(57)【要約】  本明細書において、生後の造血性内皮細胞の単離および識別の方法が提供される。生後の造血性内皮細胞の実質的に純化された集団、生後の造血性内皮細胞の複数の組成物、および被験者において造血系を再生成するべく造血性内皮細胞を用いる複数の方法が、更に提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を、生後の被験者から単離する段階を備える、複数の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を単離する方法。
【請求項２】
複数の前記ＨＥＣは、レシピエントへの移植の後に、複数の造血細胞を生成することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞は、前記被験者の肝臓、脾臓、骨髄、血液、臍帯、皮膚、腎臓、筋肉、または肺から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の前記細胞は、前記被験者の前記肝臓から単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
単離された複数の前記ＨＥＣは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の細胞の実質的に純粋な集団において備えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離する段階は、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現に基づく複数の細胞を選択する段階を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の実質的に純粋な集団を備える、組成物。
【請求項８】
複数の前記ＨＥＣは、前記組成物の投与が予期される被験者に対して自己由来である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
複数の前記ＨＥＣは、前記組成物の投与が予期される被験者に対して同種異系である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、医薬的に受け入れられるキャリアと混合して備える、請求項７から９のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、培養培地と混合して備える、請求項７から９のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、耐凍剤と混合して備える、請求項７から９および１１のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞の実質的に純粋な集団を、それらを必要とする被験者に投与する段階を備える、免疫不全疾患のための治療の方法。
【請求項１４】
前記免疫不全疾患は、Ｔ細胞不全、Ｂ細胞不全、複合Ｔ細胞／Ｂ細胞不全、抗体不全、補体不全、白血病、リンパ腫、貧血症、好中球減少症、リンパ球減少、ループス、およびウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫不全疾患は、免疫抑制または細胞毒性薬の投与の結果としてもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫不全疾患は、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝炎の結果としてもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
生後の被験者において複数の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を識別する方法であって、前記被験者において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋である複数の細胞を識別する段階を備える、方法。
【請求項１８】
ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通の４ドメインのサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現を識別する段階を更に備える、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する応用への相互参照  本出願は、２０１３年１１月１３日に提出された米国特許仮出願第６１／９５６，１９４号の優先権を主張し、それは、本明細書においてその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
マウスの成長の間、複数の決定的な造血幹細胞（ＨＳＣ）は、大動脈‐生殖腺‐中腎（ＡＧＭ）領域内の背部大動脈において発生する（Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．他，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：６６１−６７２（２００２）；ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，Ｍ．Ｆ．他，ＥＭＢＯ（欧州分子生物学機構）ジャーナル１９２：４６５−２４７４（２０００年）；Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．他，Ｃｅｌｌ  ８６：８９７−９０６（１９９６年））。ゼブラフィッシュ、マウス、および場合によってはヒトを含む複数の脊髄動物において、ＨＳＣは、@背部大動脈床および複数の臍動脈を覆う複数の造血性血管細胞の層@から出現すると考えられている（Ｚｏｖｅｉｎ，Ａ．Ｃ．他、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：６２５−６３６（２００８年）；Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．Ｃ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：１１６−１２０（２０１０年）；Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｊ．Ｙ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：１０８−１１１（２０１０年）；Ｋｉｓｓａ，Ｋ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：１１２−１１５（２０１０年））。胚において複数の内皮細胞（ＥＣ）および複数のＨＳＣ前駆細胞を成長させることの密接な関連は、造血のＥＣ造血遷移理論をもたらした（Ｚｏｖｅｉｎ，Ａ．Ｃ．他、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：６２５−６３６（２００８年））。ＨＳＣおよび決定赤血球骨髄前駆体（ＥＭＰ）は、複数の造血性ＥＣを含有する複数の部位から生じることが知られているが、一次造血性ＥＣの造血前駆体への自発的な個体発生の遷移を駆動する複数の分子プログラムを特性化することは困難であった（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４５７：８８７−８９１（２００９年）；Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．他、Ｃｅｌｌ  １３７：７３６−７４８（２００９年））。しかしながら、生後において、新規の造血は生じないことが、通常認められている。
【０００３】
哺乳類の成長の間、移行する複数のＥＣ／ＨＥＣは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋であることが示されてきたが、そのＣＤ１４４の発現（ＶＥ‐カドヘリンともまた称される）は、複数の胚のＨＥＣからの複数のＨＳＣの出現後に間もなく、下方制御された（Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．他，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：６６１−６７２（２００２年）。Ｋｉｍ他（Ｂｌｏｏｄ  １０６：９０３−９０５（２００５年））は、ＣＤ１４４発現が、胚生１３．５日目にマウスの胎児の肝臓ＨＳＣにおいて存在し、胚生１６．５日目に発現が低下し、成人するまでに、肝臓および骨髄におけるＨＳＣは消失しているとして、更に識別した。ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋へ移行する複数のＥＣ／ＨＥＣは、従って、胚において存在することだけが周知であり、出生後に存在することは示されていない。造血性内皮細胞は、出生後、生物の内部の任意の位置に存在するか、および生後の内皮は、新しいＨＳＣおよび／または多能な造血前駆体を生じさせることが可能であるかは、未知である。
【０００４】
生後の哺乳類において、造血の可能性を持つ複数の細胞の識別は、造血系の再生に関して新しい可能性を開く。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において開示されるのは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を生後の被験者から単離することによって、複数の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を単離する複数の方法である。そのようなＨＥＣは、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）への移植に続いて造血細胞を生成することが可能である。１つの実施形態において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞は、被験者の肝臓、脾臓、骨髄、血液、臍帯、皮膚、腎臓、筋肉、または肺、望ましくは、被験者の肝臓から単離される。ＨＥＣは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞の実質的に純粋な集団を形成するべく、単離され得る。
【０００６】
他の実施形態において、単離ステップは、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子科メンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子科メンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通の４ドメインの亜科Ａメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現に基づく複数の細胞の選択を、更に含む。
【０００７】
本開示は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣの実質的に純粋な集団を組み込む複数の組成物を、更に考慮する。１つの実施形態において、ＨＥＣは、組成物の投与が予期される被験者に対し、自己由来である。別の実施形態において、ＨＥＣは、組成物の投与が予期される被験者に対し、同種異系である。複数の更なる実施形態において、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣは、医薬的に受け入れられるキャリアと混合しているか、または適切な培養培地との混合、または耐凍剤と混合している。
【０００８】
本明細書において更に開示されているのは、免疫不全疾患のための治療の複数の方法であり、方法において、治療は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞の実質的に純粋な集団を、それらを必要としている被験者に投与することを含む。免疫不全疾患は、Ｔ細胞欠乏、Ｂ細胞欠乏、複合Ｔ細胞／Ｂ細胞欠乏、抗体欠乏、補体欠乏、白血病、リンパ腫、貧血症、好中球減少症、リンパ球減少、ループス、およびウィスコット・アルドリッチ症候群から選択され得る。免疫不全疾患は、免疫抑制もしくは細胞毒性薬の投与、またはヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくは肝臓炎から発生し得、または結果として生じ得る。
【０００９】
本明細書において更に開示されるのは、被験者においてＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋である複数の細胞を識別する段階を含む、生後の被験者において複数の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を識別する複数の方法である。複数のＨＥＣを識別する複数の方法は、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子科メンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子科メンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通の４ドメインの亜科Ａメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカを発現している複数の細胞を識別する段階を更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】生後の複数のマウスにおける内皮細胞の時間的に制限された遺伝的特性である。  図１のＡ．タモキシフェン誘導性ＣｒｅリコンビナーゼＣｒｅＥＲＴ２を、内皮特異的ＶＥ‐カドヘリン増進剤の制御下において持つ遺伝子組換えの複数のマウス（ＶＣＣ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）は、複数の誘導型ＶＣＣ‐ＥＧＦＰレポーターマウスを生成すべく、複数のＡＣＴＢ‐ｌｏｘｐ‐ｔｄＴｏｍａｔｏ‐ＳＴＯＰ‐ｌｏｘｐ‐ＥＧＦＰレポーターマウスと交配させられた（ｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰ）。  図１のＢ．生後の複数のマウスにおける内皮細胞の時間的に制限された遺伝的特性である。複数の血管ベッドを覆う複数の内皮細胞を発現させるＶＥ‐カドヘリンにおいて、タモキシフェン注射は、ＥＧＦＰ発現を誘導した。左側のパネルは、複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスの皮膚におけるｔｄＴｏｍａｔｏ（赤）の発現を示す。中央のパネルは、タモキシフェン誘導の後（生後３週間）に左側のパネルにおいて示されるような同じエリアについてのＥＧＦＰ発現（緑）を示す。右側のパネルは、左側および中央のパネルの重なりを示す。血管系だけがＥＧＦＰ発現を示している。
【００１１】
【図２】複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞が、肝臓、脾臓、肺および骨髄を含む組織において発見された。複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、生後４週間においてタモキシフェンで誘導された。  図２のＡ．誘導された複数のマウスから採取された、いくつかの臓器の解析は、肺、肝臓、脾臓、および骨髄において複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞の存在を明らかにした。  図２のＢ．複数の選別されたＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞の明るい視野の画像である。スケールバー、４００μｍ。  図２のＣ．複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞はまた、ＧＦＰ＋でもあることを示す、図２Ｂと同じ視野の緑色蛍光の画像である。  図２Ｂおよび図２Ｃにおいて見られるように、複数の選別された細胞は、正常な内皮細胞がおそらくするように、プレート表面に付着せず、正常な造血前駆体細胞がおそらくするように、造血サイトカインの存在において拡張しなかった。
【００１２】
【図３】複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞は、造血系の機能的再構成が可能である。ＳＳＣ、側方散乱光。ＦＳＣ、前方散乱光。ＢＭ、骨髄。ＰＢ、末梢血複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、出生の６週間後（成人のマウス）にタモキシフェンで誘導され、誘導後２週間の複数の実験において使用された。  図３のＡ．複数のマウスは、抗ＣＤ１４４＋抗体が注射され、注射後８分で犠牲にされた。肝臓は、消化され、ＣＤ３１およびＣＤ４５に対する複数の抗体でポスト染色された。複数のＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋ＣＤ４５＋細胞（複数の赤いエリア）は、ＦＡＣＳを用いて選別され、免疫欠陥を持つ亜致死の照射を受けた複数のマウス（ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ‐ＩＬ２ｇ（「ＮＳＧ」）マウス）へと移植された。  図３のＢ．移植後１２週間で、複数のマウスは、それらの末梢血において提供者細胞が存在するかに対し試験が行われた。それらの末梢血のかなりの大部分（＞３５％）は、複数の提供者ＧＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞（複数の緑のエリア）で組成されていた（複数のＮＳＧマウスは、ＣＤ４５．１表面タンパク質を発現させる）。  図３のＣ．複数のＧＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞は、複数の一次レシピエントの骨髄から単離され、亜致死性の照射（６５０ＲＡＤ）を受けた複数のＣＤ４５．１発現マウス（非ＮＳＧ）への二次移植のために使用された。  移植後１９週間で、複数のＣＤ４５．２＋ＧＦＰ＋細胞（複数の緑のエリア）は、複数の二次レシピエントの末梢血において検出された。これらの実験は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞が造血性（ＨＥＣ）であり、インビボで移植される場合、造血系の再構成が可能であることを証明する。
【００１３】
【図４】全トランスクリプトームディープシークエンシングは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞の造血のシグネチャを明らかにする。  図４のＡ．複数の６週間経過した（成人の）ｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、タモキシフェンで誘導され、誘導の２週間後に抗ＣＤ１４４＋抗体が注射された。肝臓は消化され、複数の抗ＣＤ４５抗体でポスト染色された。ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋（左側のプロットにおける赤いゲート）およびＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５−（左側のプロットにおける青いゲート）の内皮細胞は、ＦＡＣＳ（中央のプロットにおける緑のゲート）を用いて選別された。複数の選別された細胞は、合計のＲＮＡ抽出のために使用された。ＲＮＡは、全トランスクリプトーム大量シークエンシング（ＲＮＡ‐ＳＥＱ）のために使用された。  図４のＢ．ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５−内皮細胞の複数の全トランスクリプトームシーケンスの比較は、複数のＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋内皮細胞において上方制御された（ｌｏｇ２［ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋／ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５−］＞３）複数の遺伝子（赤い点）のクラスタを明らかにした。  図４のＣ．複数の上方制御された遺伝子の解析（最小発現、青；最大発現、赤）は、複数の追加の生後のＨＥＣ表面マーカを表す細胞表面に発現するタンパク質の一組（複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞において最大発現を示し、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５−細胞において最小発現を示す）を明らかにした。  図４のＤ．複数の追加の生後のＨＥＣ表面マーカの解析は、これらのマーカが、通常、特に大動脈‐生殖腺‐中腎（ＡＧＭ）等、決定的な造血に関連していると知られている複数のエリア（最大／赤い発現パターンを示している）における成長の間に、出現している複数の造血細胞／造血性内皮細胞において上方制御されることを明らかにした。
【００１４】
【図５】複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞が、ヒトの肝臓の試料から発見され、単離される。ヒトの肝臓の生検が、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＣＤ４５−細胞の存在について解析された。複数のＣＤＤ１４４＋細胞の大部分は、また、複数のマウスの肝臓に類似するＣＤ４５＋でもあった。左側のグラフにおける赤いゲートは、右側のグラフにおける赤い輪郭プロットに対応する。左側のグラフの青いゲートは、右側のグラフの青いプロットに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、複数の造血細胞を生じさせ得る複数の生後の哺乳類における、複数の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の以前に未知であった保有宿主と、複数のＨＥＣを複数の他の細胞型から分離することを可能にする複数の表面マーカとを提供する。複数のＨＥＣは、いくつかの臓器の複数の内皮細胞層において見られ、複数の造血障害の治療のための免疫システムを再構成する能力を有する。造血性内皮細胞
【００１６】
「造血性内皮細胞」（ＨＥＣ）は、複数の造血幹細胞を含む、複数の造血細胞を生成する容量を有する内皮細胞である。ＨＥＣは、本明細書において開示されるように、免疫障害を持つ被験者等のレシピエントへの移植後に、複数の造血細胞の長期の再増殖を付け足して（レジデンシーを確立し）、提供する能力を有する。開示される複数のＨＥＣは、また、１つのレシピエントから１または複数の更なるレシピエントへと続く生着が可能であり、従って、免疫システムを再生する能力を保持する。長期の生着（例えば、移植後４週間、８週間、１２週間、１６週間、あるいは２０週間、またはより長期）および二次生着のための能力は、造血障害の治療のための細胞集団において、非常に望ましい。
【００１７】
本明細書において開示される複数のＨＥＣは、マーカＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ、レセプタータイプＣまたは白血球共通抗原／ＬＣＡとしてもまた知られる分化４５のクラスタ）およびＣＤ１４４（血管内皮カドヘリンまたはＶＥ‐カドヘリンとしてもまた知られる分化１４４のクラスタ）の発現によって定義され得る。ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋発現は、複数のＨＥＣを定義し、複数のマーカのこの組み合わせは、生後の被験者のいずれの細胞型においても以前、識別されていない。
【００１８】
複数のＨＥＣは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋に加えて、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通の４ドメインのサブファミリーＡ、メンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される、１または複数の追加のマーカの発現によって更に任意に定義され得る。望ましくは、複数の細胞は、これらの追加のマーカのうち１または複数の陽性の発現を示す。ＨＥＣは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋発現に加えて、これらの追加のマーカのうち１、２、３、４、５、６、７、８、または全ての発現によって定義され得る。１つの実施形態において、ＨＥＣは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋ＳＬＡＭＦ９＋ＣＸＣＲ１＋細胞として定義される。
【００１９】
ＨＥＣは、例えばＥＣマーカＣＤ１４４の発現および任意に、ＥＣマーカＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子‐１またはＰＥＣＡＭ−１としてもまた知られる）の発現等、内皮細胞（ＥＣ）の幾つかの特性を有する。ＨＥＣは、また、ＥＣに隣接する複数の臓器および組織における複数の正常な内皮細胞層において発見され得る。しかしながら、培養においてゼラチン被覆のまたは他の被覆表面に付着する正常なＥＣとは異なり、ＨＥＣは、培養において、ゼラチン被覆表面等、被覆された表面には付着しない。
【００２０】
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、造血細胞（ＨＣ）を生成し得る細胞である。ＨＳＣは、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５＋（ヒトのＨＳＣ）およびＬｉｎ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａｌ＋Ｆｌｋ２−ＣＤ３４−Ｓｌａｍｆ１＋（マウスのＨＳＣ）の発現によって定義され得る。
【００２１】
「造血細胞」は、赤血球、単球、マクロファージ、巨核球、骨髄芽球、樹状細胞、および顆粒球（好塩基球、好中球、好酸球、およびマスト細胞）を含む骨髄系細胞、およびＴリンパ球／Ｔ細胞、Ｂリンパ球／Ｂ細胞を含むリンパ球系細胞、およびナチュラルキラー細胞を包含する。本明細書において開示されるＨＥＣは、骨髄系細胞およびリンパ球系細胞を含むＨＳＣおよびＨＣを生成する能力を有する。
【００２２】
ＨＥＣは、ＨＳＣの幾つかの特性を有し、例えば、ＨＥＣは、新しいＨＣを生成し得る。しかしながら、ＨＣおよびＨＳＣとは異なり、ＨＥＣは、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、ＦＬＴ３Ｌ（Ｆｌｔ−３リガンド）、およびＩＬ−３（インターロイキン３）等の、造血サイトカインの複数の標準的な濃度を用いて複数のＨＳＣを培養するための複数の典型的な条件下において、拡大することは見られていない。複数のＨＥＣを識別すること
【００２３】
被験者において複数の生後造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を識別する複数の方法が、本明細書において開示される。複数の方法は、生後の被験者において複数のＣＤＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を識別する段階を伴う。複数の方法は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋であり、また、１または複数の追加のマーカの発現、特に、ＣＤ１８０、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ９、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１７４、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ９、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＸ、およびＭＳ４Ａ６Ｄから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くのマーカの発現を示す複数の細胞を識別する段階を、更に伴ってよい。識別は、例えば、蛍光または磁気剤、放射性同位体、または他の適切な造影剤等、造影部分に共役である、複数の細胞表面マーカに結合するそれらの複数の抗体または複数の抗原結合性フラグメントを用い、インビトロまたはインビボであってよい。
【００２４】
１つの実施形態において、特異的に結合され、標識された抗体は、インビボの画像検査法を用いて個体において検出され得、その画像検査法は、放射性核種イメージング、陽電子放出トモグラフィ、コンピュータ制御の軸方向トモグラフィ、光線または磁気共鳴画像検査法、蛍光検出、および化学発光検出を含むがこれらに限定されない。複数のＨＥＣの単離
【００２５】
本明細書において開示されるのは、複数の生後のＨＥＣを単離する複数の方法である。複数の方法は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を、生後の被験者の少なくとも一の組織から単離する段階を伴う。複数の方法は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋であって、また、１または複数の追加のマーカの発現、特に、ＣＤ１８０、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ９、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１７４、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ９、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＸ、およびＭＳ４Ａ６Ｄから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くのマーカの発現を示す複数の細胞を単離する段階を、更に伴ってよい。
【００２６】
「単離された」および「純化された」という用語は、実質的にまたは根本的にその自然な環境から除去される、またはそこで濃縮される物質を指すべく、本明細書においては区別なく使用される。例えば、細胞は、それが、他の複数の内在性細胞型、複数の組織、および細胞が被験者の近くに普通に見られる複数の物質から実質的に除去される場合に、単離される。複数の細胞表面マーカの発現に従って複数の細胞型を純化し単離する複数の方法は、文書化された複数の手法である。「実質的に単離された」細胞または細胞集団は、複数の他の細胞型、複数の組織、または被験者の組織において見られる複数の物質から少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％、またはそれより多くが単離される細胞または細胞集団である。また、細胞または細胞集団は、細胞試料における複数の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％、またはそれより多くが、対象の複数の細胞表面マーカを発現させる場合、「実質的に純化」されている。
【００２７】
ＨＥＣは、体全体にわたって、肝臓、脾臓、骨髄、血液、臍帯、皮膚、腎臓、筋肉、または肺を含むがこれらに限定されない複数の組織および複数の臓器から単離され得る。望ましくは、複数の組織は、肝臓、血液、臍帯、および皮膚を含む。１つの実施形態において、ＨＥＣは、組織または臓器の生検によって得られた生物学的試料から単離される。別の実施形態において、ＨＥＣは、血液または血漿試料から単離される。自己由来のＨＥＣは、ＨＥＣが投与されるべきである同じ被験者から単離される。同種異系ＨＥＣは、ＨＥＣが投与されるべきである被験者と同じ種の少なくとも１つの個体から単離される。異種ＨＥＣは、ＨＥＣが投与されるべきである被験者とは異なる種の少なくとも１つの個体から単離される。非自己ＨＥＣ（つまり、同種異系または異種ＨＥＣ）は、出生前、生後、または死後の複数の組織または複数の臓器から生じ得る。望ましいＨＥＣは、自己由来である。望ましくは、非自己ＨＥＣは、同種異系または出生後のＨＥＣである。最も望ましいＨＥＣは、自己由来であり、生後のものである。
【００２８】
第１ステップとして、ＨＥＣは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋発現に従って、上記で開示されたように、任意に１または複数の追加のマーカとの組み合わせにおいて、組織、臓器、または生物学的試料から単離される。複数の細胞表面マーカの発現に従って、複数の細胞を単離または分離する複数の方法は：例えばＣＤ１４４およびＣＤ４５に向けられる複数の抗体またはそれらの複数の断片の使用、および任意に、複数の追加のマーカに向けられる追加の複数の抗体またはそれらの複数の断片を用いることによって蛍光活性細胞選別を行う段階、例えば抗体で被覆された複数の磁気ビーズを用いる磁選段階、複数の抗体またはそれらの複数の断片を用いる親和性クロマトグラフィー段階、例えばプレートまたは他の固体母材等、固体母材に付着された複数の抗体またはそれらの複数の断片で「パニング」する段階、または、細胞表面マーカ発現に基づいて複数の細胞の分離のための技術分野において周知であり使用されている他の複数の技術を含む。複数の望ましい実施形態において、蛍光活性細胞選別または磁選は、非ＨＥＣからＨＥＣを単離するために使用される。
【００２９】
ＨＥＣの単離は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞の実質的に純粋な集団を生成する。本明細書において定義されるように、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞の「実質的に純粋な集団」は、単離／分離ステップの後は、複数の細胞の５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９８％より多く、９９％より多くが、またはさらに１００％が、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋であることを意味する。複数のＨＥＣの培養、維持、および凍結保存 
【００３０】
単離の後、複数のＨＥＣは、ＲＰＭＩ１６４０、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（これらのそれぞれ、および例えばＧｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを通して入手可能な複数の類似の培地）等、標準的なヒト／哺乳類の複数の細胞培養培地を用いて、最大１週間、培養において維持され得、胎児のウシ胎児（ｂｏｖｉｎｅ／ｃａｌｆ）血清（ＦＢＳまたはＦＣＳ）等の、５−３０％、望ましくは１０−２５％、最も望ましくは、２０％等の血清、および２−２００μｇ／ｍＬで内皮細胞成長補助剤（ＥＣＧＳ）等の内皮細胞のための１または複数の成長補助剤で補充され得る。望ましい実施形態において、複数のＨＥＣは、２０％ＦＣＳおよびＥＣＧＳを用いて２−２００μｇ／ｍｌで、１日から７日間、望ましくは、４時間から７２時間まで、または１、２、３、もしくは４日間、複数のＲＰＭＩ１６４０培地において維持され、次に、本明細書で開示された複数の凍結保存方法を用い、必要とされるまで保存用に凍結される。
【００３１】
複数のＨＥＣの培養は、これらの細胞が、複数の内皮または造血細胞を培養するための複数の標準的な方法を用いて、それほどまたは全く生き残って増殖しないことから、特定の複数の条件を必要とする。複数の望ましい培養条件は、骨髄基質または胎児／胚臓器特定の（肝臓）繊維芽細胞等、複数の支持細胞の層において複数のＨＥＣを培養することを含み得る。
【００３２】
複数の単離されたＨＥＣは、細胞凍結保存についての当該技術分野において周知の複数の技術を用いて凍結保存され得る。複数のＨＥＣは、単離の後に直接、または上記に記載されたように培養条件における維持の後、または培養における増殖の後の何れかにおいて、保存のために凍結され得る。それに応じて、１つの実施形態において、複数のＨＥＣは、被験者が免疫不全疾患のための治療を必要であると判断されるような時間まで、被験者から除去されて凍結され得、その時点で、複数のＨＥＣは、解凍され、被験者に移植（自己移植のために）されて戻され得るか、または解凍され、（非自己移植のための）治療が必要な異なる被験者に移植され得る。
【００３３】
複数の単離されたＨＥＣは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルポロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ‐エリトリトール、Ｄ‐リビトール、Ｄ‐マンニトール、Ｄ‐ソルビトール、ｉ‐イノシトール、Ｄ‐ラクトース、コリン、塩化物、アミノ酸類、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、および無機塩類等の耐凍剤のうち１つまたは組み合わせを添加することによって、極低温保存のために用意され得る。血漿または血清の添加（例えば、２０−２５％の濃度まで）は、ＤＭＳＯの保護効果を増大させ得る。ＨＥＣは、上記で開示されたように、例えば、６０−４０％増殖培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６５０ＭＥＭまたはＤＭＥＭ）において、４０−６０％血清および５−２０％ＤＭＳＯと共に凍結され得る。１つの実施形態において、ＨＥＣは、１０％ＤＭＳＯと共に５０％増殖培地、５０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で、凍結される。
【００３４】
複数の耐凍剤で混合された、単離された複数のＨＥＣは、極低温保存のために、制御された速度で冷却されるべきである。複数の異なる耐凍剤および異なる細胞型は、異なる最適な冷却速度を有する。複数のＨＳＣ源の操作、凍結保存および長期保存についての考慮および手順は、当該技術分野では周知である。複数の凍結細胞源の解凍および再構成においての考慮もまた、当該技術分野では周知である。単離され純化されたＨＥＣの集団およびそれらの組成物
【００３５】
ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋生後造血性内皮細胞の実質的に純粋な集団が、主題の開示によって更に包含され、単離／分離ステップの後の細胞の８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９１％より多く、９２％より多く、９３％より多く、９４％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、９９％より多く、９９．５％より多くが、またはさらに１００％が、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋である。
【００３６】
ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣの実質的に純粋な集団を含む複数の組成物も、また熟慮される。１つの実施形態において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣの実質的に純粋な集団は、上記で開示されたもの等、少なくとも１つの耐凍剤と共に組成物に含まれている。この組成物における複数の細胞は、凍結または未凍結状態にあり得る。別の実施形態において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋生後のＨＥＣの実質的に純粋な集団は、インビトロにおいての複数のＨＥＣの維持について開示された培養培地等の適切な培養培地と共に組成物に含まれる。別の実施形態において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋生後のＨＥＣの実質的に純粋な集団は、被験者への投与に適切な医薬的に受け入れられるキャリアと共に組成物において含まれる。 
【００３７】
本明細書において使用されるように、「医薬的に受け入れられる」という文言は、複数のキャリアまたは媒剤が、哺乳類に投与される場合、不利な反応を生じさせないことを意味する。そのようなキャリアは、非毒性であり、体において炎症またはアネルギー反応は生成しない。本発明を実施するために医薬的に受け入れられるキャリアは、例えば培養培地およびリン酸緩衝食塩水等、周知の複数の成分を含む。更なる医薬的に受け入れられる複数のキャリアおよびそれらの配合組成は周知であって、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１８版、ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ出版社，Ｅａｓｔｏｎ，ペンシルヴァニア，１９９０年）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓのハンドブック（第４版、Ｅｄ．Ｒｏｗｅ他，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．）において概して記載されており、それらの各々は、参照することにより組み込まれる。
【００３８】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞の複数の組成物の複数の例は、無菌性懸濁剤またはエマルション等、非経口の、皮下の、皮内の、筋肉内の、または経静脈の投与（例えば、注射可能な投与）のための複数の液状製剤を含む。そのような組成物は、適切なキャリア、希釈剤、または滅菌水、生理的食塩水、ブドウ糖または同類のもの等の賦形剤と混合していてよい。組成物は、また、凍結乾燥され得る。組成物は、投与のルートおよび所望される製剤に応じて、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度向上添加剤、防腐剤、調味料、色彩および同様のもの等の補助的物質を含有し得る。
【００３９】
複数の単離されたＨＥＣを含む、単位投与剤型の充填済み注射バイアル、アンプルまたは輸液バッグが、また提供される。注射バイアル、アンプルまたは輸液バッグは、１×１０４から１×１０１０のＨＥＣ、１×１０５から１×１０９のＨＥＣ、または１×１０６から１×１０８のＨＥＣを含み得る。
【００４０】
本発明の複数の組成物は、投与製剤と適合している様式で、治療上有効量で投与される。投与されるべき量は、例えば、治療されるべき被験者および衰弱、被験者の臓器の容量、治療用組成物を適合する細胞および免疫システム、および細胞または組織療法の性質等に依存する。投与が要求される治療用組成物の正確な量は、実行者の判断に依存し、各個人に特有である。しかしながら、本発明の治療用組成物の適切な投与量は、投与のルートに応じ、投与量当たり約１×１０４から１×１０１０のＨＥＣ、または投与量当たり約１×１０５から１×１０９のＨＥＣ、または投与量当たり約１×１０６から１×１０８のＨＥＣの範囲に及んでよい。最初の投与および後に続く投与についての適切な型もまた変化可能であるが、最初の投与の後に続き、１またはそれより長い時間もしくは日の間隔で、それに続く注射または他の投与による複数の繰り返し投与を含み得る。治療の複数の方法
【００４１】
本明細書において、免疫不全疾患のための治療の複数の方法が更に提供され、当該方法は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋のＨＥＣの実質的に純粋な集団を持つ組成物を、それらを必要としている被験者に投与する段階を含む。本発明のＨＥＣは、放射治療および化学療法等であるがそれに限らない複数の療法に続いて、免疫障害を持つ被験者における全ての造血細胞を再構成するために使用され得る。開示されるＨＥＣの投与は、被験者への点滴または移植等によって、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、または脾臓の幹または前駆細胞を増大させ、または置き換え得る。複数の提供者細胞の免疫学的拒否反応を低減すべく、受給者を治療することが必要であってよいことは理解される。
【００４２】
開示される複数の方法によって治療が可能な望ましい複数の条件は、免疫細胞の不適切な量または動作によって特徴づけられる免疫不全疾患を含む。免疫不全疾患は、一次または続発性であってよい。１つの実施形態において、免疫不全疾患は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または、重度の複合の免疫不全（ＳＣＩＤ）等の複合のＴ細胞／Ｂ細胞免疫不全、無ガンマグロブリン血症等の抗体欠乏、ループス等の補体欠乏、白血病、リンパ腫、重度の再生不良性貧血等の貧血、好中球減少症、リンパ球減少症、またはウィスコット・アルドリッチ症候群等の免疫不全に関連する任意の条件から選択される一次免疫不全疾患である。別の実施形態において、免疫不全疾患は、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝臓炎を含む感染性疾患に関連する続発性免疫不全疾患である。別の実施形態において、免疫不全疾患は、フルオロウラシル、ビンクリスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、メトトレキサート、３′‐アジド‐３′‐デオキシチミジン、パクリタキセル、ドセタキセル、アントラサイクリン系抗生物質、または二次免疫抑制効果を有するそれらの混合物等の免疫抑制剤の投与に関連する続発性免疫不全疾患である。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「被験者」および「患者」という用語は、区別なく使用され、非霊長類（例えば、牛、豚、馬、猫、犬、ネズミ等）および霊長類（例えば、サルおよびヒト）等の哺乳類を含む動物を指す。複数の特定の実施形態において、被験者は、生後のものである。つまり、被験者は、例えば、新生の動物、若い動物、青年期の動物、成人の動物、または高齢の動物である。
【００４４】
本明細書において使用されるように、「治療」は、個人または治療されている細胞の疾患過程の変更を試みた臨床的介入を指す。治療の治療効果は、疾患の再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の軽減、疾患進行の速度の低減、疾患状態の改良および改善、および鎮静または向上した予後診断を限定なく含む。本明細書において使用されるように、「治療上の有効量」および「有効量」という用語は、区別なく使用され、免疫学的条件を治療するのに十分な、本発明の組成物の量を指す。
【００４５】
本明細書において提供されるＨＥＣを患者に投与することに関し、細胞の有効量は、数百個ほどの少ない量またはそれよりも少ない量から、数百万個またはそれより多くの量までの範囲に及んでよい。投与されるべきＨＥＣの数は、医療専門家に良く知られている他の複数の因子のうち、治療されるべき大きさまたは合計の量、並びにレシピエントのニーズおよび条件を含むが限定されない、治療されるべき疾患の詳細に応じて変わるであろうことは理解されるであろう。幾つかの実施形態において、１００ｋｇの人間毎に１０４から１０１０個の間の細胞が、被験者または個人の中へ投与されまたは移植される。本明細書において提供されるＨＥＣは、当該技術分野において周知の複数の方法を用い、例えば、経静脈点滴または直接的なグラフトによって、投与または移植され得る。
【００４６】
１つの実施形態において、ＨＥＣは、骨髄移植において複数の骨髄細胞を増大させるか、または置き換えるために使用される。ヒトの自己由来および同種異系の骨髄移植は、現在、白血病およびリンパ腫等の疾患のための複数の治療法として使用されている。しかしながら、これらの処置の欠点は、大量の提供者骨髄が、生着のために十分な細胞があることを保証するべく除去されなければいけないことである。本発明は、骨髄提供をレシピエントへの移植用の複数のＨＥＣで置換するかまたは補足することによって、大きい骨髄提供に対する必要性を低減する。複数のＨＥＣは、被験者にとって自己由来であり得、または被験者にとって同種異系であり得、あるいは被験者にとって異種であり得る。
【００４７】
別の実施形態において、複数のＨＥＣは、点滴によって血流へと投与される。
【００４８】
別の実施形態において、複数のＨＥＣは、肝臓、脾臓、腎臓、肺、目、中央神経系、筋肉、皮膚、骨、卵巣、精巣、心臓、血管、腸、またはリンパ節等の臓器への移植によって投与される。
【００４９】
幾つかの実施形態において、複数の細胞の単独の投与が提供される。複数の他の実施形態においては、複数の投与が使用される。複数の投与は、連続３日から７日の初期治療計画等、定期的な期間を通して提供され得、次に他の期間に繰り返され得る。
【００５０】
同時投与、つまり、被験者の免疫システムまたは免疫反応を激減させ得る治療の投与の前、後、またはそれと同時に、本発明の組成物の投与を含む複数の方法が、更に熟慮される。そのような複数の方法は、癌治療および免疫抑制剤を用いる治療を含む治療の前、その間および／またはその後に、ＨＥＣを用いる組成物を被験者に投与する段階を伴う。「癌治療」という用語は、複数の放射性同位体および細胞毒性薬を含む任意の抗癌剤の投与を含む。細胞毒性薬の複数の例は、メイタンシノイド、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ‐チェーン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タクソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡチェーン、モデシンＡチェーン、アルファサルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアミシン、サポナリア・オフィシナリス阻害剤、およびグルココルチコイドおよび複数の他の化学療法剤を含むが、それらに限定されない。免疫抑制剤の複数の例は、シクロスポリン、ＧＡＤ６５抗体、フルオロウラシル、シスプラチン、オキサリプラチン、メトトレキサート、３′‐アジド３′‐デオキシチミジン、パクリタキセル、ドセタキセル、アントラサイクリン系抗生物質、または二次免疫抑制効果を有するそれらの混合物を含む。本明細書において明示されるようないくつかの細胞毒性薬は、また、免疫抑制剤である。
【００５１】
本開示は、以下の複数の非限定的な例によって更に例示される。例  例１  ＣＤ１４４増進剤の制御下における、Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導性発現を用いる複数のマウスの生成内皮特異的ＶＥ‐カドヘリン増進剤の制御下における、タモキシフェン誘導性ＣｒｅリコンビナーゼＣｒｅＥＲＴ２を持つ複数の遺伝子導入のマウス（ＶＣＣ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）（Ｐｉｔｕｌｅｓｃｕ  Ｍ．他，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５：１５１８−１５３４（２０１０年））は、複数のＡＣＴＢ‐ｌｏｘｐ‐ｔｄＴｏｍａｔｏ‐ＳＴＯＰ‐ｌｏｘｐ‐ＥＧＦＰレポーターマウスと交配した（Ｍａｚｕｍｄａｒ  Ｍ．他，Ｇｅｎｅｓｉｓ４５：５９３−６０５（２００７年））（図１のＡ）。ＡＣＴＢ‐ｌｏｘｐ‐ｔｄＴｏｍａｔｏ‐ＳＴＯＰ‐ｌｏｘｐ‐ＥＧＦＰレポーターは、膜標的タンデムダイマーＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴｏｍａｔｏ）の、ｌｏｘＰで挟み込んだコード配列をドライブする、ＣＭＶエンハンサー（ｐＣＡ）を持ったニワトリβアクチンコアプロモーターで構成され、膜局在型ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク質）発現をもたらす。交配からの子孫（複数の誘導性ＶＣＣ‐ＥＧＦＰレポーターマウスまたは「ｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウス」）において、タモキシフェンの注射は、ＶＥ‐カドヘリン／ＣＤ１４４発現が活性化された複数の細胞において、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を誘導する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、染色体内の組み換えを仲介し、複数のＣＤ１４４発現細胞において、複数のｌｏｘＰ部位におけるｔｄＴｏｍａｔｏの切除（および赤色蛍光の損失）の原因となる。ｔｄＴｏｍａｔｏの切除は、ｐＣＡ増進剤が、膜を標的とした増強された緑色蛍光タンパク質の発現を駆動することを可能にし、従って、緑色蛍光によるタモキシフェン誘導の後にＣＤ１４４発現が始まる複数の細胞を識別する。これは、時間的に制限された形式において、複数の内皮細胞の追跡を可能にした。
【００５２】
複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、生後４週間（マウスは、３週間の離乳時期で成人のマウスであると考えられている）で、タモキシフェンで誘導された。図１のＢにおいて見られるように、タモキシフェン注射は、複数のＶＥ‐カドヘリン発現細胞において、ＥＧＦＰ発現を誘導した。図１のＢの左側のパネルは、複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスの皮膚におけるｔｄＴｏｍａｔｏの発現（赤色）を示す。中央のパネルは、タモキシフェン誘導の後に、左側のパネルにおいて示されるような同じエリアについてのＥＧＦＰ発現（緑色）を示す。右側のパネルは、左側および中央のパネルの重複を示す。血管系だけが、ＥＧＦＰ発現を示している。
【００５３】
例２  複数の生後ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞は、肝臓、脾臓、肺および骨髄から単離される。生後４週間においてタモキシフェンで誘導された複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスから採取されたいくつかの臓器の解析は、肺、肝臓、脾臓、および骨髄においてＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞の存在を明らかにした（図２のＡ）。
【００５４】
複数のＣＤ１４４＋（ＧＦＰ＋）ＣＤ４５＋細胞は、複数の標準的な技術を用いて選別され、２０％ＦＣＳが補足され、内皮細胞成長補助剤（ＥＣＧＳ）が２−２００μｇ／ｍｌで補足され、造血細胞の膨張のために使用されるサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６、およびＩＬ３）が補足された複数のＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、複数のゼラチンで包んだ組織培養プレートにおいてインビトロの培養のために蒔かれた（図２のＢ）。複数の選別された細胞は、正常な内皮細胞がおそらくするように、ゼラチンで包んだ組織培養表面に付着しなかった。複数の選別された細胞は、また、正常な造血前駆体がおそらくするように、造血サイトカインの存在に反応または拡大しなかった。これは、複数の単離された細胞は本来の内皮細胞ではなく、標準的な造血細胞でもないことを示唆した。
【００５５】
例３  複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞は、造血系の機能的再構成が可能である。複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、出生６週間後（成人のマウス）において、タモキシフェンで誘導され、誘導の２週間後に、複数の実験に使用された。複数の（動脈の、静脈の、および毛細管の）ＣＤ１４４＋内皮細胞をラベル付けするべく、複数のマウスは、抗ＣＤ１４４＋抗体を眼窩周囲に注射された。注射された複数のマウスは、リンパ管床のラベリングの余地を与えないことを目的として、注射の８分後に犠牲死された。これは、ＣＤ１４４＋内皮細胞の二重のラベル付けを、遺伝的に（ＶＥ‐カドヘリンプロモーターでドライブされるＣＲＥリコンビナーゼの発現を、タモキシフェンで誘導することによって）および複数の抗ＣＤ１４４＋抗体を用いたＣＤ１４４＋内皮細胞の生体内染色によって、可能にした。肝臓は、Ｎｏｌａｎ  Ｄ．Ｊ．他，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ２６：２０４−２１９（２０１３年）において記載されるように、消化された。手短に言えば、肝臓は、単独の細胞懸濁液を生成するべく、コラゲナーゼＡ（２５ｍｇ／ｍｌ）、ディスパーゼＩＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）、およびＤＮａｓｅ（２５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）を用い、３７℃で２０−３０分間インキュベートされた。消化の後、複数の細胞は、抗ＣＤ４５抗体、および付加的な内皮特異的表面マーカであるＣＤ３１に対する抗体でポスト染色された。
【００５６】
複数のＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋ＣＤ４５＋細胞は、ＦＡＣＳを用いて選別され、免疫無防備状態の亜致死の照射をされた複数のマウス（ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ‐ＩＬ２ｇまたは「ＮＳＧ」マウス）に移植された（図３のＡ）。移植から１２週間後、移植された複数のマウスは、それらの末梢血における提供者細胞の存在に関し試験が行われた。それらの末梢血の大部分（＞３５％）は、複数の提供者ＧＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞で構成された（ＮＳＧマウスは、ＣＤ４５．１表面タンパク質を発現する）（図３のＢ）。複数のＧＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞は、複数の一次レシピエントの骨髄から単離され、亜致死の照射がされた（６５０ＲＡＤ）ＣＤ４５．１を発現する複数のマウス（非ＮＳＧ）への二次移植のために使用された。移植後１９週間のＣＤ４５．２＋ＧＦＰ＋細胞は、複数の二次レシピエントの末梢血において検出された。これらの実験は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋内皮細胞が造血性であり（ＨＥＣ）、インビボで移植される場合、造血系の再構成が可能であることを証明する（図３のＣ）。
【００５７】
例４  複数のＨＥＣを区別する複数の追加のマーカの識別肝臓を含むがそれに限定されない複数の提供者組織から、複数のＨＥＣを更に描写し得る複数の追加の表面マーカを識別するべく、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋肝臓細胞の全トランスクリプトームプロファイルが、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５‐肝臓細胞と比較された。複数のｉＶＣＣ‐ＥＧＦＰマウスは、出生の６週間後（成人のマウス）にタモキシフェンで誘導され、誘導の２週間後に複数の実験に使用された。複数のＣＤ１４４＋内皮細胞をラベル付けするべく、複数のマウスは、複数の抗ＣＤ１４４＋抗体が眼窩周囲に注射され、注射の８分後に犠牲にされた。肝臓は、上記に記載されたように消化され、複数の抗ＣＤ４５抗体でポスト染色された。ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５‐内皮細胞は、ＦＡＣＳを用いて選別された。複数の選別された細胞は、合計のＲＮＡ抽出のあめに使用された。ＲＮＡは、全トランスクリプトーム大量シークエンシング（ＲＮＡ‐ＳＥＱ）のために使用された（図４のＡ）。
【００５８】
ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５‐内皮細胞の全トランスクリプトームシーケンスの比較は、遺伝子の分離したクラスタ（図４のＢにおける複数の赤い点）は、ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋内皮細胞において過剰発現（ｌｏｇ２［ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋／ＣＤ１４４＋ＧＦＰ＋ＣＤ４５‐］＞３）したことを明らかにした。複数の過剰発現した遺伝子の解析（図４のＢ）は、一式の追加の細胞表面が、複数の生後のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋のＨＥＣを更に定義するために任意に使用され得るタンパク質を発現させることを明らかにした（図４のＣ）。
【００５９】
複数の新規の生後のＨＥＣ表面マーカの解析は、これらのマーカが通常、決定的な造血に関連していると知られる複数のエリア、具体的には胎盤、大動脈‐生殖腺‐中腎（ＡＧＭ）、および胎児の肝臓における発達の間、複数の出現する造血細胞／造血性内皮細胞において過剰発現したことを明らかにした（ＭｃＫｉｎｎｅｙ−Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｓ．他，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１：７０１−１４（２０１２年））（図４のＤ）。
【００６０】
例５複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞のヒトの肝臓からの単離。複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋のＨＥＣの存在は、成人のヒトの肝臓において調査された。３人の身元が明らかにされていない成人した個人から得たヒト肝臓組織の試料は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＣＤ４５‐細胞の存在について解析された。驚くべきことに、複数のＣＤＤ１４４＋肝臓細胞の大部分は、また、複数のマウスの肝臓に類似したＣＤ４５＋であった（図５）。これは、複数のＨＥＣを、成人したヒトにおいて存在するとして識別する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月24日(2016.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を、生後の被験者から単離する段階を備える、複数の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を単離する方法。
【請求項２】
複数の前記ＨＥＣは、レシピエントへの移植の後に、複数の造血細胞を生成することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞は、前記被験者の肝臓、脾臓、骨髄、血液、臍帯、皮膚、腎臓、筋肉、または肺から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の前記細胞は、前記被験者の前記肝臓から単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
単離された複数の前記ＨＥＣは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の細胞の実質的に純粋な集団において備えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離する段階は、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現に基づく複数の細胞を選択する段階を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の実質的に純粋な集団を備える、組成物。
【請求項８】
複数の前記ＨＥＣは、前記組成物の投与が予期される被験者に対して自己由来である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
複数の前記ＨＥＣは、前記組成物の投与が熟考される被験者に対して同種異系である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、医薬的に受け入れられるキャリアと混合して備える、請求項７から９のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、培養培地と混合して備える、請求項７から９のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、耐凍剤と混合して備える、請求項７から９および１１のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞の実質的に純粋な集団を、それらを必要とする被験者に投与する段階を備える、免疫不全疾患のための治療の方法において使用するための、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の実質的に純粋な集団を備える、組成物。
【請求項１４】
前記免疫不全疾患は、Ｔ細胞不全、Ｂ細胞不全、複合Ｔ細胞／Ｂ細胞不全、抗体不全、補体不全、白血病、リンパ腫、貧血症、好中球減少症、リンパ球減少、ループス、およびウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫不全疾患は、免疫抑制または細胞毒性薬の投与の結果としてもたらされる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫不全疾患は、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝臓炎の結果としてもたらされる、請求項１３から１５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
生後の被験者において複数の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を識別する方法であって、前記被験者において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋である複数の細胞を識別する段階を備える、方法。
【請求項１８】
ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現を識別する段階を更に備える、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
例５  複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞のヒトの肝臓からの単離。複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋のＨＥＣの存在は、成人のヒトの肝臓において調査された。３人の身元が明らかにされていない成人した個人から得たヒト肝臓組織の試料は、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋およびＣＤ１４４＋ＣＤ４５‐細胞の存在について解析された。驚くべきことに、複数のＣＤＤ１４４＋肝臓細胞の大部分は、また、複数のマウスの肝臓に類似したＣＤ４５＋であった（図５）。これは、複数のＨＥＣを、成人したヒトにおいて存在するとして識別する。
［項目１］
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞を、生後の被験者から単離する段階を備える、複数の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を単離する方法。
［項目２］
複数の上記ＨＥＣは、レシピエントへの移植の後に、複数の造血細胞を生成することが可能である、項目１に記載の方法。
［項目３］
上記複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋細胞は、上記被験者の肝臓、脾臓、骨髄、血液、臍帯、皮膚、腎臓、筋肉、または肺から単離される、項目１に記載の方法。
［項目４］
複数の上記細胞は、上記被験者の上記肝臓から単離される、請求項３に記載の方法。
［項目５］
単離された複数の上記ＨＥＣは、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の細胞の実質的に純粋な集団において備えられる、項目１に記載の方法。
［項目６］
上記単離する段階は、ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現に基づく複数の細胞を選択する段階を更に備える、項目１に記載の方法。
［項目７］
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の実質的に純粋な集団を備える、組成物。
［項目８］
複数の上記ＨＥＣは、上記組成物の投与が予期される被験者に対して自己由来である、項目７に記載の組成物。
［項目９］
複数の上記ＨＥＣは、上記組成物の投与が予期される被験者に対して同種異系である、項目７に記載の組成物。
［項目１０］
上記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、医薬的に受け入れられるキャリアと混合して備える、請求項７から９のうちいずれか一項に記載の組成物。
［項目１１］
上記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、培養培地と混合して備える、項目７から９のうちいずれか一項目に記載の組成物。
［項目１２］
上記組成物は、複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後のＨＥＣを、耐凍剤と混合して備える、項目７から９および１１のうちいずれか一項に記載の組成物。
［項目１３］
複数のＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋の生後の造血性内皮細胞の実質的に純粋な集団を、それらを必要とする被験者に投与する段階を備える、免疫不全疾患のための治療の方法。
［項目１４］
上記免疫不全疾患は、Ｔ細胞不全、Ｂ細胞不全、複合Ｔ細胞／Ｂ細胞不全、抗体不全、補体不全、白血病、リンパ腫、貧血症、好中球減少症、リンパ球減少、ループス、およびウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される、項目１３に記載の治療の方法。
［項目１５］
上記免疫不全疾患は、免疫抑制または細胞毒性薬の投与の結果としてもたらされる、項目１３に記載の治療の方法。
［項目１６］
上記免疫不全疾患は、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝炎の結果としてもたらされる、項目１３に記載の治療の方法。
［項目１７］
生後の被験者において複数の造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を識別する方法であって、上記被験者において、ＣＤ１４４＋ＣＤ４５＋である複数の細胞を識別する段階を備える、治療の方法。
［項目１８］
ＣＤ１８０、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター２（ＣＸＣＲ２）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインＣ−Ｘ３−Ｃモチーフレセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカインＣ−Ｃモチーフレセプター９（ＣＣＲ９）、Ｇタンパク質共役レセプター１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役レセプター１７４（ＧＰＲ１７４）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ７）、シグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバ７（ＳＬＡＭＦ９）、インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）、インテグリンアルファＸ（ＩＴＧＡＸ）、および膜貫通の４ドメインのサブファミリーＡメンバ６Ｄ（ＭＳ４Ａ６Ｄ）から選択される少なくとも１つの追加のマーカの発現を識別する段階を更に備える、項目１７に記載の治療の方法。
【国際調査報告】
2016537337.tif 000008