(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヒアルロン酸（ＨＡ）、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物であって、前記第二抗腫瘍剤が、チモテ菌(Mycobacterium phlei)ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）−チモテ菌細胞壁複合体（ＭＣＣ）、オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２である組成物。
【請求項２】
精製ヒアルロン酸（ＨＡ）、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む哺乳動物のガンを治療するための医薬組成物であって、前記第二抗腫瘍剤が、チモテ菌(Mycobacterium phlei)ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）−チモテ菌細胞壁複合体（ＭＣＣ）、オリゴヌクレオチド、ホルモンアンタゴニスト、またはそれらの組み合わせであり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２である医薬組成物。
【請求項３】
精製ヒアルロン酸（ＨＡ）、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む哺乳動物のガンを治療するための医薬組成物であって、前記第二抗腫瘍剤が、チモテ菌(Mycobacterium phlei)ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）−チモテ菌細胞壁複合体（ＭＣＣ）、オリゴヌクレオチド、またはホルモンアンタゴニストであり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２である医薬組成物であり、前記ガンが、扁平上皮癌、繊維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉種、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣がん、前立腺癌、白血病、およびリンパ腫からなる群から選択される医薬組成物。
【請求項４】
前記精製ヒアルロン酸が、哺乳類における使用に適するヒアルロナン、ヒアルロネート、またはヒアルロン酸の塩、同族体、類縁体、誘導体、複合体、エステル、断片もしくはサブユニットである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記製薬上許容可能な担体が、液体担体、固体担体またはそれらの両方を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記液体担体が、水、生理食塩水、生理学的に許容可能な緩衝液、水性懸濁液、油エマルション、油中水型エマルション、水中油中水型エマルション、部位特異的エマルション、長期滞留型エマルション、粘着性エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、鉱油または中性油、あるいはそれらの混合物である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記固体担体が、化学的担体、生物学的担体、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、ならびに組成物の持続性放出を可能にする生分解性もしくは非生分解性天然または合成ポリマーあるいはそれらの混合物である請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ガンが、扁平上皮癌、繊維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉種、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣がん、前立腺癌、白血病、およびリンパ腫である請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、経口、局所、皮下、経皮、真皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、関節内、動脈内、静脈内、皮膚内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、脊椎内、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧入、エレクトロポレーション、浸透ミニポンプおよび当該部位へのカニューレによる投与のためのものである請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
精製ヒアルロン酸（ＨＡ）、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む哺乳動物のガンを治療するための医薬組成物であって、前記第二抗腫瘍剤が、チモテ菌(Mycobacterium phlei)ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、チモテ菌ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）−チモテ菌細胞壁複合体（ＭＣＣ）、オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであり、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２である医薬組成物。
【請求項１１】
前記ガンが、扁平上皮癌、繊維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉種、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣がん、前立腺癌、白血病、およびリンパ腫からなる群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、経口、局所、皮下、経皮、真皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、関節内、動脈内、静脈内、皮膚内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、脊椎内、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧入、エレクトロポレーション、浸透ミニポンプおよび当該部位へのカニューレによる投与のためのものである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記精製ヒアルロン酸が、１×１０３〜１×１０７Ｄａの分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記精製ヒアルロン酸が、５×１０４〜１×１０６Ｄａの分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記精製ヒアルロン酸が、１×１０４〜８×１０５Ｄａの分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
１回用量につき投与される前記精製ヒアルロン酸の量が、０．００１〜２５ｍｇ／体重ｋｇである請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
１回用量につき投与される前記精製ヒアルロン酸の量が、０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇである請求項２に記載の組成物。
【請求項１８】
１回用量につき投与される前記精製ヒアルロン酸の量が、０．００１〜２５ｍｇ／体重ｋｇである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
１回用量につき投与される前記精製ヒアルロン酸の量が、０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇである請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、癌治療におけるヒアルロン酸および第二抗腫瘍剤に関する。
【０００３】
［発明の背景］
ヒアルロン酸（以後「ＨＡ」）は、その天然の形態では高分子量ポリマー（１０6〜１０7Ｄａ）として存在するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの反復二糖単位を有するグルコサミノグリカンである（Laurent et al. FASEB J. 6: 2397, 1992）。ＨＡは結合組織の主要非構造的構成成分であり、細胞外マトリックス構造を維持するために、そして細胞の運動性、接着および増殖を促進するために重要である（Entwistle, J. Cell. Biochem. 61:569, 1996）。
【０００４】
正常細胞に及ぼす低分子量ＨＡ（５×１０5Ｄａ以下）および高分子量ＨＡ（５×１０5Ｄａ以上）の両方の作用は、広範に研究されてきた（McKee et al. J. Biol. Chem. 272:8013, 1997; Hodge-Dufour et al. J. Immunol. 159:2492, 1997; Rooney et al. Int. J. Cancer 60: 632, 1995）。しかしながら、悪性細胞に及ぼすＨＡの作用についてはほとんど分かっていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＡ（＞０．３２０ｍｇ／ｍｌ）は、Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞の増殖を５０％〜９０％抑制した。ｉｎ ｖｉｖｏでは、Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫の近傍にアルゼット（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプにより７日間に亘って投与されたＨＡ（１ｍｇ／ｍｌ）は、腫瘍体積を８５％以上低減した。ｉｎ ｖｉｖｏで、種々のその他の治療薬とともに種々の期間に亘って投与されたＨＡ（＞７５０ｍｇ／ｋｇ）は、直腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌および子宮内膜癌を低減または排除した（ＰＣＴ／ＣＡ／００２８３）。ｉｎ ｖｉｖｏで、２．５ｍｇ／ｋｇの親油性チューブリン安定化化学療法薬パクリタキセル（paclitaxel, ＴＡＸＯＬ（登録商標））とともに投与されたヒアルロナン（ＨＡ）（７．５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウス中に播種された結腸２６細胞の腫瘍塊を低減した。水不溶性パクリタキセルはＨＡ上で疎水性パッチと結合し、そしてＨＡは悪性細胞の表面でＨＡ受容体と結合し、それによりパクリタキセルを悪性細胞に直接送達する、ということが提示された（ＰＣＴ／ＣＡ９８／００６６０）。即ち、ＨＡはパクリタキセルの送達剤として機能し、この送達の効率はＣＤ４４のようなＨＡ細胞表面受容体の発現に依存する。しかしながら、結腸−２６癌細胞は高レベルのＨＡ受容体を発現するので、ＨＡは単独でこれらの癌細胞の成長を有意に抑制する（Freemantle et al. Int. J. Tissue React. 17: 157, 1995）。
【０００５】
癌は、過剰な細胞増殖、不十分な細胞死または２つの組合せに起因する異型細胞の異常網状蓄積である。細胞増殖は、全細胞ＤＮＡの複製および１つの細胞の２つの細胞への分裂により特徴付けられる（Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapy Agents 8: 903, 1997）。細胞死は、細胞溶解過程を開始し、アポトーシスを促進するＩＬ−６およびＩＬ−１２を含むがこれらに限定されない免疫媒介物質により、及び細胞死に至る経路を直接開始するアポトーシス誘導物質により、影響を及ぼされる（Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997）。
【０００６】
最新癌治療は、癌細胞の増殖を抑制することにより、または癌細胞にアポトーシスを誘導することにより行う。しかしながら、これらの治療の多くは臨床用途にあまり適正でないことが立証されており、そして標準投薬量では、非効率的または有毒であり、相当の不都合な副作用を有し、薬剤耐性または免疫感作の発生を生じ、患者の生活の質を衰弱させ危うくする。さらにこれらの治療の経費は、個々の患者にとっても社会にとっても相当なものである。
【０００７】
したがって、癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞にアポトーシスを誘導し、最小毒性を伴う用量療法で有効であり、そして費用有効性のある新規の癌治療が引き続き必要とされている。
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、精製ＨＡ、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物および方法であって、ＨＡおよび第二抗腫瘍剤が相乗的に作用して、癌細胞に及ぼす互いの作用を増強する組成物および方法を提供することにより、これらの必要性を満たす。
【０００９】
ＨＡは、癌細胞中で増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する化学療法薬を含むがこれに限定されない他の抗腫瘍剤と、相乗的に作用する非毒性抗腫瘍性薬である。ＨＡおよび化学療法薬は癌細胞に及ぼす互いの作用を増強するので、化学療法薬の標準用量は、癌治療の療法的有効性を危うくすることなく低減され得る。さらにＨＡは安価であるので、そしてほとんどの化学療法薬が高価であるので、ＨＡと化学療法薬の併用は、癌治療の経費を有意に低減し得る。用量有効性の増大、毒性の低減および経費の低減は、医療業界で長年切実に感じられてきた実現されていない必要性に対処し、ヒトを含めた哺乳類に重要な利益を提供する。
【００１０】
したがって、ヒトを含めた哺乳類における癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
別の目的は、癌治療の毒性副作用を低減する組成物および方法を提供することである。
【００１２】
別の目的は、癌治療の経費を低減する組成物および方法を提供することである。
【００１３】
別の目的は、２つまたはそれ以上の抗腫瘍剤が癌細胞において相乗的に作用する組成物および方法を提供することである。
【００１４】
別の目的は、癌細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供することである。
【００１５】
別の目的は、癌細胞中にアポトーシスを誘導する組成物および方法を提供することである。
【００１６】
別の目的は、癌細胞に及ぼす化学療法薬の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１７】
別の目的は、癌細胞に及ぼす抗腫瘍性核酸の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１８】
別の目的は、癌細胞に及ぼす抗腫瘍性細菌ＤＮＡの効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１９】
別の目的は、癌細胞に及ぼす抗腫瘍性細菌ＤＮＡ−細菌細胞壁複合体の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２０】
別の目的は、癌細胞に及ぼす抗腫瘍性細菌細胞壁抽出物の効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２１】
別の目的は、癌細胞に及ぼす抗腫瘍性合成オリゴヌクレオチドの効果を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２２】
別の目的は、免疫系細胞によるサイトカインの産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００２３】
別の目的は、免疫系細胞によるＩＬ−６の産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００２４】
別の目的は、免疫系細胞によるＩＬ−１２の産生を刺激する組成物および方法を提供することである。
【００２５】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴ならびに利点は、開示された実施形態の以下の詳細な説明および併記の特許請求の範囲の検討後に明らかになる。
【００２６】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、精製ＨＡ、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物であって、ＨＡおよび第二抗腫瘍剤が相乗的に作用して、癌細胞に及ぼす互いの作用を増強する組成物を提供する。本発明は、精製ＨＡ、第二抗腫瘍剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物が、癌を治療するのに有効な量で癌を有する哺乳類に投与される方法も提供する。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、試験され、ヒトを含めた哺乳類における使用に適していることが判明しているヒアルロナン、ヒアルロネート、ＨＡの塩、同族体、類縁体、誘導体、複合体、エステル、断片およびサブユニットを指す。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「抗腫瘍剤」とは、癌の成長または転移を抑制する任意の薬剤を指す。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「化学療法薬」とは、ヒトを含めた哺乳類における癌を治療するために、地方または州政府の規制機関により承認された、あるいは米国薬局方、または他の一般的に認識された薬局方に列挙された任意の薬剤を指す。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「非脂肪親性」とは、水中の溶解度が０より大きい化学療法薬を指す。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「標準用量」とは、ヒトを含めた哺乳類における癌を治療するための、米国薬局方またはその他の一般的に認識された薬局方で示唆された用量または用量範囲を指す。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「相乗作用」とは、癌の成長または転移に及ぼす２つまたはそれ以上の薬剤の協調作用を指す。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「増強する」とは、相加的であるより大きい抗癌活性の程度を指す。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「毒性」とは、米国薬局方またはその他の一般的に認識された薬局方に含入されるような抗腫瘍剤の不都合な副作用を指す。
【００３５】
ＨＡは高粘性、高電気的陰性および高親水性である。ＨＡの単離、精製および分画のための種々の方法が、当業者には既知である。さらに、精製ＨＡの分子量分画は、Fluka Chemical Corporation (Ronkonkoma, NY, USA)、Genzyme Corporation (Cambridge, MA, USA)、Lifecore Inc. (Chaska, MN, USA)、Hyal Pharmaceutical Corporation (Mississauga, Ontario, Canada)およびBioniche Life Sciences, Inc. (Belleville, Ontario, Canada)を含むがこれらに限定されない市販供給源から購入され得る。
【００３６】
抗腫瘍剤は、化学療法薬、生物製剤、免疫刺激剤、サイトカイン、抗原、抗体、核酸、合成オリゴヌクレオチド、ワクチン、アプタマー核酸、アンチセンス核酸、免疫調節物質、テロメラーゼ阻害剤、カスパーゼ活性剤、アポトーシス誘導剤、サイクリン阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、安定三重らせん形成剤、遺伝子操作剤、生物学的操作剤および化学的合成剤、活性化または不活性化のための細胞死分子を標的にする薬剤、ならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
化学療法薬は、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ架橋剤、抗生物質誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン安定剤、チューブリン脱安定剤、代謝拮抗物質、ナイトロジェンマスタード誘導体、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、細菌抽出物、細菌ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ−細菌細胞壁複合体、合成オリゴヌクレオチド、分子生物学的修飾ウイルスおよび細菌構成成分、ならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
製薬上許容可能な担体は、液体担体、固体担体または両方を含む。液体担体は、水、生理食塩水、生理学的に許容可能な緩衝液、水性懸濁液、油エマルション、油中水型エマルション、水中油中水型エマルション、部位特異的エマルション、長期滞留型エマルション、粘着性エマルション、マイクロエマルションおよびナノエマルションを含むが、これらに限定されない。好ましい水性担体は、水、生理食塩水および生理学的に許容可能な緩衝液を含むが、これらに限定されない。好ましい非水性担体は、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない鉱油または中性油を含むが、これらに限定されない。固体担体は、生物学的担体、化学的担体または両方であり、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、ならびに組成物の持続性放出を可能にする生分解性もしくは非生分解性天然または合成ポリマーを含むが、これらに限定されない（Brem et al. J. Neurosurg. 74:441, 1991）。
【００３９】
癌は、扁平上皮癌、繊維肉腫、サルコイド癌腫、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉種、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣がん、前立腺癌、白血病、リンパ腫およびそれら由来の転移を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
好ましくは用いられるＨＡの分子量は、約１×１０3〜１×１０7Ｄａ、さらに好ましくは約５×１０4〜１×１０6Ｄａ、最も好ましくは約１×１０4〜８×１０5Ｄａである。好ましくは１回用量につき投与されるＨＡの量は約０．００１〜２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。１回用量につき投与される抗腫瘍剤の量は、用いられる抗腫瘍剤に依存し、好ましくは標準用量の約５〜７５％、さらに好ましくは標準用量の約５〜５０％、最も好ましくは標準用量の約５〜１０％である。
【００４１】
投与経路は、経口、局所、皮下、経皮、真皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、関節内、動脈内、静脈内、皮膚内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、脊椎内、身体の腔内配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧入、エレクトロコーポレーション、浸透ミニポンプおよび当該部位へのカニューレによる経路を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
投与経路によって、１回用量についての容量は好ましくは約０．００１〜１００ｍｌ／用量、さらに好ましくは約０．０１〜約５０ｍｌ／用量、最も好ましくは約０．１〜３０ｍｌ／用量である。用量は、治療される癌、レシピエントの症状および投与経路に適したスケジュールで、ならびに期間に亘って、単回治療で、または多数回治療で投与され得る。さらにＨＡは、ともに２４時間以内に投与される限り、抗腫瘍剤の投与の前、その投与と同時に、またはその後に投与され得る。
【００４３】
一例では、１００ｍｇの１．５×１０4Ｄａ未満のＨＡ＋４ｍｇ／ｋｇの代謝拮抗物質フッ素化ピリミジン５−フルオロウラシル（以後、「５−ＦＵ」；標準用量１２ｍｇ／ｋｇ）が、癌を治療するのに有効な回数および時間で、癌を有する哺乳類に静脈内投与される。別の例では、１００ｍｇの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋２ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵが、腫瘍を治療するのに有効な回数および時間で、腫瘍を有する哺乳類に腫瘍内投与される。別の例では、１００ｍｇの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋１．２ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵが、腫瘍を治療するのに有効な回数および時間で、癌を有する哺乳類に腫瘍内投与される。別の例では、１００ｍｇの１〜３×１０5ＤａのＨＡ＋１０ｍｇ／ｍ2のアルキル化剤シスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）；以後「ＣＩＳ」；標準用量１００ｍｇ／ｍ2）が、癌を治療するのに有効な回数および時間で、癌を有する哺乳類に静脈内投与される。別の例では、１００ｍｇの３〜５×１０5ＤａのＨＡ＋３６ｍｇ／ｍ2のＤＮＡ架橋剤カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）；標準用量３６０ｍｇ／ｍ2）が、癌を治療するのに有効な回数および時間で、癌を有する哺乳類に静脈内投与される。
【００４４】
用量あたりのＨＡの量、用いられる特定の第二抗腫瘍剤、用量あたりの第二抗腫瘍剤の量、用量スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法を用いて当業者により決定されるべきであり、そしてそれらは、癌の種類、癌の重症度、癌の位置およびその他の臨床要素、例えばレシピエントのサイズ、体重、および身体症状に依存している。さらに、ＨＡ＋抗腫瘍剤投与に関する最適範囲を同定するのを助けるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが用いられ得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために役立つが、しかしながら同時にそれらによるいかなる限定をも構成するものではない。これに反して、本発明の精神および／または併記の特許請求の範囲から逸脱せずに、種々のその他の実施形態、改変物およびその同等物に対する方策がなされてもよく、このことは、本明細書中の記載を読めば、それ自体、当業者に示唆され得ると明らかに理解されるべきである。
【００４６】
実施例１
細胞
細胞系は全て、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、Rockville, MD, USA）から入手し、ＡＴＣＣが推奨する倍地中で培養した。
【００４７】
表１は、細胞系、それらの起源およびそれらの特性を示す。
【００４８】
【表１】
0004215429.tif 000002
【００４９】
実施例２
試薬
連鎖球菌属種から精製されたＨＡをLifecore Inc.(Chaska, MN, USA)から入手し、０．８ｍｇ／ｍｌ（ＣＹＳＴＩＳＴＡＴ（登録商標）、Bioniche Life Sciences Inc., Belleville, Ontario, Canada）で、または１０．０ｍｇ／ｍｌ（ＳＵＰＬＡＳＹＮ（登録商標）、Bioniche Life Sciences Inc., Belleville, Ontario, Canada）で滅菌生理食塩水中に溶解した。
【００５０】
チモテ菌ＤＮＡ（以後、「Ｍ−ＤＮＡ」）およびＭ−ＤＮＡ−チモテ菌細胞壁複合体（以後、「ＭＣＣ」）を、米国特許出願第０９，１２９，３１２号（参照により本明細書中に援用される）と同様に調製した。
【００５１】
実施例３
５．０×１０5Ｄａ以下のＨＡの調製
ウシ精巣由来のＩＶ−Ｓ型ヒアルロニダーゼ（Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario, Canada）を用いた３７℃で６０分間の消化により、最大強度で２０分間の氷上での超音波処理（Branson Sonifier Model 450, Danbury, CT, USA）により、あるいは３０分間のオートクレーブ処理（Amsco-Steris International, Model 2002, Mentor, OH, USA）により、５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡから５．０×１０5Ｄａ以下のＨＡを調製した。
【００５２】
得られたＨＡを、１００Ｖで３時間、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス、２０ｍＭの酢酸および２．０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．９）中に調製した０．５％アガロースゲル中で電気泳動した（Lee et al. Anal. Biochem. 219:278, 1994）。０．００５％の陽イオン性色素Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（１−エチル−２−［３−（１−エチルナプトール［１，２−ｄ］チアゾリン−２−イリデン）−２−メチルプロペニル］ナプトール［１，２−ｄ］チアゾリウムブロミド(Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada)）を用いてＨＡの分子量分布を可視化し、１Ｄソフトウェア（Advance American Biotechnology, Fullerton, CA, USA）を用いてゲル写真を走査した。ＨＡの分子量は、ヒアルロニダーゼ処理後は１．５×１０4Ｄａ未満、超音波処理後は約１．０〜３．０×１０5Ｄａ、そしてオートクレーブ処理後は約３．０〜５．０×１０5Ｄａであった。
【００５３】
実施例４
細胞増殖の測定
ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）還元を用いて、細胞増殖を測定した（Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983）。別記しない限り、１ｍｌのＰＢＳ中に溶解した５ｍｇのＭＴＴ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）１００μｌを各ウエルに添加した。４時間後、各ウエルから培地を取り出して、１．０ｍｌの酸−イソプロパノール（イソプロパノール中の０．０４ＮのＨＣｌ）を添加し、混合により還元ＭＴＴを溶解させた。マルチプレート分光光度計読取器（Ｅｌｘ８００モデル、Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, Vermont, USA）を用いて５７０ｎｍで、反応産物の吸光度を測定した。
【００５４】
実施例５
ＨＡによる細胞増殖の抑制
別記しない限り、１．０×１０5細胞／ｍｌを６−ウエル平底組織培養プレート中に播種して、５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で４８時間保持した。
【００５５】
ＰＣ−３、ＬＮＣａＰおよびＤｕ−１４５ヒト前立腺癌細胞、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫癌細胞、Ｂ１６Ｆ１ネズミ黒色腫細胞、ならびにＵＭＵＣ−３、ＲＴ−４、ＨＴ−１３７６およびＴ−２４ヒト膀胱癌細胞を、０．８、８．０および８０μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡとともにインキュベートした（表２）。
【００５６】
【表２】
0004215429.tif 000003
【００５７】
表２に示したように、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、Ｄｕ−１４、ＭＣＦ−７、ＨＴ−１０８０およびＢ１６Ｆ１癌細胞の増殖抑制は、ＨＡの濃度の増大に伴って増大したが、一方、ＵＭＵＣ−３、ＲＴ−４、ＨＴ−１３７６およびＴ−２４癌細胞の増殖の抑制は、ＨＡの濃度の増大に伴って増大しなかった。
【００５８】
ＰＣ−３、ＬＮＣａＰおよびＤｕ−１４５ヒト前立腺癌細胞を、８．０μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡまたは１．５×１０4Ｄａ未満のＨＡとともにインキュベートした（表３）。
【００５９】
【表３】
0004215429.tif 000004
【００６０】
ＰＣ−３癌細胞増殖は５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡによりさらに抑制されたが、一方、ＬＮＣａＰおよびＤｕ−１４５癌細胞増殖は１．５×１０4Ｄａ未満のＨＡによりさらに抑制された。
【００６１】
実施例６
Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣの抗腫瘍作用のＨＡ増強
別記しない限り、２．０×１０4細胞／ｍｌを２４ウエルプレートに播種して、５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で４８時間保持した。ＭＴＴは、５０μｌ／ウエルで用いた。
【００６２】
Ｔ−２４ヒト膀胱癌細胞、ＰＣ−３およびＤｕ−１４５ヒト前立腺癌細胞ならびにＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、生理食塩水とともに、または８０．０μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋１．０μｇ／ｍｌのＭ−ＤＮＡとともにインキュベートした（表４）。
【００６３】
【表４】
0004215429.tif 000005
【００６４】
表４に示したように、ＨＡは、Ｔ−２４、ＰＣ−３、Ｄｕ−１４５およびＭＣＦ−７癌細胞に及ぼすＭ−ＤＮＡ抗腫瘍作用を増強した。
【００６５】
ＨＴ−１３７６、ＲＴ−４およびＴ−２４ヒト膀胱癌細胞は、０．８μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋１．０μｇ／ｍｌのＭＣＣとともにインキュベートした（表５）。
【００６６】
【表５】
0004215429.tif 000006
【００６７】
表５に示したように、ＨＡは、Ｈ−１３７６、ＲＴ−４およびＴ−２４癌細胞に及ぼすＭＣＣの抗腫瘍作用を増強した。
【００６８】
実施例７
合成オリゴヌクレオチドの抗腫瘍作用のＨＡ増強
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（２．５×１０5細胞／ｍｌ）を、０．０、０．０１および０．１μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋１００μｇ／ｍｌの合成６塩基オリゴヌクレオチドＧＧ（ＧＴ）1ＧＧ（配列番号１）または＋１００μｇ／ｍｌの合成２７塩基オリゴヌクレオチド（ＧＴ）13Ｇ（配列番号２）を用いて、実施例６と同様にインキュベートした（表６）。ＭＴＴは５０μｌ／ウエルで用いた。
【００６９】
【表６】
0004215429.tif 000007
【００７０】
表６に示したように、０．０１μｇ／ｍｌＨＡおよび０．１μｇ／ｍｌＨＡは６塩基ＧＧ（ＧＴ）1ＧＧ（配列番号１）の抗腫瘍活性を増強し、そして０．０１μｇ／ｍｌＨＡは２７塩基（Ｇ1Ｔ）13Ｇ（配列番号２）の抗腫瘍活性を増強した。
【００７１】
実施例８
化学療法薬の抗腫瘍効果のＨＡ増強
ＲＴ−４ヒト膀胱癌細胞およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、０．０、０．００８または０．０８μｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡ＋０．１μｇ／ｍｌのＣＩＳ、＋１．０μｇ／ｍｌの５−ＦＵまたは＋１０μｇ／ｍｌの５−ＦＵを用いて、実施例６と同様にインキュベートした（表７）。
【００７２】
【表７】
0004215429.tif 000008
【００７３】
表７に示したように、０．００８μｇ／ｍｌおよび０．０８μｇ／ｍｌのＨＡは、ＲＴ−４癌細胞に及ぼす０．１μｇ／ｍｌのＣＩＳおよび１．０μｇ／ｍｌの５−ＦＵの抗腫瘍効果、ならびにＭＣＦ−７癌細胞に及ぼす１０μｇ／ｍｌの５−ＦＵの抗腫瘍効果を増強した。
【００７４】
実施例９
ＣＤ４４細胞表面受容体および増殖のＨＡ抑制
ＣＤ４４は、多数の変異体を有する細胞表面ＨＡ受容体である（Screaton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12160, 1992）。ＣＤ４４変異体はヒト腫瘍中で選択的に発現され、そして多数の腫瘍細胞系で過剰発現される（Naot et al. Adv. Cancer Res. 71:241, 1997）。癌細胞上のＣＤ４４受容体は、有効量の高脂肪親和性化学療法薬パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））を低パクリタキセル投与量でＨＡが癌細胞中に送達するのを可能にするが、これは、パクリタキセルがＨＡと結合し、次いでＨＡがＣＤ４４受容体と結合するためであるということが示唆されている（ＰＣＴ／ＣＡ９８／００６６０）。
【００７５】
ＣＤ４４受容体と結合するＨＡが細胞増殖の抑制と相関するか否かを確定するために、蛍光抗ＨＡ受容体モノクローナル抗体ＦＩＴＣ−ＣＤ４４（クローンＧ４４−２６（Ｃ２６）、Pharmingen, Mississauga, Ontario. Canada）を用いて、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により、ＣＤ４４受容体発現を検出した。要するに、室温で５分間，１８０×Ｇでの遠心分離により細胞をペレット化し、ＰＢＳ中で２回洗浄して、暗所で４℃で２０分間、メーカー推奨濃度でのＦＩＴＣ−ＣＤ４４とともにインキュベートした。次に細胞を遠心分離によりＰＢＳ中で２回洗浄し、細胞蛍光を４８８ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光で測定した（ＦＬ１検出器）。プログラムＣＥＬＬＱＵＥＳＴ（Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）を用いて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲでデータを解析した。
【００７６】
ジャーカットＴ細胞白血病細胞、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、ＲＴ−４、Ｔ−２４、ＨＴ−１３７６およびＵＭＵＣ−３ヒト膀胱癌細胞、ならびにＰＣ−３、Ｄｕ−１４５およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を用いて、ＣＤ４４発現および５．０〜７．５×１０5ＤａのＨＡによる増殖の抑制を測定した（表８）。
【００７７】
【表８】
0004215429.tif 000009
【００７８】
表８に示したように、癌細胞によるＣＤ−４４受容体の発現は、ＨＡによる増殖の抑制と相関しなかった。ＰＣ−３癌細胞はＣＤ４４受容体を発現するが、一方、ＬＮＣａＰ癌細胞はＣＤ４４受容体を発現しない（Lokeshwar et al. Anticancer Res. 15:1191, 1995）。しかしながら、表８に示したように、ＰＣ−３癌細胞（３０％）の、およびＬＮＣａＰ癌細胞（２６％）の増殖のＨＡ抑制は、有意に異ならなかった。
【００７９】
実施例１０
サイトカイン産生の誘導
全血のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Quebec, Canada）密度勾配遠心分離により、５名の健常人の血液から、末梢血単核球（以後、「ＰＢＭＣ」）を単離した。適切な市販ＥＬＩＳＡ（BioSource, Camarillo, CA, USA）を用いて、免疫系細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１２産生の刺激が測定された。結果は、対照細胞と比較した処置細胞によるサイトカイン産生の「倍（×）」増として表す。
【００８０】
ＰＢＭＣを、１ｍｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5Ｄａとともにインキュベートし、そしてＩＬ−６およびＩＬ−１２の産生が測定された（表９）。
【００８１】
【表９】
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【００８２】
表９に示したように、ＨＡは、免疫系細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１２産生の両方を刺激した。
【００８３】
個体＃１の血液から単離されたＰＢＭＣを、０．００８、０．０４、０．２および１ｍｇ／ｍｌの５．０〜７．５×１０5Ｄａとともにインキュベートした（表１０）。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
表１０に示したように、ＨＡは０．００８、０．０４、０．２および１ｍｇ／ｍｌで、免疫系細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１２産生の両方を刺激した。
【００８６】
実施例１１
マウスにおけるＰＣ３腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣの効果
ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、２２４匹の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１１）。
【００８７】
【表１１】
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【００８８】
生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で静脈内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。群６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４および２６〜２８は、群５、９、１３、１７、２１および２５のマウスより腫瘍質量が小さく、転移が少ない。
【００８９】
実施例１２
マウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣの効果
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞（ＣＤ４４なし）を、２２４匹の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１２）。
【００９０】
【表１２】
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【００９１】
生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で静脈内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。群６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４および２６〜２８は、群５、９、１３、１７、２１および２５のマウスより腫瘍質量が小さく、転移が少ない。これらの結果は、処置結果が癌細胞によるＣＤ４４発現によらないことを示す。
【００９２】
実施例１３
マウスにおけるＢ１６Ｆ１腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣの効果
Ｂ１６Ｆ１癌細胞を、２２４匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１３）。
【００９３】
【表１３】
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【００９４】
生理食塩水、ＨＡ、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、ＨＡ＋Ｍ−ＤＮＡおよびＨＡ＋ＭＣＣを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で生理食塩水中で腫瘍内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。群６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４および２６〜２８は、群５、９、１３、１７、２１および２５のマウスより腫瘍質量が小さく、転移が少ない。
【００９５】
実施例１４
マウスにおけるＰＣ３腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５−ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５−ＦＵの作用
ＰＣ−３癌細胞を、２２４匹の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１４）。
【００９６】
【表１４】
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【００９７】
生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５−ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５ＦＵを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で生理食塩水中で静脈内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。群６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４および２６〜２８は、群５、９、１３、１７、２１および２５のマウスより腫瘍質量が小さく、転移が少ない。
【００９８】
実施例１５
マウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５−ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５−ＦＵの効果
ＬＮＣａＰ癌細胞（ＣＤ４４なし）を、２２４匹の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１５）。
【００９９】
【表１５】
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【０１００】
生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５−ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５ＦＵを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で生理食塩水中で静脈内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。群６〜８、１０〜１２、１４〜１６、１８〜２０、２２〜２４および２６〜２８は、群５、９、１３、１７、２１および２５のマウスより腫瘍質量が小さく、転移が少ない。これらの結果は、処置結果が癌細胞によるＣＤ４４発現によらないことを示す。
【０１０１】
実施例１６
マウスにおけるＢ１６Ｆ１腫瘍に及ぼす生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５−ＦＵの作用
Ｂ１６Ｆ１癌細胞を、２２４匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した。マウスは、８匹ずつの２８群に分ける（表１６）。
【０１０２】
【表１６】
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【０１０３】
生理食塩水、ＨＡ、ＣＩＳ、５−ＦＵ、ＨＡ＋ＣＩＳおよびＨＡ＋５ＦＵを、０日目、ならびに４週間の間３日間隔で生理食塩水中で静脈内投与（１０回注射）し、この時点でマウスを屠殺して、腫瘍質量および転移数を決定した。群２〜２８のマウスは、群１のマウスより腫瘍質量が小さく、転移も少ない。
【０１０４】
本発明を詳細にかつそれらの特定の実施形態を参照しながら説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、種々の変更および改変がなされ得ることは、当業者には明らかであろう。
【配列表】
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