(57)【要約】本発明は、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させるのに十分な繊維状バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）の一部分、例えば、ｇ３ｐのＮ１〜Ｎ２部分ならびにその突然変異体及び断片を含むポリペプチドであって、そのｇ３ｐアミノ酸配列が、インビボで使用されるときに、対応する野生型ｇ３ｐアミノ酸配列よりも実質的に免疫原性が低くなるようにアミノ酸置換を通じて修飾されている、ポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させるそれらの能力を保持する。本発明はさらに、アミロイドの誤った折り畳みまたは凝集に関連付けられる疾患の治療及び／または予防における、これらの変異型ｇ３ｐ−ポリペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
開始アミノ酸配列の変異型を含むポリペプチドであって、前記開始アミノ酸配列は、以下の修飾：アミノ酸４３〜４５におけるＡＡＡによるＶＶＶの置換、置換Ｃ５３Ｗ、アミノ酸９６〜１０３の欠失、アミノ酸２１２〜２１４におけるＡＧＡによるＱＰＰの置換、置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａ、アミノ酸１の欠失、ならびにアミノ酸１及び２の欠失、のうちの１つ以上を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、配列番号７のアミノ酸１〜２１７、及び前述のもののいずれかの突然変異体から選択され、
（ａ）前記ポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させ、
（ｂ）前記ポリペプチドは、前記開始アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して低減された免疫原性を有し、
（ｃ）前記変異型は、前記開始アミノ酸配列と比較して１〜９つのアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、下記のアミノ酸置換の群から選択され、
【表１５−１】
2016526044.tif 000026
【表１５−２】
2016526044.tif 000027
（ｄ）前記開始アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１〜２１７であるとき、前記１〜９つのアミノ酸置換のいずれかは、下記のアミノ酸置換の群から任意にさらに選択される、前記ポリペプチド。
【表１６】
2016526044.tif 000028
【請求項２】
前記開始アミノ酸配列内の１〜９つのアミノ酸置換の各々は、下記のアミノ酸置換の群から選択される、請求項１に記載の前記ポリペプチド。
【表１７】
2016526044.tif 000029
【請求項３】
前記開始アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、及び配列番号７のアミノ酸１〜２１７から選択される、請求項１または請求項２に記載の前記ポリペプチド。
【請求項４】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して２〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３、のうちの少なくとも２つの中に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
【請求項５】
前記修飾されたアミノ酸配列は、２つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、下記の２つのアミノ酸置換の群から選択される、請求項４に記載の前記ポリペプチド。
【表１８】
2016526044.tif 000030
【請求項６】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して３〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３の各々の中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
【請求項７】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列と比較して３つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、以下の組のアミノ酸置換：Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ、Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、のいずれかから選択される、請求項５に記載の前記ポリペプチド。
【請求項８】
ペプチドリンカーを介してか、または直接的にかのいずれかで前記変異型アミノ酸配列のＣ末端に融合されるヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的に成る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、請求項８に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカー及びヒトＩｇＧのＦｃ部分の前記アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸２１８〜４８８、配列番号３のアミノ酸２１８〜４８６、及び配列番号７のアミノ酸２１８〜４８８から選択される、請求項９に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１１】
修飾された開始配列から成るポリペプチド変異型であって、前記開始配列は、配列番号３または配列番号７から選択され、前記修飾は、２つまたは３つのアミノ酸置換であり、前記ポリペプチドは、下記のポリペプチドのうちのいずれか１つから選択される、前記ポリペプチド変異型。
【表１９−１】
2016526044.tif 000031
【表１９−２】
2016526044.tif 000032
【表１９−３】
2016526044.tif 000033
【請求項１２】
ポリペプチド番号１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１１８、１２２、１２７、１２８、または１２９のうちのいずれか１つから選択される、請求項１１に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、患者の血流中への注射または注入のために製剤化される、請求項１３に記載の前記薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、脳またはＣＮＳへの直接投与のために製剤化される、請求項１３に記載の前記薬学的組成物。
【請求項１６】
アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の低減を必要とする患者において、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体を低減させる方法であって、前記患者に、有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記ポリペプチドまたは請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の前記薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記患者は、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の存在に関連付けられる神経変性疾患の症状を示す、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記患者は、バイオマーカーフロルベタピルが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるときに、そのバイオマーカーに関して陽性である、請求項１６または請求項１７に記載の前記方法。
【請求項１９】
前記患者は、アルツハイマー病（早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含む）、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド病、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクラピー、及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがそれらに限定されない）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイド症、イギリス型／デンマーク型認知症、家族性脳症、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン病・認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患（Ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、神経原線維型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、及び前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤ）（以下の臨床症候群のうちの１つ以上を有する患者を含む：行動障害型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語症（ＰＮＦＡ）、１７番染色体に関連付けられるパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｅｙ）（ＰＳＰ）、及び意味性認知症（ＳＤ））から選択される神経変性疾患に罹患する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項２０】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である、請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２２】
前記患者は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、またはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介疾患に罹患する、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２に記載の前記ポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする核酸配列。
【請求項２４】
前記ポリペプチドコード配列にかつインフレームで融合された哺乳類シグナル配列をさらにコードする、請求項２３に記載の前記核酸配列。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列は、前記ベクター内の発現制御配列に作動可能に連結される、前記ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の前記ベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、請求項２３または２４に記載の前記核酸配列によってコードされるタンパク質を発現させるステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で、請求項２６に記載の前記宿主細胞を培養するステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させるのに十分な繊維状バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）の一部分、例えば、ｇ３ｐのＮ１〜Ｎ２部分ならびにその突然変異体及び断片を含むポリペプチドであって、そのｇ３ｐアミノ酸配列が、インビボで使用されるときに、対応する野生型ｇ３ｐアミノ酸配列よりも実質的に免疫原性が低くなるようにアミノ酸置換を通じて修飾されている、ポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させるそれらの能力を保持する。本発明はさらに、アミロイドの誤った折り畳みまたは凝集に関連付けられる疾患の治療及び／または予防における、これらのｇ３ｐ修飾されたポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質、及び具体的には、ｇ３ｐのＮ１〜Ｎ２領域を含むそのポリペプチド部分は、β−アミロイド、タウタンパク質、及びプリオンタンパク質などの種々のアミロイドに結合し、それらを脱凝集させることが実証されている。その各々の開示が参照により本明細書に援用される、同時係属ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ第２０１２／０６６７９３号、ならびに米国仮出願ＵＳ第６１／８０１，３４９号、及びＵＳ第６１／８０１，８４９号を参照されたい。同様に、Ｒ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）も参照されたい。その有効性にもかかわらず、ｇ３ｐまたはそのＮ１〜Ｎ２領域を含むポリペプチドのヒトへの全身投与は、有害な免疫応答を引き起こし得ることが予想される。しかしながら、これらの教示のうちもいずれも、ｇ３ｐの免疫原性特性をもたらす特定のＴ細胞エピトープを同定しておらず、また、本明細書に提供される特定の修飾がこれらの免疫原性特性を低減させるかまたは排除することを示唆していない。
【０００３】
多くの組換えの、さもなくば非天然の治療用タンパク質またはポリペプチドの有効性は、該治療用タンパク質またはポリペプチドに対する患者の不必要な免疫反応によって制限されることがある。タンパク質による免疫応答の誘発の主要因は、タンパク質内のＴ細胞エピトープの存在、即ち、主組織適合複合体（ＭＨＣ）ＩＩ型分子上での提示を介してＴ細胞の活性を刺激することができるアミノ酸配列である。Ｔ細胞エピトープは一般的に、ＭＨＣ  ＩＩ型分子に結合する能力を有する任意のアミノ酸残基配列として定義される。ＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されることができ、Ｔ細胞受容体に関与してＴ細胞応答を促進することによってＴ細胞の活性化を引き起こすことができる。しかしながら、概して、ＭＨＣ  ＩＩ型分子に結合する特定のＴ細胞エピトープは、これらのペプチドが、タンパク質が投与される有機体内で「自己」として認識されるため、Ｔ細胞応答を刺激しないことが理解されている。
【０００４】
いくつかのＴ細胞エピトープは、細胞内での治療用タンパク質またはポリペプチドの分解中にペプチドとして放出され、次にＭＨＣの分子によって提示されて、Ｔ細胞の活性化を引き起こすことができる。ＭＨＣ  ＩＩ型分子によって提示されるペプチドに関して、Ｔ細胞のかかる活性化は次に、例えば、Ｂ細胞の直接刺激によって抗体応答を生じさせて、かかる抗体を産生することができる。
【０００５】
ＭＨＣ  ＩＩ型分子は、ヘルパーＴ細胞の選択及び活性化において重要な役割を果たす、高度に多型のタンパク質の群である。ヒト白血球抗原群ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）は、このタンパク質群の顕著なアイソタイプである。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰは、類似の機能を果たす。ヒトにおいて、約７０のＤＲアイソタイプの異なるアロタイプが知られており、ＤＱに関しては３０の異なるアロタイプが、またＤＰに関しては４７の異なるアロタイプが知られている。各個体は、２〜４つのＤＲ対立遺伝子、２つのＤＱ及び２つのＤＰ対立遺伝子を担持する。
個体におけるタンパク質またはポリペプチドに対する免疫応答は、Ｔ細胞エピトープ認識に大きく影響を受け、それはその個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の関数である。世界人口の文脈においてタンパク質またはポリペプチド内のＴ細胞エピトープを同定するために、可能な限り多様な一連のＨＬＡ−ＤＲアロタイプの結合特性を考慮し、したがって可能な限り高い割合の世界人口を網羅することが望ましい。
Ｔ細胞エピトープ同定は、エピトープ排除の最初のステップである。Ｔ細胞エピトープの検出を可能にする方法は、当該技術分野において周知であり、ＷＯ第９８／５２９７６号、ＷＯ第００／３４３１７号、ＵＳ第２００７／０２６９４３５号、ＵＳ第７，２０８，１４７号、Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：９７５−９７８（１９９８）、及びＫｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２２：５８３−５８８（２００１）に開示される。これらのアプローチでは、予想または同定されたＴ細胞エピトープは、治療用タンパク質またはポリペプチドの一次配列内の賢明なアミノ酸置換の使用によって除去される。これらの参考文献はＴ細胞エピトープの推定同定を可能にするが、生物学的活性への悪影響を回避するアミノ酸置換の選択を合理的に予想することはできない。それは、かかる活性に関して修飾されたポリペプチドの各々を試験することによってのみ決定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９８／５２９７６号
【特許文献２】国際公開第００／３４３１７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２６９４３５号明細書
【特許文献４】米国特許第７，２０８，１４７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）
【非特許文献２】Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：９７５−９７８（１９９８）
【非特許文献３】Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２２：５８３−５８８（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、そのＮ１〜Ｎ２部分を含むポリペプチドを治療及び／または診断目的のために慢性的に全身投与することができるように、そのアミロイド結合／脱凝集特性を損なうことなくｇ３ｐのＮ１〜Ｎ２部分の免疫原性を検査し、低減させることが望ましいであろう。本発明は、Ｎ１〜Ｎ２配列内の潜在的Ｔ細胞エピトープを同定することによって、この必要を満たす。本発明はさらに、そのＴ細胞エピトープの免疫原性を低減または排除するであろう変異型Ｎ１〜Ｎ２配列を、アミロイドに結合する、アミロイド凝集を予防する、及び／またはアミロイド斑の脱凝集をもたらす変異型Ｎ１〜Ｎ２の能力を損なうことなく産生するような、これらの潜在的Ｔ細胞エピトープ内の特定のアミノ酸置換を同定する。
【０００９】
一実施形態では、本発明はまた、同定されたＴ細胞エピトープのうちの１つ以上の中の１つ以上のアミノ酸置換に起因する低減された免疫原性を有する、Ｎ１〜Ｎ２アミノ酸配列の変異型、またはその突然変異体もしくは断片を含む、ポリペプチドも提供する。一態様では、本発明は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合される変異型Ｎ１〜Ｎ２配列を含む融合タンパク質を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物、ならびに誤って折り畳まれた、及び／または凝集されたアミロイド本発明タンパク質に関連付けられる疾患を、かかる疾患に罹患するか、またはその疑いのある対象にかかる薬学的組成物を投与することによって治療または予防する方法を提供する。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそれらの核酸分子を含むベクター及びかかるベクターを有する細胞を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを産生するための方法を提供する。具体的には、かかる方法は、核酸分子及び／またはかかる核酸分子を含むベクターを有する細胞を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】太文字及び下線によって特定される５つのＴ細胞エピトープを有する、Ｎ１−Ｎ２−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列を提示する。アミノ酸１〜２１７は、野生型ｇ３ｐ配列のＮ１〜Ｎ２部分を構成する。アミノ酸２１８〜２５６は、Ｍ１３バクテリオファージ内に存在する野生型ｇ３ｐグリシン豊富Ｎ２−Ｃ末端リンカーから成るリンカー領域を表す。この領域は、網掛けによって特定される。アミノ酸２５７〜２６１は、融合タンパク質をコードする核酸分子を構築するために使用される複数のクローニング部位によってコードされるアミノ酸を表す。タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃ部分は、アミノ酸２６２から開始する。
【図２】下線によって特定される４つのＴ細胞エピトープを有する、ｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２）の代替的実施方法のアミノ酸配列を提示する。第５のＴ細胞エピトープは、配列番号１のアミノ酸２５８及び２５９に対応するアミノ酸の欠失によって排除されている。
【図３】太文字及び下線によって特定される３つのＴ細胞エピトープを有する、ｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号３）の別の代替的実施方法のアミノ酸配列を提示する。第４のＴ細胞エピトープは、配列番号１と比較してＶ２１５Ａ及びＧ２２０Ｅの置換によって排除されており、第５のＴ細胞エピトープは、配列番号１のアミノ酸２５８及び２５９に対応するアミノ酸の欠失によって排除されている。
【図４Ａ】Ｎ末端哺乳類シグナル配列を有する、配列番号１のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を提示する。
【図４Ｂ】Ｎ末端哺乳類シグナル配列を有する、配列番号２のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）を提示する。
【図５】Ｎ末端哺乳類シグナル配列を有する、配列番号３のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）を提示する。
【図６】実施例１に説明される研究において発現されたドナーアロタイプの頻度の比較を提供する。
【図７】太文字及び下線によって特定される３つのＴ細胞エピトープを有する、ｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７）の別の代替的実施形態のアミノ酸配列を提示する。第４のＴ細胞エピトープは、配列番号１と比較してＶ２１５Ｇ置換によって排除されている。
【図８】Ｎ末端哺乳類シグナル配列を有する、配列番号７のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号８）を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本出願において、用語「修飾された」（及びその同族語）は、基準（修飾されていない）アミノ酸または核酸配列に関して、１つ以上のアミノ酸置換または対応するコドンの置換を含有する配列を指す。修飾は、基準配列の物理的な操作を必ずしも必要とするわけではない。配列が基準配列と比較してかかる置換を含有する限り、それがどのように合成されたかにかかわらず、それは「修飾された」と見なされる。用語「変異型」は、基準配列と比較して免疫原性を低減させるように修飾されているアミノ酸または核酸配列を指す。本明細書で使用されるとき、「変異型ｇ３ｐ」または「変異型Ｎ１〜Ｎ２」は、アミノ酸配列（またはそれをコードする核酸配列）であって、（ａ）繊維状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質のＮ１〜Ｎ２部分（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜２１７）、または（ｂ）アミロイドに結合する、及び／もしくはアミロイドを脱凝集させる、そのアミノ酸配列の突然変異体もしくは断片（例えば、配列番号３のアミノ酸１〜２１７）を含み、該アミノ酸配列（またはそれをコードする核酸配列）が、基準（修飾されていない）アミノ酸配列と比較して免疫原性を低減させるように修飾されており、該修飾は、表１、表２、表６、もしくは表７のいずれかに記載されるアミノ酸置換、または対応する置換の群から選択される１〜９つのアミノ酸置換から成る、アミノ酸配列（もしくはそれをコードする核酸配列）を指す。用語「対応する置換」は、本明細書で使用されるとき、かかる突然変異体または断片が配列番号１のアミノ酸１〜２１７と整列されたときに、表１、表２、表６、または表７内の同等のアミノ酸置換に対応する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７の突然変異体または断片における置換を意味する。
【００１５】
アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させる配列番号１のアミノ酸１〜２１７の断片の例としては、配列番号１のアミノ酸１〜６７を含む任意の断片が挙げられるが、これらに限定されない。アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させる配列番号１のアミノ酸１〜２１７の突然変異体の例としては、（１）配列番号３のアミノ酸１〜２１７、（２）アミノ酸４３〜４５におけるＡＡＡによるＶＶＶの置換を担持する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（３）置換Ｃ５３Ｗを有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（４）アミノ酸９６〜１０３の欠失を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（５）アミノ酸２１２〜２１４におけるＡＧＡによるＱＰＰの置換を担持する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（６）置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａを有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（７）ＰＣＴ／ＵＳ第２０１２／０６６７９３号に開示される他の活性突然変異体及び断片、（８）配列番号７のアミノ酸１〜２１７、（９）配列番号１のアミノ酸２〜２１７、配列番号３のアミノ酸２〜２１７、または配列番号７のアミノ酸２〜２１７、（１０）配列番号１のアミノ酸３〜２１７、配列番号３のアミノ酸３〜２１７、または配列番号７のアミノ酸３〜２１７、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
繊維状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質のＮ１〜Ｎ２部分は、アミロイド結合及び脱凝集特性を有することがこれまでに示されている（ＰＣＴ／ＵＳ第２０１２／０６６７９３号を参照）。天然のＭ１３ファージのＮ１〜Ｎ２部分は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７によって表される。同一のＮ１〜Ｎ２アミノ酸配列はまた、ｆｄ及びｆ１繊維状バクテリオファージ内にも提示される。配列番号１のアミノ酸２１８〜２５６もまた、天然のｇ３ｐ配列の一部であり、典型的には、ｇ３ｐのＮ２領域を、Ｎ３ドメインとしても周知であるｇ３ｐのＣ末端ドメイン（ＣＴ）に接続するグリシン豊富リンカーと称されることが理解されるべきである。配列番号１のアミノ酸２５７〜２６１は、配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸分子を構築するために使用される複数のクローニング部位によってコードされるアミノ酸を表す。
【００１７】
ポリペプチド
したがって、一実施形態では、本発明は、変異型ｇ３ｐまたは変異型Ｎ１〜Ｎ２を含むポリペプチドを提供する。本発明のより具体的な実施形態は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、及び配列番号７のアミノ酸１〜２１７から選択される開始アミノ酸配列の変異型を含むポリペプチドであって、（ａ）該ポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させ、（ｂ）該ポリペプチドは、開始アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して低減された免疫原性を有し、また（ｃ）該変異型は、開始アミノ酸配列と比較して１〜９つのアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、表１及び表２に記載されるアミノ酸置換の群から選択される、ポリペプチドを提供する。用語「開始アミノ酸配列を含む対応するポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、置換（単数または複数）を除いて、開始アミノ酸配列を含むポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【００１８】
表１及び２に記載されるアミノ酸置換は、完全にＮ１〜Ｎ２アミノ酸配列内に存在するＴ細胞エピトープを同定することによって抽出された。これは、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプの世界人口を最もよく表す地域の血液ドナーのコホートに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して、Ｎ１−Ｎ２配列の異なる重複ペプチド部分を定温放置して、潜在的Ｔ細胞エピトープを同定することによって行われた。この情報を次に、既知のＴ細胞エピトープのデータベースに対してソフトウェア分析に供して、それらの潜在的エピトープ内の最適なアミノ酸置換を同定した。これらの手順は、実施例にて詳細に説明される。
【００１９】
これらの実施形態の一態様では、１〜９つのアミノ酸置換は、表１に記載のものから選択される。上記の実施形態のより具体的な態様では、ポリペプチドは、特定の単一のアミノ酸置換のみを有するアミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型、または配列番号３のアミノ酸１〜２１７の変異型、またはアミノ酸１〜２１７配列番号７の変異型を含み、該置換は、表３に記載される置換のうちの１つから選択される。
【表３】
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【００２０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２〜９つのアミノ酸置換を有するアミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型、または配列番号３のアミノ酸１〜２１７の変異型、または配列番号７のアミノ酸１〜２１７の変異型を含み、該置換は、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つ中にあり、また該置換は、表１及び２に記載のものから選択される。より具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型または配列番号３のアミノ酸アミノ酸１〜２１７の変異型または配列番号７のアミノ酸１〜２１７の変異型内の少なくとも２つの置換は、表１に記載のものから選択される。さらにより具体的な態様では、ポリペプチドは、２つのアミノ酸置換のみを有する配列番号１または配列番号３または配列番号７の変異型を含み、該置換は、表４に記載の特定２つのアミノ酸置換のいずれかから選択される。
【表４】
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【００２１】
別の実施形態では、ポリペプチドは、３〜９つのアミノ酸置換を有するアミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型または配列番号３のアミノ酸１〜２１７の変異型または配列番号７のアミノ酸１〜２１７の変異型を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換はエピトープ１、２、及び３の各々の中にあり、また該置換は、表１及び表２に記載の置換から選択される。より具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型または配列番号３のアミノ酸１〜２１７の変異型または配列番号７のアミノ酸１〜２１７の変異型内の少なくとも３つのアミノ酸置換は、表２に記載の置換から選択される。さらにより具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型または配列番号３のアミノ酸１〜２１７の変異型または配列番号７のアミノ酸１〜２１７の変異型を含むポリペプチドは、３つのアミノ酸置換のみを有し、該置換は、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のいずれかから選択される。
【表５−１】
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【表５−２】
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【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ｇ３ｐ変異型を含むポリペプチドであって、１〜９つの置換のうちの１つが、Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧもしくはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５Ｑ、またはＶ２１５Ｒから選択されるエピトープ４内の置換である、ポリペプチドを提供する。また別の実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７の変異型を含むポリペプチドであって、１〜９つの置換のうちの１つが、Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５Ｇ、Ｖ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５Ｑ、またはＶ２１５Ｒから選択されるエピトープ４内の置換である、ポリペプチドを提供する。Ｎ１〜Ｎ２配列の重複する潜在的Ｔ細胞エピトープペプチド部分の試験を通じて、本出願は、配列番号１内のＶ２１５は、配列番号のアミノ酸２１５−２２３にわたる潜在的Ｔ細胞エピトープ（図１内のエピトープ４）の一部分（グリシン豊富リンカーの一部分の通るＮ２の末端）であることを決定した。エピトープ４内のＶ２１５Ａ及びＧ２２０Ｅ置換（配列番号３参照）は、アミロイドに結合するポリペプチドの能力に影響を及ぼさないが、後の分析は、これらの置換のうちの一方または両方は、エピトープ１、２、及び３の各々において表１及び２内に示される特定の変化と組み合わされたときに、アミロイドを脱凝集させる得られるポリペプチドの能力を低減させることを示唆している。配列番号１と比較して、エピトープ４内の単一のＶ２１５Ｇ置換（配列番号７参照）は、アミロイドに結合するか、またはアミロイドを脱凝集させるポリペプチドの能力に影響を及ぼさなかった。これらのエピトープ４置換の各々は、Ｔ細胞エピトープを排除するためのソフトウェア及びデータベース分析によって予想した。上記のＶ２１５に関する他の置換の各々は、同様にＴ細胞エピトープを排除するように予想されるが、アミロイド結合に対して効果をほとんどまたは全く有さない。
【００２３】
より具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型を含むポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のうちのいずれか１つ、及び表１または表２に記載のアミノ酸置換のうちの１〜８つを有する。さらにより具体的な実施形態では、１〜８つのアミノ酸置換は、表１に記載のものから選択される。さらにより具体的な態様では、ポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のうちのいずれか１つ、及び表３に記載のものから選択される１つの追加の単一のアミノ酸置換を有する。より具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型を含むポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のいずれか１つ及び２〜８つの追加のアミノ酸置換を有し、該追加の置換は、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの中にあり、該置換は、表１または表２に記載のものから選択される。さらにより具体的な実施形態では、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの中の少なくとも１つの置換は、表１に記載の置換から選択される。またより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のうちの１つ、及び表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のうちの１つを有する。
【００２４】
より具体的な態様では、アミノ酸１〜２１７配列番号１の変異型を含むポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のいずれか１つ、及び表１または表２に記載のものから選択される３〜８つの追加のアミノ酸置換を有し、エピトープ１、２、及び３の各々は、追加の置換のうちの１つを含む。さらにより具体的な実施形態では、エピトープ１、２、及び３の各々の中の置換は、表１に記載のものから選択される。またより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、上記のＶ２１５置換のうちの１つ、及び表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つを有する。さらにより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、Ｖ２１５Ｇ置換と、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ；Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ；Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ；Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ；Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ；Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ；Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ；Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ；Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ；ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒから選択される３つのアミノ酸置換とを有する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、または直接的に変異型ｇ３ｐアミノ酸配列のＣ末端に融合されるヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的に成る融合タンパク質である。用語「ペプチドリンカー」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの機能を妨げないであろう一連の連続アミノ酸を指す。上記の通り、配列番号１〜３及び７において、アミノ酸２１８〜２５６は、Ｍ１３ｇ３ｐタンパク質内に通常存在するグリシン豊富リンカーを表す。本発明のポリペプチドにおいて、そのリンカーが使用されてもよく、または異なるリンカーがそれに置換されてもよい。別法として、Ｆｃポリペプチド配列は、Ｎ２をコードする最後のアミノ酸（例えば、配列番号１〜３のアミノ酸２１７）に直接連結されてもよい。リンカー配列及び／またはその不在の選択は、本発明のポリペプチドの組換え発現に利用可能なベクター、及びかかるリンカーがポリペプチドに付与することができる任意の二次または三次構造を考慮に入れて、当業者によって行われ得る。この実施形態の一態様では、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である。より具体的な態様では、ポリペプチドは、その中に表１、表２、または下記の表６、もしくは表７に記載のアミノ酸置換の群から選択される１〜９つのアミノ酸残基置換を有する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号７の変異型である。
【表６】
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【表７】
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【００２６】
さらにより具体的な態様では、ポリペプチドは、２〜９つのアミノ酸置換を有する配列番号１または配列番号２の変異型であり、該置換のうちの１つは、表６及び表７に記載の置換であり、該置換のうちの少なくとも１つは、表１及び表２に記載の置換である。より具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、２〜９つのアミノ酸置換を有し、該置換のうちの少なくとも１つは表６に記載され、該置換のうちの少なくとも１つは表１に記載される。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、３〜９つのアミノ酸置換を有し、該置換のうちの少なくとも１つは、表６及び表７に記載の置換から選択され、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つは、表１及び表２に記載の置換から選択される少なくとも１つの置換を含有する。より具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、表６に記載の置換のうちの少なくとも１つと、表１に記載の置換から選択される、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの中の少なくとも１つの置換とを有する。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、４〜９つのアミノ酸置換と、表６及び表７に記載の置換のうちの少なくとも１つと、表１及び表２に記載の置換から選択される、エピトープ１、２、及び３の各々の中の少なくとも１つの置換とを有する。より具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、表６に記載の置換のうちの少なくとも１つと、表１に記載のものから選択される、エピトープ１、２、及び３の各々の中の少なくとも１つの置換とを有する。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、表６に記載の置換のうちの少なくとも１つと、表３、表４、または表５にそれぞれ記載の１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換から選択される、特定の置換のうちの少なくとも１つとを有する。この実施形態のまた別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の変異型であり、表６に記載のアミノ酸置換のうちの１つのみと、表３、表４、または表５にそれぞれ記載の特定の１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換のうちの１つから選択される、１つのみ、２つ、または３つの追加のアミノ酸置換とを有する。
【００２７】
代替的実施方法では、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号７の変異型であり、表１及び表２に記載のアミノ酸置換の群から選択される１〜９つのアミノ酸残基置換を有する。より具体的な態様では、少なくとも１つの置換は、表１に記載される。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号７の変異型であり、表１及び２に記載の置換のいずれかから選択されるエピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの中の２〜９つのアミノ酸置換及び少なくとも１つの置換を有する。より具体的な態様では、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの中の少なくとも１つの置換は、表１に記載のものから選択される。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号７の変異型であり、３〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換は、エピトープ１、２、及び３の各々の中にあり、表１及び２に記載の置換のいずれかから選択される。より具体的な態様では、エピトープ１、２、及び３の各々の中の少なくとも１つの置換は、表１に記載のものから選択される。さらにより具体的な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号７の変異型であり、表３、表４、または表５にそれぞれ記載の特定の１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換のうちの１つから選択される、１つのみ、２つ、または３つのアミノ酸置換を有する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のいずれかから選択される２つのアミノ酸置換のみを有する、配列番号３または配列番号７の変異型である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のいずれかから選択される３つのアミノ酸置換のみを有する、配列番号３または配列番号７の変異型である。より具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のいずれかから選択される３つのアミノ酸置換のみを有する、配列番号７の変異型である。別のより具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、以下の組の特定の３つのアミノ酸置換：Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ、Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、のいずれかから選択される３つのアミノ酸置換のみを有する、配列番号７の変異型である。
【００２９】
核酸分子、配列、ベクター、及び宿主細胞
他の実施形態では、本発明は、上記のｇ３ｐ変異型を含むポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。この実施形態の一態様では、単離された核酸分子は、配列番号４のヌクレオチド６４〜７１４の変異型を含み、それは１〜９つのコドン置換によって修飾され、各コドン置換は、表１及び表２に記載の置換と、以下のＶ２１５アミノ酸置換：Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５Ｑ、及びＶ２１５Ｒのうちのいずれか１つとから選択されるアミノ酸置換に対応する。これらの実施形態のさらにより具体的な態様では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ１〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換によって修飾され、該追加のコドン置換の各々は、表１に記載のアミノ酸置換をコードするように選択される。これらの実施形態のまたより具体的な態様では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ２〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換によって修飾され、各追加のコドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換をコードし、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの各々の中に存在する。またより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ３〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換によって修飾され、各追加のコドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換をコードし、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３の各々の中に存在する。またより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、Ｖ２１５Ａアミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表３に記載の単一のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される１つの追加のコドン置換とによって修飾される。またより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、Ｖ２１５Ｇアミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表３に記載の単一のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される１つの追加のコドン置換とによって修飾される。別の具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５Ａアミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される２つの追加のコドン置換とによって修飾される。別の具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５Ｇアミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される２つの追加のコドン置換とによって修飾される。またより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５アミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される３つの追加のコドン置換とによって修飾される。またより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５Ｇアミノ酸置換をコードするように選択される１つのコドン置換と、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択される３つの追加のコドン置換とによって修飾される。
【００３０】
また他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号５のヌクレオチド６４〜１５２４の変異型を含み、該配列は、１〜９つのコドン置換によって修飾され、各コドン置換は、表１、表２に記載の置換と、以下のＶ２１５アミノ酸置換：Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５Ｑ、及びＶ２１５Ｒのうちのいずれか１つとから選択されるアミノ酸置換に対応する。より具体的な実施形態では、各コドン置換は、表１に記載の置換、及び上記のＶ２１５置換のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸置換に対応する。さらにより具体的な実施形態では、変異型核酸配列は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ１〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換によって修飾され、該追加のコドン置換の各々は、表１に記載の置換から選択されるアミノ酸置換に対応する。より具体的な態様では、変異型は、表３に記載の特定の１つのアミノ酸置換に対応する１つの追加のコドン置換を有する。またより具体的な実施形態では、配列番号４のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号５のヌクレオチド６４〜１５２４の変異型は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ２〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換から成る修飾を有し、各追加のコドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの各々の中に存在する。より具体的な態様では、変異型は、表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のうちの１つに対応する２つの追加のコドン置換を有する。またより具体的な実施形態では、配列番号４のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号５のヌクレオチド６４〜１５２４のうちのいずれか１つの変異型は、上記のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように、かつ３〜８つの追加のコドン置換から選択される１つのコドン置換から成る修飾を有し、各追加のコドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３の各々の中に存在する。より具体的な態様では、変異型は、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つに対応する３つの追加のコドン置換を有する。
【００３１】
また他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４または配列番号８のヌクレオチド６４〜１５２４の変異型を含み、該変異型核酸配列は、１〜９つのコドン置換によって修飾され、各コドン置換は、表１または表２に記載の置換から選択されるアミノ酸置換に対応する。より具体的な実施形態では、各コドン置換は、表１に記載の置換から選択されるアミノ酸置換に対応する。さらにより具体的な実施形態では、変異型は、表３に記載の特定の１つのアミノ酸置換のうちの１つに対応する１つのコドン置換を有する。またより具体的な実施形態では、配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４または配列番号８のヌクレオチド６４〜１５２４の変異型は、２〜８つのコドン置換によって修飾され、各コドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３のうちの少なくとも２つの各々の中に存在する。より具体的な態様では、変異型は、表４に記載の特定の２つのアミノ酸置換のうちの１つに対応する２つの追加のコドン置換を有する。またより具体的な実施形態では、配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４または配列番号８のヌクレオチド６４〜１５２４の変異型は、３〜８つのコドン置換によって修飾され、各コドン置換は、表１に記載のアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２、及び３の各々の中に存在する。より具体的な態様では、変異型は、表５に記載の特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つに対応する３つの追加のコドン置換を有する。さらにより具体的な態様では、変異型は、以下の特定の組の３つのアミノ酸置換：Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ、Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒのうちの１つに対応する、３つの追加のコドン置換を有する。
【００３２】
本発明の核酸分子のまた他の実施形態では、核酸分子は、変異型ｇ３ｐをコードする核酸配列の５’末端に同相でかつ直接融合されるシグナル配列をコードする核酸配列をさらに含む。これらの実施形態の一態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号４のヌクレオチド１〜６３である。
【００３３】
本発明の核酸分子は、退行性であるが、上記の核酸核酸分子のいずれかによってコードされるものと同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を包含する。
【００３４】
組換え産生のために、本発明の核酸分子のいずれかは、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のための必須要素か、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製及び翻訳のための必須要素を含有する、適切な発現ベクター内に挿入され得る。コード核酸は、適切なリーディングフレーム内でベクター内に挿入される。したがって、本発明は、本発明の核酸分子及び配列を含むベクターを提供する。かかるベクターとしては、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸分子及び配列をクローニングするための適切なベクターの選択は、発現を実行するために選択される宿主細部とのベクターの適合性に関する周知の知識を使用して、当業者によって行うことができる。これは、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞などのいずれかで行うことができる。これらの細胞型の各々のための適切なベクターは、当該技術分野において周知であり、概して市販されている。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子または核酸配列を含有するベクターを有する宿主細胞を提供する。本発明のベクターを宿主細胞内へ形質移入または形質転換するか、ないしは別の方法で獲得する方法は、当該技術分野において既知である。本ベクターを有する細胞は、適切な条件下で培養されるときに、本発明のポリペプチドを産生する。本発明のポリペプチドの組み換え産生に使用されるベクター及び細胞の具体的な例は、下記の実施例の章に記載される。
【００３６】
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ｇ３ｐを含む任意のポリペプチドまたは融合タンパク質を、任意に、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、薬学的組成物を提供する。「薬学的組成物」は、生理学的に好適な担体及び／または賦形剤を伴う、治療的有効量の本明細書に説明される組成物を指す。薬学的組成物は、有機体に対して著しい炎症を引き起こさない。語句「生理学的に好適な担体」及び「薬学的に許容される担体」は、互換的に使用され、有機体に対して著しい炎症を引き起こさず、投与される組成物の生物学的活性及び特性を抑制しない担体または希釈剤を指す。用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに促進するために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、限定されるものではないが、例えば、生理食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類及び種々の種類の澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えば、ポリソルベート２０を含む界面活性剤が挙げられる。
【００３７】
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、薬学的に使用することができる組成物中への活性成分の処理を促進する賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化することができる。適切な製剤化は、選択される投与の経路、及び送達される組成物の性質（例えば、ポリペプチドの大きさ及び可溶性）に依存する。これらの実施形態の一態様では、薬学的組成物は、患者の血流中への注射または注入用に製剤化される。これらの実施形態の別の態様では、薬学的組成物は、例えば、直接髄内注射、髄膜注射、または脳室内注射による、患者の脳または中枢神経系への直接投与用に製剤化される。
【００３８】
非経口投与用の薬学的組成物としては、水溶性形態の組成物の水溶液が挙げられる。それに加えて、活性成分の懸濁液を油性または水性注射懸濁液として調製することができる。それに加えて、活性成分の懸濁液を油性または水性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または高濃度溶液の調製を可能にするために活性成分の可溶性を増加させる薬剤（例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤）を含有してもよい。例えば、アルブミンなどのタンパク質ベースの薬剤は、送達表面（即ち、ＩＶバッグ、カテーテル、針など）への本発明のポリペプチドの吸着を予防するために使用することができる。
【００３９】
経口投与に関して、組成物は、活性化合物を当該技術分野において周知である薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。
【００４０】
製剤は、例えば、バイアル、アンプル内に単位剤形でか、または任意に添加された防腐剤と共に、反復用量容器内に提示することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクル内の乳剤であってもよく、また懸濁化剤、安定剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含有してもよい。単一剤形は、液体または固形であってもよい。単一剤形は、変更を伴わずに患者に直接投与されてもよく、または投与前に希釈もしくは再構築されてもよい。特定の実施形態では、単一剤形は、ボーラス形式で、例えば、単一注射、複数の錠剤、カプセル、丸剤などを含む経口用量を含む単一経口用量で投与することができる。代替的実施方法では、単一剤形は、例えば、注入によってか、または例えば、ＩＣＶポンプなどの埋め込み式ポンプを介して、経時的に投与することができる。後者の実施形態では、単一剤形は、適切な量の変異型ｇ３ｐを含むポリペプチドまたは融合タンパク質で予め充填された注入バッグまたはポンプ容器であり得る。別法として、注入バッグまたはポンプ容器は、適切な用量の変異型ｇ３ｐを注入バッグまたはポンプ容器液と混合することによって患者に投与される直前に調製することができる。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明の薬学的組成物を調製するための方法を含む。薬物の製剤化のための技術は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版に見出すことができる。
【００４２】
本発明の文脈における使用に好適な薬学的組成物は、活性成分が意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。
【００４３】
治療的または診断的有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００４４】
投薬の量及び間隔は、特定の脳疾患、障害、または病態を治療または診断するのに十分であるファージディスプレイビヒクルの脳内レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するように、個別に調節することができる。ＭＥＣは調製毎に変動するであろうが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴に依存するであろう。
【００４５】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、１０〜９０％の時間、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは５０〜９０％の時間、脳内レベルをＭＥＣより上に維持する治療計画を使用して投与されるべきである。
【００４６】
治療されるべき病態の重篤度及び応答性に応じて、投薬は、数日〜数週間、または治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の減退が達成されるまで継続する一連の治療を伴う、単回または複数回の投与であり得る。
【００４７】
勿論、投与されるべき組成物の量は、治療または診断されている対象、病気の重篤度、処方医師の判断などに依存するであろう。
【００４８】
本発明の組成物は、所望により、ＦＤＡ認可キットなどの、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサー装置中に提示されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書が添付されることができる。パックまたはディスペンサーはまた、調剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形式で、容器に関連する注意書きを備えてもよく、該注意書きは、該機関による組成物またはヒトもしくは動物投与の形式の認可を反映する。かかる注意書きは、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局によって認可されているラベル、または認可されている製品挿入物（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｓｅｒｔ）であってもよい。適合性のある薬学的な担体内に製剤化された本発明の調製物を含む組成物も、上記にさらに詳細にある通り、調製され、適切な容器内に定置され、指示される病態の治療のためにラベル付けされてもよい。
【００４９】
前述及び以下の説明のどちらも、単に例示的及び説明的なものであり、請求項に記載される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００５０】
治療的使用
本発明の別の本発明は、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、またはｆｔａｕに関与する疾患が挙げられるがそれらに限定されない、タンパク質の誤った折り畳みによる疾患（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）の治療における、本発明のポリペプチド、核酸分子、または組成物のいずれかの使用に関する。
【００５１】
治療の文脈において、用語「患者」、「対象」、及び「受容者」は、互換的に使用され、ヒト及び他の哺乳類を含む。いくつかの実施形態では、患者は、タンパク質の誤った折り畳みによる疾患に関連付けられるバイオマーカーに関して陽性のヒトである。一実施形態では、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像法によって検出されるときに、β−アミロイド沈着を示す。
【００５２】
用語「治療する」及びその同族語は、疾患の１つ以上の臨床症状を示す患者における疾患の進行の低減、減速、または逆転を意味することを意図される。「治療する」はまた、疾患の１つ以上の臨床症状を示す患者における疾患の症状低減、減速、または逆転を意味することも意図される。一実施形態では、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像法によって検出されるときにβ−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数は治療によって低減される。一実施形態では、患者は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物によって検出されるときにβ−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数は、治療によって低減または維持される。別の実施形態では、患者は、ＰＥＴ画像法によって検出されるときに任意の種類のアミロイド沈着を示し、患者の認知機能は治療によって改善される。認知機能の改善はＭｃＫｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ＆Ｄｅｍｅｎｔｉａ７（３）：２６３−９（２０１１）の方法及び試験によって分析することができる。
【００５３】
「予防」は、治療することとは異なり、任意の臨床症状の開始前の個体への組成物の投与を指す。本発明のポリペプチドまたはその組成物のいずれかを使用する予防が、包含される。予防は、専ら１つ以上の遺伝子マーカーに基づいて、疾患の増加した危険性があることが知られているか、または疾患を発症することが必至と思われる個体に関与することができる。多くの遺伝子マーカーが、種々のタンパク質の誤った折り畳みによる疾患に関して同定されている。例えば、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）中にスウェーデン突然変異、インド突然変異、またはロンドン突然変異のうちの１つ以上の有する個体は、早発性アルツハイマー病を発症する増加した危険性を有し、したがって予防の候補者である。同様に、ハンチンチン遺伝子中にトリヌクレオチドＣＡＧ反復を有する個体、特に、３６以上の反復を有する個体は、後にハンチントン病を発症することになり、したがって予防の候補者である。
【００５４】
用語「タンパク質の誤った折り畳み」は、限定されるものではないが、β−アミロイド、血清アミロイドＡ、シスタチンＣ、ＩｇＧκ軽鎖、またはプリオンタンパク質などのタンパク質（アミロイド形成ペプチド）を凝集させることによる、アミロイドタンパク質の形成によって特徴付けられる疾患を指す。誤って折り畳まれた、及び／または凝集されたアミロイドタンパク質に関連付けられることが知られている疾患としては、アルツハイマー病（早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含む）、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド病、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクラピー、及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがそれらに限定されない）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１）、（ＳＣＡ３）、（ＳＣＡ６）、（ＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイド症、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｅｙ）（ＰＳＰ）、及び家族性脳症が挙げられる。本発明のポリペプチド及び組成物は、「タンパク質の誤った折り畳みによる」疾患を治療するために使用することができる。
【００５５】
これらの誤って折り畳まれた、及び／または凝集されたアミロイドタンパク質による疾患の多くは、中枢神経系（ＣＮＳ）で生じる。ＣＮＳで生じる疾患のいくつかの例は、パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）（以下の臨床症候群を有する患者を含む：行動障害型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語症（ＰＮＦＡ）、及び意味性認知症（ＳＤ））、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、及びハンチントン病である。本発明のポリペプチド及び組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）で生じる誤って折り畳まれた、及び／または凝集されたアミロイドタンパク質によって特徴付けられる疾患を治療するために使用することができる。
【００５６】
タンパク質の誤った折り畳み及び／または凝集はまた、ＣＮＳの外部でも生じることがある。アミロイド症Ａ（ＡＡ）（前駆体タンパク質が血清急性相アポリポタンパク質である、ＳＡＡ）及び多発性骨髄腫（前駆体タンパク質免疫グロブリン軽及び／または重鎖）は、２つの広範に知られているＣＮＳの外部で生じるタンパク質誤った折り畳み及び／または凝集されたタンパク質による疾患である。他の例としては、α２−ミクログロブリン、トランスチレチン（家族性アミロイド性末梢神経障害［ＦＡＰ］、家族性アミロイド性心筋症［ＦＡＣ］、及び老人性全身性アミロイド症［ＳＳＡ］）、（アポ）血清ＡＡ、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、及びＡＩＶ、ゲルゾリン（家族性アミロイド性末梢神経障害のフィンランド型）、リゾチーム、フィブリノゲン、シスタチンＣ（脳アミロイド血管症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、アイスランド型）、（プロ）カルシトニン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰアミロイド症）、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、インスリン、ラクタヘドリン（ｌａｃｔａｈｅｄｒｉｎ）、ケラトエピセリン、ラクトフェリン、歯性エナメル芽細胞関連タンパク質、ならびにセメノゲリン（ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ）Ｉによって形成されるアミロイドに関与する疾患が挙げられる。本発明のポリペプチド及び組成物は、ＣＮＳの外部で生じるタンパク質の誤った折り畳み及び／または凝集に関与する疾患を治療するために使用することができる。
【００５７】
神経変性疾患はまた、タウ病変に関する。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１１２１−１５９（２００１）で考察される。タウタンパク質は、中枢及び末梢神経系の両方のニューロンの軸索内で発現される微小管関連タンパク質である。神経変性タウオパチー（タウオパチーと称されることもある）が包含される。タウオパチーの例としては、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン病・認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症、１７番染色体に関連付けられるパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患（Ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、及び神経原線維型認知症が挙げられる。これらの疾患のいくつかはまた、線維状アミロイドβペプチドの沈着を含む場合がある。例えば、アルツハイマー病は、アミロイドβ沈着及びタウ病変の両方を示す。同様に、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、及びゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群などのプリオン媒介疾患もまた、タウ病変を有する場合がある。したがって、疾患が「タウオパチー」であることを示す兆候は、単に便宜上、提供される他の神経変性疾患分類または群化から、該疾患を排除するように解釈されるべきではない。本発明のポリペプチド及び組成物は、神経変性疾患、及びタウ病変に関与する疾患を治療するために使用することができる。
【００５８】
一実施形態では、薬学的組成物または製剤は、アミロイドの存在に関連する症状を示すか、またはフロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）などのタンパク質の誤った折り畳みによる疾患に関連付けられるバイオマーカーに関して陽性である患者における、アミロイドを低減させる方法であって、患者に有効量の本明細書に説明される薬学的組成物または製剤を投与することを含む方法における使用のためである。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００５９】
一実施形態では、薬学的組成物または製剤は、アミロイドの存在に関連する症状を示すか、またはフロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）などのタンパク質の誤った折り畳みによる疾患に関連付けられるバイオマーカーに関して陽性である患者における、アミロイドのレベルを維持する方法であって、患者に有効量の本明細書に説明される薬学的組成物または製剤を投与することを含む方法における使用のためである。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６０】
一実施形態では、薬学的組成物または製剤は、患者におけるアミロイドを脱凝集させる方法であって、アミロイドを有する患者に有効量の本明細書に説明される薬学的組成物または製剤を投与することを含む方法における使用のためのである。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６１】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内のβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法であって、それを必要とする患者の脳内に有効量の本明細書に説明される薬学的組成物を直接注射し、それによって脳内のβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすことを含む方法における使用のためである。代替的実施方法では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内のβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に説明される薬学的組成物を静脈内送達で注射し、それによって脳内のβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすことを含む方法における使用のためである。
【００６２】
一実施形態では、薬学的組成物または製剤は、脳内のアミロイド形成を低減させる方法における使用のためである。脳内のアミロイド形成の低減は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６３】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内のアミロイドクリアランスを促進するための方法における使用のためである。アミロイドクリアランスの促進は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６４】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内のアミロイド凝集を阻害するための方法における使用のためである。脳内のアミロイド凝集の阻害は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６５】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内の毒性アミロイドオリゴマーを除去するための方法における使用のためである。脳内の毒性アミロイドオリゴマーの除去は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６６】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、脳内の毒性アミロイドオリゴマーの形成を防止するための方法における使用のためである。脳内の毒性オリゴマーの形成の防止は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００６７】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物または製剤は、アミロイド損傷からニューロンを保護するための方法における使用のためである。アミロイド損傷からのニューロンの保護は、タンパク質の誤った折り畳みまたは神経変性疾患の症状または重篤度を防止、治療、または低減させることができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。一実施形態では、アミロイド損傷からのニューロンの保護における使用のための本発明の薬学的組成物または製剤は、予防的に付与される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、患者は、タンパク質の誤った折り畳み及び／または凝集による疾患に関連付けられるバイオマーカーに関して陽性である。一実施形態では、バイオマーカーは、フロルベタピル（ＡＶ４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、患者は、アミロイドの存在に関連付けられる神経変性疾患の症状を示している。種々の実施形態では、アミロイドは、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、またはｆｔａｕのいずれかである。
【００７０】
特定の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病であり、患者は、造影剤フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）によって検出されるときにβ−アミロイドを示す。
【００７１】
いくつかの実施形態では、患者は、プリオン媒介疾患の症状を示している。
【００７２】
特定の実施形態では、プリオン媒介疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、またはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、患者は、アルツハイマー病以外の神経変性タウオパチーの症状を示している。特定の実施形態では、治療される疾患は、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症、１７番染色体に関連付けられるパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン病、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、及び神経原線維型認知症から選択される。
【００７４】
別の実施形態では、上記の疾患病態のいずれかは、本発明の核酸分子（即ち、低減された免疫原性を示し、アミロイドに結合する、アミロイド斑を脱凝集させる、及び／またはアミロイドの凝集を防止する能力を有する変異型ｇ３ｐをコードするもの）を、単独で、または例えば、脂質ナノ粒子、ポリマー担体、またはウイルスベクターなどのベクターなどの好適な担体と関連付けて、例えば、吸入及び静脈内注入などの任意の好適な経路によって、患者に直接的に投与することによって治療することができる。この治療に好適な本発明の変異型ｇ３ｐをコードする核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００７５】
診断法
本発明の別の態様では、本明細書に説明されるポリペプチド及び組成物は、本明細書に説明される種々の疾患に関連付けられる診断用途に使用される。例えば、インビボかまたはインビトロかのいずれかで造影剤として使用されるとき、本発明の組成物の結合は、説明されるタンパク質の誤った折り畳みによる疾患のうちの１つの診断の一部となり得る。診断薬として使用されるとき、本発明のポリペプチドは、検出可能な標識をさらに含んでもよく、ないしは別の方法で、インビボで検出されてもよい。種々の標識は、タンパク質を標識するための標準的な技術を使用して、診断用組成物のアミロイド結合構成成分に付着させることができる。標識の例としては、蛍光標識及び放射性標識が挙げられる。使用され得る多様な放射性標識が存在するが、概して標識は、１８Ｆ、１１Ｃ、及び１２３Ｉを含むがそれらに限定されない、放射性標識から選択されることが多い。これらの及び他の放射性同位体は、周知の化学を使用してタンパク質に付着させることができる。一実施形態では、標識は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用して検出される。しかしながら、放射性同位体の検出のための任意の他の好適な技術も、放射性追跡子を検出するために使用されてもよい。
【００７６】
本発明のポリペプチド及び組成物は、診断用造影剤として、β−アミロイドに特異的な造影剤、例えば、Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙと組み合わせて使用することができる。非β−アミロイド凝集体のための既知の造影剤は現在存在しないため、β−アミロイド特異的造影剤との本発明の診断用組成物の使用は、分別検出に基づく非β−アミロイド凝集体の検出をもたらすであろう。したがって、一実施形態では、本発明の診断用組成物は、非β−アミロイド凝集体を検出するために造影剤としてβ−アミロイド造影剤と組み合わせて使用される。
【００７７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは組成物は、脳を含む、ＣＮＳ内でβ−アミロイドを検出するための診断用造影剤として使用される。
【００７８】
本発明の診断用組成物は、治療用組成物に関して説明されるものと同一の経路を使用して投与することができる。一実施形態では、投与の経路は、髄膜注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ｇ３ｐ内のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのマッピング
配列番号１のアミノ酸１〜２４０の配列にわたる８７個の重複ペプチド（１２のアミノ酸重複を有する１５のアミノ酸の長さ）を合成し、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からの応答に関してＴ細胞エピトープマッピング分析にて試験した。個々のペプチドを、６連のＰＢＭＣ培養で試験し、エピトープの場所及びそれらの相対的有効性を同定するためにＴ細胞応答を評価した。
【００８０】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、英国国営輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）から得た健康な地域のドナーの（２４時間以内に採取した血液に由来する）軟膜から、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院地域研究倫理委員会による認可に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ，Ｄｕｎｄｅｅ、英国）密度遠心分離によって単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｌｏｎｄｏｎ、英国）を使用して欠失させた。ドナーは、ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲベース組織分類キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ，Ｓｏｌｉｈｕｌｌ、英国）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することによって特徴付けた。対照新抗原タンパク質（ＩＦＶ及びＥＢＶから抽出したＫＬＨタンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ），Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、英国）及びペプチド）に対するＴ細胞応答も決定した。次に、ＰＢＭＣを凍結させ、必要になるまで液体窒素中で保管した。
【００８１】
５５人のドナーのコホートを、世界人口において発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく表すような分析のために選択した。該コホートにおいて発現されるアロタイプの世界人口において発現されるものに対する分析は、＞８０％のカバレージが達成されたこと、及び全ての主要なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（世界人口において発現された＞５％の頻度を有する個々のアロタイプ）がよく表されたことを示した。個々のドナーハプロタイプの詳細、ならびに世界人口及び標本人口において発現されるＭＨＣ  ＩＩ型ハプロタイプの頻度の比較は、表８及び図３にそれぞれ示される。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【００８２】
各ドナーに由来するＰＢＭＣを解凍して計数し、生存率を評価した。細胞を、細胞密度を２〜３×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞ストック）に調節する前に、室温のＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）で復活させた。１５個のアミノ酸の長さのペプチドを、遊離Ｎ末端アミン及びＣ末端カルボン酸を有する１〜３ｍｇスケール上で合成した。ペプチドを、ＤＭＳＯ中で１０ｍＭの濃度に溶解させ、ペプチド培養ストックを、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地内へ５μＭのウェル内最終濃度に希釈することによって調製した。各ペプチド及び各ドナーに関して、６連培養を平底９６ウェルプレート内で確立した。正及び陰性対照培養物も６連で試験した。各ドナーに関して、３つの対照（ＩＦＶ及びＥＢＶから抽出したＫＬＨタンパク質及びペプチド）も含まれた。陽性対照のために、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｄｏｒｓｅｔ、英国）を２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【００８３】
培養物を、合計で６日間定温放置した後、０．７５μのＣｉ３［Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、英国）を各ウェルに添加した。培養物を、さらに１８時間定温放置した後、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ細胞採取器を使用して濾過マット上で採取した。各ウェルに関するＣｐｍを、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、英国）シンチレーション計数によって、パララックス、低バックグラウンド計数モードでＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、英国）上で決定した。
【００８４】
データ分析のために、ＳＩ≧２．００以上の刺激指標（ＳＩ）の閾値を使用した（ボーダーラインＳＩ≧１．９０〜１．９９応答を考慮）。陽性応答は、以下の統計的及び経験的閾値によって定義した。
１．独立２標本スチューデントｔ検定を使用して試験ウェルのｃｐｍを培地対照ウェルと比較することによる、応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２．００超の刺激指標（ＳＩ≧２．００）、ＳＩ＝試験ウェルの平均ｃｐｍ／平均ｃｐｍ培地対照ウェルである。この方法で提示されるデータは、ＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５として示される。
【００８５】
それに加えて、分析間変動を、同型培養のローデータのＣＶ及びＳＤを算出することによって評価した。増殖分析は、６連培養において設定した（「非調節データ」）。分析間変動性が低かったことを確実にするために、データを、最大及び最小ｃｐｍ値を除去した後にも分析し（「調節データ」）、ドナー応答のＳＩを、両データセットを使用して比較した。Ｔ細胞エピトープを、本研究における全ペプチドに対する陽性応答（上記に定義される）の平均頻度、及びバックグラウンド応答率を付与するためにＳＤを算出することによって同定した。調節及び非調節データの両方における、バックグラウンド応答率を上回る増殖性応答を誘発した任意のポリペプチドを、Ｔ細胞エピトープを含有すると見なした。２個の重複ペプチドが増殖性応答率を誘発した場合、Ｔ細胞エピトープは、重複領域内にあると見なした。これに基づき、以下のＴ細胞エピトープを試験ポリペプチドにおいて同定した：
エピトープ１：Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｄ  Ｅ  Ｔ  Ｑ  Ｃ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｗ（配列番号１のアミノ酸４６〜５７）
エピトープ２：Ｔ  Ｆ  Ｍ  Ｆ  Ｑ  Ｎ  Ｎ  Ｒ  Ｆ  Ｒ  Ｎ  Ｒ（配列番号１のアミノ酸１３３〜１４４）
エピトープ３：Ｓ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｍ  Ｙ  Ｄ  Ａ  Ｙ  Ｗ  Ｎ  Ｇ（１９４〜２０５配列番号１のアミノ酸）
エピトープ４：Ｐ  Ｖ  Ｎ  Ａ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ（配列番号１のアミノ酸２１４〜２２５）
エピトープ５：Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｍ  Ｖ  Ｒ  Ｓ  Ｄ  Ｋ  Ｔ  Ｈ  Ｔ  Ｃ（配列番号１のアミノ酸２５３〜２６７）
【００８６】
実施例２：インシリコ分析によるＴ細胞エピトープ４及び５の中の突然変異の設計
Ｔ細胞分析において陽性であるペプチドの配列を、ｉＴｏｐｅ（商標）及びＴＣＥＤ（商標）インシリコ技術を使用して、エピトープ領域からの重複９−ｍｅｒを使用して分析した。［Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  ９（６）：３８５−９６（２００８）。］各９−ｍｅｒを、ＭＨＣ  ＩＩ型対立遺伝子のデータベース（合計３４）に対して試験し、ＭＨＣ  ＩＩ型分子との適合及び相互作用に基づいてスコア化した。それに加えて、各９−ｍｅｒを、既知のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索して、９−ｍｅｒのものと、先行のＴ細胞分析においてＴ細胞応答を刺激した非関連タンパク質に由来するデータベースペプチドのものとの間の任意の高配列相同を同定した。インシリコ分析からの情報に基づき、突然変異を、同定されたエピトープからのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ活性の潜在的除去に関して同定した。
【００８７】
エピトープ５は、天然Ｎ２−ＣＴ  Ｇｌｙ豊富リンカーのＣ末端、配列番号１のＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇＦｃ融合タンパク質を産生するために使用されるｐＦＵＳＥベクターの複数のクローニング部位（「ＭＣＳ」）によってコードされるアミノ酸、及びヒトＩｇＦｃ領域のＮ末端にわたる。インシリコ分析は、配列番号１のＭ２５８及びＶ２５９にＰ１アンカー応答性Ｔ細胞活性として関与した。Ｎ１−Ｎ２コード領域の外部のそれらの場所に基づき、これらの２つのアミノ酸の除去は、機能の損失を引き起こさないようには予測されなかった。これらの２つのアミノ酸は、ＭＣＳによってコードされた。したがって、ＭＣＳを修飾し、配列番号１のＭ２５８及びＶ２５９をコードするヌクレオチドを排除した二本鎖ＤＮＡ分子が、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した部位特異的突然変異生成によって産生された。その後、ＭＣＳ内のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位を使用して使用して、得られた突然変異ＤＮＡ配列をｐＦＵＳＥベクター内へ戻して再クローニングした。得られた成熟（シグナル配列を欠失する）融合タンパク質は、Ｍ２５８及びＶ２５９を除外した。そのアミノ酸配列は、配列番号２に記載され、配列番号５によってコードされる。その融合タンパク質は、下記の分析において、Ａβに結合する、配列番号１融合タンパク質と同じ能力を保持した。
【００８８】
エピトープ４は、Ｎ２ドメイン及び天然Ｇｌｙ豊富リンカーに重複する。ｇ３ｐタンパク質の結晶構造（図示無し）は、エピトープ４は、アミロイド結合領域から離れて位置し、したがって活性に影響を及ぼすことなくアミノ酸置換に耐性であろうことを示唆した。Ｐ１アンカーとして同定されたＶ２１５（配列番号２）は、タンパク質コアに向かって側鎖の僅かな配向を伴って露出される表面である。構造的分析から、表６及び７に記載のＶ２１５に関する置換のいずれも、エピトープを除去するはずである。それに加えて、表６及び７に記載のこのエピトープ内の他のアミノ酸の置換のいずれかもまた、含まれるはずである。Ｖ２１５Ａ置換（配列番号６）を含むＮ１−Ｎ２−ＩｇＦｃをコードする核酸を、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した部位特異的突然変異生成によって、配列番号５から抽出した。得られる成熟融合タンパク質（配列番号３）は、結合分析において、配列番号１かまたは配列番号２かのいずれかのアミノ酸配列を有する融合タンパク質と比較して増加したＡβへの結合を実証した。配列番号６の核酸配列は、エピトープ１、２、及び３中に全ての修飾を組み込む遺伝子を作製するための親配列として使用した。
【００８９】
実施例３：インシリコ分析によるＴ細胞エピトープ１、２、及び３の中の突然変異の設計
エピトープ１は、Ｎ１〜Ｎ２の推定上のＡβ結合部分に対してちょうどＣ末端に存在する。エピトープ１のインシリコ分析は、アミノ酸置換及びＴ細胞エピトープの除去のための領域として配列番号１のアミノ酸４８〜５６を強調した。この９−ｍｅｒ内のアミノ酸を、ｇ３ｐのＸ線結晶構造から解釈して、既存のアミノ酸の性質、表面曝露、及びｇ３ｐのアミロイド結合領域との相互作用に基づいて、置換に関して標的した。具体的には、Ｇ４８、Ｔ５１、Ｙ５４、及びＴ５６を、表１に指示される変化による置換に関して標的した。この領域内の他の潜在的アミノ酸置換は、表２に記載される。
【００９０】
エピトープ２のｉＴｏｐｅ（商標）分析は、配列番号１のアミノ酸１３５〜１４３を、そのエピトープ低減または排除するための標的として指した。Ｘ線結晶構造に基づくと、配列番号１のアミノ酸１３６〜１３９は、Ｎ１〜Ｎ２のヒンジ領域との結合を形成するループ領域を形成し、したがってアミロイド結合活性にとって重要であり得る。これらのアミノ酸に対する変化は、より好ましくなく、表２にのみ提示される。より好ましい変化は、Ｍ１３５、Ｒ１４０、Ｆ１４１、及びＮ１４３に対するものであり、また表１に記載される。この９つのアミノ酸領域に対する他の潜在的変化は、表２に記載される。
【００９１】
配列番号１のアミノ酸１７３〜１８２は、インシリコ分析によって置換のための標的としてエピトープ３内に同定された。エピトープ３は、Ｎ２ドメインのα螺旋状部分内に位置し、したがって戦略は、疎水性残基及び小さい極性非荷電残基の導入を回避することであった。それに加えて、我々は、このエピトープのＣ末端に向かった極性残基酸性残基の導入を回避することを望んだ。Ｘ線結晶学的データに基づき、我々は、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｍ１７６、Ｄ１７８、及びＷ１８２を、表１に指示される変化を有する置換に関して標的した。この領域内の他の潜在的アミノ酸置換は、表２に記載される。
【００９２】
実施例４：低減されたＴ細胞エピトープを有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの生成
各々、表３に記載の異なる単一のアミノ酸置換を含有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質をコードする、５８個の異なる核酸分子を調製した。これは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、所望の置換を導入した後、ＰＣＲ増幅突然変異配列をｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（登録商標）、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，フランス、カタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｈｇ１ｆｃ２）内に再クローニングする、配列番号６の部位特異的突然変異生成によって達成された。
【００９３】
これらの「脱免疫化」Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ、カタログ番号Ｒ７９０−０７）中で個々のｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター内で一時的に発現させた。形質移入の日、細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２３３８）中で１×１０６／ｍＬに希釈して、＞９０％の生存率を確実にした。プラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９８５）中で別々に希釈し、５分間定温放置した後、ＰＥＩをゆっくりとＤＮＡに添加し、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を室温で５分間定温放置した。定温放置後、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、フラスコを回転させながら２９３−Ｆ細胞に滴下した。形質移入した培養物を、１３５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットフォーム上で３７℃、８％ＣＯ２で６〜７日間定温放置した後、採取した。
【００９４】
ポリペプチドを含有する培地を遠心分離によって採取し、１０ｘＰＢＳを使用してｐＨ調節した。タンパク質を、４℃で一晩回転させることによってＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｏｒｓｅｔ、英国）に結合させた。ビーズを１ｘＰＢＳで２回洗浄し、ＳｉｇｍａＰｒｅｐスピンカラム（Ｓｉｇｍａ）に移した。試料を、０．１ＭのグリシンｐＨ３．０を使用して遠心分離によって溶出させ、１／１０の容積の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０を使用して収集管内で中和した。溶出液を、２ｍｌのＺｅｂａＳｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、英国、カタログ番号８９８９０）を使用して１ｘＰＢＳ中へ緩衝液交換した。試料を、濾過減菌し、２８０ｎｍでの吸収度を各試料に関して測定した。
【００９５】
実施例５：脱免疫化ポリペプチドのＡβ結合分析
Ａ．Ａβ（Ａβ）線維調製。Ａβ４２（１ｍｇ、ｒペプチドＡ−１００２−２）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ、１ｍＬ）中へ溶解させ、完全にボルテックスし、透明な溶液が現れるまで２〜１８時間室温で定温放置した。アリコート（１００μｌ、１００μｇ）を、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内に定置し、真空下で２〜３時間乾燥させた（ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ５３０１）。得られたモノマーを、２０μＬのＤＭＳＯ中で再懸濁し、ピペットで採取し、完全に溶解するまで完全にボルテックスした。溶液を、２６０μＬの１０ｍＭのＨＣｌ溶液で希釈し（最終Ａβ４２濃度は８０μＭである）、２０秒間ボルテックスした。透明な溶液を、３７℃で３日間（振盪せずに）定温放置して、凝集を可能にする。分析における使用のため、得られたストック溶液からのＡβ４２線維を、１．６μＭの最終濃度にＰＢＳ中で５０倍に希釈した。
【００９６】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレート調製。９６−ウェルプレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、カタログ番号４４２４０４、ロット１２５４３６及び１２８１５８、デンマーク）の各ウェルに、２００μＬの１％ＢＳＡ溶液を添加した。プレートを密封し、７℃で３時間定温放置した。次に、プレートをＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。５０μＬの希釈したＡβ４２線維溶液（１．６μＭ）を各ウェルに添加し、蓋をせずに３７℃で一晩定温放置して完全に乾燥させた。ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）を対照ウェル（Ａβ４２線維を有さない）に添加した。次に、プレートを水で２回、ＰＢＳで１回洗浄した（各洗浄に関して２５０μＬ／ウェル）。
【００９７】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ分析。５０μＬ中の種々の濃度の各ポリペプチド（及び、配列番号３のポリペプチド）を、各ウェル、及び非Ａβ４２線維でコーティングしたウェルに添加し、３７℃で１時間定温放置した。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回、及びＰＢＳで３回洗浄した（各洗浄に関して２５０μＬ／ウェル）。次に、各ウェルに５０μｌのＨＲＰ共役ヤギ抗ヒト抗Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、カタログ番号１０９−０３５−００８、ロット番号１０６６１７）を添加し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％Ｍｉｌｋ（Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国、カタログ番号２３２１００、ロット番号７３２０４４８）中で１：２５００（最終０．３２μｇ／ｍＬ）に希釈し、３７℃で４０分間定温放置した。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔで６回、及びＰＢＳで２回洗浄した（各洗浄に関して２５０μＬ／ウェル）。次に、５０μｌ／ウェルのＯＰＤ溶液を添加し（１５ｍｇ／７．５ｍｌ、０．０５Ｍのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ−５．５／３μｌのＨ２Ｏ２）、３〜６分間着色させた。次に、２５μｌ／ウェルの４Ｎ  ＨＣｌ溶液を添加して、反応を停止した。プレートを、４９２ｎｍ及び４０５ｎｍでの吸光度に関して読み取った。４０５ｎｍでの吸収度を、４９２ｎｍでの吸収度から減算し、結果をポリペプチド濃度の関数としてプロットした。次に、各脱免疫化ポリペプチドの結合に関するＩＣ５０を算出し、配列番号３のポリペプチドに関して算出したＩＣ５０と比較した。結果は下記の表９に示される。
【表９−１】
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【表９−２】
2016526044.tif 000016
【００９８】
実施例６：全タンパク質ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の分析
本発明のポリペプチドのいずれかからのＣＤ４＋Ｔ細胞応答を配列番号１と比較して分析するために、全タンパク質Ｔ細胞分析を実施した。ＰＢＭＣを、実施例１の通りに調製した２０個の健康なヒトドナー軟膜から単離した。ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中での凍結から復活させ、ＣＤ１４＋細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ１４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を使用して単離した。単球を、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充した（「ＤＣ培地」）ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中で４〜６×１０６のＰＢＭＣ／ｍｌに再懸濁し、次に２４ウェルプレートに分配した（最終培養体積２ｍｌ）。２日目に、ＤＣ培地の体積の半分を取り換えることによって細胞に栄養を供給した。３日目までに、単球は半成熟樹枝状細胞（ＤＣ）に分化し、それは４０ｕｇ／ｍｌの試験ポリペプチドか、もしくは４０ｕｇ／ｍｌの配列番号１のポリペプチド及び１００μｇ／ｍｌのＫＬＨかのいずれかを含む抗原と共に、または培地のみで予備定温放置された。半成熟ＤＣを、抗原と共に２４時間定温放置した後、細胞を２回洗浄することによって過剰抗原を除去し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ、英国）を補充したＤＣ培地中に再懸濁した。７日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを補充したＤＣ培地の体積の半分を取り換えることによってＤＣに栄養を供給し、８日目に、成熟ＤＣを採取した。採取した成熟ＤＣを計数し、トリパンブルー色素排除を使用して生存率を評価した。次に、ＤＣをγ線照射（４０００ｒａｄｓ）し、１ｍｌ当り２×１０５個の細胞でＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した後、下記のＴ細胞増殖の分析及びＥＬＩＳｐｏｔ分析に使用した。それに加えて、８日目に、新鮮なＣＤ４＋Ｔ胞も調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製するために、ＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で復活させ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を使用してＣＤ４＋細胞を単離し、２×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で再懸濁した。
【００９９】
８日目に、Ｔ細胞増殖分析を確立し、それによって、１×１０５個の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２００ｕｌ／ウェルの最終体積に添加されたＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地を伴う９６ウェルＵ底プレート内で１×１０４個の抗原負荷ＤＣ（１０：１の比）に添加した。１４日目に、分析プレートを、２５ｕｌのＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中で６時間、１ウェル当り１ｕのＣｉ［３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、英国）でパルス化した後、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ（Ｈａｍｄｅｎ  ＣＴ、米国）細胞採取器を使用して濾過マット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に採取した。全てのポリペプチドは、６連培養で試験した。各ウェルの毎分当りの計数（ｃｐｍ）を、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）シンチレーション計数によって、パララックス、低バックグラウンド計数で１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で決定した。各抗原の毎分当りの計数を、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地のみ対照に対して正規化した。
【０１００】
ＥＬＩＳｐｏｔ分析のために、ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ、英国）を、１００ｕｌ／ウェルのＩＬ−２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）で、ＰＢＳ中でコーティングした。次に、プレートをＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロック緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））中で一晩定温放置し、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で洗浄した。８日目に、１×１０５個の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート中の１×１０４個の抗原負荷ＤＣ（１０：１の比）に添加した。全てのポリペプチド調製物は、６連培養で試験した。各ドナーＰＢＭＣに関して、陰性対照（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地単独）、無細胞対照、及びＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍｌ）陽性対照も含まれた。
【０１０１】
さらに７日の定温放置期間の後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、ｄＨ２Ｏ及びＰＢＳ中での３回の連続的洗浄によって発展させた後、１００ｕｌの濾過ビオチン化検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）をＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で添加した。３７℃、１．５時間の定温放置後、プレートをＰＢＳ中でさらに３回洗浄し、ＰＢＳ中の１００μｌの濾過ストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）／１％ＢＳＡを１時間添加した（室温で定温放置）。ストレプトアビジン−ＡＰを廃棄し、プレートをＰＢＳ中で４回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間定温放置した。ウェル及びウェルの背面をｄＨ２Ｏで３回洗浄することによって、スポットの発展を停止した。乾燥させたプレートをＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）Ａｎａｌｙｓｅｒ上でスキャンし、１ウェル当りのスポット（ｓｐｗ）をＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ４ソフトウェアを使用して決定した。
【０１０２】
増殖及びＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔ分析の両方に関して、結果は、陽性Ｔ細胞応答に関する２以上のＳＩ閾値（ＳＩ≧２．０）を使用して、試験ポリペプチドのｃｐｍ（増殖分析）またはスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ分析）の培地のみ対照に対する比として定義される、刺激指標（ＳＩ）として表した。
【０１０３】
実施例７：Ｔ細胞エピトープ１、２、及び３のうちの２つ以上の中の二重及び三重突然変異の設計。
結合分析の結果に基づいて、以下の置換を、エピトープ１、２、及び３において、配列番号３と比較して２つのアミノ酸置換を含有するポリペプチド中に存在し、各置換は異なるエピトープ中にあるように選択した。
【表１０】
2016526044.tif 000017
【０１０４】
表１０に記載のアミノ酸置換のうちの２つを各々が異なるエピトープ中にある状態で有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩＧ  Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡを、適切な開始ＤＮＡ（典型的には、実施例３に記載される通りに調製される２つの突然変異のうちの１つをコードするＤＮＡ）の部位特異的突然変異生成を使用することによって調製した。得られたこれらの融合タンパク質をコードするＤＮＡを使用して、細胞を形質転換し、実施例４に記載される通りに発現させ、精製し、実施例５に記載される通り結合に関して試験した。次に、エピトープ１、２、及び３の各々の中に１つの置換を有するポリペプチドを、２つのアミノ酸置換ポリペプチドの結合分析の結果に基づいて設計した。エピトープ１、２、及び３の各々の中に１つの置換を有するポリペプチドを、実施例６に記載される通り、Ａβ結合及びＴ細胞応答の両方に関して分析する。具体的には、以下の二重及び三重エピトープ変異型を、下記の表１１に指示される通り、配列番号３または配列番号７中の特定のアミノ酸を置換することによって作製した。
【表１１−１】
2016526044.tif 000018
【表１１−２】
2016526044.tif 000019
【表１１−３】
2016526044.tif 000020
上記のポリペプチドを、実施例５に記載のＥＬＩＳＡ分析を使用してβ−アミロイドへの結合に関して分析した。結果は、表１２及び１３に記載される。相対的結合値は、ＩＣ５０（配列番号３のポリペプチド）／ＩＣ５０（試験ポリペプチド）を反映する（例えば、値が低ければ低いほど、該ポリペプチドの結合は配列番号３のポリペプチドと比較して大きい）。複数の値は、結合分析における二重反復試験を反映している。
【表１２−１】
2016526044.tif 000021
【表１２−２】
2016526044.tif 000022
【表１３−１】
2016526044.tif 000023
【表１３−２】
2016526044.tif 000024
【０１０５】
実施例８：酢酸セルロース濾過遅延分析。
この分析は、アミロイド線維の不安定化（脱凝集）、または非アミロイド生成性もしくは可溶性の凝集体への再構築を観察するために使用した。分析は主に、Ｃｈａｎｇ，Ｅ．ａｎｄ  Ｋｕｒｅｔ，Ｊ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ３７３，３３０−６，（２００８）及びＷａｎｋｅｒ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ３０９，３７５−８６，（１９９９）から改作された。具体的には、ｆＡβアミロイド線維の２．５μＭの調製物を、異なる濃度の本発明の変異型融合ポリペプチド（１ｎＭ〜２μＭ）と共に３７℃で３日間予備定温放置した。定温放置後、融合ポリペプチドを伴う及び伴わない線維を、希釈し、真空ブロット機の酢酸セルロース膜上に点状配置した。膜を、ＰＢＳで十分に洗浄し、ＡβのＮ末端に特異的な抗体を用いて１時間プローブした。ＨＲＰ共役二次Ａｂを使用して、膜上に保持された線維状凝集体を定量化した。スポット色を分析し、デンシトメトリースキャナを使用してデジタル化した。ＥＣ５０（最大半量有効濃度）を、各スポットに添加した融合ポリペプチドの濃度に対する各スポットのシグナルの強度に基づいて算出した。
【０１０６】
配列番号３のポリペプチドをこの分析において試験したとき、ＥＣ５０は、２μＭ超と決定され、このポリペプチドが低い脱凝集活性を有することを示した。また、配列番号１及び配列番号７のポリペプチドもこの分析において試験し、各々１００ｎＭのＥＣ５０を実証し、顕著な脱凝集活性を示した。この結果に基づき、エピトープ１、２、及び３の各々の中に脱免疫化置換を含有する変異型ポリペプチドの全てを含む、ポリペプチド１０２以降の全ての後続番号のポリペプチドは、開始アミノ酸配列を修飾する際に配列番号７のポリペプチドを使用して作製した。試験ポリペプチドのＥＣ５０値は、表１４に記載される。
【表１４】
2016526044.tif 000025
【０１０７】
上記の実施例から分かる通り、本発明の変異型ポリペプチドは全て、ＥＬＩＳＡ分析によって決定されるときに、Ａβに対する結合を示した。試験された変異型ポリペプチドの大部分は、ドットブロット分析によって決定されるときに、Ａβの脱凝集も示した。
【図１】
2016526044.tif 000034
【図２】
2016526044.tif 000035
【図３】
2016526044.tif 000036
【図４Ａ】
2016526044.tif 000037
【図４Ｂ】
2016526044.tif 000038
【図５】
2016526044.tif 000039
【図６】
2016526044.tif 000040
【図７】
2016526044.tif 000041
【図８】
2016526044.tif 000042
【配列表】
2016526044000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月6日(2016.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開始アミノ酸配列の変異型を含むポリペプチドであって、前記開始アミノ酸配列は、以下の修飾：アミノ酸４３〜４５におけるＡＡＡによるＶＶＶの置換、置換Ｃ５３Ｗ、アミノ酸９６〜１０３の欠失、アミノ酸２１２〜２１４におけるＡＧＡによるＱＰＰの置換、置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａ、アミノ酸１の欠失、ならびにアミノ酸１及び２の欠失、のうちの１つ以上を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、配列番号７のアミノ酸１〜２１７、及び前述のもののいずれかの突然変異体から選択され、
（ａ）前記ポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させ、
（ｂ）前記ポリペプチドは、前記開始アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して低減された免疫原性を有し、
（ｃ）前記変異型は、前記開始アミノ酸配列と比較して１〜９つのアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、下記のアミノ酸置換の群から選択され、
【表１５−１】
2016526044.tif 000043
【表１５−２】
2016526044.tif 000044
（ｄ）前記開始アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１〜２１７であるとき、前記変異型は、下記のアミノ酸置換の群から選択される１〜９つのさらなるアミノ酸置換を任意に有する、前記ポリペプチド。
【表１６】
2016526044.tif 000045
【請求項２】
前記開始アミノ酸配列内の１〜９つのアミノ酸置換の各々は、下記のアミノ酸置換の群から選択される、請求項１に記載の前記ポリペプチド。
【表１７】
2016526044.tif 000046
【請求項３】
前記開始アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、及び配列番号７のアミノ酸１〜２１７から選択される、請求項１または請求項２に記載の前記ポリペプチド。
【請求項４】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して２〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３、のうちの少なくとも２つの中に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
【請求項５】
前記修飾されたアミノ酸配列は、２つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、下記の２つのアミノ酸置換の群から選択される、請求項４に記載の前記ポリペプチド。
【表１８】
2016526044.tif 000047
【請求項６】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して３〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３の各々の中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
【請求項７】
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列と比較して３つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、以下の組のアミノ酸置換：Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ、Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、のいずれかから選択される、請求項５に記載の前記ポリペプチド。
【請求項８】
ペプチドリンカーを介してか、または直接的にかのいずれかで前記変異型アミノ酸配列のＣ末端に融合されるヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的に成る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、請求項８に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカー及びヒトＩｇＧのＦｃ部分の前記アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸２１８〜４８８、配列番号３のアミノ酸２１８〜４８６、及び配列番号７のアミノ酸２１８〜４８８から選択される、請求項９に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１１】
修飾された開始配列から成るポリペプチド変異型であって、前記開始配列は、配列番号３または配列番号７から選択され、前記修飾は、２つまたは３つのアミノ酸置換であり、前記ポリペプチドは、下記のポリペプチドのうちのいずれか１つから選択される、前記ポリペプチド変異型。
【表１９−１】
2016526044.tif 000048
【表１９−２】
2016526044.tif 000049
【表１９−３】
2016526044.tif 000050
【請求項１２】
ポリペプチド番号１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１１８、１２２、１２７、１２８、または１２９のうちのいずれか１つから選択される、請求項１１に記載の前記ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、患者の血流中への注射または注入のために製剤化される、請求項１３に記載の前記薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、脳またはＣＮＳへの直接投与のために製剤化される、請求項１３に記載の前記薬学的組成物。
【請求項１６】
アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の低減を必要とする患者において、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体を低減させるための、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物、または請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１７】
前記患者は、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の存在に関連付けられる神経変性疾患の症状を示す、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記患者は、バイオマーカーフロルベタピルが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるときに、そのバイオマーカーに関して陽性である、請求項１６または請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記患者は、アルツハイマー病（早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含む）、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド病、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクラピー、及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがそれらに限定されない）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイド症、イギリス型／デンマーク型認知症、家族性脳症、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン病・認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患（Ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、神経原線維型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、及び前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤ）（以下の臨床症候群のうちの１つ以上を有する患者を含む：行動障害型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語症（ＰＮＦＡ）、１７番染色体に関連付けられるパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｅｙ）（ＰＳＰ）、及び意味性認知症（ＳＤ））から選択される神経変性疾患に罹患する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記患者は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、またはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介疾患に罹患する、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１２に記載の前記ポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする核酸配列。
【請求項２４】
前記ポリペプチドコード配列にかつインフレームで融合された哺乳類シグナル配列をさらにコードする、請求項２３に記載の前記核酸配列。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列は、前記ベクター内の発現制御配列に作動可能に連結される、前記ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の前記ベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、請求項２３または２４に記載の前記核酸配列によってコードされるタンパク質を発現させるステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で、請求項２６に記載の前記宿主細胞を培養するステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを産生するための方法を提供する。具体的には、かかる方法は、核酸分子及び／またはかかる核酸分子を含むベクターを有する細胞を用いる。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
開始アミノ酸配列の変異型を含むポリペプチドであって、前記開始アミノ酸配列は、以下の修飾：アミノ酸４３〜４５におけるＡＡＡによるＶＶＶの置換、置換Ｃ５３Ｗ、アミノ酸９６〜１０３の欠失、アミノ酸２１２〜２１４におけるＡＧＡによるＱＰＰの置換、置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａ、アミノ酸１の欠失、ならびにアミノ酸１及び２の欠失、のうちの１つ以上を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、配列番号７のアミノ酸１〜２１７、及び前述のもののいずれかの突然変異体から選択され、
（ａ）前記ポリペプチドは、アミロイドに結合する、及び／またはアミロイドを脱凝集させ、
（ｂ）前記ポリペプチドは、前記開始アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して低減された免疫原性を有し、
（ｃ）前記変異型は、前記開始アミノ酸配列と比較して１〜９つのアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、下記のアミノ酸置換の群から選択され、
【表１５−１】
2016526044.tif 000051
【表１５−２】
2016526044.tif 000052
（ｄ）前記開始アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１〜２１７であるとき、前記１〜９つのアミノ酸置換のいずれかは、下記のアミノ酸置換の群から任意にさらに選択される、前記ポリペプチド。
【表１６】
2016526044.tif 000053
（項目２）
前記開始アミノ酸配列内の１〜９つのアミノ酸置換の各々は、下記のアミノ酸置換の群から選択される、項目１に記載の前記ポリペプチド。
【表１７】
2016526044.tif 000054
（項目３）
前記開始アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号３のアミノ酸１〜２１７、及び配列番号７のアミノ酸１〜２１７から選択される、項目１または項目２に記載の前記ポリペプチド。
（項目４）
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して２〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３、のうちの少なくとも２つの中に存在する、項目１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
（項目５）
前記修飾されたアミノ酸配列は、２つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、下記の２つのアミノ酸置換の群から選択される、項目４に記載の前記ポリペプチド。
【表１８】
2016526044.tif 000055
（項目６）
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列に対して３〜９つのアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１、配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１３５〜１４３を含むエピトープ２、及び配列番号１、配列番号３、または配列番号７のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３の各々の中にある、項目１〜３のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド。
（項目７）
前記変異型アミノ酸配列は、前記開始アミノ酸配列と比較して３つのアミノ酸置換のみを有し、前記置換は、以下の組のアミノ酸置換：Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｋ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＤ１７８Ｎ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＷ１８１Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＷ１８１Ｒ、Ｙ５４Ｋ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、Ｙ５４Ｒ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、Ｔ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｋ、及びＫ１７４Ｒ、ならびにＴ５６Ｈ、Ｍ１３５Ｔ、及びＫ１７４Ｒ、のいずれかから選択される、項目５に記載の前記ポリペプチド。
（項目８）
ペプチドリンカーを介してか、または直接的にかのいずれかで前記変異型アミノ酸配列のＣ末端に融合されるヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的に成る、項目１〜７のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド
（項目９）
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、項目８に記載の前記ポリペプチド。
（項目１０）
前記ペプチドリンカー及びヒトＩｇＧのＦｃ部分の前記アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸２１８〜４８８、配列番号３のアミノ酸２１８〜４８６、及び配列番号７のアミノ酸２１８〜４８８から選択される、項目９に記載の前記ポリペプチド。
（項目１１）
修飾された開始配列から成るポリペプチド変異型であって、前記開始配列は、配列番号３または配列番号７から選択され、前記修飾は、２つまたは３つのアミノ酸置換であり、前記ポリペプチドは、下記のポリペプチドのうちのいずれか１つから選択される、前記ポリペプチド変異型。
【表１９−１】
2016526044.tif 000056
【表１９−２】
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【表１９−３】
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（項目１２）
ポリペプチド番号１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１１８、１２２、１２７、１２８、または１２９のうちのいずれか１つから選択される、項目１１に記載の前記ポリペプチド。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか一項に記載の前記ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
（項目１４）
前記組成物は、患者の血流中への注射または注入のために製剤化される、項目１３に記載の前記薬学的組成物。
（項目１５）
前記組成物は、脳またはＣＮＳへの直接投与のために製剤化される、項目１３に記載の前記薬学的組成物。
（項目１６）
アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の低減を必要とする患者において、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体を低減させる方法であって、前記患者に、有効量の項目１〜１２のいずれか一項に記載の前記ポリペプチドまたは項目１３〜１５のいずれか一項に記載の前記薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目１７）
前記患者は、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の存在に関連付けられる神経変性疾患の症状を示す、項目１６に記載の前記方法。
（項目１８）
前記患者は、バイオマーカーフロルベタピルが陽電子放出断層撮影において造影剤として使用されるときに、そのバイオマーカーに関して陽性である、項目１６または項目１７に記載の前記方法。
（項目１９）
前記患者は、アルツハイマー病（早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含む）、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド病、老衰、多発性骨髄腫、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクラピー、及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがそれらに限定されない）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイド症、イギリス型／デンマーク型認知症、家族性脳症、筋委縮性側索硬化症／パーキンソン病・認知症複合病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患（Ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、神経原線維型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、及び前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤ）（以下の臨床症候群のうちの１つ以上を有する患者を含む：行動障害型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語症（ＰＮＦＡ）、１７番染色体に関連付けられるパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｅｙ）（ＰＳＰ）、及び意味性認知症（ＳＤ））から選択される神経変性疾患に罹患する、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２０）
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、項目１９に記載の前記方法。
（項目２１）
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である、項目２０に記載の前記方法。
（項目２２）
前記患者は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、またはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介疾患に罹患する、項目１９に記載の前記方法。
（項目２３）
項目１〜１２に記載の前記ポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする核酸配列。
（項目２４）
前記ポリペプチドコード配列にかつインフレームで融合された哺乳類シグナル配列をさらにコードする、項目２３に記載の前記核酸配列。
（項目２５）
項目２３または２４に記載の核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列は、前記ベクター内の発現制御配列に作動可能に連結される、前記ベクター。
（項目２６）
項目２５に記載の前記ベクターを含有する、宿主細胞。
（項目２７）
項目１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、項目２３または２４に記載の前記核酸配列によってコードされるタンパク質を発現させるステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
（項目２８）
項目１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で、項目２６に記載の前記宿主細胞を培養するステップと、前記発現されたポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
それに加えて、分析間変動を、同型培養のローデータのＣＶ及びＳＤを算出することによって評価した。増殖分析は、６連培養において設定した（「非調節データ」）。分析間変動性が低かったことを確実にするために、データを、最大及び最小ｃｐｍ値を除去した後にも分析し（「調節データ」）、ドナー応答のＳＩを、両データセットを使用して比較した。Ｔ細胞エピトープを、本研究における全ペプチドに対する陽性応答（上記に定義される）の平均頻度、及びバックグラウンド応答率を付与するためにＳＤを算出することによって同定した。調節及び非調節データの両方における、バックグラウンド応答率を上回る増殖性応答を誘発した任意のポリペプチドを、Ｔ細胞エピトープを含有すると見なした。２個の重複ペプチドが増殖性応答率を誘発した場合、Ｔ細胞エピトープは、重複領域内にあると見なした。これに基づき、以下のＴ細胞エピトープを試験ポリペプチドにおいて同定した：
エピトープ１：Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｄ  Ｅ  Ｔ  Ｑ  Ｃ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｗ（配列番号１のアミノ酸４６〜５７）
エピトープ２：Ｔ  Ｆ  Ｍ  Ｆ  Ｑ  Ｎ  Ｎ  Ｒ  Ｆ  Ｒ  Ｎ  Ｒ（配列番号１のアミノ酸１３３〜１４４）
エピトープ３：Ｓ  Ｓ  Ｋ  Ａ  Ｍ  Ｙ  Ｄ  Ａ  Ｙ  Ｗ  Ｎ  Ｇ（配列番号１のアミノ酸１７２〜１８３）
エピトープ４：Ｐ  Ｖ  Ｎ  Ａ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ（配列番号１のアミノ酸２１４〜２２５）
エピトープ５：Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｍ  Ｖ  Ｒ  Ｓ  Ｄ  Ｋ  Ｔ  Ｈ  Ｔ  Ｃ（配列番号１のアミノ酸２５３〜２６７）
【国際調査報告】
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