(57)【要約】肝細胞癌を治療するための組成物および方法を本明細書に開示する。一実施形態において、肝細胞癌を有する対象を治療する方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む治療有効量の免疫複合体（ＶＢ４−８４５）を投与することを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。エフェクター分子はシュードモナス外毒素Ａであり得る。いくつかの実施形態において、この免疫複合体は、１つまたは複数の抗癌剤と同時に投与されるか、並行して投与されるか、または連続して投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌部位での肝細胞癌の治療または予防に使用するための有効量の免疫複合体であって、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体断片を含み、前記抗体が上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）に結合する、免疫複合体。
【請求項２】
前記抗体断片が、マウス抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項３】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項４】
前記抗体断片が、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項５】
配列番号２（ＶＢ４−８４５）のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項６】
抗体−抗原複合体を形成するために、対象から採取した試験試料を抗体と接触させるステップ（その際、前記抗体は、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む）と、
前記試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定するステップと、
対照に対して結果を正規化するステップと
を含む、前記対象において肝細胞癌を検出または監視する方法。
【請求項７】
配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む抗原と、その使用説明書とを含む、肝細胞癌を診断するためのキット。
【請求項８】
インビトロまたはインビボで肝癌細胞を死滅させる方法であって、
エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む有効量の免疫複合体に前記肝癌細胞を接触させることを含み、前記抗体が上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する、方法。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号１に示す重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫複合体が、配列番号２（ＶＢ４−８４５）のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
抗癌剤と共に前記免疫複合体と肝癌細胞を接触させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗癌剤が、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、ボラゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド（ｌｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポシロン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、血管新生阻害剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１およびＨｅｒ２阻害剤、ならびにモノクローナル抗体から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
肝細胞癌を有する対象を治療する方法であって、
エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む治療有効量の免疫複合体を前記対象に投与することを含み、前記抗体が上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）に結合する、方法。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号１に示す重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記エフェクター分子が、放射性同位体、抗腫瘍薬、免疫調節剤、生物学的応答修飾因子、レクチン、毒素、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記エフェクター分子が、アブリン、モデシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルディン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される毒素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫複合体が前記癌細胞によって内部移行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫複合体が、配列番号２（ＶＢ４−８４５）のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫複合体の投与が癌部位に直接的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫複合体が、１つまたは複数の抗癌剤と組み合わされて投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫複合体が、５−フルオロウラシルと組み合わされて投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫複合体がＶＢ４−８４５であり、約１００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日の投与量で投与され、５−フルオロウラシルが約２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫複合体が、１つまたは複数の抗癌剤と同時に投与されるか、並行して投与されるか、または連続して投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗癌剤が、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、ボラゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド（ｌｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポシロン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、血管新生阻害剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１およびＨｅｒ２阻害剤、ならびにモノクローナル抗体から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫複合体が、癌治療の前に、癌治療と並行して、癌治療後に、または癌の寛解中に前記対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、７〜２１日間、約１００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、７〜２１日間、約５００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、７〜２１日間、約３００マイクログラム／日の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、４週間、約５００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、４週間、約７００マイクログラム／週の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫複合体がＶＢ−８４５であり、４週間、約１０００マイクログラム／週の投与量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年４月１２日出願の米国仮出願第６１／８１１，３６０号の優先権を主張する。
【０００２】
政府の持分
該当なし
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、肝細胞癌を治療するための組成物および方法に関する。一実施形態において、肝細胞癌を有する対象を治療する方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む治療有効量の免疫複合体を前記対象に投与することを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、アブリン、モデシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルディン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素などの毒素であり得る。いくつかの実施形態において、免疫複合体は癌部位に直接投与される。
【０００４】
追加の実施形態において、この免疫複合体は、配列番号２に示すＶＢ４−８４５またはその変異体である。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、１つまたは複数の他の抗癌剤と同時に投与されるか、並行して投与されるか、または連続して投与され得る。
【０００５】
別の実施形態において、対象において癌を検出または監視する方法を開示する。例えば、肝細胞癌の検出は、抗体−抗原複合体を形成するために、前記対象から採取した試験試料を抗体と接触させることと（その際、抗体は、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む）、試験試料中の抗体−抗原複合体を測定することと、対照に対して結果を正規化することと、を含み得る。
【０００６】
さらなる実施形態において、癌を診断するためのキットを開示する。例えば、肝細胞癌を診断するためのキットは、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む抗原と、その使用説明書と、を含む。
【０００７】
さらなる実施形態において、インビトロまたはインビボで肝癌細胞を死滅させる方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む有効量の免疫複合体に肝癌細胞を接触させることを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＶＢ４−８４５のマップ。このマップは、４Ｄ５ＭＯＣＢ ｓｃＦｖおよびＥＴＡ２５２−６０８部分、ならびにヒスチジンタグ、ＰｅｌＢシグナル、リンカー領域、ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＥＴＡ領域ＩＩ、ＥＴＡ領域Ｉｂ、ＥＴＡ領域ＩＩＩ、およびＥＲ保持シグナルを含む様々なドメインが連結された免疫複合体の構成を示す。
【図２】ｐｅｌＢリーダー配列と共に、ＶＢ４−８４５のアミノ酸および核酸の配列に対応する配列番号２および３を示す。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ペリプラズム発現のためのシグナル配列、ヒスチジンタグ、ＣＤＲ１、２および３ドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、リンカー、ＥＴＡドメインＩＩ、ＥＴＡドメインＩｂ、ＥＴＡドメインＩＩＩ、およびＥＲ保持シグナルＫＤＥＬを含むドメインに分けることができる。
【図３】患者の予後の免疫組織化学染色およびヒストグラムを示す。（Ａ）ＣＭ型ＨＣＣ症例におけるＥｐ−ＣＡＭ発現の免疫組織化学的分析、（ａ）Ｅｐ−ＣＡＭ発現を示す典型的なＣＭ型ＨＣＣ、（ｂ）Ｅｐ−ＣＡＭ発現を示さない典型的なＣＭ型ＨＣＣ。隣接する非癌細胞には見られない癌細胞および胆管におけるＥｐ−ＣＡＭの膜染色（倍率、１００倍）。ＢＤ、胆管。Ｅｐ−ＣＡＭタンパク質の発現がある場合（＋）またはない場合（−）のＣＭ型ＨＣＣ患者の術後の予後。（Ｂ）全生存曲線、（Ｃ）治療手術後の無再発生存曲線。ＣＭ型ＨＣＣ患者において、Ｅｐ−ＣＡＭ発現は、治療手術後の予後不良と有意に関連していた。ログランク検定は、全生存率および無再発生存率（それぞれｐ＝０.０４４７、およびｐ＝０.０１７１）において統計的に有意な差異を示した。
【図４】ヒトＨＣＣ細胞株におけるＶＢ４−８４５および５−ＦＵのインビトロ効果とＥｐ−ＣＡＭ発現の関連を示す。（Ａ）８種類のＨＣＣ細胞株におけるＥｐ−ＣＡＭ発現をフローサイトメトリーによって分析した。（ＢおよびＣ）ＶＢ４−８４５または５−ＦＵで処理すると、腫瘍細胞増殖が阻害されることを示している。８種類のＨＣＣ細胞株を０.０１〜１０ｐＭの範囲の濃度でＶＢ４−８４５と共に７２時間インキュベートするか、または０.０１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で５−ＦＵと４８時間インキュベートした。細胞増殖をＭＴＳアッセイで測定した。グラフは平均値を示す。エラーバーは３回の測定の標準偏差を示す。（Ｄ）ＶＢ４−８４５（ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞株については１ｐＭ、残りの細胞株については１０ｐＭ）ならびに５−ＦＵ（ＨＬＥ、ＨＬＦ、およびＰLＣ／ＰＲＦ／５細胞については５μｇ／ｍｌ、残りの細胞については１μｇ／ｍｌ）で４８時間処理した８種類のＨＣＣ細胞株の細胞増殖アッセイ。カラム、生細胞（％）；縦棒、標準偏差。
【図５】ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせで処理し、３次元培養システムを用いて７日間培養した後のＥｐ−ＣＡＭ高細胞株における球形成を示す（２００倍）。５−ＦＵ処理後に対照細胞および生存細胞は球を形成したが、ＶＢ４−８４５およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせの処理後の生存細胞は、球を形成しなかった。スケールバー、５０μｍ。
【図６】ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせの処理後の、様々な幹／前駆細胞マーカーに基づくＥｐ−ＣＡＭ高細胞株のＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ）３つの独立した染色実験の代表的な結果を示し、グラフに対応するマーカーの陽性率を示す。矢印は、ＣＤ１３３発現についてＨｅｐＧ２細胞のユニークな二峰性パターンを示す。（ＢおよびＣ）ＶＢ４−８４５または５−ＦＵの処理後のＣＤ１３３の発現を示す。カラム、生細胞（％）；縦棒、標準偏差。（ＤおよびＥ）ＶＢ４−８４５または５−ＦＵの処理後のＣＤ１３発現を示す。カラム、生細胞（％）；縦棒、標準偏差。
【図７】皮下異種移植モデルにおけるインビボ試験の結果を示す。ＨｕＨ−７の樹立した皮下異種移植片を、対照の生理食塩水または３０μｇ／ｋｇのＶＢ４−８４５の静脈注射および対照の生理食塩水または３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵの腹腔内注射で２週間、週３回治療した。（Ａ）投与期間の終わりのマウスの代表的な皮下腫瘍を示す。スケールバー、１０ｍｍ。（Ｂ）４群（ｎ＝１０）において一日おきにプロットした腫瘍体積を示す。矢印は投与の時を示す。縦棒、標準エラー。両側スチューデントｔ検定により統計解析を行った（ｐ＜０.０５）。
【図８】肝臓同所異種移植片モデルにおけるインビボ試験を示す。ＨｕＨ−７の樹立した肝臓同所異種移植片を、対照の生理食塩水またはＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合せで治療した。投与の方法およびスケジュールは皮下腫瘍の場合と同じであった。（Ａ）投与期間の終了時のマウスの代表的な肝腫瘍を示す。スケールバー、１０ｍｍ。（Ｂ）対照（１９６４±３６７ｍｍ３）またはＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合せ（１４１±３４ｍｍ３）の投与後２週間の時点で分析した肝臓腫瘍体積（ｎ＝５）を示す。縦棒、標準エラー。両側スチューデントｔ検定により統計解析を行った（ｐ＝０.００１１）。（Ｃ）Ｅｐ−ＣＡＭ（倍率、４０倍）のＨ＆Ｅ染色および免疫染色を示す。（Ｄ）２群間の全ての腫瘍細胞で濃く染色された腫瘍細胞の割合を示す。縦棒、標準偏差。
【図９】異なる濃度で試験した場合の、ＶＢ４−８４５によるマンモスフェア形成効率（ＭＦＥ）の濃度依存的減少を示す。縦棒、標準偏差。
【図１０】予めＶＢ４−８４５に曝露した細胞を洗浄し、マンモスフェア増殖培地に再播種した場合の再播種アッセイを示す。トリパンブルーによる染色により、色素は生細胞（Ａ）から排除され、死細胞（Ｂ）からは排除されないので、ＶＢ４−８４５は細胞毒性であるが、細胞増殖抑制性ではないことが示された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、特定のプロセス、組成物、または方法が変化し得るので、記載された特定のプロセス、組成物、または方法に限定されない。本明細書で使用する用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきものは何もない。
【００１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その」は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数参照を含む。したがって、例えば、「抗酸化剤」への言及は、１つまたは複数の抗酸化剤および当業者に公知のその等価物などへの言及である。
【００１１】
本明細書で使用する用語「約」は、使用されている数±１０％の数値を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲内を意味する。
【００１２】
本明細書で使用する用語「動物」、「患者」または「対象」には、ヒトならびに野生動物、家畜および農場の動物などの非ヒト脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、この用語はヒトを指す。
【００１３】
本明細書で使用され得る「抗体断片」には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、およびそれらの任意の組み合わせ、ならびに組換え源からの断片および／またはトランスジェニック動物において産生される断片が含まれる。抗体または断片は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターおよびヒトを含む任意の種由来のものであってよい。キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物可変領域およびヒト定常領域を組み合わせた抗体分子も、本発明の範囲内であると企図される。キメラ抗体分子には、例えば、ヒト定常領域を有するマウス、ラット、または他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを含むヒト化抗体が含まれ得る。従来の方法を用いて、キメラ抗体を作製してもよい。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象において免疫原性が低いことが予想される。ヒト化抗体は、例えば、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ００／６１６３５に記載されるように安定化できる。
【００１４】
本明細書で使用する語句「抗癌剤」は、限定されないが、化学物質、他の免疫療法、癌ワクチン、抗血管形成化合物、特定のサイトカイン、特定のホルモン、遺伝子治療、放射線療法、手術、および食事療法を含む癌の治療または予防に有効である化合物または治療剤を指す。
【００１５】
本明細書で使用する語句「有効量」は、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を意味する。有効量の免疫複合体は、動物の疾患状態、年齢、性別、体重などの要因に応じて変動し得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少させてもよい。
【００１６】
本明細書で使用する語句「ヒト化抗体または抗体断片」は、抗体または断片がヒトフレームワーク領域を含むことを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する語句「免疫複合体」は、エフェクター分子に結合する抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体またはＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、およびそれらの任意の組み合わせ、ならびに組換え源からの断片および／またはトランスジェニック動物において産生される断片などの抗体断片であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、合成タンパク質、結合タンパク質またはポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、毒素、放射性ヌクレオチド、放射性医薬品、標識剤、薬物、細胞毒性剤、ペプチド、およびタンパク質などであり得る。これらのエフェクター分子は、抗体が抗原に結合した時に、殺傷、溶解もしくは標識するか、または他の効果を誘導することが可能であり得る。
【００１８】
本明細書で使用する語句「癌部位に直接投与されるまたは直接投与」は、限定されないが、腫瘍もしくは腫瘍周囲への直接的な免疫複合体の単回または複数回注射、腫瘍もしくは腫瘍周囲への連続または不連続の灌流、腫瘍または腫瘍周囲への貯留の導入、腫瘍または周囲腫瘍への徐放性装置の導入、腫瘍または腫瘍周囲への徐放製剤の導入、腫瘍上への直接適用、腫瘍の領域に実質的に直接供給している動脈内への直接注射、腫瘍の領域に実質的に排出するリンパ管への直接注入、実質的に囲まれた空洞（例えば、胸腔）もしくは内腔（例えば、小胞内）への直接導入または実質的な直接導入を含む直接導入または実質的な直接導入を指す。「腫瘍周囲」は、限定されないが、触知可能な腫瘍の境界などの腫瘍の境界とみなされるものの約１０ｃｍ以内、好ましくは５ｃｍ以内、より好ましくは１ｃｍ以内の領域を説明する用語である。発生の予防または再発の防止の文脈における「直接投与」は、癌の発生または再発の危険性のある部位への直接投与として定義される。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ＭＯＣ−３１抗体」は、マウス抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体または抗ＥＧＰ−２抗体を意味し、ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、カタログ番号ＭＵ３１６−ＵＣ、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号１８−０２７０またはＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号Ｍ４１６５などの商業的供給源から入手可能である。
【００２０】
本明細書で使用する用語「４Ｄ５ＭＯＣ−Ａ」は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ００／６１６３５に記載のｓｃＦｖ  ４Ｄ５の人工ヒトコンセンサスフレームワーク上に移植したヒト化ｓｃＦｖ  ＭＯＣ３１抗体を意味する。
【００２１】
本明細書で使用する用語「４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂ」は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ００／６１６３５に記載されるように調製された４Ｄ５ＭＯＣ−Ａの安定変異体を意味する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ＶＢ４−８４５」は、ｂ）シュードモナス外毒素Ａの切断型（アミノ酸２５２〜６０８）に融合されたａ）ｓｃＦｖヒト化抗体４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂを含む免疫複合体を意味する。ＶＢ４−８４５の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１００２４９０３９号に開示されている。
【００２３】
本明細書で使用する語句「薬学的に許容される」は、一般的な臨床使用および／または連邦政府もしくは州政府の規制当局による承認、米国薬局方に掲載されていること、または当業者による一般的な受け入れを指す。
【００２４】
本明細書で使用する抗体結合についての「生理学的条件」は、Ｅｐ−ＣＡＭ結合ポリペプチドがインビボでＥｐ−ＣＡＭ分子に遭遇する条件を示すが、必ずしも正確に再現する必要はない。生理的条件下での結合は、インビボでの結合が発生することを合理的に予測するものでなければならない。
【００２５】
本明細書で使用する語句「癌の予防」は、癌発生の予防を指す。特定の場合において、予防的治療は、癌の再発を低減する。他の場合では、予防的治療は、患者の癌の発症リスクを低減するか、または前癌状態（例えば、結腸ポリープ）から実際の悪性腫瘍への進行を阻止する。
【００２６】
本明細書で使用する語句「用量の減少」は、通常投与および／または推奨される用量を下回る用量を指す。抗癌剤の通常投与量は、例えば、医師用卓上参考書の最新版などの中の当技術分野で公知の標準物質に見出すことができる。
【００２７】
本明細書で使用する語句「癌の治療」は、癌細胞の複製およびアポトーシスの抑制、腫瘍増殖の阻害、癌細胞数もしくは腫瘍成長の低下、癌の悪性度の減少（例えば、分化の増強）、または癌関連症状の改善を指す。
【００２８】
本明細書で使用する用語「治療」は、患者の望ましくない病状、疾患もしくは症状を阻止、対抗、寛解、防止または改善するために利用される薬剤を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「変異体」は、任意の薬学的に許容される誘導体、類似体、もしくは免疫複合体の断片、抗体もしくは抗体断片、毒素（例えば、シュードモナス毒素）、または本明細書に記載のエフェクター分子を指す。変異体はまた、多量体、個々の構成要素を含む多量体、複数の個々の構成要素を含む多量体（例えば、参照分子の多量体）、化学的な分解産物、および生物学的分解産物のうちの１つまたは複数の構成要素も包含する。特定の、非限定的な実施形態において、免疫複合体は、Ｅｐ−ＣＡＭ結合部分および／または参照免疫複合体の毒素部分の変化（複数可）により、参照免疫複合体に対して「変異体」であり得る。例えば、変異体免疫複合体は、抗体部分および／または毒素部分の多量体を含み得る。分子の毒素部分の変異体は、参照毒素の製剤の毒性を測定するために使用される標準的なアッセイにおいて、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の毒性を保持する。いくつかの実施形態において、変異体はまた、本発明の免疫複合体と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドを指すこともできる。いくつかの実施形態において、変異体はまた、競合結合アッセイにより測定した場合、本発明の免疫複合体と少なくとも３０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％の結合親和性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指すこともできる。
【００３０】
参照免疫複合体のＥｐ−ＣＡＭ結合部分に変化を有する変異体の免疫複合体は、生理的条件下で、抗Ｅｐ−ＣＡＭ参照抗体の結合と少なくとも１０パーセント、好ましくは少なくとも３０％競合する（下記参照）。１０％の競合とは、飽和濃度の抗Ｅｐ−ＣＡＭ参照抗体がＥｐ−ＣＡＭに結合するアッセイにおいて、これらの結合した参照抗体の１０％が、平衡に達したときに、等しい濃度の試験抗Ｅｐ−ＣＡＭ免疫複合体変異体と置き換えられることを意味する。非限定的な例として、抗体間の競合、または抗体と免疫複合体との間の競合は、事実上全てのＥｐ−ＣＡＭ部位が抗体と結合するように、細胞の表面上のＥｐ−ＣＡＭまたはＥｐ−ＣＡＭ被覆固体基板へ標識された抗Ｅｐ−ＣＡＭ参照抗体を結合させること、これらの抗体−抗原複合体を非標識試験抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体または非標識試験免疫複合体と接触させること、Ｅｐ−ＣＡＭ結合部位から置換された標識抗体の量を測定することによって測定され、その際、遊離標識抗体の量は生じた競合の量を示す。
【００３１】
免疫療法は、癌と闘うための強力なツールとして現れた。腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）に対して作られたマウス抗体およびヒト化／キメラ抗体、ならびにそれらのそれぞれの抗体断片は、特定のヒト癌の診断および治療のために使用されてきた。これらの抗体の非コンジュゲート型、毒素コンジュゲート型、および放射性標識型は、このような療法に使用されてきた。
【００３２】
興味のある免疫療法のための１つの腫瘍関連抗原は、１７−１Ａ、ＫＳＡ、ＥＧＰ−２およびＧＡ７３３−２としても知られる上皮細胞接着分子（「Ｅｐ−ＣＡＭ」）である。Ｅｐ−ＣＡＭは、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および頭頸部扁平上皮癌を含む多くの固形腫瘍で高発現しているが、ほとんどの正常上皮組織ではあまり発現していない膜貫通タンパク質である。その発現は細胞増殖の速度と相関する。Ｅｐ−ＣＡＭ特異的抗体は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌の患者の主な腫瘍を撮像し、検出するのに使用されてきた。
【００３３】
肝細胞癌（「ＨＣＣ」）は、世界中で５番目に最も多い癌であり、癌による死亡の主な原因の１つである。ＨＣＣは予後不良で、米国でのＨＣＣの５年生存率は１２％未満にとどまっている。ＨＣＣ腫瘍の悪性度は、血管侵襲および全体の形態を含むいくつかの病理組織学的所見に関して報告されている。ＨＣＣの主要な根治的治療は肝移植を含む外科的切除であり、ラジオ波焼灼療法、経動脈化学塞栓療法、および化学療法（５−ＦＵ）を含む様々な治療選択が利用されてきた。効果的な対症療法は、ＨＣＣが従来の細胞毒性薬に対してしばしば耐性を示すという事実によって妨げられる。進行したＨＣＣ患者における全生存期間の中央値は、未だ１年未満であり、予後は不良のままである。
【００３４】
多くの癌細胞は、化学療法および放射線の現在の治療法に耐性を示すようになり、細胞の小グループでも大規模な治療後に生き残る。この耐性を説明する１つの仮説は、癌幹細胞の存在である。理論に束縛されるものではないが、各腫瘍内の細胞の異なるサブセットは不正確な自己再生が可能であり、比較的複製能力が限られている成人の腫瘍細胞（複数可）に発展し得る。これらの癌幹細胞（ＣＳＣ）は、化学療法剤、放射線または他の毒性条件に対してより耐性であり、したがって、臨床治療後にも生き残り、後に二次腫瘍に成長し、転移または再発に関与すると仮定されている。ＣＳＣは、組織幹細胞またはより分化した組織前駆細胞（複数可）のいずれかから生じ得ることが示唆されている。
【００３５】
一部の研究者は、癌幹細胞がマーカー発現に基づいて同定できることを提案した。例えば、ＣＤ１３３は、脳腫瘍における癌幹細胞およびヒト前立腺上皮幹細胞に見られるマーカーであると考えられている。いくつかの乳癌幹細胞は、ＣＤ２４を発現しないかまたは少し発現するのと同時にＣＤ４４を発現する。結腸癌幹細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＣＤ１６６を発現する。肝幹細胞マーカーには、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＣＤ９０が含まれる。
【００３６】
この医学的問題に対して、新しい、腫瘍特異的な治療法の開発がとても必要とされている。１つの新しいアプローチは、毒素とコンジュゲートさせた抗体などの免疫複合体を用いた標的療法である。抗体は、効率的な腫瘍細胞死滅のための毒素を送達するために、腫瘍細胞に特異的に結合する。
【００３７】
シュードモナス外毒素Ａに連結させたヒトＥｐ−ＣＡＭの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体断片を含む免疫複合体が、肝細胞癌の治療に有効であることを本明細書で開示する。特に、本発明者らは、細胞結合ドメインを欠くシュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ）の切断型に融合されたＥｐ−ＣＡＭに対する安定化された単鎖Ｆｖ組換えヒト化抗体断片を含む免疫複合体が肝癌細胞に対して細胞傷害性であることを示した。この免疫複合体は、肝癌細胞上で発現するＥｐ−ＣＡＭに結合する。結合すると、免疫複合体は内部移行し、シュードモナス外毒素Ａが細胞を死滅させるか、またはタンパク質合成を阻止し、それによって細胞死に至る。重要なのは、ほとんどの正常粘膜細胞および線維芽細胞はＥｐ−ＣＡＭを広範囲に発現しておらず、したがって、免疫複合体を内部移行させることができず、外毒素の潜在的な副作用から保護される。
【００３８】
本開示は、肝細胞癌を治療するための組成物および方法に関する。一実施形態において、肝細胞癌を有する対象を治療する方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む治療有効量の免疫複合体を前記対象に投与することを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。抗体は、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む。エフェクター分子は、放射性同位体、抗腫瘍薬、免疫調節剤、生物学的応答修飾因子、レクチン、毒素、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、アブリン、モデシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルディン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素などの毒素およびそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、癌部位に直接投与される。
【００３９】
追加の実施形態において、免疫複合体は、配列番号２に示すＶＢ４−８４５またはその変異体である。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、１つまたは複数の他の抗癌剤と同時に投与されるか、並行して投与されるか、または連続して投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫複合体ＶＢ４−８４５は、ｐｅｌＢリーダー配列を欠いていてもよく、配列番号２のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９を含む。
【００４０】
別の実施形態において、対象において肝細胞癌を検出または監視する方法は、抗体−抗原複合体を形成するために、前記対象から採取した試験試料を抗体と接触させるステップと（その際、抗体は、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む）、試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定するステップと、ならびに対照に対して結果を正規化するステップと、を含む。
【００４１】
さらなる実施形態において、肝細胞癌を診断するためのキットは、配列番号４、５および６によって定義されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびに配列番号７、８、および９によって定義されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域を含む抗原と、その使用説明書と、を含む。
【００４２】
さらなる実施形態において、肝細胞癌を治療するための方法は、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）の発現について患者からの腫瘍試料を試験することと、タンパク質が対照と比較して腫瘍試料中でより高いレベルで発現している場合に、配列番号２に示す配列を有する有効量のＶＢ４−８４５を患者に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、免疫複合体ＶＢ４−８４５は、ｐｅｌＢリーダー配列を欠いていてもよく、配列番号２のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫複合体は癌部位に直接投与される。
【００４３】
さらなる実施形態において、肝細胞癌を治療するためのキットは、配列番号２に示す配列を有するＶＢ４−８４５である有効量の免疫複合体と、癌を治療するためのその使用説明書と、を含む。いくつかの実施形態において、免疫複合体ＶＢ４−８４５は、ｐｅｌＢリーダー配列を欠いていてもよく、配列番号２のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
本明細書に開示する方法およびシステムは、肝臓または肝細胞癌の原発腫瘍を治療すること、または肝細胞癌の転移の可能性を減少させることが企図される。このような方法は、異なる起源の癌性腫瘍が身体の別の部分から肝臓に転移（蔓延）する肝転移の治療を含まない。
【００４５】
別の実施形態において、インビトロまたはインビボでの癌幹細胞を死滅させる方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む有効量の免疫複合体に癌幹細胞を接触させることを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。予後不良の多くの悪性腫瘍は、通常、胚性幹細胞が濃縮されている遺伝子の優先的過剰発現を示す。これらの肝幹／前駆細胞マーカーのいくつかには、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＣＤ９０が含まれる。したがって、幹細胞／前駆細胞マーカーを発現する癌細胞は、肝細胞癌の治療のための重要な標的として認識される可能性がある。さらに、本明細書で開示する免疫複合体はまた、肺の癌幹細胞、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、肝癌幹細胞、脳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、結腸癌幹細胞、胃癌幹細胞、頭頸部癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、および卵巣癌幹細胞などの様々な癌幹細胞を死滅させるために使用され得る。
【００４６】
さらなる実施形態において、インビトロまたはインビボで肝癌細胞を死滅させる方法は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含む有効量の免疫複合体に肝癌細胞を接触させることを含み、ここで前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボで肝癌細胞を死滅させる方法は、抗癌剤と共に有効量の免疫複合体と肝癌細胞を接触させることを含む。免疫複合体は、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体を含んでもよく、前記抗体は上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を認識する。抗癌剤は、本明細書に記載の任意の抗癌剤であってよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体はＶＢ４−８４５であり、抗癌剤は５−フルオロウラシルである。
【００４８】
したがって、一実施形態において、本発明は、肝細胞癌を治療または予防する方法であって、（ａ）結合される癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素とを含む有効量の免疫複合体を、そのような治療を必要とする動物に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、肝細胞癌を治療または予防するための、（ａ）結合される癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素とを含む有効量の免疫複合体の使用も提供する。本発明は、肝細胞癌を治療または予防するための医薬の製造における（ａ）結合される癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素と、を含む有効量の免疫複合体の使用をさらに提供する。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、癌幹細胞を死滅させるための方法であって、（ａ）結合される癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素とを含む有効量の免疫複合体を、そのような治療を必要とする動物に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、癌幹細胞を死滅させるための医薬の製造における（ａ）結合される癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素と、を含む有効量の免疫複合体の使用を提供する。
【００５０】
癌細胞上のタンパク質に結合する抗体は、癌細胞に対して免疫複合体を選択的に標的化することができる任意の分子であり得る。一実施形態において、本抗体は、腫瘍関連抗原に結合する。肝癌細胞上で発現するタンパク質の例としては、ＩＬ−４受容体、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ表面タンパク質、ＥＧＦ受容体、ｇｐ５４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３、ＣＤ４４、およびＣＤ９０が挙げられる。特定の実施形態において、本抗体はＥｐ−ＣＡＭに結合する。
【００５１】
肝癌細胞または癌幹細胞上の抗原を認識する特異的抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングし、そのタンパク質をコードする核酸分子から産生されるペプチドと共に細菌内で発現させることによって生成できる。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域およびＦｖ領域は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌内で発現させることができる。あるいは、ＳＣＩＤ−ｈｕ  マウスを用いて、抗体またはその断片を産生することができる。
【００５２】
免疫複合体の抗体部分は、免疫グロブリン由来であってもよく、すなわち、免疫グロブリン（または抗体）である出発分子を追跡することができる。例えば、抗体は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用する免疫グロブリン骨格の修飾によって産生できる。別の非限定的な例では、免疫グロブリンドメイン（例えば、可変重鎖および／または軽鎖）は、非免疫グロブリン骨格に連結できる。さらに、抗体は、限定されないが、化学反応または遺伝子設計なしで開発できる。したがって、非限定的な例において、免疫複合体は、肝癌細胞に特異的に結合する免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば、抗体ライブラリーから選択された抗体）、またはその変異体と、毒素またはその変異体と、を含み得る。このような免疫グロブリンポリペプチドは、例えば、標的腫瘍関連分子へのそれらの結合特性に影響を与えるように、またはそれらの物理的特性を改善するように再設計できる。
【００５３】
免疫複合体の抗体部分は、免疫グロブリンベースである必要はない。したがって、免疫複合体は、肝癌細胞に特異的に結合する非免疫グロブリンポリペプチド（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））、またはその変異体と、毒素またはその変異体と、を含み得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、標的腫瘍関連分子に結合するように設計できる。さらに、非免疫グロブリンポリペプチドは、所望の親和性または結合活性を有するように操作でき、かつ極端なｐＨ範囲および比較的高い温度を含む様々な物理的条件に耐容性を示すように設計できる。
【００５４】
実際に、医薬組成物で使用するために、生理的条件（例えば、ペプチダーゼの存在下で３７℃）で比較的長い半減期を有する非免疫グロブリンポリペプチドの設計が有利であり得る。さらに、そのような分子、またはその変異体は、良好な溶解性、小型、適切な折り畳みを実証することができ、容易に入手可能で低コストの細菌系で発現させることができ、したがって、商業的に合理的な量で製造できる。非免疫グロブリンポリペプチドを設計する能力は、当業者の技術の範囲内である。
【００５５】
エピトープ結合ポリペプチドの例としては、限定されないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むリガンド、プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン、およびアンキリンリピートなどを含むタンパク質リピートドメインのアセンブリに基づく結合分子が挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、ヒト化、安定化、単鎖、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、マウスモノクローナル抗体ＭＯＣ３１に由来する４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂであり得、本発明の主題である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、抗体は、好ましくは、Ｅｐ−ＣＡＭを認識する。一実施形態において、免疫複合体は、（ａ）結合される癌細胞上のＥｐ−ＣＡＭに結合する抗体または抗体断片と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素と、を含む。特定の実施形態において、免疫複合体は、（ａ）ヒトＥｐ−ＣＡＭの細胞外ドメインに結合し、結合されるＭＯＣ−３１抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含むヒト化抗体または抗体断片と、（ｂ）癌細胞に対して細胞傷害性である毒素と、を含む。４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂ抗体由来のＣＤＲ配列を配列番号４〜９に示す。
【００５８】
一実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の変異体のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４〜９と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。
【００５９】
別の実施形態において、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の変異体のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０、さらにより好ましくは少なくとも９０％、およびさらに最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。
【００６０】
適切なＥｐ−ＣＡＭ標的免疫複合体には、限定されないが、ＶＢ４−８４５またはその変異体、ＭＯＣ３１可変領域またはその変異体を含む他の免疫複合体、およびＥｐ−ＣＡＭに選択的に結合する他の一本鎖または二本鎖免疫グロブリンを含む免疫複合体が含まれる。
【００６１】
具体的な、非限定的な実施形態において、この免疫複合体は、配列番号２に示されるようなＶＢ４−８４５を含む。他の非限定的な実施形態において、この免疫複合体は、ＶＢ４−８４５の変異体を含む。ＶＢ４−８４５の変異体は、ＶＢ４−８４５が結合する同じＥｐ−ＣＡＭエピトープまたは実質的に類似したＥｐ−ＣＡＭエピトープに結合し、この変異体は、生理的条件下でＥｐ−ＣＡＭへのＶＢ４−８４５の結合を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％競合的に阻害し得る。ＶＢ４−８４５変異体は、ＶＢ４−８４５と同じシュードモナス外毒素Ａ断片を含むか、もしくは同じ外毒素の異なる部分または異なる毒素を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫複合体ＶＢ４−８４５は、ｐｅｌＢリーダー配列を欠いていてもよく、配列番号２のアミノ酸２３〜アミノ酸６６９のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
一実施形態において、ＶＢ４−８４５の変異体アミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００６３】
同様に、様々な毒素を用いて、本発明によるＥｐ−ＣＡＭ−標的化免疫複合体を設計してもよい。好ましい実施形態において、毒素は、植物毒素または細菌毒素であり得る。非限定的な例としては、アブリン、モデシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルディン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素およびそれらの組み合わせが挙げられる。毒素がリボソーム不活性化タンパク質である場合、免疫複合体は、毒素が細胞にとって細胞傷害性であるために、癌細胞に結合すると内部移行できる。
【００６４】
特に好ましい実施形態において、毒素部分は、少なくともシュードモナス外毒素Ａ（「ＥＴＡ」）の毒性部分、またはその変異体を含む。特定の実施形態において、細胞傷害性部分は、単独で投与された場合、細胞に結合することが実質的にできないＥＴＡ変異体を含む。さらに、特定の実施形態において、細胞傷害性部分は、ΕΤΑ２５２−６０８を含む。細胞傷害性部分は、当技術分野で公知の１つまたは複数のシュードモナス外毒素を含み得る。
【００６５】
他の非限定的な実施形態において、毒素は、ＤＮＡを妨害するように作用する薬剤を含む。したがって、毒素は、限定されないが、エンジイン（例えば、カリケアマイシンおよびエスペラマイシン）および非エンジイン低分子薬剤（例えば、ブレオマイシン、メチジウムプロピル−ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）を含み得る。本発明による有用な他の毒素には、限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ジスタマイシンＡ、シスプラチン、マイトマイシンＣ、エクチナサイジン、デュオカルマイシン／ＣＣ−１０６５、およびブレオマイシン／ペプレオマイシンが含まれる。
【００６６】
他の非限定的な実施形態において、毒素は、チューブリンを破壊するように作用する薬剤を含む。このような毒素は、限定されないが、リゾキシン／メイタンシン、パクリタキセル、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、コルヒチン、アウリスタチン、ドラスタチン１０ ＭＭＡＥ、ならびにペロルシドＡを含み得る。
【００６７】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、アサレイ（Ａｓａｌｅｙ）ＮＳＣ １６７７８０、ＡＺＱ ＮＳＣ １８２９８６、ＢＣＮＵ ＮＳＣ ４０９９６２、ブスルファンＮＳＣ ７５０、カルボキシフタラート白金  ＮＳＣ ２７１６７４、ＣＢＤＣＡ ＮＳＣ ２４１２４０、ＣＣＮＵ ＮＳＣ ７９０３７、ＣＨＩＰ ＮＳＣ ２５６９２７、クロラムブシル  ＮＳＣ ３０８８、クロロゾトシン ＮＳＣ  １７８２４８、シスプラチンＮＳＣ １１９８７５、クロメゾン  ＮＳＣ  ３３８９４７、シアノモルホリノドキソルビシン  ＮＳＣ ３５７７０４、シクロジソン ＮＳＣ ３４８９４８、ジアンヒドロガラクチトール  ＮＳＣ １３２３１３、フルオロドパン  ＮＳＣ ７３７５４、ヘプスルファン  ＮＳＣ ３２９６８０、ヒカントン  ＮＳＣ １４２９８２、メルファラン  ＮＳＣ ８８０６、メチル  ＣＣＮＵ ＮＳＣ ９５４４１、マイトマイシンＣ ＮＳＣ ２６９８０、ミトゾラミド  ＮＳＣ ３５３４５１、窒素マスタード、ＮＳＣ ７６２、ＰＣＮＵ ＮＳＣ ９５４６６、ピペラジンＮＳＣ ３４４００７、ピペラジンジオン  ＮＳＣ １３５７５８、ピポブロマン  ＮＳＣ ２５１５４、ポルフィロマイシン  ＮＳＣ ５６４１０、スピロヒダントインマスタード  ＮＳＣ １７２１１２、テロキシロン  ＮＳＣ ２９６９３４、テトラプラチン  ＮＳＣ ３６３８１２、チオテパ  ＮＳＣ ６３９６、トリエチレンメラミン  ＮＳＣ ９７０６、ウラシルナイトロジェンマスタード  ＮＳＣ ３４４６２、およびＹｏｓｈｉ−８６４  ＮＳＣ １０２６２７を含むアルキル化剤を含み得る。
【００６８】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、アロコルヒチン  ＮＳＣ ４０６０４２、ハリコンドリンＢ ＮＳＣ ６０９３９５、コルヒチン  ＮＳＣ ７５７、コルヒチン誘導体  ＮＳＣ ３３４１０、ドラスタチン１０ ＮＳＣ  ３７６１２８、メイタンシン  ＮＳＣ １５３８５８、リゾキシン  ＮＳＣ ３３２５９８、タキソール  ＮＳＣ １２５９７３、タキソール誘導体  ＮＳＣ ６０８８３２、チオコルヒチン  ＮＳＣ ３６１７９２、トリチルシステイン  ＮＳＣ ８３２６５、ビンブラスチン硫酸塩  ＮＳＣ ４９８４２、およびビンクリスチン硫酸塩  ＮＳＣ  ６７５７４を含む抗有糸分裂剤を含み得る。
【００６９】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、カンプトテシン  ＮＳＣ ９４６００、カンプトテシンＮａ塩  ＮＳＣ １００８８０、アミノカンプトテシン  ＮＳＣ ６０３０７１、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ９５３８２、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ １０７１２４、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６４３８３３、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６２９９７１、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ２９５５００、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ２４９９１０、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６０６９８５、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ３７４０２８、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ １７６３２３、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ２９５５０１、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６０６１７２、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６０６１７３、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６１８９３９、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６１０４５７、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６０６４９９、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６１０４５６、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ３６４８３０、カンプトテシン誘導体  ＮＳＣ ６０６４９７、およびモルホリノドキソルビシン  ＮＳＣ ３５４６４６を含むトポイソメラーゼＩ阻害剤を含み得る。
【００７０】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、ドキソルビシン  ＮＳＣ １２３１２７、アモナフィド  ＮＳＣ ３０８８４７、ｍ−ＡＭＳＡ ＮＳＣ ２４９９９２、アントラピラゾール誘導体  ＮＳＣ ３５５６４４、ピラゾロアクリジン  ＮＳＣ ３６６１４０、ビサントレン  ＨＣＬ ＮＳＣ ３３７７６６、ダウノルビシン  ＮＳＣ ８２１５１、デオキシドキソルビシン  ＮＳＣ ２６７４６９、ミトキサントロン  ＮＳＣ ３０１７３９、メノガリル  ＮＳＣ ２６９１４８、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン  ＮＳＣ ２６８２４２、オキサントラゾール  ＮＳＣ ３４９１７４、ルビダゾン  ＮＳＣ １６４０１１、ＶＭ−２６  ＮＳＣ １２２８１９、およびＶＰ−１６  ＮＳＣ １４１５４０を含むトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含み得る。
【００７１】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、Ｌ−ａｌ−アノシン ＮＳＣ １５３３５３、５−アザシチジン  ＮＳＣ １０２８１６、５−フルオロウラシル  ＮＳＣ １９８９３、アシビシン ＮＳＣ １６３５０１、アミノプテリン誘導体  ＮＳＣ １３２４８３、アミノプテリン誘導体  ＮＳＣ １８４６９２、アミノプテリン誘導体  ＮＳＣ １３４０３３、アンチホル（ａｎｔｉｆｏｌ） ＮＳＣ ６３３７１３、アナンチホル ＮＳＣ ６２３０１７、ベイカーの可溶性アンチホル ＮＳＣ １３９１０５、ジクロロアリルローソン  ＮＳＣ １２６７７１、ブレキナル  ＮＳＣ ３６８３９０、フトラフール（プロドラッグ）  ＮＳＣ  １４８９５８、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン  ＮＳＣ ２６４８８０、メトトレキサート  ＮＳＣ ７４０、メトトレキサート誘導体  ＮＳＣ １７４１２１、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）  ＮＳＣ ２２４１３１、ピラゾフリン  ＮＳＣ １４３０９５、トリメトトレキサート  ＮＳＣ ３５２１２２、３−ＨＰ ＮＳＣ  ９５６７８、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン  ＮＳＣ ２７６４０、５−ＨＰＮＳＣ １０７３９２、アルファ−ＴＧＤＲ  ＮＳＣ ７１８５１、アフィジコリングリシネート  ＮＳＣ ３０３８１２、ａｒａ−Ｃ ＮＳＣ ６３８７８、５−アザ−２'−デオキシシチジン  ＮＳＣ １２７７１６、ベータ−ＴＧＤＲ  ＮＳＣ ７１２６１、シクロシチジン ＮＳＣ １４５６６８、グアナゾール  ＮＳＣ １８９５、ヒドロキシウレア  ＮＳＣ ３２０６５、イノシングリコジアルデヒド ＮＳＣ １１８９９４、マクベシンＩＩ ＮＳＣ ３３０５００、ピラゾールイミダゾール ＮＳＣ ５１１４３、チオグアニン  ＮＳＣ ７５２、およびチオプリン  ＮＳＣ ７５５を含むＲＮＡまたはＤＮＡ代謝拮抗物質を含み得る。
【００７２】
抗体は、毒素に関連付けることができるか、または毒素に連結できる任意の手段によって、標的にコンジュゲートさせてもよい。例えば、抗体または抗体断片は、化学的または組換え手段によって毒素に結合させることができる。融合またはコンジュゲートを調製するための化学的手段は、当技術分野で公知であり、免疫複合体を調製するために用いることができる。抗体および毒素をコンジュゲートするために使用される方法は、癌細胞上の標的分子に結合する抗体の能力を妨害することなく、毒素と抗体を結合することができなければならない。
【００７３】
一実施形態において、抗体および毒素の両方はタンパク質であり、当技術分野において公知の技術を用いてコンジュゲートできる。２つのタンパク質をコンジュゲートでき、当技術分野で開示されている架橋剤は数百存在する。架橋剤は、一般的に利用可能な反応性官能基または抗体もしくは毒素に挿入される反応性官能基に基づいて選択される。さらに、反応性基がない場合には、光活性化架橋剤が使用できる。特定の例において、抗体と毒素の間にスペーサーを含めることが望ましい場合がある。当技術分野で公知の架橋剤には、ホモ二官能性剤：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデートおよびビス（ジアゾベンジジン）およびヘテロ二官能性剤：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが含まれる。
【００７４】
抗体−毒素タンパク質融合はまた、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することもできる。このような場合には、抗体をコードするＤＮＡ配列は毒素をコードするＤＮＡ配列に融合され、その結果、キメラＤＮＡ分子が生じる。このキメラＤＮＡ配列は、抗体−毒素融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。融合タンパク質は、当技術分野において公知の技術を用いて細胞培養物から収集され、精製できる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫複合体を用いて、肝臓癌または肝細胞癌を治療できる。
【００７６】
さらに、本発明はまた、幹／前駆細胞マーカーを発現する肝細胞を含む癌幹細胞を死滅させるための方法も提供する。腫瘍または腫瘍細胞は、本発明の治療方法に対するそれらの感受性を決定するために、例えば、腫瘍組織または細胞の試料を入手し、免疫複合体の抗体部分に結合する試料の能力を決定することによって評価され得る。一実施形態において、癌細胞上のタンパク質はＥｐ−ＣＡＭである。Ｅｐ−ＣＡＭの細胞表面発現を、前癌または癌組織中の細胞表面Ｅｐ−ＣＡＭの定常状態レベルを増加させる薬剤により誘導または上昇させてもよい。
【００７７】
したがって、本発明は、肝癌細胞が免疫複合体中の抗体によって結合されるタンパク質のレベルを発現するか否かを判定するために、本発明の治療方法の前に使用できる診断方法およびキットを含む。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞癌を治療または予防するための方法であって、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）の発現について、患者の腫瘍試料を試験することと、タンパク質が対照と比較して腫瘍試料中でより高いレベルで発現される場合に、配列番号２に示す配列を有する有効量のＶＢ４−８４５を患者に投与することと、を含む方法を含む。
【００７８】
本発明は、肝細胞癌を診断するためのキットであって、癌を診断するための癌細胞上のタンパク質に結合する抗体と、その使用説明書と、を含むキットを含む。
【００７９】
好ましい非限定的な実施形態において、癌は、免疫複合体の直接投与による治療の影響を受けやすい。例えば、標的腫瘍塊は皮膚の表面の近くに存在し得る。別の例では、病変組織は嚢胞によってカプセル化され得るか、または限定されないが、管腔を含む実質的に密閉されたキャビティ内に見出される。他の実施形態において、癌は、免疫複合体の静脈内投与による治療の影響を受けやすい。
【００８０】
本発明はまた、手術後合併症のリスクを低減するための方法であって、手術、および特定の非限定的な実施形態において、癌を治療するための手術の前、手術中、または手術後に、有効量の免疫複合体を投与することを含む方法も提供する。
【００８１】
本発明はまた、肝細胞癌の発生を予防する、再発を予防もしくは遅延させる、または再発率を低下させるための方法であって、有効量の免疫複合体を、それを必要とする患者に
直接投与することを含む方法も提供する。
【００８２】
本発明はまた、１つまたは複数の他の抗癌剤に対して腫瘍または癌を感作させるための方法であって、本発明の免疫複合体を投与することを含む方法も提供する。非限定的な実施形態において、他の抗癌剤は、別のＥｐ−ＣＡＭ標的免疫複合体を含む。別の非限定的な実施形態において、他の抗癌剤は放射線を含む。他の抗癌剤は、免疫複合体の投与前に、それと重複して、それと同時に、および／またはその後に投与されてもよい。同時に投与される場合には、免疫複合体および他の抗癌剤は、単一の製剤または別々の製剤で投与されてもよく、別々であれば、必要に応じて、異なる投与様式による。したがって、１つまたは複数の免疫複合体と１つまたは複数の他の抗癌剤との組み合わせは、相乗的に腫瘍または癌に対抗するように作用し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、抗癌剤は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、ボラゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド（ｌｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポシロン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、血管新生阻害剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１およびＨｅｒ２阻害剤、ならびにモノクローナル抗体であり得る。
【００８４】
別の実施形態において、免疫複合体は、放射線療法の計画と組み合わせて投与される。この療法はまた、外科手術および／または化学療法も含み得る。例えば、免疫複合体は、放射線療法とシスプラチン（プラチノール）、フルオロウラシル（５−ＦＵ、アドルシル）、カルボプラチン（パラプラチン）、および／またはパクリタキセル（タキソール）と組み合わせて投与されてもよい。免疫複合体による治療は、例えば、望ましくない体重減少または脱水をもたらす可能性のある嚥下機能を妨げる深刻な咽頭炎の発生率を減少させることができる低用量の放射線および／またはより低頻度の放射線治療の使用を可能し得る。
【００８５】
１つまたは複数の他の抗癌剤に加えて本発明の免疫複合体が投与される場合、これらの他の抗癌剤には、限定されないが、２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン、６−アザウリジン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、メルカプトプリン、アセグラロン（ａｃｅｇｌａｒｏｎｅ）、アクラシノマイシンＡ、アクチノマイシン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アンシタビン、アンギオゲニンアンチセンスオリゴヌクレオチド、アントラマイシン、アザシチジン、アザセリン、アジリジン、バチマスター（ｂａｔｉｍａｓｔａｒ）、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、カルムスチン、カルビシン、カルジノフィリン、クロラムブシル、クロルナファジン、酢酸クロルマジノン、クロロゾトシン、クロモマイシン、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフォスファミド、デメコルチン、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ジアジコン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、エダトレキセート、エフロミシン、酢酸エリプチニウム、エミテフル、エノシタブン（ｅｎｏｃｉｔａｂｕｎｅ）、エピルビシン、エピチオスタノール、エストラムスチン、エトグルシド、エトポシド、ファドロゾール、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、フォルメスタン、ホスフェストロール、フォテムスチン、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘキセストロール、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、インプロスルファン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、Ｌ−アスパラギナーゼ、レンチナン、レトロゾール、ロイプロリド、ロムスチン、ロニダミン、マンノムスチン、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メトトレキサート、メツレデパ、ミボプラチン、ミルテフォシン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モピダモール、ミコフェノール酸、ニルタミド、ニムスチン、ニトラシン、ノガラマイシン、ノベムビチン、オリボマイシン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルフォスファミド、フェナメット、フェネステリン、ピポブロマン、ピポスルファン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プリカマイシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、リン酸ポリエストラジオール、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、プロパゲルマニウム、ＰＳＫ、プテロプテリン、ピューロマイシン、ラニムスチン、ラゾキサン、ロキニメックス、シゾフィカン（ｓｉｚｏｆｉｃａｎ）、ソブゾキサン、スピロゲル���ニウム、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テガフール、テモゾロミド、テニポシド、テヌゾン酸（ｔｅｎｕｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、テストラコン(ｔｅｓｔｏｌａｃｏｎｅ)、チアミプリン、チオグアニン、トムデックス、トポテカン、トレミフェン、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、トリロスタン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロホスファミド、トロンテカン（ｔｒｏｎｔｅｃａｎ）、ツベルシジン、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ、ウレタン、ビンクリスチン、ジノスタチン、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、ゲムツズマブ、チオテパ、シクロホスファミド、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、ダカルバジン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏａｍｉｄｅ））、ヘキサメチルメラミン、リソドレン（ＬＹＳＯＤＲＥＮ）、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド（例えば、タキソール、パクリタキセル、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ、ＣＰＴ−１１）、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、ＶＰ−１６（エトポシド）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、アントラサイクリン、リポソーマルドキソルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、アルデスロイキン、アルタミン、ビアオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン(ｃａｒｂｏｐｌａｉｎ)、クロラブシン(ｃｈｌｏｒａｂｕｓｉｎ)、シクララビン(ｃｙｃｌａｒａｂｉｎｅ)、ダクリノマイシン（ｄａｃｌｉｎｏｍｙｃｉｎ)、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｈｅ）、酢酸ラウプロリド（ｌａｕｐｒｏｌｉｄｅ）、レバミゾール、ロムスリン（ｌｏｍｕｓｌｉｎｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｏ）、メスナ、ミトランク（ｍｉｔｏｌａｎｃ）、ペガスペルガーゼ（ｐｅｇａｓｐｅｒｇａｓｅ）、ペントスラチン（ｐｅｎｔｏｓｌａｔｉｎ）、ピカマイシン（ｐｉｃａｍｙｃｉｎ）、リウキシルマブ（ｒｉｕｘｌｍａｂ）、カンパス（ｃａｍｐａｔｈ）−１、ストラプロゾシン（ｓｔｒａｐｌｏｚｏｃｉｎ）、トレチノイン、ＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチド、ビンデシン、ならびにビノレルビンが含まれ得る。１つまたは複数の抗癌剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）もまた、本発明によって企図される。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａrａ−Ｃ）およびＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。同様に、本発明の免疫複合体は、放射線療法または他の既知の抗癌モダリティと組み合わせて使用できる。
【００８６】
併用療法のための医薬組成物はまた、限定されないが、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン）、アスパラギナーゼ、ＢＣＧタンパク質、ジフテリア毒素、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、抗有糸分裂剤、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、抗ヒスタミン薬、抗悪心薬なども含まれ得る。
【００８７】
実際に、そのような治療を必要とする患者への有効量の免疫複合体の直接投与は、臨床的に有意な効果を有する別の抗癌剤の用量の低減をもたらし得る。このような用量が低減された他の抗癌剤の有効性は、免疫複合体の投与が無い場合には観察され得ない。したがって、本発明は、腫瘍または癌を治療するための方法であって、用量が低減された１つまたは複数の他の抗癌剤を投与することを含む方法を提供する。
【００８８】
さらに、このような治療を必要とする患者に対する免疫複合体を含む併用療法は、標準的な治療計画の期間またはサイクル数と比較して、比較的短い治療回数を可能し得る。したがって、本発明は、腫瘍または癌を治療するための方法であって、比較的短い期間および／またはより少ない治療サイクルで１つまたは複数の他の抗癌剤を投与することを含む方法を提供する。
【００８９】
したがって、本発明によれば、免疫複合体および別の抗癌剤を含む併用療法は、全体的な癌治療の毒性（すなわち、副作用）を低減し得る。例えば、単独療法または別の併用療法と比較した場合に、毒性の低減は、低減された用量の免疫複合体および／または他の抗癌剤を送達する場合、かつ／またはサイクルの期間（すなわち、単回投与の期間または一連のそのような投与の期間）を低減した場合、かつ／またはサイクル数を低減した場合に観察され得る。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明は、肝細胞癌を患っている患者の臨床状態を治療および／または改善するための方法を提供する。したがって、本発明は、（ｉ）肝臓腫瘍サイズ、成長速度、侵襲性、悪性度、および／または再発のリスクを減少させるため、（ｉｉ）治療後の無病期間を延長するため、ならびに（ｉｉｉ）有効量の免疫複合体を患者に投与することにより肝細胞癌の転移の可能性を減少させるため、の方法を提供する。
【００９１】
本発明の免疫複合体を用いた癌治療の臨床転帰は、医師などの関連分野の当業者によって容易に認識される。例えば、癌の臨床マーカーを測定するための標準的な医学的検査は、治療の有効性の強力な指標であり得る。このような試験には、限定されないが、身体検査、性能尺度、疾患マーカー、１２−誘導ＥＣＧ、腫瘍測定、組織生検、細胞検査、細胞診、腫瘍の最長直径の計算、Ｘ線検査、腫瘍のデジタル画像、バイタルサイン、体重、有害事象の記録、感染エピソードの評価、併用薬の評価、痛みの評価、血液または血清化学、血清マーカーの検出、尿検査、ＣＴスキャン、および薬物動態解析が含まれ得る。さらに、免疫複合体および別の抗癌剤を含む併用療法の相乗効果は、単剤療法を受けている患者との比較研究によって決定され得る。
【００９２】
サイクル中に投与される有効量の免疫複合体は、投与の様式に応じて変化する。直接投与（例えば、腫瘍内注射）は、免疫複合体の全身静脈内投与と比較して、はるかに少ない免疫複合体の全身投与量を必要とする。局所投与は、より低い全身用量をもたらし、そのような状況では、結果として低い循環血漿レベルの免疫複合体が期待および希望されることは当業者には明らかであろう。
【００９３】
一実施形態において、免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１０〜３０００、２０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、６０〜５００、７０〜４００、８０〜３００、９０〜２００、または１００〜１５０マイクログラム／腫瘍／日の範囲であり得る。他の実施形態において、この用量は、約１０〜２０、２１〜４０、４１〜８０、８１〜１００、１０１〜１３０、１３１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２８０、２８１〜３５０、３５１〜５００、５０１〜１０００、１００１〜２０００、または２００１〜３０００マイクログラム／腫瘍／日の範囲であり得る。特定の実施形態において、この用量は、少なくとも約２０、４０、８０、１３０、２００、２８０、４００、５００、７５０、１０００、２０００、または３０００マイクログラム／腫瘍／日であり得る。
【００９４】
別の実施形態において、免疫複合体の有効用量は、１００〜５０００、２００〜４０００、３００〜３０００、４００〜２０００、５００〜１０００、６００〜９００、または７００〜１５００マイクログラム／腫瘍／月の範囲であり得る。他の実施形態において、この用量は、約１００〜１９９、２００〜３９９、４００〜６４９、６５０〜９９９、１０００〜１７９９、１８００〜２４９９、２５００〜３４９９、３５００〜４９９９、５０００〜７４９９、７５００〜１００００、または１０００１〜２００００マイクログラム／腫瘍／月の範囲であり得る。特定の実施形態において、この用量は、少なくとも約１００、２００、４００、６５０、１０００、１４００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７５００、１００００、または２００００マイクログラム／腫瘍／月であり得る。
【００９５】
別の実施形態において、免疫複合体の有効用量は、免疫複合体の少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１００、２００、３００、４００、または５００マイクログラム／ｃｍ３の腫瘍内濃度をもたらす。他の実施形態において、結果として生じる免疫複合体の腫瘍内濃度は、約５〜５００、１０〜４００、１５〜３００、２０〜２００、２５〜１００、３０〜９０、３５〜８０、４０〜７０、４５〜６０、または５０〜５５マイクログラム／ｃｍ３である。他の実施形態において、結果として生じる免疫複合体の腫瘍内濃度は、約１０〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、または１００〜２００マイクログラム／ｃｍ３である。
【００９６】
別の実施形態において、免疫複合体の有効用量は、約０.１、１、２.５、５、７.５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０マイクログラム／リットル未満の血漿濃度をもたらす。他の実施形態において、結果として生じる免疫複合体の循環濃度は、約０.１〜５０、１〜４０、２.５〜３０、５〜２０、または７.５〜１０マイクログラム／リットルである。他の実施形態において、結果として生じる免疫複合体の循環濃度は、約０.１〜１、１.１〜２.４、２.５〜５、５.１〜７.４、７.５〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜３０、３１〜４０、または４１〜５０マイクログラム／リットルである。
【００９７】
特定の非限定的な実施形態において、免疫複合体の有効用量は、約１００〜３０００マイクログラム／腫瘍／月、例えば、約１００、２００、３００、４００、７５０、または１０００マイクログラム／腫瘍／月であり、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量は、約１、２、３、４、５、または６ヶ月連続でほぼ毎月投与される。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、４、６または１２ヶ月後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、４、６、または１２ヶ月間隔を開けてもよい。
【００９８】
特定の非限定的な実施形態において、免疫複合体の有効用量は、約２０〜１２４０マイクログラム／腫瘍／日、例えば、約２０、４０、８０、１３０、２００、もしくは２８０マイクログラム／腫瘍／日または約１００、２００、３３０、５００、７００、９３０、１２４０マイクログラム／腫瘍／日であり、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量は、約１、２、３、４、５、６、または７日間連続してほぼ毎日（必要に応じて、１日または複数日省略されてもよい）投与される。このサイクルの後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。
【００９９】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約９００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１０００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１１００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１２００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１３００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１４００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１５００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約２０００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１００】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約１００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約６００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約５００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約４００マイクログラム／日、約１００マイクログラム／日〜約３００マイクログラム／日、または約１００マイクログラム／日〜約２００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０１】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約２００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約２００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約６００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約５００マイクログラム／日、約２００マイクログラム／日〜約４００マイクログラム／日、または約２００マイクログラム／日〜約３００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０２】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約３００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約３００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約６００マイクログラム／日、約３００マイクログラム／日〜約５００マイクログラム／日、または約３００マイクログラム／日〜約４００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０３】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約４００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約４００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日、約４００マイクログラム／日〜約６００マイクログラム／日、または約４００マイクログラム／日〜約５００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０４】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約５００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約５００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、約５００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日、または約５００マイクログラム／日〜約６００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０５】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約６００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約６００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、約６００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日、または約６００マイクログラム／日〜約７００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０６】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約７００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約７００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、約７００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日、または約７００マイクログラム／日〜約８００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０７】
一実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約８００マイクログラム／日〜約２５００マイクログラム／日、約８００マイクログラム〜約２４００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約２３００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約２２００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約２１００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約２０００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１９００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１８００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１７００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１６００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１５００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１４００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１３００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１２００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１１００マイクログラム／日、約８００マイクログラム／日〜約１０００マイクログラム／日、または約８００マイクログラム／日〜約９００マイクログラム／日の範囲であり得る。投与量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、または７０日間、毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。ストックＶＢ４−８４５は、投与に必要な濃度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の滅菌溶液で希釈され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約１００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約６００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約５００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約４００マイクログラム／週、約１００マイクログラム／週〜約３００マイクログラム／週、または約１００マイクログラム／週〜約２００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約２００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約２００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約６００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約５００マイクログラム／週、約２００マイクログラム／週〜約４００マイクログラム／週、または約２００マイクログラム／週〜約３００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約３００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約３００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約６００マイクログラム／週、約３００マイクログラム／週〜約５００マイクログラム／週、または約３００マイクログラム／週〜約４００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約４００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約４００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週、約４００マイクログラム／週〜約６００マイクログラム／週、または約４００マイクログラム／週〜約５００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約５００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約５００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、約５００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週、または約５００マイクログラム／週〜約６００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約６００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約６００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、約６００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週、または約６００マイクログラム／週〜約７００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約７００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約７００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、約７００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週、または約７００マイクログラム／週〜約８００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約８００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約８００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、約８００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週、または約８００マイクログラム／週〜約９００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約９００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約９００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、約９００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週、または約９００マイクログラム／週〜約１０００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、癌部位でのＶＢ４−８４５免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１０００マイクログラム／週〜約５０００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム〜約４５００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約４０００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約３５００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約３０００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約２５００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約２０００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１８００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１７００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１６００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１５００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１４００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１３００マイクログラム／週、約１０００マイクログラム／週〜約１２００マイクログラム／週、または約１０００マイクログラム／週〜約１１００マイクログラム／週の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単回用量は１週間で投与され得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、例えば、週に２用量、３用量、４用量、または５用量を投与され得る。投与サイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の投与を含み得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてもよい。
【０１１８】
注入量は、好ましくは、腫瘍の種類および／または場所に適する少なくとも有効量である。単回用量の最大注入量は、腫瘍体積の約２５％〜７５％、例えば、推定標的腫瘍体積の４分の１、３分の１、または４分の３であり得る。特定の非限定的な実施形態において、単回用量の最大注入量は、腫瘍容積の約３０％である。
【０１１９】
別の実施形態において、免疫複合体は、安全性試験で確立された最大耐量以下で、サイクルあたり総用量で腫瘍内に投与されるが、投与量は腫瘍容積に関して標準化される。例えば、対象は、腫瘍１ｃｍ３あたり１マイクログラム〜５００マイクログラム、または腫瘍組織１ｃｍ３あたり約１４ピコモル〜７ナノモルに達するのに十分な用量を受け取る。用量は、腫瘍容積の約２０〜５０％を超えない量で投与される。免疫複合体は、適切な塩溶液中に希釈される。例えば、３ｃｍ３推定容積の腫瘍、１４ピコモル（１ｃｍ３あたり１マイクログラム）の標的用量、および腫瘍の約１／３の最大注入相対量については、３マイクログラムの免疫複合体が約１ｍｌの希釈液に希釈される。
【０１２０】
別の特定の実施形態において、免疫複合体の有効用量は、約２０〜３００マイクログラム／腫瘍／日、例えば、約２０、４０、８０、１３０、２００、または２８０マイクログラム／腫瘍／日であり、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量の最大注入量は、腫瘍体積の約２５％〜７５％、例えば、推定標的腫瘍体積の約４分の１、３分の１、または４分の３であり得る。単回用量は、約５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１日間連続して一日おきに投与される。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間隔を開けてよい。
【０１２１】
１つの特定の非限定的な実施形態において、ＶＢ４−８４５などの免疫複合体は、約２８０マイクログラム／腫瘍／日の用量で投与され、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量の最大注入量は、推定標的腫瘍容積の約３分の１である。単回用量は、約５日間連続して毎日投与される。このサイクル後、次のサイクルは約１ヶ月後、好ましくは最初のサイクルの最初の日から１ヶ月目に開始され得る。治療計画は３サイクルを含み、各サイクルは、無治療の約１週の間隔を開けてもよい。
【０１２２】
別の特定の非限定的な実施形態において、ＶＢ４−８４５などの免疫複合体は、約２８０マイクログラム／腫瘍／日の用量で投与され、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量の最大注入量は、推定標的腫瘍容積の約３分の１である。単回用量は、約１週間、一日おきに投与される。このサイクル後、次のサイクルは、約１週間後に開始され得る。治療計画は３サイクルを含み、各サイクルは約１週間隔を開けてもよい。
【０１２３】
さらに別の特定の実施形態において、ＶＢ４−８４５などの免疫複合体は、約２８０マイクログラム／腫瘍／日の用量で投与され、患者は１日あたりの単回用量を投与される。単回用量の最大注入量は、推定標的腫瘍容積の約３分の１である。単回用量は、約３週間、一日おきに投与される。このサイクル後、次のサイクルは、約１週間後に開始され得る。治療計画は３サイクルを含み、各サイクルは約１週間隔を開けてもよい。
【０１２４】
腹腔などの空洞への投与については、免疫複合体の有効用量は、５０ｍｌに約１００〜２０００マイクログラム／週、例えば、５０ｍｌに約１００、２００、３３５、５００、７００、９３０、１２４０マイクログラム／週であり、患者は１週あたりの単回用量を投与され、腫瘍組織は、少なくとも約３０分間、免疫複合体に暴露される。例えば、溶液は約３０分〜３時間腔内に保持される。特定の非限定的な実施形態において、腫瘍組織は、約１時間以上、より好ましくは、約２時間、免疫複合体に曝露される。このサイクル後、次のサイクルは、前回投与後約１、２、４、６、または１２週目に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、４、６、または１２ヶ月間隔を開けてもよい。
【０１２５】
免疫複合体の投与量はまた、癌細胞上のタンパク質の結合部位のモル濃度として表すこともできる。例えば、免疫複合体ＶＢ４−８４５は、約６９.７ｋＤａの分子量、およびＥｐ−ＣＡＭの１つの結合部位を有する。二価フォーマット、Ｆａｂ、Ｆａｂ１'または（Ｆａｂ１'）２断片などの他の免疫複合体形式が、ポリペプチド鎖（複数可）の中のアミノ酸の数によって異なる分子量を有し得ることは知られている。また、同様の形式のために、糖部分などのポリペプチドまたはポリエチレングリコールに追加の基を結合することによって分子量を変化させることができることも知られている。別の毒素または毒素の異なる変異体の使用はまた、実施例で使用したＶＢ４−８４５とは異なる分子量を有する免疫複合体をもたらし得る。さらに、より長いまたはより短い断片をもたらすポリペプチド鎖への変更は、癌細胞上の選択されたタンパク質への免疫複合体の結合を失うことなく行うこともできる。全てのこれらの変形は、本出願において企図される。結果として、癌細胞上のタンパク質の結合部位のモル数に関して免疫複合体の投与量を示すことは、有用であり得る。実施例および様々な実施形態において、投与量は、マイクログラムで表され、ＶＢ４−８４５の分子量に基づく。
【０１２６】
サイクルの間に免疫複合体と共に投与される別の抗癌剤の有効用量も、投与の様式に応じて変化する。１つまたは複数の抗癌剤は、腫瘍内に、または他の投与様式によって送達されてもよい。典型的には、化学療法剤は全身に投与される。標準的な投与量および治療計画は当技術分野で公知である（例えば、メルクインデックスの最新版および医師用卓上参考書を参照されたい）。
【０１２７】
例えば、一実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜４０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でダカルバジンを含む。好ましい実施形態において、用量は、７００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲である。
【０１２８】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２５〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でフルダラビンを含む。
【０１２９】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜２０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシトシンアラビノシド（Ａrａ−Ｃ）を含む。
【０１３０】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１.５〜７.５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でドセタキセルを含む。
【０１３１】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜１５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でパクリタキセルを含む。
【０１３２】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でシスプラチンを含む。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１４ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で５−フルオロウラシルを含む。抗癌剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または３０日間連続して毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは、約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。いくつかの実施形態において、５−ＦＵは、前の治療コースの最後の日から３０日ごとに、最初のサイクルの投薬を繰り返すメンテナンス療法の中に含まれてよい。
【０１３４】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜８ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でドキソルビシンを含む。
【０１３５】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約４０〜１６０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でエピポドフィロトキシンを含む。
【０１３６】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５０〜２００ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でシクロホスファミドを含む。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、または１２５〜１５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でイリノテカンを含む。
【０１３８】
さらに別の実施形態において、抗癌剤は、約３.７〜５.４、５.５〜７.４、７.５〜１１、または１１〜１８.５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンブラスチンを含む。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.７〜１.４、または１.５〜２ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンクリスチンを含む。
【０１４０】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約３.３〜５、５〜１０、１０〜１００、または１００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でメトトレキサートを含む。
【０１４１】
上述の実施形態において、抗癌剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日間連続して毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてもよい。
【０１４２】
免疫複合体との併用療法は、追加の抗癌剤の投与に対して癌または腫瘍を感作させ得る。したがって、本発明は、癌の予防、治療、および／または癌の再発の予防のための併用療法であって、用量が低減された抗癌剤の前、その後、またはそれと同時に有効量の免疫複合体を投与することを含む併用療法を企図する。例えば、免疫複合体により初期治療は、抗癌剤の投与によるその後の負荷に対する癌または腫瘍の感受性を増大できる。抗癌剤が単独で、または免疫複合体の不存在下で投与される場合には、この用量は標準的な投与量下限に近いか、またはそれ未満である。同時に投与される場合は、免疫複合体は抗癌剤とは別に投与され、かつ必要に応じて、異なる投与様式により投与されてもよい。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、以下のＶＢ４−８４５および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の組み合わせが投与され得る：
2016526009.tif 000002
ＶＢ４−８４５および５−ＦＵの組み合せは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日間連続して毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは、約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、以下のＶＢ４−８４５および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の組み合わせが投与され得る：
2016526009.tif 000003
ＶＢ４−８４５および５−ＦＵの組み合せは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日間連続して毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは、約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてよい。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、以下のＶＢ４−８４５および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の組み合わせが投与され得る：
2016526009.tif 000004
ＶＢ４−８４５および５−ＦＵの組み合せは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日間連続して毎日投与され得る。このサイクル後、次のサイクルは、約１、２、３、４、５、または６週後に開始され得る。治療計画は、１、２、３、４、５、または６サイクルを含み、各サイクルは、約１、２、３、４、５、または６週間隔を開けてよい。
【０１４６】
したがって、一実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜１０、１１〜２０、２１〜４０、または４１〜７５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシスプラチン、例えば、プラチノールまたはプラチノール−ＡＱ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ社）を含む。
【０１４７】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜３、４〜８、９〜１６、１７〜３５、または３６〜７５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でカルボプラチン、例えば、パラプラチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ社）を含む。
【０１４８】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.２５〜０.５、０.６〜０.９、１〜２、３〜５、６〜１０、１１〜２０、または２１〜４０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でシクロホスファミド、例えば、シトキサン（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）を含む。
【０１４９】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.５〜１、２〜４、５〜１０、１１〜２５、２６〜５０、または５１〜１００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシタラビン、例えば、サイトサール（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社）を含む。別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、シタラビンリポソーム、例えば、デポサイト（ＤＥＰＯＣＹＴ）（Ｃｈｉｒｏｎ社）を含む。
【０１５０】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１５〜２５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲または約０.２〜２ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、ダカルバジン、例えば、ＤＴＩＣまたはＤＴＩＣＤＯＭＥ（Ｂａｙｅｒ社）を含む。
【０１５１】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.１〜０.２、０.３〜０.４、０.５〜０．８、または０．９〜１．５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でトポテカン、例えば、ハイカムチン（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社）を含む。
【０１５２】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜９、１０〜２５、または２６〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でイリノテカン、例えば、カンプトサール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社）を含む。
【０１５３】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２.５〜５、６〜１０、１１〜１５、または１６〜２５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でフルダラビン、例えば、フルダラ（Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を含む。
【０１５４】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜２０００ｍｇ／ｍ２／サイクル、３００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクル、４００〜８００ｍｇ／ｍ２／サイクル、または５００〜７００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含む。
【０１５５】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、６〜１０、１１〜３０、または３１〜６０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でドセタキセル、例えば、タキソテール（Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ社）を含む。
【０１５６】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１０〜２０、２１〜４０、４１〜７０、または７１〜１３５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でパクリタキセル、例えば、タキソール（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）を含む。
【０１５７】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.５〜５ｍｇ／ｋｇ／サイクル、１〜４ｍｇ／ｋｇ／サイクル、または２〜３ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、５−フルオロウラシルを含む。
【０１５８】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜４、５〜８、９〜１５、１６〜３０、または３１〜６０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でドキソルビシン、例えば、アドリアマイシン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社）、ドキシル（Ａｌｚａ社）、ルベックス（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）を含む。
【０１５９】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約３.５〜７、８〜１５、１６〜２５、または２６〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でエトポシド、例えば、ベペシド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社）を含む。
【０１６０】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.３〜０.５、０.６〜０.９、１〜２、または３〜３.６ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンブラスチン、例えば、ベルバン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）を含む。
【０１６１】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６または０.７ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンクリスチン、例えば、オンコビン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）を含む。
【０１６２】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０.２〜０.９、１〜５、６〜１０、または１１〜２０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でメトトレキサートを含む。
【０１６３】
別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、リツキサン、リツキシマブ、キャンパス−１、ゲムツズマブ、およびトラツズマブを含む少なくとも１つの他の免疫治療薬と組み合わせて投与される。
【０１６４】
別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、アンジオスタチン、サリドマイド、クリングル５、エンドスタチン、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）、抗トロンビン、フィブロネクチンの２９ｋＤａのＮ末端および４０ｋＤａのＣ末端タンパク質分解断片、プロラクチンの１６ｋＤａのタンパク質分解断片、血小板因子−４の７.８ｋＤａのタンパク質分解断片、血小板因子−４の断片に対応する１３アミノ酸ペプチド、コラーゲンＩの断片に対応する１４アミノ酸ペプチド、トロンボスポンジンＩの断片に対応する１９アミノ酸ペプチド、ＳＰＡＲＣの断片に対応する２０アミノ酸ペプチド、およびその変異体を含み、その薬学的に許容される塩を含む１つまたは複数の抗血管新生剤と組み合わせて投与される。
【０１６５】
別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子様サイトカイン、リンホトキシン、インターフェロン、マクロファージ炎症性タンパク質、顆粒球単球コロニー刺激因子、インターロイキン（限定されないが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８を含む）、およびその変異体を含み、その薬学的に許容される塩を含む１つまたは複数のサイトカインと組み合わせて投与される。
【０１６６】
さらに別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、自己細胞または組織、非自己細胞または組織、癌胎児性抗原、アルファ−フェトプロテイン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＢＣＧ生ワクチン、メラニン細胞系統タンパク質、および腫瘍特異的変異抗原
を含む癌ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１６７】
さらに別の実施形態において、免疫複合体は、ホルモン療法と関連して投与される。ホルモン治療薬には、限定されないが、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、タモキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ））、およびステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）が含まれる。
【０１６８】
さらに別の実施形態において、免疫複合体は、癌を治療または予防するための遺伝子治療プログラムと関連して投与される。
【０１６９】
さらに別の実施形態において、Ｅｐ−ＣＡＭ標的免疫複合体は、興味の腫瘍細胞においてＥｐ−ＣＡＭ発現を増加させる１つまたは複数の薬剤と組み合わせて投与される。Ｅｐ−ＣＡＭの発現は、好ましくは、より多数のＥｐ−ＣＡＭ分子が腫瘍細胞表面上に発現するように増加される。例えば、この薬剤は、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原エンドサイトーシスの通常のサイクルを阻害し得る。このような併用治療は、単独で、または他の抗癌剤もしくは放射線療法と共にＥｐ−ＣＡＭ標的免疫複合体の臨床的有効性を改善し得る。特定の非限定的な実施形態において、腫瘍細胞内でＥｐ−ＣＡＭ発現を増加させる薬剤は、酒石酸ビノレルビン（ナベルビン）および／またはパクリタキセル（タキソール）である。
【０１７０】
したがって、併用療法は、投与される免疫複合体および／もしくは追加の抗癌剤に対する癌または腫瘍の感受性を増大させ得る。このように、より短い治療サイクルが可能になることにより、毒性事象を減少させることができる。したがって、本発明は癌を治療または予防するための方法であって、短い治療サイクルの間、有効量の免疫複合体および少なくとも１つの他の抗癌剤を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。サイクル期間は、約１〜３０、２〜２７、３〜１５、４〜１２、５〜９、または６〜８日の範囲であり得る。サイクル期間は、使用する特定の抗癌剤に応じて変化してよい。本発明はまた、連続もしくは不連続投与、またはいくつかの部分投与に分割した１日用量も企図する。特定の抗癌剤のための適切なサイクル期間は当業者によって理解され、本発明は、各抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を企図する。当業者のための具体的な指針は、当技術分野で公知である。
【０１７１】
あるいは、より長い治療サイクルが望ましい場合がある。したがって、サイクル期間は、約１０〜５６、１２〜４８、１４〜２８、１６〜２４、または１８〜２０日の範囲であり得る。サイクル期間は、使用する特定の抗癌剤に応じて変化してよい。
【０１７２】
本発明は、単一の抗癌剤または一連の薬剤が投与される間、少なくとも１サイクル、好ましくは複数のサイクルを企図する。適切な全サイクル数、およびサイクル間の間隔は、当業者によって理解されるであろう。サイクル数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１サイクルであってよい。サイクル間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日であってよい。本発明は、それぞれの免疫複合体および追加の抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を企図する。
【０１７３】
本発明の非限定的な一実施形態において、免疫複合体は、より短い期間、高用量（例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、または１０００マイクログラム／ｃｍ３より高くなる用量）で直接投与される。したがって、１つの非限定的な、具体的な実施態様において、免疫複合体は、少なくとも約２００、３００、４００、または５００マイクログラム／ｃｍ３の免疫複合体の腫瘍内濃度をもたらす用量で週に１回、２週間腫瘍内に投与される。
【０１７４】
本発明による免疫複合体は、医薬組成物または医薬品に含まれ得る。直接投与に適合する医薬組成物には、限定されないが、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性の滅菌注射溶液または水性もしくは非水性の懸濁液が含まれ、この組成物を意図されるレシピエントの血液と実質的に等張にさせる抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質をさらに含んでもよい。そのような組成物中に存在し得る他の成分には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。即席の注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製できる。免疫複合体は、例えば、限定されないが、患者への投与の前に滅菌水または生理食塩水で再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。適切な薬学的に許容される担体には、医薬組成物の生物活性の有効性を妨げない本質的に化学的に不活性かつ非毒性の組成物が含まれる。好適な医薬担体の例としては、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。このような組成物は、患者への直接投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、治療有効量の化合物を含まなければならない。
【０１７６】
別の実施形態において、医薬組成物は、必要に応じて、薬学的に許容される担体中に、免疫複合体および１つまたは複数の追加の抗癌剤を含む。
【０１７７】
本組成物は、限定されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離カルボキシル基で形成されるものを含む薬学的に許容される塩の形態であり得る。
【０１７８】
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、例えば、手術中の局所注入、（例えば、外科手術後の創傷包帯と併せた）局所適用、注射、カテーテルの手段、坐薬の手段、またはインプラントの手段によって腫瘍（複数可）の領域に直接投与される。インプラントは、シラスティック膜、または繊維などの膜を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料であり得る。坐剤は、一般的に、０.５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含む。
【０１７９】
他の実施形態において、放出制御システムを標的腫瘍の近傍に配置できる。例えば、マイクロポンプで腫瘍の領域に制御された用量を直接送達することにより、医薬組成物のタイミングおよび濃度を細かく調節できる。
【０１８０】
本発明の一態様によれば、免疫複合体および／または他の抗癌剤は、直接投与によって患者に送達される。したがって、免疫複合体および／または他の抗癌剤は、限定されないが、腫瘍への１回または複数回の直接注射によって、腫瘍への連続的または不連続な灌流によって、免疫複合体の貯蔵庫の導入により、腫瘍への徐放器具の導入により、腫瘍への徐放製剤の導入により、および／または腫瘍への直接適用により投与され得る。腫瘍内への投与様式により、腫瘍の領域、または腫瘍の領域に実質的に直接流入する血管もしくはリンパ管への免疫複合体および／または他の抗癌剤の導入も企図される。それぞれの場合において、医薬組成物は、少なくともエンドポイントを達成するのに十分な量で投与され、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含む。
【０１８１】
免疫複合体は腫瘍内に投与され得るが、任意の他の抗癌剤は、他の投与様式（例えば、静脈内）によって患者に送達され得ることが企図される。さらに、多数の抗癌剤が患者に送達されることが意図される場合は、免疫複合体および他の抗癌剤のうちの１つまたは複数は腫瘍内に送達され得るが、他の抗癌剤は他の投与様式（例えば、静脈内および経口）によって送達され得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、薬学的担体は、限定されないが、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤、希釈剤、香料、着色剤、潤滑剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤、甘味料、共役リノール酸（ＣＬＡ）、ゼラチン、ミツロウ、精製水、グリセリン、または限定されないが、魚油もしくは大豆油を含む任意の種類の油などを含み得る。ペプチド／化合物の医薬組成物はまた、適切な固相もしくはゲル相の担体または固相もしくはゲル相の賦形剤も含み得る。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明の免疫複合体は、それらが活性である任意の経路によって従来の方法で投与できる。投与は、全身、局所、または経口投与であり得る。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、口腔内、もしくは眼内の経路、または膣内投与、吸入によって、デポー注射によって、またはインプラントによって投与され得るが、これらに限定されない。したがって、本発明のペプチド／化合物のための（単独、または他の医薬品と組み合わせた）投与形態は、舌下、（皮下または筋肉内に注射される短期作用型、デポー、インプラントおよびペレットの形態を含む）注射、または膣クリーム、坐剤、ペッサリー、膣リング、直腸坐剤、子宮内デバイス、ならびにパッチおよびクリームなどの経皮形態の使用によるものであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫複合体の投与は、癌部位への直接投与であり得る。
【０１８４】
経口投与の場合には、免疫複合体は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体とこれらの免疫複合体を組み合わせることによって容易に製剤化できる。このような担体は、本発明の免疫複合体が、治療される患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などとして製剤化されるのを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、必要に応じて、錠剤または糖衣錠コアを得るために、適切な助剤を添加した後に、固体賦形剤を添加し、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理することにより取得できる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含むが、これらに限定されない糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物が含まれるが、これらに限定されない。所望の場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤が添加され得るが、これらに限定されない。
【０１８５】
糖衣錠コアは、適切なコーティングで提供され得る。この目的のために、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液が使用され得る。染料または色素は、識別のために錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得るか、または活性ペプチド／化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために添加され得る。
【０１８６】
経口使用できる医薬品には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどのゼラチンおよび可塑剤で作られた密封軟カプセル剤が含まれるが、これらに限定されない。押し込み型カプセルは、例えば、ラクトースなどの充填剤、例えば、デンプンなどの結合剤、および／または、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに必要に応じて、安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセルでは、活性ペプチド／化合物は、脂肪油、液体パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与用の全ての製剤は、このような投与に適した投与量でなければならない。
【０１８７】
口腔投与の場合には、本組成物は、例えば、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
【０１８８】
吸入による投与の場合には、本発明に従って使用するための組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの提示形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定できる。ペプチド／化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤を含む、例えば、吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化できる。
【０１８９】
本発明の組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物にも製剤化できる。
【０１９０】
前述の製剤に加えて、本発明の組成物はまた、デポー製剤としても製剤化できる。このような長期作用製剤は、移植によって（例えば、皮下もしくは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与できる。
【０１９１】
デポー注射は、約１〜約６ヶ月またはそれより長い間隔で投与できる。したがって、例えば、ペプチド／化合物は、（例えば、許容される油中のエマルジョンとしての）適切なポリマーまたは疎水性材料もしくはイオン交換樹脂で、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化できる。
【０１９２】
経皮投与では、本発明の組成物は、例えば、石膏に適用できるか、または結果として生物に供給される経皮治療システムによって適用できる。
【０１９３】
本発明の組成物はまた、例えば、アジュバント、プロテアーゼ阻害剤、または他の適合性の薬剤もしくは化合物などの他の有効成分と組み合わせて投与でき、そのような組み合わせが、本明細書に記載の方法の所望の効果を達成するのに望ましいまたは有利であると考えられる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、崩壊剤成分は、クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、食物の酸性およびアルカリ性炭酸成分に基づく発泡系、クレー、タルク、デンプン、アルファ化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、セルロースフロック、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸カルシウム、金属炭酸塩、重炭酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、またはリン酸カルシウムのうちの１つまたは複数を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、希釈剤成分は、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、ソルビトール、キシリトール、粉末セルロース、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、リン酸カルシウム、金属炭酸塩、金属酸化物、または金属アルミノケイ酸塩のうちの１つまたは複数を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、任意の潤滑剤成分は、存在する場合、ステアリン酸、金属ステアレート、ステアリルフマル酸ナトリウム、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ベヘン酸グリセリル、鉱物油、植物油、パラフィン、ロイシン、シリカ、ケイ酸、タルク、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリエトキシル化ステロール、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエトキシル化植物油、または塩化ナトリウムのうちの１つまたは複数を含む。
【実施例】
【０１９７】
実施例１：ＶＢ４−８４５の構築
ＶＢ４−８４５は、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ ２５２−６０８）の切断型に融合されている一本鎖Ｆｖ組換えヒト抗体断片で構成された免疫複合体である。この抗体断片は、Ｅｐ−ＣＡＭに特異的に結合するヒト化ＭＯＣ３１一本鎖抗体断片の４Ｄ５ＭＯＣＢに由来する。
【０１９８】
外毒素Ａは、緑膿菌の病原性株によって放出される毒性タンパク質の１種である。外毒素Ａは、６６，０００ダルトンの分子量を有するプロ酵素として分泌される。外毒素Ａは感受性哺乳動物細胞内に移行し、分子の共有改変により酵素的に活性化される。シュードモナス外毒素Ａは、ジフタミドと呼ばれる伸長因子−２の翻訳後修飾されたヒスチジン残基をアデノシン二リン酸−リボシル化することにより細胞内でタンパク質合成を不可逆的に阻止し、アポトーシスを誘導する。この構築物に使用されるＥＴＡの切断型は、細胞死を誘導するドメインを依然として含むが、細胞結合ドメインを欠いており、それによって、免疫複合体の抗体部分による標的化を欠く細胞にＥＴＡ部分が入るのを阻止する。
【０１９９】
ＥＴＡ（ＥＴＡ２５２−６０８）の切断型をコードする遺伝子配列、およびＥｐ−ＣＡＭに結合する４Ｄ５ＭＯＣＢのｓｃＦｖ配列を用いて、ＶＢ４−８４５を構築した。分子は、図１に示すように、精製のためにＮ末端およびＣ末端の両方にＨｉｓ６テールを含む。ＶＢ４−８４５のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２ならびに配列番号３および２に示す。Ｅｐ−ＣＡＭ結合部分を図２に示す。ＣＤＲ配列を配列番号４〜９に示す。
【０２００】
得られたタンパク質は、Ｅｐ−ＣＡＭに対する親４Ｄ５ＭＯＣＢの特異性を保持する。タンパク質用の発現ベクターｐＩＮＧ３３０２（Ｘｏｍａ Ｉｒｅｌａｎｄ社のプラスミドｐＩＮＧ３３０２を発現ベクターの構築のために使用した）は、Ｅ１０４大腸菌宿主株によって保有および発現される。このタンパク質は、６４８アミノ酸長であり、６９.７キロダルトン（ｋＤａ）の予測分子量を有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析では、ＶＢ４−８４５は約７０ｋＤａの単一タンパク質バンドとして観察される。このタンパク質は、約５.９の等電点（ｐＩ）を有し、水溶性で、透明な溶液を形成する。
【０２０１】
実施例２：投与量および製剤
ＶＢ４−８４５は、新生薬剤として研究されており、腫瘍細胞株への結合に有効であり、いくつかのモデル系において腫瘍の増殖を防止するのに有効であることが見出された。ＶＢ４−８４５は、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に１ｍｇ／ｍｌで製剤化され、２２ゲージ針を用いて腫瘍内経路によって投与できる。ＶＢ４−８４５は、灰色のブチル栓およびアルミニウムのオーバーシールで閉じられた１ｍｌのホウケイ酸ガラスバイアルにパッケージされる。現在、２つのフィルサイズが利用できる：０.１および０.２ｍＬ（それぞれ０.１ｍｇおよび０.２ｍｇのＶＢ４−８４５）。この薬物は−７０℃で保存される。最終生成物は保存されず、使い捨てである。
【０２０２】
実施例３：ＶＢ４−８４５の安定性
試料生成物は、記入および承認された標準操作手順に従って標識、貯蔵、および出荷される。生成物は凍結状態（例えば、ドライアイス上）で出荷され、温度が定期的に監視され、アクセスが限られている制御された−７０℃のフリーザーの中で研究場所にて維持され得る。この生成物は、使用時までこの状態で維持され得る。
【０２０３】
−７０℃で保存される場合、生成物の貯蔵寿命は少なくとも６ヶ月である。生理的条件下（例えば、３７℃で４時間、ＰＢＳ中での薬品のインキュベーション）で、免疫複合体分子の大部分（少なくとも９１％）は、依然として適切な分子量（約７０ｋＤａ）の単量体として溶出される。ＶＢ４−８４５の量は、ゆっくりと時間とともに減少し、３７℃で２０時間後、初期タンパク質の約４７％以上が単量体型で存在する。同様の結果が、ヒト血清中の９９ｍＴｃ標識ＶＢ４−８４５のインキュベーション時に得られ、さらにインビボアプリケーションのための免疫複合体の適合性を裏付ける。
【０２０４】
短期安定性研究を行い、臨床現場で日常的取り扱いの下で治験薬の固有の安定性を評価した。その標準製剤中のＶＢ４−８４５を室温および２〜８℃で評価した。さらに、ＶＢ４−８４５を、８００ｍＭの尿素を含む場合と含まない場合のリン酸緩衝生理食塩水の注入緩衝液で調製し、室温で６時間まで試験した。短期安定性研究はまた、ＶＢ４−８４５に対する凍結融解サイクルの繰り返しの影響も評価した。
【０２０５】
ＶＢ４−８４５は、全ての短期安定性研究の間にその生物活性を保持することが見出された。ＶＢ４−８４５は、投与日に−７０℃の冷凍庫から取り出され、室温で解凍され得る。ＶＢ４−８４５は、−７０℃の貯蔵条件から取り出された後４〜６時間で注入緩衝液中に調製され得る。この生成物は、リン酸緩衝生理食塩水の注入緩衝液中で製剤化されると、調製後６時間以内に患者に注入され得る。この生成物が適切な時間内に使用できない場合は、新しいバイアルが投薬の全リストから取得され得る。
【０２０６】
ＶＢ４−８４５は、室温では少なくとも２０時間、冷蔵保存（例えば、２〜８℃）では少なくとも２４時間、元のパッケージ内で安定している。生成物が使用されない場合、特に元の容器／閉鎖系が無傷である場合には、後の使用のために再凍結できる。
【０２０７】
ヒトの血漿、血清および尿を含む生体液中での短期安定性試験（最大１６時間のインキュベーション時間）により、ＶＢ４−８４５がその結合特性および細胞毒性を少なくとも１６時間保持することが実証された。
【０２０８】
実施例４：生体内分布
一般的に文献には、ｓｃＦｖが、動物モデルにおいて循環から急速にクリアされ、早期の時点で高い腫瘍対バックグラウンド比（腫瘍塊内の特定の保持率）を与えると示されている。Ｔ１／２は平均で２〜４時間であるが、分子の構造および投与経路に依存してより長く（＞８時間）なり得る。最高の取り込みは、分子に依存して、全身注入後に腎臓および肝臓で生じる傾向にある。
【０２０９】
ＶＢ４−８４５の体内分布を、樹立したＥｐ−ＣＡＭ陽性ＳＷ２およびＥｐ−ＣＡＭ陰性ＣＯＬＯ３２０異種移植片を反対側面に有するマウスで評価した。ＳＷ２腫瘍で検出された放射性標識ＶＢ４−８４５の最大用量は、４時間後に２.９３％ＩＤ／ｇであり、その後、２４および４８時間後にそれぞれ、１.９５％ＩＤ／ｇおよび１.１３％ＩＤ／ｇまで徐々に減少した。対照的に、ＣＯＬＯ３２０対照腫瘍におけるＶＢ４−８４５は、３０分後に１.６５％ＩＤ／ｇの最大用量で局在化しており、次いで、４時間後には１.０６％ＩＤ／ｇまで急速に減少し、４８時間後にはバックグラウンドレベルのみを示した。
【０２１０】
ＶＢ４−８４５は、親ｓｃＦｖよりも遅い血液クリアランスを示した。２４時間後、血液中のＶＢ４−８４５の総用量は０.４２％ＩＤ／ｇであり、親のｓｃＦｖ（０.２８％ＩＤ／ｇ）を１.５倍上回っていた。さらに、ＳＷ２腫瘍における免疫複合体の局在化はまた、親ｓｃＦｖに比べて遅れており、ＶＢ４−８４５の分布は４８時間後に５.３８の腫瘍血液比を示し、２４時間後にｓｃＦｖで得られた比率に匹敵していた。各時点で、ＶＢ４−８４５は、ＣＯＬＯ３２０対照腫瘍と比較してＥｐ−ＣＡＭ陽性ＳＷ２腫瘍に優先的に蓄積し、ＳＷ２：ＣＯＬＯ３２０比は１.２８〜２.９５で変化する。これは、ＶＢ４−８４５が、特定の抗体−抗原相互作用および細胞内取り込みにより、Ｅｐ−ＣＡＭ陽性腫瘍内に保持されたことを示す。ＣＯＬＯ３２０対照腫瘍におけるわずかな蓄積は、腫瘍で見られる場合が多い血管透過性の増加に起因し得る。これらの動物における正常組織の分析により、ＶＢ４−８４５が腎臓、脾臓、肝臓に局在し、より低い程度で骨に局在することも示された。
【０２１１】
マウスモデルにおける薬物動態および有効性の分析中に行った臨床観察は、毒性を示す臨床徴候はなく、生成物が十分に耐容性であることを示す。全ての動物は、研究の間生きており、薬剤関連死はなかった。
【０２１２】
実施例５：ＶＢ４−８４５の調製
ＶＢ４−８４５（４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡとも呼ばれる）発現ベクターの構築
ＥＴＡ（ＥＴＡ２５２−６０８）の切断型をコードする配列を、プラスミドｐＳＷ２００からＰＣＲにより増幅し、ｐＩＧ６ベース４Ｄ５ＭＯＣＢ ｓｃＦｖ発現ベクターに存在するＥｐ−ＣＡＭ結合４Ｄ５ＭＯＣＢ ｓｃＦｖ配列の下流に１１６４塩基対のＥＣｏＲＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ断片としてクローニングした。プライマー（Ｔｏｘ１：ＣＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＡＧＴＴＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＡ（配列番号１０）；Ｔｏｘ２：ＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧ（配列番号１１）を、ｓｃＦｖと毒素とＣ末端ヘキサヒスチジンタグの間のＥＣｏＲＩ制限部位に導入し、その後に、小胞体（ＥＲ）保持シグナルＫＤＥＬ、終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が続く。ＩＭＡＣにおける純度および収率を改善するために、第２のヘキサヒスチジンタグを、ペリプラズムシグナル配列と４Ｄ５ＭＯＣＢコード領域の間のＮ末端に付加した。この目的のために、２つのオリゴヌクレオチド対（ＸＢａｌ  ５'：ＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧ−ＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴ（配列番号１２）；ＸＢａｌ  ３'：ＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴ（配列番号１３）；およびＥｃｏＲＶ ５'：ＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴ（配列番号１４）；ＥｃｏＲＶ ３'：ＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴ（配列番号１５）を８０℃まで加熱し、徐々に室温まで冷却することによりアニーリングさせ、次いで、ｐＩＧ６−４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡＨ６ＫＤＥＬのＸbａｌとＥｃｏＲＶの間の部位にライゲーションした。配列を実験で確認した。
【０２１３】
ＶＢ４−８４５のペリプラズム発現については、ペリプラズムプロテアーゼＨｈｏＡおよびＨｈｏＢを欠く大腸菌株ＳＢ５３６のｌａｃプロモーター制御下に遺伝子を配置しているベクターｐＩＧ６を用いた。アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含む５ｍｌの２ＹＴ培地にＶＢ４−８４５（４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡ）発現プラスミドを含む単一細菌コロニーを接種し、２５℃で一晩増殖させた。０.５％グルコースおよびアンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）を補充した２ＹＴ培地１リットルで細菌を希釈し、Ａ５５０ｎｍが０.１〜０.２に到達すると、３リットルのバッフル付き振盪フラスコに移した。Ａ５５０ｎｍが０.５になるまで、培養物をさらに２５℃で増殖させ、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ＳＩｇｍａ社）を添加することにより、免疫複合体産生を４時間誘導した。最終のＡ５５０ｎｍが６である細菌培養物由来の収集ペレットを−８０℃で保存した。
【０２１４】
精製については、１リットルの培養物から得られたペレットを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含み、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、マンハイム、ドイツ）およびＤＮアーゼＩを補った２５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液をフレンチ圧力セルプレス（ＳＬＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アーバナ）で、２サイクルで溶解し、４℃で３０分間、ＳＳ−３４ローター中で４８，０００×ｇで遠心分離し、その後、濾過滅菌した。透明な上清に存在する免疫複合体を、直列に接続されたＮｉ２＋−イミノ二酢酸（ＩＤＡ）カラムとＨＱ／Ｍ−陰イオン交換カラムを有するＢＩＯＣＡＤ−システム（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、記載されるようにクロマグラフィーにより精製した。溶解液を添加する前に、Ｎｉ２＋−ＩＤＡカラムを２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。添加後、全て２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７.５）で緩衝化した異なる塩溶液（順に３００ｍＭ、５１０ｍＭ、９０ｍＭのＮａＣｌ）で３回カラムを洗浄した。その後、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７.５）、１０ｍＭ  イミダゾール、９０ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを洗浄し、結合した免疫複合体を２００ｍＭ  イミダゾール（ｐＨ７.５）を含む同じ溶液で溶出した。
【０２１５】
溶出液をＨＱ／Ｍ−イオン交換カラムに直接添加し、結合した免疫複合体を２０ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）で緩衝化した９０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ塩勾配で溶出した。４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡを含む画分を収集し、４℃で２０００×ｇの遠心分離によって１０ｋＤａのカットオフフィルター（ウルトラフリ−ＭＣ低タンパク質結合、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。精製したＶＢ４−８４５（４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡ）の品質を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよび製造業者の推奨に従って１：５０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗テトラヒスチジン抗体（ＱＩＡＧＥＮ社、ヒルデン、ドイツ）を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。
【０２１６】
分析用ゲル濾過および熱安定性の決定
精製したＶＢ４−８４５（４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡ）の１０マイクログラムを、０.００５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む５０ｍｌ  ＰＢＳ ｐＨ７.４に希釈し、その後、３７℃でインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２ ＰＣ３.２／３０カラムを有するスマートシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ウプサラ）を用いたゲルろ過によって異なる時点（０時間、２時間、４時間、８時間、１０時間および２０時間後）で試料を分析した。カラムを、３種類のタンパク質標準物質のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｍｒ １５０，０００）、ウシ血清アルブミン（Ｍｒ ６６，０００）および炭酸脱水酵素（Ｍｒ ２９，０００）を有する同じ緩衝液で較正した。３７℃で２０時間インキュベーションした後のヒト血清中の９９ｍＴｃ標識免疫複合体の熱安定性を、同じ分析設定を用いて評価した。免疫複合体の単量体の量を、溶出画分のｇ−シンチレーション計数によって決定した。
【０２１７】
放射性標識および抗原結合親和性の決定
ＶＢ４−８４５（４Ｄ５ＭＯＣＢ−ＥＴＡ）を、タンパク質配列に存在するヘキサヒスチジンタグへの９９ｍＴｃ−トリカルボニル三水和物の安定した部位特異的配位により放射性標識した。この自然反応を、３０ｍｌの免疫複合体溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と１／３体積の１Ｍの２[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ６.８および１／３体積の新たに合成した９９ｍＴｃ−トリカルボニル化合物を混合することによって誘導した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、製造業者の推奨に従って、０.００５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで平衡化したＢｉｏｓｐｉｎ−６カラム（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上で脱塩することによって反応を停止させた。記載のように、免疫反応性免疫複合体の割合を評価した。９９ｍＴｃ標識免疫複合体の結合親和性を、本質的にはｓｃＦｖ  ４Ｄ５ＭＯＣＢについて記載したように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）でＳＷ２細胞にて決定した。
【０２１８】
実施例６：コドン最適化ＤＮＡ配列を有するＶＢ４−８４５の構築および表現
大腸菌におけるＶＢ４−８４５の発現収量を、発現ベクターのコーディングおよび非コーディング核酸配列を改変することによって改善した。より具体的には、改変にはオープンリーディングフレーム中の主な停止の除去が含まれ、この詳細については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１８，４７２号に開示されている。ＶＢ４−８４５をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を配列番号１６に示す。コドン最適化ＶＢ４−８４５のＤＮＡ配列を、実施例５のようにｐＩＮＧ３３０２プラスミドにライゲーションし、大腸菌で発現させた。
【０２１９】
実施例７：製造プロセス
ＶＢ４−８４５の大腸菌発酵
ＶＢ４−８４５の生成を、研究室でロータリーインキュベーターシェーカーを用いて２Lの振盪フラスコ中で行う。ロータリーシェーカーは、温度が摂氏１度の範囲内に調節できる環境制御室内に存在する。種培地、生成培地の接種および全ての無菌操作を、ＨＥＰＡ濾過および１００の空気分級を備える生物学的安全キャビネットタイプＩＩ／Ｂ下で行う。細胞の分離、濃縮およびダイアフィルトレーションを研究室で行う。
【０２２０】
ＶＢ４−８４５を、ＶＢ４−８４５ Ｅ１０４宿主細胞大腸菌マスター細胞バンク（ＭＣＢ）から生成する（Ｘｏｍａ Ｉｒｅｌａｎｄ社のプラスミドｐＩＮＧ３３０２を発現ベクターの構築のために使用した）。臨床グレードのＶＢ４−８４５の生成のための細胞増殖（発酵）の最初のスケールアップは、フラスコあたり１リットルの作業容積で２６ｘ２Ｌの振盪フラスコのレベルまでであり、総容積は２６Ｌである。ＶＢ４−８４５大腸菌ＭＣＢを、細胞成長のための主な炭素源としてグリセロールを含む複合窒素培地中で成長させる。発酵手順を以下に記載する。
【０２２１】
接種物の調製
２６Ｌの振盪フラスコでの実行のために、ＶＢ４−８４５大腸菌ＭＣＢの１つの５００ｍｌ培養物をプレ接種物として調製する。各培養物について、ＭＣＢのバイアルを−１８℃の貯蔵タンクから取り出し、室温で解凍した。バイアルを７０％エタノールで外部を拭き、生物学的安全キャビネット内で空気乾燥させる。ＭＣＢ（１.５ｍｌ）の細胞懸濁液を、無菌の種培地（改変２ＹＴ培地および２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン）５００ｍＬを含む２Ｌの三角フラスコに添加する。フラスコを２００ｒｐｍに設定したロータリーシェーカーに移し、３.０±０.２以上の光学密度に到達するまで（１０．５±１時間、増殖の中期対数期）２５±１℃で成長させた。その後、接種物を種培養物として用い、２６個の生成振盪フラスコに接種する。
【０２２２】
２６ｘ２Ｌの振盪フラスコでの発酵
発酵を、それぞれ生成培地１Ｌを含む２Ｌ−バッフルなしフラスコで行う。臨床グレードのＶＢ４−８４５のための代表的な生成工程は、フラスコあたり生成培地（改変テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）、ＴＢ）１Ｌを含む２６ｘ２Ｌフラスコで行った。発酵培地に上記培養物からの１％の接種物を播種し、接種した最後の振盪フラスコで光学濃度が１.２に達するまで（約６〜７時間）、２５±１℃で、シェーカー（２００ｒｐｍ）上でインキュベートする。誘導の典型的なＯＤ６００の範囲は１.２〜１.５である。ＶＢ４−８４５発現は、０.１％のＬ−アラビノースの添加により誘導される。誘導後約６時間の時点で細胞を収集する。
【０２２３】
細胞分離
収集時に、最初に接種したフラスコを最初に取り出し、全ての振盪フラスコを接種順にシェーカー室から取り出す。第１の振盪フラスコの内容物を、生物学的フード下で第２の振盪フラスコに加える。全ての後続の振盪フラスコも同様に取り出す。プールした振盪フラスコを２〜８℃の冷凍庫に配置する。６群中のＶＢ４−８４５のＥ１０４大腸菌細胞を、ソーバルおよびベックマンの遠心分離機で２〜８℃で１５分間、６８００ｇの力で遠心分離することにより、上記の発酵培養物から取り出す。細胞を廃棄し、無細胞培養液をさらなる処理のために保持する。濃縮した細胞懸濁液を収集し、不活性化して、確立された方法により処理する。得られた上清をプールし、試料５ｍｌを生成物の定量化のために貯蔵する。遠心分離機、ローターおよび遠心ボトルを、発酵ブロスを処理する前に完全に洗浄する。
【０２２４】
濃縮／ダイアフィルトレーション
収集した培養上清の濃縮およびダイアフィルトレーションを、１０ｋＤの分子量カットオフＮＭＷ（公称分子量）のザルトリウス膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ社）を有し、３平方フィートの表面積を有する接線流ペリコンシステムを使用して行う。ペリコン濾過システムを使用前に完全に洗浄する。濃度は４Ｌ／分の供給速度で、透過率は５００ｍＬ／分で行う。試料５ｍｌを最終濃度段階で取得する。ダイアフィルトレーションを、０.０２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７.２±０.２に対して行う。１０ミリ秒を下回る所望の導電率を達成するために、５容積変化が必要とされる。ダイアフィルトレーション濃縮生成物を、２〜８℃の設定温度で約３０分間、６８００ｇの力でソーバル遠心機により清澄にする。目的の生成物を含む透明溶液を、０.２２μｍフィルターを使用して精製前に濾過する。清澄化ステップには、ダイアフィルトレーション後に、遠心分離、０.２μｍフィルターへの通過、トリトンＸ−１００の添加、導電性の調整、ｐＨの調節が含まれ、その後に、精製が続く。
【０２２５】
ＶＢ４−８４５精製手順
ＶＢ４−８４５の精製を、ＨＥＰＡろ過を用いてｃＧＭＰ管理区域および１０，０００の空気分級を有する制御環境内で行う。ＶＢ４−タンパク質を金属親和性キレートクロマトグラフィーにより単離し、陰イオン交換クロマトグラフィー溶出によりさらに精製する。精製プロセスを図９のフローチャートに要約し、以下に記載する。
【０２２６】
キレーティングセファロース金属相互作用クロマトグラフィー
金属親和性カラムを、約１７±１ｍＬのカラム容量でＸＫ２６／２０ガラスカラムにキレート化セファロースＨＰ樹脂を充填することによって調製する。充填を３バールの背圧で行う。作業線流速（ＬＦＲ）は９０ｃｍ／時である。５カラム容量（ＣＶ）の注射用水（ＷＦＩ）を、キレート化セファロースカラムに通す。金属イオンをキレート化セファロースカラムにチャージするために、５ＣＶの０.１Ｍ塩化ニッケル溶液をカラムに通す。未結合の塩化ニッケルの残りを、５ＣＶのＷＦＩで洗い流す。次いで、カラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０.１％トリトンＸ−１００を含む１０ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液（キレート化セファロース平衡緩衝液）で平衡化する。
【０２２７】
ＶＢ４−８４５を含む濃縮／ダイアフィルトレーション溶液の伝導率を、塩化ナトリウムで１５±１ミリ秒に調整し、ｐＨを１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で７.２±０.１に調整する。ＶＢ４−８４５含有溶液を９０ｃｍ／時または８ｍｌ／分のＬＦＲでキレート化セファロースＨＰカラムに適用する。次いで、カラムを、２０ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  イミダゾールおよび０.１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液（洗浄緩衝液））で洗浄する。ＶＢ４−８４５を、５００ｍＭ  イミダゾールを含む６ＣＶの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液（キレートセファロース溶出緩衝液）でカラムから溶出する。溶出ピークの始めから３ＣＶ画分中の生成物を収集する。
【０２２８】
Ｑ−セファロース−陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｑ−セファロースＨＰ樹脂をＸＫ１６／２０ガラスカラムに充填すると、最終カラム体積は５.０±０.５ｍＬになる。動作線流速は１５６ｃｍ／時である。このカラムを１０ＣＶのＷＦＩで洗浄し、次いで、５ＣＶの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液中１Ｍの塩化ナトリウムで洗浄し、１０ＣＶの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、９０  ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液（２−セファロース平衡緩衝液）で平衡化する。キレート化セファロースカラムからの溶出を、１０±１ミリ秒の導電率になるまで２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液で希釈する。エンドトキシンレベルおよびＤＮＡをさらに減少させるために、部分精製したＶＢ４−８４５を５.２ｍｌ／分の流速でＱセファロースカラム上に添加する。生成物が結合した後、陰イオン交換カラムを、１５ＣＶのＱセファロース平衡緩衝液で洗浄する。汚染物質がフロースルーおよび洗浄工程中に見られる。生成物を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７.２±０.１緩衝液で３ｍＬ画分として溶出する。
【０２２９】
実施例８：肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のためおよび癌幹細胞を死滅させるためのＶＢ４−８４５
対象および組織試料
２００８年１１月〜２０１０年３月に、９０人のＨＣＣ患者に東京医科歯科大学病院で治癒的肝切除術を施行した。全形態の種類の決定およびＥｐ−ＣＡＭ発現の分析に使用する実験法を、以前に報告されたように行った。患者を、α−フェトプロテインおよびビタミンＫ欠乏により誘導されるタンパク質またはアンタゴニスト−ＩＩの血清レベルのアッセイで毎月経過観察し、超音波検査、コンピュータ断層撮影、および磁気共鳴断層撮影を３ヶ月ごとに行った。観察時間の中央値は２５.２ヶ月（９５％信頼区間[ＣＩ]、１０.４〜３７.７ヶ月）であった。書面によるインフォームドコンセントを各対象から取得し、施設内倫理委員会が試験手順を承認した。
【０２３０】
細胞培養
ヒトＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、およびＳＫ−Ｈｅｐ１を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国バージニア州マナッサス）から入手した。他のヒトＨＣＣ細胞株のＨｕＨ−７、ＨｕＨ−１、ＨｅｐＧ２、ＨＬＥ、およびＨＬＦは、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪、日本）から入手した。ＨｕＨ−７、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＳＫ−Ｈｅｐ１細胞は、１６４０  ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）で対数増殖培養し、ＨｕＨ−１、ＨＬＥ、ＨＬＦ、およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞はダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養し、その際、ＨＬＦ細胞については５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）または残りの細胞株については１０％ＦＢＳを培養した。全ての培地に１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ社）を補充した。ルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４.５０[ｌｕｃ２／ＣＭＶ／ハイグロ]ベクター（＃Ｅ１３１Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を、製造業者の取扱説明書に従ってＨｕＨ−７細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現ＨｕＨ−７細胞（ＨｕＨ−７−Ｌｕｃ）を作製した。全ての細胞株は、５％二酸化炭素中、３７℃の加湿インキュベーター中で培養し、０.０５％トリプシン−０.０３％ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて収集した。
【０２３１】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーについては、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いた。癌細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次いで、０.０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で酵素的に分離した。トリプシン処理細胞をＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩで分析した。肝幹／前駆細胞マーカーの分析については、Ｅｐ−ＣＡＭに対する一次抗体（＃３２４２０６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＣＤ１３（＃５５５３９４；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ４４（＃５５５４７９；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ９０（＃３２８１１０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ＣＤ１３３（＃１３０−０８０−８０１；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、グラートバハ、ドイツ）、マウスＩｇＧ１  κタイプ（＃５５５７４９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、およびマウスＩｇＧ２ｂ  κタイプ（＃４００３１４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いた。全ての抗体を、フィコエリトリン（ＰＥ）に直接結合させた。免疫染色および分析は、製造業者の取扱説明書に従って行った。
【０２３２】
細胞の増殖および生存率の分析
ＨＣＣ細胞株を、総体積５０μｌの培地中１ウェル当たり３×１０３細胞で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、０.００１〜１０ｐＭの濃度範囲のＶＢ４−８４５を総体積１００μｌに添加し、さらに７２時間インキュベートするか、または０.０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲の５−ＦＵを添加し、標準細胞培養条件下で４８時間インキュベートした。細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６水性１溶液細胞増殖アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ社））を用いて監視し、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値を算出した。ＩＣ５０の平均値および標準偏差を、各細胞株について３つ組で計算した。細胞生存率を調べるために、ＨＣＣ細胞株を、総容量２ｍｌの培地１ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、ＶＢ４−８４５（１〜１０ｐＭ）および５−ＦＵ（１〜５μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間インキュベートした。死細胞を排除するために、残りの生細胞をトリパンブルーで染色した後Ｃｙｔｏｒｅｃｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて計数した。各分析を３つ組で行い、データを平均±標準偏差として表した。
【０２３３】
球形成アッセイ
簡単に説明すると、ＨｕＨ−７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｕＨ−１の１×１０６細胞を、４枚の１０ｃｍ皿に播種した。２４時間後、ＰＢＳ、ＶＢ４−８４５（１〜１０ｐＭ）、５−ＦＵ（１〜５μｇ／ｍｌ）、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせを各皿に投与した。４８時間後、この培地を薬物を含まない培地と交換し、２４時間インキュベートした。細胞生存率をトリパンブルー排除によって確認した後、残りの生細胞を収集し、低接着プレート（９６ウェル超低クラスタープレート；Ｃｏｓｔａｒ社、ニューヨーク州コーニング）に１×１０２細胞で別々に播種し、血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でインキュベートした。球形成をＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて観察し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いてデジタル画像を得た。
【０２３４】
免疫組織化学的分析
Ｅｐ−ＣＡＭの免疫組織化学的分析を、ＰＢＳで１：１６０希釈した抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（＃ａｂ７１９１６；Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、英国）を用いて腫瘍の組織切片上で実施し、その後、熱誘導エピトープ検索および標準ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ社）を用いて自動免疫染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ社；米国アリゾナ州ツーソン）中で反応させた。腫瘍細胞は、強く染色された腫瘍細胞として定義される通常の胆管上皮と等しい膜染色を示した。免疫染色を、２人の独立した研究者が光学顕微鏡下で少なくとも３つの異なるランダムフィールド（１００倍の拡大）で計数することによって定量的に評価した。データを平均±標準偏差として表す。
【０２３５】
皮下異種移植片モデルにおけるインビボ研究
皮下腫瘍モデルを用いて、ＶＢ４−８４５のインビボ活性を分析した。チャールズリバー研究所（神奈川県、日本）から購入した２５週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−ＰＲｋｄｃＳｃｉｄ／Ｊマウスに、同量のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合した１×１０６ＨｕＨ−７細胞を麻酔下でマウスの両脇腹に皮下注射した。接種後２週間の時点で、全部で４０個の注射部位に触知可能な腫瘍が確認され、マウスを４群（ｎ＝５）：対照、ＶＢ４−８４５（３０μｇ／ｋｇ）、５−ＦＵ（３０ｍｇ／ｋｇ）、およびＶＢ４−８４５と５−ＦＵの組み合せに無作為化した。生理食塩水または生理食塩水１００μｌで希釈したＶＢ４−８４５を尾静脈注射により注入し、生理食塩水または生理食塩水１００μｌで希釈した５−ＦＵを全６用量について２週間、週に３回腹腔内注射した。腫瘍サイズを、キャリパーを用いて週３回測定し、次式：
体積＝（長さ）×（幅）２×０.５
を用いて腫瘍体積を計算した。マウスを治療開始後３週目に屠殺した。
【０２３６】
同所性肝異種移植モデルにおけるインビボ研究
同所性異種移植モデルをＨｕＨ−７−Ｌｕｃ細胞の直接肝内接種によって作製した。１０匹の５週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢ１７−ＰＲｋｄｃＳｃｉｄ／Ｊマウスに完全麻酔を行い、２０μｌのマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に懸濁した５×１０５細胞をゆっくりと肝臓の左上葉に注入した。接種後３週目に、ＩＶＩＳシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社、カリフォルニア州アラメダ）を用いるルシフェラーゼ−ルシフェリンベースのイメージングを用いて、肝臓における正しい移植を監視した。全てのマウスは肝腫瘍を示し、対照群およびＶＢ４−８４５と５−ＦＵの組み合わせ群（各５匹）の２群に無作為化した。投与法は皮下モデルと同じであった。治療の開始後２週目に、マウスを屠殺し、肝腫瘍のサイズを測定した。
【０２３７】
結果
融合性多結節（ＣＭ）型ＨＣＣにおけるＥｐ−ＣＡＭ発現のプロスペクティブ研究および患者の予後
９０人のＨＣＣ患者のうち、１８症例を、日本肝癌研究会による原発性肝癌の臨床および病理学研究のための一般規則に従って、「原発巣を示唆する任意の識別可能な大腫瘍結節のない、単焦点であるが多結節性の境界明瞭な腫瘍」であるＣＭ型として診断した。図３Ａに示すように、ＨＣＣ細胞におけるＥｐ−ＣＡＭ発現が１０症例で観察され、残りの８症例では観察されなかった。その後、Ｅｐ−ＣＡＭ発現の予後的意義を前向きに評価した。有意な関係が、Ｅｐ−ＣＡＭ発現と患者の予後（図３Ｂ；ｐ＝０.０４４７）ならびに再発（図３Ｃ；ｐ＝０.０１７１）の間で観察されたことは注目すべきである。
【０２３８】
ヒトＨＣＣ細胞におけるＥｐ−ＣＡＭの発現
図４Ａに示すように、８種類のヒトＨＣＣ細胞株におけるＥｐ−ＣＡＭ発現を、ＦＡＣＳ解析を用いて評価した。これらの細胞株を以下の２群に分けた：９５％を上回る細胞がＥｐ−ＣＡＭ陽性であるＨｕＨ−７（９８.０±０.３％）、ＨｅｐＧ２（９８.０±０.９％）、Ｈｅｐ３Ｂ（９９.８±０.１％）、およびＨｕＨ−１（９７.７±０.２％）を含むＥｐ−ＣＡＭ高発現（Ｅｐ−ＣＡＭ高）ＨＣＣ細胞株、ならびに５％未満の細胞がＥｐ−ＣＡＭ陽性であるＨＬＥ（０.４±０.１％）、ＨＬＦ（０.４±０.２％）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（４.０±０.３％）、およびＳＫ−Ｈｅｐ１（０.７±０.２％）を含むＥｐ−ＣＡＭ低発現（Ｅｐ−ＣＡＭ低）ＨＣＣ細胞株。これらの２群間で増殖活性および形態学的特徴に差はなかった。
【０２３９】
ヒトＨＣＣ細胞におけるＶＢ４−８４５＋５−ＦＵのインビトロ効果
ＶＢ４−８４５の効果を、ヒトＨＣＣ細胞株において分析した。図４Ｂに示すように、ＶＢ４−８４５は、Ｅｐ−ＣＡＭ高細胞株では効果的であるが、Ｅｐ−ＣＡＭ低細胞株では効果的ではなかった。ＶＢ４−８４５のＩＣ５０値は、ＨｕＨ−７では４.６±０.１×１０−２ｐＭ、ＨｅｐＧ２では１.０±０.１×１０−２ｐＭ、Ｈｅｐ３Ｂでは０.９±０.１×１０−２ｐＭ、およびＨｕＨ−１では７.３±０.２×１０−２ｐＭあった。一方、ＶＢ４−８４５は、Ｅｐ−ＣＡＭ低細胞株に対しては全く効果がなく、これらの細胞株ではＩＣ５０値を決定できなかった。図４Ｃに示すように、５−ＦＵは、全てのＨＣＣ細胞型において強力な抗増殖活性を示し、ＩＣ５０値は、ＨｕＨ−７細胞については０.８±０.１μｇ／ｍｌ、ＨｅｐＧ２細胞については３９.５±９.６μｇ／ｍｌ、Ｈｅｐ３Ｂ細胞については５.９±１.８μｇ／ｍｌ、ＨｕＨ−１細胞については１１.３±６.３μｇ／ｍｌ、ＨＬＥ細胞については１６.５±６.６μｇ／ｍｌ、ＨＬＦ細胞については３３.５±１７.２μｇ／ｍｌ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞については５５.６±１１.２μｇ／ｍｌ、ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞については４.３±０.５μｇ／ｍｌであった。各細胞株における５−ＦＵの有効性とＥｐ−ＣＡＭ発現の間に有意な相関は認められなかった（Ｒ＝０.１６、ｐ＝０.３８）。
【０２４０】
図４Ｄに示すように、ＶＢ４−８４５と５−ＦＵの併用効果を８種類のヒトＨＣＣ細胞株で評価した。ＶＢ４−８４５と５−ＦＵの組み合せは、Ｅｐ−ＣＡＭ高細胞株の全てにおいて細胞増殖を有意に抑制した（ｐ＜０.０５）。しかし、Ｅｐ−ＣＡＭ低細胞株では、５−ＦＵは、ＶＢ４−８４５と５−ＦＵの組み合わせと同程度に細胞増殖を抑制し（Ｐ＞０.０５）、したがって、これらの細胞株は、両方の薬物の組み合わせ効果を示さなかった。したがって、Ｅｐ−ＣＡＭ高細胞株をさらなる分析のために選択した。
【０２４１】
ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせ処理後の球形成アッセイ
ＥＰ−ＣＡＭ高細胞株におけるＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせで処理した後に、生細胞を収集し、再培養における球形成能について分析した（図５）。５−ＦＵ処理した生細胞は、培養７日後に４種類の細胞株の全てにおいて球形成したが、ＶＢ４−８４５を単独でまたは５−ＦＵと組み合わせて暴露した後に残っている生細胞は、培養７日後にこのような球を形成しなかった（図５）。このアッセイで使用したＶＢ４−８４５および５−ＦＵの用量は類似の抗増殖活性を示したが、球形成能に及ぼす影響は互いに正反対であった。球形成細胞は、幹細胞性の本質的な特徴の１つである自己複製が可能であると考えられているため、Ｅｐ−ＣＡＭ高細胞株に対するＶＢ４−８４５の効果は、それらの幹細胞性と密接に関連することが見出された。
【０２４２】
ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせ処理後の幹細胞／前駆細胞マーカーの改変
図６Ａに示すように、Ｅｐ−ＣＡＭ高細胞株では、ＣＤ１３３、ＣＤ１３、ＣＤ４４、およびＣＤ９０などいくつかの幹／前駆細胞マーカーの発現を、ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせ処理後にＦＡＣＳ分析を用いて分析した。これらのマーカーは、予後不良のＨＣＣのバイオマーカーとして報告されたために選択した。図６Ｂに示すように、ＨｕＨ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＤ１３３の陽性率は、対照と比較してＶＢ４−８４５の投与後に有意に減少した。（ｐ＜O.０００５）。興味深いことに、ＨｅｐＧ２細胞は、ＣＤ１３３の発現についてユニークな二峰性のパターンを示し（図６Ａ、矢印）、ＶＢ４−８４５の投与が、ＨｅｐＧ２細胞のこのＣＤ１３３陽性亜集団を統計的に有意に著しく減少させた。一方で、図６Ｃに示すように、５−ＦＵの投与は、対照と比較してＨｕＨ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＤ１３３の陽性率を有意に増加させた（ｐ＜０.０５）。ＨｕＨ−７およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＤ１３の陽性率は、ＶＢ４−８４５処理で有意に減少し（図６Ｄ、ｐ＜０.０１）、５−ＦＵ処理で有意に増加した（図６Ｅ、ｐ＜０.０５）。各細胞株の処理後のＣＤ４４およびＣＤ９０の陽性率には一貫した傾向はなかった。これらの結果は、ＶＢ４−８４５の効果がヒトＨＣＣ細胞の幹細胞性に密接に関連する可能性があることを示す。
【０２４３】
ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせのインビボ効果
インビボ抗腫瘍活性を調べるために、樹立したＨｕＨ−７皮下異種移植片を有するＮＯＤ．ＣＢ１７−ＰＲｋｄｃＳｃｉｄ／Ｊマウスを利用した。治療開始後３週目にマウスを屠殺し、腫瘍の体積を測定した（対照群では８６５±２３８ｍｍ３、ＶＢ４−８４５治療群では４７６±１３４ｍｍ３、５−ＦＵ治療群では５５５±１４７ｍｍ３、ＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合せ治療群では４３±８.４ｍｍ３）。図７Ａおよび７Ｂに示すように、対照群と比較した場合、ＶＢ４−８４５および５−ＦＵ単独療法群の腫瘍体積はより小さく見えた（それぞれ、ｐ＝０.０７８および０.３１）。対照群、ＶＢ４−８４５治療群、および５−ＦＵ治療群と比較して、ＶＢ４−８４５＋５−ＦＵ治療群において有意な腫瘍退縮が観察された（ｐ＜０.０５）。治療したマウスのいずれも、対照マウスと比較して消耗または他の毒性の徴候を示さなかった。データは、ＶＢ４−８４５および５−ＦＵが、球形成能および肝幹／前駆細胞マーカー発現集団に対して異なる効果をもたらしたことを示している。腫瘍細胞の幹細胞性に関連するこれらの異なる効果は、併用群における腫瘍の有意な退縮と密接に関連し得る。
【０２４４】
同所移植モデルの図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＶＢ４−８４５と５−ＦＵの併用療法は、対照（１９６４±３６７ｍｍ３）と比較して全てのマウス（１４１±３４ｍｍ３）の肝腫瘍を有意に抑制した（ｐ＝０．０１１）。Ｅｐ−ＣＡＭ免疫組織学的発現（図８Ｃ）は、強く染色された腫瘍細胞の集団が対照群（７６.７±６.０％）と比較してＶＢ４−８４５＋５−ＦＵ群（４７.４±１９.４％）において減少したことを実証した（図８Ｄ、ｐ＝０.０１２）。治療マウスのいずれも、対照マウスと比較して消耗または他の毒性の徴候を示さなかった。肝臓、骨髄、腎臓、腸および肺を含む試験した全ての宿主組織は、全ての実験で組織学的に正常であった。
【０２４５】
考察
この試験で、Ｅｐ−ＣＡＭ発現のＦＡＣＳ分析により、８種類のヒトＨＣＣ細胞株が４種類のＥｐ−ＣＡＭ高（＞９５％）および４種類のＥｐ−ＣＡＭ低（＜５％）ＨＣＣの２群に分類されたことが明らかになった（図４Ａ）。ＨＣＣ細胞においてＥｐ−ＣＡＭの発現と球形成の間の密接な相関関係が報告されたので、球形成能に対するＶＢ４−８４５の効果を分析した。図５に示すように、５−ＦＵ処理は球形成に影響を及ぼさなかったが、ＶＢ４−８４５ならびにＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合わせ処理は、全４種類のＨＣＣ細胞株における球形成を明らかに抑制した。球形成能は、幹細胞の自己再生能力によって調節されることが知られているため、ＶＢ４−８４５の効果は、Ｅｐ−ＣＡＭ高ＨＣＣ細胞の幹細胞性に密接に関連する可能性がある。
【０２４６】
幹細胞性に対するＶＢ４−８４５の効果のさらなる調査のために、ＶＢ４−８４５、５−ＦＵ、およびＶＢ４−８４５＋５−ＦＵの組み合せ処理後に、ＣＤ１３３、ＣＤ１３、ＣＤ４４、およびＣＤ９０などのいくつかの幹／前駆マーカーの発現を分析した。図６Ｃに示すように、５−ＦＵ処理が、３種類のＨＣＣ細胞株においてＣＤ１３３の陽性率を有意に増加させた（ｐ＜０.０５）。さらに、ＶＢ４−８４５は、これらのＨＣＣ細胞におけるＣＤ１３３＋亜集団を劇的に減少させた（図６Ｂ、ｐ＜０.０００５）。同様の結果が、別の幹細胞マーカーのＣＤ１３の分析から得られた。ＣＤ１３の陽性率は、ＶＢ４−８４５処理では有意に減少したが（図６Ｄ）、５−ＦＵ処理では増加した（図６Ｅ）。これらの結果は、標的化亜集団がＶＢ４−８４５処理と５−ＦＵ処理間で異なることを示した。幹細胞／前駆細胞マーカーに関して、ＶＢ４−８４５の効果はまた、ヒトＨＣＣ細胞の幹細胞性と密接に関連することが見出された。
【０２４７】
さらに、ＶＢ４−８４５および／または５−ＦＵのインビボ抗腫瘍効果を、皮下異種移植モデルならびに肝臓同所性異種移植片モデルを用いて分析した。皮下異種移植モデルにおいて（図７）、抗腫瘍作用は、ＶＢ４−８４５または５−ＦＵ単剤療法のいずれかによって検出され、ＶＢ４−８４５と５−ＦＵの併用療法は腫瘍体積をさらに減少させた。癌における臓器微小環境は、特に、ＨＣＣの臓器親和性癌に対する薬剤感受性において重要な役割を果たす可能性があるため、臨床症状との類似性を有する肝同所移植モデルを利用して、腫瘍増殖阻害も探索した。皮下異種移植片モデルで観察されたように、腫瘍の著しい退縮が、対照群と比較してＶＢ４−８４５＋５−ＦＵ治療群において観察された（図８、／ｐ＝０.００１１）。
【０２４８】
理論に拘束されることを望まないが、これらの研究は、Ｅｐ−ＣＡＭ標的療法が従来の細胞傷害剤５−ＦＵとは潜在的に異なる機構（例えば、幹細胞性）を介して抗癌効果を示すように思われる。実際には、前臨床試験は、従来の細胞毒性剤とＥｐ−ＣＡＭを標的にする免疫複合体の併用療法がヒトＨＣＣの治療のための有望な新規アプローチであることを示している。Ｅｐ−ＣＡＭ標的剤のさらなる研究および臨床試験は、ＨＣＣ管理におけるその治療的役割を確認する。
【０２４９】
実施例９：乳癌幹細胞に対するＶＢ４−８４５の効果
ＭＣＦ−７乳癌細胞を低密度で単一細胞懸濁液中に入れ、細胞接着を防ぐために６ウェルのポリＨＥＭＡコーティングプレート中の無血清培地中で７日間培養した。ＶＢ４−８４５および対照を、複数の濃度で（濃度あたりｎ＝３ウェル）プレーティング時に培地に添加した。ビヒクル対照およびγセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（５０μΜ）も含めた（図９）。非幹様細胞が死滅し、幹様細胞は存続および増殖して、マンモスフェアを形成した。７日後に、サイズが５０μｍを超える１ウェルあたりのマンモスフェアの数を計数し、試験薬剤および対照に対するマンモスフェア形成効率（ＭＦＥ）を計算した。
【０２５０】
マンモスフェアの減少が、増殖の阻止によるものではなく、幹細胞の死滅によるものであるか否かを評価するために、ＶＢ４−８４５で処理した培養物を収集し、６ウェルのポリＨＥＭＡコーティングプレートに再播種し、７日間、ＶＢ４−８４５の存在／非存在下で培養して、トリパンブルー排除によって細胞毒性を測定した（図１０）。ＶＢ４−８４５は、最初の球アッセイにおいて球形成を完全に阻害する能力を示した。この効果は、試験品が培養培地から除去されたときに球を形成しなかったことにより、再播種アッセイで試験した濃度でも観察された。再播種後１０日目に細胞培地にトリパンブルーを添加して、細胞毒性を確認した。
【０２５１】
これらの研究は、ｐＭ範囲で球形成を完全に阻害するＶＢ４−８４５の能力を実証した。ＶＢ４−８４５で処理した細胞の再播種は、いかなる球も生成せず、細胞毒性効果を示した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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