(57)【要約】  ポリマーが接合したＦＶＩＩＩ、例えば、ＰＥＧ化因子ＶＩＩＩのための配合物を含め、液体および凍結乾燥した組み換え因子ＶＩＩＩ配合物が提供される。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｂ）約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｃ）約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、
ｒＦＶＩＩＩが、配列番号３のアミノ酸配列中の１つ以上の非システイン残基がシステイン残基と置き換わったアミノ酸配列を含み、
ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項２】
（ａ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の糖または糖アルコール；および
（ｃ）約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの範囲のグリシンをさらに含む、請求項１に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項３】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；
（ｂ）０．５重量％〜１０重量％の糖または糖アルコール；
（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｄ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）５０〜１５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および
（ｆ）約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約１５００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、
ｒＦＶＩＩＩ配合物が、ｒＦＶＩＩＩ以外の一級アミン基または二級アミン基を有する成分を５．０重量％未満含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項４】
ヒスチジンおよびグリシンを本質的に含まない、請求項３に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項５】
生体適合性ポリマーにｒＦＶＩＩＩを共有結合させるための方法であって、
（ａ）請求項３または４に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物を得ることと；
（ｂ）ｒＦＶＩＩＩ上のアミン基と反応性の化学部分で官能基化されたポリマーを加え、反応混合物を作成することと；
（ｃ）ｒＦＶＩＩＩに対するポリマーの共有結合が起こるような時間条件および温度条件で、反応混合物をインキュベートすること
とを含む、方法。
【請求項６】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；
（ｂ）１５０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；
（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合していないｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項７】
（ａ）０．５％〜１０％の範囲の糖または糖アルコール；および
（ｂ）２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項６に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項８】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳまたはヒスチジン；
（ｂ）２５ｍＭ〜２００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；
（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項９】
（ａ）０．５％〜１０％の範囲の糖または糖アルコール；および
（ｂ）２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項８に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１０】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）約０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）０．５％〜２０％の範囲のスクロースまたはトレハロース；
（ｃ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｄ）約０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム；
（ｅ）約０ｍＭ、または約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約０％、または約１．０％〜約５．０％の範囲のグリシン、および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含み；ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１１】
（ａ）塩化ナトリウムが、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲で存在し；
（ｂ）スクロースが、０．５％〜２．０％の範囲で存在し、
（ｃ）グリシンが、約１．０％〜約５．０％の範囲で存在し、
（ｄ）ヒスチジンが、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲で存在し、
（ｅ）非イオン性界面活性剤が、約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍの範囲で存在する、請求項１０に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１２】
（ａ）塩化ナトリウムが、１．０重量％未満の量で存在するか、または存在せず；
（ｂ）スクロースまたはトレハロースが、０．５％〜２０％の範囲で存在し、
（ｃ）グリシンが、１．０重量％未満の量で存在するか、または存在しない、請求項１０に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１３】
スクロースまたはトレハロースが、１．０％〜１０．０％の範囲で存在する、請求項１２に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１４】
血友病Ａを処置することが必要な患者に、請求項１、３、６、８または１０のいずれか一項に記載の治療に有効な量のｒＦＶＩＩＩ配合物を投与することを含む、血友病Ａを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７７９，４９５号および２０１３年８月２３日に出願された米国仮出願第６１／８６９、１９１号の利益を請求し、この両者は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、凝固因子ＶＩＩＩ（「ＦＶＩＩＩ」）の欠損によって引き起こされ、最も一般的な遺伝性の凝固障害であり、男性５０００人あたり１人に発生すると概算されている。血友病Ａの現在の処置は、組み換えヒトＦＶＩＩＩまたは血漿から誘導されるヒトＦＶＩＩＩの静脈内注射を伴う。ＦＶＩＩＩの注射は、出血事象に応答して要求に応じて行われるか、または週に２〜４回投与される予防治療として行われる。予防治療によって血友病Ａの合併症が減るという多くの研究が示されているが、頻繁な静脈内注射の必要性が、患者のコンプライアンスに対する障壁を作り出し、患者の生活の質に影響を与える。頻繁な注射が必要なのは、主に、患者でのＦＶＩＩＩの循環血中半減期が１２〜１４時間と短いことに起因する。
【０００３】
長鎖ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を共有結合により付加すると、タンパク質治療薬の半減期が延びることが示されている。ＰＥＧ化は、タンパク質に対するＰＥＧ分子の共有結合である。
【０００４】
米国特許第５，７６３，４０１号（Ｎａｙａｒ）は、全長組み換えＦＶＩＩＩ（「ＦＬ−ｒＦＶＩＨ」）の安定でアルブミンを含まない凍結乾燥した配合物を開示する。米国特許第７，６３２，９２１号（Ｐａｎら）およびＭｅｉら、Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ、ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ＰＥＧ化されたｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｉａ  Ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、１１６  ＢＬＯＯＤ  ２７０−２７９（２０１０）は、１つ以上の生体適合性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に共有結合した、システインを増やしたＦＶＩＩＩ変異体を開示する。米国特許第７，０８７，７２３号（Ｂｅｓｍａｎら）は、アルブミンを含まないＦＶＩＩＩ配合物に関する。Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｅｌ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒｅｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ＳＱ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．７（１９９７）、ｐｐ．８９２−８９８およびＯｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｂ−ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．２、ｓｕｐｐｌ．４（２００１年４月）、ｐｐ．４０−４３は、塩化ナトリウム、スクロース、ヒスチジン、塩化カルシウム無水物およびポリソルベート８０を含有する配合物を含め、凍結乾燥のためのＢ−ドメイン欠損ＦＶＩＩＩの配合物を記載する。Ｆａｔｏｕｒｏｓら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ＳＱ−ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ、ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ、ｐＨ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １５５（１９９７）１２１−１３１は、アルブミンを含まない溶液中で保存する際のｒＦＶＩＩＩ  ＳＱの特性を開示する。国際公開第２０１１／０２７１５２号（Ｊｅｚｅｋら）は、ＦＶＩＩＩの配合物を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，７６３，４０１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，６３２，９２１号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０８７，７２３号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１１／０２７１５２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅｉら、Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ、ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ＰＥＧ化されたｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｉａ  Ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、１１６  ＢＬＯＯＤ  ２７０−２７９（２０１０）。
【非特許文献２】Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｅｌ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒｅｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ＳＱ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．７（１９９７）、ｐｐ．８９２−８９８。
【非特許文献３】Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｂ−ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．２、ｓｕｐｐｌ．４（２００１年４月）、ｐｐ．４０−４３。
【非特許文献４】Ｆａｔｏｕｒｏｓら、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  因子ＶＩＩＩ  ＳＱ−ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ、ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ、ｐＨ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １５５（１９９７）１２１−１３１。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、（ａ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；（ｂ）約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；（ｃ）約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；および（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、ｒＦＶＩＩＩが、配列番号３のアミノ酸配列中の１つ以上の非システイン残基がシステイン残基と置き換わったアミノ酸配列を含み、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。別の実施形態では、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；（ｂ）０．５重量％〜１０重量％の糖または糖アルコール；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；（ｄ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；（ｅ）５０〜１５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および（ｆ）約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約１５００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、ｒＦＶＩＩＩ配合物が、ｒＦＶＩＩＩ以外の一級アミン基または二級アミン基を有する成分を５．０重量％未満含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【０００８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；（ｂ）１５０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合していないｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。さらなる実施形態では、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳまたはヒスチジン；（ｂ）２５ｍＭ〜２００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。なおさらなる実施形態では、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、（ａ）約０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲のヒスチジン；（ｂ）０．５％〜２０％の範囲のスクロースまたはトレハロース；（ｃ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；（ｄ）約０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム；（ｅ）約０ｍＭ、または約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；（ｆ）約０％、または約１．０％〜約５．０％の範囲のグリシン、および（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含み；ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【０００９】
当業者は、以下に記載する図面が、単なる説明のためのものであることを理解するだろう。図面は、本明細書で与えられる本開示の範囲または特許請求の範囲をいかなる様式にも限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、全長ヒト因子ＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのドメインを模式的に示す。
【図２】図２は、ジスルフィド結合によって接続したドメインを有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の相対濁度を示すグラフである。濁度は、塩化ナトリウムの濃度を徐々に増やしたバッファー中で測定された。濁度は、Α３４０ｎｍで測定された。バッファーは、塩化ナトリウムに加え、２０ｍＭのヒスチジン、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２９ｍＭのスクロース、２９３ｍＭのグリシンおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含んでいた。
【図３】図３は、ジスルフィド結合によって接続したドメインを有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の相対濁度を示すグラフである。濁度は、ポリソルベート８０の濃度を徐々に増やしたバッファー中で測定された。濁度は、Α３４０ｎｍで測定された。バッファーは、ポリソルベート８０に加え、２０ｍＭのヒスチジン、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭの塩化ナトリウム、２９ｍＭのスクロースおよび２９３ｍＭのグリシンを含んでいた。
【図４】図４は、ジスルフィド結合によって接続したドメインを有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の相対濁度を示すグラフである。濁度は、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）の濃度を徐々に増やしたバッファー中で測定された。濁度は、Α３４０ｎｍで測定された。バッファーは、２０ｍＭのヒスチジン、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２９ｍＭのスクロース、２９３ｍＭのグリシンおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含んでいた。
【図５】図５は、ジスルフィド結合によって接続したドメインを有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の相対濁度を示すグラフである。濁度は、ポリソルベート８０およびＨＳＡと組み合わせて、塩化ナトリウムの濃度を徐々に増やしたバッファー中で測定された。濁度は、Α３４０ｎｍで測定された。バッファーは、塩化ナトリウム、ＨＳＡおよびポリソルベート８０に加え、２０ｍＭのヒスチジン、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２９ｍＭのスクロースおよび２９３ｍＭのグリシンを含んでいた。
【図６】図６は、賦形剤を添加する前または後の、ドメインを接続するジスルフィド結合を有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の溶液中の透明性の変化を示す。左から右に、（１）賦形剤（ＨＳＡ、塩化ナトリウムおよびポリソルベート８０）の組み合わせ、（２）ＨＳＡ、（３）塩化ナトリウム、（４）ポリソルベート８０および（５）ＨＳＡ、ポリソルベート８０および塩化ナトリウムを添加する前である。
【図７】図７は、４０℃で７日間保存中の、ヒスチジン、ＭＯＰＳおよびＴＥＡバッファー中の全長ＦＶＩＩＩの液体安定性を示すグラフである。
【図８】図８は、２５℃でのＭＯＰＳおよびヒスチジンバッファー中のｒＦＶＩＩＩ安定性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの構造を示す図である。Ａ３領域から突出する鎖は、ＰＥＧ分子を表す。
【図１０】図１０は、２３℃で６日間保存中に、塩化ナトリウムが、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの有効性の回収率に与える影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、２３℃で６日間保存中に、塩化ナトリウムが、ＰＥＧ化されていないＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの有効性の回収率に与える影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、２６週間後の凍結乾燥された配合物Ａ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ａは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、２９３ｍＭのグリシン、２９ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１３】図１３は、２６週間後の凍結乾燥された配合物Ｂ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ｂは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、３４６ｍＭのグリシン、３８ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１４】図１４は、２６週間後の凍結乾燥された配合物Ｃ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ｃは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２０ｍＭのヒスチジン、２３４ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１５】図１５は、２６週間後の凍結乾燥された配合物Ｄ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ｄは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２０ｍＭのヒスチジン、２１１ｍＭのトレハロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１６】図１６は、３０ヶ月までの凍結乾燥された配合物Ａ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ａは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、２９３ｍＭのグリシン、２９ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１７】図１７は、１３週間までの凍結乾燥された配合物Ｂ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ｂは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、３４６ｍＭのグリシン、３８ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１８】図１８は、１２ヶ月までの凍結乾燥された配合物Ａ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｍＬ）の正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ａは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、２９３ｍＭのグリシン、２９ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図１９】図１９は、９ヶ月までの凍結乾燥された配合物Ａ中のＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（１２００ＩＵ／ｍＬ）の正規化された有効性の傾向を示すグラフである。配合物Ａは、２．５ｍＭの塩化カルシウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、２９３ｍＭのグリシン、２９ｍＭのスクロースおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含有する。
【図２０】図２０は、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ  ＳＱのアミノ酸配列（配列番号ＮＯ：３）である。
【図２１】図２１は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書を解釈する目的のために、特に指示のない限り、以下の定義を適用する。本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【００１２】
因子ＶＩＩＩ：因子ＶＩＩＩ（「ＦＶＩＩＩ」）は、約２００ｋＤａの重鎖と、８０ｋＤａの軽鎖とで構成されるヘテロダイマーとして循環する凝固因子である。重鎖は、構造的に関連するＡ１ドメインとＡ２ドメインと、固有のＢドメインを含み、軽鎖は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む。例えば、Ｍｅｉら、１１６  ＢＬＯＯＤ  ２７０−２７９（２０１０）を参照。例えば、ＦＶＩＩＩのドメインを示す図１も参照。「因子ＶＩＩＩ」または「ＦＶＩＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、血漿から誘導されるか、または組み換えＤＮＡ技術の使用によって作られるかによらず、野生型ヒトＦＶＩＩＩに特徴的なある程度の凝固促進活性を有するすべての因子ＶＩＩＩ分子を指す。本明細書で使用される場合、ＦＶＩＩＩは、野生型因子ＦＶＩＩＩまたは活性化された野生型因子ＦＶＩＩＩの凝固促進活性の一部またはすべてを保持する、野生型因子ＶＩＩＩまたは組み換え因子ＶＩＩＩの改変された形態またはトランケーションされた形態を含み、野生型因子ＶＩＩＩまたは活性化された野生型因子ＶＩＩＩの活性を超える凝固促進活性を有する改変体またはトランケーションされた形態を含む。ＦＶＩＩＩは、活性な因子ＶＩＩＩを含む融合産物、例えば、免疫グロブリンフラグメントまたはドメインとの融合物も含む。ＦＶＩＩＩを含有する治療調製物の市販例としては、商標名ＫＯＧＥＮＡＴＥ  ＦＳの名称で販売されるものが挙げられる（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ、バークレー、ＣＡ、米国から入手可能）。
【００１３】
組み換え因子ＶＩＩＩ：組み換え因子ＶＩＩＩ（「ｒＦＶＩＩＩ」）は、本明細書で使用される場合、組み換え技術によって作られるＦＶＩＩＩ、またはその生物学的に活性な誘導体を指し、哺乳動物の血漿から得られるＦＶＩＩＩを含まない。
【００１４】
全長ネイティブヒト因子ＶＩＩＩ（「ＦＬ−ＦＶＩＩＩ」）は、２，３５１アミノ酸の一本鎖糖タンパク質である。発現した２，３５１アミノ酸配列は、配列番号１として与えられる。しかし、発現したポリペプチドが小胞体の内腔に移動する場合は、１９アミノ酸シグナル配列が開裂し、第２の配列が得られる。この第２の配列は、本明細書では配列番号２として与えられ、最初の１９アミノ酸が欠損しており、ＶＩＩＩの所与のアミノ酸配列に対し、研究者が、数による位置（例えば、Ａｒｇ３７２）を割り当てるために従来から使用されている配列である。従って、特に明記されていない限り、本明細書に与えられるようなアミノ酸残基の数による位置のすべての割り当ては、配列番号２に基づく。例えば、従来のように、また、本明細書で使用される場合、ＢＤＤ  ｒＦＶＩＩＩにおいて変異したアミノ酸に言及するとき、変異したアミノ酸は、全長ＦＶＩＩＩの配列の位置によって名付けられる。例えば、ＢＤＤ  ｒＦＶＩＩＩ変異体は、Ｋ１８０８Ｃアミノ酸置換を含んでいてもよく、この場合、全長配列（ここでは配列番号２）の１８０８に類似する位置にあるリジン（Ｋ）が、システイン（Ｃ）に置換されている。
【００１５】
Ｂ−ドメインが欠損した（「ＢＤＤ」）因子ＶＩＩＩ：本明細書で使用される場合、ＢＤＤまたはＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部の欠失を伴うアミノ酸配列を有することを特徴とする。一実施形態では、ＢＤＤは、ＢＤＤ−ＳＱとして知られる分子であり、因子ＶＩＩＩのＢドメインのすべてではないが、１４アミノ酸の欠失を含む。ＢＤＤ−ＳＱでは、Ｂドメインの最初の４アミノ酸（配列番号４）は、Ｂドメインの最後の１０残基に接続している（配列番号５）。例えば、Ｌｉｎｄら、Ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｍｌｅｃｕｌｅｓ、２３２  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  １９−２７（１９９５）を参照。ドメイン構成によるＢＤＤを示す図１も参照。ＢＤＤ−ＳＱは、本明細書で使用される場合、配列番号３のアミノ酸配列を含む。因子ＶＩＩＩのＢドメインは、血友病Ａの代替治療として有効であることが示されている９０ｋＤのＡ１−Ａ２重鎖と８０ｋＤの軽鎖とを有するＢＤＤ分子としては不必要であると思われる。Ｂドメインの別の部分が欠失しているか、またはＢドメインのすべてが欠失しているＦＶＩＩＩ分子も、本発明の配合物および方法に含まれる。
【００１６】
ＢＤＤ変異体またはＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体：ＢＤＤ変異体またはＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体は、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性の少なくとも一部を維持し、ＢＤＤ−ＳＱとは少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるＢＤＤ−ＳＱの改変体である。ＢＤＤ変異体またはＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体は、ＢＤＤ−ＳＱとはアミノ酸配列が異なる改変体を含み、例えば、限定されないが、１個以上のアミノ酸残基の部位特異的突然変異によるものを含む。限定されないが、ＢＤＤ変異体またはＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体は、米国特許第７，９２８，１９９号（Ｇｒｉｆｆｉｎら）に開示される、システイン残基が導入されたＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。
【００１７】
ＰＥＧ化：ＰＥＧ化は、例えば、ＦＶＩＩＩ上に存在する部位に結合する活性な官能基を有するＰＥＧが接続することによる、タンパク質に対する長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の共有結合である。ＰＥＧ化に使用される１つの方法は、ネイティブタンパク質中に存在するリジン残基またはＮ末端アミンに対する、官能基化されたＰＥＧ部分の結合である。ＦＶｌｌｌが多くのアミン残基を含有するため、アミン官能基化されたポリマーは、ＦＶＩＩＩ上の異なる部位にランダムに接合している。
【００１８】
部位特異的なＰＥＧ化によって、特定の部位に対するＰＥＧ分子の標的化を可能にする。これらの特異的な部位は、導入された表面に露出するシステインを含んでいてもよく、この部位にＰＥＧポリマーが接合することができる。米国特許第７，６３２，９２１（Ｐａｎら）を参照。ＰＥＧは、ＦＶＩＩＩ上の糖に対する共有結合によってＦＶＩＩＩに接続してもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１１２０２８号（Ｔｕｒｅｃｅｋら）を参照。ＰＥＧは、ＦＶＩＩＩ上のグリカン（例えば、Ｏ−グリカン）に対するＰＥＧの酵素カップリングによってＦＶＩＩＩに接続してもよい。Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅらは、シアリダーゼおよび過剰なＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ試薬と共にバッファー中で全長ＦＶＩＩＩをインキュベートすることによる、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン中の固有のＯ−グリカンに対するＰＥＧの選択的なカップリングを開示する。Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂ−ｄｏｍａｉｎ  Ｏ−ｇｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＦＶＩＩＩ（Ｎ８−ＧＰ）  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｆｕｌｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌｓ」、１２１（１１）ＢＬＯＯＤ  ２１０８−１６（２０１３）。米国特許出願公開第２０１３０１３７６３８号（Ｂｏｌｔ）は、トランケーションされたＢドメインを有するＦＶＩＩＩ改変体に対するＰＥＧの接続を開示する。ＦＶＩＩＩ分子は、トランケーションされたＢドメイン中のＯ−接続したオリゴ糖を介し、親水性ポリマーと共有結合している。米国特許出願公開第２０１２０３２２７３８号（Ｂｅｈｒｅｎｓ）は、Ｂドメイン中のＯ−接続した糖を介し、ＦＶＩＩＩにＰＥＧを共有結合することを含む、ＦＶＩＩＩにポリマーを接合する方法を開示する。本明細書で使用される場合、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩは、上述の当該技術分野で公知の種々の方法を含め、任意の方法によるＰＥＧ化を含む。
【００１９】
国際単位ＩＵ：国際単位（すなわちＩＵ）は、標準的なアッセイによって測定されるようなＦＶＩＩＩの血液凝固活性（有効性）の測定単位である。標準的なアッセイは、当該技術分野で記載されるような１ステージアッセイを含む。例えば、Ｌｅｅら、Ａｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｖｌｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、３０  ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ５１１−５１９（１９８３）を参照。この１ステージアッセイは、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく。ＦＶＩＩＩは、因子ＸからＸａへの酵素変換において、因子ＩＸａ、カルシウムおよびリン脂質存在下、補因子として作用する。このアッセイでは、希釈した試験サンプルを、ＦＶＩＩＩが欠損した血漿基質とａＰＴＴ試薬の混合物と共に３７℃でインキュベートする。このインキュベートした混合物に塩化カルシウムを加え、血餅生成が開始する。血餅が生成するのにかかる時間（秒）と、ＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度のｌｏｇ対数とに逆相関が存在する。未知のサンプルの活性レベルは、試験材料の種々の希釈物の血餅生成時間と、既知の活性を有する標準材料の一連の希釈物から構築された曲線とを比較することによって内挿し、１ｍＬあたりの国際単位で報告される（ＩＵ／ｍＬ）。色素アッセイも有用であり、商標名ＣＯＡＴＥＳＴ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  ＡＢ、モルンダル、スウェーデンから入手可能）のアッセイを含め、商業的に購入されてもよい。色素生成アッセイ方法は、２つの連続した工程からなり、色強度は、ＦＶＩＩＩ活性に比例する。第１の工程では、因子Ｘは、最適量のカルシウムイオンおよびリン脂質存在下、ＦＩＸａとその補因子ＦＶＩＩＩａによって、ＦＸａに活性化される。過剰量の因子Ｘは、因子Ｘの活性化速度が、単にＦＶＩＩＩの量に依存するように存在する。第２の工程では、因子Ｘａが色素生成基質を加水分解し、発色団が得られ、その色強度は、４０５ｎｍで測光法によって読み取られる。未知のものの有効性が計算され、アッセイの妥当性は、傾き比の統計方法を用いて確認される。活性は、１ｍＬあたりの国際単位で報告される（ＩＵ／ｍＬ）。
【００２０】
フリーズドライする、凍結する、凍結乾燥する：「フリーズドライする」は、表示される本文に特に指示のない限り、調製物から水を取り出すために、医薬調製物の温度が第１および第２の凍結乾燥プロセスで上げられる凍結乾燥プロセスの一部を示すために用いられる。凍結乾燥プロセスの「凍結する」工程は、第１および第２の乾燥段階の前に行われる工程である。「凍結乾燥する」は、特に指示のない限り、凍結乾燥のプロセス全体を指し、凍結乾燥およびフリーズドライ工程の両方を含む。
【００２１】
本開示の特定の態様の中で、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶｌＩｌを含む配合物を含め、ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩを含む配合物を、当該技術分野で公知の方法に従って凍結乾燥することができる。例えば、米国特許第５，３９９，６７０号および第５，７６３，４０１号は、溶解度を高めた凍結乾燥したＦＶＩＩＩ配合物を製造する方法論を記載し、この方法論は、本明細書に記載される配合物を凍結乾燥するために使用されてもよい。凍結乾燥プロセスは、凍結段階、第１の乾燥段階および第２の乾燥段階を含む。凍結段階では、アニーリング工程が存在する。凍結段階は、−４０℃を超えない温度で行われ、アニーリング工程は、−１５℃を超えない温度で行われ、第１の乾燥は、０℃を超えない温度で行われ、第２の乾燥は、３０℃を超えない温度で行われる。設定温度が凍結温度、アニーリング温度、最終的な凍結温度、第１の乾燥温度および第２の乾燥温度に達したら、関与する特定のタンパク質サンプルを考慮して当業者によって簡単に理解されるように、このような温度を、合理的な期間（例えば、１時間、２時間、３時間、または３時間より長く）保持してもよい。
【００２２】
アニーリング：用語「アニーリング」は、凍結乾燥を受ける医薬調製の凍結乾燥プロセスにおいて、調製物の凍結乾燥の前の工程を示すために用いられ、この調製物の温度は、低い温度から高い温度まで上げられ、次いで、所定時間後に再び冷却される。
【００２３】
増量剤：本明細書の目的のために、増量剤は、凍結乾燥した後に、医薬調製物の「ケーキ」または残留する固体塊の構造を与え、崩壊を防止する化学物質である。結晶化可能な増量剤は、凍結乾燥中に結晶化させることができる本明細書に記載されるような増量剤を意味する。
【００２４】
界面活性剤：本明細書で使用される場合、用語「界面活性剤」は、「非イオン性界面活性剤」、例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０を含むポリソルベート、ポロキサマー１８４または１８８を含むポロキサマー、プルロニックポリオール（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の商標名ＰＬＵＲＯＮＩＣで販売される）および他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーを含む。非イオン性界面活性剤は、処理および保存の間に、界面の相互作用を減らし、タンパク質が吸着するのを防ぐことによって、ｒＦＶＩＩＩを安定化する。非イオン性界面活性剤の使用によって、ｒＦＶＩＩＩの変性を起こすことなく、配合物が剪断力および表面応力にさらされる。本明細書に開示される配合物は、１種類以上の（１種類または複数の）非イオン性界面活性剤を含む配合物を含み、本明細書では、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０（商標名ＴＷＥＥＮ  ２０で販売される）またはポリソルベート８０（商標名ＴＷＥＥＮ  ８０で販売される）を含む配合物が例示される。
【００２５】
モル浸透圧濃度：本明細書で使用される場合、用語「モル浸透圧濃度」は、溶質濃度の測定値を指し、溶媒１ｋｇあたりの溶質の浸透圧モル数であると定義される。望ましいレベルのモル浸透圧濃度は、１種類以上の安定化剤（例えば、マンニトール、デキストロース、グルコース、トレハロース、および／またはスクロースを含む糖または糖アルコール）を加えることによって達成することができる。モル浸透圧濃度を得るのに適したさらなる安定化剤は、参考文献、例えば、ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｒｏｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている。本明細書に記載される配合物は、モル浸透圧濃度が約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約７５０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４２５ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。
【００２６】
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数のものも含み、その逆も真である。特に述べられていない限り、または「１つ以上の」の使用が明確に不適切である場合を除き、「１つの（ａ）」の使用は、「１つ以上の」を意味する。「または」の使用は、特に述べられていない限り、「および／または」を意味する。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、相互に置き換え可能であり、限定することを意図していない。用語「例えば」も、限定することを意図していない。例えば、用語「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜を含むが、限定されない」を意味する。さらに、１つ以上の実施形態の記載が、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、ある特定の場合において、１つ以上の実施形態が、「〜から本質的になる」および／または「〜からなる」という言語を用いて代替的に記載されてもよいことを理解するだろう。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、提供された単位値の±１０％を指す。本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の程度の全体またはおおよその値を示す定性的な状態を指す。生物学の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、あるにしても、生物学的および化学的な組成物および材料の試験、製造および貯蔵に影響を与える多くの変数のため、また、生物学的および化学的な組成物および材料の試験、製造および貯蔵に使用される設備および装置に固有の誤差のため、絶対的な結果を達成するか、または避けることはまれであることが理解するだろう。従って、実質的という用語は、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全さが潜在的にないものを捕捉するために使用される。
【００２８】
本明細書に記載される本発明の配合物は、重量基準、例えば、重量％基準、またはモル濃度基準の成分濃度の観点で記載されてもよい。本発明は、これらの配合物の凍結乾燥した調製物も包含することが理解されるべきであり、適切な希釈剤（例えば、生理食塩水または水）で再構築される場合、投与または保存のために報告される濃度を有する。本明細書の範囲は、この範囲の終点を含む。
【００２９】
特に示されていない限り、パーセントという用語は、重量／体積パーセントを表し、温度は、摂氏スケールである。
【００３０】
（組成物の成分）
本発明のＦＶＴＩＩ組成物は、安定化剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、カルシウム塩を含んでいてもよく、有利には、他の賦形剤を含んでいてもよい。これらの賦形剤は、凍結乾燥した調製物および／または液体調製物中のＦＶＩＩＩの安定性を最大限にするために選択されている。
【００３１】
本組成物に使用される増量剤は、好ましくは、マンニトール、グリシンおよびアラニンからなる群から選択される。マンニトール、グリシン、またはアラニンは、１〜５％、２〜３％および２．２〜２．６％の量で存在していてもよい。グリシンは、選択された増量剤であってもよい。増量剤を含有しない組成物も想定される。
【００３２】
本組成物に使用される安定化剤は、糖類または糖アルコールからなる群から選択され、限定されないが、スクロース、マンニトール、デキストロース、グルコースおよびトレハロースからなる群から選択される。これらの薬剤は、組成物中に、０．５〜１０％、１〜８％、２〜７％、３〜６％、４〜５％、１〜５％、１〜４％、１〜３％、または１〜２％の量で存在する。増量剤を含有する組成物では、スクロースは、１〜３％の量で好ましい安定化剤である。増量剤を含まない組成物では、スクロースまたはトレハロースは、約８％の量で安定化剤として選択されてもよい。これらの糖類または糖アルコールは、細胞保護剤としても機能する。
【００３３】
それに加え、バッファーは、特定の本発明の組成物中に存在する。凍結乾燥中、ＦＶＩＩＩがｐＨ移動によって悪い影響を受け得ると考えられるため、バッファーは、例えば、凍結乾燥を受けるＦＶＩＩＩ配合物中で有用であろう。緩衝剤は、バッファーとして作用する能力を有する、生理学的に許容される化学物質または化学物質の組み合わせであってもよく、ヒスチジンおよびＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含む。ヒスチジンは、約２０ｍＭの量で選択される緩衝剤であってもよい。
【００３４】
ＦＶＩＩＩの活性を保存するために、本発明の組成物は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、その活性を維持することができるカルシウムまたは別の二価のカチオンも含んでいてもよく、おそらく、ＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖の会合を維持することによると思われる。１ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム塩を使用してもよい。カルシウム塩は、塩化カルシウムであってもよいが、他のカルシウム塩、例えば、グルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、またはグルセプチン酸カルシウムであってもよい。本発明のＦＶＩＩＩ組成物は、界面活性剤、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０、ポロキサマー１８４または１８８を含むポロキサマー、プルロニックポリオール（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の商標名ＰＬＵＲＯＮＩＣで販売される）および他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーからなる群から選択される非イオン性界面活性剤も含んでいてもよい。界面活性剤は、約８０ｐｐｍの量のポリソルベート８０であってもよい。
【００３５】
本組成物に使用されるＦＶＩＩＩは、生体適合性ポリマー、例えば、ＰＥＧに共有結合してもよい。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、相互に置き換え可能であり、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含む。ＰＥＧは、以下の構造「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−」を含み、（ｎ）は、２〜４０００である。本明細書で使用される場合、ＰＥＧは、末端酸素が置き換わっているかいないかに依存して、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」および「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」も含む。用語「ＰＥＧ」は、種々の末端基または「末端を保護する」基、例えば、限定されないが、ヒドロキシル基またはＣ１−２０アルコキシ基、例えば、メトキシを有する構造を含む。用語「ＰＥＧ」は、大部分の（つまり、５０％より多い）−ＯＣＨ２ＣＨ２−繰り返しサブユニットを含むポリマーも意味する。特定の形態に関し、ＰＥＧは、任意の種々の数の分子量および構造または幾何形状であってもよく、例えば、分枝鎖、線状、フォーク状および多官能であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「ＰＥＧ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、タンパク質のような分子に共有結合するプロセスを指す。官能基（例えば、生体適合性ポリマー）が活性化していると記載されている場合、この官能基は、別の分子上の求電子試薬または求核試薬と簡単に反応する。
【００３６】
本明細書に開示される接合体に使用される生体適合性ポリマーは、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で公知の任意のポリマーであってもよい。生体適合性ポリマーは、薬物動態において望ましい改良を与えるように選択される。例えば、ポリマーの属性、大きさおよび構造は、活性を受け入れられないほど低下させることなく、ＦＶＩＩＩの循環血中半減期を向上させるか、またはＦＶＩＩＩの抗原性を減らすように選択される。ポリマーは、ＰＥＧを含んでいてもよい。例えば、ポリマーは、末端を保護する部分、例えば、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケンオキシ、置換アルケンオキシ、アルキンオキシ、置換アルキンオキシ、アリールオキシおよび置換アリールオキシで末端が保護されたポリエチレングリコールであってもよい。ある実施形態では、ポリマーは、メトキシポリエチレングリコール、例えば、粒径が３ｋＤ〜２００ｋＤのメトキシポリエチレングリコールを含んでいてもよい。
【００３７】
ポリマーは、反応性部分を含んでいてもよい。例えば、ポリマーは、官能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の遊離システインと反応し、共有結合を生成することができるスルフヒドリル反応性部分を含んでいてもよい。このようなスルフヒドリル反応性部分としては、チオールトリフラート部分、トレシラート部分、アジリジン部分、オキシラン部分、Ｓ−ピリジル部分またはマレイミド部分が挙げられる。ポリマーは、直鎖であってもよく、片方の末端に、他の末端のスルフヒドリル（例えば、メトキシ）およびスルフヒドリル反応性部分と強反応性ではない「保護部」を含んでいてもよい。接合体は、粒径が５ｋＤ〜６４ｋＤのＰＥＧ−マレイミドを含んでいてもよい。または、ポリマーは、アミン反応性部分、例えば、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、ベンゾトリアゾールカーボネート、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、例えば、ピロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、アセタール、ピペリドン、メチルケトン、などを含んでいてもよい（例えば、米国特許第７，１９９，２２３号（Ｂｏｓｓａｒｄ）を参照）。
【００３８】
ＦＶＩＩＩ分子を、ＦＶＩＩＩの炭水化物部分に対するポリマーの接合によって生体適合性ポリマーに接合してもよい。米国特許出願公開第２０１１０１１２０２８号（Ｔｕｒｅｃｅｋら）を参照。ＦＶＩＩＩの酸化された炭水化物部分に水溶性ポリマーを接合することによって、ＦＶＩＩＩ分子を水溶性ポリマーに接合してもよい。水溶性ポリマーは、ある実施形態では、ＰＥＧ、ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）およびデキストランからなる群から選択される。さらに別の態様では、活性化された水溶性ポリマーは、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＳＡ−ヒドラジンおよびアルデヒド−活性化されたデキストランからなる群から選択される。本発明の別の態様では、炭水化物部分は、ＮａＩＯ４を含むバッファー中でインキュベートすることによって酸化される。
【００３９】
本発明で使用されるのに適したＦＶＩＩＩタンパク質は、特定の既知のアミノ酸配列と同一性を有する。例えば、本発明で使用するのに適したＦＶＩＩＩ改変体は、既知のＦＶＩＩＩアミノ酸配列、例えば、全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）またはＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号３）に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する改変体である。本発明では、既知のＦＶＩＩＩ配列に対し、定義される配列差を有する遺伝子改変体、例えば、ネイティブ配列、既知の配列またはコントロール配列、例えば、全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）またはＢＤＤ−ＳＱのアミノ酸配列（配列番号３）と比較したとき、アミノ酸配列において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜１０、１〜５、２〜６または３〜８の違いを有するアミノ酸配列を含むＦＶＩＩＩ分子も有用である。対立遺伝子改変体も本発明に有用である。ＦＶＩＩＩの対立遺伝子改変体の例は、米国特許出願公開第２０１０／０２５６０６２号（Ｈｏｗａｒｄら）；Ｈｏｗａｒｄら、「Ａｆｒｉｃａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｉｃ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｉｌｄｔｙｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ＦＶＩＩＩ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？」Ｂｌｏｏｄ、Ｖｏｌ．１０４、２００４、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３８４；およびＶｉｃｌ、Ｋ．Ｒら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ」、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．３６０、２００９、ｐｐ．１６１８−２７に開示される。対立遺伝子改変体としては、例えば、位置４８４でのアルギニンをヒスチジンに変える置換（Ｒ４８４Ｈ）、７７６位置でアルギニンをグリシンに変える置換（Ｒ７７６Ｇ）、１２４１位置でアスパラギン酸をグルタミン酸に変える置換（Ｄ１２４１Ｅ）および２２３８位置でメチオニンをバリンに変える置換（Ｍ２２３８Ｖ）を含め、アミノ酸置換を含むものが挙げられる。アミノ酸置換を示すために使用される番号付けシステムは、本明細書の配列番号２に基づく。
【００４０】
比較のためのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のアラインメント方法は、当該技術分野で周知である。本発明のアラインメントは、適切な方法によって、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所的な同一性アルゴリズム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いることによって測定されてもよく、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｉｍｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズム（ＧＡＰ）を用いることによって、またはＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）類似性を検索するための方法（ＴｆａｓｔａおよびＦａｓｔａ）を用いることによって、比較のための配列の最適なアラインメントを行ってもよい。アラインメントは、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行を用いて、限定されないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（マウンテンビュー、カリフォルニア）製のＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能（ＧＣＧ（登録商標）プログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ））の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを用いて行われてもよい。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５−６５（１９９２）およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）によく記載される。複数の配列の最適な全体的なアラインメントのために使用する１つのプログラムは、ＰｉｌｅＵｐ（ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、２５：３５１−６０（１９８７））であり、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−５３（１９８９）に記載される方法に似ている。ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを、例えば、他の適切なＦＶＩＩＩ分子を特定するためのデータベースの類似性検索に使用することができる。ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １９、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照。
【００４１】
上述のように、ＦＶＩＩＩのＢドメインは、活性に不必要であると考えられる。特定の実施形態では、本発明で使用されるＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部が欠損していてもよい。従って、本発明は、全長ＦＶＩＩＩ（配列番号１）のアミノ酸１〜７４０と少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列をコードし、全長ＦＶＩＩＩ（配列番号１）のアミノ酸１６８９〜２３５１と少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列をコードする、ＦＶＩＩＩ改変体またはこのような改変体をコードするヌクレオチド配列に適用される。または、本発明は、配列番号１の全長アミノ酸配列と少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列をコードする、ＦＶＩＩＩ改変体またはこのような改変体をコードするヌクレオチド配列に適用される。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、部位特異的突然変異の結果、例えば、ＦＶＩＩＩに対する結合部位を作成するか、または生体適合性ポリマー（例えばＰＥＧ）に共有結合するものであってもよい。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の部位特異的突然変異は、当該技術分野で公知の任意の方法によって行われてもよい。方法は、ポリマーに共有結合するために選択される部位にシステインコドンを導入するような突然変異誘発を含む。この突然変異誘発は、市販の部位特異的突然変異誘発キット、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  ＣＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ  ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ部位特異的突然変異誘発キット  Ｋ１６００−１番、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＧＥＮＴＡＹＬＯＲ部位特異的突然変異誘発システム  １２３９７０１４番、ＰＲＯＭＥＧＡ  ＡＬＴＥＲＥＤ  ＳＩＴＥＳ  ＩＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システムキット  Ｑ６２１０番、またはＴＡＫＡＲＡ  ＭＩＲＵＳ  ＢＩＯ  ＬＡ  ＰＧＲ突然変異誘発キットＴＡＫ  ＲＲ０１６番を用いて達成されてもよい。本明細書に記載される接合体は、最初に、官能性ＦＶＩＩＩポリペプチド表面の１つ以上のアミノ酸ためのコドンを、システインのためのコドンと交換し、組み換え発現系の中にシステイン変異体を作成し、変異体と、システイン特異的なポリマー試薬とを反応させ、ムテインを精製することによって調製されてもよい。この系では、システイン部位へのポリマーの付加は、ポリマー上のマレイミドに活性な官能基によって達成することができる。例えば、米国特許第７，６３２，９２１号（Ｐａｎら）を参照。
【００４３】
使用されるスルフヒドリル反応性ポリマーの量は、誘導体化されるシステインのモル量と少なくとも等モルであるべきであり、過剰に存在してもよい。５倍過剰または１０倍過剰のスルフヒドリル反応性ポリマーを使用してもよい。共有結合に有用な他の条件も、当該分野の技術の範囲内である。
【００４４】
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の共有結合のためにあらかじめ規定された部位は、ＦＶＩＩＩ活性に関与しないか、またはｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩを安定化させる他の機能（例えば、ｖＷＦに結合する）に関与する、ｒＦＶＴＩＩポリペプチドまたはＢＤＤ  ｒＦＶＩＩＩポリペプチドの表面に露出した部位から選択することができる。このような部位は、ＦＶＩＩＩが不活性化されるか、または循環から排出される機構に関与することが知られている部位からも、最もよく選択される。アミノ酸をシステインで置換する部位としては、（ａ）低密度リポタンパク質受容体に関連するタンパク質、（ｂ）硫酸ヘパリンプロテオグリカン、（ｃ）低密度リポタンパク質受容体および／または（ｄ）ＦＶＩＩＩ阻害活性のための結合部位またはこれらの部位付近のアミノ酸残基が挙げられる。「結合部位またはこれらの部位付近」とは、この部位に対する生体適合性ポリマーの共有結合によって、結合部位の立体障害が生じるような結合部位に十分に近い残基を意味する。このような部位は、例えば、結合部位の２０Å以内であると予想される。
【００４５】
生体適合性ポリマーは、ｒＦＶＩＩＩポリペプチドまたはＢＤＤ  ｒＦＶＩＩＩポリペプチド、またはこれらの変異改変体に、８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４の１つ以上のＦＶＩＩＩアミノ酸位置で共有結合してもよい。官能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の１つ以上の部位（例えば、１つまたは２つ）は、ポリマー接続のためにあらかじめ規定された部位であってもよい。具体的な実施形態では、ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されているか、またはジＰＥＧ化されており、このことは、１個のＰＥＧ分子または２個のＰＥＧ分子がそれぞれ、それぞれのＦＶＩＩＩに結合していることを意味する。
【００４６】
ＦＶＩＩＩ変異体の部位特異的なＰＥＧ化は、（ａ）変異体が、ＦＶＩＩＩ変異体の露出した表面にアミノ酸残基についてシステイン交換を有し、システインが保護されているような部位特異的ＦＶＩＩＩ変異体を発現し、（ｂ）システイン変異体を穏和に還元し、保護を放出するための条件で、システイン変異体と、還元剤とを接触させ；（ｃ）システイン変異体から保護および還元剤を除去し、（ｄ）還元剤を除去した後に、ＰＥＧ化されたＦＶｌｌｌムテインが生成するような条件で、システイン変異体を、スルフヒドリルカップリング部分を含むＰＥＧで処理することによって達成することもできる。ＰＥＧのスルフヒドリルカップリング部分は、チオール部分、トリフラート部分、トレシラート部分、アジリジン部分、オキシラン部分、Ｓ−ピリジル部分およびマレイミド部分からなる群から選択され、マレイミドであってもよい。
【００４７】
別の実施形態では、生体適合性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を、アミンに特異的な官能基で官能基化されたポリマーを使用することによって共有結合する。ポリマーは、例えば、ＦＶＩＩＩ上のリジンと反応性であるようなｍＰＥＧトレシラートまたはｍＰＥスクシンイミジルサクシネートで官能基化されてもよい。カップリングは、固体状態で活性化されたｍＰＥＧを、ＦＶＩＩＩの溶液に加え、室温で回転させることによって、ＦＶＩＩＩ上のランダムなリジンで起こり得る。改変度は、使用される活性化されたｍＰＥＧの過剰度によってゆるく制御されるだろう。Ｒｏｓｔｉｎら、「Ｂ−Ｄｏｍａｉｎ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ」１１  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２０００、ｐｐ．３８７−３９６。ＰＥＧ化の条件および試薬のさらなる例は、米国特許第７，１９９，２２３号（Ｂｏｓｓａｒｄ）および米国特許第４，９７０，３００号（Ｆｕｌｔｏｎ）に与えられる。本発明は、ＦＶＩＩＩに対し、生体適合性ポリマーを共有結合させるための方法にも関し、本発明の液体配合物の片方は溶液であり、この溶液内で反応が起こる。
【００４８】
本開示は、血友病Ａを処置することが必要な患者に、本明細書に記載される治療に有効な量の１つ以上の配合物を投与することを含む、患者の血友病Ａを処置する方法も提供する。これらの配合物は、静脈内注射、皮下注射によって、または連続的な注入によって患者に投与されてもよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、ｒＦＶＩＩＩ配合物またはＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩ配合物の「治療に有効な量」という用語は、治療効果を与えることが必要な患者に、投与計画で治療効果を与える配合物の量を指す。例えば、血友病Ａの代替治療のために、静脈内注射のために１０〜３０ＩＵ／ｋｇ（体重）の量の組み換え全長ＦＶＩＩＩが推奨される。血友病Ａを有する子供の予防のために、静脈内注射のために２５ＩＵ／ｋｇ（体重）の量の組み換え全長ＦＶＩＩＩが推奨される。血友病Ａを有する子供の予防のために、手術の前に、静脈内注射のために１５〜３０ＩＵ／ｋｇ（小さな手術）または５０ＩＵ／ｋｇ（大きな手術）の組み換え全長ＦＶＩＩＩが推奨される。本発明の配合物に使用される種々のＦＶＩＩＩ分子のための対応する投薬量は、当業者が決定することができる。好ましくは、本発明の治療用のＦＶＩＩＩ配合物は、単回使用で、１００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、または５０００ＩＵの投薬量で、これらの任意の２つの投薬量範囲で、すなわち、１００〜２５０ＩＵ、１００〜５００ＩＵ、１０００〜２０００ＩＵなどで提供されてもよく、終点を含む。これらが低粘度であるため、本明細書に開示されるｒＦＶＩＩＩ配合物およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＴＴ配合物は、例えば、超濾過および滅菌濾過によって簡便に処理することができ、静脈内注射、皮下注射および連続注入を含む注射によって患者に投与することができる。
【００５０】
本明細書に記載されるＦＶＩＩＩ組成物は、所定の濃度で凍結乾燥し、再構築することができる。これらのＦＶＩＩＩ組成物を、もっと希釈した形態で再構築することもできる。例えば、凍結乾燥され、および／または２ｍｌの溶液に通常のように再構築された本発明の調製物も、もっと大容積の希釈剤（例えば、５ｍｌ）に再構築することもできる。この場合には、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩのもっと希釈した溶液でもっと迅速に起こり得るような活性の喪失があまりないと考えられるため、特に、ＦＶＩＩＩ調製物が患者にすぐに注射される場合に適している。
【００５１】
（実施形態１）
組み換えＦＶＩＩＩは、血漿から誘導されるＦＶＩＩＩ（例えば、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎ因子（ｖＷＦ））を安定化する血漿タンパク質が存在しない状態で作られる。このような安定化するタンパク質が存在しないと、ｒＦＶＩＩＩがきわめて不安定になる。それに加え、ｒＦＶＩＩＩは、治療薬溶液に非常に低濃度で存在し（治療投薬量１０００ＩＵのＢＤＤ−ＳＱのために、１ｍｌあたり０．０２ｍｇのタンパク質）、表面吸着によって活性の低下を引き起こす。
【００５２】
本発明の一実施形態は、ｒＦＶＩＩＩ、特に、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、さらに特定的には、ドメイン（例えば、Ａ１ドメインと、Ａ２ドメインまたはＡ３ドメイン）の間が架橋したＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の配合物である。一実施形態では、配合物は、例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎらに対する米国特許第７，９２８，１９９号（２０１１年４月１９日に登録）に記載されるようなジスルフィド架橋によって、Ａ２ドメインと、Ａ１ドメインまたはＡ３ドメイン、好ましくは、Ａ２ドメインとＡ３ドメインを架橋する二重のシステイン突然変異を有するＦＶＩＩＩの配合物であり、限定されないが、ＦＶＩＩＩの変異体を含み、１つ以上のシステインが、１つ以上の部位に導入されたＢＤＤ  ＳＱ（配列番号３）の変異体を含み、その結果、少なくとも一対のシステインが、野生型ＦＶＩＩＩにはみられないジスルフィド結合を生成する。一実施形態では、変異体ＦＶＩＩＩは、少なくとも一対の組み換えによって導入されたシステインを含み、一対のシステインは、Ｍｅｔ  ６６２およびＡｓｐ  １８２８、Ｓｅｒ  ２６８およびＰｈｅ  ６７３、Ｈｅ  ３１２およびＰｒｏ  ６７２、Ｓｅｒ  ３１３およびＡｌａ  ６４４、Ｍｅｔ  ６６２およびＬｙｓ  １８２７、Ｔｙｒ  ６６４およびＴｈｒ  １８２６、Ｐｒｏ  ２６４およびＧｉｎ  ６４５、Ａｒｇ  ２８２およびＴｈｒ  ５２２、Ｓｅｒ  ２８５およびＰｈｅ  ６７３、Ｈｉｓ  ３１１およびＰｈｅ  ６７３、Ｓｅｒ  ３１４およびＡｌａ  ６４４、Ｓｅｒ  ３１４およびＧｉｎ  ６４５、Ｖａｌ  ６６３およびＧｌｕ  １８２９、Ａｓｎ  ６９４およびＰｒｏ  １９８０およびＳｅｒ  ６９５およびＧｌｕ  １８４４からなる群から選択される少なくとも一対の残基を置き換える。本実施形態の配合物に適したＦＶＩＩＩ分子は、溶液中で凝集し、および／または高い沈殿の傾向を示すという欠点がある。これらの欠点は、安定な治療投薬量を調製するときに問題となる。また、例えば、生体適合性ポリマー（例えばＰＥＧ）の共有結合によって、ＦＶＩＩＩ分子をさらに処理すべき場合、ＦＶＩＩＩ分子は、好ましくは、良好な処理を与え、例えば、ＰＥＧ化したときに良好な収率を与えるような溶液であり、ＦＶＩＩＩが懸濁物または溶液であり、懸濁しないことを必要とする。一実施形態では、本出願のＦＶＩＩＩ配合物は、沈殿および／または凝集を減らすか、または止め、安定性を与えるのに十分な量で塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有する。
【００５３】
実施形態１の配合物は、以下のとおりであってもよい。ｒＦＶＩＩＩ配合物は、
（ａ）約０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約０ｍＭ〜約２９ｍＭ、約１ｍＭ〜約２９ｍＭ、約１ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２９ｍＭ〜約５８ｍＭ、約３４ｍＭ〜約５８ｍＭ、約５８ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲、または約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または約３００ｍＭの量の糖または糖アルコール；
（ｃ）約１ｍＭ〜約２ｍＭ、約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン、例えば、二価のカルシウム塩（塩化カルシウムを含む）；
（ｄ）約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約１９０ｍＭ、約１７０ｍＭ〜約２５０ｍＭ；約２００ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１７０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１７０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１９０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約２１０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、または約２２０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、または約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤、または、約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２１０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２９３ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ；約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約２００ｍＭ〜約４００ｍＭの範囲のグリシン、または、約１００、２００、２１０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、２９３、２９５、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、または約４００ｍＭのグリシン；および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１２００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３５００、３８００、４０００、４２００、４５００、４８００、５０００、５５００、または６０００ＩＵ／ｍｌのｒＦＶＩＩｌ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体およびＦＶＩＩＩドメイン間に架橋を有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体から選択されるｒＦＶＩＩｌ
を含み、ｒＦＶＩＩｌ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５の範囲、またはｐＨが約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または約ｐＨ７．５である。
【００５４】
実施形態１の他の態様では、本発明は、
（ａ）約０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約１ｍＭ〜約２９ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２９ｍＭ〜約５８ｍＭ、または約３４ｍＭ〜約５８ｍＭの範囲、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｍＭの量の糖または糖アルコール；
（ｃ）約１ｍＭ〜約２ｍＭ、約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン、例えば、二価のカルシウム塩（塩化カルシウムを含む）；
（ｄ）約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１７０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、または約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤、または、約７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ；または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲、または約２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、２９３、２９５、３００、３１０、または約３２０ｍＭのグリシン；および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１２００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３５００、３８００、４０００、４２００、４５００、４６００、４８００、５０００、５５００、または６０００ＩＵ／ｍｌのＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体およびＦＶＩＩＩドメイン間に架橋を有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体から選択されるｒＦＶＩＩｌを含み、
ｒＦＶｌｌｌ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５の範囲であるか、またはｐＨが約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または約ｐＨ７．５である、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【００５５】
特定の実施形態では、糖または糖アルコールは、スクロースであり、塩化ナトリウムが存在する。
【００５６】
実施形態１の別の態様では、本発明は、
（ａ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２９ｍＭ〜約５８ｍＭ、または約３４ｍＭ〜約５８ｍＭの範囲の糖または糖アルコール；
（ｃ）約１ｍＭ〜約２ｍＭ、約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカルシウム塩（塩化カルシウムを含む）；
（ｄ）約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、約１７０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲のグリシン；および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１２００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３５００、３８００、４０００、４２００、４５００、４６００、４８００、５０００、５５００、または６０００ＩＵ／ｍｌのＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体およびＦＶＩＩＩドメイン間に架橋を有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体から選択されるｒＦＶＩＩｌを含み、
ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５の範囲であるか、またはｐＨが約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または約ｐＨ７．５である、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【００５７】
実施形態１のさらに別の態様では、本発明は、
（ａ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のスクロース；
（ｃ）約１．５ｍＭ〜約３．５ｍＭの範囲の塩化カルシウム；
（ｄ）約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭまたは約１７０ｍＭ〜約２２０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム；
（ｅ）約７０ｐｐｍ〜約９０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約２００ｍＭ〜約３００ｍＭまたは約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲のグリシン；および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌのＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体およびＦＶＩＩＩドメイン間に架橋を有するＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体から選択されるｒＦＶＩＩｌを含み、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５の範囲、またはｐＨが約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または約ｐＨ７．５である、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【００５８】
実施形態１のｒＦＶＩＩＩ配合物は、アルブミン、例えば、ＨＳＡを含んでいてもよい。特定の実施形態では、ＨＳＡは、約１０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１５〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約３０ｍｇ／ｍＬまたは約２５〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
【００５９】
（実施形態２）
ＦＶＩＩＩに対する生体適合性ポリマーの共有結合性付加の間、バッファー成分が共有結合性付加を妨害し得ることが観察された。例えば、ＦＶＩＩＩが、リジン残基に付加するようなアミン反応性基を有するように官能基化されたＰＥＧを用いてＰＥＧに共有結合した場合、反応バッファー中のアミン含有成分がこの反応を妨害することが観察された。従って、本発明は、ＦＶＩＩＩに対する付加反応が起こり得る液体ＦＶＩＩＩ配合物またはバッファーを改良したものを含む。実施形態２の一態様では、液体ＦＶＩＩＩ配合物は、ＦＶＩＩＩ以外の一級アミン基または二級アミン基を含む成分を含まないか、または１０重量％未満、または５重量％未満、または１重量％未満、または０．５重量％未満、またはわずか痕跡量のＦＶＩＩＩ以外の一級アミン基または二級アミン基を含む成分を含む。この実施形態の本発明のＦＶＩＩＩ配合物は、ヒスチジンおよびグリシンの使用を避ける配合物を含む。ヒスチジンおよびグリシンは、ＰＥＧ化プロセスを妨害し得るアミンを含有する。
【００６０】
本発明の実施形態２の一態様は、ｐＨ６〜７でバッファー能を有し、塩化カルシウム（重要なｒＦＶＩＩＩ安定化剤）との不溶性複合物またはキレートを生成せず、一級アミン基または二級アミン基を有する成分を含まないか、またはこのような成分を１０重量％以下、５重量％以下、１重量％以下の重量％で、または痕跡量含む、ｒＦＶＩＩＩの配合物である。この配合物は、ＭＯＰＳを１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１４ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１６ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１８ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜２８ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２８ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２６ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２２ｍＭの範囲で、１４ｍＭ〜２２ｍＭの範囲で、または１８ｍＭ〜２２ｍＭの範囲で含んでいてもよく、または、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍＭのＭＯＰＳを含んでいてもよい。この配合物は、ｒＦＶＩＩＩを約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約２５００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１２００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１５００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２５００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約１５００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約６０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲で含んでいてもよく、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３５００、３８００、４０００、４２００、４５００、４８００、５０００、５５００、６０００ＩＵ／ｍｌのｒＦＶＩＩＩを含んでいてもよい。本発明を、６０００ＩＵ／ｍｌより高い活性を有するｒＦＶＩＩＩ配合物と共に用いてもよいことも可能である。
【００６１】
実施形態２の一態様では、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、組み換えによって作られたＦＶＩＩＩまたはＢＤＤを含む。実施形態２の別の態様では、配合物は、組み換えによって作られた全長ＦＶＩＩＩ、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＶＩＩＩ、またはその対立遺伝子改変体を含む。実施形態２の別の態様では、配合物は、ＢＤＤの変異体またはＦＬ−ＦＶＩＩＩの変異体を含む。
【００６２】
この配合物は、糖または糖アルコール（例えば、スクロース）も、０．５重量％〜１０重量％の範囲で、０．６重量％〜１０重量％の範囲で、０．７重量％〜１０重量％の範囲で、０．８重量％〜１０重量％の範囲で、０．９重量％〜１０重量％の範囲で、１．０重量％〜１０重量％の範囲で、０．６重量％〜５重量％の範囲で、０．６重量％〜２．５重量％の範囲で、０．６重量％〜２．０重量％の範囲で、０．６重量％〜１．５重量％の範囲で、０．６重量％〜１．２重量％の範囲で、０．８重量％〜１．２重量％の範囲で、０．９重量％〜１．２重量％の範囲で、または０．９重量％〜１．１重量％の範囲で、または約０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０重量％の量で含んでいてもよい。この配合物は、二価のカチオン（例えば、カルシウム塩、例えば、塩化カルシウム）を０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で、１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で、１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、２ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、２．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、３ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、３．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、４ｍＭ〜５ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜４．５ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜４ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜３．５ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜３ｍＭの範囲で、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの範囲で、２ｍＭ〜３ｍＭの範囲で、２．２ｍＭ〜２．８ｍＭの範囲で、または２．４ｍＭ〜２．６ｍＭの範囲で含んでいてもよい。この配合物は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムも、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、１５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、３０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、１５ｍＭ〜４５ｍＭの範囲で、１５ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、１５ｍＭ〜３５ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜４５ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜３５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、または３０ｍＭ〜３５ｍＭの範囲で含んでいてもよい。この配合物は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を、５０〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１４０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１２０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍの範囲で含んでいてもよい。この組成物は、溶液状態のｒＦＶＩＩＩに許容される安定性を与え、アミン残基で活性であるように官能基化されたポリマーを用い、ＦＶＩＩＩに対するポリマーの共有結合の間、反応バッファーとして使用することができる。
【００６３】
実施形態２の一態様では、本発明は、
（ａ）１２ｍＭ〜２８ｍＭの範囲、１２ｍＭ〜２２ｍＭの範囲、または１８ｍＭ〜２２ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；
（ｂ）１００ＩＵ／ｍｌ〜３０００ＩＵ／ｍｌの範囲、または１０００〜１５００ＩＵ／ｍｌの範囲のＦＶＩＩＩ；
（ｃ）０．５％〜５％の範囲、０．６％〜２．５％の範囲、または０．９％〜１．１％の範囲のスクロース；
（ｄ）１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲、１５ｍＭ〜３５ｍＭの範囲、または２５ｍＭ〜３５ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）１ｍＭ〜５ｍＭの範囲、１．５ｍＭ〜３．５ｍＭの範囲、または２．４ｍＭ〜２．６ｍＭの範囲の二価のカルシウム塩、例えば、塩化カルシウム；および
（ｆ）６０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲、または約７０ｐｐｍ〜９０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０
を含み、ｒＦＶＩＩＩ配合物が、一級アミン基または二級アミン基を含む成分を１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、または痕跡量未満含むか、または本質的に含まない、ｒＦＶＩＩＩ配合物に関する。
【００６４】
本発明は、実施形態２のｒＦＶＩＩＩ配合物にＦＶＩＩＩを懸濁または溶解させ、アミン−反応性ポリマーを加え、得られた混合物を、接合が起こる時間条件および温度条件でインキュベートすることを含む、ＦＶＩＩＩに対し、アミン−反応性生体適合性ポリマー（例えば、アミン−反応性ＰＥＧ）を接合する方法にも関する。このような状態は、好ましくは、ほぼ周囲温度である。ポリマーを、ＦＶＩＩＩに対して過剰モル量で（１〜１００倍過剰で）加えてもよい。ポリマーおよびＦＶＩＩＩを、回転または攪拌しつつ、一緒に数時間インキュベートすることによって接合してもよい。
【００６５】
上の実施形態２の配合物は、アミン反応性官能基が関与する重付加中、反応バッファーとして有用であることが示されたが、この配合物が、このような反応からはずれた他の内容で有用であることも推定され、従って、この配合物を、安定なＦＶＩＩＩ配合物が必要な場合に使用してもよい。
【００６６】
（実施形態３）
実施形態３では、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ＮａＣｌ、ＭＯＰＳ、二価のカルシウムイオン、または別の二価のカチオンを含み、非イオン性界面活性剤および／または糖または糖アルコールを含んでいてもよい。実施形態３の配合物は、特に、生体適合性ポリマーに接合していないＦＶＩＩＩ分子、例えば、ＰＥＧに共有結合しておらず、野生型ＦＶＩＩＩ中に存在するグリカン以外の任意のポリマーに共有結合していないＦＶＩＩＩの凝集が起こらない保存を与えることが示される。実施形態３の配合物は、ＰＥＧ化されていないＢＤＤに特に適している。本明細書で使用される場合、「接合していないＦＶＩＩＩ」は、ＦＶＩＩＩが産生する宿主細胞から得られるネイティブ哺乳動物グリコシル化パターンと関係があるグリカン以外のポリマーに接合していないＦＶＩＩＩを指す。例えば、「接合していないＦＶＩＩＩ」は、宿主細胞（例えば、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞、例えば、上市されているＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）およびＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）ＦＶＩＩＩ）中で組み換えによって作られた野生型ヒトＦＶＩＩＩを含む。
【００６７】
本明細書に記載される組成物の実施形態３の一態様は、ＦＶＩＩＩに安定性を与え、塩化ナトリウムを、１５０ｍＭ〜３００ｍＭ、１５０ｍＭ〜２７５ｍＭ、１５０ｍＭ〜２５０ｍＭ、１５０ｍＭ〜２２５ｍＭ、１５０ｍＭ〜２００ｍＭ、１５０ｍＭ〜１７５ｍＭ、１７５ｍＭ〜３００ｍＭ、１７５ｍＭ〜２７５ｍＭ、１７５ｍＭ〜２５０ｍＭ、１７５ｍＭ〜２２５ｍＭ、１７５ｍＭ〜２００ｍＭ、１７５ｍＭ〜１９０ｍＭ、２００ｍＭ〜３００ｍＭ、２００ｍＭ〜２７５ｍＭ、２００ｍＭ〜２５０ｍＭ、２００ｍＭ〜２２５ｍＭ、２００ｍＭ〜２１０ｍＭ、２５０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲で、または約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００ｍＭの量で含む組成物である。組成物は、ＭＯＰＳバッファーも、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１４ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１６ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１８ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２８ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２６ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、１６ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、１８ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、または１８ｍＭ〜２２ｍＭの範囲で含む。組成物は、二価のカチオン、例えば、塩化カルシウムも、１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で、５ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で、１ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、６ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、７ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、８ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で、５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲で、または９ｍＭ〜１２ｍＭの範囲で含む。実施形態３の配合物中に存在するｒＦＶＩＩＩの量は、実施形態１で与えられる量と同じであってもよい。
【００６８】
組成物は、糖または糖アルコール、例えば、スクロースも、０．５％〜１０％の範囲で、０．６％〜１０％の範囲で、０．７％〜１０％の範囲で、０．８％〜１０％の範囲で、０．９％〜１０％の範囲で、１．０％〜１０％の範囲で、０．５％〜５％の範囲で、０．６％〜５％の範囲で、０．７％〜５％の範囲で、０．８％〜５％の範囲で、０．９％〜５％の範囲で、１．０％〜５％の範囲で、０．５％〜２．５％の範囲で、０．６％〜２．５％の範囲で、０．５％〜２．０％の範囲で、０．５％〜１．５％の範囲で、０．６％〜１．２％の範囲で、０．８％〜１．２％の範囲で、０．９％〜１．２％の範囲で、または０．９％〜１．１％の範囲で含んでいてもよい。組成物は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０も、２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲で、５０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲で、５０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１４０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１２０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１０５ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、または９０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で含んでいてもよい。
【００６９】
実施形態３の特定の態様では、ＦＶＩＩＩ配合物は、ヒスチジンおよび／または（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（「ＨＥＰＥＳ」）および／またはアルブミンを含まないか、または０．１重量％未満、０．５重量％未満、０．８重量％未満、１．０重量％未満、または５．０重量％未満のヒスチジン、および／またはＨＥＰＥＳ、および／またはアルブミンを含んでいてもよい。実施形態３の一態様は、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳおよびアルブミンを本質的に含まないＦＶＩＩＩ配合物である。
【００７０】
（実施形態４）
ポリマーが接合したＦＶＩＩＩ、例えば、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩは、対応する接合していないＦＶＩＩＩよりも親水性が高いだろう。従って、接合したＦＶＩＩＩ、例えば、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩのための配合物は、接合していないＦＶＩＩのために特定されたものとは異なる成分を必要とする場合がある。出願人らは、高いレベルのＮａＣｌ（２００ｍＭ）を含有するバッファー中、ＰＥＧ化したＦＶＩＩＩを調製した。このような高いレベルの塩化ナトリウムは、凍結乾燥中に困難さを与えることが観察された。出願人らは、周囲温度で６日間保存したとき、望ましくない高いレベルのＮａＣｌを避け、凝集物の生成を避け、ＦＶＩＩＩの効力を実質的に保持する、ポリマーが接合したＦＶＩＩＩのための本発明の組成物を開発した。本出願は、塩化ナトリウム濃度を２００ｍＭから５０ｍＭまで減らすことができ、周囲温度で保存した後、依然としてｒＦＶＵＩの有効性を達成するという予想されない結果を提供する。実施形態４では、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、バッファー、例えば、ヒスチジンまたはＭＯＰＳ、ＮａＣｌ、二価のカルシウムイオンまたは別の二価のカチオンを含み、非イオン性界面活性剤および／または糖または糖アルコールを含んでいてもよい。実施形態４の配合物は、特に、生体適合性ポリマー（特に、ＰＥＧのような親水性生体適合性ポリマー）に接合していないＦＶＩＩＩ分子の凝集が起こらない保存を与えることが示される。本明細書で使用される場合、「接合したＦＶＩＩＩ」は、ＦＶＩＩＩが産生する宿主細胞から得られるネイティブ哺乳動物グリコシル化パターンと関係があるグリカン以外のポリマーに接合したＦＶＩＩＩを指す。
【００７１】
本明細書に記載される実施形態４の一態様は、塩化ナトリウムを２５ｍＭ〜２００ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜１７５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜１２５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜７５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、４０ｍＭ〜５５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜３５ｍＭの範囲で、２５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、３０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲で、５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲で、５０ｍＭ〜１７５ｍＭの範囲で、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲で、５０ｍＭ〜１２５ｍＭの範囲で、５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、または５０ｍＭ〜７５ｍＭの範囲で含有するｒＦＶＩＩＩ組成物である。配合物を凍結乾燥させる場合、上に提供されたものからの低いレベルのＮａＣｌが好ましい。実施形態４の配合物中に存在するｒＦＶＩＩＩの量は、実施形態１で提供されるのと同じ値であってもよい。
【００７２】
組成物は、緩衝剤、例えば、ヒスチジンまたはＭＯＰＳバッファーも、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１４ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１６ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１８ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２８ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２６ｍＭの範囲で、１２ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、１６ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、１８ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、２０ｍＭ〜２４ｍＭの範囲で、または１８ｍＭ〜２２ｍＭの範囲で含む。組成物は、二価のカチオン、例えば、塩化カルシウムも、１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で、５ｍＭ〜１０ｍＭの範囲で、１ｍＭ〜３０ｍＭの範囲で、６ｎＭ〜３０ｍＭの範囲で、７ｎＭ〜３０ｍＭの範囲で、８ｎＭ〜３０ｍＭの範囲で、５ｎＭ〜２０ｍＭの範囲で、５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲で、または９ｍＭ〜１２ｍＭの範囲で含む。
【００７３】
組成物は、糖または糖アルコール、例えば、スクロースまたはトレハロースも、０．５％〜１０％の範囲で、０．６％〜１０％の範囲で、０．７％〜１０％の範囲で、０．８％〜１０％の範囲で、０．９％〜１０％の範囲で、１．０％〜１０％の範囲で、０．５％〜５％の範囲で、０．６％〜５％の範囲で、０．７％〜５％の範囲で、０．８％〜５％の範囲で、０．９％〜５％の範囲で、１．０％〜５％の範囲で、０．５％〜２．５％の範囲で、０．６％〜２．５％の範囲で、０．５％〜２．０％の範囲で、０．５％〜１．５％の範囲で、０．６％〜１．２％の範囲で、０．８％〜１．２％の範囲で、０．９％〜１．２％の範囲で、または０．９％〜１．１％の範囲で含んでいてもよい。組成物は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０も、２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲で、５０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲で、５０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜１５０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１４０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１２０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で、６０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１０５ｐｐｍの範囲で、７０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、８０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で、または９０ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍの範囲で含んでいてもよい。
【００７４】
実施形態４の特定の態様では、ＦＶＩＩＩ配合物は、ヒスチジンおよび／またはＨＥＰＥＳおよび／またはアルブミンを含まないか、または０．１％未満、０．５％未満、０．８％未満、１．０％未満、または５．０重量％未満のヒスチジン、および／またはＨＥＰＥＳ、および／またはアルブミンを含有する。実施形態３の一態様は、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳおよびアルブミンを本質的に含まないＦＶＩＩＩ配合物である。
【００７５】
（実施形態５）
本発明は、凍結乾燥に適したｒＦＶＩＩＩ配合物も含む。この実施形態の特定の態様では、ＦＶＩＩＩ配合物は、接合されたＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ化されたＦＶ１１１、ＰＥＧ化されたＢＤＤ、またはＰＥＧ化されたＢＤＤ変異体の凍結乾燥に特に適している。この実施形態のｒＦＶＩＩＩ配合物は、（１）塩化ナトリウム、および／またはスクロース、および／またはトレハロース、（２）グリシンおよび／またはスクロースおよび／またはトレハロース；および（３）二価のカチオン、例えば、塩化カルシウムを含み、（１）非イオン性界面活性剤、および／または（２）ヒスチジンを含んでいてもよく、ＮａＣｌが存在する場合、限定されないが、スクロースおよび／またはトレハロースを含む糖または糖アルコールも含んでいてもよい。
【００７６】
本発明は、以下のような実施形態５の配合物を含む。ｒＦＶＩＩＩ配合物は、
（ａ）約０ｍＭ、または約ｌｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）０．５％〜２０％の範囲、１．０％〜２０％の範囲、０．６％〜１０％の範囲、０．７％〜１０％の範囲、０．８％〜１０％の範囲、０．９％〜１０％の範囲、１．０％〜１０％の範囲、０．５％〜５％の範囲、０．６％〜５％の範囲、０．７％〜５％の範囲、０．８％〜５％の範囲、０．９％〜５％の範囲、１．０％〜５％の範囲、０．５％〜２．５％の範囲、０．６％〜２．５％の範囲、０．５％〜２．０％の範囲、０．５％〜１．５％の範囲、０．６％〜１．４％の範囲、０．８％〜１．４％の範囲、０．９％〜１．２％の範囲、３．０％〜９．０％の範囲、５．０％〜９．０％の範囲、６．０％〜８．０％の範囲、７．０％〜９．０％の範囲、または０．９％〜１．１％の範囲、または約１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１２．０％、または１５．０％のスクロースまたはトレハロース；
（ｃ）約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２．５ｍＭの範囲の二価のカチオン、例えば、二価のカルシウム塩（塩化カルシウムを含む）；
（ｄ）約０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム；
（ｅ）約０ｍＭ、または約２０ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ、または約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤、または約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約０％、または約１．０％〜約５．０％の範囲、約１．０％〜約４．０％の範囲、約１．０％〜約３．０％の範囲、約１．０％〜約２．０％の範囲、約１．０％〜約１．５％の範囲、約１．０％〜約１．４％の範囲、約０．５％〜約５．０％の範囲、約０．５％〜約４．０％の範囲、約０．５％〜約３．０％の範囲、約０．５％〜約２．０％の範囲、約０．５％〜約１．５％の範囲のグリシン、または約１．５％、１．８％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．３％、３．５％、または４．０％のグリシン、および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１２００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約２５０ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約３０００ＩＵ／ｍｌ、約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約４０００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３５００、３８００、４０００、４２００、４５００、４６００、４８００、５０００、５５００、または６０００ＩＵ／ｍｌのｒＦＶＩＩＩを含み；
ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．５の範囲であるか、またはｐＨが、約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４または約ｐＨ７．５である。
【００７７】
実施形態５の一態様では、ｒＦＶＩＩＩ配合物は、塩化ナトリウムを含み２．０％未満のスクロースを含有するか、または０．５％〜２．０％の範囲のスクロースを含有し、１．０％未満、０．５％未満、０．１％未満のトレハロースを含有するか、またはトレハロースを含有しない。この態様では、ＮａＣｌは、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約８０ｍＭの塩化ナトリウムの範囲で存在していてもよい。実施形態５のこの態様では、グリシンは、約１．０％〜約５．０％の範囲、約１．０％〜約４．０％の範囲、約１．０％〜約３．０％の範囲、約１．０％〜約２．０％の範囲、約１．０％〜約１．５％の範囲、約１．０％〜約１．４％の範囲、約０．５％〜約５，０％の範囲、約０．５％〜約４．０％の範囲、約０．５％〜約３．０％の範囲、約０．５％〜約２．０％の範囲、約０．５％〜約１．５％の範囲で存在するか、または、約１．５％、１．８％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．３％、３．５％、または４．０％で存在し、スクロースは、０．５％〜５％の範囲、０．６％〜５％の範囲、０．７％〜５％の範囲、０．８％〜５％の範囲、０．９％〜５％の範囲、１．０％〜５％の範囲、０．５％〜２．５％の範囲、０．６％〜２．５％の範囲、０．５％〜２．０％の範囲、０．５％〜１．５％の範囲、０．６％〜１．４％の範囲、０．８％〜１．４％の範囲、０．９％〜１．２％の範囲、または０．９％〜１．１％の範囲で存在するか、または、約１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、３．０％、４．０％のスクロースが存在する。実施形態５のこの態様では、ヒスチジンは、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲で存在し、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０は、約２０ｐｐｍ〜約５０ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、約８０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ、または約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの非イオン性界面活性剤の範囲で存在するか、または、約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｐｐｍで存在する。実施形態５のこの態様では、トレハロースは、１．０重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満存在するか、存在しない。
【００７８】
実施形態５の別の態様では、塩化ナトリウムは、１．０重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満存在するか、または存在しない。この態様では、スクロースまたはトレハロースは、０．５％〜２０％の範囲、１．０％〜２０％の範囲、０．６％〜１０％の範囲、０．７％〜１０％の範囲、０．８％〜１０％の範囲、０．９％〜１０％の範囲、１．０％〜１０％の範囲、３．０％〜９．０％の範囲、％、５．０％〜９．０％の範囲、６．０％〜８．０％の範囲、または７．０％〜９．０％の範囲、または約５．０％、６．０％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、または１２．０％で存在する。実施形態５のこの態様では、グリシンは、１．０重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％存在するか、または存在しない。
【００７９】
本開示の態様は、以下の実施例の観点でさらに理解されてもよく、以下の実施例は、本教示の範囲をいかなる様式にも限定すると解釈すべきではない。
【００８０】
［実施例］
［実施例１］
塩化ナトリウム、ポリソルベート８０およびヒト血清アルブミンが、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩタンパク質の溶解度および安定性に与える影響
塩化ナトリウムの影響
ＦＶＩＩＩの異なるドメイン間の少なくとの１つのジスルフィド結合の生成によってＦＶＩＩＩの安定化を可能にするシステイン残基が導入されたＢＤＤ変異体について、試験を行った。特に、ＢＤＤ−ＳＱ（配列番号３）をＴｙｒ６６４Ｃｙｓ：Ｔｈｒｌ８２６Ｃｙｓで変異させ、この実施例で使用するＣ６６４−ＢＤＤ変異体を作成した。調製方法については、米国特許第７，９２８，１９９号（Ｇｒｉｆｆｉｎら）を参照。Ｃ６６４−ＢＤＤ変異体を、ヒスチジンを含有するバッファー中で配合し、許容されないレベルの沈殿が観察された。
【００８１】
試験を行い、Ｃ６６４−ＢＤＤ変異体をヒスチジンバッファーに入れたときに観察された沈殿が逆戻りするかどうかを決定した。沈殿が観察されたバッファー溶液は、２０ｍＭのヒスチジン、３０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭの塩化カルシウム、２９ｍＭのスクロース、２９３ｍＭのグリシンおよび８０ｐｐｍのポリソルベート８０を含んでいた。Ｃ６６４  ＢＤＤ変異体は、１４５ＩＵ／ｍｌで存在した。この試験の目的は、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体を安定化させる配合物を開発することであった。変異体の溶解度を高めるか、またはタンパク質の凝集を減らすことによって安定性を高めるために、可溶化剤および安定化剤、例えば、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を試験した。結果を図２〜６に示す。図２および図５の両方に示される実験は、ＮａＣｌ濃度の変更を含んでおり、それぞれの場合の結果は、約１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液と比較した場合、３０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液から、顕著な濁度の低下を示した。この試験は、塩化ナトリウム濃度が増加するにつれて、変異体を含む溶液の濁度が低下することを確立し、このことは、塩化ナトリウムが、沈殿プロセスを逆戻りさせることを示唆している。塩化ナトリウム濃度が１７６ｍＭ以上である場合、濁った溶液が透明溶液に変化し、濁度は、０．１６９から０．０２９に低下し、Ａ３４０ｎｍ測定に基づいて、８０％を超えている（図２）。これらの結果は、塩化ナトリウムが、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の有効な可溶化剤であり、その沈殿を逆戻りさせることができることを示した。まとめると、塩化ナトリウム濃度が大きくなると、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体の溶解度が向上した。表２は、好ましい配合物を示す。表２の「ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ変異体」は、Ｔｙｒ６６４Ｃｙｓ：Ｔｈｒ１８２６Ｃｙｓで変異したＢＤＤ−ＳＱの配合物を指す。表２の「全長ｒＦＶＩＩＩ」は、配列番号２のアミノ酸（全長ＦＶＩＩＩ）を有するＦＶＩＩＩの配合物を指す。
【表１】
2016518321.tif 000003
2016518321.tif 000004
【００８２】
［実施例２］
ランダムリジンカップリングによるｒＦＶＩＩＩ  ＰＥＧ化のための配合物の開発
ランダムリジンカップリングを用い、ＰＥＧポリマーを、配列番号１の全長ｒＦＶＩＩＩに接合した。この種のカップリングでは、反応性基は、主に、タンパク質中のＮ末端アミンまたはリジンのε−アミノ基である。配合物中の他の一級アミン基または二級アミン基が、反応を妨害するだろう。多くの全長およびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ配合物は、アミノ酸、例えば、グリシンおよびヒスチジンを含み、これらの分子のＰＥＧ化のために新しい配合物が開発された。グリシンを全長ｒＦＶＩＩＩ配合物中の増量剤として使用し、ＰＥＧ化中に除外することができたが、ヒスチジンは、バッファー成分として機能し、別のバッファーと置き換えることが必要であった。
【００８３】
適切なバッファー系は、以下の基準を満たす。（１）ｐＨ６〜７でバッファー能を与える；（２）塩化カルシウム（重要なｒＦＶＩＩＩ  安定化剤）と不溶性複合体またはキレートを生成しない；および（３）一級アミン基または二級アミン基を含まない。
【００８４】
ｒＦＶＩＩＩのランダムＰＥＧ化のために、いくつかの一般的に使用されるバッファーが考慮された。表３に示されるように、わずか２種類のバッファー系であるトリ−エタノールアミン（「ＴＥＡ」）およびＭＯＰＳを、さらなる観察のために選択した。
【表２】
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2016518321.tif 000006
【００８５】
この試験のために、表４に列挙した配合物に対し、全長ｒＦＶＩＩＩを透析した。３種類の配合物中で透析したｒＦＶＩＩＩを、４０℃（図７）または２５℃（図８）に置き、促進された状態で安定性を確立し、結果を図７および図８に示す。
【表３】
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【００８６】
［実施例３］
ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのためのＰＥＧ化
ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ配合物は、その凝集傾向のため、問題がある。従って、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩのための配合物を設計することに伴う目的の１つは、溶液中での安定性を確保することであった。ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのための作業配合物は、２００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＭＯＰＳ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｐｐｍのポリソルベート８０および２９ｍＭのスクロースを含んでいた。２００ｍＭの塩化ナトリウムは、凍結乾燥中に困難さを付与するだろう。従って、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの溶解度および有効性を、５０〜２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム濃度の関数として評価した。
【００８７】
この試験に使用するためのバッファー組成を表５に示し、データを図１０および図１１にまとめている。この実施例で使用されるＰＥＧ化されたＢＤＤは、ＰＥＧが付加される遊離システインを作成するための１つのアミノ酸突然変異を有する配列番号３のアミノ酸配列を含んでいた。このことは、図９にグラフで示されている。ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは、５０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む配合物中で、２３℃で６日間保存している間、８７％を超える有効性を保持していた。ＰＥＧ化されていないＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは、２３℃で６日間保存している間、同じ配合物中で７０％の有効性を保持していた。両方の分子がこの試験中可溶性のままであり、沈殿または不透明性の目に見える検出はなかった。これらのデータおよび以前のデータは、１００ｍＭの塩化ナトリウムをさらなる配合物研究のために使用することができることを示唆している。
【表４】
2016518321.tif 000008
【００８８】
塩化ナトリウムが、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化されていないＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの溶解度および凝集に与える影響を観察した。
【００８９】
２５ｍＭ、５５ｍＭ、７５ｍＭ、１２５ｍＭおよび２００ｍＭの塩化ナトリウムを含むＭＯＰＳバッファー中、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのＵＶ吸収は、試験したすべての塩化ナトリウム濃度で、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの散乱を示さず、このことは凝集がないことを示唆している。対照的に、ＰＥＧ化されていないｒＦＶＩＩＩは、２５ｍＭ、５５ｍＭおよび７５ｍＭの塩化ナトリウムでかなりの散乱を示し、おそらくこれは可溶性凝集物の生成に起因するものであろう。塩化ナトリウム濃度を１２５ｍＭおよび２００ｍＭまで上げると、散乱は観察されなかった。従って、塩濃度を高くすると、凝集物の生成が妨げられると結論づけられた。
【００９０】
［実施例４］
ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのための凍結乾燥配合物の開発
ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの凍結乾燥のために、４種類の候補配合物をスクリーニングした。この実施例で使用されるＰＥＧ化されたＢＤＤは、ＰＥＧが付加される遊離システインを作成するための１つのアミノ酸突然変異を有する配列番号３のアミノ酸配列を含んでいた。その目的は、これらの配合物中の凍結乾燥した薬物製品の安定性を評価することと、重要な安定性試験のための配合物を選択することであった。スクリーニングされた配合物は、（１）ＰＥＧ化されていない全長ｒＦＶＩＩＩについて成功した配合物Ａ、（２）配合物Ａと比較して、固体含有量が高い配合物Ｂ、（３）配合物Ａに使用したＮａＣｌの代わりにスクロースを含む配合物Ｃ、および（４）配合物Ａに使用したＮａＣｌの代わりにトレハロースを含む配合物Ｄであった。最後の２つの配合物は、凍結乾燥した薬物製品のためのアモルファスマトリックスをもたらした。
【００９１】
３種類の保存温度（５℃、２５℃および４０℃）で安定性を評価した。表６は、安定性評価に用いられるＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの配合物組成を示す。
【００９２】
スクロースおよびグリシンの濃度は、配合物Ａで２９ｍＭから２９３ｍＭまで増加し、配合物Ｂで３８ｍＭから３４６ｍＭまで増加した。凍結乾燥したケーキの機械強度を高め、最終的な薬物製品の外観を向上させるために、さらなる固形分を加えた。
【表５】
2016518321.tif 000009
【００９３】
配合物ＣおよびＤは、他の２つの配合物と比較して、代替的なマトリックスを与えるように設計された。配合物ＡおよびＢは、凍結乾燥すると、構造安定性および増量剤としての塩化ナトリウムおよびグリシンの存在に起因して、結晶性マトリックスを生成した。スクロースおよびトレハロースの濃度は、それぞれ、塩化ナトリウムおよびグリシンを含む代わりに、２３４ｍＭおよび２１１ｍＭまで増加した。これにより、凍結乾燥した薬物製品のためのアモルファスマトリックスを得た。
【００９４】
それぞれの４種類の候補配合物のための安定性プログラムは、２６週間に設定された。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる有効性、含水量、高分子量（ＨＭＷ）不純物の割合および製品から放出された不純物の合計によって、安定性を評価した。４種類の配合物のための有効性回収データを図１２〜１５にまとめている。
【００９５】
４種類の配合物のためのＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒによる有効性回収度、含水量のデータ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集物の割合および生成物に関連する不純物の合計（２６週間目に試験した）は、この４種類の配合物でｒＦＶＩＩｌが安定であることを示す。
【００９６】
配合物ＡおよびＢを用い、ＰＥＧ化されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの安定性をさらに評価した（配合物の組成については、表６を参照）。２つの薬物製品のロットを実験室スケールで調製し、安定性について、５℃、２５℃および４０℃に置いた。色素生成アッセイによる有効性、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる高分子量不純物の割合および生成物に関連する不純物の合計、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒによる水分を薬物製品の安定性評価に使用した。配合物Ａに使用される成分の目標濃度および範囲を表７に示す。
【表６】
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【００９７】
これらのデータは、２つの配合物において匹敵する薬物製品安定性を示した。配合物Ａを用いた試験は３０ヶ月まで続き、一方、配合物Ｂを用いた試験は、３ヶ月で終了した（それぞれ、図１６および１７）。図１８および１９のｒＦＶＩＩＩ濃度は、４００ＩＵ／ｍｌであった。
【００９８】
配合物Ａをさらなる開発のために選択し、２００ＩＵ／ｍｌおよび１２００ＩＵ／ｍｌの濃度のＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩｌを用いて試験した。２００ＩＵ／ｍｌおよび１２００ＩＵ／ｍｌでの有効性プロフィールを、それぞれ図１８および図１９に示す。このデータは、配合物Ａが、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩについて継続した安定性を与えることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月12日(2015.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｂ）約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｃ）約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、
少なくとも一対のシステイン残基が野生型ＦＶＩＩＩにはみられないジスルフィド結合を生成するために、ｒＦＶＩＩＩは配列番号３のアミノ酸配列中の１つ以上の非システイン残基がシステイン残基と置き換わったアミノ酸配列を含み、
ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項２】
（ａ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の糖または糖アルコール；および
（ｃ）約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの範囲のグリシンをさらに含む、請求項１に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項３】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；
（ｂ）０．５重量％〜１０重量％の糖または糖アルコール；
（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｄ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；
（ｅ）５０〜１５０ｐｐｍの非イオン性界面活性剤；および
（ｆ）約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約１５００ＩＵ／ｍｌの範囲のｒＦＶＩＩＩを含み、
ｒＦＶＩＩＩ配合物が、ｒＦＶＩＩＩ以外の一級アミン基または二級アミン基を有する成分を５．０重量％未満含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項４】
ヒスチジンおよびグリシンを本質的に含まない、請求項３に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項５】
生体適合性ポリマーにｒＦＶＩＩＩを共有結合させるための方法であって、
（ａ）請求項３または４に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物を得ることと；
（ｂ）ｒＦＶＩＩＩ上のアミン基と反応性の化学部分で官能基化されたポリマーを加え、反応混合物を作成することと；
（ｃ）ｒＦＶＩＩＩに対するポリマーの共有結合が起こるような時間条件および温度条件で、反応混合物をインキュベートすること
とを含む、方法。
【請求項６】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳ；
（ｂ）１５０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；
（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合していないｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項７】
（ａ）０．５％〜１０％の範囲の糖または糖アルコール；および
（ｂ）２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項６に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項８】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のＭＯＰＳまたはヒスチジン；
（ｂ）２５ｍＭ〜２００ｍＭの範囲のＮａＣｌ；
（ｃ）１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の二価のカチオン；および
（ｄ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含む、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項９】
（ａ）０．５％〜１０％の範囲の糖または糖アルコール；および
（ｂ）２０ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項８に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１０】
ｒＦＶＩＩＩ配合物であって、
（ａ）約０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲のヒスチジン；
（ｂ）０．５％〜２０％の範囲のスクロースまたはトレハロース；
（ｃ）約１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の二価のカチオン；
（ｄ）約０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の塩化ナトリウム；
（ｅ）約０ｍＭ、または約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍの範囲の非イオン性界面活性剤；
（ｆ）約０％、または約１．０％〜約５．０％の範囲のグリシン、および
（ｇ）約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５０００ＩＵ／ｍｌの範囲の接合したｒＦＶＩＩＩを含み；ｒＦＶＩＩＩ配合物は、ｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５の範囲である、ｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１１】
（ａ）塩化ナトリウムが、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲で存在し；
（ｂ）スクロースが、０．５％〜２．０％の範囲で存在し、
（ｃ）グリシンが、約１．０％〜約５．０％の範囲で存在し、
（ｄ）ヒスチジンが、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲で存在し、
（ｅ）非イオン性界面活性剤が、約２０ｐｐｍ〜約８０ｐｐｍの範囲で存在する、請求項１０に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１２】
（ａ）塩化ナトリウムが、１．０重量％未満の量で存在するか、または存在せず；
（ｂ）スクロースまたはトレハロースが、０．５％〜２０％の範囲で存在し、
（ｃ）グリシンが、１．０重量％未満の量で存在するか、または存在しない、請求項１０に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１３】
スクロースまたはトレハロースが、１．０％〜１０．０％の範囲で存在する、請求項１２に記載のｒＦＶＩＩＩ配合物。
【請求項１４】
血友病Ａを処置することが必要な患者に、請求項１、３、６、８または１０のいずれか一項に記載の治療に有効な量のｒＦＶＩＩＩ配合物を投与することを含む、血友病Ａを処置する方法。
【国際調査報告】
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