(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被滅菌物をオゾンガス又はオゾン水で滅菌する滅菌装置の滅菌保証方法において、親水性のＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）からなる可撓性、復元性を備えているメンブレンフィルターを用い、その表面に、Bacillus subtilis ATCC9372、又はBacillus stearothermophilus ATCC12980のいずれかの指標菌を付着させてなるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータを、被滅菌物と同じ形状をしたダミー容器内に小さく折り畳んで収容したのち、その復元力で元の形に戻し、そのダミー容器内のオゾン滅菌処理を行った後、そのオゾン滅菌処理後のダミー容器内に培養液を注入して一定時間培養を行って滅菌力評価を行うことにより、前記滅菌装置の滅菌保証を行うことを特徴とするオゾン滅菌用滅菌保証方法。
【請求項２】
被滅菌物をオゾンガス又はオゾン水で滅菌する滅菌装置の滅菌保証方法において、親水性のＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）からなる可撓性、復元性を備えているメンブレンフィルターを用い、その表面に、Bacillus subtilis ATCC9372、又はBacillus stearothermophilus ATCC12980のいずれかの指標菌を付着させると共に、これをオゾン透気性の滅菌紙で包装してなるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータを、被滅菌物と同じ形状をしたダミー容器内に小さく折り畳んで収容したのち、その復元力で元の形に戻し、そのダミー容器内のオゾン滅菌処理を行った後、そのオゾン滅菌処理後のダミー容器内に培養液を注入して一定時間培養を行って滅菌力評価を行うことにより、前記滅菌装置の滅菌保証を行うことを特徴とするオゾン滅菌用滅菌保証方法。
【請求項３】
前記被滅菌物が、プラスチック製の目薬容器である請求項１又は２に記載のオゾン滅菌用滅菌保証方法。
【請求項４】
上記メンブレンフィルターの径が４７ｍｍ以下、孔径が０．４５μｍ以下である請求項１〜３のいずれかに記載のオゾン滅菌用滅菌保証方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医療分野における手術用医療器具や医薬品容器等の滅菌装置の滅菌保証のために用いられるバイオロジカル（生物学的）インジケータを用いた滅菌保証方法に係り、特にオゾンによる滅菌に適したオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータを用いたオゾン滅菌用滅菌保証方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、かかる医療器具や医薬品容器の滅菌方法としては、高圧蒸気滅菌方法、エチレンオキサイドガス滅菌方法、過酸化水素水滅菌方法等が採用されているが、最近ではこれら従来の滅菌方法に代わり、オゾンガスやオゾン水を用いたオゾン滅菌方法が検討されている。
【０００３】
すなわち、このオゾン（Ｏ3 ）は、その強い酸化力によって優れた滅菌力を発揮することは勿論、高圧蒸気滅菌方法のような高温高圧条件を要しないため、プラスチック容器等の熱に弱い被滅菌物に対しても適している上に、短時間で無害な酸素に分解することから、エチレンオキサイドガス滅菌方法等のように被滅菌物に対して有害な残留物を残さない等といった優れた長所を有している。さらに、このオゾンは、乾燥空気又は酸素中に無声放電を行わせたり、空気中に紫外線を照射したりすることで容易に得ることができることから、従来方法に比較して安価かつ大量に得ることができるといった優れた長所を有している。
【０００４】
一方、従来の滅菌方法を利用した装置にあっては、滅菌保証のために定期的に滅菌性能検査が行われるようになっている。この滅菌性能検査方法としては、従来、滅菌処理後の被滅菌物に対して直接無菌試験を行う方法が採用されてきたが、最近ではより簡便な方法として滅菌装置内の任意の箇所にバイオロジカル（生物学的）インジケータを設置し、滅菌処理後におけるそのバイオロジカルインジケータの滅菌効果を指標にして判定を行う方法が採用されてきている。
【０００５】
例えば、被滅菌物として多数の医薬品容器を纏めて滅菌処理する装置の場合には、その医薬品容器と同じ形状をしたダミー容器内にその滅菌方法に対して最大の抵抗値を示すと考えられる細菌の芽胞を塗布したシート状の担体を収容してから滅菌処理を行った後に、そのダミー容器内に培養液を注入して一定時間培養を行うことにより、生物学的な滅菌効果の判定を行うようにしたものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、このようなバイオロジカルインジケータを構成する担体として従来から使用されているものは、その殆どがステンレスやガラス繊維濾紙等の可撓性に乏しい材質から構成されているため、口径が小さい（数ｍｍ）容器、例えば目薬の容器の中等には入れ難いといった欠点があった。
【０００７】
そのため、その担体としてセルロース等の可撓性に富んだ材料から形成することも考えられるが、上述したように滅菌方法としてオゾンを用いた場合、オゾンの滅菌力（酸化力）の一部がセルロースの分解に採られてしまうため、正確な滅菌保証検査のために用いることは不適当であった。
【０００８】
また、ステンレス担体は接種した菌が凝縮しやすく滅菌効果が大きくばらついてしまうため、オゾン用のバイオロジカルインジケータとしては適さず、また、ガラス繊維濾紙担体は一般に孔径が粗く、菌が内部まで潜り込んでしまうため、オゾン水等の液系の滅菌には不向きあるといった欠点がある。
【０００９】
そこで、本発明はこのような課題を有効に解決するために案出されたものであり、その主な目的は、可撓性等に富み、かつオゾンの滅菌力に影響を及ぼすことのないオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータを用いた新規なオゾン滅菌用滅菌保証方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、請求項１に示すように、被滅菌物をオゾンガス又はオゾン水で滅菌する滅菌装置の滅菌保証方法において、親水性のＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）からなる可撓性、復元性を備えているメンブレンフィルターを用い、その表面に、Bacillus subtilis ATCC9372、又はBacillus stearothermophilus ATCC12980のいずれかの指標菌を付着させてなるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータを、被滅菌物と同じ形状をしたダミー容器内に小さく折り畳んで収容したのち、その復元力で元の形に戻し、そのダミー容器内のオゾン滅菌処理を行った後、そのオゾン滅菌処理後のダミー容器内に培養液を注入して一定時間培養を行って滅菌力評価を行うことにより、前記滅菌装置の滅菌保証を行うオゾン滅菌用滅菌保証方法である。
【００１１】
すなわち、耐酸化性を有する可撓性のメンブレンフィルターを菌の担体として用いることによって、目薬の容器等といった口径の小さい容器内にも容易に折り畳んで収容できると共に、収容後にその容器内で略元の形に復元するようになるため、オゾン水やオゾンガスとの接触も良好となり、当該容器のオゾンによる生物学的な滅菌効果の判定を正確に行うことが可能となる。尚、このメンブレンフィルターの付着（塗布）は、従来から微生物試験方法として一般的に用いられている吸引濾過法等によって容易に行うことができる。
【００１２】
また、オゾンガスに対しては、請求項２に示すように、請求項１のメンブレンフィルターをさらに透気性の滅菌紙で包装すれば、取り扱いに際して汚染や損傷からバイオロジカルインジケータを効果的に保護することができる上に、生残している指標菌による滅菌装置や環境への二次汚染も同時に防止することが可能となる。
【００１３】
そして、上記指標菌として、Bacillus subtilis ATCC9372、又はBacillus stearothermophilus ATCC12980のいずれかを用いることが最適である理由は、後述するように、既知の指標菌のうちオゾン滅菌力に対して高い抵抗性を有するといわれているBacillus属に属する菌のオゾン滅菌抵抗性を調べた結果、Bacillus stearothermophilusが最も優れたオゾン滅菌抵抗性を発揮することが判明し、また、バイオバーゲン菌として良く検出されるBacillus subtilisも同様に使用可能であることが分かったからである。
【００１４】
また、上述したように口径の小さい目薬容器等を対象とすると共に指標菌としてBacillus subtilis ATCC9372等を用いる場合には、さらに請求項４に示すように、径４７ｍｍ以下及び孔径０．４５μｍ以下のメンブレンフィルターを用いることが望ましい。すなわち、径４７ｍｍ以下の大きさであれば、請求項３に示すように口径の小さい目薬容器等にも簡単に入れることができると同時に、小さい容器内でも入れた後に略元の形に復元可能であるからである。また、孔径０．４５μｍ以下であれば、Bacillus subtilis ATCC9372等の指標菌がフィルターの目に食い込む程度で、その内部まで潜り込んでしまうようなことがないため、正確な滅菌効果が得られるからである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を実施する好適一形態を添付図面を参照しながら説明する。
【００１６】
図１は、本発明に係るオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータ（以下、ＢＩと略す）１の実施の一形態を示したものである。
【００１７】
図示するように、このＢＩは、例えば、径２５ｍｍ、膜厚１２５μｍ、孔径０．２２μｍの耐酸化性を有する可撓性のメンブレンフィルター２の片面に、吸引濾過法等によってオゾン滅菌力に対して高い抵抗性を発揮する指標菌３を付着（塗布）させてなるものである。
【００１８】
このメンブレンフィルター２は、優れた耐酸化性と可撓性、すなわち、オゾンに対して不活性でオゾンの殺菌力に影響しない程度の耐酸化性を備えると共に、容易に折り畳め、かつ放置した後（容器内に収容した後）に容易に元の形に復元するような可撓性・復元性を備えているものが用いられる。さらに、加えてその表面は、吸引濾過法等によって液体中の指標菌を付着させるために適当な親水性を有していることが望ましい。
【００１９】
このような条件を満たす公知の材料としては、親水性のＰＶＤＦ（Polivinylidenedifluoride）が最適であり、その他、親水性のＰＴＦＥ（Polytetrafluoroethilene ）等も用いることもできる。
【００２０】
一方、このメンブレンフィルター２上に付着される指標菌３としては、オゾン水の滅菌力に対して最も高い抵抗性を有するといわれている、Bacillus属のBacillus stearothermophilus ATCC12980 、又はBacillus subtilis ATCC9372を用いることが望ましい。すなわち、本発明に至るに際して予め本発明者らがオゾン水滅菌に対する最抵抗性菌の選定を行ったところ、これら２種類の菌がオゾン水に対して高い抵抗性を発揮し、特にBacillus stearothermophilus ATCC12980 は最抵抗性を発揮したことから本発明のＢＩに適用する指標菌としては最適であることが判明したからである。具体的には、主要なBacillus属１１菌種の芽胞懸濁液とAspergillus Nigar の胞子懸濁液を用いて、水温約２０℃、濃度約５０ｍｇ／Ｌのオゾン水に対する抵抗性試験を実施した結果、初期菌数約１０4 ＣＦＵ（Colony Forming Unit 、コロニー形成単位）／ｍｌに対してBacillus stearothermophilus ATCC12980 のみ保持時間４５秒でも２４４ＣＦＵ／ｍｌ生残したのに対し、残り１０種のBacillus属とAspergillus Nigar は保持時間４５秒で殆ど全部死滅したからである。但し、このBacillus stearothermophilus ATCC12980 はプラントのバイオバーデン菌として存在することは殆どなく、むしろBacillus subtilis ATCC9372のほうが良く検出されるため、実際にはこのBacillus subtilis ATCC9372の方が多く用いられるものと考えられる。
【００２１】
また、このような構造をした本発明のオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるＢＩの製造方法としては、特に限定するものではないが、メンブレンフィルター２に付着した指標菌３がメンブレンフィルター２上から容易に離脱しないようにする必要がある。すなわち、オゾン水に浸漬された際に指標菌３がオゾン水側に流出したり、オゾンガスの流れによって吹き飛ばされたりすると後に行う正確な滅菌効果の判定が行えなくなるからである。このような条件を満足するＢＩの製造方法として上述したようなＰＶＤＦからなるメンブレンフィルター２を用いた場合には、吸引濾過法が最適であり、具体的には、指標菌の原液から約１．５ラ１０3／ｍｌに希釈した菌液を作成して初期菌数をカウントした後、その菌液の２５倍希釈水を作成し、フィルタートラップに設置したメンブレンフィルター２上に２５ｍｌ注ぎ、これを真空ポンプで約３００ｍｍＨｇの圧力で吸引してメンブレンフィルター２内に指標菌３を食い込ませるように密着させ、その後、このメンブレンフィルター２を減菌ピンセットで減菌シャーレ上に移し、クリーンベンチ上で自然乾燥させることで容易に得ることができる。
【００２２】
そして、このようにして得られた本発明のオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるＢＩにあっては、これを小さく折り畳むことで、例えば図２に示すようにＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等からなる口径が数ｍｍ程度の小さい目薬容器４内にも容易に収容することができ、かつ、収容後にそのメンブレンフィルター２自体の復元力によって略元の形に戻るようになる。従って、オゾン滅菌時においてその表面の指標菌３と、その容器４内に流入してきたオゾン水又はオゾンガスとが確実に接触するようになるため、オゾンによる滅菌効果の判定を正確に行うことが可能となる。
【００２３】
また、オゾンガスに対するＢＩとしては、図３に示すように、上記ＢＩをそのまま適用することも可能であるが、さらに上記ＢＩを透気性の滅菌紙５で一次包装して用いることが望ましい。すなわち、このＢＩを透気性の滅菌紙５で保護することによって取扱上でのＢＩの破損や汚染を防止できると同時に、生残した指標菌による機器や搬送時等におけるクリーンルーム等の製造環境の二次汚染を効果的に防止することができるからである。尚、この透気性の滅菌紙としては、オゾンガスを吸収せず、かつこれを良好に透過するものを用いる必要があり、例えば、従来から過酸化水素滅菌用ＢＩの一次包装の滅菌紙として既に使用されているタイベック包装紙等が適している。
【００２４】
【実施例】
次に、オゾン滅菌用ＢＩを用いた本発明に係るオゾンの滅菌力評価（オゾン滅菌用滅菌保証方法）に関する具体的実施例を説明する。
【００２５】
（実施例１：オゾン水滅菌）
上記の方法で得られた医薬用容器内に入れてその内部にオゾン水を充満させ、保持時間経過後にチオ硫酸ナトリウム溶液を滴下することによってその容器中のオゾンを取り除いた後、その処理水を容器から振り出し、処理水とＢＩをＳＣＤ培地（Soybean Casein Digest 、大豆カゼイン消化物培地）で１週間培養して指標菌の生残の有無を調べると共に、フラクション・ネガティブ法のStumbo-Murphy Cochran Procedure （ＳＭＣＰ）によりＤ値を算出した。
【００２６】
そして、濃度４０ｍｇ／Ｌ、水温２０℃のオゾン水で滅菌した場合には、初期菌数が１．０×１０3 ＣＦＵのBacillus stearothermophilus ATCC12980 でのＤ値は約４７秒、同じ初期菌数のBacillus subtilis ATCC9372でのＤ値は６．８秒であった。
【００２７】
また、以下の表１に示すように、濃度を３０ｍｇ／Ｌに低下させても水温２０℃のオゾン水で滅菌すると、初期菌数が１．０×１０3 ＣＦＵのBacillus stearothermophilus ATCC12980 でのＤ値は約５７．２秒、同じ初期菌数のBacillus subtilis ATCC9372でのＤ値は７．５秒であり、濃度が４０ｍｇ／Ｌの時と滅菌力はあまり変わらないことが分かった。
【００２８】
【表１】
0004378828.tif 000002
【００２９】
また、以下の表２に示すように、濃度を３０ｍｇ／Ｌに固定し水温を２３℃と１７℃に分けて初期菌数が１．０×１０3 ＣＦＵのBacillus subtilis ATCC9372で同じ滅菌試験を行ったところ、水温が高い方がＤ値が小さくなり、滅菌力が高くなることが確認された。
【００３０】
【表２】
0004378828.tif 000003
【００３１】
（実施例２：オゾンガス滅菌）
実施例１で用いたＢＩと同じＢＩをタイベック包装して作成し、そのＢＩを設定温度２３℃の恒温恒湿機内に設置して、濃度６０００ｐｐｍのオゾンガスを２．５Ｌ／ｍｉｎの流量で恒温恒湿機内に流し、保持時間経過後に酸素ガスをパージしてオゾンを取り除いた後、オゾンガス処理したＢＩをＳＣＤ培地で１週間培養して指標菌の生残の有無を調べると共に、ＳＭＣＰ法によりＤ値を算出した。
【００３２】
この結果、以下に表３に示すように、１．０×１０3 ＣＦＵのBacillus subtilis ATCC9372をドライのオゾンガスで処理するとＤ値は１８分となった。一方、同じＢＩを相対湿度６０％のオゾンガスで処理すると、Ｄ値は１０．７分となった。さらに、同じＢＩを相対湿度８０％のオゾンガスで処理すると１０分間処理しただけで２０検体全致死となり、Ｄ値は２分以内になることが推定された。また、同じ相対湿度８０％で温度を２３℃から１８℃に低下させてもやはりＤ値は２分以内になると算出された。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
そして、以上の実施例からもわかるように、メンブレンフィルターにBacillus stearothermophilus ATCC12980、またはBacillus subtilis ATCC9372を付着（塗布）させた本発明のオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるオゾン滅菌用ＢＩでは、オゾン水滅菌バリデーション試験で安定したＤ値が得られることが確認でき、また、オゾン水滅菌用ＢＩをタイベック包装することにより、オゾンガス滅菌用ＢＩとして使用可能であることが確認できた。
【００３５】
【発明の効果】
以上要するに本発明によれば、以下に示すように優れた効果を発揮することができる。
【００３６】
（１）親水性を有するＰＶＤＦ等をメンブレンフィルターを菌の担体として用いるようにしたため、目薬の容器等といった口径の小さい容器内にも容易に折り畳んで収容できると共に、収容後にその容器内で略元の形に復元するようになるため、オゾン水やオゾンガスとの接触も良好となり、当該容器のオゾンによる生物学的な滅菌効果の判定を正確に行うことが可能となる。
【００３７】
（２）このメンブレンフィルターをさらに透気性の滅菌紙で包装することにより、生残した指標菌によるクリーンルーム等の汚染を防止できると共に滅菌後のＢＩを無菌的に搬送できるため、オゾンガスによる機器・製造環境等の滅菌用として使用することができる。
【００３８】
（３）指標菌として、オゾン滅菌力に対して高い抵抗性を有するBacillus subtilis ATCC9372、又はBacillus stearothermophilus ATCC12980 のいずれかを用いるようにしたため、オゾンによる滅菌効果を正確に判定することができる。
【００３９】
（４）メンブレンフィルターとして径４７ｍｍ以下及び孔径０．４５μｍ以下の薄膜のメンブレンフィルターを用いることで、口径の小さい目薬容器等にも簡単に入れることができると同時に、小さな容器内でも略元の形に復元可能であり、また、指標菌がその内部まで潜り込んでしまうようなことがないため、滅菌効果を正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係るオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータの実施の一形態を示す拡大斜視図である。
【図２】  本発明に係るオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータの使用例を示す説明図である。
【図３】  本発明に係るオゾン滅菌用滅菌保証方法に用いるオゾン滅菌用バイオロジカルインジケータの他の実施の形態を示す拡大斜視図である。
【符号の説明】
１  オゾン滅菌用バイオロジカルインジケータ
２  メンブレンフィルター
３  指標菌
４  小口径容器
５  減菌紙
【図１】
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【図２】
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【図３】
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