(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する標的核酸分子を定量的に分析する方法において、
標的核酸分子を含む生物学的試料と、該標的核酸分子における相互に離間した２つの塩基配列領域に対してそれぞれ相補的な塩基配列を有する第１および第２のプライマ分子とを含んだ混合液を、ハイブリダイゼーション反応および核酸増幅反応が達成される状態に維持する増幅工程であって、前記第１および第２のプライマのいずれか一方は光学的に測定可能な標識分子で標識されており、少なくとも該標識されたプライマの数は既知であり、且つ前記第１および第２のプライマの混合比率は、非対称な核酸増幅が達成されるように、前記標識分子で標識されたプライマの混合数が他方のプライマの混合数よりも少ないように選ばれる増幅工程と、
少なくとも１回の増幅工程を実行した上記混合液の少なくとも一部を用いて、前記標識分子に関する測定データを得るために、共焦点光学系により形成された３次元的な微小視野にて個々の光学的に測定可能な標識分子の挙動に依存した複数時点での測定データを得る測定工程と、
上記測定データを位置的変化に応じた統計学的データに変換し、この統計学的データに基づいて試料中に含有される標的核酸分子の個数を決定する決定工程、
を有することを特徴とする標的核酸の定量分析方法。
【請求項２】
前記２種類のプライマの混合比率が、１：０．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記統計学的データが、自己相関関数を用いて演算される工程を含む事を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程が、標識分子の液体中のゆらぎ運動を測定するものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識分子が蛍光色素を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光色素が、前記ハイブリダイゼーション反応により前記標的核酸とのハイブリッド体に取込まれたときに蛍光特性が変化するものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光色素が、ローダミン、アクリジンオレンジ、チアゾールイエロー、オキサゾールイエローから選ばれることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記測定工程が、単一フォトンを計測するための測定モードにより実行されることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する核酸分子を検出する技術に関し、特に、核酸増幅反応を用いて標的核酸分子を特異的に検出する方法に関する。本発明は、単一の核酸分子に関する測定データが得られるような検出方法に適用される。従って、本発明は、標的核酸分子の個数に関係した情報を得る任意の目的に、有効に適用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の検出と分子量の測定は、生化学や分子生物学の研究において最も重要な分析手段である。また、最近では、遺伝子診断や遺伝子治療においても重要な分析手段となっている。例えば、遺伝子増幅法として非常に重要なＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）法においては、その増幅した遺伝子の最終的な検出は、ゲル電気泳動法を用い、鎖長（分子量）毎の分画に分離した後に、特定位置の分画の有無を測定している。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、複製を開始するためのプライマと、複製時のタンパク源としての四種類のＤＮＡ基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）が存在する時、一本鎖ＤＮＡを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）にして、相補鎖 を合成して二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を形成することが知られている。ここで、基質の一部に蛍光分子で標識したヌクレオチドであるＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ｄＵＴＰ（Ｒｈｏ−ｄＵＴＰと略す）を加えておくと、これも一緒に取込まれて、蛍光標識されたｄｓＤＮＡを合成することができる（Ｖｏｓｓ，Ｈ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３、３０−３４，１９９４）。
【０００４】
ＰＣＲ法は、通常２種類のプライマ（第１プライマ、第２プライマ）を用いるので、これら第１および第２プライマが等量ではないとき、少ない方のプライマがＰＣＲサイクル中に消費し終わると、以後のＰＣＲサイクルでは、一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が毎回生成される。このように、ＰＣＲ用の一対のプライマの個数比率が１対１でない場合に展開されるＤＮＡ増幅過程を、非対称ＰＣＲ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）と呼ぶ。非対称ＰＣＲによって得られたｓｓＤＮＡは、塩基配列を決定するために有効に利用できる。
【０００５】
ＰＣＲ法において、増幅されたｄｓＤＮＡの総量は、適宜の容器中またはプレート上の検液全体が放つ蛍光総量として蛍光計測計により測定される。こうして測定された蛍光総量は、充分に増幅された後の標的ＤＮＡに相当する。しかし、ＰＣＲにおける増幅反応は、相反する温度条件下での反応過程、即ち、ｄｓＤＮＡを二本の分かれたｓｓＤＮＡに分離するように変性させるために高温下に試料を置く昇温段階と、ｓｓＤＮＡを上述した１対のプライマとハイブリダイズさせるために温度を下げる降温段階とを含んでいるので、増幅の様子を定量的に追跡することは困難である。従って、従来のＰＣＲ法では、標的核酸の増幅中または増幅前の総量を定量的に解析することは不可能であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述した核酸検出方法の実態に鑑み、標的核酸分子の存在量を正確に定量する検出方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、ＰＣＲ法における増幅反応を定量的に測定できる方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、少ないコピー数でも定量できる核酸分子の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、微量の試料でも標的核酸分子の有無を検出できる方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、ＰＣＲにおける増幅過程を分子レベルで知ることができる、核酸分子の測定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段および作用効果】
本発明は、試料中に存在する標的核酸分子を検出する方法において、 少なく とも１塩基以上の標的核酸分子に相補的である第１および第２のプライマ分子を、核酸分子を含む生物学的試料と混合する工程、ここで、第１プライマ分子は第２プライマ分子よりも少ない混合比率であり、少なくとも第１プライマ分子は測定可能な標識分子により標識されている、標的核酸分子と第１、第２プライマとを、核酸増幅が達成されるようにハイブリダイゼーション反応が可能な状態に維持する増幅工程、増幅工程中の混合液を、標識分子の時間的な位置変化を得るように微小視野において顕微鏡的に測定する工程、複数の測定データを時間変化のばらつきに応じた統計学的データに変換する工程、統計学的データに基づいてハイブリダイゼーション反応の反応曲線を得る工程、ここで、反応曲線の立ち上がりの高さが核酸分子の個数を表している、を有していることを特徴とする核酸配列の増幅反応を用いた標的核酸の検出方法である。
【０００８】
本発明では、第１のプライマおよび第２のプライマの混合比率は、等量でないので、非対称ＰＣＲが行われる。非対称ＰＣＲの結果は、ＰＣＲにおける定量的な反応解析を実現するという画期的な作用効果をもたらす。従って、本発明の方法によれば、ＰＣＲの増幅途中または増幅前の標的核酸分子を高精度に検出することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で実施される非対称ＰＣＲは、第２のプライマの分量を第１のプライマよりも少なく設定しするとともに、第２のプライマが光学的に測定可能な標識分子で標識されていることが重要である。この第１および第２のプライマの分量は、少なくとも１回の増幅反応が、過剰な標識分子の下で標的核酸分子とハイブリダイズするように下限値を設定するのが好ましい。また、図１において本発明に係わる非対称ＰＣＲの概念図のように、第２のプライマの数量（図１では、１個の標的核酸分子に対して５個の第２プライマおよび過剰量の第１プライマからなる混合比率で混合した場合）は、非対称ＰＣＲにおけるハイブリダイズ反応の許容回数を決定する要素となる。
【００１０】
非対称ＰＣＲによる増幅反応サイクルは、標的核酸を多量に含む試料でさえ、１回以上の増幅が、第２プライマが不足することなく、完全に実行される必要がある。本発明の方法は、標的核酸が少量でも検出できるので、試料含有液を少なくすることで、第２プライマのさらなる節約が可能となる。第２プライマに要求される数量は、ＰＣＲに付す試料中において自然条件で出現し得る最大量の標的核酸分子について、１回以上のＰＣＲを完了できるよに統計的に決定すればよい。従って、同量の第２プライマを用いて、種々の数量の標的核酸分子との増幅反応を実行すると、試料中に標的核酸分子が少量であればあるほど、許容回数に達するまで、即ち、第２プライマが完全に消費されるまで、ＰＣＲサイクルを繰り返す必要が有る。従って、第２のプライマの数量は、測定に付された試料中にたった１個の標的核酸が存在する場合でも、適当な回数のＰＣＲサイクルで第１プライマが消費されるように、設定するのが好ましい。図１からも判るように、第２プライマの数量と試料含有液中の標的核酸の数量とは、非対称ＰＣＲにおいて増幅反応が飽和状態（プラトー）に達するまでに要する時間もしくはＰＣＲサイクル数に影響する。
【００１１】
有効回数のＰＣＲサイクルを経た試料含有の混合液の少なくとも一部は、定量的に分取されるか容器その他に収容されたまま、適宜の測定に付す。ここで、測定手法は、増幅に伴う標識分子の大きさ変化に関する測定を行うものであれば、適宜選択してよく、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、蛍光計測用フローサイトメータ、イメージサイトメータ、蛍光顕微鏡等が有効に利用できる。測定工程が、３次元の微小視野内において実行されることにより、標的分子の試料含有液の中における自由な微小運動を、ＰＣＲ反応の結果に応じた自然状態のままで高精度に測定できる。これに対して、２次元的な視野内で測定すると、ブラウン運動のように、標識分子の３次元的に自由な移動をもれなく捕らえることができないので、測定精度が低い。微小視野を形成するに当たっては、ハロゲンランプからの光を収束させたり極微小の平均半径からなるアパーチャーまたはピンホールに通すことによって得ることもできるが、レーザ光線による収束光を利用するのが好ましい。
【００１２】
測定工程の微小視野が、共焦点光学系により形成されることにより、被写界深度の深い測定データが得られるので、個々の任意の標識分子が視野内で常に合焦して正確な位置および出力データを測定手段に供給することができる。
【００１３】
微小視野が、焦点付近の回折限定領域であることにより、個々の標識分子を高いＳ／Ｎ比で測定できる。
【００１４】
回折限定が平均直径１５±５μｍのピンホールにより形成されることにより、少数の選ばれた標識分子からの測定データを効率良く得ることができる。
【００１５】
微小領域が平均半径２００±５０ｎｍおよび光軸上の平均長さ２０００±５００ｎｍの略円柱状領域であることにより、測定視野内に照準された標識分子に関する自由な微小運動を効率良く取得することができる。
【００１６】
本発明では、微小の測定視野内を出入りする標識分子の運動速度を、所定空間内において１以上の個々の標識分子から測定される出力強度の増減または消出を指標として測定している。従って、第２のプライマを標識する標識分子の種類は、複数の測定時点において、ほぼ一定の出力を維持するような標識材料であるのが好ましい。このような標識分子の材料としては、発光性物質、蛍光性物質、磁性物質、放射性物質その他が挙げられる。特に、発光性物質と蛍光物質は、長時間、発光または蛍光を発するような色素を選ぶのが好ましい。標識分子として、発光色素や蛍光色素を有するものを使用すれば、光学的に容易な構成で分子レベルの測定を実行できる。蛍光色素の中では、特に、核酸分子同士の相補的な結合の際に、その相補的結合部分にインターカレートすることによって遊離時とは蛍光特性が変化するものであればよい。インターカレートに伴い蛍光特性が変化する蛍光色素としては、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミンが挙げられる。
【００１７】
測定工程が、蛍光分子の位置変化を測定する場合には、フォトマルチプライヤやフォトダイオード等の蛍光測定手段により蛍光データを受光することができる。蛍光測定手段は、単一フォトンを計測し得るような測定モードを備えている方が、蛍光分子に関する個別の測定を行うのに有利である。
【００１８】
測定工程が、標識分子の液体中のゆらぎ運動を測定するものである場合には、本発明を更に有効な実施形態とすることができ、個々の標的分子の微小運動を正確に測定することができる。ゆらぎ運動の測定を行うに当っては、自己相関関数（Ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて演算するのが好ましい。特に、標識分子として、蛍光を用いる場合には、自己相関蛍光分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、略してＦＣＳ）を採用するのが好ましい。ＦＣＳを用いた生物学的材料に関する測定データの演算手法は、標識された核酸プローブと標的核酸分子とのハイブリダイゼーション反応においてＦＣＳを利用した報告（Ｋｉｎｊｏ，Ｍ．、Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３、１７９５−１７９９、１９９５）を参照することができる。
【００１９】
ＦＣＳを用いたＰＣＲの定量の可能性は、発明者自身が、等量の２種のプラ イマを用いた場合において、複製のタンパク源としての塩基であるｄＵＴＰに蛍光分子を標識して、ＰＣＲを行った所、少ないＰＣＲサイクルでも標的核酸分子の検出が可能となることを発見した。しかし、この発見した方法は、蛍光測定の前に、標的核酸分子に結合しなかった蛍光分子を除去する工程が必要であった。そこで、発明者は、ＰＣＲ法により、未結合の標識分子を除去することなく、標的核酸分子を定量できる新たな方法をさらに突き止めた。
【００２０】
ＦＣＳを実施する装置の概略は、図２に示す。このＦＣＳ装置は、共焦点光学系を用いた倒立型の蛍光顕微鏡１と試料からの蛍光を測定するためのフォトマルチプライヤ２と測定データを受信して自己相関関数による演算を行って数値化またはグラフ化を行うデータ処理装置３と、演算結果を画面上に表示する表示装置４とを備えている。
【００２１】
試料含有液１１は、図２に示す通り、試料台１２に載せたスライドガラス１ ３上に点着させることで、簡単にセットできる。この装置では、特に、微量の試料含有液１１を用いるため、水分の蒸発を防止するための蓋１４をスライドガラス１３上にかぶせてある。この蓋１４は、好ましくは、光透過性がなるべく低いものを用いることで、気密性と遮光性を同時に得られる。但し、蓋の内面は、励起光線の反射を防止するように、できるだけ光反射性の低いものを使用するのが好ましい。試料含有液１１が位置するスライドガラス１３部分の真下には、試料含有液１１中で焦点を結ぶように設定した対物レンズ１５が配置している。なお、蛍光顕微鏡１は、落射型でもよい。落射型においては、対物レンズ１５のレンズ下面に直接的に試料含有液１１を点着してもよい。また、蛍光顕微鏡１の光源であるレーザ発生装置１６は、図２ではアルゴン（Ａｒ）イオンレーザーを使用しているが、蛍光の種類に応じて、クリプトンアルゴン（Ｋｒ−Ａｒ）イオンレーザー、ヘリウムネオン（Ｈｅ−Ｎｅ）レーザー、ヘリウムカドニウム（Ｈｅ−Ｃｄ）レーザー等に種々変更して構わない。また、蛍光顕微鏡１におけるスライドガラス１３の搬入や搬出、スライドガラス１３等への試料含有液の点着、蓋１４の開閉等の各種動作は、必要に応じて適宜自動化してもよい。
【００２２】
図３は、図２の蛍光顕微鏡１の測定部分を示す拡大図である。図３（Ａ）において、スライドガラス１３と所定の開口数（図ではＦＡ＝１．２）の対物レンズ１５との位置関係により、微小視野領域２０が形成される。この微小視野領域２０は、図３（Ｂ）に示すように、実際には、ボリュームを持ったレーザ光線の焦点（図では中間のくびれた部分）から上下に伸びた略円柱状の視野を有している。この視野領域２０は、焦点を基準位置として、光軸上の長さＺと平均半径Ｗにより規定される。このような、微小領域２０における蛍光測定は、蛍光分子の微小運動を追跡し得る最小限の領域にまで小さくすることにより、試料含有液１１中の焦点付近以外の蛍光分子に由来するノイズを有効に除去し、１個づつの蛍光分子を正確に測定するのに寄与している。
【００２３】
本発明は、上述した種々の実施の形態に基づき、遺伝病診断、親子鑑定、犯罪調査、遺伝子治療、分子生物学的研究、医薬品開発等に応用可能である。上述した実施の形態についても、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、変更可能な発明を包含する。例えば、上述した実施の形態では、測定装置として、蛍光顕微鏡の試料台にて、顕微鏡観察時と同じ環境下で測定可能なものを説明したが、欧州公開特許第６４０８２８Ａ１号に開示している装置を改良し、サーマルサイクラーの内部の試料含有液に対して、対物レンズから出射するレーザ光をフォーカシング可能となるように光学的に設計すれば、試料含有液をスライドガラス上に移すことなく、増幅反応を連続的に測定できる。また、ＰＣＲサイクルにおける経過時間内の複数データの取り方は、所定サイクル後の一定時間内に継続的または断続的に複数得る場合と、異なるサイクル毎に適当数の測定データを得る場合の何れもあり得る。
【００２４】
以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限定される ことなく、発明の主旨に基づいて、本発明の出願時の技術水準に応じて自明な範囲における種々の変更が可能である。
【００２５】
【実施例】
Ｒｈｏ−プライマによる５００ｂｐＤＮＡの増幅量及びＦＣＳ測定で算定した蛍光分子の総数
（１）非対称ＰＣＲの実施
プライマの準備とＰＣＲ用の混合液の調製
２種類の非標識のプライマ（プライマ１；５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧ−３’、プライマ２；５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣ−３’、北海道システムサイエンス製）と、これらプライマを蛍光分子であるローダミンで標識した２種類のプライマ（Ｒｈｏ−プライマ１、Ｒｈｏ−プライマ２、宝酒造（株）製）および鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡとしての全長ラムダ・ファージＤＮＡ（４８．５ｋｂｐ、３．２×１０7Ｄａ、１ｂｐ＝６６０Ｄａ）を表１に示すような組合せと濃度により、２． ５ＵのポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄTM（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）および０．２ｍＭ   のｄＮＴＰとともに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭの ＭｇＣｌ2、０．００１％ゼラ チン、ｐＨ８．３の緩衝液２５μｌ中に混和した。鋳型（テンプレート）の濃度は、１ｎｇ／２５μＬ〜０．１ｆｇ／２５μＬの間で変えた。それは、１．９×１０7〜１．９×１０1分子／２５μＬに相当する。
【００２６】
ＰＣＲによる増幅反応の実施
上記鋳型ＤＮＡの５００ｂｐの塩基配列に関するＰＣＲ反応は、プログラム可能なサーマルコントローラーであるＭｏｄｅｌＰＣ−７００（アステック社製）を使用し、まず、９６℃で１５分間の事前の変性工程用のプレインキュベートを行った後に、５５℃で１分間のアニーリング工程、７２℃で２分間の伸長工程および９６℃で１分間の変性工程というＰＣＲサイクルを５０回のサイクル数で実行した。
【００２７】
（２）ＦＣＳによる増幅反応結果の測定
測定用の混合液の測定
５０サイクルの増幅反応の後に、適当量（１０μＬ）の混合試料液を、カバーグラスＬａｂ−Ｔｅｋ（商標）（Ｎａｌｇｅ，Ｎｕｎｃ社製）上にピペッティングにより点着し、共焦点光学系を有する倒立型のＦＣＳ装置であるＣｏｎｆｏＣｏｒ（商標）（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ製）の試料台にセットした。倍率４０倍、開口数１．２を有する対物レンズＣ−Ａｐｏｃｒｏｍａｔ（商標）（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ製）をカバーガラス上の試料含有液に対してフォーカシングするようにした。アルゴンレーザーの励起光を用いた測定期間中（１分間）の試料含有液からの蒸発を防ぐために、カバーガラス上に点着した試料含有液の液滴上にさらに同様のカバーガラスを載せた上で、蛍光測定を室温にて実行した。なお、このＦＣＳ装置における微小視野としての検出領域の体積を、標準サンプルとしてローダミン６Ｇを用いた拡散時間の測定によって定義付けしたところ、検出領域の長さに対する径の比Ｓは、約５．２であり、体積要素は計算により１×１０-15Ｌで あった。ＦＣＳ測定した後に、試料混合液をアガロースゲル電気泳動により、分画を確認した。
【００２８】
測定データの統計学的データへの変換
焦点上のレーザービームの強度分布はガウシャン分布であるが、蛍光観測領域は準円筒形状で表した。それゆえ、サンプル液中に焦点を結んだレーザービームは非常に小さい円筒形状の場を形成し、その中に蛍光粒子がブラウン運動で出入りしている。その微少領域における蛍光粒子の数の変動により引き起こされた蛍光強度の変動がモニター出来る。蛍光強度の変動は自己相関関数を用いて解析され、焦点領域内の分子の平均数と並進拡散時間が求められた。蛍光自己相関関数Ｇ（ｔ）は、蛍光分子の平均数（Ｎ）、フリープライマの並進拡散時間（τ  ｆｒｅｅ）及び伸長プライマ（τｐｏｌｙ）を用い、式１により単純な２成分モデルで近似させた（Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．ら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃ ｔｒｏｓｃｏｐｙ、１３−２４、Ｉｎ Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄ．）、 １９９２参照）。なお、τ―ｆｒｅｅ,ｐｏｌｙ＝ｗｏ2/4Ｄｆｒｅｅ，ｐｏｌｙ及びＳ＝ｗｏ／ｚｏ、ここでｙは伸長プライマの割合、ｗｏは検出領域の径（体積要素）、２ｚｏは領域長、Ｄｆｒｅｅ及びＤｐｏｌｙはそれぞれフリーと伸長プライマの並進拡散定数である。体積要素における拡散時間は、拡散定数に関係している。ＦＣＳによるデータ解析は、非線形最少二乗法を用い、「ＦＣＳ」と言うコンピュータープログラム（ＥＶＯＴＥＣ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、で行った。
【００２９】
【表１】
0004262336.tif 000002
【００３０】
【数１】
0004262336.tif 000003
【００３１】
表１において、フィット曲線では、τｆｒｅｅ（０．１７ｍｓ）とτｐｏｌｙ（１．９８ｍｓ）は自由なパラメターを減らすために、固定してある。なお、表１において、ａは、増幅されたローダミン標識プライマーの産生量、ｂは、焦点領域に於ける蛍光分子の平均数、ｃは、総産生量（総産生量は蛍光標識プライマーの初期濃度とローダミン標識プライマーの増幅産生量（ｙ）から計算した）、ｄは、ローダミン標識プライマーの濃度、ｅは、Ｎｏｎ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ（検出出来ず）を意味する。
【００３２】
表１の結果は、非対称ＰＣＲにおけるプライマ・セットの最適比を決定するために行った予備実験の結果である。６通りのプライマ比、即ち、１ｎｇの鋳型の存在下に、プライマ１：Ｒｈｏ―プライマに対して３通り（８００ｎＭ：４００ｎＭ、４０ｎＭ：８００ｎＭ、４ｎＭ：８００ｎＭ）、そして、Ｒｈｏ−プライマ１：プライマ２（４００ｎＭ：８００ｎＭ、４０ｎＭ：８００ｎＭ、４ｎＭ：８００ｎＭ）、をテストした。５０サイクルのＰＣＲの後、１０μＬの反応液がカバーグラスの上にセットされ、１分間ＦＣＳで測定した。図４は典型的な蛍光自己相関関数を示す。Ｒｈｏプライマ２（τｆｒｅｅ＝０．１６４ｍｓ）の並進拡散時間はサーマルサイクルを受けていない対象サンプルから定義した（図４の丸印）。
【００３３】
ＰＣＲ５０サイクル後、プライマ１：Ｒｈｏプライマ２（４００ｎＭ：８００ｎＭ）の条件下における、フリーＲｈｏプライマ（図４の丸印でプロットした曲線）と、非対称ＰＣＲ産物の自己相関関数。曲線は式１でフィットして得られた。そして、フリーＲｈｏプライマτｆｒｅｅ−０．１６４ｍｓの並進拡散時間、及び増幅されたＤＮＡの並進拡散時間と増幅産物の収率をそれぞれτｐｏｌｙ＝１．９８、ｙ＝０．６として、式１に与えた。もう一つの対象サンプル（酵素を除いて、サーマルサイクルはかけてある）もまた測定された。ここではデータは示していないが、結果は０．１６９ｍｓであった。５００ｂｐＤＮＡ（ＰＣＲプロダクト）の並進拡散時間は自己相関曲線から計算され、τｐｏｌｙ＝１．９８ｍｓであった（図４の四角印でプロットした曲線）。この値はロッド様分子の並進拡散定数の理論計算によると、５００ｂｐ長のＤＮＡと一致した。このように、増幅産物は自己相関関数における変化からよく決定することが出来た。フリープライマと増幅プライマの並進拡散時間の違いから、増幅産物の割合を定量することが出来た。
【００３４】
この解析では、τｐｏｌｙ,τｆｒｅｅ及びＳがフィッティングで固定され、 自由なパラメターの数を減らし、フリーと伸長したパラメター（ｙ）の比を明確にした。フリープライマと産物はサーマルサイクルの後でも、物理的に分離されていないけれども、この解析により、産物の量を測定することが可能であった（表１）。プライマ１：Ｒｈｏプライマ２が８００ｎＭ：４０ｎＭの場合には、残ったフリープライマとＰＣＲ産物の比（ｙ＝０，６）は他よりも良かった。８００ｎＭ：４００ｎＭのプライマー比では、５００ｂｐの総生産量は他のプライマ比の場合よりも良かった。しかしながら、フリープライマのほぼ７０％がまだ残っていた。プライマ比が８００ｎＭ：４ｎＭでは、Ｒｈｏプライマ２の全部がＰＣＲ産物に組み込まれることが予想されていたけれど、ラベルされたプライマ２の約半分だけが組み込まれ、産物の生産量は８００ｎＭ：４０ｎＭの比の場合よりも良くはなかった。逆に、Ｒｈｏプライマ１：プライマ２が、４０００ｎＭ：８００ｎＭ、４０ｎＭ：８００ｎＭ、４ｎｍ：８００ｎＭ、の場合では、ＰＣＲ産物の生産量は０．３５以下であった。この理由については、詳細なハイブリダイゼーションの動力学的な検討により明かに出来るであろう。
【００３５】
図５は、増幅標的産物、５００ｂｐ、はＦＣＳによる定量測定の後に、アガロースゲル電気泳動により解析した結果を示したものである。すなわち、異なるプライマー比における非対称ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動による特性解析５０サイクル後の非対称ＰＣＲ液（３μＬ）を１．４％アガロースゲルに添加した。図５（Ａ）は、エチジウムブロマイド染色をしない場合、図５（Ｂ）は、エチジウムブロマイド染色した場合である。レーン１：ＨａｅIIIで消化したΦＸ１７４マーカー、レーン２：プライマ１：Ｒｈｏプライマ２比  ８００ｎＭ：４００ｎＭ、レーン３：プライマ１：Ｒｈｏプライマ２比  ８００ｎＭ：４０ｎＭ、レーン４：プライマ１：Ｒｈｏプライマ２比  ８００ｎＭ：４ｎＭ、レーン５：Ｒｈｏプライマ１：プライマ２比  ４００ｎＭ：８００ｎＭ、レーン６：Ｒｈｏプライマ１：プライマ２比  ４０ｎＭ：８００ｎＭ、レーン７：Ｒｈｏプライマ１：プライマ２比  ４ｎＭ：８００ｎＭ、レーン８：コントロール（通常プライマ使用ＰＣＲ）、レーン９：コントロール（Ｒｈｏプライマ２）、コントロール（Ｒｈｏプライマ１とＲｈｏプライマ２によるＰＣＲ）、５００ｂｐとＲｈｏプライマ２の位置は矢印で示した。５００ｂｐとＲｈｏプライマの間のかすかな太いバンドはブロモフェノール色素である。
【００３６】
５００ｂｐのローダミン蛍光バンドはすべての場合において、エチジウム染色なしに検出出来た（図５（Ａ））。ＰＣＲ産物もまた電気泳動後エチジウム染色によって確認出来た（図５（Ｂ））。５００ｂｐのｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ）はゲルでは明瞭ではなかった。理由はｓｓＤＮＡの蛍光強度はこの染色方法ではｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ）のそれよりも弱いからである。Ｒｈｏプライマ１：プライマ２比が４０ｎＭ：８００ｎＭ及び４ｎＭ：８００ｎＭの場合には、スメアーと非特異的バンドがゲル内に検出された（図５、レーン５−７）。逆に、プライマ１：Ｒｈｏプライマ２比が８００ｎＭ：４００ｎＭ、８００ｎＭ：４０ｎＭ、８００ｎＭ：４ｎＭの場合には、５００ｂｐバンドは明瞭に検出出来た。また、その強度は比が１：０．０５から１：０．００５に変化するにつれ減少した（図５、レーン２−４）。これらの結果は、ＦＣＳ測定結果（表１）と良く一致した。プライマ１：Ｒｈｏプライマ２比が８００ｎＭ：４０ｎＭがこのあとの実験に使用された。理由は５００ｂｐの産生量（ｙ＝０．６）が他の比の場合よりも多かったからである。ＦＣＳをベースとしたＦＡ−ＰＣＲ検出法は定量的正確性と簡便性と言う長所を有している。たった１０μＬの反応液量で、ＦＡ−ＰＣＲ後、１分間のＦＣＳ測定で目標遺伝子を検出出来る。もしも少数の鋳型遺伝子コピーがＦＡ−ＰＣＲ出来、ＦＣＳで測定出来たら、大変に興味深いものである。
【００３７】
図６は、本発明の上記方法の感度を調べる為に、２５μＬの反応液中におけるＰＣＲ前の初期鋳型濃度を１．９×１０7から１．９分子の間で変化させた結果 である（１．９×１０7は白抜き逆三角印、１．９×１０6は黒三角印、１．９×１０5は白抜き丸印、１．９×１０4は黒四角印、１．９×１０3は白抜き菱形印 、１．９×１０1は白抜き三角印、１．９は黒丸印で示した）。Ｒｈｏプライマ ２の自己相関関数Ｇ（ｔ）は、５０サーマルサイクル後の鋳型数の増加に比例して長い相関時間の方向（図６の右方向）に移行した。これは伸長したＲｈｏプライマ２の増加に相当している。産生量及びＦＡ−ＰＣＲ産物の数は式１によって計算した。
【００３８】
光計測領域における蛍光分子の平均数は、図７に示した。標識ＤＮＡ分子の数への影響は特になかったので、反応容器表面やガラスへの特異的あるいは非特異的吸着はこの実験では検出出来なかった。図８は、初期鋳型濃度に対する５０００ｂｐの収率（％）を示すようにしたグラフであり、２５μＬ中１０2から１０4分子までの範囲では、ＰＣＲ産物の産生量が鋳型ＤＮＡ分子の初期個数に依存し相関していたので、その範囲は定量測定範囲として使用出来る。初期量として２５μＬ中に１９０の鋳型分子が存在している場合でも、増幅ＤＮＡの相関値の減少曲線は分離出来、明瞭に検出出来た。１０5以上の鋳型分子の場合、５０サイ クル後にはプラトー効果が観察された。いくつかの要因がこのプラトー効果に寄与しているが、この効果はサイクル数と単純に相関していた。それ故、初期鋳型分子が高濃度であるような領域の測定については、サーマルサイクル数を減らすことによって、定量測定範囲を最適化することが出来る。
【００３９】
発明者が、行った実験においては、ＰＣＲの反応条件を最適化するにつれて、２０個の鋳型ＤＮＡ分子が試料中に存在する場合でも、検出できる所まで、突き止めた。ＰＣＲその他の反応条件をさらに最適化すれば、５個以内の鋳型ＤＮＡの検出レベルにまで設計することは、容易と考えられる。このような実験結果の示す傾向は、本発明の方法が、原理的には、たった１分子の鋳型ＤＮＡが存在する場合でさえ検出可能であるということを強く示唆している。
【００４０】
図９は、異なるＰＣＲサイクル数のそれぞれについて、反応のための混合液２５μＬ中の初期鋳型数とＰＣＲ産物の収率（％）を示したものである。この結果によれば、例えば、初期鋳型数が１０6以上の多量の場合には２０サイクルまた はそれ以下のサイクル数、１０4〜１０6の範囲では３０サイクル、１０2〜１０4の範囲では４０サイクル、１０3以下では５０サイクルまたはそれ以上のサイク ル数の非対称ＰＣＲが、標的ＤＮＡの定量に利用可能であると認められる。特に、初期鋳型数が高濃度の場合には、ＰＣＲサイクル数を減らすことによって、定量可能範囲が最適化されるといえる。このように、定量可能なサイクル数におけるデータが得られれば、サイクル数を遡る（例えば乗算する）ことにより、初期鋳型数を決定することができる。
【００４１】
図１０は、図９の測定データを、開始時の鋳型ＤＮＡ数毎に振り分けた時の、ＰＣＲサイクル数に対するＰＣＲ生産量を示すグラフである。この結果からは、初期鋳型数が２×１０3存在していれば、明確に定量できるということが分かっ た。また、図９のデータを考慮すると、２×１０2存在していても定量可能と推 測できる。
【００４２】
ＦＣＳを用いた標的遺伝子の検出は、最近いくつか報告されている。ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）がＦＣＳと結合され、血清中のＨＩＶ（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）の診断に有効な検出法であることが分かった（Ｏｅｈｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２８１１−１２８１６、１９９６）。このＮＡＳＢＡ法は、ＰＣＲの変法であるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びＲＮａｓｅＨと言う、３つの酵素の存在下で、２つのプライマと、プローブとして蛍光標識した別途のプライマとを必要とする。より簡単な方法（ＦＣＳによる増幅プローブ伸長検出法、ＡＰＥＸ（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｒｏｂｅＥｘｔｅｎｓｉｏｎ）が同じグループから報告されている（Ｗａｌｔｅｒ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２８０５−１２８１０、１９９６）。それでも、順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマと逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマ・セットの他に、プローブとして蛍光標識した別途のプライマを必要とする。このＡＰＥＸの実験では、自己相関関数の時間的変移が２６サイクル後に観測される。
【００４３】
発明者は、それら従来のＰＣＲ技法におけるＦＣＳ法の感度を高める為に、ＰＣＲにおいて蛍光モノヌクレオチドを用いる蛍光ランダム標識法を開発した。そして増幅２０サイクル後に目標遺伝子の定量が出来た（Ｋｉｎｊｏ，Ｍ、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３６５、４３−４８、１９９８）。この開発した方法により、やや少数回の増幅サイクル数がランダム標識法に用いられたが、スピンカラムを用いてＰＣＲ産物から取込まれなかった蛍光単分子を物理的に分離する、いわゆるＢｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離も必要とされた。逆に、ここに述べたＦＣＳに基づいたＦＡ−ＰＣＲ検出法は、ゲル濾過法のような物理的分離法を用いることなしに、反応条件下で蛍光標識したプライマのみを必要とするだけである。
【００４４】
蛍光エネルギー転移解析のような蛍光クエンチングに基づいたＰＣＲ定量法が以前に報告されている（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．、６、９８６−９９４、１９９６、Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．、ＰＣＲ ＭｅｔｈｏｄＡｐｐ ｌ．、４、３５７−３６２、１９９５）。この技法は市販されているが、第１、第２のＰＣＲプライマ・ペアーの他に、前節で述べたＮＡＳＢＡ法とかＡＰＥＸ法と同じく、一つのプローブ・シーケンスの中に２種類の色素を含んでいる。プローブのオリゴ塩基設計にあたっては、プライマの塩基配列と競合しない塩基配列を考えるだけでなく、融解温度（Ｔｍ）も考慮する必要がある。しかも、ドナーとアクセプター色素の位置も蛍光強度の増加効率及びポリメラーゼの５'ヌク レアーゼ活性に影響する。もう一つのゆらぎ分光法（蛍光クロスコリレーション分光法）が均一溶液中における特定目標遺伝子の検出法として報告されている（Ｃａｓｔｒｏ，Ａ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６９、３９１５−３９２０、１９９７）。クロスコリレーション法では非常に低濃度の目標配列を検出出来るけれど、この方法は依然として、実験溶液中では２種類の蛍光プローブを必要とする。
【００４５】
簡便性の観点からは、ＦＣＳに基づいたＰＣＲ定量法はエネルギー転移法およびクロスコリレーション法に比べて、重要な利点を有する。ＰＣＲの再現性と感度は、酵素のタイプ（ＰｏｌＩタイプ或いはタイプ）、プライマ配列、及び反応条件に強く依存する。一度これらの条件が決定されると、ＦＣＳに基づいたＦＡ−ＰＣＲはプライマ比をわずかに変えるだけで、通常のＰＣＲアッセイにすぐに応用出来る。それ故、ルーチン的ＰＣＲ条件はＦＡ−ＰＣＲの条件に容易に変更出来る。しかも、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）のような他の増幅方法も、この方法に変更することが出来、将来的には一個の細胞中のｍＲＮＡを定量することも出来る。
【００４６】
ゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーではＰＣＲ産物はプライマと副産物から分離される。しかしながら、目標産物は電気泳動とゲル物質からの抽出課程で稀釈され、さらにヌクレアーゼと接触する機会もあり、変成することもある。逆にＦＣＳでは測定後のサンプル回収に便利であり、それはサンプル液滴はカバーグラスの上に置くだけであり、ＦＣＳは非浸襲性であるため、ＰＣＲ溶液は稀釈されることがなく、測定中に変成することもない。ゲル電気泳動の分解能は高く、１塩基の長さの違いを検出出来るが通常１時間程度の泳動時間を要するのに対して、ＦＣＳは非常な高速測定であり（実施例では１分間）、例えば臨床検査やスクリーニング検査のような大量検体検査では利点がある。ＦＣＳ検査後のサンプルは直ちにゲル電気泳動等で詳細に解析出来、ＦＣＳ測定結果を確認したり、塩基配列を解析したり出来る。かつまた、回収されたサンプルは後に続く実験に使用することが出来る。たとえば、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることが出来る。もしも、ＦＣＳ測定後に増幅サンプルを回収する必要がなければ、キャリーオーバーによる汚染の危険性もなく廃棄出来る。というのは、ＦＣＳは非接触型の測定法だからである。
【００４７】
ＦＣＳは非侵襲性であり、直接測定を可能にするので、ＰＣＲサンプル量はＦＣＳが必要とする測定量で決まる。発明者による今回の測定は１０μＬのサンプル量で行ったが、理論的には１０-15Lの体積要素レベルまで減らすことが出来る。しかし、ＰＣＲ量は１μＬまで減らすことが出来れば、他の方法と比べて、経済面で大きな利点と言える。かつまた、ＦＣＳは蛍光顕微鏡を基礎としており、検出領域を対物レンズ上におくことが出来るため、ｉｎ−ｓｉｔｕＰＣＲによる特定のＲＮＡやＤＮＡの定量に用いることが出来る。
【００４８】
発明者は、ＰＣＲ溶液の解析に２成分モデルを使用して、良好な結果を得た。しかし、他の実験では多くのＤＮＡ種が存在するかもしれない。そのような場合には、ＤＮＡの種は従来のゲル電気泳動法で良く分離出来る。観測されたＦＣＳデータのモデル関数からの相関曲線の違いから溶液中に分布する他の成分の存在が示唆することができるが、単純な２成分モデルはそのような場合は限界があると思われる。その結果、もっと詳細な定量解析が必要とされる場合は、ＣＯＮＴＩＶＮ（Ｍａｘ−ＰｌａｎｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ製）のようなコンピュータープログラムを用いて、分布関数を得る多成分ＦＣＳ解析法の開発が必要である。
【００４９】
本発明の方法は物理的分離方法を用いることもなく、非侵襲的、非接触的であり、使用するサンプル量も少ない。このような少量のサンプルの物理的取り扱いは毛細管を使用したり、薄いカバーグラスや、フィルムをかぶせたガラス表面上の小さな穴を用いて行うことが出来、リアルタイム解析に用いることも出来る。これらの特性とさらなる改良により、増幅課程のモニターは容易に（リアルタイムモニタリング）、自動検出システム（ロボティックス）も可能であることは明白である。我々はＦＣＳに基づいたＦＡ−ＰＣＲ定量法は感度、定量精度、簡便性において利点を有すると結論する。この方法は迅速スクリーニングのみならず、分子診断の新時代を開くものと期待している。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、プライマに標識分子を標識してＰＣＲによる増幅反応を行うとともに、微小視野内で測定するようにして個々の標識分子の位置的変化を統計学的に解析したので、試料中の標的核酸の存在量を正確に定量的に検出できる。また、Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離を行うことなく、定量分析できるので、取り扱いが簡単であり、自動化にも適している。また、少量の第２プライマに対して標識分子を結合させて用いるので、経済的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係わる非対称ＰＣＲの概念図。
【図２】図２は、本発明の方法を実施するための装置の一例を示す概略図。
【図３】図３は、図２の装置の一部拡大図。
【図４】図４は、典型的な蛍光自己相関関数を示すグラフ。
【図５】図５は、増幅標的産物、５００ｂｐ、はＦＣＳによる定量測定の後に、アガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す図。
【図６】図６は、本発明の方法の感度を調べる為に、２５μＬの反応液中におけるＰＣＲ前の初期鋳型濃度を１．９×１０7から１．９分子の間で変化させた場合のそ れぞれの蛍光自己相関関数を示すグラフ。
【図７】図７は、図６で行った初期鋳型濃度毎の測定時の光計測領域（微小視野）における蛍光分子の平均数。
【図８】図８は、初期鋳型濃度に対する５０００ｂｐの収率（％）を示すようにしたグラフ。
【図９】図９は、異なるＰＣＲサイクル数のそれぞれについて、混合液２５μＬ中の初期鋳型数とＰＣＲ産物の収率（％）を示したグラフ。
【図１０】図１０は、図９の測定データを、開始時の鋳型ＤＮＡ数毎に振り分けた時の、ＰＣＲサイクル数に対するＰＣＲ生産量を示すグラフ。
【符号の説明】
１…蛍光顕微鏡、
２…フォトマルチプライヤ、
３…データ処理装置、
４…表示装置、
１１…試料含有液、
１２…試料台、
１３…スライドガラス、
１４…蓋、
１５…対物レンズ、
１６…レーザー発生装置。
【図１】
0004262336.tif 000004
【図２】
0004262336.tif 000005
【図３】
0004262336.tif 000006
【図４】
0004262336.tif 000007
【図５】
0004262336.tif 000008
【図６】
0004262336.tif 000009
【図７】
0004262336.tif 000010
【図８】
0004262336.tif 000011
【図９】
0004262336.tif 000012
【図１０】
0004262336.tif 000013