(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットの複合体から成り、上記ＲＮＡサブユニットが、ステム部分を形成するペプチド結合領域と、ペプチド結合領域に挟まれた中央ループ部分を形成する基質結合領域とを含んでおり、当該基質結合領域にランダムな塩基配列が導入されていることを特徴とする、リボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項２】
ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域がヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵素（Ｒｅｖ）応答エレメント（ＲＲＥ）由来であり、ペプチドサブユニットがＲｅｖ由来であることを特徴とする、請求項１に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項３】
ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列：
ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc
（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０の整数である）を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項４】
塩基配列において、「n」が２０であることを特徴とする請求項３に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項５】
(N)nが以下の塩基配列：
5'-nguguannnnnnnuanncun-3'
から成ることを特徴とする請求項４記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項６】
ペプチドサブユニットが以下の１７個のアミノ酸から成るアミノ酸配列：
ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６
（アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択される一種類のアミノ酸を示す）
を含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項７】
ペプチドサブユニットが以下のアミノ酸配列：
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ
を含むことを特徴とする、請求項６記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリー。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリーを製造する方法であって、ステム部分を形成するペプチド結合領域と、該ペプチド結合領域に挟まれた中央ループ部分を有する基質結合領域とが結合したＲＮＡサブユニットにおいて、上記中央ループ部分にランダムな塩基配列を導入し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとの複合体を形成させたライブラリーを作成することから成る、リボヌクレオペプチドリセプターライブラリーの製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターライブラリーであって、ステム部分を形成するペプチド結合領域と、該ペプチド結合領域に挟まれた、ランダムな塩基配列が導入された中央ループ部分を有する基質結合領域とが結合したＲＮＡサブユニットと、ペプチドサブユニットとの複合体を形成させたライブラリーから、インビトロセレクション法によって、該複合体と目的の基質を反応させた後に該基質に対する結合能を有する複合体を選択することから成る、リボヌクレオペプチドリセプターの製造方法。
【請求項１０】
選択された複合体からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡを逆転写反応によりＤＮＡに変換し、これをＰＣＲにより増幅させることにより新たなＲＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットに基づき、再び、ペプチドサブユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法によって該基質に対する結合能を有する複合体を選択する操作を繰り返すことによって、該基質に対するより高い親和性を有する複合体を得ることから成る、請求項９に記載のリボヌクレオペプチドリセプターの製造方法。
【請求項１１】
基質が固定化された樹脂を使用して、複合体と基質との反応を行うことを特徴とする、請求項９又は１０に記載のリボヌクレオペプチドリセプターの製造方法。
【請求項１２】
基質がアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）であることを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターの製造方法。
【請求項１３】
請求項９ないし１２のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターの製造方法により製造された、ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットの複合体から成るリボヌクレオペプチドリセプターであって、ＲＮＡサブユニットの基質結合領域とペプチドサブユニットとによって基質と特異的に結合する領域が形成され、上記ＲＮＡサブユニットが、ＨＩＶの逆転写酵素（Ｒｅｖ）応答エレメント（ＲＲＥ）由来のステム部分を形成するペプチド結合領域と、ペプチド結合領域に挟まれた中央ループ部分を形成する基質結合領域とを含んでおり、上記ペプチドサブユニットがＲｅｖ由来であることを特徴とする、リボヌクレオペプチドリセプター。
【請求項１４】
ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列：
ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc
（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０の整数である）を含み、かつペプチドサブユニットが以下の１７個のアミノ酸から成るアミノ酸配列：
ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６
（アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択される一種類のアミノ酸を示す）
を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のリボヌクレオペプチドリセプター。
【請求項１５】
前記ペプチドサブユニットが以下のアミノ酸配列：
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ
を含むことを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のリボヌクレオペプチドリセプター。
【請求項１６】
前記ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列：
ggucugggcgca-gguguacuggggguauucuc-ugacgguacaggcc
から成り、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）結合能を有することを特徴とする、請求項１３ないし１５のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプター。
【請求項１７】
請求項１３ないし１６のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプターを含むことを特徴とする、リセプター機能を有するドメイン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い活性及び基質選択性を有し、任意の基質に対する結合部位を作成することが可能なリボヌクレオペプチド複合体である、リボヌクレオペプチドリセプターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内では酵素により多くの化学反応が温和な条件のもとで、基質特異的に効率よく進行している。この優れた機能を人工的に構築して「任意の基質に対して、望み通りの化学反応を行う」ことは、化学・生物学領域における非常に大きな目的である。
【０００３】
しかしながら、天然の酵素に匹敵する機能を作り出すのは難しく、タンパク質や核酸から成る酵素の三次元構造が数多く解明されて原子レベルで構造と機能を議論できるようになってきた現在においても、望み通りの機能を持った三次元構造体の一般的な構築法は確立されていない。
【０００４】
酵素反応の特徴としては、▲１▼基質特異的であること、▲２▼温和な条件で反応が進行すること、そして▲３▼触媒的に機能することが挙げられるが、これらの機能を支えているのが酵素の「活性中心」である。活性中心は安定な三次元構造をもったドメインの中にあり、基質のかたちに適合し、化学反応を効率よく進行させるための官能基が配置されていると同時に、化学反応の進行に従って変化しうる柔らかな構造により形成されている。
【０００５】
即ち、精密な分子認識能を持つ反応場を反応の各ステップで最適化した柔軟性のある立体構造を設計することが人工的に酵素を作製するための必要条件であると考えられる。
【０００６】
天然の酵素では限られたパーツ（アミノ酸・核酸）を用いて、多くの官能基と疎水的な部分からなる活性中心を進化させてきたが、「多様な分子種の中から目的に応じた最適なものを選び出す」方法は、今では生物の進化に任せて何億年もかけなくとも実験室で実現可能な手法になっている。
【０００７】
しかしながら、例えば無作為に100アミノ酸をつなぎあわせたタンパク質の混合物（約103000種類）から望みの機能を持ったものを選び出すのは非効率的な方法である。そこで、「活性中心のおおまかなかたち」は既知の三次構造を利用してコンピューターにより分子をデザインする Structure−based design の手法で設計したのち、構造ドメインの一部を多様化させた分子種（ライブラリー）中から目的の機能をもった分子を選び出すコンビナトリアルな手法を組み合わせる、という方法が人工酵素を作る上で有効である。
【０００８】
したがって、人工酵素をつくるための第一段階として、酵素の活性部位をはじめとする既知のタンパク質や核酸の立体構造をもとにしながら、安定な三次元構造を形成する新しい活性中心の前駆体、即ち、「機能性ドメイン前駆体」を持った機能性ドメインのデザインが重要である。
【０００９】
コンピューターによるデザイン (Structure−based Design) を用いると、望みの機能を持った安定な三次元構造の前駆体を設計することは可能である。しかしながら、前駆体の機能を合目的に最適化していくために、機能性ドメイン前駆体には予めいくつかの特性を持たせておくことが必要となる。
【００１０】
即ち、機能性ドメインへと変換していくためには機能性ドメイン前駆体は協同性を発揮するために柔軟な構造をとり得ること、そしてコンビナトリアルな手法によって多様な分子種を作製できることが必要である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに、化学反応中間体の類似化合物に対するモノクローナル抗体を利用する抗体触媒法や、RNA分子にコンビナトリアルな手法を応用するRNAアプタマー法を用いて多くの人工リセプターや人工酵素が作製されてきた。しかしながら、これらは天然リセプターや酵素に比べて低い活性しか示すことが出来なかった。又、いずれの場合も望みの基質に対して反応を行う人工酵素を作製するための一般的手法としては用いることができない。
【００１２】
そこで、本発明者は、これまでの人工酵素設計では着目されなかった天然の酵素の特徴の一つである「協同性の発揮」に注目して、複数のサブユニットからなる機能性ドメインを合目的に設計し協同性を発揮することにより、より効率的に目的とする基質に対して高い分子認識能を提供する分子認識場を作製することに成功し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は、ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットの複合体（リボヌクレオペプチド）から成るリボヌクレオペプチドリセプターに係る。
【００１４】
ＲＮＡサブユニットは、ペプチドサブユニットと特異的に相互作用して結合するペプチド結合領域、及び基質と特異的に結合する領域を形成する基質結合領域を含むものである。
更に、本発明のリボヌクレオペプチドリセプターにおいて、ＲＮＡサブユニットの基質結合領域とペプチドサブユニットの両者によって基質と特異的に結合する領域が形成されていることが好ましい。
【００１５】
ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域及びペプチドサブユニットは、ＲＮＡとペプチドとの空間的配置、分子間の相互作用様式が構造解析により既に解明されているものから、目的とする基質の種類などに基づき、当業者が適宜選択することができる。
【００１６】
一方、ＲＮＡサブユニットの基質結合領域は、ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域とペプチドサブユニットとの特異的な相互作用に影響を与えないような塩基配列を選択する。
【００１７】
例えば、ＲＮＡサブユニットの好適例として、ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡがある。特に、以下の塩基配列：
ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc
（塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０の整数、好ましくは、２０である）を含むＲＮＡを挙げることができる。
【００１８】
塩基数が２０である(N)nの例として、以下の塩基配列を上げることが出来る。
（１）5'-nguguannnnnnnuanncun-3'
（２）5'-uggaauggcguacuccnnnn-3'
（３）5'-nnuugucnngugguannnnn-3'
上記塩基配列の一端または両端に、ペプチドサブユニットとの相互作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及び数の塩基を付加することも可能である。
【００１９】
例えば、ペプチドサブユニットの好適例として、上記ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡサブユニットと組み合わせて使用できる、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）由来のペプチドを挙げることが出来る。特に、以下の１７個のアミノ酸から成るアミノ酸配列：
ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６
（アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択されるアミノ酸を示す）
を含むペプチドが好ましい。
上記アミノ酸配列の一端または両端に、ＲＮＡサブユニットとの相互作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及び数のアミノ酸又は酢酸残基（Ａｃ）を付加することも可能である。
【００２０】
アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）結合性である本発明のリボヌクレオペプチドリセプターの一例としては、以下の塩基配列を有するＲＮＡサブユニット：
ggucugggcgca-gguguacuggggguauucuc-ugacgguacaggcc
、及び、以下のアミノ酸配列を有するペプチドサブユニット：
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ
が好ましい。
【００２１】
本発明は、又、インビトロセレクション法を利用した、本発明リボヌクレオペプチドリセプターの製造方法に係る。
特に、ペプチド結合領域とランダムな塩基配列を有する基質結合領域が結合したＲＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法によって、該複合体と目的の基質を反応させた後に該基質に対する結合能を有する複合体を選択することから成る、リボヌクレオペプチドリセプターの製造方法に係る。
【００２２】
本発明の製造法において、選択された複合体からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡを逆転写反応によりＤＮＡに変換し、これをＰＣＲにより増幅させることにより新たなＲＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットに基づき、再び、ペプチドサブユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法によって該基質に対する結合能を有する複合体を選択する操作を繰り返すことによって、基質に対するより高い親和性を有する複合体を得ることが出来る。
【００２３】
基質としては任意の物質を使用することが可能であり、例えば、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）等の生体内の重要な代謝反応等に関わる分子を挙げることが出来る。  このような基質と複合体との反応系及びその反応条件等は、それらの種類等に応じては当業者が適宜選択することが出来る。
【００２４】
例えば、基質に結合した複合体を選択し、そこからＲＮＡを回収する等の操作が容易と成るために、アガロース等のに公知である適当な樹脂に該基質が固定化された基質状態で複合体との反応を行うことが好ましい。
【００２５】
本発明方法に使用する転写反応、逆転写反応、ＰＣＲ等の各反応における手順及び反応条件は当業者には周知のものである。
【００２６】
更に、本発明は、上記リボヌクレオペプチドリセプターを含む機能性ドメイン、及び、該リセプターを基質結合部位として有する人工酵素にも係る。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明において、任意の基質認識能および化学反応性をもつ人工酵素の一般的な設計法を確立する上での第一段階の目標として、複数のサブユニットからなり、基質結合部位として機能するリボヌクレペプチドリセプターを作製する。空間的配置、分子間の相互作用様式が、構造解析により解明されたＲＮＡとペプチドの複合体をもとに、本発明のリボヌクレオペプチドを構成する複合体ＲＮＡ及びペプチドを夫々のサブユニットとして設計する。
【００２８】
ペプチドとの特異的な結合に影響が及ばないと推定されるＲＮＡの領域にランダムな塩基配列を導入し、この塩基配列を基質との結合領域としたＲＮＡ分子を第一のサブユニットであるＲＮＡサブユニットとする。次に、ＲＮＡとの結合部位を保存しながら基質と相互作用しうるようにデザインしたペプチドを第二のサブユニットであるペプチドサブユニットとして合成し、ＲＮＡサブユニットとの複合体（リボヌクレオペプチド）を形成させる。
【００２９】
ランダムなＲＮＡ塩基配列部分により多様性のあるリボヌクレオペプチドのライブラリーの中から、インビトロ（in vitro）セレクション法を用いて、例えば、ＡＴＰ(アデノシン５'−３リン酸) のような、目的の基質に対し結合能を有するリボヌクレオペプチド分子を選択し、これらを増幅することで新たなリボヌクレオペプチドライブラリーを作製する。このようにして、多種類の分子種から選択を繰り返すことで合目的に、目的の基質に対してより選択的に結合する結合能の高いリボヌクレオペプチド複合体を選択することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】
本発明のリボヌクレオペプチドレセプタ−の調製
ＲＮＡ−ペプチド複合体の設計は、ＲＮＡとペプチドの空間的配置と相互作用様式がＮＭＲ構造解析により解明されたＨＩＶ RevペプチドとRRE (Rev Response Element) ＲＮＡとの複合体（Battiste, J. L.; Mao, H.; Rao, N.S.; Tan, R.; Muhandiram, D. R.; Kay, L.E.; Frankel, A. D.; Williamson, J. R. Science 1996, 273, 1547−1551）を基にして行った。以下に記載するようにＤＮＡライブラリー及びＲＮＡライブラリーを調製し、ペプチドとの特異的な結合に影響を及ぼさないと推定されるＲＮＡ領域に２０塩基のランダムな塩基配列が導入された、ＲＮＡサブユニットを作成した。
【００３２】
ＤＮＡライブラリ−の調製
２０塩基のランダム領域を含んだ鋳型ＤＮＡ（temp−01：5'-ggaataggtctgggcgca-(N)２０-tgacggtacaggcgaaag-3'）、プライマーrev−01 (5'-ctttcggcctgtaccgtca-3')を含む溶液をアニーリングした後、Klenowポリメラーゼにより２本鎖ＤＮＡを調製した後、プライマーfor−01 （5'-tcaatacgactcactataggaataggtctgggcgca-3'） とプライマーrev−01を用いてＰＣＲによりプロモーターを含むＤＮＡライブラリーを調製した。ＰＣＲ反応液はフェノール−クロロホルム処理により除タンパク、酢酸アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、ＴＥに溶解し、ＮＩＣＫカラム（ファルマシア社）を用い、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを除去し精製した。
【００３３】
ＲＮＡライブラリ−の作製
こうして得られたdsＤＮＡライブラリ−を鋳型としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写反応を行った。Epicentre社のキット（AmpliScribe T7 Transcription Kits）のプロトコ−ルに従い、1 μｇ の鋳型dsＤＮＡを用い37℃、３時間反応させた。37℃、15分間のＤＮＡse処理後フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿、ＮＡＰ−５カラムを用いて精製し、5'-ggaauaggucugggcgca-(N)２０-ugacgguacaggccgaaag-3'を得た。１００μＭとなるように20ｍＭ  Tris−HCl （ｐＨ７．６）、150 ｍＭ  ＮａＣｌを含んだバッファーに希釈し80 ℃３分加熱後２時間かけてフォールディングさせた。
【００３４】
次に、ＲＮＡとの結合部位を保存しながら基質と相互作用しうるようにデザインしたペプチドを第二のサブユニットとして合成し、ＲＮＡサブユニットとの複合体（リボヌクレオペプチド）ライブラリーを形成させた。
尚、上記ペプチドとしては、天然のＨＩＶ Revタンパク質がＲＲＥ配列へ結合するために必須である34から50番目のアミノ酸をとりだし、化学合成により作成したものを使用した。また、ペプチドの安定性を向上させるため、Ｎ末端はアセチル化し、Ｃ末端はアミド化した。以上の化学合成反応は当業者に周知の方法で行うことが出来る。
【００３５】
In vitro selection 法
次に、インビトロセレクション法（Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818−822) を用いて本発明のリボヌクレオペプチドリセプターを選択した。
インビトロセレクション法は20塩基のランダムなＲＮＡ塩基配列部分からなるＲＮＡ  （RREN20）とＲＥＶペプチドを用いて作製したリボヌクレオペプチドライブラリーの中から、ＡＴＰが固定化された樹脂に結合するリボヌクレオペプチドを選択し、それを回収し増幅した後、ふたたび選択する、という方法をとった。
【００３６】
回収したＲＮＡ分子は逆転写反応によりＤＮＡ分子に変換し、さらにＰＣＲ反応により増幅した後、転写反応により新たなＲＮＡプールを作製し、これをもとにして新たなリボヌクレオペプチドライブラリーを作成し、再び、ＡＴＰに対するインビトロセレクション法を用いて、ＡＴＰに対し選択的に結合するリボヌクレオペプチドリセプターを選択した。ＡＴＰに対し、このようなインビトロセレクション法のサイクルを繰り返すことにより、リボヌクレオペプチドライブラリーについて、ＡＴＰに対する親和性の増強が認められた。尚、インビトロセレクション法の具体的な手順及び反応条件は以下の通りである。
【００３７】
結合実験には４％  beadedアガロース固定されたＡＴＰ樹脂（2.6 μmol/ml樹脂容量）と、４％  beadedアガロース固定されたグルコース樹脂（0.147 μmol/ml樹脂容量）を用いた。樹脂はあらかじめ、結合バッファー（10 ｍＭ  Tris−ＨＣｌ ｐＨ７．６、100 ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に平衡化した。ＡＴＰの糖部分に結合する複合体を予め除去するためのグルコースプレセレクションとして50 μｌ容量のグルコース樹脂に、10μＭのＲＮＡ（ＲＮＡサブユニット）、15μＭ  ac−Rev−am （Ac−ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ−NH２） （ペプチドサブユニット）を加え氷上で30分時々攪拌しながら結合させた。反応後、上清を50μｌ容量のＡＴＰ樹脂に加え、時々攪拌しながら氷上で30分結合させた。結合反応後上清を除いた後、300 μｌの結合バッファー（ペプチド存在下選択を行ったものは１μＭ Revペプチドを含んだ結合バッファー）で３回洗浄した。固定化されたリガンドに結合したＲＮＡは、10ｍＭ  ＡＴＰを含んだ結合バッファー100μｌで溶出させこれを３回繰り返した。
【００３８】
リボヌクレオチド複合体を300 mM NaCl を含んだ結合バッファ−に溶解した後、フェノ−ル抽出を行ない、ＲＮＡサブユニットを分離・単離した。こうして回収したＲＮＡは10μｌ  TEに溶解し、1.5μｌのＲＮＡを鋳型として、プライマーrev−01とのアニーリングについては80 ℃３分加熱後30分かけるところ以外はPromega社のキット（Reverse Transcription System）のプロトコールに従い、逆転写反応（42℃、30分間反応）を行った。反応液を99℃５分間加熱処理し逆転写酵素を失活させた後、反応液の一部について94 ℃ 30sec、55 ℃ 30sec、72 ℃ 1minの条件でＰＣＲを行い、５サイクル毎に反応液を分取し、８％ PAGE により増幅ＤＮＡ量を分析した。PAGEでの分析により、指数的にＤＮＡの増幅が確認されるサイクル数でＰＣＲを行い、dsＤＮＡを精製し次のサイクルに用いた。
【００３９】
クローニングおよび塩基配列決定
［制限酵素認識部位付加用ＰＣＲ］
逆転写−ＰＣＲ反応により得られたＤＮＡをBamHI、EcoRI認識領域を含むように設計したＰＣＲプライマー（for−02：5'-gcgggatcctttcggcctgtaccgtca-3'、rev−02：5'-cggaattctaatacgactcactatagg-3'）により増幅した。
ＰＣＲ反応液は、フェノール−クロロホルム処理により除タンパク、酢酸アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、EcoRI反応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断した。反応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパクした後、エタノール沈殿により精製した。
［クローニング用ベクターの調製］
pUC19 (10μｇ)をEcoRI反応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断した。反応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパク後、エタノール沈殿により精製した。
［ライゲーションと形質転換］
BamHI、EcoRIにより切断したpUC19 にクローニング用インサートＤＮＡをモル比で３倍量加え、TaKaRaライゲーションキットver.1のプロトコールに従い16℃、30分間ライゲ−ションを行った。反応液を直接ＤＨ５αコンピーテントセル（ライブラリーエフィシエンシーGibco BRL）に加え、プロトコールに従い形質転換を行った。
【００４０】
シークエンスはＡＢＩのBigDyeTerminator法を用い、キットのプロトコールに従いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサンプルからの未反応ddNTPsの除去にはCTAB（cetyl−trimethyl ammonium bromide）沈殿法を用いた。
【００４１】
【実施例２】
ＡＴＰとリボヌクレオペプチドリセプターの結合試験
(1)各ＲＮＡクローンの調製
クローニングし、配列解析を行ったプラスミドＤＮＡ１ngを鋳型として、Ｔ７プロモーターを含んだプライマーを用いてＰＣＲにより転写用の２本鎖ＤＮＡを増幅し（ＰＣＲ反応は94 ℃、30 sec、55 ℃、30 sec、72 ℃、1 minの条件で30サイクル行った）、鋳型ＤＮＡを調製したのち前述のプロトコールに従ってＲＮＡを転写精製して実験に用いた。
【００４２】
(2)結合試験（各種ペプチド）
樹脂50μｌを結合バッファー（10ｍＭ Tris−HCl, 100 ｍＭ ＫＣｌ,5 ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ７．６）で平衡化し、10％  DMSO存在下[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ Ligase(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各RNA10 μＭ、ペプチド15 μＭの条件で結合試験を行った。結合反応はＲＮＡ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキュベート後、300 μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回洗浄した後150 μｌ 10ｍ Ｍ ＡＴＰを含む１×結合バッファーで３回溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの放射活性とトータルＲＮＡの放射活性との比から結合活性（％）を算出した。
【００４３】
ペプチド存在下に９回の選択を行ったＲＮＡの配列解析を行ったところ、得られたＲＮＡ配列は３種類の相同性の高い配列 (class I, II, III) が認められた。
これらを以下の表１に示した。尚、表１の各配列において、ハイフン「−」で示された部分は、クローン０２の塩基と同一の塩基である為省略したものである。
【００４４】
【表１】
0004226810.tif 000002
【００４５】
各クラスのＲＮＡについてリボヌクレオペプチド複合体を形成させＡＴＰとの結合活性を評価した結果によれば、上記の各クラスごとにＡＴＰ結合におけるペプチド分子の影響は異なるものであった。即ち、class II, III のＲＮＡについてはペプチド非存在下についてもＡＴＰ結合活性を示したが、class IのＲＮＡを含んだリボヌクレオペプチド複合体については、ペプチド存在下についてのみＡＴＰ結合活性を示したことから、class I のＲＮＡにおいてはＲＮＡ分子とペプチド分子によりＡＴＰに対する基質結合領域が形成されたことが示唆された。
【００４６】
具体的には、class I に属するクローン02の結合活性はペプチド非存在下1.2±0.1%、ペプチド存在下20.1±4.7%であった。class II に属するクローン06の結合活性はペプチド非存在下28.4±2.1%、ペプチド存在下21.6±1.2%であった。class III に属するクローン30の結合活性はペプチド非存在下17.0±2.4%、ペプチド存在下25.6±3.3%であった。同様の条件で、すでに報告されているＡＴＰアプタマーの解離定数は３μＭであり、樹脂に対する結合（％）が40％であったことから、class IリボヌクレオペプチドのＡＴＰに対する解離定数は約10μＭであると考えられる。
【００４７】
（3）競合試験（ＡＴＰ誘導体）
次に、ＡＴＰへの選択性を評価する目的で結合系にＮＴＰを添加し競合試験を行った。樹脂50μｌを結合バッファー（10ｍＭ Tris−HCl, 100ｍＭ KCl, 50ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ7.6）で平衡化し、[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ Ligase(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各ＲＮＡ10μＭ、ペプチド15μＭの条件で結合試験を行った。あらかじめ中性になるように調製したＡＴＰ誘導体を添加し、結合反応はＲＮＡ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキュベ−ト後、300μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回洗浄した後150μｌ 10ｍＭ ＡＴＰを含む１×結合バッファーで３回溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの放射活性とトータルＲＮＡの放射活性との比から結合割合（％）を算出した。
【００４８】
その結果を以下の表２に示す。ＧＴＰに関しては20ｍＭで白濁が起こり10ｍＭまでしか評価できなかった。ＡＴＰ については濃度の増加に応じて競合阻害が起こったが、ＣＴＰ、ＵＴＰについては用いた濃度範囲で競合阻害は認められず、いずれのクラスのリボヌクレオペプチドリセプターについてもＡＴＰに対して選択的に結合することがわかった。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
【発明の効果】
本発明のリボヌクレオペプチドリセプターにおいては、機能性ドメインの前駆体として三次元構造が明らかになっている「ＲＮＡ−ペプチド複合体」を利用している。こうして得られた本発明のリボヌクレオペプチドリセプターは、▲１▼二つのサブユニット（ＲＮＡとペプチド）を組み合わせることにより柔軟な構造が形成され、協同性の発揮が期待される、▲２▼ＲＮＡ、ペプチド両サブユニット共に化学的もしくは分子生物学的にライブラリー化できる、▲３▼非天然アミノ酸を導入することが容易である等の点から、理想的な機能性ドメイン前駆体であるのみならず、多様な分子種を作製して望みの機能性ドメインへと発展させることが可能である。
【００５１】
本発明を利用することによって、コンビナトリアルな手法を多段階に用いて、例えば酵素反応の出発物質と反応中間体に対しては親和性が高く、生成物に対しては親和性が低い、という特性がある分子種をＲＮＡ−ペプチド複合体ライブラリーから選び出すことが出来るため、より高機能な人工酵素が作製できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のリボヌクレオペプチドリセプターの基本骨格を示す。
ＲＮＡの塩基配列は、例えば、5'-ggucugggcgca(N)２０ugacgguacaggccであり、図１のＲＮＡ中、黒い部分がＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃすべての塩基からなる混合２０塩基配列である。下線部はペプチド結合部位である。
ペプチドのアミノ酸配列は、例えば、Ａｃ−ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲである。
【図１】
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