(57)【要約】  本開示は、宿主生物におけるＰＵＦＡの産生を可能にするおよび／または改良する多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼ系および１つまたは複数のアクセサリータンパク質を用いて遺伝子改変された組換え宿主生物に関する。本開示は、そのような生物を作製および使用する方法ならびにそのような生物から得られる生産物にも関する。
2016537985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼの少なくとも１つのポリペプチド、およびノストック（Nostoc）種由来の少なくとも１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変された植物。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子改変された植物の細胞、組織、または部分。
【請求項３】
高等植物、双子葉植物、単子葉植物、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、消費可能植物、油糧種子植物、ダイズ、ナタネ、キャノーラ、亜麻仁、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、マメ科の植物、ダイズ（Glycine）属の植物、ピーナツ、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ソラマメ（Vicia faba）、およびエンドウマメ（Pisum sativum）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド（複数可）が、プロモーター、種子特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および終結配列のうちの少なくとも１つに作動可能に連結している、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド（複数可）が、種子特異的プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結している、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド（複数可）がＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ユビキチン、ＣｓＶＭＶ、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、およびＳＳＰＲＯ２７４３．１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項７】
前記植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ｎ−３））および／またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３））を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項８】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０１重量％から１５重量％の間の量のＤＨＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項９】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０５重量％から１０重量％の間の量のＤＨＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１０】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０５重量％から５重量％の間の量のＤＨＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１１】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０１重量％から１０重量％の間の量のＥＰＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１２】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０５重量％から５重量％の間の量のＥＰＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１３】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の０．０５重量％から１重量％の間の量のＥＰＡを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１４】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の重量で１：１から１：３０の間の比のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１５】
植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分が、全脂肪酸の重量で１：１から１：３の間の比のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項１４に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の遺伝子改変された植物から得られる種子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子改変された植物から得られる商品生産物。
【請求項１８】
有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼポリペプチドをコードする検出可能な量のポリヌクレオチドまたは有意水準のＥＰＡを有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の検出可能な量のＰＵＦＡシンターゼポリペプチド、およびノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする検出可能な量のポリヌクレオチドまたはノストック（Nostoc）種由来の検出可能な量のＰＰＴａｓｅを含む、請求項１７に記載の商品生産物。
【請求項１９】
異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする検出可能な量のポリヌクレオチドまたは検出可能な量の異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣＳをさらに含む、請求項１８に記載の商品生産物。
【請求項２０】
精製油、未精製油、粗油、食料もしくはミール組成物、または機能的食品生産物である、請求項１７に記載の商品生産物。
【請求項２１】
油である、請求項１７に記載の商品生産物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の油と別の油を含む、油混合物。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された植物、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分から油を回収することを含む、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む油を得るための方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された植物を生育することと、
前記遺伝子改変された植物から、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分から油を回収することと
を含む、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む油を産生するための方法。
【請求項２５】
配列番号２および／または配列番号３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、配列番号５および／または配列番号６と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、ならびに配列番号８、配列番号９および／または配列番号１３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項２６】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１３のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項２７】
前記ＰＵＦＡシンターゼのポリペプチドが、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号７もしくは配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４を含む、請求項２７に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３０】
前記ノストック（Nostoc）ＰＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドが配列番号１０と少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３１】
前記ノストック（Nostoc）ＰＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドが配列番号１０である、請求項３０に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３２】
ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＮｏＨｅｔＩを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３３】
ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＮｏＨｅｔＩのコード領域がヘッドトゥーテールの配置で配列されている、請求項３２に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３４】
ＰＦＡ１とＮｏＨｅｔＩのコード領域がテールトゥーテールの配置で配列されており、ＰＦＡ３とＰＦＡ２のコード領域がテールトゥーテールの配置で配列されている、請求項３２に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３５】
ＰＦＡ１とＮｏＨｅｔＩのコード領域がヘッドトゥーヘッドの配置で配列されており、ＰＦＡ３とＰＦＡ２のコード領域がヘッドトゥーヘッドの配置で配列されている、請求項３２に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、
配列番号２および／もしくは配列番号３；
配列番号５および／もしくは配列番号６；
配列番号８、配列番号９および／もしくは配列番号１３；ならびに／または
配列番号１０
の相補体に厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項１に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３７】
有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼの少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ノストック（Nostoc）種由来の少なくとも１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド、および少なくとも１つの異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変された植物。
【請求項３８】
前記スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣＳが配列番号１１と少なくとも８０％同一である、請求項３７に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項３９】
前記スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣＳが配列番号１１である、請求項３８に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項４０】
前記生物がＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、ＮｏＨｅｔＩ、およびＳｚＡＣＳ２を含む、請求項３７に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、
配列番号２および／もしくは配列番号３；
配列番号５および／もしくは配列番号６；
配列番号８、配列番号９および／もしくは配列番号１３；
配列番号１０；ならびに／または
配列番号１１
の相補体に厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項３７に記載の遺伝子改変された植物。
【請求項４２】
植物特異的プロモーターを含む単離された核酸であって、前記プロモーターが、有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼ、およびノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）のうちの少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、単離された核酸。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２および／または配列番号３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、配列番号５および／または配列番号６と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、ならびに配列番号８、配列番号９および／または配列番号１３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の単離された核酸。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１３のうちの少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の単離された核酸。
【請求項４５】
前記ＰＵＦＡシンターゼのポリペプチドが、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３からなる群から選択される、請求項４２に記載の単離された核酸。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号７もしくは配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の単離された核酸。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４を含む、請求項４５に記載の単離された核酸。
【請求項４８】
前記ノストック（Nostoc）ＰＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドが配列番号１０と少なくとも８０％同一である、請求項４２に記載の単離された核酸。
【請求項４９】
前記ノストック（Nostoc）ＰＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドが配列番号１０である、請求項４８に記載の単離された核酸。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドがＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＮｏＨｅｔＩをコードしている、請求項４２に記載の単離された核酸。
【請求項５１】
ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＮｏＨｅｔＩのコード領域がヘッドトゥーテールの配置で配列されている、請求項５０に記載の単離された核酸。
【請求項５２】
ＰＦＡ１とＮｏＨｅｔＩのコード領域がテールトゥーテールの配置で配列されており、ＰＦＡ３とＰＦＡ２のコード領域がテールトゥーテールの配置で配列されている、請求項５０に記載の単離された核酸。
【請求項５３】
ＰＦＡ１とＮｏＨｅｔＩのコード領域がヘッドトゥーヘッドの配置で配列されており、ＰＦＡ３とＰＦＡ２のコード領域がヘッドトゥーヘッドの配置で配列されている、請求項５０に記載の単離された核酸。
【請求項５４】
遺伝子改変された植物を産生するためのシステムであって、単離された核酸を含み、有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＦＡ）ポリペプチド、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３、ならびにノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）、ＮｏＨｅｔＩのそれぞれが１つまたは複数の前記単離された核酸中のポリヌクレオチドによりコードされる、システム。
【請求項５５】
遺伝子改変された植物を産生するためのシステムであって、単離された核酸を含み、前記単離された核酸のうちの少なくとも１つが、有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸シンターゼ（ＰＦＡ）ポリペプチド、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３、ならびにノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）、ＮｏＨｅｔＩの相補体のそれぞれに厳密な条件下でハイブリダイズする、システム。
【請求項５６】
前記単離された核酸のうちの少なくとも１つが、
配列番号２および／もしくは配列番号３；
配列番号５および／もしくは配列番号６；
配列番号８、配列番号９および／もしくは配列番号１３；ならびに
配列番号１０
の相補体のそれぞれに厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
植物特異的プロモーターを含む単離された核酸であって、前記プロモーターが、有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼ、ノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）、および異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）のうちの少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、単離された核酸。
【請求項５８】
前記スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣＳが配列番号１１と少なくとも８０％同一である、請求項５７に記載の単離された核酸。
【請求項５９】
前記スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣＳが配列番号１１である、請求項５８に記載の単離された核酸。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチドがＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、ＮｏＨｅｔＩ、およびＳｚＡＣＳ２をコードする、請求項５７に記載の単離された核酸。
【請求項６１】
遺伝子改変された植物を産生するためのシステムであって、単離された核酸を含み、有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸シンターゼ（ＰＦＡ）ポリペプチド、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３；ノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）、ＮｏＨｅｔＩ、ならびに異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）、ＳｚＡＣＳ２のそれぞれが１つまたは複数の前記単離された核酸中のポリヌクレオチドによりコードされる、システム。
【請求項６２】
遺伝子改変された植物を産生するためのシステムであって、単離された核酸を含み、前記単離された核酸の少なくとも１つが、前記有意水準のエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３）（ＥＰＡ）を有する油を産生するスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来の多価不飽和脂肪酸シンターゼ（ＰＦＡ）ポリペプチド、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３；ノストック（Nostoc）種由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）、ＮｏＨｅｔＩ、ならびに異種スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）、ＳｚＡＣＳ２の相補体のそれぞれに厳密な条件下でハイブリダイズする、システム。
【請求項６３】
前記単離された核酸のうちの少なくとも１つが、
配列番号２および／もしくは配列番号３；
配列番号５および／もしくは配列番号６；
配列番号８、配列番号９および／もしくは配列番号１３；
配列番号１０；ならびに
配列番号１１
の相補体のそれぞれに厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６４】
組換え発現ベクターである、請求項４１〜５３および５７〜６０のいずれかに記載の核酸。
【請求項６５】
配列番号１４〜３７からなる群から選択される、請求項６４に記載の核酸。
【請求項６６】
前記核酸分子が１つまたは複数の組換え発現ベクター（複数可）である、請求項５４〜５６および６１〜６３のいずれかに記載のシステム。
【請求項６７】
前記核酸分子のそれぞれが配列番号１４〜３７からなる群から選択される、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
請求項４２〜５３および５７〜６０に記載の核酸のいずれか、または請求項５４〜５６および６１〜６３に記載のシステムのいずれかからの核酸を植物に導入し、それによって遺伝子改変された植物を産生すること
を含む、遺伝子改変された植物を産生するための方法。
【請求項６９】
前記核酸（複数可）が形質転換により植物中に導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸（複数可）が、前記核酸（複数可）を既に含む異なる植物からの遺伝子移入により植物中に導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
請求項４２〜５３および５７〜６０に記載の核酸のいずれか、または請求項５４〜５６および６１〜６３に記載のシステムのいずれかからの核酸を植物に導入して、遺伝子改変された植物を産生することと、
前記遺伝子改変された植物を生育することと、
前記遺伝子改変された植物から、またはその細胞、組織、種子、もしくは部分から油を回収することと、
を含む、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む油を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は「スラウストキトリドＰＵＦＡシンターゼによる油糧種子作物におけるオメガ−３長鎖多価不飽和脂肪酸の産生」についての２０１３年１１月２６日出願の米国特許仮出願第６１／９０９２８９号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、一般的には、宿主生物におけるＰＵＦＡの産生を可能にするおよび／または改良する多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼ系および１つまたは複数のアクセサリータンパク質を用いて遺伝子改変された組換え宿主生物（例えば、植物）に関する。本発明は、（例えば、ＰＵＦＡを得るために）そのような生物を作製および使用する方法ならびにそのような生物から得られる生産物（例えば、油および種子）にも関する。
【背景技術】
【０００３】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は栄養学上、薬学上、および産業上の用途ならびに他の目的に有用だと考えられている。しかし、天然資源（例えば、魚油および藻類油）からのおよび化学的合成からのＰＵＦＡの現行の供給は、多くの長期的な商業上の要求には十分ではないし対費用効果も高くはない。
【０００４】
植物（例えば、油糧種子作物）由来の植物油は比較的安価であり、魚油に関連する汚染問題がなく、環境にやさしいと考えられている。しかし、商業的に開発された植物および植物油に含まれるＰＵＦＡは、典型的にはより飽和したまたはより長鎖のＰＵＦＡを含まず、典型的にはリノール酸（１８炭素でデルタ９位および１２位に２つの二重結合がある−１８：２  デルタ９、１２）およびリノレン酸（１８：３  デルタ９、１２、１５）などの脂肪酸を含むだけである。
【０００５】
植物により内因的に産生される脂肪酸を改変することによる植物中でのより不飽和のまたはより長鎖のＰＵＦＡの産生が記述されてきた。例えば、脂肪酸エロンガーゼおよび／またはデサチュラーゼをコードする種々の個別の遺伝子を用いて植物を遺伝子改変すると、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの有意水準のより長鎖でより不飽和のＰＵＦＡを含有するが、有意水準の混合したより短鎖でより不飽和の少ないＰＵＦＡも含有する葉または種子が生成されたと記述されてきた。Qi et al. (2004) Nature Biotech. 22:739;ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ０４／０７１４６７号; Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16:1; Napier and Sayanova (2005) Proc. Nutr. Soc. 64:387-93; Robert et al. (2005) Functional Plant Biol. 32:473-79; 米国特許出願公開第２００４／０１７２６８２号; Petrie et al. (2012) PLOS One 7:e49165; および米国特許仮出願第６１／３４５５３７号（２０１０年５月１７日出願）。
【発明の概要】
【０００６】
トランスジェニック宿主生物（例えば、植物細胞、植物部分および植物）においてＬＣ−ＰＵＦＡ、ならびに多量の非天然植物脂質、例えばそのようなＰＵＦＡが濃縮されるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびリン脂質（ＰＬ）を産生し、以前入手可能であったよりも長い骨格を有し、より大きな不飽和度の前記物質を産生するために利用することができる方法および組成物が本明細書には記載されている。機能的ＰＵＦＡシンターゼ系を用いて遺伝子改変されている宿主生物を提供することにより宿主植物においてＰＵＦＡを産生するためのシステムも本明細書には記載されている。
【０００７】
本明細書のいくつかの実施形態は、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類（その代表的な例はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５で預託されているスキゾキトリウム（Schizochytrium）種である）由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼ（ＰＦＡ１、ＰＦＡ２およびＰＦＡ３）および、シアノバクテリア属ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）の少なくとも１つのポリペプチドをコードしており、その発現産物が機能的ＰＵＦＡシンターゼ系を再構成するポリヌクレオチド（複数可）を含む遺伝子改変された植物細胞（例えば、キャノーラ、ダイズ、および／またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物細胞）を含む。例えば、植物細胞はスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＦＡ１、ＰＦＡ２およびＰＦＡ３、ならびにノストック（Nostoc）ＨｅｔＩをコードするポリヌクレオチド（複数可）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、植物細胞は、アシルＣｏＡシンセターゼアイソザイム２（ＳｚＡＣＳ２）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドも含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＤＨＡ選択性アクセサリータンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）も宿主植物細胞で発現されてＬＣ−ＰＵＦＡの種油（例えば、ＡＣＳ、ＤＧＡＴ、ＬＰＡＴ、ＬＰＣＡＴ、およびＰＤＡＴ）への組込みを促進する。
【０００８】
本明細書の特定の実施形態は、そのような植物細胞を含む遺伝子改変された植物（例えば、アブラナ属（Brassica）、ダイズ（Glycine）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）および油糧種子作物植物）、ならびにその子孫、種子、組織、または部分を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物細胞は油糧種子作物植物細胞、例えば、限定せずに、ベニバナ、ヒマワリ、およびヤシである。機能的ＰＵＦＡシンターゼ系を発現している遺伝子改変された油糧種子作物植物細胞は、例えば、ＤＨＡ含有植物油を含む特徴的な脂肪酸プロファイルを生み出すことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態は、機能的ＰＵＦＡシンターゼ系の成分（例えば、スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびノストック（Nostoc）ＨｅｔＩ）、および場合により、少なくとも１つのアクセサリータンパク質（例えば、ＳｚＡＣＳ２）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を提供する。いくつかの例では、これらのポリヌクレオチドは単一の組換え発現ベクターに含まれる。他の例では、ポリヌクレオチドは異なる組換え発現ベクターに含まれる。
【００１０】
特定の実施形態では、機能的ＰＵＦＡシンターゼ系の成分、および場合により、少なくとも１つのアクセサリータンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）は種子特異的プロモーターに作動可能に連結されている。例えば、ポリヌクレオチド（複数可）は特定の例では、そのプロモーターエレメントを本明細書に例示しているＰｖＤｌｅｃ２、ＰｖＰｈａｓ、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、およびＳＳＰＲＯ２７４３．１からなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）は構成的プロモーター（例えば、ユビキチンおよびＣｓＶＭＶプロモーター）、または葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている。追加のプロモーターを、成長の異なる段階中におよび／または種子発生中にはより高レベルで機能的ＰＵＦＡシンターゼ系の発現を推進し、ＬＣ−ＰＵＦＡの蓄積の増加を提供するように、特定の実施形態で用いることができる。
【００１１】
他の実施形態では、機能的ＰＵＦＡシンターゼの成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および／または配列番号７もしくは配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしており、前記ポリヌクレオチド（複数可）はＨｅｔＩ遺伝子（例えば、配列番号１０のコード産物と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）も含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）はＳｚＡＣＳ２遺伝子（例えば、配列番号１１のコード産物と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）も含む。
【００１２】
特定の例では、機能的ＰＵＦＡシンターゼの成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、配列番号２および／もしくは配列番号３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、配列番号５および／もしくは配列番号６と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、配列番号８、配列番号９、および／もしくは配列番号１３と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある種の例では、ポリヌクレオチド（複数可）は、配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。
【００１３】
特定の例では、機能的ＰＵＦＡシンターゼの成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、厳密な条件（例えば、極めて厳密な条件）下で配列番号２および／または配列番号３；配列番号５および／または配列番号６；配列番号８、配列番号９、および／または配列番号１３；配列番号１０および／または配列番号１１にハイブリダイズする。ある種の例では、ポリヌクレオチド（複数可）は、厳密な条件下で配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１１のすべてにハイブリダイズする。
【００１４】
機能的ＰＵＦＡシンターゼの成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）を植物細胞内に導入し、植物細胞から植物を再生することを含む、トランスジェニック植物を産生するための方法も本明細書には記載されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）は単一のベクターで作物植物細胞内へ形質転換される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）は複数のベクターにより作物植物細胞内へ形質転換されて、異なる事象で構成遺伝子を含有する植物を生成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）は従来の育種による遺伝子移入（introgression）により作物植物細胞内に導入される。機能的ＰＵＦＡシンターゼ系は特定の例では育種交雑により再構成されて、子孫植物ＰＵＦＡプロファイルを最適化する（例えば、ＤＨＡ（Ｃ２２：６、ｎ−３）および／またはＥＰＡ（Ｃ２０：５、ｎ−３）を産生する植物を選択することにより）。
【００１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、種子、細胞、組織、種子、もしくは部分から得られる非天然油（例えば、生種子油）は検出可能な量のＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）（Ｃ２２：５、ｎ−６）、および／またはＥＰＡを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、０．０１重量％から１５重量％ＤＨＡ（例えば、０．０５重量％から１０重量％ＤＨＡ、または０．０５重量％から５重量％ＤＨＡ）を有する脂肪酸プロファイルを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、０．０１重量％から１０重量％ＥＰＡ（例えば、０．０５重量％から５重量％ＥＰＡ、または０．０５重量％から１重量％ＥＰＡ）を有する脂肪酸プロファイルを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、０．０１重量％から１０重量％ＤＰＡ（ｎ−６）（例えば、０．０１重量％から５重量％ＤＰＡ（ｎ−６）、または０．０１重量％から１重量％ＤＰＡ（ｎ−６））を有する脂肪酸プロファイルを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、全脂肪酸の重量で１０：１から１：３０（例えば、約２：１から約１：１０、約１：１から約１：１２、約２：１から約１：１１、約１：１．５から約１：５、約６：１から約１：６．５、および約１：１．２５）の比のＥＰＡ：ＤＨＡを有する脂肪酸プロファイルを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、全脂肪酸の重量で１：１から１：１０（例えば、１：２から１：５、約１：３から約１：５、約１：３から約１：６、および約１：５）の比のＤＰＡ（ｎ−６）対ＤＨＡを有する脂肪酸プロファイルを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分または油は、油のうち７０重量％から９９重量％トリグリセリドを有する脂肪酸プロファイルを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、検出可能な量のＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡは遺伝子改変された植物から得られる植物商品生産物（例えば、油脂製品、特に、油脂製品、穀物、およびミール）にも含まれる。本明細書に記載される遺伝子改変された植物から得られるＬＣ−ＰＵＦＡ含有植物油は、改善されたヒト栄養に向けた食品成分のためのＤＨＡ／ＥＰＡの低コスト供給源として使用することができる。本明細書に記載される遺伝子改変された植物から得られる油および油糧種子は、動物食料および水産養殖のための低コスト高品質ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ供給源として、または医薬品用および栄養補助食品用にω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡが濃縮された構造化脂質（structured lipids）を構築するためのエステル交換用の供給原料として使用することができる。
【００１７】
本明細書に記載される遺伝子改変された植物（例えば、油糧種子植物）、その子孫、細胞、組織、種子、もしくは部分を生育することおよび／または本明細書に記載される遺伝子改変された植物から油（例えば、種子油）を回収することを含む、少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを含む油を産生するための方法も本明細書には記載されている。
【００１８】
本明細書に記載される遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、本明細書に記載される油、本明細書に記載される種子、本明細書に記載される食品生産物、本明細書に記載される機能的食品、または本明細書に記載される医薬製品を個人に提供することを含む、個人に少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを含む補助栄養食品または治療剤製品を提供するための方法も本明細書には記載されている。いくつかの実施形態では、そのような実施形態に含まれるＬＣ−ＰＵＦＡはＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡである。
【００１９】
前述のおよび他の特長は、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からさらに明らかになり、説明は添付の図面を参照して続く。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】いくつかの実施形態において利用する例示的なＰＵＦＡシンターゼ構築物の概要を含む図である。転写の方向はそれぞれの囲みＰＴＵ上に示し、コード配列はそれぞれのＰＴＵ上に付記し、使用されるプロモーター／ターミネーター組合せを示す。  図１ａは「配向１」に配列されたＰＵＦＡシンターゼ構築物を含む。
【図１ｂ】いくつかの実施形態において利用する例示的なＰＵＦＡシンターゼ構築物の概要を含む図である。転写の方向はそれぞれの囲みＰＴＵ上に示し、コード配列はそれぞれのＰＴＵ上に付記し、使用されるプロモーター／ターミネーター組合せを示す。  図１ｂは「配向２」に配列された構築物を含む。
【図１ｃ】いくつかの実施形態において利用する例示的なＰＵＦＡシンターゼ構築物の概要を含む図である。転写の方向はそれぞれの囲みＰＴＵ上に示し、コード配列はそれぞれのＰＴＵ上に付記し、使用されるプロモーター／ターミネーター組合せを示す。  図１ｃは「配向３」に配列された構築物を含む。
【図２】１４Ｃ標識ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびＤＰＡ標準物質のＨＰＬＣ放射測定痕を含む図である。ＥＰＡおよびＤＨＡの保持時間はそれぞれ約５．３分および約６．１分で標識されている。
【図３】はＰＵＦＡシンターゼおよびＨｅｔＩ導入遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）事象のＴ２種子中のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の概要を含む図である。それぞれの垂直棒は１つのシロイヌナズナ（Arabidopsis）事象からのＬＣ−ＰＵＦＡ含有量を表し、黒＝ＤＨＡ、濃い灰色＝ＥＰＡ、薄い灰色＝ＤＰＡ（ｎ−６）。
【図４】選択されたトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＤＨＡ産生Ｔ２系統由来のＴ３種子子孫のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の図表示である。それぞれの環は１つのホモ接合性Ｔ２苗由来のＴ３種子を表す。灰色棒はＴ３種子系統ごとの平均ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量を表す。
【図５】４つのホモ接合性および５つのヘミ接合性Ｔ１キャノーラ苗由来の個々のＴ２種子のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の図表示である。４８種子は系統ごとに分析した。「ＰＵＦＡｓ」はＤＨＡ＋ＥＰＡ＋ＤＰＡ（ｎ−６）の合計を表す。縦軸は、全ＦＡＭＥの％としてのＬＣ−ＰＵＦＡ含有量に対応している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表
添付の配列表に収載されている核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２２に定義されるヌクレオチド塩基の標準文字略号を使用して示されている。それぞれの核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は表示されている鎖のいかなる参照によっても含まれると理解されている。添付の配列表では、
【００２２】
配列番号１は例示的なＰＦＡ１タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００２３】
【化１】
2016537985.tif 000003
【００２４】
配列番号２は、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５で代表される）から単離した、本明細書ではＰＦＡ１  ｖ１と呼ばれる、例示的なＰＦＡ１遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００２５】
【化２−１】
2016537985.tif 000004
【００２６】
【化２−２】
2016537985.tif 000005
【００２７】
【化２−３】
2016537985.tif 000006
【００２８】
【化２−４】
2016537985.tif 000007
【００２９】
配列番号３は、本明細書ではＰＦＡ１  ｖ２と呼ばれる、例示的な植物最適化されたＰＦＡ１遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００３０】
【化３−１】
2016537985.tif 000008
【００３１】
【化３−２】
2016537985.tif 000009
【００３２】
【化３−３】
2016537985.tif 000010
【００３３】
配列番号４は、例示的なＰＦＡ２タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００３４】
【化４】
2016537985.tif 000011
【００３５】
配列番号５は、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５で代表される）から単離した、本明細書ではＰＦＡ２  ｖ１と呼ばれる、例示的なＰＦＡ２遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００３６】
【化５−１】
2016537985.tif 000012
【００３７】
【化５−２】
2016537985.tif 000013
【００３８】
配列番号６は、本明細書ではＰＦＡ２  ｖ２と呼ばれる、例示的な植物最適化されたＰＦＡ２遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００３９】
【化６−１】
2016537985.tif 000014
【００４０】
【化６−２】
2016537985.tif 000015
【００４１】
配列番号７は、例示的なＰＦＡ３タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００４２】
【化７】
2016537985.tif 000016
【００４３】
配列番号８は、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５で代表される）から単離した、本明細書ではＰＦＡ３  ｖ１と呼ばれる、例示的なＰＦＡ３遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００４４】
【化８−１】
2016537985.tif 000017
【００４５】
【化８−２】
2016537985.tif 000018
【００４６】
【化８−３】
2016537985.tif 000019
【００４７】
配列番号９は、本明細書ではＰＦＡ３  ｖ２と呼ばれる、例示的な植物最適化されたＰＦＡ３遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００４８】
【化９−１】
2016537985.tif 000020
【００４９】
【化９−２】
2016537985.tif 000021
【００５０】
配列番号１０は例示的なＨｅｔＩ遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００５１】
【化１０】
2016537985.tif 000022
【００５２】
配列番号１１は、スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ受託番号２０８８８から単離された、例示的なＳｚＡＣＳ２遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００５３】
【化１１】
2016537985.tif 000023
【００５４】
配列番号１２は、いくつかの実施形態において利用されるランダム「スペーサー」ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示している。
【００５５】
配列番号１３は、本明細書ではＰＦＡ３  ｖ３と呼ばれる、例示的な５’切断型ＰＦＡ３遺伝子のヌクレオチド配列を示している。
【００５６】
【化１２−１】
2016537985.tif 000024
【００５７】
【化１２−２】
2016537985.tif 000025
【００５８】
配列番号１４は例示的な５’切断型ＰＦＡ３タンパク質（ＰＦＡ３ｖ３）のアミノ酸配列を示している。
【００５９】
【化１３】
2016537985.tif 000026
【００６０】
配列番号１５〜３８は、本明細書のある種の実施例で利用されるいくつかのプラスミドのヌクレオチド配列を示している。
【００６１】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
真核生物におけるＬＣ−ＰＵＦＡの合成のための古典的経路は、飽和またはモノ不飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を含む。ＰＵＦＡシンターゼによるＬＣ−ＰＵＦＡの合成のための経路は古典的経路とは全く異なっている。具体的には、ＰＵＦＡシンターゼは炭素源としてマロニル−ＣｏＡを利用して、中間体をかなりの量で放出することなく最終ＰＵＦＡ（複数可）を産生する。その上、ＰＵＦＡシンターゼで、酸素を必要としない機構を使用する合成中に適切なシス二重結合が付加される。例えば、ＮＡＤＰＨを合成サイクル中に還元剤として使用してもよい。
【００６２】
植物、植物種子、または植物油におけるより長鎖のまたはより不飽和のＰＵＦＡ（ならびに、そのようなＰＵＦＡが濃縮されている脂質、例えば、ＴＡＧおよびＰＬの量）の効率的で効果的な産生のための比較的安価な組成物および方法が本明細書に記載されている。そのような脂肪酸およびその産生の方法は、食物および工業用途を含む種々の状況において有用である。本明細書に記載されるように、ＰＵＦＡシンターゼ系を用いて遺伝子改変された（例えば、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類から同定されたＰＵＦＡシンターゼ成分およびシアノバクテリア属、例えば、ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）を含有する、スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼアイソザイム２も含有する）組換え宿主生物を提供することにより宿主生物（例えば、植物）におけるＰＵＦＡ産生を提供し改良するためのシステムは、これらの脂肪酸を得るための従来のアプローチに勝る著しい利点を提供する。
【００６３】
海洋スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５により表される）は作物形質転換のためのＰＵＦＡシンターゼ遺伝子の供給源としても使用できる高ω−３／ω−６比の油を産生する。さらに、スキゾキトリウム（Schizochytrium）は、ＤＨＡに加えて有意水準のＥＰＡを含有する油を産生することが可能である。かなりの量のＥＰＡを産生するその能力は一部の他のスラウストキトリウム（Thraustochytrium）株（例えば、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種、ＡＴＣＣ受託番号２０８８８）と対照的である。米国特許出願公開第２０１３／０１５０５９９Ａ１号、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ２０１３／０１６５４６号。スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼ系は、キャノーラ、ダイズ、およびモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis）において本明細書で実施例により示されるように、多種多様な作物植物において異種性に発現されると機能して、商業的に有意水準のω−３  ＬＵ−ＰＵＦＡ（例えば、ＤＨＡおよびＥＰＡ）を作製することができる。したがって、この遺伝子セットはいくつかの実施形態では、植物において他のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子セットよりも有意に多くのＤＨＡおよびＥＰＡを産生することができる。
【００６４】
異なる種子特異的プロモーターおよびターミネーターの多様化、スペーサーエレメントの使用、変更された転写方向、Ｔ−ＤＮＡ内の遺伝子の異なる相対的位置決め、ならびに天然のおよび改変された遺伝子配列の使用を含む、種々の構築物設計の利用も本明細書に記載されている。これらの構築物設計を使用して、回収するＬＣ−ＰＵＦＡ産生事象の数およびそれに続く世代におけるω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ形質の遺伝率をさらに改良することができる。
【００６５】
本明細書の実施例では、キャノーラ、ダイズ、およびシロイヌナズナ（Arabidopsis）苗を、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類由来のＰＵＦＡシンターゼの３つの成分ポリペプチド（すなわち、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３）を、ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）と共にコードする遺伝子を宿すベクターで形質転換した。いくつかの例では、４つの遺伝子すべてが種子特異的プロモーターの制御下の単一構築物に含まれており、種々の配置の種々の種子特異的プロモーターにより推進された。植物形質転換実験は、４つの導入遺伝子すべてを含有し、種子において４つのポリペプチドすべてを発現する事象を生じた。ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ  ＤＨＡおよびＥＰＡは、得られたトランスジェニック事象から種子脂質において産生された。ω−６  ＬＣ−ＰＵＦＡ  ＤＰＡも検出された。Ｔ１種子の容積分析において、最大２．９％ＤＨＡおよび１．０％ＥＰＡ（３．９％全ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ）ならびに１．１％ＤＨＡ＋２．０％ＥＰＡを含有するキャノーラ事象が回収された。Ｔ１キャノーラ種子の単一種子分析において最大４．６％ＤＨＡおよび３．７％ＥＰＡが検出された。Ｔ１種子の単一種子分析において最大１．９％ＤＨＡおよび２．２％ＥＰＡを含有するダイズ事象が回収された。
【００６６】
ＩＩ．略字
ＡＣＳ          アセチルＣｏＡシンセターゼ
ＤＧＡＴ        ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
ＤＨＡ          ドコサヘキサエン酸
ＤＰＡ          ドコサペンタエン酸
ＥＰＡ          エイコサペンタエン酸
ＦＡＭＥ        脂肪酸メチルエステル
ＨＰＬＣ        高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＰＵＦＡ  長鎖多価不飽和脂肪酸
ＬＰＡＴ        リゾホスファチジルアシルトランスフェラーゼ
ＬＰＣＡＴ      リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ
Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｈ  ＨｅｔＩで発現されるＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３遺伝子
Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｈ−ＡＣＳ  ＨｅｔＩおよびＳｚＡＣＳ２で発現されるＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３遺伝子
ＰＤＡＴ        リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
ＰＬ            リン脂質
ＰＰＴａｓｅ    ホスホパンテテイントランスフェラーゼ
ＰＴＵ          植物転写単位
ＰＵＦＡ        多価不飽和脂肪酸
ＳｚＡＣＳ２    スキゾキトリウム（Schizochytrium）アシルＣｏＡシンセターゼアイソザイム２
ＴＡＧ          トリアシルグリセロール
【００６７】
ＩＩＩ．用語
戻し交配：戻し交配法を使用して植物に核酸配列を導入することができる。戻し交配技法は、新しい形質を植物に導入するために数十年間広く使用されてきた。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交配プロトコルでは、目的の最初の種（反復親）を移行させる目的の遺伝子を担持する第２の種（一回親）に交配させる。次に、この交配から得られる子孫を再び反復親に交配させ、このプロセスは、一回親から移行した遺伝子に加えて、反復親の所望の形態上のおよび生理学上の特徴の基本的にすべてが変換された植物で回収される植物が得られるまで繰り返される。
【００６８】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、成分に化学的または機能的変化をもたらしつつ（例えば、核酸は、染色体中で核酸を残りのＤＮＡに結合させている化学結合を壊すことにより染色体から単離されていることがある）、その成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離されている、から離れて産生されている、またはから精製されている。「単離」されている核酸分子およびタンパク質には、標準的精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。前記用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。
【００６９】
核酸分子：本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」とはポリマー型のヌクレオチドのことであってよく、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに上記の合成型および混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでいてよい。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変型のことであってよい。本明細書で使用される「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、他の方法で明記されていなければ、通常は少なくとも１０塩基長である。前記用語は一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結されている天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことが可能である。
【００７０】
核酸分子は、当業者であれば容易に認識するように、化学的にもしくは生化学的に改変してもよく、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。そのような改変には、例えば、標識、メチル化、１つもしくは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、無電荷連鎖：例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸、等；電荷連鎖：例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等；ペンデント部分：例えば、ペプチド；介入物：例えば、アクリジン、ソラレン、等；キレート剤；アルキル化剤；および改変連鎖：例えば、アルファアノマー核酸、等）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、およびパドロック立体構造を含む、いかなるトポロジカル立体構造でも含まれる。
【００７１】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係にある場合、第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。組換え的に産生される場合、作動可能に連結される核酸配列は一般に近接しており、必要な場合には、同じリーディングフレームにおいて２つのタンパク質コード領域を連結する（例えば、多シストロン性ＯＲＦでは）。しかし、核酸は作動可能に連結されるのに近接している必要はない。
【００７２】
用語「作動可能に連結された」は、調節配列およびコード配列に関連して使用される場合、調節配列が連結されたコード配列の発現に影響を与えることを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」とは、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列のことである。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造体、リプレッサー結合配列、終結配列、およびポリアデニル化認識配列が含まれうる。特定の調節配列は、それに作動可能に連結されているコード配列の上流および／または下流に位置していてもよい。その上、コード配列に作動可能に連結されている特定の調節配列は二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置していてもよい。
【００７３】
プロモーター：本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」とは、転写開始点から上流に存在することができ、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与しうるＤＮＡの領域のことである。プロモーターは細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結していてもよく、または細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結していることがあるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。「植物プロモーター」とは、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターでありうる。発生制御下のプロモーターの例には、葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管、または厚壁組織などの、ある種の組織での転写を優先的に開始させるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは「組織優先的」と呼ばれる。ある種の組織のみで転写を開始するプロモーターは「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは主に、１つまたは複数の器官においてある種の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞での発現を推進する。「誘導性」プロモーターは環境制御下にありうるプロモーターでありうる。誘導性プロモーターにより転写を開始しうる環境条件の例には、嫌気条件および光の存在が含まれる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導性プロモーターが「非構成的」プロモータークラスを構成する。「構成的」プロモーターは、大半の環境条件下で生物の大半の細胞において活性でありうるプロモーターである。
【００７４】
いかなる誘導性プロモーターでも本発明のいくつかの実施形態で使用することが可能である。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366参照。誘導性プロモーターを用いれば、転写速度は誘導剤に応じて増加する。例示的な誘導性プロモーターには、銅に応答するＡＣＥＩ系由来のプロモーター、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー、およびその転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンにより誘導されうるステロイドホルモン遺伝子由来に誘導性プロモーター（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７５】
例示的な構成的プロモーターには、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、イネアクチン遺伝子由来のプロモーター、ユビキチンプロモーター、ｐＥＭＵ、ＭＡＳ、トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター、およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片に対するヌクレオチド配列類似性）（国際特許公開第ＷＯ９６／３０５３０号）を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
さらに、いかなる組織特異的または組織優先的プロモーターも本発明のいくつかの実施形態において利用しうる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結しているコード配列を含む核酸分子で形質転換された植物は、もっぱらまたは優先的に特異的な組織においてそのコード配列の産物を産生しうる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターには、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーター、ｃａｂまたはｒｕｂｉｓｃｏ由来のプロモーターなどの葉特異的および光誘導プロモーター、ＬＡＴ５２由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーター、Ｚｍ１３由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター、ａｐｇ由来のプロモーターなどの小胞子優先プロモーター、および種子特異的プロモーター（例えば、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、またはＢｎａＮａｐｉｎＣ由来のプロモーター）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
異種性の：用語「異種性の」は、本明細書で核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および遺伝子）に適用される場合、起源が異なることを意味する。例えば、宿主細胞が天然のその非形質転換宿主細胞には存在しない核酸で形質転換されている場合は、その核酸は宿主細胞にとって異種性（および外来性）である。さらに、形質転換する核酸の異なるエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、コード配列、ターミネーター、等）は互いにとっておよび／または形質転換される宿主にとって異種性でありうる。用語「異種性の」は、本明細書で使用されるように、宿主細胞内に既に存在する核酸に対して配列が同一であるが、現時点では異なる追加の配列に連結されているおよび／または異なるコピー数で存在している、等の１つまたは複数の核酸（複数可）にも適用しうる。
【００７８】
天然の：本明細書で使用されるように、用語「天然の」とは、存在するのであればそれ独自の調節配列と共に、天然に存在する生物におけるまたは生物のゲノムにおけるその天然の位置でのポリヌクレオチドまたは遺伝子の形態のことである。
【００７９】
内在性の：本明細書で使用されるように、用語「内在性の」とは、通常その分子を天然に含む生物またはゲノム内にあるポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドのことである。
【００８０】
形質転換：本明細書で使用されるように、用語「形質転換」または「形質導入」とは１つまたは複数の核酸分子（複数可）の細胞内への移入のことである。核酸分子の細胞ゲノムへの組込みによりまたはエピソーム複製により核酸分子が細胞により安定して複製されるようになると、細胞は、細胞内に形質導入された核酸分子により「形質転換」される。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞内に導入することが可能であるすべての技法を包含する。例には、ウイルスベクターでのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、電気穿孔法(Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3)、リポフェクション(Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7)、マイクロインジェクション(Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85)、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入(Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)、直接ＤＮＡ取込み、および微粒子銃(Klein et al. (1987) Nature 327:70)が含まれるがこれらに限定されない。
【００８１】
導入遺伝子：宿主のゲノムに組み込まれている外来性核酸配列。いくつかの実施例では、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列に作動可能に連結されている調節配列（例えば、プロモーター）を含有しうる。
【００８２】
ベクター：例えば、形質転換細胞を作製するために細胞内に導入される核酸分子。ベクターは、複製起点などの、ベクターが宿主細胞で複製するのを可能にする核酸配列を含みうる。ベクターの例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外来性ＤＮＡを細胞に運び入れるウイルスが含まれるがこれらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能なマーカー遺伝子ならびに当技術分野で既知の他の遺伝子エレメントも含みうる。ベクターは、細胞に形質導入する、細胞を形質転換する、または細胞に感染し、それによって細胞にベクターによりコードされる核酸分子をおよび／またはタンパク質を発現させることができる。ベクターは場合により、核酸分子の細胞内への侵入を達成するのを助ける物質（例えば、リポソーム、およびタンパク質被覆）を含む。
【００８３】
発現：本明細書で使用されるように、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドによりコードされたｍＲＮＡの転写および安定した蓄積のこと、またはそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳のことでありうる。用語「過剰発現」は、本明細書で使用されるように、同じまたは密接に関係する遺伝子の内在性発現よりも高度な発現のことである。異種遺伝子は、その発現が密接に関係する内在性遺伝子（例えば、ホモログ）の発現よりも高度である場合には、過剰発現されている。
【００８４】
外来性の：用語「外来性の」とは、本明細書で核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および遺伝子）に適用される場合、その特定の環境または状況内では通常存在しない１つまたは複数の核酸（複数可）のことである。例えば、宿主細胞が天然のその非形質転換宿主細胞には存在しない核酸で形質転換されている場合は、その核酸は宿主細胞にとって外来性である。用語外来性のは、本明細書で使用するように、宿主細胞に既に存在する核酸に対して配列が同一であるが、宿主細胞に既に存在する同じ配列を有する核酸とは異なる細胞またはゲノム状況に位置している１つまたは複数の核酸（複数可）のことでもある。例えば、同じ配列を有する核酸が通常宿主細胞のゲノムに組み込まれているのとは異なる位置で宿主細胞のゲノムに組み込まれている核酸は、宿主細胞にとって外来性である。さらに、宿主細胞のプラスミドまたはベクターに存在する核酸（例えば、ＤＮＡ分子）は、同じ配列を有する核酸が通常、宿主細胞のゲノムにしか存在しない場合には、宿主細胞にとって外来性である。
【００８５】
配列同一性：用語「配列同一性」または「同一性」とは、本明細書で使用されるように、２つの核酸またはポリペプチド配列という文脈では、特定の比較窓にわたり最大一致するように整列させた場合に同じである２つの配列における残基のことでありうる。
【００８６】
本明細書で使用されるように、用語「配列同一性の割合」とは、比較窓における配列の一部が、２つの配列の至適整列のための基準配列（付加も欠失も含まない）と比べた場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい、比較窓にわたり２つの至適に整列させた配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することにより決定される値のことでありうる。割合は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を出し、マッチする位置の数を比較窓の中の位置の総数で割ってその結果に１００を掛けて配列同一性の割合を出すことにより、計算する。
【００８７】
比較のために配列を整列させるための方法は当技術分野では周知である。種々のプログラムおよび整列アルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列整列法および相同性計算の詳細な検討は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見ることができる。
【００８８】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Basic Local Alignment Search Tool（ブラスト（商標）、Altschul et al. (1990)）は、いくつかの配列解析プログラムに接続して使用するための国立バイオテクノロジー情報センター（Bethesda, MD）およびインターネット上を含むいくつかのソースから入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法についての説明はインターネット上、ブラスト（商標）の「ヘルプ」セクションで入手可能である。核酸配列の比較には、ブラスト（商標）（Blastn）プログラムの「ブラスト２配列」機能をデフォルトパラメータを使用して用いることができる。基準配列にはるかに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法で評価される場合には、増加する割合同一性を示すことになる。
【００８９】
本明細書で使用されるように、用語「実質的に同一の」とは、８５％を超えて同一であるヌクレオチド配列のことでありうる。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、基準配列と少なくとも８５．５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であってよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、植物中の異種核酸の存在は、核酸プローブの使用を通じて検出することができる。プローブはＤＮＡ分子でもＲＮＡ分子でもよい。ＲＮＡプローブは、当技術分野で既知の手段により、例えば、ＤＮＡ分子鋳型を使用して合成することが可能である。プローブは、異種核酸のヌクレオチド配列のすべてまたは一部および植物ゲノム由来の追加の近接するヌクレオチド配列を含有しうる。これは本明細書では「近接プローブ」と呼ばれる。追加の近接するヌクレオチド配列は、従来から理解されている通りに、植物染色体由来の追加の近接するヌクレオチド配列が異種核酸の５’側にあるのか３’側にあるのかに応じて、異種核酸の「上流」または「下流」と呼ばれる。当業者であれば認識しているように、プローブに包含するための追加の近接するヌクレオチド配列を得るプロセスはほぼ無期限に繰り返され（染色体の長さによってのみ制限される）、それによって染色体に沿って追加の核酸を同定しうる。ありとあらゆる上述の変種のプローブが本発明のいくつかの実施形態で使用しうる。
【００９１】
プローブは異種核酸のヌクレオチド配列に近接していないヌクレオチド配列を含有していてもよく、このプローブは本明細書では「非近接プローブ」と呼ばれる。非近接プローブの配列は、非近接プローブが異種核酸に遺伝的に連結されるように染色体上の異種核酸の配列の十分近くに位置する。プローブは検出される異種核酸の正確なコピーであってもよい。プローブは、検出される異種核酸を含む染色体ＤＮＡのクローン化されたセグメントに実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、またはからなる核酸分子であってもよい。
【００９２】
オリゴヌクレオチドプローブ配列は合成的に、またはクローニングにより調製しうる。適切なクローニングベクターは当業者には周知である。オリゴヌクレオチドプローブは標識してもよいし非標識でもよい。例えばおよび限定なしに、用いるヌクレオチドが、例えば、放射性３２Ｐで標識されている、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、末端デオキシトランスフェラーゼでのテーリング等による放射標識を含む、核酸分子を標識するための多種多様な技法が存在する。使用しうる他の標識には、例えばおよび限定なしに、フルオロフォア、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、等が含まれうる。代わりに、検出可能なシグナルを発する標識の単独でのまたは他の反応性薬剤と併せての使用は、受容体が結合するリガンドに置き換えられてもよく、その場合、受容体は標識されて（例えば、上に示す標識により）、単独でまたは他の試薬と併せて検出可能なシグナルを発する。例えば、Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9参照。
【００９３】
プローブは、検出される核酸（「ＤＮＡ標的」）の正確なコピーに「特異的にハイブリダイズ可能で」あるまたは「特異的に相補的で」ある核酸分子でもよい。「特異的にハイブリダイズ可能で」および「特異的に相補的で」は、安定した特異的な結合が核酸分子とＤＮＡ標的の間で起こるのに十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列に１００％相補的である必要はない。核酸分子は、特異的な結合が所望されている条件下で、例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件下で核酸の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合には、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００９４】
特定の程度の厳密性を生じるハイブリダイゼーション条件は、好まれるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションの厳密性を決定するが、洗浄回数も厳密性に影響を及ぼす。特定の程度の厳密性を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は当業者には既知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985で考察されている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらに詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出しうる。
【００９５】
本明細書で使用されるように、「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「厳密な条件」はさらなる特定のレベルの厳密性を含む。したがって、本明細書で使用されるように、「中等度の厳密性」条件は、配列ミスマッチが２５％を超える分子ではハイブリダイズしない条件であり、「中間の厳密性」の条件は、ミスマッチが１５％を超える分子ではハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件はミスマッチが１０％を超える配列ではハイブリダイズしない条件である。「超高厳密性」の条件はミスマッチが６％を超える配列ではハイブリダイズしない条件である。
【００９６】
特定の実施形態では、厳密性条件は、６×生理クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファー、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇの剪断サーモン精巣ＤＮＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ、続いて１×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ、最後に０．２×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃での１５〜３０分逐次洗浄である。
【００９７】
上で考察されたすべてのプローブに関して、プローブは追加の核酸配列、例えば、プロモーター、転写シグナル、および／またはベクター配列を含んでいてもよい。
【００９８】
最適化された：本明細書で使用されるように、タンパク質をコードする核酸という文脈では、用語「最適化された」とは、異種ヌクレオチド配列が標的宿主生物のコドンバイアスを反映するように変更されている核酸のことである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、遺伝子発現を妨害しうる遺伝子エレメントを取り除くようにさらに変更してもよい。
【００９９】
遺伝コードの重複性のせいで、複数のＤＮＡ配列が単一のアミノ酸配列をコードするように設計しうることは理解されるであろう。したがって、最適化されたＤＮＡ配列は、例えば、コドン組成がＤＮＡが発現されることになっている宿主の全体のコドン組成に類似するようにコード領域のヌクレオチド配列を最適化しつつ、過剰な制限部位および望ましくないＲＮＡ二次構造を取り除くように設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計および作製に関する指針は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１３０１６５４６号、国際特許出願第ＷＯ２０１１１４６５２４号、国際特許出願第ＷＯ１９９７０１３４０２号、ならびに米国特許第６１６６３０２号、および米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。
【０１００】
保存的置換：本明細書で使用されるように、用語「保存的置換」とは、アミノ酸残基を同じクラスの別のアミノ酸で置き換える置換のことである。非保存的アミノ酸置換とは、残基が同じクラスに分類されない置換、例えば、塩基性アミノ酸の中性または非極性アミノ酸での置換である。保存的置換を実施する目的で定義されるアミノ酸のクラスは当技術分野では既知である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の脂肪族アミノ酸の第２の異なる脂肪族アミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。特定の例では、第１のアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。疎水性脂肪族アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の芳香族アミノ酸の第２の異なる芳香族アミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。非電荷芳香族アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＰｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＰｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の疎水性アミノ酸の第２の異なる疎水性アミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。非芳香族疎水性アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の極性アミノ酸の第２の異なる極性アミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。非電荷極性アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。電荷極性アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。電荷極性アミノ酸の置換に関するさらなる例では、第１のアミノ酸がＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。正電荷（塩基性）極性アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＨｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。正電荷極性アミノ酸の置換に関するさらなる例では、第１のアミノ酸がＡｒｇまたはＬｙｓである場合、第１のアミノ酸はＡｒｇおよびＬｙｓのうちの他方のアミノ酸で置き換えうる。負電荷（酸性）極性アミノ酸の置換に関する特定の例では、第１のアミノ酸がＡｓｐまたはＧｌｕである場合、第１のアミノ酸はＡｓｐおよびＧｌｕのうちの他方のアミノ酸で置き換えうる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の電気的に中性のアミノ酸の第２の異なる電気的に中性のアミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、保存的置換は第１の非極性アミノ酸の第２の異なる非極性アミノ酸での置換を含む。例えば、第１のアミノ酸がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸で置き換えうる。
【０１０７】
多くの例で、第１のアミノ酸に取って代わる保存的置換で使用する特定の第２のアミノ酸の選択は、第１と第２のアミノ酸の両方が属する前述のクラスの数を最大にするように行うことができる。したがって、第１のアミノ酸がＳｅｒ（極性非芳香族で電気的に中性のアミノ酸）である場合、第２のアミノ酸は別の極性アミノ酸（すなわち、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕ）、別の非芳香族アミノ酸（すなわち、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔ）、または別の電気的に中性のアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒ）であってよい。しかし、第２のアミノ酸はこの場合、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＧｌｙのうちの１つであることが好ましい可能性がある。なぜならば、これらのアミノ酸は極性、非芳香族性、および電気的中立性によるすべての分類を共有しているからである。保存的置換で使用する特定の第２のアミノ酸を選択するために場合により使用しうる追加の基準は当技術分野では既知である。例えば、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＧｌｙがＳｅｒに代わる保存的置換において使用するのに利用できる場合、望ましくない架橋および／またはジスルフィド結合の形成を回避するためにＣｙｓを選択から除きうる。同様に、Ｇｌｙはアルキル側鎖を欠くので選択から除きうる。この場合、例えば、側鎖ヒドロキシル基の官能性を保持するためにＴｈｒを選択してもよい。しかし、保存的置換で使用する特定の第２のアミノ酸の選択は最終的には実践者の判断に委ねられる。
【０１０８】
ＰＵＦＡ：本明細書で使用されるように、用語「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」とは、炭素鎖長が少なくとも１６炭素（例えば、少なくとも１８炭素、少なくとも２０炭素、および２２炭素またはそれよりも多い）で、二重結合が少なくとも３個またはそれよりも多く（例えば、４またはそれよりも多い二重結合、５またはそれよりも多い二重結合、および６またはそれよりも多い二重結合）、すべての二重結合がシス配置である脂肪酸のことである。
【０１０９】
本明細書で使用されるように、用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＬＣ−ＰＵＦＡ」とは、３もしくはそれよりも多い二重結合を含有する２０もしくはそれよりも多い炭素の、または３もしくはそれよりも多い二重結合（例えば、４もしくはそれよりも多い二重結合、５もしくはそれよりも多い二重結合、および６もしくはそれよりも多い二重結合）を含有する２２もしくはそれよりも多い炭素の炭素鎖長である脂肪酸のことである。ω−６シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡには、例えばおよび限定なしに、ジホモガンマリノレン酸（Ｃ２０：３  ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ−６）、アドレン酸（ドコサテトラエン酸またはＤＴＡとも呼ばれる；Ｃ２２：４  ｎ−６）、およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５  ｎ−６）が含まれる。ω−３シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡには、例えばおよび限定なしに、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３  ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４  ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５  ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５  ｎ−３）、およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６  ｎ−３）が含まれる。ＬＣ−ＰＵＦＡには、２２炭素よりも多いおよび４個またはそれよりも多い二重結合を有する、例えばおよび限定なしに、Ｃ２８：８（ｎ−３）の脂肪酸も含まれる。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「ＰＵＦＡシンターゼ」または「ＰＦＡ」とは、ＰＵＦＡ（例えば、ＬＣ−ＰＵＦＡ）を産生する酵素、ならびに系または複合体中のそのような酵素のドメインのことである。用語ＰＵＦＡシンターゼには、例えばおよび限定なしに、ＰＵＦＡの産生のためのＰＵＦＡ  ＰＫＳ系またはＰＫＳ様系が含まれる。いくつかの特異的なＰＵＦＡシンターゼは本明細書では追加の記号により名付けられる（例えば、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５由来の「スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼ」、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３）。用語「ＰＵＦＡシンターゼ系」とは、１つまたは複数のＰＵＦＡシンターゼ（複数可）およびＰＵＦＡシンターゼの機能に影響を及ぼすことができる任意の異種アクセサリー酵素（例えば、ＰＰＴａｓｅまたはＡＣＳ）のことである。
【０１１１】
ＰＰＴａｓｅ：本明細書で使用される用語「ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ」または「ＰＰＴａｓｅ」とは、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）由来のコファクター（例えば、４−ホスホパンテテイン）をＰＵＦＡシンターゼに存在する１つまたは複数のＡＣＰドメインに移すことによりＰＵＦＡシンターゼを活性化する酵素のことである。本明細書の実施形態において利用されるＰＵＦＡシンターゼの１つまたは複数のＡＣＰドメインを活性化することができるＰＰＴａｓｅの一例は、本明細書では「ＮｏＨｅｔＩ」と名付けられたノストック（Nostoc）種のＨｅｔＩタンパク質（例えば、ＰＣＣ７１２０由来のＨｅｔＩ；以前にアナベラ（Anabaena）種ＰＣＣ７１２０と呼ばれていた）である。
【０１１２】
ＡＣＳ：本明細書で使用されるように、用語「アシルＣｏＡシンセターゼ」、「ＡＣｏＡＳ」、または「ＡＣＳ」とは、長鎖多価不飽和遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシルＣｏＡへの転換を触媒する酵素のことである。本明細書の特定の実施形態で利用され、スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ受託番号２０８８８に由来する特異的アシルＣｏＡシンセターゼは、追加の記号、例えば、「ＳｚＡＣＳ２」により言及される。
【０１１３】
植物：本明細書で使用される用語「植物」には、そのいかなる子孫、細胞、組織、種子、種子油、または部分も含まれる。
【０１１４】
形質または表現型：用語「形質」および「表現型」は本明細書では互換的に使用される。本開示の目的のため、特定の対象の形質には、例えば、油糧種子作物植物において発現することができるω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ形質が含まれる。
【０１１５】
機能性食品：本明細書で使用されるように、用語「機能性食品」とは、通常食の一部として消費される従来の食物に外見が類似していて、従来の食物の改変されていない供給源物質に典型的に存在する成分の割合の改変に基づいて栄養価および／または特定の食物利点が増強されている食物のことである。
【０１１６】
具体的に示されるまたは意味されていなければ、本明細書で使用されるように、用語「一つ（a）」、「一つ（an）」および「その（the）」は「少なくとも１つ」を示す。
【０１１７】
他の方法で具体的に説明されていなければ、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。分子生物学での共通語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見ることができる。他の方法で記述されていなければ、すべての百分率は重量百分率であり、すべての溶媒混合割合は体積割合である。すべての温度は摂氏度である。
【０１１８】
ＩＶ．異種ＰＵＦＡシンターゼ系
スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼ
本明細書の実施形態は、遺伝子改変されてＰＵＦＡシンターゼを発現する宿主生物（例えば、植物）を含む。いくつかの実施形態では、生物は異種ＰＵＦＡシンターゼ系、例えば、ＰＵＦＡシンターゼおよび少なくとも１つのそのアクセサリータンパク質を含む機能的異種タンパク質系を発現するように遺伝子改変されている。本明細書の遺伝的改変は、ＰＵＦＡシンターゼを内因的に発現する宿主生物におけるＰＵＦＡ産生を改良するためにいくつかの実施形態では使用することもできる。
【０１１９】
ＰＵＦＡシンターゼ系は一緒に作用して、トランス−シス異性化および選択された周期でのエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復プロセシングもならびに非反復プロセシングも行うことができるいくつかの多機能性タンパク質を含みうる（および単一機能タンパク質を含むことが可能である）。これらのタンパク質は本明細書ではコアＰＵＦＡシンターゼ酵素系またはコアＰＵＦＡシンターゼと呼ばれる。これらのタンパク質内に含有されるドメインおよびモチーフについての概説および詳細は、例えば、米国特許第６１４０４８６号、および米国特許第６５６６５８３号；米国特許出願公開第２００２／０１９４６４１号、米国特許出願公開第２００４／０２３５１２７号、および米国特許出願公開第２００５／０１００９９５号；国際特許公開第ＷＯ２００６／１３５８６６号；ならびにMetz et al. (2001) Science 293:290-3に見出しうる。機能的ＰＵＦＡシンターゼドメインは、単一タンパク質として（例えば、ドメインとタンパク質は同義である）または単一タンパク質中の２つまたはそれよりも多いドメインのうちの１つとして見出しうる。
【０１２０】
ＰＵＦＡシンターゼ活性を有するポリペプチド（およびそれをコードするポリヌクレオチドおよび遺伝子）の数多くの例が当技術分野では既知であり、本明細書に開示されている異種ＰＵＦＡシンターゼを含む遺伝子改変された宿主において組み合わせることができる。そのようなＰＵＦＡシンターゼタンパク質（またはドメイン）には、細菌性と非細菌性ＰＵＦＡシンターゼの両方が含まれる。非細菌性ＰＵＦＡシンターゼは真核生物ＰＦＡであってよい。ある種の細菌性ＰＵＦＡシンターゼは、例えば、米国特許出願公開第２００８／００５０５０５号に記載されている。細菌性ＰＵＦＡシンターゼ機能的ドメインならびに他のＰＫＳ系（例えば、Ｉ型反復またはモジュラー、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）および／またはＦＡＳ系由来のＰＵＦＡシンターゼ機能的ドメインまたはタンパク質と共に非細菌性ＰＵＦＡシンターゼ機能的ドメインを組み込む本発明の遺伝子改変された植物を産生することが可能である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼは、少なくとも１つのエノイルＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン；複数のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（複数可）（例えば、少なくとも１から４つ、または少なくとも５つのＡＣＰドメイン、およびいくつかの実施形態では、最大６、７、８、９，１０、または１０を超えるＡＣＰドメイン）；少なくとも２つのβケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；少なくとも１つのβケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン；少なくとも２つのＦａｂＡ様βヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；少なくとも１つの鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；および少なくとも１つのマロニルＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメインからなる群から選択される３つ、４つ、またはそれよりも多いタンパク質に典型的には含有される生物活性ドメインを含む。特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼは、デヒドラターゼ保存活性部位モチーフを含有する少なくとも１つの領域も含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系は、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類由来のＰＵＦＡシンターゼ（例えば、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３）を含む。例えば、本明細書の実施形態に従った異種ＰＵＦＡシンターゼ系は、例えばおよび限定なしに、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質を含んでいてよい。特定の例では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系は配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４を含む少なくとも１つのタンパク質を含む。特定の例では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系は配列番号１、配列番号４、配列番号７、および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４の少なくとも１つの機能的等価物を含む異種ＰＵＦＡシンターゼ系を含む。例えば、前記系は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４のバリアント、部分、断片、または誘導体を含んでいてもよく、そのようなポリペプチドはＰＵＦＡシンターゼ活性を有する。例えば、他のＰＵＦＡシンターゼポリペプチド（およびそれをコードする遺伝子）の配列は、当技術分野で利用可能な文献およびバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することが可能である。そのような配列は、例えば、既知のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列を用いて、一般公開されているデータベースのＢＬＡＳＴ検索を通じて同定してもよい。そのような方法では、同一性は、デフォルトパラメータＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのタンパク質質量マトリックスを使用するＣｌｕｓｔａｌＷアライメント法に基づかせることが可能である。
【０１２４】
さらに、本明細書に開示されるＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列を使用すれば、天然の他のＰＵＦＡシンターゼホモログを同定することが可能である。例えば、本明細書に開示されるＰＵＦＡシンターゼ核酸断片のそれぞれを使用すれば、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することが可能である。配列依存性プロトコルを使用する相同遺伝子の単離は当技術分野では周知である。配列依存性プロトコルの例には、例えばおよび限定なしで、核酸ハイブリダイゼーションの方法；核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ））の種々の使用により例証される、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法；ならびに相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法が含まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼは、異なるＰＵＦＡシンターゼ由来の１つまたは複数のドメインと組み合わされてＰＵＦＡシンターゼ活性を有する完全なＰＵＦＡシンターゼを形成するスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼドメイン（例えば、ＥＲドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、ＣＬＦドメイン、ＭＡＴドメイン、およびデヒドラターゼ保存活性部位モチーフ）を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼを含む遺伝子改変された生物は、別のＰＵＦＡシンターゼの少なくとも１つのドメインまたはその生物活性断片でさらに改変することが可能である。特定の実施形態では、ＰＵＦＡシンターゼのドメインのいずれでもその天然構造から改変して、ＰＵＦＡシンターゼ系におけるそのドメインの機能を改変するまたは増強する（例えば、その系により産生されるＰＵＦＡ種類またはその比を改変する）ことができる。
【０１２７】
ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ
ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）は、脂肪酸合成、ポリケタイド合成、および非リボソームペプチド合成に関与する酵素のファミリーである。特に、ＰＵＦＡシンターゼ酵素に存在するＡＣＰドメインは、コエンザイムＡ由来のコファクター（４−ホスホパンテテイン）のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）への結合による活性化が必要である。このコファクターの結合はＰＰＴａｓｅにより実行される。宿主生物の内在性ＰＰＴａｓｅがＰＵＦＡシンターゼＡＣＰドメインを活性化することができなければ、その機能を実行することができるＰＰＴａｓｅを提供する必要がある。
【０１２８】
ＡＣＰドメインを基質として認識することが実証されているＰＰＴａｓｅの一例は、ノストック（Nostoc）種のＨｅｔＩタンパク質である。ＨｅｔＩは、前記生物中でのある種の脂肪酸の合成の原因となることが知られているノストック（Nostoc）中の遺伝子のクラスターに存在する。Black and Wolk (1994) J. Bacteriol. 176:2282-92; Campbell et al. (1997) Arch. Microbiol. 167:251-8。ＨｅｔＩはそのクラスターに存在するタンパク質ＨｇｌＥのＡＣＰドメインを活性化する可能性がある。
【０１２９】
実施形態では、ＰＵＦＡシンターゼ系は、ＰＵＦＡシンターゼにとってアクセサリードメインまたはタンパク質として少なくとも１つのＰＰＴａｓｅまたは４’ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼドメインを含む。ＰＰＴａｓｅ活性を有するポリペプチドの数多くの例が当技術分野では知られており、使用している特定のＰＵＦＡシンターゼのＡＣＰドメインを活性化することができるのであれば、本明細書の遺伝子改変された生物において使用することができる。そのような異種ＰＵＦＡシンターゼ系に含まれてもよいポリペプチドの例には、例えばおよび限定なしに、配列番号１０（ＮｏＨｅｔＩタンパク質）によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質が含まれる。特定の例では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系には、配列番号１０によりコードされるポリペプチドが含まれる。
【０１３０】
いくつかの実施形態は、配列番号１０によりコードされるポリペプチドの機能的等価物を含む異種ＰＵＦＡシンターゼ系を含む。例えば、前記系は配列番号１０によりコードされるポリペプチドのバリアント、部分、断片、または誘導体を含んでいてもよく、そのようなポリペプチドはホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ活性を有する。例えば、他のＰＰＴａｓｅ（およびそれをコードする遺伝子）の配列は、当技術分野で利用可能な文献およびバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することが可能である。そのような配列は、例えば、既知のＰＰＴａｓｅ遺伝子またはポリペプチド配列を用いて、一般公開されているデータベースのＢＬＡＳＴ検索を通じて同定してもよい。そのような方法では、同一性は、デフォルトパラメータＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのタンパク質質量マトリックスを使用するＣｌｕｓｔａｌＷアライメント法に基づかせることが可能である。本明細書に開示されるＰＰＴａｓｅ配列を使用すれば天然の他のＰＰＴａｓｅホモログを同定することが可能である。例えば、本明細書のＰＰＴａｓｅ核酸（例えば、配列番号１０）を使用すれば相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することが可能である。
【０１３１】
前述に従えば、いくつかの実施形態では、遺伝子改変された生物（例えば、植物）および／またはその子孫、細胞、組織、もしくは部分は異種ＰＵＦＡシンターゼ（例えば、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）藻類由来のＰＵＦＡシンターゼ）および異種ＰＰＴａｓｅ（例えば、ＮｏＨｅｔＩ  ＰＰＴａｓｅ）を含む。
【０１３２】
アシルＣｏＡシンセターゼ
アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ、または代わりにＡＣｏＡＳ）タンパク質は、長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシルＣｏＡへの転換を触媒する。ＡＣｏＡＳ活性を有するポリペプチドの数多くの例が当技術分野では既知であり、本明細書の実施形態において使用することができる。例えば、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種、ＡＴＣＣ受託番号２０８８８は、配列番号１１によりコードされるポリペプチド（ＳｚＡＣＳ２タンパク質）を含む、ＰＵＦＡシンターゼの遊離脂肪酸産物をアシルＣｏＡに転換することができる１つまたは複数のＡＣｏＡＳを有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系には、例えばおよび限定なしに、配列番号１１によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質が含まれる。特定の例では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系は配列番号１１によりコードされるポリペプチドを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態は、配列番号１１によりコードされるポリペプチドの機能的等価物を含む異種ＰＵＦＡシンターゼ系を含む。例えば、前記系は配列番号１１によりコードされるポリペプチドのバリアント、部分、断片、または誘導体を含んでいてもよく、そのようなポリペプチドはアシルＣｏＡシンセターゼ活性を有する。例えば、他のＡＣｏＡＳ（およびそれをコードする遺伝子）の配列は、当技術分野で利用可能な文献およびバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することが可能である。そのような配列は、例えば、既知のＡＣｏＡＳ遺伝子またはポリペプチド配列を用いて、一般公開されているデータベースのＢＬＡＳＴ検索を通じて同定してもよい。そのような方法では、同一性は、デフォルトパラメータＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズのタンパク質質量マトリックスを使用するＣｌｕｓｔａｌＷアライメント法に基づかせることが可能である。本明細書に開示されるＡＣｏＡＳ配列を使用すれば天然の他のＡＣｏＡＳホモログを同定することが可能である。例えば、本明細書のＡＣｏＡＳ核酸（例えば、配列番号１１）を使用すれば相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することが可能である。
【０１３５】
前述に従えば、いくつかの実施形態では、遺伝子改変された生物（例えば、植物）および／またはその子孫、細胞、組織、もしくは部分は異種ＰＵＦＡシンターゼ（例えば、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種由来のＰＵＦＡシンターゼ）、異種ＰＰＴａｓｅ（例えば、ＮｏＨｅｔＩ  ＰＰＴａｓｅ）、および異種ＡＣｏＡＳ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０８８８由来のスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣｏＡＳ）を含む。
【０１３６】
機能的等価物には、基準アミノ酸配列（すなわち、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０によりコードされるポリペプチド、配列番号１１または配列番号１４によりコードされるポリペプチド）内のアミノ酸残基の付加または置換が含まれるがこれらに限定されず、この付加または置換はサイレント変化をもたらし、したがって、機能的に等価な遺伝子産物を産生する。例えば、保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似に基づいて行うことができる。
【０１３７】
ＰＵＦＡシンターゼ、ＰＰＴａｓｅ、および／またはＡＣｏＡＳに部位特異的変異を（当業者には周知のランダム変異誘発技法を使用して）加えることが可能であり、こうして得られる変異酵素をアッセイして予想される活性を確かめることができる。例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０によりコードされるポリペプチド、配列番号１１または配列番号１４によりコードされるポリペプチドを相同体および他の関係するタンパク質と整列させることができ、同一アミノ酸残基および保存された残基が示される。機能、例えば、ＰＵＦＡシンターゼ活性、ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ活性、およびアシルＣｏＡシンセターゼ活性を保持するポリペプチドを産生するために種々の位置での保存的変化を操作することが可能である。
【０１３８】
本明細書の実施形態は、例えば、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の少なくとも１つの成分をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物（例えば、植物）を提供することにより、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の発現を行う。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の少なくとも１つの成分をコードしている異種ポリヌクレオチドは、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種由来のＰＵＦＡシンターゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書の実施形態の異種ポリヌクレオチドは、例えばおよび限定なしに、配列番号１、配列番号４、配列番号７、および／または配列番号１４に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質をコードしうる。
【０１４０】
いくつかの例では、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種由来のＰＵＦＡシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および／または配列番号１３に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
特定の例では、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種由来のＰＵＦＡシンターゼをコードする異種ポリヌクレオチドは、厳密な条件（例えば、極めて厳密な条件）下で配列番号２および／または配列番号３；配列番号５および／または配列番号６；配列番号８、配列番号９、および／または配列番号１３にハイブリダイズする。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の少なくとも１つの成分をコードしている異種ポリヌクレオチドは、シアノバクテリア属ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書の実施形態の異種ポリヌクレオチドは、例えばおよび限定なしに、配列番号１０によりコードされるポリペプチド（すなわち、ＮｏＨｅｔＩ）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質をコードしうる。
【０１４３】
いくつかの例では、シアノバクテリア属ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１４４】
特定の例では、ノストック（Nostoc）ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＮｏＨｅｔＩ）をコードするポリヌクレオチドは、厳密な条件（例えば、極めて厳密な条件）下で配列番号１０にハイブリダイズする。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の少なくとも１つの成分をコードしている異種ポリヌクレオチドは、スキゾキトリウム（Schizochytrium）由来のＡＣｏＡＳをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書の実施形態の異種ポリヌクレオチドは、例えばおよび限定なしに、配列番号１１によりコードされるポリペプチド（すなわち、ＳｚＡＣＳ２）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質をコードしうる。
【０１４６】
いくつかの例では、スキゾキトリウム（Schizochytrium）（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０８８８）由来の異種ＡＣｏＡＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％）同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
特定の例では、異種ＡＣｏＡＳをコードするポリヌクレオチドは、厳密な条件（例えば、極めて厳密な条件）下で配列番号１１にハイブリダイズする。
【０１４８】
実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼの少なくとも１つの成分をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドは、スラウストキトリドスキゾキトリウム（Schizochytrium）種由来のＰＵＦＡシンターゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、シアノバクテリア属ノストック（Nostoc）由来のホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼ（ＨｅｔＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／またはスキゾキトリウム（Schizochytrium）由来のＡＣｏＡＳをコードする異種ポリヌクレオチドと一緒にまたはなしで含みうる。いくつかの例では、前述の成分をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは単一の核酸分子に存在する。いくつかの例では、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは複数の核酸分子に存在する。
【０１４９】
いくつかの実施形態は異種ＰＵＦＡシンターゼの少なくとも１つの成分をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、プラスミド）を含む。例では、そのようなベクターは、標的宿主生物において前記ポリヌクレオチドの発現を引き起こすように、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む。そのようなベクターの特定の例には、ｐＤＡＢ１０１４２９（配列番号１５）、ｐＤＡＢ１０１４５４（配列番号１６）、ｐＤＡＢ１０１４９６（配列番号１７）、ｐＤＡＢ１０９５２５（配列番号１８）、ｐＤＡＢ１０９５８４（配列番号１９）、ｐＤＡＢ１０９５８８（配列番号２０）、ｐＤＡＢ１１２２１０（配列番号２１）、ｐＤＡＢ１１２２０６（配列番号２２）、ｐＤＡＢ１０７９６２（配列番号２３）、ｐＤＡＢ１０９５９１（配列番号２４）、ｐＤＡＢ１０９５９２（配列番号２５）、ｐＤＡＢ１０７９６０（配列番号２６）、ｐＤＡＢ１１０１３２（配列番号２７）、ｐＤＡＢ１０７９６１（配列番号２８）、ｐＤＡＢ１１０１５１（配列番号２９）、ｐＤＡＢ１１２２８５（配列番号３０）、ｐＤＡＢ１１７５０１（配列番号３１）、ｐＤＡＢ１１７５０２（配列番号３２）、ｐＤＡＢ１１２２００（配列番号３３）、ｐＤＡＢ１１２２０１（配列番号３４）、ｐＤＡＢ１１２２０３（配列番号３５）、ｐＤＡＢ１１２２０５（配列番号３６）、ｐＤＡＢ１１２２０８（配列番号３７）、およびｐＤＡＢ１１２２０９（配列番号３８）などの組換え発現ベクターが含まれる。
【０１５０】
組換えＤＮＡ技術における既知の技法をある種の実施形態で使用すれば、例えばおよび限定なしに、宿主細胞内のポリヌクレオチドのコピー数を操作することにより、それらのポリヌクレオチドが転写される効率を操作することにより、得られた転写物が翻訳される効率を操作することにより、および翻訳後修飾の効率を操作することにより、異種ポリヌクレオチドの発現の制御を改良することができる。追加の例として、プロモーター配列を遺伝的に操作すれば、基準プロモーターと比べた場合に宿主における発現レベルを改良することができる。このように、核酸分子の発現を制御するのに有用な技法には、例えばおよび限定なしに、１つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組込み、ベクター安定性配列のプラスミドへの付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、およびエンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位およびシャインダルガーノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応する核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の削除が含まれる。
【０１５１】
Ｖ．遺伝子改変された生物を作製する方法
著しく高収量の１つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸を産生するために、宿主生物（例えば、植物）を遺伝子改変して生物内に異種ＰＵＦＡシンターゼ系を導入することが可能である。いくつかの実施形態では、このプロセスを用いて異種ＰＵＦＡシンターゼ系を含む遺伝子改変された生物を生産する。いくつかの例には、例えば、ＰＵＦＡシンターゼ系の最終産物、例えば、ＤＨＡおよびＥＰＡなどのＬＣ−ＰＵＦＡの産生および／または蓄積を改良するまたは増強するために、そのような遺伝的改変の有効性を改良するまたは増強する方法も含まれる。本明細書の特定の実施形態は、上述のように、１つまたは複数のスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅの発現をもたらし、異種宿主においてＰＵＦＡ産生および／または蓄積を増加する。特定の実施形態は宿主においてＡＣＳの発現ももたらす。
【０１５２】
例えばおよび限定なしに、植物を含む、遺伝子改変された生物における遺伝子発現のための方法は当技術分野では既知である。いくつかの実施形態では、発現されるＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする異種ポリヌクレオチドのコード領域は、標的宿主細胞についてコドン最適化されている。例えばおよび限定なしに、植物細胞を含む、組換え宿主細胞における遺伝子の発現は、対象のコード領域に作動可能に連結されているプロモーターおよび／または転写ターミネーターを必要とすることがある。いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする異種ポリヌクレオチドは種子特異的プロモーター（例えば、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、およびＢｎａＮａｐｉｎＣ）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする異種ポリヌクレオチドは葉特異的プロモーター（例えば、ユビキチンおよびＣｓＶＭＶ）に作動可能に連結されている。ある種の実施形態で使用しうるプロモーターの他の非限定的例には、アシルキャリアータンパク質プロモーター（国際特許公開第ＷＯ１９９２／１８６３４号）およびインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリンプロモーター（および切断型）が含まれる。例えば、Slightom et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1897-1901; Sengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-4; van der Geest et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:553-7; and Bustos et al. (1991) EMBO J. 10:1469-79参照。
【０１５３】
いくつかの実施形態は、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（例えば、プラスミド）を含む。組換えベクターは、好ましい核酸配列を操作するためのおよび／またはそのような核酸配列を宿主細胞内に導入するためのツールとして使用される工学的に操作された（例えば、人工的に作製される）核酸分子である。したがって、組換えベクターは、その中でポリヌクレオチドをクローニングする、シークエンシングする、ならびに／または、ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるおよび／もしくはそこに送達して組換え細胞を形成することによりなどの他の方法でポリヌクレオチドを操作するための使用に適切でありうる。ベクターは、クローニングされるまたは送達されるポリヌクレオチドに天然には隣接して存在しないヌクレオチド配列を含有しうる。ベクターは、前記ポリヌクレオチドに天然には隣接して存在するまたは前記ポリヌクレオチドの発現に有用である調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含有しうる。組み込まれたポリヌクレオチドは、染色体プロモーター制御下、天然のもしくはプラスミドプロモーター制御下、またはいくつかのプロモーター制御の組合せ下にあってもよい。ベクターはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、原核生物でも真核生物でもよい。ベクターは、染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として維持されてもよく、または組換え生物（例えば、微生物および植物細胞）の染色体に組み込まれてもよい。全ベクターは宿主細胞内の決まった場所に残っていてもよく、またはある種の条件下では、外来性ＤＮＡ（例えば、不必要なプラスミド配列）を削除して、後にＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを残してもよい。異種ポリヌクレオチドの単一または複数コピーが宿主ゲノムに組み込まれてもよい。本発明の組換えベクターは少なくとも１つの選択可能マーカーを含有することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、発現ベクター、例えば、植物発現ベクターである。そのような実施形態では、産生される産物（例えば、スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼ、ＮｏＨｅｔＩ、およびＳｚＡＣＳ２）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター内の調節配列にポリヌクレオチド（複数可）を作動可能に連結するように組換えベクター内に挿入することができる。種々の宿主生物および細胞の形質転換に有用なベクターは当技術分野では既知である。典型的には、ベクターは選択可能なマーカー、および所望の宿主での自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。
【０１５５】
宿主細胞の形質転換に適した方法には、プロトプラストの形質転換により（例えば、米国特許第５５０８１８４号参照）、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取込みにより（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8参照）、エレクトロポレーションにより（例えば、米国特許第５３８４２５３号参照）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌により（例えば、米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により（例えば、米国特許第５５６３０５５号、米国特許第５５９１６１６号、米国特許第５６９３５１２号、米国特許第５８２４８７７号、米国特許第５９８１８４０号、および米国特許第６３８４３０１号参照）、およびＤＮＡ被覆粒子の加速により（例えば、米国特許第５０１５５８０号、米国特許第５５５０３１８号、米国特許第５５３８８８０号、米国特許第６１６０２０８号、米国特許第６３９９８６１号、および米国特許第６４０３８６５号参照）などのＤＮＡを細胞に導入することが可能ないかなる方法も含まれる。こうした技法の適用を通じて、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む、事実上いかなる種の細胞でも安定的に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合には、トランスジェニック細胞をトランスジェニック生物中に再生することができる。これらの技法のうちのいずれでも使用して、例えば、トランスジェニック植物のゲノムにＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック単子葉植物または双子葉植物を産生することができる。
【０１５６】
発現ベクターを植物内に導入するための最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然の形質転換系に基づいている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。それぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）とアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉとＲｉプラスミドは植物の遺伝子形質転換の原因である遺伝子を担持している。Ｔｉ（腫瘍誘発）プラスミドは、形質転換された植物に移入されるＴ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含有する。Ｔｉプラスミドの別のセグメント、ｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ移入の原因である。Ｔ−ＤＮＡ領域は末端反復と境を接している。改変バイナリーベクターでは、腫瘍誘発遺伝子は削除されており、ｖｉｒ領域の機能を利用してＴ−ＤＮＡボーダー配列と境を接する外来ＤＮＡを移入する。Ｔ領域は、トランスジェニック植物および細胞の効率的な回収のための選択可能なマーカーならびにｄｓＲＮＡコード核酸などの移入のための配列を挿入するための複数のクローニング部位も含有することができる。
【０１５７】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４５３６４７５号、米国特許第４６９３９７７号、米国特許第４８８６９３７号、および米国特許第５５０１９６７号、ならびに欧州特許第０１２２７９１号参照）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターには、例えばおよび限定なしで、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42、および欧州特許第０１２０５１６号に記載されているベクター、ならびに前述のいずれかに由来するベクターが含まれる。天然に植物と相互作用するシノリゾビウム（Sinorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）、およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）などの他の細菌を改変すれば、いくつかの多様な植物への遺伝子移入を媒介することが可能である。これらの植物関連共生細菌は、武装解除されたＴｉプラスミドと適切なバイナリーベクターの両方を獲得することにより遺伝子移入に対しコンピテントになることが可能である。
【０１５８】
受容細胞に外来性ＤＮＡを提供した後、形質転換細胞は一般に、さらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改良するためには、形質転換体を生み出すために使用する形質転換ベクターと一緒に、前述のように、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を用いることを望みうる。選択可能マーカーが使用される場合、形質転換細胞は、細胞を選択剤（単数または複数）に曝露することにより潜在的に形質転換された細胞集団の中で同定される。スクリーニング可能マーカーが使用される場合、細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【０１５９】
選択剤への曝露を乗り切る細胞またはスクリーニングアッセイにおいてプラスのスコアーが出た細胞は、植物の再生を支持する培地において培養することができる。いくつかの実施形態では、いかなる適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）でも、成長調節剤などの追加の物質を含むことにより改変することができる。組織は、植物再生の試みを開始するのに十分な組織が入手可能になるまで、または各個選択の繰り返しラウンドに続いて、組織の形態が再生にとり適切になるまで（例えば、少なくとも２週間）、成長調節剤を有する基本培地上で維持し、その後苗条形成を助成する培地に移すことができる。培養物は十分な苗条形成が起こるまで定期的に移される。苗条は、形成されると、根形成を助成する培地に移される。十分な根が形成されると、苗はさらなる成長および成熟のために土壌に移すことが可能である。
【０１６０】
再生中の植物において対象の核酸分子（例えば、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする異種ポリヌクレオチド）の存在を確認するため、種々のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲ、および核酸シークエンシングなどの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）によりまたは酵素的機能によりタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ；葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ、ならびに全再生された植物の表現型の分析が含まれる。
【０１６１】
組込み事象は、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅により分析することができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み込まれている対象の核酸分子を含有すると予想される単離された宿主植物カルス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むがこれに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に説明されており（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、細胞培養物を含めて、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）またはジーマックス（G. max））または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用することができる。
【０１６２】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を使用して形成されるトランスジェニック植物は、典型的には１つの染色体に挿入された単一の組換えＤＮＡ配列を含有する。単一の組換えＤＮＡ配列は「トランスジェニック事象」または「組込み事象」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は、挿入された外来性配列についてヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物は、単一の外来性遺伝子配列を含有する独立した分離個体のトランスジェニック植物をそれ自体、例えば、Ｔ０植物に性的に交配（自家受粉）させてＴ１種子を生成することにより、得ることができる。生成されたＴ１種子の４分の１は導入遺伝子に関してホモ接合性になる。Ｔ１種子を発芽させると、典型的にはＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能にする熱増幅アッセイ（すなわち、接合状態アッセイ）を使用してヘテロ接合性について試験することが可能である苗が生じる。
【０１６３】
組換え核酸分子での植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニック事象を有する第１の植物をそのような事象に欠く第２の植物と交雑させることによりトランスジェニック植物を調製することが可能である。例えば、ＰＵＦＡシンターゼ系の成分をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド（複数可）を含む組換え核酸分子を、形質転換を受け入れられる第１の植物系統に導入してトランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交雑させて、第２の植物系統に前記ポリヌクレオチド（複数可）を遺伝子移入することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態は、宿主の１つまたは複数のオルガネラへの異種ＰＵＦＡシンターゼ系ポリペプチドの発現のターゲティングを含む。例えば、いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の発現は植物の色素体を標的にする。色素体ターゲティング配列の変種は当技術分野では既知であり、異種宿主が植物または植物細胞であり、色素体へのターゲティングが望ましい実施形態で使用することが可能である。いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の発現はサイトゾルを標的にする。いくつかの実施形態では、アシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣｏＡＳ）はサイトゾルで発現されてＬＣ−ＰＵＦＡ遊離脂肪酸をアシルＣｏＡに転換し、次にアシルＣｏＡをアシルトランスフェラーゼが利用することが可能である。いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の発現は植物の色素体とサイトゾルの両方を標的にする。
【０１６５】
特定の実施形態は、少なくとも１つのスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼのオルガネラターゲティング（例えば、植物中の色素体または葉緑体への）のＮｏＨｅｔＩ  ＰＰＴａｓｅと一緒の使用を含む。遺伝子産物の色素体または葉緑体へのターゲティングは種々のタンパク質のアミノ末端に存在するシグナル配列により制御され、シグナル配列は移入中に切断されて、成熟タンパク質を産生する。例えば、Comai et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15104-9参照。これらのシグナル配列は異種遺伝子産物に融合させて異種産物の葉緑体中への移入をもたらすことが可能である。van den Broeck et al. (1985) Nature 313:358-63。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質、および葉緑体局在性であることが知られている他の多くのタンパク質をコードするｃＤＮＡから単離することが可能である。
【０１６６】
特定の実施形態で利用される葉緑体または色素体に遺伝子を局在化させるための代わりの方法には、葉緑体または色素体形質転換が含まれる。葉緑体ＤＮＡのみが異種ＰＵＦＡシンターゼ系ポリペプチドを組み込むように改変されている組換え植物を産生することが可能である。葉緑体で機能するプロモーターは当技術分野では既知である。Hanley-Bowden et al. (1987) Trends in Biochem. Sci. 12:67-70。異種ＤＮＡが挿入されている葉緑体を含有する細胞を入手するための方法および組成物は、例えば、米国特許第５６９３５０７号および米国特許第５４５１５１３号に記載されている。
【０１６７】
組換え宿主の前述の遺伝子操作は、標準的遺伝子技法およびスクリーニングを使用して実施することが可能であり、遺伝子操作に適しているいかなる宿主細胞においても行うことができる。いくつかの実施形態では、組換え宿主は、双子葉植物と単子葉植物の両方を含む高等植物、ならびに作物植物およびその油のために使用される植物を含む消費可能植物である。したがって、さらに下に記載されているように、いかなる植物種または植物細胞でも選択することが可能である。
【０１６８】
ＶＩ．トランスジェニック植物
異種ＰＵＦＡシンターゼ系、例えば、ＰＵＦＡシンターゼおよび少なくとも１つのそのアクセサリータンパク質を含む機能的異種タンパク質系を発現しているいかなる植物または植物細胞でも本明細書の特定の実施形態に含まれる。特定の実施形態は、スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼをコードする異種ポリヌクレオチドおよびＮｏＨｅｔＩ  ＰＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含み、この植物細胞はスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＣｏＡＳをコードするポリヌクレオチドを含むこともできる。いくつかの例では、そのようなトランスジェニック植物は、宿主によるＰＵＦＡまたはＰＵＦＡシンターゼの他の生理活性産物の産生および／または蓄積を改良するために追加のポリペプチド（例えば、ＡＣｏＡＳ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＡＧＡＴ、およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ））を発現するように遺伝的にさらに改変されている。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された植物（および／またはその植物細胞）は、例えばおよび限定なしで、高等植物；双子葉植物；単子葉植物；消費可能植物（例えば、作物植物およびその油のために使用される植物）；ダイズ；ナタネ；亜麻仁；トウモロコシ；ベニバナ；ヒマワリ；タバコ；マメ科の植物（マメ科（Leguminosae）、マメ科（legume family）、エンドウマメ科、マメ科（bean family）、またはマメ科（pulse family））；ダイズ（Glycine）属の植物（例えば、Ｇ．アルビカンス（G.albicans）、Ｇ．アフィオノタ（G.aphyonota）、Ｇ．アレナリ（G.arenari）、Ｇ．アルギレア（G.argyrea）、Ｇ.カネセンス（G.canescens）、Ｇ．クランデスチン（G.clandestine）、Ｇ．カーバタ（G.curvata）、Ｇ．シルトロバ（G.cyrtoloba）、Ｇ．ファルカテ（G.falcate）、Ｇ．グラセイ（G.gracei）、Ｇ．ヒルチカウリス（G. hirticaulis）、Ｇ．ヒルチカウリス亜種レプトサ（G. hirticaulis亜種leptosa）、Ｇ．ラクトビレンス（G.lactovirens）、Ｇ．ラチフォリア（G.latifolia）、Ｇ．ラトロベアナ（G.latrobeana）、Ｇ．ミクロフィラ（G.microphylla）、Ｇ．モンティス−ダグラス（G.montis-douglas）、Ｇ．ペラトサ（G.peratosa）、Ｇ．ペスカドレンシス（G.pescadrensis）、Ｇ．ピンダニカ（G.pindanica）、Ｇ．プレニイ（G.pullenii）、Ｇ．ルビギノサ（G.rubiginosa）、Ｇ．ステノフィタ（G.stenophita）、Ｇ．シンデチカ（G.syndetika）、Ｇ．タバシナ（G.tabacina）、Ｇ．トメンテラ（G.tomentella）、Ｇ．ソジャ（G.soja）、およびＧ．マックス（G.max）（ダイズ））；ピーナツ；インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ソラマメ（Vicia faba）；およびエンドウマメ（Pisum sativum）からなる群から選択される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された植物は、医薬品、香味料、栄養補助食品、機能的食品原料成分もしくは美容活性物質として使用される化合物を産生することが知られている植物、またはこれらの化合物／薬剤を産生するよう遺伝的に操作されている植物である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された植物は、油糧種子、および／またはそこからの油が異種ＰＵＦＡシンターゼ系により産生されるＬＣ−ＰＵＦＡを含有する、油糧種子植物である。特定の実施形態では、そのような油はＰＵＦＡシンターゼの産物（例えば、ＤＨＡおよびＥＰＡ）である検出可能な量の少なくとも１つの標的または主要ＬＣ−ＰＵＦＡを含有する。いくつかの実施形態では、そのような油は、標的または主要ＬＣ−ＰＵＦＡ産物ではなく野生型植物中の内在性ＦＡＳ系によっては天然に産生されない中間産物または副産物が実質的にないことが可能である（例えば、野生型植物はＦＡＳ系により１８炭素ＰＵＦＡなどのいくつかのより短いまたは中間鎖ＰＵＦＡを産生するが、異種ＰＵＦＡシンターゼを用いた遺伝的改変の結果として植物には新たな、または追加の脂肪酸が産生されることになる）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現するトランスジェニック植物または種子は、殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫性タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を与える遺伝子）；および収量の増加、変化した脂肪酸代謝、または細胞質雄性不稔性の回復などのトランスジェニック植物における望ましい表現型に貢献する遺伝子を含むが限定されない、少なくとも１つの他のトランスジェニック事象をそのゲノムに含むこともできる。特定の実施形態では、少なくとも１つのスキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技法、または既に追加の導入遺伝子（複数可）を含む植物を用いた従来の育種によりそのような追加の導入遺伝子と組み合わされる。
【０１７３】
本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する植物の部分もいくつかの実施形態に含まれる。そのような植物部分には、例えばおよび限定なしに、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）、組織、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、および移植片を含む植物のいかなる部分でも含まれる。特定の実施形態は、本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する植物の子孫を含む。
【０１７４】
ＶＩＩ．商品生産物
本明細書の実施形態は、例えばおよび限定せずに、そこから生産される油を含む、本明細書に記載される植物、子孫、植物部分、または細胞によりまたはそれから生産される産物を含む。したがって、いくつかの実施形態は、本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系の１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含有し、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する組換え植物または種子から生産される商品生産物を含む。本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系の１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含有する商品生産物には、例えばおよび限定せずに、前記ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数を含有するミール、油、破砕または全粒穀物または種子、ならびに組換え植物または種子のミール、油、または破砕もしくは全粒穀物を含むいかなる食物産物でも含まれる。本明細書で企図されている１つまたは複数の植物商品または植物商品生産物中で本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを検出すれば、前記商品または商品生産物が異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現するトランスジェニック植物で構成されていることの事実上の証拠である。例えば、油中の混入物として本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを検出すれば、前記油が異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現するトランスジェニック植物から生産されたことの事実上の証拠である。
【０１７５】
本明細書の実施形態は、他の方法では植物種により産生されないＰＵＦＡを産生する異種ＰＵＦＡシンターゼ系の使用を手段とした、遺伝子改変された植物の成長により１つまたは複数の所望の（標的または主要な）ＰＵＦＡが濃縮された商業的に価値ある脂質の生産を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変された生物は、ＥＰＡ（Ｃ２０：５、ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６、ｎ−３）、ＤＰＡ（Ｃ２２：５、ｎ−６またはｎ−３）およびこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を生産する。本明細書のいくつかの実施形態は、これらのＰＵＦＡを含む本明細書に記載される遺伝子改変された植物から得られる油糧種子および油を特に含む。
【０１７６】
ＰＵＦＡシンターゼを内因的に含有する植物は知られておらず、したがって、本明細書の実施形態は他に類のない脂肪酸産生能力のある植物を産生する機会を提供する。いくつかの実施形態は、植物由来の脂肪酸の新規組合せを種々の比および形態で含むいくつかの「デザイナー油」のいずれか１つを創造する能力を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される異種ＰＵＦＡシンターゼ系を使用すれば、ＰＵＦＡ産生の範囲を拡大し、大部分の作物植物を成長させるのに使用されている温度範囲内でそのようなＰＵＦＡを首尾よく産生することが可能になる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、植物商品生産物は、ＰＵＦＡを合成するための系の中間または副産物が「実質的にない」。この文脈において本明細書で使用されるように、用語「実質的にない」とは、異種ＰＵＦＡ系（例えば、野生型植物でも、示されている遺伝子改変のためにレシピエントとして使用される親植物でも産生しない）の導入または存在の結果として遺伝子改変された植物（および／または植物の部分および／または種子油部分）において産生されるいかなる中間または副産物脂肪酸（非標的ＰＵＦＡ）も、例えばおよび限定なしに、全脂肪酸の１０重量％未満、全脂肪酸の９重量％未満、全脂肪酸の８重量％未満、全脂肪酸の７重量％未満、全脂肪酸の６重量％未満、全脂肪酸の５重量％未満、全脂肪酸の４重量％未満、全脂肪酸の３重量％未満、全脂肪酸の２重量％未満、全脂肪酸の１重量％未満、および全脂肪酸の０．５重量％未満である量で存在することを意味する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサン酸（Ｃ２２：６、ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５、ｎ−６））、および／またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ｎ−３））を含む。
【０１７９】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしに、重量で全脂肪酸の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、少なくとも１０％、少なくとも１０．５％、少なくとも１１％、少なくとも１１．５％、少なくとも１２％、少なくとも１２．５％、少なくとも１３％、少なくとも１３．５％、少なくとも１４％、少なくとも１４．５％、または少なくとも１５％のＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、重量で全脂肪酸の０．０１％〜１５％、０．０５％〜１０％および１％〜５％のＤＨＡから選択することが可能である。
【０１８０】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしに、重量で全脂肪酸の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、および／または少なくとも１０％のＥＰＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、重量で全脂肪酸の０．０１％〜１０％、０．０５％〜５％および０．１％〜５％のＥＰＡから選択することが可能である。
【０１８１】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしに、重量で全脂肪酸の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、および／または少なくとも１０％、のＤＰＡ（ｎ−６）を含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、重量で全脂肪酸の０．０１％〜１０％、０．０１％〜５％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜５％および０．１％〜５％のＤＰＡ（ｎ−６）から選択することが可能である。
【０１８２】
ＰＵＦＡのパーセント量は、他の方法で明言されていなければ、抽出された全脂肪酸の重量パーセントである。いくつかの実施形態では、全脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）調製物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により決定されるが、全脂肪酸の決定はこの方法に限定されない。
【０１８３】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしに、重量で全脂肪酸の少なくとも１０：１、少なくとも９．５：１、少なくとも９：１、少なくとも８．５：１、少なくとも８：１、少なくとも７．５：１、少なくとも７：１、少なくとも６．５：１、少なくとも６：１、少なくとも５．５：１、少なくとも５：１、少なくとも４．５：１、少なくとも４：１、少なくとも３．５：１、少なくとも３：１、少なくとも２．５：１、少なくとも２：１、少なくとも１．５：１、少なくとも１：１、少なくとも１：１．５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１１、少なくとも１：１２、少なくとも１：１３、少なくとも１：１４、少なくとも１：１５、少なくとも１：１６、少なくとも１：１７、少なくとも１：１８、少なくとも１：１９、少なくとも１：２０、少なくとも１：２１、少なくとも１：２２、少なくとも１：２３、少なくとも１：２４、少なくとも１：２５、少なくとも１：２６、少なくとも１：２７、少なくとも１：２８、少なくとも１：２９、または少なくとも１：３０の比のＥＰＡ：ＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、重量で全脂肪酸の１０：１、５：１〜１：１、２：１〜１：１、１〜１：３０、１：１〜１：２５、１：１〜１：２０、１：１〜１：１５、１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１〜１：３、および１：１〜１：２のＥＰＡ：ＤＨＡの比から選択することが可能である。
【０１８４】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしに、重量で全脂肪酸の少なくとも１：１、少なくとも１：１．５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、または少なくとも１：１０の比のＤＰＡ（ｎ−６）対ＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、重量で全脂肪酸の１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１〜１：３および１：１〜１：２のＤＰＡ（ｎ−６）対ＤＨＡの比から選択することが可能である。
【０１８５】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現する遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から得られる油もしくは種子は、例えばおよび限定なしで、重量で油の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のトリグリセリドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変された植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分、または種子から得られる油は、重量で油の７０％〜９９％のトリグリセリド、重量で油の７５％〜９９％のトリグリセリド、重量で油の８０％〜９９％のトリグリセリド、重量で油の８５％〜９９％のトリグリセリド、または重量で油の９０％〜９９％のトリグリセリドを含む。そのようなトリグリセリドは、異種ＰＵＦＡシンターゼ系により産生されるＬＣ−ＰＵＦＡを組み込むことができる。
【０１８６】
特定の実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系の標的産物がＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６またはｎ−３）、またはＥＰＡなどのＬＣ−ＰＵＦＡである場合、前記系を発現する遺伝子改変された植物の全脂質に相当量では存在しない中間産物および副産物には、例えばおよび限定なしで、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ；１８：３、ｎ−６）、ステアリドン酸（ＳＴＡまたはＳＤＡ；１８：４、ｎ−３）、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡまたはＨＧＬＡ；２０：３、ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ；Ｃ２０：４、ｎ−６）、エイコサトリエン酸（ＥＴＡ；２０：３、ｎ−９）、および２０：０；２０：１（△５）；２０：１（△１１）；２０：２（△８，１１）；２０：２（△１１，１４）；２０：３（△５，１１，１４）；２０：３（△１１，１４，１７）；ミード酸（２０：３；△５，８，１１）；または２０：４（△５，１，１４，１７）などの他の種々の中間または副産物が含まれる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系により産生されるＰＵＦＡは、植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から前記化合物を抽出する精製過程を通じて前記系を発現している遺伝子改変された植物から回収される。いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡは、植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分を収穫することにより回収される。いくつかの実施形態では、ＰＵＦＡは、植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分から（例えば、油糧種子から）油を収穫することにより回収される。いくつかの実施形態では、植物、その子孫、細胞、組織、もしくは部分はその自然状態で消費される、または消費可能産物にさらに加工される。
【０１８８】
本明細書のいくつかの実施形態では、異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現している遺伝子改変された植物由来の油は、料理以外のまたは食餌以外の工程および組成物に使用することができる。これらの使用のいくつかは工業上、美容上、または医療上（例えば、前記油は感染に対する防御バリアにおいて使用して移植片生存を増強することができる（米国特許第６２１０７００号））である。異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現している遺伝子改変された植物由来の油は、本発明の油が適しているいかなる適用においても使用可能である。一般に、前記油を使用すれば、潤滑剤、潤滑添加剤、金属加工油、油圧油および不燃性油圧油などの種々の適用において、例えば、鉱油、エステル、脂肪酸、または動物性脂肪に取って代わることが可能である。前記油は変性油を生産する工程において材料として使用することも可能である。油を変性するための技法の例には、分別、水素付加、油のオレイン酸またはリノレン酸含有量の変更、および当業者に既知の他の改変技法が含まれる。
【０１８９】
異種ＰＵＦＡシンターゼ系を発現している遺伝子改変された植物由来の油の美容使用の例には、化粧品組成物中の皮膚軟化剤として、ワセリン代替品として、石鹸の構成部分として、石鹸を生産するための工程における材料として、経口治療液の構成部分として、時効硬化処理組成物の構成部分として、および皮膚または毛髪エアロゾルフォーム調製物の構成部分としての使用が含まれる。
【０１９０】
以下の実施例はある特定の特長および／または実施形態を説明するために提供される。実施例は、本開示を例示される特定の特長または実施形態に限定すると解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１９１】
材料および方法
他の方法で明示していなければ、後の実施例に記載される分子生物学的および生化学的操作は、例えば、Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press;および同類のものに開示されている標準的方法により実施した。
【０１９２】
植物最適化ポリヌクレオチド
トランスジェニック植物においてＰＵＦＡシンターゼ酵素を産生するために、キャノーラコドンバイアスを有する複数のＤＮＡ配列を設計し合成した。キャノーラ（セイヨウアブラナ（Brassica napus L.））のコドン使用表は、ジェンバンクに預託されている配列（インターネット上のncbi.nlm.nih.govから入手可能）から得られるタンパク質コード配列から計算した。スケール変更したキャノーラコドンセットは、そのアミノ酸の全コドン使用の約１０％未満使用されているいかなる同義コドンも取り除いた後に計算した。コドンごとのスケール変更表示は、次の式を使用して計算した。
Ｃ１のスケール変更％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３．．．）×％Ｃ１×１００で、Ｃ１は問題のコドンであり、％Ｃ１、％Ｃ２および％Ｃ３．．．は残っている同義コドンの最初の％使用値を表す。
【０１９３】
配列番号１のＰＦＡ１タンパク質、配列番号４のＰＦＡ２タンパク質、および配列番号７のＰＦＡ３タンパク質のアミノ酸をコードするキャノーラコドン最適化ＤＮＡ配列を導き出すために、実験的に決定された（天然の）ＰＦＡ１  ＤＮＡ配列（配列番号２）、ＰＦＡ２  ＤＮＡ配列（配列番号５）、およびＰＦＡ３  ＤＮＡ配列（配列番号８）へのコドン置換が、得られたＤＮＡ配列がキャノーラ最適化コドンバイアス表の全体のコドン組成を持つように行われた。
【０１９４】
望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、長く続くＡ／ＴまたはＣ／Ｇ残基、および植物細胞におけるコード領域のｍＲＮＡ安定性、転写、または翻訳を妨げる可能性のある他のモチーフを取り除くために配列にさらに改良を加えた。所望の制限酵素認識部位を導入し、長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を取り除くために他の変更を加えた。これらの変更はすべて、キャノーラ偏向スケール変更コドン組成を保持するという制約内で行った。得られたヌクレオチドキャノーラコドン最適化ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを合成した。表１。
【０１９５】
【表１】
2016537985.tif 000027
【０１９６】
脂質抽出および分析
分離種子はＦＡＭＥ分析法により分析して、同じ条件で生育させた対照植物と比べた場合のＬＵ−ＰＵＦＡを含んだトランスジェニック植物事象（ダイズ、キャノーラ、およびシロイヌナズナ（Arabidopsis）から得られた）を同定した。ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（ＦＡＭＥ重量％）を定量化し負の対照植物と比較した。ＦＡＭＥ分析は、下記のプロトコルを使用してアッセイしたそれぞれ個別のトランスジェニック事象由来の単一の種子上で完了させるまたはバルク種子上で実施した。
【０１９７】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）およびキャノーラ種子分析。トランスジェニック種子試料（キャノーラ単一種子またはバルクシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子試料）を、鋼鉄製のボールミルを使用して、トリアシルグリセロール内部標準物質としてトリヘプタデカノイン（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ（商標）Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を含有するヘプタン中でホモジナイズした。均質化に先立って、メタノール中０．２５Ｍの新たに調製したナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液を添加した。抽出および誘導は絶えず振盪しながら４０℃で行い、ＦＡＭＥ抽出は３回繰り返し、ヘプタン層は分析に先立ってプールした。バルクシロイヌナズナ（Arabidopsis）およびキャノーラ種子分析は、それぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis）では１０ｍｇアリコートまたはキャノーラ種子では８〜１２ｍｇアリコートからなっていた。誘導体化反応を完全なまでに推進するため、バルク種子キャノーラおよびダイズ単一種子由来の油は先ずヘプタンを用いて３回抽出した。次に、アリコートの混合油抽出物をＦＡＭＥにおいて誘導体化した。反応の完全性は、４度目の抽出／誘導体化において内在性ＦＡＭＥの存在について検査することにより確認した。得られたＦＡＭＥは、Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＳＧＥ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）社製のキャピラリーカラムＢＰＸ７０（商標）（１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用してＧＣ−ＦＩＤにより分析した。それぞれのＦＡＭＥは保持時間により同定し、適切な長鎖脂肪酸（Ｎｕ-Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ  ＭＮ）を添加して、較正標準物質としてＭａｔｒｅｙａＬＬＣ（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ、ＰＡ）社製のナタネ油基準混合物の注入により定量化した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、およびキャノーラにおけるＤＨＡおよび他のＬＣ−ＰＵＦＡの産生の結果は下に記載している。
【実施例２】
【０１９８】
植物におけるＰＵＦＡシンターゼ遺伝子の発現
プロモーターおよび３’ＵＴＲに作動可能に連結された天然のおよびコドン最適化ＰＵＦＡシンターゼ系導入遺伝子（ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３）を含む植物転写単位（ＰＴＵ）を含有するバイナリーベクターを構築した。得られたバイナリーベクターはプロモーターおよび３’ＵＴＲに作動可能に連結されたＨｅｔＩ導入遺伝子を含むＰＴＵも含有していた。１つのバイナリーベクターのみがプロモーターおよび３’ＵＴＲに作動可能に連結されたＳｚＡＣＳ２導入遺伝子を含んでいた（ｐＤＡＢ１０１４２９）。ＰＵＦＡシンターゼ系とＨｅｔＩ導入遺伝子の発現を推進するために、異なるプロモーターと３’ＵＴＲ配列組合せがバイナリーベクターに組み込まれた。これらの異なる調節遺伝子エレメントの使用は、導入遺伝子の発現レベルを変化させ変えるためにＰＴＵの設計に組み込まれた。同様に、ＰＴＵは、前記ＰＴＵの配向が導入遺伝子の発現レベルを変化させたまたは変えたのかどうかを調べるために異なる配向でバイナリーベクター内に置かれた。
【０１９９】
ＰＴＵの３つの異なる配向を試験した。第１の配向に配列されたＰＴＵを含むバイナリーベクターはヘッドトゥーテールの配置に位置していた。
【０２００】
第２の配向に配列されたＰＴＵを含むバイナリーベクターは３’ＵＴＲの双方向性を利用するように構築された。ＰＦＡ１とＨｅｔＩ  ＰＴＵは単一の３’ＵＴＲを共有し、以下の配置、プロモーター：：対象の遺伝子：：３’ＵＴＲ：：対象の遺伝子：：プロモーターに方向付けた。同様に、ＰＦＡ３とＰＦＡ２  ＰＴＵは単一の３’ＵＴＲを共有し、以下の配置、プロモーター：：対象の遺伝子：：３’ＵＴＲ：：対象の遺伝子：：プロモーターに方向付けた。
【０２０１】
最後に、第３の配向はランダムＤＮＡスペーサー配列（配列番号１２）を組み込んだ。ランダムＤＮＡスペーサーは、ランダムＤＮＡスペーサーの上流に方向付けられた２つのＰＴＵとランダムＤＮＡスペーサーの下流に方向付けられた２つのＰＴＵの間に置かれる。両セットのＰＴＵはヘッドトゥーヘッドの配向で構築される。したがって、その配向は以下の通りである。←ＰＦＡ１  ＰＴＵ：：ＨｅｔＩ  ＰＴＵ→：：ランダムＤＮＡスペーサー：：←ＰＦＡ３  ＰＴＵ：：ＰＦＡ２  ＰＴＵ→。
【０２０２】
第１の配向
ｐＤＡＢ１０１４２９。ｐＤＡＢ１０１４２９プラスミド（配列番号１５）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシルＣｏＡシンセターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、切断型インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）フィトヘマグルニチン−Ｌ遺伝子プロモーター（ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２；ジェンバンク受託番号Ｘ０６３３６）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴ２Ｓ３遺伝子５’非翻訳領域（２Ｓ  ５’ＵＴＲ；ジェンバンク受託番号ＮＭ＿１１８８５０）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種多価不飽和脂肪酸シンターゼＰＦＡ１  ｖ２およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）２Ｓアルブミン遺伝子３’非翻訳領域ターミネーターｖ１（Ａｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１；ジェンバンク受託番号Ｍ２２０３５）を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種多価不飽和脂肪酸シンターゼＰＦＡ２  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種多価不飽和脂肪酸シンターゼＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。アシルＣｏＡシンセターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種アシルＣｏＡシンターゼ（ＳｚＡＣＳ−２  ｖ３）、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、ノストック（Nostoc）種４’ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＨｅｔＩ（ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３）およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。これらの５つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター（ｐＤＡＢ７３３３）のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ２、ＳｚＡＣＳ−２  ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。植物形質転換バイナリーベクターは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２；Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ  ｖ５；Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ１  ３’非翻訳領域(ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ４；Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990)、これに加えてオーバードライブ（Overdrive）などの他の調節エレメント(Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988)およびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡボーダーＡおよびＴ−ＤＮＡボーダーＢ；Gardner et al., Science 231:725-727; 1986および国際公開第ＷＯ２００１／０２５４５９  Ａ１号）も含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮ���シークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０３】
ｐＤＡＢ１０１４５４。ｐＤＡＢ１０１４５４プラスミド（配列番号１６）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。上記のこれら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０４】
ｐＤＡＢ１０１４９６。ｐＤＡＢ１０１４９６プラスミド（配列番号１７）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＴｉプラスミドｐＴｉ１５９５５オープンリーディングフレーム２３／２４  ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１  ジェンバンク受託番号ＡＦ２４２８８１．１）を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３（配列番号１３、これは配列番号１４のポリペプチドをコードする）、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ  ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。これら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０５】
ｐＤＡＢ１０９５２５。ｐＤＡＢ１０９５２５プラスミド（配列番号１８）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。これら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＰＦＡ２  ｖ１、ＰＦＡ３  ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。次に、４つのＰＴＵを含有する組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いて４つのＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０６】
ｐＤＡＢ１０９５８４。ｐＤＡＢ１０９５８４プラスミド（配列番号１９）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、セイヨウアブラナ（Brassica napus napin）遺伝子プロモーター（ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１；ジェンバンク受託番号Ｍ６４６３３．１）、セイヨウアブラナ（Brassica napus napin）遺伝子５’非翻訳領域（ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１；ジェンバンク受託番号Ｍ６４６３３．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびセイヨウアブラナ（Brassica napus napin）遺伝子５’非翻訳領域（ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１；ジェンバンク受託番号Ｍ６４６３３．１）を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、切断型インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリンプロモーター（ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリン５’非翻訳領域（ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリン３’非翻訳領域（ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、およびインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリン３’ＭＡＲ（ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）アシルキャリアータンパク質遺伝子プロモーター（ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１；国際公開第ＷＯ１９９２／１８６３４号）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）アシルキャリアータンパク質遺伝子５’非翻訳領域（ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲｖ２；国際公開第ＷＯ１９９２／１８６３４号）、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびセイヨウアブラナ（Brassica napus）アシルキャリアータンパク質遺伝子３’非翻訳領域（ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１；ジェンバンク受託番号Ｘ６４１１４．１）を含有する。これら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０７】
ｐＤＡＢ１０９５８８。ｐＤＡＢ１０９５８８プラスミド（配列番号２０）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリンプロモーター（ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）アシルキャリアータンパク質遺伝子５’非翻訳領域（ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲｖ１；国際公開第ＷＯ１９９２／１８６３４号）、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。これら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０８】
ｐＤＡＢ１１２２１０。ｐＤＡＢ１１２２１０プラスミド（配列番号２１）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。これら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＰＦＡ２  ｖ１、ＰＦＡ３  ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いて４つのＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２０９】
ｐＤＡＢ１１２２０６。ｐＤＡＢ１１２２０６プラスミド（配列番号２２）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、切断型インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリンプロモーター（ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。上記のこれら４つのＰＴＵは、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２、ＰＦＡ３  ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いて４つのＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１０】
第２の配向
ｐＤＡＢ１０７９６２。ｐＤＡＢ１０７９６２プラスミド（配列番号２３）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１１】
ｐＤＡＢ１０９５９１。ｐＤＡＢ１０９５９１プラスミド（配列番号２４）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ３とＰＦＡ２  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ３、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１２】
ｐＤＡＢ１０９５９２。ｐＤＡＢ１０９５９２プラスミド（配列番号２５）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）アシルキャリアータンパク質遺伝子５’非翻訳領域（ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲｖ２；国際公開第ＷＯ１９９２／１８６３４号）、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリン５’非翻訳領域（ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ３とＰＦＡ２  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ３、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。次に、４つのＰＴＵを含有する組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いて４つのＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１３】
ｐＤＡＢ１０７９６０。ｐＤＡＢ１０７９６０プラスミド（配列番号２６）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ１とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ３とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ３、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１４】
ｐＤＡＢ１１０１３２。ｐＤＡＢ１１０１３２プラスミド（配列番号２７）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリンプロモーター（ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ベータファゼオリン５’非翻訳領域（ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１５】
ｐＤＡＢ１０７９６１。ｐＤＡＢ１０７９６１プラスミド（配列番号２８）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ３、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ１とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ３とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ３、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１６】
ｐＤＡＢ１１０１５１。ｐＤＡＢ１１０１５１プラスミド（配列番号２９）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１７】
ｐＤＡＢ１１２２８５。ｐＤＡＢ１１２２８５プラスミド（配列番号３０）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ３を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。次に、組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１８】
ｐＤＡＢ１１７５０１。ｐＤＡＢ１１７５０１プラスミド（配列番号３１）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２；ジェンバンク受託番号Ｊ０１２６３．１、およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ３を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ダイズ（Glycine max）ベータコングリシニンアルファプライムサブユニット遺伝子プロモーターおよび５’非翻訳領域（ＳＳＰＲＯ２７４５．１；ジェンバンク受託番号ＧＵ７２３６９１．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ１とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ１はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ１とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ１、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２１９】
ｐＤＡＢ１１７５０２。ｐＤＡＢ１１７５０２プラスミド（配列番号３２）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓプロモーターＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ５’ＵＴＲｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎａＮａｐｉｎＣ  ３’ＵＴＲｖ１、およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ１、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲｖ２を含有する。ＰＦＡ１  ｖ１とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲは２つのＰＴＵの間に置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ１はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＰＦＡ３  ｖ１とＰＦＡ２  ｖ１はテールトゥーテールの配向で置かれ、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲは植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内の２つのＰＴＵの間に置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ１、ＰＦＡ２  ｖ１である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２０】
第３の配向
ｐＤＡＢ１１２２００。ｐＤＡＢ１１２２００プラスミド（配列番号３３）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２１】
ｐＤＡＢ１１２２０１。ｐＤＡＢ１１２２０１プラスミド（配列番号３４）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、レスケレーラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子プロモーターおよび５’非翻訳領域（ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ２；ジェンバンク受託番号ＡＦ３６７０５２．１）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、ならびに３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子３’非翻訳領域（ＳＳＴＥＲ２７４２．１；ジェンバンク受託番号ＡＦ３６７０５２．１）を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲ  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１、およびランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ２、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４２．１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲ  ｖ２、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２２】
ｐＤＡＢ１１２２０３。ｐＤＡＢ１１２２０３プラスミド（配列番号３５）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ダイズ（Glycine max）クニッツトリプシンインヒビター３遺伝子プロモーターおよび５’非翻訳領域（ＳＳＰＲＯ２７４３．１；ジェンバンク受託番号ＡＦ２３３２９６．１）、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ダイズ（Glycine max）クニッツトリプシンインヒビター３遺伝子３’非翻訳領域（ＳＳＴＥＲ２７４４．１；ジェンバンク受託番号ＡＦ２３３２９６．１）、ならびにランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４３．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４４．１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２３】
ｐＤＡＢ１１２２０５。ｐＤＡＢ１１２２０５プラスミド（配列番号３６）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲ  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４３．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４４．１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。その後、組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２４】
ｐＤＡＢ１１２２０８。ｐＤＡＢ１１２２０８プラスミド（配列番号３７）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４３．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４４．１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲ  ｖ１、ＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２、およびランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４３．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４４．１を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２５】
ｐＤＡＢ１１２２０９。ｐＤＡＢ１１２２０９プラスミド（配列番号３８）は３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵ、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含有している。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４３．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ１  ｖ２、およびＳＳＴＥＲ２７４４．１を含有する。ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ５’ＵＴＲ  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＢｎＡＣＰ０５  ３’ＵＴＲｖ１、およびランダムＤＮＡスペーサーを含有する。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＳＳＰＲＯ２７４５．１、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ３  ｖ２、ＰｖＰｈａｓ３’ＵＴＲ  ｖ１、およびＰｖＰｈａｓ３’ＭＡＲ  ｖ２を含有する。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ  ５’ＵＴＲ、スキゾキトリウム（Schizochytrium）種ＰＦＡ２  ｖ２、およびＡｔ２Ｓ  ＳＳＰターミネーターｖ１を含有する。ＰＦＡ１  ｖ２とＮｏＨｅｔＩ  ｖ３はヘッドトゥーヘッドの配向で置かれ、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３とＰＦＡ３  ｖ２はテールトゥーテールの配向で置かれランダムＤＮＡスペーサーを２つのＰＴＵの間に置き、ＰＦＡ３  ｖ２とＰＦＡ２  ｖ２は、植物形質転換バイナリーベクター、ｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッドの配向で置かれた。遺伝子の順番は、ＰＦＡ１  ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ  ｖ３、ＰＦＡ３  ｖ２、ＰＦＡ２  ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、前述のように、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵも含有する。組換えプラスミドは単離し、制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングを用いてＰＴＵの組込みについて試験した。
【０２２６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）形質転換
選択されたバイナリー構築物を植物形質転換のためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）株に形質転換した。形質転換のために選択された株はＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株ＥＨＡ１０５の類縁体であった。以下の２つのＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株、ＡＧＬ１およびＤＡ２５５２（国際特許公開第ＷＯ２０１２０１６２２２号参照）は、バイナリー構築物で形質転換され、制限酵素消化およびシークエンシングにより確認された。
【０２２７】
上記の植物発現エレメントの制御下、ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびＨｅｔＩ（およびいくつかの場合にはＳｚＡＣＳ２）をコードするバイナリープラスミドを宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）で形質転換されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ０事象は、基本的にClough and Bent (1998) Plant J. 16(6):735-43に記載されるフローラルディップ法を使用して生み出した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ０事象が得られて選択され、成熟するまで生育し自家受粉させた。得られたＴ１種子は収穫して蒔いた。形質転換Ｔ１苗は、ホスフィノトリシンを噴霧することにより、選択可能なマーカーとして機能的ｐａｔ遺伝子を含有する苗を選び出すことにより選択した。生存するＴ１苗由来の葉組織を試料採取し、ｐａｔ遺伝子に特異的な定量的ＰＣＲ反応により分析して、選択可能マーカー（および関連する導入遺伝子）の単一コピーを含有する苗を同定した。これらの苗は成熟するまで生育し、Ｔ２種子を収穫して、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した（全抽出可能ＦＡＭＥの％として）。
【０２２８】
キャノーラ形質転換
種子発芽。野生型キャノーラ種子（変種ＤＨ１２０７５；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ１４５６１２０／）を、１０％クロロックス（Clorox）中で１０分間表面減菌し、無菌蒸留水で３回濯いだ（種子はこの過程中鋼鉄製の漉し器に含まれる）。種子は発芽のためにフィタトレイ（phytatray）に含有される１／２ＭＳキャノーラ培地（１／２×ＭＳ、２％スクロース、０．８％寒天）にフィタトレイあたり２５種子で植え、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育箱（商標）中に置き、成長計画は２５℃に設定し、光周期は１６時間明、８時間暗で、５日間で発芽させた。
【０２２９】
前処理。５日目、約３ｍｍ長の胚軸切片を無菌的に切除し、根と苗条部分は破棄した（胚軸の乾燥は、切除過程中胚軸切片を１０ｍｌの無菌ＭＩＬＬＩＱ（登録商標）水中に置くことにより防止される）。胚軸切片は、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育箱（商標）中、成長計画は２２〜２３℃に設定し、光周期は１６時間明、８時間暗で、３日間の前処理の間カルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１（１×ＭＳ、１ｍｇ／Ｌキネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３％スクロース、０．７％ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標））上の無菌フィルター紙上に水平に置いた。
【０２３０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）との共培養。アグロバクテリウム（Agrobacterium）処理の前日、適切な抗生物質を含有するＹＥＰ培地のフラスコに播種した。胚軸切片は、乾燥を防止するために、フィルター紙から１０ｍＬの液体Ｍ培養液を含有する空の１００×２５ｍｍペトリ皿に移した。この段階でスパーテルを使用して切片をすくい取り、移した。液体Ｍ培養液はピペットで取り除き、４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液をペトリ皿に添加した（５００切片と４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液）。切片は、胚軸がアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中に浸漬したままでいられるように、ペトリ皿を定期的に旋回させて３０分間処理した。
【０２３１】
処理期間の終了時、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液はピペットで廃ビーカーに移し、オートクレーブし、破棄した（アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液はアグロバクテリウム（Agrobacterium）の異常増殖を防ぐために完全に取り除いた）。処理された胚軸は、フィルター紙付のＭＳＫ１Ｄ１を含有する元のプレートにピンセットで戻した（切片が間違いなく乾燥しないように注意を払った）。胚軸切片は対照切片と共に抑えた光強度の下で（プレートをアルミホイルで覆うことにより）Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育箱（商標）に戻し、処理された胚軸はアグロバクテリウム（Agrobacterium）と共に３日間共培養した。
【０２３２】
選択培地上でのカスル誘導。３日間の共培養後、胚軸切片はピンセットで個別にカルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ１（１×ＭＳ、１ｍｇ／Ｌキネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、２００ｍｇ／Ｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（商標）、１ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標））上に移した。胚軸切片は培地上に固着させたが、培地に包埋させなかった。
【０２３３】
選択および苗条再生。カルス誘導培地上での７日間の後、カルス化胚軸切片を選択ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ１を有する苗条再生培地１（１×ＭＳ、３ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌゼアチン、０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、２００ｍｇ／Ｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（商標）、１ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標））に移した。１４日後、苗条を有する胚軸は、増加した選択ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ３を有する再生培地２（１×ＭＳ、３ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌゼアチン、０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、２００ｍｇ／Ｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（商標）、３ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標））に移した。
【０２３４】
苗条伸長。１４日後、苗条を有する切片は苗条伸長培地ＭＳＭＥＳＨ５（１×ＭＳ、３００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、５ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、２％スクロース、０．７％ＴＣ  Ａｇａｒ（商標））に移した。既に伸長している苗条は単離し、ＭＳＭＥＳＨ５に移した。１４日後、第１ラウンドで確かに伸長した残りの苗条はＭＳＭＥＳＨ５上に置き、同一組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、残っている胚軸切片はすべて破棄した。２週間後にＭＳＢ３Ｚ１Ｈ３培地で伸長する苗条は単離しＭＳＭＥＳＨ５培地に移した。第１ラウンドにＭＳＭＥＳＨ５で確かに伸長した残りの苗条は単離し、同一組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、残っている胚軸切片はすべて破棄した。
【０２３５】
根誘導。１４日後、苗条は根誘導のためにＭＳＭＥＳＴ培地（１×ＭＳ、０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、３００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、２％スクロース、０．７％ＴＣ  Ａｇａｒ（商標））に移した。最初の移動でＭＳＭＥＳＴ培地に根を下ろさなかった苗条は、根付いた苗が得られるまで第２または第３サイクルでＭＳＭＥＳＴ培地に移した。
【０２３６】
ＰＣＲ分析。ＰＣＲ用の試料は、苗条が少なくとも１４日間ＭＳＭＥＳＨ５培地で培養された後に単離した。若芽由来の葉組織をｐａｔ選択可能マーカー遺伝子の存在についてＰＣＲにより試験した。萎黄病苗条はすべて破棄し、ＰＣＲアッセイにはかけなかった。ＰＣＲ反応に陽性である試料は保持し、その苗条はＭＳＭＥＳＴ培地に残して、根を伸長させ成長させた。ＰＣＲアッセイに従って陰性であった苗条は破棄した。ＭＳＭＥＳＨ５またはＭＳＭＥＳＴで根を下ろし、ＰＣＲ陽性であった苗は土壌への移植のために送られた。ハードニング後、Ｔ０キャノーラ苗は導入遺伝子ＰＴＵカセットのすべてを含有する事象についてさらに分析し、これらの苗は温室に移して、成熟まで生育し、Ｔ１種子を脂肪酸組成分析のために収穫した。
【０２３７】
ダイズ形質転換
子葉節ダイズ。ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃ．ｖ．，Ｍａｖｅｒｉｃｋ）のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換は、Zeng et al. (2004) Plant Cell Rep. 22(7): 478-82の修正手順によりバイナリーベクターを宿すアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して実施した。前記プロトコルは、選択剤として除草剤グルホシネートを含むように修正した。さらに、別の修正には、３ｇ／Ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）で凝固されたＢ５基本培地(Gamborg et al. (1968) Exp Cell Res. 50(1):151-8)上での殺菌したダイズ種子の発芽が含まれた。前記プロトコルの最終修正は、Zhang et al. (1999) Plant Cell Tiss. Org. 56: 37-46に記載されたように、生後５〜６日の実生から調製されアグロバクテリウム（Agrobacterium）を感染させた子葉節外植片の使用を配備した。Zeng et al. (2004)により記載されたように、共培養は共培養培地上で５日間実施した。苗条開始、苗条伸長、および発根培地には、５０ｍｇ／Ｌ  Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ（商標）、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、および５０ｍｇ／Ｌ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ（商標）を補充し、３ｇ／Ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌ（商標）で凝固した。
【０２３８】
スプリット種子ダイズ形質転換法。ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃ．ｖ．，Ｍａｖｅｒｉｃｋ）のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換は、Paz et al. (2005) Plant Cell Rep. 25:206-13の手順の修正版によりバイナリーベクターを宿すアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して実施した。手短に言えば、ダイズ種子は臍に沿った縦切込みにより半分に切断して種子を分離し種皮を取り除いた。胚軸は切除し、軸方向の苗条／芽はいずれも子葉節から取り除いた。得られた半分の種子外植片にアグロバクテリウム（Agrobacterium）を感染させた。苗条開始、苗条伸長、および発根培地には、５０ｍｇ／Ｌ  Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ（商標）、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標）、および５０ｍｇ／Ｌ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ（商標）を補充し、３ｇ／Ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌ（商標）で凝固した。グルホシネート選択を用いて、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。
【０２３９】
部分的胚軸付スプリット種子ダイズ形質転換法。ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃ．ｖ．，Ｍａｖｅｒｉｃｋ）のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換は、米国特許仮出願第６１／７３９３４９号に記載される部分的胚軸付スプリット種子外植片ダイズ形質転換プロトコルによりバイナリーベクターを宿すアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を使用して実施した。形質転換後、ダイズ組織は米国特許仮出願第６１／７３９３４９号に記載される組織培養法を使用して培養した。グルホシネート選択を用いて、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。選択された苗条は根成長のために発根培地に移し、次に小植物の気候順化のために混合土壌に移した。
【０２４０】
選択された小植物の末端小葉は、推定形質転換体を求めてスクリーニングするためにグルホシネートを用いて局所的に処理した（葉ペイント法）。スクリーニングされた小植物は温室に移し、気候順化させておき、その後耐性を再確認するためにグルホシネートを用いて葉ペイントした。これらの推定形質転換Ｔ０苗は試料採取し、分子分析を使用してＰＴＵ内の導入遺伝子の存在を確認した。同定されたＴ０苗は、脂肪酸組成分析用にＴ１種子を生産するため温室で自家受粉させておいた。
【０２４１】
トランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ１種子の脂質分析
３つの構築物、ｐＤＡＢ１０１４５４、ｐＤＡＢ１０１４９６、およびｐＤＡＢ１０７９６０由来のＴ０苗を温室において成熟するまで生育した。ＰＡＴ  ｖ５のコピーおよびＤＨＡ産生のための付随する４つの遺伝子を含有する苗を選択した。これらの苗は自家受粉させ、得られたＴ１種子は成熟して収穫した。単一の種子はＦＡＭＥ  ＧＣ−ＦＩＤにより分析して、Ｔ１ダイズ種子中のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含有量を決定した。苗あたり１２の全成熟種子は、鋼鉄製のボールとボールミル（Ｓｐｅｘ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ、ＬＬＣ）を使用する圧力と均質化を用いて種子を粉砕することにより個別に分析した。組織はヘキサンを用いて３回脱脂し、プールしたヘキサン画分は乾燥するまで蒸発させ、残留物は重量を計ってＦＡＭＥ分析のためにヘプタン中に再構成した。既知の量の残渣油は、代替物のトリヘプタデカノイン（Ｎｕ-Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）の存在下、メタノール中０．２５Ｍの新たに調製したナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）でメチル基転移させた。前記反応は軽度の熱さ（４０℃）で絶えず振盪して行い、得られたＦＡＭＥはヘプタンで抽出した。反応の完了は反応したヘプタデカノエートメチルエステル代替物の回収により確認した。ＦＡＭＥ抽出物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＳＧＥ社（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）製の１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ  ＢＰＸ  ７０キャピラリーカラムを使用してＧＣ−ＦＩＤにより分析した。それぞれのＦＡＭＥピークは、その保持時間により同定し、Ｍａｔｒｅｙａ  ＬＬＣ社（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ、ＰＡ）製のナタネ油基準混合物の注入により定量化した。較正標準物質は、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ社製のＤＨＡ（Ｃ２２：６）、ＥＰＡ（Ｃ２０：５）、ＤＰＡ（ｎ−６）（Ｃ２２：５）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、およびアラキドン酸メチルエステルの個々に添加された標準物質を含有していた。データ解析はＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ４ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。
【０２４２】
ＤＨＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡを含有するＴ２種子において全ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の６０％を占めた。２つの新規ＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）のみがＴ２ダイズ種子で検出された。ダイズ種子に存在すると予想されている脂肪酸は、全Ｃ１８脂肪酸がＬＣ−ＰＵＦＡの存在のせいで比例してより低かったこと以外、正常なレベルで検出された。他の２つの脂肪酸（γ−リノレン酸およびアラキドン酸）は、これらのトランスジェニックダイズ種子中で検出されたレベルは低かった（合わせて１％未満）。
【０２４３】
植物形質転換体の分子確認
コピー数分析およびコード領域の検出。Ｔ０苗は上記の形質転換から同定され選択された。これらの形質転換体は、導入遺伝子ＰＴＵ発現カセットのそれぞれを含有する苗を同定するためにさらに分析した。加水分解プローブアッセイは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に類似しているが、最初にＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、ＨｅｔＩ、ＳｚＡＣＳ２、およびｐａｔ導入遺伝子を求めてスクリーニングし、これらの導入遺伝子の存在およびＶｉｒＤ２アグロバクテリウム（Agrobacterium）遺伝子の非存在を確認するために実施した。アッセイは国際特許公開第ＷＯ２０１３０１６５４６号におよび国際特許公開第ＷＯ２０１１１４６５２４号に既に記載されている通りに配備した。これらの定量的ＰＣＲ研究から生じるデータを使用して、導入遺伝子存在およびコピー数を決定した。ＰＴＵのすべてを含有する事象は、Ｔ１苗に進むために選択した。
【０２４４】
キャノーラおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子におけるＰＵＦＡシンターゼタンパク質の検出。キャノーラおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）の種子試料からＰＵＦＡシンターゼポリペプチドを検出する定量的ウェスタンブロット法を開発した。完全長ＰＦＡ１およびＰＦＡ３についての抗原は、Ｎ末端ＨＩＳタグを付けて組換え的に発現され、Ｃｏｂａｌｔ親和性クロマトグラフィーによって部分的に精製された。完全長ＰＦＡ２についての抗原はＨＩＳタグを含有せず、封入体から単離された。予想されたＥＲドメインと重複したＮ末端ＰＦＡ２断片およびＰＦＡ３断片も抗原として組換え的に発現させた。これらの断片はすべて、ウサギにおけるポリクローナル抗体産生のためにゲル切片として提示された。完全長ＨｅｔＩについての抗原は、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Escherichia coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）においてＮ末端６×Ｈｉｓタグ付きで組換え的に発現させ、Ｃｏｂａｌｔ親和性クロマトグラフィーによって高度に精製した。抗原はウサギにおけるポリクローナル産生のために約２ｍｇ／ｍＬの濃度でＴＢＳバッファー可溶性タンパク質として提示された。すべての抗血清はプロテインＧ抗体親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【０２４５】
ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＨｅｔＩについての組換え参照標準物質は、Ａｒｃｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （ＤＥ３）  ＲＩＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において異種性に発現され、産生され、Ｈｉｓ−ＣｏｍＡＣ精製によって精製された。タンパク質濃度は、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を用いてインゲル定量化のためのＢＳＡ標準曲線を使用してデンシトメトリーにより決定した。
【０２４６】
種子試料は、Ｋｌｅｃｏ  Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ（商標）（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）中で２つのステンレス鋼ビーズで乾燥シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子を砕くことにより、または上記のように、バルクキャノーラ種子ＦＡＭＥ分析から得られた脱脂ケーキを加工することにより分析のために調製した。抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％  ＳＤＳ）を種子試料に添加し、試料と抽出バッファーを含むチューブを１５〜３０分間穏やかに振動させた。試料は３０００×ｇで３０分間遠心分離した。上澄みを収集して分析に使用した。
【０２４７】
種子抽出物中の全可溶性タンパク質の量はＰｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定した。試料は１．５５ｍｇ／ｍＬ全可溶性タンパク質に正規化し、レーンあたり２０μｇの全可溶性タンパク質の正規化負荷のために４０ｍＭ  ＤＴＴを有するＬＤＳ試料バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で調製した。試料は３〜８％Ｔｒｉｓ酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットはブロッキングバッファー中で遮断し、異なるＰＵＦＡシンターゼポリペプチド（ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、およびＰＦＡ３）に対する抗体で探索した。抗ウサギ蛍光標識二次抗体、ヤギ抗ウサギＡＦ  ６３３（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を検出のために使用した。ブロットは、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ(商標)（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）上で可視化した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ２種子、ダイズＴ１種子、およびキャノーラＴ１種子の成熟種子からの抽出物の得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットは、ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＨｅｔＩ特異的抗血清で探索すると、適切なサイズでバンドを生じた。
【０２４８】
事象１０１４５４［２６７］-２６７０２．００１についてのＴ１ダイズ種子抽出物中でのＰＵＦＡシンターゼポリペプチドＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＨｅｔＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット検出により、予想された分子量のバンドが生じた。
【０２４９】
その上、以下の事象、６５８０［２］-０１６．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０１７．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０１７．Ｓｘ００２；６５８０［２］-０１８．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０１９．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０２０．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０２１．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０２１．Ｓｘ００２；６５８０［２］-０２４．Ｓｘ００１；６５８０［２］-０３９．Ｓｘ００１；および６５８０［２］-０３９．Ｓｘ００２についてのＴ１キャノーラ種子抽出物中でのＰＵＦＡシンターゼポリペプチドＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、およびＨｅｔＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット検出により、予想された分子量のバンドが生じた。
【０２５０】
次に、ＰＵＦＡシンターゼ特異的タンパク質を、ポリペプチドごとに５点標準曲線（１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１２．５ｎｇおよび６．２５ｎｇ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットによって定量化した。表２および表３はそれぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis）とキャノーラの結果を要約している。
【０２５１】
【表２】
2016537985.tif 000028
【０２５２】
【表３】
2016537985.tif 000029
【実施例３】
【０２５３】
ＰＵＦＡシンターゼで形質転換されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ産生
ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子をコードする構築物を用いて生成されたトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ１事象の種子から得られたＤＨＡおよび他のＬＣ−ＰＵＦＡ油含有量の要約は、表４に示されている。ＤＨＡおよびＥＰＡ  ＨＰＬＣ保持時間は真正１４Ｃ標識標準物質を使用して同定した。図２。ＰＵＦＡの定量化は、１−１４Ｃ標識ＤＨＡ標準曲線を使用して実施した。分析されたそれぞれの事象のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量は図３に示している。これらのデータにより、構築物ＰＴＵ配置の種類ならびにＰＵＦＡシンターゼおよびＨｅｔＩ遺伝子を発現するための調節エレメントの特定の組合せの利用を使用すれば、Ｔ２シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子においてＬＣ−ＰＵＦＡを産生する得られたトランスジェニック事象の数を変更して使用できることが示されている。
【０２５４】
【表４】
2016537985.tif 000030
【０２５５】
例えば、ｐＤＡＢ１０１４５４ではすべての単一コピー事象の２２％のみがＤＨＡを産生したが、ｐＤＡＢ１０１４９６事象の６５％およびｐＤＡＢ１１２２０６事象の７９％がＤＨＡを産生した。ｐＤＡＢ１０１４５４と比べた場合、ｐＤＡＢ１０１４９６バイナリーベクターは多様化した調節エレメントを含有する。同様に、ｐＤＡＢ１０１４５４と比べた場合、ｐＤＡＢ１１２２０６構築物は多様化した調節エレメントと改変ＰＴＵ配置の両方を含有する。別の構築物、ｐＤＡＢ１０９５８４は追加の調節エレメント多様化を含有し、「植物最適化」バージョンよりはむしろＰＦＡ３遺伝子の天然コード配列バージョンも含有する。この場合、すべての単一コピー事象の８２％がＬＣ−ＰＵＦＡを産生した。
【０２５６】
調節エレメント、構築物配置のさらなる改変、および第２の配向のＰＴＵ配置における天然の遺伝子配列の使用により、すべての単一コピー事象の６１〜８０％がＬＣ−ＰＵＦＡを産生しているトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）苗を生産する構築物が得られた。第２の配向のＰＴＵ配置構築物も、Ｔ２シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子においてＬＣ−ＰＵＦＡ含有量が１％を超える事象の割合が比較的高い（４１〜６２％）トランスジェニック苗を生産した。天然（植物最適化に対して）ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子配列の存在も、１％を超えるＬＣ−ＰＵＦＡの事象の割合を改善した。例えば、天然の遺伝子配列を含有するｐＤＡＢ１０９５２５およびｐＤＡＢ１１２２１０はそれぞれ１％を超えるＬＣ−ＰＵＦＡを作る単一コピー事象の６０％および５４％を有していた。これとは対照的に、植物最適化遺伝子のすべてを含むｐＤＡＢ１０１４５４（同一フォーマットで同じ調節エレメントを使用して）は、１％を超えるＬＣ−ＰＵＦＡを作る事象の５％しかなかった。
【０２５７】
種々の構築物を使用する事象由来のＴ２種子の最大ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量は０．７１〜２．１４％の幅があった。最大ＤＨＡ含有量は０．３９〜１．５９％の幅があった。最も高いレベルのＤＨＡは、第２の配向のＰＴＵ配置の構築物、例えば、ｐＤＡＢ１０９５９１、ｐＤＡＢ１０７９６２およびｐＤＡＢ１０７９６０で得られた。これらの構築物は、４つの導入遺伝子および１つまたは３つの天然のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を推進する２つの異なるプロモーター／ターミネーター組合せを含有していた。
【０２５８】
最大ＥＰＡ含有量は、生み出されたすべての構築物および事象にわたり０〜１．１７％の幅があった。構築物ｐＤＡＢ１１２２０３（第３の配向のＰＴＵ配置）、ｐＤＡＢ１１２２００（第３の配向のＰＴＵ配置）、ｐＤＡＢ１１２２０１（第３の配向のＰＴＵ配置）およびｐＤＡＢ１０１４９６（第１の配向のＰＴＵ配置）は、他の構築物と比べて比較的高いレベルのＥＰＡを作るのに効果的であった。これらの構築物由来のＬＣ−ＰＵＦＡ産生事象はＤＨＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡの３７〜４５％）と比較して比較的高い割合のＥＰＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡの３９〜５６％）を含有したが、他の構築物は典型的にはより低い割合のＥＰＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡの９〜２７％）、およびより高い割合のＤＨＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡの６０〜７０％）を含有した。
【０２５９】
これらのデータにより、シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子において構築物配置と遺伝子調節エレメントの選択によって、両ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡとＥＰＡを産生する効率が改善されること、ならびに作物植物において構築物配置と遺伝子調節エレメントの選択を利用すれば両ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡとＥＰＡを産生する効率を高めることが可能であることが示されている。
【０２６０】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ３種子
高ＬＣ−ＰＵＦＡ産生シロイヌナズナ（Arabidopsis）事象由来のＴ２種子を植え、Ｔ２苗由来の葉組織をｐａｔ遺伝子および他の導入遺伝子についての定量的ＰＣＲ反応によって試料採取した。導入遺伝子の２コピーを含有する苗（すなわち、ホモ接合体）を同定し成熟するまで生育した。得られたＴ３種子を収穫し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。繰り返しプロモーター／ターミネーター発現エレメントを含有しすべての「植物最適化」ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子配列を使用した構築物ｐＤＡＢ１０１４５４およびｐＤＡＢ１０１４２９は、その後に続くＴ３種子世代ではＬＣ−ＰＵＦＡ形質の非常に低い安定性を示し、Ｔ３種子子孫ではＬＣ−ＰＵＦＡはほとんどまたは全く検出されなかった。異なるＰＴＵ配置および／または多様化した発現エレメントを有する構築物（ｐＤＡＢ１０９５８８、ｐＤＡＢ１０１４９６）で形質転換された他の事象は、Ｔ３種子世代で検出可能なＬＣ−ＰＵＦＡのレベルが様々であるトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統を生産した（表５、図４）。完全に多様化したプロモーター／ターミネーター組合せを有する構築物（ｐＤＡＢ１０９５８４）または第１の配向ＰＴＵフォーマットで完全に天然のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子配列を有する構築物（ｐＤＡＢ１０９５２５）由来の系統はＴ３種子世代では極めて良好な安定性を示した。多様化したプロモーター／ターミネーター組合せの使用および／または第２の配向もしくは第３の配向のＰＴＵフォーマットでの１つもしくは３つの天然のＰＵＦＡシンターゼ配列の使用を組み合わせると、Ｔ３種子世代では一貫した安定性も得られた（例えば、構築物ｐＤＡＢ１０７９６０およびｐＤＡＢ１０７９６１）。これにより、最大１．７７％ＤＨＡ、最大１．１％ＥＰＡ、および最大２．５７％全ＬＣ−ＰＵＦＡを含有する個別のＴ３ホモ接合性種子系統が得られた。
【０２６１】
【表５−１】
2016537985.tif 000031
【０２６２】
【表５−２】
2016537985.tif 000032
【０２６３】
ＤＨＡ産生導入遺伝子についてホモ接合性である例示的な個別のシロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ３系統の完全な種子脂肪酸プロファイルを、Ｔ３同胞欠損の平均脂質プロファイルと比較して、表６に示している。ＰＵＦＡシンターゼにより推進されるＬＣ−ＰＵＦＡの産生は、天然の伸長した脂肪酸、特にエイコセン酸（２２：１）の含有量の減少、ならびにオレイン酸（１８：１）およびリノール酸（１８：２）含有量のわずかな増加を伴った。飽和脂肪酸、パルミチン酸（１６：０）およびステアリン酸（１８：０）の含有量には有意な変化はなかった。
【０２６４】
【表６】
2016537985.tif 000033
【０２６５】
選択された高ＤＨＡ産生ホモ接合性Ｔ３系統を植え、これらの苗由来のＴ４種子を分析した。ｐＤＡＢ１０９５９１、ｐＤＡＢ１０９５８４、ｐＤＡＢ１０９５２５、ｐＤＡＢ１０９５９２、ｐＤＡＢ１０７９６０、およびｐＤＡＢ１０７９６１形質転換由来の１０の系統を分析した。これらの系統はＴ４種子世代においてＤＨＡ（最大１．８５％）およびＥＰＡ（最大１．００％）を産生し続け、自家受粉種子３世代を通じてω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ形質の安定な伝達を示した。
【実施例４】
【０２６６】
スキゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼで形質転換されたキャノーラ種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ産生
トランスジェニックキャノーラは、バイナリー構築物ｐＤＡＢ１０１４９６、ｐＤＡＢ１０９５８４、ｐＤＡＢ１０９５９２、ｐＤＡＢ１０７９６０、ｐＤＡＢ１０７９６１、ｐＤＡＢ１０７９６２およびｐＤＡＢ１１７５０１（すべてがＰＵＦＡシンターゼ遺伝子ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３およびノストック（Nostoc）ＰＰＴａｓｅ  ＮｏＨｅｔＩを含有する）を用いて産生し、分子確認によってＴ鎖導入遺伝子のコピーを含有することを確認した。
【０２６７】
Ｔ１種子は個々のＴ０トランスジェニックキャノーラ苗から収穫され、それぞれのＴ１種子試料由来のおおよそ１０種子のバルク種子試料を前述の通りにＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。
【０２６８】
構築物ごとに分析したＴ１試料のうち、高い割合（８１〜９３％）がＬＣ−ＰＵＦＡを含有していた。表７。キャノーラＴ１種子試料において観察された最大ＤＨＡ含有量はｐＤＡＢ１０７９６０の３．０４％であった。観察された最大ＥＰＡ含有量はｐＤＡＢ１０１４９６の１．９７％であった。最大複合ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（ＤＨＡ＋ＥＰＡ）はｐＤＡＢ１０７９６０の４．２０％であった。
【０２６９】
【表７】
2016537985.tif 000034
【０２７０】
トランスジェニック形質分離の初期徴候を得るために、選択されたＴ１種子試料由来の４８種子をＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。単一遺伝子座にＴ−ＤＮＡ挿入（複数可）を有する事象はメンデル分離によりおおよそ２５％のヌル種子を与えると予想されるであろう。ｐＤＡＢ１０１４９６事象から分析した４２のＴ１種子試料のうち、２４はＬＣ−ＰＵＦＡのない種子の１２〜３５％を有することが分かった（ヌル種子の平均割合は２４の試料すべてにわたって２４％であった。表８。最大５．４１％ＤＨＡ、最大３．７２％ＥＰＡ、および最大７．３３％混合ω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ（ＤＨＡ＋ＥＰＡ）を有する単一キャノーラＴ１種子を検出した。
【０２７１】
【表８】
2016537985.tif 000035
【０２７２】
選択されたＴ１キャノーラ種子試料を温室に植えて約６０〜７５のＴ１苗を生み出した。ＤＮＡ分析のために４〜５葉期に実生から葉試料を採取して、それぞれのＴ１分離苗におけるトランスジェニックコピー数を決定した。コピー数分析は、上記のプロトコルを使用して導入遺伝子の加水分解プローブアッセイにより実施した。これらの分析から、導入遺伝子についてホモ接合性の、ヘテロ接合性の、およびヌルの苗を同定した。サザン分析は、９系統由来のホモ接合性苗の葉試料から抽出したゲノムＤＮＡに関して、ＰＦＡ１導入遺伝子、ｐａｔ導入遺伝子（Ｔ−ＤＮＡのそれぞれの末端で）、およびプラスミド骨格由来のＳｐｅｃＲ遺伝子の存在について探索して実施した。６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００１と６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２由来のＴ１苗のサザンバンドパターンは類似しており、前記事象が６５８０［１］-０５２．Ｓｘ００１と６５８０［１］-０５７．Ｓｘ００１同様に、おそらくクローン起源であったことを示している。サザン分析の結果は表９に示している。
【０２７３】
【表９】
2016537985.tif 000036
【０２７４】
ｐＤＡＢ１０１４９６導入遺伝子についてホモ接合性のキャノーラ苗（ならびにいくつかのヘテロ接合性およびヌル苗を含む）を成熟するまで生育し、Ｔ２種子を収穫してバルク種子試料をＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。表１０。１０の選択されたｐＤＡＢ１０１４９６キャノーラ系統すべてがＴ２種子においてＤＨＡとＥＰＡを産生した。最大ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量は３．２６％ＤＨＡ（系統６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２）および１．４２％ＥＰＡ（系統６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００１）であった。前記系統中のω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡ（ＤＨＡおよびＥＰＡ）の量は全ＬＣ−ＰＵＦＡの８０〜８８％（平均８５％）であり、残りの１２〜２０％はω−６  ＤＰＡであった。Ｔ２種子におけるＰＵＦＡシンターゼ形質の予想された分離のせいで、ヘミ接合性Ｔ１苗が産生するＬＣ−ＰＵＦＡは少なかった。図５。キャノーラ系統６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２由来のホモ接合性およびヌル種子の完全なＦＡＭＥプロファイルは表１０に示している。この系統は３．３％ＤＨＡおよび１．３％ＥＰＡを産生した。アルファ−リノレン酸（Ｃ１８：３）およびリノール酸（Ｃ１８：２）はわずかに増加し、オレイン酸（Ｃ１８：１）含有量は減少していた。予想されるＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびＤＰＡに加えて、ガンマ−リノレン酸およびアラキドン酸などの低レベルの新たなω−６脂肪酸も検出可能であった（それぞれ０．４および０．７％）。
【０２７５】
【表１０】
2016537985.tif 000037
【０２７６】
バルク種子分析においてより高いレベルのＤＨＡおよびＥＰＡ産生を示したキャノーラ系統６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２からの同胞ホモ接合性およびヘミ接合性苗由来のＴ２種子バッチで単一種子ＬＣ−ＰＵＦＡ分析を実施した。図５。ホモ接合性苗由来の種子はＤＨＡ含有量が極めて均一であり、変動係数（ＣＶ）は１４％未満であった。導入遺伝子についてホモ接合性であった苗から分析した４８の個別の種子の４試料は、平均ＤＨＡ含有量３．７０％（ＳＤ＝０．４４、ＣＶ＝１４％）、３．６７％（ＳＤ＝０．３１、ＣＶ＝８％）、３．１１％（ＳＤ＝０．３６、ＣＶ＝１２％）、および３．１１％（ＳＤ＝０．３５、ＣＶ＝１１％）を有していた。ホモ接合性苗由来の種子は４８種子試料あたり平均で１５ヌル種子を含有しており、単一遺伝子座のメンデル分離により予想される１２種子の値に近かった。これらのホモ接合性苗由来の個別の種子のＤＨＡ含有量は最大値５．８１％まで変動した。図５。
【０２７７】
ｐＤＡＢ１０１４９６で形質転換された４つのキャノーラ事象から導かれるホモ接合性系統由来のＴ２種子を温室に植え生育して、Ｔ３種子を生産した。すべての系統が収穫されたＴ３種子においてＤＨＡおよびＥＰＡを産生し続けた。事象［６］-２７４．Ｓｘ００１および６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２から導かれる系統はＬＣ−ＰＵＦＡ産生が特に安定しており、個別の苗からのＴ３バルク種子測定において、それぞれ、平均３．１６％ＤＨＡ（３つのＴ２系統由来の１３苗にわたり範囲２．７３〜３．６１％）および０．７８％ＥＰＡ（範囲０．４８〜１．１３％）ならびに３．３４％ＤＨＡ（８Ｔ２系統由来の５３苗にわたり範囲２．８５〜３．８９％）および１．１２％ＥＰＡ（範囲０．７５〜１．７１％）を産生した。
【実施例５】
【０２７８】
ＰＵＦＡシンターゼで形質転換されたダイズ種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ産生
バイナリー構築物ｐＤＡＢ１０１４５４（１０１４５４［１６］-３４１．００１および１０１４５４［２６７］２６７０２．００１）、ｐＤＡＢ１０１４９６（１０１４５４［３３０］３３００７．００１、１０１４５４［３３３］３３３０８．００１、および１０１４５４［３３４］３３４０２．００１）、およびｐＤＡＢ１０７９６（１０７９６０［１２］-６２６．００１、１０７９６０［１２］-６４１．００１、１０７９６０［１２］-６４４．００１、１０７９６０［２６］-６５５．００１、および１０７９６０［２６］-７３３．００１）を使用して植物形質転換により生み出されたトランスジェニックＴ０ダイズ事象を温室において成熟するまで生育した。ｐａｔ導入遺伝子のコピーならびに付随するＰＵＦＡシンターゼおよびＨｅｔＩ導入遺伝子を含有するダイズ事象を選択した。選択されたトランスジェニック苗は自家受粉させ、得られたＴ１種子は成熟時に収穫した。単一種子が得られ、ＦＡＭＥ  ＧＣ−ＦＩＤによって分析してＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含有量を決定した。苗あたり１２のホール成熟種子を、鋼鉄製のボールとボールミルを使用して圧力と均質化で種子を粉砕することにより個別に分析した。組織はヘキサンを用いて３回脱脂し、プールしたヘキサン画分は乾燥するまで蒸発させて、残渣は重量を計り以前の実施例において記載されている通りに実施するＦＡＭＥ分析のためにヘプタン中で再構成した。トランスジェニック種子の油含有量（個々のＦＡＭＥの質量の合計を種子質量で割る）およびトランスジェニックＴ１系統により生産される種子の数は、同一条件下同一時間に温室で生育した非トランスジェニックマーベリック対照品種と有意に異なってはいなかった。選択された事象での平均および最大レベル（％）の単一Ｔ１種子ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量は表１１に要約している。ＤＨＡ含有量は最大２．０％であり、全ＰＵＦＡ含有量は最大５．１％であった。さらに、３つの新規の非内在性ＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびＤＰＡ（ｎ−６）は、Ｔ１ダイズ種子において検出された。表１１。
【０２７９】
【表１１】
2016537985.tif 000038
【０２８０】
ＤＨＡとＥＰＡはＬＣ−ＰＵＦＡを含有するＴ１種子において全ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の９０％〜９９％を占めた。最も高いＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（５．１％）は、事象１０７９６０［１２］-６２６．００１において構築物１０７９６０で達成された。
【０２８１】
ダイズ事象１０１４５４［１６］-３４１．Ｓｘ００１、ｐＤＡＢ１０１４９６｛３３０｝３３００７．００１、１０７９６０［１２］-６２６．００１、および１０７９６０［１２］-６４１．００１由来の個別のＴ１種子の完全脂質プロファイルは表１２に示している。マーベリック対照由来の２つの個別の種子を比較のために加えた。検出されたＦＡＭＥすべてを収載した。
【０２８２】
【表１２】
2016537985.tif 000039
【実施例６】
【０２８３】
トランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ２種子の脂質分析
世代をこえたＬＣ−ＰＵＦＡ形質の遺伝およびその安定性を評価するために、試験した３つの構築物由来のいくつかの代表的な事象、１０１４５４［１６］-３４１．Ｓｘ００１、１０７９６０［１２］-６４１．００１、１０７９６０［１２］-６４４．００１およびｐＤＡＢ１０１４９６｛３３４｝３３４０２．００１を、温室での生育物についてのＬＣ−ＰＵＦＡ含有量に基づいて選択した。Ｔ１種子は温室で発芽させ、Ｔ１小植物はＰＡＴ、ＰＦＡ１およびＮｏＨｅｔＩ導入遺伝子の存在についてアッセイした。導入遺伝子を有するＴ１苗は成熟するまで生育し、自家受粉から生じたＴ２種子をさらに油分析するために収穫した。それぞれのＴ２苗から、５〜１１Ｔ２種子を実施例１に記載する方法によりＦＡＭＥについて個別に分析した。Ｔ１種子結果を参考として表１３に太字で追加した。事象１０７９６０［１２］-６４４．００１およびｐＤＡＢ１０１４９６｛３３４｝３３４０２．００１のＴ１系統はホモ接合性ではなく、したがって、いくつかのＴ２分離種子はＬＣ−ＰＵＦＡを含有していなかった（最小ＬＣ−ＰＵＦＡは０である）。事象１０１４５４［１６］-３４１．Ｓｘ００１由来のＴ２種子はＴ１（３％）に匹敵する安定したＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（２．２〜５．６％）を示している。観察された平均ＰＵＦＡのわずかな増加は、導入遺伝子遺伝子座がホモ接合性苗を選択し、それによりＴ２子孫において同胞ヌル種子を排除したせいである。大多数のＬＣ−ＰＵＦＡはｎ３（比＝０．９）であり、ＥＰＡ（０．６〜２．４％）とＤＨＡ（１．３〜２．７％）の間で分かれている。事象１０７９６０［１２］-６４１．００１由来のＴ２種子は、親種子と比べて類似する傾向を示している。ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（１．５〜２．１％）はＴ１種子（３．２％）に匹敵する。事象ｐＤＡＢ１０１４９６｛３３４｝３３４０２．００１から選択されたすべての系統がＬＣ−ＰＵＦＡがないＴ２種子を有しており、Ｔ１苗が導入遺伝子遺伝子座について固定されなかったことを示している。Ｔ２種子の平均ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量（０．１〜１．１％）はＴ１（０．６％）に匹敵する。すべてのそれらの構築物では、ＬＣ−ＰＵＦＡ形質は次世代に受け継がれており、蓄積されたＬＣ−ＰＵＦＡの量に有意差はない。
【０２８４】
【表１３】
2016537985.tif 000040
【実施例７】
【０２８５】
圃場で生育したｐＤＡＢ１０１４９６由来のキャノーラ種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ産生
中等度から高レベルのＤＨＡを産生する６つのｐＤＡＢ１０１４９６（配列番号１７）キャノーラ事象（上記）から導かれるいくつかのホモ接合性Ｔ１苗由来のＴ２キャノーラ種子バッチを独立してプールした。この種子を２０１３年ミネソタおよびノースダコタの圃場に植えた。非形質転換苗由来のキャノーラ種子エントリーを対照として使用し、市販のキャノーラ系統を照合として使用した。種子エントリーごとに４つの複製試験区（１．２×６ｍ）に植え付け、成熟時に得られた種子（トランスジェニック試料の場合はＴ３種子）をそれぞれの試験区から収穫し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。それぞれの実験試験区から収穫されたキャノーラ粒子のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量は、４つの複製圃場試験区のそれぞれからのバルク粒子から試料採取した３つの１０種子アリコートのＦＡＭＥ抽出から決定した。表１４。
【０２８６】
事象６５８０［１］-０３５．Ｓｘ００２では、エントリーあたり４つの圃場試験区により、最大ＤＨＡおよびＥＰＡ含有量はそれぞれ４．２７％および０．６５％であった。個別の試験区からの最大ＤＨＡ含有量は４．５４％であった。圃場における植付けのための事象ごとにひとまとめにされた同一Ｔ２種子系統も、得られるＴ３種子のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量を比較するために温室で生育した。圃場で生育された上位４つのｐＤＡＢ１０１４９６系統のＤＨＡ含有量は、温室で生育した等価な系統よりも平均で２２％高かった。表１４。
【０２８７】
【表１４】
2016537985.tif 000041
【０２８８】
非トランスジェニックＤＨ１２０７５苗と比べてＤＨＡを産生するトランスジェニックキャノーラ系統の穀物収量に有意差はなかった。表１５。圃場で生育したすべての系統が、４０％ｇ油／ｇ種子を超える平均油含有量を有する種子を生産した。種子の葉緑素含有量で、または油抽出後のグラムミールあたりの％種子タンパク質でトランスジェニックと非トランスジェニック対照の間に有意差はなかった。開花期と成熟期はトランスジェニック系統と対照苗の間で変化はなかった。
【０２８９】
【表１５】
2016537985.tif 000042
【０２９０】
野外試験からの穀物バッチはプールし、粉砕してＬＣ−ＰＵＦＡ含有油を抽出し、前記油は標準的方法を使用して、精製、漂白および脱臭を通じて加工した。種子の２つのバッチを加工して、３．０２％ＤＨＡおよび１．０％ＥＰＡを含有する１．２ｋｇのＲＢＤ油ならびに４．１％ＤＨＡおよび０．７％ＥＰＡを含有する１．０ｋｇのＲＢＤ油を産した。これにより、ＰＵＦＡシンターゼおよびＨｅｔＩを発現しているトランスジェニックキャノーラ苗からの穀物を加工すれば、ＤＨＡおよびＥＰＡが高濃縮されたキャノーラ油を生産可能であることが実証されている。
【実施例８】
【０２９１】
ｐＤＡＢ１０７９６０キャノーラ事象での複数の種子世代にわたるＬＣ−ＰＵＦＡ形質安定性
プラスミドｐＤＡＢ１０７９６０では、シロイヌナズナ（Arabidopsis）で試験した場合、多様化したプロモーター／ターミネーター組合せの使用と３つの天然のＰＵＦＡシンターゼ配列の第２の配向のＰＴＵフォーマットでの使用を組み合わせるとＴ３種子世代ではＬＣ−ＰＵＦＡ形質が一貫して安定した。表５。ｐＤＡＢ１０７９６０で生じたキャノーラ事象は、自家受粉作物種子３世代にわたるＬＣ−ＰＵＦＡ形質安定性について同様に試験した。
【０２９２】
前述の通りにＴ１種子の単一種子分析により選択された９つのｐＤＡＢ１０７９６０キャノーラ事象由来のＴ１種子を温室に植えた。ｐＤＡＢ１０７９６０導入遺伝子についてホモ接合性であり単一メンデル遺伝子座として分離している苗を成熟するまで生育し、Ｔ２種子を苗から収穫し、種子試料をＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。９つの選択されたｐＤＡＢ１０７９６０キャノーラ事象由来の苗すべてがＴ２種子においてＤＨＡおよびＥＰＡを産生した。表１６。７事象（１１３苗）由来のＴ２種子を温室に植え、成熟するまで生育し、Ｔ３種子をこれらの苗から収穫した。種子試料は、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量についてそれぞれの子孫苗から再び分析した。７つの選択されたｐＤＡＢ１０７９６０事象由来の１１３のＴ２キャノーラ苗すべてがＴ３種子においてＤＨＡおよびＥＰＡを産生した。表１６。６つの事象（１３７苗）由来のＴ３種子を温室に植え、成熟するまで生育し、Ｔ４種子をこれらの苗から収穫した。６つの選択されたｐＤＡＢ１０７９６０事象由来の１３７のキャノーラＴ３苗すべてがＴ４種子においてＤＨＡおよびＥＰＡを産生した。表１６。試験した６事象のうちの５つがそれぞれの種子世代において類似する高レベルのＤＨＡを維持し、複数事象にわたるＤＨＡ形質安定性が実証された。
【０２９３】
【表１６】
2016537985.tif 000043
【０２９４】
Ｔ４種子世代まで持ち込まれた６つの単一遺伝子座ｐＤＡＢ１０７９６０キャノーラ事象における導入遺伝子コピー数は前述の通りに決定した。事象１０７９６０［６］-１０６、１０７９６０［６］-１０７、１０７９６０［７］-１１１、および１０７９６０［６］-３５３はすべての導入遺伝子の２コピーを含有しており、事象１０７９６０［７］-０８５および１０７９６０［６］-３５２はすべての導入遺伝子（ＰＦＡ１、ＰＦＡ２、ＰＦＡ３、ＮｏＨｅｔＩ）の１コピーを含有していた。したがって、ＬＣ−ＰＵＦＡ形質は導入遺伝子セットの１コピーまたは２コピーで送達され、３種子世代にわたり安定したままであった。
【０２９５】
２つの異なる事象（１０７９６０［７］-０８５および１０７９６０［６］-３５３）から導かれる２つのＴ３苗由来のバルクＴ４種子試料の完全なＦＡＭＥプロファイルを表１７に示している。これらの種子は、それぞれ４．４％および４．６％ＤＨＡ、ならびに０．６％および０．７％ＥＰＡを含有していた。オレイン酸（Ｃ１８：１）含有量は付随減少しており（−８％）、リノール酸（１８：２）含有量はわずかに増加しており（＋２％）、その他の点ではプロファイルは新たなＬＣ−ＰＵＦＡの存在により著しく変化することはなかった。予想されたＬＣ−ＰＵＦＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびＤＰＡ（n−６）に加えて、低レベルの新たなω−６脂肪酸、ガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３）およびアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４）も検出可能であった（総計約１％）。
【０２９６】
【表１７】
2016537985.tif 000044
【実施例９】
【０２９７】
圃場で生育されたｐＤＡＢ１０７９６０由来のＴ４キャノーラ種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ産生
約３％ＤＨＡを産生している６つの異なるｐＤＡＢ１０７９６０キャノーラ事象から導かれるホモ接合性Ｔ２苗由来のＴ３キャノーラ種子バッチ（上記）は独立してプールした。この種子は２０１４年にノースダコタの２つの場所の圃場に植えた。非形質転換ＤＨ１２０７５苗由来のキャノーラ種子エントリーは対照として使用し、市販のキャノーラ系統は照合として使用した。種子エントリーごとに４つの複製試験区（１．２×６ｍ）に植え付け、得られた種子（トランスジェニック試料ではＴ４種子）をそれぞれの試験区から収穫し、前述の通りに、ＦＡＭＥ分析によりＬＣ−ＰＵＦＡ含有量について分析した。４つの複製圃場試験区のそれぞれからのバルク粒子から試料採取した３つの１０種子技術的複製物でＦＡＭＥ抽出を実施した。表１８。
【０２９８】
【表１８】
2016537985.tif 000045
【０２９９】
最大ＤＨＡとＥＰＡ含有量（エントリーあたり４試験区の平均）は、現場１で事象１０７９６０［６］-３５３および１０７９６０［６］-１０６ではそれぞれ３．９８％および０．８８％であった。個別の試験区からの最大ＤＨＡ含有量は事象１０７９６０［６］-３５３では現場１で４．６９％であった。圃場に植えるため事象ごとにひとつにまとめられた同一Ｔ３種子系統は温室でも生育し、得られたＴ４種子のＬＣ−ＰＵＦＡ含有量を比較した。表１６。両現場における６つの圃場生育ｐＤＡＢ１０７９６０事象すべてにわたる平均ＤＨＡ含有量は３．２４％であり、温室において生育された等価の事象すべてにわたる平均ＤＨＡ含有量は３．０６％であった。したがって、圃場生育キャノーラのＤＨＡ含有量は、等価の温室生育材料よりも平均で＋６％高かった。
【図１ａ】
2016537985.tif 000046
【図１ｂ】
2016537985.tif 000047
【図１ｃ】
2016537985.tif 000048
【図２】
2016537985.tif 000049
【図３】
2016537985.tif 000050
【図４】
2016537985.tif 000051
【図５】
2016537985.tif 000052
【配列表】
2016537985000001.app
【国際調査報告】
2016537985.tif 000053
2016537985.tif 000054
2016537985.tif 000055
2016537985.tif 000056
2016537985.tif 000057
2016537985.tif 000058
2016537985.tif 000059
2016537985.tif 000060
2016537985.tif 000061