(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるリン酸化領域の両側に、蛍光を発する蛋白質が結合している蛋白質であって、該リン酸化により蛍光変化を起こす蛋白質。
【請求項２】
該リン酸化領域の両側に結合した蛍光を発する蛋白質が、発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク（GFP）を構成するRSGFPとBSGFPとからなることを特徴とする、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を担持する発現ベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載の蛋白質、請求項３に記載の核酸、または請求項４に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入することにより、該細胞のリン酸化能を測定する方法。
【請求項６】
被験蛋白質と請求項１または２に記載の蛋白質とを反応させ、該蛋白質の蛍光変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のリン酸化能を測定する方法。
【請求項７】
リン酸化酵素をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験蛋白質と請求項１または２に記載の蛋白質とを反応させる工程、
（ｂ）該蛋白質の蛍光変化を測定する工程、および
（ｃ）該蛋白質の蛍光を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法。
【請求項８】
リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験試料の存在下、請求項１または２に記載の蛋白質と、該蛋白質の該リン酸化領域をリン酸化する酵素とを接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質の蛍光変化を測定する工程、および
（ｃ）被験試料の非存在下における場合と比較して、該蛍光変化を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項４に記載の発現ベクターが導入された細胞を調製する工程、
（ｂ）被験試料の存在下、該細胞で発現された蛋白質の蛍光変化を測定する工程、および
（ｃ）被験試料の非存在下における場合と比較して、該蛍光変化を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛋白質をリン酸化する活性を測定するための蛋白質及びこれをコードする核酸に関する。
背景技術
生物の生体内には巧みなスイッチ機構が存在し、このスイッチ機構により分化発生、防御反応、代謝活動等が制御されている。このスイッチ機構の一つとして蛋白質のリン酸化という現象が知られている（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：３−３７）。このリン酸化は酵素の介在により行なわれているものである。すなわちこの酵素は基質蛋白質にリン酸基を導入して、この基質蛋白質を活性化する。ここで活性化された基質蛋白質は、遺伝子の発現調節や細胞の増殖等、種々の反応を誘導する。
近年、細胞のシグナル伝達と呼ばれる細胞の発生分化等を含めた種々の生体内の反応の基礎となるカスケード機構が明らかにされつつある。この細胞のシグナル伝達経路において、上記リン酸化反応が該経路のオンオフを決定するスイッチ機構の一つとして重要な機能を果たすことが示されている（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．，１９９５，Ｃｅｌｌ  ８０：２２５−２３６）。
現在までの研究において、シグナル伝達経路には複数の経路が存在することが示されている。例えば、ホルモンなどのように直接細胞膜を通過して細胞外の情報を細胞内に伝達する比較的単純な経路もこのシグナル伝達経路の一つであるが、近年では、複数の分子が相互に連絡して一定の情報を細胞内に伝える複雑な経路も発見されている。
その一例として、Ｇ蛋白質を介したシグナル伝達の経路がある（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．，１９８７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６１５−６４９）。この経路においては、細胞膜上に形成されている受容体に特定の物質が結合することが伝達経路を始動させる信号となる。一方、細胞内で受容体と共役しているＧ蛋白質が、セカンドメッセンジャであるｃＡＭＰ（サイクリックアデノシンモノホスフェート；ｃｙｃｌｉｃ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の細胞内濃度を上昇させる。このｃＡＭＰ濃度の上昇を利用してある特定のリン酸化酵素がＡキナーゼをリン酸化する。このようにして生じたＡキナーゼのリン酸化すなわち活性化が核などに信号として伝達されて、カスケード反応の最終ステージにおける生体反応に必要な蛋白などの発現が誘導されるものと考えられている。このＧ蛋白質を介したシグナル伝達の経路以外には、細胞表面の受容体及びＭＡＰキナーゼに基く伝達経路（Ｍａｄｈａｎｉ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１４：１５１−１５５）や、細胞膜のリン脂質及びＣキナーゼに基く伝達経路（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｉ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４００Ａ：３１３−３２１）等が知られているが、いずれの場合も蛋白質のリン酸化が経路の活性化のスイッチとして重要な機能を果たしていることが示されている。しかしながら、現在知られているシグナル伝達経路は、細胞内に存在することが予想される多くの伝達経路のごく一部であることが種々の研究から示唆されている。
このようにシグナル伝達経路を解明することは、生命活動の種々のメカニズムを解明する上で重要となることから、さらに新たな伝達経路の探索や既に知られている伝達経路に関与する物質の探索及びその物質の機能解析が進められている。中でも、シグナル伝達のスイッチ機構として重要な機能を果たすリン酸化反応の解析およびこの反応を担う酵素の探索等に関する研究が広く行われている。
このような蛋白質のリン酸化反応を担う酵素の探索は、主として既存の蛋白質リン酸化酵素をコードする遺伝子との相同性を比較することによりなされてきた。例えば、チロシン残基をリン酸化するリン酸化酵素のファミリーでは、これらファミリーに共通する配列（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ａｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１７：４４３−４５５）が知られていることから、この共通配列に基いてプローブ等を設計しライブラリー等のスクリーニングを行うことによって、新たな酵素の探索が可能となる。このようにして新たに発見された酵素が蛋白質リン酸化活性を有するか否かは、主として３２Ｐ同位元素を用いたインビトロの解析系を用いて解析される（Ｄ．Ｇｒａｈａｍｅ  Ｈａｒｄｉｅ編，「蛋白質のリン酸化：実践的アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，１９９３，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。すなわち、探索した酵素、リン酸化領域を有する基質蛋白または既知のアミノ酸断片、および３２Ｐリン酸の三者を混合し、該基質蛋白質又は該アミノ酸断片に３２Ｐが付加されるか否かを反応産物の放射能活性をモニターすることにより判定を行っている。
しかしながら、従来の蛋白質リン酸化の解析法においては３２Ｐのような放射性同位体を用いることが必要であるため、実験設備等の制約があり、また、実験操作自体も慎重を期す必要があることから操作が煩雑となっていた。また、このような実験は放射性同位元素の廃棄物を伴うので、自然環境的にも好ましいとは言えなかった。さらには、上記の解析法では細胞内の活性そのものを測定することはできず、人工的に作られた環境下での測定結果しか得られないという問題があった。
こうしたインビトロの解析系の問題を解消するために、インビボの測定系も開発されている。この方法は、直接リン酸化を測定するものではなく、リン酸化により誘導された細胞増殖を指標として蛋白質リン酸化反応を測定するものである。より具体的には、この解析系は細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込み量から細胞増殖率を測定し、この細胞増殖率に基いてシグナル伝達経路の初期のリン酸化反応を測定しようとするものである。しかし、この方法においては、伝達経路の末端の活性、すなわち細胞増殖を指標として測定を行うため、リン酸化反応を迅速に測定することは困難である。また、リン酸化反応が生じるタイミング等を測定するには適した方法とはいえない。
一方、最近の報告では、生体内のカルシウム濃度を測定する解析系が報告されている（Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：８８２−８８７）。この系は、カルモジュリン蛋白質の両端に発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を融合させた融合蛋白質を用いて測定するものであり、この両端のＧＦＰ蛋白質が互いに接近し相互作用すると蛍光を発するという性質を利用したものである。すなわち、一定量のカルシウムが中央のカルモジュリン蛋白質に結合するとカルモジュリン蛋白質の立体構造が変化して、その両端のＧＦＰ蛋白質が相互作用により蛍光を発する。ここで発する光を測定することにより生体内のカルシウムの濃度を測定するという仕組みである。このようにカルシウム濃度の測定については、放射性同位体を使用せず、かつ、インビボの測定にも適用可能な優れた系が開発されているが、上述した蛋白質リン酸化反応についてはこのような系の開発が遅れている。
発明の開示
本発明は、放射性同位体を使用せず、かつ、インビボの測定にも適用可能な蛋白質リン酸化の解析系を樹立することを課題とする。
本発明者らはまず、リン酸化を受けることがすでに知られているアミノ酸配列の代表例として、ＣＲＥＢリン酸化配列（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５９：６７５−６８０）およびケンプタイドリン酸化配列（Ｋｅｍｐ  Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：４８８８−４８９４）をそれぞれコードする遺伝子を取得し、それぞれの遺伝子をプラスミドｐＥＴＩＣ（Ｒｏｍｏｓｅｒ  Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３２７０−１３２７４）のＲＳＧＦＰ部位（ＲＧＦＰとも呼ばれる）とＢＳＧＦＰ部位（ＢＧＦＰとも呼ばれる）の間に挿入することによりプラスミド「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」および「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」をそれぞれ作製した。両プラスミドともに「ＲＳＧＦＰ−蛋白質リン酸化配列−ＢＳＧＦＰ」なる構成を有する融合蛋白質を発現しうるプラスミドであり、蛋白質リン酸化配列のみが異なっている。また、リン酸化反応試験における陰性対照として、ｐＥＴＩＣ−１を用いた。本プラスミドは、「ＲＳＧＦＰ−カルモジュリン結合部位−ＢＳＧＦＰ」なる構成を有する融合蛋白質を発現しうるプラスミド（Ｒｏｍｏｓｅｒ  Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：１３２７０−１３２７４）である。
大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）をｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ、ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ、またはｐＥＴＩＣ−１を用いて形質転換し、培養後細胞内の菌体より上記融合蛋白質を抽出した。
３２Ｐ同位元素を用いたインビトロの解析系を用いて解析したところ、ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴおよびｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔに由来する融合蛋白質はリン酸化を受けたが、ｐＥＴＩＣ−１に由来する融合蛋白質はリン酸化を受けなかった。
一方、３２Ｐ同位元素を用いずに非放射性のリン酸を基質として反応を行った場合に蛍光変化が生じるかどうかを検討した。その結果、ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴに由来する融合蛋白質はリン酸化反応の有無によって吸収波長の変化が観察されたが、ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔまたはｐＥＴＩＣ−１に由来する融合蛋白質は、リン酸化反応の有無によって吸収波長の変化が観察されなかった。この結果より、次の２つのことが明らかとなった。
１．「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」に由来する融合蛋白質は、リン酸化を受けることにより、ＧＦＰの蛍光変化を惹起するために必要な蛋白質立体構造変化を生じる。
２．「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」に由来する融合蛋白質は、リン酸化を受けるが、それによって、ＧＦＰの蛍光変化を惹起するために必要な蛋白質立体構造変化を生じることはない。
すなわち、本発明者らは蛋白質のリン酸化が蛋白質の立体構造変化を惹起する場合があることを示した。上記に示した二種のＧＦＰ蛋白質の組み合わせは、立体構造変化を特性変化として捕らえるための一例であり、他の特性を有する蛋白質等でも同様の系の構築が可能であることは自明である。
したがって、特性変化を捕らえる領域、すなわち特性可変領域と、リン酸化を受ける領域、すなわちリン酸化領域とが融合した蛋白質を、蛋白質のリン酸化をモニターする蛋白質（モニター蛋白質）として使用することが可能となった。この場合、放射性同位体を使用する必要はなく、かつ、インビボの測定にも適用可能である。実際、本発明者らは、モニター蛋白質を発現するベクターを導入した細胞において、細胞が生きたままリアルタイムにリン酸化をモニターすることに成功した。
このようなモニター蛋白質は、蛋白質のリン酸化反応を容易にモニターできることより、新しいリン酸化酵素等のスクリーニング方法として利用することができる。また、この系を利用して、リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングすることも可能である。
なお、蛋白質リン酸化酵素には、立体構造変化を生じるものと生じないものと二種類あることが示されたことより、既存の３２Ｐ同位元素を用いたインビトロの解析系とモニター蛋白質の特性変化を利用した方法とを併用することにより、蛋白質のリン酸化が立体構造変化を惹起するかどうかを判定することも可能となった。すなわち本発明は、
〔１〕リン酸化を受けるアミノ酸残基またはアミノ酸配列を含むリン酸化領域と、該アミノ酸残基または該アミノ酸配列がリン酸化を受けることにより生じる少なくとも該リン酸化領域を含む蛋白質の立体構造変化に起因した特性変化を示す特性可変領域とを含む、蛋白質のリン酸化を測定するためのモニター蛋白質、
〔２〕特性可変領域が蛍光を発する蛋白質であることを特徴とする、〔１〕に記載のモニター蛋白質、
〔３〕特性可変領域がリン酸化領域の両側に結合していることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のモニター蛋白質、
〔４〕特性可変領域が、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）を構成するＲＳＧＦＰとＢＳＧＦＰとからなることを特徴とする、〔３〕に記載のモニター蛋白質、
〔５〕リン酸化領域が配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のモニター蛋白質、
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のモニター蛋白質をコードする核酸、
〔７〕〔６〕に記載の核酸を担持する発現ベクター、
〔８〕〔１〕〜〔５〕に記載のモニター蛋白質、〔６〕に記載の核酸、または〔７〕に記載の発現ベクターのいずれかをある特定の細胞に導入することにより、該細胞のリン酸化能を測定する方法、
〔９〕被験蛋白質と〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させ、該モニター蛋白質の特性変化を測定する工程を含む、被験蛋白質のリン酸化能を測定する方法、
〔１０〕リン酸化酵素をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験蛋白質と〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のモニター蛋白質とを反応させる工程、
（ｂ）該モニター蛋白質の特性変化を測定する工程、および
（ｃ）該モニター蛋白質の特性を変化させる被験蛋白質を選択する工程、を含む方法、
〔１１〕リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験試料の存在下、リン酸化酵素および該リン酸化酵素によりリン酸化され得るリン酸化領域を含む〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のモニター蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）該モニター蛋白質の特性変化を測定する工程、および
（ｃ）被験試料の非存在下における場合と比較して、該特性変化を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１２〕リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）〔７〕に記載の発現ベクターが導入された細胞を調製する工程、
（ｂ）被験試料の存在下、該細胞で発現されたモニター蛋白質の特性変化を測定する工程、および
（ｃ）被験試料の非存在下における場合と比較して、該特性変化を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
に関する。
以下本発明を具体的に説明する。
１．蛋白質のリン酸化を測定するためのモニター蛋白質
リン酸化を測定するためのモニター蛋白質（以下、モニター蛋白質）は、「リン酸化領域」と１または複数の「特性可変領域」とを含む蛋白質である。
ここで「リン酸化領域」は、リン酸化を受けるアミノ酸残基を含み該アミノ酸残基がリン酸化を受けることにより立体構造が変化しうるものをいい、以下に示すリン酸化を受けることが知られている蛋白のうち、リン酸化により立体構造変化を示しうるものを用いることができる。リン酸化を受ける蛋白質としては、ＣＲＥＢ転写因子（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４８５２−４８５９）、ＡＴＦ１（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７９５７−１７９６０）等が挙げられる。
例えば、通常ではリン酸化によって立体構造の変化を起こさない蛋白質でも、モニター蛋白質にリン酸基特異的抗体を含めることによって、立体構造の変化を誘起することができると考えられる。よって、リン酸基特異的抗体と他の特性可変領域を組み合わせることも可能である。
また、リン酸化領域は蛋白質の全長を用いてもよいが、リン酸化を受けるアミノ酸残基を含む一部配列でも好適に使用することができる。例えば、ＣＲＥＢ転写因子の場合には、１３３残基目のセリンがプロテインキナーゼＡによるリン酸化の基質となることが知られており、この１３３残基目のセリンを含みリン酸化受ける配列であればその一部配列であってもよく、例えば、この一部配列としては配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を選択することができる。また、この「リン酸化を受けるアミノ酸残基」としては、セリンの他にチロシン、スレオニン等が挙げられる。
「特性可変領域」は、蛋白質がリン酸化を受けたことが容易に判定できるものであれば、いかなるアミノ酸配列であっても構わない。ＧＦＰ等を例示することができる。
「特性可変領域」は、リン酸化領域と融合蛋白質を形成していれば分散して存在していても構わない。リン酸化領域を挟んで設けられた「測定蛋白対」としてモニター蛋白質を構成することも好適である。すなわち、リン酸化領域内のアミノ酸残基はリン酸化を受けることによりリン酸化領域の立体構造が変化して、両側に設けられた測定蛋白対が相互作用して測定可能な特性を示すことを特徴とする。従って、例えば各構成を以下のように設定することも可能である。
前記リン酸化領域を挟んで設けられる「測定蛋白対」は、前記リン酸化領域の立体構造変化により互いに相互作用をして測定可能な特性を示すものであればいかなるものをも用いることができるが、例えば、発光オワンクラゲのＢＳＧＦＰ及びＲＳＧＦＰのように相互作用して蛍光を発光するものなどを好適に使用することができる。
モニター蛋白質には、上記「リン酸化領域」及び「特性可変領域」以外に所望の機能領域を付加することもできる。例えば、核内でのリン酸化を測定するためにモニター蛋白質を核に運ばせる核移行シグナル（Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：６４１−６４４）やモニター蛋白質を細胞に導入する際の指標となるマーカー（Ｈｅｉｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６６３−６６４）等である。
２．モニター蛋白質の生成
上記モニター蛋白質の生成方法は特に限定はないが、例えば、モニター蛋白質をコードする核酸を大腸菌等の任意の宿主細胞内で発現させることにより生成することができる。すなわち、この「モニター蛋白質をコードする核酸」は、前記特性可変領域をコードする塩基配列とリン酸化領域をコードする塩基配列とを読み枠が一致するように接続し、これら測定蛋白対とリン酸化領域とが融合蛋白質として発現し得るように構築する。ここで構築されたモニター蛋白質をコードする核酸を任意のベクターに接続し、適当な宿主細胞内に導入、発現させることにより増幅生成させることができる。ここで生成されたモニター蛋白質は、直接、好ましくは単離精製した後、インビトロ又はインビボのリン酸化の測定に用いることができる。
尚、モニター蛋白質の生成に使用する際のベクター及び宿主細胞の組合わせには特に限定はないが、モニター蛋白質の発現を高めるためには発現活性の高いプロモータの下流に接続させることもできる。こうしたプロモータ等は、既知のプロモータから任意に選定し使用することができる。
３．モニター蛋白質をコードする核酸
上記「モニター蛋白質をコードする核酸」は、モニター蛋白質をコードしていれば、その他の配列を有するものも含まれる。その他の配列としては、モニター蛋白質を細胞内で効率的に発現させる配列、例えば、プロモータ、エンハンサのような制御配列等、または細胞内に該核酸が導入されたことを検出するための薬剤耐性マーカ等の選択遺伝子等が含まれる。
この核酸は、上述したモニター蛋白質を生成する目的で使用することができる以外に、細胞内に導入し直接モニター蛋白質を発現させて細胞内のリン酸化反応を直接検出する目的にも用いることができる。一般に蛋白に比べ核酸の形態のほうが、細胞内への導入効率は高いことから、核酸として細胞内に上記モニター蛋白質をコードする核酸を用いることにより、前記モニター蛋白質の細胞内への運搬効率を高めることができる。また、後述する通り、前記核酸をベクターに担持させることにより細胞内への運搬、核酸の調製を容易にすることができる。
４．モニター蛋白質をコードする核酸を担持するベクター
ベクターは、特に限定はなく、自己複製可能であり、転写開始配列を含むものであれば大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにおいて発現可能な公知のプラスミドを用いることができる。従って、これら公知のプラスミドの中から試験対照とする細胞等に対応して適宜選択して使用することができる。
５．リン酸化酵素をスクリーニングするためのモニター蛋白質
モニター蛋白質は、該モニター蛋白質のリン酸化領域をリン酸化する酵素の検索やスクリーニングに用いることもできる。所望のリン酸化領域を有するモニター蛋白質を、インビボまたはインビトロで被験蛋白質に作用させ、モニター蛋白質のリン酸化を検出することによって、該リン酸化領域をリン酸化する酵素をスクリーニングすることができる。インビボでスクリーニングを行う場合は、モニター蛋白質をコードする核酸を担持するベクターを用いることができる。被験蛋白質としては特に制限はない。天然の蛋白質ライブラリー、人工蛋白質ライブラリー、またはそれらのｃＤＮＡライブラリーなどを使用することができる。また、リボザイムライブラリー等も使用できる。
６．リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングするためのモニター蛋白質
モニター蛋白質は、該モニター蛋白質のリン酸化領域をリン酸化または脱リン酸化する酵素の活性の促進剤や阻害剤のスクリーニングに用いることもできる。例えば、被験試料の存在下、所望のリン酸化酵素を、該酵素によりリン酸化され得るリン酸化領域を有するモニター蛋白質に接触させ、モニター蛋白質の特性変化を検出する。被験試料としては特に制限はない。例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、修飾ペプチド、天然化合物などが挙げられる。被験試料非存在下と比較して、該特性変化を促進または抑制する化合物を選択する。モニター蛋白質の特性変化を促進する化合物は、リン酸化酵素活性を促進する化合物であると判定され、該特性変化を抑制する化合物は、リン酸化酵素活性を抑制する化合物であると判定される。これにより、該リン酸化酵素のリン酸化活性を促進または抑制する化合物を単離することが可能である。スクリーニングに用いるリン酸化酵素とリン酸化領域の組み合わせとしては、特に限定されない。
本発明のスクリーニングに用いられるリン酸化酵素（およびそのリン酸化配列）の例としては、例えば、Ａキナーゼ（配列番号：１に記載のＣＲＥＢリン酸化配列）、Ｇキナーゼ（ＲＫＲＳ＊ＲＡＥ；ヒストン）、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＨＭＲＳＡＭＳ＊ＧＬＨＬＶＫＲＲ；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＰＬＲＲＴＬＳ＊ＶＡＡ；グリコーゲンシンターゼ）、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ＫＫＲＡＡＲＡＴＳ＊ＮＶＦＡ；ミオシン軽鎖）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＫＲＫＱＩＳ＊ＶＲＧＳＬ；ホスホリラーゼ）、Ｃキナーゼ（ＶＲＫＲＴ＊ＬＲＲＬ；ＥＧＦ受容体）、ｖ−Ａｂｌ（ＲＲＬＩＥＤＡＥＹ＊ＡＡＲＧ；ＲＲ６０ＳＲＣ）、ＥＧＦ受容体プロテインキナーゼ（ＲＲＥＥＬＱＤＤＹ＊ＥＤＤ；エリスロサイト  バンドＩＩＩ）などが挙げられるが、これらに限定されない（括弧内はリン酸化される基質アミノ酸配列と基質蛋白質を示す）（Ｒ．Ｂ．Ｒｅａｒｓｏｎら，「合成ペプチドを用いたプロテインキナーゼおよびホスファターゼの特異的研究法」，Ｄ．Ｇ．Ｈａｒｄｉｅ編  日高弘義監修，ＭＥＤＳｉバイオ実験法シリーズプロテインキナーゼとホスファターゼ，ｐｐ．２２５−２２８，１９９５年，メディカル・サイエンス・インターナショナル）。また、これらのキナーゼは、上記以外のアミノ酸配列を持つ蛋白質もリン酸化することが知られており、これらの基質部位のアミノ酸配列を適宜選択して使用することが可能である。
インビボでスクリーニングを行う場合は、モニター蛋白質をコードする核酸を担持するベクターを用いることができる。この系においては、目的のリン酸化酵素の活性を直接促進または抑制する化合物（該リン酸化酵素のアゴニストやアンタゴニスト）以外にも、該リン酸化酵素の発現や活性化に至るシグナル伝達を促進または抑制する化合物や、モニター蛋白質の脱リン酸化を促進または抑制する化合物などをスクリーニングすることもできる。化合物がリン酸化酵素に直接作用しているか否かは、精製したリン酸化酵素を用いたインビトロ系により確認することができる。インビボ系においては、例えば実施例に記載のようにＧＦＰを特性可変領域に用いた場合、細胞を破砕することなくモニター蛋白質の特性変化を検出することが可能である。また、モニター蛋白質の特性変化を、生きた細胞においてリアルタイムに検出することも可能である。これにより、被験化合物がリン酸化に及ぼす効果をより詳細に検証することができる。
これらのスクリーニングにより、特定のキナーゼの特異的な阻害剤などを簡便にスクリーニングすることが可能となる。キナーゼは細胞の増殖や分化、免疫応答などにおけるシグナル伝達に重要な機能を有しており、単離される阻害剤などは、これらのシグナル伝達が関与する種々の疾患の予防薬や治療薬としての応用が期待される。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
尚、この実施例では、リン酸化領域としてＣＲＥＢ転写因子のリン酸化配列（以下、ＣＲＥＢリン酸化配列という）を用い、また、測定蛋白対として発光オワンクラゲのＲＳＧＦＰおよびＢＳＧＦＰを用いてモニター蛋白質「ＡＲＴ」（Ａキナーゼ反応性トレーサー；Ａ−ｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｔｒａｃｅｒ）を構築し、リン酸化の検出を行った。なお、ＣＲＥＢリン酸化配列を配列番号：１に示した。
また、ＣＲＥＢリン酸化配列に代えてケンプタイド（ｋｅｍｐｔｉｄｅ）のリン酸化配列（配列番号：２）を用いたモニター蛋白質「Ｋｅｍｐａｒｔ」も同時に構築し、上記ＣＲＥＢリン酸化配列を保持するモニター蛋白質との比較を行った。
［実施例１］  リン酸化配列をコードするＤＮＡ断片の合成
先ず、上記モニター蛋白質を構築するために、リン酸化配列をコードするＤＮＡ断片を合成した。ＣＲＥＢリン酸化配列をコードするＤＮＡ断片（以下ＣＲＥＢ−ＤＮＡ断片という）は、オリゴヌクレオチドＬＣＲ−１Ｂ（配列番号：３）を鋳型とし、また、プライマーとしてＰＣＲ−１Ｋ（配列番号：５）及びＰＣＲ−１Ａ（配列番号：６）を用いてＰＣＲにより増幅し合成した。
また、対照として用いるケンプタイドのリン酸化配列をコードするＤＮＡ断片（ケンプタイド−ＤＮＡ断片という）は、オリゴヌクレオチドＬＫｅ−１Ｂ（配列番号：４）を鋳型とし、また、プライマーとしてＰＫｅ−１Ｋ（配列番号：７）及びＰＫｅ−１Ａ（配列番号：８）のプライマーセットを用いて同様にＰＣＲにより増幅し合成した。ＰＣＲ反応の詳細な操作は次の通り行った。
ＰＣＲ反応液をマイクロチューブ（０．２ｍｌ用）に調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、滅菌水（１８．３μｌ）、１０×ＥＸＴａｑバッファ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ混合液（２．０μｌ）、ＥＸＴａｑポリメラーゼ（０．２μｌ）（宝酒造）、鋳型オリゴヌクレオチド（２０ｎｍｏｌ／ｍｌ）（１．０μｌ）、プライマー（約５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）（各０．５μｌ）とした。
上記各反応液を含むマイクロチューブをＤＮＡ増幅器（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００、パーキンエルマージャパン株式会社）にセットしてＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ反応は、次の条件で行った。ＰＣＲ反応は、変性工程（９４℃、３０秒）を１サイクル行った後、変性工程（９４℃、５０秒）、アニーリング工程（５７℃、１分）及び伸長工程（７２℃、１分）の一連工程を４０サイクル実行し、最終的に伸長工程（７２℃、７分）を行った後、４℃に冷却した。
ＰＣＲ反応終了後、電気泳動により増幅断片の確認のため電気泳動を行った。電気泳動を行うために反応液の一部（１０μｌ）を分取し、この反応液に電気泳動用バッファーを混合した。この混合液を１０％アガロースゲル上で分画し、分画後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色法により、目的の断片を確認した。
目的の断片を剃刀等で切り出し、それぞれマイクロチューブ（１．５ｍｌ用）に移し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩＩキット（ＢＩＯ  １０１社）を用いて各断片を回収した。回収した各ＤＮＡはトリスＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）（１００μｌ）に溶解し、精製した。精製は、次の操作により行った。先ず、溶解液にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて攪拌した。静置後、上清を除去して、エタノール沈殿を行った。上清を除去し、沈さを滅菌水を用いて溶解した。
［実施例２］  モニター蛋白質遺伝子を担持するプラスミドの構築
上記各ＤＮＡ断片を図１に示すｐＥＴＩＣベクター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３２７０−１３２７４，１９９７）に挿入した。このｐＥＴＩＣベクターは、既に測定蛋白対としてＲＳＧＦＰ遺伝子及びＢＳＧＦＰ遺伝子が担持されていることから、これらＲＳＧＦＰ遺伝子とＢＳＧＦＰ遺伝子との間に上記ＤＮＡ断片を挿入することにより、「ＲＳＧＦＰ遺伝子−リン酸化配列−ＢＳＧＦＰ遺伝子」が配列されたモニター蛋白質遺伝子が構築される。
先ず、ｐＥＴＩＣベクター及び上記２つのＤＮＡ断片を常法に従い制限酵素ＫｐｎＩ、ＡｇｅＩにより切断した。切断後、１０％アガロースゲルを用いて、各断片及び直鎖状としたベクターを電気泳動により分画した。分画後、それぞれ目的の断片を上記と同様にＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩＩキットにより回収し、精製した。これら切断片は、それぞれＴＥバッファー（１０μｌ）に溶解した。
次に、上記溶解液を用い、ｐＥＴＩＣベクターにＣＲＥＢ−ＤＮＡ断片又はケンプタイド−ＤＮＡ断片をライゲーションにより接続した。ライゲーションはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社）を用いて行った。
ＣＲＥＢ断片液（５μｌ）に直鎖状としたｐＥＴＩＣベクター液（３μｌ）を混合し、これに上記キットのＩ液（８μｌ）を添加し、１６℃、３０分間反応させた。ケンプタイド断片液（５μｌ）も同様にｐＥＴＩＣベクター液（３μｌ）及び上記キットのＩ液（８μｌ）を混合して、ライゲーション反応を実行した。また、これ以外にも挿入断片に代えてＴＥバッファーのみのライゲーションサンプルも調製した。
上記ライゲーション反応液から目的のプラスミドを回収するために、上記ライゲーション反応液（８μｌ）をＪＭ１０９コンピテントセル（１００μｌ）と混合し、形質転換を行った。形質転換は、常法に従って行った。形質転換後のＪＭ１０９を、カナマイシンを含有する寒天培地にひろげ、３７℃で一晩培養した。培養後、生育したカナマイシン耐性コロニーをかきとり、細胞内のプラスミドを解析した。この解析により、ｐＥＴＩＣベクターに目的の断片が挿入されているプラスミドを保持する細胞を選択し、これら細胞からプラスミドを調製した。なお、ここで調製されたプラスミドのうち、ＣＲＥＢ断片が挿入されているプラスミドを「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」とし、ケンプタイド断片が挿入されているプラスミドを「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」とした。
［実施例３］  モニター蛋白質の生成
上記「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」または「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」を用いて、それぞれＣＲＥＢ由来又はケンプタイド由来のリン酸化配列を含むモニター蛋白質の生成を行った。なお、これらプラスミドのベクターであるｐＥＴＩＣベクターは、ｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を基に作製されたものであり、このｐＥＴ３０ａベクターの有する機能を保持している。すなわち、このｐＥＴＩＣベクターは、インサート領域の上流にＴ７プロモータが備えられ、ＢＬ２１（ＤＥ３）のような、ｌａｃＵＶ５プロモータの下流にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌内でＩＰＴＧにより目的蛋白質を発現誘導することができる。また、ここで発現した組換え蛋白質には、ヒスチジンの標識（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が付加されるためＮｉアガロースにより容易に回収することが可能となる。「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」、「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」を用いたモニター蛋白質の生成は、上記原理に基いて次の通り行った。
上記「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」、「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」をそれぞれ上記と同様の方法によりＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルへ形質転換した。形質転換後、カナマイシン含有寒天培地上に形成されたコロニーをかきとり、３ｍｌのＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に植菌し、３７℃で一晩培養し、前培養液を調製した。この前培養液（２ｍｌ）を同様のＬＢ培地５００ｍｌを含む２Ｌフラスコに移し、３７℃で吸光度（６００ｎｍ）が０．６となるまで培養した。吸光度（６００ｎｍ）が０．６となったところでＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、２３℃でさらに一夜培養した。
培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行い、細胞を回収した。回収した細胞をバッファー（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）１０ｍｌに懸濁した。懸濁液を氷上にて３０秒パルスの条件で５回超音波破砕を行った。破砕液にＮＰ−４０、およびイミダゾールをそれぞれ最終濃度０．１％、および２０ｍＭとなるように添加し、その後、破砕液を４℃にて攪拌器を用いて攪拌した。攪拌後、４℃にて遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分）を行い、上清を回収した。
回収した上清にＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（キアゲン社）を５００μｌ添加して、４℃にて攪拌器により６０分間攪拌した。攪拌後、上記Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースを２ｍｌのバインディングバッファー（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％ＮＰ−４０、２０ｍＭイミダゾール）により４回洗浄した。
洗浄後、１ｍｌ溶出バッファー（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％ＮＰ−４０、２００ｍＭイミダゾール）を加えて、４℃にて攪拌器を用いて３０分間攪拌した。攪拌後、遠心分離を行い、上清を回収した。この一連の溶出操作を２回繰り返した。ここで回収された溶出液に、最終濃度２０％となるようにグリセロールを添加し、−８０℃下で保存した。
上記の方法で回収した溶出液１０μｌを１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行いモニター蛋白質を確認した。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて染色した結果を図２に示す。なお、図２において、ｐＥＴＩＣ−１（Ｒｏｍｅｓｅｒ，Ｖ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３２７０−１３２７４）はｐＥＴＩＣベクターにＣａ２＋カルモジュリン結合部位をコードする配列が組み込まれたものであり、組換え蛋白質（ＲＳＧＦＰ−カルモジュリン結合部位−ＢＳＧＦＰ）の調製において陽性対照として用いた。また、「ＩＰＴＧ−」は培養時にＩＰＴＧによる誘導を行わなかったもの、「ＩＰＴＧ＋」は培養時にＩＰＴＧによる誘導を行なったものを示す。
図２に示す通り、ＩＰＴＧによる発現誘導を行った場合に「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」および「ｐＥＴＩＣ−Ｋｅｍｐａｒｔ」においてそれぞれ単一のバンドとして示される蛋白質が検出された。これら蛋白質は、陽性対照であるｐＥＴＩＣ−１より発現される蛋白とほぼ同等のサイズを有していることから、ここで発現されている蛋白質が目的のモニター蛋白質、すなわち、ＲＳＧＦＰ−ＣＲＥＢリン酸化配列−ＢＳＧＦＰ、およびＲＳＧＦＰ−ケンプタイドリン酸化配列−ＢＳＧＦＰが生成されていることが予想された。
［実施例４］  γ−３２Ｐを用いたリン酸化の測定
本実施例では、インビトロ系において上記２つのモニター蛋白質のリン酸化配列がリン酸化を受けるかを確認した。この確認試験は、リン酸化酵素としてＡキナーゼを、また、基質として［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、以下の操作により実施した。
反応液を調製するために、１０×キナーゼバッファ（２５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ）（５μｌ）、Ａキナーゼ（１μｌ）、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（０．５μｌ）、滅菌水（４３μｌ）を加え混合した。この混合液に各モニター蛋白質を含有する溶出液（０．５μｌ）をそれぞれ添加した。添加後、反応液を３０℃にて９０分保温することによりリン酸化反応を実行させた。
反応後、各モニター蛋白質がリン酸化されているか否かを電気泳動により確認した。電気泳動の前処理として、反応後の反応液（５０μｌ）に２×サンプルバッファー（５０μｌ）を添加し３分間煮沸した。煮沸後の液（２０μｌ）を用い１０％アクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをフィルムに感光させ、γ−３２Ｐのシグナルを検出した（図３）。
図３に示す通り、「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」由来のモニター蛋白質、及び「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」由来のモニター蛋白質において、いずれもシグナルが検出された。また、このシグナルが特異的であることは、リン酸化配列を保持していないｐＥＴＩＣ−１由来蛋白質においてシグナルが検出されないことから明らかである。また、「ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ」及び「ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ」において検出されたシグナルの位置は、図２に示すこれらプラスミドが発現するモニター蛋白質のサイズともそれぞれ一致していた。これらの結果より、実施例３において生成された２つのモニター蛋白質はリン酸化配列を保持し、この配列がリン酸化を受けることが確認された。
［実施例５］  蛍光変化によるリン酸化の測定
上記２つのモニター蛋白質は、リン酸化配列の一方にＲＳＧＦＰが、他方にＢＳＧＦＰが接続されている。これら２つのモニター蛋白質におけるリン酸化配列がリン酸化を受けることにより両側のＲＳＧＦＰとＢＳＧＦＰとが相互干渉して蛍光変化が生じるかを検討した。
反応液として、１０×キナーゼバッファ（２０μｌ）、ＡＴＰ（１００ｍＭ）（２μｌ）、滅菌水（１６８μｌ）を混合し、この混合液に上記モニター蛋白質（５μｇ／μｌ）（１０μｌ）を添加した。さらに、この反応液にＡキナーゼを、添加量を変えて０、１、２又は４μｌ添加した。
調製された反応液を３０℃にて３０分間保温した。保温後の反応液を蛍光分光光度計（日本分光株式会社）により波長域４３０〜５２０ｎｍの範囲における吸収する波長域の変化を測定した。「ＡＲＴ」（ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ由来）、「Ｋｅｍｐａｒｔ」（ｐＥＴＩＣ−ｋｅｍｐａｒｔ由来）、および陰性対照であるｐＥＴＩＣ−１由来の組換え蛋白質における蛍光変化の結果を、それぞれ図４、５、および６に示す。また、上記においてＡキナーゼの添加量の相違は、グラフ線を異ならして表現した。
図４に示す通り、「ＡＲＴ」については、Ａキナーゼの非添加の吸収パターンと添加した場合の吸収パターンとの間に差が観られた。Ａキナーゼ非添加の場合には、５００ｎｍにおいてより強い吸収が観られるが、Ａキナーゼの添加量を増加させるに従って、４５０ｎｍにおける吸収が増強された。このことからＣＲＥＢリン酸化配列は、リン酸化を受けることにより立体構造の変化が生じ、これによってその両側のＲＳＧＦＰとＢＳＧＦＰとの相互干渉が可能となり、蛍光が発光されていることが示された。
一方、「Ｋｅｍｐａｒｔ」（図５）については、上記実施例３における［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたリン酸化測定ではリン酸化が確認されているにもかかわらず、蛍光変化に関しては陰性対照（図６）と同様に上述したような波長域の変化は観察されなかった。このことからケンプタイドのリン酸化配列はリン酸化されるが、その際に立体構造の変化を伴なわないことが予想された。
以上の通り、上記「ＡＲＴ」は、上述した蛍光変化を指標として、リン酸化反応の検出等に利用することができることが明らかになった。この「ＡＲＴ」を発現するｐＥＴＩＣ−ＡＲＴを細胞内に導入することによりインビボ系の構築も可能となる。また、上記「ＡＲＴ」は、単にリン酸化反応の検出のみならず、リン酸化酵素のスクリーニングや、リン酸化活性の促進剤や阻害剤のスクリーニングにも利用することができる。
一方、ここではＣＲＥＢリン酸化配列とケンプタイドリン酸化配列とではリン酸化された際の構造変化の有無という点で相違することが示された。このことは、ＲＳＧＦＰ及びＢＳＧＦＰは、リン酸化された際のリン酸化配列の構造変化の解析に利用することができることを示している。すなわち、ＲＳＧＦＰとＢＳＧＦＰとの間に任意のリン酸化配列を挿入し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたリン酸化測定及び蛍光変化に基くリン酸化測定の双方を実施し、これら結果によりリン酸化を受けた際の構造変化を観察することができることをも示された。
［実施例６］  インビボによるリン酸化の測定
１）ｐＣＥＰ４−ＡＲＴの構造と構築
ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴプラスミドと哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）プラスミドベクター（図７）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩにて切断後、１０％アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドをＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩＩキットで回収した。回収したＤＮＡは１０μｌのＴＥに溶解し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社）のＩ液８μｌとＤＮＡ溶液８μｌを混ぜ、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。その８μｌを１００μｌのＪＭ１０９大腸菌コンピタントセルと混ぜ、形質転換した。アンピシリンプレートにまいて３７℃終夜培養した後コロニーをかきとり、ＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）３ｍｌ中で３７℃終夜培養した。終夜培養液２ｍｌを２リットルフラスコ中のＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）５００ｍｌに加え、３７℃で終夜培養した。大腸菌を回収し、キアゲン社キアゲンチップにてプラスミドＤＮＡ（ｐＣＥＰ４−ＡＲＴ）を回収した。
２）ＣＯＳ−７細胞へのプラスミドＤＮＡ導入
ｐＣＥＰ４−ＡＲＴプラスミドＤＮＡ  １μｇとリポフェクタミン試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）４μｌを各々１００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に入れた後、それらを混合し室温にて３０−４０分静置した。３０−４０分後、ガラス底培養ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ社）にＤＮＡ導入前日から継代培養しておいたＣＯＳ−７細胞の培地を無血清ＤＭＥＭ培地８００μｌと交換し、そこにプラスミドＤＮＡとリポフェクタミン試薬の混合液を加えて３時間培養した。その後、培地を１０％ウシ血清の入ったＤＭＥＭ培地１ｍｌと交換して２日間培養した。
３）リン酸化のイメージング
ｐＣＥＰ４−ＡＲＴをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞をガラス底培養ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）のカバースリップ（直径１４ｍｍ）に播いた。３０℃で４８時間インキュベートした後、細胞を２回リンガーバッファー（１５ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣＩ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），および５．６ｍＭグルコース）でリンスした後、このバッファー中で室温で暗所に維持した。蛍光強度は、励起光３８０ｎｍ、検出は４４０±２０ｎｍおよび５２０±２０ｎｍのバンドパスフィルターで行い、１００倍の油浸対物レンズ（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＵＶ−ｆｌｕｏｒ）とＱｕａｎｔｉｘ  ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）を用いて測定した。３８０ｎｍの励起光の露光時間は０．２秒とし、露光間隔は２０秒とした。まず４４０±２０ｎｍのフィルターを通った像を検出し、５秒後に５２０±２０ｎｍのフィルターを通った像を検出した。ｃＡＭＰアナログであるジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｌｙｌ−ｃＡＭＰ；ｄｂ−ｃＡＭＰ）による細胞の誘導は、５００μｌのリンガーバッファーを含む培養ディッシュに、１０μＭ  ｄｂ−ｃＡＭＰを含む５００μｌのリンガーバッファー添加して行った。
４）結果
「ＡＲＴ」の細胞内局在を観察したところ、「ＡＲＴ」はＣＯＳ−７細胞内で拡散して存在していた（図８Ａ）。ｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のアナログであるｄｂ−ｃＡＭＰで細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させてＡキナーゼを活性化し、細胞の蛍光変化を冷却ＣＣＤカメラでリアルタイムで測定した（図８Ｂ）。０秒の時点でｄｂ−ｃＡＭＰを加えた。その細胞像の蛍光強度比をみると、ｄｂ−ｃＡＭＰを加えると時間に依存して誘導倍率（ｈｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）の値（蛍光強度比）が上昇した。誘導倍率の上昇は細胞膜側から核へと起っており、これは細胞質ｃＡＭＰ上昇後活性型Ａキナーゼが細胞質から核内へと移動する現象とよく一致している。時間ごとの誘導倍率の平均値を表すと、その値はｄｂ−ｃＡＭＰ刺激後経時的に上昇していた。このことは、「ＡＲＴ」が生きた細胞においてもリン酸化モニター系として利用可能なことを示している。
ＣＯＳ−７細胞内で「ＡＲＴ」は実際にＡキナーゼ依存的なリン酸化がなされているのかを調べるため、Ａキナーゼの選択的インヒビターであるＨ−８９によって、細胞内Ａキナーゼを阻害し、図８と同様にｄｂ−ｃＡＭＰ刺激する実験を行った。細胞を１０μＭ  Ｈ−８９を含むＤＭＥＭで約２時間前処理を行い、その後１０μＭのＨ−８９を含むリンガーバッファーに交換した以外は、上記と同様に実験を行った。このときの「ＡＲＴ」の細胞内での蛍光変化を冷却ＣＣＤカメラでリアルタイムで測定した（図９）。１０μｍ×１０μｍの範囲の領域の蛍光強度比を比較すると、Ｈ−８９存在時は蛍光強度比が低かった。つまりＡキナーゼの活性が抑制されていることが、生きた細胞においてリアルタイムで観察できることが示された。
以上に示したように、本発明のモニター蛋白質を用いて、インビボでリン酸化をモニターする系が構築された。この系を用いれば、より生理条件に近い環境下で、簡便にリン酸化をモニターすることが可能である。また、この系を用いてリン酸化酵素の阻害剤の効果を簡便にモニターできることが示された。従ってこの系は、リン酸化を促進または抑制する化合物をスクリーニングするために有用である。
産業上の利用の可能性
本発明によって、放射性同位体を使用せず、かつ、インビボの測定にも適用可能な蛋白質リン酸化の解析系が開発された。本発明の解析系は、単にリン酸化反応の検出のみならず、リン酸化酵素のスクリーニングや、リン酸を促進または抑制する化合物のスクリーニングにも利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＥＴＩＣベクターの構造図である。
図２は、精製組換え蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像を示す図である。
図３は、Ａキナーゼによるリン酸化アッセイの結果を示す図である。
図４は、「ＡＲＴ」（Ａキナーゼ反応性トレーサー；Ａ−ｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｔｒａｃｅｒ）（ｐＥＴＩＣ−ＡＲＴ由来）の吸収波長のＡキナーゼ添加による効果を示すグラフである。
図５は、「Ｋｅｍｐａｒｔ」（ｐＥＴＩＣ−Ｋｅｍｐａｒｔ由来）の吸収波長のＡキナーゼ添加による効果を示すグラフである。
図６は、陰性対照蛋白質（ｐＥＴＩＣ−１由来）の吸収波長のＡキナーゼ添加による効果を示すグラフである。
図７は、ｐＣＥＰ４の構造を示す図である。
図８は、ＣＯＳ−７生細胞内のＡＲＴ像を示す図である。（Ａ）は、細胞全体で発現されたＡＲＴのＢＳＧＦＰ蛍光像である。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ領域の細胞のＢＳＧＦＰ／ＲＳＧＦＰ蛍光強度比の擬似カラー像である。細胞は０時間に５μＭのジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）で処理を行った。バーは３０μｍを表す。
図９は、ＰＫＡ阻害剤  Ｈ−８９の存在下（白いバー）または非存在下（黒いバー）においてｄｂ−ｃＡＭＰ処理した後のＣＯＳ−７細胞内のＡＲＴの蛍光強度比（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）を示す図である。０時間にｃＡＭＰアナログであるｄｂ−ｃＡＭＰ（シブチリル−ｃＡＭＰ）を添加した。Ｒはさまざまな時間に約１０μｍ×１０μｍの正方形の領域内で検出された細胞像の蛍光強度比を表す。Ｒｍｉｎは同じ細胞の最小蛍光強度比を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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