(57)【要約】  多胎妊娠において、母性および父性ハプロタイプの遺伝を決定するための技術を提供する。母性遺伝は、母親がヘテロ接合型で父親の遺伝性アレルが分かっている（例えば父親がホモ接合型の）遺伝子座で決定することができる。一方が第一の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有し、もう一方が第二の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有する２種類の遺伝子座を利用してもよい。父性遺伝は、父親がヘテロ接合型で母親がホモ接合型の遺伝子座から決定することができる。各遺伝子座について、異なるアレルの量を測定することができる。その量を比較することで（例えば、各アレルの分画濃度とカットオフ値を用いて）ハプロタイプの遺伝を決定することができる。ハプロタイプを目的の条件と関連付けることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法であって、
・第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定すること、ここで、前記女性は各第一の遺伝子座について、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型であり、第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでおり；
・前記２人の胎児が、前記第一の遺伝子座の前記対応する第一のアレルを前記男性から受け継いでいることを決定すること；
・第一の染色体上にある１つ以上の第二の遺伝子座を含む第二の群を同定すること、ここで、前記第二の群の第二の遺伝子座のそれぞれについて、前記第一の母性ハプロタイプは対応する第三のアレルを含み、前記第二の母性ハプロタイプは対応する第四のアレルを含んでいる；
・前記２人の胎児が、前記第二の遺伝子座の前記対応する第三のアレルを前記男性から受け継いでいることを決定すること；
・前記女性から得られた生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第一の遺伝子座に存在する、前記対応する第一のアレルの第一の量および前記対応する第二のアレルの第二の量を測定すること、ここで前記生体試料は前記女性および前記２人の胎児に由来する細胞を伴わないＤＮＡを含むものであり；
・前記生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある前記第二の遺伝子に存在する、前記対応する第三のアレルの第三の量および前記対応する第四のアレルの第四の量を測定すること；
・以下のように、前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定すること：
（ｉ）前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に高く、かつ、前記第三の量と前記第四の量が統計的に等しい場合、胎児が２人とも前記第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定すること、
（ｉｉ）前記第一の量と前記第二の量が統計的に等しく、かつ、前記第四の量が前記第三の量よりも統計的に大きい場合、胎児が２人とも前記第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定すること、
または、（ｉｉｉ）前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に大きく、かつ、前記第四の量が前記第三の量よりも統計的に大きい場合、前記胎児のうちの１人が前記第一の母性ハプロタイプを受け継いでおり、もう１人が前記第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定すること、
を含む、２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法。
【請求項２】
さらに、前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に大きく、かつ、前記第三の量と前記第四の量が統計的に等しいことを、
・前記第一の量と前記第二の量に関する第一の比を算出すること、
・前記第三の量と前記第四の量に関する第二の比を算出すること、
・前記第一の比と前記第二の比に関する第三の比を算出すること、および
・前記第三の比をカットオフ値と比較すること
によって決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
さらに、前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に大きく、かつ、前記第四の量が前記第三の量よりも統計的に大きいことを、
・前記第一の量と前記第二の量に関する第一の比を算出すること、
・前記第四の量と前記第三の量に関する第二の比を算出すること、
・前記第一の比と前記第二の比に関する第三の比を算出すること、および
・前記第三の比をカットオフ値と比較すること
によって決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記第三の比と前記カットオフ値の前記比較することが、前記第三の比が１と統計的に等しいか否かを決定する、請求項１の方法。
【請求項５】
第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含んでいる前記第一の群を同定することが、前記生体試料中の前記対応する第一のアレルおよび第二のアレルを検出することを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
男性が前記第一の群に含まれている各第一の遺伝子座の前記対応する第一のアレルについてホモ接合型で、かつ、前記男性が前記第二の群に含まれている各第二の遺伝子座の前記対応する第四のアレルについてホモ接合型である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記対応する第一のアレルの前記第一の量および前記対応する第二のアレルの前記第二の量を測定することが、
第一の遺伝子座のそれぞれについて：
・前記対応する第一のアレルを含んでいるＤＮＡ断片の第一の数と、前記対応する第二のアレルを含んでいるＤＮＡ断片の第二の数に関する比を決定すること；および
・前記比の平均の比を決定すること、
を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記平均の比をカットオフ値と比較することで、前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に大きいことを決定することをさらに含む、請求項７の方法。
【請求項９】
さらに、前記第一の量が前記第二の量よりも統計的に大きいことを、
・前記第一の量と前記第二の量から第一の指標を算出すること；および
・前記第一の指標をカットオフ値と比較すること、
によって決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記第一のアレルのうちの１つ以上、前記第二のアレルのうちの１つ以上、前記第三のアレルのうちの１つ以上および／または前記第四のアレルのうちの１つ以上が目的の表現型と関連付けられている、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記第二のアレルのうちの１つ以上および／または前記第四のアレルのうちの１つ以上が常染色体優性の疾患または疾患感受性と関連付けられている、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記第一のアレルのうちの１つ以上および／または前記第二のアレルのうちの１つ以上が常染色体劣性の疾患または疾患感受性と関連付けられている、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記第三のアレルのうちの１つ以上および／または前記第四のアレルのうちの１つ以上が常染色体劣性の疾患または疾患感受性と関連付けられている、請求項１の方法。
【請求項１４】
男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法であって、
・第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定すること、ここで、前記女性は各第一の遺伝子座について、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型であり、第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでおり；
・前記２人の胎児が、前記第一の遺伝子座の前記対応する第一のアレルを前記男性から受け継いでいることを決定すること；
・前記女性から得られた生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第一の遺伝子座に存在する、前記対応する第一のアレルの第一の量および前記対応する第二のアレルの第二の量を測定すること、ここで前記生体試料は前記女性および前記２人の胎児に由来する細胞を伴わないＤＮＡを含むものであり；
・前記第一の量と前記第二の量に関する比を算出すること、
・以下のように、前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定すること：
（ｉ）比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
（ｉｉ）比が第二のカットオフ値よりも小さい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、または
（ｉｉｉ）比が第三のカットオフ値よりは小さく、かつ、第四のカットオフ値よりは大きく、ここで第三のカットオフ値は第一のカットオフ値と等しいかそれ未満で、さらに、第四のカットオフ値が第二のカットオフ値と等しいかそれより大きく、かつ、第三のカットオフ値よりも小さい場合、胎児のうちの１人が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいて、もう１人が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
を含む、２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法。
【請求項１５】
前記第一の量と前記第二の量に関する前記比を算出することが、
・第一の遺伝子座のそれぞれについて、前記対応する第一のアレルの量と前記対応する第二のアレルの量に対応する比を算出すること；および
・前記対応する比に基づいて前記比をコンピューターで計算すること
を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記対応する比に基づく比が、前記対応する比の平均または中央値をコンピューターで計算することを含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記女性が３人の胎児を妊娠していて、前記２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定することが、
・前記第一の量が前記第二の量と統計的に等しい場合に、前記１つ以上第一の遺伝子座に関し前記３人の胎児がヘテロ接合型であると同定すること、
・前記比が前記第三のカットオフ値よりも小さく、かつ、前記第四のカットオフ値よりも大きい場合に、前記１つ以上の第一の遺伝子座の前記第一のアレルについて、胎児のうちの２人がヘテロ接合型で、胎児のうちの１人がホモ接合型であると同定すること、または
・前記比が前記第一のカットオフ値よりも大きく、かつ、前記第五のカットオフ値よりも小さい場合に、前記１つ以上の第一の遺伝子座の前記第一のアレルについて、胎児のうちの２人がホモ接合型で、胎児のうちの１人がヘテロ接合型であると同定すること、または
・比が第五のカットオフ値よりも大きい場合、第一のアレルについて胎児が３人ともホモ接合型であると同定すること、
をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１８】
前記第一の群に含まれている前記第一のアレルのうちの１つ以上が状態または感受性に関連付けられており、
・前記ハプロタイプの前記遺伝に基づく前記状態または感受性を、前記胎児のうちの両方が受け継いでいる、どちらも受け継いでいない、または１人が受け継いでいるか否かを決定すること、
をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記女性が、常染色体劣性の状態または感受性に関連付けられているハプロタイプを有し、かつ、前記胎児のうちの１人または両方が、前記状態または感受性の保因者であると決定される、請求項１４の方法。
【請求項２０】
男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法であって、
・第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定すること、ここで、前記女性は各第一の遺伝子座について、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型であり、第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでおり；
・前記２人の胎児が、前記第一の遺伝子座の前記対応する第一のアレルを前記男性から受け継いでいることを決定すること；
・第一の染色体上にある１つ以上の第二の遺伝子座を含む第二の群を同定すること、ここで、前記第二の群の第二の遺伝子座のそれぞれについて、前記第一の母性ハプロタイプは対応する第三のアレルを含み、前記第二の母性ハプロタイプは対応する第四のアレルを含んでいる；
・前記２人の胎児が、前記第二の遺伝子座の前記対応する第四のアレルを前記男性から受け継いでいることを決定すること；
・前記女性から得られた生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第一の遺伝子座に存在する、前記対応する第一のアレルの第一の量および前記対応する第二のアレルの第二の量に関する第一の比を算出すること、ここで前記生体試料は前記女性および前記２人の胎児に由来する細胞を伴わないＤＮＡを含むものであり；
・前記生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第二の遺伝子座に存在する、前記対応する第三のアレルの第三の量および前記対応する第四のアレルの第四の量に関する第二の比を算出すること、ここで前記第一、第二、第三および第四の量は、前記生体試料の測定から得られるものであり；
・前記第一の比と第二の比に関する第三の比を算出すること；
・以下のように、前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定すること：
（ｉ）第三の比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
（ｉｉ）第三の比が第二のカットオフ値よりも小さく、ここで第一のカットオフ値が第二のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
（ｉｉｉ）第三の比が第三のカットオフ値よりは小さく、かつ、第四のカットオフ値よりは大きく、ここで第三のカットオフ値は第一のカットオフ値と等しいかそれ未満で、さらに、第四のカットオフ値が第二のカットオフ値と等しいかそれより大きく、かつ、第三のカットオフ値よりも小さい場合、胎児のうちの１人が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいて、もう１人が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
を含む、２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法。
【請求項２１】
前記第三のカットオフ値が前記第一のカットオフ値と等しく、前記第四のカットオフ値が前記第二のカットオフ値と等しい、請求項２０の方法。
【請求項２２】
さらに、前記第三の比が第一のカットオフ値よりも大きいことを、
・前記第三の比を１と比較すること；および
・前記第三の比が１よりも大きいときに、前記第三の比を前記第一のカットオフ値と比較すること、
によって決定することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２３】
さらに、前記第三の比が第三のカットオフ値よりも小さく、かつ、第四のカットオフ値よりも大きいことを、
・前記第三の比が１と統計的に等しいと決定すること、
によって決定することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２４】
さらに、
・第一の胎児が寄与している胎児ＤＮＡパーセンテージの第一の割合（ａ％）および第二の胎児が寄与している胎児ＤＮＡパーセンテージの第二の割合（ｂ％）を決定すること、ここで前記第一、第二、第三、および第四のカットオフ値は、ａ％およびｂ％に基づいて決定される、
を含む、請求項２０の方法。
【請求項２５】
前記第一のカットオフ値が、（１＋ａ％＋ｂ％）／１と（５０％＋ａ％／２）／（５０％＋ｂ％／２）を区別するものである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記第二のカットオフ値が、１／（１＋ａ％＋ｂ％）と（５０％＋ａ％／２）／（５０％＋ｂ％／２）を区別するものである、請求項２４の方法。
【請求項２７】
工程（ｉ）が前記第一の比が前記第二の比よりも統計的に大きいか否かを決定することを含み、工程（ｉｉ）が第二の比が前記第一の比よりも統計的に大きいか否かを決定することを含み、および工程（ｉｉｉ）が前記第一の比と前記第三の比が統計的に等しいと決定することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２８】
男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法であって、
・第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定すること、ここで、前記女性は各第一の遺伝子座について、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型であり、第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいて、かつ、前記男性は前記第一の遺伝子座についてヘテロ接合型であり；
・前記女性から得られた生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第一の遺伝子座に存在する、前記対応する第一のアレルの第一の量を測定すること、ここで前記生体試料は前記女性および前記２人の胎児に由来する細胞を伴わないＤＮＡを含むものであり；
・第一の遺伝子座から、生体試料に含まれているＤＮＡ断片の第二の量を測定すること；
・前記第一の量と前記第二の量に関する比を算出すること、
・以下のように、前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定すること：
（ｉ）比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、および
（ｉｉ）比が第二のカットオフ値よりも小さい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する、
を含む、２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法。
【請求項２９】
第一の父性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定することが、前記比が５０％と統計的に等しい場合に、
・前記１つ以上の第一の遺伝子座について、胎児が両方ヘテロ接合型である、または
・胎児のうちの１人が前記第一のアレルについてホモ接合型で、もう１人の胎児が前記第二のアレルについてホモ接合型である、
ことの２つの可能性を同定することを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定することが、
・前記比が前記第二のカットオフ値より大きく、第三のカットオフ値より小さく、かつ、前記第三のカットオフ値が前記第一のカットオフ値より小さいときに、胎児のうちの１人が前記第二のアレルについてホモ接合型で、もう１人の胎児が前記１つ以上の第一の遺伝子座についてヘテロ接合型であると同定すること、
を含む、請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定することが、
・前記比が前記第一のカットオフ値より小さく、第四のカットオフ値より大きく、かつ、前記第四のカットオフ値が前記第三のカットオフ値より大きいときに、胎児のうちの１人が前記第一のアレルについてホモ接合型で、もう１人の胎児が前記１つ以上の第一の遺伝子座についてヘテロ接合型であると同定すること
を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
第一の父性ハプロタイプが対応する第三のアレルを含み、第二の父性ハプロタイプが対応する第四のアレルを含んでいる、請求項２８の方法。
【請求項３４】
前記２人の胎児における母性ハプロタイプの遺伝を決定することが、前記比が前記第一のカットオフ値より小さく、かつ、前記第二のカットオフ値よりも大きいときに、
・胎児のうちの１人が、前記第一のアレルと、前記第三のアレルまたは第四のアレルのいずれかについてヘテロ接合型である、および
・もう１人の胎児が、前記第二のアレルと、前記第三のアレルまたは第四のアレルのいずれかについてヘテロ接合型である
可能性を同定することを含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
男性によって受精した女性における２人の胎児の父性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法であって、
・第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定すること、ここで、前記男性は各第一の遺伝子座について、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型であり、第一の父性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の父性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいて、かつ、前記女性は前記第二のアレルのホモ接合型であり；
・前記女性から得られた生体試料に含まれているＤＮＡ断片中の前記第一の遺伝子座に存在する、前記対応する第一のアレルの第一の量を測定すること、ここで前記生体試料は前記女性および前記２人の胎児に由来する細胞を伴わないＤＮＡを含むものであり；
・前記第一の量を正規化して、正規化された第一の量を得ること；
・前記正規化された第一の量を１つ以上のカットオフ値と比較すること；
・前記比較に基づいて、前記第一の父性ハプロタイプを前記胎児のうちの１人が受け継いでいる、胎児両方が受け継いでいる、またはどちらの胎児も受け継いでいない、のいずれかであると決定すること；
を含む、２人の胎児の父性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法。
【請求項３６】
さらに、
・前記生体試料における、前記２人の胎児のうちの片方または両方の胎児に由来する胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定すること；および
・前記胎児ＤＮＡのパーセンテージに基づいて、前記１つ以上のカットオフ値を決定すること、
を含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記正規化された第一の量を第一のカットオフ値および第二のカットオフ値と比較し、前記正規化された第一の量が前記第二のカットオフ値よりも小さい場合には前記胎児はいずれも前記第一の父性ハプロタイプを受け継いでいないと決定し、前記正規化された第一の量が前記第二のカットオフ値よりも大きく、かつ、前記第一のカットオフ値よりも小さい場合には、前記胎児のうちの１人が前記第一の父性ハプロタイプを受け継いでいると決定し、ならびに前記正規化された第一の量が前記第一のカットオフ値よりも大きい場合には前記胎児は２人とも前記第一の父性ハプロタイプを受け継いでいると決定する、請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記第一の量を正規化し、正規化された第一の量を得ることが、
・前記生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第一の遺伝子座に存在している、前記対応する第二のアレルの第二の量を測定すること；および
・前記第一の量の前記第二の量に対する比を算出し、前記正規化された第一の量を得ること
を含む、請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記比が、第一の量と第二の量の和で割った第一の量である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記比較に基づいて、前記第一の父性ハプロタイプを前記胎児のうちの１人が受け継いでいる、胎児両方が受け継いでいる、またはどちらの胎児も受け継いでいない、のいずれかであると決定することが、
・前記正規化された第一の量が０よりも統計的に大きいが、第一のカットオフ値よりも小さい場合に、前記胎児のうちの１人だけが前記ハプロタイプを受け継いでいると同定すること；または
・前記正規化された第一の量が第二のカットオフ値よりも大きい場合に、前記胎児が２人とも前記ハプロタイプを受け継いでいると同定すること、
を含む、請求項３５の方法。
【請求項４１】
さらに、
・前記第一の染色体上にある１つ以上の第二の遺伝子座を含む第二の群を同定すること、ここで、前記男性は各第二の遺伝子座について、対応する第三のアレルと対応する第四のアレルのヘテロ接合型であり、前記第一の父性ハプロタイプは第三のアレルを含み、前記第二の父性ハプロタイプは第四のアレルを含んでいて、かつ、前記女性は前記第三のアレルについてホモ接合型であり；
・前記生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第二の遺伝子座に存在している、前記対応する第四のアレルの第二の量を測定すること；
・前記第二の量を正規化して、正規化された第二の量を得ること；
・前記正規化された第二の量を１つ以上のカットオフ値と比較すること；
・前記比較に基づいて、前記第二の父性ハプロタイプを前記胎児のうちの１人が受け継いでいる、胎児両方が受け継いでいる、またはどちらの胎児も受け継いでいない、のいずれかであると決定すること、
を含む、請求項３５の方法。
【請求項４２】
さらに、
・前記第一のおよび第二の父性ハプロタイプの遺伝に関する前記決定を利用して、前記第一のおよび第二の父性ハプロタイプを、胎児のうちの１人が受け継いでいる、胎児両方が受け継いでいる、または前記胎児は２人ともそれらを受け継いでいない、のいずれかであると決定すること、
を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記第一のアレルのうちの１つ以上および／または前記第二のアレルのうちの１つ以上が目的の表現型と関連付けられている、請求項３５の方法。
【請求項４４】
前記目的の表現型が疾患または疾患感受性である、請求項３５の方法。
【請求項４５】
前記父性ハプロタイプが常染色体劣性の状態または感受性に関連付けられており、かつ、前記胎児のうちの１人または両方が、前記状態または感受性の保因者であると決定される、請求項３５の方法。
【請求項４６】
前記生体試料が血漿である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
測定する工程が、前記生体試料に含まれているＤＮＡの配列決定を含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
操作を実施するようにコンピューターシステムを制御するための複数の指示を格納しているコンピューターで読み込み可能なメディアを備えている、コンピュータープログラム製品であって、前記指示は、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成された１つ以上のプロセッサを含む、システム。
【請求項５０】
生体試料に含まれているＤＮＡの配列を決定するように構成されている装置をさらに含む、請求項４９のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は基本的に母体試料に基づく胎児ゲノムの解析に関し、より具体的には、母体試料に含まれているゲノム断片の解析に基づく多胎妊娠における胎児ゲノム全体または一部を決定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願の、名称を「多胎妊娠に関する胎児ゲノムの決定（Determining Fetal Genomes For Multiple Fetus Pregnancies）」とする米国仮特許出願第６１／７８９，９９２号の優先権を主張し、その全体は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、Ｌｏらによる、名称を「母体生体試料による胎児ゲノム解析（Fetal Genomic Analysis From A Maternal Biological Sample）」とする共有の米国特許出願第２０１１／０１０５３５３号およびＬｏらによる、名称を「多胎妊娠の分子検査（Molecular Testing Of Multiple Pregnancies）」とする米国特許出願第２０１３／００５９７３３号に関連し、それら開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
背景
１９９７年、母体血漿中に細胞を伴わない胎児の核酸が存在することが発見されたことから、非侵襲性出生前診断に関する新たな可能性が広がった（Lo Y M D et al Lancet 1997; 350: 485-487および米国特許第６，２５８，５４０号）。この技術は直ちに、胎児由来の、部分的に遺伝性の遺伝子または配列を用いた臨床上の応用、例えば胎児の性別判定、胎児のＲｈＤの状態の判定、および胎児が遺伝性もしくは部分的に遺伝性の変異を持っているか否かの判定などに変換された（Amicucci P et al Clin Chem 2000; 46: 301-302；Saito H et al Lancet 2000; 356: 1170; and Chiu R W K et al Lancet 2002; 360: 998-1000）。近年のこの分野における進歩から、母体の血漿中に含まれる核酸の解析による胎児の染色体異常、例えば２１番染色体トリソミーの出生前診断が可能になった（Lo Y M D et al Nat Med 2007; 13: 218-223；Tong Y K et al Clin Chem 2006; 52: 2194-2202；米国特許公開第２００６／０２５２０７１号；Lo Y M D et al Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 13116-13121；Chiu R W K et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 20458-20463；Fan H C et al Proc Natl Acad Sci 2008; 105: 16266-16271；米国特許公開第２００７／０２０２５２５号；および同第２００９／００２９３７７号）。
【０００５】
別の分野における最近の成果の中では、母親と父親の双方が同じ変異を有する単一遺伝子疾患の非侵襲的な出生前診断に関する単一分子カウント法、例えばデジタルＰＣＲの使用が有効である。これは、母体血漿に含まれる相対的な変異量（ＲＭＤ）の解析によって達成された（米国特許出願第２００９／００８７８４７号；Lun F M F et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 19920-19925；およびChiu R W K et al. Trends Genet 2009; 25: 324-331）。
【０００６】
しかしながらこのような方法では、突然変異が起こる可能性に関して既に分かっている知識を使用してゲノムの特定の部分を解析するため、不顕性のもしくは珍しい突然変異または遺伝的疾患を同定できない可能性がある。さらに、在胎している双子の接合型に関する情報は一般的に、超音波スキャン（Chauhan SP et al. Am J Obstet Gynecol 2010; 203: 305-315）または侵襲性の出生前診断（例えば羊水穿刺）（Chen CP et al. Hum Reprod 2000; 15: 929-934）によって得られてきた。
【０００７】
そのため、非侵襲性の技術を使って多胎妊娠における胎児ゲノムの全体または一部を同定することが可能な新しい方法、システム、および装置の提供が望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明の態様では、多胎妊娠におけるハプロタイプの母性および父性遺伝を決定するための方法、システム、および装置を提供する。母性遺伝は、母親がヘテロ接合型で父親の遺伝性アレルが分かっている（例えば父親がホモ接合型の）遺伝子座で決定することができる。一方が第一の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有し、もう一方が第二の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有する２種類の遺伝子座を利用してもよい。父性遺伝は、父親がヘテロ接合型で母親がホモ接合型の遺伝子座から決定することができる。各遺伝子座について、異なるアレルの量を測定することができる。その量を比較することで（例えば、各アレルとカットオフ値の分画濃度（fractional concentration）を用いて）ハプロタイプの遺伝を決定することができる。ハプロタイプを目的の条件と関連づけることができる。
【０００９】
いくつかの態様は、本明細書に記載の方法に関連するシステムおよびコンピューターで読み込み可能なメディアに関する。
【００１０】
以下に示す詳細な説明および添付の図面を参照することで、本発明の態様の本質および利点をより深く理解することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１では、本発明の態様による、母親がホモ接合型で、父親がヘテロ接合型の遺伝子座の例を２つ示している。
【図２】図２は、本発明の態様による、多胎妊娠の胎児における父性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法２００のフローチャートである。
【図３】図３は、本発明の態様による、２種類の遺伝子座の同定を利用した、父性および母性ハプロタイプの仮説を示している。
【図４Ａ】図４Ａでは、図３に示した遺伝子座について、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有している例を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。
【図５Ａ】図５Ａでは、図３に示した遺伝子座について、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している例を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。
【図６Ａ】図６Ａでは、図３に示した遺伝子座について、片方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、もう片方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している例を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、片方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、もう片方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。
【図７Ａ】図７Ａでは、２人の胎児が母親由来のハプロタイプを有している３種類の状況に関して、母性特異的アレル（Ｂアレル）および父親と母親に共通のアレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、特定の種類の全ての遺伝子座について、各情報ＳＮＰ遺伝子座のそれぞれの分画濃度をどのように利用すれば共通のアレル（Ａアレル）の分画濃度が予測できるかを示している。
【図８】図８は、本発明の態様による、両方の遺伝子座を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法８００のフローチャートである。
【図９】図９は、本発明の態様による、片方の遺伝子座を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法９００のフローチャートである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有しており、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、片方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、もう片方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有していて、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、３つの条件における、αおよびβ型ＳＮＰを用いたＡアレルの分画濃度、ならびにこれら２つの濃度の比に関する表１１５０を示している。
【図１２】図１２は、本発明の態様による、両方の遺伝子座から得られる値の比を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法１２００のフローチャートである。
【図１３】図１３は、本発明の態様による、母親と父親の両方がヘテロ接合で、男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法１３００のフローチャートである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、例１に関して予想されるα／β比の分布を示している。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、例２に関して予想されるα／β比の分布を示している。
【図１５】図１５は、例１について、４番染色体長腕にある染色体セグメントをＲＨＤＯ解析した結果を示している表１５００である。
【図１６】図１６は、例２について、４番染色体長腕にある染色体セグメントをＲＨＤＯ解析した結果を示している表１６００である。
【図１７】図１７は、本発明の態様によるシステムおよび方法で使用可能なコンピューターシステム１０の例をブロック図で示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本開示で使用する場合「生体試料」という用語は、対象（例えば、妊娠している女性などのヒト）から得られ、かつ、目的の核酸分子を１種以上含んでいる全ての試料を指す。本発明の実施に有用な試料としては血漿、血清、血液細胞、白血球、網状赤血球、および全血が挙げられる。いくつかの目的では、唾液、胸膜液、汗、腹水、胆汁、尿、膵液、便または子宮頸スメア試料も使用することができる。
【００１３】
「遺伝子座」またはその複数形の「遺伝子座」と言う用語は、ゲノム全体の中で差異のある任意の長さのヌクレオチド（または塩基対）の位置、つまり配置されている場所である。
【００１４】
本明細書で使用する場合「遺伝子座」またはその複数形の「遺伝子座」と言う用語は、ゲノム全体の中で差異のある任意の長さのヌクレオチド（または塩基対）の位置、つまり配置されている場所である。「アレル」という用語は、物理的にゲノムの同じ位置にある遺伝子座の、別のＤＮＡ配列を指し、アレルは場合によって、異なる表現型を生じ得る。各染色体について（ヒト男性対象の性染色体は除く）２つのコピーを有する任意の特定の二倍体生物では、各遺伝子の遺伝子型はその遺伝子座に、ホモ接合型では同じでヘテロ接合型では異なる１対のアレルを含む。ある生物の集団または種は通常、各遺伝子座に、個体ごとにことなる複数のアレルを含んでいる。その集団で２つ以上のアレルが存在するゲノム遺伝子座を多型部位と呼ぶ。遺伝子座のアレル変異は、存在するアレルの数（つまり多型の程度）、またはその集団に占めるヘテロ接合型の部分（つまりヘテロ接合型の割合）として測定することができる。ある遺伝子座が配列を含む場合も、またはその配列を含まない可能性もあるため、ある配列（例えば遺伝子）が存在することまたは欠損していることもアレル変異の一種と考えられている。そのような配列（例えばＲＨＤ遺伝子）の欠損は、例えば、通常は欠失している配列の前後にある配列の接合部によって、同定することができる。本明細書で使用する場合「多型」という用語は、その頻度にかかわらず、ヒトゲノム中に見られる個体間のいずれもの変異を指す。そのような変異の例としては、これらには限定されないが、一塩基多型、単純縦型反復多型、挿入−欠損型多型、突然変異（これは疾患の原因となりうる）およびコピー数多型が挙げられる。
【００１５】
「ハプロタイプ」という用語は、同じ染色体または染色体領域に共に伝達される複数の遺伝子座のアレルの組み合わせを指す。ハプロタイプは、わずか１対の遺伝子座もしくは染色体領域、または染色体の全体を指す場合もある。
【００１６】
「染色体領域」とは、特定の染色体に関する複数のヌクレオチドのある位置を指す。染色体領域は染色体全体であっても、それよりは小さい小区分であってもよい。正常なヒトの染色体領域には、それぞれがその領域を含んでいる染色体のどちらかのコピーに位置している、２つのハプロタイプがある。２つのハプロタイプはその染色体領域中で同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００１７】
本開示で使用する場合「カットオフ値」または「量」という用語は、生物試料の２つ以上の分類（例えば、特定の表現型の状態または疾患に関連しているまたは関係している遺伝配列の存在または欠損、あるいは表現型の状態または疾患に対する感受性の有無）を区別するのに用いられる数値または量を意味する。例えば、指標がカットオフ値を超える場合には、定量データの第一の分類が生成され、または、指標がカットオフ値に満たない場合には、定量データの別の分類が生成される。
【００１８】
詳細な説明
態様によって、多胎妊娠における母性および父性ハプロタイプの遺伝を決定することができる。父性遺伝は、父親がヘテロ接合型で母親がホモ接合型の遺伝子座から決定することができる。父親特異的アレルの量（例えば、それらアレルの分画濃度）を利用して、何人の胎児に父親特異的アレルを有するハプロタイプが遺伝しているのかを決定することができる。胎児における父親由来のハプロタイプについて知ることで、胎児に受け継がれた母親由来のハプロタイプを決定することができる。
【００１９】
母性遺伝は、母親がヘテロ接合型で父親の遺伝性アレルが分かっている（例えば、父親がホモ接合型であるか、父親由来のハプロタイプが決定されている）遺伝子座で決定することができる。２種類の遺伝子座を利用することができる。一方が第一の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有し、もう一方が第二の母性ハプロタイプに見られる父性アレルを有する。各遺伝子座について、異なるアレルの量を測定することができる。その量を比較することで（例えば、各アレルとカットオフ値の分画濃度を用いて）ハプロタイプの遺伝を決定することができる。また、ハプロタイプを目的の条件に関連づけることができ、この目的のハプロタイプに関しては、どの父性および／または母性ハプロタイプが遺伝性であるかの否かの決定に基づいて、遺伝性であるかまたは遺伝性でないかを決定することができる。
【００２０】
Ｉ．接合性
多胎妊娠とは、女性が２人以上の胎児を妊娠していることを指す。多胎妊娠の中で最も多く見られるのは双胎である。双胎は、一卵性（同一）および二卵性（同一ではない）によって特徴付けることができる。主に双子について議論しているが、より多い数の胎児についても側面を応用することができる。
【００２１】
母体血漿中に含まれているＤＮＡ断片の解析は、双胎妊娠、特に二卵性（同一でない）の場合により複雑になる。母体血漿中の特定のハプロタイプまたは特定の疾患に関連している多型が胎児由来だと同定されたとしても、両方の胎児が影響しているのか、あるいは一方の胎児が影響しているのかをどうやって決定すれば良いのかという新たな問題が生じる。
【００２２】
Ａ．一卵性双生児
女性が、一卵性双生児を妊娠している場合、その胎児の遺伝解析は単胎妊娠の場合と同様になる可能性がある。けれども、二卵性双生児の可能性があるために、解析はより複雑になる。父性遺伝の解析については、母方のゲノムには存在していない父性アレルを、どの父性アレルが胎児に受け継がれているかを決定するためのマーカーとして利用することができる。特定のアレルが、父親の特定のハプロタイプにのっていることが分かっている場合には、特定のハプロタイプが少なくとも１人の胎児に（一卵性の場合には両方の胎児に）受け継がれているかを決定することができる。
【００２３】
どの母性アレルが胎児に受け継がれているかにかかわらず、２つの母性アレルが母体血漿中で検出できるため、母性アレルの遺伝を解析するには、複雑な定量的なアプローチが必要である。母体血漿に含まれている２つの母性アレルの相対量を比較し、胎児に受け継がれているアレルがより高濃度で含まれるだろうと予測することができる。別の態様では、母体血漿に含まれている２つの母性ハプロタイプの相対量を比較する。血漿試料中のＤＮＡ量が限られている場合には、このハプロタイプの相対量を利用するアプローチによってより正確な結果が得られるだろう。ハプロタイプの相対量を利用するアプローチの詳細については、米国特許第８，４６７，９７６号に見ることができ、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２４】
Ｂ．二卵性双生児
胎児が二卵性双生児の場合、この２人の胎児は両親のそれぞれから、同じまたは異なるアレルを受け継ぐ可能性がある。この場合、どの父性および母性アレルがそれぞれの胎児に遺伝しているかを決定するためには、より複雑な遺伝解析が必要になる。この情報は、一遺伝性の疾患や他の状態の解析に有用である。
【００２５】
態様では、多胎妊娠の場合に、親から胎児に受け継がれるハプロタイプの解析のための技術を説明する。この解析は父性遺伝の解析と、母性遺伝の解析に分けられる。
【００２６】
ＩＩ．父性遺伝の解析
どの父性ハプロタイプが胎児に受け継がれているかの決定は、父親に関する遺伝子型および／またはハプロタイプ情報が分かっている場合に実施することができる。いくつかの態様では、父性特異的ハプロタイプの同定と測定による、父性遺伝の決定方法を提供する。
【００２７】
Ａ．父性特異的ハプロタイプの同定
父性遺伝の決定は、母親がホモ接合型で、父親がヘテロ接合型の遺伝子座を解析することで実施することができる。そのような例では、胎児特異的アレルは父親から、胎児のうちの一方または両方に受け継がれたものである可能性がある。
【００２８】
図１では、本発明の態様による、母親がホモ接合型で、父親がヘテロ接合型の遺伝子座の例を２つ示している。これら２つの遺伝子座、１１０と１２０は互いに近接しており、一回の減数分裂の間に、これら２つの遺伝子座の間で組換えが起こる可能性は低い。この例では、遺伝子座１１０の父性Ａアレルは母性アレルと同じで、父性Ｂアレルは母親には存在しないため父親特異的である。同様に、遺伝子座１２０のＣアレルの父親特異的である。
【００２９】
一態様では、２つの遺伝子座の父親特異的アレルの相（phase）を決定することができる。アレルの相は、これらのアレルが同じ染色体上にあるか、または相同ではあるが異なる染色体上にあるかに関する、これらアレルの関係を指す。同じ染色体上にある種々の遺伝子座のアレルがハプロタイプを形成する。各父性ハプロタイプについて解析された特定の遺伝子座の数が増えると、より多くの父親特異的アレルを検出することができるため、母体血漿に含まれる父親特異的アレルの検出感度も上がる可能性がある。検出された父親-特異的アレルの数が増えれば、胎児の父性遺伝の予測精度が上がる。
【００３０】
次に、これら２つの遺伝子座の父親特異的アレルについて母体血漿ＤＮＡを解析する。母体血漿中のこれら父親特異的アレルの検出には、当業者に知られている種々の技術を使用することができる。これらの方法の例としては、これらには限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、プライマーエクステンション反応、質量分析を利用する方法および次世代シークエンシングが挙げられる。
【００３１】
２人の胎児が同じ父性ハプロタイプを受け継いでいるかを決定するためには、２つの父性ハプロタイプのそれぞれについて、少なくとも１つの父親特異的アレルを解析することができる。図１では、２つの父性ハプロタイプであるＨａｐＩＩとＨａｐＩＶを示している。一例では、母体血漿の解析で遺伝子座１１０に関してＢアレルが検出されれば、父性ハプロタイプのＨａｐＩＶが少なくとも１人の胎児に遺伝していると予測される。同様に、母体血漿の解析で遺伝子座１２０に関してＣアレルが検出されれば、父性ハプロタイプのＨａｐＩＩＩが少なくとも１人の胎児に遺伝している。双胎妊娠では、母体血漿中に２つの父性ハプロタイプのそれぞれに位置している父親特異的アレルが含まれていれば、これは、２人の胎児が遺伝的に異なる父性ハプロタイプを有することを示している。母体血漿中に、遺伝子座１１０の父親特異的アレル（Ｂアレル）だけが認められ、遺伝子座１２０の父親特異的アレルが（Ｃアレル）認められなかった場合には、胎児は２人とも父性ＨａｐＩＶを受け継いでいる。同様に、母体血漿中に、遺伝子座１２０の父親特異的アレル（Ｃアレル）だけが認められ、遺伝子座１１０の父親特異的アレルが（Ｂアレル）認められなかった場合には、胎児は２人とも父性ＨａｐＩＩＩを受け継いでいる。
【００３２】
母体血漿を使った父性ハプロタイプにおける父親特異的アレルの検出性は、それぞれの胎児に由来するＤＮＡの分画濃度、および各父親特異的アレルの検出感度に影響を受ける可能性がある。胎児ＤＮＡ濃度の割合が低い場合には、胎児が父親特異的アレルを受け継いでいるとしても、そのアレルが母体血漿からは検出されない可能性がある。父性ハプロタイプが胎児に遺伝していないと誤った結論を下す可能性を下げるためには、父性ハプロタイプを形成しているより多くの数の父親特異的アレルを解析することができる。
【００３３】
Ｂ．父性遺伝の決定方法
図２は、本発明の態様による、多胎妊娠の胎児における父性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法２００のフローチャートである。態様では、二卵性双生児における父性遺伝を解析することができる。方法２００では、２人以上の胎児を妊娠している女性から得られた生体試料を使用することができる。この生体試料は、女性と２人の胎児に由来する、細胞を伴わないＤＮＡを含むものである。血液関連試料、例えば血漿、血清、血液細胞、白血球、網状赤血球、または全血が使用されることが多い。他の種類の試料としては、尿、唾液、膣液、女性生殖器洗浄液、涙および汗がある。
【００３４】
生体試料を、デジタルＰＣＲ、配列決定、または他の好適な技術などの様々な技術によって解析することができる。この解析から、ゲノム中にある測定の遺伝子座のアレル数カウントを得ることができる。例えば、配列リードを参照ゲノムと整列させ、配列リード中にあるアレルをメモリに保存することができる。別の態様では、特定の遺伝子座およびアレルに関する標識したプローブに対応するＤＮＡ断片を含んでいるウェルの数（またはＲＴ−ＰＣＲに用いた特定のウェル中の量）が、ＰＣＲシグナルで示される可能性がある。方法２００はコンピューターシステムによって遂行することができる。
【００３５】
ブロック２１０では、第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定する。各遺伝子座で、父親は第一のアレルと第二のアレルのヘテロ接合型であり、母親は第一のアレルのホモ接合型である。第一のアレルは、第一の染色体領域（例えば、染色体全体または染色体の一部）の第一のハプロタイプに含まれる。第二の父性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる。
【００３６】
母親の遺伝子型を当業者に知られている様々な方法で解析することができる。例えば、母親の細胞から抽出したＤＮＡを解析し、アレルが１つだけ検出された遺伝子座をホモ接合型と同定することができる。
【００３７】
父親の第一のハプロタイプを様々な方法で決定することができる。一態様では、父親の遺伝型を同定し、ハプロタイプを、父親に対応する特定の集団から決定することができる参照ハプロタイプ（例えば、特定の人種について決定された参照）に基づいて決定することができる。別の態様では、父親の生体試料を解析し、第一のハプロタイプを決定することができる。
【００３８】
ブロック２２０では、生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第一の遺伝子座に関し、第一のアレルそれぞれの第一の量を測定する。前述の通り、第二の量は配列リードまたはＰＣＲリードを受け取るコンピューターによって決定することができる（例えば、ウェルの数に対応する色シグナルによって）。コンピューターによって、特定の第一の遺伝子座に対応するＤＮＡ断片の数を決定することができ、また、第二のアレルを含んでいるそのようなＤＮＡ断片の数を計数することができる（例えば、特定の色を示しているウェルの数、または整列させた配列リードの中で、第二のアレルを含んでいる配列リードの数によって）。
【００３９】
いくつかの態様において解析は、コンピューターによって、これまでに得られている配列データを利用して行われる。好適な技術の選択肢には、米国特許第２０１１／０１０５３５３号Ａ１および米国特許第２０１３／００５９７３３号Ａ１に記載されているものが含まれる。各遺伝子座を介した配列決定の他に、特異的なプローブまたはＰＣＲプライマーを使って、特定のアレルを試験してもよい。目的のハプロタイプおよび／またはハプロタイプが関連しているアレル自体のまたはそれら周辺のリードを得るために、実際の物理的な配列決定の工程および／またはこの工程から得られた配列データをマスキングし、選別し、さもなければ選択するという点で、測定を「選択的」に行ってもよい。
【００４０】
ブロック２３０では、必要に応じて第一の量を正規化する。他の態様では、第一の量を正規化しない。一態様では、第一の遺伝子座にある第二のアレルの第二の量で割ることで、第一の量を正規化する。別の態様では、第一の量を、第一の遺伝子座に関するＤＮＡ断片の総量で割ることで、正規化を実施することができる。その結果が、第一のアレルの分画濃度となり得る。
【００４１】
次に、各遺伝子座にあるアレルの分画濃度を、それぞれのアレルカウントを別々に全アレルカウントの総数で割ることで算出する。生体（母性）試料のリード数が増えれば、評価の精度が上がる。各遺伝子座を個別に分析し、その結果をまとめて、結果同士が一致しているかを決定する。あるいは、全遺伝子座上のアレルのカウントを、それらが第一のハプロタイプと関連しているか否かに従ってまとめる。
【００４２】
ブロック２４０では、正規化した第一の量を第一のカットオフ値と比較する。第一の量に関する未処理の値を使用する一態様では、第一のカットオフ値は０（または他の、相対的に小さい正規化していない値）であってよく、この場合、第一のアレルが検出された時はいつでも、母体試料中に第一のハプロタイプが含まれていることを示している可能性がある。第一のハプロタイプの存在が、第一のアレルがいくつか存在することにのみ基づいて（そのパーセンテージまたは第一のアレルに関する正規化された他の値についての知識を伴わずに）想定されるため、この解析は本質的に、より定性的であってよい。また、両方の胎児が第一のアレルを遺伝的に受け継いでいるか否かも分かっていない。
【００４３】
他の態様では、カットオフ値をより高く設定して、１つ以上の第一のアレルの検出が不正確な場合に（例えば、配列決定またはＰＣＲなどの使用した生化学的過程中に起きたエラーが原因で）、偽陽性を生じ得る誤ったデータを回避することができる。
【００４４】
ブロック２５０では、比較に基づいて第一のハプロタイプの遺伝を決定することができる。前述の通り、第一の量または正規化した第一の量が第一のカットオフ値を超えた場合に、少なくとも１人の胎児が第一のハプロタイプを受け継いでいると決定してもよい。
【００４５】
いくつかの態様では、２つ以上のカットオフ値を使用することができる。第一のアレルの分画濃度が決定されている場合、そのようになる可能性がある。生体試料中の胎児由来および／または個人由来のＤＮＡの総パーセンテージが分かっている場合、この定量的な測定によって、胎児のうちの一方がまたは両方が目的のハプロタイプをもっているか否かを決定することができる。
【００４６】
例えば、分画濃度が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児がハプロタイプを受け継いでいると同定することができる。分画濃度が０よりも有意に大きくない場合には（例えば、第二のカットオフ値に満たない場合には）、両方の胎児がハプロタイプを受け継いでいないと同定する。分画濃度が第一のカットオフ値を超えていないが、第二のカットオフ値よりは大きい場合、一方の胎児は第一のハプロタイプを受け継いでいるが、もう一方の胎児は受け継いでいないと決定することができる。
【００４７】
具体例の一つでは、胎児由来ＤＮＡの総パーセンテージが１０％で、各胎児が５％ずつ寄与していると仮定する。第一のカットオフ値は７〜９％の間であってよく、または測定の所与の統計的正確さである５％と１０％を判別できるいかなる好適なパーセンテージであってもよい。第二のカットオフ値は２〜４％の間であってよく、または測定の所与の統計的正確さである０％と５％を判別できるいかなる好適なパーセンテージであってもよい。いくつかの態様では、各胎児のそれぞれが寄与しているＤＮＡのパーセンテージは分かっていない場合があるが、他の試料の測定に基づいて、典型的な範囲を想定することができる。従ってそのような例でも、カットオフ値を決定することができる。
【００４８】
この解析で利用するカットオフ値は母体試料中の各胎児に由来するＤＮＡの相対量またはパーセンテージから決定することができる。カットオフ値によって、いずれの胎児もアレルに寄与していない、一方の胎児がアレルに寄与している、両方の胎児がアレルに寄与している、ことを判別できる。それぞれの患者、または集団全体についてのカットオフ値の設定に関するより詳細な情報は、米国特許第２０１１／０１０５３５３号Ａ１および米国特許第２０１３／００５９７３３号Ａ１に記載されている。
【００４９】
ブロック２６０では、第一の染色体領域上の第二のハプロタイプについて、ブロック２１０〜２５０を繰り返して実行することができる。例えば、第二のハプロタイプに父親特異的アレル（図１のＨａｐＩＩＩ）を有する遺伝子座１２０などの１つ以上の第二の遺伝子座を同定することができる。少なくとも１人の胎児が第二のハプロタイプを受け継いでいるか否かを決定することができる。そして、この決定を第一のハプロタイプの遺伝に関する決定と合わせることができる。両方のハプロタイプが受け継がれていると決定されれば、１人の胎児がハプロタイプのうちの一方を受け継いでいることになる。１つのハプロタイプだけが受け継がれていると決定されれば、両方の胎児が同じハプロタイプを受け継いでいると決定することができる。その結果、両方の胎児について遺伝に関する決定を下すことができる。
【００５０】
分画濃度を決定し、第一のハプロタイプに適用すれば、第二のハプロタイプの分画濃度を利用して、分画濃度と第一の遺伝子座の閾値から、遺伝に関する決定を確認することができる。
【００５１】
父性ハプロタイプの遺伝が決定されれば、母親がヘテロ接合の遺伝子座において受け継がれたアレルを決定することができる。父親から受け継がれるアレルに関するこの情報を利用して、胎児に母性ハプロタイプが受け継がれているかを決定することができる。
【００５２】
Ｃ．遺伝子座の同定
両親のゲノムに関するデータは、母体および胎児ＤＮＡの混合物を含んでいる生体試料の解析を行う前、行っている最中、または解析後に得ることができる。父性ゲノム配列は、父親から採取した生体試料の配列決定を行うことで得ることができる。母性ゲノム配列は、妊娠前に採取した別の生体試料、または本質的に胎児ＤＮＡを含んでいない生体試料、例えば失血した組織または毛包の配列決定を行うことで得ることができる。あるいは、母体血漿または妊娠中に採取された試料の定量的評価から、父親および／また母親のゲノム中で関連している部分を予測してもよい。
【００５３】
いくつかの態様では、どちらかの親の遺伝子型に関する情報を、家族の他のメンバー、例えば現在妊娠している胎児の兄弟の遺伝子型情報、または祖父母などの遺伝子型と比較することによって、その両親のハプロタイプに広げることができる。また、両親のハプロタイプは当業者であれば知っている他の方法でも構築することができる。そのような方法の例としては、単一分子解析に基づく方法、例えばデジタルＰＣＲ（Ding C and Cantor CR. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 7449-7453；Ruano G et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6296-6300）、精子を使ったハプロタイプ解析（Lien S et al. Curr Protoc Hum Genet 2002；第１章：１．６）および画像化技術（Xiao M et al. Hum Mutat 2007; 28: 913-921）がある。他の方法としては、アレル特異的ＰＣＲに基づくもの（Michalatos-Beloin S et al. Nucleic Acids Res 1996; 24: 4841-4843；Lo YMD et al. Nucleic Acids Res 1991; Nucleic Acids Res 19: 3561-3567）、クローニングと制限酵素消化に基づくもの（Smirnova AS et al. Immunogenetics 2007; 59: 93-8）などがあげられる。さらに他の方法には、集団におけるハプロタイプ・ブロック構造の分布および連鎖不平衡に基づく方法があり、この方法では、統計的な評価から母性ハプロタイプを推測することができる（Clark AG. Mol Biol Evol 1990; 7:111-22; 10:13-9；Salem RM et al. Hum Genomics 2005; 2:39-66）。
【００５４】
解析する遺伝子座は、特定の領域、例えばハプロタイプが分かっている遺伝子座または目的の遺伝学的な特徴が存在している遺伝子座との近さによって選択することもできる。従って、ハプロタイプが分かっている領域中にある遺伝子座を選択することができる。互いが近接している遺伝子座を同じハプロタイプと関連づけることができ、また、遺伝子座同士の間に染色体の交差がなければ、別のハプロタイプとしてもよい。使用者は、解析する染色体領域を拡大してもまたは縮小してもよい。母体試料中のより多くのＤＮＡが関連している可能性があるため、領域を拡大することで、解析の正確性を高めることができる。しかしながら、領域を拡大すると重複が生じる危険性もあり、その場合には、アレルの遺伝からはハプロタイプの遺伝を正確に予測することができない。
【００５５】
一態様では、解析する遺伝子座は病原遺伝子である。この場合、２つの目的の父性アレルは、病原性の変異体であっても非病原性のアレルであってもよい。別の態様では、解析する遺伝子座は、遺伝性疾患に関係のある遺伝子に関連づけられている多型である。この場合、２つの目的の父性アレルのうち、１つのアレルは突然変異体遺伝子に、もう一方は正常な（つまり非突然変異）遺伝子に関連づけられているアレルである。
【００５６】
Ｄ．臨床評価
父性遺伝性の常染色体優性状態は、どの父性ハプロタイプが遺伝的に受け継がれた状態と関連があるかを突き止めることで評価することができる。これは例えば、デジタルＰＣＲ、染色体ソーティング、家系調査を用いることおよび集団のハプロタイプ情報から推測することで実施することができる。その後、母体血漿中に含まれている、特定のハプロタイプに関連づけられている父性特異的疾患を同定することができる。目的のハプロタイプに位置している父親特異的アレルが母体試料（例えば母体血漿）中に存在しているということは、片方または両方の胎児がこの条件を受け継いでいることを示している可能性がある。
【００５７】
常染色体劣性の条件は、母体血漿を使って、同じ父性ハプロタイプを形成しているアレルを同定し、一方の胎児が父性ハプロタイプを受け継いでいるかを決定することによって、評価することができる。疾患関連アレルを検出することで、胎児のうちの少なくとも１人が、疾患関連父性ハプロタイプを受け継いでいることを示すころができる。従って、第一のアレルのうちの１つ以上および／または第二のアレルのうちの１つ以上が目的の表現型と関連している。また、目的の表現型が疾患であるかまたは疾患感受性である場合がある。
【００５８】
ＩＩＩ．母性遺伝の解析
母親の血漿に含まれているＤＮＡの大部分が母体由来であるため、在胎している複数の胎児の母性遺伝の解析は複雑である。胎児由来のＤＮＡの割合は小さく（例えば１０パーセント程度であり）、双胎の場合には、両方の胎児由来のＤＮＡが混ざっている。従って、以下に記載するような定量的なアプローチを利用して胎児ＤＮＡを区別し、特徴づける。
【００５９】
Ａ．相対ハプロタイプ量（ＲＨＤＯ）解析
ＲＨＤＯ解析について本発明の一態様では、遺伝子座の分類の中でも、母親がヘテロ接合型で、かつ、父親がホモ接合型の遺伝子座に注目する。これによって、母性および父性アレルの両方を同時に解析する必要性を排除する。そうして、ホモ接合型のＳＮＰをＲＨＤＯ解析に関する情報と定義する。
【００６０】
図３は、本発明の態様による、２種類の遺伝子座の同定を利用した、父性および母性ハプロタイプの仮説を示している。母親がヘテロ接合型で、かつ、父親がホモ接合型の遺伝子座だけを示している。この図では、これらの情報遺伝子座について、２つのアレル（例えば一塩基多型（ＳＮＰ））を同定している。他の種の多型、例えばマイクロサテライト多型を利用することもできる。一部ではＳＮＰについて考察しているが、他の種の多型（変異）を利用してもよい。
【００６１】
ＲＨＤＯ解析の一環として、ＳＮＰをα型とβ型の２つに分類することができる。α型のＳＮＰは、父性アレルが、ＨａｐＩにある母性アレルと同一のＳＮＰ遺伝子座であり、β型ＳＮＰは、父性アレルが、ＨａｐＩＩにある母性アレルと同一のＳＮＰ遺伝子座である。ＨａｐＩおよびＨａｐＩＩの割り当ては任意であり、解析の前にＨａｐＩとＨａｐＩＩを互換的に定義することができる。
【００６２】
この例では、その遺伝子座に関しては父親がホモ接合型であるため、ＨａｐＩＩＩとＨａｐＩＶは同一である。しかしながら他の態様では、父親はホモ接合型ではないが、父性ハプロタイプの遺伝を決定することで、父性遺伝性アレルが分かっている。
【００６３】
二卵性の双胎妊娠では、母性ハプロタイプは以下の３通りのように遺伝する可能性がある。
・胎児が２人とも母親からＨａｐＩを受け継いでいる（図４Ａ）
・胎児が２人とも母親からＨａｐＩＩを受け継いでいる（図５Ａ）
・母親から、１人の胎児がＨａｐＩを受け継いでおり、もう１人の胎児がＨａｐＩＩを受け継いでいる（図６Ａ）
【００６４】
図４Ａでは、図３と同じ、母親と父親のハプロタイプを示している。胎児が２人とも母親からＨａｐＩを受け継いでいることを示している。ここで示す遺伝子座ではＨａｐＩＩＩとＨａｐＩＶが均等であるため、それぞれの胎児のその他のハプロタイプはＨａｐＩＩＩまたはＨａｐＩＶのいずれかに対応している。
【００６５】
図４Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。母体血漿中に含まれているＤＮＡの総量に対し、各胎児が１０％ずつ寄与しており、母親が総血漿ＤＮＡの８０％に寄与していると仮定する。α型ＳＮＰについては、母体ゲノム中にＢアレルしか存在しない。その結果、母体血漿中のＢアレルの分画濃度は４０％で、Ａアレル（母親と父親に共通のアレル）の分画濃度は６０％となる。β型ＳＮＰについては、胎児の両方と母親は、ＡおよびＢアレルのヘテロ接合型である。その結果、母体血漿中のＡアレルの分画濃度は５０％となる。
【００６６】
図５Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。母体血漿中に含まれているＤＮＡの総量に対し、各胎児が１０％ずつ、母親が８０％寄与していると仮定する。α型ＳＮＰについては、胎児の両方と母親は、ＡおよびＢアレルのヘテロ接合型である。その結果、母体血漿中のＡアレルとＢアレルの分画濃度はいずれも５０％となる。β型ＳＮＰについては、Ｂアレルは母体のゲノム中にしか存在せず、胎児には存在しない。その結果、母体血漿中のＢアレルの分画濃度は４０％で、Ａアレルの分画濃度は６０％となる。
【００６７】
図６Ｂは、片方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、もう片方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有している場合の、父親と母親で共通のアレル（Ａアレル）の母体血漿中での分画濃度の算出の例を示している。母体血漿中に含まれているＤＮＡの総量に対し、各胎児が１０％ずつ寄与しており、母親が総血漿ＤＮＡの８０％に寄与していると仮定すると、α型およびβ型両方のＳＮＰに関し、Ａアレルの分画濃度は５５％となる。
【００６８】
Ｂ．予測した値と実際の分画濃度との比較
前述の例では、胎児ＤＮＡの特定の分画濃度を推測した。胎児ＤＮＡの分画濃度は、胎児特異的後成的マーカーの解析や他の遺伝子座における母親と父親の多型マーカーの解析など、複数の方法によって決定することができる。母体血漿における双子両方の分画濃度および各胎児の寄与率の測定方法は米国特許第２０１３／００５９７３３号Ａ１に記載されている。
【００６９】
これら３つの例を区別するために、ＡアレルまたはＢアレルのそれぞれ（または両方の）分画濃度について統計分析を行うことができる。以下の議論については今後も、胎児それぞれが試料中の総ＤＮＡ断片量に対して１０％ずつ寄与していると仮定する。それぞれの胎児が、異なるパーセンテージでＤＮＡに寄与している態様については後の項で取り扱う。
【００７０】
図７Ａでは、２人の胎児が母親由来のハプロタイプを有している３種類の状況に関して、母性特異的アレル（Ｂアレル）および父親と母親に共通のアレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。図７Ａでは、２人の胎児それぞれが、総母体血漿ＤＮＡに１０％ずつ寄与していると仮定し、α型ＳＮＰとβ型ＳＮＰについて共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を推測した。ＳＮＰ遺伝子座のＡアレルの分画濃度は実験的に測定することが可能で、その後予測した値と比較して、どの遺伝パターンが生じる可能性が最も高いかを決定することができる。
【００７１】
目的の領域内にある同じ種類（αまたはβ）の全ＳＮＰに関するＡアレルとＢアレルのアレルカウントをまとめ、α型およびβ型ＳＮＰのまとめた分画濃度を算出することができる。予測した値に由来するまとめた分画濃度の偏差を決定することができる。偏差の合計が最も小さかったパターンをその双子の母性遺伝として推定することができる。
【００７２】
図７Ａでは、胎児のうちの１人が母親からＨａｐＩを受け継いでいて、もう１人がＨａｐＩＩを受け継いでいる場合には、α型およびβ型ＳＮＰから決定した共通アレル（Ａアレル）の分画濃度は同じになる。胎児が２人とも母親からＨａｐＩを受け継いでいる場合には、α型ＳＮＰのＡアレルの分画濃度はβ型ＳＮＰのものよりも高くなる。対照的に、胎児が２人とも母親からＨａｐＩＩを受け継いでいる場合には、β型ＳＮＰの分画濃度がα型ＳＮＰのものよりも高くなる。
【００７３】
α型およびβ型ＳＮＰの共通アレル（Ａアレル）の分画濃度同士を比較して、それらに統計的な差があるか否かを決定することができる。例えば、α型およびβ型ＳＮＰから決定した共通アレルの分画濃度に統計的な差がない場合には、胎児のうちの１人が母親からＨａｐＩを受け継いでいて、もう１人がＨａｐＩＩを受け継いでいることになる。一方、α型ＳＮＰの共通アレルの分画濃度がβ型ＳＮＰのものよりも高い場合、胎児は２人とも母親からＨａｐＩを受け継いでいる。α型ＳＮＰの共通アレルの分画濃度がβ型ＳＮＰのものよりも有意に低い場合、これは、胎児が２人とも母親からＨａｐＩＩを受け継いでいることを示している。
【００７４】
別の態様では、α型遺伝子座およびβ型遺伝子座の分画濃度（または他の量）の比をコンピューターで計算することができる。この比をカラム７１０の比と比較することができる。
【００７５】
別の検定法によっても、α型およびβ型ＳＮＰの共通アレルの分画濃度に有意差があるか否かを決定することができる。このような方法の例としては（これらには限定されないが）逐次確率比検定（ＳＰＲＴ）、スチューデントのｔ検定、マンホイットニーの順位和検定、χ二乗検定がある。
【００７６】
図７Ｂは、特定の種類の全ての遺伝子座について、各情報ＳＮＰ遺伝子座のそれぞれの分画濃度をどのように利用すれば共通のアレル（Ａアレル）の分画濃度が予測できるかを示している。その後、全ＳＮＰ遺伝子座の分画濃度の分布を構築し、分布の最も多いところから、測定した分画濃度を決定することができる。この統計分析は、全Ａアレルカウントと全Ｂアレルを加算することの代わりに実施することができる。
【００７７】
従って、各遺伝子座における量の個々の比（例えば分画濃度）をコンピューターで計算することができる。その後、これら個々の比を利用して全体の比（例えば全体の分画濃度）を得ることができる。そのため、個々の比の平均、中央値、または他の統計学的な値（例えば分布のピーク）を治療して全体の比を決定することができ、この全体の比をカットオフ値と比較してもよい。
【００７８】
Ｃ．両方の種の遺伝子座を利用して母性遺伝を決定するための図式
一態様では、定量的な過程において両種の遺伝子座を利用して、母性ハプロタイプの遺伝を決定することができる。例えば、α型の遺伝子座を利用して、両方の胎児が同じハプロタイプを受け継いでいるか否かを決定することができる。また、β型の遺伝子座を利用して、それぞれの胎児が別のハプロタイプを受け継いでいるか否かを決定することができる。
【００７９】
図８は、本発明の態様による、両方の遺伝子座を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法８００のフローチャートである。方法８００では、二卵性双生児における母性遺伝を解析することができる。この解析は、母体ＤＮＡと、各胎児に由来する胎児ＤＮＡ（例えば細胞を伴わないＤＮＡ）を含んでいる、母親から採取した試料について行われる。胎児ＤＮＡを含んでいる生体試料（例えば本明細書で定義する生体試料）であればいずれをも用いることができる。他の方法と同様に、方法８００ではコンピューターシステムを使用する。
【００８０】
ブロック８１０では、第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定する。女性は、第一の遺伝子座のそれぞれで、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型である。第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる。第一の遺伝子座は、特定の染色体上にある目的の遺伝的特性に隣接していてもよい。遺伝子座の第一の群は、本発明の例で説明したα型遺伝子座に相当するものであってもよい。
【００８１】
ブロック８２０では、２人の胎児が、第一の遺伝子座の対応する第一のアレルを父親から受け継いでいることを決定する。一態様では、父親が対応する第一のアレルについてはホモ接合型であると決定してもよく、この場合、どの父性ハプロタイプが遺伝するかにかかわらず、第一のアレルが受け継がれる。この父親の遺伝子型判定は父親由来の試料を使って実施することができる。別の態様では、方法２００を利用して、遺伝した父性ハプロタイプを決定することができる。父性ハプロタイプが決定すれば、第一の遺伝子座について父親がヘテロ接合型であっても、第一の遺伝子座にある父親から受け継いだアレルを決定することができる。
【００８２】
従って、最初に父性遺伝を決定すれば、父親がホモ接合型で母親がヘテロ接合型の遺伝子座については母性遺伝の解析を制限する必要はない。両親の遺伝によって、どの父性アレルが２人の胎児に受け継がれたかが分かるので、両親がヘテロ接合型の遺伝子座も利用することができる。この情報に基づいて、遺伝子座が第一の群か第二の群に分類することができる。
【００８３】
ブロック８３０では、第一の染色体上にある１つ以上の第二の遺伝子座を含む第二の群を同定する。第二の群の第二の遺伝子座のそれぞれについて、第一の母性ハプロタイプは対応する第三のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは対応する第四のアレルを含む。遺伝子座の第一の群は、本発明の例で説明したβ型遺伝子座に相当するものであってもよい。
【００８４】
ブロック８４０では、２人の胎児が、第二の遺伝子座の対応する第四のアレルを父親から受け継いでいることを決定する。父親から第四のアレルが遺伝したことの決定は、ブロック８２０について前述したのと同様に決定することができる。例えば、父親が、第二の遺伝子座の各遺伝子座について、対応する第四のアレルではホモ接合型の場合がある。別の態様では、父親は第二の遺伝子座についてはヘテロ接合型の可能性があるが、別のセットの遺伝子（例えば母親がホモ接合型の遺伝子のセット）を利用する方法２００を使い、他の遺伝子座を利用して、対応する第四のアレルが特定の父性ハプロタイプから遺伝していることを決定することができる。
【００８５】
ブロック８５０では、コンピューターシステムによって、女性から採取した生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第一の遺伝子座に関し、対応する第一のアレルの第一の量と、対応する第二のアレルの第二の量を測定する。例えば、ＤＮＡ断片の配列決定を行って配列リードを得ることができ、リードを参照ゲノムと整列させて第一の遺伝子座に整列するリードを同定することができる。第一のアレルおよび第二のアレルを含んでいるリードの数を計数し、第一の量と第二の量をそれぞれ決定することができる。他の態様では、本明細書または組み込んだ文書で言及しているように他の技術を使用する。
【００８６】
ブロック８６０では、コンピューターシステムによって、生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第二の遺伝子座に関し、対応する第三のアレルの第三の量と、対応する第四のアレルの第四の量を測定する。第三の量と第四の量は第一の量および第二の量と同様の様式で、コンピューターによって計算することができる。
【００８７】
いくつかの態様では、量を、例えば特定のアレルの分画濃度を決定するために、正規化することができる。従って、第一の量は、全第一の遺伝子座にあるＤＮＡ断片の総数で割った、第一のアレルの含むＤＮＡ断片のカウントに相当する場合がある。第二の量の正規化も同様の様式で決定することができる。第三の量および第四の量の正規化は、第二の遺伝子座にあるＤＮＡ断片の総数を使って決定することができる。
【００８８】
ブロック８７０では、４つの量を利用して、２人の胎児に遺伝した母性ハプロタイプを決定する。一態様ではその後、測定した４つ量から、以下のように母性遺伝を決定する。
（ｉ）第一の量が第二の量よりも統計的に大きく、かつ、第三の量と第四の量が統計的に等しい場合、胎児は２人とも、第一の母性ハプロタイプを受け継いでいる。
（ｉ）第一の量と第二の量が統計的に等しく、かつ、第四の量が第三の量よりも統計的に大きい場合、胎児は２人とも、第二の母性ハプロタイプを受け継いでいる。
または、
（ｉｉｉ）第一の量が第二の量よりも統計的大きく、かつ、第四の量が第三の量よりも統計的に大きい場合、胎児のうちの１人は第一の母性ハプロタイプを受け継いでおり、もう１人は第二の母性ハプロタイプを受け継いでいる。
【００８９】
ある量が統計的により大きいか否かは、カットオフ値を利用することで、例えば、指定された数の標準偏差を要求することで、決定することができる。カットオフ値は、胎児全員について算出されるおよび／または個々の胎児について算出され得る胎児ＤＮＡ濃度の割合に依存する可能性がある。
【００９０】
一態様では、第一の量を、第二の量にカットオフ値を加えたものと直接比較することができる。この様式では、第一の量が、第二の量にカットオフ値を加えたものよりも大きい場合、２つの量の差が統計的に大きいと見なすことができる。
【００９１】
別の態様では、第一の量と第二の量から、指標（例えば差または比）を決定し、この指標をカットオフ値と比較して、第一の量が第二の量よりも統計的大きいかどうかを見る。同じことを、他の統計的な差または統計的に等しいことの決定についても行うことができる。一実施形態では、差を決定するためのカットオフ値は多様であり得る。例えば、（ｉｉｉ）のカットオフ値は、（ｉ）および（ｉｉ）のカットオフ値よりも必要とされる統計的な偏差は小さくてよい。
【００９２】
前述したように、胎児ＤＮＡのパーセンテージが２０％で、それぞれの胎児がこれに１０％ずつ寄与している場合、（ｉ）および（ｉｉ）に関する統計的に等しいことおよび統計的に大きいことの決定から、５０％（等しい）および６０％（大きい）を区別することができる。従って、統計的に大きいことを決定するためのカットオフ値は、指標（例えば分画濃度）が、５０％と６０％の中間である５５％を超える場合に、真であり得る。第一の量の第二の量に対する比を使用することもできる。この比は、α型遺伝子座でＡアレルが６０％を占める例では１．５になる。
【００９３】
（ｉｉｉ）では、統計的に大きいことを決定すれば、５０％と５５％を区別することができる。従ってカットオフ値は、所望の感度および特異性によって５１〜５４％の間になる。第一の量の第二の量に対する比を使用することもできる。この比は、α型遺伝子座でＡアレルが５５％を占める例では１．２２になる。
Ｄ．一種の遺伝子座を利用して母性遺伝を決定するための方法
【００９４】
いくつかの態様では、一方の遺伝子座だけを利用する。例えば図７Ａでは、α型遺伝子座についての３つの異なる比、５０％、５５％、および６０％を示している。比を様々なカットオフ値と比較して、このような異なる分類を区別することができる。
【００９５】
図９は、本発明の態様による、片方の遺伝子座を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法９００のフローチャートである。方法９００では、母親と胎児のＤＮＡ（例えば細胞を伴わないＤＮＡ）を含んでいる母体の生体試料から得られたデータを利用する。
【００９６】
ブロック９１０では、第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定する。母親は、第一の遺伝子座のそれぞれで、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型である。第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる。ブロック９１０は、ブロック８１０と同様の様式で実施することができる。
【００９７】
ブロック９２０では、２人の胎児が、第一の遺伝子座の対応する第一のアレルを父親から受け継いでいることを決定する。ブロック９２０は、ブロック８２０と同様の様式で実施することができる。前述したように、様々な工程は様々な順序で実施することができる。例えば、母体試料の解析を行う前、行っている間、またはその後に、両親のゲノムに関するデータを得ることができ、また、任意の好適なＤＮＡ技術（例えば、配列決定またはＰＣＲ）を利用してよい。
【００９８】
ブロック９３０では、コンピューターシステムによって、母体生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第一の遺伝子座に関し、対応する第一のアレルの第一の量と、対応する第二のアレルの第二の量を測定する。ブロック９２０は、ブロック８５０と同様の様式で実施することができる。
【００９９】
ブロック９４０では、第一の量と第二の量の比を算出する。比は様々な形式にある可能性がある。例えば、第二の量で割った第一の量；第一の量で割った第二の量；第一の量と第二の量の和で割った第一の量；または第一の量と第二の量の和で割った第二の量など。
【０１００】
ブロック９５０では、４つの比を利用して、２人の胎児に遺伝した母性ハプロタイプを決定する。一態様では、次に、測定した４つ量から、以下のように母性遺伝を決定する。
（ｉ）比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する；
（ｉｉ）比が第二のカットオフ値よりも小さい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する；
（ｉｉｉ）比が第三のカットオフ値よりは小さく、かつ、第四のカットオフ値よりは大きく、ここで第三のカットオフ値は第一のカットオフ値と等しいかそれ未満で、さらに、第四のカットオフ値が第二のカットオフ値と等しいかそれより大きく、かつ、第三のカットオフ値よりも小さい場合、胎児のうちの１人が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいて、もう１人が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する。
【０１０１】
この解析で利用するカットオフ値は母体試料中の各胎児に由来するＤＮＡの相対量またはパーセンテージから決定することができる。カットオフ値によって、様々な分類を区別することができる。図７Ａの例では、第一のカットオフ値によって６０％と５５％を区別することができる。具体的には、この試料を両方の胎児がＨａｐＩを受け継いでいると分類することができるか否かを決定することができる。決定されていない範囲がある場合には、特異性を高めるために、第三のカットオフ値が第一のカットオフ値より小さくなる可能性がある。第二のカットオフ値によって５０％と５５％を区別することができる。具体的には、この試料を両方の胎児がＨａｐＩＩを受け継いでいると分類することができるか否かを決定することができる。決定されていない範囲がある場合には、特異性を高めるために、第四のカットオフ値が第二のカットオフ値より大きくなる可能性がある。
【０１０２】
一態様では、男性および女性患者で共通しているアレルの分画濃度から、直接母性遺伝を決定するために、２つのカットオフ値を確立する。対応するハプロタイプを、両方の胎児が受け継いでいる、片方の胎児が受け継いでいる、またはどちらの胎児も受け継いでいないという３つの状況がある。それぞれの状況で、図７Ｂに示したような特徴をもつ、関連付けられたアレルに関する分画濃度の分布がそれぞれ形成される（中央値が小さくなっていく）。例えば、両方の胎児が生体試料に含まれるＤＮＡの５％ずつに寄与している場合、この３つの状況における分画濃度の中央値はそれぞれ、約６０％、５５％、および５０％になる（図７Ａ）。これらの条件を区別するようにカットオフ値を設定する。第一のカットオフ値またはより大きいカットオフ値は、２人の胎児の受け継がれていることと、１人の胎児に受け継がれていることを区別するもので、約５７．５％に設定される。第二のカットオフ値またはより小さいカットオフ値は、１人の胎児の受け継がれていることと、いずれの胎児にも受け継がれていないことを区別するもので、約５２．５％に設定される。
【０１０３】
父性ゲノム配列は、父親から採取した生体試料の配列決定を行うことで得ることができる。母性ゲノム配列は、妊娠前に採取した生体試料、または本質的に胎児ＤＮＡを含んでいない生体試料、例えば失血した組織または毛包の配列決定を行うことで得ることができる。あるいは、母体血漿または妊娠中に採取された試料の定量的評価から、父親および／また母親のゲノム中で関連している部分を予測してもよい。
【０１０４】
解析する遺伝子座は、特定の染色体領域との近さまたは目的の遺伝学的な特徴によっても選択される。互いが隣接しているという理由で第一の遺伝子座を選択してもよく、また、遺伝子座同士の間に染色体の交差がなければ、第一の遺伝子座によって両親のハプロタイプを分離する。使用者は、解析する染色体領域を拡大してもまたは縮小してもよい。母体試料中のより多くのＤＮＡが関連している可能性があるため、領域を拡大することで、解析の正確性を高めることができる。しかしながら、領域を拡大すると重複が生じる危険性もあり、その場合には、アレルの遺伝からはハプロタイプの遺伝を正確に予測することができない。
【０１０５】
一態様では次に、各遺伝子座にあるアレルの比を、それぞれのアレルカウントを別々に全アレルカウントの総数で割ることで算出する。母体試料のリード数が増えれば、評価の精度が上がる。各遺伝子座を個別に分析し、その結果をまとめてコンセンサスを得る（例えば図７Ｂに図示しているように）。あるいは、全遺伝子座のアレルカウントを合計する。
【０１０６】
Ｅ．母体血漿に寄与しているＤＮＡの量が胎児毎に異なる場合
女性が双子を妊娠している場合、この２人の胎児が異なる量のＤＮＡを母体血中に放出する可能性がある。その結果、２人の胎児に由来する胎児ＤＮＡ濃度の割合は異なる可能性がある。
【０１０７】
図１０Ａは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。この例では、胎児１がａ％、胎児２がｂ％寄与している。β型遺伝子座については、両方のアレルが等しいため、そのパーセンテージは５０％に維持されている。しかしながらＡアレルがより多いため、α型遺伝子座のパーセンテージは変わっている。そのパーセンテージは、式Ｆ＝５０％＋（ａ％＋ｂ％）／２に従う。
【０１０８】
図１０Ｂは、両方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有しており、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。この例では、胎児１がａ％、胎児２がｂ％寄与している。α型遺伝子座については、両方のアレルが等しいため、そのパーセンテージは５０％に維持されている。しかしながらＡアレルがより多いため、β型遺伝子座のパーセンテージは変わっている。そのパーセンテージは、式Ｆ＝５０％＋（ａ％＋ｂ％）／２に従う。
【０１０９】
図１１Ａは、片方の胎児が母親由来のＨａｐＩを有しており、もう片方の胎児が母親由来のＨａｐＩＩを有していて、各胎児が異なるパーセンテージの胎児ＤＮＡに寄与している場合の、母体血漿中に含まれているα型およびβ型ＳＮＰにおける共通アレル（Ａアレル）の分画濃度を示している。この例では、胎児１がａ％、胎児２がｂ％寄与している。いずれの遺伝子座についても、量の多いアレルのパーセンテージは胎児寄与率によって変化する。α型遺伝子座に関しては、そのパーセンテージはＦ＝５０％＋ａ％／２となる。また、β型遺伝子座のパーセンテージはＦ＝５０％＋ｂ％／２となる。
【０１１０】
図１１Ｂは、α型およびβ型ＳＮＰを利用して決定したＡアレルの分画濃度に関する表１１５０、ならびに、３つの状況、すなわち胎児が２人とも母性ＨａｐＩを受け継いでいる、胎児が２人とも母性ＨａｐＩＩを受け継いでいる、および２人の胎児が別の母性ハプロタイプを受け継いでいるという状況におけるこれら２つの濃度の比を示している。カラム１１６０では、α型遺伝子座の共通アレルＡについて、３つの状況で予測される比を示している。カラム１１６０では、β型遺伝子座の共通アレルＡについて、３つの状況で予測される比を示している。カラム１１８０では、その他のカラムから得られた指標の比、すなわち、β型の値と比較したα型の値の比を示している。次項で説明するように、態様では、両方の型の遺伝子から得られた濃度の比に関するカットオフ値を決定するためにカラム１１８０の値を利用することができる。
【０１１１】
Ｆ．比の比を用いる方法
一態様では、方法９００では比を（例えば、カラム１１８０と同様にα型とβ型の比を）利用することができる。例えば、ブロック９４０で利用する比はカラム１１８０の比であってもよい。そのような比を利用するために、両方の型の遺伝子座を使用する。加えて、方法８００は、カラム１１８０の比を利用して実行することができる。そのような方法について以下で説明する。
【０１１２】
図１２は、本発明の態様による、両方の遺伝子座から得られる値の比を利用した母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法１２００のフローチャートである。方法１２００では、母親と胎児のＤＮＡ（例えば細胞を伴わないＤＮＡ）を含んでいる母体の生体試料から得られたデータを利用する。
【０１１３】
ブロック１２１０〜１２４０は、方法８００のブロック８１０〜８４０と同じ様式で実行することができる。
【０１１４】
ブロック１２５０では、母体生体試料に含まれているＤＮＡ断片上の第一の遺伝子座に存在する、対応する第一のアレルの第一の量と対応する第二のアレルの第二の量に関する第一の比を算出する。一態様において第一の比は、第二の量で割った第一の量である。別の態様では、第一の比は、第一のアレルの分画濃度を得るための、第一の量と第二の量の和で割った第一の量である。
【０１１５】
ブロック１２６０では、生体試料に含まれているＤＮＡ断片の第二の遺伝子座に存在する、対応する第三のアレルの第三の量と対応する第四のアレルの第四の量に関する第二の比を算出する。本明細書に記載したように、第一、第二、第三、および第四の量は、生体試料の測定から、例えば配列決定またはＰＣＲデータから得られる。
【０１１６】
ブロック１２７０では、第一の比と第二の比に関する第三の比を算出する。一態様では、第三の比は、図１１Ｂに示すように、第四の量で割った第三の量である。別の態様では、第三の比は、第三の量と第四の量の和で割った第三の量である。
【０１１７】
ブロック１２８０では、４つの比を利用して、２人の胎児に遺伝した母性ハプロタイプを決定する。一態様では、次に、測定した４つ量から、以下のように母性遺伝を決定する。
（ｉ）第三の比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する；
（ｉｉ）第三の比が第二のカットオフ値よりも小さく、ここで第一のカットオフ値が第二のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する；
（ｉｉｉ）第三の比が第三のカットオフ値よりは小さく、かつ、第四のカットオフ値よりは大きく、ここで第三のカットオフ値は第一のカットオフ値と等しいかそれ未満で、さらに、第四のカットオフ値が第二のカットオフ値と等しいかそれより大きく、かつ、第三のカットオフ値よりも小さい場合、胎児のうちの１人が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいて、もう１人が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する。
【０１１８】
一態様では、ブロック１２８０は、第一の比（α型）または第二の比（β型）のどちらが大きいのかに関する第一の決定によって実行することができる。これによって、胎児が２人ともＨａｐＩまたはＨａｐＩＩを受け継いでいるか否かを区別することができる。そのような決定をした後には、選択肢のうちの１つだけが残る。その後、第三の比が残る２つの値に近いか否かを決定することができる。例えばａがｂよりも大きい場合、α型およびβ型遺伝子座の濃度の比が、以下の２つの値のうちの１つに近いかどうかを決定することができる：
【０１１９】
【数１】
2016518811.tif 000002
【０１２０】
使用される特定のカットオフ値または閾値は、任意の好適な統計検定によって決定することができる。逐次確率比検定（ＳＰＲＴ），正規混合分布モデル（McLachlan G and Peel D. Multivariate normal mixtures. Finite mixture models 2004: p81-116. John Wiley & Sons Press），二項混合分布モデルおよびポワソン混合分布モデル（McLachlan G and Peel D. Mixtures with non-normal components, Finite mixture models 2004: p135-174. John Wiley & Sons Press）などを含むがこれらには限定されない統計検定を本明細書で記載の方法において使用することができる。例えば、第三の比と前述した２つの値との間に有意差があれば、カットオフ値を決定することができる。あるいは、コンピューターによるシミュレーションによって、どの真値が、試験した例における比の値に最も適合するかを決定することができる（Qu JZ et al. Clin Chem. 2013;59:427-35）。
【０１２１】
Ｇ．臨床評価
母性遺伝性の常染色体疾患を、疾患遺伝子座に関連付けられている染色体領域を解析することによって評価することができる。疾患アレルと関連している母性ハプロタイプが両方の胎児に遺伝している場合、胎児は２人とも、その条件に罹患する可能性がある。２人の胎児が異なる母性ハプロタイプを受け継いでいると推定される場合、胎児のうちの１人だけが罹患する可能性がある。胎児が２人とも、正常なアレルに関連付けられている母性ハプロタイプを受け継いでいる場合、胎児は２人ともその状態に罹患しないだろう。
【０１２２】
常染色体劣性の疾患は、父性ハプロタイプの遺伝を考慮に入れることで評価することができる。胎児が２人とも疾患アレルと関連付けられている父性ハプロタイプを受け継いでいる場合、母性ハプロタイプの遺伝に関する解析に基づいて、胎児がその条件に罹患しているか、または保因者であるかを決定することができる。胎児が２人とも正常な父性アレルを受け継いでいる場合、母性ハプロタイプの遺伝に関する解析によって、胎児がその状態の保因者であるか否かを決定することができる。２人の胎児がそれぞれ異なる父性ハプロタイプと異なる母性ハプロタイプを受け継いでいる場合、胎児のうちの１人が罹患していて、もう１人が正常である可能性が５０％であり、胎児が２人ともその条件の保因者である可能性が５０％である。
【０１２３】
ＩＶ．母親も父親もヘテロ接合型である場合
その延長線上で、前述した態様の根底にある原理を他の遺伝様式にも当てはめることができる。前述の通り、同じ父性遺伝性アレルが両方の胎児に受け継がれる可能性がある。また、父性遺伝性アレルは、父親がヘテロ接合型の例でも決定することができる。例えば、父性遺伝性のハプロタイプを、母親がホモ接合型で父親がヘテロ接合型の遺伝子座から決定することができ、その後、ハプロタイプを形成している他の遺伝子座の父性遺伝性アレルを決定することができる。しかしながらいくつかの態様は、父性遺伝性アレルが分かっているときにしか使用することができない。
【０１２４】
一態様では、母親と父親の両方の遺伝子型が両方ともＡアレルとＢアレルのヘテロ接合型で、かつ、父性遺伝性のアレルが両方の胎児で異なっているまたは分かっていない遺伝子座を利用して母性遺伝を決定することができる。これら２つのハプロタイプの母体血漿中での有無を測定することで、５つの範囲が分かる。例えば、２人の胎児が母体血漿に含まれているＤＮＡに対してそれぞれ１０％ずつ寄与している場合、測定されるＡアレルの寄与率は、胎児が２人ともホモ接合型Ｂの場合にはおよそ４０％、１人の胎児がホモ接合型Ｂでもう１人の胎児がヘテロ接合型の場合には４５％；胎児が２人ともヘテロ接合型であるか、または１人がホモ接合型Ａでもう１人がホモ接合型Ｂの場合には５０％；１人の胎児がホモ接合型Ａでもう１人がヘテロ接合型の場合には５５％；および胎児が２人ともホモ接合型Ａの場合には６０％となる。生じ得るこの５つの状況を区別するためには、４つのカットオフ量を定義する。この複雑さを解消するためには通常、両親の遺伝子座がホモ接合型Ａのときよりも、血漿試料に関してより多くのＤＮＡリードが必要となる。
【０１２５】
各遺伝子座に２を超えるアレル変異が存在する母性遺伝も決定することができる。従って、特定の遺伝子座について、母性遺伝子型がＡＢで父性遺伝子型がＣＤの場合、測定される母体血漿のＤＮＡ量は、Ａアレルの寄与率が、胎児が２人ともＢＣまたはＢＤの場合には４０％、胎児がＡＣまたはＡＤとＢＣまたはＢＤの組み合わせの場合には４５％、および胎児が２人ともＡＣまたはＡＤの場合には５０％になるように分けられる。母性遺伝子型がＡＢで父性遺伝子型がＡＣの場合、測定される母体血漿中のＤＮＡ量は、漁師の遺伝子型がＡアレルについてＡＢの例と同様に、５つの範囲に分けられるが、Ｂアレルについてはより少なくなる。
【０１２６】
図１３は、本発明の態様による、母親と父親の両方がヘテロ接合で、男性によって受精した女性における２人の胎児の母性ハプロタイプの遺伝を決定するための方法１３００のフローチャートである。方法１３００では母親から採取した生体試料、例えば女性と２人の胎児由来の細胞を伴わないＤＮＡを含む試料を使用する。
【０１２７】
ブロック１３１０では、第一の染色体上にある１つ以上の第一の遺伝子座を含む第一の群を同定する。女性は、第一の遺伝子座のそれぞれで、対応する第一のアレルと対応する第二のアレルのヘテロ接合型である。第一の母性ハプロタイプは第一のアレルを含み、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる。男性も第一の遺伝子座のヘテロ接合型である。第一の群はどちらの型の遺伝子座であってもよい。
【０１２８】
ブロック１３２０では、生体試料に含まれているＤＮＡ断片上にある第一の遺伝子座に関し、第一のアレルそれぞれの第一の量を測定する。ブロック１３２０は、他の測定操作と同様の様式で実施することができる。
【０１２９】
ブロック１３３０では、生体試料に含まれているＤＮＡ断片の第一の遺伝子座から第二の量を測定する。第二の量は、第一の遺伝子座のうちの１つに配置されている任意のＤＮＡ断片に相当する可能性がある。あるＤＮＡ断片（任意のアレルを含む）が第一の遺伝子座のうちの１つに由来するものであることを示す任意のシグナルを利用して第二の量を決定することができる。そのようなシグナルは例えば、第一の遺伝子座のうちの１つに整列する配列リードであってもまたは、ＰＣＲを行っているウェルの、第一の遺伝子座のうちの１つに対するプローブに対応している色であってもよい。
【０１３０】
ブロック１３４０では、第一の量と第二の量の比を算出する。比は例えば、本明細書に記載したような任意の比であってよい。
【０１３１】
ブロック１３５０ではこの比を利用して、２人の胎児に遺伝した母性ハプロタイプを決定する。一態様では、次に、以下のように母性遺伝を決定する。
（ｉ）比が第一のカットオフ値よりも大きい場合、両方の胎児が第一の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する；および
（ｉｉ）比が第二のカットオフ値よりも小さい場合、両方の胎児が第二の母性ハプロタイプを受け継いでいると同定する。
【０１３２】
他の母性遺伝を決定することができる。いくつかの態様では、第一の父性ハプロタイプは第一のアレルを含み、前述の第一の例のように、第二の母性ハプロタイプは第二のアレルを含んでいる。比が５０％と統計的に等しい場合、胎児は２人とも１つ以上の第一の遺伝子座でヘテロ接合型（例えばＡｔブロック）であるか、または胎児のうちの１人は第一のアレルがホモ接合型（例えばＡＡ）で、もう１人の胎児は第二のアレルがホモ接合型（例えばＢＢ）であると同定することができる。別の例には、比が第二のカットオフ値（例えば、前述の例における４０％と４５％を区別するための値）よりも大きく、かつ、第三のカットオフ値（例えば、前述の例における４５％と５０％を区別するための値）よりも小さいのときに、１つ以上の第一の遺伝子座について、１人の胎児は第二のアレルがホモ接合型（例えばＢＢ）でその他の胎児がヘテロ接合型（例えばＡＢ）であると同定することが含まれる。従って、第三のカットオフ値は第一のカットオフ値よりも小さい。別の例には、比が第一のカットオフ値（例えば、前述の例における６０％と５５％を区別するための値）よりも小さく、かつ、第四のカットオフ値（例えば、前述の例における５０％と５５％を区別するための値）よりも大きいのときに、１つ以上の第一の遺伝子座について、１人の胎児は第一のアレルがホモ接合型（例えばＡＡ）でその他の胎児がヘテロ接合型（例えばＡｔブロック）であると同定することが含まれる。従って、第四のカットオフ値は第三のカットオフ値よりも大きい。
【０１３３】
いくつかの態様では、第一の父性ハプロタイプが対応する第三のアレル（例えばＣ）を含み、第二の父性ハプロタイプが対応する第四のアレル（例えばＤ）を含む。比が第一のカットオフ値よりも小さく、かつ、第二のカットオフ値よりも大きい場合、１人の胎児は第一のアレルと第三のまたは第四のアレルのいずれかのヘテロ接合型（例えばＡＣまたはＡＤ）であると同定することができる。もう１人の胎児は、第二のアレルと第三のまたは第四のアレルのいずれかのヘテロ接合型（例えばＢＣまたはＢＤ）であると同定することができる。
【０１３４】
Ｖ．品胎
本発明の原理に従えば、３人以上の胎児が在胎している妊娠での母性遺伝についても理解することができる。例えば、母親がヘテロ接合型ＡＢ、父親がホモ接合型ＡＡであり、３人の胎児（三つ子）が母体血漿試料中に含まれるＤＮＡにそれぞれ１０％ずつ寄与している例について検討する。Ａの寄与率は、三つ子全員がヘテロ接合型の場合は５０％；胎児のうちの２人がヘテロ接合型で１人がホモ接合型Ａの場合には５５％；胎児のうちの１人がヘテロ接合型で２人がホモ接合型Ａの場合には６０％；および胎児が３人ともホモ接合型Ａの場合には６５％であると理解される。品胎以上の多胎妊娠の場合、試料の理解には通常、血漿試料に関するより多くのＤＮＡリードが必要になる。
【０１３５】
従って、一態様では、第一の量が第二の量（例えば、およそ５０％の値の比）と統計的に等しい場合、胎児が３人とも、１つ以上の第一の遺伝子座についてヘテロ接合型であると同定することができる。比が第三のカットオフ値（例えば、６０％と５５％を区別するための値）よりも小さく、かつ、第四のカットオフ値（例えば、５０％と５５％を区別するための値）よりも大きい場合、１つ以上の第一の遺伝子座の第一のアレルについて、胎児のうちの２人がヘテロ接合型で、１人の胎児がホモ接合型であると同定することができる。比が第一のカットオフ値（例えば、６０％と５５％を区別するための値）よりも大きく、かつ、第五のカットオフ値（例えば、６５％と６０％を区別するための値）よりも小さい場合、１つ以上の第一の遺伝子座について、胎児のうちの２人は第一のアレルがホモ接合型で、１人の胎児がヘテロ接合型であると同定することができる。比が第五のカットオフ値よりも大きい場合、第一のアレルについては、胎児は３人ともホモ接合型であると同定することができる。
【実施例】
【０１３６】
以後の項では、本発明のいくつかの原理を例証する、非限定的な実施例を提供する。
Ａ．双子からの胎児ＤＮＡの採取および測定
プリンスオブウェールズ病院（Prince of Wales Hospital、香港）の産婦人科で、それぞれ双子を妊娠している２人の妊婦を募集し、インフォームド・コンセントを得た。血液試料を妊娠２１週と２５週の時点で採取した。出産後、それぞれの胎児から別々に臍帯血を採取した。本試験は、香港中文大学・新界東病院連網臨床研究倫理連席委員会（Joint Chinese University of Hong Kong Hospital Authority New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee）による認可を受けた。
【０１３７】
母体血液試料を４℃、１，６００ｇで１０分間遠心した。血漿画分を再度、４℃、１６，０００ｇで１０分間遠心し、残っている血液細胞を除去した。血液細胞を再度、室温、２，５００ｇで５分間遠心し、残っている血漿を除去した。ＤＳＰ（商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して血漿ＤＮＡを抽出した。ＤＳＰ（商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して臍帯血からＤＮＡを抽出した。臍帯血試料から抽出したゲノムＤＮＡの遺伝子型を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰアレイ６．０システム（商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって判定した。遺伝子型解析から、各対象が妊娠している２対の双子が二卵性であることを確認した。
【０１３８】
Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、血漿ＤＮＡの配列決定用ライブラリーを構築した。それぞれのライブラリーの調製におよそ３０ｎｇのＤＮＡを使用した。これらのライブラリーを次に、特注したＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔシステム（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した標的化濃縮にかけた。この補足用ライブラリーは、以下のように１４の染色体（ｃｈｒ）に分布している５．５Ｍｂのゲノム領域をカバーするものであった：ｃｈｒ１（０．３３Ｍｂ）、ｃｈｒ２（０．３０Ｍｂ）、ｃｈｒ３（０．６２Ｍｂ）、ｃｈｒ４（０．３２Ｍｂ）、ｃｈｒ５（０．３３Ｍｂ）、ｃｈｒ７（０．３１Ｍｂ）、ｃｈｒ８（０．６２Ｍｂ）、ｃｈｒ９（０．３１Ｍｂ）、ｃｈｒ１３（０．３０Ｍｂ）、ｃｈｒ１５（０．３３Ｍｂ）、ｃｈｒ１７（０．６６Ｍｂ）、ｃｈｒ１９（０．３５Ｍｂ）、ｃｈｒ２０（０．３４Ｍｂ）、およびｃｈｒ２２（０．３０Ｍｂ）。
【０１３９】
このライブラリーの配列を、標準的なペアエンド手法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使って決定した。それぞれのリードの各末端を５０ｂｐずつ読んだ。配列決用のフローセルを２レーンずつ使って、それぞれのライブラリーの配列を決定した。ＳＯＡＰ２アルゴリズムを使い、配列を決定した全リートと、マスクされていない非反復ヒト参照ゲノム（Ｈｇ１８）とを整列させた。
【０１４０】
母体血漿中の胎児ＤＮＡの分画濃度を、父性遺伝性胎児アレルの分画濃度から決定した。２種類のアレルを含む任意のＳＮＰ遺伝子座でのマイナーアレルとしての出現に基づいて、母体血漿中の父性遺伝性の胎児アレルを同定した。
【０１４１】
母体血漿中の父性遺伝性胎児アレルの分画濃度の分布に基づいて、母体血漿中の胎児ＤＮＡの総分画濃度を予測した。胎児ＤＮＡの分画濃度は症例１および２のそれぞれについて、２２．６％および３０．６％であると決定された。全情報遺伝子座についての胎児ＤＮＡ分画濃度の分布を使用して、母体血漿ＤＮＡに対する双子のそれぞれの寄与率を決定した。
【０１４２】
Ｂ．解析および結論
この解析では、母親がホモ接合型であるが、少なくとも１人の胎児がヘテロ接合型で、父親から別のアレルを受け継いでいるＳＮＰ遺伝子座を情報遺伝子座とした。症例１では、母体血漿に対するそれぞれの胎児の胎児ＤＮＡの分画濃度は、１０％および１１．６％であった。症例２では、母体血漿に対するそれぞれの胎児の胎児ＤＮＡの分画濃度は、１２．４％および１８．２％であった。
【０１４３】
それぞれの妊婦についてＲＨＤＯ解析を行い、２人の胎児が同じまたは別の母性ハプロタイプを受け継いでいるのかどうかを決定した。この実施例では、第４染色体長腕に位置している領域を使ってＲＨＤＯ解析について説明する。胎児由来の臍帯血を使った遺伝子型解析から、症例１の２人の胎児が、この領域については異なる母性ハプロタイプを受け継いでいることが分かった。症例２では、胎児は２人とも同じ母性ハプロタイプを受け継いでいた。家系解析から、父性遺伝子型を決定した。このＲＨＤＯ解析では、母親がヘテロ接合型で、父親がホモ接合型のＳＮＰ遺伝子座だけを利用した。他の態様では、遺伝している父性ハプロタイプが決定されていれば、母親と父親の両方がヘテロ接合型のＳＮＰ遺伝子座もＲＨＤＯ解析に利用することができる。
【０１４４】
この解析では尤度比の閾値を使って、α型およびβ型ＳＮＰ（α／β比）から決定した分画濃度が、双子のどの母性ハプロタイプ遺伝と最も適合するかを決定した。それぞれの例でα／β比についてのシミュレーション分析を、２人の胎児の分画濃度に基づいて行った。α型ＳＮＰおよびβ型ＳＮＰの共通アレルに関する分画濃度分布の配列リードをシミュレーションするために、二項分布では、５，０００のデータ点を生成した。（ａ）胎児が２人とも同じ母性ハプロタイプを受け継いでいる、または（ｂ）２人の胎児が異なる母性ハプロタイプを受け継いでいるという状況のα／β比の分布を決定した。
【０１４５】
図１４Ａおよび１４Ｂはそれぞれ、例１および例２に関して予想されるα／β比の分布を示している。生じ得る２つの遺伝様式について予測したα／β比の分布から、この２人の胎児が同じまたは異なる母性ハプロタイプを受け継いでいるか否かを区別するためのカットオフ値量を決定した。この具体例では、オッズ比を１２００として、上下のカットオフ値を算出した。α／β比が上のカットオフ値より大きい場合には、２人の胎児が同じ母性ハプロタイプを受け継いでいることが示唆され、α／β比が下のカットオフ値よりも小さい場合には、２人の胎児が異なる母性ハプロタイプを受け継いでいることが示唆される。症例１のシミュレーション分析では、上下のカットオフ値がそれぞれ、１．１１３および１．０９８であると推測された。症例２のシミュレーション分析では、上下のカットオフ値がそれぞれ、１．１７０および１．１５８であると推測された。
【０１４６】
図１５は、例１について、４番染色体長腕にある染色体セグメントをＲＨＤＯ解析した結果を示している表１５００である。この解析の統計的検出力が分析した配列リードの数に依存することから、必要とされる配列リード数の閾値を、分類ブロック当たり５，０００とした。言い換えると、ＲＨＤＯの各分類ブロックに含まれるＳＮＰの数は多様であるが、これらのＳＮＰ遺伝子座について配列を決定するリードの総数が、１解析当たり５，０００を上回るようにするということである。第一のＲＨＤＯ分類ブロックでは、α／β比は０．９７８３７と決定され、これはシミュレーション分析から推定された下のカットオフ値、１．０９８、よりも小さかった。
【０１４７】
この結果から、２人の胎児がこの領域については異なる母性ハプロタイプを受け継いでいることが示された。次のＲＨＤＯ解析には、第一の分類ブロックの下流にあるＳＮＰを使用した。この結果は、２人の胎児が異なる母性ハプロタイプを受け継いでいることを示唆するものであった。この領域にある合計９つのＲＨＤＯ分類ブロックを使った実験から、同じ結果が得られた。これらの結果が正しいことを、２人の胎児の遺伝子型判定から確認した。
【０１４８】
図１６は、例２について、４番染色体長腕にある染色体セグメントをＲＨＤＯ解析した結果を示している表１６００である。ＲＨＤＯ分類ブロック１では、α／β比は１．２９９と決定され、これはシミュレーション分析から推定された上のカットオフ値、１．１７０、よりも大きかった。
【０１４９】
この結果は、この領域については胎児は２人とも同じ母性ハプロタイプを受け継いでいることを示している。加えて、α型ＳＮＰから決定した分画濃度はβ型ＳＮＰから決定した分画濃度よりも高かった。このことは、胎児が２人とも、母性ＨａｐＩを受け継いでいることを示している（図１０Ａ）。
【０１５０】
次のＲＨＤＯ解析には、第一の分類ブロックに含まれている領域の下流にあるＳＮＰを利用し、この領域にある合計９つのＲＨＤＯ分類ブロックを使った実験から、同じ結果が得られた。これらの結果が正しいことを、２人の胎児の遺伝子型判定から確認した。
【０１５１】
ＶＩＩＩ．コンピューターシステム
本明細書で言及するコンピューターシステムはいずれも、好適な数のサブシステムを使用し得る。コンピューター装置１０に含まれるそのようなサブシステムの例を図１７に示している。いくつかの態様では、コンピューターシステムは単一のコンピューター装置を含み、この場合、サブシステムはコンピューター装置の構成要素であってよい。他の態様では、コンピューターシステムは複数のコンピューター装置を含み、コンピューター装置はそれぞれがサブシステムであって、内部コンポーネントを有している。
【０１５２】
図１７に示しているサブシステムはシステムバス７５を介して相互に接続している。その他のサブシステム、例えば印刷装置７４、キーボード７８、記憶装置７９、モニター７６（ディスプレーアダプター８２に接続されている）なども示している。周辺機器および入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置（Ｉ／Ｏ制御装置７１に接続されている）は、任意の数の当該分野で知られている手段、例えば入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート９７７（ＵＳＢ、ファイヤーワイヤー（登録商標）など）によってコンピューターシステムに接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えばイーサーネット、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用して、コンピューターシステム１０を、インターネット、マウス入力装置、またはスキャナーなどの広域ネットワークに接続することができる。システムバス７５を使った相互接続により、中央処理装置７３は各サブシステムとの通信およびシステムメモリー７２または記憶装置７９（例えば、ハードドライブなどの固定ディスクまたは光学ディスク）からの指示の実行の制御が可能になり、ならびに、各サブシステム間での情報のやりとりが可能になる。システムメモリー７２および／または記憶装置７９は読み込み可能なメディアを内蔵していてもよい。本明細書で言及するデータは全て、ある構成要素から別の構成要素に出力することができ、また、利用者に対して出力することができる。
【０１５３】
コンピューターシステムは複数の同じ構成要素またはサブシステムを含む場合があり、これらは例えば、外部インターフェース８１または内部インターフェースによって接続されている。いくつかの態様では、コンピューターシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク越しに通信している場合もある。そのような例では、１つのコンピューターはクライアントで別のコンピューターはサーバーであって、いずれもが同じコンピューターの一部分であってもよいと考えることができる。クライアントとサーバーはそれぞれが複数のシステム、サブシステムまたは構成要素を含んでいてもよい。
【０１５４】
本発明の態様はいずれも、ハードウェア（例えばアプリケーションに特異的な集積回路またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）および／またはモジュラー式または統合式に通常プログラム可能なプロセッサを備えたコンピューターソフトウェアを使った制御理論の形式で実装することが可能であると理解される。本明細書で使用されるプロセッサには、同じ集積チップ上にあるマルチコア・プロセッサ、または単一の回路基板上にあるかもしくはネットワークで繋がれた複数の処理装置が含まれる。当業者は本明細書で提供する技術や教示に基づいて、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組み合わせを用いて本発明の態様を実行するための別の手段および／または方法を理解・認識することができるだろう。
【０１５５】
本出願に記載のソフトウェアの構成要素または機能はいずれも、プロセッサによって実行されるソフトウェアコードであって、コンピューター言語（例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃）またはスクリプト言語（例えばＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎ）等の好適な言語のいずれかを使用し、例えば、標準的なまたは目的に沿った技術によってプログラムされたソフトウェアコードとして実装してもよい。ソフトウェアコードは、一連の指示またはコマンドとして、保存および／または伝達用のコンピューターで読み込み可能なメディアに保存してもよく、好適なメディアとしては、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブもしくはフロッピーディスクなどの磁気媒体、またはコンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）などの光媒体、フラッシュメモリなどが挙げられる。コンピューターで読み込み可能なメディアは、そのような記憶または送信装置のいかなる組み合わせであってもよい。
【０１５６】
そのようなプログラムは、様々なプロトコールに共通の有線、光学および／または無線のネットワーク、例えばインターネットに適応している搬送波信号を用いてコードおよび送信してもよい。つまり、そのようなプログラムでコードされたデータ信号を使って本発明の態様によるコンピューターで読み込み可能なメディアを作成してもよい。プログラムコードでコードされているコンピューターで読み込み可能なメディアを互換性のある装置とともに梱包してもよく、または他の装置とは別個に提供してもよい（例えば、インターネット上でのダウンロードによって）。そのようなコンピューターで読み込み可能なメディアはいずれも、単一のコンピューター製品（例えばハードドライブ、ＣＤ、もしくはコンピューターシステム全体）に置くことまたは組み込むこともでき、システムもしくはネットワーク上の複数のコンピューター製品に置くこともまたは組み込むこともできる。コンピューターシステムには、モニター、印刷装置、または本明細書で言及したいずれかの結果を利用者に提供するための他の好適なディスプレーを含めることもできる。
【０１５７】
本明細書に記載の方法はいずれも完全にまたは部分的に、１つ以上のプロセッサを含むコンピューターシステムを利用して実施してもよく、工程を実行するようにコンピューターシステムを構成することができる。従って態様は、本明細書に記載の方法のいずれかにおける工程を実行するように構成されたコンピューターシステムに関する場合があり、コンピューターシステムは、それぞれの工程またはそれぞれの工程群を実施する異なる構成要素を含む場合がある。工程に番号を付けて示しているが、本明細書の方法の工程は、同時にまたは異なる順序で実施することができる。加えて、これらの工程の一部分を、他の方法に由来する他の工程の一部分と共に使用してもよい。また、工程のうちの全てまたは一部は随意選択であってもよい。加えて、いずれかの方法のうちのいずれかの工程は、モジュール、回路、またはこれらの工程を実施するための他の手段を利用して実施することができる。
【０１５８】
特定の態様の具体的な項目は、本発明の態様の精神および範囲から逸脱することなく、任意の好適な様式で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の態様は、それぞれ個別の側面、またはこれら個別の側面の特定の組み合わせに関する具体的な態様に関する場合もある。
【０１５９】
本発明の例示的な態様に関するこれまでの記載は、例を示し、説明する目的で提示したものである。これらは完全なものでも、記載した形態に本発明を限定するものでもなく、前述の教示を考慮すれば多数の修正形態および変更形態が可能である。態様は、本発明の原理およびその実用化を最もよく説明するための選択・記載されたものである。従って、当業者が様々な態様において本発明を最もよく実施することができ、また、想定される特定の使用に適している様々な変更を施すことができる。
【０１６０】
「１つ」、「１種」または「この」という記載は、そうではないことが具体的に示されていない限り、「１つ以上」を意味することを意図している。
【０１６１】
本明細書で言及した全ての特許、特許出願、出版物、および記述は、全ての目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。いずれも先行技術であるとは認められない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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