(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
0004226245.tif 000007
〔式中、Ｒは下記の式（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）：
0004226245.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ３はアミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｘ−はアニオン種を示す）で表される基を示し、ｎは２〜５の整数を示す〕で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表される化合物が下記の式（Ｉ−１）：
0004226245.tif 000009
（式中の定義は上記と同義である）で表される化合物である請求の範囲第１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒが上記の式（Ａ）（式中、Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３がジメチルアミノ基であり、Ｘ−が塩素イオンである）で表される基であり、ｎが３である請求の範囲第１項又は第２項に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項に記載の化合物又はその塩を含むＩＰ３受容体リガンド。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第３項に記載の化合物又はその塩をＩＰ３受容体に結合させた後に光照射する工程を含むＩＰ３受容体の変性方法。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載の方法によりＩＰ３受容体を変性させた細胞又は細胞抽出液。
【請求項７】
請求の範囲第１項ないし第３項に記載の化合物又はその塩を含むＩＰ３受容体の変性用試薬。
【請求項８】
請求の範囲第１項ないし第３項に記載の化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イノシトール１，４，５−トリスリン酸受容体のリガンドに関するものである。
背景技術
Ｄ−ｍｙｏ−イノシトール１，４，５−トリスリン酸（本明細書において「ＩＰ３」と略す場合がある。）はＩＰ３受容体に結合してＣａ２＋の細胞内貯蔵部位からＣａ２＋を遊離させるセカンドメッセンジャーであり、多様な細胞において細胞内Ｃａ２＋濃度の動力学を制御している。ＩＰ３は、例えば、分泌、受精、筋収縮、神経シグナル伝達および細胞成長などの種々の細胞機能の制御に重要な役割を演じている（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６１，３１５，１９９３；Ｃｌａｐｈａｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｅｌｌ，８０，２５９，１９９５）。
ＩＰ３が惹起するシグナル伝達を研究するために多くのＩＰ３アナログが合成されており（Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９２，９３６，１９９８；ＭｃＣａｒｒｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ，３，４６１，１９８９）、ＩＰ３受容体および他のＩＰ３結合タンパクの構造が検討されているが（Ｍｏｕｒｅｙ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１７１９，１９９３）、ＩＰ３の１位のリン酸を修飾しても、ＩＰ３受容体への結合親和性にはほとんど影響がないことが報告されている（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７２，８１７，１９９０；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２，１９９１）。なお、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒｅｖｉｏｃｏｍｐａｃｔｕｍの培養液から単離した代謝産物であるアデノホスチン類がＩＰ３受容体に対する最も強力なアゴニストであることが知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３６９，１９９４）。
発明の開示
本発明者らは、新規なＩＰ３受容体リガンドを提供すべく鋭意研究を行った結果、予期しなかったことに、ＩＰ３の１位のリン酸をマラカイトグリーンやフルオレセインなどの色素誘導体又は蛍光色素誘導体で修飾することにより、ＩＰ３受容体に対して極めて高い親和性を有する化合物を提供できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）：
0004226245.tif 000002
〔式中、Ｒは下記の式（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）：
0004226245.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ３はアミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｘ−はアニオン種を示す）で表される基を示し、ｎは２〜５の整数を示す〕で表される化合物又はその塩を提供するものである。
本発明の好ましい態様によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物が下記の式（Ｉ−１）：
0004226245.tif 000004
（式中、Ｒは上記と同義である）で表される上記化合物又はその塩；Ｒが上記の式（Ａ）（式中、Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３がジメチルアミノ基であり、Ｘ−が塩素イオンである）で表される基であり、ｎが３である上記化合物又はその塩；及び、Ｒが上記の式（Ａ）（式中、Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３がジメチルアミノ基であり、Ｘ−が塩素イオンである）で表される基であり、ｎが３である上記化合物又はその塩が提供される。
別の観点からは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含むＩＰ３受容体リガンドが提供される。このＩＰ３受容体リガンドをＩＰ３受容体に結合させた後に光照射することによって、ＩＰ３受容体を変性させることができる。従って、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含むＩＰ３受容体リガンドは、ＩＰ３受容体の変性用試薬として有用である。また、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む医薬が本発明により提供される。この医薬は、ＩＰ３過剰やＩＰ３受容体の過剰発現に起因する疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
さらに別の観点からは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とＩＰ３受容体とを結合させた後に光照射する工程を含むＩＰ３受容体の変性方法が本発明により提供される。また、本発明により、好ましくは上記の方法によりＩＰ３受容体を変性させた細胞又は細胞抽出液が提供される。
発明を実施するための最良の形態
Ｒ１及びＲ２が示すＣ１−６アルキル基は、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、シクロブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基などを用いることができる。Ｒ１及びＲ２がメチル基であることが好ましい。Ｒ３が示すモノＣ１−６アルキルアミノ基又はジＣ１−６アルキルアミノ基におけるアルキル基、及びＣ１−６アルコキシ基におけるアルキル部分としては、上記に説明したＣ１−６アルキル基を用いることができる。Ｒ３としてはジメチルアミノ基が好ましい。Ｘ−はアニオン種を示し、その種類は特に限定されないが、例えば、塩素イオンなどのハロゲンイオンが好ましい。ｎは２〜５の整数を示すが、ｎが３であることが好ましい。Ｒとしては、マラカイトグリーンの残基である上記式（Ａ）で表される基が好ましい。
上記式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、下記のスキームに従って製造することができる。
0004226245.tif 000005
（スキーム中、ｎが３の化合物の製造を記載した）
Ｄ−ｍｙｏ−イノシトールから１４工程で１Ｄ−１−０−（３−アミノプロピル−１−ホスホ）−ｍｙｏ−イノシトール４，５−ビスリン酸（化合物１：Ｓｔｒｕｐｉｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３，９０１，１９８８）を製造することができる（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２，１９９１；Ｏｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，１９９２，７２９；Ｇｉｇｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，４２３，１９８７；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７０，１７５，１９８７）。この化合物１に対して、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとフルオレセイン誘導体又はマラカイトグリーン誘導体とのエステルなどを反応させることにより、本発明の化合物を製造することができる。例えば、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）中に溶解した化合物１に対して、ジメチルホルムアミドなどの溶媒の共存下で上述のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを加え、遮光下に室温で２〜３時間反応させればよい。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して得た４−カルボキシマラカイトグリーン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＭＧ−ＳＥ）は、例えば、４−カルボキシベンズアルデヒド（１当量）とジメチルアニリン（２当量）との酸縮合物で塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をアシル化し、続いて２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）で酸化することにより得ることができる。５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＦ−ＳＥ）は市販のものを入手することができる（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）。
式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、塩を形成する場合があるが、いかなる塩も本発明の範囲に包含される。また、分子内で対イオン（ツビッターイオン）を形成する場合がある。本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、光学活性体やジアステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。また、Ｒで表される基については、互変異性体が存在する場合もあるが、それらはいずれも本発明の範囲に包含される。さらに、遊離形態の本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合があるが、これらの物質も本発明の範囲に包含される。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、ＩＰ３受容体に対して高い親和性を有しており、ＩＰ３受容体リガンドとして有用である。本発明の化合物は発色団又は蛍光団を有しているので、例えば、ＩＰ３受容体に対する被検物質の親和性を測定するための蛍光試薬として用いることができる。その方法の具体例を本明細書の実施例に詳細に示した。また、本発明の化合物をＩＰ３受容体と結合させた後、光照射することにより、本発明の化合物が結合したＩＰ３受容体を変性させることができる。例えば、培養細胞、培養組織、又は細胞抽出物などに対して本発明の化合物の存在下で光照射することにより、イン・ビトロにおいてＩＰ３受容体を変性させることができる。また、本発明の化合物をヒトを除く哺乳類動物に投与し、光照射することによって生体内でＩＰ３受容体を変性させ、ＩＰ３受容体の機能が低下ないし停止した実験動物を作出することもできる。
さらに、ＩＰ３過剰やＩＰ３受容体の過剰発現に起因する疾患の治療のために、本発明の化合物をヒトを含む哺乳類動物に医薬として投与し、光照射することにより、生体内でＩＰ３受容体の機能を低下させて疾患を治療することができる。従って、本発明により、上記ＩＰ３受容体リガンドとＩＰ３受容体とを結合させた後に光照射する工程を含むＩＰ３受容体の変性方法、ＩＰ３受容体を変性させた細胞又は細胞抽出物、及び上記ＩＰ３受容体リガンドを含むＩＰ３受容体の変性剤が提供される。ＩＰ３受容体変性のための光照射は、上記ＩＰ３受容体リガンドの色素誘導体又は蛍光色素誘導体の特性にあわせて条件を選択することができる。通常は６２０ｎｍ程度あるいは５００ｎｍ程度の細胞に影響を与えない長波長のレーザー光を用いて行うことができる。
本発明の医薬は、上記の式（Ｉ）で表される化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種または２種以上を有効成分として含んでいる。本発明の医薬としては上記物質それ自体を投与してもよいが、好ましくは、医薬組成物として投与することができる。医薬組成物の形態は特に限定されず、１又は２以上の適宜の製剤用添加物を用いて、経口投与用又は非経口投与用の医薬組成物を製造して使用することができる。経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、及び貼付剤等を挙げることができる。
上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができる。
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、その作用の種類や作用の強弱などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。例えば、経口投与の場合には成人一日あたり０．０１〜１，０００ｍｇ程度の範囲で用いることができる。本発明の医薬を投与した後、生体内ＩＰ３受容体の機能を低下させるために十分な強度の光照射を行うことによって、ＩＰ３過剰やＩＰ３受容体の過剰発現に起因する疾患の治療及び／又は予防を行うことができる。光照射の強度及び頻度は、本発明の医薬の投与量及び投与方法、疾患の種類、患者の体重や年齢などに応じて当業者が適宜選択可能である。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：化合物の製造
１Ｄ−１−０−（３−アミノプロピル−１−ホスホ）−ｍｙｏ−イノシトール４，５−ビスリン酸（上記スキーム中の化合物１：Ｓｔｒｕｐｉｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３，９０１，１９８８）を文献記載の方法に従って製造した（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２，１９９１；Ｏｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，１９９２，７２９；Ｇｉｇｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，４２３，１９８７；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７０，１７５，１９８７）。４−カルボキシベンズアルデヒド（１当量）とジメチルアニリン（２当量）との酸縮合産物をアシル化剤として、塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をアシル化した。次に、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）で酸化し、４−カルボキシマラカイトグリーン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＭＧ−ＳＥ）を得た。
０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）中の化合物１に、５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＦ−ＳＥ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）又はＣＭＧ−ＳＥを加えた後、反応混合物を室温で２〜３時間攪拌し、上記スキーム中の化合物２ａ及び２ｂをそれぞれ得た。ＣＭＧ−ＳＥ、化合物２ａ及び２ｂはＣ１８逆相ＨＰＬＣで精製した。上記化合物の光学純度は、１Ｄ−４，５−ジ−０−アリル−３，６−ジ−０−ベンジル−１−ｌ−メトキシアセチル−ｍｙｏ−イノシトール（１の中間体）の比旋光度から算出した（Ｏｚａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ，７２９，１９９２）。
化合物のスペクトルデータ（Ｒａｄｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６４，３２３，１９８９）：
１Ｄ−４，５−ジ−０−アリル−３，６−ジ−０−ベンジル−１−ｌ−メトキシアセチル−ｍｙｏ−イノシトール：［α］２５Ｄ＝−５２．５（ｃ２．２，ＣＨＣｌ３）：
４−カルボキシマラカイトグリーン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＭＧ−ＳＥ）：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ２．９６（ｓ，４Ｈ），３．３７（ｓ，１２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，４Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，４Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ，２Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ，２Ｈ）；ＦＡＢＭＳ  ４７０（Ｍ）＋
化合物２ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  １．８８（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｄｄ，Ｊ＝２．３７，９．７８Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，１Ｈ），３．８７−４．００（ｍ，４Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝２．１９Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．７９，９．６９Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝２．１９，９．２４Ｈｚ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝２．１９Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．７１Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄｄ，Ｊ＝１．６５，７．９５Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝１．１１Ｈｚ，１Ｈ）；ＦＡＢＭＳ  ８３６（ＭＨ）＋
化合物２ｂ：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  １．８０（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｓ，１２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝２．５８，９．８０Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｔ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．９７（ｍ，４Ｈ），４．０７（ｔ，Ｊ＝２．９１Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝６．２１，９．５４Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．２５Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，４Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．９７Ｈｚ，４Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ，２Ｈ）；ＦＡＢＭＳ  ８３２（Ｍ）＋
例２：結合アッセイ
（１）ヒトＩＰ３受容体１型の発現および精製
ヒトＩＰ３受容体１型（Ｙａｍａｄａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０２，７８１，１９９４）のＩＰ３結合ドメイン（ＩＢＤ、アミノ酸残基１−８８５）（Ｍｉｇｎｅｒｙ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，９，３８９３，１９９０）を細菌で発現させるためにｐＧＥＸ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングした。ＩＢＤのＮ−末端をリンカー配列であるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＳｅｒでグルタチオンＳ−トランスフェラーゼに融合させ、一方、ＩＢＤのＣ−末端はリンカー配列のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＳｅｒでＨｉｓを標識した。大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）中で発現させた後、Ｎｉ−ＮＴＡを固定化した樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び化合物１が結合したＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化アフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて組換えタンパクを精製した。タンパクの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥから２２％と算定した。
（２）表面プラズモン共鳴の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定を行った。ＮＨＳおよびＥＤＣで活性化した後、ＣＭ５センサーチップの表面に、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の１０ｍＭの化合物１を結合させ、エタノールアミンで不活化した。ＩＰ３、化合物１、化合物２ａ、及び化合物２ｂの解離定数を求めるために、それぞれの化合物と共に、予め精製したＩＢＤを通液緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中に溶解した。サンプル注入後、チップ表面を１００ｍＭ  ＮａＯＨで再生した。
ＩＢＤは濃度に依存してチップと結合したが、ＢＳＡ（またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）との非特異的な結合は見られなかった。この結果から、様々な濃度のＩＢＤまたはウシ血漿アルブミン（ＢＳＡ、図１Ａ）の注入によって、化合物１の固定化センサーチップが我々のアッセイに好適であることが確認された。ＩＰ３、化合物１、化合物２ａ、及び化合物２ｂのＩＢＤに対する親和性を測定するために、以下の競合アッセイを行った。ＩＢＤ（５２．８ｎＭ）を種々の濃度の上記化合物と混合した。チップ上に注入すると、化合物１と競合する化合物はＩＢＤに結合してチップ表面に固定化された（図１Ｂ）。これらのアッセイから得られたＳＰＲを等式にあてはめて化合物の解離定数（Ｋｄ）を計算した。
（３）解離定数の計算
化合物のＫｄを計算するために、図１Ｂ及び１Ｃにプロットした得られたデータを式にあてはめた。式：１００［１−［Ｘ＋Ｙ＋Ｋｄ−｛Ｘ２＋２Ｘ（Ｋｄ−Ｙ）＋（Ｋｄ＋Ｙ）２｝１／２］／２Ｙ］ここで、ＸおよびＹはそれぞれ化合物の濃度およびＩＢＤ濃度である。化合物２ｂのＫｄは、ＩＢＤ濃度の半分よりもかなり小さいために正確に計算することができなかった。従って、ＩＢＤ濃度を１．７６ｎＭに下げて、化合物２ｂの競合アッセイを再度行った（図１Ｃ）。結合アッセイを明条件下および暗条件下で実施し、結合が光の影響を受けないことを確認した。化合物２ｂのＩＰ３受容体に対する非特異的結合を算定するために、カルボキシマラカイトグリーン（ＣＭＧ、化合物２ｂの疎水性部分）を競合アッセイ中に注入したが（図１Ｃ）、非特異的結合は認められなかった。従って化合物２ｂは特異的にＩＰ３受容体に結合することが示された。
化合物１の親和性はＩＰ３の約１／６であったが（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２，１９９１）、化合物２ａの親和性はＩＰ３と同等であり、化合物２ｂはＩＰ３の１６７倍の親和性を有していた（表１）。
0004226245.tif 000006
例３：本発明の化合物を用いた光照射によるＩＰ３受容体の変性
（１）組織標本の作製
雄モルモット（体重２００−３００ｇ）の門脈より調製した短冊状平滑筋組織をステンレスワイヤーに固定し、組織標本を作成した。
（２）Ｃａ２＋放出活性の測定
前記標本をＣａ２＋蛍光指示薬ｍａｇ−ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）４０μＭ溶液中３５℃で３．５時間インキュベートし、ｍａｇ−ｆｕｒａ−２  ＡＭを標本に取り込ませた。ついで、界面活性剤β−ｅｓｃｉｎ４０−６０μＭ溶液中、３５℃で１．５〜２時間インキュベートし細胞内小器官以外に存在するｍａｇ−ｆｕｒａ−２  ＡＭを除去した。
前記標本をガラスキャピラリーに挿入し、各種溶液を前記標本に添加した際の蛍光強度比（Ｅｘ．３４０ｎｍ，Ｅｍ．４８０ｎｍの蛍光強度／Ｅｘ．３７５ｎｍ，Ｅｍ．４８０ｎｍの蛍光強度）の初期変化（放出速度）を指数関数にフィットさせてＣａ２＋の放出活性として求めた。蛍光光度計はＣＡＦ−１１０（ＪＡＳＣＯ）を使用した。
（３）本発明の化合物を用いた光照射によるＩＰ３受容体の変性方法
前記（１）で作成した組織標本に１μＭのＩＰ３を添加してＣａ２＋放出活性を測定した（照射前）。測定後、該標本を蛍光光度計から取り外し、キャピラリー内を１μＭの化合物２ｂの溶液で満たした。ついで、該標本をピペッティングして乾燥を避けながら３分間レーザーを照射した。
レーザー照射後、該標本を再び蛍光光度計に取り付け１μＭのＩＰ３を添加してＣａ２＋放出活性を測定し、照射前の値と比較した（照射後）。なお、標本を蛍光光度計から取り出し、化合物２ｂを添加後、レーザー照射するまでに２．５分、レーザー照射終了後、再び蛍光光度計に戻すまでに１．５分を要した（すなわち作業時間は照射時間＋４分）。レーザーを照射しないコントロール実験は標本に化合物２ｂを添加し２．５分後にピペッティングのみ３分行い、１．５分放置した後、測定を再開した。また、照射時間の変動を検討する試験では、照射時間０分は標本を化合物２ｂ溶液で満たし、４分放置した後に測定を再開した。レーザーはＹＡＧ：Ｎｄ−ｐｕｍｐｅｄ  ｄａｙ  ｌａｓｅｒ（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ６３５ｎｍ，ｐｕｌｓｅｄ２−４ｎｓ，１５ｍＪ  ｐｅｒ  ｐｕｌｓｅ  ａｔ  １０Ｈｚ，３ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｌａｓｅｒ  ｓｐｏｔ，Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）を使用した。
レーザー照射の前後でＩＰ３により惹起されるＣａ２＋放出活性の抑制が認められた（図２Ａ）。レーザー照射時間を変化させると、照射時間依存的にＣａ２＋放出活性が抑制された（図２Ｂ）。化合物２ｂの添加もレーザー照射もない条件での放出活性と比較して、レーザー照射のみ、あるいは化合物２ｂの添加のみの条件ではＣａ２＋放出活性の低下は認められなかったが、化合物２ｂの添加とレーザー照射の両方を実施した場合には顕著なＣａ２＋放出活性の低下が認められた（図２Ｃ）。
以上の結果から、本発明の化合物をＩＰ３受容体と結合させた後、光照射することにより、本発明の化合物が結合したＩＰ３受容体を変性させることができることが確認された。
産業上の利用可能性
上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、ＩＰ３受容体にリガンドとして結合する性質を有しており、例えば、このＩＰ３受容体リガンドをＩＰ３受容体に結合させた後に光照射することによってＩＰ３受容体を変性させることができるので、医薬の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の化合物がＩＰ３受容体リガンドとして作用することを示した図である。図中、（Ａ）はＩＢＤ及びＢＳＡによって惹起される表面プラズモン共鳴の結果を示す。（Ｂ）はＩＰ３、化合物１、化合物２ａ、及び化合物２ｂの競合アッセイの結果を示し、これらの化合物によって化合物１固定化チップへのＩＢＤの結合が阻害されたことを示している。（Ｃ）はＩＢＤ低濃度における化合物２ｂ及びカルボキシマラカイトグリーン（ＣＭＧ）の競合アッセイの結果を示す。ＩＢＤ濃度は５２．８ｎＭ（Ｂ）又は１．７６ｎＭ（Ｃ）である。
第２図は、本発明の化合物をＩＰ３受容体に結合させた後、光照射することによりＩＰ３受容体を変性できることを示した図である。図２Ａは、レーザー照射の前後でＩＰ３により惹起されるＣａ２＋放出活性の抑制が認められた結果を示し：図２Ｂはレーザー照射時間を変化させると、照射時間依存的にＣａ２＋放出活性が抑制された結果を示し；図２Ｃは、化合物２ｂの添加もレーザー照射もない条件での放出活性と比較して、レーザー照射のみ、あるいは化合物２ｂの添加のみの条件ではＣａ２＋放出活性の低下は認められなかったが、化合物２ｂの添加とレーザー照射の両方を実施した場合には顕著なＣａ２＋放出活性の低下が認められたことを示す。
【図１】
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【図２】
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