(57)【要約】  本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を酵母細胞において発現させることにより、再現性良く大量の可溶かつ活性なテロメラーゼ逆転写酵素を産生する方法に関する。精製プロセスの特定のパラメータを制御することにより、高収率の活性な組換えＴＥＲＴが得られた。このようにして得られたＴＥＲＴタンパク質は、生体外で転写されたＴＲによりテロメラーゼ活性を示し、これはテロメラーゼ構築阻害剤のハイスループット化学スクリーニングおよび治療適用への道を開くものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質（ｃＭＢＰ）、および
・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質
を含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
ｂ）工程ａ）の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
ｃ）必要であれば、前記抽出物のｐＨを６．０〜７．５の範囲内のｐＨに調整する工程と、
ｄ）アミロース結合固体担体により前記融合タンパク質ｃＭＢＰ−ＴＥＲＴを精製する工程と、
を含む、活性かつ可溶なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質の産生方法。
【請求項２】
前記酵母細胞の細胞内ｐＨが５．８未満の値に到達する前に工程ｂ）を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母細胞はピキア・パストリス細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記構成的プロモーターは好ましくは配列番号１０のＧＡＰＤＨプロモーターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記マルトース結合タンパク質タグは配列番号８のポリペプチドを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列は、前記マルトース結合タンパク質タグをコードする配列と前記ＴＥＲＴタンパク質をコードする配列との間に、プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）は、水性溶液、好ましくは塩および界面活性剤非含有水への前記酵母細胞の溶解を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記水性溶液はどんなプロテアーゼ阻害剤も含有していない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記固体担体はアミロース結合アガロースビーズからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体担体を６．０〜７．５の範囲内のｐＨを有する洗浄緩衝液で洗浄する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製済画分中にプロテアーゼを添加することにより、前記ｃＭＢＰタグを前記ＴＥＲＴタンパク質から切断する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターは組み込みベクターである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られた前記ＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物。
【請求項１４】
ＴＥＲＴは前記ｃＭＢＰに連結されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＴＥＲＴは酵母ＲＮＡに結合されている、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項１３、１４または１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
薬として使用される請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
実験的生体外アッセイのための請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
細胞老化または不妊症を治療するために使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られた前記ＴＥＲＴタンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項２０】
ＴＥＲＴは前記ｃＭＢＰに連結されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＴＥＲＴは酵母ＲＮＡに結合されている、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
対象において抗ＴＥＲＴ免疫応答を誘導させるために使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られた前記ＴＥＲＴタンパク質を含有するワクチン組成物。
【請求項２４】
ＴＥＲＴは前記ｃＭＢＰに連結されている、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
ＴＥＲＴは酵母ＲＮＡに結合されている、請求項２３または２４に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
どんな界面活性剤も変性剤も含有していない、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られた前記ＴＥＲＴタンパクを用いて効率的なテロメラーゼ阻害剤を生体外で同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
テロメアは、非コード反復ＤＮＡ配列（ヒトのＴＴＡＧＧＧ）を含む真核生物の染色体の末端に位置する構造である。これらの領域は連続的な細胞分裂周期において次第に短くなり、これにより必須な遺伝情報が失われ、最終的に細胞死が引き起こされる。従って、テロメア領域の存在により染色体末端からのＤＮＡの喪失が妨げられ、それにより細胞老化現象に対する保護が得られる。
【０００２】
テロメアの維持は、テロメラーゼとして知られているテロメア特異的ＤＮＡポリメラーゼの機能である。テロメラーゼは、テロメアのＧリッチストランドの３’側に複数のＴＴＡＧＧＧ反復配列を付加するための鋳型として使用されるそれ自身のＲＮＡ分子（ＴＲ）を運ぶ逆転写酵素である。従って、テロメラーゼは２つの必須成分、すなわち逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するタンパク質コアとＲＮＡ分子（ＴＲ）とを含む。ヒトのテロメラーゼのコアタンパク質は、「テロメラーゼ触媒サブユニット」または「ｈＴＥＲＴ」（ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素）と呼ばれる。このサブユニットは、３つの領域、すなわちｉ）ＲＴ触媒ドメインと、ｉｉ）テロメラーゼ活性、ＲＮＡサブユニットへの結合および多量体化に関与しているテロメラーゼ特異的Ｎ末端ドメインと、ｉｉｉ）酵素処理能力を促進する役割を担っていると推定されるＣ末端伸長部とを含む、１２７ｋＤａのポリペプチドである(Autexier C. et al, Annu. Rev. Biochem. 2006)。細胞において、ｈＴＥＲＴおよびその鋳型ＲＮＡは、ＴＬＰ１(Nakayama J. et al., Cell 1997)、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ２３(Holt S.E. et al., Genes Dev. 1999)およびジスケリン（ｄｙｓｋｅｒｉｎ）(Mitchell J.R. et al. Nature 1999)などの多くの他のタンパク質を含むより大きな複合体の一部である。
【０００３】
現在では、テロメラーゼ活性は多くの癌型の不死を促進するということが広く受け入れられている。従って、テロメア短縮プロセスを回復させ、かつ最終的に癌細胞死を引き起すために、正常な体細胞に影響を与えずに（これらの細胞はテロメラーゼを発現しないため）、ｈＴＥＲＴ触媒成分を阻害することが期待される。従って、ｈＴＥＲＴ酵素活性すなわちテロメラーゼ構築の阻害剤は、癌治療のための有望な手段として考えられている(Zhang X. et al, Genes Dev. 1999)。
【０００４】
しかし、効率的なテロメラーゼ阻害剤の同定には、確実なスクリーニングアッセイを行うために、プロセッシブ型テロメラーゼ複合体、特に活性なｈＴＥＲＴ触媒サブユニットの事前の生体外再構成が必要である。
【０００５】
さらに、多量の組換えｈＴＥＲＴの活性型の産生は、癌罹患患者のための免疫療法手順で使用することができる、抗テロメラーゼ免疫応答を誘導することを目的としたワクチンを開発するのに最も重要であろう。
【０００６】
最後に、有利なことに、細胞老化に関連する疾患（特に加齢疾患）および不妊症などのヒトのテロメラーゼ活性の欠如を特徴とする疾患および病気を治療するために、組換えｈＴＥＲＴを医薬組成物に使用することができる。
【０００７】
従って、多量の可溶かつ活性な組換えｈＴＥＲＴタンパク質を得ることが強く求められている。しかし、これまでのところ、満足が得られるような発現および精製手順は開発されていない。
【０００８】
事実、異なる発現および精製システムを用いたこのタンパク質を産生するための様々な試みでは限られた結果しか得られなかったため、大量の適切に折り畳まれた酵素的に活性な組換えｈＴＥＲＴを精製することは非常に難しい問題とみなされている。全長ｈＴＥＲＴは、過剰発現させることができなかったり(Holt S.E. et al., Genes Dev. 1999)、不溶であると報告されたりしている(Masutomi K. et al. J. Biol. Chem. 2000、Mikuni O. et al. BBRC 2002、Wu C.K. et al. Protein Expr. Purif. 2007)。ＭＥＧＡ−９界面活性剤を用いた酵素の可溶化(Masutomi K. et al. J. Biol. Chem. 2000によって提唱されている)は再現不可能である(Wu C.K. et al. Protein Expr. Purif. 2007)。さらに、親和性タグによる活性なｈＴＥＲＴの精製は効率が悪く、Ｈｉｓ−ｈＴＥＲＴ融合物が発現されたが、Ｈｉｓタグを用いた精製の成功は報告されていない(Bachand F. et al, JBC 1999および Wenz et al. EMBO 2001)。精製に代わる手段としての昆虫細胞による分泌ｈＴＥＲＴは、その酵素が小胞体に結合したままであるため成功していない(Wu et al, Protein Expr. Purif. 2007)。最後に、グルタチオンセファロースまたはヘパリンセファロースを用いて精製されたｈＴＥＲＴは、カラム精製後にそのテロメラーゼ再構成能力が失われたと報告されている(Bachand F et al, JBC 1999およびMizuno H. et al, J. Biochem., 2007)。従って、組換えテロメラーゼを調製するためのタグ付けされたｈＴＥＲＴタンパク質を容易に産生することはできないと思われる。全てのこれらの試みの失敗から、ヒトのテロメラーゼは「精製が困難であり、かつ大量に調製することができない」と結論づけられた(Alves D. et al, Nat. Chem. Biol. 2008)。
【発明の概要】
【０００９】
しかし、本発明者らは、例えばピキア・パストリス（学名：Pichia pastoris）細胞などの酵母細胞においてｈＴＥＲＴを発現させることにより、大量の可溶かつ活性なｈＴＥＲＴを再現性良く産生することが実際に可能であることを本明細書に示す。以下に詳述するように、精製プロセスの特定のパラメータを制御することにより高収率の活性な組換えｈＴＥＲＴをさらに得ることができる。このようにして得られたｈＴＥＲＴタンパク質は、生体外で転写されたｈＴＲによりテロメラーゼ活性を示し、これはテロメラーゼ構築阻害剤のハイスループット化学スクリーニングおよび治療適用への道を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＧＡＰＺベクターを用いてｈＴＥＲＴを発現させることができるが、特定のＭＢＰタグを使用しない限り精製することができない。
【図１Ａ】ＰＧＡＰＺベクターを用いてＧＳＴ−ｈＴＥＲＴ（１５５ｋＤａ）を細胞内で発現させる。抗ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、野生型ピキア・パストリスからの細胞抽出物（レーン１）またはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア・パストリス細胞からの細胞抽出物（レーン２）に対してウエスタンブロットを行った。
【図１Ｂ】ゼオシン耐性クローンはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現する。抗ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、野生型ピキア・パストリスからの細胞抽出物（レーン１）またはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現するように形質転換された異なるピキア・パストリスクローンの細胞抽出物（レーン２〜７）に対してウエスタンブロットを行った。
【図１Ｃ】ＧＳＴ−ｈＴＥＲＴはグルタチオンセファロースとの低い親和性を示す（レーン１：流出、レーン２：結合された画分）。
【図１Ｄ】α−ｈＴＥＲＴを分泌させることができない。野生型ピキア・パストリス細胞（レーン１、３）または、出芽酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（学名：Saccharomyces cerevisiae）α因子の分泌シグナルに融合されたｈＴＥＲＴに対応するα−ｈＴＥＲＴ形質転換酵母（レーン２、４）の細胞内画分（レーン１〜２）または細胞外画分（レーン３〜４）に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｅ】異なるタグを含むｈＴＥＲＴ発現レベルの比較。α−ｈＴＥＲＴ（レーン１）、ＧＳＴ−ｈＴＥＲＴ（レーン２）およびタグ無しｈＴＥＲＴ（レーン３、１２７ｋＤａ）で形質転換されたピキア・パストリス細胞に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロットにより、酵母の可溶な細胞内内容物を分析した。
【図１Ｆ】ピキア・パストリス細胞においてＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを低レベルで発現させる。ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ（レーン１および２）、ｈＴＥＲＴ（レーン３）およびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ（レーン４）で形質転換されたピキア・パストリス細胞の細胞抽出物に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｇ】ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質はメタノールを用いた発現系では検出されない。ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター）の制御下でＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア細胞（レーン１）またはα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア細胞（レーン２）に対する抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｈ】ｈＴＥＲＴのＮ末端部分はアクセス可能である。Ｈｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア・パストリス細胞の全細胞溶解物からのＨｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴの免疫沈降後の抗ＨＡタグ抗体を用いたウエスタンブロット（レーン３）。対照：Ｈｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴを発現している酵母からの全細胞溶解物（レーン１）およびＡ＋Ｇビーズのみを用いた免疫沈降（レーン２）。
【図１Ｉ】低い細胞内ｐＨによりタンパク質分解が生じる。本発明の条件（細胞内ｐＨ６．３）でｈＴＥＲＴを精製した場合、分解されず（レーン１）、細胞内ｐＨが５．５である場合、顕著に分解される（レーン２）。
【図１Ｊ】プロテアーゼ阻害剤および界面活性剤は必要ではない。標準的な精製を行い（レーン１）、抽出および洗浄溶液中にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）および１％ｔｒｉｔｏｎを添加して行った精製と比較し（レーン２）、これにより収率は増加せず、非常に僅かにのみ純度が向上した。
【図１Ｋ】弱酸性／中性のｐＨで最良の精製が生じる。カラム結合前に抽出物のｐＨを異なるｐＨに調整し、次いで各条件に対応するｐＨを用いて洗浄工程を行った。
【図２】ピキア・パストリスにおけるｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの精製。
【図２Ａ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの精製および切断。アミロースセファロースを用いてｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを精製した。ウエスタンブロット（左）およびクマシーブリリアントブルー染色（右）の両方によって、精製済タンパク質を監視した。レーン１：細胞抽出物、レーン２：アミロースビーズから溶出したｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ、およびレーン３：ＴＥＶプロテアーゼによるＭＢＰタグ切断後のタンパク質。
【図２Ｂ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ純度およびＭＢＰタグ除去効率。レーン１：アミロースカラムからの溶出後のｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン２：過剰なＨｉｓ−ＴＥＶプロテアーゼにより室温で１時間切断されたｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン３：ニッケルカラム再結合によりＴＥＶプロテアーゼを除去し、試料を再濃縮して、純度レベルおよびＴＥＶプロテアーゼによる切断効率をより正確に評価した。
【図３】テロメラーゼ活性の再構成。５００ｎｇの生体外で転写されたｈＴＲを１００ｎｇの精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴに添加してテロメラーゼ活性を再構成し、いくつかの方法で検出した。
【図３Ａ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲ（レーン１）、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴのみ（レーン２）またはｈＴＲのみ（レーン３）を用いたテロメラーゼ直接アッセイ。
【図３Ｂ】ｑＴＲＡＰ。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いたテロメラーゼ活性の定量的測定により、再構成された活性が１つの２９３Ｔ細胞で認められたもの（３）よりも約９０００倍高い（１、２）ことが分かった。
【図３Ｃ】ｈＴＲのみ（レーン１）、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ｈＴＲ（レーン２）、およびＭＢＰ−ｈＴＥＲＴのみ（レーン３）を用いたＴＲＡＰ（テロメア反復配列の増幅手順）。
【図３Ｄ】ｑＴＲＡＰによって測定したテロメラーゼ再構成の速度。
【図４】ｈＴＥＲＴと内因性酵母ＲＮＡとの結合。
【図４Ａ】アガロースゲル泳動によって示されるように、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてｈＴＥＲＴタンパク質を精製した。
【図４Ｂ】レーンＬ：１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）。レーン３：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン４：プロテイナーゼＫで消化したｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン５：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン６：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋デオキシリボヌクレアーゼＩ。レーン７：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋リボヌクレアーゼＡ。レーン８：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋リボヌクレアーゼＴ１。レーン８：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ミクロコッカス・ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）。レーン９：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ベンゾナーゼ。
【図５】電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）。５０μＣｉの［α−３２Ｐ］−ＣＴＰを添加してｈＴＲを生体外で合成した。各レーンに対して、１μｇのｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを０．５μｇの標識されたｈＴＲと共に２０μｌ中で１時間インキュベートした。１×ＴＢＥ中に１．２％の冷蔵したアガロースゲル上で複合体を１１０Ｖで２時間泳動させた。このゲルを１０％酢酸および１０％エタノールで１時間固定し、乾燥し、ホスホイメージャースクリーンに露光した。ＳＴＯＲＭ８６０(GE Healthcare社)を使用してスキャンを行った。レーン１はｈＴＲのみを含んでいる。レーン２および３はリボヌクレアーゼＡで精製したｈＴＲおよびｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを含んでいる。レーン４および５はリボヌクレアーゼＡで精製していないｈＴＲおよびｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを含んでいる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
テロメラーゼのｈＴＥＲＴサブユニットの発現の成功は、例えば昆虫細胞(Masutomi K. et al. J. Biol. Chem. 2000、Wenz C. et al. EMBO 2001、Mikuni O. et al. BBRC 2002およびWu C.K. et al, Protein Expr. Purif. 2007)または酵母細胞(Bachand F. et al, JBC 1999)において報告されている。しかし、これらの方法は全て、これらの操作コストに著しく影響を与えるプロテアーゼ阻害剤の使用を必要とする。従って、これらの方法は大量のｈＴＥＲＴ酵素を得るのには適していない。
【００１２】
本発明は、低コストで再現性良く多量の可溶かつ活性なＴＥＲＴを産生する方法に関する。本発明の方法は、酵母細胞に導入される組換えベクター（例えば、組み込みプラスミド）の使用を必要とする。プロテアーゼ阻害剤を必要とすることなく細胞溶解およびＴＥＲＴ精製を行うことが重要である。純水により最良の結果が得られることが分かったため、市販の溶解緩衝液の使用も推奨されない。従って、従来の施設を有する研究所において低コストで本発明の方法を行うことができる。
【００１３】
本発明者らは、酵母系において正確に折り畳まれたｈＴＥＲＴを発現させ、かつ厳重に規制された精製プロセスによりこの酵素を再現可能かつ大量に回収することについて開示する。重要なことに、先行技術で開示されている手順とは対照的に、本発現および精製プロセスでは精製後に酵素的に活性なｈＴＥＲＴを回収することができる。さらに、本発明の方法によって回収される酵素は可溶であり、かつヒトのテロメラーゼ構築および／または活性の強力かつ特異的な阻害剤を同定するためのスクリーニング方法で効率的に使用することができる。
【００１４】
本発明者らは、本発現および精製プロセスの各工程にとって最良の条件を同定するために数多くの実験条件を試験および比較した。その結果、非常に難しいと考えられていたテロメラーゼのＴＥＲＴサブユニットを生体外で産生するための最適化された再現可能な方法をそれらにより同定した。
【００１５】
この方法を使用してヒトのｈＴＥＲＴと相同なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、例えば他の生物種（出芽酵母、分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ）（学名：Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（学名：Kluyveromyces lactis）、ピキア・パストリス、テトラヒメナ・サーモフィラ（学名：Tetrahymena thermophila）、ゼブラフィッシュ（学名：Danio rerio）、トラフグ（学名：Takifugu rubripes）、メダカ（学名：Oryzias latipes）、ハツカネズミ（学名：Mus musculus）など）由来のテロメラーゼ逆転写酵素を産生することができる。従って、本発明の方法によってヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）および非ヒトＴＥＲＴを産生することができる。
【００１６】
より詳細には、本発明の方法は、以下の少なくとも４つの別個の工程：
ａ）適当なタグでタグ付けされたＴＥＲＴタンパク質をコードするヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を用意する工程、
ｂ）酵母細胞によって組換えＴＥＲＴタンパク質が細胞内で産生されるように、特定の条件で前記細胞を増殖させる工程、
ｃ）特定の条件で前記酵母細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程、
ｄ）適当な親和性精製手順によりＴＥＲＴタンパク質を精製する工程、
を含む。
【００１７】
さらにより詳細には、前記適当なタグは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のそのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したタグ（ｃＭＢＰ）である。事実、本発明者らは、ＴＥＲＴを前記タグに結合させると酵母から大量の活性なＴＥＲＴを回収できること、およびｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質の発現は有利なことに酵母において機能する構成的プロモーター（例えばＧＡＰＤＨプロモーター）に機能的に連結させると向上することを示した。
【００１８】
本発明者ら、定常期に到達するまでｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ発現酵母細胞の増殖を正確に監視しなければならないこと、および酵母細胞が培養される培地が最も重要であることも実証した。
【００１９】
有利なことにどんなプロテアーゼ阻害剤も含有していない冷たい純水中で機械的剪断を行うことができるため、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の抽出のために複雑な溶解緩衝液は必要ではない。次いで、ｐＨが好ましくは６．０〜７．５、より好ましくは６．３〜７．０の範囲内の結合および洗浄緩衝液を使用して精製工程を行う。ｐＨが７．６未満の結合および洗浄緩衝液の使用により、精製済ｈＴＥＲＴの収率および比活性度を高めることができる。
【００２０】
これらの実験条件を再現することにより、当業者であれば、低コストで多量のｈＴＥＲＴ酵素を活性型で産生することができるであろう。典型的には、振盪フラスコ内で増殖させた酵母細胞１リットル当たり０．３ｍｇの活性かつ可溶なｈＴＥＲＴ酵素を回収することができる。
【００２１】
第１の態様では、本発明は、
ａ）ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグ（ｃＭＢＰ）、および
・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質
を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
ｂ）工程ａ）の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
ｃ）必要であれば、前記抽出物のｐＨを６．０〜７．５の範囲内のｐＨに調整する工程と、
ｄ）アミロース結合固体担体により融合タンパク質ｃＭＢＰ−ＴＥＲＴを精製する工程と、
を含む、可溶かつ活性なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質の産生方法に関する。
【００２２】
本発明の方法を使用して、ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）ならびにヒトのｈＴＥＲＴと相同な他の動物種由来のＴＥＲＴ酵素を産生することができる。
【００２３】
これらの非ヒトＴＥＲＴタンパク質は、以下：
・出芽酵母のＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０６１６３）、
・分裂酵母のＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１３３３９）、
・クルイベロミセス・ラクチスのＴＥＲＴ（ジェンバンク：ＣＡＨ０１８７０．１）、
・ピキア・パストリスのＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｆ２ＱＴ８０）、
・テトラヒメナ・サーモフィラのＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ７７４４８）、
・トラフグのＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ４ＫＴＡ７）、
・メダカのＴＥＲＴ（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１０９８２８６．１）、
・ハツカネズミのＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ７０３７２）、
・ドブネズミ（学名：Rattus Norvegicus）のＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６７３Ｌ６）、
・ゼブラフィッシュのＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ２ＴＨＥ９）、
・ハイイロオオカミ（学名：Canis lupus）のＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６Ａ５４８）、
・あるいは、当該技術分野において記載されているあらゆるＴＥＲＴタンパク質、例えば、ＮＣＢＩウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ＋ｒｅｖｅｒｓｅ＋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ上のタンパク質、
・ＥＮＳＥＭＢＬゲノムサーバ：ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｌｔｉ／Ｓｅａｒｃｈ／Ｒｅｓｕｌｔｓ？ｑ＝ＴＥＲＴ；ｆａｃｅｔ＿ｆｅａｔｕｒｅ＿ｔｙｐｅ＝Ｇｅｎｅ上のタンパク質、
・またはＵｎｉｐｒｏｔ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｔｅｒｔ＆ｓｏｒｔ＝ｓｃｏｒｅによって参照されるタンパク質、
からなる群から選択してもよい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、
ａ）ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
・そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグ（ｃＭＢＰ）、および
・ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質
を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
ｂ）工程ａ）の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
ｃ）必要であれば、前記抽出物のｐＨを６．０〜７．５の範囲内のｐＨに調整する工程と、
ｄ）アミロース結合固体担体により融合タンパク質ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを精製する工程と、
を含む、可溶かつ活性なヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質の産生方法に関する。
【００２５】
好ましくは、工程ａ）の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程を、酵母細胞の細胞内ｐＨが５．８未満の値に到達する前、より好ましくは酵母細胞の細胞内ｐＨが６．３未満の値に到達する前に行う。
【００２６】
好ましくは、工程ｃ）では、前記抽出物のｐＨを６．３〜７．０の範囲内のｐＨに調整する。前記粗製タンパク質抽出物が工程ｂ）の後に６．３〜７．０の範囲内のｐＨを有する場合には、この工程は不要である。
【００２７】
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴまたはヒトにおけるｈＴＥＲＴと略す）は、テロメラーゼ酵素の触媒サブユニットである。このサブユニットは、テロメラーゼＲＮＡ成分（ｈＴＲ）と共に、テロメラーゼ複合体の最も重要な成分である(Weinrich SL. et al, Nat. Genet. 1997)。具体的には、ｈＴＥＲＴは、染色体テロメアのそれぞれの端部へのＴＴＡＧＧＧ配列（配列番号５）の付加を触媒することに関与している。ＤＮＡの反復配列のこの付加により、複数回の複製周期後の染色体末端部の分解が防止される(Poole JC et al, Gene 2001)。ｈＴＥＲＴは、例えば配列番号１（イソ型１、ジェンバンク受入番号：ＮＰ＿９３７９８３．２）を有する。この酵素は逆転写酵素（ＲＴ）活性を示すＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、すなわちＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる。
【００２８】
本明細書中の「ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質」という用語は、配列番号１のｈＴＥＲＴタンパク質ならびにその変異体を指す。本発明の文脈における「ｈＴＥＲＴ変異体」は、配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を共有し、かつ配列番号１の酵素と同じテロメラーゼ触媒活性を有するものとして定義される。
【００２９】
通常は、ｈＴＥＲＴ変異体は、１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、好ましくは１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量を有する。それらはアミノ酸残基の内部欠失、挿入または保存的置換により、配列番号１のｈＴＥＲＴタンパク質とは異なり得る。そのような変異は、天然のスプライシング変異体において認められるものに対応し得る。好ましい変異体の例は欧州特許第０８４１３９６号に開示されている。触媒活性のｈＴＥＲＴタンパク質変異体の他の例は、文献に提供されている。テロメラーゼ活性にとって必要ではないリンカー領域Ｌ１およびＬ２が欠損している突然変異体については、Armbruster et al , Mol. Cell. Biol. 2001に記載されている。また、Banik SSR et al(Mol. Cell. Biol. 2002)は、ｈＴＥＲＴの触媒活性に影響を与えることなく置換を許容する領域Ｅ−Ｉ〜Ｅ−ＩＶ間に突然変異を示す突然変異体について記載している。
【００３０】
「配列同一性」という用語は、アミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す。本発明の文脈では、２つのアミノ酸配列は、それらのアミノ酸の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が同一であれば、それぞれ少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。アミノポリペプチド配列の同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアルゴリズム(J.Mol.Biol. 1970)を用いて同定することが好ましい。
【００３１】
本明細書で使用されるｈＴＥＲＴタンパク質変異体は、前記ｈＴＥＲＴタンパク質変異体が配列番号１の酵素と同じ逆転写酵素活性を有している場合、配列番号１のｈＴＥＲＴタンパク質と「同じテロメラーゼ触媒活性」を有する。より詳細には、これらの変異体は、配列番号１の酵素と同程度に多くの反復配列ＴＴＡＧＧＧ（配列番号５）を付加することによりＤＮＡプライマーまたは染色体テロメアを伸長させることができるものでなければならない。逆転写酵素活性の測定方法は当該技術分野でよく知られている。それらのうちのいくつかは以下に開示されている。
【００３２】
好ましくは、「ｈＴＥＲＴタンパク質」という用語は本出願で使用される場合、配列番号１のｈＴＥＲＴタンパク質そのものを指す。
【００３３】
本発明の方法で使用されるヌクレオチドベクターは、ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。当然のことながら、遺伝暗号の変性の結果として、前記ヌクレオチド配列は天然に生じるｈＴＥＲＴ遺伝子の配列（ＮＭ＿１９８２５３．２、配列番号２）を有する必要はない。事実、多数のポリヌクレオチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するｈＴＥＲＴタンパク質またはその変異体をコードする。ｈＴＥＲＴタンパク質またはその変異体をコードするヌクレオチドをクローニングするための試薬および方法は、例えば欧州特許第０８４１３９６号に開示されている。特に、酵母発現のために最適化されているｈＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を使用すると有利である。
【００３４】
本明細書で使用される、「ヌクレオチドベクター」という用語は、外来遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。ヌクレオチドベクターとしては、例えばプラスミド、ファージおよびウイルスが挙げられる。酵母では、３種類のベクター、すなわち組み込みベクタープラスミド（ＹＩｐ）、エピソームプラスミド（ＹＥｐ）およびセントロメアプラスミド（ＹＣｐ）を使用することができる。酵母における発現に適したベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＰＧＡＰＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびｐＴＥＦ−ＭＦ（Dualsystems Biotech Product社）、ｐＫＬＡＣ２（New England Biolabs社）が挙げられる。好ましくは、本発明のヌクレオチドベクターは組み込みプラスミド、すなわち生存および複製のために宿主染色体への組み込みに依存するプラスミドである。より好ましくは、このヌクレオチドベクターは組み込みプラスミドＰＧＡＰＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。
【００３５】
ＲＮＡまたは酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現されると前記ＲＮＡまたは前記酵素の産生を生じるヌクレオチド配列である。
【００３６】
本発明のベクターでは、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、構成的プロモーターに機能的に連結されている。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが前記コード配列をＲＮＡに転写し、次いでこれをタンパク質に翻訳する際にその発現を制御するプロモーター配列「に機能的に連結」されている。
【００３７】
「プロモーター」は、そこから（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖の３’方向に）転写を開始することができるヌクレオチド配列である。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより好都合に見つけられる）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。プロモーターは構成的であってもよく（すなわち、それらは酵母細胞での全ての状況において活性であり、その機能的に結合された遺伝子の連続転写を可能にする）、あるいは誘導性であってもよい（すなわち、それらの活性は、規定の生物的もしくは非生物的因子の存在または不存在によって誘導される）。
【００３８】
本発明の方法で使用することができる酵母細胞は、好ましくは、出芽酵母、分裂酵母、クルイベロミセス・ラクチスおよびハンゼヌラポリモルファならびにピキア・パストリスおよびピキア・メタノリカのようなメチロトローフ酵母からなる群から選択される。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される酵母細胞はピキア・パストリス細胞である。
【００３９】
好ましくは本発明の遺伝子の発現を制御するために使用されるプロモーターは、酵母細胞において構成的に機能するプロモーターである。いくつかの構成的酵母プロモーターは、酵母宿主細胞においてタンパク質発現のために利用可能である。これらとしては、例えば、ｐＣＹＣプロモーター、ｐＡｄｈプロモーター、ｐＳｔｅ５プロモーター、酵母ＡＤＨ１プロモーター、ｃｙｃ１００最小プロモーター、ｃｙｃ７０最小プロモーター、ｃｙｃ４３最小プロモーター、ｃｙｃ２８最小プロモーター、ｃｙｃ１６最小プロモーター、ｐＰＧＫ１プロモーター、ＣＬＢ１プロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）プロモーターが挙げられる（これらのプロモーターの配列は、例えばｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｙｅａｓｔ／Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅに開示されている）。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドベクターは、ＧＡＰＤＨプロモーターを含む。このプロモーターは実際には、ピキア・パストリス酵母細胞において構成的に機能する。より好ましい実施形態では、前記ＧＡＰＤＨプロモーターは配列番号１０を有する。
【００４１】
本発明のヌクレオチドベクターは、そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグをコードするヌクレオチド配列も必然的に含む。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、マルトデキストリンの取り込みおよび効率的な異化作用に関与する大腸菌のマルトース／マルトデキストリン系の一部である。それは多くのタンパク質が関わる複雑な輸送系である。そのＮ末端部分は、「ペリプラズムシグナルペプチド」（配列番号７）とも呼ばれるペリプラズム標的シグナルを含む。このシグナルペプチドは、ＭＢＰタンパク質の細菌細胞のペリプラズムへの搬出に関与している。
【００４２】
完全長ＭＢＰタグ（配列番号６）との融合を使用して、大腸菌において発現される組換えタンパク質の溶解性を増加させることが多い。また、組換えタンパク質の精製のための親和性タグとしてＭＢＰを使用することができる。典型的には、ＭＢＰを含む融合タンパク質は、全ての他のタンパク質がアミロースカラムを流れている間にそこに結合する。カラムをマルトースで溶出することにより、これらの融合タンパク質を精製することができる。本発明では、ＭＢＰをｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴの精製を促進するためのタグとして使用する。
【００４３】
過去の報告(Wu et al, Protein Expr. Purif. 2007)に反して、本発明者らは、ｈＴＥＲＴタンパク質の細胞外搬出を低減することによりｈＴＥＲＴ精製収率が高まることを示した。これは、融合タンパク質ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ中のＭＢＰのＮ末端ペリプラズム標的シグナルを除去することにより達成される。そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したＭＢＰタグを以下「ｃＭＢＰ」と呼ぶ。ｃＭＢＰは配列番号８を有することが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドベクターは、ｈＴＥＲＴタンパク質が細胞内に残存するように、酵母において機能する分泌シグナルを含んでいない。
【００４５】
従って、好ましい実施形態では、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質は、配列番号８のマルトース結合タンパク質タグ（そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグに対応する）でタグ付けされている。このｃＭＢＰタグは、例えばヌクレオチド配列番号９によってコードされる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ｃＭＢＰタグをコードするヌクレオチド配列の５’に位置している。本発明の別の実施形態では、ｈＴＥＲＴタンパク質またはＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ｃＭＢＰタグをコードするヌクレオチド配列の３’に位置している。従って、本発明の融合タンパク質では、ｃＭＢＰタグは、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素のＣ末端またはＮ末端に位置していていもよい。ｃＭＢＰタグは、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素のＮ末端に位置していることが好ましい。
【００４７】
本発明の融合タンパク質は、ｃＭＢＰタグに直接または間接的に連結されたｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素を含む。この２つのポリペプチドは、それらの間の立体障害を低減するスペーシング配列（すなわち「スペーサー」）によって特に分離されていてもよい。従って、好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ｃＭＢＰタグとｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質との間に位置するスペーサーを含んでいてもよい。従って、本実施形態では、本発明のヌクレオチドベクターは、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴおよびｃＭＢＰをコードするヌクレオチド配列間にスペーサーをコードするヌクレオチド配列を含む。このスペーサーは、例えば配列番号１２または配列番号１３を有する。
【００４８】
融合タンパク質ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴが精製された形態で得られたら、対象のタンパク質ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴをｃＭＢＰタグから分離すると有利であり得る。本発明の融合タンパク質がｃＭＢＰタグとｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質との間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む場合、特異的プロテアーゼによりこの分離を達成することができる。
【００４９】
有利なことに、本発明のヌクレオチドベクターは、公知のプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。このヌクレオチド配列は、マルトース結合タンパク質タグをコードする配列とｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質をコードする配列との間に位置することが好ましい。
【００５０】
プロテアーゼ切断部位は当該技術分野でよく知られている。それらは、少なくとも１種のプロテアーゼ酵素（例えば、特にセリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼ）によって認識されるアミノ酸配列である。ペプチド切断部位の例は配列番号１６（Asp Asp Asp Asp Lys/Asp）のエンテロキナーゼ切断部位である。エンテロキナーゼは、配列のＣ末端における切断により不活性なトリプシノーゲンを活性なトリプシンに、すなわちＶａｌ−−（Ａｓｐ）４−−Ｌｙｓ−−Ｉｌｅ−−Ｖａｌ〜（トリプシノーゲン）をＶａｌ−−（Ａｓｐ）４−−Ｌｙｓ（ヘキサペプチド）＋Ｉｌｅ−−Ｖａｌ〜（トリプシン）に変換することが知られているセリンプロテアーゼ酵素（ＥＣ３．４．２１．９）である。エンテロキナーゼは、Ｌｙｓの前に４つのＡｓｐがあり、かつプロリン残基がその後ろにない場合にリジンの後ろを切断する。別の有用なプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列番号１４または配列番号１５（Glu Asn Leu Tyr Phe Gln GlyまたはSer）を有する、いわゆる「ＴＥＶプロテアーゼ」切断部位である。ＴＥＶプロテアーゼは、核内封入体（タバコエッチウイルスによってコードされるタンパク質）の２７ｋＤａの触媒ドメインの一般的な名前である。これは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、マルトース結合タンパク質タグをコードする配列とｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質をコードする配列との間に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位（配列番号１４または配列番号１５）をコードする配列を含む。
【００５２】
本明細書で使用される「ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ」または「ｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ」という用語は、「本発明の融合タンパク質」という表現と同義で使用される。それらは、全てのそれらの可能な空間的定位におけるｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴポリペプチド配列またはその変異体と、そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質タグとを含む融合タンパク質（ｈＴＥＲＴ−ｃＭＢＰまたはｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ）を指し、この融合タンパク質の２つの部分は、スペーサーおよび／またはプロテアーゼ切断部位によって任意に分離されている。
【００５３】
より好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるヌクレオチドベクターは、融合タンパク質ｃＭＢＰ−ＴＥＶ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたＧＡＰＤＨプロモーターなどの酵母において機能する構成的プロモーターを含む。
【００５４】
特定の実施形態では、ヌクレオチドベクターは、融合タンパク質ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＶ−ｈＴＥＲＴ（配列番号１７）（あるいはｈＴＥＲＴ−ｃＭＢＰまたはｈＴＥＲＴ−ＴＥＶ−ｃＭＢＰ）をコードするヌクレオチド配列に機能的に結合されたＧＡＰＤＨプロモーターを含む組み込みプラスミドＰＧＡＰＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。このベクターは配列番号１８を有する。
【００５５】
本発明の発現ベクターを、当該技術分野で知られている任意の方法によって本発明の酵母細胞に導入してもよい。好ましくは、前記ベクターは酵母細胞に形質転換されている。いくつかの形質転換方法が当業者に知られている。それらとしては、酢酸リチウムを用いた形質転換法、スフェロプラスト法、電気穿孔法などが挙げられる。
【００５６】
本明細書中の「形質転換」という用語は、酵母宿主細胞が、導入された核酸によってコードされたタンパク質を発現するような、規定のタンパク質をコードする異種核酸の前記細胞への導入を意味する。導入された核酸を受け取って発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００５７】
その後、融合タンパク質の発現が可能になるように、形質転換された酵母細胞を増殖させる。酵母細胞の増殖のために従来通りに使用される培地が本明細書では推奨される。当業者は、広範に記載されているこれらの培地についてよく知っている。
【００５８】
好ましい実施形態では、発現実験のために使用される形質転換された酵母細胞を、アガロースペトリ皿（例えば、１．５％寒天、１％酵母抽出物、２％ペプトン、硫酸アンモニウムを含む０．２％酵母窒素原基礎培地、２％デキストロースを含む）上で予め増殖させておく。より好ましくは、この前培養工程を１〜２日間継続する。興味深いことに、この前培養工程は、精製された酵素の比活性および安定性を高め、かつ夾雑ＲＮＡレベルの低下も引き起こす。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、形質転換された酵母細胞を少なくとも０．５％、より好ましくは１％、さらにより好ましくは少なくとも２％の酵母抽出物を含む栄養培地で増殖させる。前記栄養培地は、炭素源（グルコースなど）および塩（ＮａＨＰＯ４など）も含んでいてもよい。グルコースは約２〜８％、好ましくは４％の量で前記栄養培地中に存在してもよい。ＮａＨＰＯ４は、約１０〜３００ｍＭ、好ましくは約５０〜２００ｍＭ、より好ましくは１００ｍＭの量で前記栄養培地中に存在してもよい。栄養培地の最初のｐＨは好ましくは６．０〜７．０の範囲内である。さらに、酵母細胞は、１５℃〜３５℃、好ましくは２７℃〜３０℃の範囲内の温度で増殖させることが好ましい。
【００６０】
これらの条件で形質転換された酵母細胞を増殖させることにより、それらの細胞内ｐＨはゆっくりと低下する。さらに、重要なことに、機械的剪断後に測定される酵母細胞の細胞内ｐＨを５．８未満、好ましくは６．３未満の値に低下させてはいけない。言い換えると、それらの細胞内ｐＨが約５．８以上、好ましくは約６．３以上である間は酵母細胞を栄養培地で増殖させる。細胞内ｐＨの測定方法は当該技術分野でよく知られている（概説についてはLoiselle FB and Casey JR, Methods Mol. Biol. 2010を参照）。例えば、酵母細胞を低温（典型的には４℃）の冷水に溶解させ、かつｐＨメータで上澄みのｐＨを測定することにより、細胞内ｐＨを測定することができる。
【００６１】
なお、この臨界ｐＨ値は指数増殖の終了後すぐに、すなわち定常増殖期の開始時に到達する。実際には、６．３／５．８の臨界細胞内ｐＨ値（細胞溶解後に測定）は、酵母含有培養物の６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学濃度が１１〜１６、好ましくは１２〜１５（例えばエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）分光光度計で測定した場合）の範囲内である場合に到達することが本発明者らによって観察された。
【００６２】
細胞増殖中に、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質は発現され、分泌することなく酵母細胞内に蓄積する。細胞内に蓄積されたｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質を放出させるために酵母細胞を溶解すると有利である。この溶解工程ｂ）は、形質転換された細胞の細胞内ｐＨが５．８、好ましくは６．３に到達する前に行わなければならない。特定の実施形態では、形質転換された細胞の細胞内ｐＨが６．３に到達したらすぐに、この溶解工程ｂ）を行わなければならない。
【００６３】
好ましい実施形態では、工程ｂ）において酵母細胞を水性溶液中に溶解する。より好ましい実施形態では、前記水性溶液は塩および界面活性剤を含まない。さらにより好ましい実施形態では、前記水性溶液は純水である。特に好ましい実施形態では、前記水性溶液はどんなプロテアーゼ阻害剤も含有していない。本発明者らは、驚くべきことに、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質は最適化された培養条件ではタンパク質分解に対して敏感ではなく、かつプロテアーゼ阻害剤は必要ではないことを実際に観察した。これにより、本発明のプロセスは先行技術の精製手順よりも高価にならない。
【００６４】
溶解工程ｂ）を、好ましくは低温、すなわち０℃〜１０℃の範囲内の温度（典型的には４℃）で達成する。
【００６５】
好ましい実施形態では、任意の従来の手段によって細胞溶解を行う。例えば、加圧型細胞破砕装置などの任意の物理的手段を用いて酵母細胞壁を機械的に破壊することが好ましい。あるいは、専用のガラスビーズを酵母細胞を含む水性溶解溶液に添加してもよく、その後に前記混合物を例えば５〜１５分間、好ましくは１０分間激しくボルテックスで撹拌する。適当な速度（例えば、３０００ｇ／１０分間、次いで必要に応じて１００００ｇ／１５分間）で混合物を遠心分離することにより、細胞画分（細胞残屑および大きな細胞小器官など）およびガラスビーズを破棄できると有利である。細胞溶解および遠心分離を低温、すなわち０℃〜１０℃の範囲内の温度（典型的には４℃）で達成しなければならない。
【００６６】
ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質を含有する粗製タンパク質抽出物は、酵母細胞を含有する水性溶液の低温での遠心分離によって得ることができる。本明細書中の「粗製タンパク質抽出物」は、細胞内タンパク質、例えば融合タンパク質ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴを含み、かつ細胞壁の画分または残屑および大きな細胞小器官をほとんど含まない溶液画分に対応する。
【００６７】
当業者は、対象のｈＴＥＲＴタンパク質の量または活性を変えることなく細胞画分（細胞残屑および大きな細胞小器官など）の全てを効率的に除去するために使用することができる適当な遠心分離条件を十分に心得ている。遠心分離速度は典型的に、３，０００ｇ〜２０，０００ｇの範囲内である。可溶なタンパク質などの非圧縮粒子は、大部分が「上澄み」と呼ばれる液体中に残留し、それを別の管に移すことによりタンパク質を細胞画分から分離することができる。次いで、この上澄みをさらなる精製工程のために使用する。
【００６８】
本発明の方法は、６．０〜７．５の範囲内のｐＨ、好ましくは６．３〜７．０の範囲内のｐＨに到達させるために、溶解した細胞を含有する水性溶液のｐＨを上昇させる工程（工程ｃ）をさらに必要とする場合もある。このｐＨの上昇は、好ましくは工程ｂ）の後に得られた粗製タンパク質抽出物において達成される。但し、細胞画分を除去する前にｐＨを上昇させることもできる。前記粗製タンパク質抽出物が６．０〜７．５、より好ましくは６．３〜７．０の範囲内のｐＨを既に有している場合には、この工程は不要である。
【００６９】
本発明者らは、ｈＴＥＲＴ含有試料のｐＨをこの範囲内に維持することで、精製プロセスの終了時に多量の活性なｈＴＥＲＴタンパク質の回収が支援されることを実際に観察した。任意の塩基性緩衝液を使用してこのｐＨの上昇を達成してもよい。タンパク質抽出方法で通常利用される緩衝液としては、例えばトリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。
【００７０】
親和性精製により、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質を容易に精製することができる。好ましくは、この工程で使用される緩衝液は、６．０〜７．５の範囲内のｐＨ、より好ましくは６．３〜７．０の範囲内のｐＨを有する（図１Ｋ）。
【００７１】
リボヌクレアーゼＡ（例えば、１ｍＬの抽出物当たり１０μｇのＦｅｒｍｅｎｔａｓ社製ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ）などのリボヌクレアーゼをこの工程で任意に添加して夾雑ＲＮＡのレベルを低下させていもよい。但し、内因性酵母ＲＮＡによりｈＴＥＲＴの安定性および溶解性を高めた場合（実施例２．８および図５を参照）、放出されたＲＮＡを分解するがＲＮＰ中のｈＴＥＲＴと堅く結合された酵母ＲＮＡを除去しないという理由から、ベンゾナーゼおよびミクロコッカス・ヌクレアーゼ（Ｍｎａｓｅ）が好ましい（図４Ｂを参照）。
【００７２】
親和性精製では、固体担体に固定化されたリガンドとの結合相互作用の差に基づいて粗製タンパク質抽出物に含まれるｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴタンパク質の分離を行う。前記リガンドは固体担体に共有結合されているが、融合タンパク質には非共有結合的に結合されている。従って、融合タンパク質を当該技術分野でよく知られている特異的溶出条件において固体担体から溶出させてもよい。
【００７３】
好ましくは、本発明では固体担体に共有結合されるリガンドは、ＭＢＰおよびｃＭＢＰに非共有結合させることができるアミロースである。アミロースは、Ｄ−グルコース単位を含む直鎖状ポリマーである。これは、ＭＢＰでタグ付けされた融合タンパク質を精製するために一般に使用されている（ｐＭＡＬ（商標）タンパク質融合＆精製システム、New England Biolabs社）。
【００７４】
本発明の方法の精製工程で使用される固体担体は、アミロースを共有結合させることができる任意の材料である。有用な固体担体は、高い表面積：体積の比、リガンドの共有結合のために容易に修飾される化学基、最小の非特異的結合特性、良好な流動特性および機械的／化学的安定性を有するものである。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される固体担体は、親和性マトリックスおよびビーズからなる群から選択される。典型的には、それらはアガロース、セファロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックスおよびガラスで作られている。また、多孔性担体（例えば、糖もしくはアクリルアミド系ポリマー樹脂またはゲル）および磁気担体（例えば磁気ビーズ）を使用してもよい。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の方法の精製工程ｄ）は、アミロース結合アガロースビーズを使用する。アミロース結合アガロースビーズは、例えばNew England Biolabs社（ＮＥＢ）によって市販されている。
【００７６】
次いで、前記抽出物中に存在するｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴタンパク質が固体担体に非共有結合された状態になるように、粗製タンパク質抽出物をリガンド結合固体担体と接触させる。当業者は、この結合を促進する実験条件をよく知っている。典型的には、接触を３０分間、好ましくは１時間続けてもよい。この工程は低温で行うことが好ましい。
【００７７】
次いで、固体担体を適当な洗浄緩衝液で洗い流して未結合成分を除去すると有利である。これらの洗浄緩衝液のｐＨは６．０〜７．５、より好ましくは６．３〜７．０の範囲内であると有利である。従って、好ましい実施形態では、本発明の方法の工程ｄ）は、固体担体を６．０〜７．５、好ましくは６．３〜７．０の範囲内のｐＨを有する緩衝液で洗浄する工程を含む。本発明者らは、これらの緩衝液のｐＨをこの範囲に維持することにより、精製プロセスの終了時に多量の活性なｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質の回収が支援されることを実際に観察した。
【００７８】
洗浄緩衝液は、非特異的結合（例えばイオン結合）相互作用を防止するために高レベルの１種以上の塩を含有していてもよい。高塩緩衝液は、典型的にＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび／またはリン酸ナトリウム、より詳細には４００ｍＭ〜８００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭ〜２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する。好ましい高塩緩衝液は、６００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのモノリン酸ナトリウムを含有する。
【００７９】
好ましい実施形態では、固体担体を最初に上に定義した高塩緩衝液で洗い、次いで塩非含有緩衝液で洗う。これらの従来の工程は、固体担体に非特異的に結合された全ての夾雑分子を効率的に除去するために必要である。
【００８０】
塩非含有緩衝液としては、例えばトリス（ｐＨ７．０、１０ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（例えば１０ｍＭ）、ＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられる。
【００８１】
マルトースをこの系に添加することにより、本発明の融合タンパク質をさらに溶出させた。これにより、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質を固体担体から溶出させて融合タンパク質を回収することができる。実際のところ、マルトース−タンパク質がアミロースと競合して、融合タンパク質の放出を促進してもよい。
【００８２】
マルトースを含有する従来の溶出緩衝液を使用してもよい。好ましい実施形態では、前記溶出緩衝液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＭｇＣｌ２などの塩を含有する。これは５ｍＭ〜３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含んでいてもよい。より好ましい実施形態では、前記溶出緩衝液は、１００ｍＭ〜２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭ〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭ〜３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ〜８０ｍＭのマルトースを含有し、かつ６．５〜７．５の範囲内のｐＨを有する。さらにより好ましい実施形態では、前記溶出緩衝液は、１３０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのマルトースを含有し、かつ約７．０のｐＨを有する。
【００８３】
溶出された画分は典型的に、約３００ｎｇ／μＬの活性かつ可溶なｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴタンパク質を含有する。本発明の方法は、再現性良くかつ低コストで少なくとも１００μｇ／Ｌの実質的に純粋かつ活性なｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素を得ることができる最初の方法である。
【００８４】
好ましい実施形態では、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴは、プロテアーゼを溶出された画分に添加することによりＭＢＰタグを切断して外す。前記プロテアーゼは前記融合タンパク質に対してのみ活性であり得、前記融合タンパク質は、融合タンパク質の２つの部分の間に位置する前記プロテアーゼによって認識される切断部位を含むことは明らかである。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする配列がｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質およびｃＭＢＰタグをコードするヌクレオチド配列間に付加されている場合、有利なことに溶出された画分中にＴＥＶプロテアーゼを添加することにより２つのポリペプチドの分離が得られる。これらのプロテアーゼの使用については過去に記載されており、市販のキットが利用可能である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【００８５】
本発明者らは、上記発現および精製方法を適用することにより、精製収率が約５０％になることを示した。従って、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質は溶出された画分中に存在する主要なタンパク質である。言い換えると、これは、溶出された画分がｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ以外の分子を５０％のみ含有することを意味する。
【００８６】
本発明の方法により回収された融合タンパク質およびｃＭＢＰタグの切断後に回収されるｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質は活性であることが重要である。すなわち、それらはテロメア反復配列の合成のための鋳型を含むテロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＲ）の存在下で有意なテロメラーゼ活性、より詳細には有意な逆転写酵素（ＲＴ）活性を示す。好ましい実施形態では、それらは、配列番号１の天然のｈＴＥＲＴ酵素がヒトのテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）の存在下で示すものと同じ逆転写酵素（ＲＴ）活性を示す。別の好ましい実施形態では、それらは天然の非ヒトＴＥＲＴ酵素がその対応する非ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ）の存在下で示すものと同じ逆転写酵素（ＲＴ）活性を示す。ＴＲ配列は当該技術分野でよく知られている。それらは、例えばＮＣ＿００１１３４．８（出芽酵母Ｓ２８８ｃのＴＲ）、ＮＣ＿００６０３８．１（クルイベロミセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０のＴＲ）、ＮＣ＿００００６９．６（ハツカネズミのＴＲ）、ＥＦ５６９６３６．１（ゼブラフィッシュ（学名：Danio rerio）のＴＲ）などとして参照番号が付されている。
【００８７】
本発明のタンパク質の活性は、任意の従来のアッセイによって評価することができる。典型的には、これらのアッセイはＴＲの存在下で行う。このＴＲは、例えば配列番号４（ジェンバンク：Ｕ８６０４６．１）またはその他の生物種におけるその相同な配列を有する。これらのアッセイのうちのいくつかを以下に簡単に説明する。
【００８８】
最初に、ＰＣＲを用いたテロメア反復配列増幅手順（ＴＲＡＰアッセイ）を使用することができる(Kim et al. NAR 1997)。ＴＲＡＰアッセイは、試験されるｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質の調製、および生体外で転写されたＴＲ、プライマーおよびｄＮＴＰの添加を含んでもよい（以下の実施例を参照）。ｈＴＥＲＴタンパク質またはＴＥＲＴまたはその変異体が酵素的に活性であれば、添加されたプライマーは伸長し、かつ反応産物（鋳型）はＰＣＲによって増幅される。この技術は非常に高感度であるが、定性的評価しか提供することができない。定量的分析のために、コンピュータプログラムを用いた濃度測定によりＸ線フィルム中に現れる６ｂｐのラダーの面積または強度を測定することができる。市販のキットでは試料処理時間の短縮と共に高感度が得られ、多くの試料においてテロメラーゼ活性の検出を高めることができる。ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質および／またはその変異体の酵素的な逆転写酵素活性を測定するための別の定量的方法は、プライマー伸長アッセイである。このアッセイでは、プライマー配列に対して合成されたポリヌクレオチド内に組み込まれた放射性ヌクレオチドの量を測定する。放射性産物が分離されるゲルに露光されたホスホイメージャースクリーン上のバンドの強度の関数として、組み込まれた量を測定する。ホスホイメージャースクリーン上で目視によってテスト実験および対照実験を比較することができる。このアッセイはMorin, G. B., Cell, 1989によって記載されているアッセイに基づく。ｈＴＥＲＴタンパク質および変異体の逆転写酵素活性を評価するための別のアッセイは、ドットブロットアッセイである。
【００８９】
ドットブロットアッセイは、ハイスループットを有し、かつ大抵の場合は自動的に１日に何百回ものアッセイを実施することができるため、日常的なスクリーニングにとって有用である。２日目の午後までには結果の入手が可能である。最後に、いつくかの感受性の高い直接的なテロメラーゼ活性アッセイが提案されている（Cohen SB. et al, Nat. Methods, 2008, Capital Biosciences社のＨｏｕｄｉｎｉ（商標））。
【００９０】
必須ではないが、例えば、ゲル濾過、グリセリン勾配濾過または限外濾過により、さらなる精製工程を達成してもよい。
【００９１】
本発明のｈＴＥＲＴ／ＴＥＲＴタンパク質の特性評価
本発明の方法により、ＭＢＰでタグ付けされたｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素を産生することができる。興味深いことに、ＭＢＰは先天免疫に関与することが知られているため、本発明の方法により得られるＭＢＰでタグ付けされたｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素をワクチン組成物などに使用することができる。この場合、ＭＢＰタグの切断は不要であり、本発明の方法は先行技術の精製方法よりもはるかに実施が容易である。
【００９２】
以下の実施例に示すように、本発明の方法により、ｈＴＥＲＴを酵母細胞において発現させた場合、精製された可溶かつ活性なｈＴＥＲＴタンパク質を得ることができる。本発明者らは、酵母細胞で産生されたｈＴＥＲＴが、酵素を可溶化および安定化することができる酵母内因性ＲＮＡ（図４）と同時精製されることを観察した。図５に示すように、本発明によって得られるｈＴＥＲＴタンパク質は、外から加えられたリボヌクレアーゼを含有する試料中では凝集するが、未処理試料中では凝集しない。より詳細には、リボヌクレアーゼＡの存在下で精製した場合、本発明の方法によって得られるｈＴＥＲＴ酵素は４℃での２４時間の貯蔵後に活性が低下していたが、未処理ｈＴＥＲＴは活性を喪失することなく（データは示さず）同じ条件で少なくとも４８時間貯蔵することができることが観察された。従って、内因性酵母ＲＮＡは本発明の方法によって得られるｈＴＥＲＴに結合し、かつｈＴＥＲＴタンパク質の安定化に関与していると思われる。
【００９３】
故に、本発明の方法により得られるｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質は、酵母ＲＮＡに結合するという点で先行技術よりも特有の特徴を有する。本発明者らの結果によれば、この結合は安定化を誘導し、かつｈＴＥＲＴ酵素の溶解性を長期間維持する。
【００９４】
従って、本明細書で使用される「本発明のＴＥＲＴタンパク質」という用語は、本発明の方法によって得られた、すなわち酵母において得られたヒトのＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）タンパク質またはあらゆる他の動物ＴＥＲＴタンパク質に関する。上に説明したように、本タンパク質は、
・酵母ＲＮＡに結合させることができ、
・ＭＢＰタグに融合させることができ、
・どんな変性剤または界面活性剤も含まない産生プロセスで得られた、
という特有の特徴を含む。
【００９５】
本発明は、本発明のＴＥＲＴタンパク質を含むあらゆる組成物に関する。
【００９６】
上に説明したように、本発明のＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物は、分泌シグナルを含まずＭＢＰタグを含むという点で、先行技術に記載されているものとは異なり得る。
【００９７】
さらに、本発明のＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物は、酵母ＲＮＡを含有するという点で（リボヌクレアーゼ処理を使用しなかった場合）、先行技術に記載されているものとは異なり得る。
【００９８】
最後に、これらの組成物は、どんな界面活性剤または変性剤も含有しておらず、それらを微量にも含有していないという点でも、先行技術に記載されているものとは異なり得る。実際のところ、先行技術の方法とは異なり、本発明の方法は、本発明の可溶かつ活性なＴＥＲＴタンパク質の産生および／または精製プロセスの間に、どんな界面活性剤または変性剤の使用も必要としない。
【００９９】
好ましい実施形態では、本発明は、Triton X-100、IGEPAL CA-630 (Nonidet P-40)、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳ、ドデシル硫酸ナトリウムまたはＭＥＧＡ−９からなる群から選択されるどんな界面活性剤または変性剤も含まない本発明のＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物に関する。
【０１００】
より好ましい実施形態では、本発明は、どんな界面活性剤または変性剤も含まない、リボ核タンパク質複合体中の酵母ＲＮＡに結合された、精製された可溶かつ活性なＴＥＲＴタンパク質を含む組成物に関する。
【０１０１】
好ましい実施形態では、本発明は、Triton X-100、IGEPAL CA-630 (Nonidet P-40)、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳ、ドデシル硫酸ナトリウムまたはＭＥＧＡ−９からなる群から選択されるどんな界面活性剤または変性剤も含まない、本発明のＭＢＰでタグ付けされたＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物に関する。
【０１０２】
好ましい実施形態では、本発明は、酵母ＲＮＡに結合された、本発明のＭＢＰでタグ付けされたＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物に関する。
【０１０３】
本発明の組成物は、医薬組成物または実験的アッセイにおいて生体外で使用される組成物であってもよい。
【０１０４】
特に、これらの組成物はワクチン組成物であってもよい。あるいは、これらを例えば結晶学によってＴＥＲＴ構造を分析するための実験道具として使用してもよい。
【０１０５】
本発明のＴＥＲＴタンパク質の治療的使用
本発明のＴＥＲＴタンパク質をいくつかの用途で使用することができる。
【０１０６】
第２の態様では、このように精製した本発明の組換えＴＥＲＴタンパク質を使用して、細胞においてテロメラーゼ活性を生成するか上昇させ、その増殖能を高めることができる。例えば、テロメア長を増加させる皮膚の線維芽細胞におけるＴＥＲＴタンパク質の発現により線維芽細胞の増殖能を高め、そのような発現により年齢依存的な創傷閉鎖の低下を遅らせたり改善したりすることができる（例えば、West, Arch. Derm. 1994を参照）。
【０１０７】
従って、本態様では、本発明は、細胞におけるヒトのテロメラーゼ活性の欠如を特徴とする疾患および病気を治療するのに有用な試薬および方法を提供する。これらの疾患としては、以下により完全に記載するように、特に細胞老化に関連する疾患（特に加齢疾患）および不妊症が挙げられる。
【０１０８】
従って、一態様では、本発明は、安定化化合物、希釈剤、担体または別の有効成分もしくは薬剤と任意に組み合わせた、本発明のＴＥＲＴタンパク質を含有する薬学的に許容される組成物に関する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、これらの医薬組成物に使用される本発明のＴＥＲＴタンパク質はさらにＭＢＰタグに連結されている。別の好ましい実施形態では、これらの医薬組成物に使用される本発明のＴＥＲＴタンパク質は、リボ核タンパク質複合体中の酵母内因性ＲＮＡにさらに結合されている。別の好ましい実施形態では、これらの医薬組成物は、どんな界面活性剤または変性剤も含有しておらず、それらを微量にも含有していない。
【０１１０】
あらゆる好適な薬学的に許容される担体を本発明の組成物に使用することができ、そのような担体は当該技術分野でよく知られている。担体の選択は、組成物が投与される特定の部位および本組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決まる。注射に適した製剤としては、水性および非水性溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および製剤を目的のレシピエントの血液と等張させる溶質を含有することができる等張性無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。これらの製剤をアンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量密封容器に入れて提供することができ、使用の直前に無菌の液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件に貯蔵することができる。先に記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から即時注射溶液および懸濁液を調製することができる。
【０１１１】
特に、本発明は、細胞老化に関連する疾患（特に加齢疾患）および不妊症などのヒトのテロメラーゼ活性の欠如を特徴とする疾患および病気を治療するために使用される、本発明のＴＥＲＴタンパク質を含有する医薬組成物に関する。
【０１１２】
また、本発明は、細胞老化に関連する疾患（特に加齢疾患）および不妊症などのヒトのテロメラーゼ活性の欠如を特徴とする疾患および病気の治療を目的とした医薬組成物の調製のための本発明のＴＥＲＴタンパク質の使用に関する。
【０１１３】
ある種の加齢疾患は、テロメア長の減少および複製能の低下を引き起こす細胞におけるテロメラーゼ活性の欠如（またはそのレベルが非常に低いこと）により生じる、テロメア長の減少（より若い細胞と比較）を起因とする細胞老化に伴う変化を特徴とする。細胞老化に伴う病気としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および脳卒中、外皮の加齢性疾患、例えば、真皮の萎縮、弾力線維分解や皮膚のしわ、皮脂腺過形成、老人性黒子、白髪や脱毛、慢性皮膚潰瘍および加齢性創傷治癒障害、変形性関節症、骨粗鬆症、加齢性免疫系機能障害（例えば、ＢおよびＴリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞およびそれらのそれぞれの前駆細胞などの細胞が関与）、加齢性血管系疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、石灰化、血栓症および動脈瘤、糖尿病、筋萎縮、呼吸器疾患、肝臓および消化管の疾患、代謝性疾患、内分泌疾患（例えば、脳下垂体および副腎の疾患）、生殖系疾患ならびに加齢性黄斑変性症が挙げられる。
【０１１４】
本発明は、不妊症を治療するのに有用な方法および組成物も提供する。ヒトの生殖細胞（例えば、精原細胞、それらの前駆細胞または子孫細胞）は、無限増殖を可能にし、かつ高いテロメラーゼ活性を特徴とする。ＴＥＲＴタンパク質の異常なレベルまたはレベルの低下により、例えば精子の不適切または異常な産生が生じて、不妊症すなわち生殖障害が生じる可能性がある。従って、テロメラーゼレベルを上昇させるために本明細書に記載されている方法および組成物を用いて「テロメラーゼ系」不妊症を治療することができる。本発明の方法および試薬は、治療的介入前に低レベルのテロメラーゼを発現するかテロメラーゼを発現しない幹細胞においてテロメラーゼ活性および増殖能を上昇させるのにも有用である。
【０１１５】
細胞においてＴＥＲＴタンパク質レベルを上昇させてテロメア長を増加させ、それにより複製能を回復させるかより高い複製能を細胞に付与することにより、これらの疾患および病気を治療することができる。生体外で培養された細胞または生体内の細胞に対してそのような方法を実施することができる。一実施形態では、テロメラーゼを活性化させ、かつテロメアを長くするためにこれらの細胞を生体外でＴＥＲＴタンパク質に接触させ、次いで、前記細胞をそれを必要としている対象に投与する。例えば微量注入または当該技術分野で知られている他の手段によって、触媒活性のＴＥＲＴポリペプチドを細胞または組織に導入することができる。
【０１１６】
本発明のＴＥＲＴタンパク質のワクチン接種使用
別の態様では、本発明のＴＥＲＴタンパク質は、患者における抗ＴＥＲＴ免疫応答を誘導するために使用（すなわち、ワクチンとして作用）することができる。ワクチン接種を受けると、個体または動物は、高レベルのテロメラーゼを発現している細胞（例えば悪性細胞）に対する免疫応答の増加を誘発する。
【０１１７】
従って、別の態様では、本発明は、例えば癌に罹患している対象において抗ＴＥＲＴ免疫応答を誘導するために使用されるワクチン組成物に関する。
【０１１８】
また、本発明は、対象において抗ＴＥＲＴ免疫応答を誘導することを目的とした免疫原性ワクチンを調製するための本発明のＴＥＲＴタンパク質の使用に関する。特に、免疫原性ワクチンは癌に罹患している患者に投与することを目的としている。
【０１１９】
好ましい実施形態では、これらのワクチン組成物に使用される本発明のＴＥＲＴタンパク質はさらにＭＢＰタグに連結されている。別の好ましい実施形態では、これらのワクチン組成物に使用される本発明のＴＥＲＴタンパク質は、リボ核タンパク質複合体中の酵母内因性ＲＮＡにさらに結合されている。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、これらのワクチン組成物はどんな界面活性剤または変性剤も含有していない。
【０１２１】
本発明のＴＥＲＴタンパク質によるテロメラーゼ阻害剤のスクリーニング
あるいは、本発明のＴＥＲＴタンパク質は、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて治療用化合物のスクリーニングのために使用することができる。そのような試験で用いられる本発明のＴＥＲＴタンパク質は、溶液中に遊離していてもよく、固体担体に固定されていてもよく、細胞表面に支持されていてもよく、あるいは細胞内に位置していてもよい。ＴＥＲＴタンパク質と試験されている薬剤との結合複合体の形成は、ＥＭＳＡ、ゲル濾過またはグリセリン勾配によって検出してもよい。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、特に、ｉ）酵素活性部位に結合する調節剤、ｉｉ）テロメラーゼ結合タンパク質（ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、Ｄｙｓｋｅｒｉｎ、Ｐｏｎｔｉｎなど）、ヌクレオチドまたはテロメアのＤＮＡによりＴＥＲＴとそのＲＮＡ部分との結合を阻害する調節剤、ｉｉｉ）酵素複合体の分離を促進する調節剤、ｉｖ）テロメアＤＮＡの合成を妨害する調節剤、あるいはｖ）酵素の処理能力に影響を与える調節剤を単離することができる。
【０１２３】
一実施形態では、本発明は、テロメラーゼ複合体の拮抗薬を同定するための生体外アッセイに関する。これらの拮抗薬は、例えばペプチド（構造的模倣剤など）、ポリペプチド（ＴＥＲＴまたはテロメラーゼ結合タンパク質のドミナントネガティブ突然変異体など）、小さい化学分子（天然もしくは合成）、オリゴヌクレオチド（ＴＥＲＴもしくはＴＲに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）など）または抗体である。
【０１２４】
これらのアッセイは、本発明のＴＥＲＴタンパク質を試料中の試験化合物に接触させる工程と、この試験化合物が試料中のテロメラーゼ活性に影響を与えるか否かを判定する工程とを含む。通常は、この判定は、試料中のテロメラーゼ活性を試験化合物を含有しない試料のテロメラーゼ活性と比較する工程を含む。
【０１２５】
効率的なテロメラーゼ阻害剤の同定方法は、
・試料中で本発明のＴＥＲＴタンパク質、テロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ）および候補阻害剤を接触させる工程と、
・試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を含む。
【０１２６】
好ましくは、テロメラーゼ構築阻害剤である効率的なテロメラーゼ阻害剤の同定方法は、
ａ）試料中で本発明のＴＥＲＴタンパク質および候補阻害剤を接触させる工程と、
ｂ）テロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ）を添加する工程と、
ｃ）試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を上記順序で含む。
【０１２７】
別の好ましい実施形態では、テロメラーゼ触媒阻害剤である効率的なテロメラーゼ阻害剤の同定方法は、
ａ）試料中で本発明のＴＥＲＴタンパク質およびテロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ）を接触させる工程と、
ｂ）候補阻害剤を添加する工程と、
ｃ）試料のテロメラーゼ活性を試験する工程と、
を上記順序で含む。
【０１２８】
好ましくは、候補阻害剤を含有する試料中のテロメラーゼ活性が低いか存在しない場合にこの候補阻害剤を選択する。
【０１２９】
好ましい実施形態では、前記スクリーニング方法は、候補阻害剤の不存在および存在下でテロメラーゼ活性を比較する工程を必要とする。この場合、前記阻害剤の不存在下で試料中で測定したテロメラーゼ活性と比較した場合に、候補阻害剤の存在下で試料中で測定したテロメラーゼ活性が少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％低下している場合にこの候補阻害剤を選択する。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、前記スクリーニング方法は、テロメラーゼ活性アッセイのＰＣＲ工程に対する候補阻害剤の影響の評価を含む。この場合、テロメア伸長前に候補阻害剤を添加した場合にテロメラーゼ活性が影響を受けるがテロメア伸長後に候補阻害剤を添加した場合に影響を受けない場合にこの候補阻害剤を選択する。
【０１３１】
試料のテロメラーゼ活性をアッセイするための実験条件については過去に記載されている。テロメラーゼ複合体の活性を測定するために使用される古典的なアッセイは、例えば、ＴＲＡＰアッセイ、ドットブロットアッセイまたは直接テロメラーゼ活性アッセイであり、これらについては上に記載されている。正確な手順は以下の実施例に詳細に記載されている。
【０１３２】
好ましくは、本発明のＴＥＲＴタンパク質および鋳型ＲＮＡ（例えば、配列番号４のｈＴＲ）を含む、生体外で再構成されるリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のテロメラーゼ活性の変化を監視することにより、前記阻害剤を同定する。
【０１３３】
本発明の方法の異なる工程を実施するために、当該技術分野の範囲内で従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書では「Sambrook et al., 1989」という)、DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)、Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984)、Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986)、Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)、B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)、F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【実施例】
【０１３４】
１．材料および実験的設定
【０１３５】
１．１．プラスミド構築
hTERT cDNA（Whitehead Institute of Biomedical ResearchのRobert Weinbergからの贈り物）およびpMAL p-2（New England Biolabs社）を以下のプライマーと共に、ＭＢＰ（配列番号：９）およびｈＴＥＲＴ（配列番号３）のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
・ＭＢＰ−Ｆ（配列番号１９）：ＡＴＧＣＡＡＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＣ
・ＭＢＰ−Ｒ（配列番号２０）：ｐ−ＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧ
・ｈＴＥＲＴ−Ｆ（配列番号２１）：ｐ−ＣＣＧＡＡＡＡＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＡＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＧ、および
・ｈＴＥＲＴ−Ｒ（配列番号２２）：ＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＡ
【０１３６】
次いで、ＰＣＲ断片をカラム精製した。ＭＢＰのＤＮＡをＢｓｔＢＩで消化し、ｈＴＥＲＴのＤＮＡをＸｂａＩで消化した。両断片を再度カラム精製し、ＰＧＡＰＺαベクターのＢｓｔＢＩ／ＸｂａＩ部位の中に二重連結した。
【０１３７】
１．２．本発明の方法に係るｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの発現および精製
このプラスミドをシークエンシングで確認し、次いで２０μｇをＡｖｒＩＩで直線化し、精製し、Bio-Rad Gene Pulser（１５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω）を用いてピキア・パストリスのＸ−３３株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中に電気穿孔法により導入した。複数の組み込み体を、寒天プレート（硫酸アンモニウムを含む０．２％酵母窒素原基礎培地、１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍのソルビトール、ｐＨ７．０、３００μｇ／ｍｌのゼオシン）上で選択し、２７℃で２〜３日間インキュベートした。コロニーを再画線し、次いでＬＢＧ（それぞれ２０ｇ／ＬのＬ培地およびグルコース）中で増殖させて、ウエスタンブロット（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社製のｈＴＥＲＴ抗体）でｈＴＥＲＴ発現を確認した。２００ｍｌ（１％酵母抽出物、ｐＨ７．０、１％デキストロース、５００μｇ／ｍｌのゼオシン）中、１６０ｒｐｍおよび２７℃で確認済みのクローンを増幅させ、次いで２ｍｌの管に分注し、１０％グリセリンと共に−８０℃で保存した。
【０１３８】
各培養のために１つのバイアルを解凍し、酵母を固体培地上で１〜２日間前培養し、細胞内ｐＨが６．３以上になるようにＯＤ６００が１２〜１５になるまで、２Ｌの振盪フラスコ中の２５０〜５００ｍＬの培地（２％酵母抽出物、４％グルコース、１００ｍＭのＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．５）で増幅させた。
【０１３９】
全ての精製工程を、冷たい溶液および冷蔵した器具を用いて低温室で行った。
【０１４０】
酵母を１５００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、水で洗浄し、次いで１５ｍＬの水に再懸濁させ、かつ５ｍＬのガラスビーズと共にボルテックスで１０分間撹拌した。水の中に塩も界面活性剤も添加する必要はない。この溶解物のｐＨは約５．９〜６．４である。
【０１４１】
上澄みを３０００ｇで１０分間遠心分離し、新しい管の中で再度３０００ｇで１５分間遠心分離した。そのｐＨを確認すると約６．３であり、この上澄みを２ｍＬの予備洗浄したアミロース−アガロースビーズ（ＮＥＢ社）に接触させた。回転ホイール上で１時間後、アミロースビーズを高塩緩衝液（６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのモノリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で１回洗浄し、塩非含有緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で１回洗浄した。ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを５００μＬの溶出緩衝液（１３０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭのマルトース）で溶出させた。ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質の濃度をＢＳＡラダーに対するクマシーブリリアントブルー染色によりゲル上で推定した（図２Ａ）。ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴは典型的に約０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬであることが分かった。ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを２日間４℃に維持した。
【０１４２】
１．３．精製プロセスの制御
アミロースセファロースを用いてｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質の精製を行った後、ウエスタンブロットおよびクマシーブリリアントブルー染色を行った（図２Ａ）。レーン２（ＴＥＶプロテアーゼによるＭＢＰタグの切断前）とレーン３（ＴＥＶプロテアーゼによるＭＢＰタグの切断後）との間でのサイズの変化により、精製済タンパク質はｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴであることを確認した（ＭＢＰとｈＴＥＲＴとの間にＴＥＶ部位が含められていた）。
【０１４３】
ＴＥＶプロテアーゼにより室温で１時間切断し、次いでニッケルカラム再結合により取り出したｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの純度により、純度レベルおよびＴＥＶプロテアーゼによる切断効率をより正確に評価することができた（図２Ｂ）。
【０１４４】
精製済ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質をトリプシンで消化し、ＭＳ／ＭＳで分析した。ｈＴＥＲＴは最も高い配列包括度（７５％、図示せず）を有するタンパク質であった。
【０１４５】
５００ｎｇの生体外で転写されたｈＴＲを１００ｎｇの精製済ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴに添加して、テロメラーゼ活性を再構成した。この活性はテロメラーゼ直接アッセイ（図３Ａ）、テロメア反復配列増幅手順（ＴＲＡＰまたはｑＴＲＡＰ、図３Ｂおよび図３Ｃ）などのいくつかの方法によって明らかとなった。テロメラーゼ活性は、安定期に到達する前の最初の１分間で増加する（図３Ｄ）。最終的にＥＭＳＡにより、組換えｈＴＥＲＴの３２Ｐで標識されたｈＴＲへの結合を示すこともできる。
【０１４６】
１．４．テロメラーゼ直接アッセイ
僅かな修正を伴うが記載されているとおりに(D'Ambrosio et al., 2012)直接アッセイを行った。テロメラーゼ基質として、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのスペルミジン、４０μＭのｄＡＴＰ、８０μＭのｄＴＴＰ、２μＭのｄＧＴＰ、２０μＣｉの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および３３ｎＭの５’ビオチン化プライマーを含有する２０μＬの反応緩衝液中で、再構成されたテロメラーゼを３０℃で４５分間インキュベートした。２５ｍＭになるまでＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。ビオチン化プライマーを２０μＬのストレプトアビジン−アガロースビーズ（GE Healthcare社）に室温で１０分間結合させることにより、取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。ビーズを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌで２回、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡで１回洗浄する。プライマーを９０％ホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ社）中、９５℃で１０分間加熱して溶出させ、１５％ポリアクリルアミド−尿素シークエンシングゲル（１９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド比）上で分離させた。ゲルをプラスチックフィルムで覆い、ホスホイメージャースクリーンに露光し、ＳＴＯＲＭ８６０（Molecular Dynamics社）を用いてスキャンした。
【０１４７】
１．５．電気泳動移動度シフト解析
電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によりｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ／ｈＴＲ複合体を分析した。５０μＣｉの［α−３２Ｐ］−ＣＴＰを添加してｈＴＲを合成し、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴと共に１時間構築した。１×ＴＢＥ中に１．２％の冷蔵したアガロースゲル上で全長ｈＴＲを１１０Ｖで２時間泳動させた。ゲルを１０％酢酸および１０％エタノール中で１時間固定し、乾燥して、ホスホイメージャースクリーンに露光した。ＳＴＯＲＭ８６０（Molecular Dynamics社）を使用してスキャンを行った。
【０１４８】
１．６．酵母ＲＮＡの検出
１０μＬ（１μｇ）の精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質を、それらの専売緩衝液に入れたいくつかの市販の酵素の１μＬ原液と共に３０分間インキュベートした後、試料をＴＡＥ緩衝液（トリス、酢酸、ＥＤＴＡ）中にSYBR GREEN II RNA（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有する１％アガロースゲル中で３０分間泳動させた。
【０１４９】
２．ｈＴＥＲＴの発現のために最適化された条件の同定
【０１５０】
２．１．Ｎ末端ペリプラズム標的シグナルの除去により酵母におけるより良好な発現が可能になる
ＭＢＰはＮ末端ペリプラズム標的シグナルを含有する。本発明者らは、この配列をＭＢＰ−ｈＴＥＲＴから除去することにより、クマシーブリリアントブルー染色で精製済タンパク質ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを検出することができるような酵母におけるより良好な発現が可能になることを示した（図２を参照）。
【０１５１】
有利なことに、これにより望ましくないグリコシル化の発生が回避される。
【０１５２】
２．２．ｈＴＥＲＴを酵母細胞から分泌させることができない
ＰＧＡＰＺベクターを用いてＧＳＴ−ｈＴＥＲＴ（１５５ｋＤａ）を細胞内で発現させる（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。
【０１５３】
しかし、ＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを出芽酵母α因子の分泌シグナルに融合させた場合（α−ｈＴＥＲＴ、１３６ｋＤａ）、α−ｈＴＥＲＴは細胞内に残留した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。ｈＴＥＲＴおよびα−ｈＴＥＲＴの細胞内および細胞外基質レベルを比較すると、分泌シグナルの添加によってｈＴＥＲＴの発現レベルが高まらないことが分かった。図１Ｆは、α−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴが細胞内または細胞外のいずれにおいてもウエスタンブロット抗ＨＡによってほとんど検出不可能であることも示している。
【０１５４】
従って、昆虫細胞における記載されている状況(Wu et al., Protein Expr. Purif. 2007)に反して、本酵母系では、可溶なｈＴＥＲＴを発現させるために（出芽酵母α因子からの）ペプチドシグナルの添加は必要ではなかった（図１Ｅ）。
【０１５５】
さらに、ＭＢＰのペリプラズムシグナルの除去により酵母におけるＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの発現レベルが高まることも実証された（図２）。
【０１５６】
２．３．ＭＢＰのみがｈＴＥＲＴの効率的な精製を可能にする
本発明者らは、いくつかの他のタグ（Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＭＢＰ、ＧＳＴ）の使用により効率的な精製が支援されないことを実証した（ＧＳＴの実施例、図１Ｃを参照）。Ｈｉｓでタグ付けされたｈＴＥＲＴは、精製後にクマシーブリリアントブルー染色によって検出できず、精製済ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴで得られたテロメラーゼ活性レベルの２〜５％しか生じなかった。ウエスタンブロットでは、そのＮ末端においてＳｔｒｅｐ−タグＩＩに融合されたｈＴＥＲＴを発現するように形質転換された酵母においてタンパク質発現を検出することができず（２種類の異なる構築物を試験）、従って、このタグはタンパク質の発現または安定性にとって有害であり得る。
【０１５７】
２．４．発現系の重要性（構成的プロモーターおよびリッチ培地）
ＡＯＸ１プロモーターに基づく古典的なピキア系では完全なタンパク質を効率的に発現させることができなかった（図１Ｇ）。ＧＡＰＤＨプロモーターを用いた場合、ｈＴＥＲＴは、リッチ培地（酵母抽出物を含有）のみで効率的に発現されることが分かった。従って、構成的プロモーターまたは場合により、リッチ培地において抑制されない誘導性プロモーターが好ましい。
【０１５８】
２．５．増殖条件の重要性
最近解凍したか４℃で保存した酵母は、より低品質のｈＴＥＲＴタンパク質を産生する。新しい前培養物からの指数関数的に増殖している酵母を用いた場合に最良の結果が得られた。
【０１５９】
細胞内ｐＨが約６．０になるまで酵母を増殖させなければならない。振盪フラスコ条件では、これは通常、ＯＤ６００ｎｍ＝１０〜１２に対応する。酸性条件での酵母増殖では、劣化したＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質が回収される（図１Ｉ）。
【０１６０】
２．６．抽出条件の重要性
核／塩基性タンパク質では予期せずに、高塩濃度（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）が抽出効率を低下させることが分かった。緩衝液（ＨＥＰＥＳまたはトリス、ｐＨ７〜８）も抽出を低下させた。
【０１６１】
興味深いことに、純水を用いた場合に、細胞破壊後の酵母の細胞内ｐＨ（約６．０）が得られる最良の結果が認められた。抽出／精製の間のグリセリン、界面活性剤、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤の添加ならびに抽出後の塩（ＫＣＬ、Ｍｇ２＋、ＮａＣＬ、重炭酸アンモニウム）の添加は全て、精製済タンパク質の収率、純度および活性レベルに対してほとんど影響を与えなかった（図１Ｊ）。
【０１６２】
２．７．精製条件の重要性
僅かに酸性のｐＨ（６．３〜７．０）においてアミロース樹脂への最良の結合が観察された（図１Ｋ）。従って、効率的な精製は、結合および全ての洗浄溶液を６．０〜７．５の範囲内のｐＨに設定することを要件とする。
【０１６３】
２．８．リボ核タンパク質としてのｈＴＥＲＴタンパク質の精製および酵母ＲＮＡの重要性
本方法を用いて産生されるｈＴＥＲＴタンパク質は、いくつかの内因性酵母ＲＮＡと結合されていることが分かった（図４Ａ）。これらの要素をリボヌクレアーゼＡによって除去することができた（図４Ｂ）。ｈＴＥＲＴに対して高い親和性を有するｈＴＲの導入によって置換されるため、それらはｈＴＥＲＴに（恐らくイオン相互作用および／または水素結合を介して）可逆的に結合するものと思われる。従って、リボヌクレアーゼＡを用いたこれらのＲＮＡの除去は、ｈＴＲによりテロメラーゼ活性を再構成するために必要ではない。しかし、精製プロセス中にリボヌクレアーゼＡを添加してこれらの要素を除去した場合、３ｍｇ／ｍｌを超えて濃縮すると精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴは凝集する傾向があり、かつ沈殿することが分かった。電気泳動移動度シフト解析によるｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ−ｈＴＲ複合体の分析により、調製されたタンパク質とリボヌクレアーゼＡとの高分子重量の凝集体が形成されることが明らかとなった。実際には、かなりの割合の複合体がウェルの底に残留し、かつこのゲルの中に進入することができなかった（図５、レーン２および３）。さらに、結合された酵母ＲＮＡを保存する条件で精製されたｈＴＥＲＴタンパク質は、精製後に４℃で少なくとも４８時間安定な触媒活性を示すが、これらのＲＮＡなしに回収されたｈＴＥＲＴは、最初の２４時間以内にその活性の大部分を失う。従って、これらの酵母ＲＮＡへのその結合を保存する条件でのｈＴＥＲＴの精製により、長期間の高い安定性を有し、かつこれらの要素なしに精製されたｈＴＥＲＴと比較して向上した溶解性を有する組換えタンパク質が得られる。
【０１６４】
３．ハイスループットスクリーニングにおけるＭＢＰで精製したｈＴＥＲＴの使用
ＭＢＰで精製したｈＴＥＲＴを使用して、８０００の構成要素からなる化学ライブラリーを用いて潜在的テロメラーゼ阻害剤を同定した。
【０１６５】
阻害モードの決定：３種類の条件で各分子を試験する。テロメラーゼ構築前（ＰＲＥ）またはテロメラーゼ構築後（ＰＯＳＴ）、あるいはテロメア伸長後（ＰＣＲ−Ｃ）のいずれかの時点で各分子を添加する。工程１で導入した場合にのみ阻害することを条件に、テロメラーゼ構築阻害剤を同定する。テロメラーゼ触媒阻害剤は工程１または２のいずれかにおいて導入された場合に作用する。ＰＣＲ阻害剤（偽陽性）は工程３においてのみ阻害する。
【０１６６】
参考文献
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Zhang X. et al, Genes Dev. 1999, 13(18):2388-99
【図１−１】
2016537026.tif 000002
【図１−２】
2016537026.tif 000003
【図２Ａ】
2016537026.tif 000004
【図２Ｂ】
2016537026.tif 000005
【図３Ａ】
2016537026.tif 000006
【図３Ｂ】
2016537026.tif 000007
【図３Ｃ】
2016537026.tif 000008
【図３Ｄ】
2016537026.tif 000009
【図４Ａ】
2016537026.tif 000010
【図４Ｂ】
2016537026.tif 000011
【図５】
2016537026.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月11日(2016.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】ＰＧＡＰＺベクターを用いてｈＴＥＲＴを発現させることができるが、特定のｃＭＢＰタグを使用しない限り精製することができない。
【図１Ａ】ＰＧＡＰＺベクターを用いてＧＳＴ−ｈＴＥＲＴ（１５５ｋＤａ）を細胞内で発現させる。抗ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、野生型ピキア・パストリスからの細胞抽出物（レーン１）またはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア・パストリス細胞からの細胞抽出物（レーン２）に対してウエスタンブロットを行った。
【図１Ｂ】ゼオシン耐性クローンはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現する。抗ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、野生型ピキア・パストリスからの細胞抽出物（レーン１）またはＧＳＴ−ｈＴＥＲＴを発現するように形質転換された異なるピキア・パストリスクローンの細胞抽出物（レーン２〜７）に対してウエスタンブロットを行った。
【図１Ｃ】ＧＳＴ−ｈＴＥＲＴはグルタチオンセファロースとの低い親和性を示す（レーン１：流出、レーン２：結合された画分）。
【図１Ｄ】α−ｈＴＥＲＴを分泌させることができない。野生型ピキア・パストリス細胞（レーン１、３）または、出芽酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（学名：Saccharomyces cerevisiae）α因子の分泌シグナルに融合されたｈＴＥＲＴに対応するα−ｈＴＥＲＴ形質転換酵母（レーン２、４）の細胞内画分（レーン１〜２）または細胞外画分（レーン３〜４）に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｅ】異なるタグを含むｈＴＥＲＴ発現レベルの比較。α−ｈＴＥＲＴ（レーン１）、ＧＳＴ−ｈＴＥＲＴ（レーン２）およびタグ無しｈＴＥＲＴ（レーン３、１２７ｋＤａ）で形質転換されたピキア・パストリス細胞に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロットにより、酵母の可溶な細胞内内容物を分析した。
【図１Ｆ】ピキア・パストリス細胞においてＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを低レベルで発現させる。ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ（レーン１および２）、ｈＴＥＲＴ（レーン３）およびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ（レーン４）で形質転換されたピキア・パストリス細胞の細胞抽出物に対する抗ｈＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｇ】ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質はメタノールを用いた発現系では検出されない。ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター）の制御下でＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア細胞（レーン１）またはα−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア細胞（レーン２）に対する抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１Ｈ】ｈＴＥＲＴのＮ末端部分はアクセス可能である。Ｈｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴを発現しているピキア・パストリス細胞の全細胞溶解物からのＨｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴの免疫沈降後の抗ＨＡタグ抗体を用いたウエスタンブロット（レーン３）。対照：Ｈｉｓ−ＨＡ−ｈＴＥＲＴを発現している酵母からの全細胞溶解物（レーン１）およびＡ＋Ｇビーズのみを用いた免疫沈降（レーン２）。
【図１Ｉ】低い細胞内ｐＨによりタンパク質分解が生じる。本発明の条件（細胞内ｐＨ６．３）でｈＴＥＲＴを精製した場合、分解されず（レーン１）、細胞内ｐＨが５．５である場合、顕著に分解される（レーン２）。
【図１Ｊ】プロテアーゼ阻害剤および界面活性剤は必要ではない。標準的な精製を行い（レーン１）、抽出および洗浄溶液中にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）および１％ｔｒｉｔｏｎを添加して行った精製と比較し（レーン２）、これにより収率は増加せず、非常に僅かにのみ純度が向上した。
【図１Ｋ】弱酸性／中性のｐＨで最良の精製が生じる。カラム結合前に抽出物のｐＨを異なるｐＨに調整し、次いで各条件に対応するｐＨを用いて洗浄工程を行った。
【図２】ピキア・パストリスにおけるｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの精製。
【図２Ａ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴの精製および切断。アミロースセファロースを用いてｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを精製した。ウエスタンブロット（左）およびクマシーブリリアントブルー染色（右）の両方によって、精製済タンパク質を監視した。レーン１：細胞抽出物、レーン２：アミロースビーズから溶出したｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ、およびレーン３：ＴＥＶプロテアーゼによるｃＭＢＰタグ切断後のタンパク質。
【図２Ｂ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ純度およびｃＭＢＰタグ除去効率。レーン１：アミロースカラムからの溶出後のｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン２：過剰なＨｉｓ−ＴＥＶプロテアーゼにより室温で１時間切断されたｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン３：ニッケルカラム再結合によりＴＥＶプロテアーゼを除去し、試料を再濃縮して、純度レベルおよびＴＥＶプロテアーゼによる切断効率をより正確に評価した。
【図３】テロメラーゼ活性の再構成。５００ｎｇの生体外で転写されたｈＴＲを１００ｎｇの精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴに添加してテロメラーゼ活性を再構成し、いくつかの方法で検出した。
【図３Ａ】ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲ（レーン１）、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴのみ（レーン２）またはｈＴＲのみ（レーン３）を用いたテロメラーゼ直接アッセイ。
【図３Ｂ】ｑＴＲＡＰ。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いたテロメラーゼ活性の定量的測定により、再構成された活性が１つの２９３Ｔ細胞で認められたもの（３）よりも約９０００倍高い（１、２）ことが分かった。
【図３Ｃ】ｈＴＲのみ（レーン１）、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ｈＴＲ（レーン２）、およびｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴのみ（レーン３）を用いたＴＲＡＰ（テロメア反復配列の増幅手順）。
【図３Ｄ】ｑＴＲＡＰによって測定したテロメラーゼ再構成の速度。
【図４】ｈＴＥＲＴと内因性酵母ＲＮＡとの結合。
【図４Ａ】アガロースゲル泳動によって示されるように、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてｈＴＥＲＴタンパク質を精製した。レーンＬ：１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）。レーン３：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン４：プロテイナーゼＫで消化したｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。
【図４Ｂ】レーン５：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ。レーン６：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋デオキシリボヌクレアーゼＩ。レーン７：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋リボヌクレアーゼＡ。レーン８：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋リボヌクレアーゼＴ１。レーン９：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ミクロコッカス・ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）。レーン１０：精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴ＋ベンゾナーゼ。
【図５】電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）。５０μＣｉの［α−３２Ｐ］−ＣＴＰを添加してｈＴＲを生体外で合成した。各レーンに対して、１μｇのｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを０．５μｇの標識されたｈＴＲと共に２０μｌ中で１時間インキュベートした。１×ＴＢＥ中に１．２％の冷蔵したアガロースゲル上で複合体を１１０Ｖで２時間泳動させた。このゲルを１０％酢酸および１０％エタノールで１時間固定し、乾燥し、ホスホイメージャースクリーンに露光した。ＳＴＯＲＭ８６０(GE Healthcare社)を使用してスキャンを行った。レーン１はｈＴＲのみを含んでいる。レーン２および３はリボヌクレアーゼＡで精製したｈＴＲおよびｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを含んでいる。レーン４および５はリボヌクレアーゼＡで精製していないｈＴＲおよびｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴを含んでいる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
マルトースをこの系に添加することにより、本発明の融合タンパク質をさらに溶出させた。これにより、ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴまたはｃＭＢＰ−ＴＥＲＴ融合タンパク質を固体担体から溶出させて融合タンパク質を回収することができる。実際のところ、マルトースがアミロースと競合して、融合タンパク質の放出を促進してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
好ましい実施形態では、ｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴは、プロテアーゼを溶出された画分に添加することによりｃＭＢＰタグを切断して外す。前記プロテアーゼは前記融合タンパク質に対してのみ活性であり得、前記融合タンパク質は、融合タンパク質の２つの部分の間に位置する前記プロテアーゼによって認識される切断部位を含むことは明らかである。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする配列がｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴタンパク質およびｃＭＢＰタグをコードするヌクレオチド配列間に付加されている場合、有利なことに溶出された画分中にＴＥＶプロテアーゼを添加することにより２つのポリペプチドの分離が得られる。これらのプロテアーゼの使用については過去に記載されており、市販のキットが利用可能である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
本発明のｈＴＥＲＴ／ＴＥＲＴタンパク質の特性評価
本発明の方法により、ｃＭＢＰでタグ付けされたｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素を産生することができる。興味深いことに、ＭＢＰは先天免疫に関与することが知られているため、本発明の方法により得られるＭＢＰでタグ付けされたｈＴＥＲＴまたはＴＥＲＴ酵素をワクチン組成物などに使用することができる。この場合、ＭＢＰタグの切断は不要であり、本発明の方法は先行技術の精製方法よりもはるかに実施が容易である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴタンパク質をトリプシンで消化し、ＭＳ／ＭＳで分析した。ｈＴＥＲＴは最も高い配列包括度（７５％、図示せず）を有するタンパク質であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
５００ｎｇの生体外で転写されたｈＴＲを１００ｎｇの精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴに添加して、テロメラーゼ活性を再構成した。この活性はテロメラーゼ直接アッセイ（図３Ａ）、テロメア反復配列増幅手順（ＴＲＡＰまたはｑＴＲＡＰ、図３Ｂおよび図３Ｃ）などのいくつかの方法によって明らかとなった。テロメラーゼ活性は、安定期に到達する前の最初の１分間で増加する（図３Ｄ）。最終的にＥＭＳＡにより、組換えｈＴＥＲＴの３２Ｐで標識されたｈＴＲへの結合を示すこともできる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
しかし、ｈＴＥＲＴを出芽酵母α因子の分泌シグナルに融合させた場合（α−ｈＴＥＲＴ、１３６ｋＤａ）、α−ｈＴＥＲＴは細胞内に残留した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。ｈＴＥＲＴおよびα−ｈＴＥＲＴの細胞内および細胞外基質レベルを比較すると、分泌シグナルの添加によってｈＴＥＲＴの発現レベルが高まらないことが分かった。図１Ｆは、α−ＭＢＰ−ｈＴＥＲＴが細胞内または細胞外のいずれにおいてもウエスタンブロット抗ＨＡによってほとんど検出不可能であることも示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
２．３．ＭＢＰのみがｈＴＥＲＴの効率的な精製を可能にする
本発明者らは、いくつかの他のタグ（Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＭＢＰ、ＧＳＴ）の使用により効率的な精製が支援されないことを実証した（ＧＳＴの実施例、図１Ｃを参照）。Ｈｉｓでタグ付けされたｈＴＥＲＴは、精製後にクマシーブリリアントブルー染色によって検出できず、精製済ｃＭＢＰ−ｈＴＥＲＴで得られたテロメラーゼ活性レベルの２〜５％しか生じなかった。ウエスタンブロットでは、そのＮ末端においてＳｔｒｅｐ−タグＩＩに融合されたｈＴＥＲＴを発現するように形質転換された酵母においてタンパク質発現を検出することができず（２種類の異なる構築物を試験）、従って、このタグはタンパク質の発現または安定性にとって有害であり得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
３．ハイスループットスクリーニングにおけるＭＢＰで精製したｈＴＥＲＴの使用
ｃＭＢＰで精製したｈＴＥＲＴを使用して、８０００の構成要素からなる化学ライブラリーを用いて潜在的テロメラーゼ阻害剤を同定した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオチドベクターを含む酵母細胞を増殖させる工程であって、前記ベクターは、
そのＮ末端ペリプラズム標的シグナルが欠失したマルトース結合タンパク質（ｃＭＢＰ）、および
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質
を含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーターを含むことを特徴とする工程と、
ｂ）工程ａ）の細胞の粗製タンパク質抽出物を調製する工程と、
ｃ）必要であれば、前記抽出物のｐＨを６．０〜７．５の範囲内のｐＨに調整する工程と、
ｄ）前記融合タンパク質ｃＭＢＰ−ＴＥＲＴを精製する工程と、
を含む、活性かつ可溶なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質の産生方法。
【請求項２】
前記酵母細胞の細胞内ｐＨが５．８未満の値に到達する前に工程ｂ）を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母細胞はピキア・パストリス細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記構成的プロモーターは、好ましくは配列番号１０の、ＧＡＰＤＨプロモーターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記マルトース結合タンパク質タグは配列番号８のポリペプチド配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列は、前記マルトース結合タンパク質タグをコードする配列と前記ＴＥＲＴタンパク質をコードする配列との間に、プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）は、いかなるプロテアーゼ阻害剤も含有していない水性溶液中での前記酵母細胞の溶解を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｃＭＢＰ−ＴＥＲＴは、アミロース結合固体担体によって、好ましくはアミロース結合アガロースビーズを用いて、精製される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記精製済画分中にプロテアーゼを添加することにより、前記ｃＭＢＰタグを前記ＴＥＲＴタンパク質から切断する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｃＭＢＰに連結されており、および／または酵母ＲＮＡと結合しているＴＥＲＴタンパク質を含有する組成物。
【請求項１１】
ｃＭＢＰに連結されており、および酵母ＲＮＡと結合しているＴＥＲＴタンパク質を含有する請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ｃＭＢＰに連結されており、および／または酵母ＲＮＡと結合しているＴＥＲＴタンパク質と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１３】
ｃＭＢＰに連結されており、および／または酵母ＲＮＡと結合しているＴＥＲＴタンパク質を含有するワクチン組成物。
【請求項１４】
医薬品として使用するための請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１５】
癌の治療に使用するための請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2016537026.tif 000013
2016537026.tif 000014
2016537026.tif 000015