(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項２】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項３】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項４】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項５】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項６】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項７】
請求項１に記載のプライマーと請求項２に記載のプライマーのセット、請求項３に記載のプライマーと請求項４に記載のプライマーのセット、および、請求項５に記載のプライマーと請求項６に記載のプライマーのセットからなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することを特徴とするキャベツ混入判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャベツＤＮＡ検出用プライマー及び当該プライマーを用いて簡易且つ良好な精度で原料ケールまたはケール加工食品中に含まれるキャベツ混入の有無を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、種々の健康食品が上市されているが、その中に、ケール（Brassica oleracea var. acephala）を原料にした健康食品がある。ケールはキャベツ（Brassica oleracea var. capitata）の原種であるが、その栄養価の高さから葉を搾って飲料としたり粉末にしたものを水に溶かして飲用している。しかしながら、原料の状態でのケールとキャベツは、葉（特に外葉・幼葉）の形状が外観上酷似している。従って、原料ケールとして入荷した場合であっても、その中にキャベツの外葉や幼葉が混入している場合に、ケールとキャベツを肉眼で識別することは困難である。ましてや、原料を搾汁した後は、両者の判別は更に困難となる。
【０００３】
一方、ケールなど植物原料を加工した食品（青汁等）における原料の純度およびキャベツなどの他原料の混入を判定する方法はこれまで効果的な手段がなく、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等に頼らざるを得なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題を解決するためになされたものであり、キャベツ品種のＤＮＡに結合可能なオリゴヌクレオチドを見出し、当該オリゴヌクレオチドをＰＣＲにおけるプライマーとして用いることにより、原料ケールまたはケール加工食品中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、より簡易な方法で、原料ケール中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１乃至６に記載のキャベツＤＮＡ検出用プライマーを提供するものである。
【０００７】
これらはケールとキャベツの識別が可能であり、ケール加工食品の原料として入荷した中に混入したキャベツの有無や、青汁等のケール利用食品に混入したキャベツの有無を判定することを目的としたキャベツＤＮＡ検出用のプライマーとして用いることができる。
【０００８】
また、本発明は、配列番号１乃至６に記載のキャベツＤＮＡ検出用プライマーのうち２種以上を使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより、原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することができる。
【０００９】
特に、前記プライマーを用いる際、フォワード側プライマーとリバース側プライマーとの組み合わせとして、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６をセットで用いる。このフォワード側プライマーとリバース側プライマーのセットを１セットとして用いることができる。但し、より確実に結果を導くためには、少なくとも２セット用いることが必要であり、３セットのプライマーを用いてＰＣＲを行うことがより好ましい。
【００１０】
また、本発明は、配列番号１０〜１２で表されるＤＮＡ配列をプライマーとして用い、原料ケールから抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールに混入したキャベツを識別することにより、原料ケールに含まれるキャベツをケールと識別することもできる。
【００１１】
即ち、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法（Nucleic Acid Res.18, 6531-6535(1990)など）によっても、原料ケールに混入したキャベツを識別することができる。
【００１２】
これにより、市販のプライマーを用いて、後述するＳＴＳ化をすることなく、青汁等の原料ケールに混入したキャベツの有無を判定することができる。市販のプライマーとしては、例えば、Upstream primer（TaKaRa社製、Differential Display Kit）、10-mer kit A（オペロン社製）等が好適に用いられる。特に、配列番号１０〜１２で表されるＤＮＡ配列をプライマーとして用いることが好ましい。
【００１３】
【実施例等】
以下、実施例等により本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）植物体からの全ＤＮＡの抽出およびＲＡＰＤマーカーの検索
キャベツ−ケール間で多型の得られるプライマーを、ＲＡＰＤ法により検索した。まず1系統のケール（キューサイ社の契約生産者より入手）およびキャベツ(市販品を購入)それぞれの成葉からＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、44種類の10ヌクレオチド（TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer 24種[DD 0l〜DD24]（以下、「DDプライマー」と称することがある）及びオペロン社製10-merkit A 20種[OPA01〜20]) （以下、「OPAプライマー」と称することがある）を1種または2種組み合わせて(うち85通りを解析)プライマーとし、ＰＣＲ（PerkinElmer社製GeneAmp（商標）PCR System 9700）を用いて抽出したＤＮＡを増幅した。
【００１４】
ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型ＤＮＡ（150ng）、2μM DDプライマー（2.5μl）あるいは20ng/μl OPAプライマー（1.5μl）（それぞれ２種のプライマーを混合する場合は、半量ずつ）、2.5mM dNTP mix（2μl、TaKaRa社製）、10×PCR 緩衝液（100mM Tris-HCl緩衝液（pH8.3）、500mM KCl）2.5μl、25mM MgCl2（1.5μl）、5U/μl 耐熱性ポリメラーゼTaq polymerase（0.25μl、TaKaRa社製）を混合し、滅菌水を加えて全量25μlの反応液を調製した。
【００１５】
ＰＣＲ反応は、予備変性94℃/1分に続き、変性94℃/1分、アニーリング35℃/1分、伸長反応72℃/2分を45サイクル行い、72℃/3分の伸長反応で終了した。得られた増幅断片について、1.5%アガロースゲル電気泳動を行った。この結果、11通りのプライマーの組み合わせで、13のキャベツ特異的多型断片が得られた。これらのうち、明瞭なバンドとして観察された、塩基長▲１▼約1.4kb、▲２▼約0.5kb、▲３▼約1.5kbの多型断片3種を以降の解析に用いた。それらの電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図１に示す。なお、上記多型断片は、それぞれ▲１▼DD04（TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer：配列番号１０）、▲２▼DD19（TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer：配列番号１１）、▲３▼OPA06（オペロン社製10-merkit A：配列番号１２）の増幅産物である。
【００１６】
図に示すように、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＲＡＰＤ法を行うことにより、キャベツ（Ｃ）とケール（Ｋ）との間で多型が得られた。以上の結果から、上記3種のプライマーを用いたＲＡＰＤ法によりキャベツとケールを識別できる可能性が示唆された。
【００１７】
一方、その他のプライマー、例えば、図１中のOPA03(5'→3')AGTCAGCCACおよびOPA11(5'→3')CAATCGCCGTではキャベツ（Ｃ）とケール（Ｋ）との間で多型は得られず、両者を識別することはできなかった。
【００１８】
（実施例２）ＲＡＰＤ法によるケール−キャベツの識別
実施例1で得られた3種の多型断片を、それぞれ▲１▼DD0404-1400、▲２▼DD1919-500、▲３▼OPA0606-1500と命名し、これらをＲＡＰＤマーカーとしてケールとキャベツの識別を試みた。即ち、実施例1に記載の方法（ＣＴＡＢ法）により複数系統のケール及びキャベツから全ＤＮＡを抽出し、前記プライマー（▲１▼DD04、▲２▼DD19、▲３▼OPA06）を用いてＰＣＲを行い、前記3種のＲＡＰＤマーカー（▲１▼DD0404-1400、▲２▼DD1919-500、▲３▼OPA0606-1500）が検出されるか否かを観察した。なお、ＰＣＲ条件は実施例1と同様とした。
【００１９】
得られた増副産物の電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図２に示す。図から明らかなように、プライマーDD04を用いた場合、キャベツは1400bp付近で増幅バンド（DD0404-1400）が検出されたが、ケール＃1、＃3〜5では検出されなかった。また、プライマーDD19を用いた場合、キャベツは500bp付近で増幅バンド（DD1919-500）が検出されたが、ケール＃1、2および＃6、7には検出されなかった。更に、プライマーOPA06を用いた場合、キャベツは1500bp付近で増幅バンド（OPA0606-1500）が検出されたが、ケール＃1および＃5には検出されなかった。
【００２０】
一方、3種のＲＡＰＤマーカーの有無を一覧表としたＤＮＡタイピングを下記表に示す。
【００２１】
【表１】
0004226277.tif 000002
これら３種のＲＡＰＤマーカーは、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合にはすべての検体で検出された。一方、ケールＤＮＡを鋳型とした場合には系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、少なくとも２種のプライマー（DD04、DD19）の検出結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【００２２】
即ち、表１におけるケール＃1はいずれのＲＡＰＤマーカーが検出されなかったためキャベツと異なることは明らかであるが、ケール＃2はプライマーDD04を用いた場合にはＲＡＰＤマーカーDD0404-1400が検出されてしまう（キャベツと識別できない）。ところが、プライマーDD19を用いた場合、ＲＡＰＤマーカーDD1919-500は検出されないため、このケール＃2はキャベツとバンドパターンが異なることにより、キャベツと識別することができることになる。
【００２３】
（実施例３）キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーの塩基配列の決定
実施例２に記載のＲＡＰＤマーカーを、後述する実施例４でＳＴＳ（Sequence Tagged Site）化するために、それらの塩基配列を以下の要領で決定した。キャベツＤＮＡを鋳型とした際に増幅された3種のＲＡＰＤマーカー（▲１▼DD0404-1400、▲２▼DD1919-500、▲３▼OPA0606-1500）をそれぞれ電気泳動ゲルから切り出した。次いで、TaKaRa社製SUPREC（商標）-01（pore size 0.22μm）を用いてゲル中のＤＮＡを抽出し、TAクローニングによって、T4DNAリガーゼでプラスミドベクター (Promega社製pGEM（商標）−T Easy Vector)に挿入した後、大腸菌（TaKaRa社製E. coli JM109コンピテントセル）を形質転換した。
【００２４】
塩基配列の決定は、前記大腸菌を集菌し、アルカリ-SDS法（アルカリミニプレップ）およびポリエチレングリコール沈殿（PEG沈殿）によりプラスミドを回収し、回収したプラスミドを鋳型にBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit(Perkin Elmer社製)を用いたサイクルシークエンス（Cycle-Sequencing）反応を行った後、シークエンサー（PerkinElmer社製ABI PRISM（商標）Genetic Analyzer）により両端から塩基配列を決定した。
【００２５】
これらの操作の結果、キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーの塩基数は、▲１▼DD0404-1400…1437bp（配列番号７）、▲２▼DD1919-500…535bp（配列番号８）、▲３▼OPA0606-1500…1542bp（配列番号９）であることが判明した。その塩基配列を図３〜５に示す。
（実施例４）キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーのＳＴＳ（Sequence Tagged Site）化
原料ケールあるいはケール食品中に含まれるキャベツを再現性よく、更に特異的に検出するため、実施例２で得られたキャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーのＳＴＳ化(DNA res.1,139-148(1994))を行った。
【００２６】
実施例３で得られたそれぞれの塩基配列をもとに、ＧＣ含量、Ｔｍ値、二次構造などを考慮し、ＰＣＲプライマーの塩基配列を以下のように決定した（図３〜５下線部参照)。
【００２７】
【表２】
0004226277.tif 000003
ここで、上記表におけるForward-1及びReverse-1はDD040-1400に特異的なプライマーであり、図３の矢印で示したように、Forward-1はDD0404-1400における3-27番目のヌクレオチドに対応し、Reverse-1はDD0404-1400における1370-1393番目のヌクレオチドに対応する。
【００２８】
また、上記表におけるForward-2及び Reverse-2はDD1919-500に特異的なプライマーであり、図４の矢印で示したように、Forward-2はDD1919-500における19-43番目のヌクレオチドに対応し、Reverse-2はDD1919-500における466-490番目のヌクレオチドに対応する。
【００２９】
更に、上記表におけるForward-3及び Reverse-3はOPA0606-1500に特異的なプライマーであり、図５の矢印で示したように、Forward-3はOPA0606-1500における23-46番目のヌクレオチドに対応し、Reverse-3はOPA0606-1500における1492-1515番目のヌクレオチドに対応する。
【００３０】
（実施例５）ＳＴＳ化プライマーを用いたケールとキャベツの識別
実施例４に記載のＳＴＳ化プライマーをForward-1とReverse-1(以下、両者をまとめて「set1」と称する)、Forward-2とReverse-2(以下、両者をまとめて「set2」と称する)、Forward-3とReverse-3(以下、両者をまとめて「set3」と称する)で組み合わせ、これらをキャベツＤＮＡ検出用プライマーとして、ケールとキャベツの識別を行った。
【００３１】
まず、複数系統のケール（キューサイ社の契約生産者より入手）およびキャベツ(市販品を購入)の成葉からＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出し、抽出した全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（PerkinElmer社製GeneAmp（商標）ＰＣＲ System9700）を行った。
【００３２】
ＳＴＳ化プライマーを用いたＤＮＡの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型ＤＮＡ（150ng）、20μM ＳＴＳ化プライマー（Forward/Reverse それぞれ0.5μl）、2.5mM dNTP mix（4μl、TaKaRa社製）、10×PCR 緩衝液（100mM Tris-HCl緩衝液（pH8.3）、500mM KCl）5μl、25mM MgCl2（3μl）、5U/μl 耐熱性ポリメラーゼTaq polymerase（0.25μl、TaKaRa社製）を混合し、滅菌水（35.25μl）を加えて全量50μlの反応液を調製した。
【００３３】
ＰＣＲ反応は、予備変性（94℃/2分）に続き、変性（94℃/45秒）、アニーリング（66℃/1分）、伸長反応（72℃/1分）を30サイクル行った。
【００３４】
前記の各プライマーによる増幅産物の電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図６に示す。また、同様の条件で他の検体についても行った結果を下記表に示す。
【００３５】
【表３】
0004226277.tif 000004
これら３種のＳＴＳ化プライマーを用いることで、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合にはすべての目的サイズのバンドが検出された。
【００３６】
一方、ケールＤＮＡは系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、ケール＃３および＃５は、ＲＡＰＤ法においてはＲＡＰＤマーカーが増幅されていたが（表１）、ＳＴＳ化プライマーを用いた場合にはＤＮＡが増幅されず、ＳＴＳ化によりプライマーのキャベツＤＮＡに対する特異性が向上したことがわかる。
【００３７】
また、表３に示すように、これら３種のＳＴＳ化プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合には、すべての検体で３種の目的サイズＤＮＡが増幅された。一方、ケールＤＮＡを鋳型とした場合には系統によって増幅パターンが異なったが、２種のプライマー（set-1、set-2）を用いたＰＣＲで同時にＤＮＡが増幅されることはなかった。よって、少なくとも２種のプライマー（set-1、set-2）を用いたＰＣＲの結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【００３８】
以上の結果、これらＳＴＳ化プライマーを用いることで、ＲＡＰＤ法と比較してＰＣＲの再現性と鋳型ＤＮＡへの特異性および操作・判定の簡便性を更に高めたキャベツ識別を行うことができることが判明した。
【００３９】
（実施例６）キャベツ添加ケール利用食品における判定
実際にケール利用食品にキャベツを混入したモデル系を作成し、実施例４で得られたＳＴＳ化プライマー（set-1、set-2、set-3）を用いたキャベツ混入判定を行った。
【００４０】
試料として、前記ＳＴＳ化プライマーではＤＮＡが増幅されないことを確認しているケール(表３の＃１２、キューサイ社の契約農家から入手)及び青汁(キューサイ社製)と、前記ＳＴＳ化プライマーによってＤＮＡが３種共に増幅されることを確認しているキャベツ（表３の＃３、市販品を購入）を用いた。
【００４１】
1.5mlサンプリングチューブに、キャベツ混入量が▲１▼0、▲２▼1.5、▲３▼5、▲４▼10、▲５▼30、▲６▼50、▲７▼70%(w/w)となるようにキャベツ葉を採取し、ケールまたは青汁を加えて総量を200mgとした。次いで、これらのサンプルの全ＤＮＡをＣＴＡＢ法により抽出した。抽出したＤＮＡの濃度を260nmにおける吸光度から求め、当該ＤＮＡをＰＣＲ反応系に一定量（約150ng/tube）ずつ添加した。実施例５と同様の条件でＰＣＲ反応後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅バンドを観察した。その結果を下記表に示す。
【００４２】
【表４】
0004226277.tif 000005
ケールの場合は、set-2、set-3のプライマーを用いたとき、当該ケール中にキャベツが5％(w/w)混入している場合であってもキャベツＤＮＡを検出することができ、青汁の場合はset-3のプライマーを用いたとき、1.5％(w/w)のキャベツ混入でもキャベツＤＮＡを検出することができた。
【００４３】
よって、今回の結果から、本発明に係る３種のキャベツＤＮＡ検出用ＳＴＳプライマーを用いて、ケール中へのキャベツ混入を実際に判定することが可能であることが示された。
【００４４】
このモデル系でのキャベツの検出限界（set-1、set-2のプライマーで共にバンドが検出され、キャベツの混入を判断可能な点）は、青汁製品を用いた系で5%(w/w)、ケールを用いた系では30%(w/w)であった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係るキャベツＤＮＡ検出用プライマー及び当該プライマーを用いたキャベツ混入判定方法によれば、キャベツなどのケールに近似した野菜との間においてもキャベツＤＮＡを検出することができるため、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等では識別が困難な場合であっても、簡易かつ良好な精度でケール食品中のキャベツの混入を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＡＰＤプライマー（DD04、DD19、OPA06）を用いＲＡＰＤ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図２】ＲＡＰＤプライマー（DD04、DD19、OPA06）を用いＲＡＰＤ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図３】ＲＡＰＤマーカー（DD0404-1400）の塩基配列を示す図である。
【図４】ＲＡＰＤマーカー（DD1919-500）の塩基配列を示す図である。
【図５】ＲＡＰＤマーカー（OPA0606-1500）の塩基配列を示す図である。
【図６】ＳＴＳ化されたキャベツＤＮＡ検出用プライマー（set1〜set3）を用いＰＣＲ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【配列表】
0004226277.tif 000006
0004226277.tif 000007
0004226277.tif 000008
0004226277.tif 000009
0004226277.tif 000010
0004226277.tif 000011
0004226277.tif 000012
【図１】
0004226277.tif 000013
【図２】
0004226277.tif 000014
【図３】
0004226277.tif 000015
【図４】
0004226277.tif 000016
【図５】
0004226277.tif 000017
【図６】
0004226277.tif 000018