(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＯ酸化活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡであって、請求項１に記載のタンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮＯ酸化活性を有するタンパク質（ｂ）をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】
組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７０）。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組換えベクターを導入してなる形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするＮＯ酸化酵素タンパク質を生産する方法。
【請求項７】
請求項１に記載のタンパク質を使用すること、を特徴とするＮＯの測定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質を含有してなること、を特徴とするＮＯ測定試薬。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３５０ｎｍから４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡであって、請求項９に記載のタンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３５０ｎｍから４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質（ｂ）をコードする遺伝子。
【請求項１１】
組換えベクターｐｓｏｄＭ−ＦＬＨ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７１）。
【請求項１２】
請求項３または請求項１１に記載の組換えベクターを利用すること、を特徴とする麹菌に対する形質転換方法。
【請求項１３】
請求項３または請求項１１に記載の組換えベクターを利用すること、を特徴とする糸状菌に対する形質転換方法。
【請求項１４】
請求項３または請求項１１に記載の組換えベクターを利用すること、を特徴とする真核生物に対する形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規フラボヘモグロビン遺伝子及びその利用に関するものである。更に詳細には、本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼー：Aspergillus oryzae）より新規に単離したフラボヘモグロビン遺伝子を用いて、新規酵素であるＮＯ酸化酵素を大量に生産させ、ＮＯ測定試薬など様々な産業分野に利用することを可能にするものであり、また、麹菌をはじめとする糸状菌に対する遺伝子導入、形質転換ならびに遺伝子導入株、遺伝子導入株のスクリーニングを簡便にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
一酸化窒素ＮＯは、分子内に不対電子対を1個含むフリーラジカルである。生体内でのＮＯはＮＯ合成酵素により産生されるが、哺乳類のほとんどの細胞主がＮＯ合成酵素を持っていることが明らかとなっている。従って、全ての細胞がＮＯの影響下にあるといえる。また、ＮＯは電荷が中性の小さな分子であるために、細胞膜を通って自由に他の細胞内に拡散し、細胞間情報伝達因子として働くことができる。この様にＮＯは、ラジカルとして生体内の多様な反応にかかわり、多種類の細胞内でそれぞれの細胞機能に影響を及ぼすなど多彩な役割を演じており、ＮＯに関連する研究は盛んに行われている（例えば、非特許文献1参照）。
【０００３】
ＮＯの検出・濃度測定は広く研究されているが、それぞれ短所と長所を併せ持っている（例えば、非特許文献２参照）。ＥＳＲとＮＯスピントラップ剤を用いた測定方法も存在するが、ＥＳＲという特殊且つ高価な機器を必要とする。簡便な測定方法として、グリース法などが考案されているが、ＮＯが酸化されて生じる亜硝酸イオン濃度を測定するものである。簡便、安価、且つ、直接定量によるＮＯ測定方法は存在していない。
【０００４】
Saccharomyces cerevisiae、Alcaligenes eutrophus、E.coliなどが持つフラボヘモグロビンがＮＯ酸化活性を持つことが知られているが（例えば、非特許文献３参照）、然しながら、これらの微生物から生産される酵素は、生産性や安全性などが解決されず、実用化に至っていない。
【０００５】
また、麹菌をはじめとする糸状菌に対する遺伝子導入は、栄養要求性、資化性、薬剤耐性、などを選択マーカーとしていくつかの形質転換系が開発されてきている（例えば、非特許文献４参照）。然しながら、栄養要求性、資化性、の場合は、先ず変異株を取得する必要があり汎用性が高いとはいえない。公知の手法であるｎｉａＤ遺伝子（例えば、非特許文献５参照）を用いた手法では、数μｇのＤＮＡを用いて得られる株が十数個程度であり、その中でも実際に遺伝子が導入された株は数株である。更に、遺伝子が導入されたか否かは、サザン解析を行なう必要があり、形質転換操作を行ってからスクリーニングが終了するまで、１ヶ月以上に及ぶ時間を必要とする。このように、実験手順の煩雑さや、形質転換効率の面から、大腸菌や酵母に比べると糸状面の形質転換には、高度な技術と手間が必要とされてきた。
【０００６】
【非特許文献１】
「蛋白質  核酸  酵素」、vol.47、No.15、p2024−2031、2002年
【０００７】
【非特許文献２】
「生体内一酸化窒素（NO）実験プロトコール」、共立出版株式会社、吉村哲彦編、2000年
【０００８】
【非特許文献３】
「Printed in U. S. A.」、275巻、41号、p.31581−31587、2000年
【０００９】
【非特許文献４】
「生物化学実験法45  組替えタンパク質生産法」、学会出版センター、塚越規弘編著、2001年
【００１０】
【非特許文献５】
Mol. Gen. Gent., 218巻、p99−104、 1989年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、ＮＯの定量、検出その他様々な産業利用に可能なＮＯ酸化酵素の有用性に鑑み、ＮＯ酸化酵素を効率よく生産させることであり、また、麹菌をはじめとする産業上有用とされる糸状菌を含む真核生物において、変異株の取得を必要としないため汎用性が高く、また、形質転換株のスクリーニングを簡便にする技術の開発である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
糸状菌の中でも、特にアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae：黄麹菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国のＦＤＡ（食品医薬局）によりＧＲＡＳ（Generally Recognized as Safe）にリストアップされている安全な遺伝子源である。
従って、通常の菌由来の遺伝子を食品などに利用する際に必要な慢性毒性検査等の安全審査において、通常の菌由来の遺伝子の場合には約１０億円要するのに対して、上記のＧＲＡＳグレードである遺伝子の場合にはその約３分の１程度の経費で済むし、更に、該審査に要する時間もより短いというメリットがある。
このように、糸状菌、特に麹菌は、安全性及び経済性の点から極めて利用価値の高い遺伝子の宝庫と言える。
【００１３】
従って、これら菌のゲノムＤＮＡ情報を明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明らかにすることによって、バイオテクノロジーを利用した物質生産等のような、食品産業において安全な遺伝子資源の有効な活用法を提供するとともに、農薬及び医薬分野における各種遺伝子スクリーニングの為の有用な情報を提供することが出来る。
更に、近縁種であるアスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus) 、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)等のように穀物汚染菌、ヒト感染菌のゲノム情報を解析する有用なツールともなり得るものである。
【００１４】
本発明者らは、上記観点にたち、麹菌の一種であるアスペルギルス・オリゼのゲノム解析を行い、遂にそれに成功し、更にそれらの塩基配列の決定及び各種機能等の決定にも成功し、これらの成果を先に特許出願したところである（先の出願：特願２００１−４０３２６１）。
【００１５】
そして今回、更に、本発明者らは、上記した先の出願に記載された配列番号に示される塩基配列情報に基づき、実際に遺伝子組換え手段を用いてトランスフォーマントを作成し、その産生物を得て、更に詳細に該遺伝子の配列およびその機能を検証した。その検証の結果、先の出願において配列番号３８７６５で示される遺伝子配列情報にしたがって単離した遺伝子がＮＯ酸化活性を有するタンパク質を発現するという具体的な機能、有用性、及び、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質を発現するという具体的な機能、有用性を有するという新規事実をはじめて確認した。
【００１６】
すなわち、この発明は、先の出願において配列番号３８７６５に示される塩基情報を使用して、Aｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ中に、これと相同性を有する遺伝子を単離し、この遺伝子を導入した宿主が、配列番号３８７６５号についての説明中に示されるＮＯ酸化活性を有するタンパク質を現に産生することを確認したことに基づくものである。
また、この発明は、先の出願において配列番号３８７６５に示される塩基情報を使用して、Aｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ中に、これと相同性を有する遺伝子を単離し、この遺伝子を導入した宿主が、配列番号３８７６５についての説明中に示される３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質を現に産生することにより、形質転換体のスクリーニングにおいて、遺伝子導入株を着色度の差により判別可能となる事を確認したことに基づくものである。
【００１７】
具体的には、上記配列番号３８７６５号に示される塩基配列情報を解析し、その結果、フラボヘモグロビンに相同性を示した予測遺伝子を見出した。これをｆｌｈ２と命名した。
【００１８】
次に、このｆｌｈ２遺伝子の機能を調べるため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｆｌｈ２遺伝子はイントロンを含まない為、ゲノムＤＮＡに対してｆｌｈ２遺伝子のコード領域をＰＣＲにより増幅した。
【００１９】
このようにして得られたｆｌｈ２  ｃＤＮＡ（１．２ｋｂ）を取得し、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、得られた形質転換体（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｔ７−ＦＬＨ２）を常法に従って培養した。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べて極めて高いＮＯ酸化活性を示した。
従って、我々が単離したｆｌｈ２遺伝子には、ＮＯ酸化活性を有する蛋白がコードされていることが示された。
【００２０】
また、同じく上記形質転換体（Escherichia coli）Ｔ７−ＦＬＨ２を培養した結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べて極めて高い３５０〜４５０ｎｍにおける極大吸収を示した。
従って、我々が単離したｆｌｈ２遺伝子には、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質がコードされていることが示された。
【００２１】
次に、ｆｌｈ２  ｃＤＮＡ（１．２ｋｂ）と麹菌発現プロモーター（ＭｎＳＯＤプロモーター：特開２００１−２２４３８１）とのキメラ遺伝子を作成し、常法に従って麹菌への形質転換を行った。その結果得られた形質転換体をＣｚ−ＤＯＸプレート培地において培養した際、野生株に比べて、形質転換体ではコロニーが黄色からオレンジ色に着色した。従って、我々が単離したＦＬＨ２タンパクが形質転換体中に蓄積することにより、目視による形質転換体の判別が可能であることが示された。
【００２２】
本発明は、これら有用新知見に基づいてなされたものであって、（Ａ）ＮＯ酸化活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、および、（Ｂ）３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質、それをコードする遺伝子に関するものである。
【００２３】
はじめに前者（Ａ）について説明する。
すなわち、本発明は、ＮＯ酸化活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子に関するものであり、その態様例は以下に示される。
【００２４】
（態様１）
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＯ酸化活性を有するタンパク質。
【００２５】
（態様２）
配列番号２の塩基配列で示される、上記のタンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮＯ酸化活性を有する上記タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【００２６】
後者（Ｂ）の場合も同様であるが、本発明において、上記した特定のアミノ酸配列には、これと実質的に同一のアミノ酸配列も包含されるものである。本発明における特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列と全アミノ酸配列に亘ってアラインメントして比較した場合に、全体の平均で約３０％以上、好ましくは約５０％以上、更に好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上のアミノ酸が同一であるようなアミノ酸配列を意味する。従って、或るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るタンパク質は、該アミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同等の機能を有するものと考えられる。
【００２７】
又、本発明タンパク質における特定のアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同等の機能を有する限りにおいて、好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成るものを意味する。又、タンパク質の「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び／又は外部において示す生物学的機能又は活性、あるいは極大吸収等の理化学的性質を意味する。
【００２８】
上記の特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るタンパク質、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るタンパク質は、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該タンパク質を構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各タンパク質に含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ  ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３０】
このように、本発明に係るｆｌｈ２遺伝子は、新規なものであって、従来既知のＮＯ酸化酵素とは異なる新規ＮＯ酸化酵素をコードする遺伝子、該新規ＮＯ酸化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｆｌｈ２遺伝子ということもあり、その塩基配列（４０００ｂｐ）を配列表の配列番号２、及び、図面の図３、図４、図５に示す。）
【００３１】
本発明ＤＮＡは、当業者に公知の方法で調製することが出来る。例えば、本明細書において具体的な塩基配列で示される各ＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼのゲノムを出発材料として用いて、例えば、ショットガン・クローニング法によって調製することができる。その際、断片化された各染色体ＤＮＡは、その長さ等に応じて、プラスミドベクター又はファージ等の適当なクローニングベクターに連結し、これを用いてエレクトロポレーション法等の適当な方法によって大腸菌等の適当な宿主細胞を形質転換し、該断片化各染色体ＤＮＡをクローニングする為の、クローンライブラリーを調製することができる。
更に、化学分解法（マキサム−ギルバート法）及びジデオキシ法等の公知の方法に従って、かかるクローンライブラリーから得られる断片化各染色体ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００３２】
或は、本明細書に記載された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸配列の情報に基づき、当業者に周知の化学合成、又は、本発明のプライマーを使用したＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。
【００３３】
本発明に係るＤＮＡ源として用いるアスペルギルス・オリゼのゲノムの１例としては、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムを使用することができる。なお、本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８２７３として寄託されている。
【００３４】
本発明において、このようにして単離したｆｌｈ２遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、ＮＯ酸化酵素又はＮＯ酸化酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、ＮＯ酸化酵素活性を有するタンパク質にはＮＯ酸化酵素も包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列番号１（図１、図２）に示される。
【００３５】
例えば、ｆｌｈ２遺伝子のコード領域（１．２ｋｂｐ）をベクター（例えば、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ）に挿入して組換えベクターを調製する。このようにして調製した大腸菌発現プラスミドをｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２と命名し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９１７０として寄託した（図１２）。
【００３６】
このようにして調製した大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２を宿主（例えば大腸菌）に導入して形質転換体を得る。このようにして得た形質転換体をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｔ７−ＦＬＨ２と命名した。本形質転換体を培養したところ、菌体破砕液がきわめて高いＮＯ酸化酵素活性を示すことから、本遺伝子の発現が確認された。
【００３７】
本発明に係るｆｌｈ２遺伝子の発現産物は、従来既知のフラボヘモグロビンと同様に、ＮＯを酸化する活性を有する。しかし、そのアミノ酸配列は、従来のものとは相違していることから、本酵素を新規酵素と同定し、ＮＯ酸化酵素ＦＬＨ２と命名した。
【００３８】
次いで、後者（Ｂ）について説明する。
すなわち、本発明は、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質、それをコードする遺伝子に関するものであり、その態様例は以下に示される。
【００３９】
（態様１）
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質。
【００４０】
（態様２）
配列番号２の塩基配列で示される、上記タンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有する上記タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【００４１】
このように本発明に係るｆｌｈ２遺伝子は、新規なものであって、従来既知の３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質とは異なる新規３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｆｌｈ２遺伝子ということもあり、その塩基配列（４０００ｂｐ）を配列表の配列番号２、及び、図面の図３、図４、図５に示す。）
【００４２】
本発明において、先に述べた手法により単離したｆｌｈ２遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質を蓄積することにより、目視による形質転換体の判別するものである。なお、本発明において、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質にはＦＬＨ２タンパク質も包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列番号1（図１、２）に示される。
【００４３】
例えば、ｆｌｈ２遺伝子のコード領域（１．２ｋｂｐ）を麹菌発現プロモーター（ＭｎＳＯＤ：特開２００１−２２４３８１）とのキメラ遺伝子を作成し、組換えベクターを調製する。このようにして調製した麹菌発現プラスミドをｐｓｏｄＭ−ＦＬＨ２と命名し、これを特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９１７１として寄託した（図１３）。
【００４４】
このようにして調製した麹菌発現プラスミドｐｓｏｄＭ−ＦＬＨ２を宿主（例えば麹菌）に導入して形質転換体を得る。このようにして得た形質転換体をアスペルギルス・オリゼ（Aｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＯ−ＦＬＨ２と命名した。本形質転換体をＣｚ−ＤＯＸプレート培地において培養した際、野生株に比べて、形質転換体ではコロニーが黄色からオレンジ色に着色した。従って、我々が単離したＦＬＨ２タンパクが形質転換体中に蓄積することにより、目視による形質転換体の判別が可能であることが確認された。
【００４５】
本発明に係るｆｌｈ２遺伝子は、従来既知のフラボヘモグロビンと同様に、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有する。しかし、そのアミノ酸配列は、従来のものとは相違していることから、本遺伝子を新規遺伝子と同定し、ｆｌｈ２遺伝子と命名した。
以下、本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。
【００４６】
【実施例Ａ−１】
ｆｌｈ２遺伝子のクローニング及びｆｌｈ２遺伝子の塩基配列の決定
先の出願に記載したように、麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム解析結果のうち、フラボヘモグロビンに相同性を示した予測遺伝子Ｃｏｎ１６２１＿ｈ＿１２５８について妥当性を検討した。本遺伝子はゲノムコンティグ１６２１番の逆鎖上にコードされる、全長２．５ｋｂｐの遺伝子として予測されていた。そのうち１−１０００ｂｐがプロモーター領域、１００１−２２５２ｂｐがコード領域、２２５３−２５６０ｂｐがターミネーター領域と予測されていた。
【００４７】
そこで、Ｃｏｎ１６２１＿ｈ＿１２５８に含まれる遺伝子をｆｌｈ２と命名し、予測される開始コドンを含むプライマー（オリゴＤＮＡ＃１）とｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーによりＣｚ−ＤＯＸ液体培地から得たＲＮＡをテンペレートとしてｃＤＮＡを増幅し、塩基配列の解析を行った。オリゴＤＮＡ＃１の塩基配列を配列番号３（図６）に示す。
【００４８】
その結果、ｆｌｈ２遺伝子は、コーディング領域に４１６アミノ酸がコードされていた。ｆｌｈ２をコードする遺伝子の塩基配列は先の出願に係る配列番号３８７６５号に示される塩基配列の中に含まれており、先の出願に係る配列番号３８７６５に示される遺伝子はフラボヘモグロビンであることが確認された。
【００４９】
【実施例Ａ−２】
ｆｌｈ２遺伝子の大腸菌への導入
次に、ｆｌｈ２遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｆｌｈ２遺伝子のコード領域（１．２ｋｂｐ）を麹ゲノムＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会社製ＰｙｔｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃２、オリゴＤＮＡ＃３を用いて増幅した断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで処理し、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトとＸｈｏＩサイトに挿入して、新規組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２を構築し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９１７０として寄託した。常法にしたがって本組換えベクターを用いて大腸菌の形質転換を行い、得られた新規形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔ７−ＦＬＨ２と命名した。
【００５０】
なお上記において、ＰＣＲ用プライマーとして用いたオリゴＤＮＡ＃２、及びオリゴＤＮＡ＃３の塩基配列を、それぞれ、配列番号４（図７）および配列番号５（図８）に示す。
【００５１】
上記によって得た形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いＮＯ酸化活性を示した。
【００５２】
従って、我々が単離したｆｌｈ２遺伝子には、ＮＯ酸化活性を有する蛋白がコードされていることが明らかとなった。このように本発明に係るｆｌｈ２遺伝子は、新規なものであって、従来既知のＮＯ酸化酵素とは異なる新規ＮＯ酸化酵素をコードする遺伝子、該新規ＮＯ酸化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくとも一つを含有する遺伝子、から選ばれる少なくとも一つを指示するものである。
【００５３】
【実施例Ａ−３】
組換えＮＯ酸化酵素ＦＬＨ２の利用
ＮＯ酸化酵素が触媒する反応の反応式を以下に示す。
【００５４】
デオキシ状態酵素  +  Ｏ2  →  オキシ状態酵素
オキシ状態酵素  ＋  ＮＯ  →  ＮＯ3-  +  メトキシ状態酵素
メトキシ状態酵素  +  1/2ＮＡＤＰＨ  →  デオキシ状態酵素
【００５５】
反応式から明らかな様に、ＮＡＤＰＨの減少を検出してＮＯを定量することが出来る。例えば減少したＮＡＤＰＨの検出には、分光学的手法、蛍光法などが知られており、それらが使用できる。分光学的手法では、ＮＡＤＰＨの１６０μＭでは、３４０ｎｍの吸光度は１．０となるため、この値の減少量からＮＯ濃度を測定できる。また、蛍光法では、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍを用いることで、同様の測定を行うことができる。ＮＡＤＰＨ濃度は、吸光度法では、１０〜２００μＭ、蛍光法では、０．１〜１０μＭで測定が可能であり、すなわち、それぞれの測定方法で、２０〜４００μＭ、０．２〜２０μＭのＮＯ濃度測定が可能となる。
【００５６】
また、ＦＬＨ２タンパク質と、ＦＬＨ２タンパク質とＮＯの結合状態との吸光スペクトルの差やＥＳＲスペクトルをとることにより、ＮＯの検出・濃度測定などが可能となる。
【００５７】
具体的に、ＦＬＨ２タンパク質によるＮＯ酸化反応のＮＡＤＰＨ減少からＮＯ濃度を算出した結果を示す。
反応溶液組成を以下に示す。（濃度は最終濃度）
【００５８】
１６０μＭ      ＮＡＤＰＨ
５０ｍＭ        リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
１２０μＭ      ＮＯＣ７
２μｇ／ｍｌ  ＦＬＨ２酵素溶液
【００５９】
ＮＯ発生剤であるＮＯＣ７溶液以外を混合し、３７℃でインキュベート。分光光度計を用いて測定スタートし、３４０ｎｍの吸光度減少を１分間隔で測定した。測定開始１分後にＮＯＣ７添加。１０分後まで、１分おきにデーター収集。（図１４）ＮＡＤＰＨの減少量から、１０分後の時点で、１６５μＭのＮＯを酸化して算出される。ＮＯＣ７は半減期５分で１分子から２分子のＮＯを放出する試薬であることから、今回の測定では、ＮＯＣ７から放出されたＮＯ全てを酸化していることが示された。また、後記するように、麹菌での遺伝子導入株の作成と酵素活性の確認を行った。
【００６０】
【実施例Ｂ−１】
ｆｌｈ２遺伝子の大腸菌への導入
ｆｌｈ２遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。上記した実施例Ａ−２の手法により、新規組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２を構築し、常法にしたがって本組換えベクターを用いて大腸菌の形質転換を行い、得られた新規形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔ７−ＦＬＨ２と命名した。
【００６１】
上記によって得た形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体は、ＬＢプレート上でオレンジ色の着色を示し、菌体破砕液より精製した酵素は、ｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高い３５０〜４５０ｎｍでの極大吸収を示した。（図１５）
【００６２】
従って、我々が単離したｆｌｈ２遺伝子には、３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有する蛋白がコードされていることが明らかとなった。このように本発明に係るｆｌｈ２遺伝子は、新規なものであって、従来既知の３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質とは異なる新規３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する遺伝子、から選ばれる少なくとも一つを指示するものである。
【００６３】
【実施例Ｂ−２】
ｆｌｈ２遺伝子の麹菌への導入
次に、ｆｌｈ２遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の麹菌への導入を試みた。ｆｌｈ２遺伝子のコード領域（１．２ｋｂｐ）を麹ゲノムＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会社製ＰｙｔｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃４、オリゴＤＮＡ＃３を用いて増幅した断片と、ＭｎＳＯＤプロモーター（１．０ｋｂｐ）を麹ゲノムＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会社製ＰｙｔｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃５、オリゴＤＮＡ＃６を用いて増幅した断片を作成。この２つの断片の混合物をテンプレートとしてＰｙｔｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃5、オリゴＤＮＡ＃３を用いて増幅した断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩで処理し、麹菌形質転換用ｐＩＮ９３のＰｓｔＩとＳａｌＩサイトに挿入し、得られた新規組換えベクターｐｓｏｄＭ−ＦＬＨ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７１）を用い、常法に従って麹菌の形質転換を行い、得られた形質転換体（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＡＯ−ＦＬＨ２）の培養を行った。
【００６４】
なお上記において、ＰＣＲ用プライマーとして用いたオリゴＤＮＡ＃３、オリゴＤＮＡ＃４、オリゴＤＮＡ＃５、およびオリゴＤＮＡ＃６、の塩基配列を、それぞれ、配列番号５（図８）、配列番号６（図９）、配列番号７（図１０）、および配列番号８（図１１）に示す。
【００６５】
上記によって得られた形質転換体をＣｚ−ＤＯＸプレート培地において培養した際、野生株に比べて、形質転換体ではコロニーが黄色に着色した。また、この着色は培地中にＦｅＣｌ3をはじめとする鉄溶液を高濃度含ませることにより、より明瞭に着色する（図１６：図面代用写真）。また、他にも形態的変化として、野生株と比較し、形質転換株では、菌糸の生育、ならびに胞子形成においても盛んであり、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の入った培地においてもコロニーの起毛が多くなる（図１７：図面代用写真）。このようにｆｌｈ２遺伝子が導入された株は、色、形、胞子形成などにおいて、野生株、あるいは遺伝子非導入株との区別が可能となり、遺伝子導入株のスクリーニングを容易にすることができる。また、更に、本法で得られた麹菌ＦＬＨ２酵素告発現株（ＡＯ−ＦＬＨ２）の菌体破砕液においても、ＮＯ酸化活性があることが確認された。
【００６６】
また、麹菌形質転換ベクターを作成する際、遺伝子発現プロモーターに、本来宿主が生育できない条件、例えば嫌気的条件下、高鉄濃度条件下などで高い発現活性を有するプロモーターを用いることにより、より効率的に遺伝子導入株のスクリーニングが可能となる事がわかる。
【００６７】
また、形質転換株と野生株、もしくは遺伝子非導入株との間で、目視による判別が可能な程、明瞭な形態的差が現れることから、麹菌形質転換ベクターを作成する際、ｆｌｈ２遺伝子をマーカーとして用いることが可能である。すなわち、栄養要求性マーカーを使用する際のように、変異を導入した宿主をあらかじめ用意する必要がない、簡便な形質転換方法の構築を可能にすることができる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の新規ＮＯ酸化酵素を大量に生産することがはじめて可能となり、研究用試薬やＮＯ測定用の検査薬への応用などＮＯ酸化酵素を産業上広く利用することを可能にするものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させることも可能であり、その場合、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００６９】
また、本発明により、麹菌ｆｌｈ２遺伝子の産物である３５０〜４５０ｎｍに極大吸収を有するタンパク質を形質転換株の中に蓄積させる事により、形質転換体のスクリーニングにおいて、遺伝子導入株、目視による形質転換体の判別が可能となった。また、本遺伝子をマーカーとして用いる際には、宿主にあらかじめ変異処理をかける必要がないため、栄養要求性株が困難な生物においても遺伝子導入が可能となる。すなわち、本発明はバイオテクノロジー全般に対して、簡便且つ汎用性の高い、遺伝子導入株方法、ならびに遺伝子導入株スクリーニング方法を実現するものである。
【００７０】
しかも、これらの効果は、麹菌のみにとどまらず、糸状菌及び真核生物にも広く奏される点でも本発明はすぐれている。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＯ酸化酵素ＦＬＨ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上の続きを示す。
【図３】ＮＯ酸化酵素ｆｌｈ２遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上の続きを示す。
【図５】同上の続きを示す。
【図６】オリゴＤＮＡ＃１プライマーを示す。
【図７】オリゴＤＮＡ＃２プライマーを示す。
【図８】オリゴＤＮＡ＃３プライマーを示す。
【図９】オリゴＤＮＡ＃４プライマーを示す。
【図１０】オリゴＤＮＡ＃５プライマーを示す。
【図１１】オリゴＤＮＡ＃６プライマーを示す。
【図１２】大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ＦＬＨ２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図１３】麹菌発現プラスミドｐｓｏｄＭ−ＦＬＨ２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図１４】ＦＬＨ２酵素を用いたＮＯ酸化反応によるＮＡＤＰＨ減少を測定した例。
【図１５】ＦＬＨ２タンパクの吸収スペクトル。
【図１６】ｆｌｈ２遺伝子を導入した株における着色の例を示す、すなわち、培養条件：Ｃz−Ｄｏｘ培地（０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５％アガー、１．５ｍＭ FeＣl3）での野生株（上段）と遺伝子導入株（下段）の着色の違いを示す（図面代用写真）。
【図１７】ｆｌｈ２遺伝子を導入した株における形態的変化の例を示す。すなわち、培養条件：Ｃｚ−ＤＯＸ培地（０．２５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５％アガー、１．５ｍＭ  ＦｅＣｌ3）での野生株と遺伝子導入株の形態の違いを示す（図面代用写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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