(57)【要約】  本発明は、タンパク質Ａｘｌに結合し得る抗体薬物複合体に関する。１つの態様から、本発明は、Ａｘｌに結合し得る抗体を含んでなる抗体薬物複合体に関し、前記抗体は、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）薬である、少なくとも１つの薬物にコンジュゲートされている。本発明はまた、癌の治療のための、治療方法および前記抗体薬物複合体の使用を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造一般式（Ｉ）を有する抗体薬物複合体：
（Ｉ）
ＣＢＡ−（Ｄ）ｎ
［式中、ＣＢＡは、配列番号１、２および３の配列の３つの軽鎖ＣＤＲと配列番号４、５および６の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなる抗体であり；ｎは１〜１２であり；かつ、Ｄは、式（ＡＢ）または（ＡＣ）：
【化１】
2016518382.tif 000099
を有するピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）からなる薬物であり、式中、
点線は、Ｃ１とＣ２またはＣ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、場合によりハロまたはジハロからさらに選択され；
ここで、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから独立に選択され；
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ１０は、ＣＢＡに連結されたリンカーであり；
Ｑは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立に選択され；
Ｒ１１は、ＨもしくはＲのいずれかであるか、またはＱはＯ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは金属陽イオンであり；
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基から選択され、場合により、基ＮＲＲ’に関しては、  ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒に、置換されていてもよい４員、５員、６員または７員複素環式環を形成していてもよく；
ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよく；かつ、
ここで、Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”およびＲ１１”は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、ＱおよびＲ１１に従って定義された通りであり、ＲＣは、キャッピング基である］。
【請求項２】
１６１３Ｆ１２がヒト化されている、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１または２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４】
１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１８〜２８の配列または配列番号１８〜２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項３に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５】
１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１または２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３０〜４９の配列または配列番号３０〜４９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列から選択される重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項５に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントが、配列番号８１の配列または配列番号８１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８２の配列または配列番号８２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項１または２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
１６１３Ｆ１２が、
ａ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；または
ｄ）配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
を含んでなる、抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、請求項７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項９】
Ｒ１０が、
【化２】
2016518382.tif 000100
であり、式中、ＡはＬ１とＣＢＡを連結する連結基であり、Ｌ１は切断可能なリンカーであり、Ｌ２は共有結合であるか、または−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒に自壊的リンカーを形成し、かつ、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１０】
Ａが
【化３】
2016518382.tif 000101
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である）；または
【化４】
2016518382.tif 000102
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である）；または
【化５】
2016518382.tif 000103
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である）；または
【化６】
2016518382.tif 000104
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である）
から選択される、請求項９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１１】
ＣＢＡが、ＣＢＡのシステインチオール残基とＡのマレミド基(malemide group)から形成されるチオエーテル結合を介してＡに連結されている、請求項１０に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１２】
Ｌ１がジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−を含んでなり、基−Ｘ１−Ｘ２−は−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、Ｃｉｔはシトルリンである、請求項９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１３】
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２が一緒に基：
【化７】
2016518382.tif 000105
（式中、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示し、波線はリンカーＬ１との結合点を示し、Ｙは−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、かつ、ｎは０〜３である）
を形成する、請求項９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１４】
Ｌ１およびＬ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒に、
【化８】
2016518382.tif 000106
（式中、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示し、かつ、波線はリンカーＬ１の残りの部分との結合点またはＡとの結合点を示す）；または
【化９】
2016518382.tif 000107
（式中、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである）；または
【化１０】
2016518382.tif 000108
（式中、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである）
から選択される基を含んでなる、請求項９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１５】
Ｄが
【化１１】
2016518382.tif 000109
から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１６】
【化１２】
2016518382.tif 000110
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である）；または
【化１３】
2016518382.tif 000111
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である）
から選択される構造一般式の抗体薬物複合体。
【請求項１７】
構造一般式：
【化１４】
2016518382.tif 000112
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である）；または
【化１５】
2016518382.tif 000113
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である）
を有する抗体薬物複合体。
【請求項１８】
ｎが２である、請求項１６または１７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１９】
ｎが４である、請求項１６または１７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２０】
Ａｘｌ発現癌の治療において使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体を少なくとも含んでなる組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ａｘｌ発現癌の治療において使用するための、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
Ａｘｌ発現癌の治療のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体の、または請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
【請求項２５】
前記Ａｘｌ発現癌が乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
対象においてＡｘｌ発現癌を治療するための方法であって、前記対象に有効量の少なくとも請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体または請求項２１もしくは２３に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２７】
ｉ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体および／または請求項２１もしくは２３に記載の組成物と、ｉｉ）前記抗体薬物複合体および／または組成物が配備されたシリンジまたはバイアルまたはアンプルを少なくとも含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質Ａｘｌに結合し得る抗体薬物複合体に関する。１つの態様から、本発明は、Ａｘｌに結合し得る抗体を含んでなる抗体薬物複合体に関し、前記抗体はピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）薬である、少なくとも１つの薬物にコンジュゲートされている。本発明はまた、癌の治療のための、治療方法および前記抗体薬物複合体の使用を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
「Ａｘｌ」（「Ｕｆｏ」、「Ａｒｋ」または「Ｔｙｒｏ７」とも呼ばれる）は、マウスＮＩＨ３Ｔ３により過剰発現された際に形質転換を誘発する癌遺伝子として、慢性骨髄性白血病患者からクローニングされた。Ａｘｌは、ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｍｅｒ）ファミリーと呼ばれる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の一ファミリーに属し、Ｔｙｒｏ３（Ｒｓｅ、Ｓｋｙ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ、Ｂｒｔ、Ｔｉｆ）、Ａｘｌ、およびＭｅｒ（Ｅｙｋ、Ｎｙｋ、Ｔｙｒｏ−１２）を含む。
【０００３】
ヒトタンパク質Ａｘｌは８９４アミノ酸のタンパク質であり、その配列は配列表に配列番号８３として表される。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、前記ペプチドシグナルを含まないヒトタンパク質Ａｘｌは、配列表に配列番号８４として表される。
【０００４】
当初は増殖停止特異的遺伝子(growth arrest-specific gene)として単離されたＧａｓ６は、ＴＡＭファミリーのメンバーに共通のリガンドである。Ｇａｓ６はＡｘｌに対して最も高い親和性を示し、次いで、Ｔｙｒｏ３、最後にＭｅｒと続く。Ｇａｓ６は、リン脂質膜との結合を媒介するγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）リッチドメイン、４つの上皮細胞増殖因子様ドメイン、および２つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインからなる。多くの他のＲＴＫと同様に、リガンド結合は受容体の二量体化とチロシン残基（受容体Ａｘｌについては、チロシン残基７７９、８２１および８６６）の自己リン酸化をもたらし、これらが様々な細胞内シグナル伝達分子の合体部位として働く。さらに、Ａｘｌ受容体は、リガンド非依存的プロセスを介しても活性化され得る。この活性化は、Ａｘｌ受容体が過剰発現された際に起こり得る。
【０００５】
Ｇａｓ６／Ａｘｌシグナル伝達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多様な細胞において細胞増殖、接着、遊走および生存を含む、様々な細胞プロセスを調節することが示されている。加えて、ＴＡＭ受容体は自然免疫の制御にも関与し、それらは樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージにおいて病原体に対する炎症性応答を阻害する。ＴＡＭ受容体はまた、これらの免疫細胞によるアポトーシス細胞の貪食も駆動し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の成熟および細胞傷害活性に必要とされる。
【０００６】
Ａｘｌは、正常細胞では発現は弱く、主として線維芽細胞、骨髄前駆細胞、マクロファージ、神経組織、心筋および骨格筋に見られ、そこで主に細胞生存を助けている。Ｇａｓ６／Ａｘｌ系は、血管平滑筋細胞の恒常性を調節することにより血管の生物学に重要な役割を果たしている。
【０００７】
腫瘍細胞では、Ａｘｌは、細胞の浸潤および遊走の調節に重要な役割を果たす。Ａｘｌの過剰発現は不良な予後に関連するだけでなく、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌および子宮内膜癌に関して報告されているように、種々のヒト癌の浸潤性の増大にも関連する。乳癌では、Ａｘｌは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の強力なエフェクターであると思われ、ＥＭＴプログラムは、生物において癌細胞の移動および転移に能動的に寄与する。
【０００８】
Ａｘｌはまた、血管新生を調節することも示されている。実際に、内皮細胞におけるＡｘｌのノックダウンは、管形成および移動を損なうとともに、特異的血管新生シグナル伝達経路を混乱させた。
【０００９】
さらに最近では、一定範囲の細胞モデルにおけるいくつかの研究が、卵巣癌（シスプラチン）、ＧＩＳＴ（イマチニブ）、ＮＳＣＬＣ（ドキソルビシン、エルロチニブ）、ＡＭＬ（ドキソルビシン／シスプラチン）、乳癌（ラパチニブ）、星状細胞腫（テモゾロミド、カルボプラチン、ビンクリスチン）などの薬剤耐性現象におけるＡｘｌ過剰発現の関与を記載している。
【００１０】
このような文脈で、Ａｘｌは腫瘍学において興味深い標的と考えられる。いくつかのグループが、裸のモノクローナル抗体または標的化小分子のいずれかを用いた、ｇａｓ６／Ａｘｌ軸を標的とする抗腫瘍戦略をすでに開発している。
【００１１】
この文脈で、本発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）とも呼ばれる免疫複合体、または癌、より詳しくはＡｘｌ発現癌の治療のための複合体およびその使用に関する。
【００１２】
本発明は、少なくとも１種類の薬物（Ｄ）とコンジュゲートされた細胞結合剤（ＣＢＡ）、優先的には抗体を含んでなるＡＤＣに関し、ここで、前記ＣＢＡはＡｘｌに結合することができる。
【００１３】
ＡＤＣは、ＣＢＡの結合特異性と、例えば細胞傷害性薬剤などの薬物の効力を合わせたものである。モノクローナル抗体の開発、より効果的な薬物の使用、およびこれらの成分を共有結合させるための化学リンカーの設計に関連する技術は近年、急速に進んできた。
【００１４】
ＡＤＣの使用は、非複合体薬物として投与した場合に正常細胞に許容できない毒性をもたらし得る薬物の局所送達を可能とする。
【００１５】
言い換えれば、最小の毒性で最大の有効性が求められる。ＡＤＣを設計および精密化するための努力は、ＣＢＡの選択性、ならびに薬物の作用機序、薬物の結合、薬物／ＣＢＡ比（負荷率）、および薬物放出特性に注がれてきた。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、プロテアソームおよび／またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞傷害作用および細胞増殖抑制作用を付与し得る。細胞傷害性薬剤によっては、大きなＣＢＡとコンジュゲートすると不活性または低活性となる傾向がある。ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含んでなるＡＤＣが、例えば、ＷＯ２０１１１／１３０５９８に開示されている。
【００１６】
各ＣＢＡを個別に特性決定し、適当なリンカーを設計し、腫瘍細胞に送達した際にその効力を保持する好適な細胞傷害性薬剤を特定しなければならない。癌標的に対する抗原密度および正常組織がその標的抗原を発現するかどうかを考慮しなければならない。他の考慮すべき点としては、標的と結合した際にＡＤＣ全体がインターナリゼーションを受けるかどうか；正常組織暴露の可能性および／または処置する癌の種類および病期を考慮した場合に細胞増殖抑制薬剤または細胞傷害性薬剤が好ましいかどうかを含む。ＣＢＡと薬物弾頭を連結するリンカーは切断可能または切断不能な結合である。さらに、ＣＢＡと薬物成分のコンジュゲーション比は、ＣＢＡの結合活性および／または薬物の効力を損なわずに、十分なものでなければならない。
【００１７】
ＡＤＣは複雑な生物製剤であり、効果的なＡＤＣを開発するための挑戦はなお大きな問題である。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、この問題に取り組もうとするものであり、少なくとも１つの薬物（Ｄ）にコンジュゲートされた細胞結合剤（ＣＢＡ）を含んでなるＡＤＣに関し、ここで、前記ＣＢＡはＡｘｌと結合し得る抗体であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体と呼称）からなる。
【００１９】
本発明は、構造一般式：
ＣＢＡ−（Ｄ）ｎ
を有する抗体薬物複合体に関し、式中、
ＣＢＡは、配列番号１、２および３の配列の３つの軽鎖ＣＤＲと配列番号４、５および６の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなる抗体であり；ｎは１〜１２であり；かつ、Ｄは、式（ＡＢ）または（ＡＣ）：
【化１】
2016518382.tif 000002
を有するピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）からなる薬物であり、式中、
点線は、Ｃ１とＣ２またはＣ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、場合によりハロまたはジハロからさらに選択され；
ここで、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから独立に選択され；
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ１０は、ＣＢＡに連結されたリンカーであり；
Ｑは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立に選択され；
Ｒ１１は、ＨもしくはＲのいずれかであるか、またはＱはＯ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは金属陽イオンであり；
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基から選択され、場合により、基ＮＲＲ’に関しては、  ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒に、置換されていてもよい４員、５員、６員または７員複素環式環を形成していてもよく；
ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよく；かつ、
ここで、Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”およびＲ１１”は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、ＱおよびＲ１１に従って定義された通りであり、ＲＣは、キャッピング基である。
【００２０】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２はヒト化抗体である。
【００２１】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００２２】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１８〜２８の配列またはと配列番号１８〜２８少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００２３】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００２４】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３０〜４９の配列または配列番号３０〜４９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列から選択される重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００２５】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８１の配列または配列番号８１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８２の配列または配列番号８２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００２６】
一実施態様では、１６１３Ｆ１２は、
ａ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；または
ｄ）配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
を含んでなる抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される。
【００２７】
別の実施態様では、Ｒ１０は、
【化２】
2016518382.tif 000003
であり、式中、ＡはＬ１とＣＢＡを連結する連結基であり、Ｌ１は切断可能なリンカーであり、Ｌ２は共有結合であるか、または−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒に自壊的リンカーを形成し、かつ、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示す。
【００２８】
一実施態様では、Ａは、
【化３】
2016518382.tif 000004
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である）；または
【化４】
2016518382.tif 000005
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である）；または
【化５】
2016518382.tif 000006
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である）；または
【化６】
2016518382.tif 000007
（式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線はＣＢＡとの結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である）
から選択される。
【００２９】
一実施態様では、ＣＢＡは、ＣＢＡのシステインチオール残基とＡのマレミド基(malemide group)から形成されるチオエーテル結合を介してＡに連結されている。
【００３０】
一実施態様では、Ｌ１は、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−を含んでなり、基−Ｘ１−Ｘ２−は−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、Ｃｉｔはシトルリンである。
【００３１】
一実施態様では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒に基：
【化７】
2016518382.tif 000008
（式中、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示し、波線はリンカーＬ１との結合点を示し、Ｙは−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、かつ、ｎは０〜３である）
を形成する。
【００３２】
一実施態様では、Ｌ１およびＬ２は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒に、
【化８】
2016518382.tif 000009
（式中、アステリスクはＤのＮ１０位との結合点を示し、かつ、波線はリンカーＬ１の残りの部分との結合点またはＡとの結合点を示す）；または
【化９】
2016518382.tif 000010
（式中、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである）；または
【化１０】
2016518382.tif 000011
（式中、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである）
から選択される基を含んでなる。
【００３３】
一実施態様では、Ｄは、
【化１１】
2016518382.tif 000012
から選択される。
【００３４】
好ましい実施態様では、ＡＤＣは、
【化１２】
2016518382.tif 000013
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である）；または
【化１３】
2016518382.tif 000014
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である）
から選択される構造一般式のものである。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、ＡＤＣは、
【化１４】
2016518382.tif 000015
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である）；または
【化１５】
2016518382.tif 000016
（式中、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である）
から選択される構造一般式のものである。
【００３６】
一実施態様では、ｎは２である。
【００３７】
一実施態様では、ｎは４である。
【００３８】
本発明はまた、Ａｘｌ発現癌の治療において使用するためのこのようなＡＤＣに関する。
【００３９】
本発明はまた、本発明によるＡＤＣを少なくとも含んでなる組成物に関する。
【００４０】
一実施態様では、このような組成物は、薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物である。
【００４１】
本発明はまた、Ａｘｌ発現癌の治療において使用するための組成物に関する。
【００４２】
本発明は、Ａｘｌ発現癌の治療のためのＡＤＣのまたは組成物の使用に関する。
【００４３】
一実施態様では、前記Ａｘｌ発現癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である。
【００４４】
本発明はまた、対象においてＡｘｌ発現癌を治療するための方法であって、前記対象に有効量の少なくとも記載のようなＡＤＣまたは組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００４５】
本発明はまた、ｉ）記載のようなＡＤＣおよび／または組成物と、ｉｉ）前記ＡＤＣおよび／または組成物が配備されたシリンジまたはバイアルまたはアンプルとを少なくとも含んでなるキットに関する。
【発明の具体的説明】
【００４６】
Ｉ−細胞結合剤（ＣＢＡ）
本発明によれば、ＣＢＡは、Ａｘｌと結合し得る、後に１６１３Ｆ１２またはＡｘｌ抗体と命名された、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【００４７】
１６１３Ｆ１２は、２０１１年７月２８日にFrench collection for microorganism cultures（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）に番号Ｉ−４５０５として提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞の融合により得られたものである。
【００４８】
一実施態様では、本発明のＡｘｌ抗体は、後にｍ１６１３Ｆ１２と呼ばれるマウス抗体から優先的になる。
【００４９】
一実施態様では、本発明のＡｘｌ抗体は、後にｃ１６１３Ｆ１２と呼ばれるキメラ抗体から優先的になる。
【００５０】
一実施態様では、本発明のＡｘｌ抗体は、後にｈｚ１６１３Ｆ１２と呼ばれるヒト化抗体から優先的になる。
【００５１】
疑念を避けるため、以下の明細書において、「Ａｘｌ抗体」および「１６１３Ｆ１２」という表現は同等であり、（そうではないことが明示されない限り）１６１３Ｆ１２のマウス型、キメラ型およびヒト化型を含む。必要に応じて接頭辞ｍ−（マウス）、ｃ−（キメラ）またはｈｚ−（ヒト化）を使用する。
【００５２】
Ａｘｌ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得る。より詳しくは、前記標的は、Ａｘｌの細胞外ドメイン（Ａｘｌ  ＥＣＤドメインと呼称）に局在するエピトープである。
【００５３】
ヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号８３の配列のアミノ酸１〜４５１に相当する４５１アミノ酸のフラグメントであり、その配列は配列表に配列番号８５として表される。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当するので、シグナルペプチドを含まないヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号８３の配列のアミノ酸２６〜４５１に相当し、配列番号８６の配列で表される。
【００５４】
本発明の別の実施態様では、前記Ａｘｌ抗体は、前記ヒトタンパク質Ａｘｌとのその結合の後にインターナリゼーションを受ける。
【００５５】
本発明による抗体の「抗原結合フラグメント」により、抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）と結合する能力を保持し、より好ましくは、前記抗体の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を含んでなるいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すものとする。
【００５６】
好ましい実施態様では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントまたはダイアボディ、またはポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧもしくはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾によって、もしくはリポソーム内への組み込みによって半減期が延長されたと考えられるその任意のフラグメントからなる群において選択される（なお、前記フラグメントは、本発明による抗体の特徴的なＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する）。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、またはそれを含んでなると考えられ、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性と、標的に対して十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では、少なくとも１／１０に相当する親和性とを保持するのに十分なものである。このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列の、最低５個のアミノ酸、好ましくは、１０、１５、２５、５０および１００個の連続するアミノ酸を含むと考えられる。本発明の一実施態様では、前記抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列の３つの軽鎖ＣＤＲと配列番号４、５および６の配列の３つの重鎖ＣＤＲに相当するアミノ酸配列を含んでなる。
【００５７】
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的と定義することができる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を持つ。エピトープはまた、コンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施態様では、特定の三次元構造の特徴および／または特定の電荷特徴を持ち得る。
【００５８】
本出願では、エピトープは、ヒトタンパク質Ａｘｌの細胞外ドメインに局在する。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在し、好ましくは、配列番号８５もしくは８６の配列またはその天然変異体配列を有するエピトープと結合する。
【００６０】
一般的には、「と結合する」抗体などとは、十分な親和性で抗原と結合し得る抗体を意味し、従って、この抗体は抗原を発現する細胞の標的化に有用である。このＡｘｌ抗体の結合は、限定されるものではないが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫沈降（ＲＩＡ）またはＢＩＡＣＯＲＥまたは当業者に知られている任意の他の方法によって測定することができる。より詳しくは、「結合(binding)」、「結合する(binds)」などは、本抗体、またはその抗原結合フラグメントは、生理条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することが意図される。特異的結合は、少なくとも約１．１０−６Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑念を避けるため、それは前記抗体が低レベルで別の抗原と結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、好ましい実施態様としては、前記抗体は前記抗原のみと結合する。
【００６１】
Ａｘｌ抗体はまた、Ａｘｌが結合した後にインターナリゼーションを受ける高い能力を提供する。このような抗体はＡＤＣ成分の１つとして注目され、従って、それは連結された細胞傷害薬を標的とされる癌細胞へ向ける。ひと度、インターナリゼーションを受ければ、その細胞傷害薬は癌の細胞死を誘発する。
【００６２】
ＡＤＣ療法の成功の重要な鍵は、標的抗原特異性と抗体複合体の癌細胞へのインターナリゼーションであると思われる。明らかに、非インターナライズ性の抗原は、インターナライズ性の抗原よりも細胞傷害性薬剤を送達する効果が低い。インターナリゼーションプロセスは抗原間で異なり、結合するタンパク質によって影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。細胞表面ＲＴＫは、このようなアプローチを検討するために興味深い抗原ファミリーを構成する。
【００６３】
この生体分子では、細胞傷害薬は細胞傷害活性をもたらし、使用する抗原結合タンパク質は癌細胞に対するその特異性をもたらすとともに、細胞傷害薬を細胞内に入れて適切にアドレス指定するためのベクターとなる。
【００６４】
よって、ＡＤＣ分子を改良するためには、抗体は、標的癌細胞への高いインターナライズ能を示さなければならない。抗体がインターナリゼーションを媒介した効率は、標的エピトープによって有意に異なる。
【００６５】
本発明の意味における抗体はまた、ある特定のその抗体フラグメントも含む。前記抗体フラグメントは、供給源または免疫グロブリンのタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）にかかわらず、所望の結合特異性および親和性を示し、すなわち、抗体フラグメントは、本発明の全長抗体に匹敵する親和性でＡｘｌタンパク質と特異的に結合することができる。
【００６６】
一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメント、特にマウス起源のものの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマからの作製技術を参照することができる。
【００６７】
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗原に向けられ、かつ、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって生産され得る抗体分子を意味する。モノクローナル抗体はまた組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学によって作製されてもよい。さらに、一般に様々な決定基またはエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、天然源から精製により単離もしくは取得された、または遺伝子組換えもしくは化学合成により得られた抗体に関する。
【００６８】
本発明のＡｘｌ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも９０％、好ましくは９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも９０％、好ましくは９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００６９】
本発明の一実施態様では、Ａｘｌ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００７０】
好ましい態様では、ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴにより定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。相反する記述がなければ、ＣＤＲは、本明細書では、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される。
【００７１】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖のタイプ、または種が何であれ可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を有し、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）がそうである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは非占有の位置を表し、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の間にドットで区切って示される、例えば、［８．８．１３］）は、重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２次元グラフ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]、およびＩＭＧＴ／３次元構造−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]で用いられる。
【００７２】
本明細書において相反する記述がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものと理解しなければならない。
【００７３】
本発明の意味において、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後にこれらの配列を比較することにより慣行するが、この比較はセグメントによるか、または「アライメントウインドウ」を用いて行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ）の手段によって行うことができる。
【００７４】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアラインしたこれら２つの配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントのために、参照配列に対して付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、２配列間で、好ましくは２つの完全な配列間で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である位置の数を求め、この同一の位置の数をアライメントウインドウの位置の総数で割り、その商に１００を掛け、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより算出される。
【００７５】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択されるマトリックスは、例えば、このプログラムにより提案されている「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用することができ、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接算出される。
【００７６】
参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例としては、参照配列、ある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。ここで「等価なアミノ酸」という表現は、対応する抗体の生物活性を改変せずに構造アミノ酸の１つで置換され得る任意のアミノ酸を示すものとし、これらの具体例は以下に定義される。
【００７７】
等価なアミノ酸は、それらに代わって置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成可能な種々の抗原結合タンパク質間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに対して決定することができる。
【００７８】
限定されない例として、下表１に、対応する改変抗原結合タンパク質の生物活性の著しい改変を生じさせることなく実施可能な置換の可能性をまとめる。当然のことながら、同じ条件で逆の置換も可能である。
【００７９】
【表１】
2016518382.tif 000017
【００８０】
本発明の一実施態様では、Ａｘｌ抗体は、ｉ）配列番号７の配列、もしくは配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン；ならびに／またはｉｉ）配列番号８の配列、もしくは配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、ｍ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【００８１】
軽鎖（または重鎖、それぞれ）可変ドメインの配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列とは、３つの軽鎖（または重鎖、それぞれ）ＣＤＲを示し、さらに軽鎖（または重鎖、それぞれ）の全配列と、前記ＣＤＲに相当する配列以外で、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【００８２】
より明確にするため、下表２ａに、本発明のＡｘｌ抗体に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（ｍ．＝マウス）。
【００８３】
【表２】
2016518382.tif 000018
【００８４】
本発明の一実施態様では、Ａｘｌ抗体は、ｉ）配列番号７の配列、もしくは配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン；ならびに／またはｉｉ）配列番号８の配列、もしくは配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる、ｃ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【００８５】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を、その所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【００８６】
抗体、またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝学の技術を用いることにより作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にマウス、モノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体定常領域をコードする配列とを含有する組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような１つの組換え遺伝子によりコードされている本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体を作製するための方法については、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
【００８７】
本発明の一実施態様では、Ａｘｌ抗体は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【００８８】
本発明の一実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【００８９】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含有し、その抗体分子の他の部分は１つ（または数個の）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは結合親和性を保存するために改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
【００９０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に知られている技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているものなど）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的処置および／もしくは治療的処置を含む方法におけるそれらの使用のために好ましい。例えば、ＰＤＬにより欧州特許第０４５１２６１号、同第０６８２０４０号、同第０９３９１２７号、同第０５６６６４７号または米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術など、他のヒト化技術も当業者に知られている。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
【００９１】
本発明の一実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、または抗原結合フラグメントは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列からなる軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６の配列からなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００９２】
本発明の別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１８〜２８からなる群において選択される配列、または配列番号１８〜２８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６からなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【００９３】
本発明の別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８１の配列、または配列番号８１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６からなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００９４】
以上に定義されるような同一性パーセンテージを示すために、「配列番号１７、１８〜２８または８１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、さらに、配列番号１７、１８〜２８または８１の全配列と、前記ＣＤＲ（すなわち、配列番号１、２および３）に相当する配列以外で、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【００９５】
より明確にするため、下表２ｂに、本発明のヒト化Ａｘｌ抗体軽鎖（ＶＬ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（ｈｚ．＝ヒト化）。
【００９６】
【表３】
2016518382.tif 000019
【００９７】
本発明の一実施態様では、ＣＢＡは、
ｉ）配列番号１７の配列または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン、
ｉｉ）配列番号８１の配列または配列番号８１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン；および
ｉｉｉ）配列番号１８〜２８の配列または配列番号１８〜２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン
からなる群において選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【００９８】
本発明の一実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、または抗原結合フラグメントは、配列番号２９の配列、または配列番号２９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列からなる重鎖可変ドメインと；配列番号１、２および３の配列からなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【００９９】
本発明の別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３０〜４９からなる群において選択される配列、または配列番号３０〜４９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと；配列番号１、２および３からなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる。
【０１００】
本発明の別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８２の配列、または配列番号８２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと；配列番号１、２および３からなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１０１】
以上に定義されるような同一性パーセンテージを示すために、「配列番号２９、３０〜４９または８２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、さらに、配列番号２９、３０〜４９または８２の全配列と、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号２、３および４）以外で、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１０２】
より明確にするため、下表２ｃに、本発明のヒト化抗原結合タンパク質重鎖（ＶＨ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（ｈｚ．＝ヒト化）。
【０１０３】
【表４】
2016518382.tif 000020
【０１０４】
本発明の一実施態様では、ＣＢＡは、
ｉ）配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン、
ｉｉ）配列番号８２の配列または配列番号８２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；および
ｉｉｉ）配列番号３０〜４９の配列または配列番号３０〜４９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
からなる群において選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【０１０５】
本発明の一実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７〜２８および８１からなる群において選択される配列、または配列番号１７〜２８および８１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号２９〜４９および８２からなる群において選択される配列、または配列番号２９〜４９および８２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【０１０６】
本発明の一実施態様では、ＣＢＡは、
ｉ）配列番号１７〜２８もしくは８１から選択される配列、または配列番号１７〜２８もしくは８１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；
ｉｉ）配列番号２９〜４９および８２から選択される配列、または配列番号２９〜４９および８２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
を含んでなる、抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる。
【０１０７】
下表３ａに、本発明のＣＢＡに関する種々のヌクレオチド配列をまとめる（ｍ＝マウス）。
【０１０８】
【表５】
2016518382.tif 000021
【０１０９】
より明確にするため、下表３ｂに、本発明のｈｚ１６１３Ｆ１２軽鎖（ＶＬ）に相当する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１１０】
【表６】
2016518382.tif 000022
【０１１１】
より明確にするため、下表３ｃに、本発明のｈｚ１６１３Ｆ１２重鎖（ＶＨ）に相当する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１１２】
【表７】
2016518382.tif 000023
【０１１３】
用語「核酸」、「核酸配列(nucleic sequence)」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に用いられ、改変または非改変型の、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含有する、または含有しない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【０１１４】
本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境から、例えばコピーによって直接的または間接的にサンプリングされたものである。ここでまた、例えば宿主細胞の手段による組換え遺伝学によって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸も記載しておくべきであろう。
【０１１５】
ＩＩ−薬物（Ｄ）
好適な薬物部分は、ＷＯ２０１１／１３０５９８に記載されているＰＢＤ二量体であり得る。よって、本発明の好ましい薬物部分（Ｄ）は式（ＡＢ）または（ＡＣ）：
【化１６】
2016518382.tif 000024
を有するものであり、式中、
点線は、Ｃ１とＣ２またはＣ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示し；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、場合によりハロまたはジハロからさらに選択され；
ここで、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから独立に選択され；
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；
Ｒ１０は、上記のように、モジュレーターまたはそのフラグメントまたは誘導体に連結されたリンカーであり；
Ｑは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立に選択され；
Ｒ１１は、ＨもしくはＲのいずれかであるか、またはＱはＯ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは金属陽イオンであり；
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基から選択され、場合により、基ＮＲＲ’に関しては、  ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒に、置換されていてもよい４員、５員、６員または７員複素環式環を形成していてもよく；
Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよく；かつ、
ここで、Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”およびＲ１１”は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、ＱおよびＲ１１に従って定義された通りであり、ＲＣは、キャッピング基である。
【０１１６】
二重結合
一実施態様では、Ｃ１とＣ２、およびＣ２とＣ３の間に存在する二重結合はない。
【０１１７】
一実施態様では、点線は、以下に示されるように、Ｃ２とＣ３の間の二重結合の任意の存在を示す。
【化１７】
2016518382.tif 000025
【０１１８】
一実施態様では、Ｒ２がＣ５−２０アリールまたはＣ１−１２アルキルである場合、Ｃ２とＣ３の間に二重結合が存在する。
【０１１９】
一実施態様では、点線は、以下に示されるように、Ｃ１とＣ２の間の二重結合の任意の存在を示す。
【化１８】
2016518382.tif 000026
【０１２０】
一実施態様では、Ｒ２がＣ５−２０アリールまたはＣ１−１２アルキルである場合、Ｃ１とＣ２の間に二重結合が存在する。
【０１２１】
Ｒ２
一実施態様では、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、場合によりハロまたはジハロからさらに選択される。
【０１２２】
一実施態様では、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択される。
【０１２３】
一実施態様では、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ、および＝Ｃ（ＲＤ）２から独立に選択される。
【０１２４】
一実施態様では、Ｒ２は独立にＨである。
【０１２５】
一実施態様では、Ｒ２は独立に＝Ｏである。
【０１２６】
一実施態様では、Ｒ２は独立に＝ＣＨ２である。
【０１２７】
一実施態様では、Ｒ２は独立に＝ＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物の範囲内で、基＝ＣＨ−ＲＤは、以下に示されるいずれかの立体配置を持ち得る。
【化１９】
2016518382.tif 000027
【０１２８】
一実施態様では、この立体配置は立体配置（Ｉ）である。
【０１２９】
一実施態様では、Ｒ２は独立に＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１３０】
一実施態様では、Ｒ２は独立に＝ＣＦ２である。
【０１３１】
一実施態様では、Ｒ２は独立にＲである。
【０１３２】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０１３３】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである。
【０１３４】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０１３５】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいＣ５−７アリールである。
【０１３６】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいＣ８−１０アリールである。
【０１３７】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいフェニルである。
【０１３８】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいナフチルである。
【０１３９】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいピリジルである。
【０１４０】
一実施態様では、Ｒ２は独立に、置換されていてもよいキノリニルまたはイソキノリニルである。
【０１４１】
一実施態様では、Ｒ２は１〜３個の置換基を有し、１および２個がより好ましく、単一の置換基が最も好ましい。これらの置換基はいずれの位置であってもよい。
【０１４２】
Ｒ２がＣ５−７アリール基である場合、単一の置換基は好ましくは、化合物の残りの部分との結合に隣接しない環原子上にあり、すなわち、それは好ましくは、化合物の残りの部分との結合に対してβまたはγである。従って、Ｃ５−７アリール基がフェニルである場合、前記置換基は好ましくはメタ位またはパラ位であり、より好ましくはパラ位である。
【０１４３】
一実施態様では、Ｒ２は、
【化２０】
2016518382.tif 000028
から選択され、式中、アステリスクは結合点を示す。
【０１４４】
Ｒ２がＣ８−１０アリール基、例えば、キノリニルまたはイソキノリニルである場合、それはキノリンまたはイソキノリン環のいずれの位置にいずれの数の置換基を持っていてもよい。いくつかの実施態様では、それは１個、２個または３個の置換基を持ち、これらは近位環および遠位環のいずれかまたは（２個以上の置換基であれば）両方にあってもよい。
【０１４５】
一実施態様では、Ｒ２が置換されていてもよい場合、これらの置換基は、以下の置換基の節に示される置換基から選択される。
【０１４６】
Ｒが置換されていてもよい場合、これらの置換基は好ましくは、ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノおよびチオエーテルから選択される。
【０１４７】
一実施態様では、ＲまたはＲ２が置換されていてもよい場合、これらの置換基はＲ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０１４８】
Ｒ２がＣ１−１２アルキルである場合、任意選択の置換基はＣ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基をさらに含み得る。
【０１４９】
Ｒ２がＣ３−２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基はＣ１−１２アルキルおよびＣ５−２０アリール基をさらに含み得る。
【０１５０】
Ｒ２がＣ５−２０アリール基である場合、任意選択の置換基はＣ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ１−１２アルキル基をさらに含み得る。
【０１５１】
用語「アルキル」は、サブクラスであるアルケニルおよびアルキニルならびにシクロアルキルを包含すると理解される。よって、Ｒ２が置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである場合、そのアルキル基は１以上の炭素−炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、これはコンジュゲート系の一部を形成し得ると理解される。一実施態様では、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル基は少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または三重結合を含み、この結合はＣ１とＣ２、またはＣ２とＣ３の間に存在する二重結合と共役している。一実施態様では、Ｃ１−１２アルキル基は、飽和Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニルおよびＣ３−１２シクロアルキルから選択される基である。
【０１５２】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、それは好ましくはＦまたはＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０１５３】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、それは、いくつかの実施態様では、アルコキシ基、例えば、Ｃ１−７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であり得るか、またはそれはいくつかの実施態様では、Ｃ５−７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であり得る。
【０１５４】
Ｒ２上の置換基がＣ１−７アルキルである場合、それは好ましくは、Ｃ１−４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）であり得る。
【０１５５】
Ｒ２上の置換基がＣ３−７ヘテロシクリルである場合、それは、いくつかの実施態様では、Ｃ６窒素を含有するヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであり得る。これらの基は、窒素原子を介してＰＢＤ部分の残りの部分に結合されていてもよい。これらの基は、例えばＣ１−４アルキル基でさらに置換されていてもよい。
【０１５６】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレンである場合、これは好ましくはビス−オキシ−メチレンまたはビス−オキシ−エチレンである。
【０１５７】
Ｒ２に対する特に好ましい置換基としては、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノおよびメチル−チエニルが含まれる。
【０１５８】
特に好ましい置換Ｒ２基としては、限定されるものではないが、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イルおよびキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イルおよびイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル、およびナフチルが含まれる。
【０１５９】
特に好ましい非置換Ｒ２基はメチルである。
【０１６０】
一実施態様では、Ｒ２は、ハロまたはジハロである。一実施態様では、Ｒ２は、−Ｆまたは−Ｆ２であり、これらの置換基は以下にそれぞれ（ＩＩＩ）および（ＩＶ）として示される。
【化２１】
2016518382.tif 000029
【０１６１】
ＲＤ
一実施態様では、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから独立に選択される。
【０１６２】
一実施態様では、ＲＤは独立にＲである。
【０１６３】
一実施態様では、ＲＤは独立にハロである。
【０１６４】
Ｒ６
一実施態様では、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−およびハロから独立に選択される。
【０１６５】
一実施態様では、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２およびハロから独立に選択される。
【０１６６】
一実施態様では、Ｒ６は、Ｈおよびハロから独立に選択される。
【０１６７】
一実施態様では、Ｒ６は独立にＨである。
【０１６８】
一実施態様では、Ｒ６およびＲ７は一緒に基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−を形成し、ここで、ｐは１または２である。
【０１６９】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択される。
【０１７０】
一実施態様では、Ｒ７は独立にＯＲである。
【０１７１】
一実施態様では、Ｒ７は独立にＯＲ７Ａであり、ここで、Ｒ７Ａは独立に、置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【０１７２】
一実施態様では、Ｒ７Ａは独立に、置換されていてもよい飽和Ｃ１−６アルキルである。
【０１７３】
一実施態様では、Ｒ７Ａは独立に、置換されていてもよいＣ２−４アルケニルである。
【０１７４】
一実施態様では、Ｒ７Ａは独立にＭｅである。
【０１７５】
一実施態様では、Ｒ７Ａは独立にＣＨ２Ｐｈである。
【０１７６】
一実施態様では、Ｒ７Ａは独立にアリルである。
【０１７７】
一実施態様では、本化合物は、各単量体のＲ７基が一緒にこれらの単量体を連結する、式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成している二量体である。
【０１７８】
Ｒ９
一実施態様では、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−およびハロから独立に選択される。
【０１７９】
一実施態様では、Ｒ９は独立にＨである。
【０１８０】
一実施態様では、Ｒ９は独立にＲまたはＯＲである。
【０１８１】
ＲおよびＲ’
一実施態様では、Ｒは、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基から独立に選択される。これらの基はそれぞれ以下の置換基の節に定義される。
【０１８２】
一実施態様では、Ｒは独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである。
【０１８３】
一実施態様では、Ｒは独立に、置換されていてもよいＣ３−２０ヘテロシクリルである。
【０１８４】
一実施態様では、Ｒは独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０１８５】
一実施態様では、Ｒは独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである。
【０１８６】
Ｒ２に関して上記したものは、好ましいアルキルおよびアリール基ならびに任意選択の置換基の属性および数に関する種々の実施態様である。Ｒ２に関して示した選択肢は、それがＲに当てはまるように、適当であれば、他の総てのＲ基（例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８またはＲ９がＲである）についても適用可能である。
【０１８７】
Ｒの選択肢は、Ｒ’にも当てはまる。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施態様では、置換基−ＮＲＲ’を有する化合物が提供される。一実施態様では、ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒に、置換されていてもよい４員、５員、６員または７員複素環式環を形成する。この環はさらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、ＯまたはＳを含有してもよい。
【０１８９】
一実施態様では、前記複素環式環はそれ自体、Ｒ基で置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基はＮヘテロ原子上に存在し得る。
【０１９０】
Ｒ”
Ｒ”はＣ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよい。
【０１９１】
一実施態様では、Ｒ”はＣ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよい。
【０１９２】
一実施態様では、アルキレン基は、Ｏ、Ｓ、およびＮＭｅから選択される１個以上のヘテロ原子および／または芳香環が挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよい。
【０１９３】
一実施態様では、前記芳香環はＣ５−２０アリーレン基であり、アリーレンが、芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を取り去ることによって得られる二価部分に関係する場合、その部分は５〜２０個の環原子を有する。
【０１９４】
一実施態様では、Ｒ”はＣ３−１２アルキレン基であり、その鎖に１個以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環はＮＨ２で置換されていてもよい。
【０１９５】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基である。
【０１９６】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９およびＣ１１アルキレン基から選択される。
【０１９７】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５およびＣ７アルキレン基から選択される。
【０１９８】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ３およびＣ５アルキレン基から選択される。
【０１９９】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基である。
【０２００】
一実施態様では、Ｒ”は、Ｃ５アルキレン基である。
【０２０１】
上記に挙げたアルキレン基には１個以上のヘテロ原子および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよく、これらの環は置換されていてもよい。
【０２０２】
上記に挙げたアルキレン基には１個以上のヘテロ原子および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンが挿入されていてもよい。
【０２０３】
上記に挙げたアルキレン基は非置換直鎖脂肪族アルキレン基であり得る。
【０２０４】
Ｘ
一実施態様では、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｈ）から選択される。
【０２０５】
好ましくは、ＸはＯである。
【０２０６】
Ｒ１０
リンカーは、細胞結合剤（ＣＢＡ）とＰＢＤ薬物成分Ｄを１または複数の共有結合を介して結合させる。リンカーは、１以上の薬物成分（Ｄ）と細胞結合剤（ＣＢＡ）を連結して抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するために使用可能な二官能性部分または多官能性部分である。リンカー（Ｌ）は、細胞の外部、すなわち、細胞外では安定であり得るか、または酵素活性、加水分解、もしくは他の代謝条件によって切断可能であり得る。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、好都合には、薬物成分との、また抗体との結合に対して反応性官能性を有するリンカーを使用して作製することができる。システインチオール、またはアミン、例えば、抗体（Ａｂ）のＮ末端またはアミノ酸側鎖、例えばリシンは、リンカーまたはスペーサー試薬、ＰＢＤ薬物成分（Ｄ）または薬物−リンカー試薬（Ｄ−Ｌ）の官能基と結合を形成することができる。
【０２０７】
ＰＢＤ部分のＮ１０位に結合しているリンカー上の多くの官能基は、細胞結合剤と反応させるのに有用であり得る。例えば、エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、チオアミド結合、カルバメート結合、チオカルバメート結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、またはジスルフィド結合が、リンカー−ＰＢＤ薬物中間体と細胞結合剤の反応から形成され得る。
【０２０８】
ＡＤＣのリンカーは、好ましくは、ＡＤＣ分子の凝集を防ぎ、ＡＤＣを水性媒体中に自由に溶解し、かつ、単量体状態で保持する。
【０２０９】
ＡＤＣのリンカーは好ましくは細胞外で安定である。細胞に輸送または送達されるまで、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は好ましくは安定であり、完全な状態で留まり、すなわち、抗体は薬物成分と連結されたままである。リンカーは標的細胞の外部では安定であり、細胞内では、ある効果的な速度で切断され得る。有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し；（ｉｉ）複合体または薬物成分の細胞内送達を可能とし；（ｉｉｉ）複合体がその標的部位に送達または輸送されるまで安定かつ完全な状態で留まる、すなわち、切断されない；および（ｉｖ）ＰＢＤ薬物成分の細胞傷害性、細胞死滅作用または細胞増殖抑制作用を保持する。ＡＤＣの安定性は、質量分析、ＨＰＬＣ、および分離／分析技術ＬＣ／ＭＳなどの標準的な分析技術によって測定され得る。
【０２１０】
抗体と薬物成分の共有結合には、２つの反応性官能基を有する、すなわち、反応性に関して二価のリンカーが必要である。２以上の官能性部分または生物学的に活性な部分、例えば、ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン、およびリポーター基を結合させるのに有用な二価リンカー試薬、ならびにそれらの結果として得られる複合体が記載されている方法は既知である(Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242)。
【０２１１】
別の実施態様では、リンカーは、凝集、溶解度または反応性を調節する基で置換されてもよい。例えば、スルホネート置換基は、試薬の水溶解度を高め得るか、リンカー試薬と抗体または薬物成分のカップリング反応を促進し得るか、またはＡＤＣを作製するために使用する合成経路に応じて、Ａｂ−ＬとＤ、もしくはＤ−ＬとＡｂのカップリング反応を促進し得る。
【０２１２】
一実施態様では、Ｒ１０は基：
【化２２】
2016518382.tif 000030
であり、式中、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、ＣＢＡは細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１はリンカーであり、ＡはＬ１と細胞結合剤を連結する連結基であり、Ｌ２は共有結合であるか、または−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒に自壊的リンカーを形成し、かつ、Ｌ１またはＬ２は切断可能なリンカーである。
【０２１３】
Ｌ１は好ましくは切断可能なリンカーであり、切断のためのリンカーの活性化のトリガーと言うことができる。
【０２１４】
存在する場合、Ｌ１およびＬ２の性質は広範囲に異なり得る。これらの基は、複合体が送達される部位の条件によって指定され得るそれらの切断の特徴に基づいて選択される。酵素の作用によって切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸または塩基解離性）、温度または照射（例えば、光解離性）によって切断可能なリンカーも使用可能である。還元または酸化条件下で切断可能なリンカーも本発明において使用が見出せる。
【０２１５】
Ｌ１は、連続するアミノ酸配列を含んでなり得る。このアミノ酸配列は、Ｎ１０位からＲ１０の放出を可能とする酵素的切断の標的基質であり得る。
【０２１６】
一実施態様では、Ｌ１は、酵素の作用により切断され得る。一実施態様では、この酵素はエステラーゼまたはペプチダーゼである。
【０２１７】
一実施態様では、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒に自壊的リンカーを形成する。一実施態様では、Ｌ２は、Ｎ１０位からＲ１０の放出を可能とする酵素活性の基質である。
【０２１８】
一実施態様では、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、かつ、Ｌ２が存在する場合、その酵素はＬ１とＬ２の間の結合を切断する。
【０２１９】
Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合によって連結され得る。
【０２２０】
Ｌ２に連結するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来してもよい。
【０２２１】
Ｌ２に連結するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来してもよい。
【０２２２】
Ｌ２に連結するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来してもよい。
【０２２３】
用語「アミノ酸側鎖」には、（ｉ）天然アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン；（ｉｉ）希少アミノ酸、例えば、オルニチンおよびシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、β−アミノ酸、天然アミノ酸の合成類似体および誘導体；ならびに（ｉｖ）総ての鏡像異性体、ジアステレオマー、それらの異性体的に富化された形態、同位体標識形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護形態、およびラセミ混合物に見られる基が含まれる。
【０２２４】
一実施態様では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒に基：
【化２３】
2016518382.tif 000031
を形成し、ここで、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、波線はリンカーＬ１との結合点を示し、Ｙは−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、かつ、ｎは０〜３である。フェニレン環は、本明細書に記載されるように１、２または３個の置換基で置換されていてもよい。一実施態様では、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、ＲまたはＯＲで置換されていてもよい。
【０２２５】
一実施態様では、ＹはＮＨである。
【０２２６】
一実施態様では、ｎは０または１である。好ましくは、ｎは０である。
【０２２７】
ＹがＮＨであり、かつ、ｎが０である場合、自壊的リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と呼ばれ得る。
【０２２８】
自壊的リンカーは、遠隔部位が活性化された際に保護された化合物の放出を可能とし、これは以下に示すように進行する（ｎ＝０の場合）：
【化２４】
2016518382.tif 000032
（式中、Ｌ＊は、リンカーの残りの部分の活性形態である）。これらの基は、活性化部位を保護される化合物から隔離する利点を有する。上記のように、フェニレン基は置換されていてもよい。
【０２２９】
本明細書に記載の一実施態様では、基Ｌ＊は、本明細書に記載されるようなリンカーＬ１であり、ジペプチド基を含み得る。
【０２３０】
別の実施態様では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒に、
【化２５】
2016518382.tif 000033
から選択される基を形成し、ここで、アステリスク、波線、Ｙ、およびｎは上記で定義される通りである。各フェニレン環は、本明細書に記載されるように１、２または３個の置換基で置換されていてもよい。一実施態様では、Ｙ置換基を有するフェニレン環は置換されていてもよく、Ｙ置換基を有さないフェニレン環は非置換型である。一実施態様では、Ｙ置換基を有するフェニレン環は非置換型であり、Ｙ置換基を有さないフェニレン環は置換されていてもよい。
【０２３１】
別の実施態様では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒に
【化２６】
2016518382.tif 000034
から選択される基を形成し、ここで、アステリスク、波線、Ｙ、およびｎは上記で定義される通りであり、ＥはＯ、ＳまたはＮＲであり、ＤはＮ、ＣＨ、またはＣＲであり、かつ、ＦはＮ、ＣＨ、またはＣＲである。
【０２３２】
一実施態様では、ＤはＮである。
【０２３３】
一実施態様では、ＤはＣＨである。
【０２３４】
一実施態様では、ＥはＯまたはＳである。
【０２３５】
一実施態様では、ＦはＣＨである。
【０２３６】
好ましい実施態様では、リンカーは、カテプシン解離性リンカーである。
【０２３７】
一実施態様では、Ｌ１はジペプチドを含んでなる。ジペプチドは−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−と表すことができ、ここで、−ＮＨ−および−ＣＯ−はそれぞれ、アミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、いずれの組合せの天然アミノ酸であってもよい。リンカーがカテプシン解離性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシンを介した切断の作用部位であり得る。
【０２３８】
加えて、それらのアミノ酸について、カルボキシル側鎖またはアミノ側鎖官能性を有する基、例えば、それぞれＧｌｕおよびＬｙｓ、ＣＯおよびＮＨは、その鎖官能性を表し得る。
【０２３９】
一実施態様では、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、
−Ｖａｌ−Ａｌａ−、
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、
−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、
−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、
−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、
−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、
−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−
から選択され、ここで、Ｃｉｔはシトルリンである。
【０２４０】
好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、
−Ｖａｌ−Ａｌａ−、
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、
−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−
から選択される。
【０２４１】
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
【０２４２】
他のジペプチド組合せも、引用することにより本明細書の一部とされるDubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869に記載されているものを含め、使用可能である。
【０２４３】
一実施態様では、アミノ酸側鎖は、適当であれば誘導体化される。例えば、アミノ酸側鎖のアミノ基またはカルボキシ基が誘導体化され得る。
【０２４４】
一実施態様では、リシンなどの側鎖アミノ酸のアミノ基ＮＨ２は、ＮＨＲおよびＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
【０２４５】
一実施態様では、アスパラギン酸などの側鎖アミノ酸のカルボキシ基ＣＯＯＨは、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲおよびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
【０２４６】
一実施態様では、アミノ酸側鎖は、適当であれば化学的に保護される。側鎖保護基は、基ＲＬに関して後述される基であり得る。保護されたアミノ酸配列は、酵素により切断可能である。例えば、Ｂｏｃ側鎖保護Ｌｙｓ残基を含んでなるジペプチド配列はカテプシンにより切断可能であることが確認されている。
【０２４７】
アミノ酸の側鎖の保護基は当技術分野で周知であり、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログに記載されている。さらなる保護基戦略はProtective Groups in Organic Synthesis, Greene and Wutsに示されている。
【０２４８】
反応性側鎖官能性を有するアミノ酸に関して、可能な側鎖保護基を以下に示す：
Ａｒｇ：Ｚ、Ｍｔｒ、Ｔｏｓ；
Ａｓｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ａｓｐ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｃｙｓ：Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、Ｔｒｔ；
Ｇｌｕ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｇｌｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ｈｉｓ：Ｂｏｃ、Ｄｎｐ、Ｔｏｓ、Ｔｒｔ；
Ｌｙｓ：Ｂｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、Ａｌｌｏｃ；
Ｓｅｒ：Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ；
Ｔｈｒ：Ｂｚ；
Ｔｒｐ：Ｂｏｃ；
Ｔｙｒ：Ｂｚｌ、Ｚ、Ｚ−Ｂｒ。
【０２４９】
一実施態様では、側鎖保護は、存在する場合には、キャッピング基として、またはその一部として提供される基に直行するように選択される。よって、側鎖保護基を除去しても、キャッピング基、またはキャッピング基の一部である保護基の官能性が除去されることはない。
【０２５０】
本発明の他の実施態様では、選択されるアミノ酸は、反応性側鎖官能性を持たないものである。例えば、アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、およびＶａｌから選択され得る。
【０２５１】
一実施態様では、ジペプチドは、自壊的リンカーと組み合わせて使用される。自壊的リンカーは−Ｘ２−に連結することができる。
【０２５２】
自壊的リンカーが存在する場合、−Ｘ２−は自壊的リンカーに直接連結される。好ましくは、基−Ｘ２−ＣＯ−をＹ（ＹはＮＨである）に連結し、それにより基−Ｘ２−ＣＯ−ＮＨ−が形成される。
【０２５３】
−ＮＨ−Ｘ１−はＡに直接連結する。Ａは、官能基−ＣＯ−を含んでなってよく、それにより、−Ｘ１−とアミド結合が形成される。
【０２５４】
一実施態様では、Ｌ１およびＬ２は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒に基ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−ＰＡＢＣ−を含んでなる。ＰＡＢＣ基はＮ１０位に直接連結する。好ましくは、自壊的リンカーおよびジペプチドは一緒に基−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示され：
【化２７】
2016518382.tif 000035
ここで、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、波線はリンカーＬ１の残りの部分との結合点、またはＡとの結合点を示す。好ましくは、波線はＡとの結合点を示す。Ｌｙｓアミノ酸の側鎖は、上記のように、例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、またはＡｌｌｏｃで保護されてもよい。
【０２５５】
あるいは、自壊的リンカーおよびジペプチドは一緒に基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示され：
【化２８】
2016518382.tif 000036
ここで、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである。
【０２５６】
あるいは、自壊的リンカーおよびジペプチドは一緒に基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し、これは以下に示され：
【化２９】
2016518382.tif 000037
ここで、アステリスクおよび波線は上記で定義される通りである。
【０２５７】
本発明のいくつかの実施態様では、ＰＢＤ／薬物成分が非保護イミン結合を含む場合、例えば、部分Ｂが存在する場合には、リンカーは遊離アミノ（Ｈ２Ｎ−）基を含まないことが好ましいものであり得る。従って、リンカーが構造−Ａ−Ｌ１−Ｌ２−を有する場合には、これは遊離アミノ基を含まないことが好ましい。この選択肢は特に、リンカーが例えばＬ１としてジペプチドを含む場合に特に関連し、この実施態様では、２個のアミノ酸のうち１個はリシンから選択されないことが好ましいと考えられる。
【０２５８】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、薬物成分における非保護イミン結合とリンカーにおける遊離アミノ基の組合せは、このような薬物−リンカー部分と抗体とのコンジュゲーションに干渉し得る薬物−リンカー部分の二量体化を招くことがあると考えられる。これらの基の交差反応は、遊離アミノ基がアンモニウムイオン（Ｈ３Ｎ＋−）として存在する場合、例えば、遊離アミノ基を脱保護するために強酸（例えば、ＴＦＡ）が使用された場合に加速化され得る。
【０２５９】
一実施態様では、Ａは共有結合である。従って、Ｌ１と細胞結合剤は直接連結される。例えば、Ｌ１が連続するアミノ酸配列を含んでなる場合には、その配列のＮ末端を細胞結合剤に直接連結させることができる。
【０２６０】
従って、Ａが共有結合である場合、細胞結合剤とＬ１の間の連結は、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−Ｓ−、
−Ｓ−Ｓ−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、および
＝Ｎ−ＮＨ−
から選択される。
【０２６１】
細胞結合剤と連結するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得るか、またはアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来してもよい。
【０２６２】
細胞結合剤と連結するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得るか、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来してもよい。
【０２６３】
結合剤と連結するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来してもよい。
【０２６４】
結合剤と連結するＬ１のチオール基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のチオール基に由来してもよい。
【０２６５】
Ｌ１のアミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよびチオール基に関する上記の注釈は、細胞結合剤にも当てはまる。
【０２６６】
一実施態様では、Ｌ２は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒に
【化３０】
2016518382.tif 000038
を表し、ここで、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、波線はＬ１との結合点を示し、ｎは０〜３であり、Ｙは共有結合または官能基であり、かつ、Ｅは、例えば酵素作用または光により活性化可能であり、それにより自壊的単位を生成する基である。フェニレン環は、本明細書に記載されるように、１、２または３個の置換基でさらに置換されていてもよい。一実施態様では、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、ＲまたはＯＲでさらに置換されていてもよい。好ましくは、ｎは０または１であり、最も好ましくは、０である。
【０２６７】
Ｅは、基が例えば光によるまたは酵素の作用による活性化に感受性となるように選択される。Ｅは−ＮＯ２またはグルクロン酸であり得る。前者はニトロレダクターゼの作用に、後者はβ−グルクロニダーゼの作用に感受性があり得る。
【０２６８】
この実施態様では、自壊的リンカーは、Ｅが活性化された際に保護された化合物の放出を可能とし、これは以下に示すように進行する（ｎ＝０の場合）：
【化３１】
2016518382.tif 000039
（式中、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、Ｅ＊はＥの活性化形態であり、かつ、Ｙは上記の通りである）。これらの基は、活性化部位を保護される化合物から隔離する利点を有する。上記のように、フェニレン基は置換されていてもよい。
【０２６９】
基ＹはＬ１との共有結合であり得る。
【０２７０】
基Ｙは
−Ｃ（＝Ｏ）−
−ＮＨ−
−Ｏ−
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、および
−Ｓ−
から選択される官能基であり得る。
【０２７１】
Ｌ１がジペプチドである場合、Ｙは−ＮＨ−または−Ｃ（＝Ｏ）−であることが好ましく、それにより、Ｌ１とＹの間にアミド結合を形成する。この実施態様では、ジペプチド配列は、酵素活性の基質である必要はない。
【０２７２】
別の実施態様では、Ａはスペーサー基である。従って、Ｌ１と細胞結合剤は間接的に連結される。
【０２７３】
Ｌ１とＡは、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合によって連結され得る。
【０２７４】
好ましくは、リンカーは、細胞結合剤上の求核官能基との反応のための求電子官能基を含有する。抗体上の求核基としては、限定されるものではないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合には、糖のヒドロキシル基またはアミノ基が含まれる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート、および酸ハリドなどの活性エステル；（ｉｖ）アルキルおよびベンジルハリド、例えばハロアセトアミド；および（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができ、そのいくつかが次のように例示される。
【化３２】
2016518382.tif 000040
【０２７５】
ある種の抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤で処理することによってリンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核試薬を形成する。リシンを２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応させてアミンをチオールに変換することにより、さらなる求核基を抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４、またはそれを超えるシステイン残基を導入することにより、抗体（またはそのフラグメント）に導入することができる（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製する）。ＵＳ７５２１５４１は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体操作を教示している。
【０２７６】
いくつかの実施態様では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応性がある反応性求核基を有する。抗体上の有用な求電子基としては、限定されるものではないが、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が含まれる。リンカーの求核基のヘテロ原子は抗体上の求電子基と反応し、抗体単位と共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基としては、限定されるものではないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、およびアリールヒドラジドが含まれる。抗体上の求電子基はリンカーとの結合に好都合な部位を提供する。
【０２７７】
一実施態様では、基Ａは、
【化３３】
2016518382.tif 000041
であり、ここで、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である。一実施態様では、ｎは５である。
【０２７８】
一実施態様では、基Ａは、
【化３４】
2016518382.tif 000042
であり、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、かつ、ｎは０〜６である。一実施態様では、ｎは５である。
【０２７９】
一実施態様では、基Ａは、
【化３５】
2016518382.tif 000043
であり、式中、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である。好ましい実施態様では、ｎは１であり、かつ、ｍは０〜１０、１〜８、好ましくは４〜８、最も好ましくは４または８である。別の実施態様では、ｍは１０〜３０、好ましくは２０〜３０である。あるいは、ｍは０〜５０である。この実施態様では、ｍは好ましくは１０〜４０であり、かつ、ｎは１である。
【０２８０】
一実施態様では、基Ａは、
【化３６】
2016518382.tif 000044
であり、ここで、アステリスクはＬ１との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、ｎは０または１であり、かつ、ｍは０〜３０である。好ましい実施態様では、ｎは１であり、かつ、ｍは０〜１０、１〜８、好ましくは４〜８、最も好ましくは４または８である。別の実施態様では、ｍは１０〜３０、好ましくは２０〜３０である。あるいは、ｍは０〜５０である。この実施態様では、ｍは好ましくは１０〜４０であり、かつ、ｎは１である。
【０２８１】
一実施態様では、細胞結合剤とＡの間の連結は、細胞結合剤のチオール残基とＡのマレイミド基を介したものである。
【０２８２】
一実施態様では、細胞結合剤とＡの間の連結は
【化３７】
2016518382.tif 000045
であり、ここで、アステリスクはＡの残りの部分との結合点を示し、かつ、波線は細胞結合剤の残りの部分との結合点を示す。この実施態様では、Ｓ原子は一般に細胞結合剤に由来する。
【０２８３】
上記実施態様のそれぞれにおいて、以下に示すマレイミド由来基：
【化３８】
2016518382.tif 000046
の代わりに別の官能基を用いてもよく、式中、波線は上記の通り細胞結合剤との結合点を示し、かつ、アステリスクはＡ基の残りの部分との結合を示す。
【０２８４】
一実施態様では、マレイミド由来基は、基：
【化３９】
2016518382.tif 000047
に置き換えられ、式中、波線は細胞結合剤との結合点を示し、かつ、アステリスクはＡ基の残りの部分との結合を示す。
【０２８５】
一実施態様では、マレイミド由来基は、場合により細胞結合剤とともに
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）−、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、
−Ｓ−、
−Ｓ−Ｓ−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、
＝Ｎ−ＮＨ−、および
−ＮＨ−Ｎ＝
から選択される基で置き換えられる。
【０２８６】
一実施態様では、マレイミド由来基は、場合により細胞結合剤とともに、
【化４０】
2016518382.tif 000048
から選択される基で置き換えられ、ここで、波線は細胞結合剤との結合点またはＡ基の残りの部分との結合のいずれかを示し、かつ、アステリスクは細胞結合剤との結合点またはＡ基の残りの部分との結合の他方のものを示す。
【０２８７】
Ｌ１と細胞結合剤を連結するために好適な他の基は、ＷＯ２００５／０８２０２３に記載されている。
【０２８８】
基ＲＣは、Ｎ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、ＱＲ１１がＯＳＯ３Ｍである場合には重亜硫酸付加物、チオカルビノールアミン、置換チオカルビノールアミン、または置換カルビナルアミンを残すようにＰＢＤ部分のＮ１０位から除去可能である。
【０２８９】
一実施態様では、ＲＣは、Ｎ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、またはＱＲ１１がＯＳＯ３Ｍである場合には重亜硫酸付加物を残すように除去可能な保護基であり得る。一実施態様では、ＲＣは、Ｎ１０−Ｃ１１イミン結合を残すように除去可能な保護基である。
【０２９０】
基Ｒｃは、例えばＮ１０−Ｃ１１イミン結合、カルビノールアミンなどを得るための基Ｒ１０の除去に必要なものと同じ条件下で除去可能であることが意図される。このキャッピング基は、Ｎ１０位における意図される官能基の保護基として働く。キャッピング基は、細胞結合剤に対して反応性が無いように意図される。例えば、ＲＣは、ＲＬと同じでない。
【０２９１】
キャッピング基を有する化合物は、イミン単量体を有する二量体の合成における中間体として使用可能である。あるいは、キャッピング基を有する化合物は、キャッピング基が目的の場所で除去されてイミン、カルビノールアミン、置換カルビノールアミンなどとなる場合のコンジュゲートとして使用可能である。従って、この実施態様では、キャッピング基は、ＷＯ００／１２５０７に定義されているように、治療的に除去可能な窒素保護基と言うことができる。
【０２９２】
一実施態様では、基ＲＣは、基Ｒ１０のリンカーＲＬを切断する条件下で除去可能である。従って、一実施態様では、キャッピング基は、酵素の作用によって切断可能である。
【０２９３】
別の実施態様では、キャッピング基は、リンカーＲＬと細胞結合剤の連結の前に除去可能である。この実施態様では、キャッピング基は、リンカーＲＬを切断しない条件下で除去可能である。
【０２９４】
化合物が細胞結合剤との連結を形成するために官能基Ｇ１を含む場合、キャッピング基は、Ｇ１の付加またはアンマスキングの前に除去可能である。
【０２９５】
キャッピング基は、二量体中の単量体単位の一方だけが細胞結合剤と連結されることを保証するための保護基戦略の一部として使用可能である。
【０２９６】
キャッピング基はＮ１０−Ｃ１１イミン結合のマスクとして使用可能である。キャッピング基は、その化合物においてイミン官能基が必要とされる時点で除去することができる。キャッピング基はまた、上記のように、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、および重亜硫酸付加物のマスクでもある。
【０２９７】
一実施態様では、ＲＣはカルバメート保護基である。
【０２９８】
一実施態様では、カルバメート保護基は、Ａｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、ＣｂｚおよびＰＮＺから選択される。
【０２９９】
場合により、カルバメート保護基はＭｏｃからさらに選択される。
【０３００】
一実施態様では、ＲＣは、細胞結合剤と連結するための官能基を欠くリンカー基ＲＬである。
【０３０１】
本出願では、特に、カルバメートであるＲＣ基に関連する。
【０３０２】
一実施態様では、ＲＣは基：
【化４１】
2016518382.tif 000049
であり、ここで、アステリスクはＮ１０位との結合点を示し、Ｇ２は末端基であり、Ｌ３は共有結合または切断可能なリンカーＬ１であり、Ｌ２は共有結合であるかまたはＯＣ（＝Ｏ）と一緒に自壊的リンカーを形成する。
【０３０３】
Ｌ３およびＬ２が両方とも共有結合である場合、上記で定義されるように、Ｇ２およびＯＣ（＝Ｏ）は一緒にカルバメート保護基を形成する。
【０３０４】
Ｌ１は、Ｒ１０に関して上記で定義される通りである。
【０３０５】
Ｌ２は、Ｒ１０に関して上記で定義される通りである。
【０３０６】
種々の末端基を、周知の保護基に基づくものを含め、以下に記載する。
【０３０７】
一実施態様では、Ｌ３は切断可能なリンカーＬ１であり、かつ、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）と一緒に自壊的リンカーを形成する。この実施態様では、Ｇ２はＡｃ（アセチル）またはＭｏｃ、またはＡｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、ＣｂｚおよびＰＮＺから選択されるカルバメート保護基である。
【０３０８】
場合により、カルバメート保護基は、Ｍｏｃからさらに選択される。
【０３０９】
別の実施態様では、Ｇ２はアシル基−Ｃ（＝Ｏ）Ｇ３であり、ここで、Ｇ３はアルキル（シクロアルキル、アルケニルおよびアルキニルを含む）、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルおよびアリール（ヘテロアリールおよびカルボアリールを含む）から選択される。これらの基は置換されていてもよい。アシル基は、適当であれば、Ｌ３またはＬ２のアミノ基と一緒にアミド結合を形成していてもよい。アシル基は、適当であれば、Ｌ３またはＬ２のヒドロキシ基と一緒にエステル結合を形成していてもよい。
【０３１０】
一実施態様では、Ｇ３はヘテロアルキルである。ヘテロアルキル基は、ポリエチレングリコールを含んでなり得る。ヘテロアルキル基は、アシル基に隣接する、ＯまたはＮなどのヘテロ原子を有し、それにより、適当であれば基Ｌ３またはＬ２中に存在するヘテロ原子とともに、適当であればカルバメート基またはカーボネート基を形成してもよい。
【０３１１】
一実施態様では、Ｇ３は、ＮＨ２、ＮＨＲおよびＮＲＲ’から選択される。好ましくは、Ｇ３はＮＲＲ’である。
【０３１２】
一実施態様では、Ｇ２は基：
【化４２】
2016518382.tif 000050
であり、ここで、アステリスクはＬ３との結合点を示し、ｎは０〜６であり、かつ、Ｇ４はＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２およびＮＨＲは保護される。一実施態様では、ｎは１〜６であり、好ましくはｎは５である。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４はＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくは、Ｇ４はＯＲである。最も好ましくは、Ｇ４はＯＭｅである。
【０３１３】
一実施態様では、基Ｇ２は、
【化４３】
2016518382.tif 000051
であり、アステリスクはＬ３との結合点を示し、かつ、ｎおよびＧ４は上記で定義される通りである。
【０３１４】
一実施態様では、基Ｇ２は、
【化４４】
2016518382.tif 000052
であり、ここで、アステリスクはＬ３との結合点を示し、ｎは０または１であり、ｍは０〜５０であり、かつ、Ｇ４はＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される。好ましい実施態様では、ｎは１であり、かつ、ｍは０〜１０、１〜２、好ましくは４〜８、最も好ましくは４または８である。別の実施態様では、ｎは１であり、かつ、ｍは１０〜５０、好ましくは２０〜４０である。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２およびＮＨＲは保護される。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４はＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくはＧ４はＯＲである。好ましくは、Ｇ４はＯＭｅである。
【０３１５】
一実施態様では、基Ｇ２は、
【化４５】
2016518382.tif 000053
であり、ここで、アステリスクはＬ３との結合点を示し、かつ、ｎ、ｍおよびＧ４は上記で定義される通りである。
【０３１６】
一実施態様では、基Ｇ２は、
【化４６】
2016518382.tif 000054
であり、ここで、ｎは１〜２０であり、ｍは０〜６であり、かつ、Ｇ４はＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される。一実施態様では、ｎは１〜１０である。別の実施態様では、ｎは１０〜５０、好ましくは２０〜４０である。一実施態様では、ｎは１である。一実施態様では、ｍは１である。基ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２およびＮＨＲは保護される。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施態様では、Ｇ４はＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４はＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくはＧ４はＯＲである。好ましくは、Ｇ４はＯＭｅである。
【０３１７】
一実施態様では、基Ｇ２は、
【化４７】
2016518382.tif 000055
であり、ここで、アステリスクはＬ３との結合点を示し、かつ、ｎ、ｍおよびＧ４は上記で定義される通りである。
【０３１８】
上記実施態様のそれぞれにおいて、Ｇ４はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２およびＮＨＲであり得る。これらの基は好ましくは保護される。
【０３１９】
一実施態様では、ＯＨは、Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、またはＴＢＤＰＳで保護される。
【０３２０】
一実施態様では、ＳＨは、Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、またはＴｒｔで保護される。
【０３２１】
一実施態様では、ＮＨ２またはＮＨＲは、Ｂｏｃ、Ｍｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、またはＡｌｌｏｃで保護される。
【０３２２】
一実施態様では、基Ｇ２は、基Ｌ３との組合せで存在し、この基はジペプチドである。
【０３２３】
このキャッピング基は、細胞結合剤との連結のために意図されるものではない。従って、この二量体中に存在する他の単量体が、リンカーを介して細胞結合剤との連結点として機能する。よって、キャッピング基中に存在する官能基は細胞結合剤との反応に利用できないことが好ましい。従って、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨなどの反応性官能基を避けることが好ましい。しかしながら、このような官能基は、上記のように、保護されればキャッピング基中に存在してもよい。
【０３２４】
特に断りのない限り、上記にはこれらの置換基の周知のイオン、塩、溶媒和物、および保護形態が含まれる。例えば、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）という場合には、陰イオン（カルボキシレート）形態（−ＣＯＯ−）、その塩または溶媒和物、ならびに従来の保護形態も含む。同様に、アミノ基という場合には、そのプロトン化形態（−Ｎ＋ＨＲ１Ｒ２）、アミノ基の塩または溶媒和物、例えば、塩酸塩、ならびにアミノ基の従来の保護形態を含む。同様に、ヒドロキシル基という場合には、その陰イオン形態（−Ｏ−）、塩または溶媒和物、ならびに従来の保護形態も含む。
【０３２５】
異性体
本発明のある特定の化合物は、１以上の特定の幾何異性型、光学異性型、鏡像異性型、ジアステレオマー型、エピマー型、アトロプ異性型、立体異性型、互変異性型、配座異性型、またはアノマー型で存在してもよく、限定されるものではないが、シス型およびトランス型；Ｅ型およびＺ型；ｃ型、ｔ型、およびｒ型；エンド型およびエキソ型；Ｒ型、Ｓ型、およびメソ型；Ｄ型およびＬ型；ｄ型およびｌ型；（＋）型および（−）型；ケト型、エノール型、およびエノラート型；ｓｙｎ型およびａｎｔｉ型；シンクリナル型およびアンチクリナル型；α型およびβ型；アクシアル型およびエカトリアル型；舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型、および半いす型；およびそれらの組合せを含み、以下、「異性体」（または「異性型」）と総称する。
【０３２６】
用語「キラル」は、鏡像相手と重ね合せできない(non-superimposability)特性を有する分子を意味し、用語「アキラル」は、それらの鏡像相手と重ね合せできる(superimposability)分子を意味する。
【０３２７】
用語「立体異性体」は、同一の化学構成を有するが、空間内の原子または基の配置が異なる化合物を意味する。
【０３２８】
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラル中心を有し、それらの分子が互いの鏡像でない、立体異性体を意味する。ジアステレオマーは、異なる物理特性、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動およびクロマトグラフィーなどの高解像度分析手順の下で分離可能である。
【０３２９】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合せできない鏡像である化合物の２つの立体異性体を意味する。
【０３３０】
本明細書で使用される立体化学的な定義および慣例は、一般に、S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994に従う。本発明の化合物は不斉中心またはキラル中心を含んでよく、従って、種々の立体異性型で存在し得る。限定されるものではないが、ジアステレオマー、鏡像異性体およびアトロプ異性体、ならびにそれらの混合物、例えば、ラセミ混合物を含め、本発明の化合物の総ての立体異性型は本発明の一部をなすことが意図される。多くの有機化合物は、光学活性型で存在し、すなわち、それらは、平面偏光の平面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を説明する際に、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳは、その１または複数のキラル中心の周りの分子の絶対配置を表すために使用される。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転の徴候を表すために用いられ、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞を有する化合物は、右旋性である。所与の化学構造について、これらの立体異性体は、それらが互いの鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、鏡像異性体とも呼ばれ、このような異性体の混合物は、しばしば鏡像異性体混合物と呼ばれる。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれ、それらは化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性が存在していない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」および「ラセミ体」という用語は、光学活性を欠く２つの鏡像異性体種の等モル混合物を意味する。
【０３３１】
互変異性型に関して後述する場合を除き、本明細書で使用する場合、「異性体」という用語から構造異性体(structural (or constitutional) isomers)（すなわち、空間内の原子または基の位置だけでなく原子間の結合が異なる異性体）が特に除かれることに留意されたい。例えば、メトキシ基−ＯＣＨ３に対する言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基−ＣＨ２ＯＨに対する言及と解釈されるべきでない。同様に、オルト−クロロフェニルに対する言及は、その構造異性体であるメタ−クロロフェニルに対する言及と解釈されるべきでない。しかしながら、構造のクラスに対する言及は、そのクラスに入る構造的異性型を十分含み得る（例えば、Ｃ１−７アルキルは、ｎ−プロピルおよびイソ−プロピルを含み；ブチルは、ｎ−、イソ−、ｓｅｃ−、およびｔｅｒｔ−ブチルを含み；メトキシフェニルは、オルト−、メタ−、およびパラ−メトキシフェニルを含む）。
【０３３２】
上記の例外は、例えば、下記の互変異性体対：ケト／エノール（下記に示す）、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エネチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒロキシアゾ(hyroxyazo)、およびニトロ／ａｃｉ−ニトロのように、互変異性型、例えば、ケト型、エノール型、およびエノラート型には当てはまらない。
【化４８】
2016518382.tif 000056
【０３３３】
用語「互変異性体」または「互変異性型」は、低いエネルギー障壁で相互転換可能な、エネルギーの異なる構造異性体を意味する。例えば、プロトン互変異性体（プロトン移動互変異性体(prototropic tautomer)としても知られる）は、ケト−エノールおよびイミン−エナミン異性化などの、プロトンの移動による相互転換を含む。原子価互変異性体は、結合電子の一部の再配列による相互転換を含む。
【０３３４】
用語「異性体」には１以上の同位体置換を有する化合物が特に含まれることに留意されたい。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、および３Ｈ（Ｔ）を含む、いずれの同位体形態であってもよく；Ｃは、１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃを含むいずれの同位体形態であってもよく；Ｏは、１６Ｏおよび１８Ｏを含む、いずれの同位体形態であってもよいのである。
【０３３５】
本発明の化合物に組み込み可能な同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、および塩素の同位体、例えば、限定されるものではないが、２Ｈ（重水素、Ｄ）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、および１２５Ｉが含まれる。本発明の種々の同位体標識化合物、例えば、３Ｈ、１３Ｃ、および１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものである。このような同位体標識化合物は、代謝研究、反応動態研究、検出またはイメージング技術、例えば、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）（薬物または基質組織分布アッセイ、または患者の放射線治療を含む）において有用であり得る。本発明の重水素標識または置換療法化合物は、分布、代謝、および排泄（ＡＤＭＥ）に関してＤＭＰＫ（薬物代謝および薬物動態）特性を改善した可能性がある。重水素などのより重い同位体での置換により、より大きな代謝安定性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または用量要求の低減をもたらすある種の治療利点が得られ得る。１８Ｆ標識化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究に有用であり得る。本発明の同位体標識化合物およびそのプロドラッグは一般に、非同位体標識試薬を容易に入手できる同位体標識試薬に置き換えて、以下に記載のスキームまたは実施例および製法に開示されている手順を行うことによって作製することができる。さらに、より重い同位体、特に重水素（すなわち、２ＨまたはＤ）での置換により、より大きな代謝安定性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または用量要求の低減または治療係数の改善をもたらすある種の治療利点が得られ得る。この文脈で重水素は置換基とみなされると理解される。このようなより重い同位体、具体的には重水素の濃度は、同位体濃縮係数によって定義することができる。本発明の化合物において、特定の同位体として明示されない原子はいずれも、その原子の任意の安定な同位体を表すことを意味する。
【０３３６】
特に断りのない限り、特定の化合物という場合には、（完全なまたは部分的な）そのラセミ混合物およびその他の混合物を含む、このような総ての異性型を含む。このような異性型の製造（例えば、不斉合成）および分離（例えば、分別結晶およびクロマトグラフィー手段）のための方法は当技術分野で公知であるか、または本明細書に教示される方法もしくは既知の方法を既知の様式で適合させることによって容易に得られる。
【０３３７】
ＩＩＩ−抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
Ｃ２アルキレン
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化４９】
2016518382.tif 000057
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１およびＬ２は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３３８】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化５０】
2016518382.tif 000058
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１、Ｌ２およびＧ２は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３３９】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化５１】
2016518382.tif 000059
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３４０】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化５２】
2016518382.tif 000060
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３４１】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化５３】
2016518382.tif 000061
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３４２】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化５４】
2016518382.tif 000062
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、かつ、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ独立にＨまたはＲＤから選択される。
【０３４３】
上記化合物のそれぞれについて、適当であれば、以下の選択肢が当てはまる：
ｎは０であり；
ｎは１であり；
ＲＥはＨであり；
ＲＥはＲＤであり、ここで、ＲＤは、置換されていてもよいアルキルであり；
ＲＥはＲＤであり、ここで、ＲＤはメチルであり；
Ｌ１はジペプチドであるかまたはジペプチドを含んでなり；
Ｌ１は（Ｈ２Ｎ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＣＯ）または（Ｈ２Ｎ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（ＣＯ）であり、ここで、（Ｈ２Ｎ）および（ＣＯ）はそれぞれＮ末端およびＣ末端を示し；
Ｌ２はｐ−アミノベンジレンであり；
Ｇ２はＡｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、ＣｂｚおよびＰＮＺから選択される。
【０３４４】
上記の選択肢に加え、以下の選択肢も当てはまり得る：
Ｇ２は、
【化５５】
2016518382.tif 000063
であり、ここで、アステリスクはＬ１のＮ末端との結合点を示し；
Ａは、
【化５６】
2016518382.tif 000064
であり、ここで、アステリスクはＬ１のＮ末端との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、かつ、ｍは４または８であり；
Ａは、
【化５７】
2016518382.tif 000065
であり、ここで、アステリスクはＬ１のＮ末端との結合点を示し、波線は細胞結合剤との結合点を示し、かつ、ｍは４または８である。
【０３４５】
特に好ましい実施態様では、ｎは１であり；ＲＥはＨであり；ＣＢＡは抗体であり；Ｌ１は（Ｈ２Ｎ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＣＯ）または（Ｈ２Ｎ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（ＣＯ）であり、ここで、（Ｈ２Ｎ）および（ＣＯ）はそれぞれＮ末端およびＣ末端を示し；Ｌ２はｐ−アミノベンジレンであり；Ｇ２は、
【化５８】
2016518382.tif 000066
であり、ここで、アステリスクはＬ１のＮ末端との結合点を示し；かつ、Ａは、
【化５９】
2016518382.tif 000067
であり、ここで、アステリスクはＬ１のＮ末端との結合点を示し、かつ、波線は細胞結合剤との結合点を示す。
【０３４６】
Ｃ２アリール
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６０】
2016518382.tif 000068
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１およびＬ２は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。Ａｒ１およびＡｒ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３４７】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６１】
2016518382.tif 000069
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１、Ｌ２およびＧ２は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。
【０３４８】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６２】
2016518382.tif 000070
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。
【０３４９】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６３】
2016518382.tif 000071
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。
【０３５０】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６４】
2016518382.tif 000072
であり、ここで、細胞結合剤は上記で定義される通りであり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。
【０３５１】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６５】
2016518382.tif 000073
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、かつ、ｎは０または１である。
【０３５２】
一実施態様では、Ａｒ１およびＡｒ２は、上記実施態様のそれぞれにおいて、それぞれ独立に、置換されていてもよいフェニル、フラニル、チオフェニルおよびピリジルから選択される。
【０３５３】
一実施態様では、Ａｒ１およびＡｒ２は、上記実施態様のそれぞれにおいて、置換されていてもよいフェニルである。
【０３５４】
一実施態様では、Ａｒ１およびＡｒ２は、上記実施態様のそれぞれにおいて、置換されていてもよいチオフェン−２−イルまたはチオフェン−３−イルである。
【０３５５】
一実施態様では、Ａｒ１およびＡｒ２は、上記実施態様のそれぞれにおいて、置換されていてもよいキノリニルまたはイソキノリニルである。
【０３５６】
キノリニルまたはイソキノリニル基は、利用可能ないずれの環位を介してＰＢＤ核に結合されていてもよい。例えば、キノリニルは、キノリン−２−イル、キノリン−３−イル、キノリン−４イル、キノリン−５−イル、キノリン−６−イル、キノリン−７−イルおよびキノリン−８−イルであり得る。これらのうち、キノリン−３−イルおよびキノリン−６−イルが好ましいものであり得る。イソキノリニルは、イソキノリン−１−イル、イソキノリン−３−イル、イソキノリン−４イル、イソキノリン−５−イル、イソキノリン−６−イル、イソキノリン−７−イルおよびイソキノリン−８−イルであり得る。これらのうち、イソキノリン−３−イルおよびイソキノリン−６−イルが好ましいものであり得る。
【０３５７】
Ｃ２ビニル
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６６】
2016518382.tif 000074
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１およびＬ２は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３５８】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６７】
2016518382.tif 000075
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１、Ｌ２およびＧ２は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３５９】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６８】
2016518382.tif 000076
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３６０】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化６９】
2016518382.tif 000077
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、Ｌ１は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３６１】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化７０】
2016518382.tif 000078
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３６２】
一実施態様では、本複合体は化合物：
【化７１】
2016518382.tif 000079
であり、ここで、ＣＢＡは上記で定義される細胞結合剤であり、かつ、ｎは０または１である。Ｌ１は従前に定義される通りであり、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、メチル、エチルおよびフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されていてもよい）およびＣ５−６ヘテロシクリルから独立に選択され、かつ、ｎは０または１である。ＲＶ１およびＲＶ２は同じであっても異なっていてもよい。
【０３６３】
上記実施態様のいくつかでは、ＲＶ１およびＲＶ２はＨ、フェニル、および４−フルオロフェニルから独立に選択され得る。
【０３６４】
好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの薬物Ｄは、
【化７２】
2016518382.tif 000080
から選択される。
【０３６５】
好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣは、構造一般式：
【化７３】
2016518382.tif 000081
のものであり、ここで、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である。
【０３６６】
好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣは、構造一般式：
【化７４】
2016518382.tif 000082
のものであり、ここで、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、ｍは０〜３０であり、かつ、ｎは１〜１２である。
【０３６７】
好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣは、構造一般式：
【化７５】
2016518382.tif 000083
のものであり、ここで、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２，またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である。
【０３６８】
好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣは、構造一般式：
【化７６】
2016518382.tif 000084
のものであり、ここで、ＣＢＡは１６１３Ｆ１２、またはその抗原結合フラグメントからなり、かつ、ｎは１〜１２である。
【０３６９】
薬物負荷率は、薬物抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれ、細胞結合剤当たりのＰＢＤ薬の平均数である。
【０３７０】
薬物が部分的抗体還元後にシステインに結合される抗体ＩｇＧ１アイソタイプの場合、薬物負荷率は抗体当たり１〜８個の薬物（Ｄ）の範囲であってよく、すなわち、この場合、１、２、３、４、５、６、７、および８個の薬物部分が抗体に結合されている。
【０３７１】
薬物が部分的抗体還元後にシステインに結合される抗体ＩｇＧ２アイソタイプの場合、薬物負荷率は抗体当たり１〜１２個の薬物（Ｄ）の範囲であってよく、すなわち、この場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２個の薬物部分が抗体に結合されている。
【０３７２】
ＡＤＣの組成物は、１〜８または１〜１２の範囲の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば、抗体の集合体を含む。
【０３７３】
本発明の化合物がリシンに結合される場合、薬物負荷率は細胞抗体当たり１〜８０の薬物（Ｄ）の範囲であり得るが、上限は４０、２０、１０または８が好ましいものであり得る。ＡＤＣの組成物は、１〜８０、１〜４０、１〜２０、１〜１０または１〜８の範囲の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば、抗体の集合体を含む。
【０３７４】
コンジュゲーション反応からのＡＤＣ製剤中の抗体当たりの薬物の平均数は、ＵＶ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および電気泳動などの従来の手段によって特徴付けることができる。薬物比に関するＡＤＣの量的分布も決定可能である。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定の製剤における薬物比の平均値が決定できる(Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852)。しかしながら、薬物比の値の分布は、抗体抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界によって識別可能でない。また、抗体薬物複合体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が重鎖もしくは軽鎖フラグメントなどの抗体、または特定のアミノ酸残基と結合しているかどうかを決定するものではない。場合によっては、ｐが他の薬物負荷率を有するＡＤＣからの特定の値である同種ＡＤＣの分離、精製、および同定は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成され得る。このような技術は他種の複合体にも適用可能である。
【０３７５】
抗体薬物複合体によっては、薬物比は抗体上の付着部位の数によって限定される場合がある。例えば、抗体は、１つのみまたは複数のシステインチオール基を有してもよく、またはそれを介してリンカーが結合され得る、１つのみまたは複数の、十分に反応性のあるチオール基を有し得る。薬物負荷率が高いほど、例えば、薬物比＞５であれば、特定の抗体薬物複合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞浸透の低下を引き起こし得る。
【０３７６】
一般に、理論的最大値よりも少ない薬物部分がコンジュゲーション反応中に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬と反応しない多くのリシン残基を含有し得る。最も反応性の高いリシン基だけがアミン反応性リンカー試薬と反応し得る。また、最も反応性の高いシステインチオール基だけがチオール反応性リンカー試薬と反応し得る。一般に、抗体は、たとえあるとしても、薬物成分と連結され得る多くの遊離の反応性システインチオール基を含有しない。本化合物の抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的または完全な還元条件下で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤で還元されなければならない。ＡＤＣの負荷率（薬物／抗体比）は、（ｉ）抗体に対する薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬のモル過剰率を制限すること（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度を制限すること、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾の還元条件を部分的にするかまたは制限することを含む、いくつかの異なる方式で制御することができる。
【０３７７】
ある種の抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤で処理することによってリンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核試薬を形成する。リシンを２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応させてアミンをチオールに変換することにより、抗体にさらなる求核基を導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４、またはそれを超えるシステイン残基を操作することにより、抗体（またはそのフラグメント）に導入することができる（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製する）。ＵＳ７５２１５４１は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示している。
【０３７８】
システインアミノ酸は、抗体中の、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない反応性部位で操作し得る (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249)。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドなどのチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応して、システインが操作された抗体とＰＢＤ薬物部分を有するＡＤＣを形成し得る。従って、薬物成分の場所を設計すること、制御することおよび知ることができる。薬物負荷率は、操作されたシステインチオール基は一般に高収率でチオール反応性リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応するので制御することができる。重鎖または軽鎖上の単一の部位における置換によってシステインアミノ酸を導入してＩｇＧ抗体を操作することで、対称性の抗体上に２つの新たなシステインが得られる。コンジュゲーション生成物ＡＤＣが均質に近づけば、２に近い薬物負荷率が達成できる。
【０３７９】
抗体の２つ以上の求核基または求電子基が薬物−リンカー中間体、またはリンカー試薬、次いで、薬物成分試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗体と結合された、ある分布の薬物部分（例えば、１、２、３など）を有するＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。単一の薬物負荷値（ｐ）を有するＡＤＣ製剤は単離可能であるが、これらの単一の負荷値のＡＤＣは、薬物部分は抗体の異なる部位にリンカーを介して結合され得るので、やはり異種混合物であり得る。
【０３８０】
従って、本発明のＡＤＣ組成物は、抗体が１以上のＰＢＤ薬物部分を有し、それらの薬物部分がその抗体に種々のアミノ酸残基で結合され得る、ＡＤＣの混合物を含む。
【０３８１】
一実施態様では、細胞結合剤当たりの二量体ＰＢＤ基の平均数は、１〜２０の範囲である。いくつかの実施態様では、この範囲は１〜１２、１〜８、２〜８、２〜６、２〜４、および４〜８から選択される。
【０３８２】
いくつかの実施態様では、細胞結合剤当たりに２個の二量体ピロロベンゾジアゼピン基が存在する。
【０３８３】
いくつかの実施態様では、細胞結合剤当たりに３個の二量体ピロロベンゾジアゼピン基が存在する。
【０３８４】
いくつかの実施態様では、細胞結合剤当たりに４個の二量体ピロロベンゾジアゼピン基が存在する。
【０３８５】
最後に、本発明は、癌の治療において使用するための上記のＡＤＣに関する。
【０３８６】
癌は好ましくは、表面にタンパク質Ａｘｌの全体または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含むＡｘｌ関連癌から選択できる。
【０３８７】
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、神経鞘腫、神経芽腫、口腔扁平上皮癌、中皮腫、平滑筋肉腫および任意の薬物耐性現象または癌である。本発明のもう１つの目的は、本明細書に記載の免疫複合体を含んでなる医薬組成物である。
【０３８８】
疑念を避けるため、薬物耐性Ａｘｌ発現癌とは、元々Ａｘｌを発現する耐性癌だけでなく、元はＡｘｌを発現または過剰発現しないが、従前の処置にひと度耐性となったときにＡｘｌを発現する癌と理解されなければならない。
【０３８９】
より詳しくは、本発明は、本発明のＡＤＣを少なくとも１種類の賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
【０３９０】
本明細書において、「薬学的に許容可能なビヒクル」または「賦形剤」という表現は、二次反応を誘発せずに医薬組成物に入り、例えば、１または複数の活性化合物の投与、体内におけるその寿命の延長および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大あるいはまたその保存の向上を可能とする化合物または化合物の組合せを示すものとする。これらの薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、選択された１または複数の活性化合物の性質および投与様式に関して当業者により適合される。
【０３９１】
好ましくは、これらのＡＤＣは、全身経路により、特に、静脈内経路により、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、本発明によるＡＤＣを含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。
【０３９２】
それらの投与様式、用量および最適な薬理形態は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療に対する忍容性および示されている二次作用など、患者に適合される治療の確立を一般に考慮した基準に従って決定することができる。
【０３９３】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面（その凡例をは以下に示される）を含む本明細書の続きにおいて明らかとなり、図面の判例を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【０３９４】
【図１Ａ−１Ｃ】固定化されたｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（１Ａ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（１Ｂ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（１Ｃ）タンパク質に対する、ＥＬＩＳＡによる１６１３Ｆ１２の結合特異性
【図２】ヒト腫瘍細胞に対する１６１３Ｆ１２結合のＦＡＣＳ分析
【図３】ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対するｍ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２の両方の結合を調べるＥＬＩＳＡ実験
【図４Ａ−４Ｃ】１６１３Ｆ１２とともにインキュベートした後のＳＮ１２Ｃ細胞の免疫蛍光顕微鏡法。図４Ａ−膜および細胞内染色の両方に関するｍＩｇＧ１アイソタイプ対照条件の写真。図４Ｂ−膜染色。図４Ｃ−１６１３Ｆ１２を用いたＡｘｌ受容体と初期エンドソームマーカーＥＥＡ１の両方の細胞内染色。画像の重ね合わせを下に示し、可視化された共局在を矢印で示す。
【図５】ＦＡＣＳ分析により決定された、ＳＮ１２Ｃヒト腎臓腫瘍細胞に対するｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびＤＡＲ２の結合。データは、抗体またはＡＤＣの一定範囲の用量にわたって得られた平均蛍光強度を示す。
【図６】ＥＬＩＳＡにより決定された、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃ固定化タンパク質に対するｈｚ１６１３Ｆ１２、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２の結合。データは、供試抗体の一定範囲の用量にわたって得られた光学密度を示す。データはＰｒｉｓｍアプリケーションを用いて分析した。
【図７】ＦＡＣＳ分析により決定された、ＳＮ１２Ｃヒト腎臓腫瘍細胞に対するｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４の結合。データは、抗体またはＡＤＣの一定範囲の用量にわたって得られた平均蛍光強度を示す。
【図８】ＥＬＩＳＡにより決定された、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃ固定化タンパク質に対するｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４の結合。データは、供試抗体の一定範囲の用量にわたって得られた光学密度を示す。データはＰｒｉｓｍアプリケーションを用いて分析した。
【図９】多様なヒト腫瘍細胞におけるｈｚ１６１３Ｆ１２−２４の濃度応答細胞傷害性曲線。
【図１０Ａ−１０Ｂ】Ａｘｌ＋ＳＮ１２Ｃ（●）および対照Ａｘｌ−  ＭＣＦ７（□）細胞株におけるｈｚ１６１３Ｆ１２−２４に対する濃度応答細胞傷害性曲線。Ａ−３日目、Ｂ−６日目。ＥＣ５０濃度の値を、各曲線の回帰分析を用い、Ｐｒｉｓｍアプリケーションを用いて決定した。
【図１１】ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３は、ヒトＡｘｌ発現腫瘍細胞株の細胞傷害性を誘導する。ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３との６日のインキュベーション期間後にＳＮ１２Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＣＦ７に対して決定された細胞傷害性のパーセンテージ。
【図１２】ＳＮ１２Ｃグラフトマウスにおいて０．９ｍｇ／ｋｇ用量、Ｑ４ｄ４でｉ．ｐ．注射したｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４およびアイソタイプ対照ＡＤＣ  ｃ−９Ｇ４−２４のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
【図１３】ＳＮ１２Ｃ異種移植片において、ＰＢＳと比較した場合の、移植後２０日目に開始した０．９ｍｇ／ｋｇ用量、Ｑ７ｄ４でｉ．ｐ．注射したｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ３）−２４  ＤＡＲ２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ＰＢＳおよび／またはｃ９Ｇ４−２４  ＡＤＣと比較した場合の、ＳＮ１２Ｃ異種移植片におけるｉ．ｐ．注射したｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ２．１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ１Ｉ２Ｖ）−２４のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。Ａ−１ｍｇ／ｋｇ用量、Ｑ４ｄ４。Ｂ−０．９ｍｇ／ｋｇ用量、Ｑ７ｄ４。
【図１５Ａ−１５Ｃ】５ｍｇ／ｋｇの単回用量でｉ．ｐ．注射したｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。Ａ−ＮＣＩ−Ｈ１２９９、Ｂ−Ｐａｎｃ１およびＣ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
【図１６】生存分析。ヌードマウスにおいて胸腔内（ｉ．ｐｌ．）移植したヒトＡ５４９肺腫瘍細胞に対するｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２の抗腫瘍活性。Ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣは７ｍｇ／ｋｇの用量で、キャップ−２４化合物は７ｍｇ／ｋｇ  ＡＤＣに相当する用量でｉ．ｐ．投与した。３群の動物（ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４、ｃａｐｐｅｄ−２４およびＰＢＳ）に相当する生存曲線を示す。ログランク検定ならびにＴ／Ｃパーセンテージを適用することにより得られた統計値を示す。
【実施例】
【０３９５】
以下の実施例において、用いたアイソタイプ対照抗体は、９Ｇ４と呼ばれるマウスＩｇＧ１からなる。以下の実施例において、ｍＩｇＧ１対照と９Ｇ４という表現は同等であるものとする。
【０３９６】
実施例１：１６１３Ｆ１２の作製
Ａｘｌ受容体のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを１５−２０．１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞で５回、および２０μｇのｒｈＡｘｌ  ＥＣＤで２回、ｓ．ｃ．免疫した。初回の免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０３９７】
融合３日前に、免疫マウスにＩＦＡを伴う２０．１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞と２０μｇのｒｈＡｘｌ  ＥＣＤの両方で追加免疫を行った。
【０３９８】
ハイブリドーマを作製するために、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ、脾臓の灌流および近位リンパ節の細断によって調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体から採取し（血清滴定後に選択）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールは、Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されている。次に、融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの作製に関しては、特に、マウスの場合、“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。
【０３９９】
融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングについては、ハイブリドーマの上清をＡｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対して生じたＭａｂの分泌に関して、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。並行して、ｗｔ  ＣＨＯ細胞およびＡｘｌ発現ＣＨＯ細胞の両方を用い、細胞表面に存在する細胞型のＡｘｌに結合することができるＭａｂを選択するためのＦＡＣＳ分析を行った。
【０４００】
できる限り速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングし、その後、Ａｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対するそれらの反応性をスクリーニングした。次に、クローニングされたＭａｂに、アイソタイピングキット（カタログ＃５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いてアイソタイプ分析を行った。各ハイブリドーマから得られた１つのクローンを選択し、拡大培養した。
【０４０１】
ＥＬＩＳＡアッセイは次のようにして行い、純粋なハイブリドーマ上清を使用するか、または上清中のＩｇＧ含量が決定された場合には、５μｇ／ｍｌから始めて滴定を実行した。次に、以下の１１列において１／２限界希釈を行った。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルのｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）またはｒｈＡｘｌ  ＥＣＤ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを、０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳを用い、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを軽く打ち付けて飽和バッファーは排出したところで、ＥＬＩＳＡプレートに５０μｌの純粋なハイブリドーマ細胞上清または５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウエストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈として、３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション時間の後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定した。
【０４０２】
フローサイトメトリーによる選択については、１０５個の細胞（ＣＨＯ  ｗｔまたはＣＨＯ−Ａｘｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離後、バッファーを除去し、ハイブリドーマ上清または供試する精製Ｍａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後に、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）に１／５００°希釈したＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで最終の洗浄を行った後、各試験管にヨウ化プロピジウムを終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞単独を含有するウェルおよびＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。各実験においてアイソタイプ対照を使用した（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。少なくとも５０００細胞を評価して、蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出した。
【０４０３】
１６１３Ｆ１２を産生するハイブリドーマを候補として選択した。
【０４０４】
実施例２：１６１３Ｆ１２のヒト化
ヒトにおける治療適用のためのマウス抗体（Ｍａｂ）の使用は一般に、重大な有害作用を招き、患者はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を生じ、それにより、その治療の有効性が低下し、継続的投与を妨げる。この問題を克服するための１つのアプローチが、それらのヒト対応物を、抗原結合活性を改変することなくマウス配列に置き換えることによってマウスＭａｂをヒト化することである。（ｉ）マウス可変領域がヒト定常領域に連結されているマウス／ヒトキメラ抗体の構築(Boulianne et al., 1984)による、および（ｉｉ）マウス可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を注意深く選択したヒト可変領域にグラフトした後に、これらの「再成形ヒト」可変領域をヒト定常領域に連結すること(Riechmann et al., 1988)による、２つの主要な方法で達成され得る。
【０４０５】
２．１  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化
予備工程として、１６１３Ｆ１２  ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://www.imgt.org)のマウス生殖細胞系遺伝子配列部分と比較した。マウスＩＧＫＶ１６−１０４＊０１およびＩＧＫＪ５＊０１生殖細胞系遺伝子を同定した。ＣＤＲグラフトのための最良のヒト候補を同定するために、１６１３Ｆ１２  ＶＬマウス配列と最大の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベース解析ツールの助けで、マウス１６１３Ｆ１２  ＶＬ  ＣＤＲに対する、可能性のあるアクセプターヒトＶ領域：ＩＧＫＶ１−２７＊０１およびＩＧＫＪ４＊０２を同定した。軽鎖可変ドメインのヒト化を実施するために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先順位を与えた。これらの優先度（１〜４）を用いて、最大１４の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域の、１１の異なるヒト化変異体を作出した。
【０４０６】
【表８】
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【０４０７】
２．２  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化
ＣＤＲグラフトのための最良のヒト候補を同定するために、１６１３Ｆ１２  ＶＨと最大の同一性を示すマウスおよびヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベースの一部である配列アラインメントソフトウエア「ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ」を使用することにより、１６１３Ｆ１２  ＶＨのヌクレオチド配列をマウスおよびヒト両方の生殖細胞系遺伝子配列とアラインした。また、アミノ酸配列のアラインメントも、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージの「Ａｌｉｇｎ  Ｘ」ソフトウエアを用いて実施し、ヌクレオチド配列アラインメントの結果を確認した。マウス生殖細胞系遺伝子とのアラインメントは、マウス生殖細胞系Ｖ−遺伝子ＩＧＨＶ１４−３＊０２およびＪ−遺伝子ＩＧＨＪ２＊０１が最も相同性の高いマウス生殖細胞系遺伝子であることを示した。ＩＭＧＴデータベースを用い、マウスＤ−遺伝子生殖細胞系ＩＧＨＤ１−１＊０１を相同配列と同定した。ＣＤＲグラフトのための適当なヒト生殖細胞系を選択するために、１６１３Ｆ１２  ＶＨマウス配列と最も高い相同性を有するヒト生殖細胞系遺伝子を同定した。ＩＭＧＴデータベースおよびツールの助けで、ヒトＩＧＨＶ１−２＊０２生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ５＊０１  Ｊ生殖細胞系遺伝子を、マウス１６１３Ｆ１２  ＶＨ  ＣＤＲに対するヒトアクセプター配列として選択した。重鎖可変ドメインに対するヒト化を行うために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先順位（１〜４）を与えた。これらの優先度を用いて、最大１８の復帰突然変異を有する重鎖可変領域の、２０の異なるヒト化変異体を作出した。
【０４０８】
【表９】
2016518382.tif 000086
【０４０９】
実施例３：  Ａｘｌ結合特異性
この実施例では、１６１３Ｆ１２の結合は、まず、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対して検討した。次に、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋ−ＦｃおよびｒｈＭｅｒ−Ｆｃに対するその結合を検討した。
【０４１０】
簡単に述べれば、組換えヒトＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４ＡＬ／ＣＦ）、ｒｈＤｔｋ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１−ＭＲ）タンパク質を４℃で一晩、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ９６ウェルプレートにコーティングし、０．５％ゼラチン溶液での１時間のブロッキング工程の後、１６１３Ｆ１２を５μｇ／ｍｌ（３．３３  １０−８Ｍ）の初期濃度で、３７℃にてさらに１時間加えた。次に、１／２連続希釈を１２列で行った。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。反応の可視化はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１および市販の抗Ａｘｌ  Ｍａｂ  １５４抗体も並行して用いた。コーティング対照実験は、ＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ  １０９−０３５−０９８）の存在下、および／またはＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で行った。
【０４１１】
結果をそれぞれ図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。
【０４１２】
この実施例は、１６１３Ｆ１２がｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質とのみ結合し、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋまたはｒｈＭｅｒには結合しないことを示す。１６１３Ｆ１２の結合の交差特異性がＴＡＭメンバー間に見られない。一次抗体の不在下（希釈剤）では非特異的結合は見られなかった。アイソタイプ対照抗体の存在下では結合は見られなかった。
【０４１３】
実施例４：  １６１３Ｆ１２はヒト腫瘍細胞上で発現される細胞形態のＡｘｌを認識した
まず、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ発現レベルを、Ａｘｌ発現レベルの定量を可能とする較正ビーズと並行し、市販のＡｘｌ抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ１５４）を用いて確認した。次に、細胞表面Ａｘｌの結合を、１６１３Ｆ１２を用いて検討した。
【０４１４】
細胞表面結合研究のため、１０μｇ／ｍｌ（６．６６  １０−８Ｍ）一次抗体溶液（１６１３Ｆ１２、ＭＡＢ１５４またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照９Ｇ４  Ｍａｂ）の２倍希釈系を調製し、２．１０５細胞に４℃で２０分間適用する。１％ＢＳＡおよび０．０１％  ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８二次抗体（１／５００°希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度の平均値を算出した。
【０４１５】
ＭＡＢ１５４を用いた定量的ＡＢＣ測定のためには、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）較正ビーズを使用する。次に、これらの細胞を飽和濃度のＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）ビーズと並行して、ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＦＩＴＣ，ヤギＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートした。次に、検体細胞上の抗原部位の数を検量線（ビーズ上のＭａｂ分子の数に対する個々のビーズ集団の蛍光強度）の補間によって決定した。
【０４１６】
４．１．  細胞表面Ａｘｌ発現レベルの定量
ヒト腫瘍細胞の表面上のＡｘｌ発現レベルを、細胞表面抗原を評価するための定量的フローサイトメトリーキットである間接的免疫蛍光アッセイ（ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）法（Ｄａｋｏ、デンマーク）を用いてフローサイトメトリーで決定した。較正グラフによるビーズの既知の抗原レベルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較により、細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）の決定が可能となる。
【０４１７】
表４は、ＭＡＢ１５４（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）を用いて決定した際の、種々のヒト腫瘍細胞株（ＳＮ１２Ｃ、Ｃａｌｕ−１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ１）の表面上に検出されたＡｘｌ発現レベルを示す。値は抗原結合複合体（ＡＢＣ）として示される。
【０４１８】
【表１０】
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【０４１９】
ＭＡＢ１５４で得られた結果は、Ａｘｌ受容体は検討するヒト腫瘍細胞によって種々のレベルで発現されることを示した。
【０４２０】
４．２．  ヒト腫瘍細胞に対する１６１３Ｆ１２によるＡｘｌ検出
より具体的には、Ａｘｌ結合を、１６１３Ｆ１２を用いて検討した。
【０４２１】
１６１３Ｆ１２用量応答曲線を作成した。次に、種々のヒト腫瘍細胞を用いて得られたＭＦＩをＰｒｉｓｍソフトウエアで分析した。データを図２に示す。
【０４２２】
データは、飽和曲線プロファイルにより実証されるように、１６１３Ｆ１２は膜Ａｘｌ受容体に特異的に結合することを示す。しかしながら、種々の標識強度が見られ、ヒト腫瘍細胞に対する細胞表面Ａｘｌ受容体の、変動のあるレベルが明らかとなった。ＭＣＦ７ヒト乳房腫瘍細胞株を用いた場合、Ａｘｌ受容体の結合が見られなかった。
【０４２３】
実施例５：  ｈｚ１６１３Ｆ１２対ｍ１６１３Ｆ１２のバリデーション
ｈｚ１６１３Ｆ１２がそのマウス型に匹敵するかどうかを確認するために、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質アッセイを用いたＥＬＩＳＡにより結合実験を行った。
【０４２４】
このアッセイでは、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、１×ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの１６１３Ｆ１２溶液中、４℃で一晩コーティングした。飽和工程の後、一定範囲のｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：１５４−ＡＬ）をコーティングプレート上で３７℃にて１時間インキュベートした。顕色工程としては、ビオチン化−Ａｘｌ抗体（自家製品）を０．８５μｇ／ｍｌで３７℃にて１時間加えた。このＡｘｌ抗体は、別個のエピトープ基に属す。次に、希釈バッファー中１／２０００°のアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液をウェルに加える。次に、ＴＭＢ基質溶液を５分間加える。ペルオキシダーゼ停止溶液を添加した後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０４２５】
図３は、マウス型およびヒト化型の両１６１３Ｆ１２がｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に同等に結合することを示す。
【０４２６】
実施例６：  蛍光免疫細胞化学標識を用いた１６１３Ｆ１２インターナリゼーション試験
間接的蛍光標識法を用いた共焦点顕微鏡により、相補的インターナリゼーション結果が得られる。
【０４２７】
簡単に述べれば、ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０中で試験前に３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、カバーガラスを含む６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。翌日、１６１３Ｆ１２を１０μｇ／ｍｌで加えた。また、無関連の抗体で処理した細胞も含めた。次に、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間および２時間インキュベートした。Ｔ０時間については、細胞を４℃で３０分間インキュベートして、細胞表面への抗体の結合を判定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をすすぎ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８抗体とともに４℃で６０分間インキュベートして、細胞表面に留まっている抗体を同定した。細胞内への抗体の浸透を追跡するために、細胞を固定し、サポニンで透過処理を施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、膜抗体と細胞内抗体の両方を染色した。初期エンドソームは、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化したＥＥＡ１に対するウサギポリクローナル抗体を用いて同定した。細胞を３回洗浄し、Ｄｒａｑ５を用いて核を染色した。染色後、細胞をＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に包埋し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦顕微鏡を用いて分析した。
【０４２８】
写真を図４Ａ〜４Ｃに示す。
【０４２９】
共焦点顕微鏡により画像を得た。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（９Ｇ４）の存在下では、膜染色も細胞内標識も見られない（図４Ａ）。ＳＮ１２Ｃ細胞を１６１３Ｆ１２とともに１時間インキュベートした後すぐに、膜抗Ａｘｌ標識の段階的低下が見られる（図４Ｂ）。１６１３Ｆ１２抗体の細胞内蓄積は１時間および２時間の時点で明らかに見られる（図４Ｃ）。細胞内抗体は初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１と共局在する。これらの写真から、ＳＮ１２Ｃ細胞への１６１３Ｆ１２のインターナリゼーションが確認される。
【０４３０】
実施例７：  本発明のＰＢＤ二量体の合成
７．１  一般実験法
旋光度は、ＡＤＰ  ２２０旋光計（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｌｔｄ．）で測定し、濃度（ｃ）は、ｇ／１００ｍＬで示す。融点は、デジタル融点装置（Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ）を用いて測定した。ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １０００  ＦＴ  ＩＲ分光計で記録した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＮＭＲ分光計をそれぞれ４００および１００ＭＨｚで用い、３００Ｋで取得した。化学シフトは、ＴＭＳ（δ＝０．０ｐｐｍ）に対して報告し、シグナルは、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｄｔ（二重の三重線）、ｄｄ（二重の二重線）、ｄｄｄ（二重の二重線の二重線）またはｍ（多重線）として表記し、結合定数をヘルツ（Ｈｚ）で示す。質量分析（ＭＳ）データは、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡを備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  ＨＰＬＣに接続したＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ装置を用いて収集した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱパラメーターは、キャピラリー（ｋＶ）、３．３８；コーン（Ｖ）、３５；エクストラクター（Ｖ）、３．０；イオン源温度（℃）、１００；脱溶媒和温度（℃）、２００；コーン流速（Ｌ／ｈ）、５０；脱溶媒和流速（Ｌ／ｈ）、２５０を用いた。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）データは、装置にサンプルを導入するための金属コーティングされたボロシリケートガラスチップを用い、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱＴＯＦ  ＧｌｏｂａｌのポジティブＷモードで記録した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲルアルミニウムプレート（Ｍｅｒｃｋ  ６０、Ｆ２５４）上で行い、フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  ６０、２３０〜４００メッシュ  ＡＳＴＭ）を用いた。ＨＯＢｔ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）および固相支持試薬（Ａｒｇｏｎａｕｔ）を除き、他の総ての化学薬品および溶媒はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、供給されたまま、それ以上精製せずに用いた。無水溶媒は、乾燥窒素雰囲気下、適当な乾燥剤の存在下で蒸留することにより作製し、４Åモレキュラーシーブスまたはナトリウムワイヤ上で保存した。石油エーテルは、４０〜６０℃での分別沸騰を指す。
【０４３１】
一般ＬＣ／ＭＳ条件：ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５）は、水（Ａ）（ギ酸０．１％）およびアセトニトリル（Ｂ）（ギ酸０．１％）の移動相を用いて行う。勾配：１．０分で初期組成５％Ｂ、次いで、２．５分で５％Ｂから９５％Ｂ。組成を９５％Ｂで０．５分間保持し、次いで、０．１分で５％Ｂに戻し、そこで０．９分間保持する。総勾配実行時間は５分に相当する。流速３．０ｍＬ／分、４００μＬを質量分析計へと送るゼロデッドボリュームのＴ継手で分割する。波長検出範囲：２２０〜４００ｎｍ。関数種：ダイオードアレイ（５３５スキャン）。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｏｎｙｘ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  Ｃ１８  ５０×４．６０ｍｍ。
【０４３２】
７．２：  薬物成分２４（以下「２４」と呼称）の合成
（ｉ）（Ｓ）−（２−アミノ−５−メトキシ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メタノン（９）
【化７７】
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【０４３３】
（ａ）５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンズアルデヒド（２）
無希釈トリイソプロピルシリルクロリド（５６．４ｍＬ、２６２ｍｍｏｌ）をイミダゾール（４８．７ｇ、７１５．２３ｍｍｏｌ）と４−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ニトロベンズアルデヒド１（４７ｇ、２３８ｍｍｏｌ）の混合物に加えた（ともに摩砕）。この混合物をフェノールおよびイミダゾールが融解して溶液となるまで加熱した（１００℃）。この反応混合物を１５分間撹拌した後、放冷したところ、固体がフラスコの底に形成するのが見られた（塩化イミダゾール）。この反応混合物を５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで希釈し、そのままシリカゲルにロードし、そのパッドを５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、次いで、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した（低過剰のため、生成物中に見られた未反応ＴＩＰＳＣｌは極めて少ない）。目的生成物をヘキサン中５％の酢酸エチルで溶出した。余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去した後、高真空下で乾燥させて結晶性の感光性固体を得た（７４．４ｇ、８８％）。
【０４３４】
LC/MSによれば満足のいく純度であった(4.22分(ES+) m/z (相対強度) 353.88 ([M + H]+., 100)); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.43 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.10 (m, 18H)。
【０４３５】
（ｂ）５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）安息香酸  （３）
室温で、テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中、化合物２（７４ｇ、２０９ｍｍｏｌ）の溶液に、水（８００ｍＬ）中、亜塩素酸ナトリウム（４７．３ｇ、５２３ｍｍｏｌ、８０％テクニカルグレード）および第一リン酸二水素ナトリウム（３５．２ｇ、２９３ｍｍｏｌ）（ＮａＨ２ＰＯ４）の溶液を加えた。この激しく撹拌した二相混合物に過酸化水素（６０％ｗ／ｗ、１４０ｍＬ、２．９３ｍｏｌ）を迅速に加えた。この反応混合物はガス（酸素）を発生し、出発材料は溶解し、反応混合物の温度は４５℃に上がった。３０分後、ＬＣ／ＭＳは反応が完了したことを示した。この反応混合物を氷浴中で冷却し、塩酸（１Ｍ）を加えてｐＨを３まで低下させた（反応の終了時のｐＨはすでに酸性であるので、この工程は多くの場合で不要であることが分かった；抽出前にｐＨを確認されたい）。次に、この反応混合物を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出し、有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物６を定量的収量の黄色固体として得た。
【０４３６】
LC/MS (3.93分 (ES-) m/z (相対強度) 367.74 ([M - H]-., 100)); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 1.34 - 1.22 (m, 3H), 1.10 (m, 18H)。
【０４３７】
（ｃ）（（２Ｓ，４Ｒ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）メタノン（５）
０℃でジクロロメタン（２００ｍＬ）中、酸３（４３．５ｇ、１１７．８ｍｍｏｌ、１当量）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１９．８ｇ、１２９．６ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液に、ＤＣＣ（２９．２ｇ、１４１ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。冷浴を外し、反応を室温で３０分間進行させ、その時点でアルゴン下、−１０℃で、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中、（２Ｓ，４Ｒ）−２−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル−４−ヒドロキシピロリジン４（３０ｇ、１２９．６ｍｍｏｌ、１．１当量）およびトリエチルアミン（２４．６６ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を迅速に加えた（大スケールでは、反応混合物をさらに冷却することにより添加時間を短縮することができる）。この反応混合物を室温で４０分〜１時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳおよびＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によりモニタリングした。これらの固体をセライトで濾過することにより除去し、有機相を０．１Ｍ  ＨＣｌ冷水溶液で、ｐＨが４または５と評価されるまで洗浄した。次に、有機相を水、次いで、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；４０／６０酢酸エチル／ヘキサンから８０／２０酢酸エチル／ヘキサンへの勾配）に付した。余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去し、純粋な生成物１３を得た（４５．５ｇの純粋な生成物６６％、および１７ｇのやや不純な生成物、合計９０％）。
【０４３８】
LC/MS 4.43分(ES+) m/z (相対強度) 582.92 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.40 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.77 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J = 11.3, 4.5 Hz, 1H), 3.14 - 3.02 (m, 1H), 2.38 - 2.28 (m, 1H), 2.10 (ddd, J = 13.3, 8.4, 2.2 Hz, 1H), 1.36 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.05 (m, 18H), 0.91 (s, 9H), 0.17 - 0.05 (m, 6H), (回転異性体の存在)。
【０４３９】
（ｄ）（Ｓ）−５−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−１−（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンゾイル）ピロリジン−３−オン（６）
０℃で乾燥ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中、５（３１．７ｇ、５４ｍｍｏｌ、１当量）およびＴＥＭＰＯ（０．８５ｇ、５．４ｍｍｏｌ、０．１当量）の撹拌溶液に、ＴＣＣＡ（８．８２ｇ、４０ｍｍｏｌ、０．７当量）を加えた。この反応混合物を２０分間激しく撹拌し、この時点でＴＬＣ（５０／５０酢酸エチル／ヘキサン）は出発材料の完全な消費を示した。この反応混合物をセライトで濾過し、濾液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、チオ硫酸ナトリウム（３００ｍＬ中９ｇ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。減圧下での回転蒸発により生成物６を定量的収量で得た。
【０４４０】
LC/MS 4.52 min (ES+) m/z (相対強度) 581.08 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 - 7.60 (m, 1H), 6.85 - 6.62 (m, 1H), 4.94 (dd, J = 30.8, 7.8 Hz, 1H), 4.50 - 4.16 (m, 1H), 3.99 - 3.82 (m, 3H), 3.80 - 3.34 (m, 3H), 2.92 - 2.17 (m, 2H), 1.40 - 1.18 (m, 3H), 1.11 (t, J = 6.2 Hz, 18H), 0.97 - 0.75 (m, 9H), 0.15 - -0.06 (m, 6H), (回転異性体の存在)。
【０４４１】
（ｅ）トリフルオロメタンスルホン酸（Ｓ）−５−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−１−（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンゾイル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル（７）
−５０℃（アセトン／ドライアイス浴）にて、乾燥ジクロロメタン（９００ｍＬ）中、２，６−ルチジン（２５．６ｍＬ、２３．５ｇ、２２０ｍｍｏｌ、４当量、シーブスで乾燥）の存在下、ケトン６（３１．９ｇ、５５ｍｍｏｌ、１当量）の激しく撹拌した懸濁液に、トリフリック無水物（２７．７ｍＬ、４６．４ｇ、１６５ｍｍｏｌ、３当量）を注入した（温度制御）。この反応混合物を１．５時間撹拌し、この時、ミニ後処理（水／ジクロロメタン）の後のＬＣ／ＭＳは、反応が完了したことを示した。まだ冷たい反応混合物に水を加え、有機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインおよび硫酸マグネシウムで洗浄した。有機相を濾過し、余分な溶媒を減圧下で回転蒸発により除去した。残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；１０／９０ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）に付し、余分な溶出剤を除去し、生成物７（３７．６ｇ、９６％）を得た。
【０４４２】
LC/MS, 方法2, 4.32分 (ES+) m/z (相対強度) 712.89 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.05 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 9.8, 5.5 Hz, 1H), 4.15 - 3.75 (m, 5H), 3.17 (ddd, J = 16.2, 10.4, 2.3 Hz, 1H), 2.99 (ddd, J = 16.3, 4.0, 1.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.08 (m, 18H), 1.05 (s, 6H), 0.95 - 0.87 (m, 9H), 0.15 - 0.08 (m, 6H)。
【０４４３】
（ｆ）（Ｓ）−（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）メタノン（８）
アルゴン雰囲気下、乾燥ジオキサン（８０ｍＬ）中、トリフレート７（１０．００ｇ、１４ｍｍｏｌ、１当量）、メチルボロン酸（２．９４ｇ、４９．１ｍｍｏｌ、３．５当量）、酸化銀（１３ｇ、５６ｍｍｏｌ、４当量）および第３リン酸カリウム（１７．８ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）の混合物に、トリフェニルアルシン（１．７１ｇ、５．６０ｍｍｏｌ、０．４当量）を加えた。この反応物をアルゴンで３回フラッシュし、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（ＩＩ）クロリド（５４０ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。この反応物をアルゴンで３回フラッシュした後、即座に１１０℃まで温めた（フラスコを加える前にｄｒｙｓｙｎ加熱ブロックを予め１１０℃まで温めておいた）。１０分後、この反応物を室温まで冷却し、セライトパッドで濾過した。溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；１０％酢酸エチル／ヘキサン）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物８を得た（４．５ｇ、５５％）。
【０４４４】
LC/MS, 4.27分 (ES+) m/z (相対強度) 579.18 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.70 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.51 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.77 - 4.59 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.92 - 2.65 (m, 1H), 2.55 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 1.62 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.40 - 1.18 (m, 3H), 1.11 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (d, J = 2.3 Hz, 6H)。
【０４４５】
（ｇ）（Ｓ）−（２−アミノ−５−メトキシ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メタノン（９）
１５℃前後で、エタノール中５％ギ酸ｖ／ｖ（７０ｍＬ）中、化合物８（６．７ｇ、１１．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、亜鉛末（２８ｇ、４３０ｍｍｏｌ、３７当量）を加えた。結果として生じる発熱を、反応混合物の温度を３０℃までに保つように氷浴を用いて制御した。３０分後、この反応混合物をセライトパッドで濾過した。濾液を酢酸エチルで希釈し、有機相を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン中、１０％酢酸エチル）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物９を得た（５．１ｇ、８０％）。
【０４４６】
LC/MS, 4.23分 (ES+) m/z (相対強度) 550.21 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.64 - 4.53 (m, J = 4.1 Hz, 1H), 4.17 (s, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.77 - 3.69 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 2.53 - 2.43 (m, 1H), 2.04 - 1.97 (m, J = 11.9 Hz, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.26 - 1.13 (m, 3H), 1.08 - 0.99 (m, 18H), 0.82 (s, 9H), 0.03 - -0.03 (m, J = 6.2 Hz, 6H)。
【０４４７】
（ｉｉ）  １１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−（（５−ヨードペンチル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル
【化７８】
2016518382.tif 000089
【０４４８】
（ａ）（２−（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバミン酸（Ｓ）−アリル（１０）
−７８℃（アセトン／ドライアイス浴）で、乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中、乾燥ピリジン（０．４８ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ、２．２当量）の存在下、アミン９（１．５ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロギ酸アリル（０．３０ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。３０分後、この浴槽を外し、反応混合物を室温まで温めた。この反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和硫酸銅水溶液を加えた。次に、有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して生成物１０を得、これをそのまま次の反応で使用した。
【０４４９】
LC/MS, 4.45分(ES+) m/z (相対強度) 632.91 ([M + H]+., 100)。
【０４５０】
（ｂ）（２−（２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバミン酸（Ｓ）−アリル（１１）
粗物質１０を酢酸／メタノール／テトラヒドロフラン／水（２８：４：４：８ｍＬ）の７：１：１：２混合物に溶かし、室温で撹拌した。３時間後、ＬＣ／ＭＳにより出発材料の完全な消失が見られた。この反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中２５％酢酸エチル）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、目的生成物１１を得た（１ｇ、７１％）。
【０４５１】
LC/MS, 3.70分(ES+) m/z (相対強度) 519.13 ([M + H]+., 95); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.34 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.95 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.7 Hz, 1H), 5.33 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.23 (ddd, J = 10.4, 2.6, 1.3 Hz, 1H), 4.73 (tt, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 4.63 (dt, J = 5.7, 1.4 Hz, 2H), 4.54 (s, 1H), 3.89 - 3.70 (m, 5H), 2.87 (dd, J = 16.5, 10.5 Hz, 1H), 2.19 (dd, J = 16.8, 4.6 Hz, 1H), 1.70 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.38 - 1.23 (m, 3H), 1.12 (s, 10H), 1.10 (s, 8H)。
【０４５２】
（ｃ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル（１２）
アルゴン雰囲気下、−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中、塩化オキサリル（０．２ｍＬ、２．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ジメチルスルホキシド（０．３５ｍＬ、４．８３ｍｍｏｌ、２．５当量）を滴下した。１０分後、乾燥ジクロロメタン（８ｍＬ）中、１１（１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）の溶液を、温度をなお−７８℃に維持しながら、ゆっくり加えた。１５分後、トリエチルアミン（１．３５ｍＬ、４Åモレキュラーシーブスで乾燥、９．６５ｍｍｏｌ、５当量）を滴下し、ドライアイス／アセトン浴を外した。この反応混合物を室温とし、冷塩酸（０．１Ｍ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去し、生成物１２を得た（６５８ｍｇ、６６％）。
【０４５３】
LC/MS, 3.52分(ES+) m/z (相対強度) 517.14 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 1H), 6.75 - 6.63 (m, J = 8.8, 4.0 Hz, 2H), 5.89 - 5.64 (m, J = 9.6, 4.1 Hz, 2H), 5.23 - 5.03 (m, 2H), 4.68 - 4.38 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.83 - 3.77 (m, 1H), 3.40 (s, 1H), 3.05 - 2.83 (m, 1H), 2.59 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.33 - 1.16 (m, 3H), 1.09 (d, J = 2.2 Hz, 9H), 1.07 (d, J = 2.1 Hz, 9H)。
【０４５４】
（ｄ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル（１３）
アルゴン下、０℃で、乾燥ジクロロメタン（４０ｍＬ）中、化合物１２（５２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（０．４６ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ、４当量）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（０．７０ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。１０分後、冷浴を外し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン中１０％酢酸エチルからヘキサン中２０％酢酸エチルへの勾配）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物２３を得た（５４０ｍｇ、８５％）。
【０４５５】
LC/MS, 4.42分(ES+) m/z (相対強度) 653.14 ([M + Na]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 1H), 6.71 - 6.64 (m, J = 5.5 Hz, 2H), 5.83 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.80 - 5.68 (m, J = 5.9 Hz, 1H), 5.14 - 5.06 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 13.2, 5.2 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 13.3, 5.5 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.71 (td, J = 10.1, 3.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J = 16.9, 10.3 Hz, 1H), 2.36 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.31 - 1.16 (m, 3H), 1.12 - 1.01 (m, J = 7.4, 2.1 Hz, 18H), 0.89 - 0.81 (m, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.19 (s, 3H)。
【０４５６】
（ｅ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル（２４）
含水ジメチルホルムアミド（６ｍＬ、５０：１  ＤＭＦ／水）中、化合物１３（５４０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸リチウム（８７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を加えた。４時間後、反応は完了し、この反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、クエン酸水溶液（ｐＨ約３）、水およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン中２５％から７５％酢酸エチルへの勾配）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物１４を得た（４００ｍｇ、定量的）。
【０４５７】
LC/MS, (3.33分(ES+) m/z (相対強度) 475.26 ([M+H]+, 100)。
【０４５８】
（ｆ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−（（５−ヨードペンチル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル（１５）
アセトン（４ｍＬ、モレキュラーシーブスで乾燥）中、フェノール１４（４００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジヨードペンタン（０．６３ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ、５当量）および炭酸カリウム（１１６ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。次に、この反応混合物を６０℃まで温め、６時間撹拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；５０／５０、ｖ／ｖ、ヘキサン／酢酸エチル）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を除去して１５を収率９０％で得た。
【０４５９】
LC/MS, 3.90分(ES+) m/z (相対強度) 670.91 ([M]+, 100)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.23 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.87 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.83 - 5.68 (m, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 - 5.01 (m, 2H), 4.67 - 4.58 (m, 1H), 4.45 - 4.35 (m, 1H), 4.04 - 3.93 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.73 (td, J = 10.0, 3.8 Hz, 1H), 3.25 - 3.14 (m, J = 8.5, 7.0 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 16.8, 10.3 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.95 - 1.81 (m, 4H), 1.77 (s, 3H), 1.64 - 1.49 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.23 (s, 3H)。
【０４６０】
（ｉｉｉ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル（２０）
【化７９】
2016518382.tif 000090
【０４６１】
（ａ）３−（２−（２−（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）ヒドラジニル）プロパンアミド）−４−メチル−２−オキソペンタン酸アリル（１６）
５℃（氷浴）で、乾燥テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中、アミン９（４ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（７７８ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ、０．３６当量）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（２．２３ｍＬ、１８．０４ｍｍｏｌ、２．２当量）を加えた。イソシアネート反応の進行を、反応混合物から周期的にアリコートを取り出し、メタノールで急冷し、ＬＣ／ＭＳ分析を行うことによりモニタリングした。イソシアネートの形成が完了したところで、乾燥テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中、ａｌｌｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＯＨ（４．１２ｇ、１２．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびトリエチルアミン（１．５２ｍＬ、１２．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を、新たに調製したイソシアネートに注入することにより迅速に添加した。この反応混合物を４０℃で４時間撹拌した。余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン中１％メタノールから５％メタノールへの勾配）に付した（ＥｔＯＡｃおよびヘキサンを用いる別のクロマトグラフィー条件も成功した）。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物１６を得た（３．９ｇ、５０％）。
【０４６２】
LC/MS, 4.23分(ES+) m/z (相対強度) 952.36 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (br s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.77 (br s, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.03 - 5.83 (m, 1H), 5.26 (dd, J = 33.8, 13.5 Hz, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.70 - 4.60 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 5.7, 1.3 Hz, 2H), 4.06 - 3.99 (m, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.82 - 3.71 (m, 1H), 3.75 (s, 3H), 2.79 - 2.64 (m, 1H), 2.54 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.16 (dq, J = 13.5, 6.7 Hz, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.46 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.07 - -0.02 (m, 6H)。
【０４６３】
（ｂ）３−（２−（２−（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）ヒドラジニル）プロパンアミド）−４−メチル−２−オキソペンタン酸アリル（１７）
ＴＢＳエーテル１６（１．３２ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を酢酸／メタノール／テトラヒドロフラン／水の７：１：１：２混合物（１４：２：２：４ｍＬ）に溶かし、室温で撹拌する。３時間後、ＬＣ／ＭＳによってはもはや出発材料は見られなかった。この反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中２％メタノール）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、目的生成物１７を得た（９２０ｍｇ、８０％）。
【０４６４】
LC/MS, 3.60分(ES+) m/z (相対強度) 838.18 ([M+H]+., 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.97 - 5.82 (m, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 - 5.15 (m, 3H), 5.10 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 4.76 - 4.42 (m, 5H), 4.03 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.77 (s, 5H), 2.84 (dd, J = 16.7, 10.4 Hz, 1H), 2.26 - 2.08 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.30 (dt, J = 14.7, 7.4 Hz, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.96 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
【０４６５】
（ｃ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル（１８）
アルゴン雰囲気下、−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）で、乾燥ジクロロメタン（７ｍＬ）中、塩化オキサリル（０．１１ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ジメチルスルホキシド（０．２ｍＬ、２．７５ｍｍｏｌ、２．５当量）を滴下した。１０分後、乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）中、１７（９２０ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、なお−７８℃の温度でゆっくり加えた。１５分後、トリエチルアミン（０．７７ｍＬ、４Åモレキュラーシーブスで乾燥、５．５０ｍｍｏｌ、５当量）を滴下し、ドライアイス／アセトン浴を外した。この反応混合物を室温とし、冷塩酸（０．１Ｍ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン中２％メタノールから５％メタノールへの勾配）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物１８を得た（５５０ｍｇ、６０％）。
【０４６６】
LC/MS, 3.43分(ES+) m/z (相対強度) 836.01 ([M]+., 100)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1H), 7.52 - 7.40 (m, 2H), 7.21 - 7.08 (m, J = 11.5 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.60 - 6.47 (m, J = 7.4 Hz, 1H), 5.97 - 5.83 (m, 1H), 5.79 - 5.66 (m, 1H), 5.38 - 4.90 (m, 6H), 4.68 - 4.52 (m, J = 18.4, 5.5 Hz, 4H), 4.04 - 3.94 (m, J = 6.5 Hz, 1H), 3.87 - 3.76 (m, 5H), 3.00 - 2.88 (m, 1H), 2.66 - 2.49 (m, 2H), 2.21 - 2.08 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.45 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.09 - 0.98 (m, J = 8.9 Hz, 18H), 0.96 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。
【０４６７】
（ｄ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル（１９）
アルゴン下、０℃で、乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）中、化合物１８（４５０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（０．２５ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ、４当量）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（０．３８ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。１０分後、冷浴を外し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；５０／５０ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物１９を得た（３３４ｍｇ、６５％）。
【０４６８】
LC/MS, 4.18分(ES+) m/z (相対強度) 950.50 ([M]+., 100)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H)。
【０４６９】
（ｅ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル（２０）
含水ジメチルホルムアミド（４ｍＬ、５０：１ＤＭＦ／水）中、化合物１９（４７０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸リチウム（５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を加えた。４時間後、反応は完了し、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、クエン酸（ｐＨ約３）、水およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；５０／５０から２５／７５ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチルへの勾配）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物３２を得た（４００ｍｇ、定量的）。
【０４７０】
LC/MS, 3.32分(ES+) m/z (相対強度) 794.18 ([M+H]+., 100)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H)。
【０４７１】
（ｉｖ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−２−メチル−４，７，３５−トリオキソ−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキサ−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル（２４）
【化８０】
2016518382.tif 000091
【０４７２】
（ａ）８−（（５−（（（１１Ｓ）−１０−（（（４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ）−アリル（２１）
乾燥アセトン（２５ｍＬ）中、１５（３７０ｍｇ、０．５５２ｍｍｏｌ、１．２当量）およびフェノール２０（４００ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（７０ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この反応物を７０℃で８時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳは総ての出発材料が消費されていたことを示したので、この反応物を室温で一晩撹拌し、翌日さらに２時間撹拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン中８０％酢酸エチルから１００％酢酸エチルへ）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物２１を得た（３８５ｍｇ、５７％）。
【０４７３】
LC/MS, 4.07分(ES+) m/z (相対強度) 1336.55 ([M+H]+., 50)。
【０４７４】
（ｂ）８−（（５−（（（１１Ｓ）−１０−（（（４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ）−アリル（２２）
乾燥テトラヒドロフラン（３ｍＬ）中、２１（２３０ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラ−ｎ−ブチルフッ化アンモニウム（１Ｍ、０．３４ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。出発材料は１０分後に完全に消費されていた。この反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、水およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣２２を粗混合物として次の反応に使用した。
【０４７５】
LC/MS, 2.87分(ES+) m/z (相対強度) 1108.11 ([M+H]+., 100)。
【０４７６】
（ｃ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ）−４−（２−（１−（（１−アミノ−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル（２３）
乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中、粗２２（０．１７２ｍｍｏｌ）およびピロリジン（３６μＬ、０．４３ｍｍｏｌ、２．５当量）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、０．０６当量）を加えた。この反応混合物を２０分間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣２３を粗混合物として次の反応に使用した。
【０４７７】
LC/MS, 2.38分(ES+) m/z (相対強度) 922.16 ([M+H]+ ., 40)。
【０４７８】
（ｄ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−２−メチル−４，７，３５−トリオキソ−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキサ−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル（２４）
乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中、粗２３（０．１７２ｍｍｏｌ）およびＭａｌ−（ＰＥＧ）８−酸（１００ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）の溶液に、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、３３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を２時間撹拌したところ、ＬＣ／ＭＳによって出発材料の存在はもはや見られなった。この反応物をジクロロメタンで希釈し、水およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；クロロホルム中１００％クロロホルムから１０％メタノールへ）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、２４（Ｂ）を得た（６０ｍｇ、３段階で２５％）。
【０４７９】
７．３：  薬物成分３３（以下「３３」と呼称）の合成
（ｉ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２９）
【化８１】
2016518382.tif 000092
【０４８０】
（ａ）（２−（（Ｓ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２５）
０℃（氷浴）で、乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中、アミン９（１．６９ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（３２９ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、０．３６当量）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（１．０７ｍＬ、７．６９ｍｍｏｌ、２．５当量）を加えた。イソシアネート反応の進行を、反応混合物から周期的にアリコートを取り出し、メタノールで急冷し、ＬＣ／ＭＳ分析を行うことによりモニタリングした。イソシアネートの形成が完了したところで、乾燥テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中、ａｌｌｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１．８５ｇ、４．００ｍｍｏｌ、１．３当量）およびトリエチルアミン（０．５６ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を、新たに調製したイソシアネートに注入することにより迅速に添加した。この反応混合物を４０℃で４時間撹拌した。余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；クロロホルム中、１％メタノールから５％メタノールへの勾配）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物２５を得た（０．９８ｇ、３１％）。
【０４８１】
LC/MS, 4.13分(ES+) m/z (相対強度) 1038.39 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.07 (s, 1H), 9.00 (br s, 1H), 8.11 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8 Hz, 2H), 6.85 (s, 1H), 6.06 - 5.90 (m, 3H), 5.42 (s, 2H), 5.34 (d, J = 16 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.52-4.45 (m, 4H), 3.97 - 3.85 (m, 2H), 3.77 (m, 4H), 3.05-2.99 (m, 2H), 2.68 (m, 1H), 2.43 (m, 1H), 2.01 (m, 1H), 1.69-1.65 (m, 5H), 1.46 (m, 2H), 1.28 - 1.24 (m, 2H), 1.10 (s, 9H), 1.09 (s, 9H), 0.87 (m, 12H), 0.07 - 0.06 (m, 6H)。
【０４８２】
（ｂ）（２−（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２６）
ＴＢＳエーテル２５（１．８８ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を酢酸／メタノール／テトラヒドロフラン／水（２１：３：３：６ｍＬ）の７：１：１：２混合物に溶かし、室温で撹拌した。２時間後、ＬＣ／ＭＳによってはもはや出発材料は見られなかった。この反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中１％メタノールから５％メタノールへ）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、目的生成物２６を得た（８７７ｍｇ、５３％）。
【０４８３】
LC/MS, 3.43分(ES+) m/z (相対強度) 924.05 ([M+H]+., 100)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.07 (s, 1H), 8.99 (br s, 1H), 8.11 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 6.05 - 5.90 (m, 3H), 5.43 (s, 2H), 5.34 (d, J = 16 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.87 (m, 1H), 4.53-4.45 (m, 4H), 3.95 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.67 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.09-2.96 (m, 2H), 2.69 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.02 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 5H), 1.43 (m, 2H), 1.27 (m, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.08 (s, 9H), 0.89 (dd, J = 4 Hz,12H)。
【０４８４】
（ｃ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２７）
Ａｒ下、室温で９６時間、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、２６（０．８４０ｇ、０．９０９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＳＩＢＸ（０．６７８ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭに抽出し、有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なＭｅＯＨ／ＤＣＭを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中１％メタノールから５％メタノールへ）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、目的生成物２７を得た（１２０ｍｇ、１２％）。
【０４８５】
LC/MS, 7.55分(ES+) m/z (相対強度) 922.68 ([M+H]+., 100)。
【０４８６】
（ｄ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２８）
０℃、アルゴン下、乾燥ジクロロメタン（１．５ｍＬ）中、化合物２７（１０２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（０．０５ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ、４当量）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（０．０８ｍＬ、０．３３ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。１０分後、冷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた粗生成物を次の工程で使用した。
【０４８７】
LC/MS, 4.07分(ES+) m/z (相対強度) 1036.07 ([M]+, 100)。
【０４８８】
（ｅ）１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（２９）
含水ジメチルホルムアミド（２ｍＬ、５０：１ＤＭＦ／水）中、化合物２８（推定１００％、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸リチウム（２１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。４時間後、反応は完了し、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、クエン酸（ｐＨ約３）、水およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた粗生成物を次の工程で使用した。
【０４８９】
LC/MS, 3.15分(ES+) m/z (相対強度) 880.45 ([M+H]+., 100)。
【０４９０】
（ｉｉ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−４，７，３５−トリオキソ−２−（３−ウレイドプロピル）−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキサ−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル（３３）
【化８２】
2016518382.tif 000093
【０４９１】
（ａ）８−（（５−（（（３ａＲ，４Ｓ）−５−（（アリルオキシ）カルボニル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−メトキシ−２−メチル−１０−オキソ−３，３ａ，４，５，１０，１０ａ−ヘキサヒドロベンゾ［ｂ］シクロペンタ［ｅ］アゼピン−７−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（３０）
乾燥アセトン（３ｍＬ）中、１５（１３０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ、１当量）およびフェノール２９（推定１００％、０．１９４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、０．８当量）を加えた。この反応物を７０℃で２．５時間撹拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；１００％クロロホルムから４％メタノールへ）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を減圧下での回転蒸発により除去し、生成物３０を得た（２９ｍｇ、１１％）。
【０４９２】
LC/MS, 4.00分(ES+) m/z (相対強度) 1423.30 ([M+H]+., 100)。
【０４９３】
（ｂ）８−（（５−（（（３ａＲ，４Ｓ）−５−（（アリルオキシ）カルボニル）−４−ヒドロキシ−８−メトキシ−２−メチル−１０−オキソ−３，３ａ，４，５，１０，１０ａ−ヘキサヒドロベンゾ［ｂ］シクロペンタ［ｅ］アゼピン−７−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（３１）
乾燥テトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）中、３０（２９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラ−ｎ−ブチルフッ化アンモニウム（１Ｍ、０．０４ｍＬ、０．０４ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。出発材料は１０分後に完全に消費されていた。この反応混合物をジクロロメタン（２５ｍＬ）で希釈し、水およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣３１を粗混合物として次の工程で使用した。
【０４９４】
LC/MS, 2.75分(ES+) m/z (相対強度) 1193.93 ([M+H]+., 100)。
【０４９５】
（ｃ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（（３ａＲ）−８−メトキシ−２−メチル−１０−オキソ−３，３ａ，１０，１０ａ−テトラヒドロベンゾ［ｂ］シクロペンタ［ｅ］アゼピン−７−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（３２）
乾燥ジクロロメタン（２ｍＬ）中、粗３１（推定１００％、０．０２ｍｍｏｌ）およびピロリジン（４．２μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、２．５当量）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、０．０６当量）を加えた。この反応混合物を４０分間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液およびブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、余分なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残渣３２を粗混合物として次の反応に使用した。
【０４９６】
LC/MS, 2.35分(ES+) m/z (相対強度) 1008.22 ([M+H]+ ., 100)。
【０４９７】
（ｄ）１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボン酸（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−４，７，３５−トリオキソ−２−（３−ウレイドプロピル）−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキサ−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル（３３）
乾燥ジクロロメタン（１．５ｍＬ）中、粗３２（推定１００％、０．０２ｍｍｏｌ）およびＭａｌ−（ＰＥＧ）８−酸（１２．１ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、３．９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を１時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳによってはもはや出発材料の存在は見られなかった。この反応混合物を蒸発させ、得られた残渣を分取ＨＰＬＣ（水［Ａ］［ギ酸０．１％］およびアセトニトリル［Ｂ］［ギ酸０．１％］の移動相。勾配：１５．０分で初期組成１００％Ａから１００％Ｂへ、１００％Ｂで２．０分間保持、次いで、０．１分で１３％Ｂに戻し、そこで２．９分間保持。総勾配実行時間は２０分に相当、流速２０ｍＬ／分）に付した。純粋な画分を回収し、合わせ、余分な溶出剤を凍結乾燥により除去し、３３を得た（１．６ｍｇ、３段階で５％）。
【０４９８】
実施例８  ＰＢＤ二量体を含むＡＤＣの作製
抗体（５ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃にて２時間、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．４中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）で部分的に還元した。一般に、約２および４の薬物抗体比（ＤＡＲ）を目標とするために、それぞれ１．５および３モル当量のＴＣＥＰを用いた。遊離チオール残基の濃度は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬）で滴定することにより測定し、一般に、２および４のＤＡＲを目標として実施されるＴＣＥＰ処理後に、抗体当たりに遊離されるチオールはぞれぞれ３および５前後となる。部分的抗体還元はまた、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっても確認した。薬物を遊離した鎖内システイン残基とカップリングさせる前に、この還元混合物を室温まで冷却した。次に、抗体濃度を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調整し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭ溶液から反応性チオール基に１．５〜２モル過剰の薬物を加えた。カップリングの際に水性媒体における薬物の溶解度を保持するために、ＤＭＳＯの終濃度を１０％に調整した。反応は室温で１時間行った。反応混合物のサンプルを採取し、これを用いて、反応を止める前にＤＴＮＢを使用することにより、残りの遊離チオールを評価した。薬物１モル当たり１．５モルのＮ−アセチルシステインを加えて室温で１時間インキュベートすることにより、余分な薬物の反応を止めた。
【０４９９】
４℃で一晩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨｉｓバッファーｐＨ６．５に対して透析した後、抗体薬物複合体を、市販のクロマトグラフィーカラムおよび限外濾過装置に基づき、当業者に公知の方法を用いることで精製した。まず、結合していない薬物とＡＤＣの凝集物をＳ２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去した。次に、精製されたＡＤＣ単量体を３０または５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濾過装置での限外濾過またはプロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより２〜３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。精製されたＡＤＣは、０．２μｍフィルターでの濾過除菌の後に４℃で保存した。それらはさらに、薬物のコンジュゲーションを確認するために還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、また、単量体および凝集形態の含量を決定するために分析用Ｓ２００またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラムでのＳＥＣにより分析した。タンパク質濃度は、標品としてのＩｇＧとともにビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を用いることにより決定した。
【０５００】
ＤＡＲは各ＡＤＣについて、薬物カップリングおよび軽度の還元工程の後に試薬ＤＴＮＢを用いた滴定により決定された遊離チオールの数の違いを算出することによって評価した。一般に、この方法を使用することにより測定されるＤＡＲは、目標ＤＡＲ４に対して３．４〜４．９の間（平均値３．９）、目標ＤＡＲ２に対して１．２〜２．１の間（平均値１．８）であった。凝集形態の含量は、精製後では５％より低かった。
【０５０１】
本発明による好ましいＡＤＣは、ｉ）薬物成分２４と連結されたｈｚ１６１３Ｆ１２を含んでなるＡＤＣ（ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４と呼称）およびｉｉ）薬物成分３３と連結されたｈｚ１６１３Ｆ１２を含んでなるＡＤＣ（ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３と呼称）である。薬物抗体比は、「ＤＡＲ  Ｘ」（ここで、Ｘが前記の比に相当する）という表現でＡＤＣの名称の後に示される。
【０５０２】
実施例９  薬物リンカーコンジュゲーションの後のＡｘｌ受容体への本発明のＡＤＣの結合の判定
生成物の活性をその特異的受容体への結合によって特性決定するためには、結合アッセイが慣用される。本実施例において、コンジュゲーションプロセスおよびグラフトされるリンカー薬物の存在がその結果得られるＡＤＣの標的抗原結合能を変化させるかどうかを確認するために、ＦＡＣＳ分析を行った。そこで、第一に、ＳＮ１２Ｃヒト腎臓腫瘍細胞を用いたフローサイトメトリー実験、および第二に、ｒｈＡｘｌ固定化タンパク質上でのＥＬＩＳＡで、裸のｈｚ１６１３Ｆ１２の結合と本発明のＡＤＣの結合とを比較した。
【０５０３】
９．１  フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞表面Ａｘｌ受容体へのｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびＤＡＲ２の結合のバリデーション
ＦＡＣＳ実験は以下に記載されるように行った。簡単に述べれば、コンフルエントＳＮ１２Ｃ細胞を１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで５分間解離させた後、完全増殖培地に再懸濁させた。細胞密度および生存率は、Ｖｉｃｅｌｌ装置でトリパンブルー排除法を用いて決定した。細胞密度を１０６細胞／ｍｌに調整し、１０５細胞で染色を行った。ｈｚ１６１３Ｆ１２またはｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４またはＤＡＲ２の２倍希釈系（６．６７  １０−８Ｍ〜６．５  １０−１１Ｍ）を細胞に添加し、４℃で２０分間放置した。細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１３、１：５００）を加え、細胞を４℃で２０分間染色した。細胞を上記のように２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。サンプル分析の前に、細胞サンプルにヨウ化プロピジウムを加える。４８８アルゴンレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ装置を用いた。その後、Ｐｒｉｓｍアプリケーションを用いてデータを解析した。
結果を図５に示す。
【０５０４】
データは、ｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびＤＡＲ２の結合について同等のＥＣ５０値が得られることを示す。
【０５０５】
９．２  ＥＬＩＳＡによるｒｈＡｘｌ細胞外ドメインへのｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびＤＡＲ２の結合のバリデーション
本実施例では、ＥＬＩＳＡにより、固定化ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対するｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４とＤＡＲ２の両方の結合を比較した。
【０５０６】
簡単に述べれば、組換えヒトＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログナンバー１５４ＡＬ／ＣＦ）タンパク質を４℃で一晩、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ９６ウェルプレートにコーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間ブロッキングした後、供試する１６１３Ｆ１２またはｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＡＤＣを３７℃にて開始濃度３．３３  １０−８Ｍで１時間加えた。次に、２倍連続希釈を１２列で行った。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ７１６４、１／５０００°）を３７℃で１時間加えた。反応の可視化はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。
結果を図６に示す。
【０５０７】
データは、ｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４およびＤＡＲ２  ＡＤＣの結合について同等のＥＣ５０値が得られることを示す。本実施例で、ｈｚ１６１３Ｆ１２の遊離システイン残基への薬物成分２４のコンジュゲーションがＡＤＣのその標的への結合能に影響を及ぼさないことが確認される。
【０５０８】
９．３  フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞表面Ａｘｌ受容体へのｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４  ＡＤＣの結合のバリデーション
ＦＡＣＳ実験は、ＡＤＣがｈｚ１６１３Ｆ１２−３３であること以外は、９．１において上記したように行った。
結果を図７に示す。
【０５０９】
データは、ＥＣ５０が極めて近いことから、薬物のカップリングはＳＮ１２Ｃ細胞へのＡＤＣの結合に影響を及ぼさなかったことを示す。
【０５１０】
９．４  ＥＬＩＳＡによるｒｈＡｘｌ細胞外ドメインへのｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４  ＡＤＣ結合のバリデーション
本実施例では、ＥＬＩＳＡにより、固定化ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対するｈｚ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４の結合を比較した。プロトコールは、使用するＡＤＣがｈｚ１６１３Ｆ１２−３３であること以外は、上記９．２に示す。
結果を図８に示す。
【０５１１】
Ｐｒｉｓｍ分析により、ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４の結合のＥＣ５０値は、非コンジュゲートｈｚ１６１３Ｆ１２のその値に匹敵することが明らかになった。
【０５１２】
本実施例により、ｈｚ１６１３Ｆ１２の還元型システイン残基への薬物成分３３のコンジュゲーションはＡＤＣのその標的への結合能に影響を及ぼさないことが確認される。
【０５１３】
実施例１０：  ヒト腫瘍細胞パネルに対するｈｚ１６１３Ｆ１２−ＰＢＤ  ＡＤＣの細胞傷害活性
本発明では、ｈｚ１６１３Ｆ１２を薬物成分２４および３３とカップリングさせてＡＤＣ化合物を形成する。使用するリンカーの性質は様々であり得る。推定リンカーの一覧は上記した。しかしながら、様々なリンカーを用いても、その結果としてのＡＤＣの強力な細胞傷害活性が得られる。
【０５１４】
１０．１．  ヒト腫瘍細胞株パネルに対するｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
まず、ＰＢＤ薬物リンカー化合物とカップリングしたところで、得られたＡＤＣ  ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４（実施例８に記載の製法）の細胞傷害活性、下記のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイでアッセイした。ＡＤＣを種々のレベルの細胞表面Ａｘｌを発現するヒト腫瘍細胞株のパネルならびに対照細胞株ＭＣＦ７に対して試験した。
【０５１５】
簡単に述べれば、ヒト腫瘍細胞をｍｗ９６プレートの完全培養培地に２４時間播種した。翌日、漸増濃度のｈｚ１６１２Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４を加えた。各条件について三反復のウェルを調製した。抗体薬物複合体を添加した後、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ；マディソン；ＵＳＡ）を製造者のプロトコールに従って用いて評価した。細胞傷害性のパーセンテージは、抗体薬物複合体の各濃度について決定した（図９）。
【０５１６】
次に、各供試抗体薬物複合体に関してＥＣ５０値を決定するためにＰｒｉｓｍアプリケーションを用いてデータを解析し、以下の表５にまとめる。
【０５１７】
【表１１】
2016518382.tif 000094
【０５１８】
図９のデータは、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ４の添加は種々の細胞株に高い細胞傷害性を誘導することを示した。Ａｘｌを発現しなかったＭＣＦ−７では細胞傷害性は測定されなかった。最も高い細胞傷害活性は、最も高い細胞表面Ａｘｌレベルの発現を示す両ヒト腫瘍細胞株に対して見られた。逆に、それぞれ７１および５５４０  ＡＢＣを示すＭＣＦ７およびＮＣＩ−Ｈ１２５ヒト腫瘍細胞株では、有意な細胞傷害活性は見られなかった。
【０５１９】
１０．２．  ヒト腫瘍細胞株パネルに対するｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
また、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣも実施例８において上記したように調製し、抗体薬物複合体のインキュベーションを３日または６日続けることができること以外は１１．１に記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮ１２Ｃ細胞傷害アッセイを用いて評価した。
【０５２０】
両条件の細胞傷害性曲線を、３日目に相当する図１０Ａおよび６日目に相当する図１０Ｂで示す。
【０５２１】
図１０Ａおよび１０Ｂを参照すると、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２の添加は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対しては高い細胞傷害性を誘導するが、Ａｘｌを発現しないＭＣＦ−７に対しては誘導しない。ＳＮ１２Ｃ細胞のほぼ９０％はｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２の存在下では培養６日後に死滅した。各曲線について回帰分析とともにＰｒｉｓｍアプリケーションを用いて決定したＥＣ５０濃度の値は、それぞれ抗体薬物複合体との３日または６日のインキュベーション期間の後、５．４  １０−１１Ｍおよび２．７  １０−１１Ｍであった。
【０５２２】
１０．３．  ヒト腫瘍細胞株に対するｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
ｈｚ１６１３Ｆ１２はまた、薬物成分３３など、リンカーの性質が異なる別の関連ＰＢＤともカップリングさせた。この薬物成分３３は、ペグ化（ｎ＝８）マレイミジルペプチド（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）リンカー（実施例８で提示）を含んでなる。ｈｚ１６１３Ｆ１２を薬物成分３３とカップリングしたところで、得られたｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４（実施例８に記載の製法）の細胞傷害活性を、下記のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで評価した。ＡＤＣを、種々のレベルの細胞表面Ａｘｌを発現するヒト腫瘍細胞株ならびに対照Ａｘｌ−細胞株ＭＣＦ７に対して試験した。
【０５２３】
簡単に述べれば、ヒト腫瘍細胞をｍｗ９６プレートの完全培養培地に２４時間播種した。翌日、ｈｚ１６１２Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４を１μｇ／ｍｌという特異な濃度でヒト腫瘍細胞（ＳＮ１２Ｃ、ＭＤＡＭＢ２３１およびＭＣＦ７）に加えた。各条件について三反復のウェルを調製した。抗体薬物複合体を添加した後、細胞を３７℃で６日間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ；マディソン；ＵＳＡ）を製造者のプロトコールに従って用いて評価した。細胞傷害性のパーセンテージは、６日目に１μｇ／ｍｌ濃度の抗体薬物複合体で決定した（図１１）。
【０５２４】
図１１のデータは、ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４とともに６日間のインキュベーション期間の後にヒト腫瘍細胞で見られた細胞傷害活性のパーセンテージを示した。このように、ｈｚ１６１３Ｆ１２−３３  ＤＡＲ４は、それぞれＳＮ１２Ｃ細胞およびＭＤＡ−ＭＤ２３１細胞の７７％および７９％の細胞傷害性を誘導した。これらの実験条件において、Ａｘｌを発現しなかったＭＣＦ−７細胞で測定された細胞傷害性は約１０％であった。
【０５２５】
実施例１１：  マウスのヒト腫瘍細胞異種移植モデルにおけるヒト化型ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２の効果
１１．１．  マウスのＳＮ１２Ｃ異種移植モデルにおけるｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣの種々のヒト化型のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
薬物成分２４とカップリングしたところで、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＮ１２Ｃ異種移植モデルに関して１６１３Ｆ１２抗体のいくつかのヒト化型を選択した。
【０５２６】
総ての動物手順は、科学目的で使用する動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って行った。プロトコールは、ピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。
【０５２７】
ＳＮ１２Ｃ異種移植実験では、無胸腺７週齢雌ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ、フランス）は１２／１２時間の明暗周期で飼育し、滅菌済み齧歯類餌および水を自由に摂らせた。
【０５２８】
ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌からのＳＮ１２Ｃ細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で通常培養した。対数増殖期となるように移植の４８時間前に細胞を分割した。７週齢の雌無胸腺ヌードマウスにＰＢＳ中７００万個のＳＮ１２Ｃ細胞を皮下移植した。移植後２０日前後、腫瘍が１１５〜１３０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、動物を腫瘍のサイズと性状に従って６個体のマウスの群に分けた。次に、異なる処置を施した。動物の健康状態を毎日モニタリングした。腫瘍体積を、試験終了まで週に２回、電子カリパスで測定した。腫瘍体積は下式：ｐ／６×長さ×幅×高さを用いて算出する。毒性は、週に３回、動物の秤量の後に評価した。統計分析は各測定においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【０５２９】
本実施例では、ＤＡＲ  ２において薬物成分２４とカップリングした１６１３Ｆ１２抗体の３つの異なるヒト化型の抗腫瘍活性を示す：ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４は図１２、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ３）−２４は図１３およびｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ２．１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ１Ｉ２Ｖ）−２４は図１４Ａ−１４Ｂ。数種類の用量および投与計画も記載する。
【０５３０】
図１２は、ＳＮ１２Ｃ異種移植モデルにおいてｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＡＤＣの強い抗腫瘍作用を示す。４８日目のｈｚ１６１３Ｆ１２  （ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＤＡＲ２で処置した総ての動物で完全な退縮が見られた。測定値の統計分析から、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４処置動物の腫瘍退縮とｃ９Ｇ４−２４処置動物の腫瘍退縮を比べた場合、３６日目と７２日目の間で０．０２未満のＰ値が得られる。２２日目のＶ３：１２６ｍｍ３；４８日目から６５日目までのＣＲ５／５。
【０５３１】
図１３は、ｈｚ１６１３Ｆ１２  （ＶＨ１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ３）−２４  ＡＤＣがヒトＳＮ１２Ｃ腎細胞に対して有力な抗腫瘍活性を誘発することを示す。５４日目以降、５個体のうち３個体の動物でＳＮ１２Ｃ腫瘍の完全な退縮が見られる。２２日目のＶ３：１１５ｍｍ３。
【０５３２】
図１４Ａ〜１４Ｂは、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ４ｄ４および０．９ｍｇ／ｋｇ  Ｑ７ｄ４の両方で注射した場合のＳＮ１２Ｃ異種移植モデルにおけるｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ２．１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ１Ｉ２Ｖ）−２４  ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。それは両方の投与計画が、ｃ９Ｇ４−２４免疫複合体を用いた場合に見られるものに反して、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ２．１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ１Ｉ２Ｖ）−２４  ＡＤＣで処置した総てのＳＮ１２Ｃ腫瘍の完全退縮を誘発するのに有効であることを示す。１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ４ｄ４の用量でのｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ２．１Ｗ５５ＲＮ６６Ｋ／ＶＬ１Ｉ２Ｖ）−２４およびｃ９Ｇ４−２４処置群からの測定値の統計分析から、２９日目と７２日目の間で０．０５未満のＰ値が得られる。
【０５３３】
図１４Ａでは、２２日目のＶ３：１２６ｍｍ３および４８日以降のＣＲ５／５。
【０５３４】
図１４Ｂでは、２０日目のＶ３：１１５ｍｍ３および６１日以降のＣＲ４／５。
【０５３５】
これらの実験では、処置中に毒性も死亡も見られない。
【０５３６】
１１．２．  マウスのＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＰＡＮＣ−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおけるｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
可能性としての将来の臨床適応をさらに示すために、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＡＤＣを種々の異種移植モデルに注射した。本実施例では、それらのうち３つを、種々のヒト細胞：ＮＣＩ−Ｈ１２９９非小細胞肺癌細胞株、ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（トリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−、非ＨＥＲ２過剰発現）である）を用いて記載する。
【０５３７】
マウスに細胞を皮下移植するために、対数増殖期となるように移植の４８時間前に細胞を分割した。
【０５３８】
各細胞株に特定の実験条件を適用する。第一に、ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％ＳＶＦ（Ｓｉｇｍａ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で通常培養した。７週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳ中、７００万個のＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を移植した。移植後２６日前後、腫瘍が１３０〜１７０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、動物を腫瘍のサイズと性状に従って５個体のマウスの群に分けた。第二に、ＡＴＣＣからのＰＡＮＣ−１細胞をＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％ＳＶＦ（Ｓｉｇｍａ）で通常培養した。７週齢の雌無胸腺ヌードマウスに、ＰＢＳ中、７００万個ののＰＡＮＣ−１細胞を移植した。移植後２７日前後、腫瘍が１４０〜１７０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、動物を腫瘍のサイズと性状に従って６個体のマウスの群に分けた。第三に、ＡＴＣＣからのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％ＳＶＦ（Ｓｉｇｍａ）で通常培養した。７週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳ中、１０００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植した。移植後２０日前後、腫瘍が１４５〜１６５ｍｍ３の平均サイズに達した際に、動物を腫瘍のサイズと性状に従って６個体のマウスの群に分けた。
【０５３９】
次に、異なる処置計画を施し、動物の健康状態を毎日モニタリングした。腫瘍体積を、試験終了まで週に２回、電子カリパスで測定した。腫瘍体積は下式：π／６×長さ×幅×高さを用いて算出した。毒性は、週に３回、動物の秤量の後に評価した。統計分析は各測定においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【０５４０】
これらの種々のモデルにおいて、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＡＤＣを５ｍｇ／ｋｇの用量で１回ｉ．ｐ．投与した。並行して、５ｍｋ／ｋｇのｈｚ１６１３Ｆ１２  （ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＤＡＲ２に相当するものと同等の用量でキャップを有する薬物成分２４を注射する。より正確には、薬物成分２４を以下の条件下でＮ−アセチルシステインによるキャップを付けた。化合物２４の１０ｍＭ保存溶液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５％ＤＭＳＯを含有する１０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．４で０．２５ｍＭに希釈した。２．６モル過剰のＮ−アセチルシステインを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．４中１０ｍＭの溶液から加えた。反応は室温で４５分間行った。インキュベーション後、キャップ−化合物２４を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨｉｓバッファーｐＨ６．５に希釈した後、濾過除菌および４℃での貯蔵を行った。キャップの付加はＬＣ−ＭＳ分析により制御した。
【０５４１】
データを図１５に示す。
【０５４２】
図１５Ａに関する表６
【０５４３】
【表１２】
2016518382.tif 000095
【０５４４】
図１５Ｂに関する表７
【０５４５】
【表１３】
2016518382.tif 000096
【０５４６】
図１５Ｃに関する表８
【０５４７】
【表１４】
2016518382.tif 000097
【０５４８】
ＮＣＩ−Ｈ１２９９異種移植モデルで得られたデータは、４１日目において９５．７％の増殖阻害を示す。７５日目に、５ｍｇ／ｋｇのｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４で処置した５個体のうち４個体のマウスが、ＮＣＨ−Ｈ１２９９腫瘍の完全退縮を示す。
【０５４９】
同様に、５４日目には、ＰＡＮＣ１腫瘍の９８．４％の増殖阻害が見られる。加えて、５４日目に、用量５ｍｇ／ｋｇでのｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４処置群では、６個体のうち２個体のマウスが完全退縮を示し、６個体のうち２個体のマウスが測定可能な腫瘍を持っていない。両実験において、キャップ−２４化合物の効果は見られない。最後に、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＡＤＣで処置した総て（６個体のうち６個体）の動物が６２日目に完全な腫瘍退縮を示す。
【０５５０】
本実施例は、Ａｘｌ発現腫瘍細胞の退縮を誘導するｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＡＤＣの効力を示す。
【０５５１】
実施例１２：  Ａ５４９同所モデルにおけるｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣの効果
本実施例では、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣを、ヌードマウスの胸腔に腫瘍細胞を接種することにより、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、Ａ５４９腺癌の転移性モデルで評価する。腫瘍の胸部内移植は、ｓ．ｃ．異種移植モデルに比べて高い腫瘍形成性および転移能をもたらし、従って、臨床状態により良く関連すると思われる。
【０５５２】
より詳しくは、Ｋｒａｕｓ−Ｂｅｒｔｈｉｅｒらが記載しているようにＡ５４９ヒト肺腫瘍細胞に関して同所モデルを設定する。簡単に述べれば、動物をケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、リヨン、フランス）とキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）２％；Ｂａｙｅｒ、ピュトー、フランス）の４／１混合物のｉ．ｐ．投与で麻酔する。１００万個の腫瘍細胞を、２６ゲージ針を用い、容量１００μｌで、ヌードマウスの胸壁を介して左胸腔に移植した（ｉ．ｐｌ．）。原発腫瘍は４日目にすでに局部的に拡散し、縦隔、肺および横隔膜を含めた連続的構造物となっていた。臨床状態をより良く模倣するために、処置は、Ａ５４９腫瘍細胞のｉ．ｐ．注入の７日後、疾病が発症した場合にのみ開始した。１０個体のマウスの群を無作為に作り、細胞移植後１４日目に１回、ｈｚ１６１３Ｆ１２（ＶＨ３／ＶＬ３）−２４  ＤＡＲ２は用量７ｍｇ／ｋｇ、およびキャップ−２４は７ｍｇ／ｋｇ薬物相当量で処置した。対照マウスにはビヒクルを施した。マウスの体重および寿命の変化をモニタリングした。抗腫瘍活性は次のように評価した：Ｔ／Ｃ％＝処置群の生存期間中央値／対照群の生存期間中央値×１００。ログランク検定統計分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエアを用いて行った。有意性閾値は５％であった。データを図１６に示す。
【０５５３】
【表１５】
2016518382.tif 000098
【０５５４】
図１６に示されるように、ヒトＡ５４９同所モデルで評価した場合、用量７ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与したｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣは、ヒトＡ５４９癌に対して顕著な抗腫瘍活性を示した。このヒト肺癌モデルでは、ｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２  ＡＤＣは、対照群（ＰＢＳ、キャップ−２４）に対してｈｚ１６１３Ｆ１２−２４  ＤＡＲ２で処置した動物に、有意な生存利益を誘導した。Ｔ／Ｃ値はそれぞれ約１９３％および１５８％である。
【０５５５】
略号
Ａｃ          アセチル
Ａｃｍ        アセトアミドメチル
Ａｌｌｏｃ    アリルオキシカルボニル
Ｂｏｃ        二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル
ｔ−Ｂｕ      ｔｅｒｔ−ブチル
Ｂｚｌ        ベンジル、なお、Ｂｚｌ−ＯＭｅはメトキシベンジルおよびＢｚｌ−Ｍｅはメチルベンゼンである。
ＣｂｚまたはＺ  ベンジルオキシ−カルボニル、なお、Ｚ−ＣｌおよびＺ−Ｂｒはそれぞれクロロ−およびブロモベンジルオキシカルボニルである。
ＤＭＦ        Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄｎｐ        ジニトロフェニル
ＤＴＴ        ジチオトレイトール
Ｆｍｏｃ      ９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
ｉｍｐ        Ｎ−１０イミン保護基：３−（２−メトキシエトキシ）プロパノエート−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ  ＭＣ−ＯＳｕマレイミドカプロイル−Ｏ−Ｎ−スクシンイミド
Ｍｏｃ        メトキシカルボニル
ＭＰ          マレイミドプロパンアミド
Ｍｔｒ        ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル
ＰＡＢ        パラ−アミノベンジルオキシカルボニル
ＰＥＧ        エチレンオキシ
ＰＮＺ        カルバミン酸ｐ−ニトロベンジル
Ｐｓｅｃ      ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル
ＴＢＤＭＳ    ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＢＤＰＳ    ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
Ｔｅｏｃ      ２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル
Ｔｏｓ        トシル
Ｔｒｏｃ      ２，２，２−トリクロルエトキシカルボニルクロリド
Ｔｒｔ        トリチル
Ｘａｎ        キサンチル
【図１Ａ】
2016518382.tif 000114
【図１Ｂ】
2016518382.tif 000115
【図１Ｃ】
2016518382.tif 000116
【図３】
2016518382.tif 000117
【図５】
2016518382.tif 000118
【図６】
2016518382.tif 000119
【図７】
2016518382.tif 000120
【図８】
2016518382.tif 000121
【図９】
2016518382.tif 000122
【図１０Ａ】
2016518382.tif 000123
【図１０Ｂ】
2016518382.tif 000124
【図１１】
2016518382.tif 000125
【図１２】
2016518382.tif 000126
【図１３】
2016518382.tif 000127
【図１４Ａ】
2016518382.tif 000128
【図１４Ｂ】
2016518382.tif 000129
【図１６】
2016518382.tif 000130
【図２】
2016518382.tif 000131
【図４Ａ】
2016518382.tif 000132
【図４Ｂ】
2016518382.tif 000133
【図４Ｃ】
2016518382.tif 000134
【図１５Ａ】
2016518382.tif 000135
【図１５Ｂ】
2016518382.tif 000136
【図１５Ｃ】
2016518382.tif 000137
【配列表】
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【国際調査報告】
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2016518382.tif 000139