(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンに吸着し得るアプタマーであって、下記(a) または(b) の塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖ＤＮＡ分子。
(a) 配列表配列番号１４に示される塩基配列中塩基番号２３〜８３で示される塩基配列
(b) 配列表配列番号１５に示される塩基配列中塩基番号２３〜８３で示される塩基配列
【請求項２】
前記(b)の塩基配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はキチンおよびキチンオリゴ糖を特異的に認識して吸着し得る一本鎖核酸アプタマー、特にＤＮＡアプタマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞表面オリゴ糖は、細胞接着、分子認識および炎症応答等の様々な生命現象において必要不可欠な役割を担っている。例えば、キトビオースやキトトリオース等のキチンオリゴ糖は、免疫亢進活性、抗腫瘍活性、植物に対するエリシター活性等の種々の生理活性を有することが知られている。このような細胞表面オリゴ糖の生理機能に関する研究の道具として、あるいは細胞表面オリゴ糖が関与する疾患の臨床診断および治療のための道具として、異なるオリゴ糖を選択的に認識することができる高アフィニティーリガンドの開発は非常に重要である。
【０００３】
近年、進化分子工学の発達により、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする技術（"systematic evolution of ligands by exponential enrichment" ；ＳＥＬＥＸあるいはin vitro selection）が開発された。この方法を用いた、抗体よりも迅速且つ容易な高アフィニティーリガンドの調製が数多く報告されている（例えば、Nature, 355: 564 (1992) 、国際特許出願WO92/14843号公報、特開平8-252100号公報、特開平9-216895号公報等）。糖を認識するアプタマーとしては、これまでにセロビオースのＤＮＡアプタマーが報告されている。
【０００４】
しかしながら、糖の認識においては、結合様式が水素結合に限られることもあって、解離定数の小さいアプタマーを取得することは一般的に困難であるとされており、他の糖類については未だそれを選択的に認識し得る高アフィニティーアプタマーを取得するには至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、特定の糖類、特にキチンおよびその構成単位であるキチンオリゴ糖を標的分子として認識することができる新規アプタマーを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、配列中にグアニン含有量が豊富な領域を少なくとも１つ含み、且つ該領域の各々の前後に、該領域をループ部分としてヘアピン構造を形成し得るような、逆向きに相補的な配列を含む一本鎖核酸分子が、キチンを特異的に認識し得るアプタマーとして機能することを見出した。さらに、それらとは異なる配列的特徴を有する別のキチン特異的アプタマーのスクリーニングにも成功して本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．キチンに吸着し得るアプタマーであって、以下の配列的特徴を有する一本鎖核酸分子。
(a) グアニンが４０％以上を占める５〜１５塩基からなるグアニンリッチクラスター部分を少なくとも１つ含む
(b) 該グアニンリッチクラスター部分の各々の前後に、ヘアピン構造を形成し得る逆向きに相補的な配列の対を含む（但し、該配列対は１または数塩基のミスマッチを含んでもよい）
２．核酸がＤＮＡである上記１の核酸分子。
３．逆向きに相補的な配列の対が３〜６塩基対からなる上記１または２の核酸分子。
４．全長が約３０〜約１２０塩基からなる上記１〜３のいずれかの核酸分子。
５．少なくとも１つのグアニンリッチクラスター部分の塩基配列が、配列表配列番号１〜６に示される塩基配列、NGGGGGGNおよびGGNGGGGNからなる群より選択されるものである上記１〜４のいずれかの核酸分子。
６．キチンに吸着し得るアプタマーであって、下記(a) 〜(c) のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
(a) 配列表配列番号１３に示される塩基配列中塩基番号２３〜７５で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである）
(b) 配列表配列番号１６に示される塩基配列中塩基番号２３〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである）
(c) 上記(a) または(b) の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸分子はキチンに特異的に吸着し得るアプタマーである。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンが（１→４）結合したホモ多糖であり、軟体動物、甲殻類、昆虫類、菌類等に多く含まれるセルロース様高分子化合物である。本発明の核酸分子はまた、キチンの構成単位であるキチンオリゴ糖（例えば、キトビオース、キトトリオース等）にも特異的に吸着し得る。
【０００９】
本発明のアプタマーは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは約３０〜約１２０塩基である。
【００１０】
本発明のアプタマーは、配列中にグアニンリッチクラスター部分を少なくとも１つ、好ましくは１〜３つ含む。本発明において、「グアニンリッチクラスター部分」とは、５〜１５塩基からなり且つグアニン含量が４０％以上を占める部分を意味する。好ましくは、本発明のアプタマーは、少なくとも１つのグアニンリッチクラスター部分が、以下に示すいずれかの塩基配列からなるものである。
GGNNGNGNGG    （配列番号１）        NGGGGGGN
GGNGGGGN                            NGNGGGNGGNGN  （配列番号４）
NNGGNNGGGN    （配列番号２）        NGNGNGGGGN    （配列番号５）
GGNGGGGNGNGN  （配列番号３）        NGGGGGGGGGNG  （配列番号６）
【００１１】
さらに、本発明のアプタマーは、上記グアニンリッチクラスター部分の各々の前後に、ヘアピン構造を形成し得る逆向きに相補的な配列の対、好ましくは３〜６塩基対からなる配列の対を含む。ここで「逆向きに相補的な配列の対」とは、一方の配列を逆の方向（３’→５’）から見ると、他方の配列（５’→３’）の相補配列になるような配列の組（例えば、5' ATCG---CGAT 3' ）を意味する。そのような配列の対は、適当なアニーリング条件下でハイブリダイズし、それらに挟まれたグアニンリッチクラスター部分をループとしてヘアピン構造をとることができる。したがって、該配列対は、そのようなヘアピンループを形成し得る限り必ずしも完全相補的（すなわち１００％マッチング）である必要はなく、１または数塩基のミスマッチを含んでもよい。
【００１２】
好ましい実施態様においては、本発明のアプタマーは、配列表配列番号１０に示される塩基配列中塩基番号２３〜８３で示される塩基配列、配列表配列番号１１に示される塩基配列中塩基番号２３〜７６で示される塩基配列、配列表配列番号１２に示される塩基配列中塩基番号２３〜８１で示される塩基配列、配列表配列番号１４に示される塩基配列中塩基番号２３〜８３で示される塩基配列および配列表配列番号１５に示される塩基配列中塩基番号２３〜８３で示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである）を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」とは、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、あるいは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つキチン特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味する。
【００１３】
本発明はまた、上記アプタマーとは異なる配列的特徴を有するキチン特異的なアプタマーを提供する。このようなアプタマーは、例えば、配列表配列番号１３に示される塩基配列中塩基番号２３〜７５で示される塩基配列または配列表配列番号１６に示される塩基配列中塩基番号２３〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである）を実質的に含むものである。
【００１４】
本発明のアプタマーはいかなる方法によっても調製することができるが、好ましくは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、チキンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、キチンに吸着する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これをＰＣＲ法を用いて増幅し、再度アフィニティーカラムで分離するという選抜プロセスを繰り返し実施する方法（in vitro selection法）が例示される。以下に、本発明におけるin vitro selection法の好ましい態様をさらに詳細に説明する。
【００１５】
まず、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って約３０〜約８０塩基の予め決められた長さのランダム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮｔという場合もある）のライブラリーを作製する。該ライブラリーは１０13〜１０14種類もしくはそれ以上のｓｓＮｔを含んでいることが好ましい。以下の選抜プロセスにおけるＰＣＲ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアンチセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設計することが好ましい（ここで「センス」および「アンチセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよびその相補鎖を増幅するためのプライマーである）。このようなプライミング部位は、それぞれ約１５〜約３０塩基で、それらに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一般的条件を満たすように設計することが望ましい。さらに、選抜後のアプタマーを適当なベクターにサブクローニングする必要がある場合、当該クローニングを容易にするために、該プライミング部位は適当な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしながら、後述のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オリゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプタマーの塩基配列を決定することができる。
【００１６】
得られたｓｓＮｔライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、常法に従ってＰＣＲを実施することにより、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔという場合もある）を増幅することができる。
【００１７】
本発明のアプタマーは、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子であるという構造的・配列的特徴に基づいてキチンへの吸着能を有するものであるから、キチンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖の状態で存在しなければならない。そのため、上記ＰＣＲにより増幅されたｄｓＮｔライブラリーについてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行い、センス鎖（すなわち、元のｓｓＮｔ）のみが増幅されたｓｓＮｔのプールを調製する。あるいは、上記ＰＣＲにおいてセンスプライマーをアンチセンスプライマーに対して大過剰（例えば５０〜１００：１程度）に加えることにより、センス鎖のみが増幅されたｓｓＮｔプールを調製することもできる。
【００１８】
非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製することができる。所望により、電気泳動に先立ってＰＣＲ産物をエタノール沈澱して濃縮することもできる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニティーカラムクロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次構造を形成させる。
【００１９】
アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、ビーズなどのキチン固相を充填したカラムに、上記のように調製されたｓｓＮｔをアプライし、非吸着画分および高塩濃度緩衝液で溶出する画分を分離除去した後、低塩濃度緩衝液、あるいは好ましくは水を用いて、吸着画分を溶出させることにより行う。
【００２０】
回収されたキチン吸着画分について、上記のＰＣＲ増幅、非対称ＰＣＲおよびキチンカラムアフィニティークロマトグラフィーのサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜１０回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得ることができる。
【００２１】
得られたアプタマーは、常法に従って二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限酵素認識部位を用いて、または平滑末端化して、あるいはＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクローニングすることができ、マキサム・ギルバート法またはジデオキシ法によりその塩基配列を決定することができる。あるいは、得られた一本鎖アプタマーをサブクローニングすることなくダイレクトにシークエンスすることもできる。
【００２２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２３】
実施例１  増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの作製
（１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）およびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成した。
鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N59-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3' （配列番号７）
Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3' （配列番号８）
Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG                    （配列番号９）
（２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
蒸留水                    ７３．５μｌ
１０×ＰＣＲバッファー*   １０    μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ        １    μｌ
１０μＭ  Ｐ１プライマー    ５    μｌ
１０μＭ  Ｐ２プライマー    ５    μｌ
１μｇ／ｍｌ  鋳型ＤＮＡ    ５    μｌ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ    ０．５μｌ（２．５単位）
* １０×ＰＣＲバッファー組成
２５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液
５００ｍＭ  ＫＣｌ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 
１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
２．５μｌ  活性化サケ精子ＤＮＡ
反応条件
最初の変性：  ９４℃，１分
変性：        ９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒    １０サイクル
伸長：        ７２℃，１５秒
最後の伸長：  ７２℃，６分
（３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライマーに用いて非対称ＰＣＲを行った。最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
蒸留水                    ７８．５μｌ
１０×ＰＣＲバッファー    １０    μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ        １    μｌ
１０μＭ  Ｐ１プライマー    ５    μｌ
１μｇ／ｍｌ  鋳型ＤＮＡ    ５    μｌ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ    ０．５μｌ（２．５単位）
反応条件
最初の変性：  ９４℃，１分
変性：        ９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒    ４０サイクル
伸長：        ７２℃，１５秒
最後の伸長：  ７２℃，６分
ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイクロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテックスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０２５％  ＳＴＳ，０．０２５％キシレンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％  ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。
【００２４】
実施例２  アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（１）実施例１で得られたＤＮＡをエタノール沈澱させ、減圧乾燥後、蒸留水１６０μｌに溶解し、５×結合バッファー（５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１Ｍ  ＫＣｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．０））４０μｌを加えてよく混合し、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと室温まで自然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により二次構造の形成を確認した。
（２）キチンビーズ（ニュー・イングランド・ラボラトリーズ社）を８ｍｍ×５ｃｍのカラムに充填し、約２０倍量の水で洗浄、さらに２０倍量の１×結合バッファーで平衡化した（このとき出てくる液をベースラインとして用いた）。上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムにアプライした後コックを開いて溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムにアプライした。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分間放置した。１×結合バッファー５μｌを注いでコックを開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクションをマイクロチューブに分取した。いったんコックを閉じた後、水１ｍｌを注ぎコックを開いた。溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作を３回繰り返すことによりバッファーを水で置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクションをマイクロチューブに分取した。該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれにグリコーゲン２μｌを加えた後、エタノール沈澱させ、減圧乾燥した。該沈澱を水１５μｌによく溶解した。
【００２５】
実施例３  キチン特異的ＤＮＡアプタマーの同定
実施例１の（２）〜実施例２の各操作を８回繰り返して行った。該操作により選抜された７種のキチン特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定した。これらのランダム領域の塩基配列を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0004234250.tif 000002
【００２７】
得られたアプタマーのうち、５つのクローンＣｈｉ＃１，Ｃｈｉ＃２３，Ｃｈｉ＃２８，Ｃｈｉ＃４６およびＣｈｉ＃５２は、１〜３個のグアニンリッチクラスター部分とその前後にヘアピン構造を形成し得る逆向きに相補的な配列の対を含んでいた。これら５つのアプタマーの予想される部分的二次構造を図１に示す。また、該二次構造において形成されるループ部分のグアニン含有率を表２に示す。Ｃｈｉ＃４６で形成され得るバルジループを除いて、連続する配列から形成されるループはいずれもグアニン含有率が４０％以上を占めるグアニンリッチクラスターで構成されていることがわかった。
【００２８】
【表２】
0004234250.tif 000003
【００２９】
【発明の効果】
本発明のアプタマーはキチンおよびその構成単位であるキチンオリゴ糖を特異的に認識することができるので、これらの物質の検出・定量に使用することができる他、これらの物質の生理機能（例えば、免疫亢進活性、抗腫瘍活性、エリシター活性など）の研究や、これらの物質が関与する疾患や障害の診断あるいは治療等、広範な分野での応用が可能であり、極めて有用である。
【００３０】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号２：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号３：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号４：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号５：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号６：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ（Ｕ）。
キチンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー中に存在するグアニンリッチクラスター。
配列番号７：
Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ。
ＰＣＲプライミング部位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮＡ。
配列番号８：
配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号９：
配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号１０：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１１：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１２：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１３：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１４：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１５：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１６：
in vitro selectionによりスクリーニングされた、キチンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
【００３１】
【配列表】
0004234250.tif 000004
0004234250.tif 000005
0004234250.tif 000006
0004234250.tif 000007
0004234250.tif 000008
0004234250.tif 000009
0004234250.tif 000010
0004234250.tif 000011
0004234250.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】５つのキチン特異的ＤＮＡアプタマーの予測される二次構造を表す図である（Ａ：Ｃｈｉ＃１，Ｂ：Ｃｈｉ＃２３，Ｃ：Ｃｈｉ＃２８，Ｄ：Ｃｈｉ＃４６，Ｅ：Ｃｈｉ＃５２）。なお、Ｃｈｉ＃４６のloop 2〜loop 4はいわゆるバルジループであり、グアニンリッチクラスター部分ではない。
【図１】
0004234250.tif 000013