(57)【要約】  本発明は、ウィラーティアマグナ種の原生動物を用いることを特徴とし、ヒトまたは動物の体に適用される治療方法を除く、ネグレリア属、特に、ネグレリアフォーレリ種の増殖を抑制するプロセスに関し、さらにそのような原生動物を含む殺菌剤にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の体に適用される治療方法を除く、ネグレリア属、特に、ネグレリアフォーレリ種の増殖を抑制するプロセスであって、
ウィラーティア属の原生動物を用いることを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１に係るプロセスにおいて、
気体若しくは液体の流れ、又は固体表面を、前記ウィラーティア属、特に、ウィラーティアマグナ種の原生動物により処理することを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、
前記原生動物は、有利には、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当することを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
下水若しくは工業用水の配管網、工場若しくは原子力プラントの冷却回路、又は空調ネットワークの消毒のために実施されることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
送水管内、又は、ヒト若しくは動物の食品と接触してもよいし、しなくてもよい表面におけるバイオフィルムの形成を抑制するために実施されることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
ウィラーティア属、特にウィラーティアマグナ種の原生動物を含む消毒剤。
【請求項７】
請求項６に記載の消毒剤において、
前記原生動物は、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当することを特徴とする消毒剤。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の消毒剤において、
水溶液又は懸濁液の形態であることを特徴とする消毒剤。
【請求項９】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当するウィラーティア属に属する原生動物。
【請求項１０】
請求項６から８のいずれか１項に記載の殺菌剤、又は請求項９に記載の原生動物のネグレリアに対する殺菌剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネグレリア（Naegleria）属、特に、ネグレリアフォーレリ（Naegleria fowleri）種の存在、及びその増殖を生物的に抑制するための新規のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ネグレリアフォーレリ（Ｎ．ｆ．）は、バルカンフィーダ（Vahlkampfiidae）科に属する自由生活アメーバである。このアメーバは、ヒトにおける深刻な病態の原因であり、この病態は非常に幸いなことに極めて珍しい（２００７年に発見された２３５件）：原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）（Cervantes-Sandoval I, 2008; Kemble SK, 2012; TW, 2010; Su MY, 2013）。これらの自由生活アメーバによる感染症は、抗生物質治療により約１週間及び数週間のうちに破局的予後を有する（Su MY, 2013）。この感染症に対する真に効果的な治療は無いが、非常に幸運なことに、これらの疾病は稀であり、ＰＡＭを引き起こすには特定条件の同時発生が要求される。これらの特別な条件及び要求される種菌は、現在のところ依然として不明である。しかしながら、いくつかの薬剤及び抗生物質は感染症の進行に影響を及ぼすように見え、アンフォテリシンＢ、リファンピシン、及びミコナゾールなどは組み合わされた場合に、２又は３固体において効果的であることが証明された。１９９２年に、文献は、たった７件のＰＡＭ後の生存が証明され（Gautam PL, 2012）、２〜１４歳の非常に若い被検者においてのみであって、被検者には治療及び感染症が多少の顕著な神経的後遺症を残したことを報告した。したがって、生存率は、エボラウイルスによる感染症についてよりも一層低い。それゆえ、この自由生活アメーバの監視及び抑制は、益々重要な優先事項となっている。
【０００３】
一般的に、ネグレリアフォーレリは環境において汎存種分布を有するということが知られている（Martinez AJ, 1997）。なぜなら、このアメーバは、このアメーバが他の自由生活アメーバと共有する特徴である土壌、河川水、及び湖沼水（Jamerson M, 2009）、又は、産業排水、及びバイオフィルム（Goudot S, 2012; S. A. Huws, 2005）、から隔離されているためである。レジオネラ菌を含む複数の潜在的な病原菌は、自由生活アメーバの内部で生き延び複製するためのメカニズムを進化させた（Huang SW, 2010; De Jonckheere, 2011）。さらに、原子力発電所は数度分の河川水の再加熱によりネグレリアフォーレリアメーバの発現に大きく寄与するということが証明された。実際、ネグレリアフォーレリアメーバは、２５°Ｃ〜４５°Ｃの発現温度範囲で好熱性である（Visvesvara GS, 2007）。
【０００４】
フランスにおいて１１基を上回る原子力発電所を運転するＥＤＦは、水中に検出されるネグレリアフォーレリのレベルに関するリスクを定量化した。
【０００５】
このリスクをよりよく理解するために、ＥＤＦの研究調査部及び医学研究部は、水中のネグレリアフォーレリの濃度の関数として、泳いだ場合のＰＡＭによる死のリスクを計算した。このリスクは、以下のように分析することができる。
【０００６】
１回の水泳についてのリスク＝ネグレリアフォーレリが濃度「ｃ」で存在する水中で泳いだ場合に「ｎ」個のネグレリアフォーレリの吸引の可能性（１回の水泳につき１０ｍｌの水が吸引される）
掛ける
「ｎ」個のネグレリアフォーレリが吸引された場合の死の可能性（動物データに従ったモデリング）
最低推定を付与し、実際のデータに良好に適合する対数正規モデルを選択する場合（USA, Australia, New Zealand）、以下のリスクが得られる。
【０００７】
水泳用水におけるＮ．ｆ．の量ｎについての濃度リスク
１ネグレリアフォーレリ／リットル、リスク＝１０−８、すなわち、１００，０００，０００回の水泳当たり１の死
１０ネグレリアフォーレリ／リットル、リスク＝１．４５×１０−７、すなわち、７，０００，０００回の水泳当たり１の死
１００ネグレリアフォーレリ／リットル、リスク＝７．２４×１０−６、すなわち、１４０，０００回の水泳当たり１の死
１０００ネグレリアフォーレリ／リットル、リスク＝１．３４×１０−３、すなわち、７４６回の水泳当たり１の死
フランス公衆衛生高等審議会（ＣＳＨＰＦ）の勧告によると、リットル当たり１００ネグレリアフォーレリ（Ｎ．ｆ．）の極限値を超過すると、水泳を禁止しなければならない（特に、ビュジェ、ショー、ダンピエール、ゴルフェッシュ、及びノジャンの原子力発電センター（ＣＮＰＥ）においてＥＤＦにより２００３年に行われたモノクロラミンによるリットル抗アメーバ薬処理の経験からのフィードバックに関する２００４年５月４日のＣＳＨＰＦの意見を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これに関連して、発明者らは、アメーバ属であるウィラーティアマグナ（Ｗ．ｍ．）が自由生活アメーバであるネグレリアフォーレリを除去するということを全く予期外に証明した。この殺菌効果は、細菌であるレジオネラ菌、シュードモナス、及びリステリア菌などの他の細菌性剤に対するウィラーティアマグナの既に証明された捕食能力によりサポートされる（Bodennec Jacques 2006）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の対象は、まず、ウィラーティア属、好ましくはウィラーティアマグナの原生動物を使用して、ネグレリア、特に、ネグレリアフォーレリの増殖を抑制するプロセスである。本発明に係るこのプロセスは、ヒト又は動物の体に適用される治療方法を含まない。本発明に係るプロセスにおいて、ウィラーティア属、特に、ウィラーティアマグナ種の原生動物により処理されるのは、通常は気体又は液体の流れである。しかしながら、固体表面であってもよい。
【００１０】
本発明に係るプロセスは、特に、下水若しくは工業用水の配管網、例えば、原子炉タイプの工場の冷却回路、又は空調ネットワークの消毒に使用される。このプロセスを、送水管内、又は、ヒト若しくは動物の食品と接触してもよいし、しなくてもよい表面におけるバイオフィルムの形成を抑制するために実施することができる。
【００１１】
原生動物は、処理しようとする管又はネットワークを循環する水又は液体に直接加えられてもよい。原生動物を、殺菌しようとする工業ネットワーク、煙突、プラント、工業製品の表面に、例えば、エアロゾルとしての水溶液の形態で噴霧することも可能である。
【００１２】
本発明において使用される原生動物は、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４として２００６年８月２１日に寄託された株、又は、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５として２００６年８月２１日に寄託された株に相当していることが有利であり、これらの２つの菌種は、フランス国立科学研究センター（CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE（CNRS））−3 rue MichelAnge - 75794 PARIS CEDEX 16/France及びクロード・ベルナール・リヨン第１大学（UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD）−43 Boulevard du 11 Novembre 1918 -69622 VILLEURBANNE Cedex/Franceの名義で寄託された。
【００１３】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４として寄託された株、又は、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５として寄託された株に相当するウィラーティア属に属する原生動物は、本発明の不可欠な部分である。上記の寄託された株は、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００８／０４３９６９にも記載されている。
【００１４】
したがって、このような原生動物は、消毒剤において、特に、ネグレリアフォーレリアメーバを排除するために、また、ネグレリアフォーレリの増殖及び汚染を抑制するために用いられてもよい。
【００１５】
さらに、本発明の対象は、ウィラーティア属、特にウィラーティアマグナ種の原生動物を含む消毒剤である。ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当する原生動物が好ましい。本発明に係る消毒剤は、例えば、蒸留水を用いた水溶液又は水性懸濁液の形態であることが有利である。消毒剤は、例えばエアロゾル又は任意の他の適用方法として噴霧可能な形態であってもよい。
【００１６】
ウィラーティア属、特に、ウィラーティアマグナ種の原生動物のネグレリアフォーレリ増殖阻害活性は、ウィラーティア属、特に、ウィラーティアマグナ種の存在及び不在においてネグレリアフォーレリの複製を比較することにより発明者らによって証明された。発明者らは、ネグレリアフォーレリ成長阻害を引き起こさない対照株として別の種の自由生活アメーバであるアカントアメーバ（Acanthamoeba）を使用することにより、ウィラーティアマグナ属によるこのネグレリアフォーレリ成長阻害の独自の特性も証明した。
【００１７】
１週間未満で９５％を上回る死亡率のヒトに対するネグレリアフォーレリリスクの治療的又は予防的な処理が行われない場合、本発明は、環境及びヒトに対する自然の影響によるこのアメーバ性疫病を抑制するための主な科学的進歩である。実際、ＥＣ規則１２７１／２００８号は、現在使用されているモノクロラミンとは異なり、ウィラーティアマグナ株は危険なクラスに分類されず、何らかの危険性又は警告の推奨も言及されない、ということを現在認識している。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明の殺菌剤及び／又はウィラーティア属、特に、ウィラーティアマグナ種の原生動物の使用を対象とし、原生動物は、ネグレリアに対する生物致死剤として、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は共培養（ウィラーティアマグナ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験結果を示す。
【図２】図２は共培養（ウィラーティアマグナ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験結果を示す。
【図３】図３は共培養（ウィラーティアマグナ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験を示す。
【図４】図４ａ及び図４ｂは、ウィラーティアマグナアメーバの存在下での経時的なネグレリアフォーレリアメーバの生理学的状態を示す。図４ａは、ウィラーティアマグナとの共培養におけるネグレリアフォーレリの迅速な生理学的分解の画像に対応する。図４ｂは、ネグレリアフォーレリにおけるウィラーティアマグナの「死の接吻」の現象を示す画像に対応する。
【図５】図５は共培養（アカントアメーバ・カステラーニ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、実施例は、本発明の説明を可能にするものであるが、制限的なものでは全くない。
【００２１】
１．材料及び方法
１．１．使用される株
アメーバ：使用される株は、以下の異なる３つのアメーバ性種に属する。
【００２２】
ネグレリアフォーレリ（ＡＴＣＣ３０８０９）
アカントアメーバ・カステラーニ（Acanthamoeba castellanii）（ＡＴＣＣ３００１０）
ウィラーティアマグナ（寄託番号ＰＴＡ７８２４及びＰＴＡ７８２５としてＡＴＣＣに寄託された株）
これらの３つの株は、ＧＲＥＩＮＥＲ（登録商標）チューブに３ｍｌずつ分注された１０％のウシ胎児血清を含むＳＣＧＹＥＭ培地（Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium）において無菌培養される。その維持において、増殖型は８〜９日毎に継代培養される。共培養のために、指数増殖期の最中に栄養体を有するように３〜４日の継代培養が用いられる。
【００２３】
ＳＣＧＹＥＭ培地は以下のように得られる。
【００２４】
カゼイン（ＭＥＲＣＫ，１．０２２４４．０１０）           １０ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４                                                                     １．３２５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                                        ０．８ｇ
グルコース                                                                          ２．５ｇ
酵母エキス    （ＤＩＦＣＯ  ０１２７−１７−９）       ５ｇ
蒸留水                                                                                 ９００ｍｌ
ウシ胎児血清                                                                      １００ｍｌ
２．５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）が、そしてその後、Ｎａ２ＨＰＯ４及びＫＨ２ＰＯ４が９００ｍｌの蒸留水に加えられる。ホットプレート上で少し温められた後、マグネチックスターラーを用いながらカゼインが徐々に加えられる。カゼインが溶解した後に、グルコース及び酵母エキスが加えられる。
【００２５】
完全に溶解した後に、培地は、グラスファイバ（SARTORIUS SM 6513400）、その後に１μｍメンブレン（WHATMAN 7190 004）を用いて連続的に濾過される。その後、その培地はガラス瓶にアリコートされる。その瓶は、１２０℃で２０分間のオートクレーブにより滅菌される。培地の最終的な使用及び分配の前に、クリーンベンチ内で血清の割合が１０％となるように、ウシ胎児血清が無菌的に加えられる。
【００２６】
１．２．ウィラーティアマグナ及びネグレリアフォーレリのアメーバ性原料混濁液の調製
各初期アメーバ性混濁液（原料混濁液）の調製は、ＳＣＧＹＥＭ培地において培養された各アメーバの無菌培養の４つのフラスコ（Ｔ１７５ｍｌ）を用いて実施される。ネグレリアフォーレリ、アカントアメーバ、及びウィラーティアマグナのこれらの原料アメーバ性混濁液は、指数増殖期の終了時に回収され、培養開始後４〜５日で一般的には得られる。
【００２７】
回収されるアメーバ濃度を上昇させるため、フラスコを５〜１０分間氷浴させ、その後、できる限り多くのアメーバを収集するために手動で攪拌する。
【００２８】
これら４つのフラスコの内容物を組み合わせて得られたアメーバ性混濁液をＴＨＯＭＡセルにおいてカウントする（［Ｃ］／ｍｌ）。
【００２９】
１５００ｇで１０分間の遠心分離によりＳＣＧＹＥＭ培養培地を除去するために、アメーバ性混濁液をＦＡＬＣＯＮ（登録商標）タイプの５０ｍｌチューブへ移す。第１遠心分離の結果生じるアメーバ性ペレットは、滅菌蒸留水により２回洗浄され、１５００ｇで１０分間遠心分離される。２回の洗浄の終了後、最終的なペレットは４０ｍｌの体積の滅菌水に取り出される。
【００３０】
１．３．ネグレリアフォーレリ（株ＡＴＣＣ３０８０９）に対するウィラーティアマグナの殺菌効果の証明
アメーバ性共培養は、１０ｍｌの無菌ＰＡＳ（Ｐａｇｅ’ｓ  Ａｍｏｅｂａ  Ｓａｌｉｎｅ）培地を含むＴ２５ｍｌフラスコにおいて実施される。アメーバ性共培養のフラスコは、Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計で事前にカウントされた無菌アメーバ性懸濁液から１×１０５ウィラーティアマグナ／ｍｌ及び１×１０５ネグレリアフォーレリ／ｍｌの割合で播種される。ネグレリアフォーレリによるウィラーティアマグナの感染は、ネグレリアフォーレリ／ウィラーティアマグナの比率を１に固定して実施される。Ｔ２５ｍｌフラスコは、３０℃のインキュベータにおいてインキュベートされる。
【００３１】
ＰＡＳ培地は以下のように得られる。
2016537330.tif 000002
【００３２】
０．２２μｍフィルタを用いて溶液１及び２を無菌的に濾過する。１リットルのＰＡＳ培地を取得するために、０．５ｍｌの溶液１と５．０ｍｌの溶液２とを加え、その後、体積を１リットルになるように滅菌蒸留水で調整する。
【００３３】
ウィラーティアマグナ及びネグレリアフォーレリの対照アメーバ性個体培養は、１０ｍｌの蒸留ＰＡＳ培地においてＴ２５ｍｌフラスコにおいて分離して培養される。
【００３４】
フラスコは、Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計で事前にカウントされた無菌アメーバ性懸濁液からウィラーティアマグナ対照用の１×１０５ウィラーティアマグナ／ｍｌ及びネグレリアフォーレリ対照用の１×１０５ネグレリアフォーレリ／ｍｌの割合で播種される。対照Ｔ２５ｍｌフラスコは、３０℃のインキュベータにおいてインキュベートされる。
【００３５】
各条件は３重に行われる。Ｍａｌａｓｓｅｚセルでの各カウントは５回繰り返される。実験は、３か月の期間に亘って三（３）回繰り返された。
【００３６】
共培養及び対照フラスコにおけるネグレリアフォーレリ及びウィラーティアマグナアメーバの最後は、以下の方法で決定される。
【００３７】
アメーバ濃度は、ネグレリアフォーレリによる感染後１２０時間の間監視される。各時間間隔（３時間、その後は２４時間毎）において、共培養及び対照フラスコは、サンプリングされ、２つのアメーバの細胞成長の観点とそれらの形態学的及び動体学的状態の観点との双方から試験される。各フラスコについて、試験された。
【００３８】
アメーバは、Ｍａｌａｓｓｅｚセルで直接カウントされる。
【００３９】
１２０時間で、ネグレリアフォーレリアメーバのレベルが低いため、Ｍａｌａｓｓｅｚセルでの信頼性のおけるカウント、よって、最確数（ＭＰＮ）法の共同使用ができなくなる。アメーバをカウントするために広く使用されているこの方法は、より正確であるという利点を有するが、全体であり生きているアメーバを全体ではあるが死んでいるアメーバから区別するという利点も有する。
【００４０】
２．結果
図１、図２、及び図３は、共培養（ウィラーティアマグナ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験を示す。
【００４１】
これらは、固体培養におけるアメーバの各個体群の進化と比較した、１の初期ウィラーティア／ネグレリア比率での共培養後のウィラーティアマグナ及びネグレリアフォーレリアメーバの各個体群の自己進化を示す。
【００４２】
図４ａ及び図４ｂは、ウィラーティアマグナアメーバの存在下での経時的なネグレリアフォーレリアメーバの生理学的状態を示す。図４ａは、ウィラーティアマグナとの共培養におけるネグレリアフォーレリの迅速な生理学的分解の画像に対応する。図４ｂは、ネグレリアフォーレリにおけるウィラーティアマグナの「死の接吻」の現象を示す画像に対応する。
【００４３】
図５は、共培養（アカントアメーバ・カステラーニ／ネグレリアフォーレリ）及びアメーバの対照固体培養の実験を示す。
【００４４】
図１、図２、及び図３において、ダイヤ形の点（◆）を有する、ウィラーティアマグナと称される曲線は、滅菌ＰＡＳ培地における培養において単独でウィラーティアマグナの測定された濃度を説明している。
【００４５】
方形の点（■）を有する、ネグレリアフォーレリと称される曲線は、滅菌ＰＡＳ培地における培養において単独でネグレリアフォーレリの測定された濃度を説明している。
【００４６】
三角形の点（△）を有する、Ｗ＋ＮＦと称される曲線は、滅菌ＰＡＳ培地におけるネグレリアフォーレリとの共培養においてウィラーティアマグナの測定された濃度を説明している。
【００４７】
十字形の点（×）を有する、ＮＦ＋Ｗと称される曲線は、滅菌ＰＡＳ培地におけるウィラーティアマグナとの共培養においてネグレリアフォーレリの測定された濃度を説明している。
【００４８】
データは、Ｍａｌａｓｓｅｚセルでカウントされた、ミリリットル（ｍｌ）当たりの細胞全体の濃度として表されている。
【００４９】
図４ａにおいて、黒い矢印はウィラーティアマグナの存在を示し、白い矢印は全体又は断片のネグレリアフォーレリの存在を示す。
【００５０】
図４ｂにおいて、黒い矢印はウィラーティアマグナの存在を示し、白い矢印はネグレリアフォーレリの存在を示す。白い円は、ネグレリアフォーレリ細胞の輪郭を具体化している。この「死の接吻」現象は、グランザイムを通過させ、標的細胞のアポトーシスを引き起こす接触として文献（Berke G. Source Department of Cell Biology, 1995）に記載されている。
【００５１】
図５において、ダイヤ形の点（◆）からなる曲線Ａは、アカントアメーバ・カステラーニの固体培養を表している。
【００５２】
三角形の点（△）からなる曲線Ａ＋ＮＦは、ネグレリアフォーレリとの共培養におけるアカントアメーバ・カステラーニの濃度を表している。
【００５３】
方形の点（◆）からなる曲線ＮＦは、ネグレリアフォーレリの固体培養を表している。
【００５４】
十字形の点（×）からなる曲線ＮＦ＋Ａは、アカントアメーバ・カステラーニとの共培養におけるネグレリアフォーレリの濃度を表している。
【００５５】
２．１．ウィラーティアマグナはネグレリアフォーレリの成長を完全に阻害する
ウィラーティアマグナとの共培養におけるネグレリアフォーレリの進化を表す図１、図２、及び図３の十字形の曲線により示されるように、ネグレリアフォーレリ個体群曲線において、約２４時間で、下落が非常に迅速に起こる。ネグレリアフォーレリ個体群におけるこの減少は、ウィラーティアマグナの存在下においてのみ観察される。２４時間での実験１、２、及び３（図１、図２、及び図３）の固体培養におけるネグレリアフォーレリの対照曲線（方形の点の曲線）は、全て成長している。また、固体培養におけるネグレリアフォーレリのレベルは２４時間で実質的に２倍となる。
【００５６】
顕微鏡観察は早くも２４時間でウィラーティアマグナとの共培養におけるネグレリアフォーレリに重要な形態的変化を確認することが注目される（図４）。ネグレリアフォーレリ細胞の生理学的状態は、広がった栄養型からより丸いストレスを受けた形態へ変化するが、まだシスト形には類似していない。ネグレリアフォーレリ細胞の内部は、内部液胞、アメーバの成長のサインをマスクして不透明となる。ウィラーティアマグナの存在下におけるネグレリアフォーレリ細胞のサイズは、共培養の早くも３時間で固体培養におけるサイズの半分未満である（図４ａ）。ウィラーティアマグナアメーバの捕食のモードは、ファゴサイトーシスに基づく。図４ｂは、最初の２４時間において、「死の接吻」に類似した阻害の現象を証明している。ウィラーティアマグナによるネグレリアフォーレリのファゴサイトーシスは実際に起こるが、このファゴサイトーシスにおいてネグレリアフォーレリを含むウィラーティアマグナの存在により共培養の２５時間後にしか裏付けられない（データは報告されていない）。
【００５７】
実施された全ての実験は、１２０時間でネグレリアフォーレリの完全な除去を伴う最大阻害効果を証明する。１２０時間でのＭａｌａｓｓｅｚセルにおける読み取りは、存在し且つ全体であるネグレリアフォーレリ細胞をカウントするが、このカウントを用いて死細胞を生細胞から区別することはできない。ＮＮＡ寒天＋大腸菌での二重の読み取りにより、栄養型及び／又はシスト型のみから派生したネグレリアフォーレリ生細胞をカウントすることが可能になる。
【００５８】
以下の表は、Ｍａｌａｓｓｅｚセルでの読み取りにより取得されたアメーバ（ネグレリアフォーレリ）及びＭＰＮ法により取得されたアメーバ（ネグレリアフォーレリ）の濃度を示す。
【００５９】
感染後１２０時間で採取したウィラーティアマグナ／ネグレリアフォーレリ共培養の実験１、２、及び３（図１〜３を参照）の各フラスコのアリコートは、大腸菌の層により被覆されたＮＮＡ寒天に播種される。
【００６０】
各種の濃度の決定は、シャーレ当たりのピンポイントされたフロントの数をカウントすることにより測定され、アメーバ濃度をそこから推定するために、ＭＰＮ表に示される。
【００６１】
Ｎｆ＝ネグレリアフォーレリ
Ｗ．ｍ＝ウィラーティアマグナ
2016537330.tif 000003
【００６２】
この表は、ＮＮＡ寒天におけるネグレリアフォーレリフロントの不在を確認し、１２０時間で生きているシスト型又は栄養型のネグレリアフォーレリの不在を示す。
【００６３】
発明者らは、ネグレリア属、特に、ネグレリアフォーレリ種に対するウィラーティアマグナの殺菌効果の予期しない特性が他のアメーバ性種により共有されないことを証明した。
【００６４】
図５に示すように、アメーバ属であるアカントアメーバ・カステラーニ及びネグレリアフォーレリの共培養は、固体培養において測定されたこれらの種の濃度と比べて、これら２つの種の各濃度に対して何らかの影響を及ぼすことはない。この図は、別のアメーバ属、アカントアメーバタイプのネグレリアフォーレリの個体群の進化に対する相互作用がこれら２つのアメーバの共培養中に無いことを示す。
【００６５】
ウィラーティアマグナだけは、ネグレリアアメーバ、特に、ネグレリアフォーレリ種の成長を阻害するこの特性を有する。
【００６６】
文献
Bodennec Jacques, Pernin Pierre, Dey Rafick. Novel method for biologically combating the proliferation ofLegionella pneumophila, and novel disinfecting agent containing amoebicprotozoa of the Willaertia genus. France Brevet 2906968. 12 10 2006.
Cervantes-Sandoval I, Serrano-Luna J,Garcia-Latorre E, Tsutsumi V, Shibayama M. "Characterization of braininflammation during primary amoebic meningoencephalitis." Parasitol Int,57 (2008): 307 e13.
De Jonckheere. "Origin and evolutionof the worldwide distributed pathogenic amoeboflagellate Naegleriafowleri." Infect Genet Evol. 11, n° (7) (Oct; 2011): 1520-8.
Gautam PL, Sharma S, Puri S, Kumar R, MidhaV, Bansal R. "A rare case of survival from primary amebicmeningoencephalitis." Indian J Crit Care Med. 16, n° (1) (Jan. 2012):34-6.
Goudot S, Herbelin P, Mathieu L, Soreau S,Banas S, Jorand F. "Growth dynamic of Naegleria fowleri in a microbialfreshwater biofilm." Water res. 46, n° (13) (Sep. 2012): 3958-66.
Huang SW, Hsu BM. "Survey of Naegleriaand its resisting bacteria-Legionella in hot spring water of Taiwan usingmolecular method." Parasitol Res. 106, n° (6) (May 2010): 1395-402.
Jamerson M, Remmers K, Cabral G,Marciano-Cabral F. "Survey for the presence of Naegleria fowleri amebae inlake water used to cool reactors at a nuclear power generating plant." Parasitol Res. 104, n° (5) (Apr; 2009): 969-78.
Kemble SK, Lynfield R, DeVries AS et al. "Fatal Naegleria fowleri infection acquired in Minnesota:possible expanded range of a deadly thermophilic organism." Clin InfectDis 54 (2012): 805-809.
Martinez AJ, Visvesvara GS."Free-living, amphizoic and opportunistic amebas." Brain Pathol. 7,n° (1) (Jan; 1997): 583-98. Review.
S.A. Huws, A.J. McBain and P. Gilbert."Protozoan grazing and its impact upon population dynamics in biofilmcommunities." Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 238-244 98 (2005):238-244.
Su MY, Lee Shyu LY, Lin WC, Hsiao PC, WangCP, Ji DD, Chen KM, Lai SC. "A fatal case of Naegleria fowlerimenigoencephalitis in Taiwan." Korean J parasitol. 51, n° (2) (April2013): 203-206.
TW, Heggie. "Swimming with death:Naegleria fowleri infections in recreational waters." Travel Med InfectDis 8 (2010): 201-206.
Visvesvara GS, Moura H, Schuster FL."Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp.,Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea." FEMSImmunol Med Microbiol 50 (2007): 1-26.
【図１】
2016537330.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月10日(2016.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネグレリア属の増殖を抑制するプロセスであって、
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当するウィラーティアマグナ種の原生動物を接触させることを含むプロセス。
【請求項２】
請求項１に係るプロセスにおいて、
ネグレリアフォーレリ種の増殖を抑制するためのプロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスにおいて、
気体若しくは液体の流れ、又は固体表面を、前記ウィラーティアマグナ種の前記原生動物により処理することを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスにおいて、
下水若しくは工業用水の配管網、工場若しくは原子力プラントの冷却回路、又は空調ネットワーク又は工業製品の表面の消毒のために実施されることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスにおいて、
送水管内、又は、ヒト若しくは動物の食品と接触してもよいし、しなくてもよい表面におけるバイオフィルムの形成を抑制するために実施されることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
処理しようとする管又はネットワークを循環する水又は液体におけるネグレリアを除去するための方法であって、
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４として寄託された株又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５として寄託された株に相当する原生動物を加えることを含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記原生動物を水溶液又は懸濁液の形態で加える方法。
【国際調査報告】
2016537330.tif 000009
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2016537330.tif 000011
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