(57)【要約】  血小板減少症治療薬の使用、特に、血小板減少症治療薬の製造におけるデンシチンの使用を開示する。薬学的に許容可能な従来の補助物質を添加することにより、デンシチンから経口用製剤または注射剤を調製することができる。薬力学的な試験は、デンシチンが、化学療法の薬剤によって引き起こされる血小板減少症を効果的に抑制できること、および明らかな治療効果と低毒性の副作用とをもって血小板減少性紫斑病を治療できることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板減少症の治療におけるデンシチンの使用。
【請求項２】
血小板減少症の治療薬の製造におけるデンシチンの使用。
【請求項３】
上記血小板減少症は、薬剤性の血小板減少症、原発性血小板減少性紫斑病、続発性血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、急性白血病、巨赤芽球性貧血、ＤＩＣ、脾機能亢進症、放射線症候群、カラアザール、腸チフス、結核、骨転移、および進行性体外循環を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のデンシチンの使用。
【請求項４】
薬学的に許容可能な従来の賦形剤を添加することにより、上記デンシチンから、医学的に許容可能な任意の製剤を作ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンシチンの使用。
【請求項５】
上記製剤は、経口用製剤または注射用製剤であることを特徴とする、請求項４に記載のデンシチンの使用。
【請求項６】
上記経口用製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、または粉剤であり、上記注射用製剤は、注射液または粉末注射剤であることを特徴とする、請求項５に記載のデンシチンの使用。
【請求項７】
上記経口用製剤は、分散性錠剤、口腔内崩壊錠、または徐放錠であることを特徴とする、請求項５に記載のデンシチンの使用。
【請求項８】
上記注射用製剤は注射液であることを特徴とする、請求項５に記載のデンシチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、医薬品の技術分野に属していると共に、血小板減少症の治療に用いられる医薬品に関し、特に、血小板減少症治療薬の製造におけるデンシチンの使用に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
血小板は最小の血液細胞であって、その主要な機能は凝血および止血である。人体が負傷し流血した場合、その怪我をした場所に血小板は群れを成して数秒以内に集結する。初めに、上記血小板は、血管収縮性の物質を放出して、損傷した血管を様々な度合いで収縮させる。次に、上記血小板および血中の他の血液凝固物質が、損傷した血管壁に付着すると共に一堂に凝集して凝血塊を形成することにより、損傷した傷口および血管を塞ぐ。健康な人における血小板数は１００×１０９／Ｌ〜３００×１０９／Ｌであり、血小板の平均寿命は８日〜１２日である。血小板減少症とは、様々な原因によって、結果として血小板数が基準値の下限を下回ることを意味する。
【０００３】
血小板減少症は以下の危害をもたらし得る：１．粘膜出血（例えば、鼻粘膜出血、口腔粘膜出血、胃腸管粘膜出血、泌尿生殖路出血、膣出血等）を引き起こす；２．手術後の大量出血；３．多発性の点状出血および脚部に最も高頻度に出現する紫斑；４．生命を脅かし得る、胃腸管の大量出血および中枢神経系の内出血を引き起こす。
【０００４】
血小板減少は、例えば、血小板生成の減少、血小板の過剰な破壊、脾臓内における血小板の過剰な滞留、等の非常に多くの原因によって引き起こされる。（１）血小板生成の減少は、例えば、薬、悪性腫瘍、感染症、電離放射線、等のいくつかの要因に起因する、造血幹細胞の破壊、または骨髄細胞中における造血幹細胞の増殖の影響によって引き起こされる。（２）血小板の過剰な破壊は、一般に、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病といった、特発性の血小板減少性紫斑病および消耗性の血小板減少症において見られうる。（３）脾臓内における血小板の過剰な滞留は、一般に、脾機能亢進症において見られうる。上述の因子は、１つの身体にて共存することが多い。臨床では、治療を必要としない偽血小板減少症を除いて、薬剤性の血小板減少症および病理学的な血小板減少症の両方が、治療手段による治療を求めている。
【０００５】
薬剤性の血小板減少症（ＤＩＴＰ）は、一部の薬による、血中の血小板数の減少に起因する出血性の疾患であり、薬剤に誘発された血小板数が１００×１０９／Ｌよりも低いこと、および深刻な血小板減少症の血小板数が５×１０９／Ｌよりも低いことを表す。ＤＩＴＰは、以下の薬によって引き起こされることが多い：抗凝固剤（例えば、ヘパリン、抗悪性腫瘍薬、および免疫抑制剤）、抗菌剤（例えば、クロラムフェニコール、およびスルホンアミド）、解熱性鎮痛薬（例えば、アスピリン、およびアセトアミノフェン）、利尿薬（例えば、クロロチアジド）、抗癲癇薬（例えば、フェニトイン、およびカルバマゼピン）、血糖降下剤（例えば、クロルプロパミド、およびトルブタミド）、エストロゲン物質（例えば、ジエチルスチルベストロール）、一部のワクチン、一部の漢方製剤、一部の脂質低下薬、シメチジン、ビスマス、ジギトキシン、有機ヒ素、および他の薬。
【０００６】
病理学的な血小板減少症は、主として、原発性血小板減少性紫斑病、続発性血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、急性白血病、巨赤芽球性貧血、ＤＩＣ、脾機能亢進症、放射線症候群、カラアザール、腸チフス、結核、骨転移、および進行性体外循環、並びにそれらに類するもの、を含む。臨床において最も一般的なものは、血小板減少性紫斑病である。
【０００７】
長年、国内外の多くの学者らは、血小板減少症の治療について、詳細な研究を行い、いくつかの成果を達成してきた。血小板減少症の治療方法は複数あり、当該治療方法は、副腎皮質ステロイドの投与、静注用免疫グロブリン、および脾臓摘出術といった第１選択治療、並びに、静注用抗Ｒｈ（Ｄ）免疫グロブリン、および免疫抑制剤といった第２選択治療、を含む。上述の第１選択治療および第２選択治療が不成功に終わった場合には、血小板輸血、血漿交換、タンパク質免疫吸着といった治療方法を用いることができる。ここで、上記血小板輸血は、血小板減少症の効果的な治療法であるが、その臨床応用は、保存期間の短さ、輸血用血液の不足、コストの高さ、血液由来の感染症の可能性、輸血反応、および血小板抗体の生成、を理由に制限される。加えて、血小板輸血を繰り返すことは、血小板輸血不応を引き起こすことがあり、その結果、患者の生命が常に脅かされる。インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板減少症の治療に対して優れた治療効果を有するけれども、重大な副作用および高い価格のために、臨床において広く適用することができない。従って、著しい社会的利益と広範な潜在市場とを有する、安全かつ効果的な治療薬を研究し開発することが目標である。
【０００８】
血小板減少症に関して、伝統中国医学（ＴＣＭ）理論における治療理論も存在する。血小板減少性紫斑病（１ＴＰ）に対して通常用いられる治療薬は、血小板を増加させるカプセルである維血寧（Weixuening）粒、等である。化学療法によって引き起こされた血小板減少症に対して、ＴＣＭでは、化学療法薬は、発熱性の毒性を有する強烈な薬であって、気を消耗し陰を弱め、脾臓、腎臓、および肝臓といった内臓を損傷して、その結果、先天的および後天的な源を枯渇させ、気血の損傷、肝臓および腎臓の不全、脾臓および胃の機能低下、等をもたらす、と考える。最も一般的に用いられる漢方薬は、化合物緑礬丸薬（Compound Zaofan pills）やシェンバン処方（Sheng Ban Recipe）といった一部の化合物製剤だけでなく、人参（Radix et Rhizoma Ginseng）、オウギ（Astragali Radix）、白朮（Rhizoma Atractylodis Macrocephalae）、当帰（Angelicae Sinensis Radix）、地黄（Rehmanniae Radix）、阿膠（Asini Corii Colla）、鶏血藤（Spatholobi Caulis）、補骨脂（Psoraleae Fructus）、枸杞子（Lycii Fructus）、女真子（Ligustri Lucidi Fructus）、仙鶴草（Agrimoniae Herba）、落花生（Arachis hypogaea Linn）、等である。
【０００９】
三七人参（Radix et Rhizoma Notoginseng）は、田七人参または華千金藤（Stephania sinica Diels）としても知られ、ウコギ科トチバニンジン属のpanax notoginseng (Burk.) F.H.Chenの乾燥した根である。「本草綱目（The Compendium of Materia Medica）」に記載されているように、「三七人参は止血性作用および鎮痛作用を有しており、噛んだまたは粉末にした三七人参を傷に適用することによって、刀傷、矢傷、転落外傷、鞭打ち外傷、および傷からの手に負えないほどの出血を止めることができる。三七人参は、吐血、血便を特徴とする赤痢、子宮出血、持続性の月経、産後の悪露の持続（postpartum retention of lochia）、血行不良による月経困難症、眼の膨張や痛み、および虎や蛇による噛傷、といった疾病を治療することもできる」。「The Records of Combination between Traditional Chinese Medicine and Western Medicine」を参照すると、「三七人参は、新しく血を損なうことなく、血管外遊出した血を散逸させることができるという、血の調整に対する驚くべき薬である」。「New Compilation of Materia Medic」を参照すれば、「三七人参の根は、出血を止める妙薬である」。「Chinese Pharmacopoeia」は、三七人参の主効能を、「鬱血の散逸および出血の停止、膨張の漸減および痛みの軽減」と定義している。三七人参は、数千年にわたって、外傷や身体の内部の損傷によって引き起こされる、内部出血または外部出血する病理現象の治療に広く適用されている。
【００１０】
デンシチン（ニューロトキンとも呼ばれ、ＯＤＡＰと称される、化学名：β−Ｎ−オキサリル−Ｌ−α、β−ジアミノプロピオン酸）は、非タンパク質アミノ酸であり、三七人参の止血性有効成分である。Ｒａｏらは、１９６４年に、グラスピーの種子からデンシチンを単離して、その化学構造を同定した。そして、１９７１年に、デンシチンを合成することに成功した。同時に、デンシチンの、光学活性と中枢神経性の毒性との間の関係について調べた。その後は、様々な合成方法が逐次報告された。現在では、デンシチンの中枢性の神経毒性の研究は細胞レベルおよび分子レベルまで深化しており、デンシチンの中枢性の神経毒性は、デンシチンがＬ−グルタミン酸塩の類似物質であって、中枢神経系の細胞膜を分極化してＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、等を含むイオンの活性に影響を与えることが理由であると考えられている。
【００１１】
１９８０年代中頃に、漢方医学従事者らは、デンシチンの、合成、薬理学、および毒物学の研究を開始した。Tianjin Institute of Traditional Chinese Medicineに勤めるZhao Guoqiangらは、１９８４年に、三七人参の止血活性成分であるデンシチンを合成し、止血、血小板数の増加、および神経毒性、等に関する、デンシチンおよびその鏡像異性体であるβ−Ｎ−オキサリル−Ｄ−α、β−ジアミノプロピオン酸の影響について研究した。これにより、デンシチンおよびその鏡像異性体の両方ともが、止血および血小板数の増加等に関する顕著な効果を有することが見い出された。Zhao Guoqiangは、Ringer-Locke溶液０．５ｍｌにデンシチン１ｍｇを溶解させて混合溶液を調製し、当該混合溶液を雌のマウスの腹腔に注射することによって、デンシチンに血小板数を３０％も顕著に増加させる能力があることを発見した。Jilin Agricultural UniversityのLu Qiらは、１９８８年に、止血成分として用いられるデンシチンを、朝鮮人参（Ginseng Radix et Rhizoma）のような漢方薬から個別に分離した。それによって、古くからの処方箋に記されている、朝鮮人参等のような漢方薬が止血作用を有していることを学術的に確認した。Liu Hezhiらは、デンシチンの止血の機序を研究し、三七人参の注射によって、血小板が、伸長、仮足、凝集、変形といった粘性変形運動を生成することが可能であり、その結果一部の細胞が崩壊または溶解して、脱顆粒および分泌反応が引き起こされ、それにより、血小板が、ＡＤＰ、血小板因子、およびカルシウムイオンといった止血作用物質を放出することを誘発し、止血効果をもたらすと考察した。
【００１２】
デンシチンが血小板数を増加させる能力があるという報告に関して、本願発明者らはデンシチンの血小板減少症の治療における使用について実験的研究を行った。結果は、デンシチンの単回注射投与、および薬の種々の用量のそれぞれによって、ウサギの血小板数に明らかな変化は生じないことを示す（表１参照）。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
３日間、５日間、および７日間の予防的投与といった、予防的な頻回投与プロセスのそれぞれにおいて、結果は、インターロイキン１１またはデンシチンの５日間および７日間の予防的投与のそれぞれが、モデル群に比べて血小板数を増加させることを示している。３日間の予防的投与によっては、モデル群に比べて血小板数は顕著な違いを示さなかった（表２）。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
薬力学的研究は、さらに、デンシチンが、カルボプラチンによって引き起こされたラットの血小板数の減少に抵抗する顕著な効果を有することを見出す。そのことは、血小板の増加に対する効果、および同時に、カルボプラチンの注射によって引き起こされるラットの血小板凝集速度の低下に抵抗する血小板の機能を向上させて血小板凝集速度を増加させることを示す。これまでのところ、中国特許出願公開第ＣＮ１２９２３７６Ａに、少量のデンシチンが止血を達成することができる、と記載されているように、従来技術では、少量のデンシチンを止血剤として用いることができることが報告されている。しかしながら、デンシチンが血小板減少症を治療することができることについては、全く報告されていない。
【００１７】
〔発明の概要〕
本発明は、血小板減少症の治療薬の製造におけるデンシチンの使用を提供することを目的とする。
【００１８】
好ましくは、薬学的に許容可能な従来の賦形剤を添加することにより、デンシチンから、血小板減少症の臨床治療に用いられる経口用製剤または注射用製剤を作る。
【００１９】
さらに好ましくは、上記経口用製剤は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、または粉剤であり、上記注射用製剤は、注射液または粉末注射剤である。ここで、上記経口用製剤は分散性錠剤、口腔内崩壊錠、または徐放錠であることが好ましく、上記注射用製剤は注射液であることが好ましい。
【００２０】
本発明は、以下の技術的効果を有する。本発明は、デンシチンを血小板減少症の治療に用いることができることを初めて発見する。研究室の薬力学的な実験において、化学療法の薬剤によって引き起こされる血小板減少症および血小板減少性紫斑病を、デンシチンが効果的に抑制できることが示され、デンシチンは顕著な効果を有し副作用が少ないことが示された。
【００２１】
〔実施形態の詳細な説明〕
以下は、研究室における、デンシチンが血小板減少症の治療活性を有することを示す有効性試験である。
【００２２】
［実施形態１  カルボプラチンの複数回注射によって引き起こされた血小板減少症モデルのラットについてのデンシチン投与の影響］
１．１  試験材料
試験動物：Changchun Yisi Experimental animal technology Inc.から購入した、証明書Ｎｏ．：ＳＣＸＫ-(JI)2011-0004、体重１８０ｇ〜２１０ｇの、雄のウィスターラット。
【００２３】
試験薬剤および調製方法は以下の通りである：
デンシチン試薬、規格：Kunming Shenghuo Pharmaceutical (Group) Co., Ltdから提供された、バッチＮｏ．：２０１２０３２３、４６ｍｋ／瓶。使用時には、デンシチン試薬は、生理食塩水を用いて新たに調製し、４℃にて保管し、腹腔内注射に用いる。
【００２４】
注射用の遺伝子組み換えインターロイキン−１１、規格：４℃にて保管され、Qilu Pharmaceutical Co., Ltd.にて製造され、無菌の凍結乾燥製剤に形成された、バッチＮｏ．：２０１２０２００８ＳＫ、２．４×１０７ＡＵ／３．０ｍｇ。調製方法：使用時には、生理食塩水を用いて新たに調製し、皮下注射に用いる。
【００２５】
カルボプラチン注射液、Qilu Pharmaceutical Co., Ltd.にて製造され、遮光された、バッチＮｏ．：１０４００４２ＥＳ、規格：１０ｍｌ：１００ｍｇ。静脈注射に使用する前に、生理食塩水を用いて新たに希釈した。
【００２６】
試験機器：US Shuangjie Brothers Limited製の電子天秤Ｔ２０００、Prokan Electronics Inc. in Shenzhen製の自動血液分析装置ＰＥ−６８００ＶＥＴ、Prokan Electronics Inc.in Shenzhen製の血液凝固分析装置ＦＢ−４０、Olympus Corporation製の顕微鏡ＣＨ−２０。
【００２７】
１．２  試験方法
８１匹のラットを用意し、以下の８つの群に無作為に分ける：空白対照群、高用量群Ａ（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、非モデリング）、モデル群（４０ｍｇ／ｋｇ、尾静脈注射）、インターロイキン−１１群（２６０μｇ／ｋｇ、皮下注射）、高用量群Ｂ（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、モデリング）、高用量群（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）、中用量群（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）、および低用量群（０．２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）。ここで、上記モデル群のラットは１１匹であり、他の群のラットはそれぞれ１０匹である。実験前に、これらの動物は２日間環境に適応することが求められる。その後、血液学的指数を検出するために、それらの動物の尾から血を採取する。
【００２８】
１０日間の投与後、空白対照群、高用量群Ａ、およびポジティブ薬剤群のそれぞれのラットの尾から血を採取し、血液学的指数を検出する。
【００２９】
その後、空白群および高用量群Ａ以外の全ての動物に、モデリングのために個々にカルボプラチン（４０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて１５日間連続投与する。この１５日間の間に、高用量群Ａおよび高用量群Ｂのラットは、モデリング後５日目、１０日目、１５日目のそれぞれにおいて、投与を停止して、尾から血を採取し、血液学的指数を検出する。モデリング後１５日目、カルボプラチン（４０ｍｇ／ｋｇ）を再度注射し、第２のモデリングを行う。そして、前述の方法に基づいて、１０日間連続して一日一回、全ての群に連続投与する。それぞれの血液学的指数の検出の前に、動物の体重をそれぞれ測定する。カルボプラチンの２回目の注射の５日後に、ラットの尾の血を採取し、血液学的指数を検出する。そして、カルボプラチンの２回目の注射の１０日後に、ラットの尾の血を採取し、血液学的指数、網状赤血球指数、および血液凝固指数を検出する。そして、動物の体重を測定して、殺し、肝臓、胸腺、脾臓、および副腎を死んだラットから採取して重量を測定し内臓指数を算出する。さらに、病理学検査を行うために骨髄を採取する。
【００３０】
１．３  試験結果
１．３．１  動物の体重への影響
【００３１】
【表３】
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【００３２】
表３の結果に示すように、空白対照群の動物は、標準的な体重増加を示す。デンシチンを投与された高用量群Ａの動物は、有意な違いとして、対照群に比べて緩やかな体重増加を示す。試験の当初は、皮下注射によってインターロイキン−１１（２８０μｇ／ｋｇ）を服用するインターロイキン−１１群の動物は明らかな体重減少を示し、不良な状態である。そして、１０日間の予防的投与の後に、以下のような、対照群とは明らかな違いを示す；動物が、カルボプラチンを注射するとすぐに死に始めるが、投与量を２６０μｇ／ｋｇに減らすと、動物の体重および状態は徐々に標準へと回復する。全投与期間の観察を通じて、カルボプラチンを注射されるモデル群の動物は、空白対照群に比べて明らかな体重減少を示す。そして他の群の動物は、体重において、モデル群の動物に対する明らかな違いを示さない。
【００３３】
１．３．２  動物の内臓指数への影響
モデル群のラットは、空白対照群のラットに比べて、胸腺指数の明らかな減少を示す。インターロイキン−１１群のラットは、空白対照群のラットに比べて、肝臓、脾臓、副腎の指数の明らかな増加を示す。他の群の動物は、モデル群の動物に比べて、内臓指数において明らかな違いを示さない。結果を表４に示す。
【００３４】
【表４】
2016518455.tif 000005
【００３５】
１．３．３  動物の血小板数への影響
表５に示すように、１０日間の予防的投与の後、動物の血小板数は、インターロイキン−１１によって有意に増加することが可能であり、このことは対照群とは著しく異なる。カルボプラチンの１回目の注射から５日後、デンシチンを予防投与された高用量群Ａの動物の血小板数は、すでに投与を停止しているにも関わらず増加する傾向を示し、モデル群の動物の血小板数は、対照群に比べて５１．４％にまで明らかに減少し、他の群はモデル群に比べて血小板数の明らかな違いを示さない。カルボプラチンの１回目の注射から１０日後、モデル群の動物の血小板数は、対照群に比べて１９．８％にまで明らかに減少し、インターロイキン−１１群の動物の血小板数はモデル群よりも明らかに高く、このことは血小板の減少を抑制できることを示している。高用量デンシチン群および中用量デンシチン群の血小板数は、モデル群に比べて、それぞれ２７．１％および３４．４％増加するという、増加傾向を示す。予防投与の高用量群Ｂの血小板数は、モデル群の血小板数に対する明らかな違いを示さず、このとき高用量群Ｂに対する投与はすでに停止している。カルボプラチンの１回目の注射から１５日後、それぞれの群の血小板数は、基本的に標準に戻り、空白対照群の血小板数に対して明らかな違いを示さない。ここで、インターロイキン−１１群、高用量デンシチン群、および中用量デンシチン群の血小板数が比較的早く回復する。カルボプラチンの２回目の注射から５日後、それぞれの群は用量に基づいた投与を受け、予防投与群Ａの動物の血小板数が、空白対照群の血小板数よりも著しく高いことが見い出されうる。カルボプラチンの２回目の注射から１０日後、予防投与群Ａの動物の血小板数は、空白対照群の血小板数よりも著しく高く；モデル群の動物の血小板数は、２１．６％にまで減少し、空白対照群よりも著しく低く；インターロイキン−１１群の動物の血小板数は、モデル群の血小板数よりも著しく高く；他の群の動物は、血小板数においてモデル群に対して著しい違いを示さず、不良な状態である。
【００３６】
【表５】
2016518455.tif 000006
【００３７】
［実施形態２  特発性血小板減少性紫斑病のマウスの治療に関するデンシチンの薬力学的研究］
１．１  試験材料
試験薬剤
Kunming Shenghuo Pharmaceutical(Group)Co., Ltdから提供され、バッチＮｏ．：20091101、規格：５ｍｇ／瓶のデンシチン。
【００３８】
Tianjin Pacific Pharmaceutical Co., Ltdにて製造され、ＮＭＰＮ（国家薬品承認番号：national medicine permission number）H12020809のプレドニゾン酢酸塩錠剤。当該プレドニゾン酢酸塩錠剤を粉末にし、生理食塩水を用いて懸濁溶液（０．３ｇ／Ｌ）とする。
【００３９】
試験動物
体重１８〜２２ｇ、雄と雌とが半分ずつ、ＳＰＦ（特定病原体除去）レベルの、健康なＢＡＬＢ／Ｃマウス；
Kunming Medical College Experimental Animal Centerから提供された、動物適合証明書（Animal Certificate of Conformity）：SCXK (YUNNAN) 2005-0008、４〜６週齢、通常レベル、体重２５０〜３５０ｇの、モルモット。
【００４０】
１．２  試験方法
動物の群分けおよび処理分け
健康なＢＡＬＢ／Ｃマウス（体重１８〜２２ｇ）を、それぞれの群が１２匹のマウスとなるように、以下の６つの群に無作為に分ける：空白群、モデル群、プレドニゾン酢酸塩群、デンシチン（高用量、中用量、および低用量）群。
【００４１】
モデリング方法：ＢＡＬＢ／Ｃマウスの眼窩の静脈から血を採取し、続いて、ＥＤＴＡ−Ｎａ２にて抗凝血処理した後、血小板を分離して洗浄する。調製した血小板の懸濁溶液を等量の完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントのそれぞれと均一に混合した。初めの１週間において、抗原を含む完全フロイントアジュバントを、モルモットの後足、背中、および鼠径部に皮下注射する。注射は合計で４回行い、各回の注射は、５箇所のスポットに、各スポットに対し１００μｌで行う。６週目において、非抗凝血処理の全血をモルモットから採取し、３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間、遠心分離し、上清を生じさせる。この上清は、モルモットの抗マウス血小板血清（ＧＰ−ＡＰＳ）である。上記上清を、ウォータバス（５６℃）中に３０分間設置し、完全に不活性化した。その後、不活性化した上清を、通常生理食塩水で希釈した。続いて、寒天拡散法によって抗体力価を試験し、最後に、後の使用のために−２０℃の冷凍庫に保管した。
【００４２】
試験の１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、および１３日目に、正常群を除いて、残りの５つの群のマウスは、モルモットの抗マウス血小板血清（ＡＰＳ）を、体重２０ｇあたり１００μｌの用量にて、腹腔内注射によって注射する。
【００４３】
投与方法
１日目から、それぞれの群のマウスに胃内投与する。デンシチン高用量、中用量、および低用量マウスは、それぞれ１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および６ｍｇ／ｋｇを胃内投与する。プレドニゾン酢酸塩群のマウスは、プレドニゾン酢酸塩の懸濁液を、５ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）にて、胃内投与する。他の群のマウスは、同容量の通常生理食塩水を、体重２０ｇあたり０．２ｍｌにて、胃内投与する。胃内投与を、一日一回、１４日間連続して行った。
【００４４】
指数検出
皮下紫斑の観察：
分類Ｉは、注射部位に軽微な出血が見られ、他の部位では出血場所は点在している；
分類ＩＩは、注射部位に明白な出血が見られ、他の部位では斑状出血および点状出血が見られる；
分類ＩＩＩは、注射部位に深刻な出血が見られ、皮膚上に多数の斑状出血および点状出血が現れ、皮膚上に潰瘍形成および黒い皮膚が認められる。
【００４５】
体重検出
それぞれの群のマウスの体重は、モデリング前、試験７日目、および試験１４日目に測定する。
【００４６】
血小板数検出
モデリング前および試験１４日目のそれぞれに、それぞれの群のそれぞれのマウスの眼窩の静脈から血２０μｌを収集し、抗凝血管に滴下し、その後、自動血液分析装置にて血小板数を検出した。
【００４７】
１．３  試験結果
１．３．１  ＩＴＰモデルマウスの皮下紫斑に関するデンシチンの影響
試験の終わりにおける、それぞれの群のマウスの皮下紫斑（例えば、出血度）についての結果を、表６に示す。
【００４８】
【表６】
2016518455.tif 000007
【００４９】
１．３．２  異なる時点における、ＩＴＰモデルマウスの体重に関するデンシチンの影響
モデリング前、試験７日目、および試験１４日目の、それぞれの群のマウスの体重変化を表７に示す。
【００５０】
【表７】
2016518455.tif 000008
【００５１】
１．３．３  異なる時点における、ＩＴＰモデルマウスの血小板数に関するデンシチンの影響
モデリング前、および試験１４日目の、それぞれの群のマウスの血小板数の変化を表８に示す。
【００５２】
【表８】
2016518455.tif 000009
【００５３】
前述の試験結果は、デンシチンが、血小板の減少を効果的に抑制できること、およびそれによって血小板減少症を効果的に治療できることを示している。
【国際調査報告】
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