(57)【要約】  Ｒ型ω−トランスアミナーゼを提供する。該Ｒ型ω−トランスアミナーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２と少なくとも８０％の同一性を有し又は一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠乏又は添加され且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性の蛋白質のアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列により符号化されたアミノ酸配列ではない。高度の立体選択性とはその中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。そして、Ｒ型ω−トランスアミナーゼの応用を提供し、キラル純度の高いＲ体キラルアミンを効率的に合成することができ、キラルアミンの産業化生産に適合する。
2016537991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体であって、前記Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列が下記の配列から選ばれる一つを含み、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列であって、但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列により符号化されたアミノ酸配列ではないアミノ酸配列、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加することで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２から派生し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性の蛋白質であって、但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列により符号化されたアミノ酸配列ではない蛋白質、
高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指すことを特徴とするＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体。
【請求項２】
上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第１９９位のロイシンをバリンに置換したアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体の符号化を行うことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列は、下記の配列から選ばれる一つの配列を含み、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼを符号化するヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、
ｃ）厳密な条件でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼを符号化するヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、
高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指すことを特徴とする請求項３に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のヌクレオチドが有効に接続されていることを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣであることを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載の組換えベクターにより形質転換又は形質導入されることを特徴とする宿主細胞。
【請求項８】
ケトン系化合物と、請求項１に記載のＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体と、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを、反応系で反応させてＲ型キラルアミンを得ることを特徴とするＲ型キラルアミンの合成方法。
【請求項９】
上記ケトン系化合物は
【化１】
2016537991.tif 000009
で、ここで、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０ナフテン基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であって、又は、Ｒ１とＲ２がカルボニル基の炭素と協同にＣ５〜Ｃ１０複素環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、上記Ｃ５〜Ｃ１０複素環基とＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロ原子がそれぞれ独自に、窒素、酸素、硫黄から選ばれる少なくとも１種であって、上記Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基がそれぞれ独自に、置換されていないか又はハロゲン、アルコキシル基又はアルキル基の中の少なくとも一つの基によって置換されたものであって、好ましくは、上記ケトン系化合物
【化２】
2016537991.tif 000010
が
【化３】
2016537991.tif 000011
から選ばれることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、上記カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであって、好ましくは、上記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
上記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、上記Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、上記アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、上記Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンで、上記Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基の置換基ははそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンであることを特徴とする請求項９に記載のキラルアミンの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キラル化合物の合成分野に関し、具体的に、Ｒ型ω−トランスアミナーゼ及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラルアミンは自然界に汎用されており、数多い重要な生物活性分子の構造ユニットで、天然産物やキラル薬物を合成する際の重要な中間体であって、多いキラルアミンは重要なキラル補助剤やキラル選択剤としても用いられる。その故、キラルアミン化合物の製造は重要な経済上の意味を持っている。
【０００３】
現在、キラルアミンの製造は主に、化学還元の方法を用いて、プロキラルケトンを利用して光学活性を持つアミンを製造している。Ｐｄ／Ｃ及びキニーネの触媒作用で、プロキラルケトンと蟻酸及び無機アンモニア／有機第一級アミンとが反応してキラルアミンを生成する。他の研究者は、ルテニウム配合物を触媒として、プロキラルケトンで非対称アミン化還元を行ってキラルアミンを得ている（Renat Kadyrov et al. Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination: Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines. Angewandte Chemie International Edition. 2003,42（44）、第5472〜5474頁）。このような反応において金属触媒はかなり重要な要素であって、かつ、金属触媒に対する要求も厳しく、反応は高圧条件で行わなければならなく、操作機器に対する要求も高く、同時に、金属触媒の価格が高く、環境に対する汚染も大きい（Ohkuma T et al. Trans-RuH（eta1-BH4）（binap）（1,2-diamine）:a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions. Journal of the American Chemical Society.2002, 124（23）、第6508〜6509頁）。
【０００４】
アミノ基転移酵素はトランスアミナーゼとも呼ばれ、一つのアミノ基とカルボニル基とが交換する過程を触媒する。ω−トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼの中の一つであるが、若干の差異がある。ω−トランスアミナーゼは第１類の酵素を指し、それにより触媒するアミノ基転移反応における反応物質又は産物がα−アミノ酸を含有しない限り、当該酵素をω−トランスアミナーゼと称することができる。ω−トランスアミナーゼは、ケトン類化合物を原料として、立体選択性のアミノ基転移作用によって、効率的にキラルアミンを生産している。その反応物質が比較的に低価格で、産物の純度が高い特徴を有するので、研究者たちの注目を集めている。それを、充分に潜在力を発揮させて、キラルアミンの産業化生産へ普及することを望んであるが、当該酵素の研究及び応用は少ないのが現状である。
【０００５】
本分野において、キラルアミン化合物を製造するための需要を満たすように、高度の立体選択性を持つＲ体触媒活性のω−トランスアミナーゼに対する需要が依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Renat Kadyrov et al. Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination: Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines. Angewandte Chemie International Edition. 2003,42（44）、第5472〜5474頁
【非特許文献２】Ohkuma T et al. Trans-RuH（eta1-BH4）（binap）（1,2-diamine）:a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions. Journal of the American Chemical Society.2002, 124（23）、第6508〜6509頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、既存技術におけるω−トランスアミナーゼがキラルアミンの産業化生産の需要を満たすことができない欠陥を解消できるＲ型ω−トランスアミナーゼ及びその応用を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を実現するため、本発明の一態様によると、Ｒ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を提供し、該Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は以下の配列から選ばれる一つである：ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列、ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列であって、但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列により符号化されたアミノ酸配列ではないアミノ酸配列、ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加することで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２から派生し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性の蛋白質であって、但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列により符号化されたアミノ酸配列ではない蛋白質。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
【０００９】
さらに、上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第１９９位のロイシンをバリンに置換したアミノ酸配列である。
【００１０】
本発明の他の一態様によると、上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体の符号化を行うヌクレオチドを提供する。
【００１１】
さらに、ヌクレオチドの配列は以下の配列から選ばれる一つである：ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列、ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼを符号化するヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、ｃ）厳密な条件でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼを符号化するヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
【００１２】
本発明の他の一態様によると、上述したいずれかのヌクレオチドが有効に接続されている組換えベクターを提供する。
【００１３】
さらに、組換えベクターはｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣである。
【００１４】
本発明の他の一態様によると、上述したいずれかの組換えベクターにより形質転換又は形質導入される宿主細胞を提供する。
【００１５】
本発明の他の一態様によると、ケトン系化合物と、請求項１に記載のＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体と、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを、反応系で反応させてキラルアミンを得るキラルアミンの合成方法を提供する。
【００１６】
さらに、上記ケトン系化合物は
【化１】
2016537991.tif 000003
で、ここで、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０ナフテン基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であって、又は、Ｒ１とＲ２がカルボニル基の炭素と協同にＣ５〜Ｃ１０複素環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基とＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロ原子がそれぞれ独自に、窒素、酸素、硫黄から選ばれる少なくとも１種であって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基がそれぞれ独自に、置換されていないか又はハロゲン、アルコキシル基又はアルキル基の中の少なくとも一つの基によって置換されたものであって、好ましくは、ケトン系化合物
【化２】
2016537991.tif 000004
が
【化３】
2016537991.tif 000005
から選ばれる。
【００１７】
さらに、上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであって、ここで、好ましくは、ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００である。
【００１８】
さらに、上記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンで、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基の置換基はそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンである。
【００１９】
本発明の技術案を応用すると、高度の立体選択性を有するＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を利用することで、効率的に高いキラル純度のＲ体のキラルアミンを合成することができ、キラルアミンの産業化生産へ応用できる。
【００２０】
本願の一部を構成する図面は本発明を一層理解させるためのもので、本発明における例示的な実施例及びその説明は本発明を解釈するが、本発明を不当に限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のＲ型ω−トランスアミナーゼをキラルアミンの合成に応用した場合の化学反応を示すフローチャートである。
【図２】本発明のＲ型ω−トランスアミナーゼをキラルアミンの合成に応用した場合の化学反応方程式である。
【図３】本発明の実施例１中の酵素による消化の認定結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例１中の突然変異遺伝子をＰＣＲを行った後の測定結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例１中の組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢが表現する蛋白を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ここで、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例中の特徴を互いに結合することができる。以下、図面を参照しつつ実施例を結合して本発明を説明する。
【００２３】
用語解釈
用語「選択的／任意」又は「選択的に／任意に」はその後に記載の事件又は状況が発生する可能性があれば発生しない可能性もあることを表し、このような記載は該当事件又は状況が発生する場合と発生しない場合とを含む。例えば、以下の定義によって、「選択的に置換されたアルキル基」は「置換されていないアルキル基」（置換基によって置換されていないアルキル基）又は「置換されたアルキル基」（置換基によって置換されたアルキル基）とを表す。
【００２４】
本願に記載のＣ１〜ＣｎはＣ１〜Ｃ２、Ｃ１〜Ｃ３、……Ｃ１〜Ｃnを含む。例えば、前記「Ｃ１〜Ｃ４」基は該部分において１〜４個の炭素原子を含有することを表し、即ち、基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子又は４個の炭素原子を含有することを表す。
【００２５】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「アルキル基」は選択的に置換された直鎖又は選択的に置換された枝分鎖の脂肪族炭化水素系を指す。本願の「アルキル基」は１〜２０個の炭素原子を含有することが好ましく、例えば、１〜１０個の炭素原子を有し、１〜８個の炭素原子、又は１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子又は１〜３個の炭素原子を含有する。本願において、単独に又は組み合わせて使用される用語「アルコキシル基」はアルキル基エーテル基（Ｏ−アルキル基）を指し、アルコキシル基の非限定性実施例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等を含む。
【００２６】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「ハロゲン」又は「ハロゲン置換」は選択的に置換された基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基）の一つ又は複数の水素原子がフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子又はその組み合せに置換されたものを指す。
【００２７】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「芳香基／アリール基」は選択的に置換された芳香炭化水素基を指し、６個〜２０個の環炭素原子（環をなすための炭素原子）、例えば６〜１２個又は６〜１０個の環炭素原子を有する。縮合芳香環又は非縮合芳香環であることができる。
【００２８】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「ヘテロアリール基」は、任意に置換されたの一価ヘテロアリール基を指し、５〜２０個の骨格環原子、例えば５〜１２個又は５〜１０個の骨格環原子を有し、ここで、一つ又は複数の（例えば、１〜４個、１〜３個、１〜２個）環原子はヘテロ原子で、前記ヘテロ原子は独立に、酸素、窒素、硫黄、リン、ケイ素、セレン、錫から選ばれるヘテロ原子であるが、これに限定されることはない。前記基の環は二つの隣り合うＯ又はＳ原子は含まない。ヘテロアリール基は、単一環ヘテロアリール基又は多環ヘテロアリール基（例えば双環ヘテロアリール基、三環ヘテロアリール基等）を含む。
【００２９】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「複素環」又は「複素環基」は非芳香複素環を指し、ヘテロナフテン基とヘテロシクロアルケニル基を含む。ここで、一つ又は複数の（例えば、１〜４個、１〜３個、１〜２個）環原子はヘテロ原子であって、例えば酸素、窒素又は硫黄原子である。複素環基は、単一環複素環基（複素環基が一つの環を有する）又は多環複素環基（例えば、双環複素環基（複素環基が二つの環を有する）、三環複素環基等）を含む。
【００３０】
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「炭素環基」は非芳香族の炭素環を指し、ナフテン基とシクロアルケニル基とを含む。ナフテン基は単一環ナフテン基又は多環ナフテン基（例えば、２、３又は４個の環を有し、例えば双環ナフテン基である）であることができ、スピロ又はブリッジリングであることができる。炭素環基は３〜２０個の炭素原子を有することができ、例えば３〜１５個の環炭素原子又は３〜１０個の環炭素原子又は３〜６個の環炭素原子を有することができ、そして、０、１、２又は３個の二重結合及び／又は０、１又は２個の三重結合を有することができる。例えば、３〜８個又は３〜６個の環炭素原子のナフテン基を有する。
【００３１】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を指し、フッ素、塩素、臭素を指すことが好ましい。シアノ基は「−ＣＮ」を指し、ヒドロキシ基は「−ＯＨ」を指し、メルカプト基は「−ＳＨ」を指し、アミノ基は「−ＮＨ２」を指す。
【００３２】
用語「置換された」は一つの特定の原子の一つ又は更に多い水素が所定の基によって切り替えられたことを言い、所定の原子の正常な原子価が今の状況で越えていないと、置換後の結果は安定的な化合物である。
【００３３】
背景技術部分に記載のように、既存技術におけるω−トランスアミナーゼには依然としてキラルアミン化合物の製造の需要を満たすことのできない欠陥が存在し、上記状況を改善するため、本発明においてＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を提供し、該Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、下記の配列から選ばれる一つを含み、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列、ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列であって、但し、該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列で符号化されたアミノ酸配列ではないアミノ酸配列、ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列における一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠乏又は添加されることによってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２から派生され且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性の蛋白質であって、但し、該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列で符号化されたアミノ酸配列ではない蛋白質。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
【００３４】
本発明の上記高度の立体選択性を有するＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を利用することで、キラル高純度のＲ体のキラルアミンを効率的に合成することができ、キラルアミンの産業化生産に適合される。
【００３５】
本発明の上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼは、高度のＲ体立体選択性を有するω−トランスアミナーゼを指し、一実施形態において、本発明のトランスアミナーゼは配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すようなトランスアミナーゼを指す。上記トランスアミナーゼは、本発明において分子生物学の技術を利用して、アルスロバクター（Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ）から由来したトランスアミナーゼ遺伝子を突然変異及び分子改善を行ってＲ型ω−トランスアミナーゼを得る。ここで、アミノ酸配列を変更させない前提で、アルスロバクターから由来したトランスアミナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を最適化改善を行った後のトランスアミナーゼ遺伝子ｔａＡのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すとおりで、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：５に示すとおりである。
【００３６】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％又は９９.７％の同一性を有し且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：５に示すアミノ酸配列ではない配列を指す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列の中のトランスアミナーゼの触媒活性に核心作用を果たすアミノ酸配列を不変に保持した状況下、当業者であれば他の非活性位のアミノ酸配列を変更させて、得られるトランスアミナーゼのアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％以上になるようにすることができる。このようにして得られたトランスアミナーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
【００３７】
同じ理由により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列の中のトランスアミナーゼの触媒活性に核心作用を果たすアミノ酸配列を不変に保持した状況下、上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列の中のアミノ酸において一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加を行って、このようにしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２から派生された蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すトランスアミナーゼの高度の立体選択性を保持することができる。ここで、置換、欠乏又は添加を行う塩基性基は一つ又は複数であることができ、例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個又は５０個のアミノ酸であることができ、例えば保存アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）の置換を行うことができ、ここで、該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：５に示すアミノ酸配列ではない。「保存アミノ酸の切り替え」とは、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒの組み合せを指す。
【００３８】
ここで、立体選択性とは、一つの反応を経てＡとＢの二つの立体異性体を得た時、Ａの生産高がＢより多いことを言う。高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指し、例えば少なくとも約１.２倍、少なくとも約１.３倍、少なくとも約１.４倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であることができ、又は更に高いことも可能である。
【００３９】
本発明において、上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼの修飾物は化学修飾物で、例えばアシル化、アルキル基化、ＰＥＧ化産物であることができ、これらの修飾物が上記高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性を保留していればよい。上記機能同等物は、Ｒ型ω−トランスアミナーゼ活性を実現できる他のポリペプチド破片を指す。上記機能破片は、高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性のω−トランスアミナーゼ活性を保留した蛋白質破片を指す。上記変異体は、一つ又は複数（幾つかの）の位置の一つ又は複数のアミノ酸を変更させることで、即ち置換、挿入及び／又は欠乏を行うことでｐａｒｅｎｔａｌ蛋白質から派生されるポリペプチドを指す。
【００４０】
本発明の一好適な実施例において、上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第１９９位のロイシンをバリンで置換したアミノ酸配列である。該アミノ酸置換を行ったトランスアミナーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すトランスアミナーゼと同一な活性及び機能を有する。
【００４１】
他の典型的な実施形態において、ヌクレオチドを提供し、該ヌクレオチドによって上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体の符号化を行う。本発明の上述したＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体のヌクレオチドによる符号化ルールは通常のコドン使用テーブルに符合する。
【００４２】
本発明の一好適な実施例において、上記ヌクレオチドの配列は、以下の配列から選ばれた一つの配列である：ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列、ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列；ｃ）厳密な条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
【００４３】
上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列は、例えば少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％、９９.８％又は９９.９％の同一性を有し、ここで、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではない。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列に基づいて、トランスアミナーゼ触媒活性に核心作用を果たすヌクレオチド配列を不変に保持した状況下、当業者であれば他の非活性位のヌクレオチド配列を変更させることで得られるトランスアミナーゼのヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％以上になるようにすることができる。このようにして得たトランスアミナーゼはヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
【００４４】
上記厳密な条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：４に示すヌクレオチド配列ではない。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列に基づいて、厳密な条件で、それと交雑可能であると共に、高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列を選別すると、このようにして得たＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列の変異体配列は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
【００４５】
ここで、立体選択性とは、一つの反応を経てＡとＢの二つの立体異性体を生成した時、Ａの生産高がＢより多いことを指す。高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指し、例えば少なくとも約１.２倍、少なくとも約１.３倍、少なくとも約１.４倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であることができ、又は更に高いこともできる。
【００４６】
一例示的な厳密な条件として、６  Ｘ  ＳＳＣ、０.５％  ＳＤＳの溶液を利用して、６５°Cで交雑し、その後２  Ｘ  ＳＳＣ、０.１  ％  ＳＤＳ  と  １  Ｘ  ＳＳＣ、０.１  ％  ＳＤＳを利用して膜をそれぞれ一回ずつ洗浄する。
【００４７】
本発明において使用される用語「同一性」は本分野の通常の既知の意味である配列類似性又は相同性を持つことを指し、当業者であれば異なる配列間の同一性を測定するルール、標準を理解できる。本発明において異なるレベルの同一性で限定する配列は同時に高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの活性を有しなければならない。当業者であれば該高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの活性を利用して変異体配列を選別する方法及び手段を理解できる。当業者であれば本願に開示された内容から示唆を得てこのような変異体配列を容易に得ることができる。
【００４８】
当業者であれば、本発明において前記アミノ酸配列又はポリヌクレオチドを限定する際に「含む」を用いているが、上記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の両端にその機能と関係ない他の配列を任意に追加できることを意味することではないことを理解できる。当業者であれば、組換え操作の要求を満たすため、前記ポリヌクレオチドの両端に適切な限定性エンドヌクレアーゼの酵素消化位を追加する、又は開始コドン、終了コドン等を別途に追加しなければならないので、閉鎖式の表現で上記配列を限定すると、このような状況をカバーできないことを理解できる。
【００４９】
当業者であれば、符号化されたアミノ酸を変更させない状況下、上記ヌクレオチド配列の中の一つ又は複数のコドンを等同意義での取り替えを行うことが可能であることを理解でき、例えばＣＴＴにより符号化されたロイシンＬｅｕをＣＴＡ、ＣＴＣ又はＣＴＧに取り替えることができる。取り替えられるコドン数量は一つ又は複数のコドンであることができ、例えば１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のコドンであることができる。コドン使用テーブルは本分野の周知のものである。
【００５０】
本発明の他の一態様によると組換えベクターを提供し、該組換えベクターに上述したいずれか一つのヌクレオチドが有効に接続されている。本発明の組換えベクターは組換え発現ベクターを含むがこれに限定されることはなく、組換えクローニングベクターを含むこともできる。組換えベクターは原核発現ベクター又は真核発現ベクターであることができ、本発明の一実施例において、上記組換えベクターは発現を誘導可能な組換え原核発現ベクターである。例えば、ｐＥＴ２２ｂベクターのような、ＩＰＴＧを利用して遺伝子の発現を誘導するｐＥＴシリーズのベクターである。ここで、「有効に接続される」とは、このような接続方式、つまりポリヌクレオチドをベクターの適切な位置に置くことで、ポリヌクレオチドが正確且つ順調にコピー、転写及び／又は翻訳されるようにすることを指す。本発明の他の一好適な実施例において、本発明の上記組換えベクターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示すヌクレオチド配列を含有するｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣである。
【００５１】
本発明の他の一態様において宿主細胞を提供し、該宿主細胞は上述したいずれかの組換えベクターが形質転換又は形質導入されている。本発明の宿主細胞は原核宿主細胞と真核宿主細胞とを含み、本発明の一実施例において、上記宿主細胞は原核宿主細胞で、例えば大腸菌であって、大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）であることがさらに好ましい。
【００５２】
本発明の他の一態様においてキラルアミンの合成方法を提供し、該方法は、ケトン系化合物と、請求項１に記載のＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体と、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを反応系で反応させてキラルアミンを得ることを含む。本発明のキラルアミンの合成方法によると、本分野の通常の生物酵素触媒反応によってキラル化合物を製造する方法に基づいて、反応系の各種の反応原料の成分、比例、使用量、ｐＨ値、温度、反応時間等のパラメータを適切に変更させている。
【００５３】
本発明の一好適な実施例において、上記ケトン系化合物は
【化４】
2016537991.tif 000006
であって、ここで、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０ナフテン基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であって、又はＲ１とＲ２はカルボニル基の炭素と協同にＣ５〜Ｃ１０複素環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基とＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロ原子はそれぞれ独自に、窒素、酸素、硫黄から選ばれる少なくとも一つであって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基はそれぞれ独自に、置換されておらず又はハロゲン、アルコキシル基又はアルキル基の中の少なくとも一つの基によって置換され、そして、ケトン系化合物
【化５】
2016537991.tif 000007
が
【化６】
2016537991.tif 000008
から選ばれることが好ましい。上記ケトン系化合物は商業化された原料又は簡単に製造できる原料であって価格が低く、大量生産の需要を満たすことができる。
【００５４】
本発明の他の一好適な実施例において、上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであって、ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００であることが好ましい。カオトロピック剤は反応が順調に行われるように上記原料を良好に溶解させる作用を果たし、ＰＥＧ−４００は溶解触媒効果が一層良好である。
【００５５】
本発明の他の好適な実施例において、上記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンであって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基の中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基の置換基はそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンである。上記原料は商業化された原料又は簡単に製造できる原料であって、価格が低く、大量生産の需要を満たすことができる。
【００５６】
本発明の一好適な実施例において、上記反応系は反応系のｐＨ値を７.０〜９.５の範囲に維持するための緩衝液を含有し、及び／又は、ケトン系化合物とカオトロピック剤の使用量比例は１ｇ／１ｍＬ〜１５ｍＬであって、及び／又は、ケトン系化合物と緩衝液の使用量比例は１ｇ／１５ｍＬ〜５０ｍＬであって、及び／又は、ケトン系化合物とピリドキサールリン酸の使用量比例は１ｇ／０.０１ｇ〜０.１ｇであって、及び／又は、ケトン系化合物とアミノ基供与体の使用量比例は１ｅｑ／１ｅｑ〜５ｅｑであって、及び／又は、ケトン系化合物とＲ型ω−トランスアミナーゼの使用量比例は１ｇ／０.２g〜１０ｇであって、及び／又は、反応系の温度は２０〜４５℃であって反応時間は１２ｈ〜４８ｈであって、及び／又は、緩衝液はリン酸塩緩衝液又はｐＨ＝９.３〜９.５のトリエタノールアミン緩衝液である。
【００５７】
本発明の他の一好適な実施例において、上記方法はさらに、塩基で反応系をｐＨ≧１０まで調節し、有機溶剤で水相中の製品であるキラルアミンを抽出する工程を含み、好ましくは、塩基が水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで、有機溶剤が酢酸エチル、メチルtert‐ブチルエーテル又は２−メチルテトラヒドロフランであることが好ましい。
【００５８】
以下、具体的な実施例を結合して本発明の有益な効果を説明する。
【実施例】
【００５９】
実施例１：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの製造
本発明のＲ型ω−トランスアミナーゼの製造方法の具体的な工程は以下のとおりである：
【００６０】
（１）モデルの構築：
アミノ酸配列を変更させない前提で、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ.）から由来したトランスアミナーゼ遺伝子ＴＡＳ部分のヌクレオチドを最適化し、最適化されたトランスアミナーゼ遺伝子ｔａＡ（配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.:４に示すとおりで、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.:５に示すとおりである）を合成し（生工生物工程（上海）有限会社）、合成されたｔａＡ遺伝子をベクターｐＵＣ５７に接続して組換えプラスミドｐＵＣ−ｔａＡを得て、その後、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限性エンドヌクレアーゼを利用して、組換えプラスミドｐＵＣ−ｔａＡとベクターｐＥＴ−２２b（+）を同時に酵素消化を行って、酵素消化産物をT４  ＤＮＡ接続酵素で接続反応させ、接続産物を大腸菌ＤＨ５α菌株の受容性細胞に形質転換し、振分盤による復活を経て、アンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃の培養器で一夜培養する。上記ペトリ皿上のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質に接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎで一夜振動培養し、プラスミドを抽出し、ＰＣＲと酵素消化認定を行って、酵素消化認定結果は図３に示す。
【００６１】
図３はｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡプラスミドをＮｄｅＩ酵素とＸｈｏＩ酵素との二つの酵素消化を経た後の認定結果を示す図で、１はｐＥＴ２２ｂ空きベクターを表し、２はＤＮＡ分子サイズマークを表し（上から下へそれぞれ、１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ）、３はｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡ−ＤＨ５αを表す。図３に示すように、酵素消化後の破片サイズが１０００ｂｐ程度である比較的に弱いストライプが目標破片であって（目標破片を切り出した後のプラスミドストライプは比較的に強い）、これにより、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡの挿入配列の挿入方向及びサイズは正確であることを確定することができ、その後、正確な組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡを次の突然変異の鋳型とする。
【００６２】
（２）遺伝子突然変異のクローニング及び発現：
ＮＣＢＩ報道に基づいて、５'−ＡＴＧＧＣＧＴＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＣＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＣＣＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＣＣＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＣＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：３）の遺伝子を設計する。
【００６３】
上記遺伝子の正反方向配列をプライマーとし、上記組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡを鋳型とし、全プラスミドＰＣＲを行って、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化後に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、振分盤による復活を経てアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃で一夜培養する。上記ペトリ皿中のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質５ｍＬに接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ  で一夜培養する。菌液を生工生物工程（上海）有限会社に持っていて測定し、測定された菌液の組換えプラスミドをＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢと命名し、その測定結果とプライマー配列(ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ.３)及びｔａＡ比較結果は図４に示す。
【００６４】
図４に示すように、測定結果においてＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢプラスミドに携帯した、上記ｔａＡ遺伝子をＡＴＧから開始する１９８ｂｐの配列を上記設計した配列に完全に切り替えられ、予期と完全に一致し、突然変異した塩基性基はなかった。測定を経て正確が検証された後、該組換えプラスミドを目標プラスミド配列とした。
【００６５】
上記菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質５ｍＬに接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、同時に、ＩＰＴＧ誘導剤を添加していない培養液を陰性対照とした。１６ｈ誘導した後、菌液を取り出し、１２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心処理して菌体を得た。菌体を超音波破砕器を利用して細胞破砕し、超音波パラメータは、ヘッドプローブ直径は６ｍｍで、出力は２００Ｗで、２ｓ動作し、６ｓ間欠的に休憩し、合計で１０ｍｉｎ行い、超音波処理後に４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理を経て、超音波上澄みと沈殿物を取得し、上澄みに垂直電気泳動装置を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定を行った。
【００６６】
検定結果は図５の組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢ蛋白質発現図に示し、ここで、１はｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢを表し、２はｐＥＴ２２ｂ−ｔａＡを表し、３はｐＥＴ２２ｂを表し、４は蛋白質ＭＡＲＫＥＲ  （上から下へそれぞれ、９７.４ＫＤａ、６６.２ＫＤａ、４３ＫＤａ、３１ＫＤａである）を表す。図５の結果に示すように、蛋白質発現は良好であって、ＴａＡ蛋白質発現状況と明確な差異がない。測定結果は挿入されたヌクレオチド配列が正確であることを表す。
【００６７】
（３）ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣの取得：
上記組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｔａＢを鋳型として、標準的な連続エラーＰＣＲを（エラーＰＣＲ反応系は、１０×ＰＣＲ  緩衝液  １０  ｕｌ、ｄＮＴＰ  １０ｍＭ  ２ｕｌ、ｄＣＴＰ  １０ｍＭ  １ｕｌ、ｄＴＴＰ  １０ｍＭ  １ｕｌ、プライマー各１０ｕＭ  １ｕｌ、鋳型５０ｎｇ／ｕｌ  ３ｕｌ、Taq  ＤＮＡ重合酵素  ０.５ｕｌ、ＭｇＣｌ２  ７ｍＭ  １.４ｕｌ、ＭｎＣｌ２  ０.０５ｍＭ  ０.２ｕｌ、Ｈ２Ｏ  ７６.９ｕｌ）を行う。プライマーセンスストランドは５−ＣＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＧ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：６）である。プライマーアンチセンスは５−ＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＧＣ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：７）で、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化後に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、アンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃で一夜培養し、大量のシングルコロニーを得る。上記ペトリ皿上のシングルコロニーを選別してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基５ｍＬに接種し、大量の突変異体を取得した。
【００６８】
その後、取得した大量の突然変異体にトランスアミナーゼ酵素活性検証を行って、検証工程は以下を含む：
【００６９】
突然変異体菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培養基１００ｍＬに接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、同時に、ＩＰＴＧ誘導剤を添加していない培養液を陰性対照とした。１６ｈ誘導した後、菌液を取り出して、１２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。０.５ｇの菌体を計って再懸濁させ２.５ｍＬトリエタノールアミン緩衝液  （ｐＨ９.５）菌体と超音波破砕器で細胞破砕し、超音波パラメータはプローブ直径が６ｍｍで、出力が２００Ｗで、２ｓ動作し、６ｓ間欠的に休憩し、合計で１０ｍｉｎ行い、超音波処理を終了した後、４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理を行って、超音波上澄みと沈殿物を取得し、上澄みを酵素活性の検証に用いた。
【００７０】
反応瓶に０.１ｇの主原料（Ｎ−ＢＯＣ−ピペリドン、ＣＡＳ：７９０９９−０７−３）と０.１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、７.５ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.５９１ｇ  イソプロピルアミン、０.００２５gピリドキサールリン酸、２.５ｍＬ上記大量の突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨで１０以上に調節し、酢酸エチルで二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得た（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定を経て、反応性が最も優れている一つの突変異体を選別し、その形質転換率は９２.７％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【００７１】
測定の結果、得られた酵素活性が最も良好な突変異体の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１が発現したＲ型トランスアミナーゼをＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣと命名した。
【００７２】
（４）Ｒ型ω−トランスアミナーゼの製造：
上記菌株ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ｔａＣ菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基に接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、１６ｈ誘導した後、発酵液を取り出して、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。菌体に細胞破砕を行った後、４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理して上澄みを取得し、これが製造したＲ型ω−トランスアミナーゼであって、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すとおりである。
【００７３】
実施例２：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの活性テスト１
反応瓶に１ｇ主原料（Ｎ−ＢＯＣ−ピペリドン、ＣＡＳ：７９０９９−０７−３）と１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、５０ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５まで調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.７６５g  イソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.０１ｇ上記アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを用いて１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得て（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９０.８％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【００７４】
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ−ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４.００−３.７８（ｍ，２Ｈ）、３.８０（ｍ，２Ｈ）、３.６０（ｍ，１Ｈ）、１.９０（ｍ，１Ｈ）、１.７０（ｍ，１Ｈ）、１.６０−１.４０（ｍ，１２Ｈ）、１.３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍである。
【００７５】
実施例３：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの活性テスト２
反応瓶に０.１ｇ主原料（２,４−ジクロロアセトフェノン、ＣＡＳ:  ２２３４−１６−４）と１.５  ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２３.５ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）、０.０３１  gイソプロピルアミン、０.００７５ｇピリドキサールリン酸、０.０２ｇ  上記アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示す突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは８.０で、４５℃の恒温で２０ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物  （（Ｒ）−２,４−ジクロロフェネチルアミン）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は９５％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【００７６】
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ  Ｄ６）：δ＝７.６７  （ｄ  １Ｈ）,  ７.６０  （ｄ，１Ｈ）、７.４７  （ｄｄ，１Ｈ）、７.３４（ｄｄ，４Ｈ）、７.２３−７.１２（ｍ，６Ｈ）、４.８４（ｓ，１Ｈ）、４.４７  （ｑｕａｒｔｅｔ，１Ｈ）、１.３１（ｄ，３Ｈ）である。
【００７７】
実施例４：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの活性テスト３
反応瓶に０.１ｇ主原料（２−アセトナフトン、ＣＡＳ：９３−０８−３）と１ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２４ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨが７.０）、０.１７ｇイソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.００４g上記突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは７.０で、２０℃の恒温で４８ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物（Ｒ）−（+）−１−（２−ナフチル基）エチラミンＣＡＳ：３９０６−１６−９）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は２７％で、ｅ.ｅ値は９９.５％であった。
【００７８】
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７.８６−７.７６（ｍ，４Ｈ）、７.５２−７.４１  （ｍ，３Ｈ）、４.２９（ｑ，Ｊ＝６.４Ｈｚ，１Ｈ）、１.７４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、１.４８（ｄ，Ｊ＝６.４Ｈｚ，３Ｈ）である。
【００７９】
実施例５
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２であるトランスアミナーゼを基に、該トランスアミナーゼを第１９９位のイソロイシンに突然変異させて、イソロイシンをバリンに置換して、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：８で符号化されたトランスアミナーゼを得た。
【００８０】
該トランスアミナーゼに酵素活性テストを行って検定し、検定工程は以下のようである：
突然変異体菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基１００ｍＬに接種し、３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、同時に、ＩＰＴＧ誘導剤を添加していない培養液を陰性対照とした。１６ｈ誘導した後、菌液を取り出して、１２０００ｒ／ｍｉｎで、５ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。０.５ｇの菌体を計って再懸濁させ２.５ｍＬトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９.５）菌体と超音波破砕器で細胞破砕し、超音波パラメータはプローブ直径が６ｍｍで、出力が２００Ｗで、２ｓ動作し、６ｓ間欠的に休憩し、合計で１０ｍｉｎ行って、超音波処理後に４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理して超音波上澄みと沈殿物を得て、上澄みは酵素活性のテスト反応へ用いた。
【００８１】
反応瓶に０.１ｇ主原料（Ｎ−ＢＯＣ−ピペリドン、ＣＡＳ：７９０９９−０７−３）と０.１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、７.５ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５に調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.５９１ｇ  イソプロピルアミン、０.００２５ｇピリドキサールリン酸、２.５ｍＬ上記突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物  （中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）を得て、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９１.６％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【００８２】
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ−ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４.００−３.７８（ｍ，２Ｈ）、３.８０（ｍ，２Ｈ）、３.６０（ｍ，１Ｈ）、１.９０（ｍ，１Ｈ）、１.７０（ｍ，１Ｈ）、１.６０−１.４０（ｍ，１２Ｈ）、１.３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍである。
【００８３】
上述のように、本発明の上記実施例によると、以下のような技術効果を実現できる：本発明に開示された新規のトランスアミナーゼは、アミノ基供与体の中のアミノ基がプロキラルケトン又はアルデヒド系へ移転されることを触媒し、対応するＲ体のキラルアミンを生成する。本発明の新規のトランスアミナーゼを利用して合成アミノを製造すると、さらに多い反応物質を転化させることができ、得られるＲ体キラルアミンは純度が高く、９８％以上に安定することになる。上述した合成方法に用いられる原料は容易に入手できるものであって、方法は簡単で、化学反応の条件は温和であって、収率及び鏡像体の純度も高く、生産全般において操作が簡単で、実行可能なものであって且つ汚染の低い合成工程で、キラルアミンの製造のために新しいルート及び方法を提供した。
【００８４】
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者であれば本発明に様々な修正や変形が可能である。本発明の精神や原則内での如何なる修正、置換、改良などは本発明の保護範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年5月27日(2016.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
反応瓶に０.１ｇの主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と０.１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、７.５ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.５９１ｇ  イソプロピルアミン、０.００２５gピリドキサールリン酸、２.５ｍＬ上記大量の突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨで１０以上に調節し、酢酸エチルで二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得た（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定を経て、反応性が最も優れている一つの突変異体を選別し、その形質転換率は９２.７％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
実施例２：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの活性テスト１
反応瓶に１ｇ主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、５０ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５まで調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.７６５g  イソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.０１ｇ上記アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示すＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを用いて１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得て（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９０.８％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例３：Ｒ型ω−トランスアミナーゼの活性テスト２
反応瓶に０.１ｇ主原料（２,４−ジクロロアセトフェノン、ＣＡＳ:  ２２３４−１６−４）と１.５  ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２３.５ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）、０.０３１  gイソプロピルアミン、０.００７５ｇピリドキサールリン酸、０.０２ｇ  上記アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示す突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは８.０で、４５℃の恒温で２０ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物  （［（Ｒ）−（＋）−１−（２,４−ジクロロフェニル）エチル］アミン、ＣＡＳ：１３３７７３−２９−２）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は９５％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
反応瓶に０.１ｇ主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と０.１ｍＬ  ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、７.５ｍＬ  ０.２ｍｏｌ／Ｌの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５に調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.５９１ｇ  イソプロピルアミン、０.００２５ｇピリドキサールリン酸、２.５ｍＬ上記突然変異のＲ型ω−トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物  （中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）を得て、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９１.６％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
【国際調査報告】
2016537991.tif 000017
2016537991.tif 000018
2016537991.tif 000019
2016537991.tif 000020