(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の一重鎖ハイブリッド形成アームを有する樹枝状ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドはハイブリッド形成により互いに結合された複数のポリヌクレオチドモノマを備え、各ポリヌクレオチドモノマは第１の端部と第２の端部とを有する線形の二重鎖ウエスト領域を備えた中間領域を有し、前記第１の端部はそれぞれウエスト領域の１つのストランドからの２つの一重鎖ハイブリッド形成領域で終端しており、前記第２の端部はそれぞれがウエスト領域の１つのストランドからの１つまたは２つの一重鎖ハイブリッド形成領域で終端しており、前記樹枝状ポリヌクレオチドにおいては各ポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つのハイブリッド形成領域において少なくとも１つの他のポリヌクレオチドモノマにハイブリッド形成結合されており、
前記各ハイブリッド形成領域及び前記複数のモノマの前記ウエスト領域はＸのヌクレオチドを有する副配列の反復を含まないマスター配列から得られる配列を備え、Ｘは２乃至６の整数を示すことを特徴とする樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項２】
存在する複数のポリヌクレオチドモノマは樹枝状ポリヌクレオチドの飽和を越えないことを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項３】
互いに結合されたハイブリッド形成領域は架橋されていることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記モノマのウエスト領域は架橋されていることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項５】
ウエスト及びハイブリッド形成領域は架橋されていることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項６】
Ｘは３であることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｘは４であることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｘは５であることを特徴とする請求項１に記載の樹枝状ポリヌクレオチド。
【請求項９】
核酸配列検出のハイブリッド形成試薬として使用する組成物であって、複数の一重鎖ハイブリッド形成アームを有する樹枝状ポリヌクレオチドを備え、該ポリヌクレオチドはハイブリッド形成により互いに結合された複数のポリヌクレオチドモノマを備え、各ポリヌクレオチドモノマは第１の端部と第２の端部とを有する線形の二重鎖ウエスト領域を備えた中間領域を有し、前記第１の端部はそれぞれウエスト領域の１つのストランドからの２つの一重鎖ハイブリッド形成領域で終端しており、前記第２の端部はウエスト領域の１つのストランドからの１つまたは２つの一重鎖ハイブリッド形成領域で終端しており、前記樹枝状ポリヌクレオチドにおいては各ポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つのハイブリッド形成領域において少なくとも１つの他のポリヌクレオチドモノマにハイブリッド形成結合されており、
前記各ハイブリッド形成領域及び前記複数のモノマの前記ウエスト領域はＸのヌクレオチドを有する副配列の反復を含まないマスター配列から得られる配列を備え、Ｘは２乃至６の整数を示すことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の検出方法、より特定すると、問題の核酸に対してハイブリッド形成を行うプローブの標識キャリヤに関する。
【０００２】
【従来の技術】
樹枝状分子は、著しく枝分かれした分枝構造体であり、化学試薬、滑剤、磁気共鳴のコントラスト媒体などとしての用途が見いだされている。例えば、バース(Barth)らのBioconjugate Chemistrty、第５巻、第５８−６６頁（１９９４年）に掲載の論文、ギトブ(Gitsov)及びフレチェット(Frechet)のMacromolecules、第２６巻、第６５３６−６５４６頁（１９９３年）に掲載の論文、ホーカー(Hawker)及びフレチェットのJ. Amer. Chem. Soc.、第１１２巻、第７６３８−７６４７頁（１９９０ａ年）に掲載の論文、ホーカー及びフレチェットのMacromolecules、第２３巻、第４７２６−４７２９頁（１９９０ｂ年）に掲載の論文、ホーカー等のJ. Chem. Soc. Perkin Trans.、第１巻、第１２８７−１２９７頁（１９９３年）に掲載の論文、ロクマン(Lockmann)等のJ. Amer. Chem. Soc.、第１１５巻、第７０４３乃至７０４４頁（１９９３年）に掲載の論文、ミラー(Miller)等のJ. Amer. Chem. Soc.、第１１４巻、第１０１８−１０２５頁（１９９２年）に記載の論文、マウシー(Mausy)等のMacromolecules、第２５巻、第２４０１−２４０６頁（１９９２年）に掲載の論文、ネイラー(Naylor)等のJ. Amer. Chem. Soc.、第１１１巻、第２３３９−２３４１頁（１９８９年）に掲載の論文、スピンドラー(Spindler)及びフレチェットのMacromolecules、第２６巻、第４８０９−４８１３頁（１９９３年）に掲載の論文、ターナー(Turner)等のMacromelecules、第２６巻、第４６１７−４６２３頁（１９９３年）に掲載の論文、ウイーナー(Wiener)等のMagnetic Resonance Med.、第３１（１）巻、第１−８頁（１９９４年）に記載の論文、Service、第２６７巻、第４５８−４５９頁（１９９５年）に掲載の論文、トマリア(Tomalia)のSci. Amer.、第６２−６６頁（１９９５年）に掲載の論文、並びに、トマリアの米国特許第４，５５８，１２０号、第４，５０７，４６６号、第４，５６８，７３７号、第４，５８７，３２９号、第４，８５７，５９９号、第５，５２７，５２４号及び第５，３３８，５３２号を参照されたい。樹枝状分子は、他の分子構造体と比較して幾つかの利点を呈する。先づ、デンドリマは、最大の容積または面積を最小の構造要素と接触させる。また、樹枝状分子の成長は、理想的なサイズと分子量の分子を得るように著しく制御することができる。更に、多数の所定の「端部」を誘導体化して、標識間に所定のスペースを有する高度に標識処理された分子を得ることができる。
【０００３】
核酸デンドリマは、トマリア(Tomalia) が従来の有機ポリマに適用した技術に従って構成されてきた。ハドソン(Hudson)等のAm. Chem. Soc.、第１１５巻、第２１１９−２１２４頁（１９９３年）に掲載の「核酸デンドリマ：新規なバイオポリマ構造体(Nucleic Acid Dendrimers: Novel Biopolymer Structures)」と題する論文及びカンター(Cantor)の米国特許第５，５６１，０４３号を参照されたい。
【０００４】
ＤＮＡの検出は、多くの場合、ＤＮＡの量が溶液の吸光度に直接比例する吸収測定により行われる。この技術は比較的感度があるが、ＤＮＡの特定のシーケンス即ち配列については何らの情報も提供することはなく、如何に多くのＤＮＡが存在するかだけである。ＤＮＡはまた、蛍光、放射性または化学発光分子を用いて標識処理することができる。標識処理は、検出感度と特異性を高めることができるという利点を発揮する。特異性は、ＤＮＡの所望の片を標識処理だけすることにより生ずる。ＤＮＡ検出に関するこの標識処理の最大の使用は、標的ＤＮＡに対して相補的プローブを標識処理することによるものである。標識処理されたプローブがその標的に対してハイブリッド形成を行い、検出することができる場合には、標的が存在するとを推察することができる。この技術の最も一般的な使用は、サザン法と呼ばれており、ＤＮＡ−ＤＮＡ標的が標識プローブに対するハイブリッド形成後に検出される。樹枝状核酸は、核酸診断学を信号増幅ツールとして開発するのに有用である。核酸分子はサイズが比較的大きいので、核酸デンドリマは、数多くの蛍光化合物並びに／あるいは制限された立体障害及び／またはクエンチングを有するタンパク質成分を用いて容易に標識処理される。これらはまた、薬剤（アンチセンス）配給ビヒクルとしての可能性を示している。
【０００５】
最も広く用いられているＤＮＡの検出法は、標識を加えるものではなくＤＮＡの増幅によるものと考えられる。この増幅技術は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる。この技術においては、標的ストランドは、全４つの塩基のデオキシヌクレオチドトリホスフェート、熱安定性ポリメラーゼ及び標的に対して相補性のある短いストランド即ち鎖(strand)であるプライマＤＮＡの添加によりインシトゥ(in situ)で増幅される。プライマは、重複のポイント（及び終了のポイント）をマークする。単一のプライマが使用される場合には、相補的ストランドは終了までコピーされるが、より一般的には、２つのプライマが増幅された配列の開始と終了を示すために使用される。増幅されたＤＮＡの検出は、数多くの技術のいずれかにより行うことができる。最も一般的な方法は、電気泳動により増幅ＤＮＡを分離（典型的には、アガロースまたはポリアクリルアミドにおいて行われるが、毛管電気泳動も使用されている）するとともに、蛍光挿入試薬（通常は臭化エチジウム）を用いた染色によりこれを検出するものである。従って、ＰＣＲ法は、感度と特異性の双方を高めることができる。
【０００６】
核酸のハイブリッド形成により実質上組み立てられ、かつ、樹枝状構造を特徴とするが上記した有機及び核酸デンドリマとは構造的に異なる核酸マトリックスが、ニルセン(nilsen)に付与され、ポリプローブ・インコーポレイテッド(Polyprobe, Inc.)に譲渡された米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号及び第５，４８７，９７３号に記載されている。ポリプローブ社のマトリックスの特有の分子構造は、多数の標識に適応することにより、種々の先行技術の方法と比較して信号を１００倍以上に増幅することができ、標的の核酸は、サンプル中に極めて少量（例えば、フェムプトグラム（１０−１５））存在する場合にも検出することができる。かくして、ポリプローブ社の技術は、現状の核酸検出方法、最も顕著には、ＰＣＲと比べて有意の改良を提供するものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したニルセンの特許に記載されている核酸デンドリマの改良に関し、最大の自己アセンブリを提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の一の観点によれば、複数のハイブリッド形成アームを有する樹枝状ポリヌクレオチドが提供されており、前記ポリヌクレオチドはハイブリッド形成により互いに結合された複数のポリヌクレオチドモノマを備え、各ポリヌクレオチドモノマは第１の端部と第２の端部とを有する線形の二重鎖ウエスト(waist)領域を備えた中間領域を有しており、前記第１の端部はそれぞれがウエスト領域の１つのストランドからの２つの一重鎖(single stranded)ハイブリッド形成領域で終端しており、前記第２の端部はそれぞれがウエスト領域の１つのストランドからの１つまたは２つの一重鎖ハイブリッド形成領域で終端しており、前記樹枝状ポリヌクレオチドにおいては各ポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つのハイブリッド形成領域において少なくとも１つの他のポリヌクレオチドモノマにハイブリッド形成結合されており、
前記各ハイブリッド形成領域及び前記複数のモノマの前記ウエスト領域はＸのヌクレオチドを有する副配列(subsequence)の反復を含まない配列を備え、Ｘは少なくとも２の整数を示すことを特徴とする構成に係る。好ましい実施の形態においては、Ｘは２乃至約７の整数であり、より好ましい実施の形態においては、Ｘは３、４または５である。
【０００９】
モノマからなるＤＮＡの性質及び構成は、本発明の核酸樹枝状マトリックスの著しく正確でかつ制御されるアセンブリ、例えば、最大の自己アセンブリを許容する。即ち、所定のモノマのハイブリッド形成領域は実質上、別のモノマの実質上相補的なハイブリッド形成領域だけとハイブリッド形成を行う。従って、自己ハイブリッド形成は、好ましくは、無視することができる程度まで低減される。これにより、検定を妨害することが少なくなり、精度及び感度が高まるという利点が得られる。
【００１０】
ポリヌクレオチドの製造及び使用装置及び方法も説明されている。
【００１１】
樹枝状核酸構造体は、比較的低分子量で高度に枝分かれし、複数の配列特異性を有し、ごく少数の単一ストランド(single strand)から構成され、予測可能な制御成長を有し、しかもモノマの付加に対する立体障害が最小であるのが理想的である。核酸デンドリマは、２つ程度の少ない一重鎖分子を使用したハイブリッド形成により組み立てることができる。しかしながら、７つの一重鎖分子を使用すると多くの望ましい特徴を有する構造が得られるので、７つの一重鎖分子を使用するのが好ましい。核酸分子を種々の構造とすることにより、大きな樹枝状構造体を得ることができる。本明細書に記載の特定の構造体は、試薬の複雑性と、試薬の合成の容易性と、ハイブリッド形成を通した各付加層によるデンドリマの幾何学的成長の速度との間でバランスを示す。
【００１２】
説明されている構造体においては、２つのａ（＋）及び２つのｃ（＋）一重鎖領域を有する２つの部分一重鎖核酸分子のヘテロダイマである開始デンドリマモノマは、４つのデンドリマモノマの第１の層がハイブリッド形成を行う４本のアームを提供する（図１及び２参照）。このイニシエータと同様に、第１の層のデンドリマモノマもまた、４つの一重鎖領域、即ち、１つの（−）配列であるａ（−）またはｃ（−）と、３つの（＋）配列、即ち、ｄ（＋）またはｅ（＋）とを有している。第２の層のモノマは、（−）配列がｄ（−）またはｅ（−）であり、（＋）配列がａ（＋）またはｃ（＋）である点を除き、イニシエータ及び第１の層のモノマと同様である。かくして、ａ（＋）及びｃ（＋）配列を有するイニシエータから、第１の層が付加されて、ｄ（＋）及びｅ（＋）配列を有する１層デンドリマを発生する。第２の層の付加によりａ（＋）及びｃ（＋）が再生され、デンドリマモノマの交互のハイブリッド形成により樹枝状構造体の幾何学アセンブリを許容することができる。第４の層により、アセンブリは、３２４の一重鎖（ｓｓ）アーム領域を有する分子を形成し、第６の層により２，９１６のｓｓ領域を有する分子、第８の層により２６，２４４のｓｓ領域を有する分子を形成する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１ａは、好ましい樹枝状またはマトリックスモノマのアセンブリに使用される７つの一重鎖核酸オリゴマを示す。これら７つの分子は、６つのオリゴマ配列、即ち、４つのアーム配列と２つのウエスト配列から構成される。文字が付された各セグメント（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）は、異なるオリゴマの独特の配列の１つを示す。示される各オリゴマについて、実線は「＋」（正）のストランドを示し、破線は「−」（負）即ち相補的ストランド配列を示す。配列（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）のそれぞれは、互いに類似する最小の配列を有するように構成されている。
【００１４】
図１ｂに示すように、モノマＡ、Ｂ’、Ｂ”、Ｃ’及びＣ”は構造体の繰り返し即ち反復単位であり、デンドリマモノマと呼ばれる。モノマは、図１ａに示す７つの一重鎖試薬から組み立てられる。イニシエータ、即ち、「Ａ」モノマは、ｓｓ２にハイブリッド形成されたｓｓ１（＋）である。Ａモノマは、モノマＢ’及びＢ”の一重鎖アームの１つにそれぞれが相補する４つの一重鎖アームを有する。ストランド番号４は、双方のＢタイプモノマの（−）ウエストストランドである。ストランド４は、（Ｂ’の）ストランド＃３または（Ｂ”の）ストランド＃５にアニーリングされている。Ｂ’モノマは、Ａモノマであるイニシエータのアームの２本にアニーリングすることができ、一方、Ｂ”はイニシエータのＡモノマの残りの２本のアームにアニーリングすることができる。１つのＡモノマから４つのＢタイプモノマのｓｓアームに対する部位飽和アニーリングにより、図２ａに示す１層樹枝状構造が形成される。ステップの提案された配列に従う場合には、他のハイブリッド形成は不可能である。Ｂ’及びＢ”は、協働して、イニシエータであるＡモノマの全ての利用することができるハイブリッド形成部位を飽和させる。
【００１５】
同様にして、６番と７番のストランドは番号２のストランドとハイブリッド形成を行い、モノマＣ’及びＣ”を形成する。これらのＣタイプモノマは、モノマＢ’及びＢ”の一重鎖部位の全てをハイブリッド形成により飽和させる能力を有することにより、図２ｂに示すように、番号２の層を介して樹枝状試薬のアセンブリを完成する。Ｂ’及びＢ”続いてＣ’及びＣ”を交互に付加することにより、図２ｃ及び２ｄに示すようにデンドリマを成長させることができる。
【００１６】
各モノマは、結合用の１つの（−）アームとともに、４つの一重鎖アームを有しており、従って、各添加によりその後のハイブリッド形成に利用できる一重鎖アームの数を３倍にする。第１の層は１２本のアームを有し、第２は３６、第３は１０８、第４は３２４本のアームを有するなどとなっている。一重鎖アームの数を３倍にすることに加えて、各層を付加することにより、成長する構造体の全質量を約２倍にすることができる。２層のデンドリマは、１７個のモノマ（開始モノマと、第１の層の４個のモノマと、第２の層の１２個のモノマ）と、３６の端部とを有しており、従って、第３の層は３６個のモノマを有する。かくして、デンドリマの成長の各段階において、全ての質量の３分の２は表面層にある。
【００１７】
オリゴマは、種々の塩基組成と長さを有することができる。好ましい実施の形態においては、塩基の組成は、オリゴマが特異的ハイブリッド形成を許容するが効率的な生産には十分に短い長さと、最小の非特異的相同とを有するように選定される。非特異的相同の最小化は、２つの点で有意である。先づ、試薬は、自己ハイブリッド形成を行う能力が著しく制限される。第２に、試薬がハイブリッド形成を行う他の試薬の相補部分に関して制限を受け、かくして、ＤＮＡマトリックスを精確かつ制御された態様で支配する。一般に、オリゴマの長さは、約２０乃至約２００塩基の範囲にある。
【００１８】
より好ましい実施の形態においては、本発明の核酸マトリックスは、「オイラー」タイプの配列を使用してつくられる。これらのマトリックスは、自己ハイブリッド形成の欠落を呈するだけでなく、オイラーの配列はオイラーの補体とだけハイブリッド形成を行う。これらの好ましい実施の形態においては、非自己ハイブリッド形成オリゴマは、特定の長さの反復副配列を持たないことを特徴とするいわゆるマスター配列を構成することにより得られる。かかるマスター配列の長さと組成を計算するために、非反復副配列の最小長さ「Ｘ」は可能な限り小さくなるように選定される。次いで、マスター配列の長さ（Ｌ）は、次の式を使用して計算される。
Ｌ＝（（４Ｘ−Ｐ）÷２）＋（ｘ−１）
【００１９】
上記式において、ｘ＝非反復副配列の長さ、Ｐ＝長さｘを有するパリンドローム副配列の数である。パリンドロームは最小２塩基で、偶数の塩基を有する副配列の場合にのみ存在する。例えば、ｘ＝３または５である場合には、Ｐ＝０である。
【００２０】
（マスター配列が２以上のヌクレオチドを有する副配列の反復を含まないように）ｘ＝２の場合の実施の形態に式を提供すると、次のように動作を行う。先づ、「２−マー」("2-mer")の数が４２＝１６として計算される。１６の２−マーは次の通りである。AA,AC,AG,AT,CA,CC,CG,CT,GA,GC,GG,GT,TA,TC,TG及びTTである。４つのパリンドローム、即ち、TA,AT,GC及びCGである。マスター配列の構成は、１２の残りの２−マーの１つを選択することにより開始され、これには第１の２−マーに相補する第２の２−マーを選択することが必要となる。２−マーＡＡの任意の選定により、下記が得られる。
0004221145.tif 000002
この場合には、２−マーＡＡの選定には、相補的ストランドに関して２−マーＴＴを選定することが必要となる。次に、トップのストランド（即ち、正即ちワトソン(Watson)ストランド）に関する第３の塩基の選定は、ＣまたはＧでなければならないが、これは、Ａを選定すると２−マーの反復を持たないという原則を犯すことになり、またＡＴはパリンドロームであるからである。かくして、Ｃを選定すると、成長する二重鎖マスター配列である
５’  Ａ  Ａ  Ｃ  ３’
３’  Ｔ  Ｔ  Ｇ  ５’
が得られる。
【００２１】
２−マーのＡＣ及びＧＴは、更なる使用から排除される。トップストランドの次の選択は、Ａ（即ち、ＣＡ）、Ｃ（即ち、ＣＣ）またはＴ（即ちＣＴ）とすることができる。「Ａ」を選択すると、第４塩基はＧに限定され（ＡＧが最後の２−マーとなり）、一方、ＣまたはＴを選定すると、融通性を大きくすることができる（即ち、Ｃが選択されるときにはＡまたはＴであり、Ｔが選択された場合にはＣまたはＧ）。マスター配列を構成する場合には、ヌクレオチドは少なくとも次のヌクレオチドの選択を最大にするように選定されるべきである。「Ｃ」を選択すると、下記の二重鎖配列が得られ、
５’  Ａ  Ａ  Ｃ  Ｃ  ３’
３’  Ｔ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  ５’
２−マーＣＣ及びＧＧは、将来の選択として排除される。
【００２２】
トップストランドに関する５番目の塩基は、ＡまたはＴとすることができる。Ａが選択される場合には、６番目の塩基はＧと指示される（この場合はＡＧであるので、最後の残りの２−マーは、「Ａ」で始まる）。これに対して、Ｔが選択されると、ＣまたはＧが６番目の塩基として許容される。かくして、Ｔはトップストランドの５番目の塩基に選択される。
５’  Ａ  Ａ  Ｃ  Ｃ  Ｔ  ３’
３’  Ｔ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  Ａ  ５’
ここで、ＣＴ及びＡＧが排除された。ＣまたはＧが６番目の塩基として付加されるかどうかに拘わらず、Ａは、（ＣＡ及びＧＡが最後の残りの利用できる２−マーであるので）７番目の塩基でなければならない。次いで、マスター配列は次のように完結され、
５’  Ａ  Ａ  Ｃ  Ｃ  Ｔ  Ｃ  Ａ  ３’
３’  Ｔ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｔ  ５’
全部で、１２の２−マーが利用された。
【００２３】
同じ基準を満たす多くの異なるマスター配列を構成することができるのは明らかである。即ち、３、４または５塩基の長さを有する副配列の反復を持たないマスター配列の構成は、２つの塩基の長さを有する副配列の反復を持たないマスター配列よりも複雑である。しかしながら、上記原則に従うことにより、容易にマスター配列が得られる。本発明においては、マスター配列全体が単一の所定の長さを有する副配列の反復を持たないことを特徴とすることは必要とされない。マスター配列のある部分は、一の所定の長さを有する副配列の反復を含まず、他の部分は第２の異なる長さの副配列の反復を持たないようにすることができる。かかる配列の例を、配列番号１及び２として下記する。これら２つの配列はいずれも、２６１の塩基対を含み、最初の８６の塩基対は３塩基よりも大きい長さを有する副配列の反復を持たず、配列全体、即ち、塩基１−２６１は、４塩基よりも大きい長さを有する副配列の反復を持たない。
CGACAAAAGA ACTGAGGAAG TGGGGTAATG ATAGAGCAAC AGGTGACGGA TGGCAGACTA
AATACACGAA ACCAAGGGAG ATTGAATTAA GCTAGGCTGG ACCGAGTAGA AAAATGTGCA
TAACGTACAA TATAAAGTAA GATCGAATCA AACATGAAGG ATACGCAAGC GATGCTAACT
ATGGAACGAG AGGTAGGGCG GGACAGAAGA CGCGCAGTGA GTCGGCCAAC CGGAGCGGCA
CGGGTGTGGT CAGGCGAACA A         （配列番号１）
TTGTTCGCCT GACCACACCC GTGCCGCTCC GGTTGGCCGA CTCACTGCGC GTCTTCTGTC
CCGCCCTACC TCTCGTTCCA TAGTTAGCAT CGCTTGCGTA TCCTTCATGT TTGATTCGAT
CTTACTTTAT ATTGTACGTT ATGCACATTT TTCTACTCGG TCCAGCCTAG CTTAATTCAA
TCTCCCTTGG TTTCGTGTAT TTAGTCTGCC ATCCGTCACC TGTTGCTCTA TCATTACCCC
ACTTCCTCAG TTCTTTTGTC G         （配列番号２）
【００２４】
所望の結果に応じて、これらのマスター配列の異なる部分を、モノマのウエストまたはアーム配列を最終的に構成するオリゴマとして選択することができる。例えば、比較的高いＧＣ含量を有する所定の長さの配列を選択することにより、比較的高い融点を有するオリゴマが得られる。これは、部分溶解する、即ち、変性する構造体を制御されかつ予測可能な態様で構成するうえで有利である。図３及び４は、上記したマスター配列に関してそれぞれ２９塩基及び４９塩基の長さを有する配列についてのＧＣ含量を示す棒グラフである。図８において分析されている配列において最初の８６塩基により画定される部分配列は、３塩基よりも大きい反復は持たず、塩基１−２６１により画定される配列は、４塩基よりも大きい反復は持たない。同じことが、図９において分析されているそれぞれの部分配列についても当てはまる。この種の分析によれば、当業者は所定の融点を有するマスター配列の部分を選択することができる。マスター配列はまた、種々のウエスト及びアーム配列の選択における融通性を最大にするように選択することができる。例えば、異なる融点を有する、４つの３０塩基アームオリゴマと２つの５０塩基ウエストオリゴマなどが、正確に２２０塩基の長さを有するマスター配列とは異なり、長さが２２０（即ち、（４ｘ３０）＋（２ｘ５０））よりも大きい塩基を含むマスター配列から容易に選択される。
【００２５】
より好ましい実施の形態においては、マスター配列は、４つ以上のヌクレオチドを有する副配列の反復を含まない。これらの実施の形態においては、マスター配列は、二重鎖の（（４４−１６）÷２）＋（４−１）＝１２３塩基の長さ（Ｌ）を有する。１６のパリンドローム配列（即ち、Ｐ＝１６）は、ＡＡＴＴ、ＴＴＡＡ、ＣＣＧＧ、ＧＧＣＣ、ＴＡＴＡ、ＡＴＡＴ、ＧＣＧＣ、ＣＧＣＧ、ＡＣＧＴ、ＴＣＧＡ、ＡＧＣＴ、ＴＧＣＡ、ＣＡＴＧ、ＣＴＡＧ、ＧＡＴＣ及びＧＴＡＣである。ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅモノマの間で１２３の塩基を均等に分割することにより、各モノマについて２４の塩基（即ち、２４−マー(24-mer)）が得られる。２４−マーは、比較的低い融点（〜５５−７０℃）を有しているので、好ましい実施の形態においては、マトリックスアセンブリに使用されるマスター配列は＞３０塩基のａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅ配列については４塩基よりも大きい反復を含まない。これらの実施の形態においては、塩基の長さが５１６のマスター二重鎖配列を組み立てることができる（即ち、（４５÷２）＋（５−１）＝５１６）。４塩基よりも大きい反復を持たない３０乃至１００塩基のサイズの範囲にあるオリゴヌクレオチドは、５１２の塩基を有するマスター配列に基づいて構成される。
【００２６】
オイラー配列を使用することにより、本発明の核酸マトリックスの極めて正確で制御されたアセンブリを許容するオリゴマが得られる。オリゴマ及びこれから組み立てられるモノマは、自己ハイブリッド形成の能力を無視することができ、あるいはかかる能力を持たない。即ち、これらは、相補的オイラー配列を有するオリゴマまたはモノマにだけハイブリッド形成を行い、かくして、検定の妨害を少なくすることができる。これにより、精度及び感度が一層高められる。例えば、３以上の塩基を有する副配列の反復を含まない同じまたは異なるマスター配列から得られる複数の非反復３−マーを含む２つの一重鎖オリゴマは、塩基対形成において最小３３％の不整合を有することになる。同様に、４つ以上の塩基を有する副配列の反復を持たない同じまたは異なるマスター配列から構成される複数の非反復４−マーを持ついずれか２つの一重鎖オリゴマは、最小２５％の不整合を有することになる。複数の非反復５−マーの場合には、最小の不整合は２０％ということになる。オリゴマのウエスト配列とアーム配列間のこの程度の不同性により、各ウエストとアームがオイラーの補体にだけ結合することが更に確保される。これらの実施の形態は、イソＣ核酸、イソＴ核酸及びイノシン含有核酸を含むマトリックスの構成に同等に適用することができるが、これは、これらのいずれもがＤＮＡに関するハイブリッド形成ルールにより制御することができるからである。
【００２７】
本発明のデンドリマ形成用のモノマは、各端部に１つの二重鎖ウエストと２つの一重鎖アームとを含む中間領域を有している。別の実施の形態においては、モノマの一方の端部が一重鎖アームを１つだけ有するモノマが使用される。更に別の実施の形態においては、双方のタイプのモノマが使用される。３つの一重鎖領域を有するモノマ試薬は、立体障害が少なくかつデンドリマ内部の液体容積が大きいので、ある場合には、好ましいものとすることができる。更に、図５に示すように、モノマの中間領域部は、その全長に沿って完全に二重鎖にする必要はなく、モノマの端部の中間に一重鎖の部分を含むことができる。かかるモノマ構造体は、所望の場合には、より多くの数のハイブリッド形成部位を有する。
【００２８】
ハイブリッド形成による樹枝状アセンブリは、３つ以上の一重鎖領域を有するイニシエータ核酸分子をもって開始することができる。これらの場合には、イニシエータの一重鎖自由端部に対する核酸分子のハイブリッド形成により、第１の層の生成物が得られる。３本アームのデンドリマモノマを持った３本のアームを有するイニシエータのハイブリッド形成の場合には、６本のアームを有する第１の層が得られる。より好ましい七重鎖樹枝構造体は、４本のアームを有するモノマを利用し、従って、第１の層は１２本のアームを有する。ハイブリッド形成のその後の層により、一重鎖端部の幾何学的拡大と核酸の３次元樹枝状組織とが得られる。
【００２９】
デンドリマアセンブリは、生成された一重鎖核酸分子からデンドリマモノマのアニーリングに進み、次いで、溶液においてまたは固体の支持体上において、指示された核酸構造体を組み立てる。本明細書において使用されている「核酸デンドリマ」とは、一部が二重鎖となっている核酸分子のサブユニットからなる核酸の複合体である。
【００３０】
図６に示すように、本発明の核酸デンドリマは、２つという少ない一重鎖核酸から組み立てることができ、図６において、ストランド１＝［配列１（＋）］ｎ［配列２（−）］、ストランド２＝［配列２（＋）］ｎ［配列１（−）］であり、配列１と配列２は核酸配列であり、（＋）及び（−）は相補的配列を示す（図６参照）。ｎが２である場合には、過剰のストランド２からストランド１へ連続したハイブリッド形成を行い、次いで、過剰のストランド１とストランド２を交互させることにより、樹枝状構造体を得ることができる。ストランド１のストランド２との化学量論により、重合をハイブリッド形成により半分ランダムに行うことができるので、２つの単一ストランドにより得られる構造体は不均質であると考えられる。
【００３１】
（＋）配列要素を含む第３のストランドの付加をイニシエータとして使用することにより、成長する構造体の不均質性を低減させることができる。実際に、３種類の樹枝状モノマ（一重鎖核酸）が、ハイブリッド形成による制御された重合にとって必要である。この３種類の樹枝状モノマは、イニシエータであり、（＋）配列だけを担持する「Ａ」モノマと、「Ａ」モノマの配列と相補する単一の（−）配列及び「Ａ」モノマで見いだされる（＋）配列とは異なる複数の（＋）配列を含む第１の層を形成する「Ｂ」モノマと、「Ｂ」モノマからの（＋）配列と相補する単一の（−）配列及び「Ａ」モノマの（＋）配列と同一の複数の（＋）配列を含む「Ｃ」モノマとである。
【００３２】
デンドリマアセンブリの更なる変更例が図７に示されており、これは、４つのストランドを利用しており、図７において、ストランド１＝［配列（＋）］ｎ、ストランド２＝［配列１（−）］［配列２（＋）］ｎ、ストランド３＝［配列２（−）］［配列３（＋）］ｎ、ストランド４＝［配列３（−）］［配列１（＋）］ｎである。これらのデンドリマは、イニシエータ「Ａ」モノマと、第１層「Ｂ」モノマと、第２層「Ｃ」タイプモノマと、第３層「Ｄ」タイプモノマとからなり、次いで、Ｂ、Ｃ及びＤタイプモノマを逐次付加する。樹枝状構造体は、モノマのタイプを増やしてより一層複雑につくることができる。しかしながら、試薬の数は最小にするのが好ましい。
【００３３】
３つの単一ストランドが３つのモノマとして作用することができる。しかしながら、得られる櫛状構造体は、ハイブリッド形成の幾つかのサイクル内において立体障害を受けるものと考えられる。核酸の２つの単一ストランドからなる部分二重鎖のモノマは、櫛状構造体の立体障害を克服することができる。この構成においては、各一重鎖分子は、３つの領域、５’−−−＞３’＝［アーム１配列］［ウエスト配列］［アーム２配列］を有する。この構成においては、各デンドリマモノマは２つの一重鎖核酸分子からなり、４つの一重鎖アームと１つの二重鎖ウエスト領域とを有する分子が得られる。イニシエータＡ、第１層Ｂ及び第２層Ｃモノマのアセンブリは、５つという少ない一重鎖核酸分子を用いて行うことができる。しかしながら、図８に示すように、得られる構造体は、各モノマのアーム配列のうちの２つのアーム配列の同じ端部のモノマのウエストの２つを有するという必要な拘束から生ずる大きな立体障害を有するものと考えられる。
【００３４】
デンドリマモノマの最大の間隔は、７つという少ない一重鎖核酸を用いて行うことができる。他の改良は、２つの異なるウエスト配列を組み込むことであり、これにより、デンドリマモノマ間のストランドの交換を最小にするとともに、望ましくないハイブリッド形成を更に制限することができる。更に、得られるデンドリマは、各層に２つのタイプの一重鎖アームを等量示すことにより、一方のタイプのアームを特定の標的配列へのハイブリッド形成に使用することができるとともに、他方のアームを単一分子の取着に使用することができる。
【００３５】
組み立てられた核酸デンドリマの構造的一体性を強化しかつ保持を容易にするために、モノマ間(inter-monomer)結合（即ち、ハイブリッド形成結合された相補的アーム）の複数、好ましくは全てが架橋される。より好ましい実施の形態においては、複数の、より一層好ましくは、全てのモノマの二重鎖ウエスト領域も架橋される。本出願人によれば、これらの部位におけるマトリックスの架橋により、実質上より安定な構造体が得られることがわかった。架橋は、標準的な処理により、種々の試薬を用いて行うことができる。適宜の架橋剤には、マイトマイシンＣ〔例えば、Science、第２３５巻、第１２０４−１２０８頁（１９８７年）に掲載のトーマス(Tomasz)等の論文、Biochemistry、第３２巻、第４７０８−４７１８頁（１９９３年）に掲載のバス(Basu)等の論文、Biochemistry、第２９巻、第２９９９−３００６頁（１９９０年）に掲載のボロウイ−ボロウスキ(Borowy-Borowski)等の論文、Biochemistry、第２９巻、第２８６１−２８９５頁（１９９０年）に掲載のノーマン(Norman)等の論文〕、ダウノマイシン、並びに、ＤＮＡ、エチジウムダイアジド、シスプラチン(Cisplatin)、ＥＤＣタイプの化合物及びプソラレン(psoralen)を架橋させることにより抗癌作用を発揮する抗癌剤が含まれる。
【００３６】
当業者であれば認識することができるように、配列の要件及び操作条件は、特定の架橋剤により変わる。例えば、上記した刊行物のほかに、J. Mol. Biol.、第１２２巻、第１４５−１６２頁（１９７８年）に掲載のサマートン(Summerton)等の論文を参照されたい。例えば、マイトマイシンＣは、５’ＣｐＧを好む。一般に反応条件に関しては、架橋反応は、約−２０℃のＴｍ及び中性ｐＨで行われる。当業者が本発明の核酸デンドリマを架橋することができる種々の手引きが文献に提供されている。例えば、The Pierce Catalog、発明の名称が「共有架橋オリゴヌクレオチド」の米国特許第５，５４３，５０７号及び該特許において検討されている文献、特に、FEBS、第３５１−３５５頁（１９７３年）に掲載のグリネバ(Grineva)等の論文；J. Mol. Biol.、第１２２巻、第１４５−１６２頁（１９７８年）に掲載のサマートン等の論文；J. Theor. Biol.、第７８巻、第６１−７５頁（１９７９年）に掲載のサマートンの論文、米国特許第４，１２３，６１０号；J. Amer. Chem. Soc.、第１１１巻、第８５１７−１９頁（１９８９年）に掲載のメイヤ(Meyer)等の論文；Nucleic Acids Res.、第１４巻、第７６６１−７６７４頁に掲載のマテッチ(Matteucci)等の論文；Tetrahedron Letters、第２８巻、第２４６９−２４７２頁（１９８７年）に掲載のマテッチの論文；J. Am. Chem. Soc.、第１１３巻、第４０００−４００２頁（１９９１年）に掲載のフェレンツ(Ferentz)等の論文；Biochemistry、第２７巻、第３１９７−３２０３頁（１９８８年）に掲載のリー(Lee)等の論文；J. Am. Chem. Soc.、第１０９巻、第７２１７−７２１９頁（１９８７年）に掲載のマノハラン(Manoharan)等の論文；J. Am. Chem. Soc.、第１１０巻、第２６９０−２６９１頁（１９８８年）に掲載のマノハラン等の論文；Nucleosides & Nuclotides、第８巻、第８６３−８６６頁（１９８９年）に掲載のバッサー(Vasseur)等の論文；Nucleic Acids Research、第１７巻、第１０３０７−１０３１９頁（１９８９年）に掲載のバートランド(Bertrand)等の論文；Tetrahedron Letters、第３１巻、第６３４７−６３５０頁（１９９０年）に掲載のフィリップ(Philippe)等の論文；Nucleic Acids Research、第１８巻、第２８５５−２８５９頁（１９９０年）に掲載のピー・アイヤー(P. Iyer)等の論文；Helvetica Chimca Acta、第７３巻、第６０８−６１７頁（１９９０年）に掲載のグローケ(Groehke)等の論文並びにTetrahedron Letters、第３２巻、第２０７−２１０頁（１９９１年）に掲載のピーチ(Peoc'h)等の論文を参照されたい。
【００３７】
プソラレン処理が好ましい。プソラレンは平面構造であるので、核酸の二重螺旋分子構造の塩基部分間に挿入することができる。適宜のＵＶＡ波長、例えば、約３１５ｎｍ乃至約３５０ｎｍの光の照射により、プソラレンは、核酸ストランドの一体的な存在として生ずるピリミジンヌクレオチドと共有結合することができる。プソラレンのほかに、架橋に適したプソラレン誘導体には、８−メトキシプソラレン、４，５’，８−トリメチルプソラレン、並びに、トリオキサレンの４’−付加物（例えば、４’−ヒドロキシメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン、４’−メトキシメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン、４’Ｎ−フタルイミドメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン及び４’−アミノメチル−４，５’,８−トリメチルプソラレン塩酸塩）が含まれる。例えば、米国特許第４，１９６，２８１号を参照されたい。
【００３８】
一般に、プソラレンによる架橋は、標準的な手順に従って行われる。例えば、Annu. Rev. Biochem.、第５４巻、第１１５１−１１９３頁（１９８５年）に掲載のシミノ(Cimino)等の論文、Biochemistry、第２５巻、第５８９５−５９０２頁（１９８６年）に掲載のシャイ(Shi)等の論文及びBiochemistry、第２５巻、第３０１３−３０２０頁（１９８６年）に掲載のシミノ等の論文を参照されたい。更に、核酸架橋剤としてのトリオキサレン４’−付加物に関する、発明の名称が「プソラレン」の米国特許第４，１９６，２８１号を参照されたい。この’２８１号特許には、水溶液におけるプソラレンの溶解度及びプソラレンの核酸に対する非共有結合に関する解離定数のような種々の反応パラメータの決定に関する別の手引きが提供されている。かくして、溶解度が高くなると、結合部位に利用することができる周囲の液体媒体の分子の数が多くなる。同様に、解離定数が小さくなると、可能な結合部位を常に占めるプソラレンの数が大きくなる。好ましい実施の形態においては、Ｔｍは約−２０℃であり、核酸の濃度は約１００ｎｇ／μｌよりも低く、プソラレンは使用の直前に再結晶化される。
【００３９】
核酸の多陰イオン性により、核酸構造体はほぼ球状で内部に液体を含み、異なる層内に異なる濃度の核酸を有するものとなる。それぞれを連続して付加することにより、特定の層を含むことができる理論上球形の容積は、ハイブリッド形成の最後の層、即ち、シェル層に存在する付加の容積だけ増加する。更に、各層とともに付加される核酸は、極めて迅速に増加し、付加前に存在する全ての核酸の合計の２倍に近くなる。かくして、付加層が蓄積するにつれて、球の容積のシェルによる部分が減少するとともに、核酸デンドリマに存在する核酸部分の容積は２倍になる。自明のように、シェル層、即ち、最後の付加層に存在する核酸の容積は、シェルの容積よりも大きくすることはできず、シェルの飽和はある層番号で生ずる。シェルにおける核酸の飽和が生ずる層は、半透過性の核酸の膜の開始を定め、飽和前に観察される全核酸の幾何学的進行とは異なり、デンドリマからなる全核酸の略線形の進行により実験的に示される。シェルにおける核酸の飽和は、立体（容積／容積）障害あるいはシェルにおける高濃度の負電荷によるものと考えられる。いずれの場合にも、余分な核酸は、シェル層において全ての可能なハイブリッドを形成しないように一部が排除されるとともに、デンドリマの内部から完全に排除される。
【００４０】
同じまたは類似の構成のモノマから構成されるデンドリマは、以下のパラメータ、即ち、モノマの全数、所定の付加層において付加されるモノマの数、球の半径、球の容積、シェルの容積、核酸（ＮＡ）の全容積及び所定の付加サイクルにおいて付加される核酸の容積に関して説明することができる。モノマの幾何学形状とサイズを変えて構成されるデンドリマについては、各付加番号でのモノマの説明において調整を行わなければならない。しかしながら、種々の構造のモノマ、全塩基の秤量平均値、塩基の長さ、容積、質量及びハイブリッド形成部位の長さを説明に使用して、非均一の核酸デンドリマに対処することができる。
【００４１】
核酸（ＮＡ）デンドリマは、分子間共有架橋により任意に強化された分子間塩基対形成を介して緊密に連係して保持された少なくとも３つの一重鎖核酸分子の集まりとして定義される。デンドリマ分子は、ＮＡデンドリマのアセンブリにおいて使用される単一のまたはグループをなすＮＡストランドとして定義される。このモデルは、４つのデンドリマモノマ変数、即ち、
ｍ＝モノマ全塩基
ｎ＝塩基におけるモノマの長さ
ｊ＝モノマのハイブリッド形成部位
ｐ＝塩基におけるハイブリッド形成部位の長さ
を使用する。
【００４２】
これらの変数は、ＮＡ樹枝状成長をモデルするのに十分である。
デンドリマのモノマの長さはｎから誘導され、溶液において測定される開始デンドリマモノマから半径方向に突出する平均的な最長寸法として定義される。デンドリマモノマの長さは、モノマの最長の単一ストランドにおける塩基の数に、塩基当たりの距離を掛けたものに近似する。
デンドリマモノマの長さｎｍ＝ｎ塩基＊０．３４ｎｍ／塩基＝ｑｎｍ
モデルにおいて使用される別の重要な長さは、ハイブリッド形成部位の長さである。
モノマハイブリッド形成部位の長さｎｍ＝ｐ塩基＊０．３４ｎｍ／塩基＝ｒｎｍ
【００４３】
デンドリマモノマの容積は、単一のモノマにより置換される全溶媒として定義される。デンドリマモノマの容積は、１．０（ｎｍ）の直径と上記のように定義される長さとを有する円筒体としてモノマを処理することにより近似される。
デンドリマモノマの容積ｎｍ＾３＝Ｐ＊（１ｎｍ）＾２＊ｑｎｍ＝ｓｎｍ＾３
【００４４】
核酸樹枝状アセンブリの数学モデルでは、幾つかの仮定が行われる。第１の仮定は、デンドリマモノマ全長マイナスハイブリッド形成部位の長さを理論的な球の半径に与えるものである。次に、モデルにおいて、各付加に関して、付加されるモノマはシェル層に位置すると仮定する。最後に、ｐＨ、温度及び塩濃度の影響は無視することができるとする仮定である。
【００４５】
核酸デンドリマの０番目の（開始）層
単一のモノマは、層番号ゼロとして定義される。
ｋ＝０
球の容積（０）＝（４／３）＊ｐ＊（半径）＾３
０番目の層の半径（０）は、モノマの長さの半分である。
即ち、球の容積（０）＝（４／３）＊ｐ＊（ｑｎｍ／２）＾３
層番号ゼロのシェルの容積（０）は、ゼロ層の球の容積に等しい。
層番号ゼロのＮＡの全容積（０）は、１つのモノマの容積に等しい。
即ち、ＮＡの全容積（０）＝ｓｎｍ＾３
層番号ゼロの付加されるＮＡ容積（０）は、ＮＡ全容積（０）に等しい。
【００４６】
核酸デンドリマの第１の層
ｋ＝１
一般に、層番号１において付加されるものは、開始モノマ当たりにつき利用することができるハイブリッド形成部位の番号に等しい。
半径（１）＝ｑ／２＋ｑ−ｒ
球の容積（１）＝（４／３）＊ｐ＊（ｑ／２＋ｑ−ｒ）＾３
シェルの容積（１）＝球の容積（１）−ｓ
ＮＡの容積（１）＝ｊ＊ｓ
ＮＡの容積の合計（１）＝（１＋ｊ）＊ｓ
一般化されたデンドリマ（ｋ＞０）のｋ番目の層
モノマの合計（ｋ）＝１＋（（ｊ＊（１−（ｊ−１）＾ｋ））／（２−ｊ）
付加モノマ（ｋ）＝ｊ＊（ｊ−１）＾（ｋ−１）
球の半径（ｋ）＝ｑ／２＋ｋ＊（ｑ−ｒ）
球の容積（ｋ）＝（４／３）＊ｐ＊（ｑ／２＋ｋ＊（ｑ−ｒ））＾３
シェルの容積（ｋ）＝（球の容積（ｋ））−（球の容積（ｋ−１））
ＮＡの容積の合計（ｋ）＝（モノマの合計（ｋ））＊ｓ
付加されたＮＡの容積（ｋ）＝（付加されたモノマ（ｋ））＊ｓ
【００４７】
核酸を連続して付加することにより球の表面が最終的に飽和されて、試薬の「膜特性」が生ずるとともに、付加された潜在的な核酸の容積が、利用することができる球の容積の増加よりも大きくなるものと考えられる。層１１に続いて、核酸は、全ての利用することができる表面容積の〜９０％を占めるが、これは８９９ｍｇ／ｍｌを越える近似密度を表している。デンドリマの表面における核酸の濃度は著しく高く、全ての核酸分子の大部分は相補的配列にハイブリッド形成する表面付近で自由であると考えられる。更に、球の核酸の１０サイクル（より少ないサイクルの方が所望の半透過性を有するが）を越える高濃度は、球形の樹枝状構造体への核酸の非特異的な吸収をなくすことができる。
【００４８】
最大で２０の連続するモノマの付加に関して生産される樹枝状核酸の予測されるパラメータが表１に示されており、これは核酸デンドリマに形成されるモノマの本発明による数学的処理である。層番号がより大きくなると、モデルはシェル層即ち表面層の核酸の飽和を明らかに越える。図３は、付加番号の関数としての容積の関係を示すグラフ図である。
【００４９】
核酸デンドリマモノマの核酸デンドリマへのアセンブリは、固体の支持体、即ち、蛍光ポリスチレンボール、ナイロン膜、ニトロセルロースなどのような水不溶性基体において行うことができる。コアのデンドリマモノマ「Ａ」は、固体の表面に固着した一重鎖核酸の開始層により置換される。選択される核酸の開始層は、上記したＢ’、Ｂ”、Ｃ’、Ｃ”モノマの一重鎖アームのどれに対しても相補的である。過剰の（Ｂ’＋Ｂ”）を用いたその後のハイブリッド形成、次いで行われる洗浄工程、その後の過剰の（Ｃ’＋Ｃ”）によるハイブリッド形成などにより、固体支持体に固着された半透過性の核酸表面が得られる。
【００５０】
核酸デンドリマの予測されるハイブリッド形成速度論
この場合も、特定の操作理論に拘束されるものではないが、ハイブリッド形成の妥当な反応速度に到達するうえでデンドリマにおいて必要とされるＤＮＡの量を、計算することができる。完全に変性したＤＮＡの再生の速度は、速度論的には二次元反応であり、ＤＮＡの再生速度は
ｋ２＝（（３ｅ＋５）ｘＬ＾０．５）／Ｎ  リットルモル−１秒−１
により近似的に与えられ、上記式において、Ｌ＝最も短い単一ストランドの長さであり、Ｎ＝ＤＮＡの複雑性、即ち、非反復塩基対の数である（J. Mol. Biol.、第３１巻、第３４９−３７０頁（１９６８年）に掲載のウエットマー(Wetmur)及びダビッドソン(Davidson)の論文）。核酸のアニーリングの予測速度は、樹枝状分子に適用すべきであるが、これは、ｋ２の実験値が剪断された及び剪断されていないバクテリオファージＴ４及びＴ７並びに核酸デンドリマの予測質量に対して匹敵しうる分子量を有するＥ．ｃｏｌｉＤＮＡに適用することができることが示されているからである。
【００５１】
一例として、１１０塩基モノマから構成される６層デンドリマは、１６０，２７０塩基対の合計に対応する１，４５７のモノマからなると考えられる。このサイズは、Ｔ７バクテリオファージＤＮＡの３９，９３６塩基対と対照をなすものである、即ち、６層デンドリマはＴ７ＤＮＡよりも約４ｘ大きい。これらのデンドリマは、検出されるべき単一の５０ヌクレオチド（ｎｔ）長さの配列ＤＮＡにハイブリッド形成するのに利用することができる２つのタイプの２，９１６一重鎖アーム配列、１，４５８アームを有する。
【００５２】
各反応により、同じ５０の塩基対が得られるので、Ｎ＝５０である。Ｌは、反応に関与する最も短い一重鎖領域の長さであり、この場合には、Ｌ＝５０である。かくして、速度定数は、
ｋ２＝３ｅ５＊５０＾０．５／５０＝４．２４ｅ＋４  Ｌモル＾−１秒＾−１
となる。反応は、（感度検出条件を模擬するために）ＤＮＡマトリックス濃度により駆動されると仮定される場合がある。サンプルの標的ＤＮＡの濃度を無視することができ、かくして、所望のアニーリングパラメータを有効にするのに必要とされるデンドリマの濃度を定めることができる。デンドリマの濃度が１ｍｇ／ｍｌ、即ち、３ｅ−６Ｍである場合には、ヌクレオチドの５０％、即ち、ｓｓアームの半分が反応に利用される。
一重鎖アームのＣ０＝３ｅ−６／２＝１．５ｅ−６モル
かくして、半反応時間は、ｔ１／２＝ｌｎ２／［４．２４ｅ４＊１．５ｅ−６］＝１１秒即ちｔ３／４＜０．５分となる。この計算は、ビーズの表面に共有結合される相補的配列に対するオリゴヌクレオチドのアニーリングの結果を正確に予測するために確認された。この計算は、デンドリマオリゴヌクレオチドの全てが反応に利用される（即ち速度が比例して小さくなる）と仮定するとともに、混合が完全である（即ち反応が迅速な均質反応からなり、次いでより緩慢な拡散制御反応となる）と仮定している。与えられた例の場合、即ち、１ｍｇ／ｍｌに等しいデンドリマ濃度の場合には、全ての可能なブリッジの７５％を超える部分が３０秒で形成されることになる。１ｍｇ／ｍｌは１ｎｇ／ｍｌと等しいので、５０ｍｌの反応は、５０マーの濃度とは無関係に、５０マー核酸分子の７５％捕捉に５０ｎｇのＤＮＡデンドリマだけを必要とする。
【００５３】
【表１】
0004221145.tif 000003
【００５４】
【略語の説明】
ＢＰ＝塩基対
ｃ０＝ゼロ時の濃度
ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸
ｄｓ＝二重鎖
ｌ＝リットル
ｌｎ＝自然対数
Ｍ＝モル
−マー(-mer)＝オリゴマ
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｌ＝ミリリットル
ＮＡ＝核酸
ｎｍ＝ナノメートル
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＲＮＡ＝リボ核酸
ｓｓ＝一重鎖
ｔ＝時間
ｍｇ＝マイクログラム
ｍｌ＝マイクロリットル
記号の説明
＊＝乗算
ｐ＝ｐｉ−３．１４１５９２６
＾＝べきへの持ち上げ
ｅ＝塩基１０べき指数
［］＝濃度
【００５５】
本発明の樹枝状ポリヌクレオチドは、米国特許第５，１７５，２７０号において主張されている組成物の製造及び米国特許第５，４８７，９７３号に記載されかつ主張されている検定において使用することができる。
【００５６】
【発明の効果】
産業上の利用可能性
本発明は、核酸及び抗原を含む、重要な種々の被分析体の検出のための検定において有用である。
【００５７】
本明細書において引用されている全ての特許及び非特許刊行物は、当業者の水準を示すものである。個々のそれぞれの刊行物または特許出願を引用してその説明に代えると特にかつ個別に明示されている場合と同様に、本明細書においては、これらの全ての刊行物及び特許刊行物を引用してその説明に代える。
【００５８】
本発明を特定の実施の形態について説明したが、これらの実施の形態は、本発明の構成及び利用性を単に例示するものである。従って、例示した実施の形態について数多くの変更を行うことができるとともに、特許請求の範囲に記載の本発明の精神と範囲とから逸脱することなく他の構成とすることができるものである。
【００５９】
【配列表】
0004221145.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  ａは、本発明の好ましい実施の形態、即ち、本核酸モノマを組み立てるのに使用する７つの独特の一重鎖核酸オリゴマを示す概略図である。実線は”＋”ストランド配列を示し、破線は”−”ストランド配列を示す。ｂは
核酸デンドリマアセンブリの構築ブロックとして使用されるヘテロダイマ（デンドリマモノマ）を示す。ヘテロダイマＡは、ヘテロダイマＢ’およびＢ”のアームがＡにアニーリングすることができるので、コアモノマである。次に、Ｃ’およびＣ”のアームがＢ’およびＢ”の３つのアームにアニーリングすることができる。
【図２】  ａは、イニシエータモノマが４つのＢタイプモノマにハイブリッド形成される１層核酸デンドリマを概略示する図である。ｂは、２層核酸デンドリマを概略示する図である。ｃは、３層核酸デンドリマを概略示する図である。ｄは、４層核酸デンドリマを概略示する図である。注：３及び４層デンドリマの付加容積は１及び２層デンドリマよりも比例して小さく示されることが必要である。
【図３】  好ましいマスターＤＮＡ配列から得られる２９塩基の長さを有するオリゴマ副配列のＧＣ含量を示す棒グラフである。
【図４】  好ましいマスターＤＮＡ配列から得られる４９塩基の長さを有するオリゴマ副配列のＧＣ含量を示す棒グラフである。
【図５】  「バブルウエスト」モノマ構造を示す概略図である。
【図６】  二重鎖核酸樹枝形状を示す図である。
【図７】  四重鎖核酸樹脂形状を示す図である。
【図８】  ４アームデンドリマモノマを利用したデンドリマのアセンブリに５つの鎖を利用することにより得られる立体拘束を示す図である。この構造体は、「核酸ツリー」即ち核酸の層からなるデンドリマであり、各層は、本明細書においてデンドリマモノマと云われている部分一重鎖のヘテロ複体である。所定の核酸デンドリマの最外層は、相補的核酸配列とハイブリッド形成することができる複数の一重鎖アームを有するものと考えられる。デンドリマモノマは、モノマの逐次付加により核酸からなる３次元構造を形成するという特性を有している。
【図９】  核酸の樹枝状成長を示すグラフ図であり、（＊）は球容積に対するシェル容積の比を示し、（◇）はｋ層により付加される容積に対するｋ−１層を通るデンドリマの全容積の比を示し、（Ｘ）は球の容積ｋに対する層ｋを通る樹枝状ＤＮＡの全容積の比を示し、（●）は層ｋのシェルの容積に対する層ｋにおいて付加される樹枝状ＤＮＡの容積の比を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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