴ活性を持つ組み換え酵素の生成のための、請求項１４に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学的に関連する抗ウイルス剤及び抗癌薬、それらの中間体又はプロドラッグとしてのヌクレオシドアナログ（ＮＡ）活性の生成に有用な、新規の酵素法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は、天然のヌクレオシドと構造上関係する合成化合物である。それらの構造に関して、ヌクレオシドは３つの重要な要素によって構成される：（ｉ）ヒドロキシメチル基、（ｉｉ）ヘテロ環式窒素含有塩基部分、及び（ｉｉｉ）フラノース環であり、これらは、様々な例において、正確な配向でヒドロキシメチル基と塩基を提示するスペーサとして作用するものと考えられる。
【０００３】
ＮＡは、抗ウイルス剤と抗腫瘍剤として広く使用される。これらの分子は従来、自然発生のヌクレオシドの修飾を可能にするために、複素環塩基及び／又はペントース部分に対する保護−脱保護反応を含む、時間を消費する多段階のプロセスを頻繁に必要とする、異なる化学的方法によって合成されてきた（Ｂｏｒｙｓｋｉ  Ｊ．  ２００８．  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  １２：３０９−３２５）。この時間を消費する多段階のプロセスは頻繁に、低い収率と費用の増加に繋がる。実際、化学的方法は通常、正確な立体選択性と配向選択性を伴う生成物を得て、二次産品を生成することの難易度を高くする（Ｃｏｎｄｅｚｏ，  Ｌ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  ｐ．  ４０１−４２３．  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，  Ｉ．  Ａ．  ２００７）。更に、化学的方法は、高価であり且つ環境上有害な化学試薬及び有機溶媒の使用を含む。
【０００４】
抗ウイルス剤又は抗癌剤として作用する様々な非天然のヌクレオシドはそれらの糖部分に対する修飾を有するので、ヌクレオシドアナログの酵素的合成を触媒するために、即ち、工業規模で適用することができる活性医薬成分（ＡＰＩ）又はそれらの中間体の合成を発達させるために、新規で効果的な産業上の生体触媒を発達させる可能性を探究することが、興味深い。
【０００５】
自然発生のＤＮＡ、ＲＮＡヌクレオシド、及びＮＡは、生体触媒のプロセスによって調製される先行技術において開示される。しかし、それらのプロセスは通常、工業規模で化合物を生成することができないか、又は、その生成に適していない（即ち、プロセスは、マイクロラボデモンストレーション（ｍｉｃｒｏｌａｂ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ）規模、或いは、生成目的に有用でない研究所規模でのミリグラム量でも、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド、及びＮＡを調製するだけである）。更に、先行技術文献に開示された前記プロセスは、ＡＰＩとして機能することができないか、又は商業規模での生成に適していないＮＡに関して、研究所規模で設計された。
【０００６】
驚くことに、以前に引用した化学的又は生体触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｉｔｙｃ）合成経路の欠点を回避することができ、且つ、５０％より高い転換率及び／又は９５％より高いアノマー純度と共に、ＡＰＩとして有用なＮＡを得ることができることが、見出された。それは、本発明において主張されたヌクレオシド・デオキシリボシル（Ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｙｌ）トランスフェラーゼ（ＮＤＴ又はＮｄＴ）酵素の使用に基づいて可能となる。
【０００７】
ＮＤＴの生体酵素（ｂｉｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ）合成の利点は次の通りである：
（ｉ）ワンポット合成
（ｉｉ）工程の数の減少
（ｉｉｉ）より高い転換率と収率
（ｉｖ）酵素工程における有機溶媒の回避
（ｖ）例えば糖の中のヒドロキシル基のための保護／脱保護の方策は、必要とされない
（ｖｉ）軽度の反応条件：環境に優しい技術（水又は水性媒体、中性のｐＨ）
（ｖｉｉ）極端に優れた選択性：立体選択性−エナンチオ選択性と化学−配向選択性
（ｖｉｉｉ）少数の副反応又は副作用が無い：不純物プロファイル（減少した副産物含有量）
（ｉｘ）廃棄物の総発生量の減少
（ｘ）プロセス生産性
（ｘｉ）総生産コストの低減
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＮＤＴ酵素を使用する、本明細書に記載されるプロセスは、以下のように概説される：
【０００９】
【化１】
2016518838.tif 000003
より具体的に、以下のように概説される（式中、Ｚ１、Ｚ２、ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、ＲＳ４、ＲＳ５は本明細書中で定義される）：
【００１０】
【化２】
2016518838.tif 000004
【００１１】
本記載のために、以下の用語が、以下のように更に定義される。
【００１２】
用語「ヌクレオシド」は、複素環塩基が糖に共有結合する全ての化合物を指し、特に好ましい糖へのヌクレオシドの結合は、糖の中の炭素原子の、複素環塩基の中の炭素原子又はヘテロ原子（典型的に窒素）へのＣ１’−（グリコシド）結合を含む。それ故、本文脈において、用語「ヌクレオシド」は、複素環塩基のグリコシドを意味する。
【００１３】
本明細書で更に使用されるように、用語「糖」は、全ての炭水化物とその誘導体を指し、特に考慮される誘導体は、糖における化学基又は原子の欠失、置換、又は付加を含む。例えば、特に考慮される欠失は、２’−デオキシ及び／又は３’−デオキシの糖を含む。特に考慮される置換は、環酸素の硫黄又はメチレンへの置換、或いは、ヒドロキシル基のハロゲン、アミノ基、スルフヒドリル基、又はメチル基への置換を含み、及び、特に考慮される付加はメチレンホスホン酸基を含む。更に考慮される糖はまた、糖アナログ（即ち、自然発生でない糖）と、特に環状炭素系とを含む。用語「環状炭素系」は、本明細書で使用されるように、複数の炭素原子が環を形成する任意の分子を指し、特に考慮される環状炭素系において、環は３、４、５、又は６の炭素原子から形成される。
【００１４】
用語「ヌクレオシド」は、非自然発生のヌクレオシド、自然発生のヌクレオシド、同様に他のヌクレオシドアナログを含むように、広く使用されてもよい。ヌクレオシドの例示的な例は、リボース部分も含むリボヌクレオシド、同様にデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドである。そのようなヌクレオシドの塩基に関して、これは、自然発生の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル）、同様に、その任意の修飾した変異体、或いは任意の可能な非天然の塩基の何れかでもよいことを、理解されたい。
【００１５】
用語「ヌクレオシドアナログ」、「ＮＡ」、又は「ＮＡｓ」は、本明細書で使用されるように、全てのヌクレオシド、その異性体又はエナンチオマー、同様に、ラセミ体又はそのエナンチオが豊富な（ｅｎａｎｔｉｏ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）混合物を指し、それは、自然発生のＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオシド、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、及びチミジンのオキシアナログ又はデオキシアナログである。好ましくは、前記ＮＡは、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、又はチミジンの各々の対応する糖部分及び／又は塩基部分とは異なる、糖部分及び／又は塩基部分を含むヌクレオシドである。より好ましくは、前記ＮＡは、糖部分と塩基部分とで構成される非自然発生のヌクレオシドであり、前記糖部分と前記塩基部分の少なくとも１つは、自然発生のＤＮＡ又はＲＮＡ、より好ましくは自然発生のポリヌクレオチドにおいて見出されない。代替的に、前記ＮＡは、糖がリボフラノースではない、及び／又は、複素環塩基が自然発生の塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｉなど）ではない、ヌクレオシドである。同様に、用語「ヌクレオチド」は、リン酸基が糖に結合するヌクレオシド（Ｄ−ヌクレオシド又はＬ−ヌクレオシドの何れか）を指す。
【００１６】
用語「ワンステップ／ワンポット」、「ワンステップ・ワンポット」、又は「ワンステップ−ワンポット」は、連続する別個の段階において反応を行なうことよりむしろ、使用される材料を１つの管の中で共に混合して反応させる、１つの工程を介する化合物の合成方法を指す。この方策は、反応効率を改善し、収率を増加させて、時間と資源を節約するために使用される。
【００１７】
用語「複素環」又は「複素環塩基」は、本明細書で互換的に使用され、複数の原子が複数の共有結合を介して環を形成する任意の化合物を指し、ここで環は、炭素原子以外に少なくとも１つの原子を含む。特に考慮される複素環塩基は、非炭素原子として窒素、酸素、及び硫黄から各々独立して選択される、少なくとも１乃至４のヘテロ原子を含有する、５員環及び６員環を含む（例えば、イミダゾール、ピロール、トリアゾール、ジヒドロピリミジン）。更に考慮されるヘテロ環は、別の環又はヘテロ環に縮合されることもあり（即ち、共有結合される）、故に本明細書で使用されるように「縮合ヘテロ環」又は「縮合複素環塩基」と称される。特に考慮される縮合ヘテロ環は、６員環に縮合した５員環（例えば、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）、及び、別の６員以上の環に縮合した６員環（例えば、ピリド［４，５−ｄ］ピリミジン、ベンゾジアゼピン）を含む。これら及び更に好ましい複素環塩基の例が、以下に挙げられる。また更に考慮される複素環塩基は芳香族でもよく、又は、１以上の二重結合又は三重結合を含んでもよい。また、考慮される複素環塩基と縮合ヘテロ環は更に、１以上の位置において置換されてもよい。及び、環の何れか１つは、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アミノ、モノ又はジＣ１−６アルキルアミノ、アジド、メルカプト、ポリハロＣ１−６アルキル、ポリハロＣ１−６アルコキシ、及びＣ３−７シクロアルキルから成る群から各々独立して選択される、１、２、又は３の置換基で随意に置換される。
【００１８】
用語「核酸塩基」は、自然発生の核酸塩基、同様に非自然発生の核酸塩基もカバーする。「非自然発生」と以前に考慮された様々な核酸塩基が後に自然に見出されたことは、当業者に明白であるに違いない。故に、「核酸塩基」は、既知のプリンとピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環アナログ（Ｎ−置換ヘテロ環など）及びその互変異性体も含む。式Ａ乃至Ｈを参照。核酸塩基の例示的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、２−クロロアデニン、２−フルオロアデニン、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２，ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメート、シトシンＮ−アルキルカルバメート、シトシンＮ−アルキルエステル、５−アザシトシン、５−ブロモビニルウラシル、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、６−メトキシ−９Ｈ−プリン−２−アミン、及び（Ｒ）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｄ］［１，３］ジアゼピン−８−オールである。用語「核酸塩基」は、これらの例の全て、同様にそのアナログ、互変異性体、及び位置異性体をカバーするように意図される。
【００１９】
用語「互変異性体」又は「互変異性型」は、低エネルギーバリアを介して相互転換可能な、異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー互変異性体としても知られる）は、ケト−エノール及びイミン−エナミンの異性化など、プロトンの移動を介する相互転換を含む。原子価互変異性体は、結合電子の幾つかの再組織による相互転換を含む。
【００２０】
用語「位置異性体」は、原子が異なる順の接続性で結合される同じ分子式を持つ分子を指すという意味では、構造異性体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｍｅｒ）、又は構造異性体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒ）を指す。
【００２１】
用語「転換率」は、生成物（予期された最終生成物、副産物、又は分解の生成物の何れか）に転換される出発物質のパーセンテージを指す。
【００２２】
用語「アノマー純度」は、混合物中に存在する化合物の全てのアノマーの総量で割り、１００％を掛けた、化合物の特定のアノマーの量を指す。
【００２３】
用語「２’−フルオロ−アラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）ヌクレオシド−タイプ」は、前述の糖に結合した核酸塩基から独立して、糖部分の２’−位置にある炭素原子が２’−アラビノ構成においてフッ素原子によって置換される、任意のヌクレオシドアナログを指す。
【００２４】
用語「中間の」又は「中間体」は、適切な付加的な化学反応によりヌクレオシド構造の活性医薬成分（ＡＰＩ）に転換され得る、任意のヌクレオシドアナログ型化合物を指す。それ故、中間体はＡＰＩ前駆物質であると考慮され得る分子である。ＡＰＩ又はその中間体としては使用されない、任意のヌクレオシドアナログ型化合物は、本発明において放棄される（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｄ）。
【００２５】
用語「アルキル」及び「非置換のアルキル」は本明細書で互換的に使用され、全ての炭素−炭素結合が単結合である任意のＣ１−Ｃ２５の直線の、分枝の、又は環式の炭化水素を指す。
【００２６】
用語「アルケニル」及び「非置換のアルケニル」は本明細書で互換的に使用され、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する任意のＣ１−Ｃ２５の直線の、分枝の、又は環式のアルキルを指す。
【００２７】
更に、用語「アルキニル」及び「非置換のアルキニル」は本明細書で互換的に使用され、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する任意のＣ１−Ｃ２５の直線の、分枝の、又は環式のアルキル又はアルケニルを指す。
【００２８】
用語「アリール」及び「非置換のアリール」は本明細書で互換的に使用され、芳香族乾式アルケニル又はアルキニルを指し、それは、基又は基の一部がフェニル又はナフタレニルであり、各々が、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アミノ、モノ−又はジＣ１−６アルキルアミノ、アジド、メルカプト、ポリハロＣ１−６アルキル、及びポリハロＣ１−６アルコキシから選択される、１、２、又は３の置換基で随意に置換される。用語「アルカリール」は、アリールがアルキル、アルケニル、又はアルキニルに共有結合される場合に利用される。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「置換した」は、原子又は化学基（例えば、Ｈ、ＮＨ２、又はＯＨ）の官能基への置換を指し、特に考慮される官能基は、求核基（例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣなど）、求電子基（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｘ）ＯＨなど）、極性基（例えば、−ＯＨ）、非極性基（例えば、アリール、アルキル、アルケニル、アルキニルなど）、イオン性基（例えば、−ＮＨ３＋）、及びハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ）、並びに、それらの全ての化学的に合理的な組み合わせを含む。故に、用語「官能基」及び用語「置換基」は本明細書で互換的に使用され、求核基（例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣ、−ＣＮなど）、求電子基（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｘ）ＯＨ、Ｃ（ハロゲン）ＯＲなど）、極性基（例えば、−ＯＨ）、非極性基（例えば、アリール、アルキル、アルケニル、アルキニルなど）、イオン性基（例えば、−ＮＨ３＋）、及びハロゲンを指す。
【００３０】
また、本明細書で使用されるように、用語「複素環」及び「複素環塩基」は、本明細書で互換的に使用され、複数の原子が複数の共有結合を介して環を形成する任意の化合物を指し、ここで環は、炭素原子以外に少なくとも１つの原子を含む。特に考慮される複素環塩基は、非炭素原子として窒素、酸素、及び硫黄から各々独立して選択される、少なくとも１乃至４のヘテロ原子を含有する、５員環及び６員環を含む（例えば、イミダゾール、ピロール、トリアゾール、ジヒドロピリミジン）。更に考慮されるヘテロ環は、別の環又はヘテロ環に縮合されることもあり（即ち、共有結合される）、故に本明細書で使用されるように「縮合ヘテロ環」又は「縮合複素環塩基」と称される。特に考慮される縮合ヘテロ環は、６員環に縮合した５員環（例えば、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）、及び、別の６員以上の環に縮合した６員環（例えば、ピリド［４，５−ｄ］ピリミジン、ベンゾジアゼピン）を含む。これら及び更に好ましい複素環塩基の例が、以下に挙げられる。また更に考慮される複素環塩基は芳香族でもよく、又は、１以上の二重結合又は三重結合を含んでもよい。また、考慮される複素環塩基と縮合ヘテロ環は更に、１以上の位置において置換されてもよい。及び、環の何れか１つは、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アミノ、モノ又はジＣ１−６アルキルアミノ、アジド、メルカプト、ポリハロＣ１−６アルキル、ポリハロＣ１−６アルコキシ、及びＣ３−７シクロアルキルから成る群から各々独立して選択される、１、２、又は３の置換基で随意に置換される。
【００３１】
本発明に係る、Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）活性を持つ酵素をコード化する核酸分子は、次のものを含む：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるようなヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の補体であるヌクレオチド配列；又は
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５により縮重している（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ヌクレオチド配列；又は
ｄ）高い厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５へと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の補体へと、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５由来のハイブリダイゼーションプローブへと、又はそれらの補体へとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；又は
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５との少なくとも８０％の配列同一性があるヌクレオチド配列；又は
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５との少なくとも６５％の配列同一性があるヌクレオチド配列：ここで、前記配列は好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素又はその機能部分をコード化するか、又はそれをコード化する配列に相補的である；又は
ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００３２】
本発明の意味における厳密性のハイブリダイゼーションの条件は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９），  １．１０１１．１０４」に記載されるものとして定義される。これに従い、厳密な条件下のハイブリダイゼーションは、陽性のハイブリダイゼーションシグナルが、５５℃、好ましくは６２℃、及び最も好ましくは６８℃で１ｘＳＳＣバッファー及び０．１％のＳＤＳにより１時間の、特に、５５℃、好ましくは６２℃、及び最も好ましくは６８℃で０．２ｘＳＳＣバッファー及び０．１％のＳＤＳにより１時間の洗浄後も今なお観察されることを意味する。
【００３３】
更に、本記載の意味において、本発明は、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列もカバーするものであり、これらはヌクレオチド又はアミノの酸性レベルでそれぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、又は５（ヌクレオチド）或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、又は６（アミノ酸）に示されるヌクレオチド又はアミノ酸の配列との少なくとも７０％の、特に好ましくは少なくとも８０％の、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有している。パーセント同一性は以下の方程式に従って判定される：
Ｉ＝（ｎ／Ｌ）×１００
式中、Ｉはパーセント同一性であり、Ｌは塩基性配列の長さであり、ｎは、塩基性配列に対する配列のヌクレオチド又はアミノ酸の差の数である。
【００３４】
本発明のまた別の主題は、発現制御配列と効果的に結合される、上記に定義されるような核酸分子の少なくとも１つのコピーを含む組み換えベクターである。該ベクターは任意の原核生物又は真核生物のベクターでもよい。原核生物ベクターの例は、バクテリオファージなどの染色体ベクター（例えば、バクテリオファージ・ラムダ）、及び、プラスミドなどの染色体外ベクター（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １−４を参照）である。ベクターは、真核生物ベクター（例えば、酵母ベクター）、又は高等細胞に適しているベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、又は植物ベクター）でもよい。適切な真核生物ベクターは、例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  ｓｕｐｒａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６」に記載される。本発明は更に、上述のような核酸又は組み換えベクターにより形質転換される組み換え細胞に関係する。細胞は、例えば、原核細胞又は真核細胞といった任意の細胞でもよい。原核細胞、とりわけ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が特に好ましい。
【００３５】
本記載のために、本発明は、変異体、前駆物質、又はオルソログ、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６の組み合わせもカバーする。
【００３６】
用語「変異体」は、本明細書の全体にわたって使用されるように、核酸のヌクレオチド配列、又は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸によって変更されるタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列それぞれを意味することを、理解されたい。変異体は「保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」変化を有し得、ここで、置換したヌクレオチド又はアミノ酸は、置き換えられたヌクレオチド又はアミノ酸と同様の構造的又は化学的特性を有する。変異体は、「非保存的な」変化、又は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の欠失及び／又は挿入も有してもよい。この用語は、その範囲内に、特定の核酸又はタンパク質又はポリペプチドのためのヌクレオチド又はアミノ酸の任意の挿入／欠失をも含む。「機能的変異体」は、言及したヌクレオチド配列又はタンパク質又はポリペプチドの機能的能力を保持する変異体を意味することを、理解されたい。
【００３７】
用語「補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」又は「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、本明細書で使用されるように、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの２０の二重らせん構造の核酸の各々の鎖が他のものに相補的であり、その中で、間にある塩基対が２又は３の水素結合を介して非共有的に結合されることを意味し得る。ＤＮＡに関して、アデニン（Ａ）塩基はチミン（Ｔ）塩基を補完し、その逆もある。グアニン（Ｇ）塩基はシトシン（Ｃ）塩基を補完し、その逆もある。ＲＮＡでは、それは、アデニン（Ａ）塩基はチミン（Ｔ）塩基の代わりにウラシル（Ｕ）塩基を補完する以外は、同じである。ＤＮＡ及びＲＮＡに見出される塩基の各々について２５の相補的塩基が１つだけ存在するので、１つは、任意の一本鎖用の相補鎖を再構築することができる。
【００３８】
本明細書の全体にわたって使用されるような用語「オルソログ」は、異なる種に見出される相同遺伝子又はｍｉＲＮＡの配列として理解されねばならない。
【００３９】
本記載のために、用語「ＮＤＴ」は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ又はＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素のファミリーに属する生体触媒を意味する。前記ＮＤＴは、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素又はＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素でもよく、或いは、特定の反応条件下で、及び／又は、酵素が修飾され、それによりヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を得る場合に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を持つ別の酵素（加水分解反応ではなく縮合反応を触媒するために｛即ち、グリコシダーゼ反応を逆に行なうために｝修飾され、それによりヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとして行動する、グリコシダーゼなど）でもよい。
【００４０】
また、本記載のために、用語「活性医薬成分」又は「ＡＰＩ」は、人間又は動物において治療活性を示す化合物、基本的にはＮＡを意味する。本記載に開示されたＡＰＩは全て、任意の異性体、ラセミ体、又は、異性体のエナンチオマー豊富化した混合物の何れかの下で、言及される。
【００４１】
本記載は、活性医薬成分（ＡＰＩ）又はその中間体を生成するための生体触媒プロセスを開示し、ＡＰＩ又はその中間体は、式Ｉのヌクレオシドアナログ（ＮＡ）、Ｄ異性体であり：
【００４２】
【化３】
2016518838.tif 000005
式中、
Ｚ１はＯ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１から独立して、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（ＲＳ２）、又はＮ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【００４３】
【化４】
2016518838.tif 000006
から選択された水素、メチル、ＯＨ、それらのエーテル又はエステルであり；
ｎは０又は１であり、Ｍは、水素、或いは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、又はアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ハロゲン、好ましくはＦ、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、デオキシリボヌクレオシドに由来するＮＡの場合には水素であり、或いは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来する場合は、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン（好ましくはＦ）、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２、ハロゲン、好ましくはＦであり、
但し、ＲＳ１とＲＳ４がＯＨ残留物のエーテル又はエステルである場合にその両方は異なることを前提とし；
ＲＳ５は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２又はハロゲン、好ましくはＦであり；
リボース部分に結合した塩基は、式Ａ−Ｈ、又は、それらの互変異性体及びその位置異性体から選択され：
【００４４】
【化５】
2016518838.tif 000007
式中、
Ｒ１は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ３は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ４は、水素、メチル、随意に置換したにアルキル鎖、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＣＨ２−複素環であり；
Ｒ５は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、随意に置換したアルケニル鎖、随意に置換したアルキニル鎖、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４であり；
及び、独立して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の随意に置換した複素環又は随意に置換したアリールは、
【００４５】
【化６】
2016518838.tif 000008
から選択され：
式中、
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６は、水素、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ７は、水素、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ８は、ヒドロキシル又はアミノ、ＯＲ１３、ＯＳＯ２Ｒ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ９は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１０とＲ１１は互いに独立して、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ１２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１３とＲ１４は互いに独立して、水素、置換又は非置換のアルキル鎖、置換又は非置換のアルケニル鎖、置換又は非置換のアルキニル鎖、置換又は非置換の複素環、又はフェニル環であり；
前記プロセスは、ワンステップ／ワンポットの反応で行なわれ、ここで、該反応は、適切な反応水性媒体において、及び適切な反応条件下で、式ＩＩの少なくともヌクレオシド、Ｄ異性体を含む出発物質の混合物への、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＮＤＴ）の追加を含み；
【００４６】
【化７】
2016518838.tif 000009
式中、
Ｚ１はＯ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１から独立して、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）（ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（ＲＳ２）、又はＮ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【００４７】
【化８】
2016518838.tif 000010
から選択された水素、メチル、ＯＨ、それらのエーテル又はエステルであり；
ｎは０又は１であり、Ｍは、水素、或いは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、又はアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ハロゲン、好ましくはＦ、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、デオキシリボヌクレオシドに由来するＮＡの場合には水素であり、或いは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来する場合は、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン（好ましくはＦ）、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２、ハロゲン、好ましくはＦであり、
但し、ＲＳ１とＲＳ４がＯＨ残留物のエーテル又はエステルである場合にその両方は異なることを前提とし；
ＲＳ５は、水素、ＯＨ、又はそれらのエーテル又はエステルの残留物、ＮＨ２又はハロゲン、好ましくはＦであり；
リボース部分に結合した塩基は、複素環を含む任意の基から選択され；
及び、ＮＤＴ酵素によって転写される、少なくとも遊離核酸塩基は、
【００４８】
【化９】
2016518838.tif 000011
から選択され：
式中、
Ｒ１は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＲ１３であり；
Ｒ３は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ４は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＣＨ２−複素環であり；
Ｒ５は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、随意に置換したアルケニル鎖、随意に置換したアルキニル鎖、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４であり；
及び、独立して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５の随意に置換した複素環又は随意に置換したアリールは、
【００４９】
【化１０】
2016518838.tif 000012
から選択され：
式中
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、直鎖又は分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６は、水素、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ７は、水素、ハロゲン、トリハロアルキル、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ８は、ヒドロキシル又はアミノ、ＯＲ１３、ＯＳＯ２Ｒ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ９は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１０とＲ１１は互いに独立して、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖であり；
Ｒ１２は、水素、メチル、随意に置換したアルキル鎖、ハロゲン、ＯＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＮ、ＣＯＲ１３、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｓ）ＯＲ１３、ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＯ２Ｒ１３、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ１３、ＮＨＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣＯ２Ｒ１３、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ１３であり；
Ｒ１３とＲ１４は互いに独立して、水素、置換又は非置換のアルキル鎖、置換又は非置換のアルケニル鎖、置換又は非置換のアルキニル鎖、置換又は非置換の複素環、又はフェニル環である。
【００５０】
出発物質の式ＩＩにおいて塩基を構成する複素環は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、キサンチン、チオウラシル、チオグアニン、９−Ｈ−プリン−２−アミン、７−メチルグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシン、プテリドン、およびそれらの任意の置換した誘導体から選択され得る。好ましくは、出発物質の式ＩＩにおいて塩基を構成する複素環は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、キサンチン、チオウラシル、チオグアニン、９−Ｈ−プリン−２−アミン、７−メチルグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシン、およびそれらの任意の置換した誘導体から選択される。
【００５１】
その上、ＮＤＴ酵素によって移される遊離核酸塩基は、好ましくは以下から選択される：
【００５２】
【化１１−１】
2016518838.tif 000013
【００５３】
【化１１−２】
2016518838.tif 000014
【００５４】
前述のプロセスの好ましい実施形態では、Ｚ２は、Ｃ（ＲＳ２ＲＳ５）である。本明細書に記載されるプロセスによって、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、以下から選択される：クロファラビン（Ｃｌ−Ｆ−ａｒａＡ）、デシタビン（ａｚａ−ｄＣｙｄ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、クラドリビン（Ｃｌ−ｄＡｄｏ）、フルダラビン（Ｆ−ａｒａＡ）、ネララビン（ＭＡＹ）、ジドブジン、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、β−チミジン、イドクスウリジン（ＩｄＵ）、トリフルリジン（ＴＦＴ）、アセドゥリド（ａｃｅｄｕｒｉｄ）（ＥｄＵ）、リバビリン、ジダノシン（ｄｄＩ）およびペントスタチン。
【００５５】
より好ましくは、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、以下から選択され：クロファラビン、シタラビン、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン、ザルシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ジドブジン、フロクスウリジンおよびペントスタチン；さらにより好ましくは、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジン（ＡＺＴ）から選択され；および、またさらにより好ましくは、記載されるプロセスは、特に、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンの中間体の工業生産に向けられ；またさらに、クロファラビンまたはその中間体がより好ましく、クロファラビンもさらにより好ましい。
【００５６】
しかしながら、本発明の範囲を限定する目的で、以下のＮＡ：ＣＡＳ Ｎｏ．２６２７−６２−５、ＣＡＳＮｏ．７４８１−８９−２、ＣＡＳ Ｎｏ．５０−９１−９、ＣＡＳ Ｎｏ．５０−９０−８、ＣＡＳ Ｎｏ．５４−４２−２、ＣＡＳ Ｎｏ．１０３５６−７６−０、ＣＡＳ Ｎｏ．２２３９−６４−７、ＣＡＳ Ｎｏ．４５４６−７０−７、ＣＡＳ Ｎｏ．１５１７６−２９−１、ＣＡＳ Ｎｏ．７０−００−８、ＣＡＳ Ｎｏ．８３８−０７−３、ＣＡＳ Ｎｏ．１０２１２−２０−１が具体的に放棄されるが、これは中温性のＮＤＴによって媒介された生体触媒合成に関してのみであり、ここでＮＡの前述のリストのパイロット生産は、産業に対するその産生を効率的にスケールアップするのに十分な収率をもたらさなかった。
【００５７】
本発明の説明の目的で、ＮＤＴ活性を有する酵素が生じる使用される有機体は、中温生物（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅｓ）、好熱生物（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）または超中温生物（ｈｙｐｅｒｍｅｓｏｐｈｉｌｅｓ）であり得る。中温生物または中温菌（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）は、１８℃から６０℃の範囲の温度で、４０−５５℃の最適温度範囲を有して、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を働かせる又は実行することができる。有機体またはＮＤＴ酵素、好熱生物または好熱菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ）は、６０℃を超えて８０℃までの範囲の温度で、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を働かせる又は実行することができる。有機体またはＮＤＴ酵素、超好熱生物（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）または超好熱菌（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ）は、８０℃を超えて１００℃までの範囲の温度で、８０−９５℃の最適温度範囲を有して、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を働かせる又は実行することができる。
【００５８】
さらに、本明細書に記載されるプロセスを実施する１つのより好ましい実施形態では、生成されるＡＰＩ、またはその中間体は、クロファラビンである（模式図２）。
【００５９】
【化１２】
2016518838.tif 000015
【００６０】
クロファラビンの産生に適用される本発明のプロセスは、このＮＡの化学合成のために先行技術で使用される工業的プロセス、いわゆるＩＬＥＸ手順（ＩＬＥＸ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（Ｂａｕｔａ ｅｔ ａｌ， Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ． ２００４， ８， ８８９−８９６）以上に以下の幾つかの利点を有する：
（ｉ）ワンポット合成、
（ｉｉ）工程の数の減少、
（ｉｉｉ）より高い転換率と収率、
（ｉｖ）酵素工程における有機溶媒の回避、
（ｖ）例えば糖中のヒドロキシル基のための保護／脱保護の方策は必要とされない、
（ｖｉ）軽度の反応条件：環境に優しい技術（水または水性媒体、中性ｐＨ）、
（ｖｉｉ）極端に優れた選択性：立体選択性−エナンチオ選択性、化学−配向選択性、
（ｖｉｉｉ）少数の副反応または副作用が無い：不純物プロファイル（減少した副産物含有量）、
（ｉｘ）廃棄物の総発生量の減少、
（ｘ）プロセス生産性
（ｘｉ）総生産コストの低減
【００６１】
その上、先行技術で使用される化学プロセス以上の本発明の生体触媒プロセスの他の追加の利点がある。特に関連があるのは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、メタノール、ヘプタンなどの、Ｂａｕｔａ ｅｔ ａｌ．の化学プロセスで使用される有機溶媒の本発明のプロセスにおける欠如である。これらの有機溶媒はすべて、環境への任意のプロセス廃棄物の排出前に取り除かれなければならない。本発明の手順に関するＩＬＥＸプロセスで補足的に不都合なのは（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｉｎｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）、ＩＬＥＸプロセスが、少なくとも３つの手順の工程を含む限り、本発明の単一のステップ−ワンポットプロセスに対して複雑であることである。一例としてＩＬＥＸプロセスとして先行技術で開示されたプロセスに関して、上に言及されたこれらの主要な違い及び利点によって、本発明の生体触媒プロセスは工業レベルで容易に実施され、それ故、結果として、医薬品部門においてＡＰＩとしてＮＡを生成するためのはるかにより競合的なプロセスをもたらす。
【００６２】
要約：一方では、ＮＡの工業生産用の先行技術において利用可能な化学プロセスは、本発明の生体触媒プロセスよりはるかに複雑である。他方では、ヌクレオシドの合成のための最先端技術で開示された生体触媒プロセスは、ＮＡ（特に工業規模で）またはＡＰＩであるＮＡではなく、研究室規模に、および自然発生のヌクレオシドに限定される。
【００６３】
本発明のプロセスで使用される天然または組み換えの酵素のソースは、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）または古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）の生物である。本発明のプロセスで使用されるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、一例として細菌、特にラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属から、または古細菌、特に、テルモフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）；ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）；ナトロノコッカス（Ｎａｔｒｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）；ナトリアルバ（Ｎａｔｒｉａｌｂａ）；ハロビフォーマ（Ｈａｌｏｂｉｆｏｒｍａ）；メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）；メタノメチロヴォラス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ）；メタノクレウス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ）；メタノスフェルラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒｕｌａ）；メタノハロビウム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ）；メタノサルサム（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ）またはメタノサエタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）、から選択される微生物から単離され得る。
【００６４】
本発明のさらに別の実施形態は、古細菌から単離された、核酸配列によってコード化されたアミノ酸配列を含む組み換え型ＮＤＴ酵素、またはそのフラグメントの開示されるプロセスにおける使用に関する。
【００６５】
本明細書の全体にわたって記載されるように、本発明のプロセスを実施するための好ましい実施形態の１つは、塩基転移のワンステップ−ワンポット反応を行うためのＮＤＴ酵素の生体触媒としての使用に基づく。好ましくは、ＮＤＴ酵素は、６０℃を超えて１００℃までの範囲の温度で、より具体的には、本明細書に記載される適切な反応条件で、核酸塩基転移のワンステップ−ワンポット反応を実行することができるＮＤＴ酵素活性をコード化する、そのフラグメントの遺伝子配列を含む、組み換え型の酵素である。
【００６６】
本発明のプロセスの異なる実施形態を実行するための適切な条件は、以下を含む：
ａ）１８℃−１００℃、好ましくは２０℃−１００℃の範囲、およびより好ましくは４０℃−１００℃、さらにより好ましくは５０℃−１００℃の範囲の温度
ｂ）１−６００時間の範囲の反応時間
ｃ）１−５００ｍＭの範囲の出発物質の濃度
ｄ）１：５から５：１までの化学量論的なヌクレオシドの出発物質：核酸塩基の範囲
ｅ）ＮＤＴ活性を有する酵素または０，００１−１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１−１０ｍｇ／ｍＬの範囲のＮＤＴ酵素の量
ｆ）随意に有機溶媒中に溶解される、反応媒体に加えられた遊離核酸塩基
ｇ）随意に適切な有機溶媒の４０％までをも含有している、水性反応媒体。好ましくは２０％まで、およびより好ましくは５％まで。
【００６７】
反応媒体に加えられる又は遊離核酸塩基を事前に溶解するために使用される好ましい有機溶媒は、好ましくはテトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）から選択される、極性の非プロトン性溶媒である。
【００６８】
本発明によるプロセスはまた、クロマトグラフィー、沈澱、ろ過、濃縮または結晶化から選択される標準的な操作手段によって生成されたＮＡの単離及び／又は精製の工程を含む。
【００６９】
本明細書の記載目的のために、組み換え酵素または組み換え型酵素という用語は、組み換えＤＮＡから生じるタンパク質または酵素として理解されるべきである。用語「組み換えＤＮＡ」は、通常はともに生じないＤＮＡ配列を組み合わせることによって作り出される、自然には存在しないＤＮＡの形態である。
【００７０】
本発明のプロセスは、具体的には、生成されるＡＰＩがクロファラビン（模式図２）であり、出発物質として使用される２’−デオキシリボヌクレオシドが２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジンであり、ＮＤＴ酵素によって転移される出発物質としても使用される核酸塩基が２−クロロアデニンであり、およびＮＤＴが、ラクトバチルス・デルブリッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（以前にはラクトバチルス・ライヒマニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）と呼ばれた）から単離された、自然発生のＮＤＴ酵素である、プロセスを包含する。
【００７１】
本発明のプロセスの実施形態の１つは、生成されるＡＰＩがクロファラビン（模式図２）であり、出発物質として使用される２’−デオキシアラビノヌクレオシドが、任意の適切な２’−フルオロ−アラビノ−タイプ、好ましくは２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジンであり、ＮＤＴ酵素によって転移される出発物質としても使用される核酸塩基が２−クロロアデニンである、実施形態を包含する。
【００７２】
本発明のプロセスの別の実施形態では、生成されるＡＰＩはシタラビンであり、出発物質として使用される２’−デオキシアラビノヌクレオシドは、アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジンであり、ＮＤＴ酵素によって転移される出発物質としても使用される核酸塩基は、シトシンである。
【００７３】
本発明のプロセスの別の実施形態では、生成されるＡＰＩは、ジドブジンの合成における中間体であり、出発物質として使用されるヌクレオシドは、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンであり、ＮＤＴ酵素によって転移される出発物質としても使用される核酸塩基は、チミンである。それ故得られるジドブジンの前記中間体は、例えば、トリフルオロメタンスルホニルアジドまたはイミダゾール−１―スルフォニルアジドなどの、無機アジドまたはアゾ転移の化合物（ａｚｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を使用する更なるアジ化工程を使用して、ジドブジンに容易に転換され得る第１アミン部分を含む。
【００７４】
同じ発明概念の部分を形成して、本記載はまた、上に記載される本発明のプロセスを実行することができる、組み換え型のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＮＤＴ）を開示する。前記天然または組み換えのＮＤＴ酵素は、好ましくはラクトバチルス・デルブリッキー（以前はラクトバチルス・ライヒマニ）またはラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）から選択される細菌；あるいは好ましくは、テルモフィルム・ペンデンス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓ）；ハロアーキュラ・シネイーンシス（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｓｉｎａｉｉｅｎｓｉｓ）；ナトロコッカス・アミロリティカス（Ｎａｔｒｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）；ナトリアルバ・フルンベイレンシス（Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ｈｕｌｕｎｂｅｉｒｅｎｓｉｓ）；ハロビフォーマ・ニトラティレデューセンス（Ｈａｌｏｂｉｆｏｒｍａ  ｎｉｔｒａｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）；メタノサルシーナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）；メタノメチロヴォラス・ホランディカ（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ  ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ）；メタノクレウス・ボアジェンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｂｏｕｒｇｅｎｓｉｓ）；メタノスフェルラ・パルストレス（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒｕｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｅｓ）；メタノハロビウム・エベスチガトゥム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）；メタノサルサム・ジルナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ  ｚｈｉｌｉｎａｅ）またはメタノサエタ・ハルンジナセア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、から選択される古細菌から単離され得る。
【００７５】
本発明の１つの好ましい実施形態では、ＮＤＴ酵素は以下から得られる：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるラクトバチルス・デルブリッキー（以前にはラクトバチルス・ライヒマニと呼ばれた）のヌクレオチド・コード化配列、または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の補体であるヌクレオチド配列、または
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １で縮重しているヌクレオチド配列、または
ｄ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の補体に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいはその補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １との少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素またはその機能部分をコード化する又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列、または
ｇ）ＮＤＴ活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２で示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列、さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００７６】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＮＤＴ酵素は以下から得られる：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３で示されるラクトコッカス・ラクチスのヌクレオチド・コード化配列、または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３の補体であるヌクレオチド配列、または
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３で縮重しているヌクレオチド配列、または
ｄ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３の補体に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいはその補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３との少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素またはその機能部分をコード化する又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列、または
ｇ）ＮＤＴ活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４で示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列、さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００７７】
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、ＮＤＴ酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５で示されるテルモフィルム・ペンデンスのヌクレオチド・コード化配列から得られるか、あるいは以下から得られる：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５の補体であるヌクレオチド配列、または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５で縮重しているヌクレオチド配列、または
ｃ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５の補体に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいはその補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５との少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素またはその機能部分をコード化する又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列、または
ｆ）ＮＤＴ活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６で示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列、さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００７８】
また、単一の発明に関連する概念を統合する同じ方針で、本記載はまた、ＡＰＩまたはその中間体の生成におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）の使用を開示し、それらのＡＰＩまたはその中間体、ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は、抗癌薬または抗ウイルス薬として有用である。より好ましくは、前に言及された使用は、前にも詳述された、ＡＰＩまたはその中間体としてのＮＡの生成プロセスおよびその変形によって達成される。特に、前に言及された使用に関連して、組み換えのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）は、ＡＰＩの生成に好ましく、ＡＰＩまたはその中間体、ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は、抗癌薬または抗ウイルス薬として特に有用である。
【００７９】
そのような使用によって生成されたＡＰＩまたはその中間体の中で、以下が見られ得る：
クロファラビン（Ｃｌ−Ｆ−ａｒａＡ）、デシタビン（ａｚａ−ｄＣｙｄ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、クラドリビン（Ｃｌ−ｄＡｄｏ）、フルダラビン（Ｆ−ａｒａＡ）、ネララビン（ＭＡＹ）、ジドブジン、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、β−チミジン、イドクスウリジン（ＩｄＵ）、トリフルリジン（ＴＦＴ）、アセドゥリド（ＥｄＵ）、リバビリン、ジダノシン（ｄｄＩ）およびペントスタチン。
【００８０】
より好ましくは、本明細書に開示される酵素の使用によって生成されたＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビン、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン、ザルシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ジドブジン、フロクスウリジンおよびペントスタチンから選択され、さらにより好ましくは、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンまたはその中間体から選択され、および、またさらにより好ましくは、記載された使用は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンの中間体の工業生産に特に向けられ、またさらに、クロファラビンまたはその中間体がより好ましく、クロファラビンもさらにより好ましい。
【００８１】
本発明に従って使用されるＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）活性を有する酵素は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５から選択される核酸配列または以下によってコード化される組み換えのＮＤＴ酵素を含む：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の補体であるヌクレオチド配列、または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で縮重しているヌクレオチド配列、または
ｃ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の補体に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいはその補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５との少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素またはその機能部分をコード化する又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列、または
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００８２】
また、本発明には、適切な宿主内でデオキシリボシルトランスフェラーゼの発現または過剰発現を配向する１つ以上の制御配列に操作可能に結合されたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）をコード化する配列を含む、組み換え発現ベクターが包含される。本発明に従う好ましい組み換え発現ベクターは、前記ＮＤＴの酵素活性をコード化する任意の運ぶ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）及び発現する又は過剰発現する遺伝子である。
【００８３】
本発明に従う好ましい組み換え発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５から選択される核酸配列、あるいは
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の補体であるヌクレオチド配列、または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で縮重しているヌクレオチド配列、または
ｃ）高い厳密性の条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の補体に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいはその補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５との少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、好ましくは、少なくともＮＤＴ酵素またはその機能部分をコード化する又はそれをコード化する配列に相補的である、ヌクレオチド配列、または
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、を運ぶ及び発現する又は過剰発現する。
【００８４】
本発明はまた、組み換え型ＮＤＴ酵素の生成または活性医薬成分（ＡＰＩ）またはその中間体の生成のいずれかのための、前に言及した組み換え発現ベクターの使用を包含し、これらのＡＰＩまたはその中間体、ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は、抗癌薬または抗ウイルス薬として特に有用である。特に、前述の使用によって生成されたＡＰＩまたはその中間体は、以下から選択される：クロファラビン（Ｃｌ−Ｆ−ａｒａＡ）、デシタビン（ａｚａ−ｄＣｙｄ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、クラドリビン（Ｃｌ−ｄＡｄｏ）、フルダラビン（Ｆ−ａｒａＡ）、ネララビン（ＭＡＹ）、ジドブジン、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、β−チミジン、イドクスウリジン（ＩｄＵ）、トリフルリジン（ＴＦＴ）、アセドゥリド（ＥｄＵ）、リバビリン、ジダノシン（ｄｄＩ）およびペントスタチン。
【００８５】
より具体的には、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビン、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン、ザルシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ジドブジン、フロクスウリジンおよびペントスタチンから選択され、さらにより好ましくは、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンから選択され、さらにより好ましくは、本明細書に記載される発現ベクターは、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンの中間体の工業生産に特に適している。またさらに、クロファラビンまたはその中間体がより好ましく、クロファラビンもさらにより好ましい。
【００８６】
より好ましくは、ＡＰＩまたはその中間体の生成のための前に言及した使用は、前にも詳述された、生成プロセスおよびその変形によって達成される。
【００８７】
本発明はまた、特に大腸菌であるときの、前に記載された、組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を包含する。同じ発明の単一の関連する概念の一部として含まれる、前に記載されたような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞の使用も、組み換えＮＤＴの生成のために熟慮される。同様に、活性医薬成分（ＡＰＩ）またはその中間体の生成のための、前に記載されたような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞の使用も、本発明の一部である（それらのＡＰＩまたはその中間体、シトシンヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は、抗癌薬または抗ウイルス薬として有用である）。特に、前に記載されるように組み換え発現ベクターを含む宿主細胞は、以下から選択されるＡＰＩまたはその中間体を生成するために使用される：クロファラビン（Ｃｌ−Ｆ−ａｒａＡ）、デシタビン（ａｚａ−ｄＣｙｄ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビダラビン（ａｒａＡ）、ブリブジン、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、クラドリビン（Ｃｌ−ｄＡｄｏ）、フルダラビン（Ｆ−ａｒａＡ）、ネララビン（ＭＡＹ）、ジドブジン、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、β−チミジン、イドクスウリジン（ＩｄＵ）、トリフルリジン（ＴＦＴ）、アセドゥリド（ＥｄＵ）、リバビリン、ジダノシン（ｄｄＩ）およびペントスタチン。
【００８８】
より好ましくは、前に記載された、組み換え発現ベクターによって形質転換された、本発明の宿主細胞を使用して生成された、ＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビン、ビダラビン、ブリブジン、エノシタビン、ザルシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、ジドブジン、フロクスウリジンおよびペントスタチンから選択され、さらにより好ましくは、生成されるＡＰＩまたはその中間体は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンから選択され、さらにより好ましくは、本明細書に記載される宿主を形質転換した細胞は、クロファラビン、シタラビンおよびジドブジンの中間体の工業生産に特に適しており、またさらに、クロファラビンまたはその中間体がより好ましく、クロファラビンもさらにより好ましい。
【００８９】
より好ましくは、前に言及された使用は、以前に詳述された、ＡＰＩまたはその中間体としてのＮＡの生成プロセスおよびその変形によって達成される。
【００９０】
実施例１．ラクトバチルス・デルブリッキー亜種、ラクチス（ｌａｃｔｉｓ） ＤＳＭ ２００７２からのＮＤＴのクローニングおよび発現
クローニング。
（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＧＤ２７０１２．１における）ラクトバチルス・デルブリッキー亜種、ラクチスからＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子を、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種、ラクチス ＤＳＭ ２００７２のゲノムＤＮＡからポリマー鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｌＩを使用して、遺伝子を、発現ベクター：ｐＥＴ２２ ｂ（＋）のポリリンカー領域へとクローニングした。
【００９１】
使用するプライマーを、５’−末端で適切な修飾とともに設計した（配列を参照）：
Ｌｄｎｄｔ２ ｆｗ：５’−ＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１９）
Ｌｄｎｄｔ２ ｒｖ：５’−ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＧＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．２０）
【００９２】
ヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼ配列に対する対応する遺伝子を、対応するフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）およびリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）のオリゴヌクレオチドとともに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１９およびＮｏ．２０）。増幅した０．−ｋｂ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクターへと挿入した。クローニングした領域を、完全に配列決定し、それは、データバンク配列と同じであることが分かった。インサートＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、その後、同じ制限酵素を用いて消化したｐＥＴ−２２ｂ（＋）の発現ベクターへと結紮させた。
【００９３】
ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）生成物を、化学的に適格性の大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。陽性のプラスミドを、選択し、続いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）の化学的に適格性の細胞に形質転換した。
【００９４】
ラクトバチルス・デルブリッキー亜種、ラクチスからのＮＤＴの発現および精製
組み換えプラスミドを有する大腸菌株を、０．５のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで、アンピシリン（１００μｇ ｍｌ−１）を補足したＬＢ培地中で好気的に成長させた。タンパク質の過剰発現を、４時間３７℃で０．５ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌培養液を誘発することによって達成した。細菌細胞を、２０分間４，０００ｘｇで４℃で遠心分離によって採取した。採取した細胞を、１リットルの細胞培養液から収集した細胞のための２０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ）中で再懸濁した。細胞懸濁液を、音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０）を使用して溶解した。ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ．１によってコード化され、ＮＤＴ活性を有している、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ．２に対応する酵素を得るために、４５分間１３０００ｘｇでの遠心分離によって細胞溶解液（上清）を得た。
【００９５】
実施例２：ラクトコッカス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＮＤＴのクローニングおよび発現。
クローニング。
（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００６２８４における）ラクトコッカス・ラクチス亜種、ラクチスからＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子を、ラクトコッカス・ラクチス亜種、ラクチスのゲノムＤＮＡからポリマー鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。遺伝子を、制限部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、発現ベクター：ｐＥＴ２２ ｂ（＋）のポリリンカー領域へとクローニングした。
【００９６】
使用するプライマーを、５’−末端で適切な修飾とともに設計した（配列を参照）：
Ｌｌａｃ ｆｗ：５’−ＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＡＴＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１７）
Ｌｌａｃ ｒｖ：５  ’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＡＴＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１８）
【００９７】
ヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＮＤＴ）配列に対する対応する遺伝子を、フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドとともに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１７およびＮｏ．１８）。増幅した０．５−ｋｂの生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクターへと挿入した。クローニングした領域を、完全に配列決定し、それは、データバンク配列と同じであることが分かった。インサートＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後、同じ制限酵素を用いて消化したｐＥＴ−２２ｂ（＋）の発現ベクターへと結紮させた。
【００９８】
ライゲーション生成物を、化学的に適格性の大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。陽性のプラスミドを、選択し、続いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）の化学的に適格性の細胞に形質転換した。
【００９９】
ラクトコッカス・ラクチス亜種、ラクチスからのＮＤＴの発現および精製。
組み換えプラスミドを有する大腸菌株を、０．５のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで、アンピシリン（１００μｇ ｍｌ−１）を補足したＬＢ培地中で好気的に成長させた。タンパク質の過剰発現を、４時間３７℃で０．５ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌培養液を誘発することによって達成した。細菌細胞を、２０分間４，０００ｘｇで４℃で遠心分離によって採取した。採取した細胞を、１リットルの細胞培養液から収集した細胞のための２０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ）中で再懸濁した。細胞懸濁液を、音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０）を使用して溶解した。細胞溶解液（上清）を、４５分間１３０００ｘｇで遠心分離によって得た。
【０１００】
実施例３：テルモフィルム・ペンデンス（Ｔ．ｐｅｎｄｅｎｓ）からのヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼのホモログ酵素のクローニングおよび発現。
大腸菌ＮＤＴの構成および形質転換
クローニング
配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）を、ＧｅｎＢａｎｋから回収し（補体の株（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ））、それは、テルモフィルム・ペンデンス Ｈｒｋ ５ 染色体からのもであった。Ｔｐｅｎ＿００１７遺伝子座（ＮＣ＿００８６９８， Ｖｅｒｓｉｏｎ： ＮＣ＿００８６９８．１， Ｒｅｇｉｏｎ： １４９００．．．１５３３１）を、テルモフィルム・ペンデンス Ｈｒｋ ５（ＤＳＭ ２４７５）ゲノムＤＮＡからポリマー鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。全長００１７遺伝子を、タグなしでクローニングし、随意にＣ−Ｈｉｓ６−タグ付きの融合タンパク質またはＮ末端のＨｉｓ６−タグ付きの融合タンパク質のいずれかとしてクローニングした。
【０１０１】
制限部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩまたはＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用して、遺伝子を、発現ベクター：ｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯまたはｐＥＴ２２ ｂ（＋）のポリリンカー領域へとクローニングした。
【０１０２】
使用するプライマーを、５’−末端で適切な修飾とともに設計した（配列を参照）：
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．７）Ｔｐｅｎ＿００１７＿Ｆｏｒ：５’−ｃａｔａｔｇａａｇｇｔｃｔａｃｃｔｇｇｃｇ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．８）Ｔｐｅｎ＿００１７＿４Ｒｅｖ：５’−ｇａａｔｔｃｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｃｔａｃｃ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．９）Ｔｐｅｎ＿００１７＿Ｆｏｒ：５’−ｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｃｔａｃｃｔｇｇｃｇｇ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１０）Ｔｐｅｎ＿００１７＿ＲｅｖＩ：５’−ｔｃａｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｃｔａｃｃ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１１）Ｔｐｅｎ＿００１７＿ＲｅｖＩＩ：５’−ｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｃｔａｃｃｔｇ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１２）Ｔｐｅｎ＿００１７＿Ｒｅｖ：５’−ｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１３）Ｔｐｅｎ＿００１７＿２Ｒｅｖ：５’−ｃｔｃｇａｇｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｔｃａ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１４）Ｔｐｅｎ＿００１７＿３Ｒｅｖ：５’−ｇａａｔｔｃｔｃａｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｔｃ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１５）Ｔｐｅｎ＿００１７＿４Ｒｅｖ：５’−ｇａａｔｔｃｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｔｃａｃｃ−３’
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１６）Ｔｐｅｎ＿００１７＿５Ｒｅｖ：５’−ｇｇａａｔｔｃｃｇｃｔｔｇｃａｔｇｔｃａａｃｇｃｔａｃｃ−３’
【０１０３】
開始シグナルを大腸菌の用途に適応させる（ＧＴＧからＡＴＧ）ために、フォワードプライマーを設計した。
【０１０４】
Ｔｐｅｎ＿００１７配列に対する遺伝子を、フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドとともに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７からＮｏ．１６）。増幅したフラグメントを、容易なｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙにおいてサブクローニングし、その後、アンピシリン抵抗性遺伝子を運ぶｐＥＴ２２ ｂ（＋）ベクターのポリリンカー領域へと消化し、クローニングした。クローニングした領域を、完全に配列決定し、それは、データバンク配列と同じであることが分かった。
【０１０５】
ライゲーション生成物を、化学的に適格性の細胞、大腸菌ＴＯＰ １０ 細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。陽性のプラスミドを、選択し、続いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）の化学的に適格性の細胞に形質転換した。
【０１０６】
テルモフィルム・ペンデンスからのＮＤＴの発現および精製
組み換えプラスミドを有する大腸菌株を、０．５−０．８のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで、アンピシリン（１００μｇ ｍｌ−１）を補足したＬＢ培地中で成長させた。タンパク質の過剰発現を、４時間３７℃で１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌培養液を誘発することによって達成した。細菌細胞を、２０分間４，０００ｘｇで４℃で遠心分離によって採取した。採取した細胞を、１リットルの細胞培養液から収集した細胞のための２０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ）中で再懸濁した。細胞懸濁液を、音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０）を使用して溶解した。細胞溶解液（上清）を、２０分間１３０００ｘｇで遠心分離によって得た。抽出液（上清）を、−８０℃で保存した。
【０１０７】
実施例４：Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼのアッセイ
活性アッセイを、５０ｍＭのＭＥＳ（モルホリンエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．５）中で４０℃で行った。これらの条件下では、１０ｍＭのアデニンおよび１０ｍＭの２’−デオキシウリジンの溶液を、１０分の間インキュベートした。その後、酵素を、２４０μｌの最終容量まで加え（２．０４μｇの精製した酵素または３０μｌの細胞抽出液）、反応を５分の間進めたままにした。反応を、氷浴中で２４０μＬの冷たいＭｅＯＨを加えることによってクエンチし、５分間９５℃でさらに加熱した。サンプルを、２分間９７００ｒｐｍで遠心分離にかけ、上清を水で１／２に希釈した。希釈した分割量を、０．４５μｍの親水性フィルターを介して、およびその後１０ＫＤａの限外濾過膜を介してろ過した。
【０１０８】
サンプルを、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの勾配溶出条件、１ｍｌ／分の流量の下で、４０℃でＴｒａｃｅｒ Ｅｘｃｅｌ Ｃ１８（Ｔｅｋｎｏｋｒｏｍａ、５ μｍ、２５ ｘ ０．４６ｃｍ）での高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を使用して、分析した。検出を少なくとも２５４ｎｍで行った。
【０１０９】
定量化を、同じ条件下で溶出した２’−デオキシアデノシンの標準溶液に従って、放出された塩基の計算を介して行った。酵素活性は、
（１）ｕｎｉｔ・ｍｇ タンパク質−１（２’−デオキシアデノシン−ｍｉｎ−１・ｍｇ−１のμｍｏｌｅｓ）としての比活性度（Ｓｐ ａｃｔ）
（２）ｕｎｉｔ・ｍｌ−１（２’−デオキシアデノシン−ｍｉｎ−１・ｍｌ−１のμｍｏｌｅｓ）としての酵素活性、のいずれかとして表わされ、
ここで、酵素活性の１つの単位を、本明細書に記載される標準条件下で１分当たり１μｍｏｌの生成物を生成するのに必要とされる酵素の量として定義した。
【０１１０】
実施例５：４．５Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用する水性溶媒中のクロファラビン生成
ｐＨ６．５での水性緩衝液（４２ｍｌ）中の２０ｍＭの２−クロロアデニン（０．１４２ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）および２０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（０．２０６ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｅｄ）。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（４．５Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．４２２ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも１０日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、塩基性のｐＨ条件および濃度下で部分的に沈殿させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物は、随意に、水または適切な無極性溶媒と組み合わされて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化または再結晶化されてもよい。
【０１１１】
実施例６：１．７８Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用する水性溶媒中のクロファラビン生成
ｐＨ６．５での水性緩衝液（４２ｍｌ）中の５０ｍＭの２−クロロアデニン（０．３５６ｇ、２．１ｍｍｏｌ）および５０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（０．５１７ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（１．７８Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．４２２ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも１０日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、塩基性のｐＨ条件および濃度下で部分的に沈殿させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物は、随意に、水または適切な無極性溶媒と組み合わされて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化または再結晶化されてもよい。
【０１１２】
実施例８：０．９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用する有機溶媒を含有している水性緩衝液中のクロファラビン生成
ｐＨ６．５での水性緩衝液と５％のＴＨＦ（反応容量３ｍｌ）の混合物中の２０ｍＭの２−クロロアデニン（１０．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）および２０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（１４．８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．０８８ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも５日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、塩基性のｐＨ条件および濃度下で部分的に沈殿させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物は、随意に、水または適切な無極性溶媒と組み合わされて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化または再結晶化されてもよい。
【０１１３】
実施例９：０．９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用する水性溶媒中のクロファラビン生成。
ｐＨ６．５での水性緩衝液（４２ｍｌ）中の１００ｍＭの２−クロロアデニン（０．７１２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）および１００ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（１．０３４ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．４２２ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも１０日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、塩基性のｐＨ条件および濃度下で部分的に沈殿させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物は、随意に、水または適切な無極性溶媒と組み合わされて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化または再結晶化されてもよい。
【０１１４】
実施例１０：１２．８Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するクロファラビン生成。
ｐＨ６．５での水性緩衝液（２Ｌ）中の１０ｍＭの２−クロロアデニン（３．４７ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）および１０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（５．０ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（１２．８Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．６４２ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも３日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１１５】
実施例１１：１．２Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するクロファラビン生成
ｐＨ６．５での水性緩衝液（０．３５Ｌ）中の５０ｍＭの２−クロロアデニン（３．０３ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）および５０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（４．４ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（１．２Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ、０．３７ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも４日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１１６】
実施例１２：９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するクロファラビン生成。
ｐＨ６．５での水性緩衝液（４２ｍｌ）中の１０ｍＭの２−クロロアデニン（０．０６ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）および１０ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）（０．０９ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（９Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１１７】
実施例１３：１．１Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するクロファラビン生成
水性のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を含有しているアンモニウム中の５ｍＭの２−クロロアデニンおよび５ｍＭの２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン（ａｒａＦ）の懸濁液を、２５分の間２５℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を、滴下で加え（１．１Ｕ／μｍｏｌａｒａＦ）、反応物を、同じ条件で少なくとも４日の間２５℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１１８】
実施例１４：０．０６Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するジドブジン中間体の生成
水性の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中の１ｍＭのチミンおよび１ｍＭの３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの懸濁液を、２０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．０６ｍｇ／μｍｏｌｂａｓｅ，）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１１９】
実施例１５：０．１４Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素および６０ｍＭのチミンを使用するジドブジン中間体の生成
水性の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中の６０ｍＭのチミンおよび６０ｍＭの３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの懸濁液を、２０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．１４ｍｇ／μｍｏｌｂａｓｅ，）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１２０】
実施例１６：０．０７Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するジドブジン中間体の生成
水性の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中の１００ｍＭのチミンおよび１００ｍＭの３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの懸濁液を、２０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．０７ｍｇ／μｍｏｌｂａｓｅ，）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１２１】
実施例１７：０．１４Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素および８０ｍＭのチミンを使用するジドブジン中間体の生成
水性の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中の８０ｍＭのチミンおよび８０ｍＭの３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの懸濁液を、２０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．１４ｍｇ／μｍｏｌｂａｓｅ，）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【０１２２】
実施例１８：０．０８５Ｕ／μｍｏｌａｒａＦでＮＤＴ酵素を使用するシタラビン生成
水性の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中の１ｍＭのシトシンおよび１ｍＭの１−（Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシルの懸濁液を、３０分の間５０℃でサーモスタット処理した。その後、ＮＤＴ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、滴下で加え（０．０８５ｍｇ／ｍｌ）、反応物を、同じ条件で少なくとも１日の間５０℃で撹拌した。その後、懸濁液を熱ろ過し、固形物を、洗浄し、乾燥させた。水性のろ液を、部分的に濃縮し、冷却し、ろ過した。回収した固形物を、部分的に沈殿および濃縮させた。一旦ろ過され、洗浄されると、固形物を、水または適切な無極性溶媒と組み合わせて、極性のプロトン性溶媒または極性の非プロトン性溶媒などの適切な溶媒を使用して、結晶化した。
【配列表】
2016518838000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月16日(2015.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性医薬成分（ＡＰＩ）又はその中間体を生成するための生体触媒プロセスであって、該プロセスは、好ましくはワンステップ／ワンポットの反応で行なわれ、ここで、該反応は、適切な反応水性媒体において、及び適切な反応条件下で、出発物質の混合物への、天然又は組み換え型のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＮＤＴ）活性を持つ酵素の追加を含み、前記出発物質の混合物は、
ｉ）２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’−デオキシウリジン、１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル、又は３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの、少なくともヌクレオシド、Ｄ異性体、及び
ｉｉ）それぞれ２−クロロアデニン、シトシン、又はチミンである、ＮＤＴ活性を持つ酵素によって転写される、少なくとも遊離核酸塩基
を含み、
ここで、生成されたＡＰＩ又はその中間体は、クロファラビン、シタラビン、及びジドブジンから選択される
ことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
生成されたＡＰＩ又はその中間体はクロファラビンである、ことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
ＮＤＴ活性を持つ酵素は、ラクトバチルス・デルブリッキーから単離されたＮＤＴである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
ＮＤＴ活性を持つ酵素は、ラクトコッカス・ラクチスから単離されたＮＤＴである、ことを２特徴とする請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項５】
ＮＤＴが、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるラクトバチルス・デルブリッキーのヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列
から得られる、ことを特徴とする請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
ＮＤＴが、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるラクトコッカス・ラクチスのヌクレオチド配列；又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列
から得られる、ことを特徴とする請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れかに記載のプロセスに従う、ＡＰＩ又はその中間体の生成におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を持つ組み換え酵素の使用であって、ＡＰＩ又はその中間体は、クロファラビン、シタラビン、及びジドブジンから選択される、抗癌薬又は抗ウイルス薬として特に有用なヌクレオシドアナログ（ＮＡ）であり、ここで、前記組み換え酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列を含む核酸配列；或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列によりコード化されることを特徴とする、使用。
【国際調査報告】
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