(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域である、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入された弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型。
【請求項２】
ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域が、ネコヘルペスウイルス１型の増殖に致死的な影響を与えない２つの領域である請求項１に記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型。
【請求項３】
外来性遺伝子が、病原微生物に由来し、動物に対して感染防御能を誘導するポリペプチドをコードしている遺伝子あるいはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片である請求項１に記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型。
【請求項４】
外来性遺伝子が、各種サイトカインに由来し、動物に対して治療効果を示す産物をコードしている遺伝子あるいはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片である請求項１に記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型。
【請求項５】
請求項３に記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型を含む多価ワクチン。
【請求項６】
ワクチンの接種方法が経粘膜接種または注射による接種である請求項５記載の多価ワクチン。
【請求項７】
ネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる２つの遺伝子領域である、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域とにそれぞれ異なる発現可能な外来性遺伝子が挿入された少なくとも２種類のトランスファーベクターを調製する工程と、
得られた少なくとも２種類のトランスファーベクターを用いて、外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる遺伝子領域からなる遺伝子断片を、ネコの細胞に、導入するとともにネコヘルペスウイルス１型を感染させ、導入された遺伝子断片とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、
相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択する工程とを含む、
ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入された弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型の調製方法。
【請求項８】
ネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる２つの遺伝子領域である、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域とにそれぞれ異なる発現可能な外来性遺伝子が挿入された少なくとも２種類のトランスファーベクターを調製する工程と、
得られた少なくとも２種類のトランスファーベクターのうちそれぞれのトランスファーベクターを用いて、個々に、外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる遺伝子領域からなる遺伝子断片を、ネコの細胞に、導入するとともにネコヘルペスウイルス１型を感染させ、導入された遺伝子断片とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、
相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択し、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の１箇所の遺伝子領域が組換えられている少なくとも２種類の組換えネコヘルペスウイルス１型を、それぞれ得る工程と、
得られた、それぞれの組換えネコヘルペスウイルス１型をネコの細胞に重感染させ、少なくとも２種類の組換えネコヘルペスウイルス１型のゲノムの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、
相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択する工程とを含む、
ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入された弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型の調製方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項４のいずれかに一つに記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型を細胞に感染させる工程を含む、外来性遺伝子の導入方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型を動物（ただし、ヒトを除く）に経粘膜接種または注射接種し、接種された動物に免疫を賦与する免疫賦与方法。
【請求項１１】
受託番号FERM  BP-7761で寄託されたトランスファーベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ネコヘルペスウイルス１型(feline herpesvirus type 1、以下FHV-1と略す)のベクターウイルスとしての利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにネコを宿主とするウイルスの遺伝子に関して、例えば、ヘルペスビリダエ（Herpesviridae）のアルファーヘルペスビリナエ（Alphaherpesvirinae）亜科に属し、ネコにウイルス性鼻気管炎を誘発するヘルペスウイルスであるFHV-1のゲノムDNAの一部を、遺伝子工学の技術を駆使して人為的に欠損させ、その欠損領域に細胞内あるいは動物体内で発現するように外来性遺伝子を導入することで、天然には存在しない組換えウイルスベクターが作出されている。このような組換えウイルスベクターは、細胞あるいは動物に感染させることでFHV-1由来のウイルス抗原の他に外来性遺伝子に由来する産物をも産生し、動物に接種した場合には、FHV-1に加え外来性遺伝子産物に対する免疫を賦与することが知られている (N. Yokoyama et al., 1996, Arch. Virol. 141: 481-494； N. Yokoyama et al., 1996, Arch. Virol. 141: 2339-2351)。
【０００３】
このようなFHV-1ベクターの具体例としては、ウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（以下、TKと略す）遺伝子領域を欠損させ、その欠損部位に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスベクターが知られている(J. H. Nunberg et al., 1989, J. Virol. 63: 3240-3249； N. Yokoyama et al., 1995, J. Vet. Med. Sci. 57: 709-714)。また、このような組換えFHV-1が、ウイルスの複製能を損なうことなく、FHV-1タンパク質に加えてTK遺伝子領域に導入した外来性遺伝子に由来するタンパク質を発現することが確認されている (G. H. Cole et al., J. Virol. 1990, 64: 4930-4938； R. C. Wardley et al., 1992, J. G. Virol. 73: 1811-1818)。さらに、Yokoyamaら(N. Yokoyama et al., 1996, Arch. Virol. 141: 2339-2351)は、TK遺伝子領域に外来性遺伝子を挿入した組換えFHV-1が、ネコに対して病原性を示さず、その組換えFHV-1を接種したネコは外来性遺伝子産物に対する抗体を産生することを報告している。
【０００４】
一方、FHV-1ゲノム内のTK遺伝子領域以外の外来性遺伝子挿入部位としてＵＬ（Unique long）領域内のｇＣ遺伝子領域の下流に位置するオープンリーディングフレーム２（open reading frame 2、ORF2)が知られている。Willemseら(M. J. Willemse et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 3107-3116)は、ORF2に外来性遺伝子であるβガラクトシダーゼをコードする遺伝子 (以下、LacZと略す)断片を挿入した組換えFHV-1が、弱毒型FHV-1と同程度のウイルス複製能を保有していたと報告している。また、FHV-1ゲノムのＵＳ（unique short）領域内のＵＳ 8.5、ｇＩおよびｇＥなどの遺伝子領域が、FHV-1の複製に必ずしも必要ではないことも知られている。
【０００５】
これらの遺伝子領域へ外来性遺伝子を挿入した組換えFHV-1に関しては、ＵＳ 8.5遺伝子領域にLacZを挿入した組換えFHV-1が弱毒型FHV-1と同程度のウイルス複製能を保持しているとの報告(M. J. Willemse et al., 1995, Virology 208: 704-711)がある一方で、ｇＩおよびｇＥ遺伝子領域にLacZを挿入した組換えFHV-1は弱毒型FHV-1に比較して著しく複製能が低下したとの報告がある (M. J. Willemse et al., 1996, Vaccine 14: 1-5； M. D. Sussman et al., 1995, Virology 214: 12-20)。これらＵＳ遺伝子を外来性遺伝子挿入部位とした組換えFHV-1に加えて、FHV-1ゲノムのORF5（塩基番号5869-7113）に外来性遺伝子を挿入した組換えFHV-1が提案されている（特表2000-501927号公報）。しかしながら、これらの組換えウイルスベクターの動物に対する安全性は調べられておらず、従って宿主であるネコに対して非病原性であるかは不明である。図１の一部分に、参考としてこれらの外来性遺伝子挿入部位を、SalIマップとともに示した。
【０００６】
また、組換えFHV-1については、上記のようにFHV-1ゲノムの数カ所が外来性遺伝子挿入部位として同定されているが、複数の遺伝子挿入部位に複数の外来性遺伝子を同時に挿入した組換えFHV-1ベクターは作製された例はない。
【０００７】
一方、ワクチンとして利用することを考慮すると、本質的に１箇所の遺伝子挿入部位に１種類の外来性遺伝子を挿入することを仮定した場合、これまでの技術では作製される組換えFHV-1ベクターは、FHV-1自体を含めて２価のワクチンとして使用できるものの、多価化の需要が高まっている各種ネコ用ワクチンの現状に必ずしも十分に対応するものではない。
【０００８】
ところで、ウイルスのライフサイクルの維持にはウイルスタンパク質のリン酸化が必要とされ、リン酸化は細胞性若しくはウイルス性のプロテインキナーゼ（タンパク質リン酸化酵素：セリン／スレオニン・キナーゼおよびチロシン・キナーゼ）が担っていると考えられている。FHV-1と同じくアルファヘルペスウイルス亜科に属する単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）や帯状庖疹ウイルス（VZV）あるいはガンマヘルペスウイルス亜科に分類されるエプスタイン−バーウイルス(EBV）については、そのウイルスゲノム内にプロテインキナーゼをコードする遺伝子配列の存在が知られており、その遺伝子でコードされるアミノ酸の配列は各ヘルペスウイルス間で高度に保存されている。
【０００９】
特に、プロテイン・キナーゼの触媒ドメインＩからVIは各種ヘルペスウイルスで保存性が高いことが報告されている(R. F. Smith, and T. F. Smith. 1989. J.Virol. 63:450-455)。またヘルペスウイルスのプロテイン・キナーゼの触媒ドメインのうちドメインＩの典型的なアミノ酸配列は、GXGXXGXV(Xは保存性の低いアミノ酸)で、このようなアミノ酸配列はHSV-1、VZV、EBV、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV）およびヒトヘルペスウイルス６型(HHV-6)で高度に保存されていることが見出されている(M. S. Chee, G. J. Lawrence, and B. G. Barrel. 1989. J. Gen. Virol. 70:1151-1160)。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の技術では、TK遺伝子欠損組換えFHV-1ベクターを除き、十分に弱毒化されネコに対する安全性を備え、ワクチン用ウイルスとしての生産に十分な複製能を保持し、さらには、FHV-1自体を含め３種類以上の病原性遺伝子産物に対する免疫を同時に賦与できる組換えFHV-1ベクターを作出した例はない。すなわち、既知の組換えFHV-1ベクターでは、本質的には外来性遺伝子挿入可能部位がFHV-1ゲノムの一つの領域に限られていることから、組換えFHV-1を接種したネコにFHV-1以外には１種類の外来性抗原に対する免疫の賦与しか期待できない。
【００１１】
従って、例えば、ネコにFHV-1を含む３種の病原微生物に対する感染防御免疫を賦与するためには、１種類の外来性遺伝子を挿入した組換えFHV-1を接種し、さらにもう１種類の対象病原性微生物あるいはそれ由来の抗原からなるワクチンを接種しなければならない。このことは、ワクチン製造の場において、製品および製造工程の多様化や製造コストの高騰が避けられないばかりか、病原微生物からなる複数のワクチンを接種することによる副作用の増大が容易に予想される。
【００１２】
一方、ベクターウイルスを対象動物に接種導入した際問題になるのが、動物個体内におけるベクターウイルスと自然感染ウイルス間における相同性遺伝子組換えであり、その遺伝子組換えにより弱毒化ベクターウイルスが病原性を獲得してしまうことが懸念される。このような遺伝子組換えによるベクターウイルスの病原性の獲得を低減させるためには、ベクターウイルスゲノムの複数箇所に遺伝子変異あるいは外来性遺伝子断片を導入し、ベクターウイルスゲノムと病原性ウイルスゲノム間の相同性遺伝子組換えによって、ベクターウイルスゲノムの複数箇所の遺伝子配列が同時に病原性ウイルス型に転換しない限りベクターウイルスが病原性ウイルスに転換しないようにする必要がある。しかしながら、現状では、そのような複数の遺伝子領域を病原性ウイルスとは異なる遺伝子配列に転換させるか、あるいは複数の遺伝子領域に外来性遺伝子を同時に導入した弱毒化組換えFHV-1ベクターは、主にベクターウイルスが複製能を損なうという理由から作出されていない。
【００１３】
現行のネコのウイルス感染症や細菌感染症の予防に用いられているワクチン、具体的には、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、FHV-1およびクラミジアなどによる感染を予防するワクチンは、弱毒生ワクチンおよび不活化ワクチンの両者共に注射による接種方法が施行されている。しかしながら、注射による接種は、接種の煩雑さや動物に疼痛などの苦痛を与えるなど、接種方法として必ずしも最良の方法とは限らない。それに反して、点眼、経鼻および経口接種等による経粘膜接種法は接種が容易であり、また、接種動物に苦痛を与えることもなく、更には粘膜免疫を誘導できるという点で注射接種法に比べ秀でた点が多い。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく検討し、既知のTK欠損弱毒化組換えFHV-1ベクター（特開平9-267号公報）をさらに改良した。すなわち、FHV-1の複製・増殖に致死的な影響を与えない新たな外来性遺伝子挿入部位として、FHV-1ゲノムのSalI切断DNA断片のうちＵＬ領域に位置するＩ断片内のBamHI切断部位（以下、Ｉ断片と略す）を同定することにより、組換えFHV-1がウイルス複製能を保持し、挿入された外来性遺伝子産物が発現されることを見出した。そして、このＩ断片内のBamHI部位の近傍がプロテイン・キナーゼをコードしている遺伝子領域であることを明らかにすることで本発明を完成するに至った。
【００１５】
さらには、そのＩ断片と既知のTK遺伝子の両遺伝子領域にそれぞれ異なった外来性遺伝子を挿入した、ベクターとして利用可能な組換えFHV-1を作出した。それにより該ウイルス（ウイルスベクター）が、それを感染させた細胞や経粘膜接種したネコ体内で複製可能なこと、および、感染細胞やネコ体内で組換えFHV-1ゲノム内に挿入した少なくとも２種類の外来性遺伝子産物を産生することを見いだし、本発明を完成させたものである。
【００１６】
すなわち、本発明の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型は、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入されたものであり、この少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入されるネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域は、ネコヘルペスウイルス１型の増殖に致死的な影響を与えない２つの領域であることを特徴とする。また、前記領域の具体的な例を示せば、この領域は、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのSalI切断DNA断片のうちユニークロング(ＵＬ)領域に存在するＩ断片部と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域、あるいは、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域が挙げられる。
【００１７】
このネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列をその一部に含むものであり、従って、外来性遺伝子の挿入箇所としては、Ｉ断片部でコードされる遺伝子領域に限らず、このプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域全体が対象となる。
【００１８】
なお、本発明で「発現可能に」とは、挿入された外来性遺伝子が細胞内でその遺伝子産物を発現するように、プロモーターやエンハンサー等の遺伝子発現調節配列にリンクして外来性遺伝子またはその一部の配列からなる遺伝子断片が挿入されていることを意味する。この外来性遺伝子を発現可能とするための遺伝子発現調節配列であるプロモーター等の配列は、挿入する外来性遺伝子の一部として外来性遺伝子とともに挿入されていてもよく、あるいは、ネコヘルペスウイルス１型（FHV-1）自体がゲノム中に有するプロモーター等の遺伝子発現調節配列を利用するように、構造遺伝子である外来性遺伝子を挿入、配置してもよい。すなわち、本発明における挿入する外来性遺伝子は、構造遺伝子のみであっても、あるいは構造遺伝子とプロモーター等の遺伝子発現調節配列とを結合した遺伝子カセットでもよい。好ましくは、挿入した外来性遺伝子の遺伝子産物の発現をより確実とし、また挿入箇所の自由度を確保できる点で、構造遺伝子と遺伝子発現調節配列とを予め結合した遺伝子カセットを用いる。
【００１９】
Ｉ断片部への外来性遺伝子の挿入では、Ｉ断片内、特に外来性遺伝子挿入部位であるBamHI認識部位における外来性遺伝子の発現に必要なプロモーター等の遺伝子発現調節配列の存在が不明である。また仮にBamHI認識部位近傍に遺伝子発現調節配列が存在したとしても、外来性遺伝子を挿入する機序がトランスファーベクターとFHV-1ゲノムの間で生じる相同性遺伝子組換えである。これらのことから、その遺伝子発現調節配列によって効率良く外来性遺伝子の発現が調節される部位に外来性遺伝子が挿入されるとは限らない。従って、プロモーター等の遺伝子発現調節配列を含む遺伝子カセットとして外来性遺伝子を挿入することが好ましい。また、プロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域への外来性遺伝子の挿入においても、同様な理由によりプロモーター等の遺伝子発現調節配列を含む遺伝子カセットとして外来性遺伝子を挿入することが好ましい。
【００２０】
また、プロモーター等の遺伝子発現調節配列としては、FHV-1由来のgCプロモーターやgBプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の前初期（IE）プロモーター、あるいはマレック病ウイルス（MDV）由来のRNA 1.8プロモーター（G. Bradley et al., 1989, J. Virol. 63: 2534-2542）などが挙げられる。これらのうちFHV-1由来のgCプロモーターはFHV-1が自然感染した場合と同様レベルに外来性遺伝子産物を産生させ、また、ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターはその強力なプロモーター活性により活発に外来性遺伝子産物を産生させ、その発現させた外来性遺伝子産物により高度な免疫原性が得られるという点で特に好ましいものである。
【００２１】
一方、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域への外来性遺伝子の挿入では、チミジンキナーゼの発現のためのプロモーターやエンハンサーなどの遺伝子発現調節配列が外来性遺伝子挿入部位近傍に存在するが、上記同様に遺伝子発現調節配列を含む遺伝子カセットとして挿入することが、より適格にまたより効率よく外来性遺伝子の発現を調節できる点で好ましい。またこの場合、プロモーター等の遺伝子発現調節配列としては、FHV-1由来のgCプロモーターやgBプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、あるいはMDV由来のRNA 1.8プロモーターなどが挙げられる。これらのうちgCプロモーターやヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターが上述の理由で特に好ましいものである。
【００２２】
一方、上記ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に発現可能に挿入される外来性遺伝子は、病原微生物に由来し、動物に対して感染防御能を誘導するポリペプチドをコードしている遺伝子もしくはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片、あるいは、例えば、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン１０、ＴＮＦαのような各種サイトカインなどに由来し、動物に対して治療効果を示す産物をコードしている遺伝子もしくはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明は、上記の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型を含むワクチンあるいは治療用組成物をも包含し、これらのワクチンあるいは治療用組成物は経粘膜接種により用いられることを特徴としている。
【００２４】
さらに、本発明は、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入された弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型の調製方法を含む。この調製方法は、（１）ネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる２つの遺伝子領域からなる遺伝子断片内にそれぞれ異なる発現可能な外来性遺伝子が挿入された少なくとも２種類のトランスファーベクターを調製する工程と、（２）得られた少なくとも２種類のトランスファーベクターを用いて、ネコの細胞、好ましくはネコ株化細胞に、外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる遺伝子領域からなる遺伝子断片を導入するとともに、ネコヘルペスウイルス１型を感染させ、導入された遺伝子断片とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、（３）相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択する工程とを含むことを特徴とする。この方法は、導入された複数の遺伝子断片とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換を一回の操作で行うものである。
【００２５】
また、本発明の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型は、ゲノム内の異なる領域に外来性遺伝子が挿入された組換えウイルス同士をネコの細胞、好ましくはネコ株化細胞に重感染させることによっても得ることができる。この調製方法は、（１）ネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる２つの遺伝子領域からなる遺伝子断片内にそれぞれ異なる発現可能な外来性遺伝子が挿入された少なくとも２種類のトランスファーベクターを調製する工程と、（２）得られた少なくとも２種類のトランスファーベクターのうちそれぞれのトランスファーベクターを用いて、ネコの細胞、好ましくはネコ株化細胞に、外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型のゲノムの異なる遺伝子領域からなる遺伝子断片を導入するとともに、ネコヘルペスウイルス１型を感染させ、導入された遺伝子断片とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、（３）相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択し、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の１箇所の遺伝子領域が組換えられている少なくとも２種類の組換えネコヘルペスウイルス１型を、それぞれ得る工程と、（４）得られた、それぞれの組換えネコヘルペスウイルス１型をネコの細胞、好ましくはネコ株化細胞に重感染させ、少なくとも２種類の組換えネコヘルペスウイルス１型のゲノムの間で相同性遺伝子組換えを起こさせる工程と、（５）相同性遺伝子組換えが生じたネコヘルペスウイルス１型を選択する工程とを含むことを特徴とするものである。この方法では、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の１箇所の遺伝子領域に外来性遺伝子が挿入された組換えネコヘルペスウイルス１型を少なくとも２種類以上、調製・単離する工程を含むものである。
【００２６】
上記のネコヘルペスウイルス１型を感染させる細胞とは、ネコ由来の細胞を意味するものでる。ネコ株化細胞とは、単一の細胞種からなり、継続的に組織培養技術により培養することが可能であるという特徴を有する細胞である。このようなネコ株化細胞としては、例えば、ネコ腎由来株化細胞であるCrFK細胞（R. A. Crandell et al., 1973, In Vitro 9: 176-185）、インターロイキン２依存性株化リンパ球であるMYA-1細胞（T. Miyazawa et al., 1989, Arch. Virol. 108: 131-135）、インターロイキン非依存性CD4陽性株化リンパ球であるFeT-J細胞（T. Hohdatsu et al., 1996, J. Gen. Virol. 77: 93-100）などがある。これらのうちCrFK細胞がFHV-1に対する感受性が高く、またFHV-1の増殖性の良い点で好ましいものである。
【００２７】
なお、上記のネコヘルペスウイルス１型の調製方法において、外来性遺伝子を挿入するネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる遺伝子領域は、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのSalI切断DNA断片のうちユニークロング(ＵＬ)領域に存在するＩ断片部と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域、あるいはネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域が好ましいものである。
【００２８】
また、本発明は、このようにして得られた弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型をベクターとして用い、細胞に感染させることにより外来性遺伝子を細胞内で発現または産生する方法を提供するものであり、また、多価ワクチンとして用い、動物に経粘膜接種し、接種された動物に免疫を賦与する免疫賦与方法をも提供する。
【００２９】
ここで感染させる細胞としては、ネコヘルペスウイルス１型に対するレセプターを有しているものが好ましい。このような細胞としては、ネコ由来の細胞、好ましくはネコ株化細胞がある。またワクチンを接種する動物としては、ネコ科の動物、好ましくはネコのような、ネコヘルペスウイルス１型に対して感染が成立する動物が好ましい対象となる。なお、賦与される免疫には、全身性の液性免疫や細胞性免疫の他、粘膜接種に基づく局所性の免疫も含まれる。一方、ネコ科以外の動物であっても、本発明の組換えネコヘルペスウィルス１型をワクチンとして接種し、免疫を賦与することもできる。すなわち、ネコ以外の動物のような、ネコヘルペスウィルス１型に非感受性の動物であっても、この組換えネコヘルペスウィルス１型を接種することで少なくともFHV-1ゲノムに挿入した外来性遺伝子を接種動物体内で発現・産生することができる。その結果、外来性遺伝子が病原微生物の抗原性タンパク質をコードする場合、接種動物にその病原微生物に対する免疫が賦与される。
【００３０】
以上のように、本発明は新たな外来性遺伝子挿入箇所を見出し、これによりこれまでに例がない、FHV-1ゲノム内の２箇所の遺伝子領域に外来性遺伝子を挿入可能とした新たなFHV-1ベクターを作出したものである。
【００３１】
また、ネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、挿入される外来性遺伝子のうち、動物に対して感染防御能を誘導するポリペプチドをコードしている遺伝子もしくはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片には、ネコ科に属する動物、主にはネコに感染する種々の微生物が産生する抗原性を有するタンパク質をコードする遺伝子もしくはその一部の配列からなる遺伝子断片およびネコ以外の動物に感染する種々の病原微生物が産生する抗原性タンパク質がある。この様な例としては、ネコ白血病ウイルスの外被タンパク質およびコアタンパク質、ネコ汎白血球減少症ウイルスのVP2タンパク質、ネコ免疫不全ウイルスの外被タンパク質およびコアタンパク質、ネコカリシウイルスのカプシドタンパク質、クラミジアの主要外膜タンパク質MOMP-1、狂犬病ウイルスの外被タンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質、およびイヌジステンバーウィルスあるいはイヌパルボウィルスの構造タンパク質などをコードする遺伝子あるいはその一部の配列からなる遺伝子断片が挙げられる。
【００３２】
また、動物に対して治療効果を示す遺伝子産物をコードしている遺伝子もしくはその遺伝子の一部の配列からなる遺伝子断片には、ネコあるいは他の動物のウイルス感染症、細菌感染症あるいは腫瘍に対して感染防御効果や治療効果を示すＴＨ１型やＴＨ２型のサイトカインをコードする遺伝子がある。この様な例としては、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン１０、ＴＮＦαなどをコードする遺伝子あるいはその一部の配列からなる遺伝子断片が挙げられる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型はネコヘルペスウイルス１型のゲノム内の２つの異なる領域に、少なくとも２種類の外来性遺伝子が発現可能に挿入されたものであり、ベクターあるいはワクチンとして用いることができる。
【００３４】
このような組換えウイルスは異なるトランスファーベクターを作製し、このトランスファーベクターの遺伝子配列とネコヘルペスウイルス１型ゲノムとの間で相同性遺伝子組換えにより得ることができる。すなわち、本発明のようにゲノム内の２つの異なる領域に外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型を得るためには、２種類のトランスファーベクターを用いてゲノム内のそれぞれの領域で相同遺伝子組換えを生じさせることによっても、あるいは、一旦、ゲノム内の異なる領域に外来性遺伝子が挿入されたネコヘルペスウイルス１型をそれぞれ調製した後、これらのウイルスを重感染させることで相同遺伝子組換えを生じさせることによっても得ることができる。後者は、それぞれの組換えウイルスが、感染させた細胞内で増殖することで、相同性遺伝子組換えを起こす確率が高くなるという点から好ましい方法である。
【００３５】
また、外来性遺伝子が挿入される領域は、ウイルスの増殖に必須の遺伝子をコードしている領域であってはならず、また挿入された外来性遺伝子の発現が可能な領域でなくてはならない。このような条件を満たす外来性遺伝子の挿入領域としては、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのSalI切断DNA断片のうちユニークロング(ＵＬ)領域に存在するＩ断片部とチミジンキナーゼをコードする遺伝子領域の二つの遺伝子領域や、あるいは、ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのユニークロング(ＵＬ)領域に存在するプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域と、チミジンキナーゼをコードする遺伝子領域との二つの遺伝子領域が例示される。
【００３６】
Ｉ断片部に外来性遺伝子を挿入する場合、外来性遺伝子の挿入箇所はＩ断片のいずれの部分でもよい。特に、Ｉ断片のうち配列が確定している配列番号１で示される部分（Ｉ断片中のPstI-HindHI、シークエンス領域、図１）は、外来性遺伝子の挿入が容易となる点で好ましい領域である。
【００３７】
また、プロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域部分に外来性遺伝子を挿入する場合におけるプロテイン・キナーゼはＩ断片部の遺伝子配列によりコードされ、配列番号２に示されるアミノ酸配列をその一部として含むものである。従って、外来性遺伝子の挿入箇所は、このプロテイン・キナーゼをコードする構造遺伝子ばかりでなく、プロテイン・キナーゼの制御遺伝子部であってもよく、またＩ断片部に限らず、プロテイン・キナーゼをコードする全遺伝子の範囲が対象となるものである。
【００３８】
ネコヘルペスウィルス１型のゲノムとSalIで消化した場合のマップを、従来知られている外来性遺伝子の挿入箇所とともに図１に示した。図中、ＵＬはユニークロング領域を、ＵＳはユニークショート領域を、ＩＲＳはインターナルリピートショート領域を、ＴＲＳはターミナルリピートショート領域を示した図である。一方、Ａ〜Ｎの各英文字は、SalIで切断した場合の各断片の名称を示している（P. A. Rota et al., 1986, Virology 154: 168-179； A. Grail et al., 1991, Arch. Virol. 116: 209-220）。本発明における特に好ましい外来性遺伝子挿入領域は、一つはこのＩ断片中のシークエンス領域、特にBamHIサイトであり、もうひとつはＡ断片中のＴＫで示されるチミジンキナーゼ領域である。
【００３９】
そして、このユニークな外来性遺伝子の挿入部領域であるＩ断片中のBamHIサイトの近傍の遺伝子配列を調べたところ、この遺伝子配列は、プロテイン・キナーゼをコードする遺伝子配列の一部を構成するものであった。従って、プロテイン・キナーゼをコードする遺伝子領域が外来性遺伝子の挿入部位として好ましいものである。
【００４０】
これらの領域に挿入された外来性遺伝子は、感染細胞中でそれぞれ遺伝子産物であるタンパク質を発現することが確認されている。加えて、本発明で構築された組換えFHV-1は、組換えウイルスの作製に用いた弱毒化FHV-1のチミジンキナーゼを欠損させたことでより弱毒化（非病原性）が増したウイルスとなっている。
【００４１】
従って、本発明の弱毒化組換えネコヘルペスウイルス１型は、ベクターとして、あるいはワクチンとして用いることができる。ワクチンとして用いた場合には、少なくとも２種類の挿入された外来性遺伝子の発現により産生されたタンパク質に対する抗体と、ネコヘルペスウイルス１型に対する抗体との産生を誘発することが確認されている。また、このワクチンはヘルペスウイルスであることから経粘膜投与、すなわち経鼻、点眼および経口投与が特に好ましい投与方法であるが、従来から用いられている注射による投与も有効である。
【００４２】
ワクチンは、本発明の組換えFHV-1を等張のリン酸緩衝液に懸濁することで調製することができる。また、動物に接種するウイルス量は、ウイルスの力価や免疫原性により変化するが、例えば、ネコに経粘膜接種する場合には、その投与するワクチン液量は１〜２mlが一般的である。この投与液量で免疫を惹起できるウイルス量に調製することが好ましい。
【００４３】
以下、本発明の一例として、外来性遺伝子としてネコカリシウイルスカプシドタンパク質をコードする遺伝子断片およびβガラクトシダーゼをコードする遺伝子を用いた場合について説明する。
【００４４】
本発明の組換えFHV-1は、図２にその概要を模式的に示すように、既知のTK欠損FHV-1の欠損TK部位にFHV-1由来のGlycoprotein Cプロモーター（以下、gCプロモーターと略す）が付随したネコカリシウイルス（以下、FCVと略す）カプシドタンパク質をコードする遺伝子断片（以下、gC-Capと略す）を組み込んだ組換えFHV-1（dTK-gC/Cap-FHV、図２Ａ、特開平9-267号公報、参照）およびFHV-1のＩ断片にサイトメガロウイルス(CMV)由来前初期プロモーターが付随したβガラクトシダーゼ遺伝子(以下、Pro-LacZと略す)断片を組み込んだ組換えFHV-1（Lac FHV、図２Ｂ参照）をネコ腎由来株化細胞に重感染させ、両ウイルス間の相同性遺伝子組換えによって出現した同一ウイルスゲノム中にgC-Cap断片とPro-LacZ断片とが組み込まれた組換えFHV-1（FHV-Cap/Lac、図２Ｃ参照）である。
【００４５】
以下、組換えFHV-1の作製方法について説明する。
【００４６】
まず、Pro-LacZ断片を含有するトランスファーベクターを次のようにして作製した。すなわち、FHV-1ゲノムDNAのSalI切断DNA断片の一つであるＩ断片を組み込んだプラスミドベクター pSal-I（東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与）のＩ断片をBamHI認識部位を消失させた市販のプラスミドベクターに再クローニングし、その新たに構築したＩ断片を含有するプラスミドpdBSIのＩ断片内のユニークなBamHI切断部位に、市販の真核細胞発現ベクターpCMVβ（CLONTECH社製）由来の前初期プロモーターが付随したLacZ遺伝子断片（Pro-LacZ）を組み込み、トランスファーベクターpdBSI-LacZを作製した。
【００４７】
このpdBSI-LacZを含む形質転換体である大腸菌は、E-dBSI-LacZとして受託番号FERM P-17935で通商産業省工業技術院生命工学研究所特許微生物寄託センターに平成１２年６月３０日付けで寄託（受託番号FERM P-17935）し、平成１３年１０月３日付けで国際寄託に変更した（受託番号FERM BP-7761）。なお、現在、寄託機関は、「独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター」と名称が変更されている。
【００４８】
次いで、以上のように構築した形質転換体E-dBSI-LacZからpdBSI-LacZ DNAを抽出しCrFK細胞(Crandell feline kidney細胞、ネコ腎由来株化細胞、東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与)にトランスフェクション法で導入した後、そのCrFK細胞に弱毒化FHV-1を感染させた。その後、pdBSI-LacZ内のFHV-1ゲノムDNA由来Ｉ断片とFHV-1ゲノムDNA間で相同性遺伝子組換えを起こさせ、FHV-1のＩ断片領域にPro-LacZが挿入した組換えFHV-1を作製した。このようにして作製した組換えFHV-1をLacZ-FHV（図２Ｂ）と名付けた。
【００４９】
次いで、FHV-1のゲノムからTK遺伝子領域内のEcoRV-SmaI遺伝子断片を遺伝子工学の技術を用いて欠損させ、その欠損部位にFHV-1由来gCプロモーターとFCVカプシドタンパク質をコードする遺伝子とを連結したDNA断片を挿入した組換えFHV-1（dTK-gC/Cap-FHV、図２Ａ、東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与；参考文献、N. Yokoyama et al., 1998, J. Vet. Med. Sci. 60: 717-723）と上記LacZ-FHVとを共にCrFK細胞に共感染させ、これら２種類の組換えFHV-1間の相同性遺伝子組換えを起こさせ、FHV-1ゲノムのＩ断片内BamHI部位にLacZが、またTK遺伝子領域にFCVカプシドタンパク質遺伝子がそれぞれ組み込まれた組換えFHV-1を作製した。
【００５０】
このようにして得られた最終目的とした組換えFHV-1、すなわちFCVカプシドタンパク質とβガラクトシダーゼとを産生可能な組換えFHV-1をFHV-Cap/LacZ（図２Ｃ）と名付けた。
【００５１】
以上の操作は、サムブロックら(J. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Press)によって記載されている既知の遺伝子操作技術ならびに細胞工学技術によって行うことができる。
【００５２】
上記のように作製したFHV-Cap/LacZは、ネコ由来細胞株およびネコ個体内での複製能を有し、またネコの鼻腔、眼あるいは口腔内に接種した場合、ネコは何ら臨床的に副作用を呈さないことからネコに対する安全性が確認された。
【００５３】
以上のように、FHV-1ゲノムのSalI切断DNA断片のうちＵＬ領域に位置するＩ断片内のBamHI認識部位がFHV-1の複製に必須ではないことを見いだし、そのＩ断片内に外来性遺伝子を組み込み、さらには組み込んだ外来性遺伝子から遺伝子産物が動物由来細胞内および動物体内で産生されることを見いだしたのは本発明が最初である。
【００５４】
加えて、FHV-1ゲノムのSalI切断DNA断片のうちＵＬ領域に存在するＩ断片およびTK遺伝子の二つの遺伝子領域に外来性遺伝子を組み込んだ組換えFHV-1を構築したこと、また、その組換えFHV-1がネコ由来細胞株およびネコ体内で複製することを見いだしたのも本発明が最初である。
【００５５】
さらに、外来性遺伝子の挿入部位として新たに見出したSalI Ｉ断片内BamHI消化部位近傍の塩基配列を決定し、さらにその塩基配列から予想されるアミノ酸配列を解析した結果、BamHI消化部位近傍が、他のヘルペスウイルスのプロテイン・キナーゼの触媒ドメインＩからVIのアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列を保有していることを見出した。FHV-1ゲノム内のSalI Ｉ断片の塩基配列はこれまでに決定されたことはなく、Ｉ断片内にプロテイン・キナーゼをコードする塩基配列が存在することを見出したのは本発明が初めてである。
【００５６】
さらに、FHV-1ゲノムのＵＬ領域のプロテイン・キナーゼ領域が外来性遺伝子挿入部位として有効であることを見出したのも本発明が最初である。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。図３、４に本発明で実施した実験操作の概略を示す。なお、図３はLacZ挿入トランスファーベクターpdBSI-LacZの作製までの概要を示し、図４はこのトランスファーベクターpdBSI-LacZからのDNAを用いて、LacZおよびFCVカプシド遺伝子を挿入した組換えFHV-1であるFHV-Cap/Lacの作製法の概要を示したものである。
【００５８】
１.  組換えFHV-1ベクター作出用トランスファーベクターの構築
(1) FHV-1ゲノムＩ断片組み込みプラスミドの構築
FHV-1ゲノムDNAのSalIライブラリーのＩ断片を含有するプラスミドベクターであるpSal-I（東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与）をSalIで消化後、市販のQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製)を用い、添付されたマニュアルに従ってFHV-1ゲノムのＩ断片を分離調製した。
【００５９】
一方、このＩ断片を組み込むためのプラスミドベクターは、BamHI消化で開環した市販のプラスミドベクターpUC18（Amersham Pharmacia Biotech社製）を、T4 DNAポリメラーゼ (宝酒造社製)存在下、37℃、5分間のインキュベーションにより平滑末端化した。その後、T4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL社製）存在下、16℃、17時間のインキュベーションにより平滑化したBamHI切断部位を連結して調製した。得られたBamHI認識部位を欠乏させたプラスミドベクターをpUC-dBと名付けた。図中、四角で囲んだBamHIは、このような操作により消失したBamHI部位を示している。
【００６０】
次いで、pUC-dBをSalI消化して開環し、そのSalI消化部位に上記で分離調製したFHV-1ゲノムのＩ断片をT4 DNAリガーゼを用いて連結した。このようにして得られたpUC-dBのSalI消化部位にFHV-1ゲノムのＩ断片を組み込んだプラスミドをpdBSIと名付けた。
【００６１】
(2) pdBSIを含有する形質転換体の調製
pdBSIのDNA液を市販のコンピテント化した大腸菌XL-1 Blue（ストラタジーン社製）と混合し、添付のマニュアルに従いプラスミドDNAを大腸菌に導入することにより大腸菌を形質転換した。さらに形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（1L中、バクト・トリプトン10 g、バクト・イースト・エクストラクト5 g、塩化ナトリウム10 g、およびバクト・アガー15 gを含む寒天培地）を用いて37℃で17時間培養することで寒天培地上に生育したアンピシリン耐性の形質転換体クローンを得た。次いで各形質転換体クローンから抽出したプラスミドDNAをSalIで消化し、0.8%アガロース・ゲルを用いた電気泳動によるで解析で（図６、レーン１）約6,800塩基対のＩ断片を有する形質転換体クローンを選別し、そのクローンをE-dBSIとした。
【００６２】
(3)トランスファーベクターの構築
市販の真核細胞発現プラスミドベクターでβガラクトシダーゼを発現するpCMVβ（CLONETECH社製）をPstIで消化し、前述のQIAquick Gel Extraction Kit を用いてCMV由来の前初期プロモーターが付随したLacZ遺伝子を含む遺伝子断片（Pro-LacZ）を単離精製した。その後、そのPro-LacZをT4 DNAポリメラーゼ存在下37℃で5分間インキュベーションすることでPstI消化部位を平滑化した。
【００６３】
一方、このPro-LacZを組み込むためのプラスミドである前述のpdBSIについては、Ｉ断片内に１箇所認識部位が存在するBamHIによる消化で開環し、さらにそのBamHI部位を前述同様のT4 DNAポリメラーゼ処理で平滑化した。
【００６４】
次いで、平滑末端化したPro-LacZと、開環し平滑末端化したpdBSIとをT4 DNAリガーゼ存在下、16℃、17時間のインキュベーションにより連結した。このようにして得られたFHV-1ゲノム由来SalIライブラリーのＩ断片内の平滑化BamHI部位にPro-LacZが組み込まれたトランスファーベクターをpdBSI-LacZと名付けた（図３）。
【００６５】
構築したトランスファーベクターpdBSI-LacZの模式図を図５に示した。図中、「LacZ」はLacZ遺伝子断片を示し、四角で囲まれたPstIおよびBamHIは、それぞれ平滑末端化したPstI認識部位およびBamHI認識部位を示し、「Pro」は、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の前初期プロモーターを示し、矢印はLacZ遺伝子断片およびプロモーターの方向性を示している。
【００６６】
２．pdBSI-LacZを含有する形質転換体の調製
pdBSI-LacZのDNA液を市販のコンピテント化した大腸菌XL-2 Blue MRF'と混合し、添付のマニュアルに従いプラスミドDNAを大腸菌に導入することにより大腸菌を形質転換し、さらに形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地を用いて37℃で17時間培養することで寒天培地上に生育したアンピシリン耐性の形質転換体クローンを得た。
【００６７】
次いで各形質転換体クローンから抽出したプラスミドDNAをSalIで消化し、0.8%アガロース・ゲルを用いた電気泳動よる解析で、約6,600塩基対と約4,700塩基対とに２分割（Ｉ断片中に挿入されたPro-LacZカセット中のSalI部位に基づく、図５参照）されたＩ断片および約2,600塩基対のベクタープラスミドpUC18のDNA断片のそれぞれを有するクローンを選別した（図６、レーン２、pdBSI-LacZのSalIによる消化）。また、選別したクローンのNotI消化で、そのクローンが3,474塩基対のLacZ DNA断片を有することを確認した（図６、レーン３、pdBSI-LacZのNotIによる消化）。なお、図６に示した電気泳動結果中、レーン１はPro-LacZが挿入されていないＩ断片が挿入されたpdBSIをSalIで消化したもので、約7,000塩基対のＩ断片と約2,600塩基対のベクタープラスミドpUC18のDNA断片との２つが存在することが認められる（図５参照）。また、図６中、レーンＭは分子量マーカーであり、おおよその塩基対数を示している。
【００６８】
このようにして選別したトランスファーベクターpdBSI-LacZを含み、形質転換された大腸菌をE-dBSI-LacZと名付け、通商産業省工業技術院生命工学研究所特許微生物寄託センターに寄託し（受託番号FERM P-17935）、平成１３年１０月３日付けで国際寄託に変更した（受託番号FERM BP-7716）。
【００６９】
３．LacZ挿入組換えFHV-1の作製
CrFK細胞に上述のトランスファーベクターpdBSI-LacZのDNAをトランスフェクション法で導入し、更にその遺伝子を導入したCrFK細胞に弱毒化FHV-1を感染させ、細胞内でのpdBSI-LacZ DNAと弱毒化FHV-1ゲノム間の相同性遺伝子組換えによって、FHV-1ゲノムのSalI切断DNA断片の一つであるＩ断片内のBamHI切断部位にLacZ遺伝子が組み込まれたＩ断片を有する組換えFHV-1を得た。以下に、その詳細について説明する。
【００７０】
3μgのpdBSI-LacZ DNAと市販のトランスフェクション用試薬であるLipofectAMINE (GIBCO BRL社製) 10μlとを混合し室温で45分間反応させた。次いで、組織培養用6穴プレートを用い10%牛胎児血清を含むダルベッコの最少必須培地(以下、D-MEMと略す、ニッスイ社製)中、37℃、5%炭酸ガス存在下で培養後、D-MEM 3mlで２回洗浄した１×106個のCrFK細胞に、上記pdBSI-LacZ DNAとトランスフェクション試薬との反応液を加え、pdBSI-LacZ DNAをCrFK細胞に導入した。
【００７１】
次に、この遺伝子導入したCrFK細胞を37℃、5%炭酸ガス存在下で24時間培養し、そのCrFK細胞に弱毒型FHV-1をMOI (multiplicity of infection、ウイルス感染価):0.01の割合で感染させた。このようにpdBSI-LacZ DNAを遺伝子導入した後、弱毒型FHV-1を感染させたCrFK細胞をおよそ３日間培養し、ほとんどの細胞で細胞傷害（cytopathic effect、以下、CPEと略す）が認められた時点で細胞懸濁液を３回凍結融解することで細胞を破砕し、最終的にはその細胞破砕液の遠心上清中に弱毒化FHV-1と組換えFHV-1との両方を含むウイルス液を回収した。このウイルス液からの組換えFHV-1のスクリーニングは以下に示すプラーク選択法で行った。
【００７２】
すなわち、回収したウイルス液をD-MEMで10-1から10-5まで階段希釈し、各希釈ウイルス液300μlを６穴の組織培養プレート内で増殖した１×106個のCrFK細胞に加え、37℃で1時間ウイルスを吸着させた後、2%牛胎児血清および1%アガロースを含むD-MEM軟寒天培地1mlを重層して２日間培養した。続いて、0.01%のニュートラルレッド、1mg/mlのX-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside、SIGMA社製)、1%の牛胎児血清および1%のアガロースを含んだD-MEM軟寒天培地1mlを重層し、さらに24時間細胞を培養し、増殖した組換えウイルスによって形成された青色のプラークを単離した。以後、同様のプラーク選別法を２回繰り返してLacZをゲノム内Ｉ断片に組み込んだ組換えFHV-1を選別した。このようにして得られたLacZ挿入組換えFHV-1をLac-FHV（図２Ｂ参照）と名付けた。
【００７３】
４．LacZおよびFCVカプシドタンパク質遺伝子挿入組換えFHV-1の作製
(1) TK欠損／FCVカプシドタンパク質遺伝子挿入FHV-1の調製
組織培養フラスコ中で、TK遺伝子領域にFHV-1由来gCプロモーターが付随したFCVカプシドタンパク質遺伝子を組み込んだ組換えFHV-1（以下、dTK-gC/Cap-FHVと略す、東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与）を１×107個のCrFK細胞にMOI:0.01になるように加え、37℃で1時間のインキュベーションで吸着・感染させた。次いで、細胞を2%牛胎児血清を含むD-MEM培地中、37℃、5%炭酸ガス存在下でほとんどの細胞でCPEが認められるまでおよそ3日間培養した。続いて、細胞懸濁液を３回凍結融解することで細胞を破砕し、その細胞破砕液の遠心上清中に欠損させたTK遺伝子領域内にFCVのカプシドタンパク質遺伝子が挿入された組換えFHV-1を得た。このようにして得られた組換えFHV-1をdTK-gC/Cap-FHV（図２Ａ参照）と名付けた。
【００７４】
なお、前記組換えFHV-1であるdTK-gC/Cap-FHVを作出するのに用いたネコカリシウイルスカプシドタンパク質遺伝子とFHV-1由来のgCプロモーターを組み込んだトランスファーベクター（pfTK(gCp)-Capと命名されている）は、図７に示す構造を有したもので、図中、斜線部分は、pfTK(gCp)-Cap構築の際に組み込まれたプラスミドベクター（pBluescript KS-）由来のマルチクローニングサイトの一部を示し、「Pro」はFHV-1由来のgCプロモーターを、「FCV Capsid」はネコカリシウイルスカプシドタンパク質遺伝子を、「SalI A」はFHV-1ゲノム由来のSalI A断片を、「ＴＫ」はチミジンキナーゼ遺伝子をそれぞれ示し、また、上記チミジンキナーゼ遺伝子（「ＴＫ」）中の点線の部分は、欠損させた遺伝子領域を示している。なお、図中の矢印は、ネコカリシウイルスカプシド遺伝子およびプロモーターの方向性を示している。
【００７５】
(2) FHV-Cap/Lacの作製
6穴の組織培養プレート中で、１×106個のCrFK細胞にLac-FHVをMOI:0.01になるように加え、37℃、1時間のインキュベーションで組換えウイルスをCrFK細胞に吸着・感染させた後、2%牛胎児血清を含むD-MEM培地中で24時間培養することでLac-FHVが感染したCrFK細胞を増殖させた。次に、このLac-FHV感染CrFK細胞にdTK-gC/Cap-FHVのウイルス液をMOI:0.01になるように加え、上記同様の操作でLac-FHV感染CrFK細胞にdTK-gC/Cap FHVを吸着・重感染させた。このようにしてLac-FHVとdTK-gC/Cap-FHVとを重感染させたCrFK細胞をCPEが認められるまで約３日間培養した後、上記同様の凍結融解操作で細胞を破砕し、その細胞破砕液の遠心上清中に組換えウイルス、すなわち、Lac-FHVとdTK-gC/Cap-FHVとが部分的に遺伝子組換えを起こし、一つのウイルスゲノム中にLacZ遺伝子とgCプロモーターが付随したFCVカプシドタンパク質遺伝子とが組み込まれた組換えFHV-1を含むウイルス液を得た。このウイルス液からの上記組換えFHV-1の選別は以下に示すプラーク選別法で行った。
【００７６】
すなわち、ウイルス液を10-1から10-5まで階段希釈した後、各希釈ウイルス液300μlを6穴の組織培養プレート中の１×106個のCrFK細胞に加え、37℃で１時間ウイルスを細胞に吸着・感染させた後、培養プレート底面に付着して増殖したCrFK細胞に、100mgのアラビノフラノシルウラシル (arabinofuranocyluracil)、2%の牛胎児血清および1%のアガロースを含むD-MEM軟寒天培地１mlを重層し、5%炭酸ガス存在下、37℃で培養した。２日後、D-MEM軟寒天培地の上に0.01%のニュートラルレッド、１mg/mlのX-gal、100mgのアラビノフラノシルウラシル、1%の牛胎児血清および1%のアガロースを含んだD-MEM軟寒天培地1mlを重層し、さらに培養を続け、24時間後、増殖した組換えウイルスによって形成された青色のプラークを単離した。以後、同様のプラーク選別法を２回繰り返しウイルスゲノム内のＩ断片内にLacZ遺伝子が、また欠損したTK遺伝子領域にFHV-1由来gCプロモーターが付随したFCVのカプシドタンパク質遺伝子がそれぞれ挿入された組換えFHV-1を選別した。このようにして得られた組換えFHV-1をFHV-Cap/Lac（図２Ｃ参照）と名付けた。
【００７７】
なお、ここで得られたFHV-Cap/Lacについては、通商産業省工業技術院生命工学研究所特許微生物寄託センターにより平成１１年１２月２日付けで受託拒否証明書（平成１１年１１月２９日申請）が発行され、同センターには寄託されていないが、この組換えウイルスFHV-Cap/Lacは、共立製薬株式会社つくば中央研究所内に保管されており、必要に応じ分譲することができる。また、このFHV-Cap/Lacについては、ECACC(European Collection of Cell Cultures)に寄託し、２００２年１月１６日付けで受託された（受託番号02011625）。
【００７８】
５．株化細胞におけるFHV-Cap/Lacからの外来性タンパク質の発現
組換えFHV-1であるFHV-Cap/Lacを感染させたCrFK細胞におけるFHV-Cap/Lac由来のFCVカプシドタンパク質およびβガラクトシダーゼの発現は、以下に示す蛍光抗体法で解析した。
【００７９】
すなわち、１×106個のCrFK細胞にFHV-Cap/LacをMOI:0.01になるように添加し、上記同様にウイルスを吸着・感染させた後、2%牛胎児血清を含むD-MEM培地中、5%炭酸ガス存在下、37℃で24時間培養した。次いで、培養した細胞をリン酸緩衝液（137mMの塩化ナトリウム、2.68mMの塩化カリウム、8.1mMのリン酸水素二ナトリウム、および1.47mMのリン酸二水素カリウム、pH 7.4、からなる）で洗浄し、冷却アセトンで固定した。このようにして固定したFHV-Cap/Lac感染CrFK細胞におけるFCVカプシドタンパク質およびβガラクトシダーゼの発現を以下に説明する蛍光抗体法で解析した。
【００８０】
FCVカプシドタンパク質の発現解析は以下の手順で行った。まず固定したCrFK細胞を、リン酸緩衝液で1:100希釈したマウス抗FCVカプシドタンパク質モノクローン抗体（東京大学農学部・宮沢孝幸博士より分与）と37℃で１時間反応させ、リン酸緩衝液で細胞を３回洗浄したのち、1:1,000希釈したテトラメチルローダミン-5(-6)-イソチオシアネート（Tetramethylrhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate、TRITC）標識ヤギ抗マウスIgG抗体（ICN Pharmaceuticals社製）と37℃で１時間反応させた。次いで、細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、蛍光顕微鏡で検鏡することでFCVのカプシドタンパク質の発現を観察した。なお、FHV-Cap/Lacを感染させていないCrFK細胞を上記同様に処理し陰性対照とした。
【００８１】
検鏡した結果、図８Ｂに示したように、陰性対照としたFHV-Cap/Lac非感染CrFK細胞では検出されない赤色の特異蛍光がFHV-Cap/Lac感染CrFK細胞で検出され、CrFK細胞においてFHV-Cap/LacからFCVのカプシドタンパク質が発現・産生されていることが明らかになった。
【００８２】
一方、FHV-Cap/Lacからのβガラクトシダーゼの発現は、上記のように調製したFHV-Cap/Lac感染CrFK細胞に、１次抗体として1:100希釈したウサギ抗βガラクトシダーゼ血清（Chemicon International社製）を、また２次抗体として1:2,000に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（Fluorescein isothiocyanate、FITC）標識ヤギ抗ウサギIgG血清（和光純薬工業社製）のそれぞれを添加し上記同様に反応させ、蛍光顕微鏡による検鏡下で蛍光標識されたβガラクトシダーゼを検出した。なお、上記同様FHV-Cap/Lacを感染させていないCrFK細胞を陰性対照とした。
【００８３】
その結果図８Ａに示したように、陰性対照のFHV-Cap/Lac非感染CrFK細胞では検出されず、FHV-Cap/Lac感染CrFK細胞でのみ緑色蛍光に標識されたβガラクトシダーゼが検出されたことから、CrFK細胞においてFHV-Cap/Lacからβガラクトシダーゼが発現・産生されていることが明らかになった。
【００８４】
また、上記のFCVカプシドタンパク質検出のための蛍光抗体法とβガラクトシダーゼ検出のための蛍光抗体法を同時に行った二重染色法において、赤色蛍光で標識されたFCVカプシドタンパク質と緑色蛍光で標識されたβガラクトシダーゼが同一細胞上で検出されたことから、FHV-Cap/Lac感染CrFK 細胞においてFCVカプシドタンパク質とβガラクトシダーゼとの両方が同時に発現・産生されていることも明らかになった。
【００８５】
以上の結果から、組換えFHV-1であるFHV-Cap/Lacはネコ株化細胞で複製し、外来性遺伝子として挿入したFCVのカプシドタンパク質遺伝子およびLacZ遺伝子からのカプシドタンパク質とβガラクトシダーゼのそれぞれを同時に発現することが証明された。
【００８６】
６．ネコにおける抗体の産生
(1) FHV-Cap/Lacの調製
上記同様に、１×107個のCrFK細胞にFHV-Cap/LacをMOI:0.01で吸着・感染させた。次いで、感染させたCrFK細胞を2%牛胎児血清を含むD-MEM培地中、37℃、5%炭酸ガス存在下でほとんどの細胞でCPEが認められるまでおよそ４日間培養した。続いて、培養した細胞の懸濁液を３回凍結融解することで細胞を破砕し、その細胞破砕液の遠心上清中にFHV-Cap/Lacを得た。
【００８７】
(2) FHV-Cap/Lac接種ネコにおける抗βガラクトシダーゼ抗体、抗FHV-1抗体、および抗カプシド抗体の検出
２×106TCID50/mlのFHV-Cap/Lac 2mlを１才の雄性ネコ３頭にそれぞれ経鼻、経口および点眼接種し、更に３週間後、同条件で各ネコに追加接種した。この追加接種後５日目に各ネコの頸静脈から採血し、その血液から調製した血清中の抗βガラクトシダーゼ抗体を間接蛍光抗体法で検出するとともに、抗FHV-1抗体をFHV-1に対する中和試験により、また、抗カプシド抗体を間接蛍光抗体法により、それぞれ検出した。以下に間接蛍光抗体法と中和試験法およびそれらの結果について説明する。
【００８８】
(2-1) 抗βガラクトシダーゼ抗体の検出
βガラクトシダーゼ発現プラスミドベクターpCMVβ 0.3μgと市販のトランスフェクション用試薬であるリポフェクトアミン(LipofectAMINE、GIBCO BRL社製）2μlとを室温で45分間反応させ、その反応物を、８穴の培養用スライドガラス（BECTON DIKINSON社製）上で培養した８×104個のCrFK細胞に加え、細胞内にpCMVβのDNAを導入した。次いで、この遺伝子導入したCrFK細胞を37℃、5%炭酸ガス存在下で24時間培養し、リン酸緩衝液で3回洗浄した後、冷却したアセトン中で細胞を固定した。
【００８９】
一方、間接蛍光抗体法に先だって、FHV-Cap/Lac接種ネコの血清は、血清と等量のCrFK細胞破砕液遠心上清とを混合し、37℃、30分間の吸収操作により非特異的抗原抗体反応を低減させた。このネコ血清を、リン酸緩衝液で1:20希釈して一次抗体として用いた。
【００９０】
上記のように調製したアセトン固定CrFK細胞と1:20希釈ネコ血清100μlとを37℃で１時間反応後、細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、更に、リン酸緩衝液で1:1,000希釈したFITC標識ヤギ抗ネコIgG抗体（ICN/CAPPEL社製）と37℃で1時間反応させた。次いで、細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、蛍光顕微鏡下で検鏡することでCrFK細胞中の蛍光標識されたβガラクトシダーゼを検出した。なお、pCMVβをトランスフェクトしていないCrFK細胞およびFHV-Cap/Lac接種前のネコ血清のそれぞれを用いて上記同様の間接蛍光抗体法を行い陰性対照とした。
【００９１】
図９に示したように、陰性対照としたpCMVβ DNAを導入していないCrFK細胞ならびにFHV-Cap/Lac接種前ネコ血清を用いた場合には検出されず（図９Ａ）、FHV-Cap/Lac接種ネコ血清と反応させたpCMVβ DNA導入CrFK細胞でのみ蛍光標識されたβガラクトシダーゼが検出された（図９Ｂ）。この結果、ネコ体内において接種したFHV-Cap/Lacが複製し、さらにそのFHV-Cap/Lacからβガラクトシダーゼが産生されていることが明かとなった。
【００９２】
(2-2) 抗FHV-1抗体の測定
D-MEM培地で２倍階段希釈したFHV-Cap/Lac接種ネコ血清100μlと６×102TCID50/mlに調製したFHV-1液100μlとを96穴の組織培養プレート中、37℃、5%炭酸ガス存在下で1時間インキュベーションした後、その100μlを２×105個の24穴の繊維培養用シート中のCrFK細胞に加え、更に37℃、5%炭酸ガス存在下で1時間インキュベーションし、CrFK細胞にFHV-1を吸着・感染させた。
【００９３】
次いで、細胞培養液を除き、そのCrFK細胞に2%牛胎児血清および1%アガロースを含むD-MEM軟寒天培地を300μlを重層し２日間培養した後、さらに0.01%のニュートラルレッド、1%牛胎児血清および1%のアガロースを含むD-MEM軟寒天培地300μlを細胞に重層し24時間培養したときに出現した増殖ウイルスによるプラークを計数した。なお、この時出現したプラーク数がFHV-Cap/Lac未接種ネコ血清で処理したFHV-1を感染させたCrFK細胞で出現したプラーク数の半数以下であったネコ血清の希釈倍率を求め、それらのネコ血清希釈倍率のうちの最高希釈倍率の逆数をもって中和抗体価とした。以上の中和抗体価の測定において、FHV-Cap/Lacを接種した３頭のネコの血清は、それぞれ８倍、16倍、および16倍の中和抗体価を示した。この結果、ネコ体内で接種したFHV-Cap/Lacが複製していることが確認された。
【００９４】
(2-3) 抗カリシウイルスカプシドタンパク質抗体の測定
８×10３TCID５０/mlのネコカリシウイルスF4株のウイルス液100μlを８穴の培養用スライドガラス（BECTON DIKINSON社製）上で培養した８×10４個のCrFK細胞に加え、37℃、5%炭酸ガス存在下で１時間インキュベーションし、CrFK細胞にネコカリシウイルスF4株を吸着・感染させた。次いで、D-MEM培地で細胞を洗浄後、2%牛胎児血清を含むD-MEM培地中、37℃、5%炭酸ガス存在下で２日間細胞を培養した。培養したネコカリシウイルスF4株感染細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、冷却したアセトン中で固定した。
【００９５】
一方、間接抗体法に先だって、FHV-Cap/Lac接種ネコの血清を等量のCrFK細胞破砕液遠心上清と混合し、37℃、30分間の吸収操作で非特異的抗原抗体反応を低減させた。次いで、このネコ血清をリン酸緩衝液で1:8希釈し一次抗体として用いた。
【００９６】
上記のように調製したアセトン固定ネコカリシウイルス感染CrFK細胞と1:8希釈FHV-Cap/Lac接種ネコ血清100μlを37℃で１時間反応後、細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、更に、リン酸緩衝液で1:1,000希釈したFITC標識ヤギ抗ネコIgG抗体（ICN/CAPPEL社製）と37℃で１時間反応させた。次いで、細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、蛍光顕微鏡下で検鏡することでCrFK細胞中の蛍光標識されたネコカリシウイルスカプシドタンパク質を検出した。なお、ネコカリシウイルスが感染していないCrFK細胞およびFHV-Cap/Lac接種前ネコ血清のそれぞれを用いて上記同様の間接蛍光抗体法を行い、陰性対照とした。結果を図１０に示した。
【００９７】
図１０Ａに示したように、陰性対照として、FHV-Cap/Lac接種前ネコ血清とネコカリシウイルス感染CrFK細胞とを反応させた場合には蛍光標識されたネコカリシウイルスカプシドタンパク質は検出されなかった。また、FHV-Cap/Lac接種ネコ血清とネコカリシウイルス非感染CrFK細胞とを反応させた場合にも、前記同様蛍光標識されたネコカリシウイルスカプシドタンパク質は検出されなかった（図示せず）。すなわち、蛍光標識されたネコカリシウイルスカプシドタンパク質が検出されたのは、図１０Ｂに示すように、FHV-Cap/Lac接種ネコ血清とネコカリシウイルス感染CrFK細胞とを反応させた場合でのみであった。このことから、ネコ体内で、接種したFHV-Cap/Lacが複製し、さらにそのFHV-Cap/LacからネコカリシウイルスF4株カプシドタンパク質が産生されていることが明らかとなった。
【００９８】
以上の結果より、FHV-Cap/Lacをネコに経粘膜接種したとき、接種されたネコは、健康状態を維持しつつ、FHV-1に対する抗体産生はもとより、チミジンキナーゼ領域に挿入された外来性遺伝子の産物であるネコカリシウイルスのカプシドタンパク質に対する抗体と、Ｉ断片中のBamHI領域に挿入された外来性遺伝子の産物であるβガラクトシダーゼに対する抗体との３種類の抗体を産生していることから、本発明における組換えFHV-1における外来性遺伝子の挿入箇所はウイルス自体の複製には影響を与えないものであり、しかもこれらの挿入箇所に組込まれた外来性遺伝子は、それぞれ別個にタンパク質を産生することがわかる。
【００９９】
すなわち、本組換えウイルスをネコに経鼻、経口および点眼による経粘膜接種することで、ネコにFHV-1に加え少なくとも２種の外来性遺伝子産物に対する免疫を賦与することが可能であり、事実、本組換えウイルスベクターFHV-Cap/Lacをネコに経鼻、経口および点眼接種した結果、接種ネコは健康状態を維持しつつ、カリシウイルスのカプシドタンパク質、βガラクトシダーゼおよびウイルスベクターであるFHV-1に対する抗体を産生した。
【０１００】
７．ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのSalI Ｉ断片の部分的塩基配列の決定
(1) 配列の決定
プラスミドpdBSIに組込んだFHV-1ゲノム由来SalI Ｉ断片の部分的塩基配列（図１参照）をDNAシークエンサー(ファルマシア社製)を用いて決定した。以下にその詳細について説明する。
【０１０１】
pdBSIに組込んだFHV-1のSalI Ｉ断片から1969塩基対の部分的DNA断片(PstI-HindIII DNA断片)を切り出し、市販のクローニングベクターであるpB1uescript II SK(+)(ストラタジーン社製)のPstI-HindIII消化部位に組込んだ。得られたFHV-1のSalI Ｉ断片の部分的塩基配列を含有するプラスミドをpSal-Hindと名付けた。次いで、pSal-HindのプラスミドDNAを鋳型に、PstI-HindIII DNA断片の上流あるいは下流に存在するプラスミドベクター由来の配列からなるフォワードプライマー(M13  Universal primer, 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT、配列番号３)およびリバースプライマー(M13 Reverse primer, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC、配列番号４)を用い、サイクルシークエンス法によってPstI-HindIII DNA断片の5'末端および3'末端からそれぞれ約600塩基の塩基配列を決定した。さらに、決定したPstl-HindIII DNA断片の5'末端側および3'末端側の塩基配列を基に新たなプライマー４種(Primer X1：配列番号５、Primer X2：配列番号６、Primer X3：配列番号７およびPrimer X4：配列番号８)を合成し、プライマーウオーキング法でPstI-HindIII DNA断片の全塩基配列1969塩基を決定した。決定したFHV-1ゲノム由来SalI Ｉ断片内のPstI-HindIII DNA断片の塩基配列を配列番号１に示した。また、配列番号１に示した塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０１０２】
(2) ネコヘルペスウイルス１型ゲノムのSalI Ｉ断片の塩基配列がコードするアミノ酸配列の比較解析
配列番号２に示したFHV-1ゲノムのＵＬ領域に存在するSalI Ｉ断片内BamHI消化部位近傍(PstI-HindIII DNA断片)の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）、ウマヘルペスウイルス１型(EHV-1)およびウマヘルペスウイルス４型(EHV-4)のＵＬ領域に存在するプロテイン・キナーゼのアミノ酸配列(R. F. Smith, and T. F. Smith. 1989. J. Virol. 63:450-455, GenBank accession number:EHV-1，NC001491 ; EHV-4，NC001844)と比較し、図１１及び図１２に示した。図１１及び図１２に示した各アミノ酸配列の比較から明らかなように、四角で囲んだプロテイン・キナーゼの触媒ドメインＩからVIのアミノ酸配列は、FHV-1、HSV-1、EHV-1およびEHV-4などのヘルペスウイルス間で高度に保存されていた。特に、FHV-1のSalI Ｉ断片内PstI-HindIII DNA断片がコードするアミノ酸配列については、その配列中に認められるプロテイン・キナーゼの各触媒ドメインの構成アミノ酸に相当するアミノ酸がHSV-1のプロテイン・キナーゼの各触媒ドメインの構成アミノ酸と異なっている場合でも、EHV-1やEHV-4のプロテイン.キナーゼの各触媒ドメインの構成アミノ酸と同一のアミノ酸であるケースが多く認められた。
【０１０３】
以上の解析より、本発明で見出した外来性遺伝子挿入部位であるＵＬ領域SalIＩ断片内のBamHI消化部位近傍の塩基配列は、プロテイン・キナーゼをコードすることが明らかになった。
【０１０４】
一方、FHV-1と同じアルファヘルペスウイルス亜科に属する仮性狂犬病ウイルスのＵＬ領域内のプロテイン・キナーゼは、ウイルスの増殖あるいは複製には必須ではないという知見が報告されている(N. de Wind, J. Domen, and A. Berns. 1992. J. Virol. 66:5200-5209)。
【０１０５】
以上のアミノ酸配列の解析結果と、ヘルペスウイルスのＵＬ領域内のプロテイン・キナーゼがそのウイルスの複製・増殖に必須ではないという知見を総合すると、Ｉ断片部のBamHI近傍の遺伝子は、ＵＬ領域内のプロテイン・キナーゼをコードする遺伝子の一部であって、しかも、この遺伝子産物であるプロテイン・キナーゼがウイルスの複製・増殖に必須ではないものであることがわかり、本発明で見出した外来性遺伝子挿入部位は、FHV-1ゲノムのSalI Ｉ断片内のBamHI消化部位に限ったものではなく、FHV-1ゲノムＵＬ領域内のプロテイン・キナーゼ遺伝子領域内であれば良いことが明らかになった。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明によれば、少なくとも２種類以上の外来性遺伝子産物を発現産生することが可能な組換えFHV-1ベクターを作製することができ、安全且つ有効な多価のワクチンウイルスとして、この組換えFHV-1ベクターを用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ネコヘルペスウイルス１型のゲノムとSalIで消化した場合のマップを示す図である。また、図には本発明の外来性遺伝子挿入領域およびシークエンス領域とともに、従来知られている外来性遺伝子の挿入領域も併せて示した。
【図２】本発明の組換えFHV-1のゲノムにおける挿入箇所を模式的に示した図である。
【図３】  LacZ挿入トランスファーベクター(pdBSI-LacZ)の作製法の概要を示した図である。
【図４】  LacZ/FCVカプシド遺伝子挿入組換えFHV-1の作製法の概要を示した図である。
【図５】構築したトランスファーベクターpdBSI-LacZの模式図を示した図である。
【図６】各種プラスミドベクターのアガロースゲル電気泳動による解析結果を示した図である。
【図７】ＴＫ欠損ネコカリシウイルスカプシドタンパク質遺伝子挿入組換えFHV-1であるdTK-gC/Cap-FHVを作出するのに用いたネコカリシウイルスカプシドタンパク質遺伝子とFHV-1由来のgCプロモーターを組み込んだトランスファーベクターpfTK(gCp)-Capの構造を示す模式図である。
【図８】間接蛍光抗体法によるFHV-Cap/Lac感染CrFK細胞におけるβガラクトシダーゼおよびFCVカプシドタンパク質の検出結果を示した図である。図中、ＡはFITC標識されたβガラクトシダーゼの結果を示し、ＢはTRITC標識されたFCVカプシドタンパク質の結果を示している。
【図９】一次抗体としてFHV-Cap/Lac接種後５日目のネコ血清、二次抗体としてFITC標識ヤギ抗ネコIgG抗体を用いた間接蛍光抗体法によるFHV-Cap/Lac接種ネコ血清中抗βガラクトシダーゼ抗体の検出結果を示した図である。図中、ＡはpCMVβ DNAを導入していないCrFK細胞の結果を示し（陰性対照）、ＢはpCMVβ DNAを導入したCrFK細胞での結果を示している。
【図１０】間接蛍光抗体法による、抗カリシウイルスカプシドタンパク質抗体の検出結果を示した図である。図中、ＡはFHV-Cap/Lac接種前ネコ血清とネコカリシウイルス感染CrFK細胞とを反応させた陰性対照であり、ＢはFHV-Cap/Lac接種ネコ血清とネコカリシウイルス感染CrFK細胞とを反応させた場合の結果を示している。
【図１１】本発明のFHV-1ゲノムのＵＬ領域に存在するSalI Ｉ断片内BamHI消化部位近傍(PstI-HindIII DNA断片)の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）、ウマヘルペスウイルス１型(EHV-1)およびウマヘルペスウイルス４型(EHV-4)のＵＬ領域に存在するプロテイン・キナーゼのアミノ酸配列との比較を示す図である。図中、四角で囲んだ部分は、プロテイン・キナーゼの触媒ドメインＩからVIを示し、「＊」はFHV-1のアミノ酸が、HSV-1、EHV-1またはEHV-4のアミノ酸のどれかと同じであることを示している。
【図１２】図１１の続きである。
【配列表】
0004390423.tif 000002
0004390423.tif 000003
0004390423.tif 000004
0004390423.tif 000005
0004390423.tif 000006
0004390423.tif 000007
0004390423.tif 000008
0004390423.tif 000009
0004390423.tif 000010
0004390423.tif 000011
0004390423.tif 000012
0004390423.tif 000013
0004390423.tif 000014
【図１】
0004390423.tif 000015
【図２】
0004390423.tif 000016
【図３】
0004390423.tif 000017
【図４】
0004390423.tif 000018
【図５】
0004390423.tif 000019
【図６】
0004390423.tif 000020
【図７】
0004390423.tif 000021
【図８】
0004390423.tif 000022
【図９】
0004390423.tif 000023
【図１０】
0004390423.tif 000024
【図１１】
0004390423.tif 000025
【図１２】
0004390423.tif 000026