(57)【要約】【構成】本発明は、拡張性培養脳細胞の産生方法に関する。脳細胞は神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である。拡張性培養脳細胞は、生体の皮質および／または皮質下脳領域からの生検組織の培養によって得られる。生検組織は、脳深部刺激療法などの神経外科的な処置時に得ることができる。本発明の拡張性培養脳細胞は、神経学的疾病やその他の症状の治療に有用である。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性であることを特徴とする培養脳組織由来細胞。
【請求項２】
前記培養脳組織由来細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性である請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項３】
前記培養脳組織由来細胞がさらに少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項４】
前記培養脳組織由来細胞がさらに少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項５】
前記培養脳組織由来細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項６】
前記培養脳組織由来細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項７】
前記の少なくとも一つのＮＴＦが、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィンおよびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーのメンバーを有する請求項１に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項８】
前記培養脳組織由来細胞が、対象となる細胞分子を過少発現、発現または過大発現するように遺伝子学的に、あるいは生理学的に修飾されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項９】
前記培養脳組織由来細胞が、非遺伝子学的に修飾されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項１０】
前記培養脳組織由来細胞が研究グレードの細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項１１】
前記培養脳組織由来細胞を生体から得る請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項１２】
（ａ）生体から脳細胞を採取し、そして（ｂ）培養培地においてこれら脳細胞を拡張処理することによって拡張脳細胞を産生することを特徴とする拡張性脳細胞の産生方法。
【請求項１３】
前記脳細胞を生体の神経外科的な処置時に得る請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記拡張脳細胞が、少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である細胞を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィンおよびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーのメンバーの一つかそれ以上を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記拡張脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性の細胞を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記拡張脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性の細胞を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記拡張脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性の細胞を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、遺伝子学的に、あるいは生理学的に前記拡張脳細胞を操作して、対象となる分子を過少発現、発現または過大発現させる請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（ｂ）が（ｉ）前記脳細胞を成長培地で培養する工程、および（ｉｉ）脳細胞の培養物を継代培養する工程を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記脳細胞を生体内研究目的のために産生する請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療のために前記拡張脳細胞を産生する請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記拡張脳細胞が前記被験者に対してオートロガスである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）脳細胞を拡張する工程、そして（ｂ）被験者に有効量の前記拡張脳細胞を投与する工程を有し、神経学的障害の治療を前記拡張脳細胞によって加速する被験者の神経学的障害を治療することを特徴とする方法。
【請求項２５】
さらに、培養培地において前記脳細胞を培養し、培養された脳細胞が投与時に非免疫原性になるようにした請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養培地が脳組織を有する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記脳細胞を神経外科的な処置時に得る請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記拡張脳細胞が、少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である細胞を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ、ニューロトロフィンおよびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーのメンバーの一つかそれ以上を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記拡張脳細胞が、少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性の細胞を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記拡張脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性の細胞を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記拡張脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性の細胞を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
さらに前記拡張脳細胞を遺伝子学的に、あるいは生理学的に操作する請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記工程（ａ）で（ｉ）生体から脳細胞を採取し、（ｉｉ）この脳細胞を成長培地で培養し、そして（ｉｉｉ）脳細胞の培養物を継代培養する請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記脳細胞が生体に対してオートロガスである請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記脳細胞を、静脈内筋肉内、管こう内、気管内、腹腔内、皮下、脳内、心室内または髄腔内に投与する請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療への、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来脳細胞の使用。
【請求項３８】
前記培養脳細胞が被験者に対してオートロガスである請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療に使用する請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来脳細胞。
【請求項４０】
前記培養脳組織由来脳細胞が被験者に対してオートロガスである請求項３９に記載の培養脳組織由来脳細胞。
【請求項４１】
神経学的疾患または障害、あるいはその他の症状の移植治療に使用する細胞組成物の調製への、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養脳組織由来脳細胞の使用。
【請求項４２】
前記移植がオートロガス移植である請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
細胞の単離および培養する培養培地の最適化への、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項４４】
目的の細胞分子に対して脳培養細胞を選択する方法において、生体の脳から脳細胞を採取し、採取した脳細胞を培養して、拡張性脳細胞の培養物を得、目的の細胞分子に対してこの拡張性細胞を評価し、そしてこの評価に従って前記拡張性脳細胞を選択することを特徴とする方法。
【請求項４５】
神経栄養因子（ＮＴＦ）、オリゴデンドログリアタンパク質、前駆体マーカー、および間充織蛋白質の一つまたはそれ以上から目的のマーカーを選択する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
単離脳細胞が少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性であることを特徴とする単離脳細胞。
【請求項４７】
前記単離脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項４８】
前記単離脳細胞が、さらに少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項４９】
前記単離脳細胞が、さらに少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５０】
前記単離脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５１】
前記単離脳細胞が、さらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカー、および少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５２】
少なくとも一つのＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィンおよびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーのメンバーを有する請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５３】
前記単離細胞が研究グレードの細胞である請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５４】
遺伝子学的に、あるいは生理学的に前記単離脳細胞を修飾して、対象となる細胞分子を過少発現、発現または過大発現させる請求項４６に記載の単離脳細胞。
【請求項５５】
本発明の前記脳組織由来細胞およびキャリヤを有することを特徴とする組成物。
【請求項５６】
さらに、脳組織を有する請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
生体の脳から得られることを特徴とする培養脳組織由来細胞。
【請求項５８】
前記脳細胞を神経外科的処置時に得る請求項５７に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項５９】
前記の培養脳組織由来細胞を遺伝子学的に、あるいは生理学的に操作する請求項５７に記載の培養脳組織由来細胞。
【請求項６０】
前記の培養脳組織由来細胞が神経栄養因子（ＮＴＦ）、オリゴデンドログリアタンパク質、前駆体マーカー、および間充織蛋白質の一つかそれ以上に対して陽性である請求項５７に記載の培養脳組織由来細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体脳組織から得た細胞培養物に関するとともに、研究用途および臨床用途の両者におけるその産生方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、ドーパミン作動性間充織(dopaminergic mesencephalon）内の組織変性によるものとして良く認識されているが、中枢神経系、抹消神経系および自律神経系内のニューロンおよび非ニューロン細胞に広く影響する疾病である（１−４）。決定的な治療法はなく、現在の標準的な治療では症状制御を目的とするドーパミン置換療法および脳深部刺激療法（ＤＢＳ）を行っている。
【０００３】
脳内における効き目のある細胞保護剤として各種の神経栄養因子（ＮＴＦ）が確立され、現在ＰＤやその他の神経学的疾病の潜在的な治療有効性に関して評価が行われている。ＮＴＦには主に４つの科／ファミリー（ｆａｍｉｌｙ）がある。即ち、１．グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、２．ニューロトロフィン(neurotrophins)、３．ニューロキン（ｎｅｕｒｏｋｉｎｅ）、および４．大脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）/間充織アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）ファミリーである。これらタンパク質は発達中や成人の神経系の不可欠な生物学的プログラムを制御し、実験ＰＤモデルにおいて広範な再生効果および生存効果を与えるものである（５−１１）。ＮＴＦ治療の臨床への適用には、数多くの薬理学的難題、例えば低い血液脳関門透過性(blood brain barrier permeability)、小さな組織拡散および急激な実質内代謝によって制限がある。各種のタンパク質修飾を使用して、中枢神経系（ＣＮＳ）への浸透性ＮＴＦの吸収を促進し、マイクロ注入ポンプおよび遺伝子移入法を使用して脳内への直接送達を行っている（１０、１２）。これら技術的な進歩展開にかかわらず、臨床への応用は遅々として進まず、依然として脳内送達位置の適正な選択、実質組織薬剤レベルの十分性や外因性ＮＴＦに対する免疫増感に関して懸念がある。
【０００４】
胚幹細胞を使用して脳内の神経細胞またはグリア細胞を再生することは可能であるが、倫理的な理由やロジステックな理由によってＥＳ細胞の使用には障害がある（ＵＳ Pat.  No. ７９２３００７）。
【０００５】
適正な内因性遺伝子発現または適正な工学的な遺伝子発現を示す移植細胞の場合、ＰＤ罹患脳内への栄養剤の長期投与のための生物学的ビヒクルまたは移植基質として働く可能性がある。この方法の効果は、ターゲット領域内における移植細胞の持続性、ディスバースメント（ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）および機能によって定義が大きく変わる。オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）な組織源、特にＣＮＳ由来の組織源の場合、免疫学的関門をすり抜け、移植後のホスト環境に効率よく統合する移植体を発生するための適合性は高いが、残念ながら、ＣＮＳ組織はＰＤ患者から得ることができないため、大脳内移植体としての適合性および有用性を確保するためには生体外形質転換または複雑な遺伝子の再プログラミングが必要な他の細胞型の使用が義務付けられている。
【０００６】
ＤＢＳは、ＰＤ徴候学の管理に広く許容されている（２０）。外科的処置では、大脳内電極の定位的移植を可能にするため皮質の露出を最小限に抑える。一般的に、頭蓋骨孔は前頭葉の非雄弁的な領域に開け、この脳領域をサンプリングするための特権的な孔であり、臨床的に後遺症が残る恐れが小さい。
【０００７】
外科手術のＰＤ患者における脳生検組織は、治療において利用できるオートロガス(autologous)で、拡張可能なＣＮＳ細胞源を発生する十分なソース細胞を与えることが可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US Pat. No. ７９２３００７
【非特許文献】
【０００９】
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【発明の概要】
【００１０】
本発明は、生体の脳組織、サンプルまたは生検組織から得られる細胞および細胞培養物に関するとともに、研究、臨床の両者における産生方法および使用方法に関する。
【００１１】
本発明の一実施態様は、少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である培養脳組織由来細胞(cultured brain tissue-derived cell/cells)を提供するものである。
【００１２】
本発明の一実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞がさらに少なくとも一つのoligodendrogial/オリゴデンドログリア(oligodendroglia)タンパク質に対して陽性である。
【００１３】
本発明の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞がさらに少なくとも一つの前駆体／前駆体細胞マーカー(progenitor marker)に対して陽性である。
【００１４】
本発明の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞がさらに少なくとも一つの間充織(mesenchymal)蛋白質に対して陽性である。
【００１５】
本発明の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である。
【００１６】
本発明の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である。
【００１７】
本発明の培養脳組織由来脳細胞の別な実施態様の場合、上記の少なくとも一つのＮＴＦが、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）のメンバー、ニューロトロフィン、およびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーを有する。
【００１８】
本発明の培養脳組織由来脳細胞の別な実施態様の場合、対象となる細胞分子を過少発現、発現または過大発現するように遺伝子学的に、あるいは生理学的に修飾されている。
【００１９】
本発明の培養脳組織由来脳細胞の別な実施態様の場合、上記培養脳は非遺伝子学的に修飾されている。
【００２０】
本発明の培養脳組織由来脳細胞の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞は研究グレードの細胞である。
【００２１】
本発明の培養脳組織由来脳細胞の別な実施態様の場合、培養脳組織由来脳細胞を生体から得る。
【００２２】
本発明の一実施態様は、（ａ）生体から脳細胞を採取し、そして（ｂ）培養培地においてこれら脳細胞を拡張処理することによって拡張脳細胞を産生する拡張性脳細胞（ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｂｒａｉｎ  ｃｅｌｌ）の産生方法を提供するものである。
【００２３】
拡張性脳細胞を産生する方法の一実施態様の場合、上記脳細胞は生体の神経外科的な処置時に得られる。
【００２４】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞は少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性な細胞を有する。
【００２５】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞はさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性な細胞を有する。
【００２６】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、上記ＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィン、およびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーの一つかそれ以上のメンバーを有する。
【００２７】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞が少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対してさらに陽性の細胞を有する。
【００２８】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞が少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカー、および少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性の細胞を有する。
【００２９】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、さらに遺伝子学的にあるいは生理学的に上記拡張脳細胞を操作して、対象となる分子を過少発現、発現または過大発現させる。
【００３０】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、工程（ｂ）が（ｉ）上記脳細胞を成長培地で培養する工程、および（ｉｉ）脳細胞の培養物を継代培養する工程を有する。
【００３１】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、脳細胞を生体外研究目的のために産生する。
【００３２】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療のために拡張脳細胞を産生する。
【００３３】
拡張性脳細胞を産生する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞が上記被験者に対してオートロガス(autologous)である。
【００３４】
本発明の一実施態様は、（ａ）脳細胞を拡張する工程、そして（ｂ）被験者に有効量の上記拡張脳細胞を投与する工程を有し、神経学的障害の治療を上記拡張脳細胞によって加速する被験者の神経学的障害を治療する方法を提供するものである。
【００３５】
本発明の被験者の神経学的障害を治療方法の一実施態様の場合さらに、培養培地において上記脳細胞を培養し、培養された脳細胞が投与時に非免疫原性になるように構成する。
【００３６】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、培養培地が脳細胞を有する。
【００３７】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、脳細胞を神経外科的な処置時に得る。
【００３８】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞が、少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である細胞を有する。
【００３９】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性である細胞を有する。
【００４０】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、ＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィン、およびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーの一つかそれ以上のメンバーを有する。
【００４１】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞がさらに、少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性の細胞を有する。
【００４２】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞がさらに、少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性の細胞を有する。
【００４３】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、拡張脳細胞をさらに遺伝子学的に、あるいは生理学的に操作する。
【００４４】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、工程（ａ）で（ｉ）生体から脳細胞を採取し、（ｉｉ）この脳細胞を成長培地で培養し、そして（ｉｉｉ）脳細胞の培養物を継代培養する。この実施態様の一つの態様では、治療を受ける患者と上記生体が同じであるため、脳細胞は治療を受ける患者に対してオートロガスになる。
【００４５】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、脳細胞が被験者に対してオートロガスである。
【００４６】
本発明の被験者の神経学的障害を治療する方法の別な実施態様の場合、脳細胞を、静脈内、筋肉内、管こう内、気管内、腹腔内、皮下、脳内、心室内または髄腔内に投与する。
【００４７】
本発明の一実施態様は、被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療への本発明の培養脳組織由来脳細胞の使用に関するものである。
【００４８】
被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療への培養細胞の使用の一実施態様の場合、培養細胞が被験者に対してオートロガスである。
【００４９】
さらに別な本発明の実施態様は、被験者の神経学的障害またはその他の症状の治療への上記実施態様のいずれかの態様の培養脳細胞の使用に関するものである。一実施態様の場合、培養脳細胞は被験者に対してオートロガスである。
【００５０】
本発明の別な実施態様は、神経学的疾病または障害やその他の症状の移植治療に使用する細胞組成物を製造するために上記実施態様のいずれかの態様の培養脳組織誘導脳細胞を使用することに関する。一つの実施態様では、移植はオートロガス移植である。
【００５１】
本発明の別な実施態様は、細胞の単離および培養する培養培地を最適化するために上記実施態様のいずれかの態様の培養脳細胞を使用することに関する。
【００５２】
さらに別な本発明の実施態様は、目的の細胞分子に対して脳培養細胞を選択する方法に関するものである。この方法の一実施態様の場合、生体の脳から脳細胞を採取し、採取した脳細胞を培養して、拡張性脳細胞の培養物を得、目的の細胞分子に対して拡張性細胞を評価し、そしてこの評価に従って上記の拡張性脳細胞を選択する。
【００５３】
目的の細胞分子に対して脳培養細胞を選択する方法の一実施態様の場合、神経栄養因子（ＮＴＦ）、オリゴデンドログリアタンパク質、前駆体マーカー、および間充織蛋白質の一つまたはそれ以上から目的のマーカーを選択する。
【００５４】
本発明の別な実施態様の場合、単離脳細胞が少なくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）に対して陽性である。
【００５５】
本発明の一つの実施態様の場合、単離脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質に対して陽性である。
【００５６】
本発明の別な実施態様の場合、単離脳細胞がさらに少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である。
【００５７】
本発明の別な実施態様の場合、単離脳細胞がさらに少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である。
【００５８】
本発明の別な実施態様の場合、単離脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質および少なくとも一つの前駆体マーカーに対して陽性である。
【００５９】
本発明の別な実施態様の場合、単離脳細胞がさらに少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質、少なくとも一つの前駆体マーカーおよび少なくとも一つの間充織蛋白質に対して陽性である。
【００６０】
本発明の単離脳細胞の別な実施態様の場合、少なくとも一つのＮＴＦがグリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィン、およびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーのメンバーを有する。
【００６１】
本発明の別な実施態様の場合、単離細胞が研究グレードの細胞である。
【００６２】
本発明の別な実施態様の場合、遺伝子学的に、あるいは生理学的に単離脳細胞を修飾して、対象となる細胞の分子を過少発現、発現または過大発現させたものである。
【００６３】
本発明の別な実施態様は、本発明の脳組織由来細胞又は細胞およびキャリヤを有する組成物に関する。
【００６４】
本発明の一実施態様の場合、この組成物はさらに脳組織を有する。
【００６５】
本発明の別な実施態様は、生体から得られる培養脳組織由来細胞を提供するものである。
【００６６】
培養脳組織由来細胞の一実施態様の場合、上記脳細胞を神経外科的処置時に得る。
【００６７】
培養脳組織由来細胞の別な実施態様の場合、前記培養脳組織由来細胞を遺伝子学的に、あるいは生理学的に操作する。
【００６８】
培養脳組織由来細胞の別な実施態様の場合、培養脳組織由来細胞は神経栄養因子（ＮＴＦ）、オリゴデンドログリアタンパク質、前駆体マーカーおよび間充織蛋白質の一つかそれ以上に対して陽性である。
【００６９】
何らかの動作原理に拘るわけではないが、本明細書に開示する脳細胞は、細胞基質の拡張源を構成し、ＰＤやその他の神経学的症状および医学的症状又は疾病の治療に適用可能であると考えられる。
【００７０】
以下、本発明の各種の態様および好適な実施態様を示す図面について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】拡張性一次細胞培養物を産生するＰＤ患者の脳生検組織を示す図である。Ａ〜Ｃ）はＰＤ患者のＤＢＳ手術時に撮像した手術画像である。Ａ）前頭葉における１４ｍｍの頭蓋骨孔(burr hole)および硬膜孔を介して行った皮質露出である。Ｂ）軟膜切開および脳生検後の脳の外観である。Ｃ）生検部位に関しては、微小電極アレー（図示あり）およびそれに続くＤＢＳリード線の挿入ポータルとして使用する。生検組織は旺盛な増殖能力および特徴的な形態をもつ培養物を産生した。サブコンフルエンス(subconfluence)（Ｄ）では細胞は平坦で、広い多角形の体細胞および豊富な細胞質を有し、密度が高くなると（Ｅ）、細胞質は目立たくなり、体細胞が紡錘体状になり、細胞突起(lamellopodia)が細くなった。Ｆ）細胞は前駆体マーカーのネスチンの発現において旺盛であった。Ｅ）における評価スケールバーはパネルＤ）およびＥ）に関しては５０μｍで、Ｆ）における評価スケールバーは２０μｍである。
【図２】一次ＰＤ脳培養物における神経細胞系マーカーを示す図である。二人の異なるＰＤ患者（レーン１、２）の脳培養物からの細胞ライーセート(cell lysate)を使用した代表的なウェスタンブロット分析である。Ａ）ステム/前駆体細胞マーカーネスチン（１７６ｋＤａ）およびＣＤ１３３（９７ｋＤａ）だけでなくグリア蛋白質および神経堤蛋白質(neural crest proteins)ＧＬＡＳＴ（５６ｋＤａ）およびｐ７５ＮＴＲ（７０ｋＤａ）についても予想されるサイズの具体的なバンドを同定した。ＳＯＸ１０（５０ｋＤａ）は神経堤の発達およびオリゴデンドロサイト個体発生に関与するもので、オリゴデンドロサイトマーカーＯｌｉｇ１（２７ｋＤａ二重）およびＧａｌＣ（７５ｋＤａ）に加えて、信頼性高く同定されたものである。Ｂ）ニューロンマーカーβｌｌｌチューブリン（５５ｋＤａ）の発現はほとんど認められなく、アストロサイトおよびミクログリアマーカーＧＦＡＰ（４５ｋＤａ）およびｌｂａｌ（２０ｋＤａ）それぞれについては検出できなかった。正常な脳全体（ＷＢ）サンプルから単離されるたんぱく質は、これらの分析において、陽性コントロールとして供給される。Ｃ）間充織タンパク質コラーゲンｌ（１３８ｋＤａ）、コラーゲンｌｌｌ（１３８ｋＤａ）およびフィブロネクチン（２２０ｋＤａ）については、ばらつきなく同定できた。β−アクチン（４２ｋＤａ）はローディング・コントロール抗体として働き、それぞれ対応する神経細胞系マーカーＣｏｌｌ  ｌ（コラーゲンｌ）、Ｃｏｌｌ  ｌｌｌ（コラーゲンｌｌｌ）、ＦＮ（フィブロネクチン）、ＧａｌＣ（ガラクトセレブロシド）の下に示されている。
【図３】オリゴデンドロサイトマーカーＯｌｉｇ１が、ＰＤ脳生検組織から培養した細胞において間充織タンパク質と同時発現することを示す図である。共焦点顕微鏡写真に示すのは、Ｏｌｉｇ１（緑色染色）およびコラーゲンｌ（赤色染色パネルＡ〜Ｃ）またはフィブロネクチン（赤色染色、パネルＤ〜Ｆ）について二重免疫標識化した２つの代表的な細胞フィールドである。マージ（Ｍｍｅｒｇｅ）パネルＣ、Ｆの細胞は赤色染色および緑色染色を示し、Ｏｌｉｇ１が間充織タンパク質と同時発現していることが分かる。コラーゲンｌｌｌの発現はコラーゲンｌの発現と同様であった（データは省略）。スケールバーはＣｏｌｌ  １（コラーゲンｌ）およびＦＮ（フィブロネクチン）について２０μｍである。
【図４】パーキンソン病（ＰＤ）脳生検組織から培養した拡張細胞においてオリゴデンドロサイトマーカーが、間充織タンパク質とともに同時発現することを示す共焦点顕微鏡写真である。共焦点顕微鏡写真に示すのは、ＧａｌＣ（緑色染色）およびコラーゲンｌ（赤色染色パネルＡ〜Ｃ）またはフィブロネクチン（緑色染色、パネルＤ〜Ｆ）について二重免疫標識化した２つの代表的な細胞フィールドである。マージパネルＣ、Ｆの細胞は赤色染色および緑色染色を示し、ガラクトセレブロシド(galactocerebroside)が間充織(mesenchymal)タンパク質と同時発現していることが分かる。コラーゲンｌｌｌの発現はコラーゲンｌの発現と同様であった（データは省略）。スケールバーはＣｏｌｌ  ｌ（コラーゲンｌ）、ＦＮ（フィブロネクチン）およＧａｌＣ（ガラクトセレブロシド）について２０μｍである。
【図５】ＰＤ脳培養物が広いプロフィルのＮＴＦ発現を示す図である。パネルＡ及びＢのレーン１〜４は、個々の患者から採取したサンプルを示す。Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析から、予想されたサイズの単一の転写物が確認でき、各ＮＴＦについて配列特異性が確認できた。内部対照として働くＧＡＰＤＨ（２４７ｂｐ）を対応する下部パネルに示す。Ｂ）ウェスタンブロット分析から、ＧＤＮＦ（２４ｋＤａ）、ＢＤＮＦ（２８ｋＤａ）およびＣＤＮＦ（１８ｋＤａ）について適正分子量の特異的な蛋白質バンドが確認できた。対応するβアクチンブロット（４２ｋＤａ）を各ＮＴＦのブロットの下に示す。
【図６】拡張ＰＤ脳培養物からの細胞がオリゴデンドロサイトマーカー(oligodendrocyte marker)Ｏｌｉｇ１および多数の細胞保護ＮＴＦを同時発現したことを示す共焦点顕微鏡写真である。また、共焦点顕微鏡写真は、Ｏｌｉｇ１（緑色染色）及びＧＤＮＦ（赤色染色、パネルＡ〜Ｃ）、ＢＤＮＦ（赤色染色、パネルＤ〜Ｆ）またはＣＤＮＦ（赤色染色、パネルＧ〜Ｉ）について二重免疫標識化した３つの代表的な細胞フィールドを示す写真である。ＮＴＦそれぞれは、信頼性よく発現し、Ｏｌｉｇ１と同時局在していた。マージパネルＣ、ＦおよびＩの細胞は赤色染色および緑色染色を示し、同時発現を確認するものである。スケールバーは２０μｍである。ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子であり、ＣＤＮＦは大脳ドーパミン神経栄養因子であり、ＧＤＮＦはグリア由来神経栄養因子である。
【図７】拡張ＰＤ脳培養物からの細胞がオリゴデンドロサイトマーカー、ガラクトセレブロシドおよび多数の細胞保護ＮＴＦを同時発現したことを示す。また、共焦点顕微鏡写真は、ガラクトセレブロシド（緑色染色）、ＧＤＮＦ（赤色染色、パネルＡ〜Ｃ）、ＢＤＮＦ（赤色染色、パネルＤ〜Ｆ）またはＣＤＮＦ（赤色染色、パネルＧ〜Ｉ）について二重免疫標識化した３つの代表的な細胞フィールドを示す写真である。ＮＴＦそれぞれは、信頼性よく発現し、ＧａｌＣと同時局在していた。マージパネルＣ、ＦおよびＩの細胞は赤色染色および緑色染色を示し、同時発現を確認するものである。スケールバーは２０μｍである。ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子であり、ＣＤＮＦは大脳ドーパミン神経栄養因子であり、ＧａｌＣはガラクトセレブロシドであり、ＧＤＮＦはグリア由来神経栄養因子である。
【図８】ヒトＰＤ脳培養物におけるネスチン発現細胞についての蛍光補助細胞選別（ＦＡＣＳ）を示す図である。Ａ：ネスチン分析のドットプロットおよびゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）であり、そしてＢ：ネスチン標識化細胞および対照細胞の選別結果を示すグラフである。
【図９】ヒトＰＤ脳培養物におけるＯｌｉｇ１発現細胞についての蛍光補助細胞選別（ＦＡＣＳ）を示す図である。Ａ：Ｏｌｉｇ１分析のドットプロットおよびゲーティングである。Ｂ：Ｏｌｉｇ１標識化細胞および対照細胞の選別結果を示すグラフである。
【図１０】ｔｄＴｏｍａｔｏ発現レンチウィルス導入ＰＤ細胞を証明する共焦点蛍光顕微鏡写真である。（Ａ）は単細胞分裂の例であり、（Ｂ）は培養時のクローン拡張を示す。
【図１１】ＭＲＩで検出可能な鉄ナノ粒子で標識化したヒトＰＤ脳由来細胞の光学顕微鏡写真である。（Ａ）プルシアンブルー染色はヒトＰＤ細胞における鉄粒子を証明し、そして（Ｂ）はモールディローダミン(Moldayrhodamine)Ｂ標識化ＰＤ細胞の共焦点撮像を示す。
【図１２】脳由来ＰＤ患者細胞におけるヒト細胞質抗原（ＳＴＥＭ１２１抗体、ＳＴＥＭＣＥＬＬＳ  Ｉｎｃ．）の免疫標識化を示す図である。培養中の細胞は強い標識化（Ａ）を示し、非一次対照条件では背景信号は弱かった（Ｂ）。パネルＣ）に、ＰＤ細胞移植２８日後に免疫不全マウス線条体を介して高出力光顕微鏡法を使用して行った抗原標識化を示す。ＢにおけるスケールバーはパネルＡ、Ｂについては５０μｍで、Ｃにおけるスケールバーは１００μｍである。
【図１３】マウス脳におけるヒトＰＤ脳由来細胞の細胞ＭＲＩ追跡を示すマウス脳のクローンＭＲＩ像である。パネルＡは線条体における注射位置の細胞を示し、パネルＢは側脳室における注射位置の細胞を示し、パネルＣは大脳水道における注射位置の細胞を示す。
【００７２】
発明の説明
定義
特に断らない限り、本明細書で使用する技術用語および科学的用語はいずれも、本発明が属する分野における当業者が通常理解しているのと同じ意味をもつものである。また、特に断らない限り、請求の範囲を除いて、“または”は“および”と同じ意味を含意し、逆もそうである。特に断らない限り、あるいは特に逆のことを意味しない限り、非制限的な用語は、制限的に解釈すべきものではない。（例えば、“含む”、“有する”そして“からなる”は“制限の意味合いがない有する”を意味するものである）。請求項に含まれる“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”のような単数表現は、特に断らない限り複数表現を包含するものである。本発明の理解などを容易にするために、以下の例示的な、即ち非制限的な実施例を参照して本発明を説明する。
【００７３】
本明細書において、“有効量”とは治療対象被験者において医学的に望ましい結果をもたらすことができる組成物の量を指す。本発明の方法については、単独で実施してもよく、あるいは他の治療薬または治療方法を併用してもよい。
【００７４】
また、ある分子の過大発現とは、細胞内において多量に生み出される分子を指す。この過剰発現に関しては、例えば、ある遺伝子のコピー数を増やすことによって、ある遺伝子それ自身のプロモーターよりも強いプロモーターの下にこの遺伝子を置くことによって、あるいはサプレッサー遺伝子などの突然変異によって行えばよい。
【００７５】
また、ある分子の過小発現とは、ある細胞内において生み出されない分子、あるいは生み出されたとしても少量で生み出される分子を指す。
【００７６】
“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容でき、かつ一般的にヒトに投与したときに望ましくない反応をもたらさない組成物の分子要素および他の成分を指す。
【００７７】
“研究”とは、主に実験室規模の研究を対象とする本発明の細胞および方法を適用することを指す。即ち、研究用培養細胞に関しては、培養時ヒトやヒト以外の被検動物に導入しない。
【００７８】
“被検者”とは、ヒトやヒト以外の哺乳動物を指す。
【００７９】
“治療”とは、脳組織損傷を発症しているか、発症する恐れのある被検者、あるいはこのような脳組織損傷の原因となる障害を発症しているか、発症する恐れのある被検者に細胞組成物または細胞を始めとする組成物を投与して、このような損傷/障害の治療、緩和、軽減、矯正、予防又は改良などを行う行為を指す。
【００８０】
発明の概要
本発明は、生体被検者の脳組織から、例えばＤＢＳ（脳深部刺激療法：ｄｅｅｐ  ｂｒａｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）手術時に摘出した拡張性脳細胞、脳サンプルから拡張性脳細胞を産生する方法、および拡張性脳細胞の利用に関する。この拡張性脳細胞としては、神経栄養因子（ＮＴＦ）産生細胞であればよい。本発明のＮＴＦ産生細胞は、ＮＴＦを始めとする内因性および/またはエンジニアード治療薬を、例えば患部中枢神経系に持続的に送り込むことができる移植体基質またはコンジット（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｒ  ｃｏｎｄｕｉｔ）として使用することができる。本発明のＮＴＦ細胞は、生体内細胞トラッキングおよび遺伝子を基礎とする磁気共鳴撮像コントラスト強調法に好適である。本発明の拡張された脳細胞は、非遺伝子的に、あるいは遺伝子的に変更されたものであればよい。本発明の拡張された脳細胞は、蛋白質、核酸、脂質、糖類などを始めとする目的の細胞分子を過小発現（即ち、抑制、減衰、改善など）、発現または過大発現するように遺伝子的に、あるいは生理学的に変更されたものであればよい。本発明のＮＴＦ細胞それ自体は、ヒトおよびヒト以外の動物研究および臨床に使用することが可能である。臨床の場合、ヒトの臨床および獣医学的臨床の両者を含む。
【００８１】
脳細胞培養
本発明の一つの実施態様の場合、生体被検体の生体検査組織から誘導され、中枢神経系関連障害の治療に使用することができる脳細部の単離および培養に関する。
【００８２】
生体諸個人からの脳検査組織は、例えば、ＤＢＳ時に処置を受けている患者から得ることができる。
【００８３】
持続的でかつ有効な細胞治療に理想的な移植体としては、移植後のホスト環境に再統合するのに好適なＣＮＳ由来のオートロガス薬剤（ドーパミン、ＮＴＦ）産生細胞を例示することができる。本発明では、大脳皮質部位および/または大脳皮質下部位から得た生体検査組織から培養した脳細胞から、すくなくとも一つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現する実質的に均質な集団が得られることを見出した。これら培養物におけるＮＴＦの発現を確認したことに発明性があり、またこれらにはグリア細胞誘導ニューロトロフィン因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィン（即ちＢＤＮＦ）、およびそれぞれが前臨床パーキンソン病（ＰＤ）モデル（１０）において防止作用および/または再生作用をもつことが広く確認されている大脳ドーパミンニューロトロフィン因子（ＣＤＮＦ）/中脳アストロサイト誘導ニューロトロフィン因子（ＭＡＮＦ）ファミリーのメンバーが含まれる。さらに本発明では、脳の生体検査組織から培養した細胞がＮＴＦおよびオリゴデンドログリア細胞蛋白質に対して陽性になり得ることを確認した。また、本発明の培養脳細胞は同時にＮＴＦ、少なくとも一種のオリゴデンドログリア細胞蛋白質、始原細胞マーカーおよび少なくとも一種の間充織蛋白質を発現できることも確認した。
【００８４】
以下の実施例１に記載した方法を使用すれば、脳細胞培養物を調製することができる。
【００８５】
培養した細胞がＮＴＦ陽性であることを確認し、あるいはこれら細胞が同時に少なくとも一種のＮＴＦ、少なくとも一種のオリゴデンドログリア細胞蛋白質、少なくとも一種の始原細胞マーカーおよび少なくとも一種の間充織蛋白質を発現することを確認するために、標準的な分析によって、例えば以下の実施例に記載するような免疫化学的な分析によって細胞を試験または評価することができる。
【００８６】
培養した脳細胞は、１０またはそれ以上の継代経路を通じて成長培地において増殖できる。
【００８７】
培養した細胞は、公知の標準方法（例えば実施例１を参照）によって保存することができ、また脳内に、心室内または髄こう内に投与することができ、あるいは他の有効な送達経路によって必要とする被検者に投与することができる。また、細胞は被検者の一つかそれ以上の部位に投与することができる。被験者がＤＢＳに罹患している場合に、本発明の一つの実施態様では、電極挿入点として作用する部位に細胞を投与することができる。本発明の細胞の投与は、細胞を受け取る被験者にとってオートロガスでもよく、あるいはアロジェニック（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）でもよい。オートロガス投与の場合、本発明の培養細胞は採取部位にある大脳欠損部を介して、あるいは異なる脳挿入部位を介して目的の脳領域に投与することができる。アロジェニック投与の場合、本発明の培養細胞は大脳欠損部を介して、あるいは異なる脳挿入部位を介して目的の脳領域に投与することが可能である。
【００８８】
組成物  
本発明の培養細胞は、薬剤組成物または研究用組成物を調製するために使用することができる。
【００８９】
本発明の一つの実施態様は、ＮＴＦ陽性脳細胞とすることができる本発明の拡張脳細胞を含有することができる組成物を提供するものである。別な実施態様では、この組成物は本発明の拡張脳細胞と、脳組織とを有することが可能である。
【００９０】
薬剤組成物は治療上有効な量の本発明の細胞、適宜配合する他の活性物質および薬学的に許容できる基剤（ｃａｒｒｉｅｒ）を混合することによって製造することが可能である。基剤としては、投与経路に応じて、異なる形態を取ることができる。
【００９１】
薬剤組成物は、通常の薬剤用賦形剤を使用する製造方法によって製造することができる。賦形剤はいずれも崩壊剤、溶剤、製造粒剤、保湿剤および結合剤と混合することができる。脳細胞の有効量については、公知方法によって決定することができる。障害治療に有効な量は、当業者にとって公知な経験的な方法によって容易に決定することができる。ある患者に投与すべき正確な量は、障害の状態および深刻性、および患者の物理的状態に応じて選定すればよい。症候や特徴の測定可能な緩和度については、検査技術者が決定してもよく、あるいは患者が医者に伝えてもよい。なお、上記障害の症候または特徴の臨床的に有意な、あるいは統計的に有意な緩和度（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｒ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）は、本発明の範囲に包含されるものである。臨床的に有意な緩和度は、患者および/または医者にとって認識できる程度を意味する。薬学上許容できる塩、エステル類、アミド類およびプロドラグとは、健全な医学的判断の範囲内において患者の組織に接触使用しても、過度の有毒性、刺激、アレルギー反応を惹き起こさず、また合理的な危険度/受益度比に比例し、かつ意図する用途に好適な（カルボン酸塩、アミノ酸付加塩などの）塩、エステル類、アミド類およびプロドラグを指す。
【００９２】
本発明の薬剤組成物に適用することができる基剤とは、ある化合物と併用投与する希釈剤、賦形剤またはビヒクルを指す。このような薬用基剤としては水やオイル類などの殺菌処理液体を使用することができる。基剤、特に注射薬液用の基剤としては水または水溶液、塩化ナトリウム水溶液、水性デキストロース溶液、水性グリセロール溶液を使用するのが好ましい。好適な薬剤用基剤は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１８版に記載されている。
【００９３】
本発明の脳細胞は、点滴または注射（例えば、静脈内点滴または注射、脳内点滴または注射、髄こう内点滴または注射、筋肉内点滴または注射、管こう内点滴または注射、気管内点滴または注射、腹腔内点滴または注射、皮下点滴または注射など）によって、あるいは経口投与法、経皮投与法や他の公知方法によって患者個人に投与することができる。投与回数は２週間おきに一回、一週間に一回かそれ以上であればよいが、投与回数は疾患や障害の持続状態時には減らすことが可能である。
【００９４】
細胞については、ヘテロロガス(heterologus)細胞およびオートロガス(autologus)細胞の両者を使用することが可能である。前者の場合、ホスト（宿主）反応を避けるために、あるいはこれを最小限に抑えるためにＨＬＡマッチングを行うことができる。後者の場合には、被験者からのオートロガス細胞を富化処理し、精製処理し、後での使用に備えればよい。細胞は、ホストまたはグラフトＴ細胞の存在下で体外培養し、ホストに再導入すればよい。これには、ホストが細胞を自己の細胞として認識でき、Ｔ細胞活性を良好に低く抑えることができる作用効果がある。
【００９５】
方法および適用
本発明の一つの実施態様は、神経障害や他の症状の治療方法、および神経障害や他の症状の治療に使用するＮＴＦ陽性細胞を提供するものである。本発明の一つの実施態様による方法では、神経障害や他の症状に罹患しているか、あるいは神経障害や他の症状を発症する恐れがある被験者などの治療を必要とする被験者に有効量の本発明の拡張脳細胞を投与する。
【００９６】
神経障害としては、ＰＤ、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症やハンチントン(Huntington)病などの神経変性症を例示することができる。また、神経障害には例えば発作時に発症する大脳貧血を原因とする脳組織損傷も含めることができる。治療効果は、撮像技術（ＭＲＩ、ＣＴ、ドップラー超音波法など）を始めとする公知の標準的な技術によって評価することが可能である。被験者側においては治療前後に評価すればよい。
【００９７】
一つの実施態様では、上記細胞および方法を使用することによって、脳サンプルから誘導した細胞の体外拡張集団を効率良く確定することが容易になる。なお、このサンプルについては、脳深部刺激（ＤＢＳ）手術時に、あるいは中枢神経系に移植するのに好適な他の頭蓋神経手術時に採取することが可能である。具体的には、体外拡張脳細胞を使用することによって、中枢神経系の疾病やその他の症状を治療することが可能になる。本発明の方法の場合、移植され、再配置された器官の細胞遺伝子治療にも適用することが可能である。
【００９８】
以下に特別な実施例を示すが、いずれも例示に過ぎず、いかなる意味においても、以下の説明に限定を加えるものではない。これ以上詳しく説明するまでもなく、本明細書の開示に基づいて、当業者ならば本発明を完全に実施できるはずである。本明細書で言及した文献および優先権書類などはいずれもここに援用するものとする。以下に提出する作用機序などは、請求項に記載された発明の範囲を制限するものではない。従って、本発明の範囲に関しては、以下の実施例ではなく、請求項の記載およびその法的な等価物によって決定すべきものである。
【実施例】
【００９９】
実施例１−物質および方法
患者の選択および脳深部刺激（ＤＢＳ）手術
この研究は、ウエスタンオンタリオ大学の研究倫理委員会によって承認された研究である。被験者資格としてはパーキンソン病（ＰＤ）であるとの明確な診断が必要であり、またＤＢＳ手術に対する神経生理学的かつ医学的な適応性をもつことが必要であった。インフォームドコンセントについては、ＤＢＳ手術および研究参加の両者に関して各患者から得た。
【０１００】
手術適応ではあるが、手術前撮像時の、あるいは手術時の生体組織検査で解剖学的に望ましくない所見（著しい大脳委縮、顕著な脈管構造など）が発見された患者については、排除した。標準化された座標によって確認され、かつ患者の解剖学的所見によって補正された視床下核をＤＢＳターゲットとして使用して処置を行った。前頭葉の非雄弁的（ｎｏｎ−ｅｌｏｑｕｅｎｔ）領域全体にわたって頭蓋に頭蓋骨孔（１４ｍｍ）を穿孔し、微小電極およびＤＢＳリード線を埋設した。５チャネル式微小電極アレーを使用して、患者が覚醒した状態で電気生理学的なマッピングを行い、かつ刺激試験を行った。十分なターゲット・ローカリゼーション状態で、微小電極を取り外し、ＤＢＳリード線（Ａｃｔｉｖａ３３８９、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）を移植した。次に、パルス発生器（Ｋｉｎｅｔｒａ（登録商標）、あるいはＡｃｔｉｖａ  ＰＣ（登録商標）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）を胸郭上部の皮下組織にセットし、皮下延長ワイヤをもつＤＢＳリード線の先端に接続した。手術後７２時間以内にＣＴ(Computed tomography)画像および/またはＭＲＩ(magnetic resonance imaging)画像を得、リード線位置を確認し、脳梗塞または出血について評価した。
【０１０１】
脳生検および一次細胞培養
微小電極を挿入する前に、頭蓋骨孔を露出した状態で行った脳生検でＤＢＳプロトコルを修正した。硬膜を広く開き、軟膜を鋭く裂いた。顕微解剖器を使用して脳皮質表面直下から約０．５ｃｃ容量の組織を採取し、採取後、手術を標準法に従って行った。両側部位からの試料を各患者の単独組織源として結合した。脳サンプルを直ちに０．５％の胎児牛血清（ＦＢＳ）を含有するリン酸塩緩衝塩（ＰＢＳ）中に置き、手術室から実験室に移送した後、５ｍｌ容量のＰＢＳ中３７℃において０．２５％のトリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用し、さらにＤＮａｓｅ  ｌ（７５μｇ；Ｒｏｃｈｅ、Ｌａｖａｌ、ＰＱ、Ｃａｎａｄａ）を使用して２０分間加水分解した。１００μｍの細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で濾過後、１２００ｒｐｍで１０分間脳組織を遠心分離してから、１０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁してから、３５ｍｍの皿に２時間プレート（培養基）培養してから、血液細胞を分離した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）。次に、新たに１０μｍｌのポリ−Ｌ−リシン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で予め被覆処理した２４ウェルプレートの２つのウェルに上部の細胞懸濁液を移し、湿度５％のＣＯ２雰囲気中で３７℃で培養した。培養物を融合率約８０％で培養し、０．５３ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid)を含有する０．２５％のトリプシン（Ｗｉｓｅｎｔ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓｔ．Ｂｒｕｎｏ、ＰＱ、Ｃａｎａｄａ）を使用して１：２で分割した。培地は、一週間に２回変えた。それぞれの継代培養段階で、２０％のＦＢＳおよび１０％のジメチルスルフォキシドを含有するＤＭＥＭの凍結保存用培地に細胞を再懸濁させた。低温保存バイアルにアリコート（５×１０６細胞/ｍｌ）を移し、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）凍結容器（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ  ＬＬＣ、Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して凍結処理してから、−８０℃フリーザーまたは液体窒素に移した。表現型分析を継代培養４〜６中に行い、増殖細胞および前駆体細胞を選択した。このさい、培養物は形態において特徴的な均質性を示し、かつ急速成長した。
【０１０２】
ウェスタンブロット分析
ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を１：１０で追加補充した溶解バッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ｐＨ７．４）に一次細胞培養物から細胞を回収し、１５分間氷上で培養してから、超音波処理した。細胞溶解物を１３，０００ｇで１５分間遠心分離し、蛋白質上澄み液を回収した。非病態的な脳の凍結サンプル（１７０ｍｇ）から同様に単離した蛋白質を、ＰＤ細胞内では発現されない神経マーカーの陽性対照として使用した。ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して蛋白質濃度を求め、すべての画分を使用するまで−８０℃で凍結した。２０μｇの各蛋白質抽出物を１２％のナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)上で分離し、電気泳動によってｌｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＰＶＤＦメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）に移した。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝塩化ナトリウム水溶液中(Tris-buffered saline)の５％の粉末化脱脂乳でこのメンブランを室温で１時間ブロック処理してから、一次抗体を含有する同じ溶液中４℃で一夜培養した（表１）。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝塩化ナトリウム水溶液中でメンブランを洗浄してから、ホースラディッシュペルオキシダーゼで共役化した、ゴートアンチラビット二次抗体またはゴートアンチマウス二次抗体（１：３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して室温で１時間培養した。強調化学発光及び検出システム撮像装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用してペルオキシダーゼ活性を可視化した。
【０１０３】
１０％ナトリウムドデシルサルフェート溶液（２０ｍｌ）、トリスＨＣｌ（１２．５ｍｌ、ｐＨ６．８、０．５Ｍ）、超純水（６７．５ｍｌ）およびβ−メルカプトエタノール（０．８ｍｌ）を含有する緩衝液を使用して、５０℃で最長４５分間メンブランをストリッピングした後、超純水（２時間）で洗浄し、次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝塩化ナトリウム水溶液で（５分間）洗浄した。
【０１０４】
メンブランをブロック処理し、ローディング・コントロールとしてのβアクチンについてリプローブした。
【０１０５】
免疫細胞化学および顕微鏡検査
１２ｍｍの円形カバーグラス（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）上で３日間細胞を培養基で培養し、次にＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、０．２５％トリトンＸ−１００を含有したＰＢＳ中で１０分間透過処理した。非特異性蛋白質結合を１％牛血清アルブミン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ．、ＵＳＡ）でブロック処理してから、４℃で一夜一次抗体を使用して培養した（表１）。次にＰＢＳで細胞を洗浄し、１時間室温においてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ゴートアンチマウスｌｇＧおよび／またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６ゴートアンチラビットｌｇＧ二次抗体（１：１００）を使用して培養し、４’−６−ジアミノー２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色し、核視覚化した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）。これと平行して、一次抗体を使用せずに、対照カバーグラスを処理した。Ｚｅｉｓｓ６３×ＮＡ１．４油侵レンズ、適正なフィルターおよびＡＩＭソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０ＭＥＴＡレーザー走査型顕微鏡を使用して細胞を撮像した。無限１−３科学的補完金属酸化物半導体カメラ（Ｌｕｍｅｎｅｒａ  Ｃｏｒｐ．、Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を備えたＭｏｔｉｃ  ＡＥ３１倒立顕微鏡を使用して生きた細胞の明視野画像を得た。
【０１０６】
【表１】
2016518846.tif 000003
2016518846.tif 000004
【０１０７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびヌクレチオド配列
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して５×１０５個の細胞からトータル（全）ＲＮＡを単離した。サンプル毎に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｌｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して１μｇＲＮＡからｃＤＮＡを発生した。次に、ｃＤＮＡの１μｌアリコートを最終容量が２０μｌになるように、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのオリゴヌクレチオドプライマー(oligonucleotide primer)および１Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ混合物に添加した。ヒトＧＤＮＦ（順ｃｇｇａｃｇｇｇａｃｔｔtａａｇａｔｇａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）、逆ｇｇａａｇｃａｃｔｇｃｃａｔｔｔｇｔｔｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２））、ＢＤＮＦ（順ｔｔｇｇｃｔｇａｃａｃｔｔｔｃｇａａｃａｃａｔｇａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）；逆ｔｇｃｃｇｃｃｇｔｔａｃｃｃａｃｔｃａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４））、ＣＤＮＦ（順ｇｃａｔａｔｇｃｃｔｇｃａａｔｇａａｇａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）；逆ａｇｃｔｃｔｇｔｔｔｔｇｇｇｇｔｇｔｇｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６））またはグリセルアルデヒド３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；順ｇｇｔｇａａｇｃａｇｇｃｇｔｃｇｇａｇｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）；逆ｇｇｃｔｇｇｔｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｃｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）ｍＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）のカスタムプライマーを使用してｃＤＮＡを増幅処理した。標準アガロースゲル電気泳動を行い、デジタル撮像系（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して臭化エチジウム（０．５μｇ/ｍｌ）で可視化した。各サンプルを２回繰り返して評価し、ある特定の増幅処理体が二回の評価で検出された場合に、このサンプルを陽性とみなす。このプロセス時、ヌクレアーゼを取り除いた水を陰性対照として使用した。ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）をメーカーのプロトコルに従って使用してＲＴ−ＰＣＲを精製処理した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用してＬｏｎｄｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ；ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｌｒｇｃ．ｃａ/）ヌクレオチド配列処理を行った。単離されたＲＴ−ＰＣＲの配列特異性について、ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：//ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して確認した。
【０１０８】
実施例２−ＰＤ患者の脳生検から発生した拡張性細胞培養物
年齢５３〜７３歳の１９人のＰＤ患者の前頭葉から試料を採取した。軟膜分裂の範囲を局部的な脳のしわおよび血管解剖によって調べた。これら部位を試料採取後の微小電極挿入点とした（図１Ａ〜図１Ｃ）。各患者の前頭葉両側の組織の合計容量は、約０．５〜１．０ｃｃの範囲にあった。一人の患者は偏側ＤＢＳ処置を受け、そしてもう一人の患者は片側のみ解剖を受諾していた。術後１〜２６月間にわたって臨床上、放射線医学上の合併症は認められなかった。
【０１０９】
初期組織試料から形態学的に異種の培養物が得られ、培養基培養後１〜２週間で盛んな増殖を開始した。細胞は６〜１０継代で急速に分裂し、その後増殖は減速した。第４継代までに、培養物は均質な外観を示し、サブコンフルエント(subconfluent)な細胞は、平坦で多角形の体細胞およびブロードな突起を有する特徴的な外観を示した。密度が高くなる程、細胞質が目立たくなり、体細胞が紡錘体状になり、細胞突起(lamellopodia)が細くなった（図１Ｄ、図１Ｅ）。一年もの長期にわたって凍結した細胞アリコートは再培養時に再生し、増殖可能であり、成長速度は未凍結細胞に匹敵するものであった。
【０１１０】
実施例３−拡張ＰＤ脳培養物における混合系マーカーの発現
細胞表現型について、前駆体、分化神経（即ち、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドログリア）および間充織タンパク質の発現を明確に定義することによって評価した。細胞は、前駆体/幹細胞マーカーであるネスチンの旺盛な発現を示したが、ウェスタンブロット分析および免疫細胞化学（図１Ｆ、図２Ａ）において明白なＣＤ１３３のレベルはそれほど強くなかった。グルタミン酸・アウパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）および神経堤/グリア関連転写因子ＳＯ×１０を観察でき、その信頼性も高かった。オリゴデンドロサイト血統遺伝子であるＯｌｉｇ１およびミエリン特異性スフィンゴ脂質であり、オリゴデンドロサイトマーカーとして知られているガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）が、分析したすべてのサンプルにおいて標識化できた（図２Ａ）。ニューロンマーカーβｌｌｌチュービュリンのレベルはほとんど認められなく、またアストロサイトタンパク質またはミクログリアタンパク質、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（ｌｂａ１）それぞれの発現を検出できなかった（図２Ｂ）。オリゴデンドログリアマーカーＯｌｉｇ１およびＧａｌＣについては、ネスチン（データ省略）および間充織蛋白質、コラーゲンｌ、コラーゲンｌｌｌおよびフィブロネクチンとともに発現した（図２Ｃ、図３および図４）。
【０１１１】
実施例４−広いプロフィルのＮＴＦ発現を示すＰＤ脳培養物
評価対象の全患者サンプルの各神経栄養因子（ＮＴＦ）について、予想されるサイズの単一ｃＤＮＡ転写物を同定した（図５Ａ）。増幅したグリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）産生物は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ １９９２３１．２、ＮＭ ００１１９０４６９．１、ＮＭ ００１１９０４６８．１、およびＮＭ ０００５１４．３として公表されているヒトＧＤＮＦ転写変異型について報告されたものと同じであった。また、増幅したＢＤＮＦ産生物は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ １７０７３５．５、ＮＭ ００１１４３８１６．１、ＮＭ １７０７３４．３、ＮＭ ００１１４３８１３．１、ＮＭ ００１７０９．４、ＮＭ ００１１４３８１４．１、ＮＭ ００１１４３８１２．１、ＮＭ ００１１４３８０９．１、ＮＭ ００１１４３８０８．１、ＮＭ ００１１４３８１０．１、ＮＭ ００１１４３８１１．１、ＮＭ １７０７３３．３、ＮＭ ００１１４３８０７．１、ＮＭ ００１１４３８０６．１、ＮＭ ００１１４３８０５．１、ＮＭ １７０７３２．４、およびＮＭ １７０７３１．４として公開されているヒトＢＤＮＤ転写変異型の既知配列と同じであった。増幅した大脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）産生物は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ ００１０２９９５４．２として公開されているヒトＣＤＮＦ転写変異型の既知配列と同じであった。
【０１１２】
ウェスタンブロット分析および免疫細胞化学を使用してＮＴＦタンパク質発現を評価した。予想されるサイズのバンドおよびＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＣＤＮＦの細胞質発現が評価対象のすべてのサンプルにおいて検出できた（図５Ｂ）。二重標識化研究では、オリゴデンドログリアマーカーＯｌｉｇ１（図６）およびＧａｌＣ（図７）とともに各ＮＴＦの同時局在が確認できた。一時抗体を使用しないで調製した対照細胞には、二次蛍光色素の徴候は認められなかった（データは省略）。
【０１１３】
実施例５−ネスチン
ヒトＰＤ脳培養物中のネスチン発現細胞に関する細胞選別（ＦＡＣＳ）では蛍光を利用した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で走るＬＳＲｌｌフローサイトメーターを使用してデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏ（ｖ９．５．２）でＦＡＣＳデータを分析した。サンプル毎に第６継代または第７継代の約５０，０００個の細胞を使用した。異なるＰＤ患者サンプルを使用して、各選別を三度行った。図８Ａに、ネスチン分析のドットプロットおよびゲーティングを示す。図８Ｂに、ネスチン標識化および対照細胞選別の結果を示す。ネスチン抗体を使用して、細胞サンプルをほぼ完全に標識化できた。非一次対照（Ｃｏｎ１）細胞集団および未染色（Ｃｏｎ２）細胞集団はいずれもゲートパラメーター内には属さなかった。これら結果は、ヒトＰＤ患者の脳試料から単離し、かつ拡張したネスチン発現細胞の実質的に均質な集団と一致していた。
【０１１４】
実施例６−Ｏｌｉｇ１
ヒトＰＤ脳培養物中のＯｌｉｇ１発現細胞に関する細胞選別（ＦＡＣＳ）では蛍光を利用した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で走るＬＳＲｌｌフローサイトメーターを使用してデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏ（ｖ９．５．２）でＦＡＣＳデータを分析した。サンプル毎に第６継代または第７継代の約５０，０００個の細胞を使用した。異なるＰＤ患者サンプルを使用して、各選別を三度行った。図９Ａに、Ｏｌｉｇ１および分析のドットプロットおよびゲーティングを示す。図９Ｂに、Ｏｌｉｇ１標識化および対照細胞選別の結果を示す。Ｏｌｉｇ１抗体を使用して、細胞サンプルをほぼ完全に標識化できた。非一次対照（Ｃｏｎ１）細胞集団および未染色（Ｃｏｎ２）細胞集団はいずれもゲートパラメーター内には属さなかった。これら結果は、ヒトＰＤ患者の脳試料から単離し、かつ拡張したＯｌｉｇ１発現細胞の実質的に均質な集団と一致していた。
【０１１５】
実施例７−生体内ＭＲＩ細胞追跡
脳由来ＰＤ患者細胞の超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）標識化
標準ＳＰＩＯ粒子（５０〜１２０ｎｍ）、超微粒酸化鉄剤（ＵＳＰＩＯ、１０〜５０ｎｍ）およびミクロンサイズ酸化鉄粒子（ＭＰＩＯ、０．７５μｍ以上）を始めとする前臨床研究には各種の酸化鉄系標識を利用した。この研究では、ＰＤ脳由来細胞追跡用の鉄ナノ粒子モルディイオンローダミンＢ（ＭＩＲＢ）を使用した。
【０１１６】
脳由来ＰＤ患者細胞のＳＰＩＯ標識化のために、鉄ナノ粒子モルディイオンローダミンＢ（ＭＩＲＢ；ＢｉｏＰａｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＤ患者脳由来細胞を２４時間培養した。この粒子のコロイドサイズは３５ｎｍで、ゼータポテンシャルは＋３１ｍＶであり、ＭＲＩおよび蛍光顕微鏡法の両者を可視化するためにローダミンＢで架橋し、標識化を行う。細胞を８×１０４個/ｍＬの濃度でシード処理し、５０ｍｇ/ｍＬＭＩＲＢの鉄濃度において２４時間培養した。細胞を回収し、Ｈａｎｋｓ平衡塩化ナトリウム水溶液を使用して三回洗浄した。最後に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液（ＤＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）に細胞を再懸濁し、自動細胞カウンター（Ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞数を計数した。細胞間鉄を定量するために、前述したように、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、Ｖａｒｉａｎ、８００  ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を行った。パールズプルシアンブルー（ＰＰＢ）染色を使用して、細胞内の酸化鉄粒子を可視化する。すなわち、メタノール酢酸溶液によって細胞を固定し、塩化水素の２％カリウムフェロシアニド溶液を使用した染色を行う。スライドをリンス処理し、エオシンで対比染色し、キシレンで終わるアルコール脱水を行う。標識化細胞についても、ローダミン特異性フィルターを使用する蛍光顕微鏡法によって調べる。
【０１１７】
脳由来ＰＤ患者細胞へのｔｄＴｏｍａｔｏおよびＭａｇＡの導入
ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、対象となるタンパク質およびｔｄＴｏｍａｔｏを哺乳類細胞において同時発現させるレンチウィルス発現ベクトルである。ｔｄＴｏｍａｔｏと単独で発現する未変更ベクトルを使用するか、あるいはＭａｇＡ遺伝子の挿入に従ってＰＣ細胞を導入すると、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＭａｇＡが同時に発現する。ＭａｇＡ  ｃＤＮＡは、プライマー５´−ｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔｇａｔａａｇａａｃｇｃｇｔｃｃ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）および５´−ｔｔｇａｇａｔｃｇｇｃｇｇｃａｔｃｇｔｃａ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を使用するＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ｓｐ．ＡＭＢ−１のポリメラーゼ連鎖反応によって得られる。
【０１１８】
鉄分に富む培養物については、２５０μＭの硝酸第２鉄  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を追加補充した培地中で７日間細胞を培養することによって得る。体内のすべての細胞および組織に栄養を与える自然な毛細血管床へ血液供給機能に追従するように細胞培養条件を設定する。蛍光顕微鏡法を使用してｔｄＴｏｍａｔｏ発現を確認し、ＰＣＲ（４４）を使用してＭａｇＡ発現を確認する。ＭａｇＡ由来鉄コントラストは、ＩＣＰ−ＭＳ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ）および横断緩和率マッピング（４５）によって確認する。生体内撮像は、公表されているプロトコル（４６）を採用する３Ｔ法によって行う。
【０１１９】
マウス異種移植モデル
移植を目的として実施例１と同様にして得たＰＤ細胞懸濁液は、３μｌのリン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液中（ＰＢＳ）に約１×１０５個の細胞を含有する。走触性フレームに入れる前に、ＳＣＩＤ（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）に罹患している成体マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）にイソフルラン麻酔薬および０．０５ｍｇ/ｋｇのブプレノフィン（ｉ．ｐ．）を投与した。無菌条件下正中線開頭手術よって頭蓋骨穴を開け、硬膜を鋭く開き、線条体に注射する（前項からの座標：前後方向０ｍｍ、横方向±２ｍｍ、背腹方向２．５ｍｍ）。ハミルトンシリンジおよびマイクロインフュージョンポンプを使用して細胞懸濁液を５分間にわたって灌流し、さらに４分間放置して、細胞懸濁液の逆流を防止した後、これを取り出す。最初の３日間は一日に２回鎮痛剤を投与し、手術１０日後に抜糸した。特注の挿入可能な勾配磁場コイルを内蔵した３ＴＭＲＩシステムを使用してマウスの脳および細胞移植体をモニターする。細胞増殖性およびマイグレーションをモニターするために、細胞移植の翌日および生存最終日に線条体容積撮像および細胞追跡を行う。
【０１２０】
免疫組織化学および共焦点顕微鏡法
処置期間の最後に、あるいは神経学的に重篤な危険な徴候が認められた場合（例えば自力で飲食ができない場合）には早期に動物を安楽死に導く。１５０ｍｇ/ｋｇのペントバルビタールナトリウム（ｉ．ｐ．）をマウスに注射する。動物の深麻酔処理後、５ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液、次に３０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドを使用して経心腔的灌流を行う。脳を取り出し、次に凍結処理し、ｃｒｙｏｔｏｍｅ上で薄片化処理する。組織の一体性の評価に関しては基本的な組織学（即ちニッスル染色）を使用し、鉄分研究（プルシアンブルー）および免疫組織化学に関しては標準法において薄片を連続番号に従って使用する。薄片をスライドに置き、ＰＢＳで洗浄してから、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで１０分間透過処理する。１％の牛血清アルブミン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で非特異性蛋白結合をブロック処理してから、４℃において一夜一次抗体を使用して培養する。次に、薄片をＰＢＳで洗浄してから、室温で１時間Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧおよび／またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧの二次抗体（１：１００）を使用して培養した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）。二次抗体またはその組み合わせについては、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する細胞をローダミンＢで標識化するかどうかに応じて選択する。これと並行して、一次抗体を使用しない対照薄片を処理する。ヒトＰＤ細胞については、生体内においてｔｄＴｏｍａｔｏまたはローダミンＢ免疫蛍光によって同定する。また、ナイーブ細胞については、ヒトプラズママーカー（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、Ｉｎｃ．）に対して特異的なマウスモノクローン抗体を使用して同定する。さらに、移植されたヒトＰＤ細胞の表現型に関しては、細胞培養（４７）で評価した細胞系マーカーのパネルで評価する。Ｚｅｉｓｓ６３×ＮＡ１．４油侵レンズ、適正なフィルターおよびＡＩＭソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０ＭＥＴＡレーザー走査型顕微鏡を使用して薄片を撮像する。
【０１２１】
結果
図１０は、蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏ単細胞分裂を発現するレンチウィルス導入ＰＤ細胞（図１０Ａ）および培養物におけるクローン拡張（図１０Ｂ）を示す顕微鏡写真である。これら写真は、導入後数週間の間に撮影され、遺伝子操作後のＰＤ脳由来患者の細胞の増殖性を確認するものである。これらの修飾された培養物の特徴に関しては、ナイーブ細胞と比較した場合変化しない特徴を示す。スケールバーはパネルＡおよびパネルＢに関してそれぞれ５０μｍおよび１００μｍである。
【０１２２】
図１１は、ＭＲＩで検出可能な鉄ナノ粒子で標識化したヒトＰＤ脳由来細胞を示す図である。図１１Ａは、プルシアンブルー染色を示し、ヒトＰＤ細胞内に鉄粒子を確認できる。図１１Ｂは、モールディローダミンＢで標識化したＰＤ細胞の共焦点撮像を示す図である。モールディは、赤色蛍光タグをもつ３５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子である。細胞については、緑色細胞トラッカーであるカルボキシフルオレスセインスクシニミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）で対比標識化する。
【０１２３】
図１２に、脳由来ＰＤ患者の細胞中のヒト細胞質抗原（ＳＴＥＭ１２１抗体、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．）の免疫標識化を示す。培養中の細胞は強い標識化を示し（図１２Ａ）、非一次対照状態における背景信号は弱い（図１２Ｂ）。図１２のパネルＣに、ＰＤ細胞移植２８日後、免疫不全のマウス線条体に高出力光顕微鏡法を使用して行った抗原標識化を示す。矢印は、この研究のヒト細胞を示す。この抗体を使用して、生体内におけるナイーブＰＤ細胞を標識化し、導入ＰＤ細胞を同時標識化する。
【０１２４】
図１３に、モールディローダミンＢで標識化し、３Ｔ  ＭＲＩシステムを使用してマウスの脳内に移植した２日後に撮像したＰＤ細胞のＭＲＩ写真を示す。線条体の移植体付着位置における図１３のパネルＡには、細胞信号が顕著に認められ（矢印で示す）、周囲の脳における変化は最小であったことが示されている。図１３のパネルＢには、ＰＤ細胞が脳室系に侵入し、下角尾側方向(caudally in the temporal horn)（矢印で示す）に認められることが示されている。中脳水道のパネルＣには、細胞が脳室系の吻側尾側範囲(rostrocaudal extent)に細胞が分散していることが示されている。
【０１２５】
実施例８−動物研究
神経毒１−メチル−４−フェニルー１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を使用すると、パーキンソン病（ＰＤ）の信頼性の高いマウスモデルを得ることができる。ＭＰＴＰマウスを得るためのプロトコルは、ここに全面的に援用するＪａｃｋｓｏｎ−Ｌｅｗｉｓ  Ｖ、Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ  Ｓ．、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１）：１４１−５１に記載されている。ＭＰＴＰマウスの前頭頭頂領域に頭蓋骨孔を開ける。比較的小さな脳生検組織を得る（約０．５μｍ）。実施例１と同様にして脳生検組織を培養し、ＮＴＦ発現について（神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリー（ＧＦＬ）、ニューロトロフィンおよびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦファミリーについて）試験を行う。また、少なくとも一つのオリゴデンドログリアタンパク質（Ｏｌｉｇ１およびＧａｌＣ）、そして少なくとも一つのネスチンなどの前駆体マーカーについても培養細胞の試験を行う。また、コラーゲンｌ、コラーゲンｌｌｌおよびフィブロネクチンなどの少なくとも一つの間充織タンパク質についても培養細胞の試験を行う。マーカーの試験については、前記の実施例に従って行う。頭蓋骨孔を介して培養細胞を黒質および線条体の領域に移植する。オートロガス脳内移植および非オートロガス脳内移植の両者を行う。対照：（ａ）マウスに頭蓋骨孔のみを開ける（即ち、生検組織を得ない）、および（ｂ）マウスに頭蓋骨孔を開け、生検組織を得るが、細胞は移植しない。頭蓋骨孔を開ける５日前と、細胞移植から１週間後、７週間後、１４週間後および２８週間後に神経学的な行動測定を行う。身体の自発運動を調べる。脳は、組織病理学的にネスチン陽性細胞について、そして線条体黒質系ドーパミンシステムの欠損について評価する。別な実験では、細胞マーカーの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で培養細胞を標識化し、脳内注射後のＧＦＰ陽性の生存率および分布について上記に従って評価を行う。
【０１２６】
実施例９−遺伝子工学
生検組織から培養した細胞に遺伝子修正を加え、対象となるＮＴＦを過剰発現させ、および／または公知の遺伝子工学技術に従ってＰＤ治療特性を使用して遺伝子、分子またはタンパク質を発現させる。これら遺伝子工学細胞は、実施例８に記載した実験における別なグループとして使用する。
【０１２７】
実施例１０−検討
細胞をベースとする治療は、ＰＤ罹患脳における神経組織の再生を再配置、保存および促進する潜在的可能性をもつが、信頼性の高い基質および方法論はまだ確立されていない。本発明によれば、ＰＤ患者のＤＢＳ手術時に採取された小容量の脳生検組織から拡張性細胞集団を単離することが可能になる。最も顕著なことは、細胞がオリゴデンドログリア蛋白質および脳内の既知細胞保護属性を有する広いプロフィルのＮＴＦを発現したことである。培養物は、急速に成長でき、長期間の低温保存後も増殖できるものであった。
【０１２８】
ＰＤの細胞をベースとする治療の共通の目的は、ドーパミン源を補充することであり、またＮＴＦを脳に送り込むことである。これら方法は、顕著な生理学的な結果を生み出す可能性があり、前者の場合、ドーパミン作動系に低い駆動力または非調整的な駆動力を与え、そして後者の場合、理論的には、すべてではないにせよ多くの露出ＣＮＳ回路を支持する栄養分子を供給する。初期の神経移植研究の場合、胎児の中脳移植体を使用して線条体のドーパミン産生を促していた。非盲検および盲検臨床調査(open label and blinded clinical trials)の結果は、ばらつきがひどく、免疫拒絶、移植誘導運動機能異常、標準化された方法論の欠如、胎児組織の使用に関する倫理的な反対の意味を過少評価していた（２１−２６）。本発明が明らかにしたことは、移植基質の再生可能源が必要であり、オートロガスな組織は特に免疫適合性および倫理的な難題に関して自家移植以上に顕著な作用効果をもつことである。
【０１２９】
本発明は、固有な、あるいは環境がトリガーになる(environmentally-cued)オリゴデンドログリア特性をもつ細胞を成人の生体ＰＤ脳から採取した生検組織から安全に単離し、かつ拡張することを可能にするものである。培養物は前駆体および神経マーカー、特にネスチン、多機能性細胞に存在する中間フィラメント蛋白質、Ｏｌｉｇ１、オリゴデンドロサイト分化に必要な転写因子、およびＧａｌＣ、ミエリン関連糖脂質を発現した（２７−２９）。ＧＬＡＳＴ、ｐ７５ＮＴＲおよびＳＯＸ１０の同定が簡単であった。ＧＬＡＳＴはＣＮＳ全体に存在し、グリアに高度発現したグルタミン酸メンブラントランスポーターであり（３０）、一方ｐ７５ＮＴＲはニューロン死/生存経路、分化および神経突起伸長において機能し、そして発達中の神経システム、神経堤誘導体に成人脳の所定条件下で広く発現する（３１、３２）。ＳＯＸ１０は、神経堤および末梢神経系の成長やオリゴデンドロサイトの最終分化に不可欠な転写因子である。成人の場合、ＳＯＸ１０は主にオリゴデンドロサイト、シュワン細胞、メラニン形成細胞や神経堤幹細胞に存在する（３３−３６）。このマーカープロフィルは、成人脳試料におけるグリア前駆体の存在を支持する過去の研究知見に一致し、これを詳しく敷衍するものである（１４−２０）。これら細胞培養物にＮＴＦの存在が確認されたことは、新規であり、ＧＦＬ（即ちＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン（即ちＢＤＮＦ）およびＣＤＮＦ/ＭＡＮＦ（即ちＣＤＮＦ）ファミリーのメンバーを含み、いずれも臨床前のＰＤモデルにおいて保護および／または再生効果があることは広く文献に記載されている（１０）。オリゴデンドログリアタンパク質とＮＴＦの同時局在は、これら細胞がオートロガスなグリアとしてホスト脳に有効に戻ることが可能になり、広範で持続的な治療機能を担保することができるという魅力的な展望を開くものである。また、Ｏｌｉｇ１およびＧａｌＣ陽性細胞中に間充組織タンパク質（即ちコラーゲンｌ、コラーゲンｌｌｌ、フィブロネクチン）が存在するという予期しない発見もあった。これらや、その他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分については、正常なグリアや新生グリアにおいて報告され、いずれも医原性（即ちストレス反応）またはナイーブな分化状態を反映するものと考えることができる（３７−４１）。ＥＣＭタンパク質は細胞成長に深甚な影響を与え、ＰＤ培養物において直接葉状仮足伸長、マイグレーションおよび細胞相互作用に仕えることができると考えられる（４２−４３）。
【０１３０】
ＰＤ治療には革新的で個人向け方法が臨床上求められている。本発明によれば、生体ＰＤ患者のＤＢＳ手術時に採取した脳サンプルから拡張したオートロガスな細胞集団の独創的な方法および発現型の特性化が可能になる。標準的な大脳整形技術は、ＤＢＳに不向きな患者において同様な結果をもたらすことになる。制限的ではあるが、確実な自己再生はこれら細胞を生体内で拡張することを確実にするが、脳への移植時の新形成には向いていない恐れがある。これら培養細胞に認められる一貫性はあるが複雑な発現型は、ＣＮＳのミクロな環境内における細胞組み込み、固有な細胞保護や栄養上の影響において有望である。この技術分野におけるさらなる進歩は、ＰＤやその他の神経学的な疾病において待たれている新規な治療戦略に資するものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2016518846.tif 000023
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2016518846.tif 000028
【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2016518846.tif 000033
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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