(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）EIAV gag及びEIAV polをコードするウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）の核酸配列を含んでなる第一のベクターであって、（i）EIAV構造タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子において、少なくとも一つの欠損を含み、（ii）欠損性パッケージングシグナルを含む第一のベクターと、
（ｂ）ベクターゲノムの逆転写に必要なcis−作用性配列エレメントを含むEIAV核酸配列を含んでなる第二のベクターであって、（i）応答能のあるパッケージングシグナルを含み、（ii）異種遺伝子が挿入されうる複数のクローニング部位を含む第二のベクターと、
（ｃ）ウイルスの核酸配列を含んでなる第三のベクターであって、（i）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（ii）欠損性パッケージングシグナルを含む第三のベクターと
を含み、
前記第一のベクターが、
（Ａ）キメラCMV/EIAVエンハンサープロモーター領域、プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列、組込みに重要なcis-作用性配列エレメント、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列、EIAV tatコード領域、gagコード領域、polコード領域、EIAV tatコード領域、ORF S2コード領域、revコード領域を含む部分envコード領域、及びポリアデニル化シグナルをこの順に含み、さらに欠損性パッケージングシグナルを含むプラスミドと、
（Ｂ）プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列と、組込みに重要なcis-作用性配列エレメントと、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列とが削除されている、上記（Ａ）に由来するプラスミドと
からなる群から選択され、
前記第二のベクターが、プロモーター領域、EIAV長末端反復（LTR）からのR-U5配列ドメイン、部分EIAV gag配列、プロモーター領域、複数のクローニング部位、及びEIAV LTR配列をこの順に含み、さらに逆転写に必要なcis-作用性配列エレメントと、応答能のあるパッケージングシグナルを含むプラスミドであり、
前記第三のベクターが、プロモーター領域、キメライントロン領域、ウイルスエンベロープタンパク質コード領域、及びポリアデニル化シグナルをこの順に含み、さらに欠損性パッケージングシグナルを含むプラスミドである、組換えレンチウイルスベクター発現システム。
【請求項２】
前記第三のベクターが、EIAVエンベロープタンパク質ではないエンベロープタンパク質をコードする請求項１に記載のベクター発現システム。
【請求項３】
前記第三のベクターが、水疱性口内炎ウイルスG糖タンパク質を発現する請求項１に記載のベクター発現システム。
【請求項４】
前記第二のベクターが、異種遺伝子を含んでいる請求項１に記載のベクター発現システム。
【請求項５】
前記異種遺伝子が、抗原タンパク質又はペプチドをコードする請求項４に記載のベクター発現システム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の前記ベクター発現システムによって細胞をトランスフェクションすることを含み、前記細胞が複製欠損性レンチウイルス粒子を産生する、複製欠損性レンチウイルス粒子をインビトロで産生する方法。
【請求項７】
前記細胞が、非分裂細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法により産生される複製欠損性レンチウイルス粒子。
【請求項９】
前記レンチウイルス粒子が、請求項６の方法により産生される複製欠損性レンチウイルス粒子を含む細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の前記ベクター発現システムによって、レンチウイルス許容プロデューサー細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）該プロデューサー細胞において複製欠損性レンチウイルス粒子の産生を許容するのに十分な細胞培養条件下で前記プロデューサー細胞を増殖させるステップと、
（ｃ）該プロデューサー細胞から複製欠損性レンチウイルス粒子を収集するステップと
を含むレンチウイルス株を産生する方法。
【請求項１１】
前記プロデューサー細胞を細胞培養培地で増殖させ、また前記複製欠損性レンチウイルス粒子が該培地から収集される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０のステップ（ｃ）により収集される複製欠損性レンチウイルス粒子によって標的細胞を感染させることを含む標的細胞に異種遺伝子をインビトロでデリバリーする方法。
【請求項１３】
前記標的細胞が、非分裂細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞が、ヒト気道上皮細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の複製欠損性レンチウイルス粒子によって標的細胞を感染させることを含む標的細胞に異種遺伝子をインビトロでデリバリーする方法。
【請求項１６】
薬理学的に受容可能なキャリヤーの中に請求項８に記載される複製欠損性レンチウイルス粒子を含んでなる医薬製剤。
【請求項１７】
EIAV核酸配列を含んでなるベクターであって、欠損性パッケージングシグナルを含むベクターによってレンチウイルス許容細胞をトランスフェクションすることを含むパッケージング細胞を作成する方法であって、前記ベクターが
（Ａ）キメラCMV/EIAVエンハンサープロモーター領域、プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列、組込みに重要なcis-作用性配列エレメント、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列、EIAV tatコード領域、gagコード領域、polコード領域、EIAV tatコード領域、ORF S2コード領域、revコード領域を含む部分envコード領域、及びポリアデニル化シグナルをこの順に含み、さらに欠損性パッケージングシグナルを含むプラスミドと、
（Ｂ）プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列と、組込みに重要なcis-作用性配列エレメントと、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列とが削除されている、上記（Ａ）に由来するプラスミドと
からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
前記レンチウイルス許容細胞が、ヒト293細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも一つのEIAV構造タンパク質をコードするEIAV核酸配列を含むレンチウイルス許容宿主細胞を含んでなるパッケージング細胞であって、前記核酸配列がパッケージシグナル欠損性であり、前記核酸配列が
（Ａ）キメラCMV/EIAVエンハンサープロモーター領域、プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列、組込みに重要なcis-作用性配列エレメント、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列、EIAV tatコード領域、gagコード領域、polコード領域、EIAV tatコード領域、ORF S2コード領域、revコード領域を含む部分envコード領域、及びポリアデニル化シグナルをこの順に含み、さらに欠損性パッケージングシグナルを含むプラスミドと、
（Ｂ）プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列と、組込みに重要なcis-作用性配列エレメントと、逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列とが削除されている、上記（Ａ）に由来するプラスミドと
からなる群から選択される、パッケージング細胞。
【請求項２０】
医薬としての使用のための、請求項８に記載のウイルス粒子。
【請求項２１】
請求項１０のステップ（Ｃ）に従って収集される、医薬としての使用のための複製欠損性レンチウイルス粒子。
【請求項２２】
請求項１０のステップ（Ｃ）に従って収集される複製欠損性レンチウイルス粒子を、薬理学的に受容可能なキャリヤーの中に含む医薬製剤。
【請求項２３】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の組換えレンチウイルスベクター発現システム。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、1997年5月13日に提出された米国仮特許出願第60/046,891号の利益を主張しており、その出願は全体として本明細書に組み込まれている。
発明の分野
本発明は遺伝子デリバリーに有用なベクターとしてのウイルスに関する。とくに、非分裂および分裂細胞への遺伝子デリバリーに有用なレンチウイルスベクターに関する。
発明の背景
特定の外来あるいは在来の遺伝子配列を哺乳動物の細胞の中に導入する能力、そしてその遺伝子の発現を制御する能力は、医学および生物学的研究の分野ではかなりの価値をもっている。こういった能力があれば、遺伝子調節を研究するための手段、また疾病を治療する治療上の基盤を設計するための手段が用意されることになる。
特定の外来あるいは在来遺伝子の哺乳動物の宿主細胞への導入は、遺伝子配列を適当な核酸ベクターの中に導入することによって促進される。所望する宿主細胞へのこうした組換えベクターの導入を許容できるさまざまな方法が開発されてきた。DNA形質転換あるいはトランスフェクション関連の方法とは対照的に、ウイルスベクターを使用すると、広範なさまざまな宿主細胞で組換え分子の迅速な導入ができるという結果が得られる。とくに、ウイルスベクターは宿主細胞への組換え核酸ベクター導入の効率を増加するために用いられてきた。哺乳動物細胞における外来遺伝子形質導入および発現用のベクターとして用いられてきたウイルスには、SV40ウイルス（例えば、H.Okayamaら、Molec.Cell.Biol.5,1136-1142（1985）を参照されたい）、ウシパピローマウイルス（例えば、D.DiMaioら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,4030-4034（1982）を参照されたい）、アデノウイルス（例えば、J.E.Morinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,4626（1987））、アデノ関連ウイルス（AAV;例えば、N.Muzyczkaら、J.Clin.Invest.94,1351（1994）を参照されたい）、単純疱疹ウイルス（例えば、A.I.Gellerら、Science 241,1667（1988）を参照されたい）、そのほかが含まれている。
レトロウイルスをベースとしたベクターは、哺乳動物細胞への安定した外来遺伝子の組込み遺伝子転移を達成するための道具として、とくに好まれている。哺乳動物細胞における外来遺伝子導入および発現用のベクターとして用いられてきたレトロウイルスには、モロニーマウス肉腫ウイルス（T.Curranら、J.Virol.44,674-682（1982）;A.Gazitら、J.Virol.60,19-28（1986））とマウス白血病ウイルス（MuLV;A.D.Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158,1-24（1992））が含まれている。
哺乳動物細胞の中に組換え分子を導入しようとする努力は、上述のウイルスあるいはレトロウイルスベクターによって感染させられる細胞の側の能力の無さによって多くの場合、妨げられてきた。レトロウイルスベクターに関する制限には、例えば、ウイルス受容体として役立つ膜タンパク質発現レベルを部分的にはベースとして、かなり限定された宿主域が含まれている。これについては、M.P.Kavanaughら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,7071-7075（1994）を参照されたい。そのほかの制限には、非分裂細胞（例えば、神経単位、肝細胞、筋線維、造血幹細胞）の中に組込む能力が無いこと、現行のパッケージングシステムに利用可能なベクターの力価が貧弱なこと、ベクター粒子が脆いために精製や濃縮が阻害されること、が含まれる。
レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができるレトロウイルスのサブグループである。L.Naldiniらは、ヒト初代マクロファージと終末分化神経単位の中にだけではなく、非増殖性HeLa細胞やラット線維芽細胞の中にも異種遺伝子配列を形質導入することができるヒト免疫不全ウイルス（HIV）をベースにしたレンチウイルスベクターシステムを報告している。これについては、Science 272,263-267（1996）を参照されたい。しかし、ヒトにおいてこうしたシステムを使用することは、毒性のある、また疾病を引き起こす形態へとベクターによって組み換えられてしまう可能性があるため、深刻な安全問題を引き起こす。
したがって、広範な範囲の分裂および非分裂細胞への遺伝子転移を仲介することができる安全かつ効率的なレンチウイルスベクターシステムに対する必要性が残る。
発明の概要
本発明は、遺伝子デリバリー用にウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）由来のベクターを使用して細胞の中に異種遺伝子配列を転移させることを意図している。
本発明の第一の様態はウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）ゲノムの少なくとも一部分の核酸配列から成る第一のベクターを含む組換えレンチウイルスベクター発現システムであり、そこではそのベクターには、（i）EIAV構造タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子に少なくとも一つの欠損が含まれ、また（ii）欠損性パッケージングシグナルが含まれている。発現システムにはさらに、EIAVゲノムの少なくとも一部分の核酸配列から成る第二のベクターが含まれ、そこではそのベクターには、（i）応答能のあるパッケージングシグナルが含まれており、また（ii）異種遺伝子が挿入されることになるであろう複数のクローニング部位が含まれている。ベクター発現システムにはまた、ウイルスの核酸配列から成る第三のベクターが含まれており、そこでは第三のベクターが（i）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、また（ii）欠損性パッケージングシグナルを包含している。
本発明の第二の様態は、上述のように、本発明のベクター発現システムによって細胞をトランスフェクションすることから成る、複製-欠損性レンチウイルス粒子の産生方法である。
本発明の第三の様態は、上述のように、本発明のベクター発現システムによって標的細胞をトランスフェクションすることから成る、前述の標的細胞に異種遺伝子をデリバリーする方法である。
本発明の第四の様態は、（a）上述のように、本発明のベクター発現システムによってプロデューサー細胞をトランスフェクションすること、（b）細胞の中で複製-欠損性レンチウイルス粒子の産生を許容するのに十分な細胞培養条件下でプロデューサー細胞を成長させること、（c）そのプロデューサー細胞から複製-欠損性レンチウイルス粒子を収集することから成るレンチウイルス株を産生する方法である。
本発明の前述の、またそのほかの様態はここに、図面の中、また以下に述べる明細書の中において詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のEIAV由来のベクターを生成するのに使用されるプラスミド構築物の概略説明図である。各プラスミドの一部分のみを描写している。
図2AはプラスミドpEV53の概略説明図である。
図2BはプラスミドpEV53Aの概略説明図である。
図3はプラスミドpEC-lacZの概略説明図である。
図4はプラスミドpEC-puroの概略説明図である。
図5はプラスミドpCI-VSV-Gの概略説明図である。
図6Aには、以下の実施例3に説明されているように、MuLV（上の列）およびEIAVベクター（下の列）による分裂（左の段）および非分裂細胞（右の段）への遺伝子転移を説明する4枚の写真が含まれている。
図6Bは、MuLVをベースにしたベクター（棒グラフの左側対）とEIAVをベースにしたベクター（棒グラフの右側対）による分裂および非分裂細胞への遺伝子転移の相対的な効率のグラフ表示である。成功した遺伝子転移は以下に説明してあるように、青色に染色された（すなわち、X-gal陽性）感染細胞のパーセンテージとしてグラフのy軸上に表示されている。
図6Cは、MuLVをベースにした遺伝子転移ベクターによって感染させられた細胞の中のDNAに、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を組み込むことをブロックするアフィジコリンの能力に関するグラフ表示である。成功した遺伝子転移は、後述の実施例3に説明されているように、BrdUに対して陽性である感染細胞のパーセンテージとしてグラフのy軸上に表示されている。
図7には、遺伝子を感染させて分裂および非分裂細胞に遺伝子を転移させるEIAVをベースにしたベクターEC-lacZの能力を図示する2つのグラフが含まれる。図7の左側のグラフでは、白丸がアフィジコリンによって処理されていないヒトCFT1細胞を表わし、黒三角がアフィジコリンによって処理されたヒトCFT1細胞を表している。図7の右側のグラフでは、白三角がアフィジコリンによって処理されていないウマ皮膚細胞を表し、黒三角がアフィジコリンによって処理されたウマ皮膚細胞を表している。両方のグラフで、遺伝子転移がX-gal陽性である感染細胞のパーセンテージとしてy軸上に表示されている。両方のグラフで、EC-lacZベクターの投与量がμLウイルス/mL接種材料という単位でx軸上に表示されている。
図8は、濃縮されていない（遠心分離されていない）か、あるいは濃縮されている（遠心分離されている）かのいずれかのEC-lacZ/VSV-G偽型ウイルス粒子の感染力の投与-反応曲線である。図8では、白丸が濃縮されたウイルス粒子を表し、黒丸が濃縮されていないウイルス粒子を表している。EC-lacZベクターの投与量はμLウイルス/mL接種材料という単位でx軸上に表示され、感染力はX-galに対して陽性である細胞のパーセンテージとしてy軸上に表示されている。
発明の詳細な説明
本発明はここでは以降、さらに完全な形で添付の図面を参照して説明されるが、その中で本発明の好適な実施様態が示される。なお、本発明は多くの異なった形態で実施されることが考えられ、ここに述べられた実施様態に限定されるものとして解釈されるべきではない。というよりは、この開示によって本発明の範囲を当業者に対して完全に伝えるられるように、これらの実施様態は提供される。
Ｉ．ウマ伝染性貧血ウイルスゲノム
ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）は、レトロウイルス科のレンチウイルス属の構成員である。野生型EIAVウイルスは、核タンパク質コアを含む球状エンベロープビリオンの中にパッケージされる二量体RNAゲノム（一本鎖、正の極性）を有する。野生型EIAVゲノムの複製は、宿主細胞ゲノムでの逆転写や組込みを介して起こる。そのゲノムには、構造タンパク質gag、pol、envをコードする3つの遺伝子と組込みウイルスゲノムの各末端にある長末端反復（LTR）が含まれる。すべてのレトロウイルスに共通するgag、pol、env配列に加えて、EIAVゲノムにはいくつかの短い読み取り枠（ORF）が含まれる。これらの短いORFは多重にスプライシングされたmRNAから翻訳される。ORF S1は転写トランスアクチベーターtatをコードする。ORF S2はその機能が分かっていないタンパク質をコードし、またORF S3はrevタンパク質をコードすると考えられる。revはgag、pol、envの効率的な発現に必要であると考えられている。Revは、env遺伝子内にある、EIAVに位置するrev-反応性エレメント（RRE）として知られているRNA配列との相互作用により転写後に作用する。
EIAVの野生型ゲノムにはまた、R配列（ゲノムの各末端での短い反復）、U5配列（R配列直後のユニーク配列エレメント）、U3配列（構造タンパク質から下流に位置するユニーク配列エレメント）、組込みプロウイルスの転写開始を制御するプロモーターエレメント、パッケージング配列（ここではパッケージング部位あるいはパッケージングシグナルとして交換可能であるように言及されている）、5’-スプライシング供与体部位を含むいくつかのcis-作用性配列が含まれる。
II．本発明のEIAVベクター
本発明のベクターは、広範な系統樹的な宿主細胞域にある宿主細胞核から独立した異種核酸を複製ならびに発現させるための手段を提供する。宿主細胞の中に異種核酸をこのベクターが仲介して組み込むことは、宿主細胞のトランスフェクションあるいは感染として言及されるが、そこでは感染はウイルス粒子を使用することを意味し、またトランスフェクションは核酸の裸の分子を使用することを意味する。
本発明のベクターはさらに、ウイルス粒子の中に異種核酸を組み込むことを許容し、それによってその中に異種核酸を含む感染宿主細胞の数を増幅するための手段を提供する。異種核酸の組込みは、ウイルス粒子内にある異種核酸の複製を促進し、またその結果としてそこに起こる異種タンパク質の産生を促進する。異種タンパク質はここでは、そこからはタンパク質のすべてあるいは一部分が宿主細胞によっては発現されないタンパク質あるいはフラグメントとして定義される。核酸あるいは遺伝子配列は、細胞の中に遺伝子をデリバリーするのに使用されるウイルスベクターの野生型（例えば、野生型EIAVゲノム）においては自然に存在しない場合は、異種であるといわれる。ここで使用されているように、核酸配列あるいは遺伝子配列という用語は、核酸分子（好適にはDNA）に言及することを意図している。こうした遺伝子配列はDNA、cDNA、合成DNA、RNAあるいはその組合せを含むさまざまな源から得られることが考えられる。こうした遺伝子配列は自然に発生するイントロンを含むか、あるいは含まないことがあるゲノムDNAから成ることが考えられる。さらに、こうしたゲノムDNAはプロモーター配列あるいはポリアデニル化配列と関連して得られることが考えられる。本発明の遺伝子配列は好適にはcDNAである。ゲノムDNAあるいはcDNAはいくつかの方法で得られることが可能である。ゲノムDNAは当業者には周知の手段によって適当な細胞から抽出し、また精製することができる。代替的には、mRNAは細胞から分離することができ、また逆転写あるいはそのほかの方法によってcDNAを作成するのに使用することができる。
本発明の一つの目的は、標的細胞へ関心の対象である遺伝子をデリバリーする過程で一つの複製ラウンドを実行することが可能なベクターを生成することである。この技術の様態は、標的細胞にウイルス遺伝子の転移を除外する遺伝子デリバリーシステムである。これは関心の対象であるその遺伝子をコードするベクターからウイルス遺伝子をコードする発現ベクターを物理的に分離することによって達成される。分離発現ベクターは許容細胞（例えば、「プロデューサー細胞」）の中にトランスフェクションされる。ウイルス遺伝子産物はウイルス粒子の産生に必要である。なお、本発明では、これらの遺伝子をコードする遺伝子は欠損性パッケージングシグナルを包含する発現ベクター上に位置する。したがって、構造タンパク質をコードする遺伝子はパッケージされない。
「構造タンパク質」あるいは「EIAV構造タンパク質」という慣用句は、ここで使用されているように、EIAVゲノムの包膜化（例えば、パッケージング）に必要であって、またgag、pol、envを含むコードされたタンパク質のことを言っている。
「欠損性」という用語は、ここで使用されているように、その遺伝子産物をコードするかあるいはシグナル配列として役に立つかのいずれかに関して機能的ではない核酸配列のことを言っている。説明すると、欠損性env遺伝子配列はenvタンパク質をコードすることはないであろうということである。すなわち、欠損性パッケージングシグナルは欠損性シグナルがその上に位置している核酸分子のパッケージングを促進することはないであろうということである。核酸配列は、その配列のいくつかあるいはすべてを削除することによって、その配列を読み取り枠の外に置くことによって、あるいはそのほかのその配列をブロックすることによって行われる手段を含む、当業者には公知の何らかの手段により欠損性は作成されることであろう。
ここで使用されているように、「削除された」あるいは「欠失」という用語は、標準的な使用法に従って、そのセグメントを操作不能にする、あるいは非機能的にするために、指定されたセグメントの全欠失か、あるいは指定されたセグメントの十分な部分の欠失かのいずれかを意味する。「複製欠損性」という用語は、ここで使用されているように、EIAV構造タンパク質をコードするベクターはそのベクターのトランスフェクション後に標的細胞の中で包膜化されることは不可能であることを意味している。その結果としてレンチウイルス粒子は、そのウイルスゲノム全体を複製することができないように、包膜化に必要なウイルス構造タンパク質のすべてをパッケージされたベクターが包含することがなく、そこから削除される必要がある構造タンパク質の少なくとも一つでも包含しないかぎりは、複製欠損性である。
本発明の好適なベクターはEIAVから得られる。在来EIAV核酸は、ウイルスによって感染した細胞と、それから作成されたベクターから分離される。EIAVベクターを作成するための典型的な方法がS.T.Perryら、J.Virol.66,4085-4097（1992）に提供されている。例えば、cDNAは、当業者には公知の方法を使用して、逆転写によりEIAV RNAから産生されることが考えられる。二重鎖EIAV cDNAはその後に産生され、細菌クローニングベクターなどのクローニングベクターの中にクローン化される。細菌、イースト菌、あるいは真核生物のベクターなど、当業者には公知のもので、また使用されているあらゆるクローニングベクターが使用されると考えられる。本発明のベクターは好適には、EIAVのRNAゲノムの少なくとも一部分に相補的なcDNAから成る。一つのベクターには、異種cDNA分子が含まれることがあり、その分子は異種分子の転写あるいは発現を達成するためにヒトあるいは動物の細胞の中に導入することができる。そのcDNA分子は、細胞の中でプロモーター配列機能の転写制御下に置かれているcDNA分子を伴い、EIAVゲノムの少なくとも一部分に相補的なcDNAを包含し、またそのゲノムの複製に必要なRNAゲノムの一部分を包含する。
本発明のプロモーター配列は、真核生物あるいは原核生物起源のプロモーターから成り、また細胞の中で遠位に位置する配列（すなわち、プロモーター配列の5’末端にリンクされている配列）の転写を指示するのに十分であろう。プロモーター領域にはまた、転写の促進あるいは抑制のための制御エレメントが含まれると考えられる。適当なプロモーターとは、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（pCMV）、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター（pRSV）、SP6、T3、T7プロモーターである。プロモーターから上流にあるエンハンサー配列、あるいはコード領域の下流にある転写終末区配列は発現を促進するために、本発明のベクターの中に任意に含めることができる。本発明のベクターにはまた、ポリアデニル化配列、局在性配列、あるいはシグナル配列などの付加的な核酸配列が含まれており、ベクターの核酸によって発現させられるタンパク質を効率的にかつ効果的に処理することを細胞に許容するのに十分である。好適なポリアデニル化配列の実施例はSV40初期領域ポリアデニル化部位（C.V.Hallら、J.Molec.App.Genet.2,101（1983））とSV40後期領域ポリアデニル化部位（S.CarswellとJ.C.Alwine,Mol.Cell Biol.9,4248（1989））である。こうした付加的な配列は、転写が所望される場合には、プロモーター配列に操作可能にリンクされ、あるいは翻訳とプロセシングが所望される場合には、開始およびプロセシング配列にさらに操作可能にリンクされるように、ベクターの中に挿入される。代替的には、挿入配列は、ベクターの中の何らかの位置に置かれることが考えられる。「操作可能にリンクされる」という用語は、遺伝子配列の転写は操作可能にリンクされたプロモーター配列によって指示され、遺伝子配列の翻訳は操作可能にリンクされた翻訳調節配列によって指示され、また遺伝子配列の翻訳後プロセシングは操作可能にリンクされたプロセシング配列によって指示されるといったように、遺伝子配列とプロモーターあるいはそのほかの調節ないしはプロセシング配列の間の連関を説明するのに使用される。
本発明のベクターの構築のための標準的な技術は当業者には周知のものであり、またSambrookら執筆の『分子クローニング-ラボマニュアル第2版（Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed）』（コールド・スプリング・ハーバー社刊、ニューヨーク、1989年）などの参考文献に見つけることができる。さまざまな戦略がDNAのフラグメントを結合するために利用可能であり、その選択はDNAフラグメントの末端の性質に拠るが、その選択は技術にたけた人であれば、容易に行うことができる。
本発明の一つの実施様態では、組換えレンチウイルス発現システムは3つのベクターから構成される。第一のベクターはウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）ゲノムの少なくとも一部分の核酸配列から構成され、そこではそのベクターには、（i）EIAV構造タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子に少なくとも一つの欠損が含まれており、また（ii）欠損性パッケージングシグナルが含まれる。第二のベクターは、EIAVゲノムの少なくとも一部分の核酸配列から構成されており、そこではそのベクターには、（i）応答能のあるパッケージングシグナルが含まれ、また（ii）異種遺伝子が挿入されることになるであろう複数のクローニング部位が含まれる。第三のベクターはウイルスの核酸配列から構成され、そこではそのベクターは、（i）ウイルスエンベロープタンパク質を発現させ、また（ii）欠損性パッケージングシグナルを包含する。
本発明の一つの実施様態では、第一のベクターはgag/pol発現ベクターである。Gag/pol発現ベクターは細胞からのウイルス粒子の集合と放出に必要なEIAVタンパク質を発現させ、またタンパク質gagとpolをコードする遺伝子を含む。第一のベクターはまた、副次的なタンパク質revとtatをコードする遺伝子を発現させる。その機能が分かっていないタンパク質をコードする読み取り枠S2は、第一のベクターの中に付加的に含まれることがある。第一のベクターはレトロウイルスが仲介するウイルス遺伝子の転移を除外する突然変異を包含するように構築されている。こうした突然変異とは、ウイルスenv遺伝子の中にある配列の欠失であり、そのため、複製能力のあるEIAVを生成する可能性を除外することであり、あるいはウイルスの逆転写と組込みに必要なゲノムの3’末端でのある一定のcis-作用性配列エレメントの欠失であると考えられる。したがって、この構築物からのウイルス遺伝子がウイルス粒子の中にパッケージされるような場合があっても、それらが複製され、また複製能力のある野生型ウイルスが生成されることはないであろう。
本発明の一つの好適な実施様態では、発現システムの第一のベクターは、図2Aに示されているプラスミドpEV53である。pEV53は、12170塩基対（bp）プラスミドと、塩基対209-1072でEIAV tatコード領域（bp 1124-1210と5886-6026）から上流に位置しているキメラCMV/EIAVエンハンサープロモーター領域を含んでいるcDNAクローン、gagコード領域（bp 1216-2676）、polコード領域（bp 2433-5874）、ORF S2コード領域（bp 6037-6234）である。ベクターはまた部分envコード領域（bp 6063-7733）とrevコード領域（bp 6188-6288と7250-7654）を包含する。ファージf1領域（bp 8037-8450）、SV40初期プロモーター領域と複製の起源（bp 8514-8839）、ネオマイシン耐性コード領域（bp 9685-9924）、SV40ポリアデニル化シグナル（bp 9685-9924）、Col E1複製の起源（bp 10356-11029）、β-ラクタマーゼ（アンピシリン耐性）コード領域（bp 11174-12035）はそのままの状態で、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナルは提供される。
本発明のさらに好適な一つの実施様態では、発現システムの第一のベクターは、図2Bに示されているプラスミドpEV53Aである。プラスミドpEV53AはpEV53プラスミドから得られ、そこではEIAVタンパク質の発現レベルに影響を与えることなく、ウイルス遺伝子のレトロウイルス仲介転移の機会をさらに減らすために修飾がなされてきた。プラスミドpEV53Aでは、プロモーター/エンハンサーエレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列と組込みに重要なcis-作用性配列エレメントと逆転写の開始用のtRNAプライマー結合部位配列がpEV53から削除されてきた。pEV53のヌクレオチド902から1077までを削除することによって、pEV53AはpEV53から構築される。
本発明の発現システムの第二のベクターは、遺伝子転移用のベクターとして役立つように設計され、また、関心の対象である異種遺伝をコードするcDNAの挿入のための複数のクローニング部位だけではなく、ベクターゲノムの逆転写（複製）を支持するのに必要とされるすべてのcis-作用性配列エレメントを包含している。本発明では、関心の対象である遺伝子をコードするベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングと組込みに必要なcis-作用性配列エレメントのほかに、標的細胞の中に形質導入されるべき遺伝子情報を運ぶ組換えEIAV由来のベクターである。gag配列の一定の部分がEIAVゲノムのパッケージングにおいて役割を果たしていると考えられているので、第二のベクターにはgagコード配列のある部分が含まれることが好ましい。さらに、LTRの中に含まれている5’スプライシング供与体部位には、例えば、W.Tanら、J.Virol.70,3645-3658（1996）に説明されているように、好適には産生されたウイルスの力価を増加させる突然変異が含まれる。
好適な第二のベクターの2つの実施例が図3と4に提供されている。図3では、プラスミドとcDNAクローンpEC-lacZ、E.Coli lacZリポーター遺伝子を発現させるEIAVから得られた8749 bpプラスミドが図示されている。プラスミドには2つのCMV即時型エンハンサープロモーター領域（bp 1-734と1609-2224に位置している）、EIAV長末端反復（LTR）からのR-U5配列ドメイン（bp 735-849）、部分EIAV gag配列（bp 993-1570）、lacZコード配列（bp 2297-5437）、EIAV LTR配列（bp 5752-6073）、ファージf1領域（bp 6163-6618）、アンピシリン耐性コード領域（bp 7057-7917）、複製のColE1起源（bp 8062-8736）が含まれる。
図4では、プラスミドとcDNAクローンpEC-puro、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現させるEIAVから得られた6099 bpプラスミドが図示されている。このベクターにはまた、2つのCMV即時型エンハンサープロモーター領域（bp 1-734と1609-2224）、EIAV長末端反復（LTR）からのR-U5配列ドメイン（bp 735-849）、EIAVからの部分gag配列（bp 993-1570）、ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列（bp 2334-2933）、EIAV LTR配列（bp 3102-3423）、ファージf1領域（bp 3513-3968）、アンピシリン耐性コード領域（bp 4407-5267）、DNA複製のColE1起源（bp 5412-6086）が含まれる。
当業者であれば分かるように、挿入異種遺伝子配列あるいは配列（複数）のヌクレオチド配列は、いかなるヌクレオチド配列でも良い。例えば、挿入異種遺伝子配列はリポーター遺伝子配列かあるいは選択可能なマーカー遺伝子配列であると考えられる。リポーター遺伝子配列とは、ここで使用されているように、発現させられたときには、その存在あるいは活性が監視できるタンパク質を産生する結果になる、何らかの遺伝子配列である。適当なリポーター遺伝子の実施例には、ガラクトキナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、β-ラクタマーゼなどが含まれている。代替的には、リポーター遺伝子配列は、その発現が細胞生理に影響を与える遺伝子産物を産生する何らかの遺伝子配列であると考えられる。本発明の異種遺伝子配列は、一つあるいはそれ以上のプロモーター、開始配列、あるいはプロセシング配列をすでに所持している、一つあるいはそれ以上の遺伝子配列から成ると考えられる。
選択可能なマーカー遺伝子配列とは、それが存在すると、それを含む細胞を選択的に増殖させることを許容するタンパク質を発現させることができる、何らかの遺伝子配列である。選択可能なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなど）に宿主耐性を付与することができる遺伝子配列、あるいはアミノ酸類似体に宿主耐性を付与することができる遺伝子配列、あるいは付加的な炭素源上で、ないしはそのほかの許容できない培養条件の下で、細菌の成長を許容することができる遺伝子配列、が含まれている。遺伝子配列はリポーター遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子配列の両方であると考えられる。本発明のもっとも好適なリポーター遺伝子とは、E.Coliのβ-ガラクトシダーゼ活性をコードするlacZ遺伝子であり、またピューロマイシン耐性をコードする遺伝子である。
好適なリポーターあるいは選択可能なマーカー遺伝子配列であれば、正常細胞においてベクターの認識あるいは選択を可能にするのに十分である。本発明の一つの実施様態では、リポーター遺伝子配列は哺乳動物細胞には正常であれば欠けている酵素あるいはほかのタンパク質をコードし、またそれらが存在する場合には、したがって、そうした細胞においてベクターの存在を明確に立証することができる。
異種遺伝子配列はまた、適当な、生物学的に活性のあるタンパク質ないしはポリペプチド、免疫原性あるいは抗原性のタンパク質ないしはポリペプチド、あるいは治療上活性のあるタンパク質ないしはポリペプチドなどの所望されている産物のコード配列から成る。代替的には、異種遺伝子配列はアンチセンスRNA配列などのRNA配列に対して相補的である配列から成ると考えられるが、そのアンチセンス配列は個々の細胞における相補的なポリヌクレオチドの発現を阻害するために、個々に対して投与することができる。
異種遺伝子の発現は抗体反応を達成するために免疫原性あるいは抗原性のタンパク質ないしはポリペプチドを提供することが考えられるが、その抗体は動物の血液、血清あるいは腹水などの体液から収集することがてきる。
本発明の好適な実施様態では、組換えレンチウイルス発現システムの第三のベクターはウイルスエンベロープタンパク質を発現させる。こうしたベクターはしたがって、適当なプロモーターの制御下でウイルスタンパク質をコードする核酸配列から成る。本発明のウイルスベクターは、近しい関連性をもっているもう一つのウイルスからのエンベロープ遺伝子を使用することによって感染させることができるので、細胞の宿主域を変えることが可能である。言い換えると、ほかのウイルスの包膜化に参加するウイルスのエンベロープタンパク質の能力を利用することによって、本発明のEIAVベクターの宿主域を拡張することが可能である。本発明のとくに好適な実施様態では、水疱性口内炎ウイルスのG-タンパク質（VSV-G;例えば、RoseとGillione,J.Virol.39,519-528（1981）;RoseとBergmann,Cell 30,753-762（1982）を参照されたい）、あるいはそこから得られたフラグメントないしは誘導体は、第三のベクターによって発現させられるエンベロープタンパク質である。VSV-Gは効率的に、ほかのウイルスのゲノムとマトリックス組成物によって偽型ビリオンを形成する。ここで使用されているように、「偽型」という用語は、一つのウイルスの核酸と、ほかのもう一つのウイルスのエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子のことを言っている。一般的には、VSV-G偽型ベクターは非常に広範な宿主域を有しており、また超遠心分離法（例えば、J.C.Burnsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,8033-8037（1993）の方法による）によって粒状の沈殿物を収集して高濃縮の力価にすることが可能であるが、しかし一方、まだ高いレベルの感染力が残る。
本発明の第三のベクターの分かりやすく、また好適な実施例が図5に示されている。この図ではプラスミドとcDNAクローンpCI-VSV-G、エンベロープ糖タンパク質VSV-Gのための好適な発現ベクターが図示説明されている。プラスミドには5679塩基対が含まれていて、またCMV即時型エンハンサープロモーター領域（bp 1-795）、キメライントロン領域（bp 857-989）、VSV-Gコード領域（bp 1088-2633）、ファージf1領域（bp 3093-3548）、SV40後期ポリアデニル化シグナル（bp 2782-3003）、DNA複製のColE1起源（bp 4992-5666）、アンピシリン耐性コード領域（bp 3987-4847）が含まれている。
本発明の一つの方法では、感染性、複製-欠損性EIAV粒子は当業者には公知の技術と組合せてここに開示された方法により作成することが可能である。この方法には、本発明のベクター発現システムによってレンチウイルス-許容細胞をトランスフェクションすること、トランスフェクションされた細胞の中でEIAV由来の粒子を産生すること、その細胞からウイルス粒子を収集すること、が含まれる。レンチウイルス-許容細胞をトランスフェクションするステップは、当業者には公知のいずれかの適当な手段により実行することができる。例えば、本発明の一つの方法では、ここで説明されたプラスミド発現システムが一過性のトランスフェクションによってEIAV由来のレトロウイルスベクター粒子を生成するのに使用される。ほかのもう一つの実施例では、例えば、DEAE-デキストランによって細胞を処理することによる、細胞に付加する前に「LIPOFECTIN▲Ｒ▼（リポフェクチン）」または電子穿孔によってRNAを処理することによるなどの、細胞の中へのベクターの取込みをいずれかの適当な手段によって達成することができる。これらの技術は当業者には周知のものである。
細胞の中で感染性ウイルス粒子の産生を促進するステップはまた、標準的な細胞培養成長技術によるなど、従来の技術を使用して実行することが可能である。
感染性ウイルス粒子を収集するステップはまた、従来の技術を使用して実行することが可能である。例えば、感染性粒子は細胞溶解によって収集が可能であり、あるいは細胞培養の上清の収集も当業者には公知の従来技術そのままで可能である。収集されたウイルス粒子は所望されれば任意に精製することが可能である。適当な精製技術は当業者には周知のものである。
当業者が望めば、レンチウイルス株溶液は本発明のベクターと方法を使用して作成することが可能である。ウイルス株溶液作成方法は当業者には公知のものであり、例えば、Y.Soneokaら、Nucl.Acids Res.23,628-633（1995）やN.R.Landauら、J.Virol.66,5110-5113（1992）によって説明されている。本発明においてウイルス株溶液を産生する方法では、レンチウイルス-許容細胞（ここではプロデューサー細胞として言及）が本発明のベクターシステムによってトランスフェクションされる。細胞はその後適当な細胞培養条件下で成長させ、レンチウイルス粒子は上述のように、細胞自体かあるいは細胞培地かのいずれかから収集される。適当なプロデューサー細胞系には、これに限定されるわけではないが、ヒト胎芽性腎細胞系293、ウマ皮膚細胞系NBL-6、イヌ胎児性胸腺細胞系Cf2THが含まれる。
本発明のベクターはまた、安定したパッケージング細胞（すなわち、EIAVウイルスタンパク質を安定的に発現させる細胞で、その細胞は、それ自体では感染性ウイルス粒子を生成することはできない）を作成するのに有用である。レトロウイルスタンパク質を発現させるパッケージング細胞を作成する方法は当業者には公知のものであり、また、例えば、その開示が全体としてここに組込まれている、Teminらに付与された米国特許No.4,650,764号に述べられている方法によって例証されている。本発明の範囲内で、パッケージング細胞は、少なくとも一つのEIAV構造タンパク質をコードするEIAV核酸配列から成るレンチウイルス-許容宿主細胞から成り、その核酸配列はパッケージングシグナル欠損性であり、そのため、その細胞自体が少なくとも一つのEIAV構造タンパク質を産生できるようになるが、しかし複製能力のある感染性ウイルスを産生できるようにはならない。一つの実施様態では、EIAV核酸配列は、例えば、pEV53などのEIAV gag-pol発現ベクターである。パッケージング細胞は、EIAV-許容宿主細胞（例えば、ヒト胎芽性腎臓293細胞）を公知の手順により上に用意されたように、適当なEIAV核酸配列を用いてトランスフェクションすることによって作成することが可能である。その結果としてパッケージング細胞はしたがって、少なくとも一つのEIAV構造タンパク質を発現させ、産生することができるようになる。しかし、EIAV核酸配列はパッケージングシグナルにおいては欠損性であるという点では、その細胞はそれ自体に関しては、複製能力のあるEIAVウイルスを産生することはできない。パッケージング細胞はしたがってほかの核酸配列（例えば、pEC-puro、pEC-lacZ、pCI-VSV-G）によってトランスフェクションすることは可能であり、またそれには関心の対象となっている異種遺伝子と適当なパッケージングシグナルが含まれることになるであろう。一旦、付加的な配列あるいは配列（複数）によってトランスフェクションされると、パッケージング細胞はしたがって異種遺伝子を含むEIAVウイルス株を供給することに使用することが可能であるが、そのウイルス自体には複製能力は無い。
本発明のワクチンなどの医薬品製剤は、医薬品として受け入れ可能なキャリヤーと組合せて、ここに開示されているように、感染性、複製欠損性ウイルス粒子の免疫原性の分量から成る。「免疫原性の分量」はその医薬品が投与される対象において免疫反応を引き起こすのに十分な感染性ウイルス粒子の分量である。約103から約107ウイルス粒子の分量、また好適には投与毎に約104から106ウイルス粒子が適当であると考えられているが、治療を受けている対象の年齢や種、その所望されている免疫反応を起こす免疫原に拠る。典型的な医薬品として受け入れ可能なキャリヤーには、それに限定されるものではないが、無菌状態で発熱物質が入っていない水、無菌状態で発熱物質が入っていない生理食塩水溶液が含まれる。本発明の感染性、複製-欠損性ウイルス粒子の免疫原性の分量を投与される対象には、これに限定されるわけではないが、ヒトや動物（例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ロバ、マウス、ハムスター、サル）対象が含まれる。
本発明の医薬品製剤には、非経口投与に適当なもの（例えば、皮下、皮内、筋内、静脈内、関節内）、経口あるいは吸入投与が含まれる。代替的には、本発明の医薬品製剤は、対象の粘膜に対する投与に適しているであろう（例えば、鼻腔内投与）。その製剤は単位投与量形態で利便的に作成され、また当業者には周知のいずれかの方法によって作成されることであろう。
本発明のベクターと方法はin vitroの発現システムで有用であり、そこでは第二のベクター上に位置している挿入異種遺伝子がin vitroに望ましい形で産生されるタンパク質あるいはペプチドをコードする。
本発明のベクター、方法、医薬品製剤はさらに、治療あるいはそのほかの方法として、所望されるタンパク質あるいはペプチドを必要とする対象にタンパク質あるいはペプチドを投与する方法において有用である。本発明のこの実施様態では、第二のベクター上に位置している本発明の異種遺伝子は所望されるタンパク質あるいはペプチドをコードし、また本発明のヘルパー細胞、あるいは本発明のヘルパー細胞を含む医薬品製剤は所望されるタンパク質あるいはペプチドを必要とする対象に投与される。この方法では、タンパク質あるいはペプチドはしたがって対象の中でin vivoに産生されることになる。対象はタンパク質あるいはペプチドが欠乏しているために、また対象におけるタンパク質あるいはペプチドの産生が何らかの治療上の効果を与える可能性があるので、治療あるいはそのほかの方法として、また以下にさらに説明されているように、対象にはタンパク質あるいはペプチドが必要とされる。
III．遺伝子転移技術
本発明の遺伝子転移技術にはいくつか用途がある。当面の用途はおそらく、ペプチドならびにタンパク質の機能的なドメインのプロセスを解明する際に用いられるものであろう。タンパク質については、プロセシングと細胞の運命における細胞特異的な差異を研究する目的で、クローン化されたcDNAあるいはゲノム配列は培養において、あるいはin vivoに異なった細胞の型に導入することができる。コード配列を強いプロモーターの制御下に置くことによって、所望されるタンパク質のかなりの分量を作成することができる。さらに、タンパク質プロセシング、細胞内選別、あるいは生物学的活性に関わる特異的な残基を、コード配列の分離した残基における突然変異的な変化によって判定することができる。
本発明の遺伝子転移技術はまた、タンパク質の発現を制御する手段、あるいは細胞の出来事を調節するその能力を評価する手段を提供するのに適用できる。分化における役割など、タンパク質のいくつかの機能は組織培養において研究される可能性があり、一方、ほかのものは、該当する特性における変化を監視するため、発育の異なった経過時間別にin vivoシステムの中に再導入する必要があるだろう。
遺伝子転移は、特異的な遺伝子の発現を調節する核酸配列と細胞因子を研究するための手段を提供する。こうした研究に対するアプローチの一つとして、リポートされた遺伝子に、研究の対象である調節エレメントを融合させ、その後そのリポーター遺伝子の発現を測定することが挙げられる。
遺伝子転移にはまた、疾病状態に対する治療を理解し提供する際に実質的で潜在能力のある使用法を有している。欠損性遺伝子が分かり、クローン化された遺伝性疾患は数多くある。いくつかの例では、クローン化されたこれら遺伝子の機能が分かっている。一般的には、上述の疾患の状態は二つのクラスに分類される。すなわち、一般的には劣性に遺伝する通常は酵素の欠乏状態と、優性に遺伝する調節あるいは構造タンパク質に少なくともときには関連している不均衡状態である。欠乏状態の疾患については、遺伝子転移は、アンチセンス突然変異を使用して疾患のための動物モデルを作り出すだけではなく、代償療法として、冒された組織の中に正常な遺伝子を運び入れるのに使用することができる。不均衡になっている疾患の状態については、遺伝子転移はモデルシステムの中で疾患の状態を作り出すのに使用することができ、その後にその疾患の状態を除去する努力において使用することができる。したがって、本発明の方法は遺伝性疾患の治療を可能にするものである。ここで使用されているように、疾患の状態は、その疾患を起こす、あるいはそれをさらに重篤にする欠乏あるいは不均衡を部分的にあるいは全体的に直すことによって治療される。突然変異を起こす、あるいは欠損を補正するために、核酸配列の部位-特異的な組込みを使用することもまた可能である。
造血幹細胞、白血球、血管内皮細胞、呼吸上皮細胞、表皮細胞、骨格および心筋細胞、神経単位、癌細胞は、ex vivoあるいはin vivoで治療目的の遺伝子転移の標的として考えられているものである。これについては、例えば、A.D.Miller,Nature 357,455-460（1992）;R.C.Mulligan,Science 260,926-932（1993）を参照されたい。これらの細胞やそのほかのものは、本発明のベクターならびに方法にとっては適当な標的細胞である。
要約すると、本発明のウイルスベクターは分裂あるいは非分裂細胞のいずれかを安定的にトランスフェクションして、安定的に異種遺伝子を発現させるのに使用することができる。本ベクターシステムを使用すれば、分裂あるいは非分裂細胞の中に、細胞生理に影響を与えることができるタンパク質をコードする遺伝子を導入することが現在可能である。本発明のベクターはしたがって疾患状態に対する遺伝子治療において、あるいは細胞生理を実験的に修飾することにおいて、有用となりうる。
本発明を今まで説明してきたが、同じことが図示説明だけの目的でここに含めた一定の実施例を参照して図示説明がなされるが、それは本発明を制限することを意図しているわけではない。
実施例1
プラスミド構築
ここで説明されているEIAVベクターの親プラスミドはプラスミドpER2.1であるが、米国ノースカロライナ州ラレイ（Raleigh）市にあるノースカロライナ州立大学のFred Fuller博士によって寛大にも提供されたものである。クローンpER2.1構築物がS.T.Perryら、J.Virol.66,4085-4097（1992）に説明されている。pER2.1はEIAVのマルムクイストワイオミング株の感染性DNAクローンをコードする。生成されたウイルスはその野生のウマ宿主に疾病を引き起こすことはないことが、このクローンの一つの安全性の側面を示している。また、遺伝子転移における使用を考慮されているほかのレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス）から得られたベクターとは違い、野生型EIAVはヒト細胞において活発な感染を繰り広げることはない。
EIAV gag/pol（第一の）発現ベクター。pEV53プラスミド（図2Aに図示）はウイルス粒子形態細胞の集合と放出に必要なEIAVタンパク質を発現するように設計されたもので、gagとpol遺伝子によってコードされているタンパク質をコードする遺伝子、また副次的なタンパク質revとtatを包含する。その機能が分かっていないタンパク質をコードする読み取り枠S2もまた包含された。pEV53はウイルス遺伝子のレトロウイルスが仲介する転移を除外する突然変異を包含するように構築された。突然変異には、ウイルスenv遺伝子での配列欠失（したがって複製能力のあるEIAVウイルス粒子を生成する可能性は除外してある）とウイルス逆転写と組込みに必要なゲノムの3’末端でのあるcis-作用性配列エレメントの欠失が含まれる。欠失は包含されているので、ウイルス遺伝子が感染性粒子の中にパッケージされるといったありそうもない出来事があったとしても、それらは複製されることはない（例えば、複製能力のある野生型ベクターは生成されないであろう）。図2Bに示されているプラスミドpEV53AはpEV53から得られたものであるが、逆転写開始用のtRNAプライマー結合部位配列だけではなく、組込みには重要な、プロモーター/エンハンサーエレメントとcis-作用性配列エレメントを含むすべてのEIAV長末端反復（LTR）配列が、ヌクレオチド902から1077までをpEV53から除去することによって、削除されたという点では、pEV53とは異なる。pEV53Aプラスミドは、EIAVタンパク質の発現レベルに影響を与えずにウイルス遺伝子のレトロウイルスが仲介する転移の機会をさらに減少するように作成された。
遺伝子転移（第二の）ベクター。pEC-lacZ（図3に図示）とpEC-puro（図4に図示）プラスミドは、遺伝子転移のためのベクターとして役立つように設計されたものであり、また関心の対象である遺伝子をコードするcDNAの挿入のための複数のクローニング部位だけではなく、ベクターゲノムの逆転写（例えば、複製）を支えるのに必要なすべてのcis-作用性配列エレメントを包含する。pEC-lacZプラスミドはβ-ガラクトシダーゼリポーター遺伝子lacZをコードし、一方、pEC-puroプラスミドはピューロマイシン-N-アセチル転移酵素の優性選択可能なマーカー遺伝子puroをコードする。
ウイルスエンベロープ遺伝子発現（第三の）ベクター。ここで述べられている発現システムの第三のプラスミドは、図5に示されているプラスミドpCI-VSV-Gである。このプラスミドはウイルスエンベロープ遺伝子を発現させ、とくに水疱性口内炎ウイルスG糖タンパク質遺伝子を発現させる。
実施例2
ウイルスベクターの産生と検定
EIAVベクターは、pEV53A gag-pol発現プラスミド、pCI-VSV-G env発現プラスミド、またpEC-lacZかあるいはpEC-puro発現ベクタープラスミドのいずれかをヒト293細胞の培養の中に入れて標準的なリン酸カルシウム仲介コ-トランスフェクション法に従って産生された（American Type Culture Collection、メリーランド州ロックビル市）。トランスフェクション後48時間で、培地から細胞を収集し、EIAVベクター産生に関して検定された。pEC-puroベクターの遺伝子転移効率が薬剤ピューロマイシンに耐性を与えるベクターの連続希釈の能力によって測定された。この測定では、感染細胞は細胞の薬剤耐性コロニーを生じさせるが、その後それを数えることができる。ヒト293細胞は標的細胞として使用された。6つの独立した実験から、EC-puroベクターの平均力価は2±1×105コロニー形成単位（cfu）/mLであると判定された。
EC-lacZベクターの遺伝子転移効率は感染ヒトCFT1ヒト気道上皮細胞をX-gal（Molecular Probes,Inc.、オレゴン州ユージーン市）、ガラクトースの類似体によって染色することによって判定された。この測定では、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させる細胞が青色に変わり、また数を数えることにより青色細胞のパーセンテージが求められた。ウイルスの力価は、染色細胞の比率に最初に感染させられた細胞の数を乗算することによって求められた。この方法では、EC-lacZウイルスの力価は約5±1×104感染力単位（n=5）/mLであると判定された。
いくつかの制御実験が、puroとlacZ遺伝子の発現がウイルス組成物によって実際に仲介されたかどうかを判定するために行われた。最初の実験では、EC-puroとEC-lacZベクターの両方について、pEV53あるいはpEV53AとpCI-VSV-Gベクターが遺伝子転移には欠かせないことが示された。この結果は、ウイルス（と遊離DNAではない）によって仲介された遺伝子転移および発現と一致している。lacZベクターを使用した第二の制御実験では、細胞は2時間の感染の直後にX-galによって染色されたが、青色の細胞は見られなかった。この結果は逆転写、組込み、遺伝子発現の時間的経過のアスペクトと一致していたが、ほかのレトロウイルスは完了するのに最低約10時間を要することが知られている。
実施例3
非分裂細胞に対する遺伝子転移
EIAVはマクロファージや気道上皮といった非分裂、終末分化細胞を感染させることができる。本発明によってこの特性を検定するために、ヒトCFT1気道上皮細胞（チャペルヒル市にあるノースカロライナ大学のJ.R.Yankaskas氏によって寛大にも提供された）がアフィジコリン（Calbiochem-Novabiochem Corp.、カリフォルニア州ラジョラ市）によって細胞サイクルにおいて停止され、それからpEC-lacZベクターによって感染させた。対照として、LZベクターと、マウス白血病ウイルス（MuLV）から得たlacZを含有するレトロウイルスベクターとを並行して細胞を感染させた。感染後48時間で、培養はβ-ガラクトシダーゼ活性に関してX-galによって染色した。アフィジコリン処理培養では、アフィジコリンは感染の間と感染後の両方で存在した。
染色細胞の顕微鏡視野が図6Aに示されている。LZベクターはアフィジコリンによって処理されていない細胞を効率よく感染させた（左上のパネル）。しかし、細胞が細胞サイクルにおいてアフィジコリンによって停止されたときに、遺伝子転移効率は著明に低下した（右上のパネル）。分裂細胞と非分裂細胞への遺伝子転移の相対効率はLZベクターに関しては、約100対1であった（図6Bに図示されているように、棒グラフの左側対）。結果はほかの研究所での実験で得られた結果と一致する。これについては、例えば、D.G.Millerら、Mol.Cell.Biol.10,4329-4242（1990）;P.E.LewisとM.Emerman,J.Virol.68,510-516（1994）を参照されたい。感染時、並行培養にはブロモデオキシウリジン（BrdU）により2時間の間アフィジコリンブロックの効果を検定するために培養の細胞に同位元素で標識された基質が適用され、また図6Cに示したように、DNAへのBrdU組込みに関して分析が行われた。アフィジコリンがDNAへのBrdUの組込みを著明に減らしたことが見出された。
LZベクターについて得られた結果とは対照的に、アフィジコリン処理はEC-lacZベクターによって感染させたヒトCFT1細胞のパーセンテージには著明な効果は見られなかった（図6Aの下側パネルと図6Bの棒グラフの右側対の結果を参照されたい）。これらの結果から、EIAVベクターは非分裂細胞を効率的に感染させることができることが示された。例えば、図7に示されている実験では、アフィジコリンで処理されていなかった細胞と比較して、細胞がアフィジコリンで処理されたときには、ウマ皮膚線維芽細胞系NBL-6は（与えられたウイスル量に関し）約10倍容易に感染した。
実施例4
VSV-G偽型EIAVベクターの超遠心分離
VSV-G偽型ベクターの長所の一つは、VSV-Gにより増大した安定性がもたらされ、超遠心分離法での沈殿物収集によって感染力の濃縮が許容されることである（例えば、J.C.Burnsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,8033-8037（1993）を参照されたい）。VSV-G偽型EIAVベクターの感染力はまた、遠心分離技術を使用して沈殿物を収集することによって回復できることが測定された。この実験では、293細胞（pEV53プラスミドを発現させるために安定的に修飾されている）の2-プラスミド（pEC-lacZ/pCI-VSV-G）コ-トランスフェクションからのEC-lacZを含んだ上清720mLが高速遠心分離におけるウイルスの沈殿物を収集することによって濃縮された。粒状沈殿物は、ウイルス粒子の2000倍の濃縮を達成するために、1×0.36mLのHankの平衡食塩溶液（HBSS,Cat.#14175,Life Technologies,Inc.、メリーランド州ゲティスバーグ市）に懸濁された。感染力が測定され（感染力の投与-反応曲線については図8を参照されたい）、またその力価が5×105から6×108へ約1200倍に増加したことが見出された。結果的に、感染力の収率は約60％であった。この結果により、粒状沈殿物の収集によってEIAVベクターは高い力価まで濃縮できることが説明されている。
実施例5
パッケージング細胞系
安定したパッケージング細胞を得るために、標準カルシウムトランフェクション手順を使用してヒト胎芽性腎細胞系293がpEV53によってトランスフェクションされた。細胞はG418（ジェネティシン）（Life Technologies,Inc.、米国メリーランド州ゲティズバーグ市）を使用してネオマイシンの発現のために選択された。個々のコロニーが選択されて、拡張され、またpEC-puroとpCI-VSV-Gによってトランスフェクションした後、ウイルス産生に関して検定が行われた。最大のベクター産生を示したクローンパッケージング細胞系は長期間の貯蔵のために凍結していたか、あるいはパッケージング機能の永続性の分析のために培養の中に保持されていたかのいずれかであった。パッケージング機能は少なくとも1ヵ月間は安定していたことが分かり、本発明は安定したEIAVをベースとしたパッケージング細胞系の作成において有用かつ成功したことを示した。
本発明はそれについての特定の実施様態と関連して説明されてきたが、本発明にはさらなる修飾が可能であり、また本出願は、一般的に本発明の原則に従い、また本発明が伝える当業界内で公知の、あるいは慣習的な行為内に収まるような、本開示からのそうした試みを含む発明のあらゆる変化、使用法、あるいは適応をカバーすることを意図しており、また添付の請求範囲に述べられている重要な特徴に対して適用されるものと考えられる。
【図１Ａ】
0004390860.tif 000002
【図１Ｂ】
0004390860.tif 000003
【図１Ｃ】
0004390860.tif 000004
【図１Ｄ】
0004390860.tif 000005
【図１Ｅ】
0004390860.tif 000006
【図２Ａ】
0004390860.tif 000007
【図２Ｂ】
0004390860.tif 000008
【図３】
0004390860.tif 000009
【図４】
0004390860.tif 000010
【図５】
0004390860.tif 000011
【図６Ａ】
0004390860.tif 000012
【図６Ｂ】
0004390860.tif 000013
【図６Ｃ】
0004390860.tif 000014
【図７Ａ】
0004390860.tif 000015
【図７Ｂ】
0004390860.tif 000016
【図８】
0004390860.tif 000017