(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のレプチンを有効成分として含有することを特徴とする学習・記憶能力改善剤。
【請求項２】
上記レプチンがヒトのレプチンであることを特徴とする請求項１に記載の学習・記憶能力改善剤。
【請求項３】
痴呆症治療剤であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の学習・記憶能力改善剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物のレプチンを有効成分として含有する学習・記憶能力改善剤に関し、詳しくは、アルツハイマー病等の痴呆症や脳卒中等の予防や治療、脳卒中の後遺症の治療等に有効な学習・記憶能力改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化社会が進行し社会問題として深刻化しており、高齢化社会の進行に伴って、アルツハイマー病等の痴呆症患者も増加傾向にあり、これら痴呆症の治療薬の開発が急がれている。
【０００３】
一方、レプチンは以前からその存在を知られており、脂肪組織にのみ特異的に高濃度に検出され、摂食抑制作用及びエネルギー消費増加作用を奏することは、様々な研究により明らかにされており、抗肥満薬や糖尿病治療薬としての開発が進められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記レプチンについて更に鋭意研究した結果、哺乳類のレプチンが上記摂食抑制作用及びエネルギー消費増加作用以外に、アルツハイマー病等の痴呆症や脳卒中等の予防や治療、脳卒中の後遺症の治療等に有効な学習・記憶能力改善作用を奏することを見出した。即ち、本発明の目的は、哺乳動物のレプチンを有効成分として含有する学習・記憶能力改善剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の学習・記憶能力改善剤は、哺乳動物のレプチンを有効成分として含有する。上記哺乳動物のレプチンは、アミノ酸レベルのホモロジーにおいてマウス・ヒト間で８４％、マウス・ラット間で９６％と高度に保存され、相同性の高いタンパク質として知られ、異種動物に投与しても同種の生理活性を示すことが認められており、従って、本発明の哺乳動物のレプチンとしては、アミノ酸配列がヒトと実質的に相同的であり、生理活性がヒトのレプチンと同様に認められる動物のものであれば如何なる哺乳動物のレプチンであってよく、配列番号１で示されるヒトのレプチンの他に、例えば、配列番号２で示されるマウスのレプチンや配列番号３で示されるラットのレプチン等であってもよい。
【０００６】
本発明のレプチンには、生体内に存在する上記配列番号１乃至配列番号３で示されるようなポリペプチド、所謂、生体内成熟レプチンの他に、上記レプチンのアナログペプチドも含有される。即ち、本発明の本質は、肥満遺伝子産物である哺乳動物のレプチンが、学習・記憶能力改善剤として有用であることを初めて見出したことにあり、生体内に存在する生体内成熟レプチンと実質的に相同性があり、生体内成熟レプチンと同様の生理活性を有するようなレプチンのアナログペプチドも本願発明に包含される。
【０００７】
上記配列番号１に示されるヒトのレプチンは肥満遺伝子（ｏｂ遺伝子）産物として細胞内で１６７アミノ酸残基よりなる前駆体ポリペプチドとして発現され、その後、アミノ末端部の２１アミノ酸残基からなるシグナルペプチドは切断されて、１４６アミノ酸残基よりなる成熟タンパク質として生体内に分泌されるものである。
【０００８】
上記レプチンのアナログペプチドとは、上記生体内成熟レプチンに１又は複数のアミノ酸残基が付加、欠損、置換されたポリペプチドをいい、例えば、上記レプチンのアミノ末端にメチオニンが付加された配列番号４乃至配列番号６で示される組換えレプチン等が挙げられる。
【０００９】
本発明の学習・記憶能力改善剤は、上記哺乳動物のレプチンを薬学的に許容される塩として含有したものであってもよく、このような哺乳動物のレプチンの薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、又はアルミニウム等の金属との塩、或いは塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、チオシアン酸、ホウ酸、ギ酸、酢酸、ハロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等との酸付加塩等を挙げることができる。これらの塩は公知の方法により、遊離の上記レプチンより製造でき或いは相互に変換することができる。
【００１０】
本発明の学習・記憶能力改善剤は、上記哺乳動物のレプチンと上記哺乳動物のレプチンのアナログペプチドの少なくとも１つが含有されていればよく、これらは単独で用いられても併用されてもよい。
【００１１】
又、異種哺乳動物由来のタンパク質製剤をヒトの治療に用いた場合、免疫防御系に基づく拒絶反応やショック症状等を誘発する場合も少なくないので、本発明の学習・記憶能力改善剤としては、ヒトのレプチン、即ち、ヒトのレプチン、ヒトのレプチンのアナログペプチドが好ましく、ヒトのレプチンのアナログペプチドが更に好ましく、配設番号４で示されるヒトのレプチンのアナログペプチドが特に好ましい。
【００１２】
本発明のレプチンを取得する方法としては、例えば、生体又は培養細胞から精製単離する方法、固相ペプチド合成法や液相ペプチド合成法等のペプチド合成法、遺伝子組換え技術を用いて生産する方法等が挙げられるが、本発明のレプチンはアミノ酸残基数が多いことから工業的には遺伝子組換え技術を用いて生産する方法が好ましい。
【００１３】
遺伝子組換え技術を用いてレプチンやレプチンのアナログペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。そして、遺伝子組換え技術によって、例えば、上記配列番号４乃至配列番号６をコードするｃＤＮＡを任意の発現用ベクターと連結させた上で適当な宿主細胞内に導入して上記配列番号４乃至配列番号６に示されたレプチンのアナログペプチドを得ることができる。
【００１４】
本発明のレプチンをコードする上記ｃＤＮＡは、ヒトやマウスのｃＤＮＡに関しては、特表平９−５０６２６４号公報等に、又、ラットのｃＤＮＡに関してはＯｇａｗａ等の文献〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６巻、１６４７頁（１９９５年）〕等に記載されている。
【００１５】
それらレプチン遺伝子を用いて遺伝子工学的に遺伝子組換えレプチンを製造する方法も前記公表公報等に詳述されており、これら既知の方法に従って製造して本発明のレプチンを得ることができ、又、これら遺伝子組換えレプチンは市販されているものもあり入手可能である。
【００１６】
例えば、配列番号１に示された成熟タンパク質部分に対応するｃＤＮＡの先頭に翻訳に必須の開始コドンを結合させたｃＤＮＡを用い、配列番号１に示されたポリペプチドのアミノ末端に開始コドンに対応するアミノ酸であるメチオニンが結合した配列番号４に示されたヒト遺伝子組換レプチンを得ることができる。
【００１７】
なお、上記方法によって得られたポリペプチドが目的とするアミノ酸配列を有するものであるか否かの確認方法としては、従来から公知の方法が用いられ、例えば、上記の如くして得られたポリペプチド鎖を基質特異性を有する臭化シアン等の試薬又はトリプシン等の酵素によって断片化し、生じた各ペプチド片を高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製し均一なペプチド断片を単離して、これら各ペプチド断片のアミノ酸配列を自動エドマン法により決定し、得られたポリペプチド鎖のアミノ酸配列を確認することができる。
【００１８】
本発明の学習・記憶能力改善剤は、通常、適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて用いられ、通常の公知の方法によって製剤化される。処方にあたっては、本発明の学習・記憶能力改善剤は単独で用いられても複数で併用されてもよく、又、適宜他の薬剤と組み合わせて用いられてもよい。本発明の学習・記憶能力改善剤はペプチド類であるため、通常は注射剤として製剤化されるのが一般的であり、水性溶剤又は非水性溶剤、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、プロピレングリコール等の溶液若しくは懸濁液とすることができ、汎用されている安定化剤、緩衝化剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤等の医薬品添加物を適宜添加してもよい。注射剤以外に口腔粘膜や鼻粘膜を介して吸収させる舌下剤やネゴライザー剤等がペプチド製剤では用いられることがあり、これらも本発明に適用可能である。又、疾患の種類に応じて、その治療に最適な上記以外の剤形、例えば、経口投与しても分解されてないような特殊な製剤化を行い、経口剤等に処方することも可能である。
【００１９】
【実施例】
正常ラット（雄性ウイスター系、体重１５０〜２００ｇ）を用いて本発明の学習・記憶能力改善剤の学習・記憶能力改善作用を調べた結果について詳述する。なお、学習・記憶能力改善剤として、配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチド（Pepro Tech EC Ltd.製  商品名：Recombinant Murine Leptin ）を用いた。
【００２０】
（１）受動的回避学習試験
本試験で用いた試験装置１は、図１に示したように、縦３０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ３０ｃｍの暗箱２とこの暗箱２に連設し且つ縦２４ｃｍ×横２４ｃｍ×高さ３０ｃｍの明箱３とからなり、上記暗箱２と明箱３との連設面には横２４ｃｍ×高さ３０ｃｍの通口４が形成されているとともに、該通口４にはこの通口４を開閉自在に閉止する仕切板５が設けられている一方、上記明箱３内面には１０ルクスの照明（図示せず）が配設されている。従って、上記明箱３は常に照明によって明るくされているとともに、上記仕切板５で上記通口４を閉止すると上記明箱３からの光は遮断されて上記暗箱２は真っ暗となるように構成されている。
【００２１】
このような試験装置を用い、先ず、上記明箱２と暗箱３との間の通口４に仕切板５を設けて通口４を閉止した状態で、上記１０ルクスの照明で明るくされた明箱３内に一匹のラットを放置して３０秒経過後、上記仕切板５を除去し通口４を開放して明箱３と暗箱２とを連通状態としてからラットが明箱３から暗室２に入るまでの時間を測定した。なお、ラットが暗室２に入った後、上記仕切板５によって通口４を閉止した上で暗室２の内底面に０．０６〜０．６ｍＡの電流を通電し上記ラットに電気ショックを２秒間に亘って与えた。
【００２２】
上記正常ラット（雄性ウイスター系、体重１５０〜２００ｇ）を２８匹用意し、一群７匹のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群に分けた。そして、Ａ群７匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを０．５μｇ／ｋｇづつ毎日投与し、Ｂ群７匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを５．０μｇ／ｋｇづつ毎日投与し、Ｃ群７匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを５０μｇ／ｋｇづつ毎日投与し、上記試験を夫々のラットについて四日間に亘って毎日行った。なお、上記試験は配列番号５で示されるレプチンのアナログペプチドをラットに投与３０分経過後に行った。Ｄ群７匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを投与することなく上記試験を行い対照群として比較した。上記試験の結果を図２にグラフで示した（グラフにおいて縦軸は一群ラットの平均値を示した）。
【００２３】
なお、ラットは暗所を好むが、上記試験では暗室２に入った後電気ショックを与えていることから、記憶能力に優れたラット程上記電気ショックを記憶しているため、暗箱２に入るまでの時間が延長される。
【００２４】
（２）水迷路学習試験（Ｍｏｒｒｉｓ水迷路学習試験）
直径１５０ｃｍ、深さ４０ｃｍの平面円形試験用プール６の後述するＳＥ区画に、半径１２ｃｍの平面円形状のプラットホーム７を水面下１ｃｍに置き、ラットからプラットホームが見えないように水面に細かいビーズ状の発泡スチロールを一様に散布した。装置の周辺の空間的手掛かり（試験者、テーブル、蛍光灯、試験装置など）は試験期間を通じて常に一定にした。
【００２５】
試験日には円形試験用プール６を図３に示すように四等分割してＮＷ区画、ＳＷ区画、ＳＥ区画、ＮＥ区画を形成し、ラットを１０分間隔毎に円形試験用プール６の上記四区画（ＮＷ区画、ＳＷ区画、ＳＥ区画、ＮＥ区画）の出発点より泳がせて、上記プラットホーム７上にたどり着く迄の時間を測定し、その四回の試験の合計時間を算出した。又、プラットホーム７上にたどり着く迄に泳いだ距離も同時に測定した。
【００２６】
上記正常ラット（雄性ウイスター系、体重１５０〜２００ｇ）を５６匹用意し、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈの四群に分けた。Ｅ群１６匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを０．５μｇ／ｋｇづつ毎日投与し、Ｆ群２０匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを５．０μｇ／ｋｇづつ毎日投与し、Ｇ群２０匹のラットには配列番号２で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを５０μｇ／ｋｇづつ毎日投与した上で、上記試験を夫々のラットについて四日間に亘って毎日行った。なお、上記試験は配列番号５で示されるレプチンのアナログペプチドをラットに投与３０分経過後に行った。Ｈ群２０匹のラットには配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを投与することなく上記試験を行い対照群として比較した。上記試験の結果を図４及び図５にグラフで示した（グラフにおいて縦軸は一群ラットの平均値を示した）。
【００２７】
なお、記憶能力に優れたラットになる程、円形試験用プール６におけるプラットホーム７の位置を記憶しているので、プラットホーム７にたどり着くまでの時間及び泳いだ距離は短くなる。
【００２８】
図４及び図５に示した結果の通り、配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを投与した群Ｅ、Ｆ、Ｇは対照群Ｈと比べて、２日目で泳動時間及び距離が明らかに短縮された。
【００２９】
（３）海馬切片を用いた電気生理学的試験
ラットの脳を手早く摘出し、切片標本作成器で海馬の部位の切片を４００μｍの厚さで作製した。９５体積％Ｏ2 、５体積％ＣＯ2 の雰囲気下において、灌流速度３ｍｌ／ｍｉｎで３４℃のクレブスリンガー液を灌流しているチャンバー内に上記海馬の切片を固定し、この海馬の切片に配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを１／１０12Ｍ添加し１５分経過後、刺激電極をシャッファー側副枝に置き、先端径約５μｍの記録用ガラス微小電極をＣＡ１のシナプス部に置いた。
【００３０】
しかる後、刺激電極によって矩形状の短い刺激電流（持続時間５０μｓｅｃ、強度１０〜１５Ｖ）を１５秒に１回シャッファー側副枝に与え、ＣＡ１ニューロンのシナプス電位を上記記録用ガラス微小電極によって測定し、シナプス電位の振幅が安定してから、テタヌス刺激（１００Ｈｚで１秒間持続）、即ち、１０発の矩形波パルスを与え、シナプス電位を上記記録用ガラス微小電極によって１５秒毎に測定し、その結果を図６に示した。又、海馬の切片に配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを添加しなかった場合についても同様にシナプス電位を測定し、その結果を図６に示した。図６において、テタヌス刺激を海馬の切片に与えた時点を０秒とし、それ以前をマイナス、それ以後をプラス表示した。上記図６において、テタヌス刺激によってその後３０分以上シナプス電位の振幅が１１０％以上増加した場合、シナプス電位の長期増強が促進されているものと判断することができる。
【００３１】
（４）長期抑圧試験
ラットの脳を手早く摘出し、切片標本作成器で海馬の部位の切片を４００μｍの厚さで作製した。９５体積％Ｏ2 、５体積％ＣＯ2 の雰囲気下において、灌流速度３ｍｌ／ｍｉｎで３４℃のクレブスリンガー液を灌流しているチャンバー内に上記海馬の切片を固定し、この海馬の切片に配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを１／１０12Ｍ添加し１５分経過後、刺激電極をシャッファー側副枝に置き、先端径約５μｍの記録用ガラス微小電極をＣＡ１のシナプス部に置いた。
【００３２】
しかる後、刺激電極によって矩形状の短い刺激電流（持続時間５０μｓｅｃ、強度１０〜１５Ｖ）を１５秒に１回シャッファー側副枝に与え、ＣＡ１ニューロンのシナプス電位を上記記録用ガラス微小電極によって測定し、シナプス電位の振幅が安定してから、テタヌス刺激を１秒間に１回１５分間に亘って与え、シナプス電位を上記記録用ガラス微小電極によって１５秒毎に測定し、その結果を図７に示した。又、海馬の切片に配列番号５で示されるマウスのレプチンのアナログペプチドを添加しなかった場合についても同様にシナプス電位を測定し、その結果を図７に示した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の学習・記憶能力改善剤は、上記試験からも明らかなように、優れた学習、記憶能力の改善効果を奏する。そして、本発明の学習・記憶能力改善剤は、脳の機能低下をきたす疾患、例えば、アルツハイマー病、老年痴呆、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソニズム痴呆症候群、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上麻痺、視床変性症、遺伝性失語症、ミオクローヌス癲癇等の脳変性疾患、脳動脈硬化症等の脳血管障害、進行麻痺、各種脳炎、クロイツフェルト−ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症、全身性エリテマト−デス等の脳の感染性・炎症性疾患、慢性アルコール中毒、一酸化炭素中毒、重金属中毒等の中毒性脳障害、頭部外傷、癲癇、脳腫瘍、頭蓋内血腫、透析脳症、脳梗塞や脳血栓等の虚血性脳疾患等の治療、並びにこれら疾患に伴う記憶減退、失語、意識障害、うつ状態、無関心、妄想、錯乱等の諸症状を改善するための薬剤として有用性が高い。
【００３４】
【配列表】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】受動的回避学習試験を行うための試験装置の斜視図である。
【図２】受動的回避学習試験の測定結果を示したグラフである。
【図３】水迷路学習試験で用いた円形試験用プールを示した平面図である。
【図４】水迷路学習試験におけるプラットホームにたどり着くまでの時間を示したグラフである。
【図５】水迷路学習試験におけるプラットホームにたどり着くまでに泳いだ距離を示したグラフである。
【図６】海馬切片を用いた電気生理学的試験の結果を示したグラフである。
【図７】長期抑圧試験の結果を示したグラフである。
【符号の説明】
１  試験装置
２  暗室
３  明室
４  通口
５  仕切板
６  円形試験用プール
７  プラットホーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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