(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ギ酸濃度が５０重量％以上のギ酸水溶液中においてペクチンを加水分解することを特徴する、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の製造方法。
【請求項２】
加水分解が、前記ギ酸水溶液を加熱することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱が５０℃以上の温度で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記ギ酸水溶液のギ酸濃度が６０重量％以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ギ酸水溶液のｐＨが０．５以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記加水分解の後、ギ酸水溶液を留去し、場合によって析出物をさらに低分子量アルコールによって洗浄することにより、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸を単離することを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記低分子量アルコールが、メタノール、エタノール、およびイソプロパノールまたはそれらの混合物からなる群から選択されたものである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
ポリガラクツロン酸は、カルシウムイオンに対して高い親和性を有することから、スケール防止剤およびスケール沈積物除去剤としての利用が期待されている。また、ポリガラクツロン酸は、生物分解性であることから、環境適用性および廃棄物処理の面で特に有利である。
【０００３】
修飾柑橘系ペクチン（Modified Citrus PectinまたはＭＣＰ）は、経口投与すると、ラット前立腺癌モデルにおける自然転移を阻害することが報告されている（K.Pienta,H.Naik,A.Akhtar,K.Yamazaki,T.Replogle,J.Lehr,T.Donat,L.Tait,V.Hogan, and A.Raz,Journal of the National Cancer Institute,87(5),348-53(1995)）。さらに、ポリガラクツロン酸は、マウスの免疫調節活性、例えば、分裂性、アジュバント活性、インターフェロン誘発活性、マクロファージ活性化活性および抗腫瘍活性を示すことも報告されている（Y.Kumazawa,K.Mizunoe, and Y.Otsuka, Immunostimulating Polysaccharide Separated from Hot Water Extract of Angelic Acutiloba Kitagawa Yamato Tohki,Immunology,47,75-83(1982)）。また、ポリガラクツロン酸は、植物防御刺激活性を示すことも明らかにされている（E.A.Nothnagel,M.McNeil,P.Albersheim, and A.Dell, Host-Pathogen Interactions XXII.A Galacturonic Acid Oligosaccharide from Plant Cell Walls Elicits Phytoalexins,Plant Physiology,71,916-926(1983)）。
【０００４】
さらに、疎水性ポリマーがポリガラクツロン酸の還元性末端に共有結合したポリガラクツロン酸誘導体は、インクジェット記録用顔料分散水系インク組成物における分散剤としても有用である。
【０００５】
ポリガラクツロン酸を得ることができるペクチンは、果実および野菜、例えば、レモン、ライム、グレープフルーツ、オレンジ、マンゴ、リンゴ、ヒマワリ、テンサイ、ジャガイモ、の天然ヒドロコロイド成分である。ペクチンは、１→４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸メチルエステルおよび１→４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸を主成分としている。ペクチンのガラクツロン酸メチルエステルとガラクツロン酸の合計含量は、典型的には約７０％を超える。ポリガラクツロネート配列は、１→２結合Ｌ−ラムノース単位により中断されている場合がある。また、ペクチンは、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびフコース等の中性糖単位から主としてなる分岐鎖を含有している。
【０００６】
ペクチンは、実質的に水に不溶な形態で果実や野菜に存在しており、これはプロトペクチンと呼ばれる。ペクチンは、柑皮、リンゴの絞りかすまたはテンサイパルプの、希酸性熱水溶液を用いた抽出により、プロトペクチンから得られる。酸抽出中、ガラクツロン酸メチルエステル単位の一部分が脱エステル化され、これによりガラクツロン酸単位となる。抽出工程を慎重に制御することによって、ガラクツロン酸メチルエステル単位：ガラクツロン酸単位比が２０：１（より典型的には約２：１）のペクチンを得ることができる。ペクチンをさらにアルカリ性または酸性水溶液で処理すると、さらなる脱エステル化を生じさせることができる。通常、用語「ペクチン」は、ガラクツロン酸単位が酸の形態で存在するペクチン多糖、若しくはガラクツロン酸単位が塩基中性塩の形態で存在するペクチン多糖、またはそれらの混合物を意味する。典型的な市販のペクチンは、水溶液のｐＨ値が約３．３〜約６の範囲であるように実質的に中和される。また、通常、ガラクツロン酸メチルエステル単位：ガラクツロン酸単位比が１：１９以下であるペクチンがペクチン酸と呼ばれる。厳密に言えば、ペクチン酸は、この物質の酸型を指す。ペクチン酸塩類は、ペクチン酸を適当な塩基で中和することにより得ることができる。
【０００７】
好適な前駆体の酸加水分解、アルカリ加水分解または酵素的加水分解を用いて低エステル化度および高ポリガラクツロン酸含量の低分子量ペクチンを得ることができることは、当該技術分野において周知である。これらの方法の例を、以下、より詳細に述べる。
【０００８】
典型的な酸加水分解法は、R.Kohn、"The Activity of Calcium Ions in Aqueous Solutions of the Lower Calcium Oligogalacturonates",Carbohydrate Research,20,351-356(1971)に記載されている。ここに述べられている酸加水分解では、ペクチン酸を水酸化ナトリウムで中和することにより、ペクチン酸のナトリウム塩の１重量％溶液を調製する。出発原料であるペクチン酸は、市販のリンゴペクチンから、アルカリ脱エステル化処理を繰り返すことにより得られる。次に、ペクチン酸のナトリウム塩の溶液を、希薄硫酸の滴下により酸性化してｐＨ３．３とする。同じ酸を断続的に添加することにより溶液のｐＨを３．３に維持しながら、得られた溶液を、１００℃で１７時間加熱する。溶液を冷却し、濾過し、濾液を最小量の炭酸バリウムで中和する。次に、中和溶液を、酸型イオン交換樹脂（Ｚｅｒｏｌｉｔ  ２２５−Ｈ＋）カラムに通す。集めたイオン交換溶液を減圧濃縮して、出発溶液の容積の３分の１とする。次に、４容のエタノールを添加してオリゴマー生成物を析出させる。低平均重合度のポリガラクツロン酸生成物を、濾取し、エタノールで洗浄し、乾燥する。
【０００９】
上記酸加水分解法は、ポリガラクツロン酸を実験規模で調製するのに有効と考えられるが、工業生産のような大規模で実行するのは困難と思われる。これは、出発物質であるペクチン酸の濃度が１重量％とわずかだからである。さらに、上記酸加水分解法は、複数の工程からなり、複雑である。さらに、上記水溶液から生成物を単離するのに、水溶液の容積よりも比較的大容積のエタノールを必要とする。
【００１０】
この方法を工業的規模で実行するにあたり課題となると思われる点をさらに指摘する。まず、溶媒である水は毒性および安全取扱い性の面で数多くの利点があるが、いくつか不利となる点がある。第一に、水を溶媒として用いたペクチン溶液は極めて粘性であり、したがって、撹拌することが困難である。さらに、ペクチン水溶液が高粘度であるために、初期ペクチン濃度が最大約１または２％に制限される。第二に、ペクチンは、ｐＨ値が約３を超える水にしか溶解しない。加水分解速度を増加させる観点からは、より低いｐＨ値が望ましいが、水においては、約３より低いｐＨ値では、出発物質であるペクチンが析出してしまう。第三に、水は比較的高い蒸発熱（５４０ｃａｌ／ｇ）を有し、他の普通溶媒と比較して、水を蒸発させて除去するのに比較的エネルギーを必要とする。生成物であるガラクツロン酸が極めて水溶性であるので、水を部分的または完全に蒸発除去することが、水を溶媒として使用したいずれかの実用的な工業法で生成物を単離するのに必要である。
【００１１】
典型的なアルカリ加水分解法が、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０４８７３４０Ａ１「Coating for Food Composition Limiting Fat Absorption upon Frying」に記載されている。ここに記載されているアルカリ加水分解では、６０％イソプロパノール水溶液にペクチンを添加した１０重量％スラリーを調製する。次に、エステルまたは酸には関わりなく、ガラクツロニドの１当量当たり３当量の固形水酸化ナトリウムをスラリーに添加する。このスラリーを４０℃で２日間撹拌して、脱重合と脱エステル化を生じさせる。得られた生成物を濾過し、フィルターケーキを、６０％イソプロパノール水溶液で洗浄することによって過剰のアルカリを除去する。鉱酸を添加してフィルターケーキのｐＨを４〜６に調整する。次に、酸性化された生成物を乾燥させる。この方法によれば、平均分子量が２０００〜２０，０００の範囲にある高ポリガラクツロン酸含量を有する低分子量ペクチン生成物が得られる。この平均分子量の範囲は、平均重合度１０〜１１０に相当する。この公報に記載の具体例では、低分子量ペクチンの平均重合度は約７０であり、ガラクツロニドの４％はエステル化された状態のままである。
【００１２】
上記アルカリ加水分解法は、食物コーテイング組成物を調製するのに有用であるが、この方法をポリガラクツロン酸の調製に適用するには２つの問題がある。第１に、当該技術分野において周知なように、ペクチンのアルカリ加水分解の機構が、アルカリ触媒β−アルコキシ脱離であり、得られた低分子量生成物の非還元末端を不飽和ウロン酸、とりわけ４−デオキシ−ヘキセ−４−エノピラノシルウロン酸として離脱させる。したがって、厳密に言えば、これらの生成物は、モノマー単位の全てがガラクツロン酸ではないのでポリガラクツロン酸とはみなされない。第２に、不均一プロセスである上記アルカリ加水分解は、再現性よく実行することが困難であると予想される。
【００１３】
典型的な酵素的加水分解法が、Y.K.Liu, and B.S.Luh、"Quantitative Aspects of Pectic Acid Hydrolysis by Endo-polygalacturonase from Rhizopus Arrhizus",Journal of Food Science,45,601-604(1980)に記載されている。この酵素的加水分解では、Rhizopus arrhizusで感染させたアンズから単離したエンドポリガラクツロナーゼ（ＲＡＰＧ）を使用している。加水分解では、ペクチン酸のナトリウム塩の０．４５重量％溶液を、ｐＨ５の０．０３Ｍ酢酸／０．０６Ｍ塩化ナトリウム緩衝液により調製する。ペクチン酸溶液１０ｍＬ当たり０．１ｍＬの精製ＲＡＰＧ（標準アッセイで測定したときのポリガラクツロナーゼ単位が０．６２）を使用する。３０℃で４８時間ＲＡＰＧにより加水分解した後の主要生成物は、ガラクツロン酸（ＧＡと略する；６．５％）、ＧＡダイマー（１８％）、ＧＡトリマー（５５．０％）、ＧＡテトラマー（６．６％）、ＧＡペンタマー（５．１％）、ＧＡヘキサマー（３．０％）および少量の他のオリゴマーである。この報告に記載されている分析によれば、ＲＡＰＧが、重合度が約２４であるペクチン酸と最も迅速に反応する。
【００１４】
上記酵素的加水分解法は実験規模の調製には有用と考えられるが、工業生産に使用されるような大規模で実施することは困難と思われる。その理由は、出発物質であるペクチン酸の濃度が０．４５重量％とわずかだからである。さらに、酵素からの生成物の単離は、容易なことではないと予想されるからである。
【００１５】
低エステル化度および高ポリガラクツロン酸含量を有する低分子量ペクチンを調製するための上記方法に加えて、従来法の一例として、野菜原料からペクチンを抽出するために希薄ギ酸水溶液を使用する方法が知られている。具体的には、ロシア特許第２０９５３７１Ｃ１号において、ｐＨ２〜４、温度４５〜５０℃の希釈酸水溶液を用いて野菜原料からペクチンを単離する抽出法が記載されている。希釈酸水溶液に使用される酸には、ギ酸、酢酸、シュウ酸およびクエン酸などがある。６つの実施例の全てにおいて、単離された生成物の重合度は、８０を超えるものであった。希釈酸水溶液を中和し、中和した水溶液を減圧濃縮した後、アルコールによりペクチンを析出させ、抽出されたペクチン生成物を単離している。
【００１６】
この方法ではギ酸が使用されているが、希釈されて使用されている。また、この方法は、熱希釈酸性水溶液を用いて適当な天然源を抽出することにより、プロトペクチンからペクチンを得るための当該技術分野において公知の方法の延長線上の態様にすぎないと解される。さらに、抽出条件は、比較的高重合度のペクチンが得られるように穏やかなものとされている。
【００１７】
上記例から明らかなように、工業的規模で容易かつ効率的に実施できる、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の製造方法への希求が存在している。また、本発明者の知る限りでは、高濃度のギ酸水溶液を溶媒としたペクチンの加水分解は知られていない。
【００１８】
【発明の概要】
本発明者は、今般、比較的濃度の高いギ酸水溶液が、ペクチンの酸加水分解に有用な溶媒であることを見いだした。比較的少量の水を含有するギ酸中でペクチンを比較的短時間加熱すると、ペクチン溶液の粘度が急速に減少することが判明した。平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の混合物は、溶媒を蒸発させた後、非ポリガラクツロン酸副生成物を選択的に洗い流すことにより、溶液から容易に単離される。
【００１９】
従って、本発明は、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の実用的な製造方法を提供することを目的としている。
【００２０】
そして、本発明による平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸の製造方法は、ギ酸濃度が５０重量％以上のギ酸水溶液中においてペクチンを加水分解することを特徴するものである。
【００２１】
【発明の具体的説明】
目的生産物：平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸
本発明による方法によって得られる目的生産物は、平均重合度が４０未満であるポリガラクツロン酸である。本発明による方法にあっては、出発物質であるペクチンが天然物から得られることを主な要因として、ポリガラクツロン酸は種々の重合度のものの混合物として得られるのが一般的である。この混合物中のポリガラクツロン酸の平均重合度が４０未満である限りにおいては、重合度が４０を越えるポリガラクツロン酸が混合物に含まれることは許容される。
【００２２】
反応溶媒としてのギ酸水溶液
本発明にあっては、ペクチンの酸加水分解用の反応溶媒として、比較的濃度の高いギ酸水溶液、言い換えれば比較的少量の水を含有するギ酸、を使用する。具体的には、ギ酸濃度が５０重量％以上のギ酸水溶液中で、ペクチンを加水分解する。本発明の好ましい態様によれば、ギ酸水溶液のギ酸濃度は６０重量％以上がより好ましく、最も好ましくは７０重量％以上である。濃度５０重量％以上のギ酸水溶液の利用は、種々の利点をもたらす。
【００２３】
まず、ペクチンは濃度５０重量％以上のギ酸水溶液容易に溶解し、約１０％以上の濃度のペクチン溶液を容易に与える。水と比較したとき、このような大きな濃度を実現できることは、工業的規模での実施に極めて有利である。
【００２４】
また、ペクチンの加水分解の速度は、水の濃度と溶液の酸性度とにより主に影響されると考えられるが、ギ酸濃度が５０％以上のギ酸水溶液中にあっては加水分解が顕著に効率よく進行し、エネルギーおよび時間効率の観点から好ましい。ここで、水は加水分解に必要な反応剤であり、理論量の存在は必須であるが、加水分解の効率の観点から約５重量％程度、より好ましくは約１０重量％程度の水の存在が好ましいと考えられる。
【００２５】
また、ギ酸の蒸発熱は比較的小さい（１１５ｃａｌ／ｇ）ことから、例えば水（蒸発熱：５４０ｃａｌ／ｇ）と比較して、経済的にその除去および回収できるとの利点も得られる。
【００２６】
市販のギ酸は、典型的には２％、１２％、１５％、および２０％の量の水を含有してなる。１２％グレードおよび１５％グレードが、最も一般的に入手可能である。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、加水分解はギ酸水溶液を加熱して行われ、具体的には５０℃以上の温度が好ましく、より好ましくは１００℃以上である。また、加水分解中のギ酸水溶液のｐＨは、水を反応溶媒としたときと異なり、反応中調整される必要はないが、ｐＨ０．５以下であることが好ましく、より好ましいｐＨは０以下である。
【００２８】
本発明が以下の理論により限定されないことを条件に、本発明の生成物であるポリガラクツロン酸の生成の機構を予測すれば、主に反応速度がかなり異なる三つの加水分解反応によるものと思われる。１→４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸メチルエステル単位の対応の１→４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸単位への脱エステル化加水分解は、三種の主要な加水分解反応のうちで最も速いと思われる。これは、脱エステル化が、通常のペクチンの製造方法において、柑皮、リンゴの絞りかすおよびテンサイパルプのおだやかな酸水溶液処理中に極めて容易に生じるという事実に基づくものである。Ｌ−ラムノース−α−Ｄ−ガラクツロン酸結合の加水分解は、三種の主要な加水分解反応のうちで次に速い速度であると思われる。最後に、１→４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸単位の加水分解は、三種の主要な加水分解反応のうちで最も遅い速度であると思われる。最後の二つの反応速度の順序は、（１）本発明の生成物であるポリガラクツロン酸にはＬ−ラムノース単位が見られなかったことと、（２）単離された生成物であるポリガラクツロン酸を、比較的少量の水を含有する熱ギ酸中で第二処理しても、ポリガラクツロン酸の平均重合度が顕著には減少しないことによる。たとえ、反応化学が上記したように正確に生じないとしても、ペクチンの加水分解用反応媒体としての比較的少量の水を含有するギ酸が有用であることには変わりがない。
【００２９】
ペクチン
本発明において出発物質として使用されるペクチンは、市販されているペクチンであってよい。柑橘類ペクチンやリンゴ製ペクチンは市場において周知である。しかしながら、テンサイおよびジャガイモ等の一般的ではないペクチンも、本発明において利用可能である。ポリガラクツロン酸が目的物質であるので、ガラクツロン酸リッチペクチンが、ガラクツロン酸含量がもっと低いペクチンよりも出発物質として好ましいと一般的には考えられるが、上記した加水分解反応速度の順序が正しいことを前提として、ラムノース単位が均等な間隔で位置し、ラムノース単位間のポリガラクツロン酸鎖が４０単位の長さかそれ以下の長さであるペクチンが、総ポリガラクツロン酸含量とは無関係に、ラムノース単位が不規則な間隔で位置し、ラムノース単位間のポリガラクツロン酸鎖の長さが４０単位を超えるペクチンよりも好ましいと思われる。従って、柑橘類ペクチンよりも、リンゴ製ペクチンの利用が本発明にあっては好ましい。さらに、本発明にあっては、ペクチンの純度および交雑物の量は限定されない。市販のペクチンは食品用途を前提としているため一般に純度が高く、交雑物の量が制限されている。しかし、最終生成物として得られたポリガラクツロン酸の用途が許す場合には、さらにはポリガラクツロン酸の精製を十分に行うことができる場合には、出発物質たるペクチンが低純度であっても、また交雑物が存在しても、それらは本発明にあっては許容される。例えば、リンゴ製ペクチンの場合、リンゴの皮を圧搾して得られた程度のペクチン含有物を出発物質として利用することも可能である。また、出発物質であるペクチンの平均分子量は限定されないのは無論である。高メトキシペクチンが、低メトキシペクチンよりも好ましい。このことは、低メトキシペクチンが高メトキシペクチンより一般的に高価であるので問題がない。
【００３０】
好ましい具体的態様
本発明の好ましい態様によれば、上記したCarbohydrate Research,20,351-356(1971)における方法において、溶媒としての水を、ギ酸濃度が５０重量％以上のギ酸水溶液に置き換えた方法を、本発明をその好ましい具体的態様として挙げることができる。この態様を例に、本発明による方法をさらに説明する。
【００３１】
その第一の工程として、ペクチンを、好ましくは加熱したギ酸水溶液に溶解する。得られた溶液におけるペクチンの最大濃度は、ギ酸中の水の濃度、溶液の温度、ペクチンの種類およびペクチンの平均分子量などのいくつかの因子に依存するが、ペクチン濃度が５〜１５％の範囲である溶液を容易に得ることができ、また、その程度の濃度が好ましい。
【００３２】
本発明の好ましい方法によれば、ギ酸水溶液の温度は５０℃以上である。出発物質であるペクチンを溶解するのに、より低い温度を使用してもよいことが、溶解速度および加水分解速度は温度とともに増加するので、低温よりも高温が好ましい。
【００３３】
この溶解工程およびこれに続く加水分解工程は、好ましくは酸素を排除した不活性雰囲気下で実施するこのとが好ましい。具体的には、高純度窒素雰囲気下において行われることが好ましい。溶解工程とそれに続く加水分解工程のいずれにおいても、ギ酸水溶液は撹拌することが好ましい。
【００３４】
第二工程では、第一工程で調製した溶液を、５０℃以上の温度で、目的とするポリガラクツロン酸の平均重合度値が得られるような時間、加熱する。この反応は温度が高いほど速く、１００℃以上の温度が好ましい。ギ酸（７７．５％）／水（２２．５％）共沸混合物の１気圧での沸点は、１０７．３℃である。１気圧を超える圧力下で加水分解を実施することにより、温度をより高くしてもよい。目的とする平均重合度の値が得られるのに要する時間は、ギ酸中の水の濃度、溶液の温度、ペクチンの種類およびペクチンの平均分子量などのいくつかの因子に依存するが、例えば、８５％重量％ギ酸水溶液の還流温度では、市販のリンゴ製ペクチンから、平均重合度４０未満のポリガラクツロン酸を得るのに、数時間程度の加熱時間を必要とする。
【００３５】
加水分解の後、生成したポリガラクツロン酸を水溶液から単離する。一般的に、酸性水系溶媒中における加水分解を行った場合、遊離酸型の生成物を得るためには、生成物の単離の前に溶液を酸性化することが必要とされる。この酸性化は、強酸を添加するか、または溶液を酸型イオン交換カラムを通過させることにより行うことができる。しかしながら、本発明による方法にあっては、ギ酸は、ポリガラクツロン酸生成物を遊離酸の形態で与えるのに十分な程度に強い酸である。つまり、本発明にあっては、ポリガラクツロン酸生成物を遊離酸の形態で得るために強酸の添加または酸型イオン交換カラムを通過させる操作を必要とせず、これは本発明の別の利点でもある。
【００３６】
生成したポリガラクツロン酸の単離は、（１）溶剤および揮発性加水分解副生成物の留去、（２）ギ酸水溶液と混和性を有し、生成物が不溶である溶媒を用いた選択的析出、または（３）上記（１）と（２）との組み合わせ、により実施される。具体的には、その単離は、（ｉ）ギ酸−水共沸混合物、水、ギ酸、および／または揮発性加水分解副生成物の完全または部分的な蒸発、（ii）ギ酸水溶液と混和性を有し、生成物が不溶である溶媒を用いた選択的析出、または（iii）上記（ｉ）と（ii）との組み合わせにより行うことができる。
【００３７】
従って、例えば、加水分解の工程として、ギ酸水溶液の実質的に全量を、固形物含有生成物から留去する。この留去は大気圧下または減圧下で実施できる。出発物質であるペクチンの初期エステル化度に応じて、一定量のメタノールまたはギ酸メチルが、留去されたギ酸水溶液に含有されると思われる。このメタノール／ギ酸メチルは、留去されたギ酸水溶液のバルクから、先留出分を分離することにより回収できる。留去されたギ酸水溶液は再使用可能である。
【００３８】
そして最後の工程として、固形物含有生成物を低分子量アルコールで洗浄することにより、廃棄物を生成物であるポリガラクツロン酸から除去する。この低分子量アルコールは、メタノール、エタノールおよびイソプロパノール、またはそれらの混合物からなる群から選択されるものである。洗液を、濾過および遠心分離を含む当該技術分野において公知のいずれかの方法により生成物から分離してよい。次に、洗浄した生成物を、常法により乾燥してよい。
【００３９】
以上の方法は段階バッチ法であるが、本発明による方法は、連続法として実施することも可能である。最初の二工程（混合および加熱）は、連続流動溶媒を用いたある種の流動反応器で実施できる。反応床の物理的長さを短く保つために、おそらく高圧および高温を使用する必要となると思われる。同様に、連続噴霧乾燥機を使用して留去を実施することも可能である。噴霧乾燥物の洗浄は、向流法を用いて実施でき、その後洗浄物を噴霧乾燥により再び乾燥できる。バッチ処理と連続処理との組み合わせも、また本発明の範囲内である。
【００４０】
単離した生成物であるポリガラクツロン酸は、ＮＭＲ、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよび末端基分析等の当業者に公知の種々の手法で分析できる。１ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲにより、非ガラクツロン酸糖類汚染の程度、すなわち試料の純度についての情報を得ることができる。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーとＨＰＬＣの両方とも、校正標準が入手できかつそれを使用するならば、平均重合度についての情報を得ることができる。標準は、分取ＨＰＬＣによりポリガラクツロン酸の多成分混合物から単離できる。平均重合度を測定するのに有用な一つの末端基分析法に、P.A.ShafferおよびM.Somogyi、J.Biol.Chem.,100,695-713(1993)に記載されている銅−ヨウ素還元滴定法が挙げられる。
【００４１】
【実施例】
本発明を、以下の具体的実施例によりさらに説明する。全ての操作は、十分換気されたドラフトフード内で実施した。
【００４２】
ポリガラクツロン酸の調製
温度計、オーバーヘッド機械式攪拌機およびコンデンサを備えた四つ口１リットル丸底フラスコを、可変温度制御加熱マントル内に密着配置した。８８％試薬級ギ酸（関東化学株式会社）４１０ｇを、フラスコに移した。次に、ギ酸を、穏やかに撹拌しながら、１００℃に暖めた。激しく撹拌しながら、リンゴ製ペクチン（Herbstreith & Fox, Classic AM201,ドイツ国）４５ｇを、粉末漏斗を用いて熱ギ酸に徐々に添加した。窒素を勢いよく流して系を迅速にパージした後、フラスコの４つ目の口をガラス栓で密封した。パージ後、オイルバブラーに接続した窒素入り口アダプタをコンデンサの上部に取り付けて、オイルバブラーを通して窒素をゆっくりと制御して流し始めた。６０分間激しく撹拌した後にペクチンは完全に溶解した。次に、溶液を適度に撹拌しながら、溶液を加熱還流させた。加熱還流および撹拌を３時間継続した後、脱イオン水１９０ｇを熱溶液に添加した。合わせた溶液を、さらに４時間、還流しながら加熱撹拌した後、溶液を約４０℃に冷却した。＃１Whatmanフィルターにより温溶液を１リットルエルレンマイヤーフラスコに濾過して少量の褐色の不溶性不純物を除去した。採取した濾液を、１リットルナス形フラスコに移した。循環型アスピレータを備えたロータリーエバポレーターを用い、水浴を７０℃に設定して、粘性のある淡褐色油がフラスコに残存するまで溶媒を蒸発させた。エタノール７００ｍＬをフラスコに添加したところ、灰色がかった白色の結晶固形物がただちに析出した。アスピレータを用いて採取フラスコ内を減圧しながら、微細孔（細孔サイズ：１６〜４０ミクロン）ガラスフィルターにより固形物を濾取した。得られた固形物を、エタノール約４００ｍＬづつで二回洗浄した後、自然乾燥させた。最後に、固形物を一定重量となるまで減圧乾燥した。生成物の収量は、１４．９ｇであった。
【００４３】
生成物の重合度をP.A.ShafferおよびM.Somogyi(J.Biol.Chem.,100,695-713(1993)の方法を用いて測定したところ、２６．２であった。また、生成物を、ｄ６-ＤＭＳＯとｄ１-トリフルオロ酢酸との混合溶液中での１Ｈ-ＮＭＲ、およびＤ２Ｏ中での１３Ｃ-ＮＭＲにより特性付けした。１Ｈ-ＮＭＲのための混合溶液はS. A. RossおよびG. Lowe(Tetrahedron Letters, 41, 3225-3227(2000))の記載に従った。この溶媒によって、混入した水のプロトンのシグナルは、大きく低磁場にシフトした。１３Ｃ-ＮＭＲのサンプルとして標準パルスの順番が使用され、１６０００捜査についてデータを収集した。その結果、両方のスペクトルが、高純度ポリガラクツロン酸の混合物と一致した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｄ６-ＤＭＳＯおよびｄ１-トリフルオロ酢酸中、室温で測定したポリガラクツロン酸試料の１ＨＮＭＲスペクトルである。０から１１ppmの範囲のスペクトルが示されている。テトラメチルシランのピークを標準として用いたところ、水のプロトンが７．８ppm、ジメチルスルフォキシドのプロトンが２．５ppm、そして不純物のエタノールのアルキル基のプロトンが１．１と３．２ppmで吸収を示した。
【図２】Ｄ２Ｏ中、室温で測定したポリガラクツロン酸試料の１３ＣＮＭＲスペクトルである。６０から１８５ppmの範囲のスペクトルが示されている。
【図１】
0004221946.tif 000002
【図２】
0004221946.tif 000003