(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のＤＮＡベクターを含み、かかる単数又は複数のベクターが、ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあり、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂する、標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含むベクターキットであって、
前記標的ハンマーヘッド開裂リボザイムＤＮＡ配列は、（５’から３’）に、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第一認識配列：ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔを含み、その下流にＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第二認識配列：ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む前記ベクターキット。
【請求項２】
ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４標的遺伝子の両方から転写されたｍＲＮＡを開裂するための標的開裂リボザイム配列を含む、請求項１に記載のベクターキット。
【請求項３】
少なくとも２個のＤＮＡベクターを含み、その内の第一ベクターが、第二プロモーターに作用することができる活性化因子蛋白質を産生するように発現される遺伝子に機能的に結合された、ヒト細胞において有効な第一プロモーターを含み、第二ベクターが、ＣＣＲ５標的遺伝子、ＣＸＣＲ４標的遺伝子あるいはＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方の標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂するための標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列に機能的に結合された第二プロモーターを含む、請求項１又は２に記載のベクターキットであって、
前記標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列は、（５’から３’）に、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第一認識配列：ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔを含み、その下流にＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第二認識配列：ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む前記ベクターキット。
【請求項４】
少なくとも３個のＤＮＡベクターを含み、その内の第二ベクターがＣＣＲ５標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂するための標的開裂リボザイムＤＮＡを含み、第三ベクターがＣＸＣＲ４標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂するための標的開裂リボザイムＤＮＡを含む、請求項３に記載のベクターキット。
【請求項５】
第二プロモーターがＴ７ポリメラーゼプロモーターであり、活性化因子蛋白質がＴ７ポリメラーゼである、請求項３又は４に記載のベクターキット。
【請求項６】
プロモーターが、ヒト細胞におけるＴ７ポリメラーゼ遺伝子の翻訳を助けるためのインターナルリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を提供するＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のベクターキット。
【請求項７】
リボザイムＤＮＡ配列が、標的開裂リボザイム配列の下流に３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列をさらに含み、その結果リボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されたとき、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡを標的する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触媒的リボザイムの第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現される形態を持つ、請求項１から６のいずれか１項に記載のベクターキット。
【請求項８】
第一及び第二構造安定化ステムループが第一認識配列の両側にひとつずつ位置する、請求項１から７のいずれか１項に記載のベクターキット。
【請求項９】
第二認識配列が第二構造安定化ステムループの下流に位置する、請求項８に記載のベクターキット。
【請求項１０】
標的開裂リボザイム配列が順に（５’から３’）次のものを含む、請求項９に記載のベクターキット：
第一構造安定化ステムループ；
第一標的認識配列；
第一触媒配列；
第二構造安定化ステムループ；
第二触媒配列；及び
第二標的認識配列。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに定義されているベクターキットを含む製薬上許容される担体。
【請求項１２】
リポソームの形態の請求項１１に記載の担体。
【請求項１３】
請求項１２に記載のリポソームと希釈剤又は担体を含む製薬組成物。
【請求項１４】
ＨＩＶ感染に関連する疾患の治療において使用するための製剤を製造するための、請求項１から１０のいずれか１項に記載のベクターキット。
【請求項１５】
（１）ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあり、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝子から転写されたＲＮＡを開裂する標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列、及び
その下流に、（２）リボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、２個のハンマーヘッドに接合する共通の第三ステムと共に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡを標的する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触媒的リボザイムの第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現される形態を持つ３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含む、リボザイムＤＮＡであって、
前記標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列は、（５’から３’）に、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第一認識配列：ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔを含み、その下流にＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、第二認識配列：ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む前記リボザイムＤＮＡ。
【請求項１６】
ＲＮＡに転写されるとき、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４ ＲＮＡに存在する標的ＲＮＡ配列を開裂し、また次の第一認識配列（５’から３’）： ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ｔａｇａｔｔｇ又はｃｔｃａｃｔを含み、さらにその下流に次の第二認識配列： ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４についてそれぞれ、ａｃｔｔｇ又はａｃｇｔｔｇｔを含む、リボザイムＤＮＡ
【請求項１７】
タンデムＣＣＲ５ ＲＮＡ及びＣＸＣＲ４ ＲＮＡ開裂配列を含む、請求項１６に記載のリボザイムＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換えＤＮＡテクノロジーの分野に属するものであり、リボザイムに関する。
【０００２】
関連技術の説明
当該技術は現在、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に代表されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を攻撃する多くの異なる方法、あるいはＨＩＶによる感染とｉｎ  ｖｉｖｏでのその進行に関わる細胞機序を探求している。最近になって、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）は、ウイルスエンベロープ蛋白質と２つの細胞表面膜レセプタ：ＣＤ４及び経膜ケモカインレセプタの間で複合体を形成することによって標的細胞に入り込むことが示された。細胞屈性が異なるＨＩＶ単離物は、侵入補因子として異なるサブセットのケモカインレセプタを使用する：マクロファージ親和性ＨＩＶは主としてＣＣＲ５を使用するのに対し、二元親和性分離物はＣＣＲ５とＣＸＣＲ４（「フュージン（Ｆｕｓｉｎ）」とも称される）レセプタの両方を用いる；ＣＸＣＲ４はＴ親和性ウイルスによっても使用される。
【０００３】
ＣＣＲ５の役割はＳ．Ｏ’ＢｒｉｅｎとＭ．Ｄｅａｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２８−３５（１９９７年９月）によって検討された。この総説は、この段階のＨＩＶ感染あるいは維持を遮断しうるいくつかの方法を示唆している。かかる方法は次のものを含む：
−天然ケモカインと競合するケモカイン誘導体を使用することによる、あるいは合成抗体を使用することによる、ＨＩＶに関するＣＣＲ５上の結合部位の遮断、
−ＣＣＲ５断片によるワクチン接種、
−その産物が、ＣＣＲ５が産生されるのを妨げる若しくはＣＣＲ５がＨＩＶに関するドッキング部位として働くのを停止させる新しい遺伝子。
【０００４】
ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／４５５４３号は、抗体による治療、ＣＣＲ５の突然変異体を作製しておとり（デコイ）として使用し、それによって細胞の融合を妨げること、ＣＣＲ５をコードするＤＮＡの発現を防ぐためにＣＣＲ５に結合する作用物質及びアンチセンスオリゴマーとリボザイムを使用することを含めて、様々な方法でＣＣＲ５レセプタの作用あるいは産生を阻害することを提案している。
【０００５】
ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／４４０５５号は同様に、ＣＸＣＲ４を含めた他のケモカインレセプタにまでコンセプトを拡大して、ＣＣＲ５レセプタの作用あるいは産生を阻害する多くの方法を提案している。
【０００６】
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １０（第９号）、２６１−２６２（１９９７年９月）の中の“Ｔｒｏｊａｎ  Ｈｏｒｓｅ  Ｖｉｒｕｓ’  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＨＩＶ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”と題する論文において、ＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現するように改変した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ細胞を選択的に標的し、死滅させうることが報告されている。このアプローチは問題があると述べられているが、「ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子、他の抗レトロウイルス薬剤、アンチセンス作用物質、遺伝子治療、リボザイムあるいはＨＩＶ感染細胞に対する他の作用物質を標的送達するために、ＨＩＶ模倣弱毒化ウイルスあるいは表面細胞ＨＩＶレセプタを持つリポソームを使用する潜在的可能性を強調している」。
【０００７】
発明の要旨
ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４蛋白質をコードするｍＲＮＡが、これらの蛋白質の産生を遮断するほど有効にハンマーヘッドリボザイムによって開裂されうることが認められた。
【０００８】
ひとつの局面では、本発明は、少なくとも１個のＤＮＡベクターを含み、かかる単数又は複数のベクターが、ヒト細胞において有効なプロモーターの制御下にあり、ＲＮＡへの転写の際にＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４蛋白質をコードする標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを開裂する、標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含むベクター系を提供する。
【０００９】
リボザイムＤＮＡ配列のプロモーターへの結合は直接的であり、１個のベクターだけを用いる必要がある。しかし、間接結合にはプロモーターの作用を増幅するという利点がある。そのような間接結合は通常２個又はそれ以上のベクターを必要とする。従って本発明は、少なくとも２個のＤＮＡベクターを含み、第一ベクターが、第二プロモーターに作用することができる活性化因子蛋白質を産生するように発現されうる遺伝子に機能的に結合された、ヒト細胞において有効な第一プロモーターを含み、第二ベクターが、上述した標的開裂ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列に機能的に結合された第二プロモーターを含むベクター系を包含する。リボザイムＤＮＡ配列は、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡを開裂するための単一配列、あるいはＣＣＲ５とＣＸＣＲ４  ＲＮＡの両方を開裂するための複数配列を含みうる。本文中で使用するとき「ベクター系」という用語は、１個のベクターあるいは２個又はそれ以上のベクターのキット又は組成物を包含する一般的な用語である。
【００１０】
厳密には、リボザイムはＲＮＡ標的を開裂するＲＮＡ分子である。一部の文献は、ＲＮＡに転写される、従って本来のリボザイムを生じるＤＮＡ分子を表すのにこの語を使用している。本明細書では、「リボザイムＤＮＡ」の語は本来のリボザイムに転写されうるＤＮＡを意味する。
【００１１】
本発明は、上記に定義したようなＤＮＡベクター系を含むリポソーム及びかかるリポソームを含む製薬組成物を包含する。
【００１２】
さらに、本発明は、感染、特にＨＩＶ及びＡＩＤＳに関連する疾患の治療に使用するための、上述したようなベクター、組成物及びリポソームを包含する。本発明はまた、そのような目的のための医学的製剤の製造における核酸、ベクターあるいはリポソームの使用も包含する。さらに、特許法で認められる場合には（例えばオーストラリア、米国）、ベクター、組成物あるいはリポソームを有効用量で、あるいはもうひとつ別の治療と組み合わせて投与するときには有効用量の一部として患者に投与することを含む、ＨＩＶ感染を生じている患者を治療する方法を包含する。
【００１３】
さらに本発明は、リボザイムＤＮＡをそれ自体として及びベクター内に含まれるリボザイムＤＮＡ配列として包含し、かかるリボザイムＤＮＡは標的開裂リボザイム配列の下流に３’自己触媒的ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡ配列を含み、その結果リボザイムＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、２個のハンマーヘッドに接合する共通の第三ステムと共に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的する標的開裂リボザイムの第一及び第二ステムと、３’自己触媒的リボザイムの第一及び第二ステムを備えた二重ハンマーヘッドとして表現される形態を持つ。この第三ステムは、塩基対合の際に標的開裂リボザイムと３’自己触媒的リボザイムのハンマーヘッドに接合する上記の共通ステムを形成するように、好ましくは自己触媒的リボザイム配列の３’末端近くの少なくとも４個の塩基の相補的配列と塩基対合することができる、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４リボザイム配列の３’末端近くの少なくとも４個の塩基である。
【００１４】
どのような文法形態でも本文中で使用するときには常に、「含む」という動詞は、「〜から成る」又は「包含する」ことを意味する。
【００１５】
追加先行技術
ＡＩＤＳ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｐｌｕｓ  １９９７年５月１９日、ｐ．３１は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙと題するＫｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７年５月１６日−２１日、Ｔａｍａｒｒｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡに提出されたＲ．Ｔｒｉｔｚらによる抄録の報告を載せている。この抄録は、ＣＣＲ５がリボザイム遺伝子治療の適切な標的であると提案し、ＣＣＲ５  ＲＮＡを標的するいくつかのヘアピンリボザイムを作製したことを報告している。
【００１６】
（好ましい実施態様の説明）
本発明におけるリボザイムはハンマーヘッド型である。リボザイムは、所望する標的部位でＲＮＡを開裂する触媒配列を持つ。ハンマーヘッドリボザイムの触媒配列は通常、（１）ｃｕｇａｎｇａ・・・及び（２）・・・ｇａａという形態（５’から３’まで）であり、ｎはヌクレオチドである。本発明においては、ｎは好ましくはｕである。それらは安定な構造、好ましくはステムループによって分けられている。本発明におけるリボザイムＤＮＡはこの形態を持ちうる（ウラシルをチミンで置換する）。
【００１７】
本発明のために最も好ましい標的配列は次のものである：
ＣＣＲ５：    ５’    ｃａａｇｕｃｃａａｕｃｕａ    ３’（配列番号：１）
ＣＸＣＲ４：  ５’    ａｃａａｃｇｕｃａｇｕｇａｇ  ３’（配列番号：２）
下線を付した部分が、本発明で使用するハンマーヘッドリボザイムが必要とする３個の塩基の基本配列である。
【００１８】
触媒配列のすぐ上流と下流に標的結合（すなわち標的認識）配列がある。標的はＲＮＡであり、ＲＮＡであるリボザイムは標的ＲＮＡと相補的である（以下に説明するように、標的中に存在する付加的なｃヌクレオチドは考慮しない）。
【００１９】
従って、好ましい標的及びそれに結合する好ましいリボザイムに関わる配列は次のように要約できるであろう：
CCR5
(a)5’ Caagu          c*    caaucua 3’(標的RNA)
(b)3’ guuca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-guuagau 5’(rzRNA)
(c)5’ caatg-触媒配列-ステムループ-触媒配列-caatcta 3’(rzDNA;鎖1)
(d)3’ gttca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-gttagat 5’(rzDNA;鎖2)
CXCR4
(a)5’acaacgu          c*     agugag 3’(標的RNA)
(b)3’ uguugca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-ucacuc 5’(rzRNA)
(c)5’ acaacgt-触媒配列-ステムループ-触媒配列-agtgag 3’(rzDNA;鎖1)
(d)3’ tgttgca-触媒配列-ステムループ-触媒配列-tcactc 5’(rzDNA;鎖2)
(*=開裂されたヌクレオチド、cat.seq.=触媒配列;s.l.=ステムループ)
ＣＣＲ５  ｍＲＮＡを標的するリボザイムについては、５’ｕａｇａｕｕｇ３’が最初の標的認識配列であり、５’ａｃｕｕｇ３’が２番目の標的認識配列である。標的中の開裂部位はｇｕｃ＊である；星印をつけたｃヌクレオチドは開裂部位であり、従ってリボザイム中の対応部分を持たない。ＣＣＲ５に関する配列（ａ）と（ｂ）は図面の図４に示されている。ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的とするリポザイムに関しては、５’ｃｕｃａｃｕ３’と５’ａｃｇｕｕｇｕ３’が第一及び第二標的認識配列である。標的中の開裂部位はやはりｇｕｃ＊である。本発明で使用するためのリボザイムの好ましい亜属は、これらの標的認識配列を持つものである。
【００２０】
下記の説明では、ハンマーヘッドリボザイムの構造をＲＮＡの見地から論じるが、それらが転写されるリボザイムＤＮＡは、ウラシルをチミンで置換したものに対応することは理解されるであろう。また、本文中で示すこれらのリボザイムのコンフォメーションは塩基対合や他のエネルギー関係から明白なものであること、また本発明はいかなる意味においてもこれらの図面によって限定されない、すなわち本発明が同じ分子の他のコンフォメーションを包含することも認識されるであろう。
【００２１】
ハンマーヘッドリボザイムは２つのステムループによって保持されており、第一ステムループ（「ステムＩ」）は第一標的認識配列に先行し、第二ステムループ（「ステムＩＩ」）は第一と第二の標的認識配列の間に位置する。これら２つのステムループはどのような所望形態も持ちうるが、典型的にはステムを形成する３−５個の相補的塩基対とループ中の４又は５個の塩基を含む。ＣＣＲ５  ｍＲＮＡを標的するリボザイムに関する図１は、本来のステム部分の４個の塩基対とループ部分の５個の塩基を例示している。ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的するリボザイムに関する図１１は、ステムＩの５個の塩基対、ステムＩＩの４個及び各ループ部分の４個の塩基対を例示している。
【００２２】
第二触媒配列に続いて、第二標的認識配列から成る又は第二標的認識配列を含む３番目のステムが存在する。本発明のひとつの実施態様では、ステムＩＩＩは３’末端にｇｕｃの特別な配列を持ち、これは、天然に存在しなければ部分的あるいは全面的に付加することができる。本発明におけるように、ｇが天然の末端である場合には、その最後の数個の塩基が第二触媒配列の塩基と対合するようにｕｃを突出部分として付加する。図１参照。図１では、これはａ−ｕ及びｇ−ｃ塩基対によって実現されている。このタイプの構築は、リボザイムが３’自己触媒配列を含まないときに適するが、３’自己触媒配列を含むときにも使用できる。
【００２３】
より好ましくは、リボザイムは３’自己触媒配列を含む。そのような配列は、それ自体が、特にＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／１７４３３号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）から既知である。３’自己触媒配列は、好ましくは標的開裂リボザイムの３’末端近くの配列がその３’末端で又はその近くで自己触媒配列の下流部分と塩基対合するように設計される。これらの好ましい構築物は、ステムＩＩＩに少なくとも４個の塩基対、すなわち自己触媒的リボザイムからの４個と塩基対合する標的開裂リボザイムからの４個の塩基対を持つ。それらの塩基対を１０個持つ場合もある。典型的にはステムＩＩＩを越えて伸びる非塩基対合ヌクレオチドの突出部は、標的開裂リボザイム配列の３’末端の１又は２個だけと自己触媒配列の３’末端の０−５個である。そのような構築は、図２でＣＣＲ５に関して、また図１１でＣＸＣＲ４に関して例示されている。ここでは、３’自己触媒（＝自己開裂）配列は、３’開裂部位（ｇｕｃ）、第一ステムループ（「ｓｃａｓステムＩ」）、第二ステムループ（「ｓｃａｓステムＩＩ」）及び第三ステム（「ｓｃａｓステムＩＩＩ」）を含むハンマーヘッドリボザイムの形態であり、第三ステムは標的開裂リボザイムのステムＩＩＩと塩基対合する。開裂はｇｕｃ３’開裂部位のｃのあとで起こる。ｓｃａｓステムＩとｓｃａｓステムＩＩの間の触媒配列（ｃｕｇａｕｇａ）はハンマーヘッド構造を安定させるのを助けるものであり、第ＷＯ９７／１７４３３号においても使用されている。ステムＩＩとＩＩＩの間にｇａａ触媒部位が位置する。
【００２４】
本発明において使用するリボザイムは、例えばＷＯ９７／１７４３３号に述べられているような５’自己触媒配列を含みうる。ＷＯ９７／１７４３３号には、所望する標的認識配列及び触媒配列を挿入することができる、中心に位置するＢｇ／ＩＩクローニング部位、ａｇａｔｃｔを含む二重リボザイムが提供されている。ＷＯ９７／１７４３３号では、インサートは４２塩基である。これらは、第一標的認識配列（８塩基）、触媒及び構造安定化配列（２３塩基）及び第二標的認識配列（１１塩基、その内最後の２個はＢｇ／ＩＩ部位のａｇである）から成る。重要でない改変を加えて、例えばＷＯ９７／１７４３３号の２３塩基を３６塩基のＤＮＡ等価物、図１の１３‐４８に置換し、その３’末端のＢｇ／ＩＩ部位にクローニングするために必要なヌクレオチドを付加して、同じ構築物を本発明に適合させることができる。この構築物では、ステムＩを削除して、５’自己触媒部位を含むＷＯ９７／１７４３３号の５’配列に置き換える。しかし、ＷＯ９７／１７４３３号では触媒部位の間の配列部分は緊密なステムループの形態ではなく、そのためあまり構造が安定していないと思われる。
【００２５】
本発明における構築物は、リボザイムＤＮＡを含む１又はそれ以上のベクターである。真核細胞、特にヒト細胞において有効であるためには、リボザイムＤＮＡは直接又は間接的に真核細胞プロモーターによって制御されなければならない。特に適切なそのようなプロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。トランスフェクトされる宿主細胞中の内因性ポリメラーゼに全面的に依存するのではなく、ＲＮＡの転写のためのＲＮＡポリメラーゼの他の供給源を提供することも好ましい。好ましくはポリメラーゼは、典型的にはｉｎ  ｔｒａｎｓで作用することによってプロモーターの作用を触媒するものである。すなわち、最初のＤＮＡ分子又はＤＮＡの長さが発現されて、もうひとつのＤＮＡ分子又はＤＮＡの異なる長さに含まれるプロモーターに作用するポリメラーゼを産生し、それがリボザイムＤＮＡの転写を促進する。好都合には、ポリメラーゼをコードするＤＮＡはベクター内のリボザイムＤＮＡの下流に位置する。ＤＮＡによって産生されるポリメラーゼはそれ自体がプロモーターを刺激するように「フィードバックする」ので、今度はｉｎ  ｃｉｓで作用する。例えば、図１７、プラスミド２あるいは図１８の自己ポリメラーゼベクター参照。
【００２６】
図１７を参照すると、プラスミド２はＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡ又はその両方を開裂するリボザイムＤＮＡ「ｒｚ１」を含む。しかし、ＨＩＶをその感染、増殖及び複製の周期中１つ以上の時点で攻撃することが望ましいと長い間考えられてきた。従って、同じベクターが、ＨＩＶによって産生される、又はＨＩＶがその増殖又は複製のために依存する蛋白質を生成するのに必要な、他のＲＮＡを標的する１又はそれ以上の他の種のリボザイムＤＮＡを含みうる。例えば、図１７はｒｚ１、ｒｚ２及びｒｚ３の３種類のリボザイムＤＮＡを例示している。これらのいずれか１つがＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡ又はその両方に対するものと考えられ、他は存在しないかあるいはＨＩＶ又はケモカインレセプタによって産生されるもうひとつ別のＲＮＡを標的することができる。特に好ましいのは、ケモカインレセプタＣＣＲ２ｂ又はＣＣＲ３のｍＲＮＡを標的するリボザイム配列である。ＣＸＣＲ４のＲＮＡ／ＤＮＡ配列はＢ．Ｆｅｄｅｒｓｐｐｉｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６，７０７−７１２（１９９３）に記述されている。ＣＣＲ２ｂ及びＣＣＲ３のＲＮＡ／ＤＮＡ配列も既知であり、これらのケモカインレセプタを標的するリボザイムを、好ましくはＣＣＲ５やＣＸＣＲ４に関するものと同様にして開発することが可能である。これまではヒト単球化学誘引性蛋白質１レセプタ（ＭＣＰ−１ＲＢ）と呼ばれていたＣＣＲ２ｂについてはＧｅｎＢａｎｋ，受託番号Ｕ０３９０５及びＩ．Ｆ．Ｃｈａｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，２７５２−２７５６（１９９４）参照、そしてＣＣＲ３についてはＧｅｎＢａｎｋ、受託番号Ｕ２８６９４及びＣ．Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６４９１−１６４９４及び３０２３５（１９９５）及び同上、２７１、１１０３４（１９９６）参照。ＨＩＶ感染におけるＣＣＲ２ｂとＣＣＲ３の役割は、Ｂ．Ｊ．Ｄｏｒａｎｚ，Ｃｅｌｌ  ８５，１１４９−１１５８（１９９６）及びＲ．Ｉ．Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６２１−６２８（１９９７）によって記述されている。
【００２７】
もうひとつの標的は、ＨＩＶウイルスｍＲＮＡの３’末端の配列（ＤＮＡで言えば５’リーダー配列）である。ヘアピンリボザイムを記述し、標的を同定しているＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／０７６６７号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）参照。
【００２８】
プロモーターを「キックスタートさせる」ためには、酵素それ自体として、あるいはより好ましくはこの目的に供されるもうひとつ別のベクターの形態で、ポリメラーゼの別個のソースを提供することが望ましく、かかるもうひとつのベクターは好ましくはプラスミドである。図１７、プラスミド１及び図１８参照。
【００２９】
図１８を参照すると、第一プラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子の転写を推進するＣＭＶプロモーターを含み、第二プラスミドはＴ７プロモーターとＴ７ポリメラーゼ産生のための翻訳エンハンサー（ＩＲＥＳとして例示され、ＥＭＣウイルスからのものが図示されている）を含み、さらに第三プラスミドでは、最初の２つのプラスミドによって産生されるポリメラーゼによって活性化されるＴ７プロモーターがＣＣＲ５及び／あるいはＣＸＣＲ４リボザイムの転写を推進する。図示したものの代わりに他の翻訳エンハンサーも使用できる。
【００３０】
他の標的は、ＬＴＲ（ロングターミナルリピート）及びＨＩＶのｔａｔ遺伝子領域である。このためのハンマーヘッドリボザイムはＰＣＴ出願公開第ＷＯ９５／０４８１８号に記述されており、これはｇａｇ遺伝子［Ｃｈａｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２，２３（１９９０）及びＮ．Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１２２２−１２２５（１９９０）］及びｖｉｆ遺伝子［Ｅ．Ｕ．Ｌｏｒｅｎｔｚｅｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５，１７−２３（１９９１）］を含めて、これまでに標的された他のＨＩＶ遺伝子の目録も含んでいる。
【００３１】
効率を高めるため、図１７に示すように、各リボザイム配列ならびにポリメラーゼ配列の前にプロモーターを挿入することができる。しかしこの配置は、遺伝子の順序を変化させる１個のプロモーターを使用して変えることができる。また、プラスミド２の代わりにいくつかのベクターを使用することにより、リボザイムの発現を変化させうる。
【００３２】
使用しうる送達の方法は、薬剤送達ビヒクル、特にリポソーム中への被包、レトロウイルスベクターによる形質導入、及びコレステロールとの接合を含む。
【００３３】
薬剤送達ビヒクルは全身投与と局所投与の両方に有効である。それらは徐放性レザバーとして働くように、あるいは内容物を直接標的細胞に送達するようにデザインすることができる。そのような特殊薬剤送達ビヒクルの一部の例は、リポソーム、ヒドロゲル、サイクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生物粘着性ミクロスフィアである。
【００３４】
リポソームが好ましい。リポソームは、細胞膜の脂質と同じように配列された脂質から成る中空球状小胞である。内部に水溶性化合物を捕捉する水性空間を持ち、サイズは直径０．０５から数ミクロンの範囲である。リポソームはＤＮＡを細胞に送達できるので、核酸は生物学的に活性なままである。
【００３５】
リポソーム形成の技術において既知であるように、リポソームはジアルキル又はジアシルグリセロール又はホスファチジルコリンのようなリポソーム形成脂質とＤＮＡを混合することによって容易に調製できる。Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８，１８３−１８９（１９９２）参照。
【００３６】
本発明において有用なリポソーム製剤は次のものを含む：（ａ）分子比のポリカチオン性脂質を含むリポフェクタミン試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）、（ｂ）２：１の比率の陽イオン脂質、ＤＤＡＢ及びＤＯＰＥ、Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４，２４１１−２４１８，（１９９４）；及び（ｃ）例えば１：１のモル比で、任意にＤＯＰＥと組み合わせたＤＭＲＩＥ（ＶＩＣＡＬ  Ｃｏｒｐ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。より新しいリポソーム、例えば血清耐性陽イオン脂質ＧＳ２８８８、Ｊ．Ｇ．Ｌｅｗｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，３１７６（１９９６）やポリリシン／ＤＮＡ複合体を含むリポソーム、Ｓ．ＬｉとＬ．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，６３−７５（１９９７）も使用できる。
【００３７】
ナノ粒子やヒドロゲル担体が化学療法剤や蛋白質ベースの薬剤のために開発されたものであり、従って本発明のためのリボザイム送達に適合させうる。
【００３８】
もうひとつの送達方法はＴ細胞を通してである。適合性Ｔ細胞、好ましくは患者自身のＴ細胞を、例えばエレクトロポレーションによって本発明のリボザイムＤＮＡに感染させ、次にこれらの細胞を患者に注入する。ＤＮＡによるＴリンパ球のエレクトロポレーションはＰＣＴ出願公開第ＷＯ９６／２２６３８号（Ｇｅｎｅ  Ｓｈｅａｒｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．）の実施例６に述べられており、この方法は本発明に適用できる。
【００３９】
製薬用途のための組成物は通常、好ましくは緩衝塩化マグネシウムとしてマグネシウム塩を含み、これはリボザイムの機能に必要である。かかる組成物はまた担体あるいは希釈剤も含むことができ、それには沈殿防止剤あるいは乳化剤が含まれうる。
【００４０】
好ましくはリポソーム製剤中の本発明のベクター系は、例えば静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内あるいはクモ膜下腔内経路によって、好ましくは全身的に投与される。ベクター系によって供給されるリボザイムの用量は、適応疾患及び投与経路に依存するが、２００ｍｇ／ｋｇまで、通常は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重／日とすべきである。投与回数は疾患、送達ビヒクル及び臨床試験からの有効性データに依存するであろう。
【００４１】
下記の実施例は本発明を例示するものである。
【００４２】
実施例
１．ＣＣＲ５  ＤＮＡのクローニングと発現
ヒトＣＣＲ５  ｍＲＮＡを次のようにして健常者の血液サンプルから単離した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒ．Ｆ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ及びＮ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｐｕｂ．Ｖ．Ｃ．Ｈ．Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９３），第３巻、「Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ」、ｐ．１２１−１３５に述べられているように培養し、勾配遠心分離を用いて単離する。次に細胞を１μｇ／ｍｌのベニバナインゲンレシチン（ＰＨＡ−Ｌ，Ｓｉｇｍａ）で２４時間刺激した。刺激した細胞を４ＭグアニジニウムチオシアネートとＳＤＳ溶液で処理し、その後酸−フェノール分離及びイソプロパノール沈殿法に供した。これらはすべて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，第２版、１９８９に述べられている手順に従った。次に標準的な手順によってオリゴｄＴ（１６−１８塩基）と逆転写酵素でｃＤＮＡを作製した。Ｍ．Ｓａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，３３６２−３３６７（１９９６）に開示されているＤＮＡ配列に基づいてデザインしたプライマーでＰＣＲを実施した。すなわち、正プライマーの配列は
5’-tgcacagggt ggaacaagat gg-3’(配列番号:3)
であり、逆プライマーの配列は
5’-cacttgagtc cgtgtcacaa gc-3’(配列番号:4)
である。
【００４３】
３’末端に（アデノシン）突出末端を与えるＴａｑポリメラーゼを使用した。次にＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ．から市販されている５．４Ｋｂプラスミド、ｐｃＤＮＡ３（図７参照）にＥｃｏＲＶ制限部位でクローニングした。その後、ベクター中に「ｔａクローニング」部位を生じるように、ｔ（チミジン）ヌクレオチドをベクターのＥｃｏＲＶ制限部位の３’末端に付加した。「ｔａクローニング」は、Ｊ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，９６７７―９６８６（１９８８）、米国特許第５，４８７，９９３号及びＷｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏ４２．ｈｔｍに記述されている。次にプラスミドを大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅにトランスフェクトし、スクリーニングした。ＣＣＲ５  ＤＮＡインサートを完全に塩基配列決定し、公表されているＣＣＲ５  ＤＮＡ配列と同一であることを認めた。図７に示すように、ｐｃＤＮＡ３はマルチクローニングサイトの前にＴ７プロモーターを含む。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｔｄ．の「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ」に述べられているように「Ｒｉｂｏｍａｘ」溶液にＴ７ポリメラーゼを加えることによりＣＣＲ５  ｍＲＮＡ転写産物を生成した。
【００４４】
２．ＣＣＲ５リボザイムＤＮＡカセット
図３により詳細に示す、配列番号：５のヌクレオチド配列を有する完全なリボザイムＤＮＡカセットを構築した：
【００４５】
【表１】
0004312957.tif 000002
これは、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いてコード配列の１−８０位からの正オリゴマーと１３７−５６位からの逆オリゴマーから作製した。オリゴマーの３’末端の２５塩基は互いに全面的に相補的であり、２本の鎖をアニールした。完全な二本鎖になるようにＰＣＲ装置でＤＮＡポリメラーゼによる延長を行った。５’末端と３’末端にそれぞれＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位を使用して１３７の長さの二本鎖ＤＮＡカセットをｐＵＣ１９にクローニングした（図３参照）。ＤＮＡ塩基配列決定によってその配列を確認した。市販のｐＵＣ１９がＴ７プロモーターを含まないときに、カセットはこの部位を含む。
【００４６】
図３及び１を参照して、カセットは順に（５’から３’）次のものを含む：
【００４７】
【表２】
0004312957.tif 000003
【００４８】
リボザイムＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａの「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ」マニュアルに述べられているように「Ｒｉｂｏｍａｘ」溶液にＴ７ポリメラーゼを加えて作製した。「Ｒｉｂｏｍａｘ」はリボザイム活性に必要なマグネシウムイオンを含む平衡塩類溶液である。Ｔ７ポリメラーゼはＴ７プロモーターがＤＮＡからＲＮＡを転写する引き金になる。ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを使用し、次いでＲＮＡの酸／フェノール単離、さらにエタノール沈殿によって転写産物を単離した。これは上記に引用した「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に述べられているように実施した。
【００４９】
ＲＮＡをアガロースゲル上におくと、開裂前のリボザイム（１０３塩基）は開裂後のリボザイム（４８塩基、図１）から明瞭に分離された。ＲＮＡはゲルに含まれる臭化エチジウムによって示した（ＵＶ光の下で視覚化した）。
【００５０】
３．ヒトＣＣＲ５標的開裂
上記の第１項で述べたように調製し、ｐｃＤＮＡ３にクローニングしたヒトＣＣＲ５  ＤＮＡを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（上記に引用した「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」）にトランスフェクトしてＣＣＲ５のＲＮＡ転写産物を生成した。
【００５１】
上記の第２項で述べたプラスミドから転写したリボザイムを、リボザイム１モル対ＣＣＲ５  ＲＮＡ転写産物１０モルのモル比でＣＣＲ５  ＲＮＡ転写産物と共にインキュベートした。３７℃でインキュベートして３時間以内にＣＣＲ５  ｍＲＮＡ標的の完全な開裂が達成された。臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上にＲＮＡをおいた。ＵＶ照射下で撮影したゲル写真を図５ａと５ｂに示す。図５ａの左側のレーンは１時間のインキュベーション後の産物を示しており、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡは完全には開裂されておらず、上部の高分子量のバンドとして発現した。右側のレーンは分子量マーカから成る。左側のレーンには、（分子量の高いものから順に）開裂後のＣＣＲ５  ｍＲＮＡの３’断片、開裂後のＣＣＲ５  ｍＲＮＡの５’断片及びリボザイムＲＮＡに帰せられる低分子量のバンドも存在した。従って、ｒｚｓｃｃｒ５リボザイムが自己開裂して、ＣＣＲ５を触媒的に開裂する活性リボザイムを産生することは明らかである。図５ｂを参照すると、右側のレーンは、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡが完全に開裂した、３時間のインキュベーション後の産物を示している。図５ａ中の開裂していないｍＲＮＡを示すバンドは消失しており、より低い分子量の開裂した産物の３’末端に対応するバンドに置き代わっていた。ＣＣＲ５  ｍＲＮＡの５’末端を含む断片は、図５ａよりもさらに低い分子量で認められる。ＣＣＲ５リボザイムを含む可視のバンドは存在しない。これは、図５ａで使用したものより１０倍希薄なサンプルをゲルに充填したためである。
【００５２】
４．プラスミドのＰＢＭＣへのトランスフェクション
プラスミドを血液銀行から入手した健常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にトランスフェクトした。細胞を単離し、Ｓ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３３０−３４２（１９９４）の標準的な手順を用いてＰＨＡ−ＬとＩＬ−２で刺激した。６日後、次のようにしてＧｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．のものから適合させた手順で細胞を処理した。リポソーム形成製剤、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）１２μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地０．５ｍｌと混合した。プラスミド２０μｌ又は２００μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地０．５ｍｌ中で混合物に加え、十分に混合した。次に溶液を室温で４５分間放置したあと、４百万個の細胞を含むＰＢＭＣ懸濁液０．２ｍｌを加えた。１／４の培養上清と３／４のＲＰＭＩで細胞懸濁液を調製し、ＩＬ−２を加えて１０Ｕ／ｍｌにした。最終混合物を５％ＣＯ２と共に３７℃で４〜５時間インキュベートした。その後、分割量の混合物を培地に加えることによって細胞を標準培地（ＲＰＭＩ６４０、ＩＬ−２  １０Ｕ／ｍｌ及び１０％ウシ胎児血清）に懸濁した。この時点での生存度はトリパンブルー染色によって９０％以上であった。次に細胞を通常の方法で分析用に培養した。
【００５３】
上記の手順を最初に、マウスモロニー白血病ウイルスプロモーター及びリポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む９．８Ｋｂプラスミドを使用して実施した。トランスフェクション後８日目に、内因性β−ガラクトシダーゼの阻害（Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）後、β−ガラクトシダーゼ産物をＦＡＣＳ−ＦＤＧ染色によって分析した。パーセンテージとしての細胞数を縦軸に、蛍光の強さを横軸にとった図６ａと６ｂに示すように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の明らかなシフトが存在し、これはプラスミドのヒトＰＢＭＣへのトランスフェクションが成功したことを示唆している。
【００５４】
第９項に示すように、リボザイムＤＮＡを担う本発明のプラスミドを使用して、わずかな変更を加えてこの手順を実施することができる。
【００５５】
５．ＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡ
ヒトＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡを、上記の第１項におけるようにヒトＣＣＲ５リボザイムＤＮＡと同様にして調製した。ＣＸＣＲ４  ＤＮＡ配列はＢ．Ｆｅｄｅｒｓｐｐｉｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６，７０７−７１２（１９９３）に開示されている。正プライマーの配列は
【００５６】
【表３】
0004312957.tif 000004
（配列番号：６）
であり、逆プライマーの配列は
【００５７】
【表４】
0004312957.tif 000005
（配列番号：７）
であった。
【００５８】
図１２により詳しく示すように、配列番号：８のヌクレオチド配列を持つリボザイムＤＮＡカセットを構築した：
【００５９】
【表５】
0004312957.tif 000006
【００６０】
図１２を参照すると、カセットは順に（５’から３’）次のものを含む：
【００６１】
【表６】
0004312957.tif 000007
【００６２】
６．ポリメラーゼベクターの構築
図１８を参照すると、ポリメラーゼベクターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーターとＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含む。完全なＴ７ポリメラーゼＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬから受託番号Ｍ．３８３０８の下に入手可能である。本実施例では、改変したＴ７ポリメラーゼＤＮＡを入手し、プラスミドｐＴ７Ａｕｔｏｌ［Ｊ．ＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆとＦ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，６１−６８（１９９１）］でＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに使用したプライマーは、正プライマーの５’末端にＥｃｏＲＩとＮｃｏＩ制限部位、逆プライマーの５’末端にＢａｍＨＩ制限部位が組み込まれていた（ＢａｍＨＩは後程自己ポリメラーゼベクターのクローニングのために使用した）。プライマーの配列は次の通りであり、重複Ｔ７ポリメラーゼに下線を付している。
【００６３】
正プライマー：
5’acgaattccatggacacgattaacatcg3’(配列番号:9)
EcoRI部位=gaattc;NcoI部位=ccatgg
逆プライマー：
5’atataaggatccttacgcgaacgcgaac3’(配列番号:10)
BamHI部位=ggatcc
Ｖｅｎｔポリメラーゼ（これはＰＣＲ産物において「平滑末端」を提供した）を使用してＰＣＲを実施した。正プライマーによって導入されるＮｃｏＩ部位はクローニング外の部位であり、Ｔ７ポリメラーゼの第二コドン、ＡｓｎからのＤＮＡ（ａａｃ）をＡｓｐ（ｇａｃ）に変更することによって生成した。これはＴ７ポリメラーゼの活性を変化させない。
【００６４】
Ｔ７ポリメラーゼのＰＣＲ産物をｐＣＳ２−ＮＬＳプラスミド（［Ｒ．Ａ．Ｗ．Ｒｕｐｐら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ８，１３１１−１３２３（１９９４）及びＤ．Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ  ＆  Ｈ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、同上、１４３４−１４４７］にクローニングした。図８はプラスミドｐＣＳ２−ＮＬＳのマップである。Ｔ７ポリメラーゼＤＮＡをＣＳ２のＥｃｏＲＩ部位及びＳｎａＢ１（平滑末端）部位に導入し、時計回り方向でＮＬＳのすぐあとに位置付けた。ｐＣＳ２中のＮＬＳ配列はこの段階では本発明の目的に必要なく、ＮＬＳ配列は２つのＮｃｏＩ部位の間に位置しているので、制限酵素ＮｃｏＩで切断することによって削除した。次にＮｃｏＩ部位を通して再びプラスミドを連結した。図９はこれらの操作を説明している。図１８に示すようにポリメラーゼプラスミドベクターが完成した。かかるベクターはＣＭＶプロモーター（ＣＳ２ベクター中に既に存在する）を含み、これがＴ７ポリメラーゼの産生を開始させた。Ｔ７ポリメラーゼはリボザイムＤＮＡベクター及び下記に詳述する自己ポリメラーゼベクターに必要である。
【００６５】
７．自己ポリメラーゼベクターの構築
このベクターの目的は、Ｔ７ポリメラーゼを安定且つ適切に供給することである。Ｔ７プロモーターを使用してＴ７ポリメラーゼの産生を開始させた。このポリメラーゼは、より多くのＴ７ポリメラーゼを産生する、より多くのＴ７プロモーターを生成するように自己触媒的に作用した（図１８）。
【００６６】
哺乳類の細胞質に非哺乳類プロモーターを通してトランスフェクトしたベクターによって作製したｍＲＮＡは通常、蛋白への翻訳に関して細胞によって認識されない。細胞に、プロモーターによって転写されたＴ７ポリメラーゼｍＲＮＡを翻訳させるために、脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスのＵＴＲ（非翻訳領域）配列（Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，９１−９２（１９９０）を付加した。この配列はリボソームのための結合部位を提供する翻訳エンハンサーとして働き、ｐＴＭ１ベクターからＥＭＣ  ＵＴＲをＰＣＲ増幅することによって得た。Ｂ．Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，９１−９２（１９９０）参照。プライマーは正鎖にＸｂａＩ制限部位を含んだ。このベクターから得られるＥＭＣ配列はＢａｍＨＩやＮｃｏＩのようないくつかの構築された制限部位を含むため、逆プライマーには制限部位を導入しなかった。プライマーは次の通りであり、重複ＥＭＣ配列に下線を付している：
正プライマー：
5’gctctagaccacaacggtttccctctag3’(配列番号:11)
XbaI部位=tctaga、
逆プライマー：
5’cagcttcctttcgggctttgttagcagc3’(配列番号:12)
次にＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位を使用してＥＭＣ配列をｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）にクローニングした。マップについては、例えばＲ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄの１９９６／９７カタログ、ｐ．７４参照。ＥＭＣ  ＵＴＲ配列は、天然でその３’末端に、ＢａｍＨＩ部位の前にＮｃｏＩ制限部位を含んでいた。従って、第６項で上述したように、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位を含むＴ７ポリメラーゼ配列は、Ｘ．Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，２１１４−２１２０（１９９４）が述べているように、ＥＭＣ  ＵＴＲ配列の下流でプラスミドに容易にクローニングされた。
【００６７】
８．リボザイムベクターの構築
完全なリボザイムＤＮＡとＴ７プロモーターを含むカセットを周知のプラスミドｐＵＣ１９にクローニングした。ひと組の実験については、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位を使用してヒトＣＣＲ５リボザイムＤＮＡをプラスミドにクローニングした。もうひと組みの実験に関しては、ＣＸＣＲ４カセットをＣＣＲ５カセットの直前で同じプラスミドにクローニングした。これはＰｓｔＩ及びＸｂａＩ制限酵素を用いて実施した。ＣＸＣＲ４カセットはその５’末端近くにＰｓｔＩ部位を持ち、３’末端の近くにＸｂａＩ部位を持つ（図１２）。ＸｂａＩによる制限は、ＣＸＣＲ４カセットの３’末端をＣＣＲ５カセットの５’末端近くのＸｂａＩ部位に直接連結する（図３）。生じるプラスミドは、図１８に示す「リボザイムベクター」に適合する。
【００６８】
９．ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４  ＲＮＡの強力な阻害を示す、ヒト末梢血単核細胞におけるベクターの発現
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を第１項で述べたように単離し、培養した。図１８に示すように、３種類のベクター、すなわちポリメラーゼ、自己ポリメラーゼ及びリボザイムＤＮＡのいくつかをトランスフェクションのために等しい割合で付加した。次の３種類の実験を実施した：（１）３つのベクター全部を付加する、（２）ポリメラーゼベクターとリボザイムＤＮＡベクターだけを付加する、及び（３）ポリメラーゼベクターだけを付加する。
【００６９】
ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬を供給するＧｉｂｃｏ  Ｌｔｄ．が述べているようにトランスフェクションを実施した。ＤＭＲＩＥ−Ｃ  ８μｌをＯｐｔｉｃ−ＭＥＭ１ｍｌ中４μｇと混合したあと、Ｇｉｂｃｏの指示に述べられているようにしてトランスフェクションのために２×１０６細胞を加えた。次に細胞を１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）とＩＬ−２  １０Ｕ／ｍｌで４８時間刺激したあと（最終容量、３ｍｌ）、分析のために採集した。最初のセットの実験では、ＣＣＲ５リボザイムＤＮＡだけを含むリボザイムＤＮＡプラスミドを使用した。２番目のセットの実験では、単一プラスミド中にＣＸＣＲ４とＣＣＲ５リボザイムＤＮＡの両方を含むプラスミドでＰＢＭＣをトランスフェクトした（図１８、上記第８項）。
【００７０】
第１項で述べたようにトランスフェクトした細胞からＲＮＡを単離し、ＰＣＲを実施して、上述したＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４プライマーを用いて細胞ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを同定した。また、細胞は天然でアクチンを発現するので、アクチンのｍＲＮＡの量は定量的対照となる。そのような対照は、ＣＣＲ５及び／あるいはＣＸＣＲ４の阻害がＲＮＡの一般的な分解によるものではないことを確認する；さもなければアクチンＲＮＡも分解していたはずである。同様に、リボザイムはアクチンＲＮＡを開裂しないことから、リボザイムの作用が特異的であることも確認される。アクチンを用いるこの対照は分子生物学において広く適用されている。
【００７１】
結果を図１３ａ、１３ｂ及び１４に示しており、これらは該当するＰＣＲ産物の染色アガロースゲル写真である。図１３ａと１３ｂはそれぞれ第一セットと第二セットの実験に関するものであり、図１３ａはＣＣＲ５  ＲＮＡに対するリボザイムの作用を示し、１３ｂはＣＸＣＲ４  ＲＮＡに対する作用を示している。図１３ａと１３ｂの設定は同じで、次の通りであり、レーンは左から右に１〜８の番号を付している：
【００７２】
【表７】
0004312957.tif 000008
【００７３】
レーン１は、３つのベクター全部、すなわちポリメラーゼ、自己ポリメラーゼ及びリボザイムＤＮＡベクターでトランスフェクトしたＰＢＭＣからＣＣＲ５及びｍＲＮＡが欠失されていないことを示し、従ってＣＣＲ５  ｍＲＮＡの完全な阻害を示唆している。レーン２は、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡの弱いバンドを含み、自己ポリメラーゼベクターがない場合にはＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの阻害が不完全であることを示している。レーン３はＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡの明るいバンドを含み、リボザイムベクターがない場合にはＣＣＲ５（図１３ａ）及びＣＸＣＲ４（１３ｂ）ｍＲＮＡの阻害が全く起こらないことを示している。レーン５−７の対照は、レーン１−３と同じトランスフェクション細胞からのアクチンｍＲＮＡの明るいバンドを明瞭に示しているので、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡの阻害は特異的であった。従って、本発明によってＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４の特異的で強力な阻害が実現された。強力な阻害は自己ポリメラーゼベクターを必要としたが、当業者は、リボザイム産生を等しい又はそれ以上のレベルまで高める代替方法を考案することができるであろう。これは、例えば単数又は複数のベクター中のリボザイムＤＮＡ配列の多重コピーを使用してリボザイムの濃度を高めることによって、及び／あるいはプロモーターの量及び／あるいは効率を高めることによって実施できる。
【００７４】
本文中で述べるＴ７関連の作業はすべて、ｐＬｙｓＳゲル精製を含めてＮｏｖａｇｅｎ  Ｌｔｄ．によるプロトコールの推奨に従った。残りの部分は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、１９８９年版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｚｃｈとＭａｎｉａｔｉｓの中のプロトコールに従った。
【００７５】
上述したように、ＣＸＣＲ４リボザイムＤＮＡを含むリボザイムＤＮＡベクターは、同時にＣＣＲ５リボザイムＤＮＡも含む。このベクターで処理したＰＢＭＣからのＣＣＲ５のｍＲＮＡレベルをモニターし、結果を表１４に示している。図１４を参照すると、レーンを右から左に番号付けている。レーン１は分子量マーカーであり、大きな明るいバンドを含むレーン２は、リボザイムを含まない対照ベクターＣＳ２で処理したＰＢＭＣである。レーン３はポリメラーゼとリボザイムＤＮＡベクターだけで処理したＰＢＭＣを示し、レーン４はポリメラーゼ、自己ポリメラーゼ及びリボザイムＤＮＡベクターで処理したＰＢＭＣを示す。ＣＣＲ５バンドの消失が示すように、完全な開裂が認められる。このことはまた、自己開裂リボザイムが同じベクターから多数のリボザイムを精製できることの明瞭な証拠を提供した。
【００７６】
１０．リボザイムによる処理後のＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４蛋白質分子のＰＢＭＣ細胞発現ヘの影響
第９項で述べたようなトランスフェクションに続いて、個々のドナーからのヒトＰＢＭＣ（プールされていない）を第４項で述べたようにＰＨＡ−ＬとＩＬ−２で刺激するか、又はＭａｓｓｅｙｅｆｆらが「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（ｐｕｂ．ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９３））の中で述べているように、ＵＣＨＴ−１と呼ばれるＣＤ３に対するモノクローナル抗体（Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫより入手可能）と１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で刺激した。３、５、７、１０、１２日目に、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体あるいはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  Ｌｔｄ．から市販されている蛍光物質と直接結合した対照抗体で細胞を染色した。染色の手順は同社からの指示に従った。第４項におけるようにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌｔｄ．）を使用してデータを解析した。結果を下記ならびに図１６ａ、１６ｂ（ＣＣＲ５）及び１７ａ、１７ｂ（ＣＸＣＲ４）に要約する。これらの図は第４項で言及した図６ａ及び６ｂと同様である。これらの図は細胞群の左側への明瞭なシフトを示しており、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４の発現低下を示唆している。
【００７７】
異なる各個人によって異なる日に最大抑制が認められた。平均すると、ＣＣＲ５リボザイムはＣＣＲ５発現の７８％を抑制した。ＣＸＣＲ４リボザイム（同時にＣＣＲ５リボザイムも含む）はＣＸＣＲ４の発現を６９％抑制し、ＣＣＲ５の発現を７９％抑制した。
【００７８】
１１．リボザイムで処理したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＩＶ感染の抑制
第９項で述べたようなトランスフェクションに続いて、第４項で述べたように細胞をＰＨＡ−ＬとＩＬ−２で刺激した。これらの細胞を５日目にペレット化したあと、ＭＲＣ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，ＵＫ）から入手できるＬＡＩと呼ばれるＨＩＶ株１００μｌと共にインキュベートした。これは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｔｄ．から供給されているサンドイッチＥＬＩＳＡで定量したとき、ｐ２４  ＨＩＶ表面抗原蛋白質３０００ｐｇを含有した。（これは患者の血液中のウイルスの量を調べるために臨床で使用されるのと同じアッセイである。）次に混合物を５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。懸濁液をＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｔｄ．）で３回洗浄し、２００ｇで遠心分離にかけた。その後百万個の細胞を、前に述べたように、１０％ウシ胎児血清と１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地４ｍｌに懸濁した。３、４日後にＩＬ−２を１００ｍｌとなる様に加えた。培養上清を感染後７日目に採集した。上述したようなサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ウイルス量の直接の指標を示すｐ２４の量を測定した。ＥＬＩＳＡの標準曲線の信頼検量区間内のｐｇ／ｍｌのデータを得るため、アッセイ用に培養上清を１：１００及び１：５００に希釈した。結果は次の通りである。
【００７９】
【表８】
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【００８０】
上記のデータは、すべてのＨＩＶ感染性がリボザイムベクター系での処理によって抑制されたことを明らかに示している。
【００８１】
既知の物質、配列及び手順を参照するために本文中で引用したこれまでの参考文献はすべて、言及されている物質、配列及び手順を説明する範囲まで、参照して明白にここに組み込まれる。
【００８２】
配列リストのフリーテキスト
配列リストのための「人工的」とみなされる配列は、次のような識別子＜２２３＞の下でのフリーテキストを含む：
【００８３】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＣＣＲ５に関する本発明の標的開裂リボザイム配列の概要図である。
【図２】  図２は、それぞれＣＣＲ５とＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的とするための二重ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡを提供する、３’自己触媒的配列に連結された標的開裂リボザイムＤＮＡ配列の概要図である。
【図３】  図３は、Ｔ７プロモーターによって推進される、図２及び１１のリボザイムＤＮＡを含むカセットのＤＮＡ配列を示す。
【図４】  図４ａ及び４ｂは、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ標的に関連して、本発明において使用する標的開裂リボザイム配列の概要図である。
【図５】  図５ａ及び５ｂは、ヒトＣＣＲ５  ｍＲＮＡを含み、本発明のベクター系によって提供されるリボザイムＤＮＡ配列に対応するリボザイムと共にインキュベートした、臭化エチジウムによるアガロースゲルの写真である；これらの写真は、１時間のインキュベーション後（図５ａ）及び３時間のインキュベーション後（図５ｂ）にどの程度ＣＣＲ５  ＲＮＡが開裂されたかを示している。
【図６】  図６ａと６ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６ａ）とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミドを含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５  ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的とするリボザイムを含む本発明のプラスミドベクター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ（ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β−ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、１５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。
【図７】  図７は、ＣＣＲ５  ｃＤＮＡのクローニングにおいて使用するプラスミドｐｃＤＮＡ３のマップである。
【図８】  図８は、Ｔ７ポリメラーゼＤＮＡのクローニングのために使用するプラスミドｐＣＳ２＋ＮＬＳの概要図である。
【図９】  図９は、図８のプラスミドｐＣＳ２＋ＮＬＳにおいてＴ７ポリメラーゼをクローニングするために必要な操作のある程度の詳細を図式的に示している。
【図１０】  図１０は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）からのインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含むプラスミドｐＴＭ１の概要図である。
【図１１】  図１１は、それぞれＣＣＲ５とＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的するための二重ハンマーヘッドリボザイムＤＮＡを提供する、３’自己触媒的配列に連結された標的開裂リボザイムＤＮＡ配列の概要図である。
【図１２】  図１２は、Ｔ７プロモーターによって推進される、図２及び１１のリボザイムＤＮＡを含むカセットのＤＮＡ配列を示す。
【図１３】  図１３ａ、１３ｂは、本発明のリボザイムでトランスフェクトしたヒト末梢血単核細胞から転写したＲＮＡの断片を含むアガロースゲルの写真である；
【図１４】  図１４は、本発明のリボザイムでトランスフェクトしたヒト末梢血単核細胞から転写したＲＮＡの断片を含むアガロースゲルの写真である。
【図１５】  図１５ａと１５ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６ａ）とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミドを含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５  ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的するリボザイムを含む本発明のプラスミドベクター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ（ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β−ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、１５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。
【図１６】  図１６ａと１６ｂは、トランスフェクトしていない細胞（６ａ、１５ａ、１６ａ）とβ−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子を発現するプラスミドを含むリポソーム製剤（６ｂ）あるいはＣＣＲ５  ｍＲＮＡ（１５ｂ）又はＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ（１６ｂ）を標的するリボザイムを含む本発明のプラスミドベクター系でトランスフェクトした細胞（６ｂ、１５ｂ、１６ｂ）の蛍光の強さ（ｘ軸）に対して細胞数（ｙ軸）をプロットしたものである；蛍光の強さは、β−ガラクトシダーゼのレベル（６ａ、６ｂ）、ＣＣＲ５蛋白質の発現（１５ａ、１５ｂ）及びＣＸＣＲ４蛋白質の発現（１６ａ、１６ｂ）を示唆する。
【図１７】  図１７は、本発明の２つのプラスミドベクター系の概要図であり、最初のプラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのＲＮＡの転写を推進するＣＭＶプロモーターを含み、２番目はタンデム中の３個のリボザイムＤＮＡからのＲＮＡの転写を推進するＴ７プロモーターを含む。
【図１８】  図１８は、本発明の３つのプラスミドベクター系を示す概要図であり、最初のプラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのｍＲＮＡの転写を推進するＣＭＶプロモーターを含み、２番目のプラスミドはＴ７ポリメラーゼ遺伝子からのｍＲＮＡの転写を推進するＴ７プロモーターを含み、さらに３番目のプラスミドはＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４  ＲＮＡ又はその両方を標的するリボザイムＤＮＡからのＲＮＡの転写を推進するＴ７プロモーターを含む。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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