(57)【要約】      （修正有）【課題】血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い免疫透析濾過装置を提供する。【解決手段】免疫透析濾過装置の精密ろ過膜２のマトリックスに少なくとも１つの検出エリアを含み、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、前記ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、前記血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、前記ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである。【選択図】図１
0003222251.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、
（２）血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインを精密ろ過膜上のレンズマメレクチンと結合させるステップと、
（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、発色基質を加え、検出結果を得るステップと、
を含む、ことを特徴とする血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法。
【請求項２】
ステップ（１）におけるα−フェトプロテイン抗原は原核発現ヒトα−フェトプロテイン抗原である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（３）における酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（３）における酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、
（２）１０〜１５μＬの血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインと精密ろ過膜上のレンズマメレクチンとを結合させた後、ブロッキング液で洗浄し、非特異的結合物を除去するステップと、
（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、３〜５ｓインキュベートした後、ブロッキング液で洗浄し、非特異的結合物を除去し、発色基質発色液を添加するステップと、
を含み、
陽性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原およびフコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは青色を示し、陰性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原の検出エリアは青色を示し、フコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは発色しない、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置であって、前記免疫透析濾過装置の精密ろ過膜のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアを含み、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、前記ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、前記血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、前記ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである、ことを特徴とする免疫透析濾過装置。
【請求項７】
前記検出サブエリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項８】
前記精密ろ過膜のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよび前記ネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有する、ことを特徴とする請求項６又は７に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項９】
前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである、ことを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項１０】
前記免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含む、ことを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項１１】
前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である、ことを特徴とする請求項１０に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項１２】
前記免疫透析濾過装置は、洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む、ことを特徴とする請求項６〜１１のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項１３】
請求項６〜１２のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置の、非診断および／または非治療目的の血清フコースタンパク質の検出における使用。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案はタンパク質検出の技術分野に関し、特に、血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法および免疫透析濾過装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性肝癌および肝炎、肝硬変等の良性肝臓疾患が発生したα−フェトプロテイン（ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）は、その糖鎖構造に大きな違いが存在し、すなわち、良性肝臓疾患と比べ、肝癌が発生したＡＦＰは、そのフコースの指数が非常に高い。フコースは、レンズマメレクチンと結合する特性を有する。ＡＦＰは、その（フコシル）のレンズマメレクチンに対する親和力に応じて、ＡＦＰ−Ｌ１、ＡＦＰ−Ｌ２、およびＡＦＰ−Ｌ３に分けることができる。そのうち、ＡＦＰ−Ｌ１は主に良性肝臓疾患に由来し、ＡＦＰ−Ｌ２は主に妊婦に由来し、ＡＦＰ−Ｌ３はα−フェトプロテインのフコースのグルコシル化形式であり、主に肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）に由来する。２００５年、ＦＤＡは、ＡＦＰ−Ｌ３を原発性肝癌のマーカーの１つとすることを正式に承認した。ＡＦＰ−Ｌ３は、肝癌の早期診断、鑑別診断、治療効果評価、および予後判定と監視等の面でいずれも高い特異性および敏感性を有する。
【０００３】
フコースはメチル化六炭糖であり、組織および血清等の複数種の糖タンパク質の糖鎖に存在し、タンパク結合フコース（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ、Ｐ−ｂｆ）と呼ばれている。ＡＦＰ炭水化物鎖にフコース残基が存在し、このような異質体はフコシル化ＡＦＰ（ＦｕｃＡＦＰ）と呼ばれ、重要な理論的意義と臨床応用意義を有し、肝癌診断および予後応用において、１つの重要な指標とすることができる。
【０００４】
従来の血清フコースタンパク質の分離方法は、交差親和免疫電気泳動技術、アフィニティーブロッティング、アフィニティークロマトグラフィー、「２部位サンドイッチ」酵素結合免疫吸着法、ＬｉＢＡＳｙｓ測定装置、μＴＡＳＷａｋｏ（登録商標）ｉ３０検出システム技術、および熱景生物（社名）のグリコシル捕獲遠心カラム前処理技術を含む。そのうち、フィトヘムアグルチニン親和免疫電気泳動技術およびμＴＡＳＷａｋｏ（登録商標）ｉ３０検出システム技術は、要求が高く、操作が煩雑で、試薬が高価であるため、その普及と応用が制限されている。グリコシル捕獲遠心カラムは、試料処理および検出が別々に行われるため、操作の煩雑さが増える。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】
現在のフコースタンパク質分離方法に存在する問題に対し、本考案の目的は、血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法および免疫透析濾過装置を提供することであり、前記方法および免疫透析濾過装置は、生物試料におけるフコシル化α−フェトプロテインの検出に特に適用し、且つ、各種のフコシル化タンパク質に対して汎用性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的を達成するために、本考案は以下の技術案を採用する。
【０００７】
第１の態様において、本考案は、
（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、
（２）血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインを精密ろ過膜上のレンズマメレクチンと結合させるステップと、
（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、発色基質を加え、検出結果を得るステップと、
を含む血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法を提供する。
【０００８】
本考案は、精密ろ過膜を使用し、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、その検出過程は３〜５ｍｉｎのみで完成できる。タンパク質チップを採用するものと比べ、本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い等の利点を有する。
【０００９】
本考案の免疫透析濾過方法は、捕獲されたタンパク質をニトロセルロース膜に固定し、負の電荷を帯びている抗体とニトロセルロース膜とが疎水作用を起こして高親和力で結合する。且つ、ＨＲＰおよび発色基質を用いて反応して青っぽい茶色の安定した生成物を生成することにより、該生成物は長時間安定して存在することができ、時間の経過に従って徐々に弱くなったり消えたりすることがなく、観察結果は時間帯によって誤差を生じることがなく、結果の安定性が良い。更に、本考案の免疫透析濾過方法は、結果のスキャン分析を行う機器が不要で、５ｍｉｎ内に目視で結果を観察して判断することができる。また、本考案の免疫透析濾過方法は室温のみで完成でき、保温箱が不要である。
【００１０】
本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、生物試料中のフコシル化α−フェトプロテインの検出に適用し、且つ、各種のフコシル化タンパク質に対して汎用性を有する。
【００１１】
本考案におけるフコシル化α−フェトプロテインとは、α−フェトプロテイン炭水化物鎖にフコース残基が存在する異質体を指す。
【００１２】
本考案によれば、ステップ（１）におけるα−フェトプロテイン抗原は原核発現ヒトα−フェトプロテイン抗原であり、真核発現α−フェトプロテイン抗原を選択してもよく、ここでは特に限定しない。
【００１３】
本考案によれば、ステップ（３）における酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である。
【００１４】
本考案によれば、ステップ（３）における酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であってもよく、酵素の基質発色の実現に用いられる。
【００１５】
本考案によれば、前記血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法は、
（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、
（２）１０〜１５μＬの血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインと精密ろ過膜上のレンズマメレクチンとを結合させた後、ブロッキング液で洗浄し、非特異的結合物を除去するステップと、
（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、３〜５ｓインキュベートした後、ブロッキング液で洗浄し、非特異的結合物を除去し、発色基質発色液を添加するステップと、
を含むことができ、
陽性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原およびフコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは青色を示し、陰性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原の検出エリアは青色を示し、フコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは発色しない。ネガティブコントロールは陽性血清であっても陰性血清であっても発色しない。
【００１６】
例示的に、前記免疫透析濾過方法は、具体的に以下のステップを含むことができる。
【００１７】
試料の検出：
検出待ちの血清試料を希釈してから精密ろ過膜を含む検出エリアに滴下し、インキュベートした後、ＰＢＳＴで検出エリアを洗浄し、非特異的結合物を除去し、ＰＢＳにより希釈したＨＲＰで標識したＡＦＰ抗体を添加し、インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、非特異的結合物を除去し、ＨＲＰ基質発色液を添加し、目視で結果を観察する。
【００１８】
本考案によれば、前記インキュベートとは、室温で３〜５ｓインキュベートすることを意味し、例えば、３ｓ、３．５ｓ、４ｓ、４．５ｓまたは５ｓインキュベートする。
【００１９】
本考案によれば、前記血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法は、以下のような免疫透析濾過装置内で行うことができるが、これらに限定されない。
【００２０】
血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置は精密ろ過膜を含み、精密ろ過膜のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアが設けられ、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである。検出サブエリアおよび対照エリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含み、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ等であってもよい。
【００２１】
本考案における免疫透析濾過装置は、強靭なプラスチック製品、紙の吸水材、およびニトロセルロース膜で構成され、衝撃や衝突に耐えることができ、壊れにくい。
【００２２】
本考案において、前記精密ろ過膜のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよびネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有し、前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである。
【００２３】
本考案の免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含み、前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体であり、前記免疫透析濾過装置は、洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む。
【００２４】
本考案は、精密ろ過膜を有する免疫透析濾過装置を採用することが好ましく、タンパク質チップと比べ、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い等の利点を有し、検出過程を３〜５ｍｉｎにコントロールすることができる。
【００２５】
第２の態様において、本考案は、免疫透析濾過装置の精密ろ過膜のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアを含み、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置を更に提供する。
【００２６】
本考案によれば、前記検出サブエリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含み、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ等であってもよい。
【００２７】
本考案によれば、前記精密ろ過膜のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよびネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有する。
【００２８】
本考案によれば、前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである。
【００２９】
本考案によれば、前記免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含む。
【００３０】
本考案によれば、前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である。
【００３１】
本考案によれば、前記免疫透析濾過装置は洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む。
【００３２】
本考案は、免疫透析濾過装置の、非診断および／または非治療目的の血清フコースタンパク質の検出における使用を更に提供する。
【考案の効果】
【００３３】
従来の技術案と比べ、本考案は少なくとも以下の有益な効果を有する。
【００３４】
（１）本考案は、精密ろ過膜を使用することにより、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、血清フコースタンパク質を正確に検出することができ、検出時間が短く、安定性が良く、コストが低い等の利点を有する。
【００３５】
（２）本考案に係る検出方法および免疫透析濾過装置は、必要な原材料および機器設備のコストが全て大幅に減少し、免疫透析濾過の装置は紙およびプラスチック製品であり、コストが非常に低く、約１元人民元であり、実験フローにおける準備、インキュベート、結果のスキャンを行うための機器設備が不要であり、検出コストおよび費用を大幅に低減する。
【００３６】
（３）本考案の免疫透析濾過方法は時間の面で他の方法と比べ、ＥＬＩＳＡ検出は少なくとも３ｈが必要で、タンパク質チップ検出は１．５ｈが必要であるが、本考案は３〜５ｍｉｎのみが必要であり、検出時間は大きく短縮される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本考案の免疫透析濾過装置の模式図であり、１は蓋で、２は精密ろ過膜で、３は紙の吸水材で、４はプラスチック基板である。
【図２】本考案の免疫透析濾過方法の結果模式図であり、１〜３は陽性結果で、ＮＣ膜の上方のポジティブコントロール検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、真ん中のレンズマメレクチン検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、下方のＢＳＡ対照斑は発色しない。４〜５は陰性結果で、ＮＣ膜の上方のポジティブコントロール検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、真ん中のレンズマメレクチン検出斑および下方のＢＳＡ対照斑は発色しない。
【図３】免疫透析濾過ニトロセルロース膜を調製する模式図であり、ポジティブコントロール検出サブエリアにＡＦＰが固定され、真ん中の検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにＢＳＡが固定される。
【００３８】
以下、本考案について更に詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本考案の簡単な例に過ぎず、本考案の実用新案登録請求の範囲を代表または制限するものではなく、本考案の保護範囲は実用新案登録請求の範囲を基準にする。
【考案を実施するための形態】
【００３９】
以下、図面を参照しながら具体的な実施形態により、本考案の技術案について更に説明する。
【００４０】
図１に示すように、本考案における免疫透析濾過装置の構造模式図であり、該免疫透析濾過装置は精密ろ過膜を有し、蓋１、精密ろ過膜２、紙の吸水材３、およびプラスチック基板４が上から下へ順に構成される。組み立ての場合、精密ろ過膜を事前に直径が約１．５ｃｍの円形に裁断し、紙の吸水材３をプラスチック基板４内に置き、紙の吸水材の上面の中央に予め裁断された精密ろ過膜２を置いた後、蓋１を被せる。
【００４１】
本考案に使用される精密ろ過膜はニトロセルロース膜であってもよく、本考案では、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ３０３Ｂを使用する。紙の吸水材は吸水紙であってもよく、蓋および基板は全てプラスチック製品を使用する。
【００４２】
図２に示すように、本考案の免疫透析濾過方法を採用する結果模式図であり、陽性血清の場合（図２における１〜３）、ポジティブコントロールおよびフコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは全て青色を示し、陰性血清の場合（図２における４〜６）であれば、フコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは発色せず、ポジティブコントロールは青色を示す。陽性血清であっても陰性血清であっても、ネガティブコントロールは全て発色しない。
【００４３】
図３は免疫透析濾過ニトロセルロース膜を調製する模式図であり、ポジティブコントロール検出サブエリアにＡＦＰが固定され、真ん中の検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにＢＳＡが固定される。
【００４４】
本考案をより良好に説明し、本考案の技術案を理解しやすいために、本考案の典型的かつ非限定的な実施例は以下のとおりである。
【００４５】
実施例１  免疫透析濾過装置の調製および使用フロー
実験に使用する試薬および機器：原核発現ＡＦＰ（米国ａｂｃａｍ社）、レンズマメレクチン（Ｓｉｇｍａ社）、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来抗体（米国ａｂｃａｍ社）、ＨＲＰ発色基質液（米国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）。
【００４６】
ＰＢＳ処方：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）８ｇ、塩化カリウム（ＫＣｌ）０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０．２４ｇであり、ｐＨを７．４に調整し、１Ｌに定容した。
【００４７】
ＰＢＳＴ処方：ＰＢＳ、１Ｌ＋Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＬ。
【００４８】
ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、各免疫透析濾過装置に１つの検出エリアを含み、それぞれの検出エリアで１つの血清を検出することができ、ＡＦＰＬ３マーカーを一度に検出した。
【００４９】
各検出エリアにおいて、それぞれ０．５ｐＬのネズミ由来の原核発現ヒトＡＦＰ（米国ａｂｃａｍ社）とレンズマメレクチン（Ｓｉｇｍａ社）とをニトロセルロース膜に順にスポットし、スポッティング濃度はＡＦＰが０．５ｍｇ／ｍＬであり、レンズマメレクチンが４ｍｇ／ｍＬである。０．５μＬの１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照斑にスポッティングしてネガティブコントロールとした。
【００５０】
免疫透析濾過の操作フロー：
調製された免疫透析濾過装置を使用し、健康対照グループおよび肝癌実験グループの動的血清検体におけるＡＦＰＬ３腫瘍マーカーを検出した。
【００５１】
室温条件で、１０μＬの血清試料を免疫透析濾過装置の膜片に滴下し、レンズマメレクチンとフコースの結合の特性を利用し、レンズマメレクチンを血清中のフコースと結合させてレンズマメレクチン抗原複合物を形成した。３秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５２】
１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、３回繰り返した。また、ＰＢＳにより希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来一次抗体を添加し、ウサギ由来抗体は血清中のＡＦＰ抗原と結合し、レンズマメレクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。ウサギ由来抗体は同時に固定膜上のポジティブコントロールＡＦＰと結合し、ＡＦＰ−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。３秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５３】
１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、３回繰り返し、ＨＲＰ発色基質を添加し、１分間遮光し、１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄した。陽性血清の検出斑は青色を呈した。
【００５４】
実施例２
調製された免疫透析濾過装置を使用し、健康対照グループおよび肝癌実験グループの動的血清検体におけるＡＦＰＬ３腫瘍マーカーを検出した。
【００５５】
室温条件で、２．５μＬの血清試料を４倍希釈した後、免疫透析濾過装置の膜に滴下し、レンズマメレクチンとフコースの結合の特性を利用し、レンズマメレクチンを血清中のフコースと結合させてレンズマメレクチン抗原複合物を形成した。５秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５６】
１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、５回繰り返した。また、ＰＢＳにより希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来一次抗体を添加し、ウサギ由来抗体は血清中のＡＦＰ抗原と結合し、レンズマメレクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。ウサギ由来抗体は同時に固定膜上のポジティブコントロールＡＦＰと結合し、ＡＦＰ−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。５秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５７】
１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、５回繰り返し、ＨＲＰ発色基質を添加し、１分間遮光し、１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄した。陽性血清の検出斑は青色を呈した。
【００５８】
以上から分かるように、本考案は、精密ろ過膜を使用し、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、その検出過程は３〜５ｍｉｎのみで完成でき、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い等の利点を有する。
【００５９】
本考案は、上記実施例によって本考案の詳細な構造的特徴を説明したが、本考案は上記詳細な構造的特徴に限定されるものではなく、すなわち、本考案は上記詳細な構造的特徴に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本考案に対するいかなる改良、本考案に使用される部材に対する等価的な置換および補助部材の追加、具体的な方式の選択等は、全て本考案の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
【００６０】
以上、本考案の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本考案は上記実施形態における具体的な内容に限定されるものではなく、本考案の技術的思想の範囲内で、本考案の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本出願の実用新案登録請求の範囲に属している。
【００６１】
なお、上記具体的な実施形態に説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾なき限り、いかなる適切な形態で組み合わせることができ、必要がない重複を回避するために、本出願では様々な可能な組み合わせの形態については特に説明しない。
【００６２】
また、本出願の各種の異なる実施形態の間も任意に組み合わせることができ、本出願の思想に違反しない限り、同様に本出願の開示内容と見なすべきである。
【図１】
0003222251.tif 000003
【図２】
0003222251.tif 000004
【図３】
0003222251.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月23日(2019.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本考案はタンパク質検出の技術分野に関し、特に、血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置に関する。
【背景技術】
【０００２】原発性肝癌および肝炎、肝硬変等の良性肝臓疾患が発生したα−フェトプロテイン（ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）は、その糖鎖構造に大きな違いが存在し、すなわち、良性肝臓疾患と比べ、肝癌が発生したＡＦＰは、そのフコースの指数が非常に高い。フコースは、レンズマメレクチンと結合する特性を有する。ＡＦＰは、その（フコシル）のレンズマメレクチンに対する親和力に応じて、ＡＦＰ−Ｌ１、ＡＦＰ−Ｌ２、およびＡＦＰ−Ｌ３に分けることができる。そのうち、ＡＦＰ−Ｌ１は主に良性肝臓疾患に由来し、ＡＦＰ−Ｌ２は主に妊婦に由来し、ＡＦＰ−Ｌ３はα−フェトプロテインのフコースのグルコシル化形式であり、主に肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）に由来する。２００５年、ＦＤＡは、ＡＦＰ−Ｌ３を原発性肝癌のマーカーの１つとすることを正式に承認した。ＡＦＰ−Ｌ３は、肝癌の早期診断、鑑別診断、治療効果評価、および予後判定と監視等の面でいずれも高い特異性および敏感性を有する。【０００３】フコースはメチル化六炭糖であり、組織および血清等の複数種の糖タンパク質の糖鎖に存在し、タンパク結合フコース（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ、Ｐ−ｂｆ）と呼ばれている。ＡＦＰ炭水化物鎖にフコース残基が存在し、このような異質体はフコシル化ＡＦＰ（ＦｕｃＡＦＰ）と呼ばれ、重要な理論的意義と臨床応用意義を有し、肝癌診断および予後応用において、１つの重要な指標とすることができる。【０００４】従来の血清フコースタンパク質の分離方法は、交差親和免疫電気泳動技術、アフィニティーブロッティング、アフィニティークロマトグラフィー、「２部位サンドイッチ」酵素結合免疫吸着法、ＬｉＢＡＳｙｓ測定装置、μＴＡＳＷａｋｏ（登録商標）ｉ３０検出システム技術、および熱景生物（社名）のグリコシル捕獲遠心カラム前処理技術を含む。そのうち、フィトヘムアグルチニン親和免疫電気泳動技術およびμＴＡＳＷａｋｏ（登録商標）ｉ３０検出システム技術は、要求が高く、操作が煩雑で、試薬が高価であるため、その普及と応用が制限されている。グリコシル捕獲遠心カラムは、試料処理および検出が別々に行われるため、操作の煩雑さが増える。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】現在のフコースタンパク質分離方法に存在する問題に対し、本考案の目的は、血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置を提供することであり、前記免疫透析濾過装置は、生物試料におけるフコシル化α−フェトプロテインの検出に特に適用し、且つ、各種のフコシル化タンパク質に対して汎用性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】この目的を達成するために、本考案は以下の技術案を採用する。【０００７】第１の態様において、本考案は、（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、（２）血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインを精密ろ過膜上のレンズマメレクチンと結合させるステップと、（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、発色基質を加え、検出結果を得るステップと、を含む血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法を提供する。【０００８】本考案は、精密ろ過膜を使用し、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、その検出過程は３〜５ｍｉｎのみで完成できる。タンパク質チップを採用するものと比べ、本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い等の利点を有する。【０００９】本考案の免疫透析濾過方法は、捕獲されたタンパク質をニトロセルロース膜に固定し、負の電荷を帯びている抗体とニトロセルロース膜とが疎水作用を起こして高親和力で結合する。且つ、ＨＲＰおよび発色基質を用いて反応して青っぽい茶色の安定した生成物を生成することにより、該生成物は長時間安定して存在することができ、時間の経過に従って徐々に弱くなったり消えたりすることがなく、観察結果は時間帯によって誤差を生じることがなく、結果の安定性が良い。更に、本考案の免疫透析濾過方法は、結果のスキャン分析を行う機器が不要で、５ｍｉｎ内に目視で結果を観察して判断することができる。また、本考案の免疫透析濾過方法は室温のみで完成でき、保温箱が不要である。【００１０】本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、生物試料中のフコシル化α−フェトプロテインの検出に適用し、且つ、各種のフコシル化タンパク質に対して汎用性を有する。【００１１】本考案におけるフコシル化α−フェトプロテインとは、α−フェトプロテイン炭水化物鎖にフコース残基が存在する異質体を指す。【００１２】本考案によれば、ステップ（１）におけるα−フェトプロテイン抗原は原核発現ヒトα−フェトプロテイン抗原であり、真核発現α−フェトプロテイン抗原を選択してもよく、ここでは特に限定しない。【００１３】本考案によれば、ステップ（３）における酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である。【００１４】本考案によれば、ステップ（３）における酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であってもよく、酵素の基質発色の実現に用いられる。【００１５】本考案によれば、前記血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法は、（１）α−フェトプロテイン抗原とレンズマメレクチンとを精密ろ過膜に複合するステップと、（２）１０〜１５μＬの血清試料を精密ろ過膜に滴下し、試料中のフコシル化α−フェトプロテインと精密ろ過膜上のレンズマメレクチンとを結合させた後、ブロッキング液で洗浄し、非特異的結合物を除去するステップと、（３）精密ろ過膜に酵素で標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体を滴下し、３〜５ｓインキュベートした後、ブロッキング液で��浄し、非特異的結合物を除去し、発色基質発色液を添加するステップと、を含むことができ、陽性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原およびフコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは青色を示し、陰性血清の場合、α−フェトプロテイン抗原の検出エリアは青色を示し、フコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは発色しない。ネガティブコントロールは陽性血清であっても陰性血清であっても発色しない。【００１６】例示的に、前記免疫透析濾過方法は、具体的に以下のステップを含むことができる。【００１７】試料の検出：検出待ちの血清試料を希釈してから精密ろ過膜を含む検出エリアに滴下し、インキュベートした後、ＰＢＳＴで検出エリアを洗浄し、非特異的結合物を除去し、ＰＢＳにより希釈したＨＲＰで標識したＡＦＰ抗体を添加し、インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、非特異的結合物を除去し、ＨＲＰ基質発色液を添加し、目視で結果を観察する。【００１８】本考案によれば、前記インキュベートとは、室温で３〜５ｓインキュベートすることを意味し、例えば、３ｓ、３．５ｓ、４ｓ、４．５ｓまたは５ｓインキュベートする。【００１９】本考案によれば、前記血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過方法は、以下のような免疫透析濾過装置内で行うことができるが、これらに限定されない。【００２０】血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置は精密ろ過膜を含み、精密ろ過膜のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアが設けられ、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである。検出サブエリアおよび対照エリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含み、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ等であってもよい。【００２１】本考案における免疫透析濾過装置は、強靭なプラスチック製品、紙の吸水材、およびニトロセルロース膜で構成され、衝撃や衝突に耐えることができ、壊れにくい。【００２２】本考案において、前記精密ろ過膜のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよびネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有し、前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである。【００２３】本考案の免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含み、前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体であり、前記免疫透析濾過装置は、洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む。【００２４】本考案は、精密ろ過膜を有する免疫透析濾過装置を採用することが好ましく、タンパク質チップと比べ、検出時間が短く、コス��が低く、安定性が良い等の利点を有し、検出過程を３〜５ｍｉｎにコントロールすることができる。【００２５】第２の態様において、本考案は、免疫透析濾過装置の精密ろ過膜のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアを含み、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置を更に提供する。【００２６】本考案によれば、前記検出サブエリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含み、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ等であってもよい。【００２７】本考案によれば、前記精密ろ過膜のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよびネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有する。【００２８】本考案によれば、前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである。【００２９】本考案によれば、前記免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含む。【００３０】本考案によれば、前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である。【００３１】本考案によれば、前記免疫透析濾過装置は洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む。【００３２】本考案は、免疫透析濾過装置の、非診断および／または非治療目的の血清フコースタンパク質の検出における使用を更に提供する。
【考案の効果】
【００３３】従来の技術案と比べ、本考案は少なくとも以下の有益な効果を有する。【００３４】（１）本考案は、精密ろ過膜を使用することにより、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、本考案に係る免疫透析濾過検出方法は、血清フコースタンパク質を正確に検出することができ、検出時間が短く、安定性が良く、コストが低い等の利点を有する。【００３５】（２）本考案に係る免疫透析濾過装置は、必要な原材料および機器設備のコストが全て大幅に減少し、免疫透析濾過の装置は紙およびプラスチック製品であり、コストが非常に低く、約１元人民元であり、実験フローにおける準備、インキュベート、結果のスキャンを行うための機器設備が不要であり、検出コストおよび費用を大幅に低減する。【００３６】（３）本考案の免疫透析濾過方法は時間の面で他の方法と比べ、ＥＬＩＳＡ検出は少なくとも３ｈが必要で、タンパク質チップ検出は１．５ｈが必要であるが、本考案は３〜５ｍｉｎのみが必要であり、検出時間は大きく短縮される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本考案の免疫透析濾過装置の模式図であり、１は蓋で、２は精密ろ過膜で、３は紙の吸水材で、４はプラスチック基板である。
【図２】本考案の免疫透析濾過方法の結果模式図であり、１〜３は陽性結果で、ＮＣ膜の上方のポジティブコントロール検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、真ん中のレンズマメレクチン検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、下方のＢＳＡ対照斑は発色しない。４〜５は陰性結果で、ＮＣ膜の上方のポジティブコントロール検出斑は青っぽい茶色の陽性信号を呈し、真ん中のレンズマメレクチン検出斑および下方のＢＳＡ対照斑は発色しない。
【図３】免疫透析濾過ニトロセルロース膜を調製する模式図であり、ポジティブコントロール検出サブエリアにＡＦＰが固定され、真ん中の検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにＢＳＡが固定される。
【００３８】以下、本考案について更に詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本考案の簡単な例に過ぎず、本考案の実用新案登録請求の範囲を代表または制限するものではなく、本考案の保護範囲は実用新案登録請求の範囲を基準にする。
【考案を実施するための形態】
【００３９】以下、図面を参照しながら具体的な実施形態により、本考案の技術案について更に説明する。
【００４０】図１に示すように、本考案における免疫透析濾過装置の構造模式図であり、該免疫透析濾過装置は精密ろ過膜を有し、蓋１、精密ろ過膜２、紙の吸水材３、およびプラスチック基板４が上から下へ順に構成される。組み立ての場合、精密ろ過膜を事前に直径が約１．５ｃｍの円形に裁断し、紙の吸水材３をプラスチック基板４内に置き、紙の吸水材の上面の中央に予め裁断された精密ろ過膜２を置いた後、蓋１を被せる。
【００４１】本考案に使用される精密ろ過膜はニトロセルロース膜であってもよく、本考案では、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ３０３Ｂを使用する。紙の吸水材は吸水紙であってもよく、蓋および基板は全てプラスチック製品を使用する。
【００４２】図２に示すように、本考案の免疫透析濾過方法を採用する結果模式図であり、陽性血清の場合（図２における１〜３）、ポジティブコントロールおよびフコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは全て青色を示し、陰性血清の場合（図２における４〜６）であれば、フコシル化α−フェトプロテインの検出エリアは発色せず、ポジティブコントロールは青色を示す。陽性血清であっても陰性血清であっても、ネガティブコントロールは全て発色しない。
【００４３】図３は免疫透析濾過ニトロセルロース膜を調製する模式図であり、ポジティブコントロール検出サブエリアにＡＦＰが固定され、真ん中の検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、ネガティブコントロール検出サブエリアにＢＳＡが固定される。
【００４４】本考案をより良好に説明し、本考案の技術案を理解しやすいために、本考案の典型的かつ非限定的な実施例は以下のとおりである。
【００４５】実施例１  免疫透析濾過装置の調製および使用フロー実験に使用する試薬および機器：原核発現ＡＦＰ（米国ａｂｃａｍ社）、レンズマメレクチン（Ｓｉｇｍａ社）、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来抗体（米国ａｂｃａｍ社）、ＨＲＰ発色基質液（米国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）。
【００４６】ＰＢＳ処方：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）８ｇ、塩化カリウム（ＫＣｌ）０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．２４ｇであり、ｐＨを７．４に調整し、１Ｌに定容した。
【００４７】ＰＢＳＴ処方：ＰＢＳ、１Ｌ＋Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＬ。
【００４８】ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、各免疫透析濾過装置に１つの検出エリアを含み、それぞれの検出エリアで１つの血清を検出することができ、ＡＦＰＬ３マーカーを一度に検出した。
【００４９】各検出エリアにおいて、それぞれ０．５ｐＬのネズミ由来の原核発現ヒトＡＦＰ（米国ａｂｃａｍ社）とレンズマメレクチン（Ｓｉｇｍａ社）とをニトロセルロース膜に順にスポットし、スポッティング濃度はＡＦＰが０．５ｍｇ／ｍＬであり、レンズマメレクチンが４ｍｇ／ｍＬである。０．５μＬの１０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照斑にスポッティングしてネガティブコントロールとした。
【００５０】免疫透析濾過の操作フロー：調製された免疫透析濾過装置を使用し、健康対照グループおよび肝癌実験グループの動的血清検体におけるＡＦＰＬ３腫瘍マーカーを検出した。
【００５１】室温条件で、１０μＬの血清試料を免疫透析濾過装置の膜片に滴下し、レンズマメレクチンとフコースの結合の特性を利用し、レンズマメレクチンを血清中のフコースと結合させてレンズマメレクチン抗原複合物を形成した。３秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５２】１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、３回繰り返した。また、ＰＢＳにより希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来一次抗体を添加し、ウサギ由来抗体は血清中のＡＦＰ抗原と結合し、レンズマメレクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。ウサギ由来抗体は同時に固定膜上のポジティブコントロールＡＦＰと結合し、ＡＦＰ−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。３秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５３】１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、３回繰り返し、ＨＲＰ発色基質を添加し、１分間遮光し、１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄した。陽性血清の検出斑は青色を呈した。
【００５４】実施例２調製された免疫透析濾過装置を使用し、健康対照グループおよび肝癌実験グループの動的血清検体におけるＡＦＰＬ３腫瘍マーカーを検出した。
【００５５】室温条件で、２．５μＬの血清試料を４倍希釈した後、免疫透析濾過装置の膜に滴下し、レンズマメレクチンとフコースの結合の特性を利用し、レンズマメレクチンを血清中のフコースと結合させてレンズマメレクチン抗原複合物を形成した。５秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５６】１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、５回繰り返した。また、ＰＢＳにより希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギ由来一次抗体を添加し、ウサギ由来抗体は血清中のＡＦＰ抗原と結合し、レンズマメレクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。ウサギ由来抗体は同時に固定膜上のポジティブコントロールＡＦＰと結合し、ＡＦＰ−ウサギ由来西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗体の複合物を形成した。５秒後、血清液体浸透性膜片は膜片の下の吸水材に吸水された。
【００５７】１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄し、非特異的結合を除去し、５回繰り返し、ＨＲＰ発色基質を添加し、１分間遮光し、１０μＬのＰＢＳＴを滴下して洗浄した。陽性血清の検出斑は青色を呈した。
【００５８】以上から分かるように、本考案は、精密ろ過膜を使用し、血清試料中の複数種の抗原または抗体の一度の同時検出を短時間内に実現し、その検出過程は３〜５ｍｉｎのみで完成でき、検出時間が短く、コストが低く、安定性が良い等の利点を有する。
【００５９】本考案は、上記実施例によって本考案の詳細な構造的特徴を説明したが、本考案は上記詳細な構造的特徴に限定されるものではなく、すなわち、本考案は上記詳細な構造的特徴に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本考案に対するいかなる改良、本考案に使用される部材に対する等価的な置換および補助部材の追加、具体的な方式の選択等は、全て本考案の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
【００６０】以上、本考案の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本考案は上記実施形態における具体的な内容に限定されるものではなく、本考案の技術的思想の範囲内で、本考案の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本出願の実用新案登録請求の範囲に属している。
【００６１】なお、上記具体的な実施形態に説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾なき限り、いかなる適切な形態で組み合わせることができ、必要がない重複を回避するために、本出願では様々な可能な組み合わせの形態については特に説明しない。
【００６２】また、本出願の各種の異なる実施形態の間も任意に組み合わせることができ、本出願の思想に違反しない限り、同様に本出願の開示内容と見なすべきである。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
血清フコースタンパク質を検出する免疫透析濾過装置であって、前記免疫透析濾過装置の精密ろ過膜（２）のマトリックスは、少なくとも１つの検出エリアを含み、前記検出エリア内にポジティブコントロール検出サブエリア、血清フコースタンパク質検出サブエリア、およびネガティブコントロール検出サブエリアが設けられ、前記ポジティブコントロール検出サブエリアにα−フェトプロテインが固定され、前記血清フコースタンパク質検出サブエリアにレンズマメレクチンが固定され、前記ネガティブコントロール検出サブエリアにウシ血清アルブミンが固定され、同一の検出サブエリア内の検出斑上の物質濃度は同じである、ことを特徴とする免疫透析濾過装置。
【請求項２】
前記検出サブエリアはそれぞれ少なくとも１つの検出斑を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項３】
前記精密ろ過膜（２）のマトリックスは１つの検出エリアを有し、前記検出サブエリアはそれぞれ１つの検出斑を有し、前記ポジティブコントロール検出サブエリアおよび前記ネガティブコントロール検出サブエリアはそれぞれ１つの対照斑を有する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項４】
前記α−フェトプロテインは原核発現ヒトα−フェトプロテインである、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項５】
前記免疫透析濾過装置は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体および発色基質液を更に含む、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項６】
前記西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したα−フェトプロテインポリクローナル抗体はウサギ由来抗体である、ことを特徴とする請求項５に記載の免疫透析濾過装置。
【請求項７】
前記免疫透析濾過装置は、洗浄と希釈用のＰＢＳＴおよびＰＢＳブロッキング液を更に含む、ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫透析濾過装置。