(57)【要約】  組換えタンパク質を発現するためのＣＨＯ細胞に特異的な合成プロモーター構築物、そのプロモーター構築物のライブラリ、及びプロモーター構築物を作製するための方法。プロモーター構築物は、３桁にわたる組換え遺伝子転写の正確な制御を可能にし、最上位の発現プロモーターは、ＣＭＶプロモーターの転写活性を２倍にすることができる。
2016537987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の発現を細胞中に誘発するのに適する合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞であって、前記合成プロモーターが、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、上記ＣＨＯ細胞。
【請求項２】
プロモーターコアが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵｂＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、及びＣＡＧＧ、例えば、ＣＭＶコア、特にｈＣＭＶ−ＩＥ１コア（配列番号１７０）から選択される、請求項１に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項３】
合成プロモーターが、転写因子調節エレメントを２から５０個、例えば、前記調節エレメントを２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個、例えば、５、６、７、又は８個含む、請求項１又は２に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項４】
転写因子調節エレメントが全て同じタイプである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項５】
転写因子調節エレメントが異なるタイプの組合せである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項６】
転写因子調節エレメントが直列に配列されている、請求項１から５までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項７】
組合せにおける各転写因子調節エレメントが、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＣＲＥ、及びＥ４１Ｆから独立に選択され、特に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥから、とりわけ、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘからから選択され、特に、前記組合せにおける少なくとも１つの調節エレメントの２つ以上のコピーである、請求項５に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項８】
合成プロモーターのＤＮＡ配列が、完全長のＣＭＶプロモーター配列のサイズの０．９以下、例えば、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５又はそれ未満である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項９】
合成プロモーターが、合成プロモーターのＤＮＡ配列１単位あたり、ＣＭＶプロモーターのＤＮＡ１単位あたりの転写活性を超える転写活性を有する、例えば、活性が１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、又は２．５倍増大している、請求項１から８までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１０】
ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１１】
転写因子調節エレメントＹＹ１の活性が、例えば、ＹＹ１に特異的なブロックデコイにより阻害されているか、又は細胞が、転写因子ＹＹ１を欠失させ且つ／若しくはＹＹ１をサイレントすることによってＹＹ１の活性を阻害するように変異している、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１２】
合成プロモーターの制御下に、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１３】
組換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１２に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１４】
プロモーターが、プロモーターコア又は野生型プロモーターに比べて改善されたタンパク質発現を示す、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１５】
改善されたタンパク質発現が、より高レベルの組換えタンパク質の発現である、請求項１４に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１６】
合成プロモーターが、配列番号３０から１６９のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１７】
合成プロモーターが、配列番号１２６から１６９のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１６に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１８】
合成プロモーターが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号１２６、配列番号１２８、又は配列番号１４４に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１９】
合成プロモーターが、いかなるＣｐＧアイランドも含まない、請求項１から１８までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項２０】
合成プロモーターが、それが関連する特定の組換えタンパク質の発現に適する特性を有する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項２１】
ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターであって、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントの混合、特に前記組合せにおける少なくとも１つの調節エレメントの２つ以上のコピーを含む上記合成プロモーター。
【請求項２２】
ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターであって、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＣＲＥを含む又はからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントの混合を含む上記合成プロモーター。
【請求項２３】
所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを作製する方法であって、
ａ）転写因子調節エレメントのモチーフを同定するステップと、
ｂ）ステップａ）において同定した各転写因子調節エレメントをプロモーターコアと組合せて、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系における活性について試験するステップと、
ｃ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系においてプロモーターコア単独よりも活性である、ステップ（ｂ）から２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｄ）ステップｃ）において選択した転写因子調節エレメントから独立に選択される、２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物を調製するステップと、
ｅ）ステップｄ）において調製した合成プロモーター構築物（単数又は複数）を、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞における活性について試験するステップと、
ｆ）野生型プロモーターに比べて同じ又は改善されたタンパク質発現を示す合成プロモーター構築物（単数又は複数）を同定するステップと
を含む上記方法。
【請求項２４】
ｇ）ステップｆ）において同定した構築物に関連する、２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｈ）ステップｇ）において独立に選択された転写因子調節エレメントを含む、又は前記転写因子調節エレメントからなるＴＦＲＥ構築物を含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物（単数又は複数）を調製するステップと
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｈにおいて調製したＴＦＲＥ構築物が、ステップｆ）において同定した構築物の相対存在度を反映する化学量論で転写因子調節エレメントを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
方法のステップ（ｆ）が、野生型プロモーターに比べて低減されたタンパク質発現を示すプロモーター構築物に最も頻繁に関連する転写因子調節エレメント（単数又は複数）を同定するステップと、ステップ（ｇ）においてこれらを除外するステップをさらに含む、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
所望のレベルの所与の、哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを同定する方法であって、
ａ）請求項２１又は請求項２２に記載の２つ以上の合成プロモーター構築物を得るステップと、
ｂ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞において各構築物によって駆動される組換えタンパク質の発現のレベルを決定するために、ステップａ）において得た合成プロモーター構築物を試験するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において試験した合成プロモーター構築物が、所望のレベルの組換えタンパク質の発現を促進する場合、前記合成プロモーター構築物を選択するステップと
を含む上記方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）において得た２つ以上の合成プロモーターが、それぞれ配列番号３０から１６９又は配列番号１２６〜１６９のいずれか１つから独立に選択される配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
所望のレベルのタンパク質発現が、野生型プロモーターを用いて実現されるものより高い、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望のレベルのタンパク質発現が、野生型プロモーターを用いて実現されるものより低い、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
転写因子調節エレメントＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘを５：３の比でランダムにライゲートするステップを含む、転写因子調節エレメント構築物ライブラリを構築する方法。
【請求項３２】
転写因子調節エレメントＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥを５：３：１：１の比でランダムにライゲートするステップを含む、転写因子調節エレメント構築物ライブラリを構築する方法。
【請求項３３】
転写因子調節エレメントＹＹ１の活性がノックダウン又はノックアウトされている、ＣＨＯ細胞。
【請求項３４】
ＹＹ１活性が、ＹＹ１に特異的なブロックデコイによってノックダウン又はノックアウトされている、請求項３３に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項３５】
合成プロモーターの制御下に、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３３又は請求項３４に記載のＣＨＯ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において用いるための合成プロモーター構築物、及び合成プロモーター構築物を含む組換え宿主細胞に関する。本発明は、これらのプロモーター構築物を作製するための方法、前記組換え細胞、及び組換えタンパク質の発現などにおける合成プロモーター構築物のいずれか１つの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣に由来し、遺伝子研究、毒性スクリーニング、及び、特に組換えタンパク質の発現のための遺伝子発現において広く用いられている。ＣＨＯ細胞は、１０６０年代に最初に導入され、懸濁培養において増殖し、培養培地にプロリンを必要とする。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質治療薬の大規模生成に最も一般的に用いられる哺乳動物宿主細胞系である。よって、ＣＨＯ細胞は、バイオ医薬品産業における重要なツールである。
【０００３】
ＣＨＯ細胞を組換えタンパク質の生成に用いる場合に直面する主要な難題の１つは、ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質の発現レベルを正確に制御するのが困難であり得るということである。候補バイオ医薬品の現在のバイオ業界における品ぞろえは多様であり、ポリペプチドに特異的なフォールディング及びアセンブリ速度と動力学的に同調させて、遺伝子の転写をタンパク質特異的に制御することを必要とする、多くの「発現困難な」（ＤＴＥ）タンパク質を含むことに鑑みて、組換えタンパク質の発現レベルを正確に制御する能力はとりわけ重要である。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発現は、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の遺伝子発現率のタイトレーションにより、大きく改善することができる（Ｈｏら、２０１３年）。
【０００４】
表現型（タンパク質のフォールディング、グリコシル化、アポトーシスなど）が最適化された新たな細胞工場を開発するには、複数の遺伝子の転写活性を同時に変化させる能力も必要とされる（Ｄａｔｔａら、２０１３年、Ｌａｎｚａら、２０１２年）。目下のところ、強力なウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス最初期１（ｈＣＭＶ−ＩＥ１又はＣＭＶ）プロモーター）は、細胞ストレス誘発、細胞周期依存性、及びエピジェネティックなサイレンシングに関連するのにも関わらず、これによって、ＣＨＯ細胞における組換え遺伝子の転写は依然としてルーチン的に制御されている（Ｄａｌｅ、２００６年、Ｋｉｍら、２０１１年）。ＣＭＶは、殆どのバイオ医薬品の発現を駆動するために、現在用いられている「黄金律」のプロモーターである。ＣＭＶは、ウイルスを多くの哺乳動物の宿主細胞に感染できるようにする、ウイルスの進化によって生み出された高度に複雑なエレメントである（Ｓｔｉｎｓｋｉ及びＩｓｏｍｕｒａ、２００８年）。しかし、２５年を超えてバイオ医薬品の生成を駆動するために用いられているに関わらず、ＣＭＶがＣＨＯ細胞において機構的にどのように機能するかについては殆ど知られておらず、したがってＣＭＶの転写活性を正確に制御又は改善するための戦略は一般的に得られていない。
【０００５】
したがって、合成プロモーターは、発現ベクターにおける、機能が明確でなく、制御できない遺伝子エレメントを、宿主細胞の機能を予想通りに設計することができる、改良された、所望の通りの制御因子で置き換えることができるため、潜在的に魅力的な解決策を提供する。
【０００６】
合成プロモーターは、両方とも最小コアプロモーターモチーフの上流にある、（ｉ）ランダム化されたＤＮＡ配列若しくは合成オリゴヌクレオチドリピート、又は（ｉｉ）知られているシス調節エレメントのアセンブリ（例えば、転写因子結合部位、若しくは調節エレメント、若しくはＴＦＲＥ）のいずれかをスクリーニングすることにより、伝統的に作製されてきた。これらの努力により、ある範囲の生物体、主に微生物、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｙｉｍら、２０１３年）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｂｌａｚｅｃｋら、２０１２年）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、２０１０年）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（１０）だけでなく、哺乳動物細胞（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１１年；Ｓｃｈｌａｂａｃｈら、２０１０年）において機能するようにデザインされた合成プロモーターライブラリが得られた。これらの研究は、合成プロモーターによって提供される精巧な遺伝子発現制御は極めてコンテクスト依存的であり、プロモーターを各宿主細胞型に特異的に構築することを必要とすることを実証した。Ｓｃｈｌａｂａｃｈらは、例えば、ＨｅＬａ細胞においてスクリーニングした哺乳動物細胞に対する合成プロモーターの合成を記載しているが（ＣＭＶ活性の２０７％）、異なる哺乳動物細胞型における大きく変化するレポーター遺伝子発現についても報告している（ＣＭＶの２１〜１１３％）（Ｓｃｈｌａｂａｃｈら、２０１０年）。
【０００７】
しかし、これまでに、ＣＨＯ細胞における合成プロモーターの利用を検討した研究は殆どない。Ｔｏｒｎｏｅらは、キメラのプロモーター内でＴＦＲＥを分離する配列をランダム化することにより、活性が１０倍の範囲である小プールのプロモーター（＜２０）を創出した（Ｔｏｒｎｏｅら、２００２年）。さらに、Ｇｒａｂｈｅｒｒらは、極めて活性なプロモーターに見出されるヌクレオチド組成を模倣したヌクレオチド組成の連続配列を構築することにより、およそ同等の活性を有する合成プロモーターを５つ構築した（Ｇｒａｂｈｅｒｒら、２０１１年）。しかし、これらの研究は両方とも、（多数の多様な細胞系で試験した）哺乳動物細胞における広範な活性を対象としたものであり、どちらもＣＨＯ細胞工場のトランス活性化機構と協調して機能させるための合成プロモーターを特異的にデザインすることを探求するものではなかった。
【０００８】
したがって、上記のプロモーター構築物のいずれも、広範なダイナミックレンジにわたってＣＨＯ遺伝子発現の予想可能で正確且つ強力な制御を可能にするものではなく、報告されている合成プロモーターの活性は、ＣＭＶの活性を大幅に下回るものであった。
【０００９】
より最近、Ｌｅらは、トランスクリプトミクスのデータを利用して、所望の発現の動力学を有するＣＨＯ内在性プロモーターを同定した（Ｌｅら、２０１３年）。これは、別個の発現レベルを有するプロモーターを同定する有望な手段であるが、天然に存在する活性に限定される。さらに、特定の遺伝子の発現を制御する、ゲノムの調節配列を規定するのは大きな難題であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、現在のバイオ医薬品の難題に対する扱いやすい解決策を提供し得る、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に特異的な遺伝子発現制御技術が必要とされる。本発明は、上記の難題に取り組むことを模索するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、転写因子調節エレメントに関連するモチーフを機能的にスクリーニングし、ＣＨＯ細胞において活性であるエレメントを初めて同定した。
【００１２】
活性なエレメントを用い、組合せて、組換え宿主細胞、特にＣＨＯ細胞において有用な合成プロモーターを調製した。
【００１３】
次いで、これらのＣＨＯ活性エレメントを使用して、３桁にわたる発現を示す、大規模な合成プロモーターライブラリを構築した。よって、本発明者らは、ＣＨＯ細胞工場の既存の転写活性機構を役立てるように特にデザインした合成プロモーターの第１のライブラリを構築した。
【００１４】
本発明者らは、次世代のライブラリを特定の発現レベルに調節し、一過性の生成プロセスなどにおいてｈＣＭＶ−ＩＥ１を超える活性を有する多重プロモーターを構築することができることをさらに示した。さらに、発現の広範なダイナミックレンジにわたる相対的なプロモーター活性を、多岐にわたるＣＨＯ細胞宿主及び長期の流加一過性生成の両方で維持した。
【００１５】
この合成プロモーター技術が可能にする確固とした正確さの遺伝子発現制御により、最適の、デザインされた化学量論で作動する多重の遺伝成分を有する、所望の通りの、合成の哺乳動物細胞工場の作製が促進される。さらに、この遺伝子発現制御を利用して、組換え遺伝子転写の最適化された、タンパク質特異的な制御を可能にして、発現困難なタンパク質の生成を促進することができる。流加一過性ＳＥＡＰ生成においてＣＭＶよりも高い力価を可能にする本発明の合成プロモーターは、毒性学用の材料の開発及び臨床治験における試験など、初期の製品の製造（例えば、一過性発現）を最適化するために利用してもよい（Ｄａｒａｍｏｌａら、２０１３年）。
【００１６】
第１の態様において、組換えタンパク質の発現を細胞中に誘発するのに適する合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞を提供し、前記合成プロモーターは、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントを含む。
【００１７】
ＣＨＯ細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターも提供し、前記合成プロモーターは、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４Ｆ１、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントの混合、特に少なくとも１つの調節エレメントの２つ以上のコピーを含む。
【００１８】
以下のステップを含む、所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを作製する方法：
Ａ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系における使用に適する、２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
Ｂ）ステップＡ）において選択した転写因子調節エレメントから独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物を調製するステップと、
Ｃ）ステップＢ）において調製した合成プロモーター構築物（単数又は複数）を、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞における活性について試験するステップ。
【００１９】
本発明者らは、ＣＨＯ細胞において遺伝子発現をネガティブに調節することができる、少なくとも１つの転写因子／転写因子調節エレメント、すなわちＹＹ１も同定した。よって、一実施形態において、転写因子ＹＹ１の活性がノックダウン又はノックアウトされたＣＨＯ細胞を提供する。一実施形態において、ＹＹ１に特異的なブロックデコイの使用を提供する。
【００２０】
本発明は以下のパラグラフに要約される：
１．組換えタンパク質の発現を細胞中に誘発するのに適する合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞であって、前記合成プロモーターが、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、上記ＣＨＯ細胞。
２．プロモーターコアが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵｂＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、及びＣＡＧＧ、例えば、ＣＭＶコア、特にｈＣＭＶ−ＩＥ１から選択される、パラグラフ１に記載のＣＨＯ細胞。
３．合成プロモーターが、転写因子調節エレメントを２から５０個、例えば、調節エレメントを２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個、例えば、５、６、７、又は８個含む、パラグラフ１又は２に記載のＣＨＯ細胞。
４．転写因子調節エレメントが、相互に全て同じである、パラグラフ１から３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
５．転写因子調節エレメントが異なるタイプの組合せである、パラグラフ１から３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
６．転写因子調節エレメントが相互に直列である、パラグラフ１から５までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
７．合成プロモーターがＮＦκＢ−ＲＥ、例えば、ＮＦκＢ−ＲＥの２つ以上のコピーを含む、パラグラフ１から６までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
８．合成プロモーターが、Ｅ−ｂｏｘ、例えば、Ｅ−ｂｏｘの２つ以上のコピーを含む、パラグラフ１から７までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
９．合成プロモーターが、ＣＲＥ、例えば、ＣＲＥの２つ以上のコピーを含む、パラグラフ１から８までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１０．組合せにおける各転写因子調節エレメントが、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＣＲＥ、及びＥ４１Ｆから独立に選択され、特に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥから、とりわけ、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘから選択され、特に、組合せにおける少なくとも１つの調節エレメントの２つ以上のコピーである、パラグラフ５に記載のＣＨＯ細胞。
１１．合成プロモーターのＤＮＡ配列が、完全長のＣＭＶプロモーター配列の量の０．９以下、例えば、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５又はそれ未満である、パラグラフ１から１０までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１２．合成プロモーターが、合成プロモーターのＤＮＡ配列１単位あたり、ＣＭＶプロモーターのＤＮＡ１単位あたりの転写活性を超える転写活性を有する、例えば、活性が１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、又は２．５倍増大している、パラグラフ１から１１までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１３．ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４から選択される、パラグラフ１から１２までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１４．転写因子調節エレメントＹＹ１の活性が、例えば、ＹＹ１に特異的なブロックデコイにより阻害されている、パラグラフ１から１３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１５．細胞が、転写因子ＹＹ１を欠失させ且つ／又はＹＹ１をサイレントすることによってＹＹ１の活性を阻害するように変異している、パラグラフ１４に記載のＣＨＯ細胞。
１６．細胞が、合成プロモーターの制御下に、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ１から１５までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１７．組換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、パラグラフ１６に記載のＣＨＯ細胞。
１８．プロモーターが、プロモーターコア又は野生型プロモーターに比べて改善されたタンパク質発現を示す、パラグラフ１から１７までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
１９．改善されたタンパク質発現が、より高レベルの組換えタンパク質の発現である、パラグラフ１８に記載のＣＨＯ細胞。
２０．合成プロモーターが、配列番号３０から１６９のいずれか１つに示す配列を含む、パラグラフ１から１９までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
２１．合成プロモーターが、配列番号１２６から１６９のいずれか１つに示す配列を含む、パラグラフ２０に記載のＣＨＯ細胞。
２２．合成プロモーターが、いかなるＣｐＧアイランドも含まない、前記パラグラフのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
２３．２つ以上のプロモーター、例えば、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の２つ以上の合成プロモーターを含む、パラグラフ１から２２までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
２４．合成プロモーターが特定の細胞に適する特性を有し、例えば、合成プロモーターにおける転写因子調節エレメントが、細胞中に見出される転写因子に対応する、パラグラフ１から２３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
２５．合成プロモーターが、それが関連する特定の組換えタンパク質の発現に適する特性を有する、パラグラフ１から２３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
２６．ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターであって、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントの混合、特に組合せにおける少なくとも１つの調節エレメントの２つ以上のコピーを含む上記合成プロモーター。
２７．ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターであって、プロモーターコア、並びにその上流に、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＣＲＥを含む又はからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントの混合を含む上記合成プロモーター。
２８．合成プロモーターのＤＮＡ配列が、全長のＣＭＶプロモーター配列の量の０．９以下、例えば、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５又はそれ未満である、パラグラフ２６又は２７に記載の合成プロモーター配列。
２９．合成プロモーターが、合成プロモーターのＤＮＡ配列１単位あたり、ＣＭＶプロモーターのＤＮＡ１単位あたりの転写活性を超える転写活性を有する、例えば、活性が１．２、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、又は２．５倍増大している、パラグラフ２６から２８までのいずれか一項に記載の合成プロモーター配列。
３０．所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを作製する方法であって、
ａ）転写因子調節エレメントのモチーフを同定するステップと、
ｂ）ステップａ）において同定した各転写因子調節エレメントをプロモーターコアと組合せて、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系における活性について試験するステップと、
ｃ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系においてプロモーターコア単独よりも活性である、ステップ（ｂ）から２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｄ）ステップｃ）において選択した転写因子調節エレメントから独立に選択される、２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物を調製するステップと、
ｅ）ステップｄ）において調製した合成プロモーター構築物（単数又は複数）を、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞における活性について試験するステップと、
ｆ）野生型プロモーターに比べて同じ又は改善されたタンパク質発現を示す合成プロモーター構築物（単数又は複数）を同定するステップと
を含む上記方法。
３１．  ｇ）ステップｆ）において同定した構築物に関連する、２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｈ）ステップｇ）において独立に選択されたエレメントを含む又はからなるＴＦＲＥ構築物を含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物を調製するステップと
をさらに含む、パラグラフ３０に記載の方法。
３２．ステップｈにおいて調製したＴＦＲＥ構築物が、ステップｆ）において同定した構築物の相対存在度を反映する化学量論で転写因子調節エレメントを含む、パラグラフ３１に記載の方法。
３３．方法のステップ（ｆ）が、野生型プロモーターに比べて低減されたタンパク質発現を示すプロモーター構築物に最も頻繁に関連する転写因子調節エレメント（単数又は複数）を同定するステップと、ステップ（ｇ）においてこれらを除外するステップをさらに含む、パラグラフ３０から３２までのいずれか一項に記載の方法。
３４．所望のレベルの所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを同定する方法であって、
ａ）請求項２６から２８に記載の２つ以上の合成プロモーター構築物を得るステップと、
ｂ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞において各構築物によって駆動される組換えタンパク質の発現のレベルを決定するために、ステップａ）において得た合成プロモーター構築物を試験するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において試験した合成プロモーター構築物が所望のレベルの組換えタンパク質の発現を促進する場合、その合成プロモーター構築物を選択するステップと
を含む上記方法。
３５．ステップ（ａ）において得た２つ以上の合成プロモーターが、それぞれ配列番号３０から１６９又は配列番号１２６〜１６９のいずれか１つから独立に選択される配列を含む、パラグラフ３４に記載の方法。
３６．所望のレベルのタンパク質発現が、野生型プロモーターを用いて実現されるものより高い、パラグラフ３４又は３５記載の方法。
３７．所望のレベルのタンパク質発現が、野生型プロモーターを用いて実現されるものよりも低い、パラグラフ３４又は３５に記載の方法。
３８．転写因子調節エレメントＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘを５：３の比でランダムにライゲートするステップを含む、転写因子調節エレメント構築物ライブラリを構築する方法。
３９．転写因子調節エレメントＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥを５：３：１：１の比でランダムにライゲートするステップを含む、転写因子調節エレメント構築物ライブラリを構築する方法。
４０．転写因子調節エレメントＹＹ１の活性がノックダウン又はノックアウトされている、ＣＨＯ細胞。
４１．ＹＹ１活性が、ＹＹ１に特異的なブロックデコイによってノックダウン又はノックアウトされている、パラグラフ４０に記載のＣＨＯ細胞。
４２．転写因子調節エレメントＹＹ１を欠失させ且つ／又はＹＹ１をサイレントにすることによってＹＹ１の活性を阻害するように変異している、パラグラフ４０に記載のＣＨＯ細胞。
４３．合成プロモーターの制御下に、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ４０から４３までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
４４．組換えタンパク質が抗体又はその抗原結合フラグメントである、パラグラフ４３に記載のＣＨＯ細胞。
４５．細胞型が、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４から選択される、パラグラフ４０から４４までのいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【００２１】
有利には、本発明者らは、ある種の転写因子調節エレメントは、ＣＨＯ細胞において特に活性であり、本発明のプロモーター構築物中に組み入れる場合、転写を調節することができ、例えば、コアプロモーター単独を用いた場合に比べて、組換えタンパク質の発現のレベルを増大することができることを見出した。したがって、本発明者らは、これらの転写因子調節エレメントの組合せを含むプロモーター構築物により、ＣＨＯ細胞における広範なダイナミックレンジにわたって組換え遺伝子の転写を正確に制御することができるようになる（３桁にわたる）ことを見出した。
【００２２】
有利には、合成プロモーターは、進化したというよりむしろ特異的にデザインされているため、プロモーターには重複する配列がなく、したがって１単位のＤＮＡ配列あたりはるかに効率的な転写活性を有する。例えば、本明細書に記載する合成プロモーター２／０１（配列番号１２６）は、活性がＣＭＶプロモーターを２．２倍上回る増大を示すが、ＣＭＶのサイズの半分未満である。
【００２３】
しかし、正確な制御が必ずしも発現の増大に関するわけではない、というのは、組換え系の安定性、好適なフォールディングに対する必要性、及び二特異的抗体などの発現困難なタンパク質を発現する能力などの他の要因は、組換えタンパク質の最高レベルの発現が必ずしも究極の目標ではないことを意味し得るからである。実際、本発明の意義深い利点は、提供される柔軟性であり、これによって、合成プロモーターに含まれるＴＦＲＥの組合せに応じて、適宜、発現のレベルを調節することが可能になる。
【００２４】
例えば、転写速度が、生成量に対する高レベルの制御を発揮することが示されている、発現容易なタンパク質には（ＭｃＬｅｏｄら、２０１１年；Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎら、２０１０年）、本発明の合成プロモーターを用いて、組換え遺伝子の転写レベルを最大にしてもよい（例えば、合成プロモーター２／０１を用いることによって）。
【００２５】
対照的に、転写の最大化が有益である可能性が低い、発現困難なタンパク質（例えば、二特異的抗体、融合タンパク質）には、これらのプロモーターを利用して、ポリペプチドに特異的なフォールディング及びアセンブリ率と動力学的に協調させた、最適化されたタンパク質特異的な転写活性を提供してもよい。例えば、適用候補はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発現におけるものであり、例えば、様々な活性の２つの合成プロモーターを用いてｍＡｂ特異的な軽鎖：重鎖（ＬＣ：ＨＣ）の発現比を実現してｍＡｂ生成を最適化し得る（Ｈｏら、２０１３年；Ｐｙｂｕｓら、２０１３年）。
【００２６】
よって、一実施形態において、特定の組換えタンパク質の発現に適するように合成プロモーターを適合させ又は選択する、すなわち、プロモーターの特性を、特定のタンパク質の適切な発現に対応したものにする。
【００２７】
本明細書で用いる特定のタンパク質の適切な発現は、知られているＣＭＶプロモーターに対して得た結果に比べた場合、望ましい形態の所与のタンパク質の発現を最大にし、例えば、収率を増大し、且つ／又は好適にフォールディングされたタンパク質の量を増大するプロモーターを意味する。
【００２８】
一実施形態において、本発明の合成プロモーターはＣｐＧアイランドを含まない。ＣＭＶにおけるＣｐＧアイランドは、マトリクス付着領域の機能性を妨害することが示されている（Ｇｉｒｏｄら、２００５年）。ＣｐＧアイランド内のシトシンのメチル化は、不安定性をもたらすことが知られている。それ故、本発明のプロモーターにはＣｐＧアイランドがないためプロモーターは安定性が増強され得、組換えタンパク質を発現させるのに用いた場合に極めて再現性のあるレベルの発現をもたらす。
【００２９】
有利には、本発明の合成プロモーターは、遍在性に作用するクロマチンオープニングエレメント、細菌の人工染色体、及び部位特異的組込み系などの既存の転写増強性の技術と、より適合性である（Ｍａｄｅｒら、２０１２年；Ｚｈｏｕら、２０１０年）。
【００３０】
さらに、本発明のプロモーターは、極めて正確な調節を必要とする研究応用において、他の発現制御技術とともに利用してもよい。例えば、これらは、ＴＦＲＥ特異的デコイ技術（Ｂｒｏｗｎら、２０１３年）と、又は最近記載された翻訳開始速度を制御する合成エレメントと併せて使用してもよい（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１３年）。よって、一態様において、少なくともＹＹ１に特異的な転写因子調節エレメントを含むブロックデコイを提供する。
【００３１】
一実施形態において、本開示の合成プロモーターにおける２つ以上の転写因子調節エレメントは、直列である。
【００３２】
一実施形態において、本開示の合成プロモーターにおける２つ以上の転写因子調節エレメントは、全て同じである。
【００３３】
一実施形態において、本開示の合成プロモーターにおける２つ以上の転写因子調節エレメントは、異なるタイプの組合せである。一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、１つ又は複数の同じＴＦＲＥの３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超えるコピーなど、１つ又は複数の同じＴＦＲＥの複数のコピーを含めた、異なるタイプの組合せである。一例において、合成プロモーターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超えるコピーのＮＦκＢ−ＲＥを含む。
【００３４】
一実施形態において、合成プロモーターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＥ−ｂｏｘを含む。
【００３５】
一実施形態において、合成プロモーターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＣＲＥを含む。
【００３６】
一実施形態において、合成プロモーターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＮＦκＢ−ＲＥ、及び２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＥ−ｂｏｘを含む。
【００３７】
一実施形態において、合成プロモーターは、２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＮＦκＢ−ＲＥ、及び２つ以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＣＲＥを含む。
【００３８】
合成プロモーターが、２タイプ以上、例えば２タイプの転写因子調節エレメント、及び１つ又は複数の転写因子調節エレメントの複数コピーを含む場合、これらは任意の適切な配列において、例えば、第１のＴＦＲＥの完全長配列を１つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＮＦκＢ−ＲＥ）、続いて少なくとも第２のＴＦＲＥの完全長配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＥ−ｂｏｘ）とすることができる。或いは、第１及び第２のＴＦＲＥなどをランダムに、又は例えば、第１のＴＦＲＥの１つのコピー（又はその部分配列）に第２のＴＦＲＥの１つのコピー（又はその部分配列）が続き、次にそれに第１のＴＦＲＥの１つのコピー（又はその部分配列）が続くパターンなどで混合してもよい。
【００３９】
有利なことには、本発明者らは、異なるタイプの転写因子調節エレメントを合成プロモーター内で組合せる場合、様々なレベルの発現レベルの変化、例えば、ＣＭＶプロモーターとりも増大した又は低減された発現レベルをもたらすことを見出した。或いは、又はさらに、本明細書に提供する合成プロモーターは、タンパク質が、正しいフォールディングなどの望ましい形態において発現されるように、改善された発現安定性を有し、且つ／又は特定のタンパク質の発現に最適化されていてもよい。
【００４０】
転写因子調節エレメントの組合せを含むプロモーター構築物は、構築物がたった１タイプの転写因子調節エレメントからなる場合に比べて様々な転写活性を有し、したがって、得ることができる転写活性の潜在的な範囲を著しく拡張し、それにより、特定の組換えタンパク質の発現に適するように適合することができる合成プロモーターから広範囲の様々な転写活性をもたらす。したがって、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現を正確に制御するために、プロモーター構築物を用いることができる。
【００４１】
例えば、特定のＴＦＲＥの組合せを利用することにより、合成プロモーターを、生理学的温度以下での活性の増大（Ａｌ−Ｆａｇｅｅｈら、２００６年）、又は静止期の間の細胞増殖（Ｐｒｅｎｔｉｃｅら、２００７年）など、所望のバイオ生成（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）の機能性を示すように改良してもよい。
【００４２】
一実施形態において、本開示の合成プロモーターは、野生型のＣＭＶプロモーターより小型であり、例えば、配列はＣＭＶプロモーターのサイズの約０．９以下、例えば、ＣＭＶプロモーターのサイズの０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５又はそれ未満である。本明細書で用いるサイズの０．５は、ＣＭＶプロモーターのサイズの半分である、すなわち、ＣＭＶプロモーターの塩基対の数の約２分の１を含み、又はＣＭＶプロモーターの分子量の半分である、合成プロモーターを意味する。
【００４３】
有利には、ＣＭＶプロモーターより小型である合成プロモーターを調製することができることで、多重遺伝子操作ベクター（ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ）における、より大型の組換え遺伝子又は増大した数の機能的な遺伝子（例えば、シャペロン、酸化還元タンパク質、アンフォールディングされたタンパク質応答のトランス活性化因子、小胞輸送成分など）など、他の遺伝材料をコードする発現ベクターに、より多くの余地が与えられる。より小型の合成プロモーターはまた、ＣＭＶプロモーターに対する対応する値より、ＤＮＡ１単位あたりの転写活性が増大している。
【００４４】
一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、アクチベータタンパク質１調節エレメント（ＡＰ１−ＲＥ）、ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧエレメント（ＣＡｒＧ）、ＣＣＡＡＴ置換タンパク質調節エレメント（ＣＤＰ−ＲＥ）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質α調節エレメント（Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ）、細胞の骨髄芽球症（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）調節エレメント（ｃＭｙｂ−ＲＥ）、ｃＡＭＰ調節エレメント（ＣＲＥ）、延長因子２調節エレメント（Ｅ２Ｆ−ＲＥ）、Ｅ４Ｆ１調節エレメント（Ｅ４Ｆ１−ＲＥ）、初期増殖応答タンパク質１調節エレメント（ＥＧＲ１−ＲＥ）、ＥＲＲ−アルファ調節エレメント（ＥＲＲＥ）、エンハンサーボックス（Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｂｏｘ）（Ｅ−Ｂｏｘ）、ＧＡＴＡ−１調節エレメント（ＧＡＴＡ−ＲＥ）、ＧＣ−ｂｏｘ、グルココルチコイド調節エレメント（ＧＲＥ）、増殖因子非依存性１調節エレメント（Ｇｆｉ１−ＲＥ）、Ｈｅｌｉｏｓ調節エレメント（ＨＲＥ）、肝細胞核因子１調節エレメント（ＨＮＦ−ＲＥ）、インスリンプロモーター因子１調節エレメント（ＩＰＦ１−ＲＥ）、インターフェロン刺激（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）調節エレメント（ＩＳＲＥ）、筋細胞エンハンサー因子２調節エレメント（ＭＥＦ２−ＲＥ）、Ｍｓｘホメオボックス調節エレメント（ＭＳＸ−ＲＥ）、神経増殖因子誘発性遺伝子−Ｂ調節エレメント（ＮＢＲＥ）、核因子１調節エレメント（ＮＦ１−ＲＥ）、活性化Ｔ細胞の核因子（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ）調節エレメント（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、核因子カッパＢ調節エレメント（ＮＦκＢ−ＲＥ）、８量体モチーフ（ＯＣＴ）、レチノイン酸調節エレメント（ＲＡＲＥ）、及びＹｉｎ  Ｙａｎｇ１調節エレメント（ＹＹ１−ＲＥ）からなる群から独立に選択される。これらのエレメントの配列を、表１の配列番号１〜２８に提供する。
【００４５】
一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される。
【００４６】
一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥからなる群から独立に選択される。
【００４７】
一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ（配列番号２５）、Ｅ−ｂｏｘ（配列番号１１）、ＧＣ−ｂｏｘ（配列番号１３）、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥ（配列番号４）からなる群から独立に選択される。
【００４８】
有利には、これら４つの転写因子調節エレメントは、高発現性プロモーター構築物と著しく関連する。よって、これら特定の転写因子調節エレメントを含むプロモーター構築物は、ＣＭＶプロモーターの転写活性を２倍にすることができる。
【００４９】
一例において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、及びＧＣ−ｂｏｘからなる群から独立に選択される。
【００５０】
一例において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥからなる群から独立に選択される。
【００５１】
さらなる一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘからなる群から独立に選択される。
【００５２】
さらなる一実施形態において、２つ以上の転写因子調節エレメントは、ＮＦκＢ−ＲＥ及びＣＲＥからなる群から独立に選択される。
【００５３】
一実施形態において、転写因子調節エレメントはＹＹ１ではない。
【００５４】
有利には、これらの組合せの２つ又は３つの転写因子調節エレメントは、本発明の高発現性プロモーター構築物において優勢であり、したがって発現レベルに対して特に強力な影響を発揮する可能性がある。
【００５５】
よって、一実施形態において、使用する合成プロモーターは、知られているプロモーター、特に野生型ＣＭＶプロモーターに比べて増大したレベルの発現、例えば、発現レベルにおける５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％又はそれを超える増大を提供する。
【００５６】
別の一実施形態において、ライブラリ又はコレクションなどにおける合成プロモーターを用いて、３桁にわたる特異的な活性を提供する。これにより、選択マーカーの発現、抗体重鎖：軽鎖比の制御、及びタンパク質の発現を困難にするための転写のポリペプチド特異的制御など、特定の目的に最適化された転写活性が可能になる。
【００５７】
よって、一実施形態において、使用する合成プロモーターは、知られているプロモーター、特に野生型ＣＭＶプロモーターに比べて低減されたレベルの発現を提供する。しかし、これらのプロモーターは、より多くのタンパク質を好適なフォールディング又は類似したフォールディングで生成できるようにするなど、知られているプロモーターを超え、上回る有利な特性を有するため、これらのプロモーターが一般的に選択される。
【００５８】
一実施形態において、転写因子調節エレメントは、配列番号１から２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有し、例えば、転写因子調節エレメントは、配列番号１、４、６、８、１１、１３、２５、２６、及び２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、例えば、配列番号４、１１、１３、及び２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、特に配列番号１１及び２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、合成プロモーターは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の転写因子調節エレメントなど、２から５０個の転写因子調節エレメントを含む。
【００５９】
有利には、２つ以上の組換え遺伝子（例えば、重鎖及び軽鎖の遺伝子）の発現を制御する２つ以上の異なる合成プロモーター配列を用いると、遺伝子コピーの損失を最小化する助けとなり得る。標準的な現在の発現系では、２つの同一のＣＭＶプロモーターを用いて両方の遺伝子の発現を制御し、これが相同組換えによる遺伝子コピーの損失をもたらし得る。さらに別の一実施形態において、各プロモーターは、４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又はそれを超える転写因子調節エレメントを含む。
【００６０】
本開示の合成プロモーターは、より多くのタイプの転写因子調節エレメントを組み入れることができ、それにより、得ることができる転写活性の範囲がさらに増大する。
【００６１】
一実施形態において、コアプロモーターは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵｂＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、及びＣＡＧＧ、例えばＣＭＶからなる群から選択されるプロモーターに由来する。
【００６２】
一実施形態において、プロモーター又はコアプロモーターはＥＡＡＴ２ではなく、特に、ＷＯ０３／０７０９６５に開示される配列番号１、２、及び／又は３ではない。一実施形態において、プロモーター又はコアプロモーターはＥＡＡＴ２に由来しない。
【００６３】
一実施形態において、プロモーター又はプロモーターコアは、ＣＯＸ−２遺伝子プロモーターではない。一実施形態において、プロモーター又はコアプロモーターは、ＣＯＸ−２遺伝子プロモーターに由来しない。
【００６４】
有利には、本発明者らは、ＣＭＶコアプロモーターの転写活性は、ＣＭＶコアプロモーターの上流の転写因子調節エレメントのブロックを含めることにより、確実に修飾することができることを見出した。それ故、ＣＭＶコアプロモーター（配列番号１７０）は、本発明の合成プロモーター構築物における使用に特に適する。
【００６５】
別の一実施形態において、コアプロモーターは、誘導性プロモーターに由来し、例えば、ＴＲＥ、ＰＴＲＥ３Ｇ、及びｃ−Ｆｏｓからなる群から選択される。
【００６６】
有利には、コアプロモーターとして誘導性プロモーターを用いると、組換えタンパク質の発現のタイミングの制御が可能になることによって、本発明のプロモーター構築物の転写活性のさらなるレベルの制御がもたらされる。一実施形態において、本発明の合成プロモーターは、配列番号３０から１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
有利には、これらの合成プロモーターは、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１−ＲＥ、ＣＲＥ、ＧＣ−ｂｏｘ、Ｅ４Ｆ１−ＲＥ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥから独立に選択される最高７つの転写因子調節エレメントから構成され、これらはＣＨＯ細胞において特に活性であることを、本発明者らは発見した。５’から３’、又は３’から５’いずれかのあらゆる配向で本発明の合成プロモーター中に組み入れる場合、これらのＴＦＲＥは広範囲の様々な転写活性をもたらす。
【００６８】
一実施形態において、本開示による合成プロモーターは、ＣＭＶから近位プロモーターの一部又は全て、例えば、近位プロモーターの１０、２０、３０、４０、５０％を含む。
【００６９】
一実施形態において、本開示による合成プロモーターは、ＣＭＶから遠位プロモーターの一部又は全て、例えば、遠位プロモーターの１０、２０、３０、４０、５０％を含む。
【００７０】
一実施形態において、本開示による合成プロモーターは、ＣＭＶから近位プロモーターの一部又は全て、及び遠位プロモーターの一部又は全て、例えば、近位プロモーター及び近位プロモーターの独立に１０、２０、３０、４０、５０％を含む。
【００７１】
一例において、合成プロモーターは、２つ以上の、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＮＦκＢ−ＲＥ、及び２つ以上の、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるコピーのＥ−ｂｏｘ、並びに任意選択により１つ又は複数のコピーのＧＣ−Ｂｏｘ及び／又はＣ／ＥＢＰα−ＲＥからなるＴＦＲＥ構築物を含む。
【００７２】
一実施形態において、本発明の合成プロモーターは、配列番号３０から１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
一例において、本発明の合成プロモーターは、配列番号１２６から１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
一例において、本発明の合成プロモーターは、配列番号１２６から１５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一例において、本発明の合成プロモーターは、配列番号３０、３１、３２、１２６、１２８、及び１４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
有利には、配列番号１２６から１６９を有する転写因子調節エレメント構築物は、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥの４つの転写因子調節エレメントのみを用いて構築される。したがって、これらのＴＦＲＥを用いて得た発現レベルは、配列番号３０から１２５を有する構築物に比べて著しく高い傾向がある。
【００７６】
別の一態様において、本明細書に記載の複数の合成プロモーターを含む、哺乳動物細胞に特異的な合成プロモーター構築物のライブラリを提供する。
【００７７】
別の一態様において、例えば、配列番号３０〜１６９、例えば、１２６から１６９を有する転写因子調節エレメント構築物のライブラリを提供する。
【００７８】
有利には、ＣＨＯ細胞において組換えタンパク質を発現するようにデザインされた、本発明の転写因子調節エレメント構築物のライブラリ、及びこれらを含む合成プロモーター構築物のライブラリは、発現レベルが様々な範囲である、入手可能なプロモーター構築物の宝庫を提供する。ライブラリは、そこから使用者が所望のレベルの発現を有するプロモーター構築物を容易に選択し、又はあらゆる所与のタンパク質に望ましいレベルの発現に対して試験することができる、便利な供給源を提供する。
【００７９】
一実施形態において、本開示による合成プロモーター配列を含むプラスミド又はベクターを提供する。
【００８０】
一実施形態において、プラスミド又はベクターは、組換えタンパク質又は転写可能なポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子などのポリヌクレオチド配列をさらに含む。後者には、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、及び他の有用なポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００８１】
一実施形態において、プラスミド又はベクターは、例えば、組換えタンパク質又は転写可能なポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を間にはさむ、一対の制限部位を含むことができる。制限部位は、プラスミド又はベクターにおける遺伝材料の交換を促進する。
【００８２】
上記に論じた通り、本開示は、本明細書に記載する合成プロモーターを含む、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞にも拡張する。
【００８３】
一実施形態において、細胞に、対象とする関連ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の合成プロモーター、本開示によるプラスミド又はベクターを一過性にトランスフェクトする。
【００８４】
一実施形態において、細胞に、本開示による合成プロモーターを安定にトランスフェクトし、例えば、合成プロモーターは、対象とするポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に関連する。
【００８５】
本開示によるある範囲の合成プロモーターを安定にトランスフェクトした、ＣＨＯ細胞などの細胞のライブラリも提供する。本明細書で使用するある範囲の合成プロモーターは、一般的に、各細胞が、そのゲノム中に安定に組み込まれた、様々な合成プロモーター又は様々な組合せの合成プロモーターを含む場合を意味するものとされる。
【００８６】
一態様において、上記に記載の合成プロモーター又は発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞を提供する。一実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスミエローマ細胞、及びハイブリドーマ細胞からなる群から選択される。適切な細胞型の例には、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞及びＳＰ２細胞及びＣＯＳ細胞が含まれる。本発明における使用に適するＣＨＯ細胞の型は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などのｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むことができ、これらの細胞はＤＨＦＲ選択マーカー又はＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞と用いてもよく、グルタミン合成酵素選択マーカーと用いてもよい。一実施形態において、ＣＨＯは、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４から独立に選択される。
【００８７】
一実施形態において、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞は、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１０／０９２３３５に開示されている野生型細胞と比べて、Ｅｒｏ１及び／又はＸＢＰ１の発現レベルが増大している。
【００８８】
一実施形態において、参照によって本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７０３１７に開示されている通り、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞に、ＮＨＥＪタンパク質（非相同な末端結合タンパク質）又はその機能的なフラグメントをトランスフェクトする。
【００８９】
一例において、組換えタンパク質の発現を細胞中に誘発するのに適する合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞であって、前記合成プロモーターが、プロモーターコア、及びその上流に少なくとも１つのＴＦＲＥ構築物を含み、各ＴＦＲＥ構築物が、ＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１、ＣＲＥ、ＧＣ−Ｂｏｘ、Ｅ４１Ｆ、Ｃ／ＥＢＰα−ＲＥ、ＯＣＴ、及びＲＡＲＥからなる群から独立に選択される２つ以上の転写因子調節エレメントからなる、上記ＣＨＯ細胞を提供する。
【００９０】
一態様において、例えば、直接組み合わされて新規なキメラを創出する、上記に記載の２つ以上の合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞を提供する。有利には、これにより、細胞にトランスフェクトしようとする発現ベクター中にさらなるプロモーターを挿入することによって、存在している転写因子調節エレメントの組合せを修飾する容易な方法が提供される。
【００９１】
一態様において、上記に記載の２つ以上の合成プロモーターを含むＣＨＯ細胞を提供し、各々は、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖など、様々な組換えタンパク質の合成を導くのに用いられる。これらがベクター中に組み入れられる場合、これらの異なる合成プロモーターは同じ又は異なるベクター上にあり得ることが理解されよう。
【００９２】
一実施形態において、各々が本開示による合成プロモーターを含む、プラスミドのライブラリ、ベクター、又は細胞も提供する。上記に論じた通り、本開示は、本開示の前記合成プロモーター（単数若しくは複数）、又はプラスミド／ベクターを含む、宿主細胞のライブラリにも拡張する。
【００９３】
一例において、本発明は、所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを同定する方法であって、
ａ）各々が、プロモーターコア、及びその上流に、配列番号３０から１６９のいずれか１つから選択される配列を含む又はからなる転写因子調節エレメント構築物を含む、２つ以上の合成プロモーターのライブラリを得るステップと、
ｂ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞において各構築物によって駆動される組換えタンパク質の発現のレベルを決定するために、ステップａ）において得た合成プロモーター構築物のライブラリを試験するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において試験した合成プロモーター構築物が、所望のレベルで組換えタンパク質の発現を促進する場合、前記合成プロモーター構築物を選択するステップと
を含む上記方法を提供する。
【００９４】
さらなる一態様において、特定のタンパク質の発現に、プロモーター及び細胞の組合せを最適化する方法を提供する。よって、ｉ）匹敵する条件下の同じタンパク質に対して、各々が本開示による合成プロモーターを含む少なくとも２つの宿主細胞（例えば、少なくとも２つのＣＨＯ細胞）の、発現のレベルなど、少なくとも１つのパラメータを分析するステップを含む方法を提供する。
【００９５】
一実施形態において、本方法は、所与のタンパク質の発現に最も適する、細胞及び合成プロモーターの組合せを選択するステップをさらに含む。
【００９６】
この文脈において用いる「異なる」は、細胞におけるエレメントの組合せが、比べられる細胞と同じではない（同一ではない）ことを意味するものとされ、例えば、比べられる細胞のゲノムが本質的に同一である場合、細胞における合成プロモーターが異なる（又は細胞における別の実体が異なる）ことを意味するものとする。前記少なくとも２つの細胞における合成プロモーターが同じである場合、細胞中のエレメント又は遺伝子、ゲノムなど、一部のエレメントが異なる（同一ではない）。
【００９７】
よって、本方法は、典型的に、同様の条件下で分析を行った場合、例えば、本質的に同じ時間、又は同じ実験において分析を行った場合、少なくとも２つの細胞の比較を提供する。
【００９８】
本明細書上記に記載のＴＦＲＥエレメントを用いてさらなるライブラリを構築してもよく、合成プロモーター及びプロモーターライブラリを作製するために使用してもよく、本明細書上記に記載の通りスクリーニングしてもよいことが理解されよう。一例において、本発明は、ＴＦＲＥエレメントであるＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−Ｂｏｘ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥを一緒にランダムにライゲートするステップを含む、ＴＦＲＥ構築物のライブラリを構築する方法を提供する。一例において、ライブラリは、例えば、これらのエレメントを５：３：１：１の比でランダムにライゲートする場合に構築される。
【００９９】
一実施形態において、本発明は、ＴＦＲＥエレメントであるＮＦκＢ−ＲＥ及びＥ−ｂｏｘ及び／又はＣＲＥを一緒にランダムにライゲートするステップを含む、ＴＦＲＥ構築物のライブラリを構築する方法を提供する。一例において、ライブラリは、実施形態に対して、これらのエレメントを５：３の比でランダムにライゲートする場合に構築される。
【０１００】
一実施形態において、合成プロモーターのライブラリは、例えば、本明細書に開示する、異なる順列の様々な組合せのＴＦＲＥで特にデザインされる（合理的なデザイン）。
【０１０１】
上記に論じた通り、ある範囲の活性を有するプロモーターを、本明細書の開示を用いて調製することができる。細胞機能のシステムレベル制御が、いくつかの遺伝子の構成的発現が化学量論的に釣合っていることを必要とし得る場合、３桁にわたる活性を網羅する別個のプロモーターを提供することで、ＣＨＯ細胞のエンジニアが適切な細胞工場を正確に設計できるようになる。
【０１０２】
一実施形態において、本開示の合成プロモーター、それを含むプラスミド、及びプロモーター、プラスミド、又はベクターを含む細胞、例えば、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなどの転写を駆動するのに適する。
【０１０３】
一態様において、所与の哺乳動物組換え宿主細胞において組換えタンパク質の発現を促進するのに適する合成プロモーターを作製する方法であって、
ａ）転写因子調節エレメントのモチーフを同定するステップと、
ｂ）ステップａ）において同定した各転写因子調節エレメントを、プロモーターコアと組合せて、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系における活性について試験するステップと、
ｃ）選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞系において、プロモーターコア単独よりも活性である２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｄ）ステップｃ）において選択したエレメントから独立に選択される、２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物を調製するステップと、
ｅ）ステップｄ）において調製した構築物（単数又は複数）を、選ばれた哺乳動物組換え宿主細胞における活性について試験するステップと、
ｆ）野生型プロモーター、例えば、プロモーターコアが由来する野生型プロモーターに比べて改善されたタンパク質発現を示す合成プロモーター構築物（単数又は複数）を同定するステップと
を含む上記方法を提供する。
【０１０４】
一実施形態において、上記方法は、
ｇ）ステップｆ）において同定した構築物に関連する、２つ以上の転写因子調節エレメントを選択するステップと、
ｈ）ステップｇ）において独立に選択されたエレメントを含む又はからなるＴＦＲＥ構築物を含む、１つ又は複数の合成プロモーター構築物（単数又は複数）を調製するステップと
をさらに含む。
【０１０５】
有利には、これらの追加ステップにより、上記の方法により作製した合成プロモーター構築物のさらなる改良が可能になり、それにより、発現レベルの増強など、増強された発現を示す標的の宿主細胞系に対するプロモーター構築物がもたらされる。
【０１０６】
一実施形態において、ステップｈ）において調製した合成プロモーター構築物は、ステップｆ）において同定した構築物の相対存在度を反映する化学量論の転写因子調節エレメントからなるＴＦＲＥ構築物を含む。
【０１０７】
有利には、高発現性の合成プロモーターにおける相対存在度を反映する化学量論の様々な転写因子調節エレメントを組み入れることにより、これは、さらに純化され、コアプロモーターの基本的な転写活性レベルを増強する可能性がより高い転写因子調節エレメントを単離するのを助ける。
【０１０８】
一実施形態において、本方法は、野生型プロモーターに比べて低減された活性を示すプロモーター構築物に最も頻繁に関連する転写因子調節エレメント（単数又は複数）を同定するステップと、ステップ（ｇ）においてこれらを選択しないステップとをさらに含む。
【０１０９】
上記に記載した方法における「活性」は、典型的に、あらゆる所与のプロモーターによって駆動されるタンパク質発現のレベルであり、例えば、組換えタンパク質又はレポーター遺伝子発現のレベルである。
【０１１０】
関連する一態様において、本発明のプロモーターを合成する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞系においてレポーター遺伝子の発現レベルを分析するステップであって、レポーター遺伝子の発現は複数の合成プロモーターによって駆動され、各プロモーターはコアプロモーターの上流に位置する１つ又は複数の転写因子調節エレメント構築物を含み、各ＴＦＲＥ構築物は単一のタイプの転写因子調節エレメントからなる、上記ステップと、
ｂ．合成プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現レベルを、既知の活性のレベルを有する対照プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現レベルと比べるステップと、
ｃ．対照プロモーター構築物の発現レベルよりレポーター遺伝子の発現レベルが高い合成プロモーターをと同定するステップであって、それによって哺乳動物細胞系において活性である転写因子調節エレメントを同定する上記ステップと、
ｄ．ステップｃにおいて同定した転写因子調節エレメントを選択し、２つ以上のこれらのエレメントを転写因子調節エレメント構築物中に組み入れ、前記構築物を合成プロモーター中に組み入れるステップであって、各転写因子調節構築物は、選択された転写因子調節エレメントのみからなる上記ステップと
を含む上記方法。
【０１１１】
有利には、上記の方法によって、どの特定の転写因子調節エレメントが、標的の宿主細胞系において活性であり、よってその標的の宿主細胞系に適するのかについての事前の知識がない場合に、本発明のプロモーターの合成が可能になる。
【０１１２】
関連する一実施形態において、上記の方法は、
ｅ．哺乳動物細胞系におけるレポーター遺伝子の発現レベルを分析するステップであって、レポーター遺伝子の発現が、ステップｄからの複数の合成プロモーターによって駆動される、上記ステップと、
ｆ．最高レベル及び最低レベルの発現を有するプロモーターを同定するステップと、
ｇ．ステップｆからのプロモーター構築物に存在する各々の転写因子調節エレメントの相対頻度を決定するステップであって、それによって高発現レベルに関連する転写因子調節エレメントを同定する上記ステップと、
ｈ．ステップｇにおいて同定した転写因子調節エレメントを選択し、これらのエレメントを１つ又は複数の転写因子調節構築物を含む合成プロモーター中に組み入れるステップであって、各構築物は、選択された転写因子調節エレメントのみからなる上記ステップと
をさらに含む。
【０１１３】
明らかに、上記に開示した方法を修飾して、タンパク質の発現レベルを、機能的なアッセイにおいて発現されたタンパク質の活性、又はタンパク質のフォールディングの適切さ／レベルなど、別の所望のパラメータで置き換えることができる。
【０１１４】
本明細書で用いる複数の合成プロモーターは、各々が異なる合成プロモーター、又は異なる組合せの合成プロモーターを含み、したがって異なる集団からの発現レベルを比べることができる、類似の細胞集団を意味する。
【０１１５】
一実施形態において、組換えタンパク質は、以下により詳しく論じるものなど、抗体又はその結合フラグメントである。
【０１１６】
有利には、これらの追加ステップにより、上記の方法により作製される合成プロモーター構築物のさらなる改良が可能になり、それによって増強されたレベルの発現を示す標的の宿主細胞系に対するプロモーター構築物がもたらされる。
【０１１７】
一実施形態において、転写因子調節エレメントを、ステップｄからの合成プロモーター構築物におけるこれらの相対的出現率から導出される化学量論で、ステップｈにおけるプロモーター構築物中に組み入れる。有利には、高発現性の合成プロモーターにおける相対存在度を反映する化学量論で、様々な転写因子調節エレメントを組み入れることにより、これはさらに純化され、コアプロモーターの基本的な転写活性レベルを増強する可能性がより高い転写因子調節エレメントを単離するのを助ける。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＣＨＯ細胞において活性である転写因子調節エレメントを同定するためのレポーター遺伝子アッセイの結果を示すグラフを示す図である。２８の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）（表１を参照されたい）は、哺乳動物細胞において活性であることが知られている通常のウイルスプロモーターにおける転写因子結合部位のインフォマティクス分析に由来するものであった。  ２８個のＴＦＲＥを、ＣＨＯ−Ｓ細胞（配列リストを表２に示す）におけるそれらの転写活性に対して、ＳＥＡＰ／ＧＦＰレポーター構築物を用いて評価した。レポーター構築物の一般構造の模式図も図１に示す。各ＴＦＲＥの７つのコピー（表１に記載する通り）を、ＧＦＰ又はＳＥＡＰレポーターのいずれかをコードするレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に連続してクローニングした。  ２４ウエルプレート中ＣＨＯ−Ｓ細胞（２×１０５）に、ＳＥＡＰ（黒色バー）又はＧＦＰ（白色バー）ＴＦＲＥレポーター−ベクター１μｇをトランスフェクトした。細胞培養上清中のＳＥＡＰ活性及び細胞内ＧＦＰを、トランスフェクション２４時間後に測定した。データを、最小ＣＭＶコアプロモーターのみを含むベクターの活性（コア）に関する倍数変化として表す。ＴＦＲＥ配列（８ｍｅｒ）に対してホモロジーが知られていないランダム８ｂｐ配列をやはり、−ｖｅ対照として用いた。バーは、各ＴＦＲＥレポーター構築物に対してクローン的に由来するプラスミド３つを用いて各々３回ずつ行った、３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図２】本発明の特定の第１世代の合成プロモーターの発現レベルを比べる、レポーター遺伝子アッセイの結果のいくつかを示すグラフを示す図である（配列を表３に示す）。  第１世代の合成プロモーターを、等しい比の、ＮＦκＢ、ＣＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−ｂｏｘ、Ｅ４Ｆ１、及びＣ／ＥＢＰαのＴＦＲＥのランダムライゲーションにより構築した。合成プロモーターを、ＳＥＡＰレポータープラスミドにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入し、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。図２は、第１世代の合成プロモーターの一般構造を示す模式図を含む。  ＳＥＡＰ発現を、トランスフェクション２４時間後に定量した。データを、プロモーター１／０１（配列は表３を参照されたい）が示した生成のパーセント値として表す。対照のＣＭＶ−ＳＥＡＰレポーターからのＳＥＡＰ生成を黒色バーとして示す。各バーは、２つのトランスフェクションの平均値を表し、各プロモーターに対してＳＥＡＰ生成における１０％未満の変動が観察された。
【図３ａ】各々が、ＴＦＲＥが存在する第１世代のプロモーター構築物の発現レベルに対する、ＴＦＲＥの存在比を分析した結果を示す、一連のグラフを示す図である。  各合成プロモーターにおける各ＴＦＲＥの数を、そのプロモーター（Ａ〜Ｆ）の相対的活性に対してプロットする。各場合において、直線状の回帰直線を示し、線の傾斜は、各ＴＦＲＥが様々な活性のプロモーターにおいて生じる度合いを示す。  平均値の上：平均の発現レベルより高い（すなわち、高発現性の構築物）。  平均値の下：平均の発現レベルより低い（すなわち、低発現性の構築物）。
【図３ｂ】各々が、ＴＦＲＥが存在する第１世代のプロモーター構築物の発現レベルに対する、ＴＦＲＥの存在比を分析した結果を示す、一連のグラフを示す図である。  各合成プロモーターにおける各ＴＦＲＥの数を、そのプロモーター（Ａ〜Ｆ）の相対的活性に対してプロットする。各場合において、直線状の回帰直線を示し、線の傾斜は、各ＴＦＲＥが様々な活性のプロモーターにおいて生じる度合いを示す。  平均値の上：平均の発現レベルより高い（すなわち、高発現性の構築物）。  平均値の下：平均の発現レベルより低い（すなわち、低発現性の構築物）。
【図４】本発明の特定の第２世代の合成プロモーター構築物の発現レベルを比べる、レポーター遺伝子アッセイの結果のいくつかを示すグラフを示す図である（配列を表４に示す）。  第２世代の合成プロモーターを、５：３：１：１の比において、ＮＦκＢ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−ｂｏｘ、Ｃ／ＥＢＰαのＴＦＲＥのランダムライゲーションにより構築した。合成プロモーターを、ＳＥＡＰレポータープラスミドにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入し、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。ＳＥＡＰ発現を、トランスフェクション２４時間後に定量した。データを、ＣＭＶ対照プロモーターが示した生成のパーセント値として表す（黒色バー）。第１世代のライブラリ（１／０１、図２）のレポーターからの最も活性なプロモーターからのＳＥＡＰ生成を、市松模様のバーとして示す。その他の場合、各バーは２つのトランスフェクションの平均値を表し、各プロモーターに、ＳＥＡＰ生成における１０％未満の変動が観察された。  プロモーター構築物１／０１（斜線の入ったバー）：上  最高レベルの発現を作製した第１世代のプロモーター。
【図５】各々が、ＴＦＲＥが存在する第２世代のプロモーター構築物の発現レベルに対する、ＴＦＲＥの存在比の分析の結果を示す、一連のグラフを示す図である。  各合成プロモーターにおける各ＴＦＲＥの数を、そのプロモーター（Ａ〜Ｄ）の相対的活性に対してプロットする。各場合において、直線状の回帰直線を示し、線の傾斜は、それに対して各ＴＦＲＥが様々な活性のプロモーターにおいて生じる度合いを示す。  平均値の上：平均の発現レベルより高い（すなわち、高発現性の構築物）。  平均値の下：平均の発現レベルより低い（すなわち、低発現性の構築物）。
【図６】相対的活性の異なる７つの合成プロモーターの相対的活性を、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において決定したことを示すレポーター遺伝子アッセイの結果を示す図である。細胞（２×１０５）にＳＥＡＰ−レポーターベクター２５０ｎｇをトランスフェクトし、ＳＥＡＰ生成を、トランスフェクション２４時間後に定量した。データを、各細胞系におけるＣＭＶプロモーターの活性のパーセント値として表す。値は、３回ずつ行った３つの独立した実験の平均値＋Ｓ．Ｄを表す。  興味深いことに、各プロモーターの相対的な性能が、試験した全ての細胞系で同じではなかった。
【図７】図６に示すのと同じ合成プロモーター構築物を用いた、ＣＨＯ−Ｓ細胞の流加培養物における、長期間の一過性発現（すなわち、７日を超えて行った）に関する、レポーター遺伝子アッセイの結果を示す図である。  ＣＨＯ−Ｓ細胞（６×１０６）に、ＳＥＡＰレポーター−ベクター７．５μｇをトランスフェクトしたが、ＳＥＡＰ発現は、様々な活性を有する合成プロモーター又は対照のＣＭＶプロモーターの制御下にあった。ＳＥＡＰ生成及び生存細胞濃度を、チューブスピンバイオリアクターにおける流加プロセスの７日の経過にわたって測定した。７日目のＩＶＣＤ平均値（生存細胞密度の積分）（白色バー）及びＳＥＡＰ力価（黒色バー）を示す。ＳＥＡＰデータを、対照のＣＭＶプロモーターの活性のパーセント値として表す。２つの独立したトランスフェクションを２回ずつ行った。
【図８ａ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｂ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｃ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｄ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｅ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｆ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｇ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｈ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｉ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｊ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｋ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｌ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｍ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｎ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｏ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｐ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【図８ｑ】本開示による様々な配列の合成プロモーターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
本明細書で用いる「直列の」は、連続する「一列に並んだ」配列を意味する。
【０１２０】
本明細書で用いる「転写因子」の語は、ｃｉｓ−作動性領域に結合し、遺伝子の発現をポジティブ又はネガティブのいずれかに調節するタンパク質を含めたあらゆる細胞因子を意味し、例えば、転写因子は、遺伝子のコード配列の上流に結合して、ＲＮＡポリメラーゼの結合を補助又はブロックすることにより、遺伝子の転写を増強又は抑制のいずれかをし得る。転写因子、又はリプレッサー、又はコアクチベータ、又はコリプレッサーなどが、この定義内に包含される。
【０１２１】
本明細書で用いる「転写因子調節エレメント」、又は「ＴＦＲＥ」、又は「調節エレメント」の語は、転写因子によって認識され、結合されるヌクレオチド配列を意味する。
【０１２２】
ＴＦＲＥは、適切には二本鎖ＤＮＡ配列である、核酸配列を含む。ＴＦＲＥは、シス作動性領域を含むことができ、さらなる核酸も含むことができる。プロモーター及びエンハンサーエレメントのコアの６から８個のヌクレオチドは、これらの対応する転写因子の結合に十分であり得る。よって、ＴＦＲＥは、６から８個の核酸塩基からなっていてよい。本発明のＴＦＲＥは、長さ、６以上、８以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、又は３０以上の塩基であってよい。本発明のＴＦＲＥは、長さ、１００以下、７５以下、５０以下、３０以下、２５以下、２０以下、又は１５以下の塩基であってよい。
【０１２３】
しかし、当業者であれば、一般的な転写因子、又は転写因子のポリヌクレオチドに対する乱交雑的な結合など、他の転写因子からの影響が必ずしも除外されるとは限らないことを理解されよう。よって、転写活性又は阻止活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が、転写因子調節エレメントが前記プロモーター中に組み込まれる転写因子によって媒介される合成プロモーター構築物は、転写因子によって特異的に制御されると考えるべきである。
【０１２４】
特に適切なＴＦＲＥは、対象とする細胞又は組織において活性であるＴＦＲＥである。このようなＴＦＲＥは、対象とする細胞又は組織において発現される遺伝子に関連すると同定され得、例えば、ＴＦＲＥは、別の細胞又は組織と比べた場合、その細胞又は組織において差次的に発現される遺伝子に関連し得る。遺伝子の差次的な発現は、２つの異なる細胞若しくは組織において、又は異なる条件下の同じ細胞若しくは組織において、遺伝子の発現を比べることによって見ることができる。
【０１２５】
１つの細胞型又は組織型における発現を、異なるが関連のある組織型における発現と比べてもよく、例えば、対象とする細胞若しくは組織が疾患細胞若しくは組織であり、又は本明細書に記載する通り人工的に巧みに操作されている場合、その細胞又は組織における遺伝子の発現を、等しく正常な、又は非処置の細胞若しくは組織における同じ遺伝子の発現と比べてもよい。これにより、２つの細胞型又は組織型間で差次的に調節される遺伝子を同定できるようになり得る。
【０１２６】
このような遺伝子と関連しているＴＦＲＥは、一般的に、細胞のゲノム内の遺伝子のコード配列の近くに位置し、例えば、このようなＴＦＲＥは、そのコード配列のすぐ上流又は下流の領域に位置し得る。このようなＴＦＲＥは、プロモーター、又は遺伝子の発現を調節する他の調節配列の近くに位置し得る。ＴＦＲＥの位置は、当業者であれば、本明細書に記載する方法など、知られている様々な方法を用いて決定することができる。
【０１２７】
本発明の転写因子調節エレメントの適切な例をいくつか、以下の表１に示す。
【表１】
2016537987.tif 000003
【０１２８】
本発明の転写調節エレメントは、本明細書において言及する特定の配列に限定されないが、これらの構造上及び機能上の類似体／相同体も包含することが理解されよう。このような類似体は、定方向突然変異誘発又はランダム変異導入のいずれかによって導入される１つ又は複数のヌクレオチドの、切断、欠失、挿入、及び置換を含むことができる。切断は、知られている転写リプレッサーに対する１つ又は複数の結合部位を欠失するように導入され得る。
【０１２９】
加えて、このような配列は、本発明における配列に対して高度の同一性を示す、自然界に天然に見出される配列に由来し得る。ヌクレオチド約２０個以上の核酸は、ストリンジェントな条件下で、関連する転写因子にハイブリダイズする場合、本発明の転写因子調節エレメントに対して高度の同一性を有すると考えられる。或いは、核酸は、ヌクレオチド約２０個以上の隣接する配列を含む場合、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、２１５巻：４０３〜４１０頁に記載されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、４８巻：４４４〜４５３頁のアルゴリズム、又はＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１９８８年、４巻：１１〜１７頁のアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムによって決定して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれを超えるパーセント同一性を有する、本発明の転写因子調節エレメントに対して高度の同一性を有すると考えられる。
【０１３０】
本発明の転写因子調節エレメントは、標的の宿主細胞において活性であることがすでに知られている転写因子調節エレメントから選んでもよく、又は当業者には知られている方法を用いることにより、コアプロモーターの上流の配列のインシリコ分析によって決定する、推定上の調節エレメントであってもよい。
【０１３１】
一実施形態において、本明細書に記載する群から選択される、組合せの転写因子調節エレメントの組合せの使用、例えば、特に合成プロモーター中に組み入れることによる、宿主における転写、翻訳、又は発現を改善するための使用を提供する。
【０１３２】
一実施形態において、例えば、ＣＨＯ細胞など、哺乳動物宿主細胞において発現を駆動するための、本明細書に記載する合成プロモーターの使用を提供する。
【０１３３】
これらのインシリコ分析は、典型的に、様々な生物体のゲノム間の非コード調節配列を比べることによって作動して、候補の遺伝子のプロモーターにおいて、又はマイクロアレイ分析によって同定されるクラスターから大幅に濃縮され、転写因子調節エレメントとして潜在的に機能することができる保存領域の同定を可能にする。これらのソフトウエア一式の例には、ＴＲＡＦＡＣ、ＣＯＲＧ、ＣＯＮＳＩＴＥ、ＣＯＮＦＡＣ、ＶＡＭＰ、及びＣｉｓＭｏＩｓ  Ａｎａｌｙｓｅｒが含まれる。
【０１３４】
本明細書で用いる「プロモーター」又は「プロモーター構築物」の語は、遺伝子の効果的な転写のための成分を含むＤＮＡセグメントを意味し、転写因子調節エレメント；コアプロモーター領域；及び任意選択により、５’−非翻訳領域又はイントロンからの配列の１つ又は複数を含む。
【０１３５】
本明細書で用いる「合成プロモーター構築物」又は「合成プロモーター」の語は、例えば、２つ以上の転写因子調節エレメントを含む、例えば、１つ又は複数の転写因子調節エレメント構築物を含む、人工の、又は操作された、又は集合されたプロモーター配列を意味する。
【０１３６】
本明細書で用いる「転写因子調節エレメント構築物」又は「ＴＦＲＥ構築物」の語は、１つを超える転写調節エレメント配列を含む、集合された二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。構築物は、様々な二本鎖転写調節エレメントを一緒に、ランダム又は定方向にライゲートすることを含む、当業者であれば知っている、数々の異なる方法によって創出することができる。構築物は、転写因子の結合を媒介しないが、結合部位の正確な空間配列を可能にするスペーサーなど、他の核酸配列も含むことができる。スペーサー領域は、例えば、様々なＴＦＲＥを相互に容易にライゲートできるようにする通常のオーバーハングであってもよい。
【０１３７】
ＴＦＲＥは通常、相互に直列であるが、オーバーハング配列によって分離されていてもよい。
【０１３８】
構築物は、同じである、少なくとも２つの転写因子調節エレメントを含むことができる。
【０１３９】
構築物は、少なくとも２つの異なる転写因子に対して、少なくとも２つの異なる転写因子調節エレメントを含むことができる。
【０１４０】
構築物は、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個、又はそれを超える転写因子調節エレメントを含むこともできる。これらの数は同じであってもよく、又は全て異なってもよい。
【０１４１】
構築物内で集合される場合、転写因子調節エレメントは、標的の宿主細胞において発現される複数の転写因子に結合し、組換えタンパク質又はレポータータンパク質の発現を効果的に駆動する。しかし、同じ組み合わされた転写因子調節エレメントは、配列エレメントに結合するのに必要とされる特定の転写因子がないため、非標的の宿主細胞では不活性であり得る。よって、標的の宿主細胞において活性である、転写因子及び共調節因子の正確なプロファイルを知ることにより、遺伝子転写の組合せの性質が最も効果的に利用される。
【０１４２】
本明細書で用いる「コアプロモーター」又は「プロモーターコア」の語は、転写を開始するのに必要とされる最小部分のプロモーターである、短いＤＮＡセグメントを意味する。コアプロモーター配列は、原核生物及び真核生物の遺伝子を含めた、様々な異なる供給源に由来することができる。この例には、ドパミンベータ−ヒドロキシラーゼ遺伝子最小プロモーター、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーターがある。一例において、コアプロモーターは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵｂＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、及びＣＡＧＧからなる群から選択されるプロモーター、例えばＣＭＶに由来する。
【０１４３】
コアプロモーターは、「誘導性」であってもよく、この場合、転写は、誘導剤に応答して、又はあったとしても誘導剤の非存在下の転写のレベルに比べて作動可能に連結している発現性ポリヌクレオチドの増大したレベルの転写に応答して、開始する。
【０１４４】
或いは、プロモーターは「構成的」であってもよく、この場合、転写活性は、誘導剤の存在によって影響を受けない。
【０１４５】
「誘導剤」の語は、誘導性プロモーターからの転写をもたらす、化学的、生物学的、又は物理的な薬剤を意味するのに用いられる。誘導剤は、例えば、熱若しくは寒冷ショックなどそれに対して細胞を暴露するストレス状態、重金属イオンなどの毒性薬剤、又は栄養、ホルモン、増殖因子などの欠如でもよく、或いはホルモン又は増殖因子など、細胞の増殖又は分化状態に影響を及ぼす分子に対する曝露でもよい。
【０１４６】
コアプロモーターはまた、特定の組織型において作動可能に連結されたコード領域の転写においてのみ活性であるように、「組織特異的」又は「組織優先的」に調節され得る。
【０１４７】
本明細書で用いる「野生型プロモーター」の語は、天然に存在するプロモーター配列を意味する。
【０１４８】
別段の記載がなければ、「ＣＭＶプロモーター」の語は、一般に認められる完全長のｈＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター（すなわち、コア及び近位のエレメント）を意味する（ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号Ｍ６０３２１．１、塩基５９５〜１１９３）。本明細書で用いる「ＣＭＶコア」又は「ｈＣＭＶ−ＩＥ１コア」の語は、本明細書において配列番号１７０に提供する、最小ｈＣＭＶ−ＩＥ１コアプロモーターを意味する。
【０１４９】
本明細書で用いる「作動可能に連結される」の語は、物理的な位置ではなく、作動的な機能（すなわち、他のエレメントの機能に影響を及ぼし、又は他のエレメントの機能に応答することができる）によって連結されている、核酸配列におけるエレメント又は構造を意味する。よって、核酸配列におけるエレメント又は構造が、作動可能に連結される直列又は隣接の順序である必要はない。
【０１５０】
本明細書で用いる「ベクター」の語は、細胞又は生物体中に核酸を送達するあらゆるビヒクルを意味する。ベクターの一例は、その中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲートすることができ、染色体ＤＮＡに独立に複製することができる、環状の二本鎖ＤＮＡループである、「プラスミド」である。プラスミドは、主に細菌、及びときに他の微生物から生じ、又は由来する。しかし、ミトコンドリア及び葉緑体のＤＮＡ、キラー酵母、及び他の場合は、通常除外される。
【０１５１】
別のタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスの配列中にライゲートされ得る、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、その中に導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、そこで宿主のゲノムと一緒に引き続き複製する。プラスミドは最も一般的に用いられる形態のベクターであるため、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」の語は交換可能に用いることができる。
【０１５２】
それによってベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者にはよく知られている。これに関して、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ作製、ｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。本発明のベクターは、選択マーカーを含むことができ、選択マーカーは、その発現により、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換され、又はベクターにトランスフェクトされた細胞を同定できるようにするタンパク質である。
【０１５３】
当技術分野では広範囲の選択マーカーが知られており、例えば、選択マーカーは、抗生物質であるカナマイシンに対する耐性を付与する酵素を発現する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）に対する遺伝子、並びに関連する抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、及びＧ４１８に対する遺伝子、又はハイグロマイシンに対する耐性を付与する酵素を発現する、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）に対する遺伝子であってよい。
【０１５４】
本明細書で用いる「発現ベクター」の語は、標的の宿主細胞において発現させようとする組換えタンパク質をコードするベクターを意味する。本明細書に記載する複数の異なる発現ベクターを提供することができる。これらはライブラリを形成することができる。本明細書で用いる「宿主細胞」は、１つ又は複数の合成プロモーター、ベクター、又は本発明の発現ベクターを含む細胞である。細胞は、哺乳動物細胞であってよい。宿主細胞は、培養細胞でも、又は体細胞でもよい。適切な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ミエローマ、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１５５】
ベクターの、本発明の標的宿主細胞へのトランスフェクションは、あらゆる適切な方法を用いて実現することができる。様々なトランスフェクション方法が当技術分野では知られており、当業者であれば、所望のベクターのタイプ及び宿主細胞の型に応じて、適切な方法を選択することができる。
【０１５６】
本明細書で用いる「一過性発現」の語は、宿主細胞が、組換え遺伝子配列の転写及び翻訳を導く能力を意味する。この転写及び翻訳は、遺伝子の配列が宿主細胞に導入された直後に生じる。このような発現は、機能的なプロモーターに作動可能に連結しているレポーター遺伝子配列を保有するプラスミドを、プラスミドを複製又は伝播させることができない宿主細胞に導入した場合にも生じ得る。
【０１５７】
本明細書で用いる「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。対象とするタンパク質は、内因性タンパク質に同一の外因性配列でも、又は例えば、外因性のベクターから発現された、減弱した生物学的活性を有する、これらの変異したバージョンでも、若しくはこれらのフラグメントでもよい。或いは、対象とするタンパク質は、宿主細胞が通常発現しない異種タンパク質でもよい。
【０１５８】
組換えタンパク質は、治療用、予防用、又は診断用のタンパク質を含めたあらゆる適切なタンパク質であってよい。
【０１５９】
本発明による合成プロモーターの制御下で発現された組換えタンパク質は、例えば、免疫原性タンパク質、２つの異種性タンパク質又は抗体を含む融合タンパク質でもよい。組換えタンパク質として用いるための抗体には、モノクローナル、多価、多特異的（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、ヒト化、完全ヒト、又はキメラの抗体が含まれる。抗体は、完全長の重鎖及び軽鎖、又はこれらのフラグメントを有する完全な抗体分子、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、修飾されているＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖフラグメントでもよい。
【０１６０】
発現後、抗体フラグメントを、例えば別の実体にコンジュゲートすることにより、さらに加工してもよく、又は例えば、抗体フラグメントをＰＥＧ化して、所望により、全抗体に同様など、必要とされる特性を有する生成物を得てもよい。
【０１６１】
抗体又はそのフラグメントが結合している対象とする抗原の例には、それだけには限定されないが、疾患又は感染症の間に上方制御されるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなど、あらゆる医学的に関連するあるタンパク質が含まれ得る。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、インテグリン、例えばβ１インテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ズズリン（ｄｕｄｕｌｉｎ）２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、及びＶＥＧＦ、並びに適宜これらの受容体が含まれる。
【０１６２】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−２３などのインターロイキン、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適宜これらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細胞性毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ、及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム薬剤、放射性核種、並びに重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が含まれる。
【０１６３】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」の語は、容易にアッセイされるタンパク質をコードする核酸配列を意味する。より一般的に用いられるレポーター遺伝子の中には以下の「レポータータンパク質」に対するものがある：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌性アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）。当業者であれば、他の入手可能なレポーター遺伝子を知っているであろう。
【０１６４】
本発明は、それによって細胞内の特定の合成プロモーター構築物の転写活性を分析することができる方法として、「レポーター遺伝子アッセイ」も提供する。これらのアッセイは、対象とするプロモーターの下流にある、プロモーター活性を視覚化するためのレポーター遺伝子に連結させて、それによりレポーター構築物を得るステップと、レポーター構築物を試験細胞に導入するステップと、測定される、発現されたレポータータンパク質のレベルに基づいてプロモーター活性化の状態を定量するステップとを含むことができる。
【０１６５】
レポーター遺伝子は、例えば、分泌性のレポータータンパク質をコードし、レポータータンパク質は転写及び翻訳されると、合成され、外部の培養培地中に分泌される分泌性のレポータータンパク質をもたらす。レポーター分子の存在は、培養培地をアッセイすることによってモニタリングされ、微生物の宿主細胞を破壊又は破裂させる必要はない。培養培地のアリコートを、レポーター分子を検出することができるあらゆる手段によって評価する。このような手段は、例えば、免疫アッセイ、又は当技術分野では知られている他の手段のいずれかであってよい。レポーター分子が外部の培養培地に蓄積する速度は、したがって、プラスミド／発現ベクター上のレポーター遺伝子配列に隣接し又は先立ってクローニングされたフラグメント上に存在した、あらゆるプロモーター構築物の転写活性の指標である。
【０１６６】
或いは、ルシフェラーゼ（基質であるルシフェリン及びＡＴＰの存在下で光子の放出をもたらす）など、視覚的に同定できるレポーター遺伝子を用いる場合、レポータータンパク質の発現レベルは、ルミノメーターを用いて容易にモニタリングすることができる。
【０１６７】
一実施形態において、組換えタンパク質はレポータータンパク質ではなく、すなわち、本開示の構築物はレポーター遺伝子を含まない。一実施形態において、組換えタンパク質はルシフェラーゼではなく、すなわち、本開示の構築物はルシフェラーゼをコードする遺伝子を含まない。
【０１６８】
本明細書で用いる「転写活性」の語は、ＤＮＡにコードされる情報の、ＲＮＡ分子への転写、又はＲＮＡ分子のヌクレオチドにコードされる情報の、タンパク質における規定された配列のアミノ酸への翻訳を意味する。
【０１６９】
「高」転写活性を有するプロモーター構築物は、ある範囲のプロモーター構築物にわたって得られる平均の発現レベルよりも高い発現レベルと規定される、「高」レベルの発現で組換えタンパク質又はレポータータンパク質を発現する構築物を意味する。基準点として、最高レベルの活性を有する合成プロモーターは、ＣＨＯ細胞における最強のプロモーターの１つとして広く認められているｈＣＭＶ−ＩＥ１の活性を超える。
【０１７０】
反対に、「低」転写活性を有するプロモーター構築物は、ある範囲のプロモーター構築物にわたって得られる平均の発現レベルよりも低い発現レベルと規定される、「低」レベルの発現で組換えタンパク質又はレポータータンパク質を発現する構築物を意味する。
【０１７１】
したがって、「転写活性」及び「発現レベル」の語は、本明細書の範囲内では交換可能に用いる。
【０１７２】
「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、又は「ヌクレオチド配列」の語は本明細書において広く用いて、ホスホジエステル結合により一緒に連結されている、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの配列を意味する。したがって、これらの語は、遺伝子又はその部分であり得る、ＲＮＡ及びＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成のポリデオキシリボ核酸配列又はポリリボ核酸配列などを含み、一本鎖又は二本鎖でもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもよい。さらに、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」の語には、細胞から単離することができる、天然に存在する核酸分子、及び、例えば、化学合成方法によって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるなど酵素的な方法によって調製することができる、合成分子が含まれる。
【０１７３】
ヌクレオチド配列を調製するための合成方法には、例えば、ホスホトリエステル方法及びホスホジエステル方法が含まれる（各々が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：９０頁（１９７９年）；米国特許第４，３５６，２７０号，米国特許第４，４５８，０６６号，米国特許第４，４１６，９８８号，米国特許第４，２９３，６５２号；及びＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：１０９頁（１９７９年）を参照されたい）。様々な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、又は本発明の方法において有用であるポリヌクレオチドは、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体、又はホスホジエステル結合の他にバックボーン結合を含むことができる。
【０１７４】
オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチド）を含むヌクレオチドは一般的に、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、例えば、２’−デオキシリボースに連結しているアデニン、シトシン、グアニン、若しくはチミン、又はリボヌクレオチド、例えば、リボースに連結しているアデニン、シトシン、グアニン、又はウラシルである。しかし、ポリヌクレオチドは、天然に存在しない合成ヌクレオチド、又は修飾されている天然に存在するヌクレオチドを含めたヌクレオチド類似体も含むことができる。このようなヌクレオチド類似体は、このようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチド同様、当技術分野においてよく知られており、市販されている（各々が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻：５２２０〜５２３４頁（１９９４年）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻：１１３６３〜１１３７２頁（１９９５年）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：６８〜７３頁（１９９７年））。
【０１７５】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する共有結合は、一般的に、ホスホジエステル結合である。しかし、共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ペプチド様結合、又はヌクレオチドを連結して合成のポリヌクレオチドを生成するのに有用であると当業者に知られている他のあらゆる結合を含めた、他の多数の結合のいずれであってもよい（例えば、各々が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｔａｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻：９７７〜９８６頁（１９９４年）；Ｅｃｋｅｒ及びＣｒｏｏｋｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻：３５１３６０頁（１９９５年）を参照されたい）。天然に存在しないヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド若しくは類似体を連結する結合の組入れは、修飾されたヌクレオチド配列は分解を受けにくい可能性があるため、ヌクレオチド配列を、組織培養培地などを含めた核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を含み得る環境に暴露しようとする場合に、又は生存する対象に投与するときに、特に有用であり得る。
【０１７６】
天然に存在するヌクレオチド及びホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学的に合成することができ、又は組換えＤＮＡ方法を用い、鋳型として好適なポリヌクレオチドを用いて生成することができる。相対的に、ヌクレオチド類似体、又はホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般的に化学的に合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素はあるタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み入れることができ、したがって好適な鋳型からこのようなポリヌクレオチドを組換えで生成するのに用いることができる（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、上述、１９９５年）。
【０１７７】
本明細書で用いる「ライブラリ」の語は、文脈により指示される場合、本開示の２つ以上のＴＦＲＥ構築物、２つ以上の合成のプロモーター、又は２つ以上の発現ベクター、又は本開示の２つ以上の細胞を意味する。本明細書を通して記載する「ライブラリ」の語は、その最も広い意味において用い、本開示のライブラリを作製するように、組み合わされていても、又は組み合わされていなくてもよいサブライブラリ（ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）も包含することができる。本発明の方法によって対象とする細胞型又は組織型において活性であると同定されたＴＦＲＥは、その細胞型又は組織型に対する遺伝子を標的化するのに用いることができる。例えば、本発明の方法が、ＴＦＲＥが特定の細胞型において特に活性であるが、対照の細胞型では活性ではないことを示す場合、そのＴＦＲＥは、特異的に、対象とする細胞型における発現を導くのに用いることができる。よって、本発明のＴＦＲＥは、特定の細胞型において発現させることが望ましい遺伝子と組合せてもよい。
【０１７８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、本明細書の文脈内では「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するものとする。
【０１７９】
「約」又は「およそ」の語は、所与の値又は範囲の、２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【０１８０】
技術的に好適である場合、本発明の実施形態を組合せてもよい。
【０１８１】
実施形態は、ある特徴／エレメントを含むものとして本明細書に記載する。本開示は、前記の特徴／エレメントからなる、又は本質的になる別々の実施形態にも拡張する。
【０１８２】
特許及び出願などの技術上の参考文献が、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１８３】
特に、且つ明確に本明細書に挙げたあらゆる実施形態は、単独で、又は１つ若しくは複数のさらなる実施形態と組合せてのいずれかで、放棄の根拠を形成し得る。
【０１８４】
本発明を、次に、以下の実施例を参照して記載するが、以下の実施例は説明にすぎず、本発明の範囲を制限するものと決して解釈されるべきではない。
【０１８５】
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【実施例】
【０１８６】
（例１）ＣＨＯ−Ｓ細胞において活性である転写因子調節エレメントの同定
転写因子調節エレメントのインシリコ分析
ＣＨＯ−Ｓ細胞において組換え遺伝子のトランス活性化の能力のある、別個のＴＦＲＥ（転写因子結合部位）を同定するために、本発明者らは、ＣＨＯ細胞において活性であることが一般的に知られている１０個のウイルスプロモーターにおいて推定上のＴＦＲＥを吟味した。
【０１８７】
以下のプロモーター配列をＧｅｎＢａｎｋから取得した：ｈＣＭＶ−ＩＥ１（受諾番号Ｍ６０３２１．１）、マウスＣＭＶ−ＩＥ１（Ｍ１１７８８）、ラットＣＭＶ−ＩＥ１（Ｕ６２３９６）、モルモットＣＭＶ−ＩＥ１（ＣＳ４１９２７５）、マウスＣＭＶ−ＩＥ２（Ｌ０６８１６．１）、サルウイルス４０初期プロモーター及びエンハンサー（ＮＣ＿００１６６９．１）、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＫＦ２６８３１０）、骨髄増殖性肉腫ウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）（Ｋ０１６８３．１）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｊ０２０２５．１）、及びヒト免疫不全ウイルスＬＴＲ（Ｋ０３４５５．１）。
【０１８８】
プロモーターを、転写エレメント検索システム（ＴＥＳＳ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｅｓｓ／ｔｅｓｓ）、及び転写親和性予測ツール（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）（ＴＲＡＰ：ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｐ．ｍｏｌｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｒａｐ＿ｆｏｒｍ．ｃｇｉ）を用いて、Ｓｃｈｕｇ（Ｓｃｈｕｇ、２００８年）及びＭａｎｋｅら（Ｍａｎｋｅら、２００８年）によって以前に記載されている方法にしたがって分析した。ストリンジェントな検索パラメータを用いて偽陽性を最小にした。
【０１８９】
転写因子（ＴＦ）結合部位に対するＤＮＡ配列をスキャンするオンライン検索ツール、特に転写エレメント検索システム（ＴＥＳＳ）及び転写親和性予測ツール（ＴＲＡＰ）、ストリンジェントな検索パラメータ（Ｍａｎｋｅら、２００８年；Ｓｃｈｕｇ、２００８年）を用いて偽陽性を最小にした。全てのウイルスプロモーター配列にわたって、６７個の別個のＴＦＲＥが、１つ又は複数のプロモーターに存在することを同定した。このプール（デザインスペース）をさらに最小化するために、少なくとも２つのプロモーターに生じなかったＴＦＲＥを選別して除いた。上記のインシリコ分析に基づき、２８個の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）（下記表２を参照されたい）を同定した。
【表２】
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【０１９０】
ＴＦＲＥ−レポーターベクター構築物
以前に記載された（Ｂｒｏｗｎら、２０１３年）プロモーターレスレポーター−ベクター（ｐＳＥＡＰ２対照からサブクローニングした）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ））を、この研究において利用した。これらのプラスミドは、最小ｈＣＭＶ−ＩＥ１コアプロモーター（５’−ＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＡＴＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号１７０）を、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又はターボ（ｔｕｒｂｏ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のいずれかの上流に含む。
【０１９１】
ＲＥレポータープラスミドを創出するために、表１における各ＴＦＲＥコンセンサス配列の７×反復コピーを含む合成のオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ）、ＰＣＲ増幅し、ＣＭＶコアプロモーターの上流のＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部位中に挿入した。各ＴＦＲＥレポーターに対するクローン由来のプラスミドを３つ、Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて精製した。プラスミド構築物全ての配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１９２】
細胞培養及びトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｓ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を、それぞれ８ｍＭ及び６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、Ｌ−グルタミン８ｍＭ及びプルロニクＦ６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１８ｍＬ／Ｌを補ったＣＤ−ＤＧ４４培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を全て、１４０ｒｐｍで振盪する通気したエルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＫ）中５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃でルーチン的に培養し、３〜４日毎に２×１０５細胞／ｍｌの接種密度で継代培養した。細胞の濃度及び生存性を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存性分析器（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｅｒ）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ、ＵＫ）を用いて、自動化したトリパンブルー排除アッセイにより決定した。トランスフェクションの２時間前に、中対数期（ｍｉｄ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）の培養物から細胞２×１０５個を、２４ウエルプレート（Ｎｕｎｃ、ＵＫ）の個々のウエル中に接種した。細胞に、製造元の指示にしたがって調製した、ＤＮＡ及びリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＮＡ−脂質複合体をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２４時間インキュベートした後、タンパク質発現分析を行った。
【０１９３】
レポーター発現の定量
ＳＥＡＰタンパク質発現を、製造元の指示にしたがって、Ｓｅｎｓｏｌｙｔｅ  ｐＮＰＰ  ＳＥＡＰ比色分析レポーター遺伝子アッセイキット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて定量した。ＧＦＰタンパク質発現を、Ｆｌｏｕｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計（励起フィルタ：４８５ｎｍ、発光フィルタ：５２０ｎｍ）を用いて定量した。バックグラウンドの蛍光／吸光度を、プロモーターレスベクターをトランスフェクトした細胞において決定した。
【０１９４】
レポーターアッセイの結果を図１に示す。ＣＭＶコアプロモーターに、無視できる基礎活性が観察された（ＴＳＳに対して−３４から＋４８、ＴＡＴＡボックス及びイニシエーターエレメントを含む）。
【０１９５】
見ることができる通り、大多数のＴＦＲＥは、コアプロモーター単独を用いた場合に比べて、増大した発現レベルのＳＥＡＰ／ＧＦＰをもたらさなかった。しかし、７つのＴＦＲＥ、すなわちＮＦκＢ−ＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＡＰ１−ＲＥ、ＣＲＥ、ＧＣ−ｂｏｘ、Ｅ４Ｆ１−ＲＥ、及びＣ／ＥＢＰα−ＲＥは、コアプロモーターＣＭＶ単独に比べて、より高い発現レベルのＳＥＡＰ／ＧＦＰを示した。
【０１９６】
これら７つのＴＦＲＥを、第１世代の合成プロモーター中に組み入れるために選択した。
【０１９７】
（例２）第１世代のプロモーターの構築及び分析
合成プロモーターライブラリの構築
合成プロモーターＴＦＲＥを、相補的な一本鎖の５’リン酸化オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から構築し、ＳＴＥバッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８、Ｓｉｇｍａ）中、９５℃で５分間加熱した後、２時間かけて２５℃に徐々に冷却することによりアニーリングした。結果として得られた二本鎖のブロックが、特異的なＴＦＲＥ（表１）及び４ｂｐのＴＣＧＡ一本鎖のオーバーハングを各５’末端に含むように、オリゴヌクレオチドをデザインした。例えば、ＮＦκＢ−ＲＥブロックに用いた配列は以下の通りであった（ＲＥ部位に下線を付す）：５’−ＴＣＧＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡ−３’配列番号：１７１及び５’−ＴＣＧＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡ−３’配列番号１７２。
【０１９８】
第１世代の合成プロモーターライブラリを構築するために、ＣＨＯ−Ｓ細胞において転写的に活性であると同定された７つのＴＦＲＥを全て用いた。各ＴＦＲＥ配列の単一のコピーを含むオリゴヌクレオチドのビルディングブロックを化学合成した。ＮＦκＢ、ＣＲＥ、Ｅ−ｂｏｘ、ＧＣ−ｂｏｘ、Ｅ４Ｆ１、及びＣ／ＥＢＰα；ＡＰ１は、ＣＲＥとＡＰ１部位との間に機能的な重複が以前に観察されたため、ライブラリから省いた（Ｈａｉ及びＣｕｒｒａｎ、１９９１年）。
【０１９９】
転写因子調節エレメントブロックを、好適な化学量論のモル比のＴＦＲＥを、高濃度のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）とライゲートすることにより合成した。ＴＦＲＥのモル比１：２０で、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部位を含む「クローニングブロック」がライゲーション混合物中に含まれた。ライゲートした分子を、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）で消化し、ゲル抽出し（Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、プロモーターレスＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入した。クローンに由来するプラスミドを精製し、配列決定した。対照のＣＭＶプロモーターレポータープラスミドを、ＳＥＡＰ  ＯＲＦの上流のｈＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター（以降ＣＭＶと呼ぶ）を用いて構築した。
【０２００】
ＳＥＡＰは、組込み特異的な（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）効果、又はサイレンシングからの潜在的な干渉なく、処理量を最大にし、且つ合成プロモーターのトランス活性化の直接読出しを提供するため、ＳＥＡＰの一過性生成を用いて、合成プロモーターの相対的活性を決定した。ＳＥＡＰ生成は、転写活性の直接的な測定ではないが、この実験室で行った以前の実験により、細胞培養上清におけるＳＥＡＰ活性は、トランスフェクション後のＳＥＡＰ  ｍＲＮＡレベルと直線的に相関することが確認された。その上、対照のＣＭＶ−ＳＥＡＰレポーター活性が、プラスミドのコピー数（ＤＮＡローディング）に関して、及び測定されたＳＥＡＰ出力（データは示さず）に関して、直線状のアッセイ範囲の中心にあるように、アッセイ条件を最適化した。
【０２０１】
無作為に拾った、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニー１１０個から精製したプラスミドＤＮＡを、ＳＥＡＰレポーター生成の測定に利用した。トランスフェクション後２４時間におけるＳＥＡＰ生成を、各合成プロモーターに対して測定し、各プロモーターを配列決定してそのＴＦＲＥ−ブロック組成を明らかにした。小さな割合（１４個）のレポータープラスミドにプロモーター挿入がなかったことが見出され、これらをさらなる分析から除外した。
【０２０２】
残りの９６個のプロモーターの相対的な転写活性を図２に示し、これらのＴＦＲＥ−ブロック組成を以下の表３に列挙する。これらのデータは、第１世代の合成プロモーターの活性は２桁にわたり、最も活性な合成プロモーターは、ＣＭＶ対照ベクターに由来するものを上回って、ＳＥＡＰ生成における１．２倍の増大を呈したことを示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０２０３】
合成プロモーターの組成の分析により、（ｉ）合成プロモーターの長さはＴＦＲＥ７から３１個の間で変動した（平均＝１１．９±４．２ブロック；１８９±６６ｂｐ）が、相対的な転写活性はプロモーターの長さと無関係であり、（ｉｉ）第１世代のライブラリ全体で、６つのＴＦＲＥの相対存在度はおよそ等しく、（ｉｉｉ）個々のＴＦＲＥはフォワード又はリバースいずれかの配向において生じ得る［すなわち、コンセンサスＴＦ認識配列（表１を参照されたい）がいずれかのＤＮＡ鎖上に生じ得る］が、これは、全体的な発生頻度、又は特定のＴＦＲＥブロックの相対的配向のいずれかに関しても、合成プロモーターの活性との関連は明らかにないことが明らかにされた。
【０２０４】
よって、本発明者らは、合成プロモーターの活性における変動は、プロモーター内の特定のＴＦＲＥの様々な相対存在度、及び／又は位置効果の結果である（すなわち、ＴＦＲＥの近接又は遠位の特定の組合せがプロモーターの強度に影響を及ぼし得る）と推測した。後者は、ライブラリのサイズを考慮すると計算上解決困難であるが、本発明者らは、個々のＴＦＲＥが様々な活性の合成プロモーター内に生じる相対頻度を決定することにより、前者に取り組んだ。これらのデータを図３に示す。
【０２０５】
どの単一のＴＦＲＥも、合成プロモーターの強度に対し、明らかに支配的な影響を示さなかったが、個々のＴＦＲＥは、高転写活性のプロモーターにおいて比較的豊富である（ＮＦκＢ、Ｅ−ｂｏｘ）、プロモーターにわたって等しく分布している（Ｃ／ＥＢＰα、ＧＣ−ｂｏｘ）、又は低活性のプロモーターにおいて比較的豊富である（Ｅ４Ｆ１、ＣＲＥ）のいずれかであった。この偏りは、多重直線回帰分析によって確認され、全因子モデル（６つのＴＦＲＥ全てを含む、ｒ２＝０．５７、ｐ＝１．７×１０−１４）、又はＣ／ＥＢＰα及びＧＣ−ｂｏｘのＴＦＲＥを排除する倹約モデル（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ）（これらはモデル適合を改善しないため；ｒ２＝０．５６、ｐ＝８．８４×１０−１６）のいずれかにより、ＴＦＲＥブロックの最適な化学量論はＮＦκＢ  １．５８：Ｅ−ｂｏｘ  １であると予測された。
【０２０６】
他のＴＦＲＥは、ニュートラル（Ｃ／ＥＢＰα、ＧＣ−ｂｏｘ）又はネガティブ（Ｅ４Ｆ１、ＣＲＥ）いずれかのエフェクターであった。ライブラリを通して特定のプロモーター配列を分析することにより、ポジティブ、ニュートラル、又はネガティブであるとする部位の呼称が裏付けられた。例えば、最強のプロモーター（１／０１）は、ライブラリにおいて、最高比率のポジティブ（ＮＦκＢ、Ｅ−ｂｏｘ）：ネガティブ（Ｅ４Ｆ１、ＣＲＥ）部位（９：１）を含む。その上、最も活性な３つのプロモーター（１／０１〜１／０３）は、７つを超えるポジティブ部位、及び３つ未満のネガティブ部位を含む、ライブラリにおける唯一のプロモーターである。多数のポジティブ部位に、多数のネガティブ部位が見かけ上対抗して、ポジティブ／ネガティブ比８：８、８：８、及び９：１１をそれぞれ有するプロモーター１／３７、１／５２、及び１／６８など、比較的弱いプロモーターが生ずる例も多数存在する。
【０２０７】
したがって、本例は、本発明の合成プロモーターには、選択されるプロモーター構築物に応じて、組換えタンパク質の発現を特定の発現レベルに調節する能力があることを実証する。
【０２０８】
（例３）第２世代の合成プロモーターの構築及び分析
第１世代の合成プロモーターの上記の分析に基づいて、本発明者らは、第１世代のプロモーターの組成の分析に由来する最適比のＴＦＲＥ混合物のランダムライゲーションを用いて、第２世代の合成プロモーターライブラリを創出することにより、合成プロモーター活性をさらに改善することを探求した。
【０２０９】
同定した最初の７つのＴＦＲＥのうち４つ（図１を参照されたい）を、第１世代の合成プロモーター構築物における活性な合成プロモーターにおける相対的出現率から定量的に導出される化学量論での合成プロモーター構築物の第２世代のライブラリの構築に利用した。用いた化学量論比は５：３：１：１（ＮＦκＢ−ＲＥ：Ｅ−ｂｏｘ：Ｃ／ＥＢＰａ−ＲＥ：ＧＣｂｏｘ）であった。
【０２１０】
具体的に、最初の７つのＴＦＲＥのうち、ネガティブだったＴＦＲＥ、Ｅ４Ｆ１、及びＣＲＥ（図３を参照されたい）を省略した（すなわち、これらのＴＦＲＥをより多数含むプロモーターほど、より低レベルのレポーター遺伝子発現に関連した）が、複雑さが増大すると有利であり得るという仮説に基づき、ニュートラルＴＦＲＥ、Ｃ／ＥＢＰα、及びＧＣ−ｂｏｘを含めた。例えば、第１世代のライブラリにおける最も活性な３つの合成プロモーターは全て、両方のニュートラルＴＦＲＥの少なくとも２つのコピーを含み（表３を参照されたい）、よって、これらは知られていない位置効果の一因となり得た。本発明者らは、第２世代のプロモーターは、第１世代のプロモーターと同じ平均数のＴＦＲＥ（１２個）を含むと予想した。
【０２１１】
上記の例２に記載したのと同じ構築方法を用いて、第２世代のプロモーター構築物（配列に対して以下の表４を参照されたい）を作製した。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０２１２】
形質転換した大腸菌のコロニー５０個を無作為に拾い、精製したプラスミドＤＮＡにおける合成プロモーターを配列決定し、プロモーター配列を含むレポータープラスミド４４個をＳＥＡＰレポーター生成の測定に利用した。第２世代のプロモーターの相対的な転写活性を図４に示す。
【０２１３】
第２世代の合成プロモーターは、第１世代のプロモーターに比べて著しく増大した活性を示した。特に、平均発現レベルは（ＣＭＶに対して）、第１世代のプロモーターの２１．２％から、第２世代のライブラリの１１６％に推移した。実際、結果は、多数の第２世代のプロモーターには、第１世代の最上位のプロモーターよりも高い活性があった。第２世代の合成プロモーター２５個（ライブラリの５７％）は、ＣＭＶ対照よりも高いＳＥＡＰ生成を実現し、最強のプロモーター（２／０１）は２．２倍の増大を示した。
【０２１４】
図５は、ＴＦＲＥが存在する第２世代の合成プロモーター構築物の発現レベルに対する、各ＴＦＲＥの相対存在度の分析の結果を示す。
【０２１５】
第２世代のプロモーターのＴＦＲＥブロック組成の分析により、ライブラリ全体におけるＴＦＲＥの相対的な化学量論は、およそデザインした通りであったことが明らかにされた（ＮＦκＢ  ５：Ｅ−ｂｏｘ  ２．８１：ＧＣ−ｂｏｘ  １．３２：Ｃ／ＥＢＰα  １．１５）。図５に示す通り、第２世代のプロモーターでは、ＧＣ−ｂｏｘ及びＣ／ＥＢＰαの影響は全体的にネガティブであるが、ＮＦκＢ及びＥ−ｂｏｘは依然としてポジティブのエフェクターである。
【０２１６】
しかし、第２世代のプロモーターの組成を考慮すると（表４における配列を参照されたい）、結果は、ＴＦＲＥブロックのＮＦκＢもＥ−ｂｏｘも、単独で高転写活性を実現することができず、両者の組合せが必要であることを示唆する。
【０２１７】
最強のプロモーター（２／０１〜２／０３）は、およそ等しい比率の両方のＴＦＲＥを比較的多数含み、対応して少数のネガティブのＧＣ−ｂｏｘ及びＣ／ＥＢＰαブロックを含む。活性の低いプロモーターのいくつかは、比較的多数のＮＦκＢ又はＥ−ｂｏｘブロックを含む（例えば、２／１１、２／１３、２／１７）が、（ｉ）最適以下の比率のＮＦκＢ：Ｅ−ｂｏｘ（２／１１、２／１７）を含む、又は（ｉｉ）比較的多数のＧＣ−ｂｏｘ及びＣ／ＥＢＰαブロックも含む（２／１３）。
【０２１８】
したがって、本例は、第２世代のプロモーターは、第１世代のプロモーター構築物を用いてＣＨＯ細胞において実現することができる、可能な転写活性範囲を上首尾に拡張することができることを実証する。
【０２１９】
（例４）異なるＣＨＯ宿主細胞型における第１世代及び第２世代のプロモーター構築物の分析
本発明の合成プロモーターが、強力且つ予想通りに働いたか否かを決定するために、本発明者らは、異なるＣＨＯ宿主系におけるこれらの相対的な機能上の能力を評価した。
【０２２０】
第１世代及び第２世代両方のライブラリから、広範囲のプロモーター活性を網羅する、一連の７つのプロモーターを選択した（すなわち、１／５１＜１／１７＜１／０４＜１／０２＜２／１９＜２／０３＜２／０１）。これらをＣＭＶの活性と比べた。
【０２２１】
図６は、通常利用される３つの宿主系である、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、及びＣＨＯ−Ｋ１における全てのプロモーターからの一過性ＳＥＡＰ生成を示す。プロモーター活性の相対的な順位は３つの細胞系全てにおいて維持されているが、例外として、オリジナルのスクリーニングと対照的に、ＣＨＯ−Ｋ１において２／０３は２／０１より性能が優れており（例３を参照されたい）、ＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯ−Ｓにおいてプロモーター２／０３及び２／０１はおよそ等しい発現を有する。
【０２２２】
各細胞系において、性能が最上位である合成プロモーターは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｓ、及びＣＨＯ−Ｋ１細胞においてそれぞれ３．１倍、１．９倍、及び１．７倍、ＣＭＶよりも著しく高いＳＥＡＰ生成を駆動する。全般的に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、おそらくリポフェクションによる「トランスフェクト可能性（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）」の低減のため、ＣＨＯ−Ｓ又はＣＨＯ−Ｋ１細胞のいずれかより著しく低いレポーター生成を示した。
【０２２３】
それにもかかわらず、本例によって、プロモーター構築物の順位は、異なるＣＨＯ細胞型の間で概ね保存されることが示され、プロモーター構築物は、試験した３タイプの以外の他のＣＨＯ細胞型でも有効であることが示唆され、合成プロモーターは、形質転換した様々な哺乳動物細胞型で機能的である可能性が高く、癌標的化遺伝子治療の応用における使用があり得ることも示唆される。
【０２２４】
（例５）長期間一過性トランスフェクションにおける第１世代及び第２世代のプロモーター構築物の分析
次に、産業上関連のある生成プロセスにおける合成プロモーターの機能性を決定するために、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞を利用して、同じパネルのプロモーターを、より長期間にわたる一過性トランスフェクション（７日）の流加ＳＥＡＰ生成プロセスにおいて評価した。
【０２２５】
一過性のシステム（安定なシステムではなく）を用いて、生成量の変動は、細胞系に特異的な、部位特異的組入れ又はプロモーターサイレンシング（例えば、メチル化、欠失）のアーチファクトよりもむしろ、プロモーター活性の違いに直接関連することを確実にした。
【０２２６】
トランスフェクション２時間前に、中対数期のＣＨＯ−Ｓ培養物から細胞６×１０６個を、５０ｍＬ  ＣｕｌｔｉＦｌａｓｋバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）中に、ワーキング体積６ｍＬを接種した。細胞に、製造元の指示にしたがって調製したＤＮＡ：リポフェクタミン複合体をトランスフェクトした。流加培養物を、２、４、及び６日目に１０％ｖ／ｖのＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を栄養補充することにより、７日間維持した。ＳＥＡＰの発現及び細胞の増殖を、２４時間間隔で測定した。
【０２２７】
ＳＥＡＰ発現アッセイの結果を図７に示す。見ることができる通り、活性の相対的順序は、短期間の一過性発現の結果（すなわち、例４からの静的マイクロプレート実験、図６を参照されたい）に比べた場合、殆ど保存されており、本発明の合成プロモーター構築物を用いて、強く且つ再現性がある発現レベルを長期間実現することができることが示される。加えて、プロモーター２／０３が駆動するＳＥＡＰの最高力価は、ＣＭＶ媒介性発現によって得たＳＥＡＰの最高力価の１．６５倍を上回った。
【０２２８】
ＩＶＣＤの結果は、ＣＨＯ細胞に本発明のプロモーター構築物をトランスフェクトした場合、細胞の生存性は、著しい影響は受けないことをさらに示す。この結果は、プロモーター構築物には、正常な細胞機能に有害な影響を及ぼさずに宿主細胞において用いられる潜在性があることを示すため、重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図８ｉ】
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【図８ｊ】
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【図８ｋ】
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【図８ｌ】
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【図８ｍ】
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【図８ｎ】
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【図８ｏ】
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【図８ｐ】
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【図８ｑ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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