(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繰り返し単位が、式（Ｉ）
【化１】
0004215308.tif 000007
（式中、グリコシド単位の間の結合はβ（１→４）であり、Ｒは−ＮＨＣＯ−Ｒ'（ここで、ＣＯ−Ｒ'は、カルボキシル基を有する単糖からカルボキシル基のＯＨを除いた残基を示す））
で表されることを特徴とする複合キトサン化合物。
【請求項２】
繰り返し単位が式（Ｉ）の複合キトサン化合物を含有する保湿剤。
【請求項３】
繰り返し単位が式（Ｉ）の複合キトサン化合物を含有するゲル基剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複合キトサン化合物及びその用途に関し、より詳細には、キトサン中のＤ−グルコサミンのアミノ基と、カルボキシル基を有する単糖のカルボキシル基とが結合してなる複合キトサン化合物及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
蟹等の甲殻類や昆虫類等の節足動物の外骨格、菌類等の細胞壁には、キチンが多く含まれていることが知られている。キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ（１→４）結合で数多く結合した高分子多糖であり、セルロースと同様に、生物構造を支持したり、保護する多糖として、自然界にも多く存在している（阿武喜美子・長谷川栄一編、ムコ多糖実験法〔Ｉ〕、ｐ５、南光堂（1972））。
【０００３】
このように自然界に多く存在するキチンを有効利用する目的で、従来から種々の研究がなされ、その過程で、キチンをアルカリ加水分解によって部分的もしくは完全に脱アセチル化して、キトサンが創り出された。
一般に、キトサンは、キチンのアセチル基の約８０％以上が脱アセチル化されたものを意味し（木船紘爾、キチン、キトサンのメディカルへの応用、ｐ11、技報堂出版（1994））、部分的にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含んだＤ−グルコサミンがβ（１→４）結合した高分子多糖である。特に、α型のキトサンは、水には溶解しないが、構造中にＤ−グルコサミン由来の遊離のアミノ基が存在するために、キチンと異なり希塩酸、有機酸水溶液等に溶解するとともに、高分子電解質となり得ることから生物資源としてはキチンより有望視されている。そのため、キチンの年間消費量の８割以上は、キトサンを生産するための原料として使用されている（キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、ｐ８、技報堂出版（1990））。
【０００４】
しかし、α型のキトサンは水や多くの有機溶媒に不溶であること、酸溶液には溶解するが塩基性になると不溶化し、析出すること等から、溶液状態での利用はあまり研究されておらず、低分子化処理したキトサンを除けば、溶液状態で利用されていないのが現状である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、以上のことから、キトサンの構成糖であるＤ−グルコサミンのアミノ基に着目して、キトサンの水への親和性を高めるべく鋭意研究を進めた結果、Ｄ−グルコサミンのアミノ基をカルボキシル基を有する単糖と結合させることにより、カルボキシル基を有する単糖の水酸基をはじめとする極性基の影響によってキトサンと単糖との複合体が、優れた親水性を示すことを見出し、本発明の完成に至った。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、繰り返し単位が、式（Ｉ）
【０００７】
【化２】
0004215308.tif 000002
【０００８】
（式中、グリコシド単位の間の結合はβ（１→４）であり、Ｒは−ＮＨ2 ・ＣＯＯＨ−Ｒ’又は−ＮＨＣＯ−Ｒ’（ここで、ＣＯＯＨ−Ｒ’は少なくとも１つのカルボキシル基を有する単糖を示し、ＣＯ−Ｒ’は、該単糖のカルボキシル基からＯＨを除いた残基を示す））
で表される複合キトサン化合物が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の複合キトサン化合物は、繰り返し単位が、式（Ｉ）
【００１０】
【化３】
0004215308.tif 000003
【００１１】
（式中、グリコシド単位の間の結合はβ（１→４）であり、Ｒは−ＮＨ2 ・ＣＯＯＨ−Ｒ’又は−ＮＨＣＯ−Ｒ’（ここで、ＣＯＯＨ−Ｒ’は少なくとも１つのカルボキシル基を有する単糖を示し、ＣＯ−Ｒ’は、該単糖のカルボキシル基からＯＨを除いた残基を示す））
で表されるように、キトサンの遊離のアミノ基に、少なくとも１つのカルボキシル基を有する単糖が共有結合又はイオン結合した化学構造を有し、優れた親水性を示す化合物である。
【００１２】
本発明の複合キトサン化合物におけるキトサンは、キチンのアセチル基の約８０％程度以上が脱アセチル化された遊離のアミノ基を有する化合物である。キトサンとしては、天然品（α型及びβ型）又は合成品のいずれも使用することができるが、なかでも、市販されているα型のキトサンが粘度やアセチル化度が既知であるため好ましい。本発明においては、キトサンのアミノ基のうちの１０〜８０％、好ましくは１０〜６０％程度が、単糖のカルボキシ基と、アミド結合等の共有結合及び／又はイオン結合を構成する。なお、単糖のカルボキシル基と結合を形成していないアミノ基は、酸、例えば塩酸、臭酸、硫酸、酢酸、蟻酸等と塩を形成していてもよい。
【００１３】
上記の式（Ｉ）における「少なくとも１つのカルボキシル基を有する単糖」は、その構造中に１つ以上のカルボキシル基を有するものであれば特に限定されず、例えば、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−イズロン酸、Ｄ−マンヌロン酸等の各種ウロン酸；Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ、Ｏ−ジアセチルノイラミン酸等の各種シアル酸等が挙げられる。なかでも、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸が好ましい。
【００１４】
本発明の複合キトサン化合物は、例えば、以下のような方法で製造することができる。
例えば、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とが共有結合した複合キトサン化合物を得るために、まず、カルボキシル基を有する単糖の水溶液（０．１〜２％（ｗ／ｖ）程度）中に、単糖に対してキトサン（１０〜３０％（ｗ／ｗ））を溶解し、その後、水溶性の縮合剤（例えば、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩等）を加えて反応させ、続いて、透析等で精製を行い、さらに、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール等）で複合キトサン化合物を不溶化させる。また、単糖のカルボキシル基を、アミノ基と反応しうる活性誘導体とした後、反応させてもよい。
【００１５】
さらに、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とがイオン結合した複合キトサン化合物を得るために、まず、カルボキシル基を有する単糖の水溶液（０．１〜２％（ｗ／ｖ）程度）中に、単糖に対して当量もしくはそれ以下の量（ｗ／ｗ）のキトサンを溶解することにより両者を反応させ、その後、透析等で精製を行い、さらに、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール等）で複合キトサン化合物を不溶化させる。
【００１６】
なお、本発明の複合キトサン化合物は、上述したように、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とが共有結合するか、イオン結合するか、あるいは両方の結合が同じ分子内に存在しているものでもよく、いずれにしても、水に不溶性であるキトサンと単糖とが複合化合物を形成することにより、親水性を発揮し得るものである。
【００１７】
本発明の複合キトサン化合物は、一般に保湿作用を有するヒアルロン酸と同等の保湿作用を有する。また、一般にキトサンには殺菌作用のあることが知られており（キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、ｐ７１、技報堂出版（1990））、本発明の複合キトサン化合物も、その基本構造がキトサンであることから、同様の活性を有している。さらに、本発明の複合キトサン化合物は、水との親和性が非常に高く、水を骨格中に取り込んで容易にゲルを形成し、水に溶けている物質も水と共に骨格中に取り込む性質を有している。
【００１８】
しかも、キトサン自体はマウスに１日体重１ｋｇあたり１８ｇを１９日間連続投与してもほぼ無害なほど毒性が低いことも知られており（荒井ら、キトサンの毒性について、東海水研報、５６、ｐ８９−９４（1986））、複合キトサン化合物を形成する単糖もそれ自体、生体内に多く存在しているものであることから、本発明の複合キトサン化合物も無害である。
【００１９】
よって、本発明の複合キトサン化合物は、高い安全性を有し、医薬品、化粧品、衛生用品、食品等の種々の分野で、例えば、創傷治療剤、創傷保護剤、保湿剤、種々のゲル製剤調製のための基剤、水分吸収体（例えば、流せるオムツ）、健康食品、ダイエット食品あるいはこれら食品への添加物等として使用することができる。
【００２０】
本発明の複合キトサン化合物を保湿剤として使用する場合には、本発明の複合キトサン化合物は、０．５〜１０％（ｗ／ｖ）程度の割合で、水に溶解して使用することが好ましい。ここで水とは、水道水、イオン交換水、精製水、蒸留水等いずれでもよい。
以下に本発明の複合キトサン化合物の実施例及び試験例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
なお、実施例において、Ｄ−グルクロン酸の結合率は、以下のようにして算出した。
Ｄ−グルクロン酸の分子量を１９４．１４、Ｄ−グルコサミン酸の分子量を１７９．１７とし、脱アセチル化度Ａ％のキトサン１ｇにＤ−グルクロン酸を最大限結合させた場合、Ｄ−グルクロン酸の含量（％）は、
【００２２】
【数１】
0004215308.tif 000004
【００２３】
となる。
そして、実際に得られた複合キトサン化合物についてＤ−グルクロン酸の定量を行って、その含量（％）を求め、上記のＤ−グルクロン酸を最大限結合させたときのＤ−グルクロン酸の含量（％）は、Ｄ−グルクロン酸の含量で割ることにより、遊離アミノ基に対するＤ−グルクロン酸の結合率％（mol/mol)を得ることができる。
【００２４】
実施例１
キトサン（和光純薬製、キトサン１０００：０．５％酢酸水溶液に０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた場合に９９１センチポアズの粘度を示す脱アセチル化度８５．９％のキトサン）０．４ｇとＤ−グルクロン酸２．４ｇとを、水２００ｍｌに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した。次いで、この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．２ｇを加え、塩酸でｐＨ４〜５に調整した後、室温で４８時間攪拌した。
【００２５】
反応混合物を、１００倍量の水で３回透析し、５倍量のメタノール中で３回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、Ｄ−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物０．５７ｇを得た。
得られた複合キトサン化合物について、以下の方法でＤ−グルクロン酸の定量を行った。
【００２６】
まず、キトサンに結合しているＤ−グルクロン酸をはずすために、得られた複合キトサン化合物に１Ｍ硫酸を加え、１００℃で２時間加熱し（阿武喜美子・長谷川栄一編、ムコ多糖実験法［Ｉ］、ｐ９６、南光堂（１９７２））、ろ過した。ろ液を、ウロン酸として４〜４０μｇ／ｍｌになるように希釈し、カルバゾール硫酸法（Bitter−Muirの改良法）によりＤ−グルクロン酸を呈色した。なお、対照として、濃度が既知のＤ−グルクロン酸についても同様の操作を行った。
【００２７】
上記定量の結果、キトサンの遊離のアミノ基のうち、２９．６％（mol/mol ）にＤ−グルクロン酸が結合していることがわかった。
また、得られた複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを図１に示す。なお、参考のために、図４に原料として使用したキトサン（和光純薬製、キトサン１０００）のＩＲスペクトルを示す。
【００２８】
実施例２
キトサン（和光純薬製、キトサン１０００）０．５ｇとＤ−グルクロン酸０．５ｇとを水２５０ｍｌに溶解した。得られた溶液を、１００倍量の水で３回透析し、５倍量のメタノール中で３回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄して乾燥し、Ｄ−グルクロン酸とのイオン結合を有する複合キトサン化合物０．７２ｇを得た。
【００２９】
得られた複合キトサン化合物について、実施例１と同様にＤ−グルクロン酸を定量したところ、キトサンの遊離のアミノ基に対し、３５．１％（mol/mol ）のＤ−グルクロン酸が結合していた。
また、得られた複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを図２に示す。
【００３０】
実施例３
キトサン（和光純薬製、キトサン１０００）０．２ｇとＤ−ガラクツロン酸１．２ｇとを、水１００ｍｌに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した。次いで、この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．６ｇを加え、塩酸でｐＨ４〜５に調整した後、室温で４８時間攪拌した。
【００３１】
反応溶液を、１００倍量の水で３回透析し、５倍量のメタノール中で３回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、Ｄ−ガラクツロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物０．２７ｇを得た。
得られた複合キトサン化合物について実施例１と同様にＤ−グルクロン酸を定量したところ、遊離のアミノ基に対し、４６．９％（mol/mol ）のＤ−ガラクツロン酸が結合していた。
【００３２】
実施例４
キトサン（和光純薬製、キトサン１０：０．５％酢酸水溶液に０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた場合に６．０センチポアズの粘度を示す脱アセチル化度８４．８％のキトサン）１．０ｇとＤ−グルクロン酸６．０ｇとを水５００ｍｌに溶解し、この溶液を、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した。次いで、この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３．０ｇを加え、塩酸でｐＨ４〜５に調整した後、室温で９６時間攪拌した。
【００３３】
反応溶液を、１００倍量の水で３回透析し、５倍量のメタノール中で３回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、Ｄ−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物１．８ｇを得た。
得られた複合キトサン化合物について実施例１と同様にＤ−グルクロン酸を定量したところ、遊離のアミノ基に対し、６１．２％（mol/mol ）のＤ−グルクロン酸が結合していた。
【００３４】
実施例５
キトサン（和光純薬製、キトサン１０００）１ｇとＤ−グルクロン酸６ｇとを、水５００ｍｌに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した。次いで、この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３ｇを加え、塩酸でｐＨ４〜５に調整した後、室温で７２時間攪拌した。その後、反応液の半量をとり、塩酸を加えてｐＨ１とした後、１００倍量の水で３回透析し、５倍量のメタノール中で３回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、Ｄ−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物０．５２ｇを得た。また、残りの反応液をさらに６０時間反応させ、（合計１３２時間）、上記と同様の操作を行い、Ｄ−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物０．６７ｇを得た。
【００３５】
得られた複合キトサン化合物について実施例１と同様にＤ−グルクロン酸を定量したところ、それぞれ、キトサンの遊離のアミノ基のうち、１３．０％（mol/mol ）又は３６．０％（mol/mol ）にＤ−グルクロン酸が共有結合していた。  また、得られた複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを図３に示す。
【００３６】
試験例１：ゲル化試験
実施例１及び実施例２の複合キトサン化合物各１０ｍｇを試験管にとり、１ｍｌの水又は１Ｎ塩酸をそれぞれ各１ｍｌを加えたところ、いずれの溶液においても良好なゲルを形成した。そのまま試験管を倒立し、室温で２４時間静置したが、ゲルの形状はほとんど変化しなかった。
【００３７】
また、実施例１及び実施例２で得られた複合キトサン化合物各１０ｍｇを試験管にとり、１Ｎ水酸化ナトリウム０．５ｍｌを加えたところ、いずれの複合キトサン化合物も良好なゲルを形成した。そのまま室温で７２時間静置したが変化は認められなかった。
一般に、水溶性の有機化合物等において１Ｎ塩酸より強い酸性物質や１Ｎ水酸化ナトリウムより強い塩基性物質はほとんど存在しない。したがって、これらの複合キトサン化合物は、酸性から塩基性を示すいずれの物質の存在下においても、良好なゲルを形成することがわかった。
【００３８】
試験例２：保湿性試験
文献（松井健次、フラグランスジャーナル、56、32〜38（1982）：酸性ムコ多糖体の保湿性について）に準じて保湿性試験を行った。
【００３９】
実施例１及び実施例２の複合キトサン化合物及び対照としてのヒアルロン酸ナトリウムの１０％水溶液をそれぞれ調製し、２５℃でシリカゲルデシケーター中及び２５℃、３０％相対湿度下の双方で放置し、経時的な重量変化を調べた。
この試験は、低湿度下における水分の蒸発を調べる試験で、水分の蒸発は重量減少率として表される。したがって、重量減少率が小さいものほど、水分をよく保持し、水分が蒸発しにくい物質、すなわち保湿能の高い物質であるということができる。
【００４０】
試験結果をそれぞれ表１及び表２に示す。
【００４１】
【表１】
0004215308.tif 000005
【００４２】
【表２】
0004215308.tif 000006
【００４３】
表１及び２から、いずれの複合キトサン化合物もヒアルロン酸ナトリウムと同等の保湿能を示し、優れた保湿効果を示すことが確認された。
【００４４】
試験例３：タンパク質の影響
キトサンは、タンパク質等の高分子物質に添加すると凝集することが知られている（キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、ｐ８９、技報堂出版（1990））。そこで、本発明の複合キトサン化合物のタンパク質共存下でのゲル化について調べた。
【００４５】
実施例２の複合キトサン化合物５ｍｇをとり、水又は１％ウシ血清アルブミン溶液をそれぞれ０．５ｍｌずつ加えたところ、いずれの溶液においても良好なゲルを形成した。そのまま試験管を倒立し、室温で２４時間静置したが、ゲルの形状はほとんど変化しなかった。
したがって、本発明の複合キトサン化合物は、タンパク質のような高分子の存在下でも良好なゲルを形成することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１で得られたＤ−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを示す図である。
【図２】本発明の実施例２で得られたＤ−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】本発明の実施例５で得られたＤ−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のＩＲスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の実施例１で使用したキトサンのＩＲスペクトルを示す図である。
【図１】
0004215308.tif 000008
【図２】
0004215308.tif 000009
【図３】
0004215308.tif 000010
【図４】
0004215308.tif 000011