(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１から１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１から１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号７９に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号７９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡで形質転換された微生物を培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を培地に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項５】
前記微生物が前記ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換されている、請求項４に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項６】
前記微生物がコリネ型細菌に属する、請求項４又は５に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項７】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム又はコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスである、請求項４から６の何れか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である、請求項４から７の何れか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高温耐性コリネ型細菌であるコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの耐熱性酵素遺伝子、特にＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸生合成系酵素及び取り込み系遺伝子に関する。
背景技術
現在、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造は、コリネ型細菌による発酵生産が主流となっている。アミノ酸の発酵生産は、生産能に優れた菌株の育種や発酵技術の開発によって、コストダウンが図られている。従来、コストダウン実現の方向性は、高収率化が主なものであるが、発酵におけるコストとしては、原料以外にも培養中に発生する発酵熱の冷却エネルギーを無視することはできない。すなわち、発酵に用いられている通常の微生物は、発酵中に自らが発生する発酵熱により培地の温度が上昇し、発酵に必要な酵素が失活したり生産菌が死滅したりするために、発酵中に培地を冷却することが必要となっている。したがって、冷却費用を低減するために、高温での発酵に関する検討が古くから行われている。また、高温で発酵を行うことが可能となれば、反応速度を向上させることができる可能性もある。しかし、これまでのところ、Ｌ−アミノ酸発酵において、有効な高温培養は実現していない。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）は、Ｌ−アミノ酸の発酵に汎用されているコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ））等と同様にコリネ型細菌に分類される細菌であるが、生育至適温度はコリネバクテリウム・グルタミカムの３０〜３５℃に対して３７〜４３℃と高く、Ｌ−グルタミン酸生成の至適温度も４２〜４５℃とかなり高温側にシフトしている（特開昭６３−２４０７７９号）。
ところで、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＬ−アミノ酸合成系酵素をコードする遺伝子を導入することにより、同Ｌ−アミノ酸の生産能を増強する技術が開発されている。例えば、このような酵素として、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素であるクエン酸シンターゼ（特公平７−１２１２２８号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開昭６３−２１４１８９号）等がある。
しかし、高温耐性のコリネ型細菌由来のＬ−アミノ酸生合成酵素及びそれらをコードする遺伝子は報告されていない。
発明の開示
本発明は、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス由来の酵素、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムよりも高い温度で機能する酵素をコードする遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのアミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子、又はアミノ酸の細胞内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、５０℃、５分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有するイソシトレートリアーゼ活性を有するタンパク質。
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するアシルＣｏ−Ａカルボキシラーゼ活性に関与するタンパク質。
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するＤｔｓＲ活性を有するタンパク質。
（４）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するＤｔｓＲ活性を有するタンパク質。
（５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６０℃で３０℃における活性と同等又はそれ以上のホスホフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスにシュークロース資化能を付与する活性を有するタンパク質。
（７）配列番号１７〜２０に記載のアミノ酸配列のいずれかを有するタンパク質、又は、前記アミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するグルタミン酸の取り込みに関与する機能を有するタンパク質。
（８）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（９）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４５℃、５分の熱処理後に５０％以上の残存活性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、５０℃、３分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有するアコニターゼ活性を有するタンパク質。
（１２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４５℃、１０分の熱処理後に５０％以上の残存活性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスに由来するジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１４）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、５０℃、１０分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有する２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１５）配列表の配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１６）配列表の配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、３７℃で２３℃における活性と同等又はそれ以上のクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（１７）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、イソシトレートリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１８）下記（ａ１）又は（ｂ１）に示すＤＮＡである（１７）のＤＮＡ。
（ａ１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イソシトレートリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１９）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アシルＣｏ−Ａカルボキシラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２０）下記（ａ２）又は（ｂ２）に示すＤＮＡである（１９）のＤＮＡ。
（ａ２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アシルＣｏ−Ａカルボキシラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２１）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ＤｔｓＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２２）下記（ａ３）又は（ｂ３）に示すＤＮＡである（２１）のＤＮＡ。
（ａ３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤｔｓＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２３）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ＤｔｓＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２４）下記（ａ４）又は（ｂ４）に示すＤＮＡである（２３）のＤＮＡ。
（ａ４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤｔｓＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ホスホフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２６）下記（ａ５）又は（ｂ５）に示すＤＮＡである（２５）のＤＮＡ。
（ａ５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２７）配列番号９３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、インベルターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２８）下記（ａ６）又は（ｂ６）に示すＤＮＡである（２７）のＤＮＡ。
（ａ６）配列表の配列番号９３に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ６）配列表の配列番号９３に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インベルターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２９）配列番号１７〜２０に記載のアミノ酸配列のいずれかを有するタンパク質、又は、前記アミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸の取り込みに関与する機能を有するタンパク質、をコードするＤＮＡ。
（３０）下記（ａ７）又は（ｂ７）に示すＤＮＡである（２９）のＤＮＡ。
（ａ７）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ７）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミン酸の取り込みに関与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３２）下記（ａ８）又は（ｂ８）に示すＤＮＡである（３２）のＤＮＡ。
（ａ８）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ８）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３３）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３４）下記（ａ９）又は（ｂ９）に示すＤＮＡである（３３）のＤＮＡ。
（ａ９）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ９）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３５）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３６）下記（ａ１０）又は（ｂ１０）に示すＤＮＡである（３５）のＤＮＡ。
（ａ１０）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１０）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３７）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３８）下記（ａ１１）又は（ｂ１１）に示すＤＮＡである（３７）のＤＮＡ。
（ａ１１）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１１）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アコニターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３９）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４０）下記（ａ１２）又は（ｂ１２）に示すＤＮＡである（３９）のＤＮＡ。
（ａ１２）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１２）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４１）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４２）下記（ａ１３）又は（ｂ１３）に示すＤＮＡである（４１）のＤＮＡ。
（ａ１３）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１３）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４４）下記（ａ１４）又は（ｂ１４）に示すＤＮＡである（４３）のＤＮＡ。
（ａ１４）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１４）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４５）配列表の配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４６）下記（ａ１５）又は（ｂ１５）に示すＤＮＡである（４５）のＤＮＡ。
（ａ１５）配列表の配列番号７９に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１５）配列表の配列番号７９に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４７）配列表の配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、３７℃で２３℃における活性と同等又はそれ以上のクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４８）下記（ａ１６）又は（ｂ１６）に示すＤＮＡである（４７）のＤＮＡ。
（ａ１６）配列表の配列番号８９に記載の塩基配列からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ１６）配列表の配列番号８９に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製されるプライマーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３７℃で２３℃における活性と同等又はそれ以上のクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４９）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、（１７）〜（４８）のいずれかのＤＮＡが導入された微生物を培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を培地に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
以下、上記の各ＤＮＡのいずれか、又はこれらを総称して、本発明のＤＮＡということがある。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡの塩基配列及び遺伝子名、並びに本発明のＤＮＡがコードするタンパク質を表１に示す。
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尚、配列番号３、２３、２５、３１及び３３におけるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、及び配列番号１６の４番目のＯＲＦはいずれもＧＴＧから始まっている。配列表にはこのＧＴＧによりコードされるアミノ酸はバリンとして記載されているが、メチオニンである可能性がある。
また、配列番号１６は４つのＯＲＦを含み、５’側から順にｇｌｕＡ、ｇｌｕＢ、ｇｌｕＣ及びｇｌｕＤに対応する。
上記の各ＤＮＡは、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４２）の染色体ＤＮＡから単離されたものである。但し、ＡＪ１２３１０株は、インベルターゼ活性及びシュークロース資化性を持たず、同株から単離したｓｃｒＢ遺伝子断片には、オープンリーディングフレームが存在しなかったため、配列番号１１及び１３に示すＤＮＡは、インベルターゼ活性及びシュークロース資化性を有するコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）及びＡＪ１２３０９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４１）からそれぞれ単離されたものである。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株（ＹＳ−３１４株とも称される）及びＡＪ１２３０９株（ＹＳ−１５５株とも称される）は、１９８７年３月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、各々順にＦＥＲＭ  Ｐ−９２４６及びＦＥＲＭ  Ｐ−９２４５の受託番号で寄託され、１９８７年１０月２７日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４２及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４１が付与されている。
ＡＪ１２３４０株（ＹＳ−４０株とも称される）は、１９８７年３月１３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−９２７７の受託番号で寄託され、１９８７年１０月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９が付与されている。
尚、配列番号１１、１３及び１５に示す塩基配列は、ｓｃｒＢの部分配列であって、配列番号１１及び１３は配列番号１２及び１４に示すインベルターゼの部分アミノ酸配列をコードしている。
目的とする遺伝子の部分断片を含むＤＮＡは、すでに報告されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等の種々の微生物の目的とする遺伝子の塩基配列の比較を行い、塩基配列がよく保存されている領域を選択し、その領域の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことによって、取得することができる。得られたＤＮＡ断片又はその配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、目的とする遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。また、得られた遺伝子の部分断片を用いてゲノムウォーキングを行うことによっても、目的とする遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。ゲノムウォーキングと、市販のキット、例えばＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて行うことができる。
例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）をコードするＤＮＡ（以下、「ｇｄｈ」ともいう）は、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、例えばコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号７７及び７８に示す塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により部分断片を取得することができる。さらに、得られた部分断片を用いてゲノムウォーキングを行うことにより、ｇｄｈ遺伝子全体を取得することができる。
また、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」ともいう）をコードするＤＮＡ（以下、「ｇｌｔＡ」ともいう）は、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、例えばコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の染色体ＤＮＡから、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号８３及び８４に示す塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により部分断片を取得することができる。さらに、得られた部分断片を用いてゲノムウォーキングを行うことにより、ｇｌｔＡ遺伝子全体を取得することができる。
上記プライマーの塩基配列は、すでに報告されている種々の微生物のｇｄｈ遺伝子又はｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列の比較を行い、塩基配列がよく保存されている領域を見出し、その領域の塩基配列に基づいて設計したものである。
同様に、他の酵素をコードするＤＮＡも、表１に示すプライマーを用いてそれらの酵素をコードする部分断片を取得することができ、得られた部分断片を用いて目的とする遺伝子全長を得ることができる。
本発明のＤＮＡは、上記のようにして取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの染色体ＤＮＡライブラリーから取得することもできる。
染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１．２１（１９８９）に記載されている。また、ゲノムウォーキングは、市販のキット、例えばＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて行うことができる。
次に、本発明のＤＮＡを取得する具体的な方法を例示する。
まず、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの染色体ＤＮＡを、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分画して約４〜６ｋｂのＤＮＡフラグメントを取得する。得られたＤＮＡフラグメントをｐＨＳＧ３９９等のクローニングベクターに挿入し、得られた組換えプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換して、染色体ＤＮＡのプラスミドライブラリーを作製する。
一方、プラスミドライブラリーから目的の遺伝子を含むクローンをＰＣＲにより選択するために用いるプライマーを作製する。このプライマーは、目的とする遺伝子に対応する種々の微生物の既知の遺伝子配列の間でアミノ酸レベルで保存されている領域に基づいて設計する。その際、コリネ型細菌のコドンユーセージを考慮してプライマーを複数組づつ設計する。
次に、作製されたプライマーの適正を調べるために、これらのプライマーを用いて、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。そして、増幅断片が得られたプライマーをスクリーニング用プライマーとして用い、プラスミドライブラリーから調製した組換えプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、目的とするＤＮＡ断片を含むクローンを選択する。この操作は、一次スクリーニングとして形質転換体数十株を含むバッチ毎に行い、二次スクリーニングとして増幅断片が得られたバッチについてコロニーＰＣＲを行うことにより、迅速に行うことができる。尚、増幅された遺伝子の断片長は、表２〜７に記載した。
上記のようにして選択された形質転換体から組換えＤＮＡを調製し、挿入断片の塩基配列をダイ・デオキシ・ターミネーション法等により決定し、塩基配列を既知の遺伝子配列と比較することによって、目的の遺伝子を含むことを確認する。
得られたＤＮＡ断片が、目的とする遺伝子の一部を含んでいる場合には、ゲノムウォーキングにより欠失部分を取得する。
本発明のＤＮＡは、コードされるタンパク質が本来の機能を有する限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、一般的に、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列全体に対し、３０から４０％以上、好ましくは５５〜６５％以上の相同性を有することが好ましい。具体的には、前記「数個」は、２〜数百個、好ましくは、２〜数十個、より好ましくは２〜１０個である。
塩基配列及びアミノ酸配列の相同性解析は、例えば、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｓｏｎの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）等により、市販のソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて計算することができる。
ＧＤＨは、ＧＤＨを構成するアミノ酸配列全体に対し、４０〜８０％以上、好ましくは８０〜９０％以上の相同性を有し、４２℃で３７℃におけるＧＤＨ活性と同等又はそれ以上の活性を有するものであってもよい。また、前記「数個」は、２から３００個、好ましくは、２から５０個、より好ましくは２から１０個である。
ＣＳは、ＣＳを構成するアミノ酸配列全体に対し、４０〜８０％以上、好ましくは８０〜９０％以上の相同性を有し、３７℃で２３℃におけるＣＳ活性と同等又はそれ以上の活性を有するものであってもよい。また、前記「数個」は、２から３００個、好ましくは、２から５０個、より好ましくは２から１０個である。
上記のような本来のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、目的の遺伝子をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び目的の遺伝子をコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの菌株の違い等に基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のタンパク質の活性又は機能を調べることにより、本来のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、そのようなＤＮＡは、変異を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば表１に示す各配列番号の塩基配列を有するＤＮＡもしくはそのコード領域又はその塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、当該タンパク質が本来有する活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても得ることができる。前記活性としては、ＧＤＨでは４２℃で、ＣＳでは３７℃で、各々の酵素活性を示すことが好ましい。
上記プローブは、表１に示す各配列番号の塩基配列を有するＤＮＡ、又はそれらの塩基配列を有するＤＮＡから、適当なプライマーを用いてＰＣＲにより調製することができる。
上記でいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、活性又は機能を調べることによって容易に取り除くことができる。
本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることにより、それぞれのＤＮＡに対応したタンパク質を製造することができる。
遺伝子の発現に用いる宿主としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリスをはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をはじめとする種々の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細胞、特にコリネ型細菌及びエシェリヒア・コリが好ましい。
本発明のＤＮＡは、エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌等の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０等が挙げられる。
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報参照）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
ｐＡＪ６５５    エシェリヒア・コリＡＪ１１８８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６）
コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０１（ＡＴＣＣ３９１３５）
ｐＡＪ１８４４  エシェリヒア・コリＡＪ１１８８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３７）
コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０２（ＡＴＣＣ３９１３６）
ｐＡＪ６１１    エシェリヒア・ＡＪ１１８８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３８）
ｐＡＪ３１４８  コリネバクテリウム・グルタミクムＳＲ８２０３（ＡＴＣＣ３９１３７）
ｐＡＪ４４０    バチルス・ズブチリスＡＪ１１９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４０）
ｐＨＣ４        エシェリヒア・コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５３２）
本発明のＤＮＡとコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、本発明のＤＮＡの末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
上記のように調製した組み換えＤＮＡをコリネ型細菌等の宿主に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））も応用できる。コリネ型細菌においては、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）が有効である。
また、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス等の高温耐性コリネ型細菌の形質転換は、宿主細胞の細胞壁の構造を変化させる薬剤で処理し、細胞壁の構造が変化した細胞とＤＮＡを含む溶液に電気パルスを印加することにより、効率よく形質転換を行うことができる。前記薬剤とは、薬剤で処理した細菌とＤＮＡを含む溶液に電気パルスを印加したときに、同細菌がＤＮＡを取り込むことができるように、細胞壁の構造を変化させることができる薬剤（以下、「細胞壁処理剤」ということがある）であり、細菌の正常な細胞壁の合成を阻害する薬剤、又は、細菌の細胞壁を溶解する薬剤が挙げられる。具体的には、リゾチーム、ペニシリンＧ、グリシン等が挙げられる。
細胞壁処理剤は１種でもよく、２種以上を用いてもよい。前記薬剤の中では、リゾチーム又はペニシリンＧが好ましく、リゾチームが特に好ましい。
さらに、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスの形質転換は、細胞壁を超音波処理（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５１，１３５−１３８（１９８７））等の物理的な方法で弱化させた宿主細胞とＤＮＡを含む溶液に電気パルスを印加することによっても、行うことができる。
本発明のＤＮＡに含まれる遺伝子の発現を効率的に実施するために、これらの遺伝子のコード領域の上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等のプロモーターを連結してもよい。ベクターとして、プロモーターを含むベクターを用いると、各遺伝子と、ベクター及びプロモーターとの連結を一度に行うことができる。
上記のようにして製造され得る本発明のタンパク質は、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析、溶媒沈殿等、通常の酵素の精製法を用いて精製することができる。
本発明のタンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカム等の対応するタンパク質に比べて、熱安定性に優れているか、又は高温下で高い活性を示すことが期待される。例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＧＤＨが３７℃付近で最もＧＤＨの比活性が高く、４２℃付近で活性は著しく低下するのに対し、本発明のＧＤＨは、４２℃で３７℃における活性と同等又はそれ以上のＧＤＨ活性を示す。好ましい実施態様では、本発明のＧＤＨは、４２℃付近で最も比活性が高く、４５℃でも活性を示す。
ＧＤＨ活性は、例えば、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸ナトリウム、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰＨに酵素を加え、３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって、測定することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）６，３１７−３２６）。
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳが２３℃付近で最もＣＳの比活性が高く、３３℃付近で活性が著しく低下するのに対し、本発明のＣＳは、３７℃で２３℃における活性と同等又はそれ以上の活性を示す。好ましい実施態様では、本発明のＣＳは、３７℃付近までは反応温度に依存して高い比活性を示し、４０℃でも３７℃における活性の約４割の活性を示す。
ＣＳ活性は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３，３−１１（１９６９）に記載の方法によって測定することができる。
さらに、本発明の他のタンパク質は、典型的には以下の性質を有する。イソシトレートリアーゼは、５０℃、５分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有する。ホスホフルクトキナーゼは、６０℃で３０℃における活性と同等又はそれ以上の活性を有する。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、４５℃、５分の熱処理後に５０％以上の残存活性を有する。アコニターゼは、５０℃、３分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、４５℃、１０分の熱処理後に５０％以上の残存活性を有する。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼは、５０℃、１０分の熱処理後に３０％以上の残存活性を有する。
本発明のタンパク質は、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、例えばコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の菌体破砕液から、それぞれの活性を指標として、通常の酵素の精製法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析、溶媒沈殿等の方法で精製することによって、取得することもできる。
本発明のＤＮＡのうち、ｐｆｋ、ｐｄｈＡ、ｐｃ、ｐｐｃ、ａｃｎ、ｉｃｄ、ｇｄｈ及びｇｌｔＡ（これらの遺伝子がコードする酵素名は表１に示す）は、コリネ型細菌等のＬ−アミノ酸生産菌に導入することによって、Ｌ−アミノ酸生産能を高めることができる。また、本発明のＤＮＡが導入されたコリネ型細菌は、通常よりも高い温度でのＬ−アミノ酸の生産が可能となることが期待される。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン及びＬ−グルタミン等が挙げられる。
例えば、ｇｄｈ遺伝子又はｇｌｔＡ遺伝子を、コリネ型細菌等のＬ−グルタミン酸生産菌に導入することによって、通常よりも高い温度でのＬ−グルタミン酸の生産が可能となることが期待される。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳは、通常の培養温度、例えば３１．５℃では十分に機能していない可能性があるが、本発明のｇｌｔＡ遺伝子を導入することによって、活性を高めることができる。
また、ｄｔｓＲ１及びｄｔｓＲ２は、コリネ型細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質（ＤＴＳＲ蛋白）をコードする遺伝子であり、これらの遺伝子が破壊されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成する。また、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、ｄｔｓＲ１及びｄｔｓＲ２遺伝子を増幅すると、著量のＬ−リジンを生産する能力が付与される（ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット、特開平１０−２３４３７１号公報）。
ｓｃｒＢ遺伝子は、シュークロースを含む培地でコリネ型細菌を用いてＬ−アミノ酸を製造する場合に、同コリネ型細菌の育種に用いることができる。
コリネ型細菌等のＬ−グルタミン酸生産菌において、ａｃｅＡ、ａｃｃＢＣ、ｌｐｄ又はｏｄｈＡを欠失させることにより、Ｌ−グルタミン酸生産性を高めることができる。また、ｇｌｕＡＢＣＤはＬ−グルタミン酸の取り込み系の遺伝子クラスターであり、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌において、ｇｌｕＡ、ｇｌｕＢ、ｇｌｕＣもしくはｇｌｕＤ、又はこれらの１種、２種、３種もしくは４種を欠失させることにより、培地に蓄積されるＬ−グルタミン酸量を増大させることができる。本発明のａｃｅＡ、ａｃｃＢＣ、ｌｐｄ、ｏｄｈＡ及びｇｌｕＡＢＣＤは、染色体上のこれらの遺伝子を破壊するのに用いることができる。
上記のようにして本発明のＤＮＡが導入された微生物を用いてＬ−アミノ酸を製造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４７℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。培養温度は、本発明のＤＮＡが導入されていない微生物の培養に適した温度、又はそれよりも高い温度で培養する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、Ｌ−アミノ酸の種類に応じてイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのプラスミドライブラリーの作製
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株を、ＣＭ２Ｂ液体培地（イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン（日本製薬製）１ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｄｌ、ビオチン１０μｇ／ｄｌ、ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整））で３７℃にて１５時間培養し、１０ｍｌの培養液から、染色体ＤＮＡを染色体ＤＮＡ抽出キット（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて取得した。取得したＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて部分消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを分画した後に、約４〜６ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、ＤＮＡゲル抽出キット（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、ＣｏｎｃｅｒｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、目的サイズのＤＮＡ断片を取得した。
プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）製）をＢａｍＨＩで完全消化し、末端をアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ；宝酒造（株）製）を用いて脱リン酸化した。このベクター断片と、上記の染色体ＤＮＡ断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、得られた組換えベクターを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体の選択は、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．０４ｍｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、０．０４ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地（寒天１．５ｇ／ｄｌを含む）上にて行い、白色コロニーを約４０００コロニー取得した。
＜２＞各遺伝子断片増幅用プライマーの設定
上記で得られたプラスミドライブラリーから目的の遺伝子を含むクローンをＰＣＲにより選択するために用いるプライマーを設計した。目的とする遺伝子は前記のとおりである。
プライマーは、コリネ型細菌の既知の遺伝子配列をベースとして、他の微生物の相当する遺伝子との間でアミノ酸レベルで保存されている領域に基づいて設計した。その際、コリネ型細菌のコドンユーセージを考慮してプライマーを複数組づつ設計した。
作製されたプライマーの適正を調べるために、これらのプライマーを用いて、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、遺伝子断片を増幅した。その結果、いずれの遺伝子も、表２〜表７の上段に示すプライマーを用い、各表中に「部分断片取得のＰＣＲ」として示した条件及びポリメラーゼでＰＣＲを行った場合に、増幅断片が認められた。各プライマーの末尾のカッコ内の数字は、配列表中の配列番号を示す。これらのプライマーを、後述のスクリーニング用プライマーとして用いた。
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＜３＞ＰＣＲによるプラスミドライブラリーのスクリーニング
前記のプラスミドライブラリーから目的の遺伝子を含むクローンを、ＰＣＲにより選択した。プラスミドライブラリーから、コロニーを６０個ずつピックアップし、２枚づつのＬＢ寒天培地プレートにレプリカした。各プレートのコロニー６０個づつをまとめて、４ｍｌのＬＢ液体培地を含む試験管に接種し、１５時間培養した後、プロメガ社製プラスミドＤＮＡ抽出キットを用いてそれぞれプラスミドの混合物を取得した。このプラスミド混合物を鋳型とし、各目的遺伝子毎に作製したスクリーニング用プライマーを用いて、各表中に「スクリーニングＰＣＲの条件」として示した条件でＰＣＲを行い、染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲと同じ大きさのＤＮＡ断片が増幅されるクローンを選択した。
増幅されたＤＮＡ断片は、パーキンエルマー社製ビッグダイ・ダイターミネーターサイクルシークエンスキットを用いて塩基配列を決定し、既知の遺伝子情報との相同性を比較することにより、目的遺伝子の取得の成否を確認した。
尚、ｌｐｄについては、＜２＞で作製したプライマーでは目的のＤＮＡ断片が増幅されなかったので、決定された塩基配列に基づいて、スクリーニング用プライマーを別途作製した。
＜４＞コロニーＰＣＲによる目的遺伝子保持クローンの選択
目的の遺伝子断片の増幅が確認されたプラスミド混合物が由来するプレートを用いて、コロニーＰＣＲを行い、遺伝子断片を含むクローンを選択した。コロニーＰＣＲは、表２〜７に示す条件で行った。
選択された形質転換体からプラスミドＤＮＡを回収し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。挿入ＤＮＡ断片に目的遺伝子の全長が挿入されておらず、遺伝子の上流域、下流域またはこれらの両方が欠失している場合は、判明した塩基配列を利用してプライマーを作製し、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて、目的遺伝子の全領域の遺伝子断片を取得し、塩基配列を決定した。
ＬＡ  ＰＣＲクローニングの概要は以下のとおりである。挿入ＤＮＡ断片のうち２つの領域の塩基配列を有する２種のプライマーを作製する。コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の染色体ＤＮＡを各種制限酵素で切断し、各制限酵素に対応したカセットプライマーと連結する。これを鋳型として、作製されたプライマーのうち欠失部分から遠い位置に対応するプライマー（Ｓ１）と、カセットプライマーの外側の位置に対応するカセットプライマー（Ｃ１）を用いてＰＣＲを行う。次に、作製されたプライマーのうち欠失部分に近い位置に対応するプライマー（Ｓ２）と、カセットプライマーの内側の位置に対応するカセットプライマー（Ｃ２）を用いてＰＣＲを行う。こうして、欠失部分を含むＤＮＡ断片が得られる。得られたＤＮＡ断片と既に取得されいるＤＮＡ断片を連結することにより、目的遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。尚、カセットの５’末端にはリン酸基が付いていないので、ＤＮＡ断片の３’末端とカセットの５’末端との接続部位にはニックができる。そのため、１回目のＰＣＲではプライマーＣ１からのＤＮＡ合成はこの接続部分でストップし、非特異的な増幅は起こらないため、特異的な増幅を行うことができる。
ＬＡ  ＰＣＲクローニングに用いたプライマーと反応条件は、表２〜７に示した。表中「（Ｎ’）」は上流側の欠失部分のクローニングに用いたプライマーを、「（Ｃ’）」は下流側の欠失部分のクローニングに用いたプライマーを、それぞれ示す。また、ＰＣＲ反応はＬＡ  ＰＣＲクローニングキットの説明書に従い、２回行った。表に示したプライマーのうち、上段には１回目の反応に用いたプライマー（Ｓ１）を、下段には２回目の反応に用いたプライマー（Ｓ２）を示す。
上記のようにして得られた各遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、前記と同様にして決定した。それらの塩基配列及び同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１〜３４に示す。各配列番号に記載された配列は、後記〔配列表の説明〕に示したとおりである。
ｓｃｒＢについては、オープン・リーディング・フレームが見つからなかった。コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株は、インベルターゼ活性を有しておらず、シュークロース資化性を持たないため、シュークロース資化性を有するコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０株及びＡＪ１２３０９株から、同様にしてｓｃｒＢ遺伝子断片を取得した。その結果、いずれの株からもオープン・リーディング・フレームを有するＤＮＡ断片が得られた。
実施例２  ｇｄｈ、及びｇｌｔＡ遺伝子の取得
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのＧＤＨ活性の検討
ＣＭ−２Ｂ寒天培地（イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｇ／ｄｌ、ポリペプトン（日本製薬製）１ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｄｌ、ビオチン１０μｇ／ｄｌ、寒天１．５ｇ／ｄｌ、ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整））で生育させたコリネバクテリウム・サーモアミノゲネス野生株であるＡＪ１２３１０株の菌体を、下記組成のフラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃で１７時間（残糖が１ｇ／ｄｌ程度になるまで）培養した。
同様に、ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）の菌体を３１．５℃で１７時間培養した。
〔フラスコ用培地〕
グルコース                  ３      ｇ／ｄｌ
ＫＨ２ＰＯ４                ０．１  ｇ／ｄｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．０４ｇ／ｄｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        １    ｍｇ／ｄｌ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ        １    ｍｇ／ｄｌ
ビタミンＢ１−ＨＣｌ    ２００    μｇ／Ｌ
ビオチン                  ５０    μｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４          １．５  ｇ／ｄｌ
大豆蛋白加水分解液          ４８ｍｇ／ｄｌ
（Ｍｅｍｅｎｏ（Ｔ−Ｎ））
ＣａＣｏ３（局方）          ５      ｇ／ｄｌ（別殺菌）
ｐＨ８．０（ＫＯＨで調整）
上記培養液約１ｍｌを１０００ｒｐｍで１分遠心してＣａＣＯ３を除去した後、菌体を２００ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で２回洗浄し、同緩衝液３００μｌに懸濁させた。得られた菌体懸濁液を５分間超音波処理して菌体を破砕した後、１０００ｒｐｍで３０分遠心し、上清を粗酵素液として得た。
上記粗酵素液を用いてＧＤＨ活性の至適反応温度及び熱安定性を調べた。ＧＤＨ活性の測定は、反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭα−ケトグルタル酸ナトリウム、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ）に粗酵素液を加え、３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって行った。また、粗酵素液のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用）により、ウシ血清アルブミンを標準として、５９５ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。吸光度の測定は、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２０００（日立製作所製）を用いて行った。
種々の反応温度で測定したＧＤＨ活性を、図１に示す。ＡＴＣＣ１３８６９株では、３７℃付近で最もＧＤＨの比活性が高く、４２℃付近で活性が著しく低下するのに対し、ＡＪ１２３１０株では４２℃付近で最も比活性が高く、４５℃でも活性を示した。
次に、ＧＤＨの熱安定性を調べた。反応前に、粗酵素液を０〜３０分間６５℃においた後、３０℃における酵素活性を測定した。その結果を図２に示す。この結果から明らかなように、ＡＴＣＣ１３８６９株のＧＤＨは５分間の熱処理で失活したのに対し、ＡＪ１２３１０株のＧＤＨは３０分間の熱処理でも活性が維持された。尚、ＡＪ１２３１０株の粗酵素液は、少なくとも６５℃、９０分の熱処理後にもＧＤＨ活性にほとんど変化が認められなかった（データは示さない）。
＜２＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのＣＳ活性の検討
実施例１と同様にコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株の菌体及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株から調製した粗酵素液を用いて、ＣＳの反応至適温度及び熱安定性を調べた。ＣＳ活性の測定は、反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），０．１ｍＭ  ＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）），２００ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウム、０．３ｍＭアセチルＣｏ−Ａ）に粗酵素液を加え、４１２ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって行った。
種々の反応温度で測定したＣＳ活性を、図３に示す。ＡＴＣＣ１３８６９株では２３℃付近で最もＣＳの比活性が高く、３３℃付近で活性が著しく低下するのに対し、ＡＪ１２３１０株では３７℃付近までは反応温度に依存して高い比活性を示し、４０℃でも３７℃における活性の約４割の活性を示した。
次に、ＣＳの熱安定性を調べた。反応前に、粗酵素液を３３〜５５℃で５分間おいた後、３０℃における酵素活性を測定した。その結果を図４に示す。ＡＴＣＣ１３８６９株のＣＳは３５〜４０℃の熱処理で失活したのに対し、ＡＪ１２３１０株のＣＳは５０℃の熱処理でも約４割の活性が維持された。
＜３＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのｇｄｈ遺伝子の取得
すでに報告されている種々の微生物のｇｄｈ遺伝子の塩基配列の比較を行った。そして、塩基配列がよく保存されている領域を見出し、その領域の塩基配列に基づいて配列番号７７及び７８に示す塩基配列を有するプライマーを作製した。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株からＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をもとに、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いてゲノムウォーキングを行い、ｇｄｈ遺伝子全体を取得し、全塩基配列を決定した。結果を配列番号７９に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号８０に示す。
同様にして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株のｇｄｈ遺伝子を取得し、塩基配列を決定した。結果を配列番号８１に示す。また同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号８２に示す。
上記のようにして決定されたコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株のｇｄｈ遺伝子の塩基配列及びＧＤＨのアミノ酸配列と、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株のｇｄｈ遺伝子及びＧＤＨのアミノ酸配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）６，３１７−３２６）との相同性を調べた。結果を表８（塩基配列）及び表９（アミノ酸配列）に示す。
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＜４＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのｇｌｔＡ遺伝子の取得
すでに報告されている種々の微生物のｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列の比較を行った。そして、塩基配列がよく保存されている領域を見出し、その領域の塩基配列の基づいて配列番号８３及び８４に示す塩基配列を有するプライマーを作製した。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４２）からＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマー７、８を用いてＰＣＲを行い、増幅した約０．９ｋｂの塩基配列を決定した。
得られたコリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４０，１８１７−１８２８（１９９４））をもとに、配列番号８５、８６、８７、及び８８のプライマーを作成し、上記と同様にＡＪ１２３１０の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号８５、８６、８７、及び８８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ｇｌｔＡ遺伝子全体の全塩基配列を決定した。結果を配列番号８９に示す。また、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号９０に示す。
同様にして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株のｇｌｔＡ遺伝子を取得し、塩基配列を決定した。結果を配列番号９１に示す。また同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号９２に示す。
上記のようにして決定されたコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株のｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列及びＣＳのアミノ酸配列と、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４０，１８１７−１８２８（１９９４））ＡＴＣＣ１３０３２株のｇｌｔＡ遺伝子及びＣＳのアミノ酸配列との相同性を調べた。結果を表１０（塩基配列）及び表１１（アミノ酸配列）に示す。
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実施例３  コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのｓｃｒＢ遺伝子の取得
実施例１に示したように、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３０９株からｓｃｒＢ遺伝子断片が得られたので、同遺伝子の全配列の取得を行った。まず、実施例１と同様にして、配列番号４５及び配列番号４６に示すプライマーを用いて部分断片の取得を行った。これらのプライマーは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株のｓｃｒＢ配列（特開平０８−１９６２８０）をもとに合成した。
一方、ＡＪ１２３０９株からＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて染色体を調製した。この染色体ＤＮＡを０．５μｇ、前記プライマーを各々５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μｌ、１０×Ｚ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、Ｚ−Ｔａｑ  ２Ｕ（宝酒造）に滅菌水を加えて全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液を用いて、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥ）を使用して、変性９８℃５秒、会合５０℃１０秒、伸長反応７２℃２０秒の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、ｓｃｒＢの部分断片約６００ｂｐを増幅した。
次にＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてｓｃｒＢ全配列を決定した。方法はすべて、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに従った。取得した部分配列をもとに、配列番号９７、９８、９９、１００に示すプライマーを合成した。上流部分の配列決定のための１回目のＰＣＲ反応は、配列番号９５、９７に示すプライマーを、鋳型ＤＮＡとしてＥｃｏＴ１４Ｉで処理したＡＪ１２３０９株染色体ＤＮＡを用いた。２回目のＰＣＲ反応は、配列番号９６、９８に示すプライマーを用いた。下流部分の配列決定のための１回目のＰＣＲ反応は、配列番号９５、９９に示すプライマーを、鋳型ＤＮＡとしてＳａｌＩ（宝酒造）で処理したＡＪ１２３０９株染色体ＤＮＡを用いた。２回目のＰＣＲ反応は、配列番号９６、１００に示すプライマーを用いた。以上の操作から、ｓｃｒＢのＯＲＦを含む全長１６５６ｂｐの配列を決定した。この塩基配列を配列番号９３に、アミノ酸配列を配列番号９４に示す。
実施例４  イソシトレートリアーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの熱安定性の検討
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス由来の下記の酵素について、熱安定性を調べた。尚、本実施例では、タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用）により、標準タンパク質に牛血清アルブミンを用いて測定した。また、吸光度の測定は、特記しない限りＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２０００（日立製作所）を用いて行った。
＜１＞イソシトレートリアーゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来イソシトレートリアーゼ（以下、「ＩＣＬ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）由来ＩＣＬの活性の熱安定性を調べた。活性測定には、表１２に示した培地にて完全に糖を消費し尽くす前に培養を終了させた菌体を用いた。活性測定方法は、Ｄｉｅｔｅｒ  Ｊ．Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６（１２），３４７４（１９９４））に従った。具体的には、菌体を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．３）にて洗浄後、同バッファーに懸濁し、超音波破砕（ＫＵＢＯＴＡ社製  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍを使用、２００Ｗ、５分）を行った。超音波破砕後、遠心分離（１３０００×ｇ、３０分）を行い、未破砕菌体を取り除いたものを粗酵素液とした。
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３）、５ｍＭジチオスレイトール、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｄ−ｔｈｒｅｏ−ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１８Ｕ  ＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）を含む反応系に粗酵素液を添加し、各温度（３０、４０、５０、６０、７０℃）における３４０ｎｍの吸収を日立分光光度計Ｕ−３２１０にて測定した。反応温度を変化させた測定結果を図５に示す。また、粗酵素液を５０℃にて前処理（前処理時間５分、又は１５分）し、３７℃における活性を測定した結果を図６に示す。
その結果、２２５６株のＩＣＬは５０℃近辺に最大活性を示すのに対し、ＡＪ１２３１０株のＩＣＬは６０℃で最大活性を示した。また、２２５６株のＩＣＬは前処理時間５分で完全に失活しているのに対し、ＡＪ１２３１０株のＩＣＬは前処理時間５分では約半分の活性を維持していたことから、ＡＪ１２３１０株のＩＣＬの高温での安定性が確認された。
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＜２＞ホスホフルクトキナーゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来ホスホフルクトキナーゼ（以下、「ＰＦＫ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株由来ＰＦＫの活性の熱安定性について調べた。活性測定には、表１３に示した培地にて完全に糖を消費し尽くす前に培養を終了させた菌体を用いた。活性測定方法は、Ｍｉｃｈｉｋｏ  Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（１０），２６７１（１９９４））に従った。具体的には、菌体を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、同緩衝液に懸濁し、超音波破砕（ＫＵＢＯＴＡ社製  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍを使用、２００Ｗ、５分）を行った。超音波破砕後、遠心分離（１３０００×ｇ、３０分）を行い、未破砕菌体を取り除いたものを粗酵素液とした。
１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭホスホエノールピルビン酸、６．４ｍＭフルクトース６リン酸、１ｍＭ  ＡＴＰ、４０μｇ  ＬＤＨ／ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）を含む反応系に粗酵素液を添加し、各温度（３０、４０、５０、６０、７０℃）における３４０ｎｍの吸収を日立分光光度計Ｕ−３２１０にて測定した。反応温度を変化させた測定結果を図７に示す。また、粗酵素液を５０℃にて前処理（前処理時間１、３、５、１０分）し、３７℃における活性を測定した結果を図８に示す。
以上の結果、２２５６株のＰＦＫは３０℃近辺で最大活性を示すことに対し、ＡＪ１２３１０株のＰＦＫは５０℃近辺で最大活性を示したことから、ＡＪ１２３１０のＰＦＫ株の至適温度は高温域にあることが確認された。
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＜３＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株由来のＰＥＰＣ活性の熱安定性について検討した。
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株の菌体を、フラスコ用培地（グルコース８ｇ／ｄｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０４ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／ｄｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ／ｄｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３ｇ／ｄｌ、ＴＮ（大豆タンパク質加水分解液）４８ｍｇ／ｄｌ、ビタミンＢ１  ２００μｇ／ｌ、ビオチン３００μｇ／ｌ、ＧＤ−１１３（消胞剤）５０μｌ／ｌ、ＣａＣＯ３  ５ｇ／ｄｌ（局方、別殺菌）、ｐＨ８．０（ＫＯＨで調整））を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃で培養した。同様に、ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させた２２５６株の菌体を３１．５℃で培養した。
対数増殖期まで生育させた上記培養液を１０００ｒｐｍで１分間遠心してＣａＣＯ３を除去した後、菌体を洗浄緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で３回洗浄、超音波で破砕し、１５ｋｒｐｍで１０分間遠心し破砕片を除去し、上清をさらに６０ｋｒｐｍで１時間遠心し、上清を粗酵素液として得た。
上記粗酵素液を用いてＰＥＰＣ活性の至適反応温度及び熱安定性を調べた。ＰＥＰＣ活性の測定は、反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ８．５）、５ｍＭホスホエノールピルビン酸、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、０．１５ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０Ｕリンゴ酸脱水素酵素、０．１ｍＭ  ＤＴＴ）に粗酵素液を添加し、反応液量８００μｌ中で３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって行った。
種々の反応温度で測定したＰＥＰＣ活性を図９に示す。２２５６株では４０℃で活性が著しく低下するのに対し、ＡＪ１２３１０株では４０℃でも活性の低下はほとんど認められなかった。
次に、ＰＥＰＣの熱安定性を調べた。反応前に、粗酵素液を０〜２０分間４５℃においた後、２０℃における酵素活性を測定した。その結果を図１０に示す。この結果から明らかなように、２２５６株では１０分間の熱処理後にはＰＥＰＣ活性はほとんど失われてしまったが、ＡＪ１２３１０株では２０分間の熱処理後でも活性は維持されていた。
これらの結果からＡＪ１２３１０のＰＥＰＣの高温での安定性が示された。
＜４＞アコニターゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来アコニターゼ（以下、「ＡＣＮ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株由来ＡＣＮを測定し、その熱安定性について検討した。
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株の菌体を、＜３＞と同じ組成のフラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃で培養した。同様に、ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させた２２５６株の菌体を３１．５℃で培養した。
対数増殖期まで生育させた上記培養液を１０００ｒｐｍで１分間遠心してＣａＣＯ３を除去した後、菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５で３回洗浄、超音波で破砕し、１５ｋｒｐｍで１０分間遠心した上清を粗酵素液として得た。
上記粗酵素液を用いてＡＣＮ活性の至適反応温度及び熱安定性を調べた。ＡＣＮ活性の測定は反応液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ・３Ｎａ）に粗酵素液を添加し反応液量８００μｌ中で２４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって行った。
種々の反応温度で測定したＡＣＮ活性を図１１に示す。ＡＪ１２３１０株はより高温において２２５６株よりも高い活性を示した。
次に、ＡＣＮの熱安定性を調べた。反応前に、粗酵素液を０〜１５分間５０℃においた後、３０℃における酵素活性を測定した。その結果を図１２に示す。この結果から明らかなように、ＡＪ１２３１０株のＡＣＮは２２５６株のＡＣＮよりも熱処理による活性の低下が少なかった。
これらの結果からＡＪ１２３１０のＡＣＮの高温での熱安定性が確認された。
＜５＞イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＩＣＤＨ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株由来ＩＣＤＨの活性の熱安定性について検討した。
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株の菌体を、＜３＞と同じ組成のフラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃で培養した。同様に、ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させた２２５６株の菌体を３１．５℃で培養した。
対数増殖期まで生育させた上記培養液を１０００ｒｐｍで１分間遠心してＣａＣＯ３を除去した後、菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５で３回洗浄、超音波で破砕し、１５ｋｒｐｍで１０分間遠心した上清を粗酵素液として得た。
上記粗酵素液を用いてＩＣＤＨ活性の至適反応温度及び熱安定性を調べた。ＩＣＤＨ活性の測定は反応液（３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．３５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、１．５ｍＭ  ＭｎＳＯ４、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ、１．３ｍＭ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ・３Ｎａ）に粗酵素液を添加し反応液量８００μｌ中で３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによって行った。
種々の反応温度で測定したＩＣＤＨ活性を図１３に示す。２２５６株では７０℃で活性が著しく低下するのに対し、ＡＪ１２３１０株では７０℃でも活性の低下はほとんど認められなかった。
次に、ＩＣＤＨの熱安定性を調べた。反応前に、粗酵素液を０〜１５分間４５℃においた後、３０℃における酵素活性を測定した。その結果を図１４に示す。この結果から明らかなように、２２５６株では１５分間の熱処理後には１５％ほどのＩＣＤＨの活性が残存するだけであったが、ＡＪ１２３１０株では約６０％のＩＣＤＨの活性が残存していた。
これらの結果から、ＡＪ１２３１０のＩＣＤＨの高温での熱安定性が示された。
＜６＞２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＯＤＨＣ」ともいう）とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株由来ＯＤＨＣを測定し、その熱安定性について調べた。
活性測定には、表１４に示した培地にて完全に糖を消費し尽くす前に培養を終了させた菌体を用いた。活性測定方法は、Ｉｓａｍｕ  Ｓｈｉｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（８），１８９７（１９８０））に従った。具体的には、菌体を０．２％塩化カリウムにて洗浄後、１００ｍＭ  ＴＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、３０％グルセロール溶液に懸濁し、超音波破砕（ＫＵＢＯＴＡ社製  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍを使用、２００Ｗ、５分）を行った。超音波破砕後、遠心分離（１００００×ｇ、３０分）を行い、未破砕菌体を取り除いたものをＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５を用いて、同バッファーにてゲルろ過することによって調製したものを粗酵素液とした。
１００ｍＭ  ＴＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、０．３ｍＭコカルボキシラーゼ、１ｍＭ  α−ケトグルタル酸、３ｍＭ  Ｌ−システイン、１ｍＭ  アセチルピリジン−アデニン−ジヌクレオチドを含む反応系に粗酵素液を添加し、各温度（３０、４０、５０、６０、７０℃）における３６５ｎｍの吸収を日立分光光度計Ｕ−３２１０にて測定した。粗酵素液を５０℃にて前処理（前処理時間１、３、５、１０分）し、３７℃における活性を測定した結果を図１５に示す。
その結果、２２５６株のＯＤＨＣは前処理時間１０分で完全に失活しているのに対し、ＡＪ１２３１０のＯＤＨＣは前処理時間に関係なく、ほぼ一定の活性を有しており、高温処理に対する安定性が確認された。
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実施例５  ｓｃｒＢ遺伝子導入によるシュークロース資化能の付与
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株は、インベルターゼ活性及びシュークロース資化性を持たないため、同株に、ＡＪ１２３０９株由来のｓｃｒＢ遺伝子を導入することによってシュークロースに対する資化能を付与できるのかを調べた。
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３０９株由来ｓｃｒＢ搭載プラスミドの作製
ｓｃｒＢ遺伝子断片を取得するために、配列番号９３に示す塩基配列をもとに、両端にＳｍａＩ配列を連結した配列番号１０１、１０２に示すプライマーを合成した。ＡＪ１２３０９株染色体ＤＮＡを０．５μｇ、前記オリゴヌクレオチドを各々５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μｌ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２Ｕ（宝酒造）に滅菌水を加えて全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液を用いて、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥ）を使用して、変性９８℃１０秒、会合５５℃３０秒、伸長反応７２℃２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、ｓｃｒＢ  ＯＲＦを含む約１．７ｋｂを増幅した。
次に、上記の増幅断片をＳｍａＩ（宝酒造）にて消化し、脱リン酸化処理したコリネ型細菌で機能する複製起点を搭載したプラスミドｐＳＡＣ４をＳｍａＩで切断したものと連結し、ｐＳＣＲ１５５を作製した。ｐＳＣＲ１５５の構築を図１６に示す。なおｐＳＡＣ４は、以下のようにして作製した。エシェリヒア・コリ用ベクターｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株））をコリネ型細菌で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（Ｍｉｗａ，ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８（１９８４）２９０１−２９０３）由来の複製起点（特開平５−７４９１号公報）を導入した。具体的には、ｐＨＭ１５１９を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を宝酒造（株）製Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔを用いて平滑末端化した後、ＳａｌＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いて、ｐＨＳＧ３９９のＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＳＡＣ４を得た。
＜２＞ＡＪ１２３１０株へのｓｃｒＢ遺伝子搭載プラスミドの導入
上記で作製したｐＳＣＲ１５５、及び、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ｓｃｒＢ遺伝子を搭載したプラスミドｐＳＳＭ３０ＢＳ（特開平０８−１９６２８０号）を、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株に導入した。形質転換は、以下の手順で行った。菌体を、２０％シュクロースを含むＣＭ−２Ｂ培地にＯＤ６６０＝０．１となるように接種し、ＯＤ６６０＝０．３まで３７℃で振盪培養した後、１００μｇ／ｍｌになるようにリゾチームを添加し、さらに２時間培養した。菌体を２０％シュクロースで３回洗浄後、２０％シュクロースに懸濁し、エシェリヒア・コリＪＭ１１０から回収したプラスミドを加えよく混合し、電気パルス（１８ＫＶ／ｃｍ  ３００ｍｓｅｃ）をかけ、ＤＮＡを導入した。２０％シュクロースを含むＣＭ−２Ｂ培地で一晩回復培養を行なった後、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−２Ｂ寒天培地で形質転換体を選択した。具体的には、電気パルス法（特開平１２−２０４２３６号）を用い、形質転換体の選択は５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地で、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ｓｃｒＢ搭載プラスミドｐＳＳＭ３０ＢＳを保持する形質転換体は得られず、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス由来ｓｃｒＢを搭載プラスミドｐＳＣＲ１５５を保持する形質転換体のみが取得出来た。この株をＡＪ１２３１０／ｐＳＣＲ１５５と命名した。
＜３＞ＡＪ１２３１０／ｐＳＣＲ１５５株のシュークロースを糖源とする培養評価
上記で作製したＡＪ１２３１０／ｐＳＣＲ１５５を、表１５に示す組成の培地に接種し、３７℃にて２２時間振とう培養した。培養後の培地の吸光度（ＯＤ）及び残糖（ＲＳ）を測定した結果を表１６に示す。その結果、ＡＪ１２３１０株は、シュークロースを資化出来ず、生育が不能であるのに対し、ｓｃｒＢ遺伝子導入株ＡＪ１２３１０／ｐＳＣＲ１５５株はシュークロースを資化出来るようになったことが確認された。
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実施例６  ｐｄｈＡ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
＜１＞由来ｐｄｈＡ搭載プラスミドｐＰＤＨＡ−２の構築
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株のＰｄｈＡ遺伝子は、プラスミドライブラリのスクリーニングにより取得した。具体的には、プラスミドライブラリ混合物を鋳型として、実施例１の表４に示した条件にてＰＣＲを行い、染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲと同じ大きさのＤＮＡ断片が増幅されるクローンｐ２１Ａを選択した。このプラスミドのＤＮＡ配列を決定することによりｐｄｈＡの全長が含まれていることを確認した。
ｐ２１ＡをＸｂａＩ、ＫｐｎＩで消化し、ｐｄｈＡ遺伝子の全長とプロモーター領域を含む４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。このｐｄｈＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造）のＸｂａＩ，ＫｐｎＩサイトに挿入した。次にこのプラスミドをＸｂａＩで消化し、ｐＸＫ４をＸｂａＩで処理した断片を挿入してｐＰＤＨＡ−２を作成した。ｐＰＤＨＡ−２の構築の過程を図１７に示す。ライゲーション反応はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を、遺伝子操作のホストにはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造）を用いた。尚、前記ｐＸＫ４は、以下のようにして作製した。コリネ型細菌とエシェリヒア・コリのシャトルベクターｐＨＫ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで消化して、複製起点を持つＤＮＡ断片を取得して、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて平滑末端化したあと、ＸｂａＩリンカー（宝酒造社製）を結合し、ｐＨＳＧ２９９のＸｂａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＸＫ４を得た。
＜２＞ＡＪ１２３１０株へのｐｄｈＡ遺伝子搭載プラスミドの導入
上記で作製したプラスミドｐＰＤＨＡ−２をコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株に導入し、ｐｄｈＡ遺伝子増幅株を作製した。形質転換は実施例５と同様にして行い、形質転換体はカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−２Ｂ寒天培地で選択し、ＡＪ１２３１０／ｐＰＤＨＡ−２株を取得した。
＜３＞ｐｄｈＡ増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株、及び上記で取得したｐｄｈＡ遺伝子増幅株ＡＪ１２３１０／ｐＰＤＨＡ−２株を、表１７に示す種培養フラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃でグルコースを完全消費するまで振盪培養した。この培養液を、表１７に示す本培養フラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに２ｍｌ接種し、３７℃及び４４℃において本培養を行なった。本培養はグルコースを完全消費するまで行い、培養終了後、培養液のＯＤ６２０及びＬ−グルタミン酸の蓄積量を測定し、遺伝子増幅による菌体形成及びグルタミン酸の生産に対する効果を検討した。ＯＤの測定は分光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２０００（日立製作所）を、Ｌ−グルタミン酸濃度の測定はグルタミン酸アナライザーＡＳ−２１０（旭化成）を用いた。結果を図１８に示す。
ｐｄｈＡ遺伝子増幅株ＡＪ１２３１０／ｐＰＤＨＡ−２株では、ＡＪ１２３１０株に比べ、Ｌ−グルタミン酸蓄積、ＯＤともに上昇し、ｐｄｈＡ遺伝子の増幅がＬ−グルタミン酸生産に有効であることが明らかとなった。
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実施例７  ｉｃｄ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来ｉｃｄ搭載プラスミドｐＩＣＤ−４の構築
配列番号２９記載のＡＪ１２３１０株のｉｃｄ遺伝子配列をもとに、配列番号１０３及び配列番号１０４に示すプライマーを合成した。この両プライマーの５’端にはＢｇｌＩＩサイトを導入した。一方、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株のゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、上記プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）８μｌ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造）１０μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）２．５Ｕに滅菌水を加えて全量１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液を用いて、サーマルサイクラーＴＰ２４０（宝酒造）を使用して、変性９８℃１０秒、会合５５℃１分、伸長反応７２℃４分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、ｉｃｄ遺伝子及びそのプロモーターを含む３．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
このｉｃｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで処理し、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造）のＢａｍＨＩサイトに挿入した。次にこのプラスミドをＸｂａＩで処理し、ｐＸＫ４をＸｂａＩで処理した断片を挿入してｐＩＣＤ−４を構築した。ｐＩＣＤ−４の作製の手順は図１９に示す。ライゲーション反応は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を、遺伝子操作のホストにはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造）を用いた。
＜２＞ＡＪ１２３１０株へのｉｃｄ遺伝子搭載プラスミドの導入
上記で作製したプラスミドｐＩＣＤ−４を、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株に導入し、ｉｃｄ遺伝子増幅株を作製した。形質転換は、実施例５と同様にして行い、形質転換体は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−２Ｂ寒天培地で選択し、ＡＪ１２３１０／ｐＩＣＤ−４株を取得した。
＜３＞ｉｃｄ増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
ＡＪ１２３１０株、およびそのｉｃｄ増幅株であるＡＪ１２３１０／ｐＩＣＤについて、実施例６記載の培養方法により培養評価を行った。結果を図２０に示す。ｉｃｄ遺伝子増幅株ＡＪ１２３１０／ｐＩＣＤ−４株では、野生株ＡＪ１２３１０株に比べ、Ｌ−グルタミン酸蓄積、ＯＤともに上昇し、ｉｃｄ遺伝子の増幅はグルタミン酸生産に有効であることが示された。
実施例８  ｇｄｈ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株由来のｇｄｈ遺伝子搭載プラスミドの作製
配列番号７９に記載のＡＪ１２３１０株のｇｄｈ遺伝子の配列をもとに、配列番号１０５および配列番号１０６に示すプライマーを合成した。
一方、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いてＡＪ１２３１０の染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを０．５μｇ、前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）８μｌ、１０×ＬＡ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）２Ｕに滅菌水を加えて全量５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液を用いて、サーマルサイクラーＴＰ２４０（宝酒造）を使用して、変性９４℃３０秒、会合５５℃１秒、伸長反応７２℃３分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行ない、ｇｄｈ遺伝子およびそのプロモーターを含む約２ＫｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅断片をＰｓｔＩ（宝酒造社製）で消化し、これとｐＨＳＧ２９９（宝酒造）をＰｓｔＩで完全分解したものを混合し連結した。連結反応は宝酒造社製ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２にて行なった。連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２１に示す制限酵素地図と同等であるものをｐＨＳＧ２９９ＹＧＤＨと名付けた。
このｐＨＳＧ２９９ＹＧＤＨにコリネ型細菌で機能する複製起点を導入した。具体的には、ｐＸＣ４を制限酵素ＸｂａＩにて消化し、ｐＨＭ１５１９由来の複製起点を含む断片を取得し、ｐＨＳＧ２９９ＹＧＤＨをＸｂａＩで完全分解したものと混合し連結した。上記と同様の方法でプラスミドを調製し、図２１に示す制限酵素地図と同等であるものをｐＹＧＤＨと名付けた。尚、ｐＸＣ４は、ｐＨＳＧ２９９の代わりにｐＨＳＧ３９９（Ｃｍｒ）を用いた以外は、実施例６に記載したｐＸＫ４と同様にして構築した。
＜２＞ＡＪ１２３１０株へのｇｄｈ遺伝子搭載プラスミドの導入
上記で作製したプラスミドを、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株に導入し、ｇｄｈ遺伝子増幅株を作製した。形質転換は、実施例５と同様にして行い、形質転換体はカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＣＭ−２Ｂ寒天培地で、３１℃にて選択し、ＡＪ１２３１０／ｐＹＧＤＨを取得した。
＜３＞ｇｄｈ増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株及び上記で取得したｇｄｈ遺伝子増幅株ＡＪ１２３１０／ｐＹＧＤＨ株を、表１８に示す種培養フラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに接種し、３７℃でグルコースを完全消費するまで振盪培養した。この培養液を、表１９に示す本培養フラスコ用培地を２０ｍｌ入れた５００ｍｌ容フラスコに２ｍｌ接種し、３７℃及び４４℃において本培養を行なった。本培養はグルコースを完全消費するまで行い、培養終了後、培養液のＯＤ６２０及びＬ−グルタミン酸の蓄積量を測定し、遺伝子増幅による菌体形成及びグルタミン酸の生産に対する効果を検討した。ＯＤの測定は分光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２０００（日立製作所）を、Ｌ−グルタミン酸濃度の測定はグルタミン酸アナライザーＡＳ−２１０（旭化成）を用いた。
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培養結果を表２０、表２１に示す。３７℃では、ｇｄｈ増幅株は、糖消費速度が、親株のＡＪ１２３１０株と比較して速く、生育も良く、到達ＯＤが上昇した。またＬ−グルタミン酸蓄積に関しても、収率に関しても３７℃では３〜５％と大幅に向上した。４４℃においても収率が向上し、また到達ＯＤも上昇した。一方、ｇｄｈ増幅株では副生物であるα−ケトグルタル酸の蓄積が減少していることが確認された。これらの結果から、ｇｄｈの増幅がＬ−グルタミン酸収率の向上および副生物の低減に有効であることが示された。
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実施例９  ｇｌｔＡ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
＜１＞コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス由来ｇｌｔＡ遺伝子搭載プラスミドの作製
配列番号８９記載のＡＪ１２３１０株由来のｇｌｔＡ遺伝子の配列をもとに、配列番号１０７および配列番号１０８に示すプライマーを合成した。
一方、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いてコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０の染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを０．５μｇ、前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）８μｌ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）１０μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｔａｑ（宝酒造）２Ｕに滅菌水を加えて全量１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。この反応液を用いて、サーマルサイクラーＴＰ２４０（宝酒造）を使用して、変性９４℃３０秒、会合４５℃３０秒、伸長反応７２℃３分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行ない、ｇｌｔＡ遺伝子およびそのプロモーターを含む約２ＫｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅断片をＫｐｎＩ（宝酒造）で消化し、これとｐＨＳＧ２９９（宝酒造）をＫｐｎＩで完全分解したものを混合し連結した。連結反応は宝酒造社製ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２にて行なった。連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２２に示す制限酵素地図と同等であるものをｐＨＳＧ２９９ＹＣＳと名付けた。
このｐＨＳＧ２９９ＹＣＳにコリネ型細菌内で複製出来る複製起点を導入した。具体的には、ｐＸＣ４を制限酵素ＸｂａＩにて消化し、ｐＨＭ１５１９の複製起点を含むＤＮＡ断片を取得し、ｐＨＳＧ２９９ＹＣＳをＸｂａＩで完全分解したものと混合、連結した。上記と同様の方法でプラスミドを調製し、図２２に示す制限酵素地図と同等であるものをｐＹＣＳと名付けた。
＜２＞ＡＪ１２３１０株へのｇｌｔＡ遺伝子搭載プラスミドの導入
上記で作製したプラスミドを、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株を導入し、ｇｌｔＡ遺伝子増幅株を作製した。形質転換は、実施例５と同様にして行い、形質転換体の選択は２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂ寒天培地で、３１℃にて選択し、ＡＪ１２３１０／ｐＹＣＳを取得した。
＜３＞ｇｌｔＡ増幅株によるＬ−グルタミン酸生産
ＣＭ−２Ｂ寒天培地で生育させたＡＪ１２３１０株及び上記で取得したｇｌｔＡ遺伝子増幅株ＡＪ１２３１０／ｐＹＣＳ株を、実施例８と同様にして培養した。培養結果を表２２、表２３に示す。ＣＳ増強株では、３７℃、４４℃いずれの培養温度においても、親株よりＬ−グルタミン酸蓄積が向上していることが確認された。また、ｇｌｔＡ増幅株はオキサロ酢酸から合成されるＬ−アスパラギン酸、Ｌ−リジンが減少していた。
以上の結果から、ｇｌｔＡの増幅がＬ−グルタミン酸の収率向上および副生物低減に有効であることが示された。
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〔配列表の説明〕
配列番号１：ａｃｅＡ                      塩基配列
配列番号２：ａｃｅＡ                      アミノ酸配列
配列番号３：ａｃｃＢＣ                    塩基配列
配列番号４：ａｃｃＢＣ                    アミノ酸配列
配列番号５：ｄｔｓＲ１                    塩基配列
配列番号６：ｄｔｓＲ１                    アミノ酸配列
配列番号７：ｄｔｓＲ２                    塩基配列
配列番号８：ｄｔｓＲ２                    アミノ酸配列
配列番号９：ｐｆｋ                        塩基配列
配列番号１０：ｐｆｋ                      アミノ酸配列
配列番号１１：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３４０株）塩基配列
配列番号１２：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３４０株）アミノ酸配列
配列番号１３：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３０９株）塩基配列
配列番号１４：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３０９株）アミノ酸配列
配列番号１５：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３１０株）塩基配列
配列番号１６：ｇｌｕＡＢＣＤ              塩基配列
配列番号１７：ｇｌｕＡＢＣＤ              アミノ酸配列
配列番号１８：ｇｌｕＡＢＣＤ              アミノ酸配列
配列番号１９：ｇｌｕＡＢＣＤ              アミノ酸配列
配列番号２０：ｇｌｕＡＢＣＤ              アミノ酸配列
配列番号２１：ｐｄｈＡ                    塩基配列
配列番号２２：ｐｄｈＡ                    アミノ酸配列
配列番号２３：ｐｃ                        塩基配列
配列番号２４：ｐｃ                        アミノ酸配列
配列番号２５：ｐｐｃ                      塩基配列
配列番号２６：ｐｐｃ                      アミノ酸配列
配列番号２７：ａｃｎ                      塩基配列
配列番号２８：ａｃｎ                      アミノ酸配列
配列番号２９：ｉｃｄ                      塩基配列
配列番号３０：ｉｃｄ                      アミノ酸配列
配列番号３１：ｌｐｄ                      塩基配列
配列番号３２：ｌｐｄ                      アミノ酸配列
配列番号３３：ｏｄｈＡ                    塩基配列
配列番号３４：ｏｄｈＡ                    アミノ酸配列
配列番号７９：ｇｄｈ（ＡＪ１２３１０株）  塩基配列
配列番号８０：ｇｄｈ（ＡＪ１２３１０株）  アミノ酸配列
配列番号８１：ｇｄｈ（２２５６株）        塩基配列
配列番号８２：ｇｄｈ（２２５６株）        アミノ酸配列
配列番号８９：ｇｌｔＡ（ＡＪ１２３１０株）塩基配列
配列番号９０：ｇｌｔＡ（ＡＪ１２３１０株）アミノ酸配列
配列番号９１：ｇｌｔＡ（２２５６株）      塩基配列
配列番号９２：ｇｌｔＡ（２２５６株）      アミノ酸配列
配列番号９３：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３０９株）塩基配列
配列番号９４：ｓｃｒＢ（ＡＪ１２３０９株）アミノ酸配列
産業上の利用可能性
本発明により、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスのアミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子、又はアミノ酸の細胞内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子は、前記酵素又はタンパク質の製造、又はアミノ酸生産菌の育種に利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３１０株及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性の温度による変化を示す図である。
図２は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。
図３は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のクエン酸シンターゼの活性の温度による変化を示す図である。
図４は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のクエン酸シンターゼの熱安定性を示す図である。
図５は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のイソシトレートリアーゼの活性の温度による変化を示す図である。
図６は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のイソシトレートリアーゼの熱安定性を示す図である。
図７は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のホスホフルクトキナーゼの活性の温度による変化を示す図である。
図８は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のホスホフルクトキナーゼの熱安定性を示す図である。
図９は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性の温度による変化を示す図である。
図１０は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの熱安定性を示す図である。
図１１は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のアコニターゼの活性の温度による変化を示す図である。
図１２は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のアコニターゼの熱安定性を示す図である。
図１３は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の温度による変化を示す図である。
図１４は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。
図１５は、ＡＪ１２３１０株及び２２５６株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。
図１６は、ｓｃｒＢ遺伝子搭載プラスミドｐＳＣＲ１５５の構築を示す図
図１７は、ｐｄｈＡ遺伝子搭載プラスミドｐＰＤＨＡ−２の構築を示す図である。
図１８は、ｐｄｈＡ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産性を示す図である。（ａ）：３７℃  （ｂ）：４４℃
図１９は、ｉｃｄ遺伝子搭載プラスミドｐＩＣＤ−４の構築を示す図である。
図２０は、ｉｃｄ遺伝子増幅株によるＬ−グルタミン酸生産性を示す図である。（ａ）：３７℃  （ｂ）：４４℃
図２１は、プラスミドｐＨＳＧ２９９ＹＧＤＨ及びｐＹＧＤＨの構築を示す図である。
図２２は、プラスミドｐＨＳＧ２９９ＹＣＳ及びｐＹＣＳの構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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