(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を保持した組換え単純ヘルペスウイルスであって、
野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたバクミド（bacmid）が挿入された組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の病原性を有する請求項１記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項３】
野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有する請求項１記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項４】
野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能を有する請求項１〜３のいずれかに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項５】
Creリコンビナーゼによってバクミド（bacmid）の除去が可能な請求項１〜４のいずれかに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換え単純ヘルペスウイルスから、Creリコンビナーゼによってバクミド（bacmid）が除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項７】
野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能を有する請求項６記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項８】
野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の病原性を有する請求項６又は７記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項９】
ウイルスベクターとして用いられる請求項１〜８のいずれかに記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を保持し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたバクミド（bacmid）が挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入された大腸菌。
【請求項１１】
当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスが、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有する請求項１０に記載の大腸菌。
【請求項１２】
当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスが、Creリコンビナーゼによってバクミド（bacmid）の除去が可能である請求項１０又は１１に記載の大腸菌。
【請求項１３】
当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってバクミド（bacmid）が除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルスが、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有する請求項１０〜１２のいずれかに記載の大腸菌。
【請求項１４】
目的の変異をウイルスゲノムに導入することができる請求項１０〜１３のいずれかに記載の大腸菌。
【請求項１５】
野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたバクミド（bacmid）が挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入された大腸菌。
【請求項１６】
当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってバクミド（bacmid）の除去が可能である請求項１５に記載の大腸菌。
【請求項１７】
ウイルスベクター又はワクチンを開発する際に用いられる請求項１５又は１６に記載の大腸菌。
【請求項１８】
（ａ）野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間に、ｌｏｘＰ配列で挟まれたバクミド（bacmid）を挿入して、第一の組換えウイルスを得る工程と、（ｂ）第一の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出して第一の大腸菌に導入する工程と、（ｃ）該大腸菌からゲノムを抽出しこれをＲＳＣ細胞（rabbit skin cell）に導入して、第二の組換えウイルスを得る工程と、（ｄ）第二の組換えウイルスをチミヂンキナーゼにより修復して第三の組換えウイルスを得る工程と、（ｅ）第三の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出しこれを第二の大腸菌に導入する工程と、からなる、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を保持した大腸菌を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現やワクチン開発のためのベクター及び基礎研究に有用な、組換え単純ヘルペスウイルス、大腸菌、並びにこれらを得る方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに様々な疾患を引き起こす重要なウイルスであるが、一方でその神経指向性を利用した遺伝子ベクター（ウイルスベクター）としても注目されている。ＨＳＶ自体の基礎研究や、遺伝子治療ベクターの開発においては、組換えＨＳＶの作製技術が極めて重要な要素である。
【０００３】
組換えＨＳＶの作製技術の従来の手法としては、マーカー（ＴＫ、ＬａｃＺ）遺伝子を利用した培養細胞内での相同組換え法（Post L. E. et al. Cell24:555-565, 1981）や、コスミドを利用した培養細胞内での相同組換え法（Cunningham C. et al. Virol. 197:116-124, 1993）等が知られているが、これらの手法は煩雑であり作製に長時間を要することから、より簡便な技術の開発が望まれていた。
【０００４】
近年、大型のＤＮＡ cloning systemであるbac system（bacterial artificial chromosome system）を利用し、大腸菌内で相同組換えを行う手法が報告され、従来よりも組換えウイルスの作製が迅速かつ簡便に行えるようになりつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
bac systemにおいて中核をなす材料は、HSVゲノムを保持する大腸菌である。この大腸菌を得ることができれば、大腸菌の遺伝学を用いて、様々なHSVゲノムの改変が可能となる。しかしながら、bac systemを利用してHSVゲノムを保持する大腸菌の作製に関する従来の報告例においては、bacmidの挿入によってPackagin signalが欠損していたり（Saeki Y. et al.Hum.  Gen.  Ther.  9:2787-2794，1998、Tom A. S. et al． J． Virol． 72:7137-7143, 1998、Suter M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12697-12702, 1999）、あるいはＴＫ（非必須なＨＳＶ遺伝子）にbacmidが挿入されており（Horsburgh B. C. et al. Gene Ther. 6:922-930, 1999）、ゲノムの全長を実質的に保持した組換えＨＳＶを維持しうる大腸菌は得られていなかった。
【０００６】
このような欠損や挿入が存在していると、多目的なベクターの作製に適さない場合があり、また、ＨＳＶ自体の基礎研究に用いる上で障害となっていた。また、bacmidは7kbpと比較的大きいので、組換えウイルスの病原性やその組換えウイルスが保持しうる外来遺伝子の長さを限定してしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、野生型ＨＳＶのゲノムの全長を保持したＨＳＶを維持する大腸菌を提供することを目的とする。また、得られた大腸菌由来の感染性組換えＨＳＶはbacmidが挿入されているが、これらの組換えＨＳＶより容易にbacmidを除去しうる系を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究の結果、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した組換え単純ヘルペスウイルス及び大腸菌を得ることに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルス（野生株の単純ヘルペスウイルス）のゲノムの全長を実質的に保持することを特徴とする。
【００１０】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の病原性を有するものである。
【００１１】
また、本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ＴＫ）部位に欠損を有することを特徴とする。
【００１２】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能を有するものである。
【００１３】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入されてもよい。
【００１４】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、Creリコンビナーゼによって容易にそのゲノムよりbacmidの除去が可能である。
Creリコンビナーゼによってbacmidを除去された組換え単純ヘルペスウイルスは、ウイルスベクターとして用いることが可能である。
上記組換え単純ヘルペスウイルスより、Creリコンビナーゼによってbacmidが除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有し、ウイルスベクターとして用いることが可能である。
本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００１６】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００１７】
上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入して再構築された組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有するものである。
また、上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入して再構築された組換え単純ヘルペスウイルスは、Creリコンビナーゼによって容易にそのゲノムよりbacmidの除去が可能である。
【００１８】
また、上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってbacmidが除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有するものである。
また、上記の大腸菌は、当該大腸菌が保持するウイルスゲノムに、目的の変異を導入することができる。すなわち、任意の変異についてウイルスゲノムに変異導入することが可能である。
【００１９】
本発明に係る別の大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有する組換え単純ヘルペスウイルスのゲノムを保持することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有する組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００２１】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００２２】
上記大腸菌は、当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってbacmidの除去が可能である。
【００２３】
上記大腸菌は、ウイルスベクター又はワクチンの開発に有用である。
【００２４】
本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、上記大腸菌に保持されたものである。
本発明に係るワクチンは、上記組換え単純ヘルペスウイルスを有効成分として含み、毒性単純ヘルペスウイルスに対して有効である。
【００２５】
本発明に係る野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した大腸菌を得る方法は、（ａ）野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間に、ｌｏｘＰ配列で挟まれたbacmidを挿入して、第一の組換えウイルスを得る工程と、（ｂ）第一の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出して第一の大腸菌に導入する工程と、（ｃ）該大腸菌からゲノムを抽出しこれをＲＳＣ細胞（rabbit skin cell）に導入して、第二の組換えウイルスを得る工程と、（ｄ）第二の組換えウイルスをチミヂンキナーゼにより修復して第三の組換えウイルスを得る工程と、（ｅ）第三の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出しこれを第二の大腸菌に導入する工程と、からなる。
【００２６】
本発明に係る感染性の組換え単純ヘルペスウイルスを得る方法は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した大腸菌からウイルスＤＮＡを抽出しこれをＲＳＣ細胞（rabbit skin cell）に導入するプロセスから成る。本発明に係るbacmidを有する組換え単純ヘルペスウイルスよりbacmidを除去する方法は、bacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスとCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルスをVero細胞に重感染させた後、挿入されたbacmidを組換え単純ヘルペスウイルスから除去するプロセスから成る。
本発明に係る単純ヘルペスウイルスゲノムの全長を実質的に保持する大腸菌内において目的の変異をウイルスゲノムに導入する方法は、(a) RecAを発現するプラスミドに変異導入およびそのflanking領域をクローニングしたものを大腸菌に導入後、第一の選択によって、このプラスミドがウイルスゲノムに挿入された大腸菌を得る工程と、(b) 第二の選択によって、目的の変異を有するウイルスゲノムを有する大腸菌を得る工程より成る。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。なお、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００２８】
本実施例においては、遺伝子クローニング及びその解析は、マニアティス（Maniates）らのモレキュラー・クローニング・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual），及びコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）(1982)に基づいて行った。実験方法は、Ausubel. FらのCurrent Protocols in Molecular Biology(1987)中に詳細に記載されているような標準の実験室的方法に従った。
【００２９】
〔プラスミドｐＢ２の創製〕
図１は、プラスミドｐＢ２の創製手順を表すフローシートである。以下に、図１を参照しながらプラスミドｐＢ２の創製について説明する。
【００３０】
まず、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Research  Genetics,  Huntsville, USA）の６．８ｋｂｐ NotI fragmentを平滑末端化し、これをｐＲＢ５１９８のHincII部位にクローニングし、ｐＢ１を得た。用いたｐＲＢ５１９８は、ＨＳＶ−１  ＵＬ２１及びＵＬ２２の双方向ｐｏｌｙＡシグナルを含む約２７０ｂｐ断片をＰＣＲにて増幅し、pBluescript II KS+ (Stratagene, La Jolla CA, USA)のXhoI，KpnI部位にクローニングしたプラスミドである。
【００３１】
一方、LoxP配列の両端にBamHI部位及びBgIII部位を有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、BamHI部位及びBgIII部位で消化後、ｐＲＢ４４２（J. Virol.65: 938-944, 1991）のBamHI部位にクローニングし、ｐＢ０を得た。２つの相補的なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１のものと配列番号２のものを用いた。
【００３２】
ＨＳＶ−１（Ｆ）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ７３３）感染Vero細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５８７）からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、HindIIIで消化後、HindIIIＯ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離・精製した。ｐＢ０のHindIII部位に、精製されたＨＳＶ−１（Ｆ）HindIIIＯ断片をクローニングし、ｐＢ０−１を得た。
【００３３】
次に、ｐＢ１のBamHI−SphI断片を平滑末端化し、これをｐＢ０−１のBamHI部位を平滑末端化したところにクローニングし、ｐＢ２を得た。
【００３４】
〔ＨＳＶ−１ゲノムの全長を保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）の創製〕
図２は、ＹＫ３０４の創製手順を表すフローシートである。以下に、図２を参照しながらＹＥｂａｃ１０２を得る工程、及びＹＥｂａｃ１０２からＹＫ３０４を得る工程について説明する。
【００３５】
なお、組換えウイルスの作製は、ポスト（Post）及びロイズマン（Roizman）が報告した論文（Cell 25: 227-232）に記載の作製方法に従い、以下の工程により行った。
【００３６】
（ｉ）まず、Ｒ７２０５(J. Virol. 65: 938-944, 1991)感染Vero細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５８７）からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、これをｐＢ２とrabbit skin cell（ＲＳＣ細胞）にコトランスフェクションした。その後、相同組換えによって生産されたｐＢ２プラスミドに含まれるbacmidがゲノムに挿入されたＴＫ−組換え体（thymidine kinase negative組換え体）を、ＴＫ＋ウイルス（thymidine kinase positive virus）を不活化するＢｕＤＲ存在下においてＴＫ−細胞である143ＴＫ−細胞にて培養することによって選択した。これにより、loxP配列で挟まれたbacmidをＵＬ３及びＵＬ４遺伝子間に挿入した組換えＨＳＶ（ＹＫ３０１）を得た。
【００３７】
（ｉｉ）得られたＹＫ３０１をVero細胞に感染させ、そのＹＫ３０１感染細胞から、Hint法により環状ウイルスＤＮＡを抽出した。抽出した環状ウイルスＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ（GibcoBRL Tokyo Japan）にエレクトロポーション法によって導入した。これをクロラムフェニコール（Chloramphenicol）添加培地にて選択して、bacmidにＹＫ３０１ゲノムを保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）を得た。
【００３８】
得られた大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）から抽出されたウイルスＤＮＡと、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡについて、アガロース電気泳動上の制限酵素（BamHI）切断（消化）パターンを図３に示す。図３において、ａはbacmid挿入によって見られるバンドであり、ｂはＴＫが修復されたときに見られるバンドであり、ｃはＴＫが欠損しているときに見られるバンドである。図３に示すように、ＹＥｂａｃ１０１のパターンは、ＴＫ領域及びbacmid挿入領域を除いて、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）のパターンとほぼ一致した。
【００３９】
これより、大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）内において、野生型ＨＳＶ−１のゲノムの全長が保持されていることが確認された。
【００４０】
（ｉｉｉ）大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）から、アルカリＳＤＳ法によって感染性ＨＳＶのＤＮＡを抽出し、これをリン酸カルシウム法によってＲＳＣ細胞に導入したところ、感染性の組換えＨＳＶ（ＹＫ３０２）の産生が確認された。
【００４１】
得られたＹＫ３０２は、ＵＬ３及びＵＬ４遺伝子のジャンクション領域にbacmidが挿入され、かつ、ＴＫ−の組換えウイルスである。
【００４２】
得られたＹＫ３０２、及びＹＫ３０２と同じくＴＫ−の組換えウイルスであるＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５（Cell 24: 555-565, 1981）について、Vero感染細胞内に２４時間放置して増殖を比較した結果を表１に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においては、ＭＯＩ（感染多重度；multiplicity of infection）１とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。表１において、数値はウイルス価を表す。
【００４３】
【表１】
0004226294.tif 000002
表１に示すように、ＹＫ３０２は、少なくともin  vitroでは、コントロールのΔ３０５と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００４４】
（ｉｖ）ＹＫ３０２感染細胞からウイルスＤＮＡを抽出し、これとｐＲＢ４８６７（J. Virol. 70:84-90, 1996）をＲＳＣ細胞にコトランスフェクションした。その後、相同組換えによって生産されたＴＫが修復されたＴＫ＋組換え体を、ＴＫ−ウイルスを不活化するＨＡＴ存在下においてＴＫ−細胞である143ＴＫ−細胞にて培養することによって選択した。これにより、組換えＨＳＶ（ＹＫ３０３）を得た。
【００４５】
（ｖ）ＹＫ３０３感染細胞から、Hint法により環状ウイルスＤＮＡを抽出した。これを、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーション法によって導入した。これをクロラムフェニコール添加培地にて選択して、bacmidにＹＫ３０３ゲノムを保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）を得た。
【００４６】
得られた大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）から抽出されたウイルスＤＮＡと、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡについて、アガロース電気泳動上の制限酵素（BamHI）切断パターンを測定した（図３）。図３に示すように、ＹＥｂａｃ１０２のパターンは、bacmid挿入領域を除いて、野生型ＨＳＶ（Ｆ）のパターンとほぼ一致した。
【００４７】
これより、大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）内において、野生型ＨＳＶのゲノムの全長が保持されていることが確認された。この大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）は、遺伝子治療用ベクターやワクチンの開発、並びに基礎研究に有用である。
【００４８】
（ｖｉ）大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）から、アルカリＳＤＳ法によって感染性ＨＳＶのＤＮＡを抽出し、これをリン酸カルシウム法によってＲＳＣ細胞に導入したところ、感染性の組換えＨＳＶ（ＹＫ３０４）の産生が確認された。
【００４９】
得られたＹＫ３０４は、ＵＬ３及びＵＬ４遺伝子のジャンクション領域にbacmidが挿入され、いかなる既知のＨＳＶ−１オープンリーディングフレームも欠損しない全長のＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡを有していた。
【００５０】
得られたＹＫ３０４、及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に２４時間放置した結果を表２に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においては、ＭＯＩ１とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。表２において、数値はウイルス価を表す。
【００５１】
【表２】
0004226294.tif 000003
また、ＹＫ３０４、及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に６，１２，２４時間放置した結果を図４に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においてはＭＯＩ１０とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。
【００５２】
図４及び表２に示すように、ＹＫ３０４は、少なくともin  vitroでは、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００５３】
（ｖｉｉ）Ｃｒｅリコンビナーゼ（causes recombination相同組換え酵素）を発現する組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）は、ＡｘＣＡＮＣｒｅ  ＤＮＡ−ＴＰＣ（Takara Tokyo Japan）を、293細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）に導入することによって得た。293細胞にＡｘＣＡＮＣｒｅをＭＯＩ100以上で感染させ、２４時間後にＹＫ３０４をＭＯＩ０．０５で重感染させた。ＹＫ３０４感染後２４時間後に感染細胞を回収し、ウイルスＤＮＡを抽出した。ＹＫ３０４感染細胞、及びＹＫ３０４及びＡｘＣＡＮＣｒｅ重感染細胞のそれぞれからウイルスＤＮＡを抽出し、ＲｃｏＲＩで消化後、サザン法によって解析した。プローブとしては、ｐＲＢ４４２のＥｃｏＲＶ断片を用いた。
【００５４】
サザン法によって解析した結果を図５に示す。図５において、lane１はＹＫ３０４感染細胞を表し、lane２はＹＫ３０４及びＡｘＣＡＮＣｒｅ重感染細胞を表す。図５に示すように、Creリコンビナーゼによって、ＹＫ３０４のゲノムよりbacmidが効率良く除去可能であることが明らかになった。
ＹＫ３０４よりCreリコンビナーゼによりbacmidが除去された組換え単純ヘルペスウイルスＹＫ３１１及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に６，１２，２４時間放置した結果を図６に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においてはＭＯＩ１０とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。
【００５５】
図６に示すように、ＹＫ３１１は、少なくともin  vitroでは、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００５６】
また、ＹＫ３０４ 、ＹＫ３１１および野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）についてBALB/Cマウスの脳内に接種し、２週間マウスの生死を観察した結果を表３に示す。数値は、PFU/LD50の値（死亡率は、接種後２日〜１４日で評価した。PFU/LD50はbehrens-Karber法によって計算した）を示す。
【００５７】
【表３】
0004226294.tif 000004
表３に示すように、ＹＫ３０４およびＹＫ３１１は野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）とマウス動物モデルにおいて同等な病原性を発揮することが確認された。
〔大腸菌内における単純ヘルペスウイルスゲノムへの目的変異の導入〕
pKO3 (J. Bacteriol. 179: 6228-6237)をBstBI処理後、ライゲーション反応を行うことによってクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去し、さらに、NaeI部位にpcDNA4/HisMax C(Invitrogen)のBclI-FokI断片を平滑末端化したものをクローニングし、ゼオシン耐性遺伝子を導入したプラスミドpKO5Mを構築した。さらに、pK05MのSalI部位に大腸菌由来のrecA遺伝子をPCRで増幅したものをクローニングし、pKO5MRAを構築した。単純ヘルペスウイルスICP6遺伝子を含む約10kbpのNotI断片のXmnI部位に85bpのオリゴヌクレオチドを挿入したものを平滑末端化し、pKO5MRAのSalI部位にクローニングし、pKO5MRA-ICP6-FRTを作製した。
【００５８】
pKO5MRA-ICP6-FRTをYEbac102に導入後、クロラムフェニコールおよびゼオシン添加培地に接種し、４３度（℃）にて１晩培養した。できた大腸菌コロニーをシュークロースおよびゼオシン添加培地に接種し、３０度（℃）で１晩培養した。クロラムフェニコールおよびシュークロース耐性、ゼオシン感受性のコロニーをPCRにて解析し、目的の変異を有する単純ヘルペスウイルスゲノムを保持する大腸菌を選択した。
【００５９】
その大腸菌よりウイルスゲノムを抽出し、RSCに導入したところ、感染性の組換え単純ヘルペスウイルス(YK351)の産生が確認された。このYK351感染細胞中よりウイルスゲノムを抽出し、オリゴヌクレオチド挿入部位をPCRで解析した結果を図７に示す。図７に示すように、野生型HSV-1(F)と比して、YK351ゲノムではオリゴヌクレオチドが挿入された分だけサイズの大きなPCR産物が検出された。
【００６０】
以上より、YEbac102内において目的の変異が単純ヘルペスウイルスゲノムに導入可能であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドｐＢ２の創製手順を表すフローシートである。
【図２】  ＹＫ３０４の創製手順を表すフローシートである。
【図３】  野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）、ＹＥｂａｃ１０１、及びＹＥｂａｃ１０２に保持されたＨＳＶゲノムＤＮＡのBamHI制限酵素消化パターンを表す写真である。
【図４】  野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３０４のVero感染細胞内での増殖比較実験データである。
【図５】  Creリコンビナーゼによるbacmidの除去に関する解析パターンを表す写真である。
【図６】  野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３１１のVero感染細胞内での増殖比較実験データである。
【図７】  野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３５１のICP6遺伝子内XmnI部位付近のPCR解析結果を表す写真である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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