(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２００原子質量単位あたり少なくとも１個の−ＳＮＯ基を含むＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項２】
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンがＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンである請求項１記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項３】
Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンがＳ−ニトロシル化されたポリ〔ペル−（６−デオキシ−６−チオ）β−チオシクロデキストリン〕である請求項２記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項４】
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンがニトロシル化剤またはニトロ化剤で錯化されている請求項１記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項５】
ニトロシル化剤が、Ｓ−ニトロソチオール、有機亜硝酸エステル、オキサジアゾール、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩および金属ニトロシル錯体からなる群より選ばれたものである請求項４記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項６】
ニトロシル化剤が、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソジチオトレイトール、Ｓ−ニトロソメルカプトエタノール、Ｓ−ニトロソチオグリセロールおよびＳ−ニトロソペニシラミンからなる群より選ばれたＳ−ニトロソチオールである請求項４記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項７】
ニトロ化剤が、有機硝酸エステルおよびニトロニウム塩からなる群より選ばれたものである請求項４記載のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリン。
【請求項８】
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンの６００原子質量単位あたり少なくとも１個の−ＳＮＯ基で誘導体化されたＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンと、エラストマーまたは可塑剤とを含む組成物。
【請求項９】
可塑剤がニトロソチオグリセロールである請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
遊離チオール基をニトロシル化させるのに適した条件下で、ポリチオール化されたシクロデキストリンを含む溶液をニトロシル化剤と反応させることによって製造されたポリマー。
【請求項１１】
ニトロシル化剤が酸性化された亜硝酸塩である請求項１０記載のポリマー。
【請求項１２】
ポリチオール化されたシクロデキストリンを、遊離チオール１モルあたり０．８〜２．０モル当量の酸性化された亜硝酸塩と反応させてなる請求項１０記載のポリマー。
【請求項１３】
ポリチオール化されたシクロデキストリンを、遊離チオール１モルあたり０．９〜１．１モル当量の酸性化された亜硝酸塩と反応させてなる請求項１２記載のポリマー。
【請求項１４】
ポリチオール化されたシクロデキストリンがペル−６−チオ−β−シクロデキストリンである請求項１３記載のポリマー。
【請求項１５】
ニトロシル化剤が塩化ニトロシルである請求項１０記載のポリマー。
【請求項１６】
ニトロシル化剤がＳ−ニトロソチオール、有機亜硝酸エステル、オキサジアゾール、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩および金属ニトロシル錯体からなる群より選ばれたものである請求項１０記載のポリマー。
【請求項１７】
Ｓ−ニトロソチオールが、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソペニシラミニル−Ｓ−ニトロソペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソジチオトレイトール、Ｓ−ニトロソメルカプトエタノール、Ｓ−ニトロソチオグリセロールおよびＳ−ニトロソペニシラミンからなる群より選ばれたものである請求項１６記載のポリマー。
【請求項１８】
遊離チオール基をニトロシル化させるのに適した条件下で、ポリチオール化されたシクロデキストリンをニトロシル化剤と反応させることを含むＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンの製造法。
【請求項１９】
ニトロシル化剤が酸性化された亜硝酸塩である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ポリチオール化されたシクロデキストリンを、遊離チオール１モルあたり０．８〜２．０モル当量の酸性化された亜硝酸塩と反応させる請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ポリチオール化されたシクロデキストリンを、遊離チオール１モルあたり０．９〜１．１モル当量の酸性化された亜硝酸塩と反応させる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ポリチオール化されたシクロデキストリンがペル−６−チオ−β−シクロデキストリンである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ニトロシル化剤が塩化ニトロシルである請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
ニトロシル化剤が、Ｓ−ニトロソチオール、有機亜硝酸エステル、オキサジアゾール、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩および金属ニトロシル錯体からなる群より選ばれたものである請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
Ｓ−ニトロソチオールが、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソペニシラミニル−Ｓ−ニトロソペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソジチオトレイトール、Ｓ−ニトロソメルカプトエタノール、Ｓ−ニトロソチオグリセロールおよびＳ−ニトロソペニシラミンからなる群より選ばれたものである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
個体または動物の治療部位に接触させるのに適した医療器具を、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンの１２００ａｍｕあたり少なくとも１個の−ＳＮＯ基で誘導体化されたＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンで被覆することを含む、個体または動物の治療部位に酸化窒素を送達する器具の製造法。
【請求項２７】
医療器具の表面上の被膜と組合せてなり、前記被膜がＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンの１２００ａｍｕあたり少なくとも１個の−ＳＮＯ基で誘導体化されたＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンを含むものである、個体または動物に差し込むか、あるいは個体または動物の体液に接触させるための医療器具。
【請求項２８】
医療器具がステントである請求項２７記載の医療器具。
【請求項２９】
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンを有効量のガス状のニトロシル化剤と接触させることを含む、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンからＮＯ基の損失を補う方法。
【請求項３０】
ガス状のニトロシル化剤が塩化ニトロシルまたは酸化窒素である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
個体または動物におけるＮＯを用いた治療を必要とする部位に差し込むのに適した医療器具に、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンを被覆する請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ＮＯの損失が医療器具の殺菌から生じる請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
現在の多くの医療的処置では、合成医療器具が治療を受けている個体の中にあることが必要とされる。例えば、冠状動脈および末梢の処置には、診断カテーテル、ガイドワイヤ、ガイドカテーテル、（経皮経管冠状動脈形成用）ＰＴＣＡバルーンカテーテルおよびステントを血管中へ挿入することが含まれる。他の例としては、（静脈のおよび動脈の）内在しているシース、動脈内バルーンポンプカテーテル、心肺装置中の管、ゴア・テックス（ＧＯＲＥ−ＴＥＸ）外科用人工器官の導管および尿道に内在しているカテーテルがある。しかしながら、これらの医療方法が原因で引き起こされる合併症がある。例えば、合成材料の管腔内への挿入は、瘢痕や再狭窄を引き起こすことがあり、それにより管腔の閉塞または封鎖が生じることがある。血管中の合成材料は、血小板の凝集も引き起こすことがあり、ある場合には、潜在的に生命を脅かす血栓形成を生じる。
酸化窒素（本明細書では「ＮＯ」という）は、血小板の凝集を阻害する。また、ＮＯは、平滑筋の増殖を低減させ、再狭窄を減少させることが知られている。従って、ＮＯを個体内の合成医療器具と接触している治療部位に送達すると、ＮＯを用いて、再狭窄や血栓形成等の合併症を予防および／または治療することができる。さらに、ＮＯは、抗炎症性であり、内在の尿道またはＴＰＮのカテーテルに価値がある。
しかしながら、ＮＯを治療部位へ送達する現在の方法に関する欠点は多い。ＮＯは、それ自身が反応性が高すぎるため、治療部位に到達するまで分子を安定化させる方法がなければ使用できない。従って、ＮＯは、通常、ＮＯを放出するポリマーや低分子を用いて個体内の治療部位に送達される。しかしながら、これらのポリマーや低分子は、一般的にはＮＯをすばやく放出する。その結果、これらは、短い貯蔵寿命しかもたず、生理学的条件下でＮＯを送達する能力を急速に失う。例えば、生理溶液中のＳ−ニトロソ−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンやＳ−ニトロソシステインの寿命は、わずか約１時間以下にすぎない。これらの組成物による急速なＮＯ放出の結果、より長い期間、十分な量のＮＯを治療部位に送達したり、送達されるＮＯの量を調整することは難しい。
ＮＯを送達することが可能な基を含有するポリマー、例えば、ジアゼニウムジオレート基（ＮＯＮＯエート基）を含有するポリマーは、医療器具を被覆するのに用いられてきた。しかしながら、酸素化処理条件下でのＮＯＮＯエートの分解生成物には、ニトロソアミンが含まれ（ラグスダール（Ragsdale）ら、Inorg. Chem. 4:420（1965））、それらのうちのいくつかは、発癌性である。さらに、ＮＯＮＯエートは、一般にＮＯ・を放出し、ヘモグロビンによりすばやく消費され、動脈硬化症の個体に有毒なものとなり得る。さらに、公知のＮＯ送達ポリマーの弾性は、一般に不十分であり、該ポリマーで医療器具を被覆し、その被覆した器具を用いてＮＯを生理学的条件下で送達することは難しい。蛋白質を基材としたポリマーは、血液への溶解性が高いため、寿命が短い。最後に、多くのＮＯ送達ポリマーは、ポリマーからＮＯを失わせずに滅菌することができず、送達されるＮＯの量が限られている。
従って、前記の欠点を克服する方法で治療部位にＮＯを送達することが可能な新規の組成物が必要とされている。
発明の概要
本発明は、ＮＯx（式中、Ｘは１または２）で誘導された新規なポリマーに関する。本発明の新規なポリマーで被覆された医療器具は、動物モデル内に差し込まれた場合に血小板の沈着および再狭窄を低減させるのに効果的であることが現在わかっている。特に、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンまたはＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンもしくはＳ−ニトロソ−ペニシラミンで錯化されたＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンで被覆されたステントは、イヌの冠状またはコートイド（cortoid）動脈内に挿入した場合には、ポリマーの被覆がないステントと比べて血小板の沈着を低減させた（実施例１２）。また、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンおよびＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンで錯化されたＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンは、生物検定において血管拡張を引き起こすことがわかった（実施例８および１０）。さらに、Ｓ−ニトロソチオールで錯化されたＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンを含有する組成物は、インビボでＮＯを送達するのに現在用いられている化合物と比べて、長期間、ＮＯに関連した活性を送達し、貯蔵安定性の向上を発現することがわかった。特に、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンで錯化されたＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンは、ＮＯを失わずに少なくとも３週間貯蔵することができ、２４時間よりも長い時間生理溶液中でＮＯを送達することが可能である（実施例１０）。数カ月間の寿命が観察された（実施例９および１０）。
本発明は、新規のニトロ化またはニトロシル化されたポリマーを含む。従って、新規のポリマーは、ＮＯxで誘導される該ポリマーは、ポリマー１２００原子質量単位（ａｍｕ）あたり、好ましくはポリマー６００ａｍｕあたり、さらに好ましくはポリマー７０ａｍｕあたり、少なくとも１つのＮＯx基を有する。好ましい態様において、該ポリマーは、ペンダント状の−Ｓ−ＮＯ基および／またはペンダント状の−Ｏ−ＮＯ基を有する、即ち、該ポリマーは、Ｓ−ニトロシル化および／またはＯ−ニトロシル化されている。他の態様において、ポリマーは、遊離チオール基をニトロシル化またはニトロ化するのに好適な条件下で、ポリチオール化された多糖類をニトロシル化剤またはニトロ化剤と反応させることにより調製される。
本発明のその他の態様は、ＮＯx基を有するポリマーの製造方法である。該方法には、遊離求核基をニトロシル化またはニトロ化するのに好適な条件下で、多数のペンダント状の求核基を有するポリマーをニトロシル化剤またはニトロ化剤と反応させることが含まれる。好ましい態様において、ポリマーはポリチオール化されたポリマーである。
本発明のその他の態様は、個体または動物の治療部位に酸化窒素を送達する方法である。該方法は、前記のようにＮＯxで誘導されたポリマーで被覆された医療器具を提供することを含む。好ましくは、該ポリマーは、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーである。次いで、該医療器具を、個体または動物内の治療部位に差し込む。体液、例えば血液に酸化窒素を送達するため、被覆された医療器具と体液を接触させる。
さらに、本発明のその他の態様は、個体または動物内の治療部位へ酸化窒素を送達するための器具を製造する方法である。該方法は、前記のように、個体または動物内の治療部位に接触させるのに好適な医療器具をＮＯxで誘導されたポリマーを用いて被覆することを含む。好ましくは、該ポリマーは、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーである。
本発明のその他の態様は、酸化窒素を個体または動物内の治療部位に送達するための医療器具である。該器具は、個体または動物内の治療部位へ差し込むのに好適な医療器具を含み、前記のようにＮＯxで誘導されたポリマーで被覆されている。好ましくは、該ポリマーは、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーである。
本発明のその他の態様は、ＮＯ基の損失をＳ−ニトロシル化されたポリマーから補う方法である。該方法は、遊離チオールをニトロシル化するのに好適な条件下で、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーを有効量のガス状ニトロシル化剤、例えば塩化ニトロシル（ＮＯＣｌ）と接触させることを含む。
本発明のＳ−ニトロシル化されたシクロデキストリンは、−Ｓ−ＮＯ基のヘテロリティック開裂を受け、結果として基本的にＮＯ・を放出しない。これらのポリマーは、高いＮＯ容量を有しており、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン等のニトロシル化剤のポリマーマトリックスへの取り込みが、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンの安定性を数週間以上に増大させる。また、ニトロシル化剤の取り込みは、そのＮＯ送達能力を天然のシクロデキストリンの約２倍、および蛋白質ベースのポリマーの約２００倍まで増加させる。増大した安定性とＮＯ送達能力とを組み合せることにより、ＮＯ効力を高め、ＮＯの送達を調整し、治療期間やポリマーの貯蔵寿命を延ばすことができる。これらのポリマーのさらなる利点は、該ポリマーが他のＮＯを送達する組成物の脆性がなく、生理学的条件下でステント等の医療器具に被覆や接着するのに十分な弾性を有していることである。
【図面の簡単な説明】
図１は、イヌの動脈に差し込まれた、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンで被覆されたステントおよび被覆されていない対照ステントの１平方センチメートルあたりに沈着した血小板数を示すグラフである。
図２は、ペル−６−チオ−β−シクロデキストリンを１倍（１×）、２倍（２×）、３倍（３×）、６倍（６×）および１０倍（１０×）当量の酸性亜硝酸塩と反応させて得られた生成物におけるシクロデキストリンあたりの−Ｓ−ＮＯ基の数を示すグラフである。
図３は、β−シクロデキストリンおよび５０倍過剰量の酸性亜硝酸塩を含む反応混合物の可視／紫外線スペクトルであり、（１）５分間、（２）１５分間、（３）３０分間、（４）４５分間、（５）６０分間、（７）７５分間および（７）９０分間の間隔で取った。
発明の詳細な説明
本明細書で用いられているように、「ポリマー」とは、用語として一般に使用されている意味を有する。その例としては、ホモポリマー、（ブロックコポリマーおよびグラフトコポリマーを含む）コポリマー、樹枝状ポリマー、架橋ポリマー等が挙げられる。好適なポリマーは、合成および天然ポリマー（例えば、多糖類、ペプチド）ならびに縮合、付加および開環重合により調製されたポリマーを含む。ゴム、繊維およびプラスチックも含まれる。ポリマーは、親水性、両親媒性または疎水性であってもよい。１つの面において、本発明のポリマーは、非ペプチドポリマーである。
好ましいポリマーは、水不溶性でかつ親水性であり、即ち、ヒドロゲルを形成しうるものである。ヒドロゲルは、多量の水を吸収しうる組成物である。ヒドロゲルを形成しうるポリマーは、一般に他のポリマーよりも生物学的適合性がよく、例えば、血管系に挿入される器具に用いることができる。血小板や蛋白質は、普通、ポリマーを血管部位内に挿入するとすぐに沈着し、再狭窄や創傷を導く出来事のカスケードを始める。ヒドロゲルを形成するポリマーを用いることにより、この過程を遅らせたり、除去し、蛋白質沈着や血小板活性化のリスクが低減される。ヒドロゲルを形成するポリマーは、一般的には親水性架橋ポリマーである。ヒドロゲルのさらに詳細な開示や例は、ヒドロゲル・アンド・バイオデグレーダブル・ポリマー・フォー・バイオアプリケーションズ（Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications）、アッテンブライト（Attenbrite）編、ヒュアング（Huang）とパーク（Park）、ACS Symposium Series、No.627（1996）、米国特許第5,476,654号、第5,498,613号および第5,487,898号明細書に規定されており、その内容は参照として本明細書に取り込まれている。ヒドロゲルの例としては、部分的に水和されたポリエチレン、多糖類および架橋多糖類が挙げられる。
ＮＯxは、ＮＯxの窒素原子と架橋基Ｍとの間の１本の共有結合で本発明のポリマーに結合しており、Ｍは該ポリマーのペンダントであるか、または該ポリマーと共有結合している。従って、本発明のポリマーは、ペンダント状の−Ｍ−ＮＯx基を有する。−Ｍ−ＮＯx基の例は、−Ｓ−ＮＯx、−Ｏ−ＮＯx、−ＮＲ−ＮＯx、−ＣＨ2−ＮＯx、−ＮＯＨ−ＮＯx、−ＣＯ−ＮＲ−ＮＯx、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ2）＝Ｎ−ＮＯx、＝Ｎ−ＮＲ−ＮＯx、＝Ｎ−ＮＯxおよび＞Ｎ−ＮＯxを含む。また、脂肪族および芳香族のＣ−ニトロおよびＣ−ニトロソ化合物が含まれる。Ｒは、−Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。アルキル基は、直鎖状または分岐鎖状でもよく、約１〜約１０個の炭素原子を有していてもよい。好適な置換基には、−ＣＮ、ハロゲン、フェニルおよびアルキルが含まれる。ＮＯ送達速度は、安定な基よりも速いＮＯ送達速度を有する不安定な基を用いて、ペンダント状の−Ｍ−ＮＯx基の安定性によって変化させることができる。−Ｓ−ＮＯx基は、通常、最も安定性が低く、一方、−Ｃ−ＮＯx基は、通常、最も安定である。−Ｏ−ＮＯxは、通常、−Ｓ−ＮＯx基より安定であり、一方、−Ｎ−ＮＯx基は、通常、安定性が中間である。
好ましい態様において、本発明のポリマーは、ペンダント状の−Ｓ−ＮＯx基、より好ましくは−Ｓ−ＮＯ基を有する。−Ｓ−ＮＯ基を有するポリマーは、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーと言われる。「−Ｓ−ＮＯ基」とは、亜硝酸スルフォニル、チオ亜硝酸エステル、Ｓ−ニトロソチオールまたはチオ亜硝酸塩とも呼ばれる。１つの面において、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーも、ペンダント状の−Ｏ−ＮＯx基、好ましくは−Ｏ−ＮＯ基を有する。「−Ｏ−ＮＯ」基とは、亜硝酸塩を意味する。本発明のＳ−ニトロシル化されたポリマーは、ポリマーの１２００原子質量単位あたり少なくとも１つのＮＯ基を有する。例えば、−Ｓ−ＮＯ基を含有する約６００，０００原子質量単位（ａｍｕ）の分子量を有するＳ−ニトロシル化されたポリマーは、ポリマーに共有結合した約５００個のＮＯ基を有する。好ましくは、本発明のＳ−ニトロシル化されたポリマーは、ポリマーの６００ａｍｕあたり少なくとも１つのＮＯ基を有しており（実施例１３を参照）、そして、より好ましくは、７０ａｍｕのポリマーあたり少なくとも１つのＮＯ基を有している（実施例１４を参照）。
ペンダント状の−Ｓ−ＮＯ2基を有するポリマーは、Ｓ−ニトロ化されたポリマーと呼ばれる。「−Ｓ−ＮＯ2基」は、硝酸スルフォニル、Ｓ−ニトロチオールまたはチオ硝酸塩とも呼ばれる。−Ｓ−ＮＯ2基は、インビボで分解され、ＮＯを送達する。１つの面において、Ｓ−ニトロ化されたポリマーも、ペンダント状の−Ｏ−ＮＯx基を有する。本発明のＳ−ニトロ化されたポリマーは、ポリマーの１２００原子質量単位あたり少なくとも１つのＮＯ2基を有する。好ましくは、本発明のＳ−ニトロ化されたポリマーは、ポリマーの６００ａｍｕあたり少なくとも１つのＮＯ2基を有し、そして、より好ましくは、ポリマーの７０ａｍｕあたり少なくとも１つのＮＯ2基を有する。
本発明のポリマーは、多数の求核基を有するポリマーから調製することができる。好ましい求核基には、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、アミド、グアニジン、イミン、芳香環および求核性炭素原子が含まれる。ニトロシル化されたポリマーを調製するため、求核基をニトロシル化するのに好適な条件下で、多数のペンダント状の求核基を有するポリマーをニトロシル化剤と反応させる。ニトロ化されたポリマーを調製するため、求核基をニトロ化するのに好適な条件下で、多数のペンダント状の求核基を有するポリマーをニトロ化剤と反応させる。
ここでは、ニトロ化およびニトロシル化されたポリマーの調製は、Ｓ−ニトロシル化およびＳ−ニトロ化されたポリマーに関して記載する。本明細書に記載のＳ−ニトロシル化およびＳ−ニトロ化されたポリマーの調製方法は、前記のように、チオール以外のペンダント状の求核基を有するポリマーのニトロ化またはニトロシル化に用いることができることが理解されるだろう。条件においていくつかの変更が必要とされるであろうが、そのような変更は、当業者が日常的な実験のみを用いて決定することができる。
Ｓ−ニトロシル化されたポリマーおよびＳ−ニトロ化されたポリマーは、本明細書で「ポリチオール化されたポリマー」と呼ぶ、多数のペンダント状のチオール基を有するポリマーから調製することができる。Ｓ−ニトロシル化されたポリマーを調製するため、遊離チオール基をニトロシル化するのに好適な条件下で、ポリチオール化されたポリマーをニトロシル化剤と反応させる。Ｓ−ニトロ化されたポリマーを調製するため、遊離チオール基をニトロ化するのに好適な条件下で、ポリチオール化されたポリマーをニトロ化剤と反応させる。好適な、ニトロシル化剤およびニトロ化剤は、フィーリッシュ（Feelisch）とスタムラー（Stamler）、”Donors of Nitrogen Oxides”、Methods in Nitric Oxide Researchフィーリッシュとスタムラー編、（John Wiley & Sons）（1996）に開示されており、その内容は参照により本明細書に取り込まれている。好適なニトロシル化剤には、酸性亜硝酸塩、塩化ニトロシル、Ｓ−ニトロソ基を含む化合物（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソペニシラミニル−Ｓ−ニトロソペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソチオグリセロール、Ｓ−ニトロソジチオトレイトールおよびＳ−ニトロソメルカプトエタノール）、有機亜硝酸エステル（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸イソブチルおよび亜硝酸アミル）ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩（例えば、硫酸水素ニトロシル）、オキサジアゾール（例えば、４−フェニル−３−フロキサンカルボニトリル）等が含まれる。好適なニトロ化剤は、有機硝酸エステル（例えば、ニトログリセリン、イソソルビド二硝酸エステル、イソソルビド５−モノ硝酸エステル、硝酸イソブチルおよび硝酸イソペンチル）、ニトロニウム塩（例えば、テトラフルオロホウ酸ニトロニウム）等を含む。
酸性亜硝酸塩を用いるニトロシル化は、例えば、水溶液中で亜硝酸塩、例えば、ＮａＮＯ2、ＫＮＯ2、ＬｉＮＯ2等を用いて、酸、例えば、ＨＣｌ、酢酸、Ｈ3ＰＯ4等の存在下で、約−２０℃〜約５０℃の温度で、好ましくは常温で行うことができる。一般に、ニトロシル化されるチオールあたり約０．８〜約２．０好ましくは約０．９〜約１．１当量のニトロシル化剤が用いられる。十分な酸を添加し、全ての亜硝酸塩を亜硝酸に変換する。酸性亜硝酸塩を用いてポリチオール化されたシクロデキストリンをニトロシル化させるのに特定の条件が、実施例３に与えられている。
ＮＯＣｌを用いるニトロシル化は、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒中で、約−２０℃〜約５０℃の温度で、好ましくは常温で行うことができる。ＮＯＣｌを溶液中で泡立てることにより、遊離チオール基をニトロシル化させる。ポリチオール化されたシクロデキストリンをＮＯＣｌを用いてニトロシル化させる特定の条件が、実施例４に与えられている。
組成物中の−Ｓ−ＮＯ基の量は、”Preparation and Detection of S-Nitrosothiols”、Methods in Nitric Oxide Research、フィーリッシュ（Feelisch）とスタムラー（Stamler）編、（John Wiley & Sons）521-541頁、（1996）に開示されているサヴィル（Savile）の方法により測定することができる。ポリマーの分子量あたりのＮＯの量を計算するため、ポリマー濃度、例えば、炭水化物の濃度も測定する。炭水化物の濃度は、デュボイス（Dubois）ら、Anal. Chem. 28:350（1956）に開示の方法により測定することができる。
ポリチオール化されたポリマーは、アルコールやアミン等の多数のペンダント状の求核基を有するポリマーから生成させることができる。ペンダント状の求核基は、当該技術分野に公知の方法や、ガッデル（Gaddell）とデファイエ（Defaye）、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:78（1991）やロジャス（Rojas）ら、J. Am. Chem. Soc. 117:336（1995）に開示された方法により、ペンダント状のチオール基に変換することができ、その内容は参照により本明細書に取り込まれている。
特に好ましい態様において、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーは、Ｓ−ニトロシル化された多糖類である。好適なＳ−ニトロシル化された多糖類の例は、Ｓ−ニトロシル化されたアルギン酸、κ−カラギーナン、デンプン、セルロース、フコイジン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン等のシクロデキストリンを含む。他の好適な例は、Bioactive Carbohydrates、ケネディ（Kennedy）とホワイト（White）編、（John Wiley Sons）、８章、142-182頁、（1983）に開示されており、その内容は参照により本明細書に取り込まれている。多糖類は、ペンダント状の第一および第二アルコール基を有している。従って、Ｓ−ニトロシル化された多糖類は、前記した方法によりポリチオール化された多糖類から調製することができる。好ましい多糖類には、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等のシクロデキストリンが含まれる。多糖類は、まず、例えば、ガッデル（Gaddell）とデファイエ（Defaye）らロジャス（Rojas）らに開示された方法により、ポリチオール化された多糖類に変換する。これらの方法において、第一アルコールは第二アルコールよりも優先的にチオール化される。好ましくは、十分な過剰量のチオール化剤を用いて、ペルチオール化された多糖類を生成する。多糖類は、全ての第一アルコールがチオール基に変換されているとき、「ペルチオール化される」。β−シクロデキストリンをペルチオール化させる特定の条件は、実施例１および２に与えられている。ポリチオール化およびペルチオール化された多糖類は、前記のように、酸性亜硝酸塩（実施例３）または塩化ニトロシル（実施例４）等の好適なニトロシル化剤の存在下でニトロシル化することができる。
一つの面において、Ｓ−ニトロシル化された多糖類、例えば、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンを調製する場合には、過剰量の酸性亜硝酸塩を遊離チオール基について用いる。過剰量の酸性亜硝酸塩により、ペンダント状の−Ｓ−ＮＯおよび−Ｏ−ＮＯ基を有する多糖類が得られる。Ｏ−ニトロシル化の程度は、どのくらいの過剰量の酸性亜硝酸塩を用いるかによって決まる。例えば、５０倍過剰量の酸性亜硝酸塩を用いるペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化により、各シクロデキストリンに対して約１０モルのＮＯ（実施例１４）、または１４０ａｍｕあたり約１モルのＮＯを含む生成物が得られる。１００倍過剰量の酸性亜硝酸塩を用いるペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化により、各シクロデキストリンに対して約２１モルのＮＯ（実施例１４）、または７０ａｍｕあたり約１モルのＮＯを含む生成物が生じる。ペンダント状の−Ｏ−ＮＯおよび−Ｓ−ＮＯ基を有するβ−シクロデキストリンの特定の調製条件が、実施例１４に開示されている。
他の面において、ポリチオール化された多糖類は、多糖類のアルコール基、好ましくは第一アルコール基を、遊離チオールまたは保護されたチオールを含有する部分をアルコールに付加する試薬と反応させることにより、調製することができる。一つの例において、多糖類は、構造式（Ｉ）：
0004312263.tif 000002
に示されるように、ビスイソシアナトアルキルジスルフィドと反応させ、次いでアルコールを官能基化するために還元する。この反応を行うための条件は、Cellulose and its Derivatives、フカモタ（Fukamota）、ヤマダ（Yamada）とトナミ（Tonami）編、（John Wiley & Sons）、40章、（1985）に見られ、その内容は参照により本明細書に取り込まれている。この経路により得ることができるポリチオール化された多糖類の一例を構造式（II）：
0004312263.tif 000003
に示す。
遊離チオールをニトロシル化させることができる試薬は、ある場合には、遊離チオールも酸化させ、ジスルフィド結合を形成することがわかる。従って、ポリチオール化されたポリマー（例えば、ポリチオール化されたシクロデキストリン等のポリチオール化された多糖類）をニトロシル化剤、例えば酸性化された亜硝酸塩、塩化ニトロシル、Ｓ−ニトロソチオールで処理することにより、ある場合には、架橋Ｓ−ニトロシル化されたポリマーマトリックスが生成することになる。「ポリマーマトリックス」とは、分子間結合によって結合または「架橋した」多数の個々のポリマーを含む分子である。従って、ある場合には、ニトロシル化剤は、いくつかのチオールをニトロシル化し、さらに分子内ジスルフィド結合を形成させることにより各ポリマーを架橋する。そのようなポリマーマトリックスは、「Ｓ−ニトロシル化されたポリマー」という用語に含まれ、本発明の範囲内に含まれている。過剰量のニトロシル化剤を用いる場合、およびニトロシル化剤が十分な量のものである場合には、それは、個々のポリマー分子を架橋する分子間ジスルフィド結合により重合体マトリックス内に取り込まれ、または「からみ合って」、それによりポリマーとニトロシル化剤との間で錯体が形成される。
Ｓ−ニトロシル化された多糖類、特に、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリン等のＳ−ニトロシル化された環状多糖類は、前記のように、ニトロシル化反応の際にポリチオール化された多糖類中の遊離チオールに対して１当量を超えるニトロシル化剤を用いた場合、好適なニトロシル化剤と錯体を形成しうる。一般に、約１．１〜約５．０当量のニトロシル化剤を用いると、好ましくは約１．１〜約２．０当量の錯体が形成される。
Ｓ−ニトロシル化された環状多糖類と錯化することができるニトロシル化剤には、環状多糖類との包接錯体を形成するのに必要な大きさや疎水性を有するものが含まれる。「包接錯体」とは、シクロデキストリン等の環状多糖類と該環状多糖類の空洞内に位置する低分子等の低分子との間の錯体である。シクロデキストリン等の環状多糖類の空洞の大きさや、包接錯体の調製のために適当な分子を選択する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、スゼジトリ（Szejtli）Cyclodextrins In Pharmaceutical、Kluwer Academic Publishers、186-307頁、（1988）に見ることができ、その内容は参照により本明細書に取り込まれている。
Ｓ−ニトロシル化された環状多糖類と錯化しうるニトロシル化剤には、ニトロシル化剤がＳ−ニトロシル化された多糖類のポリマーマトリックスの構造の中に取り込まれうるような十分な大きさを有するニトロシル化剤も含まれる。前述したように、ある例では、ポリチオール化されたポリマーのニトロシル化も、分子間のジスルフィド結合の形成により個々のポリマー分子を架橋し、ポリマーマトリックスを与えることになりうる。好適なニトロシル化剤は、ニトロシル化剤がこのマトリックスの中に取り込まれうるような適した大きさのものである。大きさに要求される条件は、それぞれ個々のポリチオール化されたポリマーの構造により決定され、好適なニトロシル化剤は、調製される個々のＳ−ニトロシル化されたポリマーに応じて、当業者によりごく普通に決定することができることが理解される。
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンと錯体を形成しうるニトロシル化剤には、Ｓ−ニトロソ基を有する化合物（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソペニシラミニル−Ｓ−ニトロソペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソチオグリセロール、Ｓ−ニトロソジチオトレイトールおよびＳ−ニトロソメルカプトエタノール）、有機亜硝酸エステル（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸イソブチルおよび亜硝酸アミル）、オキサジアゾール（例えば、４−フェニル−３−フロキサンカルボニトリル）、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩およびニトロプルシド（nitroprusside）ならびに他の金属のニトロシル錯体（フィーリッシュ（Feelisch）およびスタムラー（Stamler）著、「窒素酸化物の供与体（Donors of Nitrogen Oxides）」、フィーリッシュおよびスタムラー編、酸化窒素の研究における方法（Methods in Nitric Oxide Research）（ジョンウィリー・アンド・ソンズ（John Wiley & Sons））（１９９６年）を見よ）が含まれる。以下でさらに詳細に論議するように、Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンのＮＯ送達時間および送達容量は、ニトロシル化剤の取り込みによって増大される。送達時間および容量が増大される程度および度合いはニトロシル化剤に依存する。
Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリンとニトロシル化剤との間で錯体を形成するための特定の条件が、実施例５および６に与えられている。これらの実施例に記載された条件により、多糖類中の少なくとも数個の遊離チオールをニトロシル化することになる。なぜなら、過剰のニトロシル化剤は、用いられた多糖類中の遊離チオールの量について用いられているので、生成する組成物は、未反応のニトロシル化剤を含有する。Ｓ−ニトロシル化された多糖類がニトロシル化剤と錯体を形成するという確証は、本明細書で報告されているように、ペルー（６−デオキシ−６−−チオ）β−チオシクロデキストリンとＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンの反応生成物から放出されるＮＯの割合が、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン単独と比較して大きい（実施例１０）という発見からきている。
本件出願人は、いかなる特定の機構により限定されることも決して望まないが、Ｓ−ニトロシル化された環状多糖類中へのニトロシル化剤の取り込みが、該多糖類および該ニトロシル化剤の両者による治療部位へのＮＯの送達を可能にすると考えられる。また、該環状多糖類と該ニトロシル化剤との間の相互作用がニトロシル化剤中の−Ｓ−ＮＯ官能基を安定化するとも考えられる。さらに、組成物中のニトロシル化剤が存在することで、Ｓ−ニトロシル化された多糖類中のニトロシル基を与え、即ち補給し、それによりポリマーがＮＯ供与体として働きうる寿命を延ばすのに役立つとも考えられる。Ｓ−ニトロシル化された環状多糖類の寿命を延ばすことが可能な程度は、ニトロシル化剤がチオ亜硝酸塩であるとき、Ｓ−ニトロシル基の安定性により決定される。−Ｓ−ＮＯ基の安定性は多くの因子に依存し；金属と化合してキレート環を形成する−Ｓ−ＮＯ基の能力は、ホモリシスな分解を促進し；第三級の−Ｓ−ＮＯ基は、第一級の基よりも安定な第二級の−Ｓ−ＮＯ基よりもさらに安定であり；シクロデキストリンの疎水性ポケットに適合する−Ｓ−ＮＯ基は、適合しないものよりも安定であり；−Ｓ−ＮＯ基へのアミンの近接は安定性を低下させ；β位での−Ｓ−ＮＯ基への修飾は安定性を変える。
Ｓ−ニトロシル化されたポリマーとニトロシル化剤について前記したように、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーまたはＳ−ニトロ化されたポリマーと、好適な大きさおよび疎水性を有するニトロ化剤との間で錯体が形成されうることが理解されるべきである。架橋されたＳ−ニトロ化されたシクロデキストリンおよびＳ−ニトロ化されたポリマーとニトロ化剤との間の錯体は、「Ｓ−ニトロ化されたシクロデキストリン」という用語に含まれる。好適なニトロ化剤には、ニトログリセリン、イソソルビド二硝酸、イソソルビド５−モノ硝酸、イソブチル硝酸およびイソペンチル硝酸などの有機硝酸塩ならびにニトロニウム塩が含まれる。ニトロシル化剤を用いた場合、ＮＯの放出の速度は、ポリマーの中に取り込まれるニトロ化剤に依存する。
１つの態様において、本発明は、ＮＯxで誘導されたポリマーを含み、さらにポリマーに望ましい特性を与える他の成分を含む組成物である。例えば、可塑剤およびエラストマーを該組成物に添加して、ポリマーにより強い弾性を与えてもよい。一般に、好適な可塑剤およびエラストマーは、１）生物学的適合性であり、すなわちそれが投与された個体における血小板およびタンパク質の沈着などの有害な反応を最小限にし、そして２）ＮＯを送達することができるポリマーに溶解し、代わって前記ポリマーの溶解度を高めうる化合物である。好適な可塑剤の例には、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールが含まれる。好ましい可塑剤は、ＮＯも送達することができるもの、例えばニトロソチオグリセロールである。
本発明のもう１つの態様は、ＮＯを送達する本発明の新規なポリマーおよび組成物を用いて、ＮＯを個体または動物の治療部位に送達する方法である。「治療部位」には、ＮＯを該部位に接触させることにより望ましい治療効果が得られうる個体または動物の体内の部位が含まれる。「個体」とは、ヒトをいい、動物には、犬、猫などの家畜動物および馬、牛、豚などの農地動物が含まれる。
治療部位は、例えば、該部位を合成物質または医療器具と接触させることによって生じた外傷の結果として、再狭窄、創傷または血栓症が発現した体内の部位で見出される。例えば、再狭窄は、ＰＴＣＡバルーンカテーテルによる冠状動脈の処置または末梢の処置（例えば、経皮経管動脈形成術）を受けた血管内で発現しうる。再狭窄は、術後約３〜６ヵ月の瘢痕組織の発現であり、血管を狭くする。ＮＯは、血小板の沈着と平滑筋の増殖を阻害することにより、再狭窄を軽減する。ＮＯは、血小板を阻害することによって血栓症を抑制したり、抗炎症性剤として働くことにより創傷を制限することもできる。
治療部位は、しばしば合成物質または医療器具と接触している管の部位で展開する。例えば、血管形成などの処置後の再狭窄および血管の再収縮を防止するために、ステントをしばしば血管中に挿入する。血栓を形成させる血小板の凝集は、ステントの挿入から生じたであろう合併症である。ＮＯは、抗血小板物質剤であり、それゆえこれらの医療器具の使用に関係する血栓の形成の危険を軽減するために用いることができる。管の部位と接触し、それにより血栓形成の危険を増加させる他の医療器具の例には、静脈および動脈用シースならびにゴアテックス（GORE-TEX）の外科的プロテーゼが含まれる。
治療部位は、管でない部位、例えば炎症性応答を軽減することにより、有効な治療効果が得られうる部位でも展開しうる。例には、気道、胃腸管、膀胱、子宮および海綿体が含まれる。このように、本発明の組成物、方法および器具は、呼吸障害、胃腸障害、泌尿器機能不全、不能症、子宮機能障害および早産を治療するために用いられうる。治療部位でのＮＯ送達により、平滑筋の弛緩も生じ、例えば気管支鏡検査、内視鏡検査、腹腔鏡検査および膀胱鏡検査などの処置における医療器具の挿入を容易にする。ＮＯの送達は、大脳の血管痙攣後の出血を予防したり、膀胱の被刺激性、尿道狭窄および胆管痙縮を治療するためにも用いることができる。
治療部位は、体外で、治療のために体から一時的に取り出された体液、例えば血液を処置するために用いられる医療器具の中にも展開することができる。例には、心肺機能の導管および透析装置の管が含まれる。
個体または動物の治療部位にＮＯを送達する方法には、該治療部位に本発明のポリマーで被覆された医療器具を差し込むことが含まれる。ＮＯは、体液を本発明のポリマーで被覆された医療器具と接触させることにより、体液、例えば血液に送達することができる。好ましいポリマーは、上記で定義したようにＳ−ニトロシル化されたポリマーである。個体または動物の治療部位、該治療部位で行なうのに好適な医療器具および血液などの体液を接触させるのに好適な医療器具の例は、前記段落に記載している。
「治療部位で医療器具を差し込むこと」とは、治療部位との実際の身体の接点に医療器具を持ってくること、あるいは医療器具から放出されたＮＯが治療部位との身体の接点にくるように、治療部位に十分に近接した部分に医療器具を持ってくることをいう。例えば、医療器具による治療のために体液を一時的に体内から取り出すとき、体液は本発明のポリマーで被覆された医療器具と接触し、ポリマー被膜が体液と医療器具との間の界面となる。例には、透析のための、または心肺機による血液の除去が含まれる。
本発明の１つの態様において、医療器具、例えばステントは、本発明のポリマーで被覆される。１つの例では、器具はＳ−ニトロシル化された多糖類、好ましくは環状のＳ−ニトロシル化またはＳ−ニトロ化された多糖類、さらにより好ましくはＳ−ニトロシル化またはＳ−ニトロ化されたシクロデキストリンで被覆されている。ポリチオール化された多糖類を含む溶液と該溶液中に溶解しない医療器具とを組み合わせることにより、混合物が形成される。次に、遊離チオール基をニトロシル化（またはニトロ化）するのに好適な条件下で、該混合物をニトロシル化剤（またはニトロソ化剤（nitrosating agent）と合わせて、Ｓ−ニトロシル化された多糖類を形成させる。水溶液中で、Ｓ−ニトロシル化された多糖類は、該溶液から沈澱し、医療器具を被覆する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性の非プロトン性溶媒中で、医療器具を反応混合物の中に浸し、次いで、減圧下または窒素もしくはアルゴンなどの不活性ガスの気流下で乾燥させ、それにより医療器具を被覆することができる。好適なニトロシル化剤には、酸性化された亜硝酸エステル、Ｓ−ニトロソチオール、有機亜硝酸エステル、塩化ニトロシル、オキサジアゾール、ニトロプルシドおよび他の金属のニトロシル錯体、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩（例えば、ニトロシル硫酸水素塩）などが含まれる。好適なニトロ化剤には、有機硝酸エステル、ニトロニウム塩（例えば、テトラフルオロホウ酸ニトロニウム）などが含まれる。本発明のポリマーは、脆くなく、従って生理的条件下であっても、医療器具に付着して残存する。したがって、これらのポリマーは、長期間患者に差し込まれる器具を被覆するのに特に好適である。
当該技術分野で知られている方法を含めて、装置にポリマーの被膜を塗布する他の方法が、本発明のポリマーで医療器具を被覆するために用いられうることが理解されるべきである。
本発明のもう１つの態様は、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーからのＮＯ基の損失を補う方法である。前記で論議したように、ＮＯは時間を経るにつれてＳ−ニトロシル化された化合物から失われる。さらに、Ｓ−ニトロシル化された化合物を含む医療機具の殺菌は、Ｓ−ニトロシル化された化合物からＮＯを損失させることにもなる。Ｓ−ニトロシル化された化合物からのＮＯの損失は、治療部位にＮＯを送達する化合物の容量を減少させる。ＮＯ基は、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーを、有効量の塩化ニトロシルまたは酸化窒素などのガス状のニトロシル化剤と接触させることにより、補うことができる。
ガス状のニトロシル化剤の「有効量」とは、化合物またはポリマー中の遊離チオール基をニトロシル化する量である。好ましくは、ガス状のニトロシル化剤の十分な量が、ＮＯを有する化合物またはポリマー中の遊離チオール基、すなわちニトロシル化されるチオール基の全てを飽和するのに用いられる。有効量は、約０．８気圧〜約１０気圧の範囲であり、好ましくは約１気圧である。
本発明のもう１つの態様は、個体の治療においてニトロ化またはニトロシル化されたポリマーからのＮＯまたはＮＯ2基の損失を補う方法である。該方法は、前記したように、ＮＯ2またはＮＯ基を有するペンダント状の求核基を再生するのに好適なニトロ化剤またはニトロシル化剤の再生量を個体に投与することを含む。例には、Ｓ−ニトロソチオール、有機亜硝酸エステル、オキサジアゾール、金属のニトロシル錯体、有機硝酸エステル、ペルオキシ亜硝酸塩、ニトロソニウム塩およびテトラフルオロホウ酸ニトロニウムが含まれる。本件出願人は、いかなる特定の機構により限定されることも決して望まないが、いくつかのニトロ化剤またはニトロシル化剤が治療部位でポリマーと接触し、インビボで遊離した求核基をニトロ化またはニトロシル化し、それによりポリマーのＮＯ2またはＮＯ容量が再生するであろうと考えられる。
ニトロ化剤またはニトロシル化剤の「再生量」とは、治療部位での試薬の局所的な濃度を十分に高くし、治療部位に位置したポリマーの遊離したペンダント状の求核基をニトロ化またはニトロシル化する量である。「再生量」は、個体に不適当な望ましくない副作用を生じさせない量でもある。個体に投与される量は、該個体の年齢、体重、性別および普段の健康状態などの因子に依存し、当業者は、そのような因子を考慮したうえで、投与される量を変更することができることが理解されるであろう。例えば、投薬量は、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。化合物は、一度の投与または複数回の投与で、適切な経路により投与することができる。
投与経路の種類は、病気または治療される条件に応じて、非経口（例えば、静脈注射、動脈注射、筋内注射、皮下注射）、経口（例えば、規定食）、鼻腔、除放微小担体または直腸を含みうるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。経口、非経口および静脈投与は、投与の好ましい態様である。投与される化合物の処方は、選択される投与経路（例えば、溶液、エマルジョン、エアゾール、カプセル）によって変わるであろう。投与される化合物を含む好適な組成物は、生理学的に許容されうる賦形剤または担体の中に調製することができる。溶液またはエマルジョンに対して好適な担体には、例えば、食塩水および緩衝培地を含む、水性またはアルコール性／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口の賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸エステル化したリンガー油または不揮発性油が含まれうる。静脈の賦形剤には、各種の添加物、保存剤または流体、栄養素もしくは電解質の補給剤が含まれうる（一般には、レミントンの製薬学（Remington’s Pharmaceutical Science）、第１６版、マック（Mack）編（１９８０年）を見よ）。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、いかなる限定をも意味するものでない。
実施例１
ペル−（６−デオキシ−６−ヨード）−β−ヨードシクロデキストリンの調製
β−シクロデキストリン（２０．０ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、１２３ｍｍｏｌの第一級水酸基）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４００ｍｌ）中でトリフェニルホスフィン（９７．２ｇ、３７１ｍｍｏｌ、第一級水酸基あたり３当量）およびヨウ素片（９３．５ｇ、３７１ｍｍｏｌ、第一級水酸基あたり３当量）を攪拌した溶液に添加した。該混合物を、添加時に温めた。該溶液を油浴中で８０℃で２０時間置き、次いで室温まで冷却し、ＤＭＦ（３５０ｍｌ）を減圧下で除去して、濃縮物を得た。この濃いシロップは元の溶液の容量のおおよそ３分の１であった。氷浴中で冷却したこのシロップに、３ＭのＮａＯＭｅ１６０ｍＬを添加した。そのｐＨは９であった（水滴を用いたｐＨ紙）。添加後、該シロップを室温まで温め、さらに１時間攪拌した。該シロップを次いでＭｅＯＨ（３６００ｍＬ）中に注いで、少量の沈澱物を得た。水（１０００ｍＬ）をゆっくりと該ＭｅＯＨ溶液に添加すると、濃い茶色の溶液中に乳白色の沈澱物が生成した。該沈澱物を濾過により除去し、黄色の固体を得、それをＭｅＯＨ（総量１０００ｍＬ）で数回洗浄して、色をほとんど除去し、黄褐色の固体を得、１２時間よりも長くソックスレー抽出し、高真空下で乾燥させて、わずかに灰色がかった白色の固体１９．８４ｇを得た（５９％）。
実施例２
ペル−（６−デオキシ−６−−チオ）β−チオシクロデキストリンの調製
ペル−（６−デオキシ−６−ヨード）−β−シクロデキストリン（１９．８４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、７２．９ｍｍｏｌの第一級ヨウ化物）をＤＭＦ（２１０ｍＬ）に溶解させ、チオ尿素（６．３ｇ、８２．８ｍｍｏｌ、１．１３当量）を添加した。その溶液を窒素下、７０℃で４８時間攪拌した。ＤＭＦを減圧下で除去して、オレンジ色の油を得、それをＮａＯＨ水溶液（１０００ｍＬ中に５．４ｇ、１３５ｍｍｏｌ）に添加し、攪拌時に白色の沈澱物を得た。該溶液を加熱して１時間おだやかに還流させると、該沈澱物の完全な溶媒和が生じ、次いで冷却すると、沈澱物を生成し、それを濾過により除去し、水で洗浄した（この沈澱物は用いない）。該溶液を１ＭのＫＨＳＯ4で酸性にし、微細な白色の沈殿物を得、それを濾過し、水で洗浄し、次いで一晩風乾させた。該沈殿物を水（７００ｍＬ）中に懸濁させ、次いで１ＭのＮａＯＨ水溶液７０ｍｌを添加して溶媒和させ、次いで１ＭのＫＨＳＯ4水溶液９０ｍｌで再び沈澱させた。該沈澱物を濾過し、一晩風乾し、次いで高真空下で乾燥させて、わずかに灰色がかった白色の固体６．０ｇ（４６％）、融点２８９℃（ｄｅｃ）を得た。
実施例３
酸性亜硝酸塩を用いたペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化
ペル−（６−デオキシ−６−チオ）−β−シクロデキストリン（５００ｍｇ、０．４０１ｍｍｏｌ、２．８１ｍｍｏｌの第一級チオール基）を０．５ＭのＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）に溶解させ、淡黄色の溶液を得た。１ＭのＮａＯＨ2水溶液２．８ｍｌ（２．８ｍｍｏｌ、遊離チオール基１モル当たり１当量）と２ＭのＨＣｌ（１５ｍＬ）の混合物をすばやく添加して、赤煉瓦色の沈澱物を得た。該沈澱物を遠心分離によりペレット化し、酸性の上澄みをシリンジにより除去した。脱イオン水で添加し、該沈澱物を攪拌して十分に分散させた。遠心分離／上澄みの除去工程を（上澄みがｐＨ紙で中世になるまで）６回繰り返し、少量の水中に濃赤色のペレットを得た。
実施例４
ＤＭＦ中での塩化ニトロシルを用いたペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化
ペル−（６−デオキシ−６−チオ）−β−チオシクロデキストリン（５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．２８ｍｍｏｌの第一級チオール基）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。塩化ニトロシルをバブリングし、濃い茶色の溶液を得た。該溶媒を減圧下または窒素、アルゴンなどの不活性ガスの気流下で除去することにより、ポリマー生成物を得ることができる。
実施例５
Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンを用いたペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化
ペル−（６−デオキシ−６−チオ）−β−シクロデキストリン（３２．３ｍｇ、０．０２５９ｍｍｏｌ、０．１８１ｍｍｏｌの第一級チオール基）を１ＭのＮａＯＨ１ｍｌに溶解させた。Ｄ（＋）−Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（５７．０ｍｇ、チオール基あたり１．４当量）を添加して、濃い赤色の沈澱物を得た。該沈澱物を遠心分離によりペレット化し、酸性の上澄みをシリンジにより除去した。脱イオン水を添加し、該沈澱物を攪拌して十分に分散させた。遠心分離／上澄みの除去工程を（上澄みがｐＨ紙で中性になるまで）４回繰り返し、少量の水中に濃赤色のペレットを得た。
実施例６
ジメチルホルムアミド中でのＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンを用いたペル−６−チオ−β−シクロデキストリンのニトロシル化
ペル−（６−デオキシ−６−チオ）−β−シクロデキストリン（１０ｍｇ、０．００８０ｍｍｏｌ、０．０５６ｍｍｏｌの第一級チオール基）をＤＭＦ１ｍｌに溶解させた。Ｄ（＋）−Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（１７．７ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ、チオール基あたり１．４当量）を添加して、緑色の溶液を得た。２時間放置後、該溶液は深赤色に変化した。該溶媒を減圧下または窒素、アルゴンなどの不活性ガスの気流下で除去することにより、ポリマー生成物を得ることができる。
実施例７
酸化窒素の放出をアッセイする方法
化合物に血管が曝されることから生じる血管拡張の程度および持続時間により測定される、血管平滑筋の弛緩を生じさせる化合物の容量は、インビボでＮＯを送達する能力の尺度である。スタムラーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:444（1992年）、オズボーン（Osborne）ら、J. Clin. Invest. 83:465（1989年）ならびに酸化窒素の研究における方法（Methods in Nitric Oxide Research）、フィーリッシュおよびスタムラー編、（ジョンウィリー・アンド・ソンズ（John Wiley & Sons））（1996年）におけるファーチゴット（Furchgott）による章に報告されている方法を血管平滑筋の収縮を測定するために用いた。より低い濃度のＮＯが血管拡張よりも血小板の凝集を阻害するために必要とされるので、平滑筋の収縮の測定は、組成物が十分なＮＯを送達して血小板の凝集を低減させるかどうかのよい指標を提供する。
体重が３〜４ｋｇのニュージーランドホワイト雌ウサギをペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。下行性の胸大動脈を単離し、その管を付着した組織を除去してきれいにし、管腔の中に差し込んだ、コットンが先についたアプリケーターでやさしくこすり落とすことにより、内皮を除去した。その管を５ｍｍの環に切断し、器官浴２０ｍｌ中のあぶみに据えつけた。該環を、３７℃の酸素化したクレブズの（Kreb’s）緩衝液（ｐＨ７．５）７ｍｌに１ｇの静止圧下で懸垂させ、１時間平衡化させた。等長性の収縮を変換器（ＴＯ３Ｃ型、ガラスインストルメント、Quincy、ＭＡ）に接続した７型のオシログラフ記録器で測定した。新しいクレブズ溶液を平衡期間中および各試験応答の後で定期的に該浴に添加した。試験化合物の添加の前に７μＭノルエピネフリンを用いて、持続した収縮を誘発した。
実施例８
ポリマーで被覆したステントによる酸化窒素の送達
持続的な血管拡張を生じさせるＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリン（「遊離ポリマー」という）の能力を、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンにより被覆されたステントのＮＯ放出活性と比較した。Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンを実施例３に記載の方法により得た。実施例３に記載の方法に従って調製した反応混合物中にステントを懸濁させ、それにより、該ステントに沈澱したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンを被覆させることにより、ポリマーで被覆したステントを得た。あるいは、実施例４の方法により調製した反応混合物中にステントを浸漬することにより、ポリマーで被覆したステントを得た。いずれの場合においても、ポリマーで被覆したステントを次いで減圧下または窒素気流下で乾燥させた。ポリマーで被覆したステントおよび遊離ポリマーによるＮＯの送達を実施例７に記載の方法に従ってアッセイした。
ポリマーで被覆したステントは持続的な血管拡張を１時間以上生じさせた。該ステントを除去すると、すぐに正常な状態に回復し、持続的なＮＯ放出を示した。
ポリマーで被覆した新しいステントを器官室に添加した。次に、ステントを該器官室から除去し、第２の器官室へ移した。同様の程度の平滑筋の弛緩が各器官室に生じることが観察された。それはＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンからの持続的なＮＯの放出を示している。
実施例９
Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンを用いてペル−６−チオ−β−シクロデキストリンをニトロシル化することにより調製されたポリマーの安定性
実施例５に記載された方法により調製されたＳ−ニトロシル化されたポリマーを金属の土台上に置き、減圧下または窒素気流下で乾燥させて、茶色の固体を得た。この固体は、約５４０〜約６００ナノメーターの可視範囲で約１５の吸光度を有していた。１．０ｍＭの範囲のＮＯの濃度は、この領域の可視スペクトルで約０．１５の吸光度を与えるのに十分である。
次に、該ポリマーを保管し、３週間光から保護した。約５４０〜６００ナノメーターの領域での吸光度は、本質的には変化せず、ポリマーによるＳ−ＮＯの保持を示していた。加えて、実施例７で記載したアッセイにより測定したように、血管拡張を生じさせる化合物の能力もまた、３週間の期間を越えても本質的に変化せず残存していた。
実施例１０
Ｓ−ニトロシル化されたポリマーの中へのＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンの取り込みが酸化窒素の送達容量と該ポリマーの半減期を増加させる
Ｓ−ニトロソ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリン（実施例３の方法に従って調製）およびＳ−ニトロソ−ペニシラミンと錯体を形成したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリン（実施例５の方法に従って調製）を、実施例７に記載された方法により血管拡張を生じさせる能力についてアッセイした。加えて、生理学的溶液中のこれらの組成物に関する半減期を測定した。半減期とは、組成物が結合したＮＯの半分を失うのに必要とされる時間である。組成物中のＮＯの量は実施例１３に記載したように、サビル（Saville）の方法により測定する。
Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンと錯体を形成したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンは、Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンよりも、生理学的溶液中で数次数多いＮＯを送達することが発見された。加えて、Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンは、約１時間しかＮＯを送達できず、一方、Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンと錯体を形成したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンは、４０時間より長い半減期を有していた。この結果は、ポリマーマトリックスへのＳ−ニトロソ−ペニシラミンの取り込みが、Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンの−Ｓ−ＮＯ基を安定化させることを示している。
Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンのポリマーマトリックスへのＳ−ニトロソ−ペニシラミンの取り込みは、酸化窒素が放出されうる期間を延長させた。Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンの半減期が約１８時間より長く、一方、Ｓ−ニトロソ−ペニシラミンと錯体を形成したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンの半減期は約４０時間よりも長かった。この結果は、ポリマーマトリックス中に取り込まれるＮＯ供与体の種類に基づいて、Ｓ−ニトロシル化されたポリマーがＮＯを放出しうる期間を延長することができることを示している。この結果はまた、ＮＯ供与体がＮＯ活性を有するポリマーに「機能を与え」、それゆえにポリマーの寿命を延長するのに役立つことも示唆している。
実施例１１
抗血小板物質の効果を測定するためのアッセイ
３．４ｍＭのクエン酸ナトリウムで血液凝固が阻止された静脈血を、少なくとも１０日間アセチルサリチル酸または他のいかなる血小板に活性のある薬剤をも消費していないボランティアから得た。１５０ｘｇで１０分間２５℃で遠心分離することにより、多血小板血漿を調製した。血小板の数は、コールターカウンター（ＺＭ型）で測定した。
血小板の一部０．３ｍｌを３７℃でインキュベートし、ＰＡＰ−４血小板凝集計（バイオデータ（Biodata）、ハツボロ（Hatsboro）、ＰＡ）中で１０００ｒｐｍで攪拌する標準的な比濁分析の技術により多血小板血漿の凝集をモニターした。
実施例３に記載の方法に従って調製したＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンを、多血小板血漿４００μＬ中１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの濃度で３分間インキュベートした。１０μＭのＡＤＰ１００μＬを添加することにより凝集を誘導した。対照実験はポリマーの非存在下で行なった。凝集を光の透過率の変化の最大比率と大きさを測定することにより定量し、対照実験の凝集と比較した標準値として表した。
ＡＤＰで誘導された血小板の凝集の投与量に依存する阻害を、Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリン１μＭ〜１００μＭの範囲にわたって観察した。最も低い濃度であっても、血小板凝集の阻害が観察された。
実施例１２
Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンで被覆されたステントによるイヌにおける血小板沈着の阻害
血小板は、血管形成後の後期再狭窄のみならず、急性閉鎖の発現にも中心的な役割を果たす。血小板の糖蛋白IIB／IIIAの強力な阻害剤は、全身に与えられたとき、高い危険性を有する血管形成後３０日および６ヶ月の臨床的な事件を減少させるのに効果的であることが示されてきた。しかしながら、これを行うと、より高い割合で出血を伴う合併症が生じた。強力な糖蛋白IIB／IIIAの阻害剤を局所的に送達することにより、血小板阻害の利益が全身的な血小板阻害の危険なく達成されるかもしれない。この研究の目的は、シクロデキストリン−酸化窒素の局所的な血小板阻害の効果を測定することである。
方法
７匹の雑種犬を研究した。血管造影による診断後、ステントをＬＡＤおよびＬＣＸの動脈内に差し込んだ。最初の３匹の動物は普通の８ｍｍの波形の金属環ステントを与え、残りの４匹にはＳＮＯ−シクロデキストリンで被覆されたステントを与えた。冠動脈の大きさをオンラインのＱＣＡ測定を利用して測定し、ステント：動脈が１．２〜１３：１の割合となる大きさに適正にステントを作製した。ステントの差し込みの前に、自己の血小板をインジウム１１１オキシムで標識し、再び注入して、１時間再循環させた。割り当てたステントを、次いで１０〜１４ＡＴＭで展開し、定量的な冠動脈の血管造影を繰り返した。血小板をさらに２４時間循環させた後、血小板沈着の分析の研究を終了した。
結果
その差は統計的にわずか、すなわち５．１９±５．７８対４．０３±５．３３血小板×１０8／ｃｍ2ｐ＝０．５８２７であったが、普通の金属ステントでの血小板沈着は、ＮＯ被覆されたステントよりも多かった。しかしながら、６個の金属対照物のうちの４個では、あらゆるＮＯ被覆されたステントよりも多く血小板が沈着していた。金属対照物の平均値は、２つのかなり低い値に影響を受けていた。これらのデータは、６個のＮＯ被覆なしの金属ステントのうちの４個で見られたような基準を超える血小板沈着を薬剤が防止することを示唆している。各対照ステントおよび各被覆ステントにおける１平方センチメートル当たりの血小板の数を図１に示す。
実施例１３
Ｓ−ニトロシル化された多糖類におけるＳ−ニトロシル化の量の測定
炭水化物濃度の測定
存在する炭水化物の量を次のドゥボイス（Dubois）ら、Anal. Chem. 28:350（1956年）に開示された方法より測定する。１０〜７０γの炭水化物を含有する炭水化物溶液２ｍｌを比色分析の試験管にピペットで移し、８０％フェノール０．０５ｍｌを添加する。次に、濃硫酸５ｍｌをすみやかに添加する。酸は、十分な混合を得るために、試験管の側面よりもむしろ、液体表面に向かって流し込む。試験管を１０分間放置し、次いで、振り動かして、記録を取る前に２５℃〜３０℃の水浴に１０〜２０分間置く。色は数時間安定であり、記録は必要なら後でとってもよい。特有の黄−オレンジ色の吸光度は、ヘキソースの４９０ｍμとペントースおよびウロン酸による４８０ｍμで測定される。糖溶液の代わりに蒸留水を用いることにより、ブランクを調製する。次いで、糖の量を、予め検査して、特定の糖で作成した標準曲線を参照して測定してもよい。
セルロースの繊維片の偶発的な混入から生じる誤差を最小限にするため、すべての溶液を全く同じに３個調製する。
Ｒ−Ｓ−ＮＯ濃度の測定
試料中のＲ−Ｓ−ＮＯ基の濃度は、サヴィル（Saville）、アナリスト（Analyst）83:620（1958年）に報告された方法に基づいている。この方法により、Ｒ−Ｓ−ＮＯ基をアゾ染料に転換する。この染料の濃度は、５４０ｎｍでの吸光度（ε〜５００００Ｍ-1ｃｍ-1）を測定することにより決定する。方法を以下に示す：
試薬
溶液Ａ：０．５ＭのＨＣｌ中に１％溶解したスルファニルアミド。
溶液Ｂ：０．２％のＨｇＣｌ2を用いたＡと同じ溶液
溶液Ｃ：０．５ＭのＨＣｌ中に溶解したＮ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンジヒドロクロリドの０．０２％溶液。
方法
アッセイする試料の所定量（５０μｌ−１ｍ）を等量の溶液Ａと溶液Ｂに添加する。この２つの試料を５分間かたわらに置いて、ジアゾニウム塩を形成させ、その後等量の溶液Ｃを各混合物に添加する。アゾ染料の生成を示す色の形成は、通常５分間で完了する。次に、試料の吸光度を５４０ｎｍで吸光分光分析的に記録する。ＲＳＮＯを溶液ＢとＡの間の吸光度の差（すなわち、Ｂ−Ａ）として定量する。バックグラウンドの亜硝酸塩の濃度が高い（すなわち、Ａにおけるバックグラウンドを増加させる）時には、スルファニルアミドの添加の５分前に、酸（４５ｍＭ）中の０．５％スルファミン酸アンモニウムを等量添加することにより、測定の精密度を増加させることができる。溶液中の亜硝酸は、すぐに過剰のスルファミン酸アンモニウムと反応して、窒素ガスと硫酸塩を形成する。
亜硝酸塩もミクロモルの濃度で存在しているなら、試料中の５００μＭより高いチオールの濃度はアッセイを妨げるかもしれない。なぜなら、亜硝酸塩は、採用された酸性条件下で無差別にニトロソ化し（nitrosate）、それらの濃度がミリモルの範囲に達すると、チオールはスルファニルアミド（このアッセイでは５０ｍＭ存在）との反応と効果的に競争するであろう。これは、ＲＳＮＯの人為的な検出に導くであろう。（１）チオールのスルファニルアミドあたりの割合を０．０１未満に維持する、（２）最初に溶液中のチオールをアルキル化する、または（３）ありうる人為産物について補正するために、基準試料に遊離チオールを添加することにより、この問題を避けることができる。
Ｓ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンを、１ｍＭのペルチオール化された（perthiolated）β−シクロデキストリンと、１）１当量（１Ｘ）；２）２当量（２Ｘ）；３当量（３Ｘ）；６当量（６Ｘ）；および１０当量（１０Ｘ）の酸性亜硝酸塩を用いて、実施例３に記載されたように調製した。次いでそれぞれの得られた炭水化物ポリマーの炭水化物濃度および−Ｓ−ＮＯ濃度を、前記のようにして測定した。結果を図２に示す。６倍過剰の酸性化された亜硝酸塩では、シクロデキストリン１モルあたり約３個の−Ｓ−ＮＯ基、または４７０分子量あたり約１個の−Ｓ−ＮＯ基となる。３および１０当量の酸性化された亜硝酸塩を使用することにより、シクロデキストリンあたり約２〜２．５個の−Ｓ−ＮＯ基を有する生成物を得る。
実施例１４
Ｏ−およびＳ−ニトロシル化されたβ−シクロデキストリンの調製
ペンダント状の−Ｏ−ＮＯおよび−Ｓ−ＮＯ基を有するβ−シクロデキストリンを、５０および１００当量の酸性亜硝酸塩を用いた以外は実施例３に記載の方法に従って調製した。
−Ｏ−ＮＯ基の形成は、紫外／可視スペクトルの３２０〜３６０ｎｍの範囲での吸光度の増加を伴う。なぜなら、−Ｓ−ＮＯ基もまた、紫外／可視スペクトルのこの領域において吸収し、Ｏ−ニトロシル化の確認は、３２０〜３６０ｎｍ領域での吸光度の増加が−Ｓ−ＮＯ濃度におけるさらなる増加を伴わないという観測により得られる。−Ｓ−ＮＯの濃度は実施例１３に記載されているサヴィルの方法により測定する。ポリマー中の−Ｏ−ＮＯの存在量は３２０〜３６０ｎｍ領域での吸光度の強度および媒体からのＮＯの損失により測定することができる。分子量あたりの−Ｏ−ＮＯの量は、前記実施例１３に記載されているように、最初に炭水化物濃度を測定することにより算出することができる。
図３は前記のように、５０倍過剰の酸性亜硝酸塩の存在下でのβ−シクロデキストリンの紫外／可視スペクトルを示す。見られるように、３４０〜３５０ｎｍ領域での吸光度は時間とともに増加し、約４５分後最大に達する。−Ｏ−ＮＯおよび−Ｓ−ＮＯ基を合わせた濃度は、５０倍過剰の酸性亜硝酸塩を用いたときにはシクロデキストリンあたり約１０個のＮＯ基が、または１４０ａｍｕあたり約１個のＮＯ基が測定された。−Ｏ−ＮＯおよび−Ｓ−ＮＯ基を合わせた濃度は、酸性化された１００倍過剰の亜硝酸塩を用いたときにはシクロデキストリンあたり約２１個のＮＯ基が、または６７ａｍｕあたり約１個のＮＯ基が測定された。
均等物
当業者は、本明細書に記載された発明の特定の態様に対して多くの均等物を、日常的な経験を用いるだけで認識し、あるいは確認することができるであろう。これらおよび他のすべての均等物は、以下の請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１】
0004312263.tif 000004
【図２】
0004312263.tif 000005
【図３】
0004312263.tif 000006