(57)【要約】  方法上の労力が可能な限り少なく有害な副次的影響のない表面官能化を行うことを目的とする。官能化された表面は、恒久的な化学的活性および１よりも大きい高い置換度（ＤＳ）を有することになる。本発明によれば、官能化は、極性カルバメート結合およびスペーサー（Ｘ）を介して連結された少なくとも１つの遊離官能基、特にはアミノ基を含有する、一般式（Ｉ）の溶解したオリゴ糖誘導体または多糖誘導体を用いて行われる。【化１】2016518481.tif 000015
2016518481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖およびタンパク質などの合成ポリマーおよび天然ポリマー、紙、ガラス、セラミック、シリコン、金属ならびに金属酸化物から成るかまたはそれらを含む表面を官能化するためのプロセスであって、
表面官能化のために、前記表面を、前記表面の材料との材料複合体を形成するための少なくとも１つの化合物を含有する溶液と接触させ、
ここで、前記材料複合体を形成するための前記少なくとも１つの化合物として、極性カルバメート結合およびスペーサー（Ｘ）を介して連結された少なくとも１つの遊離官能基Ｒ１を有する、一般式Ｉの溶解したオリゴ糖または多糖の誘導体が用いられることを特徴とする、前記プロセス。
【化１】
2016518481.tif 000010
式中、Ｒ１は、ＮＨ２、ＳＨ、またはＯＨであり；
Ｒ２または（独立して）Ｒ３は、Ｈ、または以下で表され；
【化２】
2016518481.tif 000011
Ｘは、以下で表される。
【化３】
2016518481.tif 000012
【請求項２】
官能基Ｒ１の少なくとも１つとして、ヒドロキシ基が提供されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
官能基Ｒ１の少なくとも１つとして、チオール基が提供されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
官能基Ｒ１の少なくとも１つとして、アミノ基が提供されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記オリゴ糖または多糖として、ホモグリカンまたはヘテログリカンが用いられることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記オリゴ糖または多糖として、グルカン、特にはβ‐１‐４‐グルカン、セルロース、またはキチンが用いられることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
一般式ＩＩの官能基を有する少なくとも二官能であるアミノ置換オリゴ糖またはアミノ置換多糖が提供されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【化４】
2016518481.tif 000013
式中、Ｘは、任意の有機部分を表し、特には、任意に置換されていてもよい、芳香族、縮合芳香族、ヘテロ環および／またはヘテロ芳香族の部分であるか、アルキルおよび／またはアルケニルの部分であるか、または上記（Ｉ）において示された部分Ｘである。
【請求項８】
前記オリゴ糖または多糖が、一般式ＩＩＩのセルロース骨格を有することを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【化５】
2016518481.tif 000014
式中、セルロースのヒドロキシ基は、少なくとも一部がＯＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｘ）ＮＨ２で置換されており、Ｘは、任意の有機部分を表し、特には、任意に置換されていてもよい、芳香族、縮合芳香族、ヘテロ環および／またはヘテロ芳香族の部分であるか、アルキルおよび／またはアルケニルの部分であるか、または上記（Ｉ）において示された部分Ｘを含む。
【請求項９】
分子量に基づいた平均重合度（ＤＰ）が、３０〜１５００、好ましくは５０〜３００の範囲内であるセルロースが、前記オリゴ糖または多糖として用いられることを特徴とする、請求項６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面の官能化のためのプロセスに関し、例えば、化学的用途および生化学的用途のための、特には、分析目的のためのサンプル支持体としての、または表面が定められた特性および機能を備えることになる直接の物理的用途、化学的用途、生物学的用途、および工業的用途のための、特定の表面特性を有することが意図される基材の表面の官能化のためのプロセスに関する。特に、多糖およびタンパク質などの合成ポリマーおよび天然ポリマー、紙、ガラス、セラミック、シリコン、金属、および磁性材料を含む金属酸化物が、そのような表面のための材料として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
物理的プロセスおよび／または化学的プロセスによる表面の修飾は、材料の特性を容易に変更し、それらを所望の用途に適合させるための重要な方法である。
【０００３】
例えば、プラズマ法は重要な役割を果たしているが、表面の改変が恒久的ではないという欠点を有する。
【０００４】
また、無機分子または有機分子が表面に堆積されて固定される数多くの方法も知られている。したがって、例えば、酸化チタンまたは酸化ケイ素を堆積させることによって、超親水性表面または超疎水性表面を作製することができる（Peter Forbes, Spektrum der Wissenschaft, August 2009, pp. 88-95）。そのような表面は、化学的に不活性である。様々なポリマーもまた、表面修飾に用いられる。恐らく最も知られている使用はポリマーワニス形成剤に関し、これは長い間、広く用いられてきた。これらもまた、非反応性表面を形成する（G. Menges et al., Menges Werkstoffkunde Kunststoffe, Carl Hanser Verlag, Munich 2011, p. 23）。
【０００５】
独国特許出願公開第１０２００５００８４３４号には、いわゆるアミノセルロースが記載されており、これは様々な材料上に堆積させることができ、そのアミノ基は化学的に反応性であり、例えば、共有結合による酵素の固定に適している。そのような表面は、例えば酵素の結合を介して、材料の生体適合性表面処理およびバイオアッセイの開発を可能とするはずである。国際公開第２００６／０８９４９９号に記載のアミノセルロースは、求核置換反応（ＳＮ反応）によるセルロースｐ‐トルエンスルホン酸エステルとジアミンまたはオリゴアミンとの公知の反応によって得られ、この場合、可溶性生成物を得るためには、ジアミンまたはオリゴアミンを、トシル基の１モルあたり１０〜２０モルという大過剰量で用いる必要がある。ＳＮ２反応の機構のために、繰り返し単位あたり最大で１つのアミノ置換基を有する６‐デオキシ‐６‐アミノセルロース誘導体が形成され、これは平均置換度（ＤＳ）１に相当する（K. Petzold-Welcke et al.: Unconventional Cellulose Products Through Nucleophilic Displacement Reactions, Macromolecular Symposia 280, 2009, 72-85）。デオキシ‐アミノ結合の構造には四面体炭素原子（ｓｐ３炭素）が関与しており、その立体的要因のために、表面との相互作用において問題となる。加えて、Ｃ−Ｎ結合中の二級窒素原子は、反応性であり、プロトン化され得るため、制御不能な副反応および二次構造をもたらし得る。
【０００６】
セルロース誘導体の置換度は最大３まで達することが可能であるが、この反応では、実際に達成される最大値は０．８である。したがって、原理的には可能である表面上の多数の結合にも拘わらず、比較的少数のアミノ基しか実際には表面に存在しない。作製の際に大過剰量のジアミンまたはオリゴアミンを用いることが避けられないことは、経済的に非効率的であるだけでなく、単調でコストのかかるアミノセルロースの精製をさらに必要とする。ジアミンおよびオリゴアミンが生物学的活性を有する傾向があることが知られているため、サンプル中のジアミンまたはオリゴアミンの残留物は、使用過程での危険な生物学的効果を含む様々な望ましくない副反応をもたらし得る。水または有機溶媒への溶解性などの６‐デオキシ‐６‐アミノセルロース誘導体の特性は、残留するヒドロキシ基のエステル化またはエーテル化など、続いて行われる複雑な化学的方法によってのみ実現することができる。これらの続いて行われる化学的方法によってトシル基が制御不能に開裂されることはさらなる欠点であり、こうして、置換基の分布が不明瞭である非単一構造（ｎｏｎ‐ｕｎｉｔａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が形成される（P. Berlin et al.: A novel soluble aminocellulose derivative type: its transparent film-forming properties and its efficient coupling with enzyme proteins for biosensors, Macromol. Chem. Phys. 2000, 201, 2070-2082）。さらに、アミンとのＳＮ反応の過程で、エステル基もまた制御不能に開裂される（P. Berlin et al.: Film-forming aminocellulose derivatives as enzyme-compatible support matrices for biosensor developments, Cellulose 2003, 10, 343-367）。
【０００７】
欧州特許出願公開第１２２２９２６号によると、還元アミノ化により、多糖、好ましくは分岐デキストランにアミノ基が導入される。したがって、多糖は、最初に、繰り返し単位の開裂と共に、酸化されて対応するジアルデヒド多糖誘導体となる。原理的には、平均置換度２という比較的高いアミノ基数をポリマー中に実現することが可能であるが、ジアルデヒドの部分酸化のみが可能であり、加えて、存在するアルデヒド基の一部しかジアミンまたはオリゴアミンと反応しないために達成されない。分岐デキストランからそのように入手可能であるアミノ基を含有する多糖誘導体も、非分岐セルロースから入手可能であるものも、接着性を示さない。これらは遺伝子治療におけるポリカチオンとして利用され得る。アミノ基とは異なり、カチオン性アンモニウム基は化学的に活性ではないので、上述した用途に適していない。
【０００８】
材料修飾のための別のプロセスは、イソシアネート基によって活性化されたポリマーから進行する（米国特許公開第５，７２８，７５１号）。イソシアネートは、極めて毒性の高い化合物であることが良く知られており、とりわけ生物学的分野での用途が排除され、その調製および使用において計り知れないリスクが伴う。
【０００９】
多糖のヒドロキシ基の活性化はまた、カーボネートへの変換によっても達成することができ、この場合、毒性の高いホスゲンまたはクロロカーボネートのいずれかが試薬として用いられる（S. Barker, H.M. Disney, P. Somers: The reaction of dextran carbonate with amino acids and polypeptides, Carbohydrate Research 1972, 25, 237-241; M.S. Chaves, F. Arranz: Water-insoluble dextrans by grafting 2: Reaction of dextrans with normal-alkyl chloroformates, Chemical and enzymatic hydrolysis, Macromolecular Chemistry and Physics, 1985, 186, 17-29）。しかし、ほとんどの場合、この変換により構造的にばらつきのある生成物が生じ（例えば、モノカーボネートに加えて、環状カーボネート構造が形成される）、架橋反応のために不溶性の生成物が生じる。しかしながら、カーボネート化セルロースは、アミノ官能基を１つのみ有するアミンと反応することが好ましいが、ジアミンおよびオリゴアミンとも反応して、非反応性生成物が得られるか、または後者の場合、製紙業では関心の高いものではあるが、不定構造のアミノセルロースが得られた（独国特許出願公開第３８３６５９９号）。セルロース誘導体は、主として出発材料として機能した。セルロース自体も、記載の方法により反応させることができたが、ＤＳはわずかに１．０〜１．２までであった（最大で３．０のＤＳが達成され得る）。また、表面の官能化のためのその使用については、本技術分野において何も知られていない。
【００１０】
活性化後のデキストランなどの水溶性多糖および水溶性セルロース誘導体と、Ｎ，Ｎ’‐カルボニルジイミダゾールとの反応、ならびにジアミンとの反応により、カチオン性の水溶性高分子電解質が得られ、これは、ＤＮＡとのポリプレックスを形成し、遺伝子療法に用いることができる（米国特許出願公開第２０１１／０２５１２６５号）。しかし、この場合も、架橋を回避するために、２０倍から３０倍過剰量のジアミンを用いなければならない。したがって、生成物の精製に大半の労力を払う必要がある。米国特許出願公開第２０１１／０２５１２６５号に提供される情報によると、誘導体化されていないセルロースは、この方法には明らかに適していない。
【００１１】
Ｎ，Ｎ’‐カルボニルジイミダゾールによる活性化後の表面の直接修飾、およびそれに続くモノアミンとの反応もまた知られているが、制御された反応が関与するものではない。構造も基の量も選択的に制御することができない。特に、遊離の反応性一級アミノ基は存在しない（Sabrine Alila, Ana Maria Ferraria, Ana Maria Botelho do Rego, Sami Boufi: Controlled surface modification of cellulose fibers by amino derivatives using N,N-carbonyldiimidazole as activator, Carbohydrate Polymers 77, 2009, 553-562）。この方法は、繊維のｉｎ  ｓｉｔｕ修飾に適しているが、残留するヒドロキシ基の反応が常に架橋をもたらして、不溶性生成物の形成をもたらすことから、コーティング材料には適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、方法上の労力が可能な限り少なく先行技術に記載される副次的影響のない、表面官能化を行うことであり、官能化された表面は、恒久的な化学的活性および１よりも大きい高い置換度（ＤＳ）を有することになる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、極性カルバメート結合およびスペーサー（Ｘ）を介して連結された少なくとも１つの遊離官能基、特にはアミノ基を含有し、そのような溶液中で処理表面と接触される、以下の一般式Ｉの溶解したオリゴ糖または多糖の誘導体により、恒久的な化学的活性を有し、公知の先行技術と比較してより高い平均置換度（ＤＳ）を有する、非常に有利な表面官能化が引き起こされることが見いだされた。
【００１４】
【化１】
2016518481.tif 000003
【００１５】
式中、Ｒ１は、ＮＨ２、ＳＨ、またはＯＨであり；
Ｒ２または（独立して）Ｒ３は、Ｈ、または以下で表される。
【００１６】
【化２】
2016518481.tif 000004
【００１７】
Ｘは、以下で表される。
【００１８】
【化３】
2016518481.tif 000005
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい実施形態では、アミノ置換オリゴ糖またはアミノ置換多糖は、ホモグリカンもしくはヘテログリカン、グルカン、特にはβ‐１‐４‐グルカン、セルロース、またはキチンである。
【００２０】
有利な化合物としては、一般式ＩＩの官能基を有する少なくとも二官能のアミノ置換オリゴ糖またはアミノ置換多糖が挙げられる。
【化４】
2016518481.tif 000006
【００２１】
式中、Ｘは、任意の有機部分を表し、特には、任意に置換されていてもよい、芳香族、縮合芳香族、ヘテロ環および／またはヘテロ芳香族の部分であるか、アルキルおよび／またはアルケニルの部分であるか、または上記（Ｉ）において示された部分Ｘである。
【００２２】
オリゴ糖または多糖は、都合良くは、一般式ＩＩＩのセルロース骨格を有していてもよい。
【００２３】
【化５】
2016518481.tif 000007
【００２４】
式中、セルロースのヒドロキシ基は、少なくとも一部がＯＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｘ）ＮＨ２によって置換されており、Ｘは、任意の有機部分を表し、特には、任意に置換されていてもよい、芳香族、縮合芳香族、ヘテロ環および／またはヘテロ芳香族の部分であるか、アルキルおよび／またはアルケニルの部分を表すか、または上記（Ｉ）において示された部分Ｘを含む。セルロースは、有利には、その分子量に基づいた平均重合度（ＤＰ）が３０〜１５００、好ましくは５０〜３００の範囲内であるものが用いられる。
【００２５】
ヒドロキシ基またはチオール基もまた、極性カルバメート結合およびスペーサーを介して連結された前記遊離官能基として用いてもよい。
【００２６】
プロセス技術という意味では、表面官能化は、それ自体公知の方法で行われてもよい。一般式Ｉによる提案されたオリゴ糖または多糖の溶液は、官能化される表面と接触され、それには、特に、多糖およびタンパク質などの合成ポリマーおよび天然ポリマー、ガラス、セラミック、シリコン、金属、磁性材料を含む金属酸化物が適している。そのような接触は、例えば、浸漬およびそれに続く溶媒での洗浄、または種々の技術によるスプレーによって実現されてもよい。しかし、スピンコーティングまたは浸漬コーティングなどの複雑な方法、およびその他の同様に公知の方法を適用してもよい。
【００２７】
本発明のオリゴ糖または多糖による官能化は、処理表面上の接着性自己組織化により、反応性基、特にはアミノ基を含有する非常に薄く強固な層を形成する。「強固な層」とは、続いて行われる処理において、例えば超音波処理など、さらにエネルギーが加えられる場合であっても、層を除去することができないことを意味する。本発明により作製されるこのような表面層は多種多様な電解質組成の溶媒の影響下であっても除去されず、そのような官能化により意図される強度および化学的活性は悪影響を受けない。
【００２８】
したがって、この表面官能化により、出発材料が有していない新しい特性を有する材料が得られる。
【００２９】
表面の疎水性‐親水性バランスは、特別な労力を払うことなく変更することができる。したがって、浄水におけるポリエチレンなど、多くの合成ポリマーフィルターに用いられるように、それ自体が疎水性であり且つ多孔性であり得る材料の効果を、顕著に改善することができる。ラテラル用途またはフロースルー用途における疎水性ポリマーの適用もまた、顕著に改善される。さらに、表面に電荷が発生することで、アニオン交換特性が作り出され得る。また、それによりタンパク質を、静電的、且つ可逆的に表面に固定することもでき、それは、高い平均置換度（ＤＳ）に由来する高い正電荷により効率的に行うことができる。達成され得る高い電荷は、選択された配向のタンパク質を固定するために利用することができる。
【００３０】
ＤＳは、アミノ分解によってオリゴ糖または多糖に導入された少なくとも２つの反応性アミノ官能基を有するアミンの数を、オリゴ糖または多糖の元のヒドロキシ基の数で除し、オリゴマーまたはポリマーの基本単位あたりの元のヒドロキシ基の数を掛けた割合として定義される。
【００３１】
前記反応性基、特にアミノ基は、例えば多種多様なアルデヒドと直接的に、あるいは、ジアルデヒドまたはジカルボン酸もしくはその環状無水物との反応後に間接的に、共有結合を形成し、それにより、上述のように、分子が強固、且つ不可逆的に結合される。生化学において確立された検出および処理の反応、例えばグルタルジアルデヒドまたは無水コハク酸との反応は、本発明により形成される材料複合体層を用いて通常通り簡便に行うことができ、生体分子および抗体を、表面上に共有結合により固定することができる。
【００３２】
オリゴ糖および多糖を得るために、ヒドロキシ基は、少なくとも一部がアミノ基によって置換される。本発明により用いられる基本単位を構成するオリゴ糖または多糖は、オリゴ糖または多糖のヒドロキシ基をカーボネート構造に誘導体化して誘導体化オリゴ糖または誘導体化多糖を得た後、この誘導体化オリゴ糖または誘導体化多糖を、少なくとも２つの反応性アミノ官能基を有するアミンとアミノ分解によって反応させて、ＤＳが０．４〜２．９、好ましくは０．８〜２．０、より好ましくは１．０〜１．５であるアミノ置換オリゴ糖またはアミノ置換多糖を形成することによって入手可能である。
【００３３】
オリゴ糖カーボネートまたは多糖カーボネート、好ましくはオリゴ糖フェニルカーボネートまたは多糖フェニルカーボネートの合成は、例えばＮ，Ｎ‐ジメチルアセタミド／ＬｉＣｌに溶解したオリゴ糖または多糖とクロロカルボン酸エステルまたはフルオロカルボン酸エステルとの均一系反応で行われる。ＤＳが０．３〜２．５の範囲内である、可溶性、且つ構造的に均一な生成物が入手可能であり、これは、ジアミンおよびオリゴアミンとのアミノ分解によって、一般式Ｉの多糖誘導体に変換することができる。アミンとの反応はモル過剰を必要としないが、アミンは、所望の平均置換度に応じた等モル量で用いてもよく、アミノベンジルアミンの場合などのジアミンまたはオリゴアミンの固有の選択性、または、例えばｔ‐ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）などのアミノ官能基の一時的な保護を利用してもよい。
【００３４】
したがって、アミノベンジルアミンのベンジルアミノ基は、芳香族アミノ基よりも明らかに求核性であるため、カーボネート基と選択的に反応する。それによりビスカルバメート構造を介したポリマー鎖の架橋がモル過剰でない場合でも阻止され、芳香族アミノ基が常に末端位置に存在することから明確な構造を有するポリマーが得られる。脂肪族ジアミンは、Ｂｏｃ基によって一方の側が保護され、モル過剰のアミンは必要とされない。原理的には、反応は非常に温和な条件（室温）下で行うことができる。したがって、生物学的方法または分光学的方法に悪影響を与える可能性のある着色副生物は形成されない。
【００３５】
デオキシアミノ構造とは対照的に、カルバメート結合はｓｐ２炭素のために平面であり、表面との相互作用に最適な構造を有する。カルバメート構造は反応性ではなく、プロトン化されることもない。したがって、本発明の化合物には反応性一級アミノ官能基が存在し、それにより、明確な反応性および明確な構造が得られる結果となり、非常に有利なことに、用途における明確な構造と特性との関係が得られることになる。
【実施例】
【００３６】
以下において、実施例により本発明をさらに説明する。
【００３７】
実施例１：
セルロースフェニルカーボネートの合成：
セルロース（Ａｖｉｃｅｌ、ＤＰ  ２２０、５ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を、１５０ｍＬの乾燥ＤＭＡｃ中、１２０℃で２時間撹拌して処理した。続いて、９ｇのＬｉＣｌ（２１２．３ｍｍｏｌ）を９０℃で添加した。この懸濁液を、透明溶液が得られるまで撹拌した（５〜２４時間）。このセルロース溶液を、２５０ｍＬの二重壁反応器中で０℃まで冷却し、等量のピリジンおよびカルボン酸フェニルエステルクロリドを、Ｎ２雰囲気下で添加した。０℃で４時間の反応時間の後、この混合物を、１．５リットルの氷水中で析出させ、析出物をろ取し、１リットルの水で２回、および１リットルのエタノールで２回洗浄した。生成物を４０℃で真空乾燥し、続いて１２０ｍＬのアセトンから再析出させた。
【００３８】
【表１】
2016518481.tif 000008
【００３９】
サンプル１の分光分析データ：
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ）：３４６０ｃｍ−１  ν（ＯＨ），３０７０ｃｍ−１  ν（ＣＨａｒｏｍ），２９００ｃｍ−１  ν（ＣＨ），１７６６ｃｍ−１  ν（Ｃ＝Ｏ），１２５４ｃｍ−１  ν（Ｃ−Ｏ−Ｃ）
１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ［ｐｐｍ］＝７．３８‐７．２５（Ｈａｒｏｍ），５．６０‐３．１６（Ｈ‐１〜Ｈ‐６およびＯＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ［ｐｐｍ］＝１５３．４（Ｃ＝Ｏ），１５１．２（Ｃｉｐｓｏ），１３０．０（Ｃ−Ｈｍ），１２６．６（Ｃ−Ｈｐ），１２１．８（Ｃ−Ｈｏ），１０２．７（Ｃ‐１），７９．１，７４．３，７３．０，７２．３（Ｃ‐４，Ｃ‐５，Ｃ‐３，Ｃ‐２），６７．７（Ｃ‐６ｓ），６０．８（Ｃ‐６）
【００４０】
実施例２：
ａ）Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルジアミンを用いたセルロースフェニルカーボネートのアミノ分解：
１５ｍＬのＤＭＦ中のセルロースフェニルカーボネート（２ｇ）を、１５ｍＬのＤＭＦ中の対応するアミン（以下参照）の溶液と、激しく撹拌しながら混合し、この反応混合物を、６０℃で２４時間撹拌した。続いて、生成物を、４００ｍＬの水で析出させ、ろ取し、水で２回、炭酸水素ナトリウム溶液で２回、続いて水で再度２回洗浄した。４０℃で真空乾燥して、白色粉末を得た。
【００４１】
ｂ）ｐ‐アミノベンジルアミンを用いたセルロースフェニルカーボネートのアミノ分解：
８ｍＬのＤＭＦ中のセルロースフェニルカーボネート（１ｇ）を、８ｍＬのＤＭＦ中のｐ‐アミノベンジルアミン（カーボネート基あたり２〜３当量）の溶液と、激しく撹拌しながら混合し、この反応混合物を、６０℃で２４時間撹拌した。続いて、生成物を、１５０ｍＬの２‐プルパノールで析出させ、ろ取し、２‐プルパノールで４回洗浄した。４０℃で真空乾燥して、白色粉末を得た。
【００４２】
【表２】
2016518481.tif 000009
【００４３】
サンプル７の分光分析データ：
ＦＴＩＲ（ＫＢｒ）：１７０１ｃｍ−１（νＣ＝Ｏ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ［ｐｐｍ］＝１５６（Ｃ＝Ｏ），１０２．９（Ｃ‐１），１０１．１（Ｃ‐１’），７８．３（ＣＭｅ３），８２‐７２（Ｃ‐２，Ｃ‐３，Ｃ‐４，Ｃ‐５），６３．４（Ｃ‐６），ＣＨ２  溶媒シグナルに隠される，２８．７（ＣＨ３）
【００４４】
実施例３：
Ｂｏｃ保護基の脱保護：
セルロースカルバメート（２ｇ）を４０ｍＬのＴＦＡに溶解し、続いて室温で１５分間撹拌した。４００ｍＬの２‐プロパノール中での析出によって生成物を単離し、次に各々１００ｍＬの析出剤で４回洗浄した。４０℃での真空乾燥後、生成物を５０ｍＬの水に溶解し、イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ‐４１０（塩化物型）で一晩処理した。続いて、得られた溶液を凍結乾燥した。
【００４５】
アミノエチルセルロースカルバメートの分光分析データ：
ＦＴＩＲ（ＫＢｒ）：１７１０ｃｍ−１（νＣ＝Ｏ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝１５８（Ｃ＝Ｏ），１０２．９（Ｃ‐１），１０１．８（Ｃ‐１’），８１‐７１（Ｃ‐２，Ｃ‐３，Ｃ‐４，Ｃ‐５），６３．０（Ｃ‐６），３９．６（ＣＨ２），３８．１（ＣＨ２）
【００４６】
実施例４：
金表面のコーティング：
金でコーティングしたシリコンウエハを、ピラニア溶液（硫酸／過酸化水素、２：１）中に３時間置き、コーティングの前に表面を洗浄した。続いて、その支持体を蒸留水で十分にリンスした。ＤＳが１．４３であるアミノセルロースエチルカルバメートの１％水溶液を用い、スピンコーター（ＭｉｃｒｏＴｅｃ  Ｄｅｌｔａ  １０ＴＴ、Ｓuｓｓ社）によって１分間に２００回転でウエハをコーティングし、続いて蒸留水でリンスした。コーティング表面の接触角（水）は、６１°である。
【００４７】
実施例５：
金単結晶のコーティング：
Ａｕ（１１１）基材を、濃硫酸で４８時間処理し、蒸留水および純エタノールで洗浄し、窒素気流中で乾燥し、続いてブタンガスバーナーで白熱するまで５〜１０分間加熱した。次に、原子間力顕微鏡（Ｄｕａｌｓｃｏｐｅ  Ｃ‐２１、ＤＭＥ）を用いて表面を測定し、続いてＤＳが１．４３であるアミノセルロースエチルカルバメートの０．１％溶液で処理した。続いて、水で激しく洗浄した。表面の粗度（ＲＭＳ、平均二乗）は、官能化により、８０ｐｍ（Ａｕ（１１１）基材）から２６０ｐｍに増加し、このことはコーティングされたことを示している。
【００４８】
実施例６：
ＱＣＭによる金のコーティングの定量：
アミノエチルセルロースカルバメートの金表面への吸着を、水晶振動子マイクロバランス（Ｑ‐Ｓｅｎｃｅ）を用いて実証した。ＱＣＭ基材を、コーティング前にピラニア溶液で洗浄し、蒸留水でリンスし、続いて窒素気流中で乾燥した。水晶を、アミノエチルセルロースカルバメート溶液（０．００１〜１％の濃度）に浸し、続いて、平衡振動数に達するまで水で洗浄した。≧０．１％の濃度の場合、１ｃｍ２あたり２００ｎｇの吸着質量が検出された。
【００４９】
実施例７：
ガラスのコーティング：
ガラス支持体（ビーズ  φ１．５ｍｍ、ＫＧＭ  Ｆｕｌｄａ社）を、コーティング前にピラニア溶液で洗浄し、続いて蒸留水でリンスした。ガラスを、ＤＳが１．４３であるアミノセルロースエチルカルバメートの０．１％水溶液に１５分間浸漬し、続いて蒸留水で洗浄した。
【００５０】
アミノ基の表面密度を特定するために、４，４’‐ジメトキシトリチルクロリドでアミノ基を誘導体化し、過塩素酸‐メタノールで処理し、ジメトキシトリチルカチオンの濃度を、紫外・可視分光法（４９８ｎｍ）によって測定した。ガラス上のアミノエチルセルロースカルバメート層について、アミノ基密度は１ｃｍ２あたり０．６〜０．８ｎｍｏｌであった。
【００５１】
実施例８：
ポリエチレンのコーティング：
ポリエチレン支持体を、酸素プラズマ中で処理し、その後、ＤＳが１．４３であるアミノセルロースエチルカルバメートの０．１％水溶液中に１５分間置いた。続いて、支持体を蒸留水で洗浄した。アミノ基の濃度は、１ｃｍ２あたり０．３０ｎｍｏｌであった。
【００５２】
実施例９：
ホモ二官能試薬グルタルジアルデヒドを用いたＮＨ２‐官能化支持体上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１．グルタルジアルデヒドによるＮＨ２‐官能化表面の活性化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルター（ｈ＝２．５ｍｍ、φ＝５ｍｍ、１８０型、Ｐｏｒｅｘ社）を、２ｍＬの５％グルタルジアルデヒド水溶液と共に、室温にて１５分間撹拌した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄の後、マイクロフィルターは固定化に利用可能であった。
【００５３】
２．グルタルアルデヒド活性化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１に記載のように処理したＰＥマイクロフィルターに、２ｍＬの炭酸水素塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で４時間撹拌した。残存する活性化表面をブロックするために、固定化の後、５μＬのエタノールアミンをこの固定化溶液に添加し、撹拌をさらに２時間継続した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面（ＣＲＰ−ａｆｆｉｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）を得た。マイクロフィルターあたり６．０μｇの固定に成功し、固定化された抗体の３０％が活性であった。
【００５４】
実施例１０：
ＥＤＣ／ｓ‐ＮＨＳ化学によるＣＯＯＨ‐官能化支持体上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１．ＮＨ２‐官能化表面の再官能化、およびそれに続くＣＯＯＨ‐官能化表面の活性化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルターを、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸（ｃ＝４０ｍｇ／ｍＬ）および５μＬのピリジンの溶液の２ｍＬ中で、室温で１６時間撹拌した。無水コハク酸と表面のアミノ基との反応により、ＰＥマイクロフィルター上にカルボキシ基を導入した。各々３ｍＬの水で表面を繰り返し洗浄した後、カルボキシ基を、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびスルホ‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ｓ‐ＮＨＳ）で活性化することができた。このように、マイクロフィルターを、２ｍＬの２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）中、ＥＤＣ（２ｍＭ）およびｓ‐ＮＨＳ（５ｍＭ）と共に撹拌し、撹拌を３０分間行った。
【００５５】
２．抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の活性化ＣＯＯＨ表面上への固定：
抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定化は、１に記載のように処理したマイクロフィルターを水で洗浄した後、２ｍＬのリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で２時間撹拌することで行った。この固定化溶液に５μＬのエタノールアミンを添加し、撹拌をさらに６０分間行うことで、残存する活性化カルボキシ基をブロックした。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり７．０μｇの固定に成功し、固定化された抗体の３０％が活性であった。
【００５６】
実施例１１：
アスコルビン酸試薬を用いたＮＨ２‐官能化支持体上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１．ＮＨ２‐官能化表面のアスコルビン酸による活性化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルター（ｈ＝２．５ｍｍ、φ＝５ｍｍ、１８０型、Ｐｏｒｅｘ社）を、２ｍＬのＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中のアスコルビン酸飽和溶液と共に、室温にて１５分間撹拌した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄の後、マイクロフィルターは固定化に利用可能であった。
【００５７】
２．アスコルビン酸活性化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１に記載のように処理したＰＥマイクロフィルターに、２ｍＬの炭酸水素塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で１６時間撹拌した。残存する活性化表面をブロックするために、固定化の後、５μＬのエタノールアミンをこの固定化溶液に添加し、撹拌をさらに２時間継続した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり５．２μｇの固定に成功し、固定化された抗体の３５％が活性であった。
【００５８】
実施例１２：
ベンゾキノン試薬を用いたＮＨ２‐官能化支持体上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１．ＮＨ２‐官能化表面のベンゾキノンによる活性化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルター（ｈ＝２．５ｍｍ、φ＝５ｍｍ、１８０型、Ｐｏｒｅｘ社）を、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中の２ｍＬのベンゾキノン飽和溶液と共に、室温にて１５分間撹拌した。各々３ｍＬのＤＭＦによる４回の洗浄、およびそれに続く水による２回の洗浄の後、マイクロフィルターは固定化に利用可能であった。
【００５９】
２．ベンゾキノン活性化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１に記載のように処理したＰＥマイクロフィルターに、２ｍＬの炭酸水素塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で１６時間撹拌した。残存する活性化表面をブロックするために、固定化の後、５μＬのエタノールアミンをこの固定化溶液に添加し、撹拌をさらに２時間継続した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり６．０μｇの固定に成功し、固定化された抗体の３６％が活性であった。
【００６０】
実施例１３：
４，４’‐ジヒドロキシビフェニルジグリシジルエーテル試薬を用いたＮＨ２‐官能化支持体上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１．４，４’‐ジヒドロキシビフェニルジグリシジルエーテルによるＮＨ２‐官能化表面の活性化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルター（ｈ＝２．５ｍｍ、φ＝５ｍｍ、１８０型、Ｐｏｒｅｘ社）を、２ｍＬの５％４，４’‐ジヒドロキシビフェニルジグリシジルエーテル水溶液と共に、室温にて１５分間撹拌した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄の後、マイクロフィルターは固定化に利用可能であった。
【００６１】
２．４，４’‐ジヒドロキシビフェニルジグリシジルエーテル活性化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
１に記載のように処理したＰＥマイクロフィルターに、２ｍＬの炭酸水素塩緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で１６時間撹拌した。残存する活性化表面をブロックするために、固定化の後、５μＬのエタノールアミンをこの固定化溶液に添加し、撹拌をさらに２時間継続した。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり５．５μｇの固定に成功し、固定化された抗体の３５％が活性であった。
【００６２】
実施例１４：
接着性相互作用による抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）のＣＯＯＨ‐官能化支持体上への固定：
１．表面上へのカルボキシ基導入のためのＮＨ２‐官能化表面の再官能化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルターを、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸（ｃ＝４０ｍｇ／ｍＬ）および５μＬのピリジンの溶液の２ｍＬ中で、室温で１６時間撹拌した。無水コハク酸と表面のアミノ基との反応によって、ＰＥマイクロフィルター上にカルボキシ基を導入した。
【００６３】
２．ＣＯＯＨ官能化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定：
抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定化は、１に記載のように処理したマイクロフィルターを水で洗浄した後、２ｍＬの２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で２時間撹拌することで行った。この固定化溶液に１０μＬの１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を添加し、撹拌をさらに６０分間行うことで、残存する活性化カルボキシ基をブロックした。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり５．９μｇの固定に成功し、固定化された抗体の１５％が活性であった。
【００６４】
実施例１５：
接着性相互作用による抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）のＳＯ３Ｈ官能化支持体上への固定：
１．表面上へのスルホン酸基導入のためのＮＨ２‐官能化表面の再官能化：
１０個のＮＨ２‐官能化ＰＥマイクロフィルターを、乾燥ジエチルエーテル中の４，４’‐ビフェニルジスルホン酸ジクロリド飽和溶液の２ｍＬ中で、室温で１５分間撹拌した。４，４’‐ビフェニルジスルホン酸ジクロリドと表面のアミノ基との反応によって、ＰＥマイクロフィルター上に塩化スルホン酸基を導入した。これらのアミノ基を、２ｍＬの０．１Ｍ塩酸で一晩処理することにより加水分解して、表面上のスルホン酸基を得た。
【００６５】
２．ＳＯ３Ｈ官能化表面上への抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定
抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）の固定化は、１に記載のように処理したマイクロフィルターを水で洗浄した後、２ｍＬの２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の７５μｇの抗ｈＣＲＰ抗体（クローン６４０４、Ｍｅｄｉｘ社）を添加し、室温で２時間撹拌することで行った。この固定化溶液に１０μＬの１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を添加し、撹拌をさらに６０分間行うことで、残存する活性化カルボキシ基をブロックした。各々３ｍＬの水による４回の洗浄、およびそれに続く空気流による乾燥の後、ＣＲＰ‐アフィン表面を得た。マイクロフィルターあたり５．８μｇの固定に成功し、固定化された抗体の１５％が活性であった。
【国際調査報告】
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