(57)【要約】本発明は、数ある中でも、製造中の組換えヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の特性評価のための方法を提供する。本発明は、組換えＨＮＳの電荷プロファイル、アイソフォーム分布、および／またはグリカンプロファイルを決定するためにキャピラリーゾーン電気泳動を使用し、またこの酵素のバッチ一貫性、貯蔵安定性、生物学的半減期、薬物動態的活性、薬力学的活性、および生物学的活性についての良質の特徴を表す。特に、このような特性評価法は、酵素補充療法を使用する、サンフィリポ症候群と診断された患者の治療のために、ＨＮＳの製造についての条件を最適化し、一貫性を確保するために有益であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を分析する方法であって、キャピラリーゾーン電気泳動によってＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルを特性評価することを含む方法。
【請求項２】
前記特性評価するステップが、キャピラリーゾーン電気泳動によって、電荷変動成分の不在または存在を示すピーク群を分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電荷プロファイルが、少なくとも１４のピーク群を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在、存在に関連する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記電荷変動成分が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在、存在に関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記特性評価するステップが、各ピーク群の相対的泳動時間および／または相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各ピーク群の前記相対的泳動時間が、電気浸透流（ＥＯＦ）マーカーに対して決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各ピーク群の前記相対的ピーク面積が、総ピーク面積と比べてのピーク面積百分率によって計算される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、前記ＨＮＳタンパク質の品質を決定することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＮＳタンパク質が、哺乳動物細胞によって産生される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＮＳタンパク質が、大規模に生産される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、基準値と比べて前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルにおいて変動があるかどうかを決定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基準値が、異なるバッチにより生産されたＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、バッチ間電荷変動性を評価するステップを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バッチ間電荷変動性を評価するステップが、異なるバッチによって生産された各ＨＮＳタンパク質に対比する前記相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、より長い泳動時間が増加する負電荷を持つ種に相当するような条件下で行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、トリスを含む緩衝系を使用して行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝系が、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝系が、トリスをおよそ２５ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝系が、およそ７．８〜８．２の範囲のｐＨを有する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記緩衝系が、およそ８のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、５６〜１１２．５ｃｍの範囲の長さを有するキャピラリーを使用して行われる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャピラリーが、およそ７２ｃｍまたは１０４ｃｍの有効長さを有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法によるキャピラリーゾーン電気泳動によって、大規模で製造されたヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を分析するステップを含む、製造方法。
【請求項２６】
前記製造方法が、前記電荷プロファイルの前記分析に基づいて、製造条件を調整するステップを含む、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記分析ステップが、ロットの出荷前に行われる請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２８】
キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、前記ＨＮＳタンパク質の電荷変動成分を示す少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルで特性評価される、実質的に純粋なヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２９】
前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在、存在に関連する、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記電荷変化体が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在、存在に関連する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ＨＮＳタンパク質が、哺乳動物細胞によって産生される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＨＮＳタンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ＨＮＳタンパク質が、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度でトリスを含み、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する緩衝系を使用して行われる、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記緩衝系が、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含み、およそ８．０のｐＨを有する、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、治療を必要する被験体に投与するステップを含む、Ａ型サンフィリポ症候群を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７７９，７６７号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）は、硫酸ヘパランの分解に関与するリソソーム系酵素である。この酵素の欠損をもたらす遺伝的欠陥は、ＩＩＩＡ型ムコ多糖蓄積症またはＡ型サンフィリポ病として知られている。この稀な常染色体劣性疾患は、２４，０００人の出生児に１人の割合で生じ、使用可能な承認された医学的治療はない。酵素補充療法（ＥＲＴ）が現在臨床的に評価されており、ここでは、遺伝子突然変異から生じる酵素欠損に対処するために、外因性酵素の組換え型が被験体に導入される。特に、組換えＨＮＳ酵素が、硫酸ヘパランの分解および生物学的代謝回転を容易にするために、Ａ型サンフィリポ病と診断された患者に導入され得る。この治療では、組換えＨＮＳ糖タンパク質が、細胞に基づく発現系を使用して典型的に産生される。典型的には、組換え酵素は、翻訳後修飾のためのいくつかの追加の部位と共に、５つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を含有する５４．７ｋＤａの糖タンパク質である。末端マンノース−６−リン酸を保有するものなどのこれらの修飾構造のいくつかは、生物有効性に重要であり、一方他のものは、タンパク質安定性および／または溶解性において役割を果たし得る。したがって、上流側の細胞培養および下流側の精製プロセスの両方によって影響を受ける最終組換え生成物中に存在する異なるグリコフォームの多様性は、治療用酵素の潜在的有効性、薬力学的パラメータおよび薬物動態パラメータに大きな影響を与え得る。
【０００３】
したがって商業的環境における組換えタンパク質治療薬の生産は、物理化学的特性を解明し、生成物の純度、安定性、および／または活性を監視するために、一連の高感度の分析方法論を伴う製造工程の制御を必要とする。精製されたバッチ間の微妙な物理化学的相違を検出するための能力は、制御された、確実な生産工程ならびに一貫性があり、安全かつ有効な生成物の達成に向けて重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、数ある中でも、組換えヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質の重要な物理化学的特性を解明するための改善された方法を提供し、商業的な製造工程により生じた生成物の品質、純度、および安定性のより効果的なモニタリングおよび制御を可能にする。したがって、本発明は、Ａ型サンフィリポ症候群に対する有効な酵素補充療法のためのより確実な生産工程ならびに一貫性のある、安全かつ有効な生成物を可能にする。本発明は、あらゆるリソソーム系酵素にも適用可能であると考えられる。
【０００５】
一部には、本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動が、リソソーム蓄積症に関連する酵素をコード化する組換えタンパク質の物理化学的特性を正確に特性評価するために使用され得るとの発見に基づいている。いくつかの特定の実施形態では、組換えタンパク質は、ＨＮＳ酵素をコード化する。１つの物理化学的特性である、リソソーム系酵素（すなわち、ＨＮＳタンパク質）の分子電荷が特に重要な属性であると考えられる。電荷微細不均一性の度合いは、タンパク質構造中の修飾（すなわち、脱アミド化）および／またはポリペプチド鎖に結合した炭水化物部分によって起こり得る。重要なことに、分子電荷の度合い（すなわち、荷電炭水化物構造）は、ＨＮＳタンパク質の生物有効性および血清半減期ならびにタンパク質抗原性、溶解性、およびプロテアーゼ耐性に及ぼす重大な影響力を有することが示されている。したがって、ＨＮＳなどの組換えリソソーム系酵素の固有の電荷不均一性の定量的分析および特性評価は、製品開発の重要な部分である。
【０００６】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動等電点焦点（ゲル−ＩＥＦ）、キャピラリー等電点焦点（ｃＩＥＦ）、画像ｃＩＥＦ、およびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を含む固有の電荷不均一性を監視するための多数の異なる分析技術が知られている。これらの技術のそれぞれは、長所と短所を有するが、所定のタンパク質の電荷不均一性を解明するための最適な方法は、個々の状況に応じて決定される。以下の実施例の項に記載されるように、キャピラリーゾーン電気泳動は、ＨＮＳなどのリソソーム系酵素についての固有の電荷およびグリカンプロファイルを特性評価するのに特に良く適していて、アッセイ条件の範囲にわたって高レベルの再現性および頑強性を提供する。したがって、本発明は、任意のリソソーム系酵素の商業的生産の標準化および最適化を可能にする。例えば、このようなアプローチは、特異的に組換えＨＮＳタンパク質に対して使用されてもよい。ＨＮＳタンパク質は、実施例に記載されているＣＺＥ分析に関する例として使用されたが、本発明は任意のリソソーム系酵素に適用可能であり得ることが考えられる。
【０００７】
一態様では、本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動により酵素の電荷プロファイルを特性評価することを含む、ヘパランＮ−スルファターゼタンパク質などのリソソーム系酵素を分析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、組換え的技術により産生される。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、キャピラリーゾーン電気泳動によって、電荷変動に対応するピーク群を分離するステップを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分に相当する１４未満のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する少なくとも１４のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の群を含む。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸および／またはマンノース６−リン酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群の相対的泳動時間を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群の相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群の相対的泳動時間および／または相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、各ピーク群の相対的泳動時間は、電気浸透流（ＥＯＦ）マーカーに対して決定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＥＯＦマーカーが使用される。いくつかの実施形態では、各ピーク群の相対的ピーク面積は、総ピーク面積と比べたピーク面積百分率によって計算される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、電荷プロファイルに基づいて総シアル酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、電荷プロファイルに基づいて総マンノース６−リン酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、電荷プロファイルに基づいて総シアル酸および／またはマンノース６−リン酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、シアル酸含量を決定する方法は、モノ−、ジ−および／またはトリ−シアル酸付加グリカンの不在、存在または量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐ含量を決定する方法は、モノ−および／またはジ−Ｍ６Ｐの不在、存在または量を決定することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本方法は、リソソーム系酵素、例えば組換え技術により産生されるＨＮＳタンパク質の品質を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質品質は、製造生産の開始時に決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素の品質は、生産中の１回以上で決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素の品質は、生産の異なる段階および／またはステップ中に決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素の品質は、生産プロセスにおける進行、変化および／または異常を監視するために決定される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、細胞培養系を使用して産生される。いくつかの特定の実施形態では、リソソーム系酵素は、ＨＮＳである。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、哺乳動物細胞を使用する。いくつかの実施形態では、使用される哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素は、微小規模の生産速度で生産される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、中型生産規模で生産される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、大規模生産速度で生産される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本方法は、生産中に組換えリソソーム系酵素、すなわちＨＮＳの電荷プロファイルにおいて変動があるかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルにおける変動は、生産の開始時に酵素電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中に１回以上酵素電荷を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりに酵素電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造方法を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造バッチ内で生産された酵素の１つ以上のロットから採取したタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、異なる製造方法を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本方法は、基準値と比較して組換えリソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルにおいて変動が存在するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する酵素についての電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する１つ以上の異なる酵素についての平均電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる市販のバッチから生産されたＨＮＳタンパク質からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、同一の市販のバッチ内の２つ以上の異なるロットからアッセイされたＨＮＳタンパク質からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、ＦＤＡ承認製品からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、同一の商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチからアッセイされたＨＮＳタンパク質から生じた平均ＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチからアッセイされたＨＮＳタンパク質から生じた平均ＨＮＳ電荷プロファイルである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルにおける変動は、生産の開始時にＨＮＳ電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中の１つ以上の異なる時間にＨＮＳ電荷を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりにＨＮＳ電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造方法を使用して生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のバッチから採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造バッチ内で生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のロットから採取したＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造方法を使用して生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のバッチから採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本方法は、基準値と比較して組換えリソソーム系酵素タンパク質の電荷アイソフォーム数を決定することを含む。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する酵素についてのＣＺＥによって得られる電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる市販のバッチからＣＺＥによって得られる電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ市販のバッチ内の２つ以上の異なるロットからＣＺＥによって得られる平均酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、ＦＤＡ承認製品からの酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均酵素電荷アイソフォーム数である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本方法は、基準値と比較して組換えＨＮＳタンパク質の電荷アイソフォーム数における変動を決定することを含む。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する酵素についてのＣＺＥによって得られる電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる市販のバッチからＣＺＥによって得られるＨＮＳ電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ市販のバッチ内の２つ以上の異なるロットからＣＺＥによって得られる平均ＨＮＳ電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、ＦＤＡ承認製品からのＨＮＳ電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均ＨＮＳ電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均ＨＮＳ電荷アイソフォーム数である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、電荷アイソフォーム数における変動は、生産の開始時に酵素電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中の１回以上酵素電荷アイソフォーム数を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりに酵素電荷アイソフォーム数を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、酵素ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取された酵素電荷アイソフォーム数を比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造方法を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取された酵素電荷アイソフォーム数を比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷アイソフォーム数における変動は、同一の製造バッチ内で生産された酵素の１つ以上のロットから採取した酵素電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷アイソフォーム数における変動は、同一の製造方法を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取された酵素電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法は、ロット間電荷変動性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ロット間変動性を評価する方法は、製造バッチ中に生産された組換えリソソーム系酵素タンパク質の各ロットについてのピーク群に対比する相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本方法は、バッチ間電荷変動性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、バッチ間変動性を評価する方法は、異なるバッチによる各組換えリソソーム系酵素タンパク質生産についてのピーク群に対比する相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本方法は、生産方法の電荷変動性を評価するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、生産方法の電荷変動性を評価する方法は、異なる製造方法によって生産された各組換えリソソーム系酵素タンパク質についてのピーク群に対比する相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、より長い泳動時間が負電荷を増加させる種と一致するような条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、トリスを含む緩衝液を使用して行われる。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ８．０のｐＨを有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、５０〜１１０ｃｍの長さの範囲のキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、７２ｃｍの長さのキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、１０４ｃｍの長さのキャピラリーを使用して行われる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動によって酵素の電荷プロファイルを特性評価することを含む、リソソーム系酵素タンパク質、例えば、ヘパランＮ−スルファターゼを分析する製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、キャピラリーゾーン電気泳動によって、電荷変動成分に相当するピーク群を分離するステップを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する１４未満のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する少なくとも１４のピーク群を含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、電荷変動成分の存在に相当する少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の群を含む。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸および／またはマンノース６−リン酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群の相対的泳動時間を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群ついて相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、特性評価ステップは、各ピーク群ついて相対的泳動時間および／または相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む。いくつかの実施形態では、各ピーク群の相対的泳動時間は、電気浸透流（ＥＯＦ）マーカーに対して決定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＥＯＦマーカーが使用される。いくつかの実施形態では、各ピーク群の相対的ピーク面積は、総ピーク面積に比べてのピーク面積百分率によって計算される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、電荷プロファイルに基づいて総シアル酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本製造方法は、電荷プロファイルに基づいて総マンノース６−リン酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本製造方法は、電荷プロファイルに基づいて総シアル酸および／またはマンノース６−リン酸含量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、シアル酸含量を決定する本製造方法は、モノ−、ジ−および／またはトリ−シアル酸付加グリカンの不在、存在または量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐ含量を決定する本製造方法は、モノ−および／またはジ−Ｍ６Ｐの不在、存在または量を決定することを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、生産されるリソソーム系酵素タンパク質の品質を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、酵素の品質は、製造生産の開始時に決定される。いくつかの実施形態では、酵素の品質は、生産中の１回以上で決定される。いくつかの実施形態では、酵素の品質は、生産の異なる段階および／またはステップ中に決定される。いくつかの実施形態では、酵素の品質は、生産プロセスにおける進行、変化および／または異常を監視するために決定される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、細胞培養系を使用して産生される。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、哺乳動物細胞を使用する。いくつかの実施形態では、使用される哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素は、微小規模の生産速度で生産される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、中型生産規模で生産される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、大規模生産速度で生産される。ある特定の実施形態においては、リソソーム系酵素は、ＨＮＳである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、生産中に組換えリソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルにおいて変動があるかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、電荷プロファイルにおける変動は、生産の開始時にタンパク質電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中に１回以上タンパク質電荷を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりにタンパク質電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造工程を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造バッチ内で生産された酵素の１つ以上のロットから採取したタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、異なる製造工程を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取されたタンパク質電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、基準値と比較して組換えリソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルにおいて変動が存在するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する酵素についての電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する１つ以上の異なる酵素についての平均電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる市販のバッチから生産されたＨＮＳタンパク質からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、同一の市販のバッチ内の２つ以上の異なるロットからアッセイされたＨＮＳタンパク質からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、ＦＤＡ承認製品からのＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、同一の商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチからアッセイされたＨＮＳタンパク質から生じた平均ＨＮＳ電荷プロファイルである。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチからアッセイされたＨＮＳタンパク質から生じた平均ＨＮＳ電荷プロファイルである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルにおける変動は、生産の開始時にＨＮＳ電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中の１つ以上の異なる時間にＨＮＳ電荷を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりにＨＮＳ電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造工程を使用して生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のバッチから採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造バッチ内で生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のロットから採取したＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造工程を使用して生産されたＨＮＳ酵素の１つ以上のバッチから採取されたＨＮＳ電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、基準値と比較して組換えリソソーム系酵素タンパク質の電荷アイソフォーム数における変動を決定することを含む。いくつかの実施形態では、基準値は、リソソーム蓄積症に関連する酵素についてのＣＺＥによって得られる電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる市販のバッチからＣＺＥによって得られる酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ市販のバッチ内の２つ以上の異なるロットからＣＺＥによって得られる平均酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、ＦＤＡ承認製品からの酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、同じ商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均酵素電荷アイソフォーム数である。いくつかの実施形態では、基準値は、異なる商業的製造工程からの１つ以上のロットおよび／またはバッチから生じる平均酵素電荷アイソフォーム数である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、電荷アイソフォーム数における変動は、生産の開始時に酵素電荷プロファイルを決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、製造中の１回以上酵素電荷アイソフォーム数を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、電荷における変動は、生産の終わりに酵素電荷アイソフォーム数を決定することによって特定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ電荷プロファイルにおける変動は、製造中に１回以上採取された酵素電荷アイソフォーム数を比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷プロファイルにおける変動は、同一の製造工程を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取された酵素電荷アイソフォーム数を比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷アイソフォーム数における変動は、同一の製造バッチ内で生産された酵素の１つ以上のロットから採取した酵素電荷プロファイルを比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、酵素電荷アイソフォーム数における変動は、同一の製造工程を使用して生産された酵素の１つ以上のバッチから採取された酵素電荷プロファイルを比較することによって決定される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、ロット間電荷変動性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ロット間変動性を評価する方法は、製造バッチ中に生産されたリソソーム系酵素タンパク質の各ロットについてのピーク群に対比する相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、バッチ間電荷変動性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、バッチ間電荷変動性を評価する方法は、異なるバッチによる各リソソーム系酵素タンパク質生産についてのピーク群に対比する相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、生産方法の電荷変動性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、生産方法の電荷変動性を評価する方法は、異なる製造工程によって生産された各リソソーム系酵素タンパク質についてのピーク群に対比するピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、より長い泳動時間が負電荷を増加させる種と一致するような条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、トリスを含む緩衝液を使用して行われる。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ８．０のｐＨを有する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、５０〜１１０ｃｍの長さの範囲のキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、長さが７２〜１０４ｃｍの間の範囲であるキャピラリーを使用して行われる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本製造方法は、電荷プロファイルの分析に基づいて、製造条件を調整するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、分析ステップは、精製の前に行われる。いくつかの実施形態では、分析ステップは、精製中に行われる。いくつかの実施形態では、分析ステップは、製造工程中に１回以上行われる。いくつかの実施形態では、分析ステップは、商業販売用にロットを引き渡す前に行われる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、リソソーム系酵素タンパク質の電荷変動成分に相当する少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルによって特徴付けられる、実質的に純粋なリソソーム系酵素タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、ＨＮＳタンパク質の電荷変動成分に相当する少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルによって特徴付けられる、実質的に純粋なヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸および／またはマンノース６−リン酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−、ジ−、またはトリ−シアル酸付加グリカンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−またはジ−Ｍ６Ｐ基からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−シアル酸付加基、ジ−シアル酸付加基、トリ−シアル酸付加基、モノ−Ｍ６Ｐ基、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、モノ−Ｍ６Ｐに相当するピーク群は、総ピーク面積のおよそ８〜１２％の相対的ピーク面積を有する。いくつかの実施形態では、ジ−Ｍ６Ｐに相当するピーク群は、総ピーク面積のおよそ１０〜１５％の相対的ピーク面積を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系タンパク質は、表２内に列挙された１つ以上のリソソーム系酵素である。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なリソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素の組換え変型であってもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、限定されないが表２中で見られるものなどの本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型のまたは天然に存在する配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型のまたは天然に存在する配列と実質的相同性または同一性を有する修飾配列を有してもよい（例えば、野生型のまたは天然に存在する配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）。
【００４８】
いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、核酸を有し、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号１を含む核酸配列によってコード化される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳをコード化する核酸配列は、配列番号１と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、ＨＮＳをコード化する核酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、細胞培養系を使用して生産される。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、哺乳動物細胞を使用する。いくつかの実施形態では、使用される哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳは、微小規模の生産速度で生産される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳは、中型生産規模で生産される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、より長い泳動時間が負電荷を増加させる種と一致するような条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、トリスを含む緩衝液を使用して行われる。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ８．０のｐＨを有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、５０〜１１０ｃｍの長さの範囲のキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、長さが７２〜１０４ｃｍの間の範囲であるキャピラリーを使用して行われる。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、Ａ型サンフィリポ症候群を治療する方法を提供し、本方法は、キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、ＨＮＳタンパク質の電荷変動成分に相当する少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルによって特徴付けられる、実質的に純粋なヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。いくつかの実施形態では、ピーク群は、シアル酸および／またはマンノース６−リン酸の不在、存在または種々の量に関連する電荷変動成分に相当する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−、ジ−、またはトリ−シアル酸付加グリカンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−またはジ−Ｍ６Ｐ基からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電荷変動成分は、モノ−シアル酸付加基、ジ−シアル酸付加基、トリ−シアル酸付加基、モノ−Ｍ６Ｐ基、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、モノ−Ｍ６Ｐに相当するピーク群は、総ピーク面積のおよそ８〜１２％の相対的ピーク面積を有する。いくつかの実施形態では、ジ−Ｍ６Ｐに相当するピーク群は、総ピーク面積のおよそ１０〜１５％の相対的ピーク面積を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系タンパク質は、表２内二列挙される１つ以上のリソソーム系酵素である。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なリソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素の組換え変型であってもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、限定されるものではないが、表２中で見出されるものなどの、本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型または天然に存在する配列を有することができる。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型または天然に存在する配列と実質的相同性または同一性を有する修飾配列を有してもよい（例えば、野生型のまたは天然に存在する配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）。
【００５８】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素はＨＮＳである。いくつかの実施形態では、ＨＮＳは、組換え技術により生産される。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号１を含む核酸配列によってコード化される核酸を有する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳをコード化する核酸配列は、配列番号１と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、ＨＮＳをコード化する核酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、細胞培養系を使用して生産される。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、哺乳動物細胞を使用する。いくつかの実施形態では、使用される哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳは、微小規模の生産速度で生産される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳは、中型生産規模で生産される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、より長い泳動時間が負電荷を増加させる種と一致するような条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、トリスを含む緩衝液を使用して行われる。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝系は、およそ８．０のｐＨを有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、５０〜１１０ｃｍの長さの範囲のキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、長さが７２ｃｍ〜１０４ｃｍの間の範囲であるキャピラリーを使用して行われる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
全体として図面を構成する以下に示した図は、単に説明目的であって、限定するためのものではない。
【００６３】
【図１】図１ＡおよびＢ。同一の製造工程を使用して生産された組換えＨＮＳ酵素（ｒＨＮＳ）の２つの異なるロットの特性評価を示す。２つの製造ロット（ｒＨＮＳロット１およびｒＨＮＳロット２）についての電荷プロファイルが、キャピラリーゾーン電気泳動（Ａ）および等電点電気泳動ゲルを使用してアッセイされた。より長い泳動時間は、増加した負電荷のアイソフォームに相当する。
【００６４】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃ。キャピラリーゾーン電気泳動中のピーク分離に及ぼす緩衝液強度の効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、トリス緩衝液を（Ａ）１００ｍＭ、（Ｂ）５０ｍＭおよび（Ｃ）２５ｍＭの濃度において使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃ。キャピラリーゾーン電気泳動中のピーク分離に及ぼす緩衝液強度の効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、トリス緩衝液を（Ａ）１００ｍＭ、（Ｂ）５０ｍＭおよび（Ｃ）２５ｍＭの濃度において使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃ。キャピラリーゾーン電気泳動中のピーク分離に及ぼす緩衝液強度の効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、トリス緩衝液を（Ａ）１００ｍＭ、（Ｂ）５０ｍＭおよび（Ｃ）２５ｍＭの濃度において使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【００６５】
【図３】様々な緩衝液濃度にわたるｐＨ８．０のトリス緩衝液を使用して、（Ｂ）キャピラリーゾーン電気泳動図および（Ａ）相対的ピーク面積によって分析された、組換えＨＮＳについての電荷プロファイルを描写する。
【００６６】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜Ｄ。キャピラリーゾーン電気泳動中のピーク分離に及ぼす緩衝液のｐＨの効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、トリス緩衝液を（Ａ）ｐＨ８．５、（Ｂ）ｐＨ８．０、（Ｃ）ｐＨ７．５および（Ｄ）ｐＨ７．０で使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ａ〜Ｄ。キャピラリーゾーン電気泳動中のピーク分離に及ぼす緩衝液のｐＨの効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、トリス緩衝液を（Ａ）ｐＨ８．５、（Ｂ）ｐＨ８．０、（Ｃ）ｐＨ７．５および（Ｄ）ｐＨ７．０で使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【００６７】
【図５】図５ＡおよびＢ。異なるｐＨにわたるトリス緩衝液を２５ｍＭの濃度で使用して、（Ｂ）キャピラリーゾーン電気泳動図および（Ａ）相対的ピーク面積によって分析された、組換えＨＮＳについての電荷プロファイルを描写する。
【００６８】
【図６】キャピラリーゾーン電気泳動中にキャピラリーの長さがピーク分離に及ぼす効果を示す。組換えＨＮＳについての電荷プロファイルは、（Ａ）７２ｃｍまたは（Ｂ）１０４ｃｍの長さのいずれかの裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。
【００６９】
【図７】図７ＡおよびＢ。異なる電荷プロファイルを有する１４個のＨＮＳアイソフォームの（Ａ）分離および（Ｂ）統合を可能にする、例示のキャピラリーゾーン電気泳動の条件を示す。
【００７０】
【図８】同一の製造ロットについて三通りの注入を使用してアッセイされた、キャピラリーゾーン電気泳動によって分析された組換えＨＮＳ酵素の電荷プロファイルに関するランツーラン（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）再現性を描写する。
【００７１】
【図９】組換えＨＮＳ酵素の電荷プロファイルについての日差再現性を描写する。組換えヒトＨＮＳ酵素は、４ヶ月間のコースにわたる７つの独立した実験の実行についてキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。データは、相対的泳動時間（ＲＭＴ）および相対的ピーク面積（％）として表され、再現性におけるいかなる変化も決定した。
【００７２】
【図１０Ａ】図１０ＡおよびＢ。１４個の異なるＨＮＳ電荷アイソフォームについて（Ｂ）相対的ピーク面積（％）を決定するために、（Ａ）キャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、同一の製造工程を使用して生産された組換えＨＮＳ酵素の２つの異なるロットについての電荷プロファイルを描写する。
【図１０Ｂ】図１０ＡおよびＢ。１４個の異なるＨＮＳ電荷アイソフォームについて（Ｂ）相対的ピーク面積（％）を決定するために、（Ａ）キャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、同一の製造工程を使用して生産された組換えＨＮＳ酵素の２つの異なるロットについての電荷プロファイルを描写する。
【００７３】
【図１１】同一の製造工程を使用して、１４個の異なるＨＮＳ電荷アイソフォームについて相対的ピーク面積（％）を決定するためにキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、組換えＨＮＳ酵素の４つの異なるロットに関する電荷プロファイルを描写する。
【００７４】
【図１２Ａ】図１２ＡおよびＢ。同一の製造工程によって生産され、製造工程の（Ａ）初期および（Ｂ）終了時にキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、組換えＨＮＳ酵素の２つの異なるロットについての電荷プロファイルを描写する。
【図１２Ｂ】図１２ＡおよびＢ。同一の製造工程によって生産され、製造工程の（Ａ）初期および（Ｂ）終了時にキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、組換えＨＮＳ酵素の２つの異なるロットについての電荷プロファイルを描写する。
【００７５】
【図１３Ａ】図１３ＡおよびＢ。異なるＨＮＳ電荷アイソフォームについて（Ｂ）相対的ピーク面積（％）を決定するために（Ａ）キャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、２つの異なる製造工程を使用して生産された組換えＨＮＳ酵素に関する電荷プロファイルを描写する。ラベルＸおよびＹは、先に同定された１４個のアイソフォームを除く追加のピークの存在を描写する。
【図１３Ｂ】図１３ＡおよびＢ。異なるＨＮＳ電荷アイソフォームについて（Ｂ）相対的ピーク面積（％）を決定するために（Ａ）キャピラリーゾーン電気泳動によって分析された、２つの異なる製造工程を使用して生産された組換えＨＮＳ酵素に関する電荷プロファイルを描写する。ラベルＸおよびＹは、先に同定された１４個のアイソフォームを除く追加のピークの存在を描写する。
【００７６】
【図１４Ａ】図１４ＡおよびＢ。組換えＨＮＳ電荷不均一性のグリコ−特性評価を描写する。（Ａ）組換えＨＮＳは、ホスファターゼ、ノイラミニダーゼのいずれか、これら両者で前処理されたか、または対照として処理されず、次いでキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。（Ｂ）放出されるグリカンは、全Ｎ−グリカン分析のためのグリカンマップを作成する、パルス電流滴定検出を備える高速アニオン交換クロマトグラフィーによって分析された。
【図１４Ｂ】図１４ＡおよびＢ。組換えＨＮＳ電荷不均一性のグリコ−特性評価を描写する。（Ａ）組換えＨＮＳは、ホスファターゼ、ノイラミニダーゼのいずれか、これら両者で前処理されたか、または対照として処理されず、次いでキャピラリーゾーン電気泳動によって分析された。（Ｂ）放出されるグリカンは、全Ｎ−グリカン分析のためのグリカンマップを作成する、パルス電流滴定検出を備える高速アニオン交換クロマトグラフィーによって分析された。
【００７７】
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａ〜Ｄ。（Ａ）組換えＨＮＳ酵素についての固有の電荷プロファイルを、キャピラリーゾーン電気泳動による分析用に（Ｂ）ホスファターゼならびにノイラミダーゼ、（Ｃ）ホスファターゼ、および（Ｄ）ノイラミダーゼのいずれかで前処理された組換えＨＮＳについての電荷プロファイルと共に描写する。
【図１５Ｃ−Ｄ】図１５Ａ〜Ｄ。（Ａ）組換えＨＮＳ酵素についての固有の電荷プロファイルを、キャピラリーゾーン電気泳動による分析用に（Ｂ）ホスファターゼならびにノイラミダーゼ、（Ｃ）ホスファターゼ、および（Ｄ）ノイラミダーゼのいずれかで前処理された組換えＨＮＳについての電荷プロファイルと共に描写する。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語が初めに定義される。以下の用語および他の用語についての追加の定義は、明細書の全体を通して記載されている。
【００７９】
アミノ酸：本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準的アミノ酸」は、天然に存在するペプチド中で通常見出される２０個の標準的Ｌ−アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準的アミノ酸」は、それが合成的に調製されるかまたは天然源から得られるかに無関係に、標準的アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される「合成アミノ酸」は、限定されないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換を含める化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中にカルボキシ−および／またはアミノ−末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはペプチドの循環半減期をそれらの活性に悪影響を及ぼすことなく変更することができる他の化学基による置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。アミノ酸は、１つ以上の化学物質（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、ホスフェート基、ホルミル部分、イソプレノイド基、スルフェート基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）に関連するものなどの１つまたは翻訳後修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸は、細胞培養中に提供されてもよく、または細胞培養用の培地を補足するよう使用されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地に提供されまたは細胞培養培地を捕捉するよう使用されるアミノ酸は、塩としてまたは水和物形態で提供されてもよい。
【００８０】
およそ：関心の１つ以上の値に適用される、本明細書で使用される用語「およそ」または「約」は、述べられた参照値に同様である値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に明記しない限り、または前後関係から明白でない限り、いずれかの方向で（超えるまたは未満で）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す（このような数字が可能な値の１００％を超える場合を除外する）。
【００８１】
バッチ：本明細書で使用される用語「バッチ」は、製品、完成品または構成部品が生産される完全な生産ランを指す。いくつかの実施形態では、バッチは複数の「ロット」を含む。本明細書で使用される用語「ロット」は、商業用バッチの製造中に生産された全完成製品の一部または分画を指す。いくつかの実施形態では、バッチは単一のロットからなる。いくつかの実施形態では、バッチは複数のロットからなる。いくつかの実施形態では、バッチは、試料サイズ、ＦＤＡ規格および／または出荷条件に基づいて個々のロットに分割される。いくつかの実施形態では、バッチは、バッチの製造中に生産される特定の分画に基づいて、ロットに分割される。
【００８２】
生物学的に活性：本明細書で使用されるフレーズ「生物学的に活性」は、生物学的系（例えば、細胞培養、生物体等）において活性を有する任意の物質の特性を指す。例えば、生物体に投与される場合、その生物体に及ぼす生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。生物学的活性は、インビトロアッセイ（例えば、硫酸塩放出アッセイなどのインビトロ酵素アッセイ）によって決定することもできる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、典型的には「生物学的に活性な」部分と呼ばれる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞培養系から産生されおよび／または精製され、これは被験体に投与される場合、生物学的に活性を呈する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的に活性になるために、さらなる処理を必要とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的に活性になるために、限定されないが、グリコシル化（例えば、シアル酸付加）、ファルネシル化、切断、折りたたみ、ホルミルグリシン変換およびこれらの組み合わせなどの翻訳後修飾を必要とする。いくつかの実施形態では、プロフォーム（すなわち、未成熟形態）として生産されたタンパク質は、生物学的に活性になるために追加の修飾を必要とする。
【００８３】
対照：本明細書で使用される用語「対照」は、それに対して結果が比較される標準であるとの当該技術分野で認識されている意味を有する。典型的には、対照は、変数についての結論を述べるために、このような変数を特定することによって、実験における一貫性を増大させるために使用される。いくつかの実施形態では、対照は、反応または試験反応と同時に行われるアッセイ、またはコンパレータを提供するようアッセイである。１つの実験において、「試験」（すなわち、試験される変数）が適用される。第２の実験においては、「対照」、すなわち試験される変数は適用されない。いくつかの実施形態では、対照は、既存対照（すなわち、以前に行われた試験またはアッセイの、またはこれまで知られている量もしくは結果の）である。いくつかの実施形態では、対照は、印刷された、もしくは別の方法で保存された記録であるか、これらを含む。対照は、陽性対照であっても、または陰性対照であってもよい。いくつかの実施形態では、対照は、「基準対照」であってもよく、これは差異を検討するために試験試料との比較のために、または特性評価の目的のために使用される試料である。
【００８４】
酵素補充療法（ＥＲＴ）：本明細書で使用される用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、欠損酵素を提供することによって、酵素欠乏を矯正する任意の治療戦略である。いくつかの実施形態では、欠損酵素は、髄腔内投与によって提供される。いくつかの実施形態では、欠損酵素は、血流への注入によって提供される。一旦投与されると、酵素は細胞によって取り込まれ、リソソームまで輸送され、ここでは、酵素は酵素欠乏のためにリソソーム内に蓄積された物質を排除するよう作用する。典型的には、リソソーム系酵素補充療法が有効であるためには、治療用酵素は、蓄積欠損症が顕在化している標的組織内の適切な細胞中のリソソームに送達される。
【００８５】
遺伝子：本明細書で使用される用語「遺伝子」は、任意のヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、細胞過程のいくつかの態様において機能する、別個の最終生成物、典型的には、限定されないが、ポリペプチドをコード化するものの少なくともいくつかの部分を指す。この用語は、ポリペプチドまたは他の別個の最終生成物をコード化するコーディング配列を指すよう意味するのみならず、発現の基礎レベルを調節するコーディング配列の前後の領域、ならびに個々のコーディングセグメント（「エクソン」）間の介在配列（「イントロン」）も包含してもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、終止配列、Ｋｏｚａｋ配列、ＴＡＴＡボックス等）および／または修飾配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質をコード化しないが、むしろｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘発作用物質などの機能的ＲＮＡ分子をコード化する核酸に対する参照を含んでもよい。
【００８６】
遺伝子生成物または発現生成物：本明細書で使用される用語「遺伝子生成物」または「発現生成物」は、一般的に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（処理前のおよび／または処理後の）または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコード化されるポリペプチド（修飾前のおよび／または修飾後の）を指す。
【００８７】
相同性：本明細書で使用される用語「相同性」は、ポリマー性分子間の、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的近縁性を指す。いつかの実施形態では、ポリマー性分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるならば、互いに「相同」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ポリマー性分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似していれば、互いに「相同」であるとみなされる。
【００８８】
同一性：本明細書で使用される用語「同一性」は、ポリマー性分子間の、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的近縁性を指す。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較の目的のために２つの配列を整列させることによって行われ得る（例えば、最適なアライメントのためにギャップが第１および第２の核酸配列の一方または双方に導入され得、および比較の目的のために非同一配列が無視され得る）。特定の実施形態では、比較の目的のために整列された配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドによって占有される場合、このとき、分子はこの位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる、その配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）を使用して決定することができ、これは、ＰＡＭ１２０重量残基一覧表、１２のギャップ長さペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌなどの種々の他の配列アライメントプログラムが利用可能であり、配列同一性を決定するために使用することができる。
【００８９】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される用語「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」、または文法的等価物は、本明細書に記載される処置の開始前の同一の個体における測定値、または本明細書に記載される処置の不在下の１つの対照の個体における（もしくは複数の対照の個体）測定値などのベースライン測定値に対しての値を示す。「対照の個体」は、処置される個体と同一の形態のリソソーム蓄積症に冒される個体であり、（処置される個体と対照の個体（複数可）における疾患の段階が比較可能であることを確実にするために）処置される個体とほぼ同一の年齢である。
【００９０】
単離された：本明細書で使用される用語「単離された」は、（１）最初に産生される場合、それが結合される成分の少なくともいくつかから分離されている（本質的におよび／または実験的設定においてのいずれであっても）、および／または（２）ヒトの手によって産生、調製、および／または製造された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に結合されている他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えるものから分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される物質は、実質的に他の成分を含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される、単離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水等）を含むべきではない。
【００９１】
核酸：本明細書で使用される用語「核酸」は、広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるまたは組み込まれ得る化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスフォジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるまたは組み込まれ得る化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖ならびに／もしくは二重鎖ＤＮＡ、および／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスフォジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当該技術分野において既知であり、骨格中のホスフォジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内と考えられる。用語「アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列」は、互いの変性型であるおよび／または同一のアミノ酸配列をコード化する全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。核酸は、天然源から精製され、組換え発現系を使用して産生され、必要に応じて精製され、化学的に合成される等が可能である。必要な場合には、例えば、化学的に合成された分子の場合には、核酸は、化学的に修飾された塩基もしくは糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示のない限り、５’から３’方向で表わされる。用語「核酸セグメント」は、より長い核酸配列の一部である核酸配列を指すよう本明細書で使用される。多くの実施形態において、核酸セグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０個の、またはそれ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、層間塩基、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスフォロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスフォルアミデート結合）であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、「非修飾核酸」を特に目的とし、「非修飾核酸」は、送達を容易にするために、または送達を達成するために、化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドならびに残基）を意味する。
【００９２】
タンパク質：本明細書で使用される用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸のストリング）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）および／またはその他の処理を施されもしくは修飾されてもよい。当業者であれば、「タンパク質」は、細胞（シグナル配列を含むかまたは含まない）によって産生される完全なポリペプチド鎖であり得るか、またはその特徴的な部分であり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって結合された、または他の手段によって会合された複数のポリペプチド鎖を含むことがある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこの双方を含有してもよく、当該技術分野において既知の種々のアミノ酸修飾もしくは類似体のいずれかを含有してもよい。有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。用語「ペプチド」は、一般的には、約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、または１０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを指すよう使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、および／またはその特徴的な部分である。
【００９３】
組換えタンパク質および組換えポリペプチド：本明細書で使用されるこれらの用語は、このポリペプチドを発現するよう遺伝子的に操作された宿主細胞から発現されるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、動物に由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、昆虫に由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、酵母に由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、原核生物に由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、哺乳動物に由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、ヒトに由来する宿主細胞中で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え的に発現されたポリペプチドは、宿主細胞中で通常発現されるポリペプチドと同一であるかまたは類似し得る。いくつかの実施形態では、組換え的に発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して外来、すなわち、宿主細胞中で通常発現されるペプチドに対して異種であり得る。あるいは、いくつかの実施形態では、組換え的に発現されたポリペプチドは、そのポリペプチドの一部が宿主細胞中で通常発現されるポリペプチドと同一であるかまたは類似しているアミノ酸配列を含有するが、一方他の部分が宿主細胞に対して外来であるアミノ酸配列を含有するという点でキメラであり得る。
【００９４】
置換酵素：用語「置換酵素」は、治療される疾患における欠乏または欠損酵素を少なくとも部分的に置き換えるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、用語「置換酵素」は、治療されるリソソーム蓄積症における欠乏または欠損酵素を少なくとも部分的に置き換えるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、置換酵素は、哺乳動物のリソソーム中で蓄積した物質を低減することができるか、または１つ以上のリソソーム蓄積症の症状を救済しまたは軽減することができる。本発明に好適な置換酵素は、野生型または修飾されたリソソーム酵素の双方を含むことができ、組換え体および合成法を使用して産生され、天然源から精製され得る。置換酵素は、組換え酵素、合成酵素、遺伝子活性化酵素または天然酵素であり得る。
【００９５】
被験体：本明細書で使用される用語「被験体」は、ヒトを含める任意の哺乳動物を意味する。本発明の特定の実施形態では、被験体は、成人、青少年、または乳幼児である。医薬組成物の投与および／または子宮内の治療の方法の性能も、本発明によって企図される。
【００９６】
実質的に：本明細書で使用される用語「実質的に」は、関心の特性もしくは性質の完全もしくはほぼ完全な程度もしくは度合いを示す質的な条件を指す。生物学的分野における当業者であれば、生物学的および化学的現象は、完結するおよび／または完結に向けて進むまたは絶対的結果を得るもしくは絶対的結果を回避することがあるにせよ、ごくまれであることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象につきものの完結の潜在的欠如を取り込むために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、フレーズ「実質的に精製された」の「実質的に純粋な」は、例えば、他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸およびそれが自然に結合されている他の生物物質などの、混入している内性物質を実質的に含まないタンパク質（天然または組換え）を指す。例えば、実質的に純粋な分子は、関心の分子の乾燥重量で少なくとも約６０％、好ましくは約７０％、８０％、９０％、９５％または９９％であり得る。
【００９７】
治療：本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（さらに「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、特定の疾患、疾病、および／または病状（例えば、サンフィリポ症候群）の１つ以上の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和し、改善し、軽減し、阻害し、重症度を減少させおよび／または発症を遅延させ、発生率を減少させる治療用タンパク質（例えば、リソソーム系酵素）の任意の投与を指す。このような治療は、関連する疾患、疾病および／または病状の徴候を示していない被験体および／または関連する疾患、疾病および／または病状の初期徴候のみを示している被験体の治療であり得る。あるいは、またはこれに加えて、このような治療は、関連する疾患、疾病および／または病状の１つ以上の既存の徴候を示している被験者の治療であり得る。
【００９８】
（発明を実施するための形態）
本発明は、数ある中でも、リソソーム蓄積症を治療するためのより有効な酵素補充療法を可能にする、組換えリソソーム系酵素（すなわち、ヘパランＮ−スルファターゼタンパク質）の生産のための改善された方法および組成物を提供する。いくつかの特定の実施形態では、リソソーム系酵素は、ヘパリンＮ−スルファターゼであり、本方法および組成物は、Ａ型サンフィリポ症候群のより有効な治療を可能にする。本発明は、組換え酵素の電荷および／またはグリカンプロファイルを決定することによって、キャピラリーゾーン電気泳動が、商業的生産中に組換え酵素（すなわち、ヘパランＮ−スルファターゼ）を正確に特性評価するために使用され得ることの発見を包含する。本発明によるリソソーム系酵素の特性評価は、組換えタンパク質不均一性の標準化および商業的生産の最適化を可能にする。酵素組成物の多くの特徴が酵素活性に悪影響を及ぼし得るために、本発明は生物学的に活性な組換えリソソーム系酵素タンパク質のより有効な大規模生産を可能にする。組換えＨＮＳが例で示されているが、本明細書に記載される本発明の種々の方法および組成物は、他のリソソーム系酵素にも適用可能である。
【００９９】
本発明の種々の態様が、以下のサブセクションでさらに詳細に記載される。サブセクションの使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各サブセクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「および／または」を意味する。
リソソーム系酵素
【０１００】
本発明は、リソソーム蓄積症に関連する任意の酵素をプロファイルするおよび／または特性評価するために使用され得る。特に、本発明は、商業的製造中に組換え的に生産されたリソソーム系酵素を特性評価するために使用され得る。本発明によると、リソソーム系酵素は、リソソームを標的化する場合、任意の酵素またはタンパク質を包含することが想定され、リソソーム蓄積症の治療に好適である。非限定的な例として、特に好適なリソソーム酵素は、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質であり、これはＡ型サンフィリポ症候群において欠損している。追加の例示のリソソーム系酵素を表２に示す。
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）
【０１０１】
本明細書で使用されるＨＮＳタンパク質は、天然に存在するヘパランＮ−スルファターゼ（Ｎ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ）タンパク質の少なくとも部分的活性を置き換えることができる、またはＨＮＳ欠損およびＡ型サンフィリポ症候群に関連する１つ以上の表現型もしくは症状を救済することができる任意のタンパク質もしくはタンパク質の一部である。本明細書で使用される用語「ＨＮＳ酵素」ならびに「ＨＮＳタンパク質」、および文法的等価物は、互換的に使用される。
【０１０２】
典型的には、ヒトＨＮＳタンパク質は、前駆体型として産生される。ヒトＨＮＳの前駆体型は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜２０）および鎖（完全長前駆体のアミノ酸残基２１〜５０２）を含有する。典型的には、前駆体型は、完全長前駆体または完全長ＨＮＳタンパク質とも呼ばれ、これは５０２個のアミノ酸を含有する。典型的な野生型または天然に存在するヒトＨＮＳタンパク質の除去されたシグナルペプチドおよび完全長前駆体（配列番号３）を有する成熟型のアミノ酸配列（配列番号２）を表１に示す。シグナルペプチドには下線が施されている。
【表１】
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【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）である。本明細書に開示されるように、配列番号１は、ヒトＨＮＳタンパク質についての規範的アミノ酸配列を表している。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、ＨＮＳ遺伝子の５’ＵＴＲ内の選択的開始部位における転写から得られる、配列番号１のスプライシングされたアイソフォームおよび／または変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、好適な置換酵素は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＨＮＳタンパク質活性を保持しつつ、野生型または天然に存在するＨＮＳタンパク質（例えば、配列番号１）と比べて、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含有する修飾された成熟ヒトＨＮＳタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の断片または一部を含有する。
【０１０４】
あるいは、ＨＮＳ酵素は完全長ＨＮＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素は、完全長ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、完全長ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＨＮＳタンパク質活性を保持しつつ、野生型または天然に存在する完全長ＨＮＳタンパク質（例えば、配列番号２）と比べて、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含有する修飾された完全長ヒトＨＮＳタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素は、完全長ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＨＮＳ酵素は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＨＮＳ酵素は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＨＮＳ酵素は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＨＮＳ酵素は、完全長ヒトＨＮＳタンパク質の断片または一部を含有する。本明細書で使用される完全長ＨＮＳタンパク質は、典型的には、シグナルペプチド配列を含有する。
【０１０５】
ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知であるポリペプチド配列を変更するための方法、例えばこのような方法をコンパイルする参考文献で見出される方法にしたがって調製することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的な置換は、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。いくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を変更しないアミノ酸置換を指す。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素は、細胞の取り込みおよび／またはリソソームの標的化を容易にするために、細胞の表面上の受容体に結合する部分を含有する。例えば、このような受容体は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基に結合するカチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。加えて、ＣＩ−ＭＰＲは、ＩＧＦ−ＩＩを含む他のタンパク質にも結合する。好適なリソソーム標的化部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、およびその変異体、相同体または断片（例えば、野生型成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の配列を有するこれらのペプチドを含む）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐ残基が結合する好適な受容体は、カチオン依存性であり得る。
追加のリソソーム系酵素
【０１０７】
本明細書で使用されるリソソーム系酵素は、天然に存在するタンパク質の少なくとも一部の活性を置き換えるかまたはリソソーム蓄積症に関連する１つ以上の表現型もしくは症状を救済することができる任意のタンパク質もしくはタンパク質の一部を含むと理解される。本明細書で使用される用語「リソソーム系酵素タンパク質」、「リソソーム系タンパク質」および「リソソーム系酵素」は等価であり、互換的に使用され得る。
【０１０８】
本発明は、任意のリソソーム蓄積症、特にＣＮＳ病因および／または症状を有するこれらのリソソーム蓄積症を治療するために使用され得る任意のリソソーム系酵素を特性評価するために使用してもよく、リソソーム蓄積症としては、限定されるものではないが、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、ファーバー病、フコシド蓄積症、Ｉ／ＩＩ型ガラクトシアリドーシス、Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型ゴーシェ病、グロボイド細胞性ロイコジストロフィー、クラッベ病、ＩＩ型グリコーゲン蓄積症、ポンペ病、Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型ＧＭ１−ガングリオシド蓄積症、Ｉ型ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症、テイ・サックス病、ＩＩ型ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症、Ｉ／ＩＩ型α−マンノース蓄積症、ベータ−マンノース蓄積症、異染性白質ジストロフィー、Ｉ型ムコリリピド症、Ｉ／ＩＩ型シアリドーシス、ＩＩ／ＩＩＩ型ムコリピド症、Ｉ−細胞病、ＩＩＩＣ型ムコリピド症偽ハーラー多発性ジストロフィー、Ｉ型ムコ多糖蓄積症、ＩＩ型ムコ多糖蓄積症、ＩＩＩＡ型ムコ多糖蓄積症、サンフィリポ症候群、ＩＩＩＢ型ムコ多糖蓄積症、ＩＩＩＣ型ムコ多糖蓄積症、ＩＩＩＤ型ムコ多糖蓄積症、ＩＶＡ型ムコ多糖蓄積症、モルキオ症候群、ＩＶＢ型ムコ多糖蓄積症、ＶＩ型ムコ多糖蓄積症、ＶＩＩ型ムコ多糖蓄積症、スライ症候群、ＩＸ型ムコ多糖蓄積症、多重スルファターゼ欠損症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、ＣＬＮ１  Ｂａｔｔｅｎ病、ＣＬＮ２  Ｂａｔｔｅｎ病、Ａ／Ｂ型ニーマン・ピック病、Ｃ１型ニーマン・ピック病、Ｃ２型ニーマン・ピック病、濃化異骨症、Ｉ／ＩＩ型シンドラー病、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症が挙げられる。
【０１０９】
リソソーム蓄積症の遺伝的原因、臨床所見、および分子生物学の詳細なレビューは、Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，（１９９５）で詳説されている。したがって、上記の疾患における酵素欠損は、当業者に既知であり、これらの一部を以下の表２に例示する。
【表２−１】
2016518113.tif 000003
【表２−２】
2016518113.tif 000004
【表２−３】
2016518113.tif 000005
【０１１０】
いくつかの実施形態では、好適なリソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なリソソーム系酵素は、天然に存在するリソソーム系酵素の組換え型であってもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型または天然に存在する配列を有してもよい。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリソソーム系酵素は、野生型または天然に存在する配列と実質的相同性または同一性を有する修飾配列を有してもよい（例えば、野生型または天然に存在する配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）。
組換えヒトＨＮＳの生産
【０１１２】
本発明は、種々の製造方法を通して生物学的に活性なＨＮＳの高レベルの商業的生産に対する必要性を認識する。多数の生産因子が翻訳後修飾、およびＨＮＳのサブ配列のインビボでの生物学的活性に影響を及ぼすために、ＣＺＥによって特性評価し、ＣＺＥによって特性評価されたＨＮＳを生産する方法が、本明細書で開示される。
【０１１３】
特定の態様では、本発明は、種々の手段によって生産された組換えＨＮＳタンパク質を特性評価するために使用され得る。例えば、ＨＮＳタンパク質は、ＨＮＳをコード化する核酸を発現するよう操作された宿主細胞系を利用することによって、組換え技術により生産することができる。本明細書に開示される核酸分子は、広範囲の原核細胞ならびに真核細胞および／または細胞系、例えば、限定されずに、細菌株、酵母株、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞ならびにヒト細胞に向けられる。あるいは、ＨＮＳタンパク質は、活性化された内因性ＨＮＳ遺伝子によって産生されてもよい。
ＨＮＳをコード化する核酸
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書の種々の実施形態において記載されるＨＮＳタンパク質などの関心の組換え遺伝子（本明細書では導入遺伝子と呼ぶ）をコード化する核酸配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコード化する核酸は、コード化されたＨＮＳタンパク質の発現の増加をもたらすよう修飾されてもよく、これはコドン最適化とも呼ばれる。例えば、導入遺伝子をコード化する核酸は、コーディング配列に対してオープンリーディングフレームを変更することによって修飾され得る。本明細書で使用される「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と同義であり、タンパク質またはタンパク質の一部を潜在的にコード化することができる任意のヌクレオチド配列を意味する。オープンリーディングフレームは、通常、開始コドン（例えば、標準コードにおいてはＲＮＡ分子ではＡＵＧおよびＤＮＡ分子ではＡＴＧとして表される）で始まり、フレームが終止コドン（例えば、標準コードにおいてはＲＮＡ分子ではＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧおよびＤＮＡ分子ではＴＡＡ、ＴＧＡまたＴＡＧはとして表される）で終了するまで、コドン−トリプレット中で読み取られる。本明細書で使用される用語「コドン」は、トリプレットまたはコドン−トリプレットとも呼ばれる、タンパク質合成中に特定のアミノ酸を規定する核酸分子中の３つのヌクレオチドの配列を意味する。例えば、標準遺伝暗号中の６４の可能なコドンのうちで、２つのコドン、ＧＡＡおよびＧＡＧはアミノ酸のグルタミンをコード化し、一方コドンＡＡＡおよびＡＡＧは、アミノ酸のリジンを規定する。標準遺伝暗号において、３つのコドンは停止コドンであり、これはアミノ酸を規定しない。本明細書で使用される用語「同義コドン」は、シグナルアミノ酸をコードするコドンのいずれかおよび全てを意味する。メチオニンおよびトリプトファンを除いては、アミノ酸は２〜６個の同義コドンによってコードされる。例えば、標準遺伝暗号において、アミノ酸のアラニンをコードする４つの同義コドンは、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵであり、グルタミンを規定する２つの同義コドンは、ＧＡＡおよびＧＡＧであり、リジンをコード化する２つの同義コドンは、ＡＡＡおよびＡＡＧである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質のオープンリーディングフレームをコード化する核酸は、標準コドン最適化法を使用して修飾されてもよい。コドン最適化のための種々の市販のアルゴリズムが利用可能であり、本発明を実施化するために使用され得る。典型的には、コドン最適化は、コード化されたアミノ酸配列を変更することはない。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、置換、欠失または挿入などのアミノ酸改変をもたらすことができる。典型的には、このようなアミノ酸改変は、タンパク質活性を実質的に変更しない。ＨＮＳをコード化する例示の核酸配列を配列番号３に示す。
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）をコード化する例示の核酸配列
ＡＴＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧＡＡＣＧＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＧＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＣＣＣＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＧＧＡＡＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＡＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＧＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＣＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＣＴＣＣＡＴＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡ（配列番号３）
【０１１６】
いくつかの実施形態では、特にＨＮＳを発現するために選択された異種細胞中で見られる内在のコドン使用と一致させるために、ヌクレオチドの変化は、オープンリーディングフレーム内の同義コドンを変更する場合がある。あるいはまたはこれに加えて、ヌクレオチドの変化は、オープンリーディングフレーム内のＧ＋Ｃ含量を、異種宿主細胞中に存在する内在する核酸配列中で見られるオープンリーディングフレームの平均Ｇ＋Ｃ含量とより良く整合するために変更する場合がある。ヌクレオチドの変化はまた、ＨＮＳ配列内で見られるポリモノヌクレオチド領域または内部の調節もしくは構造部位を変更する場合がある。したがって、限定されずに、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞中でＨＮＳタンパク質の発現の増加をもたらす核酸配列を含む多種多様な修飾されたまたは最適化されたヌクレオチド配列が想定される。
【０１１７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＨＮＳタンパク質をコード化する核酸は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のヌクレオチド配列を有する。典型的には、修飾された核酸は、アミノ酸配列改変を含むまたは含まないＨＮＳタンパク質をコード化する。アミノ酸改変が存在する場合、このような改変は、典型的には、ＨＮＳタンパク質の活性を実質的に変更することはない。
発現ベクター／細胞系
【０１１８】
本願に記載されるリソソーム系酵素タンパク質をコード化する核酸は、宿主細胞中の伸長または発現に好適なベクター中に分子をクローン化する（挿入される）ことができる。限定されないが、原核細胞発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターおよび哺乳動物発現ベクターを含む多種多様なベクターが本発明を実施化するために使用することができる。本発明に好適な例示のベクターとしては、限定されるものではないが、ウイルス系ベクター（例えば、ＡＡＶ系ベクター、レトロウイルス系ベクター、プラスミド系ベクター）が挙げられる。典型的には、リソソーム系酵素タンパク質をコード化する核酸は、種々の調節配列または要素に操作可能となるよう結合される。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、組換えリソソーム系酵素を産生するよう使用することができる細胞を指す。特に、宿主細胞は、大規模で組換えリソソーム系酵素を産生するために好適である。好適な宿主細胞は、限定されるものではないが、哺乳動物、植物、鳥類（例えば、トリ系）、昆虫、酵母、および細菌を含む多様な生物体に由来することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、エンドソーム酸性化欠損細胞ではない。
哺乳動物細胞系
【０１２０】
細胞培養に対して、およびポリペプチドの発現に対して感受性のある任意の哺乳動物細胞または細胞型が、宿主細胞として本発明にしたがって利用され得る。本発明にしたがって使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例は、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞系（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓系（浮遊培養中の増殖用にサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）を含む。いくつかの実施形態では、好適な哺乳動物細胞は、エンドソーム酸性化欠損細胞ではない。
【０１２１】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する、多くの商業的におよび非商業的に入手可能なハイブリドーマ細胞系が、本発明にしたがって利用されてもよい。当業者であれば、ハイブリドーマ細胞系が異なる栄養要求量を有し得ることおよび／または最適増殖およびポリペプチドもしくはタンパク質の発現のための異なる培養条件を要求し得ることを理解するであろうし、必要に応じて条件を修正することができるであろう。
非哺乳動物細胞系
【０１２２】
細胞培養に対して、およびポリペプチドの発現に対して感受性のある任意の非哺乳動物由来細胞または細胞型が、本発明にしたがって利用されてもよい。本発明にしたがって使用され得る非哺乳動物宿主細胞および細胞系の非限定的な例としては、酵母については、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびにヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、昆虫については、スポドプテラ・フルギペルダ（ヨトウガ、Ｓｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシス・ニ（イラクサギンウワバ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉ）、ドロソフィラ・メラノガスター（キイロショウジョウバエ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇｏｓｔｅｒ）、ならびにマンデュカ・セキタ（タバコスズメガ、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）、および細菌については、エッシェリキア・コリ（大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（ネズミチフス菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、バチルス・ズブチリス（枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォンニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロストリディア・パーフリンゲンス（ウェルシュ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリディア・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、および両生類についてはゼノパス・ラエビス（ツメガエル、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ）が挙げられる。
接着増殖の適合性対浮遊増殖の適合性
【０１２３】
特定の実施形態では、宿主細胞は、特定の好ましい属性または細胞を培養するために選択された特定の条件下の増殖に基づいて細胞系を産生するために選び出される。このような属性は、確立された系（すなわち、特性評価された商業的に入手可能な細胞系）の既知の特性および／または形質に基づいて、または経験的な評価を通して解明され得ることを、当業者であれば理解するであろう。いくつかの実施形態では、細胞系は、細胞のフィーダー層上で増殖するためのその能力について選択されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞系は、懸濁液中で増殖するためのその能力について選択されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞系は、細胞の接着性単層として増殖するためのその能力について選択されてもよい。いくつかの実施形態では、このような細胞は、任意の組織培養容器または適切な接着基質で処理された任意の容器と一緒に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、適切な接着基質は、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ）、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、基礎膜マトリックス、ダルマタン硫酸プロテオグリカン、ポリ−Ｄ−リジンおよび／またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、接着宿主細胞は、懸濁液中で増殖するために特定の増殖条件下で選択されかつ変更されてもよい。このような接着細胞を懸濁液中で増殖するよう変更する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、動物血清を増殖培地から経時的に徐々に除去することによって、細胞は懸濁液中で増殖するよう調整されてもよい。
細胞培養系および方法
【０１２４】
様々な細胞培養基および条件が、組換えリソソーム酵素タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、血清含有培地または無血清培地中で産生されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、無血清培地中で産生される。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、無動物培地、すなわち、動物由来成分を欠如する培地中で産生される。いくつかの実施形態では、組換えＨＮＳタンパク質は、既知組成の培地中で産生される。本明細書で使用される「既知組成の栄養培地」は、その化学成分の実質的にすべてが既知である培地を指す。いくつかの実施形態では、既知組成の栄養培地は、血清、血清由来タンパク質（例えば、アルブミンまたはフェチュイン）、および他の成分などの動物由来の成分を含まないものである。場合によっては、既知組成の培地は、１つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質成長因子またはサイトカイン）を含む。場合によっては、既知組成の栄養培地は、１つ以上のタンパク質加水分解物を含む。その他の場合では、既知組成の栄養培地は、無タンパク質培地、すなわち、未知組成のタンパク質、加水分解物または成分を含有しない無血清培地である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、既知組成の培地は、１つ以上の動物由来の成分で補充されてもよい。このような動物由来の成分としては、限定されるものではないが、胎児ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清、およびアルブミンなどの血清由来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）が挙げられる。血清の添加は、それが、ビタミン、アミノ酸、成長因子、およびホルモンなどの構成成分を含有するために望ましい一方で、これはまた、組換えタンパク質の精製を妨げ得る外来のタンパク質の濃縮された供給源も構成する。したがって、いくつかの実施形態では、好適な培地は、ゼノフリー培地、例えば、いかなるウシ血清またはウシ血清由来成分も含有しない培地である。例えば、ゼノフリー培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、およびヒト脂質のうちの１つ以上を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な培地は、フェチュインが減少した血清を含有する。フェチュインは、当該技術分野において既知の種々の方法を使用して、血清から減少させ得る。例えば、フェチュインは、抗体親和性クロマトグラフィーによって血清から減少させてもよい（例えば、Ｔｏｒｏｉａｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ  ＰＡ，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ（２００８）８２：１１６−１２６を参照）。いくつかの実施形態では、好適な培地は無フェチュインである。
【０１２６】
限定されるものではないが、ローラーボトル培養、バイオリアクターバッチ培養およびバイオリアクター流加バッチ培養を含む大規模において組換えリソソーム系酵素を産生するために、様々な細胞培養条件が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、サスペンス中で培養された細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、接着細胞によって産生される。
発現されたリソソーム系酵素タンパク質の精製
【０１２７】
本明細書に記載される様々な方法にしたがって産生されたリソソーム系酵素タンパク質を精製または単離するために、様々な方法が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、発現された酵素は、培地中に分泌されるので、精製プロセスの最初のステップとして、例えば遠心分離または濾過によってなど、細胞および他の固形物が除去される。あるいは、またはこれに加えて、発現された酵素は、宿主細胞の表面に結合される。この実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞が、精製用に溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の多くの手段によって達成することができる。
【０１２８】
リソソーム系酵素タンパク質は、限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは溶解度の違い、エタノール沈降法またはタンパク質の精製に利用可能な任意の他の技術によるものを含む標準的な方法によって単離かつ精製され得る（例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９、およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（ｅｄｓ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  １８２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照）。特に、免疫親和性クロマトグラフィーについては、タンパク質は、そのタンパク質に向けられた抗体を含み、固定支持体に装着された親和性カラムにそのタンパク質を結合させることによって、単離され得る。あるいは、インフルエンザコート配列、ポリ−ヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグが、適切な親和性カラムを通る通路により精製を容易にさせるための標準的な組換え技術によって、タンパク質に取り付けることができる。精製プロセス中にポリペプチドまたはタンパク質の分解を減少または排除するために、フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害物質がいずれかの段階または全ての段階で添加されてもよい。プロテアーゼ阻害物質は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を単離かつ精製するために細胞が溶解されなければならない場合、特に望ましい。
精製されたリソソーム系酵素タンパク質の特性評価
【０１２９】
本願に記載される精製されたリソソーム系酵素タンパク質は、いくつかの生物学的特性に対してアッセイすることによって特性評価され得る。本明細書で使用される用語「生物学的特性」は、生物学的活性および／または機能に相当する化学的特徴、生理学的特徴または分子の特徴を指し、規範的核酸またはアミノ酸配列の付加、欠失および／または修飾の結果として変更されてもよい（すなわち、増強され、減少され、阻害されおよび／または妨害される）。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、不均一な混合物中の他のタンパク質に関してその純度を決定するために、１つ以上の生物学的特性について特性評価されてもよい。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、特性評価されていないリソソーム系酵素タンパク質の化学的または物理的特性を決定および／または予測するために、リソソーム系酵素タンパク質は、特性評価されていないリソソーム系酵素タンパク質を既知の特性評価された基準タンパク質に対して比較することによって特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、商業的に入手可能なタンパク質標準である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、リソソーム蓄積症に関連する、精製された酵素である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、精製されたリソソーム系酵素である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、精製された組換えリソソーム系酵素である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、限定されるものではないが、本明細書に記載されるこれらの方法などの、当該技術分野において既知の多くの方法を使用して修飾された、修飾組換えリソソーム系酵素タンパク質である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、精製されたＨＮＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、精製された組換えＨＮＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、基準タンパク質は、限定されるものではないが、本明細書に記載されるこれらの方法などの、当該技術分野において既知の多くの方法を使用して修飾された、修飾組換えＨＮＳタンパク質である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＨＮＳなどのリソソーム系酵素タンパク質は、潜在的な製造の方法を評価するために、特定の生物学的特性について特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その生物学的特性のうちの１つ以上を、同一の製造工程を使用して生産された別のリソソーム系酵素タンパク質のものと比較するために、特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その生物学的特性のうちの１つ以上を、同一の製造工程を使用して生産されたリソソーム系酵素タンパク質の異なるロットに対して比較するために、特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その生物学的特性のうちの１つ以上を、異なる製造バッチ中で生産されたリソソーム系酵素タンパク質に対して比較するために、特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その生物学的特性のうちの１つ以上を、異なる製造工程を使用して生産されたリソソーム系酵素タンパク質に対して比較するために、特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その生物学的特性のうちの１つ以上を、製造の様々な段階中に生産された１つ以上のリソソーム系酵素タンパク質に対して比較するために、特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、潜在的な製造工程を改変する、修正する、監視するおよび／または変更する目的で、その生物学的特性のうちの１つ以上を別の精製されたＨＮＳタンパク質（同一のまたは異なる製造法のいずれかを使用して）に対して比較するために特性評価されてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＨＮＳリソソーム系酵素タンパク質は、その既知のおよび／または予測された生物学的機能をインビトロで行うための能力を予測するために、生物学的特性について特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、その既知のおよび／または予測された生物学的機能をインビボで行うための能力を予測するために、生物学的特性について特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、限定されるものではないが、薬力学、薬物動態、生物学的利用能、体積分布、異化作用、定常状態血清レベルおよび／またはクリアランスなどのその薬理特性における変化（増加および／または減少）を予測するために、生物学的特性について特性評価されてもよい。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質は、インビボでのその細胞取り込みを予測するために、生物学的特性について特性評価されてもよい。
純度および濃度
【０１３４】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素の純度は、タンパク質サイズ、形状または濃度にしたがって特性評価され得る。具体的には、精製された組換えＨＮＳの純度は、製造の様々な段階中に存在するまたは最終製品中に存在する様々な不純物（例えば、宿主細胞のタンパク質または宿主細胞のＤＮＡ）のレベルによって測定され得る。例えば、リソソーム系酵素タンパク質の純度および／または濃度は、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質の濃度は、タンパク質濃度を決定するための当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって決定され得る。いくつかの特定の実施形態では、タンパク質濃度は、紫外線吸光度アッセイによって決定される。このような吸光度アッセイは、典型的には、約２８０ｎｍの波長（Ａ２８０）で行われる。様々なアッセイ対照、特にＦＤＡなどの規制機関に対して許容可能なものが使用されてもよい。
酵素活性
【０１３５】
精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質は、機能的および／または生物学的活性を評価することによっても特性評価され得る。組換えリソソーム系酵素組成物の酵素活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して決定され得る。典型的には、この方法は、硫酸塩放出アッセイとして知られる、合成基質からのＮ結合型硫酸塩部分の除去を検出することを伴う。酵素活性アッセイの一例は、イオンクロマトグラフィーの使用を伴う。この方法は、組換えヘパランスルファターゼ（すなわち、ＨＮＳ）によって基質から酵素的に放出された硫酸塩イオンの量を定量する。この基質は、天然基質でもよくまたは合成基質でもよい。場合によっては、この基質は、硫酸ヘパリン、硫酸ダルマタン、またはこれらの機能的等価物である。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、蛍光性のメチルウンベリフェロンを形成するために、４−メチルウンベリフェリル−スルフェート（４−ＭＵＦ−スルフェート）基質からの硫酸塩の除去を測定することによって決定されてもよい。この例では、試験試料により発生する蛍光シグナルを、４−ＭＵＦの標準を使用して酵素活性（ｍＵ／ｍＬで）を計算することに用いることができる。活性の１ミリ単位は、１ナノモルの４−ＭＵＦ−スルフェートを、３７℃にて１分間で４−ＭＵＦに変換するために必要とされる酵素の量として定義される。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって、比活性が計算され得る。
電荷プロファイル
【０１３６】
精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質は、タンパク質に関連する電荷プロファイルによって特性評価され得る。典型的には、タンパク質電荷プロファイルは、典型的には、タンパク質の表面上に存在する残存側鎖電荷のパターンを反映する。本明細書で使用される用語「電荷プロファイル」は、所定のｐＨにおけるその固有の電荷から得られる、ある時点においてカラムおよび／またはキャピラリーから溶出するタンパク質の量を表す一組の値を指す。タンパク質に関連する電荷の差は、限定されるものではないが、翻訳後のタンパク質の修飾などのいくつかの因子によって影響され得る。例えば、糖タンパク質（ＨＮＳを含む多くのヒトリソソーム系酵素）の場合、電荷変動の結果は、シアル酸およびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）などの荷電末端炭水化物部分に原因すると考えられている。いかなる理論にも拘束されようとするものではないが、分岐構造の形状および複雑性に加えて、グリカン結合は、インビボクリアランス、リソソームの標的化、生物学的利用能、および／または有効性に影響を与え得ると考えられている。
【０１３７】
したがって、用語「電荷プロファイル」は、「電荷アイソフォーム数」および「グリカンマップ」などの異なる電荷関連分類にさらに特性評価され得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語「電荷アイソフォーム数」は、不均一試料中に存在するタンパク質の種々の荷電型の数を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用するＣＺＥによる組換えヒトＨＮＳの特性評価は、それぞれが異なる電荷アイソフォームに相当する１４の明確なピークをもたらす。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、キャピラリーゾーン電気泳動を使用して、精製されたリソソーム系酵素タンパク質について決定される。一般的に、精製されたリソソーム系酵素タンパク質は、特定のｐＨに平衡化された緩衝液を収容するキャピラリーチューブ内に配置される。強電磁場の印加は、ｐＨ、緩衝液組成および緩衝液強度などのいくつかの可変動要因によって影響される溶出速度を伴い、陰極に向かうバルク流をもたらす。溶質のこのバルク移動は、各々の個々の分析物の電荷質量比に基づいて試料の分離をもたらす、電気浸透流によって引き起こされる。より多くの負電荷を持つ（より酸性の）リソソーム系酵素タンパク質（すなわち、ＨＮＳ種）は、より少ない負電荷を持つ（より低い酸性の）リソソーム系酵素タンパク質（すなわち、ＨＮＳ種）よりも早く溶出する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質についての電荷プロファイルは、トリス、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、Ｇｌｙ−Ｇｌｙおよび／またはこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝液を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質についての電荷プロファイルは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｍＭの濃度を有する緩衝液を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、ホウ酸塩緩衝液を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、ＨＥＰＥＳ緩衝液を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、リン酸塩緩衝液を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ緩衝液を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を２５、５０または１００ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を２５ｍＭの濃度で使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨに平衡化された緩衝液を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、ホウ酸塩緩衝液を６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルは、リン酸塩緩衝液を６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ緩衝液を６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を７．９〜８．１１のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、トリス緩衝液を８．０のｐＨで使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、裸の溶融シリカキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、ポリビニルアルコールキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５または１２０ｃｍの長さのキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、５０〜１１０ｃｍの範囲の長さのキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、７２ｃｍの長さのキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、１０４ｃｍの長さのキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０μｍのｉ．ｄ．（内径）を備えたキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、２５〜１１０μｍの範囲のｉ．ｄ．（内径）を備えたキャピラリーチューブを使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ｋＶの電圧を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、１５〜３０ｋＶの電圧を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、３０ｋＶの電圧を使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０℃の温度を使用するＣＺＥによって決定される。いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質の電荷プロファイルは、３０℃の温度を使用するＣＺＥによって決定される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、精製されたリソソーム系酵素タンパク質組成物は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の異なる電荷アイソフォームピークをその電荷プロファイル内に示す。いくつかの実施形態では、精製されたリソソーム系酵素タンパク質組成物は、少なくとも１４の異なる電荷アイソフォームピークをその電荷プロファイル内に示す。ＨＮＳの例示の電荷プロファイルは、実施例項および図７に描写されている。図７に示すように、１４のピークは、増加する負の電荷およびクロマトグラムの総ピーク面積への減少する寄与率の順序で、ラベル付け（１〜１４）されている。いくつかの実施形態では、精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質組成物についての電荷プロファイルは、タンパク質の表面上の負電荷および正電荷の量に応じて、ピークの異なる数、サイズ、形状または時間間隔を含有する。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質組成物は、１４よりも少ない（例えば、５、４、３、または２よりも少ない）ピークを有する。典型的には、電荷プロファイルは、より少ない数のピークが存在するならば、より均一であるとみなされる。
グリカンマッピング
【０１４６】
いくつかの実施形態では、精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質は、典型的にはグリカンマッピングと呼ばれる、それらのプロテオグリカン組成によって特性評価され得る。本明細書で使用される用語「グリカンマップ」は、酵素によるタンパク質の切断後のクロマトグラフィーによる電荷分離中に産生されるタンパク質の特徴的なマップまたはフットプリントを指す。例えば、いくつかの実施形態において、組換えリソソーム系酵素タンパク質は、本明細書に記載される方法を使用して、酵素による切断後にＣＺＥによって特性評価され、その後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、濃縮されたグリカンマップを作成することが可能である。
【０１４７】
限定されるものではないが、好適なグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エクソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、およびホスファターゼを含む様々な酵素が酵素的消化に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、好適な酵素は、アルカリ性ホスファターゼである。いくつかの実施形態では、好適な酵素は、ノイラミニダーゼである。グリカン（例えば、ホスフォグリカン）は、クロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、ホスフォグリカンは、パルス電流滴定検出を備えた高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出されてもよい。グリカンマップ上の各ピークによって表されるグリカン（例えば、ホスフォグリカン）の量は、当該技術分野において既知の方法および本明細書に開示される方法にしたがって、グリカン（例えば、ホスフォグリカン）の標準曲線を使用して計算され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、リソソーム系酵素タンパク質、例えば、本発明によるＨＮＳは、それぞれ中性（ピーク群１）、モノ−シアル酸付加（ピーク群２）、ジ−シアル酸付加（ピーク群３）、モノリン酸化（ピーク群４）、トリ−シアル酸付加（ピーク群５）、テトラ−シアル酸付加（ピーク群６）、およびジリン酸化（ピーク群７）を指し示している７つのピーク群を含むグリカンマップを示す。Ｉ２Ｓの例示のグリカンマップを図１４Ｂに描写する。いくつかの実施形態では、精製された組換え体Ｉ２Ｓは、７つよりも少ないピーク群を有するグリカンマップを有する（例えば、６、５、４、３、または２個のピーク群を有するグリカンマップ）。いくつかの実施形態では、精製された組換え体Ｉ２Ｓは、７つを超える（例えば、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上）ピーク群を有するグリカンマップを有する。いくつかの実施形態では、各ピーク群に相当するグリカンの相対的な量は、予め決定された参照標準中の対応するピーク群面積に対するこのピーク群面積に基づいて、決定され得る。グリカンマッピングについての様々な参照標準が当該技術分野において既知であり、本発明を実施化するために使用することができる。
医薬組成物および投与
【０１４９】
精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質は、既知の方法にしたがって、リソソーム蓄積症に冒された患者に投与され得る。いくつかの特定の例では、精製されたＨＮＳタンパク質は、既知の方法にしたがって、Ａ型サンフィリポ症候群患者に投与されてもよい。例えば、ＨＮＳなどの精製された組換えリソソーム系酵素タンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口または鼻腔）送達されてもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物は、静脈内投与によって被験体に投与される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物は、髄腔内投与によって被験体に投与される。本明細書で使用される用語「髄腔内投与」または「髄腔内注射」は、脊柱管（脊髄を包囲する髄腔内空間）への注射を指す。限定されずに、頭蓋穿孔または脳槽もしくは腰椎穿刺等を通しての側方脳室注射を含める様々な技術が使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、腰部区域もしくは領域を介してのＩＴ投与または送達、すなわち、腰部ＩＴ投与または送達を指す。本明細書で使用される用語「腰部領域」または「腰部区域」は、第３腰椎と第４腰椎との間の区域（背下部）を指し、より包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物は、皮下（すなわち、表皮の下）投与によって、被験者に投与される。このような目的のために、製剤は、注射器を使用して注入され得る。しかしながら、注入装置（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（商標）ならびにＧｅｎｊｅｃｔ（商標）装置）、インジェクターペン（ＧｅｎＰｅｎ（商標）など）、無針装置（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）ならびにＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））、および皮下パッチ送達システムなどの製剤を投与するための他の装置が利用可能である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、投与の他の経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口もしくは鼻腔））と併せて使用されてもよい。
【０１５４】
本発明は、本明細書に記載される組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物の治療的有効量の単回ならびに複数回投与を企図する。組換えＨＮＳまたはこれを含有する医薬組成物は、被験体の病状（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度および程度に応じて、規則的な間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物の治療的有効量は、規則的な間隔で（例えば、毎年１回、６ヶ月毎に１回、５か月毎に１回、３ヶ月毎に１回、隔月（２ヶ月毎に１回）、月毎（毎月１回）、隔週（２週間毎に１回）、毎週、毎日または持続的に）定期的に投与され得る。
【０１５５】
組換えリソソーム系酵素タンパク質またはこれを含有する医薬組成物は、医薬組成物を調製するために、生理学的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化され得る。担体および賦形剤は、無菌であり得る。製剤は、投与の様式に適するべきである。
【０１５６】
好適な薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロースもしくはデンプンなどの炭水化物、マンニトール、スクロース等、デキストロースなどの糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。医薬調製物は、所望される場合、活性化合物と有害に反応しないか、またはこれらの活性を妨害しない助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝液、着色剤、風味剤および／または芳香族物質等）と混合され得る。いくつかの実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性の担体が使用される。
【０１５７】
組成物または医薬品は、所望される場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤も含有することができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉剤であり得る。組成物はまた、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、標準的担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。
【０１５８】
組成物または医薬品は、常法にしたがって、ヒトへの投与に適合された医薬組成物として製剤化され得る。例えば、いくつかの実施形態において、静脈内投与用の組成物は、典型的には、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤および注射部位で痛みを和らげるための局所麻酔剤を含んでもよい。一般に成分は個別にもしくは一緒に混合された単一用量形態として、例えば活性剤の量を示すアンプルもしくは小容器として気密封入コンテナ内で減圧凍結乾燥粉もしくは無水濃縮物として供給される。この組成物を輸注によって投与する場合は、それを無菌医薬用水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する輸注ビンで調剤してもよい。その組成物が注射によって投与される場合には、成分が投与前に混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１５９】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、本発明の医薬組成物中に含有される治療用薬剤の総量に基づいて、主として決定される。一般に、治療的有効量は、被験体に対する有意な利益を達成する（例えば、基礎疾患または病状を治療する、調節する、治癒する、予防するおよび／または軽減する）のに十分なものである。例えば、治療的有効量は、リソソーム系酵素受容体またはそれらの活性を調節し、それによってこのようなリソソーム蓄積症またはその症状を治療する（例えば、被験体への本発明の組成物の投与後の「ゼブラ小体」または細胞液胞化の存在または発生の減少もしくは排除）のに十分な量などの、所望の治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量であり得る。一般に、それを必要とする被験体に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム系酵素）は、被験体の特性に依存するであろう。このような特性は、被験体の病状、疾患の重症度、全身的健康状態、年齢、性別および体重を含む。当業者であれば、これらの因子および他の関連する因子に応じて適切な投与量を容易に決定することができるであろう。加えて、客観的および主観的アッセイの双方が、最適な投与量範囲を特定するために必要に応じて採用されてもよい。
【０１６０】
治療的有効量は、通常、複数の単位用量を含み得る投与計画において投与される。任意の特定の治療用タンパク質については、治療的有効量（および／または有効な投与計画内の適切な単位用量）は、投与の経路に応じて、他の医薬品との併用に応じて様々であってもよい。また、任意の特別な患者に対する特定の治療的有効量（および／または単位用量）は、治療されている疾病ならびに疾病の重症度；使用される特定の医薬品の活性；患者の年齢、体重、全身的健康状態、性別ならびに食事法；使用される特定の融合タンパク質の投与の時間、投与の経路、および／または排出もしくは代謝の速度；治療の持続時間；および医療分野において周知である同様な因子を含む種々の因子に依存し得る。
【実施例】
【０１６１】
実施例
実施例１．組換えＨＮＳのＣＺＥ分析の開発
この実施例は、組換えＨＮＳタンパク質のＣＺＥ分析の初期開発を説明する。
化学物質および試薬
【０１６２】
水酸化ナトリウム溶液（１．０Ｎならびに０．１Ｎ）および超純水は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）により提供された。トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）およびトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−塩基）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により供給された。バックグラウンド電解質緩衝液（ＢＧＥ）を、トリス−ＨＣｌおよびトリス−塩基の両方の２５ｍＭのストック溶液を作成することによって調製した。ｐＨメーターを使用して、トリス−ＨＣｌのｐＨをトリス−塩基溶液を用いてｐＨ８に調整した。この溶液を、０．２２μｍのナイロンまたはテフロン（登録商標）フィルターを通して濾過し、プラスチック瓶内に保存した。アルカリ性ホスファターゼおよびノイラミニダーゼは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。
試料の調製
【０１６３】
ヒトヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を、ヒト線維肉腫細胞系中で産生させた。精製されたＨＮＳバッチを、様々なクロマトグラフィーステップの組み合わせによって得た。タンパク質を、５ｍＭのリン酸ナトリウム、１４５ｍＭの塩化ナトリウム中、１５ｍｇ／ｍＬの濃度にてｐＨ７．０で製剤化した。ＣＺＥ分析の前に、試料を、０．１Ｘ  ＢＧＥ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈した。各電気泳動図上の負のピークは、ゼロの正味の電荷を有する溶質泳動の位置を表す、通り抜ける電気浸透流（ＥＯＦ）を特徴付けた。これは、同一の位置に泳動する酸化メシチルを中性マーカーとして使用することにより確認された（データ図示せず）。
ＣＺＥ条件
【０１６４】
ＣＺＥを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ  ７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１１２．５ｃｍ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）により供給された。最初の使用の前に、キャピラリーを、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、次いで２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０（ＢＧＥ）で１０分間すすいだ。最適な泳動時間精度をもたらすために、キャピラリーをＢＧＥ中で一晩保存した。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴い２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間および４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、水で０．５分間、およびＢＧＥで６分間すすいだ。各試料について、単一の調製物から３つの別個の注入を行った。ピークの絶対的面積を全ての１４のピークの総絶対的面積で割ることによって、各ピークの相対的面積を計算した。報告できる値は、３通りの注入の平均値からなる。新しい緩衝液調製物を、７つのアッセイのうちの５つについて作成し、合計で４つの異なるキャピラリーを使用した。
【０１６５】
組換えヒトヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を、ヒト線維肉腫細胞中で産生させ、様々なクロマトグラフィーステップの組み合わせにより精製し、５ｍＭのリン酸ナトリウム、１４５ｍＭの塩化ナトリウム中、１５ｍｇ／ｍＬにてｐＨ７．０で製剤化した。ＣＺＥ分析の前に、試料を、０．１Ｘ  ＢＧＥＡ中でおよそ１ｍｇ／ｍｌに希釈し、精製されたＨＮＳ試料を、アニオン交換クロマトグラフィーにより分析し、これは合計で７つの別個のピークを生じ、キャピラリー等電点電気泳動は、３〜１０のｐＨ勾配にわたって８つのピークを生じたが（データ図示せず）、一方キャピラリーゾーン電気泳動は、８．０のｐＨで１４の明確なピークの部分的分離をもたらした（図７）。図１に示すように、ゲル等電点電気泳動などの従来の方法は、商業的製造方法を使用して生産された組換えタンパク質の固有の電荷プロファイル内の別個ではあるが、時として微妙な相違を定量的に識別するために必要な感度のレベルを欠如する。
実施例２．ピーク分離を決定する上での実験的ＣＺＥ条件の評価
【０１６６】
天然ＨＮＳは、等電点電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるおよそ５．１〜６．５の範囲のｐＩを有する（データ図示せず）。このどちらかと言えば広範なｐＩ範囲は、糖タンパク質（および、概してヒトリソソーム系酵素）に共通の特性であり、多くの場合、翻訳後修飾から生じる、シアル酸およびマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）などの荷電末端炭化水素部分における変化の結果である。図７に示すように、ＨＮＳについての固有電荷プロファイルを評価するためのＣＺＥの使用は、１４の明確なピークの分離をもたらした。ｐＨ、緩衝液組成、緩衝液強度およびカラム長さなどのいくつかの変動要因は、全てが電荷アイソフォーム分離および分解能に影響を及ぼし得る。故に、これらの変動要因を試験して、ＣＺＥによるＨＮＳの特性評価に及ぼすこれらの全体的な効果を決定した。加えて、このような洞察を用いて、アッセイ忍容性および再現性を決定した。
緩衝液組成のピーク分離に及ぼす効果
【０１６７】
緩衝液組成のＨＮＳピーク分離に及ぼす効果を決定するために、上記の通りに、ＣＺＥを、精製された組換えＨＮＳタンパク質を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１１２．５ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、次いで２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間および４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１６８】
この実験については、ＨＮＳのピーク分離を、ｐＨ８．０に平衡化された以下の緩衝液を使用して評価した：２５ｍＭのトリス、１５ｍＭのホウ酸塩、２５ｍＭのホウ酸塩、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのＧｌｙ−Ｇｌｙ、およびリン酸塩（表３）。このデータは、トリス緩衝液を使用して、ｐＨ８．０においてのＣＺＥによるＨＮＳの分離が、それぞれのＨＮＳの電荷アイソフォームの良好な分離、検出および分解能をもたらしたことを示唆している。ＨＥＰＥＳおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ緩衝液の双方は、トリスのものに匹敵するＨＮＳの電荷アイソフォーム分離を生じたが、高いバックグラウンド信号をもたらす、それぞれの緩衝液の２００ｎｍの波長におけるＵＶ吸収のために、検出は減少した。ホウ酸塩およびリン酸塩緩衝液は、双方ともにＨＮＳアイソフォームのレベルの減少ならびに不良なピーク分解能を示した。いくつかのアジュヴァントもまた、２５ｍＭのトリス中の電荷アイソフォーム分離をさらに増強するためのそれらの能力について試験を行った（データ図示せず）。このデータは、２５ｍＭの塩化ナトリウム、尿素、ヒドロキシエチルセルロースまたはＥＤＴＡの２５ｍＭのトリス緩衝液への添加が、ピーク分解能およびアイソフォーム分離を減少させたことを示唆している。
【表３】
2016518113.tif 000006
緩衝液濃度のピーク分離に及ぼす効果
【０１６９】
上記の所見に基づいて、トリス緩衝液の濃度のＨＮＳピーク分離に及ぼす効果を探索するために追加の試験を行った。上記の通りに精製された組換えＨＮＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置を使用して、ＣＺＥにかけた。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１１２．５ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、次いでｐＨ８．０に平衡化した、所望の実験的なトリス緩衝液の濃度で１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間）（４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１７０】
最初の実験については、ＨＮＳピーク分離を、以下の反応条件を使用して広範なｐＨ範囲にわたって評価した：ｐＨ８．０の１００ｍＭのトリス緩衝液（図２Ａ）、ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス緩衝液（図２Ｂ）、およびｐＨ８．０の２５ｍＭのトリス緩衝液（図２Ｃ）。このデータは、ｐＨ８．０のトリス緩衝液を使用するＣＺＥによるＨＮＳの分離が、２５ｍＭの緩衝液の濃度に近い電荷アイソフォームにおけるより大きな分離をもたらすことを示唆している。図２Ａおよび２Ｂに示すように、２５ｍＭよりも高いトリス緩衝液濃度においては、ＨＮＳ分離は減少し、個々のアイソフォームピーク分離の不良な分解能をもたらした。
【０１７１】
これらの最初の所見に基づいて、ＨＮＳ特性評価中のトリス緩衝液の濃度におけるわずかな変化に対するＣＺＥアッセイの忍容性を評価するために、追加の試験を行った。上述した同一のＣＺＥ条件を用いて、精製された組換えＨＮＳタンパク質を、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または３０ｍＭのトリス緩衝液を使用するＣＺＥによって分析を行った（図３Ｂ）。図３に示すようにトリス緩衝液濃度におけるわずかな変動は、１４の明確な電荷アイソフォーム（Ａ）の鋭い分解能と共に、なお確実なピーク分離（Ｂ）をもたらした。このデータは、ＨＮＳの電荷プロファイルを決定するためのＣＺＥの使用が、確実で高感度でもある方法であることを強く示唆している。さらに、これらの所見はまた、少なくとも２０〜３０ｍＭのトリス緩衝液の範囲が、ヒトＨＮＳのＣＺＥ特性評価に使用され得ることも示唆している。２０ｍＭにおいてみられる分解能のわずかな損失が存在するが（初期ピークを参照）（図３Ｂ）、ピークの定量化に及ぼす影響はないと思われる。これらのデータは、本方法が標的緩衝液濃度の２０％以内で確実であることを示している。
ｐＨのピーク分離に及ぼす効果
【０１７２】
ＨＮＳピーク分離に及ぼすｐＨの効果を決定するために、ＣＺＥを、上記の通りの精製した組換えＨＮＳタンパク質を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１１２．５ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、次いで所望の実験的ｐＨの２５ｍＭのトリスで１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間および４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１７３】
この実験については、ＨＮＳのピーク分離を、広範な範囲のｐＨ条件にわたって評価した：ｐＨ８．５（図４Ａ）、ｐＨ８．０（図４Ｂ）、ｐＨ７．５（図４Ｃ）、およびｐＨ７．０（図４Ｄ）のトリス緩衝液。これらのデータは、ｐＨ８．０におけるＣＺＥによるＨＮＳ分離が、識別可能なアイソォームピークの最大数を伴い、より良好な電荷分離をもたらすことを示唆している。このデータはまた、ヒトＨＮＳについては、より塩基性のアイソフォームのｐＩがｐＨ７．０の周辺に近づくと、分離がほとんど失われたことも示唆している（図４Ｄ）。
【０１７４】
これらの最初の所見に基づいて、ＨＮＳ特性評価中のｐＨのわずかな変化に対するＣＺＥ分析の忍容性を評価するために、追加の試験を実施した。上記の同一のＣＺＥ条件を使用して、精製された組換えＨＮＳタンパク質を、７．８９、８．０または８．１１のｐＨに平衡化された２５ｍＭのトリス緩衝液を使用するＣＺＥによって分析した（図５Ｂ）。示したように、ｐＨ８．０周辺のわずかな変動でも、１４の明確な電荷アイソフォームの鋭い分解能と共に（図５Ａ）、なお確実なピーク分離をもたらした（図５Ｂ）。このデータは、ＨＮＳ電荷プロファイルを決定するためのＣＺＥの使用が、確実で高感度でもある方法であることを強く示唆している。さらに、これらの所見は、２５ｍＭのトリス緩衝液中の少なくとも７．８９〜８．１１のｐＨ範囲が、ヒトＨＮＳのＣＺＥ特性評価に使用され得ることも示唆している。
キャピラリー組成および長さのピーク分離に及ぼす効果
【０１７５】
キャピラリー組成および長さのＨＮＳピーク分離に及ぼす効果を決定するために、ＣＺＥを、上記の通りに、精製された組換えＨＮＳタンパク質を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。７２ｃｍまたは１０４ｃｍのいずれかの長さのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）または裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径））を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間および４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１７６】
先行実験は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムとは異なり、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムが、１４の個々の電荷アイソフォームのそれぞれの分離のレベルの低下および不良な分解能をもたらすことを明らかにした。タンパク質とカラムのＰＶＡコーティングとの間の相互作用のために分離が遅延されたことを示唆し、このことは、ヒトＨＮＳグリコ型の分離にとって、負荷電のタンパク質とキャピラリーの壁との間の反発力が最適な分離には必須であり得ることを示している。短いキャピラリーカラムを使用し、緩衝液および緩衝添加剤を最適化することが多くの場合最適である。ＨＮＳにとっては、このアプローチは不可能であった。その結果、ＨＮＳアイソフォームの分離を最適化するのに役立つために、キャピラリーの長さを評価した。機器のカセットに嵌合するキャピラリーの最長の長さである１０４ｃｍを使用した。キャピラリーの長い長さにもかかわらず、強い電気浸透流（ＥＯＦ）のために、分離は１６分以内に完了した。７２ｃｍと１０４ｃｍのキャピラリーで行われた分離間の正規化された比較を図６に示す。運転時間は約６分から１４分まで延長したが、分解能は、電界強度が減少したにもかかわらず、より長いキャピラリーで改善された。
実施例３．再現性および精度
【０１７７】
この実施例に関しては、製品開発の際の組換えＨＮＳのその製剤的定量分析および固有の電荷不均一性の特性評価を評価するために、上記のＣＺＥアプローチをＨＮＳの特性化における再現性および精度について検討した。この実施例については、ＣＺＥの性能（泳動時間ならびに相対的ピーク面積の関数として）および組換えＨＮＳの同様な製造ロットと異なる製造ロット間のグリコフォーム分布の微妙な変動を識別するための方法の能力によって、再現性および精度を検定した。
【０１７８】
組換えヒトＨＮＳの共通製造ロット（ロットＡ）を使用して、相対的ピーク面積ならびに泳動時間のランツーラン（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）再現性ならびに日差再現性の双方を評価した。三重反復試験についてのランツーラン（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）再現性を、図８に示す。通過時間を除いては、異なるバッチのグリコフォーム集団を比較することが必要であったために、４ヶ月の期間にわたって三重反復試験で行われた７つの個々の測定（図９）からの相対的および絶対的泳動時間を計算し、これを表４に示す。
【表４】
2016518113.tif 000007
【０１７９】
絶対的泳動時間（ｔｍ）は全て１％以下であったが、相対的泳動時間（ＲＭＴ）は、レポートパラメータとして好ましかった（ｔｍ／ｔＥＯＦ）。ピーク幅が狭く、泳動時間はわずか１０秒の差であったために、ＲＭＴは正確なピーク同定を良好に保証した。ＲＭＴは、０．３〜０．５％の範囲であった。相対的ピーク面積（ピーク面積の百分率）の精度を表３に示す。相対的面積の相対標準偏差（ＲＳＤ）は、アイソフォーム３〜１２については０．６％〜２．８％であって、アイソフォーム１ならびに２については４．０％〜５．０％であって、およびアイソフォーム１３ならびに１４については７．４％〜２３．２％であった。このデータは、アイソフォーム１〜２ならびに１３〜１４についてのより高いＲＳＤ百分率は、それらの低い相対的面積によるものであり得ることを示唆している。このデータを、１４のＨＮＳアイソフォームのそれぞれの総ピーク面積％を、日差比較データに対してプロットすることによっても評価し、さらに計算し、これを表５に示す。図９は、総ピーク面積または１４のアイソフォームのそれぞれで、４ヶ月の期間にわたってほとんどまたは全く変動がなかったことを示している。まとめると、これらのデータは、上述の方法および条件によるＣＺＥの使用が、精密かつ再現可能な様式でＨＮＳグリコフォームを正確に特性評価するために使用され得ることを強く示唆している。
【表５】
2016518113.tif 000008
実施例４．製造変動を特定するためのＨＮＳのＣＺＥ特性評価
【０１８０】
ヒト組換えＨＮＳの製造中のグリコフォームおよび不均一な固有電荷構造の特定などの定量的なＨＮＳ特性評価を実行するためのＣＺＥの使用に関する方法を評価するために、試験をさらに行った。定量的で再現可能な特性評価データの作成は、生産方法を監視および／または最適化するために、ならびにＦＤＡのガイドラインにしたがって商業的製品の生産を標準化するために使用され得る。
ロット間変化の特性化
【０１８１】
この実施例については、同一の製造工程の異なるロット間の組換えＨＮＳのその潜在的定量分析および固有の電荷不均一性の特性評価を評価するために、上述のＣＺＥアプローチを、ＨＮＳの特性評価のために検討した。
【０１８２】
精製された組換えＨＮＳ酵素を、同一の下流側の製造工程を使用して、２つの別個の生産ランで生産した。キャピラリーゾーン電気泳動を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１０４ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、ｐＨ８．０に平衡化した２５ｍＭのトリスで１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間）（４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１８３】
図１０Ａは、各製造ロット（ロット１およびロット２）の重ね合わせた電気泳動図を示す。このデータは、同じ数の固有電荷アイソフォームのピークが両製造ロット内に存在するが、ピーク分布または「製造フィンガープリント」において微妙な違いが存在することを示唆している。これらの違いを、各製造ロットについての相対的ピーク面積（総面積のパーセントとして表される）を計算することによってさらに描写した（図１０Ｂ）。ロット１および２に関する相対的ピーク面積のデータを、特性評価済みの参照用ロット１８９と比較し（図７）、これを表６に示した。
【表６】
2016518113.tif 000009
【０１８４】
ＨＮＳ特性評価用にＣＺＥを使用することの分析能を、ＩＥＦ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＣＺＥを使用して、個々のＨＮＳロットについての電荷アイソフォームの検出レベルにおける違いを検討することによって試験を行った。この実験については、４つの異なるＨＮＳ製造ロットで、それぞれが同じ下流側の精製法で製造されたものを試験した。キャピラリーゾーン電気泳動を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１０４ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、ｐＨ８．０に平衡化した２５ｍＭのトリスで１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間）（４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。ＩＥＦ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥを、当業者に既知の標準的分子生物学技術を使用して行った。
【０１８５】
図１１は、特性評価済みＨＮＳ製造参照標準（ＲＳ）に対して比較された各製造ロット（ロット１、２、３および４）の重ね合わせた電気泳動図を示す。このデータは、同数の固有電荷アイソフォームピークが両製造ロット内に存在するが、ピーク分布または「製造フィンガープリント」における違いが存在することを示唆している。これらの違いを、各製造ロットについて相対的ピーク面積（総面積のパーセントとして表された）を計算することによって定量的に確認し、これを表７に示す。
【表７】
2016518113.tif 000010
【０１８６】
ＣＺＥを使用して立証されたＨＮＳの固有電荷分布における違いは、標準的ＩＥＦ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用しては観測されず、標準的ＩＥＦ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、アッセイの不良な分解能および主観的な性質をもたらした（データ図示せず）。まとめると、これらのデータは、ＨＮＳの特性評価におけるＣＺＥの使用が、製造ロット間の数学的に定量可能な違いを可能にすることを示唆している。さらに、ＨＮＳ電荷アイソフォームの特性評価においてＣＺＥのピーク分解および分解能特性があると仮定すれば、このアプローチは、他の分析的アプローチでは容易に明らかになり得ない不均一なＨＮＳ集団における微妙な違いを認識することができることを強く示唆している。
製造段階中のＨＮＳの特性評価
【０１８７】
同一の製造工程の異なる段階中のＨＮＳ固有電荷アイソフォームにおける変動を検定する能力もまた試験した。精製された組換えＨＮＳ酵素を、２つの別個の生産ランで生産した。試料を、下流側の精製の開始前に、および製造工程の完了時に採取した。キャピラリーゾーン電気泳動を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１０４ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、ｐＨ８．０に平衡化した２５ｍＭのトリスで１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間）（４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１８８】
図１２ＡおよびＢは、（Ａ）の前、および（Ｂ）下流側の精製後の各製造ロット（ロット１および２）の重ね合わせた電気泳動図を示す。このデータは、製造工程の様々な段階中のＨＮＳについての固有の電荷プロファイルにおける違いを立証している。これは、ＣＺＥが、製造中および磨きをかけた完成品におけるＨＮＳ不均一性の変化を監視するために使用され得ることを示唆している。これはまた、機能的表示としてのＣＺＥを示唆し、ＣＺＥは、完成品についてＨＮＳ電荷プロファイルを制御するために、製造ステップを最適化かつ修正するよう使用され得る。
異なる製造工程から生産されたＨＮＳの特性評価
【０１８９】
異なる製造工程に関連する電荷プロファイルにおける違いもまた検討した。この実験については、精製された組換えＨＮＳ酵素を、２つの異なる下流側の製造工程を使用して生産し、この製造工程では、代替緩衝液組成物を使用した。キャピラリーゾーン電気泳動を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）から入手した、光ダイオードアレイ検出器およびＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを装備したＡｇｉｌｅｎｔ（商標）７１００装置で行った。裸の溶融シリカキャピラリーカラム（１０４ｃｍ×５０μｍ（内径）、Ｌ＝１０４ｃｍ）を、１．０ＮのＮａＯＨで１時間、水で５分間、ｐＨ８．０に平衡化した２５ｍＭのトリスで１０分間すすいだ。５０ｍｂａｒの圧力下２秒間の加圧注入によって、試料を、キャピラリーの陽極端部に導入した。電圧は、＋３０ｋＶであり、およそ８μＡの電流を発生した。キャピラリーの温度は３０℃であった。検出波長は、８ｎｍの帯域通過を伴って２００ｎｍであった。参考波長は使用しなかった。データを、＜０．００６分のピーク幅（０．０６２秒の応答時間）（４０Ｈｚ）で収集した。注入の合間に、キャピラリーを水で０．５分間、０．１ＮのＮａＯＨで３分間、および水で０．５分間すすいだ。
【０１９０】
図１３Ａは、それぞれの製造されたＨＮＳ試料（製造方法＃１および製造方法＃２）の重ね合わせた電気泳動図を示す。このデータは、ＨＮＳ製造工程における微妙なずれが、固有の電荷プロファイルにおける観測可能な違いをもたらし得ることを立証している。特に製造方法１は、計算された相対的ピーク面積（総面積のパーセントとして表された）にしたがってグラフ化される場合、２つの追加の負荷電ピーク（図１３Ａでは（「Ｘ」ならびに「Ｙ」として表示）、および図１３Ｂでは「ｐｋｘ」ならびに「ｐｋｙ」として表示）を伴う、異なるアイソフォーム集団をもたらした。これらの定量可能な違いは、各々異なって製造された試料（Ｍａｎ．Ｐｒｏ．１およびＭａｎ．Ｐｒｏ．２）について計算された相対的ピーク面積を、特性評価済みの参照製造ロット１８９（図７）と比較することによって表され、これを表８に示した。
【表８】
2016518113.tif 000011
実施例５．組換えＨＮＳのグリカンプロファイル
【０１９１】
観測される電荷不均一性の根拠が、グリコシル化に起因するかどうかを決定するために、それぞれシアル酸およびリン酸塩を放出する、酵素ノイラミニダーゼおよび／またはホスファターゼで前処理された試料で、ＣＺＥを行った（図１４）。両酵素の組み合わせによる処理は、主なピークおよびいくつかの少数のピークの全てがＥＯＦマーカーのより近くにシフトした状態で、電気泳動図の複雑性を著しく低減し、これは、負電荷の除去によるものと予測される。
【０１９２】
次に、組換えＨＮＳについて濃縮グリカンマップを作成した。この実験については、ＨＮＳタンパク質を、０．５％のＳＤＳの存在下、１００℃で３〜４分間変性させ、その後Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）でグリカンの酵素による放出を行った。ＨＮＳ試料を、Ｎ−グリコシダーゼＦ（３０ｍＵ／３μＬ）と、０．９％ＮＰ４０と共に３７℃で４〜６時間インキュベートし、その後、Ｎ−グリコシダーゼＦの第２の添加を行い、３７℃でさらに１７〜１９時間インキュベートした。放出されたグリカンの分離を、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１ガードカラムを備えたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１分析カラム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、パルス電流滴定検出器を装備した高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）により行った。グリカンを、１２ｍＭの酢酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＯＨ中でカラムに加え、続いて１００ｍＭのＮａＯＨ中１２〜３００ｍＭの酢酸ナトリウム濃度勾配（６．４ｍＭ／分）で４５分以内に溶出させた。カラムは、１ｍＬ／分の流速および周囲の室温を使用した。グリカンは、増加する電荷特性の順番で溶出し、７つの明らかなピーク群に分類される。ヒト組換えＨＮＳについては、ピーク群１は、全ての非荷電グリカンからなり、ピーク群２、３、および５は、それぞれモノ−、ジ−、およびトリ−シアル酸付加グリカンからなる。ピーク群４および７中に存在する炭水化物構造は、それぞれモノ−およびジ−Ｍ６Ｐ基を有するグリカンである。ピーク群６は、シアル酸およびＭ６Ｐの両方を含有するハイブリッドグリカンからなる。グリカンマップ中の追加の少数のピークは、シアル酸および／またはリン酸塩残基のいずれかの不完全な除去によるものと思われる。これらの所見は、ＣＺＥによって見られる固有の電荷不均一性の根拠が、シアル酸およびＭ６Ｐ含量の双方における違いに起因することを強く示唆している。
【０１９３】
異なる固有の電荷アイソフォームプロファイルを有することを先に示された（図１５Ａ）、多様な製造方法を使用して生産されたＨＮＳの２つの異なるロットを評価するために、実験をさらに行った。この実験については、観測された電荷アイソフォームプロファイルにおける違いが、シアル酸およびＭ６Ｐ含量の双方における違いに起因することを確認するために、グリカン分析を行った。この実験については、２つの異なる製造工程（プロセス＃１およびプロセス＃２）からのＨＮＳタンパク質を、０．５％のＳＤＳの存在下、１００℃で３〜４分間変性させ、その後Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）でグリカンの酵素による放出を行った。ＨＮＳ試料を、Ｎ−グリコシダーゼＦ（３０ｍＵ／３μＬ）と、０．９％ＮＰ４０と共に３７℃で４〜６時間インキュベートし、その後、Ｎ−グリコシダーゼＦの第２の添加を行い、３７℃でさらに１７〜１９時間インキュベートした。放出されたグリカンの分離を、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１ガードカラムを備えたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１分析カラム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、パルス電流滴定検出器を装備した高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）により行った。グリカンを、１２ｍＭの酢酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＯＨ中でカラムに加え、続いて１００ｍＭのＮａＯＨ中１２〜３００ｍＭの酢酸ナトリウム濃度勾配（６．４ｍＭ／分）で４５分以内に溶出させた。カラムは、１ｍＬ／分の流速および周囲の室温を使用した。図１５は、酵素的消化後に観測されたアイソフォーム電荷プロファイル（図１５Ｂ、ＣおよびＤ）が、プロセス１およびプロセス２の両試料で同様であったことを立証している。これは、ＣＺＥによりみられる最初の固有電荷アイソフォームプロファイルで観測された任意の変化が、シアル酸およびＭ６Ｐ含量の双方における違いによるものであったことを示唆している。
【図２Ａ】
2016518113.tif 000012
【図２Ｂ】
2016518113.tif 000013
【図２Ｃ】
2016518113.tif 000014
【図１】
2016518113.tif 000015
【図３】
2016518113.tif 000016
【図４Ａ−Ｂ】
2016518113.tif 000017
【図４Ｃ−Ｄ】
2016518113.tif 000018
【図５】
2016518113.tif 000019
【図６】
2016518113.tif 000020
【図７】
2016518113.tif 000021
【図８】
2016518113.tif 000022
【図９】
2016518113.tif 000023
【図１０Ａ】
2016518113.tif 000024
【図１０Ｂ】
2016518113.tif 000025
【図１１】
2016518113.tif 000026
【図１２Ａ】
2016518113.tif 000027
【図１２Ｂ】
2016518113.tif 000028
【図１３Ａ】
2016518113.tif 000029
【図１３Ｂ】
2016518113.tif 000030
【図１４Ａ】
2016518113.tif 000031
【図１４Ｂ】
2016518113.tif 000032
【図１５Ａ−Ｂ】
2016518113.tif 000033
【図１５Ｃ−Ｄ】
2016518113.tif 000034
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月16日(2015.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を分析する方法であって、キャピラリーゾーン電気泳動によってＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルを特性評価することを含む方法。
【請求項２】
前記特性評価するステップが、
（ｉ）キャピラリーゾーン電気泳動によって、電荷変動成分の不在または存在を示すピーク群を分離するステップであって、場合によって
（ａ）前記電荷プロファイルが、少なくとも１４のピーク群を含む、ならびに／あるいは
（ｂ）前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在または存在に関連する、
場合によって、前記電荷変動成分が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在または存在に関連する、
ステップ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）各ピーク群の相対的泳動時間および／または相対的ピーク面積を定量的に決定するステップであって、場合によって
（ａ）各ピーク群の前記相対的泳動時間が、電気浸透流（ＥＯＦ）マーカーに対して決定される、ならびに／あるいは
（ｂ）各ピーク群の前記相対的ピーク面積が、総ピーク面積と比べてのピーク面積百分率によって計算される、
ステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記ＨＮＳタンパク質の品質を決定することを更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＮＳタンパク質が、哺乳動物細胞によって産生され、
場合によって、前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＮＳタンパク質が、大規模に生産される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、基準値と比べて前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルにおいて変動があるかどうかを決定することを含み、
場合によって、前記基準値が、異なるバッチにより生産されたＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルであり、
場合によって、前記方法が、バッチ間電荷変動性を評価するステップを更に含み、
場合によって、前記バッチ間電荷変動性を評価するステップが、異なるバッチによって生産された各ＨＮＳタンパク質に対比する前記相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、
（ｉ）より長い泳動時間が増加する負電荷を持つ種に相当するような条件下で、
（ｉｉ）トリスを含む緩衝系を使用して、および／または
（ｉｉｉ）５６〜１１２．５ｃｍの範囲の長さを有するキャピラリーを使用して
行われ、
場合によって、前記緩衝系が、トリスを２０〜３０ｍＭの範囲の、例えば２５ｍＭの、濃度で含み、
場合によって、前記緩衝系が、７．８〜８．２の範囲の、例えば８の、ｐＨを有し、
場合によって、前記キャピラリーが、７２ｃｍまたは１０４ｃｍの有効長さを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によるキャピラリーゾーン電気泳動によって、大規模で製造されたヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を分析するステップを含む、製造方法。
【請求項９】
前記製造方法が、前記電荷プロファイルの前記分析に基づいて、製造条件を調整するステップを含むかまたは
前記分析ステップが、ロットの出荷前に行われる請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、前記ＨＮＳタンパク質の電荷変動成分を示す少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルで特性評価される、実質的に純粋なヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在または存在に関連し、
場合によって、前記電荷変化体が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在または存在に関連する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＨＮＳタンパク質が、
（ｉ）哺乳動物細胞によって産生される、場合によっては前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、および／または
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、場合によっては配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、
請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、２０〜３０ｍＭの範囲の濃度でトリスを含み、７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する緩衝系を使用して行われ、
場合によって、前記緩衝系が、トリスを２５ｍＭの濃度で含み、８．０のｐＨを有する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ａ型サンフィリポ症候群を治療する方法において使用するための、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
いくつかの実施形態では、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、裸の溶融シリカキャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被覆キャピラリーカラムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、５０〜１１０ｃｍの長さの範囲のキャピラリーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、長さが７２ｃｍ〜１０４ｃｍの間の範囲であるキャピラリーを使用して行われる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される；
（項目１）
ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を分析する方法であって、キャピラリーゾーン電気泳動によってＨＮＳタンパク質の電荷プロファイルを特性評価することを含む方法。
（項目２）
前記特性評価するステップが、キャピラリーゾーン電気泳動によって、電荷変動成分の不在または存在を示すピーク群を分離するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記電荷プロファイルが、少なくとも１４のピーク群を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在、存在に関連する、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記電荷変動成分が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在、存在に関連する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記特性評価するステップが、各ピーク群の相対的泳動時間および／または相対的ピーク面積を定量的に決定することを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
各ピーク群の前記相対的泳動時間が、電気浸透流（ＥＯＦ）マーカーに対して決定される、項目６に記載の方法。
（項目８）
各ピーク群の前記相対的ピーク面積が、総ピーク面積と比べてのピーク面積百分率によって計算される、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
前記方法が、前記ＨＮＳタンパク質の品質を決定することを更に含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＨＮＳタンパク質が、哺乳動物細胞によって産生される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＮＳタンパク質が、大規模に生産される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記方法が、基準値と比べて前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルにおいて変動があるかどうかを決定することを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記基準値が、異なるバッチにより生産されたＨＮＳタンパク質の前記電荷プロファイルである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記方法が、バッチ間電荷変動性を評価するステップを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記バッチ間電荷変動性を評価するステップが、異なるバッチによって生産された各ＨＮＳタンパク質に対比する前記相対的ピーク面積の傾向を示すグラフを比較することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、より長い泳動時間が増加する負電荷を持つ種に相当するような条件下で行われる、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、トリスを含む緩衝系を使用して行われる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記緩衝系が、トリスを約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度で含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記緩衝系が、トリスをおよそ２５ｍＭの範囲の濃度で含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記緩衝系が、およそ７．８〜８．２の範囲のｐＨを有する、項目１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記緩衝系が、およそ８のｐＨを有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、５６〜１１２．５ｃｍの範囲の長さを有するキャピラリーを使用して行われる、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記キャピラリーが、およそ７２ｃｍまたは１０４ｃｍの有効長さを有する、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法によるキャピラリーゾーン電気泳動によって、大規模で製造されたヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）を分析するステップを含む、製造方法。
（項目２６）
前記製造方法が、前記電荷プロファイルの前記分析に基づいて、製造条件を調整するステップを含む、項目２５に記載の製造方法。
（項目２７）
前記分析ステップが、ロットの出荷前に行われる項目２５に記載の製造方法。
（項目２８）
キャピラリーゾーン電気泳動によって決定される、前記ＨＮＳタンパク質の電荷変動成分を示す少なくとも１４のピーク群を含む電荷プロファイルで特性評価される、実質的に純粋なヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質を含む医薬組成物。
（項目２９）
前記ＨＮＳタンパク質の前記電荷変動成分が、種々の量のシアル酸および／またはＭ６Ｐ基の不在、存在に関連する、項目２８に記載の医薬組成物。
（項目３０）
前記電荷変化体が、種々の量のモノ−、ジ−、トリ−シアル酸付加グリカン、モノ−、ジ−Ｍ６Ｐ基、およびこれらの組み合わせの不在、存在に関連する、項目２９に記載の医薬組成物。
（項目３１）
前記ＨＮＳタンパク質が、哺乳動物細胞によって産生される、項目２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３３）
前記ＨＮＳタンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、項目２８〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記ＨＮＳタンパク質が、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する、項目２８〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３５）
前記キャピラリーゾーン電気泳動が、約２０〜３０ｍＭの範囲の濃度でトリスを含み、およそ７．５〜８．５の範囲のｐＨを有する緩衝系を使用して行われる、項目２８〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３６）
前記緩衝系が、トリスをおよそ２５ｍＭの濃度で含み、およそ８．０のｐＨを有する、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目３７）
項目２８〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、治療を必要する被験体に投与するステップを含む、Ａ型サンフィリポ症候群を治療する方法。
【国際調査報告】
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