(57)【要約】  本明細書に記載した本発明は、概して、治療で使用するための糖タンパク質を産生するための宿主細胞の糖鎖工学に関する。宿主細胞は、グリコシル化の生合成経路を発現するように改変されている。新規の原核宿主細胞は、ポリシアル酸または血液型抗原を含むＮ−結合型糖タンパク質を産生するように工学的に作製されている。
2016518825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性およびガラクトシルトランスフェラーゼ活性を含む組換え宿主細胞であって、脂質担体に連結した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ、ガラクトースまたはガラクトース−ＧａｌＮＡｃ残基を含むオリゴ糖組成物を産生する宿主細胞。
【請求項２】
フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選択される１種または複数の酵素活性をさらに含み、脂質担体に連結した少なくとも１つのフコース、シアル酸またはＧｌｃＮＡｃ残基を含むオリゴ糖組成物を産生する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
ＵｎｄＰ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵｎｄＰＰ  ＧａｌＮＡｃエピメラーゼおよびＵｎｄＰ  バシロサミントランスフェラーゼから選択される１種または複数の活性を有する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性が、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ活性を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性から選択される１種または複数の活性を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記フコシルトランスフェラーゼ活性が、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼから選択される１種または複数の活性を含む、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性が、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を含む、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記シアリルトランスフェラーゼ活性が、α２，３ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ、α２，６ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ、二機能性α２，３α２，８ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼおよびα２，８ポリシアリルトランスフェラーゼ活性から選択される１種または複数の活性を含む、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記ＵｎｄＰ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性が、ウンデカプレニル−リン酸  α−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＵｎｄＰＰ  ＧａｌＮＡｃエピメラーゼ活性が、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル−ジホスホ−ジトランス，オクタシス−ウンデカプレノール  ４−エピメラーゼ活性を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記ＵｎｄＰバシロサミントランスフェラーゼ活性が、ウンデカプレニルリン酸  Ｎ，Ｎ’−ジアセチルバシロサミン  １−リン酸トランスフェラーゼ活性を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、ウンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼおよびＯ−抗原リガーゼ活性から選択される酵素活性の少なくとも１種の減衰をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼおよびＮ−アセチルノイラミン酸アセチルトランスフェラーゼから選択される１種または複数の活性をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＧａｌＮＡｃエピメラーゼ活性をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
Ｇａｌエピメラーゼ活性をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
ＧＤＰ−マンノース  ４，６デヒドラターゼ、ＧＤＰ−フコースシンセターゼ、ＧＤＰ−マンノース  マンノシルヒドロラーゼ、マンノース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼおよびホスホマンノムターゼから選択される１種または複数の酵素活性をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルバシロサミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４，６デヒドラターゼおよびＵＤＰ−Ｎ−アセチルバシロサミントランスアミナーゼから選択される１種または複数の酵素活性をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
Ａ抗原、Ｈ抗原、Ｂ抗原、Ｔ抗原、シアリルＴ抗原、ルイスＸ抗原およびポリシアル化抗原から選択されるヒトまたはヒト様抗原として特徴付けられる１種または複数のオリゴ糖組成物を産生する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ａ．（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｂ．（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｃ．（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｄ．（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｅ．Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｆ．Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｇ．Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｈ．Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｉ．Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃ１−；
ｊ．Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｋ．Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｌ．Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｍ．Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｎ．Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｏ．Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｐ．Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｑ．Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｒ．Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｓ．Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｔ．ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｕ．ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｖ．ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ｗ．Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ｘ．Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ｙ．Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−Ｂａｃα１−；
ｚ．Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ａａ．Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；および
ｂｂ．Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃ１−
から選択される１種または複数のオリゴ糖組成物を産生する、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
目的の異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記目的のタンパク質が、前記オリゴ糖組成物を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記目的のタンパク質のＮ−グリコシル化アクセプター部位へ前記オリゴ糖組成物を転移しうるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性をさらに含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の宿主細胞によって産生されるオリゴ糖組成物。
【請求項２４】
請求項２０に記載の宿主細胞によって産生される糖タンパク質組成物。
【請求項２５】
請求項１または２に記載の宿主細胞を含む細胞培養物。
【請求項２６】
請求項１または２に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、オリゴ糖組成物を産生する方法。
【請求項２７】
請求項２０に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、糖タンパク質組成物を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦助成の研究および開発の陳述
本発明は、政府の支援によって、国立衛生研究所による助成金番号第１Ｒ４３ＧＭ０９３４８３−０１号、第５Ｒ４３ＡＩ０９１３３６−０１号および第５Ｒ４３ＡＩ０９１３３６−０２号の下でなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／８０１，９４８号に関連する。
【０００３】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている配列表を含む。［日付］に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、［．ｔｘｔ］と命名され、［＃＃＃＃＃＃＃］バイトのサイズである。
【０００４】
本明細書の開示は、概して、糖鎖生物学およびタンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本明細書に記載した実施形態は、オリゴ糖組成物および組換え宿主における治療用糖タンパク質の産生に関する。
【背景技術】
【０００５】
タンパク質薬剤およびペプチド薬剤は、莫大な臨床上の影響力を有し、７００億ドルの市場を占める。残念なことに、タンパク質薬剤の有効性は、多くの場合に、タンパク質分解、細網内皮系の細胞による取り込み、腎臓による除去および免疫複合体の形成から生じる制約によって損なわれる。このことは、有効な濃度に達する前に血液からの排除を引き起こし、治療時間域を許容しがたいほど短くしうる。これらの薬物動態学的な制約に寄与する有力な要因は、安定性および免疫原性である。これらの課題に対処するために、一次構造の変更、タンパク質へのグリカンもしくはポリマーのコンジュゲーション、または滞留時間の改善と免疫原性の低減のためのタンパク質のナノ粒子への封入を含めた取り組みがなされている。これまでの最もありふれたアプローチは、通常はＰＥＧ化と呼ばれる、モノメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）へのコンジュゲーションである。ＰＥＧ化は、タンパク質薬剤およびペプチド薬剤に、より長い循環半減期を付与し、免疫原性を低減しうる。多くのＰＥＧ化薬剤が今や臨床で使用されている（例えばアスパラギナーゼ、インターフェロンα、腫瘍壊死因子および顆粒球コロニー刺激因子）。しかし、ＰＥＧは、平常の解毒機序を介して生分解可能ではなく、ＰＥＧ化タンパク質の投与は、抗ＰＥＧ抗体を誘発することが見出されている。
【０００６】
ＰＥＧ化は、安定性を増強し免疫原性を低減するために広く許容されたアプローチであり、この場合、タンパク質は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）へコンジュゲートされる［１］。そのようなＰＥＧ化は、タンパク質上のαもしくはεのどちらかのアミノ基に連結するために、ヒドロキシスクシニミジルエステル基やアルデヒド基などの化学的に反応性のある側鎖を介した、ＰＥＧの線状鎖または分岐鎖のどちらかの共有結合性の付加を含む［２］。ＰＥＧは水溶性であり、タンパク質のサイズを増加させて、切断部位を塞ぐことによってタンパク質分解性の切断を低減するため、ＰＥＧ化は、タンパク質薬剤およびペプチド薬剤により長い循環半減期を付与し、免疫原性を低減しうる［１］。ＰＥＧ化の価値は、（ｉ）白血病の治療に使用される酵素であるアスパラギナーゼ［３］、および（ｉｉ）プリン代謝に関与するアデノシンデアミナーゼ［４］を含めて、いくつかのタンパク質について実証された。ＰＥＧ化は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［５］、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンα−２ａ（ＩＦＮα−２ａ）やＩＦＮα−２ｂ［１］などの、免疫学的因子の活性を増強するためにも使用された。ＰＥＧ化は、薬物動態学的な特性を増強しうる化学修飾である一方で、欠点がないわけではない。第１に、ＰＥＧ化の不均一性は、生物活性の異なる多数の相異なるアイソフォームを産み出す。これは、主にポリマーの多分散的な性質の結果である。第２に、完全には生分解性がないように思われる合成ポリマーを人体内に導入することに関して懸念が挙げられている［６］。第３に、ＰＥＧ化タンパク質のしばしば観察される延長された半減期は、コンジュゲーションの結果としての分子内の構造変化に関連して、生物活性の低減を伴いうる［２］。第４に、ＰＥＧ化の工程は、高価であり、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学反応と複数の精製とを要する［７］。このように、ＰＥＧ化は、循環半減期を増加させ、免疫原性を低減させるための方法として、臨床的に証明されている一方で、明確には最適な解決策ではない。
【０００７】
ＰＥＧ化に代わって台頭しつつある臨床上の代替は、天然のＮ−アセチルノイラミン酸（ポリシアル酸またはＰＳＡ）のポリマーがタンパク質へ付加することを伴う、ポリシアル化である。ＰＳＡは、ＰＥＧに類似した水和特性を伴う高い親水性を有し、自然免疫系および獲得免疫系を惹起せず、天然に合成されてヒト細胞上に提示される。ＰＳＡは、近年、インシュリンおよびエリスロポエチンのポリシアル化バージョンを用いて、臨床使用のために開発されており、それぞれが忍容性および薬物動態の改善を示している。残念なことに、ＰＥＧ化を用いる場合のように、ＰＳＡコンジュゲーションの工程は、技術的に難度がありかつ高価であり、医療消費者にとって最終産物をコスト面で使用不能にする。ＰＳＡコンジュゲーションは、標的タンパク質とＰＳＡの別々の産生および精製、ならびにタンパク質上の第一級アミン基へ化学結合するようにするためのＰＳＡの非還元末端のｉｎ  ｖｉｔｒｏの還元的アミノ化を要する。
【０００８】
ＰＳＡコンジュゲーションは、治療用タンパク質の活性寿命を増加させ、かつ免疫系によって認識されるのを防ぐために、非常に有効な方法であることが証明されている。ＰＳＡコンジュゲーションは、ＰＥＧ化を超えるいくつかの性能上の利点を有し、現在、臨床で供試されている。
【０００９】
自然免疫系および獲得免疫系を惹起しない分子は、循環血液中で長期間にわたって存続しやすい。ポリシアル酸［ＰＳＡ；Ｎ−アセチルノイラミン（シアル）酸のポリマー］は、そのような分子の１つであり、タンパク質の血清中持続性を改変しうるコンジュゲートとして、ＰＥＧに代わる天然の代替を与える。ＰＳＡは、脳の発達において抗接着機能を有する神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）上にほぼ限られて見出される、ヒトのポリマーである［８］。タンパク質および治療用ペプチド薬剤の送達に使用する場合、コンジュゲートＰＳＡは、保護的な微小環境を与える。このことは、循環中の治療用タンパク質の活性寿命を増加させ、免疫系によって認識されるのを防ぐ。ＰＥＧとは異なり、ＰＳＡは、天然の糖質分子として組織性シアリダーゼによって代謝される［９］。ＰＳＡの高親水性の性質は、ＰＥＧに類似した水和特性をもたらし、血液中に高い見かけ上の分子量を与える。このことは、ＰＳＡ特異性を有する受容体がこれまでに特定されていないために、循環時間を増加させる［１０］。
【００１０】
ＰＳＡは、天然に人体内に見出される一方で、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよび大腸菌のある特定の株などのバクテリアによって、莢膜として合成もされる［１１］。これらのポリシアル化バクテリアは、分子模倣を使用して、人体の防御系をかいくぐる。バクテリアＰＳＡは、タンパク質に繋がれている場合でさえ、完全に免疫原性がなく、臨床使用のためにＰＳＡが開発されているほどに、人体のＰＳＡと化学的に同一である。酸化ＰＳＡの非還元末端の還元的アミノ化は、タンパク質上の第一級アミン基を介したｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的コンジュゲーションをなし得、ＰＳＡコンジュゲーションの治療上の利益が、白血病および糖尿病の治療のために、アスパラギナーゼ［１２］、およびインシュリン［１３］をそれぞれ用いて実証されている。ポリシアル化されたインシュリンおよびエリスロポエチンを用いた治験由来の最新の臨床データは、これらのバイオ医薬が、薬物動態の増強を伴う良好な忍容性があることを示している［１４］。最近では、２つの興味深い発見が、ＰＳＡコンジュゲーションへの熱烈な関心を増やしている。第１に、化学的にポリシアル化された抗腫瘍Ｆａｂ断片が、非修飾のＦａｂに比べて、５倍のバイオアベイラビリティの増加と、それに伴って３倍の腫瘍取り込みの増加とをもたらすことが見出された［１５］。第２に、工学的に作製されたＣ末チオールに、部位特異的（無作為よりもむしろ）にＰＳＡを繋げることによって、全免疫反応性、増加した血液半減期、より高い腫瘍取り込み、および改善された特異性比を有した抗体断片を生じる［１４］。ＰＳＡコンジュゲーションは、治療上の価値を大幅に追加する可能性があり、ポリシアル化された抗体断片は、血清中半減期を改善し、Ｆｃドメインに関連のある懸案を緩和することによって、ＩｇＧ全体の実用的な代替となりうる。
【００１１】
残念なことに、ＰＳＡコンジュゲーションでさえ欠点がないわけではない。治療上の状況では有効である一方で、ＰＳＡコンジュゲーションの産生工程は、集約的であり、莫大な資本および加工コストが付いて回る。現在、産生には、労力の必要な８段階の工程が含まれる：（ｉ）大腸菌Ｋ１の発酵および（ｉｉ）莢膜被包の精製、（ｉｉｉ）治療用タンパク質を発現している大腸菌の発酵および（ｉＶ）治療用タンパク質の精製、（ｖ）膜アンカーからのＰＳＡの化学切断、（ｖｉ）ＰＳＡの精製、（ｖｉｉ）酸化ＰＳＡの非還元末端の還元的アミノ化による、治療用タンパク質上の第一級アミン基へのＰＳＡの化学架橋、ならびに（ｖｉｉｉ）ＰＳＡコンジュゲートタンパク質の精製。この８段階の工程は、２回の発酵と２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学反応と４回の精製とを要する。本工程は、ＰＳＡの標準的なアミン指向型化学コンジュゲーションが、望ましからぬ不均一性を持った無作為な付加パターンをもたらすという事実から、さらに複雑である［１４］。この課題に対処するために、部位特異的なチオール指向性の化学コンジュゲーションが使用されうる。しかし、これは、複数のＣ末チオールの付加を要し、この複数のチオールの付加は、大腸菌発酵で発現するには問題を孕み、哺乳類発現系を必要とする［１４］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、求められているのは、構造的に均一であり、かつ制御された費用効率の高い迅速な方法で、ヒト様に産生されるオリゴ糖組成物に連結した、治療用タンパク質を組換え産生するための方法および組成物である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に記載したのは、タンパク質上にポリシアル酸および血液型抗原を含むヒトまたはヒト様グリカンを、組換え産生するための方法および組成物である。本願の発明は、Ａ抗原、Ｈ抗原、Ｂ抗原、Ｔ抗原、シアリルＴ抗原、ルイスＸ抗原およびポリシアル化抗原を含むヒトまたはヒト様グリカンを、組換え産生するための方法および組成物を提供する。本法は、原核宿主細胞においてヒトグリカンを含有する非天然の糖を産生して、それをＮ−結合型グリカンとしてタンパク質に付加するためにさらに提供する。様々な宿主細胞が、指定のオリゴ糖構造を合成するのに必要な必須の糖ヌクレオチドおよびグリコシルトランスフェラーゼ活性を産生するための必要なタンパク質を発現するように工学的に作製される。
【００１４】
ある特定の態様では、組換え宿主細胞を培養して、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．２９０）およびガラクトシルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．３０９）を発現させるステップを含む方法および化合物が、オリゴ糖組成物を産生するために提供され、ここで、該宿主細胞は、脂質担体に連結した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ、ガラクトースまたはガラクトース−ＧａｌＮＡｃ残基を含むオリゴ糖組成物を産生する。
【００１５】
追加的な実施形態は、脂質担体に連結した少なくとも１つのフコース、シアル酸またはＧｌｃＮＡｃ残基を含むオリゴ糖組成物を産生するためのフコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６９）、シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４、ＥＣ２．４．９９．−、ＥＣ２．４．９９．８）およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）から選択される、１または複数の酵素活性の発現を提供する。
【００１６】
ある特定の実施形態は、ＵｎｄＰ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ７．８．３３）、ＵｎｄＰＰ  ＧａｌＮＡｃエピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．ｃ）およびＵｎｄＰ  バシロサミントランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．３６）から選択される、１種または複数の活性の発現を提供する。
【００１７】
ある特定の実施形態は、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−、ＥＣ２．４．１．３０６）の発現を提供する。
【００１８】
ある特定の実施形態は、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）、β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．２２）およびα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．３０９）から選択される１種または複数の活性の発現を提供する。
【００１９】
ある特定の実施形態は、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６９）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１５２）およびα１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６５）から選択される１種または複数の活性の発現を提供する。
【００２０】
ある特定の実施形態は、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．１０１）の発現を提供する。
【００２１】
ある特定の実施形態は、α２，３ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）、α２，６ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、二機能性α２，３α２，８ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．−、ＥＣ２．４．９９．４、ＥＣ２．４．９９．８）およびα２，８ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．８）から選択される１種または複数の活性の発現を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態は、ウンデカプレニル−リン酸  α−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．８．３３）の発現を提供する。
【００２３】
ある特定の実施形態は、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル−ジホスホ−ジトランス，オクタシス−ウンデカプレノール  ４−エピメラーゼ活性（ＥＣ５．１．３．ｃ）の発現を提供する。
【００２４】
ある特定の実施形態は、ウンデカプレニルリン酸  Ｎ，Ｎ’−ジアセチルバシロサミン  １−リン酸トランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．８．３６）の発現を提供する。
【００２５】
追加的な実施形態は、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．３）、ウンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．−）（ＥＣ２．７．８．３１）およびＯ抗原リガーゼから選択される酵素活性の少なくとも１種の減衰を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態は、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．５６）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．４３）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１４）およびＮ−アセチルノイラミン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４５）から選択される１種または複数の活性の発現を提供する。
【００２７】
ある特定の実施形態は、ＧａｌＮＡｃエピメラーゼ活性（ＥＣ５．１．３．２）の発現を提供する。
【００２８】
ある特定の実施形態は、Ｇａｌエピメラーゼ活性（ＥＣ５．１．３．２）の発現を提供する。
【００２９】
ある特定の実施形態は、ＧＤＰ−マンノース  ４，６デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．４７）、ＧＤＰ−フコースシンセターゼ（ＥＣ１．１．１．２７１）、ＧＤＰ−マンノース  マンノシルヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．４２）、マンノース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．１３）およびホスホマンノムターゼ（ＥＣ５．４．２．８）から選択される１種または複数の酵素活性の発現を提供する。
【００３０】
ある特定の実施形態は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルバシロサミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０３）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４，６デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１３５）およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルバシロサミントランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．３４）から選択される１種または複数の酵素活性の発現を提供する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、糖タンパク質上にＮ−結合型シアル酸残基を含む糖タンパク質組成物を提供する。好ましくは、Ｎ−結合型シアル酸残基を含む糖タンパク質組成物は、以下のグリコフォームのうち１種を含む：（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ、（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃおよび（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−（ＧａｌＮＡｃα１，３）。あるいは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃに変換する酵素活性が、選択された宿主系に導入されて発現される。例として、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃに変換するＮｅｕ酵素活性は、ＮｅｕＢ（シンターゼ）、ＮｅｕＣ（エピメラーゼ）およびＮｅｕＡ（シンターゼ）を含む。また、ポリシアル酸および／またはアセチル化形態を合成するために必要とされるＮｅｕＥ、ＮｅｕＳ（ポリシアリルトランスフェラーゼ）、ＮｅｕＤ（アシルトランスフェラーゼファミリー）、ＮｅｕＯ（ＰＳＡ  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ）およびＫｐｓＣＳを含めた酵素活性が発現される。ある特定の実施形態では、［α（２→３）Ｎｅｕ５Ａｃ］n、［α（２→６）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；  ［α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ］n、［α（２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ］nもしくは［α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ  −α（２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ］nまたはそれらの組合せを産生するための最小限の遺伝子であるｎｅｕＥＳおよびｋｐｓＣＳを使用して、ＰＳＡを産生する。いっそうさらなる実施形態では、糖タンパク質組成物は、約１から約５００までの規定の重合度を有し、好ましくはシアル酸残基数が２と１２５との間である。
【００３２】
本発明の様々な他の態様では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素の組合せを発現させて、例えばＨ抗原（Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ）；Ｔ抗原（Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃβ）；およびシアリルＴ抗原（Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ）を含有するグリカンを産生する。
【００３３】
様々な宿主細胞が、オリゴ糖および糖タンパク質組成物を産生するように工学的に作製されうるが、好適な発現系は原核宿主細胞を伴う。原核宿主細胞は、オリゴ糖組成物を目的のタンパク質のＮ−グリコシル化アクセプター部位上へ転移させうるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．１１９）をさらに含む。
【００３４】
好適な態様では、本発明は、目的の異種タンパク質を含む方法および宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、所望のオリゴ糖組成物を含む。したがって、本発明は、本明細書に記載したように産生される様々なオリゴ糖組成物を提供する。
【００３５】
他の好適な態様では、宿主細胞によって産生された糖タンパク質組成物が、本明細書に記載されている。より好適な態様では、糖タンパク質は、血清中半減期の向上、安定性の増強、免疫原性の低下や無免疫原性化など、薬物動態学的な特性を増強するか、所望の免疫反応を誘発する。
【００３６】
なお他の態様では、宿主細胞を含む細胞培養が提供される。さらに、組換え原核宿主細胞を培養するステップを含む、オリゴ糖組成物を産生するための様々な方法が提供される。組換え原核宿主細胞を培養するステップを含む、糖タンパク質組成物を産生するための様々な方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】種々のヒトおよびヒト様グリカン構造を含有するオリゴ糖、ならびにポリシアル酸（ＰＳＡ）の組換え産生の代表的な生合成経路を描写する図である。
【図２】ＲＣＡ（左）、ＳＢＡ（中央）により検出した細菌の細胞表面の工学的に作製されたヒトＴ抗原のＦＡＣＳ分析、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出したグリコシル化ｈＧＨ（右）を表す図である。
【図３】緩衝液またはβ１，３ガラクトシダーゼで処理した、組換え発現したヒトＴ抗原のＭＳを表す図である。
【図４】組換え産生した非グリコシル化ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴ（ｐＭＷ０７）またはＴ抗原グリカンを有するＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴ（ｐＪＤ−０７）のウエスタンブロット分析を表す図である。
【図５】Ｔ抗原グリカンにコンジュゲートしたＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴまたは非グリコシル化ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴで免疫したマウスからもたらされた血清を使用したＩｇＭ−またはＩｇＧ−クラス特異的ＥＬＩＳＡを表す図である。長方形は平均を表す。
【図６】Ｔ抗原−ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴ（グリコシル化）またはＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴ（非グリコシル化）で免疫したマウス由来の血清を使用したＥＬＩＳＡ結果を表す図である。ウェルをＴ抗原−ＧＦＰ４×ＤＱＮＡＴまたはＧＦＰ４×ＤＱＮＡＴでコーティングされている。
【図７】グルカゴン上に組換え的に発現させたヒト２，３シアリル−Ｔ抗原のＭＳを表す図である。
【図８】グルカゴンプラスミドでのｎｅｕＤＢＡＣの発現により改善されたグルカゴン上に組換え的に発現させたヒト２，３シアリル−Ｔ抗原のＭＳを表す図である。
【図９】シアリル化および連結を確認する、α２，３ノイラミニダーゼでの処理後グルカゴン上に組換え的に発現させたヒトシアリル−Ｔ抗原のＭＳを表す図である。
【図１０】グルカゴン単独（左）、またはヒト２，３シアリル−Ｔ抗原と（右）の経時ＭＳを表す図である。
【図１１】グルカゴン上に組換え的に発現させた２，６シアリル化Ｔ抗原のＭＳを表す図である。
【図１２】α２，３ノイラミニダーゼまたは非結合特異的ノイラミニダーゼで処理したグルカゴン上に組換え的に発現させた２，６シアリル化Ｔ抗原のＭＳを表す図である。
【図１３】ＮｅｕＮＡｃ（ａ）を添加した大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  ΔｎａｎＡの細胞表面の組換えＰＳＡ発現のドットブロット、および代表的グリカンの予測される結合（ｂ）を表す図である。
【図１４】ｐＪＬｉｃ３ＢＳ−０７およびＮｅｕＮＡｃ添加の存在下、αＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロット（上）、およびαＨｉｓ抗血清でヘキサヒスチジンタグの存在により検出した総タンパク質（下）を表す図である。
【図１５】ｐＪＬｉｃ３ＢＳ−０７の発現により産生された細胞表面ＰＳＡに対するｎｅｕＤ発現の作用を強調するドットブロットを表す図である。
【図１６】ＣｓｔＩＩ−ＳｉａＤ融合プラスミドでのＭＢＰ４ＸＧＴのｅｘ  ｖｉｖｏポリシアリル化の抗ＰＳＡ（上）および抗Ｈｉｓ（下）のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを表す図である。
【図１７】緩衝液対照またはα１，２フコシダーゼで処理した組換え的に発現させたフコシル化ヒトＨ抗原グリカンのＭＳ（ａ）、およびＧＤＰ−フコース生合成遺伝子の発現を伴う組換え的に発現させたフコシル化Ｈ抗原グリカンのＭＳ（ｂ）を表す図である。
【図１８】ｐＪＫ−０７グリコシル化プラスミドで発現させたＴＮＦαＦａｂのウエスタンブロットを表す図である。
【図１９】ヒトＨ抗原を有する組換えフコシル化グルカゴンペプチドのＭＳ（左）、ならびにヒトＨ抗原およびＧＤＰ−フコース生合成遺伝子のさらなる発現を有するグルカゴンペプチドのＭＳ（右）を表す図である。
【図２０】フコシル化および結合を確認する、緩衝液のみ、またはα１，２フコシダーゼで処理した組換え的に発現させたフコシル化グルカゴンペプチドのＭＳを表す図である。
【図２１】抗ｈＧＨ抗体で検出したｐＪＫ−０７で発現されたＧＨ２のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（左）、ならびにＨ抗原でグリコシル化したＧＨ２のＭＳ（右）を表す図である。
【図２２】ＧＨ２またはＧＨ２−Ｈ抗原のボルテックス後の経時的濁度の増大（ａ）、ならびにＧＨ２およびＧＨ２−Ｈ抗原の受容体結合を表す図である。
【図２３】それぞれのタンパク質の注射後に経時的にラット血清において検出したＧＨ２またはＧＨ２−Ｈ抗原のＥＬＩＳＡを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
略語および用語
以下の用語および方法の説明は、本願の開示をよりよく記載するために、および本願の開示の実施に際して当業者を指南するために、提供される。本明細書に使用する場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形の「ａ」もしくは「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は、１または複数のそのような細胞を含む。「ｏｒ」という用語は、別途文脈が明確に指示しない限り、陳述された代替の要素のうちの単一の要素または２以上の組合せを指す。
【００３９】
本明細書でふれた全ての刊行物、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
ＥＣ番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／にて入手可能）によって確立されている。本明細書で参照する場合のＥＣ番号は、京都遺伝子ゲノム百科事典が維持し、東京大学が一部を助成している、ＫＥＧＧリガンドデータベースに由来する。別段に示さない限り、ＥＣ番号は、２０１３年３月にデータベースに提供されていた通りである。
【００４１】
本明細書に参照する場合の受託番号は、米国国立保健衛生研究所が維持しているＮＣＢＩデータベース（国立生物工学情報センター）に由来する。別段に示さない限り、受託番号は、２０１３年３月にデータベースに提供されていた通りである。
【００４２】
本発明の方法および手法は、別段に示さない限り、概して、当技術分野に知られ、本願の明細書を通じて引用および議論している様々な総合的およびより特別な参考文献に記載されているような、既存の方法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２および２００２の補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第ＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００４３】
仮特許出願における「請求項」という用語は、実施形態または好適な実施形態と同義である。
【００４４】
糖タンパク質に関する「ヒト様」という用語は、タンパク質のアスパラギン残基のアミド窒素に連結した（Ｎ−結合された）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基のどちらかが付加したタンパク質を指し、このタンパク質は、ヒトで産生されるタンパク質と類似しているか、またはほぼ同一である。
【００４５】
「Ｎ−グリカン」または「Ｎ−結合型グリカン」は、Ｎ−結合型の糖類の構造を指す。Ｎ−グリカンは、タンパク質または合成の糖タンパク質中間体に付加されうるが、これらは、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで操作されうる。糖タンパク質上に優勢に見出される糖は、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸［例えばＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＮＡ、ＮｅｕＮＡｃ、ＳｉａまたはＮＡＮＡ）］である。ヘキソース（Ｈｅｘ）は、マンノースまたはガラクトースを指す。
【００４６】
「血液型抗原」、「ＢＧＡ」または「ヒト抗原」という用語は、互換的に使用され、オリゴ糖部分（複数可）を含む。
【００４７】
「ポリシアル酸」または「ＰＳＡ」という用語は、少なくとも２つのＮｅｕＮＡｃ残基を含むオリゴ糖構造を指す。
【００４８】
別段に示さない限り、そして「配列番号」の一般型式下で本明細書に記載した全ての配列に関する例について、「配列番号１を含む核酸」は、少なくとも一部が（ｉ）配列番号１の配列であるか、（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列である、核酸を指す。この二者の択一は、文脈によって決定付けられる。例として、核酸をプローブとして使用する場合、二者の択一は、プローブが所定の標的に相補的であるべきということの要求によって決定付けられる。
【００４９】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸もしくはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくは混合ポリマー）または糖タンパク質は、自然の宿主細胞において天然のポリヌクレオチドに自然に付随する他の細胞性構成成分、例えば、ポリヌクレオチドに自然に会合しているリボソーム、ポリメラーゼまたはゲノム配列から実質的に分離したものを指す。この用語は、（１）天然に発生している環境から除去されている、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が自然に見出される、ポリヌクレオチドの全てまたは一部と会合していない、（３）天然に連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結している、または（４）天然には発生しない核酸、ポリヌクレオチドにおよぶ。「単離された」または「実質的に純粋な」という用語は、組換えもしくはクローン化されたＤＮＡの単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種系で生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関連しても使用されうる。
【００５０】
しかし、「単離された」は、そのように記載した核酸、ポリヌクレオチドまたは糖タンパク質が、それ自体が天然の環境から物理的に除去されることを必ずしも必要としない。例として、生物のゲノム中の内在的な核酸配列は、当該内在的な核酸配列の発現が変化するように、当該内在的な核酸配列に隣接して異種配列が配置される場合に、「単離された」とみなされる。この文脈では、異種配列がそれ自体で内在的（同じ宿主細胞またはその子孫を起源としている）または外来的（異なる宿主細胞またはその子孫を起源としている）であろうとなかろうと、該異種配列は、当該内在的な核酸配列に天然には隣接しない配列である。例によれば、ある遺伝子が変化した発現パターンを有するように、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノム中のこの遺伝子の天然のプロモーターに置換されうる（例えば相同組換えによって）。この遺伝子は、天然にその側面に位置する少なくともいくつかの配列から隔てられているために、もはや「単離された」ものとなることになる。
【００５１】
核酸配列はまた、ゲノム中の対応する核酸において天然には発生しない任意の改変を含有する場合に、「単離された」と考えられる。例として、内在的な翻訳配列は、人工的に導入された、例えば人手の介入による、挿入、欠失または点変異を含有する場合に、「単離された」と考えられる。「単離された核酸」としては、非相同の部位で宿主細胞の染色体内に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物も挙げられる。さらに、「単離された核酸」は、実質的に他の細胞性素材がないか、または組換え手法によって産生される場合に、実質的に培養培地がないか、または化学合成される場合に、実質的に化学的前駆体または他の化学物質がないものでありうる。
【００５２】
「結合親和性」の用語は、標的受容体に対するタンパク質の結合を指す。グリコシル化されたタンパク質またはペプチドの結合親和性は、対応する非グリコシル化タンパク質またはペプチドの結合親和性の約０．０１％〜３０％に、または約０．１％から約２０％に、または約１％から約１５％に、または約２％から約１０％に及びうる。グリコシル化されたタンパク質またはペプチドの結合親和性は、非グリコシル化タンパク質またはペプチドの結合親和性に比べて、少なくとも約３倍に、または少なくとも約５倍に、または少なくとも約６倍に、または少なくとも約７倍に、または少なくとも約８倍に、または少なくとも約９倍に、または少なくとも約１０倍に、または少なくとも約１２倍に、または少なくとも約１５倍に、または少なくとも約１７倍に、または少なくとも約２０倍に、または少なくとも約３０倍に、または少なくとも約５０倍に、または少なくとも約１００倍少ない結合親和性に、増加または低下しうる。
【００５３】
タンパク質またはペプチドに適用する場合の「血清中持続性」の用語は、タンパク質またはペプチドが血液またはその構成成分において分解に耐える能力を指し、その分解には通常、血清または血漿中のプロテアーゼが関与する。血清中分解耐性は、実施例２０に示したように測定されうる。
【００５４】
別段に説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常に理解している通りと同じ意味を持つ。本明細書に記載したものと類似のまたは等価の方法および材料が、本願の開示の実施または供試に際して使用されうるが、適した方法および材料は、後段に記載される。材料、方法および実施例は実例にすぎず、限定を意図しない。本開示の他の要件は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかである。
【００５５】
様々な態様で、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学修飾のためのステップを加えることなく、単一の発酵において、ＢＧＡコンジュゲートやＰＳＡコンジュゲートされたタンパク質などのオリゴ糖を組換え産生するために、糖鎖工学的に作製された宿主細胞を提供する。好都合にも、糖鎖工学的に作製された宿主発現技術は、付加している多糖の位置および化学量論を制御することを可能にするものであり、過剰量のチオールおよび ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学反応の必要性を排除する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、オリゴ糖組成物を産生するための方法および組成物を提供し、本法は、組換え宿主細胞を培養して、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．２９０）およびガラクトシルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．３０９）を発現させるステップを含み、本法では、宿主細胞は、脂質担体に連結した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ、ガラクトースまたはガラクトース−ＧａｌＮＡｃ残基を含むオリゴ糖組成物を産生する。
【００５６】
図１は、ＢＧＡコンジュゲート、シアル酸またはＰＳＡコンジュゲートのいずれかのタンパク質を原核生物で産生するための、例示的な生合成の機序の概観である。好適な実施形態では、組換えオリゴ糖の合成は、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．３０６）を発現させることによって開始される。追加的な実施形態としては、組換えオリゴ糖の合成を開始するためのＷｂｉＰやＣｇｔＡなどの他のガラクトシルトランスフェラーゼの活性を発現させることが挙げられる。あるいは、組換えオリゴ糖の合成は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼの活性を発現させることによって、タンパク質のＮ−結合部位上で直接的に開始されうる［Ｒｕｓｈら（２０１０）、ＪＢＣ、第２８５巻、第３号、１６７１〜１６８０ページ］。さらに別の代替は、オリゴ糖合成を開始するためのバシロサミンを提供する。したがって、本願の発明は、ＧｌｃＮＡｃ残基、ＧａｌＮＡｃ残基またはバシロサミン上の組換えオリゴ糖の合成のための方法を提供し、これらの残基は、目的のタンパク質上へＮ−結合されうる。
【００５７】
ＵｎｄＰ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ７．８．３３）、ＵｎｄＰＰ  ＧａｌＮＡｃエピメラーゼ活性（ＥＣ５．１．３．ｃ）およびＵｎｄＰ  バシロサミントランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．８．３６）から選択される１種または複数の活性を発現するための方法および組成物も提供される。
【００５８】
ヒトＴ抗原
例示的な実施形態では、本発明は、様々なＢＧＡの産生のために求められる遺伝子機構を組換え発現させるための方法を提供する。ヒトＴ抗原を産生するための好適な方法は、アクセプター基質であるβ１，４ＧｌｃＮＡｃへのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ残基の転移を触媒する、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．２９０）を組換え発現させるステップを含む。宿主細胞は、ＧａｌＮＡｃアクセプターオリゴ糖をキャップしてヒトＴ抗原を生じる、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．３０９）をさらに発現する。図３は、構造：Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃと相関する組換え産生されたグリコフォーム、すなわちヒトＴ抗原の実験的な支持を与える。
【００５９】
ヒトシアリルＴ抗原
本発明の別の態様では、ヒトシアリルＴ抗原を産生するための方法が提供され、本法は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．２９０）、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．−）（ＥＣ２．４．１．３０９）およびａ２，３ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．９９．４、ＥＣ２．４．９９．−、ＥＣ２．４．９９．８）の組換え発現を含む。図７は、構造Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃと相関する、グルカゴンペプチド上の組換え産生されたグリコフォームのＭＳを表す。
【００６０】
さらに好適な実施形態では、シアル酸生合成タンパク質、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．５６）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．４３）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１４）およびＮ−アセチルノイラミン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４５）、例えばｎｅｕＤＢＡＣから選択される１種または複数の酵素活性を発現させることによって、グリコフォームのレベルの向上が生じる。図８は、糖ヌクレオチド酵素活性の異所性発現または発現増加を介して、グルカゴンペプチド上のシアリルＴグリコフォームのレベルが向上している、グルカゴンペプチド上の組換え産生されたグリコフォームを描写している。シアル酸の添加は、グリコシル化されたグルカゴンペプチドをα２，３ノイラミニダーゼで処理することによって確認された図９。
【００６１】
追加的な実施形態では、α２，６シアリルＴグリコフォームは、１種または複数のα２，６ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）を発現させることによって産生される。α２，３結合以外の結合、例えばα２，６シアリルＴグリコフォームを含むグルカゴンペプチドを、図１１に示す。
【００６２】
ポリシアル酸
他の例示的な実施形態では、本発明は、オリゴ糖組成物を産生するための方法を提供し、本法は、組換え宿主細胞を培養してＧａｌＮＡｃ残基をアクセプター基質に転移するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．−）、フコシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．６９）およびシアリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．９９．４、ＥＣ２．４．９９．−、ＥＣ２．４．９９．８）を含む１種または複数の酵素を発現するステップを含み、本法では、宿主細胞は、ポリシアル酸を産生する。
【００６３】
細胞壁上にＰＳＡがあるという証拠は、図１３および図１５に示されている。ＰＳＡグリコフォームの予想される構造的な結合としては、
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；および
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−（ＧａｌＮＡｃα１，３）n
が挙げられる。
【００６４】
選択された実施形態では、本発明は、ＰＳＡ産生に求められている遺伝子機構を組換え発現させるための方法を提供する。実施例１２に記載したように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１およびＫ９２のｋｐｓおよびｎｅｕ遺伝子を具えた莢膜生合成遺伝子座を代表する遺伝子が、大腸菌の好適な株を形質転換するために、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローニングされる。
【００６５】
他の選択された実施形態では、Ｎ−結合型オリゴ糖組成物は、［α（２→３）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→６）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ］nもしくはそれらの組合せを含むか、またはそれらからなる。
【００６６】
また、開示するのは、所望のＰＳＡオリゴ糖組成物を産生するための遺伝子である。ある特定の実施形態では、ＮｅｕＤＢＡＣＥＳなどのＮｅｕ活性およびＫｐｓＳＣＵＤＥＦなどのＫｐｓ活性のうち１種または複数が発現される。さらに他の実施形態では、ＫｐｓＭＴをコードする１つまたは複数の遺伝子が減弱される。本発明は、糖タンパク質上にＮ−結合型シアル酸を産生するための方法を提供し、本法は、宿主細胞を培養して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃからＰＳＡを産生するステップ、ならびにＯＳＴ活性を発現させるステップを含み、本法では、ＯＳＴ活性は、結果として生じる糖タンパク質のアクセプターアスパラギン上へシアル酸を転移する。
【００６７】
好ましくは、オリゴ糖構造は、タンパク質にＮ−結合されており、端部シアル酸残基を含み、より好ましくは、互いにα２−８またはα２−９結合を介して接続された少なくとも２個のシアル酸残基を含む、多糖であるポリシアル酸である。適したポリシアル酸は、２から１００ｋＤａの範囲の、好ましくは１から３５ｋＤａの範囲の重量平均分子量を有する。最も好適なポリシアル酸は、１０〜２０ｋＤａの範囲の、典型的には約１４ｋＤａの分子量を有する。
【００６８】
より好ましくは、Ｎ−結合型ＰＳＡの糖タンパク質は、約２〜１２５個のシアル酸残基を含む。ポリマー化したＰＳＡは、糖タンパク質上に転移すなわちＮ−結合されうるが、１０〜８０個のシアル酸残基を含むものもあれば、２０〜６０個のシアル酸残基または４０〜５０個のシアル酸残基を含むものもある。好適なＮ−結合型ＰＳＡの糖タンパク質組成物は、規定の重合度を有する。
【００６９】
追加的な実施形態では、糖タンパク質組成物は、第２のＮ−結合型オリゴ糖構造、例えばＮｅｕ５Ａｃ1-4Ｇａｌ1-4ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3-5ＧｌｃＮＡｃ1-2やＧｌｃＮＡｃ1-2などの真核生物、ヒトまたはヒト様グリカン、ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，４−［Ｇｌｃβ１，３］ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，３−Ｂａｃ−β１，Ｎ−Ａｓｎ（ＧａｌＮＡｃ5ＧｌｃＢａｃであり、ここで、Ｂａｃは、バシロサミンまたは２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシグルコースである）などのバクテリアのグリカンをさらに含む。Ｎ−結合型ＰＳＡとＮ−結合型オリゴ糖組成物との混合物もまた想定される。
【００７０】
糖鎖工学的に作製された大腸菌は、多様な脂質結合型Ｏ−抗原グリカンを、アクセプタータンパク質中の対応するアスパラギンへｉｎ  ｖｉｖｏで付加するために使用されている（Ｆｅｌｄｍａｎ  ＭＦら（２００５）、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００５年２月２２日、第１０２巻、第８号、３０１６〜２１ページ）。ＰＳＡのアミン指向性化学的コンジュゲーションは、無作為であり、許容しがたいほどの不均一な産物をもたらすことから、ＰＳＡなどの付加多糖の位置および化学量論を制御可能とすることは、極めて重要であろう。好都合なコンジュゲーションは、工学的に作製されたＣ端のチオールにＰＳＡを部位特異的に化学的カップリングすることによって、最近ようやく達成された。
【００７１】
ＰＳＡコンジュゲートされたタンパク質は、循環半減期を向上させ、安定性を与えることが期待される。ＰＳＡは、人体の天然の一部であることから、組換えＰＳＡ組成物は、化学的および免疫学的にヒトＰＳＡに類似しており（かつＰＥＧとは違い）シアル酸残基に対する組織性のノイラミニダーゼまたはシアリダーゼによって、分解または代謝されることが期待される。組換えＰＳＡ組成物はまた、生分解性ポリマーとして、免疫学的に姿が見えない。
【００７２】
組換え生合成の追加的な利点は、以下の通りである。ＰＳＡコンジュゲーションは、いくつかの込み入ったｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学反応と複数の精製とを要するのに対し、宿主細胞の発現を介した直接的なＰＳＡの組換え産生は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学反応の必要性を回避する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学架橋の前に、大腸菌Ｋ１の莢膜からＰＳＡを単離する必要がない。ＰＳＡの標準的なアミン指向性化学的コンジュゲーションによってもたらされる、無作為な付加パターンと望ましからぬ不均一性もまた回避される。部位特異的なチオール指向性化学的コンジュゲーションが使用されうるが、これは複数のＣ端チオールの付与と哺乳類宿主からの発現とを要する。資本コストおよび産生は、糖鎖工学的に作製された宿主を使用した効率的な産生および加工については低く保たれる。それゆえ、本発明の一態様では、方法および宿主細胞を、構造的に均一なヒト様グリカンを伴うＮ−結合型糖タンパク質を産生するための糖タンパク質の発現系として供給し、上記の限界と難題の多くを克服する。この宿主細胞は、ＰＳＡコンジュゲートされたタンパク質医薬に対する臨床上の明確な需要に応えるものである。
【００７３】
ヒトＨ抗原
さらに例示的な実施形態では、本発明は、組換え宿主細胞を培養して１種または複数の酵素を発現させるステップを含む、オリゴ糖組成物を産生するための方法を提供し、該１種または複数の酵素は、ＧａｌＮＡｃ残基をアクセプター基質上に触媒するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．４．１．−）；ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素活性（ＥＣ２．４．１．−）；ならびにα１，２フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．６９）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１５２）およびα１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．６５）から選択される１種または複数の活性を含む。ＧＤＰ−フコースの転移は、グリカンをα１，２フコシダーゼで処理することによって確認された図１７Ａ。構造α１，２Ｆｕｃ−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃと相関する組換え産生されたグリコフォームであるヒトＨ抗原を、図１７Ｂに示す。ヒトＨ抗原はまた、ＧＤＰ−フコース生合成機構を発現させるために組換え宿主を培養することによって、グルカゴンペプチド上に転移された（実施例１８）。Ｈ抗原を含むフコシル化糖ペプチドの産生の増加を図１９に示した。ＧＤＰ−フコースのグルカゴン上への転移は、グリカンをα１，２−フコシダーゼで処理することによって確認された図２０。
【００７４】
図１８は、ヒトＨ抗原を持ったグリコシル化ＴＮＦαＦａｂの重鎖を示している。したがって、例示的な一実施形態では、本発明は、ヒトＨ抗原を含むＴＮＦαＦａｂの重鎖を組換え発現するための方法を提供する。
【００７５】
原核生物発現系
好適な態様では、本発明は、真核細胞培養系またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的コンジュゲーションに関連のある重大なハードルを迂回するための魅力ある解決策として、糖タンパク質の産生系を提供する。産生媒材としてバクテリアを使用することによって、構造的に均一な糖タンパク質が産出されることが期待され、その一方で同時に、タンパク質薬剤の開発および製造に関連があるコストおよび時間を劇的に減少させる。鍵となる他の利点としては、（ｉ）バクテリアの遺伝子操作にまつわる膨大なデータがあること、（ｉｉ）タンパク質産生のためのバクテリアの使用実績があること、例えば、２００３年からＦＤＡによって認可されたタンパク質医薬の３０％が、大腸菌バクテリアで産生されている、（ｉｉｉ）数多くの企業内に、タンパク質薬剤をバクテリアで産生するための既存のインフラがあること、が挙げられる。
【００７６】
既に、大腸菌において外来性のグリカンをアクセプタータンパク質へ付加するための能力は示されている（Ｗａｃｋｅｒら、２００２、Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年１１月２９日、第２９８巻、第５５９９号、１７９０〜３ページ）。また、我々が所有権を有するＣ端のＧｌｙｃＴａｇを使用して、部位特異的かつ化学量論的な様式で、外来性のグリカンを組換えタンパク質に付加するための能力も実証されている（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３０１１０）。さらに、大腸菌において、脂質結合型多糖（例えばポリ−ＦｕｃＮＡｃ）をアクセプタータンパク質に付加するための能力が記載されている（Ｆｅｌｄｍａｎ、２００５）。最近、Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎらが［Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら、「Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ＡＯＰ（２０１２）］、大腸菌の細胞質膜のＵｎｄ−ＰＰ上でＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2の生合成および組立てを行うための生合成経路を開示しているが、これまでに、ＢＧＡコンジュゲートまたはＰＳＡコンジュゲートされたタンパク質を、簡素な発酵および精製の工程における発現プラットフォームから直接的に組換え産生するための能力を実証した研究はない。
【００７７】
核酸配列
選択された実施形態では、本発明は、開示された遺伝子の単離された核酸分子、そのバリアント、発現最適化形態、およびそれらを改善するための方法を提供する。
【００７８】
一実施形態では、野生型コード配列のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のホモログ、バリアント、および誘導体を含むまたはそれらからなる核酸配列を有する、単離された核酸分子が提供される。本発明は、野生型遺伝子の構造的および機能的に最適化されたバージョンである配列を含むまたは該配列からなる、核酸分子を提供する。好適な実施形態では、基質親和性、特異性および／もしくは基質触媒転換比率を最適化され、熱安定性、異なるｐＨでの活性を改善された、ならびに／または宿主細胞での発現を改善するためにコドン使用を最適化された、配列を含むまたは該配列からなる、核酸分子ならびにホモログ、バリアントおよび誘導体を提供する。
【００７９】
さらなる実施形態では、少なくとも６０％の同一性を有するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のバリアントである配列を含む、または該配列からなる、核酸分子ならびにホモログ、バリアントおよび誘導体を提供する。さらなる実施形態では、野生型遺伝子と少なくとも６２％、６５％、６８％、７０％、７５％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％、９９．９％の、もしくはいっそう高い同一性を有するバリアントである配列を含む、または該配列からなる、核酸分子ならびにホモログ、バリアントおよび誘導体を提供する。
【００８０】
別の実施形態では、コードされたポリペプチドは、野生型遺伝子と少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも５５％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％、より好ましくは９８％、９９％、９９．９％またはいっそう高い同一性を有する。
【００８１】
また提供するのは、上記の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子である。先に規定したように、また当技術分野で周知であるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、特定の条件一式の下で、特異的なＤＮＡのハイブリッドの熱融点（Ｔm）を約２５℃下回る温度で実施されるが、この条件では、Ｔmは、完全にマッチしたプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな洗浄は、特定の条件一式の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドのＴmよりも約５℃低い温度で実施されうる。
【００８２】
核酸分子としては、ＤＮＡ分子（例えば線状、環状、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、二本鎖または一本鎖）およびＲＮＡ分子（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を使用した本明細書に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体が挙げられる。本発明の単離された核酸分子としては、当該核酸の由来する生物の染色体ＤＮＡ中で天然に側面に配置する配列（すなわち、当該核酸分子の５’および３’末端に位置する配列）のない核酸分子が挙げられる。様々な実施形態では、単離された核酸分子は、当該核酸分子の由来する微生物の天然に側面に配置するヌクレオチド染色体ＤＮＡ配列を、約１０Ｋｂ、５Ｋｂ、４Ｋｂ、３Ｋｂ、２Ｋｂ、１Ｋｂ、０．５Ｋｂ、０．１Ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐまたは１０ｂｐより小さく含有しうる。
【００８３】
本明細書に記載する場合、遺伝子としては、別の１または複数の遺伝子から遺伝子間ＤＮＡ（例えば、生物の染色体ＤＮＡ中で天然に該遺伝子の側面に位置するおよび／または該遺伝子を隔てる介在ＤＮＡもしくはスペーサーＤＮＡ）によって隔てられた核酸分子、例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡをコードした核酸分子が挙げられる。
【００８４】
上記の核酸配列の任意の１つの断片を含む核酸分子も提供される。これらの断片は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを好ましくは含有する。さらに好ましくは、核酸配列の断片は、少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはいっそう連続したヌクレオチドを含有する。
【００８５】
別の実施形態では、核酸分子をコードする単離されたグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列表に記載のヌクレオチド配列を有する、核酸分子の全体または一部にハイブリダイズし、または、配列表に記載のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、核酸分子の全体または一部にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者に知られている［例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい］。別の実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に記載のヌクレオチド配列をコードするｎｅｕまたはｋｐｓ遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
核酸配列断片は、種々の系および方法において実用性を発揮する。例えば、該断片は、様々なハイブリダイゼーション手法において、プローブとして使用されることがある。方法に応じて、標的の核酸配列は、ＤＮＡとＲＮＡのどちらかであってもよい。標的核酸配列は、ハイブリダイゼーションの前に分画（例えばゲル電気泳動によって）されてもよいし、ハイブリダイゼーションは、ｉｎ  ｓｉｔｕで試料上に実施されてもよい。当業者は、染色体構造を決定する場合に（例えばサザンブロッティングによって）、および遺伝子の発現を測定する場合に（例えばノーザンブロッティングによって）、公知の配列の核酸プローブの実用性が見出されることを理解するだろう。そのような実験では、配列の断片は、望ましくは検出が可能となるように標識されており、その結果、標的配列との特異的なハイブリダイゼーションが、検出されるか、場合によっては定量されうる。当業者は、核酸断片が、本明細書に特段に記載されていない、広範な種類のブロッティング手法に使用されうることを理解するだろう。
【００８７】
本明細書に開示した核酸配列断片はまた、マイクロアレイ上に固相化されている場合に、プローブとしての実用性が見出されるということも理解されるべきである。支持基板上へ核酸を沈着および固定させることによってマイクロアレイを作り出す方法は、当技術分野で周知である。ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｓｃｈｅｎａ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻（１）（補遺）：１〜６０ページ（１９９９）；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃｈｅｎａ編、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）に概説されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。例えば、本明細書に開示された核酸配列断片などの核酸配列断片を含む、マイクロアレイを使用した遺伝子発現の分析は、細胞生物学または分子生物学の分野における十分に確立された配列断片についての実用である。マイクロアレイに固相化した配列断片についての他の使用は、Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、第２４巻、１６８〜１７３ページ（１９９９）およびＺｗｅｉｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１７巻、４２９〜４３６ページ（１９９９）；ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｓｃｈｅｎａ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻（１）（補遺）、１〜６０ページ（１９９９）；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃｈｅｎａ編、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）に記載されており、これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８８】
当技術分野で周知であるように、酵素活性は、様々な手段で測定される。例えば、ＯＭＰの加ピロリン酸分解は、分光学的に追跡されうる。Ｇｒｕｂｍｅｙｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、２０２９９〜２０３０４ページ（１９９３）。あるいは、酵素の活性は、高速液体クロマトグラフィーによるなどのクロマトグラフィー手法を使用して追跡される。ＣｈｕｎｇおよびＳｌｏａｎ、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、第３７１巻、７１〜８１ページ（１９８６）。別の代替としては、活性は、その酵素活性から作られた産物のレベルを決定することによって、間接的に測定される。より現代的な手法としては、質量分析計に連結したガスクロマトグラフィーを使用することが挙げられる［Ｎｉｅｓｓｅｎ、Ｗ．Ｍ．Ａ．（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（ＩＳＢＮ：０８２４７０４７３８）］。組換えタンパク質の活性および産物を特定するための追加の現代的な手法としては、液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、近赤外線（ＮＩＲ）分光法、粘度法（Ｋｎｏｔｈｅ、Ｇ．、Ｒ．Ｏ．ＤｕｎｎおよびＭ．Ｏ．Ｂａｇｂｙ、１９９７、Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ：  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｄｉｅｓｅｌ  ｆｕｅｌｓ、Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒｉｅｓ、第６６６巻、１７２〜２０８ページ）、物性に基づく方法、湿式化学法などが挙げられ、これらは、生物によって産生された産物のレベルおよびアイデンティティを分析するために使用される。他の方法および手法も、当業者におそらく知られるように、酵素活性の測定に適する場合がある。
【００８９】
別の実施形態は、変異型またはキメラ型の核酸分子または遺伝子を含む。典型的には、変異型核酸分子または変異型遺伝子は、単純な置換、挿入または欠失を含めるもこれらに限定されない少なくとも１つの変形を有する、核酸配列からなる。前記変異型のポリペプチドは、野生型の核酸分子または遺伝子によってコードされるポリペプチドとは異なる活性を表出しうる。典型的には、キメラ変異型ポリペプチドは、対応するドメインと同一線上となるように遺伝子工学的に作製された別のポリペプチド由来のドメイン全体を含む。好ましくは、変異型核酸分子または変異型遺伝子は、基質親和性、基質特異性、改善された熱安定性、異なるｐＨでの活性、改善された溶解性、改善された発現や宿主細胞での発現を改善するために最適化されたコドン使用などの、改善された活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９０】
単離されたポリペプチド
一実施形態では、核酸配列によってコードされるポリペプチドは、組換えＤＮＡ手法によって産生される、標準的なポリペプチド精製手法を使用して、適切な精製スキームによって、発現宿主細胞から単離されうる。別の実施形態では、核酸配列によってコードされるポリペプチドは、標準的なペプチド合成手法を使用して、化学的に合成される。
【００９１】
本発明の範囲内に含まれているのは、天然に発生したバクテリア遺伝子によってコードされる由来したポリペプチドまたは遺伝子産物である、グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドまたは遺伝子産物である。さらに、本発明の範囲内に含まれているのは、野生型遺伝子とは異なるバクテリア由来のポリペプチドまたは遺伝子産物であり、変形、挿入または欠失のある核酸を有するが、構造および／または機能が実質的に類似しているポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【００９２】
例えば、当業者が、核酸を変異（例えば置換）させて、遺伝子コードの縮重のために、天然に発生した遺伝子によってコードされるものに一致するアミノ酸をコードするものにしうることは、よく理解されている。このことは、特定の生物で発現される核酸のコドン使用を改善するために望ましい。また、当業者が、核酸を変異（例えば置換）させて、保存的なアミノ酸置換をコードするものにしうることは、よく理解されている。当業者が、アミノ酸をある程度まで置換、添加または欠失させて、遺伝子産物の機能および／または構造（例えばグリコシルトランスフェラーゼ活性）を、天然に発生した遺伝子産物に比べて、改善させるか、少なくとも実体なく影響されるようにしうることは、さらによく理解されており、それぞれの例は、本発明の範囲に含まれる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ活性、酵素／基質親和性、酵素の熱安定性および／または様々なｐＨにおける酵素活性は、影響を受けないかまたは合理的に変化され得、本明細書に記載したアッセイを使用して、容易に評価されうる。
【００９３】
様々な態様では、核酸分子によってコードされた、単離されたポリペプチド（変異タンパク質、対立遺伝子性のバリアント、断片、誘導体および類似体を含む）が提供される。好ましくは、単離されたポリペプチドは、基質親和性および／または基質触媒転換比率を最適化された配列に、好ましくは５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の、またはいっそう高い同一性を有する。
【００９４】
他の実施形態によれば、上記のポリペプチド配列の断片を含む、単離されたポリペプチドが提供される。これらの断片は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸を、より好ましくは少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはいっそう数多くの連続したアミノ酸を好ましくは含む。
【００９５】
ポリペプチドは、上記のポリペプチド配列と異種ポリペプチドとの融合も含む。異種配列は、例えば、精製を容易にするために設計された配列、例えばヒスチジンタグ、および／または組換え発現されたタンパク質の可視化を容易にするために設計された配列を含みうる。タンパク質融合体の他の非限定的な例としては、コードされたタンパク質をファージまたは細胞の表面に提示させうるもの、タンパク質の細胞内局在を変えるもの、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの本質的に蛍光をもつタンパク質への融合体、およびＩｇＧ  Ｆｃ領域への融合体が挙げられる。
【００９６】
分泌シグナル配列
選択された実施形態では、オリゴ糖コンジュゲートされたポリペプチドは、分泌シグナル配列と共に発現される。分泌シグナルは、膜の通過を容易にするアミノ端配列としうる。これらの実施形態では、宿主生物が原核生物である場合に、分泌シグナルは、膜内への挿入または膜を経る輸送を容易にする、タンパク質のリーダーペプチドドメインである。シグナル配列は、内部膜を横断した後に除去され、タンパク質は、ペリプラズム空間に保持される場合がある。
【００９７】
様々な分泌シグナルが使用されており、例としてはｐｅｌＢがある。エルウィニア・カロトーバ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａ）由来の２つのＰｅｌＢ遺伝子産物のバリアントからの分泌シグナルドメインの予測されたアミノ酸残基配列は、Ｌｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３１巻、５４３〜５４６ページ（１９８８）に記載されている。ＰｅｌＢタンパク質のリーダー配列は、以前に融合タンパク質のための分泌シグナルとして使用されている［Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４０巻、１０４１〜１０４３ページ（１９８８）；Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、第８６巻、５７２８〜５７３２ページ（１９８９）；およびＭｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、第８７巻、８０９５〜８０９９ページ（１９９０）］。本発明に有用な大腸菌由来の他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列としては、Ｏｌｉｖｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｄｈａｒｄ，Ｆ．Ｃ．編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、第１巻、５６〜６９ページ（１９８７）に記載されたものが挙げられる。
【００９８】
別の典型的な分泌シグナル配列は、遺伝子ＩＩＩ（ｇｉｌｌ）分泌シグナルである。遺伝子ＨＩは、繊維状ファージｆｄ（Ｍｌ３およびｒｌに類似）由来のマイナーカプシドタンパク質の１つであるＰｉｌｌをコードしている。Ｐｉｌｌは、１８アミノ酸のアミノ端シグナル配列を用いて合成され、膜内への挿入のためにバクテリアのＳｅｃ系を要する。
【００９９】
別の典型的な分泌シグナル配列は、ＳＲＰ分泌シグナルである。ＳＲＰ分泌シグナルは、例えば、ファージディスプレイ用の融合タンパク質の産生を改善するために使用されている［Ｓｔｅｉｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２４巻、８２３〜８３１ページ（２００６）］。ＰｅｌＢ分泌シグナルなどの最もよく使用されるＩＩ型分泌シグナルは、ＳｅｃＢ経路を使用する。そのため、ヒトｍＡｂの重鎖および軽鎖の発現用の本明細書に掲げる分泌構築物は、ＳＲＰ分泌シグナル、すなわち大腸菌ｄｓｂＡ遺伝子の分泌シグナルを使用する。本明細書に提供した方法、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに使用されうる他のＳＲＰ分泌シグナルとしては、ＳｆｍＣ（シャペロン）、ＴｏＩＢ（転位タンパク質）およびＴｏｒＴ（呼吸制御物質）が挙げられる。これらのシグナルの配列は、当技術分野に知られている。
【０１００】
大腸菌のＳｅｃＢ機序による分泌は、生成初期のポリペプチドが最初にトリガー因子であるＴＦへ、次いでＳｅｃＢへ付着するステップを含む。ＳｃＢタンパク質は、次いで、ペリプラズム内へタンパク質を分泌するＩＩ型分泌複合体への、完成されたポリペプチドの付着に向かう。理論に捉われなければ、いくつかの組換えタンパク質は、この機序によってはほとんど分泌しない形態へと折り畳まれる場合があると考えられている。逆に、ＳＲＰ機序は、異なる一連の分泌シグナルを認識し、ＩＩ型分泌複合体を介したペリプラズム内への生成初期ポリペプチドの共翻訳および分泌に向かう。この機序は、ＳｅｃＢ経路による分泌において発生しうる問題を避けるために使用されうる。
【０１０１】
当業者には、適した任意の分泌シグナル配列が、発現されたポリペプチドの分泌を容易にするために使用されうることは明らかだろう。
【０１０２】
ペリプラズムおよび培地中へのタンパク質の分泌
活性のある抗体の培養培地への分泌を決定するために、様々なＰ構築物の発現解析の間に採集した培地試料は、その抗原結合活性についてＥＬＩＳＡによってアッセイされる。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドまたは核酸分子は、少なくとも１０塩基長であるヌクレオチドの重合形態を指す。これらは、ＤＮＡ分子（例えば、直鎖、環状、ｃＤＮＡ、染色体、ゲノム、もしくは合成の二本鎖、一本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分枝状、ヘアピン状、環状または南京錠型の立体構造をとる）およびＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノム、または合成の）および記載のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子の類似体、ならびに非天然ヌクレオチド類似体、非天然のヌクレオシド間結合、もしくはその両方を含むＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。本発明の単離された核酸分子は、当該核酸が由来する生物の染色体ＤＮＡで天然に側面に位置する配列（すなわち、核酸分子の５’および３’末端に位置する配列）のない核酸分子を含む。様々な実施形態では、単離された核酸分子は、当該核酸分子が由来する微生物の天然に側面に位置するヌクレオチド染色体ＤＮＡ配列を、約１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．１ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐまたは１０ｂｐより小さく含有しうる。
【０１０４】
異種の核酸分子は、プロモーターおよび任意の他の５’調節分子に対して適正なセンス（５’→３’）の配向性と、正しい読み取り枠とで、発現系またはベクターに挿入される。核酸構築物の調製は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているような、当技術分野に周知である標準的なクローニング方法を使用して行われうる。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒへの米国特許第４，２３７，２２４号もまた、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを使用した、組換えプラスミドの形態での発現系の作製を記載する。核酸構築物の調製は、Ｓｈａｎｋｓら、ＡＥＭ、第７２巻、２（２００６）に記載されているような酵母における相同組換えによって代替的に供されうる。
【０１０５】
適した発現ベクターとしては、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有する発現ベクターが挙げられる。例えば、大腸菌が宿主細胞として用いられる場合は、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、またはｐＢＲ３２２などのプラスミドが用いられることがある。他の適した発現ベクターは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。例えば核酸構築物の調製、変異、シークエンシング、ＤＮＡの細胞内への導入および遺伝子発現などの核酸の操作、ならびにタンパク質の解析のための、多くの公知の技術およびプロトコールは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９２）に、詳細に記載されている。
【０１０６】
相異なる遺伝子性シグナルおよびプロセシング現象は、遺伝子発現の多くのレベル［例えば、ＤＮＡの転写およびメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の翻訳］と、引き続いてリボソーム表面に提示される融合タンパク質の量とを制御する。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、その結果ｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である、プロモーターの存在に依存する。プロモーターは、その「強度」（すなわち転写を促進するための能力）が異なる。クローニングされた遺伝子を発現させるには、高レベルの転写と、それによって発現と表面提示とを得るために、強力なプロモーターを使用することが望ましい場合が多い。そのため、利用される宿主系に応じて、ストール配列と繋げた目的のタンパク質をコードするデオキシリボ核酸分子を保有する発現ベクター内に、複数の適したプロモーターのうち任意の１つを組み入れてもよい。例として、大腸菌、そのバクテリオファージ、またはプラスミドを使用する場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージラムダのＰRおよびＰLプロモーター、ならびにｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａおよびｌｐｐなどを含めるがそれらに限定されない他のプロモーターなどのプロモーターを、隣接するＤＮＡセグメントの高レベルの転写を誘導するために使用してもよい。また、組換えＤＮＡまたは他の合成ＤＮＡ手法によって産生されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは他の大腸菌プロモーターを、挿入遺伝子の転写を与えるために使用してもよい。
【０１０７】
原核生物でのｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なった適正な原核生物のシグナルの存在に依存する。原核生物でのｍＲＮＡの効率的な翻訳は、ｍＲＮＡ上にシャイン・ダルガルノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を要する。この配列は、通常はＡＵＧである、タンパク質のアミノ端メチオニンをコードする開始コドンの前に配置される、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は、１６ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端に相補的であり、ｒＲＮＡとの二本鎖形成によってｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進し、リボソームを正確に位置決めすることを可能にすると考えられる。遺伝子発現の最大化に関する総説については、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：４７３  （１９７９）を参照されたい。
【０１０８】
宿主細胞
本発明によれば、宿主細胞は原核生物としてもよい。そのような細胞は、目的の組換え医薬タンパク質の産生のために、組換えタンパク質を発現するための宿主として供される。例示的な宿主細胞としては、大腸菌および他の腸内バクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エシェリキア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ウォリネラ種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、デスルホビブリオ種（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ，）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、リステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ペプトストレプトコッカス種（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、メガスフェラ種（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、ペクチネタス種（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｓｐ．）、セレノモナス種（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ザイモフィラス種（Ｚｙｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、アクチノミセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アルスロバクター種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、フランキア種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．）、ミクロモノスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、ノカルジア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）、プロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アセトバクテリウム種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ユーバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ヘリオバクテリウム種（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ヘリオスピリルム種（Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、スポロミュサ種（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐ．）、スピロプラズマ種（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ウレアプラズマ種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、エリシペロスリクス種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アクチノバクテリア種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、モラクセラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．）、ヘリコバクター種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ステノトロホモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ミクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓ��．）、デロビブリオ種（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、ヘモフィラス種（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．）、セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）、エルシニア種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、アクチノバチルス種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）、キャプノサイトファーガ種（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）、カルジオバクテリウム種（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、エイケネラ種（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．）、ヘモフィルス種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、キンゲラ種（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、パスツレラ種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐ）．、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、キサントモナス種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、エロモナス種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プレジオモナス種（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、レジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ならびにボルバキア種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐ．）、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、緑色硫黄バクテリア、緑色非硫黄バクテリア、グラム陰性球菌、選好性グラム陰性桿菌、腸内バクテリア科のグルコース発酵グラム陰性桿菌、非グルコース発酵性グラム陰性桿菌、グルコース発酵性オキシダーゼ陽性のグラム陰性桿菌などのアルファ−プロテオバクテリアが挙げられる。
【０１０９】
本発明の一実施形態では、大腸菌宿主株Ｃ４１（ＤＥ３）が、以前にこの株が一般的な膜タンパク質の過剰発現に最適化されていることから使用される［Ｍｉｒｏｕｘら、「Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｍｕｔａｎｔ  Ｈｏｓｔｓ  Ｔｈａｔ  Ａｌｌｏｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｏｍｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌｓ」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２６０巻、２８９〜２９８ページ（１９９６）、参照により本明細書にその全体が組み入れられている］。宿主株のさらなる最適化としては、ＤｎａＪタンパク質をコードする遺伝子の欠失（例えばΔｄｎａＪ細胞）が挙げられる。この欠失の理由は、ｄｎａＪの不活性化が、過剰発現された膜タンパク質の蓄積を増加させ、膜タンパク質過剰発現に通常伴う重篤な細胞毒性を抑制することが知られているためである［Ｓｋｒｅｔａｓら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤｎａＪ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ（２００８）、参照により本明細書にその全体が組み入れられている］。出願人らは、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２の発現の後にこれを観察している。さらに、競合する糖の生合成反応の欠失は、最適なレベルのＮ−グリカン生合成を確実にするために必要とされる。例えば、大腸菌Ｏ抗原生合成経路における遺伝子の欠失［Ｆｅｌｄｍａｎら、「Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｏｌ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｓｕｇａｒ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ  （Ｗｚｘ）  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｓ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ  Ｒｅｐｅａｔ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７４巻、３５１２９〜３５１３８ページ（１９９９）、その全体が参照により本明細書に組み入れられる］は、バクトプレノール−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＰ基質が他の反応に利用可能となることを確実にすることになる。望ましからぬ副反応を排除するために、大腸菌宿主株から欠失させうる代表的な遺伝子は以下である：ｗｂｂＬ、ｇｌｃＴ、ｇｌｆ、ｇａｆＴ、ｗｚｘ、ｗｚｙ、ｗａａＬ、ｎａｎＡ、ｗｃａＪ。
【０１１０】
発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換／トランスフェクションする方法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているように、選択された宿主系に依拠するものである。真核生物について、適した手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えばワクシニアもしくは昆虫細胞のためにバキュロウイルスを使用する形質導入が挙げられうる。バクテリア細胞について、適した手法としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられうる。
【０１１１】
本発明の一態様は、タンパク質に融合させたＤ−Ｘ1−Ｎ−Ｘ2−Ｔモチーフを含むタンパク質または少なくとも１つのペプチドを含む、糖タンパク質コンジュゲートを目的とし、上式で、Ｄは、アスパラギン酸であり、Ｘ1およびＸ2は、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｔは、スレオニンである。
【０１１２】
様々な宿主細胞が、ＰＳＡを組換え産生するのに使用されうる。選択された実施形態では、宿主細胞は、既存の天然のグリコシルトランスフェラーゼを除去するために遺伝子改変され、ＰＳＡ産生のための本発明のグリコシルトランスフェラーゼを発現させるように工学的に作製される。既存のグリコシル化を除去するために、例えば、真核宿主細胞は、Ｎ−結合型糖タンパク質由来の高マンノース、ハイブリッドおよび複合型のオリゴ糖の最奥部にあるＧｌｃＮＡｃとアスパラギン残基との間を切断するエンドグリコシダーゼまたはアミダーゼを発現させるように工学的に作製される。グリコシル化は不可欠であるため、天然のグリカンを完全には排除しえない。他の実施形態では、シアル酸担持グリカンは、宿主細胞において工学的に作製され、複数のα２−８シアル酸をアクセプターＮ−グリカンへ転移するためのＳＴ８ＳｉａＩＩ、ＳＴ８ＳｉａＩＶやＮｅｕＳなどのポリシアル化の基質として使用される。
【０１１３】
好適な態様では、本発明は、様々な糖タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで組換え産生するための方法を提供する。一実施形態では、ＰＳＡコンジュゲートされたグルカゴンペプチドは、糖鎖工学的に作製された大腸菌において産生される。グリコシル化タグ（ＧｌｙｃＴａｇ）（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３０１１０）を使用して、ＰＳＡ遺伝子機構を具えた糖鎖工学的に作製された大腸菌由来のグルカゴンペプチドが、発現されて精製される。ＰＳＡのコンジュゲーションは、市販で入手可能な抗ＰＳＡ抗体を使用して、ウエスタンブロット解析によって確認される。
【０１１４】
代替の発現系
哺乳類、酵母、真菌、植物や昆虫細胞などの真核発現系の使用は、ＰＳＡコンジュゲートタンパク質を産生するために採用されうる。これらの実施形態では、工学的に作製されたグリカン経路への干渉を低減するために、生得のグリコシル化経路を中断させる場合がある。
【０１１５】
酵母または真菌系を使用したＰＳＡの産生
シアリルトランスフェラーゼの発現は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて実証されている［Ｈａｍｉｌｔｏｎら、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３１３巻、１４４１〜１４４３ページ（２００６）］。大腸菌のｎｅｕＡ 、ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣ遺伝子を増幅させることによって、ＣＭＰ−シアル酸のプールが酵母に蓄積することが示された。酵母または他の真菌系は、ヒト抗原またはＰＳＡを産生するための、様々なグリコシルトランスフェラーゼを発現させるのに適した発現宿主である。
【０１１６】
植物細胞、例えばタバコ、ウキクサまたは藻類におけるＰＳＡオペロンの発現
米国特許第６，０４０，４９８号に記載されているように、ウキクサ［ｌｅｍｎａ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）］は、アグロバクテリウム法と遺伝子銃法との両方を使用して、形質転換されうる。記載されているプロトコールを使用して、ウキクサは形質転換され、その結果として生じたオリゴ糖組成物は、標的タンパク質上に転移される。形質転換植物は、公知のスクリーニング手法に従って、所望のヒト抗原またはＰＳＡ残基を具えたタンパク質を産生するものであるかをアッセイされうる。
【０１１７】
昆虫細胞系を使用したＰＳＡの産生
本願の発明はまた、Ｓｆ９細胞由来の代謝的に形質転換された細胞株に適用されうる。Ｓｆ９は、哺乳類細胞と比較して、タンパク質が比較的容易にクローニング、発現および精製されることに基づいて、インターフェロン、ＩＬ−２、プラスミノーゲン活性化因子その他の組換えタンパク質の産生宿主として使用されている。Ｓｆ９は、ウイルス感染および複製に対して非常に受容性が高いために、多くの脊椎動物細胞よりも、組換えタンパク質をコードする外来性遺伝子をより受け入れ易い［Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｈ．Ｌ．およびＰｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．、Ａｄｖ．Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第１巻、５５ページ（１９９０）］。組換えタンパク質の発現レベルは、Ｓｆ９において極めて高く、５００ｍｇ／リットルに迫る［Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２巻、１７３ページ（１９９０）］。細胞株は、鍵となるいくつかの翻訳後修飾を行う。しかし、それらは、脊椎動物のものとは同一ではなく、それゆえに、タンパク質の機能を変える場合がある［Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第２５巻、２２５ページ（１９８９）］。これにも関わらず、昆虫細胞内で翻訳後修飾を受ける大部分の組換えタンパク質は、免疫学的および機能的に、その生得のカウンターパートに類似している［Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第２５巻、２２５ページ（１９８９）］。動物細胞培養とは対照的に、Ｓｆ９は、比較的低いレベルのプロテアーゼを発現することによって、および生得のタンパク質発現に対して高い割合の組換え体を有することによって、タンパク質精製を容易にする［Ｇｏｓｗａｍｉ，Ｂ．Ｂ．およびＧｌａｚｅｒ，Ｒ．Ｏ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１０巻、６２６ページ（１９９１）］。
【０１１８】
バキュロウイルスは、昆虫細胞における組換えタンパク質の産生のための発現系として供される。これらのウイルスは、特異的な昆虫種に対して病原性があり、細胞溶解を引き起こす［Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２巻、１７３ページ（１９９０）］。
【０１１９】
昆虫細胞における組換えタンパク質発現は、ウイルス感染または安定的な形質転換によって達成される。前者については、所望の遺伝子が、バキュロウイルス内で野生型多角体遺伝子の部位にクローニングされる［Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２巻、１７３ページ（１９９０）；Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｈ．Ｌ．およびＰｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．、Ａｄｖ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第１巻、５５ページ（１９９０）］。多角体遺伝子は、バキュロウイルスの感染または複製に必須ではない。それは、ウイルス粒子を被包する包埋体内のタンパク質性被覆の主要な構成成分である。欠失または挿入が多角体遺伝子になされる場合は、包埋体を形成することができない。包埋体陰性であるウイルスは、野生型ウイルスとははっきりとした形態学的な違いを生じる。これらの違いによって、研究者は、組換えウイルスを特定し精製しうる。バキュロウイルスでは、クローニングされた遺伝子は、多角体プロモーターの制御下にあり、このプロモーターは、本系を特徴付ける組換えタンパク質の高い発現レベルの原因である、強力なプロモーターである。組換えタンパク質の発現は、典型的には、ウイルス感染後２４時間以内に開始し、Ｓｆ９培養が溶解する７２時間後に終了する。
【０１２０】
安定的に形質転換された昆虫細胞は、組換えタンパク質産生のための代替の発現系を提供する［Ｊａｒｖｉｓ，Ｄ．Ｌ．、Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｊ．−Ａ．Ｇ．Ｗ．、Ｋｏｖａｃｓ，Ｇ．Ｒ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＧｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、９５０ページ（１９９０）；Ｃａｖｅｇｎ，Ｃ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．、Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｍ．およびＢｅｒｎａｒｄ，Ａ．Ｒ．、ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｏｄａｙ，  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｍｏｒｒｏｗ，  Ｓｐｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｂ．およびＢｅｒｔｈｏｌｄ，Ｗ．編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９４、４３〜４９ページ）］。これらの細胞では、所望の遺伝子が、ウイルス感染の非存在下で連続的に発現される。組換えタンパク質産生が、バキュロウイルスによって損なわれる細胞過程を必要とする場合、安定的な形質転換がウイルス感染よりも好まれる。このことは、例えば、Ｓｆ９細胞からの組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の分泌の際に発生する［Ｊａｒｖｉｓ，Ｄ．Ｌ．、Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｊ．−Ａ．Ｇ．Ｗ．、Ｋｏｖａｃｓ，Ｇ．Ｒ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＧｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、９５０ページ（１９９０）］。組換えタンパク質が細胞毒性をもつ場合は、ウイルス感染が好まれるが、この系ではタンパク質発現が一過的であるためである。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養用の昆虫細胞が生産されており、いくつかの細胞株が市販されている。この工程は、供給元に関わらず本明細書に記載されているように培養されうる昆虫細胞を使用するステップを含む。好適な細胞株は、鱗翅目のＳｆ９細胞である。他の細胞株としては、欧州細胞培養収集機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ソールズベリー、英国）由来のショウジョウバエ細胞、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（サンディエゴ、カリフォルニア州）から入手可能なＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅを含めたキャベツシャクトリムシのイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞が挙げられる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎと米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル、メリーランド州）のどちらかの由来のＳｆ９昆虫細胞は、好適な細胞株であり、バイオリアクター内で、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（レネックサ、カンザス州）から購入された無血清ＥＸ−ＣＥＬＬ４０１培養中に自由に懸濁して培養され、２７℃で維持された。
【０１２２】
オリゴ糖組成物
原核生物系は、均一なグリカンを比較的高い産出量で産出しうる。好適な実施形態では、オリゴ糖組成物は、単一のグリコフォームを少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％を含む、またはから実質的になる。さらなる実施形態では、オリゴ糖組成物は、２種の望ましいグリコフォームを少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％から実質的になる。さらなる実施形態では、オリゴ糖組成物は、３種の望ましいグリコフォームを少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％で含むか、またはそれらから実質的になる。本発明は、そのため、ＢＧＡおよびＰＳＡのついてのグリカンを含めた、おびただしい数の新規のオリゴ糖組成物およびＮ−結合型糖タンパク質に関する、立体特異的な生合成を提供する。グリカンまたは糖タンパク質の均一性および産出量を見積もるための方法としては、質量分析、ＮＭＲ、レクチンブロッティング、発蛍光団支援糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）またはクロマトグラフィー法が挙げられうる（１６〜１８）。
【０１２３】
選択ＰＳＡオリゴ糖組成物として挙げられるのは：
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−（ＧａｌＮＡｃα１，３）n-ＧｌｃＮＡｃである。
【０１２４】
選択シアリルＴ抗原オリゴ糖組成物として挙げられるのは：
Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３；Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃである。
【０１２５】
選択Ｈ抗原オリゴ糖組成物として挙げられるのは：
Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃである。
【０１２６】
選択Ｔ抗原オリゴ糖組成物として挙げられるのは：
Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃ；およびＧａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３である。
【０１２７】
他の選択ＰＳＡオリゴ糖組成物として挙げられるのは：
［βＧｌｃＮＡｃ］［αＧａｌＮＡｃ］［βＧａｌＮＡｃ］Ｇａｌ［β１，３］［α（２→３）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→６）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ］n；［α（２→８）Ｎｅｕ５Ａｃ−α（２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ］または［α（２→９）Ｎｅｕ５Ａｃ］nである。
【０１２８】
本発明の方法および組成物を使用して産生した様々なオリゴ糖組成物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
（Ｓｉａα２，８）n−Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃ１−；
Ｓｉａα２，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
Ｓｉａα２，６−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
Ｆｕｃα１，２−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；
Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１−；
Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，３−Ｂａｃα１−；
Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−；
Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−Ｂａｃα１−；および
Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα１，３−ＧａｌＮＡｃ１−。
【０１２９】
標的糖タンパク質
適した標的糖タンパク質の様々な例が、本発明に従って生み出され得るが、限定なく、以下が挙げられる：インターフェロンなどのサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子やヒトプロテインＣなどの凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシン阻害物質、ＩＧＦ−結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮細胞成長因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１−アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、α−フェトプロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム修飾因子およびシクロフィリンリガンド相互作用物質）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、グルカゴン、グルカゴンペプチド、ＦＣを有するまたは有さないＧＬＰ−１（グルカゴン様タンパク質１）、ＧＬＰ−１受容体拮抗物質、例えばエキセナチド、直接的トロンビン阻害物質、例えばビバリルジン、ＩＧＦ−１、例えばメカセルミン、副甲状腺ホルモン、例えばテリパラチド、血漿カリクレイン阻害物質、例えばエカランチド、ＩＬ−Ｉ受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（別名可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４−Ｉｇ）、受容体、ヒト成長ホルモンなどのホルモン、エリスロポエチン、ペプチド、ステープルペプチド、ヒトワクチン、動物ワクチン、血清アルブミンならびにＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼやアスパラギナーゼなどの酵素を含む。
【０１３０】
アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アトロリムマブ（ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、シファリムマブ（ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、レキサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ネチツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツマムブ（ｏｆａｔｕｍａｍｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、スタムルマブ（ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、エファングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エキシビビルマブ（ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、フォラビルマブ（ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、リビビルマブ（ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、レガビルマブ（ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、セビルマブ（ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、ツビルマブ（ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ネバクマブ（ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、パノバクマブ（ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、  ラキシバクマブ（ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）などの抗体、その断片、およびより特別にはＦａｂ領域。
【０１３１】
完全長のモノクローナル抗体は、その親ハイブリドーマの出処、分子の複雑さおよびモノクローナル抗体のグリコシル化の望ましさから、昔から哺乳類細胞培養にて産生されてきた。一般的に、大腸菌は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2などの抗体断片を発現させるために選ばれる宿主系である。これらの断片は、抗原結合活性を保持して、比較的速やかに大量に作製されうる。しかし、抗体断片はＦｃ断片を欠いているため、ＦｃＲｎ受容体に結合せずに速やかに一掃される。完全長の抗体鎖もまた、大腸菌において、不溶性の凝集体として発現され、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで再度折り畳まれうるが、この方法の複雑さから、その有用性には制約がある。したがって、抗体は、ペリプラズム内で産生される。
【０１３２】
抗体断片を発現させるためにバクテリア系が広範に使用されているのに対し、大腸菌において、機能的な完全な抗体を高効率で発現して回収するための試みは殆どない。完全な抗体の複雑な特性と大きなサイズゆえに、発現された軽鎖および重鎖のポリペプチドの適正な折り畳みと組立てとを達成するのは大抵は困難であり、その結果、再構成された四量体抗体の収量を乏しいものとする。さらに、原核生物内で作製された抗体は、グリコシル化されていない。グリコシル化は、Ｆｃ受容体誘発性の活性に必要であることから、従来、大腸菌は、完全な抗体を作製するためには有益な系ではないと考えられていた［ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＰａｃｋ（１９９７）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、第３巻、８３〜１０５ページ；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｉｔｔｌｅ（１９９９）、ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１２巻、１７３〜２０１ページ］。組換えオリゴ糖合成は、このパラダイムを変える。
【０１３３】
試験研究および臨床研究における最近の進展は、多数の例で、完全な抗体が抗体断片よりも好適であることを示唆している。Ｆｃ領域を含有する完全な抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分解およびクリアランスに対してより抵抗性がある傾向があり、それゆえ血液循環内でより長い生物学的半減期を有する。この特性は、抗体が、維持療法を要する疾患のための治療剤として使用される上で、特に望ましい。
【０１３４】
現在、抗ＴＮＦ抗体は、哺乳類細胞で産生されてグルコシル化される。哺乳類細胞において（多くはＣＨＯ細胞において）抗体を産生するコストは高く、手順は複雑である。抗体のグリコシル化は、２つの効果を有する。第１に、何日も、あるいは何週間にもわたって抗体が循環するように、血清中において抗体の寿命を増加させうる。これは、腎クリアランスの減少に起因するか、またはタンパク質分解に対する抵抗性の増大に起因する。第２に、本明細書に示したように、抗体の定常領域のグリコシル化は、抗体の「エフェクター機能」を活性化させるために重要であり、この機能は、細胞表面に付加している標的に抗体が結合すると起動される。これらの機能は、免疫系の活性化に連動しており、ナチュラルキラー（ＮＫ）媒介性の細胞の死滅をもたらしうる。
【０１３５】
本発明は、一部で、血清半減期の向上、安定性の増強、免疫原性の低下もしくは無免疫原性などの、増強された薬物動態学的特性を有するものとして、または所望の免疫応答を誘発するものとして、特徴付けられるペプチドを含む、糖タンパク質組成物に関する。実施例１９は、組換え発現させた、Ｈ抗原を含むヒト成長ホルモンの胎盤性バリアント（ＧＨ２）を示す。図２１は、Ｈ抗原を用いてグリコシル化されたＧＨ２と相関する質量を表す。安定性および結合性は、図２２に示したように測定された。ある特定の実施形態では、糖タンパク質組成物は、非グリコシル化ペプチドに比較して、対応するペプチドの標的受容体への結合親和性を低減または増加させるために構成される。
【０１３６】
本発明は、より十分に実施例２０に記載したように、血清中持続性が増加したものとして特徴付けられる、新規のペプチドをさらに提供する。ラットモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期アッセイは、図２３に証明されているように、非グリコシル化ＧＨ２に比較して、Ｈ抗原を含むＧＨ２の血清中持続性が増加するということの証明を提供する。したがって、本発明は、一部で、糖タンパク質が、血清半減期の向上、安定性の増強、免疫原性の低下もしくは無免疫原性などの、増強された薬物動態学的特性を含むこと、または所望の免疫応答を誘発することを実証する。
【０１３７】
医薬組成物および医薬投与
本発明の別の態様は、医薬組成物であり、かつ１種または複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、先に規定したような組成物である。医薬組成物は、水性懸濁液の形態であってもよい。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混和物中に、当該新規の化合物を含有する。医薬組成物は、滅菌された注射可能な水性または均一な懸濁液であってもよい。この懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の技法に従って製剤化されうる。
【０１３８】
医薬組成物は、ヒトまたは家畜の使用のために、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、局所または気管内に投与されてもよい。
【０１３９】
本発明のタンパク質、ペプチド、抗体および抗体の一部は、対象への投与に適した医薬組成物に組み入れられうる。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で使用する場合の「薬学的に許容される担体」としては、生理的に適合する任意または全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１種または複数、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを、組成物中に含有することが望ましい。薬学的に許容される物質または潤滑剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝液などの補助的な少量物質は、タンパク質、ペプチド、抗体および抗体の一部の有効期間または効能を増強する。
【０１４０】
本発明の組成物は、種々の形態をとる場合がある。これらには、例えば、液体、液体溶液（例えば注射および点滴が可能な溶液）などの準固体および固体剤形、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームならびに坐薬が挙げられる。好適な形態は、意図する投与方法および治療適応に依存する。典型的な好適の組成物は、他の抗体を用いてヒトを受動免疫するために使用されるものに類似した組成物などの、注射または点滴が可能な溶液の形態である。好適な投与方法は、非経口的（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好適な実施形態では、抗体は、静脈内に点滴または注射することによって投与される。別の好適な実施形態では、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与される。
【０１４１】
治療組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、滅菌されており、安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散体、リポソーム、または高い薬剤濃度に適する指定された他の構造として製剤化されうる。滅菌された注射可能な溶液は、活性化合物（すなわちタンパク質、ペプチド、抗体または抗体の一部）を、適切な溶媒に、必要であれば先に列挙した成分の１種または組合せと共に、必要量で組み入れ、次いで濾過滅菌することによって、調製されうる。一般に、分散物は、基礎分散媒材と先に列挙した必要な他の成分とを含有する滅菌されたビヒクルに、活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌された注射溶液を調製するための滅菌された粉末の場合には、好適な調整方法は、既に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分に任意の追加の所望の成分をプラスされた粉末を産出する、減圧乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えばレシチンなどの被覆剤の使用によって、分散させる場合に必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持されうる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされる。
【０１４２】
本発明のタンパク質、ペプチド、抗体または抗体の一部は、多数の治療適応において、好適な投与経路／方法が静脈内注射または点滴であるものの、当技術分野に知られた種々の方法によって投与されうる。当業者が解するように、投与経路／方法は、所望の結果に応じて異なることになる。ある特定の実施形態では、活性化合物は、急速な放出に対し化合物を保護することになる担体と共に調製される場合があり、インプラント、経皮パッチおよび微小被包体送達系を含めた制御放出剤型などがある。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルやポリ乳酸などの生分解性および生体適合性のあるポリマーが使用されうる。そのような剤型を調製するための多数の方法が、特許となっているか、または当業者に一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体および抗体の一部は、例えば、不活性な希釈剤または同化可能な可食担体を用いて、経口投与されてもよい。化合物（および所望があれば他の成分）もまた、硬ゼラチンカプセル剤皮もしくは軟ゼラチンカプセル剤皮内に封入されるか、錠剤中に圧縮されるか、または対象の食事中に直接的に組み入れられてもよい。経口治療投与のために、化合物は、賦形剤を共に組み入れられて、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって、本発明の化合物を投与するために、その不活化を防止するための素材で化合物を被覆するか、その素材と化合物とを共投与する必要がある場合がある。
【０１４４】
先の開示は、本発明を概ね記載している。より特別な記載は、以下の実施例にて後段に提供される。本実施例は、例証を目的としてのみ記載されており、本願の発明の範囲を限定することを意図しない。形態の変更および等価物の置換は、状況が示唆するかまたは理に適うものとされる場合に想定される。特別な用語が本明細書に採用されているが、そのような用語は、記述のためのものであって、限定を意図しない。
【実施例１】
【０１４５】
プラスミド構築
この研究におけるプラスミドを、酵母において標準的相同組換えを使用して構築した（Ｓｈａｎｋｓ  ＲＭ，Ｃａｉａｚｚａ  ＮＣ，Ｈｉｎｓａ  ＳＭ，Ｔｏｕｔａｉｎ  ＣＭ，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ＧＡ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００６，７２（７）：５０２７−５０３６．））。プラスミドを酵母から回収し、ＰＣＲおよび／または配列決定を介した確認のため大腸菌株ＤＨ５αに転移した。以下のリストは、この研究の過程中に構築したプラスミドを記載する。プラスミド名、続いて５’から３’の順の挿入した遺伝子／配列、続いて括弧内のベクターである。グリカン発現プラスミドをベクターｐＭＷ０７において構築した（Ｖａｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）。タンパク質発現プラスミドを、ベクターｐＴＲＣＹにおいて典型的に構築した。糖ヌクレオチド合成プラスミドをｐＴｒｃＹ、ｐＭＱ７０においてクローニングした。
【０１４６】
図の順において
ｐＭＷ０７：（ベクター）ｐＢＡＤ、ＣｈｌｏｒＲ、ｕｒａ３、ＣＥＮ  ＯＲＩ［１９］
ｐＤｉｓ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ  （ｐＭＷ０７）
ｐＤｉｓＪ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｗｂｎＪ（ｐＭＷ０７）
ｐＴｒｃＹ：（ベクター）ｐＴＲＣ、ＡｍｐＲ、ｐＢＲ３２２  ＯＲＩ、２μ
ｐＭＢＰ−ｈＧＨ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ（シグナル配列なし）−ヘキサヒスチジン−ＴＥＶ−ｈＧＨ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＴｒｃ−ｓｐＭＢＰ−ＧＴ−ＭＢＰ−ＧＴ：  ｓｓｍａｌＥ−４×ｄｑｎａｔ−ｍａｌＥ−４×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン（ｐＴｒｃ９９ａ）［２０］
ｐＤｉｓＪＤ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、ｗｂｎＪ（ｐＭＷ０７）
ｐＴｒｃ−ｓｐＴｏｒＡ−ＧＦＰ−ＧＴ：ｓｓｔｏｒＡ−ｇｆｐ−４×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン（ｐＴｒｃ９９ａ）［２０］
ｐＪＤＬＳＴ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、ｌｓｔ、ｗｂｎＪ（ｐＭＷ０７）
ｐＭＧ４Ｘ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−３×ＴＥＶ−グルカゴン−４×ｄｑｎａｔヘキサヒスチジン（ｐＴｒｃＹ）
ｐＭＧ１Ｘ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−３×ＴＥＶ−グルカゴン−１×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン（ｐＴｒｃＹ）
ｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−３×ＴＥＶ−グルカゴン−１×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン、ｎｅｕＤＢＡＣ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＪＤＰｄＳＴ６−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、Ｐｄｓｔ６（ｐＭＷ０７）
ｐＪＣｓｔＩＩＳ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＳ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、ｃｓｔＩＩ２６０、ｗｂｎＪ（ｐＭＷ０７）
ｐＪＬｉｃ３ＢＳ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＳ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、ｌｉｃ３Ｂ、ｗｂｎＪ（ｐＭＷ０７）
ｐＮｅｕＤ−Ｙ：ｎｅｕＤ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＭＢＰ４Ｘ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−４×Ｇｌｙｃタグ−ヘキサヒスタジン（ｐＴｒｃＹ）
ｐＣｓｔＩＩ*ＳｉａＤ−Ｙ：ｃｓｔＩＩ１５３Ｓ２６０−ｓｉａＤ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＣｓｔＩＩＳｉａＤ−Ｙ：ｃｓｔＩＩ２６０−ｓｉａＤ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＪＫ−０７：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｗｂｎＪＫ（ｐＭＷ０７）
ｐＧＮＦ−７０：ｇａｌＥ（Ｃｊ）、ｇａｌＥ（Ｋ１２）、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢＧ（ｐＭＱ７０）
ｐＴｎｆαＦａｂ４Ｘ−Ｙ：ｔｎｆα軽鎖、ｔｎｆα重鎖−４×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン（ｐＴｒｃＹ）
ｐＭＧ１Ｘ  ＧＮＦ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−３×ＴＥＶ−グルカゴン−１×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン、ｇａｌＥ（ＣＪ）、ｇａｌＥ（Ｋ１２）、ｗｂｎＫ、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢＧ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＭＧ１ｘ  ＫＧＦ−Ｙ：ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−３×ＴＥＶ−グルカゴン−１×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン、ｇａｌＥ（Ｅｃ）、ｗｂｎＫ、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢＧ（ｐＴｒｃＹ）
ｐＧ４−Ｈｉｓ−ＧＮＦ−Ｙ（ｓｓｄｓｂＡ−ｍａｌＥ−１×ＴＥＶ−ｈＧＨｖ−ヘキサヒスチジン、ｇａｌＥ  Ｃｊ、ｇａｌＥ  Ｅｃ、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢＧ（ｐＴｒｃＹ）
株（図の順において）
ＭＣ４１００
ＭＣ４１００  ΔｗａａＬ
ＭＣ４１００  ΔｗａａＬ  ΔｎａｎＡ
ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ
ＬＰＳ１  ΔｗａａＬ
ＬＰＳ１
【０１４７】
大腸菌ＭＣ４１００は、シアル酸を含有するグリカン構造を天然には発現せず、従前（Ｖａｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら、“Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ，”  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  ８，４３４−４３６（２０１２））にグリコシル化のための機能的宿主として機能を果たしていたので、これを機能試験のための宿主として選択した。ｗａａＬ遺伝子、およびｎａｎＡ遺伝子における変異を、Ｋｅｉｏコレクションにおける対応する変異体から形質導入した。ｋａｎカセットを、ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ株からその後取り除いた。グリカンの表面発現のため、目的のプラスミドを使用して、ＭＣ４１００、ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ、またはＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬを形質転換した。示した株において、タンパク質グリコシル化実験を行った。
【０１４８】
培地および試薬
抗生物質選択を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒ）、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）および５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋａｎ）にて維持した。大腸菌培養物の日常的成長を、０．２％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび必要に応じて抗生物質を添加したＬＢ培地において行った。ＰＳＡプラスミドの発現のため、ＬＢ培地に終濃度０．２５％（ｗ／ｖ）のシアル酸（ＳｉｇｍａまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加し、培地をｐＨ約７．５に調節し、滅菌した。グリカンおよびタンパク質発現のためのプラスミドを、それぞれ、０．２％のＬ−アラビノースまたは１００ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することで誘導した。酵母ＦＹ８３４をＹＰＤ培地にて維持し、合成的に規定したウラシル培地を使用して、酵母プラスミドを選択するか、または維持した。
【０１４９】
細胞表面グリカン検出
示した株由来の一晩ＬＢ培養物２．５μｌまたは４μｌを使用して、ドットブロットを行った。細胞をニトロセルロース膜に印付け、以下のイムノブロットにより、ＰＳＡグリカンを検出した。フローサイトメトリーのため、培養物を必要に応じて抗生物質を添加したＬＢにおいて接種した。示したレクチンおよびＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して、分析を行った。
【０１５０】
タンパク質発現および精製
Ｎ−グリコシル化の分析のため回収すべき株を、適切な抗生物質を有するＬＢに接種し、培養物がＯＤ600１．５〜２に達するまで、３０℃で振盪しながらインキュベーションした。グリカン発現のためのプラスミドを、アラビノースを加えることで誘導し、アクセプタータンパク質の産生をＩＰＴＧで誘導した。誘導の１６〜１８時間後に、培養物を回収した。小さなスケールの培養物（５０〜１００ｍＬ）のためのＮｉ−ＮＴＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞溶解および糖タンパク質の精製を行った。より大きな調製物は、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、続いて、終濃度５００ｍＭ  イミダゾールを含有する結合緩衝液で溶出した、結合緩衝液（５０ｍＭ  トリス、３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ  イミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣＬ  ｐＨ＝７．４）におけるものであった。ＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製の後に、典型的には、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ６．８を結合緩衝液として使用し、同一の緩衝液中０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配での溶出を行った。Ｔ抗原グリカンを含有する糖タンパク質の精製のため、タンパク質を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０１ｍＭ  ＭｎＣｌ2に交換し、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を使用してさらに分離した。ガラクトースを使用して、糖タンパク質を単離した。
【０１５１】
タンパク質分析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌｏｎｚａ）により、タンパク質を分離し、従前に記載される通り（ＤｅＬｉｓａ  ＭＰら，Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３，１００（１０）：６１１５−６１２０．）、ウエスタンブロッティングを行った。簡単に言うと、タンパク質をフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に導入し、膜を、以下：ＨＲＰにコンジュゲートした抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＰＮＡ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）の１つで探索した。抗ＰＳＡ抗血清の場合、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２次抗体として使用した。ＰＮＡ−ビオチンについて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を２次検出のため使用した。
【実施例２】
【０１５２】
ヒトトムゼン−フリーデンライヒ抗原（Ｔ抗原）の発現のための大腸菌の工学的作製
Ｔ抗原グリカン（Ｔ抗原、Ｇａｌβ１，３  ＧａｌＮＡｃα−）は、多数のヒト関連ヒトグリカンのコアにて見出される構造である。大腸菌においてヒトＴ抗原を含有するグリカンをアセンブリーするために、天然のＵｎｄＰＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として使用してこの構造を産生するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ヌクレオチドエピメラーゼ活性の発現のため、プラスミドを構築した。プラスミドｐＭＷ０７（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて相同組換えを介したクローニングを可能にする、少ないコピー数の複製開始点（ＯＲＩ）、誘導可能なｐＢＡＤプロモーター、および酵母ＯＲＩを含有するので、これをベクターとして使用した。ｐＭＷ０７の配列を配列番号１として提供する。
【０１５３】
構造ＧａｌＮＡｃα１，３  ＧｌｃＮＡｃを有する二糖グリカンを生成するために、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＰｇｌＡ、およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ基質の合成を促進するためのエピメラーゼＧａｌＥを発現するプラスミドを構築した。カンピロバクター・ジェジュニ由来のＯＳＴ  ＰｇｌＢをコードする遺伝子も、将来のグリコシル化において使用するため含めた。直線化ｐＭＷ０７と共にｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、およびｐｇｌＡを含むＰＣＲ断片を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを同時形質転換し、従前に記載される通り（Ｓｈａｎｋｓら）、酵母における相同組換えにより、クローニングを行った。これらの遺伝子の配列を、それぞれ、配列番号２、３および４として提供する。合成的に規定したウラシル培地にて選択したコロニーから、プラスミドを単離し、これを使用して、大腸菌ＤＨ５ａを構築の確認のため形質転換した。得られたプラスミドをｐＤｉｓ−０７と命名した。
【０１５４】
ヒトトムゼン−フリーデンライヒまたはＴ抗原グリカンは、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα構造からなる。大腸菌０８６由来のガラクトーストランスフェラーゼＷｂｎＪは、ＧａｌＮＡｃ残基へβ１，３結合によりガラクトースを結合すること、および天然の細菌酵素であることが報告されている（Ｙｉ  Ｗ，Ｓｈａｏ  Ｊ，Ｚｈｕ  Ｌ，Ｌｉ  Ｍ，Ｓｉｎｇｈ  Ｍ，Ｌｕ  Ｙ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｌｉ  Ｈ，Ｒｙｕ  Ｋ，Ｓｈｅｎ  Ｊら：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ８６  Ｏ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００５，１２７（７）：２０４０−２０４１．）ので、末端ガラクトース残基を取り込むためのグリコシルトランスフェラーゼとして選択した。ｗｂｎＪ遺伝子を、Ｍｒ．Ｇｅｎｅ由来の合成プラスミドから増幅し、酵母における相同組換えを使用して、得られたＰＣＲ産物と直線化ｐＤｉｓ−０７プラスミドを合わせた。得られたプラスミドをｐＤｉｓＪ−０７と名付け、ｐＢＡＤプロモーターの制御下に以下の遺伝子：（５’−３’）ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｗｂｎＪを合成オペロンとして含有する。ｗｂｎＪの配列を配列番号５として含む。
【０１５５】
天然の状況において、両方のグリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＡおよびＷｂｎＪのための基質は、脂質ウンデカプレニルピロリン酸塩（ＵｎｄＰＰ）上にアセンブリーした糖である。大腸菌Ｋ１２  ＬＰＳ合成経路の一部として、ＧｌｃＮＡｃ残基を、天然のＷｅｃＡの活性を介してＵｎｄＰＰにまず加え、次に、得られたＧｌｃＮＡｃを、ＷａａＬリガーゼによりペリプラズムにおける脂質Ａコアオリゴ糖に転移する。最終的に、脂質Ａ部分を、グリカンの細胞表面提示をもたらす外膜に輸送する。ｗａａＬ遺伝子における欠失を有する細胞は、ＵｎｄＰＰ結合グリカンを細胞表面に輸送することができず、従って、この変異は、グリカンがＵｎｄＰＰに連結していることを確認するのに有用である。
【０１５６】
ｗａａＬ（ｒｆａＬ）遺伝子は、Ｋｅｉｏコレクションの一部として従前変異導入され、得られた株ｒｆａＬ７３４（ｄｅｌ）：：ｋａｎ（ＪＷ３５９７−１）（Ｂａｂａ  Ｔ，Ａｒａ  Ｔ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｔａｋａｉ  Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｂａｂａ  Ｍ，Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ，Ｍｏｒｉ  Ｈ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２００６，２．）を、Ｙａｌｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から得た。Ｐ１  ｖｉｒファージを使用して、ｗａａＬ変異をＭＣ４１００レシピエントに形質導入し、株ＭＣ４１００  ΔｗａａＬ：：ｋａｎを作製した。次に、プラスミドｐＣＰ２０を使用して、ｋａｎカセットを取り除き（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ：Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０００，９７（１２）：６６４０−６６４５．）、株ＭＣ４１００  ΔｗａａＬをもたらした。
【０１５７】
フローサイトメトリーを使用して、ｐＤｉｓＪ−０７を発現する大腸菌ＭＣ４１００により産生された細胞表面グリカンを分析し、対照プラスミドｐＤｉｓ−０７と比較して、ガラクトース末端構造の存在を確認した。培養物を、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールおよび０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースを添加したＬＢ１０００μｌを含有する１．５ｍＬのチューブに接種した。振盪しながら３０℃で２４時間インキュベーション後、培養物をペレット化し、ＰＢＳ２００μｌに再懸濁した。それぞれのアリコート１００μｌを９５℃で１０分間加熱し、室温まで冷却した。ＰＢＳ４００μｌ、およびガラクトース末端グリカンに優先的に結合するフルオレセイン標識ダイズ凝集素（ＳＢＡ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３μｌまたはリシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素Ｉ（ＲＣＡ  Ｉ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３μｌをそれぞれの試料に加えた。フローサイトメトリーに先立ち、暗所において振動するプラットフォームにて室温で１０分間試料をインキュベーションした。
【０１５８】
ＲＣＡ  Ｉレクチンでのフローサイトメトリーは、ｐＤｉｓＪ−０７を発現するが、ｐＤｉｓ−０７を発現しないＭＣ４１００細胞の表面上のガラクトース末端グリカンの存在を示唆していた（図２、左）。この結果は、ガラクトシルトランスフェラーゼとしてのＷｂｎＪ酵素の従前に報告された機能と一致する。ＳＢＡ−フルオレセインでの細胞表面標識（図２、中央）は、ｐＤｉｓ−０７プラスミドと比較して、ｐＤｉｓＪ−０７プラスミドを発現する細胞において低減し、利用可能な末端ＧａｌＮＡｃ残基の量の低減を示唆する。ＭＣ４１００  ΔｗａａＬ変異体において、いずれかのプラスミドを発現する細胞について、蛍光を大いに低減し、これらが共にＵｎｄＰＰ連結グリカンとして合成されることを示唆する。
【実施例３】
【０１５９】
ヒトＴ抗原においてＮ−グリカン終結を有するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
ＯＳＴ  ＰｇｌＢを利用して、ＵｎｄＰＰ連結オリゴ糖を特異的アスパラギン残基に導入する。これは、ペリプラズムに局在化したＤ／Ｅ  Ｘ1  Ｎ  Ｘ2  Ｓ／ＴシークオンからなるＰｇｌＢ認識部位を有する標的タンパク質、および適切なグリカン基質の存在を必要とする。この研究のため、本発明者らは、糖タンパク質の発現において使用するためベクターｐＴＲＣＹも構築した。
【０１６０】
ＵＲＡ３遺伝子および酵母２ミクロンＯＲＩをｐＴＲＣ９９ａに加え、これにより、酵母において複製しうる新規ベクターを生成することにより、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて相同組換えを介してｐＴＲＣＹをクローニングした。ＵＲＡ３遺伝子および２ミクロンＯＲＩを、ｐＢＲ３２２  ＯＲＩ遺伝子とｌａｃＩ遺伝子の間の挿入のためベクターｐＴＲＣ９９ａに対する相同性を含有するプライマーで増幅した。ベクターｐＴＲＣＹの配列を配列番号６として提供する。
【０１６１】
大腸菌ＤｓｂＡ由来のシグナルペプチド、ＭＢＰ、ヘキサヒスチジンタグ、およびｔｅｖ切断部位後のＣ末端翻訳融合物として、ｈＧＨをクローニングした。単一グリコシル化アクセプター部位ＤＱＮＡＴを含有するようｈＧＨ遺伝子をさらに改変し、最終構築物をｐＭＢＰ−ｈＧＨ−Ｙと名付ける。遺伝子融合物の配列を配列番号７として供給する。
【０１６２】
プラスミドｐＤｉｓＪ−０７およびｐＭＢＰ−ｈＧＨ−Ｙ、またはｐＭＢＰ−ｈＧＨ−Ｙ単独を有する株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬを、それぞれ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）選択下で成長させた。タンパク質産生の誘導の約１６時間後、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースおよびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を加えることで、ｐＤｉｓＪ−０７を誘導した。タンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより部分的に精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色による分析に先立ち、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理して、ｈＧＨを放出させた。ｐＤｉｓＪ−０７プラスミドの存在における目に見える移動度シフトは、グリコシル化と一致する（図２、右）。
【実施例４】
【０１６３】
ヒトＴ抗原におけるガラクトース残基の同一性および連結の確認
ｐＤｉｓＪ−０７の発現の際に産生させたグリカンの同一性をさらに探索するために、本発明者らは、脂質結合型オリゴ糖を抽出し、放出されたグリカンを質量分析により分析した。１：１００の接種を使用して、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを添加したＬＢを含有する培養物４  ２５０ｍＬを播種した。培養液を３０℃で成長させ、ＡＢＳ600が約２．０に達したとき、誘導した。脂質結合型オリゴ糖の単離のため、約２０時間後に、ＧａｏおよびＬｅｈｒｍａｎ（Ｇａｏ  Ｎ，  Ｌｅｈｒｍａｎ  Ｍ：Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２００６，４１５：３−２０．）の方法により、細胞を回収した。簡単に言うと、ペレットをメタノール１０ｍＬに再懸濁し、超音波処理により溶解した。材料を６０℃で乾燥させ、続いて超音波処理を介して２：１のクロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ、ＣＭ）１ｍＬに再懸濁し、材料をＣＭにおいて２回洗浄した。次に、ペレットを水において洗浄し、次に、脂質を１０：１０：３のクロロホルム：メタノール：水（ｖ／ｖ／ｖ、ＣＭＷ）、続いてメタノールで抽出した。ＣＭＷとメタノール抽出物を合わせ、ＤＥＡＥセルロースカラムに添加した。ＣＭＷを使用して、カラムを洗浄し、脂質結合型オリゴ糖を、ＣＭＷ中３００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃで溶出した。脂質結合型オリゴ糖をクロロホルムで抽出し、乾燥させた。
【０１６４】
グリカンを脂質から放出させるために、材料を、１：１のイソプロパノール：水（ｖ／ｖ）中０．１Ｎ  ＨＣｌ１．５ｍＬに再懸濁した。溶液を５０℃で２時間加熱し、次に、７５℃で乾燥させた。残基を水飽和ブタノールに懸濁し、グリカンを含有する水相を乾燥させ、水に再懸濁し、ＡＧ５０Ｗ−Ｈ８（水素原子）カチオン交換樹脂、続いてＡｇ１−Ｘ８（ギ酸塩形態）陰イオン交換樹脂で精製した。
【０１６５】
末端グリカンの同一性を確認するために、試料を分け、半分をβ１，３ガラクトシダーゼ（ＮＥＢ）で処理し、半分を水対照で処理した。試料を３７℃で４８時間インキュベーションした。質量分析は、Ｔ抗原グリカンの予測される大きさと一致する緩衝液対照試料における主要なピーク（ｍ／ｚ  ６０９）を明らかにした（図３、上）。ガラクトシダーゼで処理した試料において、二糖ＧａｌＮＡｃ  ＧｌｃＮＡｃの予測される大きさと一致する主要なピーク（ｍ／ｚ  ４４７）を検出し、これは、末端β１，３ガラクトースの喪失を示唆する。
【実施例５】
【０１６６】
ヒトＴ抗原での免疫
ヒトＴ抗原は、がんにおいて異常に発現されることが頻繁に見出され、従って、汎性癌腫抗原として公知である。乳癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、および胃癌を含む癌腫の最大９０％が、Ｔ抗原を細胞表面に有すると推定されている［２１、２２］。複数のがんにおけるこの特異的発現のため、Ｔ抗原は、抗がん免疫療法処置の標的として関心がもたれている。
【０１６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで担体タンパク質上に複数のＴ抗原グリカンを有する免疫原の調製を可能にするために、精製目的のため、両方のＮ終端およびＣ終端の４×Ｇｌｙｃタグ（４つのＤＱＮＡＴモチーフを有する）、および６×ｈｉｓタグに融合したＭＢＰタンパク質をコードするプラスミドを得た（ｐＴｒｃ−ｓｐＭＢＰ−ＧＴ−ＭＢＰ−ＧＴ）［２０］。Ｔ抗原において一様なグリカン終結を発現する第２のプラスミド（ｐＪＤ−０７）を構築した。ｎｅｕＤＢＡＣ遺伝子のｐＤｉｓＪ−０７への挿入により、酵母における相同組換えを使用して、ｐＪＤ−０７をクローニングした。ｐＪＤ−０７は、ｐＢＡＤプロモーターの制御下に以下の遺伝子：（５’−３’）ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、およびｗｂｎＪを合成オペロンとして含有する。
【０１６８】
大腸菌株ＭＣ４１００  ΔｗａａＬを、プラスミドｐＴｒｃ−ｓｐＭＢＰ−ＧＴ−ＭＢＰ−ＧＴ、および、Ｔ抗原グリカンでグリコシル化した標的タンパク質の発現のためｐＪＤ−０７、または非グリコシル化標的タンパク質の発現のためｐＭＷ０７のいずれかで形質転換した。プラスミドｐＴｒｃ−ｓｐＭＢＰ−ＧＴ−ＭＢＰ−ＧＴから発現させた標的ＭＢＰタンパク質は、合計８つのグリコシル化部位（ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴ）を含有する。株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）の選択下３０℃で培養し、ＡＢＳ600約１．５にて、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで約１６時間誘導した。ＭＢＰ標的タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ６．８中ＮａＣｌ勾配（０〜５００ｍＭ）で溶出した。グリコシル化タンパク質を、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）で親和性精製して、Ｔ抗原グリカンにコンジュゲートしたタンパク質を単離した。得られたタンパク質をＰＡＧＥにより分離し、α６×Ｈｉｓ（左）、またはビオチンコンジュゲートＰＮＡ（５μｇ／ｍＬ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）およびペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（１：３３３３、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ、右）でのウエスタンブロットにより分析して、グリコシル化を確認した。予測した通り、グリコシル化プラスミドｐＪＤ−０７で発現させたＭＢＰは、陰性対照（ｐＭＷ０７）よりゆっくり移動し、グリコシル化と一致するＰＮＡレクチンと反応した（図４）。
【０１６９】
食餌および水を自由に提供した５匹の群における約８〜１０週齢のメスＣ３Ｈマウスを、この研究のため利用した。上述の通り調製した非グリコシル化ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴおよびＴ抗原−ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴを、ＰＢＳ中０．４ｍｇ／ｍＬの濃度に調節した。使用の直前に、タンパク質を等しい容量のＳｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、０日、７日、および１３日に０．１ｍＬの容量においてタンパク質２０μｇでの腹腔内（ＩＰ）経路を通じて、マウスを免疫した。−１日（免疫に先立ち）、ならびに１４日および２１日にて、血清試料を採取した。
【０１７０】
抗体応答の分析
ＥＬＩＳＡを使用して、得られた血清における特異的抗体の存在を決定した。担体タンパク質に対する免疫応答を評価するために、上で調製した非グリコシル化ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴを、コーティング緩衝液（４．２ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ3、１．７８ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍＬの濃度に調節し、５０μＬを、ＰｏｌｙＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに３連で適用し、４℃で一晩インキュベーションした。Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ：４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．７２ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4＋０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μＬで、ウェルを３連で洗浄し、その後、室温で６０分間、ＰＢＳＴ中１０％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μＬでウェルをブロッキングした。血清試料を、ＰＢＳＴ中１％  ＢＳＡにおいて１：５００希釈し、それぞれの試料５０μＬを、コーティングしたウェルに３連で適用し、室温で６０分間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ２００μＬで４回洗浄し、次に、いずれかのＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＭまたはＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ特異的２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：５０００の希釈液５０μＬと室温で６０分間インキュベーションした。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳＴ２００μＬで７回洗浄し、暗所において１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）１００μＬと室温で１０〜３０分間インキュベーションした。２Ｎ  ＨＣｌ１００μＬを加えることで、反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにて読み取った（図５）。グリコシル化群および非グリコシル化群について、ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴに対するＩｇＭ抗体の検出は、１４日周辺でピークに達する（図５、上部パネル）一方、ＩｇＧ抗体の検出は、研究の過程に渡り増大した（図５、下側のパネル）。
【０１７１】
第２のＥＬＩＳＡを行い、同様のタグで修飾したＧＦＰを使用した免疫原のＣ末端部分に対する抗体応答を決定した。ＤＱＮＡＴモチーフの４つの反復を含有する４×Ｇｌｙｃタグ、続いて６×Ｈｉｓタグ（ＧＦＰ４ＸＧＴ）で修飾したＧＦＰタンパク質を発現するプラスミド（ｐＴｒｃ−ｓｐＴｏｒＡ−ＧＦＰ−ＧＴ）を得た［２０］。ｐＴｒｃ−ｓｐＴｏｒＡ−ＧＦＰ−ＧＴを使用して、ｐＭＷ０７またはｐＪＤ−０７でＭＣ４１００  ΔｗａａＬ細胞を同時形質転換した。得られた株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）での選択下３０℃で培養し、ＡＢＳ600約１．５にて、０．２％ｖ／ｖアラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで約１６時間誘導した。ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて、ＧＦＰ標的タンパク質を精製し、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ６．８中のＮａＣｌ勾配（０〜５００ｍＭ）で溶出した。グリコシル化タンパク質を、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）でさらに親和性精製して、Ｔ抗原グリカンにコンジュゲートしたタンパク質を単離した。
【０１７２】
得られたＴ抗原−ＧＦＰ４ＸＧＴ、または非グリコシル化ＧＦＰ４ＸＧＴを、コーティング緩衝液中２μｇ／ｍＬの濃度に調節し、５０μＬを、ＰｏｌｙＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに３連で適用し、４℃で一晩インキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴ２００μＬで３回洗浄し、その後、室温で６０分間、ＰＢＳＴ中１０％  ＢＳＡでウェルをブロッキングした。示した血清試料を、１％  ＢＳＡを有するＰＢＳＴにおいて１：５００希釈し、５０μＬを、コーティングしたウェルに３連で適用し、室温で６０分間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴ２００μＬで４回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス２次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１：５０００希釈液５０μＬと室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳＴで７回洗浄後、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）１００μＬを加えることにより、反応を展開させ、暗所において１０〜３０分間インキュベーションした。２Ｎ  ＨＣｌ１００μｌを加えることで、反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにて読み取った（図６）。ウェルをコーティングするために使用したタンパク質を、図表の真下に示し、マウスを処置するために使用した免疫原を、記号解説において示す。ＧＦＰでコーティングしたウェルに結合している抗体を、グリコシル化Ｔ抗原−ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴと比較して、非グリコシル化ＭＢＰ８×ＤＱＮＡＴで免疫したマウス由来の血清において、平均（灰色の長方形）で上昇し、これは、グリカンが、抗体応答と干渉しうることを示唆している。
【実施例６】
【０１７３】
ヒト（２，３）シアリル−Ｔ抗原の発現のための大腸菌の工学的作製
ヒト（２，３）シアリル−Ｔ抗原は、末端α２，３ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基で修飾したＴ抗原グリカンからなり、以下の構造：ＮｅｕＮＡｃα２，３  Ｇａｌ  β１，３  ＧａｌＮＡｃα−をもたらす。大腸菌宿主においてシアリル−Ｔ抗原構造を有するグリカン終結を生成するために、シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、および産物が、大腸菌Ｋ１のシチジン５’モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ）合成経路を含む遺伝子を含むよう、Ｔ抗原グリカンを合成するのに必要とされる遺伝子を発現する上述のプラスミド（ｐＤｉｓＪ−０７）を修飾した。
【０１７４】
ＤＮＡの領域を、遺伝子ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、およびｎｅｕＣを含む大腸菌Ｋ１ゲノムからＰＣＲを使用して増幅した。これらは、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼをコードする。ｎｅｕＢ遺伝子産物を安定化するのを助けうるので、ｎｅｕＤ遺伝子も含めた（Ｄａｉｎｅｓ  ＤＡ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＬＦ，Ｃｈａｆｆｉｎ  ＤＯ，Ｒｕｂｅｎｓ  ＣＥ，Ｓｉｌｖｅｒ  ＲＰ：ＮｅｕＤ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１．ＦＥＭＳ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０００，１８９（２）：２８１−２８４．）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのα２，３シアリルトランスフェラーゼをコードするｌｓｔ遺伝子も増幅し、直線化ｐＤｉｓＪ−０７と共に両方のＰＣＲ産物を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを同時形質転換し、相同組換えにより得られたプラスミドｐＪＤＬＳＴ−０７を作製した。ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、およびｎｅｕＤの配列を、配列番号８〜１１として提供し、ｌｓｔ遺伝子の配列を配列番号１２として提供する。プラスミドｐＪＤＬＳＴ−０７は、合成オペロンをｐＢＡＤプロモーターの制御下に以下の順：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、ｌｓｔ、ｗｂｎＪの遺伝子と共に含有する。
【０１７５】
シアリル化グリカンを発現する際に使用するため、シアル酸アルドラーゼＮａｎＡをコードするｎａｎＡ遺伝子を混乱させるための標的にした株を構築した。ｎａｎＡ遺伝子の欠失は、外部供給源由来のシアル酸の分解を防ぐ（Ｖｉｍｒ  ＥＲ，Ｔｒｏｙ  ＦＡ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ（ｎａｎ）ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９８５，１６４（２）：８４５−８５３．）。ΔｎａｎＡ：：ｋａｎ変異を、Ｋｅｉｏコレクションの一部として生成された対応する変異体（ＣＧＳＣ番号１０４２３、Ｙａｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｅｒ）からＰ１  ｖｉｒファージ伝達を介してＭＣ４１００大腸菌に導入した（Ｂａｂａら）。カナマイシンカセットを、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏら）の方法により取り除いた。グリコシル化を促進するために、ΔｗａａＬ：：ｋａｎ変異を続いて導入し、上述と同一の方法によりカナマイシン耐性を直した。
【実施例７】
【０１７６】
ヒト（２，３）シアリル−Ｔ抗原においてＮ−グリカン終結を有するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
質量分析によるシアリル化糖ペプチドの分析を可能にするために、ＤＱＮＡＴモチーフを含有する１×Ｇｌｙｃタグで修飾したグルカゴンペプチドをクローニングした。このプラスミドを構築するために、ＤｓｂＡシグナルペプチド配列およびｍａｌＥ遺伝子（ＭＢＰをコードする）を、ベクターｐＴＲＣＹおよびＴＥＶプロテアーゼ部位の配列に対して相同性を含有するプライマーで増幅した。同様に、グルカゴンを、合成オリゴヌクレオチドからＴＥＶプロテアーゼ部位をコードする配列または４×Ｇｌｙｃタグおよび６×Ｈｉｓタグについての配列を含有するプライマー、続いてｐＴＲＣＹに対する相同性を用いて増幅した。これらのＰＣＲ産物を直線化ｐＴＲＣＹと共に使用して、相同組換えによるクローニングのためＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを同時形質転換し、プラスミドｐＭＧ４Ｘ−Ｙを生成した。関連するプラスミドｐＭＧ１Ｘ−Ｙは、４×Ｇｌｙｃタグを１×Ｇｌｙｃタグと置き換えることにより作製したｐＭＧ４Ｘ−Ｙの誘導体である。簡単に言うと、ｐＭＧ４Ｘ−Ｙを直線化し、１×Ｇｌｙｃタグをコードするオリゴヌクレオチドを使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける相同組換えにより４×Ｇｌｙｃタグを置き換えた。タンパク質ＭＢＰ−３ＴＥＶ−ＧＬＵＣ−４×Ｇｌｙｃタグ−６ＨおよびＭＢＰ−３ＴＥＶ−ＧＬＵＣ−１×Ｇｌｙｃタグ−６Ｈをコードする配列を、配列番号１３および１４として提供する。
【０１７７】
ヒトシアリル−Ｔ抗原を含有する糖タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで生成するため、上述の株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬを使用して、シアリル化グリカンのペリプラズム蓄積を促進した。この株を、グリコシル化アクセプタータンパク質をコードするプラスミドｐＭＧ１Ｘ−Ｙおよびシアリル−Ｔ抗原グリカンを合成するのに必要な機構を発現するｐＪＤＬＳＴ−０７と同時形質転換した。
【０１７８】
ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬ  ｐＭＧ１Ｘ−ＹおよびｐＪＤＬＳＴ−０７からなる一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを有するＬＢ中の培養物５０ｍＬに接種した。ＡＢＳ600が約１．５に達したとき、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで培養物を誘導し、誘導の約１９時間後、遠心分離により細胞を回収した。細胞溶解後、ＮｉＮＴＡカラムにてタンパク質を精製し、ＴＥＶプロテアーゼを使用して、得られた溶出液３０μｌを切断した。３０℃で３時間試料をインキュベーションし、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計にてジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリクスとして使用した質量分析によりアリコートを分析した。
【０１７９】
質量分析は、シアリル−Ｔ抗原で修飾したグルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ６２５１）およびＴ抗原末端グリカンを有するグリコシル化グルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ５９６０）と一致する主要なピークを明らかにした（図７）。
【実施例８】
【０１８０】
ｎｅｕＤＢＡＣのＴＲＣＹからの発現を通じたシアリル化の相対的改善
このシステムにおけるシアリル化を改善するための１つの可能なストラテジーは、ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃの細胞内での利用可能性を増大させることである。必要な生合成遺伝子は、プラスミドｐＪＤＬＳＴ−０７に存在するが、さらなるコピーがシアリル化を改善しうると仮定される。遺伝子ｎｅｕＤＢＡＣを単一ＰＣＲ産物として増幅し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて相同組換えを使用してグルカゴン融合タンパク質の下流のｐＭＧ１Ｘ−Ｙに挿入した。これは、プラスミドｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−Ｙの創出をもたらした。
【０１８１】
株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬにおいて、プラスミドｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−ＹをｐＪＤＬＳＴ−０７と合わせて、上述の通り、培養物５０ｍＬにおいてグリコシル化を試験した。ＴＥＶ切断ペプチド産物の質量分析は、（２，３）シアリル−Ｔ抗原含有グリカンで修飾したグルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ６２５０）と一致する主要なピークを明らかにする。Ｔ抗原グリカンで修飾したグルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ５９５９）と一致する第２の小さなピークも検出した（図８）。
【実施例９】
【０１８２】
シアリル化グルカゴンペプチドのα２，３ノイラミニダーゼ処理
グルカゴンペプチドのシアリル化を検証するために、ノイラミニダーゼ処理を行った。プラスミドｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−ＹおよびｐＪＤＬＳＴ−０７を有する株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  Δｗａａｌを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを有するＬＢ中の培養物５０ｍＬにおいて成長させ、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで約１６時間誘導する。溶菌液からニッケルアフィニティークロマトグラフィーで組換えタンパク質を精製し、溶出液を、５０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０  １００ｍＭ  ＮａＣｌで緩衝液交換し、３０℃で３時間ＴＥＶプロテアーゼとのインキュベーションに先立ち、濃縮する。タンパク質を分け、質量分析による分析に先立ち、α２，３ノイラミニダーゼ（ＮＥＢ）または緩衝液対照と３７℃で２時間インキュベーションする（図９）。緩衝液対照試料における主要なピーク（ｍ／ｚ  ６２５３、黒色）は、シアリル−Ｔ抗原グリカンで修飾したグルカゴンの予測される大きさと一致する。シアリダーゼ処理試料において、主要なピーク（ｍ／ｚ  ５９６１、灰色）は、Ｔ抗原糖ペプチドの予測される大きさと一致する。シアリル化糖ペプチドがノイラミニダーゼ処理後に存在する証拠はなかった。
【実施例１０】
【０１８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性に対するグリコシル化の作用の決定
グリコシル化は、タンパク質の安定性を改善するための周知のストラテジーであり、両方のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ持続を改善する合理的なアプローチである。細菌におけるＮ−グリコシル化をこの目的のために利用しうるかどうかを決定するために、分析のため、（２，３）シアリル−Ｔ抗原をグルカゴンにコンジュゲートした。
【０１８４】
株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬにおいて、プラスミドｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−ＹをｐＪＤＬＳＴ−０７と合わせて、シアリル化グルカゴンを生成し、得られた細胞を使用して、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを添加したＬＢ培地を含有する培養物１００ｍＬを接種した。非グリコシル化グルカゴンを生成するために、プラスミドｐＭＧ１ＸＭＣＢ−０７を宿しているＯｒｉｇａｍｉ２  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬ  Δｇｍｄ：：ｋａｎを使用して、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有する培養物１００ｍＬを接種した。この株を、非グリコシル化ペプチドを検出する我々の能力に基づき選択した。約２．３のＡＢＳ600に達するまで、振盪しながら３０℃で両方の培養物を成長させ、次に、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（両方）および０．２％ｖ／ｖ  アラビノース（グリコシル化のみ）で誘導した。３０℃で一晩培養物を維持した。Ｎｉ親和性（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）により、グルカゴン融合タンパク質を単離し、溶出液を濃縮した。ＴＥＶプロテアーゼ１μｌをグリコシル化グルカゴンまたは非グリコシル化グルカゴン５０μｌに加え、反応物を３０℃で３時間インキュベーションし、次に、３７℃まで移行させた。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析により時間を追ってグルカゴンの存在をモニターした。インキュベーションの２１時間後、非グリコシル化グルカゴンはもはや検出されず、一方で、（２，３）シアリル−Ｔ抗原を有するグルカゴンの予測されるｍ／ｚのピークは、依然最も顕著であり（図１０）、シアリル化が、グルカゴンペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける持続を増強することを示唆している。
【実施例１１】
【０１８５】
末端α２，６ＮｅｕＮＡｃで修飾したＴ抗原の発現のための大腸菌の工学的作製
ヒトシアリル−Ｔ抗原は、末端α２，３ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基で修飾したＴ抗原グリカンからなり、以下の構造：ＮｅｕＮＡｃα２，３  Ｇａｌ  β１，３  ＧａｌＮＡｃα−をもたらす。末端ＮｅｕＮＡｃ残基：ＮｅｕＮＡｃα２，６  Ｇａｌβ１，３  ＧａｌＮＡｃαの連結においてのみ異なる関連するグリカンも調べた。大腸菌宿主において２，６シアリル化Ｔ抗原構造を有するグリカン終結を生成するために、２，３シアリル−Ｔ抗原グリカンを合成するのに必要な遺伝子を発現する上述のプラスミド（ｐＪＤＬＳＴ−０７）を、ｌｓｔ遺伝子を２，６シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で置き換えることにより、修飾した。
【０１８６】
構造ＮｅｕＮＡｃα２，６  Ｇａｌβ１，３  ＧａｌＮＡｃα１，３  ＧｌｃＮＡｃを発現するために、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）ＪＴ０１６０由来の２，６シアリルトランスフェラーゼをコードするＰｄｓｔ６のコドン最適化バージョンを、Ｍｒ．Ｇｅｎｅにより合成し、ＰＣＲにより増幅した。酵母における相同組換えにより、ｐＪＤＬＳＴ−０７におけるｌｓｔ遺伝子の代わりにＰｄｓｔ６遺伝子をクローニングして、ｐＪＤＰｄＳＴ６ｆｌ−０７を生成した。ＰｄＳＴ６遺伝子の配列を配列番号１５として提供する。プラスミドｐＪＤＰｄＳＴ６ｆｌ−０７は、ｐＢＡＤプロモーターの制御下に、以下の順：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｎｅｕＤ、ｎｅｕＢ、ｎｅｕＡ、ｎｅｕＣ、Ｐｄｓｔ６、ｗｂｎＪの遺伝子で合成オペロンを含有する。
【０１８７】
２，６シアル酸においてＮ−グリカン終結を有するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
２，６シアリル化−Ｔ抗原を含有する糖タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで生成するために、上述の株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬを使用して、シアリル化グリカンのペリプラズム蓄積を促進した。この株を、グリコシル化アクセプタータンパク質をコードするプラスミドｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−Ｙおよび２，６シアル酸−末端グリカンを合成するのに必要な機構を発現するｐＪＤＰｄＳＴ６ｆｌ−０７で同時形質転換した。
【０１８８】
ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬ  ｐＭＧ１Ｘ  Ｄ−ＹおよびｐＪＤＰｄＳＴ６ｆｌ−０７からなる一晩培養物を使用して、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを有するＬＢ中の培養物５０ｍＬを接種した。ＡＢＳ600が約１．５に達したとき、培養物を、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、誘導の約１９時間後に、遠心分離により細胞を回収した。細胞溶解後、ＮｉＮＴＡカラムにて、タンパク質を精製し、ＴＥＶプロテアーゼを使用して、得られた溶出液３０μｌを切断した。試料を３０℃で３時間インキュベーションし、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計にてジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリクスとして使用した質量分析により、アリコートを分析した。
【０１８９】
質量分析は、２，６シアリル化Ｔ抗原で修飾したグルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ６２５７）およびＴ抗原末端グリカンを有するグリコシル化グルカゴンの予測される大きさ（ｍ／ｚ  ５９６４）と一致する主要なピークを明らかにした（図１１）。
【０１９０】
プラスミドｐＪＤＰｄＳＴ６ｆｌ−０７から産生されたグリカンが実際には２，３シアリル−Ｔ抗原において終結しないことを確認するために、上で生成した糖ペプチドを、異なる選択性を有するノイラミニダーゼで処理した。シアリル化グルカゴンペプチドを分け、α２，３−、α２，６−、およびα２，８−連結シアル酸をグリカンまたは糖タンパク質から加水分解することが報告されているα２，３ノイラミニダーゼ（ＮＥＢ）またはノイラミニダーゼ（ＮＥＢ）と３７℃で３０分間インキュベーションした。得られたペプチドを、Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ質量分析により分析した（図１２）。α２，３ノイラミニダーゼで処理した分画（図１２、左）は、シアリル化産物について予測される大きさにて実質的なピーク（ｍ／ｚ  ６２５６）を含有するが、このピークは、ノイラミニダーゼで処理した試料には存在しない（図１２、右）ことが見出された。ノイラミニダーゼで処理した試料における主要なピーク（ｍ／ｚ  ５９６３）は、シアル酸の欠如と一致する、Ｔ抗原糖ペプチドの予測される大きさと一致する。α２，３ノイラミニダーゼではないノイラミニダーゼでの処置にてｍ／ｚ  ６２５７のピークが欠如することは、予測される末端α２，６ＮｅｕＮＡｃ残基を有するシアリル化糖ペプチドの産生と整合する。
【実施例１２】
【０１９１】
大腸菌における組換え産生したポリシアリル化グリカンの産生
大腸菌Ｋ１およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを含む、ポリシアル酸（ＰＳＡ）グリカンを産生することが公知の幾つかの細菌が存在する。これらの株において、ＰＳＡは、保護莢膜多糖類を形成する。ＰＳＡ莢膜は、大腸菌Ｋ１において十分に研究されているが、ＰＳＡ合成のための脂質基質は、同定されていない。Ｎ−グリコシル化のためＰＳＡを適合するために、ＯＳＴに適切な基質でのその合成を指揮し、ＰＳＡポリメラーゼがシアリル化を拡大するのに必要なジシアル酸「プライマー」を提供することが恐らく必要である。本明細書に記載する、ヒトＴ抗原において終結するグリカンは、このシステムにおけるグリコシル化において効率的に使用されるので、ポリシアリル化についての良好な候補である。ジシアル酸モチーフを有するＴ抗原を作り上げるために、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来の遺伝子ｃｓｔＩＩおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ由来の遺伝子ｌｉｃ３Ｂを、それらの報告された二官能性２，３および２，８シアリルトランスフェラーゼ活性に基づき選択した。重合作用について、大腸菌遺伝子であることから、ｎｅｕＳ遺伝子を連続的２，８シアリル化のため選択した。
【０１９２】
ポリシアリル化の探索におけるプラスミドの使用をクローニングするために、ｃｓｔＩＩ遺伝子およびｌｉｃ３ｂ遺伝子の合成バージョンを得た（Ｍｒ．Ｇｅｎｅ）。ｃｓｔＩＩおよびｌｉｃ３ｂの配列を、配列番号１６および１７として供給する。
【０１９３】
二官能性α２，３  α２，８シアリルトランスフェラーゼの最初の２６０アミノ酸をコードする遺伝子ｃｓｔＩＩの切断バージョンを、ｎｅｕＢＡＣ、大腸菌Ｋ１ポリシアリルトランスフェラーゼｎｅｕＳ（配列番号１８）、およびＴ抗原グリカンを合成するための遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける相同組換えを使用して、クローニングした。全長二官能性α２，３  α２，８シアリルトランスフェラーゼｌｉｃ３ｂも、同一の方法でクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＪＣｓｔＩＩＳ−０７およびｐＪＬｉｃ３ｂＳ−０７と呼ぶ。
【０１９４】
プラスミドｐＪＣｓｔＩＩＳ−０７を使用して、機能的試験のためＭＣ４１００  ΔｎａｎＡおよびＭＣ４１００  ΔｎａｎＡ  ΔｗａａＬを形質転換した。単一コロニーを、０．２５％（ｗ／ｖ）のＮｅｕＮＡｃ、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび０．２％（ｖ／ｖ）のアラビノースを含有するＬＢ培地１ｍＬに接種した。培養物を、１．５ｍＬのチューブにおいて３０℃で約１８時間成長させ、ペレット化した。ＰＢＳで洗浄後、培養物を光学密度により規格化し、９５℃で１０分間加熱し、冷却する際、全細胞をニトロセルロースにスポットした。膜を、抗ＰＳＡ抗体、続いて抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼでブロットした（図１３ａ）。ＰＳＡ抗体との反応性は、ｗａａＬの存在下で細胞表面にＰＳＡ−グリカンが提示されることを示唆する。予測されるグリカンの構造を図示する（図１３ｂ）。
【０１９５】
グリコシル化反応において推定ＰＳＡ−末端グリカンを試験するために、ＭＣ４１００  Δｗａａｌ  ΔｎａｎＡ株を、グリコシル化アクセプタータンパク質をコードするｐＭＧ４Ｘ−Ｙで形質転換した。得られた株を、プラスミドｐＤｉｓＪ−０７またはｐＪＬｌｃ３Ｂ−０７で形質転換した。得られた株を、０．２５％  ＮｅｕＮＡｃ＋／−および適当な抗生物質を有するＬＢ５０ｍＬにおいて成長させた。培養物を、約２〜４の間の光学密度にて０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。タンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、濃縮し、ウエスタンブロットによる分析に先立ち、ＴＥＶプロテアーゼで処理した（図１４）。
【０１９６】
αＰＳＡ抗体での検出（図１４、上部）は、ｐＪＬｉｃ３ＢＳ−０７およびＮｅｕＮＡｃ添加の存在下でのみ反応性の材料のいくつかが、ＰＳＡグリカンの存在と整合することを示した。総標的タンパク質を、αＨｉｓ抗血清でヘキサヒスチジンタグの存在により検出する（図１４、下）。
【実施例１３】
【０１９７】
ＮｅｕＤは、大腸菌ＭＣ４１００においてシアリル化グリカンの合成に重要である
ＮｅｕＤ機能の矛盾する割当も存在するが、ｎｅｕＤ遺伝子は、大腸菌Ｋ１およびシアリル化グリカンを産生する他の株においてＰＳＡ合成のための遺伝子座の一部である。シアリル化プラットフォームにおけるＮｅｕＤの重要性を確認するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける相同組換えを使用して、これをベクターｐＴＲＣＹに個別の遺伝子としてクローニングした。得られた、ＮｅｕＤをＴｒｃプロモーターの制御下に含有するプラスミドを、ｐＮｅｕＤ−Ｙと呼ぶ。
【０１９８】
ｐＮｅｕＤ−Ｙを試験するために、このプラスミドをｐＪＬｉｃ３ＢＳ−０７と共に使用して、株ＭＣ４１００  ΔｎａｎＡを同時形質転換した。単一のコロニーを、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールおよび０．２％  アラビノースを含有するＬＢ培地１ｍＬに接種した。ＬＢ培地を、０．２５％（ｗ／ｖ）の終濃度のシアル酸ありまたはなしで作製し、ｐＨについて調節し、濾過滅菌した。培養物を、１．５ｍＬのチューブにおいて３０℃で約１８時間成長させ、ペレット化する。ＰＢＳで洗浄後、培養物を光学密度により基準化し、９５℃で１０分間加熱し、冷却する際、全細胞をニトロセルロースにスポットする。抗ＰＳＡ抗体、続いて抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼで膜をブロットした（図１５）。
【０１９９】
ＰＳＡ抗体との反応性は、ｐＮｅｕＤ−ＹまたはＮｅｕＮＡｃの存在下での細胞表面ＰＳＡグリカンの存在を示唆する。この結果は、実験室大腸菌においてシアリル化化合物の産生におけるＮｅｕＤの重要性を示唆する（図１５）。
【実施例１４】
【０２００】
ｅｘ  ｖｉｖｏポリシアリル化
実験室大腸菌におけるポリシアリルトランスフェラーゼの機能性を確認するための代替方法として、ポリシアリル化のｅｘ  ｖｉｖｏ方法を利用した。この方法のため、ポリシアリルトランスフェラーゼを発現する株から溶菌液を生成し、これを、別の株で産生させたＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびアクセプタータンパク質と合わせる。このシステムにおいて効率的に発現されグリコシル化されることから、ＭＢＰをアクセプタータンパク質としての使用のため選択した。
【０２０１】
アクセプタータンパク質プラスミドを調製するために、ＤｓｂＡシグナルペプチドおよび４×Ｇｌｙｃタグおよびヘキサヒスチジンモチーフで修飾したＭＢＰのコード配列を、ｐＴＲＣ９９−ＭＢＰ  ４×ＤＱＮＡＴからサブクローニングした（Ｆｉｓｈｅｒ  ＡＣ，Ｈａｉｔｊｅｍａ  ＣＨ，Ｇｕａｒｉｎｏ  Ｃ，Ｃｅｌｉｋ  Ｅ，Ｅｎｄｉｃｏｔｔ  ＣＥ，Ｒｅａｄｉｎｇ  ＣＡ，Ｍｅｒｒｉｔｔ  ＪＨ，Ｐｔａｋ  ＡＣ，Ｚｈａｎｇ  Ｓ，ＤｅＬｉｓａ  ＭＰ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，７７（３）：８７１−８８１．）。得られたプラスミドをｐＭＢＰ４ＸＧＴ−Ｙと名付ける。Ｗｉｌｌｉｓら（Ｗｉｌｌｉｓ  ＬＭ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｍ，Ｋａｒｗａｓｋｉ  Ｍ−Ｆ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  Ｍ−Ｃ，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ  ＷＷ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  α−２，８−ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８，１８（２）：１７７−１８６．）により記載されるセルフプライミングポリシアリルトランスフェラーゼを作製するために、ナイセリアのポリシアリルトランスフェラーゼＳｉａＤ（Ｇｅｎｗｉｚから得た）への翻訳融合物としてＣｓｔＩＩもクローニングした。２つのバージョンを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける相同組換えを使用してクローニングし、これはプラスミドｐＣｓｔＩＩ−ＳｉａＤ−ＹおよびｐＣｓｔＩＩ１５３Ｓ−ＳｉａＤ−Ｙをもたらし、後者は、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性を改善することが報告されている、イソロイシン５３のシステインへの変異を含む。ｓｉａＤの配列を配列番号１９として提供する。
【０２０２】
Ｔ抗原含有グリカンをＭＢＰ４ＸＧＴタンパク質に加えることにより、アクセプター糖タンパク質をまず調製した。プラスミドｐＭＢＰ４ＸＧＴ−ＹおよびｐＤｉｓＪ−０７を使用して、株ＭＣ４１００  ΔｗａａＬを形質転換した。得られた株を、ＬＢ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する培養物１Ｌに接種した。光学密度がＯＤ１．５に達するまで、培養物を３０℃でインキュベーションし、次に、グリカンおよび糖タンパク質産生の両方を、それぞれ、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。１６時間後、ペレットを回収し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、ｈｉｓタグを付けたタンパク質を精製した。溶出したタンパク質は、５０ｍＭ  トリス  ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有するｅｘ  ｖｉｖｏシアリル化緩衝液に緩衝液交換され、濃縮される。
【０２０３】
ポリシアリルトランスフェラーゼ溶菌液を調製するために、プラスミドｐＴＲＣＹ、ｐＣｓｔＩＩ−ＳｉａＤ−Ｙ、またはｐＣｓｔＩＩ１５３Ｓ−ＳｉａＤ−Ｙを含有する株ＭＣ４１００  ΔｗａａＬを、ＬＢおよびアンピシリンを含有する培養液５０ｍＬにおいて成長させた。光学密度が１．５〜１．９に達したとき、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの終濃度まで添加することで、タンパク質発現を誘導し、誘導を２０℃で約１６時間実施する。ペレットを回収し、ｅｘ  ｖｉｖｏシアリル化緩衝液に再懸濁した。細胞溶解後、材料を１０００×ｇにて１１分間遠心し、上清を保持した。
【０２０４】
ｅｘ  ｖｉｖｏ反応のため、ＭＢＰ糖タンパク質２０μｌを、３０μｌのポリシアリル化または対照溶菌液およびＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃと合わせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる分析に先立ち、反応物を３７℃で４５分間インキュベーションした（図１６）。抗ＰＳＡ抗血清（図１６、上部パネル）のインキュベーションは、両方のＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびｐＣｓｔＩＩ１５３Ｓ−ＳｉａＤ−Ｙを含有する溶菌液の存在下で高分子量材料の出現をもたらし、これはＰＳＡグリカンの形成と整合する。ｐＣｓｔＩＩ−ＳｉａＤ−Ｙプラスミドを含有する溶菌液で生成した反応性材料の量の低減が存在しているように見える一方、ベクター対照で検出されないことを明らかにした。ＭＢＰ４ＸＧＴタンパク質の存在を抗ヒスチジンウエスタンブロットで確認した（図１６、下側のパネル）。
【実施例１５】
【０２０５】
大腸菌におけるヒト血液型Ｏグリカン（Ｈ抗原）のＮ−グリカン終結のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
ヒト血液型Ｏ決定基またはＨ抗原は、ヒトＴ抗原に類似するフコシル化グリカンからなる。ＩＩＩ型Ｈ抗原構造は、フコース  α１，２  ガラクトース  β１，３  ＧａｌＮＡｃ  α−からなる。大腸菌において、ヒトＨ抗原構造におけるグリカン終結を合成するために、Ｔ抗原グリカンを合成するのに必要とされる遺伝子を発現する、上述のプラスミド由来の遺伝子を、フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と合わせた。
【０２０６】
大腸菌Ｏ８６由来のフコシルトランスフェラーゼＷｂｎＫは、その天然の状況下で同様の構造を有するグリカンをフコシル化する細菌酵素であるので、これを選択した。ｗｂｎＫの配列を、配列番号２０として提供する。ｗｂｎＪ遺伝子およびｗｂｎＫ遺伝子を含有するＰＣＲ産物を、Ｇｅｎｅｗｉｚから得た合成鋳型を使用して生成した。酵母における相同組換えを使用して、ＰＣＲ産物を直線ｐＤｉｓ−０７プラスミドと合わせて、プラスミドｐＤｉｓＪＫ−０７を生成した。得られたプラスミドｐＤｉｓＪＫ−０７は、ｐＢＡＤプロモーターの制御下に、以下の順：ｇａｌＥ、ｐｇｌＢ、ｐｇｌＡ、ｗｂｎＪ、ｗｂｎＫの遺伝子で合成オペロンを含有する。
【０２０７】
フコシル化血液型Ｈ抗原を発現させる際に使用するため、大腸菌株ＬＰＳ１（Ｙａｖｕｚ  Ｅ，Ｍａｆｆｉｏｌｉ  Ｃ，Ｉｌｇ  Ｋ，Ａｅｂｉ  Ｍ，Ｐｒｉｅｍ  Ｂ：Ｇｌｙｃｏｍｉｍｉｃｒｙ：  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１，２８（１）：３９−４７．）を使用して、ＧＤＰ−フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ）の蓄積を促進した。大腸菌は、ＧＤＰ−Ｆｕｃの合成のための天然の経路をコードするが、次に、この糖ヌクレオチドをフコース含有菌体外多糖コラン酸に正常に取り込まれる。この競合経路においてＧＤＰ−Ｆｕｃの使用を防ぐために、変異が、推定ＵＤＰ−グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードする遺伝子ｗｃａＪに存在する（ＥＣＫ２０４１）。この株においてグリコシル化をさらに促進するために、ｗａａＬ遺伝子における変異を導入した。ｗａａＬ（ｒｆａＬ）遺伝子にＫｅｉｏコレクションの一部として従前に変異導入し、得られた株ｒｆａＬ７３４（ｄｅｌ）：：ｋａｎ（ＪＷ３５９７−１）（Ｂａｂａら）を、Ｙａｌｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から得た。Ｐ１  ｖｉｒファージを使用して、ｗａａＬ変異をＬＰＳ１レシピエントに形質導入して、株ＬＰＳ１  ΔｗａａＬ：：ｋａｎを作製した。
【０２０８】
ｐＤｉｓＪＫ−０７によりコードされるグリコシルトランスフェラーゼにより産生されるグリカン構造を確認するために、プラスミドを使用して、脂質放出オリゴ糖の分析のため株ＬＰＳ１  ΔｗａａＬ：：ｋａｎを形質転換した。得られた株の培養物２５０ｍＬを３０℃で成長させ、光学密度がＡＢＳ600約２．０辺りに達したとき、誘導した。ＧａｏおよびＬｅｈｒｍａｎの方法による脂質結合型オリゴ糖の単離のため、約２０時間後に細胞を回収した。簡単に言うと、ペレットをメタノール１０ｍＬに再懸濁し、超音波処理により溶解した。材料を６０℃で乾燥させ、続いて超音波処理を介して２：１のクロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ、ＣＭ）１ｍＬに再懸濁し、材料をＣＭにおいて２回洗浄した。次に、ペレットを水において洗浄し、次に、脂質を、１０：１０：３のクロロホルム：メタノール：水（ｖ／ｖ／ｖ、ＣＭＷ）で、続いてメタノールで抽出した。ＣＭＷ抽出物とメタノール抽出物を合わせ、ＤＥＡＥセルロースカラムに添加した。ＣＭＷを使用して、カラムを洗浄し、ＣＭＷ中３００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃで脂質結合型オリゴ糖を溶出した。脂質結合型オリゴ糖をクロロホルムで抽出し、乾燥させた。
【０２０９】
グリカンを脂質から放出させるために、材料を、１：１のイソプロパノール：水（ｖ／ｖ）中０．１Ｎ  ＨＣｌ１．５ｍＬに再懸濁した。溶液を５０℃で２時間加熱し、次に、７５℃で乾燥させた。残基を水飽和ブタノールに懸濁し、グリカンを含有する水相を乾燥させ、水に再懸濁し、ＡＧ５０Ｗ−Ｈ８（水素原子）カチオン交換樹脂、続いてＡｇ１−Ｘ８（ギ酸塩形態）陰イオン交換樹脂で精製した。
【０２１０】
水に可溶化した精製したオリゴ糖を、α１，２フコシダーゼ（ＮＥＢ処理）または緩衝液のみの対照とインキュベーションし、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリクスとして使用したＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計にて分析した（図１７ａ）。緩衝液対照（上部パネル）において、（ｍ／ｚ  ７５５）および（ｍ／ｚ  ６０９）に存在する２つの主要なピークは、それぞれ、フコシル化産物（Ｆｕｃ  Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）およびＴ抗原グリカン（Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）の予測される（ｍ／ｚ）と一致する。フコシダーゼ処理（下のパネル）後、（ｍ／ｚ  ７５５）のピークは大いに低減され、一方（ｍ／ｚ  ６０９）のピークは、相対的に大きくなる。これらのピーク間の差（１４６）は、フコース残基（デオキシヘキソース）の大きさと一致する。
【実施例１６】
【０２１１】
ＧＤＰ−フコース生合成遺伝子の発現を通じた相対的フコシル化の改善
Ｔ抗原グリカンからフコシル化産物への変換を改善するために、ＧＤＰ−フコース、ＵＤＰ−Ｇａｌ、およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃについての生合成機構のさらなるコピーの発現を可能にするために、システムを考案した。これを達成するために、ｐＭＱ７０において、ｐＢＡＤプロモーターの制御下に、合成オペロンとして以下の遺伝子：ｇａｌＥ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ｇａｌＥ、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢ、ｃｐｓＧ（大腸菌Ｋ１２）をクローニングして、酵母における相同組換えを使用してプラスミドｐＧＮＦ−７０を作製した。ｐＧＮＦ−７０においてクローニングした大腸菌遺伝子の配列を、配列番号２１〜２６として提供する。
【０２１２】
株ＬＰＳ１  ΔｗａａＬ：：ｋａｎを、プラスミドｐＪＫ−０７およびｐＧＮＦ−７０で形質転換した。得られた株を、ＬＢ培地２５０ｍＬにおいてアンピシリンおよびクロラムフェニコール選択下で培養し、両方のプラスミドの発現を、光学密度約２．０にて誘導し、誘導を３０℃で約１６時間継続した。ペレットを回収し、ＧａｏおよびＬｅｈｒｍａｎの方法により従前に記載された通り、ＬＬＯを精製した。
【０２１３】
上述の通り、質量分析により精製したオリゴ糖を分析した（図１７ｂ）。この処理後に同定された主要なピーク（ｍ／ｚ  ７５５）は、所望のフコシル化グリカン（ｄＨｅｘ  Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）と一致し、これは、効率的なフコシル化を示唆する。さらなるピークは、グリカン（Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）と一致する（ｍ／ｚ  ６０９）に存在する。
【実施例１７】
【０２１４】
大腸菌におけるフコシル化糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ生成
フコシル化グリカンの分析後、グリカンが、グリコシル化反応に使用可能であることを確認することが必要である。ＴＮＦα  Ｆａｂを、グリコシル化のための最初の標的として選択した。それぞれの鎖についてのシグナルペプチド配列を含むＦａｂのコドン最適化バージョンをＤＮＡ２．０から得て、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて相同組換えを使用してｐＴＲＣＹにクローニングして、４×Ｇｌｙｃタグおよびヘキサヒスチジンタグを重鎖に付加した。得られたプラスミドを、ｐＴｎｆαＦａｂ４Ｘ−Ｙと命名した。修飾したＴＮＦα  Ｆａｂ軽鎖および重鎖の配列を、配列番号２７および２８として供給する。
【０２１５】
ｐＴｎｆαＦａｂ４Ｘ−Ｙを使用して、グリコシル化プラスミドｐＪＫ−０７または空ベクターｐＭＷ０７を有する株ＬＰＳ１を形質転換し、得られた株を、ＬＢの培養物５０ｍＬに接種し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールの選択下で成長させた。ＡＢＳ600１．５の光学密度にて、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることで、両方のプラスミドの発現を誘導し、３０℃で約１６時間培養物を維持した。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンパク質を精製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いて抗ヒスチジン抗体でのウエスタンブロットにかけた。移動度シフトは、グリコシル化プラスミドｐＪＫ−０７の存在下で成長させたＦａｂ重鎖について明らかであるが、ベクターｐＭＷ０７ではそうでなく、グリコシル化と整合する（図１８）。
【実施例１８】
【０２１６】
血液型Ｈ抗原で修飾した大腸菌におけるフコシル化糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ生成
上述の実験は、質量分析により決定されたように、ＧＤＰ−フコース生合成経路のさらなるコピーの発現を通じた、フコシル化産物の相対量を増加できる可能性を示した。グリコシル化アクセプターペプチドをコードするプラスミドｐＭＧ１Ｘ−Ｙを、以下の遺伝子：ｇａｌＥ（カンピロバクター・ジェジュニ）、ｇａｌＥ（大腸菌）、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢ、およびｃｐｓＧも含むように酵母相同組換えを使用して修飾して、プラスミドｐＭＧ１Ｘ−ＧＮＦ−Ｙを作製する。同様のプラスミドを、同一の方法において、グルカゴン構築物に加えて、以下の遺伝子：ｗｂｎＫ、ｇａｌＥ（大腸菌）、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢ、およびｃｐｓＧでクローニングし、ｐＭＧ１Ｘ−ＫＧＦ−Ｙと名付けた。
【０２１７】
グリコシル化のための調製において、株ＬＰＳ１をプラスミドｐＤｉｓＪＫ−０７で形質転換した。これに、グリコシル化アクセプタータンパク質をコードするプラスミド（ｐＭＧ１Ｘ−Ｙ）またはＧＤＰ−フコース生合成機構を有するアクセプタータンパク質をコードするプラスミドを加えた（ｐＭＧ１Ｘ−ＧＮＦ−Ｙ、ｐＭＧ１Ｘ−ＫＧＦ−Ｙ）。得られた株を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを有するＬＢ培地中の培養物５０ｍＬにおいて３０℃で成長させた。培養物が、ＡＢＳ600約１．５の光学密度に達したとき、０．２％  アラビノースおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることで、両方のプラスミドを誘導した。１６時間後、ペレットを回収し、タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。溶出液を５０ｍＭ  トリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌに交換し、濃縮したタンパク質３０μｌを、ＴＥＶプロテアーゼで３時間処理して、糖ペプチドを放出させた。
【０２１８】
ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計にてジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリクスとして使用して、糖ペプチドを分析した（図１９）。フコシル化糖ペプチド（ｄＨｅｘ  Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2、ｍ／ｚ  ６１０３）およびガラクトシル化糖ペプチド（Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2、ｍ／ｚ  ５９５７）の予測される大きさと一致するピークは、プラスミドｐＭＧ１Ｘを有する株から調製した糖ペプチドに存在する（左）。副産物をアスタリスクで示す。ｐＭＧ１Ｘ  ＧＮＦ−Ｙを宿している株由来の糖ペプチドは、Ｈ抗原糖ペプチドの予測されるｍ／ｚ（ｄＨｅｘ  Ｈｅｘ  ＨＥｘＮＡｃ2、ｍ／ｚ  ６１０５）と一致する１つの主要なピークを表した。（ｍ／ｚ  ５９６０）のさらなるより小さなピークも存在し、残存する、Ｔ抗原グリカンを含有するフコシル化されていない糖ペプチド（Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）を恐らく表している。
【０２１９】
株ＬＰＳ１  ｐＪＫ−０７  ｐＭＧ１Ｘ  ＫＧＦ−Ｙから調製した糖ペプチドを分け、ＤＨＢをマトリクスとして使用したＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計での分析に先立ち、３７℃で８時間α１，２フコシダーゼ（ＮＥＢ）または緩衝液対照で処理した（図２０）。緩衝液のみの試料に存在する主要なピーク（ｍ／ｚ  ６１０７）は、グリカンを含有するＨ抗原（ｄＨｅｘ  Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）の予測される大きさと一致する。フコシダーゼで処理した試料は、ｇａｌ末端Ｔ抗原グリカン（Ｈｅｘ  ＨｅｘＮＡｃ2）の予測される大きさと一致する（ｍ／ｚ  ５９６３）にて主要なピークを有する。
【実施例１９】
【０２２０】
Ｈ抗原グリカンでのＧＨ２のグリコシル化
組換えヒトタンパク質のグリコシル化を調べるために、ヒト成長ホルモン胎盤変異体（ＧＨ２）を、この大腸菌プラットフォームにおける発現のため適合した。酵母における相同組換えを使用して、３’ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｍａｌＥ遺伝子配列をｐＴｒｃＹにおいてＣ末端ヘキサヒスチジンモチーフを有するＧＨ２をコードする遺伝子に融合した。加えて、このタンパク質の天然のグリコシル化部位を囲む配列を、ＤＱＮＡＴをコードするよう修飾した。Ｈ抗原グリカン（ｇａｌＥ  Ｃｊ、ｇａｌＥ  Ｅｃ、ｇｍｄ、ｆｃｌ、ｇｍｍ、ｃｐｓＢ、ｃｐｓＧ）の生成を改善することが見出された遺伝子を、ＧＨ２融合タンパク質をコードする配列の３’末端の後に挿入して、プラスミドｐＧ４−Ｈｉｓ−ＧＮＦ−Ｙを作製した。ＧＨ２融合タンパク質のＤＮＡ配列を、配列番号２９として提供する。
【０２２１】
ｐＧ４−ＨｉｓＧＮＦ−Ｙを使用して、最適なフコシル化のため、大腸菌株ＬＰＳ１をＨ抗原グリカンで形質転換した。得られた株をエレクトロコンピテントとし、Ｈ抗原グリカンおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢ（ｐＪＫ−０７）を産生するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼの発現のため遺伝子を含有する第２のプラスミドで形質転換した。ＧＨ２およびＧＨ２−Ｈ抗原を発現させるために、ＬＢ１リットルに一晩培養物５０ｍＬを接種し、それぞれ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンまたは１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールでの選択下３０℃で成長させた。ＡＢＳ600約３．０に達するまで、振盪プラットフォームにおいて３０℃で培養物をインキュベーションした。ｐＧ４−Ｈｉｓ−ＧＮＦ−Ｙプラスミド単独を含有する培養物を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一方Ｇ４−Ｈｉｓ−ＧＮＦ−ＹおよびｐＪＫ−０７プラスミドを含有する培養物を、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％ｖ／ｖ  アラビノースで、３０℃で１６時間誘導した。
【０２２２】
グリコシル化の精製および決定
細胞をペレット化し、次に、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有するＮｉ−ＮＴＡカラム結合緩衝液に再懸濁した。細胞を氷上にて３０分間インキュベーションし、次に、１０秒間のパルス５回で超音波処理により破壊した。超音波処理後、次に、清澄化した溶菌液を、５μｍの濾紙、次に、０．４５μｍの濾紙を通して濾過し、５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＮｉ−親和性精製した。タンパク質をＤＥＡＥ添加緩衝液（２０ｍＭ  トリス、ｐＨ６．８）に緩衝液交換し、ＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬを使用して精製し、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ６．８中ＮａＣｌ勾配（０〜５００ｍＭ）で溶出した。溶出したタンパク質をプールし、濃縮し、１７ｍＭ  βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有するＮｉ−ＮＴＡカラム結合緩衝液に交換し、次に、約１０００Ｕ  ＴＥＶプロテアーゼで処理し、室温で一晩インキュベーションした。ＭＢＰからの切断の成功を、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。切断が完了したら、次に、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ結合緩衝液２０ｍＬに取り、上述の通り、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂により精製した。分画を１ｍＬまで濃縮し、ＧＳＴ／アミロース混合樹脂重力フローカラムに添加して、ＭＰＢおよびＴＥＶを取り除いた。ｈＧＨを、カラム洗浄緩衝液（５０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において見出した。次に、それぞれのタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２２３】
グリコシル化を評価するために精製したＧＨ２−Ｈ抗原を分析した。精製したタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、αｈＧＨ抗体（Ａｂｃａｍ  ＡＢ９８２１）による検出でのウエスタンブロットのためＰＶＤＦに導入した（図２１、左パネル）。２重の出現は、グリコシル化と整合する。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析により、ＧＨ２−Ｈ抗原をさらに分析した。分析は、主要なピーク（ｍ／ｚ  ２３０４７．８）が、フコシル化Ｈ抗原で修飾したＧＨ２タンパク質の予測される大きさと一致することを明らかにし（図２１、右）、これは効率的なグリコシル化を示唆している。さらなるピークは、ｍ／ｚ  ２２３２８．５が、非グリコシル化タンパク質の予測される大きさと一致することを意味した。
【実施例２０】
【０２２４】
ＧＨ２−Ｈ抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ特性の評価
グリコシル化がタンパク質安定性への利益をもたらすかどうかを決定するために、撹拌に対する抵抗性をＧＨ２のグリコシル化形態および非グリコシル化形態について比較した。それぞれのＧＨ２形態の溶液０．５ｍｇ／ｍＬを、０〜１０分の範囲にかけて種々の長さの時間ボルテックスした。ＡＢＳ405ｎｍを直ちに記録して、溶液の濁度を決定した。加えて、ＡＢＳ280ｎｍもモニターして、濁度の増大が凝集に起因するかどうかを決定し、ここで、可溶性タンパク質の喪失は、ＡＢＳ280ｎｍでの読み取りの低減をもたらしうる。それぞれのデータセットをプロットし、変性の割合を決定した（図２２ａ）。濁度の増大は、ＧＨ２単独と比較してＧＨ２−Ｈ抗原タンパク質について、より遅くかつより激しくなく、これは、撹拌により誘導される変性に対するより高い抵抗性と整合する。
【０２２５】
ＧＨ２のグリコシル化が、受容体結合に影響するかどうかを決定するために、ＧＨ２の両方の非グリコシル化形態およびグリコシル化形態を、ＥＬＩＳＡに基づく受容体結合アッセイにかけた。ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍＬ  ＩｇＧに融合したｈＧＨ受容体の外部ドメイン（ｈＧＨＲ）（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と、室温で２時間インキュベーションした。続いてプレートを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロッキングし、次に、ＰＢＳで洗浄した。０〜５００ｎＭの濃度範囲のそれぞれのＧＨ２形態を、ｈＧＨＲコーティングＥＬＩＳＡプレートにおいて室温で１時間インキュベーションし、続いてブロッキング緩衝液で洗浄した。それぞれのウェルを、いずれかの抗Ｈｉｓタグ−ＨＲＰ抗体または抗ｈＧＨ抗体と室温で１時間インキュベーションし、続いてブロッキング緩衝液で洗浄した。抗ｈＧＨ抗体の場合、マウスＨＲＰ−コンジュゲート２次抗体を、それぞれのウェルにおいて室温で４５分間インキュベーションした。次に、ウェルを洗浄し、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）で展開し、反応を２Ｍ  ＨＣＬで停止させ、４５０ｎｍにて読み取った。値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにプロットすることにより、それぞれのＫd値を決定した。計算した解離定数（Ｋｄ）は、ＧＨ２について１．５＋／−０．７×１０1ｎＭであり、ＧＨ２−Ｈ抗原について１．６＝／−０．９×１０1ｎＭであり、これは、グリコシル化の受容体結合に対する作用が無視できることを示唆していた（図２２ｂ）。
【０２２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期
グリコシル化が、ＧＨ２の半減期に対していずれかの影響を有するかどうかを決定するために、ラットモデルｉｎ  ｖｉｖｏ半減期アッセイにおいて、それぞれの形態を研究した。１ｍｇ／ｍＬ  ＧＨ２またはＧＨ２−Ｈ抗原溶液の１回静脈内ボーラス用量３００μｇを、４匹のオスのスプラーグドーリーラットの群に投与した。２４時間の期間に渡り種々の時間ポイントで、血液試料を採取し、遠心分離により血清を分離した。抗ｈＧＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を、炭酸緩衝液  ｐＨ９．６において２μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、これを使用して、室温で２時間ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。次に、プレートをブロッキングし、洗浄し、それぞれの時間ポイントの血清と室温で３０分間インキュベーションした。抗Ｈｉｓタグ−ＨＲＰコンジュゲート抗体を、ウェルに室温で３０分間加え、続いて１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）で展開した。２Ｍ  ＨＣｌを加えることにより、反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにて記録した。ＧＨ２−Ｈ抗原タンパク質の検出は、非グリコシル化バージョンのものより強く、最後３カ所の時間ポイントにおいて最も著しかったことは、Ｈ抗原グリカンでのグリコシル化が血清中持続性を増強することを示唆している（図２３）。
【実施例２１】
【０２２７】
関連する構造を有するグリカンの産生
大腸菌におけるＮ−糖タンパク質産生についてのストラテジーを設計する際に重要な考慮すべき事項は、恐らく多数の要因により決定されるであろうグリコシル化反応の効率である。１つのかかる要因はＯＳＴが特定のグリカン構造を提示しうるという任意の選択性である。上述の実施例において概説したグリコフォームは全ての、ＧａｌＮＡｃα１，３  ＧｌｃＮＡｃ  グリカンからなる効率的に転移した「ベース」グリカンの同化であり、これから、Ｔ抗原、（２，３）シアリル−Ｔ抗原、Ｈ抗原、および（２，６）シアリル化Ｔ抗原を含む構造を作製した。これらの実施例は、ガラクトシル化グリカン、シアリル化グリカン、およびフコシル化グリカンを含有する大腸菌糖タンパク質を生成する能力を説明するためのツールとして部分的に役立っているが、基本的構造から構築しうるグリカン構造の唯一の表現であることを意味しない。
【０２２８】
例えば、関連構造に加えて、Ｌｅｗｉｓ×グリカン（Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃ）をＴ抗原グリカンから構築することができた。これを行うために、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、β１，３ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＬｓｇＥ）活性およびβ１，４Ｇａｌトランスフェラーゼ（ＬｓｇＤ）活性を有するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のものを、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、例えば、ヘリコバクター・ピロリＦｕｃＴ［２３］と共に、ｐｄｉｓＪ−０７プラスミドに挿入するだろう。このプラスミドが、必要な糖ヌクレオチドの十分な蓄積を可能にするよう、ｐＧＮＦ−７０またはｐＭＧ１Ｘ−ＧＮＦ−Ｙと同時発現したとき、構造Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの産生をもたらすと予測されるだろう。ＬｓｇＥ、ＬｓｇＤ、およびＦｕｃＴタンパク質の配列を、配列番号３０〜３２として含む。
【０２２９】
同様に、実施例１５〜１９において考察したＨ抗原グリカンを、さらなる関連する構造を生成するようさらに構築することができた。ヒト血液型決定基ＡＢおよびＯは、血液型Ｏグリカン（Ｈ抗原）に基づく相互に関連する構造である。大腸菌Ｏ８６は、ヒト血液型Ｂグリカンと同様のオリゴ糖を天然で作製し、従って、Ｈ抗原グリカンを拡大するのに必要なガラクトシルトランスフェラーゼ活性の可能性のある供給源である。α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼＷｂｎＩをコードする遺伝子［２４］を既存のｐＪＫ−０７プラスミドに挿入し、これを、Ｈ抗原グリカンを生成するのに使用したものと同様の条件下で発現させることにより、構造Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα１，３ＧｌｃＮＡｃを有するグリカンの産生をもたらすと予測される。同様に、α１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｔｅｌａｅ由来のＢｇｔＡ［２５］を使用して、構造ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα１，３ＧｌｃＮＡｃを有するＡ抗原を含有するグリカンを生成することができた。ＷｂｎＩおよびＢｇｔＡのアミノ酸配列を、配列番号３３〜３４として含む。
【０２３０】
本明細書に記載するオリゴ糖を、代替的ＵｎｄＰＰ連結糖上にてアセンブリーしうることがさらに予測される。代替物は、大腸菌Ｏ１５７由来のＧＮＥ［２６］（配列番号３５）によりＵｎｄＰに結合しうる、またはＣ．ｊｅｊｕｎｉのグリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＣ（配列番号３６）および糖ヌクレオチド合成タンパク質ＰｇｌＦＥＤ［２７］（配列番号３７〜３９）の活性を通じてバシロサミンに結合しうる、ＧａｌＮＡｃを含みうる。
【０２３１】
非公式の配列表
配列番号１
ｐＭＷ０７：ベクター
７６１０ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２３２】
【化１−１】
2016518825.tif 000003
【０２３３】
【化１−２】
2016518825.tif 000004
【０２３４】
【化１−３】
2016518825.tif 000005
【０２３５】
配列番号２
ｇａｌＥ：エピメラーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ５．１．３．２
９８７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２３６】
【化２】
2016518825.tif 000006
【０２３７】
配列番号３
ｐｇｌＢ：ＯＳＴ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ２．４．１．１１９
２１４２ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２３８】
【化３】
2016518825.tif 000007
【０２３９】
配列番号４
ｐｇｌＡ：α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．１．−
１１３１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２４０】
【化４】
2016518825.tif 000008
【０２４１】
配列番号５
ｗｂｎＪ：β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．１．３０７
７６５ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２４２】
【化５】
2016518825.tif 000009
【０２４３】
配列番号６
ｐＴＲＣ９９Ｙ
６８６６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２４４】
【化６−１】
2016518825.tif 000010
【０２４５】
【化６−２】
2016518825.tif 000011
【０２４６】
【化６−３】
2016518825.tif 000012
【０２４７】
配列番号７
ＭＢＰ−ｈＧＨ
１７９１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２４８】
【化７】
2016518825.tif 000013
【０２４９】
配列番号８
ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
ＥＣ  ２．５．１．５６
１０４１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２５０】
【化８】
2016518825.tif 000014
【０２５１】
配列番号９
ｎｅｕＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．７．７．４３
１２５７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２５２】
【化９】
2016518825.tif 000015
【０２５３】
配列番号１０
ｎｅｕＣ：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ
ＥＣ  ５．１．３．１４
１１７６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２５４】
【化１０】
2016518825.tif 000016
【０２５５】
配列番号１１
ｎｅｕＤ：シアル酸生合成タンパク質、アセチルトランスフェラーゼファミリー
ＥＣ  ２．３．１．４５
６２４ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２５６】
【化１１】
2016518825.tif 000017
【０２５７】
配列番号１２
ｌｓｔ：２，３  ＮｅｕＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
ＥＣ  ２．４．９９．４
１１１６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２５８】
【化１２】
2016518825.tif 000018
【０２５９】
配列番号１３
ＭＢＰ−３ＴＥＶ−グルカゴン−４×Ｇｌｙｃタグ−６×−Ｈｉｓ
１４１６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２６０】
【化１３】
2016518825.tif 000019
【０２６１】
配列番号１４
ＭＢＰ−３ＴＥＶ−グルカゴン−１×Ｇｌｙｃタグ−６×−Ｈｉｓ
１３７１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２６２】
【化１４】
2016518825.tif 000020
【０２６３】
配列番号１５
Ｐｄｓｔ６：α２，６シアリルトランスフェラーゼ
Ｐ．ｄａｍｓｅｌａ
ＥＣ  ２．４．９９．１
２０２８ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ  直鎖状
【０２６４】
【化１５】
2016518825.tif 000021
【０２６５】
配列番号１６
ｃｓｔＩＩ：二官能性２，３  ２，８シアリルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．９９．４，２．４．９９．８
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ
８７６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２６６】
【化１６】
2016518825.tif 000022
【０２６７】
配列番号１７
ｌｉｃ３ｂ：二官能性２，３  ２，８シアリルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．９９．４，  ２．４．９９．８
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
９９９ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２６８】
【化１７】
2016518825.tif 000023
【０２６９】
配列番号１８
ｎｅｕＳ：２，８ポリシアリルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．９９．８
大腸菌Ｋ１
１２３０ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２７０】
【化１８】
2016518825.tif 000024
【０２７１】
配列番号１９
ｓｉａＤ：２，８ポリシアリルトランスフェラーゼ
ＥＣ  ２．４．９９．８
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
１４３１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２７２】
【化１９】
2016518825.tif 000025
【０２７３】
配列番号２０
ｗｂｎＫ：α１，２フコシルトランスフェラーゼ
大腸菌Ｏ８６
ＥＣ  ２．４．１．６９
９０９ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２７４】
【化２０】
2016518825.tif 000026
【０２７５】
配列番号２１
ｇａｌＥ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  ５．１．３．２
１０１７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２７６】
【化２１】
2016518825.tif 000027
【０２７７】
配列番号２２
ｇｍｄ：ＧＤＰ−マンノース４，６デヒドラターゼ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  ４．２．１．４７
１１２２ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２７８】
【化２２】
2016518825.tif 000028
【０２７９】
配列番号２３
Ｆｃｌ：ＧＤＰ−フコースシンセターゼ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  １．１．１．２７１
９６６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２８０】
【化２３】
2016518825.tif 000029
【０２８１】
配列番号２４
ｇｍｍ：ＧＤＰ−マンノースマンノシルヒドロラーゼ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  ３．２．１．４２
４８０ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２８２】
【化２４】
2016518825.tif 000030
【０２８３】
配列番号２５
ｃｐｓＢ：マンノース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  ２．７．７．１３
１４３７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２８４】
【化２５】
2016518825.tif 000031
【０２８５】
配列番号２６
ｃｐｓＧ：ホスホマンノムターゼ
大腸菌Ｋ１２
ＥＣ  ５．４．２．８
１３７１ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２８６】
【化２６】
2016518825.tif 000032
【０２８７】
配列番号２７
ＴＮＦα軽鎖
７０８ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２８８】
【化２７】
2016518825.tif 000033
【０２８９】
配列番号２８
ＴＮＦα重鎖−４×ｄｑｎａｔ−ヘキサヒスチジン
８７６ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２９０】
【化２８】
2016518825.tif 000034
【０２９１】
配列番号２９
ｍａｌＥ−ｔｅｖ−ｇｈ２−ヘキサヒスチジン
１７９７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０２９２】
【化２９】
2016518825.tif 000035
【０２９３】
配列番号３０
ＬｓｇＥ：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
ＥＣ  ２．４．１−
２９４ａ．ａ．
【０２９４】
【化３０】
2016518825.tif 000036
【０２９５】
配列番号３１
ＬｓｇＤ：ガラクトシルトランスフェラーゼ
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
ＥＣ  ２．４．１−
【０２９６】
【化３１】
2016518825.tif 000037
【０２９７】
配列番号３２
ＦｕｃＴ：フコシルトランスフェラーゼ
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ
２．４．１．１５２
【０２９８】
【化３２】
2016518825.tif 000038
【０２９９】
配列番号３３
ＷｂｎＩ
大腸菌０８６
ＥＣ  ２．４．１．３７
【０３００】
【化３３】
2016518825.tif 000039
【０３０１】
配列番号３４
ＢｇｔＡ：α−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ
ＥＣ  ２．４．１．４０
【０３０２】
【化３４】
2016518825.tif 000040
【０３０３】
配列番号３５
ＧＮＥ：ａｋａ  ｚ３２０６  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼ
大腸菌
ＥＣ  ５．１．３．ｃ
【０３０４】
【化３５】
2016518825.tif 000041
【０３０５】
配列番号３６
ＰｇｌＣ：バシロサミントランスフェラーゼ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ２．７．８．６
【０３０６】
【化３６】
2016518825.tif 000042
【０３０７】
配列番号３７
ＰｇｌＤ：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルバシロサミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ２．３．１．２０３
【０３０８】
【化３７】
2016518825.tif 000043
【０３０９】
配列番号３８
ＰｇｌＥ：アミノトランスフェラーゼ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ２．６．１．３４
【０３１０】
【化３８】
2016518825.tif 000044
【０３１１】
配列番号３９
ＰｇｌＦ：デヒドラターゼ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ
ＥＣ  ４．２．１．１３５
【０３１２】
【化３９】
2016518825.tif 000045
【０３１３】
配列番号４０
ＷｂｎＨ：α１，３  ＧａｌＮＡｃ  トランスフェラーゼ
大腸菌
ＥＣ  ２．４．１．３０６
１０１７ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ
【０３１４】
【化４０】
2016518825.tif 000046
【０３１５】
参考文献
【化４１−１】
2016518825.tif 000047
【化４１−２】
2016518825.tif 000048
【図１】
2016518825.tif 000049
【図２】
2016518825.tif 000050
【図３】
2016518825.tif 000051
【図４】
2016518825.tif 000052
【図５】
2016518825.tif 000053
【図６】
2016518825.tif 000054
【図７】
2016518825.tif 000055
【図８】
2016518825.tif 000056
【図９】
2016518825.tif 000057
【図１０】
2016518825.tif 000058
【図１１】
2016518825.tif 000059
【図１２】
2016518825.tif 000060
【図１３】
2016518825.tif 000061
【図１４】
2016518825.tif 000062
【図１５】
2016518825.tif 000063
【図１６】
2016518825.tif 000064
【図１７】
2016518825.tif 000065
【図１８】
2016518825.tif 000066
【図１９】
2016518825.tif 000067
【図２０】
2016518825.tif 000068
【図２１】
2016518825.tif 000069
【図２２】
2016518825.tif 000070
【図２３】
2016518825.tif 000071
【配列表】
2016518825000001.app
【国際調査報告】
2016518825.tif 000072
2016518825.tif 000073