(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソホモシステイン、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシンまたはこれらの任意の組み合わせの溶液中で単離された赤血球をインキュベートする工程を含む、ニトロソチオールで負荷された単離された赤血球の製造方法。
【請求項２】
下記工程：
ａ）非ヒト哺乳動物から赤血球を取り出す工程；
ｂ）該赤血球をＳ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソホモシステイン、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシンまたはこれらの任意の組み合わせの溶液中でインキュベートする工程；および
ｃ）該赤血球を該非ヒト哺乳動物に再導入する工程
を含む、非ヒト哺乳動物細胞へのＮＯの送達方法。
【請求項３】
インビボの内因性赤血球の細胞内Ｓ−ニトロソヘモグロビン濃度より高い細胞内濃度のＳ−ニトロソヘモグロビンを含む単離された赤血球。
【請求項４】
赤血球のO2送達能を増大させることによって治療され得るショック、アンギナ、脳卒中、再潅流損傷、急性肺損傷、鎌状赤血球貧血および赤血球の感染からなる群より選ばれる疾患または医学的障害を治療するための請求項３記載の赤血球。
【請求項５】
該疾患が鎌状赤血球貧血であり、Ｓ−ニトロソシステインで負荷されている請求項４記載の赤血球。
【請求項６】
哺乳動物において血圧を低下させるための、請求項３記載の赤血球。
【請求項７】
Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソホモシステイン、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシンまたはこれらの任意の組み合わせにより負荷された単離された赤血球を含有してなる代用血液。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ヘモグロビン（Hb）とO2、CO2、NOなどといった小さな拡散性リガンドとの相互作用はその金属中心とアミノ末端で起こることが知られている。肺と全身の微小脈管構造で起こるO2/CO2送達機能はアロステリックに制御される。環境に対するそのような反応が、NOの場合にもあてはまることは知られていない。具体的に述べると、Hb（Fe）はNOの作用範囲の制限に関与するが（Lancaster J.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:8137-8141（1994）;WoodおよびGarthwaite,J.Neuropharmacol.,33:1235-1244（1994））、NOはHbの機能性を生理学的に有意なほどには変更しないと考えられている。しかし、この仮定に基づく速度論的モデル研究によれば、脈管構造中の遊離NOの大半はHbによって捕捉されるはずである（Lancaster 1994）。したがって、仮に平静な器官ではそうでないとしても、アテローム性動脈硬化症に認められるような酸化剤ストレス（oxidant stress）が加われば、NOの定常状態レベルはグアニル酸シクラーゼなどの標的酵素に対するKmよりも低くなるだろう（Lancaster 1994）。これらの考察は、NOがどのようにしてその生理活性を発揮するのかという根本的な疑問を生じさせる。
このパラドックスに対する１つの回答は、一酸化窒素が、NO様の血管弛緩因子活性を持つが（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））、高濃度の血中Hbによる拡散的制約を受けないＳ−ニトロソチオール（RSNO）生成傾向に見出すことができる（Gaston,B.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10957-10961（1993））。具体的に述べると、RSNOのNO基は、NOそのものとは異なるニトソニウム（NO+）性を持つ。実際、NOがなしえない一定の機能を引き出す能力をRSNOが持っていることは、ますます理解されつつある（DeGroote,M.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6399-6403（1995）;Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））。また、タンパク質中の-SNO基が、おそらくはリン酸化と同様のシグナル伝達機能を果たすという可能性も考慮されている（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992）;Stamler,J.S.,Cell.78:931-926（1994））。タンパク質のＳ−ニトロシル化はタンパク質機能を調節することができるが（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992）;Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））、細胞内でのＳ−ニトロソタンパク質の同定（調節的翻訳後修飾の必須条件）は、これまでのところ実証されていない。
ヘモグロビンは２つのアルファサブユニットと２つのベータサブユニットからなる四量体である。ヒトHbでは、各サブユニットが１つのヘムを含有し、ベータ（β）サブユニットは反応性の高いSH基（cys β93）をも含有する（Olson,J.S.,Meth.of Enzym.,76:631-651（1981）;AntoniniおよびBrunori,Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands（American Elsevier Publishing Co.,Inc.,ニューヨーク）の29〜31頁（1971））。これらのシステイン残基は、その機能はまだ不明であるが、種間で高度に保存されている。
NO（一酸化窒素）は、数ある機能の中でも特に血圧を下げ血小板機能を阻害する生物学的「伝達分子」である。NOは内皮から血管平滑筋および血小板へ自由に拡散し、神経単位のシナプスを横切って生理的反応を引き起こす。条件によっては、NOと細胞および体液中に存在する他の成分との反応によって、毒性の中間体と産物が、感染性生物の増殖を阻害するのに有効な組織内局所濃度で生成しうる。したがって、NO又はその生理活性型の有効濃度を投与する方法は、ある種の医学的障害に有益であろうと考えることができる。
発明の概要
本発明は、赤血球に侵入できる低分子量試薬を赤血球に体外で負荷し、チオール基のＳ−ニトロシル化の生成を引き起こす方法に関する。赤血球への負荷にはＳ−ニトロソシステインのようなＳ−ニトロソチオール類とそれに関連するペプチドを使用することができ、次いでその赤血球を哺乳動物に導入することができる。これにより、赤血球はNOの運搬体となる。この方法で、組識の異常な酸素代謝、酸素関連毒性、異常な血管緊張、異常な赤血球接着、または赤血球による異常なO2送達を特徴とする医学的状態を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
図1A〜1Dは、実施例1に記載の異なる型のHbの分光グラフである。
図2Aは、Ｓ−ニトロシル化によるSNO-Hbの生成を経時的に示すグラフである。
図2Bは、オキシ型およびデオキシ型SNO-Hbの分解を経時的に示すグラフである。
図3Aは、赤血球に対するＳ−ニトロソシステインの負荷を経時的に示すグラフである。挿入図は、実施例３に記載するHbの形態の一連の分光グラフである。
図3Bは、ウサギ大動脈環を実施例３に記載の種々の薬剤で処理した後に、その大動脈環の等尺性緊張（isometric tone）を記録した一連の軌跡である。
図4Aは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わすグラフである。
図4Bは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わすグラフであり、ここでは、グルタチオンをも加えて、その効果を図4Aと比較検討した。
図4Cは、時間に対する生成Ｓ−ニトロソグルタチオン/出発SNO-Hb濃度の比を表わすグラフであり、オキシ型およびメト型HbからグルタチオンへのNO基転移の速度を示している。
図4Dは、負荷赤血球から輸出されたＳ−ニトロソチオール種の経時変化を表わすグラフである。
図５は、様々な用量のオキシHb（▲）、SNO-オキシHb（■）またはSNO-メトHb（●）を与えた後のラットの平均動脈血圧を示すグラフである。
図6A〜6Fは、麻酔した犬にＳ−ニトロソヘモグロビンを投与した後の、血圧（図6Aおよび6B）、冠状動脈直径（図6Cおよび6D）および冠状動脈流量（図6Eおよび6F）を記録した一連の軌跡である。
発明の詳細な説明
生理学に関するヘモグロビンの役割
肺循環路（右心室インポート（inport）−左心室）を横切って起こる赤血球のSNO-Hb含量の増大は、Hb分子が肺でＳ−ニトロシル化されることを示唆している。肺（Gastonら,（1993））と血液（Scharfsteinら,（1994））に認められる内因性RSNOからHbのSH基へのNO基の選択的転移は、これらの発見を実証するものである。それにもかかわらず、生体内で機能するＳ−ニトロシル化の機構はわかっていない。肺床を横切って起こるHb（FeII）NOレベルの対応する減少は、NOの除去またはヘムからcys β93への分子内転移に関する肺の役割を示す。総合すると、これらのデータは、COとCO2の排出およびO2の取り込みを含むことが既に知られている呼吸器系内の小分子とHbとの機能調節的相互作用のリストを拡大することになる。Hbの酸素化は、cys β93のNOに関連する反応性を増大させる構造変化をもたらすので、O2はHb  Ｓ−ニトロシル化のアロステリックエフェクターであると見なすことができる。これは、このタンパク質に関して新たに発見されたアロステリック機能である。
SNO-Hb濃度の動脈-静脈差は、このタンパク質が全身循環系でNO基供与体として作用することを示唆している。実際、SNO-Hbが血管運動の緊張状態（vasomotor tone）を調節する機能を果たすことは十分に示されている。血圧の制御が行われる微小循環系では、赤血球が内皮表面と緊密に接触する。これらの条件下で、Hbは脈管構造に作用して、遊離NOの定常状態レベルを急激に減少させることにより動脈抵抗が増大しやすい状態にすることができる（Lancaster,J.R.,（1994））。この原理は、無細胞Hbを点滴した時に起こる血圧の上昇に寄与すると考えられる（Vogel,W.M.ら,（1986）;Olsen,S.B.ら,（1996））。しかし、このような一過性の高血圧応答は、それに続いてSNO-Hbが生成し、それがこの効果を打ち消すこと（これは天然に存在する濃度における血圧の低下によって証明される）と一致するだろう。したがって、SNO-Hbの合成と代謝を支持するという赤血球の能力は、正常な血流にとって重要だと言えるだろう。
この方向の推論から、哺乳動物は微小循環系で十分なNO送達を確保するためにユニークな分子機構を採用したはずだと考えられる。我々が得た結果は、Hbが、NOホメオスタシスを達成するために、電子的切替え機構とコンフォメーション的切替機構の両方を発展させたことを示唆している。具体的に述べると、SNO-Hb（FeII）O2の金属中心によるNO補集は、そのメト（FeIII）への変換によって感知されるだろう（図1B）。この電子的事象は、NO基の放出を伴うSNO-Hbの分解をもたらすだろう（図3A、3B、4A）。このようにして、SNO-HbのNO関連活性は、捕捉されたNOの量によって部分的に決定されるだろう。本発明者らは、NOの放出が脱酸素化によって促進されることを観察したので、O2圧の変化はNOの送達を調節する機能をも果たすのかもしれない。このアロステリック効果が組識のO2不足を制限するように働くと推測することは興味ぶかい。このモデルによれば、NO基の放出は毛細管血流を調節してO2送達が増大するように作用するだろう。
タンパク質中のＳ−ニトロソチオール基は、NOの代謝および細胞機能の調節と関連付けられている（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992）;Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））。赤血球中のSNO-Hbの同定は、細胞内Ｓ−ニトロソタンパク質の最初の証明であり、細胞調節に関するそれらの役割をさらに確信させるものである。放出された遊離のNOがHb自身によって即座に捕捉される場合（Lancaster,J.R.,（1994））、SNO-Hbがどのようにして血管を弛緩させるのかという疑問が生じる。これについては、RSNO活性がチオール受容体へのニトロシル（NO+）転移を伴う（これはNO関連活性を金属中心での不活化から保護する機能を果たす）ことを示す研究（Scharfstein,J.S.ら,（1994）;ArnelleおよびStamler,（1995）;Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:7674-7677（1992））が注目に値する。この研究の発見は、グルタチオンとのＳ−ニトロソチオール/チオール交換（GSNOが生成する）が赤血球内で起こるらしいこと、そしてそれがヘムの酸化状態とリガンドによるその占有によって左右されるらしいことを示している。デグルート（DeGroote）とその共同研究者らは、GSNOが細菌で一定の活性を発揮するには、無傷のジペプチド（すなわちＳ−ニトロソシステイニルグリシン）がその細胞膜を横切って輸送される必要があることを示した（DeGroote,M.A.ら,（1995））。本明細書に示すデータは、この枠組みを、真核細胞をも含むように広げるものである。EDRFによるカリウムチャンネルのチオール依存的活性化が報告されていることから（Bolotina,V.M.ら,Nature,368:850-853（1994））、赤血球によって輸出されるGSNOや関連するチオール運搬体（KondoおよびBeutler,Methods of Enzymology,Packer,L.編,Academic Press,252:72-83（1995））も、原形質膜内または原形質膜でシグナル伝達を起こすのかもしれない（Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））。もう１つの可能性も考慮する価値がある。すなわち、Hbがcys β93を介して赤血球膜と会合するという報告である（SalhanyおよびGaines,Trends in Biochem.Sci.,１月13〜15（1981））。これは、接触している内皮表面に対して、おそらくはSNO/SH交換によって、NO基を直接提供するような位置に、Hbを置くことになるだろう。実際、他のＳ−ニトロソタンパク質によって媒介されるシグナル伝達では、細胞表面相互作用が機能しているようである（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992）;Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））。
高度に保存されたHbのcys β93残基は、金属中心の酸素化と酸化傾向に影響を及ぼすことが示されており、またこのタンパク質の物理化学的性質にも影響することが示されている（Garel,C.ら,（1982）;Jocelyn,P.C.,（1972）;Craescu,C.T.ら,（1986）;Mansouri,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,89:441-447（1979））。それにもかかわらず、長年探究されてきたそれらの生理学的機能はまだ謎のままである。本発明者らの研究は、cys β93がNO関連シグナルを血管壁に伝達する機能を果たすという、Hbの新しい感知および調節機能を示唆している。具体的に述べると、すべての哺乳類と鳥類に共通するcys β93の生理学的機能は、アロステリック制御の下に、ヘムによって補集され得ないNO関連生理活性を送達することである。したがって、これらのデータは、赤血球内Hbがその回路の微環境によってシンク（吸収体）としてもドナー（供与体）としても参加する、NO基の動的回路を明らかにするものである。このような観察結果は、遊離NOの拡散的な分布と反応のみに基づく概念的骨格（Lancaster,J.R.,（1994）;WoodおよびGarthwaite,（1994））から生じるパラドックスに解答を与え得る。またこれは、一酸化窒素シンターゼやグアニル酸シクラーゼなどの他のチオールおよび金属含有（ヘム）タンパク質にも及ぶ意味を包含し得る。
最後に、本明細書に報告する発見は、直接的な治療的意味を持ちうる。すなわち、血中Hbによる不活化ゆえのNO関連活性の喪失に関する懸念（Lancaster,J.R.,（1994））は、アロステリック制御を受けるRSNOの存在によって回避される。SNO-Hbは、金属中心におけるNO捕捉がもたらす無細胞Hb調製品の有害な高血圧特性を持たない。SNO-Hbを含有することによって血液を模倣する無細胞Hb溶液は、代用血液として使用することができる。
その他の態様
本発明の主題は、ニトロソ化剤を細胞に負荷する方法に関し、これを赤血球に関して図3Aに例示するが、本発明の方法は、より普遍的な方法で行なうことができる。好適なインキュベーションpH条件とインキュベーションの温度条件は、例えばpH範囲７〜９（pH8が好ましい）、温度範囲25〜37℃である。赤血球については、Ｓ−ニトロシル型Hbの生成を制限するために、１〜３分の短いインキュベーション時間が好ましい。しかし、ニトロソ化剤の細胞内濃度は1mMに達しうる。
ニトロソ化剤はNO+の良好な供与体であり、かつ、標的とする細胞タイプの細胞膜を通過して拡散しうるべきである。すなわち、Ｓ−ニトロソタンパク質とは対照的に低分子量でなければならない。Ｓ−ニトロソ-N-アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソホモシステイン、有機硝酸、有機亜硝酸、金属ニトロシル錯体その他、Methods in Nitric Oxide Research（Freelisch,M.およびStamler,J.S.編;Wiley,英国チチェスター（1996））の71〜119頁「Donors of Nitrogen Oxides」（この章の内容はすべて参照により本明細書に合体される）に定義されるニトロソ化剤がその例である。ニトロソ化剤は金属含有タンパク質上の異なる反応基に対して異なる活性を持つ。ニトロソ化剤は、Hbのヘム鉄の酸化が最小となり、システイン上に認められるようなチオール基をニトロシル化する活性が最大となるように選択することができる。
これらの低分子量ニトロソ化剤を赤血球中で使用することにより、NO関連活性を組識に送達することができる。さらに、ニトロソ化剤による赤血球の処理は、赤血球のO2送達能を増大させるのにも役立つ。また、このような赤血球の処理により、循環系中で酸素フリーラジカルを捕捉することも見込まれる。したがって、例えば（赤血球を単離する最小限の方法として）患者から全血を採取した後、その患者の体外での操作によって赤血球にＳ−ニトロソロチオールを負荷し、該赤血球を同じ患者に再導入することができ、それにより、組識の異常なO2代謝、酸素関連毒性、異常な血管緊張、異常な赤血球接着、または赤血球による異常なO2送達を特徴とするようないくつかのタイプの疾患および医学的障害を治療することができる。かかる疾患には、虚血性損傷、高血圧症、ショック、アンギナ、脳卒中、再潅流損傷、急性肺損傷、鎌状赤血球貧血、住血吸虫症、マラリアなどがあるが、これらに限るわけではない。かかる「負荷」赤血球の使用は、例えば代用血液療法や、移植用器官などの生きた器官の保存にも及ぶ。場合によっては、別人に由来する負荷赤血球で患者を処置することが適当なこともあるだろう。
本明細書では、この処置法の作用機序の具体例として、鎌状赤血球貧血を考察する。鎌状赤血球患者は、急性胸部症候群や肝機能不全などの臨床的症候群として顕在化する血管閉塞性クリーゼをしばしば起こす。凝血体質をもたらす内皮細胞機能不全と赤血球に内在する機能不全は共に、主要な病因である。分子レベルでは、VCAMのような血管接着分子の発現が増大して、異常なヘモグロビンを含有する鎌状赤血球の接着を促進する。したがって、内皮細胞でのサイトカイン発現を減じ、内皮機能を増進し、赤血球の鎌状化を減衰させることが、主要な治療目的となる。しかし、現在用いられている治療法は概して不成功に終わっている。
赤血球に細胞内NO供与体Ｓ−ニトロソチオール類を負荷するこの新規方法には、酸素親和力を増大させ（これはそれ自体またそれだけで赤血球の鎌状化を減衰させるはずである）、赤血球に血管拡張活性と抗血小板活性（これらは血管閉塞性クリーゼを反転させるはずである）を与えるという効果がある。さらに、一酸化窒素は、内皮細胞表面での接着分子の発現を減じることにより、内皮機能を回復させるはずである。
本明細書には、Ｓ−ニトロソチオール類その他のニトロソ化剤を赤血球に負荷することを伴う鎌状赤血球病の治療の新規治療法の手掛かりを記述する。２例の治療法を挙げる。第１の治療法では、患者自身の赤血球を体外でＳ−ニトロシル化し（これにより「負荷」赤血球を得る）、次いでその患者に与える。第２の方法は、赤血球に浸透できるＳ−ニトロソシステインのような薬剤を患者に直接投与することである。
いくつかの疾患または障害には、NO負荷赤血球の投与が特に望ましい。酸素化状態から脱酸素化状態に変化すると、あるいはヘム鉄の酸化状態が還元された状態（FeII）から酸化された（FeIII）状態に変化すると、NOがヘモグロビンのチオール基から放出され、それが速やかにグルタチオンに転移して、Ｓ−ニトロソグルタチオンが生成する。赤血球は高濃度のグルタチオンを含むことが知られている。Ｓ−ニトロソグルタチオンはNOを効率よく組識に送達する。
もう１つの側面として、本発明は、薬剤の標的となる細胞内でチオール基のＳ−ニトロシル化を引き起こす薬剤を、感染した哺乳動物に投与することによる、感染症の治療法でもある。例えば、リンパ球への浸透性が高いＳ−ニトロソチオールを、HIVに感染した患者に投与することができる。HIVに対するこのような処置は、患者から単離した血液に対して生体外で用いることもできる。もう１つの応用では、感染が細菌感染であり、抗細菌剤として使用するＳ−ニトロソチオールは、宿主細胞への浸透性と比較して、標的細菌細胞への浸透性が非常に高いものである（例えばDeGroote,M.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6399-6403（1995）を参照のこと）。別法として、ニトロソチオール類を赤血球内の熱帯熱マラリア原虫の処理に使用することもできる。
本発明のもう１つの態様は、１以上の金属原子を含有するタンパク質を、その金属の酸化状態を変えたり、その金属原子にNOを結合させるなどの修飾をその金属に加えることなく、そのタンパク質が１以上のチオール基でＳ−ニトロシル化されるように、特異的に修飾する方法である。これは、金属に結合したタンパク質のチオール基と特異的に反応するニトロソチオール類のようなNO+特性を持つ試薬（例えば実施例4A参照）を使用することによって達成できる。
ヘモグロビンの場合、このニトロソ化法はそのヘムに作用しない。SNO-Hb（SNO-Hb（FeII）O2）は、四量体あたり２つまでのSNO基とHb（FeII）O2から、ヘムFeをFeIIからFeIIIに酸化することなく合成することができる。これに対し、Hb（FeII）O2を過剰の一酸化窒素または亜硝酸塩と共にインキュベートすると、メトヘモグロビン（HbFe［III］）が迅速（実施例1B）かつ有意な程度に生成する。Hb［FeII］を一酸化窒素と共にインキュベートすると、NOがヘムにすばやく結合し、Hb（FeII）NOが有意な程度に生成する（実施例1A）。
Hb（FeII）O2からSNO-Hb（FeII）O2が生成する速度はさらに速いが（実施例2A参照）、例えば実施例1CのようにＳ−ニトロソグルタチオンやＳ−ニトロソシステインをHb（FeII）と共にインキュベートしてSNO-Hb（FeII）を得るなどにより、対応するSNO-デオキシHb型を得ることもできる。
血管拡張に対する種々の形態のHbの効果（収縮効果、拡張効果または中性効果）は、次の３つの要因に依存する:１）ヘムのFeが酸化されているかどうか、２）ヘムにO2が結合しているかどうか（すなわち、タンパク質のコンフォメーションがＲ状態にあるか、Ｔ状態にあるかによって決まる酸素化状態）および３）チオールがNO+の転移を促進するに足る濃度で存在するかどうか。
第１の要因の重要性は図4Aに示されている。Hb（FeII）O2とSNO-Hb［FeII］O2は血管収縮因子として作用するが、SNO-Hb［FeIII］（FeIIがFeIIIに酸化されたメト型）は血管拡張因子として作用する。図4Aは、ヘムに結合した酸素を持ちSNO/Hb比が2であるSNO-Hb［FeII］O2が強力な血管収縮因子として作用することを示している。
SNO-Hb（FeII）も血管拡張因子である。図2Bは、第２の要因を説明するものであり、RSNOの分解および転移速度が、オキシ状態にあるSNO-Hbよりもデオキシ状態にあるSNO-Hbの方がはるかに速いことを示している。
SNO-HbのNO+供与特性が酸素濃度にどのように依存するかがわかる。SNO-Hbは酸素濃度の低い部位または酸化条件下にある部位で酸素を放出する。SNO-HbはそのNO基を放出して、１）ヘムFeのFeIIIへの酸化または２）脱酸素化によるヘムからのO2の喪失のいずれかによる血管拡張を引き起こす。図2Bには、NOがデオキシ状態でもっともよくSNO-Hbから転移除去されることが示されている。虚血では、SNO-Hbが脱酸素化し、その後速やかにNOの喪失が起こる。このデータから、1SNO/SNO-メトHbの比を持つSNO-メトHbは、2SNO/SNO-オキシHbの比を持つSNO-オキシHbより強力な血管拡張因子であることがわかる。HbのＳ−ニトロシル化がR状態（オキシコンフォメーション）を誘導することに注目すべきである。したがって、1SNO/SNO-オキシHbの比を持つ１つのSNO-オキシHb分子は、0.1SNO/SNO-オキシHbの比を持つ10分子のSNO-オキシHbより効力が弱いことになる。
第３の要因は図4Bに示す結果によって例証される。これらの結果は、SNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb（FeIII）の血管拡張因子効果のチオールによる増強を証明している。SNO-Hbから低分子量ニトロソチオール類へのNO+の転移は、Hbがオキシ状態にあるときと比べてデオキシ状態にあるときの方が効率がよく（図2B）、また、オキシ状態にあるときと比べてメト状態にあるときの方が効率がよい（図4C）。
NOは、SNO-HbからNO+（ニトロシルカチオン）として放出または転移される。SNO-HbのSNO基はNO+特性を持つ。SNO-HbからのNO+の転移は、グルタチオンなどの小さなチオール類に対して最も効率よく起こり、ヘムが酸化されている場合（SNO-メトHb）または該SNO-Hbがデオキシ状態にある場合に最も効率がよい。
これらの発見がもたらす本発明の一態様は、小分子量チオール類をある形態のSNO-Hbと共に、NOの生理作用を必要とする哺乳動物に同時投与することにより、SNO-Hbから小さなチオール種へのNO+の転移を増大させ、それによって組識にNO生理活性を送達する治療法である。NO放出の効果をさらに増大させるためには、メトHbまたはデオキシHb（または等価なコンフォメーションまたはスピン状態）のSNO-型をチオールと共に投与することが好ましい（例えば図2Bを参照のこと）。SNO-メトHbとSNO-オキシHbの混合物、およびさらにチオールをも含む混合物を使用することもできる。これら成分の組成および比率は、その疾患状態に依存する。例えば、O2送達とNO送達の両方を増大させるには、SNO-オキシHbを使用することができる。例えば急性呼吸障害症候群のように、O2のさらなる送達が望ましくない場合は、メトHbおよびデオキシHbのSNO-型が特に好ましい。別法として、SNO/Hbの比率を調節することによって、O2放出を調節することもできる。
図4Aの血管環バイオアッセイのデータは、図５のイン・ビボのデータとよく一致している。実施例５に記載の実験の結果から、Hb（FeII）O2（オキシHb）がイン・ビトロと同様にイン・ビボでも血圧の上昇を引き起こすことが確認される。SNO-Hb（FeIII）（SNO-メトHb）は、イン・ビトロおよびイン・ビボで血圧の低下を引き起こす。SNO-Hb（FeII）O2（SNO-オキシHb）は、対応する血管環バイオアッセイで認められた張力の増大とは対照的に、イン・ビボでは血圧に対して無視しうる程度の効果しか持たない。SNO-オキシHbの場合、そのイン・ビボの効果は中性である。これは、ヘムに結合されることになるNOが引き起こす収縮効果が、脱酸素化時のNOの放出によって相殺されるということによって説明できる。したがって、SNO-オキシHbは血圧に最小限の効果しか与えずにO2を送達することができる。
本明細書に記載の結果を知れば、血管に対して収縮効果または拡張効果を持つ、あるいは血管に対して何の効果も持たない、予測されたNO放出特性を持つHbタンパク質を合成することができる。もう１つの選択は、酸素化型を作製して、それをO2送達が望ましい医学的状態に投与するか、脱酸素化型を作製して、それをO2送達が望ましくない医学的状態に投与するかの選択である。
特定の望ましいO2およびNO送達特性を持つ様々な修飾Hbを生産することができる。例えば、Ｒ状態にあるHb（オキシHb）は、いくつかの既知の方法により、Ｔ状態（デオキシHb）に変換することができる。これは、例えばイノシトール六リン酸とHbとの反応によって行なうことができる。また当業者には、例えばカルボキシペプチダーゼでHbを処理することなどにより、Ｒ状態にあるHbを製造できることも知られている。同様に、フェリシアン化物や亜硝酸塩を使用してメトHbを合成できることも知られている。
Ｔ状態に固定されたHb分子の製造は、NOの運搬体よりはむしろNOの生理活性供与体の形態で存続するRSNO-Hbの合成を可能にする。Ｒ状態に固定されたHbは、１分子あたりに最大量のNOを保持するRSNO-Hbを合成するための基質として使用できる。
本発明のもう１つの態様は、O2放出とNO放出を制御するために、Hbの１以上のチオール基が、ある程度に、特異的にＳ−ニトロシル化されている１以上の形態のHbからなる代用血液である。処置されるべき状態には、NOもしくはO2送達が望まれる状態、NOもしくはO2利用が望まれる状態、またはNOもしくはO2が過剰な状態がある。例えば、過剰な酸素フリーラジカルと過剰なNO・の存在を特徴とする医学的状態では、SNO-HbのヘムとSNO-Hbによって放出されるNOの両方が、酸素ラジカルを捕集するのに役立つ。ヘムFeは酸素フリーラジカルとNO・を捕捉する過程で酸化され、NOはチオールへの供与によって酸化型HbからRSNO+（非毒性）の形で放出される。例えば炎症と再潅流損傷は、過剰なNO生産と過剰な酸素フリーラジカルを特徴とする。種々の形態のHbは酸素フリーラジカルと遊離NOを捕捉し、NOを毒性でない形態に変換する。
本発明のさらなる態様は、ある形態のSNO-Hbからなる代用血液の投与に基づく、NO生理活性もしくはO2の送達またはその両方が有益な状態の治療法である。例えば、SNO-Hbは心筋梗塞の処置に有用である。SNO-HbはNOを供与し、血管を広げておく効果を有する。SNO-Hbは低酸素圧で脱酸素化して、酸素を送達すると共に同じ部位でNOを放出し、それによって血管拡張を引き起こす（例えば実施例７および図6A〜6Fを参照のこと）。SNO-Hbの投与と同時に、またはその前後に、チオールを投与することによっても、これらの効果を増大させることができる。例えば、心筋梗塞を処置する目的には、低いSNO/SNO-Hb比を持つ高濃度または高投与量のSNO-Hbがふさわしい。別法として、SNO-メトHbをこの目的に使用することもできる。
もう１つの側面として、本発明は、SNO-Hbを、そうしなければＳ−ニトロシル化されていないHbにおけるオキシHbからメトHbへの変換によって消費されるであろうニトロソ血管拡張薬（例えばニトログリセリン）と同時投与することにより、NO供与体療法を強化する方法でもある。
本明細書で使用するヘモグロビンまたはHbという用語には、突然変異型、化学修飾型、融合タンパク質のような遺伝子改変型、あるいは欠失型などといった変種型が含まれる。また、あらゆる種のHbおよびそれらの変種型も含まれる。これらの変種Hbの生物学的特性および/または化学的特性は、動物中に天然に認められるヘモグロビンの特性とは異なってもよい。
NOが生物学的系中で一酸化窒素ガスとしてだけではなく、種々の酸化還元型でも存在し、またＳ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソアミノ酸その他のＳ−ニトロソチオール種を含みうるＳ−ニトロソチオール類のような、一酸化窒素の生理活性付加物としても存在することは理解されるだろう（Stamler,J.S.,Cell,78:931-936（1994））。
代用血液は、酸素の運搬および/または送達、NOの運搬および/または送達、フリーラジカルの捕捉などといった、哺乳動物に認められる天然血液の１以上の機能を果たす生物適合性の液体でありうる。代用血液は、哺乳動物中に注入された時に天然の血液の１以上の機能を果たすような液体の１以上の成分からなってもよい。代用血液の例には、種々の形態のヘモグロビン製剤がある。かかる製剤は、低分子量チオールやニトロソチオールなどの他の生理活性成分をも含みうる。
医学的処置に使用される本発明の化合物と治療用製剤は、当業者が決定できる適当な組成物中で、治療的量で使用されるものとする。投与法は、その医学的障害に冒された部位または系に最も適した、当該技術分野で知られる方法である。
必要ならば、好適な医薬担体を、治療用製剤に使用する作用成分と混合してもよい。特定の場合の作用成分の実際量が、例えば、使用する特定成分、処方する特定の組成、投与法、患者の年齢、体重、状態などに応じて変化することは理解されるだろう。当業者は、従来の考察を用いることにより（例えば、適当な従来の薬理学的プロトコルを利用することにより）、特定の患者に対する投与量を決定することができる。
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、これらの実施例は決して限定を意図するものではない。
実施例
実施例１:NOおよびRSNOのHbとの相互作用
NOやRSNOなどの天然に存在するN-オキシド（Gaston,B.ら,（1993）;Scharfstein,J.S.ら,J.Clin.Invest.,94:1432-1439（1994）;Clancy,R.M.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3680-3684（1994））は、Hbとの反応に関して、著しく異なることが観察された。NOは、極めて迅速にデオキシHb（Hb［FeII］）に結合して比較的安定なHb［FeII］NO錯体を形成し（図1A）、オキシHb（Hb［FeII］O2をメトヘモグロビン（Hb［FeIII］）と硝酸塩に変換し（図1B）、過去の報告（Olson,（1981）;Toothill,C.,Brit.J.Anaesthy.,39:405-412（1967））を追認している。これに対し、RSNO種は、Hbのスルフヒドリル基とのニトロソ基転移反応に参加してＳ−ニトロソヘモグロビン（SNO-Hb）を生成することがわかり、デオキシHbまたはHb（FeII）O2いずれかのヘム中心とは反応しなかった（図1Cおよび1D）。
Ａ.NOのデオキシHbとの相互作用
一酸化窒素の濃度を増大させると、Hb（FeII）のインキュベーションにおいて、デオキシHb（Hb［FeII］）のHb（FeII）NOへの変換が観察される。ａ.デオキシHb。ｂ、ｃ、ｄ.それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のNOとHb（FeII）の反応混合物。反応生成物Hb（FeII）NOは、実質上、NOの添加の瞬間に（すなわち、装置の不感時間以内に）生成した。
Ｂ.NOのオキシHbとの相互作用
NOの濃度を増大させると、オキシHbのインキュベーションにおいて、オキシHb（Hb［Fe［II］O2）のメトHb（HbFe［III］）への変換が観察される。ａ.オキシHb。ｂ、ｃ、ｄ.それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のNOとオキシHbを含有する反応混合物。メトヘモグロビンの生成は、NOの添加の瞬間に（すなわち、装置の不感時間以内に）起こった。
Ｃ.Ｓ−ニトロソチオール類のデオキシHbとの反応
GSNO（表示）またはＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）のデオキシHbとのインキュベーションにおいて、Hb（FeII）のSNO-Hb（FeII）への変換が観察される。RSNOのHbのヘム官能基との相互作用は（あったとしても）ほとんどない。ａ.デオキシHb。ｂ、ｃ、ｄ.それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のGSNOとHb（FeII）の反応混合物。スペクトルは、ｂとｃでは60分間のインキュベーションの後、ｄでは15分後に記録した。反応生成物をさらに分析したところ、いずれの場合にも、ほどほどの量のSNO-Hbの生成が認められた。60分の時点でのｂ、ｃおよびｄにおけるSNO-Hb（S-NO/Hb）の収率は、それぞれ2.5%、5%および18.5%であった（図1Dおよび図2Aを参照）。
Ｄ.Ｓ−ニトロソチオール類のオキシHbとの相互作用
GSNO（表示）またはCYSNOのオキシHbとのインキュベーションにおいて、Hb（FeII）O2のSNO-Hb（FeII）O2への変換が観察される。Hb（FeII）O2のヘム中心におけるGSNO（またはCYSNO）の反応は（あったとしても）ほとんどない。すなわち、ヘムに対するO2結合能は、RSNO種によって影響されない。ａ.オキシHb。ｂ、ｃ、ｄ.それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のGSNOとオキシHbの反応混合物。スペクトルは、分光光度計中で60分間のインキュベーション後に記録した。反応生成物をさらに分析したところ、いずれの場合にも、SNO-Hbの生成が認めれられた。スペクトルｂ、ｃおよびｄにおけるSNO-Hbの収率は、それぞれ5%、10%および50%（S-NO/Hb）であった。他の５回の測定では、S-NO/Hbの収率は、GSNO（pH7.4、Hbに対して10倍過剰）を用いた場合で0.37±0.06、CYSNOを用いた場合で約2SNO／四量体（1.97±0.06）であった（下記参照）。最後に記したこれらのデータは、ヒトHbAが滴定可能なSH基を２つ含有するという報告と合致している。
方法
ヒトHbA0は、既に記述されているようにして赤血球から精製した（Kilbourn,R.G.ら,Biochem.Biophy.Res.Comm.,199:155-162（1994））。一酸化窒素溶液は厳密に脱気し、一般的な手法（Beckman,J.S.ら,Methods in Nitric Oxide Research,FeelischおよびStamler編,Wiley Chichester,英国（1996））に従って精製し、飽和溶液を気密シリンジに移した。Hbの脱酸素化は、過剰の亜ジチオン酸塩の添加（NO研究）、もしくはツンベルグ管での脱気によるHb（FeII）O2の還元（RSNO研究;RSNO種は亜ジチオン酸塩と反応するため）によって行なった。RSNO種は既に記述されているように合成した（Gaston,B.ら,（1993）;ArnelleおよびStamler,（1995））。HbA0とのインキュベーションは、リン酸緩衝液pH7.4、0.5mM EDTA中で行なった。SNO-Hbの定量は、セファデックスG-25カラムでタンパク質を精製した後、Savilleの方法（Gaston,B.ら,（1993）;Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:444-448（1992））に従って行なった。溶液中の遊離NOxを分析するSaville法には、スルファニルアミドとのジアゾ化反応と、それに続く発色団N-（ナフチル）エチレンジアミンとのカップリングが必要である。低分子量S-NO複合体はいずれもこの精製過程には耐えず、すべての活性は沈澱可能な蛋白質であった。反応とスペクトルは、Perkin Elmer UV/Vis Spectrometer,Lambda 2Sを用いて行なった。
実施例２:Hb  Ｓ−ニトロシル化の調節に関するO2のアロステリック機能
Hbの酸素化は、アルキル化試薬に対するcys β93の反応性を増大させるコンフォメーション変化を伴う（Garel,C.ら,J.Biochem.,123:513-519（12982）;Jocelyn,P.C.,Biochemistry of the SH Group,Academic Press,ロンドン,243頁（1972）;Craescu,C.T.ら,J.Biol.Chem.,261:14710-14716（1986））。この効果の生理学的意義は決して確立されていなかった。本発明者らは、HbのＳ−ニトロシル化速度がコンフォメーション状態に著しく依存することを観察した。オキシコンフォメーション（Ｒ状態）では、Ｓ−ニトロシル化がデオキシコンフォメーション（Ｔ状態）よりも速かった（図2A）。Ｓ−ニトロシル化の速度は、どちらのコンフォメーションでも、アルカリ条件（これは、アルカリ条件下でなければＣ末端のヒスチジン146 βによって反応から遮蔽されているcys β93を露出させる傾向がある）によって加速された（すなわちpH9.2での速度＞pH7.4での速度）。このヒスチジン残基を拘束している塩橋（asp β94---hisβ146）は高pHで緩やかになる。これらのデータは、Ｒ状態に伴うチオール反応性の増大が、少なくとも部分的には、コンフォメーションが誘導するpKの変化よりはむしろ、NOの接触が改善されることに由来することを示唆している。
Ａ.酸素化はHbのＳ−ニトロシル化を加速する
Ｓ−ニトロソシステイン（CYSNO）によるHb  Ｓ−ニトロシル化の速度は、デオキシ状態（Hb［FeII］）よりもオキシコンフォメーション（Hb［FeII］O2）にある場合の方が速い。
方法
インキュベーションは、タンパク質（50μM）に対して10倍過剰のCYSNOを用いて、曝気した2%ホウ酸塩、0.5mM EDTA中（オキシHb）、もしくは迅速なO2排気後のトノメーター中（デオキシHb）で行なった。表記の時間に、試料をG-25カラム（リン酸緩衝食塩水、0.5mM EDTA、pH7.4で予め平衡化）に通して迅速に脱塩してCYSNOを除去し、Savilleの方法（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））によってSNO-Hbを分析した。
Ｂ.脱酸素化はHbの脱ニトロシル化を加速する
RSNO分解（および転移）の速度は、オキシ状態［SNO-Hb（FeII）O2］よりもデオキシコンフォメーション［SNO-Hb（FeII）］にある場合の方がはるかに速い。SNO-Hb（FeII）の分解は、過剰のグルタチオンの存在によってさらに加速される。我々の測定の不感時間（約15秒）以内に、SNO-Hb（FeII）の大部分がGSNOに変換された。
方法
PBS（0.5mM EDTA、pH7.4）中のHbを、空気下（オキシ）または予めO2を排気したトノメーター中（デオキシ）でインキュベートした。SNO-Hb（FeII）O2分解はSavilleの方法（Saville,B.,Analyst,83:670-672（1958））によって測定した。SNO-Hb（FeII）の自発的分解を、Hb（FeII）NOの生成により、分光測光法で追跡した。グルタチオンとのニトロソ基転移反応は、タンパク質（50μM）に対して100倍過剰のグルタチオンを添加することによって行ない、その反応混合物を嫌気条件下に直ちに処理し、迅速なTCA沈澱を行い、上清中のRSNOを分析した。NO基転移の速度は速すぎて、この研究で使用した標準的方法では正確には測定できなかった。
実施例３:生理学的系におけるHbのシステイン残基とのNO関連相互作用
Hbは、主として赤血球に含まれることから、細胞内タンパク質のＳ−ニトロシル化を起こす可能性のある機構を探究した。酸素化したラット赤血球のＳ−ニトロソシステインとのインキュベーションにより、極めて迅速な細胞内SNO-Hb（FeII）O2の生成が起こった（図3A）。Hbの迅速な酸化は、これらの条件下で観察されなかった。また、赤血球内SNO-Hbは、赤血球をＳ−ニトロソホモシステインまたはＳ−ニトロソシステイニルグリシンで処理した場合にも生成したが、Ｓ−ニトロソグルタチオン（GSNO）で処理した場合には生成しなかった。したがって、RSNOの赤血球接触は、チオール基特異的である。酸素化した赤血球をNOにさらすと、主としてメトHb生成が起こった。
内皮由来弛緩因子（EDRF）とヘモグロビン
内皮依存性弛緩のHb媒介的阻害は、一般にNO応答のマーカーとして使用されている。Hbの金属中心またはチオール中心との反応は、NO/EDRF（内皮由来弛緩因子）応答の減衰をもたらすはずであるから、本発明者らは、阻害の分子的根拠を解明しようとした。β93チオール基がN-エチルマレイミド（NEM）で遮断されているHb調製品、またはヘムがシアンメト（FeIIICN）誘導体化によって遮断されているHb調製品を大動脈環バイオアッセイで調べ、それらの活性を天然Hbの活性と比較した。シアンメト-HbとNEM-Hbは共に、血管緊張の増大を引き起こし、アセチルコリン（EDRF）が媒介する弛緩を減衰させた（図3B）。しかし、天然Hbは、修飾されたHb調製品のいずれよりも有意に有効であった（図3B）。総合すると、これらの研究は、Hbのチオール基と金属基が共にそのNO関連活性に寄与することを示唆している。HbにおけるＳ−ニトロソチオールの生成を立証するために、本発明者らは胸部大動脈の2cm切片をタイゴン管に挿入し、そのタイゴン管を通して、Hb（4μM）およびACh（2μM）を含む3ccのクレブス溶液をローラーポンプで循環（1.5cc/分×５分）させるバイオアッセイを確立した。流出液を分析（Baston,B.ら,（1993））したところ、５実験中５実験でSNO-Hb（20±4nM）の生成が認められた。
Ａ.赤血球内HbのＳ−ニトロシル化
ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル;リン酸緩衝液pH7.4、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内SNO-Hb（FeII）O2が迅速に生成する。メトHbは迅速には生成しない。G-25カラムを通して細胞内RSNO種を分離すると、ほとんどの時点で、低分子量Ｓ−ニトロソチオール（例えばGSNO）として存在するのはわずかな割合にすぎないことがわかる。60分までに、Hbの４つの利用可能なSH基のうち３つがＳ−ニトロシル化される（ラットHbは４つの反応性SH基を含有することに注意）。挿入図は、ラット赤血球から単離したSNO-Hbのスペクトルおよびそれに関連する分析を示す。スペクトルＡは、G-25クロマトグラフィー後に赤血球から単離したSNO-Hbのスペクトルである。Ａを亜ジチオン酸塩で処理するとS-NO部分の還元が起こって遊離のNOが放出され、それがデオキシHbによって自己捕捉されてHb（FeII）NOが生成する（亜ジチオン酸塩が同時にHbを脱酸素化することに注意）（スペクトルＣ）。このスペクトル（Ｃ）は、四量体あたり約３個のS-NOの化学量論を示している。比較のために、四量体あたり４個のNOを含有するHb（FeII）NOのスペクトルを示す（挿入図、スペクトルＢ）。
方法
表記の間隔で、赤血球を遠心分離によって迅速にペレット化し、３回洗浄し、４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25カラムに通して迅速に脱塩した。細胞内SNO-Hbを、Savilleの方法（Gaston,B.ら,（1992）;Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））で測定し、前記のように分光法（挿入図）で確認した。
Ｂ.EDRF/Hb相互作用の分子的根拠
EDRF応答に対する天然Hbの効果を、チオールまたはヘム中心がそれぞれアルキル化もしくはシアンメト誘導体化によって遮断されているHb調製品と比較した。いずれのHb調製品も収縮を引き起こしたが、天然Hb（SH中心と金属中心が共に自由に相互作用できる）による収縮が最も著しかった。同様に、アセチルコリン（ACh）が媒介する弛緩も、天然Hbによって最も効率よく阻害された。シアンメトHb（CN-Hb）（ヘムが反応から遮断されている）とNEM-Hb（チオール基がN-エチルマレイミドによってアルキル化されている）では、弛緩が阻害される程度が低かった。これらのデータは、Hbのヘムとβ93SH基の両方が、EDRF応答の反転に寄与することを例証している。同様の条件下でEDRFから生成するSNO-Hbの直接測定は、本文（the text）に記述されている。
方法
ウサギの胸部大動脈を3mmの環に切断し、等尺性緊張の測定用の力変換器（モデルFT03、Grass Instruments、マサチューセッツ州クインシー）に取り付けたスターラップに装着した。このバイオアッセイ系の詳細は、既に記述されている（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））。シアンメトHbは、ヒトHbAから、公表された手法（Kilbourn,R.G.ら,Biochem.Biophys.Res.Comm.,199:155-162（1994））に従って調製した。HbAをN-エチルマレイミドでアルキル化した後、G-25セファデックスに通して脱塩して、過剰のNEMを除去した。修飾されていないHbcys β93の除去は、Hg含有アフィニティーカラムを通すことによって達成した。遊離SH基のアルキル化は、5,5’-ジチオ-ビス［2-ニトロ安息香酸］を用いて確認した。
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実施例４:SNO-Hb血管活性の伝達
動脈赤血球は生理学的に重要な２つの形態のヘモグロビン、Hb（FeII）O2とHb（FeIII）を含有する（Antoniniら（1971））。赤血球内HbのＳ−ニトロソチオール含量に関する動脈-静脈差は、NO基が赤血球輸送の間に放出されることを示唆している。これらの発見から、おそらくはヘムの酸化還元状態とリガンドによるその占有が、機能的結果に影響を与えるのだろうという可能性が生じる。興味深いことに、血管環バイオアッセイで調べた場合、SNO-Hb（FeII）O2は、あまり強くないNO様活性を持つことがわかった。すなわち、SNO-Hb（FeII）O2が引き起こす収縮は、天然Hb（FeII）O2の場合より少なく、Ｓ−ニトロシル化がHbの収縮作用を一部反転させることを示した（図4A）。これに対し、SNO-Hb（FeIII）は、血管拡張因子であることがわかった（図4A）。遊離のNOがHb（FeII）O2またはHb（FeIII）の存在下に弛緩因子活性を全くもたなかったことは注目に値する（記載なし）。
赤血球はmM濃度のグルタチオンを含有する。RSNO種間の平衡はRSNO／チオール交換によって迅速に確立されるので（ArnelleおよびStamler,J.S.,Arch.Biochem.Biophy.,318:279-285（1995））、SNO-Hbの血管活性をグルタチオンの存在下で再評価した。図4Bは、グルタチオンがSNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb（FeIII）両方の血管拡張因子活性を強化したことを示している。これらの条件におけるGSNO生成（化学的実験とバイオアッセイ試験によって確認した）は、この効果の完全な説明となるようであった。さらに速度論的な分析を行なったところ、グルタチオンが関与するニトロソ基交換は、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb（FeIII）との平衡により強く偏っていることがわかった（図4c）。赤血球におけるSNO-Hbの定常状態レベルに関する発見（表２および図3A）からすると、これらの結果は、１）天然に存在するRSNO種とHb（cys β93）の間の平衡が生理学的条件下ではSNO-Hb側にあること、２）SNO-HbとGSHが関与するニトロソ基転換反応が赤血球内で起こるらしいこと（実際、本発明者らはSNO-Hbを負荷した赤血球中に低分子量RSNO種が存在することを立証した）、および３）Hbの金属中心の酸化が平衡をGSNO側に移動させ、それによって生理活性に影響を与える可能性があることを示唆している。
SNO-HbからのNO基放出のもう１つの機構を探求した。SNO-Hbのレベルに関する動脈-静脈差から、S-NO結合の安定性が脱酸素化に付随するHbコンフォメーションの変化によって調節されるのかもしれないという可能性が生じた。この可能性を検討するために、本発明者らは、SNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb（FeIII）からのNO基放出速度を比較した。脱酸素化はSNO-Hbの分解速度を増大させることがわかった（図2B）。これらの速度は、GSNOを与える反応ではグルタチオンにより著しく加速された（図2B）。本発明者らの結果は、O2-金属相互作用がS-NO親和力に影響を与えることを示しており、Hbの新しいアロステリック機能を示唆している。
SNO-Hbが生理学的な意義を持つには、そのNO関連活性が赤血球膜を横切って伝達されなければならない。そこで、SNO-Hbを含有する赤血球を生理学的緩衝液中でインキュベートし、細胞外RSNO種の蓄積を経時的に測定することにより、この可能性を調査した。図4Dは、赤血球が低分子量の（トリクロロ酢酸沈澱可能な）Ｓ−ニトロソチオール種をこれらの条件下に輸出することを示している。重要なことに、これらの実験における溶血の程度がわずか（＜0.5%）であり、溶解に関する補正はRSNO放出速度に有意な影響を与えなかった。これらの結果により、赤血球内で低分子量RSNO種とタンパク質RSNO種の間に平衡が存在すること、および細胞内に位置することが、血管壁へのNO関連活性の伝達に関して制限的な因子ではないらしいことが確認される。
Ａ.異なるSNO-Hb調製品の濃度−作用応答
Hb（FeII）O2（▲）の収縮作用は、Ｓ−ニトロシル化によって一部反転されることがわかる（SNO-Hb［FeII］O2（■）;Hb（FeII）O2に対してＡＮＯＶＡでP=0.02）。SNO-Hb（SNO-Hb［FeIII］（●））の金属中心の酸化は、このタンパク質を、他のＳ−ニトロソタンパク質種（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））と同等の効力を持つ血管拡張因子に変換する（SNO-Hb［FeII］O2に対してＡＮＯＶＡでＰ＜0.0001）。比較のため、Hb（FeIII）の収縮特性を示す（□）;各データポイントにつきｎ＝６〜17。
方法
この血管環バイオアッセイの詳細は公表されている（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））。SNO-Hb（FeII）O2調製品は、Hb（FeII）O2タンパク質に対して10倍過剰のＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）を使用して合成（2%ホウ酸、0.5mM EDTA、約15分保温）した後、セファデックスG-25カラムを通して脱塩を行なった。CYSNOは、0.5N HCl、0.5mM EDTA中で合成した後、0.5mMのEDTAを含む1Mリン酸緩衝液中で中和（1:1）した。SNO-Hb（FeIII）調製品は同様の手法で、ただしHb（FeIII）を出発物質として、調製した。後者はHb（FeII）O2を過剰のフェリシアン化物で処理した後、G-25カラムに通して脱塩することにより合成した。SNO-Hb濃度は分光法で確認し、Ｓ−ニトロソチオール含量はSavilleの方法（Stamler,J.S.ら,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））によって決定した。S-NO／四量体化学量論は、どちらのSNO-Hb調製品についても約2だった。ヘムの酸化はuv-分光測光法では検出不可能だった。
Ｂ.グルタチオンによるSNO-Hb作用の増強
バイオアッセイ槽にグルタチオン（100μM）を添加すると、SNO-Hb（FeII）O2（■）とSNO-Hb（FeIII）（●）に対する用量-応答が共に増強される（ｎ＝６〜12;ａの各軌跡と比較してどちらの場合もＡＮＯＶＡによりｐ＜0.0001）。グルタチオンは、いくつかの実験で基礎緊張に対して一時的な影響を持ち、Hb（FeII）O2（▲）に対する応答には有意な影響を与えなかった。
Ｃ.SNO-Hbとグルタチオンの間のニトロソ基交換
SNO-Hb（100μM）からグルタチオン（10mM）へのNO基転移の速度を、SNO-Hb（FeII）O2（オキシ）とSNO-Hb（FeIII）（メト）について示す（ｎ＝５）。データは、出発SNO-Hb濃度に対する生成したGSNOの量として表わしてある。この転移は、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb（FeIII）の場合の方が速く（ＡＮＯＶＡによりｐ＜0.002）、GSNO/SNO-Hb平衡がメトHbの生成によりGSNO側にシフトすることが示唆される。
方法
GSNOが生成するチオール/SNO-Hb交換は、トリクロロ酢酸沈澱後にしたがって、化学的に立証された（Stamler,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:444-448（1992））（ｎ＝５）。これらの結果は、別個の実験で、反応混合物をG-25カラムに通して分離した後、残存するSNO-Hb濃度を測定することによって検証した。
Ｄ.赤血球によるＳ−ニトロソチオール種の輸出
SNO-Hbを含有するヒト赤血球が、経時的に低分子量RSNO種を輸出することを示している。溶血は、１時間で０〜＜0.5%の範囲にあって、RSNO放出速度とは相関せず、測定された細胞外RSNOのごく一部の原因にしかならなかった。
方法
遠心分離によって保存用ヒト赤血球を得、洗浄し、5mM SNOCYSを含むリン酸緩衝食塩水（0.5mM EDTA、pH7.4）中に１時間再懸濁した。これにより、0.5 S-NO／四量体の化学量論を持つSNO-Hb（FeIIO2/FeIII混合物）を含む赤血球調製品が得られる。次に、その赤血球を繰返し洗浄することにより、残存するCYSNOを除去し（確認した）、その赤血球をクレブス溶液中（1:4）でインキュベートした。細胞外RSNOの蓄積を、Savilleの方法（Saville,B.,Analyst,83:670-672（1958））で経時的に測定した。遠心分離の後、赤血球上清を分光法で分析することにより、溶血を測定した。
実施例５:in vivoでのSNO-Hb生理活性
無細胞Hbの全身投与は、高血圧応答をもたらすが、これはNOがヘムによって捕捉されるからであるとされている（Vogel,W.M.ら,Am J.Physiol.,251:H418-H420（1986）;Olsen,S.B.ら,Circulation,93:329-332（1996））。SNO-Hbがこの有害な影響を持たないかどうかを決定するため、また、NO放出のin vitro機構がin vivo環境にも及ぶかどうかを調べるため、麻酔したラットの大腿静脈にボーラスとして注入したHbとSNO-Hbに対する応答を比較した。図５に示すように、Hb（FeII）O2（200nmol/kg）は、平均動脈圧に20±3mmHgの上昇をもたらした（ｎ＝４;Ｐ＜0.05）。これに対して、SNO-Hb（FeII）O2は、高血圧作用を示さず、SNO-Hb（FeIII）は、低血圧応答を引き出した（図５）。したがって、これらの化合物のin vivoでの特性は、in vitroで認められたもの（図4A）とよく似ている。さらに、赤血球の生理学的応答が無細胞Hb調製品と同等であることを立証するために、SNO-Hbを含有する赤血球を、L-NMMA（50mg/kg）で予備処置して内因性RSNO種を枯渇させたラットの大腿静脈に注射した。正常なラットに認められるレベルと同等なSNO-Hbレベル（0.1〜0.5μM）で、SNO-Hb含有赤血球は、低血圧応答を引き出したが（8±1mmHg;平均±SEM;ｎ＝９）、天然（SNO-Hb枯渇）赤血球はそのような応答を引き出さなかった（Ｐ＝0.001）。これら約10%の平均血圧変化は、人間の高血圧と正常血圧を区別する変化にほぼ相当し、いくつかの抗高血圧治療の治療範囲内にある。HbとSNO-Hbの効果はいずれも（無細胞であるか、赤血球内に含まれるかにかかわらず）一過性であり、このことは、HbのＳ−ニトロシル化とSNO-Hbの代謝がin vivoで起こって、それが血圧の復旧をもたらしていることを示唆している。S-NO／ヘム化学量論がほぼ1:50,000である血液中でのSNO-Hbの生理活性は、Hb（Fe）不活化に対するこのNO関連活性の抵抗性の劇的な実例である。
無細胞HbとSNO-Hbのin vivo効果
スプレーグ・ドーリーラットの大腿静脈に2〜200nmol/kgのHb（FeII）O2を（ボーラスとして）投与すると、平均動脈圧が用量依存的に上昇することが示される。200nmol/kgでは、平均動脈圧が25mmHg（20±3mmHg;ｎ＝４;Ｐ＜0.05）上昇した。血圧の上昇は、10〜15分以内に反転した。（同じ用量範囲での）SNO-Hb（FeII）O2注入は、明白な血圧変化を引き起こさず、Hb（FeII）O2によって誘発される高血圧を改善することが示される。より高い投与量でも、同様の応答が認められた。これに対し、SNO-Hb（FeIII）注入は、最高投与量（200nmol/kg）で平均動脈圧の有意な低下（前108±5mmHg;後74±6mmHg、ｎ＝５;Ｐ＜0.05）を引き起こした。高血圧応答は、一過性の傾向があり、10分間で血圧が正常化した。血圧の減少は、SNO-Hbを含有する赤血球の注射でも認められた。
方法
ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により、大腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould記録計を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した。データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。
実施例６:Ｓ−ニトロソチオール種の赤血球への負荷
ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル;リン酸緩衝液pH7.4、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内Ｓ−ニトロソチオール種の迅速な生成が起こる。メトHbは迅速には生成しない。細胞内容物をG-25カラムに通して分離すると、赤血球内低分子量Ｓ−ニトロソチオール、例えばＳ−ニトロソグルタチオン（GSNO）の生成が確認される。２分までに、mM程度のGSNOを得ることができる。
RSNOのアッセイ法
Ｓ−ニトロソシステイン（5mM）処理した赤血球を遠心分離によりすばやくペレット化し、３回洗浄し、４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25カラムに通してすばやく脱塩する。細胞内RSNOはSavilleの方法で測定し、分光法で確認することができる。
負荷赤血球からの血圧に対する効果
（SNO-RBCを調製するために）Ｓ−ニトロソシステイン（S-nitroscysteine）で処理し、スプレーグ・ドーリーの大腿静脈に導入した赤血球は、用量依存的に平均動脈圧を低下させた。SNO-Hbが0.3μM（内因性in vivo SNO-Hb濃度）でアッセイされた赤血球の場合、動脈圧は8±1mmHg（９回の実験に関する平均±SEM;非処置赤血球対照と比較してｐ＜0.001）低下した。SNO-Hbで0.5μMと測定された赤血球の場合、動脈圧が10mmHg低下した。SNO-Hbが0.1μM（内因性SNO-Hb濃度未満）で測定された赤血球の場合は、動脈圧が6mmHg低下した。非処置赤血球の投与は、動脈血圧に何の効果も持たないか、もしくはわずかに上昇させた。L-モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA;50mg/kg）の投与は、約20mmHgの血圧上昇を引き起こした。負荷赤血球のボーラス投与による血圧の変化は、15〜20分間持続した。
その他の方法
ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により大腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould記録計を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した。データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。
実施例７:冠状動脈血管拡張、冠状動脈流および血圧に対するSNO-Hbの効果
SNO-Hbを実施例4Aに記述したように合成した。反応の完了は、実施例4Aに記載のように決定した。24頭の健康な雑種犬（25〜30kg）を静脈内チアミラルナトリウム（60〜80mg/kg）で麻酔し、第４肋間腔に左開胸術を施した。左過剰耳より遠位の左回旋冠状動脈を最小限切開した。一対の7-MHz圧電性結晶（1.5×2.5mm、15〜20mg）をダクロン裏材に取り付け、切開した血管部分の反対側表面の動脈血管外膜を6-0プロレンで縫合した。オシロスコープ監視とオンライン音波測微法（ソノミクロメーター120-2、Triton Technology,カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、適切な結晶位置を確保した。パルスドップラー流量プローブ（10MHz、加圧帯型）を結晶より遠位に埋め込んだ。膨張型気球閉塞具も流量プローブより遠位に設置した。結晶と閉塞具の間にある回旋動脈の全ての分岐を結紮した。ヘパリンナトリウム充填ポリビニルカテーテルを、尖から左心室腔内に、過剰耳から左心房に、左内胸動脈から上行大動脈に挿入した。カテーテル、管および線材は、首の付け根にある皮下嚢までくぐらせた。
10〜15日の回復期間後に、カテーテルと線材を全身麻酔下に体外に出し、２〜３日後に、各犬にSNO-Hb（0.4mg）のボーラス注射を与えて血管応答を評価した。5%未満の心外膜冠状血管拡張を示した２頭の犬を以降の試験から除外し、別の技術的理由で２頭を除外した。
犬を緩く拘束して外側横臥位に目をさましたまま横たわらせながら、調教し、研究した。実験室は薄暗く照明し、静かに保った。大動脈圧、左心室端-拡張期圧dP/dt、冠状動脈外径および冠状動脈流を連続的に監視した。10頭に、0.1mlのSNO-Hb溶液（50nM/kg）を左心房カテーテルから注射した。脈管構造に対する溶媒の潜在効果を確かめるために、蒸留水中の30%エタノール0.1mlを賦形剤対照として与えた。注射の間に、位相性冠状血流（phasic coronary blood flow）と冠状動脈直径を注射前のレベルに戻らせた（最低15分間）。注射間に15分の間隔を置くと、反復注射（repeated does injections）に変化が起こらなかった。コンダクタンス血管（conductance vessels）に対するSNO-Hbの直接的血管拡張効果と潜在的な流量媒介性の間接的血管拡張効果を評価するため、冠状血流が注射前のレベルかそれよりわずかに低く維持されるように可調式閉塞具を一部膨張させながら、10頭中６頭に投与を繰返した。塩化アセチルコリン（Sigma Chemical）に対する応答を、SNO-Hbの場合と同様の操作を行なった後、10頭の別の群で評価した。
心外膜冠状動脈直径、冠状血管流、心拍数、大動脈および左心室端-診断圧（diagnostic pressure）を各SNO-Hb注射の前後で比較した。冠状動脈寸法と血流の最大変化を、増大するSNO-Hb投与量の関数として表した。増大する投与量に対する冠状動脈寸法の応答は、下記の等式で記述しうる独特なＳ字型用量-応答曲線に従った:
0004262308.tif 000003
［式中、KDは薬物-受容体複合体解離定数であり、最大応答の50%が達成される投与量（EC50）である］。各動物で、その用量-応答曲線に対して非線型最小二乗回帰（r2＞0.90）を行なった。この回帰は上記の等式に束縛された。次に、これらの値の平均値を計算し、各試験群について平均KDと最大応答を得た。これらの値を用いて平均曲線を作成し、平均用量-応答値と共にプロットした（図6A〜6Fを参照のこと）。
実施例８:血液におけるＳ−ニトロソヘモグロビンとニトロシル（FeII）-ヘモグロビンの内因性レベル
SNO-Hbが血液中に天然に存在するかどうか、また天然に存在するならば、そのO2輸送能との関係および赤血球のニトロシル化ヘム含量を決定するために、本発明者らは、赤血球のＳ−ニトロソチオールおよびニトロシル-ヘム含量をアッセイするための分析法を開発した（表２）。麻酔したラットの左心室から直接穿刺によって動脈血を得、頚静脈（juglular vein）と下大静脈から静脈血を得た。次に、赤血球からHbを精製し、RSNO含量と（FeII）NO含量を測定した。動脈血には有意なレベルのSNO-Hbが含まれていたが、静脈血では実質上検出できなかった（表２）。NOシンターゼ阻害因子Nω−モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA）を注入（50mg/kg）した45分後に行なった測定は、SNO-Hbと総Hb-NOの枯渇を示した（それぞれ82および52±18%;ｎ＝３〜５;ｐ＜0.05）。これらのデータは、多少の環境的寄与は排除されないものの、SNO-Hbの内因性起源を確立するものである。SNO-Hbについて認められた動脈-静脈分布は、Hb（FeII）NOの場合は逆転し、Hb（FeII）NOは、部分的に脱酸素化された（静脈）赤血球中に、より高い濃度で検出される（図２）。したがって、ニトロシル化されたタンパク質チオールとヘムの比率は、血液の酸素化状態に依存するようである。これらの発見と一致して、Wennmalmとその共同研究者らは、Hb（FeII）NOが主として静脈（部分的に脱酸素化された）血液中で生成することを示している（Wennmalm,A.ら,Br.J.Pharmacol.,106（3）:507-508（1992））。しかし、Hb（FeII）NOのin vivoレベルは、一般的には低すぎて（EPRで）検出することができず、SNO-HbはEPRサイレントである（すなわち常磁性でない）。したがって、光分解-化学発光法は、重要な技術的進歩を意味する。というのは、これが、正常な生理学的条件でHbに対するNO結合を定量的かつ機能的に評価することができる最初の方法論だからである。
方法
麻酔したスプレーグ・ドーリーラットの左心室（動脈血）および頚静脈（静脈血）から血液を得た。同等の静脈値は下大静脈由来の血液中にも得られた。赤血球細胞を800gで遠心分離することによって単離し、４℃のリン酸緩衝食塩水中で３回洗浄し、0.5mM EDTAを含む脱イオン水４倍量を添加することにより溶解し、Penefskyの方法に従って４℃で、G-25カラムにすばやく通して脱塩した。24匹のラットで、Hb試料を２等分した後、それらを、Bradfordの方法で測定したタンパク質濃度に対して10倍過剰量のHgCl2で処理し、もしくは処理しなかった。SNO-HbとHb（FeII）NOの測定は、下記の光分解−化学発光法によって行なった。さらに12匹のラットで、HgCl2処理後に亜硝酸塩をアッセイすることにより、SNO-Hbの存在をさらに確認した。具体的に述べると、試料（HgCl2を含むものと含まないもの）を４℃で１時間、Amicon-3（セントリコンフィルター、分子量カットオフ3,000）に通して分離し、低分子量画分を0.5N HCl中の1μMグルタチオンを含む気密シリンジに集めた。これらの条件下で、存在する亜硝酸塩はすべて、Ｓ−ニトロソグルタチオンに変換され、それを光分解-化学発光法で測定した（検出限界約1nM）。SNO-Hbはすべての動脈試料中に存在し、この方法で決定されたレベル（286±33nM）は実質上同一で、表２に示すレベルと統計学的に相違しなかった。静脈血では、SNO-Hbが検出不能（0.00±25nM）で、そのレベルは上記のレベルと統計学的に相違しなかった。
Ｓ−ニトロソヘモグロビンのアッセイ法
高感度な光分解-化学発光法を使用した。多少類似するアッセイ法が、生物学的系中のRSNO種（Ｓ−ニトロソチオール種）を測定するために使用されている（Gaston,B.ら,（1993）;Stamler,J.S.ら,（1992））。この方法では、NOをチオールから光分解的に遊離させ、それをオゾンとの反応により化学発光分光計で検出する。これと同じ操作原理は、ニトロシル-金属化合物からのNOの切断（および測定）にも使用できる（Antonini,E.Brunori,M.Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands,American Elsevier Publishing Co.,Inc.,ニューヨーク,（1971）の29〜31頁）。光分解セル内の流速を調節することにより、Hb（FeII）NOのNOリガンドの完全な光分解を達成することができる。SNO-Hb、Hb（FeII）NOおよびＳ−ニトロソグルタチオンの合成調製品から作成した標準曲線は、直線（Ｒ＞0.99）で、実質上重ね合せることができ、約1nMの感度限界を示した。２つの分析基準、すなわち１）SNO-Hbからの信号は、10倍過剰のHgCl2で試料を予備処理することによって除去されたが、Hb（FeII）NOは、水銀試験に対して耐性であったこと、および２）HgCl2によるSNO-Hbの処理は（一般的なグリース反応により）定量的な収量で亜硝酸塩を生じるが、Hb（FeII）NOを同様に処理しても亜硝酸塩は生じないことによって、SNO-HbとHb（FeII）NOが確実に識別されることを発見した。UV/VIS分光法により、NOが過剰のHgCl2の存在下にヘムに結合したままであることが確認された。
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均等物
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細書に記載されている本発明の特定の態様に対して多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのようなおよび他のすべての均等物は、以下の請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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