(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）
【化１】
0004234799.tif 000010
（ここで、
Ｒ1 は水素原子であり且つＲ2 はＯＲ6 基であるか、又は
Ｒ1 はＯＲ6 基であり且つＲ2 は水素原子であるかのいずれかであり、Ｒ6 は１個以上のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜１２個の炭素原子を含有するアシル基又は水素原子を表わし、
Ｒ3 は１〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
Ｒ4 は１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
Ｒ5 はＲ6 と同一であっても異なっていてもよく、Ｒ6 と同じ意味を有し、
波線はＲ1 又はＲ2 がα又はβ位にあること及びＯＲ5 が２１Ｒ又は２１Ｓ位にあることを示す。）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ3 及びＲ4 がメチルである請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ1 が水素原子であり、Ｒ2 がヒドロキシル基である請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ｒ1 がヒドロキシル基であり、Ｒ2 が水素原子である請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
化合物名が
・［１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、又は
・［１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
であり、それらの立体異性体配置：１α−ＯＨ、１β−ＯＨ、６α−ＯＨ若しくは６β−ＯＨのいずれか単独の形態又はそれらの混合物の形態にある請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
エストロゲン化合物と請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物。
【請求項７】
１７β−エストラジオールと請求項５に記載の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）の化合物を製造するにあたり、次の一般式（II）
【化２】
0004234799.tif 000011
（ここで、Ｒ3 、Ｒ4 及び波線は前記の意味と同じ意味を有する。）の化合物の生物学的転化を糸状菌の培養によって行い、次いで適当ならば１−ヒドロキシル化化合物と６−ヒドロキシル化化合物との分離及び遊離ヒドロキシル基のエステル化を行うか、又は、１−ヒドロキシル化化合物と６−ヒドロキシル化化合物との分離を行わずに遊離ヒドロキシル基のエステル化を行うことを特徴とする、式（Ｉ）の化合物の製造法。
【請求項９】
糸状菌が下記の菌株：
クニンガメラ・バイネリ ＡＴＣＣ９２４４
モルチエレラ・イサベリナ ＮＲＬＬ１７５７又はＭＭＰ１０８
フザリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１４７１７
から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
式（II）の化合物がトリメゲストン：
［１７β−（Ｓ）］−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
であることを特徴とする、請求項８に記載の製造法。
【請求項１１】
糸状菌がクニンガメラ・バイネリ、モルチエレラ・イサベリナ又はフザリウム・ロゼウムであり、式（II）の化合物がトリメゲストンであり、これにより１−ヒドロキシル化及び６−ヒドロキシル化誘導体：
・［１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、及び
・［１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
を得、次いでこれらを分離することを特徴とする、請求項８に記載の製造法。
【請求項１２】
糸状菌がクニンガメラ・バイネリ ＡＴＣＣ ９２４４であり、式（II）の化合物がトリメゲストンであり、これにより１−ヒドロキシル化誘導体：
・［１α，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、又は
・［１β，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
を得ることを特徴とする、請求項８に記載の製造法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の一般式（Ｉ）の化合物からなる薬剤。
【請求項１４】
請求項５に記載の一般式（Ｉ）の化合物からなる薬剤。
【請求項１５】
請求項６又は７に記載の組合せからなる薬剤。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の薬剤の少なくとも１種を含有する製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ステロイド化合物に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な１又は６−ヒドロキシル化ステロイド、それらの製造法、それらの薬剤としての使用及びそれらを含む製薬組成物を提供することを目的とする。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明の主題は、次の一般式（Ｉ）
【化３】
0004234799.tif 000002
（ここで、
Ｒ1 は水素原子であり且つＲ2 はＯＲ6 基であるか、又は
Ｒ1 はＯＲ6 基であり且つＲ2 は水素原子であるかのいずれかであり、Ｒ6 は１個以上のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜１２個の炭素原子を含有するアシル基又は水素原子を表わし、
Ｒ3 は１〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
Ｒ4 は１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
Ｒ5 はＲ6 と同一であっても異なっていてもよく、Ｒ6 と同じ意味を有し、
波線はＲ1 又はＲ2 がα又はβ位にあること及びＯＲ5 が２１Ｒ又は２１Ｓ位にあることを示す。）
の化合物にある。
【０００４】
式（Ｉ）の化合物とは、その取り得る個々の全ての異性体又はそれらの異性体の混合物を意味するものとする。
【０００５】
１〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基とは、次の基：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘプチル、２−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、３−エチルペンチル、ｎ−オクチル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、３−メチル−３−エチルペンチル、ノニル、２，２−ジメチルヘプチル又はｎ−デシルを意味する。
【０００６】
１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基とは、次の基：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチルを意味する。
【０００７】
１〜１２個の炭素原子を含有するアシル基とは、次の基：ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、スクシニル、ピバロイル又はベンゾイルを意味する。
【０００８】
これらの基がハロゲン原子により置換されているときは、そらは好ましくは塩素、沃素又は弗素原子である。クロルアセチル、ジクロルアセチル、トリクロルアセチル又はトリフルオルアセチルが挙げられる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
第一の好ましい態様では、本発明の主題は、Ｒ3 及びＲ4 がメチルである式（Ｉ）の化合物にある。
第二の好ましい態様では、本発明の主題は、Ｒ1 が水素原子であり、Ｒ2 がヒドロキシル基である式（Ｉ）の化合物にある。
第三の好ましい態様では、本発明の主題は、Ｒ1 がヒドロキシル基であり、Ｒ2 が水素原子である式（Ｉ）の化合物にある。
【００１０】
第四の好ましい態様では、本発明の主題は、化合物名が
・［１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン（化合物Ａ）、又は
・［１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン（化合物Ｂ）
であり、それらの立体異性体配置：１α−ＯＨ、１β−ＯＨ、６α−ＯＨ若しくは６β−ＯＨのいずれか単独の形態で又はそれらの混合物の形態にある前記の式（Ｉ）の化合物にある。
【００１１】
また、本発明の主題は、式（Ｉ）の化合物の製造法にある。
【００１２】
本発明に従うこの製造法は、次の一般式（II）
【化４】
0004234799.tif 000003
（ここで、Ｒ3 、Ｒ4 及び波線は前記の意味と同じ意味を有する。）
の化合物の生物学的転化を糸状菌の培養によって行い、次いで適当ならば１−ヒドロキシル化化合物と６−ヒドロキシル化化合物との分離及び（又は）遊離ヒドロキシル基のエステル化を行うことを特徴とする。
【００１３】
当業者に知られた糸状菌のうちでも、特に下記の菌類が選択される。
【表１】
0004234799.tif 000004
【００１４】
菌株の出所
ＡＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州、米国。
ＭＭＰ：ミコセク・ドゥ・ミュゼーム・ディストワール・ナチュレル、パリ。ＮＲＲＬ：ノーザン・ユーチリゼーション・リサーチ・アンド・デベロプメント・デビジョン、ペオリア、イリノイ州、米国。
【００１５】
ヒドロキシル化の実施は、菌類の培養を使用するステロイドの微生物学的ヒドロキシル化を一般に利用する方法（“ステロイド及びアルカロイドの微生物学的転化”、Ｈ．イシズカ及びＡ．ナイトウ、発行所：東京大学印刷所、スプリンガー・フェルラーク、ベルリン、１９８１を参照。）に従って行われる。従って、最も好ましい発酵条件は、まず、一般的な普通の予備試験、例えば、栄養培地の最も望ましい選定、適当な基質溶媒、基質の濃度、温度、曝気、ｐＨ及び発芽の最適な期間のような技術条件、基質の添加並びに基質と微生物との接触のような予備試験において分析的なルートで、特に薄層クロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって決定される。
【００１６】
栄養培地１リットル当たりほぼ４０〜２，０００ｍｇの基質の濃度を使用するこが有利であることがわかった。ｐＨ値は、好ましくは５〜７程度の値に調節される。培地の温度は、２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３５℃である。曝気のためには、培地ブイヨン１リットル当たり毎分ほぼ１リットルの空気が提供される。基質の転化は、抽出された試料を薄層クロマトグラフィーを使用して又はＨＰＬＣを使用して分析することにより有利にモニターされる。一般に、２４〜１４４時間後に、十分な量のヒドロキシル化ステロイドが形成された。
【００１７】
本発明の製造法の生成物の単離、分離及び精製は、それ自体知られた態様で行われる。例えば、製造法の生成物は酢酸エチルのような有機溶媒により抽出し、抽出物を蒸発し、分離し、生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００１８】
本発明のさらに特定の主題は、糸状菌が下記の菌株：
【表２】
0004234799.tif 000005
から選択される前記の製造法にある。
【００１９】
さらに、本発明の特定の主題は、式（II）の化合物がトリメゲストン：
・［１７β−（Ｓ）］−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
である前記の製造法にある。
【００２０】
また、本発明の全く特定の主題は、糸状菌がクニンガメラ・バイネリ、モルチエレラ・イサベリナ又はフザリウム・ロゼウムであり、式（II）の化合物がトリメゲストンであり、これにより１−ヒドロキシル化及び６−ヒドロキシル化誘導体：
・［１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、及び
・［１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
を得、次いでこれらを分離することを特徴とする、前記の製造法にある。
【００２１】
さらに、本発明の全く特定の主題は、糸状菌がクニンガメラ・バイネリ  ＡＴＣＣ９２４４であり、式（II）の化合物がトリメゲストンであり、これにより１−ヒドロキシル化誘導体：
・［１α，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、又は
・［１β，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
を単独で又は混合物として得ることを特徴とする、前記の製造法にある。
【００２２】
遊離ヒドロキシル基の場合により行う次のエステル化は、ステロイドの化学において第二及び第三ヒドロキシル基をエステル化するのに普通に使用されている方法に従って行われる。適当なエステル化法としては、例えば、塩基性触媒、例えば、重炭酸ナトリウム若しくはカリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム若しくはカリウム、ピリジン、ルチジン、コリジン又は４−ジメチルアミノピリジンのような塩基の存在下にステロイドと酸無水物又はクロリドとを反応させることが挙げられる。
【００２３】
一般式（Ｉ）の化合物は、有用な薬理学的性質、特に黄体ホルモン様活性を有する。
さらに、これらの化合物は、エストロゲン、アンドロゲン、グルココルチコイド及びミネラロコルチコイド受容体に対して親和性を有しない。
【００２４】
一般式（Ｉ）の化合物は、黄体不全に起因する婦人科の障害：
・排卵障害に起因する月経の不規則、
・月経困難症、
・月経前症候群、
・乳房痛、
・線維腫、閉経障害の機能性出血及び月経過多、
・不妊症、
・卵巣の不活性による卵巣ジストロフィー
の治療に、又は乳房及び子宮の癌の治療に使用することができる。
【００２５】
一般式（Ｉ）の化合物とエストロゲンとの組合せは、新規であって、本発明の主題の一つを構成する。これは、閉経と関係するホルモン補充治療において、特に骨粗鬆症の予防に又は治療に有用性を有する。
好ましいエストロゲンのうちでも、１７β−エストラジオール及びそのエステル類、たとえばエストラジオールバレレート、カプリオネート、デカノエート及びアセテート、エチニルエストラジオール、エストロン、“エキニン起源”のエストロゲン、例えばプレマリン（登録商標）、又はこれらの化合物の組合せが挙げられる。
【００２６】
また、エストロゲンと一般式（Ｉ）の化合物との組合せは、避妊薬としての用途も有する。この場合に、好ましいエストロゲンは、エチニルエストラジオールである。
【００２７】
従って、本発明の主題は、一般式（Ｉ）の化合物からなる薬剤にある。
また、本発明の主題は、エストロゲンと一般式（Ｉ）の化合物との組合せからなる薬剤にある
さらに、本発明の特定の主題は、前記のような化合物Ａ及びＢからなる薬剤にある。
【００２８】
したがって、次の化合物：
・［１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン、又は
・［１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン
（これらの化合物は、それらの立体異性体配置：１α−ＯＨ、１β−ＯＨ、６α−ＯＨ若しくは６β−ＯＨのいずれか単独の形態又はそれらの混合物の形態にあり得る。）
は、１７−エストラジオールと組合せることができ、しかしてこれは本発明の特定の主題を構成する。
従って、本発明のさらに特定の主題は、このような組合せからなる薬剤にある。
【００２９】
有効薬量は、治療すべき疾病及び投与経路によって変わる。これは、例えば、成人の場合に指示に従って経口投与で１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇであろう。
【００３０】
本発明は、前記のような薬剤の少なくとも１種を活性成分として含有する製薬組成物まで及ぶ。
これらの製薬組成物は、消化器経路で、非経口的に又は局所経路で、例えば皮下経路で使用することができる。
これらの製薬組成物は、固体でも液体でもよく、人の医薬として慣用されている製剤形状で、例えば無味の若しくは糖衣錠剤、カプセル、顆粒、座薬、丸薬、注射用調合剤、軟膏、クリーム、ゲル、微小球、ナノスフィアー、インプラント、パッチの形状で提供できる。活性成分は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若しくは乳化剤、保存剤と配合することができる。
【００３１】
本発明に従う製造法の出発物質として使用される一般式（II）の化合物は、既知である（ヨーロッパ特許出願公開第０００７８２３号明細書）。
本発明に従う製造法の過程で使用される菌株も既知である。
【００３２】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、これを制限するものではない。
【００３３】
例１：１α−ＯＨ−トリメゲストンの産生／精製
蒸留水１リットル当たり、２０ｇのグルコース、５ｇのすい臓ペプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのモルトエキス及び２０ｇのバクトアガールよりなる固形栄養培地にクニンガメラ・バイネリ（Cuninghamella baineri)ＡＴＣＣ９２４４の凍結乾燥菌株を接種する。全体を加熱室において無菌条件下で２５℃で７日間インキュベートする。
７日後に、胞子を収穫する。次いで、これらの新鮮な胞子を使用して、２個の２リットルのエーレンメイヤーフラスコであってそれぞれにオートクレーブで３０分間滅菌した８００ｍｌの栄養溶液を入れたものに接種する。
この栄養培地は、９００ｍｌの蒸留水に対して１０ｇのコーンスティープ、２ｇのＮａＮＯ3 、０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇのＫＣｌを含有した。接種の時点で、無菌の燐酸塩緩衝溶液（４０ｍｌの水に２ｇのＫ2 ＨＰＯ4 及び１ｇのＫＨ2 ＰＯ4 を含有）、そして３０ｇのグルコースを含有する６０ｍｌの無菌の水溶液としての栄養補給物を添加する。
培養物を回転振盪機において２００ｒｐｍで撹拌しながら２７℃で発育させる。６５時間後に、４００ｍｇのトリメゲストンを５ｍｌの９９％エタノールに溶解してなる溶液をそれぞれのエーレンメイヤーフラスコに添加する。
【００３４】
使用した基質が全部転化した（７２時間の接触）後、インキュベート媒質をろ過し、次いでこのろ液を大過剰のＮａＣｌの添加により飽和させる。次いでＮａＣｌで飽和された溶液を２５０ｍｌの酢酸エチルを使用して撹拌しながら３回抽出する。ＭｇＳＯ4 で乾燥した後、抽出物を４０℃の浴温度で真空下に蒸発させ、９６５ｍｇの黄色油状物を得た。
この油状物を塩化メチレン／イソプロパノール混合物（９５：５）を使用して６０Ｈシリカゲルカラム（メルク社、７０〜２３０メッシュ）でクロマトグラフィーする。５個の主要画分を得た。化合物Ａの大部分を含有する２０９ｍｇの画分を、セミ分取高圧液体クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ）によりＣ１８結合逆転相でメタノール／水混合物（５０／５０）を使用して精製する。
４０℃の浴温度で溶媒を真空下に蒸発させた後、８４ｍｇの［１α，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン（化合物Ａ）を９６％よりも高いクロマトグラフィー純度で得た。
1Ｈ及び13ＣＮＭＲ分析は、後記の表１及び表２を参照されたい。
【００３５】
例２：６β−ＯＨ−トリメゲストンの産生／精製
蒸留水１リットル当たり、２０ｇのグルコース、５ｇのすい臓ペプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのモルトエキス及び２０ｇのバクトアガールよりなる固形栄養培地にモルチエレラ・イサベリナ（Mortierella isabellina）（ＮＲＲＬ１７５７）の凍結乾燥菌株を接種する。
全体を加熱室において無菌条件下で２５℃で７日間インキュベートする。
７日後に、胞子を収穫する。次いで、これらの新鮮な胞子を使用して、５個の２４０ｍｌのエーレンメイヤーフラスコであってそれぞれにオートクレーブで３０分間滅菌した１００ｍｌの栄養溶液を入れたものに接種する。
この栄養培地は、９００ｍｌの蒸留水に対して１０ｇのコーンスティープ、２ｇのＮａＮＯ3 、０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇのＫＣｌを含有した。接種の時点で、無菌の燐酸塩緩衝溶液（４０ｍｌの水に２ｇのＫ2 ＨＰＯ4 及び１ｇのＫＨ2 ＰＯ4 を含有）、そして３０ｇのグルコースを含有する６０ｍｌの無菌の水溶液としての栄養補給物を添加する。
培養物を回転振盪機で撹拌しながら２７℃で発育させる。６０〜６６時間後に、５０ｍｇのトリメゲストンを１ｍｌの９９％エタノールに溶解してなる溶液をそれぞれのエーレンメイヤーフラスコに添加する。
【００３６】
使用した基質が全部転化した（４８時間の接触）後、インキュベート媒質を布フィルターでろ過して発酵ブイヨンの菌糸を分離する。次いで、菌糸を蒸留水により十分に洗浄する。次いで、洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨンを一緒にする。洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨンとの混合物を大過剰のＮａＣｌの添加により飽和させる。
次いで、ＮａＣｌで飽和された溶液を２５０ｍｌの酢酸エチルを使用して撹拌しながら３回抽出する。抽出物を４０℃の浴温度で真空下に蒸発させる。
発酵から生じた第二生成物の抽出物を清浄にするために、塩化メチレン／メタール混合物（９５：５）を使用して６０Ｈシリカゲルカラム（メルク社、２３０〜４００メッシュ）でクロマトグラフィーを行う。得られた画分を油状物の外観を有する単一の画分として集める。
最後に、メタノール／水混合物（６０／４０）を使用してセミ分取高圧液体クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ）によりＣ１８結合逆転相で精製を行う。
有用画分の溶媒を４０℃の浴温度で真空下に蒸発させた後、２１ｍｇの［６β，１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン（化合物Ｂ）を９０％よりも高いクロマトグラフィー純度で得た。
1Ｈ及び13ＣＮＭＲ分析は、後記の表１及び表２を参照されたい。
【００３７】
例３：１α−ＯＨ−トリメゲストン及び６β−ＯＨ−トリメゲストンの産生／精製
それぞれが９０ｍｌの栄養溶液Ｎｏ．１を入れてある５個の５００ｍｌのエーレンメイヤーフラスコを用意する。この栄養培地は、１０ｇのコーンスティープ、２ｇのＮａＮＯ3 、０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇのＫＣｌ及び９００ｍｌとするに要する量の蒸留水を含有する。同様に、１０ｇのＫ2 ＨＰＯ4 、５ｇのＫＨ2 ＰＯ4 及び２００ｍｌにするのに要する量の脱塩水を含有する栄養溶液Ｎｏ．２を入れたショットフラスコを用意する。また、１５０ｇのグルコースと３００ｍｌにするに要する量の脱塩水を含有する栄養溶液Ｎｏ．３を入れたショットフラスコを用意する。実施するには、１５０ｇのグルコースを１５０ｍｌの脱塩水に強く撹拌しながら加温しながら溶解する。完全に溶解した後、容積を３００ｍｌの試験容積に調節する。５個のエーレンメイヤーフラスコ及び２個のショットフラスコをオートクレーブで１２１℃で３０分間滅菌する。
９０ｍｌの栄養栄養溶液Ｎｏ．１を入れてあるエーレンメイヤーフラスコのそれぞれに、予備培養物を播種する直前に、４ｍｌの栄養溶液Ｎｏ．２及び６ｍｌの栄養溶液Ｎｏ．３を無菌状態で添加する。次いで、１ｍｌの菌株フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum ）（ＡＴＣＣ１４７１７）の冷凍接種物により接種を行う。
５個のエーレンメイヤーフラスコを、２．５ｃｍの軌道寸法を有する軌道型振盪機において２７℃の温度で２００ｒｐｍで４８時間撹拌する。
【００３８】
次いで、この予備培養物を使用して、栄養溶液Ａ、即ち、３０ｇのコーンスティープ理カー、６ｇのＮａＮＯ3 、１．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０６ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．５ｇのＫＣｌ及び２６５０ｍｌとするに要する量の蒸留水を入れてある３リットルの発酵器に接種する。次いで、発酵器をオートクレーブで１２１℃で４５分間滅菌する。
次いで、３０ｍｌの溶液Ｂを入れた５００ｍｌの導入フラスコを準備する。これは、次のように調製する。１５０ｍｌの蒸留水を磁気撹拌機を収納した５００ｍｌのビーカーに入れ、加温しながら撹拌する。次いで、９０ｇのグルコースをゆっくりと導入する。完全に溶解した後、６ｇのＫ2 ＨＰＯ4 、次いで３ｇのＫＨ2 ＰＯ4 を添加する。蒸留水により容積（試験）を３００ｍｌにする。次いで、フラスコをオートクレーブで１２１℃で３０分間滅菌する。
播種する前に、３００ｍｌの溶液Ｂを発酵器に無菌状態で導入する。次いで、接種用フラスコを使用して５０ｍｌの予備培養物によって接種を行う。発酵は、２７℃の温度に、０．３バールの圧力、２００ｒｐｍの初期撹拌及び９０ｎｌ／ｈ、即ち０．５０ｖｖｍの曝気量で行う。酸素の分圧は５０％に調節し、ｐＨは１Ｍ硫酸を使用して２８時間まで６．５に調節する。次いで、生物学的転化の終了まで自由に発育させる。
【００３９】
４６時間の活発な増殖過程の後に、６ｇのトリメゲストンを７０ｍｌのアセトンに溶解し、次いでこれを無菌状態で細胞懸濁液に添加する。次いで、培養を同じ条件下で継続させる。
９６時間後に、発酵を止める。次いで、布フィルターによりろ過して発酵ブイヨンから菌糸体を分離する。次いで菌糸体を蒸留水で十分に洗浄する。次いで、洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨウンを一緒にする。次いで、ＮａＣｌにより飽和させた溶液を５００ｍｌの酢酸エチルで３回、次いで５００ｍｌの塩化メチレンにより１回抽出する。有機画分を集め、４０℃の浴温度で真空下に蒸留乾固させる。
得られた乾燥抽出物を、塩化メチレン／メタノール混合物（９５−５）を使用して、１０μの球状シリカで分取高圧液体クロマトグラフィーにより正常相で精製する。
いくつかの画分を得たが、そのうちの２個が化合物Ａ及び化合物Ｂを含有する。溶媒を４０℃の浴温度で真空下に蒸発させた後、次の物質：
・［１α，１７β−（Ｓ）］−１−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン／１７β−エストラジオール（組成物Ａ）、及び
・［６β，１７β−（Ｓ）］−６−ヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシ−１−オキソプロピル）−１７−メチルエストラ−４，９−ジエン−３−オン／１７β−エストラジオール（組成物Ｂ）
が９０％よりも高いクロマトグラフィー純度で得られた。
1Ｈ及び13ＣＮＭＲ分析は、後記の表１及び表２を参照されたい。
【００４０】
下記の表１は、トリメゲストンの２個の代謝産物の 1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3 、ｐｐｍで表わしたｄ、Ｈｚで表わしたＪ）を示す。この表は、得られた結果を要約する。記載した大部分の帰属化は、２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ又は１Ｈ−１３Ｃの相関関係の研究の後に行った。
【００４１】
【表３】
0004234799.tif 000006
【００４２】
下記の表２は、トリメゲストンの２個の代謝産物の13ＣＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示す。
【００４３】
【表４】
0004234799.tif 000007
【００４４】
本発明の化合物の薬理学的研究
１）ホルモン受容体に対する本発明の化合物の活性の研究
ヒト組替え型受容体（ＨＧＲ、ＨＰＲ、ＨＡＲ、ＨＭＲ、ＨＥＲ）を使用する。
【００４５】
ヒトプロゲステロン受容体（ＨＰＲ）
Ｎ．Ｒ．ウエッブ他により報告された一般的方法論（J. of Methods in Cell and Molecular Biology (1990), Vol.2, No.4, 173-188) に従って、昆虫−バキュロウイルスの細胞系において過剰発現させることによって組替え型ヒトプロゲストゲン受容体を得る。その応用がヒトホルモン受容体、例えばヒトグルココルチコイド受容体の発現について報告されている（Ｇ．スリニバサン他、Molecular Endocrinology (1990), Vol.4, NO.2, 209-216）。バキュロゴールド・トランスフェクション・キット（ファーミンゲン社、参照番号２１０００Ｋ）を使用してヒトプロゲストゲン受容体をコードする部位を含有するＰ．カストナー他により報告されたｃＤＮＡ断片（The EMBO Journal (1990), Vol.9, No.5, 1603-1614 ）をインサートし、相当する組替え型ウイルスを調製する。
【００４６】
この方法で得られた組替え型ウイルスを使用して、上記の知られた方法に従って、ＳＦ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）にプロゲストゲン受容体を発現させる。
２×１０7 個〜２．５×１０7 個のＳＦ９細胞を、１７５ｃｍ2 のファルコンフラスコにおいて１０％の胎児牛血清（ＦＳＣ）及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補給したＴＮＭ−ＦＨ培地で培養する。感染させ、次いで２７℃で４０〜４２時間インキュベートした後、細胞を１ｍｌの溶解用緩衝液（１）に採り、２回の凍結−融解サイクル（−８０℃／０℃）によって溶解させ、次いで４℃で２０９００Ｇで３０分間遠心分離する。組替え型ヒトプロゲストゲン受容体を含有する上層液を１ｍｌの量で液体窒素中に貯蔵する。
上層液を使用時に、０．１％のゼラチンを含有する１０ｍＭのトリス緩衝液（０．２５Ｍのサッカロース、ＨＣｌ、ｐＨ７．４）により希釈し、次いで増大する濃度の未標識プロゲステロン（０〜２５０００×１０-9Ｍ）か又は未標識被検化合物（１〜２５０００×１０-9Ｍ）のいずれかの存在下に一定濃度（Ｔ）のトリチウム化１７α，２１−ジメチル−１９−ノルプレグナ−４，９−ジエン−３，２０−ジオンと共に０℃で２４時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化１７，２１−ジメチル−１９−ノルプレグナ−４，９−ジエン−３，２０−ジオン（Ｂ）の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【００４７】
ヒトグルココルチコイド受容体（ＨＧＲ）
ヒトグルココルチコイド受容体をコードする部位を有するＳ．Ｍ．ホレンベルグ他により報告されたｃＤＮＡ断片（Nature (1985), Vol.318, No.19/26 635）を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ヒトグルココルチコイド受容体を含有するＳＦ９細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液（２）により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識デキサメタゾン（０〜１０００×１０-9Ｍ）か又は未標識被検化合物（１〜２５０００×１０-9Ｍ）のいずれかの存在下に一定濃度（Ｔ）のトリチウム化１１β，１７β−ジヒドロキシ−６，２１−ジメチルプレグナ−１，４，６−トリエン−２０−イン−３−オンと共に０℃で２４時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化１１β，１７β−ジヒドロキシ−６，２１−ジメチルプレグナ−１，４，６−トリエン−２０−イン−３−オン（Ｂ）の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【００４８】
ヒトエストロゲン受容体（ＨＯＲ）
位置４４０にグリシンを有する“野生型”のヒトエストロゲン受容体をコードするＬ．トーラ他により報告された発現ベクターＨＥＧＯ（The EMBO Journal (1989) Vol.8, No.7, 1981-1986）に記載されたｃＤＮＡ断片を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型エストロゲン受容体を含有するＳＦ９細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液（１）により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識エストラジオール（０〜１０００×１０-9Ｍ）か又は未標識被検化合物（１〜２５０００×１０-9Ｍ）のいずれかの存在下に一定濃度（Ｔ）のトリチウム化エストラジオールと共に０℃で２４時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化エストラジオール（Ｂ）の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【００４９】
ヒトアンドロゲン受容体（ＨＡＲ）
ヒトアンドロゲン受容体をコードする部位を含有するｃＤＮＡ断片を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ヒトアンドロゲン受容体を含有するＳＦ９細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液（３）により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識テストステロン（０〜１０００×１０-9Ｍ）か又は未標識被検化合物（１〜２５０００×１０-9Ｍ）のいずれかの存在下に一定濃度（Ｔ）のトリチウム化テストステロンと共に０℃で２４時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化テストステロン（Ｂ）の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【００５０】
ヒトミネラロコルチコイド受容体（ＨＭＲ）
ヒトミネラロコルチコイド受容体をコードする部位を含有するＥ．Ｅ．ボリウ他により報告されたｃＤＮＡ断片（Proc. Natl. Acad. Sci., (1991) Vol.88, 10681-10685）を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ミネラロコルチコイド受容体を含有するＳＦ９細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液（４）により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識アルドステロン（０〜１０００×１０-9Ｍ）か又は未標識被検化合物（１〜２５０００×１０-9Ｍ）のいずれかの存在下に一定濃度（Ｔ）のトリチウム化アルドステロンと共に０℃で２４時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化アルドステロン（Ｂ）の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【００５１】
細胞溶解用緩衝液
（１）トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８          ２０ｍＭ
ＥＤＴＡ                        ０．５ｍＭ
ＫＣｌ                          ４００ｍＭ
グリセリン                      ２０％
同時に添加
ＤＴＴ                          ２ｍＭ
ＰＩＣ* 混合物                  １％
（２）ＫＨ2 ＰＯ4 −ＮａＯＨ、ｐＨ７  ５０ｍＭ
グリセリン                      ２０％
同時添加
ＤＴＴ（ジチオトレイット）      ５ｍＭ
モリブデン酸ナトリウム          ２０ｍＭ
ＰＩＣ* 混合物                  ０．１％
（３）トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５      ２０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｈ2 Ｏ              １ｍＭ
グリセリン                      １０％
同時に添加
ＰＭＳ
（弗化フェニルメチルスルホニル）０．１ｍＭ
モリブデン酸ナトリウム          ２０ｍＭ
ＰＩＣ* 混合物                  ０．１％
（４）トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４      ２０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｈ2 Ｏ              １ｍＭ
グリセリン                      １０％
同時に添加
タングステン酸ナトリウム        ２０ｍＭ
ＰＩＣ* 混合物                  ０．１％
＊ＰＩＣ* 混合物：ロイペプチン、ペプスタチンＡ、アプロチニン、アンチペイン、キモスタチン（２．５μｇ／ｍｌの最終濃度の各ペプチド）
【００５２】
結果の表出及び計算方法
・相対的結合親和性（ＲＢＡ）の計算
相対的結合親和性（ＲＢＡ）の計算は全ての受容体につき同じである。
次の２つの曲線を描く。未標識の参照ホルモンの濃度の対数の関数としての結合トリチウム化ホルモンＢ／Ｂ0 の％、及び未標識の被検化合物の濃度の対数の関数としてのＢ／Ｂ0 。次の方程式：
【数１】
Ｉ50＝１００（Ｂ0 ／Ｂ0 ＋Ｂｍｉｎ／Ｂ0 ）／２、即ち
Ｉ50＝１００（１＋Ｂｍｉｎ／Ｂ0 ）／２＝５０（１＋Ｂｍｉｎ／Ｂ0 ）
の直線を決定する。
ここで、Ｂ0 ＝どの未標識化合物も存在しないときの結合トリチウム化ホルモンの濃度。
Ｂｍｉｎ＝最高濃度の未標識参照ホルモンの存在下での結合トリチウム化ホルモンの濃度。
直線Ｉ50と曲線との交点は、受容体へのトリチウム化ホルモンの特異的結合を５０％抑止する未標識参照ホルモンの濃度（ＣＨ）と未標識被検化合物を濃度（ＣＸ）を評価するのを可能にさせる。
試験化合物の相対的結合親和性（ＲＢＡ）は次式によって決定される。
【数２】
ＲＢＡ＝１００（ＣＨ）／（ＣＸ）
【００５３】
参照物質のエストラジオール、プロゲステロン、デキサメタゾン、テストステロン及びアルドステロンのＲＢＡは、任意に１００に等しいものとみなす。
得られたＲＢＡの結果を下記の表に示す。
【表５】
0004234799.tif 000008
ＲＢＡが０に等しい化合物は、２５００００ｎＭよりも大きいＩＣ50を有する。
【００５４】
・結論
化合物Ａ（１α−ＯＨ）はヒトプロゲステロン受容体に対して良好な相対的結合親和性を有するが、これはトリメゲストンの親和性よりも９倍弱い。他方、化合物Ｂ（６−ＯＨ）のみがこの受容体に対して中程度のＲＢＡを有する。
ヒトグルココルチコイド及びミネラロコルチコイド受容体に対して中程度のＲＢＡ並びにヒトアンドロゲン受容体に対して弱いＲＢＡを示すトリメゲストンとは対照をなして、これらの二つの化合物のみがこれらの受容体に対してＲＢＡを有しないか又は無視できるＲＢＡを有する。
ヒトエストロゲン受容体に対するＲＢＡは、トリメゲストン並びに化合物Ａ及びＢについて０である。
【００５５】
２）本発明の化合物の黄体ホルモン様活性の決定：ウサギでの子宮内膜の変化
ａ）方法
使用する動物は、生後４０〜４５日の性的未成熟の雌のウサギである。動物は、エストラジオール（ウサギ１頭当たり５μｇ／０．２ｍｌのコーンオイル溶液、１０％のエタノールを含有）により第１日から第５日まで皮下経路で毎日処理し、次いで被検化合物を第８日から第１１日まで投与する。第１２日目に、動物を犠牲にし、各動物から子宮角を切除し、組織学的研究のためにブアン氏液中で固定させる。固定させた後、試料を脱水し、包み込み、切断し、載せ、パラフィンを除き、次いで試料をヘマラム−エオシン−サフロンにより染色する。
【００５６】
ｂ）組織学
切片を光学顕微鏡の下で、まず、低倍率で切片の間に形態学的な変化が存在しないことを確認するために検査し、次いで子宮角のそれぞれについて子宮内膜の増殖（子宮レース）の半定量的な評価を０〜４（０．５の中間値として）のマックファイルスケールに従って行い、二つの数字を平均する。同様に、子宮角の肥大の程度を同じスケールに従って評価する。場合により、最高の倍率で粘膜又は子宮筋層の形態学的な観察を行うことができる。
【００５７】
ｃ）維持されたプロトコール
１−ＯＨ代謝産物（化合物Ａ）を皮下経路で１０、１００及び１０００μｇ／ｋｇの薬量で又は経口で１０００μｇ／ｋｇの薬量で試験した。また、６−ＯＨ代謝産物（化合物Ｂ）を皮下経路で１００、１０００及び１００００μｇ／ｋｇの薬量で試験した。対照例として、プロゲステロンを皮下経路で１００及び１０００μｇ／ｋｇの薬量で投与した。
【００５８】
ｄ）参照文献
Ｃ．クラウベルグ
“性ホルモン、特に黄体ホルモンの生理学及び病理学１：性的未成熟なウサギにおける黄体ホルモンのための生物学的試験”、Zetralbl. Gynakol.,1930, 54, 2757-70
Ｍ．Ｋ．マックファイル
“プロゲスチンの検定法”、J. Physiol.(London)、 1934, 83, 145-56
【００５９】
注：トリメゲストンは、この試験において、１μｇ／ｋｇの薬量から始まって黄体ホルモン様活性を、また経口投与で３及び１０μｇ／ｋｇの薬量で並びに皮下経路で３μｇ／ｋｇの薬量で強い活性を有する。他方、子宮レースへのプロゲステロンの最高活性は皮下経路で１０００μｇ／ｋｇに位置している（４のマックファイル指数）。
【００６０】
結果
得られた結果を以下の表に示す。
【表６】
0004234799.tif 000009
平均は子宮レースについて得た（マックファイル指数）。
【００６１】
結論
このクラウベルグ−マックファイル試験は、１ｍｇ／ｋｇで化合物Ｂについて良好な黄体ホルモン様活性を示す（マックファイル指数：３．８）。
同様に、化合物Ａは、０．０１ｍｇ／ｋｇの薬量から始まって活性であり（マックファイル指数：３．８）、１ｍｇ／ｋｇの薬量で経口投与で皮下経路よりも良好な活性を表わす（マックファイル指数は３．８に対して４である。子宮角の強い肥大）。
さらに、子宮の切片の組織学的観察は、形態学的な異常を示さない。