(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系薬剤の薬効低下をインビトロで防止する方法。
【請求項２】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効低下をインビトロで防止する方法。
【請求項３】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効低下をインビトロで防止する方法。
【請求項４】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系薬剤の薬効をインビトロで回復する方法。
【請求項５】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤に対し薬剤耐性を示す真菌あるいはピリミジン系抗悪性腫瘍剤に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、該ピリミジン抗真菌剤または該ピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効をインビトロで回復する方法。
【請求項６】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）またはフルシトシン（５−ＦＣ）に対し薬剤耐性を示す真菌において、６−ＡＵまたは５−ＦＣの薬効をインビトロで回復する方法。
【請求項７】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、５−ＦＵの薬効をインビトロで回復する方法。
【請求項８】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
の５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
が供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定する工程を含む、ピリミジン系薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法であって、
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
が供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定し、該供試化合物の活性代謝物が脱リン酸化を受け難い化合物を選抜する工程を含む、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
(i)配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)前記(i)のポリペプチドと９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド、および、
(iii)前記(i)のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド；
と５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを含む、請求項８または請求項９もしくは１０に記載のスクリーニング方法で使用するための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たなピリミジン特異的５’―ヌクレオチダーゼに関し、さらに詳しくは、該ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの阻害により、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法あるいは低下したピリミジン系薬剤の薬効を回復させる方法、さらに薬剤耐性の出現頻度が低減されたピリミジン系薬剤をスクリーニングする方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、真菌や悪性腫瘍細胞の増殖に対して阻害効果を示す多くのピリミジン系の薬剤が知られている。例えば、フルシトシン（５−ＦＣ）は、真菌の臓器感染症に対し有効性を示すことが確認されている数少ない抗真菌剤の一つである。また、フルオロウラシル（５−ＦＵ）やその類縁体であるテガフール（ＴＧＦ）、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）といった薬剤は、種々の癌に対し臨床的に著明な効果を奏する。しかしながら、これらの薬剤に関しては耐性菌あるいは耐性細胞が容易に出現し、薬効が低下することが問題となっている（Ｍａｄｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８）、Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，３９３−４００（１９９４））。特にフルシトシンに関しては、薬剤耐性菌の出現が主原因となりその使用が制限されている。
【０００３】
一部の抗悪性腫瘍剤については、多剤耐性タンパク質：ＭＲＰ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等の薬剤排出ポンプの発現が薬剤耐性形質の獲得と密接に関係している（Ｈｉｐｆｎｅｒ  Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４６１，３５９−３７６（１９９９））。
【０００４】
しかしながら、ピリミジン系の薬剤については、薬剤耐性の生じる詳細な機作は未だ解明されておらず、したがって、その有効な解決方法も知られていない。
【０００５】
一方、ＲＮＡポリメラーゼに対する数多くの伸長促進因子が知られているが、その一つにＳ−ＩＩがある。Ｓ−ＩＩは転写産物を正常な長さに進展するのに重要な役割を果たしていると考えられている（Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，１５８２−１５８８（１９７９））。また、哺乳類から酵母、昆虫および植物に至る真核生物で広範に発現しており、その配列は高度に保存されている。
【０００６】
ところで、酵母におけるＳ−ＩＩ発現欠損株は、ヌクレオチド三リン酸合成経路阻害剤の一つであり、上記ピリミジン系の薬剤の一例である６−アザウラシル（６−ＡＵ）に高い感受性を示すことが知られている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０，８９９１−８９９５（１９９５））。６−ＡＵは以下の機序により酵母の増殖を阻害する。すなわち、６−ＡＵは酵母内でリボシル化およびリン酸化を受け、活性体の６−アザウリジン−リン酸（６−ａｚａＵＭＰ）へと変換される。６−ａｚａＵＭＰは、それぞれプリン合成経路およびピリミジン合成経路の鍵酵素として知られている、イノシン−リン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素とオロチジル酸脱炭酸酵素活性を阻害し、その結果として、ヌクレオチド三リン酸の合成が抑制され、転写伸長反応が阻害される。以上の事実から、６−ＡＵの代謝に関与する何らかの因子がＳ−ＩＩによって発現制御を受けるものと考えられる（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０，８９９１−８９９５（１９９５））。
【０００７】
一方、Ｓ−ＩＩ発現欠損株の６−ＡＵに対する感受性を抑制する因子としてＳＤＴ１（ＳＳＭ１とも称される）が知られている（Ｓｈｉｍｏａｒａｉｓｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２９６２３−２９６２７（２０００））が、その生物学的機能については不明であるとされている。しかしながら、ＳＤＴ１が上述の通りＳ−ＩＩ発現欠損株の６−ＡＵに対する感受性を抑制すること、また、ＳＤＴ１発現欠損株が６−ＡＵに関して感受性を示す（Ｓｈｉｍｏａｒａｉｓｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２９６２３―２９６２７（２０００））ことから、ＳＤＴ１機能を抑制することにより６−ＡＵに対する感受性の低下を回復できると考えられる。
【０００８】
したがって、ＳＤＴ１の機能が解明できれば、上述のピリミジン系薬剤に関して問題となっている薬剤耐性を克服する新たな方法が提示されることが期待できると考えた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ＳＤＴ１の機能を明らかにすることにより、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性を解決する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者は、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母は、野生株と比較して、ピリミジン系薬剤に対する感受性が極端に低下する一方、イノシン５’−モノリン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素阻害剤であるマイコフェノール酸（ＭＰＡ）に対しては野生株とほぼ同等の感受性を示すことを見出した。また、該ＳＤＴ１過剰発現株の抽出液には、野生株のそれと比較して非常に高いウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）脱リン酸化活性（ＵＭＰａｓｅ活性）が観察されることを見出した。
【００１１】
さらに本発明者は、遺伝子工学的手法を用いて組換えＳＤＴ１を発現・精製し、ＳＤＴ１が、ピリミジン５’−リボヌクレオチドを良好に加水分解する一方、ピリミジン５’−デオキシリボヌクレオチドに対しては極めて弱い加水分解活性しか示さず、またプリン５’−リボヌクレオチドとプリン５’−デオキシリボヌクレオチドについても弱い加水分解活性しか示さないという基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼであることを見出した。このような基質特異性を示す５’−ヌクレオチダーゼは現在知られていない。
【００１２】
以上の結果により、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼであるＳＤＴ１の過剰発現が、抗真菌剤に関して臨床現場において問題となっている薬剤耐性の一因であると考えられる。さらに、抗真菌剤に限らず、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性は、ＳＤＴ１と同じ基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの過剰発現により生じていると考えられる。
【００１３】
これらの知見に基づき、本発明者は、（１）ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを阻害する手段を講じることにより、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法、あるいは該ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法、ならびに（２）真菌内あるいは悪性腫瘍細胞内で代謝されリン酸化をされたピリミジン系薬剤の活性代謝物が、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼによる脱リン酸化を受けないような薬剤を選抜する工程を含む、ピリミジン系薬物をスクリーニングする方法、を見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
１．下記▲１▼から▲３▼の基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼ；
▲１▼ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
▲２▼デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
▲３▼プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す。
【００１５】
２．  （１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、および、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド。
【００１６】
３．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法。
４．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効低下を防止する方法。
５．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効低下を防止する方法。
【００１７】
６．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、該ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法。
7．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤に対し薬剤耐性を示す真菌あるいはピリミジン系抗悪性腫瘍剤に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、該ピリミジン抗真菌剤または該ピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効を回復する方法。
８．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）またはフルシトシン（５−ＦＣ）に対し薬剤耐性を示す真菌において、６−ＡＵまたは５−ＦＣの薬効を回復する方法。
９．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、５−ＦＵの薬効を回復する方法。
【００１８】
１０．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
１１．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物。
１２．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する医薬組成物。
【００１９】
１３．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系薬剤の薬効低下防止剤。
１４．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系抗真菌剤あるいはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効低下防止剤。
１５．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）、またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効低下防止剤。
【００２０】
１６．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系薬剤の薬効回復剤。
１７．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効回復剤。
１８．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）、またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効回復剤。
【００２１】
１９．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系薬剤。
２０．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系抗真菌剤。
２１．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つと６−アザウラシル（６−ＡＵ）またはフルシトシン（５−ＦＣ）とを含有するピリミジン系抗真菌剤。
【００２２】
２２．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
２３．  １０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つとフルオロウラシル（５−ＦＵ）とを含有するピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
【００２３】
２４．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系薬剤の薬効低下防止剤。
２５．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系薬剤の薬効回復剤。
２６．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系抗真菌剤。
２７．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
【００２４】
２８．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドが供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定する工程を含む、ピリミジン系薬剤のスクリーニング方法。
２９．  ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法であって、１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドが供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定し、該供試化合物の活性代謝物が脱リン酸化を受け難い化合物を選抜する工程を含む、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法。
【００２５】
３０．  ２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物。
３１．  ２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有する医薬組成物。
３２．  ２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、およびそれらの水和物を少なくとも一つ含有する抗真菌剤あるいは抗悪性腫瘍剤。
【００２６】
３３．  １．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドと５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを含む、１０．または２８．もしくは２９．に記載のスクリーニング方法で使用するための試薬キット。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼは、ヌクレオチドのリン酸エステル結合加水分解して、リン酸とヌクレオシドを生じさせる活性を有する、５’−ヌクレオチダーゼ（ＥＣ  ３．１．３．５）に属する。
さらに、本発明におけるピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼとは、ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）に対しては強い加水分解活性を示す一方、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド、アデニンもしくはグアニンを塩基として有するプリンヌクレオチド、ウリジン−２’（３’）モノリン酸（２’（３’）―ＵＭＰ）、およびアデノシン−２’（３’）モノリン酸（２’（３’）―ＡＭＰ）については弱い加水分解活性しか示さない、加水分解酵素あるいは脱リン酸化酵素を意味する。本明細書においては、以降、特にことわりが無い限り、単に、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼと称した場合も、上述の基質特異性を示す、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを指すものとする。
【００２８】
５’−ヌクレオチダーゼ活性は、既に文献にて報告されている５’−ヌクレオチダーゼの活性測定方法の中から、適当な方法を選択して測定することができる（Ｗｉｄｎｅｌｌ  Ｃ．Ｃ．,Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２，３６８−３７４（１９７３）、Ａｍｉｃｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．  ４１９，２６３−２６７（１９９７）等）。基質の種類以外は同じ条件にて活性測定を行った場合、５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰを基質とした場合の活性と比較して、好ましくは１／１０以下、さらに好ましくは１／２０以下、の活性しか示さない基質については、５’−ヌクレオチダーゼが弱い活性しか示さない基質と判断できる。
【００２９】
例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するＳＤＴ１は、酵母において見出された、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの一例である。ＳＤＴ１遺伝子は、文献（Ｓｈｉｍｏａｒａｉｓｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２９６２３―２９６２７（２０００））に記載された方法で、取得することが可能である。すなわち、市販の酵母ゲノムライブラリーから、配列表の配列番号２と配列番号３に記載された塩基配列をプライマーとしたＰＣＲ法で、自己発現に必要なプロモーターなどを含めてＳＤＴ１遺伝子を増幅することが可能である。あるいは市販の酵母ｃＤＮＡライブラリーから、配列表の配列番号４と配列番号５に記載された塩基配列をプライマーとしてＰＣＲ法を用いて取得することも出来る。
【００３０】
得られたＳＤＴ１遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて適当な宿主細胞にて発現し、これを精製することによりＳＤＴ１を取得することが可能である。勿論、検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を、あるいはＦＬＡＧ−ｔａｇもしくはＨｉｓ×６−ｔａｇ等のペプチドを、直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に公知の遺伝子工学的方法を用いて付加することもできる。
【００３１】
ＳＤＴ１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチドであって、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼも本発明の範囲に包含される。アミノ酸配列上の相同性は少なくとも約７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。このような相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＳＤＴ１遺伝子をプローブとして使用して酵母以外の他の生物由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーなどをスクリーニングすることによっても取得することができる。このような相同遺伝子の取得方法は公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが出来る。
【００３２】
ＳＤＴ１において１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入等の変異を導入し、さらにＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼも本発明の範囲に包含される。欠失、置換、付加および／または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが出来る。このような変異の導入において、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。また、適宜糖鎖を付加することも可能である。
【００３３】
本発明において、ピリミジン系の薬剤とは、ピリミジン環をその構造内に保持する、微生物等の増殖を阻害する薬効を有する薬剤を意味する。例えば、ピリミジン系の抗真菌剤として広く臨床で使用されているフルシトシン（５−ＦＣ）が挙げられる。また、臨床では用いられてはいないが、６−アザウラシル（６−ＡＵ）もピリミジン系抗真菌剤の一例である。あるいは、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤として、臨床にて用いられている、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、カルモフール、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）等もピリミジン系薬剤の一例である。あるいは、抗ウィルス剤であるラミブジン、ザルシタビン（ジデオキシシチジン）等のヌクレオシドアナログもピリミジン系薬剤に含まれる。これらの薬剤は、生体にとって不都合な真菌、悪性腫瘍細胞あるいはウィルス等の増殖を阻害することにより、それら不都合な増殖により誘引された疾患を治療する目的で医薬品として使用される。あるいは、防腐剤としても利用できる。
【００３４】
薬剤耐性とは、一般に、ある薬剤を長期にわたって使用した場合に、その薬効が低下する現象、あるいは薬剤に対する感受性が低下する現象を指す。抗悪性腫瘍剤等についてこのような現象が生じうることはよく知られており、文献にて詳細に報告されている（Ｍａｄｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８）、Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，３９３−４００（１９９４））。
【００３５】
本発明において、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法とは、上記のピリミジン系薬剤について薬剤耐性の出現を防止する方法、すなわち、該ピリミジン系薬剤の投与とともに以下に記載の５’−ピリミジン特異的ヌクレオチダーゼの機能を阻害する何らかの手段を講じることにより、真菌あるいは悪性腫瘍細胞等の薬剤耐性獲得を抑制して薬剤耐性菌あるいは耐性細胞等の出現頻度を低下する方法を意味する。本防止方法を用いることにより、上記ピリミジン系薬剤を、薬剤耐性を考慮することなく使用することが可能となる。また、薬剤耐性のモニタリングの必要なしに一定の投与量で長期間治療することが可能となり、治療の簡素簡便化が達成されるものと期待できる。
【００３６】
ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの働きを阻害する手段としては、具体的には、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼのアンチセンスＲＮＡ、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼに対する抗体、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの一部を改変し、ヌクレオチダーゼ活性を有しないものの基質に対する親和性は上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼのそれと等しいような変異体（ドミナントネガティブ変異体）、下記スクリーニング系により選別された化合物等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法とは、ピリミジン系薬剤に対する耐性菌あるいは耐性細胞等において該ピリミジン系薬剤の薬効を改善する方法を意味する。たとえば、該ピリミジン系の薬剤が抗真菌剤である場合には、該抗真菌剤が奏効しなくなった真菌あるいは真菌感染症を罹患し該抗真菌剤が奏効しなくなった患者に対し、該ピリミジン系の薬剤が抗悪性腫瘍剤である場合には、該抗悪性腫瘍剤が奏効しなくなった悪性腫瘍細胞あるいは該抗悪性腫瘍剤が奏効しなくなった癌患者に対し、上述の５’−ピリミジン特異的ヌクレオチダーゼを阻害する何らかの手段を講じることにより、該ピリミジン系薬剤が再度薬効を示すようにする方法、を意味する。
【００３８】
本発明において、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法とは、ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害物質の同定方法である。これは、例えば文献（Ｗｉｄｎｅｌｌ  Ｃ．Ｃ．,Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２，３６８−３７４（１９７３））で報告されている５’−ヌクレオチダーゼの活性測定方法を用いて、本発明のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを酵素源として使用することにより具体的に実施することが可能である。例えば、マグネシウム塩を含有したトリス緩衝液に、１〜１０ｍＭの基質（５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰ）とＳＤＴ１とを適当量添加し、３０〜３７℃にて５〜１２０分加温した後、分光学的手法、あるいはＨＰＬＣで生成したリン酸を定量することによりヌクレオチダーゼ活性を測定することが出来る。この測定系に供試化合物を添加した場合としなかった場合の生成したリン酸量を比較することにより、供試化合物のヌクレオチダーゼ阻害活性を定量することが可能である。
【００３９】
あるいは、ＳＤＴ１を遺伝子導入した酵母に対しピリミジン系薬剤と共に供試化合物を添加し、野生株と比較して該ピリミジン系薬剤の感受性が低下しないような化合物を選別するといった方法で、上記ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害化合物をスクリーニングすることも可能である。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法に供される供試化合物の種類は特に限定されず、任意の化合物を供試化合物として使用することができる。供試化合物は、個々の低分子化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは低分子化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよく、これらは全て本明細書で言う化合物の範疇に属するものとする。医薬品としての用途を勘案した場合、供試化合物としては、低分子化合物あるいは低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。供試化合物としては、ピリミジン系化合物を使用することもできる。
【００４１】
こうして見出されたピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物をピリミジン系薬剤と共に投与すれば、上述の通り該ピリミジン系薬剤に対する薬剤耐性が生じ難くなる。
【００４２】
あるいは、薬剤耐性を獲得し薬剤が効果を示さなくなった患者にピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物を投与すれば、該薬剤に対する抵抗性を回復することができる。
【００４３】
また、ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物をピリミジン系薬剤との合剤として、抗真菌剤あるいは抗悪性腫瘍剤等とすることもできる。単剤としてピリミジン系薬剤と共に投与する場合には、投与割合を個体に応じて変化させることが可能であるし、合剤とした場合には患者にとっては服用しやすくなることが予測されるが、患者に好適の手段を選択すればよい。
【００４４】
一方、本発明において、ピリミジン系薬剤のスクリーニング方法とは、供試化合物の真菌あるいは悪性腫瘍細胞等に対する増殖阻害作用効果を測定する工程と共に、該供試化合物の活性代謝物である５’−リン酸化合物が上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼにより脱リン酸化されるかどうかを判別する工程を、薬剤選抜の指標の一つとして含むスクリーニング方法を意味する。活性代謝物とは、投与したピリミジン系薬剤が代謝されて生成する、ピリミジン合成経路またはプリン合成経路に関わる酵素を直接阻害する活性をもつ化合物を意味し、たとえば、６−ＡＵについては６−ａｚａＵＭＰが相当する。したがって、一般的には、例えば、ピリミジン化合物をリボシル化し５’位をリン酸化した化合物をピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼが加水分解するか否かを判定する工程を含むスクリーニング方法を意味する。
【００４５】
あるいは、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを過剰発現した細胞に対しても、野生株と同程度の阻害活性を示す薬剤を選抜するとの工程を追加することによっても、本発明のスクリーニング方法を実施することが出来る。例えば、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母と野生型酵母において、同等の増殖阻害活性を示すピリミジン系薬剤をスクリーニングすればよい。
【００４６】
このようなスクリーニング方法によって選抜されてきたピリミジン系薬剤は、通常のスクリーニング系のみで選抜されてきたピリミジン系薬剤と比較して、真菌あるいは悪性腫瘍細胞に対して薬剤耐性を生じ難い性質を示すことが期待できる。したがって、真菌感染症の患者あるいは癌を罹患した患者に対して、長期にわたり安定して薬効を示しうる薬剤となる。
【００４７】
本発明に関わるピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する活性を有する化合物、あるいはピリミジン系薬剤スクリーニング方法により得られた化合物は、医薬品を開発する際に通常実施される試験を経た後、医薬品として提供することが可能である。
【００４８】
本発明の薬剤の投与形態は特に制限されず、経口的・非経口的に投与することができる。本発明の薬剤としては、有効成分である化合物をそのまま用いてもよいが、有効成分の化合物と薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
【００４９】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、又は貼付剤等を挙げることができる。
【００５０】
本発明の薬剤の投与量は特に限定されず、有効成分の薬効、治療又は予防の目的、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能であるが、一般的には、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／成人ヒト、である。
【００５１】
さらに本発明によれば、本発明のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼと、基質として５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰを含む試薬キットを供給することも可能である。これらのキットを用いることにより、上述のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物あるいは薬剤耐性の生じ難いピリミジン系化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例１
（ＳＤＴ１過剰発現株の樹立）
文献（Ｓｈｉｍｏａｒａｉｓｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７５，２９６２３〜２９６２７（２０００））に記載された方法を用いて、ＳＤＴ１を含むプラスミドを、酵母ゲノムライブラリーより調製した。このプラスミドを、Ｋｐｎ１−ＮｃｏＩで切断することによりＳＤＴ１遺伝子の１．８Ｋｂｐ断片を得た。当該遺伝子断片をマルチコピーシャトルベクターであるｐＹＯ３２３（ｐＲＳ３１３（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  Ｒ．Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．,Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２,１９−２７（１９８９））からＣＥＮ６とＡＲＳＨ４を削除して作成した。）のＳｍａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＨ１２７５を調製した。得られたｐＨ１２７５をＢＹ４７４２酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ導入し、ＳＤＴ１過剰発現株を取得した。
【００５３】
（薬剤感受性試験方法）
上記ＳＤＴ１過剰発現株および野生株（ベクターのみを遺伝子導入した、ＢＹ４７２７酵母）、それぞれの各薬剤に対する感受性は、微量培養希釈法（Ｅｓｐｉｎｅｌ−Ｉｎｇｒｏｆｆ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９，１０８９−１０９４（１９９１））を用いて検定した。９６ウェルプレート中、ウェルあたり約２０００の酵母（０．０００１ＯＤｕｎｉｔｓ）を、１００μｇ／ｍｌリジン、２５０μｇ／ｍｌロイシン、薬剤、および１％ＤＭＳＯを含んだ２００μｌのＳＤ培地（アミノ酸非含有０．６７％ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ及び２％  グルコースを含む）に播種した。３０℃で４０時間培養後、波長５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、各薬剤の酵母の増殖に与える影響を検討した。
【００５４】
（ＵＭＰａｓｅ活性の測定方法）
ＵＭＰａｓｅ活性は、文献（Ｗｉｄｎｅｌｌ  Ｃ．Ｃ．,Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２，３６８−３７４（１９７３））に記載された方法に従って、以下に述べる方法で測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに６０μｌの反応液（適当量のタンパク質を添加した０．１Ｍ  トリス塩酸  ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１０ｍＭ  ＵＭＰを含む溶液）を調製し、３０℃で１０分間加温した。ここに１５０μｌの展開液（１．４％  アスコルビン酸、０．３６％  モリブデン酸アンモニウム、０．８６Ｎ硫酸）を添加し、４５℃で２０分間加温した後、８２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。生成したリン酸量は、リン酸一カリウム溶液を用いて作成した標準曲線を用いて換算した。１分間に１μｍｏｌのリン酸を５’−ＵＭＰより遊離する酵素活性を１ユニットと定義した。
【００５５】
（ＳＤＴ１過剰発現株の薬剤感受性）
ＳＤＴ１を過剰発現した酵母と野生型酵母それぞれの増殖に及ぼす各種抗真菌剤の効果を、図１に示す。また、ＩＣ５０値を表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
ピリミジン系以外の抗真菌剤であるアンホテリシンＢとフルコナゾール、あるいはＩＭＰ脱水素酵素の阻害剤であるＭＰＡ（マイコフェノール酸）は、野生株とＳＤＴ１過剰発現株について同等の増殖阻害活性を示した。これに対し、ピリミジン系薬剤については、今回用いたいずれの薬剤についても、ＳＤＴ１過剰発現株における薬剤の増殖阻害活性は、野生株のそれと比較して減弱した。これらの結果により、ＳＤＴ１がピリミジン系薬物に対する薬剤耐性と密接に関係していることが示された。
【００５８】
（ＳＤＴ１過剰発現株抽出液中のＵＭＰａｓｅ活性の測定）
ＳＤＴ１はハロ酸脱ハロゲン化酵素様加水分解酵素のコンセンサス配列を有している。また、６−ＡＵはＦＵＲ１タンパク質により６−ａｚａＵＭＰに代謝されること、そして６−ａｚａＵＭＰは、ＩＭＰ脱水素酵素やオロチジル酸脱炭酸酵素を阻害することが知られている（Ｅｘｉｎｇｅｒ  Ｆ．  ａｎｄ  Ｌａｃｖｏｕｆｅ  Ｆ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２２，９−１１、Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｒ．Ｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３５，２９１７−２９１９（１９６０））。さらに、これら６−ａｚａＵＭＰの酵素阻害活性は６―ａｚａウリジンへ脱リン酸されることにより消失することも知られている（Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｓ．Ａｃｔａ  ２３４，４５１−４５２（１９５８））。
【００５９】
これらの事実から、ＳＤＴ１がＵＭＰの脱リン酸に関わっているのではないかと推察し、ＳＤＴ１過剰発現株、ＳＤＴ１無発現変異株（Ｓｈｉｍｏａｒａｉｓｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２９６２３〜２９６２７（２０００）、および野生株、それぞれの酵母から細胞抽出液を調製し、これらのＵＭＰａｓｅ活性を定量した。その結果、ＳＤＴ１過剰発現株より調製した抽出液のＵＭＰａｓｅ活性は野生株より調製した抽出液の、およそ２．５倍の活性を示した。一方、無発現変異体株については、野生株の半分以下の活性しか示さなかった。以上の結果により、ＳＤＴ１がＵＭＰａｓｅ活性を有することが明らかとなった。
【００６０】
実施例２
（大腸菌における組換えＳＤＴ１蛋白質の発現と精製）
ｐＨ１２７５のＳＤＴ１遺伝子部分を、配列番号４および５に記載されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ法にて増幅し、ｐＥＴ２１ｃ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合蛋白質の取得に用いた。すなわち、得られたＨｉｓ−ｔａｇ融合ＳＤＴ１発現プラスミド（ｐＨ１１７１）をＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入し、これをＬＢ培地で培養した。０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した後、１８℃で１８時間培養することによりＨｉｓ−ｔａｇ融合ＳＤＴ１（以下、組換えＳＤＴ１と称する）の発現を誘導した。
【００６１】
組換えＳＤＴ１を発現した大腸菌を、抽出緩衝液（０．１Ｍ  トリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＵＭＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、１７ｍＭ  スペルミジン、０．２１ｍｇ／ｍｌ  ライソゾーム、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム）で溶解し、溶解液を１００，０００ｘｇで１時間超遠心することにより、透明な上清を得た。
【００６２】
この上清を、Ｎｉ樹脂（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に供し、キットに添付された溶出緩衝液に１ｍＭ  ＵＭＰと１ｍＭ  ＭｇＣｌ2とを添加した溶出緩衝液により組換えＳＤＴ１を溶出した。イミダゾールをＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（Aｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により除去し、さらに、緩衝液１（０．１Ｍ  トリス塩酸  ｐＨ  ７．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＵＭＰ）で平衡化したＨｉＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎｇカラム（Aｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供した。当該カラムに吸着した組換えＳＤＴ１は、１０−３００ｍＭの直線濃度勾配イミダゾールを溶解した緩衝液１により溶出した。
【００６３】
上記の方法により精製された組換えＳＤＴ１の分子量は、緩衝液２（２０ｍＭ  トリス塩酸  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＵＭＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（Aｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、ウシ血清アルブミン（分子量＝６７０００）、β−ラクトグロブリン（分子量＝３５０００）、およびシトクローム  Ｃ（分子量＝１２４００）を標準蛋白としたゲルろ過により決定した。
【００６４】
蛋白濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ  ７２，２４８−２５４（１９７６））により求めた。イミダゾールの濃度は、３２０ｎｍの吸光度により求めた。
【００６５】
上記の方法に従ってＨｉｓ−ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１を、大腸菌で発現し、これを電気泳動的に単一になるまで精製した。Ｎｉ−カラムに吸着したＳＤＴ１蛋白質は、図２に示すように、イミダゾール直線濃度勾配緩衝液により、ＵＭＰａｓｅ活性と同じピークとして溶出された。ＵＭＰａｓｅ活性および蛋白質のピークフラクションを集め、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、クマジブリリアントブルーによる染色にて、組換えＳＤＴ１は単一のバンドとして検出された。
【００６６】
（組換えＳＤＴ１の分子量の推定）
これまでに報告されているヌクレオチダーゼの多くはオリゴマーを形成することが知られている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２８５，３４５−３６５（１９９２））。今回上記の方法により発現、精製したＨｉｓ−Ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１の分子量は、ゲルろ過法により約３３０００と推察された。これは、アミノ酸配列より推定したＳＤＴ１の分子量３２０００とほぼ等しかったことにより、ＳＤＴ１は既知の多くのヌクレオチダーゼとは異なり、溶液中では単量体で存在することが推察された。
【００６７】
（速度量論の算出）
組換えＳＤＴ１について、見掛けＫｍ値および相対Ｖｍａｘを、Lineweaver-Burkプロットから求めた。精製組み換えＳＤＴ１のＫｍは５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてそれぞれ１．２ｍＭおよび２．３ｍＭであった。５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてのＶｍａｘはそれぞれ２３μｍｏｌ／分／ｍｇおよび２０μｍｏｌ／分／ｍｇであった。
【００６８】
（組換えＳＤＴ１の基質特異性の検討）
次に、上記方法で精製した組換えＳＤＴ１を用いて、ＳＤＴ１の基質特異性について検討した。活性測定は実施例1に記載した方法に従って、表２に記載したヌクレオチドを基質として用いて行った。活性値は、５’−ＵＭＰを基質とした時の加水分解活性を１００とした比活性で示した。表２に示すように、ＳＤＴ１は５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰを特異的に脱リン酸化することが明らかとなった。プリンヌクレオチド、２’−ＵＭＰ、３’−ＵＭＰ、デオキシヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オロチジン−５’−リン酸あるいはＰＮＰＰに対しては、脱リン酸活性を示さなかった。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
現在までに様々な基質特異性を示す５’−ヌクレオチダーゼが知られている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｈ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２８５，３４５−３６５（１９９２）、Ａｍｉｃｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０４，９８７−９９２（１９９４）、Ｒａｍｏａｚｚｏ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，５４０９−５４１５（２０００）等）。そのなかにはピリミジンヌクレオチドを特異的に加水分解する活性を示すものがある。しかしながら、それらの酵素は、ピリミジンリボヌクレオチドと同様にピリミジンデオキシリボヌクレオチドについても良好なヌクレオチダーゼ活性を示す。したがって、ＳＤＴ１はこれらの現在までに知られているピリミジン特異的ヌクレオチダーゼとは異なる基質特異性を示すヌクレオチダーゼであることが判明した。
【００７１】
これらの知見は以下に述べることを示唆している。すなわち、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母は、６−ＡＵ、５−ＦＣあるいは５−ＦＵの増殖阻害に対して抵抗性を示したことから、現在臨床の場において非常に問題とされている、ピリミジン系抗真菌剤に関する薬剤耐性は、ＳＤＴ１の過剰発現により生じている場合がある。本研究により、ＳＤＴ１は、５’−ＵＭＰと５’−ＣＭＰに対し特異的に脱リン酸化活性を示す５’−ヌクレオチダーゼであることが明らかになったことにより、ＳＤＴ１の脱リン酸化活性を阻害するような化合物を、ピリミジン系抗真菌剤と同時に投与することにより、薬剤耐性を予防することが出来るし、すでに薬剤耐性を獲得してしまった場合にもその低下した薬効を回復出来る。
【００７２】
さらに、ＳＤＴ１の活性阻害物質は、５’−ＵＭＰと５’−ＣＭＰを基質としてスクリーニング出来る。あるいは、ピリミジン系薬剤の活性本体は細胞内でリボシル化および5位リン酸化をうけたものであることが知られている（Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，３９３−４００（１９９４））ので、薬剤のスクリーニングの過程で、その５位がリン酸化された活性体がＳＤＴ１の基質とならないような薬剤を選抜することにより、長期間安定した薬効を示しうるピリミジン系薬剤を提供できる。
【００７３】
一方、５−ＦＵ等の抗悪性腫瘍剤もピリミジン系の薬剤であるが、これらの薬剤についても、抗真菌剤と同様に薬剤耐性形質の獲得が非常に問題となっている（Ｍａｄｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８））。上記、実施例１により、ＳＤＴ１過剰発現株においては５―ＦＵに対する感受性も６−ＡＵあるいは５−ＦＣと同様に低下していることから、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤に関する薬剤耐性についても、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すヌクレオチダーゼが関与している可能性が考えられる。したがって、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すヌクレオチダーゼの活性を阻害することにより、これら抗悪性腫瘍剤において問題となっている薬剤耐性についても克服できる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性の問題を解決する有効な手段が提供される。したがって、これまで薬剤耐性が問題となって使用が制限されていたピリミジン系の薬剤を、一定の用量で長期間投与することが可能となり、従来の真菌感染症あるいは癌の治療剤と比較してさらに有用な治療方法、治療剤を提供できる。
【００７５】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号１：ＳＤＴ１タンパク質のアミノ酸配列
配列表の配列番号２：酵母ゲノムＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号３：酵母ゲノムＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号４：酵母ｃＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号５：酵母ｃＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
【００７６】
【配列表】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＨ１２７５を遺伝子導入しＳＤＴ１を過剰発現したＢＹ４７４２酵母（Ａ）と、ベクターのみを遺伝子導入した野生型酵母（Ｂ）の増殖に、各種ピリミジン系薬剤が及ぼす効果を示す。６−ＡＵ；６-アザウラシル、５−ＦＵ；フルオロウラシル、５−ＦＣ；フルシトシン、ＭＰＡ；マイコフェノール酸、ＡＭＰＨ；アンフォテリシンＢ、ＦＬＣＺ；フルコナゾール。
【図２】図２は、Ｎｉキレーティングカラムに吸着したＨｉｓ−ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１を、イミダゾール直線濃度勾配緩衝液にて溶出したクロマトグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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