(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用遺伝子の発現増強のために、遺伝子発現ベクターに組み込まれる有用遺伝子発現増強用核酸であって、
以下のヌクレオチド配列、すなわち、
0004390392.tif 000017
（配列番号：１、ヌクレオチド第１８１〜３４１位）、
0004390392.tif 000018
（配列番号：１、ヌクレオチド第１〜３４１位）、
0004390392.tif 000019
（配列番号：１、ヌクレオチド第１８１〜７１３位）、及び
0004390392.tif 000020
0004390392.tif 000021
（配列番号：１）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列において、配列番号：１の第２０７位に相当する位置にチミジンが挿入された核酸配列もしくはその断片またはその変異体が有する核酸配列を含む有用遺伝子発現増強核酸。
【請求項２】
翻訳増強活性を有することにより有用遺伝子の発現を増強する請求項１に記載の有用遺伝子発現増強用核酸。
【請求項３】
ＩＲＥＳ活性を増強することにより有用遺伝子の発現を増強する請求項１または２に記載の有用遺伝子発現増強用核酸。
【請求項４】
0004390392.tif 000022
（配列番号：７）を含み、ＩＲＥＳ依存的にｍＲＮＡ翻訳を増強することにより、有用遺伝子の発現を増強させることを特徴とする有用遺伝子発現増強核酸。
【請求項５】
0004390392.tif 000023
（配列番号：７）からなる単離された有用遺伝子発現増強核酸。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の有用遺伝子発現増強核酸を含む、遺伝子発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子発現ベクターを用いて有用遺伝子産物を発現させる方法。
【請求項９】
請求項７に記載の宿主細胞を培地中で生育させ、該細胞および／または生育培地から有用遺伝子産物を単離する工程を含む、有用遺伝子産物の製造方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の遺伝子発現ベクターを用いて有用遺伝子産物を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、遺伝子発現用のベクターにおいて、有用遺伝子の発現を増強することができる有用遺伝子発現増強核酸配列、当該有用遺伝子発現増強核酸配列を含むベクター、当該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、ならびに当該ベクターを用いた有用遺伝子産物の製造方法、および有用遺伝子の発現を当該ベクターを用いて増強させる方法に関する。さらに詳細には、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子産物の生産量を増加させることができ、従って種々の実験用途の他に、臓器や腫瘍などに特異的であるがその活性が弱いために実用化が難しかったプロモーターと組み合わせることによって効果的な遺伝子治療にも応用することができる、有用遺伝子発現増強核酸配列に関する。また、この有用遺伝子発現増強核酸配列は、ＩＲＥＳとの相互作用性物質や翻訳開始因子のスクリーニングのほか、種々の疾患の治療、予防や診断にも利用される。
〔背景技術〕
ｍＲＮＡの翻訳開始機構には、キャップ依存的機構とキャップ非依存的機構が存在することが知られている。原核細胞系ｍＲＮＡの５’末端構造はｐｐｐＮであるが、真核細胞のｍＲＮＡは５’末端にキャップ構造（（７−ＭｅＧ）−５’−ｐｐｐ−５’−（Ｇ／Ａ）−３’−ｐ−）（Ｇ、Ａのリボース部分はメチル化されることもある）を有している。このキャップ構造は核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送過程に寄与し、ｍＲＮＡをＲＮａｓｅから保護する役割を有している。真核細胞の細胞質では、キャップ結合蛋白質複合体ｅＩＦ４Ｆ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ｅＩＦ）のキャップ構造への結合により、リボソームの４０ＳサブユニットのｍＲＮＡ５’末端へのエントリーが促進され、ｍＲＮＡの５’末端にエントリーしたリボソームは、１００塩基前後と短い５’非翻訳領域をスキャンニングして、ｍＲＮＡ上を３’方向に移動し、多くの場合、最初に出会うＡＵＧ配列を開始コドンとしてペプチド合成が行われる。
しかしながら、以上のようなキャップ依存的翻訳開始機構とは異なる真核細胞系ｍＲＮＡの存在が確認された。真核細胞系ｍＲＮＡの５’末端にキャップ構造の存在が明らかにされていたが、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）ｍＲＮＡの５’末端はキャップ構造ではなく、単なるｐＵであることが報告された（Ｎｏｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５３４５，１９７７）。その後、ポリオウイルスＲＮＡの全一次構造が解明され、詳細な遺伝子地図も明らかとなった（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，２９１，５４７，１９８１）。その結果、開始コドンＡＵＧはｍＲＮＡの７４３番目の塩基に位置しており、その上流に多くのＡＵＧ配列が存在していることが判明した。この様なｍＲＮＡの構造は、ポリオウイルスの仲間のウイルス（ピコルナウイルス科のウイルス）に共通であることも明らかにされた。さらに、ポリオウイルス（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３２０，１９８８）と脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＥＭＣＶ）（Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２，２６３６，１９８８）のＲＮＡを使用した実験により、キャップ非依存的翻訳開始機構（内部開始モード）の存在が証明され、リボソームはｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ；５’−ＵＴＲ）内に存在する塩基配列を認識し、エントリーすることが判明した。リボソームのエントリーに必要な領域は、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（内部リボソームエントリー部位））と言われている。
ピコルナウイルスＲＮＡの５’−非翻訳領域は約６００〜１２００塩基であり、この領域の中の約４５０塩基がＩＲＥＳ活性を有している。これらピコルナウイルスＩＲＥＳ中には共通構造が存在し、ピリミジンリッチ領域（（Ｃ／Ｕ）ｘ）とそれに続くＡＵＧを含む約７塩基の配列がある。両者の間には１０〜２０塩基のランダムな塩基配列（Ｎｙ）が介在している（Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｔｈａｃｈ，Ｒ．Ｅ．ｅｄ．，２９２−３０９，Ｋａｒｇｅｒ，１９９０）。ピリミジンリッチ領域とは、ピリミジン塩基が連続して少なくとも４〜５以上存在している領域をいう。かかる（Ｃ／Ｕ）ｘ−Ｎｙ−ＡＵＧのユニットがＩＲＥＳにとって必要な構造の一つであることが考えられ、実際にＡＵＧを含む塩基配列を欠損させるとＩＲＥＳ活性は低下し、さらに（Ｃ／Ｕ）ｘ全域の欠損によりＩＲＥＳ活性が消失することが知られている（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１，１４７８，１９８７、Ｉｉｚｕｋａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，４８６７，１９９１）。一般に、（Ｃ／Ｕ）ｘの配列の領域をＢｏｘＡ、ＡＵＧを含む約７塩基の配列の領域をＢｏｘＢと言う。両Ｂｏｘは、１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の３’末端と相補性を示すため、ＩＲＥＳは原核生物系ｍＲＮＡのシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）と類似した機能を有するものであると考えられる（Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ，Ｅ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ，６８，１１９，１９９２）。
ピコルナウイルスＩＲＥＳは、その構造上の特徴により２つの型に分類されており、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）とラノウイルスのＩＲＥＳを１型、カルジオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）とアフトウイルス（ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）のＩＲＥＳを２型と分類している。また、ヘパトウイルス（ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）のＩＲＥＳは２型に類似していると考えられている。
１型ＩＲＥＳの場合、リボソームは（Ｃ／Ｕ）ｘ−Ｎｙ−ＡＵＧユニット下流をスキャンニングし、最初に出会うＡＵＧを開始コドンとしてペプチド合成を開始する。実際に、開始コドンＡＵＧの前にＡＵＧ配列を挿入すると、ウイルス複製は著しく阻害される（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３，１０６９，１９８９、Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７，１７５，１９８９）。２型のＩＥＲＳの場合には、（Ｃ／Ｕ）ｘ−Ｎｙ−ＡＵＧユニット内のＡＵＧが開始コドンとして使われている。
１９８９年、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体として、プラス一本鎖ＲＮＡウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶ）が報告された（Ｃｈｏｏ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９，１９８９）。臨床においては慢性感染を経て高率に発生する肝硬変・肝細胞癌（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６５４７，１９９０）が問題となっている。現在までに、少なくとも４０株のＨＣＶゲノムの全塩基配列が決定された。全長約９６００塩基のゲノムＲＮＡは、３４１塩基前後の５’非翻訳領域、３００８〜３０３７アミノ酸残基のポリペプチドをコードする翻訳領域、２００〜３００塩基の３’非翻訳領域より成り、３’非翻訳領域はポリＵ／Ｃ配列の後、９８塩基の３’Ｘと呼ばれる構造で終わる。ポリペプチドはフラビウイルスもしくはペスチウイルスに類似しており（Ｋａｔｏ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５２４，１９９０、Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５，１９９１）ウイルス蛋白質にはＮ末からＣ／ｃｏｒｅ，Ｅ１，Ｅ２，ｐ７，ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａと名付けられている。Ｅ２に相当する領域は、フラビウイルス属では非構造蛋白質ＮＳ１、ペスチウイルス属ではエンベロープ蛋白質Ｅ２である。ＨＣＶはかつてＥ２／ＮＳ１と呼ばれたが、ペスチウイルス属に近い性質を示し、エンベロープ蛋白質であると予想されるようになったため、最近では単にＥ２と言う。塩基配列の相同性からウイルスの遺伝子型には少なくとも６個、最大で１１個の遺伝子型が存在することが報告されている。
ウイルス分類学上、ＨＣＶは後に同定されたＧＢウイルス／Ｇ型肝炎ウイルスとともにフラビウイルス科の独立した一属に分類される。ＨＣＶの塩基配列中、５’末端非翻訳領域には、通常真核細胞が行っているｍＲＮＡからのキャップ依存性の蛋白質への翻訳とは異なった、ピコナウイルスなどに認められる内部翻訳開始領域ＩＲＥＳが存在することが発見されている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４７６，１９９２）。このＩＲＥＳはピコルナウイルスＩＲＥＳより短い塩基配列で活性を示し、両者全く異なる二次構造が予想されている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４７６，１９９２、Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２０，５０４１，１９９２）。一方このＨＣＶのＩＲＥＳ領域にも、１８Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端に相補的なＢｏｘＡおよびＢｏｘＢに相当する塩基配列が観察されている（Ｎｏｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．；ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｓｈｉｒｉ，Ｓ．，Ｏｄａ，Ｔ．ｅｄｓ．，１１８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）。ＨＣＶのＩＲＥＳ領域の推定構造については、図１を参照されたい。図中、前記ＢｏｘＡに相当するピリミジンリッチ領域および前記ＢｏｘＢに相当する、ＡＵＧを含む約７塩基の配列を太線で示し、ＢｏｘＡの上流に存在するピリミジンリッチ領域を二重線で示し、トランス因子（後述）の結合部位に囲みを付した。
しかしながら、最近、ＩＲＥＳ活性が同定されたペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ、フラビウイルス科）のＩＲＥＳには、二次構造こそＨＣＶのＩＲＥＳに似ているものの（Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２０，５０４１，１９９２）、ＢｏｘＡおよびＢｏｘＢに相当する塩基配列は存在しない。最近次々に発見されている植物ウイルスのＩＲＥＳは、さらに短い塩基配列で活性を示し、ＢｏｘＡやＢｏｘＢに相当する塩基配列は保持されていない。これらの結果から、両ＢｏｘはＩＲＥＳ活性にとって必ずしも必須でないことが示される。ＩＲＥＳの機能発現様式は様々であり、キャップ依存的翻訳開始機構のような画一的な機構では説明しきれない可能性がある。
ＨＣＶでは、翻訳の開始は５’部位に存在するＩＲＥＳに依存する点で、通常の真核細胞ｍＲＮＡに見られるキャップ依存性の蛋白質合成における翻訳開始と異なっている。ＩＲＥＳ依存性に合成される一本の長いポリペプチドは、宿主シグナルペプチダーゼと２種のウイルスプロテアーゼによるプロセシングを受けて上述の個々の蛋白質となる。これらの蛋白質はシグナルペプチダーゼによるプロセシング、糖鎖の付加、ウイルス蛋白質によるリン酸化など、さらに個別にプロセシングを受けてウイルス複製や感染成立に必要な様々な機能を獲得して行く。
ＨＣＶの約３４１塩基と長い５’非翻訳領域は、開始コドンとならないＡＵＧ配列を複数（２〜５個）持ち、複雑な二次構造を形成し得る点でフラビウイルス属よりはペスチウイルス属もしくはピコナウイルス科のウイルスに類似している（Ｈａｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１７１１，１９９１、Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０，５０４１，１９９２）。
現在までに様々な研究者によってＨＣＶのＩＲＥＳ領域についての報告がなされているが、その内容は研究者によって差異が認められる。これは、実験で用いられたＲＮＡの構造や、翻訳系が影響したためであると考えられる。ウサギ網状赤血球抽出液、もしくはワクシニアウイルスによりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを共発現させる培養細胞へのＤＮＡトランスフェクションにより、５’非翻訳領域の４０塩基前後から翻訳領域の３０塩基前後までをＩＲＥＳ領域とする考え方がある（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．；ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４，６０１０，１９９５）。また、培養細胞に対してＲＮＡトランスフェクションを行い、５’境界は２８塩基から４５塩基の間にあることも証明されている（Ｋａｍｏｓｈｉｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３３，１０，１９９７）。さらに、無細胞系での解析によると、３’境界は翻訳領域の数十塩基ではなく、３７０塩基から５１６塩基の間にあるという結果も得られている。これはコア蛋白質（５’非翻訳領域直下の翻訳領域の配列によりコードされる蛋白質）のＮ末端側３分の２がＩＲＥＳ活性を上昇させる報告（Ｌｕ，Ｈ．−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４１２，１９９６）を支持する結果であるが、この領域がＲＮＡの構造として重要である可能性も否定できない。
ＩＲＥＳの機能発現には、キャップ依存的翻訳開始に関わる分子群の多くが動員されるが、その他の宿主細胞側分子群（トランス因子）も必要であるとされる（Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｇ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，７２６９，１９９２）。このことは、ＩＲＥＳ機能発現が種および組織・細胞特異的であることからも容易に想像できる。
キャップ構造を持つｍＲＮＡの無細胞蛋白質合成系として知られる麦芽抽出液、ウサギ網状赤血球の抽出液（ＲＲＬ）、およびＨｅＬａ細胞抽出液を使用した各ウイルスＩＲＥＳ活性の比較実験によれば、麦芽抽出液では、ピコルナウイルスＩＲＥＳは報告された限り活性を示さない。一方、ＲＲＬ中ではＥＭＣＶのＩＲＥＳは高い活性を示すが、ポリオウイルスＩＲＥＳの活性は微弱であり、ＨｅＬａ細胞抽出液を加えることによりＲＲＬでのポリオウイルスＩＲＥＳの活性は回復することが報告されている（Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９７，３９６，１９７９、Ｄｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５０，５０７，１９８４）。また、ＨｅＬａ細胞抽出液中ではこれらウイルスのＩＲＥＳはいずれも高い活性を示し、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のＩＲＥＳ活性のみがＨｅＬａ細胞抽出液中でも低いという結果も得られている（Ｇｌａｓｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９３，１０４７，１９９３）。これらのことから、キャップ構造をもつｍＲＮＡが利用する、開始因子以外の宿主細胞分子群がＩＥＲＳの機能発現には必要であることは明らかである。また、ＩＲＥＳ毎にその機能発現に要求される分子群には質的・量的な違いがあることも明らかである。
さらに、いずれのＩＲＥＳへも多くの宿主細胞側分子が結合することが、ＵＶクロスリンキング法（ＵＶ照射により、核酸とそれに結合している蛋白質を共有結合させ、結合蛋白質を検出する方法）による解析によって示されている。そして翻訳の開始には、ＲＮＡの高次構造の他に、ＩＲＥＳ特異的に作用するトランス因子が重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。すなわち、ピコルナウイルスＩＲＥＳの活性を促進する宿主分子としては、現在までのところ、２種類のＩＥＲＳ結合蛋白質であるＬａ（５２ｋＤａ）、ＰＴＢ（ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、５７ｋＤａ）が知られている（Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６７，３７９８，１９９３、Ｈｅｌｌｅｎ，Ｃ．Ｖ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７６４２，１９９３、Ｂｏｒｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１７７５，１９９３）。Ｌａは自己免疫疾患の抗原蛋白質として知られており、また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写の終結因子である。そしてＰＴＢは、ＲＮＡスプライシング因子のコファクターである。これらは核に局在している蛋白質であり、実際に核内の反応に関与している。しかしながら、例えば、ポリオウイルスの感染により、Ｌａは核から細胞質へと移行することが報告されており（Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６７，３７９８，１９９３）、これらが細胞質での反応である翻訳の開始に関与しているという報告もある。
各種ＩＲＥＳに対する、ＰＴＢおよびＬａ要求性が種々検討されており、現在のところピコルナウイルスＩＲＥＳのＰＴＢ要求性は強いが、ＨＣＶ  ＩＲＥＳではＰＴＢ要求性が非常に弱いことを示唆する結果（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．；ＲＮＡ，１，９２４，１９９５）、およびＨＣＶのＬａの要求量はポリオウイルスほど多くないという結果も得られている。これとは異なり、ＨＣＶについてＰＴＢは３箇所で結合し、ＩＲＥＳ機能に必要であり（Ａｌｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６９，６３６７，１９９５）、Ｌａは開始ＡＵＧを含むＲＮＡ構造を認識して活性化する（Ａｌｉ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，２２４９，１９９７）という報告もある。この種の実験は、ＰＴＢを極力除いた無細胞蛋白質合成系を使用して行われており、ＰＴＢ除去には特異的抗体やＰＴＢに結合性を持つＲＮＡ断片が使用されている。従って、ＰＴＢが他の分子と複合体を形成している場合には（Ｔｏｙｏｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３８，１，１９９４）、複合体そのものが除かれている可能性がある。さらに、ＰＴＢの多くはリボソームに結合していることが知られているので、リボソームまで除去されている可能性も考慮しなければならない。ゆえに、ＩＲＥＳのトランス因子要求性に関するさらなる研究が必要であるが、ＩＲＥＳが必要とするトランス因子はＩＲＥＳ毎に異なり、機能発現に至る機構もＩＲＥＳによって様々である事が予想される。新しいＩＲＥＳ関連因子がＨＣＶに存在する可能性はあり、実際に、ｐ２５という５’非翻訳領域中の２次構造を認識し、結合性が翻訳活性との相関を示すＨｅＬａ細胞中の蛋白質が報告されている（Ｆｕｋｕｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，１６６２，１９９７）。
これまでに、遺伝子操作技術を用いて様々な蛋白質またはペプチド類が産生されている。例えばインスリン、各種インターフェロン、エリスロポエチン、マンナン結合蛋白質、コングルチニン、ニューロシン等、多くの物質が大腸菌をはじめとする微生物細胞およびＣＨＯ細胞等の動物細胞で産生されている。
動物由来の有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物細胞宿主を用いると遺伝子が発現しなかったり、遺伝子産物である蛋白質が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正しくされない等の理由で活性を持たなかったりすることがしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞が宿主として用いられることが多い。動物細胞を用いると微生物細胞に比べて上記のようなメリットが得られる可能性があるものの、培養操作が煩雑になり、また逆に遺伝子の発現量が少なくなる可能性もある。
このような細胞において遺伝子発現を行うためのベクターの開発は、多くの分子生物学的研究の基礎となる重要な課題である。かかるベクターには、目的に応じて効率的な大量発現や誘導可能な一過性発現等を行えることが要求される。その様な要求を満たすための、これらの発現系における従来の発現ベクター構築概念はプロモーターやエンハンサーの生来の機能に依存するものであった。すなわち、目的とする遺伝子産物の生産効率を上げる手段としては、天然の遺伝子から強力なプロモーターまたはエンハンサーを選択し、目的の蛋白質やペプチド類をコードするＤＮＡ配列に連結することによりｍＲＮＡの転写効率を上昇させることがもっぱら行われてきた。大量発現を効率的に行わせる場合には、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）、ＳＲα、サイトメガロウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ウイルス性ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）、例えばＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ラウス肉芽種ウイルスＬＴＲ、単純ヘルペスチロシンキナーゼウイルスプロモーター等のプロモーターが強力なプロモーターとして知られており、これらを組み込んだ発現ベクターを主に哺乳動物細胞に対して使用することが行われている。また、エンハンサー配列をベクターに組み込むことにより遺伝子の転写効率を上昇させ、目的とする遺伝子産物の生産効率を上昇させることも行われている。
一方、遺伝子産物を一過性に発現させる場合には、発現誘導物質を使用することが行われており、例えばマウス乳頭ガンウイルス（ＭＭＴＶ：Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｖｉｒｕｓ）プロモーターを用いた発現系で、発現が望まれる際に発現誘導物質であるデキサメタゾンを添加する方法等も行われている。
また、２種類の異なった蛋白質をコードしているｃＤＮＡ（第１シストロンと第２シストロン）からの蛋白質発現を第１シストロンと第２シストロンの間にこの内部翻訳開始シグナルに相当する塩基配列を組み込むことにより、１個のプロモーターによって２種類の蛋白質を発現させることができることが報告されており（Ｕｒａｂｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅ，２００，１５７，１９９７）、また実際に応用されている。しかし、これら従来の手法によって得られる発現ベクターからは必ずしも十分な生産効率が達成されるわけではない。
また、近年目覚ましく開発が進められてきている遺伝子治療法によって、従来の方法では困難であった疾病の治癒が可能となり、この方法の広範なる適用が期待されているが、体内の特定部位において目的遺伝子を望ましい効率で発現させるためのベクター構築には、依然解決されるべき問題が残されている。すなわち、プロモーターが臓器や腫瘍などに特異的であっても、その活性が弱いために遺伝子発現の効率が低く、このようなプロモーターを組み込んだベクターを用いて遺伝子を導入したとしても治療効果が存分に得られない場合がある。
このように、当該技術分野において、より発現効率の優れた発現ベクターの開発が望まれている。従って、本発明は、目的とする遺伝子産物の生産効率を上げるために、従来の発現ベクター構築概念にとらわれない新規な発現ベクターを提供することを目的とする。
〔発明の開示〕
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域もしくはその断片またはその変異体が有する核酸配列を遺伝子発現ベクターに組み込むことによって、目的の有用遺伝子の発現が増強されることを見出し、本発明を完成した。
本明細書中に言う「有用遺伝子発現増強配列」とは、あらゆるウイルス遺伝子の５’非翻訳領域もしくは５’非翻訳領域及び該非翻訳領域に隣接する翻訳領域の一部を含む領域、もしくはそれらの断片またはそれらの変異体が有する核酸配列を含む配列を指す。
また、本明細書中に言う「有用遺伝子の発現を増強」するとは、発現を増強させる作用原因・翻訳過程・発現環境・発現方法等にこだわることなく、結果的に有用遺伝子発現を増強することである。
さらに本発明の有用遺伝子発現強核酸配列に含まれ得る、５’非翻訳領域に隣接する翻訳領域の一部とは、５’非翻訳領域の５倍数以下の塩基、好ましくは５’非翻訳領域と同数もしくは±１００塩基程度の断片を称する。
前記有用遺伝子発現増強核酸配列における５’非翻訳領域は、少なくとも１つのピリミジンリッチ領域を含むことが好ましく、また、ＢｏｘＡ、ＢｏｘＢ、トランス因子結合部位およびこれらの組合せよりなる群から選択される領域に該当する配列や、ＡＵＧまたはＡＴＧの配列をさらに含むことがより好ましい。尚、これらの領域および配列が、変異や断片化をうけることなく有用遺伝子発現増強核酸配列に含まれていることが特に好ましい。かかるＡＵＧまたはＡＴＧ配列およびＢｏｘＢに含まれるＡＵＧまたはＡＴＧ配列は、開始コドンとして有用遺伝子発現増強核酸配列の最下流または翻訳領域の最上流等に組み込まれてもよい。
また、前記有用遺伝子発現増強核酸配列における５’非翻訳領域は、ウイルスのｍＲＮＡのＩＲＥＳ領域の一部または全体を含むことが好ましい。該ＩＲＥＳ領域は、ＩＲＥＳ活性を有していても有していなくてもよいが、その由来となった領域がＩＲＥＳ活性を有していたものであることが好ましい。
そして、前記有用遺伝子発現増強核酸配列に含まれる５’非翻訳領域にピリミジンリッチ領域、ＢｏｘＡ、ＢｏｘＢ、および／またはトランス因子結合部位に該当する配列が存在する場合、そのうち少なくとも１箇所の配列の内部または近傍（高度保存領域以外の領域）に、野生型ウイルス由来の配列の１個または数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入および／または付加された変異配列を含むものも本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列として好ましい。また、有用遺伝子発現増強核酸配列に５’非翻訳領域の可変領域に該当する配列が含まれる場合、その配列内に野生型ウイルス由来の配列の１個または数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入および／または付加された変異配列を含んでいることが好ましい。これらの変異が、直接的あるいは間接的にＩＲＥＳ活性を増強することができるものが好ましい。
上記５’非翻訳領域もしくはその断片の変異体を含む有用遺伝子発現増強核酸配列は、ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域の高度保存領域以外の領域において、置換、挿入および／または欠失を含む変異により得られるものが好ましい。特に、有用遺伝子発現増強核酸配列にＩＲＥＳ領域が含まれる場合、ピリミジンリッチ領域、特にＢｏｘＡ、および／またはＢｏｘＢが保存された変異体が好適に利用され得る。変異の導入はＰＣＲを用いた突然変異導入法などによって行なわれる。
前記有用遺伝子発現増強核酸配列が遺伝子発現ベクターに組み込まれる位置は、有用遺伝子が発現され得るように構築された発現ベクター内に、有用遺伝子発現増強核酸配列を組み込むことにより、直接的あるいは間接的に有用遺伝子発現を増強させることができる位置とされ、発現制御プロモーター配列の下流、且つ最初の有用遺伝子の配列の上流であることが好ましい。また、有用遺伝子発現増強核酸配列は、発現ベクターに正方向すなわち、５’から３’方向へと転写、翻訳が行われるように組み込まれるべきである。
遺伝子発現ベクターに組み込まれる前記有用遺伝子発現増強核酸配列は、好ましくはｃＤＮＡ配列である。そして、前記遺伝子発現ベクターは、好ましくは真核細胞における発現用のベクターである。
前記ウイルスとしては、ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルス、ＨＣＶウイルスが好ましい。
なお、ＨＣＶのｍＲＮＡの５’非翻訳領域の場合、ＢｏｘＡは配列番号：１のヌクレオチド第１９１〜１９９位に、ＢｏｘＡの上流に存在するピリミジンリッチ領域は配列番号：１のヌクレオチド第４０〜４６位および第１２０〜１３０位に、そしてＢｏｘＢは配列番号：１のヌクレオチド第２１３〜２１９位に認められ（図１参照、図中トランス因子結合部位に囲みを付している）、また、可変領域は配列番号：１のヌクレオチド第１〜３６位および第１７５〜２７０位に、高度保存領域は配列番号：１のヌクレオチド第１２１〜１７４位および２７１〜３３９位に認められる。
遺伝子発現ベクターに組み入れられる前記有用遺伝子発現増強核酸配列に含まれる、ＨＣＶ由来５’非翻訳領域または、５’末端側領域（５’非翻訳領域及び該非翻訳領域に隣接する翻訳領域の一部）の核酸配列の断片の例として、配列番号：１のヌクレオチド第１〜１８０位、第１８１〜３４１位、第１〜３４１位、第１８１〜７１３位もしくは第１〜７１３位からなる核酸配列が現在のところ好ましいことが明らかになっている。このうち、配列番号：１のヌクレオチド第１８１〜３４１位の断片で特に強力な有用遺伝子発現増強活性が認められることが判明した（実施例５および６）。
加えて、遺伝子発現ベクターに組み入れられる前記有用遺伝子発現増強核酸配列は、配列番号：７のヌクレオチド第１〜３４２位で示される核酸配列、あるいは該配列のヌクレオチド第１１９位をアデニンで置換した核酸配列が含まれることが特に好ましいことが明らかになっている。
ウイルスがＨＣＶである場合、有用遺伝子発現増強核酸配列に含まれる、ＨＣＶ由来５’非翻訳領域または５’末端側領域の核酸配列の変異体として、上記の好ましい変異の中でも特に、配列番号；１の一部または全てを含む核酸配列のうち、第２０７位あるいはその近傍に１つまたは数個のヌクレオチドが挿入された配列、さらに好ましくは該位置に１つのチミジンが挿入された配列が好ましい。
また、ＨＣＶ由来の核酸配列が用いられる場合、５’非翻訳領域に隣接する翻訳領域はコア蛋白質であり、これをコードする領域の５’側３００塩基程度が有用遺伝子発現増強核酸配列に含まれ得る。ゆえに、前記有用遺伝子発現増強核酸配列が、ＨＣＶウイルスのコア蛋白質翻訳領域の一部をさらに含むものも、本発明において好適である。そして、かかる核酸配列の変異体も、可変領域（高度保存領域以外の領域）において、置換、挿入および／または欠失を含む変異により得られるものが好ましい。
さらに本発明は、配列番号：７で示されるヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドと、この核酸配列が有するＩＲＥＳ活性と同等のＩＲＥＳ活性を有し当該配列の断片または変異体からなるポリヌクレオチド（すなわち、配列番号：１のヌクレオチド第１〜３４１位に示されるＨＣＶ由来の核酸配列において、少なくとも第２０６位と２０７位との間に塩基が１つ挿入されたもの、またはその変異体もしくは断片）とを企図する。これらのポリヌクレオチドは、従来知られているＨＣＶ由来のＩＲＥＳ配列に比較して格段に優れたＩＲＥＳ活性を保有している。従って、このポリヌクレオチドを用いて、従来の宿主細胞発現を利用したポリペプチドの製造や、遺伝子治療用ベクターに組み入れて、翻訳開始をさらに効率よく行うことが可能となる。また、このポリヌクレオチド自体がこれまでに知られたよりも強いＩＲＥＳ活性を有しているので、発現増強はもとより、例えば生体内でＩＲＥＳ活性部位で変異等が生じ、ＩＲＥＳ活性が低下したことに起因する疾患を治療するために利用することができる。
以下、５’−ＵＴＲ３４１と特記している場合には配列番号：１およびその断片等を含む配列を指し、５’−ＵＴＲ３４２と特記している場合には本発明によって得られたＨＣＶの変異体由来の配列（配列番号：７）を指すこととする。
尚、前記有用遺伝子発現増強核酸配列は、翻訳増強活性を有することにより有用遺伝子の発現を増強するもの（例えば、５’−ＵＴＲ３４１）、そして、ＩＲＥＳ活性を増強することにより有用遺伝子の発現を増強するもの（例えば、５’−ＵＴＲ３４２）が好ましい。
本発明はまた、如上の有用遺伝子発現増強核酸配列を含む遺伝子発現用ベクター、当該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、当該ベクターを用いて有用遺伝子産物を発現・製造する方法、および当該ベクターを用いて有用遺伝子の発現を増強する方法を企図する。
本発明のさらなる特徴において、配列番号：７で示されるヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドあるいは、この核酸配列が有するＩＲＥＳ活性と同等のＩＲＥＳ活性を有し当該配列の断片または変異体からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲ３４１（配列番号：１のヌクレオチド第１〜３４１位）に示されるヌクレオチド配列の、少なくとも第２０６位と２０７位との間に塩基が１つ挿入されたもの、またはその断片もしくは変異体）を含む、ＩＲＥＳとの相互作用性を有する物質をスクリーニングするためのプローブが提供される。このプローブは好ましくはラベルされており、それが有するＩＲＥＳとの相互作用性を利用して目的の物質を同定する。本明細書中に言うＩＲＥＳとの相互作用を有する物質とは、ＩＲＥＳの活性を直接的あるいは間接的に（例えば他の因子と複合体等を形成して）変化させることができる物質および単にＩＲＥＳと結合する物質をいい、それらには、ＩＲＥＳ結合タンパク質、ピリミジン領域結合タンパク質、トランス因子および翻訳開始因子等が含まれる。従って、かかる相互作用性物質はＩＲＥＳの阻害、増強等を惹起するモジュレーターであることが予測される。本プローブは、固体支持体に固定化されて用いられても、液相で用いられてもよい。
さらに本発明は、配列番号：７で示されるヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドあるいは、この核酸配列が有するＩＲＥＳ活性と同等のＩＲＥＳ活性を有し当該配列の断片または変異体からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲ３４１（配列番号：１のヌクレオチド第１〜３４１位）に示されるヌクレオチド配列の、少なくとも第２０６位と２０７位との間に塩基が１つ挿入されたもの、またはその断片もしくは変異体）を含む、ＩＲＥＳ依存性の翻訳開始因子をスクリーニングするためのプローブを提供する。このプローブもやはり、好ましくはラベルされており、ＩＲＥＳ依存性の翻訳開始因子との会合、翻訳開始への影響を同定することによって目的の因子を同定するためのものである。
これまでに、ｃ−ｍｙｃ（Ｎａｎｂｒｕ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１），３２０６１−３２０６６，１９９８，Ｓｔｏｎｅｌｅｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６（３），１２３−４２８，１９９８）、ＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、Ｌｅ  Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（２），３６２−３６９，１９９７，Ｙａｎｇ  Ｑ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（１４），２８００−２８０７，１９９７）、ＦＧＦ−２（Ｌｅ  Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（２），３６２−３６９，１９９７）、ＰＤＧＦ２（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１４），９３５６−９３６２，１９９７）、ｅＩＦ４Ｇ（Ｇａｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（９），５００６−５０１２，１９９８）、カリウムチャンネル等が、真核細胞でＩＲＥＳ依存的ｍＲＮＡ翻訳開始機構を利用していることが判明している。
また、本発明の実施例に示すように、新規５’−ＵＴＲ３４２配列は、ウイルスの複製が活発なＣ型肝炎患者血清より単離されたものであるので、５’−ＵＴＲ３４１との配列上の違いを認識することにより、Ｃ型肝炎の重症度を診断することができる。すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎の重症度診断方法であって、配列番号：７で示されるヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドあるいは、この核酸配列が有するＩＲＥＳ活性と同等のＩＲＥＳ活性を有し当該配列の断片または変異体からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲ３４１（配列番号：１のヌクレオチド第１〜３４１位）に示されるヌクレオチド配列の、少なくとも第２０６位と２０７位との間に塩基が１つ挿入されたもの、またはその断片もしくは変異体）を標的として、被験者由来の生体試料中に含まれる当該ポリヌクレオチド配列の存在を検出し、この配列の存在に基づいてＣ型肝炎の重症度を診断することを特徴とする方法を企図する。
最後に本発明は、生体内でのキャップ依存的ｍＲＮＡ翻訳の低下に起因する疾患あるいはＩＲＥＳ活性の低下に起因する疾患を治療するために、前記有用遺伝子発現増強核酸配列核酸配列を生体内に導入することによってｍＲＮＡ翻訳を促進することができるよう、当該有用遺伝子発現増強核酸配列を含むこと特徴とする治療用組成物を提供する。これらの配列を導入して損なわれていたｍＲＮＡ翻訳機構を補うことによって、疾患の治療、あるいは予防も行うことができる。
すなわち本発明者らは、ベクター内のプロモーター配列とルシフェラーゼ蛋白質をコードしているｃＤＮＡ配列との間に有用遺伝子発現増強核酸配列を組み込んで発現させることにより、かような核酸配列を組み込まない従来型のベクターを発現させた場合よりもルシフェラーゼの酵素活性が増大していることを見いだした。これは酵素蛋白質量の増加によるものと考えられることから、組み込んだ配列は有用遺伝子の発現増強効果を呈することが判明した。
さらに、この効果は別のプロモーターや、起源の違うルシフェラーゼを用いた場合にも認められたことから、特殊なプロモーター配列−有用遺伝子発現増強核酸配列−特殊な有用遺伝子配列の特定の組み合わせだけで起こるのではなく、比較的一般的な現象であることが判明した。また、この有用遺伝子発現増強核酸配列の鎖長を変化させて、その効果を有する領域の特定を行った結果、ＨＣＶ（ＨＣＶ  ＪＴＢ株など）の遺伝子の５’側ヌクレオチド第１８１〜３４１位（配列番号：１）に相当する部分が強い効果を有していることを見いだした。加えて、ＨＣＶ１ｂの変異株である臨床分離株から得られた、配列番号：７に示される配列あるいは、該配列のヌクレオチド第１１９位をアデニンで置換したものが、その遺伝子発現増強能において特に好ましいことも見いだした。特にＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程において本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を用いる場合には、５’−ＵＴＲ３４２を好適に用いることができ、ＩＲＥＳ活性に依存しない翻訳過程（キャップ依存的翻訳過程等）において本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を用いる場合には、５’−ＵＴＲ３４１および５’−ＵＴＲ３４２を好適に用いることができる。この効果は、単なる細胞培養系における蛋白質やペプチド類（例えばサイトカイン等）の産生量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加させる目的に利用され得るだけでなく、従来、臓器や腫瘍などに特異的であるがその活性が弱いために実用化が難しかったプロモーターと組み合わせることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでも効果的な遺伝子治療用ベクター等にも応用することができる。
本発明の有用遺伝子には、宿主において発現可能なペプチドをコードする核酸、細胞由来転写調節因子の結合蛋白質をコードする遺伝子もしくは転写調節因子の結合部位の配列またはこれらに類似の配列を有するデコイをコードする核酸、自殺遺伝子等が挙げられる。この遺伝子は、好ましくはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または部分的もしくは全体的に化学合成されたＤＮＡ、特に好ましくはｃＤＮＡである。
前記ペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質を含み、遺伝子の転写、翻訳後に糖、脂質、リン酸、金属などによる修飾を受けたものも本発明におけるペプチドに含意される。例えば、インスリン、各種インターフェロン、エリスロポエチン、マンナン結合蛋白質、コングルチニン、ニューロシン等の有用なペプチドが包含されるが、これらに限定されることはない。
また、前記のデコイをコードする核酸とは、細胞由来転写調節因子の結合蛋白質をコードする核酸もしくは転写調節因子の結合部位の配列またはこれらに類似の配列を有する核酸を示す。これらの核酸を、囮として細胞内に導入することで、転写調節因子の結合部位への結合を阻害し、転写調節因子の作用を抑制し、最終的には活性化される遺伝子群を抑制することができる可能性がある。
前記自殺遺伝子とは、アポトーシス誘発遺伝子（プログラム細胞死誘発遺伝子）、ネクローシス誘発遺伝子等を含み、その発現の結果細胞が死に導かれる遺伝子を言う。
また、これら有用遺伝子を融合蛋白質として発現させることもできる。融合蛋白質とは、有用遺伝子より発現される蛋白質のＮ末端に他の蛋白質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させた蛋白質である。
次に、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を得るために利用することができる核酸の起源としては、遺伝子（好ましくはｍＲＮＡ）の５’末端に非翻訳領域を有しているものであれば特に限定されない。また、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域中にＩＲＥＳ領域の一部または全体を有しているものが好ましい。
以下、本発明で有用遺伝子発現増強のために用いられる核酸配列として使用可能な配列を有するウイルスにつき詳説する。
ウイルスは粒子内にＤＮＡまたはＲＮＡのどちらか一方を遺伝子として有しており、大きくＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスとに分類される。
ＤＮＡウイルスは、
（１）核で増殖する二本鎖ＤＮＡウイルス：例えば、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、
（２）細胞質で増殖する二本鎖ＤＮＡウイルス：例えば、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、
（３）核で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルス：例えば、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、
（４）イリドウイルス：例えば、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、および
（５）ヘパドナウイルス：例えば、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）に大きく分類されている。
また、ＲＮＡウイルスは、
（１）（＋）鎖一本鎖ＲＮＡウイルス：例えば、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
（２）非分節型（−）鎖一本鎖ＲＮＡウイルス：例えば、パラミキソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、
（３）分節型（−）鎖一本鎖ＲＮＡウイルス：例えば、オルトミキソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、
（４）二本鎖ＲＮＡウイルス：例えば、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、
（５）アンビセンスＲＮＡウイルス：例えば、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）およびブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ならびに
（６）レトロウイルス：例えば、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に大きく分類されている。
以下に遺伝子中に５’非翻訳領域を有する代表的ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスの科・属・種名を示すが、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列は、これらのウイルス由来のものから選択してもよいし、また、これらの変異体もしくは新種由来のものから選択してもよいし、さらにこれら以外の他のＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルス由来のものから選択してもよい。
パポバウイルス科には代表的属としてパピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）属およびポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ショープ乳頭腫ウイルス（Ｓｈｏｐｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）および空胞形成ウイルス（Ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
アデノウイルス科には代表的属としてマストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属およびアビアデノウイルス（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ヒトアデノウイルス（Ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）およびセロウイルス（ＣＥＬＯ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
ヘルペスウイルス科には代表的属としてアルファヘルペスウイルス（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）属、ベータヘルペスウイルス（Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）属、ガンマヘルペスウイルス（Ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、１型および２型単純疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １，２）、帯状水痘ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂウイルス（Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＥＢウイルス（ＥＢ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７等が挙げられる。
ポックスウイルス科には代表的属としてオルトポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、アビポックスウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、カプリポックスウイルス（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、レポリポックスウイルス（Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、パラポックスウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、スイポックスウイルス（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、エントモポックスウイルス（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、ヤタポックスウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属およびモルサイポックスウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、鶏痘ウイルス（Ｆｏｗｌｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、ヒツジ痘ウイルス（Ｓｈｅｅｐｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、粘膜腫ウイルス（Ｍｙｘｏｍａｖｉｒｕｓ）、羊鵞口瘡ウイルス（Ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ）、豚痘ウイルス（Ｓｗｉｎｅｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、昆虫痘ウイルス（Ｉｎｓｅｃｔｐｏｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ヤタウイルス（Ｙａｔａ  ｖｉｒｕｓ）および伝染性軟属腫ウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
パルボウイルス科には代表的属としてパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属およびデンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、パルボウイルスＢ１９（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、アデノ関連サテライトウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｖｉｒｕｓ）およびデンソヌクレオーシスウイルス（Ｄｅｎｓｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
イリドウイルス科には代表的属としてイリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、真珠光ウイルス（Ｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
ヘパドナウイルス科には代表的属としてヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
ピコルナウイルス科には代表的属としてエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）属およびライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、１型および３型ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １）、コクサッキーウイルスＡ群Ｂ群（６型以上）（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、１Ａ型ヒトライノウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １Ａ）およびエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
トガウイルス科には代表的属としてアルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）属、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）属およびペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）およびウシ粘膜病ウイルス（Ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ）等が挙げられる。
フラビウイルス科には代表的属としてフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）属およびヘパカウイルス（Ｈｅｐａｃａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、日本脳炎ウイルスＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｂ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）およびＣ型肝炎ウイルス（ａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
カリシウイルス科には代表的属としてカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）属およびヘペウイルス（Ｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ）およびＥ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
コロナウイルス科には代表的属としてコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ヒトコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、鳥類感染性気管支炎ウイルス（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）およびマウス肝炎ウイルス（Ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
パラミキソウイルス科には代表的属としてニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属、パラミキソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）属およびモービリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、呼吸性シンシチウムウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）およびパラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
ラブドウイルス科には代表的属としてベジクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）属およびリザウイルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）および狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
フィロウイルス属には代表的属としてフィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、マルブルクウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）およびエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
オルトミキソウイルス科には代表的属としてインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ａ、Ｂ  ａｎｄ  Ｃ）および豚インフルエンザ（Ｓｗｉｎｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）等が挙げられる。
ブニヤウイルス科には代表的属としてブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名として、ブニヤヴェーラウイルス（Ｂｕｎｙａｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ハンタンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）およびクリミア出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
アレナウイルス科には代表的属としてアレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名としてリンパ球脈路髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｍｅｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）およびラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
レオウイルス科には代表的属としてオルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）属、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）属およびロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属等があり、代表的種名としてブルータングウイルス（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトレオウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ）およびロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
レトロウイルス科には代表的亜科としてオンコウイルス（Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科、スプマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｅ）亜科およびレンチビウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｖｉｒｉｎａｅ）亜科等があり、代表的種名として、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）およびヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
有用遺伝子発現増強核酸配列としては、これらＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む全てのウイルスの核酸配列中に存在する５’非翻訳領域もしくは非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む核酸配列、またはその断片や、これらの変異体を使用することができる。５’非翻訳領域とは、５’末端に存在しアミノ酸に翻訳されない領域を称し、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列として使用するためには、ＩＲＥＳ活性を有していても有していなくてもよいが、有しているのが好ましい。５’非翻訳領域には、５’−ＵＴＲ；５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎまたは５−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、５’−ＮＣＲ；５’−ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、５’−ＮＴＲ；５’−ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ等が含まれる。
如上のウイルスから有用遺伝子発現増強核酸配列を得るための方法を以下に述べる。核で増殖する二本鎖ＤＮＡウイルスは、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）をゲノムとして有しているので、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってｄｓＤＮＡからｍＲＮＡを合成し、その核酸配列の５’非翻訳領域もしくは非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列、またはその断片を調製する。また、細胞質で増殖する二本鎖ＤＮＡウイルスはｄｓＤＮＡをゲノムとして有しており、ウイルス固有のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡを合成して、その核酸配列の５’非翻訳領域もしくは非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列、またはその断片を使用することができる。核で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスは、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）をゲノムとして有するので、ＤＮＡポリメラーゼによりｄｓＤＮＡを合成し、その後ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりｍＲＮＡを合成して、得られる核酸配列の５’非翻訳領域もしくは非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列、またはその断片を使用することができる。ヘパドナウイルスは、環状の部分的に二本鎖になったＤＮＡをゲノムとして有しているので、ギャップを修復し、スーパーコイル型ＤＮＡに変換させ、変換後のＤＮＡをＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりｍＲＮＡを合成し、得られた核酸配列の５’非翻訳領域もしくは非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列、またはその断片を使用することができる。
次いでＲＮＡウイルスから有用遺伝子発現増強核酸配列を得るための方法を以下に述べる。（＋）鎖ＲＮＡウイルスはｍＲＮＡをゲノムとして有しているので、該核酸配列の５’非翻訳領域または５’非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列またはその断片を使用することができる。非分節型および分節型を含む（−）鎖ＲＮＡウイルスの場合は、ｓｓＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）により相補的（＋）鎖ＲＮＡに変換し、該核酸配列の５’非翻訳領域または５’非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列またはその断片を使用することができる。二本鎖ＲＮＡウイルスは分節に分かれたｄｓＲＮＡをゲノムとして有しており、ｄｓＲＮＡ依存性ポリメラーゼによりｍＲＮＡを合成し、該核酸配列の非翻訳領域または非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列またはその断片を使用することができる。アンビセンスＲＮＡウイルスは（＋）鎖および（−）鎖の両方をゲノムとして有し、ｓｓＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡを合成し、該核酸配列の非翻訳領域または非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列またはその断片を使用することができる。レトロウイルスの場合は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）により、ｔＲＮＡをプライマーとしてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを合成する。その後、ＤＮＡにハイブリッドしたＲＮＡを逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により分解し、直鎖状ｄｓＤＮＡを合成する。これを適当に処理した後ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりｍＲＮＡを合成し、該核酸配列の非翻訳領域または非翻訳領域からそれに隣接する翻訳領域を含む配列またはその断片を使用することができる。
本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列としてｃＤＮＡ配列が用いられる場合、上記方法で得られたｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製することが好ましい。また、ウイルスゲノムから例えばＰＣＲ等を利用して調製したゲノムＤＮＡ配列や、ヌクレオチド配列決定により得られた情報に基づきＤＮＡシンセサイザー等を用いて部分的または全体的に化学合成されたＤＮＡも好適に用いられる。
本発明の発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの双方において、有用遺伝子を発現させ得るように構築された発現ベクターであって、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を好ましくはプロモーター配列の下流且つ有用遺伝子配列の上流に連結させたものであれば特に限定されない。発現ベクターの構築に用いられるベクターは市販されているものであってもよい。例えば、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８Ｎ（寶酒造社製）、ｐＵＥＸ２（アマシャム製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテック社製）、ｐＧＬ２（プロメガ社製）、ｐＤＮＡ３．１＋（インビトロジェン社製）等が挙げられる。本発明の発現ベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により制限酵素、リガーゼ等を利用して行うことができる。
本明細書で言う発現ベクターとは、プラスミド、λファージ、コスミド等のようなレプリコンに、有用遺伝子発現増強活性を有する核酸配列と有用遺伝子を組み込んで、有用遺伝子が複製・発現されるようにしたものを言い、実施例で使用したベクターに限定されない。例えば、コスミドよりもさらに長いＤＮＡ断片をクローニングできる発現ベクターとして、Ｐ１ファージ、Ｆ因子および酵母の人工染色体ＹＡＣ等がある。また、λファージには置換型ベクターおよび挿入型ベクターが含まれ、これらは有用遺伝子の長さに応じて適宜選択することができる。
また、例えば動物細胞発現可能なベクターとして公知のものに、ＳＶ４０系ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター等がある。
発現ベクターが形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用する場合には、発現ベクターは普通少なくともプロモーター領域（プロモーター、オペレーターおよびシャインダルガーノ配列を含む）、開始コドン、有用遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター領域等から構成される。酵母または動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド、有用遺伝子配列および終始コドンを含むことが好ましい。また、エンハンサー配列、有用遺伝子の５’−および３’−非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位および選択マーカーを発現ベクターに挿入することもできる。
本発明の遺伝子発現ベクターに組み込まれるプロモーターとしては、従来よりよく知られているＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）、ＳＲα、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アクチンプロモーター、ウイルス性ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）、例えばＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ラウス肉芽種ウイルスＬＴＲ、単純ヘルペスチロシンキナーゼウイルスプロモーター等の強力なプロモーター、弱いプロモーターに関わらず使用できる。
真核細胞において、線維芽細胞、神経細胞、血液細胞および実質細胞等の正常細胞から、癌細胞に至る多くの細胞種に発現を期待する場合、一般的なプロモーターとしては、サイトメガロウィルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β−アクチンおよびＳＶ４０初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。エンハンサーは通常、プロモーター配列とセットになっているのでそのまま利用することができる。
主として、これらの哺乳動物由来の細胞内で有用遺伝子を高発現させることができるプロモーターは宿主に適合する限り、本発明のプロモーターとして適宜選択して用いることができる。また、遺伝子を導入し発現させる細胞および組織が特定されている場合には、細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。さらに、これらプロモーターをホモあるいはヘテロに組合せることにより、さらに高発現が期待でき、発現したタンパク質が安定でるという効果が得られる場合がある。
一方、原核細胞において使用されるプロモーターとして、ＰＢＡＤ、ＰＬ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３、ｌａｃ等がある。
主として、これらの原核細胞由来の細胞内で有用遺伝子を高発現させることができるプロモーターは宿主に適合する限り、本発明のプロモーターとして適宜選択して用いることができる。また、遺伝子を導入し発現させる細胞および組織が特定されている場合には細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。さらに、これらプロモーターをホモあるいはヘテロに組合せることにより、さらに高発現が期待でき、発現したタンパク質が安定でるという効果が得られる場合がある。
一方、酵母において使用されるプロモーターとして、ＧＡＬ１、ＡＯＸ１、ＣＵＰ１、ＰＧＫ等がある。
遺伝子発現ベクターに組み込み、目的とするベクターのみを回収するための選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下ＤＨＦＲと略す）遺伝子（メトトレキサート耐性遺伝子）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子）等が挙げられ、例えば、ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。また、メトトレキサートの濃度を上げて培養し、耐性細胞を選択することにより、有用遺伝子を細胞内で発現させ、さらに高発現の細胞株を得ることもできる。
構築された発現ベクターの例は、図２〜４、７および８ならびに１１および１２に概略示されるとおりである（実施例２〜６、８〜１２参照）。
本発明は、この様に構築された遺伝子発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞および微生物細胞（大腸菌、枯草菌、酵母等）で、発現ベクターに組み込まれた有用遺伝子を発現することができる宿主細胞も企図するものである。好ましい宿主細胞として、プロモーター配列と有用遺伝子配列との間に組み込まれた有用遺伝子発現増強核酸配列の活性を最大限に引き出すことができる宿主細胞が選択される。
本発明の宿主細胞たる動物細胞としては、ヒト由来の細胞が挙げられるが、本発明に使用した有用遺伝子発現増強活性を有する核酸配列がその動物細胞内において有用遺伝子の発現を増強させることができる細胞であれば特に限定されるものでない。例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、マウス繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞等がある。また、微生物細胞としては、例えば大腸菌および枯草菌等の細菌類ならびにサッカロマイセス・セレビシエおよび麦酒酵母等の酵母類等が含まれる。また、植物細胞としては、綿植物細胞、アラビドプシス細胞等が挙げられる。
前記の通り、有用遺伝子発現増強核酸配列はＩＲＥＳ活性を有することが好ましいが、ウイルスのＩＲＥＳは構造的にも多様であり、その機能発現に関する宿主細胞群の要求性も異なるうえウイルス感染により局在性の変化するＩＲＥＳ関連分子群も存在するため、ＩＲＥＳ領域を含む核酸配列を本発明において用いる場合にはその核酸配列に応じて宿主を適宜選択することが好ましい。
さらに、目的の発現増強が行える適当な宿主細胞が入手できない場合には、用いる宿主細胞に形質転換等により修飾を施すことができる。例えば、宿主細胞を修飾する方法としてトランス因子（例えば、Ｌａ、ｐ２５、ＰＴＢ等）を宿主細胞に導入、もしくは宿主細胞内で発現することができるように形質転換することもできる。ＩＲＥＳの機能発現にはキャップ依存的翻訳開始に関わる分子群の多くが動員されるが、その他のトランス因子も必要であるとされる。本明細書で言うトランス因子とは、宿主細胞由来の分子群であって、直接的もしくは間接的に本発明の有用遺伝子発現増強活性を引き出すかまたは増強させることができる分子群を示す。翻訳の開始にはＲＮＡの高次構造の他に、ＩＲＥＳに作用するトランス因子が重要な役割を果たしているが、必要とされるトランス因子はＩＲＥＳ毎に異なり、機能発現に至る機構もＩＲＥＳによって様々であることが予想される。
前記発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、例えば、リポポリアミン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ハナハン法、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、マイクロインジェクションおよびエレクトロポーレーション等の方法がある。
原核細胞のＲＮＡポリメラーゼに親和性を有するプロモーターを真核細胞にて用いる場合、またはＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程を利用する場合のいずれであっても、適当な処理を施すことにより本発明の実施に応用できる。例えば、本発明の実施例に記載したように、プロモーターに適合するポリメラーゼの遺伝子を予め導入した宿主を使用することにより、真核細胞の細胞質で有用遺伝子を発現させることができる。導入する方法として、ウィルスエンベロープを用いたリポソーム製剤、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法およびウィルスベクター等の公知の方法を用いることができる。特に、臨床においては、ＨＶＪリポソーム、ＶＳＶリポソーム、カチオニックリポソーム等のリポソーム製剤あるいはアデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター等のウィルスベクターを用いることが有用である。臓器あるいは部位特異的にリポソーム製剤あるいはウィルスベクター等を用いて原植生物のＲＮＡポリメラーゼが発現するように真核細胞に導入し、該ＲＮＡポリメラーゼに親和性を有するプロモーターを用いた発現ベクターにて有用遺伝子を発現させることにより、臓器あるいは部位特異的に有用遺伝子を発現させることができる。この方法はリポソーム製剤およびウィルスベクターによって有用遺伝子が望ましくない部位に導入された場合であっても、プロモーター特異的ポリメラーゼが発現していない細胞にあっては有用遺伝子が発現されないため、副作用の軽減・臓器特異性の向上等の利点がある。この場合特に野生型ＨＣＶ由来の５’−ＵＴＲ３４１よりも変異型ＨＣＶ由来の５’−ＵＴＲ３４２配列を用いる方が、有用遺伝子の発現効率が高いことを実施例９〜１２で示している（後述）。
以上述べたように、プロモーター・宿主・作用原因・翻訳過程の相違・発現環境・発現方法等に関わらず、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列は結果として有用遺伝子発現を増強させることができる。
さらに、前記遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含み、有用遺伝子産物を効率よく発現している生物（動物、植物、昆虫など）も本明細書に開示する。
また、前記宿主細胞を培養して有用遺伝子産物を単離することによる、またはかかる宿主細胞を保有する生体内で目的とする遺伝子産物を生産する有用遺伝子産物の製造方法、有用遺伝子の発現方法、発現ベクターを利用した遺伝子発現の増強方法も本発明により企図される。
本発明の修飾された実施態様として、新規５’非翻訳領域および／またはＩＲＥＳを有する核酸配列を探索・発見する方法が包含され、この方法によって取得された配列もしくはそれらの断片、または５’非翻訳領域から翻訳領域までを含む配列もしくはその断片や、これらの変異体を有用遺伝子発現増強核酸配列として用いることもできる。
新規５’非翻訳領域および／またはＩＲＥＳを有する核酸配列を探索・発見する方法の例を以下に説明する。ポリオウイルス感染細胞内ではｅＩＦ４Ｆ（ｅＩＦ４Ｅ，ｅＩＦ４ＡおよびｅＩＦ４γの複合体）のサブユニットｅＩＦ４γ（ｐ２２０）が切断を受けることが知られている。このため、感染細胞内ではｅＩＦ４Ｆのレベルは低下する。この様な状態は熱ショックによっても作り出すことができる。しかしてキャップ結合蛋白質ｅＩＦ４Ｅの脱リン酸化が起こり、キャップ構造への親和性が低下してしまう（Ｌａｍｐｈｅａｒ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２７８９，１９９１）。この様な状態では、ｅＩＦ４Ｆの要求性が高いｍＲＮＡの翻訳は抑制され、この要求性が低いｍＲＮＡまたはＩＲＥＳを有するｍＲＮＡのみが、ｍＲＮＡとして機能して翻訳される。以上のような知見に基づき、熱ショック等を利用してＩＲＥＳ（類似）活性を含む核酸配列を新たに発見することができる。実際に、ポリオウイルス感染細胞内でも機能しているｍＲＮＡが探索され、その配列に含まれるＩＲＥＳが同定されている（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３５３，９０，１９９１）。また、別の例として、５’非翻訳領域が長く、その領域内に複数のＡＵＧ配列を持つ核酸配列を遺伝子配列バンクなどで探索する方法がある。実際に、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の発生・分化に関するｍＲＮＡにこのような配列が数多く存在することが判明し、アンテナペディア遺伝子（Ａｎｔｐ）から転写される２つのｍＲＮＡ上にＩＲＥＳが同定されている（Ｏｈ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６，１６４３，１９９２）。このような発生・分化段階における動物細胞中では、熱ショックを受けた細胞内と同様にｅＩＦ４Ｅのリン酸化が十分でなく、キャップ依存的翻訳開始機構は機能していない状態にあると考えられている（Ｂｏｎｎｅａｕ，Ａ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１１１３４，１９８７）。
さらに、前記したように、ｃ−ｍｙｃ、ＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ２、ｅＩＦ４Ｇ、カリウムチャンネルなど、真核細胞のｍＲＮＡの５’非翻訳領域にＩＲＥＳ活性を有する領域が認められることが報告されており、真核細胞でも実際にキャップ非依存的機構により翻訳開始がなされることも示されている。
また、ＩＲＥＳを同定する方法として、２つのシストロンをもつｍＲＮＡを利用することができる。この方法では、ＩＲＥＳを有する第２シストロンの翻訳は、第１シストロンの翻訳が阻害されている条件下でも行われることを利用する。最近、ＥＭＣＶの、ＩＲＥＳを有する環状ＲＮＡは、スパルソマイシンにより翻訳の伸長反応が阻害されている条件下でもＲＮＡへのリボソームの結合が起こることが示されている（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，４１５，１９９５）。
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれら実施例により限定的に解釈されるべきではなく、当業者により想到される種々の改良、修飾された態様も本発明に包含される。
先ず、以下の実施例において本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションの方法、トランスフェクタントの同定（ルシフェラーゼ活性のアッセイ）について概略説明する。
［トランスフェクション］
後記実施例２〜６における、宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、リン酸カルシウム法によって行った。使用した細胞系は実施例によって異なるが、トランスフェクションを行なう前日に細胞を６ウェルプレートの各ウェル（直径３５ｍｍ）に、翌日使用する際にウェルの約５０％の細胞濃度になるように播種した。すなわち、５×１０５の細胞を３ｍＬの培地に播種して、３７℃、５％ＣＯ２下で一夜培養したものを用いた。トランスフェクション実施当日に、リン酸カルシウムと発現ベクターＤＮＡとの沈殿を細胞培養液に加える前に、上記培養細胞の培養上清を吸引して除き、新鮮な培地を加えた。培地はすべての実験に共通で、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ社製）を使用した。
リン酸カルシウムと発現ベクターＤＮＡとの沈殿は、以下のようにして作製した。すなわち、ポリスチレンチューブを２本（ＡおよびＢ）用意し、チューブＡの方にキットに付属の水、ＣａＣｌ２および発現ベクターＤＮＡを混合し、チューブＢの方にキットに付属の２×ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．１，２８０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）をチューブＡに入っている液量と等量注入した。チューブＢの中にチューブＡの液を全てを混ぜながらゆっくりと滴下し、３０分間室温放置すると液がうっすらと白濁してくる。これをボルテックスミキサーで良く混合した後に、１つのウェルの細胞培養液の中にチューブ中の液をすべて滴下した。この結果ウェルに投入されるＤＮＡ量は５μｇとなるようにした。次いで、３７℃で６時間培養後に培養上清を吸引して除き、ＰＢＳ（−）（リン酸緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．４）：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で細胞表面を２回洗浄した。その後、新鮮な培地を加えて約４８時間３７℃で培養した。
［ルシフェラーゼ活性のアッセイ法］
ルシフェラーゼ活性のアッセイは、ｐＧＬ２ベクターを使用した実施例２、３、４、１０および１２ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）または、その他のベクターを使用した実施例５、６、９、１０および１２ではＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）キットを用いて行った。上記のようにトランスフェクションを行った約４８時間後に、キットの説明書に従って、トランスフェクション後の各ウェルの細胞よりルシフェラーゼ酵素液を得るため、キットの中のｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを１ウェル当り５００μｌづつ加えて細胞中のルシフェラーゼを抽出した。
こうして得られた酵素液につきルシフェラーゼ活性を測定した。すなわち、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、実施例２、３、４、１０および１２）またはＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、実施例５、６、９、１０および１２）キットを使用し、キットの説明書に従って、１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔに２０μｌの酵素液を加え、ルミネッセンスリーダーＢＲＬ−３０１（Ａｌｏｋａ社製）を使って各サンプルを室温で１分間測定した。
ルシフェラーゼ活性を酵素液の蛋白質量当たりで示すために、ルシフェラーゼを測定した後の残りの酵素液中の蛋白質含量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）と添付の牛アルブミン標準液を用いて測定した。
実施例２〜６において、それぞれの実験はトランスフェクションの段階から二重試験または三重試験で行った。すなわち、一種類のＤＮＡに対して２〜３ウェルで、別々に宿主細胞へのトランスフェクションを行い、その各々から得られた酵素液のルシフェラーゼ活性を測定した。後掲の表１〜５に示されるデータは、同じトランスフェクタント由来の酵素液の活性を２〜３回測定した結果ではない。
［実施例１］：ＨＣＶの核酸配列断片の作製
有用遺伝子発現増強核酸配列として、ＨＣＶ  ５’非翻訳領域由来のＩＲＥＳ領域を含むｃＤＮＡ配列を調製した。ＨＣＶ感染患者の血清より常法によってｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を反応させて、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、ＩＲＥＳ活性を有するＨＣＶの５’非翻訳領域（配列番号：１、ヌクレオチド第１〜３４１位）とコア蛋白質翻訳領域の一部（同、ヌクレオチド第３４２〜７１３位）を含む特定の断片を増幅するため、以下の配列を有するプライマー（５’末端側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を付加したもの、配列番号：２〜６）を用いてＰＣＲを行った。
0004390392.tif 000002
ＰＣＲは、９４℃で３０分間、５５℃で３０分間および７２℃で３０分間を２０サイクルにて行い、しかしてＨＣＶの５’非翻訳領域を含む断片、すなわち、配列番号：１のヌクレオチド第１〜１８０位、第１８１〜３４１位、第１〜３４１位、第１８１〜７１３位および第１〜７１３位の配列を有するＤＮＡ断片が得られた。これら断片を、以下、それぞれＨＣＶ１−１８０、ＨＣＶ１８１−３４１、ＨＣＶ１−３４１、ＨＣＶ１８１−７１３およびＨＣＶ１−７１３と称する。
［実施例２］：トランジェントトランスフェクション
ベクターとしてｐＧＬ２Ｂ（＝ｐＧＬ２Ｂａｓｉｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ホタル・ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ配列およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナルを含み、プロモーター，エンハンサー、発現増強核酸配列は含まない）ならびに、ｐＧＬ２Ｃ（＝ｐＧＬ２Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ホタル・ルシフェラーゼ、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル、ＳＶ４０  初期プロモーター／エンハンサーを含み、発現増強核酸配列は含まない、図２（ａ）参照）を入手し、ｐＧＬ２Ｂ  ＵＴＲ５’−３’（ｐＧＬ２ＢのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に実施例１で得られたＨＣＶ１−３４１が５’−３’の方向に挿入されている、図２（ｂ）参照）を以下のとおりに調製した。
ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位が付加されたＰＣＲ産物である前記ＨＣＶのｃＤＮＡ断片のうちＨＣＶ１−３４１と、ベクターｐＧＬ２Ｂを、それぞれＨｉｎｄＩＩＩを用いて、３７℃にて一夜反応させて消化した後、分子内でのセルフライゲーションを防ぐために、アルカリフォスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）により３７℃にて３０分間処理を行ったｃＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いマニュアルに従って、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後のベクターとｃＤＮＡ断片とのライゲーション反応を行った。
得られたベクターＤＮＡをコンピテント細胞に導入して形質転換細胞を得、コロニーの中からＨＣＶの各断片を含む組み換え体を選択し、常法に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。
トランスフェクションのため、上記３種のいずれかのベクターＤＮＡを５μｇと、トランスフェクション用の前記キット中のＣａＣｌ２液１８．５μｌをチューブに加え、水を加えて１５０μｌとしたものを先に述べたチューブＡとし、チューブＢには２×ＨＥＰＥＳ  １５０μｌを入れた。宿主細胞としてＣＯＳ１細胞を使用し、上記の手順に従ってトランスフェクションを行なった後、それぞれルシフェラーゼ活性を測定した。
ｐＧＬ２Ｂベクターはルシフェラーゼ活性を示さないので、これをトランスフェクションした細胞の酵素液をブランクとして用いた。ルシフェラーゼ活性は、蛋白質１ｍｇ当たりの相対発光単位（Ｕ／ｍｇ）で表した。
こうして得られた結果を以下の表１に示す。
0004390392.tif 000003
この結果から、プロモーターを含まないベクターｐＧＬ２ＢにＨＣＶ１−３４１が挿入されたベクターｐＧＬ２Ｂ  ＵＴＲ５’−３’でトランスフェクトされた宿主細胞のルシフェラーゼ活性は非常に低い数値であることが明らかである。従って、ＨＣＶの遺伝子の５’非翻訳領域（配列番号：１、ヌクレオチド第１〜３４１位）自体にはプロモーターとしての活性が無いか、またはあったとしても非常に微弱であることが示された。すなわち、本発明の実施例で用いたベクターに含まれるプロモーターよりも、ＨＣＶの５’非翻訳領域に強いプロモーターとしての強い活性があるために、見かけ上ＨＣＶの５’非翻訳領域に遺伝子発現増強効果があるように見えてしまうという可能性が否定される。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであり、複製の過程にＤＮＡに転換されることはないので遺伝子の５’非翻訳領域にプロモーター活性を持っていなくても妥当であるといえる。
実施例３：トランジェントトランスフェクション
本発明の有用遺伝子発現ベクターを構築するため、実施例２に記載のｐＧＬ２ＣのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＨＣＶ１−３４１が５’−３’方向に挿入されたｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ５’−３’（図２（ｃ））を、前記ｐＧＬ２Ｂ  ＵＴＲ５’−３’の調製法と同様にＨｉｎｄＩＩＩを用いて調製した。
ｐＧＬ２ＣまたはｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ５’−３’のいずれかのベクターＤＮＡを５μｇ用い、実施例２におけると同様にしてＣＯＳ１細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定した。
こうして得られた結果を以下の表２に示す。
0004390392.tif 000004
このデータは、発現ベクターの中のプロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子との間にＨＣＶ１−３４１を５’−３’の方向に挿入するとルシフェラーゼ活性が上昇することを明示している。従って、ＨＣＶの遺伝子の５’非翻訳領域に遺伝子発現増強効果があることが示唆された。
実施例４：トランジェントトランスフェクション
実施例３のｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ５’−３’に替えて、ｐＧＬ２ＣのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＨＣＶ１−３４１が実施例３とは逆の３’−５’方向に挿入されたｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ３’−５’（図２（ｄ）参照）を作製し、実施例３と同様の実験を行った。この結果を以下の表３に示す。
0004390392.tif 000005
この結果から明らかなとおり、ＨＣＶ１−３４１を３’−５’方向に挿入した場合実施例３で認められたような活性増強効果は全くなく、むしろ活性が低下していた。この結果と実施例３の結果を総合して、ＨＣＶの５’非翻訳領域には、その塩基配列特異的に、そして５’−３’の方向に依存して有用遺伝子産物発現増強効果があることが示される。また、この配列は従来のエンハンサー配列ともその本質を異とすることも明らかである。
なお、本実施例において、ｐＧＬ２Ｃがトランスフェクトされた細胞の活性値は、実施例２や実施例３における結果に比べて１／１０またはそれ以下であるが、これは本実施例でトランスフェクションの効率が実施例２や実施例３の１／１０であったことによるものであり、ｐＧＬ２Ｃとの比較においてｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ３’−５’による効果を考察しているので、相対的な活性値の低さについては問題ないものと考える。
実施例５：トランジェントトランスフェクション
本発明による有用遺伝子発現増強の効果がプロモーター、有用遺伝子、宿主細胞等に特異的なものであるか否かを検討するため、本実施例では、実施例２〜４で使用したものとは相違するプロモーターと、起源の異なるルシフェラーゼを含むｐＲＬＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナルおよびＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを含む、図３（ａ）参照）を用い、宿主細胞としてはヒト肝癌由来Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を使用した。
実施例１において調製したＨＣＶの５’非翻訳領域を含むｃＤＮＡ断片、ＨＣＶ１−１８０，ＨＣＶ１−３４１，ＨＣＶ１８１−３４１またはＨＣＶ１８１−７１３をそれぞれ、いずれもｐＲＬＴＫのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に実施例２に記載の手順により挿入、ｐＲＬＴＫ  １−１８０（図３（ｂ））、ｐＲＬＴＫ  １−３４１（図３（ｄ））、ｐＲＬＴＫ  １８１−３４１（図３（ｃ））、およびｐＲＬＴＫ  １８１−７１３（図３（ｅ））を作製した。ｐＲＬＴＫ  １−３４１は、実施例３におけるｐＧＬ２Ｃ  ＵＴＲ５’−３’と同じ発現増強核酸配列を挿入したもの、そしてｐＲＬＴＫ  １−１８０はｐＲＬＴＫ  １−３４０の前半分、ｐＲＬＴＫ  １８１−３４１は後半分に相当する配列を挿入したものである。ｐＲＬＴＫ  １８１−７１３はｐＲＬＴＫ  １−３４１よりも１９２塩基対だけ長い配列を含み、この１９２塩基対はコア蛋白質の翻訳領域に相当する。
宿主細胞へのトランスフェクションにあたり、１ウェル当りに用いたＤＮＡ量は実施例２、３および４と同じく５μｇでその他の条件も全く同一とした。
但し、ルシフェラーゼとしては上記実施例と異なり、ホタルではなくウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）由来のものを用いたので、アッセイキットは先に述べたようにＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した。
それぞれのベクターをトランスフェクトした宿主細胞に認められた活性を以下の表４に示す。
0004390392.tif 000006
この結果、ＨＣＶ１−１８０，ＨＣＶ１−３４１，ＨＣＶ１８１−３４１またはＨＣＶ１８１−７１３のいずれの配列を用いても活性増強効果が顕示され、実施例２、３および４で観察された活性増強効果が、ＳＶ４０  プロモーターとホタル・ルシフェラーゼの組み合わせで、しかもＣＯＳ１細胞にトランスフェクトした場合のみに認められる特異的なものではないことを示している。さらに、ｐＲＬＴＫ  １８１−３４１を用いた場合に特に効果が強く、ＨＣＶ１−３４１の核酸配列による効果は、その配列のうちヌクレオチド第１８１〜３４１位に起因している可能性を示している。
従って、本実施例によって、プロモーターや有用遺伝子の起源や種類が違っても、また宿主細胞が異なっても、やはり５’非翻訳領域（配列番号：１、ヌクレオチド第１〜３４１位に示される配列）は遺伝子発現増強効果を有していること、この配列のうちヌクレオチド第１８１〜３４１位が最も強い効果を有するので、当該配列中に本発明による効果を生み出す配列が存在することが示唆された。また、５’非翻訳領域のみならずコア蛋白質の翻訳領域の一部（配列番号：１、ヌクレオチド第３４２〜７１３位）をも含む配列を用いても発現増強の効果は認められることも明らかになった。
実施例６：ステイブルセルライン
本実施例では、実施例２〜５とは異なり、宿主細胞のトランジェントトランスフェクションによる結果ではなく、トランスフェクションの後安定に発現ベクターが組み込まれて、導入した遺伝子の発現が継続され得る系（ステイブルセルライン）における、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列の効果を確認した。ステイブルセルラインは、抗生物質Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する耐性遺伝子ｎｅｏを有する発現ベクターを使って宿主細胞をトランスフェクトし、次いでＧ４１８を含む培養液中でも増殖する細胞のみを集めることによって得ることができる。
ベクターとしては先ず、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入手し、このベクターからＴ７プロモーターの配列を除いたものを作製し、そのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位に実施例５と同様のウミシイタケ・ルシフェラーゼを組み込んだプラスミドｐｃＤＮＡＲＬ（図４（ａ））を調製した。この発現ベクターにおけるプロモーターおよびエンハンサーはＣＭＶ、ｐｏｌｙＡシグナルはウシ成長ホルモン由来のものである。
前記ＨＣＶ１−１８０，ＨＣＶ１−３４１，ＨＣＶ１８１−３４１、ＨＣＶ１８１−７１３またはＨＣＶ１−７１３の各ｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡＲＬベクターに組み込んで、それぞれプラスミドｐｃＤＮＡＲＬ  １−１８０、ｐｃＤＮＡＲＬ  １−３４１、ｐｃＤＮＡＲＬ  １８１−３４１、ｐｃＤＮＡＲＬ  １８１−７１３またはｐｃＤＮＡＲＬ  １−７１３を調製した。
これら各発現プラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションは、実施例２に記載したと同様に実施した。但し、ベクターＤＮＡを１０μｇとＣａＣｌ２を３７μｌ、これにキットに添付の水を加えて３００μｌとしたものをチューブＡ液に、チューブＢには２×ＨＥＰＥＳを３００μｌを入れて用いた。また、宿主細胞であるＨｅｐＧ２細胞は、あらかじめコラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ（細胞接着面積が７５ｃｍ２の培養フラスコ）に約５０％の細胞密度となるように準備しておいたものを使用した（５×１０６細胞数／２０ｍＬ培地）。
実施例２〜５では、トランスフェクト後の細胞を約４８時間培養した後に、細胞中のルシフェラーゼ活性を測定して結果を求めたが、本実施例では約４８時間経った頃にステイブルセルラインを獲得するべくＧ４１８を培養液中に８００μｇ／ｍｌとなるように加えた。３７℃で培養を継続すると約１週間後にはほとんどの細胞が死滅してしまうが、上記各プラスミドＤＮＡ（耐性遺伝子ｎｅｏを有する）を含む細胞は生き残り、コロニーを形成する。このコロニー群がある程度成長したら新しいフラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２で培養して増殖させると共に、細胞の一部を液体窒素に保存した。
ここでは、形成されたコロニーを一つ一つ単離して増殖した訳ではなく、生き残った細胞を含む全てのコロニーの混合物として回収したので、各ｃＤＮＡ断片由来のステイブルセルラインは、全て同条件で得られたものといえる。
こうして増殖した各ステイブルセルラインの６ウェルプレートの１ウェル（直径３５ｍｍ）に相当する面積分の細胞から、前記の通りに酵素液を抽出してルシフェラーゼ活性を測定した。この結果をｐｃＤＮＡＲＬ、ｐｃＤＮＡＲＬ  １−３４１（図４（ｃ）参照）およびｐｃＤＮＡＲＬ  １８１−３４１（図４（ｂ）参照）につき以下の表５に示す。
0004390392.tif 000007
この結果、ステイブルセルラインでも実施例５と同様にＨＣＶ１８１−３４１のｃＤＮＡ配列により活性が最も増強されることが示された。また、この実験で使用されたプロモーターは実施例２〜５で用いたプロモーターとは別のものであるが、やはり遺伝子発現増強効果は示され、本発明による効果が特定のプロモーターに依存するものでないことが明らかになった。
従って、永久発現細胞においても、トランジェント系の結果に示された有用遺伝子発現増強効果は顕示されたので、実施例２〜４において、比較されたグループ間によってルシフェラーゼを発現している細胞数が違うために、発現活性に差があるかのごとく見受けられたのではないかという疑問が解決された。
［実施例７］：ＨＣＶ１ｂ変異株由来の核酸配列断片の作製および配列
ＨＣＶ１ｂの５’非翻訳領域由来のＩＲＥＳ領域を含む別のｃＤＮＡ配列を調製した。実施例１とは異なるＨＣＶ１ｂ陽性患者の血清から、実施例１に記載したと同様にｃＤＮＡを合成した。この患者は、高ウイルス血症を呈しており（１０３ウイルスコピー数／ｍｌ血漿）、ウイルスの複製が非常に活発であり、従ってそのＨＣＶにおける翻訳が高効率で行われている可能性を有するものであった。このｃＤＮＡを鋳型にして、ＨＣＶ１ｂ変異株の５’非翻訳領域からなる断片を、以下の配列を有するプライマー（５’端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ（下線部）を付加したセンスプライマー（配列番号：８）およびアンチセンスプライマー（配列番号：９））を用いてＰＣＲを行い、増幅した。
0004390392.tif 000008
ＰＣＲの反応条件は、実施例１に記載したと同様に設定した。得られたＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＡｐａＬ  Ｉを用いて消化し、アガロースゲル電気泳動にて精製した。
この断片を定法により配列決定して、配列番号：７に示される３４２ヌクレオチドからなる配列を得た。この配列を、従来より知られているＨＣＶ１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ００８３２）由来の５’非翻訳領域の前記断片ＨＣＶ１−３４１（配列番号：１、第１〜３４１位）と比較したところ、図５にそれぞれ５’−ＵＴＲ３４２および５’−ＵＴＲ３４１として示すように、変異株由来の５’非翻訳領域は、▲１▼第１１９位のアデニンがシトシンに置換されており、且つ▲２▼第２０７位にチミジンが挿入されていることが判明し、これらの変異は同じ検体由来の他のｃＤＮＡクローンからも検出された。こうして同定された各々の変異のＩＲＥＳ領域における位置は、図６に示すように、それぞれ高度保存領域以外の領域、ピリミジンリッチ領域の内部または近傍、トランス因子の結合領域の近傍あるいはＢｏｘＡおよびＢｏｘＢの近傍に存在していた。
［実施例８］：ＨＣＶ１ｂ変異株由来の発現増強配列を含むベクターの構築
実施例７で得られた断片（以下、ＨＣＶ−３４２）による発現増強の効果と、さらにこの断片における上記変異が及ぼす発現増強効果に対する影響を調べるために、Ｔ７プロモーター、発現増強配列（ＨＣＶの５’非翻訳領域由来断片）、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）遺伝子およびＴ７ターミネーターを含むベクターを、ｐＧＥＭＥＸ−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）より構築した（図７および８参照）。
Ｒｌｕｃとしては、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から、以下の配列を有するプライマー（５’端にＡｐａ  ＬＩ切断部位（下線部）を付加した、センスプライマー（配列番号：１０）および５’端にＡｓｃ  Ｉ切断部位（下線部）を付加したアンチセンスプライマー（配列番号：１１））を用いて増幅し、次いでそのＰＣＲ産物をＡｐａＬ  ＩおよびＡｓｃ  Ｉで消化して、アガロースゲル電気泳動にて精製したものを使用した。
0004390392.tif 000009
ＨＣＶ−３４１を含むベクターｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１は、図７および８の（ｂ）に、ＨＣＶ−３４２を含むベクターｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２は、同図面の（ｃ）に、それぞれ示すとおりの構造を有する。
各ベクターは、ｐＧＥＭＥＸ−１ベクターから予めＴ７  ｇｅｎｅ  １０を全て除去し、そのＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターとの間にＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ａｓｃ  Ｉ制限酵素部位を導入しておいたものを、発現増強配列としてのＨＣＶ−３４２またはＨＣＶ−３４１のいずれかと、前記Ｒｌｕｃと共に、実施例２に記載の方法に準じてライゲーション反応を行うことによって調製した。対照となる、発現増強配列を含まないベクターｐＴ７−ＲＬは、図７および図８の（ａ）に示すように、Ｒｌｕｃレポーター遺伝子をＴ７プロモーターの直下、Ｔ７ターミネーターの直前に連結した。
さらに、ＨＣＶ−３４２における第１１９位でのアデニンからシトシンへの置換による影響を確認するため、ＨＣＶ−３４１の第１１９位にかかる置換を起こした配列を含むベクターとして、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１Ｃ（図８（ｄ））を調製し、第２０７位へのチミジンの挿入による影響を確認するため、ＨＣＶ−３４２の第１１９位のシトシンをアデニンに置換した配列を含むベクターとして、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２Ａ（図８（ｅ））を調製した。それぞれの変異配列を含むベクターは、ＰＣＲを用いた突然変異導入法により得られたものを、上記と同様にして調製した。
各ベクターに導入したＰＣＲ産物は全て、配列決定により目的とする配列を含むことを確認したものを用いた。
［実施例９］：ラン・オフＲＮＡ合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳
実施例８で得られたプラスミドベクターについて、以下の通りにラン・オフＲＮＡ合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によってルシフェラーゼを発現させることにより、導入した発現増強配列の効果を同定した。
それぞれの環状のプラスミドベクターをＡｓｃ  Ｉで消化することによって直鎖状となし、各ＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）によるラン・オフＲＮＡ合成の鋳型として用いた。転写反応の条件は、製造元のプロトコルに従うものとした。転写反応終了後、１０ＵのＲＱ  ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を反応混液に添加して、鋳型として用いたＤＮＡを消化分解し、次いでＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出した後、エタノール、７．５Ｍ酢酸ナトリウムを用いて沈降させた。合成されたＲＮＡの濃度は、分光光度計を用いて定量した。
次に、それぞれのＲＮＡから、ヌクレアーゼによる処理済のウサギ網状赤血球抽出液（Ｒａｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ：ＲＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。翻訳のための反応は、１μｇのＲＮＡ、１７．５μｌの上記抽出液、１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、２０μＭのアミノ酸混合液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含み、１２０ｍＭ塩化カリウムの存在下、２５μｌの総容量の反応混液で、３０℃にて９０分間進行させた。このように塩化カリウムを生理的塩濃度が維持されるように添加することによって、ＨＣＶのＲＮＡの翻訳がＩＲＥＳに依存的に成し遂げられる。次いでＲＮａｓｅ  Ａを添加して反応を停止し、２．５μｌの反応混液を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
こうして得られた結果を、図９に示す。図中、縦軸は、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）の活性を１００％として、各ベクターによる相対値を％にて表した。これらの結果は、三重の実験を２度繰り返して得られた結果の平均および標準偏差を示している。＊印を付したものは、ｐ＜０．０１にてｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）による結果と有意差があることを示す。
この図９から明らかなように、ＨＣＶ−３４２を発現増強配列として導入したベクターｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２（ｃ）によれば、ＨＣＶ−３４１を導入したｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）のおよそ４倍の活性が発現していた。そして、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１Ｃ（ｄ）によればｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１の場合とほぼ同等の活性が発現していたので、ＨＣＶ−３４２の第１１９位における置換は、発現増強に影響を及ぼす変異ではないことが示唆された。一方ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２Ａ（ｅ）によれば、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２の場合と同等の強い活性が発現されており、従って、配列番号：１で示されるＨＣＶ由来の配列の第２０７位へのチミジンの挿入が、ＨＣＶ−３４２による強いＩＲＥＳ依存性の発現活性増強能に寄与していることが推測された。
［実施例１０］：トランジェントトランスフェクション
実施例８にて調製した各ベクターをトランスフェクトした細胞においても、実施例９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系と同様の発現増強に関する効果が示されるか否かを調べた。
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８０６５）より入手したものを、１０％胎児牛血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ社製）で、５％ＣＯ２の湿潤条件下に培養しておいた。このＨｅｐ  Ｇ２細胞に、ｐＡＭ８−１（Ｄｒ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより供与）をトランスフェクトすることにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現している細胞系Ｈｅｐ  Ｔを樹立した。
Ｈｅｐ  Ｔ細胞をトランスフェクションの２４時間前に、３５ｍｍ径の組織培養用ディッシュに播種して、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞と同様の条件で培養しておいた。各プラスミドＤＮＡを７μｇずつトランスフェクションに用い、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によってトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの効率の標準化を目的として、ホタル・ルシフェラーゼを発現するｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を上記各ベクターと共に、１０：１のモル比にて用い、双方をコ・トランスフェクトした。各ベクターのコ・トランスフェクションに対して３つのウェルを用い、この三重の実験を２度繰り返して行った。
トランスフェクトした細胞を４８時間培養した後、その細胞溶解液について、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍで発現したルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、共にトランスフェクトしたホタル・ルシフェラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍで測定し、トランスフェクションの効率を求めて各活性値を補正した。この結果を図１０に示す。図中、図９と同様に、縦軸は、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）の活性を１００％とした各ベクターによる相対値％で、三重の実験を２度繰り返して得られた数値の平均および標準偏差によって示している。＊印を付したものは、ｐ＜０．０１にてｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）による結果と有意差があることを示す。
図１０でも、実施例９にて得られたものとほぼ同様の結果が示されている。すなわち、ＨＣＶ−３４２を発現増強配列として導入したベクターｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２（ｃ）によれば、ＨＣＶ−３４１を導入したｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）の場合のおよそ６〜７倍の活性が発現していた。そして、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２Ａ（ｅ）によれば、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４２の場合と同等の強い活性が発現されていた。
ベクターｐＴ７−ＲＬがトランスフェクトされた場合（ａ）のＲｌｕｃ活性は極めて低く、これはキャップ非依存性の翻訳開始が効率よく行われなかったことに起因するものと考えられた。しかして、ＨＣＶ−３４２の配列およびこの配列の第１１９位を置換した配列の双方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系でも、トランスフェクタント内でも発現を増強できることが明らかになった。
［実施例１１］：ＨＣＶ１ｂ変異株由来の発現増強配列を含むビ・シストロン・ベクターの構築
上記単一シストロン系における結果をさらに例証するための実験用に、実施例８で調製したベクターと同様の発現増強配列を含み、且つ２つのシストロンを有するベクターを調製した。ＳＶ４０プロモーター、ホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子、発現増強配列、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）遺伝子およびＳＶ４０ポリＡを含むベクターを、Ｆｌｕｃ遺伝子が組み込まれたｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）より構築した（図１１および１２参照）。
実施例８に記載したと同様にＰＣＲによって増幅した各発現増強配列（対照のｐＧＬ３Ｒには含まない：図１１および１２（ａ））とＲｌｕｃを、ｐＧＬ３  ＣｏｎｔｒｏｌベクターのＸｂａ  Ｉ部位に導入した。導入後のベクターは配列決定を行って、正しい方向に各配列が組み込まれたことを確認した。
［実施例１２］：トランジェントトランスフェクション
実施例１１で得られたビ・シストロン・ベクターを、実施例２におけると同様にＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣより入手、受託番号ＣＲＬ−１６５０）へトランスフェクトした。
トランスフェクト体から、先ずＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍで発現した各ルシフェラーゼ活性値を測定し、さらに、上流のシストロンより発現されるホタル・ルシフェラーゼの活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍで測定してトランスフェクションの効率を算定し、上記各活性値を補正した。こうして得られた結果を図１３に示す。図中、図９と同様に、縦軸は、ｐＴ７−ＲＬ−ＵＴＲ３４１（ｂ）の活性を１００％とした各ベクターによる相対値％で、三重の実験を３度繰り返して得られた数値の平均および標準偏差によって示している。＊印を付したものは、ｐ＜０．０５にてｐＧＬＲ３Ｒ−ＵＴＲ３４１（ｂ）による結果と有意差があることを示す。
図１３に示すように、対照のベクターであるｐＧＬ３Ｒ（ａ）によれば、下流の第２シストロン（Ｒｌｕｃ）由来の発現は殆ど認められず、発現増強配列を導入して初めて、その活性が発現していた。そして、ＨＣＶ−３４２を発現増強配列として導入したベクターｐＧＬ３Ｒ−ＵＴＲ３４２（ｃ）によれば、ＨＣＶ−３４１を導入したｐＧＬ３Ｒ−ＵＴＲ３４１（ｂ）またはＨＣＶ−３４１の第１１９位が置換されたｐＧＬ３Ｒ−ＵＴＲ３４１Ｃ（ｄ）の場合のおよそ２倍の活性が発現していた。そして、ｐＧＬ３Ｒ−ＵＴＲ３４２Ａ（ｅ）によれば、ｐＧＬ３Ｒ−ＵＴＲ３４２の場合と同等の強い活性が発現されており、やはり、第２０７位へのチミジンの挿入によって発現増強能が高められ、第１１９位の変異は発現増強にあまり影響を及ぼさないことが示唆された。
これらの結果より、ＨＣＶの変異株に由来する配列（５’−ＵＴＲ３４２）による、ＩＲＥＳ活性に基づく特に優れた発現増強の効果は、肝細胞に限らず、効果の強弱は多少あるものの、細胞特異的なものでないことが明らかになった。そして、やはり細胞非特異的に、ＨＣＶの野生株の５’非翻訳領域の第２０７位へのチミジンの挿入によって発現増強の効果が高められることも確認された。
以上の実施例から、ＨＣＶ由来の発現増強配列に単一の変異を施すことによって発現増強の効果を格段に高め得ることが示唆される。この効果が示された変異部位、すなわちＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域の第２０７位は、ピリミジン領域（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）結合蛋白質（Ａｌｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｌ，Ａ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９，６３６７−６３７５，１９９５）の結合部位であると推定される領域の中に含まれている。ピリミジン領域結合蛋白質は、翻訳因子の１つであると考えられている（Ｈｅｌｌｅｎ，Ｃ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７６４２−７６４６，１９９３、Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，８２６８−８２７５，１９９３、Ｈｅｌｌｅｎ，Ｃ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，９４１−９５０，１９９４、およびＷｉｔｈｅｒｅｌｌ，Ｇ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ，；Ｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，３１８３−３１９２，１９９４）ので、前記部位にヌクレオチドが１つ挿入することで翻訳の開始に必要とされる細胞性の因子とＩＲＥＳとの相互作用が促進するのかもしれないと考えられる。酵素によるフットプリンティング分析によって、ポリペプチド鎖開始因子ｅＩＦ３による、野生型ＨＣＶのＩＲＥＳ構造の第ＩＩＩドメイン上の第２０４、２１４、２１５、２１６および２１２位における保護が認められており、ｅＩＦ３に対するＨＣＶのＩＲＥＳ上の結合領域が、かかるドメインＩＩＩの端部に含まれていることが示唆されている（Ｓｉｚｏｖａ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，４７７５−４７８２，１９９８）。このｅＩＦ３結合領域と想定される部分の中心に、前記変異部位たる第２０７位が位置しているので、この部分へのチミジン挿入によってｅＩＦ３に対する親和性が変化し、発現増強効果の上昇が起こったのかもしれないと思われるが、この機構の詳細については未だ明確ではない。既知の５’−ＵＴＲ３４１に比較して、新規の５’−ＵＴＲ３４２が高いＩＲＥＳ活性の増強能を有するのは、▲１▼ピリミジンリッチ領域の近傍に変異がある、▲２▼トランス因子の結合部位に変異がある、もしくは▲３▼ＢｏｘＡおよびＢｏｘＢの近傍に変異がある等に起因すると考えられ、それ故にリボソームの結合が増強した結果であると思われる。
また、５’非翻訳領域に変異が認められた新規ＨＣＶ臨床分離株（配列番号：７）は、高ウィルス血症の患者より単離されたため、５’−ＵＴＲ３４２がウィルスの複製を活発にしていることが示唆される。ゆえに、２０７位にチミジンが挿入された５’−ＵＴＲ３４２を特異的に検出することにより、感染したＨＣＶの特徴を知ることもできる。
上記実施例２〜６に示すように、ＣＯＳ１およびＨｅｐＧ２等の真核細胞において、真核細胞のＲＮＡポリメラーゼに親和性を有するＳＶ４０、ＨＳＶ  ＴＫおよびＣＭＶプロモーターを用いてルシフェラーゼ発現増強実験を行った結果、発現環境・発現方法等が異なっても、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を用いることにより、ルシフェラーゼ発現を増強させることができた。これら真核細胞の翻訳はキャップ依存的な翻訳過程であり、かつＩＲＥＳ非依存的な翻訳過程であることが判っている。依って、実施例２〜６に示す様な実験はＩＲＥＳ活性に依存しない翻訳過程の実験系であるといえる。すなわち、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列は、その作用原因として、ＩＲＥＳ活性非依存的な翻訳増強因子として機能しているものと考えられる。従って、ＩＲＥＳ活性に依存しない翻訳過程の実験系において、ＨＣＶの５’−ＵＴＲ３４１が有用遺伝子の発現を増強することが本発明により初めて証明されたのである。
一方、実施例９に示すように、ＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程の実験系であるウサギ網状赤血球抽出液を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳において、５’−ＵＴＲ３４２は５’−ＵＴＲ３４１に比較してＩＲＥＳ活性を大幅に増強することにより、有用遺伝子発現を増強させることができた。さらに、実施例１０〜１２に示すように、原核細胞のＲＮＡポリメラーゼに親和性を有するＴ７プロモーターを用いてルシフェラーゼ発現増強実験を行った結果、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをＨｅｐＧ２細胞に導入し形質転換したＨｅｐＴ細胞の細胞質中であってもルシフェラーゼの発現を増強させることができた。また、ビシストロニックの系でＳＶ４０プロモーターを用い、Ｔ抗原発現ＣＯＳ細胞にてルシフェラーゼ発現増強実験を行ったところ、ルシフェラーゼ発現が増強した。これら実施例９〜１２に示したような、ＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程の実験系においてルシフェラーゼ発現を増強させるということは、５’−ＵＴＲ３４２が作用原因として５’ＵＴＲ−３４１が有するＩＲＥＳ活性の増強もしくはｍＲＮＡの安定性の向上のいずれかに働いているものと考えられる。本発明者らは、ＨＣＶの５’−ＵＴＲ３４２に関してはｍＲＮＡの安定性の向上に起因するのではないことを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓ  Ａｓｓａｙ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８７８９−８７９６，１９９８参照）によって証明している。いずれにしても、ＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程の実験系において、ＨＣＶの５’−ＵＴＲ３４２を用いることにより５’−ＵＴＲ３４１に比較して有用遺伝子の発現を増強することができる。現在までに、ＨＣＶの５’非翻訳領域においてＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程の実験系により、５’−ＵＴＲ３４１がＩＲＥＳ活性を有することが報告されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２６，４７−５６，１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８７８９−８７９６，１９９８参照）。しかしながら、本発明により初めて、本発明のＨＣＶ由来の新規５’−ＵＴＲ３４２配列がこれまで報告されている５’−ＵＴＲ３４１の有するＩＲＥＳ活性に比較して強力にＩＲＥＳ活性を増強させ、有用遺伝子の発現を増強させることが判明したのである。
実施例９〜１２の様なモノシストロニックあるいはビシストロニックな系でＴ７プロモーターの下流にＨＣＶの５’非翻訳領域を連結させ、該下流に有用遺伝子を組込み、有用遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を発現させることができるという報告は、すでに存在している（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２６，４７−５６，１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８７８９−８７９６，１９９８）。しかしながら、これらの実験はいずれも、ＨＣＶの５’−ＵＴＲ３４１を用いて実施例１０〜１２に示すごとくＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するように予め宿主を形質転換した哺乳細胞を用いているため、ＩＲＥＳに依存した翻訳過程の実験系によるものである。すなわち、ＨＣＶの５’−ＵＴＲ３４１にＩＲＥＳ活性が存在することは証明されているが、ＩＲＥＳ活性に依存しない翻訳過程の実験系により証明される、翻訳増強因子としての機能は全く示されていない。しかるに、本発明の実施例２〜６によって初めて、翻訳増強因子の機能が証明されたのである。また、ＨＣＶ由来の新規５’−ＵＴＲ３４２が、ＩＲＥＳ活性に依存した翻訳過程の実験系において既知の５’−ＵＴＲ３４１に比較してＩＲＥＳ活性をより増強させることによって有用遺伝子の発現を増強させることができることも、本発明によって初めて証明されたのである。
〔産業上の利用可能性〕
本発明によって発現ベクターの種類、これに含まれるプロモーターやシグナル、エンハンサー等の配列、有用遺伝子の種類や起源、宿主細胞種の如何に関わらず、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子の発現を増強して遺伝子産物の生産量を増加させることができるという効果がもたらされる。
また、導入する配列に特定の変異を施して、遺伝子発現を増強させる能力をさらに高めることが可能である。
これらの効果は、細胞培養系においてペプチド産生量を増加させる目的に利用され得るだけでなく、従来、臓器や腫瘍などに特異的であるがその活性が弱いために実用化が難しかったプロモーターと組み合わせることによって、効果的な遺伝子治療用のベクターへの応用にも利用することができる。
さらに、通常のＩＲＥＳ活性よりも優れたＩＲＥＳ活性を有する配列を含むプローブを用いて、ＩＲＥＳとの相互作用性を有する物質（モジュレーター等）や、ＩＲＥＳ依存性の翻訳開始因子をスクリーニングすることが可能になる。
また、本発明の有用遺伝子発現増強核酸配列を生体内に導入することによってｍＲＮＡ翻訳を促進させて、生体内でのキャップ依存的ｍＲＮＡ翻訳の低下に起因する疾患を治療することもできる。
あるいは、生体内でのＩＲＥＳ活性の低下に起因する疾患を治療するために有用遺伝子発現増強核酸配列を生体内に導入することによって、ｍＲＮＡ翻訳を促進させることも可能となる。
さらには、被験者由来の生体試料中に含まれるＨＣＶ由来の特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出し、この配列の存在に基づいてＣ型肝炎の重症度を診断することができる。
【配列表】
0004390392.tif 000010
0004390392.tif 000011
0004390392.tif 000012
0004390392.tif 000013
0004390392.tif 000014
0004390392.tif 000015
0004390392.tif 000016
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域における二次構造の概略を示す模式図である。
第２図は、本発明の一実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターを示す模式図である。
第３図は、本発明の別の実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターを示す模式図である。
第４図は、本発明のさらに別の実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターを示す模式図である。
第５図は、２種のＨＣＶの５’非翻訳領域（ＨＣＶ１〜３４１：５’−ＵＴＲ３４１およびＨＣＶ−３４２：５’−ＵＴＲ３４２）の核酸配列の比較を示す図である。
第６図は、ＨＣＶの変異株由来の核酸配列の５’非翻訳領域における二次構造上での変異部位を示す模式図である。
第７図は、本発明のさらに別の実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターを示す模式図である。
第８図は、第７図に示す実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含む発現ベクターを示す概略図である。
第９図は、第７および８図に示すベクターを用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系での発現増強の効果を示すグラフである。
第１０図は、第７および８図に示すベクターを用いてトランスフェクトされたＨｅｐ細胞における発現増強の効果を示すグラフである。
第１１図は、本発明のさらに別の実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含むビ・シストロン発現ベクターを示す模式図である。
第１２図は、第１１図に示す実施態様である、有用遺伝子発現増強核酸配列を含むビ・シストロン発現ベクターを示す概略図である。
第１３図は、第１１および１２図に示すベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞における発現増強の効果を示すグラフである。
【図１】
0004390392.tif 000024
【図２】
0004390392.tif 000025
【図３】
0004390392.tif 000026
【図４】
0004390392.tif 000027
【図５】
0004390392.tif 000028
【図６】
0004390392.tif 000029
【図７】
0004390392.tif 000030
【図８】
0004390392.tif 000031
【図９】
0004390392.tif 000032
【図１０】
0004390392.tif 000033
【図１１】
0004390392.tif 000034
【図１２】
0004390392.tif 000035
【図１３】
0004390392.tif 000036