(57)【要約】本発明は、筋細胞（心筋細胞、骨格筋ミオサイト、および平滑筋ミオサイトを含むがこれらに限定されない）と神経細胞とを含む導電性細胞の分化、成熟、および機能の解析のためのマイクロ電極アレイを含むデバイスおよび方法に関する。該アレイ上に存在するマイクロ電極は、基材上で培養された細胞を刺激するため、および該細胞から記録するために使用することができる。いくつかの態様では、該基材は、実質的に平滑な表面を有し、かつ、他の態様では、該基材は、ナノテクスチャ加工され（nanotextured）、ナノメートル幅〜マイクロメートル幅の実質的に平行な溝および隆起のアレイを備える。2016518117.tif 000008
2016518117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のマイクロ電極と複数の導電性細胞とを備え、該マイクロ電極が該導電性細胞に接触しており、かつ該マイクロ電極が、該細胞へ信号入力を伝送するためまたは該導電性細胞からの電気信号を記録するために電子インターフェイス（例えば、信号発生器および／または記録器）に接続されている、基材。
【請求項２】
前記導電性細胞が筋細胞である、請求項1に記載の基材。
【請求項３】
前記筋細胞が、心筋細胞、骨格筋ミオサイト、平滑筋ミオサイトより選択される、請求項1に記載の基材。
【請求項４】
前記導電性細胞が神経細胞である、請求項1に記載の基材。
【請求項５】
実質的に平滑な表面を有する、請求項1に記載の基材。
【請求項６】
ナノテクスチャ加工された（nanotextured）表面を有する、請求項1に記載の基材。
【請求項７】
前記ナノテクスチャ加工された表面が、溝および隆起の実質的に平行なアレイである、請求項6に記載の基材。
【請求項８】
前記溝の深さが10nm〜10μmの間であり、該溝の幅が50nm〜10μmの間であり、かつ該溝間の隆起が50nm〜10μmの間の幅を有する、請求項7に記載の基材。
【請求項９】
前記溝の深さが50nm〜500nmの間であり、該溝の幅が200nm〜1000nmの間であり、かつ該溝間の隆起が200nm〜1000nmの間の幅を有する、請求項8に記載の基材。
【請求項１０】
疾患モデリングのための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の基材の使用。
【請求項１１】
毒性を評価するためまたは前記導電性細胞の生体電位および電気特性に対する作用物質の異常な効果を評価するためのアッセイ法における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の基材の使用。
【請求項１２】
前記導電性細胞の生体電位および電気特性に対する作用物質の効果を評価するためのアッセイ法における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の基材の使用。
【請求項１３】
マイクロ電極アレイの表面上の前記導電性細胞の生体電位をモニタリングするための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の基材を含むアッセイ法。
【請求項１４】
(a)基材区域上のマイクロ電極が電子インターフェイス（例えば、信号発生器および／または信号記録器）に接続されている、該マイクロ電極を備える基材と、
(b)コンピュータに接続されている電子インターフェイスと、
(c)該基材上の該マイクロ電極への電気信号の伝送および該基材上の該マイクロ電極からの電子信号の伝送のための該電子インターフェイスに命令する、コンピュータと
を備えるシステム。
【請求項１５】
マイクロ電極を備える前記基材が導電性細胞を備える、請求項14に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）項に基づき、2013年3月15日に出願された米国特許仮出願第61/788,365号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、全体として、細胞成長および組織工学の分野に関する。より詳細には、筋細胞および神経細胞を包含する導電性細胞の分化、成熟、および機能の解析のためのマイクロ電極を備えるデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
導電性細胞、例えばニューロンおよび筋細胞のそれらの導電性挙動の測定を可能にするような培養は、これらの細胞の生物学を理解するために、候補治療がこの挙動を混乱させるどうか（患者に危険な副作用をもたらす可能性があるどうか）を判断するために、および例えば不整脈の処置のための、導電性挙動を治療的に改変することができる作用物質を特定するために重要である。しかしながら、これらの細胞を培養する既存の技術は、空間的な精度が最適ではなく、スループットが低く、かつ培養環境の特徴が原因で導電性細胞の天然生理機能および／または挙動を変化させる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書に記載される組成物および方法は、電気刺激またはデータ収集能力も柔軟に提供することができる導電性細胞の培養のためのデバイスに関する。本明細書において実証されるように、これらのデバイスは、従来の方法がもたらすもの（例えば、力の発生の増加および／または場電位の増加）より生理的に適切な挙動を呈する導電性細胞の成長を支援する。加えて、本明細書において提供されるデバイスは、以前に不可能であった分解能を有する高スループット刺激およびデータ収集を可能にする。
【０００５】
本発明は、全体として、筋細胞（心筋細胞、骨格筋ミオサイト、および平滑筋ミオサイトを含むがこれらに限定されない）と神経細胞とを含む導電性細胞の分化、成熟、および機能の解析のためのマイクロ電極アレイを含むデバイスおよび方法に関する。デバイスの細胞培養表面上に存在するかまたは細胞培養表面に隣接するマイクロ電極アレイは、表面上で培養された細胞を刺激するため、および該細胞から記録するために使用することができる。いくつかの態様では、細胞培養表面は、実質的に平滑な表面を有し、他の態様では、細胞培養表面は、ナノテクスチャ加工され（nanotextured）、ナノメートル幅および／またはマイクロメートル幅の実質的に平行な溝および隆起のアレイを含むことができる。
【０００６】
いくつかの態様では、マイクロ電極アレイ（MEA）デバイス（本明細書では「MEAデバイス」と呼ばれる）上に存在する電極は、細胞培養表面上の培養細胞と接触しており、培養細胞から生体電位を取得するために使用することができる。マイクロ電極からのリードは、細胞から信号記録および／または処理電子装置まで培養細胞が発した信号（例えば、生体電位）を伝達するために、デバイスの端部にマイクロ電極を接続することができる。代替的な態様では、培養細胞と接触するマイクロ電極に接続するリードは、信号発生器から培養細胞まで信号（例えば、電気入力）を伝達することができる。いくつかの態様では、信号発生器は、既定の形状および振幅（例えば、正弦波、矩形波、または鋸歯状波）を有する入力信号を提供することができる。
【０００７】
いくつかの態様では、デバイスの端部にマイクロ電極を接続するリードを、（例えば、リードと接触する培養細胞が信号経路に不要な生体電位を投入するのをまたは意図しない入力信号を受け取るのを防止するために）非電導性材料、絶縁材料、または誘電材料によって選択的に覆うことができる。いくつかの態様では、非伝導材料を、パリレン、または、当業者に公知である、他の非導電性材料、絶縁材料、もしくは誘電材料とすることができる。
【０００８】
いくつかの態様では、デバイスは、細胞培養表面上のまたは細胞培養表面に隣接した複数のマイクロ電極、例えば、細胞培養表面上のまたは細胞培養表面に隣接した、少なくとも約2個、または少なくとも約3個、または少なくとも約4個、または少なくとも約5個、または少なくとも約6個、または少なくとも約7個、または少なくとも約8個、または少なくとも約9個、または少なくとも約10個、または10個超のマイクロ電極を備える。いくつかの態様では、マイクロ電極を、一般に当業者に公知な任意の幾何学的形状または形状とすることができる。いくつかの態様では、マイクロ電極を、既定のパターン（例えば、円形、長円形、楕円形、長方形、正方形パターン）またはアレイで配置することができる。いくつかの態様では、マイクロ電極を、ランダムまたは疑似ランダム構成で配置することができる。いくつかの態様では、マイクロ電極のうちのいくつかを、既定のパターンまたはアレイで配置することができ、マイクロ電極のうちのいくつかを、既定のパターンもしくはアレイ内に、または既定のパターンもしくはアレイ外にランダムに設置することができる。
【０００９】
電子システムにリードを接続する任意の電気的インターフェイスを、使用することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数のマイクロ電極と培養細胞から信号を受け取ることができるかまたは培養細胞に適用される信号を発生することができる電気コンポーネントとの間の電気的接続を容易にするソケットに、デバイスを取り外し可能に装着することができる。本明細書において実証されるいくつかの態様では、マイクロ電極が受け取る電気信号を、関連するリードを介して対応するソケットピンに伝達することができる。ソケットピンを、電気コンポーネントまたはシステムに接続されている回路板トレースまたはワイヤに、はんだ付けすることまたは別途電気的に接続することができる。電気コンポーネントまたはシステムは、信号をデジタルサンプリングおよび記録することができるように、一連の信号調整コンポーネント（例えば、増幅器および／もしくはフィルタ）ならびに／またはデータ取得（DAQ）コンポーネントを含むことができる。
【００１０】
いくつかの態様では、データ取得コンポーネントを、電子信号の視覚化のために、データの解析のためのソフトウェアパッケージ、例えば、Lab VIEW（National Instruments製, Austin, TX）を備えるコンピュータに接続することができる。いくつかの態様では、捕捉された信号には、公知の技法（例えば、フィルタ処理、遮蔽、または十分に接地されたソースの提供）および／または当業者に公知のソフトウェアによって除去することができるノイズ（例えば、低周波または高周波ノイズ）が含まれる。
【００１１】
いくつかの態様では、マイクロ電極アレイは、スペクトルパターンで金属化された基材を備える。いくつかの態様では、マイクロ電極アレイは、マイクロ電極のスペクトルパターン用のシャドーイングマスクを使用して基材上に直接Cr／Au材料をスパッタコーティングすることによって、形成することができる。いくつかの態様では、マイクロ電極アレイは、基材の外側または端部上のパッドを介して接続されている1つまたは複数の外部の回路に接続するリードと共に、基材の中央に形成することができる。外部の回路は、信号調整および／またはフィルタリングコンポーネントだけでなく、信号多重化コンポーネント、信号処理コンポーネント、信号記録コンポーネント、および／または信号発生コンポーネントも含むことができる。
【００１２】
いくつかの態様では、限定されないが、活動電位持続時間（ADP）、波伝播、活動電位周波数、拍動周波数、活動電位伝送、活動電位のVmax、収縮力、ピーク間振幅、拡張末期対拡張ピーク速度などを含むがこれらに限定されない機能パラメータである生体電位などの、基材上で培養された細胞の生体電位の少なくとも1つをモジュレートするために、マイクロ電極を使用することができる。
【００１３】
いくつかの態様では、導電性細胞は、筋細胞（心筋細胞、骨格筋ミオサイト、および平滑筋ミオサイトを含むがこれらに限定されない）、および神経細胞を含む。いくつかの態様では、導電性細胞はヒト細胞である。いくつかの態様では、導電性細胞は、幹細胞に、例えばES細胞および／または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する。
【００１４】
いくつかの態様では、導電性アレイを備えるMEAデバイスを、当業者に公知のポリマーで作製することができる。いくつかの態様では、MEAデバイスは、生体適合性および／または生分解性の基材または層を備えることができる。いくつかの態様では、MEAデバイスは、限定的ではないが、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリエチレングリコール-ゼラチンメタクリレート（PEG-GelMA）、およびこれらの化学的類似体、ならびにヒドロゲルアレイなどの、拡張性のある生体適合性ポリマーからナノ製造することができる。他には、例えば、限定的ではないが、PUA、PLGA、またはPMMAが挙げられる。
【００１５】
いくつかの態様では、MEAデバイスは、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、乳酸-グリコール酸コポリマー（PLGA）、ポリアンヒドリド、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリジオキサノン、およびポリオルトエステルのうちの少なくとも1つを備えることができる。生体適合材料として使用される最も一般的なポリマーのうちの1つは、ポリエステルコポリマーであるポリ（乳酸-グリコール酸）（PLGA）である。PLGAは、高度に生体適合性であり、（例えば、移植される場合に）生体適合性モノマーへと分解し、かつこのコポリマーおよびそのホモポリマー、PLAおよびPGAを細胞堆積のための細胞培養層として有用にする広範な機械的特性を有する。層は多孔性または非多孔性であることができる。
【００１６】
いくつかの態様では、他の材料を、細胞培養層材料として使用するために選択することができ、細胞培養層材料を、ヒドロキシアパタイト（HAP）、リン酸三カルシウム（TCP）、リン酸四カルシウム（TTCP）、無水リン酸二カルシウム（DCPA）、二水和リン酸二カルシウム（DCPD）、リン酸八カルシウム（OCP）、ピロリン酸カルシウム（CPP）、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、およびポリ（エチレングリコール）からなる群より選択することができる。代替的な態様では、細胞培養層はまた、追加的な材料、例えば、限定的ではないが、アルギン酸カルシウム、アガロース、I、II、IV型もしくは他のコラーゲンアイソフォーム、フィブリン、ヒアルロン酸誘導体、または他の材料（Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311 ; Sechriest V F. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu C R et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29: 1147-1154; Hendrickson D A et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497）を含むことができる。
【００１７】
さらに、いくつかの態様では、MEA細胞培養表面上で培養された細胞の観察を容易にするために、MEAデバイスを光学的に透明とすることができる。光が伝わることができるように構造を十分に薄くすることによって、光学的透明性を、多くのMEAデバイス材料に対して実現することができる。
【００１８】
いくつかの態様では、細胞培養表面は、実質的に平滑な表面を含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養表面は、細胞培養表面上で培養された組織が既定の方法で発達または組織化されることを目的とする1つまたは複数の表面特徴を含むことができる。いくつかの態様によれば、組織を、入力信号によって刺激し、組織が発した生体電位をモニタリングおよび記録することによって研究することができるように、表面特徴およびマイクロ電極を、マイクロ電極に対する表面上の組織の成長を容易にするために、既定の構成で配置することができる。ナノメートルおよびマイクロメートルサイズの溝および隆起ならびにマイクロ電極を含むことができる表面特徴の構成は、表面上で培養された細胞および組織の発達に特異的とすることができる。
【００１９】
基材のナノテクスチャ加工された溝および隆起が、成体組織から単離された心筋細胞の異方性の配置を促進することは以前に実証されている（Kim et al.、発明の名称「Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs」、PNAS (2010) 107(2);565-570、ならびに2012年4月4日に出願された米国特許出願第61/620,301号および国際公開公報第2013/151755号：その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、代替的な態様では、MEAデバイスの細胞培養表面は、約10nm〜10μmの間、または約10nm〜1000nmの間、または約50nm〜500nmの間の深さを有する溝および隆起の実質的に平行なアレイを含むナノテクスチャ加工されたプラットホームを含むことができる。いくつかの態様では、溝の幅は、約50nm〜10μmの範囲の間で、または約200〜1000mnの範囲に、または約5〜1000nmの範囲にあり、溝間の隆起は、約50nm〜10μmの範囲の、または約200〜1000mnの範囲の、または約5〜1000nmの範囲の幅を有する。いくつかの態様では、溝および／または隆起の幅は200〜800nmの範囲の間であり、溝の深さ（または隆起の高さ）は約20〜100nmの間である。MEAデバイス用としてナノテクスチャ加工された表面を有する細胞培養層を製造する方法は、例えば、2013年3月15日に出願され、国際公開公報第2013/151755号として発行されたKim et al.によるPCT出願番号PCT/US2013/032237、発明の名称「Systems and Methods for Engineering muscle tissue」に開示されており；各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
いくつかの態様では、導電性細胞は、ナノテクスチャの方向への異方性および極性細胞配置で、本明細書において開示されるようにMEAデバイス上に単層を形成することができる。これは、例えば、蛍光顕微鏡または他の顕微鏡を使用して検出されるような、ナノテクスチャ加工されたアレイと平行に並んでいる細胞の高い紡錘形状係数または長軸によって、立証することができる。
【００２１】
いくつかの態様では、マイクロ電極（MEA）アレイ上に存在する実質的に平行な溝および隆起は、高い忠実度で大きい表面積の上に製造することができ、いくつかの態様では、（>1cm2）を超える表面積を覆うことができる。いくつかの態様では、平行な溝および隆起のアレイは、原子間力顕微鏡写真および電子顕微鏡写真によって立証されるように、少なくとも90％の忠実度のテクスチャの精密さを有する。
【００２２】
いくつかの態様では、MEAデバイスは、追加的なコーティングを備えることができる。例えば、理論に縛られることを望まないが、MEAデバイスの細胞培養表面を、細胞付着、分化および成熟、接着依存性細胞信号伝達、ならびに／またはデバイスの電気伝導度を改変するために、1つまたは複数の生体活性作用物質によって改変し、ポリマー表面上に堆積させるかまたは吸着させることができる。したがって、いくつかの態様では、MEAデバイスは、そのポリマーマトリックス内にまたはその表面上に、心筋細胞の成熟を強化し、毒性の刺激に応答した培養細胞の生残性を強化し、ポリマー層への細胞密着を強化し、かつ／またはMEAデバイス上の培養細胞の層にわたる活動電位波伝播を強化する生体活性作用物質を含むことができる。いくつかの態様では、MEAデバイスは、基材ベース層、および任意で表面層を備えてもよい。
【００２３】
いくつかの態様では、本明細書において開示される方法および組成物で使用されるMEAデバイスは、培養細胞への生体活性作用物質の制御放出、例えば、本明細書に記載される技術に関するMEAデバイス上にコーティングされた細胞についての後の細胞成長および増殖を持続させるかまたは制御する成長因子および他の作用物質の制御放出を、さらに提供することができる。このような方法で、培養細胞には、細胞コーティングされた足場の寿命を通して、成長因子および他の作用物質の一定の供給源が与えられる。いくつかの態様では、成長因子および他の作用物質は、当技術分野において一般に公知の心臓栄養因子である。
【００２４】
心臓栄養因子は、クレアチン、カルニチン、タウリン、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2003/0022367号に開示される心臓作用因子、アクチビンA、アクチビンBなどのTGFベータリガンド、インスリン様成長因子、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ナトリウム排泄増加性因子、インスリン、白血病抑制因子（LIF）、上皮成長因子（EGF）、TGFアルファ、心房ナトリウム排泄増加性因子、クリプト、ならびにGATA-4、Nkx2.5、およびMef2-Cなどの心臓転写調節因子、ならびにBMPまたはクリプト経路の生成物を含むことができるが、これらに限定されない。他の心臓強化ペプチドは、本明細書において開示されるような、サイトカインおよび成長因子などの、細胞分化作用物質を含む。様々な細胞分化作用物質の例は、米国特許出願第2003/0022367号、またはGimble et al., 1995、Lennon et al., 1995、Majumdar et al., 1998、Caplan and Goldberg, 1999、Ohgushi and Caplan, 1999、Pittenger et al., 1999、Caplan and Bruder, 2001、Fukuda, 2001、Worster et al., 2001、Zuk et al., 2001に開示され、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
いくつかの態様では、MEAデバイスは、その表面上に、または、細胞培養層マトリックスに埋め込んで、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リシン、ポリ-オルニチン、ビトロネクチン、またはエリスロネクチンを含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養層は、CS1、RGD、インテグリン受容体に結合する細胞外マトリックスタンパク質内のドメイン、インテグリン受容体に結合する細胞外マトリックスタンパク質内のドメイン、および当業者に周知な他のものを含む、操作されたペプチドを含むことができる。
【００２６】
いくつかの態様では、MEAデバイスは、その表面上にコーティングして、またはそのポリマーマトリックス内に、スフィンゴシンリン酸もしくはその類似体、フッ酸、zFADvmk、カルジオトロピン、または、FGF、HGF、IGF1、SDFla、EGF、アンジオポエチン、BMP、エリスロポエチン（EPO）、GDNG、c-GSF、GDF9、HDNF、GDF、トロンボポエチン、TGFα、TGFβ、TNFα、PIGF、PDGF、インターロイキン、IL1-IL17、およびVEGFからなる群より選択される成長因子からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体、抗原、糖タンパク質、リポタンパク質、DNA、RNA、多糖、脂質、成長ホルモン、有機化合物、および無機化合物からなる群より選択することができる。
【００２７】
加えて、いくつかの態様では、MEAデバイスの表面を、以下の群より選択される作用物質のうちの少なくとも1つを含むように改変することができる：（a）細胞接着および機能を目的とする細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど）；（b）細胞型に特異的な細胞機能を目的とする成長因子（例えば、神経成長因子、骨形態形成タンパク質、血管内皮成長因子など）；（c）脂質、脂肪酸、およびステロイド（例えば、グリセリド、非グリセリド、飽和および不飽和脂肪酸、コレステロール、副腎皮質ステロイド、性ステロイドなど）；（d）糖および他の生物学的に活性な糖質（例えば、単糖類、オリゴ糖類、スクロース、グルコース、グリコーゲンなど）；（e）プロテオグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、および／またはケラタン硫酸の結合した側鎖を有するタンパク質コア）：糖タンパク質［例えば、セレクチン、免疫クロブリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンなどのホルモン、アルファ-胎児タンパク質、およびエリスロポエチン（EPO）など］：タンパク脂質（例えば、N-ミリストイル化、パルミトイル化、およびプレニル化タンパク質）；および糖脂質（例えば、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、グリコホスファチジルイノシトールなど）などの、糖質、脂質、および／またはタンパク質の組み合わせ；（f）ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにポリ-L-リジンなどの、生体由来のホモポリマー；（g）核酸（例えば、DNA、RNAなど）；（h）ホルモン（例えば、タンパク質同化ステロイド、性ホルモン、インスリン、アンジオテンシンなど）；（i）酵素（型：酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、例：トリプシン、コラゲナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼなど）；（j）薬剤（例えば、ベータ遮断薬、血管拡張薬、血管収縮薬、鎮痛薬、遺伝子治療、ウイルスベクター、抗炎症薬など）；（k）細胞表面リガンドおよび受容体（例えば、インテグリン、セレクチン、カドヘリンなど）；ならびに（l）細胞骨格フィラメントおよび／または運動タンパク質（例えば、中間フィラメント、微小管、アクチンフィラメント、ダイニン、キネシン、ミオシンなど）。
【００２８】
いくつかの態様では、MEAデバイス細胞培養表面を、電気伝導度を高める材料でコーティングすることができる。いくつかの態様では、このような材料は、炭、グラフェン、グラフェン酸化物、還元グラフェン酸化物、ナノチューブ、チタン（Ti)）、および金（Au）からなる群より選択することができ、これにより、電気的伝導度または培養細胞の他の物理化学的特性を、細胞培養表面上に存在する細胞の単層全体から増幅させることができる。いくつかの態様では、MEAデバイスは、強い電磁場によって極性形の結晶構造を呈した繊維を産する電気活性ポリマー繊維を含む。繊維を並べる例示的なシステムおよび方法は、米国特許出願第2009/0108503号に開示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
用いられるベース基材に応じて、導電性材料であるMEAデバイス上の表面層の例は、例えば、薄い金属、または、電導性の表面堆積物、例えば、グラフェン、グラフェン酸化物および還元グラフェン酸化物（rGO）、カーボンナノチューブ、タンタル、チタン、Ti-Al-V合金、金、クロム、金属酸化物、半導体酸化物、金属窒化物、半導体窒化物、ポリマー、生体ポリマー、もしくは他の合金を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、表面組成物は、例えば、グラフェンおよびグラフェン酸化物、ならびにタンタル、チタン、白金、またはこれらの酸化物を含むことができる。いくつかの態様では、伝導表面層は、例えば、カーボンナノチューブ構造、金属（例えば、金、銀、およびチタン）、突起（例えば、ピラー、柱、突出、および隆起）、ならびにナノ空洞を含む、先に確認した材料の改変された構造を含むことができる。
【００３０】
MEAデバイスの使用
いくつかの態様では、マイクロ電極アレイを、細胞培養表面上で培養された細胞を刺激しかつ該細胞からの信号を記録するために使用することができる。いくつかの態様では、信号発生器を、培養細胞と接触するマイクロ電極アレイに電気入力を提供するために使用することができる。代替的な態様では、マイクロ電極アレイを、細胞培養表面上で培養された細胞からの信号を記録するために使用することができる。MEAデバイス上で培養された細胞からの、全範囲の生体電位および物理化学的特性、例えば、限定されないが、活動電位持続時間（ADP）、波伝播、活動電位周波数、拍動周波数、活動電位伝送、活動電位のVmax、収縮力、ピーク間振幅、拡張末期対拡張ピーク速度などを含むがこれらに限定されない機能パラメータを記録することができる。
【００３１】
いくつかの態様では、導電性細胞を備えるMEAデバイスを、例えば、培養細胞の生体電位に対する作用物質の効果を評価して、例えば、培養細胞の生体電位に悪い効果を及ぼす任意の作用物質を特定するために、毒性スクリーニングのための方法およびアッセイ法で使用することができる。
【００３２】
いくつかの態様では、導電性細胞を備えるMEAデバイスを、例えば、疾患または障害の処置のための電位治療的作用物質の効果を評価するために、薬物スクリーニング法およびアッセイ法で使用することができる。例えば、培養細胞が、心血管疾患もしくは障害を持つ対象、または不整脈を有する対象に由来する、いくつかの態様では、細胞の生体電位および導電特性を通常の表現型に部分的にまたは完全に戻す作用物質をスクリーニングおよび特定するために、導電性細胞を備えるMEAを使用することができる。このような態様では、細胞は、iPSCに元々は由来しかつ導電性細胞に、例えば、本明細書に記載される神経および／または筋細胞に分化したヒト細胞とすることができる。
【００３３】
いくつかの態様では、導電性細胞を備えるMEAデバイスを、例えば、導電性細胞の表現型に対する特定の一過性電子信号の効果を見るために、疾患モデリング用として使用することができる。いくつかの態様では、表現型は、形態もしくは細胞特徴（例えば、特定のマーカーの発現）または細胞の化学電気特性とすることができる。
【００３４】
代替的な態様では、MEAデバイスを、導電性細胞の発達、分化、成熟、機能性、および／または生残性に対する異なる電気信号の効果を評価するために使用することができる。例えば、特定の系統に沿って分化するように、例えば、幹細胞を導電性細胞型、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞などを含む、神経および筋細胞、ならびにこれらの亜型に分化するように、細胞を誘導するべく電気信号を細胞に提供するためにMEAデバイスを使用することができる。同様に、いくつかの態様では、より成熟した表現型への導電性細胞の成熟を強化するように電気信号を未成熟な導電性細胞に提供するために、MEAデバイスを使用することができ、例えば、一例に過ぎないが、MEAを、例えば、インビボで見られる成熟した成体心筋細胞の特性を有する、より成熟した心筋細胞への未成熟な心筋細胞の成熟を強化するために、使用することができる。
【００３５】
いくつかの態様では、導電性細胞を備えるMEAデバイスを、筋細胞（例えば心筋細胞）の活動電位の変化の特定で使用することができ、その結果、限定されないが対象の不整脈を含む、心血管疾患または障害の診断で使用することができる。導電性細胞が骨格筋細胞であるいくつかの態様では、骨格筋細胞を備えるMEAデバイスは、例えばALS、筋ジストロフィーなどの、神経筋疾患および障害ならびに／または筋原性障害の診断を補助することができる。同様に、導電性細胞を備えるMEAデバイスを、神経細胞の活動電位の変化の特定で使用することができ、結果として、例えば、限定されないが、パーキンソン病、ハンチントン病、ALS、アルツハイマー病を含む、神経性および／または障害ならびに神経変性障害の診断で使用することができる。このような態様では、導電性細胞を、対象から得た細胞から分化することができる、例えば、元々は対象から得たiPSCに由来する導電性細胞。
【００３６】
心電図記録は測定に応じ、筋電図記録および脳電図記録はそれぞれ、神経筋および脳障害の診断において、同様に機能する。
【００３７】
いくつかの態様では、MEAデバイスをシステムの一部とすることができ、例えば、システムでは、MEAデバイスが、コンピュータに任意で接続することができる電子インターフェイス（例えば、信号発生器および／または信号記録器）に接続されており、コンピュータが電子インターフェイスに命令し、これにより、コンピュータは、MEAデバイスへのおよびMEAデバイスからの電気信号の伝送を方向付ける。いくつかの態様では、システムのMEAデバイスは導電性細胞を備える。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1Aおよび1Bは、シャドーマスク上のパターンを示す。図1Aは、シャドーマスク上のマイクロ電極アレイ（MEA）マスクパターンを示す。暗い部分はシャドーマスクの開口部を示し（ナノ溝付きPDMS層が金属化される）、明るい部分はマスキングされる（金属化されない）。図1Bは、シャドーマスクを、ナノ溝付きPDMS層の上部に置き、Cr/Auを、最適化された製法を使用したスパッタで堆積させる態様を表す。クリップが、シャドーマスクをデバイスに物理的に取り付けるために使用される。スペクトルパターンはパッド上、左、および上に、はっきりと見え、そこにナノパターンが存在する。
【図２】図2Aおよび2Bは、PDMSナノ溝上のMEAパターンを示す。図2Aは、破損した試料上の2×3MEAを示し、MEAは、シャドーマスクを使用してナノ溝層上に直接スパッタリングされたCr／Auで作製されている。図2Bは、2×4MEAを示し；ナノ溝層の右端部が切断されている。MEAは、中央に形成され、層の端部へのリードを有し、パッドに接続されており、読み取り電子装置への生体電位の直接のインターフェイスを可能にする。
【図３】図3A〜3Cは、ナノ溝上のMEAの電子顕微鏡写真（SEM）である。図3Aは、電極およびリードを示した2×3MEAを示す。電極は生体電位を取得するために細胞に接触しており、電気リードは生体電位をインターフェイス電子装置に伝達する。図3Bは、電極の端部の拡大図である。Cr／Au電極はナノ溝の上部に位置し、PDMSナノ溝のナノメートルスケール特徴上でほとんど劣化を示さない。電極の端部はまた、視覚的に明らかである。図3Cは、Cr／Au電極によって覆われたナノ溝の拡大図である。
【図４】図4Aおよび4Bは、ナノ溝上のMEAの電気的インターフェイスを示す。図4Aは、電気的相互接続のアレイを有するソケットが（ワイヤまたはワイヤボンドなしで）ナノ溝層上のパッドの上部で直接嵌合していることを示す。この直接のインターフェイスは、より正確な生体電位を取得するために、ワイヤ／ワイヤボンドと関連した寄生を減少させるのに役立つ。MEAチップ上への配線ソケット装着：数字はソケットのピン番号であり（#1はアースされるように設定される）、図4Bはピン番号45／46の拡大図である（ピン番号はソケットの左下角から始まって、反時計回り方向に増加する）。パッドおよびソケットピンに電気リードを接続するために、Agエポキシ／塗料が添加される。いくつかの相互接続は、Agエポキシ／塗料を使用して手で接続する必要がある。これらの接続は、一体化製造技法を使用することにより排除することができる。
【図５】図5Aおよび5Bは、MEAの特徴づけを表す。図5Aは、電極がまとめて信号発生器（入力）に配線され、ソケットの全周に設置されたピンからの信号を測定していることを示す。図5Bは、図5Aの円で囲まれた区域のクローズアップを示した、アース接続の図である。
【図６】電子インターフェイス特徴づけ設備を示す。ソケットピンを介したMEAからの電気信号は、一連の信号調整ブロック（すなわち、増幅器およびフィルタ）を通過し、次いでデジタルサンプリングするためにDAQを通過する。DAQは、信号を視覚化するために、Lab VIEWを有するPCに接続されている。
【図７】信号発生器からの正弦波入力を使用し（200Hzで87.7μV）、ピン#7から取得された、MEAからの時間信号を示す：（上）デジタルフィルタ処理した信号および（下）生信号（デジタルフィルタなし）。生信号は、60Hzのノイズを包含する低周波成分の上に変調される。デジタルフィルタ処理した信号には、遮蔽または十分に接地されたソースの提供によって除去することが必要な低周波ノイズがまだ含まれる。
【図８】図8Aおよび8Bは、周波数応答を表す。図8Aは、入力：200Hzで58.5μVを用いて、入力振幅が減少すると、エンベロープ（60Hzのノイズ）がはっきりとすることを示す。図8Aは、入力：500 Hzで87.7μVを用いて、周波数応答が適切であると考えられることを示し、サンプリングレートが十分に高く、ワイヤおよびパッドと関連した寄生が測定にほとんど影響力を有しないことを示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、ピンデータを表す。図9Aは、ピン#8、入力：100Hzで58.5μVにおいて取得されたデータを示し、ピン#8は、ソケットの下部（スライド3参照）、ピン#7のすぐ隣に設置される。ピーク間振幅は約400mVである。図9Bは、ピン#19、入力：100Hzで58.5μVにおいて取得されたデータを示し、ピン#19は、ピン#7および#8と直交する、ソケットの右（図45参照）に設置される。ピーク間振幅はやはり約400mVであり、ピン#8からのものと同様である。この結果は、2つの直交する電気リードの実効抵抗および容量が測定にほとんど影響しないことを示す。
【図１０】ピン＃33、入力：100Hzで58.5μVにおいて取得されたデータを示す。ピン＃33は、ピン＃7および＃8の反対側の、ソケットの上部（スライド3参照）に設置される。ピーク間振幅は約400mVであり、本発明者らが他のピンから得たものと同様である。
【図１１】図11Aおよび11Bは、円筒形の培養チャンバおよびMEA構成を表す。図11Aは、ナノ溝層上のMEAに取り付けられた円筒形の培養チャンバを示す。チャンバを、シリコーン真空グリースを使用して細胞培養層に直接接着することができる。必要に応じて培養物を形成する前に、グリースおよび円筒をオートクレーブおよび乾熱滅菌することができる。図11Bは、3×5MEAアレイを示し、電極が露出し、残り（の場）がパリレン（約4μμm）の薄層によって絶縁されていることを示す。電気リードをパシベーションするために（そうしないと、リード上の複数の細胞が複数の生体電位を発生し、生体電位が識別可能とならない）、細胞培養表面を、電極区域を除いてパリレンによって覆うことができる。
【図１２】図12A〜12Cは、生体適合材料におけるナノトポグラフィー変化に対する細胞および組織挙動の機械的感受性を実証する。図12Aは、異なる湾曲部の溝に沿った、方向性を持った細胞の極性化を表す。図12Bは、400nm幅の溝（左）および800nm幅の溝（右）の中の初代心臓細胞突起の相違度合いを表す。図12Cは、段階的間隔を有する可変隆起パターンアレイ（左）および規則的に間隔をあけたトポグラフィーパターンアレイ（右）に対する線維芽細胞勾配応答を表す。
【図１３】インビボ環境を模倣する、ナノ溝上の本明細書に記載される多ウェルMEA（多電極アレイ）の例示的な態様の全略図である。最高128個のチャンネルの、MEAが、生体適合性の可撓性層（すなわち、PDMS（ポリジメチルシロキサン）またはPU（ポリウレタン））上に整列するナノメートルスケール溝（ナノ溝；数100nmの幅、ピッチ、および深さ）上に、直接一体化される。ナノ溝は、モニタリングされる細胞にインビボ模倣環境を提供する。細胞は、MEAの上部に位置する、ウェル（培養チャンバ）で培養されている。生体信号（生体電位およびインピーダンス）は、MEAの電極で収集される。電極は、ナノスケールの合図の完全性を維持するために、ナノ溝の輪郭をたどっているナノ溝を覆う。生体信号は、PDMS／PU層の下部に設置されたバイアを介してワイヤへ伝達され、増幅、フィルタ処理され、チャンネル多重化される。多ウェルMEAからのシリアル化された生体信号は、収集されて、PCインターフェイスで見られるようにデジタル化される。比較的遅い生体信号の上に速い電子装置をうまく用いることによって、両方の生体信号（生体電位およびインピーダンス）を、疑似リアルタイムで時分割多重化方法を使用して同時に視覚化することができる。
【図１４Ａ】ナノトポグラフィー的にパターン化された心臓組織構造体を実証する。図14Aは、平行に並んでいるマトリックス線維（下）に取り付けられた、きれいに並んでいる心筋（中央）を実証するエクスビボ成体ラット心筋のSEM画像である。
【図１４Ｂ】ナノトポグラフィー的にパターン化された心臓組織構造体を実証する。図14Bは、広い区域（約3.5cm2）ナノパターン化された細胞培養表面の写真（上）およびその断面SEM画像（下）である。
【図１４Ｃ】ナノトポグラフィー的にパターン化された心臓組織構造体を実証する。図14Cは、パターン化されない表面上およびナノパターン化された表面上でのコンフルエント新生児ラット心室ミオサイトの形成を表す。筋節のα-アクチンの免疫蛍光画像であり、パターン指向性を有する細胞核は、双方向矢印によって示される。
【図１４Ｄ】ナノトポグラフィー的にパターン化された心臓組織構造体を実証する。図14Dは、パターン化されない表面上およびナノパターン化された表面上で培養された細胞単層全体にわたる活動電位伝播を表す。等時線は、5ms間隔で設けられる。
【図１５】下層のナノ構造化された表面に対する心臓構造体の特性の感受性を実証する。（左）コネクシン-43タンパク質発現および（右）活動電位長手方向伝導速度（LCV）が共に、ナノトポグラフィー寸法の影響を受ける。
【図１６】ナノ溝PDMS上の2×3 MEAのSEMである。（左）2×3 MEAの電極およびリードを示す低倍率写真（70×）である。（中央）電極の端部のクローズアップ（1000×）であり、Cr／Au薄膜金属が周期的ナノ溝ウェルを覆っていることを示し、（右）Cr／Auによって覆われたナノ溝の拡大図（50,000×）である。ナノ溝の周期的でかつ鋭い特徴は、Cr／AuMEA形成の後に、うまく維持される。
【図１７】図17A〜17Dは、ナノ溝上でのMEAの形成を表す。図17Aは、ナノ溝上の3×5 MEAの画像である。リードはパリレン-C膜によって覆われ、電極は細胞に触れるように覆われない。図17Bは、ナノ溝上のMEAに取り付けられた円筒形の培養チャンバを表す。図17C〜17Dは、ナノ溝上のMEAの時間信号取得を表す。エミュレートされたソースが、信号発生器からの入力で使用された：（図17C）200Hzで87.7μVおよび（図17D）100HZで29.25μV。信号ははっきりと見え、周波数応答は適切である。60Hzのノイズが存在するが、追加的なシールド線によっておよび明確に画定された接地によって低下させることができる。
【図１８】単一ウェルMEAの製造順序を表す。工程（a）：スライドガラス上の金属化、工程（b）：スライドガラスへのナノ溝PDMS／PU転写、工程（c）：第1のシャドーマスクを使用した金属マスクの形成、工程（d）：PDMS／PUおよびマスク除去のドライエッチング、工程（e）：バイアの電気メッキ、工程（f）：第2のシャドーマスクを使用した電極アレイの形成、工程（g）：培養チャンバ取り付け。
【図１９】図19Aおよび19Bは、（図19A）パターン化されない表面上、および（図19B）ナノパターン化された表面上での、NRVMのコンフルエント単層の形成を表す。
【図２０】図20Aは、可変表面トポグラフィーおよび剛性に対する細胞応答の並行スクリーニングのための、大きい区域のナノパターン化された表面と一体化された多ウェル細胞培養デバイスの一例を表す。図20Bは、製造された、異なる溝幅を有するパターンのSEM画像である。
【図２１】多ウェルMEAの一態様の製作順序の概略図である。工程（a）：スライドガラス上への2工程（薄膜／厚膜）金属化：薄膜はワイヤ用で、厚膜はパッド用である。工程（b）：スライドガラスへのナノ溝PDMS／PU転写。工程（c）：バイア／電極形成、工程（d）：PDMSで作製された培養チャンバアレイ。工程（e）：MEAデバイスに対する培養チャンバアレイのプラズマ支援接合。
【図２２】信号検出不確実性解析の概略図である。信号ラインがナノ溝と直交する場合（方向1）、信号ラインと関連したRC時定数は、ナノ溝と平行なライン（方向2）のRC時定数より大きく3.84（=1.962）倍である。単一ウェルMEAでは、生体信号の取得は、ナノ溝に応じたこのRC時定数変化とは無関係である。しかしながら、生体信号の時分割多重化が実行される場合、多ウェルMEAでの信号取得はRC時定数変化の影響を受ける。RC時定数変化を排除するために、ワイヤは、PDMS／PUとスライドガラスとの間に埋め込まれる（図18および21）。
【図２３】ナノ溝上の多ウェル（96ウェル）多チャンネル（ウェル当たり128個のチャンネル）MEAに対する電子インターフェイスの信号チェーンブロック図である。各電極が1つのチャンネルに対応し、かつ1つのウェルが最高128個のチャンネルを含有する。個々のチャンネルは、パラレルチャンネルをシリアル信号に変換するために時分割多重化によって処理される。すべてのチャンネルは、時分割多重化のために多重化器（MUX）を通り抜ける前に、増幅およびフィルタ処理される。複数のウェルからのシリアル化された信号は、パラレルにデジタル化されて（DAQ）、信号をさらに純化するためにデジタル信号プロセッサ（DSP）を通り抜ける。インピーダンス測定が、DAQで提供される外部の刺激（AC電圧）を必要とすることを除き、生体電位およびインピーダンス（z）の両方が、同一の信号通信チャンネルを通る。DAQは刺激電圧を生成し、刺激電圧は、AC電流を測定してインピーダンス（Z）をコンピュータで算出するために、個々のチャンネル（電極）にアナログAC電圧を提供するように分波する（下）。時分割多重化は、生体信号の疑似リアルタイム取得を可能にする（下）。DAQが96個のウェルから同時に信号を取り込むように、各MEAウェルはパラレルで処理される。
【図２４】本明細書に記載されるMEAナノデバイスの一態様の写真である。MEAナノデバイスは、いろいろなサイズで製造することができ、任意の増幅器ソケットとの対応性を確保し、例えば、MCS 1060増幅器、またはAxion Biosciencesに対応する。
【図２５Ａ】MEAナノデバイスの代替的な積層を表す。ナノ上電極MEAナノデバイスを表す。図25Aは、ナノ上電極デバイスの設計原理を示す概略図である。電極を、ポリマーナノ溝（PDMS/PUA/PEGおよび他のUV硬化性ポリマー）上に、代替的なやり方でスパッタリングするかまたは堆積させる。
【図２５Ｂ】MEAナノデバイスの代替的な積層を表す。ナノ上電極MEAナノデバイスを表す。図25Bは、ナノ上3×5電極MEAナノデバイスの一態様の写真であり、リードはパリレン-C膜によって覆われ、電極は細胞に触れるように覆われない。
【図２５Ｃ】MEAナノデバイスの代替的な積層を表す。ナノ上電極MEAナノデバイスを表す。ナノ溝PDMS上の2×3 MEAのSEMである。図25Cは、2×3 MEAの電極およびリードを示す低倍率写真（70×）である。
【図２５Ｄ】MEAナノデバイスの代替的な積層を表す。ナノ溝PDMS上の2×3MEAのSEMである。図25Dは電極の端部のクローズアップ（1000×）であり、Cr/Au薄膜金属が周期的ナノ溝をうまく覆っていることを示す。
【図２５Ｅ】MEAナノデバイスの代替的な積層を表す。ナノ溝PDMS上の2×3MEAのSEMである。図25Eは、Cr/Auによって覆われたナノ溝の拡大図（50,000×）である。ナノ溝の周期的でかつ鋭い特徴は、Cr/AuMEA形成の後に、うまく維持される。PUAナノパターンの上にスパッタリングされた金電極を有するナノ上電極MEAナノデバイスの例が、図24に表される。
【図２６】図26Aおよび26Bは、電極上ナノMEAナノデバイスの例示的な態様を表す。図26Aは、予め製造されたMEAの上に形成された、スピンコーティングされたポリマーナノ溝を示す、概略図である。図26Bは、カスタマイズされた培養チャンバを有する多チャンネル64ピンマイクロアレイの上にスピンコーティングされナノテクスチャ加工された区域（破線によって縁取られる）を有する電極上ナノMEAデバイスの例を表す。
【図２７】図27Aおよび27Bは、適切な細胞外マトリックス分子または合成ペプチドでコーティングした後に播種された場合、心筋細胞がMEAナノデバイス上に容易に単層を形成することを実証する。電極上ナノ（図27A）およびナノ上電極（図27B）MEAナノデバイス上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞は、細胞がナノ溝の方向に並んでいる単層を形成する。矢印は、ナノ溝の方向を示す。
【図２８】図28A〜28Dは、本明細書に記載されるデバイスが、培養心筋細胞の場電位をそれほど変化させないことを実証する。電極上にパターン化されない（図28A）およびナノテクスチャ加工された（図28B）ポリマーを有するMEA上で培養された、新生児ラット心室ミオサイトの自発的に生成された場電位プロファイル。電極上にパターン化されない（図28C）およびナノテクスチャ加工された（図28D）ポリマーを有するMEA上で培養された、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の自発的に生成された場電位プロファイル。
【図２９】図29A〜29Dは、細胞上の心臓活動に対する薬物の効果を検出する際に、本明細書に記載されるMEAナノデバイスがより敏感であることを実証しており、該細胞は、成熟しており、かつ、ナノテクスチャ加工されたプラットホームの上に異方的に並べられている。（図29Aおよび29B）hERGチャネル阻害物質である、0.1μMシサプリドの添加は、非テクスチャ（パターン化されない）MEAの上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに検出可能な異常を生じさせる。ここでは、0.1μMシサプリド添加前（図29A）および添加後（図29B）の非テクスチャMEAからの代表的な場電位プロファイルが示される。（図29C〜29D）MEAナノデバイスは、MEAナノデバイス（テクスチャ化された）の上で培養されかつ成熟したヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに、はるかに少ない投与量の0.02μMシサプリドで、検出可能な異常効果を示す。ここでは、0.02μMシサプリド添加前（図29C）および添加後（図29D）のMEAナノデバイスからの代表的な場電位プロファイルが示される。
【図３０】図30Aおよび30Bは、本明細書に記載されるMEAナノデバイスが、公知のhERG阻害物質であるが偽陽性として認識される薬物を、正確に検出することができることを実証する。公知のhERG阻害物質である、ベラパミルは、非テクスチャMEA上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに投与量依存異常を生じさせるが（図30A）、MEAナノデバイスでは検出可能な異常は生じない（図30B）。上、示される投与量での、2分間のベラパミルでの潅流後に示された場電位。
【図３１】図31Aおよび31Bは、細胞上の心臓活動に対する薬物の効果を検出する際に、本明細書に記載されるMEAナノデバイスがより敏感であることを実証しており、該細胞は、成熟しており、かつ、ナノテクスチャ加工されたプラットホームの上に異方的に並べられている。（図31A）1μMカルシウムチャネル阻害物質の添加は、非テクスチャ（パターン化されない）MEAの上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに検出可能な異常を生じさせる。ここでは、1μM薬物の添加後の非テクスチャMEAからの代表的な場電位プロファイルが示される。（図31B）MEAナノデバイスは、MEAナノデバイス（テクスチャ化された）の上で培養されかつ成熟したヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに、はるかに少ない投与量の0.02μMシサプリドで、検出可能な異常効果を示す。ここでは、薬物の添加のMEAナノデバイスからの代表的な場電位プロファイルが示される。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明は、マイクロ電極アレイ（MEA）ベースのデバイスに、ならびに、例えば細胞および組織の研究においてなどのこれらのデバイスを使用するための方法に指向する。本発明によるMEAデバイスによれば、細胞をより天然に培養することができ、インビトロだが、より天然の状態で、培養細胞および組織を研究することが可能となる。本発明のいくつかの態様によれば、MEAデバイスは、研究される細胞および組織を培養することができる細胞培養表面を包含する。細胞培養表面は、細胞外マトリックス（ECM）を使用する場合などの、細胞および組織が体内で発達する方法をより綿密にモデル化した構成で細胞および組織が培養されるように促す、マイクロメートルおよびナノメートルサイズの特徴を包含することができる。
【００４０】
図1Aおよび1Bは、電極を形成するMEA、ならびに外部の信号記録／モニタリングおよび信号発生コンポーネントとの電気的接続を提供する接続リードに金属化を適用するプロセスを示す。図1Aは、本発明のいくつかの態様による、シャドーマスク上のMEAマスクパターンを示す。この態様では、暗い部分は、生体適合性細胞培養層が金属化されるシャドーマスクの開口部を示し、明るい部分は、マスキングされる（金属化されない）。本発明のいくつかの態様によれば、シャドーマスクをナノ溝PDMS細胞培養層の上部に置き、Cr/Auを、スパッタプロセスを使用して堆積させる。クリップまたはクランプを、金属化プロセス中に、生体適合性細胞培養層にシャドーマスクを物理的に取り付けるために使用することができる。いくつかの態様によれば、ナノパターニング（例えば、ナノ溝）を細胞培養層に形成した後に、金属化を生体適合性細胞培養層の上に適用することができる。スペクトルパターンはパッド上、左、および上に、はっきりと見え、そこにナノパターンが存在する。いくつかの態様によれば、金属化をベース基材に適用することができ、ナノ溝を包含する（またはナノ溝を包含するように後に処理される）生体適合性（例えばポリマー）層をベース基材上の金属化層の上に適用することができる。図2Aおよび2Bは、ナノ溝を含むPDMS細胞培養層上に形成されたMEA電極パターンの例を示す。各電極は、電極と、デバイスの周端部上に形成されるパッドとの間に電気的接続を提供するリード（例えば、ワイヤ）を包含することができる。パッドは、外部の信号検出／モニタリング／記録システム、および信号発生システムへの電気的接続を容易にする。
【００４１】
図3A、3B、および3Cは、生体適合性細胞培養層のナノ溝上に形成されたMEAの走査型電子顕微鏡画像を示す。図3Aは、2×3アレイパターンのCr/Au電極の例を示す。図3Bは、ナノ溝上に形成された電極の一部分を示した円で囲まれた部分の引き伸ばし写真である。図3Cは、Cr／Auが別個のナノ溝の隆起の上部ならびにナノ溝の側壁表面および下部表面を覆う、ナノ溝の上に形成されたCr／Au電極の引き伸ばし写真である。ノイズおよび不要信号が回路へ混入するのを防止するかまたは減少させるために、絶縁材料の層を、電極から延びているリードの上に適用することができる。
【００４２】
本発明のいくつかの態様によれば、MEAデバイスと外部の信号検知および信号発生コンポーネントとの間に電気的接続を提供するために、MEAデバイスを集積回路型ソケットに取り外し可能に差し込むことができるようにMEAデバイスを標準的な集積回路デバイスに対応する構成で形成することができる。図4Aおよび4Bは、外部との電気的接続を容易にするために、配線ソケットに装着されたMEAデバイスを示す。本発明のいくつかの態様によれば、アレイの電極を周囲のパッドと接続するために、様々な電気的相互接続を使用することができる。図4Bに示されるように、ポリマー細胞培養層に損傷を与える可能性がある熱を使用せずにパッドにリードを接続するために、Agエポキシ塗料を使用することができる。他の金属化プロセスをまた使用することができ、例えば、スパッタ堆積を包含する第2のマスクプロセスを使用して追加的な層を適用することができる。電気的接続のために生体適合性細胞培養層の部分を除去するため、ならびにマイクロメートルおよびナノメートル溝を形成するために、周知のエッチング（例えば、化学エッチング、レーザーエッチング、ドライエッチング、反応性イオンエッチング）技法を使用することができる。
【００４３】
本発明のいくつかの態様によれば、細胞培養表面を設けるための連続した層の適用を包含するプロセスによって、MEAデバイスを形成することができる。第1のマスク、および電導性材料のスパッタ堆積を使用して、パッド、リード、および任意で電極をベース基材に適用することができる。生体適合性ポリマーまたは誘電材料の細胞培養層を表面上に適用することができ、層が、表面上に形成されたマイクロ／ナノパターニングを包含することができるか、または次の工程で、マイクロ／ナノパターニングを形成することができる。任意で、マイクロ／ナノパターン化された表面に適用することができる電極に電気的接続を提供するために、孔および電導性バイアを細胞培養層に形成することができる。第2のマスクおよびスパッタ堆積プロセスを使用して、任意の表面電極を表面に適用することができる。リードおよびパッドを生体適合性細胞培養層および／またはベース基材材料に適用するために、他の周知の薄膜および厚膜金属堆積プロセスを使用することができる。
【００４４】
図5Aおよび5Bならびに6に示されるように、電極を、1つまたは複数の信号発生デバイスおよび1つまたは複数の信号処理デバイスに電気的に接続することができる。信号発生デバイスとしては、細胞／組織応答を研究するためにMEAの表面上で培養された細胞および組織に送ることを目的とした電位を発生させる電子デバイスを挙げることができる。信号処理デバイスとしては、細胞および組織からの信号を受け取りかつ信号の特徴づけを試みる、デバイスが挙げられる。信号処理デバイスは、増幅器およびフィルタなどの信号調整ブロックと、信号をデジタルサンプリングして特徴づける、データ取得（DAQ）デバイスとを備えることができる。信号処理デバイスはまた、細胞／組織が発した信号を保存する保存デバイスを備えることができる。本発明のいくつかの態様によれば、信号処理デバイスとしては、同時に複数の電極に信号を送るためおよび／または受け取るためにインターフェイスボードを備えた、1つまたは複数のプロセッサおよび関連するメモリを有するパーソナルコンピュータ（PC）を挙げることができる。PCは、信号を視覚化するために、Lab VIEWソフトウェアなどの、ソフトウェアを備えることができる。
【００４５】
図7、8Aおよび8B、9Aおよび9B、ならびに10は、図4Aおよび4Bに示されるデバイスの様々な電極から捕捉された信号の画像を示す。信号は、MEAデバイスの隣接した電極に接続するピン7、8、19、および33から捕捉される。信号は、100Hzから500Hzまで変化するサンプリングレートでサンプリングされたが、リードの位置または配向が信号測定にほとんど影響を有しないことを実証する。
【００４６】
本発明の様々な態様によれば、MEAは好ましくは、培地への浸漬によって細胞／組織生存度を維持するチャンバを備える。チャンバは、培地で細胞／組織を維持する任意の構造とすることができる。本発明のいくつかの態様によれば、MEAは、MEAを取り囲むチャンバ壁を備えることができ、アレイの電極のうちのいくつかの上で細胞が培養されるように促すことができる。チャンバは、（図11Aおよび24に示されるような）円形または長円形から規則的および不規則な多角形までの任意の形状を画定することができる。いくつかの態様によれば、チャンバの形状は、目的の細胞および組織発達により、または既定の細胞／組織の組織化を促すために、画定されることができる。
【００４７】
電極のリードが細胞培養層の上部に形成される、本発明のいくつかの態様によれば、電極と接触する細胞から受信した信号と干渉する可能性がある他の細胞からの信号をリードが捕らえないように、リードを絶縁することが望ましい場合がある。いくつかの態様によれば、図11B、25Bに示される、パリレンなどの生体適合性絶縁材料の薄層でリードを覆うことによって、リードをパシベーションすることができる。絶縁材料は、1.0 〜5.0μm程度の厚さとすることができる。
【００４８】
本発明のいくつかの態様によれば、細胞培養表面を有するMEAを、本発明に従って改変することができる。MEAは、細胞培養表面上に任意の構成で配置された複数の電極を備えることができ、電極は、デバイスの周囲の部分に設置されるパッドに、または周囲の部分に隣接して設置されたパッドに、ワイヤまたはリードによって接続されている。本発明のいくつかの態様によれば、生体適合性層を、図26Aおよび26Bに示されるようなMEAの細胞培養表面に適用することができる。本発明のいくつかの態様による生体適合性層は、任意の生体適合性材料、例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）またはポリウレタン（PU）などの、可撓性ポリマーとすることができる。本発明のいくつかの態様によれば、生体適合性層の可撓性および／または硬さを、生体適合性層上に配置される細胞のより生理的な応答を促すように選択することができる。例えば、天然に可撓性があり、細胞が収縮する場合にたわむ、細胞外マトリックス基材上に、インビボ筋細胞を通常配置する程度まで、可撓性のある生体適合性層の使用により、その上に配置された細胞は、インビボ筋組織とより良好にほぼ同じように挙動することができると考えられる。いくつかの態様では、このような配置は、本明細書に記載される多電極アレイ構造体を使用した、例えばインビボ心筋への薬効のより正確な予測に寄与することができる。本発明のいくつかの態様によれば、生体適合性層を、細胞が天然に発達する天然材料の硬さ、可撓性、およびテクスチャにより近づくように、例えば、骨、軟骨、または細胞外マトリックスに近づくよう選択された剛性、半剛性、もしくは可撓性材料にすることができる。
【００４９】
本発明のいくつかの態様によれば、MEAを、可撓性の生体適合性層（例えば、PDMSまたはPU）と一体化することができ、可撓性の生体適合性層が、溝および／または隆起などの、ナノメートル（またはマイクロメートル）スケールの特徴を持つ。本発明のいくつかの態様によれば、ナノメートル溝（または「ナノ溝」）は、100nmから1000nmの範囲の幅、ピッチ、および／または深さであり、ナノ溝の上部で培養された細胞に機械的な合図を提供することができる。ナノ溝および他のナノメートルスケールの特徴は、エッチング（例えば、レーザーエッチング、化学エッチング、ドライエッチング、および／または反応性イオンエッチング）ならびにスタンピングを包含する、周知の付加または削除製造プロセスによって形成することができる。ナノ溝は、毛細管力リソグラフィベースのナノパターニングによって形成することができる。
【００５０】
本発明の様々な態様によれば、ナノメートルおよびマイクロメートルスケールの特徴を、培養中に細胞および組織の組織化を促し、細胞および組織機能を試験するために、細胞培養表面上に構成および配置することができる。本発明のいくつかの態様によれば、ナノ溝の幅、深さ、および／またはピッチ（例えば、ナノ溝間の間隔）は、各ナノ溝の長さにわたって実質的に均一とすることができる。本発明のいくつかの態様によれば、ナノ溝の幅、深さ、および／またはピッチ（例えば、ナノ溝間の間隔）は、各ナノ溝の長さにわたって実質的に不均一（不規則）とすることができる。本発明のいくつかの態様によれば、ナノ溝のうちの2つまたは複数は、細胞培養表面の少なくとも一部分にわたって実質的に平行に延びていることができる。本発明のいくつかの態様によれば、ナノ溝のうちの2つまたは複数の間の距離を、細胞培養表面の少なくとも一部分にわたって変化させることができ、1回または複数回交差させることができる。本発明のいくつかの態様によれば、ナノ溝のうちの1つまたは複数は湾曲することができ、曲線を、規則的（例えば、一定の曲率半径を有する）かまたは不規則とする（例えば、ナノ溝の長さにわたって異なる曲率半径を有する）ことができる。本発明の態様によれば、ナノ溝を、例えば図12Aに示されるような、同心円で形成することができる。いくつかの態様によれば、溝の幅および深さは異なり、ナノ溝に異なる量の細胞突起をもたらすことができる。例えば、図12Bは、400nm幅の溝（左）および800nm幅の溝（右）の中の初代心臓細胞突起を示す。いくつかの態様によれば、ナノ溝間の間隔および／または各ナノ溝の幅を、細胞培養表面にわたって変化させることができる。例えば、図12Cは、ナノ溝間に段階的間隔を有する（例えば、左からから右に増加する）可変隆起パターンアレイに対する線維芽細胞応答を示し、図12Dは、規則的に間隔をあけたトポグラフィーナノ溝パターンアレイに対する線維芽細胞応答を示す。同様に、ナノ溝の深さを、溝の長さにわたって変化させ、および／または隣接するナノ溝間で異なるものとすることができる。
【００５１】
さらに、本発明によるMEAデバイスを、細胞培養表面の異なる領域または区域に異なる特徴を包含することができる、ナノ溝と他のナノメートルサイズの特徴との複合構成によって構成することができる。例えば、1つまたは複数のまっすぐで均一なナノ溝が、ある区域に沿って延びていることができ、隣接する区域が、湾曲した、渦巻き状の、かつ／または不規則に構成された部分を包含することができる。
【００５２】
本発明のいくつかの態様によれば、電極のアレイを、細胞培養表面に適用されたナノ特徴に対して既定の構成で位置決めするかまたは配置することができる。例えば、ナノ特徴（例えば、ナノ溝または隆起）を、細胞および／または組織が第1の軸に沿って並ぶように構成することができ、電極のアレイを、軸に対する既定の位置で細胞および／または組織に接触するように位置決めすることができる。別の例では、細胞培養表面は、ナノ特徴の異なる構成または不規則な構成を有する領域を包含することができ、電極を、これらのナノ特徴に対して戦略的に置くことができる。
【００５３】
使用される用語「不規則な」は、溝またはナノ溝に関して使用される場合、溝またはナノ溝のまっすぐで、均一で、かつ平行な組以外の構成を意味する。いくつかの態様では、不規則な溝（またはナノ溝）は、まっすぐで、平行で、かつ均一な溝（またはナノ溝）に対する異方性を増加させる溝である。いくつかの態様では、不規則な溝（またはナノ溝）は、湾曲した溝、交差溝、渦巻きパターン化された溝、セミランダムに構成された溝、および／またはランダムに構成された溝を含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養表面の一部分が不規則な溝（またはナノ溝）を含み、別の部分が（例えばまっすぐで、均一で、かつ平行な）規則的な溝（またはナノ溝）を含む。
【００５４】
これらの不規則なナノ溝は、例えば、不整脈の心筋細胞および／または正しく並んでいない心筋細胞の培養および／または研究を可能にすることができる。正しく並んでいない心筋細胞は、心筋梗塞を経験した対象の心臓組織、先天性心疾患を有する対象の心臓組織で、および／または心臓の瘢痕組織で見ることができる。本明細書に記載されるように、非限定的な例として、抗不整脈剤をまたは心臓瘢痕組織および／もしくは心臓疾患を処置するための作用物質をスクリーニングするために、このようなデバイスを使用することができる。
【００５５】
一局面では、本明細書に記載されるような多電極アレイと、細胞培養表面上に存在する導電性細胞とを含む細胞培養システムが、本明細書に記載される。いくつかの態様では、導電性細胞は、少なくとも1つの電極と接触することができる。いくつかの態様では、例えば、細胞培養表面の下に設置され、細胞培養表面の一部分を形成しない電極を有するアレイを用いる場合に、導電性細胞は、細胞と電極との間の電気信号の伝送のための少なくとも1つの電極に十分に近接することができる。
【００５６】
いくつかの態様では、細胞培養システムは、複数の導電性細胞を含むことができる。いくつかの態様では、複数の細胞は、細胞の単層を形成することができる。いくつかの態様では、複数の細胞は、例えば、筋組織または神経組織などの、組織を形成することができる。いくつかの態様では、細胞培養システムは、例えば、脂肪細胞または上皮細胞などの、非導電性細胞をさらに含むことができる。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「導電性細胞」は、電気信号を伝導し、電気信号を発生し、かつ／または電気信号に応答することが可能な細胞を意味する。導電性細胞の非限定的な例としては、ニューロンおよびミオサイト（筋細胞）を挙げることができる。導電性細胞は、天然に存在する導電性細胞（例えば、筋細胞もしくはニューロン）、または、操作された細胞、例えば、導電性活性を呈するように遺伝子改変もしくはトランスフェクトされた細胞の両方を包含することができる。非限定的な例として、少なくとも1つの電位開口型イオンチャネルを発現するように操作された細胞を、操作された導電性細胞とすることができる。当業者は細胞を操作するための方法に精通しており、この方法としては、遺伝子改変、相同組換え、一過性発現、およびタンパク質トランスフェクションを挙げることができ、例えば、プラスミド、裸のDNA、またはウイルスベクターなどの、1つまたは複数の様々なベクターによって達成することができるが、これらに限定されない。
【００５８】
いくつかの態様では、導電性細胞を筋細胞とすることができる。いくつかの態様では、筋細胞を心筋細胞とすることができる。いくつかの態様では、筋細胞を心臓ペースメーカ細胞とすることができる。いくつかの態様では、筋細胞を平滑筋細胞とすることができる。いくつかの態様では、筋細胞を骨格筋細胞とすることができる。
【００５９】
いくつかの態様では、導電性細胞を神経細胞とすることができる。
【００６０】
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞培養システムは、複数の型の導電性細胞を含むことができる。
【００６１】
一局面では、本明細書に記載されるような多電極アレイと、細胞培養表面上に存在する導電性細胞の前駆体とを含む細胞培養システムが、本明細書に記載される。いくつかの態様では、前駆細胞を、心臓前駆細胞、筋原性拘束細胞、ニューロン前駆細胞、幹細胞、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞とすることができる。いくつかの態様では、細胞培養システムは、導電性細胞および／または非導電性細胞をさらに含むことができる。
【００６２】
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞培養システムが含む細胞、例えば導電性細胞は、心臓疾患または神経疾患を有する対象から得た細胞を含むことができるか、または、該対象から得た細胞に由来する細胞を含むことができる。いくつかの態様では、心臓疾患または神経疾患は、異常な導電活性によって特徴づけられる疾患または異常な導電活性を原因とする疾患とすることができる。このような心臓疾患および神経疾患の非限定的な例としては、不整脈、長QT症候群、心臓ブロック、心房性細動、徐脈、頻脈、心室性細動、アダムズ-ストークス病、心房粗動、ウルフ-パーキンソン-ホワイト症候群、末梢神経障害、シャルコー-マリー-ツース病などを挙げることができる。いくつかの態様では、細胞は、心臓疾患もしくは神経疾患と関連することまたは心臓疾患もしくは神経疾患を引き起こすことが知られる遺伝子突然変異を含むことができる。いくつかの態様では、細胞は、心臓疾患もしくは神経疾患と関連することまたは心臓疾患もしくは神経疾患を引き起こすことが知られる遺伝的背景を含むことができる。いくつかの態様では、細胞は、心臓疾患または神経疾患と関連することが知られる民族的背景として得られることができるか、または該民族的背景として得た細胞に由来することができる。
【００６３】
いくつかの態様では、導電性細胞は、心臓疾患と関連した突然変異を含むように改変された、例えば、このような突然変異を含むように操作された、導電性細胞とすることができる。非限定的な例として、シャルコー-マリー-ツース病は、例えば、とりわけ、PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、KIF1B、MFN2、RAB7A、LMNA、MED25、TRPV4、GARS、HSPB1、GDAP1、DYNC1H1、LRSAM1、MTMR2、およびSBF2における特定の突然変異と関連し、長QT症候群は、KCNQ1、KCNH2、hERG、MiRPl、SCN5A、アンキリンB、KCNE2、KCNJ2、CACNA1C、カベオリン3、SCN4B、AKAP9、SNTA1、およびGIRK4における突然変異と結びつけられている。当業者は、さらなる例を承知している。
【００６４】
一局面では、導電性細胞に対する作用物質の効果を測定するアッセイ法が、本明細書に記載され、アッセイ法は、本明細書に記載される細胞培養システムを作用物質と接触させる工程と、導電性細胞の成長、生存度、または活性を測定する工程とを含む。作用物質は、薬物または薬物候補とすることができ、アッセイ法は、導電性細胞に対する薬物の安全性を評価することができる。いくつかの態様では、作用物質は、心血管、筋、または神経の疾患または障害のための薬物または薬物候補とすることができる。
【００６５】
用語「作用物質」は、通常存在しないか、または、細胞、組織、器官、もしくは対象に投与されるレベルで存在しない、任意の実体を意味する。作用物質は、化学物質；小分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；ペプチド模倣物；ペプチド誘導体；ペプチド類似体；アプタマー；抗体；内部抗体；生体高分子；またはこれらの機能的断片を含む群より選択することができる。核酸配列は、RNAまたはDNAであり、一本鎖または二本鎖とすることができ、関心対象のタンパク質をコードする核酸；オリゴヌクレオチド；および核酸類似体；例えばペプチド-核酸（PNA）、偽相補性PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）などを含む群より選択することができる。このような核酸配列としては、例えば転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、小さい抑制核酸配列として機能するタンパク質をコードする核酸配列、例えば、限定されないがRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質および／もしくはペプチドまたはこれらの断片は、任意の関心対象のタンパク質、例えば、限定されないが変異タンパク質；治療タンパク質；トランケートタンパク質とすることができ、このタンパク質は、通常細胞内に、存在しないか、またはより低いレベルで発現する。タンパク質はまた、変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ、トリアボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変タンパク質、およびこれらの断片を含む群より選択することができる。作用物質を培地に適用することができ、この場合、それは、細胞と接触して、効果を誘導する。代替的に、作用物質は、作用物質をコードする核酸配列の細胞内への導入、ならびに細胞内での核酸および/またはタンパク質環境刺激の産生をもたらすその転写の結果として、細胞内にあることができる。いくつかの態様では、作用物質は任意の化学物質、実体、または部分であり、限定はされないが、合成および天然に存在する非タンパク性実体を包含する。ある態様では、作用物質は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は非置換もしくは置換アルキル、芳香族、またはヘテロ環部分を包含し、マクロライド、レプトマイシン、およびこれらの関連天然生成物または類似体が挙げられる。いくつかの態様では、作用物質は、細菌、植物、真菌、または動物の細胞または組織などの生体材料から作製された抽出物とすることができる。いくつかの態様では、作用物質は、天然に存在する組成物もしくは合成組成物またはこれらの機能的断片とすることができる。作用物質は、所望の活性および/または特性を有することが知られているものとすることができるか、または、多様な化合物のライブラリーより選択することができる。
【００６６】
一般的に、導電性細胞の活性、成長、および／または生存度をモジュレートすることができる任意の濃度で、作用物質を試験することができる。いくつかの態様では、作用物質は、約0.1nMから約1000mMの範囲の濃度で試験される。一態様では、化合物は、約0.1μΜから約20μΜ、約0.1μΜから約10μΜ、または約0.1μΜから約5μΜの範囲で試験される。実践される特定の態様に応じて、候補または試験作用物質を、溶液中で遊離した状態で提供することができる。加えて、本明細書に記載される方法では、試験作用物質を、個別にまたはグループでスクリーニングすることができる。グループスクリーニングは、有効試験作用物質に対するヒット率が、所与のグループに対して複数の陽性結果を期待できないほど低いと予想される場合に、特に有用である。
【００６７】
小分子、ポリマー、およびゲノムベースのライブラリーを開発するための方法は、例えば、Ding, et al. J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596 (2002)、およびLynn, et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156 (2001)に記載される。市販の化合物ライブラリーは、例えば、ArQule (Woburn, MA)、Invitrogen (Carlsbad, CA)、Ryan Scientific (Mt. Pleasant, SC)、およびEnzo Life Sciences (Farmingdale, NY)から得ることができる。これらのライブラリーの構成要素の、導電性細胞の活性、成長、および／または生存度をモジュレートする能力を、例えば本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００６８】
いくつかの態様では、作用物質は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片とすることができる。このような作用物質は、天然起源、例えば細胞または組織ライセートから得ることができる。ポリペプチド作用物質のライブラリーはまた、例えば、市販のまたは通常の方法で生成したcDNAライブラリーから、調製することができる。作用物質はまた、ペプチド、例えば、約5から約20アミノ酸であることが好ましく、約7から約15アミノ酸であることが特に好ましい、約5から約30アミノ酸のペプチドとすることができる。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または"偏りのある"ランダムペプチドとすることができる。ペプチドライブラリー、例えばペプチド類または他の化合物のコンビナトリアルライブラリーは、任意の位置に配列優先性または定常性がなく、十分にランダム化することができる。代替的に、ライブラリーを偏らせることができ、すなわち、配列内のいくつかの位置は、定常性を保たれているか、または、限られた数の可能性より選択される。例えば、いくつかの場合には、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、定義された分類、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りのある（小さいまたは大きい）残基の分類内で、架橋結合のためのシステインの形成、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、スレオニン、チロシンもしくはヒスチジン、またはプリンについて、ランダム化される。
【００６９】
作用物質はまた、核酸とすることができる。核酸候補作用物質は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏りのある」ランダム核酸とすることができる。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物も、タンパク質について先に記したのと同様に使用することができる。
【００７０】
作用物質は、投与される形で直接機能することができる。代替的に、所望の活性をモジュレートする形態、例えば、細胞内の活性の産生をもたらす核酸配列の細胞への導入およびその転写を生じさせるために、作用物質を細胞内で改変することまたは用いることができる。
【００７１】
いくつかの態様では、未処置の対照に対して、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、本明細書に記載される方法で導電性細胞の活性、成長、および／または生存度をモジュレートする、作用物質がスクリーニングまたは特定される。参照レベル（例えば作用物質が存在しない場合のレベル）より高いかまたは低いレベルは、参照レベルとは統計学的に有意に異なるレベルとすることができる。いくつかの態様では、参照レベルより低いレベルは、参照レベルの90％またはそれ未満、例えば参照レベルの90％またはそれ未満、80％またはそれ未満、70％またはそれ未満、60％またはそれ未満、50％またはそれ未満、25％またはそれ未満、または10％またはそれ未満とすることができる。いくつかの態様では、参照レベルより高いレベルは、参照レベルの1.5×またはそれ以上、例えば参照レベルの1.5×またはそれ以上、2×またはそれ以上、3×またはそれ以上、5×またはそれ以上、または10×またはそれ以上とすることができる。参照レベルは、作用物質が存在しない場合のレベル、例えば、（例えば同一の多ウェルマイクロ電極アレイの）平行な未処置の細胞培養ウェルのレベル、作用物質との接触前の細胞および／もしくはウェルのレベル、ならびに／または作用物質と接触していない細胞の集団のレベル、例えば所定のレベルとすることができる。
【００７２】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法およびアッセイ法は、例えば導電性細胞を作用物質と接触させた後の、細胞生存度の測定または判定に関することができる。「細胞生存度を測定すること」は、健康な生存細胞か、または死および／もしくは非生存細胞かを示す、細胞の代謝、成長、構造、および／または伝播の任意の局面を測定または検出することを意味する。当技術分野において公知の比色分析、ルミネセンス、放射測定、および／または蛍光定量的アッセイ法を使用することができる。いくつかの態様では、細胞生存を判定することは、血球計数器を使用した細胞の手集計を含むことができる。いくつかの態様では、細胞生存を判定することは、生死細胞染色法、例えば、生細胞または死細胞を染色する染色法の使用を含むことができる。
【００７３】
細胞生存を判定するための比色分析技法は、非限定的な例として、トリパンブルー排除法を包含する。簡潔に説明すると、細胞は、トリパンブルーで染色され、血球計数器を使用して集計される。生存細胞は色素を排除するが、死および瀕死の細胞は、青色色素を取り入れるため、光学顕微鏡下で容易に区別される。ニュートラルレッドは、生存細胞によって吸着され、細胞リソソームにおいて濃縮し；生存細胞は、ニュートラルレッド染色細胞の数を定量化することにより、光学顕微鏡で判定することができる。
【００７４】
細胞生存を判定するための蛍光定量的技法は、非限定的な例として、ヨウ化プロピジウム、蛍光DNAインターカレート剤を包含する。ヨウ化プロピジウムは生存細胞から排除されるが、死細胞の核を染色する。次いで、ヨウ化プロピジウム標識細胞のフローサイトメトリーを、生存細胞および死細胞を定量化するために使用することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出は、構造損傷および細胞の死を示し、分光光度酵素アッセイ法により測定することができる。ブロモデオキシウリジン（BrdU）は新たに合成されたDNAに組み込まれ、蛍光色素標識抗体により検出することができる。蛍光色素Hoechst33258はDNAを標識し、細胞の増殖を定量化するために使用することができる（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSEまたはCFDA-SE）の定量的な組み込みは、細胞分裂解析を提供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。この技法は、インビトロまたはインビボのいずれかで使用することができる。7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）はDNAとの関連でスペクトルシフトを受ける蛍光インターカレーターであり、細胞分裂解析を提供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。
【００７５】
細胞増殖を判定するための放射測定技法は、非限定的な例として、［3H］-チミジンを包含し、［3H］-チミジンは、生細胞の新たに合成されたDNAに組み込まれ、細胞の増殖を判定するために頻繁に使用される。細胞生存度を定量化するために、死細胞からのクロム（51Cr）放出を、シンチレーション計数により定量化することができる。
【００７６】
細胞生存を判定するためのルミネセンス技法は、非限定的な例として、CellTiter-Gloルミネセンス細胞生存アッセイ法（Promega Madison Wis）を包含する。この技法は、生存細胞の数を判定するために、存在するATPの量を定量化する。
【００７７】
細胞生存を判定するためのキットは市販されており、例えばMUTLITOX- FLOUR（商標）Multiplex Cytotoxicity Assay（カタログ番号 G9200；Promega, Inc.；Madison, WＩ）である。いくつかの態様では、細胞生存を判定する手段は、高スループット法を含むことができ、例えば、蛍光可能多プレート読み取り器を使用して生死細胞染色を検出することができる。いくつかの態様では、画像解析を自動画像取得および解析により実行することができる。
【００７８】
細胞成長の測定は、例えば、細胞体積および／もしくはサイズの変化の測定、ならびに／または細胞増殖の測定を包含することができる。細胞サイズの変化は、例えば画像解析ソフトウェアを使用して、測定することができる。細胞増殖は、例えば、とりわけRnD Systems、およびPromegaを包含する種々の企業から市販されるMTSアッセイ法を使用して、測定することができる。
【００７９】
いくつかの態様では、導電性細胞の活性は、場電位；場電位プロファイル；場電位持続時間；QT間隔長、伝導速度；電気物理プロファイル；自発的な拍動速度；リエントラント波パターン；およびインピーダンスからなる群より選択される活性とすることができる。
【００８０】
いくつかの態様では、アッセイ法は、細胞に不整脈を誘導する工程と、通常の場電位特性を元に戻す作用物質の能力を測定する工程とをさらに含むことができる。いくつかの態様では、抗不整脈剤としての作用物質の活性が測定される。不整脈は、多数の方法によって、本明細書に記載される細胞培養システムが含む細胞に誘導することができる。いくつかの態様では、不整脈は、細胞を不整脈誘導物質と接触させることによって誘導することができる。このような作用物質は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、エピネフリンまたはノルエピネフリンを挙げることができる。いくつかの態様では、不整脈は、不規則な電気刺激を多電極アレイを介して細胞に提供することによって、例えば、大きさおよび／または周波数が変化する不規則なパターンの電気インパルスによって、誘導することができる。いくつかの態様では、不整脈は、不規則なナノ溝を有する多電極アレイ上で細胞を培養することによって、誘導することができる。いくつかの態様では、不整脈は、細胞培養表面の一部分が不規則なナノ溝を含む多電極アレイ上で細胞を培養することによって、誘導することができる。いくつかの態様では、不整脈誘導法の組み合わせを、組み合わせることができる。
【００８１】
一局面では、本明細書に記載される多電極アレイを含むキットが、本明細書において提供される。いくつかの態様では、キットは、少なくとも1つの導電性細胞をさらに含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞培養システムを含むキットが、本明細書において提供される。
【００８２】
キットは、本明細書における様々な態様による少なくとも1つの多電極アレイを含む任意の製品（例、パッケージまたは容器）であり、この製品は、本発明に記載される方法またはアッセイ法を実行するユニットとして宣伝、配布、または販売される。本明細書に記載されるキットは、導電性細胞の培養、ならびに／またはそれらの細胞と関連した電気信号の記録および／もしくは刺激を可能にする試薬および／またはコンポーネントを包含する。本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載される方法およびアッセイ法を実行するために有用な追加的なコンポーネントを任意で含むことができる。このような試薬としては、例えば細胞培養培地、成長因子、分化因子、緩衝液、標識、イメージング試薬などを挙げることができる。このような成分は、当業者に公知であり、特定の細胞によっておよび実施される方法またはアッセイ法によって異なってもよい。加えて、キットは、使用説明書を含んでもかつ／または得た結果に関連する情報を提供してもよい。
【００８３】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および句の意味を以下に提供する。別途述べられる場合または文脈から暗示的に述べられる場合を除き、以下の用語および句は、以下に提供された意味を包含する。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されることから、定義は、特定の態様の記載を助けるために提供され、特許請求される本発明を限定することを目的としない。別途定義される場合を除き、本明細書において使用されるすべての科学的かつ技術的な用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書において提供されたその定義との間に明白な相違がある場合には、本明細書において提供された定義が優先されるものとする。
【００８４】
本明細書において使用される場合、用語「基材」は、生存するためおよび／または増殖するために細胞が付着または固着することが可能である任意の好適な担体材料を意味する。いくつかの態様によれば、細胞培養層は、細胞培養層の細胞培養表面上での細胞培養を容易にするために、基材に適用することができる。
【００８５】
本明細書において使用される場合、細胞の培養のための基材に関して使用される、用語「培養に好適な」は、細胞の培養および／または維持を可能にするために、例えば細胞または細胞の集団の生存を少なくとも継続させるために、必要な特徴を有することを意味する。維持された細胞の集団は、少なくとも、代謝的に活性な細胞の分集団を有することになる。非限定的な例として、細胞の培養に好適な基材は、細胞に毒性を及ぼすいかなる作用物質も含まず；無菌、実質的に無菌、もしくは滅菌しやすく；かつ／または細胞培地もしくは細胞と接触する細胞培地を含有する手段の供給源などによって提供されることになる。
【００８６】
本明細書において使用される用語「実質的に」は、大部分、実質的に特徴とする特性と本質的に同じことを意味する。いくつかの態様では、例えば、「実質的に平行な」特徴は、平行な構造と、少なくとも約60％、もしくは好ましくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、もしくは少なくとも約99％またはそれ以上、あるいは70％〜100％の間の任意の整数で類似する、特徴を意味する。いくつかの態様では、例えば、「実質的に平滑な」表面は、平滑な構造と、少なくとも約60％、もしくは好ましくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、もしくは少なくとも約99％またはそれ以上、または70％〜100％の間の任意の整数で類似する、表面である。
【００８７】
本明細書において使用される用語「ナノテクスチャ加工された」は、溝および隆起の高さおよび深さおよび幅がすべてマイクロメートル未満のスケールである実質的に平行な溝および隆起の繰り返しパターンを意味する。
【００８８】
用語「異方性の」は、方向に関連のあるやり方で空間的に組織化または配置される、細胞などの事項を意味する。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「溝」は、長さが幅より大きい、幅、長さ、および深さを有する表面の相対的な凹部を意味する。いくつかの態様では、溝を実質的に線状とすることができる。いくつかの態様では、溝を線状とすることができる。いくつかの態様では、溝の一部分を実質的に線状とすることができる。いくつかの態様では、溝の一部分を線状とすることができる。いくつかの態様では、溝を、基材の表面、例えば溝および／または隆起の導入前の表面に対して凹ませることができる。いくつかの態様では、溝を隆起に対して凹ませることができる。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「隆起」は、相対的に高いかつ／または上昇し、長さが幅より大きい幅、長さ、および高さを有する表面の一部分を意味する。いくつかの態様では、隆起を実質的に線状とすることができる。いくつかの態様では、隆起を線状とすることができる。いくつかの態様では、隆起の一部分を実質的に線状とすることができる。いくつかの態様では、隆起の一部分を線状とすることができる。いくつかの態様では、隆起を、基材の表面、例えば溝および／または隆起の導入前の表面に対して上昇させることおよび／または高いことができる。いくつかの態様では、隆起を、溝に対して上昇させることおよび／または高いことができる。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「アレイ」は、特定の要素の順序、配置、または連続を意味する。例えば、溝および隆起の任意のアレイは、複数の溝および／または隆起の配置を意味し、電極アレイは、複数の電極（例えば2つまたはそれ以上の電極、3つまたはそれ以上の電極、または4つまたはそれ以上の電極）の配置を意味する。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「細胞培養チャンバ」は、細胞の成長および／または維持を支援するために培養培地を保持することができる基材中のまたは該基材上のリザーバを意味する。いくつかの態様では、細胞培養チャンバを、ウェル、窪み、または壁に囲まれた区域とすることができる。いくつかの態様では、細胞培養チャンバの表面の少なくとも1つは、溝および隆起を含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養チャンバは、マイクロ電極および／またはマイクロ電極のアレイを備えることができる。
【００９３】
本明細書において使用される場合、基材の文脈で本明細書において使用される用語「生体適合性」は、生物学的に有害ではない組成物、例えば、対象への移植に好適である材料、またはインビトロでの細胞の増殖および／もしくは維持に好適である材料を意味する。生体適合性基材は、対象に移植されても、または細胞と接触している場合でも、毒性効果または傷害性効果の原因とならない。
【００９４】
基材の文脈で本明細書において使用される用語「生分解性」は、生物学的に有害ではなく、天然エフェクター（例えば気候、土壌細菌、植物、動物）によって化学的に分解または崩壊することができる組成物を意味する。
【００９５】
基材の文脈で本明細書において使用される用語「生体再吸収性」は、一度再吸収されると元の存在が以後検出されないように、経時的に体に（例えばインビボで）再吸収される材料の能力を意味する。
【００９６】
本明細書において使用される基材の文脈で本明細書において使用される場合、および移植の文脈で使用される場合の用語「生体置換可能な（bioreplaceable）」は、内因性組織のデノボ成長が移植材料を置き換えるプロセスを意味する。本明細書において開示される生体置換可能な材料は、対象の免疫または炎症反応を引き起こさず、繊維化を誘導しない。生体再吸収性材料はデノボ成長によって内因性組織と置き換えられないという点で、生体置換可能な材料は生体再吸収性材料と区別される。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「マイクロ電極」は、直接接触または誘電材料により、細胞および組織から電気信号を受け取ることができ、かつ細胞および組織に対して電気信号を適用することができる金属化層を意味する。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「リード」は、パッドまたは信号の処理もしくは発生回路構成に電極を接続するワイヤまたはフィルムなどの伝導要素を意味する。
【００９９】
本明細書において使用される場合、用語「調整ブロック」は、細胞から受け取った信号を調整するために使用することができる、信号増幅器およびフィルタなどの、電気コンポーネントを意味する。
【０１００】
本明細書において使用される場合、用語「デジタルサンプリングする」は、既定の時間でまたは一定時間にわたり周期的に信号の振幅を測定することを意味する。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、用語「コンピュータ」は、1つまたは複数のプロセッサ、ならびにプログラム（例えば、命令のシーケンス）およびデータ（例えば、信号のデジタル表現）を保存するための関連するメモリを有する汎用コンピューティングデバイスを意味する。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、用語「刺激する」は、化合物、信号、条件、および／もしくは細胞から反応を惹起する力と細胞を接触させること、または化合物、信号、条件、および／もしくは細胞から反応を惹起する力を細胞に提供することを意味する。いくつかの態様では、刺激は、電気インパルスを細胞に提供することを含むことができる。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、データ（例えば生体電位データ）に関する用語「記録する」または「取得する」は、揮発性または不揮発性メモリにデジタルフォーマットで生体電位および／またはインピーダンスを表すデータを記録することを意味する。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、用語「インターフェイス電子装置」は、フォーマット間で電気信号を変換する電気コンポーネント、またはフォーマット間で信号を渡すことを可能にする電子コンポーネントを接続する電気コンポーネントを意味する。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、用語「信号発生器」は、電気信号をもたらす電気コンポーネントを意味する。信号発生器は、1つまたは複数の既定の特徴（例えば、周波数および振幅）を有する信号をもたらすように構成されたコンポーネントの一群とすることができる。信号発生器は、記録された信号を再生するメモリデバイスを備えることができる。細胞または組織試料をまた、信号発生器として使用することができる。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、用語「正弦波」は、正弦曲線または正弦関数に近似し、かつ一般に周期的な信号を提供する信号を意味する。
【０１０７】
本明細書において使用される用語場合、「信号」は、生体電位または検出されたインピーダンスなどの、検出された電位を意味する。用語「信号」はまた、インピーダンスを測定するためまたは応答を惹起するために、細胞または組織に適用される電位を意味する。
【０１０８】
本明細書において使用される用語場合、「信号記録器」は、後の使用または解析のための信号を記録するデバイスを意味する。
【０１０９】
本明細書において使用される用語「生体電位」は、MEA基材上で培養された細胞によって、特にMEA基材上の筋細胞または神経細胞によってもたらされる電圧を意味する。生体電位の機能パラメータの非限定的な例としては、活動電位持続時間（ADP）、波伝播、活動電位周波数、拍動周波数、活動電位伝送、活動電位のVmax、収縮力、ピーク間振幅、拡張末期対拡張ピーク速度などを挙げることができる。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、「場電位」は、主に組織の体積を流れる電流である電気生理信号を意味する。この場合、「電位」は、組織の体積における電位、すなわち電圧を意味する。場電位を、例えば、局所場電位または細胞外場電位とすることができる。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「伝導速度」は、電気化学インパルスが組織にわたってまたは組織に沿って、例えば筋または神経組織に沿って伝播する、速さを意味する。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「電気物理プロファイル」は、細胞および／または組織の電気特性のプロファイル（例えばパターン、周波数、大きさなど）を意味する。電気物理プロファイルは、非限定的な例として、電圧変化プロファイル、電流プロファイル、活動電位活性、場電位、導電性細胞の電気活性を調節するイオン濃度の変化または生体分子の変化または導電性細胞の電気活性によって調節されるイオン濃度の変化または生体分子の変化を包含することができる。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「リエントラント波パターン」は、組織を通過してその後に止まるのではなく、組織内で小さい輪を描いて移動する、心臓または心臓組織の電気インパルスのパターンを意味する。この現象は、不整脈の原因となる可能性がある。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、細胞および／または組織の特性に関して使用される「インピーダンス」は、その細胞または組織内の電流の抵抗の測定値を意味する。
【０１１５】
心筋細胞は、電気刺激が存在しない場合に、自発的な拍動挙動、例えば収縮のサイクルを示す。これらの収縮の周波数、自発的な拍動速度を測定することができる。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「QT間隔」は、心臓の電気サイクルにおけるQ波の始まりとT波の終わりとの間の時間を意味する。本明細書において使用される、例えば細胞に関する「導電性」という用語は、電気信号を伝導し、電気信号を発生し、かつ／または電気信号に応答することが可能な特性を意味する。導電性細胞の例は、ニューロンおよび筋細胞である。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、用語「神経細胞」または「ニューロン」は、神経信号としての情報を受け取り、処理し、伝送することに特化した、神経系に見られる細胞を意味する。ニューロンは、中央の細胞質体または細胞体と、2つの型の突起：すなわち、一般に、大多数の神経系信号を細胞質体へ搬送する樹状突起；一般に、大多数の神経系信号を細胞質体から、標的ニューロンまたは筋などの、エフェクター細胞に搬送する軸索とを包含することができる。ニューロンは、組織および器官から中枢神経系(求心性または感覚ニューロン)へ情報を搬送し、中枢神経系からエフェクター細胞(遠心性または運動ニューロン)へ信号を伝送することができる。介在ニューロンと称する他のニューロンは、神経系内でニューロンを接続する。
【０１１８】
用語「ミオサイト」は、筋細胞を意味する。ミオサイトのサブカテゴリは、例えば、骨格筋細胞、平滑筋ミオサイト、心筋細胞、ならびにESCおよびiPSC由来ミオサイトを包含する。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「心筋細胞」は、心臓の筋細胞（例えば心筋の細胞）を広く意味する。心筋細胞という用語は、心臓の平滑筋細胞だけでなく心筋の細胞を包含し、これには横紋筋細胞および自発的に拍動する心臓の筋肉細胞もまた包含される。心筋細胞は、その細胞表面上におよび／または細胞質に1つまたは複数の心臓特異的マーカーを一般に発現する。好適な心筋細胞特異的マーカーとしては、心トロポニンI、心トロポニン-C、トロポミオシン、カベオリン-3、GATA-4、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖-2a、ミオシン軽鎖-2v、リアノジン受容体、および心房ナトリウム排泄増加性因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、用語「骨格筋ミオサイト」は、骨格筋に見られる筋細胞、例えば、骨に固定されて、移動運動を果たし姿勢を維持するために使用される随意筋を意味する。
【０１２１】
本明細書において使用される場合、用語「平滑筋ミオサイト」は、器官および構造（例えば食道、胃、腸、気管支、子宮、尿道、膀胱、および血管）の壁内に見られる、随意制御ができない筋細胞を意味する。
【０１２２】
用語「筋原性に拘束された」または「筋原性拘束」は、心筋細胞などの心筋の細胞の実質的に純粋な集団に分化する筋原性前駆細胞などの前駆細胞などの細胞を意味する。
【０１２３】
用語「心臓前駆細胞」および「CPC」は、増殖可能であり、かつ多数の母細胞を発生する能力を有する、より多くの前駆細胞を生じさせることが可能な前駆細胞を意味するように本明細書において交換可能に使用され、該母細胞は、主として内皮系統ならびに筋系統（平滑、心、および骨格筋）を包含する心臓組織の細胞に最終的に末期的には分化することができる、分化したまたは分化可能な娘細胞を次々生じさせることができる。
【０１２４】
用語「前駆細胞」は、分化により生じることができる細胞に対してより原始的な（例えば、完全に分化した細胞よりも、発達経路または発達進度におけるより初期の段階にある）細胞表現型を有する細胞を意味するよう、本明細書において使用される。多くの場合、前駆細胞はまた、顕著なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発達経路に応じて、ならびに細胞が発達および分化する環境に応じて、複数の別個の分化細胞型または単一の分化細胞型を生じさせることができる。
【０１２５】
本明細書において使用される用語「幹細胞」は、増殖可能であり、かつ、分化したまたは分化可能な娘細胞を次々生じさせることができる多数の母細胞を発生する能力を有するより多くの前駆細胞を生じさせることが可能である、未分化細胞を意味する。親由来の発達能を有する1つまたは複数の細胞を保持しながら、増殖して、1つまたは複数の成熟細胞型へと後に分化する後代をもたらすように、娘細胞自体を誘導することができる。用語「幹細胞」は、特定の周囲環境下では、より特化または分化した表現型に分化する能力または能を有し、かつ、特定の周囲環境下では、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する前駆体の小集団を意味する。一態様では、幹細胞という用語は、分化によって、例えば、胚性細胞および組織の進行性の多様化で起こるような個々の特徴を完全に取得することによって、子孫（後代）が多くの場合異なる方向に特化する天然に存在する母細胞を一般に意味する。細胞分化は、多くの細胞分裂によって典型的に起こるプロセスである。分化細胞は、自身が多分化能性細胞等に由来する多分化能性細胞に由来してもよい。これらの多分化能性細胞の各々が幹細胞と考えられ得るが、各々が生じさせることができる細胞型の範囲はかなり変動し得る。いくつかの分化細胞はまた、より大きい発達能の細胞を生じさせる能力を有する。このような能力は、天然のものであり得るか、または様々な因子での処置により人工的に誘導し得る。多くの生物学的事例において、幹細胞は複数の別個の細胞型の後代をもたらすことができるため「多分化能性」でもあるが、これは「幹性」には必要ではない。自己再生が、幹細胞定義の他の古典的部分であり、これは本文書で使用される場合に不可欠である。理論的には、自己再生は2つの主要な機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞が非対称的に分裂して、一方の娘細胞が幹状態を保持し、他方の娘細胞がいくつかの別個の他の特異的機能および表現型を発現する場合がある。代替的に、集団内の幹細胞のうちのいくつかが対称的に分裂して2つの幹になり得て、したがって、その集団のいくつかの幹細胞が全体として維持され、その集団の他の細胞が分化した後代のみを生じさせ得る。
【０１２６】
使用される用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を意味する（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,843,780号、同第6,200,806号参照）。このような細胞は同様に、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,945,577号、同第5,994,619号、同第6,235,970号参照）。胚性幹細胞の際立った特徴は、胚性幹細胞表現型を画定する。したがって、胚性幹細胞と他の細胞を区別することができるように胚性幹細胞の固有の特徴の1つまたは複数を持つ場合には、細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な際立った胚性幹細胞特徴としては、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、核型、特定の培養条件への応答性などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
使用される用語「成体幹細胞」または「ASC」は、胎児組織、若年組織、および成体組織を包含する、非胚性組織に由来する任意の多分化能性幹細胞を意味する。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋を包含する多種多様な成体組織から単離されている。これらの幹細胞の各々は、遺伝子発現、因子応答性、および培養物中の形態に基づいて特徴決定することができる。先に示されるように、幹細胞は、事実上すべての組織に常在していることが見出されている。したがって、本明細書に記載される技術は、幹細胞集団を、事実上任意の動物組織から単離することができるということを認める。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、用語「成体細胞」は、胚発達後に全身に見られる細胞を意味する。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、用語「iPS細胞」および「誘導多能性幹細胞」は、交換可能に使用され、分化した体細胞に（すなわち非多能性細胞に）人工的に由来する（例えば、完全または部分的な逆転により誘導される）多能性細胞を意味する。多能性細胞は、3つの発達過程の胚葉すべての細胞に分化することができる。
【０１３０】
別の細胞に由来する細胞の文脈で使用される用語「〜に由来する」は、細胞が、異なる細胞型の細胞から生じた（例えば、細胞から変化したかまたは細胞によりもたらされた）ことを意味する。いくつかの事例では、例えば、iPS細胞に由来する細胞は、iPS細胞から分化した細胞を意味する。代替的に、分化転換または直接的な再プログラム化と呼ばれるプロセスによって、細胞を、ある1つの細胞型から異なる細胞型へ変換することができる。代替的に、iPS細胞に関しては、細胞（例えばiPS細胞）は、当技術分野において脱分化および再プログラム化と呼ばれるプロセスによって、分化細胞に由来することができる。
【０１３１】
用語「多能性の」は、生殖系列細胞を除く任意の型の体内の細胞を生じさせることができる細胞を意味するよう、本明細書において使用される。本明細書において使用される用語「多能性」または「多能性状態」は、3つの胚葉すべて：内胚葉（腸組織）、中胚葉（血液、筋肉、および管を包含する）、ならびに外胚葉（例えば、皮膚および神経）に、分化する能力を有する細胞を意味し、典型的に、長期間にわたって、例えば1年を超えて、または30回を超える継代にわたって、インビトロで分裂する能を有する。多能性はまた、胚幹（ES）細胞マーカーの発現によって立証されるが、多能性に対する好ましい試験は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイ法を使用して検出されるような、3つの胚葉層のすべての細胞へ分化する能力の実証である。iPS細胞は、多能性細胞である。多能性細胞は、特定の機能を有する細胞を生じさせるように拘束される多分化能性細胞へのさらなる分化を経る。例えば、多分化能性心血管幹細胞は、心筋細胞、および心臓の血管系に関与する他の細胞を包含する、心臓の細胞を生じさせる。本明細書において開示されるミオサイトまたは心筋細胞へのインビトロ分化に有用な細胞としては、例えば、iPS細胞および多分化能性心血管幹細胞が挙げられる。本明細書において開示される組成物および方法のための、ミオサイトまたは心筋細胞を生成するiPSCまたは他の幹細胞の使用の主な利点は、例えば特異的なヒト患者または対象から、多数のこのような細胞を調製してそれらの細胞を伝播させる能力である。この点で、成体心臓細胞の単離および使用に依拠する方法、組成物とは対照的である。
【０１３２】
用語「表現型」は、実際の遺伝子型とは関係なく、特定の組の環境条件下および因子により細胞または生物を画定する全生物学的特徴のうちの1つまたは多数を意味する。
【０１３３】
本明細書において使用される場合、「生体活性作用物質」または「生体活性材料」は、天然に存在する生体材料、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびラミニンなどの、細胞外マトリックス材料；サイトカイン；ならびに、生体細胞、組織、または器官に対して生物学的効果を有する成長因子および分化因子を意味する。「生体活性作用物質」または「生体活性材料」はまた、生体細胞、組織、または器官に対して生物学的効果を有する、人工的に合成された材料、分子、または化合物を意味する。生体活性作用物質の分子量は、非常に低い（例えば、小分子、200〜500ダルトン）〜非常に高い（例えば、プラスミドDNA、約2,000,000ダルトン）まで変動することができる。いくつかの態様では、生体活性作用物質は小分子である。本明細書において使用される場合、用語「小分子」は、「天然生成物様」の化合物を意味することができるが、用語「小分子」は、「天然生成物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、数個の炭素-炭素結合を含有し、かつ5000ダルトン（5kD）未満の分子量を有することを典型的に特徴とする。いくつかの態様では、小分子は3kD未満の分子量を有することができる。いくつかの態様では、小分子は2kD未満の分子量を有することができる。いくつかの態様では、小分子は1kD未満の分子量を有することができる。いくつかの態様では、小分子は700D未満の分子量を有することができる。
【０１３４】
本明細書において使用される用語「単離された」または「富化する」または「部分精製された」は、インビトロ分化心筋細胞の場合、少なくとも1つの他の細胞型から分離されることを意味する。用語「富化する」は、細胞を「単離する」と同義的に使用され、1つの型の細胞の収量（画分）が、出発培養物または集団におけるその型の細胞の画分より少なくとも10％増加することを意味する。
【０１３５】
本明細書において使用される用語「単離された細胞」は、当初それが見い出された生物から除去された細胞またはこのような細胞の子孫を意味する。任意で、細胞は、例えば他の細胞の存在下で、インビトロで培養されている。任意で、細胞は、後に第2の生物内に導入されるか、または、その単離した生物（またはそれの先祖にあたる細胞）内に再導入される。
【０１３６】
本明細書において使用される細胞の単離された集団に関する用語「単離された集団」は、混合されたまたは均質な細胞の集団から除去および分離された細胞の集団を意味する。いくつかの態様では、単離された集団は、細胞が単離または富化した均質な集団と比べて実質的に純粋な細胞の集団である。
【０１３７】
用語「実質的に純粋な」は、特定の細胞集団に関しては、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％純粋な、細胞の集団を意味する。換言すると、用語「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」は、未成熟な心筋細胞などの、1つまたは複数の部分的におよび／または最終的に分化した細胞型の調製に関しては、約20％より少ない、より好ましくは約15％、10％、8％、7％より少ない、最も好ましくは約5％、4％、3％、2％、1％より少ない、または1％未満の、未成熟な心筋細胞または未成熟な心筋細胞後代である、細胞を含有する細胞の集団を意味する。
【０１３８】
本明細書における用語「細胞培地」（本明細書において「培養培地」または「培地」とも呼ばれる）は、細胞生存度を維持して増殖を支援する栄養物を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培地は、適切な組み合わせで以下のうちのいずれかを含有してもよい：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコース、または他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、ペプチド成長因子などの他の構成成分など。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【０１３９】
本明細書において使用される用語「系統」は、共通の祖先を有する細胞、例えば、同じ心血管幹細胞または他の幹細胞に由来する細胞または共通の発達的運命を有する細胞を記載する用語を指す。一例に過ぎないが、内胚葉起源の細胞または「内胚葉系統」である細胞を指す場合、細胞が、内胚葉細胞に由来していたが、最終的な内胚葉細胞を生じさせる1つまたは複数の発達系統経路などの、内胚葉系統に制限される経路に沿って分化することができ、次に肝細胞、胸腺、膵臓、肺、および腸へと分化することができることを意味する。
【０１４０】
基材上に存在する成熟心筋細胞または支持体の非存在下の成熟心筋細胞を、本明細書に記載される作用物質と接触させることに関連して、本明細書において使用される用語「接触させること」または「接触」は、作用物質を含む培養培地に細胞を供することを包含する。用語「モジュレート」は、当技術分野における使用と合致して使用され、例えば、関心対象のプロセス、経路、または現象における定性的または定量的な変化、変更、または改変を引き起こすかまたは容易にすることを意味する。限定されるものではないが、このような変化は、プロセス、経路、または現象の異なる構成要素または枝部の相対的な強度または活性の増加、減少、または変化であってもよい。「モジュレーター」は、関心対象のプロセス、経路、または現象における定性的または定量的な変化、変更、または改変を引き起こすかまたは容易にする作用物質である。
【０１４１】
本明細書において使用される用語「再プログラム化」は、多能性または多分化能性前駆細胞になるための分化細胞の転換を意味する。換言すると、再プログラム化という用語は、初期の発達の表現型または発達段階への分化細胞の転換を意味する。「再プログラムされた細胞」は、前駆細胞になるために発達分化経路のすべてまたは一部を後退または逆戻りさせた細胞である。したがって、（所定の表現型または細胞系統の娘細胞をもたらすことのみができる）分化細胞、または最終的に分化した細胞は、初期の発達段階に再プログラムされ、前駆細胞になることができ、前駆細胞は、分化または未分化娘細胞を自己再生し、かつそれを生じさせることができる。娘細胞自体は、親由来の発達能を有する1つまたは複数の細胞を保持しながら、増殖して、1つまたは複数の成熟細胞型へと後に分化する後代をもたらすように誘導することができる。再プログラム化という用語はまた、当技術分野において逆分化または脱分化と一般に呼ばれる。「再プログラムされた細胞」は、当技術分野において「誘導多能性幹」（iPS）細胞と呼ばれる場合もある。
【０１４２】
細胞個体発生の文脈において、用語「分化した」または「分化すること」は相対的な用語である。「分化細胞」は、比較される細胞よりも発達経路をさらに下方へ進行した細胞である。したがって、幹細胞は、（中胚葉幹細胞などの）系統制限された前駆細胞に分化することができ、系統制限された前駆細胞は次に、経路をさらに下方へ（心房性前駆体などの）他の型の前駆細胞に、次いで、心房性心筋細胞または平滑筋細胞などの、最終段階の分化細胞に分化することができ、最終段階の分化細胞は、特定の組織型において特徴的な役割を担い、さらに増殖する能力を保持しても保持しなくてもよい。用語「分化細胞」は、その本来の形において、本明細書において定義される多能性ではない任意の初代細胞を意味する。用語「分化細胞」はまた、多分化能性細胞などの部分的に分化した細胞、または安定した非多能性の部分的に再プログラムされた細胞を網羅する。いくつかの態様では、分化細胞は、非多能性の部分的に再プログラムされた細胞などの、安定した中間的な細胞である。培養中に多くの初代細胞を置くことによって、完全に分化した特徴のいくつかが失われる可能性があることに留意する必要がある。しかしながら、このような初代細胞を、例えば組織または生物から除去または単離した後、単に培養するだけでは、これらの細胞は、非分化細胞（例えば未分化細胞）または多能性細胞にはならない。分化細胞（安定した非多能性の部分的に再プログラムされた細胞中間体を包含する）の多能性への転換には、分化した特徴を培養中に部分的に消失させる刺激を超える、再プログラム刺激が必要である。
【０１４３】
本明細書における用語「分化」は、細胞が、発達経路をさらに下方へ移動し、かつ最終的に分化した細胞になることにさらに特化しおよびさらに近づいた細胞と関連することが知られているマーカーおよび表現型の特徴を発現し始める、プロセスを意味する。細胞が、それほど拘束されていない細胞から、特定の細胞型に次第に拘束されて、結局最終的に分化した細胞へと進行する経路は、進行性分化または進行性拘束と呼ばれる。より特化されている(例えば、進行性分化の経路に沿って進行し始めている)が、未だ最終的に分化していない細胞は、部分的に分化したと呼ばれる。分化は、細胞がより特化した表現型をとる、例えば他の細胞型とは別個の1つまたは複数の特徴または機能を取得する、発達上のプロセスである。いくつかの場合には、分化した表現型は、いくつかの発達経路の成熟終了点にある細胞表現型（いわゆる最終的に分化した細胞）を意味する。すべてではないが多くの組織において、分化のプロセスは、細胞サイクルから出ることと結合する。これらの場合には、最終的に分化した細胞は、増殖する能力を失うかまたは能力が大幅に制限される。しかしながら、本明細書の文脈において、用語「分化」または「分化した」は、運命または機能において、細胞の発達における以前の時点よりも特化した細胞を意味する。例えば、本明細書の文脈において、分化細胞は、心血管前駆細胞から分化した心室性心筋細胞を含み、このような心血管前駆細胞は、いくつかの事例では、ES細胞の分化に、もしくは代替的に誘導多能性幹（iPS）細胞の分化に、またはいくつかの態様では、ヒトES細胞株に由来することができる。したがって、このような心室性心筋細胞は、心血管前駆細胞の表現型を有していた場合よりも特化し、同様に、iPS細胞が由来する成熟細胞として細胞が存在した場合（例えばiPS細胞を形成する細胞の再プログラム化の前）と比較して特化しない。
【０１４４】
前駆細胞に対して「分化した」細胞は、その前駆細胞に対する1つまたは複数の表現型の差異、およびより成熟したまたは特化した細胞型の特徴を有する。表現型の差異としては、形態上の差異、ならびに発現マーカーの有無だけでなくマーカーの量の差異および一組のマーカーの共発現パターンの差異をも含む遺伝子発現および生物活性の差異が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、「増殖すること」および「増殖」は、細胞分裂による、集団内の細胞の数の増加（成長）を意味する。細胞増殖は、成長因子および他の分裂促進因子を含む、環境に応答した複数の信号変換経路の協調的活性化によって生じると一般に理解されている。細胞増殖はまた、細胞増殖をブロックするかまたは細胞増殖に否定的な影響を及ぼす細胞内または細胞外の信号および機構の作用からの解放によって、促進され得る。
【０１４６】
用語「組織」は、ある特別な機能を共に実行する同様に特化した細胞の群または層を意味する。用語「組織特異的」は、特異的な組織に由来する細胞の供給源または決定的な特徴を意味する。
【０１４７】
本明細書において使用される用語「遺伝子改変された」は、遺伝情報または材料が人の操作によって改変されたている細胞または生物を意味する。改変は、化学、物理、ウイルス、もしくはストレス誘導、または、トランスフェクションなどの任意の標準的な手段による導入外因性核酸を含む他の手段によって、行うことができ、その結果、遺伝子改変されず選択されない対応細胞または実体には存在しない機能、特徴、または遺伝子要素が元の細胞または生物に遺伝子レベルで賦与されるように、細胞または生物が、新たな特徴、表現型、遺伝子型、ならびに／または、遺伝子マーカー、遺伝子生成物、および／もしくはmRNAを含むがこれらに限定されない遺伝子発現生成物を取得する。
【０１４８】
用語「減少する」、「低減した」、「低減」、または「抑制する」はすべて、統計学的に有意な量の減少の意味するよう、本明細書において使用される。いくつかの態様では、「低減する」、「低減」、もしくは「減少する」、または「抑制する」は、参照レベル（例えば所与の処置が存在しない）と比較して少なくとも10％の減少を典型的に意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含むことができる。本明細書において使用される場合、「低減」または「抑制」は、参照レベルと比較して、完全な抑制または低減を包含しない。「完全な抑制」は、参照レベルと比較して100％の抑制である。
【０１４９】
用語「増加した」、「増加する」、「強化する」、または「活性化する」はすべて、統計学的に有意な量の増加を意味するよう、本明細書において使用される。いくつかの態様では、用語「増加した」、「増加する」、「強化する」、または「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％近傍までの増加を意味することができ、参照レベルと比較して100％の増加、または10〜100％の間の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、または2倍〜10倍の間もしくはそれ以上の任意の増加を含む。マーカーまたは症状の文脈において、「増加」は、このようなレベルの統計学的に有意な増加である。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に使用され、隣接する残基のアルファ-アミノとカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を指す。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能とは関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合比較的大きいポリペプチドに関連して使用され、用語「ペプチド」は、多くの場合小さいポリペプチドに関連して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複する。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子生成物およびその断片を意味する場合、本明細書において交換可能に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子生成物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルトログ、パラログ、断片および他の等価物、変種、断片、ならびにこれらの類似体が挙げられる。
【０１５１】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらの類似体のユニットを組み込む任意の分子、好ましくはポリマー分子を意味する。核酸は、一本鎖または二本鎖のどちらかとすることができる。一本鎖核酸は、変性させた二本鎖DNAの一方の核酸鎖とすることができる。代替的に、一本鎖核酸は、任意の二本鎖DNAに由来しない一本鎖核酸とすることができる。一局面では、核酸をDNAとすることができる。別の局面では、核酸をRNAとすることができる。好適な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の好適な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」は、疾患または障害と関連した状態の進度または重症度を後退、軽減、改善、抑制、緩徐、または停止させることを目的とする、治療的処置を意味する。用語「処置すること」は、状態、疾患、または障害に関する少なくとも1つの有害な効果または症状を減少または軽減させることを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少した場合には、処置は一般に「有効」である。代替的に、疾患の進度が低下または休止された場合には、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善のみならず、処置が存在しない場合に予想されるものと比較しての、症状の進行または悪化の中断または少なくとも緩徐も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であるかまたは検出不可能であるかを問わず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮減、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進度の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の改善もしくは一時的緩和、寛解（一部もしくは完全）、および／または死亡率の減少が挙げられるが、これらに限定されない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放を提供すること(対症処置を含む)を含む。
【０１５３】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば製薬産業において一般に使用される担体、と組み合わせた活性作用物質を意味する。句「薬学的に許容される」は、妥当な利益／リスク比に相応し、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または投薬形態の意味するよう、本明細書において用いられる。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、用語「投与すること」は、所望の部位に作用物質を少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路による、本明細書において開示される化合物の対象への配置を意味する。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象の有効な処置となる任意の適切な経路によって投与することができる。
【０１５５】
用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計学的有意性を意味し、一般に、2標準偏差（2SD）またはそれ以上の差異を意味する。
【０１５６】
作業実施例を除きまたは別途示される場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての事例において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。百分率に関連して使用される場合の用語「約」は、±1％を意味することができる。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」または「含む（comprises）」は、組成物、方法、および方法または組成物に不可欠なこれらのそれぞれの構成要素に関して使用されるが、不可欠であるかどうかにかかわらず明記されていない要素を含めることが許容される。
【０１５８】
用語「〜からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を意味し、態様のその記載において列挙されない任意の要素を除外する。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、用語「〜から本質的になる」は、所与の態様に必要なそれらの要素を意味する。この用語は、その態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に大きく影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。
【０１６０】
単数の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別途示している場合を除き、複数を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに別途示している場合を除き、「および」を含むと意図される。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すよう、本明細書において使用される。したがって、略語「e.g.」は、用語「例えば」と同義である。
【０１６１】
細胞生物学および分子生物学における共通の用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsに見ることができる。
【０１６２】
別途明記されている場合を除き、本発明は、例えば、その内容全体がいずれも参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998) に記載されるような、標準的な手順を使用して実行された。
【０１６３】
他の用語は、本明細書において、本発明の様々な局面の記載の中で定義される。
【０１６４】
本出願を通して引用された、参照文献、交付された特許、公表された特許出願、および同時係属中の特許出願を含むすべての特許および他の刊行物は、例えば本明細書に記載される技術に関連して使用される可能性があるこのような刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の提出日の前に単にその開示がなされたために提供される。この点に関していかなるものも、先行発明によって、または任意の他の理由により、本発明者らがこのような開示に先立つ権利がないと承認したと解釈すべきではない。これらの文献の日付に関する記述または内容に関する表現はすべて、本出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も与えない。
【０１６５】
本開示の態様の記載は、網羅的であること、または、その開示を開示される厳密な形に限定することを目的としない。本開示の特異的態様および実施例は、説明目的のために本明細書に記載され、当業者が認識するように、様々な同等の改変が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で提示されるが、代替態様は異なる順序で機能を実行してもよいか、または機能が実質的に並行に実行されてもよい。本明細書に提供される本開示の教示を、適宜他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。必要に応じて、本開示の局面を改変して、本開示のさらに他の態様を提供するために上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を用いることができる。これらのおよび他の変更を、詳細な説明に照らして本開示に行うことができる。すべてのこのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【０１６６】
前述の態様のうちのいずれかの特異的要素を、組み合わせること、または他の態様における要素と置換することができる。さらに、本開示のある態様に関連する利点が、これらの態様の文脈に記載されているが、他の態様もまたこのような利点を呈す場合があり、必ずしもすべての態様が、本開示の範囲内に入るためにこのような利点を呈す必要はない。
【０１６７】
本明細書に記載される技術は、さらに限定するものと決して解釈されてはならない以下の実施例によってさらに説明される。
【０１６８】
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号付き項目のうちのいずれかによって定義することができる。
1.  細胞培養層を含み、該細胞培養層が、細胞培養表面を含み、かつ、該表面上での細胞の培養を支援するように適合されている、細胞培養チャンバと、
複数のナノ溝を含む該細胞培養表面と、
各電極が、該電極を外部の電気回路に電気的に接続するためのリードを備える、複数の電極を含む細胞培養層と
を備える、多電極アレイ。
2.  前記複数のナノ溝の各々が、第1の軸と実質的に平行に延びている、項目1に記載の多電極アレイ。
3.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが実質的に湾曲している、項目1に記載の多電極アレイ。
4.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、不規則な幅を有する部分を含む、項目1に記載の多電極アレイ。
5.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、不規則な深さを有する部分を含む、項目1に記載の多電極アレイ。
6.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、不連続である部分を含む、項目1に記載の多電極アレイ。
7.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、2つのナノ溝を形成するために分岐している、項目1に記載の多電極アレイ。
8.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、第1の軸に沿ってまっすぐに延びている第1の部分、実質的に湾曲している第2の部分を含む、項目1に記載の多電極アレイ。
9.  前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つが、前記第1の軸に沿ってまっすぐに延びている第3の部分をさらに含む、項目8に記載の多電極アレイ。
10.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、実質的に均一な幅を含む、項目1に記載の多電極アレイ。
11.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、100nm〜1000nmの間の幅である、項目1に記載の多電極アレイ。
12.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、実質的に均一な深さを含む、項目1に記載の多電極アレイ。
13.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、100nm〜1000nmの間の深さである、項目1に記載の多電極アレイ。
14.  1つの電極の少なくとも一部分が、前記細胞培養層の前記細胞培養表面の一部分に固定される、項目1に記載の多電極アレイ。
15.  前記1つの電極が、該1つの電極をリードに電気的に接続する前記細胞培養層を通って延びているバイアをさらに含む、項目14に記載の多電極アレイ。
16.  1つの電極の少なくとも一部分が、前記複数のナノ溝のうちの少なくとも1つの表面輪郭をたどっている、項目1に記載の多電極アレイ。
17.  前記1つの電極が、該1つの電極をリードに電気的に接続する前記細胞培養層を通って延びているバイアをさらに含む、項目16に記載の多電極アレイ。
18.  1つの電極の少なくとも一部分が、前記細胞培養層の前記細胞培養表面の下に延びている、項目1に記載の多電極アレイ。
19.  前記1つの電極の少なくとも一部分が、基材と前記細胞培養層との間に延びている、項目18に記載の多電極アレイ。
20.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが底部表面を含み、かつ1つの電極の少なくとも一部分が、少なくとも1つの該ナノ溝の該底部表面の少なくとも一部分を形成する、項目1に記載の多電極アレイ。
21.  前記外部の電気回路が、増幅器、記録デバイス、および解析デバイスのうちの少なくとも1つを備える、項目1に記載の多電極アレイ。
22.  複数の細胞培養チャンバを備える、項目1〜21のいずれかに記載の多電極アレイ。
23.  第1の表面の上で間隔を置いて配置された複数の電極を有する該第1の表面を画定する細胞培養チャンバを提供する工程と、
［第2の］細胞培養表面を画定する細胞培養層を、該第1の表面上に形成する工程と、
該細胞培養表面に少なくとも1つのナノ溝を形成する工程と
を含む、多電極アレイを作製する方法。
24.  前記細胞培養表面に複数のナノ溝を形成する工程を含む、項目23に記載の方法。
25.  前記少なくとも1つのナノ溝が、毛細管力リソグラフィによって形成される、項目23に記載の方法。
26.  前記細胞培養層をマスキングして前記少なくとも1つのナノ溝をエッチングすることによって、該少なくとも1つのナノ溝が形成される、項目23に記載の方法。
27.  エッチングすることがが、レーザーエッチング、化学エッチング、ドライエッチング、および反応性イオンエッチングのうちの1つまたは複数を含む、項目26に記載の方法。
28.  前記少なくとも1つのナノ溝がスタンピングによって形成される、項目23に記載の方法。
29.  前記細胞培養層が、2μm〜15μmの間の厚さである、項目23に記載の方法。
30.  前記細胞培養層が、前記細胞培養チャンバの前記第1の表面上にポリマー層を積層することによって形成される、項目23に記載の方法。
31.  前記細胞培養層が、前記細胞培養チャンバの前記第1の表面上にポリマー層をキャスティングすることによって形成される、項目23に記載の方法。
32.  前記細胞培養層が、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリウレタン（PU）、ポリエチレングリコール（PEG）、および、UV硬化性である他のヒドロゲルのうちの少なくとも1つを含む、項目23に記載の方法。
33.  前記細胞培養層が、可撓性の生体適合性材料を含む、項目23に記載の方法。
34.  ベース材料の第1の表面上に少なくとも1つの伝導リードを形成する工程、
複数のナノ溝を含む細胞培養表面を形成する細胞培養層を、該ベース材料の該第1の表面上に形成する工程、
該細胞培養表面に第1のマスクを適用して、バイアのための少なくとも1つの孔を細胞培養材料にエッチングする工程であって、該少なくとも1つの孔が該少なくとも1つの伝導リードとともに並んでいる、工程、
バイアを形成するために、該少なくとも1つの孔に伝導材料を適用する工程、
該細胞培養表面に第2のマスクを適用して、少なくとも1つの電極を該細胞培養表面上に形成する工程であって、該少なくとも1つの電極が該バイアによって該伝導リードと電気的に接触している、工程
を含む、多電極アレイを作製する方法。
34.  少なくとも1つの前記電極の周辺に細胞培養チャンバを形成するために、前記細胞培養表面上にチャンバ壁を形成する工程をさらに含む、項目33に記載の方法。
35.  前記ベース材料がガラスである、項目33に記載の方法。
36.  前記細胞培養層が、可撓性の生体適合性材料を含む、項目33に記載の方法。
37.  前記細胞培養層が、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリウレタン（PUA）、ポリエチレングリコール（PEG）、および、UV硬化性である他のヒドロゲルを含む、項目33に記載の方法。
38.  前記細胞培養層が、2μm〜15μmの間の厚さである、項目33に記載の方法。
39.  前記細胞培養層が、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、もしくは操作されたペプチドのいずれかによってまたはこれらの組み合わせによってコーティングされる、項目33に記載の方法。
40.  前記ナノ溝が、毛細管力リソグラフィベースのナノパターニングによって形成される、項目33に記載の方法。
41.  前記ナノ溝がスタンピングによって形成される、項目33に記載の方法。
42.  前記ナノ溝がエッチングによって形成される、項目33に記載の方法。
43.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、100nm〜1000nmの間の幅である、項目33に記載の方法。
44.  前記ナノ溝のうちの少なくとも1つが、100nm〜1000nmの間の深さである、項目33に記載の方法。
45.  少なくとも1つの前記電極が、前記細胞培養表面上に伝導材料をスパッタリングすることによって形成される、項目33に記載の方法。
46.  前記伝導材料が、クロム、金、チタン、該材料の酸化物および窒化物、ステンレス鋼、タングステン、または銅のうちの少なくとも1つを含む、項目45に記載の方法。
47.  前記伝導材料が、カーボンナノチューブ、金ピラー（pillar）、およびナノ空洞のうちの少なくとも1つを含む改変された構造を含む、項目45に記載の方法。
48.  前記細胞培養表面上に存在する導電性細胞をさらに含む、項目1〜22のいずれかに記載の多電極アレイを含む細胞培養システム。
49.  前記導電性細胞が筋細胞である、項目48に記載のシステム。
50.  前記筋細胞が、
心筋細胞、骨格筋ミオサイト、および平滑筋ミオサイト
からなる群より選択される、項目49に記載のシステム。
51.  前記導電性細胞が神経細胞である、項目48に記載のシステム。
52.  複数の型の導電性細胞を含む、項目48〜51のいずれかに記載のシステム。
53.  作用物質と項目48〜52のいずれかに記載のシステムを接触させる工程と、
導電性細胞の成長、生存度、または活性を測定する工程と
を含む、該導電性細胞に対する該作用物質の効果を測定するためのアッセイ法。
54.  前記導電性細胞の測定される活性が、
場電位、場電位プロファイル、場電位持続時間、QT間隔長、伝導速度、電気物理プロファイル、自発的な拍動速度、リエントラント波パターン、およびインピーダンス
からなる群より選択される、項目53に記載のアッセイ法。
55.  前記導電性細胞が、心臓疾患を有する対象から得られた細胞、または、該対象から得られた細胞に由来する細胞を含む、項目53〜54のいずれかに記載のアッセイ法。
56.  前記導電性細胞が、心臓疾患と関連した突然変異を含むように改変されている、項目53〜55のいずれかに記載のアッセイ法。
57.  前記細胞に不整脈を誘導する工程と、通常の場電位特性を元に戻す前記作用物質の能力を測定する工程とをさらに含む、項目53〜56のいずれかに記載のアッセイ法。
58.  不規則なナノ溝を含む多電極アレイ上で前記細胞を培養すること、
不整脈誘導物質と該細胞を接触させること、および
該多電極アレイを介して不規則な電気刺激を提供すること
からなる群より選択される方法によって不整脈を減少させることができる、項目57に記載のアッセイ法。
59.  項目1〜22のいずれかに記載の多電極アレイを含む、キット。
60.  少なくとも1つの導電性細胞をさらに含む、項目59に記載のキット。
【実施例】
【０１６９】
実施例1
ナノトポグラフィー的にパターン化された基材と一体化した多電極アレイ（MEA）の設計および実施が、本明細書に記載される。本明細書に記載されるMEAは、例えば、細胞外マトリックス（ECM）の複雑および明確な構造によって提供される局所マイクロスケールおよびナノスケール分子ならびにトポグラフィーパターンを含む、インビボ環境に対応することができる。既存のMEAとは異なり、提案されるMEAは、ナノスケール溝上に位置する細胞から生体信号を取得して、ナノスケール溝は、インビボECM環境に存在する構造および機械的な合図を模倣する。本明細書に記載されるMEAは、インビボ環境の細胞とぴったりと合致する細胞の生体信号の取得を可能にする。
【０１７０】
ナノ溝上の単一ウェルMEAの設計、実施、および評価；ナノ溝上の多ウェルMEAの開発；ならびに生体電位およびインピーダンス測定のインターフェイスの実施が、本明細書においてとりわけ考慮される。
【０１７１】
細胞の電気生理信号のインビトロ取得は、細胞成長および挙動を理解するための有効な方法を提供する。既存のデバイスは、平坦な剛性表面上に平面的なまたは3dの電極のアレイを有し、電気生理信号を収集するために細胞の外膜に直接接触する。しかしながら、既存のデバイスを使用して、インビトロで取得された電気生理信号をインビボ環境における電気生理信号と等しく扱うことは非常に困難である。この困難さは、主に既存のデバイス上の細胞がインビボとはかけ離れた環境を経験するためである。細胞／組織環境のナノスケール特徴に対する細胞感受性についての最近の研究は、多くの場合インビボ環境において遭遇する、ナノスケール機械的特徴へ細胞がどのように応答するかを説明する。したがって、「インビボ模倣環境におけるMEA」を達成するためのナノスケール特徴およびMEAの組み合わせが、本明細書に記載される。
【０１７２】
本明細書に記載されるデバイスは、インビボ様環境を模倣するために、数100nm特徴を有し「ナノ溝」として一般に公知の、PDMS、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、またはポリウレタン（PU）などの、軟質基材を含むことができる。MEA電極は、精巧なナノスケール特徴の輪郭を覆って、ナノ溝上に直接位置し、細胞からの電気生理信号を収集する。（i）最高128個のチャンネルを有する単一ウェルMEA、（ii）ナノ溝付き基材上の、最高96個のウェルを有する、多ウェルMEA、ならびに（iii）細胞の生体電位およびインピーダンスを取得するための電子インターフェイスの開発が、本明細書に記載される。本明細書に記載されるデバイスは、インビボ模倣環境における細胞の電気生理データの取得を可能にする。
【０１７３】
ナノスケール軟質基材上の一体型MEAの開発および評価が、本明細書に記載される。この手法は、既存のMEAを使用して得ることができない、インビボ様環境における細胞の生体電位が一体型MEAにより提供されるので、固有かつ有用である。その最終的な形では、96ウェル-128チャンネルMEAシステムが、小型プラットホームの細胞の高スループット生体信号を送出する。この調査の結果は、インビボマイクロ環境における細胞の挙動を正確に記載する、従来の方法とは大きく異なる、細胞からの有意に強化された生体信号を提供することができる。
【０１７４】
既存の多電極アレイ（MEA）および限界
（表１）既存のMEAおよびその仕様
2016518117.tif 000003
【０１７５】
インビトロ細胞培養で使用される最初に製造されたMEAは、1970年代初期に記録され、心臓細胞から場電位を取得するために使用された［11］。1980年代を過ぎると、MEA技術においていくらかの有意な前進がなされ、この前進には、電気感応電極としてのトランジスタおよび信号対ノイズ比を増加させるMEAに搭載される能動回路の集積、記録の空間分解能を増加させるための電極の高密度化、色素感受性技法または光モニタリング技法によるMEAの集積、共形基材、長期間生存などが含まれた。Multichannel Systems（Germany）、Ayanda（Switzerland, 現Qwane Biosciences）、およびPanasonic（USA, 現Alpha Med Scientific's MED64）を含む、多くのMEAが、1990年代初期および2000年代に商業化された。表1は、いくつかのMEAの仕様を要約する。MEA記録用電極は、最高256の密度、数10〜数100μmの範囲の直径、30〜1000μmの間の電極間間隔を有し、異なる幾何学的構成（六角形、長方形、他の型のアレイ幾何学的形状）を有し得る［12、13］。
【０１７６】
より高い密度、より小さい間隔、およびより多く電極が、局所場電位の微妙な変化を分解することができるので、心臓細胞培養への適用において有益であることが本明細書において考慮される。これは、高い空間的な精度を提供するだけでなく、細胞の他の生理的な効果または下層の変化などの、低い空間密度では抽出することができないかなり多くの情報を明らかにすることができる［12］。記録データの統計学的な精度をさらに増加させるために、高スループットが必要とされる場合があり、このような特徴は、複数のウェルを組み込むことによって得ることができ、結果として、複数の細胞培養集団が同時に記録され得る。
【０１７７】
細胞／組織環境のナノスケール特徴に対する細胞感受性
細胞外マトリックス（ECM）は、細胞および組織機能の制御において、数多くの役割を担うことができる。例えば、細胞外マトリックスは、好適な接着基質を細胞に提供して、種々の埋め込まれた化学的合図を細胞に供給することができる。ECMの幾分小さく評価される役割は、例えばマトリックス剛性の程度、ECM線維のサイズ、配向、変形性、および局所密度などの、機械的な合図を出す能力である［2］。細胞は、ペトリ皿またはフラスコの平坦でかつ無限剛性の表面特徴上で培養されながら一般に解析されるので、種々の組織のECMの、より柔軟で、より動的で、かつ可撓性の機械的な環境、特徴の推定的効果は、頻繁に無視される。しかしながら、証拠の迅速な蓄積は、すべてではないがほとんどの哺乳動物細胞型が、接着基質の機械的な特徴に極めて敏感であり、機械的なミリューの変化に応じて種々の表現型特徴を改変することができることを強く示唆している［18］。特に、操作されたポリマーゲルの使用は、周囲または下層のマトリックスの剛性およびナノ構造が、細胞形状および配向のような基礎的な細胞特性および機能、細胞移動および分裂の速度および指向性、ならびに細胞運命に影響を及ぼす可能性があることを示唆している［19］。
【０１７８】
本発明者らは、特に、複数の細胞型が、マイクロスケールおよびナノスケール基質特徴（例えば、ナノ隆起およびナノピラー）の密度の変化を感知することができ、結果として、トポグラフィー感知または「指向走性」を示すことを見出した［2〜4］。加えて、ラット心筋細胞の単層は、100から800nmまで様々であるスケールのナノトポグラフィー特徴密度に応じて、強化された力の発生および活動電位伝播を示すことができ、これらの心臓細胞および組織モデルにおける極めて敏感なナノ感覚能力を示唆している（図12A〜12C）［3］。
【０１７９】
天然に存在するナノスケールECMを、異方性のアレイへの細胞配列だけでなく、組織構造および機能の微細をも調節する強力な誘導合図とすることができることをこの感受性が示すことが本明細書において考慮される。残念なことに、その潜在的な臨床関連性に関する、組織の生理的な構造および機能を確立するように細胞に指示する際の、ナノトポグラフィーの程度および重要性は、十分に理解されていない。
【０１８０】
ナノテクスチャ加工されたMEAデバイスの開発、およびMEAを使用した心臓細胞の電気生理特性の特徴決定が、本明細書に記載される。一体型MEAは、既存のMEAが提供することができないインビボ模倣環境における細胞の電気生理データの取得を可能にする。図13は、本明細書に記載されるインビボ模倣MEAをベースにしたシステムの例示的な態様の全概略図である。MEAは、ナノメートルスケール溝を含む、可撓性の生体適合性層（例えばポリジメチルシロキサンまたはポリウレタン）と一体化することができる。ナノ溝は、100nm〜1000nmの幅、ピッチ、および／または深さとすることができ、溝の上部で培養された細胞に機械的な合図を提供する。ナノ溝は、毛細管力リソグラフィベースのナノパターニング、または、マイクロパターニング／ナノパターニングをもたらすためのエッチングもしくは3D印刷などの、他の製造技法によって形成することができる。PDMSまたはPU層を、スライドガラスまたは他のベース基材上に設けることができる。MEAは、ナノ溝と直接一体化することができる。電気ワイヤまたはリードを、PDMSまたはPU層とスライドガラスとの間に埋め込むことができる。電極を、ナノ溝上に形成することができ、バイアを、ワイヤに電極を接続するためにPDMSまたはPU層を通して形成することができる。電極は、ナノ溝の輪郭をたどることができ、細胞とナノスケールインビボ模倣環境との間の継ぎ目のないインターフェイスを可能にする。スライドガラスまたは他の透明もしくは半透明のベース基材材料の使用は、蛍光可視化を可能にし、電気ワイヤと関連した寄生を低くするのに役立つ。
【０１８１】
図13に示されるように、個々の電極から生体電位信号およびインピーダンスを捕捉し、その後の解析のためにコンピュータに信号を記録するシステムに、MEAデバイスを備えることができる。本発明によるMEAデバイスは、細胞培養表面上に、または細胞培養表面に隣接して、電極のアレイを各々含む、1つまたは複数のウェルまたはチャンバを備えることができる。電極の各々は、外部の回路に直接または間接的に電極を接続するために、リードまたはワイヤを備えることができる。リードまたはワイヤのうちの1つまたは複数を、増幅器、フィルタ、および信号プロセッサなどの、1つまたは複数の信号調整デバイスに接続することができる。信号のうちの1つまたは複数を時分割多重化または周波数分割多重化することができるチャンネル多重化器に、リードまたはワイヤのうちの2つまた複数を接続することができる。記録してコンピュータに視覚的に提示することができるデジタル値へ信号（例えば、生体電位およびインピーダンス）振幅を変換するために、電極から受け取った信号を、アナログデジタル変換器を使用してデジタル化することができる。2つまたは複数の電極から受け取った信号を、記録および提示、時間同期することができる。
【０１８２】
以下の節は、ナノ溝と一体化したMEAの追加的な詳細を記載する。ナノ溝上の細胞成長およびナノ溝上のMEA付着の結果が、本明細書に提示される。ナノ溝上の単一ウェルMEAの設計、実施、および評価もまた、本明細書に記載される。
【０１８３】
本明細書に記載される単一ウェルMEAは、インビボ模倣環境上の細胞からの電気生理信号の取得を可能にする。単一ウェルMEAは、様々なインビボ様環境における細胞を特徴決定するために、かつスループットを増加させるために、多ウェルMEAに拡張することができる。96ウェルMEAシステムまでの開発が、本明細書においてとりわけ考慮される。最後に、提案されるMEAの電気的インターフェイスが、本明細書に述べられる。インターフェイスは、標準的なデータ取得機器／ソフトウェア（Lab VIEW）に基づいており、使用者の特異的な必要性に合わせてカスタマイズ可能である。
【０１８４】
結果
本節は、（i）可撓性の基材上のナノ溝、および（ii）ナノ溝上のMEA形成の結果を記載する。数100nmの特徴を有するナノ溝をPDMSまたはPU基材上に形成し、心臓細胞からの生理的な応答を観察した。観察によれば、ナノ溝付き表面は、心筋細胞の成熟を有意に促進し、機能性単層にミオサイトを並べる。精巧な特徴上へのMEAの形成の技術的実行可能性を実証するために、MEAの小さいサイズのアレイ（最高3×5）をナノ溝の上部に形成した。インピーダンス測定は、MEAが生体信号取得に対応することを示した。
【０１８５】
可撓性基材上のナノ溝
インビボ心室組織化を模倣するナノトポグラフィー的に制御された心筋のモデルをもたらす容易かつ確実な方法が、本明細書に記載される〔3〕。心臓組織は、マクロからナノまで、複数の長さスケールでの複雑な構造の組織化を行う。心筋を構成するマクロスケールの細胞シート上に、ミオサイトおよび筋原線維が調和して並べられ、収縮力の発揮のための自然な方向、および活動電位の伝播のための画定された軸を提供する。天然ラット心筋の超微細構造解析において、相互に並べられた心筋細胞の配置が、下層のECMの線維の方向と強く相関することが見出された（図14A）。これは、心臓組織の組織化および発達のための天然のナノスケールの合図としての、ECMの担う役割を示す。力リソグラフィベースのナノ製造（CFL）技法が、天然のマトリックスナノトポグラフィーを反復するために、開発されている［2、3、20〜23］（図14B）。共通の技法を使用してインビトロで培養される場合に、心筋細胞は、天然の組織化を失って、ランダム分布を採用し（図14C）、心筋細胞の生理的な特性の多くを危うくする可能性がある。対照的に、パターン化された表面上の細胞は、下層のナノ溝の方向と平行なきれいに並べられた形態をとる（図14C）。興味深いことに、光学マッピング解析はまた、異方的で、並べられた細胞の方向に増加した速度を有する、活動電位伝播の発生を実証した（図14D）。
【０１８６】
さらに、心筋細胞は、それらの細胞区域および長さをモジュレートする下層のマトリックスによって提示される正確なナノ特徴サイズに高度に敏感である。重要なことは、ギャップジャンクションタンパク質コネクシン-43の発現レベルがまた、溝および隆起、幅のサイズに依存していることである（図15（左））。これは、特徴サイズを800_800nm（溝幅隆起幅）に増加させた場合の、観察されたより高い伝導速度と相関した（右）。同時に、これらの結果は、異方性のナノトポグラフィーが、心筋細胞単層の自己集合を天然の心筋組織の構造を模倣する並べられた構築物に導くことができることを実証する。さらに、これらの結果は、ナノトポグラフィーパターンの細目が平均細胞サイズ、細胞-細胞結合、および電気生理特性を制御することができ［3］、これにより、肥大化および成熟が制御される可能性があることを示している。
【０１８７】
ナノ溝とのMEA一体化
ナノ溝上でMEAを一体化する潜在的可能性を調べるために、MEAを、ナノ溝の上部に直接形成した（図16）。いくつかの態様によれば、ナノ溝はPDMS層に形成され、後の工程のサーマルバジェット（例えば、熱を加える能力）が主に制限される。いくつかの態様によれば、シャドーマスクを、MEA細胞培養層を覆うために使用することができ、Cr／Auの薄膜（例えば40〜70nm）を、ナノ溝上にシャドーマスクを介してスパッタリングすることができる。設計されたアレイのサイズは2×2から3×6の範囲にわたり、図16（左）は2×3アレイの視覚的な画像である。Cr/Au電極の端部がはっきりと見え、図16（中央）、ナノ溝の鋭い周期的な特徴すべてが堆積後にうまく維持される、図16（右）。
【０１８８】
MEAの例示的な態様の測定
電極／リードがナノ溝プロファイルと共形であるので、抵抗はナノ溝の配向の関数である。ナノ溝と平行および垂直に並べられたリードの測定抵抗はそれぞれ、10〜13Ωおよび20〜27Ωであり、幾何的算出とうまく合致する。MEA電極間に電気的分離を提供するために、薄い（約300nm）生体適合性絶縁体、パリレン-Cを電気リードの上部に堆積させ、電極を覆いがないままにした。堆積プロセスは、ナノ溝の精巧な特徴を保つために、室温で実行した。パリレン-C層は赤色のリードを覆い、細胞に触れることができるように、緑色の電極には覆いがない（図17A）。堆積後、UV硬化性の生体適合性接着剤（PU78）を使用して、培養チャンバをチップ上に取り付けた（図17B）。図17Cは、配線ソケットの下部に設置されたピンから取得される、信号発生器からのエミュレートされた入力（200Hzで87.7μV）を使用したMEAの時間信号を示す。時間信号を、増幅し、不要なノイズを除去するためにフィルタ処理した。それでも、60Hzのノイズは依然として存在し、遮蔽または十分に接地されたソースの提供により除去することが必要である。入力振幅が100Hzで29.25μVに減少すると、60Hzのノイズはよりはっきりと除去される（図17D）。ナノ溝の配向に応じた周波数応答も行われたが、信号変化は配向に応じて観察されなかった。電極／リードと関連した抵抗および容量の僅かな差は生体信号取得に影響を与える見込みがないため、これは予想通りの結果である。
【０１８９】
例示的な態様の単一ウェルMEAからの知見
先の段落に記載された結果によれば、提案されるナノ溝と一体化されたMEAには調査の見込みがある。追加的な態様が、本明細書においてとりわけ考慮される。絶縁層は、MEAの電極を電気的に絶縁する。パリレン-Cは、証明済みの生体適合性材料で、室温化学蒸着プロセスで堆積されるので、パリレン-C膜が、それぞれ細胞成長を容易にしかつナノ溝の緻密な特徴を維持するために、主に使用される。ナノ溝を傷つけることなく膜を緻密にパターン化することは、非常に困難である。アレイのサイズが増加する（最高3×6アレイまで試験した）ほど、電極間の絶縁はより重大となる。いくつかの態様では、ナノ溝、および貫通バイアを使用してナノ溝の上部に残された電極の下に、電気ワイヤを埋め込むことができることが、本明細書においてとりわけ考慮される。
【０１９０】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスを、高スループットまたは高スループット対応とすることができることが、本明細書においてとりわけ考慮される。多ウェルMEAは、薬物検査を含むある特定の適用のために有利である可能性がある。ウェルの数を、例えば最高96個のウェルまで、かなり大きくすることができる。本明細書において先に（例えば図17Aおよび17Bに）記載されたMEAの例示的な態様は、2×2から3×6アレイ上に単一の培養チャンバを含有し、高スループット適用のためのMEAの使用を有意に限定する。いくつかの態様では、ウェルのアレイの、MEAのナノ製作されたアレイとの混成一体化を使用して、ウェルのアレイを、MEAのアレイの上部に直接形成することができる。
【０１９１】
アレイが多く、例えばウェル当たり最高128個のチャンネルおよび96ウェルとなる場合、チャンネルの総数は莫大、すなわち128×96=12,288個となる。これらのチャンネルのすべてから信号を収集して、「リアルタイム」様信号を取り込むことは困難となる。系統的なインターフェイスを用いて、生体信号の疑似リアルタイム取得を可能にすることができることが、本明細書において考慮される。
【０１９２】
ナノ溝上の単一ウェルMEA
単一ウェルMEAの設計および実施
図18は、1つずつ取り扱うハンドアセンブリを排除するバッチモードプロセスにおいて、ナノ溝を有するMEAデバイスを形成する方法の例示的な態様を示す。プロセスは、図18（a）で、スライドガラスから開始することができ、次いでワイヤ用の薄い金属膜（すなわち、Cr／Au）を、周知の薄膜堆積プロセスを使用して、堆積／パターン化することができる。スライドガラスは、寄生容量を低減させるのに役立ち、つまり測定精度を改善し、また、可視化のための光学透明性を可能にする。図18（b）で、PDMSまたはPUの層を、（例えば、スライドガラスの表面に対する接着またはキャスティングによって）適用することができる。次いで、厚さ5〜10μmのPDMSまたはPU層上のナノ溝を、毛細管力リソグラフィを使用して、型から転写するかまたはスライドガラスの上部にスタンプすることができる［2、3、20〜23］。この転写またはスタンプ工程は、スライドガラスに対する位置調整を必要としない。この工程が完了すると、ナノ溝の精巧な特徴を維持するために、高温工程が実行される場合がないことに留意すべきである。図18（c）で、第1のシャドーマスクを使用して、金属の薄層、すなわち200nmのAlを堆積させることができ、次いで、金属マスクを使用してPDMS／PUの各部分を除去するために、反応性イオンエッチング（RIE）プロセスを使用することができる。図18（d）でエッチングが完了すると、金属マスクを除去することができ、次いで、Auで作製されたバイアを、図18（e）に示されるように、下部金属上に形成する（例えば、電気メッキまたは堆積させる）ことができる。図18（f）での電気メッキ工程の後、第2のシャドーマスクを使用して、厚さ50〜100nmのAuで作製された電極をナノ溝の輪郭上に形成することができる。最後に、図18（g）で、培養チャンバを、UV硬化性エポキシを使用して取り付けて、製造を完了することができる。
【０１９３】
ナノ溝上の単一ウェルMEAの評価
単一ウェルMEAを、一連の評価プロトコルを使用して特徴づけることができる。エミュレートされた生体電位信号をMEAの電極に供給し、時間出力信号を、ナノ溝の配向に応じて、エミュレートされたものと比較することができる。これは、ナノ溝配向に応じた、周波数応答および最小検出可能信号の特徴づけを可能にする。
【０１９４】
新生児心室ミオサイト（NRVM）を、6〜14日間、ナノパターン化された基材上に播種することができる。本明細書において実証されるように、細胞は、細胞間裂溝を実質的に含まないコンフルエンス間近の状態を呈した。48時間後、パターン化されない表面上で成長した単層における細胞のランダム配向とは対照的に、コンフルエント単層は、異方性のアレイへと巨視的に形成された（図19Aおよび19B）。心筋細胞の構造的な特性に対するナノ溝パラメータ（幅、ピッチ、および深さ）の影響を検査するために、単層の心臓細胞の角度、長さ、および幅を、日々測定することができる。電気生理特性特徴づけのために、NRVMを、ナノパターン化された MEAデバイス上で培養し、培養単層からの電気生理信号および伝導速度を1週間で測定することができる。細胞単層の自己集合、および、天然の心筋組織の並べられた心臓生理的構築物の機械電気特性を模倣する、活動電位伝導速度の速い方向伝播を、並べられたナノパターンが導くことができることが、本明細書において考慮される。
【０１９５】
考察
インビボ環境を模倣する、ナノメートルスケールの合図に応じた電気生理生体信号の取得は、有用で、生物学的研究におけるMEAの能力を変える可能性を有する。ワイヤ／電極の単一の層を使用する従来のMEAとは異なり、提案されるMEAの信号チェーンは、ナノ溝上の電極およびスライドガラス上のワイヤを接続するバイアを含む。電極とバイアとの間の接点、ならびにバイアとワイヤとの間の接点は、疑似正／負信号を防止するために空隙なしである必要がある。これは、バイアを電気メッキする間のインサイチュー赤外線顕微鏡モニタリングによって対処することができる。赤外線顕微鏡は、多くの場合、電子回路用のバイアの品質をモニタリングするために使用される。ここでの違いは、シリコーン中の高アスペクト比バイアではなくポリマーを貫通する有意に大きいサイズのバイアであることである。モニタリングプロトコルを採用することによって、電気メッキ製法は、バイア形成を最適化することを特徴とすることができる。
【０１９６】
PDMSまたはPUで作製された開示されるナノ溝付きデバイスの態様上で培養されたラット心筋細胞が、成体心臓組織の二次元の模倣体へと組織化することが、本明細書において実証される。しかしながら、ナノパターン化された PDMSまたはPUは、分化された心筋細胞の接着活性をほとんど惹起しない場合があり、心臓細胞が機能的な電気的に接続された単層を形成するのを妨ぐ。いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスが、細胞-基材付着を促進しかつ細胞応答をさらに増大させるために、ポリウレタンベースの材料に結合した自己組織化接着ペプチド（例えばRGD）を含むことができることが、本明細書において考慮される。
【０１９７】
ナノ溝上の多ウェルMEA
先に記載された単一ウェルMEAは、インビボ環境を模倣する、軟質材料上のナノスケール特徴に応じて、細胞成長／増殖の有用な電気生理データを提供する。ナノ溝の配向および設計パラメータ（幅、ピッチ、および深さ）は、細胞成長／増殖に影響を与え、取得した多チャンネルデータは、生物学的研究の重大な局面を明らかにする場合がある。他方で、多くの適用は、大抵、高スループットを要求し、これは、例えば、本明細書に記載されるようなナノ溝上の多ウェルMEAによって、対処することができる。
【０１９８】
図20Aおよび20Bは、MEAのないナノ溝付き基材を有する多ウェル細胞培養デバイスの一態様を表す。このデバイスは、大きい区域のナノトポグラフィー基材と一体化された各ウェルを有する24ウェルプレートからなる。基材はいろいろな剛性およびトポグラフィーで設計することができ、各ウェルでの異なるトポグラフィー／剛性のスクリーニングを可能にする。この高スループットプラットホームを使用して、可変基材剛性およびトポグラフィーに対する心筋細胞構造体の構造的および機能的特性を、迅速に解析した。使用される材料（すなわちPDMSまたはPUベースのポリマー）の生体適合性と共に、5桁を超えるパターンのスケーラビリティ（10-2mの基質サイズに対する10-7mの特徴サイズ）は、移植可能な操作された心筋パッチの構造用足場として材料を直接使用する機会を提示する。同様の手法を、ナノ溝と一体化したバッチモード多ウェル、96ウェル、MEAを構成するために用いることができることが考慮される。
【０１９９】
ナノ溝上の多ウェルMEAの一態様の設計および実施
多数のチャンネル（128チャンネル／ウェル×96ウェル=12,288チャンネル）のインターフェイスおよび複数の培養チャンバを除き、製作プロセスは、単一ウェルMEAのものと類似する。図21は、多ウェルMEAの製作順序を表す。最初に、図21（a）で、ワイヤを、スライドガラス上に金属化することができ（薄膜、50〜100nm）、次いでパッドを、リードへのソケット取り付けのために金属化することができる（厚膜、5〜10μm）。金属化工程の後、図21（b）で、PDMS／PU層を形成することができ、次いで、ナノ溝をスライドガラスに転写またはスタンプすることができる。次に、図21（c）で、電気メッキバイアを形成することができ、次いで、電極をナノ溝の上部に形成することができる。これらの工程は、単一ウェルMEAのものと同様である。電極の形成が完了すると、図21（d）で、培養チャンバアレイを調製することができる。図21（e）で、チャンバアレイを、最高12×8チャンバのサイズで、PDMS上に成形することができる。チャンバアレイの寸法は、標準的なマイクロプレート、約6.9mmの直径、約10mmの深さ、および約9.0mmのウェル間隔に従って設計することができ、これが、チャンバの最高320μLの容積を保っている。成形されたチャンバアレイを、O2プラズマに、100Wで2分間、曝露することができ、ガラスMEAスライドに接合することができる。96ウェルMEAシステムの全フットプリントは、128×86mm2とすることができる。
【０２００】
ナノ溝上の多ウェルMEAの評価
単一ウェルMEAの評価プロセスと同様に、NRVMを、6〜14日間、ナノパターン化された基材上に播種することができる。ECM合図のスケール、および心臓組織のECM原線維の可能性のある直径のばらつきを算出するために、設計されるパターンの溝および隆起の幅を150_50から1000_1000nmまで、高さを200から600nmまで変化させることができる。トポグラフィーパラメータ（例えば溝／隆起の幅、ピッチ、および高さ）ならびに初期細胞播種密度の範囲を：（1）3つの細胞培養のコンフルエント合胞体単層をもたらすため；（2）心筋細胞を並べるため；（3）1週間の培養後、無傷の細胞単層の脱離を可能にするために、特定することができる。終了点は、全培養区域に対する細胞質染色区域の比率、心筋細胞伸長、および組織レベルにわたる心筋細胞偏心の分散によって証明されるような、コンフルエンスとすることができる。各ウェルがいろいろなトポグラフィー寸法のMEA-ナノトポグラフィー基材と一体化した多ウェルプラットホームは、これらの終了点の迅速な解析を可能にすることができる。ナノトポグラフィー寸法の選択された範囲は、次いで、異方性の心臓組織構造体を生成し心筋細胞機能および成熟に対するナノトポグラフィー的な影響を特徴決定するために、使用することができる。
【０２０１】
考察
多ウェルナノ溝付きMEAは、インビボ様環境で細胞をモニタリングするための魅力的なツールである。バイアと関連した接触に加えて、多ウェルMEAは、ワイヤ（薄い金属膜）とパッド（厚い金属膜）との間に別の金属-金属接触を有する。MEAの近くで信号完全性を維持することが重要であり、接触を形成する前に焼結（300〜400度）を実行することができる。比較的低温の焼結によって、金属のリフローは空隙および不規則な接触を除去することができる（この焼結工程が、厳しいサーマルバジェットの範囲内にあるPDMS／PUナノ溝の転写／スタンプ前に実行されることに留意すべきである）。複数のウェルからのMEA間のクロストークもまた、可能である。単一ウェルMEAとは異なり、多ウェルMEAの信号密度は非常に高い。96ウェルMEAのフットプリントは128×86mm2であるが、信号ルーチングのための区域は最高7.2×103mm2までとかなり限定される。12,288個の信号ラインがこの限定されたスペース内に詰め込まれる場合、望ましくないクロストークが発生する可能性がある。信号ラインの最適化された対称的なレイアウトを、クロストークの効果を減少させるために使用することができる。対称的なレイアウトは、多くの場合、集積回路のために周囲電子装置をインターフェイスする際に使用され、非常に発達した市販のルーチングツールはこのレイアウトを生成する。また、信号ラインの下のグランドプレーンがクロストークを最小化することができることが、本明細書において考慮される。
【０２０２】
心臓の成熟を、単一の終了点特徴決定によって明確にすることは困難である。心臓の成熟は、サルコメアの超微細構造的組織化および筋原線維の配列、収縮力の増加、トロポニンIとタイチンとの間のアイソフォーム変換、Ca2+放出および取り込みの速度の増加、肥大化、心筋細胞の配列、境界板の形成、ならびに収縮力発生の増加によって評定することができる、パターン化されない基材とナノパターン化された基材の両方の上での心臓細胞の培養単層の電気生理特性を、比較することができる。細胞-細胞結合の改善、および心臓組織の方向収縮を可能にする異方性の活動電位伝播を判定するために、MEAデバイスからの生体信号を用いることができ、活動電位伝導速度を、操作された心臓細胞の生理的な検査によって測定することができる。
【０２０３】
生体電位およびインピーダンス測定のインターフェイス
MEAからの生体信号を読み取るために、インターフェイスを使用して、アナログで生体信号を収集し、それらをデジタル化し、標準的なデジタル信号プロセッサ（DSP）によってそれらを信号調整することができる。MEAからデータを収集するために使用される電子インターフェイスは、例えば、簡易的な単一ウェル単一チャンネルブレッドボードレベル読み取り器とすることができ、読み取り器は、45のゲインを有する計装増幅器を組み込み、入力高域通過を有する第4のバンドパスゲインステージ（G2=91、BW=0.05Hz〜1,061Hz）に接続されており、4,100の総ゲインを得る。増幅された／フィルタ処理された信号を、次いで、信号をデジタル化するためにDAQに接続することができ、Lab VIEWで視覚化することができる。サンプリングレートは、100kHzに設定することができる。
【０２０４】
生体信号が電極で収集されて、ワイヤを介して伝達される場合、ワイヤの伝播遅延はナノ溝の配向に依存する。図22は、信号伝達の2つの極端な場合を示し、一方はナノ溝と直交し（方向1）、もう一方はナノ溝と平行である（方向2）。方向1のワイヤの有効長は、方向2の有効長よりもはるかに長い（1.96×）ため、方向1のRC時定数は方向2のRC時定数より大きく3.84（=1.962）である。単一ウェルMEAでは、個々のチャンネルが個別に収集されるため、RC時定数の変化は測定に影響がない。
【０２０５】
しかしながら、生体信号が、時分割多重化方法を使用して多ウェルから収集される場合、RC時定数変化の影響は有意となる。最悪のシナリオでは、RC時定数変化が1.96×である。単一のウェルのための128個のワイヤのRC時定数が平均値になると仮定すると、その因子は1.614に低減するが、単調なアルゴリズムが個々のチャンネルの遅延に対応するように実施されない限り、128個のチャンネル間に2.6倍（=1.6142）の検出の不確実性がもたらされる。代替的に、これらのワイヤを、上部ナノ溝付き表面から平坦な（パターン化されない）表面へ移動させることができることが、本明細書において考慮される（図18および21）。
【０２０６】
生体信号（生体電位およびインピーダンス）測定
関心対象の主な生体信号は、細胞からの生体電位である。MEA上の各電極はチャンネルを形成し、この電極から記録される生体電位が、増幅、フィルタ処理、およびデジタル化される。関心対象の他の生体信号は、インピーダンスである。細胞が電極上に位置する場合、局所的なイオン環境が変化し、電極インピーダンスの増加をもたらす。インピーダンスは、細胞の数との、および、細胞接着または拡散を含む、電極と細胞の相互作用の良否との関数である。生体電位とインピーダンスの両方をモニタリングすることによって、多くのアッセイ法における細胞生存度、数、および形態のモニタリングが可能となる。いくつかの態様では、生体電位とインピーダンスの両方の読み取りを実行することができる。
【０２０７】
シリアル／パラレルデータ取得インターフェイス
図23に示されるようないくつかの態様では、各ウェルは、最高128個のチャンネルまたは電極を含むことができ、これらの信号は、パラレルチャンネルを単一のワイヤ上のシリアル信号に変換するために、時分割多重化によって処理される。個々のウェルのすべてのチャンネルを多重化する理由は、コンピュータが同時に取り込むことができる信号またはデータ経路の数を最小化するためである。各電極からの信号を、増幅器および／またはフィルタによって処理して、多重化器（MUX）に接続することができ、多重化器は、コンピュータ（PC）または信号プロセッサ（DSP）に接続することができるデータ取得デバイス（DAQ）に単一の出力信号（MEA #1〜MEA#96）を提供する。各チャンネルがそれ自体のシリアル信号経路を有する場合には、コンピュータは同時に128×96=12,288個の信号を読み込むことが必要である。他方で、時分割多重化によりパラレル経路の数を低減させることにより、各MEAから単一のデータ経路だけが必要となる。生体信号が現代の電子装置より非常に遅い（最高数10kHZ）ため、これは可能となる。時分割多重化のために多重化器（MUX）を通り抜ける前に、すべてのチャンネルからの信号を、増幅および／またはフィルタ処理することができる。複数のウェルからのシリアル化された信号を、パラレルにデジタル化し、次いで、デジタル信号プロセッサ（DSP）によってさらに純化することができる。インピーダンス測定が外部の刺激（AC電圧）の適用を伴うことができることを除き、生体電位およびインピーダンス（z）の両方を、同一の信号経路によって捕捉することができる。DAQは刺激電圧を生成することができ、刺激電圧は、個々のチャンネル（電極）にアナログAC電圧を提供するように分波し、レシオ型となるようにAC電流を測定することによってインピーダンス（z）をコンピュータで算出することができる。時分割多重化は、生体信号の疑似リアルタイム取得を可能にする。DAQが96個のウェルから同時に信号を取り込むように、各MEAウェルをパラレルで処理することができる。
【０２０８】
考察
個々のチャンネルが、個別に、換言するとパラレルに、収集、増幅、フィルタ処理、デジタル化、および視覚化されるので、単一ウェルMEAのインターフェイスは比較的単純である。多ウェルMEAでは、多重化を原因とする量子化または時間遅延によるノイズが発生する可能性がある。生体電位の単純な時分割多重化とは異なり、インピーダンス測定は、AC電流を測定して所与の周波数でのインピーダンスを取得するために、外部の刺激、すなわちAC電圧を使用することができる。外部の刺激は、個々のチャンネルに分波することが必要であり、次いで、チャンネルがAC電流を収集する。好ましくは、この工程を、個々のウェルのシリアル化された信号の時分割多重化順序に同期させて正確に適合させることができる。この工程が完全に同期しない場合には、時間多重化信号の精度は低下している可能性がある。いくつかの態様では、時分割多重化を、アルゴリズムによって、例えばLab VIEW Signal Expressに埋め込まれたアルゴリズムによって対処することができる。個々のチャンネルは、多重化前に同期を確保するためにチェックポイントを有することができ、チェックポイントは、非完全な同期信号のオフセット／エラーをモニタリングする。
【０２０９】
複数のウェル態様でのクロストークまたは結合。各ウェルからDAQへの平行なワイヤは、クロストークによる不要なノイズを経験する可能性がある。このクロストークは、多くの場合、特に多数の信号を収集する場合に、測定の信憑性を限定する（12,288個の信号が96ウェルMEAから生じることに留意すべきである）。アナログ信号におけるクロストークは、デジタル信号のものより非常に厳しく、したがって、MEAインターフェイスの最前端部でクロストークに対処することが重要である。遮蔽層をワイヤの下に含むことができ、ワイヤは、ナノ溝PDMS／PU基材とスライドガラスとの間に設置される。遮蔽層は、例えば、薄膜金属、すなわち100〜200 nmアルミニウム製とすることができ、絶縁層、すなわち50〜100nm Si02またはSi3N4が、遮蔽層の上部にある必要がある。このような遮蔽は非常に有効であることが証明されており、多くの場合、複数の信号ライン間のノイズを最小化するために、集積回路で使用され、ブートストラップと呼ばれる。デジタル信号におけるクロストークに対処するために、MEAを遮断された環境にパッケージすることができる［25］。
【０２１０】
心筋細胞（心臓細胞）成熟を有意に促進して、機能的な、電気的に接続された単層（組織）にミオサイトを並べるナノ溝付き表面を備えるMEAデバイスが、本明細書に記載される。ナノ表面が用意されたスライドガラスを、業界標準的なMEA「チップ」にパッケージすることができる。単一ウェルMEAチップの一態様は、10mm×10mmで、128個の有効電極を有する。本明細書に記載されるMEAチップを、このフォーマットに一体化することができる。チップは、例えばCellular DynamicsまたはAxiogenesisから市販の心臓細胞のための、および組織表面の上への薬液の導入のための、生命維持装置を提供する。次いで、チップを、MEAリーダーに置くことができ、心筋組織（個々の細胞ではない）の電気活性が、測定、記録、および解析される。
【０２１１】
本明細書に記載されるデバイスは、組織レベルで催不整脈効果（心毒性および離脱症状の主要な原因）の直接スクリーニングを可能にする。本明細書に記載されるデバイスを、例えば（1）催不整脈薬による、および（2）直接の心臓毒性効果を有することが知られているかまたは疑われている抗癌活性を有する小分子キナーゼ阻害物質のライブラリー（Enzo KI 80 compound library）による心毒性スクリーニングで使用することができる。終了点は、（i）活動電位持続時間、（ii）伝導速度、（iii）自発的な拍動速度、および（iv）リエントラント波パターンを含むことができる。独立型ヒト心毒性スクリーンプラットホームが、本明細書において考慮される。環境汚染物質または化学兵器剤の評価などの適用が、本明細書において考慮される。
【０２１２】
参照文献
2016518117.tif 000004
2016518117.tif 000005
2016518117.tif 000006
2016518117.tif 000007
【０２１３】
実施例2
ガラス基材上のポリマーナノ溝の作製
ポリマーナノ溝を、PDMS、PUA、または他の生体適合性ヒドロゲルを含む、種々の材料から作製することができる。異方性のナノ溝を形成するために、ナノパターン化する任意の方法を使用することができる。本明細書に記載されるようなMEAナノデバイスの一態様を形成するために、UV支援毛細管リソグラフィを使用したが、ナノパターン化する任意の他の方法も使用できる可能性がある。一態様では、カバーガラスを、超音波浴中イソプロピルアルコールで30分間洗浄することができ、窒素の気流で乾燥させることができる。最初に、接着促進剤を典型的にスピンコーティングして、前駆溶液を分注する前にカバーガラス上へ薄層（約200nm）を形成した。少量（約0.1ml〜0.5ml）の前駆ポリマー溶液を、カバーガラス上へ滴下分注し、次いで、PUA型を表面上に直接置くことができる。前駆体を、表面に自発的に引き込ませることができる。前駆体を、毛細管作用によって型の空洞に自発的に引き込ませることができ、約30秒間UVに曝露して硬化させた。硬化の後、型を、鋭いピンセットを使用して、基質から剥がすことができる。
【０２１４】
ナノテクスチャ加工された基材上にMEAを一体化することによるナノ上電極MEAナノデバイスの設計
シャドーマスクをMEAのために使用することができ、次いで、ナノ溝上のシャドーマスクを介して40〜70nmのCr／Auをスパッタリングした。任意の他の導電性材料を、電極を形成するために使用することができる。アレイの電極の数は、2×2から3×6、8×8、16×16、または任意の他の密度の範囲とすることができる。設計は、シャドーマスクの適切な設計によって、任意で実現することができる。MEAは、ナノメートルスケール溝を持つ可撓性の生体適合性層、すなわち、ポリジメチルシロキサン（PDMS）またはポリウレタン（PU）と一体化する。ナノ溝は、数100nmの幅、ピッチ、および深さとすることができ、溝の上部の細胞に機械的な合図を提供する。電気ワイヤを、PDMSまたはPU層とスライドガラスとの間に埋め込むことができる。電極を、ナノ溝上に置くことができ、バイアを、電極とワイヤを接続するためにPDMSまたはPU層を通して形成することができる。電極は、ナノ溝の輪郭をたどることができ、細胞とナノスケールインビボ模倣環境との間の継ぎ目のないインターフェイスを可能にする。スライドガラスは、蛍光可視化を可能にし、電気ワイヤと関連した寄生を低くするのに役立つ。
【０２１５】
ナノ上電極MEAナノデバイスの作製
いくつかの態様では、ナノ溝はPDMSまたは他の生体適合性ヒドロゲル上にあり、これは、後の工程のサーマルバジェットを主に限定する。さらに、電極／リードがナノ溝プロファイルと共形である場合には、抵抗はナノ溝の配向の関数である。ナノ溝と平行および垂直に並べられたリードの測定抵抗はそれぞれ、10〜13Ωおよび20〜27Ωであり、幾何的算出とうまく合致する。MEA電極間に電気的分離を提供するために、薄い（約300nm）生体適合性絶縁体、パリレン-Cを電気リードの上部に堆積させ、電極を覆いがないままにすることができる。堆積プロセスを、ナノ溝の精巧な特徴を保つために、室温で実行することができる。パリレン-C層はリードを覆うことができ、電極は、細胞に触れることができるように、覆いなしとすることができる。堆積後、UV硬化性の生体適合性接着剤（PU78）を使用して、培養チャンバをチップ上に取り付けることができる。
【０２１６】
単一ウェルMEAナノデバイスの設計および実施
本明細書に記載されるMEA ナノデバイスは、バッチモードプロセスにおいて、ならびに低スループット用のハンドアセンブリによって形成することができる。一態様では、スライドガラスから始まって、ワイヤ用の薄い金属膜（すなわち、Cr／Au）が、堆積／パターン化される。スライドガラスは、寄生容量を低減させるのに役立ち、つまり測定精度を改善し、また、可視化のための光学透明性を可能にする。次いで、厚さ5〜10μmのPDMSまたはPU層上のナノ溝を、例えば毛細管力リソグラフィを使用して、型から転写するかまたはスライドガラスの上部にスタンプすることができる。この転写またはスタンプ工程は、スライドガラスに対する位置調整を必要としない。この工程が完了すると、ナノ溝の精巧な特徴を維持するために、高温工程が実行される場合がないことに留意すべきである。第1のシャドーマスクを使用して、金属の薄層、すなわち200nmのAlを堆積させ、金属マスクを使用して、PDMS／PUに、反応性イオンエッチング（RIE）を実行する。エッチングが完了すると、金属マスクを除去し、次いで、Auで作製されたバイアを、下部金属から電気メッキすることができる。電気メッキ工程の後、第2のシャドーマスクを使用して、厚さ50〜100nmのAuで作製された電極をナノ溝の輪郭上に置くことができる。最後に、培養チャンバを、UV硬化性エポキシを使用して取り付けて、製造を完了することができる。この方法を、他のナノパターン化およびスパッタリングする技法を使用するために修正することができる。
【０２１７】
MEAナノデバイスの評価
単一ウェルMEAを、一連の評価プロトコルを使用して特徴づけることができる。エミュレートされた生体電位信号をMEAの電極に供給し、時間出力信号を、ナノ溝の配向に応じて、エミュレートされたものと比較することができる。こうすることによって、周波数応答および最小検出可能信号を、ナノ溝配向に応じて特徴づけることができる。
【０２１８】
さらなる評価のために、新生児心室ミオサイト（NRVM）を、3日間、ナノパターン化された基材上に播種することができる。本明細書に記載されるように、細胞は、細胞間裂溝を実質的に含まないコンフルエンス間近の状態を呈した。48時間後、パターン化されない表面上で成長した単層における細胞のランダム配向とは対照的に、コンフルエント単層は、異方性のアレイへと巨視的に形成された。心筋細胞の構造的な特性に対するナノ溝パラメータ（幅、ピッチ、および深さ）の影響を検査するために、単層の心臓細胞の角度、長さ、および幅を、日々測定することができる。電気生理特性特徴決定のために、NRVMを、ナノパターン化されたMEAデバイス上で培養し、培養単層からの電気生理信号および伝導速度を1週間で測定することができる。他の心臓細胞型を使用することができる。MEAナノデバイスの設計は、任意の市販（または自家製）の増幅器と適合するように、任意に設計することができ、これにより、確立したMEAプロトコルを使用した生体電位信号の直接測定が可能となる。
【０２１９】
マルチスループットMEAナノデバイスの作製
マルチスループットナノ上電極MEAナノデバイスを作製するために本明細書において考慮される一態様は、ウェルのアレイの、MEAのナノ製作されたアレイとの混成一体化である。アレイが多く、例えばウェル当たり最高128個のチャンネルおよび96ウェルとなる場合、チャンネルの総数は莫大、すなわち128×96=12,288個となる。これらのチャンネルのすべてから信号を収集して、「リアルタイム」様信号を取り込むことは非常に困難である。いくつかの態様では、このデータを、系統的なインターフェイスを構成することによって収集することができ、これにより、生体信号の疑似リアルタイム取得が可能となる。多数のチャンネル（128チャンネル／ウェル×96ウェル=12,288チャンネル）のインターフェイスおよび複数の培養チャンバを除き、製作プロセスは、単一ウェルMEAナノデバイスのものと類似する。図21は、多ウェルMEAのこの態様の製作順序を示す。最初に、ワイヤを、スライドガラス上に金属化することができ（薄膜、50〜100nm）、次いでパッドを、端部でのソケット取り付けのために金属化する（厚膜、5〜10μm）。金属化工程の後、ナノ溝をスライドガラスに転写またはスタンプし、バイアを電気メッキし、電極をナノ溝の上部に形成する。これらの工程は、単一ウェルMEAのものとほぼ同様である。
【０２２０】
多ウェルチャンバと大きい表面積のMEA ナノデバイスの一体化
電極の完全な形成が実現されると、培養チャンバアレイを調製することができる。いくつかの態様では、チャンバアレイを、最高12×8チャンバのサイズで、PDMS上に成形することができる。チャンバアレイの寸法は、標準的なマイクロプレート、約6.9mmの直径、約10mmの深さ、および約9.0mmのウェル間隔に従って設計することができ、これが、チャンバの最高320μLの容積を保っている。成形されたチャンバアレイを、O2プラズマに、2分間の100Wで、曝露することができ、ガラスMEAスライドに接合することができる。96ウェルMEAシステムの全フットプリントは、128×86mm2とすることができる。
【０２２１】
チャンバを、射出成形によって直接製作することまたは商業的に調達することができ、種々の生体適合性接着方法（UV硬化性接着剤、熱硬化性接着剤など）のうちのいずれかによって、大きい表面積のMEAナノデバイスに接着することができる。図21は、プロトコルを説明する。
【０２２２】
実施例3
心筋細胞は、MEAナノデバイス上に、容易に単層を形成する（図27Aおよび27B）。ナノ溝より上または下に電極を有するデバイスは、細胞外マトリックス分子および／または合成ペプチドで覆われた。次いで、デバイス上に播種された心筋細胞は、ナノ溝の方向に並んでいる単層を形成した。
【０２２３】
ラットミオサイトおよびヒト心筋細胞の自発的に生成された場電位は、ナノテクスチャ加工されたMEAデバイスによって変化しなかった（図28A〜28D）。加えて、本明細書に記載されるデバイスは、細胞上の心臓活動に対する薬物の検出効果において、より敏感であった（図29Aおよび28B、図30Aおよび30B）。
【０２２４】
本明細書に記載されるMEAナノデバイスは、公知の偽陽性である薬物を正確に特定することができる（図30Aおよび30B）。公知のhERG阻害物質であるベラパミルは、非テクスチャMEA上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに投与量依存異常を生じさせるが（図30A）、MEAナノデバイスでは検出可能な異常は生じない（図30B）。
【０２２５】
細胞上の心臓活動に対する薬物の効果を検出する際に、本明細書に記載されるMEAナノデバイスはより敏感であり、該細胞は、成熟しており、かつ、ナノテクスチャ加工されたプラットホームの上に異方的に並べられている。（図31A）1μMカルシウムチャネル阻害物質の添加は、非テクスチャ（パターン化されない）MEAの上で培養されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の場電位プロファイルに検出可能な異常を生じさせる。非テクスチャMEA上で成長した細胞に対して、ナノテクスチャ加工されたデバイス上で成長した細胞では、阻害物質の有意に少ない投与量で（0.02μMシサプリドで）場電位プロファイルにおける異常が検出された（図31B）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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