(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４のヌクレオチド４３〜３３２７、配列番号１４のヌクレオチド４３〜３３２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドの相補体、または少なくとも３０ヌクレオチド長のその連続するフラグメントに、少なくとも９５％の配列同一性を有する、単離されたポリヌクレオチドであって、ここで％同一性が、ＦＡＳＴＡ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０の一式のプログラムのようなパラメーターセットに見出されるＬＡＬＩＧＮプログラムを用いて、ＢＬＯＳＵＭ５０マトリックス、２のｋｔｕｐおよび−１２／−２のギャップペナルティーであるデフォルトパラメーターを用いて計算されるものであって、該単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド４３〜３３２７に対して、５×ＳＳＰＥ中での６５℃におけるハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＰＥ中で６５℃の洗浄条件という高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４】
請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、該核酸が、該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドを産生するためのプロセスであって、該プロセスは以下の工程：
（ａ）該前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの発現に適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）該前立腺腫瘍抗原ポリペプチドを、細胞培養物から回収する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項７】
図１１（配列番号１５）のアミノ酸残基１〜１０９５、および少なくとも１０アミノ酸長のその連続するフラグメントと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離された前立腺腫瘍抗原ポリペプチドであって、該ポリペプチドが抗原性である、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
図１１（配列番号１５）のアミノ酸残基１〜１０９５を含む、単離された前立腺腫瘍抗原ポリペプチド。
【請求項１０】
異種アミノ酸配列に融合した請求項９に記載の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドを含む、キメラ分子。
【請求項１１】
請求項９に記載の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１２】
個体中の前立腺腫瘍抗原の発現を検出するための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）第１の個体由来の組織中の前立腺腫瘍抗原の発現を測定する工程であって、該前立腺腫瘍抗原は、配列番号１５のポリペプチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、工程；ならびに
（ｂ）該発現と、第２の罹患していない個体由来の組織中の該前立腺腫瘍抗原の発現とを比較する工程であって、ここで該第１の個体からの該前立腺腫瘍抗原の発現が、該第２の個体中の前立腺腫瘍抗原の発現よりも多い場合、該第１の個体は、前立腺腫瘍抗原関連状態の危険性がある、工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
組織サンプル中の腫瘍細胞を検出する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該サンプルから生成された核酸を、２つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する工程であって、該２つのプライマーは、配列番号１４、または該配列の１つの部分を選択的に増幅するように設計される、工程；ならびに
（ｂ）該配列の少なくとも１つに対応する増幅産物またはその増幅された部分の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、前立腺腫瘍に由来する新規のコード配列およびペプチド、ならびにこのような腫瘍細胞の存在を検出するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
前立腺ガンは、合衆国において、毎年、約２５０，０００人の男性が罹患するガンの一形態であり、アメリカ人において最も高い頻度のガンの１つである。これはまた、この国における男性のガンに関連する死亡の第２の主要な原因でもある。前立腺ガンの５年間の生存率は、数十年にわたって一般的には改善されてきているが、進行した転移性形態の疾患の処置は、有意には改善されていない。
【０００３】
それゆえ、前立腺ガンの早期の検出および処置が、この疾患のさらなる蔓延および死亡率を防ぐための、最も有効な処置の１つであるままである。悪性腫瘍の特徴である多数のタンパク質抗原が見出されているが、前立腺腫瘍は、この疾患の検出および／または免疫療法(例えば、受動免疫療法による）に使用され得る標的抗原の特に豊富な供給源ではなかった。
【０００４】
それゆえ、前立腺ガンの早期検出において使用され得る１つ以上の疾患特異的分子または抗原を提供することが有用である。本発明は、前立腺ガンの診断および処置の両方に有用である新規なヌクレオチド配列および対応する発現された抗原を提供する。
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面によって、本発明は、単離された核酸分子に関し、この分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡの任意の形態であり得、特に、診断用検出法の分野で有用である。本明細書中に記載される核酸分子は、前立腺腫瘍組織サンプルにおけるそれらの独自の存在に基づいて同定された。それゆえ、この分子は、前立腺腫瘍細胞の、組織または体液サンプル中での存在を検出することにおいて有用性を有する。
【０００６】
１つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、および配列番号１４からなる群より選択される配列と配列粗同一性を有する領域を含むか、またはこのようなコード核酸配列に相補的である。
【０００７】
別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、および配列番号１４からなる群より選択される配列、またはそれらの相補体にハイブリダイズする。
【０００８】
一般的には、好ましい局面によって、このポリヌクレオチドは、約１０キロベース長未満である。なおさらなる局面において、本発明は、言及されたポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントを含む。なお別の関連する局面において、本発明は、前述の核酸配列の翻訳によって形成されるＲＮＡ分子を包含する。
【０００９】
この単離された核酸配列は、３つのｐＣＲ２．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）のｃＤＮＡインサートを含み得る。全長ＳＰ１−４（配列番号１４）配列を共に構成する３つのクローンは、ｐＣＲ２．１/ＳＰ１−４（５’ＲＡＣＥ、配列番号２７）、ｐＣＲ２．１／ＳＰ１−４（３’ＲＡＣＥ、配列番号２８）、およびｐＣＴ２．１/ＳＰ１−４（配列番号２９）と命名される。およその長さのプラスミドインサートは、それぞれ、１７００、３８５０、および３５０塩基対である。ＡＴＣＣ９８８２８、９８８２９、および９８８２７として１９９８年８月６日に寄託されたベクターは、配列番号１５をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。このようなベクターを含む宿主細胞もまた提供される。例として、この宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、または酵母であり得る。前立腺腫瘍抗原を産生するためのプロセスがさらに提供され、そしてこのプロセスは、前立腺腫瘍抗原の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養する工程、およびこの前立腺腫瘍高原を細胞培養物から回収する工程を含む。
【００１１】
本発明の一部に有用かつそれを形成するものはまた、前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子である。１つの局面において、この単離された核酸は、配列番号９〜１１および１５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡを含むか、またはこのようなコード核酸配列に相補的であり、そして少なくとも穏和な条件下および必要に応じて高ストリンジェンシー条件下でそれへの安定な結合が残存する。このようなペプチドは、診断用アッセイ、ならびに抗原組成物（例えば、体液性または細胞性免疫応答を誘発するのに使用するためのペプチドワクチン）における有用性を有する。
【００１２】
本発明はさらに、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した、前立腺腫瘍抗原またはその細胞外ドメインを含むキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例は、抗原の免疫原性特性を増強する異種ポリペプチドに融合した前立腺腫瘍抗原を含む。
【００１３】
本発明はまた、前立腺腫瘍抗原のフラグメントを含む。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、前立腺腫瘍抗原またはその細胞外ドメインに特異的に結合する１つ以上の抗体である。必要に応じて、この抗体は、モノクローナル抗体である。なお別の局面において、本発明は、前立腺腫瘍抗原に特異的な抗体を含む。この抗体は、特に前立腺関連悪性疾患の処置における、診断用および治療用の用途を有する。処置方法は、前立腺腫瘍抗原の発現を調節するためのアンチセンスまたはコード配列ポリヌクレオチドを使用するものを含むがこれらに限定されず、同様に前立腺腫瘍抗原に特異的な抗体を使用する処置方法である。
【００１５】
特定の組織サンプル中の前立腺腫瘍抗原を検出するため、および組織中の前立腺腫瘍抗原の発現のレベルを検出するための診断方法もまた、本発明の一部を形成する。
【００１６】
さらに、上記に言及されたポリヌクレオチドは、種々の核酸に基づく検出アッセイにおいて特定の有用性を有する。例示的なアッセイは、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイおよびＰＣＲに基づくアッセイを含む。
【００１７】
本発明はまた、個体における前立腺腫瘍関連状態を診断するための方法を提供する。第１の個体由来の組織中の前立腺腫瘍抗原の存在が測定され、そして第２の罹患していない個体由来の組織と比較される。前立腺腫瘍抗原が、この第１の個体から検出されそしてこの第２の個体からは検出されない場合、この第１の固体は、前立腺腫瘍関連状態の危険性がある。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付の図面と組み合わされて読まれる場合、より完全に明らかになる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、前立腺腫瘍組織サンプルにおけるこのような配列の優先的な発現によって明らかなように、前立腺腫瘍に独自の新規なヌクレオチド配列に関する。これらの配列（配列改変体およびその伸張された配列を含む)は、腫瘍細胞の存在を検出するための、体液または生検組織の診断用アッセイにおける有用性を有する。このようなＤＮＡ分子によって発現されるタンパク質およびペプチドはまた、本発明によって包含され、そして診断用アッセイ、ならびに免疫療法（例えば、腫瘍細胞に特異的に標的される抗体の使用）を含む疾患介入のための薬理学的ストラテジーの開発において使用され得る。
【００２０】
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基の一本鎖を形成する化合物をいう。本明細書中で使用される用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義であり得るか、またはさらに、２つ以上のポリペプチドの複合体をいい得る。
【００２１】
アミノ酸残基は、本明細書中では、それらの標準的な一文字記号で示される：Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒアルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「前立腺腫瘍抗原」は、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原およびそのポリペプチド改変体を包含する。この前立腺腫瘍抗原は、種々の供給源(例えば、ヒト組織型または別の供給源）から単離され得るか、または組換え方法もしくは合成方法によって調製され得る。
【００２３】
「ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原」は、天然由来の前立腺腫瘍抗原と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原は、天然から単離され得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって産生され得る。用語「ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原」は、具体的に、前立腺腫瘍抗原の天然に存在する短縮型もしくは分泌型形態（例えば、例えば細胞外ドメイン配列を含む可溶性形態）、天然に存在する改変体形態(例えば、代わりにスプライスされた形態）、および前立腺腫瘍抗原の天然に存在する対立遺伝子改変体を包含する。
【００２４】
本明細書中で同定されたアミノ酸配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、もし必要であれば、配列を整列させ、そしてギャップを誘導して最大割合配列同一性を達成した後に、ネイティブ配列中のアミノ酸残基と同一である候補体配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、そして配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド配列改変体」とは、全長のネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原について、図９Ａ〜Ｃおよび１１(それぞれ、配列番号９〜１１および１５）に示される推定アミノ酸配列を有する前立腺腫瘍抗原と、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する、活性な前立腺腫瘍抗原をいう。このような前立腺腫瘍抗原改変体は、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、図９Ａ〜Ｃおよび１１（それぞれ、配列番号９〜１１および１５）のいずれか１つに示される配列のＮ末端またはＣ末端で、付加または欠失されるポリペプチドを含む。
【００２６】
前立腺腫瘍抗原をいう場合、用語「フラグメント」とは、前立腺腫瘍抗原と同じ生物学的機能または活性を本質的に保持するか、または前立腺腫瘍抗原の機能または活性の少なくとも１つを保持するかのいずれかの前立腺腫瘍抗原のアミノ酸配列の一部（全体ではない）と同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する；例えば、レセプターに結合する能力を保持するフラグメント、または前立腺腫瘍抗原の免疫学的活性を保持するフラグメント。このフラグメントは、好ましくは、前立腺腫瘍抗原の少なくとも約１００〜２００の連続するアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも約２０〜１００の連続するアミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも約１０〜２０の連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは、前立腺腫瘍抗原の少なくとも約９〜１０の連続するアミノ酸残基を含む。
【００２７】
本明細書中で開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合「単離された」はまた、その天然の環境の成分から分離および/または回収された、同定されたポリペプチドを意味する。
【００２８】
本明細書中の目的のために、「生物学的に活性」または「生物学的活性」は、ネイティブの前立腺腫瘍抗原または天然に存在する前立腺腫瘍抗原の生物学的および/または免疫学的活性を保持する前立腺腫瘍抗原の形態をいう。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「核酸」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含む分子をいう。この核酸は、ゲノムｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびセンスおよびアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドを含む。用語「核酸」もまた、本発明のポリヌクレオチドのフラグメント、好ましくは少なくとも約３００〜６００ヌクレオチド長、より好ましくは約１５０〜３００ヌクレオチド長、なおより好ましくは約３０〜１５０ヌクレオチド長、および最も好ましくは約２７〜３０ヌクレオチド長を含む。このような核酸はまた、生理学的環境おいてこのような分子の安定性および半減期を増加するために、リボース−リン酸塩骨格における改変を含み得る。
【００３０】
この核酸は、二本鎖、一本鎖であり得るか、または二本鎖配列もしくは一本鎖は配列の両方の一部を含み得る。一本鎖の記述はまた、他の鎖の配列を定義し、従ってまた、この配列の相補体を含み得る。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、代表的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子をいい、ここでこのポリマー骨格は、ポリマー分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ）との間の配列特異的様式におけるこのような水素結合を許容する様式で塩基を示す。このような塩基は、代表的には、イノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジンである。ポリマー分子は、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、そしてこのようなメチルホスホネート結合の骨格修飾を有するポリマーを含み得る。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「組換え核酸」は、一般的には、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、天然には通常見出されない形態で、インビトロで本来形成される核酸をいう。
【００３３】
核酸サブユニットは、本明細書中で、これらの標準的な塩基命名法によって称される；Ｔ、チミン；Ａ、アデノシン；Ｃ、シトシン；Ｇ、グアニン；Ｕ、ウラシル；可変性の部位は、標準的なＩＵＰＡＣ略号によって称される：Ｗ、ＡまたはＴ/Ｕ；Ｒ、ＡまたはＧ；Ｓ、ＣまたはＧ；Ｋ：ＧまたはＴ／Ｕ（３７ＣＦＲ．§１．８２２）。
【００３４】
本明細書中で同定される前立腺腫瘍抗原配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、もし必要であれば、配列を整列しそしてギャップを誘導して、最大割合配列同一性をした後に、開示された前立腺腫瘍抗原配列中のヌクレオチドと同一である候補体配列中のヌクレオチドの割合として定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野内の種々の方法で達成され得る。当業者は、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得、この方法には、比較される配列の長さにわたって最大整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムが含まれる。
【００３５】
用語「ベクター」とは、新たな核酸を同化し得、そして適切な宿主中でこれらの新規な配列を増殖し得るヌクレオチド配列をいう。ベクターは、組換えプラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない。本発明の核酸を含むベクター(例えば、プラスミドまたは組換えウイルス)は、キャリア、例えば、タンパク質に複合体化するプラスミド、脂質ベースの核酸形質導入系と複合体化するプラスミド、または他の非ウイルスキャリア系であり得る。
【００３６】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物中で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００３７】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＰＣＲ」は、１つ以上の特定の核酸配列を増幅するプロセスをいい、ここで（ｉ）増幅される配列の末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマーは、試験サンプル中の一本鎖核酸にアニールされ、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼは、アニールされたプライマーの３’末端を伸張して、プライマーがアニールされた核酸に配列中で相補的な核酸鎖を作成し、（ｉｉｉ）得られた二本鎖核酸が変性されて、２つの一本鎖核酸を生じ、そして（ｉｖ）プライマーのアニーリング、プライマーの伸張、および産物変性のプロセスが、プライマーによって規定される配列の容易に同定かつ測定される量を生成するのに十分な回数反復される。続くアニーリング、伸張、および変性の工程は、反応容器の温度を、通常は反復する周期性様式で変化させることによって制御される。アニーリングおよび伸張は、代表的には、４０〜８０℃の間で実施されるのに対し、変性は約８０℃と１００℃との間の温度を必要とする。「サーマルサイクラー」（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ９６００）が代表的には使用されて、反応を調節する。
【００３８】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には、単一の抗前立腺腫瘍抗原モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）およびポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗前立腺腫瘍抗原抗体組成物を包含する。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質な抗体の集団(すなわち、この集団を含む個体の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である）から得られる抗体をいう。
【００４０】
（ＩＩ．前立腺腫瘍特異的ＤＮＡ分子の同定）
前立腺ガン特異的遺伝子は、核酸の２つ以上の供給源の間の遺伝子発現（例えば、一時性の発症、疾患、および/またはマイトジェンの刺激に応答する示差発現）における差異の検出を可能にする、当業者に公知の種々の技術によって単離され得る。
【００４１】
「単離された」前立腺腫瘍抗原コード核酸は、本来は会合する少なくとも１つの夾雑物から同定および分離される核酸分子である。単離された前立腺腫瘍抗原コード核酸は、天然に見出される形態または配列とは異なり、そしてそれゆえ、天然細胞に存在するような前立腺腫瘍抗原コード核酸とは区別される。
【００４２】
ディファレンシャルディスプレイまたは種々のサブトラクティブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーションストラテジーを用いて、関連する細胞型に由来するｍＲＮＡは、特定のｍＲＮＡ種における定性的および定量的差異を提供するために比較され得る。
【００４３】
ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ)は、２つの異なる型のプライマーを使用して、異なる画分のｍＲＮＡプール構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）を二本鎖ｃＤＮＡフラグメントへ変換する。これらのフラグメントは電気泳動的に分離されて、発現プロフィールの「バーコード」を提供する。第１のプライマーは、一般的には、「固定された」プライマーとして称される。ほとんどの固定されたプライマーは、一群の１０〜１２ｄＴを使用して、ｍＲＮＡのポリ（Ａ＋）テイルとのアニーリングを達成する。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、固定されたプライマーを生じ、それにより、転写物の３’末端に固定する。固定されたプライマーは、１つまたは２つのいずれかの非ｄｔ塩基を使用して、ｍＲＮＡプール内のｍＲＮＡのサブセットへの固定されたプライマーのアニーリングを達成する。単一の塩基が固定されたプライマーは、３つの異なる画分を生成し、これらは、ポリ（Ａ＋)領域のすぐ上流のＣ、ＧまたはＴのいずれかの存在に対応する。ｍＲＮＡの存在を１０，０００〜１５，０００の異なる種と仮定すると、単一の塩基が固定されたプライマーの各々は、約３，０００〜５，０００の異なる第１鎖ｃＤＮＡを生成することが予測される。各々が１塩基順列よりもかなり小さいサブセットのｍＲＮＡプールを提示するとともに、ポリ（Ａ＋）領域のすぐ上流の１２の異なる２塩基対の組み合わせの可能性が存在する。２塩基が固定されたプライマーの各々は、約１／１２（８％）のｍＲＮＡプール構成、または約８００〜１，２００の異なる第１鎖ｃＤＮＡを理論的に選択する。ｍＲＮＡプールを「抜粋する」ための２つの非ｄｔ塩基を使用する固定されたプライマーは、より扱いやすい数のｃＤＮＡフラグメントを提供する。
【００４４】
第１鎖合成を完了した後、反応物のアリコートは、第２の上流または「任意の」プライマーと組み合わせて本来の固定されたプライマーを用いる、指数（２方向性）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供される。任意のプライマーは、固定されたプライマーの上流の部位でアニールして、第１鎖ｃＤＮＡを１つ以上の短縮されたｃＤＮＡフラグメントに変換するように設計される配列を含む。比較されるＲＮＡサンプルは、１２の異なるオリゴ（ｄＴ）が固定された３’プライマーセットを用いる逆転写反応における、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして役立つ。次いで、ＲＴ反応で産生されたｃＤＮＡは、４つの異なる任意の５’プライマーと２つ１組で組み合わせて、ＲＴ反応で使用される同じ固定された３’プライマーを用いる、二重ＤＤ−ＰＣＴ反応で使用される。各ＲＮＡサンプルは、４８のプライマー対の組み合わせによって増幅される。二重ＤＤ−ＰＣＲサンプルは、高分解能変性ゲルの連続レーンにおいて共にグループ化された同じ固定されたプライマー対および任意のプライマー対を用いて増幅された異なるＲＮＡからのサンプルと共に、隣接するレーンにロードされる。ゲルはオートラジオグラフィーに供され、そして前立腺腫瘍由来サンプルに現れるが、コントロールサンプル（例えば、正常な前立腺組織またはＨｅＬａ細胞サンプル）には現れないバンドは、さらなるプロセシングのために選択される。第ＩＶ節は、本発明の支持において実施された実験に使用される実験手順の詳細を提供する。
【００４５】
実施例１に記載のされるように、前立腺腫瘍由来組織からのＲＮＡが、正常な前立腺組織またはＨｅＬａ細胞サンプルからのＲＮＡと比較された場合、５４の独自のＤＤ産物が同定された。対応するバンドがゲルから切り出され、ＰＣＲによって再増幅され、ゲル精製され、そして５’末端が、サイクル配列決定によるＤＮＡ配列決定に供される。
【００４６】
サブトラクティブハイブリダイゼーションに続く、サブトラクションに続いて得られる配列の１回以上のＰＣＲ増幅は、例えば、正常な健常組織ではない疾患状態、またはある組織型であるが別の組織型ではない組織で優先的に発現される核酸を単離するために有用である。
【００４７】
実施例３Ａ〜Ｂに記載されるように、前立腺腫瘍特異的な部分的ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅によって同定された対応する全長配列と共に、単一の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、サブトラクティブハイブリダイゼーションストラテジーおよびＰＣＲ増幅を用いて同定された（ＲＡＣＥ，Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：８９９８−９００２（１９８８））。
【００４８】
この配列は、実施例２において議論されるように、公開されたデータバンクと比較され、そして本明細書中に配列番号１〜４および６〜８として示された８つの新規なｍＲＮＡ/ＣＤＮＡが、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって得られた、ＳＰ１−４と称されるさらなる配列（配列番号１４）を用いるディファレンシャルディスプレイ法によって得られた。ディファレンシャルディスプレイ法によって得られた配列の１つ（配列番号５）はさらに、実施例２に記載される方法によって、チオレドキシンレダクターゼとのいくらかの程度の相同性を有することが見い出された。
【００４９】
（Ａ．前立腺腫瘍特異的ＤＮＡ配列改変体およびペプチドの同定）
本発明は、本明細書中に言及される特定の配列を有するＤＮＡ分子に加えて、配列改変体、伸張された配列、およびこのような配列に由来するペプチドを包含する。この節は、どのようにして、これらの種々の分子が本発明によって同定されるかを記載する。
【００５０】
（１．ＤＮＡ配列改変体）
ａ．配列同一性および特異的ハイブリダイゼーション。「改変体」ポリヌクレオチド配列は、参照ポリペプチド配列由来の１つ以上のアミノ酸によって変更される「改変体」アミノ酸配列をコードする。
【００５１】
配列改変体は、配列番号１〜８および１４のいずれか１つの核酸配列と、それぞれ、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、およびなおより好ましくは少なくとも約９５〜９８％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
前立腺腫瘍抗原をコードする核酸の文脈における配列同一性は、比較される２つの配列の対応する位置での同一の核酸を意味する。配列比較は、ＩＩＢ節で以下に記載される、当該分野で公知の標準的な技術を用いて実施される。
【００５３】
配列の類似性を評価するために代替的に使用され得る配列同一性の機能的基準は、特定のヌクレオチド分子の、規定された条件下で第２のヌクレオチドとハイブリダイズする能力である。「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成を通じて相補鎖を結合する任意のプロセスを含む。従って、厳密に言えば、この用語は、試験配列の相補体の試験配列に結合する能力、またはその逆の能力をいう。
【００５４】
核酸類似性は、ハイブリダイゼーション研究を通じて決定され得る。従って、例えば、高ストリンジェンシー下で図１〜８および１４に示される核酸配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする核酸は、前立腺腫瘍抗原遺伝子とみなされる。高ストリンジェンシー条件は、当該分野で公知である；このような条件の例は、約６５℃にて約５×ＳＳＰＥ中でのハイブリダイゼーションおよび約６５℃にて約０．１×ＳＳＰＥ中での洗浄条件を含む。Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓによる著作権（ｃ）１９８７，１９８８，１９８９，１９９０を参照のこと（これらの両方を、本明細書中において参考として援用する）。
【００５５】
ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づき、そして代表的には、その条件下でハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類される（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０）。例えば、「最高ストリンジェンシー」は、代表的には、約Ｔｍ−５℃（５％はプローブのＴｍ未満）で生じる；約５〜１０℃での「高ストリンジェンシー」はＴｍ未満である；約１０〜２０℃での「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍ未満である；そして約２０〜２５℃での「低ストリンジェンシー」はＴｍ未満である。機能的には、最高ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用され得る；一方、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために使用される。
【００５６】
（２．遺伝コードの縮重）
配列改変体はまた、本明細書中に記載される腫瘍特異的核酸分子によってコードされるのと同じペプチドをコードする核酸分子を含む。従って、種々の同定された核酸分子のコードフレームが、例えば、以下のＢまたはＣ部に記載されるように、公知の遺伝子に対する相同性または配列の伸張によって公知である場合、遺伝コードの縮重の結果として、多数のコード配列が産生され得ることが認識される。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸のアルギニンをコードする。アルギニンは、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧによって代替的にコードされる。それゆえ、コード領域におけるこのような置換が、本発明によって包含される配列改変体内にあることが理解される。任意および全てのこれらの配列改変体は、同定された親配列の配列番号１〜８について本明細書中に記載されるのと同じ方法で利用され得る。
【００５７】
このような配列改変体は、高ストリンジェンシー条件下で、親配列にハイブリダイズしてもしなくても良いことがさらに理解される。このことは、例えば、配列改変体が親ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の各々についての異なるコドンを含む場合にあり得る。それにも関わらず、このような改変体は、本発明によって具体的に意図され、かつ包含される。本発明によって、このような縮重に由来する配列改変体と少なくとも８０％同一である配列もまた包含される。
【００５８】
ヌクレオチド配列改変体は、好ましくは、中程度に高いかまたは高いストリンジェンシーの条件下で、本明細書中に言及されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、いくつかの場合において、上記のような、コードの縮重に基づいて改変体を用いる利点が存在する。例えば、コドンは、特定の宿主生物によって検出される最適コドンの使用頻度に従って、ペプチドの発現が特定の原核生物または真核生物に生じる割合を増加するために選択され得る。あるいは、言及された配列によって産生されるｍＲＮＡよりも長い半減期を有するＲＮＡを産生することが所望され得る。
【００５９】
（３．伸長されたポリヌクレオチド配列）
本明細書中に引用されるポリヌクレオチド配列は、プロモーターおよび調節エレメントのような上流の配列を検出するために、当該分野で公知の種々の方法を使用して伸長され得る。例えば、「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応は、既知の配列に隣接する未知の配列を回収するためにユニバーサルプライマーを使用する、直接的な方法である。最初に、ゲノムＤＮＡが、リンカー配列に対して指向されるプライマー、および既知の領域に特異的なプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列は、同じリンカープライマーおよび最初のプライマーの内部にある別の特異的プライマーでの次の回のＰＣＲに供される。各回のＰＣＲの産物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、そして逆転写酵素を使用して配列決定される。
【００６０】
同様に、「逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ」として公知の方法が、既知の領域に基づく拡散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プライマーを使用して配列を増幅または伸長するために使用され得る。プライマーは、標準的なプライマー分析ソフトウェア（例えば、ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ））を使用して、少なくとも１５ｎｔの長さであり、５０％以上のＧＣ含量を有し、そして約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように設計され得る。この方法は、遺伝子の既知の領域中に適切なフラグメントを生成するための、いくつかの制限酵素の使用を必要とする。次いで、フラグメントは連結によって環状にされ、そしてＰＣＲ鋳型として使用される。あるいは、隣接する配列および全長の配列、および特に、イントロン／エキソン連結部が、キット（例えば、「ＰＲＯＭＯＴＥＲ−ＦＩＮＤＥＲ」（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））を使用して同定され得る。このキットは、ＰＣＲ，ネスティッドプライマー、およびゲノムＤＮＡ中での歩行のための特異的ライブラリーを使用する。
【００６１】
全長のｃＤＮＡのスクリーニングのための好ましいライブラリーは、より大きなｃＤＮＡを含むように大きさが選択されているライブラリーである。ランダムにプライムされたライブラリーが好ましい。なぜなら、これらは、遺伝子の５’および上流領域を含有するさらなる配列を含むからである。ゲノムライブラリーは、５’非翻訳調節領域への伸長に有用である。好ましくは、このようなライブラリーは、目的の腫瘍細胞（例えば、本明細書中で説明される前立腺腫瘍細胞）から生成される。
【００６２】
本発明に従って同定された全長の配列の大きさおよび配列の分析は、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動配列決定法，ゲルでの大きさの分析、およびキャピラリー電気泳動）によって行われ得る。
【００６３】
全長の配列が同定されている場合、全長の配列のさらなる領域がハイブリダイゼーションプローブを作製するため、および／または本発明に従う腫瘍検出試薬を作製するために使用され得ることが理解される。詳細には、部分配列または全長の配列の知見は、被験体配列が他の種または組織（特に、腫瘍組織）において相同性を有し得るかどうかを決定するために、広範に入手可能なデータベースの検索を可能にする。現在の配列に基づく相同性の例が、本明細書中で実施例２に示される。
【００６４】
全長の配列はまた、ベクター中に挿入される組換え核酸を構築するため、および以下のＤ部において議論されるような、コードされるポリペプチドを発現させるために、使用され得る。
【００６５】
一旦、組換え核酸が作製され、そして宿主細胞または生物中に再導入されると、それが宿主細胞の細胞性機構を使用して非組換え的に複製され、そしてこのような（一旦、組換え的に産生されたが、しかし続いて非組換え的に複製された）核酸が、本発明の目的についてなお考慮される組換え体であることが、理解される。
【００６６】
（４．ポリペプチド改変体）
本発明の１つの実施態様において、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原は、図１１（配列番号１５）のアミノ酸１から１０９５を含む、成熟または全長のネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原である。本発明の別の実施態様において、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原は、全長の前立腺腫瘍抗原の細胞外ドメインである。必要に応じて、前立腺腫瘍抗原は、１９９８年８月６日にＡＴＣＣ  ９８８２８、９８８２９、および９８８２７として寄託された、ベクターｐＣＲ２．１／ＳＰ１−４（５’ＲＡＣＥ、配列番号２７）、ｐＣＲ２．１／ＳＰ１−４（３’ＲＡＣＥ、配列番号２８）、およびｐＣＴ２．１／ＳＰ１−４（配列番号２９）のｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現させることによって得られるか、または入手可能である。
【００６７】
通常は、前立腺腫瘍抗原改変体は、図９Ａ〜Ｃおよび図１１（それぞれ、配列番号９〜１１、および１５）のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、そしてなおより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００６８】
前立腺腫瘍抗原の状況における配列類似性は、好ましい同一性を有する配列類似性または同一性を意味する。この状況における同一は、比較される２つの配列中の対応する部位での同一のアミノ酸を意味する。この状況における類似性は、同一であるアミノ酸および類似である（機能的に等価である）アミノ酸を含む。この類似性または同一性は、当該分野で公知の標準的な技術（例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）によって記載されている「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」配列プログラム、ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＸプログラム（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０（１９９０）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）））を使用して、好ましくは、デフォルト設定を使用して決定される。アラインメントは、整列される配列中のギャップの導入を含み得る。さらに、関連するネイティブタンパク質よりも多いかまたは少ないかのいずれかであるアミノ酸を含む配列について、類似性の割合は、アミノ酸の総数に対する類似または同一のアミノ酸の数に基づいて決定される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の範囲内である種々の方法において、例えば、デフォルトパラメーターを用いてＬＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成され得る。ＬＡＬＩＧＮプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７（Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｘ  ４４０、Ｊｏｒｄａｎ  Ｈａｌｌ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡより入手可能なプログラム）において見出される。
【００６９】
当業者は、比較される配列にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズム（例えば、「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」または「ＢＬＡＳＴＸ」）を選択することを含む、アルゴリズムを測定するための適切なパラメーターを決定し得る（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８（１９９６）もまた参照のこと）。
【００７０】
本発明の前立腺腫瘍抗原の定義には、アミノ酸配列改変体もまた含まれる。これらの改変体は、以下の３つのクラスの１つ以上に入る：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体。これらの改変体は、通常は、カセット変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発、または当該分野で周知の他の技術を使用して、前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって、改変体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現させるために調製される。しかし、約１００〜１５０残基までを有する改変体前立腺腫瘍抗原フラグメントは、確立された技術を使用してインビトロでの合成によって調製され得る。アミノ酸配列改変体は、変動の予め決定された性質、天然に存在する対立遺伝子または前立腺腫瘍抗原のアミノ酸配列の種間変動からそれらを区別する様に設定した特性によって特徴付けられる。この改変体は、代表的には、天然に存在するアナログとして同じ性質の生物学的活性を示すが、以下により完全に概説されるような改変された特徴を有する改変体もまた、選択され得る。
【００７１】
「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換によって生じる。
【００７２】
「挿入」または「付加」は、天然に存在する配列と比較した場合に、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加を生じる、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。
【００７３】
「欠失」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が不在である、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化として定義される。
【００７４】
アミノ酸配列の変動を導入するための部位または領域は予め決定されるが、変化はそれ自体は、予め決定されている必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を最適化するために、ランダムな変異誘発が、標的のコドンまたは領域で行われ得、そして発現された前立腺腫瘍抗原改変体が、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位で置換を作製するための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。変異体のスクリーニングは、ＰＣＲによって直接行われ得るか、または改変された配列の発現後に、前立腺腫瘍抗原についてのアッセイを使用して、例えば、抗体検出研究が行われ得る。
【００７５】
アミノ酸置換は、代表的には、単一の残基である；挿入は、通常は、約１から２０アミノ酸までの程度であるが、かなり大きな挿入が許容され得る。欠失は、約１から約２０残基までの範囲であるが、いくつかの例においては、欠失は、さらに大きいものであり得る。
【００７６】
置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせが、最終的な誘導体で到達するために使用され得る。一般的には、これらの変化は、分子の変更を最小にするために少数のアミノ酸に対して行われる。しかし、より大きな変化が、特定の状況において許容され得る。
【００７７】
アミノ酸置換は、類似の構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸での１つのアミノ酸の置き換え（例えば、セリンでのロイシンの置換）、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、必要に応じて、１個から５個までの範囲のアミノ酸においてであり得る。
【００７８】
生物学的活性の維持とともに許容される変動は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統立ててに作製すること、および得られる改変体を活性について試験することによって決定され得る。遺伝子の発現は、免疫学的方法（例えば、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色、および細胞培養物または体液のアッセイ）によって、遺伝子産物の発現を直接定量するために測定され得る。免疫組織化学的染色および／または組織もしくは体液のサンプルのアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして天然の前立腺腫瘍抗原である、本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、または前立腺腫瘍特異的抗体エピトープを含む異種融合タンパク質に対して調製され得る。抗体に基づくアッセイにおいて診断的有用性を有する例示的な前立腺ガン抗原として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、米国特許第５，７１０，００７号；同第５，６１４，３７２号、同第５，６７２，４８０号など）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、米国特許第５，５３８，８６６号）、およびヒト前立腺カリクレイン（ＨＫ−２、米国特許第５，５１６，６３９号）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者によって慣用的に使用される種々の異なる技術に基づく多くの診断アッセイが、これらの分子について開発されている。
【００７９】
前立腺腫瘍抗原の特徴における小さな変更が所望される場合は、置換は一般的には、既知の「保存的置換」に従って作製される。
【００８０】
「保存的置換」は、同じクラス中のアミノ酸による１つのクラス中のアミノ酸の置換をいう。ここで、クラスは、共通の物理化学的アミノ酸側鎖特性、および天然に見出される相同タンパク質における高い置換頻度（例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスによって決定されるような）によって定義される。上記のように分類される６つの一般的なアミノ酸側鎖のクラスとして、以下が挙げられる：クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。例えば、別のクラスＩＩＩ残基（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ）でのＡｓｐの置換は保存的置換である。
【００８１】
「非保存的置換」は、別のクラスに由来するアミノ酸での１つのクラスのアミノ酸の置換をいう；例えば、Ａｌａ（クラスＩＩ残基）のクラスＩＩＩ残基（例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎ）での置換。
【００８２】
機能性または免疫学的同一性における実質的な変更は、「非保存的置換」である置換を選択することによって行われる。例えば、以下により、有意に影響を与える置換が作製され得る；変更の領域中のポリペプチド骨格の構造（例えば、αへリックスまたはβシート構造）、標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または側鎖の大きさ（ｂｕｌｋ）。ポリペプチドの特性において最大の変化を生じることが一般的に予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはスレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）で（またはそれによって）置換される、置換；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基で（またはそれによって）置換される、置換；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が電気的陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）で（またはそれによって）置換される、置換；あるいは（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）がそのような側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）で（またはそれによって）置換される、置換である。
【００８３】
前立腺腫瘍抗原改変体は、代表的には同質の生物学的活性を示し、そして天然に存在するアナログと同じ免疫応答を誘発するが、改変体はまた、必要とされる場合には、前立腺腫瘍抗原の特徴を改変するように選択される。例えば、グリコシル化部位、およびより詳細には、１つ以上のＯ−結合型またはＮ−結合型グリコシル化部位が変更され得るか、または除去され得る。アミノ酸の変化が、前立腺腫瘍抗原の翻訳後のプロセシングを変更し得る（例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置を変化させるか、または膜固定化特性を変更する）ことが、当業者に明らかである。
【００８４】
変動は、オリゴヌクレオチド媒介性の（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャン、およびＰＣＲ変異誘発のような当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６））、または他の公知の技術が、前立腺腫瘍抗原をコードする改変体ＤＮＡを産生するためにクローニングＤＮＡに対して行われ得る。
【００８５】
他の関連する前立腺腫瘍抗原タンパク質もまた、前立腺腫瘍抗原タンパク質の定義に含まれる。従って、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列は、他の関連するタンパク質を見出すために使用され得る。有用なプローブまたはプライマー配列は、前立腺腫瘍抗原配列の全てもしくは一部に対して、またはコード領域の外側の配列に対して設計され得る。当該分野で一般的に公知であるように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５から約３５ヌクレオチドまでの長さであり、好ましくは約２０から約３０までであり、そして必要である場合は、イノシンを含有し得る。ＰＣＲ反応の条件は一般的には当該分野で公知である。
【００８６】
（Ｂ．前立腺腫瘍抗原の改変）
前立腺腫瘍抗原の共有的改変が、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有的改変として、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの選択された側鎖、またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機的な誘導化試薬と、前立腺腫瘍抗原の標的化されたアミノ酸残基とを反応させることが挙げられる。二官能性の試薬での誘導体化が、例えば、水不溶性の支持マトリックスまたは表面に対して前立腺腫瘍抗原を架橋させるために有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような薬剤が挙げられる。
【００８７】
他の改変として、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へのグルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ．ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９−８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００８８】
本発明の範囲に含まれる前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの共有的改変の別の型として、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変更すること、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドから１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／またはそれに１つ以上の炭水化物部分を付加することによって、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドを単に改変することが挙げられる。
【００８９】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変更することによって達成され得る。変更は、例えば、ネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドに対して（Ｏ−結合型グリコシル化部位について）、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加またはそれらによる置換によって行われ得る。前立腺腫瘍抗原のアミノ酸配列は、必要に応じて、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基で、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、変更され得る。
【００９０】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。このような方法は、当該分野で、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ  ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６頁（１９８１）に記載されている。
【００９１】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に達成され得るか、またはグリコシル化の標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成され得る。さらに、炭水化物部分は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）によって記載されるような種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用による酵素的切断によって、または例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）に記載されている化学的グリコシル化技術によって、除去され得る。
【００９２】
前立腺腫瘍抗原の共有的改変の別の型として、例えば、米国特許第４，７９１，１９２号に示される、非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）に抗原を連結することが挙げられる。
【００９３】
（Ｃ．コードされるポリペプチド抗原）
（１．前立腺腫瘍抗原の発現）
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞中での対応するポリペプチドの発現を指向する組換えＤＮＡ分子中で使用され得る。上記に議論されるように、遺伝子コードの縮重は、実質的に同じであるかまたは機能的に等価であるアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、同定されたポリペプチドをクローニングし、そして発現するために使用され得ることを指示する。特定の宿主細胞に好ましいコドンが選択され得、そして発現の割合および／または効率を増大させるために、天然に存在するヌクレオチド配列中に置換され得る。
【００９４】
所望の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のための複製可能なベクター中に挿入され得る。ポリペプチドは、当業者に公知の方法に従って、任意の多数の発現系中で組換え的に発現され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０）。
【００９５】
適切な宿主細胞として、酵母、細菌、古細菌、真菌、ならびに昆虫および動物細胞（哺乳動物細胞（例えば、骨髄幹細胞を含むがこれに限定されない幹細胞を含む、初代細胞）を含む）が挙げられる。より詳細には、これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、および酵母発現ベクターで形質転換された酵母のような微生物が挙げられるが、これらに限定されない。組換え昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染させられた昆虫細胞、および哺乳動物発現系もまた、含まれる。
【００９６】
発現される核酸配列は、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般的には、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分は一般的には、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含むが、これらに限定されない。１つ以上のこれらの成分を含有する適切なベクターの構築は、当業者に公知である標準的な連結技術を使用する。
【００９７】
本発明の前立腺腫瘍抗原タンパク質は、前立腺腫瘍抗原タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、このタンパク質の発現を誘導するかまたはそれを引き起こすために適切な条件下で培養することによって産生される。前立腺腫瘍抗原タンパク質の発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択にとともに変化し、そして慣用的な実験によって当業者に容易に確認される。例えば、発現ベクター中での構成性プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化することを必要とするが、一方、誘導性プロモーターの使用は、誘導のための適切な成長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施態様においては、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルス系は溶解性ウイルスであり、従って、採取時間の選択は、生成物の収量について決定的であり得る。
【００９８】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、または所望の様式で発現されたタンパク質をプロセスするその能力について選択され得る。タンパク質のこのような改変として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、折り畳み、および／または機能のために重要であり得る。例示の目的で、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８など）は、このような翻訳後の活性についての特異的な細胞性機構およびそれに特徴的な機構を有し、そして導入された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。特定の目的は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ，およびＨｅＬａ細胞、繊維芽細胞、Ｓｃｈｗａｎｏｍａ細胞株、固定された哺乳動物骨髄細胞株およびリンパ系細胞株、Ｊｕｋａｔ細胞、ヒト細胞および他の初代細胞である。
【００９９】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にそれを配置することによって「作動可能に連結」されなければならない。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡが、それがポリペプチドの分泌において関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結される；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続的であり、そして分泌リーダーの場合には、連続的でありかつリーディング相中にある。しかし、エンハンサーは、連続的でなくても良い。連結は、便利な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合は、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の方法に従って使用される。
【０１００】
プロモーター配列は、構成性または誘導性のプロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。ハイブリッドプロモーター（これは、１つより多いプロモーターのエレメントを組み合わせる）もまた当該分野で公知であり、そして本発明において有用である。
【０１０１】
発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、従って、それは、２つの生物中（例えば、発現のための哺乳動物細胞中または昆虫細胞中、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主中）で維持されることが可能である。
【０１０２】
発現およびクローニングの両方のベクターは、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点が、ほとんどのグラム陰性細菌について適切であり、２：プラスミド複製起点が酵母に適切であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞中でのクローニングベクターに有用である。
【０１０３】
さらに、発現ベクターを組み込むためには、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに対して相同である少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組込みベクターは、ベクター中への封入のための適切な相同性配列を選択することによって、宿主細胞中で特異的な遺伝子座に対して指向され得る。組込みベクターの構築は当該分野で周知である。
【０１０４】
好ましくは、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野で周知であり、そして使用される宿主細胞とともに変化する。
【０１０５】
発現およびクローニングベクターは、代表的には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含む。代表的な選択遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与する、タンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠損を相補する、タンパク質、または（ｃ）複合培地から入手可能ではない重要な栄養素を供給する、タンパク質（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉについては、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１０６】
前立腺腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのコードされるタンパク質の発現および回収のために適切な条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、分泌され得るか、膜結合し得るか、または使用される配列および／もしくはベクターに依存して細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるように、前立腺腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞膜を通じての前立腺腫瘍抗原の分泌を指向するシグナル配列を有して設計され得る。
【０１０７】
所望される前立腺腫瘍抗原ポリペプチドは、直接組換え的に産生され得るだけではなく、異種ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとしてもまた産生され得る。これは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る。一般的には、シグナル配列はベクターの成分であり得るか、またはこれは、ベクター中に挿入された前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性腸毒素ＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であり得る。酵母分泌のためには、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ「α−因子リーダー」を含む、後者は、米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ  ３６２，１７９号）、または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ  ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現のためには、哺乳動物シグナル配列（例えば、同じ種または関連する種の分泌されるポリペプチドに由来するシグナル配列、およびウイルス分泌リーダー）が、タンパク質の分泌を指向するために使用され得る。
【０１０８】
選択される発現系に従って、コード配列は、適切なベクター中に挿入され、次いで、これは、特定の特徴的な「制御エレメント」または「調節配列」の存在を必要とし得る。適切な構築物は当該分野で一般的に公知であり（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０）、そして多くの場合、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、またはＣｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような市販の供給源から入手可能である。
【０１０９】
ａ．細菌系中での発現。細菌細胞の形質転換は、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）または「ｐＳＰＯＲＴ１」（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導性プロモーターを使用して達成され得る。さらに、多数の発現ベクターが、容易に検出され得そして／または精製され得る切断可能な融合タンパク質を産生するための細菌細胞中での使用のために選択され得る。これらとして、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（β−ガラクトシダーゼ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）またはｐＧＥＸ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
適切な細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼが結合し得、そして前立腺腫瘍抗原遺伝子のｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）の転写を開始し得る任意の核酸配列である。細菌性プロモーターは、コード配列の５’末端に対して通常は近位に配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、代表的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、糖を代謝する酵素（例えば、ガラクトース、ラクトース、およびマルトース）に由来するプロモーター配列、および生合成酵素（例えば、トリプトファン）に由来する配列が挙げられる。バクテリオファージに由来するプロモーターもまた使用され得、そして当該分野で公知である。さらに、合成のプロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた、有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌性プロモーターとして、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する、細菌ではない起源の天然に存在するプロモーターが挙げられ得る。効率的なリボソーム結合部位もまた、所望される。
【０１１１】
発現ベクターとしてまた、細菌中での前立腺腫瘍抗原タンパク質の分泌を提供する、シグナルペプチド配列が挙げられ得る。シグナル配列は、代表的には、当該分野で周知であるような、細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に局在するペリプラズム空間（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。細菌発現ベクターとしてまた、形質転換されている細菌株の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子が挙げられ得る。適切な選択遺伝子として、薬物耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリン）が挙げられる。選択マーカーとしてまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路における生合成遺伝子）が挙げられる。
【０１１２】
例えば、抗体の誘導のために、大量の前立腺腫瘍抗原が必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが、所望され得る。このようなベクターとして、多機能性のＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。ここで、前立腺腫瘍抗原をコードする配列は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端のＭｅｔおよび続く７残基の配列とともにインフレームでベクター中に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；など。
【０１１３】
細菌の発現ベクターは上記に示す種々の成分を含み、そして当該分野で周知である。例として、とりわけ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのベクターが挙げられる。細菌発現ベクターは、当該分野で周知の技術（例えば、塩化カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主細胞中に形質転換される。
【０１１４】
ｂ．酵母中での発現。酵母発現系は当該分野で周知であり、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの発現ベクターが挙げられる。酵母宿主中での使用に適切なプロモーターの例として、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーターが挙げられる（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））または他の糖化酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、α因子、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨ）が挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０；Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１１５】
誘導性である他の酵母プロモーターは、成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有し、これらとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域が挙げられる。酵母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、ＥＰ  ７３，６５７に記載されている。酵母の選択マーカーとして、ツニカマイシンに対する耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７；Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；ならびに酵母が銅イオンの存在下で成長することを可能にするＣＵＰ１遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
酵母発現ベクターは、目的の前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡに由来する前立腺腫瘍抗原の細胞内産生または分泌のために構築され得る。例えば、選択されるシグナルペプチド、および適切な構成性または誘導性プロモーターが、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの細胞内発現を指向するために選択されたプラスミド中の適切な制限部位に挿入され得る。前立腺腫瘍抗原の分泌のためには、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡが、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの発現のための、プロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α−因子分泌シグナル／リーダー配列、およびリンカー配列（必要とされる場合は）とともに選択されたプラスミド中にクローニングされ得る。
【０１１７】
次いで、酵母細胞は、上記のような発現プラスミドで形質転換され得、そして適切な醗酵培地中で培養され得る。次いで、このように形質転換された酵母によって産生されたタンパク質は、１０％のトリクロロ酢酸での沈殿によって濃縮され得、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびクマシーブル染色でのゲルの染色後に分析され得る。
【０１１８】
組換え前立腺腫瘍抗原が続いて単離され得、そして当業者に公知の技術によって醗酵培地から精製され得る。
【０１１９】
ｃ．哺乳動物系中での発現。前立腺腫瘍抗原タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現され得る。哺乳動物発現系は当業者に公知であり、そしてレトロウイルスベクター媒介性発現系が挙げられる。哺乳動物宿主細胞は、任意の多数の異なるウイルスに基づく発現系（例えば、アデノウイルス）で形質転換され得る。ここで、コード領域は、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。ウイルスゲノムの必須ではないＥ１またはＥ３領域中での挿入は、感染させられた宿主細胞中で目的のポリペプチドを発現し得る生存性のウイルスを生じる。
【０１２０】
好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系であり、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８に一般的に記載されている。これらの両方が、本明細書中で参考として明確に援用されている。
【０１２１】
適切な哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼが結合し得、そして前立腺腫瘍抗原タンパク質のコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である、哺乳動物プロモーターを含む。プロモーターは、コード配列の５’末端に対して通常は近位に配置される、転写開始領域、および転写開始部位の上流の配置された２５〜３０塩基対を使用するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正確な部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを指向すると考えられる。哺乳動物プロモーターはまた、上流のプロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含み、代表的には、ＴＡＴＡボックスの上流の１００から２００塩基対内に配置される。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれかの方向で作用し得る。哺乳動物プロモーターとしての特定の使用は、哺乳動物ウイルス遺伝子に由来するプロモーターである。なぜなら、ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有するからである。
【０１２２】
例として、以下のようなプロモーターが、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるという条件で、挙げられる：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された、ＵＫ  ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーター）から得られるプロモーター、ならびに熱ショックプロモーターから得られるプロモーター。
【０１２３】
高等真核生物による前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中へエンハンサー配列を挿入することによって増大され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は、１０から３０ｂｐまでであり、これは、その転写を増大するようにプロモーターに対して作用する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、「α−フェトプロテイン」およびインシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が、現在公知である。しかし代表的には、当業者は、真核生物細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用する。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側に対するポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは好ましくは、プロモーターから５’位置に配置される。
【０１２４】
一般的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンに対して３’に、従って、コード配列に隣接してプロモーターエレメントとともに配置された調節領域である。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。
【０１２５】
長期間の高収量の組換えタンパク質の産生は、安定な発現系中で達成され得る。ウイルス複製起点または内因性の発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターが、この目的のために使用され得る。哺乳動物細胞中での使用のための選択マーカーを含有する適切なベクターが、市販によって容易に入手可能であり、そして当業者に公知である。このような選択マーカーの例として、それぞれ、ｔｋ細胞またはｈｐｒｔ細胞中での使用のための、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
哺乳動物宿主、および他の宿主中に外因性の核酸を導入する方法は当該分野で周知であり、そして使用される宿主細胞とともに変化する。技術として、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１２７】
ｄ．昆虫細胞中での発現。前立腺腫瘍抗原ポリペプチドはまた、昆虫細胞中で産生され得る。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、および特に、バキュロウイルスに基づく発現ベクターが、当該分野で周知である。１つのこのような系においては、前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡが、バキュロウイルス発現ベクター中に含まれるエピトープタグの上流に融合される。Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞中、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫中で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。前立腺腫瘍抗原をコードする配列は、ウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローニングされ、そしてポリヘドリンプロモーターの制御化に配置される。前立腺腫瘍抗原をコードする配列の首尾よい挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質コートを欠失している組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウイルスは、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫を感染させるために使用され、ここで、前立腺腫瘍抗原が発現される（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４（１９９４）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７（１９９４））。
【０１２８】
前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡに対する融合に適切なエピトープタグとして、ポリ−ヒスタグおよびイムノグロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域と同様）が挙げられる。種々のプラスミドが使用され得、市販によって入手可能なプラスミド（例えば、ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））が挙げられる。簡潔には、前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡまたは前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡの所望の部分が、５’および３’領域に対して相補的であるプライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。５’プライマーは、隣接する制限部位を取り込み得る。次いで、ＰＣＲ産物は、選択された制限酵素で消化され、そして発現ベクター中にサブクローニングされる。
【０１２９】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）への、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから市販）または当業者に公知の他の方法を使用する同時トランスフェクションによって生成される。ウイルスは、２８℃でＳｆ９細胞の培養物中に４〜５日までに産生され、そしてさらなる増幅のために使用される。手順は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）にさらに記載されているように行われる。
【０１３０】
抽出は、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載されているように、組換えウイルスで感染させたＳｆ９細胞から調製され得る。
【０１３１】
あるいは、発現されたエピトープタグ化前立腺腫瘍抗原ポリペプチドが、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得るか、または例えば、ＩｇＧタグ化（もしくはＦｃタグ化）前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの精製が、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー技術を使用して行われ得る。
【０１３２】
（Ｄ．遺伝子発現の評価）
遺伝子発現は、例えば、当業者に公知の標準的な技術（例えば、本明細書中に提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用する、ＤＮＡの検出のためのサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を決定するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはインサイチュハイブリダイゼーション）によって、サンプル中で直接評価され得る。あるいは、抗体が、核酸（例えば、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖）の検出のためのアッセイにおいて使用され得る。このような抗体は標識され得、そして二本鎖が表面に結合され、その結果、表面上での二本鎖の形成の際に二本鎖に結合した抗体の存在が検出され得るアッセイが行われる。
【０１３３】
あるいは、遺伝子発現は、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色、および細胞培養物または体液のアッセイによって、前立腺腫瘍抗原の発現を直接評価するために、測定され得る。このような免疫学的アッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づいてネイティブ配列の前立腺腫瘍抗原に対して調製され得る。
【０１３４】
（１．発現されたタンパク質の精製）
発現された前立腺腫瘍抗原ポリペプチドは、当業者に公知の任意の種々の方法を使用して、発現後に精製され得るかまたは単離され得る。適切な技術は、どのような他の成分がサンプル中に存在するかに依存して変化する。単離または精製によって除去される混入している成分は、代表的には、ポリペプチドの診断的または治療的用途を妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他の溶質が挙げられ得る。精製工程（単数または複数）は、例えば、使用される産生プロセス、および産生される特定の前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの性質に依存して選択される。
【０１３５】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドまたはタンパク質は、培養培地または宿主細胞溶解物から回収され得る。膜に結合している場合は、それは、適切な界面活剤性溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用するか、または酵素的切断によって膜から放出させられ得る。あるいは、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの発現において使用される細胞は、種々の物理的もしくは化学的手段（例えば、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的な破砕）によって、または細胞溶解剤の使用によって破壊され得る。
【０１３６】
例示的な精製方法として、イオン交換カラムクロマトグラフィー；シリカゲルもしくは陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）を使用するクロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；前立腺腫瘍抗原ポリペプチドのエピトープタグ化形態を結合させるための金属キレート化カラムを使用するクロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；および硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。通常は、単離された前立腺腫瘍抗原ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。例えば、前立腺腫瘍抗原タンパク質は、標準的な抗前立腺腫瘍抗原抗体カラムを使用して精製され得る。限外濾過および透析技術もまた、タンパク質の濃縮と組み合わせて、有用である（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２を参照のこと）。必要とされる精製の程度は、前立腺腫瘍抗原の使用に依存して変化する。いくつかの例においては、精製は必要ではない。
【０１３７】
必要とされる場合は、一旦発現され、そして精製されると、本発明の前立腺腫瘍抗原タンパク質および核酸は、以下に詳述されるように、多数の適用において有用である。
【０１３８】
（２．発現されたタンパク質の標識）
本発明の核酸、タンパク質、および抗体は、標識され得る。本明細書中では、標識された、によって、化合物が、化合物の検出を可能にするために付着させられた少なくとも１つのエレメント、同位元素、または化合物を有すること意味する。一般的には、標識は、以下の３つのクラスに入れられる：ａ）同位元素標識（これは、放射活性同位元素または重金属同位元素であり得る）；ｂ）免疫標識（これは、抗体または抗原であり得る）；およびｃ）発色または蛍光色素。標識は、検出される化合物の生物学的活性または特徴を妨害しない任意の位置で、化合物中に取り込まれ得る。
【０１３９】
（３．前立腺腫瘍抗原融合タンパク質）
本発明の前立腺腫瘍抗原はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された前立腺腫瘍抗原を含有するキメラ分子を形成するための方法で改変され得る。本明細書中で使用される用語「融合タンパク質」は、「標的化ポリペプチド」に融合された、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドを含有するキメラポリペプチドまたはそのドメイン配列をいう。標的化ポリペプチドは、特定の細胞型またはレセプターに対する標的化を容易にするために十分な残基を有し、それはなお、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドの生物学的機能を妨害しないように十分に短い。標的化ポリペプチドはまた、好ましくは、かなり特有であり、その結果、融合タンパク質は、他の細胞型またはレセプターとは実質的に交差反応しない。適切な標的化ポリペプチドは、一般的には、少なくとも約１０個のアミノ酸残基を有し、そして通常は、約１０個から約５００個までの間のアミノ酸残基を有する。好ましい標的化ポリペプチドは、約２０個から約２００個までのアミノ酸残基を有する。
【０１４０】
融合タンパク質はまた、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの前立腺腫瘍抗原の融合体を含み得る。エピトープタグは、一般的には、前立腺腫瘍抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。このような前立腺腫瘍抗原のエピトープタグ化形態は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの供給は、前立腺腫瘍抗原が抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の型のアフィニティーマトリックスを使用することによって容易に精製されることを可能にする。あるいは、融合タンパク質は、イムノグロブリンまたはイムノグロブリンの特定の領域との前立腺腫瘍抗原の融合体を含み得る。キメラ分子の二価の形態については、このような融合体は、ＩｇＧ分子（または例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）のＦｃ領域であり得る。好ましい融合タンパク質として、前立腺腫瘍抗原の免疫標的化を容易にする分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
前立腺腫瘍抗原融合タンパク質は、当該分野で周知の技術を使用して種々の他の目的のために生成され得る。例えば、抗体の作製のためには、所望されるエピトープが小さい場合は、部分的なまたは完全な前立腺腫瘍抗原タンパク質が、免疫原を形成するために、キャリアタンパク質と融合させられ得る。あるいは、前立腺腫瘍抗原タンパク質は、抗原が細胞性および／または体液性（抗体に基づく）免疫応答を刺激する能力を増大させるような融合タンパク質として、または他の理由について生成され得る。
【０１４２】
（Ｅ．抗前立腺腫瘍抗原抗体）
本発明はさらに、抗前立腺腫瘍抗原抗体を提供する。本発明の抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的、および異種結合抗体が挙げられる。
【０１４３】
（１．ポリクローナル抗体）
本発明の抗前立腺腫瘍抗原抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。このようなポリクローナル抗体は、哺乳動物中で、例えば、免疫化薬剤、および好ましくは、アジュバントの１回以上の注射後に、産生され得る。代表的には、免疫化薬剤および／またはアジュバントは、一連の皮下または腹膜内注射によって哺乳動物中に注射される。免疫化薬剤は、前立腺腫瘍抗原またはその融合タンパク質を含み得る。免疫化される哺乳動物中で免疫原性であることが公知のタンパク質に対して抗原を結合させることが、有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆のトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントとして、例えば、フロイトの完全なアジュバント、およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルＬｉｐｉｄ  Ａ、合成のトレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、標準的なプロトコルに基づいて、または慣用的な実験によって、当業者によって決定され得る。
【０１４４】
（２．モノクローナル抗体）
あるいは、抗前立腺腫瘍抗原抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって産生され得る。ここで、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、免疫化薬剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、免疫化薬剤で免疫される（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
【０１４５】
免疫化薬剤は、代表的には、前立腺腫瘍抗原またはその融合タンパク質を含む。一般的には、非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合には、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用されるか、またはヒト起源の細胞が所望される場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用される。リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を産生するために、適切な融合化薬剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して不朽化された細胞株と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９−１０３頁（１９８６））。一般的には、不朽化された細胞株は、形質転換された哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、またはヒト起源の骨髄腫細胞）である。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不朽化された細胞の増殖または生存を阻害する、１つ以上の基質を好ましくは含有する、適切な培養培地中で培養される。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる基質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）を含有する。
【０１４６】
好ましい不朽化された細胞株は効率的に融合し、抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して敏感である細胞株である。より好ましい不朽化された細胞株は、マウスまたはヒト骨髄腫細胞株であり、これは、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能であり得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株がまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５１−６３頁（１９８７））。
【０１４７】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地（上清）は、前立腺腫瘍抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ上清中に存在するモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によって、またはインビトロでの結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。適切な技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。
【０１４８】
所望の抗体産生性ハイブリドーマ細胞が同定された後、細胞は、限界希釈手順によってクローニングされ得、および標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）によって増殖され得る。この目的のための適切な培養培地として、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水のように、インビボで増殖させられ得る。
【０１４９】
選択されたクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、当業者によって慣用的に使用されるイムノグロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水液から単離または精製され得る。
【０１５０】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような、組換えＤＮＡ法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、前立腺腫瘍抗原特異的ハイブリドーマ細胞から単離され得、そして例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、配列決定され得る。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に挿入され得る。これは次いで、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得るために、他にはイムノグロブリンタンパク質を産生しない、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトされる。ＤＮＡはまた、例えば、相同性マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））、またはイムノグロブリンコード配列の全てもしくは非イムノグロブリンポリペプチドのコード配列の一部に共有的に連結することによって、改変され得る。非イムノグロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインについて置換され得るか、またはキメラの二価抗体を作製するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインについて置換され得る。
【０１５１】
抗体はまた、一価の抗体でもあり得る。一価の抗体を調製するための１つの方法は、当該分野で周知である。例えば、インビトロでの方法が、一価の抗体を調製するために適切である。抗体のフラグメント（特に、Ｆａｂ）を産生するための抗体の消化は、当該分野で公知の慣用的である技術を使用して達成され得る。
【０１５２】
（３．ヒト化抗体）
本発明の抗前立腺腫瘍抗原抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。用語「ヒト化抗体」は、キメラ抗体、そのイムノグロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合部分の配列）である非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態をいう。これは、非ヒト抗体に由来する配列のいくつかの部分を含む。ヒト化抗体として、ヒトイムノグロブリンが挙げられる。ここでは、ヒトイムノグロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基は、所望の結合特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種のＣＤＲに由来する残基で置換される。一般的には、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、そして一般的には、２つの可変ドメインを含む。ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒトイムノグロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１５３】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト抗体により密接に似るようにするために、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸を有するが、抗体のもともとの結合活性をなお維持している。抗体のヒト化のための方法はさらに、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）にさらに詳述されている。
【０１５４】
このような「ヒト化」抗体は、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体（ここでは、実質的にインタクトではないヒト可変ドメイン）である。
【０１５５】
（４．ヘテロ結合体抗体）
２つの共有結合された抗体を含むヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、架橋剤に関する方法を含む、合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって調製され得る。
【０１５６】
（５．二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような抗体はモノクローナルであり、そして好ましくは、ヒトまたはヒト化である。本発明の二重特異的抗体の結合特異性の１つは、前立腺腫瘍抗原に対するものであり、そして他方は、好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに対するものである。
【０１５７】
二重特異的抗体を作製するための方法が当該分野で公知であり、そして一般的には、二重特異的抗体の組換え産生は、ハイブリドーマ細胞中での２つのイムノグロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。イムノグロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせが、ハイブリドーマによる可能性のある１０個の異なる抗体分子の産生を生じると仮定すると、正確な分子の精製は、通常は、いくつかの種類のアフィニティー精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を必要とする。
【０１５８】
（ＩＩＩ．有用性）
（Ａ．ポリヌクレオチド）
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補物）は、染色体および遺伝子マッピングならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ作製において種々の適用（ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む）を有する。さらに、前立腺腫瘍抗原コード核酸は、本明細書中に記載のように、薬学的介入のための（例えば、ＤＮＡワクチン開発のための）、および組換え技術による前立腺腫瘍抗原ポリペプチド調製のための標的として有用である。本明細書中に記載のポリヌクレオチド（その配列改変体を含む）は、診断アッセイ（特に、腫瘍細胞検出のための）において使用され得る。本発明の重要な特色は、記載された配列が前立腺腫瘍細胞に特異的なものとして現在認識されているが、これはまた、他の腫瘍細胞の特徴でもあり得ることである。従って、体液または組織サンプル中のこのようなポリヌクレオチドの存在の検出に基づく診断方法は、本発明の特色である。
【０１５９】
本発明に従う核酸に基づく診断アッセイの例は、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション）およびＰＣＲに基づくアッセイを含むが、それらに限定されない。本明細書中に記載のポリヌクレオチド（その長さを伸長したポリヌクレオチド、配列改変体、およびそのフラグメントを含む）を使用して、このようなアッセイにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーを作製し得る。このようなプローブおよびプライマーは、本明細書中に記載の腫瘍特異的ポリヌクレオチドに類似するかまたは相補的な、ポリヌクレオチド配列（ゲノム配列を含む）を検出し得る。
【０１６０】
ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、組織サンプル（例えば、顕微鏡スライド上に調製した固定組織切片もしくは凍結組織切片、または懸濁細胞）上でのインサイチュハイブリダイゼーションを行うことにおいて使用され得る。簡単には、標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、制御された条件下で、準備ができた顕微鏡上の組織切片中のそのＤＮＡまたはＲＮＡ標的サンプルに結合させる。一般的に、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡベクターにクローニングされた目的のＤＮＡからなるｄｓＤＮＡプローブがこの目的のために使用されるが、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡプローブもまた使用され得る。プローブは、一般的に、長さが約１５〜４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。あるいは、プローブは、ＰＣＲランダムプライミングプライマー伸長により作製されたポリヌクレオチドプローブ、またはプラスミドからのインビトロＲＮＡ転写により作製されたポリヌクレオチドプローブ（リボプローブ）であり得る。これらの後者のプローブは、代表的に、長さが数百塩基対である。プローブは、当該分野で周知の方法に従って、蛍光タグ、酵素、または放射性部分を含む多数の方法のいずれかにより標識され得る。特定の検出方法は、プローブにおいて利用される標識の型と対応する（例えば、適切なように、オートラジオグラフィー、Ｘ線検出、蛍光顕微鏡分析、または光学（ｖｉｓｕａｌ）顕微鏡分析）。反応は、使用する検出分子の標識に対して指向される免疫細胞化学的技術（例えば、蛍光標識プローブに存在する蛍光部分に指向される抗体、またはアビジンもしくはマーカー酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）に対する抗体）を用いてインサイチュにおいてさらに増幅され得る。特異的標識およびインサイチュ検出方法は、例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．編、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＮＯＮＲＡＤＩＯＡＣＴＩＶＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，（１９９３）に見出され得る。
【０１６１】
前立腺腫瘍細胞を検出するための１つの好ましいアッセイは、ＰＣＲに基づくアッセイにおけるプライマーとして、本ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを利用する。このアッセイによれば、試験組織または細胞サンプルに存在する核酸は、配列番号１〜８および１４からなる群の１つ以上に由来する少なくとも１５のヌクレオチドからなる２つのプライマー（本明細書中に記載のように、このような配列の改変体および／または伸長に由来するプライマーを含む）を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。増幅産物は、米国特許第４，６８３，１９５号に記載の方法に従って、増幅産物を標識するために使用された特定の標識に適した方法によりサンプル中で検出される。ＰＣＲ検出方法（例えば、ＰＣＲインサイチュハイブリダイゼーション）における使用のために、ＰＣＲプライマーは、長さが少なくとも１５のヌクレオチド、および好ましくは、長さが約１５〜３０のヌクレオチドであるように選択され、そして当該分野で公知の方法に従って目的のＤＮＡ分子から選択される。このようなプライマーは、本明細書中で配列番号１〜配列番号８および配列番号１４として同定される配列内から選択され得るが、一方、上記の節ＩＩＡ２に従って同定されるより長いヌクレオチド配列を含む配列を選択することもまた望ましくあり得る。好ましくは、プローブは、２つのハイブリダイゼーション部位が、約１００〜１，０００ヌクレオチド（時々、約１０，０００ヌクレオチドまで）分離されるように選択される。
【０１６２】
組織切片および／または細胞サンプルのＰＣＲインサイチュハイブリダイゼーションは、固定細胞または組織サンプル中の稀な細胞型に対する高感度検出方法を提供する。ＰＣＲインサイチュハイブリダイゼーション検出方法は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ：ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９２：米国特許第５，５３８，８７１号、これらの両方は本明細書中に参考として援用される）に従って行われる。
【０１６３】
簡単には、細胞サンプル（顕微鏡スライド上の組織、ペレット化細胞懸濁物）を、一般的な固定調製物（例えば、緩衝化ホルマリン、ホルムアルデヒドなど）を用いて固定する。試薬に対する細胞浸透性を増大させるためのプロテイナーゼまたは界面活性剤処理は、固定後が好ましい。ＰＣＲ反応を、２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインサイチュで行う。上記で議論されたように、プライマーは、本明細書中に記載のヌクレオチド配列、特に、配列番号１〜配列番号８および配列番号１４として記載される配列の１つ以上を選択的に増幅するように設計される。増幅反応混合物は、標的ヌクレオチドサンプルおよびプライマーに加えて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、米国特許第４，８８９，８１８号））および十分な量の４つの標準的なデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）（これらの１つ以上は検出を容易にするために標識され得る）を含む。反応混合物を、標的ヌクレオチド配列の複数コピー（増幅産物）を生成するために数回のサーモサイクリングに供する。次いで、増幅産物を、例えば、放射性標識増幅産物を検出することによりサンプル中で検出する。
【０１６４】
ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーはまた、本発明に従って同定される全長タンパク質に対応するゲノム配列（天然に存在するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター、エンハンサーエレメント、およびイントロンを含む）から選択され得る。
【０１６５】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はまた、前立腺腫瘍抗原をコードする遺伝子をマップするための、および個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用され得る。本明細書中に提供されるヌクレオチド配列は、既知の技術（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖解析、およびライブラリーを用いたハイブリダイゼーションスクリーニング）を用いて染色体および染色体の特定領域にマップされ得る。簡単には、配列は、前立腺腫瘍抗原ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域のコンピューター解析を使用して、増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡにおいて１を超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１６６】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り与えるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いた本発明を用いて、亜局在性（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が、特定の染色体に由来するフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて類似の様式で達成され得る。その染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識された流動選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いたプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を含む。
【０１６７】
本発明の前立腺腫瘍抗原をコードする遺伝子の変化を有する個体またはその遺伝子において変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断のために使用される核酸は、患者の細胞（例えば、組織生検および解剖材料を含む）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用され得るか、または分析前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６（１９８６））を用いることにより酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、本発明の遺伝子における変異を同定および分析し得る。欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出され得る。
【０１６８】
点変異は、増幅ＤＮＡを、本発明の放射性標識ＲＮＡあるいは本発明の放射性標識アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定され得る。特定の位置での配列変化もまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）もしくは化学切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１（１９８５））により、または融解温度の差異により明らかにされ得る。本発明の核酸に相補的なプローブ配列を含むヘアピン型１本鎖合成オリゴヌクレオチドである、「分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）」（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−１２２９（１９９８））もまた、点変異または他の配列変化を検出するために、ならびに前立腺腫瘍抗原の発現レベルをモニターするために使用され得る。
【０１６９】
前立腺腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補物はまた、治療目的のために使用され得る。前立腺腫瘍抗原の発現はアンチセンス技術により調整され得、この技術は、前立腺腫瘍抗原をコードする遺伝子の制御、５’または調節領域に対する相補ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）により遺伝子発現を制御する。例えば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する。転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチド（例えば、開始部位から−１０位と＋１０位の間）が好ましい。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であるように設計され（Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１））、それにより転写およびその後の前立腺腫瘍抗原生成を妨げるか、または防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の前立腺腫瘍抗原タンパク質への翻訳をブロックする（Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１））。アンチセンス構築物は当該分野で公知の手順により細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡはインビボで発現され得る。
【０１７０】
本発明の治療ポリヌクレオチドは、適切な薬学的キャリアと組み合せて使用され得る。このような組成物は、治療的に有効な量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせを含むが、それらに限定されない。その処方は、投与形式に従って選択される。
【０１７１】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチド、ならびにその生物学的活性を調整するアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドは、インビボでのこのようなポリペプチドの発現（すなわち「遺伝子治療」）により本発明に従って使用され得る。患者に由来する細胞は、エキソビボで、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り込むように操作され得、次いで、この操作された細胞は患者に投与される。このような処置方法は当該分野で公知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用により操作され得る。
【０１７２】
あるいは、細胞は、当該分野で公知の手順により、インビボでのポリペプチド発現のためにインビボで操作され得る。例として、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を生成し得るプロデューサー細胞は、細胞操作および発現のために患者に投与され得、両方の工程はインビボで起こる。細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えば、適切な送達ビヒクル中での後のインビボ投与のために、インビトロまたはインビボで細胞を操作するために使用され得るアデノウイルスであり得る（例えば、Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６３６７−６３７２（１９９８）を参照のこと）。
【０１７３】
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドまたはその任意の改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、次に、これらの動物は、治療上有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）はトランスジーンを含む細胞を有する動物であり、このトランスジーンは、動物または出生前（例えば、胚段階）の動物の原型（ａｎｃｅｓｔｏｒ）に導入された。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組込まれたＤＮＡである。前立腺腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡは確立した技術に従ってゲノムＤＮＡに取り込まれ得、このゲノムＤＮＡを使用して、前立腺腫瘍抗原を発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製する。トランスジェニック動物（特に、マウスおよびラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載される。このようなトランスジェニック動物は、特定の前立腺腫瘍抗原をコードするＤＮＡの改変した発現の効果を調べるために使用され得る。このような動物は、例えば、特定の前立腺腫瘍抗原の発現または過剰発現と関連する病理学的状態からの保護を付与すると考えられる試薬に対する試験動物として使用され得る。従って、動物は試薬で処置され、そしてトランスジーンを有する非処置動物と比較した、特定の前立腺腫瘍抗原と関連する病理学的状態の発生数の低減は、その病理学的状態に対する治療介入の可能性を示す。
【０１７４】
あるいは、前立腺腫瘍抗原の非ヒトホモログは、選択された前立腺腫瘍抗原をコードする欠損遺伝子または変えられた遺伝子を有する、「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。例えば、前立腺腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡは、確立した技術に従って、前立腺腫瘍抗原をコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得る。前立腺腫瘍抗原をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロ塩基の変えられていない隣接ＤＮＡ（５’および３’末端の両方）がベクターに含まれる（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは胚性幹細胞株に導入され、そして導入ＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えした細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞は動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射されて、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ），１１３−１５２（１９８７）を参照のこと）。次いで、キメラ胚は適切な雌の里親動物に移植され得、そして胚は、「ノックアウト」動物を生み出すために出産予定日まで育てられ得る。それらの生殖細胞に相同組換えＤＮＡを有する子供は、標準的な技術により同定され得る。ノックアウト動物は、例えば、選択された前立腺腫瘍抗原と通常関連する病理学的状態の非存在のために特徴づけられ得る。
【０１７５】
（Ｂ．ポリペプチド）
同様に、本明細書中で提供される全長ヌクレオチド配列、および時には部分的なヌクレオチド配列の知識は、本明細書中に記載のヌクレオチドによりコードされる種々のポリペプチドを同定するための基礎を提供する。このようなポリペプチド抗原またはその免疫原性フラグメントは、例えば、生物に存在する腫瘍細胞を根絶する目的のための、宿主生物において免疫応答（体液性または細胞性）を誘発するために、あるいは治療のためのまたは本発明に従う診断キットにおける使用のための、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体生成を刺激するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、非常に多くの使用（腫瘍特異的抗原に対するワクチンの生成における有用性を含むが、それらに限定されない）を有する。このようなワクチンは、標的生物において体液性（抗体）または細胞性免疫応答を生じるように処方され得る。一般的に、ワクチン組成物は、全長ポリペプチドまたは抗原性ペプチドを用いて生成され得、ここで後者は、一般的に免疫原性キャリアに結合され、そして細胞性免疫刺激組成物は、本明細書中に参考として援用される共有に係る同時係属米国特許出願第０８／５７９，８２３号に記載のような方法に従って生成され得る。
【０１７６】
本発明に従うポリペプチドはまた、検出方法（例えば、ラジオイムノアッセイに基づく診断アッセイおよびＥＬＩＳＡに基づく診断アッセイ）において有用性を見出し得る。このようなポリペプチドはまた、このようなアッセイにおける試薬として使用される抗体を生成するために使用され得る。このようなアッセイの準備および最適化は、アッセイ開発の当業者の技術範囲内である。
【０１７７】
本発明はまた、前立腺腫瘍抗原についてのレセプターを同定するための方法を含む。前立腺腫瘍抗原レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の非常に多くの方法（例えば、リガンドパンニング（ｌｉｇａｎｄ  ｐａｎｎｉｎｇ）およびＦＡＣＳ選別（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（２），第５章（１９９１）））により同定され得る。好ましくは、発現クローニングが使用され、ここでポリアデニル化ＲＮＡは前立腺腫瘍抗原応答性細胞から調製され、そしてこのＲＮＡから創作されたｃＤＮＡライブラリーはプールに分けられ、そしてこれを使用して、ＣＯＳ細胞または前立腺腫瘍抗原非応答性の他の細胞をトランスフェクトする。ガラススライド上で増殖されたトランスフェクト細胞は、標識された前立腺腫瘍抗原に暴露される。前立腺腫瘍抗原は、種々の手段（ヨウ素化、または部位特異的プロテインキナーゼの認識部位の封入を含む）により標識され得る。固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフ分析に供される。陽性プールは同定され、そしてサブプールは調製され、そして反復サブプーリング（ｓｕｂ−ｐｏｏｌｉｎｇ）および再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフェクトされ、最後に、推定レセプターをコードする単一クローンを得る。
【０１７８】
レセプター同定のための代替アプローチとして、標識された前立腺腫瘍抗原は、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合され得る。架橋材料はＰＡＧＥにより分離され、そしてＸ線フィルムに暴露される。前立腺腫瘍抗原−レセプターを含む標識複合体は切り出され、ペプチドフラグメントに分離され、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定レセプターをコードする遺伝子を同定するための、１セットの縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。
【０１７９】
本発明はまた、前立腺腫瘍抗原活性に対して調整効果を有する分子（例えば、合成薬物、抗体、ペプチド、または他の分子）（例えば、前立腺腫瘍抗原−レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト）を同定するための方法を含む。
【０１８０】
前立腺腫瘍抗原が別のタンパク質に結合する場合、例えば、前立腺腫瘍抗原がレセプターとして機能する場合、前立腺腫瘍抗原は、結合相互作用に関与し得る他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイにおいて使用され得る。このような方法により、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターが同定され得る。このような結合相互作用に関与するタンパク質はまた、この結合相互作用の、ペプチドもしくは小分子インヒビターまたはアゴニストをスクリーニングするために使用され得る。
【０１８１】
スクリーニングアッセイは、ネイティブな前立腺腫瘍抗原またはこのような前立腺腫瘍抗原のレセプターの生物学的活性を調整する化合物を見出すように設計され得る。好ましいスクリーニングアッセイは、それらを小分子薬物候補物の同定に特に適切にする、化学薬品ライブラリーの高スループットスクリーニングに従う。意図される小分子は、合成有機化合物または無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイ（これらの全ては当該分野において十分に特徴付けられている）を含む、種々の形式で行われ得る。
【０１８２】
（Ｃ．抗体）
前立腺腫瘍抗原ポリペプチドはまた、抗体を作製するために使用され得るが、前立腺腫瘍抗原ポリペプチドは、少なくとも１つのエピトープまたは決定基を、図９Ａ〜Ｃまたは１１のいずれか１つに示される全長タンパク質配列と共有しなければならない。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」は、抗体を作製および／または結合するタンパク質の一部を意味する。従って、大抵の場合、より小さな前立腺腫瘍抗原ポリペプチドに対して作られた抗体は、全長タンパク質に結合し得る。エピトープは独特であることが好ましく；すなわち、独特のエピトープに対して作製された抗体は、他の抗原とほとんどまたは全く交差反応性を示さない。言い換えれば、本発明の抗体は前立腺腫瘍抗原に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体が、少なくとも１０6〜１０8Ｍの範囲の結合定数でタンパク質に結合することを意味し、好ましい範囲は１０7〜１０9Ｍである。
【０１８３】
本発明の抗前立腺腫瘍抗原抗体は種々の有用性を有し、例えば、それらは、前立腺腫瘍抗原の存在についての（例えば、特定の細胞、組織、および／または血清における発現を検出するための）診断アッセイにおいて使用され得る。当該分野で公知の種々の診断アッセイ（例えば、競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイ、および不均一相または均一相いずれかにおいて行われる免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，ＣＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１４７−１５８（１９８７）））が使用され得る。このような診断アッセイにおいて使用される抗体は、検出可能な標識で標識され得る。検出可能な標識は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを生じ得るべきである。例えば、検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓもしくは125Ｉ）、蛍光もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。抗体を検出可能な標識に結合するために、当該分野で公知の任意の方法（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載される方法を含む）が使用され得る。
【０１８４】
抗前立腺腫瘍抗原抗体は、組換え細胞培養物または天然供給源からの前立腺腫瘍抗原のアフィニティ精製に有用である。このプロセスにおいて、前立腺腫瘍抗原に対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙）上に固定化される。次いで、固定化抗体は、精製される前立腺腫瘍抗原を含むサンプルと接触させられ、その後、支持体は、固定化抗体に結合している前立腺腫瘍抗原を除くサンプル中材料を実質的に全て除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は、前立腺腫瘍抗原を抗体から放出する別の適切な溶媒で洗浄される。
【０１８５】
本発明の前立腺腫瘍抗体は、この抗体が特異的に反応する前立腺腫瘍抗原の生物学的機能を低減または排除し得る。すなわち、ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル抗前立腺腫瘍抗原抗体の、前立腺腫瘍レセプターを含む細胞への添加は、前立腺腫瘍の存在と関連する病理を低減または排除し得る。一般的に、活性の少なくとも５０％の減少が好ましく、少なくとも約７５％がより好ましく、少なくとも約８５〜９０％が特に好ましく、そして約９５〜１００％の減少がとりわけ好ましい。
【０１８６】
抗前立腺腫瘍抗体組成物は、当該分野で公知の方法に従って、特異性、効力、組織代謝を確かめるために、そして投薬量を見積もるために、疾患の適切なインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて試験される。
【０１８７】
抗前立腺腫瘍抗体組成物は、一貫したおよび予測可能な濃度の抗体を標的組織において提供するように設計された多数の経路および方法のうちのいずれかにより投与され得る。抗体組成物は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、安定化化合物）と組み合せて、および／または他の薬学的薬剤（例えば、薬物もしくはホルモン）と組み合せて投与され得る。治療値（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｌｕｅ）は、前立腺腫瘍抗原に特異的な１つ以上の抗体を投与することにより達成され得る。このような抗体は、腫瘍抗原とそのレセプターとの相互作用の防止に有用であり得る。
【０１８８】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本発明の治療適用に好ましい。この抗体は、代表的に、約１〜１５ｍｇ／ｋｇ被験体体重の量でＩＶ注射により滅菌溶液として投与されるが、他の非経口投与経路が適切であり得る。適切な処置レジメは、選択された特定の抗体の親和性、選択された投与経路、用量、および患者の状態に依存して変化する。これらのパラメーターは、日常的な実験を用いて当業者により容易に決定可能である。１つの例示的な方法において、抗体処置は、抗体を腫瘍部位に投与することにより腫瘍増殖を阻害するために使用され、そしてこのような投与は治療改善が見られるまで続けられる。
【０１８９】
処置方法における使用のための治療組成物は、滅菌した注射可能な溶液中の抗体、経口送達ビヒクル中の抗体、または噴霧形態のポリペプチドを含み得、全ては周知の方法に従って調製される。このような組成物は、治療的に有効な量の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【０１９０】
以下の例は例示的な目的のためだけに提供され、そしていかようにも本発明の範囲を限定することが意図されない。
【０１９１】
本明細書中に引用された全ての特許および参考文献は、それらの全体が参考として本明細書により援用される。
【０１９２】
（ＩＶ．材料および方法）
（Ａ．ディファレンシャルディスプレイ検出キットおよびプライマー）
市販のディファレンシャルディスプレイ検出キット「ＨＩＥＲＯＧＬＹＰＨ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＥＮＯＭＹＸ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、前立腺腫瘍細胞に特異的なポリヌクレオチドを同定した。このシステムは、２連のサンプル間で優れた再現性を有する、長さが１．２〜１．５ｋｂまでのｃＤＮＡフラグメントを生成するように設計されている。ＨＩＥＲＯＧＬＹＰＨアンカー（ａｎｃｈｏｒｅｄ）プライマーは、フラグメント／ベクターサブクローニングを必要としない、最初のｍＲＮＡ転写物の３’末端からの指向性配列決定を可能にする１７ｎｔのＴ７  ＮＡポリメラーゼプロモーター由来部位（ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）を取り込んでいる。ＨＩＥＲＯＧＬＹＰＨシステムにおいて使用するアービトラリー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）５’プライマーのコアアニーリング配列は、長さが１０塩基である。２０個の異なるアービトラリー上流プライマーを使用する。アービトラリープライマー（ＡＲＰ）は、最初の転写物の５’末端からの指向性配列決定を可能にする、Ｍ１３ユニバーサル逆（１４８）２４マープライマー配列の１６ｎｔセグメント、ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡ（配列番号１３）を取り込んでいる。従って、各々のＡＲＰは、長さが２６ｎｔである。
【０１９３】
（Ｂ．差引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）前立腺ｃＤＮＡの富化）
「高度に富化された」差引き前立腺ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのｃＤＮＡサブトラクションキットに詳述される方法により調製した。簡単には、テスターｃＤＮＡを、正常ヒト前立腺ポリＡ＋ＲＮＡから調製した；目的の組織特異的配列を含むｃＤＮＡ集団。ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）ｃＤＮＡを、１０個の異なる組織（脾臓、胸腺、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、および骨格筋を含む）から調製したポリＡ＋ＲＮＡ混合物から調製した。サブトラクティブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーションおよび一次ＰＣＲを、これらの２つの集団を用いて行った。
【０１９４】
（Ｃ．前立腺腫瘍特異的核酸のクローニング）
全てのクローニング手順を、市販のキットを用いて、製造者により提供されるプロトコルに従って行った。差引き前立腺ＤＮＡを、「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて作製した。サブクローニング手順を、「ＴＡクローニングキット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて行った。
【０１９５】
（実施例１）
（前立腺腫瘍細胞からの遺伝子の分子クローニング）
正常前立腺、前立腺ガン腫細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７４０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、およびＨｅＬａ細胞のｍＲＮＡ発現パターンを、上記のＨＩＥＲＯＧＬＹＰＨ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）により比較した。全手順を、本質的に、パッケージの挿入物として提供され、そして本明細書中に参考として援用される製造者の説明書に記載されるように行った。簡単には、ＤＮＡを含まない総ＲＮＡを、ＳＮＡＰ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて細胞株から単離した。前立腺組織由来ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から商業的に得、そしてゲノムＤＮＡ汚染物を除去するためにＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅで処理した。質的に、このＲＮＡは、１．８を超える最小ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を有した。このＲＮＡは、電気泳動分析によりインタクトであることが決定された。
【０１９６】
ＲＮＡ転写物の第１鎖ｃＤＮＡコピーを、市販の転写酵素（「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ」，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、およびＨＩＥＲＯＧＬＹＰＨキットにおいて提供される３’「アンカー」プライマーを用いて作製した。反応を、４２℃で１時間行った。次いで、逆転写ＲＮＡを、１０個のアンカー３’プライマーおよび４個のアービトラリー５’プライマーの２つ一組の組み合わせを有する２連反応を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に供した。アンカープライマーは、逆転写酵素反応において使用したものと同一であった。反応混合物中に、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼおよび［α−33Ｐ］ｄＡＴＰもまた存在した。４回のＰＣＲサイクルを４６°で行い、そして２５サイクルを６０°で行った。反応産物を、４．５％および／または６％ＨＲ−１０００ゲルでの電気泳動により分離し、続いて得られたゲルのオートラジオグラフィーを行った。
【０１９７】
２０のプライマー組み合わせを、計１２０のＰＣＲ反応について、３つのｍＲＮＡ供給源各々からの２連の実験において評価した。スクリーニングレジメから作製したＤＤ−ＰＣＲフラグメントを、３３（ｇｅｎｏｍｙｘＬＲおよびＨＲ−１０００ゲルを用いた６１ｃｍゲル）でのゲル電気泳動により分析した。ゲルのオートラジオグラフを、前立腺ガン腫細胞株サンプルＬｎＣａＰのみにおいて特異的に発現するが、ＨｅＬａガン腫または正常前立腺において発現しないバンドについて分析した。これらの基準を満たす計５４のＤＤ産物を同定し；バンドをゲルから切り出し、そしてＰＣＲにより再増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を介して精製し、そして５’末端を、ジデオキシターミネーターを用いるサイクルシークエンス法によるＤＮＡ配列決定に供した。配列を、５４のフラグメントの全てについて得た。５４個のフラグメントは３５個の異なるｍＲＮＡ転写物を示し、これを、ＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＳＴ部、およびＥＭＢＬの毎日更新されるデータベース発表と比較した。ＢＬＡＳＴＮまたはＴＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いた有意なデータベース適合の欠如により証明されるように、計８個のｍＲＮＡ／ＣＤＮＡが新規であると見出された（実施例２、配列番号１〜４、６〜８）。配列番号５は、この方法により、チレドキシンレダクターゼ遺伝子ファミリーの新規メンバーと同定された。
【０１９８】
（実施例２）
（選択されたヌクレオチド配列のスクリーニング）
（Ａ．配列番号１〜８の配列同一性スクリーニング）
ヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＮＲ（１９９７年５月６日；３０９９２０配列）およびＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＥＳＴ（１９９７年５月６日；１０１５５４７４配列）データベース発表に対して、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いてスクリーニングした。配列番号１〜４および６〜８は、いずれの既知の配列とも有意な配列類似性を有さないことが見出された。配列番号５は、ＢＬＡＳＴＮにより、特徴付けられていないマウスＥＳＴと実質的な相同性（約７８％）を有することが見出された。配列番号５から推定され、本明細書中に配列番号９〜１１として援用されるアミノ酸配列もまた、ＴＢＬＡＳＴＸにより、マウスおよびヒトチオレドキシンレダクターゼの一部との相同性を有することが決定され、これは、検出されたヌクレオチド配列が、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子ファミリーの新規メンバーをコードすることを示唆する。
【０１９９】
（Ｂ．ＳＰ  １−４配列の配列同一性スクリーニング）
ＳＰ  １−４ヌクレオチド配列（配列番号１４）を、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＮＲおよびＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＥＳＴデータベース発表（１９９８年７月１日）に対して、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いてスクリーニングした。配列番号１４およびその部分配列は、任意の既知の核酸配列と約４５％未満の配列同一性を有することが見出された。推定ＳＰ  １−４アミノ酸配列である配列番号１５は、配列番号１５のアミノ酸１〜１０９５と１９９８年７月１日の「ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ＧｅｎｂａｎｋＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ」データベースとを比較する検索においてＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて、配列の全長にわたって任意の既知のポリペプチドと約３０％未満の配列同一性を有することが見出され、これは、ＳＰ  １−４ヌクレオチド配列が新規タンパク質をコードすることを示唆する。
【０２００】
（実施例３）
（ヒトＳＰ  １−４  ｃＤＮＡの分子クローニング）
（Ａ．最初の部分ｃＤＮＡ挿入物の単離）
前立腺特異的部分ｃＤＮＡ配列が高度に富化されたヒト差引き前立腺ｃＤＮＡを、以下のプライマー対：
ＮＰ１  ５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３ ’（配列番号１６）
ＮＰ２  ５’−ＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴ−３ ’（配列番号１７）
を用いて、以下の熱サイクリングプロフィール：９４℃１０秒；６８℃３０秒；７２℃５分を使用する１１サイクルで、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ９６００Ｃｙｃｌｅｒにおいて増幅した。この後に、７２℃５分でさらに１回行った。産物を、ｐＣＲ２．１  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のアンピシリン耐性細菌形質転換体を、以下のプライマー対：
Ｍ１３逆  ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ−３’（配列番号１８）
Ｍ１３正  ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号１９）
および以下の熱サイクリングプロフィール：９４℃１５秒；５５℃３０秒；７２℃１分を用いて、挿入物の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。この後に、７２℃６分でさらに１回行った。ｐＣＲ２．１プラスミド中の最初のＳＰ  １−４挿入物（配列番号２９）を、ＡＢＩ  ３７３  ＤＮＡ配列決定機において、Ｍ１３逆プライマー（配列番号１８）およびＭ１３−２０プライマー（配列番号１９）を用いて配列決定した。最初のＳＰ  １−４挿入物（配列番号２９）は、配列番号１４のヌクレオチド１５３４〜１８７５に対応する。ＤＮＡ配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．０（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて分析した。
【０２０１】
（Ｂ．全長ＳＰ  １−４  ｃＤＮＡの単離）
正常ヒト前立腺ポリＡ+ＲＮＡに由来するマラソン（ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡを、５’および３’両方のＲａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ、Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８９９８−９００２（１９８８），Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を行うために調製した５’ＲＡＣＥを、以下のプライマー対：
ＡＰ１  ５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２０）
Ａ７９３３１  ５−ＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２１）
を用いて行った。
【０２０２】
３’ＲＡＣＥを、以下のプライマー対：
ＡＰ１  ５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２０）；および
Ａ７９３２６  ５−ＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＧＡＡＣＴＴＣＣＧ−３’（配列番号２２）
を用いて行った。
【０２０３】
全ＲＡＣＥ反応の熱サイクリングプロフィールは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、９４℃１５秒；６８℃４分の３０サイクルであった。それぞれ、約４ｋｂおよび１．６ｋｂの５’および３’ＲＡＣＥ産物を、アガロースゲル電気泳動により単離し、ｐＣＲ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に連結し、そしてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。個々のアンピシリン耐性細菌コロニーを、５’ＲＡＣＥ産物については以下のプライマー対：
ＡＰ２  ５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号２３）
Ａ７９３３１  ５’−ＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧ −３’（配列番号２１）、
そして３’ＲＡＣＥ産物については以下のプライマー対：
ＡＰ２  ５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号２３）
Ａ７９３２８  ５’−ＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）
を用いて、９４℃１５秒；５５℃３０秒；７２℃１分の３５サイクル、続いて７２℃６分でさらに１回の熱サイクリングプロフィールを使用して、挿入物の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして個々の細菌形質転換体を、プラスミドＤＮＡ調製前に、液体培養（アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）中で増殖させた。個々のＲＡＣＥ産物の完全ＤＮＡ配列を、カスタムＤＮＡプライマーおよびＰｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と組み合わせてＡＢＩ  ３７３  ＤＮＡ配列決定機を用いて、自動化蛍光配列決定により決定した。
【０２０４】
ＳＰ  １−４  ｃＤＮＡと呼ぶ全５６６８塩基対のヌクレオチド配列を、図１０（配列番号１４）に示す。この配列は、ヌクレオチド４３〜４５位に明らかな翻訳開始部位を有し（Ｋｏｚａｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７３−３８９３（１９８４））、ヌクレオチド３３２８〜３３３０位に停止コドンを有する（図１０）、単一オープンリーディングフレームを含む。
【０２０５】
図１１に示す全長ＳＰ  １−４タンパク質（配列番号１５）は、１０９５アミノ酸長である。ＳＰ  １−４タンパクのアミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸７３２〜７４８、８４６〜８７６、６８１〜７０３、７８９〜８０５、９４４〜９７１、８２０〜８３７、および９９９〜１０１５それぞれに対応する膜貫通領域、ならびにアミノ酸６、７５、２４７、３０８、８１２、９２５、１０４１、および１０６３それぞれから始まる潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む。クローンｐＣＲ２．１／ＳＰ  １−４（５’ＲＡＣＥ、配列番号２７）およびｐＣＲ２．１／ＳＰ  １−４（３’ＲＡＣＥ、配列番号２８）はＡＴＣＣに寄託されており、そしてそれぞれ、ＡＴＣＣ寄託番号９８８２９および９８８２９を割り当てられている。
【０２０６】
（実施例４）
（ヒトＳＰ  １−４の発現）
（Ａ．ＲＴ−ＰＣＲ）
第１鎖ｃＤＮＡ合成を、ヒトポリＡ＋ＲＮＡおよびＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて調製した。以下のプライマー対：
Ａ８０５５２  ５’−ＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号２５）；および
Ａ８０５５３  ５’−ＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧ −３’（配列番号２６）
を使用して、９４℃１５秒；６５℃１５秒；７２℃３０秒（３０サイクル）、続いて７２℃６分でさらに１回の熱サイクリングプロフィールを用いて発現を評価した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして臭化エチジウム染色および紫外線により視覚化した。
【０２０７】
以下の表１に示すように、非常に多くのサンプルを増幅し、そしてＳＰ  １−４特異的ｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより、精巣および前立腺組織、ならびに結腸直腸腺ガン細胞株（ＳＷ４８０）、黒色腫組織サンプル（Ｇ３６１）、および前立腺ガン腫細胞株であるＬＮＣａＰにおいて明瞭に検出した。
【０２０８】
【表１】
0004234319.tif 000002
【０２０９】
（Ｂ．核酸ハイブリダイゼーション）
差引きライブラリーから単離した最初の挿入物を、ノーザンブロットおよびＲＮＡドットブロット分析のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。フラグメントを32Ｐ−ｄＣＴＰでランダムプライマー標識し、Ｇ−５０マイクロスピンカラムにおいて精製し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて６８℃で２〜４時間、フィルターにハイブリダイズさせた。フィルターを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳで室温で３０分、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で３０分、そして０．５×、０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分、連続して洗浄した。オートラジオグラフィーを、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲフィルムおよびシグナル増感スクリーンを用いて、１時間〜１日、−７０℃で行った。
【０２１０】
非常に多くの組織（以下の表２および３に示すように成人起源および胎児起源の両方）のヒトＲＮＡドットブロットおよびノーザンブロット分析の結果は、それぞれ、ＳＰ  １−４特異的ｍＲＮＡが前立腺組織において優先的に発現されることを示す。
【０２１１】
【表２】
0004234319.tif 000003
【０２１２】
【表３】
0004234319.tif 000004
【０２１３】
本発明を特定の方法および実施態様に関して記載してきたが、一方、種々の改変および変化は本発明を逸脱することなくなされ得ることが認識される。
【０２１４】
【表４】
0004234319.tif 000005
【０２１５】
【表５】
0004234319.tif 000006
【０２１６】
【表６】
0004234319.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本明細書中で配列番号１として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図２】  図２は、本明細書中で配列番号２として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図３】  図３は、本明細書中で配列番号３として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図４】  図４は、本明細書中で配列番号４として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図５】  図５は、本明細書中で配列番号５として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図６】  図６は、本明細書中で配列番号６として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図７】  図７は、本明細書中で配列番号７として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図８】  図８は、本明細書中で配列番号８として同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図９】  図９Ａ〜９Ｃは、配列番号５に由来する３つのペプチドの配列を、配列番号９（９Ａ）、配列番号１０（９Ｂ）、および配列番号１１（９Ｃ）として示す。
【図１０】  図１０は、配列番号１４として本明細書中で同定された、本発明の前立腺腫瘍由来ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図１１】  図１１は、配列番号１４に由来し、そして配列番号１５として同定されたポリペプチドの配列を示す。配列番号１４の予測した５’および３’非翻訳領域は小文字で示され、４３〜３２２７位のオープンリーディングフレームは大文字で示され、そして本来の部分ｃＤＮＡフラグメント（配列番号２９)は、下線で示される。
【配列表】
0004234319.tif 000008
0004234319.tif 000009
0004234319.tif 000010
0004234319.tif 000011
0004234319.tif 000012
0004234319.tif 000013
0004234319.tif 000014
0004234319.tif 000015
0004234319.tif 000016
0004234319.tif 000017
0004234319.tif 000018
0004234319.tif 000019
0004234319.tif 000020
0004234319.tif 000021
0004234319.tif 000022
0004234319.tif 000023
0004234319.tif 000024
0004234319.tif 000025
0004234319.tif 000026
0004234319.tif 000027
0004234319.tif 000028
0004234319.tif 000029
0004234319.tif 000030
0004234319.tif 000031
【図１】
0004234319.tif 000032
【図２】
0004234319.tif 000033
【図３】
0004234319.tif 000034
【図４】
0004234319.tif 000035
【図５】
0004234319.tif 000036
【図６】
0004234319.tif 000037
【図７】
0004234319.tif 000038
【図８】
0004234319.tif 000039
【図９Ａ】
0004234319.tif 000040
【図９Ｂ】
0004234319.tif 000041
【図９Ｃ】
0004234319.tif 000042
【図１０Ａ】
0004234319.tif 000043
【図１０Ｂ】
0004234319.tif 000044
【図１０Ｃ】
0004234319.tif 000045
【図１１】
0004234319.tif 000046