(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の７ＳＬ ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号：１記載の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソーム中に存在してなる請求項３記載の治療剤又は予防剤。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがベクターと連結されたものである請求項３又は４記載の治療剤又は予防剤。
【請求項６】
請求項２に記載の癌細胞増殖抑制剤、又は請求項３〜５いずれかに記載の治療剤若しくは予防剤の製造のための請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  動物細胞における分泌タンパク質の合成にはシグナル認識粒子（ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＳＲＰ）が関与する。ＳＲＰは全体で１１Ｓの沈降係数を持っており、７ＳＬ  ＲＮＡと６種のタンパク質よりなる。【０００３】  分泌タンパク質の合成は、そのｍＲＮＡが遊離リボソームと結合することにより開始される。リボソームとはタンパク質の合成場であり、ｒＲＮＡと多数のリボソームタンパク質からなる。真核生物の場合、全体で８０Ｓの沈降係数を持つが、さらに６０Ｓと４０Ｓからなる２つの粒子に分かれ、前者は５Ｓ、５．８Ｓ及び２８Ｓの各ｒＲＮＡを、後者は１８ＳのｒＲＮＡを、各１分子ずつ含む。【０００４】  ＳＲＰは、リボソームから伸長してきた分泌タンパク質前駆体のＮ末端或はその近傍に存在する疎水性アミノ酸配列からなるシグナルペプチドを認識し、タンパク質−リボソーム複合体に結合する。それにより、その先のタンパク質の翻訳は停止する。ＳＲＰは該複合体を小胞体の膜へ輸送し、小胞体の細胞質ゾル側にあるＳＲＰレセプタータンパク質に結合する。ＳＲＰの結合した複合体が該膜に結合すると翻訳阻害が解かれ、ＳＲＰは解離し、リボソームは該膜に固定される。次いで翻訳が継続され、ポリペプチド鎖が該膜を通過し、成熟型の分泌タンパク質が作られる。【０００５】  一方、真核細胞の核内では、前記のようにタンパク質の翻訳に関与するｍＲＮＡ等の他、長さが１００〜３００塩基程度の核内低分子ＲＮＡと呼ばれる一群のＲＮＡが合成される。それらは、通常、タンパク質と結合してリボ核タンパク質として存在する。核内低分子ＲＮＡとしては、例えば、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６と呼ばれるＲＮＡが知られている。核内低分子ＲＮＡの機能としては、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６がｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに関与することが示されているが、他の機能に関しては未だよく分かっていない。【０００６】  このように、核内低分子ＲＮＡの機能には不明な点が多いが、Ｕ５  ＲＮＡについて、トランスフェクションにより培養細胞を癌化させることが報告された（非特許文献１参照）。また、Ｕ５  ＲＮＡの二次構造におけるｆｉｒｓｔ  ｓｔｅｍの３’末端側の塩基配列（配列番号：２）にポリ（Ａ）付加し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存的に転写させた転写物〔トランスフォーミングＲＮＡ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＲＮＡ）〕も同様に癌化能を有することが示された（非特許文献２参照）。なお、癌化能はトランスフォーミングＲＮＡ内の特定の塩基配列（配列番号：３）に依存した。【０００７】  ウサギ網赤血球抽出液を用いたタンパク質合成実験においては、トランスフォーミングＲＮＡは分泌タンパク質の合成を抑制した（非特許文献３参照）。配列番号：４記載の塩基配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）も同様にウサギ網赤血球抽出液内で分泌タンパク質の合成を抑制した。さらに、ＯＤＮ内の特定の塩基配列（配列番号：５）部分でリボソームの２８Ｓ  ＲＮＡと結合することが明らかにされた。一方、ＯＤＮのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンスＯＤＮ；配列番号：６）はＳＲＰ内の７ＳＬ  ＲＮＡと結合し、分泌タンパク質の合成抑制を減ずる方向（結果として分泌タンパク質合成は促進される）に働くことが、さらに、アンチセンスＯＤＮ内の特定の塩基配列（配列番号：７）部分で７ＳＬ  ＲＮＡの４８〜５１位の塩基配列（配列番号：８）と結合することが報告された（図１参照）。【０００８】  これらの報告は、Ｕ５  ＲＮＡに内在する塩基配列が癌化能及び分泌タンパク質合成抑制能という新たな機能を発揮すると共に、Ｕ５  ＲＮＡの癌化能等の発現に関与すると推定される塩基配列部分に対するアンチセンスＯＤＮにはＵ５  ＲＮＡの癌化能等を抑制する作用があることを示唆するものであるが、Ｕ５  ＲＮＡの癌化能等の抑制にはどのような要素が必要十分であるかについては未だ不明である。
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，４３４５−４３５６（１９８９）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２０，１７５−１８８（１９９７）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２２），１５７８６−１５７９６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明は、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  前記した通り、Ｕ５  ＲＮＡの癌化能等の発現に関与すると推定される塩基配列部分に対するアンチセンスＯＤＮにはＵ５  ＲＮＡの癌化能等を抑制する作用があることが示唆されたが、Ｕ５  ＲＮＡの癌化能等の抑制にはどのような要素が必要十分であるかについては未だ不明であった。【００１１】そこで、本発明者は鋭意検討した結果、意外にも、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の７ＳＬ  ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドこそがＵ５  ＲＮＡの癌化能等の抑制に著効を発揮し得ることを初めて明らかにし、本発明を完成させるに至った。【００１２】  すなわち、本発明は、Ｕ５  ＲＮＡ及びＵ５  ＲＮＡに由来するトランスフォーミングＲＮＡの癌化能に連関する初期機能の解明を基礎に、ヒト癌細胞に対し致死並びに増殖抑制作用等を発揮して拮抗的に働く物質を探索し明らかにしたことによりなされたものである。【００１３】
本発明は、
〔１〕シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の７ＳＬ ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号：１記載の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、
〔２〕前記〔１〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤、
〔３〕前記〔１〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌の治療剤又は予防剤、
〔４〕アンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソーム中に存在してなる前記〔３〕記載の治療剤又は予防剤、
〔５〕アンチセンスオリゴヌクレオチドがベクターと連結されたものである前記〔３〕又は〔４〕記載の治療剤又は予防剤、並びに
〔６〕前記〔２〕に記載の癌細胞増殖抑制剤、又は前記〔３〕〜〔５〕いずれかに記載の治療剤若しくは予防剤の製造のための前記〔１〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】  本発明のアンチセンスヌクレオチドによれば、癌細胞の増殖抑制や死滅、癌の症状の緩和又は改善、癌の治療又は予防等を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ウサギ細胞由来ＳＲＰの７ＳＬ  ＲＮＡの構造の模式図である。図中の数字は塩基の位置を示す（３’、５’を除く）。
【図２】図２は、実施例において作製したアンチセンスオリゴヌクレオチドであるｏｌｉｇｏ１〜５のヒト癌細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】図３は、ｏｌｉｇｏ３のヒト癌細胞の増殖に及ぼす濃度依存的な影響を示すグラフである。
【図４】図４は、ｏｌｉｇｏ１〜５のヒト癌細胞の細胞ＤＮＡ合成に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、ｏｌｉｇｏ３のヒト癌細胞の死滅に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、２０μｇ／ｇ体重で静脈内投与した場合のｏｌｉｇｏ３のマウスの体重増加に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本明細書において、「ヌクレオチド」とはＤＮＡ及びＲＮＡを含む意味で用いられる。また、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定の塩基配列（以下、センス配列という）に対し相補的な塩基配列を有し、かつセンス配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドをいう。【００１７】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応するセンス配列は、ＳＲＰの７ＳＬ  ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列である。図１は、ウサギ細胞由来ＳＲＰの７ＳＬ  ＲＮＡの構造を模式的に示す。７ＳＬ  ＲＮＡの塩基配列は種々動物細胞由来のものが知られている。例えば、前記ウサギ細胞由来のものは非特許文献３に、ヒト細胞由来のものはＵｌｌｕ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｗｉｅｎｅｒ，Ａ．Ｍ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３．３３０３−３３１０．に記載されている。また、その他の動物由来のものが、例えば、Ｌａｒｚｅｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｚｗｉｅｂ，Ｃ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，２０９−２１５．に記載されている。少なくとも哺乳動物細胞では上記７ＳＬ  ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列は同一である。【００１８】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を有する。中でも、配列番号：１記載の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが有用である。癌細胞増殖抑制作用には癌細胞死滅作用も含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれの作用も、そのＵ５  ＲＮＡの癌化能等の抑制作用に基づくものと推定される。なお、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの癌細胞増殖抑制作用は後述の実施例に記載の方法に従って確認することができる。【００１９】  本発明のアンチセンスオリゴヌクオレチドの合成方法としては、特に限定されず、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を用いることができる。【００２０】  また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性や細胞に対する親和性を高めるために、その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換した誘導体として用いることも可能である。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例としては、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の水酸基をメトキシ基やアリロキシ基等のアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子等で置換したもの等が挙げられる。【００２１】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計においては、それを構成する塩基の配列が重要であり、該オリゴヌクレオチドには天然型の核酸分子の他、前記したような非天然型の修飾オリゴヌクレオチドが含まれるが、さらにペプチド核酸型の修飾化合物（ＰＮＡ）であってもよい。細胞膜や核膜等の透過性が良好であることから、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、その構造中に糖（好ましくはペントース）構造を有するものが好ましい。【００２２】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ型であってもＲＮＡ型であってもよいが、生体に投与した際の��定性がより高いという観点からＤＮＡ型であるのが好ましい。【００２３】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単独で用いることもできる。従って、本発明により提供される癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤（以下、まとめて製剤という場合がある）は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドそのものからなってもよいが、薬学的に許容され得る物質と混合し、公知の方法に従って製剤の形態に調製したものが好ましい。なお、癌細胞増殖抑制剤と癌の治療剤又は予防剤とは、その組成、製造方法等において特に区別されるものではないが、癌細胞増殖抑制剤は、癌の症状の緩和若しくは改善、又は癌の治療若しくは予防に使用される以外に、例えば、通常の実験過程において一般の試薬として癌細胞増殖抑制のために使用されることをも意図したものである点で異なる。該製剤は、例えば、以下のようにして製造することができる。【００２４】  例えば、注射剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを水、生理食塩水又はブドウ糖溶液等に溶解させて調製することができ、所望により緩衝剤、保存剤又は安定化剤等を含有させてもよい。【００２５】  軟膏剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、油脂性、乳剤性又は水溶性の基剤に溶解又は分散させて調製することができ、所望により安定化剤、ｐＨ調整剤、可塑剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤又は吸収促進剤等を含有させてもよい。【００２６】  乳剤、ローション剤等とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、水相中に溶解又は分散させ、炭化水素や高級アルコール等の油相成分と乳化することにより調製することができ、所望により安定化剤、ｐＨ調整剤、可塑剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤又は吸収促進剤等を含有させてもよい。【００２７】  また、本発明の細胞増殖抑制剤は、一般の試薬として、例えば、水を添加することで容易に溶液とすることができる乾燥品として調製してもよい。【００２８】  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生体におけるより効率的な取り込みや効果の持続性を所望する場合、薬学的に許容される公知の担体と組み合わせて製剤とするのが好ましい。担体としては、例えば、リポソーム、脂肪乳剤、ミセル等の脂質を主成分とする担体、ポリリジンやポリオルニチン等のペプチド性担体、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸／グリコール酸共重合体等の合成高分子担体等が挙げられる。中でも、リポソームと組み合わせてなる製剤が好ましい。かかる製剤においては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはリポソーム中に包埋されて存在するのが好ましい。これらの担体を用いた製剤化は公知の方法に従って行うことができる。【００２９】  例えば、リポソームを用いる製剤化の方法は、Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｇ．（ｅｄ），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒ．，１９９２．等に記載されている。リポソームと組み合わせてなる製剤は、リポソームの形成に通常使用されるリン脂質、糖脂質、中性脂質等の脂質に加え、形成され���リポソームにカチオン性の電荷を与えるような物質、例えば、ジセチルリン酸、ステアリルアミンや、リポソームの酸化を防止するような物質、例えば、α−トコフェロール等を含んでいてもよい。また、細胞への取り込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で上記担体を任意に修飾したものも使用可能である。【００３０】  なお、これらの製剤は、抗癌作用が認められている公知の他の成分を含有するものであってもよい。【００３１】  また、前記製剤においては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをベクターと連結して、すなわち、任意のベクターに組み込んでなるものを用いることができる。その場合、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは適当なプロモーターに作動可能に連結されているのが好ましい。ここで「作動可能に」とは、プロモーターの作用により該アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）が生体の細胞内で発現されうることを意味する。ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。このようなベクターは遺伝子治療用のベクターとして有用である。かかるベクターの構築方法、具体的な用法等については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ；２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．ＮＹ．，１９８９．等の成書を参照すればよい。【００３２】  本発明の製剤中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの含有量としては特に限定はなく、各製剤に応じた使用態様に合わせて所望の効果が得られるように適宜調節すればよいが、通常、１〜１０重量％程度が適当である。【００３３】  以上により、本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤が得られる。よって、本発明の別の一態様として、本発明の癌細胞増殖抑制剤、又は癌の治療剤若しくは予防剤の製造のための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用方法が提供される。【００３４】  本発明の癌の治療剤又は予防剤の生体への投与方法としては、該治療剤又は予防剤の形態に応じて、例えば、経口投与、静脈内投与、経皮的投与、局所投与、腹腔内投与等が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明の癌の治療剤又は予防剤の投与方法は、各個体、各疾患の状況等に応じてより有効性の高い方法を選択すればよいが、通常、静脈内による投与が好ましい。また、癌の治療剤又は予防剤の投与量も症状等に応じて適宜決定すればよく、特に限定されるものではないが、静脈内による投与の場合、例えば、１日当たりヒトに対し、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの量に換算して、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重が適当である。投与は１日内で単回で行なっても複数回に分けて行ってもよい。また、投与期間も特に限定されるものではない。【００３５】  なお、本発明の癌の治療剤又は予防剤の投与対象である生体としては、前記ヒトに限定されるものではなく、例えば、ヒト以外の哺乳動物等も包含される。また、本発明の癌細胞増殖抑制剤��本発明の癌の治療剤又は予防剤と同様にして用いることもできる。【００３６】  本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤による抗癌作用の標的となる癌細胞の所在は特に限定されるものではないが、中でも癌細胞が皮膚等の体表面、食道、胃及び大腸など消化管、動脈内投与可能な肝臓等に由来するものであるのが好適である。【００３７】  なお、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、例えば、後述の参考例１に示すように特に毒性は認められない。
【実施例】
【００３８】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。【００３９】実施例１
前記トランスフォーミングＲＮＡは細胞の癌化と分泌タンパク質の合成抑制に関与していることから、細胞の癌化には分泌タンパク質の合成抑制がかかわっているものと推定される。一方、アンチセンスＯＤＮ（配列番号：６）は分泌タンパク質の合成抑制を減ずる方向に作用することから、当該アンチセンスＯＤＮは癌化に抗して働くことが期待される。【００４０】  そこで、ウサギ細胞由来ＳＲＰの７ＳＬ  ＲＮＡの４８〜５１位の塩基配列（配列番号：８）を中心とした数残基からなる塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートオリゴ）を合成し、細胞外からの取り込みによるヒト癌細胞への影響を検討した。なお、ヒト細胞由来の７ＳＬ  ＲＮＡの塩基配列はウサギ細胞由来のものと同じ塩基配列を有することが知られている。【００４１】  以下の表１に示す塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）をタカラバイオ株式会社に依頼して作製した。なお、表中、ｏｌｉｇｏ１〜５はアンチセンスオリゴヌクレオチドの名称を、括弧内の番号は７ＳＬ  ＲＮＡの塩基配列の対応位置を示す。また、ｏｌｉｇｏ５は７ＳＬ  ＲＮＡの塩基配列に基づくことなくランダムに作製されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物であり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを示す。【００４２】
【表１】
0004226006.tif 000002
【００４３】  各ｏｌｉｇｏの細胞増殖に対する影響を検討した。すなわち、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地中のヒト癌細胞であるＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに１５００個の密度で播種した。２４時間培養後、培養液を、１０μＭの濃度で各ｏｌｉｇｏ及び１％  ＦＣＳを含む培養液に交換した。培養はＣＯ２存在下に３７℃で行った。その後、２４時間間隔で４日間に渡り、細胞計数キット（株式会社同仁堂製）を用い、ＭＴＴ変法（ＷＳＴ−１＋１−メトキシＰＭＳ）により生細胞の割合〔細胞生存率（％）〕を調べた（吸光度：４５０〜６５０ｎｍ）。なお、培養液を、いずれのｏｌｉｇｏも含まない培養液に交換したものを対照とした（以下、同様）。【００４４】  図２は、各ｏｌｉｇｏのヒト癌細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。実験は三連で行った。グラフ中、各データを平均±ＳＤで示す（以下、同様）。ｏｌｉｇｏ３において細胞生存率が最も低く、ヒト癌細胞の増殖抑制効果が強いことが分かる。なお、１、２、３、そして４日目の各細胞生存率は対照に対し４９．６％、６２．７％、７１．６％、そして７１．１％であった。【００４５】  次に、ｏｌｉｇｏ３に関し、培養液中の濃度を２．５、５、１０及び２０μＭに設定して同様の実験を行い、ヒト癌細胞の増殖抑制と濃度との関係を調べた。【００４６】  図３は、ｏｌｉｇｏ３のヒト癌細胞の増殖に及ぼす濃度依存的な影響を示すグラフである。ｏｌｉｇｏ３のヒト癌細胞の増殖抑制は濃度に比例して増大することが分かる。なお、１、２、３、そして４日目の各細胞生存率は対照に対し４４．４％、４５．１％、５５．５％、そして６３．８％であった。【００４７】  また、各ｏｌｉｇｏの細胞ＤＮＡ合成に与える影響について細胞による〔３Ｈ〕メチルチミジンの取り込みを観察して検討した。すなわち、前記と同様にして細胞を２４時間培養後、培養液を、５、１０又は２０μＭの濃度の各ｏｌｉｇｏ及び０．１％ＦＣＳを含む培養液に交換した。１８時間後、１μＣｉ／ｍＬの〔３Ｈ〕メチルチミジンを培養液に添加し、さらに６時間培養した。培養後、所定の処理の後に細胞の比放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。【００４８】  図４は、各ｏｌｉｇｏのヒト癌細胞の細胞ＤＮＡ合成に及ぼす影響を示すグラフである。ｏｌｉｇｏ３において〔３Ｈ〕メチルチミジンの細胞への取り込みが最も低く抑えられ、ヒト癌細胞の増殖抑制効果が強いことが分かる。なお、ｏｌｉｇｏ３存在下でのヒト癌細胞の〔３Ｈ〕メチルチミジン取り込み率は対照に対し、５、１０、そして２０μＭの濃度で、５７．５％、３２．０％、そして１６．６％であった。【００４９】  さらに、ｏｌｉｇｏ３によるヒト癌細胞における細胞死の誘発について検討した。すなわち、スライドチャンバーに３０００個のＨｅＬａ細胞を播種した。２４時間培養後、培養液を、ｏｌｉｇｏ３を２０μＭの濃度で含む培養液に交換した。ｏｌｉｇｏ３の添加から約１８時間後、実体顕微鏡（倍率１００倍；オリンパス社製）で培養細胞を観察したところ、細胞の小円化から細胞死に至る過程が観察された。さらに、ｏｌｉｇｏ３の添加から２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞洗浄後にギムザ染色を行い、生細胞と死細胞の数を測定し、得られた各細胞数から細胞生存率（％）を求めた。なお、対照として、さらにｏｌｉｇｏ５を用いた。【００５０】  図５は、ｏｌｉｇｏ３のヒト癌細胞の死滅に及ぼす影響を示すグラフである。ｏｌｉｇｏ３での細胞生存率は３０．８％である一方、対照及びｏｌｉｇｏ５ではそれぞれ９８．５％及び９８．７％であり、ｏｌｉｇｏ３での細胞生存率が他の対照に比し有意に低いことから、ｏｌｉｇｏ３はヒト癌細胞に対する高い細胞死誘発作用を有することが分かる。【００５１】  以上より、ＳＲＰの７ＳＬ  ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるｏｌｉｇｏ３（配列番号：１）は、癌細胞の増殖を抑制し、また、その細胞死を誘発する作用を有することが分かる。よって、ｏｌｉｇｏ３は抗癌剤としての効用が期待される。【００５２】参考例１
前記ｏｌｉｇｏ３の毒性について検討した。すなわち、ｏｌｉｇｏ３を１ｍｇ／ｍＬとなるように生理的食塩水に溶解させたものを用いて、雌のマウス（５週齢）に対し、体重１ｇ当たり２０μｇを静脈内投与した。投与当日（０日）及び投与から２、５、１０、１２及び１４日後のマウスの体重を測定した。【００５３】  図６は、２０μｇ／ｇ体重で静脈内投与した場合のｏｌｉｇｏ３のマウスの体重増加に及ぼす影響を示すグラフである。グラフ中、各データを平均±ＳＥで示す。なお、各データは、ｏｌｉｇｏ３については７匹、対照については６匹のマウスを用いて得た。【００５４】  図６に示すように、ｏｌｉｇｏ３と対照とで体重増加に与える影響に差はなかった。また、両者で特に異なった症状の発生も確認されなかった。これらの結果より、ｏｌｉｇｏ３は特に毒性を示さないものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】  本発明により、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤が提供される。これらは、癌の治療分野において大きく寄与し得る。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】  配列番号：１は、７ＳＬ  ＲＮＡの４７〜５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号：３は、トランスフォーミングＲＮＡの部分塩基配列である。
配列番号：４は、トランスフォーミングＲＮＡの部分塩基配列に基づいて作製されたオリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号：５は、オリゴデオキシヌクレオチドの部分塩基配列である。
配列番号：６は、オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号：７は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの部分塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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