(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を有効成分とする骨吸収抑制剤であって、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質が配列表の配列番号１のアミノ酸番号１番〜１５１番又は１９番〜１５１番で表されるアミノ酸配列を有する骨吸収抑制剤。
【請求項２】
白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質が破骨細胞による骨吸収を抑制する請求項１に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項３】
白血球活性化タンパク質因子若しくは白血球活性化タンパク質因子由来の物質を出発原料とし、又はこれらを情報源として調製した骨吸収抑制剤候補化合物について、骨吸収作用についてのインビトロ試験を指標にしてスクリーニング試験を実施し選別することからなる骨吸収抑制剤のスクリーニング方法であって、白血球活性化タンパク質因子若しくは白血球活性化タンパク質因子由来の物質が配列表の配列番号１のアミノ酸番号１番〜１５１番又は１９番〜１５１番で表されるアミノ酸配列を有するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を有効成分とすることを特徴とする骨吸収抑制剤に関する。さらに、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を利用した骨吸収抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血球活性化タンパク質因子［以下ＬＥＣＴ２（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ  ２）と称することもある。］は鈴木和男らにより見出された好中球走化性因子である（特開平８−１４０６８３公報）。ヒトおよびウシＬＥＣＴ２についてはクローニングが行われ、その塩基配列が決定されている（Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ５２，  ９−１３，  １９９６、  Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９６，  １０５−１１３，  １９９８）。ヒトＬＥＣＴ２のｍＲＮＡはシグナルペプチドと考えられる１８個のアミノ酸配列を含む１５１アミノ酸をコードすることが明らかとなっている。ウシおよびヒトＬＥＣＴ２のアミノ酸配列は、ニワトリ由来のｍｉｍ−１遺伝子産物と高いホモロジーをもっており、このｍｉｍ−１遺伝子産物の機能は不明であるが、骨髄の前骨髄球の顆粒に含まれ、癌遺伝子のｍｙｂが発現調節に関わっていることが知られている。
【０００３】
走化性因子として発見されたＬＥＣＴ２の作用については、好中球を活性化することによって、がん細胞破壊反応の亢進や、インターロイキン類の分泌の促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、腫瘍免疫としての治療、診断、予後の判定に利用できることが示唆されている。ＬＥＣＴ２は好中球の活性化に関連する作用が知られているのみであり、骨に対する作用については全く知られていなかった（蛋白質  核酸  酵素  ４２，  （７），  １０８６，  １９９７）。
【０００４】
一方、鈴木不二男らは、ウシ胎児軟骨より精製された分子量約１６ＫＤａのタンパク質であるコンドロモジュリン２を精製した（Ｙ．Ｈｉｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ２２６５７−２２６６２，  １９９６）。コンドロモジュリン２は軟骨細胞を増殖、分化を促進することが示されており（特開平５−２５５３９８公報）、また、破骨細胞の形成促進、破骨細胞活性化作用も有することが明らかになっている（特開平８−２７０２０公報）。最近になり、ホモロジー検索の結果、ＬＥＣＴ２とコンドロモジュリン２は同一であることが明らかとなった。
【０００５】
破骨細胞は骨組織で吸収を目的として存在し、骨のリモデリングに重要な働きをしている多核巨細胞である。破骨細胞の前駆細胞は、造血幹細胞に由来する細胞で、血流を介して骨表面に運ばれ、破骨細胞へと分化する。一方、骨芽細胞は、未分化間葉系細胞や線維芽細胞、間質細胞などの基質形成細胞系に属する前駆細胞から分化し、破骨細胞とはまったく細胞系列の異なる前駆細胞から由来している。骨は、常に骨の形成と骨の吸収を繰り返し、骨リモデリングを行っている。組織学的には骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収が行われ、その後、吸収された部位に骨芽細胞によって骨が作られ、バランスが保たれている。加齢に伴い種々の原因でそのバランスに異常が生じると、骨量が滅少し、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。
【０００６】
骨吸収抑制作用を有する薬剤としては、エストロジェン、カルシトニン、ビスフォスフォネート等が知られているが、いずれも副作用が報告されており、効果的に破骨細胞による骨吸収を抑制することができ、しかも安全性の高い薬剤が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
解決しようとする問題点は、新規な骨吸収抑制剤を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明はＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質が骨吸収抑制作用を有することを見出したことを最も主要な特徴とする。そして、この情報を利用して新規な骨吸収抑制剤を提供することを実現した。
【０００９】
本発明者らはＬＥＣＴ２の新規な作用を見出すため、鋭意検討を行った結果、骨に対する作用として、骨吸収を抑制する作用、特に破骨細胞に対する骨吸収抑制作用を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明はＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分とする骨吸収抑制剤に関する。さらに詳しくは、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１〜１５１番又は１９番〜１５１番で表されるアミノ酸配列を有するＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質を有効成分とする骨吸収抑制剤に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＬＥＣＴ２は、白血病細胞のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セファロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セファロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、逆相クロマトグラフィーにかけることによって精製することができる。例えば、培養したＳＫＷ−３などの白血病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラムクロマトグラフィーなどの手法を用いて、精製することができる。
【００１１】
また、本発明のＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質は、遺伝子工学的手法（特開平８−１４０６８３，特開平１０−１４６１８９）を用いて作製してもよい。例えば、ｐＭＡＬＴＭ−Ｃ又はｐＧＥＸ−３Ｘをベクターとして作製した形質転換体で産生しても良い。宿主細胞としては従来公知の細菌（大腸菌など）、酵母および動物細胞を用いることができる。動物細胞としては例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞およびヒトＨｅＬａ細胞などがあげられる。酵母としては、パン酵母、ピキア酵母等生産系の確立したものが利用に便利である。なお、工業生産の目的からは酵母分泌系を利用することがもっとも簡便である。
【００１２】
本細胞の培養、培養上清からの本発明のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の方法、さらに形質転換からの精製は公知の方法によって実施することができる。
【００１３】
本発明で用いるＬＥＣＴ２由来の物質は、骨吸収を抑制するものであれば、特に限定されない。公知のＬＥＣＴ２アミノ酸配列中に１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは誘導といった任意の変異を有し、骨吸収を抑制するものも含まれる（Ｕｌｍｅｒ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１９，６６６，  １９８３）。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質には、キメラタンパク質、融合タンパク質、部分欠失、部分配列および化学的に修飾されたものも含まれる。さらに、ＬＥＣＴ２の各種たんぱく質情報（一次、二次、三次構造及び立体表面構造）をもとにして創薬されるペプチドあるいは低分子化合物も候補化合物になりうる（特開平５−２５５３９８、特開平８−１４０６８３、ＷＯ／１６１７７）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４，  １４２１−１４２７，  １９９６）（Ｓ．Ｙａｍａｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，  ２３７，  １１６−１２０，  １９９７：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＬＥＣＴ２）。なお、その由来となるＬＥＣＴ２は骨吸収抑制活性を有する限り、その動物種を問わないが、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。
【００１４】
本発明において、ＬＥＣＴ２又はＬＥＣＴ２由来の物質の骨吸収抑制活性は、例えば次のようにして測定される。ウサギより単離した破骨細胞を象牙片上に播種し、翌日に形成されたピットの数を計測する骨吸収活性を見るアッセイ系に、ＬＥＣＴ２若しくはＬＥＣＴ２由来の物質又はこれら物質の情報をもとにして創製された修飾化合物を添加し、形成されるピット数の減少により、候補化合物の骨吸収の抑制活性を測定することができる（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  １７，  ３４７−３５９，  １９９２）（亀田ら，日薬理誌  １０９，  ７５−８４，１９９７）。
【００１５】
この測定による抑制率を指標にして、骨吸収抑制剤の候補化合物をスクリーニングし、例えば、抑制率８０％を１０μｇ／ｍｌの濃度で発揮する化合物が選択される。
【００１６】
本発明の骨吸収抑制剤を使用することのできる骨疾患の例としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ぺージェット病等が上げられる。
【００１７】
本発明の骨吸収抑制剤を治療薬剤として投与する場合には、通常成人１日当たり０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１〜３ｍｇ／ｋｇを１日１〜３回に分けて投与すればよく、これらの投与量は、用いる化合物、年齢、症状等により適宜増減することが可能である。
【００１８】
本発明の骨吸収抑制剤はその投与ルートについては所望により経口的、非経口的、あるいは局所的に投与することができる。経口投与剤としてはタンパク質又はペプチドの場合における消化分解、腸内吸収の問題を考慮して、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、点滴用剤、又は粘膜若しくは皮膚吸収の問題を考慮して粘膜投与剤若しくは外用剤とすることができる。
【００１９】
剤形についても所望により、必要に応じて、公知の担体等を併用して、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶解性製剤等の経口投与剤、又は、注射剤（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔等）、点滴剤、坐剤等による非経口剤等に製剤化されるものである。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、着色剤、安定化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、溶解補助剤、 粘着剤、乳化剤、リポソーム製剤、ｐＨ調整剤、懸濁剤、コーティング剤、腸吸収促進剤、除放性製剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。以下に実施例をもって、本発明をいっそう具体的に説明するが、これらは実施の一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
（１）未分画骨細胞の調製
ジエチルエーテルを用いた深麻酔により１０日齢、１１０ｇ前後の仔ウサギを屠殺し、四肢長管骨を採取した。軟組織を取り除いた後、５％仔ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むアルファ最小必須培地（α−ＭＥＭ）の中でハサミを用いて細切した。充分に細切した骨片と培養液を回収し、ｖｏｒｔｅｘミキサーを用いて骨片に付着している細胞を剥離させ、２分間静置した後上清を回収することにより未分画骨細胞を調製した。
【００２２】
（２）ピットアッセイ
２０〜４０μｍ厚の象牙スライスを直径６ｍｍの円盤状に切断し、７０％エタノール中で超音波処理することにより滅菌を行った。各象牙スライスをＰＢＳ、α−ＭＥＭにて洗浄後、２００μｌの培養液（５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）と共に９６穴プレートのウェルに移し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）にて、３７℃、２時間保温した。２時間後にウェル内の培養液を完全に取除き、各濃度のヒトＬＥＣＴ２を含む培養液および５×１０５個の未分画骨細胞を添加した後、さらにＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）にて、３７℃、１８時間保温した。１８時間後、ラバーポリスマンを用いて象牙スライスに付着している骨細胞を完全に取除き、酸性ヘマトキシリン溶液にて数分間染色し、顕微鏡下で象牙スライス一枚あたりのピット数を計測することにより破骨細胞の骨吸収活性を求めた。
【００２３】
図１の横軸は本アッセイ系に用いたヒトＬＥＣＴ２濃度を、縦軸は象牙スライス一枚あたりのピット数を示している。 ヒトＬＥＣＴ２は１μｇ／ｍｌの濃度で約５０％の骨吸収阻害活性を示し、１０μｇ／ｍｌの濃度でほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
【００２４】
【実施例２】
（１）破骨細胞の分離精製
実施例１の方法に従って調製した未分画骨細胞をコラーゲンゲル（新田ゼラチン、ｃｅｌｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｙｐｅ  Ｉ）でコートしたシャーレに播種し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ）にて、３７℃、２時間保温した。２時間後、シャーレ内の培地を完全に取除いた後、広口ピペットを用い、１０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄することによりゲル上から細胞を洗い流した。さらに０．００１％ プロナーゼ Ｅ／０．０２％ ＥＤＴＡ溶液を添加し、室温１５分静置した後、再び１０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄を行った。最後に、０．０１％ コラゲナーゼ溶液を添加し、室温５分静置、１０ｍｌのＰＢＳによる３回の洗浄を行うことによって破骨細胞以外の細胞をゲル上から完全に取除いた。ゲル上に残った破骨細胞は、０．１％ コラゲナーゼ溶液を添加し、室温１０分静置することにより細胞の足場ごと溶解し、破骨細胞のみを含む細胞浮遊液を回収した。
【００２５】
（２）ピットアッセイ
実施例１で用いた象牙スライス、培養液を用意し、実施例１と同様の方法でピットアッセイを行った。ただし、ここでは未分画骨細胞の代わりに、１ウェルあたり３０００個の精製破骨細胞を用いた。図２には本アッセイ系を用いてヒトＬＥＣＴ２の骨吸収阻害活性について調べた結果を示したが、未分画骨細胞を用いたピットアッセイと同様に、ヒトＬＥＣＴ２は１０μｇ／ｍｌの濃度でほぼ１００％の骨吸収阻害活性を示した。
【００２６】
【実施例３】
（急性毒性試験）
配列番号１９番から１５１番のアミノ酸配列からなる化合物を公知の手法によって調製し、このものを体重２０±１ｇのｄｄ系マウスの一群５匹に０．１ｍｇ／ｇを尾静脈より投与した。投与７日後まで観察し死亡例は確認できなかった。
【発明の効果】
本発明により、ＬＥＣＴ２が骨吸収活性を抑制することが判明した。本発明により、高カルシウム血症、骨粗鬆症等に対して有効な治療法を提供することができる。さらに、ＬＥＣＴ２由来の物質について、骨吸収抑制剤のスクリーニング法が提供できた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】未分画骨細胞に対するヒトＬＥＣＴ２の骨吸収抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
【図２】精製破骨細胞に対するのヒトＬＥＣＴ２の骨吸収抑制活性のアッセイの結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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