(57)【要約】本発明は、一つ以上のｃｙｓＬＴの異常な数値と関連された炎症性疾病および喘息を含む疾病治療用の一つ以上のシステイニルロイコトリエン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ、ｃｙｓＬＴ）と結合する抗体を使用する方法に関するものである。また、本発明は、抗−ｃｙｓＬＴ抗体および抗原に結合する前記抗体の断片、および前記抗体および前記抗体断片を含む組成物に関するものである。
2016537406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常な数値の一つ以上のシステイニルロイコトリエン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ、ｃｙｓＬＴ）種と関連された疾病または疾患がある被験者に一つ以上のｃｙｓＬＴ種と結合する抗体またはその断片を効果的な容量で投与して前記疾病または疾患を治療することを特徴とする、異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項２】
前記疾病または疾患は炎症性疾病または疾患、アレルギー、心血管疾病または疾患、呼吸器系疾病または疾患、中枢神経系疾病または疾患、癌、皮膚疾患、胃腸疾患、およびリューマチ性関節炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項３】
前記皮膚疾患は、蕁麻疹またはアトピー性皮膚炎であるか、前記胃腸疾患は大腸炎であるか、前記呼吸器系疾病または疾患は喘息、アスピリン過敏性呼吸器系疾病（ａｓｐｉｒｉｎ−ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＥＲＤ）、気道過敏症、またはアレルギー性鼻炎であるか、前記心血管疾病は異常な血管透過性であるか、前記中枢神経系疾病または疾患は脳卒中または外傷性脳損傷であることを特徴とする、請求項２に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項４】
前記抗体または前記抗体の断片は、多クローン抗体、単クローン抗体、および前記多クローン抗体および単クローン抗体の中のいずれか一つのｃｙｓＬＴ結合断片からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項５】
前記抗体または前記抗体の断片は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、またはＬＴＥ４の中の一つ以上と結合することを特徴とする、請求項１に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項６】
前記抗体またはその断片は、感知可能にＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４と結合することを特徴とする、請求項５に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項７】
前記抗体またはその断片は、優先的にＬＴＣ４またはＬＴＥ４と結合することを特徴とする、請求項５に記載の異常な数値の一つ以上のｃｙｓＬＴ種と関連された疾病または疾患の治療方法。
【請求項８】
一つ以上のｃｙｓＬＴ種と結合する抗体または前記抗体の断片を効果的な容量で被験者に投与して炎症を改善させることを特徴とする、被験者の炎症を改善する方法。
【請求項９】
前記炎症は患者の気道、皮膚、胃腸管、神経系、関節、または血管に影響を及ぼすことを特徴とする、請求項８に記載の被験者の炎症を改善する方法。
【請求項１０】
生理的条件下で一つ以上のシステイニルロイコトリエン（ｃｙｓＬＴ）種と結合し、少なくとも一つの免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖可変ドメイン（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）および少なくとも一つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）を含む分離された抗体または抗原と結合する前記抗体の断片であって、
前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは第１、第２、および第３重鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）を含み、前記第１重鎖ＣＤＲは序列番号８、１４、１５、１６、２２、２３、２４、３１、および７４からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２４または３１に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、前記第２重鎖ＣＤＲは序列番号９、１７、２５、および３２からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２５または３２に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、そして前記第３重鎖ＣＤＲは序列番号１０、１８、２６、および３３からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２６または３３に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、そして
前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは第１、第２、および第３軽鎖ＣＤＲを含み、前記第１軽鎖ＣＤＲは序列番号１１、１９、２７、３０、３４、および７５からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２７、３０、または３４に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、前記第２軽鎖ＣＤＲは序列番号１２、２０、２８、および３５からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２８または３５に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、そして前記第３軽鎖ＣＤＲは序列番号１３、２１、２９、３６、および７６からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２９または３６に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とする。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは序列番号４３、４５、４７、５０、５４、５８、５９、６１、６２、６３、６４、および６５からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは序列番号４４、４６、４８、４９、５１、６６、６８、６９、７０、７１、７２、および７３からなる群から選択されるアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
【請求項１２】
前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片は、単クローン抗体、人間化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）単クローン抗体、または前記抗体の中のいずれか一つの抗原と結合する前記抗体の断片であることを特徴とする、請求項１０に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な運搬体内に存在することを特徴とする、請求項１０に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
【請求項１４】
請求項１０に記載された抗−ｃｙｓＬＴ抗体またはその断片を含むことを特徴とする、ＥＬＩＳＡキット。
【請求項１５】
青色タンパク質運搬体に共有結合されたロイコトリエンＥ４（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ４、ＬＴＥ４）を含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載された前記組成物を含む免疫原で免疫適格（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）哺乳動物を免疫化することによって生成された、抗体。
【請求項１７】
第１、第２、および第３重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインを暗号化する分離された核酸であって、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは第１、第２、および第３重鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）を含み、前記第１重鎖ＣＤＲは序列番号８、１４、１５、１６、２２、２３、２４、３１、および７４からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２４または３１に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、前記第２重鎖ＣＤＲは序列番号９、１７、２５、および３２からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２５または３２に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、そして前記第３重鎖ＣＤＲは序列番号１０、１８、２６、および３３からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２６または３３に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とする。
【請求項１８】
第１、第２、および第３軽鎖ＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを暗号化する分離された核酸であって、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは第１、第２、および第３軽鎖ＣＤＲを含み、前記第１軽鎖ＣＤＲは序列番号１１、１９、２７、３０、３４、および７５からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２７、３０、または３４に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、前記第２軽鎖ＣＤＲは序列番号１２、２０、２８、および３５からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２８または３５に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とし、そして前記第３軽鎖ＣＤＲは序列番号１３、２１、２９、３６、および７６からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号２９または３６に対して少なくとも約７６％の同一性を有することを特徴とする。
【請求項１９】
請求項１７および請求項１８の一つ以上による前記分離された核酸を含む、ベクターまたは宿主細胞。
【請求項２０】
抗体または抗原と結合する前記抗体の断片の合成がなされる条件下で、請求項１９項による前記宿主細胞を培養して前記抗体または前記抗原と結合する抗体の断片を製造することを特徴とし、前記製造された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片を分離する段階を選択的にさらに含むことを特徴とする前記抗体または前記抗原と結合する抗体の断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシステイニルロイコトリエン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ、ｃｙｓＬＴｓ）と結合する抗体を使用して気道炎症に代表される疾病を含む疾病を治療する方法に関するものである。また、本発明は一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する抗体、具体的には、単クローン抗体に関するものである。
【０００２】
序列目録
本出願書は電子出願システムによって２０１４年１０月２４日付で提出された序列目録を含み、前記序列目録全体が本明細書に参照として含まれる。２０１４年１０月２４日付けで生成されたＡＳＣＩＩ写本はＬＰＴ３５００ＰＣ．ｔｘｔと命名され、大きさは４０、６４０バイトである。
【背景技術】
【０００３】
１．序論
後述される説明は本発明を理解するにおいて有用な情報を含む。本明細書で提供されるすべての情報または本明細書で具体的にまたは内在的に参照される従来のすべての公開文書が本発明の請求項と関連するものとして許与されるものではない。
【０００４】
２．背景技術
生理活性信号脂質
現在、脂質およびこれらの誘導体は、細胞膜の単なる構造的要素またはβ−酸化、該当作用またはその他の代謝過程のエネルギー源としてではなく、医学研究のための重要な対象と認識される。具体的には、ある生理活性脂質は動物および人間の疾病で重要な信号調節者として機能する。たとえ、原形質膜の多くの脂質が構造的な役割だけを遂行するものであるとしても、これらのうちの少数は細胞外刺激を細胞内に伝達することに関与する。このような脂質は「生理活性脂質」または「生理活性信号脂質」と言及される。「脂質信号」は第２伝令（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）として細胞膜脂質を使う数多くのすべての細胞の信号伝達経路を意味するだけでなく、この特定受容体を有する脂質信号分子の直接的な相互作用を意味する。脂質信号経路は成長因子および炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を含む数多くの細胞外刺激によって活性化され、老化、分化、および増殖のような細胞運命決定を調節する。生理活性脂質信号に対する研究は、より多くの生理活性脂質が確認され、これらの機能が糾明されるほどこれに対する科学的探求はさらに深化される。
【０００５】
システイニルロイコトリエン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ、ｃｙｓＬＴ）
ロイコトリエンは、アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ（ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ  ５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）によるアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）の酸化によって白血球から生成される炎症のエイコサノイド（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ）脂質調節者の群（ｆａｍｉｌｙ）である。このような化合物は四個の二重結合を有し、これらのうち三個は結合されている（したがって、「ロイコトリエン」と命名される）。ロイコトリエンはロイコトリエンＡ４（ＬＴＡ４）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）、ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）、およびロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）だけでなく、ロイコトリエンＦ４（ＬＴＦ４）を含み、これらは現在、合成によって生産される（ＬＴＦ４  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔ、Ｉｔｅｍ  ｎｏ．  ２０５２０、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ）。また、ロイコトリエンＧ４（ＬＴＧ４）はＬＴＥ４のアミノ基転移（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）による体外疾患でのみ確認され、本来の動物組織または体液では発見されていない（ＬＴＧ４  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔ、Ｉｔｅｍ  ｎｏ．  ２０６１０、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
システイニルロイコトリエン（ｃｙｓＬＴ）は、これらの構造内のシステイン残基によってこのように命名される。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４およびＬＴＦ４はシステイニルロイコトリエンである。ＬＴＦ４は自然的に発生するものとは見えないため、疾病および治療学的脈絡で、一般的に「ｃｙｓＬＴ」は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４を言及する。本発明の脈絡で、「ｃｙｓＬＴ」または「ｃｙｓＬＴ」は、自然的に発生し、疾病またはその他の健康に有害な疾患と関連性があるか関連された一つ以上のシステイニルロイコトリエンを意味する。具体的に、好ましくは、ｃｙｓＬＴターゲットはＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４を含み、これらの構造は下記で図示される。
【化１】
2016537406.tif 000003
2016537406.tif 000004
2016537406.tif 000005
【０００７】
図示されたように、このようなｃｙｓＬＴの極性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）は互いに異なるが、非極性の炭化水素の尻尾部（各図面の左側に図示される）は前記三個のすべての化合物で同一である。
【０００８】
ｃｙｓＬＴの合成
ｃｙｓＬＴは早く生成されるが、例えば、炎症部分で、次のような一連の反応はアラキドン酸の放出を引き起こす。５−リポキシゲナーゼ（５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ、５−ＬＯ）はアラキドン酸を５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（５−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、５−ＨＰＥＴＥ）に転換するために５−ＬＯ活性蛋白質（５−ＬＯ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＬＡＰ）を使用し、これは自然発生的に５−ヒドロオキシエイコサテトラエン酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、５−ＨＥＴＥ）に還元する。５−ＬＯ酵素は５−ＨＥＴＥをロイコトリエンＡ４（５Ｓ、６Ｓ−エポキシ−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−エイコサテトラエン酸（５Ｓ、１２Ｒ−ジヒドロキシ−６Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＴＡ４）に転換するために５−ＨＥＴＥを転換するが、このような反応は不安定である。ＬＴＡ４はＬＴＡ４加水分解酵素によってジヒドロキシ酸ロイコトリエンＢ４（５Ｓ、１２Ｒ−ジヒドロキシ−６Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１４Ｚ−エイコサテトラエン酸（５Ｓ、１２Ｒ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＴＢ４）に転換される。ＬＴＢ４は好中性白血球用化学走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）である。
【０００９】
好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）、好塩球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）、肥満細胞（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ）、および肺胞大食細胞（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）のようなＬＴＣ４シンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現する細胞で、ＬＴＡ４はトリペプチドグルタチオン（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）と結合してｃｙｓＬＴの中の最初のＬＴＣ４（５Ｓ−ヒドロキシ−６Ｒ−（Ｓ−グルタチオニル）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−エイコサテトラエン酸（５Ｓ−ｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｒ−（Ｓ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌ）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））を形成する。細胞外部では、ＬＴＣ４は随所に存在する酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ）により転換され、グルタミン酸モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）の切断によって引き続きＬＴＤ４（５Ｓ−ヒドロキシ−６Ｒ−（Ｓ−システインイルグリシニル）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−エイコサテトラエン酸（５Ｓ−ｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｒ−（Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｙｌ）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））を形成する。ＬＴＤ４はグリシンモイエティの切断によってＬＴＥ４（５Ｓ−ヒドロキシ−６Ｒ−（Ｓ−システイニル）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−エイコサテトラエン酸（５Ｓ−ｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｒ−（Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ）−７Ｅ、９Ｅ、１１Ｚ、１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））に転換され得る。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４は生物学的活性を有し、ＬＴＥ４はこれら三種類の化合物のうち最も安定で豊富なものと見なされる。
【００１０】
ｃｙｓＬＴ受容体
ｃｙｓＬＴは、炎症性疾病の病理生理学での強力な生物学的調節者であり、細胞表面受容体との特定の相互作用によって収縮性の炎症過程を誘導し、Ｇ蛋白質共役受容体の上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する。現在、二つのｃｙｓＬＴ受容体が人間と実験ネズミで同定されており、ｃｙｓＬＴ１およびｃｙｓＬＴ２と命名される。このような二つの受容体は、構造的に相異し、実験ネズミと人間のｃｙｓＬＴ１およびｃｙｓＬＴ２のアミノ酸相同性は４０％未満である（Ｋａｎａｏｋａ、Ｙ．  およびＪ．Ａ．  Ｂｏｙｃｅ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：１５０３−１５１０、２００４年）。ｃｙｓＬＴ１受容体は、脾臓および末梢血白血球で最も強く発現され、肺、小腸、結腸、膵臓および胎盤それよりは弱く発現されると見なされ、喘息を含む気道炎症に関連されたものと知られている。ｃｙｓＬＴ１受容体のようにｃｙｓＬＴ２受容体は脾臓および末梢血白血球で発現されるが、ｃｙｓＬＴ２受容体だけが心臓、脳、および副腎で発現されるものと見なされる（検討のための参照文献、Ｓｉｎｇｈなど、２０１０年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８５：３３６−３４９）。
【００１１】
前記二つのｃｙｓＬＴ受容体は、異なる特徴を有すると見られる。人間ｃｙｓＬＴ１Ｒは、ＬＴＤ４に対する高親和力（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）受容体である反面、人間ｃｙｓＬＴ２ＲはＬＴＣ４およびＬＴＤ４に対して同じ親和力を有するが、いかなる受容体もＬＴＥ４に対する相当な親和力を有さない。ＬＴＥ４に対する選好度を有する追加的なｃｙｓ−ＬＴ受容体の存在が長い間推測されてきたが、明確に確認されたことはない。アデノシンジホスフェート（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）−反応性プリン（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ、Ｐ２Ｙ１２）受容体は、ＬＴＥ４の機能に必要なものと提案されてきた（Ｐａｒｕｃｈｕｒｉなど、２００９年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６：２５４３−２５５５）。また、分離されたＬＴＥ４受容体の存在がＭａｅｋａｗａなどによって報告された（２００８年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０５：１６６９５−１６７００）。
【００１２】
ｃｙｓＬＴ１受容体拮抗物質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ、例えば、モンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ、ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ  ＴＭ）、ザフィルルカスト（ｚａｆｉｒｌｕｋａｓｔ）、およびプランルカスト（ｐｒａｎｌｕｋａｓｔ））が開発され、喘息、運動誘発性気管支収縮、およびアレルギー性鼻炎の予防および長期間治療のために広く処方される。モンテルカストの作用メカニズム（すなわち、ｃｙｓＬＴ１Ｒ上でＬＴＤ４だけでなく、ＬＴＣ４およびＬＴＥ４の作用を遮断する）により、モンテルカストは一般的に喘息急性期治療のために提供されず、むしろ、時々吸入されたコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）に対する補完的治療として提供される。しかし、急性喘息で高容量のモンテルカスト投薬が提案されてきた（Ｗｕなど、２００３年、Ｃｌｉｎ  ＆  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３３：３５９-３６６）。
【００１３】
疾病状態でｃｙｓＬＴ
ｃｙｓＬＴは病理生理学的疾病、具体的には、喘息、アレルギー性鼻炎、およびその他のアレルギーのような呼吸器系疾病および疾患を含む炎症性疾病および疾患で作用し、気道過敏症疾患（ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）、心血管疾患、脳血管疾患、癌、胃腸疾患、およびアトピー性皮膚炎、蕁麻疹を含む皮膚疾患を含む疾患と関連されたものと思われてきた。ｃｙｓＬＴは強力な血管収縮神経剤（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ）である（Ｃａｐｒａなど、２００７年、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ、２７：４６９−５２７、Ｒｉｃｃｉｏｎｉなど、２００８年、Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ８４：１３７４−１３７８．  Ｒｉｃｃｉｏｎｉ、ＧおよびＭ  Ｂａｃｋ．  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ、２０１２年５月１日付にオンライン上に公開される。ｄｏｉ：１０．１１００／２０１２／４９０９６８．  Ｓｉｎｇｈ、２０１０年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８５：３３６？３４９）。
【００１４】
ｃｙｓＬＴ数値は疾病で上昇すると見られてきた。例えば、ｃｙｓＬＴ過生成は好酸球活性化（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の誘導で核心因子であると見なされた。ＡＥＲＤ患者で、小便、痰、末梢血、および吐き出された呼吸におけるｃｙｓＬＴ数値上昇がアスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）投与後に観察された。ロイコトリエンＥ４は、他のｃｙｓＬＴよりさらに強力で、ヒスタミン誘導性気道反応（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｉｒｗａｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）の増加、好酸性物質補充、およびこれによる血管透過性の増加に寄与すると見られてきた（Ｐａｌｉｋｈｅなど、２００９年、Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ  Ｊ  ５０：７４４−７５０）。ｃｙｓＬＴは喘息および鼻炎の両方で見られる炎症に積極的に関与される。ＬＴＥ４吸入剤は非常に強力な気管支収縮因子であり、組織内に炎症細胞、特に好酸球の補充を誘導する。喘息患者の痰は鼻炎患者または健康な正常の人と比較して高い数値のＣｙｓ−ＬＴを含む（Ｔｕｖｆｅｓｓｏｎなど、２００７年、Ｃｌｉｎ  ＆  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３７：１０６７−１０７３）。ｃｙｓＬＴの分泌は冠状動脈疾病である可変性狭心症および急性心筋梗塞の繰り返される症状発現後に、冠状動脈迂迴路術後に、また、アトピー性皮膚炎、リューマチ性関節炎、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、および悪性星細胞種（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）患者で報告されてきた（Ｃａｐｒａ、ｉｂｉｄ．  「Ｓｌｏｗ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ（ＳＲＳ−Ａ）  ｉｓ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４．  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ、Ｂ、１９８３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：５６８−５７５）。
【００１５】
中枢神経系で、ｃｙｓＬＴは、脳卒中および外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ負傷、ＴＢＩ）のような数多くの急性脳損傷に対する反応で生成される。ｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質は、脳卒中実験動物モデルで実験による脳動脈閉塞後に梗塞部の大きさを減少させると見られた。ＬＴＣ４およびＬＴＤ４数値はＴＢＩラットモデルで上昇し、傷発生後、約１時間程度で最高値となる（Ｆａｒｉａｓなど、２００９年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２６：１９７７−１９８６）。
【００１６】
また、ｃｙｓＬＴは心血管問題および疾病に関連される。例えば、小便でＬＴＥ４数値は睡眠性無呼吸および急性冠動脈症候群患者で増加し、急性低酸素ストレスの間モンテルカストを使う治療によるｃｙｓ−ＬＴ信号抑制は、Ａｐｏｅ‐／‐実験ネズミの心筋低酸素の部分を正常酸素条件下で観察された数値に下げる（Ｎｏｂｉｌｉなど、２０１２年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４１７８６）。
【００１７】
内皮障壁は血管および組織恒常性を厳格に維持し、したがって血管透過性は全体機関の随所で血管形成、免疫反応、および動的交換のような数多くの生理的過程を調節する。ｃｙｓＬＴ１受容体によって作用をするｃｙｓＬＴは、先天および後天免疫のすべてを有する動物モデルで増加した血管透過性の調節に重要な役割をする（ＫａｎａｏｋａおよびＢｏｙｃｅ、２００４年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：１５０３−１５１０）。内皮障壁は血管および組織恒常性を厳格に調節し、したがって血管透過性は全体器官の至る所で血管形成、免疫反応、および動的交換のような数多くの生理的過程を調節する（Ａｚｚｉなど、２０１３年、Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．、３：１−１４、論文２１１）。したがって、ｃｙｓＬＴ（入る）の抑制剤は、非制限的な例として、炎症性疾患およびアレルギー性疾患を含む異常な血管透過性の特徴を有する疾病に対して有効なものと考えられる。
【００１８】
喘息およびアスピリン過敏性（ａｓｐｉｒｉｎ−ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ）呼吸器系疾病（ＡＥＲＤ）
ｃｙｓＬＴは、気道炎症を誘導し、喘息、具体的には、特異的な喘息表現型であるアスピリン過敏性呼吸器系疾病（ＡＥＲＤ）またはアスピリン中毒喘息（ａｓｐｉｒｉｎ−ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ  ａｓｔｈｍａ、ＡＴＡ）の発病に関連した強い脂質調節者である。これは慢性的な鼻炎、副鼻腔炎、再発性ポリープ、および喘息を引き起こす上下部気道の慢性的な深刻な炎症に関連された臨床症候群である。ＡＥＲＤは一般的に炎症調節者およびアラキドン酸生合成発現の異常後に発生する。上下部気道好酸球浸潤はＡＥＲＤの核心的な特徴であるが、このような慢性的な好酸球性炎症の正確なメカニズムは完全に理解されていない状態である。ｃｙｓＬＴ過生成は好酸球活性化を誘導するにあたって核心的な要素であり得る。ｃｙｓＬＴで最も豊富な代謝産物であるロイコトリエンＥ４（Ｌｅｕｋｏｔｉｅｎｅ  Ｅ４、ＬＴＥ４）は肺の好酸球補充の強い誘導因子／増幅因子である（Ｐａｌｉｋｈｅなど、２００９年、ＡＥＲＤ症状の臨床的管理が要求されている。ＡＥＲＤ患者はアスピリン耐性喘息（ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ａｓｔｈｍａ、ＡＴＡ）患者らと比較して非可逆的気流閉塞症および頻繁な病状悪化を含むさらに深刻な喘息表現型を示し得る。また、アスピリン投薬は顕著な罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）および死亡率に帰結され得、患者にアスピリンの危険性と関連して注意を与えなければならない。
【００１９】
ロイコトリエン受容体拮抗物質は、長期間ＡＥＲＤ管理および副鼻腔炎に有用である。アスピリン脱感覚（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）はＡＥＲＤ患者での上下部気道症状を軽減させるのに必要であり得る。増加したｃｙｓＬＴは、ＡＥＲＤ発病において強い前−炎症性調節者（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）および気管支収縮因子である。小便、痰、末梢血、および吐き出された呼吸でＣｙｓ−ＬＴ数値増加はＡＥＲＤ患者でアスピリン投与後にすでに観察されたところがある（Ｈａｍａｄなど、２００４年、Ｄｒｕｇｓ６４：２４１７−２４３２（抄録の部分に限る、Ｐａｌｉｋｈｅの前半部に引用される）。ＡＥＲＤ患者はさらに高い吐き出された酸化窒素数値およびさらに高いベースライン水準（ベースライン数値）  ｃｙｓＬＴ（具体的には、唾液、痰、体外血液、および小便でのＬＴＥ４はＡＥＲＤ患者からより高い）を有する（Ｇａｂｅｒなど、２００８年、Ｔｈｏｒａｘ  ６３：１０７６−１０８２）。
【００２０】
喘息のような呼吸器系疾病を有する実験動物モデルは広く利用される。急性および慢性的なアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）すべてを有する試験動物モデルが知られている（参照、例えば、ＮｉａｌｓおよびＵｄｄｉｎ、２００８年、Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．  １：２１３‐２２０）。誘導された喘息を有する卵アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）動物モデルが一般的に使われ、これらは急性喘息モデル（例えば、Ｗｕなど（２００３）、Ｃｌｉｎ  ＆  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３３：３５９‐３６６）または慢性的な喘息モデル（例えば、Ｔｅｍｅｌｋｏｖｓｋｉなど（１９９８）、Ｔｈｏｒａｘ  ５３：８４９‐８５６）で改質され得る。ダニおよびゴキブリ抽出物のような自然のアレルゲンによって誘導された気道炎症実験ネズミモデルも開発された（Ｊｏｈｎｓｏｎなど、２００４年、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １６９：３７８‐３８５；およびＳａｒｐｏｎｇなど、２００３年、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３２、３４６‐３５４）。この他に、重要な末端合成酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）（すなわち、マイクロ綿（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ）  ＰＧＥ２シンターゼ（ｍＰＧＥＳ）−１（ｐｔｇｅｓ（‐／‐）実験ネズミまたはＰＧＥ２シンターゼ−１欠乏実験ネズミ））が足りない実験ネズミは好酸球性肺炎症動物モデルでＡＥＲＤと類似の表現型で表れ、アスピリンによるＰＧＥ２シンターゼ−１欠乏実験ネズミは肺肥満細胞（ＭＣ）活性およびｃｙｓＬＴ過生成と共に気道抵抗の持続的な増加を示すと報告された（Ｌｉｕなど、２０１３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １１０：１６９８７−９２）。
【００２１】
喘息を治療するにあたって、抗体の使用は知られている。オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ、ＸＯＬＡＩＲ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）はアレルゲン特異性とは無関係に循環するＩｇＥに結合する再調合人間化ＩｇＧ１単クローン抗−ＩｇＥ抗体である。概念立証研究によって、オマリズマブはアレルゲン吸入投与後に初期および後期段階の喘息反応を減少させることが確認された（ＳｔｒｕｎｋおよびＢｌｏｏｍｂｅｒｇ、２００６年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：２６８９−２６９５）。オマリズマブは多年性空気アレルゲン（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ａｅｒｏａｌｌｅｒｇｅｎ）に対する陽性皮膚テストまたは体外反応性を有志、吸入用コルチコステロイドによる症状調節が適切になされない重症〜深刻な難治性喘息がある成人および青少年に投薬処方される。
【００２２】
ｃｙｓＬＴの抗体は知られている。例えば、システイニルロイコトリエンＥＬＩＳＡキットは（ジョージア州、アトランタ（製品番号：ＡＢＩＮ９３０３６８、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ、Ｉｎｃ．で購入可能）人間（製品番号：ＡＢＩＮ６２６３９３）、ラット、実験ネズミ、ギニー・ピッグ、ウサギｃｙｓＬＴ、およびその他のｃｙｓＬＴに対して特徴的である。人間ＬＴＥ４探知のために敏感度および特異性を有するＥＬＩＳＡキットも前記メーカーで購入可能である（製品番号：ＡＢＩＮ３６６７１５）。ＬＴＥ４  ＥＬＩＳＡキット（製品番号：ＭＢＳ１６１５５２、ＭＢＳ７２２１０３、およびＭＢＳ７０３８３３、他のｃｙｓＬＴに対する結合と関連して、ある特異的なデータが前記で提供されない）は、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ所在）で購入可能である。人間ＬＴＤ４である別途のＥＬＩＳＡキットも前記メーカーで購入可能である（製品番号．  ＭＢＳ２６０８０１）；他のｃｙｓＬＴに対する交差反応性に対する、ある特異的なデータが提供されない。
【００２３】
専売単クローン抗体を使うシステイニルロイコトリエンＥＩＡ（酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））キットは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社で（ミシガン州、アンアボ所在、アイテム番号：５００３９０）で購入可能である。前記システイニルロイコトリエンＥＩＡ単クローン抗体単独でも購買可能である（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、アイテム番号：５００３９０）。前記抗体はＬＴＣ４およびＬＴＤ４に対して１００％、ＬＴＥ４に対して７９％、および５、６−ｄｉＨＥＴＥ、ＬＴＢ４、５−ＨＥＴＥ、およびアラキドン酸に対して４％未満の相対的な特異性を有するものと目録化されている。ＬＴＣ４に対する単クローン抗体（ｍＡｂＬＴＣ）が説明された。前記抗体はＬＴＤ４およびＬＴＥ４それぞれに対して５．４％および０．５％の交差反応性を見せると知られており、他のエイコサノイドとの反応性テストはなされなかった。Ｋａｗａｋａｍｉなどは（２０１０年、ＢＢＲＣ  ３９２：４２１‐４２５）前記抗体がＬＴＣ４内のグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）モイエティのグルタミン（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）残基を認識することを提示する。前記抗体の多様な領域を含む単鎖変数フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖＬＴＣ）が製造され、完全な単クローン抗体に対するこれの親和力および結合特異性が確認された。ＳｃＦｖＬＴＣは単クローン母抗体と比較してＬＴＣ４に対する高い親和力を見せ、ＬＴＣ４結合と比較してＬＴＤ４およびＬＴＥ４とそれぞれ４８％および１７％反応性で結合し、ＬＴＢ４に対しては親和力が殆どない。以後、ＫａｗａｋａｍｉなどはｍＡｂＬＴＣおよびｓｃＦｖＬＴＣがｃｙｓＬＴ１受容体（ｃｙｓＬＴ１Ｒ）およびｃｙｓＬＴ２受容体（ｃｙｓＬＴ２Ｒ）に対するＬＴＣ４またはＬＴＤ４の結合を抑制することを見せてくれ、したがって、これらの受容体に対するこれらの結合を完成することによってＬＴの生物学的活性を中和するものと考えられた。興味深く、ｍＡｂＬＴＣもｃｙｓＬＴ２Ｒ拮抗物質（ＨＡＭＩ３３７９、ＢａｙｃｙｓＬＴ２）と結合したが、ｃｙｓＬＴ１Ｒ拮抗物質（プランルカスト、ＭＫ−５７１）とは結合せず、これによってＫａｗａｋａｍｉなどは前記受容体位置と前記抗体のＬＴ認識位置間の構造的類似性を提案する。ｍＡｂＬＴＣ投与によって喘息がある卵アルブミン（ＯＶＡ）−誘導ネズミ科動物モデルで肺好酸球性浸潤および杯状細胞過形成（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）が減少された（Ｋａｗａｋａｍｉなど、２０１４年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４０：１６２５−１６３３）。
【００２４】
１Ａ−ＩＤＲ１と命名されるスルフィドペプチドロイコトリエン（ｓｕｌｆｉｄｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ）に対するネズミ科単クローン抗体が説明されている。ｍＡｂは、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、およびＮａｃ−ＬＴＥ４のそれぞれに対して９５．７％、１００％、８８．７％、および８９．７％の反応性を見せると報告された。ＬＴＢ４、アラキドン酸、またはｌ−システインまたはグルタチオンのようなＬＴペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の成分に対する交差反応に対する観察は記録されたことがない（Ｒｅｉｎｋｅなど、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１０８１：２７４−２７８）。
【００２５】
ＨｏｐｐｅなどはＢＳＡと接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＬＴＥ４またはＬＴＣ４に対して免疫化されたウサギが多クローン性の抗血清を生産することを報告した。ＬＴＥ４コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に対して免疫化されたウサギ由来の抗血清は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４のそれぞれに対して４６．３２％、１２．５５％、および１００％、そしてＬＴＢ４に対して０．７９％の相対的な特異性を有すると報告された。他のｌｉｇａｎｄに対する結合は有意でないと報告された。ＬＴＣ４コンジュゲートで免疫化されたウサギ由来の抗血清は２８５  ｐｇで抗体に対するラベル（ｌａｂｌｅ）の結合を５０％抑制し、したがって、ＬＴＣ４を最もよく認識する物と知られた（Ｈｏｐｐｅなど、１９８６年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０８：２６−３０）。
【００２６】
Ｗｅｓｔｃｏｔｔなど（２００７年、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４８、２０２−２１０）はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（メサチュセツジュ、ケンブリッジ所在）で購入したマウス単クローン抗体がＬＴＣ４（５５％）、ＬＴＤ４（１００％）、ＬＴＥ４（５１％）、およびＮ−アセチルＬＴＥ４に対して有意な交差反応性を有することを報告した。
【００２７】
本発明の出願人は一つ以上のｃｙｓＬＴの異常な数値と関連されるかこれで特徴づけられる疾病または疾患治療用方法および組成物を提供する。前記方法は一つ以上のｃｙｓＬＴに結合するかこれの効果的な濃度を減少させる（中和）単クローン抗体および人間化単クローン抗体を含む抗体を使う。ｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質が治療的に使われる。反面、ｃｙｓＬＴを使う直接的な妨害は有利な受容体基盤接近方法であると考えられるが、これはすべてのｃｙｓＬＴの中和はすべてのｃｙｓＬＴ受容体を沈黙化すると考えられるためである。前述されたように、前記ｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質は互いに異なる特異性を有し、典型的にただ一つのｃｙｓＬＴ受容体（モンテルカストおよびその他の通常的に使われるｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質の場合はｃｙｓＬＴ１）をターゲットする。これはＬＴＥに対する他の受容体を信号に対して自由にさせ、ひいてはおそらく優勢にさせる。また、前述されたように、ＬＴＥ４に対する受容体は、確認されておらず、受容体作用物質（ａｇｏｎｉｓｔ）によるＬＴＥ４の調節は不可能であるのが実状である。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明の要約
本発明の目的は一つ以上のｃｙｓＬＴの異常な数値と関連された疾病または疾患治療用方法および組成物に関するものである。このような方法は、治療がなされるように典型的に効果的な容量の一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを前記疾病または疾患がある人間被験者のような被験者に投与する段階を含む。
【００２９】
一つ以上のｃｙｓＬＴの異常な数値と関連された疾病または疾患を治療する方法が提供され、前記方法は一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する抗体またはこれのフラグメントを効果的な容量で前記疾病または疾患がある被験者に投与する段階を含む。前記疾病または疾患は、例えば、炎症性疾病、アレルギー、心血管疾病または疾患、異常な血管透過性で特徴づけられる疾病または疾患、中枢神経系疾病または疾患、癌、皮膚疾患、胃腸疾患、リューマチ性関節炎、または喘息、アスピリン過敏性呼吸器系疾病（ＡＥＲＤ）、気道過敏症、およびアレルギー性鼻炎を含む呼吸器系疾病または疾患であり得る。
【００３０】
一つ以上のｃｙｓＬＴを効果的な濃度に下げる抗体および抗原に結合する抗体フラグメントは前記で目録化されたもののようなｃｙｓＬＴの異常な数値と関連された疾病および疾患の治療方法に有用なものと考えられる。具体的には、一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する前記抗体（および抗原に結合する抗体フラグメント）はＡＥＲＤを含む喘息のような呼吸器系疾病および疾患を含むアレルギー性および炎症性疾病および疾患の治療に有用なものと考えられる。一部の具体例において、ｃｙｓＬＴに対する前記の抗体は単クローン抗体である。一部の具体例において、前記抗体は優先的に一つ以上のｃｙｓＬＴに結合する。他の具体例において、前記抗体はＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４に結合する汎−ｃｙｓＬＴ抗体（ｐａｎ−ｃｙｓＬＴ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）である。前記の抗体または前記抗体のフラグメントが一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する時、前記抗体が前記ｃｙｓＬＴに対して同じ効果を有することは要求されない。さらに他の具体例において、前記抗体（または抗原に結合する抗体フラグメント）は人間化され得る。
【００３１】
前述されたように、被験者の気道に影響を与える炎症を改善する方法も提供され、前記方法は効果的な容量の一つ以上のｃｙｓＬＴと結合する前記の抗体または前記抗体のフラグメントを前記被験者に投与する段階を含む。
【００３２】
また、分離された抗体またはこれらのｃｙｓＬＴと結合するフラグメント、これらを含む薬学的組成物、およびこれらを利用したＥＬＩＳＡキットが提供される。また、免疫原または試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）で使われ得る組成物が提供される。
【００３３】
本発明の前述された様態およびその他の様態は下記の詳細な説明および請求範囲によってさらに明確になるであろう。特に定義されない限り、本明細書で使われるすべての技術的かつ科学的な用語は本発明が属する当分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似またはこれに相応する方法および材料は本発明を実施またはテストするのに使われ得るが、適切な方法および材料は下記で説明される。本明細書で言及されるすべての公開文献、特許出願書、特許、その他の文献の全体内容は参照として本発明に含まれる。衝突がある場合、定義を含む本明細書がこれを調節する。また、本明細書に記載された材料、方法、および実施例は単に説明のためのものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本特許出願は有色で図示された少なくとも一つの図面を含む。有色の図面を含む本特許または特許出願公開の写本は官庁の要求によって必要な手数料支払い時に提供されるであろう。
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、抗−ＬＴＥ４抗体の存在と関連された三匹の実験ネズミ由来の血清試料に対する直接的なＥＬＩＳＡ検査結果を示す三つの線グラフを連続的に図示する。実験ネズミはＬＴＥ４およびＢＣＰのＢＳ３−促進されたコンジュゲートであらかじめ免疫化された。図１Ａには実験ネズミＦ４に対する結果を図示し、図１Ｂは実験ネズミＥ２に対する結果を図示し、図１Ｃは実験ネズミＦ３に対する結果を図示する。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、高い抗体力価を表わす実験ネズミの脾臓から準備された５つのハイブリードマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）由来の培養上澄み液内の抗−ＬＴＥ４抗体の存在と関連された直接的なＥＬＩＳＡ検査結果を示す５つの線グラフを連続的に図示する。図２Ａは９Ｂ１２ハイブリードマに対する結果を図示し、図２Ｂは２Ｇ９ハイブリードマに対する結果を図示し、図２Ｃはハイブリードマ１０Ｇ４に対する結果を図示し、図２Ｄは１４Ｈ３ハイブリードマに対する結果を図示し、図２Ｅは２Ｆ９ハイブリードマに対する結果を図示する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＬＴＢ４、１４、１５−ＬＴＥ４、および５Ｓ−ＨＥＴＥに対する単クローン抗体である９Ｂ１２（図３Ａ）および１０Ｇ４（図３Ｂ）の特異性を確認するための競争的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）  ＥＬＩＳＡ結果を示す二つの線グラフを連続的に図示する。
【図４】賦形剤（１％  ＤＭＳＯ）、ＬＴＣ４を含む陰性対照群抗体であるＬＴ１０１７、ＬＴＣ４を含む抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体である９Ｂ１２、およびＬＴＣ４を含む抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体である１０Ｇ４を比較しながら、実験ネズミにおける血管透過性研究に対する予備結果を示す棒グラフを図示する。
【図５】塩水単独、１：１の割合で非特異的対照群（ＮＳ）抗体と事前培養されたＬＴＣ４、および抗−ｃｙｓＬＴ抗体２Ｇ９と（１：１または１：５の割合で）事前培養されたＬＴＣ４を比較し、実験ネズミにおける血管透過性に対するネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体２Ｇ９の効果を示す散布図を図示する。前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体は（染料血管外漏出（ｄｙｅ  ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）により測定されたものであって）血管透過性に対するＬＴＣ４の影響を中和した。
【図６】単に塩水だけを投与した実験ネズミ、ＬＴＣ４処理２４時間前に１０Ｇ４抗体または非特異的対照群抗体（ＮＳ）の皮下注射で事前処理された実験ネズミ、および抗−ｃｙｓＬＴ抗体１０Ｇ４と（１：１の割合で）事前培養されたＬＴＣ４が腹腔注射された実験ネズミを比較しながら、血管透過性に対するネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体である１０Ｇ４ａの影響を示す散布図を図示する。前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体は２４時間前に投与された時にも（染料血管外漏出によって測定されたものであって）血管の透過性に対するＬＴＣ４の影響を中和した。ＩＰおよびＳＣ投与経路の両方とも効果的であった。
【図７】静脈注射（ｉ．ｖ．）後、時間による実験ネズミの血漿でのネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体である９Ｂ１２（赤色）および１０Ｇ４（緑色）の薬物動力学を示す線グラフを図示する。
【図８】腹腔内注射（ｉ．ｐ．）後、時間による実験ネズミ血漿でのネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体である２Ｇ９（青色）および１０Ｇ４（緑色）の薬物動力学を示す線グラフを図示する。
【図９】骨格領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）内に復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）がないか（ＬＣ、Ｏ１２−０；ＨＣ、４−５９．０）、全体セットの復帰突然変異（ＬＣ、Ｏ１２．０；ＨＣ、４−５９．０）を有する人間化１０Ｇ４変異体に対する直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡデータを示す線グラフを図示する。
【図１０】人間化１０Ｇ４抗体変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４抗体変異体それぞれは一つの軽鎖復帰突然変異を有し、重鎖復帰突然変異は有さない（重鎖変異体４−５９．０）。
【図１１】人間化１０Ｇ４抗体変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４抗体変異体それぞれは一つの軽鎖復帰突然変異および６つの重鎖復帰突然変異を有する（重鎖変異体４−５９．６）。
【図１２】人間化１０Ｇ４抗体変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４抗体変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異および四個の軽鎖復帰突然変異を有する（軽鎖変異体Ｏ１２．５）。
【図１３】人間化１０Ｇ４変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびＯ１２．１軽鎖を有する（単一復帰突然変異）。
【図１４】人間化１０Ｇ４変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびＯ１２．２軽鎖を有する（単一復帰突然変異）。
【図１５】人間化１０Ｇ４変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびＯ１２．３軽鎖を有する（単一復帰突然変異）。
【図１６】人間化１０Ｇ４変異体の直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡを示す線グラフを図示するもので、前記人間化１０Ｇ４変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびＯ１２．４軽鎖を有する（単一復帰突然変異）。
【図１７】賦形剤、陽性対照群（シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ）またはＣｓＡ）、ネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体１０Ｇ４および２Ｇ９、または非特異的抗体対照群で処置した後で、ＤＳＳによって誘発された大腸炎がある実験ネズミの疾病活性指数（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）を示す線グラフを図示する。賦形剤および非特異的抗体（ＬＴ１０１４）で処置されたグループは最高値のＤＡＩを有し、抗−ｃｙｓＬＴ抗体１０Ｇ４および陽性対照群シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）で処置された動物は最低値のＤＡＩを有した。多重ｔ−ｔｅｓｔに基づいた１０Ｇ４対賦形剤に対する統計的有意性が図示された（＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１）。
【図１８】卵アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）により誘発された急性喘息がある実験ネズミにおける気道過敏症（ベースラインに対する百分率として「ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ」または「Ｐｅｎｈ」で測定される）を示す線グラフを図示する。予想されたように、喘息が誘導された前記実験ネズミは最高値のＰｅｎｈを示し、ＯＶＡが投与されない実験ネズミは最低値のＰｅｎｈを示した。抗−ｃｙｓＬＴ抗体である１０Ｇ４はＰｅｎｈを陽性対照群であるデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）のＰｅｎｈとほぼ同等に下げた。抗体９Ｂ１２はＰｅｎｈを中間数値に下げた。
【図１９】ＬＴ１０１７（非特異的対照群抗体）、抗−ｃｙｓＬＴ抗体９Ｂ１２、または抗−ｃｙｓＬＴ抗体１０Ｇ４で処置した後で、ＯＶＡによって誘発された急性喘息がある実験ネズミ由来の気管支肺胞洗浄（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ、ＢＡＬ）液内の総細胞数を示す棒グラフを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本段落で定義された用語の他に、その他の用語は必要に応じて本明細書で定義される。本明細書で特に明確に定義されない限り、本明細書で使われる当分野の用語は当分野で知られている意味を有する。
【００３６】
用語「ｃｙｓＬＴ」は、システイニルロイコトリエン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）の略語である。生理学的に重要なｃｙｓＬＴは、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）、ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）、およびロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）を含む。本発明の脈絡で、「ｃｙｓＬＴ」または「ｃｙｓＬＴ」は疾病またはその他の健康に有害な疾患と関連されるか関わりのある自然的に発生するシステイニルロイコトリエンを意味する。好ましいｃｙｓＬＴは、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４である。
【００３７】
用語「異常な」は、例えば、蛋白質または生理活性脂質のような細胞のターゲットの数値または効果的な濃度と関連して過度であるか望んでいないことを意味する。
【００３８】
用語「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、抗原または抗原決定部（ｅｐｉｔｏｐｅ）と結合できる免疫グロブリン遺伝子またはこれのフラグメント由来である（またはこれらに倣って製造されるかこれらによって暗号化される）すべての形態のペプチド、ポリペプチドを意味する（参照、例えば、ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙなど、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（修正本）、２００１年）。用語「抗体」は、本明細書で最も広い範囲で使われ、単クローン、多クローン性のまたは多価特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、二重体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、抗体、合成抗体、抗原結合活性を保有した抗体フラグメント、および母抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）を利用する結合剤を含む。本明細書で、抗体は母抗体の少なくとも一つの所望の活性を保有するものとして定義される。前記所望の活性は抗原に対する結合能力、抗原と優先的に結合する能力、および体外でサイトカインプロフィールを変える能力を含むことができる。
【００３９】
天然そのままの抗体（天然そのままの免疫グロブリン）は、常に約１５０，０００ダルトン（ｄａｌｔｏｎ）であり、典型的に二つの同じ軽鎖および二つの同じ重鎖からなる異形糸合体である糖蛋白質（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。前記重鎖の大きさは約５０ｋＤであり、前記軽鎖は約２５ｋＤａである。それぞれの軽鎖は典型的に一つの二硫化共有結合によって重鎖に連結され、このとき異なる免疫グロブリン同種型（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖での二硫化結合の数は異なる。また、それぞれの重鎖および軽鎖は規則的に離隔した鎖間二硫化物橋状結合を有する。それぞれの重鎖は一つの末端に数多くの繰返しドメインが繋がれた可変ドメイン（ＶＨ）を有する。それぞれの軽鎖は一つの末端に（ＶＬ）一つの可変ドメインと他の一つの末端に一つの繰返しドメインを有する。前記軽鎖の繰返しドメインは前記重鎖の第１繰返しドメインと並んで序列され、前記軽鎖可変ドメインは前記重鎖の可変ドメインと並んで序列される。特定アミノ酸残基は前記軽鎖鎖可変ドメインらと前記重鎖鎖可変ドメインの間に接点を形成するものと考えられる。
すべての脊椎動物由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖はこれらの繰返しドメインのアミノ酸序列を基礎にしてカッパ（ｋａｐｐａ、κ）およびラムダ（ｌａｍｂｄａ、λ）と命名される二つの明確に異なる形態の中の一つの形態を有する。  前記二つの軽鎖形態の比率は種により異なる。例えば、実験ネズミでλに対するκの平均比率は２０：１である反面、人間では２：１、牛では１：２０である。
【００４０】
これらのうち重鎖の繰返しドメインのアミノ酸序列にしたがって、免疫グロブリンは互いに異なるグループに分かれる。五個の主要な免疫グロブリングループが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらの免疫グロブリングループのうち一部は下位グループ（同種型）に（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）さらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるグループに該当する前記重鎖の繰返しドメインはそれぞれアルファ（ａｌｐｈａ）、デルタ（ｄｅｌｔａ）、イプシロン（ｅｐｓｉｌｏｎ）、ガンマー（ｇａｍｍａ）、およびミュー（ｍｕ）と命名される。前記免疫グロブリンの異なるグループの下位単位構造および３次元構造は良く知られている。
【００４１】
抗体は前記の抗体序列内の一つ以上のアミノ酸残基の付加、削除および／または置換によって同じ抗原に誘導され、母抗体の少なくとも一つの活性を保有するさらに他の抗体（時々「母（ｐａｒｅｎｔ）」または「天然そのままの（ｎａｔｉｖｅ）」抗体とも言及される）のアミノ酸序列から設計されるかおよび／または製造され得る。好ましい活性は、前記抗原と特異的に結合する能力、増殖体外での増殖を抑制する能力、体内で血管形成を抑制する能力、および体外でサイトカインプロフィールを変える能力を含むことができる。前記アミノ酸変更はＦｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含む軽鎖および／または重鎖の可変領域または繰返し領域内で行われ得る。一つの具体例において、一つ以上のアミノ酸置換は母抗体の一つ以上の初可変（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）領域で作られる。例えば、母抗体と比較して、一つ以上の初可変領域に少なくとも一つの、例えば、約１〜約１０個の、好ましくは、約２〜５個の、置換がある。大慨は、アミノ酸変更は母抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン序列と少なくとも５０％アミノ酸序列同一性、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性または相同性を有する新しい抗体アミノ酸序列に帰結される。本明細書で、前記序列と関連して同一性または相同性は、必要な場合、最大の序列同一性百分率を得るために序列を羅列してギャップ（ｇａｐ）を導入した後で、母抗体残基のような序列候補内のアミノ酸残基の百分率として定義される。前記の抗体序列に対するＮ−末端、Ｃ−末端、または内部の延長、削除、または挿入中のいずれも序列同一性または相同性に影響を与えるように製作されてはならない。
【００４２】
本明細書で使われるように、「抗体フラグメント」は、本来の抗体の抗原結合位置または可変領域を含む本来の抗体の一部分を意味するもので、前記一部分は前記本来の抗体のＦｃ領域の繰り返される重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まないこともあり得る。また、前記繰り返される重鎖ドメインの一部分は（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）前記の抗体フラグメントに導入され得る。抗体フラグメントは抗原−結合能力を保有することができ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｄ、およびＦｖフラグメント；二重体；三重体；単鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；抗体フラグメントから形成されたミニボディ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、および多価特異性抗体を含むことができる。抗体のパパイン浸漬（  Ｐａｐａｉｎ    ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって、それぞれ一つの抗原−結合位置を有する「Ｆａｂ」フラグメントおよび容易に結晶化する能力が名前に反映された「Ｆｃ」フラグメント残基と命名される二つの同じ抗原と結合する前記抗体のフラグメントが生成される。ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）処理によって、二つの抗原結合位置を有して依然として抗原を架橋できるＦ（ａｂ´）２フラグメントが生成される。例えば、Ｆａｂフラグメントまた軽鎖の繰返しドメインおよび重鎖の第１繰返しドメイン（ＣＨ１）を含む。「Ｆｖ」は完璧な抗原−認識および−結合位置を含む最小限の抗体フラグメントである。前記領域は密着して非共有関係にある一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインのダイマー（ｄｉｍｅｒ）である。このような構造で、各可変ドメインの三個の初可変領域（または相補性決定部位または「ＣＤＲ」）がＶＨ−ＶＬダイマーの表面の上に抗原−結合位置を決めるために相互作用をする。総合すれば、６個の初可変領域が前記抗体に抗原−結合特異性を付与する。しかし、さらに一つの可変ドメインが（またはＦｖ中の半分は抗原に単に特異的な３個の初可変領域を含む）、全体結合位置より低い親和力ではあるが、抗原を認識して抗原と結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、このようなドメインは一つのポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはｓＦｖが抗原結合のための好ましい構造を形成することができるようにするＶＨ  および  ＶＬドメインの間にポリペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）をさらに含む。ｓＦｖの検討のために次の文献を参考にすることができる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．  １１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５、１９９４年）。
Ｆａｂフラグメントも前記軽鎖の繰返しドメインおよび前記重鎖の第１繰返しドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ´フラグメントは前記抗体ヒンジ領域由来の一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）末端への若干の残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。本明細書で、Ｆａｂ´−ＳＨは、繰返しドメインのシステイン残基が自由ジオール基を含むことを特徴とするＦａｂ´を意味する。Ｆ（ａｂ´）２抗体フラグメントは本来Ｆａｂ´フラグメントペアとして生成されたもので、前記Ｆａｂ´フラグメントペア間にヒンジシステインが存在する。抗体フラグメントのその他の化学的結合も知られている。
【００４３】
「抗−ｃｙｓＬＴ抗体」または「ｃｙｓＬＴに対して反応性である免疫由来モイエティ」は一つ以上のｃｙｓＬＴ、好ましくは一つ以上のＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４と結合するすべての抗体または抗体由来分子を意味する。このような定義によって理解されるように、抗体または免疫由来モイエティは多クローンまたは単クローンであり得、多様な方法によって生産され得、人間被験者を含む動物から分離され得る。
【００４４】
「生理活性脂質」は脂質信号分子を意味する。生理活性脂質は細胞外および／または細胞内の信号を調節し、したがって分化、移動、増殖、分泌、生存、およびその他の過程を調節することによって多くの種類の細胞の機能を調節することに関与するという点で、構造的脂質（例えば、膜結合である脂質）とは異なる。体内で、生理活性脂質は細胞外液体で発見され得るが、前記細胞外液体で生理活性脂質は他の分子（例えば、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）のような血清蛋白質および脂質蛋白質）と複合体を形成するか、自由な形態で、すなわち、他の分子と複合体を形成しない形態で存在することができる。細胞外調節者として、一部生理活性脂質は細胞の機能または生存に帰結される複雑な信号システムを順次活性化する膜結合イオンチャネルまたはＧＰＣＲｓまたは酵素または因子を活性化することによって、細胞の信号を変更する。細胞内の調節者として、生理活性脂質は酵素、イオンチャネル、またはアクチン（ａｃｔｉｎ）のような構造敵要素のような細胞内成分と直接的に相互作用することによって自分たちの機能を遂行することができる。
【００４５】
生理活性脂質の例は、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、セラミド−１−ホスフェート（ｃｅｒａｍｉｄｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，、Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、スフィンガニン（ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ）、スフィンゴシルホスフォリルコリン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＳＰＣ）、およびスフィンゴシン−１−ホスフェート（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，、Ｓ１Ｐ）のようなスフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）を含む。スフィンゴ脂質およびこれらの誘導体および代謝産物はスフィンゴイド（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）（スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）で由来する）により特徴づけられる。スフィンゴ脂質およびこれらの誘導体および代謝産物は重要な細胞の過程に多面発現性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）効果を有する一つの集団の細胞外および細胞内の信号分子を表わす。これらはサルファタイド（ｓｕｌｆａｔｉｄｅｓ）、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、およびセレブロシド（ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ）を含む。この他の生理活性脂質はグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）系列のバックボーン（例えば、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ、ＬＰＣ）および多様なリゾホスファチド酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄｓ、ＬＰＡ）のようなリゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥＡ）、ホスファチド酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、血小板活性因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＡＦ）、カルジオリピン（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ）、ホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＰＧ）、およびジアシルグリセリド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＤＧ））により特徴づけられる。この他の生理活性脂質はアラキドン酸由来であり、これらはエイコサノイド、ＨＥＴＥ、カンナビノイド（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ）、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）、リポキシン（ｌｉｐｏｘｉｎｓ）、エポキシエイコサトリエン酸（ｅｐｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄｓ）、およびイソエイコサノイド（ｉｓｏｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ）、および非−エイコサノイドカンナビノイド調節者（ｎｏｎ−ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）のようなエイコサノイド代謝産物を含む。他の燐脂質およびこれらの誘導体を含む他の生理活性脂質も使われ得る。
【００４６】
細胞膜の内部および／または外部小葉（ｌｅａｆｌｅｔ）の構造的要素として優先的に機能をするホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、および代謝産物およびこれらの誘導体のような脂質は本明細書で定義された生理活性脂質に明確に含まれない。
【００４７】
抗体または抗体フラグメントの脈絡で、用語「生物学的に活性である」は所望の抗原決定部と結合でき、このような方式で生物学的効果を展示する抗体または抗体フラグメントを意味する。前記生物学的効果は、非制限的な例で、成長信号の調節、抗−老化信号の調節、老化信号の調節、作用者機能カスケード（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ）の調節、およびこの他のリガンド相互作用の調節を含む。
【００４８】
「生物指標」は疾病の発達または治療効果を測定するのに有用にさせる特定分子的特徴を有する生体内の特定生化学的物質である。例えば、Ｓ１Ｐはある過増殖性（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）および／または心血管疾患に対する生物学的指標である。
【００４９】
「運搬体」はハプテン（ｈａｐｔｅｎ）に対する接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に適合したモイエティを意味するもので、これによってハプテン免疫原を提供する。代表的な、非制限的な運搬体のグループは蛋白質であり、前記蛋白質の例はアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔａｎｉｎ）、テタヌス（ｔｅｔａｎｕｓ）、およびジフテリアトキソイド（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）を含む。この他の運搬体の適切なグループおよび例が当分野に知られている。それだけでなく、以降発見されるか、自然に発生または合成された運搬体が本記載にしたがって適用されるために使われ得る。
【００５０】
本明細書で使われるように、用語「細胞」「細胞株」および「細胞培養」は相互交換的に使われ、このようなすべての名称は所産物を含む。したがって、用語「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）」および「形質転換された細胞」は継代回数とは無関係に本来の１次細胞およびこれら細胞由来の培養物を含む。また、意図的変異または意図していない変異によって、すべての所産物が正確に同じＤＮＡ含有量を有さないこともある。最初の形質転換された細胞で調査されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異された所産物が含まれる。明確に別途表示されている場合には前記の内容とは無関係であろう。
【００５１】
用語「併用治療」は、所望の治療効果を提供するために少なくとも二つの別個の治療の提供に関連された治療療法を意味する。例えば、併用治療は二つのまたはそれ以上の化学的に別個の活性成分（例えば、速効性（ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ）コルチコステロイド剤および抗−脂質抗体、または二つの異なる抗体）の投与を含むことができる。また、併用治療は放射線治療および／または手術のような他の治療の進行と共に抗−脂質抗体の適用を含む。また、併用治療は一つ以上の他の生物学的製剤（例えば、コルチコステロイド）、抗−炎症性製剤、および／または放射線照射および／または手術のようなさらに他の治療とともに抗−脂質抗体の投与を含むことができる。二つのまたはそれ以上の化学的に別個の活性成分の投与と関連して、前記活性成分は同じ組成物の一部または異なる組成物で投与され得る。別個の組成物で投与される時、異なる活性成分を含む前記組成物は、特定要求事項および担当医師の決定により、同一時間または異なる時間帯に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投薬法で投与され得る。同様に、一つ以上の抗−脂質抗体種（単独でまたは一つ以上の化学治療剤と一緒）が、例えば、放射線照射および／または手術と共に併用される時、前記薬物は手術または放射線照射治療前または以後に投与され得る。
【００５２】
用語「繰返しドメイン」は、抗体重鎖または軽鎖のＣ−末端領域を意味する。一般的に、前記繰返しドメインは抗原に対する抗体分子の結合特性と直接的に関連することはないが、抗体による細胞毒性での前記抗体の参与のような多様な作用者機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を表わす。ここで、「作用者機能」は、Ｆｃドメインと免疫系蛋白質間の分子的相互作用による免疫細胞の補充によって調節される抗体の異なる生理的効果（例えば、オプソニン作用（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、細胞溶解、肥満細胞、好塩球および好酸球顆粒消失（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、およびこの他の過程）を意味する。重鎖の同種型は前記抗体の機能的特徴を決める。これらの特異的な機能的特徴は前記重鎖のカルボキシル−末端の部分によって付与されて、これらは軽鎖きては関係がない。
【００５３】
「誘導された生理活性脂質」は分子との反応のために（例えば、運搬体に対する接合のために）生理活性脂質を活性させる反応基（例えば、スルプヒドリル）（チオール）基  （ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  （ｔｈｉｏｌ）  ｇｒｏｕｐ）  、カルボキシル酸基、シアノ基（ｃｙａｎｏ  ｇｒｏｕｐ）、エステル、水酸基、アルケン（ａｌｋｅｎｅ）、アルキン（ａｌｋｙｎｅ）、酸クロリド（ａｃｉｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）基、またはハロゲン原子）を使うことによって誘導される生理活性脂質（例えば、ｃｙｓＬＴ）である。好ましくは、前記反応基は抗原決定部が接近できるように配置される（すなわち、前記反応基によって邪魔されない）。一部の具体例において、前記反応基は天然そのままの脂質の一部や誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）を目的に付加され得る炭化水素鎖のような脂質上に柔軟な「尻尾（ｔａｉｌ）」の末端に位置する。例えば、スフィンゴシン−１−ホスフェートの場合、チオール基が前記分子の炭化水素鎖のオメガ炭素（ｏｍｅｇａ  ｃａｒｂｏｎ）（末端）に位置することによって、  極性の頭部基が抗原決定部のように接近できるようにする（参照、例えば、アメリカ特許第８，０６７，５４９号（本発明に全体的に含まれる））。
【００５４】
「生理活性脂質コンジュゲート（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、運搬体と共有結合された生理活性脂質を意味する。前記脂質は接合に対して反応性があるように前述のように誘導され得るか、前記天然そのままの脂質は運搬体に前記脂質を接合させるために使われ得る反応基を含むことができる。前記運搬体は蛋白質分子であるか、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、コロイド質金（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ）、補剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）、またはシリコンビーズ（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｅａｄ）のような非−蛋白質性モイエティであり得る。生理活性脂質コンジュゲートは本記載にしたがって抗体反応を引き起こす免疫原として使われ、したがって同一であるか異なる生理活性脂質コンジュゲートは前記の抗体探知用試薬として使われ得る。一部の具体例において、前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは、探知のために使われる時、固体支持体に付着する。
【００５５】
「効果的な濃度」は、例えば、ある望まない生理活性脂質の絶対的な、相対的な、および／または利用可能な濃度および／または活性を意味する。言い換えれば、生理活性脂質の効果的な濃度はこの生物学的機能を遂行するかこのために利用可能な脂質の容量である。本記載で、例えば、生理活性脂質に誘導される単クローン抗体のような免疫由来モイエティは前記脂質に結合して前記脂質が自身の生物学的機能を遂行できないようにすることによって、前記脂質の有効な濃度を低くすることができる。このような例において、前記脂質自体は依然として存在するが（すなわち、前記抗体によって分解されない）、下位段階の効果を引き起こす、この受容体または他のターゲットとそれ以上結合しない。したがって、絶対的な濃度よりは効果的な濃度が適切な測定方法である。生理活性脂質の効果的な濃度を直接的におよび／または間接的に測定する方法および分析が存在する。
【００５６】
「抗原決定部」または「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は抗体由来である抗体抗原−結合部分と反応する抗原の一部を意味する。
「完全人間型抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は免疫原と共に提供される時遺伝的に改質された（すなわち、形質転換）実験ネズミ（例えば、ニュージャージー州、プリンストン所在Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．社のＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ）で生産される抗体を意味し得、ＣＤＲクラフティング（Ｇｒａｆｔｉｎｇ）を必須的に要求しない人間抗体を生産することができる。このような抗体は非−人間抗体遺伝子が抑制され、人間抗体遺伝子発現で交替させられた試験ネズミのような動物由来の完全に人間化された抗体である。本出願人は関連されたＣＤＲのために人間の構造フレームを生産できる遺伝的に改質された実験ネズミまたはその他の動物に提供される時生理活性脂質に対する抗体が提供され得ると考えた。
【００５７】
「ハプテン」は非−免疫原性であり、抗体由来である抗体または抗原−結合部分と反応できる物質である。言い換えれば、ハプテンは抗原性を有するが免疫原性を有さない。ハプテンは一般的に単に運搬体（例えば、蛋白質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コロイド質金、またはシリコンビーズ、など）に付着する時、殆どの環境で免疫反応（すなわち、抗原として機能）を誘導できる小さい分子である。前記運搬体は自ら免疫反応を誘導できないものであり得る。代表的な非制限的なハプテン分子のグループは蛋白質であり、前記蛋白質の例はアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルチニン、テタヌス、およびジフテリアトキソイドを含む。ハプテン分子の他のグループおよび例が当分野に知られている。それだけでなく、以降発見されるか、自然に発生または合成されたハプテンが本記載にしたがって適用されるために使われ得る。
【００５８】
用語「ヘテロコンジュゲート抗体」は二つの共有結合された抗体を意味し得る。このような抗体は架橋剤を使う合成蛋白質化学で知られている方法を使って生産され得る。本明細書で使われるように、用語「コンジュゲート」は一つ以上の高分子に一つ以上の抗体フラグメントまたは結合モイエティを共有結合することで形成された分子を意味する。
【００５９】
非−人間（例えば、ネズミ科）抗体の「人間化された「形態は非−人間免疫グロブリン由来の序列を最小限で含むキメラ抗体である。さらに他の観点で、人間化抗体は人間序列の代わりに非−人間（例えば、ネズミ科）抗体由来である選択された序列を含む人間抗体である。人間化抗体は前記抗体の結合および／または生物学的活性を大きく変えない同一であるか異なる種由来である保存されたアミノ酸置換または本来存在していない残基を含む。このような抗体は非−人間免疫グロブリン由来である最小序列を含むキメラ抗体である。多くの場合で、人間化抗体は人間免疫グロブリン（授与抗体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））であり、前記人間免疫グロブリンで授与抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）の残基は、所望の特性を有する実験ネズミ、ラット、ラクダ、牛、ヤギ、またはウサギのような非−人間種（供与抗体（ｄｏｎｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））のＣＤＲ由来である残基で交替される。一部例として、前記人間免疫グロブリンの骨格領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）残基は非−人間母抗体由来である相応する残基で交替される（それぞれの置換は「復帰突然変異」と命名される）。
【００６０】
さらに、人間化抗体は授与抗体または導入されたＣＤＲまたは骨格序列（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）で発見されない残基を含む。このような改質は抗体性能をさらに改善して最大化するために作られる。したがって、一般的に、人間化抗体は少なくとも一つの、一つの様態で二つの、可変ドメインすべてを含むもので、  前記可変ドメインですべてのまたは実質的にすべての初可変形ループ（ｌｏｏｐｓ）は非−人間免疫グロブリンのループに相応し、すべてのまたは実質的にすべての骨格領域は人間免疫グロブリン序列の領域である。また、前記人間化抗体は選択的に免疫グロブリン繰返し領域（Ｆｃ）の少なくとも一部または人間免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことができる（参照、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙなど、アメリカ特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙなど、ヨーロッパ特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Ｂｏｓｓなど、アメリカ特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓなど、ヨーロッパ特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど、国際特許第８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど、ヨーロッパ特許第０、１９４、２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、アメリカ特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、ヨーロッパ特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎなど、ヨーロッパ特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１号；Ｑｕｅｅｎなど（１９８９）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、ｖｏｌ．  ８６：１００２９−１００３３）。もう少し詳細な参照文献：Ｊｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６年；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、１９８８年；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９３−５９６，１９９２年；およびＨａｎｓｅｎ、国際特許第ＷＯ２００６１０５０６２号．  人間化された抗体は人間で使われる非人間抗体に対して好ましいこともあるが、これは人体は外来物質と見える非人間抗体に対する免疫反応ができるためである。人間抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応はマウス抗体治療が提供された患者中のかなりの患者で観察された。
【００６１】
「免疫由来モイエティ」は、すべての抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）を含み、免疫グロブリン遺伝子、または抗原または抗原決定部と結合できるペプチドまたはポリペプチドのフラグメント由来であるか、前記ペプチドまたはポリペプチドに倣って製造されたものや、これらによって暗号化されたすべての形態のペプチドまたはポリペプチドを意味する（参照、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ、Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．（編集長）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００１年）。本記載で、前記抗原は生理活性脂質分子のような脂質分子である。
【００６２】
「免疫原」は、特定免疫反応、具体的には、免疫原が投与された動物での抗体反応を誘導できる分子である。本記載で、前記免疫原は運搬体に接合された誘導された生理活性脂質、すなわち、  「誘導された生理活性脂質コンジュゲート」である。免疫原で使われる前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは免疫原に対する反応で生成された抗体の探知のための捕獲物質として使われ得る。したがって、前記免疫原は探知試薬で使われることもある。また、捕獲物質として使われる前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは、異なる免疫原内の生理活性脂質コンジュゲート由来である異なるリンカーおよび／または運搬体モイエティを有することができる。
【００６３】
「抑制」、具体的には、生物学的現象の脈絡で「抑制」は減少、真圧または遅延を意味する。例えば、「炎症抑制」を可能にする治療は炎症が発生しないか、治療されない対照群と比較して、炎症がゆっくり発達するか炎症範囲が減少することを意味し得る。
【００６４】
「分離された」抗体は、自然環境の成分から分離されるかおよび／または回復した抗体である。前記抗体の自然環境の汚染成分は前記抗体での診断および治療を妨害できる物質であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、前記抗体は（１）ローリー法（Ｌｏｗｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により決定されるものであって、９５重量％、最も好ましくは９９重量％、（２）スピン型カップ序列分析器（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使って少なくとも１５個残基のＮ−末端または内部のアミノ酸序列を収得するのに十分な程度、または（３）クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）または好ましくは銀汚染（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎ）を使って還元または悲還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同質性で精製されるであろう。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分は存在しないため、分離された抗体は再調合細胞の元の位置に存在する抗体を含む。しかし、大慨は、分離された抗体は少なくとも一つの精製工程によって製造されるであろう。
【００６５】
本明細書で使われる用語「標識（ｌａｂｅｌ）」は、前記抗体に直接的にまたは間接的に接合されるような探知可能な化合物または組成物を意味する。標識自体が自ら探知可能であるか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光性標識）、酵素標識の場合、探知可能な基材化合物または組成物の化学的変化を促進することができる。
【００６６】
「リガンド」は、生物学的目的を提供するために生体分子に結合して前記生体分子と複合体を形成できる物質である。したがって、抗原は抗原が結合できる抗体のリガンドと説明され得る。
【００６７】
「分離された」核酸分子は、抗体核酸の天然供給源とほとんどが関連された少なくとも一つの汚染物質核酸分子から同定されて分離された核酸分子である。分離された核酸分子は自然で発見される形態または設定とは異なる。したがって、分離された核酸分子は自然細胞で存在する核酸分子とは区別される。しかし、分離された核酸分子は大慨は抗体を発現する核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子は自然細胞とは異なる染色体位置に存在する。
【００６８】
「液体組成物」は、固体とは反対の液体または溶液を意味するもので、前記液体組成物は調製（された最終形態で製造業者から最終使用者（例えば、医師または看護婦）に提供される。ここで、「固体」は液体または溶液でない組成物を意味する。例えば、固体は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、冷凍乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）、沈殿、およびこれと類似の工程によって製造された乾燥された組成物を含む。
【００６９】
本出願書で使われる用語「線形抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はＺａｐａｔａなど（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８（１０）：１０５７−１０６２、１９９５年）により説明された抗体を意味する。要約すれば、このような抗体は一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ｔａｎｄｅｍ  Ｆｄ  ｓｅｇｍｅｎｔ、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は二重特異的または単一特異的であり得る。
【００７０】
用語「代謝産物」は、提供されたｃｙｓＬＴが生成され、ｃｙｓＬＴの分解を引き起こす化合物（すなわち、ｃｙｓＬＴ物質代謝経路と関連された化合物）を意味する。用語「物質代謝前駆体」は、提供されたｃｙｓＬＴが生産される化合物を意味し得る。
【００７１】
本明細書で使われるように、用語「単クローン抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に同質である抗体の群集から収得された抗体または抗体の前記群集を意味する。前記群集を含むそれぞれの抗体は、少量で存在できる自然的に発生する変異体を除いて、必ず同一である。単クローン抗体は一つの抗原位置に対して提供されるもので非常に特異的である。さらに、異なる決定部（抗原決定部）に対して提供される異なる抗体を典型的に含む慣例的な（多クローン性の）抗体製造と照らし合わせ、それぞれの単クローン抗体は抗原上の一つの決定部に対して提供される。改質された形態である「単クローン」は、実質的に同質である抗体の群集から収得される抗体の特徴を意味するもので、ある特定方法による前記抗体の生産が要求されるものとは理解されない。例えば、本記載により使われる前記単クローン抗体は、Ｋｏｈｌｅｒなど（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５、１９７５年）により初めて紹介されたハイブリードマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｍｅｔｈｏｄ）により製造されるか、再調合ＤＮＡ方法（参照、例えば、アメリカ特許第４、８１６、５６７号）により生産され得る。また、前記「単クローン抗体」は、Ｃｌａｃｋｓｏｎなど（Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、３５２：６２４−６２８）およびＭａｒｋｓなど（１９９１年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７）により説明された技術を使ってファージ抗体ライブラリー（ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）から分離されるか、例えば、当分野に知られている他の方法によって分離することができる。本明細書の単クローン抗体は、具体的には、キメラ抗体を含むもので、前記キメラ抗体で重鎖および／または軽鎖の部分は、所望の生物学的活性を表わす限り、特定種由来であるか特定抗体下位集合に属する抗体の相応する序列と同一であるか相同である反面、前記鎖の残りはさらに他の種由来であるかさらに他の抗体下位集合体属する抗体の相応する序列と同一であるか相同である（アメリカ特許第４、８１６、５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎなど、１９８４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００７２】
「単独治療」は、単独投薬または時間による複数回の投薬でなされる一つの治療的に効果的な化合物の伝達に基づいた治療療法を意味する。
【００７３】
用語「多価特異性抗体」は、少なくとも二つの異なる抗原決定部の結合特性を有する抗体または単クローン抗体を意味する。一つの具体例において、前記抗原決定部は同じ抗原由来である。さらに他の具体例において、前記抗原決定部は、二つのまたはそれ以上の異なる抗原由来である。多価特異性抗体製造方法は当分野で知られている。多価特異性抗体は二重特異性抗体（二つの抗原決定部に対する結合特性を有する）、三重特異性抗体（三個の抗原決定部）、などを含む。例えば、多価特異性抗体は二つのまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共同発現を使って再調合することによって生産され得る。また、多価特異性抗体は化学的結合を使って生産され得る。当業者はこのような方法または当分野で知られている他の方法を使って多価特異性抗体を生産することができる。多価特異性抗体は、多価特異性抗体フラグメントを含む。多価特異性（この場合、二重特異性）抗体の一つの例は、Ｓ１Ｐ抗原決定部およびＬＴＥ４抗原決定部に対して結合特性を有し、Ｓ１ＰおよびＬＴＥ４をすべて  認識し、これらのすべてと結合する抗体である。二重特異性抗体のさらに他の例は生理活性脂質由来の抗原決定部および細胞表面抗体由来の抗原決定部に対して結合特性を有する抗体である。したがって、前記抗体は（例えば、目的対象を的中するために）生理活性脂質を認識し、これと結合でき、細胞を認識して細胞と結合することができる。
【００７４】
「腫瘍形成」または「癌」は、非正常的で、制御されない細胞成長を意味する。「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」、腫瘍、または癌は非正常的で、調節されない無秩序な細胞増殖であり、一般的に癌と言及される。新生物は陽性か悪性であり得る。新生物が破壊的な成長、侵入力、および転移性を有するのであれば、これらは陽性か癌であり得る。侵入力は周辺組織の浸潤または破壊による新生物の位置的拡散を意味するもので、典型的に組織の境界を決める基底板を通過して時々体内循環系に入る。転移は典型的にリンパ管または血管による腫瘍細胞の拡散を意味する。また、転移は腸液空間または  クモ膜の下またはその他の空間を通した直接的な拡散による腫瘍細胞の移動を意味する。転移によって、体内の他の領域での腫瘍細胞移動により本来の発現位置から遠く離れた領域で新生物が生成される。
【００７５】
「新血管形成」は新しい血管の形成を意味する。
【００７６】
核酸はさらに他の核酸序列と機能的関係にある時、「機能的に連結」される。例えば、前序列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌性リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ）に該当するＤＮＡがポリペプチドの分泌に参与する前蛋白質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）で発現される場合、前記ＤＮＡが機能的にポリペプチド用ＤＮＡに連結されるか；プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）またはエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）がコーディング序列の転写に影響を与える場合、前記コーディング序列に機能的に連結されるか；リボソーム結合位置が転写を促進するために位置される場合、コーディング序列に機能的に連結される。一般的に、「機能的に連結された」は、連結されたＤＮＡ序列が隣接し、分泌性リーダーの場合、隣接してリーディングフェーズ  （ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）であることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接する必要はない。連結は手軽な制限酵素位置連結によって行われ得る。制限酵素位置が存在しない場合、従来の方法により合成オリゴヌクレオチドアダプタ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカーが使われる。
【００７７】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、剤形で使われる塩を意味するもので、前記塩は製剤および製剤の化合物の生物学的効果および物性を保有し、生物学的であるか好ましい形態である。多くの場合、本明細書に記載された製剤および化合物は極性基、例えば、極性のアミノ基および／またはカルボキシル基またはこれらと類似した基の存在によって酸および／または塩基塩を形成することができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は無機酸および有機酸から製造され得る反面、薬学的に許容可能な塩基付加塩は無機塩および有機塩から製造され得る。薬学的に許容可能な塩は次の文献で検討され得る：Ｂｅｒｇｅなど、１９７７年、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、ｖｏｌ．  ６６、１−１９．
【００７８】
「複数」は、一つ超過を意味する。
【００７９】
用語「プロモーター」は、細胞のコーディング序列の転写を誘導できるすべての序列を含む。したがって、構造物で使われるプロモーターは遺伝子転写時点および／または速度を調節するのに関与するシース作用転写制御要素（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）および調節序列を含むことができる。例えば、プロモーターは転写調節に関連されたエンハンサー、プロモーター、転写終結因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、複製原点（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ａ染色体統合序列（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、５´および３´非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域、またはイントロン序列を含むシース作用転写制御要素であり得る。使用に適切な転写調節領域は、非制限的な例で、人間サイトメガロ（ＣＭＶ）急初期エンハンサー／プロモーター（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、および原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御するものと知られているプロモーターを含む。
【００８０】
用語「再調合ＤＮＡ」は、研究者によって操作されるか、生産されるか、改質された核酸または前記核酸由来の遺伝子産物を意味する。「再調合」ポリペプチドまたは蛋白質は（例えば、所望のポリペプチドまたは蛋白質を暗号化する外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡ構造物によって変形された細胞から）ＤＮＡ再調合技術によって生産されたポリペプチドまたは蛋白質である。
【００８１】
用語「分離された」、「精製された」、「分離された」、などは試料が入れられた試料の一つ以上の成分が容器内の一つ以上の他の試料成分から除去されるか前記一つ以上の他の試料成分の存在下で希釈されることを意味する。分離または精製段階の間除去されるか希釈され得る試料成分は化学的反応産物、未反応された化学物質、蛋白質、炭水化物、脂質、および結合されていない分子を含む。
【００８２】
用語「固体相」は、抗体が付着できるような非−水性母体（ｍａｔｒｉｘ）を意味する。本明細書で含まれる固体相の例は  部分的にまたは全体的に  （例えば、調節孔隙ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ））、多糖類（例えば、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ））、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、およびシリコン（ｓｉｌｉｃｏｎｅ）で形成されたものを含む。一部の具体例において、文脈にしたがって、固体相は分析用実験皿（ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）を含み、他の場合、固体相は精製コラム（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ、例えば、親和性クロマトグラフィーコラム（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ））である。また、固体相はアメリカ特許第４、２７５、１４９号に記載されたように離散粒子（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の不連続的な固体相を含む。
【００８３】
用語「種（ｓｐｅｉｃｅｓ）」は、本明細書で多様な範囲（例えば、システイニルロイコトリエン（ｃｙｓＬＴ）の特定種（例えば、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、およびＬＴＦ４））で使われる。各文脈で、前記用語「種」は、特定文脈で言及される類型の化学的に不明な分子の集団を意味する。
【００８４】
抗体−抗原相互作用の脈絡で用語「特定の」または「特異性」は、抗体と前記抗体のターゲット抗原決定部間の選択的で非−無作為的な相互作用を意味する。ここで、用語「抗原」は、抗体分子または他の免疫由来モイエティによって認識されて結合される分子を意味する。抗体によって結合される抗原の特定の部分は「抗原決定部」と命名される。このような相互作用は分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能にする構造的、疏水性／親水性、および／または静電気特徴により異なる。したがって、抗体は通常的に前記抗体のターゲット抗原の抗原決定部と「結合」（または「特異的に結合」）するか「反応」（または「特異的に反応）するか、同一に、「反応性である」（または「特異的に反応性」）であると表現される。当分野で、抗体は、抗原に対する抗体結合を減らし、通常的にこれらの抗原に「対抗する」または「対する」ものと説明される。したがって、「ＬＴＥ４と結合する抗体」、「ＬＴＥ４に対して反応性である抗体」、「ＬＴＥ４と反応性である抗体」、「ＬＴＥ４に対する抗体」、および「抗−ＬＴＥ４抗体」はすべて当分野に同じ意味を有する。抗体分子は与えられた条件下で関連ない抗原または類似の抗原または抗原混合物に対する結合に対して前記所望の抗原に対する結合を比較することによって結合特異性がテストされ得る。好ましくは、抗体は関連ない抗原に対して非常に欠乏した結合を有することで、前記抗体がターゲット抗原の一つ以上の類似物に対する特異的な結合が欠乏した方が好ましい。「特異的に関連された」および「特異的な関連」、などは分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能にする構造的、疏水性／親水性、および／または静電気特徴により異なる二つの分子間の特定の、非−無作為的な相互作用を意味する。
【００８５】
ここで、「安定した」は、分子が所望の目的または操作のために維持されるように十分に安定した二つの分子（例えば、ペプチドおよびＴＬＲ分子）間の相互作用を意味する。例えば、ペプチドおよびＴＬＲ分子間の「安定した」相互作用はペプチドが所望の効果を表わすのに十分な期間の間ＴＬＲ分子と関連して関連されたまま維持されることを意味する。
【００８６】
「被験者」または「患者」は、本明細書に記載された組成物によって影響を受けることができる治療が必要な動物を意味する。治療され得る動物は牛、犬、馬、猫、ヤギ、豚、および特に好ましい例である霊長類（人間および非−人間霊長類）のような哺乳動物を含む脊椎動物である。
【００８７】
「代理標識（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ））」は、疾病状態に対する治療効果を間接的に見せる身体内の生物学的活性の実験的な測定である。過増殖性および／または心血管疾患に対する代理標識の例はＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲを含む。
【００８８】
「治療剤」は、非制限的な例で、ＣＯＸ抑制剤および他のＮＳＡＩＤＳを含む抗−炎症性薬品、抗−血管新生薬品、前記で定義された化学療法用薬品、心血管剤、免疫仲裁剤（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）、神経病性障害を治療するために使われる薬剤、目薬、抗−繊維増剤、などを含む治療効果を提供することを意図した薬物または化合物を意味する。
【００８９】
「治療的に効果的な容量」（または「効果的な容量」）は治療が必要な被験者に投与される時治療効果を表わすのに十分な活性成分の容量を意味する。したがって、組成物の治療的に効果的な容量は当分野の技術者によって容易に決定され得る。癌治療と関連して、「治療的に効果的な容量」は、特定岩に関連された一つ以上の遺伝子の発現の増加または減少、腫瘍大きさ減少、癌細胞溶解、生物学的試料（例えば、全血（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）、血小、血清、小便、などのような体液の組織バイオプシー（ｂｉｏｐｓｙ）および部分標本（ａｌｉｑｕｏｔ））内の一つ以上の癌細胞死滅標識者探知、老化または他の細胞死滅経路の誘導、などを含む癌細胞生存または物質代謝と関連された一つ以上のパラメーターで客観的に測定された変化を表わす容量である。もちろん、治療的に効果的な容量は、当分野の技術者によって容易に決定され得る、治療される特定被験者および疾患、被験者の体重および年齢、疾病の深刻度、使われる化合物の種類、後続される投薬処方、投与時間、投与方法、などにより相異なるであろう。併用治療と関連された特定活性成分の治療的に効果的な容量は単独治療（すなわち、活性成分でただ一つの化学的物質を使う治療療法）で投与される前記活性成分の治療的に効果的な容量とは相異なる可能性があることを理解できるはずである。
【００９０】
本明細書で説明される組成物は生理活性脂質基盤の治療方法で使われる。本明細書で使われるように、用語「治療」および「治療上」は、疾病、疾患または身体的外傷の予防および／または治療の全領域を含む。「治療」薬剤は危険な状態にあると確認され得る（例えば、薬品遺伝学によって）個人を治療するために考案された手続きを含むものなどを含む予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）する方式で機能するか自然的に改善されるか治る方式で機能するか治療される疾病または疾患の少なくとも一つの症状の進展の速度または範囲を低くするように作用するか必要な時間、疾病、疾患、または身体的外傷からの回復に関連されたいかなる不便または痛み、または物理的限界の発生または範囲を最小化するように機能するか他の治療剤に対する補剤として使われ得る。
【００９１】
用語「治療」または「治療する」は、疾病または疾患を予防するかこれから保護し（すなわち、臨床症状が現れないようにする）；疾病または疾患を抑制し（すなわち、臨床症状の勃発を中断させるか、延期するか、抑制する）；および／または疾病または疾患の軽減すること（臨床症状の退行を引き起こす）を含む疾病または疾患のすべての形態の治療を意味する。窮極的に誘導される現象または現象が知られていないか潜伏しているため、疾病または疾患の予防と抑制を区分することが常に可能ではないことが理解できるであろう。「治療が必要な」被験者は、すでに疾病がある被験者だけでなく、予防が必要な疾患がある被験者を含む。したがって、用語「疾病予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、予防および抑制を含む治療の形態と見なされることが理解できるであろう。したがって、用語「保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）」は、「疾病予防」を含む。
【００９２】
用語「治療療法」は、化学療法制および細胞毒性制を使うすべての疾病および疾患治療、放射線治療、手術、遺伝子治療、ＤＮＡワクチンおよび治療、ｓｉＲＮＡ治療、抗−血管新生治療、免疫治療、骨髄移植、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）および抗体および抗体フラグメントのようなその他の生物製剤、おとり受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｃｏｙ）、およびその他の蛋白質系治療剤を意味する。
【００９３】
抗体の「可変形」領域は骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）および相補性決定部位（ＣＤＲ、初可変領域としても知られている）を含む。可変性は抗体の可変ドメイン随所に全体にかけて等しく分配されない。可変性は６個のＣＤＲセグメントに集中し、軽鎖および重鎖可変ドメインそれぞれに３個のＣＤＲセグメントがある。さらに高く補助された可変ドメインの部分は骨格領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と命名される。天然そのままの重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは三個の初可変領域によって連結されてベータ−シート（ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ）構造を連結する（一部の場合で、前記ベータ−シート構造の一部を形成する）ループを形成するベータ−シート構造を主に利用し、四個のＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４それぞれ）を含む。本発明で使われる用語「初可変領域  」は、抗原結合の原因になる抗体のアミノ酸残基を意味する。初可変領域は、「相補性決定部位」または「ＣＤＲ「（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基である２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン内の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３））由来のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔなど、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、メリーランド州ペデスタ所在のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１年、６４７〜６６９面）、および／または「初可変形ループ「（例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン内の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３））由来のアミノ酸残基（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７、１９８７年）を含む。「骨格」または「ＦＲ」残基は本明細書で定義されたように初可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９４】
当分野ではアミノ酸残基を計数する一つ超過のシステムが通常的に使われることを参考しなければならない。前記でＣＤＲが説明され、カバット計数技法（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ、Ｋａｂａｔなど、前述される）により計数されるが、他の技法または序列計数法が使われ得る。一部の場合で、序列計数およびカバット計数は同一である。
【００９５】
各鎖内の初可変領域はＦＲによって非常に近く位置し、他の鎖の初可変領域と共に抗体の抗原結合位置の形成に寄与する（参照、Ｋａｂａｔなど、前述される）。繰返しドメインは抗原に対する抗体の結合に直接的に関与しないが、抗体と関連された細胞毒性で抗体の沈殿のような多様な作用者機能を表わす。
【００９６】
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」は、一つ以上の再調合遺伝子の発現に影響を与えるために細胞内に一時的にまたは安定的に維持され得る核酸を意味する。ベクターは核酸を単独で含むか他の化合物と複合化された核酸を含むことができる。ベクターは選択的にウイルスまたはバクテリア核酸および／または蛋白質、および／または膜を含む。ベクターは、非制限的な例で、ＤＮＡのフラグメントが付着して複製され得るレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。したがって、ベクターは、非制限的な例で、ＲＮＡ、自主的に複製する円形のまたは線形のＤＮＡまたはＲＮＡを含み、発現プラスミドおよび非−発現プラスミドすべてを含む。プラスミドは購買可能であるか、制限なしに公開的に利用可能であるか、公開されたプロトコルに記録された利用可能なプラスミドから製作され得る。また、発現ベクターは真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）またはネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）抵抗性、またはＥ．  ｃｏｌｉでテトラシクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）またはアンピシリン抵抗性のような形質転換された宿主細胞の選別のための形質を提供者は遺伝子を含むことができる。
【００９７】
単クローン抗体（ｍＡｂｓ）は安全で効果的な治療剤と確認されてきた。数十個の治療用単クローン抗体はＦＤＡによって臨床用に承認され、追加的な単クローン抗体が多様な形態の癌を的中するために多く発病する数多くの疾病に対して多様な臨床的開発段階にある。一般的に、単クローン抗体は非−人間哺乳動物で生産される。人間患者がネズミ科の抗体に対して主に抗体反応始めるという事実によって、ネズミ科単クローン抗体の治療用での使用は制限される。いわゆるＨＡＭＡ（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、人間抗−マウス抗体）反応と呼ばれるこのような反応はネズミ科単クローン抗体の最終的な中和および早い除去を招く。このような除去はネズミ科の抗体に対する「人間化」と呼ばれる工程の発達で克服されてきた。人間化は投与された治療用単クローン抗体に対する免疫反応の発達を大きく減らすことによって、ＨＡＭＡによる半減期および治療効能の減少を防止する。普通、前記人間化過程は人間免疫グロブリンの骨格領域（ＦＲｓ）内にネズミ科の相補性決定領域（ＣＤＲ）を組み合わせることを含む。このような戦略は「ＣＤＲクラフティング」と言及される。ＦＲ内の選択された残基のネズミ科アミノ酸残基に対する「復帰突然変異」は、時々初期の接合された構造物で消失した親和力を回復するために要求される。また、完全人間型抗体は人間免疫グロブリン遺伝子を有する再調合実験ネズミから生産され得る。
【００９８】
人間抗体または人間化抗体は典型的に次の式によって示されるアミノ酸序列を含む重鎖可変ドメインを有する：ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４．前記式で、「ＦＲ１−４」は、四個の骨格領域を示し、「ＣＤＲＨ１−３」は、抗−ｃｙｓＬＴ抗体可変形重い（ｈｅａｖｙ）  ドメインの三個の初可変領域を示す。ＦＲ１−４は下記の実施例のように「共通序列「（例えば、人間免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の部類、下位部類、または下位集団の最も一般的なアミノ酸）で由来するか、それぞれの人間抗体骨格領域または異なる骨格領域序列の組合で由来することができる。数多くの人間抗体骨格領域序列が編集されている（Ｋａｂａｔなど、前述される）。例えば。一つの具体例において、前記可変形重いＦＲは前述されたＫａｂａｔなどの文献によって編集されたように人間免疫グロブリン下位集団の共通序列によって提供される。
【００９９】
前記人間可変形重いＦＲ序列は内部に置換を有することができる。前記人間ＦＲ残基は上昇する非人間残基（「相応する非人間残基」は、人間序列および非人間序列が整列（ａｌｉｇｎｅｄ）される時に関心対象である人間残基のようなカバット位置係数を有する非人間残基を意味する）により交替されるが、非人間残基での交替は必須のものではない。例えば、前記相応する非人間残基他にＦＲ残基交替はファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）により選択され得る。
【０１００】
また、抗体は典型的に次の式によって示されるアミノ酸序列を含むアミノ酸軽鎖可変ドメインを有する：ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４．前記式で、「ＦＲ１−４」は、四個の骨格領域を示し、「ＣＤＲＬ１−３」は、抗−ｃｙｓＬＴ抗体可変形軽いドメインの三個の初可変領域を示す。ＦＲ１−４は下記の実施例でのように「共通序列」（例えば、人間免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の部類、下位部類、または下位集団の最も一般的なアミノ酸）で由来するか、それぞれの人間抗体骨格領域または異なる骨格領域序列の組合で由来することができる。一つの好ましい具体例において、前記可変形軽いＦＲは前述されたＫａｂａｔなどの文献によって編集されたように人間免疫グロブリン下位集団の共通序列によって提供される。
前記人間可変形重いＦＲ序列は内部に置換を有することができる。例えば、前記人間ＦＲ残基は相応する実験ネズミの残基で交替されるが、非人間残基で交替は必須のものではない。例えば、前記相応する非人間残基他に、交替残基はファージディスプレイによって選択され得る。
【０１０１】
単クローン抗体の製造は、蛋白質自らの多様性による複雑な工程である。単クローン抗体の多様性は蛋白質バックボーンおよび／または炭水化物モイエティで位置することができる。操作は通常的に向上した安定性、蛋白質分解酵素に対する抵抗性、集合挙動（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）などのような物性を向上させ、異種起源（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）システムでの発現数値を改善するために抗体分子に適用され得る。
【０１０２】
効果的な濃度の一つ以上のｃｙｓＬＴを低くする抗体のような製剤は炎症を減少させ、アレルギー性、心血管、および神経疾患だけでなく、喘息、癌、炎症性疾病および疾患、および一つ以上のｃｙｓＬＴの望んでいない、過度な、または異常な数値と関連された疾病または疾患を含む疾病および疾患の治療に有用なものと考えられる。
【０１０３】
好ましい具体例において、前記の抗体は単クローン抗体である。このような具体例の一部で、前記抗体はＬＴＥ４、ＬＴＣ４、および／またはＬＴＤ４の中の一つ以上の効果的な濃度を低くする。さらに他の具体例において、前記抗体はＬＴＥ４、ＬＴＣ４、およびＬＴＤ中の一つ以上の効果的な濃度を低くする。このような三個のｃｙｓＬＴの中の一つ以上の効果的な濃度は異なる範囲で減少するか、実質的に同一に減少することができる。このような具体例中の好ましいものは治療される疾病の状態により異なり得る。
【０１０４】
本発明の治療方法および組成物は一つ以上のｃｙｓＬＴの相対的な、絶対的な、または利用可能な濃度を変更するために意図された。患者で望んでいないｃｙｓＬＴの量を調節するための一つの方法は、有利な（ｆｒｅｅ）ｃｙｓＬＴの数値を低くする治療的「スポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）」として作用するように抗−ｃｙｓＬＴ抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーのような一つ以上のｃｙｓＬＴ結合剤を含む組成物を提供することである。また、このような効果的な濃度のｃｙｓＬＴの減少は、ｃｙｓＬＴ「中和」とも言及される。化合物が「ガラス（ｆｒｅｅ）」であると言及されるとき、前記化合物がこれら化合物の望まない効果を表わす位置または位置にいかなる方法で到達するかは制限されない。典型的に、ガラス化合物は血液および組織に存在し、前記血液または組織はガラス化合物の作用位置や前記作用位置を含み、化合物は前記血液または組織でこれらの作用位置に自由に移動することができる。また、ガラス化合物は化合物を望んでいない化合物に転換するある酵素によって作動するように利用され得る。
【０１０５】
ｃｙｓ−ＬＴの抗体
本発明は抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体および抗原と結合する前記抗体のフラグメントと関連された組成物および方法を提供する。抗体は典型的に多クローン性または単クローンであると説明される。前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体は（またはこれの抗原と結合する前記抗体のフラグメント）疾病、疾患、または身体的外傷の治療を含む数多くの目的に有用な薬学的組成物で剤形化できる。一つ以上の抗−ｃｙｓＬＴ抗体を含む薬学的組成物をこのような治療のためのキットおよび医療装置に含まれ得る。医療装置は治療が必要な患者に本発明の薬学的組成物を投与するｋとに使われ得る。一部の具体例にしたがって、このような装置を含むキットが提供される。このような装置およびキットは本発明の薬学的組成物の自家投与を含む日常的な投与用に考案され得る。また、このような装置およびキットは応急治療用で（例えば、救急車または応急室内に、または手術の間、または負傷または疾病がある活動の場合で（例えば、喘息「アタック（ａｔｔａｃｋ）」の場合も可能であるが全体的な治療が直ちになされないこともあり得る（例えば、ハイキングおよびキャンピング、またはスポーツまたは戦争の状況も考えられる））。
【０１０６】
また、抗−ｃｙｓＬＴ抗体（およびこれらの抗原と結合する前記抗体のフラグメント）は診断試薬および研究用試薬に有用であり、これに伴い剤形化されておよび／または包装され得る。抗−ｃｙｓＬＴ抗体は研究用または診断用で固体支持体に付着することができる。前記固体紙遅滞の例としてコラム、玉、およびＥＬＩＳＡ皿がある。
【０１０７】
抗体生産および特徴説明
ｃｙｓＬＴに対する単クローン抗体は下記の実施例で説明されたように製造され得る。一つの具体例において、ｃｙｓＬＴに対する前記単クローン抗体は一つ以上のｃｙｓＬＴに対して強い結合親和力を有する。抗体親和力は後述される実施例で説明されるように決定され得る。一つのｃｙｓＬＴ、例えば、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、またはＬＴＥ４に対して優先的なまたは特定の親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。他の具体例において、前述されたｃｙｓＬＴの中の一つ超過または三個のｃｙｓＬＴすべてに対して親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。前記抗体は異なる親和力を有する多数のｃｙｓＬＴらと結合することができる。また、治療観点で他の有益な物性を有するキメラまたは人間化抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを選択することが好ましいこともある。例えば、前記抗体は炎症性反応または血管形成を減少させるものであり得る。
【０１０８】
好ましくは、前記人間化抗体またはこれのフラグメントは人間患者に治療的に効果的な容量の前記抗体の投与時免疫反応を誘導することを失敗した。免疫反応が誘導されると、好ましくは前記反応は前記抗体が前記抗体で治療される患者に治療的利点を依然として提供するように存在するであろう。
【０１０９】
Ａ．  抗体製造
単クローン抗体を含む抗−ｃｙｓＬＴ抗体を生産する方法が下記の実施例で説明される。このような非人間抗体および母抗体を生産するための代表的な方法が下記の段落で説明されるであろう。
【０１１０】
（ｉ）抗原製造
抗体を生産するのに使われる抗原は、例えば、本来のｃｙｓＬＴまたはｃｙｓＬＴの一部（例えば、所望の天然そのままの抗原決定部を含むｃｙｓＬＴフラグメント）であり得る。一つの具体例において、前記抗原は運搬体に接合されたｃｙｓＬＴであるため、抗体コンジュゲートを形成する。抗体を生産するのに有用なｃｙｓＬＴ抗原のさらに他の形態は当分野の技術者に明確であろう。
【０１１１】
（ｉｉ）多クローン抗体
多クローン抗体は典型的に関連された抗原および補剤の皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓｃ）または腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ、ｉｐ）注射のような多数の注射によって動物で生産される。典型的に、このような方法を使用し、前記脂質抗原が免疫化される種で免疫原性が蛋白質のような運搬体（例えば、２作用剤（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）または誘導剤（リンカーにも言及される）を使ってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵アルブミン（ＯＶＡ）、血清アルブミン、牛のタイログロブリン（ｂｏｖｉｎｅ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、または豆トリプシン抑制剤（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ、システイン残基によって接合される）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基によって接合される）、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、琥珀酸無水物（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（前記式で、ＲおよびＲ１は異なるアルキルグループである）））に連結される。当分野で知られている以外のリンカーは次のような一次アミン基およびスルフヒドリル基と結合する次にのような異形二重機能架橋剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチュセッツ州、ワールサム所在）を含む。スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＳＭＣＣ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ、ＳＩＡ）、およびスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミドベンゾエート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ、ＳＩＡＢ）。前記天然そのままのｃｙｓＬＴ更には架橋剤１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロフィール］カルボジイミドヒドロクロライド（１−ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、メサチュセチュジュワ−ルサム所在）を使って運搬体蛋白質に直接的に接合され得、例えば、抗−ｃｙｓＬＴ抗体に対するスクリーン分析に使われ得る。非−蛋白質運搬体（例えば、コロイド質金、ポリエチレングリコール、シリコンビーズ）更には抗体生産に使われるものと当分野で知られている。
【０１１２】
一つの典型的なプロトコルで、実験動物たちは（例えば、実験ネズミまたはウサギｓ）、例えば、１００  ｕｇまたは５  ｕｇの蛋白質またはコンジュゲート（ウサギまたは実験ネズミそれぞれに対して）を３倍体積のプロイント完全補強剤（Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して混合された溶液を皮膚内の多数位置で注射することによってｃｙｓＬＴ免疫原（例えば、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体）に対して免疫化される。典型的に、約一ヶ月後に、前記実験動物たちは多数の位置で皮下注射によってプロイント完全補強剤内のペプチドまたはコンジュゲートの本来の容量の１／５〜１／１０で投与される。７〜１４日後に、前記実験動物たちは採血され、血清は抗体力価分析される。動物たちは力価安定期（ｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅａｕｓ）まで飼育される。好ましくは、実験動物は同じ抗原のコンジュゲートで投与されるが、異なる蛋白質に対して接合されでおよび／または異なる架橋試薬によって接合される。免疫反応を改善するために明礬（ａｌｕｍ）のような凝集剤が適切に使われ得る。コンジュゲート更には蛋白質融合のような再調合細胞培養で生産され得る。
【０１１３】
（ｉｉｉ）単クローン抗体．
単クローン抗体製造方法が当分野に知られている。例えば、単クローン抗体はＫｏｈｌｅｒなど（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５）により初めて説明されたハイブリードマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｍｅｔｈｏｄ）により生産されるか、または再調合ＤＮＡ方法（アメリカ特許第４、８１６、５６７号）により生産され得る。ハイブリードマ方法で、実験ネズミ、ウサギまたはハムスターまたは短い尻尾猿のようなこの他の適切な宿主動物たちは化のために使われる前記蛋白質に特異的に結合することになる抗体を生産するか生産できるリンパ球を誘導するために前述されたように免疫化される。また、リンパ球は体外で免疫化され得る。この後、前記リンパ球はハイブリードマ細胞を形成するためにポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使って骨髓細胞と融合することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３面、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。
【０１１４】
このように生産されたハイブリードマ細胞は好ましくは、融合しない某骨髓細胞の成長または生存を抑制する一つ以上の物質を含有する適切な培養培地に接種されて培養される。例えば、母骨髓細胞でヒポキサンチングアニンフォ  スフォ  リボシル  トランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠乏となる時、前記ハイブリードマ用培養培地はＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の成長を抑制する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を一般的に含むであろう。
【０１１５】
好ましい骨髓細胞は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞によって安定した高い数値の抗体生産を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に敏感な細胞である。このような骨髓細胞のうち、好ましい骨髓細胞株はＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（アメリカ、カリフォルニア州、サンディエゴ所在）で利用可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１実験ネズミ腫瘍由来である細胞、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ、メリーランド州、ロクビル所在）で利用可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞のようなネズミ科骨髄種（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞株である。人間骨髄腫細胞週および実験ネズミ−人間ヘテロ骨髓細胞株更には人間単クローン抗体生産と関連して説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１、１９８４年；Ｂｒｏｄｅｕｒなど、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３面、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク所在、１９８７年）。
【０１１６】
ハイブリードマ細胞が培養される培養培地は前記抗原に対して提供される単クローン抗体の生産のために分析される。好ましくは、ハイブリードマ細胞によって生産された単クローン抗体の結合特異性は免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）または放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）または酵素標識免疫検査法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）のような体外結合分析によって決定される。前記単クローン抗体の結合親和力は、例えば、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析（Ｍｕｎｓｏｎなど、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０、１９８０年）により決定され得る。
【０１１７】
所望の特異性、親和力、および／または活性を有する抗体を生産するハイブリードマ細胞を同定した後に、クローン（ｃｌｏｎｅ）は限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により亜クローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）となり、標準方法によって培養され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、単クローン抗体：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３面、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。このような目的のための適切な培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、前記ハイブリードマ細胞は複数腫瘍で動物体内で成長することができる。
【０１１８】
前記クローンによって分泌される単クローン抗体は、例えば、蛋白質Ａ−セファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、または親和力クロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン手続きによって培養培地、複数液体（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、または血清から適切に分離される。
【０１１９】
前記単クローン抗体を暗号化するＤＮＡは従来の手続きを使って（例えば、単クローン抗体の重鎖および軽鎖を暗号化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことによって）容易に分離して序列分析される。前記ハイブリードマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。前記ＤＮＡは分離すると同時に発現ベクター内に位置されて、以後再調合宿主細胞内で単クローン抗体の合成がなされるように、免疫グロブリン蛋白質を生産しないＥ  ｃｏｌｉ細胞、猿ＣＯＳ細胞、中国ハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞、または骨髓細胞のような宿主細胞内に形質導入される。再調合による抗体生産は下記でさらなる詳細に説明されるであろう。
【０１２０】
（ｉｖ）人間化およびアミノ酸序列変異
本発明の一部の好ましい具体例は一つ以上のｃｙｓＬＴに対して人間化抗体を使う。抗体を人間化する一般的な方法は例えば次の文献に説明されている：アメリカ特許第５８６１１５５号、アメリカ特許第６４７９２８４号、アメリカ特許第６４０７２１３号、アメリカ特許第６６３９０５５号、アメリカ特許第６５００９３１号、アメリカ特許第５５３０１０１号、アメリカ特許第５５８５０８９号、アメリカ特許第５６９３７６１号、アメリカ特許第５６９３７６２号、アメリカ特許第６１８０３７０号、アメリカ特許第５７１４３５０号、アメリカ特許第６３５０８６１号、アメリカ特許第５７７７０８５号、アメリカ特許第５８３４５９７号、アメリカ特許第５８８２６４４号、アメリカ特許第５９３２４４８号、アメリカ特許第６０１３２５６号、アメリカ特許第６１２９９１４号、アメリカ特許第６２１０６７１号、アメリカ特許第６３２９５１１号、アメリカ特許第２００３１６６８７１号、アメリカ特許第５２２５５３９号、アメリカ特許第６５４８６４０号、およびアメリカ特許第５６２４８２１号．一部の具体例において、最初に収得された人間化抗体（母抗体）と比較して、（具体的には、前記抗体の結合親和力またはその他の生物学的物性を改善する）アミノ酸序列変異を有する抗体を生産することが好ましいこともある。これは母抗体の最適化と言及されることもあり得る。
【０１２１】
アミノ酸序列変異を有する抗体は、前記の抗体ＤＮＡ内に適切なヌクレオチド変更（変異）を導入するかペプチド合成によって製造され得る。このような変異は、例えば、前記アミノ酸序列内残基の削除、挿入、および／または置換を含む。削除、挿入、および置換のいかなる組合が最終構造物を生産のためにまされ、これによって所望の特性を有する最終構造物が提供される。また、このようなアミノ酸変更はグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）地点の個数変化または位置変化のような抗体の転写後過程を変えることができる。蛋白質（抗体を含む）のすべての種類の転写後過程は酵素的過程で哺乳動物細胞で分離された単クローン抗体およびこの他の再調合蛋白質で非常に一般的な脱アミド化、非酵素的過程、およびＣ−末端リシンまたはアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）チピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を含む（Ｈａｒｒｉｓ  ＲＪ．、１９９５年、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ７０５：１２９‐１３４）。本明細書のアミノ酸序列は与えられた疾病下で引き起こされるか引き起こされないことがあるすべての可能な転写後改質とは関係なく提供される。
【０１２２】
突然変異化のために好ましい位置である前記抗体のある残基または領域の同定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５）により説明されたように「アラニンスキャン突然変異化（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕタグｅｎｅｓｉｓ）」と命名される。ここで、ターゲット残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕのような電荷された残基）が同定され、前記抗原と抗体間の相互作用に影響を及ぼすように中性や陰電荷されたアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により交替される。この後、前記置換に対して機能的な敏感度を表わす抗体内のこのようなアミノ酸位置は置換位置にまたは置換位置に対して追加的なまたは他の置換または改質を導入することによって定義される。したがって、アミノ酸序列変異を導入するための位置があらかじめ決定される反面、変異自らの性質があらかじめ決定されることが必要なものではない。例えば、与えられた位置で変異の有無を分析するために、ａｌａスキャニングまたは無作為的突然変異化がターゲットコドンまたは領域でなされ、生産された抗体が発現して所望の活性に対してスクリーンされる。アミノ酸序列挿入は一つの残基〜数百個またはそれ以上の残基を含むポリペプチド長さ  範囲のアミノ−末端融合および／またはカルボキシル−末端融合だけでなく、一つのまたは多数のアミノ酸残基の序列内挿入を含む。ことば端部挿入の例はＮ−末端メティオニル残基または抗原決定部タグ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇ）と融合した抗体を含む。この他の挿入の例は前記抗体のＮ−末端またはＣ−末端に対する抗体の血清半減期を向上させる酵素またはポリペプチドの融合を含む。
【０１２３】
抗体変異のさらに他の形態はアミノ酸置換である。このような変異された抗体は前記の抗体分子から除去された少なくとも一つのアミノ酸残基およびその位置に挿入された異なる残基を有する。置換型突然変異化のための最も興味深い位置は初可変領域を含むが、骨格変化更には考慮される。保全的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が好ましいが、このような置換が生物学的活性変化を引き起こす場合にはもう少し実質的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）置換が導入され、結果産物はスクリーンされる。このような置換およびこれらの保存性程度は当分野で良く知られている。
【０１２４】
前記抗体の生物学的物性の実質的な改質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は（ａ）置換領域内のポリペプチドバックボーン構造を維持するにあたってこれらの効果を有意的に変更する置換を（例えば、シート形態または螺旋形態として）、（ｂ）ターゲット位置にある分子の電荷または疏水性、または（ｃ）大量の側鎖を選択することによってなされる。自然的に発生する残基は一般的な側鎖物性によって下記のグループに分類される：
（１）疏水性：ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性（ｎｅｕｔｒａｌ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ．
【０１２５】
非保全性置換によって、このようなグループの中の一つのグループの構成員はさらに他のグループに属することになる。
【０１２６】
分子の酸化的安定性を改善して異常な架橋結合を予防するために、前記抗体の適切な形態を維持するのと関連されないすべてのシステイン残基が置換され得る。反対に、抗体の安定性を改善するために、システイン結合が抗体に付加され得る（具体的には、前記抗体はＦｖフラグメントのような抗体フラグメントだ）。
【０１２７】
一つの置換形態は母抗体（例えば、人間化抗体または人間抗体）の一つ以上の初可変領域  残基の置換を含む。一般的に、追加的な改良のために選択された抗体産物はこれらの起源である母抗体より相対的に改善された物性を有し、時々「最適化」抗体と言及される。このような置換を有する抗体生産する便利な方法で、ファージディスプレイを利用する親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）がある。要約すれば、いくつかの初可変領域位置（例えば、６〜７個の位置）がそれぞれの位置ですべての可能なアミノ酸置換をなすために変異される。このように生産された各粒子内に包装された（ｐａｃｋａｇｅｄ）Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩＩ産物に対する融合物として糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）粒子から１価の方式で展示される。前記ファージ−展示された抗体の生物学的活性（例えば、結合親和力）がスクリーンされる。改質のための候補初可変領域位置を同定するために、抗原結合に明確に寄与する初可変領域残基を確認するアラニンスキャン突然変異化が実行され得る。また、前記抗体と抗原の間の接触点を確認するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有用であり得る。このような接触残基および隣り合った残基は本発明で説明される技術にしたがって置換される候補者である。このような置換を有する抗体が生産されると同時に、このような抗体は本明細書に記載されたようにスクリーンされ得、一つ以上の関連された分析で確認された優秀な物性を有する抗体が追加的な開発のために選択され得る。
【０１２８】
前記抗体のさらに他の形態のアミノ酸変更は前記抗体の本来のグリコシル化パターンを変更する。「変更」は、前記抗体で発見される一つ以上の炭水化物モイエティの削除および／または前記抗体で発見されない一つ以上のグリコシル化位置の添加を意味する。
抗体のグリコシル化は典型的にＮ−結合型および／またはまたはＯ−結合型である。Ｎ−結合型はアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）残基の側鎖で炭水化物モイエティの付着を意味する。トリペプチド（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）序列であるアスパラギン−Ｘ−セリン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−Ｘ−ｓｅｒｉｎｅ）およびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−Ｘ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）（ここで、Ｘはプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）を除いたすべてのアミノ酸である）はアスパラギン側鎖で炭水化物モイエティの酵素的付着のための最も一般的な認識序列である。したがって、ポリペプチド内にこのようなトリペプチド序列のうちいずれか一つの存在は強制的なグリコシル化位置を生成する。Ｏ−結合型グリコシル化はヒドロキシアミノ酸（最も一般的にセリンまたはスレオニン）に対して（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンが使われることもできるが）糖（ｓｕｇａｒ）であるＮ−アセチルガラクトースまたは、ガラクトース、またはキシロースの中の一つの付着を意味する。
【０１２９】
従来に前記抗体に対するグリコシル化位置の付加は前記抗体が前述されたトリペプチド序列（Ｎ−結合型グリコシル化位置に対して）の中の一つ以上の含むようにアミノ酸序列を変更することによってなされる。また、前記変更は本来の抗体の序列に対する（Ｏ−結合型グリコシル化位置に対して）一つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または前記一つ以上のセリンまたはスレオニン残基による置換によって行われ得る。
【０１３０】
抗体アミノ酸序列を暗号化する核酸分子は当分野で知られている数多くの方法によって製造され得る。このような方法は、非制限的な例で、さらに早く製造された抗体のオリゴヌクレオチドによって調節された（または位置−指向性（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ））突然変異、ＰＣＲ突然変異、およびカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）突然変異による天然供給源または調製用物質からの分離を含む。
【０１３１】
（ｖ）人間抗体
人間化のためのさらに他の方法として、人間抗体が生産され得る。例えば、現在の来生の免疫グロブリン生産なしに免疫措置によって全体人間抗体目録を生産できる形質転換動物（例えば、実験ネズミ）を生産することが可能である。例えば、キメラ実験ネズミおよび生殖細胞系列突然変異実験ネズミの抗体重鎖結合領域（ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＪＨ）遺伝子の同型の削除は内生抗体生産の完ぺきな抑制を引き起こすということが説明されてきた。このような生殖細胞系列突然変異実験ネズミで人間生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子集合体の移動は抗原攻撃時人間抗体の生産を可能にするであろう（参照、例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  アメリカ、９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎなど、１９９３年、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３；およびアメリカ特許第５、５９１、６６９号、第５、５８９、３６９号および第５、５４５、８０７号）。また、人間抗体はファージ−ディスプレイ  ライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍなど、１９９１年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓなど、１９９１年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７；およびアメリカ特許第５、５６５、３３２号および第５、５７３、９０５号）から誘導され得る。先立って議論されたように、人間抗体は体外活性化したＢ細胞によって生産され得る（参照、アメリカ特許第５、５６７、６１０号および第５、２２９、２７５号）。
【０１３２】
（ｖｉ）抗体フラグメント
一部の具体例において、前記の抗−ｃｙｓＬＴ製剤は抗原に結合する抗体フラグメントである。抗原に結合する抗体フラグメント生産のための多様な技術が開発されてきた。伝統的に、このようなフラグメントは本来の抗体の蛋白質加水分解によって誘導される（参照、例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏなど、１９９２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７、およびＢｒｅｎｎａｎなど、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１）。しかし、現在このようなフラグメントは再調合宿主細胞によって直接的に生産され得る。例えば、Ｆａｂ´−ＳＨフラグメントはＦ（ａｂ´）２フラグメントを形成するために、Ｅ．  ｃｏｌｉから直接的に回復して化学的に結合されることができる（Ｃａｒｔｅｒなど、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。さらに他の具体例において、前記Ｆ（ａｂ´）２はＦ（ａｂ´）２分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）ＧＣＮ４を使って形成される。さらに他の接近法により、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２フラグメントが再調合宿主細胞培養から直接的に分離することができる。抗体フラグメント生産のためのこの他の技術は当業者には明確であろう。
【０１３３】
Ｂ．ベクター、宿主細胞、および再調合方法
抗体再調合体生産のために、前記抗体を暗号化する核酸が分離されて追加的なクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＤＮＡ増幅）または発現用である複製可能なベクターに挿入され得る。さらに他の具体例において、前記抗体は例えば、本明細書で参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第５、２０４、２４４号に説明されたように相同再調合によって生産され得る。単クローン抗体を暗号化するＤＮＡは従来の手続き（例えば、前記抗体の重鎖および軽鎖を暗号化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことによって）を使って容易に分離して序列分析される。数多くのベクターが利用可能である。前記ベクター成分は一般的に、非制限的な例で、例えば、本明細書に参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第５、５３４、６１５号に説明されたように次の中一つ以上を含む：信号序列、複製原点、一つ以上の標識者遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結序列。
【０１３４】
本発明のベクター内ＤＮＡのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞は、前述された原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞である。このような目的のための適切な原核細胞はグラム陰性菌またはグラム陽性菌（例えば、大腸菌の中（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラの中（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、セラシアマルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））、およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）だけでなく、バチルスズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスリチニポミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のような桿菌（例えば、１９８９年４月１２日付けで公開されたＤＤ  ２６６、７１０に記載されたＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、シュドモナスアエルギノサ（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のようなシュドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストラプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような場内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ））のような真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）を含む。Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１、５３７）、およびＥ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７、３２５）のような菌株が適切だが、一つの好ましいＥ．  ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．  ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１、４４６）である。このような例は制限するためにというよりは説明のためのものである。
【０１３５】
原核細胞の他に、真核、糸状菌またはイーストのような真核微生物が抗体暗号化ベクターに対する適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセスセレビシエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または通常のパンイーストが低級の（ｌｏｗｅｒ）真核細胞宿主固体中で最も一般的に使われる。しかし、本発明で  シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；例えば、  クルイベロミセス・ラクチス  （Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセスフラギリス（Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ  １２、４２４）、クルイベロミセスブルガリクス（Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、ＡＴＣＣ  １６、０４５）、クルイベロミセスウィッケラミ（Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ、ＡＴＣＣ  ２４、１７８）、クルイベロミセスワルチイ（Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ５６、５００）、クルイベロミセストロソピラルム（Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ、ＡＴＣＣ  ３６、９０６）、クルイベロミセステルモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびクルイベロミセスマルシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）のようなクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロイヤこれが（ｙａｒｒｏｗｉａ、ヨーロッパ特許第４０２、２２６号）；ピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、ヨーロッパ特許第１８３、０７０号）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマレエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ、ヨーロッパ特許第２４４、２３４号）；ニュロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シェバンニオミセスオキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）のようなシェバンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；および例えば、ニュロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルスニドランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルスニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）のようなアスペルギルス宿主のような糸状菌のような数多くの他の属、種、および菌株が一般的に利用可能で有用である。
【０１３６】
グリコシル化された抗体の発現のために適合した宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例は植物細胞および昆虫細胞を含む。スポドプテラプルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、幼虫）、森蚊（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、蚊）、  キイロショウジョウバエ  （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、リンゴ汁ハエ）、および蚕蛾のような宿主由来である数多くのパキュロビラル（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ）菌株および変異体および相応する複製可能な昆虫宿主細胞が同定された。トランスファクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のための数多くのウイルス菌株が公開的に利用可能である。具体的には、スポドプテラプルギペルダ細胞のトランスファクションのために、例えば、アウトグラパカリポニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）  ＮＰＶのＬ−１変異体および蚕蛾（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５菌株、およびこのようなウイルスが使われ得る。植物細胞培養ｓ  ｏｆ綿、とうもろこし、ジャガイモ、豆、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト、およびタバコのような植物の細胞培養また、宿主として利用され得る。
【０１３７】
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も大きく、培養（組織培養）で脊椎動物細胞の増殖は日常的な手続きとなってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例はＳＶ４０によって変形された猿身長由来細胞株ＣＶ１（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；人間胚胎身長細胞株（懸濁培養液で成長のために亜クローンとなった２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍなど、１９７７年、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９）；ハムスター子身長細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；中国ハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂなど、１９８０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７：４２１６）；マウスセプトルリ（Ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０年、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１）；猿身長細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカ  サバンナ猿身長細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；人間頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；犬腎臟細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；人間肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；人間肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、１９８２年、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；および人間肝癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１３８】
宿主細胞は、抗体生産のために前述された発現またはクローニングベクターに変形され、プロモーターを誘導するか、形質転換剤を選別するか、または所望の序列を暗号化する遺伝子を増幅するのに適切に改質された従来の培養器（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｅｄｉａ）で培養され得る。
【０１３９】
抗体を生産するのに使われる宿主細胞は数多くの培地で培養され得る。Ｈａｍ´ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、非常に低いＥｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ    Ｍｅｄｉｕｍ  （ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ´ｓ培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような商業的に利用可能な培地は宿主細胞を培養するのに適合する。また、Ｈａｍなど（１９７９年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４）、Ｂａｒｎｅｓなど（１９８０年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：２５５）、アメリカ特許第４、７６７、７０４号；第４、６５７、８６６号；第４、９２７、７６２号；第４、５６０、６５５号；または第５、１２２、４６９号；国際公開特許第ＷＯ９０／０３４３０号；第ＷＯ  ８７／００１９５号；またはアメリカ特許再審第３０、９８５号で説明されるすべての培地が前記宿主細胞の培養培地として使われ得る。このような培地中あるものは必要に応じてホルモンおよび／またはその他の成長因子（インスリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、または表皮成長因子）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、バッファー（ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）およびチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ））、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ  ＴＭ）、微量元素（常にマイクロモール範囲の最終濃度で存在する無機化合物で定義される）、およびグルコースまたは相応するエネルギー源で補充され得る。また、すべての以外の必要な補充物が当分野の技術者に知られている適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は発現のために選択された宿主細胞ですでに使われたもので、当業者には明確であろう。
【０１４０】
再調合技術を使う時、前記抗体は原形質周囲空間で細胞内に生産されるか培地内に直接的に分泌され得る。前記抗体が細胞内に生産される時、第１段階として、微粒子残骸物、すなわち、宿主細胞または分解されたフラグメントが、例えば、遠心分離または限外ろ過膜によって、除去される。Ｃａｒｔｅｒなど（１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）はＥ．  ｃｏｌｉの原形質周囲空間で分泌される抗体を分離する手続きを説明する。要約すれば、細胞塊り（ｃｅｌｌ  ｐａｓｔｅ）は３０分の間ソジウムアセテート（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）の存在下で解凍された。細胞残骸物は遠心分離によって除去され得る。前記抗体が培地内に分泌される時、このような発現システム由来の上澄み液は一般的に商業的に利用可能な蛋白質濃度フィルタ（例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外ろ過膜装置を使って優先的に濃縮される。ＰＭＳＦのような蛋白質分解酵素抑制剤は蛋白質加水分解を抑制する前記のすべての段階中のいずれかの段階に含まれ得、偶発的な汚染物質の成長を予防するために抗生剤が含まれ得る。
【０１４１】
細胞から製造された前記の抗体組成物は好ましい精製技術者親和力クロマトグラフィーとともに、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和力クロマトグラフィーを使って精製され得る。親和性リガンドとして蛋白質Ａの適合さは前記抗体に存在するある免疫グロブリンＦｃドメインの種および同種型により異なる。蛋白質Ａは人間のうち重鎖を基盤とする抗体を精製するのに使われ得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋなど、１９８３年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３）。蛋白質Ｇはすべての実験ネズミ同種型および人間‐３に対して推薦される（Ｇｕｓｓなど、１９８６年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：１５６７１５７５）。親和性リガンドが付着する母体は最も頻繁にアガロースであるが、他の母体も利用可能である。調節孔隙ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定した母体はアガロースによる場合よりもさらに高い流速およびさらに短い処理時間を可能にする。前記抗体がＣＨ３ドメインを含む時、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州、フィリップスバグ所在）は精製のために有用である。イオン交換コラム上で分類、エタノール沈殿、逆相（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ｈｅｐａｒｉｎ（ｈｅｐａｒｉｎ）ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、（ポリアスパルト酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）コラムのような）陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）沈殿のような蛋白質精製のための他の技術も回収される抗体により異ならせて適用しながら利用可能である。
【０１４２】
ある予備精製段階後に、関心対象である抗体および汚染物質を含む混合物は約２．５〜４．５のｐＨを有する溶離バッファーを使って（好ましくは低い塩濃度で（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩））低ｐＨ疏水性相互作用クロマトグラフィー（ｌｏｗ  ｐＨｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）される。
【０１４３】
Ｃ．薬学的剤形
前記抗体の治療用剤形は冷凍乾燥された剤形または水性溶液の形態で所望の程度の純度を有する前記抗体を選択的な生理学的に許容可能な運搬体、添加剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．  Ｅｄ．、１９８０年）と混合することによって製造される。前記許容可能な運搬体、添加剤、または安定剤の使われる投与量および濃度は被験者に非毒性で、燐酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を含む抗酸化剤；（オク・タデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ヘキサメトニウムクロライド（ｈｅｘａｍｅｔｈｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ベンザルコニウムクロライド（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ペンゼトニウムクロライド（ｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）またはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）；レゾルシノール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）；シクロヘキサノール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ）；３−ペンタノール（３−ｐｅｎｔａｎｏｌ）；およびｍ−クレゾール（ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）のような）防腐剤；低分子量（１０個の残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、またはグロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）のような親水性高分子；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、またはデキストリン（ｄｅｘｔｒｉｎ）を含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；（蔗糖  、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）またはソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）のような糖；ソジウムのような塩形成反対イオン（ｓａｌｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｏｎｓ）；金属複合体（例えば、Ｚｎ−蛋白質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４４】
本明細書で剤形は治療される特定症状のために必要な一つの活性化合物、好ましくは互いに不利となるように影響を与えない詳報的な活性を有する活性化合物も含むことができる。このような分子は意図的目的のために効果的な容量で、組合せとして適合に存在する。
【０１４５】
また、前記活性成分は、例えば、コロイド質薬品伝達システム（例えば、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、アルブミンマイクロスフェア（ａｌｂｕｍｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、マイクロエマルジョン（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン（ｍａｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）でコアセルベーション（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ）技術または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）またはゼラチン−微小カプセルおよびポリ（メチルメタクリレ−ト）微小カプセル、それぞれ）により微小カプセルに含まれ得る。このような技術は次の文献に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．  Ｅｄ．、１９８０年。
【０１４６】
体内投与のために使われる剤形は滅菌されなければならない。例えば、滅菌は滅菌されたフィルタ膜を通した濾過によって容易に行われ得る。
持効性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）調製用物質が製造され得る。持効性調製用物質の適切な例は前記の抗体を含む固体疏水性分子の半透性母体を含み、前記母体は成形体形態（例えば、フィルムまたは微小カプセル）である。持効性母体の例はポリエステル、ハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、またはポリ（ビニルアルコール）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）））、ポリラクタイド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅｓ、アメリカ特許第３、７７３、９１９号）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）およびガンマーエチル−Ｌ−グルタミン（ｇａｍｍａ  ｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）の共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ．ＴＭ．（乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ））からなる注射可能なマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ））のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ｐｏｌｙ−Ｄ−（−）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含む。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のような高分子が１００日間分子を放出できる反面、いかなるハイドロゲルはさらに短い時間の間蛋白質を放出する。カプセル化された抗体が長い時間の間体内に残留する時、これらは３７°Ｃで水分に露出する時分解されるか凝集し、生物学的活性の消失および免疫原性において可能な変化が引き起こされる。関連メカニズムにより安定化のために合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド（ｔｈｉｏ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）交換による分子間Ｓ‐Ｓ結合形成であるものと確認されると、安定化はスルフィドリル残基を改質し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適切な添加剤を使用し、特定の高分子母体組成物を開発することによって行われ得る。
また、多様な添加剤が治療効果を向上させるか、さらなる便利な治療がなされるようにするか、剤形化された抗体が意図されて承認された目的だけのために使われるのを明確に保障するために前記剤形化された抗体で添加され得る。添加剤の例はｐＨを調節する化学物質、抗微生物剤、抗体効能の消失を予防するための防腐剤、単に気道用である剤形の識別のための染料、剤形内の抗体濃度を増加するための可溶化剤、経皮吸収促進剤、および等長度および／または粘度調節用製剤を含む。必要な場合、例えば、前記抗体の半減期を延長するために蛋白質分解酵素の抑制剤が添加され得る。
【０１４７】
Ｄ．抗体の非治療的用途
本明細書に記載された抗体は親和性精製剤（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）として使われ得る。このような工程で、前記の抗体は当分野で良く知られた方法を使ってセファデックス樹脂（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ｒｅｓｉｎ）またはフィルタ紙のような固体上に固定される。固定された抗体は精製されるｃｙｓＬＴを含有して試料と接触した後、支持体は固定された抗体に結合されたｃｙｓ−ＬＴを除いた試料内のすべての物質を実質的に除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、前記支持体は前記抗体でｃｙｓＬＴを放出する、例えば、ｐＨ３〜ｐＨ５．０のグリシンバッファーのようなさらに他の適切な溶媒で洗浄される。
【０１４８】
また、抗−ｃｙｓＬＴ抗体はｃｙｓＬＴに対する診断分析（例えば、特定の細胞、組織、または体液でｃｙｓＬＴの発現を探知する）に有用であり得る。このような診断方法診断、具体的には、初期診断（例えば、気道疾病または気道疾患）に有用であり得る。
【０１４９】
診断で使用のために、前記抗体は探知可能なモイエティで標識サレウル。一般的に下記の種類でグループ化される数多くの標識が利用可能だ：
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉのようなラジオアイソトープ。前記の抗体は、次の文献で説明された技術を使ってラジオアイソトープで標識できる：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２、Ｃｏｌｉｇｅｎなど（編集者）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州、ニューヨーク所在、１９９１年公開。例えば、放射能は閃光カウンティング（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を使って測定され得る。
（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート（ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｃｈｅｌａｔｅｓ））またはプルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）およびこれの誘導体、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）およびこれの誘導体、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄのような蛍光性標識が利用可能である。前記蛍光性標識は次の文献で知られている技術を使って前記抗体に接合され得る：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前述される）、例えば。蛍光発光は蛍光測定機を使って数量化され得る。
（ｃ）多様な酵素−基材標識が利用可能で、アメリカ特許第４、２７５、１４９号はこれらのうちの一部をレビューする。前記酵素は一般的に多様な技法を使って測定され得る発色する記載の化学的変化を促進する。例えば、前記酵素は分光光度法によって測定され得る記載での色変化を促進する。また、前記酵素は記載の蛍光発光または化学発光を変更する。蛍光発光の変化を数値化する技術は前述される。前記化学発光性記載は化学的反応によって電子的に活性化した後、測定され得る（例えば、化学発光分析器（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）により）光を放出するか蛍光性受容器でエネルギーを提供する。酵素標識の例はルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ）（例えば、ファイアフライルシファーレイズ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）およびルシフェラーゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（アメリカ特許第４、７３７、４５６号））、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、２、３−ジヒドロフタルアジネジオン（２、３−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、マレートジヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、ホースラディッシュペロキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰＯ）のようなペロキシダーゼ、アルカラインフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）、ライソザイム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、サッカライドオキシダーゼ（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｘｉｄａｓｅｓ、例えば、グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ガラクトースオキシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、およびグルコース−６−ホスフェートジヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））、（ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）およびキサンチンオキシダーゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）のような）ヘテロサイクリックオキシダーゼ（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃｏｘｉｄａｓｅｓ）、ラクトペロキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、マイクロペロキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などを含む。抗体に酵素を接合する技術が次の論文に説明される：Ｏ´Ｓｕｌｌｉｖａｎなど、１９８１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（編集者）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク所在、７３：１４７−１６６。
【０１５０】
酵素−基材調合物の例は、例えば、次を含む：
（ｉ）基材としてハイドロジェンペロキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を有するホースラディッシュペロキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰＯ）（前記ハイドロゲンペロキシダーゼは染料前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ｏｒｔｈｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ、ＯＰＤ）または３、３´、５、５´−テトラメチルベンジジンヒドロクロライド（３、３´、５、５´−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＭＢ））を酸化する）；
（ｉｉ）発色する基材としてパラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐａｒａ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を有するアルカラインフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）；および
（ｉｉｉ）発色する基材（例えば、ｐ−ニトロフェニル−‐−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光源性基材である４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）を有するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、ｂｅｔａ−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０１５１】
この他の数多くの酵素−基材調合物が当分野の技術者によって利用可能である。これに対する一般的な検討のためには次の文献を参照する：アメリカ特許第４、２７５、１４９号および第４、３１８、９８０号．
【０１５２】
時々、前記標識は前記抗体で間接的に接合される。当業者はこれを実現するための多様な技術を認知しているであろう。例えば、前記抗体はビオチンと接合され得、前述された３部類の標識すべてがアビダンまたはこれとは反対に接合され得る。ビオチンは選択的にアビダンに結合し、したがって、前記標識は間接的な方法で前記抗体と接合することができる。また、前記抗体と前記標識の直接的な接合をなすために、前記抗体は小さいハプテン（例えば、ジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ））と接合され、前述された異なる形態の標識の中の一つが抗−ハプテン抗体（例えば、抗−ジゴキシン抗体）と接合される。したがって、前記抗体と前記標識の間接的な接合が行われ得る。
【０１５３】
さらに他の具体例において、前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体は標識となることが要求されず、このとき、前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体は探知され得る。例えば、前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体に結合する表示された抗体が使われる。
【０１５４】
本明細書に記載された抗体は競合結合測定法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）、直接的で間接的なサンドイッチ測定法（ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙｓ）、および免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）のような良く知られた分析方法で使われ得る（Ｚｏｌａ、１９８７年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８面、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ）。
【０１５５】
競合結合測定法は限定された容量の抗体との結合のための試験試料分析物質と競争するための表示された標準（ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）の能力により異なる。試験試料内ｃｙｓＬＴの容量は、前記抗体に結合される標準の容量に反比例する。結合される標準の容量決定を促進するために、前記抗体に結合する標準および分析物質が未結合されたまま残留する標準および分析物質から便利に分離するように、前記抗体は一般的に競争前または競争後に溶解しない。
【０１５６】
サンドイッチ測定法の場合、二つの抗体を使用し、前記抗体はそれぞれ探知される蛋白質の異なる免疫原性の部分または抗原決定部に結合することができる。サンドイッチ測定法で、前記試験試料分析物質は固体支持体に固定された第１抗体によって結合され、以後第２抗体が前記分析物質に結合し、不溶性の三部分からなる複合体を形成する（参照、例えば、アメリカ特許第４、３７６、１１０号）。前記第２抗体それ自体が探知可能なモイエティで標識となるか（直接的なサンドイッチ測定法）、探知可能なモイエティで表示された抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチ測定法）。例えば、サンドイッチ測定法の一種類でＥＬＩＳＡ分析があって、前記ＥＬＩＳＡ分析で探知可能なモイエティは酵素である。
【０１５７】
免疫組織化学のために、血液試料または組織試料は新鮮な状態または冷凍状態や、例えば、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）に挟んで入れられるかホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）のような防腐剤で固定され得る。
【０１５８】
また、前記の抗体は体内診断分析のために使われ得る。一般的に、前記抗体は結合されたターゲット分子が免疫映像（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）を使って固定されるように（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓのような）放射性核種で表示される。
【０１５９】
Ｅ．診断キド
便利のために、本明細書に記載された抗体はＥＬＩＳＡキット（例えば、診断分析のための説明書とともに所定の容量で包装された試薬調合物）のようなキットで提供され得る。前記抗体が酵素で表示される時、前記キットは基材および酵素によって要求される共同因子を（例えば、探知可能な発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）または蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を提供する基材前駆体）含むであろう。また、安定剤、バッファー（例えば、ａブロックバッファー（ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒ）または溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ））などのような添加剤が含まれ得る。前記多様な試薬の相対的な容量は分析の敏感度を実質的に最適化する濃度で試薬の溶液に提供されるように多様化され得る。具体的には、前記試薬は融解時適切な濃度を有する試薬溶液を提供する添加剤を含んで乾燥粉末（普通冷凍乾燥される）として提供され得る。
【０１６０】
Ｆ．前記抗体の治療的利用
治療的適用のために、本明細書で説明される前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体（およびｃｙｓＬＴ−結合抗体フラグメント）は前述されたような薬学的に許容可能な投与形態で（一回分または一定期間の間の連続的な注入として人間静脈注射、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、脊椎腔内、鼻腔内、口腔、局所、眼球、目の周囲、ガラス体内、または吸入経路による投与を含む）哺乳動物、好ましくは人間に投与される。後者の場合、抗体は気道に（例えば、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）、粉末式吸入器、ａ呼吸作動式定量吸入器（ｂｒｅａｔｈ−ａｃｔｕａｔｅｄ  ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）、または噴霧器）を含むか含まない定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）を使うことによって）伝達され得る。
【０１６１】
疾病の予防および治療のために、前記抗体の適切な投与量は前述されたように治療される疾病の種類、疾病の深刻度および経過（前記抗体が予防または治療目的で投与される時）、以前の治療、前記抗体に対する患者の病歴および反応、および担当医師の裁量により相異なるであろう。前記抗体は適切に一回でまたは連続的な治療で患者に投与される。
【０１６２】
疾病の種類および深刻度にしたがって、一回以上の分離された投与または連続的な注入による場合で、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者に投与される最初の候補投与量である。典型的な一日または一週間投与量は、前述された因子により異ならせつつ、約１‐ｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であり得る。数日またはそれ以上の期間にわたった繰り返される投与のために、疾病症状の所望の抑制がなされる時まで、疾病により異ならせつつ、治療が繰り返される。しかし、この他の投与療法が有用であり得る。本治療の進行は、例えば、放射線写真を含む従来の技術および分析によって容易に観察される。体液または組織内ｃｙｓＬＴ数値を決めるために前記抗体を使う探知方法は治療抗体に対する患者の露出を最適化するために使われ得る。
【０１６３】
さらに他の具体例にしたがって、疾病を予防するか治療するにあたって前記抗体の効果は前記抗体を連続的にまたは本発明の目的のために癌治療用化学療法薬品または眼球疾病治療用薬品のような効果的なさらに他の薬剤と組み合わせて投与することによって向上することができる。この他の製剤は投与される組成物内に存在するか別途投与され得る。また、前記抗体は連続的にまたは他の薬剤または方式（例えば、癌治療のための化学療法用薬品または放射線照射）と組み合わせて適切に投与される。
【０１６４】
Ｇ．製造品
さらに他の具体例において、前述された疾患を治療するのに有用な物質を含有する製造品が提供される。前記製造品は容器および標識（ｌａｂｅｌ）を含む。適合した容器は、例えば、疾病、ガラス瓶、注射器、および試験管を含む。前記容器はガラスまたはプラスチックのような多様な材料で製造され得る。前記容器は前記疾病を治療するのに効果的な組成物を含有し、滅菌された接近ポート（ａｃｃｅｓｓ  ｐｏｒｔ、例えば、前記容器は静脈注射溶液バック、皮下注射針によって貫通することができる栓を有するガラス瓶、または点滴瓶（ｄｒｏｐｐｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）であり得る）を有することができる。前記組成物内の活性剤は前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体であり得る。前記容器の上のまたはこれと関連された標識は前記組成物が選択された疾患を治療するのに使われる可能性があることを示す。また、前記製造品は燐酸塩−緩衝された塩水、Ｒｉｎｇｅｒ´ｓ溶液、およびデキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）溶液のような薬学的に許容可能なバッファーを含む第２容器を含むことができる。また、前記製造品は商業的、使用者観点で好ましいその他の材料を（他のバッファー、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器、および使用説明書がある包装内容物を含む）含むことができる。気道投与の場合、噴霧器または吸入器のような装置が使われ、前記吸入器は液体または乾燥粉末薬品投与のために考案され得る。また、前記製造品はｃｙｓＬＴ（例えば、体液で）の探知のためのｃｙｓＬＴ抗体を利用するＥＬＩＳＡキットのようなキットであり得る。
【０１６５】
本発明のこの他の製品は適切な容器（例えば、表示されたガラス瓶またはアンプル（ａｍｐｕｌｅ））内に（好ましくは前記組成物の使用のための説明書（例えば、薬剤製品包装内容物）を含む容器内に包装される）本発明の薬学的組成物を含有するキットを含む。
【０１６６】
本発明は下記の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるもので、下記の実施例は単に本発明を実施するにあたって現在の最高の方法を説明するためである。本発明の範囲はこれら実施例に制限されるものではない。
【０１６７】
実施例
【０１６８】
実施例１：免疫原（ＬＴＥ４−蛋白質複合体）の合成
免疫原として使用するためのＬＴＥ４−蛋白質複合体は、ビス（スルホスクシンイミジル）−スベレート（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）−ｓｕｂｅｒａｔｅ）およびホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）アミン−対−アミン架橋剤を使用して、ＬＴＥ４のヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）に位置するアミンによってＬＴＥ４を蛋白質運搬体に架橋結合することによって製造される。０．２２ｍｇのシステイニルロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：２０４１０）は、室温で２時間９０％ＰＢＳ／１０％ＤＭＳＯで２．５ｍｇのＩｍｊｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＣＰ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：７７１３０）および２．９ｍｇのビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：２１５８０）と培養された後、Ｉｍｊｅｃｔ精製バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、部品番号：７７１５９）で平衡化された脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、部品番号：８９８８２）を使用して蛋白質−脂質コンジュゲート精製された。
【０１６９】
実施例２：抗体生産
９匹の６〜８週齢の雌性スイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）実験ネズミは、完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）で乳化された免疫原（ＬＴＥ４およびＢＣＰのＢＳ３促進されたコンジュゲート）０．０２５ｍｇ（合計０．０５ｍｇ）の２回の皮下注射によって免疫化された。２１日後に、実験ネズミは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）内に乳化された０．０５ｍｇの免疫原で１回腹腔内（ＩＰ）注射された。その後、前記実験ネズミは、追加的な８週の期間の間に毎週１回ＩＦＡに乳化された０．０５ｍｇの免疫原でＩＰ注射された。２回目、３回目、５回目、９回目注射後に、血清試料を採血し、抗−ＬＴＥ４抗体の存在を確認するために、後述するように。直接的なＥＬＩＳＡによってスクリーンされた（図１）。その後、ハイブリードマを生産するために、ｔｈｅ  ＣｌｏｎａＣｅｌｌ(R)−ＨＹハイブリードマクローニングキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：０３８００）を使用しつつ、高い抗体力価を示す実験ネズミの脾臓を使用した。ハイブリードマが密集して増殖される次第に、ＥＬＩＳＡ分析のために細胞上澄み液を回収した（図２）。
【０１７０】
実施例３：ＥＬＩＳＡスクリーニング
血清および細胞上澄み液は、直接的なＥＬＩＳＡを使用してＬＴＥ４−特定した結合特性を有する抗体に対しスクリーンされた。ＬＴＥ４に架橋結合された牛血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：７７１１０）よりなる抗原−特異的な蛋白質−脂質コンジュゲートおよびオレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ（ＯＡ）、Ｓｉｇｍａ、製品番号：０７８０５）に架橋結合されたＢＳＡよりなる抗原−非特異的蛋白質−脂質コンジュゲートが製造され、前記二つのコンジュゲートすべてでリンカーとしてｂｉｓ（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール）（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｅｎｔａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））（ＢＳＰＥＧ５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：２１５８１）が使用された。対象試料を０．０１５ｕｇの前記抗原−特異的コンジュゲートまたは抗原−非特異的コンジュゲートでコーティングされた３８４ウェル（ｗｅｌｌ）の高結合能培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、製品番号：７８１０６１）の隣り合うウェルに適用し、１時間培養し、ＰＢＳで洗浄した。結合されたＩｇＧは、ヤギ抗−マウスＩｇＧ１−特定したＨＲＰ−接合された抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品番号：１０３０−０５）を使用して探知し、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号：ＳＢ０２）で現像した。比色分析の読み取りは、培養皿読み取り機上でＡ４５０（４５０ｎｍの波長で吸収）で行われ、Ａ４５０より高い波長は、血清または上澄み液試料上にさらに多くの抗体があることを示す。ＬＴＥ４−コーティングされたウェル（抗原−特異的）で高い信号を示し、ＯＡ−コーティングされたウェル（非特異的）では、背景信号より高い信号を示さない試料は、抗原−特異的結合特性に対して陽性として判断された（表１）。理解され得るように、免疫原に使用されるものとは完全に異なる（リンカーおよび蛋白質すべてが異なる）コンジュゲートの一部であるＬＴＥ４を使用するスクリーニングは、前記脂質自体よりはかえって前記免疫原のリンカーまたは蛋白質に結合する抗体に帰結され得る偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を除去する。
【０１７１】
【表１】
2016537406.tif 000006
【０１７２】
３回の融合後に、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、アイダホ州、ボイシ所在）を使用して、５個のハイブリードマ（９Ｂ１２、１０Ｇ４、２Ｆ９、２Ｇ９、１４Ｈ３）由来の上澄み液は、すべての三つのｃｙｓＬＴ（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４）に対して高い親和性結合を示すことが確認され（表２）、前記上澄み液に対する２回の限界希釈クローニング（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）が行われた（ウェル当たり０．三つの細胞）。各限界希釈クローニング段階で、６〜８個のサブクローンは、ＥＬＩＳＡ分析された。すべてのサブクローンは、抗−ｃｙｓＬＴ抗体の生産に対して陽性であると確認された。前記すべての抗体は、ＩｇＧ１カッパ同種型として確認された。このような抗体に対する解離定数は、表２に示す。
【０１７３】
【表２】
2016537406.tif 000007
【０１７４】
実施例４：抗体特異性
ｃｙｓＬＴ（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４）だけでなく、ＬＴＢ４、１４、１５−ＬＴＥ４および５Ｓ−ＨＥＴＥの抗原団に対する単クローン抗体である９Ｂ１２および１０Ｇ４の結合特異性が分析された。要約すれば、３８４−ウェルの高結合能マイクロリットル培養皿を炭酸塩バッファー（ｐＨ  ９．５）を使用して１ｕｇ／ｍＬの最終濃度で希釈された１５ｕＬのＬＴＥ４−ＰＥＧ５−ＢＳＡコンジュゲート（直接的なＥＬＩＳＡで使用されたものと同じコンジュゲート）でコーティングした。３７℃で１時間前記培養皿を培養した後に、前記培養皿の各ウェルは、ＰＢＳで４回洗浄され、１％ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、製品番号：１２６５７５）および０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５０ｕＬのＰＢＳを添加することによってブロック（ｂｌｏｃｋ）され、室温で１時間培養された。培養する間に、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ内に５０ｎｇ／ｍＬの９Ｂ１２または１０Ｇ４を含む溶液が準備され、次のような天然そのままのロイコトリエン脂質の３０マイクロモル溶液を滴定するために（３倍の連続的な希釈）使用した：ＬＴＢ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：２０１１０）、ＬＴＣ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：２０２１０）、ＬＴＤ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：２０３１０）、ＬＴＥ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：２０４１０）、１４、１５−ＬＴＥ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：１００１１３６２）、および５Ｓ−ＨＥＴＥ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号：３４２３０）。前記ブロッキング溶液を除去し、前記培養皿をＰＢＳで４回洗浄した後に、１５ｕＬの滴定試料をマイクロリットル培養皿の重複した２個のウェルで点滴し（ｐｉｐｅｔｔｅ）、室温で３時間培養した。培養後に、前記抗体−脂質試料を除去し、前記培養皿をＰＢＳで４回洗浄した。前記固定されたコンジュゲートに固定されたまま残っているＩｇＧは、ヤギ抗−マウスＩｇＧ１−特定のＨＲＰ−接合された抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品番号：１０３０−０５）を使用して探知し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号：ＳＢ０２）で現像し、Ａ４５０で読み取った。このような競争的ＥＬＩＳＡの結果は、図３に示す。
【０１７５】
図３ａは、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４には結合するが、ＬＴＢ４、１４、１５−ＬＴＥ４または５Ｓ−ＨＥＴＥには結合しない９Ｂ１２抗体を示す。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４と関連して、前記三つの抗原は、前記抗体によって非常に類似に結合される（各々１５％、６５％、および１００％）。図３ｂは、１０Ｇ４抗体またＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４に結合するが（各々、１００％、２９％、および４％）、ＬＴＢ４、１４、１５−ＬＴＥ４または５Ｓ−ＨＥＴＥには結合しないことを示す。２Ｆ９、２Ｇ９、および１４Ｈ３抗体は、同じ方式でテストされ、三つの抗体がすべてＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４と結合したが、次のような異なる特異性様相を有する：２Ｆ９：ＬＴＥ４結合＞ＬＴＤ４結合＞ＬＴＣ４結合（１００％／１８％／６％）；２Ｇ９：ＬＴＥ４結合＞ＬＴＤ４結合＞ＬＴＣ４結合（１００％／３７％／２１％）；１４Ｈ３：ＬＴＥ４結合＞ＬＴＤ４結合＞ＬＴＣ４結合（１００％／６８％／４２％）］。２Ｆ９、２Ｇ９または１４Ｈ３のいずれもＬＴＢ４、１４、１５−ＬＴＥ４または５Ｓ−ＨＥＴＥと結合しなかった。
本実施例から、ｃｙｓＬＴ単一クローン抗体は、一つのｃｙｓＬＴまたは二つのｃｙｓＬＴに対して優先的に結合するか、三つのｃｙｓＬＴすべてに対して良好に結合するように開発されたことを確認できる。ＬＴＥ４またはＬＴＣ４（各々２Ｆ９または１０Ｇ４のような）に優先的に結合する抗体が一部の例で好ましいことがある；このように、他の例では、汎−ｃｙｓＬＴ抗体が好ましいことがある。さらに他の例で、二つのｃｙｓＬＴ（例えば、９Ｂ１２抗体）に対して優先的に結合する抗体が好ましいことがある。このような選好度は、例えば、治療される疾患または疾患、または探知目的で使用されるとき、一つのｃｙｓＬＴ、二つのｃｙｓＬＴ、または三つのｃｙｓＬＴすべてが探知されるかによって相異に適用され得る。
【０１７６】
実施例５：抗体アミノ酸序列
ネズミ科ｍＡｂｓのクローニング：
抗−ｃｙｓＬＴハイブリードマ細胞株である９Ｂ１２：３Ｈ１０および１０Ｇ４：１Ｇ２各々から由来したクローンは、まず、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅで培養された後、Ｇｉｂｃｏ  ＦＢＳおよびＣｅｌｌｇｒｏ補充物（ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ、メサチュセツ洲、トクスベリ所在）に移されて培養された。無血清条件のために、クローンは、Ｃｅｌｌｇｒｏ補充物（ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない）を含むＳＦＭ４ＭＡｂ−ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈｙｃｌｏｎｅ、メサチュセツ洲、ウォルサム所在）に培養された。全体ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ペンシルバニア州、ベツレヘム所在）を基盤とする手続を使用してハイブリードマ細胞５Ｅ６から分離された。ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ（２５）磁性ビーズ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（２５）  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、メサチュセツ州、イプスウィッチ所在）を使用して全体ＲＮＡから分離された。前記ｍＲＮＡは、５’ＲＡＣＥクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）のための製造社のプロトコルにより、第１ｃＤＮＡストランドで生産された後、ＴｄＴテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）およびＰＣＲ増幅するのに使用された。
【０１７７】
ハイブリードマサブクローンは、イソストリップ（ｉｓｏｓｔｒｉｐｓ、Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス所在）で培養液上澄み液をテストすることによって、マウスＩｇＧ１ｋ同種型であると認められた。免疫グロブリン重鎖可変領域（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、ＶＨ）ｃＤＮＡは、同種型特異的なプライマー［ＲＡＣＥＭＯＧ１：５’−ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡ−３’（序列番号１）］を使用して生産された。ＴｄＴ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡは、ネストされた（ｎｅｓｔｅｄ）３’プライマー［ＭＯＣＧ１：５’−ＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣ−３’（序列番号３）］と一緒に、５’アンカー（ａｎｃｈｏｒ）プライマー［ＡＡＰ：５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’（序列番号２）］を使用してＰＣＲによって増幅された。反応産物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して精製され、逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー［ＣＨＩｇ−ｒｅｖ：５’−ＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡ  −３’（序列番号４）］を使用して序列分析された。その後、重鎖の可変ドメインを増幅し、ｐＦＵＳＥ−１０Ｇ４−ｍＧ１およびｐＦＵＳＥ−９Ｂ１２−ｍＧ１を生産するために、Ａｇｅ  ＩおよびＡｆｅ  Ｉ断片として挿入され、ｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターを含むｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｍＧ１発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ所在）およびガンマー−１不変部に連結された。
【０１７８】
同様に、免疫グロブリンカッパ鎖可変領域  （ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、ＶＫ）は、同種型特異的なプライマー［ＲＡＣＥＭＯＣＫ  ５’−  ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ−３’（序列番号５）］を使用して増幅された。ＴｄＴ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡは、ＶＨと同じ５’アンカープライマーとともにカッパ鎖ネストされた３’プライマー［ＣＫＭＯ：５’−ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧ−３’（序列番号６）］を使用してＰＣＲで増幅された。反応産物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して精製され、逆方向プライマー［ＣＬＩｇ−ｒｅｖ：５’−ＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡ−３’（序列番号７）］を使用して序列分析された。その後、軽鎖の可変ドメインが増幅され、ｐＦＵＳＥ２−１０Ｇ４−ｍＫおよびｐＦＵＳＥ−９Ｂ１２−ｍＫを生産するために、Ａｇｅ  ＩおよびＢｓｔＡＰ  Ｉ断片として挿入され、ｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターを含むｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｍＫ発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびカッパ不変部内に連結された。このような挿入をＲｅｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ所在）により序列分析された。
【０１７９】
９Ｂ１２、１０Ｇ４、２Ｆ９、２Ｇ９および１４Ｈ３抗体の推測されたＣＤＲアミノ酸序列は、表３〜表７に示した。このような抗体の可変ドメイン序列は、表８〜表１２に示した。可変ドメイン自体の一部ではないが、可変ドメイン序列（例えば、ベクター内の可変ドメイン序列）を取り囲むものと確認され得るカット位置（ｃｕｔ  ｓｉｔｅ）のようなリーダー（ｌｅａｄｅｒｓ）およびその他序列は示さなかった。２Ｆ９および２Ｇ９抗体は、同じ重鎖序列を共有することを注目すべきである。
【０１８０】
【表３】
2016537406.tif 000008
＊Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．である、カリフォルニア州、サンディエゴ所在）ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより定義されたＣＤＲＨ１序列は、１０個のアミノ酸序列で示される（前記ＣＤＲＨ１序列は、Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎによる、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／で確認される、ＣＤＲを同定する方法によるものと一致する）。太い字体で示した前記序列のうち５個のアミノ酸の部分（ＤＹＹＩＨ；序列番号１４）は、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲＨ１序列である。前記序列のうち下線を引いた７個のアミノ酸の部分（ＧＹＴＦＴＤＹ；序列番号１５）は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲＨ１序列である。
【０１８１】
【表４】
2016537406.tif 000009
＊Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭにより定義されたＣＤＲＨ１序列は、１１個のアミノ酸序列で示される。前記序列の太い字体で示された６個のアミノ酸の部分（ＳＳＹＳＷＮ；序列番号２２）は、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲＨ１序列である。前記序列の下線を引いた８個のアミノ酸の部分（ＧＹＳＩＴＳＳＹ；序列番号２３）は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲＨ１序列である。
【０１８２】
【表５】
2016537406.tif 000010
【０１８３】
【表６】
2016537406.tif 000011
【０１８４】
【表７】
2016537406.tif 000012
【０１８５】
前記５個の単一クローン抗体のＣＤＲ序列を比較することによって、ＬＴＥ４に対して優先的に結合する４個の抗体、具体的に２Ｆ９、２Ｇ９および１４Ｈ３は、これらのＣＤＲの各々で有意的な序列同一性を共有するが、ＬＴＣ４に優先的に結合する１０Ｇ４抗体のＣＤＲは、あまり類似していないことが確認され得る。これは、下記の表８に示され、下記の表８で、前記５個の抗体の６個のＣＤＲ序列の各々を比較した（参照として２Ｇ９序列を使用する）。
【０１８６】
【表８−１】
2016537406.tif 000013
【表８−２】
2016537406.tif 000014
【表８−３】
2016537406.tif 000015
【０１８７】
また、表８は、１０Ｇ４抗体由来であることを排除しつつ、各ＣＤＲに対する共通序列を示し、９Ｂ１２、２Ｆ９、２Ｇ９、１４Ｈ３抗体由来の各ＣＤＲのアミノ酸序列間の同じ序列の位置を示す（＊＝前記抗体の間に異なるアミノ酸の位置である）。また、表８で、２Ｆ９、２Ｇ９および１４Ｈ３抗体のＣＤＲが少なくとも７６％（７６％〜１００％）序列同一性を示すことによって、特に類似していることを確認できる。
【０１８８】
【表９】
2016537406.tif 000016
【０１８９】
【表１０】
2016537406.tif 000017
【０１９０】
【表１１】
2016537406.tif 000018
【０１９１】
【表１２】
2016537406.tif 000019
【０１９２】
【表１３】
2016537406.tif 000020
【０１９３】
実施例６：血管透過性に対する抗−ｃｙｓＬＴ抗体の効果
気道（具体的に気管（ｔｒａｃｈｅａ）および気管支（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ））炎症は、喘息の特徴である。気管支の壁で炎症細胞浸潤の他に、気道内の脈管構造と関連した構造的で且つ機能的な変化が発生する。これは、気道の壁内での血管の増殖（血管形成）、増加した血流、増加した微細血管透過性、および浮腫形成を含む。このような血管の変化は、空気流れの制限および気管支過敏反応性を含む喘息深刻度と関連しているため、臨床的に重要である（ＨｏｒｖａｔｈおよびＷａｎｎｅｒ、２００６年、Ｅｕｒ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｊ．  ２７：１７２−１８７）。前記ｃｙｓＬＴ各々は、血管透過性を増大するものと知られている（Ｌｅｅなど、２００９年、Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２４：４１７−４２１）。
【０１９４】
血管透過性は、標準方法を使用しつつ予備研究で評価された。要約すれば、実験ネズミは、４℃で一晩一緒に前培養されたＬＴＣ４および抗体（ＬＴ１０１７同種型対照群または抗−ｃｙｓＬＴ抗体（９Ｂ１２または１０Ｇ４）各々の１．５  ｎａｎｏｍｏｌｅの腹腔内の注射前にエバンスブルー（Ｅｖａｎ´ｓ  ｂｌｕｅ）染料で静脈注射された。１５分後、実験ネズミは麻酔され、腹膜洗浄液を収得した。４００×ｇで１０分間遠心分離後に、前記ブルー染料が前記脈管構造からどの程度管外に流れ出たかを確認するために、分光光度計を使用して洗浄液上澄み液のＯＤ６１０を読み取った。図４に示されたように、実験動物が賦形剤単独（１％  ＤＭＳＯ）でｉ．ｐ．注射されるとき、腹膜腔内への染料漏出はなかった。ＬＴＣ４が関連ない対照群抗体とともに注射されるとき、明白な染料漏出があった。反対に、ＬＴＣ４が抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体とともに注射されるとき、染料漏出は最小であり、これは、本研究で前記の抗−ｃｙｓ抗体が血管透過性に対するＬＴＣ４の効果を中和したことを示す。このような予備実験で、抗−ｃｙｓＬＴ  ９Ｂ１２抗体による結果は不明確であった。９Ｂ１２抗体は、１０Ｇ４抗体よりＬＴＣ４に対してさらに低い親和力を有することを注目しなければならない。
【０１９５】
実施例７：卵アルブミンによって誘導された急性喘息で抗−ｃｙｓＬＴ抗体の効果
Ｗｕなど（２００３年、Ｃｌｉｎ．＆Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３３：３５９−３６６）により説明されたように、９Ｂ１２および１０Ｇ４抗体は、急性喘息動物モデルでテストされた。
【０１９６】
６週齢〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ実験ネズミは、三つの治療群に分離された。食塩水および抗体グループは、０、７および１４日頃に５０μｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス所在）および１００μＬのミョウバン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイス州、ロクポド所在）で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって免疫化された。２１日目に、前記マウスは、１０×１８×２５ｃｍのサイズのポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）チャンバーに移動され、３０分間ＯＶＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）噴霧溶液で１回処置された。陰性対照群の場合、０日および７日目にミョウバンと共にＯＶＡを注射し、１４日目に食塩水を注射し、２１日目に噴霧された食塩水で処置された。
【０１９７】
投薬量−反応を決定するために、多様な投薬量の抗体または食塩水を尾静脈内に１９日から２３日目から毎日注射し、動物は、ＯＶＡ処置７２時間後に犠牲された。このような動物に対して、気管支肺胞洗浄液白血球百分率算定（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ（ＢＡＬ）  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）および肺組織分析が行われた。
本研究の残りの部分のために、動物に１９日から２１日目から静脈注射で（ｉ．ｖ．）抗体または食塩水を投与した。ＯＶＡ処置２４時間後に、前記実験ネズミは、０．２ｍＬのペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射によって犠牲された。これらの肺は、１．２ｍＬの食塩水を使用して気管支を介して洗浄された。少なくとも２００個の細胞の白血球百分率算定が行われた。
【０１９８】
ｃｙｓＬＴに対する抗体は、ＯＶＡ処置後にＢＡＬ液体内の炎症細胞数を減少させることが期待される。
【０１９９】
実施例８：卵アルブミンによって誘導された慢性的な喘息で抗−ｃｙｓＬＴ抗体の効果
慢性的な動物モデルで喘息抗体９Ｂ１２および１０Ｇ４抗体をテストする（Ｔｅｍｅｌｋｏｖｓｋｉなど、１９９８年、Ｔｈｏｒａｘ  ５３：８４９−８５６）。
【０２００】
感作化：８〜１０週齢の病原菌がない雌性ＢＡＬＢ／ｃ実験ネズミを吸入露出２１日前に全身に対する免疫措置なしに卵アルブミンに対する吸入露出によって感作化されるか、１０μｇのミョウバン沈殿された卵アルブミンを（Ｖ等級、純度：＞９８％、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス所在）腹腔内注射し、吸入露出７日前に補強注射することによって感作化する（「補強された」実験ネズミ）。
【０２０１】
吸入露出：実験ネズミは、普通２週間隔で反応を評価しつつ、最大８週間毎週３日間噴霧される卵アルブミンで露出する。実験群は、各時点で６匹の実験ネズミを含む。露出は、全身吸入露出システムで行われる（Ｕｎｉｆａｂ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州、カラマジュ所在）。前記露出中に動物は、ワイヤ貫流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ケージ棚に収容され、濾過された空気は、２５０Ｌ／ｍｉｎの流速で０．５ｍ３吸入チャンバーを介して流入される。温度および相対湿度は、各々２０〜２５℃および４０〜６０％に維持される。生理食塩水内の２．５％卵アルブミン溶液は、側流ジェット噴霧器（ｓｉｄｅ  ｓｔｒｅａｍ  ｊｅｔ  ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）で圧縮された空気を伝達することによって噴霧化され、チャンバーに注入される前に気流で注入される。
【０２０２】
治療：ｃｙｓＬＴに対する静脈注射で投与された抗体に対する気道反応性測定は、最後の吸入露出４８時間後に行う。繰り返される圧力下で酸素供給される麻酔された実験ネズミで多様な容量で静脈注射される抗体の累積した投与中に気道収縮を確認するために、気管支けいれん変換器（ｂｒｏｎｃｈｏｓｐａｓｍ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）［Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌ  ７０２０；Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｖａｒｅｓｅ、Ｉｔａｌｙ）］を使用する。各実験動物に対し、抗体治療によって誘発された呼吸氾濫容量（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｏｖｅｒｆｌｏｗ  ｖｏｌｕｍｅ）は、気管カニューレ（ｔｒａｃｈｅａｌ  ｃａｎｎｕｌａ）を閉塞することによって得られる最大氾濫の百分率として示す。治療群を比較するために、このような容量による反応データは、気道閉塞（肺抵抗性）において基線未満に減少を引き起こす濃度を計算するのに使用される。このような研究のための対照群は、アジュバント単独で模擬で免疫化された実験ネズミおよび補強された実験ネズミであり、前記二種類の実験ネズミは、いずれも、噴霧される生理食塩水に露出される。
【０２０３】
実施例９：ＡＥＲＤで抗−ｃｙｓＬＴ抗体の効果
ＰＧＥ２シンターゼ−１−欠乏実験ネズミ（Ｕｅｍａｔｓｕなど、２００２年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：５８１１−５８１６）は、好酸球性肺炎症動物モデルでの明確なＡＥＲＤ−類似表現型で発達する。イエダニ種類であるコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａ、Ｄｆ）の抽出物が鼻腔内（（ｉ．ｎ．）に投与されたｍＰＧＥＳ−１（ｐｔｇｅｓ−／−実験ネズミ）欠乏実験ネズミは、野生型対照群動物と比較して、明確な好酸球性気管支血管炎症を示す（Ｌｉｕ、２０１２年）。Ｄｆで処置されたｐｔｇｅｓ−／−実験ネズミは、ｃｙｓＬＴ生産およびｃｙｓＬＴによる空気流れ閉鎖およびアスピリンに対する反応で肺肥満細胞活性を示す（Ｌｉｕ、２０１３年）。肺抵抗性は、外科的肺機能制御器（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ、Ｂｕｘｃｏ社、ノースカロライナ州、ウィルミントン所在）を使用して評価する。要約すれば、実験ネズミの気管切除手術を行い、酸素を供給する。肺抵抗性が安定した基線に到達するようにした後に、Ｄｆまたは食塩水の最後投与２４時間後に、噴霧器を使用してＬｙｓ−アスピリン（Ｌｙｓ−ＡＳＡ）、１２μＬの１００ｍｇ／ｍＬ溶液、または希釈物単独を肺に伝達されるようにし、４５分間肺抵抗性を記録する。結果は、基線から肺抵抗性の百分率変化で示す。肺抵抗性は、ＷＴ実験ネズミおよび食塩水で処置されたｐｔｇｅｓ−／−対照群と比較するとき、Ｌｙｓ−ＡＳＡで実験されたＤｆで処置されたｐｔｇｅｓ−／−実験ネズミにおいて明確に増加する。このような増加は、ｃｙｓＬＴ（９Ｂ１２または１０Ｇ４）に対する抗体で処置された動物において減少するものと期待される。
【０２０４】
実施例１０：血管透過性で抗−ｃｙｓＬＴ抗体である２Ｇ９および１０Ｇ４および多様な投与方法の効果
血管の透過性は、実施例６のように、標準方法を使用しつつ予備研究で評価された。要約すれば、実験ネズミは、４℃で一晩一緒に前培養されたＬＴＣ４（Ｃａｙｍａｎ、製品番号：２０２１０）および抗体（ＬＴ１０１７同種型対照群または２Ｇ９抗−ｃｙｓＬＴ抗体各々の１．５  ｎａｎｏｍｏｌｅの腹腔内注射前にエバンスブルー（Ｅｖａｎ´ｓ  ｂｌｕｅ）染料で静脈注射された。１５分後、実験ネズミは、麻酔され、腹膜洗浄液を収得した。４００×ｇで１０分間遠心分離後に、前記ブルー染料が前記脈管構造からどの程度管外に流れ出たかを確認するために、分光光度計を使用して洗浄液上澄み液のＯＤ６１０を読み取った。図５に示されたように、実験動物が、１：１のＬＴＣ４：抗体のモル比で、食塩水単独でＩＰ注射されるとき、  腹膜腔内への染料漏出はなかった。ＬＴＣ４が関連ない対照群抗体（ＮＳ）とともに注射されるとき、明白な染料漏出があった。反対に、ＬＴＣ４が抗−ｃｙｓＬＴ抗体である２Ｇ９（１：１または１：５のＬＴＣ４：抗体）とともに注射されたとき、染料漏出は、ほぼ対照群（食塩水）数値に血管外への流出を低減する１：５混合物を使用して、容量依存的に減少する。これは、本研究で、前記の抗−ｃｙｓ抗体である２Ｇ９が血管透過性に対するＬＴＣ４の効果を中和したことを示す。星印は、非特異的陰性対照群（ＮＳ）抗体と比較するとき、統計的に有意的な差異を示す：ＮＳ（１：１）グループと統計的に異なる＊＊＊Ｐ＝０．０００２、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ダネットの複数比較試験（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）による一元変量分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【０２０５】
抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体に対する効果も、“予備投薬（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）”皮下（ＳＣ）実験で評価され、ＬＴＣ４（１．５  ｎａｎｏｍｏｌｅｓ、Ｉ．Ｐ）の投与２４時間前に前記実験で１０Ｇ４または非特異的対照群抗体であるＬＴ１０１７（ＮＳ）を実験ネズミに投与した（３０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ）。本研究は、１０Ｇ４  ＩＰグループをも含み、前記グループで３０  ｍｇ／ｋｇ投薬量（〜０．６ｍｇまたは〜４ｎａｎｏｍｏｌｅｓ）に対する相当する抗体容量が１．５  ｎａｎｏｍｏｌｅｓのＬＴＣ４とあらかじめ混合され、製造された混合物は、Ｉ．Ｐ．注射された。
【０２０６】
予備研究のように、食塩水単独の場合、染料漏出は引き起こされなかった。ＬＴＣ４投与が後続する非特異的対照群抗体（ＮＳ）の皮下投与は、染料漏出を引き起こした。反対に、ＬＴＣ４による漏出（血管透過性）は、抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体皮下注射で前処置された動物で有意的に減少した。このような結果は、図６に示される。星印は、非特異的陰性対照群（ＮＳ）抗体と比較して統計的に有意的な差異を示す：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ異なるｆｒｏｍ  ＮＳ（ＳＣ）グループ（ダネットの複数比較試験による一元変量分析）。
【０２０７】
本実施例は、抗−ｃｙｓＬＴ抗体が、投与経路とは関係なく、ＬＴＣ４によって誘導された血管透過性を抑制できたことを示す。また、このような血管透過性抑制は、ＬＴＣ４  ２４時間前に抗体が投与されたときにも観察された。
【０２０８】
実施例１１：実験ネズミで抗−ｃｙｓＬＴ  ｍＡｂの薬物動態学（ＰＫ）評価
１６匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃ実験ネズミは、（６〜８週齢）腹腔内（Ｉ．Ｐ．）または静脈注射（Ｉ．Ｖ．）により１回分の容量である３０ｍｇ／ｋｇの抗−ｃｙｓＬＴ抗体（９Ｂ１２、２Ｇ９または１０Ｇ４）で１回投与された。前記実験ネズミは、無作為的に４個のグループに分類された（各グループ毎に４匹が割り当てられる）。投薬した多様な時間帯で（１、３、６、９、２４、７２、１４４、１９２、３３６および５０４時間）、浅側頭静脈または心穿刺技術を使用して一つの実験ネズミ（Ｎ＝４）グループで採血した。血漿は、ＥＴＤＡを含有するチューブを使用してＣＡＰＩＪＥＣＴ毛細血管血液採血システム（Ｔｅｒｕｍｏ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ  ＮＪ、製品番号：Ｔ−ＭＱＫ）により分離された。
【０２０９】
分離された実験ネズミ血漿試料内の−ｃｙｓＬＴ抗体数値は、直接的な−結合ＥＬＩＳＡを使用して数値化した。要約すれば、血漿試料は、ブロッキングバッファー（１ＸＰＢＳ、１０  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して１：１００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００および１：１６０００で希釈し、各希釈物の１００ｕＬの部分標本をあらかじめ０．１ｕｇのＬＴＥ４−ＢＳＡコンジュゲートでコーティングされ、ブロッキングバッファーでブロックされた９６−ウェルＥＬＩＳＡ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ  ＮＣ、製品番号：６５５０６１）に２回繰り返して投与した。１時間培養した後に、培養皿を洗浄し、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム所在、製品番号：１０３０−０５）および３、３´、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基材（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ所在、製品番号：ＳＢ０２）を使用して前記培養皿に付着した抗−ｃｙｓＬＴ抗体を探知した。前記血漿試料での前記の抗−ｃｙｓＬＴ抗体濃度を決定するために、４５０ｎＭでの吸収を測定し、精製された抗体物質を使用して作られた標準曲線と比較した。前記の抗体濃度は、３相指数関数（３−ｐｈａｓｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用して投薬後に時間に対してグラフ化し、曲線適合化した（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔ）（図７及び図８）。図７に示されたように、静脈注射によって投与されたネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体である９Ｂ１２および１０Ｇ４の薬物動態学的プロフィールは、事実上、同一である。
【０２１０】
図８に示されたように、腹腔内に投与されたネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体である１０Ｇ４および２Ｇ９の薬物動態学的プロフィールは、事実上、同一である。ＩＶ（図７）およびＩＰ（図８）で投与された１０Ｇ４を比較してみれば、これらの薬物動態学プロフィールは、投与経路とは大きく関係がないことを示す。
【０２１１】
実施例１２：ネズミ科の１０Ｇ４抗体の人間化
ネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ単クローン抗体である１０Ｇ４の可変ドメインであるＶＨおよびＶＬは、一つ以上のｃｙｓＬＴに対して高い親和力、特異性、結合能を保有する抗体を生産するために、人間骨格領域（ＦＲ）内にネズミ科のＣＤＲを接合化されることによって人間化された（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１：３０７−１０；Ｍａｒｔｉｎ、Ａ．Ｃ．およびＪ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、１９９６年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９６、２６３：８００−１５；Ｍｏｒｅａ、Ｖ．、Ａ．Ｍ．ＬｅｓｋおよびＡ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０：２６７−７９；Ｆｏｏｔｅ、Ｊ．およびＧ．Ｗｉｎｔｅｒ、１９９２年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２４：４８７−９９；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．など、１９８５年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１８６：６５１−６３）．
【０２１２】
生命工学情報を提供する米国国立保健院（ＮＩＨ）の有料オンラインツール（ｔｏｏｌ）であるＩｇＢＬＡＳＴを使用して適合な受容子である人間骨格序列を選択した。人間免疫グロブリン重い可変形４−５９（接近番号第ＡＢ０１９４３８号）は、１０Ｇ４重鎖可変ドメインの人間化されたバージョンを人間骨格（ｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を基盤とするために人間骨格として選択され、ＪＨ６（接近番号第Ｊ００２５６）は、重鎖Ｊ領域のために使用された。前記重鎖のＣＤＲは、ネズミ科の抗体のＣＤＲであった。
【０２１３】
前記軽鎖と関連して、ＶＫＩ  Ｏ１２（接近番号第Ｘ５９３１５号）は、１０Ｇ４軽鎖可変ドメインの人間化バージョンを人間骨格を基盤とするために人間骨格として選択された。ＪＫ２（接近番号第Ｊ００２４２）は、Ｊ領域に使用された。ＣＤＲ序列は、ネズミ科の１０Ｇ４抗体のＣＤＲ序列であった。
【０２１４】
１０Ｇ４抗体の初めて人間化されたバージョンの序列は（先立って命名された人間骨格で１０Ｇ４接合されるＣＤＲ、復帰突然変異がない）、下記の表１３および表１４に示す。これは、１０Ｇ４人間化抗体鋳型と言及される。
【０２１５】
前記重鎖可変形（ＶＨ）鋳型のＤＮＡ序列およびアミノ酸序列（人間骨格内の１０Ｇ４重鎖ＣＤＲ）は、表１４に示す。ＣＤＲは、太い字体であり；前記可変ドメインを暗号化しない序列（すなわち、信号序列、繰り返されるドメイン序列）は、下線を引く。含まれた６〜２４のアミノ酸位置は、４〜５９の人間骨格リーダー（ｌｅａｄｅｒ）である：
【０２１６】
【表１４】
2016537406.tif 000021
前記の重鎖可変ドメインのアミノ酸序列のコーディング領域は、次の通りである：
2016537406.tif 000022
ＶＬ鋳型（人間骨格内の１０Ｇ４軽鎖ＣＤＲ）のＤＮＡ序列およびアミノ酸序列は、表１５に示す。ＣＤＲは、太い字体であり、前記可変ドメインをコーディングしない序列（すなわち、信号序列、繰り返されるドメイン序列）は、下線を引く。含まれる６〜２７のアミノ酸位置は、人間Ｏ１２骨格リーダー序列でる：
【表１５】
2016537406.tif 000023
【０２１７】
前記の軽鎖可変ドメインのアミノ酸序列のコーディング領域は、次の通りである：
2016537406.tif 000024
【０２１８】
前記の重鎖および軽鎖（全体の人間骨格内に接合されたネズミ科ＣＤＲ）を含む人間化抗体鋳型は、ヒト胎児腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ  Ｃｅｌｌｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：Ｒ７９０−０７、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：１２３３８−０１８）および細胞形質転換試薬である２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：１２３４７−０１９）を使用する）で全体長さの（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ＩｇＧ抗体として発現した。一時的な発現後に、上澄み液は回収され、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧを数値化した。活性は、直接的なＥＬＩＳＡによってテストされ、前記人間化鋳型（全体人間骨格でネズミ科ＣＤＲ）は、復帰突然変異の不在下に非活性のものと確認された。
【０２１９】
実施例１３：変異体の人間化１０Ｇ４−最適化の復帰突然変異
１０Ｇ４人間化軽鎖可変領域および重鎖領域の変異体連続物が連続的に生産された。生産された重鎖変異体は、表１６に示し、前記軽鎖変異体は、表１７に示す。多数の復帰突然変異の他の組合を有する変異体をも示した。ＣＤＲ変異を有する二つの変異体が製造されたことを注目すべきである：重鎖変異体である１０Ｇ４／４−５９．８は、単一復帰突然変異およびＣＤＲＨ１で変異（Ｓ３０ｂＧ）を有すれば、軽鎖変異体である１０Ｇ４／Ｏ１２．８は、四個の復帰突然変異だけでなく、二つのＣＤＲ変異（ＣＤＲＬ１でＥ２８ＳおよびＣＤＲＬ３でＳ９３Ｒ）を有する。
【０２２０】
【表１６−１】
2016537406.tif 000025
【表１６−２】
2016537406.tif 000026
【表１６−３】
2016537406.tif 000027
【０２２１】
【表１７−１】
2016537406.tif 000028
【表１７−２】
2016537406.tif 000029
【表１７−３】
2016537406.tif 000030
【０２２２】
前記表の変異体可変ドメインは、分離されたベクター内にクローニングされ、ＨＥＫ２９３ヒト胎児腎臓細胞株（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ  Ｃｅｌｌｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：Ｒ７９０−０７，ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：１２３３８−０１８）および細胞形質転換試薬である２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号：１２３４７−０１９）を使用する）内に多様な重鎖および軽鎖組合で一時的に形質導入された。一時的な形質発現後、上澄み液を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧを数値化した。（ＢＳＡで接合された）ＬＴＥ４に対する各変異体の結合活性は、最初に直接的なＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＥＬＩＳＡで結合を示す変異体は、ＫｉｎＥｘＡを使用して結合天然そのままのｃｙＬＴに対して結合測定された。
【０２２３】
テストされた重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の組合は、下記の表１８に示す。各可変ドメインの骨格（ＦＷ）内の復帰突然変異の数を示す。
【０２２４】
【表１８−１】
2016537406.tif 000031
【表１８−２】
2016537406.tif 000032
【表１８−３】
2016537406.tif 000033
【表１８−４】
2016537406.tif 000034
【０２２５】
初めに、復帰突然変異（完全な人間骨格）がない人間化可変ドメインまたは多数の復帰突然変異を有するＬＴＥ４人間化可変ドメインを含む抗体を使用して、「すべてまたはなし」スクリーニング（表１８でセット１）を行い、ＬＴＥ４との結合能をテストした。図９は、セット１の人間化１０Ｇ４変異体に対する直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡデータを示するもので、軽鎖可変領域であるＯ１２．５または重鎖可変領域である４−５９．６に復帰突然変異がないか、二つの鎖に複数個の復帰突然変異を（軽鎖可変領域であるＯ１２．０および重鎖可変領域である４−５９．０）を有するか、または、一つの鎖は、復帰突然変異がなく、一つの鎖は、多数の復帰突然変異を有する。復帰突然変異（Ｏ１２．０）を含まない変異体軽鎖を有する抗体は、重鎖とは関係なく、不活性であることを確認でき、したがって、前記人間軽鎖骨格内の一つ以上の復帰突然変異は、活性のために必要なものと考えられる。しかし、人間化抗体の重鎖が復帰突然変異（５−５９．０、青色ライン）を含まない人間化抗体は、依然として軽鎖骨格変異なしに抗原に結合できた。
【０２２６】
セット２（表１８）の人間化された変異体も、直接的なＥＬＩＳＡによってＬＴＥ４結合に対してテストされた。可変ドメイン内に単一復帰突然変異を有する軽鎖人間化変異体各々は、完全な人間（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ、復帰突然変異なし）の重鎖人間化変異体４−５９．０とともに抗体内に注入された。比較のために、軽鎖可変ドメインであるＯ１２．５および重鎖可変ドメインである４−５９．０を有するセット１の抗体が含まれる。図１０に示されたように、前記すべての抗体は、ＬＴＥ４に対する多少の結合活性を示したが、軽鎖変異体Ｏ１２．２（単一復帰突然変異であるＰ４４Ｉ）を有する抗体は、最も弱い結合を示した。このような復帰突然変異は、２回目の実験の変異体では省略された（参照として、軽鎖変異体であるＯ１２．７は、このような変異が欠乏されているが、Ｏ１２．５に存在する他の三つの復帰突然変異を含む）。本実験のように、完全な人間の重鎖変異体である４−５９．０と組合わせられるとき、ＬＴＥ４結合に対して最も活性である抗体は、Ｏ１２．５およびＯ１２．１軽鎖を有する抗体であった。
【０２２７】
表１８のセット３の人間化された変異体は、ＬＴＥ４−ＢＳＡを使用して直接的なＥＬＩＳＡによってｃｙｓＬＴ結合に対してテストされた。単一復帰突然変異を有する人間化された１０Ｇ４軽鎖変異体可変ドメインは、４−５９．６重鎖可変ドメイン（６個の復帰突然変異）と共に発現した。また、Ｏ１２．５軽鎖（四個の復帰突然変異）は、４−５９．６重鎖と組み合わせて発現された。前記すべての抗体は、ＬＴＥ４に対する多少の結合活性を示したが、Ｐ４４Ｉ（Ｏ１２．２）位置に一つの軽鎖復帰突然変異を有する抗体は、また、最も弱い結合を示した。このような復帰突然変異は、２回目の実験の変異体で省略された（参照として、軽鎖変異体であるＯ１２．７は、このような変異が欠乏されているが、Ｏ１２．５に存在する他の三つの復帰突然変異を有する）。このスクリーンでＬＴＥ４結合に対して最も活性である抗体は、図１１に示されたように、また、Ｏ１２．５およびＯ１２．１軽鎖を有する抗体であった。
【０２２８】
その後、人間化１０Ｇ４抗体重鎖変異体である４−５９．１、４−５９．２、４−５９．３、４−５９．４および４−５９．５（これらは、各々一つの復帰突然変異を有し、４−５９．３は、隣接する一対の変異を有する）は、軽鎖であるＯ１２．５（四個の復帰突然変異）とともに発現され、直接的なＬＴＥ４−結合ＥＬＩＳＡによってテストされた。図１２に示されたように、４−５９．３変異体重鎖（ＶＴ６７／６８ＩＳ復帰突然変異）を有する抗体は、どんな探知可能な結合を示さなく、重鎖変異体である４−５９．１、４−５９．２および４−５９．５を有する抗体は、高い結合活性を示し、４−５９．３重鎖を有する抗体は、ＬＴＥ４に対して中間の結合活性を示した。Ｏ１２．５軽鎖可変領域  および４−５９．６重鎖可変領域  （６個の復帰突然変異）を有する抗体は、優れたＬＴＥ４結合活性を示した。
【０２２９】
最後に、セット４（表１８）の人間化１０Ｇ４抗体変異体をテストし、前記人間化１０Ｇ４抗体変異体の重鎖変異体および軽鎖変異体は、各々一つの変異を有し（または重鎖４−５９．３の場合、一対の隣接する復帰突然変異を有する）、前記人間化１０Ｇ４抗体変異体は、多様な組合で一緒に発現され、生成された人間化ＬＴＥ４結合活性に対してＥＬＩＳＡによってテストされた。図１３は、Ｏ１２．１軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメイン（４−５９．１、４−５９．２、４−５９．３、４−５９．４または４−５９．５）を有する抗体のＬＴＥ４結合を示す。このような抗体のうち三つの抗体が（重鎖として４−５９．１、４−５９．２および４−５９．３を有する）ＬＴＥ４に対する高い結合活性を示した。残りの抗体は、普通の結合を示した。これは、Ｏ１２．１軽鎖を有する抗体が最も活性である傾向を示す前記の発見と一致する。
【０２３０】
図１４は、Ｏ１２．２軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のＬＴＥ４結合を示す。このような抗体で、単に一つの抗体（４−５９．４重鎖）が高い結合活性を有し、残りの抗体は、非常に低い結合を示した。図１５は、Ｏ１２．３軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のＬＴＥ４結合を示す。４−５９．２重鎖を有する前記抗体は、前記の抗体のうち最も優れた結合を示し、４−５９．５重鎖を有する抗体は、非常に低い結合を示し、残りの抗体は、普通の結合を示した。
【０２３１】
図１５は、Ｏ１２．４軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のＬＴＥ４結合を示す。４−５９．４重鎖を有する抗体は、優れた結合を示し、４−５９．１抗体は、普通の結合を示し、残りの抗体は、非常に低い結合を示した。
【０２３２】
実施例１４：ネズミ科ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体の追加的に最適化された人間化変異体
前記データを基礎にして、追加的な重鎖および軽鎖可変ドメイン変異体（前記表１５および表１６で示した序列）を下記の表１９で示した重鎖および軽鎖可変ドメインを使用して生産した。以前のスクリーニングで結合活性をほとんどまたは全く示さない復帰突然変異は、新しい変異体から省略された。下記の２回目の実験の変異体において軽鎖復帰突然変異であるＰ４４Ｉは省略した（新しい軽鎖変異体であるＯ１２．７は、このような変異が欠乏されているが、活性変異体であるＯ１２．５に存在する他の三つの復帰突然変異を有する）。重鎖復帰突然変異であるＶＴ６７および６８ＩＳも、下記の２回目の実験の変異で省略された（新しい重鎖変異体である４−５９．７は、このような変異が欠乏されているが、４−５９．６に存在する復帰突然変異であるＬ２０Ｖ、Ｐ４０Ｆ、Ｖ７１Ｒ、Ｒ９４Ｎを有する）。
【０２３３】
可変ドメイン序列を前記表１５および表１６に示し、以前の実施例で説明されたように、生産された変異を有するこのような追加的な序列変異を含む抗体の結合能力は、表２０で比較される。
【０２３４】
天然そのままのＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４に対する抗体の結合は、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ、アイダホ州、ボイシ所在）を使用して確認された。
【０２３５】
【表１９】
2016537406.tif 000035
【０２３６】
【表２０】
2016537406.tif 000036
【０２３７】
前記表で示したように、ＬＴ５０１３およびＬＴ５０１４抗体は、非常に活性であり、結合プロフィールで類似している。ＬＴ５０１３（Ｏ１２．７軽鎖、４−５９．６重鎖）は、合計９個の復帰突然変異を有し、ＬＴ５０１４（Ｏ１２．７軽鎖、４−５９．７重鎖）は、合計７個の復帰突然変異を有する。本研究のためにＬＴ５０１４を選択した。
【０２３８】
合計三つのＣＤＲ変異（ＣＤＲＨ１：ＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＮ、序列番号７４；ＣＤＲＬ１、ＲＡＳＱＳＩＳＧＹＬＧＷ、序列番号；７５；およびＣＤＲＬ３、ＬＱＹＡＲＦＰＲＴ、序列番号７６）および５個の骨格復帰突然変異を有するＬＴ５０１５抗体は、ＬＴ５０１０（復帰突然変異は同一であり、ＣＤＲ変異はない）と比較された。このような抗体は、直接的なＥＬＩＳＡで優れたｃｙｓＬＴ結合を示したが、ＬＴ５０１０と比較して天然そのままのｃｙｓＬＴに対して向上した結合活性を有するものと確認されなかった。
【０２３９】
実施例１５：炎症性腸疾患のネズミ科動物モデルでネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体である２Ｇ９および１０Ｇ４の活性
デキストラン硫酸ナトリウム（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）により誘導された大腸炎（ＤＳＳ−大腸炎）動物モデルは、炎症性腸疾患と関連して広く受容される動物モデルである［参照として、例えば、Ｄｅｇｕｃｈｉなど、２００６年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６：６９９−７０３］。ネズミ科ｃｙｓ−ＬＴ抗体である２Ｇ９および１０Ｇ４は、このような動物モデルで評価された。実験ネズミは、（１０／ｇｒｏｕｐ）研究の開始日である０日目から６日間１．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＤＳＳ）を含有する食水で提供され、その後、４日間きれいな水を供給した。抗体（ＰＢＳ内に３０ｍｇ／ｋｇ）は、本研究の０日目、３日目、および６日目に提供された。各動物の体重、便の硬さおよび便に少量で存在するか、目視で確認可能な血液の存在の有無を毎日観察した。これから、複合疾患活動指標（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ．  ＤＡＩ）点数を計算した。ＤＡＩが０であるとき、正常であり（体重減少なし、便に血液なし、正常な便の硬さ）、ＤＡＩ点数が最高値であるとき、四個の症状が存在する（＞１  ５％の体重減少、下痢、便に目視で観察される血液）。シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓ  ｐｏｒｉｎｅ  Ａ）は、陽性対照群として使用され、ＬＴ１０１４非特異的対照群抗体である。対照群実験ネズミは、ＤＳＳを適用されなかった。
【０２４０】
図１７に示されたように、予想されたように、対照群実験ネズミは、どんな疾患も有しなかった。賦形剤および非特異的抗体（ＬＴ１０１４）で処置されたグループは、最も高いＤＡＩを有し、抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体および陽性対照群シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）で処置された動物は、最も低いＤＡＩを有した。多重ｔ−テスト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔ−ｔｅｓｔｓ）を基盤として、１０Ｇ４  ｖｓ賦形剤に対する統計的有意度を示した（＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１）。
【０２４１】
実施例１６：アレルギー性喘息ネズミ科動物モデルでネズミ科の抗−ｃｙｓＬＴ抗体である９Ｂ１２および１０Ｇ４の活性
気道過敏反応性、肺炎症、および肺組織病理の改善と関連して、抗−ｃｙｓＬＴ抗体は、急性喘息ＯＶＡ動物モデル（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、中国、上海所在）で評価された。
試薬：卵アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）：Ｖ等級、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス所在。製品番号：Ａ５５０３；
イムジェクトミョウバン水酸化物溶液（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイス州、ロクポド所在、製品番号：７７１６１；ソジウムカルボキシメチルセルロース（Ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ、ＭＷ＝８００−１２００）、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ、中国、上海所在、製品番号：３００３６３６５；および
リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）：Ｄｙｃｅｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ＣＯ．、Ｌｔｄ．  製品番号：ＢＪ１４１．
【０２４２】
動物群：雌性ＢＡＬＢ／ｃ実験ネズミを体重により無作為的にグループ化し、一つのグループ当たり１０匹の実験ネズミを配当した：対照群（模擬で感作化される、ＰＢＳ賦形剤単独、ｉ．ｖ．）；モデル（ＰＢＳ賦形剤単独、ｉ．ｖ．）；０．１  ｍｇ／Ｍｌ濃度で０．５％ＣＭＣ−Ｎａ内のデキサメタゾン（ＳＰＧＣ  Ｓｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、経口投与される（陽性対照群）；ＰＢＳ内に９Ｂ１２（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）；ＰＢＳ内に１０Ｇ４群（３０  ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。対照群の実験ネズミをｉ．ｐ．注射によってただ１００μＬのＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）を投与した。他のすべてのグループの実験ネズミは、１日目および１４日目に感作化溶液（ＰＢＳに２０μｇの卵アルブミンおよび２ｍｇのミョウバンを含有する）を注射することによって（実験ネズミごとに０．１  ｍＬ、ｉ．ｐ．）敏感化された。
【０２４３】
ＯＶＡ処置：２８日目、２９日目、および３０日目に、実験ネズミ（対照群銀除く）は、大量投薬システム（ｍａｓｓ  ｄｏｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｕｘｃｏ／ＤＳＩ、Ｓｔ．  Ｐａｕｌ  ＭＮ）を使用して３０分間ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）（処置溶液）内の１％  ＯＶＡで処置された。対照群の実験ネズミは、ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）で処置した。
【０２４４】
投薬：
対照群：２７日目および２９日目（ＯＶＡ処置２時間前）、および３１日目（気道過敏反応性（ＡＨＲ）テスト２時間前）に静脈注射によって賦形剤を投与した。
実験動物群：２７日目および２９日目（ＯＶＡ処置２時間前）、および３１日目（気道過敏反応性（ＡＨＲ）テスト２時間前）に静脈注射によって賦形剤を投与した。
デキサメタゾン陽性対照群：０．５％ＣＭＣ−Ｎａ内に１．０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを２７、２８、２９、３０（各投薬日のＯＶＡ処置の２時間前）および３１日目に一日に一度経口投与した。
ＬＴ１０１７：非特異的抗体対照群は２７および２９日目（ＯＶＡ処置２時間前）、および３１日目（気道過敏反応性（ＡＨＲ）テスト２時間前）に静脈注射で投与した。
９Ｂ１２抗体：抗体は、２７および２９日目（ＯＶＡ処置２時間前）、および３１日目（気道過敏反応性（ＡＨＲ）テスト２時間前）に静脈注射で投与した。
１０Ｇ４抗体：抗体は２７および２９日目（ＯＶＡ処置２時間前）、および３１日目（気道過敏反応性（ＡＨＲ）テスト２時間前）に静脈注射で投与した。
【０２４５】
気道過敏反応性：３１日目に（最後の処置２４時間後に）、基線に比較して「エンハンスドポーズ」または“Ｐｅｎｈ”で測定された気道過敏反応性は、全体体重プレチスモグラフ（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ、Ｂｕｘｃｏ）により全体実験動物で確認され、実験動物を噴霧される一般ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）で処置した後、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、および５０ｍｇ／ｍＬのメタコリンを連続的に処置した。結果は、図１８に示される。予想したように、喘息が誘導された前記実験ネズミは、最も高いＰｅｎｈを示し、ＯＶＡ処置が行われない実験ネズミは、最も低いＰｅｎｈを示した。抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体は、ほぼ陽性対照群（デキサメタゾン）の水準にＰｅｎｈを低減した。９Ｂ１２抗体および非特異的対照群抗体は、中間数値にＰｅｎｈを低減した。データは、ｍｅａｎ±ＳＥＭで示す。
【０２４６】
気管支肺胞洗浄液および白血球計数：３２日目に、すべての動物は、１％ペントバルビタールナトリウム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ、６０  ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔された。血液試料は、眼窩後方（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）出血によって採血され、血漿は、ＥＤＴＡを使用して分離された。肺は、０．５ｍＬのＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）（１％  ＦＢＳ含有）で気管カニューレによってまず洗浄された。その後、毎度０．５ｍＬのＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）（１％  ＦＢＳ含有）を使用して前記過程を２回繰り返した。すべての洗浄溶液を一緒に混ぜた。細胞数を計数するために、細胞を１．５ｍＬ  ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）（１％  ＦＢＳ含有）に再浮遊した。ＢＡＬ液体内の総細胞数は、血球計算機（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して計数した。
【０２４７】
ＢＡＬ液体を４℃、３００ｇで５分間遠心分離し、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳ（ＰＨ＝７．２）（１％  ＦＢＳ含有）で再浮遊した。区別された細胞計数（リンパ球、好酸球、大食細胞、および好中球性白血球）は、ライト−ギムザ染色法（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）で染色した後に行われた。全体細胞の計数結果は、図１９に示される。データは、平均±ＳＥＭである（＃＃ｐ＜０．０１：対照群に対して比較される（対応のないｔ−ｔｅｓｔ）、＊＊ｐ＜０．０１：実験動物群に対して比較される（一元変量分析／ダネット））。区別された細胞計数結果は、下記の表２１に示す。
【０２４８】
【表２１】
2016537406.tif 000037
【０２４９】
データは、平均±ＳＥＭである（＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１：対照群（対応のないｔ−ｔｅｓｔ）に対して比較される、＊＊ｐ＜０．０１：実験動物群（一元変量分析／ダネット）に対して比較される）．
【０２５０】
予想されたように、喘息誘導された実験ネズミ（「動物モデル」）は、ＢＡＬ液体内に最も多い数の（すべての種類の細胞の）細胞を有し、喘息が誘導されなかった実験ネズミ（「対照群」）は、最も低い細胞数を有する。抗−ｃｙｓＬＴ  １０Ｇ４抗体は、陽性対照群であるデキサメタゾンと比較して細胞数を低減したが、抗−ｃｙｓＬＴ  ９Ｂ１２抗体は、さらに低いか、類似した効果を有する。興味深いことに、非特異的抗体対照群であるＬＴ１０１７も、ＢＡＬ液体内で細胞数を非常に減少させた。
【０２５１】
実施例１７：抗−ｃｙｓＬＴ単一クローン抗体の交差反応性
表２２で、ネズミ科の単一クローン抗体である２Ｇ９および１０Ｇ４および人間化単クローン抗体であるＬＴ５０１４（１０Ｇ４の人間化バージョン）は、ｃｙｓＬＴであるＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＬＴＦ４、およびＬＴＢ４、改質されたロイコトリエン、ｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質、および追加的な化合物と結合するこれらの能力を確認するために、競争ＥＬＩＳＡによってテストされた。
【０２５２】
コンジュゲート：ＬＴＥ４（Ｃａｙｍａｎ  ＃２０４１０）およびＬＴＣ４（Ｃａｙｍａｎ  ＃２０２１０）各々の１５０  ｎａｎｏｍｏｌｅをアルゴン（ａｒｇｏｎ）の下で乾燥した。各々の脂質は、製造社の説明によりＰｉｅｒｃｅ  ＥＺ−ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃２１３４３）を使用して２０：１のビオチン：脂質の比率でビオチニル化した。
【０２５３】
ＥＬＩＳＡ：９６−ウェルＥＬＩＳＡ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃６５５０６１）は、ｐＨ  ９．５の０．１Ｍ炭酸塩バッファー内の０．５μｇ／ｍＬの捕獲抗体＃１０９−００５−０９（５０１４：ヤギ抗−人間ＩｇＧ、Ｆｃγ特異的である、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ペンシルバニア州、ウェストグローブ所在）；１０Ｇ４および２Ｇ９（ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的である、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１１５−００５−０７１）を１００μＬ／ウェルの容量でコーティングした。培養皿は、感熱接着剤で密封され、４℃で一晩培養された。培養皿は、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｐ１３７９）を含む１ＸＰＢＳ（ＯｍｎｉＰｕｒ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州、スウェデスボロ所在、製品番号：６５０）４で３回洗浄された後、室温で１時間１％  ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、サンディエゴ所在、＃  １２６５７５）および０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ＸＰＢＳの１５０μＬ／ウェルでブロックされた。前記培養皿を洗浄し、１ＸＰＢＳ（ＬＴ５０１４：１００ｎｇ／ｍＬ、Ｌｏｔ  ＬＰ１２１４６８；１０Ｇ４：５０ｎｇ／ｍＬ、Ｌｏｔ  １２１４２９；２Ｇ９：５０ｎｇ／ｍＬ、Ｌｏｔ  ＬＰ１２１４５３）内の抗−ｃｙｓＬＴ抗体を１００μＬ／ウェル容量で前記培養皿に添加し、室温で１時間培養した。その後、前記培養皿を１ＸＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。Ｌ−システイン（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃４４８８９）およびＬ−システイン−Ｌ−グリシン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ０１６６−２５ＭＧ）を除いたすべてのレファレンスおよび試験競争剤は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓで購入した。１２地点で、１ｕＭ  ＬＴＣ４または１０ｕＭ  ＬＴＥ４から始まるレファレンス競争剤の３倍希釈物は、１０Ｇ４／ＬＴ５０１４または２Ｇ９各々のために使用した。１２地点で、３０ｕＭから始まる試験競争剤の３倍希釈物は、三つのすべての抗体、すなわち、２Ｇ９、１０Ｇ４およびＬＴ５０１４の交差反応性を評価するために使用した。すべての競争反応混合物は、０．５ｘ  ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ内に０．５ｎＭコンジュゲート（ＬＴＣ４−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ、１０Ｇ４およびＬＴ５０１４；ＬＴＥ４−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、２Ｇ９）を含む。１００μＬ／ウェルの希釈された競争剤／コンジュゲート溶液を培養皿に適用し、室温で２１時間培養した。前記培養皿を洗浄し、ブロッキング溶液内の第２抗体（ペルオキシダーゼ−接合されたストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃０１６−０３０−０８４）の１：６０Ｋ希釈物を１００μＬ／ウェルの容量で前記培養皿に添加し、１５分間培養した。前記培養皿を洗浄し、１００μＬ／ウェル冷たいＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｔ０４４０−１Ｌ）を前記培養皿に添加し、約５分間培養することによって現像した。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルの容量で添加することによって、反応を中断した。培養皿は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ａｋｒｏｎ  ＯＨ）培養皿読み取り機（＃１４２０）上で４５０ｎｍで読み取られた。結果は、レファレンス競争剤（ＬＴＣ４、ＬＴＤ４またはＬＴＥ４）のＩＣ５０に対する���スト競争剤のＩＣ５０の比率として計算した。
表２２は、ＬＴＣ４、ＬＴＣ４およびＬＴＥ４に対する結合の百分率として表現される、抗−ｃｙｓＬＴ抗体であるＬＴ５０１４、１０Ｇ４および２Ｇ９、多数のロイコトリエン、および他の潜在的なリガンドの交差活性を要約する。
【０２５４】
【表２２】
2016537406.tif 000038
【０２５５】
前記人間化抗体であるＬＴ５０１４は、ネズミ科母抗体であるｐ１０Ｇ４と類似の交差反応性プロフィールを有することを確認できる。反対に、ネズミ科の抗体である２Ｇ９は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４に対して異なる結合プロフィールを有し、以前の実施例で記載されたように、ＬＴＣ４またはＬＴＤ４と関連して、ＬＴＥ４に対し強い優先的な結合を示す。驚くべきことに、２Ｇ９は、ＬＴＥ４に対して結合することより、高い親和力でＮ−アセチルロイコトリエンＥ４およびロイコトリエンＦ４と結合することが確認された。Ｎ−アセチルＬＴＥ４は、胆汁で発見されたＬＴＥ４の代謝産物であり、ＬＴＣ４より生物学的に活性が低いものと考えられる。前記三つの抗体は、いずれも、ｃｙｓＬＴ受容体拮抗物質（モンテルカスト、プランルカスト、ＢａｙｃｙｓＬＴ２、ＨＡＭＩ３３７９、Ｂａｙ−ｕ９７７３、ザフィルルカスト、ＭＫ５７１）、ロイコトリエンＢ、ＨＥＴＥｓ、プロスタグランジンＥ、Ｌ−システインまたはＬ−グルタチオンに対して非常に低いか、探知不可能な結合を示した。
【０２５６】
したがって、前記単一クローン抗体である１０Ｇ４およびその人間化バージョンであるＬＴ５０１４は、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４と結合するｃｙｓＬＴ抑制剤であり、ＬＴＥ４と優先的に結合する（ＬＴ５０１４に対する相対的な親和力１００：４．１：０．６％）。また、相当な範囲でＬＴＦ４と結合し、Ｎ−アセチルＬＴＥ４とも結合する。反対に、２Ｇ９抗体は、ｃｙｓＬＴ（ＬＴＣ４：ＬＴＤ４：ＬＴＥ４  ＝１００：５．４：３．８）のうちＬＴＥ４と優先的に結合するが、驚くべきことに、一層高い親和力でＬＴＦ４およびＮ−アセチルＬＴＥ４に結合するものと確認された。
【０２５７】
本発明で説明され主張されるすべての組成物および方法は、本発明の観点で過度な実験なしに製造されるか、実施され得る。本発明の組成物および方法が好ましい具体例の形態として説明されたが、前記組成物および方法が修正され得ることは、当業者には自明である。当分野の技術者に明確なこのようなすべての置換および修正は、添付の請求範囲に定義されるように、本発明の原理および概念に含まれるものと見なされる。
【０２５８】
本明細書で言及されるすべての特許文書、特許出願文書、および公開物は、本発明の属する分野における一般技術者の観点を示す。すべての特許文書、特許出願文書、および公開物およびこれら文献に対する優先権またはその他利益を主張する文献は、これら各文献が具体的に個別的に参照として含まれるもので表示されたように、同じ程度で参照として本発明に含まれる。
【０２５９】
本明細書に例として適切に説明される本発明は、本明細書に具体的に記載されない要素の不在下で実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各々の例で、用語“含む”、“必須的によりなる”、および“よりなる”のうちいずれか一つの用語は、他の二つの用語のうちいずれか一つで置換され得る。使用される用語および表現は、説明のためのものであって、これらへの制限のために使用されるものではなく、前記用語および表現は、図示され説明された特徴またはこれらの一部のすべての等価物を排除することを意図したものではなく、主張される本発明の範囲内で多様な変形が可能になるものと認識される。したがって、本発明が好ましい具体例または選択的な特徴によって具体的に説明されるが、当分野の技術者によって本明細書に記載された概念の変形および多様化が行われることができ、このような変形および多様化は、添付の請求範囲で定義されるように本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
【図１Ａ】
2016537406.tif 000039
【図１Ｂ】
2016537406.tif 000040
【図１Ｃ】
2016537406.tif 000041
【図２Ａ】
2016537406.tif 000042
【図２Ｂ】
2016537406.tif 000043
【図２Ｃ】
2016537406.tif 000044
【図２Ｄ】
2016537406.tif 000045
【図２Ｅ】
2016537406.tif 000046
【図３ａ】
2016537406.tif 000047
【図３ｂ】
2016537406.tif 000048
【図４】
2016537406.tif 000049
【図５】
2016537406.tif 000050
【図６】
2016537406.tif 000051
【図７】
2016537406.tif 000052
【図８】
2016537406.tif 000053
【図９】
2016537406.tif 000054
【図１０】
2016537406.tif 000055
【図１１】
2016537406.tif 000056
【図１２】
2016537406.tif 000057
【図１３】
2016537406.tif 000058
【図１４】
2016537406.tif 000059
【図１５】
2016537406.tif 000060
【図１６】
2016537406.tif 000061
【図１７】
2016537406.tif 000062
【図１８】
2016537406.tif 000063
【図１９】
2016537406.tif 000064
【配列表】
2016537406000001.app
【国際調査報告】
2016537406.tif 000065
2016537406.tif 000066