(57)【要約】  本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９などのＲＮＡによってプログラム可能なエンドヌクレアーゼの特異性を改善するための組成物、方法、およびキットを提供する。核酸ターゲットを切断するための改善された特異性を有するように操作されたＣａｓ９のバリアント（例えば、Ｃａｓ９二量体および融合蛋白質）もまた提供される。Ｃａｓ９融合蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ触媒ドメインまたはリコンビナーゼ触媒ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）を用いる部位特異的な核酸改変のための組成物、方法、およびキットもまた提供される。かかるＣａｓ９バリアントは、ＤＮＡの部位特異的な改変（例えばゲノム改変）が関わる臨床および研究の設定において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）ヌクレアーゼとを含む融合蛋白質。
【請求項２】
ヌクレアーゼがＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインの単量体である、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の融合蛋白質の二量体。
【請求項４】
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合する、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
（ａ）請求項４に記載の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合することと、
（ｂ）請求項４に記載の第２の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質の不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、
を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）における融合蛋白質の結合が、融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡは、結合した融合蛋白質間の領域において切断される、
部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡがＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡがＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡが細胞内にある、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が真核細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が個体中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
二量体の各融合蛋白質の不活性なＣａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合し、その結果、１つの融合蛋白質がｇＲＮＡの一部分に結合し、もう一方の融合蛋白質がｇＲＮＡの別の部分に結合する、請求項３に記載の二量体と単一の拡張型ｇＲＮＡとを含む複合体。
【請求項１３】
ｇＲＮＡが長さ少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００ヌクレオチドである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
ターゲット核酸にハイブリダイゼーションする拡張型ｇＲＮＡの領域が、１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む、請求項１２または１３に記載の複合体。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の複合体とＤＮＡを接触させることを含み、
（ａ）ｇＲＮＡが、ＤＮＡの２つの別々の領域にハイブリダイゼーションする２つの部分を含有し、
（ｂ）複合体が、ｇＲＮＡの部分が２つの領域にハイブリダイゼーションすることの結果として、ＤＮＡに結合し、
（ｃ）複合体の結合が、各融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ドメインは、結合した融合蛋白質間の領域においてＤＮＡを切断する、
部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項１６】
ｇＲＮＡの２つの部分がＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはｇＲＮＡの２つの部分がＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｇＲＮＡの２つの部分が、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡが細胞内にある、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が真核細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が個体中にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
個体がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項２５】
請求項１または２に記載の融合蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項２６】
請求項１または２のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含むキット。
【請求項２７】
請求項１または２に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項２８】
ベクターが、請求項１または２に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキット。
【請求項２９】
請求項１または２のいずれか一項に記載の融合蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキット。
【請求項３０】
１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
蛋白質がＤＮＡ切断ドメインを含まない、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質。
【請求項３２】
蛋白質がｇＲＮＡ結合ドメインを含まない、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質。
【請求項３３】
２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含み、ドメイン（ｉｉ）がＤＮＡ切断ドメインを包含しない、融合蛋白質。
【請求項３４】
ドメイン（ｉｉ）がｇＲＮＡ結合ドメインを包含しない、２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）ＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質。
【請求項３５】
請求項３１および３２に記載の蛋白質を含む蛋白質二量体。
【請求項３６】
請求項３１および３４に記載の蛋白質を含む蛋白質二量体。
【請求項３７】
請求項３２および３３に記載の蛋白質を含む蛋白質二量体。
【請求項３８】
請求項３３および３４に記載の蛋白質を含む蛋白質二量体。
【請求項３９】
１つまたは２つ以上のｇＲＮＡをさらに含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の蛋白質二量体。
【請求項４０】
請求項３５に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、二量体が、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項４１】
請求項３６または３７に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、蛋白質二量体が、ＤＮＡの２つの領域にハイブリダイゼーションする２つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項４２】
２つのｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、蛋白質二量体が、ＤＮＡの３つの領域にハイブリダイゼーションする３つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項４４】
３つのＲＮＡが、第１および第２ならびに第２および第３の領域間として１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＤＮＡが細胞内にある、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
細胞が真核細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞が個体中にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
個体がヒトである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５０】
請求項４９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５１】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項５２】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせを発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項５３】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせを含むキット。
【請求項５４】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項５５】
ベクターが、請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキット。
【請求項５６】
請求項３１に記載の蛋白質、請求項３２に記載の蛋白質、請求項３３に記載の融合蛋白質、請求項３４に記載の融合蛋白質、またはその組み合わせを発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキット。
【請求項５７】
１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
蛋白質がＮおよび／またはＣ末端の末端欠損を含み、ＲＮＡ結合およびＤＮＡ切断活性を保持する、最小化されたＣａｓ９蛋白質。
【請求項５９】
Ｎ末端の末端欠損が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を取り除く、請求項５８に記載の蛋白質。
【請求項６０】
Ｃ末端の末端欠損が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を取り除く、請求項５８に記載の蛋白質。
【請求項６１】
ｇＲＮＡをさらに含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項６２】
請求項６１に記載の蛋白質：ｇＲＮＡ複合体とＤＮＡを接触させることを含む、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項６３】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６５】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項６６】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項６７】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質を含むキット。
【請求項６８】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項６９】
ベクターが、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキット。
【請求項７０】
請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキット。
【請求項７１】
１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
二量体が単一のｇＲＮＡを介して連係する、Ｃａｓ９またはその断片の二量体。
【請求項７３】
単一のｇＲＮＡが、（ｉ）それぞれＣａｓ９蛋白質に結合する能力があり且つ（ｉｉ）それぞれターゲット核酸にハイブリダイゼーションする少なくとも２つの部分を含む、請求項７２に記載の二量体。
【請求項７４】
ターゲット核酸にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡの部分が、それぞれ、ターゲット核酸に相補的な５以下、１０以下、または１５ヌクレオチド以下を含む、請求項７３に記載の二量体。
【請求項７５】
ｇＲＮＡの部分同士がリンカー配列によって離間される、請求項７４または７４に記載の二量体。
【請求項７６】
リンカー配列がターゲット核酸にハイブリダイゼーションする、請求項７５に記載の二量体。
【請求項７７】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体とＤＮＡを接触させることを含む、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法。
【請求項７８】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７９】
請求項７８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８０】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項８１】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡを発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項８２】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の請求項の二量体および／またはｇＲＮＡを含むキット。
【請求項８３】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項８４】
ベクターが、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキット。
【請求項８５】
請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の二量体の単量体および／またはｇＲＮＡを発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキット。
【請求項８６】
２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）リコンビナーゼ触媒ドメインとを含む融合蛋白質。
【請求項８７】
リコンビナーゼ触媒ドメインがＨｉｎリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、またはＴｎ３リゾルベースのリコンビナーゼ触媒ドメインの単量体である、請求項８６に記載の融合蛋白質。
【請求項８８】
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合する、請求項８６または８７に記載の融合蛋白質。
【請求項８９】
二量体が核酸に結合し、任意で二量体の各融合蛋白質が核酸の反対鎖に結合する、請求項８８に記載の融合蛋白質の二量体。
【請求項９０】
四量体が１つまたは２つ以上の核酸（単数または複数）に結合する、請求項８８に記載の融合蛋白質の四量体。
【請求項９１】
（ａ）請求項８６に記載の第１の融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合することと、
（ｂ）請求項８６に記載の第２の融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、
（ｃ）請求項８６に記載の第３の融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合することと、
（ｄ）請求項８６に記載の第４の融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することと、
を含み、
それによって、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合が、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらす、
２つのＤＮＡ分子間の部位特異的な組み換えのための方法。
【請求項９２】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが第１のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが第２のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡならびに／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたそれらのそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
（ａ）請求項８６に記載の第１の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合すること、
（ｂ）請求項８６に記載の第２の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合すること、
（ｃ）請求項８６に記載の第３の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第３の領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合すること、
（ｄ）請求項８６に記載の第４の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第４の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合すること、
を含み、
それによって、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合が、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらす、
単一のＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的な組み換えのための方法。
【請求項９５】
ステップ（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡの２つがＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ａ）〜（ｄ）の他の２つのｇＲＮＡがＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＤＮＡが細胞内にある、請求項９１〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
細胞が個体中の真核細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
個体がヒトである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項８６または８７に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０３】
請求項８６または８７に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項１０４】
請求項８６または８７に記載の融合蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項１０５】
請求項８６または８７のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含むキット。
【請求項１０６】
請求項８６または８７に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１０７】
ベクターが、請求項８６または８７に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキット。
【請求項１０８】
請求項８６または８７のいずれか一項に記載の融合蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキット。
【請求項１０９】
１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１０】
核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１１１】
１つまたは２つ以上のドメインがペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって離間される、請求項１１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１１２】
ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカー、トリペプチドＧＧＳの１つもしくは２つ以上のリピートを含むアミノ酸配列、または図１２Ａにおいて提供されるいずれかの配列を含む、請求項１１１に記載の融合蛋白質。
【請求項１１３】
融合蛋白質が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２として示されているヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２のいずれか１つのバリアントもしくは断片によってコードされる、請求項１に記載の融合蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年６月３０日出願の米国出願U.S.S.N14/320,498および２０１４年６月３０日出願の米国出願U.S.S.N14/320,467の米国特許法第３６５条（ｃ）の下における優先権を主張し、２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願61/874,609、２０１３年１２月１２日出願の61/915,414、および２０１４年４月１６日出願の61/980,315の米国特許法第１１９条（ｅ）の下における優先権をもまた主張し、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
部位特異的エンドヌクレアーゼは、ゲノム中の単一部位のターゲティングされたマニピュレーションを理論上は許し、治療および研究応用のための遺伝子ターゲティングの文脈において有用である。哺乳動物を包含するさまざまな生物において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、非相同末端結合または相同組み換えのいずれかを刺激することによるゲノム操作のために用いられて来た。強力な研究ツールを提供することに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは遺伝子治療薬としてのポテンシャルをもまた有し、２つの部位特異的エンドヌクレアーゼが最近になって治験に入っており、（１）ＣＣＲ５−２２４６は、抗ＨＩＶ治療手法の一部としてヒトＣＣＲ−５アレルをターゲティングし（NCT00842634、NCT01044654、NCT01252641）、（２）ＶＦ２４６８４は、抗癌治療手法の一部としてヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターをターゲティングする（NCT01082926）。
【０００３】
オフターゲット活性無しでのまたは最小限のオフターゲット活性のみでの意図するヌクレアーゼターゲット部位の特異的な切断は、部位特異的エンドヌクレアーゼの臨床応用にとって、且つ基礎研究応用における高効率のゲノムマニピュレーションにとってもまた必要条件である。例えば、操作された部位特異的結合ドメインの不完全な特異性は、細胞毒性と意図するターゲットよりも他のゲノム遺伝子座の望まれない変改とにリンクしている。しかしながら、今日利用可能な大部分のヌクレアーゼは相当なオフターゲット活性を見せ、それゆえに臨床応用にとって好適ではなくあり得る。臨床および研究の設定における使用のための新興のヌクレアーゼプラットフォームは、ＲＮＡガイド（ＲＮＡによってガイドされる）ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９である。これらのヌクレアーゼは、特異的なターゲット部位の切断を導くガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合する能力がある一方で、オフターゲット活性が、あるＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体については尚観察される（Pattanayak et al.,「High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.」Nat Biotechnol. 2013; doi: 10.1038/nbt.2673）。そのため、改善された特異性を有するヌクレアーゼを操作するためのテクノロジーが必要とされている。
【０００４】
ターゲティングされた遺伝子マニピュレーションにとって有用な酵素の別のクラスは部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）である。それらの酵素は、短いＤＮＡ配列を認識して結合することによってＤＮＡセグメントの再構成を行う。そこで、それらはＤＮＡバックボーンを切断し、関わる２つのＤＮＡらせんを交換し、ＤＮＡ鎖を再連結する。かかる再構成は、ＤＮＡセグメントのターゲティングされた挿入、逆位、切り出し、または転座を許す。しかしながら、部位特異的エンドヌクレアーゼに似て、天然に存在するＳＳＲは典型的には特異的なコンセンサス配列を認識して結合し、それゆえにこの点で限定される。変改および／または改善された特異性を有するリコンビナーゼを操作するためのテクノロジーもまた必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示のいくつかの側面は、いくつかの操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの報告された毒性がオフターゲットＤＮＡ切断に基づいているという認識に基づく。それゆえに、本明細書に記載されるある側面は、配列数を増大させること（例えば、望まれるターゲットにおいて１つよりも多くの部位においてヌクレアーゼを結合させること）、および／またはヌクレアーゼの活性（例えば、ターゲット結合およびターゲット切断）を２つもしくは３つ以上の蛋白質の間で分割することが、ヌクレアーゼの特異性を増大させ、それによってオフターゲット効果の見込みを減少させるであろうという発見に関する。従って、本開示のいくつかの側面は、部位特異的ヌクレアーゼ（特に、ＲＮＡによってプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）の特異性を改善するための戦略、組成物、システム、および方法を提供する。本開示のある側面は、改善された特異性を有するように操作されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼのバリアントを提供する。
【０００６】
本開示の他の側面は、今日利用可能な部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）が、別個のコンセンサス配列を認識して結合することに典型的には限定されているという認識に基づく。それゆえに、本明細書に記載されるある側面は、ＲＮＡによってプログラム可能な（ヌクレアーゼ不活性型）ヌクレアーゼ（またはそのＲＮＡ結合ドメイン）とリコンビナーゼドメインとの間の融合体が、例えば業者によって選ばれたいずれかの部位（例えば、組み換えられるべきエリアの配列に従って操作または選択されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって規定される部位）において、ＤＮＡに結合して組み換える力能が理論上はある新規のリコンビナーゼを提供する、という発見に関する。そのため、かかる新規のリコンビナーゼは、ことに、ターゲティングされた挿入、欠失、逆位、転座、または他のゲノム改変にとって有用である。それゆえに、例えばかかるターゲティングされたゲノムマニピュレーションのためにそれらの本発明リコンビナーゼ融合蛋白質を用いる方法もまた提供される。
【０００７】
従って、本開示の１つの態様は、融合蛋白質およびその二量体、例えば２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと（ｉｉ）ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインの単量体）とを含む融合蛋白質を提供する。例えば、図１Ａ、６Ｄ参照。融合蛋白質は核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含み得、これは融合蛋白質が細胞の核内に輸送されるようにシグナルを送る。いくつかの態様において、融合蛋白質の１つまたは２つ以上のドメインはリンカーによって離間される。ある態様において、リンカーは非ペプチド性のリンカーである。ある態様において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーのケースでは、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮリンカー、トリペプチドＧＧＳの１つまたは２つ以上のリピート（反復）を含むアミノ酸配列、または図１２Ａにおいて提供されるいずれかの配列を含み得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２として示されているヌクレオチド配列または配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２のいずれか１つのバリアントもしくは断片によってコードされる。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合する力能がある。ある態様において、ターゲット核酸の２つの別個の領域に結合するｇＲＮＡをそれぞれ含むかかる融合蛋白質の二量体を有することは、例えば、ターゲット核酸への結合を導く単一の（シングル）ｇＲＮＡを含む単量体ＲＮＡガイドヌクレアーゼと比較して改善された特異性を可能にする。
【０００８】
本発明の別の側面に従って、本発明Ｃａｓ９バリアントを用いる部位特異的なＤＮＡ切断のための方法が提供される。方法は、（ａ）本発明の融合蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインとＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質）をＤＮＡと接触させ、不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合すること、（ｂ）第２の融合蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質）をＤＮＡと接触させ、第２の融合蛋白質の不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することを典型的には含み、ステップ（ａ）および（ｂ）における融合蛋白質の結合が融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡは、結合した融合蛋白質間の領域において切断される。いくつかの態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡはＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡはＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ＤＮＡは細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）内にあり、これはヒトなどの個体中にあり得る。
【０００９】
別の態様に従って、本発明の融合蛋白質の二量体（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質の二量体）を含む複合体が提供される。いくつかの態様において、二量体の各融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは単一の拡張型ｇＲＮＡに結合し、その結果、二量体の１つの融合蛋白質はｇＲＮＡの一部分に結合し、二量体のもう一方の融合蛋白質はｇＲＮＡの別の部分に結合する。例えば図１Ｂ参照。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは長さ少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションする拡張型ｇＲＮＡの領域は１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む。
【００１０】
別の態様において、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法が提供され、単一の拡張型ｇＲＮＡに結合した２つの本発明融合蛋白質の複合体とＤＮＡを接触させることを含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、切断されるべきＤＮＡの２つの別々の領域にハイブリダイゼーションする２つの部分を含有し、複合体は、ｇＲＮＡの部分が２つの領域にハイブリダイゼーションすることの結果としてＤＮＡに結合し、複合体の結合は、融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ドメインは、結合した融合蛋白質間の領域においてＤＮＡを切断する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの２つの部分はＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションする。他の態様において、ｇＲＮＡの２つの部分はＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ｇＲＮＡの２つの部分は、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ＤＮＡは細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）内にあり、それはヒトなどの個体中にあり得る。
【００１１】
本発明の別の態様に従って、Ｃａｓ９蛋白質の断片を含む分割型Ｃａｓ９蛋白質（分割型Ｃａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質を包含する）が提供される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを包含するがＤＮＡ切断ドメインを包含しない蛋白質が提供される。他の態様において、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含むがｇＲＮＡ結合ドメインを含まない蛋白質が提供される。いくつかの態様において、２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質が提供され、例えば、ドメイン（ｉｉ）はＤＮＡ切断ドメインを包含しない。例えば図２Ｂ参照。いくつかの態様において、２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと（ｉｉ）ＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質が提供され、例えば、ドメイン（ｉｉ）はｇＲＮＡ結合ドメインを包含しない。例えば、図２Ｃ（「Ｂ」ドメインを含む右側の融合蛋白質）参照。いくつかの態様において、本明細書に記載される蛋白質のいずれかの蛋白質二量体が提供される。例えば、いくつかの態様において、二量体は、分割型Ｃａｓ９蛋白質の２つの片割れ（ハーフ）、例えば（ｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むがＤＮＡ切断ドメインを含まない蛋白質および（ｉｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含むがｇＲＮＡ結合ドメインを含まない蛋白質を含む。例えば、図２Ａ参照。いくつかの態様において、二量体は、分割型Ｃａｓ９蛋白質の１つの片割れと、分割型Ｃａｓ９蛋白質のもう一方の片割れを含む融合蛋白質とを含む。例えば、図２Ｂ参照。例えば、ある態様において、かかる二量体は、（ｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むがＤＮＡ切断ドメインを含まない蛋白質および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質を含む。他の態様において、二量体は、（ｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含むがｇＲＮＡ結合ドメインを含まない蛋白質および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質を含む。いくつかの態様において、２つの融合蛋白質を含む二量体が提供され、各融合蛋白質はヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と分割型Ｃａｓ９の１つの片割れとを含む。例えば図２Ｃ参照。例えば、ある態様において、かかる二量体は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質を含む。いくつかの態様において、提供される蛋白質二量体のいずれかは１つまたは２つ以上のｇＲＮＡ（単数または複数）と結びつく。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明の蛋白質二量体を利用する部位特異的なＤＮＡ切断のための方法が提供される。例えば、いくつかの態様において、かかる方法は、（ｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むがＤＮＡ切断ドメインを含まない蛋白質と（ｉｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含むがｇＲＮＡ結合ドメインを含まない蛋白質とを含む蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、二量体が、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる。例えば図２Ａ参照。いくつかの態様において、部位特異的なＤＮＡ切断のために用いられる蛋白質二量体は、（ｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むがＤＮＡ切断ドメインを含まない蛋白質および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質を含む。例えば、図２Ｂ参照。いくつかの態様において、部位特異的なＤＮＡ切断のために用いられる二量体は、（ｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含むがｇＲＮＡ結合ドメインを含まない蛋白質と（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質とを含む。いくつかの態様において、蛋白質二量体は、ＤＮＡの２つの領域にハイブリダイゼーションする２つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる。例えば図２Ｂ参照。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、部位特異的なＤＮＡ切断に用いられる二量体は、２つの融合蛋白質（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質を含む。いくつかの態様において、蛋白質二量体は、ＤＮＡの３つの領域にハイブリダイゼーションする３つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる。かかる編成を有することは（例えば、１つよりも多くのｇＲＮＡ（または、ターゲットにハイブリダイゼーションする１つよりも多くの領域を含むｇＲＮＡ）と結びついた二量体を用いて、例えば、ターゲット核酸の１つよりも多くの領域をターゲティングすることは）、ヌクレアーゼがターゲット核酸の単一の領域に結合することと比較して切断の特異性を増大させる。いくつかの態様において、３つのｇＲＮＡは、第１および第２ならびに第２および第３の領域間において１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ＤＮＡは細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）内にあり、それはヒトなどの個体中にあり得る。
【００１３】
別の態様に従って、最小限のＣａｓ９蛋白質が提供され、例えば、蛋白質はＮおよび／またはＣ末端の末端欠損を含み、ＲＮＡ結合およびＤＮＡ切断活性を保持する。いくつかの態様において、Ｎ末端の末端欠損は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を取り除く。いくつかの態様において、Ｃ末端の末端欠損は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を取り除く。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質は、結合したｇＲＮＡをさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法が提供され、最小化されたＣａｓ９蛋白質：ｇＲＮＡ複合体とＤＮＡを接触させることを含む。
【００１５】
別の態様に従って、Ｃａｓ９（またはその断片）の二量体が提供され、二量体はシングルｇＲＮＡを介して連係する。いくつかの態様において、シングルｇＲＮＡは、（ｉ）それぞれＣａｓ９蛋白質に結合する能力があり且つ（ｉｉ）それぞれターゲット核酸配列（例えばＤＮＡ配列）にハイブリダイゼーションする少なくとも２つの部分を含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡの部分は、ターゲット核酸配列に相補的な５以下、１０以下、または１５ヌクレオチド以下をそれぞれ含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡの部分はリンカー配列によって離間される。いくつかの態様において、リンカー配列はターゲット核酸にハイブリダイゼーションする。例えば図４参照。いくつかの態様において、部位特異的なＤＮＡ切断のための方法が提供され、シングルｇＲＮＡを介して連係するＣａｓ９蛋白質の二量体とＤＮＡを接触させることを含む。
【００１６】
別の態様に従って、本開示は、融合蛋白質ならびにその二量体および四量体、例えば２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと（ｉｉ）リコンビナーゼ触媒ドメインとを含む融合蛋白質を提供する。例えば図５参照。リコンビナーゼ触媒ドメインは、いくつかの態様において、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、またはＴｎ３リゾルベースのリコンビナーゼ触媒ドメインに由来する。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは、ｇＲＮＡに結合して例えば融合蛋白質をターゲット核酸配列にターゲティングする力能がある。融合蛋白質は核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含み得、これは融合蛋白質が細胞の核内に輸送されるようにシグナルを送る。いくつかの態様において、融合蛋白質の１つまたは２つ以上のドメインはリンカーによって離間される。ある態様において、リンカーは非ペプチド性のリンカーである。ある態様において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーのケースでは、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮリンカー、トリペプチドＧＧＳの１つまたは２つ以上のリピートを含むアミノ酸配列、または図１２Ａにおいて提供されるいずれかの配列を含み得る。
【００１７】
別の態様において、部位特異的な組み換えのための方法が提供され、これは本明細書に記載される本発明ＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質を利用する。いくつかの態様において、方法は、２つの別々のＤＮＡ分子を組み換えることにとって有用であり、（ａ）第１のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第一のｇＲＮＡに結合することと、（ｂ）第２のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、（ｃ）第３のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合することと、（ｄ）第４のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することとを含み、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合は、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらす。いくつかの態様において、単一のＤＮＡ分子の２つの領域間における部位特異的な組み換えのための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、（ａ）第１のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合すること、（ｂ）第２のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合すること、（ｃ）第３のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第３の領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合すること、（ｄ）第４のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第４の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することを含み、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合は、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらす。部位特異的な組み換えのための方法が関わるいくつかの態様において、同じＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡはＤＮＡ分子の反対鎖にハイブリダイゼーションする。例えば、単一のＤＮＡ分子の部位特異的な組み換えが関わるいくつかの態様において、２つのｇＲＮＡがＤＮＡの１つの鎖にハイブリダイゼーションし、もう一方の２つのｇＲＮＡは反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れた（例えば同じ鎖上の）それらのそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ＤＮＡは細胞（例えば真核細胞または原核細胞）内にあり、それはヒトなどの個体中にあり得るか、またはそれから得られる。
【００１８】
別の態様に従って、ポリヌクレオチドが提供され、例えばそれらは本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質のいずれか（例えば、Ｃａｓ９バリアント、Ｃａｓ９二量体、Ｃａｓ９融合蛋白質、Ｃａｓ９断片、最小化されたＣａｓ９蛋白質、切断ドメインを有さないＣａｓ９バリアント、ｇＲＮＡドメインを有さないＣａｓ９バリアント、Ｃａｓ９−リコンビナーゼ融合体など）をコードする。いくつかの態様において、本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるいずれかの本発明Ｃａｓ９蛋白質と本明細書に記載されるｇＲＮＡ（単数または複数）のいずれかの組み合わせとをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え蛋白質発現のためのベクターが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡのいずれかを発現するための遺伝子構築物を含む細胞が提供される。
【００１９】
いくつかの態様において、キットが提供される。例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡのいずれかを含むキットが提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡをコードするもの）のいずれかを含むキットが提供される。いくつかの態様において、組み換え蛋白質発現のためのベクターを含むキットが提供され、ベクターは、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質および／またはｇＲＮＡのいずれかを発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含むキットが提供される。
【００２０】
本発明の他の利点、特徴、および使用は、本発明のある限定しない態様の詳細な記載、図面（これらは模式的であり、一定の縮尺で描かれることは意図されていない）、および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のある態様を詳述する模式図である。（Ａ）この態様において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９蛋白質はＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの単量体に融合している。二本鎖ＤＮＡ切断は、ターゲット部位におけるＦｏｋＩ単量体の二量体化によって達成され、２つの別個のＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の同時の結合に依存する。（Ｂ）この態様においては代替の配置が提供され、２つのＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合体が、２つの別個のｇＲＮＡモチーフを含有する単一の拡張型ｇＲＮＡの作用を介して連係する。ｇＲＮＡモチーフは、別個の領域においてターゲットにハイブリダイゼーションする領域、さらには各融合蛋白質に結合する領域を含む。拡張型ｇＲＮＡは協同的結合を向上させ、融合体の特異性プロファイルを変改し得る。
【００２２】
【図２】本発明のある態様を詳述する模式図である。（Ａ）この態様において、二量体分割型Ｃａｓ９はＡ）ｇＲＮＡ結合能力をＢ）ｄｓＤＮＡ切断から分離している。ＤＮＡ切断は、蛋白質の両ハーフが共局在して結びつき、リフォールディングしてヌクレアーゼ活性状態になるときに起こる。（Ｂ）この態様において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９変異体は分割型Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＡハーフ（または、いくつかの態様においてはＢハーフ）に融合している。ターゲット部位におけるＣａｓ９−Ａハーフ（またはＣａｓ９−Ｂハーフ）融合体および不活性なｇＲＮＡ結合Ｃａｓ９−Ｂハーフ（それぞれ、またはＡハーフ）両方の結合によって、分割型蛋白質再アセンブリに続いてｄｓＤＮＡ切断が可能になる。この分割型Ｃａｓ９対は２つの別個のｇＲＮＡ結合Ｃａｓ９蛋白質を用いて、分割型ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９が正しいターゲット配列上でのみ再アセンブリするということを保証し得る。（Ｃ）この態様において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９変異体は分割型Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＡハーフに融合される。別のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９変異体が分割型Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＢハーフに融合される。ｇＲＮＡターゲット部位への１つのヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９変異体の結合および第２のｇＲＮＡターゲット部位へのもう一方のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９変異体の結合によって、分割型Ｃａｓ９ハーフは二量体化して第３のｇＲＮＡターゲットに結合し、ｄｓＤＮＡを切断し得る完全に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼになり得る。この分割型Ｃａｓ９対は、３つの別個のｇＲＮＡ結合Ｃａｓ９蛋白質を用いて、分割型ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９が正しいターゲット配列上でのみ再アセンブリするということを保証する。不活性なＣａｓ９の代わりのいずれかの他のＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ蛋白質など）が、分割型Ｃａｓ９ヌクレアーゼの再アセンブリを完成するために用いられ得る。
【００２３】
【図３】Ｃａｓ９活性のための必須ドメインを含む最小限のＣａｓ９蛋白質を模式的に示す。全長Ｃａｓ９は、＞１５０ｋＤａの蛋白質をもたらす４．１ｋｂ遺伝子である。特異的な欠失および／または末端欠損は、その活性（例えば、ｇＲＮＡ結合およびＤＮＡ切断活性）に影響すること無しにＣａｓ９のサイズを減少させる。最小化されたＣａｓ９蛋白質は、例えば、ＡＡＶ（約＜４７００ｂｐの配列を収容する）もしくはレンチウイルス（約＜９ｋｂの配列を収容する）などのウイルスベクターを用いる、または多重のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９手法を追求するときの細胞への送達の有効性を増大させる。
【００２４】
【図４】２つのＣａｓ９蛋白質が、２つの別個のｇＲＮＡモチーフを含有する単一の拡張型ＲＮＡの作用を介してどのように連係し得るのかを示す。各ｇＲＮＡターゲティング領域は短縮されており、その結果、単一のＣａｓ９：ｇＲＮＡ単位はそれ自体では効率的に結合し得ない。通常の２０ｎｔターゲティング配列が変改されており、その結果、何らかの部分（例えば、５’の初めの１０ｎｔ）がＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）などの何らかの非特異的リンカー配列に変化しており、残るｇＲＮＡの１０ｎｔのみがターゲット結合を導く（代替的には、この５’の１０ｎｔは全く末端欠損する）。この「低親和性」ｇＲＮＡ単位はタンデムなｇＲＮＡ構築物の一部として存在し、第２の別個の低親和性ｇＲＮＡ単位が下流にあり、リンカー配列によって離間されている。いくつかの態様においては、２つよりも多くの低親和性ｇＲＮＡ単位（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５など）がある。いくつかの態様において、リンカーはターゲット核酸相補配列（例えば、ＤＮＡターゲットに接触するリンカー領域によって図示されている）を含む。
【００２５】
【図５】Ｃａｓ９−リコンビナーゼ融合体が、どのようにｇＲＮＡを介して連係し、望まれる配列（部位）においてターゲットＤＮＡに結合して組み換え得るのかを模式的に示す。（Ａ、Ｂ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）蛋白質がリコンビナーゼドメインの単量体（Ｒｅｃ）に融合されている。部位特異的な組み換えは、ターゲット部位におけるリコンビナーゼ触媒ドメイン単量体の二量体化（Ａ）、それから、別々のＣａｓ９組み換え部位上でアセンブリされた２つの二量体の四量体化（Ｂ）によって達成される。ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体への融合はフランキングする（脇に接続する）ターゲット部位の配列アイデンティティーを決定し、一方で、リコンビナーゼ触媒ドメインはコア配列（２つのｄＣａｓ９結合部位間の配列）のアイデンティティーを決定する。（Ｂ）組み換えは、ｄＣａｓ９−リコンビナーゼ四量体複合体内における鎖切断、交換、および再ライゲーションによって進む。
【００２６】
【図６】Ｃａｓ９およびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合バリアントの構成を示す。（Ａ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との複合体のＣａｓ９蛋白質がターゲットＤＮＡに結合する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９蛋白質はＰＡＭ配列ＮＧＧを認識して、ｄｓＤＮＡの巻き戻しおよびｇＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対形成を開始する。（Ｂ）試験されたＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体構成。ＮＬＳ、ＦｏｋＩヌクレアーゼ、およびｄＣａｓ９の４つの別個の配置がアセンブリされた。１７個の（１７）蛋白質リンカーバリアントもまた試験された。（Ｃ）ＧＦＰ内の試験されたｇＲＮＡターゲット部位。７つのｇＲＮＡターゲット部位が、切断されるスペーサー配列からＰＡＭが遠位である並び（並びＡ）において、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９活性を試験するために選ばれた。まとめると、これらの７つのｇＲＮＡは、５〜４３ｂｐに渡るスペーサー長についてＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合バリアントの試験を可能にした。スペーサー配列にＰＡＭが隣接した並びＢを試験するために用いられたガイドＲＮＡについては、図９参照。（Ｄ）ｄＣａｓ９に融合されたＦｏｋＩヌクレアーゼの単量体が、ターゲット遺伝子座内の別々の部位に結合する。隣接して結合したＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９単量体のみが触媒活性なＦｏｋＩヌクレアーゼ二量体をアセンブリして、ｄｓＤＮＡ切断を誘発し得る。（Ｃ）に示されている配列は以下の通り同定される。「ＥｍＧＦＰ（ｂｐ３２６−４１５）」は配列番号２０４に対応し、「Ｇ１」は配列番号２０５に対応し、「Ｇ２」は配列番号２０６に対応し、「Ｇ３」は配列番号２０７に対応し、「Ｇ４」は配列番号２０８に対応し、「Ｇ５」は配列番号２０９に対応し、「Ｇ６」は配列番号２１０に対応し、「Ｇ７」は配列番号２１１に対応する。
【００２７】
【図７】ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９によるゲノムＤＮＡ改変を示している。（Ａ）は、ｇＲＮＡ無しかまたは並びＡのＧＦＰ遺伝子をターゲティングする可変スペーサー長のｇＲＮＡ対のいずれかを有する、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９のＧＦＰ破壊活性を図示するグラフを示す。（Ｂ）はゲルの画像であり、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９とＧＦＰ部位をターゲティングする１４ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＧ３およびＧ７。図６Ｃ）、個体的に各ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡ無しとによって処置された細胞から増幅された、変性から回復した（renatured）ターゲット部位ＤＮＡのSurveyor切断アッセイのＰＡＧＥ分析からの、ｉｎｄｅｌ改変効率を示している。ｉｎｄｅｌ改変パーセンテージが、検出限界（約２％）を超える改変を有するサンプルについて各レーンの下に示されている。（Ｃ〜Ｇ）は、（Ｃ）ＧＦＰ部位をターゲティングする１４または２５ｂｐの間隔のｇＲＮＡの２つの対、（Ｄ）ＣＬＴＡ部位をターゲティングする１９ｂｐの間隔のｇＲＮＡの１つの対、（Ｅ）ＥＭＸ部位をターゲティングする２３ｂｐの間隔のｇＲＮＡの１つの対、（Ｆ）ＨＢＢ部位をターゲティングする１６ｂｐの間隔のｇＲＮＡの１つの対、および（Ｇ）ＶＥＧＦ部位をターゲティングする１４または１６ｂｐの間隔のｇＲＮＡの２つの対について、ｉｎｄｅｌ改変効率を図示するグラフを示す。エラーバーは、異なる日に行われた３つの生物学的レプリケートからの平均の標準誤差を反映している。
【００２８】
【図８】ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９のＤＮＡ改変特異性を示す。（Ａ）は、並びＡのｇＲＮＡ対を用いる野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、およびｆＣａｓ９によるＧＦＰ遺伝子破壊を図示するグラフを示す。ｆＣａｓ９の高い活性は、おおよそ１つのＤＮＡらせん回転分離れた約１５および２５ｂｐのスペーサー長を要求する。（Ｂ）は、並びＢのｇＲＮＡ対を用いるＧＦＰ遺伝子破壊を図示するグラフを示す。Ｃａｓ９ニッカーゼはｇＲＮＡ対のいずれの並びをも受け入れるが、ｆＣａｓ９はしない。（Ｃ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは野生型Ｃａｓ９ではなくｆＣａｓ９によるＧＦＰ遺伝子破壊を図示するグラフを示し、これは２つのｇＲＮＡの存在に依存する。４つのシングルｇＲＮＡが、いろいろなスペーサー長の３つのｇＲＮＡ対と併せて試験された。１４または２５ｂｐのスペーサー長を有する並びＡのｇＲＮＡ対（それぞれｇＲＮＡの１＋５およびｇＲＮＡの３＋７）の存在下では、ｆＣａｓ９は活性であるが、１０ｂｐスペーサーを有するｇＲＮＡ対（ｇＲＮＡの１＋４）が用いられるときにはそうではなかった。（Ａ〜Ｃ）において、「処置無し」は、プラスミドＤＮＡを受容しない細胞を言う。（Ｄ〜Ｆ）は、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、もしくは野生型Ｃａｓ９と（Ｄ）ＣＬＴＡ部位をターゲティングする１９ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＣ１およびＣ２）、（Ｅ）ＥＭＸ部位をターゲティングする２３ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＥ１およびＥ２）、または（Ｆ、Ｇ）ＶＥＧＦ部位をターゲティングする１４ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＶ１およびＶ２）とによって処置されたヒト細胞からの、増幅されたゲノムオンターゲット部位およびオフターゲット部位のハイスループットＤＮＡシーケンシングから、ｉｎｄｅｌ変異頻度を図示するグラフを示している。（Ｇ）は、ＶＥＧＦオフターゲット部位１におけるゲノム改変を測定するための２つの詳しい試験を図示するグラフを示す。試験１は、ゲノムインプットＤＮＡの１５０ｎｇと＞８×１０５個の配列リードとを各サンプルについて用いた。試験２は、ゲノムインプットＤＮＡの６００ｎｇと＞２３×１０５個の配列リードとを各サンプルについて用いた。（Ｄ〜Ｇ）においては、全ての有意な（Ｐ値＜０．００５、フィッシャーの正確確率検定）ｉｎｄｅｌ頻度が示されている。Ｐ値は表３に列挙されている。（Ｄ〜Ｆ）については、各オン（On）およびオフ（Off）ターゲットサンプルが１回シーケンシングされ、＞１０，０００個の配列がオンターゲットサンプルあたり分析され、平均７６，２６０個の配列がオフターゲットサンプルあたり分析された（表３）。（Ｃ）に示されている配列は、上から下へ、以下の通り同定される。図８Ｃの上に見いだされる配列は配列番号２０４に対応し、「Ｇ１」は配列番号２０５に対応し、「Ｇ３」は配列番号２０７に対応し、「Ｇ５」は配列番号２０９に対応し、「Ｇ７」は配列番号２１１に対応し、「Ｇ１＋４」は配列番号２０５および配列番号２０８に対応し、「Ｇ１＋５」は配列番号２０５および配列番号２０９に対応し、「Ｇ３＋７」は配列番号２０７および配列番号２１１に対応する。
【００２９】
【図９】ゲノムＧＦＰ遺伝子中のターゲットＤＮＡ配列を示す。７つのｇＲＮＡターゲット部位が、切断されるスペーサー配列にＰＡＭが隣接した並び（並びＢ）においてＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９候補活性を試験するために選ばれた。まとめると、これらの７つのｇＲＮＡは、４〜４２ｂｐに渡る６つのスペーサー長についてＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合バリアントの試験を可能にした。示されている配列は以下の通り同定される。「ＥｍＧＦＰ（ｂｐ２９７−３８８）」は配列番号２１２に対応し、「Ｇ８」は配列番号２１３に対応し、「Ｇ９」は配列番号２１４に対応し、「Ｇ１０」は配列番号２１５に対応し、「Ｇ１１」は配列番号２１６に対応し、「Ｇ１２」は配列番号２１７に対応し、「Ｇ１３」は配列番号２１８に対応し、「Ｇ１４」は配列番号２１９に対応する。
【００３０】
【図１０】ゲノムＤＮＡ改変活性を測定するためのＧＦＰ破壊アッセイを示す。（Ａ）は、候補ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合構築物の活性を試験するために用いられる、ゲノムインテグレーションされたＥｍＧＦＰ遺伝子を恒常的に発現するＨＥＫ２９３由来細胞株を模式的に図示している。適切なヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ発現プラスミドによるそれらの細胞のコトランスフェクションは、ＥｍＧＦＰコード配列内におけるｄｓＤＮＡ切断に至り、誤りがちなＮＨＥＪを刺激して、ＧＦＰの発現を破壊し得るｉｎｄｅｌを作出し、細胞蛍光の喪失に至る。それから、ＧＦＰ蛍光の喪失を表示する細胞の画分がフロー部位メトリーによって定量される。（Ｂ）は、野生型Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現プラスミドによるコトランスフェクションの前および後のＥｍＧＦＰ−ＨＥＫ２９３細胞の２００×倍率での典型的な落射蛍光顕微鏡法画像を示す。
【００３１】
【図１１】異なる並びおよびいろいろなスペーサー長のｇＲＮＡ対と組み合わせられたＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体候補の活性を図示するグラフを示す。図６Ｂに記載されている融合体構成が、全ての（Ａ）並びＡのｇＲＮＡスペーサーおよび（Ｂ）並びＢのｇＲＮＡスペーサー（図６Ｃおよび図９）について、ＧＦＰ機能喪失レポーターを用いるフロー部位メトリーによって、機能性について試験された。示されている全てのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体データは単一の試験の結果である。野生型Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼデータは２つのレプリケートの平均であり、一方、「処置無し」負のコントロールデータは６つのレプリケートの平均であり、エラーバーは１標準偏差を表す。Ｙ軸と交差する灰色点線は、同日に行われた「処置無し」コントロールの平均に対応する。「（ＧＧＳ）ｘ３」として示されている配列は配列番号１４に対応する。
【００３２】
【図１２】ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９中の蛋白質リンカーの最適化を示す。（Ａ）は、試験された全てのリンカーバリアントの表を示す。野生型Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼが比較のために包含された。ＦｏｋＩとｄＣａｓ９との間に（ＧＧＳ）３（配列番号１４）リンカーを有する初めの活性構築物ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９が、各種の代替のリンカーについて試験された。ｆＣａｓ９のためのリンカーの最終的な選り抜きが強調されている。（Ｂ）は、リンカーバリアントを有するＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体の活性を図示するグラフを示す。各バリアントは、ｇＲＮＡ対並びＡを用いて５〜４３ｂｐのスペーサー長の範囲について試験された。ｇＲＮＡを欠くコントロール（「ｇＲＮＡ無し」）が、各別々の融合構築物について包含された。ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９バリアントＬ８は、Ｃａｓ９ニッカーゼの活性に迫る最良の活性を示した。バリアントＬ４〜Ｌ９は１４および２５ｂｐスペーサー長でピーク活性を示し、ｄｓＤＮＡのおおよそ１つのらせん回転分離れた２つの最適なスペーサー長を示唆している。（Ａ）に示されている配列は以下の通り同定される。ＧＧＳＧＧＳＧＧＳは配列番号１４に対応し、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳは配列番号１５に対応し、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡは配列番号２２に対応し、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳは配列番号２３に対応し、ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣは配列番号１９に対応し、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳは配列番号２４に対応し、ＭＳＲＰＤＰＡは配列番号２５に対応し、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦは配列番号２０に対応し、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡは配列番号１７に対応し、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳは配列番号１６に対応し、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳは配列番号１８に対応し、ＧＧＳＭは配列番号３０１に対応し、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡは配列番号２１に対応する。
【００３３】
【図１３】内在性ヒトＥＭＸ、ＶＥＧＦ、ＣＬＴＡ、およびＨＢＢ遺伝子内のターゲットＤＮＡ配列を示す。内在性ヒトＥＭＸ、ＶＥＧＦ、ＣＬＴＡ、およびＨＢＢ遺伝子内の試験されたｇＲＮＡターゲット部位が示されている。１３個のｇＲＮＡターゲット部位が選ばれ、切断されるスペーサー配列からＰＡＭが遠位である並び（並びＡ）で、最適化されたｆＣａｓ９融合体の活性を試験した。まとめると、これらの１３個のｇＲＮＡは、５〜４７ｂｐに渡る８つのスペーサー長についてｆＣａｓ９融合バリアントの試験を可能にした。示されている配列は以下の通り同定される。「ＣＬＴＡ−１」は配列番号２２０に対応し、「Ｃ１」は配列番号２２１に対応し、「Ｃ２」は配列番号２２２に対応し、「Ｃ３」は配列番号２２４に対応し、「Ｃ４」は配列番号２２５に対応し、「ＨＢＣ」は配列番号２２６に対応し、「Ｈ１」は配列番号２２７に対応し、「Ｈ２」は配列番号２２８に対応し、「Ｈ３」は配列番号２２９に対応し、「Ｈ４」は配列番号２３０に対応し、「Ｈ５」は配列番号２３１に対応し、「Ｈ６」は配列番号２３２に対応し、「Ｈ７」は配列番号２３３に対応し、「ＥＭＸ」は配列番号２３４に対応し、「Ｅ１」は配列番号２３５に対応し、「Ｅ２」は配列番号２３６に対応し、「Ｅ３」は配列番号２３７に対応し、「ＶＥＧＦ」は配列番号２３８に対応し、「Ｖ１」は配列番号２３９に対応し、「Ｖ２」は配列番号２４０に対応し、「Ｖ３」は配列番号２４１に対応し、「Ｖ４」は配列番号２４２に対応する。
【００３４】
【図１４】ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９によるゲノムＤＮＡ改変のスペーサー長選好性を図示するグラフを示している。（Ａ）ＧＦＰ部位をターゲティングするｇＲＮＡの対、（Ｂ）ＣＬＴＡ部位をターゲティングするｇＲＮＡの対、（Ｃ）ＥＭＸ部位をターゲティングするｇＲＮＡの対、（Ｄ）ＨＢＢ部位をターゲティングするｇＲＮＡの対、および（Ｅ）ＶＥＧＦ部位をターゲティングするｇＲＮＡの対についてのｉｎｄｅｌ改変効率。エラーバーは、異なる日に行われた３つの生物学的レプリケートからの平均の標準誤差を反映している。
【００３５】
【図１５】Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現プラスミドのいろいろな量での、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９によるゲノムＤＮＡ改変の効率を図示するグラフを示す。ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９と２つのターゲット部位ｇＲＮＡとによって処置された細胞の集団から増幅された、変性から回復したターゲット部位ＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイからのｉｎｄｅｌ改変効率。Ｃａｓ９発現プラスミドの７００ｎｇとｇＲＮＡ発現プラスミドの２５０ｎｇ（合計９５０ｎｇ）、Ｃａｓ９発現プラスミドの３５０ｎｇとｇＲＮＡ発現プラスミドの１２５ｎｇ（合計で４７５ｎｇ）、Ｃａｓ９発現プラスミドの１７５ｎｇとｇＲＮＡ発現プラスミドの６２．５ｎｇ（合計で２３８ｎｇ）、またはＣａｓ９発現プラスミドの８８ｎｇとｇＲＮＡ発現プラスミドの３１ｎｇ（合計で１１９ｎｇ）いずれかが、不活性な担体プラスミドの適切な量と一緒にトランスフェクションされ、全ての処置についてプラスミドの９５０ｎｇの一様なトランスフェクションを保証した。（Ａ）ＣＬＴＡ部位をターゲティングする１９ｂｐの間隔のｇＲＮＡ、（Ｂ）ＥＭＸ部位をターゲティングする２３ｂｐの間隔のｇＲＮＡ、および（Ｃ）ＶＥＧＦ部位をターゲティングする１４ｂｐの間隔のｇＲＮＡについてのｉｎｄｅｌ改変効率。エラーバーは、別々の日に行われた３つの生物学的レプリケートからの平均の標準誤差を表す。
【００３６】
【図１６】ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９がシングルｇＲＮＡの存在下でゲノムＤＮＡを改変する能力を示す。（Ａ）はゲルの画像を示し、Ｃａｓ９蛋白質とｇＲＮＡ（単数または複数）との指示された組み合わせによって処置された細胞のＤＮＡからのゲノムＧＦＰターゲットのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを図示している。シングルｇＲＮＡは、ｆＣａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼ両方について、検出可能なレベルでのゲノム改変を誘導しない（＜２％の改変）。野生型Ｃａｓ９は、全ての試験されたシングルおよび対ｇＲＮＡについてＧＦＰターゲットを有効に改変する。ｆＣａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼ両方について、適切な対ｇＲＮＡは、野生型Ｃａｓ９のものに匹敵するレベルでゲノム改変を誘導する。（Ｂ）は、野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｆＣａｓ９を発現するプラスミドと単一のｇＲＮＡ（Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５、またはＧ７）を発現する単一のプラスミドまたはそれぞれ異なるｇＲＮＡ（Ｇ１＋Ｇ５またはＧ３＋Ｇ７）を発現する２つのプラスミドいずれかとによって処置されたヒト細胞から単離された１５０ｎｇのゲノムから増幅されたＧＦＰオンターゲット部位をシーケンシングすることからの結果を図示するグラフを示す。負のコントロールとしては、トランスフェクションおよびシーケンシングは、いずれかのｇＲＮＡ発現プラスミド無しで上の通りに三重で行われた。エラーバーはｓ．ｄ．を表す。ＧＦＰターゲット部位（Ｇ１結合部位の始まりからＧ７結合部位の末端まで）に１つよりも多くの挿入または欠失を有する配列が、ｉｎｄｅｌと見なされた。ｉｎｄｅｌパーセンテージは、合計の配列数によってｉｎｄｅｌ数を除算することによって計算された。野生型Ｃａｓ９は全てのｇＲＮＡ処置についてｉｎｄｅｌを生成し、一方、ｆＣａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼは、対ｇＲＮＡが存在したときにのみｉｎｄｅｌを効率的に（＞１％）生成した。ｆＣａｓ９およびシングルｇＲＮＡによって誘導されるｉｎｄｅｌは、ｇＲＮＡ無しのコントロールを超えては検出されなかった。一方、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびシングルｇＲＮＡは０．１２％の平均比率でターゲットＧＦＰ配列を改変した。
【００３７】
【図１７】グラフを示しており、ゲノムターゲットのｆＣａｓ９のｉｎｄｅｌ頻度がどのようにｇＲＮＡ対スペーサー長選好性を反映しているかを図示する。グラフは、スペーサー長（２つのｇＲＮＡ間のｂｐ数）とｆＣａｓ９のｉｎｄｅｌ改変効率との間の関係を示しており、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと共発現された同じｇＲＮＡのｉｎｄｅｌ改変効率に対して正規化されている。Ｘ軸の下の有色の三角印は、試験されたが、指示されているターゲット遺伝子について検出可能なｉｎｄｅｌを産しなかったスペーサー長を印している。これらの結果は、ｆＣａｓ９が、ＤＮＡを効率的に切断するためにハーフ部位間に約１５ｂｐまたは約２５ｂｐを要求するということを示唆している。
【００３８】
【図１８】内在性遺伝子座においてＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｆＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導された改変を示す。（Ａ）は、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｆＣａｓ９ヌクレアーゼとＶＥＧＦオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＶ１およびｇＲＮＡのＶ２）を発現する単一のプラスミドとによる、ＶＥＧＦオンターゲット部位における改変された配列の例を示す。示されている各例について、未改変のゲノム部位が最初の配列であり、欠失を含有する上位８つの配列が続く。各配列の前の数は、シーケンシングカウントを指示する。ｇＲＮＡターゲット部位は太字且つ大文字である。（Ｂ）は、ＶＥＧＦオフターゲット部位１（ＶＥＧ＿Ｏｆｆ１）についての（Ａ）と同一の分析である。（Ｃ）は、ＶＥＧＦオフターゲット部位１への２つのｇＲＮＡの潜在的な結合モードを示す。上鎖は古典的なモードで結合し、一方、下鎖は、Ｇ：Ｕ塩基対を包含するｇＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対形成によって第２のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＶ２）に結合する。（Ａ）に示されている配列は、上から下へ、以下の通り同定される。配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、および配列番号２６９。（Ｂ）に示されている配列は、上から下へ、以下の通り同定される。配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、および配列番号２９６。（Ｃ）に示されている配列は、上から下へ、以下の通り同定される。配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、および配列番号３００。
【００３９】
【図１９】ゲノムＣＣＲ５遺伝子中のターゲットＤＮＡ配列を示す。（Ａ）８つのｇＲＮＡターゲット部位が、切断されるスペーサー配列にＰＡＭが隣接している並び（並びＡ）で、Ｃａｓ９バリアント（例えばＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９）活性を試験するために同定された。（Ｂ）６つのｇＲＮＡターゲット部位が、切断されるスペーサー配列にＰＡＭが隣接している並び（並びＢ）で、Ｃａｓ９バリアント（例えばＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９）活性を試験するために同定された。まとめると、これらの１４個のｇＲＮＡは、０〜７４ｂｐに渡るスペーサー長についてＣａｓ９融合バリアントの試験を可能にする。（Ａ）に示されている配列は以下の通り同定される。「ＣＲＡ」は配列番号３０２に対応し、「ＣＲＡ−１」は配列番号３０３に対応し、「ＣＲＡ−２」は配列番号３０４に対応し、「ＣＲＡ−３」は配列番号３０５に対応し、「ＣＲＡ−４」は配列番号３０６に対応し、「ＣＲＡ−５」は配列番号３０７に対応し、「ＣＲＡ−６」は配列番号３０８に対応し、「ＣＲＡ−７」は配列番号３０９に対応し、「ＣＲＡ−８」は配列番号３１０に対応する。（Ｂ）に示されている配列は以下の通り同定される。「ＣＲＢ」は配列番号３１１に対応し、「ＣＢ−１」は配列番号３１２に対応し、「ＣＢ−２」は配列番号３１３に対応し、「ＣＢ−３」は配列番号３１４に対応し、「ＣＢ−４」は配列番号３１５に対応し、「ＣＢ−５」は配列番号３１６に対応し、「ＣＢ−６」は配列番号３１７に対応する。
【００４０】
【図２０】ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９（ｆＣａｓ９）構築物を含有する例示的なプラスミドを詳述するベクターマップを図示している。
【００４１】
定義
本明細書および請求項において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別様に明確に指示しない限り、単数および複数の参照を包含する。それゆえに、例えば「薬剤」の参照は単一の薬剤および複数のかかる薬剤を包含する。
【００４２】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９蛋白質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性もしくは不活性なＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質）を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを言う。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは場合によってはｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に点在する短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼともまた言われる。ＣＲＩＳＰＲは、可動性遺伝子エレメント（ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド）からの保護を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー（先行可動性因子に相補的な配列）を含有し、侵入核酸をターゲティングする。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写およびプロセシングされてＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの正しいプロセシングはｔｒａｃｒＲＮＡ（トランスにコードされるスモールＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９蛋白質を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３によって補助されるプロセシングのためのガイドとして働く。爾後に、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖状または環状ｄｓＤＮＡターゲットをエンド的に（endonucleolytically）切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でないターゲット鎖が最初にエンド的に切断され、それから３’から５’にエキソ的に（exonucleolytically）トリミングされる。天然には、ＤＮＡ結合および切断は、典型的には蛋白質および両方のＲＮＡを要求する。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単純に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照（その全内容は参照によってここに組み込まれる）。Ｃａｓ９はＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己対非自己を見分けることを助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は当業者には周知である（例えば、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.」Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)、「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.」Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)、および「A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オーソログはさまざまな種において記載されており、それらはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを包含するが、これに限定されない。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には���らかであろう。かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,「The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems」(2013) RNA Biology 10:5, 726-737（その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている生物および遺伝子座からのＣａｓ９配列を包含する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは不活性な（例えば、不活性型の）ＤＮＡ切断ドメインを有する。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９蛋白質は、交換可能に、（ヌクレアーゼ「不能（dead）」Ｃａｓ９として）「ｄＣａｓ９」蛋白質と言われ得る。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、部分的または全体的に、下の配列番号５として示されているアミノ酸に対応するか、またはそれを含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号５のバリアント）が提供される。例えば、いくつかの態様において、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａよりも他の変異を有するバリアントが提供され、これは例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）を包含する。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号５のバリアント）が提供され、これらは配列番号５と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号５のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００または１０１アミノ酸以上だけ配列番号５よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号５）
【００４４】
不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９蛋白質（またはその断片）を作出するための方法は公知である（例えば、実施例およびJinek et al., Science. 337:816-821(2012)、Qi et al.,「Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression」(2013) Cell. 28;152(5): 1173-83参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを包含することが公知である。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに相補的な鎖を切断し、一方、ＲｕｖＣ１サブドメインは相補的でない鎖を切断する。それらのサブドメイン内の変異はＣａｓ９のヌクレアーゼ活性をサイレンシングし得る。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０ＡはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（例えば、実施例およびJinek et al., Science. 337:816-821(2012)、Qi et al., Cell. 28;152(5): 1173-83 (2013)参照）。いくつかの態様において、Ｃａｓ９の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、蛋白質は、２つのＣａｓ９ドメインの１つ、（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインまたは（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはその断片を含む蛋白質は「Ｃａｓ９バリアント」と言われる。Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９またはその断片に対して相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、その結果、断片は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９に対応する（ＮＣＢＩ参照配列：NC_017053.1。配列番号１(ヌクレオチド)、配列番号２（アミノ酸））。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号１）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号２）
【００４５】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は配列番号３（ヌクレオチド）および／または配列番号４（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む。
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA（配列番号３）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号４）
【００４６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_015683.1、NC_017317.1）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_016782.1、NC_016786.1）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_021284.1)、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_017861.1）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_021846.1）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆ: NC_021314.1）、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_018010.1）、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓＩ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_018721.1）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_820832.1）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NP_472073.1）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_002344900.1）、またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_002342100.1）からのＣａｓ９を言う。
【００４７】
用語「コンジュゲーションする」、「コンジュゲーションされる」、および「コンジュゲーション」は、２つの実体の（例えば２つの分子、例えば２つの蛋白質、２つのドメイン（例えば、結合ドメインおよび切断ドメイン）、または蛋白質および薬剤、例えば蛋白質結合ドメインおよび小分子の）結びつきを言う。いくつかの側面において、結びつきは蛋白質（例えば、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ）と核酸（例えばガイドＲＮＡ）との間であり得る。結びつきは、例えば直接的または間接的な（例えば、リンカーを介する）共有結合を介し得る。いくつかの態様において、結びつきは共有結合的である。いくつかの態様において、２つの分子は、両方の分子を繋ぐリンカーを介してコンジュゲーションされる。例えば、２つの蛋白質（例えば、操作されたヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン）が互いにコンジュゲーションされて蛋白質融合体を形成するいくつかの態様において、２つの蛋白質はポリペプチドリンカー（例えば、１つの蛋白質のＣ末端をもう一方の蛋白質のＮ末端に繋ぐアミノ酸配列）を介してコンジュゲーションされ得る。
【００４８】
用語「コンセンサス配列」は、本明細書において用いられる場合、核酸配列の文脈において、複数の類似の配列中の各位置において見いだされる最も高頻度のヌクレオチド残基を表す、計算された配列を言う。典型的には、コンセンサス配列は配列アラインメントによって決定され、類似の配列が互いに比較されて、類似の配列モチーフが計算される。ヌクレアーゼターゲット部位配列の文脈において、ヌクレアーゼターゲット部位のコンセンサス配列は、いくつかの態様において、所与のヌクレアーゼによって最も高頻度に結合または最高の親和性で結合される配列であり得る。リコンビナーゼターゲット部位配列の文脈において、リコンビナーゼターゲット部位のコンセンサス配列は、いくつかの態様において、所与のリコンビナーゼによって最も高頻度に結合または最高の親和性で結合される配列であり得る。
[0001]
用語「操作された」は、本明細書において用いられる場合、ヒトによって設計、生成、調製、合成、および／または製造された蛋白質分子、核酸、複合体、物質、または実体を言う。従って、操作された生成物は、天然に存在しない生成物である。
【００４９】
用語「有効量」は、本明細書において用いられる場合、望まれる生体応答を惹起するのに十分である生物活性薬剤の量を言う。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼによって特異的に結合および切断されるターゲット部位の切断を誘導するのに十分であるヌクレアーゼの量を言い得る。いくつかの態様において、リコンビナーゼの有効量は、リコンビナーゼによって特異的に結合されて組み換えられるターゲット部位における組み換えを誘導するのに十分であるリコンビナーゼの量を言う。当業者によって認められるであろう通り、薬剤、例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッド蛋白質、融合蛋白質、蛋白質二量体、蛋白質（または蛋白質二量体）およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば、望まれる生体応答、ターゲティングされようとする具体的なアレル、ゲノム、ターゲット部位、細胞、または組織、および用いられようとする薬剤のようなさまざまな因子に依存して変わり得る。
【００５０】
用語「相同」は、本明細書において用いられる場合、当分野において理解される用語であり、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列のレベルで高度に近縁である核酸またはポリペプチドを言う。互いに相同である核酸またはポリペプチドは、「ホモログ」と呼ばれる。２つの配列間の相同性は、当業者に公知の配列アラインメント法によって決定され得る。本発明に従って、２つの配列は、それらが少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、または少なくとも２００アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも約５０〜６０％同一（例えば、１つまたはもう一方の配列に含まれる全ての残基の少なくとも約５０〜６０％において、同一の残基（例えばアミノ酸残基）を共有する）、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である場合に、相同であると見なされる。
【００５１】
用語「リンカー」は、本明細書において用いられる場合、２つの隣接した分子または部分（例えば結合ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９）およびヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）の切断ドメイン）をリンクする化学基または分子を言う。いくつかの態様において、リンカーは核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインを別の蛋白質（例えば、Ｃａｓ９蛋白質もしくはヌクレアーゼもしくはリコンビナーゼまたはその融合体）に連結する。いくつかの態様において、リンカーは、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインとリコンビナーゼの触媒ドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーはｄＣａｓ９とリコンビナーゼとを連結する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらによってフランキングされ、共有結合を介して互いに繋がり、それゆえに２つを繋ぐ。いくつかの態様において、リンカーは一アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的な部分である。いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸のいずれかのストレッチであり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または５１個以上のアミノ酸を有する。いくつかの態様において、ペプチドリンカーはトリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのリピートを含み、例えば配列（ＧＧＳ）ｎを含み、ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個以上のリピートを表す。いくつかの態様において、リンカーは配列（ＧＧＳ）６（配列番号１５）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは１６残基「ＸＴＥＮ」リンカーまたはそのバリアントである（例えば、実施例およびSchellenberger et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009)参照）。いくつかの態様において、ＸＴＥＮリンカーは配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１６）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号１７）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、図１２Ａにおいて提供されるいずれかのリンカー、例えばＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１９）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２０）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号２１）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号２２）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号２３）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号２４）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号２５）、またはＧＧＳＭ（配列番号３０１）から選択される１つまたは２つ以上である。
【００５２】
用語「変異」は、本明細書において用いられる場合、別の残基による配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）中の残基の置換、または配列中の１つまたは２つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。変異は、元々の残基を同定し、配列中の残基の位置と新たに置換された残基のアイデンティティーとが続くことによって、典型的には本明細書に記載される。本明細書において提供されるアミノ酸置換（変異）を作るためのさまざまな方法が当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供される。
【００５３】
用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、核酸分子中の２つのヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断する力能がある薬剤（例えば蛋白質）を言う。いくつかの態様において、「ヌクレアーゼ」は、不活性なＤＮＡ切断ドメインを有する蛋白質を言い、その結果、ヌクレアーゼはホスホジエステル結合を切断する力能がない。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは蛋白質（例えば、核酸分子に結合して、核酸分子中のヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断し得る酵素）である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端のホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは部位特異的ヌクレアーゼであり、特異的なヌクレオチド配列中の特異的なホスホジエステル結合を結合および／または切断し、これは本明細書において「認識配列」、「ヌクレアーゼターゲット部位」、または「ターゲット部位」ともまた言われる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはＲＮＡガイド（すなわち、ＲＮＡによってプログラム可能な）ヌクレアーゼであり、これは、ターゲット部位を相補する配列を有するＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」）と結びつき（例えば結合し）、それによってヌクレアーゼの配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは一本鎖ターゲット部位を認識し、一方、他の態様において、ヌクレアーゼは二本鎖ターゲット部位（例えば二本鎖ＤＮＡターゲット部位）を認識する。多くの天然に存在するヌクレアーゼ（例えば、多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼ）のターゲット部位は当業者に周知である。多くのケースでは、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩ）は長さ４〜１０塩基対のパリンドローム二本鎖ＤＮＡターゲット部位を認識し、ターゲット部位内の特異的な位置において２つのＤＮＡ鎖のそれぞれを切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を同じ位置で切断して、その結果、末端は塩基対形成したヌクレオチド（本明細書においては平滑末端ともまた言われる）を含む。他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を非対称的に切断し、すなわち各鎖を異なる位置で切断して、その結果、末端は非対合ヌクレオチドを含む。二本鎖ＤＮＡ分子の末端の非対合ヌクレオチドは「オーバーハング」（例えば、非対合ヌクレオチド（単数または複数）がそれぞれのＤＮＡ鎖の５’または３’末端を形成するかどうかに依存して「５’オーバーハング」または「３’オーバーハング」）ともまた言われる。非対合ヌクレオチド（単数または複数）で終わる二本鎖ＤＮＡ分子末端は粘着末端ともまた言われる。なぜなら、それらは、相補的な非対合ヌクレオチド（単数または複数）を含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に「粘着」し得るからである。ヌクレアーゼ蛋白質は、「結合ドメイン」（これは、核酸基質との蛋白質の相互作用を媒介し、いくつかのケースではターゲット部位に特異的に結合もまたする）と「切断ドメイン」（これは、核酸バックボーン中のホスホジエステル結合の切断を触媒する）とを典型的には含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ蛋白質は単量体形態で核酸分子に結合して切断し得、一方、他の態様において、ヌクレアーゼ蛋白質はターゲット核酸分子を切断するために二量体化または多量体化しなければならない。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、さらには、特異的なターゲット部位に結合するヌクレアーゼを作製するために融合され得るモジュール的な結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者に周知である。例えば、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）の結合ドメインまたは不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９蛋白質が、望まれるターゲット部位に特異的に結合するための結合ドメイン（例えば、これはｇＲＮＡに結合してターゲット部位への結合を導く）として用いられ、切断ドメイン（例えばＦｏｋＩの切断ドメイン）に融合またはコンジュゲーションされて、ターゲット部位を切断する操作されたヌクレアーゼを作製し得る。いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質はＦｏｋＩの切断ドメインを含み、そのため「ｆＣａｓ９」蛋白質と言われる。いくつかの態様において、例えばｆＣａｓ９蛋白質中のＦｏｋＩの切断ドメインは、部分的または全体的に、下の配列番号６として示されているアミノ酸配列（またはそのバリアント）に対応するか、またはそれを含む。いくつかの態様において、ＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントまたはホモログは、ターゲット核酸中のターゲット部位において別のＦｏｋＩ切断ドメインと（例えば、ｆＣａｓ９融合蛋白質の一部として）二量体化して、それによってターゲット核酸の切断をもたらす力能があるいずれかのバリアントまたはホモログを包含する。いくつかの態様において、ＦｏｋＩ切断ドメインのバリアント（例えば配列番号６のバリアント）が提供され、それらは配列番号６と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、ＦｏｋＩ切断ドメインのバリアント（例えば配列番号６のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸または１０１アミノ酸以上だけ配列番号６よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ＦｏｋＩの切断ドメイン：
GSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF（配列番号６）
【００５５】
用語「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において用いられる場合、核酸塩基および酸部分を含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３または４ヌクレオチド以上を含む核酸分子は直鎖状分子であり、隣接したヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いにリンクされる。いくつかの態様において、「核酸」は個体的な核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を言う。いくつかの態様において、「核酸」は、３つまたは４つ以上の個体的なヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３ヌクレオチドのストリング）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡ、さらには一および／または二本鎖ＤＮＡを包摂する。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｇＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、クロマチド、または他の天然に存在する核酸分子の文脈において、天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得、または天然に存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを包含し得る。尚その上に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステルバックボーンよりも他を有するアナログを包含する。核酸は天然ソースから精製され得、組み換え発現システムを用いて生成されて任意で精製され得、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子のケースでは、核酸はヌクレオシドアナログ（例えば、化学的に改変された塩基または糖を有するアナログ）およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に指示されない限り５’から３’方向に表される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレーション塩基、改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／または改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
【００５６】
用語「医薬組成物」は、本明細書において用いられる場合、疾患または障害の処置および／または予防の文脈において対象に投与され得る組成物を言う。いくつかの態様において、医薬組成物は、有効成分、例えばＣａｓ９蛋白質またはその断片に融合されたヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ（またはかかる融合体をコードする核酸）と任意で医薬上受け入れられる添加剤とを含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、Ｃａｓ９バリアント／融合蛋白質（単数または複数）をターゲット核酸にターゲティングすることにとって好適な本発明Ｃａｓ９バリアント／融合体（例えばｆＣａｓ９）蛋白質（単数または複数）およびｇＲＮＡ（単数または複数）を含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸は遺伝子である。いくつかの態様において、ターゲット核酸は疾患に関連したアレルであり、それによって、アレルはＣａｓ９バリアント／融合蛋白質（単数または複数）の作用によって切断される。いくつかの態様において、アレルは、ＣＬＴＡ遺伝子、ＥＭＸ遺伝子、ＨＢＢ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、またはＣＣＲ５遺伝子のアレルである。例えば、実施例、図７、８、１３、１４、１５、１７、および１９参照。
【００５７】
用語「増殖性疾患」は、本明細書において用いられる場合、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖比率を見せるという点で、細胞または組織のホメオスタシスが乱されているいずれかの疾患を言う。増殖性疾患は、前新生物性の過形成状態および新生物疾患などの増殖亢進性疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖によってキャラクタリゼーションされ、良性および悪性新生物を両方とも包含する。悪性新生物は癌ともまた言われる。いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、増殖性疾患を処置することにとって有用である。例えば、いくつかの態様において、医薬組成物は、Ｃａｓ９（例えばｆＣａｓ９）蛋白質（単数または複数）とＣａｓ９蛋白質（単数または複数）をＶＥＧＦアレルにターゲティングすることにとって好適なｇＲＮＡ（単数または複数）とを含み、それによって、アレルはＣａｓ９蛋白質（単数または複数）の作用によって不活性化される。例えば実施例参照。
【００５８】
用語「蛋白質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書において交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によってリンクされたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸長であろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個体的な蛋白質または蛋白質の集まりを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つまたは２つ以上は、例えば化学的実体（例えば、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のための炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなど）の追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは単一の分子でもまたあり得るか、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する、組み換え、もしくは合成、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。用語「融合蛋白質」は、本明細書において用いられる場合、少なくとも２つの異なる蛋白質からの蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。１つの蛋白質は融合蛋白質のアミノ末端（Ｎ末端）部分にまたはカルボキシ末端（Ｃ末端）蛋白質に所在し得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」を形成し得る。本明細書において提供される蛋白質のいずれかは、当分野において公知のいずれかの方法によって生成され得る。例えば、本明細書において提供される蛋白質は、組み換え蛋白質発現および精製によって生成され得、これは、ペプチドリンカーを含む融合蛋白質にとりわけ適している。組み換え蛋白質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって記載されているものを包含し、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５９】
用語「ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ」および「ＲＮＡガイドヌクレアーゼ」は本明細書において交換可能に用いられ、切断のターゲットではない１つまたは２つ以上のＲＮＡと複合体を形成する（例えば、結合するかまたは結びつく）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と言われ得る。典型的には、結合したＲＮＡ（単数または複数）はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と言われる。ｇＲＮＡは、２つもしくは３つ以上のＲＮＡの複合体としてまたは単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡはシングル（単一の）ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と言われ得るが、「ｇＲＮＡ」は、単一の分子としてまたは２つもしくは３つ以上の分子の複合体としていずれかで存在するガイドＲＮＡを言うために交換可能に（interchangeabley）用いられる。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン（１）ターゲット核酸に対する相同性を共有する（例えば、そしてターゲットへのＣａｓ９複合体の結合を導く）ドメインと（２）Ｃａｓ９蛋白質に結合するドメインとを含む。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれるJinek et al., Science 337:816-821(2012)の図１Ｅに図示されているｔｒａｃｒＲＮＡに相同である。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を包含するもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,682、「Delivery System For Functional Nucleases」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,746、「Methods and Compositions for RNA-Directed Target DNA Modification and for RNA-Directed Modulation of Transcription」と題する２０１３年３月１５日出願のPCT出願WO2013/176722、および「RNA-Directed DNA Cleavage by the Cas9-crRNA Complex」と題する２０１３年３月２０日出願のPCT出願WO2013/142578に見いだされ得、それぞれの全内容はその全体が参照によってここに組み込まれる。ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ構造の尚他の例が本明細書において提供される。例えば実施例参照。いくつかの態様において、ｇＲＮＡはドメイン（１）および（２）の２つまたは３つ以上を含み、「拡張型ｇＲＮＡ」と言われ得る。例えば、拡張型ｇＲＮＡは例えば２つまたは３つ以上のＣａｓ９蛋白質に結合して、本明細書に記載される通り２つまたは３つ以上の別個の領域においてターゲット核酸に結合するであろう。ｇＲＮＡは、ターゲット部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これがそのターゲット部位へのヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介して、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.」 Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)、「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.」Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)、および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」 Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６０】
ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いてターゲットＤＮＡ切断部位を決定するので、それらの蛋白質は、ガイドＲＮＡによって規定されるいずれかの配列を原理的には切断する能力がある。部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを改変するために）Ｃａｓ９などのＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼを用いる方法は、当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)、Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)、Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)、Dicarlo, J. E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)、Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００６１】
用語「リコンビナーゼ」は、本明細書において用いられる場合、リコンビナーゼ認識配列間におけるＤＮＡの組み換えを媒介する部位特異的酵素を言い、これはリコンビナーゼ認識配列間におけるＤＮＡ断片の切り出し、インテグレーション、逆位、または交換（例えば転座）をもたらす。リコンビナーゼは、２つの別個のファミリー、セリンリコンビナーゼ（例えば、リゾルベースおよびインベルターゼ）およびチロシンリコンビナーゼ（例えばインテグラーゼ）に分類され得る。セリンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｔｎ３、β−ｓｉｘ、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、γδ、Ｂｘｂ１、φＣ３１、ＴＰ９０１、ＴＧ１、φＢＴ１、Ｒ４、φＲＶ１、φＦＣ１、ＭＲ１１、Ａ１１８、Ｕ１５３、およびｇｐ２９を包含する。チロシンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｒ、ラムダ、ＨＫ１０１、ＨＫ０２２、およびｐＳＡＭ２を包含する。セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名称は、リコンビナーゼがＤＮＡを攻撃するために用い、鎖交換中にＤＮＡに共有結合的にリンクされる保存された求核性アミノ酸残基から来ている。リコンビナーゼは数々の応用を有し、遺伝子ノックアウト／ノックインの作製および遺伝子治療応用を包含する。例えば、Brown et al.,「Serine recombinases as tools for genome engineering.」Methods. 2011;53(4):372-9、Hirano et al.,「Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration.」Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39、Chavez and Calos, 「Therapeutic applications of the φC31 integrase system.」Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81、Turan and Bode,「Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.」FASEB J. 2011; 25(12):4088-107、Venken and Bellen,「Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and φC31 integrase.」Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28、Murphy, 「Phage recombinases and their applications.」Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414、Zhang et al.,「Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.」J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24、Karpenshif and Bernstein,「From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination.」DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。本明細書において提供されるリコンビナーゼは、本発明の態様に用いられ得るリコンビナーゼの排他的な例であることを意味されてはいない。本発明の方法および組成物は、新たな直交系リコンビナーゼについてデータベースをマイニングすることまたは特定されたＤＮＡ特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって拡充され得る（例えば、Groth et al., 「Phage integrases: biology and applications.」J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678、Gordley et al.,「Synthesis of programmable integrases.」Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる）。本明細書に記載される方法および組成物に有用であるリコンビナーゼの他の例は当業者に公知であり、発見または作出されるいずれかの新たなリコンビナーゼは、本発明の異なる態様に用いられる能力があると予想される。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型のＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９またはその断片）に融合���れ、その結果、リコンビナーゼドメインは核酸結合ドメインを含まないか、またはターゲット核酸に結合する能力がない（例えば、リコンビナーゼドメインは、特異的なＤＮＡ結合活性を有さないように操作される）。ＤＮＡ結合活性を欠くリコンビナーゼとかかるものを操作するための方法とは公知であり、Klippel et al.,「Isolation and characterisation of unusual gin mutants.」EMBO J. 1988; 7: 3983-3989、Burke et al.,「Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948、Olorunniji et al.,「Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants.」Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191、Rowland et al.,「Regulatory mutants in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome.」Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298、Akopian et al.,「Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition.」Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691、Gordley et al., 「Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol. 2007; 367: 802-813、Gordley et al.,「Synthesis of programmable integrases.」Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 5053-5058、Arnold et al.,「Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity.」EMBO J. 1999;18: 1407-1414、Gaj et al., 「Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity.」Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(2):498-503、およびProudfoot et al., 「Zinc finger ricombinases with adaptable DNA sequence specificity.」PLoS One. 2011;6(4):e19537（それぞれの全内容は参照によってここに組み込まれる）によって記載されているものを包含する。例えば、リゾルベース・インベルターゼグループ（例えば、Ｔｎ３およびγδリゾルベースならびにＨｉｎおよびＧｉｎインベルターゼ）のセリンリコンビナーゼは、自立した触媒およびＤＮＡ結合ドメインを有するモジュール的な構造を有する（例えば、Grindley et al.,「Mechanism of site-specific recombination.」Ann Rev Biochem. 2006; 75: 567-605参照。その全内容は参照によって組み込まれる）。それらのリコンビナーゼの触媒ドメインは、それゆえに、例えば、いずれかの付随的な因子（例えばＤＮＡ結合活性）を要求しない「活性化型（activated）」リコンビナーゼ変異体の単離に続いて、本明細書に記載されるヌクレアーゼ不活性型のＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９またはその断片）と組み換えられることが容易である（例えば、Klippel et al., 「Isolation and characterisation of unusual gin mutants.」EMBO J. 1988; 7: 3983-3989、Burke et al,「Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948、Olorunniji et al.,「Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants.」Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191、Rowland et al.,「Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome.」Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298、Akopian et al.,「Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition.」Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691参照）。加えて、Ｎ末端触媒ドメインおよびＣ末端ＤＮＡ結合ドメインを有する多くの他の天然のセリンリコンビナーゼが公知であり（例えば、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、ＴｎｐＸトランスポゼース、ＩＳ６０７トランスポゼース）、それらの触媒ドメインが選入されて、本明細書に記載されるプログラム可能な部位特異的リコンビナーゼを操作し得る（例えば、Smith et al.,「Diversity in the serine recombinases.」Mol Microbiol. 2002; 44: 299-307参照。その全内容は参照によって組み込まれる）。類似に、チロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、λインテグラーゼ）のコア触媒ドメインは公知であり、類似に選入されて、本明細書に記載されるプログラム可能な部位特異的リコンビナーゼを操作し得る（例えば、Guo et al.,「Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse.」Nature. 1997; 389:40-46、Hartung et al.,「Cre mutants with altered DNA binding properties.」J Biol Chem 1998; 273:22884-22891、Shaikh et al.,「Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48、Rongrong et al.,「Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase.」Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544、Kilbride et al.,「Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system.」J Mol Biol. 2006; 355: 185-195、Warren et al.,「A chimeric cre recombinase with regulated directionality.」Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105: 18278-18283、Van Duyne,「Teaching Cre to follow directions.」Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5、Numrych et al.,「A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase arm-type binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ.」Nucleic Acids Res. 1990; 18:3953-3959、Tirumalai et al.,「The recognition of core-type DNA sites by λ integrase.」J Mol Biol. 1998; 279:513-527、Aihara et al.,「A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase.」Mol Cell. 2003; 12: 187-198、Biswas et al.,「A structural basis for allosteric control of DNA recombination by λ integrase.」Nature. 2005; 435: 1059-1066、およびWarren et al.,「Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination.」Mol Microbiol. 2005; 55: 1104-1112参照。それぞれの全内容は参照によって組み込まれる）。
【００６２】
用語「組み換える」または「組み換え」は、核酸改変（例えばゲノム改変）の文脈において、２つもしくは３つ以上の核酸分子または単一の核酸分子の２つもしくは３つ以上の領域がリコンビナーゼ蛋白質（例えば、本明細書において提供される本発明リコンビナーゼ融合蛋白質）の作用によって改変されるプロセスを言うために用いられる。組み換えは、ことに、例えば１つまたは２つ以上の核酸分子内または間における核酸の挿入、逆位、切り出し、または転座をもたらし得る。
【００６３】
用語「対象」は、本明細書において用いられる場合、個体的な生物、例えば個体的な哺乳動物を言う。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はげっ歯類である。いくつかの態様において、対象はヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。対象はいずれかの性別および成長の任意の段階であり得る。
【００６４】
用語「ターゲット核酸」および「ターゲットゲノム」は、本明細書において用いられる場合、ヌクレアーゼの文脈において、それぞれ所与のヌクレアーゼの少なくとも１つのターゲット部位を含む核酸分子またはゲノムを言う。（ヌクレアーゼ不活性型）ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼとリコンビナーゼドメインとを含む融合体の文脈において、「ターゲット核酸」および「ターゲットゲノム」は、少なくとも１つのターゲット部位を含む１つまたは２つ以上の核酸分子（単数または複数）またはゲノムをそれぞれ言う。いくつかの態様において、ターゲット核酸（単数または複数）は少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのターゲット部位を含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸（単数または複数）は４つのターゲット部位を含む。
【００６５】
用語「ターゲット部位」は、（１）ヌクレアーゼ（例えば、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質）によって結合されて切断されるかまたは（２）リコンビナーゼ（例えば、本明細書において提供されるｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質）によって（例えば、ターゲット部位においてまたは近くで）結合されて組み換えられるかいずれかの核酸分子中の配列を言う。ターゲット部位は一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡガイド（例えば、ＲＮＡによってプログラム可能な）ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインと活性なＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメインまたはＦｏｋＩなどの他のヌクレアーゼドメインとを含む蛋白質二量体）の文脈において、ターゲット部位は、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ（単数または複数）に相補的であるヌクレオチド配列と、ｇＲＮＡに相補的な配列（単数または複数）に隣接した３’末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを典型的には含む。いくつかの態様（例えば、ｆＣａｓ９が関わるもの）において、ターゲット部位は、ｆＣａｓ９単量体が結合する特定の配列および／または二量体化したＦｏｋＩドメインによって切断される結合した単量体間の介在配列を包摂し得る（例えば実施例および図１Ａ、６Ｄ参照）。ＲＮＡガイド（例えば、ＲＮＡによってプログラム可能な、ヌクレアーゼ不活性型）ヌクレアーゼとリコンビナーゼ（例えば、リコンビナーゼの触媒ドメイン）との間の融合体の文脈において、ターゲット部位は、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼドメインのｇＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列と、ｇＲＮＡに相補的な配列に隣接した３’末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを典型的には含む。例えば、いくつかの態様においては、４つのリコンビナーゼ単量体が連係してターゲット核酸（単数または複数）を組み換え、各単量体は、ｇＲＮＡによってガイドされる（ヌクレアーゼ不活性型）Ｃａｓ９蛋白質に融合される。かかる例においては、各Ｃａｓ９ドメインは、ターゲット核酸（単数または複数）に結合する別個のｇＲＮＡによってガイドされ、それゆえに、ターゲット核酸は４つのターゲット部位を含み、各部位は別々のｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合体によってターゲティングされる（それによって、ターゲット核酸（単数または複数）を組み換える４つのリコンビナーゼ単量体を連係させる）。ＲＮＡガイドヌクレアーゼＣａｓ９（またはそのｇＲＮＡ結合ドメイン）およびＣａｓ９の本発明融合体については、ターゲット部位は、いくつかの態様において、１７〜２０塩基対＋３塩基対ＰＡＭ（例えばＮＮＮ。Ｎは独立していずれかのヌクレオチドを表す）であり得る。典型的には、ＰＡＭの最初のヌクレオチドはいずれかのヌクレオチドであり得、一方、２つの下流ヌクレオチドは、具体的なＲＮＡガイドヌクレアーゼに依存して規定される。Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドヌクレアーゼの例示的なターゲット部位（例えば、ＰＡＭを含む）は当業者に公知であり、限定無しにＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧを包含し、Ｎは独立していずれかのヌクレオチドを表す。加えて、異なる種（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの代わりにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列ＮＧＧＮＧを含むＰＡＭを認識する。追加のＰＡＭ配列が公知であり、ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＲを包含するが、これに限定されない（例えば、Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの側面において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９など）のターゲット部位は構造［ＮＺ］−［ＰＡＭ］を含み得、各Ｎは独立していずれかのヌクレオチドであり、ｚは１〜５０の整数である。いくつかの態様において、ｚは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。いくつかの態様において、ｚは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。いくつかの態様において、ｚは２０である。いくつかの態様において、「ターゲット部位」は、ヌクレアーゼによって結合されるが切断はされない核酸分子中の配列をもまた言い得る。例えば、本明細書に記載されるある態様は、不活性な（または不活性型の）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質を提供する。かかる蛋白質は（例えば、Ｃａｓ９のＲＮＡ結合ドメインをもまた包含するときに）、ｇＲＮＡによって規定されるターゲット部位に結合する能力がある。しかしながら、ＤＮＡ切断部位が不活性化されているので、ターゲット部位はこの蛋白質によって切断されない。しかしながら、本明細書に記載されるかかる蛋白質は、典型的には、核酸分子の切断を媒介する別の蛋白質（例えばヌクレアーゼ）または分子にコンジュゲーション、融合、または結合される。他の態様において、かかる蛋白質はリコンビナーゼ（またはリコンビナーゼの触媒ドメイン）にコンジュゲーション、融合、または結合され、これがターゲット核酸の組み換えを媒介する。いくつかの態様において、実際に切断されるかまたは組み換えられる配列は、核酸分子の切断または組み換えを媒介する蛋白質（例えば、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ）または分子に依存するであろう。いくつかのケースでは、例えば、不活性型Ｃａｓ９蛋白質（単数または複数）が結合している近位または距離に関係するであろう。
【００６６】
二量体化する（または多量体化する）本発明蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（またはＣａｓ９のＲＮＡ結合ドメイン）とＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは活性なＣａｓ９の切断ドメイン）とを含む蛋白質またはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）とリコンビナーゼ（またはリコンビナーゼの触媒ドメイン）との間の融合体の二量体）の文脈において、ターゲット部位は、左ハーフ部位（１つの蛋白質によって結合される）、右ハーフ部位（第２の蛋白質によって結合される）、およびハーフ部位間のスペーサー配列（ここで切断または組み換えがなされる）を典型的には含む。いくつかの態様においては、左ハーフ部位または右ハーフ部位いずれか（且つスペーサー配列では無い）が切断されるかまたは組み換えられる。他の態様において、スペーサー配列は切断されるかまたは組み換えられる。この構造（［左ハーフ部位］−［スペーサー配列］−［右ハーフ部位］）は、本明細書においてＬＳＲ構造と言われる。いくつかの態様において、左ハーフ部位および／または右ハーフ部位はＲＮＡによってガイドされるターゲット部位（例えばＣａｓ９ターゲット部位）に対応する。いくつかの態様において、いずれかまたは両方のハーフ部位は、例えばＣａｓ９によってターゲティングされる典型的な領域よりも短いかまたは長く、例えば２０ヌクレオチドよりも短いかまたは長い。いくつかの態様において、左および右ハーフ部位は異なる核酸配列を含む。本発明ヌクレアーゼが関わるいくつかの態様において、ターゲット部位は、３つの（３）ＲＮＡガイドヌクレアーゼターゲット部位配列（例えばＣａｓ９ターゲット部位配列に対応する３つの配列）を含む配列であり（例えば、図２Ｃ参照）、第１および第２ならびに第２および第３のＣａｓ９ターゲット部位配列がスペーサー配列によって離間される。いくつかの態様において、スペーサー配列は少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、または少なくとも２５０ｂｐ長である。いくつかの態様において、スペーサー配列はおよそ１５ｂｐ〜およそ２５ｂｐ長である。いくつかの態様において、スペーサー配列はおよそ１５ｂｐ長である。いくつかの態様において、スペーサー配列はおよそ２５ｂｐ長である。
【００６７】
用語「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、本明細書において用いられる場合、高度に可変の２アミノ酸モチーフ（リピート可変二残基、ＲＶＤ）を含む高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含有するＤＮＡ結合ドメインを含む細菌蛋白質を言う。ＲＶＤモチーフは核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に公知の方法に従って操作されて、望まれるＤＮＡ配列に特異的に結合し得る（例えば、Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011).「A TALE nuclease architecture for efficient genome editing」. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8、Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」. PLoS ONE 6 (5): e19509、Boch, Jens (February 2011).「TALEs of genome targeting」. Nature Biotechnology 29 (2): 135-6、Boch, Jens; et.al. (December 2009).「Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors」. Science 326 (5959): 1509-12、およびMoscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009).「A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors」Science 326 (5959): 1501参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の単純な関係は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的なＤＮＡ結合ドメインの操作を許した。
【００６８】
用語「転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書において用いられる場合、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインからＤＮＡ切断ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）を含む人工ヌクレアーゼを言う。操作されたＴＡＬＥ構築物を作出するためのいくつものモジュール的なアセンブリスキームが報告されている（例えば、Zhang, Feng; et. al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」. PLoS ONE 6 (5): e19509、Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C; Bailer, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011).「Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting」. Nucleic Acids Research、Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011).「Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning」. Nucleic Acids Research、Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011).「Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes」. Nucleic Acids Research.、Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed.「Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning」. PLoS ONE 6 (5): e19722参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその１つもしくは２つ以上の症状を逆転する、緩和する、その開始を遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的なインターベンションを言う。本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその１つもしくは２つ以上の症状を逆転する、緩和する、その開始を遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的なインターベンションを言う。いくつかの態様において、処置は、１つまたは２つ以上の症状が発症した後および／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、例えば症状を予防するもしくはその開始を遅延させるまたは疾患の開始もしくは進行を阻害するために、症状の非存在下で投与され得る。例えば、処置は、症状の開始に先立って（例えば、症状の既往に照らしておよび／または遺伝子もしくは他の易罹患性因子に照らして）易罹患性個体に投与され得る。処置は、例えばそれらの再発を予防するかまたは遅延させるために、症状が消散した後にもまた継続され得る。
【００７０】
用語「ベクター」は、本発明の１つまたは２つ以上の組み換えポリヌクレオチド（例えば、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質（またはその融合体）および／またはｇＲＮＡをコードするもの）を含むポリヌクレオチドを言う。ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体、およびファージミドを包含するが、これに限定されない。ベクターは宿主細胞内で複製する能力があり、１つまたは２つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらにキャラクタリゼーションされ、そこでベクターが切断され得、望まれる核酸配列が挿入され得る。ベクターは、ベクターによって形質転換またはゲノム改変されたかまたはされていない細胞の同定および／または選択への使用にとって好適な、１つまたは２つ以上のマーカー配列を含有し得る。マーカーは、例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、アンピシリン）または他の化合物に対する耐性または感受性いずれかを増大または減少させる蛋白質をコードする遺伝子、当分野において公知の標準的なアッセイによってその活性が検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクションされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に可視的に影響する遺伝子を包含する。宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、昆虫細胞など）の形質転換にとって好適ないずれかのベクター、例えば、ｐＵＣシリーズ、ｐＧＥＭシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＢＡＤシリーズ、ｐＴＥＴシリーズ、またはｐＧＥＸシリーズに属するベクターは、本発明に含まれる。いくつかの態様において、ベクターは、組み換え蛋白質生成のための宿主細胞を形質転換することにとって好適である。蛋白質（例えば、本明細書において提供されるもの）を発現するためのベクターおよび宿主細胞を選択および操作、細胞を形質転換、および組み換え蛋白質を発現／精製するための方法は当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供される。
【００７１】
用語「ジンクフィンガー」は、本明細書において用いられる場合、小さい核酸結合蛋白質構造モチーフを言い、フォールドとフォールドを安定化する１つまたは２つ以上の亜鉛イオンの配位とによってキャラクタリゼーションされる。ジンクフィンガーは、多種多様な異なる蛋白質構造を包摂する（例えば、Klug A, Rhodes D (1987).「Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition」. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーは、ヌクレオチドの特異的な配列に結合するように設計され得、一連のジンクフィンガーの融合体を含むジンクフィンガーアレイが、ほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように設計され得る。かかるジンクフィンガーアレイは、蛋白質の（例えば、核酸切断ドメインにコンジュゲーションされた場合には例えばヌクレアーゼの）結合ドメインを形成し得る。ジンクフィンガーモチーフの異なる型が当業者に公知であり、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｇａｇナックル、Ｔｒｅｂｌｅ−ｃｌｅｆ、Ｚｉｎｃリボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフを包含するが、これに限定されない（例えば、Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003).「Structural classification of zinc fingers: survey and summary」. Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50参照）。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは核酸分子の３または４ヌクレオチドに結合する。従って、２つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは６〜８ヌクレオチドに結合し得、３つのジンクフィンガーモチーフ含むジンクフィンガードメインは９〜１２ヌクレオチドに結合し得、４つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは１２〜１６ヌクレオチドに結合し得る、などである。いずれかの好適な蛋白質操作技術が使用されて、長さ３〜３０ヌクレオチドのほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合特異性を変改および／または新規のジンクフィンガー融合体を設計し得る（例えば、Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001).「Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins」. Annual Review of Biochemistry 70: 313-340、Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003).「Drug discovery with engineered zinc-finger proteins」. Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368、およびLiu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997).「Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes」. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (11)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断する蛋白質ドメインとの間の融合体は、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を作出するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核酸分子中の特異的なターゲット部位に結合するジンクフィンガードメインと、結合ドメインによって結合されたターゲット部位内またはその近位で核酸分子を切断する核酸切断ドメインとを典型的には含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３〜６つの個体的なジンクフィンガーモチーフを有し且つ長さ９塩基対〜１８塩基対に渡るターゲット部位に結合する結合ドメインを含む。より長いターゲット部位は、所与のゲノム中のユニークであるターゲット部位��結合して切断することが望まれる状況において特に魅力的である。
【００７２】
用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲーションされた核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、切断ドメインはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの切断ドメインである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断のために所与の核酸分子中のほとんどいずれかの望まれる配列をターゲティングするように設計され得、複雑なゲノムの文脈においてユニークな部位に結合するようにジンクフィンガー結合ドメインを設計する可能性は、生細胞内の単一のゲノム部位のターゲティングされた切断を許し、例えば、治療上の価値があるターゲティングされたゲノム変改を達成する。望まれるゲノム遺伝子座への二本鎖切断をターゲティングすることは、非相同ＤＮＡ修復経路の誤りがちな性質のため、遺伝子のコード配列中にフレームシフト変異を導入するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に周知の方法によって興味ある部位をターゲティングするように作出され得る。例えば、望まれる特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、既知の特異性の個体的なジンクフィンガーモチーフを組み合わせることによって設計され得る。ＤＮＡに結合したジンクフィンガー蛋白質Ｚｉｆ２６８の構造は、この分野における研究のかなりに情報を与えた。６４個の可能な塩基対トリプレットのそれぞれについてジンクフィンガーを得て、それからそれらのモジュール的なジンクフィンガーを混合およびマッチングし、いずれかの望まれる配列特異性を有する蛋白質を設計するというコンセプトが記載されている（Pavletich NP, Pabo CO (May 1991),「Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A」. Science 252 (5007): 809-17。その全内容は参照によって組み込まれる）。いくつかの態様において、それぞれ３塩基対ＤＮＡ配列を認識する別々のジンクフィンガーが組み合わせられて、長さ９塩基対〜１８塩基対に渡るターゲット部位を認識する３、４、５、または６フィンガーアレイを作出する。いくつかの態様において、より長いアレイが考えられる。他の態様において、６〜８ヌクレオチドを認識する２フィンガーモジュールが組み合わされて、４、６、または８ジンクフィンガーアレイを作出する。いくつかの態様において、細菌またはファージディスプレイが使用されて、望まれる核酸配列（例えば長さ３〜３０ｂｐの望まれるヌクレアーゼターゲット部位）を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、いくつかの態様において、リンカー（例えばポリペプチドリンカー）を介して互いに融合または別様にコンジュゲーションされたジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインとを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインによって結合された核酸配列からの切断の距離を決定する。より短いリンカーが用いられる場合、切断ドメインは、結合した核酸配列により近い核酸を切断するであろう。一方、より長いリンカーは、切断および結合される核酸配列間のより大きい距離をもたらすであろう。いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合した核酸を切断するために二量体化し���ければならない。いくつかのかかる態様において、二量体は２つの単量体のへテロ二量体であり、そのそれぞれは異なるジンクフィンガー結合ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインＡを含む１つの単量体とＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインＢを含む１つの単量体とを含み得る。この限定しない例において、ジンクフィンガードメインＡはターゲット部位の１つの側の核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインＢはターゲット部位のもう一方の側の核酸配列に結合し、二量体化ＦｏｋＩドメインは核酸をジンクフィンガードメイン結合部位間において切断する。
【００７３】
本発明のある態様の詳細な記載
部位特異的ヌクレアーゼおよび部位特異的リコンビナーゼは、インビトロおよびインビボのターゲティングされたゲノム改変にとって強力なツールである。生細胞内でのヌクレアーゼ切断はＤＮＡ修復機序を誘発し、これは、例えば相同組み換えを介して、切断および修復されたゲノム配列の改変を高頻度にもたらすということが報告されている。従って、ゲノム中の特異的なユニークな配列のターゲティングされた切断は、生細胞（従来の遺伝子ターゲティング法によってマニピュレーションすることが難しい細胞、例えば多くのヒト体性または胚性幹細胞を包含する）における遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変のための新たな道を開く。別の手法は部位特異的リコンビナーゼを利用し、これが、規定されたＤＮＡセグメントの効率的な正確なインテグレーション、欠失、逆位、または転座を成し遂げるために要求される全ての機能性を所有する。
【００７４】
疾患関連配列（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者のＣＣＲ−５アレル）または腫瘍血管新生にとって必要な遺伝子のヌクレアーゼによって媒介される改変は、臨床の文脈において用いられ得、２つの部位特異的ヌクレアーゼが現行では治験中である（Perez, E.E. et al.,「Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.」Nature biotechnology. 26, 808-816 (2008)、Clinical trials.gov識別子：NCT00842634、NCT01044654、NCT01252641、NCT01082926）。従って、ほぼいずれかの遺伝子疾患は、部位特異的ヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼを用いて処置され得、例えば、トリプレット伸長に関連する疾患（例えば、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、脊髄小脳性運動失調症など）、嚢胞性線維症（CFTR遺伝子をターゲティングすることによる）、血液疾患（例えば、ヘモグロビン異常症）、癌、自己免疫疾患、およびウイルス感染を包含し得る。本明細書において提供される本発明組成物および／または方法を用いて処置され得る他の疾患は、軟骨無形成症、色盲、酸マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファサラセミア、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症（ataxia telangictasia）、バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、ダーカム病、外胚葉形成異常、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクト−ス血症（galactosemis）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えばＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータグロビンの第６コドンのヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター（Klinefleter）症候群、クラッベ（Krabbes）病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（nephrogenic diabetes insipdius）、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、橈骨欠損を伴う血小板減少症（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病（von Hippel-Landau disease）、ワールデンブルグ症候群、ウイリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、およびＸ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）を包含するが、これに限定されない。
【００７５】
部位特異的なゲノム改変の１つの側面は、オフターゲットヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ効果（例えば、１つまたは２つ以上のヌクレオチドだけ意図するターゲット配列と異なるゲノム配列の切断または組み換え）の可能性である。オフターゲット切断／組み換えの望まれない副作用は、遺伝子ターゲティングイベント中の求められていない遺伝子座への挿入から臨床シナリオにおける重度の合併症に渡る。対象に投与されたエンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼによる、必須遺伝子機能をコードする配列または腫瘍抑制遺伝子のオフターゲット切断または組み換えは、対象の疾患または死亡さえももたらし得る。従って、オフターゲット効果を最小化する最大の確率を有するヌクレアーゼおよびリコンビナーゼを設計する上で、新たな戦略を使用することが望ましい。
【００７６】
本開示の方法および組成物は、いくつかの側面において、以前の方法および組成物に優る改善を表し、それらの意図するターゲットに対して改善された特異性を有するように操作されたヌクレアーゼ（およびそれらの使用の方法）およびリコンビナーゼ（およびそれらの使用の方法）を提供する。例えば、当分野において公知のヌクレアーゼおよびリコンビナーゼ（天然に存在するものおよび操作されたもの両方）は、特定の配列を認識するターゲット（例えばＤＮＡ）結合ドメインを典型的には有する。加えて、公知のヌクレアーゼおよびリコンビナーゼは、切断または組み換えを誘導する力能がある単一の蛋白質中にＤＮＡ結合ドメインおよび触媒ドメインを含み得、そのため、オフターゲット効果の確率は増大する。なぜなら、切断または組み換えが、それぞれヌクレアーゼまたはリコンビナーゼのオフターゲット結合時に起こる可能性が高いからである。本発明の側面は、配列数を増大させること（例えば、望まれるターゲットにおいて１つよりも多くの部位にヌクレアーゼを結合させること）および／または２つもしくは３つ以上の蛋白質間でヌクレアーゼの活性（例えば、ターゲット結合およびターゲット切断）を分割することが、ヌクレアーゼの特異性を増大させ、それによってオフターゲット効果の見込みを減少させるであろうという認識に関する。本発明の他の側面は、リコンビナーゼの触媒ドメイン（または、不活性なＤＮＡ結合ドメインを有するリコンビナーゼ）とヌクレアーゼ不活性型のＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼとの間の融合体が、いずれかの場所におけるＤＮＡのターゲティングされた組み換えを許すという認識に関する。
【００７７】
部位特異的ヌクレアーゼの文脈において、本明細書において提供される戦略、方法、組成物、およびシステムは、いずれかの部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのバリアント、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））の特異性を改善するために利用され得る。本明細書に記載される改変にとって好適なヌクレアーゼは、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。
【００７８】
ある態様において、本明細書において提供される戦略、方法、組成物、およびシステムは、ＲＮＡガイド（例えば、ＲＮＡによってプログラム可能な）エンドヌクレアーゼＣａｓ９の特異性を改善するために利用される。典型的なエンドヌクレアーゼは単一のターゲット配列を認識して切断する一方で、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いてターゲットＤＮＡ切断部位を決定し、単一の単量体蛋白質がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって規定されるいずれかの配列を原理的には切断することを可能にする。Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡ複合体は、細胞（Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013)、Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)）および生物（Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)）両方を改変するために首尾よく用いられて来たが、ゼブラフィッシュ胚を改変するためにＣａｓ９：ガイドＲＮＡ複合体を用いる研究は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮのものと類似の比率で毒性（例えば、オフターゲット効果）を観察した（Hwang, W.Y. et al. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)）。さらに、１つのＤＮＡ鎖のみを切断するＣａｓ９の最近になって操作されたバリアント（「ニッカーゼ」）は、２つの別個のｇＲＮＡ配列によって規定される二本鎖切断を可能にする一方で（Cho, S. W. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, 132-141 (2013)、Ran, F. A. et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)、Mali, P. et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31, 833-838 (2013)）、それらのバリアントは、オフターゲット切断活性を尚被り（Ran, F. A. et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)、Fu, Y., et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. (2014)）、これは、ＤＮＡに個体的に結合したときに各単量体ニッカーゼが活性なままでいる能力から生ずる（Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823 (2013)、Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 (2012)、Gasiunas, G., et al., Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, E2579-E2586 (2012)。従って、本開示の側面は、新規の操作されたＣａｓ９バリアントを用いてＣａｓ９オフターゲット効果の確率を減少させることを狙う。１つの例において、Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｆＣａｓ９）が提供され、これはＣａｓ９ニッカーゼまたは野生型Ｃａｓ９と比較して改善された特異性を有し、例えば、野生型Ｃａｓ９よりも＞１０倍、＞５０倍、＞１００倍、＞１４０倍、＞２００倍、または２０１倍以上高い特異性を見せる（例えば、実施例参照）。
【００７９】
本開示の他の側面は、本発明ＲＮＡガイド（例えば、ＲＮＡによってプログラム可能な）Ｃａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質を利用する戦略、方法、組成物、およびシステムを提供する。典型的なリコンビナーゼは別個のターゲット配列を認識して組み換える一方で、本明細書において提供されるＣａｓ９−リコンビナーゼ融合体はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いてターゲットＤＮＡ組み換え部位を決定する。これは、融合蛋白質が、ｇＲＮＡ（単数または複数）によって規定されるいずれかの領域を原理的には組み換えることを可能にする。
【００８０】
ＤＮＡならびにＤＮＡ切断ヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼに特に関係する一方で、本明細書において提供される本発明コンセプト、方法、戦略、およびシステムはこの点で限定されず、いずれかの核酸：ヌクレアーゼまたは核酸：リコンビナーゼシステムに応用され得る。
【００８１】
ヌクレアーゼ
本開示のいくつかの側面は、向上した特異性を有する部位特異的ヌクレアーゼを提供し、これらは、本明細書に記載される方法および戦略を用いて設計される。本開示のいくつかの態様は、かかるヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。本開示のいくつかの態様は、かかるコードする核酸を含む発現構築物を提供する（例えば図２０参照）。例えば、いくつかの態様において、単離されたヌクレアーゼが提供され、これはゲノム中の望まれるターゲット部位を切断するように操作されている。いくつかの態様において、単離されたヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのバリアントである。
【００８２】
１つの態様において、融合蛋白質が提供され、２つのドメイン、（ｉｉ）ヌクレアーゼドメインに融合またはリンクされた（ｉ）ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９蛋白質またはその断片）ドメインを含む。例えば、いくつかの側面において、Ｃａｓ９蛋白質（例えば、融合蛋白質のＣａｓ９ドメイン）は、ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）結合活性を保持するヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（例えばＤＮＡ切断活性を欠くＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」）を含み、それゆえにｇＲＮＡに相補的なターゲット部位に結合する能力がある。いくつかの側面において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインに融合されたヌクレアーゼは、ターゲット核酸（例えばＤＮＡ）を切断するために二量体化（例えば、ヌクレアーゼの２つの単量体の連係すること）を要求するいずれかのヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９に融合されたヌクレアーゼは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインの単量体であり、例えば、それによってｆＣａｓ９と言われるＣａｓ９バリアントを生成する。ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは公知であり、いくつかの側面において、ＦｏｋＩのアミノ酸３８８〜５８３（ＮＣＢＩ登録番号J04623）に対応する。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインはＦｏｋＩのアミノ酸３００〜５８３、３２０〜５８３、３４０〜５８３、または３６０〜５８３に対応する。Wah et al.,「Structure of FokI has implications for DNA cleavage」Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 1;95(18): 10564-9、Li et al.,「TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain」Nucleic Acids Res. 2011; 39(l):359-72、Kim et al.,「Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain」Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93: 1156-1160をもまた参照。それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは、部分的または全体的に、配列番号６として示されているアミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは、本明細書に記載されるＦｏｋＩのバリアント（例えば配列番号６のバリアント）である。
【００８３】
いくつかの態様において、融合蛋白質の二量体が提供される（例えば、ｆＣａｓ９の二量体）。例えば、いくつかの態様において、融合蛋白質は、ターゲット核酸の切断を媒介するためにそれ自体と二量体を形成する。いくつかの態様において、融合蛋白質またはその二量体は１つまたは２つ以上のｇＲＮＡと結びつく。いくつかの側面において、二量体は２つの融合蛋白質を含有し、それぞれはｇＲＮＡ結合活性を有するＣａｓ９ドメインを有するので、ターゲット核酸は、核酸ターゲットの２つの別個の領域を相補する２つの別個のｇＲＮＡ配列を用いてターゲティングされる。例えば、図１Ａ、６Ｄ参照。それゆえに、この例においては、両方の融合蛋白質がターゲット核酸（例えば、ｇＲＮＡ：ターゲット核酸塩基対形成によって規定される）に結合してヌクレアーゼドメインが二量体化し（例えば、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン。融合蛋白質のＣａｓ９：ｇＲＮＡドメインの結合に基づくそれらの近位の結果として）、例えば結合したＣａｓ９融合蛋白質間の領域（「スペーサー配列」）においてターゲット核酸を切断するまで、ターゲット核酸の切断は起こらない。これは、図１Ａおよび６Ｄに示されている模式図によって例示される。この手法は、核酸を切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を要求しない野生型Ｃａｓ９および他のＣａｓ９バリアント（例えばニッカーゼ）に優る顕著な改善を表す（Ran et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)、Mali et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31, 833-838 (2013)）。実施例に記載されるこれらのニッカーゼバリアントは、核酸への単一のニッカーゼの結合時に切断またはニッキングを誘導し得（これはオンおよびオフターゲット部位において起こり得る）、ニッキングは変異誘発を誘導することが公知である。Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする例示的なヌクレオチド（配列番号７）およびＣａｓ９ニッカーゼの例示的なアミノ酸配列（配列番号８）が下で提供される。本明細書において提供されるバリアントは、ターゲット核酸切断を誘導するためには互いに近位にある２つのＣａｓ９バリアントの結合を要求するので、オフターゲット切断を誘導する確率は減少する。例えば実施例参照。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインに融合されたＣａｓ９バリアント（例えばｆＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９バリアント（例えばニッカーゼ）のオンターゲット：オフターゲット改変比よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７５倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、または２５１倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比を有する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインに融合されたＣａｓ９バリアント（例えばｆＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ９または他のＣ���ｓ９バリアントのオンターゲット：オフターゲット改変比よりも約６０〜１８０倍、約８０〜１６０倍、約１００〜１５０倍、または約１２０〜１４０倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比を有する。オンターゲット：オフターゲット改変比を決定するための方法は公知であり、実施例に記載されるものを包含する。ある態様において、オンターゲット：オフターゲット改変比は、ある遺伝子中の既知のＣａｓ９オフターゲット部位の改変の数または量を測定することによって決定される。例えば、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、およびＶＥＧＦ遺伝子のＣａｓ９オフターゲット部位は公知であり、それらの部位における改変が測定され、試験蛋白質とコントロールとの間で比較され得る。ターゲット部位およびその対応する既知のオフターゲット部位（例えば、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、およびＶＥＧＦオフターゲット部位については表５参照）が、特定のＣａｓ９蛋白質またはバリアントによって処置された細胞（例えばＨＥＫ２９３）から単離されたゲノムＤＮＡから増幅される。それから、改変がハイスループットシーケンシングによって分析される。潜在的なゲノムオフターゲット部位中にあり且つコントロールｇＲＮＡによって処置されたサンプルに対してターゲットｇＲＮＡによって処置されたサンプルにおいて有意により大きい数（Ｐ値＜０．００５、フィッシャーの正確確率検定）で存在する、２つまたは３つ以上の塩基対の挿入または欠失を含有する配列は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導されたゲノム改変と見なされる。
【００８４】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（ヌクレオチド配列）：
ATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC（配列番号７）
【００８５】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）（アミノ酸配列）：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号８）
【００８６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアント（例えばｆＣａｓ９）に結合するｇＲＮＡは、スペーサー配列に関して２通りの１つで並べられ得、これらは「Ａ」および「Ｂ」並びとされる。並びＡにおいて、ＰＡＭモチーフに結合するｇＲＮＡの領域はスペーサー配列に対して遠位であり、ｇＲＮＡの５’末端はスペーサー配列に隣接している（図６Ｃ）。一方、並びＢにおいて、ＰＡＭモチーフに結合するｇＲＮＡの領域はスペーサー配列に隣接している（図９）。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＡまたはＢ並びでターゲット核酸に（例えば、ｆＣａｓ９などのＣａｓ９バリアントとの複合体の一部として）結合するように操作または選択される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ａ並びでターゲット核酸に（例えば、ｆＣａｓ９などのＣａｓ９バリアントとの複合体の一部として）結合するように操作または選択される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ｂ並びでターゲット核酸に（例えば、ｆＣａｓ９などのＣａｓ９バリアントとの複合体の一部として）結合するように操作または選択される。
【００８７】
いくつかの態様において、融合蛋白質のドメインは、例えば本明細書に記載されるリンカーを介してリンクされる。ある態様において、リンカーはペプチドリンカーである。他の態様において、リンカーは非ペプチド性のリンカーである。いくつかの態様において、機能ドメインが、本発明融合蛋白質に非ペプチド性のリンカーまたはペプチドリンカーを介してリンクされる（例えば融合される）。いくつかの態様において、機能ドメインは核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインである。ＮＬＳドメインは、核輸送による細胞核内への取り込みのために蛋白質に「タグづけする」またはシグナルを送るアミノ酸配列を含む。典型的には、このシグナルは、蛋白質表面上に暴露された正荷電したリシンまたはアルギニンの１つまたは２つ以上の短い配列からなる。ＮＬＳ配列は当分野において周知であり（例えば、Lange et al.,「Classical nuclear localization signals: definition, function, and interaction with importin alpha.」J Biol Chem. 2007 Feb 23;282(8):5101-5参照。その全内容は参照によってここに組み込まれる）、例えば実施例の項に記載されているものを包含する。いくつかの態様において、ＮＬＳ配列は、アミノ酸配列ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＲＧＶＰ（配列番号３１８）を部分的または全体的に含む。リンカーを介して結びつけられたドメイン（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメイン（ｄＣａｓ９ドメイン）、触媒ヌクレアーゼドメイン、およびＮＬＳドメインの２つまたは３つ以上）は、いずれかの並びまたは順序でリンクされ得る。例えば、いくつかの態様において、いずれかのドメインは、融合蛋白質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣ末端のドメイン間にあり得る。いくつかの態様において、本発明融合蛋白質におけるドメインの並びまたは順序は図６Ｂにおいて提供される通りである。いくつかの態様において、融合蛋白質は３つのドメイン（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメイン（例えばｄＣａｓ９ドメイン）、ヌクレアーゼドメイン（例えばＦｏｋＩ）、およびＮＬＳドメイン）を含み、各ドメインは、本明細書において提供されるリンカーによって繋がれる。いくつかの態様において、ドメインはリンカーを介しては繋がれない。いくつかの態様において、ドメインの１つまたは２つ以上はリンカーを介して繋がれる。
【００８８】
いくつかの態様において、３つのドメイン（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメイン（例えばｄＣａｓ９ドメイン）、ヌクレアーゼドメイン（例えばＦｏｋＩ）、およびＮＬＳドメイン）を含む本発明融合蛋白質（例えばｆＣａｓ９）は、下で示されている配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号３１９として示されるヌクレオチド配列（またはその断片もしくはバリアント）によってコードされる。
【００８９】
ｆＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＧＧＳ３リンカー−ＦｏｋＩ）：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGATCAGGTGGAAGTGGCGGCAGCGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT（配列番号９）
【００９０】
ｆＣａｓ９（例えば、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＧＧＳ３リンカー−ＦｏｋＩ）：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACTCAGGTGGAAGTGGCGGCAGCGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACC
TTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT（配列番号１０）
【００９１】
ｆＣａｓ９（例えば、ＦｏｋＩ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ）：
ATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA（配列番号１１）
【００９２】
ｆＣａｓ９（例えば、ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９）：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC（配列番号１２）
【００９３】
ｆＣａｓ９：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTAGCGGCAGCGAGACTCCCGGGACCTCAGAGTCCGCCACACCCGAAAGTGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC（配列番号３１９）
【００９４】
いくつかの態様において、本発明融合蛋白質（例えばｆＣａｓ９）は、配列番号９〜１２または配列番号３１９のいずれか１つのホモログに対応するか、またはそれによってコードされる。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明融合蛋白質（例えばｆＣａｓ９）は、部分的または全体的に、本明細書において提供され下で示されている通り配列番号５、配列番号３２０、配列番号６、配列番号１６、配列番号３１８、および配列番号３２１として示されるアミノ酸配列の１つまたは２つ以上を含む。配列番号５、配列番号３２０、配列番号６、配列番号１６、配列番号３１８、および配列番号３２１に対応するさまざまなドメインは、互いに関していずれかの順序で編成され得る。例えば、いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメイン（例えば、配列番号５または配列番号３２０）はアミノもしくはカルボキシ末端にあるか、またはアミノおよびカルボキシ末端間のどこかにある。類似に、配列番号６、配列番号１６、配列番号３１８、および配列番号３２１に対応する他のドメインのそれぞれは、本発明融合蛋白質（例えばｆＣａｓ９）のアミノもしくはカルボキシ末端またはアミノおよびカルボキシ末端間のどこかにあり得る。さまざまなドメイン編成を有する本発明融合蛋白質の例は、配列番号９〜１２および配列番号３１９に対応する本発明融合蛋白質を包含する。いくつかの態様において、本発明融合蛋白質は、追加のまたは他のドメイン（例えば、他のリンカー、他のＮＬＳドメイン、他のヌクレアーゼドメイン、または他のＣａｓ９ドメイン）を含み、本明細書において提供されるドメインのいずれかに加えてであるかまたはそれと置換され得る。
【００９６】
ＦｏｋＩ切断ドメイン：
GSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF（配列番号６）
【００９７】
ｄＣａｓ９：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号３２０）
【００９８】
３×ＦＬＡＧタグ：
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK（配列番号３２１）
【００９９】
ＮＬＳドメイン：
MAPKKKRKVGIHRGVP（配列番号３１８）
【０１００】
ＸＴＥＮリンカー：
SGSETPGTSESATPES（配列番号１６）
【０１０１】
いくつかの態様において、二量体を形成する融合蛋白質は、（例えば、それぞれ融合蛋白質二量体の単量体に結合する２つの別々のｇＲＮＡと対比して）単一の拡張型ｇＲＮＡの作用を介して連係する。それゆえに、いくつかの側面において、単一の拡張型ｇＲＮＡは、ターゲット核酸を相補し（例えば、２つの別個の部位においてターゲット核酸に結合し）リンカー配列によって離間された少なくとも２つの部分を含有し、ｇＲＮＡは、本明細書に記載される通り少なくとも２つの融合蛋白質に結合する能力がある。これは、図１Ｂに示されている模式図によって例示される。いくつかの態様において、拡張型ｇＲＮＡ中の２つの部分を離間するリンカー配列は、ターゲット配列との相補性を有する。いくつかの態様において、拡張型ｇＲＮＡは、長さ少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００、または１００１ヌクレオチドである。融合蛋白質が、ターゲット核酸を切断し得る二量体を形成するために別々のまたは単一のｇＲＮＡを介して連係するかどうかにかかわらず、かかる切断の特異性は、単一のターゲット核酸結合部位を有するヌクレアーゼと比較して向上する（例えば、オフターゲット切断が減少するかまたはなくなる）ということが予想される。ヌクレアーゼの特異性を決定するための方法は公知である（例えば、公開ＰＣＴ出願WO2013/066438、係属中の仮出願US61/864,289、およびPattanayak, V., Ramirez, C.L., Joung, J.K. & Liu, D.R. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nature Methods 8, 765-770 (2011)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０２】
別の態様に従って、Ｃａｓ９蛋白質の二量体が提供される。いくつかの態様において、二量体は、ターゲット核酸を相補する少なくとも２つの部分を含む単一の拡張型ｇＲＮＡの作用を介して連係する。いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的な部分は、ターゲット核酸を相補する２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、または５ヌクレオチド以下を含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的な部分は５〜３０、５〜２５、または５〜２０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的な部分は１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、部分は、ターゲット核酸を相補するヌクレオチドの同じ数を含む。いくつかの態様において、部分は、ターゲット核酸を相補するヌクレオチドの異なる数を含む。例えば、いくつかの態様において、拡張型ｇＲＮＡは、ターゲット核酸を相補する（例えば、且つそれにハイブリダイゼーションする）２つの部分を含み、各部分は、ターゲット核酸を相補する５〜１９、１０〜１５、または１０ヌクレオチドを含む。いずれかの特定の理論によって束縛されようとするものではないが、ｇＲＮＡに典型的なおよそ２０ヌクレオチドよりも少しを部分が含むようにすることは（例えば、およそ５〜１９、１０〜１５、または１０個の相補的なヌクレオチドを部分が含むようにすることは）、単一のＣａｓ９：ｇＲＮＡ単位がそれ自体では効率的には結合し得ないということを保証する。それゆえに、拡張型ｇＲＮＡによって連係したＣａｓ９蛋白質間の協同的結合は、意図するターゲット核酸の特異性および切断を改善する。いくつかの態様において、拡張型ｇＲＮＡの２つの部分を離間するリンカー配列は、ターゲット配列との相補性を有する。例えば、いくつかの態様において、リンカー配列は、ターゲット核酸を相補する少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０ヌクレオチドを有する。いずれかの特定の理論によって束縛されようとするものではないが、Ｃａｓ９蛋白質によって結合されるもの、さらにはリンカー配列中のものを包含する複数の結合部位（例えば、複数の低親和性結合部位）を含む拡張型ｇＲＮＡを有することは、協同的結合を促進することによって増大した特異性を可能にするということが信じられる。この態様のある側面が図４に示されている。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質のいずれかは、単一の拡張型ｇＲＮＡを介して連係し得る。
【０１０３】
別の態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質が提供される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質はＤＮＡ切断ドメインを含まない（本明細書においてはＣａｓ９の「Ａハーフ」と言われる）。他の態様において、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン（単数または複数）（例えば、ＨＮＨ、ＲｕｖＣ１サブドメイン）を含む蛋白質が提供される。いくつかの態様において、「ＤＮＡ切断ドメイン」は、二本鎖ＤＮＡ切断のために要求されるＣａｓ９の部分を総括的に言う（例えば、ＨＮＨ、ＲｕｖＣＩサブドメイン）。いくつかの態様において、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質はｇＲＮＡ結合ドメインを含まない（本明細書においてはＣａｓ９の「Ｂハーフ」と言われる）。いくつかの態様において、二量体が提供され、これは（ｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質（例えばＡハーフ）と（ｉｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質（例えばＢハーフ）とを含む。いくつかの態様において、二量体はｇＲＮＡによって結合される。例えば、かかる二量体は全長Ｃａｓ９蛋白質の結合および切断活性を再現すると予想される。いくつかの態様において、かかる二量体は本明細書において「二量体分割型Ｃａｓ９」と言われる。ターゲット核酸を切断するために二量体分割型Ｃａｓ９を用いることは、単一の全長Ｃａｓ９蛋白質と比較して増大した特異性を可能にすると予想される。なぜなら、蛋白質の両方のハーフが共局在して、結びついてヌクレアーゼ活性状態にリフォールディングしなければならないからである。この戦略は図２Ａの模式図に示されている。
【０１０４】
いくつかの態様において、２つのドメイン、（ｉｉ）ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼの断片（例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９のＡまたはＢハーフ）に融合またはリンクされた（ｉ）ターゲット核酸に特異的に結合する力能がある蛋白質（例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９などの、ヌクレアーゼ不活性型のＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ）を含む融合蛋白質が提供される。いくつかの態様において、前述の融合蛋白質のドメイン（ｉ）はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ蛋白質のＤＮＡ結合ドメイン）を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン（例えばＣａｓ９のＡハーフ）とを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質のドメイン（ｉｉ）はＤＮＡ切断ドメインを包含しない。他の態様において、融合蛋白質は（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）ＤＮＡ切断ドメイン（例えばＣａｓ９のＢハーフ）とを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質のドメイン（ｉｉ）はｇＲＮＡ結合ドメインを包含しない。
【０１０５】
いくつかの態様において、二量体が提供され、これは、２つの蛋白質（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＡハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）および（ｉｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフ）を含む。他の態様において、二量体は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）および（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質（例えばＣａｓ９のＡハーフ）を含む。いくつかの態様において、蛋白質二量体は１つまたは２つ以上のｇＲＮＡを包含する。例えば、いくつかの態様において、二量体は２つのｇＲＮＡを包含し、１つは融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインによって結合され、もう一方はＡハーフドメイン（例えば、融合蛋白質のＡハーフまたは融合蛋白質の一部でない二量体のＡハーフいずれか）によって結合される。かかる二量体は（例えば、ターゲット核酸の別々の領域に結合する配列を有する２つのｇＲＮＡと結びついて）、例えば単一のｇＲＮＡを有するＣａｓ９蛋白質と比較して改善された特異性を有すると予想される。この戦略は図２Ｂに示されている。
【０１０６】
いくつかの態様においては蛋白質二量体が提供され、これは、２つの融合蛋白質（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＡハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）を含む。いくつかの態様において、二量体は１つまたは２つ以上の別個のｇＲＮＡと結びつく（例えば結合する）。例えば、いくつかの態様において、二量体は２つまたは３つのｇＲＮＡと結びつく。いくつかの態様において、二量体は３つのｇＲＮＡと結びつく。例えば、核酸ターゲットの一領域への１つのヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９：ｇＲＮＡの結合と核酸ターゲットの第２の領域へのもう一方のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９：ｇＲＮＡの結合とによって、分割型Ｃａｓ９ハーフ（例えば、融合蛋白質のＡハーフおよびＢハーフ）は二量体化し、核酸ターゲットの第３の領域に相補的な第３のｇＲＮＡに結合して、完全に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼになり得、これがｄｓＤＮＡを切断し得る。この戦略は図２Ｃに例解されている。
【０１０７】
本発明の別の側面に従って、最小化されたＣａｓ９蛋白質が提供される。「最小化された」によって、Ｃａｓ９蛋白質は野生型蛋白質と比較してアミノ酸欠失および／または末端欠損を含むが、ｇＲＮＡ結合活性、ＤＮＡ切断活性、または両方を保持するということが意味される。Ｃａｓ９蛋白質（例えば、分割型Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９のＡハーフ、Ｃａｓ９のＢハーフ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９融合蛋白質など）を記載する本明細書の態様のいずれかは、最小化されたＣａｓ９蛋白質を利用し得る。いくつかの態様において、Ｎ末端の欠失および／または末端欠損を含む最小化されたＣａｓ９蛋白質が提供される。いくつかの態様において、Ｃ末端の欠失および／または末端欠損を含む最小化されたＣａｓ９蛋白質が提供される。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質が提供され、それらはＮおよび／またはＣ末端の欠失および／または末端欠損を含む。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質はｇＲＮＡ結合およびＤＮＡ切断活性両方を保持する。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質はＮ末端の末端欠損を含み、これは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸を取り除く。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質はＣ末端の末端欠損を含み、これは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも４０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸を取り除く。いくつかの態様において、欠失はＣａｓ９内において（例えば、ｇＲＮＡ結合および／またはＤＮＡ切断に影響しない領域内において）なされる。いくつかの態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質は１つまたは２つ以上のｇＲＮＡと結びつく。ある態様において、最小化されたＣａｓ９蛋白質は１つのｇＲＮＡと結びつく。
【０１０８】
リコンビナーゼ
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載される方法および戦略を用いて設計されるＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質を提供する。本開示のいくつかの態様は、かかるリコンビナーゼをコードする核酸を提供する。本開示のいくつかの態様は、かかるコード核酸を含む発現構築物を提供する。例えば、いくつかの態様において、単離されたリコンビナーゼが提供され、これは、ゲノム中の望まれるターゲット部位（例えば、操作されたリコンビナーゼの１つまたは２つ以上に結合した１つまたは２つ以上のｇＲＮＡによってターゲティングされる部位）を、例えばゲノム中の別の部位または外来性核酸と組み換えるように操作されている。いくつかの態様において、単離されたリコンビナーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのバリアントを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（例えばｄＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、部分的または全体的に配列番号５または配列番号３２０を含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、配列番号５または配列番号３２０のバリアントを含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１０９】
１つの態様において、ＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質が提供される。典型的には、融合蛋白質は２つまたは３つ以上のドメインを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は２つのドメインを含む。いくつかの態様において、２つまたは３つ以上のドメインの１つは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（またはその断片、例えばＣａｓ９のＡハーフ）、例えば本明細書に記載されるもの（例えばｄＣａｓ９）である。リコンビナーゼ融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは１つまたは２つ以上のｇＲＮＡに結合する力能があり、それによって、例えば本明細書に記載されるターゲット核酸にリコンビナーゼ融合蛋白質（単数または複数）を導くかまたはターゲティングする。２つまたは３つ以上のドメインの別のドメインは、リコンビナーゼまたはその断片、例えばリコンビナーゼの触媒ドメインである。「リコンビナーゼの触媒ドメイン」によって、融合蛋白質は、リコンビナーゼの（例えばそれに由来する）アミノ酸配列を含むドメインを包含し、その結果、ドメインは、（単独で、または追加の因子（融合蛋白質の一部を形成し得るかまたは形成せずあり得る他のリコンビナーゼ触媒ドメインを包含する）と一緒にのいずれかで）ターゲット核酸と接触させられたときに組み換えを誘導するのに十分であるということが意味される。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインはリコンビナーゼのＤＮＡ結合ドメインを除外する。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインはリコンビナーゼの一部または全てを包含する。例えば、触媒ドメインはリコンビナーゼドメインおよびＤＮＡ結合ドメインもしくはその一部を包含し得るか、または触媒ドメインはリコンビナーゼドメインと変異もしくは末端欠損してＤＮＡ結合活性を廃したＤＮＡ結合ドメインとを包含し得る。リコンビナーゼおよびリコンビナーゼの触媒ドメインは当業者に公知であり、例えば本明細書に記載されるものを包含する。いくつかの態様において、触媒ドメインはいずれかのリコンビナーゼに由来する。いくつかの態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインはＴｎ３リゾルベース、Ｈｉｎリコンビナーゼ、またはＧｉｎリコンビナーゼの触媒ドメインである。いくつかの態様において、触媒ドメインはＴｎ３リゾルベース（例えば、ＳｔａｒｋのＴｎ３リコンビナーゼ）を含み、これは、下で提供される配列番号３２２を部分的または全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様において、Ｔｎ３触媒ドメインは配列番号３２２のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｔｎ３触媒ドメインは、配列番号３２５に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。いくつかの態様において、触媒ドメインは、下で提供される配列番号３２３を部分的または全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされるＨｉｎリコンビナーゼを含む。いくつかの態様において、Ｈｉｎ触媒ドメインは配列番号３２３のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｈｉｎ触媒ドメインは、配列番号３２６に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。いくつかの態様において、触媒ドメインは、下で提供される配列番号３２４を部分的または全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされるＧｉｎリコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎベータリコンビナーゼ）を含む。いくつかの態様において、Ｇｉｎ触媒ドメインは配列番号３２４のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｇｉｎ触媒ドメインは、配列番号３２７に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。
【０１１０】
ＳｔａｒｋのＴｎ３リコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号３２２、アミノ酸：配列番号３２５）：
ATGGCCCTGTTTGGCTACGCACGCGTGTCTACCAGTCAACAGTCACTCGATTTGCAAGTGAGGGCTCTTAAAGATGCCGGAGTGAAGGCAAACAGAATTTTTACTGATAAGGCCAGCGGAAGCAGCACAGACAGAGAGGGGCTGGATCTCCTGAGAATGAAGGTAAAGGAGGGTGATGTGATCTTGGTCAAAAAATTGGATCGACTGGGGAGAGACACAGCTGATATGCTTCAGCTTATTAAAGAGTTTGACGCTCAGGGTGTTGCCGTGAGGTTTATCGATGACGGCATCTCAACCGACTCCTACATTGGTCTTATGTTTGTGACAATTTTGTCCGCTGTGGCTCAGGCTGAGCGGAGAAGGATTCTCGAAAGGACGAATGAGGGACGGCAAGCAGCTAAGTTGAAAGGTATCAAATTTGGCAGACGAAGG（配列番号３２２）
MALFGYARVSTSQQSLDLQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSTDREGLDLLRMKVKEGDVILVKKLDRLGRDTADMLQLIKEFDAQGVAVRFIDDGISTDSYIGLMFVTILSAVAQAERRRILERTNEGRQAAKLKGIKFGRRR（配列番号３２５）
【０１１１】
Ｈｉｎリコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号３２３、アミノ酸：配列番号３２６）：
ATGGCAACCATTGGCTACATAAGGGTGTCTACCATCGACCAAAATATCGACCTGCAGCGCAACGCTCTGACATCCGCCAACTGCGATCGGATCTTCGAGGATAGGATCAGTGGCAAGATCGCCAACCGGCCCGGTCTGAAGCGGGCTCTGAAGTACGTGAATAAGGGCGATACTCTGGTTGTGTGGAAGTTGGATCGCTTGGGTAGATCAGTGAAGAATCTCGTAGCCCTGATAAGCGAGCTGCACGAGAGGGGTGCACATTTCCATTCTCTGACCGATTCCATCGATACGTCTAGCGCCATGGGCCGATTCTTCTTTTACGTCATGTCCGCCCTCGCTGAAATGGAGCGCGAACTTATTGTTGAACGGACTTTGGCTGGACTGGCAGCGGCTAGAGCACAGGGCCGACTTGGA（配列番号３２３）
MATIGYIRVSTIDQNIDLQRNALTSANCDRIFEDRISGKIANRPGLKRALKYVNKGDTLVVWKLDRLGRSVKNLVALISELHERGAHFHSLTDSIDTSSAMGRFFFYVMSALAEMERELIVERTLAGLAAARAQGRLG（配列番号３２６）
【０１１２】
Ｇｉｎベータリコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号３２４、アミノ酸：配列番号３２７）：
ATGCTCATTGGCTATGTAAGGGTCAGCACCAATGACCAAAACACAGACTTGCAACGCAATGCTTTGGTTTGCGCCGGATGTGAACAGATATTTGAAGATAAACTGAGCGGCACTCGGACAGACAGACCTGGGCTTAAGAGAGCACTGAAAAGACTGCAGAAGGGGGACACCCTGGTCGTCTGGAAACTGGATCGCCTCGGACGCAGCATGAAACATCTGATTAGCCTGGTTGGTGAGCTTAGGGAGAGAGGAATCAACTTCAGAAGCCTGACCGACTCCATCGACACCAGTAGCCCCATGGGACGATTCTTCTTCTATGTGATGGGAGCACTTGCTGAGATGGAAAGAGAGCTTATTATCGAAAGAACTATGGCTGGTATCGCTGCTGCCCGGAACAAAGGCAGACGGTTCGGCAGACCGCCGAAGAGCGGC（配列番号３２４）
MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG（配列番号３２７）
【０１１３】
いくつかの態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインは、Ｃａｓ９蛋白質（例えばｓＣａｓ９）のＮ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣ末端間のどこかに融合される。いくつかの態様において、融合蛋白質は核局在シグナル（ＮＬＳ。例えば、本明細書において提供されるもののいずれか）をさらに含む。例えば、いくつかの態様において、例示的なＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質（例えばＣａｓ９−リコンビナーゼ融合体）の一般的な構成は以下の構造の１つを含み、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［リコンビナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［リコンビナーゼ］−［Ｃａｓ９］、
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［Ｃａｓ９］−［リコンビナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［リコンビナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［ＮＬＳ］−［リコンビナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［リコンビナーゼ］−［ＮＬＳ］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［リコンビナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］−［リコンビナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＮＬＳ］−［ＣＯＯＨ］、
ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーがＣａｓ９ドメインとリコンビナーゼドメインとの間に挿入される（例えば、本明細書において提供されるいずれかのリンカー）。追加の特徴、例えば配列タグ（例えば、本明細書において提供されるもののいずれか）もまた存在し得る。
【０１１４】
医薬組成物
いくつかの態様において、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼドメインを含む融合蛋白質）およびリコンビナーゼ（例えば、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼ触媒ドメインを含む融合蛋白質）のいずれかは、医薬組成物の一部として提供される。例えば、いくつかの態様は医薬組成物を提供し、本明細書において提供されるヌクレアーゼおよび／もしくはリコンビナーゼ、またはかかるヌクレアーゼおよび／もしくはリコンビナーゼをコードする核酸と、医薬上受け入れられる添加剤とを含む。医薬組成物は１つまたは２つ以上の追加の治療活性物質を任意で含み得る。
【０１１５】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物は、対象中のターゲティングされたゲノム改変を実現するために対象に（例えばヒト対象に）投与される。いくつかの態様において、細胞が対象から得られ、ヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼとエクスビボで接触させられる。いくつかの態様において、対象から取り除かれて本発明ヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼとエクスビボで接触させられた細胞は、任意で望まれるゲノム改変が細胞内に実現または検出された後に、対象中に再導入される。本明細書において提供される医薬組成物の記載は、ヒトへの投与にとって好適である医薬組成物に主として向けられているが、かかる組成物が一般的に全ての種類の動物への投与にとって好適であるということは当業者によって理解されるであろう。組成物をさまざまな動物への投与にとって好適にするための、ヒトへの投与にとって好適な医薬組成物の改変は周知であり、獣医薬理学業者は、せいぜい単なる平均的な実験法によってかかる改変を設計し得るおよび／または行い得る。医薬組成物の投与が考えられる対象は、ヒトおよび／または他の霊長類、哺乳動物、家畜、ペット、および商業的に関係する哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラット）、ならびに／または鳥類（商業的に関係する鳥類、例えばニワトリ、鴨類、ガチョウ、および／または七面鳥を包含する）を包含するが、これに限定されない。
【０１１６】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知のまたは今後開発されるいずれかの方法によって調製され得る。一般的に、かかる調製法は、有効成分を添加剤と結びつけるステップと、それから、必要なおよび／または望ましい場合には、生成物を成形および／またはパッケージングして望まれる単一または複数用量の単位にすることとを包含する。
【０１１７】
加えて、医薬製剤は医薬上受け入れられる添加剤を含み得、これは、本明細書において用いられる場合、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体基剤、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘もしくは乳化剤、保存料、固体結合剤、滑剤、ならびに同類を、望まれる特定の剤形に適するように包含する。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006。参照によって本明細書にその全体が組み込まれる）は、医薬組成物を製剤することに用いられるさまざまな添加剤、およびその調製のための公知技術を開示している。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を生成するための追加の好適な方法、試薬、添加剤、および溶媒については、参照によって本明細書にその全体が組み込まれるＰＣＴ出願PCT/US2010/055131をもまた参照。いずれかの従来の添加剤媒質が物質またはその誘導体と非適合性である（例えば、いずれかの望ましくない生物学的効果を生成すること、または別様には医薬組成物のいずれかの他の構成要素（単数または複数）と有害な様式で相互作用することによる）限りを除いて、その使用は本開示の範囲内であると考えられる。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明に従った組成物は、さまざまな疾患、障害、および／または状態のいずれかの処置のために用いられ得、それらは以下の１つまたは２つ以上を包含するが、これに限定されない。自己免疫疾患（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患)、感染症（例えばウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症)、神経疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、自閉症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、心血管障害（例えば、アテローム硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）、増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）、呼吸器系障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）、消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）、筋骨格系疾患（例えば、線維筋痛症、関節炎）、内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗しょう症）、泌尿器障害（例えば、腎疾患）、精神障害（例えば、抑うつ、統合失調症）、皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）、血液およびリンパ系疾患（例えば、貧血症、血友病）など。
【０１１９】
部位特異的な核酸切断のための方法
本開示の別の態様において、部位特異的な核酸（例えばＤＮＡ）切断のための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載されるＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体のいずれかとＤＮＡを接触させることを含む。例えば、いくつかの態様において、方法は、２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）および（ｉｉ）ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン）を含む融合蛋白質（例えば、ｆＣａｓ９）と、ＤＮＡを接触させることを含み、不活性なＣａｓ９ドメインは、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合する。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載される第２の融合蛋白質（例えばｆＣａｓ９）とＤＮＡを接触させることをさらに含み、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインは、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合し、融合蛋白質の結合は融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡは、結合した融合蛋白質間の領域において切断される。例えば図１Ａ、６Ｄ参照。いくつかの態様において、各融合蛋白質に結合したｇＲＮＡはＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはそれらはＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。結合したＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体間の領域は「スペーサー配列」と言われ得、これは典型的にはターゲット核酸が切断されるところである。例えば図６Ｃ〜Ｄ参照。いくつかの態様において、スペーサー配列は、長さ少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００塩基対である。いくつかの態様において、スペーサー配列は長さ約５〜約５０塩基対、約１０〜約４０、または約１５〜約３０塩基対である。いくつかの態様において、スペーサー配列は長さ約１５〜約２５塩基対である。いくつかの態様において、スペーサー配列は長さ約１５、約２０、または約２５塩基対である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体は本明細書に記載されるＡ並びで結合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体は本明細書に記載されるＢ並びで結合する。いくつかの態様において、方法は、野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９バリアントを利用する方法のオンターゲット：オフターゲット改変比よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７５倍、少なくとも２００倍、または少なくとも２５０倍、または２５１倍以上高いオンターゲット：オフターゲット改変比を有する。いくつかの態様において、方法は、野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９バリアントを利用する方法のオンターゲット：オフターゲット改変比よりも約６０〜約１８０倍、約８０〜約１６０倍、約１００〜約１５０倍、または約１２０〜約１４０倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比を提供する。オンターゲット：オフターゲット改変比を決定するための方法は公知であり、実施例に記載されるものを包含する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、例えば本明細書に記載される単一のｇＲＮＡを介して連係するかまたは結びつけられ得る。
【０１２０】
いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載される通り単一のｇＲＮＡと連係した（例えば、結合した）Ｃａｓ９蛋白質（またはその断片）の二量体と核酸を接触させることを含む。いくつかの態様において、単一のｇＲＮＡは、核酸にハイブリダイゼーションする少なくとも２つの部分を含む。いくつかの態様において、部分は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも１９個の相補的なヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、部分は、２０個未満の相補的なヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、リンカー配列が部分を離間し、リンカー配列はターゲット核酸に相補的な（例えば、しかしＣａｓ９蛋白質によって結合されない）ヌクレオチドをもまた含む。いくつかの態様において、リンカー配列はターゲット核酸にハイブリダイゼーションしない。
【０１２１】
いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載される融合蛋白質の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、融合蛋白質は１つまたは２つ以上のｇＲＮＡによって結合される。例えば、いくつかの態様において、二量体の１つの融合蛋白質はＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン（例えばＣａｓ９のＡハーフ）を含み、蛋白質はＤＮＡ切断ドメイン（例えばＣａｓ９のＢハーフ）を含まず、二量体のもう一方の融合蛋白質はＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン（例えばＣａｓ９のＢハーフ）を含み、蛋白質はｇＲＮＡ結合ドメイン（例えばＣａｓ９のＡハーフ）を含まない。それゆえに、いくつかの態様において、二量体の単量体の１つまたは両方へのｇＲＮＡ（例えば、これはターゲット核酸にハイブリダイゼーションする）の結合は、二量体をターゲット核酸に共局在させ、二量体がリフォールディングしてヌクレアーゼ活性状態になり、ターゲット核酸を切断することを許す。
【０１２２】
いくつかの態様において、方法は、２つの蛋白質（（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＡハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）、および（ｉｉ）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフ）を含む蛋白質）を含む蛋白質二量体と核酸を接触させることを含む。他の態様において、二量体は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）および（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＡハーフ）を含む。いくつかの態様において、蛋白質二量体は１つまたは２つ以上のｇＲＮＡと結びつく。例えば、いくつかの態様において、二量体は２つのｇＲＮＡと結びつき、１つは融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインによって結合され、もう一方はＡハーフドメイン（例えば、融合蛋白質のＡハーフ、または融合蛋白質の一部でない二量体のＡハーフいずれか）によって結合される。いくつかの態様において、蛋白質二量体は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＡハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）および（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９とＤＮＡ切断ドメインとを含む融合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９のＢハーフに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９）を含む。いくつかの態様において、二量体は、１つまたは２つ以上の別個のｇＲＮＡと結びつく。例えば、いくつかの態様において、二量体は２つまたは３つのｇＲＮＡと結びつく。いくつかの態様において、二量体は３つのｇＲＮＡと結びつく。例えば、核酸ターゲットの一領域への１つのヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９：ｇＲＮＡの結合と、核酸ターゲットの第２の領域へのもう一方のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９：ｇＲＮＡとによって、分割型Ｃａｓ９ハーフ（例えば、融合蛋白質のＡハーフおよびＢハーフ）は二量体化して、核酸ターゲットの第３の領域に相補的な第３のｇＲＮＡに結合し、完全に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼになり、これがターゲットＤＮＡの切断に至る。
【０１２３】
いくつかの態様において、核酸の部位特異的な切断のための方法は、ｇＲＮＡと結びついた（例えば、本明細書に記載される）最小化されたＣａｓ９蛋白質と核酸（例えばＤＮＡ）を接触させることを含む。
【０１２４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法のいずれかは、細胞（例えば細菌、酵母細胞、または哺乳類細胞）内のＤＮＡに対して行われ得る。いくつかの態様において、本明細書において提供されるいずれかのＣａｓ９蛋白質と接触させられるＤＮＡは真核細胞内にある。いくつかの態様において、方法は、インビトロまたはエクスビボの細胞または組織に対して行われる。いくつかの態様において、真核細胞は患者または研究動物などの個体中にある。いくつかの態様において、個体はヒトである。
【０１２５】
部位特異的組み換えのための方法
本開示の別の態様において、部位特異的な核酸（例えばＤＮＡ）組み換えのための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、２つまたは３つ以上の核酸（例えばＤＮＡ）分子の２つまたは３つ以上の領域間のまたはその組み換えを誘導することにとって有用である。他の態様において、方法は、単一の核酸分子（例えばＤＮＡ）の２つまたは３つ以上の領域間のまたはその組み換えを誘導することにとって有用である。いくつかの態様において、１つまたは２つ以上のターゲット核酸分子の組み換えは、ターゲット部位における四量体複合体の形成を要求する。典型的には、四量体は、４つの（４）本発明ＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質（例えば、本明細書において提供されるいずれかの４つの本発明リコンビナーゼ融合蛋白質の複合体）を含む。いくつかの態様において、四量体の各リコンビナーゼ融合蛋白質は、各リコンビナーゼ融合蛋白質に結合した別個のｇＲＮＡを介して特定のＤＮＡ配列をターゲティングする（例えば図５参照）。
【０１２６】
いくつかの態様において、２つのＤＮＡ分子間の部位特異的組み換えのための方法は、（ａ）第１のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合することと、（ｂ）第２のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、（ｃ）第３のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合することと、（ｄ）第４のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することとを含む。ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合は、融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡが組み換えられる。いくつかの態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡは第１のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは第２のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ステップ（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡのターゲット部位は、リコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化を許す間隔である。例えば、いくつかの態様において、ステップ（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡのターゲット部位は１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れている。いくつかの態様において、組み換えられようとする２つのＤＮＡ分子の２つの領域は相同性を共有し、その結果、組み換えられようとする領域は少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％相同である。
【０１２７】
別の態様において、単一のＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的組み換えのための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、（ａ）第１のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合することと、（ｂ）第２のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、（ｃ）第３のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第３の領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合することと、（ｄ）第４のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第４の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することとを含む。ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合は融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡが組み換えられる。いくつかの態様において、ステップ（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡの２つはＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ａ）〜（ｄ）の他の２つのｇＲＮＡはＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、組み換えられようとするＤＮＡ分子の２つの領域は相同性を共有し、その結果、組み換えられようとする領域は少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％相同である。
【０１２８】
いくつかの態様において、部位特異的組み換えのための本発明方法のいずれかは、組み換えを誘導することが容易であり、その結果、組み換えは切り出し（例えば、ＤＮＡのセグメントがターゲットＤＮＡ分子から切り出される）、挿入（例えば、ＤＮＡのセグメントがターゲットＤＮＡ分子中に挿入される）、逆位（例えば、ＤＮＡのセグメントがターゲットＤＮＡ分子中で逆転する）、または転座（例えば、１つまたは２つ以上のターゲットＤＮＡ分子（単数または複数）間のＤＮＡセグメントの交換）をもたらす。いくつかの態様において、特定の組み換えイベント（例えば、切り出し、挿入、逆位、転座など）は、ことに、結合したＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質（単数または複数）の並び（例えば、ターゲットＤＮＡ分子（単数または複数）に関して）に依存する。いくつかの態様において、ＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質がターゲット核酸に結合する並びまたは方向は、例えば、ＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質（単数または複数）に結合したｇＲＮＡの特定の配列によってコントロールされ得る。特定の組み換えイベントをコントロールするかまたは導くための方法は当分野において公知であり、Turan and Bode,「Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.」FASEB J. 2011; Dec;25(12):4088-107によって記載されているものを包含し、その全内容は参照によってここに組み込まれる。
【０１２９】
いくつかの態様において、部位特異的組み換えのための方法のいずれかはインビボまたはインビトロで行われ得る。いくつかの態様において、部位特異的組み換えのための方法のいずれかは細胞内で行われ（例えば、細胞内のゲノムＤＮＡを組み換え）得る。細胞は原核または真核であり得る。真核細胞などの細胞は、本明細書に記載される対象などの個体（例えばヒト対象）中にあり得る。本明細書に記載される方法は、インビトロおよびインビボの細胞の遺伝子改変にとって、例えばトランスジェニック細胞、細胞株、もしくは動物の作出の文脈において、またはゲノム配列の変改（例えば、対象中のまたはそれから得られた細胞における遺伝子欠陥の修正）において有用である。いくつかの態様において、例えば、疾患を処置するためまたは農業もしくは生物学研究における遺伝子改変された生物の生成のために、対象から得られて本明細書において提供される方法に従って改変された細胞が、対象（例えば同じ対象）中に再導入される。
【０１３０】
ターゲット核酸中に核酸配列を挿入するように２つまたは３つ以上の核酸を組み換えることが望ましい応用において、挿入されるべきドナー配列を含む核酸もまた、例えば細胞に提供される。「ドナー配列」によって、１つまたは２つ以上のＲＮＡガイドリコンビナーゼ融合蛋白質（単数または複数）によって誘導される、ターゲット部位において挿入されるべき核酸配列を意味する。いくつかの態様において、例えばゲノム改変の文脈において、ドナー配列は、ターゲット部位におけるゲノム配列に対する相同性（例えば、ターゲット部位をフランキングするヌクレオチド配列との１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性。例えば、ターゲット部位の約１００塩基または９９塩基以下の以内、例えば、約９０塩基以内、約８０塩基以内、約７０塩基以内、約６０塩基以内、約５０塩基以内、約４０塩基以内、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内であるか、またはターゲット部位を直ちにフランキングしている）を共有するであろう。いくつかの態様において、ドナー配列はターゲット核酸とのいずれかの相同性を共有せず、例えば、ターゲット部位におけるゲノム配列に対する相同性を共有しない。ドナー配列は、いずれかの長さ、例えば１０ヌクレオチドまたは１１ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチドまたは５１ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチドまたは１０１ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチドまたは２５１ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチドまたは５０１ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチドまたは１００１ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチドまたは５００１ヌクレオチド以上、１００００ヌクレオチドまたは１０００１ヌクレオチド以上、１０００００ヌクレオチドまたは１００００１ヌクレオチド以上などであり得る。
【０１３１】
典型的には、ドナー配列は、それが置き換えるかまたは挿入されるターゲット配列と同一でない。いくつかの態様において、ドナー配列は、少なくとも１つまたは２つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または再構成をターゲット配列（例えば、ターゲットゲノム配列）に関して含有する。いくつかの態様において、ドナー配列は、興味あるＤＮＡ領域に相補的でなく且つ興味あるＤＮＡ領域への挿入を意図されていない配列を含有するベクターバックボーンをもまた含む。
【０１３２】
ドナー配列は、ターゲット（例えばゲノム）配列と比較してある配列の差異、例えば制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光蛋白質、酵素など）を含み得、これらは、ターゲット部位におけるドナー配列の首尾よい挿入について評価するために用いられ得るか、またはいくつかのケースでは他の目的のために（例えば、ターゲティングされたゲノム遺伝子座における発現を知らせるために）用いられ得る。いくつかの態様において、コード領域中に所在する場合、かかるヌクレオチド配列の差異はアミノ酸配列を変化させないか、またはサイレントなアミノ酸変化（例えば、蛋白質の構造または機能に影響しない変化）を作るであろう。いくつかの態様において、それらの配列の差異は、フランキングする組み換え配列（例えばＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列、または同類）を包含し得、これは例えばマーカー配列の取り除きのために後で活性化され得る。
【０１３３】
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。それは直鎖状または環状形態で細胞内に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合には、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって（例えば、エキソ的な（exonucleolytic）分解から）保護され得る。例えば、１つまたは２つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に追加され、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドが１つまたは両方の末端にライゲーションされる。例えば、Chang et al., Proc. Natl. Acad Sci USA. 1987; 84:4959-4963、Nehls et al., Science. 1996; 272:886-889参照。いくつかの態様において、ドナー配列は、追加の配列（例えば複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子など）を有するベクター分子の一部として細胞内に導入され得る。いくつかの態様において、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶなど）によって送達され得る。
【０１３４】
ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、キット
本開示の別の態様において、本発明蛋白質および／またはｇＲＮＡの１つまたは２つ以上をコードするポリヌクレオチドが提供される。例えば、本明細書に記載される蛋白質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが、例えば、単離されたヌクレアーゼおよびリコンビナーゼ（例えばＣａｓ９バリアントを含む）の組み換え発現および精製のために提供される。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ハーフ部位（例えば、Ａハーフおよび／またはＢハーフ）をコードする１つまたは２つ以上の配列を含む。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９融合蛋白質、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９融合蛋白質のいずれか（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９を含むもの）をコードする１つまたは２つ以上の配列を含む。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡをコードする１つまたは２つ以上の配列を単独で、または本明細書に記載される蛋白質のいずれかをコードする配列との組み合わせで含む。
【０１３５】
いくつかの態様において、本明細書に記載される蛋白質のいずれかをコードするベクターが、例えば、Ｃａｓ９蛋白質および／またはＣａｓ９蛋白質（例えばバリアント）を含む融合体の組み換え発現および精製のために提供される。いくつかの態様において、ベクターは単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるもの）を含むか、または包含するように操作される。いくつかの態様において、ベクターは、（本明細書に記載される）Ｃａｓ９蛋白質、ｇＲＮＡ、またはその組み合わせをコードする１つまたは２つ以上の配列を、本明細書に記載される通り含む。典型的には、ベクターは、プロモーターに作動可能にリンクされた本発明蛋白質をコードする配列を含み、その結果、融合蛋白質は宿主細胞内で発現される。
【０１３６】
いくつかの態様において、例えば、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかの組み換え発現および精製のために細胞が提供される。細胞は、組み換え蛋白質発現にとって好適ないずれかの細胞、例えば、本発明蛋白質を発現するかまたは発現する力能がある遺伝子構築物を含む細胞（例えば、本明細書に記載される１つもしくは２つ以上のベクターによって形質転換された細胞、またはゲノム改変を有する細胞、例えば、細胞のゲノム中に組み込まれたアレルから本明細書において提供される蛋白質を発現するもの）を包含する。細胞を形質転換、細胞を遺伝子改変、およびかかる細胞内で遺伝子および蛋白質を発現するための方法は当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))およびFriedman and Rossi, Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual (1st ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2006))によって提供されるものを包含する。
【０１３７】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９バリアントおよび／またはヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、例えば本明細書において提供される本発明Ｃａｓ９バリアント、ヌクレアーゼ、および／またはリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、キットは組み換え蛋白質発現のためのベクターを含み、ベクターは、本明細書において提供される蛋白質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、キットは細胞（例えば、Ｃａｓ９蛋白質またはＣａｓ９蛋白質を含む融合体を発現することにとって好適ないずれかの細胞、例えば細菌、酵母、または哺乳類細胞）を含み、これは、本明細書において提供される蛋白質のいずれかを発現するための遺伝子構築物を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるキットのいずれかは、１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つもしくは２つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む。いくつかの態様において、キットは、ターゲット核酸へのハイブリダイゼーションとその切断および／または組み換えが起こるように、ヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼと核酸を接触させることにとって好適な組成物を作出するために、添加剤とヌクレアーゼおよび／またはリコンビナーゼを接触させるための取扱説明書および添加剤を含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞にＣａｓ９蛋白質を送達することにとって好適である。いくつかの態様において、組成物は、対象にＣａｓ９蛋白質を送達することにとって好適である。いくつかの態様において、添加剤は医薬上受け入れられる添加剤である。
【０１３８】
本発明のこれらおよび他の態様の機能および利点は、下の実施例からより完全に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利益を例解することおよび特定の態様を記載することを意図されているが、本発明の完全な範囲を例示することは意図されていない。従って、実施例が本発明の範囲を限定することを意味されていないということは理解されるであろう。
【実施例】
【０１３９】
例１：ＦｏｋＩヌクレアーゼへの不活性型Ｃａｓ９の融合はゲノム改変特異性を改善する
方法：
オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ
全てのオリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologies（ＩＤＴ）から購入した。オリゴヌクレオチド配列は表１に列挙されている。別様に注記しない限り、ＰＣＲは、２Ｕ／μＬのPhusion Hot Start FlexＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）の０．４μＬによって、５０μＬ中で、１×ＨＦ緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス（０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ）（ＮＥＢ）、各プライマーの０．５μＭ、および９８℃，１ｍｉｎ；［９８℃，１５ｓ；６５℃，１５ｓ；７２℃，３０ｓ］の３５サイクルのプログラムによって行った。
【０１４０】
ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、およびｇＲＮＡ発現プラスミドの構築
ＮＬＳおよび３×ＦＬＡＧタグを有するヒトコドン最適化されたｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９ヌクレアーゼ（Addgeneプラスミド４３８６１）２を、野生型Ｃａｓ９発現プラスミドとして用いた。下の表１に列挙されているＣａｓ９＿Ｅｘｐプライマーによる、鋳型としての野生型Ｃａｓ９発現プラスミドのＰＣＲ（７２℃，３ｍｉｎ）生成物を、Gibson Assemblyクローニングキット（New England Biolabs）によってアセンブリし、Ｃａｓ９およびＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９バリアントを構築した。単一のｇＲＮＡ構築物（ｇＲＮＡのＧ１〜Ｇ１３）をコードする発現プラスミドを、以前に記載された通りクローニングした。簡潔には、２０ｂｐプロトスペーサーターゲット配列を含有する表１に列挙されたｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングし、もたらされた４ｂｐオーバーハングを、ＢｓｍＢＩ消化したｇＲＮＡ発現プラスミドにライゲーションした。単一のプラスミド上の別々のプロモーターからの２つの別々のｇＲＮＡ構築物の発現をコードするｇＲＮＡ発現プラスミドを、２ステッププロセスでクローニングした。最初に、１つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＥ１、Ｖ１、Ｃ１、Ｃ３、Ｈ１、Ｇ１、Ｇ２、またはＧ３）を上の通りクローニングし、ＰＣＲ＿Ｐｌａ−ｆｗｄおよびＰＣＲ＿Ｐｌａ−ｒｅｖプライマーによるＰＣＲ（７２℃，３ｍｉｎ）の鋳型として用い、１μｌのＤｐｎＩ（ＮＥＢ）を追加し、反応を３７℃で３０ｍｉｎインキュベーションし、それからQIAquickＰＣＲ精製キット（Qiagen）に供して「１ｓｔｇＲＮＡ＋ベクターＤＮＡ」とした。表１に列挙されているＰＣＲ＿ｇＲＮＡ−ｆｗｄ１、ＰＣＲ＿ｇＲＮＡ−ｒｅｖ１、ＰＣＲ＿ｇＲＮＡ−ｒｅｖ２、および適切なＰＣＲ＿ｇＲＮＡプライマーによる、鋳型としてのＢｓｍＢＩ消化したｇＲＮＡ発現プラスミドの１００ｐｇのＰＣＲ（７２℃，３ｍｉｎ）をＤｐｎＩ処置し、上の通り精製して「２ｎｄｇＲＮＡｉｎｓｔｅｒｔＤＮＡ」とした。「１ｓｔｇＲＮＡ＋ベクターＤＮＡ」の約２００ｎｇおよび「２ｎｄｇＲＮＡｉｎｓｔｅｒｔＤＮＡ」の約２００ｎｇを、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）の１μｌ中で、２０μｌの合計体積で室温（約２１℃）において１５ｍｉｎ、平滑末端ライゲーションした。全てのクローニングについて、ライゲーションまたはアセンブリ反応の１μｌをＭａｃｈ１ケミカルコンピテントセル（Life Technologies）に形質転換した。
【表１−１】
2016537008.tif 000002
【表１−２】
2016537008.tif 000003
【表１−３】
2016537008.tif 000004
【表１−４】
2016537008.tif 000005
【表１−５】
2016537008.tif 000006
【０１４１】
ゲノムＧＦＰの改変
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ安定細胞（GenTarget）を、ゲノム上にインテグレーションされたエメラルドＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ）を恒常的に発現する細胞株として用いた。細胞は、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Life Technologies）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１×、Amresco）を補ったダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Life Technologies）中で維持した。５×１０４個のＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞を４８ウェルコラーゲンコーティングＢｉｏｃｏａｔプレート（Becton Dickinson）上にプレーティングした。プレーティングに続く１日、約７５％コンフルエンスにある細胞を、製造者のプロトコールに従ってLipofecatmine 2000（Life Technologies）によってトランスフェクションした。簡潔には、Lipofecatmine 2000の１．５μＬを用いて、合計のプラスミドの９５０ｎｇ（Ｃａｓ９発現プラスミド＋ｇＲＮＡ発現プラスミド）をトランスフェクションした。Ｃａｓ９発現プラスミドの７００ｎｇ、１つのｇＲＮＡ発現プラスミドの１２５ｎｇ、および対ｇＲＮＡ発現プラスミドの１２５ｎｇ。ターゲティングされたｇＲＮＡの対は図６Ｄおよび図９Ａに列挙されている。別々のウェルを、トランスフェクションコントロールとしての近赤外ｉＲＦＰ６７０（Addgeneプラスミド４５４５７）３２の１μｇによってトランスフェクションした。トランスフェクションに続く３．５日、細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中に再懸濁し、４８８ｎｍレーザー励起および２０ｎｍバンドパスを有する５２０ｎｍフィルターによってＣ６フロー部位メータ（Accuri）上で分析した。各サンプルについて、トランスフェクションおよびフロー部位メトリー測定を一回行った。
【０１４２】
ゲノム改変のＴ７エンドヌクレアーゼＩSurveyorアッセイ
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ安定細胞を、上で記載されたＣａｓ９発現およびｇＲＮＡ発現プラスミドによってトランスフェクションした。２つの別々のｇＲＮＡをコードする単一のプラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドの合計量（Ｃａｓ９発現＋ｇＲＮＡ発現プラスミド）をタイトレーションする実験のためには、７００／２５０、３５０／１２５、１７５／６２．５、８８／３１（Ｃａｓ９発現プラスミドのｎｇ／ｇＲＮＡ発現プラスミドのｎｇ）を、合計９５０ｎｇのトランスフェクションされたプラスミドＤＮＡに達するように、必要に応じて不活性な担体プラスミドｐＵＣ１９（ＮＥＢ）と組み合わせた。
【０１４３】
ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ単離キットのＤＮＡdvanceキット（Agencourt）を用いて、トランスフェクションの２日後に細胞から単離した。簡潔には、４８ウェルプレート中の細胞を、３７℃で５ｍｉｎ、トリプシンの４０μＬと一緒にインキュベーションした。ＤＮＡdvanceリシス溶液の１６０μＬを追加し、溶液を５５℃で２ｈｒインキュベーションし、Agencourt DNAdvanceキットプロトコール中の爾後のステップに従った。単離されたゲノムＤＮＡの４０ｎｇを鋳型として用いて、表１において規定されているフランキングSurveyプライマー対によって、ターゲティングされたゲノム遺伝子座をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をQIAquickＰＣＲ精製キット（Qiagen）によって精製し、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）ｄｓＤＮＡキット（Life Technologies）によって定量した。精製されたＰＣＲのＤＮＡの２５０ｎｇを１９μＬの合計体積中でＮＥＢｕｆｆｅｒ 2（ＮＥＢ）の２μＬと組み合わせ、５ｍｉｎの９５℃、２℃／ｓで９５から８５℃、０．２℃／ｓで８５から２０℃で、熱サイクルによって変性し、それから再アニーリングした。再アニーリングされたＤＮＡを、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（１０Ｕ／μｌ、NEB）の１μｌと一緒に３７℃で１５ｍｉｎインキュベーションした。５０％グリセロールの１０μｌをＴ７エンドヌクレアーゼ反応に追加し、１２μＬを５％ＴＢＥの１８ウェルCriterion PAGEゲル（Bio-Rad）上で分析し、１５０Ｖで３０ｍｉｎ電気泳動し、それから１×SYBR Gold（Life Technologies）によって３０ｍｉｎ染色した。Ｃａｓ９によって誘導された切断バンドおよび未切断バンドをAlphalmager HP（Alpha Innotech）上で可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア３３を用いて定量した。切断されたバンドのピーク強度を全てのバンド（未切断＋切断されたバンド）の合計の強度によって除算して、切断された画分を決定し、これを用いて、以前に記載された通りに２８遺伝子改変レベルを見積もった。各サンプルについて、トランスフェクションおよび爾後の改変測定を異なる日に三重で行った。
【０１４４】
ゲノム改変のハイスループットシーケンシング
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ安定細胞をＣａｓ９発現およびｇＲＮＡ発現プラスミドによってトランスフェクションし、Ｃａｓ９発現プラスミドの７００ｎｇ＋単一のプラスミド発現（ｇＲＮＡの対）の２５０ｎｇをトランスフェクションし（高レベル）、単にＣａｓ９ヌクレアーゼでは、Ｃａｓ９発現プラスミドの８８ｎｇ＋単一のプラスミド発現（ｇＲＮＡの対）の３１ｎｇをトランスフェクションした（低いレベル）。ゲノムＤＮＡを３つの生物学的レプリケートから上の通り単離してプールした。プールされたゲノムＤＮＡの１５０ｎｇまたは６００ｎｇを鋳型として用いて、表１において規定されるフランキングＨＴＳプライマー対によって、オンターゲットおよびオフターゲットゲノム部位をＰＣＲによって増幅した。粗製ＰＣＲ生成物の相対量はゲル電気泳動によって定量し、異なるｇＲＮＡ対またはＣａｓ９ヌクレアーゼ型によって処置されたサンプルは、QIAquickＰＣＲ精製キット（Qiagen）による精製の前に等モル濃度で別々にプールした。プールされたＤＮＡの約５００ｎｇを５％ＴＢＥの１８ウェルCriterionＰＡＧＥゲル（BioRad）に２００Ｖで３０ｍｉｎ流し、長さ約１２５ｂｐ〜約３００ｂｐのＤＮＡを単離し、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）によって精製した。精製されたＤＮＡを、シーケンシングアダプターを含有するプライマーによってＰＣＲ増幅し、精製して、以前に記載されている通りに１MiSeqハイスループットＤＮＡシーケンサー（Illumina）上でシーケンシングした。
【０１４５】
データ分析
Illuminaシーケンシングリードを、ＵｎｉｘのＢａｓｈで書かれたスクリプトによってフィルタリングおよびパースした。全てのスクリプトはｂａｓｈで書いた。
【０１４６】
Ｐａｔｍａｔｃｈプログラム３８を用いて、Ｃａｓ９結合部位に対応するパターン配列（並びＡのＣＣＮＮ２０スペーサーＮ２０ＮＧＧおよび並びＢのＮ２０ＮＧＧスペーサーＣＣＮＮ２０）についてヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ビルド）をサーチした。ゲノム部位の配列中のｉｎｇｅｌの同定のためのステップは下に見いだされ得る。
【０１４７】
１）配列リードを初めにフィルタリングして、５０塩基未満のリードを取り除き、Illumina塩基スコアの１０％超がＢ〜Ｊでないリードを取り除いた。
【０１４８】
例のＳｅｑＡ−１ｓｔリード：
【０１４９】
【化１】
2016537008.tif 000007
【０１５０】
例のＳｅｑＡ−２ｓｔリード：
【０１５１】
【化２】
2016537008.tif 000008
【０１５２】
２）ＳｅｑＡ−１ｓｔリード中に、ＳｅｑＡ−２ｎｄリードの逆相補の始まりから４塩基の最初の２０塩基を見いだす。１つのミスマッチは許す。
【０１５３】
ＳｅｑＡ−２ｎｄリードの逆相補：
【０１５４】
【化３】
2016537008.tif 000009
【０１５５】
ＳｅｑＡ−１ｓｔリード中の位置
【化４】
2016537008.tif 000010
【０１５６】
３）配列をアラインメントし、それから組み合わせて、単純な塩基対アラインメントにおいて５%超のミスマッチを有するいずれかの配列を取り除く。
【０１５７】
ＳｅｑＡ−１ｓｔリードおよびＳｅｑＡ−２ｎｄリードの組み合わせ：
【０１５８】
【化５】
2016537008.tif 000011
【０１５９】
４）ターゲット部位を同定するために、フランキングゲノム配列をPatmatchプログラム３８によってサーチした。フランキングゲノム配列間の１〜３００の塩基のいろいろな量を許した（表２）：
【表２−１】
2016537008.tif 000012
【表２−２】
2016537008.tif 000013
【０１６０】
ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ビルド）中の参照ゲノム部位と同じサイズに対応するいずれかのターゲット部位配列は未改変と見なし、参照サイズでないいずれかの配列は潜在的な挿入または欠失と見なした。参照サイズでない配列は、参照ゲノム部位に対してＣｌｕｓｔａｌＷ３９によってアラインメントした。２つのハーフ部位配列間または中のＤＮＡスペーサー配列中に１つよりも多くの挿入または１つよりも多くの欠失を有するアラインメントされた配列は、ｉｎｄｅｌと見なした。ハイスループットシーケンシングは、低いが妥当な比率で１つの塩基対の挿入または欠失（誤ったフェージング）をもたらし得るので、２ｂｐのｉｎｄｅｌはＣａｓ９によって誘導される改変から生じている可能性がより高い。
【０１６１】
シーケンシング実験のためのサンプルサイズを（現実的な実験上の考慮の限りで）最大化して、効果を検出するための最大の検定力を保証した。表３のＣａｓ９によって改変されたゲノム部位についての統計分析は、ボンフェローニ法を用いる多重比較修正によって、以前に記載された通り行った３４。
【０１６２】
下の結果で参照する表３は、（Ａ）野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｆＣａｓ９いずれかを発現するプラスミドとＣＬＴＡオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡを発現する単一のプラスミド（ｇＲＮＡのＣ３およびｇＲＮＡのＣ４）とによって処置されたヒト細胞から単離された１５０ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅された、ＣＬＴＡオンターゲットおよび以前に報告されたゲノムオフターゲット部位をシーケンシングすることからの結果を示している。負のコントロールとして、トランスフェクションおよびシーケンシングを上の通り行ったが、ＧＦＰ遺伝子オンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡを用いた（ｇＲＮＡのＧ１、Ｇ２、またはＧ３およびｇＲＮＡのＧ４、Ｇ５、Ｇ６、またはＧ７。ｉｎｄｅｌ：３つのＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導される切断のいずれかと一致した、挿入または欠失を含有する観察された配列数。合計：合計の配列カウント数。最初の１０，０００個の配列のみをオンターゲット部位配列については分析した。改変：パーセンテージとしての、合計の配列数によって除算されたｉｎｄｅｌ数。潜在的な改変の上限を、ｉｎｄｅｌが観察されなかった部位について計算した。これは、１つ未満のｉｎｄｅｌがあると仮定し、それから合計の配列カウントによって除算して上限の改変パーセンテージに至ること、または理論的な検出限界（１／４９，５００）を採ることによった（より大きいどちらかの値）。Ｐ値：野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｆＣａｓ９ヌクレアーゼについて、Ｐ値は、ＣＬＴＡオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡによって処置された各サンプルとＧＦＰオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡによって処置されたコントロールサンプルとの間で、両側のフィッシャーの正確確率検定を用いて、以前に報告されている通り１８計算した。＜０．００４５のＰ値を有意と見なし、ボンフェローニ法を用いる保守的な多重比較修正に基づいて示した。オン：オフ特異性は、各部位についてのオンターゲット対オフターゲットゲノム改変頻度の比である。（Ｂ）は、ＥＭＸターゲット部位に応用された（Ａ）の実験および分析法を示しており、ＥＭＸオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＥ１およびｇＲＮＡのＥ２）を発現する単一のプラスミドを用いる。（Ｃ）は、ＶＥＧＦターゲット部位に応用された（Ａ）の実験および分析法を示しており、ＶＥＧＦオンターゲット部位をターゲティングする２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＶ１およびｇＲＮＡのｖ２）を発現する単一のプラスミドを用いる。（Ｄ）は、ＶＥＧＦオンターゲットおよびＶＥＧＦオフターゲット部位１に応用された（Ａ）の実験および分析法を示しており、検出感度を１／１９８，０００まで増大させるために６００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅された。
【表３−１】
2016537008.tif 000014
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
2016537008.tif 000017
【０１６３】
結果
１つのＤＮＡ鎖のみを切断するＣａｓ９の最近になって操作されたバリアント（「ニッカーゼ」）は、２つの別個のｇＲＮＡ配列によって規定される二本鎖切断を可能にするが５〜７、オフターゲット切断活性を尚被り６、８、これは、ＤＮＡに個体的に結合したときに各単量体ニッカーゼが活性なままでいる能力から生ずる９〜１１。対照的に、ＤＮＡを切断するために２つのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９単量体の同時のＤＮＡ結合および結びつきを要求する触媒不能Ｃａｓ９へのＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体の開発を、ここでは記載する。操作されたＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９（ｆＣａｓ９）のオフターゲットＤＮＡ切断は、約１５または２５塩基対離れた２つのｇＲＮＡによってフランキングされる部位のみが切断されるという要件（ニッカーゼよりもかなり厳しい間隔要件）によって、さらに減少する。ヒト細胞において、ｆＣａｓ９は、ニッカーゼのものに匹敵する効率で且つ野生型Ｃａｓ９よりも＞１４０倍高い特異性でターゲットＤＮＡ部位を改変した。ｆＣａｓ９の基質要件に合致するターゲット部位はヒトゲノム中に豊富にあり、平均で３４ｂｐ毎に１回起こる。
【０１６４】
細胞内では、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡによって誘導される二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介する機能的な遺伝子のノックアウト、または外来性ＤＮＡ鋳型による相同組み換え修復（ＨＤＲ）を介するほとんどいずれかの配列へのターゲット遺伝子座の変改をもたらし得る９、１５、１６。Ｃａｓ９はとりわけ便利なゲノム編集プラットフォームである１７。なぜなら、興味ある各新たなターゲット部位のためのゲノム編集薬剤が、対応するｇＲＮＡを単純に作出することによって入手され得るからである。この手法は、細胞およびモデル生物においてターゲティングされたノックアウトおよび遺伝子挿入を作製するために広く用いられて来ており、その潜在的な治療上の妥当性もまた認識されて来た。
【０１６５】
Ｃａｓ９：ｇＲＮＡシステムは、使用の容易さおよびプログラム可能性のかつてないレベルを提供するが、研究によって１〜５、Ｃａｓ９がオフターゲットゲノム部位を切断する能力が報告されており、これは、研究ツールおよび潜在的な治療薬としてのＣａｓ９の有用性および安全性を限定し得る意図しない遺伝子座の改変をもたらす。２つの同時の隣接したＣａｓ９：ＤＮＡ結合イベントが起こるときにのみＤＮＡを切断するようにＣａｓ９バリアントを操作することは、ゲノム編集特異性を実質的に改善し得るということが推測された。なぜなら、２つの隣接したオフターゲット結合イベントの見込みは、単一のオフターゲット結合イベントの見込みよりもかなり小さいからである（およそ１／ｎ２対１／ｎ）。かかる手法は、ニッカーゼなどの、ｄｓＤＮＡの単一の鎖のみを切断する変異体Ｃａｓ９蛋白質の最近の開発とは別個である。ニッカーゼは２つの近くのターゲット部位の反対鎖にニックを入れるために用いられ得、有効に二本鎖切断であるものを作出する。対になったＣａｓ９ニッカーゼは、オフターゲット改変が減少した実質的なオンターゲットＤＮＡ改変を実現し得る５、６、８。構成要素のＣａｓ９ニッカーゼのそれぞれは触媒活性なままでおり９〜１１、且つ一本鎖ＤＮＡ切断イベントは弱く変異誘発性であるので１８、１９、ニッカーゼは単量体として作用するときにさえもゲノム改変を誘導し得る５、７、１６。実に、Ｃａｓ９ニッカーゼは細胞内でオフターゲット改変を誘導することが以前に報告されている６、８。その上、対になったＣａｓ９ニッカーゼは、約１００ｂｐまで離れて結合したときにｄｓＤＮＡ切断に由来する改変イベントを効率的に誘導し得るので６、対になったニッカーゼにとっての潜在的なオフターゲット部位の統計的な数は、より空間的に制約された二量体Ｃａｓ９切断システムのものよりも大きい。
【０１６６】
Ｃａｓ９：ｇＲＮＡシステムの特異性をさらに改善するために、絶対（obligate）二量体Ｃａｓ９システムが本明細書において提供される。この例では、触媒不能Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインを融合することによって、２つの別個のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体が隣接した部位（「ハーフ部位」）に特定の間隔制約で結合するときにのみＤＮＡを切断するであろう絶対二量体を作製した（図６Ｄ）。Ｃａｓ９ニッカーゼ（単量体による一本鎖ＤＮＡ切断が独立して起こる）とは対照的に、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９のＤＮＡ切断は、２つの別個のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９単量体の同時の結合を要求する。なぜなら、単量体ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは触媒上効果的でないからである２１。この手法は、規定されるターゲット塩基の数を倍加させること（これは、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９二量体の両方の単量体によって寄与される）によって、野生型Ｃａｓ９と相対的にＤＮＡ切断の特異性を増大させ、単量体ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の不活性とＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９二量体のアセンブリのためのより厳しい空間要件とのため、ニッカーゼと比較して改善された特異性を提示した。
【０１６７】
短い機能ペプチドタグへのＣａｓ９の融合は、ｇＲＮＡによってプログラムされる転写制御を可能にすることが記載されているが２２、活性な酵素ドメインとのＣａｓ９の融合体は以前に報告されていないということが信じられる。そのため、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン、不活性化変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含有するｄＣａｓ９、ならびに核局在配列（ＮＬＳ）の別個の配置によって、多種多様なＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合蛋白質を構築してキャラクタリゼーションした。ＦｏｋＩをｄＣａｓ９のＮまたはＣ末端いずれかに融合し、いずれかの末端かまたは２つのドメイン間にあるようにＮＬＳの場所を変えた（図６Ｂ）。リンカー配列の長さは、ＦｏｋＩおよびｄＣａｓ９ドメイン間のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＳ）の１つまたは３つのリピートいずれかとして変えた。以前に開発された二量体ヌクレアーゼシステムはハーフ部位間のスペーサー配列の長さに対して感受性であるので２３、２４、幅広いスペーサー配列長を、試験ターゲット遺伝子エメラルドＧＦＰ（以降ではＧＦＰと言う）内の２つのｇＲＮＡ結合部位間において試験した（図６Ｃおよび図９）。異なる並びを有するｇＲＮＡ結合部位対の２セットをＧＦＰ内で選んだ。１つのセットはＮＧＧのＰＡＭ配列の対をスペーサー配列から遠位に置き、ｇＲＮＡの５’末端はスペーサーに隣接し（並びＡ）（図６Ｃ）、一方、もう一方はＰＡＭ配列をスペーサーに直ちに隣接して置いた（並びＢ）（図９）。合計では、ｇＲＮＡの７対が並びＡでは好適であり、９対が並びＢでは好適であった。ｇＲＮＡターゲットのペアワイズな組み合わせによって、８つのスペーサー長を両方の二量体の並びで試験した（並びＡにおいて５〜４３ｂｐ、並びＢにおいて４〜４２ｂｐに渡る）。合計では、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の１０４対に対応するＤＮＡ構築物を作出して試験し、４つの融合構成、１７個の蛋白質リンカーバリアント（下で記載される）、両方のｇＲＮＡの並び、およびハーフ部位間の１３個のスペーサー長を調べた。
【０１６８】
これらの候補ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ対の活性をアッセイするために、以前に記載されているフロー部位メトリーに基づく蛍光アッセイ２、８（ＨＥＫ２９３細胞内の安定にインテグレーションされた恒常的に発現されるＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ切断およびＮＨＥＪが、細胞蛍光の喪失に至る）を用いた（図１０）。比較のために、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９バリアントの初めのセットを、ｇＲＮＡスペーサーの並びセットＡおよびＢ両方について、同じ発現プラスミド中の対応するＣａｓ９ニッカーゼおよび野生型Ｃａｓ９と並べてアッセイした。Ｃａｓ９蛋白質バリアントおよびｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ発現プラスミドの適切な対と対応するＣａｓ９蛋白質発現プラスミドとの一過的なコトランスフェクションによって、細胞内で作出された。ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９バリアント、ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９は、全て、同一のｇＲＮＡを用いて同一の部位をターゲティングした。
【０１６９】
初めのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合バリアントの大部分は、不活性であるかまたは非常に弱く活性であった（図１１）。しかしながら、ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９構成（ＮからＣ末端に列挙されている）は、ＰＡＭがスペーサーから遠位である並びＡで用いられたときには、対応するｇＲＮＡ無しコントロールを超えるＧＦＰ陰性細胞の１０％の増大をもたらした（図１１Ａ）。対照的に、ＰＡＭがスペーサーに隣接しているｇＲＮＡ対に対して用いられたときには、ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９活性は検出不可能であった（図１１Ｂ）。最近になって報告されたＣａｓ９構造の検討は２５、２６、Ｃａｓ９のＮ末端がＲｕｖＣＩドメインから突出しており、これがｇＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の５’末端に接触するということを明らかにしている。いずれかの特定の理論によって束縛されようとするものではないが、この編成は、Ｎ末端融合したＦｏｋＩをＰＡＭから遠位に置き、切断されるスペーサーから遠位にＰＡＭを有するｇＲＮＡ対に対する選好性をもたらすと推量される（図６Ｄ）。他のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体の対およびもう一方のｇＲＮＡの並びは、いくつかのケースではそれなりの活性を示したが（図１１）、ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９が並びＡのｇＲＮＡと一緒にさらなる開発のために選ばれた。
【０１７０】
次に、ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９構成におけるＮＬＳとＦｏｋＩドメインとの間およびＦｏｋＩドメインとｄＣａｓ９との間の蛋白質リンカーを最適化した。幅広いアミノ酸組成、予測される柔軟性、および９〜２１残基のいろいろな長さを有する１７個のリンカーを試験した（図１２Ａ）。ＦｏｋＩドメインとｄＣａｓ９との間では、柔軟な１８残基リンカー（ＧＧＳ）６（配列番号１５）および１６残基「ＸＴＥＮ」リンカー（図１２ＡのＦｏｋＩ−Ｌ８）が、開放的な伸びた立体配座を有する以前に報告された操作された蛋白質に基づいて２７、ゲノムＧＦＰ改変の最も高いレベルを支持するものとして同定された（図１２Ｂ）。
【０１７１】
ＸＴＥＮ蛋白質は、それらの流体力学的半径を増大させることによって、翻訳上融合されたバイオ薬の血清中半減期を延ばすために元々は設計されており、化学的なＰＥＧ化の蛋白質に基づく機能アナログとして作用する３５。化学的に安定な非カチオン性の非疎水性一次配列と伸びた立体配座とを所有しており、ＸＴＥＮの部分は融合蛋白質のための安定で不活性なリンカー配列として機能し得るということが推測される。Ｅ−ＸＴＥＮからのＸＴＥＮ蛋白質タグの配列を分析し、アミノ酸配列中の反復するモチーフをアラインメントした。ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合構築物ＦｏｋＩ−Ｌ８（図１２Ａ）に用いた配列は普通のＥ−ＸＴＥＮモチーフのコンセンサス配列に由来し、１６アミノ酸配列をこのモチーフから選んでＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９リンカーを試験した。
【０１７２】
最適なＸＴＥＮリンカーを包含する試験されたＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９リンカーの多くは、ハーフ部位間の約１５および約２５ｂｐのスペーサー長に対して著しい選好性を有するヌクレアーゼをもたらし、２０ｂｐを包含する全ての他のスペーサー長は、実質的により低い活性を示した（図１２Ｂ）。リンカー選好性のこのパターンは、ＤＮＡを切断するためにはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体はＤＮＡ二重らせんの反対の面に結合しなければならず、最適な結合は約１．５または２．５個のらせん回転分離れて起こるというモデルと一致している。ＮＬＳ−ＦｏｋＩリンカーのバリエーションは、ヌクレアーゼ性能に強くは影響しなかった（とりわけ、ＸＴＥＮのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９リンカーと組み合わせられたとき）（図１２Ｂ）。
【０１７３】
ＮＬＳ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９構成においてＦｏｋＩドメインとｄＣａｓ９との間のリンカーをアッセイすることに加えて、Ｎ末端ＮＬＳとＦｏｋＩドメインとの間の４つのリンカーバリアントもまた試験した（図１２Ａ）。ＮＬＳ−ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２０）−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９リンカーは、単純なＧＧＳリンカーがＦｏｋＩおよびｄＣａｓ９ドメイン間に用いられたときには、試験された他のＮＬＳ−ＦｏｋＩリンカーよりもほぼ２倍良好なＧＦＰ遺伝子改変を見せたが（図１２Ｂ）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２０）リンカーは、ＦｏｋＩおよびｄＣａｓ９ドメイン間のＸＴＥＮリンカーと組み合わせられたときには、実質的により良好には働かなかった。
【０１７４】
ＮＬＳ−ＧＧＳ−ＦｏｋＩ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９構築物は、試験された候補のうちで最も高い活性を一貫して見せ、Ｃａｓ９ニッカーゼおよび野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼのそれぞれ約２０％および約３０％と比較して、細胞の約１５％においてＧＦＰの喪失を誘導した（図７Ａ）。全ての爾後の実験はこの構築物（以降ではｆＣａｓ９と言う）を用いて行った。ｆＣａｓ９がゲノムターゲット部位を効率的に改変する能力を確かめるために、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩSurveyorアッセイ２８を用いて、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９と並びＡの２つの別個のｇＲＮＡまたは負のコントロールとしてのｇＲＮＡ無しいずれかとによって処置されたＨＥＫ２９３細胞において、インテグレーションされたＧＦＰ遺伝子中の７つのターゲット部位のそれぞれにおける変異の量を測定した。フロー部位メトリーに基づく研究と一致して、ｆＣａｓ９は、約２０％の比率で、約１５または約２５ｂｐの最適なスペーサー長によってＧＦＰターゲット部位を改変する能力があった。これはニッカーゼによって誘導された改変の効率に匹敵し、野生型Ｃａｓ９のもののおよそ２／３である（図７Ａ〜Ｃ）。
【０１７５】
次に、最適化されたｆＣａｓ９が４つの別個の内在性ゲノム遺伝子座を改変する能力を、Surveyorアッセイによって評価した。ＣＬＴＡ（２つの部位）、ＥＭＸ（２つの部位）、ＨＢＢ（６つの部位）、ＶＥＧＦ（３つの部位）を、さまざまな長さの間隔の並びＡの、部位あたり２つのｇＲＮＡによってターゲティングした（図１３）。ＧＦＰをターゲティングする実験の結果と一致して、適切な間隔のターゲットハーフ部位では、ｆＣａｓ９は全ての４つの遺伝子の効率的な改変を誘導し、これは８％〜２２％のターゲット染色体部位改変に渡った（図７Ｄ〜Ｇおよび図１４）。ターゲティングされた５つの遺伝子（ＧＦＰを包含する）のそれぞれにおいて最高の改変をもたらすｇＲＮＡスペーサー長のうち、各遺伝子にとってのそれらの最適なｇＲＮＡ対から、ｆＣａｓ９は平均で１５．６％（±６．３％ｓ．ｄ．）の改変を誘導し、一方、Ｃａｓ９ニッカーゼおよび野生型Ｃａｓ９は、それぞれ平均で２２．１％（±４．９％ｓ．ｄ．）および３０．４％（±３．１％ｓ．ｄ．）の改変を誘導した。トランスフェクション中のＣａｓ９発現プラスミドおよびｇＲＮＡ発現プラスミドの量を減少させても、一般的にＣａｓ９ニッカーゼおよびｆＣａｓ９のゲノム改変活性は比例的に減少しなかったので（図１５Ａ〜Ｃ）、発現は、試験された条件下では制限的でない可能性が高かった。
【０１７６】
ｆＣａｓ９のｇＲＮＡ要件は、ｆＣａｓ９の潜在的なオフターゲット基質の数を潜在的に制限するので、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、および野生型Ｃａｓ９がターゲットＧＦＰ配列を切断する能力にガイドＲＮＡの並びが及ぼす効果を比較した。以前の報告と一致して５、６、１７、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイドＲＮＡが並びＡまたは並びＢいずれかで結合したときにターゲットを効率的に切断し、これは野生型Ｃａｓ９に類似であった（図８Ａ、Ｂ）。対照的に、ｆＣａｓ９は、ガイドＲＮＡが並びＡでアラインメントされたときにのみＧＦＰターゲットを切断した（図８Ａ）。この並びの要件は、望まれないオフターゲットＤＮＡ切断の機会をさらに限定する。
【０１７７】
重要なことに、４つのシングルｇＲＮＡのいずれかがｆＣａｓ９と一緒に個体的に発現されたときには、予想された通り、改変はＧＦＰ破壊またはSurveyorアッセイによって観察されなかった。なぜなら、２つの同時の結合イベントがＦｏｋＩ活性には要求されるからである（図７Ｂおよび図８Ｃ）。対照的に、ＧＦＰ破壊は、（予想された通り）野生型Ｃａｓ９と一緒の（２つのシングルｇＲＮＡではＣａｓ９ニッカーゼと一緒の）いずれかのシングルｇＲＮＡの発現からはもたらされた（図８Ｃ）。驚くべきことに、Surveyorアッセイから、ＧＦＰが、シングルｇＲＮＡと一緒の野生型Ｃａｓ９によっては重度に改変されたが、シングルｇＲＮＡによって処置された細胞においてはｆＣａｓ９もＣａｓ９ニッカーゼも検出可能な改変を示さなかった（＜約２％）ということが明らかになった（図１６Ａ）。シングルｇＲＮＡとｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９とによって処置された細胞内のＧＦＰターゲット部位におけるｉｎｄｅｌを検出するためのハイスループットシーケンシングによって、野生型Ｃａｓ９による改変の予想される実質的なレベル（配列リードの３〜７％）が明らかになった。４つのシングルｇＲＮＡのいずれかの存在下のｆＣａｓ９による改変は、バックグラウンドを超えては検出されなかった（＜約０．０３％の改変）。これは、ＤＮＡを切断するためにはｆＣａｓ９が２つのｇＲＮＡと連繋するという要件と一致している。対照的に、シングルｇＲＮＡの存在下のＣａｓ９ニッカーゼは、ターゲット部位における０．０５％〜０．１６％に渡る改変レベルをもたらした（図１６Ｂ）。シングルｇＲＮＡによるＣａｓ９ニッカーゼ処置に続くターゲット部位における本当のｉｎｄｅｌの検出によって、ゲノムＤＮＡニッキングの変異誘発ポテンシャルが確かめられており、これは以前の報告と一致する５、７、１８、１９。
【０１７８】
しかしながら、ニッカーゼによって誘導されたＤＮＡ改変の観察された比率からは、フロー部位メトリーアッセイにおけるかなりより高いＧＦＰ破壊シグナルは説明されなかった（図８Ｃ）。Ｃａｓ９ニッカーゼと一緒にＧＦＰシグナル喪失を誘導したｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのＧ１およびＧ３）は、両方ともＧＦＰ遺伝子の非鋳型鎖をターゲティングし、且つ、遺伝子のコード領域内でｄＣａｓ９によって非鋳型鎖をターゲティングすることは、効率的な転写抑制を媒介することが公知であるので２９、Ｇ１またはＧ３シングルガイドＲＮＡと組み合わせられたＣａｓ９ニッカーゼは、ゲノム改変の低いレベルに加えて実質的な転写抑制を誘導したと推量される。同じ効果はｆＣａｓ９では見られなかった。これは、ｆＣａｓ９が転写機構によってＤＮＡからより容易く退けられ得るということを示唆している。まとめると、これらの結果は、ｆＣａｓ９が、隣接した部位をターゲティングする２つのガイドＲＮＡの同時の連繋を要求する様式で、ゲノムＤＮＡを効率的に改変し得るということを指示している。これは、シングルガイドＲＮＡに結合したときに野生型Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼがＤＮＡを切断する能力とは違っている。
【０１７９】
上の結果からは、総括して、Ｃａｓ９ニッカーゼと比較して、ｆＣａｓ９についてはかなりより厳しいスペーサー、ｇＲＮＡの並び、およびガイドＲＮＡ対の要件が明らかになっている。ｆＣａｓ９（図１７）とは対照的に、Ｃａｓ９ニッカーゼは、アッセイされた全てのスペーサー（この研究においては並びＡの５〜４７ｂｐおよび並びＢの４〜４２ｂｐ）について部位を切断した（図８Ａ、Ｂ）。これらの観察は、Ｃａｓ９ニッカーゼが、１００ｂｐまで離れたスペーサー長を有するｇＲＮＡによってターゲティングされる部位を改変するという以前の報告と一致している６。ｆＣａｓ９のより厳しいスペーサーおよびｇＲＮＡの並びの要件は、Ｃａｓ９ニッカーゼと比較して、前者の潜在的なゲノムオフターゲット部位の数をおよそ１０倍だけ減少させる（表４）。ｆＣａｓ９のより厳しいスペーサー要件は潜在的なターゲティング可能な部位の数をもまた減少させるが、ｆＣａｓ９スペーサーおよび二元式ＰＡＭの要件に合致する配列は、ヒトゲノム中に平均で３４ｂｐ毎に１回存在する（３．１×１０９ｂｐにつき９．２×１０７部位）（表４）。異なるＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ホモログの増えて行く数が３０本明細書に記載される使用が容易であり、ｆＣａｓ９手法を用いて、ターゲティング可能な部位数をさらに増大させるであろうということもまた期待される。
【０１８０】
表４（Ａ）において、列２は、並びＡの対ｇＲＮＡ結合部位を有するヒトゲノム中の部位数を示しており、２つのｇＲＮＡ結合部位間の−８ｂｐ〜２５ｂｐのスペーサー長を許す（列１）。並びＡのｇＲＮＡ結合部位は、スペーサー配列から遠位にＮＧＧのＰＡＭ配列を有する（ＣＣＮＮ２０−スペーサー−Ｎ２０ＮＧＧ）。列３は、並びＢの対ｇＲＮＡ結合部位を有するヒトゲノム中の部位数を示しており、２つのｇＲＮＡ結合部位間の４〜２５ｂｐのスペーサー長を許す（列１）。並びＢのｇＲＮＡ結合部位は、スペーサー配列に隣接したＮＧＧのＰＡＭ配列を有する（Ｎ２０ＮＧＧスペーサーＣＣＮＮ２０）。ＮＣは、ヒトゲノム中の部位数が計算されなかったということを指示する。負のスペーサー長は、指示された塩基対数だけオーバーラップしているターゲットｇＲＮＡ結合部位を言う。表４（Ｂ）は、１３〜１９ｂｐまたは２２〜２９ｂｐのスペーサー長（ｆＣａｓ９のスペーサー選好性）を有する並びＡの対ｇＲＮＡ結合部位数の総計（図１６）、並びＡの−８ｂｐ〜１００ｂｐまたは並びＢの４〜４２ｂｐのスペーサー長（Ｃａｓ９ニッカーゼのスペーサー選好性）を有する対ｇＲＮＡ結合部位数の総計を示している（並びＢの４〜４２ｂｐは図８Ｂ、Ｃに基づき、並びＡの−８ｂｐ〜１００ｂｐは以前の報告に基づく３６、３７）。
【表４】
2016537008.tif 000018
【０１８１】
ｆＣａｓ９のＤＮＡ切断特異性を評価するために、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、およびＶＥＧＦゲノムターゲット部位の既知のＣａｓ９オフターゲット部位の改変を測定した１、２、６、８。ターゲット部位およびその対応する既知オフターゲット部位（表５）を、ｆＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、または野生型Ｃａｓ９とＣＬＴＡ部位をターゲティングする１９ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ、ＥＭＸ部位をターゲティングする２３ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ、ＶＥＧＦ部位をターゲティングする１４ｂｐの間隔の２つのｇＲＮＡ、または負のコントロールとして無関係の部位（ＧＦＰ）をターゲティングする２つのｇＲＮＡとによって処置されたＨＥＫ２９３細胞から単離されたゲノムＤＮＡから増幅した。合計では、１１個のオフターゲット部位をハイスループットシーケンシングによって分析した。
【０１８２】
ゲノムオフターゲット切断を検出するためのハイスループットシーケンシング法の感度は、各ゲノムターゲット部位のＰＣＲ増幅へのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）インプット量によって限定される。ヒトｇＤＮＡの１ｎｇサンプルは約３３０個のユニークなゲノムを表すのみであり、それゆえに各ゲノム部位の約３３０個のユニークなコピーのみが存在する。各ゲノムターゲットのＰＣＲ増幅はインプットｇＤＮＡの合計１５０ｎｇで行った。これは、多くて５０，０００個のユニークなｇＤＮＡコピーに由来するアンプリコンを提供する。そのため、ハイスループットシーケンシングアッセイでは、５０，０００分の１または０．００２％未満の頻度で起こる稀なゲノム改変イベントを検出し得ない。
【表５】
2016537008.tif 000019
【０１８３】
コントロールｇＲＮＡによって処置されたサンプルに対してターゲットｇＲＮＡによって処置されたサンプルにおいて有意により多数存在する（Ｐ値＜０．００５、フィッシャーの正確確率検定）、潜在的なゲノムオフターゲット部位内の２つまたは３つ以上の塩基対の挿入または欠失を含有する配列は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導されたゲノム改変と見なした。アッセイされた１１個のオフターゲット部位の１０個について、ｆＣａｓ９はアッセイの感度限界内でいずれかの検出可能なゲノムオフターゲット改変をもたらさず（＜０．００２％）、一方、５％〜１０％という実質的なオンターゲット改変効率を明証した（図８Ｄ〜Ｆおよび表３）。ｆＣａｓ９によって改変されたＶＥＧＦオンターゲット配列の詳細な点検（図１８Ａ）によって、塩基対の２〜多数に渡る欠失の優勢が明らかになった。これは、切断が２つのターゲット結合部位間のＤＮＡスペーサー中で起こることと一致しており、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの効果と類似である３１。
【０１８４】
対照的に、ゲノムオフターゲットＤＮＡ切断は、野生型Ｃａｓ９ではアッセイした全ての１１個の部位において観察された。オフターゲットｆＣａｓ９活性の上限としてアッセイの検出限界を用いて、ｆＣａｓ９が野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼよりもかなり低いオフターゲット改変比率を有するということが計算された。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって改変された１１個のオフターゲット部位において、ｆＣａｓ９は、野生型Ｃａｓ９のものよりも少なくとも１４０倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比をもたらした（図８Ｄ〜Ｆ）。
【０１８５】
以前の報告と一致して５、６、８、Ｃａｓ９ニッカーゼもまた、野生型Ｃａｓ９と比較して実質的に少ないオフターゲット改変イベント（１／１１個のオフターゲット部位が検出可能な比率で改変された）を誘導した。初めのハイスループットシーケンシングアッセイから、ＶＥＧＦオフターゲット部位１における配列の０．０２４％において、Ｃａｓ９ニッカーゼによって誘導された有意な（Ｐ値＜１０−３、フィッシャーの正確確率検定）改変が明らかになった。このゲノムオフターゲット部位は、Ｃａｓ９ニッカーゼの１２．３％およびｆＣａｓ９の１０．４％という類似のＶＥＧＦオンターゲット改変効率にもかかわらず、ｆＣａｓ９によって改変されなかった（図８Ｆおよび表３Ｃ）。Ｃａｓ９ニッカーゼによって誘導された改変レベルは検出限界の１桁以内であり、ｆＣａｓ９改変レベルは不検出であったので、実験を、より大きいインプットＤＮＡサンプルおよびより大きい配列リード数（初めのおよび反復実験について、それぞれ１５０対６００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび＞８×１０５対＞２３×１０５個のリード）によって反復し、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはｆＣａｓ９によるこの部位におけるオフターゲット切断を検出した。このより深い調査から、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびｆＣａｓ９が両方とも有意に（Ｐ値＜１０−５、フィッシャーの正確確率検定）ＶＥＧＦオフターゲット部位１を改変するということが観察された（図８Ｇ、表３Ｄ、図１８Ｂ）。ＶＥＧＦオフターゲット部位１における改変比率を調査する両方の実験について、ｆＣａｓ９はＣａｓ９ニッカーゼのものよりも大きいオンターゲット：オフターゲットＤＮＡ改変比を見せた（ｆＣａｓ９の＞５，１５０および１，６５０対Ｃａｓ９ニッカーゼの５１０および１，２３０。図８Ｇ）。
【０１８６】
ＶＥＧＦオフターゲット部位１のいずれの側においても、ＶＥＧＦオンターゲット配列の２つのハーフ部位のいずれかから６つまたは５つ以下の変異を有する他の部位は存在しない。１つのｇＲＮＡ（Ｖ２）の最初の１１塩基は、ＶＥＧＦオフターゲット部位１内において古典的なＣａｓ９：ｇＲＮＡ結合によってゆるめられる一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションし得る（図１８Ｃ）。このｇＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、第２のＣａｓ９ニッカーゼまたはｆＣａｓ９がリクルートされ得、非常に低いが検出可能なレベルでこのオフターゲット部位を改変することが可能である。賢明なｇＲＮＡ対の設計は、オフターゲットＤＮＡ切断のこの潜在的なモードを排除し得る。なぜなら、ＶＥＧＦオフターゲット部位１は、対の第２のｇＲＮＡとの１１個の連続した潜在的な塩基対を形成するその能力において高度に非通例的であるからである。一般的に、ｆＣａｓ９は、試験されたゲノムオフターゲット部位を改変する能力がなかった。これは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを二量体化させて活性化するために要求されるいずれかの隣接した第２の結合部位の非存在ゆえである。
【０１８７】
この研究において開発した最適化されたＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合体構成によって、ターゲティングされた全ての５つのゲノム遺伝子座が改変された。これは、ヒト細胞においてゲノム改変を誘導するためにｆＣａｓ９を用いることの一般性を明証しているが、ｆＣａｓ９による改変は野生型Ｃａｓ９よりもいくらか効率的でなかった。ｆＣａｓ９の使用は単純明快であり、ＰＡＭ配列が適切な間隔および並びで存在することのみを要求し、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼと同じｇＲＮＡを用いる。ｆＣａｓ９の観察された低いオフターゲット：オンターゲット改変比は野生型Ｃａｓ９のものよりも＞１４０倍低い。これは、二量体ＦｏｋＩの別個の作用モードから生じている可能性が高く、ＤＮＡ切断は、２つのＤＮＡ部位が、規定された距離（ここでは、約１５ｂｐまたは約２５ｂｐ離れている）で且つ特異的なハーフ部位の並びで２つのＦｏｋＩドメインによって同時に占有された場合にのみ進む。ｆＣａｓ９のもたらされる非通例的に低いオフターゲット活性は、ターゲット特異性の非常に高い程度を要求するＣａｓ９：ｇＲＮＡに基づくテクノロジーの応用（例えば、ヒト細胞のエクスビボまたはインビボの治療上の改変）を可能にする。
【表６−１】
2016537008.tif 000020
【表６−２】
2016537008.tif 000021
【表６−３】
2016537008.tif 000022
【０１８８】
例２：Ｃａｓ９バリアントによって媒介される不活性化のためにＣＣＲ５をターゲティングする
強力な研究ツールを提供することに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは遺伝子治療薬剤としてのポテンシャルをもまた有し、部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは最近になって治験に入っており、ＣＣＲ５−２２４６は抗ＨＩＶ治療手法の一部としてヒトＣＣＲ−５アレルをターゲティングする。
【０１８９】
類似の手法において、本開示の本発明Ｃａｓ９バリアントは、例えば対象から得られた自家Ｔ細胞（これは、Ｃａｓ９バリアントによってひとたび改変されたら、ＨＩＶ感染の処置または予防のために対象中に再導入される）内のＣＣＲ５を不活性化するために用いられ得る。
【０１９０】
この例において、ＣＣＲ５遺伝子は、対象から得られたＴ細胞内でターゲティングされる。ＣＣＲ５蛋白質は、ＨＩＶのある普通の型がＴ細胞に結合して入り、それによってそれらに感染するために要求される。Ｔ細胞は、ＨＩＶと戦うために体によって用いられる白血球の１つである。
【０１９１】
一部の人間はそれらのＴ細胞上のＣＣＲ５発現を欠いて生まれ、健康なままでおり、ＨＩＶによる感染に対して耐性である。他はそれらのＴ細胞上のＣＣＲ５の低い発現を有しており、それらのＨＩＶ疾患はより重度でなく、疾患（ＡＩＤＳ）を引き起こすことがより低速である。
【０１９２】
Ｔ細胞上のＣＣＲ５蛋白質を欠失させるために、多数のＴ細胞を対象から単離する。それから、ＣＣＲ５を不活性化する力能があるＣａｓ９バリアント（例えばｆＣａｓ９）およびｇＲＮＡを、単離されたＴ細胞にウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター）を用いて送達する。好適なＣａｓ９バリアントの例は、本明細書において提供される本発明融合蛋白質を包含する。ＣＣＲ５アレルをターゲティングするｇＲＮＡにとって好適なターゲット配列の例は、図１９に記載されているもの、例えば配列番号３０３〜３１０および３１２〜３１７を包含する。Ｃａｓ９バリアントおよびｇＲＮＡを発現する力能があるウイルスベクター（単数または複数）を、単離されたＴ細胞に追加して、ＣＣＲ５蛋白質をノックアウトする。Ｔ細胞が対象に戻されるときには、最小限のアデノウイルスまたはＣａｓ９バリアント蛋白質が存在する。しかしながら、対象が受容するＴ細胞上のＣＣＲ５蛋白質の取り除きは永久である。それから、細胞はＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置または予防のために対象に再導入される。
【０１９３】
例３：Ｃａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質
例示的なＣａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質が下で提供される。
【０１９４】
ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＧＧＳ３リンカー−Ｔｎ３
【化６】
2016537008.tif 000023
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０１９５】
ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＧＧＳ３リンカー−Ｔｎ３
【化７】
2016537008.tif 000024
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０１９６】
Ｔｎ３−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ
【化８】
2016537008.tif 000025
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０１９７】
ＮＬＳ−Ｔｎ３−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９
【化９】
2016537008.tif 000026
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０１９８】
ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＧＧＳ３リンカー−Ｈｉｎ
【化１０】
2016537008.tif 000027
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０１９９】
ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＧＧＳ３リンカー−Ｈｉｎ
【化１１】
2016537008.tif 000028
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２００】
Ｈｉｎ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ
【化１２】
2016537008.tif 000029
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０１】
ＮＬＳ−Ｈｉｎ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９
【化１３】
2016537008.tif 000030
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０２】
ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＧＧＳ３リンカー−Ｇｉｎ
【化１４】
2016537008.tif 000031
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０３】
ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＧＧＳ３リンカー−Ｇｉｎ
【化１５】
2016537008.tif 000032
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０４】
Ｇｉｎ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ
【化１６】
2016537008.tif 000033
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０５】
ＮＬＳ−Ｇｉｎ−ＧＧＳ３リンカー−ｄＣａｓ９
【化１７】
2016537008.tif 000034
（下線：核局在シグナル、太字：リンカー配列）
【０２０６】
例４：Ｃａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質を用いる相同組み換えによるマーカー遺伝子の導入
宿主細胞遺伝子のゲノム配列によってフランキングされた緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を保有するベクターを、ｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質（配列番号３２８〜３３９のいずれか１つ）とＧＦＰマーカー遺伝子およびＧＦＰマーカーが組み換えられるゲノム遺伝子座をターゲティングする４つの適切に設計されたｇＲＮＡとをコードする発現構築物と併せて細胞内に導入する。４つのｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合蛋白質は、ｇＲＮＡの結合を介してＧＦＰマーカー遺伝子と併せてゲノム遺伝子座において連係する（図５Ｂ）。融合蛋白質の４つのリコンビナーゼドメインが四量体化し、融合蛋白質のリコンビナーゼドメインのリコンビナーゼ活性はゲノム遺伝子座とマーカー遺伝子との間の組み換えをもたらし、それによってゲノム遺伝子座にマーカー遺伝子を導入する。マーカー遺伝子の導入はＧＦＰ発現によっておよび／またはＰＣＲによって確かめる。
【０２０７】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、または慣例以下の実験法を用いて確認する能力があるであろう。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ添付の請求項において示される通りとする。
【０２０８】
請求項において、逆に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は１つまたは１つよりも多くを意味し得る。逆に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群の１つまたは２つ以上のメンバー間に「または」を包含する請求項または記載は、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する場合に満たされていると見なされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する態様を包含する。本発明は、群のメンバーの１つよりも多くまたは全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する態様をもまた包含する。
【０２０９】
尚その上に、本発明は、請求項の１つもしくは２つ以上または記載の関係する部分からの１つまたは２つ以上の限定、要素、節、説明用語などが別の請求項中に導入される全てのバリエーション、組み合わせ、および入れ替えを包摂するということが理解されるべきである。例えば、別の請求項に依存的であるいずれかの請求項が改変されて、同じ基礎請求項に依存的であるいずれかの他の請求項中に見いだされる１つまたは２つ以上の限定を包含し得る。尚その上に、請求項が組成物を記述しているところでは、別様に指示されない限り、または矛盾もしくは非一貫性が生ずるであろうということが当業者にとって明白でない限り、本明細書において開示される目的のいずれかのために組成物を用いる方法が包含され、本明細書において開示される作る方法または当分野において公知の他の方法のいずれかに従って組成物を作る方法が包含されるということが理解されるべきである。
【０２１０】
要素がリストとして（例えばマーカッシュ群フォーマットで）表されているところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）が群から取り除かれ得るということは理解されるべきである。用語「含む」は開放的であることが意図されており、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた注記される。一般的に、本発明または本発明の側面が特定の要素、特徴、ステップなどを含むと言われるところでは、本発明のある態様または本発明の側面がかかる要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になるということが理解されるべきである。単純の目的のために、それらの態様は本明細書においては一々具体的に示されなかった。それゆえに、１つまたは２つ以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各態様について、本発明は、それらの要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になる態様をもまた提供する。
【０２１１】
範囲が与えられているところでは、エンドポイントは包含される。尚その上に、別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、本発明の異なる態様において、記された範囲内のいずれかの具体的な値を、文脈が明確に別様に述べていない限り、範囲の下限の単位の１／１０までとり得るいうことが理解されるべきである。別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現される値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の１／１０と同じ精度で表現されるということもまた理解されるべきである。
【０２１２】
加えて、本発明のいずれかの特定の態様は請求項のいずれかの１つまたは２つ以上からはっきりと除外され得るということは、理解されるべきである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれかの１つまたは２つ以上からはっきりと除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、応用、または側面は、いずれかの１つまたは２つ以上の請求項から除外され得る。簡潔さの目的のために、１つまたは２つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様の全てが本明細書においてはっきりと示されてはいない。
【０２１３】
本明細書に挙げられた全ての公開、特許、および配列データベースエントリー（上で列挙されたアイテムを包含する）は、各個体の公開または特許が参照によって組み込まれることを具体的且つ個体的に指示された場合と同じく、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。相反のケースでは、本願（本明細書のいずれかの定義を包含する）がコントロールする。
【図１】
2016537008.tif 000035
【図２】
2016537008.tif 000036
【図３】
2016537008.tif 000037
【図４】
2016537008.tif 000038
【図５Ａ】
2016537008.tif 000039
【図５Ｂ】
2016537008.tif 000040
【図６Ａ−Ｂ】
2016537008.tif 000041
【図６Ｃ】
2016537008.tif 000042
【図６Ｄ】
2016537008.tif 000043
【図７Ａ−Ｂ】
2016537008.tif 000044
【図７Ｃ−Ｅ】
2016537008.tif 000045
【図７Ｆ−Ｇ】
2016537008.tif 000046
【図８Ａ−Ｂ】
2016537008.tif 000047
【図８Ｃ】
2016537008.tif 000048
【図８Ｄ−Ｅ】
2016537008.tif 000049
【図８Ｆ−Ｇ】
2016537008.tif 000050
【図９】
2016537008.tif 000051
【図１０Ａ】
2016537008.tif 000052
【図１０Ｂ】
2016537008.tif 000053
【図１１Ａ】
2016537008.tif 000054
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2016537008.tif 000056
【図１２Ｂ】
2016537008.tif 000057
【図１３】
2016537008.tif 000058
【図１４Ａ−Ｃ】
2016537008.tif 000059
【図１４Ｄ−Ｅ】
2016537008.tif 000060
【図１５】
2016537008.tif 000061
【図１６】
2016537008.tif 000062
【図１７】
2016537008.tif 000063
【図１８Ａ】
2016537008.tif 000064
【図１８Ｂ】
2016537008.tif 000065
【図１８Ｃ】
2016537008.tif 000066
【図１９Ａ】
2016537008.tif 000067
【図１９Ｂ】
2016537008.tif 000068
【図２０】
2016537008.tif 000069
【配列表】
2016537008000001.app
【国際調査報告】
2016537008.tif 000070
2016537008.tif 000071
2016537008.tif 000072
2016537008.tif 000073
2016537008.tif 000074
2016537008.tif 000075