(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９３の１９−３４２の断片、配列番号９６の７−１１４の断片をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９７をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９８をコードするいずれかのヌクレオチド配列、及びこれらの相補配列からなる群から選択され、ＨＳＥＲＶ−９配列を除くヌクレオチド配列を含む、単離または精製された状態の核酸物質。
【請求項２】
配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９３の１９−３４２の断片、配列番号９６の７−１１４の断片をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９７をコードするいずれかのヌクレオチド配列、配列番号９８をコードするいずれかのヌクレオチド配列、及びこれらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の核酸物質。
【請求項３】
配列番号１００ないし配列番号１１１からなる群から選択された配列を含む、多発性硬化症または慢性関節リウマチにかかるウイルス性物質のＲＮＡまたはＤＮＡの重合による増幅用プライマー。
【請求項４】
請求項１または２に規定されたヌクレオチド配列に属するオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号９５、配列番号９６、配列番号９６の７−１１４の断片、配列番号９７、及び配列番号９８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のいずれかのポリペプチドから選択されることを特徴とする、ＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者、及び／またはＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化された患者の血清から認識される抗原性ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１７３、１７４、１７５、１８０、１８１、及び１８２からなる群から選択されるペプチド配列を有する、請求項４または６に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
多発性硬化症（ＭＳ）は、未だ原因が不明である中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性の疾患である。
多発性硬化症（ＭＳ）は、ヨーロッパ及び北米で１００，０００人につき２０乃至２００人の範囲の罹患率で若年の成人に、最も多くみられる神経系疾患である。この疾患は、再発／一時的な症状の軽減、又は慢性的な進行性過程によりしばしば重度の障害となることにより臨床学的に特徴づけられている。現時点での理解では、ＭＳは自己免疫に関連し、遺伝的な背景が大きな影響を及ぼし、また“感染性”の因子が関るかもしれないことが示唆されている。実際に、多くのウイルスが可能な候補として挙げられているが、その何れも、病原学的な役割を果たしているものとは示されてはいない。
数多くの研究が、本疾患のウイルス性病因についての仮説を支持しているが、既知のウイルスの何れについても、求めている原因であるとの証明はされていない。Ｅ．Ｎｏｒｒｂｙ（１）及びＲ．Ｔ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（２）により、ＭＳにおいて数年もの間探求されてきたウイルスについてのレビューが編集されている。
ヒトにおける病理学的レトロウイルス（ＨＴＬＶ及びＨＩＶ）が発見されて、免疫系を損なわせたり、中枢神経系の炎症、及び／又は変性を惹起するその能力について多大な興味が寄せられるようになった。ＨＴＬＶ−１の場合、これがヒトにおける慢性の炎症性脱髄性疾患と関連している（４８）ことから、ＨＴＬＶ−１様のレトロウイルスをＭＳ患者で発見しようとする研究が盛んに行われた。しかしながら、初期の主張にも関らず、ＨＴＬＶ−１又はＨＴＬＶ−様レトロウイルスの存在は確認されなかった。
最近になって、既知のヒトレトロウイルスとは異なったレトロウイルスが、ＭＳ患者より単離された（３，４，５）。
１９８９年に、これらの著者らは、ＭＳ患者の脳脊髄液より得た軟髄膜細胞（ＬＭ７）の培養により、逆転写酵素（ＲＴ）活性と関連する細胞外ウイルス粒子の産生について記述している。この後、同様の発見が一連のＭＳ患者からの単球の培養についてもなされている。対照の個体からはウイルス粒子もウイルス性ＲＴ活性も検出されなかった。更に、これらの著者らは、ＬＭ７ウイルスを未感染の軟髄膜細胞に試験管内で感染させることに成功した（２６）。”ＬＭ７”レトロウイルスを分子的に特徴付けることは、ＭＳにおけるその役割を更に評価するための前提であった。継続的な産生を行うレトロウイルスの培養がないこと、そして少数の一過性培養において発現レベルが低いことに起因して、かなりの困難が発生した。本願に記載する戦略では、細胞性ＲＮＡ、及びヒトＤＮＡの汚染による内在性因子の非特異的な検出を避けるため、細胞外ウイルス粒子由来のＲＮＡに焦点を当てた。数人のＭＳ患者に由来する細胞培養により産生されるウイルス粒子に関連した特異的レトロウイルス配列が同定された。この新規レトロウイルスゲノムの全配列は、細胞外ウイルス粒子由来のＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲにより、現在決定中である。以前は”ＬＭ７ウイルス”と呼ばれていたレトロウイルスは、オンコウイルスに対応していて、現在はＭＳＲＶ（多発性硬化症随伴レトロウイルス）と命名されている。
これらの著者らはまた、このレトロウイルスは試験管内で伝播することが可能であり、又ＭＳ患者はこのウイルスによる脳脊髄細胞の感染に関連したタンパク質を認識できる抗体を産生でき、更には後者の発現は数種類のヘルペスウイルス（６）の極初期遺伝子により強く刺激されることを示すことに成功している。
これらの結果は全て、少なくとも一つの未知のウイルス、又はＨ．Ｐｅｒｒｏｎ（３）により公表されている方法により検出され、”ＬＭ７様ＲＴ”活性と認定される逆転写活性を有するウイルスについての、ＭＳにおける役割を示している。（３）として示される公表の内容は、参照することにより本願に取り込む。
最近、本出願人の研究により、二人の異なるＭＳ患者に由来した天然の単離株で感染させた二つの連続細胞株が、資料ＷＯ−Ａ−９３／２０１８８に記載される培養方法によって得ることが可能になったが、この資料の内容は参照することにより本願に取り込む。これらの二つの細胞株は、ヒト脈絡叢細胞に由来するものであり、ＬＭ７ＰＣ及びＰＬＩ−２と命名され、ブタペスト条約の規定に従ってそれぞれ１９９２年７月２２日、１９９３年１月８日に９２０７２２０１、及び９３９０１０８１７の番号の下ＥＣＡＣＣに寄託された。更に、ＬＭ７様ＲＴ活性を有するウイルス単離株もまた、”株（strains）”という総括的名称の下、ＥＣＡＣＣに寄託された。この”株”、すなわちＰＬＩ−２株に保有される単離株であって、ＰＯＬ−２と命名されるものは、１９９２年７月２２日にＶ９２０７２２０２の番号の下、ＥＣＡＣＣに寄託された。”株”、すなわちＬＭ７ＰＣ株に保有される単離株であって、ＭＳ７ＰＧと命名されるものは、１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１６の番号の下、ＥＣＡＣＣに寄託された。
上記した培養物及び単離株をもって始め、生物学的及び形態学的基準による特徴付けを行った後の次のステップは、これらの培養物中で産生されるウイルス粒子に関連した核酸物質の特徴付けに努めることである。
感染及び／又はウイルス性発現に関連したエピトープに対する免疫反応を検出するため、ゲノムについてすでに特徴付けられている部分を使用して、ウイルスゲノムの分子的検出用の試験方法を開発し、又、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を使用して免疫血清学的試験方法を開発した。
ＭＳと以下に引用する特許中で同定された配列の発現との間の関連が、上記のツールによって確認された。しかしながら、本出願人により発見されたウイルス系は複雑なレトロウイルス系に関連するものである。事実上は、見いだそうとする配列であって、ＭＳ患者の異なる培養細胞により産生される細胞外ウイルス粒子にカプシド形成されているものによって、感染性ウイルス粒子を産生する”野生型”のレトロウイルスゲノムに関連するが異なっているレトロウイルスゲノムが一緒にカプシド形成されることが明らかに示される。この現象は、複製性のレトロウイルスと、内在性のレトロウイルスで同じ科に属するものとの間において見られている。内在性レトロウイルスに注目することは我々の発見との関係においては非常に重要であるが、これはＭＳＲＶ−１の場合、ＭＳＲＶ−１ゲノムに対して相同性のある配列を有している内在性レトロウイルスが、通常のヒトＤＮＡ中に存在することが判明しているからである。そのゲノムの全て又は一部においてＭＳＲＶ−１に関連している内在性レトロウイルスの因子（ＥＲＶ）が存在することは、ヒトの細胞中におけるＭＳＲＶ−１レトロウイルスの発現物が、密接に関連した内在性配列とインタラクトできるという事実を説明する。これらのインタラクションは、病原性及び／又は感染性の内在性レトロウイルスの場合や（例えば、数種のマウス白血病ウイルスのエコトロピック株）、そのヌクレオチド配列の一部又は全部が宿主動物のゲノム中においてＥＲＶの形態で見られる外因性レトロウイルスの場合（例えば、ミルクを経由して伝播する、マウス外因性乳腺癌ウイルス）に見られる。これらのインタラクションは、主に
（ｉ）複製性レトロウイルスによるＥＲＶのトランス活性化又は同時活性化、
（ｉｉ）及び、時に伝播性を有し、時に自身の病原性を有する複製性株の発現により産生されるレトロウイルス粒子内で起る、ＥＲＶに関連するＲＮＡ、又は適合性カプシド形成配列を単純に有するＥＲＶ（又は細胞性のＲＮＡでさえ）の、”非正統的な”カプシド形成、
（ｉｉｉ）一緒にカプシド形成されたゲノム間での多少の実質的組換え、特に逆転写段階におけるものにおいては、時に伝播性を有し、時にそれ自身の病原性を有するハイブリッドゲノムが形成される
ことからなる。
よって、
（ｉ）精製されたウイルス粒子中にＭＳＲＶ−１に関連する異なる配列が発見され、
（ｉｉ）ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのゲノムの異なる領域の分子的な分析が行われるべきであり、これはＭＳＲＶ−１の感染及び／又は発現により産生されて一緒にカプシド形成される、干渉性及び／又は組換え配列について系統的に行われるべきであり；更には複数のクローンは、レトロウイルスの複製、並びに鋳型の誤り及び／又は逆転写酵素の転写における誤りによって産生される欠損配列部を有するかもしれなく；
（ｉｉｉ）発現クローン中の不可変領域の同定、発現したクローンのうちの一部、若しくはたった一つにより産生されるかもしれない抗原性及び病原性ポリペプチドにより最適化することが可能である全体的な診断用検出手段が、同じレトロウイルスゲノム領域に関連する一連の配列により提供されるが、これらの条件下ではある遺伝子の領域で発現しているクローンについての前記の系統的な分析により、この領域におけるＭＳＲＶ−１ゲノムの変異の頻度及び／又は組換え頻度が評価され、適用、特には診断的適用に最適の配列が定義される；
（ｉｖ）ＭＳＲＶ−１のようなレトロウイルスにより引き起こされる病理は、その発現及びその結果産生されるタンパク質又はペプチドの直接的な影響によるものかもしれないが、関連若しくは非相同的ゲノムの活性化、カプシド形成又は組換え、及びその結果産生されるタンパク質又はペプチドの影響かもしれない；よってＭＳＲＶ−１による発現及び／又は感染に関連するこれらのゲノムは、このウイルスの潜在的病原性の肝要な部分であって、それ故に診断用検出手段及び特別な治療用の標的をなす。同様に、問題となっている病原性の原因であるこれらのインタラクションに関連するか又はコファクターであるいかなる因子、例えばＦＲ−２，７１６，１９８に公表された特許出願に記載されるＭＳＲＶ−２又は遺伝子毒性因子は、特にＭＳについての診断、予防、治療的観察、及び／又は統合された治療にとって、全体的且つ非常に効果的な戦略の開発に関与するかもしれないが、同じ因子に関連するこれ以外の疾患についても同様である。
この関係では、平行した発見が別の自己免疫疾患、即ちリウマチ性関節炎（RA）においてなされたが、これは番号９５／０２９６０の下に出願された、フランス特許出願に記載されている。この発見は、出願人がＭＳについて行った研究で使用したのと同様の方法論的アプローチにより、ＭＳにおいてＭＳＲＶ−１について記述される配列を共有した、ＲＡにおいて発現されるレトロウイルスを同定することと、ＭＳにおいても記述される関連ＭＳＲＶ−２配列の共存をも同定することが可能であったことを示している。ＭＳＲＶ−１に関しては、ＭＳ及びＲＡにおいて共通して検出される配列はｐｏｌ及びｇａｇ遺伝子に関する。現時点での知識においては、これら二つの疾患において発現されているＭＳＲＶ−１株に関して記載されてるｇａｇ及びｐｏｌ配列を関連付けることが可能である。
本特許出願は、以下のフランス特許出願によりすでに保護されているものに追加される多様な結果に関するものである：
・番号２，６８９，５１９の下に発行された、１９９２年４月３日の、番号９２／０４３２２．
・番号２，６８９，５２１の下に発行された、１９９２年１１月３日の番号９２／１３４４７．
・番号２，６８９，５２０の下に発行された、１９９２年１１月３日の番号９２／１３４４３．
・番号２，７１５，９３６の下に発行された、１９９４年２月４日の番号９４／０１５２９．
・番号２，７１５，９３９の下に発行された、１９９４年２月４日の番号９４／０１５３１．
・番号２，７１５，９３６の下に発行された、１９９４年２月４日の番号９４／０１５３０．
・番号２，７１５，９３７の下に発行された、１９９４年２月４日の番号９４／０１５３２．
・番号２，７２７，４２８の下に発行された、１９９４年１１月２４日の番号９４／１４３２２．及び
・番号２，７２８，５８５の下に発行された、１９９４年１２月２３日の番号９４／１５８１０．
本発明は第一に、単離、又は精製されたウイルス性物質に関し、これは異なる方法で認識し、又は特徴付けすることが可能である：
−そのゲノムは以下の配列群、即ち配列番号４６，配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号８９、及びこれらの相補的配列及びこれらと等価な配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を具備するものであり、特に、何れかの連続する１００の近接モノマーについては、上記の配列群、即ち配列番号４６，配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号８９のそれぞれと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を示し、又これらに対して相補的な配列を示すヌクレオチド配列を具備する。
−ｅｎｖ、及びｐｏｌ遺伝子並びにｇａｇ遺伝子の一部を具備するそのゲノムの領域は、配列番号１の配列と同一又は等価な配列を有するサブ領域を除き、連続する少なくとも３０の近接アミノ酸のいかなるものに対しても、以下の配列群、即ち配列番号４６，配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号８９からなる群より選択されるいかなるヌクレオチド配列によりコードされるペプチド配列に対しても少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする。
−ｐｏｌ遺伝子は、配列番号５７又は配列番号９３であって配列番号１を除くものに対して、一部又は全部が同一又は等価であるヌクレオチド配列を具備する。
−ｇａｇ遺伝子は、配列番号８８に一部又は全部が同一又は等価であるヌクレオチド配列を具備する。
上述したように本発明によれば、上述のように定義されるウイルス性物質は、ＭＳと関連している。又、ＭＳＲＶ−１のｐｏｌ又はｇａｇ遺伝子について参照することにより定義されるように、特には配列番号５１，５６，５７，５９，６０，６１，８８，８９，９３，１６９，１７０，１７１，１７２，１７６，１７７，１７８，及び１７９の配列については、このウイルス性物質はＲＡに関連している。
本発明は更に、以下のうち少なくとも一の定義を有し、単離又は精製された状態の核酸物質に関する：
−配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、これらに相補的な配列、及びこれらに等価な配列を含む群より選択されるヌクレオチド配列を具備する核酸物質であって、特に何れかの連続する１００の近接モノマーについては、ＨＳＥＲＶ−９（又はＥＲＶ−９）を除く、上記した配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９の配列、及びこれらに相補的な配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の相同性を示すヌクレオチド配列もの；有利には、上記核酸物質の核酸配列は、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、これらに相補的な配列、及びこれらに等価な配列を含む群より選択され、特には何れかの連続する１００の近接モノマーについては、上記した配列群、即ち配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、及びこれらに相補的な配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するものから選択される；
−単離又は精製された状態の核酸物質であって、いずれかの連続する少なくとも３０の近接アミノ酸に対しても、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、及びこれらに相補的な配列を含む群より選択される何れかのヌクレオチド配列によりコードされるペプチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する、何れかのポリペプチドをコードするもの；
−レトロウイルスタイプの、単離又は精製された状態にある核酸物質であって、多発性硬化症、又はリウマチ性関節炎に関連する単離されたレトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の少なくとも一部について同じか又は同等のヌクレオチド配列を具備するもの；有利には、当該ヌクレオチド配列は、当該ｐｏｌ遺伝子の少なくとも一部に対して８０％同等であるものである；
−アミノ酸領域ＬＰＱＧ−ＹＸＤＤの間に含まれる酵素部位を有する逆転写酵素をコードした単離ウイルスのｐｏｌ遺伝子（gen）の少なくとも一部と同じか同等であるヌクレオチド配列を具備し、ＨＳＥＲＶ−９と０．０６３±０．１、好ましくは０．０６３±０．０５の系統学的距離（phylogenic distance）を有する核酸物質；上記系統学的距離は、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（商標）ソフトウェア（ＩＮＴＥＬＬＩＧＥＮＥＴＩＣＳ）のＵＰＭＧツリーオプションによる参照用配列を基にして計算される；
酵素部位により、当該酵素の特異的活性を与えるアミノ酸領域について理解することができる。
本発明はまた、以下のものを含む群より選択されるヌクレオチド配列をそれぞれが具備する、異なったヌクレオチド断片に関する：
（ａ）ＭＳＲＶ−１ウイルスのｐｏｌ遺伝子の部分及び全ゲノム配列全て（但し、配列番号１により定義されるヌクレオチド断片の全配列は除く）；
（ｂ）ＭＳＲＶ−１ウイルスのｅｎｖ遺伝子の部分及び全ゲノム配列全て；
（ｃ）ＭＳＲＶ−１のｇａｇ遺伝子の部分ゲノム配列全て；
（ｄ）ＭＳＲＶ−１ウイルスのｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子と重なるゲノム配列と、ｐｏｌ遺伝子及びｇａｇ配列遺伝子と重なるゲノム配列との全て；
（ｅ）クローンＦＢｄ３（配列番号４６）、クローンｔ  ｐｏｌ（配列番号５１）、クローンＪＬＢｃ１（配列番号５２）、クローンＪＬＢｃ２（配列番号５３）及びクローンＧＭ３（配列番号５６）、クローンＦＢｄ１３（配列番号５８）、クローンＬＢ１９（配列番号５９）、クローンＬＴＲＧＡＧ１２（配列番号６０）、クローンＦＰ６（配列番号６１）、クローンＧ＋Ｅ＋Ａ（配列番号８９）を含むが、配列番号１に定義される配列と同等又は該配列中のものは除く群より選択したクローンについての部分及び全部についての配列全て、；
（ｆ）該ゲノム配列に対して相補的な配列；
（ｇ）上記配列（ａ）乃至（ｅ）と同等の配列、特にいずれかの連続した１００の近接モノマーについても、上記配列（ａ）乃至（ｄ）に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列；
但しこのヌクレオチド断片は、ＬＡ  ＭＡＮＴＩＡら（１８）により記載される配列ＥＲＶ−９を具備するものでもなく、これよりなるものでもない。
部分又は全部のゲノム配列とは、一緒のカプシド形成若しくは共発現により関連した全ての配列、又は組換え配列を含む。
好ましくはそのような断片は以下のいずれかを具備している：
−ＭＳＲＶ−１のｐｏｌ遺伝子のゲノム配列の一部若しくは全部に対して同一のヌクレオチド配列（但し配列番号１に定義されるヌクレオチド断片の全配列を除く）か、又は当該ゲノム配列の一部若しくは全部に対して同等のいかなる配列に対しても同一であるもの、特に後者に対して相同であるもの；
−或いは、ＭＳＲＶ−１ウイルスのｅｎｖ遺伝子のゲノム配列の一部又は全部と同一のヌクレオチド配列、又は当該ヌクレオチド配列に対して相補的な配列に対して同一のヌクレオチド配列、又は当該ヌクレオチド配列に対して等価な配列に対して同一であるヌクレオチド配列、特に後者に対して相同性のあるもの。
本発明は特に、以下を含む群より選択されたヌクレオチド配列に対して一部が、又は全部が同一の、ヌクレオチドコード配列を具備するヌクレオチド断片に関する：
−配列番号４０、配列番号６２、又は配列番号８９により定義される配列；
−配列番号４０、配列番号６２、又は配列番号８９に相補的な配列；
−配列番号４０、配列番号６２、又は配列番号８９と等価、特には相同的な配列；
−配列番号３９、配列番号６３、又は配列番号９０で定義されるペプチド配列の全部又は一部をコードする配列；
−配列番号３９、配列番号６３又は配列番号９０と等価、特には相同的であるペプチド配列の全部又は一部をコードする配列であって、このペプチド配列はＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者、又は体内でＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化された患者の血清によって認識されることが可能であるもの。
本発明はまた、以下に定めるものを少なくとも一つ有するヌクレオチド断片（断片Ｉと呼ぶ）に関する：
−配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、これらの相補的配列、及びこれらと等価な配列、特には上記配列及びその相補的配列に関して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の相同性を、いかなる連続する１００の近接モノマーに対しても示すヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を具備するヌクレオチド断片（但し、当該群からは配列番号１を除く）であって、当該ヌクレオチド断片は、ＨＳＥＲＶ−９（ＥＲＶ−９）の配列を具備せず、また当該配列からなることもなく；好ましくは当該断片の当該配列は、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、その相補的配列、及びそれと等価な配列、特に、いかなる連続する１００の近接モノマーについても、上記配列、及びその相補的配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の相同性を示すヌクレオチド配列
からなる群より選択される；
−以下を含む群より選択されるヌクレオチド配列に一部が又は全部が同一であるヌクレオチドコード配列を具備するヌクレオチド断片：
配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９；上記と相補的な配列；及び上記と等価な配列、特に、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９と相同的なもの；
配列番号９５、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２により定義されるペプチド配列の全て又は一部をコードする配列；
以下の配列と等価、特には相同的であるペプチド配列の全部又は一部をコードする配列：
配列番号９５、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２；これらはＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者、又は体内でＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化した患者の血清によって認識されうるものである。
本発明はまた、ＭＳ及び／又はリウマチ性関節炎（ＲＡ）に関連するウイルスを検出するためのいかなる核酸プローブにも関するが、これは当該病原体のゲノムに属するかゲノム内に存在する、上記で定義したいかなる断片に対しても特異的にハイブリダイズすることが可能である。本発明は、更に、ＲＡに関連する病原体及び／又は感染性因子の検出用のいかなる核酸プローブに関するが、これはｐｏｌ及びｇａｇ遺伝子との関係により定義される上記のいかなる断片、特には配列番号の４０、５１、５６、５９、６０、６１、６２、８９、並びに配列番号の３９、６３、及び９０に関して特異的にハイブリダイズすることが可能である。
本発明は更に、ＭＳ及び／又はＲＡに関連するウイルス性物質のＲＮＡ又はＤＮＡをポリメライゼーションすることによって増幅するためのプライマーに関し、これは前述のごとく定義されるようないかなる断片のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一であるか又は等価であるヌクレオチド配列であって、特にはいかなる連続する少なくとも１０の近接モノマー、好ましくは１５の近接モノマー、より好ましくは１８の近接モノマー、最も好ましくは２０の近接モノマーに対して、上記断片の上記部分と少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を具備する。そのようなプライマーのヌクレオチド配列は好ましくは、以下を含む群から選択される配列の何れか一つと同一である：配列番号４７乃至配列番号５０、配列番号５５、配列番号６４、配列番号８６、配列番号９９乃至配列番号１１１、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６。
一般的に言って、本発明はまた、いかなるＲＮＡ又はＤＮＡ、特には複製ベクターを含むものであって、これは上記したように定義されるようなウイルス性物質のゲノム断片、又は上記したように定義されるヌクレオチド断片を具備する。
本発明はまた、上記したように定義されるヌクレオチド断片に属する、何れかのオープンリーディングフレームによってコードされる、異なったペプチド、特に例えばＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者及び／又は体内でＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化した患者にの血清により認識される抗原決定基を形成するかまたは具備する何れかのオリゴペプチドのような何れかのペプチドに関する。好ましくは、このポリペプチドは抗原性があり、５’−３’方向において配列番号１の１８１位のヌクレオチドで始まり、３３０位で終わるオープンリーディングフレームによってコードされるものである。
本発明はまた、以下のポリペプチドを包含するものである：
ａ）
−上に定義したヌクレオチド断片である断片Ｉに属する何れかのオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチド；
−配列番号９３の５’−３’方向において１８位のヌクレオチドと２３０４位のヌクレオチドとの間に含まれているオープンリーディングフレームによってコードされることを特徴とするポリペプチド；
−配列番号９５と一部または全部が同一の配列を具備するペプチド配列を有するポリペプチド；
ｂ）
−配列番号９６と同一又は等価の配列を具備するペプチドを有する、組換えまたは合成のポリペプチド、特にはタンパク分解性の活性からなる酵素活性を呈するもの；
−配列番号９３の５’−３’方向において１８位のヌクレオチドで始まり、３４０位のヌクレオチドで終わるオープンリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、組換えまたは合成のポリペプチド；
−ｂ）で定義されるポリペプチドのタンパク分解活性に対して阻害活性を有するポリペプチド；
ｃ）
−配列番号９７と同一または等価である配列を具備するペプチド配列を有する、組換えまたは合成のポリペプチド；特には逆転写活性を呈するもの；
−配列番号９８と同一または等価である配列を具備するペプチド配列を有するポリペプチド；特にはリボヌクレアーゼ活性を呈するもの；
−配列番号９３の５’−３’方向において３４１位のヌクレオチドで始まり、２３０４位のヌクレオチドで終わるオープンリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、組換えまたは合成のポリペプチド；
−配列番号９３の５’−３’方向において１８５８位のヌクレオチドで始まり、２３０４位のヌクレオチドで終わるオープンリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、組換えまたは合成のポリペプチド；
−ｃ）により定義されるポリペプチドの逆転写酵素活性、またはｃ）により定義されるポリペプチドのリボヌクレアーゼＨ活性について阻害活性を有するポリペプチド。
本発明は特に、ＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者、または体内でＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化した患者の血清によって認識される抗原性ポリペプチドに関するが、このペプチド配列は、配列番号３９、配列番号６３、配列番号８７、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２によって定義される配列と一部または全部が同一または等価であり、このような配列は例えば、配列番号４１乃至配列番号４４、配列番号６３、及び配列番号８７を含む群より選択される何れかの配列と同一である。
本発明はまた、ＭＳＲＶ−１ウイルスに向けられたモノ−またはポリ−クローナル抗体を提案し、これらは人体または動物の体の、上記のように定義される抗原性ポリペプチドからなる免疫原性因子に対する免疫反応によって得られる。
次に本発明は以下のものに関する：
−試薬であってＭＳＲＶ−１ウイルスの検出用のもの、または後者への暴露の検出のための試薬であり、本発明のプローブ、ポリペプチド、特に上記で定義したような抗原性ペプチド、または抗−リガンド、特に上記ポリペプチドに対する抗体からなる群より選択される少なくとも一の反応性物質を具備するもの；
−一又はそれ以上のペプチド、特に上記で定義したような抗原性ペプチド、または一又はそれ以上の抗−リガンド、特に上記で考察したペプチドに対する抗体を具備する、全ての診断用、予防用、又は治療用組成物；好ましい例としてはワクチン組成物。
本発明はまた、診断用、予防用、又は治療用組成物の何れかに関するものであり、特にＭＳ又はＲＡに関連する少なくとも一のウイルスの発現、及び／又は当該ウイルスのタンパク質の酵素活性を阻害する為のものであって、上記で定義したようなヌクレオチド断片、又はポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドであって上記断片の配列と一部が同一であるもの（但し配列番号１のヌクレオチド配列を有する断片のものを除く）を具備する。同様に、本発明は診断用、予防用、又は治療用組成物の何れかに関するものであり、特にＲＡに関連する少なくとも一の病原性及び／又は感染性因子の発現を阻害するものであって、ｐｏｌ及びｇａｇ遺伝子、そして特には配列番号の４０、５１、５６、５９、６０、６１、６２及び８９について参照することにより上記で定義されるヌクレオチド断片を具備するものである。
本発明によれば、これらの同じ断片又はポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドは生物試料中における、それぞれＭＳ又はＲＡに関連する病原性及び／又は感染性因子を適切な過程又は方法により検出するための全ての適切な組成物に関与することができる。そのような過程においては、当該病原性及び／又は感染性因子に属するか又は由来すると推定されるＲＮＡ及び／又はＤＮＡ、及び／又はこれらの相補的ＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、上記したような組成物と接触させる。
本発明はまた、生物試料中において上記したような病原性及び／又は感染性因子の存在又は当該因子への暴露を検出するためのいかなる方法にも関するものであり、この方法は試料をペプチド、特には上記で定義したような抗原性ペプチド、又は抗−リガンド、特には上記で定義したような、このペプチドに対する抗体に接触させることによって行われる。
実際に、例として挙げると、ＭＳＲＶ−１ウイルスの検出用装置は、上記で定義されるような試薬であって免疫学的に当該試薬と適合する固体支持体によって支持されるものと、例えば血液や脳脊髄液試料のような、生物試料であって抗−ＭＳＲＶ−１抗体を含む可能性のあるものを、可能な免疫学的反応を許容する条件下で、当該試料と接触させる手段とを具備するが、前者の項目は当該試薬と形成した免疫複合体を検出する手段を伴っている。
最後に本発明はまた、例えば血液や脳脊髄液のような生物試料中の抗−ＭＳＲＶ−１抗体の検出に関するものであり、これによればこの試料を、上記で定義したような試薬であって抗体からなるものと、可能な免疫学的反応を許容する条件下で接触させて、次いでそれによって形成される当該試料の免疫複合体を検出するものである。
本発明を詳細に記載する前に、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される種々の用語について以下に定義する：
−株又は単離体とは、例えばウイルス、及び／又は細菌、及び／又は寄生虫を含む、感染性及び／又は病原性の生物学的画分のいかなるものであって、病原性及び／又は抗原性の能力を示し、培養物又は生きた状態の宿主中に宿るものであると理解される；例としては上記の定義によるウイルス株には、例えば病原性の原生生物のような重感染性因子を含むことが可能である、
−本明細書中で使用する”ＭＳＲＶ”という用語は、ＭＳに関するいかなる病原性及び／又は感染性の因子をも意味し、特にウイルス種、当該ウイルス種の弱毒化株、又は欠損干渉性粒子、又は一緒にカプシド形成されたゲノムを含む粒子、或いは当該種に由来し、ＭＳＲＶ−１ゲノムの一部と組換えを起したゲノムを意味する。ウイルス、及び特にはＲＮＡを含んだウイルスは特に相対的に高い比率の自発的突然変異に由来する多様性を有することが知られていて（７）、これは以下に定義する等価の観念においても考慮される、
−ヒトのウイルスとは、ヒトに感染することが可能であるか、又はヒトに宿ることが可能であるウイルスを意味する、
−天然の又は誘導性の変異及び／又は組換えの全てであって、本発明を実施する際に遭遇する可能性のあるものの観点より、後者の主題で上記及び特許請求の範囲に定義されものは、以下に定義する異なった生物試料の等価物又は誘導体、特には相同性のヌクレオチド配列又はペプチド配列を含むものとして表現されている、
−本発明におけるウイルス、又は病原性及び／又は感染性因子についての変異体は、
当該ウイルス、及び／又は当該病原性及び／又は感染性因子の、対応する少なくとも一の抗原に対して向けられた少なくとも一の対応した抗体によって認識される少なくとも一の抗原、及び／又は
ゲノムであってそのいかなる一部もが、当該ウイルス、及び／又は病原性及び／又は感染性因子に特異的な少なくとも一のハイブリダイゼーションプローブ及び／又は少なくとも一のヌクレオチド増幅用プライマーによって、当業者らに良く知られた特定のハイブリダイゼーション条件下で検出することが可能なものであり、例えばＭＳＲＶ−１の場合には、以下より選択されるヌクレオチド配列を有するプライマー、及びプローブによって検出されるもの：
配列番号２０乃至２４、配列番号２６、配列番号１６乃至１９、配列番号３１乃至３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号４５、及びこれらの相補的配列；
を具備する、
−本発明によれば、ヌクレオチド断片又はオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドは、モノマーの配列、又は生体高分子であり、天然の核酸についての情報的配列により特徴付けられ、予め決定しておいた条件下で他のいかなるヌクレオチド断片ともハイブリダイズすることが可能なものであるが、これは異なる化学構造のモノマーを含むように配列し、天然の核酸分子に由来するか、及び／又は遺伝的組換え及び／又は化学合成によって得ることが可能である；ヌクレオチド断片は本発明で考察したＭＳＲＶ−１ウイルスのゲノム断片、特にはこのウイルスの遺伝子、例えば当該ウイルスの場合にはｐｏｌやｅｎｖと同一であってもよい、
−故にモノマーは、構成要素が糖、リン酸基、及び窒素性塩基である天然の核酸のヌクレオチドであってもよい；ＲＮＡにおては当該糖はリボースであり、ＤＮＡにおいては当該糖は２−デオキシリボースである；核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであるかによって、窒素性塩基はアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される；又は当該ヌクレオチドは、３つの構成要素の少なくとも一つにおいて修飾されても良い；例としては、修飾は塩基で生じていてもよく、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、５−（ジメチルアミノ）デオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、及び他のいかなる修飾塩基等であってハイブリダイゼーションを促進するもののような修飾塩基を生成する；糖においては、修飾は少なくとも一のデオキシリボースをポリアミドで置換することからなり（８）、リン酸基においては、修飾は、特に二リン酸塩、アルキル−及びアリルリン酸塩、並びにホスホロチオエートエステルから選択されるエステルによる置換からなっていてもよい、
−”情報的配列”とは、順序が決められた連続するモノマーであって、その化学的性質及び参照する方向における順序が制定されているものか、或いは天然の核酸のものと同じ質の機能的情報の項目を意味するものと理解される、
−ハイブリダイゼーションとは、適切な実施条件下において、十分な相補性を有する二つのヌクレオチド配列が、特に二重又は三重の、好ましくはら旋形態の複合体構造形成するように対合する間の方法を意味するものと理解される、
−プローブは、化学的に合成されるか、又はより長いヌクレオチド断片を消化又は酵素的に開裂させて得られるヌクレオチド断片を具備し、少なくとも６のモノマー、有利には１０乃至１０００モノマー、好ましくは１０乃至３０モノマー及びより好ましくは１８乃至３０からなり、更に特定の条件下では特異的にハイブリダイゼーションする特性を有している；１０未満のモノマーを有するプローブが好ましいが、好ましくは１５未満のモノマーのものは単独では使用されず、他の同等に短いプローブまたはそれ以外の存在下で使用される；特定の特別な条件下では、１００モノマーよりも大きいサイズを有するプローブを使用することが有益であるかもしれない；プローブは特に、診断用に使用することができ、例えばそのような分子は捕獲及び／又は検出プローブ分子である、
−捕獲プローブは、何らかの適切な手段により、即ち直接的又は間接的に、例えば共有結合又は受動的吸着によって固体支持体に固定化することができる、
−検出プローブは、特に放射性同位体から選択される標識、特にペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼから選択される酵素、及び色素生産性、蛍光発生性、又は発光性の物質を加水分解することが可能なもの、発色団化合物、色素生産性、蛍光発生性、若しくは発光性の化合物、ヌクレオチド塩基類縁体、及びビオチンの手段により標識される、
−診断目的に使用される本発明のプローブは、既知の全てのハイブリダイゼーション技術、特に”ドットブロット”（９）、及び”サザンブロット”（１０）、ＲＮＡを標的として使用すること以外は”サザンブロット”と同一の技術である”ノーザンブロット”とよばれる技術、並びにサンドイッチ技術（１１）において採用されうるものである；有利には、サンドイッチ技術が本発明において使用されるが、これは特異的な捕獲プローブ及び／又は特異的な検出プローブを具備するものであるが、これは捕獲プローブ及び検出プローブには少なくとも一部において異なるヌクレオチド配列を有していなくてはならないという理解に基づくものである、
−本発明におけるいかなるプローブも、複製現象、特には翻訳及び／又は転写を阻害するため、及び／又は当該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを分解するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ及び／又はＤＮＡとハイブリダイズすることが可能である、
−プライマーは、少なくとも６のモノマー、有利には１０乃至３０のモノマー、そして好ましくは１８乃至２５のモノマーを具備し、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のような増幅技術、シーケンシングのような伸長方法、逆転写法等における、酵素的重合の開始のための特定の条件下で特異的にハイブリダイゼーションできるプローブである、
−二のヌクレオチド配列又は二のペプチド配列は、互いに又は参照配列に関して、もし対応する生体高分子が機能的に実質的に、同一であることなく、問題となる適用又は使用に関して、或いはそれらが関る技術において同じ役割を果たすのであれば、等価又は由来するものとして名付けられる；二つの配列は特に、自然の多様性、特には自身が同定された種からの自発的変異、又は誘導された多様性の結果得られるものであるならば、二つの相同的配列が以下に定義するように相同性あるように等価である、
−”多様性”は、配列のいかなる自発的又は誘導された修飾を意味するものと理解されるものであり、特にはヌクレオチド及び／又はヌクレオチド断片の置換、及び／又は挿入、及び／又は欠失、及び／又は一端若しくは両端における伸長及び／又は短縮によってなされるものである；非自然的多様性は、遺伝子工学的手法を用いることで得られるが、例えば核酸の増幅に選択した、縮体化又はそうでない合成プライマーを選択することにより得られる；この多様性は、いかなる出発配列の修飾においても明らかであり、基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として考えられ、また当該参照配列に対する相同性の度合いにより表現することが可能である、
−相同性は比較するヌクレオチド断片又はペプチド断片の同一性の度合いを特徴付ける；これは、特にヌクレオチド又はペプチド配列を、基準ヌクレオチド配列又は基準ペプチド配列に対して直接的に比較することにより決定される、同一性率によって測定される、
−この同一性率はヌクレオチド断片、特には本発明において扱われているクローンに対してとりわけ決定されていているが、これは以下の配列によりＭＳＲＶ−１に対して同定された断片に相同的であり：
配列番号１乃至９、配列番号４６、配列番号５１乃至５３、配列番号４０、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号９３、
また同様に、以下の配列により同定されるプローブ及び当該プローブに相同的なプライマーに対しても相同的である：
配列番号２０乃至２４、配列番号２６、配列番号１６乃至１９、配列番号３１乃至３３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５５、配列番号４０、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号９９乃至１１１；例を挙げると、以下に詳細を述べるプロトコールに従って、ＬＭ７ＰＣ及びＰＬＩ−２株に由来するＭＳＲＶ−１ウイルスのＲＮＡの断片より得られた核酸についての、異なる一般的コンセンサス配列の間において見られる最小の同一性率は、図１に描かれる領域内では６７％である、
−基準断片の配列に等価なヌクレオチド配列を有するものは、いかなるヌクレオチド断片も基準断片と等価又はそれに由来するものとされる；上記の定義によれば、特に以下のものは基準ヌクレオチド断片と等価である：
ａ）基準断片の相補体と少なくとも一部がハイブリダイズすることが可能ないかなる断片、
ｂ）基準断片と整列させた場合に、分類学上の他のグループに由来する断片に対するよりも、より多くの近接した同一塩基が証明されるいかなる断片、
ｃ）自身が得られた種についての自然な多様性に由来するか、又は由来することが可能であるいかなる断片、
ｄ）基準断片に適用された遺伝子工学的手法に由来することが可能であるいかなる断片、
ｅ）基準断片によりコードされるペプチドと相同的であるか又は同一であるペプチドをコードする少なくとも８の近接するヌクレオチドを含んだいかなる断片、
ｆ）少なくとも一のモノマーの挿入、欠失又は置換により、或いは一端又は両端において伸長若しくは短縮されることにより基準断片とは異なっているいかなる断片；例としては、基準断片の末端の一方又は両方に、ポリペプチドをコードしていないヌクレオチド配列が隣接した基準断片に相当するいかなる断片、
−ポリペプチドとは、特に少なくとも２のアミノ酸からなるいかなるペプチド、特にはオリゴペプチド、又はタンパク質、そして例としては酵素であって、抽出、分離又は実質的に単離されるか、又は人が介在して合成されたもの、特には化学合成又は組換生物体内で発現されたものを意味するものと理解される、
−ヌクレオチド断片により一部がコードされるポリペプチドとは、当該ヌクレオチド断片内にある少なくとも９の近接するモノマーでコードされる、少なくとも３のアミノ酸を有するポリペプチドを意味するものと理解される、
−アミノ酸は、それぞれの物理化学的性質、例えば極性、疎水性及び／又は塩基性度、及び／又は酸性度、及び／又は中性度が、実質的に同じである場合に、他のアミノ酸と類似関係にあるとされる；従って、ロイシンはイソロイシンと類似関係にある。
−いかなるポリペプチドも、比較により実質的に同じ性質を有し、特に同じ抗原性、免疫学的、酵素学的、及び／又は分子認識的に同じ性質を有するならば、基準ポリペプチドと等価又はそれに由来するとされる；特に以下のものは基準ポリペプチドと等価である：
ａ）少なくとも一のアミノ酸が類似のアミノ酸で置換されている配列を有するいかなるポリペプチド、
ｂ）基準ポリペプチド及び／又は当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド断片についての自然な又は誘導による多様性によって得られる、等価なペプチド配列を有するいかなるポリペプチド、
ｃ）当該基準ポリペプチドのミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、
ｄ）配列中の一又はそれ以上の、Ｌ系統のアミノ酸がＤ系統のアミノ酸で置換されたいかなるポリペプチド及びその逆、
ｅ）例えばアミン官能基のアセチル化、チオール官能基のカルボキシル化、カルボキシル官能基のエステル化のように、アミノ酸の側鎖に修飾が導入されたいかなるポリペプチド、
ｆ）一又はそれ以上のペプチド結合が、例えばカルバ、レトロ、インベルソ、レトロ−インベルソ、還元及びメチレノキシ結合で修飾されたポリペプチド、
（ｇ）その少なくとも一の抗原が、基準ポリペプチドに向けられた抗体により認識されるポリペプチド、
−比較する二つのペプチド断片の相同性を特徴付ける同一性率は、本発明によれば、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％である。
逆転写酵素活性を有するウイルスは、ＲＮＡ及びＤＮＡの形態において等しく、よく解析されているという事実の観点において、ウイルスＤＮＡ及びウイルスＲＮＡの両方が、そのような逆転写活性を有するウイルス、即ち本発明においてＭＳＲＶ−１とよばれるもの、に関連する配列を特徴付けるために参照されるであろう。
本明細書及び特許請求の範囲内で使用される、例えば”第一ヌクレオチド配列”のような順序の表現は、特定の順序を表現するためではなく、本発明をより明確に定義するために用いられる。
物質又は因子の検出は、当該物質又は当該因子についての、同定及び定量、又は分離若しくは単離の両方を意味するものと以下では理解される。
以下の詳細な説明を、添付した図面とともに読むことで本発明のより良い理解が得られるであろう：
−図１は、ＬＭ７ＰＣ及びＰＬＩ−２株に由来するウイルスＤＮＡであって、Ｓｈｉｎら（１２）により定義された”ｐｏｌ”領域を、ＰＣＲ技術により増幅したＭＳＲＶ−１Ｂ株の核酸の一般的コンセンサス配列であって、参照配列番号３、参照配列番号４、参照配列番号５、及び参照配列番号６の参照のもとに同定されたもの、並びに参照配列番号７を有する増幅プライマーについての共通のコンセンサスを示す；
−図２は、ＭＳＲＶ−１Ｂ／”ＰＣＲ  ｐｏｌ”型ファミリーのそれぞれについての機能的リーディングフレームの定義を与えていて、ファミリーＡ乃至Ｄのそれぞれは、図１に描かれている配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のヌクレオチド配列によって定義される；
−図３は、配列番号１１により同定されるＭＳＲＶ−２Ｂ配列のコンセンサスの例を与える；
図４は、ＭＳ患者由来のＢリンパ球の培養により産生されたウイルス粒子の精製勾配より得たショ糖画分中における、逆転写酵素（ＲＴ）活性をｄｐｍ（毎分の崩壊）で表わしたものである；
−図５は、図４におけるのと同じ実験条件下での、ＭＳとは無関係の対照より得たＢリンパ球の培養中における逆転写活性のアッセイを与える；
−図６は、クローンＰＳＪ１７（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す；
−図７は、Ｍ００３−Ｐ００４と命名されたクローンの配列番号８のヌクレオチド配列を示す；
−図８は、クローンＦ１１−１の配列番号２のヌクレオチド配列を示す；プライマー領域中の二つの矢印の間に位置する部分は、Ｆ１１−１のクローニングに使用されたプライマーの選択によってなされた多様性に対応している；同じ図中で、アミノ酸への翻訳を示している；
−図９は、配列番号１のヌクレオチド配列、及び配列番号のアミノ酸における可能な機能的リーディングフレームを示す；この配列においては、ｐｏｌ遺伝子のコンセンサス配列に下線が付されている；
−図１０及び図１１は、ＰＣＲの結果を与えるものであり、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９によって同定されるプライマーより得られた増幅産物についての、臭化エチジウムを浸透させたアガロースゲルを紫外光下で写真撮影した形態のものである；
−図１２は、ＭＳＲＶ−１の配列番号１と、ＨＳＥＲＶ９と命名される内在性レトロウイルスのそれとの間の相同性をマトリックス形態で表現したものを与える；少なくとも６５％であるこの相同性は、連続する線により証明されるが、株が存在しないことは６５％未満の相同性を意味している；
−図１３は、クローンＦＢｄ３の配列番号４６のヌクレオチド配列を示す；
−図１４は、クローンＦＢｄ３及びＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスの間の相同性配列を示す；
−図１５は、クローンｔ  ｐｏｌの配列番号５１のヌクレオチド配列を示す；
−図１６及び図１７はそれぞれ、クローンＪＬＢｃ１及びＪＬＢｃ２についての、配列番号５２、及び配列番号５３のそれぞれのヌクレオチド配列を示す；
−図１８は、クローンＪＬＢｃ１及びクローンＦＢｄ３との間の配列の相同性を示す；
−そして図１９は、クローンＪＬＢｃ２及びクローンＦＢｄ３との間の配列の相同性を示す；
−図２０は、クローンＪＬＢｃ１とＪＬＢｃ２との間の配列の相同性を示す；
−図２１及び図２２は、ＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスと、クローンＪＬＢｃ１及びクローンＪＬＢｃ２とのそれぞれ間における配列の相同性を示す；
−図２３は、クローンＧＭ３の配列番号５６のヌクレオチド配列を示す；
−図２４は、ＨＳＥＲＶ−９レトロウイルス及びクローンＧＭ３との間の配列の相同性を示す；
−図２５は、既知のレトロウイルスＥＲＶ９に対する、研究した異なるクローンの位置づけを示す；
−図２６は、以下においてＭＳＲＶ−１  ｐｏｌ＊と命名する領域における、クローンＦ１１−１、Ｍ００３−Ｐ００４、ＭＳＲＶ−１Ｂ、及びＰＳＪ１７の位置を示す；
−図２７は、連続する図２７ａ−２７ｃに分離されていて、ｐｏｌ遺伝子の全部を覆う可能なリーディングフレームを示す；
−図２８は、配列番号４０に従い、配列番号３９に同定されるアミノ酸配列を有するペプチド断片ＰＯＬ２Ｂをコードするヌクレオチド配列を示す；
−図２９は、抗Ｉｇ−Ｇ抗体で試験した、ＭＳ患者の血清２９個と健常な対照の３２個の血清に対して得られた、４９２ｎｍでのＯＤ値（ＥＬＩＳＡ試験）を示す；
−図３０は、抗Ｉｇ−Ｍ抗体で試験した、ＭＳ患者の血清３６個と健常な対照の４２個の血清に対して得られた、４９２ｎｍでのＯＤ値（ＥＬＩＳＡ試験）を示す；
−図３１乃至３３は、スポットスキャン技術により、アミノ酸配列６１−１１０を網羅する、４３の重なり合ったオクタペプチドに対して得られた結果（スポットの相対的強度）を示すものであるが、それぞれは、ＭＳ血清プール、対照血清プール、及び少なくとも一のオクタペプチドについて対照血清で検出された最大シグナル（強度＝１）に対応するバックグラウンドを控除した後のＭＳ血清プールで得られたものであるが、これはこれらの血清が１／５０に希釈されたという理解に基づくものである。はるか右手の末端におけるバーは、血清学的試験とは無関係のグラフスケール標準である；
−図３４は、免疫優性領域を具備する二つのポリペプチドの配列番号４１及び配列番号４２を示し、一方配列番号４３及び配列番号４４はＭＳに特異的な免疫反応性ポリペプチドを示す；
−図３５は、クローンＬＢ１９についての、配列番号５９のヌクレオチド配列、及び配列番号５９の可能な３つのリーディングフレームをアミノ酸で表わしたものを示す；
−図３６は、配列番号８８（ＧＡＧ＊）のヌクレオチド配列、及び配列番号８８の可能なリーディングフレームをアミノ酸で表わしたものを示す；
−図３７は、クローンＦＢｄ１３及びＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとの間の配列の相同性を示す；この表示によれば、連続した線は７０％以上の相同性率を意味し、線がないことはより小さい相同性率を意味する；
−図３８は、クローンＦＰ６の配列番号６１のヌクレオチド配列、及び配列番号６１の可能な３つのリーディングフレームをアミノ酸で示したものを示す；
−図３９は、クローンＧ＋Ｅ＋Ａの配列番号８９のヌクレオチド配列、及び配列番号８９の可能な３つのリーディングフレームをアミノ酸で示したものを示す；
−図４０は、領域Ｅ中に見られ、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのプロテアーゼをコードし、配列番号９０に同定されているリーディングフレームを示す；
−図４１は、符号（＋）で示されるＭＳ患者のそれぞれの血清の反応を示し、また符号（−）で示される健常者のものを示したものであるが、抗−ＩｇＧ抗体で試験し、４９２ｎｍにおける純光学密度で表現したものである；
−図４２は、符号（＋）で示されるＭＳ患者のそれぞれの血清の反応を示し、また符号（−）で示される健常者のものを示したものであるが、抗−ＩｇＭ抗体で試験し、４９２ｎｍにおける純光学密度で表現したものである；
−図４３は、Ｂ−細胞株の上清より得たペレットについての、ショ糖密度勾配におけるＲＴ−活性特性を示す；対照のＢ−細胞株■は、ミトコンドリア疾患（mitochondriapathy）の患者の血縁者から得た。ＭＳ Ｂ−細胞株□は、明らかにＭＳである患者から得た；
−図４４は、”全−レトロウイルス”ＰＣＲによる研究（実施例１８参照）において検出されたウイルスの、保存されたｐｏｌ領域のヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す。”欠失”はダッシュで示し、標準的な一文字略記によりアミノ酸及びヌクレオチドを標記した（ｉ＝イノシン）。最も高く保存されているＶＬＰＱＧ及びＹＸＤＤ領域を太字で別個のブロックとしてそれぞれの配列の末端において示した。全ての配列、及び一を除いて全ての配列において存在するアミノ酸には下線を引いてある。ＰＡＮ−ＵＯ及びＰＡＮ−ＵＩの、ＰＣＲプライマー（（１２）より修飾した）は、５’−３’（センス）に向いていて、一方プライマーＰＡＮ−ＤＩは３’から５’に向いている（アンチセンス）。縮退はＰＣＲプライマー配列の上（ＰＡＮ−ＵＯ及びＰＡＮ−ＤＩ）、又は下（ＰＡＮ−ＵＩ）に示した。”Ｉ”は９塩基の５’突出であるｃｔｔｇｇａｔｃｃを示し、”−Ｉ”は、９塩基の５’突出ｃｔｃａａｇｃｔｔを示す。ＥＬＯＳＡアッセイで使用した捕獲及び検出用プローブであるＤｐＶ１及びＣｐＶ１ｂを、代表的なＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ配列の下に示す。翻訳されたｃｐｏｌ配列の下の３つの位置においては、代替のアミノ酸（”非−サイレント”核酸変異を意味する）をイタリック体で示す−Ｋ及びＹ置換はＰＬＩ−１由来クローンにおいてのみ見られたが、一方Ｒ及びＷは起源には無関係に、かなりの割合のクローンにおいてコードされたいた。ＤｐＶ１はペルオキシダーゼで標識されいて、ＣｐＶ１ｂは、もしストレプトアビジンでコートされたプレートが使用されるならば、５’末端においてビオチン化されていてもよい。それぞれの配列の名称は図の左側に示されている。
ＨＴＬＶ１：ヒト白血病ウイルス１型；ＨＩＶ１：ヒト免疫不全症ウイルス１型；ＭｏＭＬＶ：モロニーマウス白血病ウイルス；ＭＰＭＶ：メーソン−ファイザーサルウイルス；ＥＲＶ９：内在性レトロウイルス９；ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ：多発性硬化症随伴レトロウイルスの保存ｐｏｌ領域。
−図４５は、ＭＳＲＶ、並びに代表的な内在性及び外来性レトロウイルス、及び逆転写酵素を有するＤＮＡウイルスのｐｏｌ遺伝子によりコードされる保存されたアミノ酸配列に基づいた系統樹を示す。これはＧｅｎｅｗｏｒｋｓ（登録商標）ソフトウェアのＵ．Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ａ．ツリープログラムにより作り出した。
ＨＳＲＶ：ヒト泡沫レトロウイルス。ＥＩＡＶ：ウマ伝染性貧血（aenemia）ウイルス；ＢＬＶ：ウシ白血病ウイルス；ＨＩＶ１、ＨＩＶ２：ヒト免疫不全症ウイルス１型、２型；Ｆ−ＭｕＬＶ：フレンド−マウス白血病ウイルス。ＭｏＭＬＶ：モロニーマウス白血病ウイルス；ＢＡＥＶ：ヒヒ内在性ウイルス；ＧａＬＶ：テナガザル白血病ウイルス；ＨＵＭＥＲ４１：ヒト内在性レトロウイルス配列、クローン４１。ＩＡＰ：嚢内Ａ−型粒子。ＭＰＭＶ：メーソン−ファイザーサルウイルス。ＨＥＲＶＫ１０：ヒト内在性レトロウイルスＫ１０。ＭＭＴＶ：マウス乳腺癌ウイルス。ＨＳＥＲＶ９（ＥＲＶ９データベース配列）：内在性レトロウイルス９のヒト配列。ＳＩＶ：サル免疫不全症ウイルス；ＲＴＬＶ−Ｈ：逆転写酵素様ウイルス配列Ｈ；ＳＦＶ：サルフォーミーウイルス；ＶＩＳＮＡ：ビスナ（Ｖｉｓｎａ）レトロウイルス；ＳＩＶ１：サル免疫不全症ウイルス１型；ＳＲＶ−２：サルレトロウイルス２型；ＳＭＴＶ−Ｈ：リスザルレトロウイルスＨ。
−図４６は、ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ及び逆転写酵素領域のＭＳＲＶ配列を示す。
アミノ酸翻訳は対応するヌクレオチド配列の下に配列してある。組換えベクター中にクローン化して、大腸菌内で発現させたプロテアーゼＯＲＦに対応する領域は、囲んである。ＭＳ患者の血漿を用いて増幅させたＡ及びＢ断片に対応する領域は、括弧で示してある。逆転写酵素（ＲＴ）及びＲＮアーゼＨ（ＲＮＨ）領域は、点線で囲んである。ＰＲＴ及びＲＴ（ＲＮＨを含む）の両方の酵素活性の活性部位について高く保存されたアミノ酸は下線を引いてある。
−図４７Ａは、ＲＴ−活性と関連する、ショ糖密度画分中、及びＭＳの血漿中における、ＭＳＲＶ−ｐｏｌ  ＲＮＡ配列についてのＲＴ−ＰＣＲによる特異的な検出を例示している；図４７Ｂは、ＭＳ脈絡叢培養物より沈殿された細胞外ウイルス粒子について得られたショ糖密度勾配についてのＲＴ特性を示す。下の写真は、ＳＴ１．２プライマーセットとともにラウンド１より増大させたＰＣＲ産物（ＳＴ１．１）をのせたアガロースゲルを示している。左から右へ：ＳＴ１．１セットでのＲＴ−ＰＣＲの対照１の水；ＳＴ１．２ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーで対照１の水を増大させた対照２の水；分子量マーカ；上記した特性のＲＴ活性に対応する画分番号１乃至１０；健常な血液提供者からの血漿試料Ｃ１及びＣ２。血漿試料ＭＳ１及びＭＳ２は二人のＭＳ患者に由来。
−図４８は、図２５においてＧＭ３、ＭＳＲＶ−１ｐｏｌ＊、ｔ  ｐｏｌ、及びＦＢｄ３として記載されている重なり合った領域との相同性により定義されるｐｏｌ遺伝子の領域中の変異及び／又は組換え配列の例を示す。
−図４９は、ｐｏｌ領域に関し、同じ患者（実施例４６−７）のクローン１、５、及び８の間のヌクレオチド（図４９Ａ）及びアミノ酸（図４９Ｂ）についての整列を示す。
−図５０は、ｐｏｌ領域に関し、同じ患者（実施例６８−１）のクローン４１、４３、及び４２のヌクレオチド（図５０Ａ）及びアミノ酸（図５０Ｂ）についての整列を示す。
−図５１は、ｐｏｌ領域に関し、同じ患者（実施例４６−７）のクローン１、５、及び８のコンセンサス配列（配列番号１７６）と配列番号１との間、及びそれぞれの対応するペプチド配列の間についてのヌクレオチド（図５１Ａ）及びアミノ酸（図５１Ｂ）についての整列を示す。
−図５２は、ｐｏｌ領域に関し、同じ患者（実施例６８−１）のクローン４１、４３、及び４２のコンセンサス配列（配列番号１６９）と配列番号１との間、及びそれぞれの対応するペプチド配列の間のヌクレオチド（図５２Ａ）及びアミノ酸（図５２Ｂ）についての整列を示す。
−図５３は、ｐｏｌ領域に関し、同じ患者（実施例４６−７）のクローン１、５、及び８のコンセンサス配列（配列番号１７６）と、同じ患者（実施例６８−１）のクローン４１、４３及び４２の間のコンセンサス配列（配列番号１７６）との間についてのヌクレオチド（図５３Ａ）及びアミノ酸（図５３Ｂ）についての整列を示す。
表５（明細書の最後にある）は、縮退したｐｏｌプライマーで、ＲＴ活性のピークを含んだショ糖密度勾配画分、又は陰性対照についてＲＴ−ＰＣＲにより得られた配列を示す；そして、
表６は（明細書の最後にある）、ＭＳ及び対照患者（ｃｆ実施例１８）由来のＣＳＦについて特異的ＥＬＯＳＡアッセイで”全−レトロ”ＰＣＲにより検出されるＭＳＲＶ−ｃｐｏｌの結果及び臨床データを示す。
実施例１：MSRV-1BとMSRV-2Bと呼ばれ、各々レトロウィルスMSRV-1と共感染因子MSRV2を定義するクローンを、LM7PCとPLI-2ライン由来のウィルス粒子調製におけるレトロウィルスの保存されたPOL領域の”ネスト化（nested）”PCR増幅による取得
Shih（12）により発表された技術由来のPCR技術を用いた。この技術は、反応媒体のすべての成分をDNaseによって処理することにより、すべての微量の汚染DNAを除去することを可能にする。付随して、２回連続のPCR増幅サイクルにおける、相違するが重なるプライマーの使用により、サンプル中の、最初から少量でさらにRNAに対するDNaseの偽作用により減少していく量のRNAから合成されたcDNAを増幅するチャンスを増やすことが可能になる。実際には、サンプル中に残存するこの酵素を８５℃１０分間の加熱により不活性化する前に、すべての微量の汚染DNAを除去できるような過剰の活性条件下で、DNaseが用いられる。H.Perron（13）により記載された技術にしたがったショ糖勾配によって、一方ではPLI-2ライン（ECACC No.92072201）により生産された”POL-2”単離体（ECACC No.V92072202）から、他方ではLM7PCライン（ECACC No.93010817）により生産されたMS７PG単離体（ECACC No.V93010816）から精製された、感染粒子画分の核酸から合成されたｃDNAには、Shih（12）に記載されたPCR技術の変法が用いられた。これらの培養物を、WO93/20188とWO93/20189として発行された特許出願の主題を形成した方法にしたがって得た。
TAクローニングキット（商標）に用いるこの技術によって、増幅産物をクローン化し、Applied Biosystems model 373A自動シークエンサーを用いて配列を分析した後、配列を、Genebank（商標）データバンクの最新バージョンによるGeneworks（商標）ソフトウェアを用いて分析した。
これらのサンプルからクローン化され配列が決められた配列は、特に２つのタイプの配列に対応する：第１のタイプの配列は、クローンの大部分に（PLI-2培養のPOL-2単離体由来のクローンの５５％と、LM7PC培養のMS7PG単離体由来のクローンの６７％）見出され、ERV-9またはHSERV-9と呼ばれる内因性ヒトレトロウィルスに非常に類似しているが異なる”pol”配列ファミリーに対応するものであり、第２のタイプの配列は、MSRV-2と呼ばれるもう１つの感染および／または病原因子に寄与する配列と非常に強い相同性があるものである。
クローンの大部分を表す第１のタイプの配列は、その多様性が配列の４つのサブファミリーを定義することを可能にする配列を構成する。これらのサブファミリーは、それらをHIV-1レトロウィルス（14）として知られている同じレトロウィルス由来の準スピーシズ（quasi-species）であると考えること、あるいはそれらを生産細胞内で共同制御されているいくつかの内因性プロウィルスによる干渉の結果であると考えることが可能になるほど、互いに十分に類似している。これらの多少欠損した内因性因子は、複製可能なプロウィルスにより生成される可能性もある同じ制御シグナルに感受性である。その理由は、内因性レトロウィルス（15）の同じファミリーに属しているからである。この内因性レトロウィルスの新しいファミリー、またはこれに代えて準スピーシーズが培養中で生成し、後述する配列のコンセンサスを含むこの新しいレトロウィルス種は、MSRV-1Bと表される。
図１は、この実験で配列決定され、各々配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６として同定された異なるMSRV-1Bクローンの配列の一般的なコンセンサス配列を示す。これらの配列は、Genebank（商標）データベース中にX57147とM37638として参照されるHSERV9配列の７０％から８８％の範囲の核酸に対して相同性を示す。内因性レトロウィルスMSRV-1Bの可能性もある異なる準スピーシーズ、あるいは内因性レトロウィルスMSRV-1Bの異なるサブファミリーを代表する４つの”コンセンサス”核酸配列が同定された。これらの代表的なコンセンサス配列を、アミノ酸への翻訳とともに図２に示した。機能するリーディングフレームがこれらのMSRV-1B配列の各サブファミリーに存在し、機能するオープンリーディングフレームが各例で核酸配列の下に2列目に表されたアミノ酸配列に対応することがみいだされる。配列番号７と同定され、”pol”領域のこのPCR技術により取得されたMSRV-1B配列の一般的なコンセンサスを、図１に示す。
配列決定されたクローンの大部分を表す第2のタイプの配列は、図３に示された配列MSRV-2Bにより表され、配列番号１１により同定される。PCRプライマーに対応する配列で観察される相違点は、異なる技術的条件下で用いられた混合形態中の縮重したプライマーの使用により説明される。
MSRV-2B配列（配列番号１１）は、問題となる配列領域がMSRV-2と呼ばれる新しい感染因子に属すると示唆されるほど十分に、すでにデータバンクに記載されたレトロウィルス配列とは異なっている。この感染因子は、原理的には、得られた第１の配列の分析に基づいて、レトロウィルスに関連しているであろうが、この配列を得るために用いた技術の見地からは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、HBV（12）の場合のように、そのゲノムが偶然逆転写活性を有する酵素をコードするようなDNAウィルスでもあり得る。さらに、このPCR増幅技術のために用いられた縮重プライマーのランダムな性質は、予測できない相同性配列の結果として、あるいは関連する酵素の遺伝子中の保存された部位の結果として、原核または真核の病原および／または共感染因子（原生生物）由来の核酸の増幅を許したことも十分考えられる。
実施例２：MSRV-1BとMSRV-2Bと呼ばれ、ファミリーMSRV-1とMSRV2を定義するクローンを、MSの新しいケースからのBリンパ球調製におけるレトロウィルスの保存されたPOL領域の”ネスト化”PCR増幅により取得すること
適当な濃度のサイクロスポリンAを含む適当な培地中の培養液中で血球リンパ球細胞をセットアップした後、エプスタイン-バーウイルス（EBV）に対して血清陽性（seropositive）であったMS患者からのBリンパ球の培養液中の自己不死化により得られた、自然な白血球芽様細胞ラインから、H.Perron（13）により記載された技術にしたがった、および実施例１に記載されたプロトコールにしたがったショ糖勾配における”LM7様”逆転写酵素活性のピークにおけるウィルス粒子の精製画分に存在するRNA核酸材料を、増幅し配列決定するために、Shih（12）の技術にしたがって修正した同じPCR技術を用いた。このラインから生産されたウィルス精製勾配から得られたショ糖画分で逆転写酵素活性の代表を、図４に示す。同様にして、MSフリーのコントロールから同じ条件下で得られたBラインの培養上清を同じ条件で処理した。ショ糖勾配画分中の逆転写酵素活性のアッセイは全部陰性で（バックグラウンド）、図５に示される。MSBラインに対応する勾配の画分３と、非MSコントロール勾配の逆転写活性のない同じ画分を、前述のShih（12）由来の同じRT-PCR技術と、その後に続く実施例1で述べたクローニングおよび配列決定と同じ工程により分析した。
MSRV-1とMSRV-2タイプの配列は、MSB白血球芽様ライン由来の”LM7様”逆転写活性のピークに関連する材料中にのみみいだれることは特記すべきことである。これらの配列は、ランダムにとられた２６組換えクローン中コントロール（非MS）B白血球芽様細胞ラインからの材料中にはみいだすことはできない。cDNA合成工程のために用いられた市販逆転写酵素由来のMo-MuLVタイプ汚染配列、および特にレトロウィルスと類似しない配列は、このPCR技術により生産される相同性ポリメラーゼ配列の”コンセンサス”増幅の結果、このコントロールにみいだされた。さらに、コントロールサンプル中に増幅反応に対し競合する濃縮されたターゲットがないことは、希釈された汚染物の増幅を可能にする。結果の相違は、非常に重要にみえる（カイ二乗，p＜0.001）。
実施例３：レトロウィルスMSRV-1を定義するクローンPSJ17を、PLI-2ライン由来のウィルス粒子調製物との内因性逆転写酵素の反応により取得すること
このアプローチは、この同じ単離体に存在する逆転写酵素活性を用いて単離体中のおそらくレトロウィルスRNAからの逆転写されたDNA配列の取得を目的としている。この逆転写酵素活性は理論的に、プライマーtRNAにリンクしたレトロウィルスRNA、またはレトロウィルス粒子（16）中ですでに逆転写されたDNAの短い鎖にハイブリダイズしたレトロウィルスRNAが存在するときのみ機能し得る。こうして、逆転写酵素活性を有するウィルスRNAの一部の特異的酵素増幅を用いたこれらの著者にしたがって、細胞内核酸で汚染された材料中の特異的レトロウィルスの配列の取得が最適化された。この終わりまで、著者は、ウィルスに含まれるRNAへの逆転写のこの酵素活性がin vitroで効果的である特別な物理化学的条件を決定した。これらの条件は、以下に示されるプロトコールの技術的記載に対応する（内因性RT反応、精製、クローニング、配列決定）。
分子的アプローチは、以下の方法にしたがって調製されたPLI-2ラインの培養上清から得られた濃縮非精製ウィルス粒子調製を用いることにある：培養上清を週に２度集め、細胞破砕物を除去するために、３０分間１０，０００ｒｐｍで前遠心分離し、ついで−８０℃で凍結するかあるは次の工程に用いた。新鮮または融解した上清は、３０％グリセロールーPBSの緩衝で、１００，０００ｇで（またはタイプ４５TLKB-HITACHIローターで３０，０００ｒｐｍ）、２時間４℃で遠心分離する。上清を除去した後、沈澱ペレットを少量のPBS中にとりだし、濃縮されたしかし精製されていないウィルス粒子画分を構成する。この濃縮非精製ウィルスサンプルは、以下のようにいわゆる内因性逆転写反応を実施するために用いられた。
上記プロトコールにしたがって精製した、約１−５００万ｄｐｍの逆転写酵素活性を含む２００ｍｌ容量のウィルスを３７℃で液相ができるまで融解し、ついで氷上に置いた。５倍濃縮バッファーを以下の成分で調製した：５００ｍM Tris-HCl ｐH8.2；７５ｍM NaCl；２５ｍM MgCl2；75mM DTTと０．１０％NP 40；１００ｍｌの５ｘバッファー＋２５ｍｌのｄATPの１００ｍM溶液＋２５ｍｌのｄTTPの１００ｍM溶液＋２５ｍｌのｄGTPの１００ｍM溶液＋２５ｍｌのｄCTPの１００mM溶液＋１００ｍｌ滅菌蒸留水＋PBS中２００ｍｌウィルス粒子懸濁液（５００DPMのRT活性）を混合し、４２℃３時間インキュベートした。このインキュベーションの後、反応混合液を直接緩衝化フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（Sigma ref.P3803）添加する；液相を集め、残りの核酸材料を再抽出するために一容量の滅菌蒸留水を有機相に添加する。集めた水相を合わせ、含まれる核酸は、３M酢酸ナトリウムｐH５．２を1／１０容量＋２容量のエタノール＋１ｍｌのグリコーゲン（Boehringer-Mannheimref.901393）に添加し、サンプルを−２０℃４ｈまたは一晩＋４℃に置くことにより沈殿させる。ついで遠心分離の後得られた沈殿は、７０％エタノールで洗い、６０ｍｌの蒸留水で再懸濁する。ついでこの反応の産物を精製し、クローン化し、以下述べるプロトコールにしたがって配列決定した：末端で対になっていないアデニンをもつ平滑末端DNAが生成した：”穴埋め”反応を最初に行った：２５ｍｌの前もって精製したDNA溶液を２ｍｌの２．５ｍMの、等量でｄATP＋ｄGTP＋ｄTTP＋ｄCTPを含む溶液／１ｍｌのT4DNAポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim ref.1004786）／５ｍｌの１０×”制限酵素のためのインキュベーションバッファー”（Boehringer-Mannheim ref.1417975）／１ｍｌの１％ウシ血清アルブミン溶液／１６ｍｌの滅菌蒸留水と混合した。この混合物を２０分間１１℃でインキュベートした。そこにフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Sigma ref.P3803）を用いた核酸の抽出と上述の酢酸ナトリウムによる沈殿の前に、５０ｍｌのTEバッファーと１ｍｌのグリコーゲン（Boehringer-Mannheim ref.901393）を添加した。遠心分離の後、沈殿したDNAは、１０ｍｌの１０ｍMTrisバッファーｐH7.5に再懸濁する。５ｍｌのこの懸濁液を、２０ｍｌの５×Taqバッファー、２０ｍｌの５ｍMｄATP、１ｍｌ（５U）のTaq DNAポリメラーゼ（Amplitaq（商標））および５４ｍｌの滅菌蒸留水とついで混合した。この混合物を２時間、７５℃で溶液の表面上のオイルのフィルムとインキュベートする。インキュベーションの後オイルのフィルムの下でぬきとった水溶液中に懸濁したDNAを、上述するように沈殿させ、２ｍｌの滅菌蒸留水に再懸濁する。得られたＤNAをプラスミド中にTAクローニング（商標）キットを用いて挿入した。２ｍｌのDNA溶液を５ｍｌの滅菌蒸留水、１ｍｌの１０倍濃縮連結バッファー”１０×LIGATION  BUFFER”、２ｍｌの”pCR（商標）ベクター”（25nｇ／ml）と１ｍｌの”TA DNA LIGASE”と混合した。この混合物を一晩１２℃でインキュベートした。以下の工程は、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）の指示にしたがって行った。方法の最後に、組換えバクテリア（白）の白いコロニーを、いわゆる”ミニプレップ”法（17）にしたがって培養して導入されたプラスミドを抽出���るために拾った。各組換えコロニーからのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後UV光の下で検出される挿入物を有するプラスミドを、TAクローニング（商標）キットのクローニングプラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補するプライマーとのハイブリダイズの後に、挿入物の配列決定の為に選択した。ついで配列決定の前の反応を、使用の為にシークエンスキット”プリズム・レディ・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット（Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit）”（Applied Biosystems, ref.401384）の使用ために推奨された方法にしたがって行い、Applied Biosystems”Automatic Sequencer model 373A”装置を用いて、製作者の指示にしたがって自動配列決定を行った。
反応混合物に存在するDNAフラグメントからクローン化された配列のコンピュータデータバンクに基づく同定分析が、レトロウィルスタイプの配列を明らかにすることができた。対応するクローンPSJ17は完全に配列決定され、図６に示され、配列番号９により同定された、取得された配列は、最新の”Genebank（商標）”データバンクに基づく”Geneworks（商標）”ソフトウェアを用いて分析された。すでに述べた同一の配列は、データバンク分析ではみいだすことはできなかった。いくつかの既知のレトロウィルス因子に対してほんの部分的相同性がみいだされた。もっとも有用な関連する相同性は、参照（18）にしたがって、ERV-9、またはHSERV-9と呼ばれる外因性レトロウィルスに関する。
実施例４：クローン”POL MSRV-1B”により定義される５’領域とクローンPSJ17により定義される３’領域の間に含まれる核酸配列のＰＣＲ増幅
５つのオリゴヌクレオチド、M001,M002-A、M003-BCD、P004およびP005が、精製POL-2ウィルス粒子由来のRNAを増幅するために定義された。コントロール反応は、汚染物の存在をチェックするように行われた（水との反応）。増幅は、実施例２に記載されたプロトコールしたがったRT-PCR工程と、その後の文献EP-A-0,569,272に記載されたPCRプロトコールにしたがった”ネスト化”PCRからなる。最初のRT-PCRサイクルでは、プライマーM001とM004またはP005を用いる。第2のPCRサイクルでは、プライマーM002-AまたはM003−BCDおよびプライマーP004を用いる。プライマーは以下の通り位置する。
0004226657.tif 000002
それらの組成は、
0004226657.tif 000003
である。
M003-P004と呼ばれる、得られた”ネスト化”増幅産物は、図７に示す。これは配列番号８に対応する。
実施例５：逆転写酵素活性のピークで精製されたウィルスのサンプル中での、すでに同定された配列を用いるMSRV-1レトロウィルスゲノムの一部の増幅とクローニング
Frohman（19）により発表された技術由来のPCR技術を用いた。この由来の技術は、増幅されるゲノムの３’末端での特異的プライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域に向けて延長させることを可能にする。この技術変法は、上述の精製ウィルス粒子画分で用いられた製品”5’-AmpliFINDERTM RACE Kit”とともに提供される”Clontech Laboratories Inc.”社（Palo-Alto、カリフォルニア、米国）の文献に記載されている。
ｃDNAの合成とPCR増幅の為にキットプロトコールで用いられる特異的３’プライマーは、各々、以下のMSRV-1配列に相補する：
0004226657.tif 000004
PCR由来の産物は、従来の方法（17）にしたがったアガロースゲル上の精製の後得、ついで１０ｍｌの蒸留水中に再懸濁した。Taqポリメラーゼ特性の１つが２つのDNA鎖の各々の３’末端のアデニンを添加することにあり、得られたDNAは、直接プラスミドに、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）を用いて挿入された。２ｍｌのDNA溶液を５ｍｌの滅菌蒸留水、１ｍｌの１０倍濃縮連結バッファー”１０×LIGATION BUFFER”、２ｍｌの”pCR（商標）ベクター”（25nｇ／ml）と１ｍｌの”TA DNA LIGASE”と混合した。この混合物を一晩１２℃でインキュベートした。以下の工程は、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）の指示にしたがって行った。方法の最後に、組換えバクテリア（白）の白いコロニーを、いわゆる”ミニプレップ”法（17）にしたがって培養して導入されたプラスミドを抽出するために拾った。各組換えコロニーからのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後UV光の下で検出される挿入物を有するプラスミドを、TAクローニング（商標）キットのクローニングプラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補するプライマーとのハイブリダイズの後に、挿入物の配列決定の為に選択した。ついで配列決定の前の反応を、使用の為にシークエンスキット”プリズム・レディ・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems,ref.401384）の使用の為に推奨された方法にしたがって行い、Applied Biosystems”Automatic Sequencer model 373A”装置を用いて、製作者の指示にしたがって自動配列決定を行った。
この技術は、第１に以下に述べるように、一方でPLI-2ラインにより生産された”POL-２”単離体から、他方でLM7PCラインにより生産されたMS7PG単離体から、ショ糖での精製ウィルスの２つの画分に適用した。培養上清を週２回集め、１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離して細胞破砕物を除去しついで−８０℃で凍結するか、そのまま以下の工程に用いる。新鮮なまたは融解した上清は、３０％グリセロールーPBSの緩衝で１００，０００ｇ（またはタイプ４５TLKB-HOTACHI  rotor中３０，０００ｒｐｍ）で、２時間４℃で遠心分離する。上清を除去した後、沈殿ペレットを少量のPBSに取りだし、濃縮非精製ウィルス粒子画分を構成する。濃縮ウィルスは、ついで滅菌PBSバッファー中ショ糖勾配（１５から５０％重量／重量）にかけ、３５，０００rpm（１００，０００ｇ）１２時間、+４℃、スィングローター中で超遠心分離にかける。１０の画分を集め、ホモゲナイズの後、H.Perron（3）に記載された技術したがってその中の逆転写酵素活性のアッセイするために各画分から２０ｍｌを取りだす。”LM7様”RT活性のピークを含む画分をついで、滅菌PBSバッファー中に希釈し、１時間３５，０００rpm（１００，０００ｇ）で、ウィルス粒子を沈殿させるために超遠心分離にかける。こうして得られた精製ウィルス粒子のペレットをついで、RNA抽出に適した少量のバッファー中に取出す。精製細胞外ウィルス粒子から抽出されたこのRNAについて上述のｃDNA合成反応を行う。上述の技術にしたがったPCR増幅により、クローンF1-11を得ることが可能となる。クローンF1-11の配列は、配列番号２と同定され、図８に示す。
このクローンは、すでに配列決定された異なるクローンを用いて、図９に示したような、MSRV-1レトロウイルスの”pol”遺伝子を代表するかなり長い（１．２ｋｂ）領域を定義することができる。この配列は、配列番号１と示され、末端が互いに重なる相違するクローンから再構築され、プライマーと、全体のリーディングフレームを人工的に妨げる増幅またはクローニング技術に関連する人工産物を修正する。この配列は、以下、”MSRV-1  pol*領域”として同定される。HSERV-9配列とのその相同性の度合いは図１２に示す。
図９で、アミノ酸へ翻訳されるリーディングフレームの可能性のある部分は、核酸配列の下に示す。
実施例６：MS患者からまたはコントロールから由来する血漿の異なるサンプル中の特異的MSRV-1とMSRV-2配列の検出
MS患者から、および非MSコントロールからEDTA上に血液サンプルを採取した後、得られたプラスマ中のMSRV-1とMSRV-2ゲノムを検出するために、PCR技術を用いた。
プラスマからのRNAの抽出は、P.Chomzynski（20）により記載された技術にしたがって、グアニジニウム・チオシアネートを含有する一容量のバッファーを、１ｍｌの収集の後−８０℃の凍結保存したプラスマに添加した後に行った。
MSRV-2については、PCRを同じ条件で、以下のプライマーを用いて行った。
-５’プライマー、配列番号１４と同定
0004226657.tif 000005
-３’プライマー、配列番号１５と同定
0004226657.tif 000006
しかしながら、以下のPCRプライマーを用いて、２つの連続する増幅中、DNaseで処理していない核酸のサンプルに対する”ネスト化”PCRにより同様の結果も得られた。
ハイブリダイズ温度４８℃での４０サイクルのこの第1の工程で用いたプライマーは以下の通りである。
-５’プライマー、配列番号２７と同定
0004226657.tif 000007
患者からのサンプルでの第1のPCRで、５’MSRV-2 PCRプライマーに対応する
-３’プライマー、配列番号２８と同定
0004226657.tif 000008
患者からのサンプルでの第1のPCRで、３’MSRV-2 PCRプライマーに対応する
この工程の後、１０ｍｌの増幅産物をとり、すでに増幅された領域内に位置するプライマーを用いた第2のいわゆる”ネスト化”PCR増幅を実施するために用いる。この第2の工程は、プライマーハイブリダイゼーション（”アニーリング”）温度５０℃で３５サイクル行う。反応用量は１００ｍｌである。第2の工程に用いるプライマーは、以下の通りである。
-５’プライマー、配列番号２９と同定
0004226657.tif 000009
患者からのサンプルでのネスト化PCRで、５’MSRV-2 PCRプライマーに対応する
-３’プライマー、配列番号３０と同定
0004226657.tif 000010
患者からのサンプルでのネスト化PCRで、３’MSRV-2 PCRプライマーに対応する
MSRV-1には、２つの工程で増幅を行う。さらに核酸サンプルをDNaseで前もって処理し、RT（AMV逆転写酵素）なしのコントロールPCRを、２つの増幅工程でRT-PCR増幅がNSRV-1RNAから排他的に起こることを証明するようにして行う。RTなしの陽性コントロールの場合、最初の量のRNAサンプルは、再びDNaseで処理し、再度増幅される。
RNAse活性を欠いたDNase処理のためのプロトコールは以下の通りである：抽出されたRNAは”RNAse阻害剤”（Boehringer-Mannheim）存在下、最終濃度１ｍｇ/１０ｍｌのDEPCで処理された水中に分取する；これら１０ｍｌに、１ｍｌの”RNAseフリーDNAse”（Boehringer-Mannheim）と、０，１M/lの酢酸ナトリウムを含む１ｍｌのpH５バッファーと、５ｍM/lのMgSO4を添加する；混合物を１５分間２０℃でインキュベートし、”thermocycler”中で１．５分間９５℃に上げる。
最初のMSRV-1  RT-PCR工程は、特許出願No.EP-A-0,569,272に記載されたRNA増幅法の変法にしたがって実施する。特に、ｃDNA合成工程は、４２℃1時間実施する；PCR増幅を、５３℃のプライマーハイブリダイゼーション（”アニーリング”）温度によって４０サイクル行う。反応容量は１００ｍｌである。
第１の工程に用いるプライマーは、以下の通りである。
-５’プライマー、配列番号１６と同定
0004226657.tif 000011
-３’プライマー、配列番号１７と同定
0004226657.tif 000012
この工程の後、１０ｍｌの増幅産物をとり、すでに増幅された領域内に位置するプライマーを用いた第２のいわゆる”ネスト化”PCR増幅を実施するために用いる。この第2の工程は、プライマーハイブリダイゼーション（”アニーリング”）温度５０℃で３５サイクル行う。反応用量は１００ｍｌである。第2の工程に用いるプライマーは、以下の通りである。
第１の工程に用いるプライマーは、以下の通りである。
-５’プライマー、配列番号１８と同定
0004226657.tif 000013
-３’プライマー、配列番号１９と同定
0004226657.tif 000014
図１０と図１１は、異なるウェルに別個にのせたPCR増幅産物が電気泳動されたエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルの紫外線光下の写真の形でPCRの結果を示すものである。
上の写真（図１０）は、特異的MSRV-2増幅の結果を示す。
ウェル番号８は、DNA分子量マーカーの混合物を含み、ウェル１から７は、順に、MSフリーの４人の健康体コントロール由来の（ウェル１から４）、および疾病の異なるステージの3人のMS患者由来の（ウェル５から７）プラスマの全体のRNAからの増幅産物表す。
このシリーズで、MSRV-2核酸材料は、テストされた３つのうち１つのケースのMSのプラスマ中で検出され、４つのコントロールプラスマからは検出されない。さらに多くのシリーズで得られる異なる結果がこれらの結果を確認する。
下の写真（図１１）は、MSRV-1”ネスト化”RT-PCRによる特異的増幅の結果を示す。
ウェル番号１は、水だけで、AMV逆転写酵素を添加せずに作製したPCR産物を含む；ウェル番号２は、MV逆転写酵素を添加して作製したPCR産物を含む；ウェル番号３は、DNA分子量マーカーの混合物を含む；ウェル番号４から１３は、順に、ショ糖勾配画分（下方向に収集された）から抽出された全体RNAから増幅した産物を含み、この画分はMSRV-1とMSRV-2で感染された培養上清から由来するウィルス粒子のペレットを、H.Perron（13）によって記載されたプロトコールに従った平衡へ遠心分離したものである；ウェル１４は何ものせていない；ウェル１５から１７へは、疾病の異なるステージのMSの３つの異なる患者由来のプラスマから抽出されたRNAの増幅産物をのせた。
MSRV-1レトロウィルスゲノムは、本当に、H.Perron（13）によって記載された技術にしたがって測定される逆転写酵素活性のピークを含有するショ糖勾配画分中に、非常につよい強度で見出された（勾配の画分５、ウェル番号８に置く）。少量の増幅が、最初の画分（ウェル番号４）で起こり、おそらく勾配の表面で浮いた溶解された粒子により放出されたRNAに対応する；同様に、凝集された破砕物は、最後の画分（筒の底）で沈殿し、低い強度の増幅を起こしたいくつかのコピーのMSRV-1ゲノムを有する。
このシリーズでテストした３つのMSプラスマのうち、MSRV-1RNAが１つのケースで非常に強い増幅を示して現れた（ウェル番号１７）。
このシリーズで、MSRV-1レトロウィルスRNAゲノムは、おそらく非常に少量プラスマに存在する細胞外ウィルスの粒子に対応しており、試験した３つのうちＭＳの１つのケースで”ネスト化”RT-PCRにより検出された。さらなるシリーズの得られた他の結果はこれらの結果を確かめる。
さらに、これらのＰＣＲ技術により増幅される配列の特異性は、F.Mallet（21）と文献FR-A-2,663,040に記載されたように”ELOSA”技術により証明し確認することができる。
MSRV-1に対し、上述のネスト化PCRの産物は、MSRV-1のコンセンサスＡとコンセンサスＢ+Ｃ+Ｄの別々の検出を可能にする２つのELOSAシステムで試験することができ、これらは実施例１と図１、図2に記載されたサブファミリーに対応している。実際に、コンセンサスB+C+Dに非常に類似する配列は、本質的に、培養から精製され、あるいはMS患者の細胞外生理液中で増幅されるMSRV-1ウィルス粒子に由来するRNAサンプル中に見出されるものであるが、コンセンサスAに非常に類似する配列は、本質的に、正常非と細胞内DNA中に見出されるものである。
サブファミリーAのPCR産物の捕捉と特異的ハイブリダイゼーションのためのELOSA/MSRV-1システムは、アミン結合を５’末端に有する捕捉オリゴヌクレオチドｃｐV1Aと、ビオチニル化（biotinylated）検出オリゴヌクレオチドdpV1Aを用いる。これらはその配列として、各々
−配列番号３１として同定されるcpV1A
0004226657.tif 000015
配列番号１６と配列番号１７により同定されたプライマーを用いたMSRV-1のネスト化PCRの産物に対するELOSA捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者からのサンプルに対し配列番号１８と配列番号１９により同定されたプライマーを用いた増幅が後続する。
−配列番号３２として同定されるdpV1A
0004226657.tif 000016
配列番号１６と配列番号１７により同定されたプライマーを用いたMSRV-1のネスト化PCRの産物のサブファミリーAに対するELOSA捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者からのサンプルに対し配列番号１８と配列番号１９により同定されたプライマーを用いた増幅が後続する。
サブファミリーB+C+DのPCR産物の捕捉と特異的ハイブリダイゼーションのためのELOSA/MSRV-1システムは、ビオチニル化検出オリゴヌクレオチドdpV1Aと、アミン結合を５’末端に有する捕捉オリゴヌクレオチドｃｐV1Bを用いる。これはその配列として、
−配列番号３３として同定されるdpV1B
0004226657.tif 000017
配列番号１６と配列番号１７により同定されたプライマーを用いたMSRV-1のネスト化PCRの産物のサブファミリーB+C+Dに対するELOSA捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者からのサンプルに対し配列番号１８と配列番号１９により同定されたプライマーを用いた増幅が後続する。
このELOSA検出システムは、MS患者のDNase処理プラスマからこうして増幅されたPCR産物がどれもサブファミリーAの配列を含んでいないこと、全てがサブファミリーB,C,dのコンセンサスにポシティブであることを証明できた。
MSRV-2に対し、同様のELOSA技術が、以下のPCR増幅プライマーを用いて、感染細胞培養から由来する単離体について評価された。
-配列番号３４として同定される５’プライマー
0004226657.tif 000018
培養からのサンプルのPCRのための、５’MSRV-2 PCRプライマーに対応する、
-配列番号３５として同定される３’プライマー
0004226657.tif 000019
培養からのサンプルのPCRのための、３’MSRV-2 PCRプライマーに対応する、
およびアミン結合を５’末端こ有する捕捉オリゴヌクレオチドｃｐV２と、ビオチニル化検出オリゴヌクレオチドｄｐV２、これらはその配列として、各々
−配列番号３６として同定されるcpV２
0004226657.tif 000020
配列番号３４と配列番号３５により同定されたプライマーを用いたMSRV-２のPCRの産物に対するELOSA捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、Shih（12）により定義された縮重プライマーを用いる。
−配列番号３７として同定されるdpV２
0004226657.tif 000021
配列番号３４と配列番号３５により同定されたプライマーを用いたMSRV-２のPCRの産物に対するELOSA捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、Shih（12）により定義された縮重プライマーを用いる。
患者からのサンプルでの増幅のためのすでに記載されたプライマーとは異なる一対のプライマーを用いたこのPCR増幅システムは、in vitro培養の、および分子生物学研究で用いた核酸サンプルのMSRV-2での感染を確認することを可能にした。
すべてのことがらを考慮すると、病原および／または感染因子のゲノムのPCR検出の最初の結果は、フリー”ウィルス”は急性毒性のフェーズの患者の血流中神経系の外で、循環できることが可能であることを示す。このことは、MSの活性フェーズの患者に血液脳関門中の”ギャップ”がほぼ不変に存在することと矛盾しない。
実施例７：MSRV-1レトロウィルスゲノムの”env”遺伝子の配列の取得
実施例５で述べたようにして、Frohman（19）により発表された技術由来のPCR技術を用いた。由来の技術は、増幅されるゲノムの３’末端での特異的プライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域に向けて延長させることを可能にする。この技術変法は、上述の精製ウィルス粒子画分で用いられた製品”5’-AmpliFINDERTM RACE Kit”とともに提供される”Clontech Laboratories Inc.”社（Palo-Alto、カリフォルニア、米国）の文献に記載されている。
”env”遺伝子の領域を包含するMSRV-1レトロウィルスゲノムの３’領域の増幅を実施するために、MSRV-1レトロウィルスと部分的相同性を示す、検出される内因性レトロウィルスHSERV-9（18,24）のそれと同様の同じタイプのLTR領域中のコンセンサス配列を決定する研究を行った。
ｃDNAの合成とPCR増幅のためのキットプロトコールで、同じ特異的３’プライマーを用いた。以下の配列を有する：
0004226657.tif 000022
相補DENA（ｃDNA）の合成と上記プライマーを用いた一方向のPCR増幅は、特許EP-A-0,569,272に記載された方法にしたがった一工程で実施した。
PCR由来の産物は、従来の方法（１７）にしたがったアガロースゲル上の精製の後抽出され、ついで１０ｍｌの蒸留水中に再懸濁した。Taqポリメラーゼ特性の１つが２つのDNA鎖の各々の３’末端のアデニンを添加することにあり、得られたDNAは、直接プラスミドに、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）を用いて挿入された。２ｍｌのDNA溶液を５ｍｌの滅菌蒸留水、１ｍｌの１０培濃縮連結バッファー”１０×LIGATION BUFFER”、２ｍｌの”pCR（商標）ベクター”（25nｇ／ml）と１ｍｌの”TA DNA LIGASE”と混合した。この混合物を一晩１２℃でインキュベートした。以下の工程は、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）の指示にしたがって行った。方法の最後に、組換えバクテリア（白）の白いコロニーを、いわゆる”ミニプレップ”法（１７）にしたがって培養して導入されたプラスミドを抽出するために拾った。各組換えコロニーからのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後UV光の下で検出される挿入物を有するプラスミドを、TAクローニング（商標）キットのクローニングプラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補するプライマーとのハイブリダイズの後に、挿入物の配列決定の為に選択した。ついで配列決定の前の反応を、使用の為にシークエンスキット”プリズム・レディ・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems,ref.401384）の使用の為に推奨された方法にしたがって行い、Applied Biosystems”Automatic Sequencer model 373A”装置を用いて、製作者の指示にしたがって自動配列決定を行った。
この技術アプローチは、以下述べるようにして、実施例２で述べたような、Perronら（3）に記載された技術により検出可能な逆転写酵素活性を有するMS患者のリンパ球から確立されたBリンパ芽球様細胞ラインにより生産される培養上清の混合物から濃縮されたウィルス粒子のサンプルに適用した：培養上清を週２回集め、１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離して細胞破砕物を除去しついで−８０℃で凍結するか、そのまま以下の工程に用いる。新鮮なまたは融解した上清は、３０％グリセロール−PBSの緩衝で１００，０００ｇで、２時間４℃で遠心分離する。上清を除去した後、沈殿ペレットを少量のPBSに取りだし、濃縮非精製ウィルス粒子画分を構成する。こうして得られた精製ウィルス粒子のペレットをついで、RNA抽出に適した少量のバッファー中に取出す。精製細胞外ウィルス粒子から抽出されたこのRNAについて上述のｃDNA合成反応を行う。
上述の技術にしたがったRT-PCR増幅により、クローンFBd3を得ることが可能となる。クローンFBd3の配列は、配列番号４６と同定され、図１３に示す。
図１４において、クローンFBd3とHSERV-9レトロウィルスとの間の配列相同性は、６５％以上の相同性を有する部分が、連続線によりマトリックスチャート上に示される。クローン（５’末端にpol遺伝子を有し、３’末端にenv遺伝子とLTRを有する）のフランキング領域に相同性があるが、内部領域は、まったく異なり、HSERV9の”env”遺伝子とは、弱い相同性さえ示さないことがわかる。さらにクローンFBd3が、欠損内因性HSERVー9で記載されたものと比べて、より長い”env”領域を含むことは明白である。こうして内部の変化する領域は、HSERV-9欠損遺伝子と部分的相同性のある領域の間の”挿入”を構成することをみることができる。
実施例８：クローンPSJ17とFBd3との間に存在するMSRV-1レトロウィルスゲノムの領域の増幅、クローニング、配列決定
４つのオリゴヌクレオチド、F1,B4,F6,およびB1が、POL-2とMS7PG株の精製ウィルス粒子由来のRNAを増幅するために定義された。コントロール反応は、汚染物の存在をチェックするように行われた（水との反応）。増幅は、特許出願EP-A-0,569,272に記載されたプロトコールしたがったRT-PCRの第1工程と、その後の増幅第1領域に向かった内部のプライマーを用いた第1工程の産物１０ｍｌについて行われるPCR（”ネスト化”PCR）の第2工程からなる。最初のRT-PCRサイクルでは、プライマーF1とB4を用いる。第2のPCRサイクルでは、プライマーF6とプライマーB1を用いる。プライマーは以下の通り位置する。
0004226657.tif 000023
それらの組成は、
0004226657.tif 000024
得られた”ネスト化”増幅産物、および”t pol”と示されたものは、図１５に示す。これは配列番号５１に対応する。
実施例９：MSRV-1を製造する培養の細胞内でRNAとして発現される新しい配列を取得すること、MSRV-1レトロウィルスゲノムの”env”領域を含むこと
cDNAのライブラリーは、実施例２で述べたように、Perronら（3）により記載された技術にしたがって検出できる逆転写酵素活性を保有するMS患者のリンパ球から確立された、Bリンパ芽球様細胞ラインの細胞から抽出されたメッセンジャーRNAから、”cDNA合成モジュール、cDNA迅速アダプターライゲーションモジュール、ｃDNA迅速クローニングモジュールおよびラムダgt10インビトロパッケージングモジュール”キット（Amersham、ref  RPN1256Y/Z, RPN1712, RPN1713, RPN1717, N334Z）の製作者により記載された方法にしたがって製造される。
オリゴヌクレオチドは、核酸ライブラリー中に、クローンPSJ17（pol）の３’領域とクローンFBd3の５’（LTR）領域との間に、クローン化されたcDNAを増幅する為に定義された。汚染物の存在をチェックするようにコントロール反応を行った（水との反応）。プライマーの異なるペアを有するライブラリー中にクローン化された核酸に対し実施されるPCR反応は、pol配列をMSRV-1タイプenvまたはLTR配列とリンクする、一連のクローンの増幅を可能にした。
２つのクローンが、細胞内ｃDNAライブラリーで得られる配列を代表するものである：
-JLBc１、その配列は図１６に配列番号５２として示される
-JLBc２、その配列は図１７に配列番号５３として示される
クローンJLBc１とJLBc２の配列は、クローンFBd3の配列と相同性があり、図１８と１９に表される。クローンJLBc１とクローンJLBc２との間の相同性は、図２０に示す。
クローンJLBc１とJLBc２の間の一方の、および」HSERV9配列との間の他方の相同性は、各々図２１と２２に示す。
JLB1,JLB2,およびFBd３との間の相同性領域は、いくつかの配列と”挿入”のサイズのバリエーションをもって、実施例８で述べたようなHSERV-9 env配列中には存在しない（”挿入された”）付加的な配列含むことは、特記される。
クローン化された”pol”領域が、HSERV-9と非常に相同性があり、リーディングフレームを有しておらず（自動シークエンサーを含めて、用いられる技術により誘導される配列エラーを考慮して）、ウィルス粒子から得られるMSRV-1配列から異なることもまた特記される。これらの配列がMSRV-1粒子を発現する細胞のRNAからクローン化されたという事実から、それらがERV9ファミリーに関連する内因性レトロウィルス因子から生じる可能である。このことは、明らかにMSRV-1ゲノムRNAでない同じRNA上にpolとenv遺伝子が存在するという事実から見てより可能性がある。これらのERV9因子のうちのいくつかが、相同またはヘテロなトランスアクチベータをコードする複製可能なウィルスにより活性化され得る機能性LTRを有している。これらの条件下で、MSRV-1とHSERV-9の間の関連は、相同、あるいはむしろ同一な、MSRV-1トランスアクチベーティングタンパクにより、おそらく検出される（あるいはそうでない）内因性ERV9因子のトランスアクチベーションをおこす。
このような現象は、MSRV-1と関連する内因性因子との発現の間のウィルス感染を含むことができる。このような干渉は、一般的にいわゆる”欠損−干渉”発現を起こし、この特徴のいくつかは、研究されたMSRV-1感染培養中に見出された。さらに、このような現象は、ポリペプチドの発現の発生を欠くものではなく、必ずしも免疫システムで寛容でない内因性レトロウィルスタンパク質の発生さえも起こる。MSRV-1に関連し、後者により誘導される内因性因子のこのような異常発現のスキームは、異常な抗原を複製し、それゆえにMSにみられるような自己免疫保有の誘導に寄与するようである。
しかしながら、クローン化JLBc1とJLBc2が、ERV9と完全に異なる付加的領域を含むより長いenv領域を有するものであるすでに述べたERV9またはHSERV9の配列と異なることを特記することが必要である。ゆえに、それらの内因性ERV9ファミリーとの類似性は、定義することができるが、それらは明白にこれまでに述べられていない新規因子を構成する。実際に、”Entrez”ソフトウェア（NCBI、NIH,ベセスダ、USA）ヴァージョンNo.15（1995）で利用可能な核酸配列のデータバンクの質問は、これらのクローンのenv領域中の既知の相同性配列の同定をすることができなかった。
実施例１０：MSRV-1レトロウィルスゲノムの５’polと３’gag領域に位置する配列の取得
実施例５で述べたように、Frohman（19）により発表された技術由来のPCR技術を用いた。由来の技術は、増幅されるゲノムの３’末端での特異的プライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域に向けて延長させることを可能にする。この技術変法は、上述の精製ウィルス粒子画分で用いられた製品”5’-AmpliFINDER（商標）RACE Kit”とともに提供される”Clontech Laboratories Inc.”社（Palo-Alto、カリフォルニア、米国）の文献に記載されている。
pol配列から始まり、gag遺伝子に向けて伸びるMSRV-1レトロウィルスゲノムの５’領域の増幅を実施するために、MSRV-1特異的プライマーを定義した。
cDNAの合成とPCR増幅の為にキットプロトコールで用いられる特異的３’プライマーは、各々、以下のMSRV-1配列に相補する：
0004226657.tif 000025
PCR由来の産物は、従来の方法（17）にしたがったアガロースゲル上の精製の後抽出され、ついで１０ｍｌの蒸留水中に再懸濁した。Taqポリメラーゼ特性の１つが２つのDNA鎖の各々の３’末端のアデニンを添加することにあり、得られたDNAは、直接プラスミドに、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）を用いて挿入された。２ｍｌのDNA溶液を５ｍｌの滅菌蒸留水、１ｍｌの１０培濃縮連結バッファー”１０×LIGATION  BUFFER”、２ｍｌの”pCR（商標）ベクター”（25nｇ／ml）と１ｍｌの”TA  DNA  LIGASE”と混合した。この混合物を一晩１２℃でインキュベートした。以下の工程は、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）の指示にしたがって行った。方法の最後に、組換えバクテリア（白）の白いコロニーを、いわゆる”ミニプレップ”法（１７）にしたがって培養して導入されたプラスミドを抽出するために拾った。各組換えコロニーからのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後UV光の下で検出される挿入物を有するプラスミドを、TAクローニング（商標）キットのクローニングプラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補するプライマーとのハイブリダイズの後に、挿入物の配列決定の為に選択した。ついで配列決定の前の反応を、使用の為にシークエンスキット”プリズム・レディ・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems,ref.401384）の使用の為に推奨された方法にしたがって行い、Applied Biosystems”Automatic Sequencer model 373A”装置を用いて、製作者の指示にしたがって自動配列決定を行った。
この技術アプローチは、以下述べるようにして、実施例２で述べたような、Perronら（3）に記載された技術により検出可能な逆転写酵素活性を有するMS患者のリンパ球から確立されたBリンパ芽球様細胞ラインにより生産される培養上清の混合物から濃縮されたウィルス粒子のサンプルに適用した：培養上清を週２回集め、１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離して細胞破砕物を除去しついで−８０℃で凍結するか、そのまま以下の工程に用いる。新鮮なまたは融解した上清は、３０％グリセロール−PBSの緩衝で１００，０００ｇで、２時間４℃で遠心分離する。上清を除去した後、沈殿ペレットを少量のPBSに取りだし、濃縮非精製ウィルス粒子画分を構成する。こうして得られた精製ウィルス粒子のペレットをついで、RNA抽出に適した少量のバッファー中に取出す。精製細胞外ウィルス粒子から抽出されたこのRNAについて上述のcDNA合成反応を行う。
上述の技術にしたがったRT-PCR増幅により、クローンGM3を得ることが可能となる。クローンFBd3の配列は、配列番号５６と同定され、図２３に示す。
図２４において、クローンGMP3とHSERV-9レトロウィルスとの間の配列相同性は、６５％以上の相同性を有する部分は、連続線によりマトリックスチャート上に示される。
要約すると、図２５は、既知のERV9ゲノムに関連する、上記研究した異なるクローンの位置づけを示す。図２５でMSRV-1 env領域は、参照ERV9 env遺伝子より長いので、挿入された材料は、示されたクローン（JLBc1,JLBc2、FBd3）の間で配列とサイズがさまざまになり得ることを示すという理解に基づき、”V”にしたがって挿入点の上に付加領域が示される。そして図２６はMSRV-1 pol*領域中研究された異なるクローンの位置を示す。
上記クローンGM3によって、リーディングフレームと考えられる部分を定義することができた。すべてのpol遺伝子をカバーしており、配列番号５７にしたがって参照され、連続する図２７ａから２７ｃに示される。
実施例１１：ヒト血清中抗MSRV-1特異的抗体の検出
MSRV-1レトロウィルスのpol遺伝子とこの遺伝子のオープンリーディングフレーム配列の同定は、上記遺伝子の領域、配列番号４０のアミノ酸配列、配列番号３９を決定することを可能にした（図２８）。
pol遺伝子にコードされたMSRV-1逆転写酵素のタンパク質配列のフラグメントに対応する異なる合成ペプチドは、MS患者と健康な血清に関してその抗原特異性をテストされた。
ペプチドは、Merrifieldの技術（Barany GおよびMerrifielsd R.B,1980, Peptides、２、１−２８４、Gross EおよびMeienhofer J，編Academic Press、New York）にしたがった固相合成により化学的に合成した。実際の詳細は以下に示す通りである。
a）ペプチド合成：
フェニルアセトアミドメチル（PAM）／ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（Applied Biosystems, Inc. Foster City，カリフォルニア）上で、”Applied Biosystems 430A”自動シークエンサーを用いてペプチドを合成した。アミノ酸をヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）エステルの形状で結合する。用いるアミノ酸は、Novabiochem（Lauferlfingen，スイス）またはBachem（Bubendorf、スイス）から取得する。
化学合成は、N-メチルピロリドン（NMP）を溶媒とする二重カップリングプロトコール用いて実施した。ペプチドは、側鎖保護基とともに、適当な装置（タイプＩ開裂装置、ペプチド・インスティチュート、大阪、日本）内でフッ化水素酸（HF）を用いて樹脂から切り出した。
１ｇのペプチド樹脂に対し、１０ｍｌのＨＦ、１ｍｌのアニソールおよび１ｍｌのジメチルサルファイド５ＤＭＳを用いる。混合物を−２℃、４５分間攪拌する。ＨＦをついで減圧下で蒸発させる。エーテルでよく洗浄した後、ペプチドを１０％酢酸で樹脂から溶出させ、ついで凍結乾燥する。
ペプチドは、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８タイプカラム（２５０×２１ｍｍ）（The Separation Group、Hesperia，カリフォルニア）で予備的な高速液体クロマトグラフィにより精製する。流量２２ｍｌ／分でのアセトニトリル勾配で溶出する。収集画分は、流量１ｍｌ/分でのＶＹＤＡＣ（商標）Ｃ１８分析カラム（２５０×４．６ｍｍ）で定組成条件の溶離によりモニターする。同じリテンションタイムを有する画分は、プールし、凍結乾燥する。優勢的な画分を、ついで上記システムを用いて分析高速液体クロマトグラフィにより分析する。認容できる純度と考えられるペプチドは、それ自身、クロマトグラムの９５％以上を示す単一ピークで現れる。
精製ペプチドは、ついでアミノ酸組成をモニターする目的で、Applied Biosystems 420H自動アミノ酸アナライザーを用いて分析する。ペプチドの（平均）化学分子量の測定は、DEC-VAX２０００捕捉システム（VG analytical Ltd,マンチェスター、イギリス）に連結されたVG.ZAB.ZSEQ二重フォーカス器具で、陽イオンモードでLSIMSマススペクトルを用いて得られる。
異なるペプチドの反応性は、MS患者の血清と健康なコントロールの血清に対して試験した。このことは、POL2Bと呼ばれるペプチドを選択することを可能にし、このペプチドの配列は、MSRV-1のpol遺伝子によりコードされる、以下の、識別名配列番号３９で、図２８中に示される（ヌクレオチド１８１から３３０）。
ｂ）抗原の特性：
POL2Bペプチドの抗原の特性は、以下に示すELISAプロトコールにしたがって示した。
凍結乾燥されたPOL2Bペプチドは滅菌蒸留水に1mg／ｍｌに溶解した。この保存溶液を分けて、2週間の使用のために＋４℃にて保存し、２ヶ月以内の使用のために、−２０℃にて凍結した。分取したものをPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中で、最終ペプチド濃度が１マクログラム／ｍｌとなるように希釈する。この希釈液１００マイクロリットルをマイクロタイトレーションプレート（”高結合（high-binding）”プラスチック、COSTAR ref：3590）の各ウェルに置く。プレートは、”プレート・シーラー（plate-sealer）”タイプの接着剤でカバーし、一晩＋４℃でプラスチックへのペプチドの吸着相のために保存する。接着剤を除去し、プレートを３００マイクロリットル容量の溶液A（１×PBS、０．０５％ Tween 20（商標））で３回洗浄し、ついで吸収紙の上に倒立させる。こうして排水したプレートに各ウェルにつき２００マイクロリットルの溶液B（溶液A＋１０％のヤギ血清）を入れ、ついで接着剤でカバーし、４５分間から1時間、37℃でインキュベートする。プレートは、ついで上記溶液Aで3回洗浄する。
テスト血清サンプルは、溶液Bで１／５０に前もって希釈し、１００マイクロリットルの各希釈テスト血清を各マイクロタイトレーションプレートのウェルの中に置く。陰性コントロールを、１００マイクロリットルの溶液Bとして各プレートの１つのウェル内に置く。接着剤でカバーされたプレートはついで１〜３時間、３７℃でインキュベートする。プレートはついで上記溶液Aで3回洗浄する。平行して、ヒトIgG（Sigma Immunochemicals ref.A6029）またはIgM（Cappel ref.55228）に対するペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体を、溶液Bで希釈する（抗IgGについて1/5000の希釈、抗IgMについて1/1000の希釈）。１００マイクロリットルの標識抗体の適当な希釈液は、ついでマイクロタイトレーションプレートの各ウェルに置き、接着剤でカバーされたプレートはついで１から２時間３７℃でインキュベートする。プレートはついで上述のようにさらに洗浄する。平行して、ペルオキシダーゼ基質を、”Sigmaファスト（fast）OPDキット”（Sigma Immunochemicals ref.P9187）指示にしたがって調製する。１００マイクロリットルの基質溶液は、各ウェルに置き、プレートは遮光して２０から３０分間室温に置く。
発色反応が安定化したら、プレートを直ちにELISAプレート分光光度計に置き、各ウェルの波長４９２nmでの吸光度（OD）を読み取る。あるいは、３０マイクロリットルの１N HClを各ウェルに入れて、反応を止め、２４時間以内にプレートを分光光度計で読み取る。
血清のサンプルは、2連でまたは３連で導入し、テストされる血清に対応する吸光度（OD）を、同じ希釈の同じサンプルで得られたOD値の平均をとって計算する。各血清のネットODは、血清の平均OD−陰性コントロール（溶液B：PBS、０．０５％ Tween 20（商標）、１０％ヤギ血清）の平均ODに対応する。
ｃ）ELISAによる抗−MSRV-1 IgG抗体の検出
上述の技術は、Poser（23）の基準にしたがって確実にあるいは仮にMSと診断された２９患者の血清中の、および３２の健康なコントロール（献血者）の血清中の抗−MSRV-1特異的IgG抗体の存在下でテストするPOLB2ペプチドで用いた。
図２９は、抗IgG抗体を用いてテストされた各血清について結果を示す。各垂直棒は、テストした血清のネット吸光度（４９２nmでのOD）を示す。縦座標は、垂直棒の頂点のネットODを示す。垂直の破線の左にある最初の２９の垂直棒は、テストされたMSの２９ケースの血清を示し、垂直の破線の右にある３２の垂直棒は、３２の健康なコントロール（献血者）の血清を示す。
テストされたMS血清に対するネットOD値の平均は、０．６２である。図は、そのネットODがコントロール母集団のグループ値を超える５つのコントロールを明らかにしている。これらの値は、症状のない血清陽性の患者の特異的IgG存在を示す可能性がある。こうして、２つの方法が、テストの陽性の統計的閾値を決定するために評価された。
コントロールに対するネットOD値の平均は０．３６で、高いネットOD値を有するコントロールを含む。０．５以上のネットODを有する５つのコントロールなしでは、”陰性”コントロールの平均は、０．３３である。陰性コントロールの標準偏差は０．１０である。陽性の理論的閾値は、
閾値（血清陰性コントロールのネットOD値の平均）＋（２または３×血清陰性コントロールのネットOD値の標準偏差）
の式にしたがって計算されることができる。
最初のケースで、症状のない血清陽性があると考えられ、閾値は
０．３３＋（２×０．１０）＝０．５３である。陰性の結果は、ペプチドのエピトープに対して特異的な抗体の存在の非特異的”バックグラウンド”を示す。
第2のケースで、みたところ血清陽性である血清を排除することなしで明らかに健康な血液提供者からなるコントロールのセットが参照ベースとしてとられたなら、”非-MS”標準偏差は０．１１６である。そして閾値は
０．３６＋（２×０．１１６）＝０．５９である。
この分析にしたがえば、テストはMSに特異的である。これに関して、図１に示すように、コントロールがどれもこの閾値を越えるネットODを有していないために、テストがMSに特異的であることがみられる。実際に、この結果は、MS患者の抗体力価が、大部分が、MSRV-1に接触したことのある健康な人より高いという事実を反映している。
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最初の計算方法にしたがって、図２９と表１に示すように、２９のMS血清のうち２６が陽性結果を示し（０．５以上のネットOD）、POL2Bペプチドに対して、それゆえにpol遺伝子によりコードされるMSRV-1レトロウィルスの逆転写酵素の一部に対して、そしてその結果MSRV-1レトロウィルスに対して、特異的なIgGの存在を示す。こうして、約９０％のMS被検患者が、POL2Bペプチドがもつエピトープに対して反応し、後者に対する循環IgGを有する。
明らかに健康な３２血液提供者のうちの５つが、陽性の結果を示す。そのため、症状のない母集団の約１５％が、それ自身特異的血清IgGの持続性を明らかにする活性免疫をもたらす条件下で、POL2Bペプチドが有しているエピトープと接触したかもしれないことは明白である。これらの条件は、MSRV-1レトロウィルスでの（および／またはその再活性での）感染の間、MSRV-1レトロウィルス逆転写酵素に対する免疫と矛盾しない。明白な神経毒性再生MSがこれらの血清陽性コントロール中に存在しないことは、それらが健康なキャリアで、感染ウィルスを自身が免疫した後に除去したことを示すかもしれないし、あるいはそれらが慢性のキャリアの危険のある母集団を構成することを示すかもしれない。実際には、MSの高い罹患率の領域の環境中に存在する毒性因子がこの疾病の原因かもしれないことを示す、疫学的データが、MSフリーの母集団の画分が必ずそのような毒性因子と接触したことを意味する。それはMSRV-1レトロウィルスが、MS源でのこの”毒性因子”の全部または一部を構成することを示し、ゆえに健康母集団からとったコントロールがMSRV-1レトロウィルスの成分に対するIgGタイプ抗体を有することは、正常である。したがって、血清罹患率でのMSとコントロール母集団との間の相違点は、非常に重要である：”カイ二乗”試験、ｐ＜０．００１。ゆえにこれらの結果はMSでのMSRV-1の原因病理上の役割を示す。
ｄ）ELISAによる抗−MSRV-1 IgM抗体の検出
POL2BペプチドによるELISA技術は、Poser（23）の基準にしたがって確実にあるいは仮にMSと診断された３６患者の血清中の、および４２の健康なコントロール（献血者）の血清中の抗−MSRV-1特異的IgM抗体の存在下でテストするのに用いた。
図３０は、抗IgM抗体を用いてテストされた各血清について結果を示す。各垂直のバーは、テストした血清のネット吸光度（４９２nmでのOD）を示す。縦座標は、垂直バーの頂点のネットODを示す。垂直の破線の左にある最初の３６の垂直バーは、テストされたMSの３６ケースの血清を示し、垂直の破線の右にある３２の垂直バーは、４２の健康なコントロール（献血者）の血清を示す。図の中央の横線は、陽性の結果（バーの頂点が超えているもの）と陰性の結果（バーの頂点が達していないもの）の境界を定義する理論的閾値を示す。
被検MSケースに対するネットOD値の平均は、０．１９である。
コントロールに対するネットOD値の平均は、０．０９である。
陰性コントロールの標準偏差は０．０５である。
コントロールの平均と標準偏差の差異が少ないことを考えて、陽性の理論的閾値は、
閾値（血清陰性コントロールのネットOD値の平均）＋（３×血清陰性コントロールのネットOD値の標準偏差）
の式にしたがって計算されることができる。
閾値は、０．０９＋（３×０．０５）＝０．２６、または実際には、０．２５である。陰性の結果は、ペプチドのエピトープに対して特異的な抗体の存在の非特異的”バックグラウンド”を示す。
この分析にしたがって、図３０と対応する表２に示すように、IgMテストはMSに特異的である。その理由はコントロールがどれもこの閾値を越えるネットODを有していないためである。３６MS血清のうちの７つが陽性のIgM結果を示す。ここで、臨床データの研究が、これらの陽性血清が、非治療患者のMSの最初の攻撃あるいは急性攻撃の間にとられたことを明らかにする。病原因子に対するIgMが、その病原因子の潜伏期の後、初期感染の間または再活性の間生成されることは知られている。
血清罹患率でのMSとコントロール母集団との間の相違点は、非常に重要である：”カイ二乗”試験、Ｐ＜０．００１。
ゆえにこれらの結果はMSでのMSRV-1の原因病理的役割を示す。
POL2Bペプチドに対するIgMとIgG抗体の検出は、MSRV-1感染のおよび／またはMSRV-1のウィルス再活性の過程を評価することを可能にする。
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ｅ）POL2Bペプチドの免疫優生エピトープのサーチ：
非特異的バックグラウンドを減らすために、および抗MSRV-1抗体の応答の検出を最適化するために、オクタペプチドの合成を、連続する１つのアミノ酸ステップで進め、POL2Bにより決定された配列の全体をカバーしながら、以下にのべるプロトコールにしたがって実施した。
識別名配列番号３９で示したアミノ酸配列６１−１１０をカバーする重なるオクタペプチド化学合成は、Cambridge Research Biochemicalｓにより商品名Spotscanの名で市販されているBERGらの技術（1989. J.Ann.Chem.Soc., 111, ８024-8026）にしたがって活性セルロース膜上で実施した。この技術は、たくさんのペプチドの同時合成とそれらの分析を可能にする。
合成は、アミノ基がFMOC基（Nova Biochem）で保護され、側鎖基がトリチル、ｔ−ブチルエステルまたはｔ−ブチルエーテルなどの保護基で保護されたエステル化アミノ酸によって行う。エステル化アミノ酸をＮ−メチルピロリドン（NMP）中に300ｎmの濃度で溶解し、０．９ｍｌをブロモフェノールブルーのデポジットのスポットに適用する。１５分間のインキュベーションの後、アミノ酸のさらなる適用はさらに１５分間のインキュベーションにしたがって実施する。もし２つのアミノ酸の間のカップリングが正しく行われたなら、着色修飾（青から黄緑への変化）が観察される。DNFで3回洗浄した後、無水酢酸によってアセチル化工程を行う。ついで合成プロセス中のペプチドの末端アミノ基が、DMF中の２０％ピリジンではずされる。デポジットのスポットをDMF中ブロモフェノールブルーの１％溶液で再度染色し、メタノールで３回洗浄し、乾燥する。この操作のセットは、アミノ酸の添加の1回のサイクルを構成し、このサイクルは合成が完了するまで繰り返される。すべてのアミノ酸が添加されたとき、最後のアミノ酸のNH2末端基がDMF中の２０％ピリジンではずされ、無水酢酸でアセチル化される。側鎖を保護する基は、ジクロロメタン／トリフルオロ酢酸／トリイソブチルシラン（５ｍｌ／５ｍｌ／２５０ｍｌ）混合物によって除去される。ペプチドの免疫活性はついでELISAでテストされる。
２つの異なる膜上での2連で異なるオクタペプチドの合成の後、後者はメタノールでリンスし、TBS（０．１M Tris pH７．２）中で洗浄し、ついで一晩室温で飽和バッファー中でインキュベートする。何度かTBS-T（０．１M Tris pH７．２−０．０５％ Tween 20）中で洗浄した後、１つの膜をMS患者由来の１／５０希釈の参照血清ととともにインキュベートし、他方の膜を健康なコントロールの血清のプールの１／５０希釈ととともにインキュベートする。膜は４時間室温でインキュベートする。TBS-Tで洗浄した後、β−ガラクトシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンコンジュゲート（ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズにより市販されている）を１／２００の希釈で添加し、混合物を２時間室温でインキュベートする。０．０５％TBS-TとPBSでの膜の洗浄の後、異なるスポットでの免疫活性を、カリウム中５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−D−ガラクトシドを添加してビジュアル化する。スポットの着色の強度を、添付する図３１から３３に示すように、０から５の相対値によって定性的に評価する。
こうして、POL2Bペプチドの各末端での２つの免疫優生領域を決定することが可能である。この領域は、図３４にしたがって、各々、アミノ酸配列６５−７５（配列番号４１）と９２−１０９（配列番号４２）に対応し、かつ各々、オクタペプチドPhe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp（FCIPVRPD）とArg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe（RPDSQFLF）の間、およびThr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg（TVLPQGFR）とLeu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln（LFGQALAQ）の間に位置する。また、オクタペプチドLeu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu（LFAFEDPL）（配列番号４３）とPhe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn（FAFEDPLN）（配列番号４４）示されるコントロール血清によってバックグラウンドを生産しないため、反応性は低いが特異性は高い領域を決定できる。
これらの領域は、通常の技術にしたがって、より特異的でより免疫活性が高い新しいペプチドを定義することが可能である。
ゆえに、なされた発見の結果と発明者により開発された方法として、MSRV-1感染および／または再活性化の診断を実施すること、およびMS治療法を、患者の生理液中のこれらの因子の検出を”中和する”ことにおける効力に基づき評価することが可能である。さらに、まだMSの神経的な兆候を示していない個体で、初期に検出したことは、それが神経的障害の始まりに対応する病変段階に先立つという事実からみて、その後の臨床的経過に関してますます効果的であろう治療を構成することを可能にした。ここで、現在、MSの診断は、神経病変の症状がはじまる前には、確立できておらず、したがって治療は、すでにすすんだ中枢神経系の病変を示唆する臨床写真の出現する前には構成されていない。ヒトにおけるMSRV-1および／またはMSRV-2感染および／または再活性化の診断は、それゆえ決定的に重要であり、本発明はそのための手段を提供する。
こうして、MSRV-1感染および／または再活性化の診断の実施以外も、MSの治療法を、患者の生理液中のこれらの因子の検出を”中和する”ことにおける効力に基づき評価することが可能である。
実施例１２：MSRV-1レトロウィルスのgag遺伝子の一部を含むクローンLB19の取得
Gonzalez-Quintial Rら（19）とPLAZAら（25）により発表された技術由来のPCR技術を用いた。上述のように精製されたウィルス粒子の画分から抽出された全体のRNAから、cDNAは、増幅されるゲノムの３’末端の特異的プライマー（配列番号６４）を用いて、EXPAND（商標）逆転写酵素（Boehringer-Mannheim）を用いて合成された。
0004226657.tif 000028
精製の後、ポリ（G）テールが、Boehringer-Mannheim社により市販されている”ターミナルトランスフェラーゼキット”を用いて、製作者のプロトコールにしたがってcDNAの５’末端に添加される。
アンカリング（anchoring）PCRが以下の５’プライマーと３’プライマーを用いて実施された。
0004226657.tif 000029
次に、セミネスト化（semi-nested）アンカリングPCRが以下の５’プライマーと３’プライマーを用いて実施された。
0004226657.tif 000030
PCR由来の産物は、従来の方法（17）にしたがったアガロースゲル上の精製の後精製され、ついで１０ｍｌの蒸留水中に再懸濁した。Taqポリメラーゼ特性の１つが２つのDNA鎖の各々の３’末端のアデニンを添加することにあり、得られたDNAは、直接プラスミドに、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）を用いて挿入された。２ｍｌのDNA溶液を５ｍｌの滅菌蒸留水、１ｍｌの１０培濃縮連結バッファー”１０×LIGATION  BUFFER”、２ｍｌの”pCR（商標）ベクター”（25nｇ／ml）と１ｍｌの”TA  DNA  LIGASE”と混合した。この混合物を一晩１２℃でインキュベートした。以下の工程は、TAクローニング（商標）キット（British Biotechnology）の指示にしたがって行った。方法の最後に、組換えバクテリア（白）の白いコロニーを、いわゆる”ミニプレップ”法（17）にしたがって培養して導入されたプラスミドを抽出するために拾った。各組換えコロニーからのプラスミド調製物は、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲル上で分析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した後UV光の下で検出される挿入物を有するプラスミドを、TAクローニング（商標）キットのクローニングプラスミド上に存在するSp6プロモーターに相補するプライマーとのハイブリダイズの後に、挿入物の配列決定の為に選択した。ついで配列決定の前の反応を、使用の為にシークエンスキット”プリズム・レディ・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems,ref.401384）の使用の為に推奨された方法にしたがって行い、Applied Biosystems”Automatic Sequencer model 373A”装置を用いて、製作者の指示にしたがって自動配列決定を行った。
上記技術にしたがったPCR増幅は、H.Perronら（3）により記載された技術により、Espstein-Barrウィルス（EBV）株B95で不滅であり、Perronら（3）と仏国特許出願MS10,11,12に記載されたような逆転写酵素活性に関連するレトロウィルス粒子を発現する、MS患者のリンパ球から確立されたBリンパ球の培養上清から、ショ糖勾配で精製された感染粒子の画分の核酸から合成されたcDNAで用いた。クローンLB19は、配列が配列番号５９で同定され、図３５に示される。
クローンは、すでに配列決定されたクローンGM3とクローンG+E+A（実施例１５参照）で、図３６で示すように、MSRV-1レトロウィルスのgag遺伝子のかなりの部分を示す６９０塩基対の領域を定義することができる。配列番号８８で示されたこの配列は、末端が重なる異なるクローンから再構成される。この配列は、MSRV-1”gag*”領域の名で同定される。図３６で、アミノ酸へ翻訳されるリーディングフレームと考えられる部分は核酸配列の下に示す。
実施例１３：ＭＳＲＶ−１レトロウイルスに関係したｐｏｌ遺伝子領域と糖タンパク質用の潜在的リーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む外見上不完全なＥＮＶ領域とを含むクローンＦＢｄ１３の獲得
ウイルスＲＮＡの抽出：該ＲＮＡは以下に概略的に記した方法に従って抽出した。
ＭＳに罹った患者のＢリンパ球の培養上清のプール（６５０ｍｌ）は、10,000ｇで３０分間遠心分離される。得られたウイルス塊は、ＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の３００マイクロリットル中に再懸濁させる。その材料は、３７℃で３０分間、ＤＮＡse（100mg/ml）／ＲＮＡse（50mg/ml）混合物で、ついで４６０℃で３０分間プロテイナーゼＫ（50mg/ml）で処理される。
核酸は、６０℃に加熱した１容量のフェノール／０．１％ＳＤＳ（V/V）混合物により抽出され、ついで１容量のフェノール／クロロホルム（1:1;V/V）により再抽出される。
該材料の沈殿は、０．１Ｖの酢酸ナトリウムｐＨ５．２の存在下で、２．５Ｖのエタノールを用いて実施される。遠心分離の後で得られたその塊は、滅菌ＤＥＰＣ水の５０マイクロリットル中に再懸濁される。
そのサンプルは、室温で３０分間、「ＲＮＡseフリー」のＤＮＡseの５０ｍｇ／ｍｌにより再度処理され、１容量のフェノール／クロロホルムにより抽出され、そして酢酸ナトリウムとエタノールの存在において沈殿させる。
得られたＲＮＡは、２６０ｎｍでＯＤを読むことにより定量化される。ＭＳＲＶ−１の存在とＤＮＡ汚染物の不在は、ＰＣＲ、並びにＭＳＲＶ−１ゲノムに特異的なＥＬＯＳＡと組み合わせたＭＳＲＶ−１特異的ＲＴＰＣＲによってモニターされる。
ｃＤＮＡの合成：
５ｍｇのＲＮＡは、いくらかの修正を伴う「ｃＤＮＡ合成モジュール」キット（ref RPN 1256, Amersham）の取扱説明書に従いポリ（DT）オリゴヌクレオチドを与えたｃＤＮＡを合成するために用いた：該逆転写は、推奨される４２℃に代えて４５℃で実施される。
合成生産物は、製造者の取扱説明書に従った二重抽出と二重精製により精製される。
ＭＳＲＶ−１の存在は、ＭＳＲＶ−１ゲノムのための特異的ＥＬＯＳＡと結合したＭＳＲＶ−１ ＰＣＲによって確認される。
「長距離ＰＣＲ」：（LD-PCR）
ｃＤＮＡの５００ｎｇが、該ＬＤ-ＰＣＲ工程（Expand Long Template System；Boehringer（ref.1681 842））のために用いられる。
オリゴヌクレオチドのいくつかの対が使用される。これらの中で、その対は次のプライマーにより定義した：
0004226657.tif 000031
増幅条件は以下の通りである：
９４℃１０秒
５６℃３０秒
６８℃５分
１０サイクル、ついでその延長時間について各サイクルで２０秒の増加とともに２０サイクル。この第１の増幅の終わりに、増幅生産物の２マイクロリットルが上記と同じ条件の下で第２の増幅にかけられる。
該ＬＤ-ＰＣＲ反応は、薄壁ミクロチューブ中、Perkin 9600型ＰＣＲ装置中に誘導される（Boehringer）。
増幅生産物は、１％アガロースゲル中、増幅容量（１０マイクロリットル）の１／５の電気泳動によってモニターされる。上述したプライマー対に関して、ほぼ１．７ｋｂのバンドが得られた。
増幅フラグメントのクローン化：
ＰＣＲ生産物は、予備のアガロースゲルを通過させ、さらに供給元の取扱説明書に従い、Costarカラム（Spin; D. Dutcher）を通して精製される。
２マイクロリットルの精製した溶液は、供給元の取扱説明書（TA Cloning Kit；British Biotechnology）に従い、５０ｎｇのベクターＰＣＲIIと合わせられる。
得られた組換えベクターは、適当なＤＨ５αＦ’細菌の形質転換によって分離される。その細菌は、アンピシリンに対するそれの抵抗性およびＸｇａｌの代謝の欠損（＝白色コロニー）を用い選択される。組換えベクターの分子構造は、プラスミドミニ調製と酵素ＥｃｏＲ１による加水分解によって確認される。
これら全ての基準に陽性なクローン、ＦＢｄ１３が選択される。組換えプラスミドの大規模調製は、供給元の取扱説明書に従いMidiprep Quiagen kit（ref 12243）を用いて実施される。
クローンＦＢｄ１３の配列決定は、製造元の取扱説明書に従いPerkin Prism Ready Amplitaq FS dye terminator kit（ref. 402119）によって実施される。連鎖反応が、Perkin 377又は373A型自動シーケンサー中に導入される。その配列決定戦略は、クローンＦｂｄ１３の両方の鎖について実行される遺伝子ワーキングを含む。
クローンＦＢｄ１３の配列は、配列番号５８により同定される。
図３７において、クローンＦＢｄ１３とＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスの間の配列相同性が、７０％に等しい又はそれ以上のいずれかの部分的相同性のために連続線によりマトリックスチャート上に示される。該クローンのフランキング領域（５’末端でｐｏｌ遺伝子を持ち且つ３’末端でｅｎｖ遺伝子とＬＴＲを持つ）において相同性があるが、しかしその中間の領域は、全体的に相違し、ＨＳＥＲＶ−９のｅｎｖ遺伝子に対して、何らの相同性も、例え弱くさえも示さないことを見出し得る。さらに、該クローンＦＢｄ１３は、不完全な内因性のＨＳＥＲＶ−９を記述した領域よりもより長い「ｅｎｖ」領域を含むように思われる；かくして内部の相違する領域は、ＨＳＥＲＶ−９不完全遺伝子と部分的に相同な領域間に「挿入」を構成すると見なし得る。
この付加的な配列は、そのアミノ酸配列が配列番号８７によって表される、ＯＲＦ Ｂ１３と定義される、可能性のあるｏｒｆと決定する。
クローンＦＢｄ１３の分子構造は、GeneWork softwareとGenebankとSwissProt data banksを用いて分析した。
５グリコシル化サイトが見出された。
そのタンパク質は、既知の配列との著しい相同性を有するものではない。
このクローンが、ＭＳＲＶ−１の複製に結合した、内因性レトロウイルスエレメント（ＥＲＶ）の組換えから生じることがありえる。
そのような現象は、免疫系により必然的に寛容とされないポリペプチド、又は等しい内因性レトロウイルスタンパク質の発現の生成を欠くものではない。ＭＳＲＶ−１に関連した及び／又は後者により誘導される内因性エレメントの異常な発現のそのようなスキームは、異常な抗原を増殖しがちであり、従って、ＭＳにおいて観測されるような自己免疫プロセスの誘導を提供する傾向がある。それは明らかに、未だかつて記載されたことのない新規なエレメントを構成する。結果において、「Entrez」ソフトウエア（NCBI, NIH, Bethesda, USA）のバージョンNo.19（1996）において利用できる核酸配列のデータバンクの質疑では、同定するべきこのクローンの全体のｅｎｖ領域を含む相同配列を知ることを可能にしていない。
実施例１４：クローンＰＯＬ*ＭＳＲＶ−１、及びクローンＰＯＬ*、ｔｐｏｌ、ＦＢｄ３、ＪＬＢｃ１及びＪＬＢｃ２で記載した均等な配列と相違する３’ｐｏｌ領域に相同の逆転写酵素をコード化する領域を持った、ｐｏｌ遺伝子の部分を含むクローンＦＰ６の獲得
３’ＲＡＣＥは、ＭＳに罹った患者の血漿から抽出した全ＲＮＡで実施した。同じ条件で処理した健康者のコントロール血漿は、陰性対照として使用した。ｃＤＮＡの合成は次の修正したオリゴ（dt）プライマー：
0004226657.tif 000032
及び製造社によって推奨された条件に従いBoehringer「Expand RT」逆転写酵素を用いて実行した。ＰＣＲは、次の条件の下に酵素Klentaq（Clontech）により実施した：９４℃５分、ついで９３℃１分、５８℃１分、６８℃３分を４０サイクル、および６８℃８分、及び５０μｌの最終反応容量を持つ。
ＰＣＲに用いたプライマー：
−５’プライマー、配列番号６９によって同定した
0004226657.tif 000033
−３’プライマー、配列番号６８によって同定した（＝ｃＤＮＡ用と同じ）
第２に、いわゆる「半ネスト化（semi-nested）」ＰＣＲは、既に増幅された領域内に位置づけられた５’プライマーを用いて行われた。この第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲから生成した増幅生産物の１０μｌを用い、第１ＰＣＲにおいて使用したそれらと同じ実験条件下に実施した。
半ネスト化ＰＣＲに用いたプライマー：
−５’プライマー、配列番号７０によって同定した
0004226657.tif 000034
−３’プライマー、配列番号６８によって同定した（＝ｃＤＮａ用と同じ）
プライマー配列番号６９と配列番号７０は、ｐｏｌ*領域に特異的である：それぞれ、位置No.４０３からNo.４２２及びNo.６４１から６７０。
増幅生産物は、ＭＳに罹った患者の血漿から抽出した細胞外ＲＮＡから、かくて得られた。相当するフラグメントは、健康者コントロールの血漿で観測されなかった。この増幅生産物は、以下の手法においてクローン化した。
増幅したＤＮＡは、ＴＡクローニングTMキットを用いてプラスミド内に挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液は、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍濃縮した連結緩衝液「10x LIGATION BUFFER」、２μｌの「pCRTM VECTOR」（25ng/ml）及び１μｌの「TA DNA LIGASE」と混合した。この混合物は、１２℃で一晩、インキュベートした。後の工程は、ＴＡクローニングTMキット（British Biotechnology）の取扱説明書に従い実施した。その手順の終わりに、組換え細菌（白色）の白色コラムは、培養及びいわゆる「miniprep」法（17）に従って導入されたプラスミドを抽出するために選別された。各組換えコロニーからの調製プラスミドは、適当な制限酵素で切断し、且つアガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによってゲルを染色した後でＵＶ光の下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、ＴＡクローニングキットTMのクローン化プラスミド上に存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーによるハイブリッド形成の後、該挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット「Prism ready reaction kitdye deoxyterminator cycle sequencing kit」（Biosystems, ref. 401384を適用）の使用のために推奨される方法に従い実施し、さらに自動配列決定は、製造者の取扱説明書に従い、Biosystems「Automatic Sequencer, model 373 A」装置によって実行した。
ＦＰ６と称される、得られたクローンは、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｐｏｌ*領域に８９％相同である４６７ｂｐの領域及び定義されるべきＥＲＶ−９（No.1634から2856）のｐｏｌ領域に６４％相同である１１６７ｂｐの領域を与える。
クローンＦＰ６は、配列番号６１によって同定されたそれのヌクレオチド配列によって図３８中に表される。このクローンの３つの潜在的なリーディングフレームは、そのヌクレオチド配列の下のそれのアミノ酸配列によって示される。
実施例１５：ＭＳに罹った患者の血漿のプールから抽出したＲＮＡからの、クローン「ＧＭ３」によって定義した５’領域とクローンｐｏｌ*により定義した３’領域との間に含まれる核酸配列のＰＣＲ増幅による、レトロウイルスプロテアーゼのためのＯＲＦを含むG+E+Aと定義した領域の獲得
本出願人によって既に同定されたＭＳＲＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＭＳに罹った患者の血漿中に存在するビリオンから生じるレトロウイルスＲＮＡを増幅するために定義された。コントロール反応は、汚染物の存在をモニターするために実行した（水による反応）。その増幅はＲＴ-ＰＣＲに続いて「ネスト化（nested）」ＰＣＲの工程からなる。プライマーの対は、上述したクローンＧＭ３とｐｏｌ*の配列により定義される領域上の３つのオーバーラップ領域（Ｇ，ＥおよびＡ）を増幅するために定義した。
領域Ｇの増幅のための半ネスト化ＲＴ-ＰＣＲ：
− 第１のＲＴ-ＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー１：配列番号７１（センス）
プライマー２：配列番号７２（アンチセンス）
− 第２のＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー１：配列番号７３（センス）
プライマー４：配列番号７４（アンチセンス）
領域Ｅの増幅のためのネスト化ＲＴ-ＰＣＲ：
− 第１のＲＴ-ＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー５：配列番号７５（センス）
プライマー６：配列番号７６（アンチセンス）
− 第２のＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー７：配列番号７７（センス）
プライマー８：配列番号７８（アンチセンス）
領域Ａの増幅のための半ネスト化ＲＴ-ＰＣＲ：
− 第１のＲＴ-ＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー９  ：配列番号７９（センス）
プライマー１０：配列番号８０（アンチセンス）
− 第２のＰＣＲサイクルにおいて、以下のプライマーを用いた：
プライマー９  ：配列番号８１（センス）
プライマー１１：配列番号８２（アンチセンス）
該プライマーとそれらが定義する領域Ｇ，Ｅ及びＡは、以下の通り配される：
0004226657.tif 000035
異なるクローンＧ，Ｅ及びＡによって定義した領域の配列は、「ネスト化」増幅生産物のクローン化と配列決定の後に決定した。
そのクローンＧ，Ｅ及びＡは、フラグメントＧの５’末端における上記プライマー１と、フラグメントＡの３’末端における上記プライマー１１とを用いて、ＰＣＲによって合成された。ほぼ１５８０-ｂｐのフラグメントG+E+Aを、増幅し且つＴＡクローニング（商標）キットを用いてプラスミド内に挿入した。G+E+Aに一致する増幅生産物の配列を決定し、且つＧ＋Ｅ及びＥ＋Ａオーバーラップの分析を実行した。該配列は、図３９中に示され、及び配列番号８９に一致する。
ＭＳＲＶ-１レトロウイルスプロテアーゼをコード化するリーディングフレームは、領域Ｅ中に見出された。配列番号９０により同定した、そのプロテアーゼのアミノ酸配列は、図４０中に提示した。
実施例１６：ビリオンを生じるＭＳリンパ芽球系のＤＮＡにおける、ＭＳＲＶ−１に接近した内因性レトロウイルスエレメント（ＥＲＶ）に関連するクローンＬＴＲＧＡＧ１２の獲得、及びＭＳＲＶ−１レトロウイルスの発現
ネスト化ＰＣＲは、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスを発現するリンパ芽球系（上述した通りの及び当業者において周知であるような、ＥＢＶウイルス株Ｂ９５によって不朽化したＢリンパ球）から抽出された、及びＭＳ患者の末梢血液リンパ球に由来するＤＮＡで実施した。
第１のＰＣＲ工程において、次のプライマーを用いた：
0004226657.tif 000036
この工程は、以下の条件を持った３５の増幅サイクルを含む：９４℃で１分、５４℃で１分及び７２℃で４分。
第２のＰＣＲ工程において、次のプライマーを用いた：
0004226657.tif 000037
この工程は、以下の条件を持った３５の増幅サイクルを含む：９４℃で１分、５４℃で１分及び７５℃で４分。
ＰＣＲから生じる生産物は、通常の方法（17）に従い、アガロースゲル上での精製後に精製し、次いで１０ｍｌ蒸留水中に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特性の一つが、２つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端においてアデニンを導入することから、得られたＤＮＡは、ＴＡクローニングTMキット（British Biotechnology）を用いてプラスミド内に直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液は、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍濃縮した連結緩衝液「10x LIGATION BUFFER」、２μｌの「pCRTM VECTOR」（25ng/ml）及び１μｌの「TA DNA LIGASE」と混合した。この混合物は、１２℃で一晩、インキュベートした。後の工程は、ＴＡクローニングTMキット（British Biotechnology）の取扱説明書に従い実施した。その手順の終わりに、組換え細菌（白色）の白色コロニーは、培養、及びいわゆる「miniprep」法（17）に従い導入されたプラスミドを抽出するために選別された。各組換えコロニーからの調製プラスミドは、適当な制限酵素で切断し、且つアガロースゲル上で分析した。臭化エチジウムによってゲルを染色した後でＵＶ光の下で検出した挿入物を所有するプラスミドは、ＴＡクローニングキットTMのクローン化プラスミド上に存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーによるハイブリッド形成の後、該挿入物の配列決定のために選択した。配列決定の前の反応は、配列決定キット「Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit」（Biosystems, ref. 401384を適用）の使用のために推奨される方法に従い実施し、さらに自動配列決定は、製造者の取扱説明書に従いBiosystems「Automatic Sequencer, model 373 A」装置によって実行した。
かくして、ＬＴＲＧＡＧ１２と表したクローンを得ることができ、且つ配列番号６０により同定したその内部にある配列によって表される。
このクローンは、ヒトＤＮＡ中に、特にＭＳに罹った患者のＤＮＡ中に存在する、ＥＲＶ−９に接近した内因性エレメントの適当な典型例であり、且つＭＳＲＶ−１レトロウイルスの発現を妨げることができ、従って、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスに関連する病因における役割を有することができ且つ問題の病状における特異的な発現のためのマーカーとすることができる。
実施例１７：ヒト血清中の抗ＭＳＲＶ−１特異的抗体の検出
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の配列及びこの遺伝子のオープンリーディングフレームの同定は、配列番号６２と称される、上記遺伝子の領域のアミノ酸配列番号６３を決定可能にした。
ｐｏｌ遺伝子によってコードされたＭＳＲＶ−１逆転写酵素のタンパク質配列のフラグメントに一致する異なる合成ペプチドは、ＭＳに罹った患者の及び健康者コントロールの血清に関してそれの抗原特異性を試験した。
そのペプチドは、メリーフィールド（Merrifield）法（22）に従う固相合成によって化学的に合成した。その実践上の詳細は後述される。
ａ）ペプチド合成：
ペプチドは「Applied Biosystems 430A」自動シンセサイザーを用い、フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）／ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（Biosystems社，Foster City, CAを適用）上で合成した。該アミノ酸は、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）エステルの形で結合した。使用したアミノ酸は、Novabiochem（Lauflerlfingen，スイス）又はBachem（Bubendorf，スイス）から得た。
化学合成は、溶媒としてＮ-メチルピロリドン（ＮＭＰ）による二重カップリング法を用いて実施した。該ペプチドは、適当な装置（Ｉ型切断装置、ペプチドInstiute，大阪、日本）内でフッ化水素酸（ＨＦ）を用い、同時に、側鎖保護基のみならず、樹脂から切り離した。
１ｇのペプチド化樹脂を得るために、１０ｍｌのＨＦ、１ｍｌのアニソール及び１ｍｌのジメチルスルフィド５ＤＭＳを用いた。その混合物は、−２℃で４５分間撹拌される。ＨＦは、次いで真空下で留去される。エーテルによる激しい洗浄の後、該ペプチドは１０％酢酸によって樹脂から溶離され、次いで凍結乾燥される。
ペプチドは、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８型カラム（250ｘ21mm）（The Separation Group, Hesperia, CA,米国）での予備高性能液体クロマトグラフィーによって精製される。溶離は、２２ｍｌ／分の流速でアセトニトリル濃度勾配により実行される。捕集したフラクションは、１ｍｌ／分の流速で、ＶＹＤＡＣTMＣ１８分析用カラム（250ｘ4.6mm）でイソクラチックな条件下（isocratic conditions）での溶離によってモニターされる。同じ保持時間を有するフラクションがプールされ且つ凍結乾燥される。量の多いフラクションは、上述したシステムを持った分析用高性能液体クロマトグラフィーにより分析される。許容し得る純度と考慮されるペプチドは、クロマトグラムの少なくとも９５％を表す単一ピークにおいてそれ自身明示する。
精製したペプチドは、ついで、適用したBiosystems 420H自動アミノ酸分析装置を用い、それのアミノ酸組成をモニターする目的によって分析される。該ペプチドの（平均）化学分子量の測定は、ＤＥＣ-ＶＡＸ ２０００獲得システムに結合したVG. ZAB.ZSEQ二重焦点化機器（VG analytical社，マンチェスター、英国）上の陽性イオンモード中でＬＳＩＭＳ質量分析を用いて得られる。
異なるペプチドの反応性は、ＭＳに罹った患者の血清に対し及び健康者コントロールの血清に対し試験した。これはＳ２４Ｑと称されるペプチドを選別可能にし、その配列は配列番号６３とされ、ＭＳＲＶ−１のｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６２）にコードされている。
ｂ）抗原性特性：
Ｓ２４Ｑペプチドの抗原性特性は、後述のＥＬＩＳＡ法に従い実証された。
凍結乾燥したＳ２４Ｑペプチドは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で１０％酢酸中に溶解した。このストック溶液はアリコートとされ、二週間を越える使用のために＋４℃で保管し、又は２ヶ月以内の使用のため−２０℃で凍結した。アリコートは、５マイクログラム／ｍｌの最終ペプチド濃度を得るためにＰＢＳ（リン酸塩緩衝化塩溶液）中に希釈される。この希釈液の１００マイクロリットルが、Nunc Maxisorb（商号）ミクロタイトレーションプレートの各ウエル中に配される。そのプレートは、「プレートシーラー」型付着物によって覆われ、そのプラスチックへのペプチドの吸着の段階として＋３７℃で２時間保持される。前記付着物が取り除かれ、該プレートは、溶液Ａ（１Ｘ’ＰＢＳ、0.05% Tween20R）の３００マイクロリットルの容量で３回洗浄され、次いで吸収ティッシュ上に逆さにした。かくて液体を排出したプレートは、各ウエル当たり２５０マイクロリットルの溶液Ｂ（溶液Ａ＋10%のヤギ血清）が充填され、次いで付着剤によって覆い、３７℃で１時間インキュベートされる。該プレートは、次いで上述した通りの溶液Ａで３回洗浄される。
試験血清サンプルは、溶液Ｂ中に１／１００に予め希釈され、各希釈試験血清の１００マイクロリットルが、各マイクロタイトレーションプレートのウエル中に配される。陰性コントロールは、緩衝液Ｂの１００マイクロリットルの形で、それぞれのプレートの一つのウェル中に配される。付着物によって覆われたプレートは、次いで３７℃で一時間インキュベートされる。該プレートは、次いで上述した通りの溶液Ａにより三回洗浄される。ＩｇＧ応答のために、ヒトＩｇＧに対して向けられたペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗体（Jackson Immuno Research社により販売）が、溶液Ｂ中で希釈される（1/10,000に希釈）。標識化抗体の適切な希釈液１００マイクロリットルは、次いでミクロタイトレーションプレートの各ウエル中に配され、そして付着物で覆った該プレートは、３７℃で１時間、インキュベートされる。該プレートの更なる洗浄が、上述した通りに実行される。並列して、ペルオキシダーゼ基質が、bioMerieuxキットの指図に従って調製される。基質溶液の１００マイクロリットルが各ウエルに配され、且つ該プレートは室温で２０から３０分間、光から遮断された。
着色反応が安定化された時に、カラー２（bioMerieux商号）の５０マイクロリットルが反応を停止するために各ウエル中に配される。そのプレートは、ＥＬＩＳＡプレート分光測定リーダー中に直接配され、そして各ウエルの吸光度（ＯＤ）が４９２ｎｍの波長で読まれる。
血清学的サンプルは、二重に、又は三重に導入され、且つ試験した血清に対応する吸光度（ＯＤ）が、同じ希釈での同じサンプルで得られたＯＤ値の平均の獲得により計算される。
各血清の正味ＯＤは、陰性コントロール（溶液Ｂ：ＰＢＳ、0.05% Tween 20x、１０％ヤギ血清）の平均ＯＤを差し引いた血清の平均ＯＤに相当する。
ｃ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ ＩｇＧ抗体（Ｓ２４Ｑ）の検出
ＭＳの明確な診断がPoser（23）の基準に従って確立された１５名の患者、及び１５名の健康者コントロール（血液ドナー）の血清中の抗ＭＳＲＶ−１特異的ＩｇＧ抗体の存在を試験するために、Ｓ２４Ｑペプチドを用いて、上記技術を用いた。
図４１は、抗ＩｇＧ抗体で試験した各血清の結果を示した。それぞれの垂直の棒は、試験した血清の正味吸光度（４９２ｎｍでのＯＤ）を表す。縦座標軸は垂直な棒の頂点での正味ＯＤを与える。垂直破断線の左側にある第１の１５垂直棒は、１５名の健康者コントロール（血液ドナー）の血清を表し、垂直破断線の右側にある１５の垂直棒は、試験したＭＳの１５ケースの血清を表す。その図は、ＯＤがコントロール母集団の集団化した値の上である二人の対照を示す。これらの値は、無症状のセロポジティブの患者における特異的ＩｇＧの存在を表現し得る。２つの方法は、従って、試験の陽性の統計的な閾を決定するために評価された。
高い正味ＯＤ値を持つコントロールを含む、コントロールの正味ＯＤ値の平均は、０．１２９であり、且つその標準偏差は０．０６である。ＯＤ値が０．２より高い二人のコントロールがなければ、「陰性」コントロールの平均は０．１０７であり、その標準偏差は０．０３である。陽性の統計学的な閾は、式に従い計算され得る：
閾値（陰性コントロールの正味ＯＤ値の平均）＋（陰性コントロールの正味ＯＤ値の２又は３´標準偏差）。
第１のケースにおいて、無症状セロポジティブとして考慮すべきものがあり、且つ閾値は、０．１１＋（３ｘ0.03）＝０．２０である。その陰性の結果は、ペプチドのエピトープに対して特異的に向けられた抗体の存在の非特異的「バックグラウンド」を表す。
第２のケースにおいて、その面に関して、セロポジティブである血清を締め出すことなしに、健康が良好に見える血液ドナーからなるコントロールのセットが参照の根拠として取り上げられるなら、「非ＭＳコントロール」の標準偏差は０．１１６である。その閾値は、０．１３＋（３ｘ0.06）＝０．３１となる。
この後者の分析によれば、その試験はＭＳに特異的である。この報告において、表１に示した通り、この閾を越える正味ＯＤを有するコントロールがないことから、この試験はＭＳに特異的であるように思われる。実際に、この結果は、ＭＳ患者における抗体力価が、たいていの場合、ＭＳＲＶ−１と接触した健康者コントロールの値より高いという事実を反映する。
計算の第１の方法に従い、図４１中と表３中に示した通り、１５人のＭＳ患者の内の６人が陽性の結果（０．２より大きいか等しいＯＤ）を示し、Ｓ２４Ｑペプチド、従ってｐｏｌ遺伝子にコードされたＭＳＲＶ−１レトロウイルスの逆転写酵素の一部、そしてその結果としてＭＳＲＶ−１レトロウイルスに対して特異的なＩｇＧの存在を示唆する。
かくして、試験したＭＳ患者のほぼ４０％が、Ｓ２４Ｑペプチドに保有されるエピトープに対して反応しており、且つ該ペプチドに対して向けられた循環性ＩｇＧを所有する。
健康に見える１５名の血液ドナーの内の二人は陽性の結果を示した。かくして、無症状母集団のほぼ１３％が、特異的な血清ＩｇＧの存続を示す能動免疫を導く条件下でＳ２４Ｑペプチドが保有するエピトープと接触したかもしれない。これらの条件は、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスによる感染（及び／又は再活性化）の間のＭＳＲＶ−１レトロウイルス逆転写酵素に対する免疫化と一致する。これらセロポジティブコントロールにおいてＭＳを想起する見かけ上の神経学的病理の不存は、彼らが健康なキャリアであり、且つ彼ら自身を免疫化した後感染ウイルスが除かれたか、又は彼らが慢性的キャリアの危険性を有する集団を構成することを示し得る。結果において、ＭＳの高い有病率の領域の環境に存在する病因因子がかかる疾患の原因であるかもしれないことを示す疫学的データは、ＭＳのない集団のフラクションが、そのような病因因子と必須に接触したことを暗示する。ＭＳＲＶ−１レトロウイルスは、ＭＳの供給源でこの「病因因子」の全部又は一部を構成することが示されており、従って、健康者母集団から採取したコントロールが、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの成分に対するＩｇＧ型抗体を所有することは、普通のことである。
最後に、ここで試験した二人のＭＳケースの内の一人のみにおいて抗Ｓ２４Ｑ抗体が検出されたことは、このペプチドがイムノドミナントＭＳＲＶ−１エピトープを表すものでないこと、個別の株間の変異は、同じ領域中の相違するペプチドモチーフに対しての免疫化を誘発し得ること、又は疾患の原因およびその後の治療が、Ｓ２４Ｑペプチドに対する抗体応答を経時的に変更し得ることを反映し得る。
0004226657.tif 000038
ｄ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ ＩｇＭ抗体の検出
Ｓ２４Ｑペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法は、上記と同じ血清中の抗ＭＳＲＶ−１ＩｇＭ特異的抗体の存在を試験するために使用した。
図４２は、抗ＩｇＭ抗体で試験した各血清の結果を示す。それぞれの垂直な棒は、試験した血清の正味吸光度（４９２ｎｍでのＯＤ）を表す。縦座標軸は、垂直の棒の頂部での正味ＯＤを与える。横座標軸を切断する垂直線の左側にある第１の１５の垂直棒は、１５名の健康者コントロール（血液ドナー）の血清を表し、垂直破断線の右側にある垂直棒は、試験したＭＳの１５ケースの血清を表す。
試験したＭＳケースのＯＤ値の平均は１．６である。
コントロールの正味ＯＤ値の平均は０．７である。
陰性コントロールの標準偏差は０．６である。
統計学的旺盛の閾は、式に従い計算され得る：
閾値＝（陰性コントロールのＯＤ値の平均）＋（３ｘ陰性コントロールのＯＤ値の標準偏差）
その閾値は、従って０．７＋（３ｘ０．６）＝２．５に等しい；
陰性の結果は、ペプチドのエピトープに対し特異的に向けられた抗体の存在の非特異的な「バックグラウンド」を表す。
この分析に従い、且つ図４２及び相当する表４中に示した通り、ＩｇＧ試験は、閾を越える正味ＯＤを有するコントロールがないことから、ＭＳに特異的である。１５のＭＳ血清の内の６が、陽性ＩｇＧの結果を生じる。
ＭＳとコントロール集団との間の血清有病率における相違は、非常に有意である：「chi-squared」試験、ｐ＜0.002。
これらの結果は、ＭＳにおいてＭＳＲＶ−１の病因病理学的な役割を示す。
かくして、Ｓ２４Ｑペプチドに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の検出は、単独で又は他のＭＳＲＶ−１ペプチドとの組合せにおいて、ＭＳＲＶ−１感染及び／又はＭＳＲＶ−１のウイルス再活性化の経過を評価することを可能とする。
0004226657.tif 000039
本発明者によってなされた新たな発見と完成された新規な方法の結果として、ＭＳＲＶ−１感染及び／又は再活性化の診断試験の改善された手段を認めること、及び／又は患者の生物学的流体中のこれらの因子の検出を「陰性化すること」におけるそれの効力に基づいてＭＳ及び／又はＲＡにおける治療を評価することを可能にする。さらに、ＭＳの神経学的徴候又はＲＡのリウマチ学的徴候を未だ示していない個人における早期検出が、それが臨床的な疾患の開始に対応する障害段階の前に来るという事実のための次の臨床的経過に関してより有効である治療を開始することを可能とする。現在、この時点で、ＭＳ又はＲＡの診断は、障害の総体的症状が開始される前に確立できず、従って、既に顕著である障害を示唆する臨床的描写の出現の前には何の治療も実行されない。ヒトにおけるＭＳＲＶ−１及び／又はＭＳＲＶ−２感染及び／又は再活性化の診断は、従って決定的に重要であって、本発明は、これをなす手段を提供する。
ＭＳＲＶ−１感染及び／又は再活性化の診断の実施は別として、患者の生物学的流体中のこれらの因子の検出を「陰性化すること」におけるその有効性に基づいてＭＳにおける治療を評価することが可能である。
実施例１８：
１）材料と方法
−  患者と臨床サンプル
ＭＳ患者及びコントロールからの脈絡叢は、脳-細胞ライブラリー、Laboratoire R. Escourolles, Hopital de la Salpetriere，パリ、フランスから得られた。コントロールからの非腫瘍軟膜細胞は、前記の通り得られた（26）。Ｂ細胞系と血漿を得るために使用したＭＳとコントロールの患者からの末梢の血液は、Neurological Departments, CHU de Grenobleから，及びINSERM U 134, Hopital de la Salpetriere，フランスから得られた。１０名のＭＳ患者の、及びＣＳＦサンプルを提供した他の神経学的疾患を持った１０名の患者の詳細と出所は、表６中に与えられる。
−  細胞培養、ウイルス分離及び精製化
全ての細胞型は、前述した通り培養した（3,5,26）。
全ての培養は、ＥＬＩＳＡマイコプラズマ検出キット（Boehringer）によりマイコプラズマ汚染物を徹底的にスクリーンした。使用した細胞抽出物と上清のいずれも検出可能なマイコプラズマを含有していない。
細胞外ビリオン精製化及びショ糖濃度勾配は、前述した通り実行した（3,5,26）。それぞれのショ糖濃度勾配からの０．５−１ｍｌフラクションは、1000μlのピペットマン（Pipetman）および各フラクション用の異なる滅菌チップを用いて、該チューブの最上部から捕集された。６０μｌがＲＴ活性アッセイのために使用され、且つその残りは、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．５％Ｌ-ラウロイルサルコシン、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％β-メルカプトエタノールを含有し、酢酸によりｐＨ５．５に調節した緩衝液の１容量と混合した。これらの混合物は、さらなるＲＮＡ抽出のため−８０℃で凍結し、或いはＲＮａｓｅフリー-グリコーゲン（Boehringer）の存在中、−２０℃で一晩の沈澱工程により、Chomzynski（20）に従い直接加工した。ＲＮＡは、１−２μｌの組換えＲＮａｓｅインヒビター（PROMEGA）及び０．１ｍＭ ＤＴＴの存在中、２０から５０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。１０μｌのアリコートをそれぞれのＲＴ-ＰＣＲのために使用した。
−  逆転写酵素活性
ＲＴ-活性は、前述した通り（3,5,26）のショ糖濃度勾配からのビリオン塊又はフラクションにおいて、２０ｍＭ Ｍｇ++とPoly-Cm又はpolyCテンプレートを用いて試験した。
−  変性プライマーによるｃＤＮＡ合成と「Pan-retro」ＲＴ-ＰＣＲ
１０6−１０7ｄｐｍの間のトータルのＲＴ-活性が、精製したビリオンのピークを含むフラクション中に要求された。「Pan-retro」ＲＴ-ＰＣＲ法（27）が、Chomczynski（20）の方法によって抽出したビリオンＲＮＡについて実施され、且つ２０μｌのＲＮａｓｅフリーの水に溶解した。５μｌのＲＮＡ溶液を、７．５ｍＭランダムヘキサマー、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．９、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭトリス塩酸ｐ７．５、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ、及び２０単位の組換えＲＮａｓｅインヒビター（Promega）を含む２０μｌ反応液中、０．３単位（ＣＳＦシリーズ用の３単位）のＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ−１（Boehringer）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅが次いで１０分間、８０℃で加熱不活性化された。２０単位のＭｏＭＬＶＲＴ（Pharmacia）とさらに２０単位のＲＮａｓｅインヒビターが、GenesphereTM容器（Safetech，アイルランド）中の各チューブに加えられ、且つｃＤＮＡを３７℃で９０分間合成した。逆転写に続き、そのｃＤＮＡを５分間煮沸し、次いで氷上で急速に冷却した。ラウンド１ ＰＣＲ混合物（反応当たり最終容量２５μｌ；２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．４、６０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各プライマーPAN-UOとPAN-DI［図４４参照］の２００ｎｇ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ）を０．３単位ＤＮａｓｅ−１で処理し、次いで上記の通り加熱不活性化した。２．５μｌ ｃＤＮＡをGenesphereTM容器中に加え、そのチューブを８０℃に加熱した後に、各チューブに個別に０．５単位Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）を添加した（”ホットスタート”）。ラウンド１ ＰＣＲパラメーターは、最終の７２℃での７分間の延長を有する、９５℃１分間、３４℃３０秒、７２０Ｃ１分間の３５サイクルとした。０．５μｌのラウンド１ ＰＣＲ生産物を、「ホットスタート」法を用いてラウンド２ ＤＮａｓｅ処理化ＰＣＲ混合物（ラウンド１と同じ組成であるが、プライマーＰＡＮ-ＵＩとＰＡＮ-ＤＩとを含む）に移した。ラウンド２ ＰＣＲパラメーターは、ラウンド１用と同様であるが、３０サイクルのみとし且つ４５℃で１分間アニーリングした。
−  ＰＣＲ法のクローン化
ＰＣＲ生産物は、製造者の推奨に従ってＴＡクローニングRキット（British Biotechnology）を用いてクローン化した。
−  配列決定
配列決定反応は、「Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit」（Biosystemsを適用）を用いて実行した。自動配列分析は、自動シーケンサー（Biosystems,373Aを適用）で実行した。
−  ＳＴ１プライマーセットによるＲＴ-ＰＣＲ
第１のＰＣＲラウンドは、Malletら（28）によって記載された一工程ＲＴ-ＰＣＲ法に従ってｃＤＮＡ反応混合物から直接実行した。この一工程ＲＴ-ＰＣＲは、独立のｃＤＮＡ合成の後、チューブの開放及びＰＣＲ試薬の転移の際に、風媒の汚染物の蓋然性を減じた。ＲＮＡは、２ｍｌの血漿（液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で保存した）から、又は１０6ｄｐｍを越えるトータルのＲＴ活性を持つ５００μｌショ糖フラクションから予め抽出し、及び５０μｌのＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁した。それぞれのＲＴ-ＰＣＲ反応のために１０μｌのＲＮＡ溶液は、１ＵのＲＮａｓｅフリーのＤＮＡＳＥ１と、１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター（PROMEGA）を含む１．２μｌの１０XＤＮＡＳＥ緩衝液（５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．１ｍＭ ＤＴＴ）と共に２０℃で１５分間、Perkin-Elmer 480サーモサイクラー中でインキュベートし、且つＤＮａｓｅ不活性化のため１０分間７０℃で加熱した。該溶液は、氷上に配され、且つ、１Ｘ Ｔａｑ緩衝液、２５ｎＭ／チューブｄＮＴＰ、４０ｐＭ／チューブのそれぞれの第１ラウンドのプライマー（ＳＴ１．１上流プライマー：5’AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3’（配列番号９９）；ＳＴ１．１下流プライマー：5’TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3’（配列番号１００））、２．５Ｕ／チューブのｔａｑ（Appligene）及び１０Ｕ／チューブのＡＭＶ-ＲＴ（Boehringer）を含む８８μｌのＰＣＲ混合物と混合した（風媒ダスト／ＤＮＡ汚染物を防ぐ条件において）。各チューブは、ｃＤＮＡ合成のため４２℃で２時間及びＡＭＶ-ＲＴの不活性化及びＤＮＡ変成のために９５℃で５分間に続き、６５℃で１０分間、Perkin-Elmer 480サーモサイクラー中でさらにインキュベートした。第１ラウンドのパラメーターは、９５℃１分間、５３℃２．５分間、７２℃１分間，７２℃で１０分間の最終の延長と共に、４０サイクルとした。第１ラウンドの１０μｌは、７０℃で１０分間ＤＮａｓｅ不活性化に続き、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ１（０．０２Ｕ／μｌ）と１５分間２０℃で予め処理した第２ラウンドＰＣＲ混合物に移した。この混合物は、１X ｔａｑ緩衝液、２５ｎＭ／チューブｄＮＴＰ、４０ｐＭ／チューブの第２ラウンドプライマー［ＳＴ１．２上流プライマー：5’TCAGGGATAGCCCCCATCTAT3’（配列番号１０１）；ＳＴ１．２下流プライマー：5’AACCCTTTGCCACTACATCAATTT3’（配列番号１０２）］及び２．５Ｕ／チューブのｔａｑ（Appligene）を含有した。第２ラウンドのパラメーターは、９５℃１分間、５３℃１．５分間、７２℃１分間、７２℃で８分間の最終の延長と共に３０サイクルとした。２０μｌのこのネスト化ＲＴ-ＰＣＲ生産物は、臭化エチジウムを含む０．７％アガロースゲル上に堆積し、且つ増幅した生産物の可視化のためにＵＶ光にさらした。
−  ＰＣＲ生産物のハイブリッド形成分析：ＥＬＯＳＡによるＭＳＲＶ-ｐｏｌ検出
そのプロトコールは、必須的に前述した通り（21）であるが、以下の修正を伴う：Nunc Maxisorbミクロタイタープレートを、受動的吸着（21）によるか或いは代替的にストレプトアビジン被覆プレート及びビオチニル化ＣｐＶ１ｂを用いることにより、ウエル当たり１００ｎｇの捕捉プローブＣｐＶ１ｂ（図４４参照）によって被覆した。ペルオキシダーゼ標識化検出プローブＤｐＶ１（図４４参照）が用いられ、且つそのアッセイのカットオフは、４の陰性コントロールの平均プラス０．２ ＯＤ492単位として定義した。
−  ＭＳ血漿サンプルからのＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅：
トータルのＲＮＡは、他の場合に記した通りのグアニジウム法によってヒトＭＳ血漿から抽出した（29）。１００μｌの血漿から抽出したトータルのＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（０．１Ｕ／μｌ；Boehringer Manheim，フランス）によって処理し、超スクリプト（superscript）逆転写酵素（Gibco-BRL，フランス）を用い、製造元により推奨された条件の下に逆転写した。得られたｃＤＮＡは、３５サイクル（９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分３０秒）及び最終の延長のための７２℃８分間を経ての半ネスト化ＰＣＲにより増幅した。ＲＴ領域中の３つの異なるフラグメントが、以下の特異的プライマーにより増幅された：
−  プロテアーゼ（ＰＲＴ）領域において、ＰＣＲの第１及び第２ラウンド用に、それぞれ、センスプライマー［5’TCC AGC AGC AGG ACT GAG GGT 3’（配列番号１０３）］及びアンチセンスプライマー［5’CTG TCC GTT GGG TTT CCT TAC TCC T 3’（配列番号１０４）／5’GAC AGC AAA TGG GTA TTC CTT TCC 3’（配列番号１０５）］
−  ＲＴ領域のフラグメントＡにおいて（図４６参照）、ＰＣＲの第１及び第２ラウンド用に、それぞれ、センスプライマー［5’AGG AGT AAG GAA ACC CAA CGG ACA G 3’（配列番号１０６）］及びアンチセンスプライマー［5’TGT ATA TAA TGG TCT GGC TAT TGG G 3’（配列番号１０７）／5’TTC GGC AGA AAC CTG TTA TGC CAA GG 3’（配列番号１０８）］
−  ＲＴ領域のフラグメントＢにおいて（図４６参照）、ＰＣＲの第１及び第２ラウンド用に、それぞれ、センスプライマー［5’GGC TCT GCT CAC AGG AGA TTA GAT AC 3’（配列番号１０９）／5’AAA GGC ACC AGG GCC CTC AGT GAG GA 3’（配列番号１１０）］及びアンチセンスプライマー3’［5’GGT TTA AGA GTT GCA CAA GTG CGC AGT C 3’（配列番号１０１）］。
増幅したフラグメントは、臭化エチジウム染色化アガロースゲル上で分析し、ＴＡクローニングベクター（Invitrogen）中でクローン化し、且つ配列決定した。
２）結果
−  特異的レトロウイルスＲＮＡは、ＭＳ患者から誘導された細胞培養由来の細胞外ビリオン及びＭＳ患者のＣＳＦ中で見出された。
ＭＳ患者からの脈絡叢細胞（4）（死後に得た）及びＥＢＶ-不死化末梢血液Ｂリンパ球（30,31）は、オリジナルのＬＭ７分離物（3）に類似のＲＴ活性と関連した１００−１２０ｎｍのウイルス粒子を発現する培養物を生じた。非ＭＳドナーからの類似の細胞型は、このＲＴ活性もビリオンも生産しない。「感染した」培養物の全ては、乏しく及び／又は一時的にもたらされ及び／又は制限されたライフスパンを有した。それ故に、細胞外ビリオンの非常に制限された量においてゲノムＲＮＡの存在を分析するために、我々は、周知のレトロウイルスの全てにおいて存在するｐｏｌ遺伝子の保存した領域を、変成したプライマーによって増幅するためにＲＴ-ＰＣＲアプローチを用いた；このアプローチに基づくその技法は「Pan-retro」ＲＴ-ＰＣＲと称されるであろう。サンプルと試薬の広範囲にわたるＤＮＡｓｅ処理は、ヒトＤＮＡがこの技法によって増幅可能な多くの内因性レトロウイルスエレメントを含むことから、必須であった。「Pan-retro」ＲＴ-ＰＣＲ実験は、種々の型の細胞培養物及び非感染コントロール、すなわち、（i）ＭＳ脳から死後にサンプリングされた脈絡叢細胞（ＰＬＩ−１）、（ii）非ＭＳ脳解剖からの脈絡叢細胞、照射されたＬＭ７細胞と共培養により感染したもの（ＬＭ７Ｐ）、及び（iii）同一の非感染脈絡叢細胞の上清からのショ糖濃度勾配精製したビリオンについて実施した。二人のＥＢＶ-セロポジティブ被験者、すなわち（iv）一人はＭＳ患者であり（v）一人は非ＭＳコントロールである、のインビトロでの自然発生的な形質転換によって得られた「初期の」Ｂ細胞系もまた分析した。図４３は、Ｂ細胞培養から得られたショ糖濃度勾配フラクションにおけるＲＴ活性を示す。Shihら（12）によって記載されたその技法は、変成したプライマー（図２）及び延長ＤＮａｓｅ処理を用い、半ネスト化ＲＴ-ＰＣＲプロトコール中で修正した。ＰＣＲ増幅は、密度勾配フラクションのコード化アリコートについてロンドン（Dpt of Virology, U.C.L.M.S.）において実行した。ＰＣＲ生産物の盲目的および組織的クローニングおよび配列決定は、独立の研究所（BioMerieux, Lyon）において着手された。ショ糖濃度勾配フラクション毎に２０から３０のクローンの完全な配列決定の後、そのコードが壊され、且つ結果はＲＴ-活性データと平行して分析した。
表５は、ＭＳ誘導培養物におけるウイルスＲＴ活性のピークを含むショ糖濃度勾配フラクションから得られた配列、及び非感染化培養物の対応するＲＴ活性陰性フラクションから増幅された配列の分布を表す。ＲＴ活性陽性フラクションの全てにおいて増幅した予期したサイズ（〜１４０ｂｐ）のバンドにおいて検出した優勢な配列（しかしＲＴ活性陰性フラクション中にはない）は、周知のレトロウイルスとは異なっており且つＭＳＲＶ−ｃｐｏｌと称した。ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ配列は、ＥＲＶ９、前述した内因性レトロウイルスの配列（18）と部分的な相同（７０−７５％）を示した。幾つかのＥＲＶ９配列（ＥＲＶ９との＞９０％相同）はまた、存在するが、しかし少数のクローンが明らかに表れた。典型的なｐｏｌ配列に加えて、変成したプライマー及び低温アニーリングの使用に関係した多数のＰＣＲ人工物（プライマーマルチマー、コンカテマー又は単一プライマー増幅）は、全てのサンプル中に見出された（表５）。
図４４は、別のレトロウイルスの対応するＶＬＰＱＧ／ＹＭＤＤ領域を伴うＭＳＲＶ−ｃｐｏｌのコンセンサス配列の整列を示す。図４５は、この領域中の外因性と内因性レトロウイルスの両方の進化上保存されたアミノ酸配列に基づいた系統樹を示す。この系統樹から、ＭＳＲＶのｐｏｌ遺伝子が、オンコウイルス亜科のＣ型群に系統的に関係があると見なすことができる。
ＭＳ患者のＣＳＦ中のＭＳＲＶ ｃ−ｐｏｌ配列の有病率を決定するために、小規模実験を実施した。クローン化と配列決定によるＰＣＲ生産物中のＭＳＲＶ−ｃｐｏｌの同定は、困難かつ手間がかかる。我々は、それ故に、「総レトロウイルス」ＰＣＲ生産物中のＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ配列の急速な同定のために、捕捉プローブ（ＣｐＶ１Ｂ）とペルオキシダーゼ標識化検出プローブ（ＤｐＶ１）を用いて、酵素結合オリゴソルベント法（ＥＬＯＳＡ）を工夫した（図４４）。ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌのためのこのサンドウイッチハイブリッド形成に基づくアッセイの特異性は、遠い関係にある（ＨＩＶとＭｏＭＬＶ）及び密接な関係にある（ＥＲＶ９）ｐｏｌ配列の両方を用いて試験した。ＥＬＯＳＡが０．０１ｎｇという少量のＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ ＤＮＡを検出できるにも関わらず、そのような標的との意味のある交差反応は観察されなかった。
脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルは、ＭＳに罹った１０名の患者と他の神経学的疾患に罹った１０名の患者から入手した。全ＲＮＡは、ＣＳＦ塊から抽出し、上記の通り逆転写し且つ増幅した。ＰＣＲ生産物のＥＬＯＳＡ分析（表６）は、１０名のＭＳ患者のサンプルの内５人にＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ配列を示したが、他の神経学的疾患に罹った患者からの１０サンプルには見られなかった（ｐ＜０．０５）。ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌの存在は、年齢、性別又はＭＳの型に相関関係があると見なすことはできないが、しかし未治療の患者のみにおいて見られた（５／６）。免疫抑制治療を受けた患者は一人も陽性ではなかった（０／４）。ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ検出とＣＳＦ細胞カウントの間の相関関係は全く観測されなかった。
−  ｐｏｌ遺伝子のより大きな領域のクローン化と配列決定
ＭＳＲＶゲノム配列の独立の同定は、脈絡叢細胞のＬＭ７-感染化二次培養の２．５リットルから得た濃縮化ビリオンから抽出したＲＮＡを用いる非ＰＣＲアプローチにより得られた。限られた数のクローンがｃＤＮＡの直接的クローニングによって得られ、そのうちの一つ（ＰＳＪ１７）が、ＥＲＶ９ ｐｏｌとの部分的な相同性を示した。ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ領域及びＰＳＪ１７クローンに基づいた特異的なプライマーは、精製したビリオンから抽出したＲＮＡにおける２つの独立の配列を連結する７４０ｂｐフラグメントを増幅した。ＰＳＪ１７は、ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌの３’側に配置された。５’サイドのＭＳＲＶ−ｃｐｏｌ上及びＰＳＪ１７の３’サイド上の更なる配列延長は、ＭＳ脈絡叢培養物（4）中の産生したＬＭ７様ビリオンからのＲＮＡについてＲＴ-ＰＣＲアプローチを用いて得られた。
図４６において、ｐｏｌ遺伝子中の配列延長によって得られたオーバーラッピングクローンに一致するヌクレオチド配列は、プロテアーゼの及び逆転写酵素の推定上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）に一致するアミノ酸翻訳により表される。プロテアーゼ（ＰＲＴ）の及び逆転写酵素（ＲＴ）の活性部位モチーフは、下線を付した。ＲＴ配列のＣ-末端領域において、レトロウイルスＲＮａｓｅ Ｈ領域中に整然と存在する分散したアミノ酸残基もまた、下線を付した。
−  未変性プライマーは、ＭＳ患者の血漿中の、およびＲＴ活性のピークに関連するビリオン中のＭＳＲＶ特異的ＲＮＡを検出する
ｐｏｌ遺伝子中のオーバーラッピングクローンに基づくＰＣＲプライマー（ＳＴ１．１プライマーセット；図４の位置６０３−６２５／１７３２−１７１４）は、異なるＭＳ患者から得た幾つかの種々の分離物からのＲＴ領域の１．１５ｋｂセグメントを増幅した。ネスト化プライマー（ＳＴ１．２；図４６上の位置８６９−８８９／１５１３−１４９０）は、ＳＴ１．１によって生成した第１ラウンド生産物よりも臭化エチジウムによってより容易に可視化される７００ｂｐフラグメント（図４７）を生じた。ＰＣＲ生産物の特異性は、ＥＬＯＳＡ法（21）を用いて、ペルオキシダーゼ標識化ＭＳＲＶ−ｃｐｏｌプローブ（図４４）を用いて、厳密なハイブリッド形成によって確認した。
ＳＴ１．１と２のプライマーのセットは、この適用に至適でないとしても、ヒト血漿中の細胞外ＭＳＲＶ ＲＮＡを検出するために用いた。図４７は、ＭＳ脈絡叢分離物のショ糖濃度勾配フラクションからのｃＤＮＡと並行して試験した２つのＭＳ患者と２つのコントロール血漿サンプルから得たｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を示す。７００ｂｐバンドのＴａｑ配列決定は、ＭＳＲＶ配列の存在を確認した。非常にぼんやりとした７００ｂｐバンドはまた、通例の沈殿物粒子が集合したチューブの底に一致するフラクション１０において視認できる。血漿誘導ＲＮＡ上の細胞のアルドラーゼ転写物のコントロールＲＴ-ＰＣＲは陰性であり、その結果が血漿分離の間、細胞の分解によって放出された細胞ＲＮＡによるものではないことを示す。このＰＣＲ技法は、要求されたｃＤＮＡの長さ（１．１５ｋｂ）によりその感受性が減じられることから、疫学的研究のために企図されたものでないことに注意すべきである。
ｐｏｌ遺伝子の３つのフラグメントを増幅する非変成プライマー（プロテアーゼ領域の全て、逆転写酵素の領域ＡとＢ；図４６参照）もまた、ＭＳ血漿からのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ中のＭＳＲＶ配列の存在を確認するために使用した。これらのフラグメントは、活性な病気に罹った更なる４名のＭＳ患者の血漿から増幅された。配列分析は、そのＰＲＴとＲＴ領域が、培養ビリオン上で予め得られたＭＳＲＶ配列に相同であった（それぞれ＞９５％と＞９０％）ことを確認した。ＭＳ血漿と並行して試験した健康者コントロール（ｎ＝４）からの血漿中ではそのような配列は検出されなかった。
３）論考
−  ＭＳＲＶの系統発生
この研究の結果から、「ＬＭ７」として称されるウイルス（3,5,26）は、ここに記載したＭＳＲＶ ｐｏｌ配列を含むＲＮＡゲノムを所有すると結論することができる。
ＭＳＲＶとＥＲＶ９の両方の保存されたＲＴモチーフは、それにも係わらず機能的ＲＴを有するヒト泡沫状ウイルスとは別に、他のレトロウイルスよりも短い２つのアミノ酸である。全体のＰＲＴ-ＲＴ領域を包含する潜在的ＯＲＦは、感染した培養上清を用いたショ糖濃度勾配において検出したビリオン関連ＲＴ活性と一致する。さらに、最近になって、我々はＭＳ血漿からクローン化したＭＳＲＶプロテアーゼの配列からの組換えタンパク質の発現に成功していることから、我々は、潜在的ＰＲＴ ＯＲＦの現実性を確認できる。ＭＳＲＶタンパク質の可能性のあるＯＲＦを含む他の配列の類似したクローニングおよび発現は、ＭＳＲＶビリオンの酵素及び構造タンパクをコード化する能力を確認するために始められている。
レトロウイルス中の最も保存されたアミノ酸配列（VLPQG...YXDD）に基づいて、図４５中の系統樹は、ＭＳＲＶ ｐｏｌ遺伝子が、Ｃ型オンコウイルス亜科に関連づけられることを示した。ＥＲＶ９と別に、最も近い周知のレトロウイルスエレメントは、機能的ｐｏｌ遺伝子を持つサブタイプを有することが知られるヒト内因性配列、ＲＴＬＶ-Ｈである（32）。ｐｏｌ領域において、Ｃ型オンコウイルス亜科に属するこの系統は、電子顕微鏡（ＥＭ）によって観測した粒子の一般的な形態学に基づいた我々の予備的な仮定と明らかに矛盾し、Ｂ又はＤ型オンコウイルス（3,5,26）に一致する。しかしながら、ＭＳＲＶウイルス中で検出したｅｎｖ配列についての予備のデータは、系統学的にＤ型に近接していることを示唆する。ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の系統差は、ＭＰＭＶ中に記載されており、Ｄ型レトロウイルスにおける組換え起源を示唆する（33）。ｇａｇタンパク質中の単一のアミノ酸置換が異なる型のそれにレトロウイルス形態の変換が可能であることが報告されていることから（34）、ＤからＣ型への形態的な変換も可能である。
−  ＭＳＲＶは、関連した内因性レトロウイルスファミリーとの広範囲にわたる相同性を共有する外因性レトロウイルスか又は細胞外ビリオンを生産する内因性レトロウイルスか？
厳密条件下でＭＳＲＶ ｐｏｌプローブを用いたサザンブロット分析は、、マルチコピーの内因性ファミリーとハイブリダイゼーションを示し（データは提示せず）、ＥＲＶ９それ自身よりもＭＳＲＶにより密接に関係した内因性エレメントの存在を示す。その結果、我々はＭＳＲＶ生産細胞中のビリオン特異的プロウイルスを探すことができなかった。サザンブロットの結果に一致して、ゲノムＤＮＡに関するＰＣＲ研究は、ＭＳＲＶに関連した内因性配列の多バンド増幅を示した。ｐｏｌが最も保存されたレトロウイルス遺伝子であることから、ここに記載した配列は、外因性と内因性配列の間を識別するために最も不適切な領域である。ゲノムの他の部分からの配列情報がそのような識別を可能にすることが期待され、それは、ヒツジの肺線腫症レトロウイルス（ＪＳＲＶ）について最近実証された（35）ような、とても小さい部分上にあるだろう。そのような配列データを用いて、ビリオン生産細胞培養のゲノム中のＭＳＲＶ特異的プロウイルスを同定することが可能になるであろう。
ＭＳＲＶは、まさに、外因性株がよく研究されたマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）とマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）レトロウイルスファミリー、及びヒツジのＪＳＲＶレトロウイルスファミリー（３６）に存在するように、ＥＲＶ９様内因性ファミリーのビリオン産生外因性メンバーを示すことができる。代替的に、細胞外ＭＳＲＶビリオンは、複製能力のある内因性プロウイルスによって産生され得ることをも想像できる。ＭＳＲＶが外因性であろうと内因性であろうと、ＭｕＬＶ，ＭＭＴＶ及びＪＳＲＶによって表されたレトロウイルスのカテゴリーとの概念の類似が存在する。欠点のある内因性エレメントとは異なり、作用因子のこのカテゴリーは、感染性及び病因性ウイルスを生産すること、神経学的疾患（37）、固い腫瘍／白血病（36,38）をもたらすこと、及び「内因性超抗原」を発現すること（39,40）が知られる。さらに、ＭｕＬＶ感染において、マウス株の遺伝的内因性レトロウイルスバックグラウンドは、疾患に対する感受性又は抵抗性を決定できる（39,41）。確かに、感染レトロウイルスとその内因性対応物の間のそのような相互作用は、内因性レトロウイルス遺伝子型が全ての個人において同一でないことから、ＭＳの病因性において関係し得る。それゆえ、関連する内因性レトロウイルス遺伝子型による遺伝的調節が、もしＭＳＲＶがこの疾患において活性な役割を果たすことが事実であるならば、ＭＳに対する周知の遺伝性の感受性（43）に寄与し得る。
他の場合に、表５中のデータは、ＥＲＶ９エレメントが、おそらく感染細胞における相互活性化を介して、共発現され得ること、及びＭＳＲＶビリオン中の非対応のＲＮＡ収容を引き起こすことを示唆する。そのような非対応の収容は、他のレトロウイルス系において生じることが知られる（42）。
−  ＭＳにおいて予め想起された多数の通常ウイルスの役割は？
ＭＳの病因病原論に推定上含まれたウイルスの多数の報告の中で、著しい割合が２つのウイルスファミリー、パラミクソウイルス科及びヘルペスウイルス科に集まる。パラミクソウイルス科に関して、鍵となる注目点は、ＣＳＦにおいて、麻疹融合タンパク質に対して、必然的に向けられたＭＳ患者における麻疹ウイルスに対し、抗体力価がしばしば増加することである（44）。パラミクソウイルス科の融合タンパク質の保存されたドメインとレトロウイルスの膜内外タンパク質との間のアミノ酸類似性の存在（45）は、もしこれら二つのタンパク質の間の抗原交差反応が生じたなら、この観測を説明し得る。
ヘルペスウイルスファミリーに関して、エプスタイン-バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペス単純ウイルス１型（ＨＳＶ−１）及び、最も新しくはヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の関与が提案されている（31,46,47）。我々の前の研究及び他のグループの研究から、ヘルペスウイルスは、ＭＳＲＶ発現において重要な役割を演じ得ることが明らかである：我々は、ＨＳＶ−１介在-初期ＩＣＰ０とＩＣＰ４タンパク質が、インビトロにおいてＭＳＲＶ／ＬＭ７を相互活性化できることを示し（6）、及びHaahrらは、ＭＳにおける共因子として、レトロウイルス再活性化を誘発するＥＢＶの重要な疫学的役割を提案している（31）。ＭＳプラーク中のＨＨＶ６の顕著な発現を示す、Challonerらによる最近の記載（47）は、脳におけるＨＨＶ６の類似の役割をも示唆し得る。
実施例１９：ＭＳＲＶゲノム検出技法
細胞の破片を取り除くための０．４μｍ濾過及び残りの非カプシド内包化ＲＮＡを取り除くためのＲＮａｓｅ消化に続いて、血清を、シリカマトリックスに吸着することによってウイルスＲＮＡを抽出するために処理した。ウイルスＲＮＡは、ＤＮａｓｅ分解を受け、ついで組み合わせた逆転写-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）反応を、プライマーＰＴｐｏｌ−Ａ（センス：5’xxxx3’,配列番号１８３）とＰＴｐｏｌ−Ｆ（アンチセンス：5’xxxx3’,配列番号１８４）を用いて実行した。ネスト化プライマーＰＴｐｏｌ−Ｂ（センス：5’xxxx3’,配列番号１８５）とＰＴｐｏｌ−Ｅ（アンチセンス：5’xxxx3’,配列番号１８６）による増幅の第２ラウンドは、ゲル電気泳動によって同定された４３５ｂｐ ＰＣＲ生産物を生成した。各生産物の特異性は、ジデオキシシーケンシングによって確認した。逆転写酵素なしのコントロールの反応は、生産物がウイルスＲＮＡから得られたことを確認するために実行した。加えて、抽出したウイルスＲＮＡが核酸を得た宿主細胞により汚染され得ることの可能性を排除するために、アリコートを、ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）ＤＮＡ及びＲＮＡの存在についてのネスト化ＰＣＲによって試験した。ＰＤＨまたは「非ＲＴ」ＰＣＲアッセイのいずれかにおけるシグナルを生成したサンプルは、その分析から排除した。
臨床的に活性なＭＳ患者及びコントロールからの血清は、ＲＴ-ＰＣＲにより増幅され且つ配列決定した。ビリオン関連ＭＳＲＶ-ＲＮＡは、ＭＳ患者１９名中１０人の血清（５３％）で検出されたが、ＭＳでない４４人のコントロールの内３人のみで検出された（ｐ＝0.0001）。そのコントロール群は、リウマチ学的疾患を持つ８名の患者（全てＭＳＲＶ-ＲＮＡ陰性）と３６名の健康な成人からなる。ＭＳ患者とコントロールの両方におけるＭＳＲＶ-ＲＮＡ力価は、血清の穏やかな希釈でさえ（＜１０倍）シグナルの損失を招くことから、明らかに低かった。
ＭＳ患者において、ＭＳＲＶ-ＲＮＡの検出は、年齢、性別、病気の継続期間、又はＭＳの型と結びつけられないが、しかしながら、治療との有意な陰性の相関関係が観測された。２６の血清サンプルが１９名の患者から得られた；未処置の患者からの血清の１００％が、検出可能なＭＳＲＶ-ＲＮＡを含有したのに対し、コルチコステロイド及び／又はアザチオプリンで治療している間に得られた１９サンプルでは、４のみ（２１％）しか検出されなかった（ｐ＝0.001）。
免疫抑制治療の間のビリオン関連ＭＳＲＶ-ＲＮＡの見かけ上の損失の理由は不明であるが、しかしその知見は、脳脊髄流体中のＭＳＲＶの検出における先行の観測と一致する。
0004226657.tif 000040
方法：
−  濾過とＲＮａｓｅ分解を伴う修正したＳＮＡＰ ＲＮＡ抽出
（全ての遠心分離は室温とした）
５００マイクロリットルまでの血清は、０．４５ミクロンのスピンフィルターを用い濾過される（FlowgenからのNanosep MFカタログNo. U3-0126 Ref. ODM45）。その血清は、13,000gで５分間（又は、もし必要であればさらに１０分間）回転させる。
濾過した血清の１５０マイクロリットルは、３７℃で３０分間、１０単位のＲＮａｓｅ１（PromegaカタログNo.M4261）とインキュベートされる。
その１５０マイクロリットルは、以下の通りにＳＮＡＰ ＲＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用いて抽出した：
−  ポリＡＲＮＡの１０マイクログラムを、キャリアとして作用させるために結合緩衝液の４５０マイクロリットルに加えた；これを血清に加え、６回の倒置により混合した；３００マイクロリットルのプロパン-２-オールを加え、１０回の倒置により混合した。５００マイクロリットルをＳＮＡＰカラムに移し、１分間、1300gで回転し、その流出分を廃棄した；その残りをＳＮＡＰカラムに加え、１分間1300gで回転し、流出分を廃棄した；ついでそのカラムを６００マイクロリットルのSuper washで洗浄し、流出分を廃棄した；ついでそのカラムを６００マイクロリットルの１ｘＲＮＡ washで洗浄し、その流出分を廃棄した；この洗浄は２分間1300g回転により繰り返し、その流出分を廃棄した；結合した核酸は、ついで１３５マイクロリットルのＲＮａｓｅフリーの水と５分間インキュベートすること及び１分間1300gで回転することにより溶離した。
−  １５マイクロリットルの１０ｘＤＮａｓｅ緩衝液と３マイクロリットル（３０単位）のＤＮａｓｅＩ、」ＲＮａｓｅフリー（Boehringer Mannheim Cat. No. 776 785）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした；４５０マイクロリットルの結合緩衝液を加え、６回倒置することにより混合した；ついで３００マイクロリットルのプロパン-２-オールを加え、１０回倒置することによって混合した；５００マイクロリットルをＳＮＡＰカラムに移し、１分間1300gで回転し、その流出分を廃棄した；ついでその残りをＳＮＡＰカラムに加え、１分間1300gで回転し、その流出分を廃棄した；ついでそのカラムを６００マイクロリットルの１ｘＲＮＡ washで洗浄し、その流出分を廃棄した；この洗浄を２分間1300g回転によって繰り返し、その流出分を廃棄した；結合した核酸は、ついで１０５マイクロリットルのＲＮａｓｅフリーの水と５分間インキュベートすること及び１分間1300gで回転することにより溶離した。
−  チタンＲＴ-ＰＣＲ
ＲＴ-ＰＣＲは、チタン１チューブＲＴ-ＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim Cat. No. 1 855 476）を用いて実行し、２５マイクロリットルのＲＮＡを結合したＲＴ-ＰＣＲにおいて用いた。全反応容量は、５０マイクロリットルとした。ＲＮａｓｅとしたプロメガ（Promega）ｒＲＮＡｓｉｎ（１０単位）を使用した。それぞれ１７０ｎｇのプライマー配列番号１８３と配列番号１８４とを用いた。単一のマスター混合物を調製し最後に加えた。これは、氷上でなく、室温で実施した。
ＲＴ工程は、５０℃と、ついで６０℃での２つの連続した３０分のインキュベーションからなる。これは、以下の工程を有したＰＣＲの直後とした。
★９４℃２分間でテンプレートの最初の変性、
★９４℃３０秒；６０℃３０秒；６８℃４５秒の４０サイクル、
★６８℃７分の１サイクル。
第２ラウンドＲＣＲは、拡大長テンプレートＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim Cat. No. 1681 842）を用いて実施した。０．５マイクロリットルのＲＴ-ＰＣＲ混合物を、２５マイクロリットルのラウンド２のＰＣＲ混合物に加えた。緩衝液Ｎｏ．３と５０ｎｇのプライマーＢとＥを用いた。そのＰＣＲは、以下の工程を有した：
★９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃４５秒の５サイクル、
★６８℃７分間の１サイクル。
そのＰＣＲ生産物は、ついで２％アガロースゲルにかけた。
ＲＴでないコントロールは、両方のラウンドの「拡大」ＰＣＲシステムを用いて実行した。その第１ラウンドは４０サイクルとし、第２ラウンドは２０サイクルとした。
陽性コントロールとしてのＤＮＡ連続希釈物は、ＲＴ-ＰＣＲと「ＲＴでない」ＰＣＲの両方において用いた。有効とされる結果のためにＲＴ-ＰＣＲと「ＲＴでない」ＰＣＲは、１と０．１細胞の間に均等な検出しているＤＮＡを要する。
ｐｏｌ領域中のほぼ４３５ｂｐフラグメントのＰＣＲ生産物の分析は、表８中に示される。
0004226657.tif 000041
表９は、データが図４９から５３の配置から決定されており、可変性を示している：
−  同じＰＣＲ増幅実験中の同じ患者の血漿サンプルから得られたクローンの間；これは、患者が、所定の時間に種々のＭＳＲＶ変異体を有するビリオン集団を所有することを意味する、
−  異なる患者からの配列決定された変異集団の間；これは該変異体がある患者と別の患者とで異なることを意味する。
0004226657.tif 000042
ａ）このパーセンテージは、プライマーを除外する配列に基づいて決定された。
ｂ）このパーセンテージは、プライマーを包含する配列に基づいてで決定された。
図５３Ａと５３Ｂから、試験した患者間の配列の可変性が決定され得る：
−  配列番号１６９と配列番号１７６の間：１６．５％aと１４．８％b
−  配列番号１６９と配列番号１７６から得たペプチド配列の間：２０％。
４つの微生物が明細書第３ページ１５−２６行中に記載され、且つそれらは以下に同定される。それらは、ブタペスト条約の規定に従い、ＥＣＡＣＣ★に全てが寄託されている。
−  ＬＭ７ＰＣは、No.92072201のもとに1992年7月22日付で寄託した、
−  ＰＬＩ−２は、No.93010817のもとに1993年1月8日付で寄託した、
−  ＰＯＬ−２は、No.V92072202のもとに1992年7月22日付で寄託した、
及び
−  ＭＳ７ＰＧは、No.V93010816のもとに1993年1月8日付で寄託した。
★ECACC：European Collection of Animal Cell Cultures
Vaccine Research and Production Laboratory
Public Health Laboratory Service
Centre of Applied Microbiology and Research
Porton Down
Salisbury, Wiltshire SP4 OJG
英国
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配列表
（1）一般情報:
（i）出願人:BIO MERIEUX
（ii）発明の名称:診断、予防、及び治療のための、多発性硬化症に関連するウイルス性物質及びヌクレオチド断片
（iii）配列の数:160
（iv）連絡の住所:
（A）住所:CABINET GERMAIN & MAUREAU
（B）通り:12 rue Boileau
（C）都市名:LYON
（D）国名:FRANCE
（E）郵便番号:69006
（v）コンピューターが読み込むことのできる形態:
（A）媒体種:フロッピーディスク
（B）コンピューター:IBM PC互換機
（C）オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア:PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）本出願の情報:
（A）出願番号:
（B）出願日:
（viii）弁理士/代理人の情報:
（A）名称:Dominique GUERRE
（B）登録番号:
（C）参照/事件整理番号:MD/B05B2679
（ix）通信情報:
（A）電話:4 72 69 84 30
（B）ファックス:4 72 69 84 31
（2）配列番号（SEQ ID NO）:1の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:1158塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:3の情報:
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（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:6の情報:
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（A）長さ:18塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:15の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:18塩基対
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（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:16の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:17の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:19塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:18の情報:
（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:19の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:19:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:20の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:15塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）特徴:
（B）存在位置:5, 7, 10, 13
（D）別の情報:Gはイノシン（i）を示す
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:21の情報:
（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:22の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:23の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
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（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:23:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:24の情報:
（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:25の情報:
（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:26の情報:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:28の情報:
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（A）長さ:18塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:28:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:29の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:29:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:30の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:31の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:32の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（B）存在位置:6, 12, 19
（D）別の情報:Gはイノシン（i）を示す
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:33の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:35の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:36の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
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（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:38の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:40塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:39の情報:
（i）配列の特徴:
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（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:41の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:11アミノ酸
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:42の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:17アミノ酸
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:43の情報:
（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:44の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:8アミノ酸
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
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（i）配列の特徴:
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:2391塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:1722塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:59の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:495塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:60の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:2503塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:1167塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:62の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:78塩基対
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（i）配列の特徴:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:64の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:28塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:65の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:30塩基対
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:66の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:67の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:68の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:34塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:69の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:30塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:70の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:30塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:70:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:71の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:72の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:72:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:73の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:73:
0004226657.tif 000121
（2）配列番号（SEQ ID NO）:74の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:74:
0004226657.tif 000122
（2）配列番号（SEQ ID NO）:75の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:75:
0004226657.tif 000123
（2）配列番号（SEQ ID NO）:76の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:76:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:77の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:77:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:78の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:78:
0004226657.tif 000126
（2）配列番号（SEQ ID NO）:79の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:79:
0004226657.tif 000127
（2）配列番号（SEQ ID NO）:80の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:80:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:81の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:81:
0004226657.tif 000129
（2）配列番号（SEQ ID NO）:82の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:82:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:83の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:83:
0004226657.tif 000131
（2）配列番号（SEQ ID NO）:84の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:84:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:85の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:85:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:86の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:19塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:86:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:87の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:433アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:87:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:88の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:693塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:88:
0004226657.tif 000138
（2）配列番号（SEQ ID NO）:89の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:1577塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:89:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:90の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:182アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:90:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:91の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:36塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:91:
0004226657.tif 000141
（2）配列番号（SEQ ID NO）:92の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:92:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:93の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:2304塩基対
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（xi）配列:SEQ ID NO:93:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:94の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:2364塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（xi）配列:SEQ ID NO:94:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:96の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:114アミノ酸
（B）型:ペプチド
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:アミノ酸
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:アミノ酸
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:100の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:19塩基対
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:102の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:103の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:18塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:104の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:105の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:106の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:ヌクレオチド
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:107の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:108の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:109の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:110の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:111の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:112の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:310塩基対
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:113の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:103アミノ酸
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（ii）配列の種類:ペプチド
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:114の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:635塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
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（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:115の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:77アミノ酸
（B）型:アミノ酸
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（ii）配列の種類:ペプチド
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:116の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:32塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:117の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:1481塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:493アミノ酸
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:32塩基対
（B）型:ヌクレオチド
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:1329塩基対
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:162アミノ酸
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（ii）配列の種類:ペプチド
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:122の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:123の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:21塩基対
（B）型:ヌクレオチド
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（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:124の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:758塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:124:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:126の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:127の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:128の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:129の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:129:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:130の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:1511塩基対
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（C）鎖の数:一本鎖
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（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:130:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:131の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:352アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:131:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:132の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:30塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:133の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:30塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:133:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:135の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:398アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:137の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:378アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:137:
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:139の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:139:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:140の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:140:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:141の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:764塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:141:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:142の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:800塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:142:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:169の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:169:
コンセンサス（41/68-1+42/68-1+cl43 68-1）
（2）配列番号（SEQ ID NO）:170の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:438塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:170:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:171の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:438塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:171:
0004226657.tif 000204
（2）配列番号（SEQ ID NO）:172の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:438塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:172:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:173の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:146アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:173:
0004226657.tif 000206
（2）配列番号（SEQ ID NO）:174の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:146アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:174:
0004226657.tif 000207
（2）配列番号（SEQ ID NO）:175の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:146アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:175:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:176の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:176:
コンセンサス（1/46-7+8/46-7+c15/46/7）
（2）配列番号（SEQ ID NO）:177の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:429塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:177:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:178の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:429塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:178:
0004226657.tif 000210
（2）配列番号（SEQ ID NO）:179の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:429塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:179:
0004226657.tif 000211
（2）配列番号（SEQ ID NO）:180の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:143アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:180:
0004226657.tif 000212
（2）配列番号（SEQ ID NO）:181の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:143アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:181:
0004226657.tif 000213
（2）配列番号（SEQ ID NO）:182の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:143アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:182:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:183の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:183:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:184の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:184:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:185の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:23塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:185:
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（2）配列番号（SEQ ID NO）:186の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:22塩基対
（B）型:ヌクレオチド
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:186:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図３９ｃ】
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【図３９ｄ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４８Ｅ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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