(57)【要約】  化学式（Ｉ）：  【化１】2016537316.tif 000035の化合物と接触させることによってデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）を阻害する方法が開示される。
2016537316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）：
【化１】
2016537316.tif 000030
（式中、
Ｒ１およびＲ３はハロもしくは水素であり、Ｒ２は水素である（ただし、Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１つはハロである）か、または
Ｒ１とＲ２とが一緒になってアリール環もしくはへテロアリール環を形成し、Ｒ３はハロもしくは水素であり；
Ｒ４は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキレンアリールであり；かつ
（ａ）Ｒ５およびＲ５’のうち１つが水素であり他方が置換アルコキシである、または（ｂ）Ｒ５およびＲ５’がいずれも置換アルコキシである、または（ｃ）Ｒ１とＲ２とが一緒になって置換アリール環もしくは置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する場合、Ｒ５およびＲ５’はいずれも水素であってもよい）を有する化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１とＲ２とが一緒になって、窒素を含む、置換されていてもよいヘテロアリールを形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化学式（Ｉ）の化合物が
【化２】
2016537316.tif 000031
の構造を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ４がプロピルまたはイソペンチルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ５’が水素であり、Ｒ５がヘテロシクリルで置換されたアルコキシである、請求項１または４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ５が−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５が水素であり、Ｒ５’がヘテロシクリルで置換されたアルコキシである、請求項１または４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５’が−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記ヘテロシクリルが、モルホリニル、スルホキシモルホリニル、ピロリジニル、ピペラジニル、またはピペリジニルである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ヘテロシクリルがモルホリニルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５またはＲ５’が、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、または−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔであり、ｍが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１または４に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１およびＲ３がいずれもハロである、請求項１および４〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ３が同一である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ３が異なる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ３の少なくとも１つがクロロである、請求項１２、１３、または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ３がいずれもクロロである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲ３の少なくとも１つがフルオロである、請求項１２、１３、１４、または１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１およびＲ３がいずれもフルオロである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
【化３】
2016537316.tif 000032
【化４】
2016537316.tif 000033
の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２０】
【化５】
2016537316.tif 000034
の構造を有する化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、クモ膜腔内投与、眼内投与、または吸入投与を目的として製剤化されている、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
細胞の増殖を抑制する方法であって、細胞を、増殖抑制に有効な量の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物または請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２４】
前記細胞ががん細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記がん細胞が、ウイルス誘発性がん細胞、カポジ肉腫細胞、鼻咽頭癌腫（ＥＢＶ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、黒色腫細胞、急性リンパ性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、形質細胞異形成細胞、骨髄増殖性障害細胞、または膠芽腫細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記がん細胞が、肺がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、膵臓がん細胞、黒色腫細胞、固形腫瘍細胞、または結腸がん細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）を阻害する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、ＤＵＢのユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）触媒ドメインを阻害する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）を請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物または請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、デユビキチナーゼを阻害する方法。
【請求項３０】
前記化合物がＵｓｐ９ｘを阻害する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物がＵｓｐ５を阻害する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
病原体の感染を抑制する方法であって、病原体または病原体に感染した細胞を、病原体の感染の抑制に有効な量の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物または請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３３】
病原体の感染によって生じる症状を治療する方法であって、病原体または病原体に感染した細胞を、症状の治療に有効な量の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物または請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３４】
前記症状が、胃腸炎、脳炎、気道感染、ＳＡＲＳ、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱、リフトバレー熱、リステリア症、およびトキソプラズマ症からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記症状が、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症、または皮膚感染である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生体である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスが、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルス、またはナイロウイルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスが、ポリオーマウイルスまたはレトロウイルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）、ノーウォークウイルス、エプスタイン・バール（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、デングウイルス、およびパピローマウイルスからなる群から選択される、請求項３６または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶである、請求項３６または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌が、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリア、およびマイコバクテリウムからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記寄生体または真菌が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、エントアメーバヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、セストダ（Ｃｅｓｔｏｄａ）、クロノルキス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｉｄｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびクリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
対象において神経障害性疼痛または炎症性疼痛を治療する方法であって、対象に、神経障害性疼痛または炎症性疼痛を治療する有効な量の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物または請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／８８９，１４２号に基づく優先権を主張し、該仮出願の記載内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ユビキチン化は、細胞内タンパク質に対して、複雑な酵素カスケードが関与して行われる共有結合性の翻訳後修飾である。新たな知見によれば、ユビキチン化カスケードに関与する多くの酵素の、いくつかの疾患における発現や活性化の状態はそれぞれ異なっており、そのため好適な治療標的となり得ることが示唆されている。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質のユビキチン化は、脱ユビキチン化酵素（デユビキチナーゼ、ＤＵＢ）による逆転または調節の可能な、動的双方向プロセスである。ヒトゲノムは、ＤＵＢ活性を有すると推定される１００種類近いタンパク質をコードしており、これらのタンパク質は、２つの主要サブグループ、すなわち、ユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）とユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）に大別することができる。ＵＳＰがヒトにおけるＤＵＢの最大のサブクラスを構成しているのに対して、ＵＣＨ  ＤＵＢは公知の４種類以外に関する報告はない。ＤＵＢは、主に、ユビキチンとタンパク質との結合に対して拮抗的に作用するが、一方でユビキチン前駆体および未結合のポリユビキチン鎖からのユビキチンの切断を促進する働きもある。このように、ＤＵＢは、細胞内の遊離ユビキチンプールのホメオスタシスを調節および維持している。いくつかのＤＵＢに関して、ヒストンの脱ユビキチン化、ＤＮＡ損傷修復、細胞増殖（ＵＳＰ２）、およびサイトカインシグナル伝達（ＤＵＢ−Ａ）を調節することが報告されている。ＵＳＰ１４、Ｕｃｈ３７、およびＲＰＮ１１などのＤＵＢは、プロテアソーム（１９Ｓ）の調節サブユニットに関与し、プロテアソームの基質上のポリユビキチン鎖を編集することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書では、ＤＵＢを阻害するための方法を開示する。これらの方法はまた、付加的にあるいは代替的にＵＣＨ触媒ドメインを阻害することに関する。本明細書に開示する化合物は、例えばＵｓｐ９ｘまたはＵｓｐ５を阻害するものでもあり得る。本明細書ではさらに、病原体の感染を治療する方法および病原体の感染による症状を治療する方法を開示する。また、本明細書では、細胞の増殖を抑制したり、細胞の生存の可能性を低下させたり、あるいは腫瘍の転移を抑制したりする方法を開示する。さらに、本明細書では、神経変性障害またはその症状を治療する方法を開示する。また、本明細書では、遺伝子障害による症状を治療する方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書は、化学式（Ｉ）：
【化１】
2016537316.tif 000003
（式中、
Ｒ１およびＲ３はハロもしくは水素であり、Ｒ２は水素である（ただし、Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１つはハロである）か、またはＲ１とＲ２とが一緒になってアリール環もしくはへテロアリール環を形成し、Ｒ３はハロもしくは水素であり；
Ｒ４は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキレンアリールであり；かつ
（ａ）Ｒ５およびＲ５’のうち１つが水素であり他方が置換アルコキシである、または（ｂ）Ｒ５およびＲ５’がいずれも置換アルコキシである、または（ｃ）Ｒ１とＲ２とが一緒になって置換アリール環もしくは置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する場合、Ｒ５およびＲ５’はいずれも水素であってもよい）を有する化合物またはその塩もしくは溶媒和物を提供する。
【０００６】
さまざまな場合において、Ｒ１とＲ２とが一緒になって、窒素を含む、置換されていてもよいヘテロアリールを形成する。いくつかの場合において、前記化学式（Ｉ）の化合物は、
【化２】
2016537316.tif 000004
の構造を有する。さまざまな場合において、Ｒ４は、プロピルまたはイソペンチルである。
【０００７】
いくつかの場合において、Ｒ５’は水素であり、Ｒ５はヘテロシクリルで置換されたアルコキシである。いくつかの場合において、Ｒ５は、−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルである。さまざまな場合において、Ｒ５は、水素であり、Ｒ５’は、ヘテロシクリルで置換されたアルコキシである。Ｒ５’は、−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルであってもよい。さまざまな場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニル、スルホキシモルホリニル、ピロリジニル、ピペラジニル、またはピペリジニルである。いくつかの場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニルである。さまざまな場合において、Ｒ５またはＲ５’は、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、または−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔであり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【０００８】
さまざまな場合において、Ｒ１およびＲ３はいずれも、ハロである。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３は、同一である。さまざまな場合において、Ｒ１およびＲ３は、異なる。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３の少なくとも１つは、クロロである。さまざまな場合において、Ｒ１およびＲ３はいずれも、クロロである。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３の少なくとも１つは、フルオロである。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３はいずれも、フルオロである。
【０００９】
化学式（Ｉ）の化合物は、
【化３】
2016537316.tif 000005
【化４】
2016537316.tif 000006
の構造を有してもよく、またはその塩もしくは溶媒和物であってもよい。
【００１０】
さらに、本明細書は、
【化５】
2016537316.tif 000007
の構造を有する化合物またはその塩もしくは溶媒和物を開示する。
【００１１】
また、本明細書は、本明細書に記載の化合物および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を開示する。前記医薬組成物は、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、クモ膜腔内投与、眼内投与、または吸入投与を目的として製剤化されてもよい。
【００１２】
さらに、本明細書では、細胞の増殖を抑制する方法であって、細胞を本明細書で開示するような化合物または組成物と接触させることを含む方法が提供される。前記細胞は、例えばウイルス誘発性がん細胞、カポジ肉腫細胞、鼻咽頭癌腫（ＥＢＶ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、黒色腫細胞、急性リンパ性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、形質細胞異形成細胞、骨髄増殖性障害細胞、または膠芽腫細胞などのがん細胞であってもよい。前記細胞は、肺がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、膵臓がん細胞、黒色腫細胞、固形腫瘍細胞、または結腸がん細胞であってもよい。前記化合物は、ＤＵＢを阻害することができ、例えばＤＵＢのＵＣＨ触媒ドメインを阻害することができる。前記ＤＵＢは、Ｕｓｐ９ｘであってもよく、Ｕｓｐ５であってもよい。
【００１３】
さらに、本明細書では、ＤＵＢを阻害する方法であって、ＤＵＢを本明細書で開示するような化合物または組成物と接触させることを含む方法が提供される。
【００１４】
また、本明細書では、病原体の感染を抑制する方法であって、病原体または病原体に感染した細胞を本明細書で開示するような化合物または組成物と接触させることを含む方法が提供される。さらに、本明細書では、病原体の感染によって生じる症状を治療する方法であって、病原体または病原体に感染した細胞を本明細書で開示するような化合物または組成物と接触させることを含む方法が提供される。前記症状は、胃腸炎、脳炎、気道感染、ＳＡＲＳ、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱、リフトバレー熱、リステリア症、またはトキソプラズマ症であってもよい。いくつかの場合において、前記症状は、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症、または皮膚感染である。前記病原体は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生体であってもよい。前記ウイルスは、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルス、またはナイロウイルスであってもよい。前記ウイルスは、ポリオーマウイルスまたはレトロウイルスであってもよい。さまざまな場合において、前記ウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）、ノーウォークウイルス、エプスタイン・バール（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、デングウイルス、およびパピローマウイルスからなる群から選択される。前記ウイルスは、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶであってもよい。前記細菌は、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリア、またはマイコバクテリウムであってもよい。いくつかの場合において、前記細菌は、黄色ブドウ球菌である。さまざまな場合において、前記細菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。前記寄生体または真菌は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、エントアメーバヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、セストダ（Ｃｅｓｔｏｄａ）、クロノルキス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｉｄｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、またはクリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｇ９によって、腫瘍細胞中のＵｓｐ９ｘが急速に不活性化されることを示す。ＭＭ１．ＳＴ骨髄腫細胞（左）および患者であるドナーから採取したＰＣＬ細胞（右）を、記載の時間だけＧ９で処理した後、細胞溶解液のＵｓｐ９ｘ活性およびＭｃｌ−１レベルについて調べた。ＭＭ１．ＳＴ細胞において、カスパーゼおよびアポトーシスの活性化のマーカーとしてＰＡＲＰも測定した。
【００１６】
【図２】２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したＧ９の、ＭＭ１．Ｓ腫瘍の増殖および動物の体重に対する効果を示す。
【００１７】
【図３】５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したＧ９の、ＭＭ１．Ｓ腫瘍の増殖および動物の体重に対する効果を示す。
【００１８】
【図４】図３に示す動物実験におけるコントロールマウスおよび処置マウスの腫瘍の容積（上）および摘出した腫瘍（下）を示す。
【００１９】
【図５】コントロールの腫瘍およびＧ９で処置した腫瘍から得た抽出タンパク質におけるＵｓｐ９ｘ活性を示す。
【００２０】
【図６】Ａ３７５黒色腫腫瘍増殖および動物の体重に対するＧ９の効果を示す。
【００２１】
【図７】Ｇ９で処理した正常なＣＤ３４＋細胞およびＧ９で処理した骨髄腫細胞株を示す。
【００２２】
【図８】さまざまなウイルスおよびマクロファージにおけるＧ９の抗ウイルス活性を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、既知の化合物ＷＰ１１３０およびＶＭ０３０と比較して示す。
【図９】さまざまなウイルスおよびマクロファージにおけるＧ９の抗ウイルス活性を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、既知の化合物ＷＰ１１３０およびＶＭ０３０と比較して示す。
【００２３】
【図１０】さまざまな濃度のＧ９による、骨髄腫（ＭＭ１．Ｓ）細胞におけるＵｓｐ９ｘおよびＵｓｐ５の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
タンパク質のユビキチン化は、いくつかの酵素の関与を必要とする厳密に制御されたプロセスであり、そのような酵素により標的タンパク質のリジン残基がユビキチン（Ｕｂ）の単量体または重合鎖で修飾される。ユビキチン経路の酵素群は、真核細胞の細胞周期タイミング、タンパク質分解、およびシグナル伝達のメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。最近の研究より、Ｕｂ調節は、真核宿主細胞と同様に、原核細胞およびウイルスのライフサイクルのさまざまな段階においても重要であることが示唆されている。したがって、特定のＵｂ調節酵素を阻害または抑制することにより抗菌活性が示される可能性もある。
【００２５】
ＤＵＢは、がん化、細胞周期調節、アポトーシス防御、および薬剤耐性に関わるタンパク質の調節において多様な役割を担っていることから、好適な治療標的になると考えられる。最近、ＵＳＰ２およびＵＳＰ９ｘの下方調節が、それぞれサイクリンＤ１およびＭＣＬ−１の分解促進を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制することが示され、腫瘍細胞において特定のＤＵＢの発現を抑制することは、がん遺伝子依存性細胞または薬剤耐性細胞における安全かつ有効な治療となり得ることが示唆されている。また、他の研究により、がん、ウイルス性および細菌性の病因ならびに神経変性障害を含む広範囲の疾患におけるＤＵＢの役割も解明されている。ＤＵＢ調節活性を有するものとしてこれまでに報告されている化合物は数少ないが、その多くは、ＤＵＢ阻害に関連する抗腫瘍活性、抗増殖活性、または抗ウイルス活性を有することが報告されている（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１およびＵＳＰ７、ＳＡＲＳプロテアーゼ）。
【００２６】
さらに、Ｕｓｐ５は未結合のポリユビキチン（Ｕｂ）鎖、ｐ５３転写活性および二本鎖ＤＮＡ修複を調節する。ノックダウンおよび過剰発現に関する調査より、Ｕｓｐ５がｐ５３（およびｐ７３）レベルを調節し、ｐ２１の誘導に関連する細胞増殖および細胞周期分布に変化を生じさせることがわかる。Ｕｓｐ５はまた、ｐ５３に依存するＦＡＳ発現を調節することにより内因性のアポトーシス経路を調節する。Ｕｓｐ５の阻害は、黒色腫内の低下したｐ５３（またはｐ７３）機能を回復させる代替法を提供し得るものであり、また、黒色腫の治療において既に使用されている標的療法に付加し得るものである。
【００２７】
したがって、本明細書において、ＤＵＢを阻害する方法、ＵＣＨ触媒ドメインを阻害する方法、Ｕｓｐ９ｘを阻害する方法、Ｕｓｐ５を阻害する方法、病原体の感染を抑制または予防する方法、細胞の生存または増殖を抑制する方法、神経変性障害を治療する方法、神経変性障害の１以上の症状を治療する方法、遺伝子障害の１以上の症状を治療する方法、およびＤＵＢを阻害し得る化合物を開示する。本発明により提供される方法においては、ＤＵＢを、例えば、化学式（Ｉ）：
【化６】
2016537316.tif 000008
（式中、
Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、ハロまたは水素であり（ただし、Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１つは水素ではない）、
Ｒ２は水素であるか、またはＲ１およびＲ２とが一緒になって置換アリール環もしくは置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキレンアリールであり；かつ
Ｒ５およびＲ５’のうち１つが水素であり他方が置換アルコキシである、またはＲ５およびＲ５’がいずれも置換アルコキシルである、またはＲ１とＲ２とが一緒になって置換されていてもよいヘテロアリール環もしくは置換アリール環を形成する場合、Ｒ５およびＲ５’はいずれも水素であってもよい）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物と接触させる。さまざまな場合において、前記化合物は、
【化７】
2016537316.tif 000009
の構造を有する。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３はいずれも、ハロであり、例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、およびフルオロから選択される。さまざまな場合において、Ｒ４は、プロピル、イソペンチル、またはフェネチルである。さまざまな場合において、Ｒ５は、ヘテロシクリルで置換されたアルコキシ、例えば−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルである。さまざまな場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニル、スルホキシモルホリニル、ピロリジニル、ピペラジニル、またはピペリジニルである。いくつかの場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニル基である。さまざまな場合において、Ｒ５は、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、または−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔであり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの場合において、前記化合物は、
【化８】
2016537316.tif 000010
【化９】
2016537316.tif 000011
またはその塩もしくは溶媒和物である。さまざまな場合において、前記ＤＵＢ阻害剤は、
【化１０】
2016537316.tif 000012
またはその塩もしくは溶媒和物の構造を有する。
化学合成
【００２８】
【化１１】
2016537316.tif 000013
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（１，８−ナフチリジン−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド（化合物２）
１，８−ナフチリジン−２−カルボアルデヒド（７３．１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミド（Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527; 化合物１; ５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、β−アラニン（１６５ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（６ｍＬ）、および水（３ｍＬ）の溶液を窒素下、室温で１８時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を合わせて水で２回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して黄色の薄膜を得た。分取厚層クロマトグラフィーにより精製し、１．５％メタノール−ジクロロメタン溶液を用いて溶出し、化合物２（３４．１ｍｇ、４１％）を黄色の泡状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 9.25 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 8.2, 4.2 Hz, 1H), 7.38 - 7.25 (m, 5H), 6.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.11 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 1.99 - 1.83 (m, 2H), 1.38 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 357.3 (M+H)+.
【００２９】
（Ｅ）−２−シアノ−３−（３，６−ジクロロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（化合物４）
この化合物は、３，６−ジクロロピコリンアルデヒドおよび２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（化合物３；Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527）、β−アラニン、および水性エタノールから、過去の文献に記載の一般化された方法（Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527）を用いて合成した。
1H NMR (400 MHz, chloroform-d)  δ 8.61 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.24 (d, 2H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.01 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.78 - 3.71 (m, 4H), 2.80 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.60 - 2.55 (m, 4H), 1.96 - 1.76 (m, 2H), 1.41 - 1.30 (m, 2H), 0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H); MS (ES-) m/z 501.3 (M - H+ / 503.4 (M - H)+ (3:1 Cl同位体パターン).
デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）
【００３０】
脱ユビキチン化酵素（すなわち、デユビキチナーゼまたはＤＵＢ）は、一般にシステインプロテアーゼであり、サブグループとしてユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）とユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）に分類され得る。ＤＵＢの例としては、例えば、ＵＳＰ５、ＵＳＰ６、ＵＳＰ４、ＵＳＰ８、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２、ＵＳＰ１１、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ７、ＵＳＰ９Ｘ、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１、ＵＳＰ１２、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ１５、ＵＳＰ１７、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２０、ＵＳＰ３、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＳＰ１８、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ３３、ＵＳＰ２９、ＵＳＰ２５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ３２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２４、ＵＳＰ４２、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ３７、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ４７、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ５０、ＵＳＰ３５、ＵＳＰ３０、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ０８８ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ０９１ペプチダーゼ、ＵＳＰ４５、ＵＳＰ５１、ＵＳＰ３４、ＵＳＰ４８、ＵＳＰ４０、ＵＳＰ３１、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１２９ペプチダーゼ、ＵＳＰ４９、ＵＳＰ１７様ペプチダーゼ、ＵＳＰ５４、ＵＳＰ５３、ＵＳＰ３９、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ３、ＵＣＨ−ＢＡＰ１、ＵＣＨ３７、セザンヌ脱ユビキチン化ペプチダーゼ、セザンヌ２、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３、ＴＲＡＢＩＤタンパク質、ＶＣＰ（ｐ９７）／ｐ４７相互作用タンパク質、オツバイン（ｏｔｕｂａｉｎ）１、オツバイン２、ＣｙｌＤタンパク質、ＳＥＮＰ１ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ３ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ６ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ２ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ５ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ７ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ８ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ４ペプチダーゼ、Ｐｏｈ１ペプチダーゼ、Ｊａｂ１／ＭＰＮドメイン金属酵素、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６５ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６６ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６７ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６８タンパク質、ＣＯＰ９シグナロソームサブユニット６、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット７、真核細胞翻訳開始因子３サブユニット５、ＩＦＰ３８ペプチダーゼホモログが挙げられる。いくつかの場合において、本明細書に開示するような化合物によって阻害されるＤＵＢは、Ｕｓｐ９ｘである。さまざまな場合において、本明細書に開示するような化合物によって阻害されるＤＵＢは、Ｕｓｐ５である。
【００３１】
想定される他のＤＵＢとしては、オートファジン（ａｕｔｏｐｈａｇｉｎ）（ＡＴＧ）、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）ドメインタンパク質、ジョセフィン（Ｊｏｓｅｐｈｉｎ）ドメイン（ＪＤ）またはマシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）タンパク質、ユビキチン様タンパク質特異的プロテアーゼ（ＵＬＰ）、およびＪＡＭＭ（Ｊａｂ１／ＭＰＮドメイン会合金属イソペプチダーゼ）ドメインタンパク質が挙げられる。
【００３２】
具体的なＤＵＢ阻害剤
本明細書で開示する方法において使用される化合物は、化学式（Ｉ）：
【化１２】
2016537316.tif 000014
（式中、
Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、水素またはハロであり（ただし、Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１つは水素ではない）、
Ｒ２は水素であるか、またはＲ１およびＲ２とが一緒になって置換アリール環もしくは置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキレンアリールであり；かつ
Ｒ５およびＲ５’のうち１つが水素であり他方が置換アルコキシである、またはＲ５およびＲ５’がいずれも置換アルコキシルである、またはＲ１とＲ２とが一緒になって置換されていてもよいヘテロアリール環もしくは置換アリール環を形成する場合、Ｒ５およびＲ５’はいずれも水素であってもよい）の化合物またはその塩を含み、より具体的には、
【化１３】
2016537316.tif 000015
の構造を有する化合物である。さまざまな場合において、Ｒ１とＲ２がヘテロアリール環を形成する場合、該ヘテロアリール環は置換される。特定の場合において、前記ヘテロアリール環は、ＯＨ、ハロ、シアノ、およびニトロのうちの１以上で置換される。さまざまな場合において、Ｒ１とＲ２が置換アリール環を形成する場合、該アリール環は、ＯＨ、ハロ、シアノ、およびニトロのうちの１以上で置換される。いくつかの場合において、Ｒ１およびＲ３はいずれも、ハロであり、例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、およびフルオロから選択される。さまざまな場合において、Ｒ４は、フェネチルである。さまざまな場合において、Ｒ４は、プロピルまたはイソペンチルである。いくつかの場合において、Ｒ５は、水素であり、Ｒ５’は、置換アルコキシ、例えば−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルなど、ヘテロシクリルで置換されたアルコキシである。さまざまな場合において、Ｒ５’は、水素であり、Ｒ５は、例えば−Ｏアルキレン−ヘテロシクリルなど、ヘテロシクリルで置換されたアルコキシである。さまざまな場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニル、スルホキシモルホリニル、ピロリジニル、ピペラジニル、またはピペリジニルである。いくつかの場合において、前記ヘテロシクリルは、モルホリニル基である。さまざまな場合において、Ｒ５またはＲ５’は、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、または−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔであり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【００３３】
いくつかの場合において、前記ＤＵＢ阻害剤は、
【化１４】
2016537316.tif 000016
【化１５】
2016537316.tif 000017
またはその塩もしくは溶媒和物である。
【００３４】
用語「アルキル」は、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。１〜６個の炭素原子を有するアルキルも考えられる。用語「アルキル」は、「架橋アルキル」、すなわち、二環式または多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、またはデカヒドロナフチルを含む。アルキル基は、例えば、ヒドロキシ（ＯＨ）、ハライド、チオール（ＳＨ）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアミノのうちの１以上で置換されていてもよい。
【００３５】
用語「シクロアルキル」は、環状炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、およびシクロペンチルを指す。「ヘテロシクリル」は、その環が酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選択される１〜３個のヘテロ原子を含むこと以外は、シクロアルキルと同様に定義される。ヘテロシクリル基の例は、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロフラン、モルホリン、チオフェンなどを含むが、これらに限定されない。シクロアルキル基およびヘテロシクリル基は、例えば、アルキル、アルキレンＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２、オキソ（＝Ｏ）、アリール、ハロアルキル、ハロ、およびＯＨからなる群から独立に選択される１〜３個の基で置換されていてもよい飽和または部分不飽和環系であり得る。ヘテロシクロアルキル基は、さらにアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキレンアリール、またはアルキレンヘテロアリールでＮ−置換されていてもよい。
【００３６】
用語「アリール」は、単環式または多環式芳香族基、好ましくは単環式または二環式芳香族基を指し、例えば、フェニルまたはナフチルを指す。特に断りのない限り、アリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立に選択される１以上の置換基、特に１〜４個の置換基で置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、クロロフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ニトロフェニル、２，４−メトキシクロロフェニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
用語「ヘテロアリール」は、１個または２個の芳香族環を含み、該芳香族環において少なくとも１個の窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を含む単環式または二環式環系を指す。前記環は、別の環系（飽和環、不飽和環、または芳香族環）と結合していてもよく、スピロ縮合していてもよい。特に断りのない限り、ヘテロアリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の置換基、特に１〜４個の置換基で置換されていてもよい。いくつかの場合において、ヘテロアリール基は、アルキル基およびアルコキシ基のうちの１以上で置換されている。ヘテロアリール基の例は、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、チオフェニル、イソキノリル、インドリル、トリアジニル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、およびチアジアゾリルを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
用語「アルコキシ」は、−−Ｏ−−結合によって親分子に共有結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本開示の治療剤の塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）は、適切な塩基または酸を化学量論的当量の治療剤と反応させることによって調製することができる。
【００４０】
薬学的に許容可能な塩を形成するために一般に使用される酸は、無機酸（二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸など）、有機酸（ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、二酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸など）、ならびに関連の無機酸および有機酸を含む。したがって、このような薬学的に許容可能な塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、Ｏ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。一実施形態において、薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸により形成されたもの、ならびに特に、マレイン酸などの有機酸により形成されたものを含む。
【００４１】
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成され得る。化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な陽イオンを用いて調製してもよい。好適な薬学的に許容可能な陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、アンモニウム陽イオン、および第４級アンモニウム陽イオンを含む。また、薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などである。好適なアミンは、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む。
【００４２】
治療方法
本明細書で開示する方法は、障害を治療する方法、例えば、ＤＵＢ活性に関連する障害またはＤＵＢ活性の調節により影響を受ける障害などを治療する方法、またはＤＵＢ活性に関連する障害および／またはＤＵＢ活性の調節により影響を受ける障害を治療するための医薬の調製における、本明細書で開示する化合物の使用を含む。さらに考えられるのは、ＵＣＨ触媒ドメインを阻害することを伴う治療の方法である。考えられる具体的な障害としては、病原体の感染、がん、発達障害および神経変性障害、Ｒｉｄｄｌｅ症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、ならびにＤＵＢを要するまたはＤＵＢにより調節される遺伝子障害（例えば、ファンコーニ貧血）が挙げられる。
【００４３】
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、ＤＵＢの活性調節により影響を受ける障害を有する対象を同定すること、およびその対象に本明細書で開示するような化合物を投与することをさらに含む方法である。
【００４４】
さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、予防の方法であり、本明細書で開示するような化合物または組成物は、障害の発症前に投与される。いくつかの場合において、前記方法は、ＤＵＢ活性に関連する障害および／またはＤＵＢ調節により影響を受ける障害に罹患するおそれのある（例えば、本明細書で開示するようなウイルス、細菌、および／または寄生体に感染するおそれのある）対象を同定すること、および本明細書で開示するような化合物の有効量を投与することをさらに含む。
【００４５】
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、細胞の増殖を抑制する方法であって、細胞を本明細書で開示するような化合物の有効量と接触させて増殖を抑制することを含む方法である。いくつかの場合において、前記細胞は、がん細胞である。考えられるがん細胞は、本明細書内に別途記載する。さまざまな場合において、前記化合物は、前記細胞の内因性のＤＵＢを阻害し、増殖を抑制する。いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、Ｕｓｐ９ｘを阻害する方法である。さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、Ｕｓｐ５を阻害する方法である。
【００４６】
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、神経障害性疼痛または炎症性疼痛を治療する方法であって、細胞を、疼痛を軽減もしくは緩和するか、または細胞内のＵｓｐ５を阻害するのに十分な量の、本明細書で開示するような化合物と接触させることを含む方法である。いくつかの場合において、前記接触は、前記化合物を神経障害性疼痛または炎症性疼痛に罹患している対象に投与することを含む。
【００４７】
いくつかの場合において、本明細書で開示する方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含む。第２の治療剤は、本明細書で開示するような化合物と同時にまたは時間差をおいて（例えば、約１時間〜約１２時間の間隔を空けて）投与してもよい。これら２種の剤を同時に投与する場合は、これらの剤を合わせて１つの製剤として調製してもよく、また別々の製剤として調製して同時にまたは約３０分以内の時間差をおいて投与してもよい。考えられる第２の剤としては、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生体剤、抗菌剤、抗がん剤、遺伝子障害の１以上の症状を治療する剤、および／または神経変性障害を治療する剤が挙げられる。
【００４８】
がん
がんは、突然変異性の多様な形状およびゲノムの変化を特徴とするゲノムの疾患であり、これらの特徴により突然変異が引き起こされ、異常な細胞内伝達カスケードが生じる。シグナル伝達カスケードによって増殖シグナルが細胞膜から核へと伝えられ、転写応答や翻訳後のタンパク質修飾が開始する。がんにおけるシグナル伝達カスケードの調節異常は、最終的に異常細胞の生存を長引かせ、異常細胞の増殖をもたらすこととなる。シグナル伝達カスケードは、タンパク質機能を制御するリン酸化反応ならびにタンパク質の代謝回転および分解を調節するユビキチン化によって調節され得る。
【００４９】
リン酸化またはキナーゼシグナル伝達カスケード、およびユビキチンによるタンパク質分解に関与するタンパク質複合体であるプロテアソームは、がん治療における重要な標的である。キナーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤の抗がん活性は、悪性細胞の成長、増殖、および生存を補助する複数のシグナル経路の遮断により発揮される。
【００５０】
多発性骨髄腫（ＭＭ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および慢性骨髄性白血病などの血液（Ｂ細胞）のがんに対して現在行われている治療には、化学療法および自家幹細胞移植に加えて、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）、免疫調節薬剤（サリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイド）、およびＢ細胞のシグナル伝達に関与するキナーゼシグナル伝達カスケードに対する阻害剤（Ｂｔｋ、ｍＴＯＲ阻害剤）の使用が含まれる。ＭＭおよびＭＣＬに対する従来の治療戦略により、患者の管理および全生存率は向上したが、これらの疾患はいまだ治療不能であり、多くの患者が最終的に該疾患を再発、死亡するため、より有効な治療法の必要性が重視されている。
【００５１】
ユビキチン／プロテアソームによるタンパク質分解は、タンパク質の代謝回転または分解のために細胞によって使用される主要な機序のうちの１つである。前記タンパク質分解は、２つの連続的段階
１）ユビキチン７６アミノ酸ポリペプチドが、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、およびユビキチン転移酵素Ｅ３を介してタンパク性基質に結合する段階、ならびに
２）２６ｓプロテアソーム複合体またはリソソームが、標識されたタンパク質またはポリユビキチン化されたタンパク質を分解する段階（Oncogene (2012) 31, 2373 - 2388 and Acta Pharmacol Sin 2007 Sep; 28 (9): 1325 - 1330）
を有する。
【００５２】
ユビキチン化は可逆的プロセスであり、デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）に触媒される酵素反応によって、ユビキチン化タンパク質からユビキチンを取り除くことができる。脱ユビキチン化酵素は、タンパク質の安定性の調節において重要な役割を担うことが知られており、タンパク質の脱ユビキチン化、ユビキチンの再利用、および遊離したユビキチンの濃度の維持を担っている。ＤＵＢは、タンパク質の分解を防ぐことによりタンパク質の安定性を高めることができる。
【００５３】
タンパク質の代謝回転と安定性においてユビキチン化およびＤＵＢが果たす役割に鑑み、これらの酵素の活性化および発現における調節異常は、がんの発生および進行に関連があると考えられてきた。ＤＵＢは、発がん性タンパク質または腫瘍抑制タンパク質の発現の安定化において役割を果たすことから、薬剤標的として、または腫瘍学研究における診断バイオマーカーおよび予後バイオマーカーとして注目されてきた。突然変異したいくつかのＤＵＢについては、がん遺伝子または腫瘍抑制因子として作用することが知られており、いくつかの血液がんおよび悪性の固形腫瘍（肺がん、膵臓がん、前立腺がん、結腸がん、甲状腺がん、および乳がん）においてＤＵＢの発現レベルの変化が確認されている（Annu Rev Biochem. 2009;78:363-97）。
【００５４】
ＤＵＢであるＵｓｐ９ｘは、骨髄細胞白血病−１に関与する発がん性タンパク質（Ｍｃｌ−１）に結合することによって該タンパク質の発現を安定させることのできる能力に基づき、いくつかのＢ細胞性悪性腫瘍（ＭＭ、ＭＣＬ、慢性骨髄性白血病）における見込みのある治療標的として、近年相当な注目を集めている（Nature. 2010 Jan 7;463(7277):103-7）。Ｍｃｌ−１タンパク質は、アポトーシス経路または細胞死経路を阻害することによって、腫瘍の増殖および生存を促進することが知られている。Ｍｃｌ−１は、ＭＭ、ＭＣＬ、および慢性骨髄性白血病において、過剰発現する。乳房、肺、皮膚（黒色腫）、神経組織、および肉腫を含む複数種の組織に及ぶがんの１０．９％において、Ｍｃｌ−１遺伝子の増幅が認められた（Nature. 2010 Feb 18;463(7283):899-905）。
【００５５】
ＭＭにおいて、Ｍｃｌ−１タンパク質の発現レベルは、化学療法に対する耐性、疾病再発、および低生存率と関連がある。Ｕｓｐ９ｘも同様に、ＭＣＬおよびＭＭにおいて高度に発現し、Ｕｓｐ９ｘの高発現は、これらの疾患において、Ｍｃｌ−１の安定性増加の発症機序である可能性がある。これを裏付けるため、ＭＭ細胞およびＭＣＬ細胞におけるＵｓｐ９ｘ発現をノックダウンしたところ、Ｍｃｌ−１レベルおよびＭＭ細胞の生存性が低下し、細胞増殖が阻止された（Leukemia. 2005 Jul;19(7):1248-52）。
【００５６】
Ｕｓｐ９ｘ遺伝子における突然変異およびＵｓｐ９ｘタンパク質の高発現は、大腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、および非小細胞肺がんにおいても見られた。ＭＭおよび大腸がんにおいてＵｓｐ９ｘ発現を抑制したところ、細胞死が増加し、細胞増殖が阻止され、細胞が化学療法に対して感作され、悪性腫瘍病理学におけるＵｓｐ９ｘの重要な役割が示唆された（Cancer Biol Ther. 2012 Nov;13(13):1319-24）。
【００５７】
Ｕｓｐ９ｘタンパク質の発現は、大腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、および非小細胞肺がんにおいてさらに高くなることがわかっている（Acta Pharmacol. Sin 2007 28(9): 1325-1330）。ＭＭおよび大腸がんにおいてＵｓｐ９ｘ発現を抑制したところ、細胞死が増加し、細胞増殖が阻止され、細胞が化学療法に対して感作され、悪性腫瘍病理学におけるＵｓｐ９ｘの重要な役割が示唆された（Nature, 2010, 463(7283):899-905 and Cancer Biol. Ther, 2012 13(13):1319-24）。
【００５８】
ＤＵＢ阻害剤であるＷＰ１１３０（例えばＷＯ  ０８／０５９５４を参照のこと）は、Ｕｓｐ９ｘ、Ｕｓｐ１４、Ｕｓｐ５、およびＵＣＨ３７を選択的に標的とする。ＷＰ１１３０によって、ＭＭ細胞株、ＭＣＬ細胞株、および患者のサンプルにおいて、Ｍｃｌ−１レベルが低下し、腫瘍抑制因子ｐ５３の発現が増加し、細胞死（アポトーシス）が増加して細胞増殖が阻止された。しかしながら、この化合物は、難溶性であり、かつ薬物速度論的特性が悪く、臨床応用化に向けたさらなる開発は進められなかった。
【００５９】
臨床応用化に向けた糸口を見つける可能性を高めるため、一連の化学的修飾を行い、多くの阻害剤の構造活性相関（ＳＡＲ）解析を行った。Ｕｓｐ９ｘを阻害する見込みのある化合物について中程度のスループット定量分析を行うため、ヒトＵｓｐ９ｘの１５５３−１９６０位のアミノ酸に相当するＤＮＡによって表されるＵｓｐ９ｘ触媒ドメイン（Ｕｓｐ９ｘＣＤ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）におけるタンパク質発現用に最適化されたコドンを使用して合成した。２つの化合物Ｇ９および０６７は、毒性を軽減し、溶解度および有効性を高めたことにより、特異性の高いＵｓｐ９ｘ阻害剤として同定された。Ｇ９はまた、ＭＭおよびＭＣＬ細胞において、Ｕｓｐ９ｘおよびＭｃｌ−１と相互に作用し、かつＭｃｌ−１の安定性を促進する働きをするＤＵＢであるＵｓｐ２４を阻害した。
【００６０】
興味深いことに、Ｕｓｐ９ｘおよびＵｓｐ５については、黒色腫細胞および黒色腫患者において過剰に発現することもまたわかっている。黒色腫細胞株でＧ９を使用したところ、腫瘍抑制因子ｐ５３の発現が増加し、Ｍｃｌ−１タンパク質が減少し、細胞死が増加し、腫瘍細胞の侵襲性が抑制されて細胞増殖が阻止された。前記化合物はまた、キナーゼ阻害剤であるベムラフェニブのアポトーシス効果および抗細胞増殖効果を高め、増大させた。ベムラフェニブは、細胞増殖および細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達カスケードの構成要素であるＢＲＡＦに突然変異を有する黒色腫患者の約６０％に現在使用されている。黒色腫の異種移植片において、Ｇ９の単剤療法を行ったところ、腫瘍増殖は抑制され、動物の体重、行動、および運動性に対する顕著な副作用は起こらなかった。
【００６１】
上述のように溶解度および薬物速度論的特性が向上し、毒性が軽減されることから、Ｍｃｌ−１、Ｕｓｐ９ｘ、およびＵｓｐ２４が増幅または過剰発現されている複数種のがんにおいて、同定された前記２つのＵｓｐ９ｘ阻害剤を治療薬として使用し得る可能性が示唆される。
【００６２】
本明細書で開示する方法および化合物は、がんの治療において、例えば、がんまたはがんの症状の予防、抑制、および／または緩和において有用である。いくつかの場合において、がんを治療する前記方法は、ＤＵＢ（例えば、がんの生存または増殖に関与するＤＵＢ）を阻害することを含む。
【００６３】
考えられる具体的ながんとしては、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、黒色腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞異形成、骨髄増殖性障害、膠芽腫、カポジ肉腫、および鼻咽頭癌腫（ＥＢＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。考えられる他のがんとしては、肺がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、および固形腫瘍が挙げられる。
神経障害性疼痛または炎症性疼痛
【００６４】
Ｕｓｐ５が、Ｃａｖ３．２チャンネル活性を高めることによって神経障害性疼痛または炎症性疼痛を調節することがわかっている（Garcia-Caballero et al., Neuron, 83:1144-1158 (2014)を参照のこと）。したがって、本明細書において提供される方法は、神経障害性疼痛または炎症性疼痛を治療または緩和する方法であって、Ｕｓｐ５を阻害するのに十分な量の、本明細書で開示するような化合物を投与することによって該疼痛を治療または緩和する方法である。
病原体の感染
【００６５】
本明細書で開示する方法および化合物は、病原体の感染の治療において有用であり、例えば、病原体の感染または病原体の感染の症状の予防、抑制、および／または緩和において有用である。いくつかの場合において、本明細書で開示する方法および化合物は、病原体の感染による症状の治療において有用である。
【００６６】
食品および水道に対する故意の汚染は、米国民全体の健康および健康関連サービスにとって、また世界の各地で任務に就いている米国軍隊にとって、大きな脅威である。水および食品を媒体とする、カテゴリーＢに属する病原体の多くは、この種のバイオテロリズムの有力な候補とならしめる特有の性質（例えば、低感染用量、高安定性）を有する。この潜在的な脅威を阻止するために、このような特定の病原体を防御または予防することが可能な方法または剤が緊急に必要とされている。理想的には、広範囲の脅威に対する防御の可能な剤が望ましい。本明細書で開示する化合物は、複数の病原体に対する幅広い活性を有する。例えば、Ｇ９は、カテゴリーＡおよびＢに属する種々の病原体、ならびにこれらと同科に属する関連する病原体による感染、例えば、マウスノロウイルス、テュレーン（Ｔｕｌａｎｅ）ウイルス、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびトキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）による感染、ならびにノーウォークウイルス複製の強力な阻害剤である。また、Ｇ９は、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスおよびラクロス（Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ）ウイルスに対する抗ウイルス活性も有する。特定の細胞において、本明細書で開示する化合物はデユビキチナーゼを阻害し、その結果細胞内の細胞質およびアグリソームコンパートメントにユビキチン化タンパク質が蓄積する。これにより、標的細胞内に病原体の感染または複製にとっては好ましくない環境を確立することができる。したがって、前記化合物は、複数の病原体を効果的に抑制することができる抗菌剤として使用されている。本明細書で開示する化合物は、カテゴリーＡおよび／もしくはＢの病原体、ならびに／またはこれらと同科に属する関連する病原体による感染を阻止する。
【００６７】
感染機序においてＤＵＢを利用する病原体が考えられる。いくつかの場合において、前記病原体は、感染細胞の内因性のＤＵＢを利用する。さまざまな場合において、前記病原体は、病原体自体の内因性のＤＵＢを利用する。
【００６８】
病原体の感染に起因する疾患または障害としては、胃腸炎、脳炎、気道感染（例えば、ＳＡＲＳ）、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱（例えば、クリミア・コンゴ、デング）、リフトバレー熱、リステリア症、またはトキソプラズマ症などが考えられる。病原体の感染に起因する疾患または障害としては、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症、および皮膚感染なども考えられる。
【００６９】
考えられる病原体としては、ウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性の病原体が挙げられる。考えられる病原性ウイルスとしては、カリシウイルス（例えば、ノロウイルス、サポウイルス）、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルス、またはナイロウイルスが挙げられる。考えられる他の病原性のウイルスとしては、ポリオーマウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。
【００７０】
考えられる具体的なウイルスとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）、ノーウォークウイルス、テュレーンウイルス、ロタウイルス、エプスタイン・バール（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、デングウイルス、およびパピローマウイルスが挙げられる。さらに考えられる具体的なウイルスとしては、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＨＩＶが挙げられる。
【００７１】
考えられる細菌としては、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリア、およびマイコバクテリウムが挙げられる。考えられる他の細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、より具体的にはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が挙げられる。
【００７２】
考えられる寄生体または真菌類としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、エントアメーバヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、セストダ（Ｃｅｓｔｏｄａ）、クロノルキス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｉｄｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびクリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００７３】
投薬および医薬製剤
本明細書において使用される用語「治療に有効な量」および「予防に有効な量」は、同定された疾患または症状を治療、緩和、または予防するのに十分な化合物の量、または検出可能な治療効果、予防効果、または抑制効果を発揮するのに十分な化合物の量を指す。このような効果は、例えば、病態の改善、症状の軽減によって、または本明細書に記載の任意のアッセイまたは臨床診断検査によって検出することができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、大きさ、および健康状態、症状の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。所定の状況における治療および予防に有効な量は、臨床医の技量および判断力の範囲内にある通常の試験により決定することができる。
【００７４】
治療剤の用量は、交互に（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、ｍｇ／ｋｇ単位で示される投与量として投与され得る。本明細書に開示する治療剤の考えられるｍｇ／ｋｇ投与量としては、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。ｍｇ／ｋｇ単位の投与量の具体的な範囲としては、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、および約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【００７５】
本明細書において、本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を用いて医薬組成物として調製することができる。本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、疾患または症状の治療を可能にする任意の経路によって投与される。投与の一経路は、経口投与である。また、本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、非経口（静脈内、腹腔内、肺内、皮下、または筋肉内など）、クモ膜腔内、局所、経皮、直腸内、経口、鼻内、または吸入を含む、任意の標準的な投与経路を使用して患者に送達することができる。また、消化管内で体液と接触した活性化合物の制御放出を可能とし、該活性化合物の血漿中濃度を実質的に一定かつ有効なものとするために、本明細書に記載の化合物を徐放製剤として調製してもよい。この目的のために、前記化合物の結晶体を、生分解性ポリマー、水溶性ポリマー、またはこれらの混合物、さらに必要に応じて好適な界面活性剤を配合して構成されるポリマーマトリクス内に組み込んでもよい。この場合、「組み込む」とは、ポリマーのマトリクス内に微粒子を包含させることを意味し得る。また、制御放出製剤は、公知の分散技術または乳化コーティング技術による分散微粒子または乳化微小液滴のカプセル化によっても得ることができる。
【００７６】
投与は、単回投与であってもよく、また本明細書で開示するような化合物を一定期間にわたって複数回に分けて投与するか、または持続放出が可能な製剤もしくは投与方法（例えば、ポンプ）により投与してもよい。本発明の実施形態の化合物をどのような方法を用いて対象に投与しようとも、投与される化合物の量および選択される投与経路は、病態に対して効果的な治療が提供されるように選択されるべきである。
【００７７】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、個々の投与方法および剤形に応じて、１以上の薬学的に許容可能な賦形剤（担体、溶媒、安定化剤、補助薬、希釈剤など）を用いて調製される。本発明の医薬組成物は、一般に、生理学的に適合可能なｐＨとなるように調製されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１、好ましくは約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であり得る。別の実施形態においては、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調節される。より詳細には、本発明の医薬組成物は、治療または予防に有効な量の、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１以上の薬学的に許容可能な賦形剤とともに含有することができる。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じて、本明細書に記載の化合物を組み合せて含有することも、細菌感染の治療または予防に有用な第２の活性成分（例えば、抗細菌（ａｎｔｉ−ｂｉｃｔｅｒｉａｌ）剤または抗菌（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）剤）を含有することもできる。
【００７８】
製剤は、例えば非経口投与または経口投与用には、固形剤、液剤、乳剤、または懸濁剤が最も一般的であり、肺内投与用の吸入可能な製剤は、一般的に液剤または散剤である。また、医薬組成物は、投与の前に生理学的に適合可能な溶媒を用いて再構築される凍結乾燥固体として調製してもよい。また、医薬組成物は、シロップ剤、クリーム、軟膏、錠剤などとして調製してもよい。
【００７９】
用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書に記載の化合物などの薬剤の投与のための賦形剤を指す。この用語は、過度の毒性を示すことなく投与され得る任意の医薬賦形剤を指す。
【００８０】
薬学的に許容可能な賦形剤は、投与される個々の組成物、およびその組成物を投与するために使用される個々の方法に応じて決定されるものでもある。したがって、医薬組成物の好適な製剤には多種多様な形態が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照のこと）。
【００８１】
好適な賦形剤としては、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子といった大型で代謝の遅い高分子などの担体分子が挙げられる。他の賦形剤の例としては、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、水、生理食塩水、グリセロール、および／またはエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられる。また、リポソームも薬学的に許容可能な賦形剤の定義に含まれる。
【００８２】
本明細書に記載の医薬組成物は、目的の投与方法に好適な任意の形態に調製される。例えば、経口使用を目的とする場合、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁剤、非水性液剤、分散性散剤もしくは顆粒剤（微粉化粒子またはナノ粒子を含む）、乳剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤として調製することができる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造分野で公知の任意の方法にしたがって調製することができ、そのような組成物は、口当たりの良い製剤を提供するために１以上の剤（甘味剤、着香剤、着色剤、および保存剤を含む）を含有してもよい。
【００８３】
錠剤に関連して使用される特に好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤（セルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど）、崩壊剤（架橋ポビドン、トウモロコシスターチ、またはアルギン酸など）、結合剤（ポビドン、スターチ、ゼラチン、またはアラビアゴムなど）、および潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなど）が挙げられる。
【００８４】
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、また消化管での崩壊および吸収を遅らせて長期間にわたって持続作用を提供できるように、公知の手法（マイクロカプセル化を含む）によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの放出遅延物質を単独で使用してもよく、またロウとともに使用してもよい。
【００８５】
また、経口用製剤は、活性成分を不活性な固体希釈剤（例えばセルロース、ラクトース、リン酸カルシウム、またはカオリン）と混合した硬ゼラチンカプセルであってもよく、また活性成分を非水性媒質または油性媒質（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油など）と混合した軟ゼラチンカプセルであってもよい。
【００８６】
別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の実施形態の化合物を懸濁剤の製造に好適な少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と混合した懸濁剤として調製してもよい。
【００８７】
さらに別の実施形態において、医薬組成物は、好適な賦形剤を添加することによって懸濁剤の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤として調製してもよい。
【００８８】
懸濁剤に関連して使用される好適な賦形剤としては、懸濁化剤（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、アラビアゴム）、分散剤または湿潤剤（例えば、天然のホスファチド（例えば、レシチン）、酸化アルキレンと脂肪酸との縮合産物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、酸化エチレンと、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合産物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン））、および増粘剤（例えば、カルボマー、蜜ロウ、固体パラフィン、またはセチルアルコール）が挙げられる。また、懸濁剤は、１以上の防腐剤（例えば、酢酸、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ−安息香酸ｎ−プロピル）、１以上の着色剤、１以上の着香剤、および１以上の甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）を含有してもよい。
【００８９】
また、本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油（オリーブ油またはラッカセイ油など）、鉱油（液体パラフィンなど）、またはこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤としては、天然ゴム（アラビアゴムおよびトラガントゴムなど）、天然のホスファチド（大豆レシチンまたは脂肪酸由来のエステルもしくは部分エステルなど）、無水ヘキシトール（モノオレイン酸ソルビタンなど）、および前記部分エステルと酸化エチレンとの縮合産物（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）が挙げられる。また、前記乳剤は、甘味剤および着香剤を含有してもよい。シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（グリセロール、ソルビトール、またはスクロースなど）を用いて調製してもよい。また、そのような製剤は、粘滑剤、防腐剤、着香剤、または着色剤を含有してもよい。
【００９０】
また、本発明の医薬組成物は、滅菌された注射可能な製剤（滅菌された注射可能な水性乳剤または油性懸濁剤など）の形態であってもよい。この乳剤または懸濁剤は、当業者により、上述したものを含む好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製されてもよい。また、滅菌された注射可能な製剤は、毒性がなく非経口で許容可能な希釈剤または溶媒（１，２−プロパン−ジオールなど）を用いて調製された、滅菌された注射可能な液剤または懸濁剤であってもよい。
【００９１】
また、滅菌された注射可能な製剤は、凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。また、滅菌された不揮発性油も、溶媒または懸濁媒質として使用することができる。この目的のために、無菌性の不揮発性油（合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む）を使用してもよい。また、脂肪酸（例えば、オレイン酸）も同様に、注射剤の調製に使用することができる。
【００９２】
安定な水溶性剤形の医薬組成物を得るために、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を、有機酸または無機酸の水性溶液（コハク酸の０．３Ｍ溶液、より好ましくはクエン酸の０．３Ｍ溶液など）に溶解してもよい。可溶性の塩を入手できない場合は、好適な１種の共溶媒、または２種以上の共溶媒の好適な組合せに、化合物を溶解してもよい。好適な共溶媒の例としては、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどが挙げられ、これらを全容量の約０％〜約６０％の濃度範囲で使用する。一実施形態においては、活性化合物をＤＭＳＯに溶解したものを水で希釈する。
【００９３】
また、本発明の医薬組成物は、活性成分の塩形態を適切な水性ビヒクル（水、等張食塩水、または等張デキストロース溶液など）に溶解した溶液の形態であってもよい。また、送達により適したものとする（例えば、溶解度、生物活性、または口当たりの良さを改善したり、副作用を低減する）ために、化学構造または生化学的構造の置換または付加によって、例えばエステル化、グリコシル化、ＰＥＧ化などによって、修飾を施した化合物も考えられる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、経口投与を目的として、溶解度の低い化合物に適した脂質系製剤として調製してもよい。一般に、脂質系製剤とすることにより、そのような化合物の経口バイオアベイラビリティを向上させることができる。
【００９５】
この場合、医薬組成物は、治療または予防に有効な量の本明細書に記載の化合物とともに、中鎖脂肪酸およびそのプロピレングリコールエステル（例えば、食用脂肪酸（カプリル脂肪酸およびカプリン脂肪酸など）のプロピレングリコールエステル）ならびに薬学的に許容可能な界面活性剤（ポリオキシル４０硬化ヒマシ油など）からなる群から選択される少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、水溶液における溶解促進剤としてシクロデキストリンを添加してもよい。シクロデキストリンの例としては、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのヒドロキシプロピル誘導体、ヒドロキシエチル誘導体、グルコシル誘導体、マルトシル誘導体、およびマルトトリオシル誘導体が挙げられる。具体的なシクロデキストリン系溶解促進剤は、ヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン（ＢＰＢＣ）であり、これは、上記組成物のいずれに添加しても当該実施形態の化合物の水溶解特性をさらに向上させることができる。一実施形態において、上記組成物は、約０．１％〜約２０％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン、より好ましくは約１％〜約１５％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン、さらにより好ましくは約２．５％〜約１０％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリンを含む。使用される溶解促進剤の量は、組成物中の本発明の化合物の量に依存する。
【００９７】
併用療法
また、本発明の実施形態の方法は、病態を治療するための、本明細書に記載の１以上の化合物と、１以上の別の治療剤との併用を含む。したがって、例えば、活性成分の組合せは、
（１）１つの組合せ製剤として製剤化し、同時に投与または送達する、
（２）別々の製剤として交互にまたは並行して送達する、
（３）当該技術分野で公知の、別の任意の組合せ治療レジメンにより送達する
のいずれで送達されてもよい。交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）において送達される場合、本明細書に記載の方法は、活性成分を、例えば、別々の液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、もしくはカプセル剤として、または別個の注射器に充填した注射剤として、順次投与または送達することを含んでもよい。一般に、交互療法においては、各活性成分の有効量を順次（すなわち、連続して）投与するが、同時療法（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｔｈｅｒａｐｙ）においては、２以上の活性成分の有効量を一緒に投与する。また、間欠的併用療法をさまざまな順序で使用してもよい。
【００９８】
いくつかの場合において、本明細書で開示する化合物は、第２の治療剤（例えば、化学療法剤）とともに投与および／または製剤化される。
【００９９】
本発明において使用が想定される化学療法剤としては、アルキル化剤（窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロランブシルなど）；ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）など）；エチレンイミン／メチルメラミン（トリエチレンメラミン（ｔｈｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ））など）；スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）；トリアジン（ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など）を含む）；代謝拮抗物質（葉酸類似体（メトトレキセートおよびトリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）など）、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンなど）、プリン類似体（６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンリン酸エステル、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）など）を含む）；天然産物（有糸分裂抑制薬（パクリタキセル、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む）、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、エストラムスチン、およびエストラムスチンリン酸エステルなど）；エピポドフィロ（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏ）毒素（エトポシドおよびテニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）など）；抗生物質（アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ））、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ））、マイトマイシンＣ、およびアクチマイシンなど）；酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）；生物応答調節物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦなど）を含む）；その他の種々の剤（白金配位錯体（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、アントラセンジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）（ミトキサントロンなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含む）、副腎皮質抑制剤（ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなど）；ホルモンおよびアンタゴニスト（副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（プレドニゾンおよび同等物など）、デキサメタゾン、ならびにアミノグルテチミドなど；プロゲスチン（ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、およびメゲストロール酢酸エステル（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）など）；エストロゲン（ジエチルス���ルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物など）；抗エストロゲン（タモキシフェンなど）；アンドロゲン（テストステロンプロピオン酸エステルおよびフルオキシメステロン／同等物を含む）；抗アンドロゲン（フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）など）；非ステロイド系抗アンドロゲン（フルタミドなど）を含む）；キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、Ｓｔａｔ阻害剤、およびナノ粒子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明の例示的な実施形態を詳細に示す以下の実施例を参照することによって本発明はさらに完全に理解されるだろう。しかし、実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本開示における引用文献はいずれも、参照により本開示において明示的に援用される。
【実施例】
【０１０１】
化合物の合成
【化１６】
2016537316.tif 000018
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（１，８−ナフチリジン−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド（化合物２）
１，８−ナフチリジン−２−カルボアルデヒド（７３．１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミド（Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527; 化合物１; ５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、β−アラニン（１６５ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（６ｍＬ）、および水（３ｍＬ）の溶液を窒素下、室温で１８時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を合わせて水で２回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して黄色の薄膜を得た。分取厚層クロマトグラフィーにより精製し、１．５％メタノール−ジクロロメタン溶液を用いて溶出し、化合物２（３４．１ｍｇ、４１％）を黄色の泡状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 9.25 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 8.2, 4.2 Hz, 1H), 7.38 - 7.25 (m, 5H), 6.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.11 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 1.99 - 1.83 (m, 2H), 1.38 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 357.3 (M+H)+.
【０１０２】
（Ｅ）−２−シアノ−３−（３，６−ジクロロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（化合物４）
この化合物は、３，６−ジクロロピコリンアルデヒドおよび２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（化合物３；Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527），β−アラニン、および水性エタノールから、過去の文献に記載の一般化された方法（Donato NJ, Wobus C, Showalter HDH, Talpaz M, Perry JW, Sorenson RJ, O’Riordan MXD, Jin Y. Deubiquitinase Inhibitors and Methods for Use of the Same.  WO 2012040527）を用いて合成した。
1H NMR (400 MHz, chloroform-d)  δ 8.61 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.24 (d, 2H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.01 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.78 - 3.71 (m, 4H), 2.80 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.60 - 2.55 (m, 4H), 1.96 - 1.76 (m, 2H), 1.41 - 1.30 (m, 2H), 0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H); MS (ES-) m/z 501.3 (M - H+ / 503.4 (M - H)+ (3:1 Cl同位体パターン).
【０１０３】
同様に、他の化合物を作製した。
【化１７】
2016537316.tif 000019
【０１０４】
（Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）−３−（１，８−ナフチリジン−２−イル）アクリルアミド
化合物４の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を３％２−プロパノール−ジクロロメタン溶液で精製し、標題化合物（２．９ｍｇ、４１％）を黄色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 9.26 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 8.2, 4.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 2.81 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.63 - 2.54 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 0.96 (t, J = 7.4 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 486.1 (M+H)+.
【化１８】
2016537316.tif 000020
【０１０５】
（Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）−３−（キノリン−２−イル）アクリルアミド
化合物４の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を３％メタノール−ジクロロメタン溶液で精製し、標題化合物（８．６ｍｇ、６１％）を黄色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.45 (s, 1H), 8.25 (dd, J = 13.8, 8.5 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.79 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 4.26 (br s, 2H), 3.86 (br s, 4H), 2.99 (br s, 2H), 2.78 (br s, 2H), 1.89 (m, 2H), 1.37 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 485.3 (M+H)+.
【化１９】
2016537316.tif 000021
【０１０６】
（Ｅ）−３−（８−クロロキノリン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド
化合物４の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を３％メタノール−ジクロロメタン溶液で精製し、標題化合物（４．７ｍｇ、３１％）を黄色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.47 (s, 1H), 8.30 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 2.82 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 5.1 Hz, 4H), 1.89 (m, 2H), 1.37 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 519.2 (M+H)+.
【化２０】
2016537316.tif 000022
【０１０７】
（Ｅ）−２−シアノ−３−（８−ヒドロキシキノリン−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド
化合物４の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を３％メタノール−ジクロロメタン溶液で精製し、標題化合物（６．１ｍｇ、４２％）を黄色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.42 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 2.81 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 1.89 (m, 3H), 1.37 (m, 3H), 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 501.3 (M+H)+.
【化２１】
2016537316.tif 000023
【０１０８】
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）−３−（キノリン−２−イル）アクリルアミド
化合物２の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を１０％酢酸エチル／ヘキサンで精製し、標題化合物（４．１ｍｇ、４２％）を無色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.46 (s, 1H), 8.25 (dd, J = 11.0, 8.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.37 (m, 4H), 7.30 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.12 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 1.91 (m, 2H), 1.38 (m, 2H), 0.98 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 356.2 (M+H)+.
【化２２】
2016537316.tif 000024
【０１０９】
（Ｓ，Ｅ）−３−（８−クロロキノリン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド
化合物２の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を２０％酢酸エチル／ヘキサンで精製し、標題化合物（３．５ｍｇ、３２％）を無色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.47 (s, 1H), 8.30 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.37 (m, 4H), 7.30 (m, 1H), 6.91 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.12 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 1.91 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 0.98 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 390.2 (M+H)+.
【化２３】
2016537316.tif 000025
【０１１０】
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（８−ヒドロキシキノリン−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド
化合物２の調製と同様にして、標題化合物を合成した。この粗生成物を２０％酢酸エチル／ヘキサンで精製し、標題化合物（８．４ｍｇ、８２％）を黄色の薄膜として得た。
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.43 (s, 1H), 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.38 (m, 4H), 7.29 (m, 1H), 6.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.12 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 1.92 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 0.98 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 372.2 (M+H)+.
【０１１１】
化合物のＤＵＢ阻害活性評価
ＣＭＬ、骨髄腫、およびマントル細胞リンパ腫の細胞株を有するパネルを用いて、ＤＵＢ阻害活性およびアポトーシス活性の有無による化合物のスクリーニングを行った。また、選択した化合物の、無傷の細胞および単離したＤＵＢ（Ｕｓｐ９ｘ−ＵＣＨドメイン）酵素調製物におけるＤＵＢ阻害についても調べた。これらのアッセイにおいて使用した方法の概要は、例えば、以下の文献に記載されている。Kapuria, et al., A novel small molecule deubiquitinase inhibitor blocks Jak2 signaling through Jak2 ubiquitination, Cell Signal, 2011, 23(12):2076-85; Kapuria, et al., Deubiquitinase inhibition by small-molecule WP1130 triggers aggresome formation and tumor cell apoptosis. Cancer Res, 2010. 70(22): p. 9265-76; Sun, et al., Bcr-Abl ubiquitination and Usp9x inhibition block kinase signaling and promote CML cell apoptosis. Blood, 2011. 117(11): p. 3151-62; Kapuria, et al., Protein cross-linking as a novel mechanism of action of a ubiquitin-activating enzyme inhibitor with anti-tumor activity. Biochem Pharmacol, 2011. 82(4): p. 341-9; and Bartholomeusz, et al., Activation of a novel Bcr/Abl destruction pathway by WP1130 induces apoptosis of chronic myelogenous leukemia cells. Blood, 2007. 109(8): p. 3470-8.
【０１１２】
一連の化学的修飾を行い、多くの阻害剤の構造活性相関（ＳＡＲ）解析を行った。Ｕｓｐ９ｘを阻害する見込みのある化合物について中程度のスループット定量分析を行うため、ヒトＵｓｐ９ｘの１５５３−１９６０位のアミノ酸に相当するＤＮＡによって表されるＵｓｐ９ｘ触媒ドメイン（Ｕｓｐ９ｘＣＤ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）におけるタンパク質発現用に最適化されたコドンを使用して合成した。前記ＤＮＡを、ｐＥＴ−２８由来の、ＵＬＰ１プロテアーゼにより開裂可能なＮ末端Ｈｉｓ６−Ｓｍｔ３融合タグ発現ベクターに導入することでクローニングした。カナマイシンを含むＴＢ培地（ＯＤ６００＝２．０）において、タンパク質発現を１６℃で一晩誘導した。細胞を採取し、使用前に急速冷凍を行った。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティ−カラムを用いて精製を行い、プロテアーゼによる開裂によりアフィニティータグを除去し、第２のＮｉ−ＮＴＡカラムに通してプロテアーゼおよび融合タグを除去し、最後に１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＤＴＴを用いてｐＨ７．４で平衡に保たれたＳ−２００カラムに通した。タンパク質を約２０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した後、アリコートを急速冷凍した。いずれの工程も、還元剤ＢＭＥ、ＤＴＴ、またはＴＣＥＰのいずれかの存在下で行った。
【０１１３】
２ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液内の精製組み換え酵素について、スピンカラムを使用して、該緩衝液を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡに交換した。３００ｎＭ  Ｕｓｐ９ｘＣＤを記載された最終濃度の阻害剤を用いて３７℃で３０分間インキュベートした後、最終反応体積が２５μＬの１．５μＭ  Ｕｂ−ＡＭＣ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社）を加えた。３８４ウェルプレートにおいて、蛍光（Ｅｘ  ３８０ｎｍおよびＥｍ  ４６０ｎｍ）をモニタリングし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  Ｍ２プレートリーダ（３７℃に加熱）を用いて経時的に測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ６を用いて各反応の勾配を統合し、ＩＣ５０値を予測した。
【０１１４】
前記アッセイを用いて、Ｕｓｐ９ｘＣＤ阻害活性の有無による新しい化学構造２１０種類のスクリーニングを行った。これらの２１０種類の化学構造のうち、２つの化合物（Ｇ９、０６７）が、（ＷＰ１１３０と比較して）優れたＵｓｐ９ｘＣＤ阻害剤であることがわかった。対象化合物すべてに対して行う前記酵素アッセイにおいて、蛍光スキャンを使用してＵｓｐ９ｘＣＤ阻害活性を調べた。各アッセイは２回ずつ行い、各反応曲線の線形領域を用いて、Ｕｓｐ９ｘＣＤに対するＩＣ５０値を計算した。結果を表１に示す。
【０１１５】
［表１］
【表１】
2016537316.tif 000026
【０１１６】
前記化合物が無傷の細胞のＵｓｐ９ｘをも阻害するか否かを確認するために、過去の文献に記載の方法と同様に、コントロール細胞および処理した細胞においてＤＵＢ活性を測定した。すなわち、コントロール細胞および処理した細胞にＤＵＢアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１×Ｒｏｃｈｅプロテイナーゼ阻害カクテル）を加えて超音波処理により溶解し、上清画分（１４，０００×ｇで遠心後）から採取したタンパク質２０μｇを、最終体積が２０μＬの２００ｎＭ  ＨＡ−Ｕｂビニルスルホン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社）とともにインキュベートした。３７℃で９０分間インキュベートした後、５Ｘサンプル緩衝液を加えて反応を停止させた。前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＨＡを用いた免疫ブロット法によって、ＤＵＢ活性を検出した。Ｚ１３８リンパ腫細胞において、ＷＰ１１３０、Ｇ９、およびＹＪ−８−０６７（細胞を１．２５μＭ、２．５μＭ、および５μＭの各化合物により４時間処理）の用量と反応の関係を調べた。その結果から、各化合物が無傷の細胞においてＵｓｐ９ｘ活性を阻害し、Ｕｓｐ９ｘの下流標的である生存促進性タンパク質Ｍｃｌ−１のレベルを減少させたことがわかる。Ｇ９のＵｓｐ９ｘ阻害活性について、ＷＰ１１３０よりも有効性が高く、また水溶解度が高いこと（ＷＰ１１３０の２．６μＭに対し、Ｇ９は１９．８μＭ）に基づき、さらに検討した。
【０１１７】
多発性骨髄腫（ＭＭ１．Ｓ）細胞および形質細胞性白血病（ＰＣＬ）に罹患した患者から採取した原発腫瘍細胞における、Ｇ９を介したＵｓｐ９ｘ阻害に要する時間について調べた。前述と同様に、ＭＭ１．ＳＴ細胞（図１（左））またはＰＣＬ細胞（図１（右））を５μＭの化合物で記載された時間処理した後、Ｕｓｐ９ｘ活性について調べた。その結果から、いずれの腫瘍サンプルにおいても、Ｇ９でわずか５分間処理することによってＵｓｐ９ｘ活性を＞８０％阻害することができ、６０分間処理することによってＵｓｐ９ｘ活性を１００％阻害できたことがわかる。Ｇ９を介したＵｓｐ９ｘ阻害はまた、Ｍｃｌ−１の減少、およびカスパーゼの基質であるＰＡＲＰの開裂によって示されるようなカスパーゼ活性の活性化との関連が見られた。これらの結果から、Ｇ９は、原発腫瘍および原発腫瘍細胞株において、Ｍｃｌ−１および腫瘍細胞のアポトーシスに影響を与えながら、Ｕｓｐ９ｘ活性を急速に阻害することがわかる。
【０１１８】
Ｕｓｐ９ｘは、黒色腫細胞において、高度に発現され、活性化されている。代表的な黒色腫細胞株であるＡ３７５およびＢＲＡＦキナーゼ阻害剤であるベムラフェニブに耐性のあるＡ３７５変異細胞株における、Ｕｓｐ９ｘ活性に対するＧ９の効果について調べた。Ｇ９を用いた処理によって、いずれの細胞種においても、Ｕｓｐ９ｘ活性は阻害された。Ｇ９は、血液悪性腫瘍およびある種の固形腫瘍において、Ｕｓｐ９ｘ活性を阻害することができる。
【０１１９】
Ｇ９または０６７が動物において抗腫瘍活性を発揮するか否かを調べるために、まず、Ｇ９または０６７をマウスに静脈内投与（ＩＶ）または強制経口投与（ＰＯ）した際のそれらの特性を調べた。各群２匹のマウスに、記載の用量レベルのＧ９または０６７を記載の経路（ＩＶまたはＰＯ）で１回投与し、記載された投与後の時点において血漿を採取した。血漿中の化合物濃度を、質量分析装置を備えた高性能液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析計））を用いて測定した。
【０１２０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ジメチルスルホキシド／ポリエチレングリコール３００（１：１）に溶解した０６７またはＧ９で処理し、記載通りに投与した。記載された時点における各マウスの血漿中の化合物レベルを線グラフで示す。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、各線グラフの下に示した。本分析から、両化合物は、ＩＶ投与後に生物学的に利用可能となり、Ｇ９を用いた場合により高いピークレベルに達することがわかる。両化合物は、経口投与に対する生物学的利用可能性が低く、半減期が比較的短い。記載された時点における各マウスの血漿中化合物レベルを表２に示す。いくつかの薬物動態パラメータの計算も行った。本分析から、両化合物は、ＩＶ投与後に生物学的に利用可能となり、Ｇ９を用いた場合により高いピークレベルに達することがわかる。両化合物は、経口投与に対する生物学的利用可能性が低く、半減期が比較的短い（Ｇ９の半減期：１．５〜２時間、０６７の半減期：１時間未満）。また、両化合物を腹腔内（ＩＰ）注入により投与したところ、ＩＶ投与により示した特性と同様な特性を示した（データ示さず）。ＩＰ注入によって投与した場合のＧ９の半減期は、０６７と同様であった（３０〜６０分）。これらの評価に基づき、Ｇ９に関しては、マウスにおける抗腫瘍活性についてもさらに評価した。
【０１２１】
［表２］
【表２】
2016537316.tif 000027
【表３】
2016537316.tif 000028
【０１２２】
ＭＭ１．Ｓ腫瘍細胞１０００万個を、体重が約２０グラムの雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンマ−２ノックアウトマウス（ＮＳＧ）２０匹の背部に注入した。３週間後には、腫瘍が目に見えるようになり、キャリパーで測定することができた。マウスを各群５匹の４群に分け、ジメチルスルホキシド／ポリエチレングリコール３００／リン酸緩衝食塩水（５５％：２５％：２０％）に溶解したＧ９を、体重１ｋｇ当たり０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、および１０ｍｇの用量レベルでマウスにＩＰ注入した。ＩＰ注入を１日１回、１４日間行い、腫瘍増殖（キャリパーで計測）および動物の体重を処置期間を通じてモニタリングした。各群における腫瘍増殖に生じた変化を、平均±標準誤差として群ごとに表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔを用いて、ｐ値を計算した。ｐ値が０．０５未満であれば有意と考えられる。結果を図２に示す。これらの結果から、いずれのＧ９投与量においても、ＭＭ１．Ｓ腫瘍増殖は抑制され、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＧ９を投与した場合、コントロールマウス（Ｇ９投与量：０ｍｇ／ｋｇ）と比較して極めて顕著に抑制されたことがわかる。いずれのマウスにおいても、体重はＧ９注入による影響を受けなかった。これらの結果から、Ｇ９がマウスにおいてＭＭ１．Ｓ腫瘍増殖を抑制することがわかる。雌のＮＳＧマウス２０匹に、全量が０．１ｍＬのマトリゲル／細胞培養培地（１：１）中のＭＭ１．Ｓ細胞１０００万個を皮下接種した。腫瘍がキャリパーで計測できるようになった時点で（腫瘍細胞注入の３週間後）、マウスを各群５匹の４群に分け、記載された投与量のＧ９で処置を行った。腫瘍増殖（左）および動物の体重（右）を、記載された間隔で記録した。各データ点に示した結果は、マウス５匹の平均±標準偏差である。ｐ値が０．０５未満であれば有意と考えられ、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔを用いて計算した。いずれのＧ９投与量においても、腫瘍増殖は抑制され、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＧ９を投与した場合、コントロールと比較して極めて顕著にＭＭ１．Ｓ腫瘍増殖が抑制された。
【０１２３】
ＮＳＧマウスに対して別の動物実験を行い、より高い用量レベルのＧ９を投与した。腫瘍接種および化合物投与については、低用量実験と同様に行った。ただし、この実験では各処置群３匹のマウスを使用し、高用量のＧ９の安全性と有効性について試験を行った。図３に示すように、Ｇ９のいずれの用量においてもＭＭ１．Ｓ腫瘍増殖は抑制され、１５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの場合、腫瘍は退縮した。図７に記載するように、ＭＭ１．Ｓ腫瘍をＮＳＧマウスに接種した。腫瘍がキャリパーで測定できるようになった時点で、マウスを各群３匹の５群に分け、０、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇのＧ９で、１２日間毎日、注入による処置を行った。腫瘍サイズ（左）および動物の体重（右）を処置期間を通じて記録した。１５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの投与で腫瘍退縮が見られ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投与により、マウスの体重がいくらか減少した。Ｇ９を用いた処置の結果をまた、処置群ごとに時間に対する腫瘍容積の変化として示す（図４（上））。最終注入後の各処置群３匹のマウスから摘出した腫瘍を撮影し、図４（下）に示す。Ｇ９を用いた処置によって、ＮＳＧマウスにおけるＭＭ１．Ｓ腫瘍増殖は安定して抑制された。コントロールマウスおよび処置マウスの腫瘍サイズを左側に示す。各処置群におけるバーは、左から右に０、４、６、８、および１１日間処置を受けた後の腫瘍サイズを表す。各バーは、各群３匹における測定値の平均±標準偏差を表す。処置マウスとコントロールマウスとの間の腫瘍容積の変化の有意性をＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔを用いて計算した。ｐ値が０．０５未満であれば有意と考えられる。下は、コントロールマウスおよび処置マウスから摘出した腫瘍の写真である。各縦列の上部に群名を記載し、該当する処置群の３匹のマウスそれぞれから摘出した腫瘍を各列に示す。
【０１２４】
マウスにおいて、Ｇ９を介したＵｓｐ９ｘ阻害が急速に起こり、血漿中のＧ９の半減期が短いことから、ＩＰ注入後すぐにＵｓｐ９ｘ阻害が起こっている可能性が示唆される。この可能性について分析するために、最終注入の１時間後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出、撮影し、ドライアイスによる急速冷凍を行った。腫瘍組織を液体窒素中でせん断し、乳鉢と乳棒とを用いて粉末状にしてタンパク質を抽出することにより、各腫瘍試料中のタンパク質２０μｇにおけるＵｓｐ９ｘ活性を評価した。コントロールマウスおよび１５ｍｇ／ｋｇのＧ９で処置されたマウスから摘出した腫瘍におけるＵｓｐ９ｘ活性について、上述のように調べた。この分析の結果として、１５ｍｇ／ｋｇのＧ９で処置されたマウス（図５右側）におけるＵｓｐ９ｘ阻害をコントロールマウス（図５左側）と対比して示す。また、Ｕｓｐ９ｘおよびＵｓｐ９ｘに密接に関連するＤＵＢであるＵｓｐ２４タンパク質における治療効果を示す。Ｕｓｐ９ｘの基質であるＭｃｌ−１に対するＧ９の効果およびカスパーゼの基質であるＰＡＲＰの開裂に対するＧ９の効果も示す。これらの結果から、ＮＳＧマウスのＭＭ１．Ｓ腫瘍において、Ｇ９がＵｓｐ９ｘＤＵＢ活性を抑制し、Ｍｃｌ−１タンパク質レベルを減少させ、アポトーシスを活性化することがわかる。
【０１２５】
Ｇ９は、Ａ３７５黒色腫細胞において、Ｕｓｐ９ｘ活性を阻害する。ＮＳＧマウスのＡ３７５腫瘍の増殖に対するＧ９の効果を調べた。０．１ｍＬのマトリゲル／細胞培養培地（１：１）中のＡ３７５細胞２００万個を、雌のＮＳＧマウス９匹の背部に皮下注入した。腫瘍が測定可能なレベルにまで増殖した後（接種の２週間後）、マウスを３群に分け、０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇのＧ９（上述のように調製）を８日間毎日、ＩＰ注入により投与した。腫瘍の容積（左）および動物の体重（右）は、処置期間を通じて一日おきに測定したものを図６に示す。Ｇ９は、試験を行ったいずれの用量においても、Ａ３７５の腫瘍増殖を抑制し、体重にもわずかに影響を与えた。この実験では、各処置群３匹のマウスについて評価した。各データ点は、マウス３匹における測定値の平均±標準偏差を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔを用いて、ｐ値を計算した。ｐ値が０．０５未満であれば有意と考えられる。
【０１２６】
Ｇ９の安全性についてさらに調べるために、正常な（病変が見られない）ドナー２名の血液から採取したＣＤ３４＋細胞（骨髄性前駆細胞／リンパ前駆細胞）および２つの骨髄腫腫瘍細胞株（ＭＭ１．Ｓ、Ｈ９２９）におけるＧ９のアポトーシス活性を比較した。細胞アポトーシスを、フローサイトメトリーを用いて細胞表面のアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖを検出することによって測定した。細胞を記載された濃度のＧ９で２４時間処理した後、各ドナーから得たサンプルを２回ずつ、計４回測定する２重アッセイを用いて細胞生存の指標であるアネキシン陽性を調べた。４つの測定値の平均±標準偏差を図７に示す。正常なドナー２名から採取したＣＤ３４＋細胞（左）または２つの骨髄腫細胞株（右）を記載された濃度のＧ９で２４時間処理した後、アネキシンＶの染色（フローサイトメトリーにより評価）により細胞生存を測定した。各データ点は、２回ずつアッセイを行い、各Ｇ９濃度において平均±標準偏差として表した２つのサンプルの平均を示す。結果から、骨髄腫腫瘍細胞は、正常なＣＤ３４＋細胞と比較して、アポトーシスに関してＧ９の影響を受けやすいことがわかる。
【０１２７】
Ｕｓｐ９ｘは、多くの腫瘍細胞型において、過剰発現または活性化される。Ｇ９（および０６７）は、Ｕｓｐ９ｘの酵素活性を阻害する。Ｇ９は、腫瘍細胞中のＵｓｐ９ｘを阻害し、過去の文献に記載のＵｓｐ９ｘ阻害剤（ＷＰ１１３０）より効果的である。Ｇ９は、腫瘍を有するマウスの腫瘍においてＵｓｐ９ｘを抑制し、動物の体重の許容可能な変化を伴いながら、腫瘍増殖（骨髄腫、黒色腫）を軽減する。Ｇ９は、正常なＣＤ３４＋細胞におけるアポトーシス誘導よりも、腫瘍（骨髄腫）におけるアポトーシス誘導において、効果が高かった（約１０倍）。
【０１２８】
Ｇ９の抗ウイルス活性
ＲＡＷ細胞、スイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）骨髄由来のマクロファージ、およびＢａｌｂ／ｃ骨髄由来のマクロファージにおいて、Ｇ９のスクリーニングを行い、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、従来の化合物ＷＰ１１３０、および化合物ＶＭ０３０と比較した。結果を図８に示す。これらの結果から、Ｇ９が前記各種マクロファージにおいて、マウスノロウイルスに対する抗ウイルス活性を示すことがわかる。ＶＭ０３０は、
【化２４】
2016537316.tif 000029
の構造を有する。
【０１２９】
同じ化合物を、シンドビスウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞、テュレーンウイルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ細胞、ラクロスウイルスに感染したＢｅ２−ｃ細胞、およびノーウォークウイルスレプリコンを含有する細胞においてスクリーニングした。全ての結果を図９に示す。これらの結果から、Ｇ９が、各種ウイルスに対して軽度から高度の抗ウイルス活性を示すことがわかる。
【０１３０】
黒色腫におけるＵｓｐ５およびＧ９
ＢＲＡＦ変異型黒色腫細胞株（Ａ３７５、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８）およびＢＲＡＦ野生型黒色腫細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ−１４７）において、ＢＲＡＦ変異型細胞においてのみ起こる細胞増殖およびｐＥＲＫ阻害に関する特異的なベムラフェニブ活性を確認した。ベムラフェニブで処理した細胞およびコントロール細胞において、タンパク質ユビキチン化全体を調べ、ｐＥＲＫ阻害がタンパク質ユビキチン化全体の進行に関連していることがわかった。ベムラフェニブに長期にわたって曝露したところ、Ｕｂポリマー（Ｕｂ２−４）の増加と同時に、単量体であるＵｂが減少した。これは、ＤＵＢ阻害細胞またはノックダウン細胞におけるＵｂポリマーの増加に関する過去の報告（Dayal et al., J. Biol. Chem. 2009, 284(8):5030-5041）に一致する。ＤＵＢ活性に対するベムラフェニブの影響の有無を調べるために、活性ＤＵＢを共有結合的にＨＡーＵｂで修飾する不可逆的ＤＵＢ阻害剤を用いて、コントロール細胞および処理した細胞由来の黒色腫細胞溶解液を対象にＤＵＢ活性評価を行った。ＤＵＢ活性は、ＨＡブロット法により評価し、ＨＡ−Ｕｂでの結合的修飾によるＤＵＢ移動度シフトをモニタリングすることにより確認を行った。ベムラフェニブ反応性細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ２８およびＡ３７５）において、ＤＵＢ阻害が検出され、切り出されたタンパク質バンド（データ示さず）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよび直接免疫ブロット法によりＵｓｐ５であると同定されるＤＵＢ（１００ｋＤａ）における変化の一貫性に着目した。ｐ５３の代謝回転を調節することが過去の文献に記載されている１３０ｋＤａのＤＵＢであるＵｓｐ７の活性については、ベムラフェニブによる変化は生じなかった。コントロール細胞とＢＲＡＦノックダウン（ＫＤ）細胞との間においても、ＤＵＢ活性の比較を行った。ＢＲＡＦ  ｓｈＲＮＡにより、ｐＥＲＫレベルおよびＵｓｐ５活性は低下した。ＢＲＡＦ活性化を通じたＤＵＢ調節の有無を確認するために、変異型ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に発現させ、ＤＵＢ活性評価を行い、この評価により、ＢＲＡＦＶ６００Ｅを発現する細胞においてＵｓｐ５活性は向上したことがわかった。これらの結果から、ＢＲＡＦの突然変異または活性化によって、Ｕｓｐ５を含む特定のＤＵＢの活性に変化が生じることが確認できる。
【０１３１】
２つの変異型ＢＲＡＦ黒色腫細胞株および２つの野生型ＢＲＡＦ黒色腫細胞株において、Ｕｓｐ５をノックダウンし、各株に同数の始原細胞を接種した後、細胞の増殖速度を４日間調べた。Ｕｓｐ５のノックダウンにより、ＢＲＡＦ変異型細胞およびＢＲＡＦ野生型細胞における増殖速度はいずれも低下した。細胞周期の解析から、Ｇ２期からＭ期への移行にとってＵｓｐ５が重要であることがわかった。増殖抑制は、Ｕｓｐ５ノックダウン細胞におけるｐ２１誘導と関連がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ３Ｄ増殖環境を部分的に複製しているマトリゲルにＡ３７５を接種した場合、Ｕｓｐ５のノックダウンにより、Ａ３７５のコロニーの数およびサイズはともに＞３倍減少した。Ｕｓｐ５の過剰発現により、黒色腫の増殖速度はコントロール細胞と比較してほぼ２倍になった。
【０１３２】
ＢＲＡＦを介したＤＵＢ活性化がベムラフェニブに対する細胞反応を調節するかどうかを確認するために、コントロール細胞およびＵｓｐ５ノックダウン細胞を記載された期間ベムラフェニブで処理した。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、Ａ３７５細胞において形態学的変化が生じ、ＢＲＡＦ変異型細胞株においてベムラフェニブに対するアポトーシスの反応性（アネキシン陽性）が＞３倍増加した。Ｕｓｐ５が、ｐ５３の２０Ｓプロテアソームへの移行および２０Ｓプロテアソームによる分解を調節することは、過去の文献に記載されている（Dayal et al., J. Biol. Chem. 2009; 284(8):5030-5041）。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、黒色腫細胞パネルにおけるｐ５３タンパク質レベルおよびＦＡＳは増加した。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、ｗ／ｔ  ｐ５３  Ａ３７５細胞においてｐ５３が上方調節され、またｐ５３変異型細胞ＳＫ−Ｍｅｌ２８においてｐ７３が上方調節されることから、Ｕｓｐ５によって両タンパク質を調節できることが示唆される。ｗ／ｔ  ｐ５３発現細胞においても変異型ｐ５３発現細胞においても、Ｕｓｐ５のノックダウンによって、ベムラフェニブにより引き起こされるアポトーシスの発現が早まるか、または程度が高まり、内因性経路および外因性経路の活性化が立証された。
【０１３３】
Ａ３７５コントロール細胞、Ｕｓｐ５ノックダウン（Ｕｓｐ５  ｓｈＲＮＡ）細胞、およびＵｓｐ５過剰発現（Ｕｓｐ５  ＦＬＡＧ）細胞を未処理のままにするか、またはベムラフェニブで処理した後、Ｕｓｐ５の発現、活性、ｐ５３タンパク質レベル、およびアポトーシスについて調べた。Ｕｓｐ５のノックダウンおよび過剰発現によって、Ｕｓｐ５  ＤＵＢ活性およびベムラフェニブを介した該活性の阻害に変化が生じた。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、ｐ５３誘導およびユビキチン化ｐ５３の付加物の蓄積が一貫して引き起こされた。一方、Ｕｓｐ５の過剰発現によって、ｐ５３の含有量が低下した。Ｕｓｐ７活性もまた、いくつかの細胞においてｐ５３レベルを調整するが、ベムラフェニブによる変化は生じなかった。Ｕｓｐ５ノックダウン細胞においてｐ５３レベルが増加すると、ＦＡＳが誘導され、ベムラフェニブ処理後すぐにアポトーシスが発現した。Ｕｓｐ５発現に変化が生じた細胞でのアポトーシスおよびＦＡＳの調節におけるｐ５３誘導の役割を調べるために、Ｕｓｐ５をノックダウンした細胞とＵｓｐ５およびｐ５３を二重にノックダウンした細胞とにおけるアポトーシス活性を比較した。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、ｐ５３、ＦＡＳ、およびＢａｘタンパク質の発現が向上し、ベムラフェニブに反応してＢｉｄ開裂およびＰＡＲＰ開裂も増加した。Ｕｓｐ５／ｐ５３二重ノックダウン細胞においては、Ｕｓｐ５およびｐ５３の活性が阻害され、ベムラフェニブを介した細胞死の活性化においてＵｓｐ５およびｐ５３のいずれもが重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１３４】
ＦＡＳ誘導およびＦＡＳ機能におけるＵｓｐ５の役割を確認するために、コントロール細胞およびＵｓｐ５ノックダウン細胞をＦＡＳ−Ｌで処理し、外因性アポトーシス経路の活性化について調べた。ＦＡＳ−Ｌによって、Ｕｓｐ５のノックダウンにより高度に増幅されたカスパーゼ８、Ｂｉｄ開裂、およびＰＡＲＰ開裂の活性化が制限された。黒色腫の臨床治療に使用されるＦＡＳアポトーシス誘導サイトカインであるＩＦＮ−αで処理した細胞においても、同様の結果が得られた。ＢＲＡＦの阻害によって、Ｕｓｐ５活性が抑制され、ＦＡＳ発現が向上し、アポトーシスが進行し、このような外因性のカスパーゼカスケードによりアポトーシスの抑制が解除される。その可能性を調べるために、長い期間をあけて細胞をベムラフェニブで処理し、ＦＡＳ誘導およびＢａｘ誘導、カスパーゼ８の活性化、Ｂｉｄ開裂およびＰＡＲＰ開裂について調べた。ベムラフェニブ処理によって、タンパク質ユビキチン化、ＦＡＳ誘導およびＢａｘ誘導が早期に進行し（２４時間）、続いて４８〜７２時間後には、カスパーゼ８が活性化し、Ｂｉｄ開裂およびＰＡＲＰ開裂が増加する。ベムラフェニブは、ＳＫ−Ｍｅｌ１９細胞においてＤＲ５レベルを減少させるが、これは先の研究に一致する（例えば、Oh et al., J. Biol. Chem., 2012; 287(1):257-267を参照のこと）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ発現によって、ＤＲ４およびＤＲ５は増加したが、ＦＡＳおよびｐ５３レベルは低下した。Ｕｓｐ５によるＦＡＳの減少は、おそらくｐ５３および他の因子の下方調節を通して、転写レベルで伝達されると考えられる。
【０１３５】
Ｕｓｐ５がＤＮＡの損傷修復において役割を担っていることが近年報告されたため（Nakajima et al., PloS one, 2014; 9(1):e84899を参照のこと）、５ＦＵおよびドキソルビシンのアポトーシス反応に対するＵｓｐ５のノックダウンの効果を調べた。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、主としてｐ５３野生型細胞およびｐ５３変異型細胞におけるカスパーゼ８の活性化が増強され、これによりカスパーゼの活性化が向上した。Ｕｓｐ５はまた、ｐ７３を調節することから、ｐ５３変異型腫瘍のアポトーシス反応において役割を担っている可能性がある（Ozaki et al., Cancer science, 2005; 96(11):729-737を参照のこと）。
【０１３６】
黒色腫におけるＵｓｐ５活性の潜在的な臨床的関連を調べるために、同質遺伝子的なベムラフェニブ感受性Ａ３７５黒色腫細胞およびベムラフェニブ耐性Ａ３７５黒色腫細胞をＧ９で処理した。ベムラフェニブ感受性細胞およびベムラフェニブ耐性細胞に対するＧ９の効果を調べたところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性（ＩＣ５０  １μＭ）は類似していたことがわかった。ベムラフェニブおよびＧ９で処理した細胞におけるＤＵＢ活性について比較したところ、ｐＥＲＫは、感受性細胞および耐性細胞のいずれにおいてもキナーゼ阻害剤によって減少したが、ベムラフェニブは、感受性細胞においてＵｓｐ５活性を抑制する一方、耐性細胞においては抑制しないことがわかった。また、耐性細胞において、ベムラフェニブによるＦＡＳ誘導は起こらなかった。ＷＰ１１３０化合物に関して過去の文献に記載されているように（Kapuria et al., Cancer Res. 2010, 70(22):9265-9276; Bartholomeusz et al., Blood, 2007, 109(8):3470-3478; and Kapuria et al., Cell Signal, 2011, 23(12):2076-2085を参照のこと）、Ｇ９は、Ｕｓｐ５（およびＵｓｐ９ｘ）活性を両細胞型において抑制し、ｐ５３レベルを上昇させ、ｐＳｔａｔ３阻害剤活性を維持した。Ｕｓｐ５のノックダウン（すなわちＧ９）がベムラフェニブ耐性を克服できるかどうかを調べるために、Ｕｓｐ５ノックダウンＡ３７５Ｒ細胞を未処理のままにするか、またはベムラフェニブで（２４時間）処理した後、カスパーゼ活性、ＰＡＲＰ開裂、およびＢｉｄ開裂について調べた。Ｕｓｐ５のノックダウンによって、ｐ５３の蓄積が増加し、ＦＡＳレベルが向上し、ベムラフェニブに反応してアポトーシスが活性化した。ＭＥＫ阻害剤で処理したＡ３７５Ｒ  Ｕｓｐ５ノックダウン細胞においても、同様の結果が得られた。さらに、Ｕｓｐ５のノックダウンによって、Ａ３７５細胞におけるベムラフェニブＩＣ５０濃度が約２分の１に低下した。Ａ３７５Ｒ細胞において、Ｇ９は、ｐＥＲＫおよびｐＳｔａｔ３を減少させ、Ｇ９によって生じるＵｓｐ９ｘ阻害に関与するＮＯＸＡレベルを上昇させた。Ｇ９をベムラフェニブまたは５ＦＵと組み合せて使用したところ、Ｇ９により、カスパーゼ８およびガスパーゼ３が活性化するとともに、ＰＡＲＰ開裂およびＢｉｄ開裂が誘導された。
【０１３７】
皮下移植物としてＡ３７５腫瘍を増殖させたＮＳＧマウスを３群に分け、ビヒクルコントロール（ＰＥＧ３００／ＤＭＳＯ）または７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇのＧ９をマウスにＩＰ注入により毎日投与した。腫瘍増殖、動物の体重、行動、および運動性を処置期間中モニタリングした。７．５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのいずれの投与も、腫瘍増殖を完全に抑制した。一方、コントロールマウスにおいては、処置８日目までに全身腫瘍組織量が最大に達した。Ｇ９注入を停止したところ、腫瘍増殖は、Ｇ９注入停止の１０日後にコントロールマウスのレベルに近づいた。体重減少については、コントロールマウスとＧ９で処理したマウスとの間に顕著な差はなく、コントロールマウスにおいてもＧ９処理マウスにおいても、行動や運動性の変化は見られなかった。これらの結果から、Ｇ９は、黒色腫に対する単剤療法として耐容性が高くかつ効果的であることが示唆される。
【図１】
2016537316.tif 000036
【図２】
2016537316.tif 000037
【図３】
2016537316.tif 000038
【図５】
2016537316.tif 000039
【図６】
2016537316.tif 000040
【図７】
2016537316.tif 000041
【図８】
2016537316.tif 000042
【図９】
2016537316.tif 000043
【図１０】
2016537316.tif 000044
【図４】
2016537316.tif 000045
【国際調査報告】
2016537316.tif 000046
2016537316.tif 000047
2016537316.tif 000048