(57)【要約】単離されたヒト褐色脂肪組織幹細胞株。一実施形態において、単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞株は、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ１４はなく、ＣＤ３４、ＣＤ４５またはＳＴＲＯ−１を発現します。別の実施形態では、単離されたヒト褐色脂肪組織幹細胞株は遺伝子ＵＣＰ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＣＲＥＢ１、ＳＩＲＴ３、およびＷＮＴ５Ａ（ＲＥＦＸ）を発現します。さらに別の実施形態において、単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞株は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することが可能です。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項２】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株は、一日齢の雄新生児由来である、請求項１に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項３】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項１の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項４】
ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂ、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、及びＷＮＴ５ＡをＣＲＥＢ１を発現する単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項５】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株は、一日齢の雄新生児由来である、請求項４に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項６】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項４に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項７】
遺伝子ＵＣＰ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＣＲＥＢ１、ＳＩＲＴ３、およびＷＮＴ５Ａ（ＲＥＦＸ）を発現する単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項８】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株は、一日齢の雄新生児に由来する、請求項７に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項９】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項７に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１０】
ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＳＴＲＯ−１を発現しない、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、およびＣＤ７３を発現する単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１１】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株は、一日齢の雄新生児から導出される、請求項１０に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１２】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項１０に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１３】
不死化されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１４】
トランスフェクトされたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株。
【請求項１５】
ヒト新生児褐色脂肪由来細胞を含む薬物スクリーニングアッセイを含む組成物。
【請求項１６】
ヒト新生児褐色脂肪由来細胞が不死化される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
薬剤化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１５に記載の組成物を提供する工程；
候補薬物化合物とヒト新生児褐色脂肪由来細胞を接触させる工程；および
前記ヒト新生児褐色脂肪由来細胞に対する薬剤化合物の効果を観察する工程
を含む方法。
【請求項１８】
移植可能な構造物であって
足場；および
前記足場上で培養された単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞株
を備える移植可能な構造物。
【請求項１９】
前記足場が多孔性細胞外マトリックスを含む、請求項１８に記載の移植可能な構造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願はそれぞれ２０１３年１１月１９日および２０１３年４月１９日に出願された米国仮出願６１／９０６，０８７、および６１／８１３，７７１の優先権を主張する。それぞれの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用されます。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞培養の分野に、より具体的には、細胞の種類を決定する分野に関する。
【０００３】
発明の背景
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、哺乳動物におけるエネルギー恒常性の根底にある進化的に保存された機構において重要な役割を果たしています。これは、脂肪空胞熱発生の調節に中心的な脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）の直径及び発現の５〜１０ミクロンによって特徴づけられます。人間の新生児では、ＢＡＴのデポは、通常、血管系および固形臓器の周りにグループ化されています。これらのデポは、周囲への配布前に、血液を加温することにより寒冷暴露時の体温を維持します。彼らはまた、固形臓器内の生化学反応に最適な温度を確保します。  ＢＡＴは幼年期と青年期を通してインボリュートと考えられていました。最近の研究では、しかし、デポには、例えば、頸部、鎖骨上、縦隔、傍脊椎および／または副腎地域に居住して、成人に積極的に褐色脂肪組織の存在を確認しています。また、それはまた、あるいはベージュ脂肪呼ばＢＡＴは、白色脂肪組織（ＷＡＴ）内に見出されることが報告されています。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明は、１日齢の新生男児から単離された単離されたヒト褐色脂肪組織幹細胞株に一部関します。一実施形態では、単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞株は、以下：ＣＲＥＢ１、ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂ、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、及びＷＮＴ５Ａのようなマーカーを表現します。別の実施形態において、細胞はまた、ＧＡＴＡ２、ＫＬＦ２およびＫＬＦ３抗白色脂肪組織の遺伝子のより高いレベルで発現します。さらに別の実施形態において、単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞株は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することが可能です。さらに別の実施形態では、ラインは、１日齢の雄新生児に由来します。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面が含まれています。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供されます。添付の図面と共に読まれるとき、本明細書に記載の本教示は、より完全に、様々な例示的な実施形態の以下の説明から理解されるであろう。なお、以下に説明する図面は例示の目的のみのためであり、いずれにせよ、本教示の範囲を限定するものではないことを理解すべきです。
【０００６】
【図１】図１は、成人における１８Ｆ−ＦＤＧの取り込みのＰＥＴスキャンです。
【０００７】
【図２Ａ】図２（ａ）新生児から縦隔脂肪組織の写真です。
【０００８】
【図２Ｂ】図２（ｂ）は５６歳から縦隔脂肪組織の写真です。
【０００９】
【図２Ｃ】図２（ｃ）は、８０歳から縦隔脂肪組織の写真です。
【００１０】
【図２Ｄ】図２（ｄ）は、図２（ａ）の組織の断面の顕微鏡写真です。
【００１１】
【図２Ｅ】図２（ｅ）は、図２（ｂ）の組織の断面の顕微鏡写真です。
【００１２】
【図２Ｆ】図２（ｆ）は、図２（ｃ）の組織の断面の顕微鏡写真です。
【００１３】
【図３Ａ】図３（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞上の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学一連のグラフです。
【００１４】
【図３Ｂ】図３（ｂ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞と白色脂肪由来幹細胞のための種々のマーカーの発現レベルの比較を示す表です。
【００１５】
【図３Ｃ】図３（ｃ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞（ＢＡＤＳＣ）および白色脂肪由来幹細胞（ＷＡＤＳＣ）の遺伝子発現プロファイルです。
【００１６】
【図４Ａ】図４（ａ）は、多孔質外マトリックス足場上で培養褐色脂肪由来幹細胞の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）です。
【００１７】
【図４Ｂ】図４（ｂ）は、足場上の一方向分化した褐色脂肪細胞のＳＥＭです。
【００１８】
【図５Ａ】図５（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第１の変換構築物のマップです。
【００１９】
【図５Ｂ】図５（ｂ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第２の変換構築物のマップです。
【００２０】
【図５Ｃ】図５（ｃ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第３の変換構築物のマップです。
【００２１】
【図５Ｄ】図５（ｄ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第四の転換構築物のマップです。
【００２２】
【図５Ｅ】図５（ｅ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第転換構築物のマップです。
【００２３】
【図６】図６は、通過による細胞増殖速度のグラフです。
【００２４】
【図７】図７は、トランスフェクト細胞および対照細胞のためのテロメラーゼ活性のグラフです。
【００２５】
【図８】図８は、通常の細胞形態を示すトランスフェクトＢＡＤＳＣの顕微鏡写真です。
【００２６】
【図９】図９はＢＡＤＳＣの顕微鏡写真は、白、茶色の脂肪生成を受けましたさ。
【００２７】
【図１０】図１０はＢＡＤＳＣの顕微鏡写真は、骨形成を受けましたさ。
【００２８】
【図１１】図１１はＢＡＤＳＣ持つ施され軟骨の顕微鏡写真です。
【００２９】
【図１２Ａ】図１２（ａ）ＢＡＤＳＣ  ／足場および対照を移植したマウスの血糖値のグラフです。
【００３０】
【図１２Ｂ】図１２（ｂ）にＢＡＤＳＣ  ／足場および対照を移植したマウスの重量を示すグラフです。
【００３１】
【図１３】図１３は、化合物のハイスループット分析のためのステップの図です。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
代謝的に活性な褐色脂肪組織幹細胞の集団は歳の男性新しいが生まれた１日から単離されています。幹細胞集団と呼ばれる「新生児褐色脂肪由来幹細胞」（新生児ＢＡＤＳＣｓ）ができる可能性を実証し、（１）インビトロで増殖することと、（２）多系列潜在能力を発揮します。（３）機能的に代謝的に活性な褐色脂肪細胞に分化します。このような幹細胞集団は、肥満の治療および関連する代謝性疾患のためのｉｎ  ｖｉｖｏでのエネルギー恒常性を回復し、強化するための新たな細胞ベースの手段を提供できます。これらの幹細胞は、脂肪組織の生物学を研究するための便利なツールです。
【００３３】
新生児縦隔褐色脂肪デポ内の幹細胞集団を同定するために、外植片を作製し、組織培養プレートにプレーティングしました。接着細胞が正常に褐色脂肪組織外植片から得られた、これらの初代細胞培養物は、ＤＭＥＭ低グルコース、１×グルタマックス、１Ｘ  ＮＥＡＡ、１０％の血小板溶解物を含有する培地中で３日毎に供給しました。細胞のクローン集団を定義するために、細胞株を、９６ウェルプレート中に単一細胞のプレーティングによって得ました。密集度は、６日目に到達し、図１に示されるように、細胞は、間葉系の細胞（ＭＳＣ）様形態幹示しました。５６歳と８０歳から８縦隔褐色脂肪組織を図に示されています。図に示すように、新生児縦隔褐色脂肪組織と比較するために、それぞれ図２ｂおよび２ｃ。図２ａ。褐色脂肪組織の減少が明らかです。図２Ｄ−２Ｆ図の生検組織を撮影したＨ／Ｅ切片の顕微鏡写真です。それぞれ図２ａ〜図２ｃ。
【００３４】
クローン細胞集団の成長速度は、人口を超える９０継代増殖させることができることを実証しました。通路７でのクローン細胞集団の核型は、染色体異常のない正常な二倍体細胞を示しました。
【００３５】
図３（ａ）及び図（３ｂ）を参照しますと、さらに、これらの新生児ＢＡＤＳＣを特徴付けるフローサイトメトリー、および免疫細胞化学を使用したしました。新生児ＢＡＤＳＣ他のＭＳＣに類似しているが同一ではない特性を示すことが見出されました。例えば、新生児ＢＡＤＳＣはＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、およびＣＤ７３陽性であったが、造血マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５陰性でした。また、新生児ＢＡＤＳＣはＳＴＲＯ−１、以前に様々な組織由来の間葉系幹細胞で発現されることが見出されている発現しませんでした。
【００３６】
通路２新生児ＢＡＤＳＣの遺伝子発現プロファイルの分析は、図に示すように新生児ＢＡＤＳＣは、異なる遺伝子発現プロファイルを有することを示しています。白色脂肪由来幹細胞と比較して、図３（ｃ）。その発現ＢＡＤＳＣに濃縮されるように、例えば、ＣＲＥＢ１、ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂとプロ褐色脂肪選択遺伝子を含む、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、及び遺伝子ＷＮＴ５Ａ。細胞はまた、ＧＡＴＡ２、ＫＬＦ２およびＫＬＦ３抗白色脂肪組織の遺伝子のより高いレベルで発現します。重要なことに、これらのプロ褐色選択遺伝子の発現は、白色脂肪デポ由来の幹細胞から褐色脂肪由来幹細胞を区別することができます。
【００３７】
通路２新生児ＢＡＤＳＣは、多系列の可能性を決定するために、骨、軟骨、白、茶色の脂肪生成細胞系統に分化するように誘導しました。誘導の３週間後、細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞に分化する能力を実証しました。骨形成促進条件下で分化するように誘導すると、細胞は、アリザリンレッド染色により確認した鉱化マトリックスを形成し；オステオカルシンの免疫細胞化学染色、およびオステオポンチン、オステオネクチンおよびアルカリホスファターゼのためのＲＴ−ＰＣＲ分析は、さらなる分化を確認しました。軟骨形成分化は誘導された細胞ペレット上で硫酸化プロテオグリカンアルシアンブルー染色により確認しました。ＲＴ−ＰＣＲは、コラーゲン２Ａ、ビグリカン、および軟骨形成分化のマーカーであるＡ６の発現を確認しました。白色脂肪生成分化は脂肪滴のオイルレッドＯ染色により確認しました。免疫細胞化学はＦＡＢＰ４の発現を確認し、ＲＴ−ＰＣＲは、脂肪細胞への分化のマーカーであるＦＡＢＰ４、ＬＰＬ、およびＰＰＡＲγの発現を確認しました。
【００３８】
新生児褐色脂肪分化細胞のリアルタイム定量ＰＣＲはＵＣＰ１など−３（ＥＬＯＶＬ３）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ１−α（ＰＧＣ１Ａ）、の主要なレギュレータ超長鎖脂肪酸の伸長のアップレギュレーションを示しました非ＦＮＤＣ５分化した細胞に比べてミトコンドリア生合成。逆に、レプチン  −白色脂肪の開発に関連する遺伝子−  は、ダウン褐色脂肪分化細胞で規制されています。これらの褐色脂肪細胞のマーカー遺伝子の発現のより高いレベルは、成熟した褐色脂肪細胞の運命と一致しています。これらの知見は、新生児から褐色脂肪デポ成人褐色脂肪デポ、皮下脂肪と内臓脂肪のデポで見つかった幹細胞よりもユニークな特性を有しており、複数の細胞型に分化する能力を有する幹細胞の供給源であることを示しています。
【００３９】
図４（ａ）に示すように一般的にはＢＡＤＳＣは、足場上に成長させることができます。及びそれによって、より容易に移植や他の実験のために処理しました。
【００４０】
加えて、様々なＢＡＤＳＣラインは、トランスフェクションによって不死化されました。一実施形態ではＢＡＤＳＣ１５０ラインを使用しました。
【００４１】
図５（ａ）−５（Ｅ）に示すように５つの異なるプラスミド構築物は、作成されました。これらは、７２８６  ｂｐの構築物は、４８６８  ｂｐの構築物は、ＢＭＩ−１の発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードし、ブラス−Ｂと呼ばれる、ＴＥＲＴの発現を駆動ＥＥＦ１プロモーターをコードし、ブラス−Ｔと呼ばました。  ８３４８  ｂｐの構築物はＢＭＩ１とＴＥＲＴ発現の両方を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードする、ブラス−ＢＦＴと呼ばれる、８３４８  ｂｐの構築物は、ＴＥＲＴとＢｓｒＳ２、およびｐＵＣＰ１−ＣＰ−ＢＦＴのエンコードと呼ばれる１６２４３  ｂｐの構造の両方を駆動するＥＥＦ１Ａ１のプロモーターをコードするＰＢＬＡＳビットと呼ばれますＢＭＩ１とＴＥＲＴの発現およびレポーター遺伝子チェリーピッカーの発現を駆動するＵＣＰ１プロモーターを駆動ＥＥＦ１Ａ１プロモーター。
【００４２】
一実施形態では、トランスフェクションは、リポフェクタミンＬＴＸとＰＬＵＳ試薬を使用していました。第二の実施形態では、トランスフェクションはのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ、Ｘｆｅｃｔ大人はメーカー推奨のプロトコルに従ってＰＬＵＳ試薬を用いて、細胞トランスフェクション試薬とリポフェクタミンＬＴＸ幹使用します。各試薬は、効率について試験しました。  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤは細胞に対して最も毒性であり、構造ブラス−ＢＦＴエンコードＥＥＦ１プロモーター駆動ＢＭＩ１とＴＥＲＴ（ＢＭＩ１−ＴＥＲＴ  ＦＭＤＶ２自己処理ポリペプチドの発現およびｔｅｒｔ−  ＢＭＩ１  ＦＭＤＶ２−でトランスフェクションしＢＡＤＳＣ１５０初代細胞のための最高のトランスフェクション効率が得られました自己処理ポリペプチド）。自己プロセシングポリペプチドの２つの方向は、細胞株に応じて異なる効率で機能するので、両方の形態は、任意の実験で試験しました。
【００４３】
他の実施形態では、ＢＡＤＳＣ１５０ラインは、以下に示す構造体の以下の組み合わせでトランスフェクトしました。ブラストシジン耐性遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、６ｕｇ／ｍｌの濃度で選択しました。ブラストシジン。安定した不死化した褐色脂肪由来幹細胞株を生成し、機能的分化能について試験しました。
【００４４】
ＥＥＦ１Ａ１の制御下で、すべての４つの抵抗のオプションが利用可能でした：
ｐＵＮＯ−ＨＰＦハイグロマイシン；
ｐＵＮＯ−ＰＵＲピューロマイシン；
ｐＵＮＯ−ＺＥＯゼオシン；および
ｐＵＮＯ−ＢＬＡブラストサイジン
【００４５】
以下の単一のレポーターシステムを使用しました：
＊ｍＣｈｅｒｒｙのみ；
＊ＮａｎｏＬｕｃ（ＮＬ）のみ；および
＊分泌ＮａｎｏＬｕｃ（ＳＮＬ）のみ。
【００４６】
以下の組み合わせのレポーターシステムも使用しました：
ＣＰ１−ＮＬ  ＦＭＤＶ２自己処理ポリペプチド；
ＣＰ１−ＳＮＬ  ＦＭＤＶ２自己処理ポリペプチド；
ＮＬ−ＣＰ１  ＦＭＤＶ２自己処理ポリペプチド；および
ＳＮＬ−ＣＰ１  ＦＭＤＶ２自己処理ポリペプチド。
【００４７】
他の実験では、ＥＥＦ１プロモーターはまた、プロ茶色で置換した（すなわちＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ−１α、Ｃ  ／ＥＢＰβ、Ｐｌａｃ８及びＵＣＰ−１）およびプロ白、特定の遺伝子（すなわち、ＰＰＡＲγ、Ｃ  ／ＥＢＰα、およびＡＫＴ−１）は、レポーター系の異なる組み合わせで使用されます。これらの構築物のすべてがＢＭＩ１とＴＥＲＴの発現を駆動するＥＥＦ１のプロモーターを含みます。
【００４８】
ＢＤＳＣ１５０細胞株をトランスフェクトし、選択したら、それを拡張された通路の効果を決定するために試験しました。ＢＡＤＳＣ１５０  ＢＭＩ１−ＴＥＲＴ  ＦＭＤＶ２、自己プロセシングポリペプチド（図５（ｄ）参照）及びｔｅｒｔ−  ＢＭＩ１  ＦＭＤＶ２、自己プロセシングポリペプチドは、Ｐ２０（図６）に継代しました。細胞発現テロメラーゼ活性対照（非トランスフェクトＢＡＤＳＣ１５０）中に存在しないと、正常な細胞形態を保持した（図７）（図８）。
【００４９】
不死化ＢＡＤＳＣ１５０細胞はまた、機能的に分化する能力を決定するために試験しました。細胞は白色、褐色脂肪細胞（図９）、骨形成（図１０）および軟骨形成（図１１）を受けるように誘導しました。これらの構築物の異なる組み合わせで、この細胞株は、小分子および褐色脂肪誘導物質（すなわちＦＮＤＣ５、ＢＭＰ７、レチノイン酸）のライブラリーをスクリーニングするために使用することができます。
【００５０】
構築物はＵＣＰ１  −  空中作業車ＢＦＴ、ある１つの組み合わせでは、（図５の（ｅ））、ＥＥＦ１Ａ１はＢＭＩ１とＴｅｒｔ１の発現を駆動しています。この構築物は、細胞を不死化するために使用されます。  ＵＣＰ１は、蛍光顕微鏡によってモニターすることができ、特異的な抗体を用いた磁気ビーズ上に捕捉される空中作業車、キメラ膜アンカー空中作業車蛍光タンパク質の発現を駆動しています。この実施形態では、この構築物でＢＡＤＳＣ１５０細胞は不滅であり、ＵＣＰ１が誘導されたときに空中作業車にのみ有効になります。  ＵＣＰ１の誘導は、褐色脂肪組織特異的な遺伝子をアップレギュレートする天然または合成の小分子のいずれかに、この細胞集団を曝露することによって達成することができます。
【００５１】
別の実施形態では、空中作業車が分泌ｎａｎｏｌｕｃ（ＳＮＬ）に置き換えられます。この構造では、ＳＮＬは、プロモーターが「ＯＮ」になっている場合にのみ合成されます。一実施形態では、プロモーターは、ＵＣＰ１あります。  ＳＮＬが細胞から細胞培養培地中に分泌されるので、一方が「オン」と順に化合物を有効にＵＣＰ１を誘導するための方法を効果的に定量分析のためにＳＮＬのレベルのメディアをアッセイすることができるＳＮＬを生成します。このシステムは、一度に、異なる濃度の小分子の数千のハイスループットスクリーニングを可能にします。
【００５２】
構築体の全ての組み合わせも茶色に白い脂肪を変換したり、代謝活性を増大させる分子を同定する目的のために白色脂肪幹細胞にトランスフェクトされています。この細胞株は、そのレポーターシステムと並行して、褐色脂肪の生物学の動態の効果的な研究のために許可し、具体的には、ＵＣＰ１の根底にあるメカニズムのアップレギュレーションおよび代謝活性の増加。このヒト褐色脂肪幹細胞株によるマウスおよびヒトＵＣＰ１のアミノ酸組成は、それによって褐色脂肪特異的遺伝子を活性化する化合物を同定するために不十分なマウスの褐色脂肪細胞株をレンダリングする、８０％未満であることに価値があります
【００５３】
加えて、不滅の植込み型ＢＡＤＳＣの人口は、ヒトにおける代謝を調節することができ褐色脂肪組織の人口を提供するであろう。図を参照します。図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示すように、二つのグラフは、マウスに移植した足場上ＢＡＤＳＣの効果を示します。イチジク。  （Ａ）１２は、移植後数週間で、高カロリー食を与えた対照マウスに対する基底血中グルコースレベルは、同じ食餌を与えたが、ＢＡＤＳＣを移植したマウスよりも有意に高い（約６６％）であることを示しています。同様に、図図１２（ｂ）は、対照マウスについての体重は、インプラントでのマウスの体重より約４０％高いです。これはＢＡＤＳＣは、糖尿病および肥満などの代謝性疾患を治療するのに有用であり得ることを示しています。
【００５４】
本発明はまた、ヒト新生児褐色脂肪由来細胞を含む細胞培養プレートを提供します。プレートは、例えば、マルチウェルプレートであることができます。細胞培養プレートの一つ以上のウェルをヒト新生児褐色脂肪由来細胞を播種することができます。細胞は褐色脂肪細胞に分化させることができます。細胞は不死化することができます。細胞培養プレートは、候補薬物化合物と細胞を接触させ、ヒト新生児褐色脂肪由来細胞に対する薬物化合物の効果を観察することによって、薬剤化合物をスクリーニングするために有用です。
【００５５】
図１３を参照します。様々な潜在的な薬物のためのそのようなスクリーニング方法は、（そのようなＢＡＤＳＣ１５０ＦＳ．ＵＣＰ１−ＳＮＬ−ＢＦＴなど）にトランスフェクト  ＢＡＤＳＣ細胞または（例えばＷＡＤＳＣＦＳ．ＵＣＰ１−ＳＮＬ−ＢＦＴなど）白色脂肪幹細胞のいずれかでウェルをめっきすることによって開始する（ス  テップ１）  。次いで、目的の化合物が十分に（ステップ２）、ウェルに添加し、プレートリーダーで読み取られ、メディアは、例えば、分泌ｎａｎｏｌｕｃ（工程３）についてアッセイしました。  ｎａｎｏｌｕｃの存在は、薬剤が幹細胞を活性化したことを示します。
【００５６】
なお、排除しながら、本発明の図面および説明は明確にする目的で、他の要素のために、本発明の明確な理解に関連する要素を説明するために簡略化されていることを理解すべきです。当業者は、これらおよび他の要素が望ましいかもしれないことが認識されるであろう。しかし、このような要素は当技術分野で知られており、それらは本発明のより良い理解を容易にしないので、このような要素の議論は、本明細書に提供されません。その図面は構造図として例示目的のために提示されていないことが理解されるべきです。省略する詳細及び改変または代替の実施形態は、当業者の知識の範囲内です。
【００５７】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実施することができます。上記実施形態は、従って、むしろ本明細書に記載の本発明を限定するよりも、あらゆる点で例示的とみなされるべきです。本発明の範囲は、したがって、添付の特許請求の範囲によってではなく、前述の説明によって示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図されます。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図１２Ａ】
2016518125.tif 000027
【図１２Ｂ】
2016518125.tif 000028
【図１３】
2016518125.tif 000029
【誤訳訂正書】
【提出日】平成28年2月3日(2016.2.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項２】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系は、一日齢の雄性新生児に由来する、請求項１に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項３】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項１に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項４】
ＣＲＥＢ１、ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂ、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、及びＷＮＴ５Ａを発現する、単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項５】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系は、一日齢の雄性新生児に由来する、請求項４に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項６】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項４に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項７】
遺伝子ＵＣＰ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＣＲＥＢ１、ＳＩＲＴ３、およびＷＮＴ５Ａ（ＲＥＦＸ）を発現する単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項８】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系は、一日齢の雄性新生児に由来する、請求項７に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項９】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項７に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１０】
ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＳＴＲＯ−１を発現せず、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、およびＣＤ７３を発現する、単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１１】
前記単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系は、一日齢の雄性新生児に由来する、請求項１０に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１２】
骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化することができる、請求項１０に記載の単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１３】
不死化されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１４】
トランスフェクトされたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系。
【請求項１５】
ヒト新生児褐色脂肪由来細胞を含む薬物スクリーニングアッセイを含む組成物。
【請求項１６】
前記ヒト新生児褐色脂肪由来細胞が不死化される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
薬物化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１５に記載の組成物を提供する工程；
候補薬物化合物と前記ヒト新生児褐色脂肪由来細胞を接触させる工程；および
該ヒト新生児褐色脂肪由来細胞に対する該薬物化合物の効果を観察する工程
を含む方法。
【請求項１８】
移植可能なコンストラクトであって
足場；および
該足場上で培養された単離されたヒト新生児褐色脂肪組織の幹細胞系
を備える移植可能なコンストラクト。
【請求項１９】
前記足場が多孔性細胞外マトリックスを含む、請求項１８に記載の移植可能なコンストラクト。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、それぞれ、２０１３年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／９０６，０８７号および２０１３年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／８１３，７７１号への優先権を主張し；この米国仮特許出願の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、細胞培養の分野、およびより具体的には細胞タイプ決定の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、哺乳動物におけるエネルギーホメオスタシスの根底にある進化上保存された機構において重要な役割を果たす。それは、５〜１０ミクロン直径の脂肪空胞および熱発生の調節に中心的な脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）の発現によって特徴付けられる。ヒト新生児において、ＢＡＴの貯蔵場所は、代表的には、脈管構造および固形器官の周りに集まっている。これらの貯蔵場所は、血液をこれが末梢に運ばれる前に温めることによって寒冷曝露の間に体温を維持する。それらはまた、固形器官内の生化学反応に最適な温度を確保する。ＢＡＴは、小児期および青年期の間を通じて消失すると考えられてきた。しかし、近年の研究では、成人において活発な褐色脂肪組織の存在とともに、例えば、頸部、鎖骨上、縦隔、傍脊椎および／もしくは副腎の領域に貯蔵場所があることが確認された。また、ＢＡＴ（あるいはベージュ脂肪ともいわれる）が白色脂肪組織（ＷＡＴ）内で見出され得ることもまた、報告された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明は、部分的に、一日齢の雄性新生児から単離された、単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞系に関する。一実施形態において、上記単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞系は、ＣＲＥＢ１、ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂ、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、およびＷＮＴ５Ａなどのマーカーを発現する。別の実施形態において、上記細胞はまた、アンチ白色脂肪組織遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ２、ＫＬＦ２、およびＫＬＦ３）のより高いレベルを発現する。さらに別の実施形態において、上記単離されたヒト褐色脂肪組織の幹細胞系は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞へと分化することができる。さらになお別の実施形態において、上記系は、一日齢の雄性新生児に由来する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
特許ファイルもしくは特許出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面付きのこの特許もしくは特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いがあれば、当局によって提供される。本明細書で記載される本教示は、添付の図面と一緒に読まれれば、種々の例証的実施形態の以下の記載からより完全に理解される。以下に記載される図は、例証目的に過ぎず、本教示の範囲を制限することを如何様にも意図するものではないことが理解されるものとする。
【０００６】
【図１】図１は、成体における１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みのＰＥＴスキャンである。
【０００７】
【図２Ａ】図２（ａ）は、新生児からの縦隔脂肪組織の写真である。
【０００８】
【図２Ｂ】図２（ｂ）は、５６歳齢からの縦隔脂肪組織の写真である。
【０００９】
【図２Ｃ】図２（ｃ）は、８０歳齢からの縦隔脂肪組織の写真である。
【００１０】
【図２Ｄ】図２（ｄ）は、図２（ａ）の組織切片の顕微鏡写真である。
【００１１】
【図２Ｅ】図２（ｅ）は、図２（ｂ）の組織切片の顕微鏡写真である。
【００１２】
【図２Ｆ】図２（ｆ）は、図２（ｃ）の組織切片の顕微鏡写真である。
【００１３】
【図３Ａ−１】図３（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞上の細胞表面マーカーに関する、一連のフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学のグラフである。
【図３Ａ−２】図３（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞上の細胞表面マーカーに関する、一連のフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学のグラフである。
【図３Ａ−３】図３（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞上の細胞表面マーカーに関する、一連のフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学のグラフである。
【００１４】
【図３Ｂ】図３（ｂ）は、新生児の褐色脂肪由来幹細胞および白色脂肪由来幹細胞に関する種々のマーカーの発現レベルの比較表である。
【００１５】
【図３Ｃ】図３（ｃ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞（ＢＡＤＳＣ）および白色脂肪由来幹細胞（ＷＡＤＳＣ）についての遺伝子発現プロフィールである。
【００１６】
【図４Ａ】図４（ａ）は、多孔性細胞外マトリクス足場上で培養した褐色脂肪由来幹細胞の走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）である。
【００１７】
【図４Ｂ】図４（ｂ）は、足場上で方向性分化した褐色脂肪細胞のＳＥＭである。
【００１８】
【図５Ａ】図５（ａ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第１の形質転換コンストラクトのマップである。
【００１９】
【図５Ｂ】図５（ｂ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第２の形質転換コンストラクトのマップである。
【００２０】
【図５Ｃ】図５（ｃ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第３の形質転換コンストラクトのマップである。
【００２１】
【図５Ｄ】図５（ｄ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第４の形質転換コンストラクトのマップである。
【００２２】
【図５Ｅ】図５（ｅ）は、新生児褐色脂肪由来幹細胞を不死化するために使用される第５の形質転換コンストラクトのマップである。
【００２３】
【図６】図６は、継代による細胞成長速度のグラフである。
【００２４】
【図７】図７は、トランスフェクトした細胞およびコントロール細胞のテロメラーゼ活性のグラフである。
【００２５】
【図８】図８は、正常な細胞形態を示すトランスフェクトされたＢＡＤＳＣの顕微鏡写真である。
【００２６】
【図９】図９は、白色脂肪形成、褐色脂肪形成を受けたＢＡＤＳＣの顕微鏡写真である。
【００２７】
【図１０】図１０は、骨形成を受けたＢＡＤＳＣの顕微鏡写真である。
【００２８】
【図１１】図１１は、軟骨形成を受けたＢＡＤＳＣの顕微鏡写真である。
【００２９】
【図１２Ａ】図１２（ａ）は、ＢＡＤＳＣ／足場を移植したマウスおよびコントロールのマウスのグルコースレベルのグラフである。
【００３０】
【図１２Ｂ】図１２（ｂ）は、ＢＡＤＳＣ／足場を移植したマウスおよびコントロールのマウスの体重のグラフである。
【００３１】
【図１３】図１３は、化合物のハイスループット分析の工程の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
代謝的に活発な褐色脂肪組織幹細胞の集団は、一日齢の雄性新生児から単離された。上記幹細胞集団は、「新生児褐色脂肪由来幹細胞」（新生児ＢＡＤＳＣ）と称され、以下に対する潜在性を明らかに示した：（１）インビトロで増える；（２）多系統の潜在性を示す；および（３）代謝的に活発な褐色脂肪細胞へ機能的に分化する。このような幹細胞集団は、肥満症および関連代謝障害の処置のために、エネルギーホメオスタシスをインビボで回復および増強する新たな細胞ベースの手段を提供し得る。これらの幹細胞はまた、脂肪組織生物学を研究するための有用なツールである。
【００３３】
新生児縦隔褐色脂肪貯蔵場所内の幹細胞集団を同定するために、外植片を生成し、組織培養プレートにプレーティングした。接着性の細胞が、上記褐色脂肪組織外植片から成功裡に得られ、これらの初代細胞培養物を、ＤＭＥＭ低グルコース、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ＮＥＡＡ、および１０％  血小板溶解物を含む培地を３日毎に供給した。細胞のクローン性集団を規定するために、細胞系を、９６ウェルプレート中に単一細胞をプレーティングすることによって得た。６日間でコンフルエントに達し、上記細胞は、図８で示されるように、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様の形態を示した。５６歳齢および８０歳齢からの縦隔褐色脂肪組織を、新生児縦隔褐色脂肪組織（図２ａで示されるとおり）との比較のために、それぞれ図２ｂおよび図２ｃに示す。褐色脂肪組織の減少が顕著である。図２ｄ〜２ｆは、それぞれ、図２ａ〜２ｃの生検組織からとったＨ／Ｅ切片の顕微鏡写真である。
【００３４】
クローン性細胞集団の増殖動態は、上記集団が９０継代より長い間成長し得ることを明らかに示した。７継代めでの上記クローン性細胞集団の核型決定は、染色体異常なしの正常な二倍体細胞を実証した。
【００３５】
図３（ａ）および図（３ｂ）を参照して、これらの新生児ＢＡＤＳＣをさらに特徴付けるために、フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学を使用した。上記新生児ＢＡＤＳＣは、他のＭＳＣに類似するが同一ではない特徴を示すことが見出された。例えば、上記新生児ＢＡＤＳＣは、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、およびＣＤ７３に関して陽性であったが、造血マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５に関しては陰性であった。さらに、上記新生児ＢＡＤＳＣは、ＳＴＲＯ−１（これは、種々の組織に由来する間葉系幹細胞において発現されることが以前から見出されている）を発現しなかった。
【００３６】
２継代目の新生児ＢＡＤＳＣの遺伝子発現プロフィールの分析は、上記新生児ＢＡＤＳＣが、図３（ｃ）で示されるように、白色脂肪由来幹細胞との比較において別個の遺伝子発現プロフィールを有することを実証する。発現がＢＡＤＳＣにおいて富化される遺伝子としては、例えば、ＣＲＥＢ１、ＤＩＯ２、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ１４、ＮＲＦ１、ＦＯＸＣ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＧＣ１−Ａ、ＰＧＣ１−Ｂ、ＰＲＤＭ１６、ＳＲＣ、ＵＣＰ１、およびＷＮＴ５Ａなどの前褐色脂肪選択遺伝子（ｐｒｏ−ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）が挙げられる。上記細胞はまた、より高レベルのアンチ白色脂肪組織遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ２、ＫＬＦ２、およびＫＬＦ３）を発現する。重要なことには、これらの前褐色選択遺伝子の発現は、褐色脂肪由来幹細胞を、白色脂肪貯蔵場所に由来する幹細胞から区別し得る。
【００３７】
２継代目の新生児ＢＡＤＳＣを、骨細胞系統、軟骨細胞系統、白色脂肪形成細胞系統および褐色脂肪形成細胞系統への分化を誘導し、多系統の潜在性を決定した。誘導の３週間後、上記細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞への分化能を明らかに示した。骨形成促進条件下で分化するように誘導した場合、上記細胞は、石灰化した基質を形成した。これを、アリザリンレッド染色法；オステオカルシンの免疫細胞化学染色、ならびにオステオポンチン、オステオネクチンおよびアルカリホスファターゼのＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認し、分化をさらに確認した。軟骨形成分化を、誘導した細胞ペレット上の硫酸化プロテオグリカンのアルシアンブルー染色によって確認した。ＲＴ−ＰＣＲは、軟骨形成分化のマーカーであるコラーゲン２Ａ、バイグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、およびＡ６の発現を確認した。白色脂肪形成分化を、脂肪小滴のオイルレッドＯ染色によって確認した。免疫細胞化学は、ＦＡＢＰ４の発現を確認し、ＲＴ  ＰＣＲは、脂肪形成分化のマーカーであるＦＡＢＰ４、ＬＰＬ、およびＰＰＡＲγの発現を確認した。
【００３８】
新生児褐色脂肪分化細胞のリアルタイムｑＰＣＲは、非ＦＮＤＣ５分化細胞と比較して、ＵＣＰ１のアップレギュレーション、超長鎖脂肪酸様（ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｌｉｋｅ）−３（ＥＬＯＶＬ３）およびペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ１−α（ＰＧＣ１Ａ）（ミトコンドリア生物発生の主要な調節因子）の伸長を実証した。逆に、レプチン（白色脂肪発達と関連する遺伝子）は、褐色脂肪分化細胞においてダウンレギュレートされる。これらの褐色脂肪細胞マーカー遺伝子のより高い発現レベルが、成熟褐色脂肪細胞運命と一致する。これらの知見は、新生児の褐色脂肪貯蔵場所が成体褐色脂肪貯蔵場所、皮下脂肪および内臓脂肪貯蔵場所において見出される幹細胞より特有な特性を有し、複数の細胞タイプに分化する能力を有する幹細胞源であることを実証する。
【００３９】
ＢＡＤＳＣは一般に、図４（ａ）で示されるように、足場上で成長し得、それによって、移植および他の実験のためにより取り扱いやすいようになっている。
【００４０】
さらに、種々のＢＡＤＳＣ系が、トランスフェクションによって不死化された。一実施形態において、ＢＡＤＳＣ１５０系を使用した。
【００４１】
図５（ａ）〜５（ｅ）で示されるように、５つの異なるプラスミドコンストラクトを作った。これらは、以下であった：Ｂｌａｓ−Ｔといわれ、ＴＥＲＴ発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードする７２８６ｂｐのコンストラクト、Ｂｌａｓ−Ｂといわれ、ＢＭＩ−１発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードする４８６８ｂｐのコンストラクト；Ｂｌａｓ−Ｂ−Ｆ−Ｔといわれ、ＢＭＩ１およびＴＥＲＴ両方の発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードする８３４８ｂｐのコンストラクト、ｐＢｌａｓ−ＢＩＴといわれ、ＴＥＲＴおよびＢｓｒＳ２両方を駆動するＥＥＦ１ａ１  プロモーターをコードする８３４８ｂｐのコンストラクト、ならびにｐＵＣＰ１−ＣＰ−ＢｆＴといわれ、ＢＭＩ１の発現を駆動するＥＥＦ１Ａ１プロモーターならびにレポーター遺伝子ｃｈｅｒｒｙ  ｐｉｃｋｅｒの発現を駆動するＴＥＲＴおよびＵＣＰ１プロモーターをコードする１６，２４３ｂｐのコンストラクト。
【００４２】
一実施形態において、トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸおよびＰＬＵＳ試薬を使用した。第２の実施形態において、トランスフェクションには、製造業者の推奨プロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ、Ｘｆｅｃｔ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸとＰＬＵＳ試薬を使用した。各試薬を、効率について試験した。Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤは、細胞に対して最小の毒性であり、ＢＭＩ１およびＴＥＲＴ（ＢＭＩ１−ＴＥＲＴ  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチドおよびＴＥＲＴ−ＢＭＩ１  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド）の発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターをコードするコンストラクトＢｌａｓ−ＢＦＴでトランスフェクトされたＢＡＤＳＣ１５０初代細胞に関して、最高のトランスフェクション効率を生じた。上記自己プロセシングポリペプチドの２つの配向が、細胞系に依存して異なる効率で機能するので、両方の形態を任意の所定の実験で試験した。
【００４３】
他の実施形態において、上記ＢＡＤＳＣ１５０系を、以下で列挙されるコンストラクトの以下の組み合わせでトランスフェクトした。ブラストサイジン耐性遺伝子でトランスフェクトした細胞を、濃度６μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択した。安定な不死化褐色脂肪由来幹細胞系を生成し、機能的分化潜在能に関して試験した。
【００４４】
ＥＥＦ１Ａ１制御下では、全４種の耐性選択肢が利用可能であった：
ｐＵＮＯ−ｈｐｆ  ハイグロマイシン；
ｐＵＮＯ−ｐｕｒ  ピューロマイシン；
ｐＵＮＯ−ｚｅｏ  ゼオシン；および
ｐＵＮＯ−ｂｌａ  ブラストサイジン。
【００４５】
以下の単一のレポーター系を使用した：
＊ｍＣｈｅｒｒｙのみ；
＊ＮａｎｏＬｕｃ（ＮＬ）のみ；および
＊Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＮａｎｏＬｕｃ（ｓＮＬ）のみ。
【００４６】
以下の組み合わせレポーター系も使用した：
ＣＰ１−ＮＬ  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド；
ＣＰ１−ｓＮＬ  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド；
ＮＬ−ＣＰ１  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド；および
ｓＮＬ−ＣＰ１  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド。
【００４７】
他の実験では、上記ＥＥＦ１プロモーターをまた、前褐色特異的遺伝子（すなわち、ＰＲＤＭ１６、ＰＧＣ−１α、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｐｌａｃ８およびＵＣＰ−１）および前白色特異的遺伝子（すなわち、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、およびＡＫＴ−１）で置き換え、上記レポーター系の種々の組み合わせとともに使用した。これらのコンストラクトの全ては、ＢＭＩ１およびＴＥＲＴの発現を駆動するＥＥＦ１プロモーターを含む。
【００４８】
いったんＢＤＳＣ１５０細胞系をトランスフェクトおよび選択した後、それを、長期の継代の効果を決定するために試験した。ＢＡＤＳＣ１５０  ＢＭＩ１−ＴＥＲＴ  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチド（図５（ｄ））およびＴＥＲＴ−ＢＭＩ１  ＦＭＤＶ２自己プロセシングポリペプチドを、ｐ２０まで継代した（図６）。細胞は、コントロール（トランスフェクトしなかったＢＡＤＳＣ１５０）には存在しなかったテロメラーゼ活性を発現し（図７）、正常な細胞形態を保持した（図８）。
【００４９】
不死化ＢＡＤＳＣ１５０細胞をまた、機能的に分化するそれらの能力を決定するために試験した。細胞を誘導して、白色脂肪形成、褐色脂肪形成（図９）、骨形成（図１０）および軟骨形成（図１１）を受けさせた。これらのコンストラクトの種々の組み合わせを有するこの細胞系を、低分子のライブラリーおよび褐色脂肪誘導物質（すなわち、ＦＮＤＣ５、ＢＭＰ７、レチノイン酸）をスクリーニングするために使用し得る。
【００５０】
上記コンストラクトがＵＣＰ１−ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ  ＢｆＴ（図５（ｅ））である１つの組み合わせにおいて、ＥＥＦ１Ａ１は、Ｂｍｉ１およびＴｅｒｔ１の発現を駆動している。このコンストラクトを、細胞を不死化するために使用する。ＵＣＰ１は、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（蛍光顕微鏡法によってモニターされ得、特異的抗体を使用して磁性ビーズに捕捉され得るキメラ膜アンカーＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ蛍光タンパク質）の発現を駆動している。この実施形態において、このコンストラクトを有するＢＡＤＳＣ１５０細胞は不死であり、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒは、ＵＣＰ１が誘導される場合にのみ活性化される。ＵＣＰ１の誘導は、褐色脂肪組織特異的遺伝子をアップレギュレートする天然に存在するかもしくは合成いずれかの低分子にこの細胞集団を曝露することによって、達成され得る。
【００５１】
別の実施形態において、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒは、分泌型ｎａｎｏｌｕｃ（ｓＮＬ）で置き換えられる。このコンストラクトにおいて、ｓＮＬは、上記プロモーターが「オン」になったときのみ合成される。一実施形態において、上記プロモーターは、ＵＣＰ１である。ｓＮＬは上記細胞から細胞培養培地へと分泌されるので、上記化合物が、どの程度効率的にＵＣＰ１を「オン」にして続いてｓＮＬを生成するように誘導するかを定量分析するために、ｓＮＬのレベルについて上記培地をアッセイし得る。この系は、一度に種々の濃度で数千もの低分子のハイスループットスクリーニングを可能にする。
【００５２】
コンストラクトの全ての組み合わせをまた、白色脂肪を褐色脂肪に変換するか、または代謝活性を増加させる分子を同定する目的で、白色脂肪幹細胞へとトランスフェクトした。この細胞系は、そのレポーター系と連携して、褐色脂肪生物学の動態；具体的には、ＵＣＰ１アップレギュレーションおよび増加した代謝活性の根底にある機構の効率的な研究を可能にする。このヒト褐色脂肪幹細胞系は、マウスおよびヒトＵＣＰ１のアミノ酸組成が８０％未満であり、それによって、マウス褐色脂肪細胞系を、褐色脂肪特異的遺伝子を活性化する化合物を同定するのに不適切にしているという事実に起因して、貴重である。
【００５３】
さらに、移植可能な不死ＢＡＤＳＣの集団は、ヒトにおいて代謝調節を助け得る褐色脂肪組織の集団を提供する。図１２（ａ）および図１２（ｂ）を参照すると、２つのグラフは、マウスに移植した足場上のＢＡＤＳＣの効果を示す。図１２（ａ）は、移植後の週数単位で、高カロリー飼料を与えたコントロールマウスの基底血糖レベルが、同じ飼料を与えたがＢＡＤＳＣを移植したマウスより有意に高い（約６６％）ことを示す。同様に、図１２（ｂ）において、上記コントロールマウスの体重は、移植物を有するマウスの体重より約４０％重い。このことは、ＢＡＤＳＣが代謝障害（例えば、糖尿病および肥満症）を処置するのに有用であり得ることを示す。
【００５４】
本発明はまた、ヒト新生児褐色脂肪由来細胞を含む細胞培養プレートを提供する。上記プレートは、例えば、マルチウェルプレートであり得る。上記細胞培養プレートの１以上のウェルに、ヒト新生児褐色脂肪由来細胞が播種され得る。上記細胞は、分化した褐色脂肪細胞であり得る。上記細胞はまた、不死化され得る。上記細胞培養プレートは、上記細胞と候補薬物化合物とを接触させ、上記ヒト新生児褐色脂肪由来細胞に対する上記薬物化合物の効果を観察することによって、薬物化合物をスクリーニングするために有用である。
【００５５】
図１３を参照すると、種々の潜在的薬物のためのこのようなスクリーニング法が、ウェルに、トランスフェクトされたＢＡＤＳＣ細胞（例えば、ＢＡＤＳＣ１５０ＦＳ．ＵＣＰ１−ｓＮＬ−ＢｆＴ）もしくは白色脂肪幹細胞（例えば、ＷＡＤＳＣＦＳ．ＵＣＰ１−ｓＮＬ−Ｂｆｔ）のいずれかをプレーティングすることによって開始する（工程１）。次いで、目的の化合物を上記ウェルに添加し（工程２）、上記ウェルをプレートリーダーで読み取り、その培地を、例えば、分泌型ｎａｎｏｌｕｃについてアッセイする（工程３）。ｎａｎｏｌｕｃの存在は、上記薬物が上記幹細胞を活性化したことを示す。
【００５６】
本発明の図面および記載が、本発明を明確に理解することに関連する要素を例証するために、明瞭さを目的として他の要素を排除しながら単純化されていることは、理解されるべきである。しかし、当業者は、これらおよび他の要素が望ましいものであり得ることを認識する。しかし、このような要素は当該分野で周知であり、それらは本発明のよりよい理解を促進しないので、このような要素の考察は、本明細書では提供されない。図面は例証目的で呈示され、構造設計図として呈示されるのではないことが認識されるものとする。省略された詳細および改変もしくは代替の実施形態は、当業者の範囲内である。
【００５７】
本発明は、その趣旨からも本質的な特徴からも逸脱することなく、他の具体的形態で具現化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書で記載される発明に対する制限ではなく、全て例証的な観点から解釈されるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、請求項の意味および均等論の範囲内に入る全ての変更は、そこに包含されるものと解釈される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３Ｂ】
2016518125.tif 000030
【図５Ａ】
2016518125.tif 000031
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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