(57)【要約】本発明は中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または中間葉幹細胞−ヒドロゲル−非分解性支持体を含む造成物、シート及びその製造方法に関するものであり、より詳しくは、本発明による脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体を含有するシートはたんぱく質分解酵素を利用した単離過程なしに高活性の幹細胞がそのまま傷部位に塗布することができ、培養ステップで中間葉幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にヒドロゲルに貼布されて存在するため従来の治療剤に比べて皮膚再生及び傷の治療能力が著しく優秀で治療期間を短縮する有利な効果を示す。
2016518912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂肪組織から中間葉幹細胞を分離して増殖培地で２継代以上培養するステップと、（ｂ）培養した脂肪由来の中間葉幹細胞をヒドロゲルを利用して生分解性支持体及び非分解性支持体で形成されるグループから選択される１種以上の支持体、または１種以上の生分解性支持体及び１種以上の非分解性支持体の複合体に付着して脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を得るステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）から得た脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を増殖培地で培養するステップと、を含むが、ここでステップ（ａ）またはステップ（ｃ）の増殖培地はＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−βｌ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ−１）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＩＦＧ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）で形成されるグループから選択される１種以上の因子を含む培地である皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項２】
ヒドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンで形成されるグループから選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項３】
フィブリン糊は０．５乃至３０ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とする請求項２に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項４】
フィブリン糊は０．５乃至１０ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とする請求項２に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項５】
フィブリン糊は１乃至５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビンを含むことを特徴とする請求項２に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項６】
生分解性支持体はＰＧＡ（ｐｏｌｙ−ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ビクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚のコラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせであり、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）フィルム、ＰＥ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）フィルム及びＰＰ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）フィルムで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項７】
１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体はＰＧＡ／不織布繊維、ＰＬＡ／不織布繊維またはＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）において、物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激及び炎症因子刺激で形成されるグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に行って細胞を活性化するステップ（ｄ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項９】
傷は糖尿性創傷であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）において、脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を１乃至２０ｗ／ｖ％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）及び１乃至５０ｗ／ｖ％人血清アルブミンを含有する凍結保管剤に入れて冷凍保管するステップ（ｅ）をさらに含み、ここで、冷凍保管してから解凍した際の脂肪由来の中間葉幹細胞の生存率が９０％以上である請求項１に記載の皮膚再生または傷治療用シートの製造方法。
【請求項１１】
脂肪由来の中間葉幹細胞及びヒドロゲルを含み、生分解性支持体及び非分解性支持体で形成されるグループから選択される１種以上の支持体、または１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体を含有する皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１２】
ヒドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンで形成される群から選択されるいずれか一つ以上である請求項１１に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１３】
フィブリン糊は０．５乃至３０ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とする請求項１２に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１４】
フィブリン糊は０．５乃至１０ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とする請求項１２に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１５】
フィブリン糊は１乃至５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビンを含むことを特徴とする請求項１２に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１６】
生分解性支持体はＰＧＡ、ＰＬＡ、ビクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚のコラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせであり、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴフィルム、ＰＥフィルム及びＰＰフィルムで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１１に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１７】
１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体はＰＧＡ／不織布繊維、ＰＬＡ／不織布繊維またはＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維であることを特徴とする請求項１１に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１８】
傷は糖尿性創傷であることを特徴とする請求項１１に記載の皮膚再生または傷治療用造成物。
【請求項１９】
請求項１１乃至請求項１８のうちいずれか一項による造成物を有効成分に含有する皮膚再生または傷治療用シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または中間葉幹細胞−ヒドロゲル−非分解性支持体を含む皮膚再生または傷治療用造成物、シート（ｓｈｅｅｔ）及びその製造方法に関するものであり、特に本発明の幹細胞を含むシート状の造成物は皮膚の再生または傷（ｗｏｕｎｄ）治癒用被覆材として使用される。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病とは、身体が摂取した飲食物を適切に使用できずに血液内の葡萄糖（血糖）数値が正常人より非常に高い状態を言い、糖尿性創傷は糖尿病足病変ともいう糖尿患者に現れる主な合併症であって、糖尿病による血液循環障害と血管中の高い糖数値が神経細胞を殺して感覚を鈍くするため発生する。
【０００３】
一般的な創傷の治癒は、損傷した組織及び侵入した病原菌の除去と損傷した組織の再形成が必要な連続過程であって、第一に、白血球などの炎症細胞が集まって外部から侵入した菌と死んだ組織などを除去する炎症過程、第二に、白血球が分泌した成長因子の刺激によって傷周囲の上皮細胞が移動し増殖して、損傷した部分を覆って真皮層の繊維細胞がコラーゲンを蓄積して新しい毛細血管を生成し傷を埋めて上皮化が行われる増殖過程、第三に、炎症細胞が消えて臨時に生成された肉芽組織が元の皮膚組織に近いように成熟する成熟過程を経る。このような復旧過程は、多様な成長因子及びサイトカイン−インシュリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ；ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）の作用を介して行われ、炎症性細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト及び内皮細胞のような互いに異なる形態の細胞の相互作用を介して行われる。
【０００４】
一般的な傷は前記創傷治癒過程を順次に行うことで容易に治癒されるが、皮膚の再生または創傷の治療は炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、再上皮化（ｒｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、肉芽組織の形成（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、繊維組織の形成（ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）、創傷組織の収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）など様々な過程を経て行われる（Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．，５７：４３３−４５５，２００１）。皮膚再生の一連の過程は、角質細胞（ｋｅｒｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、内被細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）などのような様々な細胞の協力によって行われ、このような細胞の移動、浸潤、増殖、分化のような複合的な進行は多様な成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン、ケモカインによって調節されるため、生物学的因子や化学物質の有効性が知られている。
【０００５】
しかし、前記成長因子、サイトカインを利用した創傷治癒技術はこれらのたんぱく質を生産、分離するのに多くのコストがかかり、創傷を治癒する過程にはこれらのたんぱく質が複合的に作用するため一つの種類のたんぱく質のみを使用する場合には創傷治療剤として部分的な創傷の緩和を提供するが、治癒期間が長く治療に対する反応が最適に及ばないなど効果的ではないため実際の実用化に問題点がある。
【０００６】
また、特に糖尿病患者における慢性の傷の場合、成長因子の生成減少、血管新生の減少及びケラチノサイトと繊維芽細胞の移動及び増殖の悪化など様々な要因のため創傷の治癒過程が続けられずに炎症期に留まる場合がよくあり、容易に再生されない（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８１：１５３−６０，２００２；Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ９０：１３３−４６，２００３）。
【０００７】
このような背景のため、皮膚を構成する繊維芽細胞または表皮細胞またはその両方で形成される人工皮膚及び培養皮膚を利用して糖尿病性創傷に移植する技術が開発されている。
【０００８】
最近、幹細胞の研究が活発になるにつれ、幹細胞が皮膚細胞に分化可能で皮膚細胞より活性がよいため大量の成長因子を分泌し、免疫反応まで調節可能であることが明らかになったことから、幹細胞を糖尿を誘発したマウスの創傷部位に移植して糖尿性創傷を治療する方法が試みられている（Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．２０１３；２０１３：６４７１０７，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１３  Ｊｕｌ；６２（７）：２５８８−９４、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１１  Ｏｃｔ；１２８（４）：８７２−８０．）。Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉ  ＭＫなど（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．２０１１  Ａｕｇ；９３（２）：２２８−３４）は脂肪組織から分離した成体幹細胞によって糖尿マウスにおける創傷治癒力が増加したことを示した。また、糖尿病足病変の潰瘍患者を対象に各患者の腹部から脂肪組織を吸引した後、脂肪由来の幹細胞を抽出して培養していないままの状態で創傷部位に塗布した結果、８週以内に全ての患者の創傷部位が完全に治癒されたことが報告された。
【０００９】
しかし、培養していない細胞には免疫細胞が含まれているため必ず患者自身の組織を採取しなければならない欠点がある。これは非常に煩わしいだけでなく、糖尿病患者は一度発生した傷がよく治癒されないため脂肪吸引手術の過程が他の慢性的な創傷を誘発する恐れがある。脂肪組織から細胞を分離してから継代培養すると、免疫細胞などが消えて免疫源性がないながらも逆に過度な免疫反応を抑制することができ、各種成長因子を分泌する自家及び同種移植が可能な中間葉幹細胞が残るようになる。このような状態の培養した細胞を単離して疾患に適用する技術が開発されているが、これを１世代の幹細胞治療剤という。
【００１０】
しかし、従来の１世代の幹細胞治療剤はトリプシンまたはディスパーゼなどのたんぱく質分解酵素を処理して得た単離された細胞でたんぱく質分解酵素を処理する間、細胞膜に露出されている全てのたんぱく質を非選択的に分解するため、細胞間の結合と基底膜のたんぱく質などが殆ど維持されない。また、中間葉の幹細胞は付着性の強い細胞であり、単一の細胞に分離すると６〜２４時間内に死滅するため生着率が非常に低いという欠点がある。
【００１１】
一方、傷を治癒するためのヒドロゲル形態の細胞伝達用ビヒクルに関する特許文献６がある。ここでは生理食塩水、リン酸緩衝溶液（PBS）及び細胞培養培地で形成された群から選択される水性媒質にゲラント（ｇｅｌｌａｎｔ）なしに非イオン性界面活性剤であるポリプロピレングリコールポリエチレングリコール蓄合物が１５〜５０％の重量比で混合、分散されて構成されたヒドロゲルの形態を有する細胞伝達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）用ビヒクル造成物が開示されている。しかし、湿潤効果及び傷収縮抑制効果に起因して傷の治癒をより促進する効果が開示されているだけであって、成長因子の分泌及び促進または細胞間物質のレベル上昇などのメカニズムによる治癒効果については具体的に開示されておらず、生分解性支持体または非分解性支持体シートの使用について開示されておらず、ヒドロゲルの場合には製造濃度に応じて網目構造の大きさ、硬度及び分解速度が異なるため、細胞の形態及び増殖速度に影響を及ぼすようになるが、特に中間葉幹細胞に適用されるための最適濃度条件についても示されていない。
【００１２】
本発明は、前記のような従来技術の問題点を解決しようとするものであり、培養した中間葉幹細胞をヒドロゲルに懸濁して生分解性または非分解性支持体に付着した後、培養する高活性の生きている中間葉幹細胞を含む皮膚再生または傷治癒用造成物及びシート、そしてその製造方法を提供することを目的とする。このような方法で製造されたシートに含まれている中間葉幹細胞の大部分はＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、７０％以下の細胞でＣＤ１０５を発現する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】韓国登録特許第１，２９３，７６２号
【特許文献２】韓国登録特許第１，１０６，０１５号
【特許文献３】韓国公開特許第２０１０−０１１４７２９号
【特許文献４】韓国登録特許第１，３２８，６０４号
【特許文献５】国際特許ＷＯ２０１３／０２２４４７号
【特許文献６】韓国登録特許第１，１０１，３２１号
【特許文献７】国際特許ＷＯ２００８／０６０３７４号
【特許文献８】韓国登録特許第１，３３５，１７６号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．２０１３；２０１３：６４７１０７
【非特許文献２】Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１３  Ｊｕｌ；６２（７）：２５８８−９４
【非特許文献３】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１１  Ｏｃｔ；１２８（４）：８７２−８０．
【非特許文献４】Ｍａｈａｒｌｏｏｅｉ  ＭＫなど、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．２０１１  Ａｕｇ；９３（２）：２２８−３４．
【非特許文献５】Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇ  ４（４）：１４０３〜４１４，１９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は人間の脂肪組織から分離した中間葉幹細胞を皮膚再生及び傷治癒に利用するためのものであり、臨床的に有効な治療効果を得るための高活性の中間葉幹細胞を含む皮膚再生または傷治療用造成物及び造成物シート、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明では脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体または非分解性支持体を含む造成物、シート及びその製造方法を提供する。
【００１７】
本発明による皮膚再生または傷治療用造成物において、中間葉幹細胞はＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性で、ＣＤ３４及びＣＤ４５に対して陰性である自家または同種由来細胞である。
【００１８】
本発明による一様態において、支持体としてはＰＧＡ（Ｐｏｌｙ−ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＧＡ／ＰＬＡ、ビクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚のコラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランで形成されるグループから選択される生分解性高分子支持体を使用するか、滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）フィルム、ＰＥ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）フィルム、ＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）フィルムのような非分解性支持体、またはそれらの複合体、例えばＰＧＡ／不織布繊維、ＰＬＡ／不織布繊維、ＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維を使用してもよい。
【００１９】
本発明による一様態において、ヒドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸またはそれの誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンで形成されるグループから選択されるが、この際、フィブリン糊を形成するフィブリノゲンの濃度は０．５乃至３０ｍｇ／ｍＬであってもよく、より詳しくは０．５乃至２０ｍｇ／ｍＬであってもよく、更に詳しくは０．５乃至１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００２０】
本発明による一様態において、皮膚再生及び傷治療用シートを製造するために幹細胞をヒドロゲルと混合して支持体１ｃｍ２当たり４，０００乃至６，０００に均一に塗布し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有する培地で培養して支持体１ｃｍ２当たり幹細胞２０，０００個以上、より詳しくは２０，０００乃至２００，０００個になるように増殖するステップを含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明による高活性の中間葉幹細胞を含む造成物またはシートは、たんぱく質分解酵素を利用した単離（選別）過程なしに高活性の幹細胞がそのまま傷部位に塗布されることができ、培養ステップで中間葉幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にヒドロゲルに貼布されて存在するため、従来の治療剤に比べ皮膚再生及び傷の治癒能力が著しく優秀で治療期間を短縮することができる有利な効果を示す。より詳しくは、本発明による脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体は、無血清培地でも繊維芽細胞の形態を維持し、１週が経過した後にも９０％以上生存することが示されて従来の幹細胞治療剤に比べて生存期間が著しく増加しており、凍結保管後解凍した際にシートに形態及び強度がそのまま維持され、シート内の細胞も９５％以上生存していて主な有効成分である細胞の損傷なしに−８０℃で長期間冷凍保管が可能であり、細胞成長及び血管形成を促進する多様な成長因子とサイトカインが持続的に分泌され、多様な種類の細胞外基質を多量に分泌するだけでなく分泌された細胞外基質がヒドロゲル内に留まるため体内に移植した際に多様な基質を提供することで傷の治癒を容易にし、免疫反応を誘発せずにかえって傷部位から炎症が発生しても免疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加する役割をするＴＮＦ−ａｌｐｈａの分泌量を著しく減少し炎症を緩和することで傷の治癒を助ける長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】フィブリノゲン原液及びステップ別に希釈された溶液で製造されたフィブリンゲルと混合して培養した人脂肪由来の中間葉幹細胞の形態をＡＯ／ＥｔＢｒに染色して観察した蛍光顕微鏡の写真である（４００倍率）。フィブリノゲンの希釈倍数及びトロンビンが含まれた細胞懸濁液と１：１に混合されて最終フィブリン糊を形成した際の濃度は括弧で表記した。
【図１ｂ】フィブリノゲン原液及びステップ別に希釈された溶液で製造されたフィブリンゲルと混合して培養した人脂肪由来の中間葉幹細胞にＷＳＴ−１を添加して測定した吸光度グラフである。
【図２ａ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートの写真である。
【図２ｂ】図２ａのシート内の細胞の写真であって、ａはシート形成直後（Ｄａｙ  ０）、ｂは５日間培養した後の光学顕微鏡の観察写真であり、ｃは５日間培養した後、細胞をＡＯ／ＥｔＢｒに染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図２ｃ】図２ａのシート内の細胞の時間による生存率を示すグラフである。
【図３ａ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを−８０℃で凍結保管してから解凍した写真である。
【図３ｂ】図３ａのシート内の細胞をＡＯ／ＥｔＢｒに染色して蛍光顕微鏡で観察した写真であって、ａは生分解性支持体または非分解性繊維支持体に付着された中間葉幹細胞を、ｂは非分解性フィルム支持体に付着された中間葉幹細胞を示す写真である。
【図４】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを溶かして単一の細胞に分離した後、細胞表面たんぱく質で染色してからフローサイトメトリで分析した結果である。従来技術によって２次培養した脂肪由来のの中間葉幹細胞に比べＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０の発現は類似していたが、ＣＤ１０５は発現が減少して７０％以下であった。
【図５ａ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートから分泌されるＶＥＧＦとＨＧＦの量をＥＬＩＳＡで定量して示したグラフである。
【図５ｂ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートから分泌される血管形成促進因子をサイトカインアレイキットを利用して分析した結果である。
【図６】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートを細胞外マトリックスで蛍光染色して観察した写真である。
【図７ａ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートを同種の末梢血液単核細胞と共同培養した後、末梢血液単核細胞から分泌されるＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡで定量して示したグラフである。
【図７ｂ】人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートを同種の活性化された末梢血液単核細胞に添加して共同培養した後、末梢血液単核細胞から分泌されるＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡで定量してからＴＮＦ−αの分泌抑制率（％）に換算して示したグラフである。
【図８ａ】糖尿病性創傷モデルに人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シート、ビヒクル対照群、ヒドロゲル対照群、単一幹細胞対象群を処置しその試験結果を示したグラフである。ｙ軸は元の創傷面積に対する百分率（％）を示し、ｘ軸は処置後の日数を示す。
【図８ｂ】糖尿病性創傷モデルに人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シート、ビヒクル対照群、ヒドロゲル対照群、単一幹細胞対象群を処置した後、日付別に観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
前記目的を達成するために、本発明では脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体を含む皮膚再生または傷治療用造成物、シート及びその製造方法を提供する。
【００２４】
本発明は（ａ）脂肪組織から中間葉幹細胞を分離して増殖培地で２継代以上培養するステップと、（ｂ）培養した脂肪由来の中間葉幹細胞をヒドロゲルを利用して生分解性支持体及び非分解性支持体で形成されるグループから選択される１種以上の支持体、または１種以上の生分解性支持体及び１種以上の非分解性支持体の複合体に付着して脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を得るステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）から得た脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を増殖培地で培養するステップと、を含むが、ここでステップ（ａ）またはステップ（ｃ）の増殖培地はＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａｌ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ−１）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＩＦＧ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）で形成されるグループから選択される１種以上の因子を含む培地である、皮膚再生または傷治療用シートの製造方法に関するものである。
本発明による一様態において、前記増殖培地に含まれる因子は、より詳しくはｂＦＧＦ、ＥＧＦまたはそれらの組み合わせである。
【００２５】
本発明による一様態において、中間葉幹細胞はＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性で、ＣＤ３４及びＣＤ４５に対して陰性である自家または同種由来細胞である。
【００２６】
本発明の一様態において、創傷治療用シートを製造するために幹細胞をヒドロゲルと混合して支持体１ｃｍ２当たり４，０００乃至６，０００に均一に塗布し、ＦＢＳ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦで形成される群から選択される一つ以上が含まれる培地で培養して、支持体１ｃｍ２当たり幹細胞２０，０００個以上、より詳しくは２０，０００乃至２００，０００個になるように増殖するステップを含む。
【００２７】
本発明による一様体において、前記ステップ（ｃ）において、物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激及びＩＦＮ−γのような炎症因子刺激で形成されるグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に行って細胞を活性化するステップ（ｄ）をさらに含んでもよい。特に、糖尿性創傷で損傷された組織の場合、血管が破壊されるか機能が低下されて酸素供給が円滑ではなく慢性炎症が存在するため、損傷された組織に投与された幹細胞は低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化されて成長因子及びサイトカインの分泌が急激に増加する。よって、支持体シートの製造ステップで低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理して高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含む造成物、シートを製造することができる。
【００２８】
本発明による一様態において、ヒドロゲルとしてはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンを使用するが、それに限ることではない。ヒドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊は０．５乃至３０ｍｇ／ｍＬ濃度、詳しくは０．５乃至２０ｍｇ／ｍＬの濃度、より詳しくは０．５乃至１０ｍｇ／ｍＬ濃度、更に詳しくは０．５乃至５ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とし、１乃至５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度、詳しくは１乃至３０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度、より詳しくは１乃至２０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビンを含む。
【００２９】
本発明の一様態において、ヒドロゲル自体だけでも幹細胞−ヒドロゲルシートを製造することができるが、ヒドロゲルは強度が低く機械的／物理的力によって容易に破れるためシートの大きさが制限され、使用の際に細心な注意が要求される短所があるが、生分解性支持体または非分解性支持体に中間葉幹細胞−ヒドロゲルを付着する場合、支持体が中間葉幹細胞−ヒドロゲルの強度を上げて操作がより容易になる。
【００３０】
本発明の一様態において、生分解性支持体としてはＰＧＡ、ＰＬＡ、ビクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚のコラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせを使用してもよく、非分解性支持体としては滅菌された不織布繊維、ＰＥＴフィルム、ＰＥフィルム及びＰＰフィルムで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせを使用してもよいが、それに限ることではない。
【００３１】
本発明による一様態において、１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体を支持体として使用してもよく、例えばＰＧＡ／不織布繊維、ＰＬＡ／不織布繊維またはＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維の形態で使用してもよいが、それに制限されることはない。
本発明の一様態において、傷は特に糖尿性創傷である。
【００３２】
本発明の一様体において、前記ステップ（ｃ）において、脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−支持体を１乃至２０ｗ／ｖ％ＤＭＳＯ及び１乃至５０ｗ／ｖ％人血清アルブミンを含有する凍結保管剤に入れて冷凍保管するステップ（ｅ）をさらに含んでもよいが、ここで、冷凍保管してから解凍した際の脂肪由来の中間葉幹細胞の生存率が９０％以上であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の他の様態において、脂肪由来の中間葉幹細胞及びヒドロゲルを含み、生分解性支持体及び非分解性支持体で形成されるグループから選択される１種以上の支持体、または１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体を含有する皮膚再生または傷治療用造成物が提供される。
【００３４】
本発明よる一様態において、ヒドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンで形成されるグループから選択されるいずれか一つであってもよいが、それに限ることはない。ヒドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊は０．５乃至３０ｍｇ／ｍＬ濃度、詳しくは０．５乃至２０ｍｇ／ｍＬの濃度、より詳しくは０．５乃至１０ｍｇ／ｍＬ濃度、更に詳しくは０．５乃至５ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とし、１乃至５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度、詳しくは１乃至３０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度、より詳しくは１乃至２０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ濃度のトロンビンを含む。
【００３５】
本発明の一様態において、生分解性支持体としてはＰＧＡ、ＰＬＡ、ビクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚のコラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせを使用してもよく、非分解性支持体としては滅菌された不織布繊維、ＰＥＴフィルム、ＰＥフィルム及びＰＰフィルムで形成されるグループから選択される１種または２種以上の組み合わせを使用してもよいが、それに限ることではない。
【００３６】
本発明による一様態において、１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の複合体を支持体として使用してもよく、例えばＰＧＡ／不織布繊維、ＰＬＡ／不織布繊維またはＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維の形態で使用してもよいが、それに限ることではない。
本発明の一様態において、傷は特に糖尿性創傷である。
本発明の他の様態において、前記造成物を有効成分に含有する皮膚再生または傷治療用シートが提供される。
【００３７】
本発明による一様態において、より具体的に前記方法は、
【００３８】
（ａ）脂肪組織から中間葉幹細胞を分離してＦＢＳ、成長因子であるｂＦＧＦまたはＥＧＦを含む増殖培地で２継代以上培養するステップと、（ｂ）培養した脂肪由来の中間葉幹細胞をヒドロゲルを利用して生分解性または非分解性支持体、またはそれらの複合体に付着するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）の脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体をＦＢＳ、成長因子であるｂＦＧＦまたはＥＧＦを含む培地で約５日間培養してシートを製造するステップと、（ｄ）前記ステップ（ｃ）の培養の際に物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激、炎症因子刺激を追加的に行って細胞を活性化するステップと、（ｅ）前記ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートにＦＢＳと成長因子であるｂＦＧＦまたはＥＧＦが除去された培地で洗浄するステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを１０％ＤＭＳＯ及び５％人血清アルブミンで構成された凍結保管剤に入れて冷凍保管するステップと、（ｇ）凍結保管された中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを解凍して生理食塩水で洗浄して凍結保管剤を除去するステップと、（ｈ）糖尿病性創傷に創傷の大きさに合わせて切り取って傷部位に付着するステップと、（i）前記シートを被覆材で覆うステップと、を含む。前記方法をより具体的にみると以下のようである。
【００３９】
ステップ（ａ）において、人脂肪組織から中間葉幹細胞を分離し、２継代以上培養する方法は従来技術（特許文献４）によるものであって、増殖培地を使用して細胞を培養することで多量の中間葉幹細胞を短時間内に効果的に得ることができる。従来技術によって２継代以上培養した人脂肪由来の中間葉幹細胞はプラスチック培養容器に付着して繊維芽細胞の形態を維持し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性で、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６及びＳｔｒｏ−１には陰性を示す。また、幹細胞として体外で脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞に分化する能力を有する。また、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＮＧＦ、ＩＧＦのような多様な成長因子を分泌し、免疫調節能力を保有しているため多様な疾患の治療に適用する技術が開発されている。
【００４０】
前記ステップ（ｂ）においては、ステップ（ａ）で２継代以上培養した脂肪由来の中間葉幹細胞をトリプシンまたはディスパーゼ処理して単一の細胞にし、ヒドロゲルに懸濁してから生分解性または非分解性繊維に約５，０００個／ｃｍ２の濃度で均一に噴射して付着した。次に、１０％ＦＢＳ及びＥＧＦまたはｂＦＧＦが含まれた増殖培地を利用して３〜５日間培養した。本発明の実施例で使用したヒドロゲルはフィブリンゲルであるがそれに限ることではなく、それ以外にもコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン酸、セルロース、ペクチンを含んでもよい。
【００４１】
また、本発明の実施例で使用した生分解性支持体はビクリルメッシュまたは牛の羊膜を、非分解性支持体としては滅菌されたガーゼ、ＰＥＴフィルムであるがそれに限ることはなく、ＰＧＡ／不織布繊維、ＰＧＡ／ＰＬＡ／不織布繊維、人の羊膜、コラーゲン膜などを使用してもよい。
【００４２】
本発明において、ヒドロゲルは１次的には生分解性または非分解性支持体繊維またはＰＥＴフィルム、ＰＥフィルム、ＰＰフィルムに中間葉幹細胞を付着する機能を行い、２次的には付着性細胞である中間葉幹細胞に基質を提供して、細胞が基質に付着して安定的に生存し得る環境を提供する。また、ヒドロゲルは無数に多い３次元の網目構造（ｐｏｒｅ）を含んでいえるため、培養液に含まれたＦＢＳ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦが網目構造を通過して細胞に作用して増殖し得る環境を提供する。ヒドロゲルは製造する濃度に応じて網目構造の大きさ、硬度、分解速度が異なるため、細胞の形態及び増殖速度に主要な影響を及ぼす。本発明の実施例では最終０．５〜１０ｍｇ／ｍＬのフィブリンゲルを使用することで中間葉幹細胞の増殖速度を上げる一方、適切なゲルの硬度が維持されるようにしている。
【００４３】
前記ステップ（ｃ）において、中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートで中間葉幹細胞が速く増殖して３~５日間４倍以上増加し、ｃｍ２当たり２０，０００個以上の細胞を含む。
【００４４】
本発明において、ヒドロゲル内で増殖した細胞は脂肪由来の中間葉幹細胞の特性であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現し、ＶＥＧＦ、ＨＧＦを含む多様な成長因子を分泌する。また、免疫細胞から分泌される代表的な炎症性因子であるＴＮＦ−αとＩＦＮ−γの抑制能力も保有している。即ち、ヒドロゲル内で培養された細胞は中間葉幹細胞の特性を維持することを特徴とする。
【００４５】
また、前記ステップ（ｃ）では低酸素ストレス、マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）処理、炎症因子（ＩＦＮ−γ）処理を混用してもよい。糖尿病性創傷で損傷された組織は血管が破壊されるか機能が低下されて酸素の供給が円滑ではなく慢性的な炎症が存在するため、損傷された組織に投与された幹細胞は低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化され、成長因子及びサイトカインの分泌が急激に増加する。
【００４６】
上述したように、本発明は脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートの製造ステップで低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理し、高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含むシートの製造方法を提供する。
【００４７】
また、本発明によって製造した脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートは高活性の幹細胞がたんぱく質分解酵素を利用した単離過程なしにそのまま創傷に塗布されるため、治療能力に優れる。また、たんぱく質分解酵素を利用した単離過程がないため、培養ステップで中間葉幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にヒドロゲルに貼布されて存在して創傷の治療を促進する。
【００４８】
上述したように、本発明の前記ステップ（ｂ）でヒドロゲル自体でも幹細胞−ヒドロゲルシートを製造することができる。しかし、ヒドロゲルは強度が低くて機械的／物理的力によって容易に破れるため、シートの大きさが制限的で使用の際に細心な注意を要する。一方、本発明によって幹細胞−ヒドロゲルを生分解性または非分解性支持体に付着すると、支持体が幹細胞−ヒドロゲルの強度を上げて操作を容易にする。また、シートの厚さは０．１〜２ｍｍに製造して傷に適用する際にシートが破れることを防止し、シート内に十分な細胞数が含まれるようにして治療効果を高めた。
【００４９】
本発明のステップ（ｅ）は、脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートは生理食塩水で２〜３回洗浄して動物由来成分であるＦＢＳを除去し、より完全に除去するために無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄する。前記過程でＦＢＳが除去され、シートを人体に塗布する際に動物由来成分によって発生し得る副作用を最小化する。
【００５０】
本発明は、また脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを凍結保管する方法を含む。クライオバックにシートが十分に沈むように１０％ＤＭＳＯと５％人血清アルブミン溶液で構成された凍結保管剤を入れてシーリングした後、−８０℃で保管する。一般にたんぱく質酵素処理して単離された細胞、人口皮膚（表皮細胞または真皮細胞または両方の細胞で構成された人口皮膚）は−８０℃で凍結保管すると細胞が損傷して傷に適用する際に治療効果が減少すると知られている（非特許文献５）。しかし、本発明によって製造した脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートはヒドロゲルが幹細胞を包んでいるため、外部衝撃及びストレスから細胞を保護して−８０℃でも細胞を損傷せずに長期間保管することができるようにしている。
【００５１】
本発明による一様態において、傷の治療を増進するのに有用な有効量の１種以上の成長因子、サイトカイン、ホルモンまたは細胞外マトリックス化合物またはたんぱく質を本発明による造成物と一緒に投与してもよく、詳しくはＧＣＳＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＭＣＰ１、ＭＣＰ２、組織因子、ｂＦＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａｌ、ＨＧＦなどが例として挙げられるが、それに限ることはない。
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は本発明の例示に過ぎないものであって、本発明の範囲はこれらに限ることではない。
実施例１：人脂肪由来の中間葉幹細胞の培養方法
脂肪組織は普通脂肪吸引術で得られるが、それに限ることではない。
【００５２】
脂肪吸引によって得られた脂肪組織から以下のように脂肪由来の中間葉幹細胞を分離した：血液を除去するために脂肪組織を同じ容積のＰＢＳで３〜４回洗浄した。脂肪組織と同じ容積のコラゲナーゼ溶液を入れて３７℃の水浴で反応させた。これを遠心分離機用チューブに移して２０℃、１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上層液である脂肪層を除去し、下層であるコラゲナーゼ溶液を揺れないように注意して分離した。基質培地を入れて懸濁させた後、２０℃、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この際、下に沈むものがストローマ−血管分画であり、上層液を除去した。ストローマ−血管分画を基質培地に懸濁させて培養容器に接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。培養液を除去した後、リン酸塩緩衝溶液で洗浄し、基質培地または基質培地に塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が１ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれた増殖培地、または基質培地に上皮成長因子（ＥＧＦ）が５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれた培地を利用して増殖させた。脂肪由来の中間葉幹細胞が培養容器の８０〜９０％程度に育ったら、トリプシン処理し単一の細胞に分離して収得した。
実施例２：ヒドロゲルとしてのフィブリン糊の濃度決定
【００５３】
凍結乾燥されたトロンビンは塩化カルシウム溶液１ｍＬを添加して４００〜６００Ｉ．Ｕ．になるようにした。または、凍結されたトロンピンを解凍して同じ濃度になるように調節してから使用した。凍結乾燥されたフィブリノゲンにアプロニチン溶液１ｍＬを添加するか、凍結されたフィブリノゲンを解凍して７１．５〜１２６．５ｍｇ／ｍＬ（原液）を準備し１：５、１：１０、１：２０、１：４０になるように段階別に希釈した。前記実施例１で２継代以上培養した細胞を収集して懸濁した後、トロンビンを４０〜５０：１の割合（ｖ／ｖ）に混ぜてから段階別に希釈したフィブリノゲンと１：１混合してフィブリンゲルが形成されるようにした。３０分後、ゲルが完全に固まると１０％ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦが含まれた培養培地を添加してから３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで５日間培養した。培養２日目と５日目に細胞−フィブリンゲル混合物を取って薄く切片を製造した後、１０μg／ｍＬアクリンジンオレンジ／臭化エチジウム（ＡＯ／ＥｔＢｒ）で染色し、蛍光顕微鏡を利用して細胞形態と生存率を測定した。また、培養５日目にＷＳＴ−１を添加して細胞の増殖程度を測定した。
【００５４】
図１ａは、原液または希釈されたフィブリノゲン溶液で製造したフィブリンゲル内の幹細胞の形態と数を示す顕微鏡写真である。フィブリノゲン原液で製造されたフィブリンゲル内では５日目まで大部分の細胞の球状の細胞の形態をそのまま維持し、殆ど増殖していなかった。一方、希釈倍数が増加するほど細胞は速く繊維芽細胞の形態を形成し、より多く増殖していた。原液フィブリノゲンで製造したフィブリンゲル（３６〜６４ｍｇ）内では一部の死んだ細胞が観察されたが、希釈されたフィブリノゲンで製造したフィブリンゲル内では死んだ細胞が観察されなかった。即ち、３６〜６４ｍｇの高濃度フィブリンゲルは脂肪由来の中間葉幹細胞に対する細胞毒性が弱く存在するが、１８〜３２ｍｇ以下の濃度のフィブリンゲルは細胞毒性がないことを示している。
【００５５】
図１ｂは、フィブリノゲンゲルによる幹細胞の増殖能力をＷＳＴ−１を利用して定量的に測定して示したグラフであって、希釈倍数が増加するほど吸光度が増加した。即ち、フィブリノゲンを２０倍（３．６〜６．３ｍｇ／ｍＬ）または４０倍（１．８〜３．２ｍｇ／ｍＬ）希釈して製造したフィブリンゲルで幹細胞が最もよく増殖すること分かる。
実施例３：人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートの製造
【００５６】
前記実施例１で２継代以上培養した中間葉幹細胞を収集し、増殖培地で懸濁した。前記実施例２の結果に基づいて、トロンビンを最終８〜１．５Ｉ．Ｕ．になるように細胞懸濁液に添加した。支持体として、約１０×１０ｃｍの大きさの四角形の生分解性支持体であるビクリルメッシュ、牛の羊膜または非分解性支持体であるガーゼ及びＰＥＴフィルムに約３〜６．５ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲンを塗布し均一に塗布した。次に、トロンビンが含まれた細胞懸濁液を支持体にｃｍ２当たり約５，０００個になるように塗布した後、上下に丁寧に揺らして細胞−フィブリンゲルが支持体に均一に形成されて付着されるようにした。３０分後、フィブリンゲルが完全に固まると増殖培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで３〜５日間培養した。
【００５７】
図２ａは、人脂肪由来の中間葉幹細胞をフィブリンヒドロゲルと混合して生分解性支持体であるビクリルメッシュ、牛の羊膜、非分解性支持体であるガーゼまたはＰＥＴフィルムに付着してから培養して製造されたシートの写真である。即ち、本発明によって細胞−ヒドロゲルを生分解性または非分解性支持体に付着してシートを製造することでシートの強度を上げて取り扱いやすくした。また、細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートの厚さは０．１〜２ｍｍで、臨床的適用の際にシートが容易に破れるか破損することを防止し、幹細胞の含量を上げることで治療効果を増大するようにした。
【００５８】
図２ｂは、シートを顕微鏡またはＡＯ／ＥｔＢｒで染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。図２ｂに示したように、０日には球状の脂肪由来の中間葉幹細胞が支持体に低い濃度で分布されていたが、５日間培養した後には繊維芽細胞形態の細胞がヒドロゲルによって支持体に付着されて増殖されたことが観察された。シートｃｍ２当たり約２０，０００〜６０，０００個の細胞が均質に分布され、１００％生存していた。
【００５９】
他の実施例として、５日間培養した前記シートを生理食塩水で洗浄してＦＢＳを除去し、無血清ＤＭＥＭを添加して３７℃で１０日間放置した。３日、５日、７日、１０日目にＥｔＢｒ／ＡＯで染色して生存率を測定した。その結果、図２ｃに示したように前記発明によって製造したシート内で脂肪由来の中間葉幹細胞は無血清培地でも繊維芽細胞の形態を維持しており、３日目に９８％以上、７日目に９０％以上、１０日目には８０％以上生存していた。
実施例４：人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートの凍結保管
【００６０】
前記実施例３で製造した人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを洗浄して細胞培養液を除去した後、凍結保管剤（１０％ＤＭＳＯ及び人血清アルブミン溶液）が入っているクライオバックに入れて−８０℃で凍結保管した。約１ヵ月後、前記クライオバックを取り出して３７℃の恒温水槽に入れて揺らし、凍結保管剤を溶かして流した。生理食塩水を添加し上下に揺らして流した。１~３回更に追加洗浄して凍結保管剤を完全に除去した後、ＡＯ／ＥｔＢｒで染色して生存率を測定した。
【００６１】
その結果、図３に示したように、−８０℃で凍結保管してから解凍した人脂肪由来中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支体はシートの形態及び強度がそのまま維持されており、シート内の細胞も９５％以上生存していることに示された。即ち、本発明によって製造された人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートは主な有効成分である細胞を損傷せずに−８０℃で長期間冷凍保管が可能であることが分かる。
実験例１：人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の生物学的特性
【００６２】
前記実施例１で分離及び培養した脂肪由来の中間葉幹細胞は従来技術（特許文献４）によるものであって、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性で、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６及びＳｔｒｏ−１には陰性であった。前記実施例１から得た細胞を利用して製造した実施例３のシートを酵素処理してフィブリン糊を溶かした後、単一細胞に分離した。収集された細胞を１．５ｍｌの遠心分離用チューブに移し、ＦＡＣＳ染色溶液（１％ウシ胎児血清が含まれたリン酸塩緩衝溶液）１ｍｌを入れてよく混ぜた後、１０，０００ｒｐｍで５秒間遠心分離した。上層液を除去し、ＦＡＣＳ染色溶液１ｍｌに再浮遊して１０，０００ｒｐｍで５秒間遠心分離した後、上層液を除去しＦＡＣＳ染色溶液３００μlに再浮遊した。サンプルの数に応じて遠心分離用チューブ当たり約０．５〜１．０×１０６個の細胞が含まれるように新しいチューブに分柱し、抗体を添加し氷で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ染色溶液１ｍｌに再浮遊して１０，０００ｒｐｍで５秒間遠心分離してから上層液を除去した。ＦＡＣＳ固定液４００〜５００μlを添加し再浮遊してフローサイトメトリを利用して分析した。
【００６３】
その結果、図４に示したように、本発明によってヒドロゲル内で培養した脂肪由来の中間葉幹細胞は依然としてＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５に陽性反応を示し、ＣＤ３４、ＣＤ４５に陰性である免疫学的特性を維持していた。但し、ＣＤ１０５の発現は７０％以下で、従来技術（特許文献４）によって培養した際に比べて２０％以上減少していた。
実験例２：人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の成長因子の分泌
【００６４】
実施例３の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例４の凍結保管されたシートを解凍してＰＢＳで洗浄した後、０．８×０．８ｃｍに切り取って２５−ｗｅｌｌのプレートに２枚ずつ入れてＤＭＥＭ  １ｍｌを添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで７２時間培養した後、上層液を収集して中間葉幹細胞から分泌される代表的な成長因子であるＶＥＧＦ、ＨＧＦの量をＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。その結果、図５ａに示したように前記シートはＨＧＦ及びＶＥＧＦを分泌していた。
【００６５】
他の実施例として、前記収集した上層液を血管形成に関するサイトカインアレイキットを利用して分析した。その結果。図５ｂに示したように前記シートは血管形成を促進するＨＧＦ、ＶＥＧＦをはじめとする成長因子とサープリン（Ｓｅｒｐｒｉｎ）Ｅ１（ＰＡＩ−１）とＦ１（ＰＤＥＦ）、ＴＩＭＰ−１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＦＧＦ−２、ＤＰＰＩＶ（ＣＤ２６）のような多様なサイトカインを多量に分泌していた。即ち、本発明によって製造したヒドロゲル及び生分解性及び非分解性支持体を利用して培養した中間葉幹細胞を糖尿病性創傷のような傷部位に適用すると、細胞増殖及び血管形成を促進する多様な成長因子とサイトカインが持続的に分泌されることで傷の治癒を容易にすることができることが分かる。
実験例３：人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体のＥＣＭ分泌能
【００６６】
前記実施例３で製造した人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の凍結切片を製造した後、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで３０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、５％の正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）と０．１％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００を含むＰＢＳで３０分間浸透（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）及びブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。１次抗体を含むＰＢＳを添加した後、３７℃で１時間反応させてからＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体を添加し常温で３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄してからマウンティングし、蛍光顕微鏡で観察した。
【００６７】
図６はシート内の脂肪由来の中間葉幹細胞の細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）の分泌能を示す写真であり（ｘ４００）、ここに示したように本発明によって製造した脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体は全体的にコラーゲンタイプI、フィブロネクチン及びラミニンに陽性反応を示した。即ち、本発明によって製造した脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体を構成する細胞は多様な種類の細胞外基質を多量に分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質のヒドロゲル内に留まるため、体内に移植した際に多様な基質を提供することで創傷の治癒を容易にする。
実験例４：同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の免疫調節機能
【００６８】
実施例３の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例４の凍結保管されたシートを回答してＰＢＳで洗浄した後、それぞれ０．８×０．８ｃｍに切り取って２４−ｗｅｌｌのプレートに１枚ずつ入れた。そして、組織適合性抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）が他の供与者から得た抹消血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）５×１０５個を２４−ｗｅｌｌのプレートに添加した。陽性対照群としては抹消血液単核細胞にマイトジェンであるＰＨＡ（ｐｈｙｔｏ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を添加して抹消血液単核細胞の免疫反応を誘発した。反応開始後３日目に上澄液を収集し、分泌されたＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。
【００６９】
図７ａは同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の免疫反応の誘導能を示す図であり、ここに示したように陽性対照群である抹消血液単核細胞はＰＨＡによって活性化される一方、前記実施例３または４によって製造した同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体との反応ではＴＮＦ−αが殆ど分泌されていなかった。即ち、同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体は免疫反応を誘発しないことが確認された。
【００７０】
他の実験例として、抹消血液単核細胞５×１０５個を２４−ｗｅｌｌのプレートに入れ、ＰＨＡで活性化させて免疫反応を誘発し、前記実施例３または４によって製造した同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを０．８×０．８ｃｍに切り取ってプレートに１枚ずつ入れた。反応３日目に上澄液を収集し、ＴＮＦ−αの分泌量を測定した。
【００７１】
その結果、図７ｂに示したようにＰＨＡで活性化された抹消血液単核細胞で同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートはＴＮＦ−αの分泌量を６０％以上減少させた。即ち、同種の人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体は免疫反応を誘発せず、また過度な免疫反応が発生したら免疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加する役割をするＴＮＦ−αの分泌量を著しく減少する役割をする。よって、脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを糖尿病性創傷に覆うと、持続される創傷の炎症を緩和して創傷が治癒されるように助ける。
実験例５：脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体の傷治癒効果
【００７２】
雄のｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスを日本エスエルシー株式会社から購入し、血糖が２５０ｍｇ／ｄＬ以上になるまで純化した。手術のためにマウスにロンプンとゾレチル５０を１：１に混合して腹腔に投与した。麻酔されたマウスの胴部位を除毛器で除毛した後、イソプロパノールで消毒した。マウスごとに胴の両側に直径８ｍｍの円形の生検創傷を製造し、円形の創傷が維持され創傷が収縮することを防止するためにシリコーンスプリントを付着した。創傷をデジタルカメラで撮影した。実施例３人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを創傷と同じ大きさに切り取って創傷を覆った。創傷が十分に覆われるようにテガダーム（登録商標）で被覆し、その上に弾力保護帯で更に被覆した。５日後、テガダーム（登録商標）を丁寧に取り出して写真を撮影した後、更にテガダーム（登録商標）で覆った。その後約２週にわたって３日に一度ずつ連続写真を撮影し、ＮＩＨ画像プロセッシングプログラムであるＩｍａｇｅＪを利用して創傷の面積を計算して、初期創傷面積に対する百分率（％）で示して定量した。
【００７３】
その結果、図８ａに示したように創傷形成後８日までは人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを処置した群がビヒクル対照群またはヒドロゲル対照群の創傷の大きさに比べ減少する様相を示したが、統計的な差は観察されなかった。しかし、１１日から人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを処置した群がビヒクル対照群またはヒドロゲル対照群の創傷の大きさより有意に更に小さくなり、１４日目には人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートを処置した群の大部分の創傷が完全に閉ざされた一方、ビヒクル対照群、ヒドロゲル対照群、単一細胞処置群は一部の固体を除いては殆どのマウスにまだ創傷が残っていた。従来の技術で培養した単一細胞処置群は対照群に比べて創傷の大きさが減少していたが、有意な差は示さなかった。即ち、従来技術で培養した単一人脂肪由来の中間葉幹細胞は糖尿病性創傷に対する治癒効果が殆どないのに対し、本発明によって製造した人脂肪由来の中間葉幹細胞−ヒドロゲル−生分解性または非分解性支持体シートは糖尿病性創傷の治癒効果が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明による高活性の中間葉幹細胞を含む造成物またはシートは、たんぱく質分解酵素を利用した単離（選別）過程なしに高活性の幹細胞がそのまま傷部位に塗布されることができ、培養ステップで中間葉幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にヒドロゲルに貼布されて存在することで従来の治療剤に比べて皮膚再生及び傷の治癒能力が著しく優秀で治療期間を短縮することができる有利な効果を示すため、皮膚再生及び傷治癒用造成物またはシートとして有用に使用可能であるため産業上の利用可能性がある。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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