(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被験物質の存在下および非存在下において、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかの抗体を接触させる工程；
（ａ）重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含む抗体；
（ｂ）軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：１〜４又は７５に記載のアミノ酸配列を含む抗体；
（ｃ）配列表の配列番号３４〜３７、６７〜７０又は７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体；並びに、
（２）被験物質の存在下および非存在下におけるＣ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含む、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
抗体が、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗体が、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白が、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白にタグをつけた蛋白である、請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白が、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白のＣ末端にタグをつけた蛋白である、請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験物質が、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である、請求項１から５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項８】
重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１０】
配列表の配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれかに記載の塩基配列を含有する、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって得ることができ、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する組換え抗体。
【請求項１３】
抗体のＦｃ領域がヒト型である、請求項１２に記載の組換え抗体。
【請求項１４】
抗体が１本鎖抗体である請求項１３に記載の組換え抗体。
【請求項１５】
請求項７又は８に記載の抗体を有効成分として含有する医薬。
【請求項１６】
請求項１２から１４のいずれかに記載の組換え抗体を有効成分として含有する医薬。
【請求項１７】
Ｃ型肝炎の治療および／または予防のための請求項１５又は１６に記載の医薬。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎の診断のための請求項１５又は１６に記載の医薬。
【請求項１９】
請求項７又は８に記載の抗体を有効成分として含有する抗ＨＣＶ剤。
【請求項２０】
請求項１２から１４のいずれかに記載の組換え抗体を有効成分として含有する抗ＨＣＶ剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（以下「ＨＣＶ」ということもある）のエンベロープ糖蛋白に結合する抗体、並びに該抗体と該糖蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、ＨＣＶのエンベロープ糖蛋白と結合することによりＨＣＶの感染阻止作用などの抗ウィルス効果を有する抗体、並びに該抗体のスクリーニング方法に関する。
背景技術
１９８９年米国カイロン社によって、従来非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと呼ばれていたヒト肝炎ウィルスの遺伝子断片がクローニングされ、ＨＣＶと命名された（ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｖｏｌ．２４４，３５９−３６２，１９８９）。ＨＣＶは一本鎖＋鎖ＲＮＡをゲノムとするウィルスである。その後カイロン社の他、国立癌センターの下遠野ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，９５２４−９５２８，１９９０）、大阪大・微研の高見沢ら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．３，１１０５−１１１３，１９９０）によって、Ｃ型肝炎ウィルスの全遺伝子の配列が発表されている。その後ＨＣＶにはコア、エンベロープ１（以下「Ｅ１」または「Ｅ１蛋白」ということもある）、エンベロープ２（以下「Ｅ２／ＮＳ１」または「Ｅ２／ＮＳ１蛋白」ということもある）の３種類の構造蛋白質と６種類の非構造蛋白質が存在することが分かった。
ＨＣＶが発症すると高い確率で急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変を発症させ、最終的には肝癌へと移行し患者を死亡させる。従来は治療には抗ウィルス薬であるインターフェロンが代表的に使われているが、治療効果は患者ごとにばらつきがある点、発熱等の副作用がある点が問題となっている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．４２，２９９−３０５，１９９４）（日消会誌，Ｖｏｌ．９１，９９５−１００２，１９９４）。
またリバビリン等、他の抗ウィルス薬による治療も検討されているがこれも十分な効果は得られておらず（Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３３７，１０５８−１０６１，１９９１）、新たな抗ＨＣＶ薬の開発が待たれているのが現状であった。
一方、ＨＣＶの遺伝子は非常に変異がしやすいと考えられていて、ＨＣＶはその高変異性ゆえに患者の体内の免疫から逃れているものと考えられていた。特にＨＣＶのＥ２／ＮＳ１のＮ末端には２５個から３０個のアミノ酸からなるｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（超可変領域）と呼ばれる変異に富む領域があるとされており、ヒトの免疫系のエピトープはｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎなのではないかと加藤らにより予測されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．７，３９２３−３９３０，１９９３）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．８，４７７６−４７８４，１９９４）。すなわち、ヒトの免疫系、例えば中和抗体の認識する領域はｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ内にあるので中和抗体が感染患者生体内でできてもｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎがすぐに変異してウィルスが抗体からエスケープしてしまうのではないかと考えられている。しかし、石井らの報告でＥ２／ＮＳ１とヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ−４の結合を阻害する抗体が、ＨＣＶから自然治癒した患者の血中にのみ高活性で見られ、ＨＣＶの高変異性にも関わらずＨＣＶの治癒に液性免疫が関与していることが示唆された（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．４，１１１７−１１２０，１９９８）。
ところで、１９９９年米国カイロン社によりＥ２／ＮＳ１が結合する細胞表面の蛋白としてＣＤ８１が単離された（ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｖｏｌ．２８２，９３８−９４１，１９９９）。大腸菌で発現したＣＤ８１とＥ２／ＮＳ１は石井らの報告と同様に結合し、またＨＣＶ自然治癒患者の血清はこの結合を阻害した。この結果よりＣＤ８１はＨＣＶのレセプターであることが示唆された。
以上よりＨＣＶの細胞への感染に深く関与していると思われるエンベロープ蛋白に結合し、かつ、ＨＣＶの感染性のあるヒト細胞への結合を阻止する、例えば、抗体のような物質を薬剤として利用すると、血中のＨＣＶが新たに肝臓等の感染対象臓器に感染することを阻止することが可能となり、ＨＣＶ患者を治癒へと導くことが可能であると考えられた。しかしながら、ＨＣＶに起因する疾患に対する感染阻止物質については、まだ十分な検討が行われていなかったのが現状であった。
発明の開示
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ＨＣＶの細胞への感染に深く関与していると思われるエンベロープ蛋白に結合し、かつ、ＨＣＶの感染性のあるヒト細胞への結合を阻止することができる抗体、並びに当該抗体を用いた医薬を提供することを解決すべき課題とした。
ＨＣＶはＲＮＡウィルスであるため非常に変異しやすいことが知られている。この変異によりＨＣＶの構造蛋白、非構造蛋白ともに様々な箇所が変異をする。この変異のためＨＣＶの感染を阻止する物質、例えばある特定の蛋白配列を認識する抗体等を開発することは困難であると考えられていた。しかし、本発明者らは、石井らの報告にある中和抗体は、治癒患者ごとに感染しているウィルスの配列が異なるにもかかわらず、ただ一種類のＥ２／ＮＳ１への結合を阻止しているという点に着目した。すなわち、抗原の特定の領域あるいは構造を認識する物質ならば、ウィルスの配列の多様性にも関わらず、Ｅ２／ＮＳ１とＨＣＶの感染性のあるヒト細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１との結合を阻止し、感染阻止が可能であると考えた。
本発明では、Ｃ型肝炎患者の症状を改善する薬剤開発のため、Ｅ２／ＮＳ１とＨＣＶ感染性のある細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１の結合を阻害する物質の探索を重ねた結果、ＨＣＶのＨＣＶ感染性細胞への結合および感染阻止が期待される物質を取得することに成功した。さらに、取得した物質とＥ２／ＮＳ１との結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、ＨＣＶのＨＣＶ感染性細胞への結合および感染阻止が期待されるさらに異なる別の物質を取得できることを確認した。
即ち、本発明によれば、（１）被験物質の存在下および非存在下において、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかの抗体を接触させる工程；
（ａ）重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体；
（ｂ）軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：１〜４又は７５に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号：１〜４又は７５に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体；
（ｃ）配列表の配列番号３４〜３７、６７〜７０又は７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号３４〜３７、６７〜７０又は７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する一本鎖抗体；並びに、
（２）被験物質の存在下および非存在下におけるＣ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含む、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、抗体は、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体であり、さらに好ましくは、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である。好ましくは、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白は、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白にタグをつけた蛋白であり、さらに好ましくは、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白のＣ末端にタグをつけた蛋白である。本発明のスクリーニング方法で用いる被験物質は、好ましくは、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング方法により得られる、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白とＣ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体との結合を阻害する物質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体が提供される。
好ましくは、本発明の抗体は、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む。
本発明の別の側面によれば、上記の抗体をコードする核酸が提供される。
好ましくは、本発明の核酸は、配列表の配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれかに記載の塩基配列を含有する。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の核酸を用いた抗体の生産方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法によって得ることができ、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する組換え抗体が提供される。
好ましくは、本発明の組み換え抗体のＦｃ領域はヒト型である。好ましくは、本発明の組み換え抗体は、１本鎖抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を有効成分として含有する医薬、並びに、上記した本発明の組換え抗体を有効成分として含有する医薬が提供される。本発明の医薬は、Ｃ型肝炎の治療および／または予防のために使用でき、あるいはＣ型肝炎の診断のために使用できる。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を有効成分として含有する抗ＨＣＶ剤、並びに、上記した本発明の組換え抗体を有効成分として含有する抗ＨＣＶ剤が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明に関して詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、（１）被験物質の存在下および非存在下において、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかの抗体を接触させる工程；
（ａ）重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体；
（ｂ）軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号：１〜４又は７５に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号：１〜４又は７５に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体；
（ｃ）配列表の配列番号３４〜３７、６７〜７０又は７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号３４〜３７、６７〜７０又は７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する一本鎖抗体；並びに、
（２）被験物質の存在下および非存在下におけるＣ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含むことを特徴とするものであり、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質をスクリーニングするための方法である。
上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の抗体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）に記載の抗体である。これらの抗体は何れもＣ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有することを特徴とする。これらの抗体の重鎖のアミノ酸配列の一例である本出願の配列表の配列番号：９に記載のアミノ酸配列は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）の配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対応し、これらの抗体の軽鎖のアミノ酸配列の一例である本出願の配列表の配列番号：７５に記載のアミノ酸配列は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）の配列表の配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対応する。
本出願の配列表の配列番号３４〜３７に記載の配列は、ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）の配列表の配列番号６２〜６５に対応する。
本出願の配列表の配列番号６７〜７０に記載の配列は、ＳｃＦｖ１−１、ＳｃＦｖ１−２、ＳｃＦｖ１−３、及びＳｃＦｖ１−４のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）の配列表の配列番号２６〜２９に対応する。
本出願の配列表の配列番号７１〜７４に記載の配列は、ＳｃＦｖ２−１、ＳｃＦｖ２−２、ＳｃＦｖ２−３、及びＳｃＦｖ２−４のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０１／００９６７（国際公開ＷＯ０１／５８４５９）の配列表の配列番号３６〜３９に対応する。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、抗体は、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体であり、さらに好ましくは、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である。具体的には、ビオチン、フルオレセイン、ＤＩＧ、ＦＩＴＣ、アルカリフォスファターゼまたはＨＲＰ等の、蛍光を発するか、その物質とある物質、例えば酵素の基質を混合した際に発色をする物質で標識した抗体を使用することができる。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白は、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白にタグをつけた蛋白である。具体的には、ＨＣＶゲノム上の３８４番目から７１１番目までのアミノ酸からなる蛋白質のＣ末端に、それ自体公知であるＥｔａｇ（ファルマシア社）、Ｈｉｓｔａｇ、ｍｙｃｔａｇ、ＦＬＡＧｔａｇ、ＨＡ  ｔａｇ、ＧＳＴ、ＩｇＧ  Ｆｃ領域等の５個以上のアミノ酸からなる、特異的抗体に認識されうる配列を付加した蛋白質を使用することができるが、これには限定されない。さらに言えば、先に論じたとおりＨＣＶのＥ２／ＮＳ１のＮ末端にはｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎという免疫系のエピトープが存在すると考えられている。ゆえに、Ｅ２／ＮＳ１にタグを結合させて発現させる場合、Ｃ末端にタグを結合させたものを使用することが望ましい。またこのようにして得られた蛋白は、可溶性である。この可溶性のＥ２／ＮＳ１は３８４番目のアミノ酸から７４６番目のアミノ酸までの間のＥ２／ＮＳ１の膜外ドメインを発現させたものであれば特に制限なく使用可能である。タグのついた可溶化蛋白Ｅ２／ＮＳ１は、動物細胞、昆虫細胞、酵母等蛋白に糖鎖を付加することが可能な細胞に発現させることができる。
本発明のスクリーニング方法で用いる被験物質は、好ましくは、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である。
本発明で用いる被験物質としては、抗体のほか、抗体以外の蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物などを使用することができる。
抗体以外の蛋白質としては、ラクトフェリン等が挙げられる。硫酸化多糖類としては、例えば分子量が平均分子量５０００Ｄａから１００００００Ｄａの範囲のヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸１およびケラタン硫酸２等のいわゆるグリコサミノグリカン類およびデキストラン硫酸等のことを言うが、好ましくは５０００Ｄａから３００００Ｄａ程度の大きさのヘパリンがよい。低分子化合物としては、ｓｕｒａｍｉｎ等であるが、ＨＣＶのＥ２／ＮＳ１とＨＣＶの感染を阻止する物質であればこれに限らない。
この低分子化合物の結合部位はさまざまな箇所が考えられるが、上記ヘパリンが結合する箇所に結合する物質であるならば、硫酸基が付加している化合物が好ましい。
上記した本発明のスクリーニング方法により得られる、Ｃ型肝炎ウィルスのＥ２／ＮＳ１蛋白とＣ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体との結合を阻害する物質も本発明の範囲内のものである。
さらに本発明によれば、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体、並びに、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体が提供される。
本発明の抗体は、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体であり、好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白と、Ｃ型肝炎ウイルスの感染性のある細胞（以下「ＨＣＶ感染性細胞」ということもある）、ＣＤ８１を発現する細胞（以下「ＣＤ８１発現細胞」ということもある）またはＣＤ８１との結合を阻害する抗体である。
上述のような抗体を選び出し、それぞれの抗体がＥ２／ＮＳ１と、ＨＣＶ感染性細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１との結合を阻害することが可能であるかを以下に示す。
前述のとおりＨＣＶのエンベロープ蛋白にはＥ１とＥ２／ＮＳ１がある。そのうちＥ２／ＮＳ１のｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎと呼ばれる変異に富む領域がヒトの免疫系のエピトープではないかと予測されている。すなわち、ウィルスの感染の第一段階である細胞との結合にはＥ２／ＮＳ１が深く関与していることが予想されるので、本発明ではＥ２／ＮＳ１とＨＣＶ感染性細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１との結合を阻止する物質をＨＣＶの細胞への結合または感染阻止物質として開発に至った。
Ｅ２／ＮＳ１はＨＣＶのゲノムから発現される蛋白の３８４番目のアミノ酸から７４６番目のアミノ酸までである。本発明においては、Ｅ２／ＮＳ１のＨＣＶ感染細胞への結合は、例えば、ＨＣＶ遺伝子のＥ２／ＮＳ１のＣ末端にタグをつけた蛋白を可溶化した形で発現させ、ＨＣＶ感染性細胞またはＣＤ８１発現細胞に結合させ、そのタグに対する抗体を使い、発光法または発色法にてＥ２／ＮＳ１の上記細胞への結合を確認した。結合を阻害する物質は、結合を確認する系にて可溶化Ｅ２／ＮＳ１と前述の細胞を結合させる前にＥ２／ＮＳ１と結合阻害を確認したい物質を混合し、その後該細胞を混合して発光または発色の変化を測定することにより確認した。結合を阻害する物質は、詳しくは後述するが、例えばＨ鎖に配列番号１０から１２に記載のアミノ酸配列があり、Ｌ鎖に配列番号１３から１５に記載のアミノ酸配列がある抗体等が挙げられるが、Ｅ２／ＮＳ１とＨＣＶ感染性細胞またはＣＤ８１発現細胞との結合を阻害する物質であればこれに限らない。また、可溶化ＣＤ８１とＥ２が結合することも報告されている（ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｖｏｌ．２８２，９３８−９４１）ので、上記物質を用いても可溶化ＣＤ８１とＥ２の結合を阻害することが可能であることは容易に類推される。
本発明でいう抗体とは、通常生体内に存在する形の抗体の他に、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも１つ含むペプチド、１組のＨ鎖断片とＬ鎖断片からなるＦａｂ、２組のＨ鎖断片とＬ鎖断片からなるＦ（ａｂ’）２、Ｈ鎖断片とＬ鎖断片が同一ペプチドに直列に結合した一本鎖抗体（以下「ｓｃＦｖ」ということもある）なども含まれる。
本発明では、ｗｈｏｌｅ抗体が最も好ましい。ｗｈｏｌｅ抗体は全長抗体とも称し、全長Ｈ鎖と全長Ｌ鎖の２対の組み合わせから構成される、通常生体内に存在する形の抗体である。
なお、本発明におけるＦ（ａｂ’）２及びＦａｂとは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧ１をパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
本発明においては、モノクローナル抗体の作製は、Ｃ型肝炎治癒患者のＢ細胞より抗体の遺伝子を取得することにより行った。ヒト由来の複数のＢ細胞より目的とする抗体の遺伝子のみを単離する方法として、ＥＢＶを患者のＢ細胞にｔｒａｎｓｆｏｒｍしてＢ細胞を不死化してから目的の抗体を生産する細胞のみクローニングする等の手法が従来あるが、本発明者は鋭意検討の結果ファージディスプレイ法によりｓｃＦｖを取得するに至った。
ファージディスプレイ法による抗体の取得の一例を挙げれば、Ｃ型肝炎治癒患者からヘパリン採血を行い、Ｆｉｃｏｌｌ法にて末梢血単核球を取得し、抗ＣＤ１９抗体単体を利用してＢ細胞のみを精製した。この後、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−１０、Ｅ２／ＮＳ１抗原１ｎｇ／ｍｌ、抗ヒトＣＤ４０抗体１μｇ／ｍｌを用いてＢ細胞に抗体遺伝子のｍＲＮＡへの転写を刺激した。このＢ細胞の精製は、Ｂ細胞を特異的に分離できるものであれば特に制限されない。また、Ｂ細胞の刺激についても、前述以外の方法を用いてもよいし、適宜省略した方法を用いても問題ない。その後、Ｂ細胞より抗体ｍＲＮＡ、さらに抗体ｃＤＮＡを取得した。さらに、ｓｃＦｖ発現プラスミドにＨ鎖とＬ鎖可変領域の遺伝子を組み込める一本鎖抗体の遺伝子の枠組みを作製し、さらにその下流にＭ１３ファージのｇｅｎｅ３遺伝子を結合した。そのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域を組み込む場所に上記取得ｃＤＮＡからＰＣＲ法にてランダムに取得したＨ鎖およびＬ鎖を組み込んだ。このプラスミドを用いてＭ１３ファージの先端にｇｅｎｅ３蛋白と融合蛋白の形で組み込んだ一本鎖抗体を発現させ、そのうちＥ２／ＮＳ１に結合するもののみ選択することにより、Ｈ鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列表の配列番号１０、１１および１２に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列表の配列番号１３、１４および１５に記載のアミノ酸配列である一本鎖抗体ｓｃＦｖ２−１及び該ｓｃＦｖ２−１を発現するファージを取得した。そして、ｓｃＦｖ２−１及び該ｓｃＦｖ２−１を発現するファージが、特にＥ２／ＮＳ１に対して親和性が強く、Ｅ２／ＮＳ１とＨＣＶ感染性細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１の結合を強く阻害することを見いだした。
なお、上記では、Ｍ１３ファージのシステムを用いて一本鎖抗体をスクリーニングする手法を挙げたが、本発明においては、「抗体」とファージの表面に提示される蛋白が、融合蛋白の形で発現させる手法であれば特に制限されない。
本発明でいうＣ型肝炎治癒患者とは、血液中にＨＣＶのｍＲＮＡが検出され肝機能を測定する値、例えばＡＬＴ等の値に異常が見られる、いわゆるＣ型肝炎の状態であった患者の血液中のＨＣＶのｍＲＮＡが検出限界以下になり、ＡＬＴ等の肝機能測定値が正常化した状態が６ヶ月以上続いた状態の患者のことを指す。
上記で本発明の抗体の代表例として例示したｓｃＦｖ２−１は、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いてＥ２／ＮＳ１との結合定数Ｋａを測定すると、４．５×１０８（Ｍ）、解離定数Ｋｄは２．２×１０−９（１／Ｍ）であった。また、本発明者らは、ｓｃＦｖ２−１と同じ可変領域のＨ鎖を持ちＬ鎖の可変領域が異なる一本鎖抗体も複数取得しそれぞれの一本鎖抗体の結合能力とＥ２／ＮＳ１とＨＣＶ感染性細胞ならびにヒトＣＤ８１発現細胞との結合を阻害する能力を比較したところ、それぞれの結合能力とＥ２／ＮＳ１と細胞の結合阻止能力には相関が見られた。
その中で結合定数が１０８（Ｍ）以上、解離定数が１０−８（１／Ｍ）以下である一本鎖抗体ｓｃＦｖ２−１が、その阻害活性から鑑みるに医薬品としての能力が十分であると判断できる。すなわち、Ｅ２／ＮＳ１への結合定数がＢＩＡＣＯＲＥで測定して１０８（Ｍ）以上、解離定数が１０−８（１／Ｍ）以下である抗体が、ＨＣＶ感染性細胞へ感染することを阻止する医薬品としてはより好ましい。抗体の能力をさらに上げるためには、結合定数が１０９（Ｍ）以上、解離定数が１０−９（１／Ｍ）以下の抗体がさらに好ましいものとして挙げられる。
通常の抗体は大小二種類のポリペプチドからなり、大きい方のサブユニットを「Ｈ鎖」、小さい方のサブユニットを「Ｌ鎖」という。また、それぞれのペプチドはＮ末端側に存在して抗原結合部位を形成する「可変領域」と抗体のクラス別に一定の「定常領域」からなっている。可変領域はさらに特に抗原結合部位の形成に密接に関与している相補性決定領域「ＣＤＲ」とその間に存在する「フレームワーク」に分けられる。ＣＤＲにはＨ鎖とＬ鎖のそれぞれについてＮ末端側から「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの領域があることが知られている。
以下、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４について説明する。抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４の配列は配列表の配列番号１０から３７に記載される。
抗体の可変領域を構成するアミノ酸は抗体により異なることが多い。ＳｃＦｖ３−１のＨ鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号２５に示した。ここで、配列番号２５には、ｓｃＦｖを大腸菌に発現させるための配列、すなわちｓｃＦｖ３−１のＨ鎖のＮ末端に２アミノ酸を付加した配列のものを示した。ゆえに抗体としてのフレームワークとして考えると配列番号２５のアミノ酸の３位から３２位はフレームワーク１、３３位から３７位までは「ＣＤＲ１」、３８位から５１位まではフレームワーク２、５２位から６８位までは「ＣＤＲ２」、６９位から１００位まではフレームワーク３、１０１位から１１７位までは「ＣＤＲ３」、１１８位から１２８位まではフレームワーク４を示す。ＳｃＦｖ３−１のＬ鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号２６に示した。配列番号２６のアミノ酸の１位から２３位まではフレームワーク１、２４位から３４位までは「ＣＤＲ１」、３５位から４９位まではフレームワーク２、５０位から５６位までは「ＣＤＲ２」、５７位から８８位まではフレームワーク３、８９位から９７位までは「ＣＤＲ３」、９８位から１１１位まではフレームワーク４を示す。ＳｃＦｖ３−２および３−３および３−４のＨ鎖のアミノ酸配列はすべて配列番号２５に示したものである。
Ｌ鎖については、それぞれ下記の通りである。ＳｃＦｖ３−２のＬ鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号２７に示した。配列番号２７のアミノ酸の１位から２３位まではフレームワーク１、２４位から３４位までは「ＣＤＲ１」、３５位から４９位まではフレームワーク２、５０位から５６位までは「ＣＤＲ２」、５７位から８８位まではフレームワーク３、８９位から９８位までは「ＣＤＲ３」、９９位から１１２位まではフレームワーク４を示す。ＳｃＦｖ３−３のＬ鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号２８に示した。配列番号２８のアミノ酸の１位から２３位まではフレームワーク１、２４位から３４位までは「ＣＤＲ１」、３５位から４９位まではフレームワーク２、５０位から５６位までは「ＣＤＲ２」、５７位から８８位まではフレームワーク３、８９位から９７位までは「ＣＤＲ３」、９８位から１１１位まではフレームワーク４を示す。ＳｃＦｖ３−４のＬ鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号２９に示した。配列番号２９のアミノ酸の１位から２３位まではフレームワーク１、２４位から３４位までは「ＣＤＲ１」、３４位から４９位まではフレームワーク２、５０位から５６位までは「ＣＤＲ２」、５７位から８８位まではフレームワーク３、８９位から９７位までは「ＣＤＲ３」、９８位から１１１位まではフレームワーク４を示す。これらのフレームワークとＣＤＲの境目はＫａｂａｔらの「免疫学的に有利な蛋白の配列」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）および（１９９１））を参考にして決定された。
ＳｃＦｖの調製にはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社）などを利用することが可能であるが、生産宿主となる大腸菌にとって該一本鎖抗体が毒性を持ち、大腸菌の死滅、該一本鎖抗体の分解を起こすような場合には、キットを有効に利用できず多くの工夫を要する。一本鎖抗体は、ｐＳＥ３８０プラスミド（インビトロジェン社）やｐＥＴ２４ｄ（＋）プラスミド（ノバジェン社）などの誘導性のベクターと宿主となる菌体を検討することにより調製しうる。また、生産においては、上述の方法の他、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、酵母細胞発現系も有効に利用しうる。Ｈ鎖およびＬ鎖を結合するリンカーは実施例では（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）×３回繰り返しの１５残基のアミノ酸を利用したが、本発明においては、本配列に限定されずに利用することが可能である。
配列表の配列番号３０から３３には、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のＬ鎖の塩基配列を示した。なお、これらの塩基配列においても、本願で述べているような効果を呈する限り、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むものも本発明の範囲に含まれる。
抗体の抗原特異性と抗原への結合の強さが、主にＣＤＲのアミノ酸配列によって決定されることはマウスの抗体のヒト化で示されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，９９−１２１，１９９１）。
さらに、ｓｃＦｖから通常生体内にある形の抗体を作製することが可能である。一例を挙げると、Ｅ２／ＮＳ１に結合するｓｃＦｖのプラスミドからＨ鎖およびＬ鎖の可変領域部分のみをＰＣＲ法にて増幅する。それぞれの断片は、例えば、ヒトの抗体のＨ鎖遺伝子及び／またはＬ鎖遺伝子を有するプラスミドに組み換えて、上記ｓｃＦｖ上にある可変領域を持つ通常生体内にある形の抗体にすることが可能である。具体的には、例えば、プラスミドからＨ鎖およびＬ鎖の可変領域を増幅するとき得られる遺伝子断片の両端に、適当な制限酵素切断部位を入れておいて、ヒト抗体のＨ鎖及び／またはＬ鎖を有するプラスミド上の適当な制限酵素切断部位と組み合わせて、フレームシフトが起こらないように可変領域の遺伝子を入れ替える。このような方法によりプラスミド上にあった可変領域の配列をそのまま持つ通常生体内にある形の抗体を作ることは可能である。この抗体からさらに、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも１つ含むペプチド、１組のＨ鎖断片とＬ鎖断片からなるＦａｂ、２組のＨ鎖断片とＬ鎖断片からなる（Ｆａｂ’２）を作ることも可能である。
さらに、本発明に示したＨ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号１０、１１および１２に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表配列番号１３、１４および１５に記載のアミノ酸配列である抗体、またはＨ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表配列番号１０、１１および１２に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号１６、１７および１８に記載のアミノ酸配列である抗体、またはＨ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号１０、１１、および１２に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号１９、２０および２１に記載のアミノ酸配列である抗体、またはＨ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号１０、１１および１２に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３がそれぞれ配列表の配列番号２２、２３および２４に記載のアミノ酸配列である抗体の配列を置換することによりＥ２／ＮＳＴへの結合力ならびに中和活性を高めることは可能である。例えば、ＣＤＲ３の配列をランダムに置換して抗体を取り直すことも可能であり、Ｈ鎖およびＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列および遺伝子の配列を置換することにより高活性の抗体を取得することも可能である。この際、アミノ酸配列を変換した抗体については、中和活性を失わない限り問題ない。すなわち、本発明においては、Ｅ２／ＮＳ１と、ＨＣＶ感染性細胞、ＣＤ８１発現細胞またはＣＤ８１との結合を阻害する能力を有する限り、上記アミノ酸配列において、置換、欠失、挿入等の修飾を加えたものについても、本発明の範囲に含まれる。
本発明でいう抗体の発現には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いることができるが、人に医薬品として投与することを考えた場合、糖鎖修飾のされ方がよりヒト型に近い動物細胞を用いるのが好ましい。一例を挙げると、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞にて抗体を発現させるときにはｐＣＤＮＡ３．１（＋）やｐＭＡＭｎｅｏ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）等を使用することが可能である。例えば、上記の手法で取得した抗体のＨ鎖の遺伝子をｐＣＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニングサイトに、Ｌ鎖の遺伝子をｐＭＡＭｎｅｏにそれぞれ組み込む。その上でＨ鎖の組み込まれたベクターの適当なサイトにプロモーターとｐｏｌｙＡの間にＬ鎖の遺伝子がある発現ユニットを組み込む。このベクターをＣＯＳ細胞やＣＨＯ−Ｋ１、またはＣＨＯ  ＤＧ４４に遺伝子工学の定法にて導入することにより目的の抗体の生産が行える。さらに、上記作製したベクターに例えばｐＳＶ２／ＤＨＦＲ（Ｎａｔｕｒｅ，１９８１．Ｖｏｌ．２９４，Ｌｅｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，）からＤＨＦＲ遺伝子の発現ユニットを切り出し、Ｈ鎖とＬ鎖を発現するベクターに組み込む。このベクターをＣＨＯＤＧ４４に遺伝子工学の定法にて遺伝子導入する。これにより選択した細胞はＭＴＸを用いたＤＨＦＲ遺伝子増幅系を使用することにより抗体の生産性を大幅に上昇させることが可能である。ＣＯＳ細胞では一過性の抗体の発現のみしか行えないが、ＣＨＯ細胞では抗体の遺伝子が染色体の組み込まれた形で発現することが可能である。また、先に論じたＤＨＦＲ遺伝子増幅系を用いることにより抗体を高発現させることも可能であり、無血清培地で抗体生産を行うことができるので工業生産はＣＨＯ細胞を用いるのがより好ましい。
ＣＯＳ細胞は、通常１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用い、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養する。ＣＯＳ細胞への遺伝子導入後の細胞の育種生産法は、「バイオマニュアルシリーズ４  遺伝子導入と発現・解析法；横田崇、新井賢一」（羊土社、１９９４）等の実験書に記載されている。ＣＯＳ細胞への遺伝子導入法は電気穿孔法の他、ＤＥＡＥデキストラン法、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ等のトランスフェクション試薬を用いた方法であってもよい。
ＣＨＯ  Ｋ−１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳを加えた培地の他、例えばＣＨＯＳ  ＳＦＭ２（ＧＩＢＣＯ社）等の市販されている無血清培地を用いて５％ＣＯ２存在下３７℃で培養することも可能である。ＣＨＯ細胞への遺伝子導入もＣＯＳ細胞と同様に電気穿孔法の他、ＤＥＡＥデキストラン法、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ等のトランスフェクション試薬を用いた方法を用いることが可能である。特にＣＨＯ  ＤＧ４４ではヒポキサンチン、チミジンのない培地で培養し、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸを培地に加えることにより遺伝子増幅による抗体の生産性の上昇が可能である。
本発明での抗体の生産時には、血清由来のウシ抗体の混入を避けるために、無血清の培地にて培養することが望ましい。無血清培地に馴化していないＣＯＳおよびＣＨＯの血清培地で培養している細胞については、血清を入れていないＤＭＥＭによって培養することが望ましい。こうして培養上清中に得られた本発明の抗体は、例えばプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いる一般的なＩｇＧ抗体の精製法によって容易に精製することが可能である。
本発明で生産した抗体はＨＣＶの治療に利用可能である。抗体の形状としては、生産抗体分子をそのまま利用することも可能であるが、各種プロテアーゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、あるいはＦｄなども適用することができるが、ｗｈｏｌｅ抗体が最も好ましい。これらの断片については「抗体工学入門」（地人書館）に詳細な説明がなされている。断片ペプチドの場合は抗体分子の酵素処理により得ることができるが、遺伝子工学的な手法により細菌、酵母などに生産させることも可能である。これらの方法により得たモノクローナル抗体、モノクローナル抗体由来抗体断片、ペプチド等を組み合わせることにより、より強固な結合性を生じる。
本発明で生産した抗体を利用し、ＨＣＶ感染患者の血液中のＨＣＶ粒子を減少しうる。例えば、ＨＣＶのｍＲＮＡまたは、市販のＨＣＶ診断薬により抗ＨＣＶ抗体が血液中に観察される患者に本発明で生産した抗体を投与することにより血液中のＨＣＶ粒子の量を減少させることによりＨＣＶの再感染を防ぎ、ＨＣＶの治癒へと患者を導くことが可能である。さらに、本抗体はＨＣＶ患者に投与されるとＨＣＶ患者の体内でＨＣＶが感染している細胞のうち特に細胞表面にＥ２／ＮＳ１が提示されている細胞にも結合しうる。この結合と生体内の補体等の免疫系の活性化によりＨＣＶの感染している細胞に対する障害能力をも期待できる。また、他の抗体由来の可変領域の遺伝子を組み合わせることにより、バイスペシフィック抗体、マルチスペシフィック抗体の生産も可能となる。マルチスペシフィック抗体とは、異なる抗原もしくは同じ抗原の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を少なくとも２種類以上保有する抗体を言う。中でもバイスペシフィック抗体とは、異なる抗原もしくはエピトープを認識する抗原結合部位を２種類以上有する抗体を言う。例えば、通常の抗体の一方の抗原結合部位ともう一方の抗原結合部位が異なるバイスペシフィック抗体は通常の抗体よりも抗原と強くまた、幅広い配列のＨＣＶと結合可能であると考えられる。さらにＩｇＭとしてより多価に抗原を認識する抗体の作成も可能である。こうした生産時にバイスペシフィック化する以外に、モノクローナル抗体を生産、精製し、その後に抗体同士を結合させバイスペシフィック化、マルチスペシフィック化することができる。このバイスペシフィック化は同一抗原のみでなく他の抗原に対する組み合わせも可能である。例えば、ＨＣＶ粒子に表出していると言われているＥ１に対する抗体を利用してバイスペシフィック抗体、およびマルチスペシフィック抗体を作製することも可能である。
一本鎖抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のアミノ酸配列は配列表の配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７に示した。また、それをコードする核酸配列の例をアミノ酸配列とともに示した。配列番号３４のアミノ酸配列の１位から２２位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、２３位から１４８位はＨ鎖の可変領域、１４９位から１６５位はリンカー、１６６位から２７６位はＬ鎖の可変領域、２７７位から２９９位はｔａｇを含む配列を示す。配列番号３５のアミノ酸配列の１位から２２位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、２３位から１４８位はＨ鎖の可変領域、１４９位から１６５位はリンカー、１６６位から２７７位はＬ鎖の可変領域、２７８位から３００位はｔａｇを含む配列を示す。配列番号３６のアミノ酸配列の１位から２２位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、２３位から１４８位はＨ鎖の可変領域、１４９位から１６５位はリンカー、１６６位から２７６位はＬ鎖の可変領域、２７７位から２９９位はｔａｇを含む配列を示す。配列番号３７のアミノ酸配列の１位から２２位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、２３位から１４８位はＨ鎖の可変領域、１４９位から１６５位はリンカー、１６６位から２７６位はＬ鎖の可変領域、２７７位から２９９位はｔａｇを含む配列を示す。
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７に記載のアミノ酸配列の１位から２２位を欠失させ大腸菌菌体内に一本鎖抗体を発現することも可能である。また、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７に記載のアミノ酸の２７７位から２９９（又は３００）位までは一本鎖抗体の検出、ならびに精製のための配列であり、欠失あるいは如何なる配列にも置換しうる。
大腸菌からの分泌シグナルおよび精製のための配列を含むベクターの作製は実施例に示したとおりである。配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７に記載のアミノ酸配列の１４９位から１６５位のリンカー配列はＨ鎖およびＬ鎖の可変領域の立体構造を実質的にｓｃＦｖ３−１と同様に保持できるものであれば如何なる配列にも置換しうる。一本鎖抗体は動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞の他大腸菌でも生産可能である。
一本鎖抗体でもバイスペシフィック化およびマルチスペシフィック化が可能である。例えば、１ペプチド内に複数の抗原認識部位の組み合わせのＨ鎖とＬ鎖を繰り返して並べることにより生産させることができる。また、生産、精製後に連結することも可能である。Ｈ鎖およびＬ鎖の組み合わせによらず、Ｈ鎖のみもしくはＬ鎖のみでも利用は可能である。こうした抗体種の選択は利用用途により行うことが可能であり、結合強度、抗原結合部位等により選択しうる。
本発明の抗体は、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２／ＮＳ１蛋白に対して親和性を有する抗体である。本発明の抗体は、好ましくは、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものである。
さらに本発明は、上記の抗体を有効成分として含有する医薬、例えば上記抗体と薬学的に許容しうる担体とからなる医薬組成物を提供する。特に、本発明における抗Ｅ２／ＮＳ１抗体遺伝子は、効率的に抗Ｅ２／ＮＳ１抗体を生産することを可能とし、種々の形態の治療用製剤を提供する。こうして生産された組換え抗体は、例えば薬学的に許容される成分組成の担体や安定化剤などの人体への投与に際し、該抗体の活性を保持させるために使用される物質とともに医薬用組成物中に含まれていてもよい。
本発明における医薬組成物は、本発明の抗体又は組み換え抗体を有効成分として、薬学的に許容され得る担体、即ち、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等の一つ以上とともに医薬組成物とし、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態により経口あるいは非経口的に投与することができる。薬学的に許容され得る担体の具体例としては、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等を例示することができる。薬学的に許容されるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などがおきないことを意味する。さらに、本発明の抗体に例えば毒素等の物質を結合させた抗体も医薬品として使用可能である。
本発明の医薬組成物としては、例えば、薬学的に許容される適当な溶剤や希釈剤、安定化剤とともに溶解された液状の医薬用組成物でもよい。とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容される担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
さらに上記の医薬組成物に加えて生体内における濃度調節を目的とするミクロスフィアー、リポソームにおいて非経口（注射）する場合は、抗体および一本鎖抗体で１μｇ〜５０ｍｇ／体重ｋｇが適当であるがこの範囲に限らない。
なお、上記一本鎖抗体の場合には、Ｃ型肝炎ウイルスの診断用途として好適に用いることができる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例
１．Ｅ２の発現
（Ｅ２ｔａｇ発現ベクターの構築）
ＨＣＶ  Ｊ１クローンの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｄ８９８１５）の内Ｅ２／ＮＳ１のＨＣＶゲノムにおける３８４番目のアミノ酸より７１１アミノ酸からなる部分１００ｎｇを用い、ＰＣＲ増幅用プライマーとして動物細胞での分泌を促すシグナルペプチド配列を有するＰＣＲプライマー（５’ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＧＧ  ３’；配列番号３８）遺伝子を５’側に用い、Ｅ−ｔａｇの配列を有するＰＣＲプライマー（５’ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＴＡＣ  Ｃ  ３’；配列番号３９）を遺伝子３’側に用い、ＰＣＲ反応によりＤＮＡ（ｔＰＡシグナル＋Ｅ２（３８４−７１１）＋ｔａｇ）断片を増幅した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片１μｇを１ユニットのＨＩｎｄＩＩＩとＸｂａＩを用いて５０μＬの系Ｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃で２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた。これと、動物細胞用発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）１μｇを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを用いて５０μＬの系Ｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃で２時間反応させて切断し７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させたものをともに、フェノールとクロロホルムとイソアミルアルコールを２５：２４：１で混合した溶液を酵素液と等量添加し混合し遠心を行い水層のみを回収した（今後この操作をフェノールクロロホルム抽出と呼ぶ）。さらに回収した水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍容のエタノールを混合し−２０℃で一晩、もしくは−８０℃で１５分静置し、遠心してＤＮＡ断片を回収した。さらに７０％のエタノールを加えてからデカンテーションを行い、真空乾燥を行った（今後このエタノールを加えてＤＮＡ断片を回収する一連の操作をエタノール沈殿と呼ぶ）後、５μＬの滅菌水に回収したＤＮＡ断片を溶かした。この精製ＤＮＡ断片どうしをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望のＥ２ｔａｇ発現プラスミドｐＥ２ｔａｇを得た。
（Ｅ２ｔａｇの動物細胞での発現）
プラスミドｐＥ２ｔａｇを保有する大腸菌を５０ｍＬバッフルフラスコで一晩培養した。菌体を８，０００ｒｐｍで１０分遠心により回収しＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社より購入）を用いて説明書に従いプラスミドを精製した。
さらに精製したプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＬＩＦＥＴＥＣＨ社より購入）を用いて説明書に従い５％ＦＢＳを添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３０２（ＪＲＨより購入）で培養したＣＨＯ  ＤＧ４４株にトランスフェクションした。ＣＨＯ  ＤＧ４４は５％ＣＯ２中３７℃にて培養した。トランスフェクション２日後、細胞を０．２５％トリプシンではがした後、Ｇ４１８を４００μｇ／ｍＬ添加したＥＸ−ＣＥＬＬ３０２に細胞を播種した。２週間程度Ｇ４１８添加培地を用いて培地の交換を行い、コロニーが立ち上がってくるのを確認した。
得られた細胞のＥ２ｔａｇの発現の確認は細胞の上清をウェスタンブロッティングする事により確認した。ウェスタンブロッティングはファルマシア社より購入したＡｎｔｉ−Ｅ  Ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙの説明書に従い行った。検出抗体にはＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。発光反応はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテクより購入）を用いて説明書に従いＸ線フィルムに感光させることにより行った。複数得られたクローンのうち発現がもっとも高い細胞を以後の実験に用いた。
（Ｅ２ｔａｇの精製）
上記の方法で得たＥ２ｔａｇ発現株をＥＸ−ＣＥＬＬ３０２にて必要量の上清が得られるよう培養した。細胞の対数増殖期が終了した時点で細胞を遠心にて除き上清を回収した。上清はさらに０．４５μｍのフィルターを用いて混入物を除いた。そのようにして得られた上清はＲＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（ファルマシア社より購入）を用いてアフィニティー精製を行った。精製はＲＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅに添付の説明書に従い行った。Ｅ２ｔａｇはＲＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅに添付のＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ中に得られるのでＰＢＳへ置換した。具体的には、セントリコン３０（アミコン社より購入）のフィルター上部に上記Ｅ２ｔａｇが含まれるＥｌｕｔｉｏｎ各分を添加し中に含まれるｂｕｆｆｅｒ量が１００μＬ以下になるまで５０００ｒｐｍで遠心を行った。さらに、そこへＰＢＳを２ｍＬ程度添加し同様の遠心操作を行った。この操作を４回以上繰り返すことによりＰＢＳ中に溶解しているＥ２ｔａｇを回収した。
２．ＮＯＢ  ａｓｓａｙ系構築
（ＣＤ８１発現ベクターの構築）
ヒトＣＤ８１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３３６８０）の全長ＤＮＡを取得するため、Ｈｅｌａ細胞から精製したｍＲＮＡ１μｇから、ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いｃＤＮＡを合成した。次にこのｋｉｔの添付資料に従い、ＰＣＲ増幅用プライマーとして５’側をＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣ（配列番号４０）に設定し、３’側をＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＡ（配列番号４１）に設定してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動し、目的のバンドをＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社より購入）を用いて添付の説明書に従い精製した。さらに、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＫＩＴ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｃｅｌｌｓ（インビトロゲン社より購入）を用いて、添付の説明書に従いｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯと上記目的ＣＤ８１のフラグメントを結合および大腸菌へのトランスフォーメーションを行い、目的とするｐＣＲｈＣＤ８１を得た。さらに、ｐＣＲｈＣＤ８１  １μｇを１ユニットのＥｃｏＲＩを用いて５０μＬの系Ｈ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた後ＱＩＡＥＸＩ  Ｉ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社より購入）を用いて添付の説明書に従いＣＤ８１遺伝子を含むフラグメントを精製した。ｐＣＤＮＡ３．１（＋）も別途同様の系にてＥｃｏＲＩ処理し酵素を失活させた後、バクテリアルアルカリフォスファターゼ（ＴＯＹＯＢＯ社より購入）を１μＬ加え６５℃で１時間インキュベートした。その後、フェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製後、５μＬの滅菌水にそれぞれ回収したＤＮＡ断片を溶かした。その上、両断片をリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望のＣＤ８１発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）／ＣＤ８１を得た。
（ＣＤ８１発現細胞構築）
プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）／ＣＤ８１を保有する大腸菌を５０ｍＬバッフルフラスコで一晩培養した。菌体を８０００ｒｐｍの遠心によりＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社より購入）を用いて説明書に従いプラスミドを精製した。
さらに精製したプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＬＩＦＥＴＥＣＨ社より購入）を用いて説明書に従い１０％ＦＢＳを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で培養しておいたＮＩＨ３Ｔ３株にトランスフェクションした。ＮＩＨ３Ｔ３は以下すべて５％ＣＯ２中３７℃にて培養した。トランスフェクション２日後、細胞を０．２５％トリプシンではがし、１０％ＦＢＳとＧ４１８を８００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに細胞を播種した。２週間程度Ｇ４１８添加培地を用いて培地の交換を行い、コロニーが立ち上がってくるのを確認した。
得られた細胞株におけるＣＤ８１発現の確認は下記の操作により行った。得られた細胞株を選択培地中で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにてコンフルエントになるまで培養した。細胞をＰＢＳ／０．０５％ＥＤＴＡで一度洗った後、ＰＢＳ／０．０５％ＥＤＴＡを用いてはがした後０．１％ＢＳＡと０．１％アサイドを含むＰＢＳ（以下ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒと呼ぶ）２０μＬに懸濁し、抗ＣＤ８１抗体（ファーミンジェン社より購入）の終濃度が０．０２５ｍｇ／ｍＬとなるように加え混合後、氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加えた後３０００ｒｐｍで遠心して細胞を回収する操作を２回繰り返した。回収した細胞を３０μＬのＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇｓ抗体（カペル社より購入）を終濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加え混合後、遮光して氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加えた後３０００ｒｐｍで遠心して細胞を回収する操作を２回繰り返した後、２００μＬのＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに細胞を懸濁してＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社）により細胞の蛍光量を測定しもっとも蛍光量の大きい細胞を選択しＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１と命名した。
（Ｅ２ｔａｇとＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１との結合確認）
Ｍｏｌｔ−４（理研ＲＣＢ  Ｎｏ．０２０６）またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１を終濃度５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとし、Ｅ２ｔａｇが最終濃度５０μｇ／ｍＬ以下となるように濃度をふって混合し１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中にて２０μＬの系で氷上で１時間インキュベートした。５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３０００ｒｐｍで遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０にて抗Ｅｔａｇ抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し各サンプルに１０μＬ加え混合後１時間氷上にてインキュベートした。５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３０００ｒｐｍで遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。５％ＦＢＳを含むＰＢＳにてＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇｓ（カペル社より購入）を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液１０μＬを各サンプルに加え混合後１時間氷上にてインキュベートした。５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３０００ｒｐｍで遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。サンプルを５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬに懸濁後ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社）により細胞の蛍光量の変化を測定し、Ｅ２ｔａｇがＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１と結合していることを確認した。
（取得ｗｈｏｌｅ抗体によるＥ２ｔａｇとＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１との結合阻止の確認）
本実施例以下に説明する手法で取得したｗｈｏｌｅ抗体を用いて、Ｅ２ｔａｇとＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１との結合阻止を確認した。
Ｅ２ｔａｇの最終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０で希釈した溶液と、１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０でｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−１、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−２、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−４をそれぞれ０μｇ／ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬの範囲で希釈した溶液をそれぞれ５μＬづつ混合し、３７℃で３０分インキュベートした。１×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度にＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１を１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中に懸濁した溶液１０μＬを混合し１時間氷上にてインキュベートした。５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３０００回転で遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０にて抗Ｅｔａｇ抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し各サンプルに１０μＬ加え混合後１時間氷上にてインキュベートした。５％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３０００回転で遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。５％ＦＢＳを含むＰＢＳにてｂｉｏｔｉｎ化抗マウス抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し各サンプルに１０μＬ加え混合後１時間氷上にてインキュベートした。ＰＢＳを２００μＬ加え、３０００回転で遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。ＰＢＳにてＦＩＴＣ標識アビジン（ピアス社より購入）を１／２００に希釈し各サンプルに１０μＬ加え混合後１時間氷上にてインキュベートしたＰＢＳを２００μＬ加え、３０００回転で遠心し細胞を回収する操作を２回繰り返した。サンプルをＰＢＳ２００μＬに懸濁後フローサイトメーターＢＤ−ＬＳＲ（ベクトンディッキンソン社）により細胞の蛍光量の変化を測定し、Ｅ２ｔａｇとＭｏｌｔ−４またはＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１の結合が添加した患者血清または抗体で阻止されていることを確認した。
結果を図１に示す。図１は、全長抗体１−１、３−１、３−２、３−３、及び３−４の中和活性を示す。
各取得抗体の結合阻止活性（中和活性）は以下の通りであった。
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−１      ３μｇ／ｍＬ
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−２      ２μｇ／ｍＬ
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３      １μｇ／ｍＬ
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−４      １μｇ／ｍＬ
本発明の組み換えｗｈｏｌｅ抗体をＷｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−１、Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−２、Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３、及びＷｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−４と称し、それらのＬ鎖全長アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜４に記載し、それらのＨ鎖全長アミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号９に記載する。
また、全長抗体１−１（Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１）のＨ鎖全長のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号９に記載し、Ｌ鎖全長のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号６６に記載する。
３．抗体ライブラリーの作製
（ＨＣＶ治癒患者からのｍＲＮＡの精製）
採血した血清にＥ２ｔａｇとＭｏｌｔ−４およびＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ８１発現細胞との結合を阻止する能力のある抗体を有するＨＣＶ治癒患者から４０ｍＬヘパリン採血を行い、血液を取得した。末梢血リンパ球を分離する為、比重遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ：ファルマシア）を行い、４×１０７のリンパ球細胞を得た。ＭＡＣＳ（第一化学薬品，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製）を用いて抗ＣＤ１９抗体を利用したＢ細胞精製と行い、２．８×１０６の細胞を得た。精製した細胞のうちのＢ細胞の純度を確認するため、抗ＣＤ１９抗体で精製した細胞を染色しフローサイトメトリー解析法にて９５％以上の精製度であることを確認した。この精製Ｂ細胞を用いて、ヒトＩＬ−２（ジェンザイム）２００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ヒトＩＬ−１０（ジェンザイム）１０ｎｇ／ｍＬ、Ｅ２／ＮＳ１抗原１ｎｇ／ｍＬ、抗ヒトＣＤ４０抗体（ジェンザイム）１μｇ／ｍＬの刺激の元、５×１０５Ｂ細胞／ｍｌ  １０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩの条件で７２時間培養した。Ｂ細胞の活性化を顕微鏡にて確認し，ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて説明書に従って操作してＢ細胞よりｍＲＮＡを取得、精製した。
（抗体ライブラリー１の作製）
抗体ライブラリー作製はＢｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９１  ２２２５８２−５９７）の記載方法に従い行った。精製したｍＲＮＡ１μｇから、ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いｃＤＮＡを合成した。次にこのｋｉｔの添付資料に従い、このｃＤＮＡを鋳型にし、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖（λ鎖、κ鎖）をそれぞれＰＣＲで増幅した。抗体遺伝子クローニング用のプライマー及びリンカーは、上記論文の記載に従い作製した物を用いた。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動を行い、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。次に抽出したＨ鎖、Ｌ鎖、リンカーを同モルになるようにして混合し、連結用プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは５０μＬの系で、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）１単位を用い、９４℃で５分加熱した後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル、その後７２℃で５分間加熱し完了した。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動を行い、Ｈ鎖、Ｌ鎖、リンカーが一本に連結したバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。次に制限酵素ＳｆｉＩと５０マイクロリットルの系Ｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で５５℃２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた。さらに制限酵素ＮｏｔＩを加え５０マイクロリットルの系Ｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた。ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を順次行い精製し５０μＬの滅菌水に溶解した。このＤＮＡ断片１００ｎｇと、５０ｎｇのｐＣａｎｔａｂ５ＭｙｃＨｉｓ（ｐＣａｎｔａｂ５Ｅ（アマシャムファルマシア）のＥｔａｇ配列をＭｙｃ−Ｈｉｓｔａｇに入れ換えたベクター）とを、ＴＡＫＡＲＡ社のリガーゼキットを用いて説明書に従い結合させた。ライゲーションサンプルをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で順次精製し１０μＬの滅菌水に溶解した。この半量を用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ２４９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ．に従い形質転換した。こうして１×１０６のコロニーを得た。これを一本鎖抗体ライブラリー（抗体ライブラリー１）として以後用いた。
（抗体ライブラリー２の作製）
抗体ライブラリー作製はＢｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９１  ２２２５８２−５９７）の記載方法に従い行った。
まず、ＰＣａｎｔａｂ５ｓｃＦｖ３−１ＭｙｃＨｉｓ（ＰＣａｎｔａｂ５ＭｙｃＨｉｓのＳｆｉＩ  ｓｉｔｅとＮｏｔＩ  ｓｉｔｅの間に実施例に示したｓｃＦｖ２−１遺伝子が挿入されておりＬ鎖の５’末にＡｌｗ４４Ｉ、３’末にＮｏｔＩのサイトが配してある）のＬ鎖部分をＨＣＶ抗原に反応性のないＬ鎖に入れ替えたベクターを作製した。これをＰｃａｎｔａｂ５ｓｃＦｖ３−１／Ｌ−／ＭｙｃＨｉｓと呼ぶ。
精製したｍＲＮＡ１μｇから、ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いｃＤＮＡを合成した。次にこのｋｉｔの添付資料に従い、このｃＤＮＡを鋳型にし、抗体のＬ鎖（λ鎖、κ鎖）をそれぞれＰＣＲで増幅した。抗体遺伝子クローニング用のプライマーは、上記論文の記載に従い作製した物を用いた。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動を行い、抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
次に制限酵素Ａｌｗ４４Ｉと５０マイクロリットルの系Ｍ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた。さらに制限酵素ＮｏｔＩを加え１００マイクロリットルの系Ｈ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３７℃２時間反応させて切断し、７０℃１０分の熱処理により酵素を失活させた。ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を順次行い精製し５０μＬの滅菌水に溶解した。このＤＮＡ断片１００ｎｇと、同様にＡｌｗ４４ＩとＮｏｔＩで処理した５０ｎｇのｐＣａｎｔａｂ５ｓｃＦｖ３−１／Ｌ−／ＭｙｃＨｉｓとを、ＴＡＫＡＲＡ社のリガーゼキットを用いて説明書に従い結合させた。ライゲーションサンプルをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で順次精製し１０μＬの滅菌水に溶解した。この半量を用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ２４９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ．に従い形質転換した。こうして１×１０６のコロニーを得た。これを一本鎖抗体ライブラリー（抗体ライブラリー２）として以後用いた。
４．ライブラリーのスクリーニング
（ファージの調製）
プレート上に生えている大腸菌を２ｍｌの２ｘＴＹ液体培地で回収し、そのうち２０μｌを２０ｍｌの２ｘＴＹ液体培地（１００μｇ／Ｌアンピシリンと２％グルコースを含む）に加えた。３７℃で２００ｒｐｍで振とうしながら、吸光度６００ｎｍの値が１．０になるまで培養した。この培養液に１×１０１１ｐｆｕ／ｍＬのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を加え、３７℃に３０分静置した。続いて、３７℃２００ｒｐｍで振とうした。３０分後、溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、大腸菌を回収した。上清を廃棄し、２０ｍｌの２ｘＴＹ液体培地（１００μｇ／Ｌアンピシリンと５０μｇ／Ｌカナマイシンを含む）に懸濁し、３７℃で２００ｒｐｍで振とうしながら、一晩培養した。翌日、培養液を１５０００ｒｐｍで遠心し、大腸菌を沈殿させ、上清を回収した。この上清をファージ溶液として用いた。
（スクリーニング操作）
５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）溶液に溶解した、１０μｇ／ｍｌのＥ２抗原１ｍｌをプラスチックチューブ（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐＴｕｂｅ）に加え、４℃に一晩おいた。翌日、抗原溶液を廃棄し、次にＰＢＳ溶液５ｍＬでそのチューブを洗い、これを３回繰り返した。その後５ｍｌの５％ＢＳＡを加え、３７℃に置いた。２時間後、ＢＳＡ溶液を廃棄し、５ｍｌのＰＢＳ溶液でチューブを洗った。次に、用意したファージ溶液２５０μＬと５％ＢＳＡ溶液７５０μＬを混合し、これをチューブに加え３７℃に置いた。１時間後、加えた溶液を廃棄し、ＰＢＳＴ（０．１％）溶液５ｍｌでチューブを洗った。これを２０回繰り返した。次にＰＢＳ溶液５ｍＬでチューブを洗った。これを２０回繰り返した。このチューブに１ｍＬの１００ｍＭトリエチルアミンを加え、室温に１０分間置いた。その後、トリエチルアミン溶液を回収し、これに５００μＬの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、よく混合した。この溶液７５０μＬを吸光度６００ｎｍの値が０．６になるまで培養した１０ｍＬの大腸菌ＴＧ−１に加え、３７℃に３０分置いた。続いて、３７℃で２００ｒｐｍで振とうした。３０分後、溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、大腸菌を回収した。この大腸菌を２×ＴＹプレート培地（１００μｇ／Ｌアンピシリンと２％グルコースを含む）に撒き、３７℃で一晩置いた。翌日、プレート上に生えている大腸菌から、（ファージの調製）に記した操作でファージを回収し、（スクリーニング操作）に記した操作を繰り返した。このスクリーニング操作を３回繰り返した。
抗体ライブラリー１を用いたスクリーニングの結果、抗体ＳｃＦｖ１−１、及び抗体ＳｃＦｖ２−１を取得した。
抗体ＳｃＦｖ１−１のアミノ酸配列と塩基配列を配列番号６７に示し、抗体ＳｃＦｖ２−１のアミノ酸配列と塩基配列を配列番号７１に示す。
抗体ライブラリー２を用いたスクリーニングの結果、配列表の配列番号１０〜３７に記載のアミノ酸配列を有する抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３（及びＳｃＦｖ３−４が得られた。
配列表の配列番号１０〜１２は、抗体抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のＨ鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号１３〜１５は、抗体ＳｃＦｖ３−１のＬ鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号１６〜１８は、抗体ＳｃＦｖ３−２のＬ鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号１９〜２１は、抗体ＳｃＦｖ３−３のＬ鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号２２〜２４は、抗体ＳｃＦｖ３−４のＬ鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号２５は、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のＨ鎖の部分アミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号２６〜２９はそれぞれ、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号３０〜３３はそれぞれ、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４のＬ鎖の塩基配列を示す。
配列表の配列番号３４〜３７はそれぞれ、抗体ＳｃＦｖ３−１、ＳｃＦｖ３−２、ＳｃＦｖ３−３、及びＳｃＦｖ３−４の塩基配列とアミノ酸配列を示す。
５．抗体発現ベクター構築
ＰＣＲ法によりｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）のＣＭＶプロモーターを含む領域、マルチクロニーングサイト、ｐｏｌｙ  Ａシグナル配列領域（同社遺伝子マップ２０９−１２５０塩基領域を増幅する。使用したプライマーの配列は、５’側は５’ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＣＧ  ３’（配列番号４２）、３’側は５’ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ３’（配列番号４３）であり、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４用い合成後、定法にて調製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望の約１．０  Ｋｂｐ  ＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＢｃｌＩ用いて５０マイクロリットルの系Ｈで３７℃２時間反応させて切断する。別にｐｐＵＣ１１９（宝酒造社より購入）ＤＮＡ１マイクログラムを１ユニットのＢａｍＨＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｈで３７℃２時間反応させて切断する。切断したＤＮＡ断片と切断したプラスミドをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＫＳ１を得た。
上記で得たｐＫＳ１（１マイクログラム）をＳｐｅＩ１ユニットを用い５０マイクロの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用い、ＰＣＲによりｌｏｘＰ−Ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ融合遺伝子を増幅する。使用したプライマーの配列は、５’側はＨｙｇ−ｓｔｏｐ：ｃｃｃｃａｇａｔｃｔｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃｃｔｃｇｇａｃｇａｇ（配列番号４４）３’側はＨｙ−ａｔｇ：ｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｔｇａａａａａｇｃｃｔｇａａｃｔｃａｃｃｇｃｇ３’（配列番号４５）であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＮｈｅＩ及びＮａｅＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させて切断する。
ｐＮｅｏβｇａｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）を用い、ＰＣＲによりＴＫ（Ａ）ｎを含むＤＮＡを増幅する。使用したプライマーの配列は、５’側はｃｃｃｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃ３’（配列番号４６）、３’側は５’ｃｃｃｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃａａｇｃ３’（配列番号４７）であり、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４用い合成後、定法にて調製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＸｂａＩ及びＮａｅＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させて切断する。
切断したプラスミドと切断したｌｏｘＰ−ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＤＮＡ断片とＴｋ（Ａ）ｎＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸ  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇを得た。
ｐＥＸ１−３−１ＷをＷＯ０１／９４５７１に記載の方法に従い調製した。先ず、特開平５−３０４９８７（ＥＰ５２０４９９Ｂ１）に記載の１−３−１抗体遺伝子の内、Ｈ鎖がγ１、Ｌ鎖がラムダのサブタイプのものを用いＰＣＲ法により両鎖の５’側にＨｉｎｄＩＩＩ、３’側にＳｐｅＩ切断部位を付加した。使用したプライマーの配列は、Ｈ鎖５’側は５’ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＣ  ３’（配列番号４８）、３’側は５’ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  Ｃ  ３’（配列番号４９）、Ｌ鎖５’側は５’ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＣ  ３’（配列番号５０）、３’側は５’ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣ  ３’（配列番号５１）であり、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４を用いて合成後、定法にて調製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩを用いて５０μｌの系Ｍで３７℃で２時間反応させて切断する。別に上記ｐＫＳ１  ＤＮＡ１μｇを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて５０μｌの系Ｍで３７℃で２時間反応させて切断する。切断したプラスミドを切断したＨ鎖ＤＮＡ断片とＬ鎖ＤＮＡ断片を別々にリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望のＨ鎖発現プラスミドｐＥＸ１−３−１Ｈ及びＬ鎖発現プラスミドｐＥＸ１−３−１Ｌを得た。
上記ｐＥＸ１−３−１Ｌ  ＤＮＡ１μｇを１ユニットのＳｐｅＩ及びＮｈｅＩを用いて５０μｌの系Ｍで３７℃２時間反応させて切断する。その後、約１．０ｋｂｐの抗体Ｌ鎖発現ＤＮＡ断片を５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。別に上記ｐＥＸ１−３−１Ｈ  ＤＮＡ１μｇを１ユニットのＮｈｅＩを用いて５０μｌの系Ｍで３７℃で２時間反応させて切断する。切断したＨ鎖発現プラスミドとＬ鎖発現プラスミドをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の１−３−１抗体発現プラスミドｐＥＸ１−３−１Ｗを得た。
上記したｐＥＸ１−３−１Ｗ（ＷＯ０１／９４５７１）を用い、ＰＣＲにより重鎖定常域をを含むＤＮＡ断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、５’側は５’ｃｃｃｃａａｇｃｔｔｃｔｃｇａｇａｃｔａｇｔａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃ３’（配列番号５２）、３’側は５’ｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇｔａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇ３’（配列番号５３）であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させて切断する。
ｐＥＸ  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ  ＤＮＡ１マイクログラムをＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｐａＩ１ユニットを用い５０マイクロの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖定常域を含むＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸ  ｇａｍｍａ１  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇを得た。
ＳｃＦｖ１−１を用い、ＰＣＲにより重鎖可変域を含むＤＮＡ断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、ＨＢ１−Ｎ５’ｃｃｃａａｇｃｔｔｃａｃｃＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇ３’（配列番号５４），ＨＢ１−Ｃ５’ｃｃｃｇｃｔａｇｃＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣ３’（配列番号５５）であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させ切断する。
ｐＥＸ  ｇａｍｍａ１  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ  ＤＮＡ１マイクログラムをＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｐｅＩ  １ユニットを用い５０マイクロの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖可変域を含むＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸ  ｇａｍｍａ１  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ  ＨＣＶＩを得た（図２）。
ｐＥＧＦＰＮ２（クローンテック社より購入）を用い、ＰＣＲによりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、Ｈ鎖５’側は５’ｃｃｃｃａｇａｇｃｔａｇｔｃｃｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｔｇｃｇｃｇｇａａｃｃｃｃｔ３’（配列番号５６）、３’側は５’ｃｃｃｃｇｃｔａｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃａｔｔｔｃｇａａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃｃｃ３’（配列番号５７）であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＳｐｅＩ及びＮｈｅＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させた後、３７℃、２時間反応させ切断する。
ｐＫＳ１  ＤＮＡ１マイクログラムをＮｈｅＩ１ユニットを用い５０マイクロの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断したカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸ−１Ｋｍ、Ａｍｐを得た。
ｐＥＸ−１  Ｋｍ，Ａｍｐ  １  ＤＮＡ１マイクログラムをＤｒａＩ，ＳｃａＩ１ユニットを用い５０マイクロの系Ｈにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸ−１Ｋｍを得た。
ｐＣＺＯｋ（Ｔ，ＳｈｉｂｕｉらＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３）３８，７７０−７７５記載）を用い、ＰＣＲにより軽鎖定常域を含むＤＮＡ断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、Ｈ鎖５’側は５’ｃｃｃｃａａｇｃｔｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｇｔｇｇａａａｔｃａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇ３’（配列番号５８）、３’側は５’ｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃ３’（配列番号５９）であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１マイクログラムを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを用いて５０マイクロリットルの系Ｍで３７℃、２時間反応させ切断する。
ｐＥＸ−１  Ｋｍ  ＤＮＡ１マイクログラムをＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｐａＩ  １ユニットを用い５０マイクロの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した軽鎖定常域を含むＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミドｐＥＸｋａｐｐａ  Ｋｍを得た。
４種のｓｃＦｖ発現ｖｅｃｔｏｒ、ＳｃＦｖ３−１、ｓｃＦｖ３−２、ｓｃＦｖ３−３、ｓｃＦｖ３−４を用い、ＰＣＲにより軽鎖可変域を含むＤＮＡ断片をそれぞれ増幅する。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
ＳｃＦｖ３−１  Ｎ末端側  配列番号６０
ＳｃＦｖ３−１  Ｃ末端側  配列番号６１
ＳｃＦｖ３−２  Ｎ末端側  配列番号６２
ＳｃＦｖ３−２  Ｃ末端側  配列番号６３
ＳｃＦｖ３−３  Ｎ末端側  配列番号６２
ＳｃＦｖ３−３  Ｃ末端側  配列番号６１
ＳｃＦｖ３−４  Ｎ末端側  配列番号６４
ＳｃＦｖ３−４  Ｃ末端側  配列番号６５
それぞれサイメディア社に合成を依頼し購入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用い、ポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った）を用いて行った。その後、所望のＤＮＡ断片は、５％アクリルアミド電気泳動法を用いＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇセクション６．４６−６．４８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ記載の方法により精製した。精製ＤＮＡ断片約１μｇを１ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩを用いて５０μｌの系Ｍで３７℃、２時間反応させた後、５０℃、２時間反応させ切断する。
ｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｓｐ１８７  Ｉ１ユニットを用い５０μｌの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖可変域を含むＤＮＡ断片とをリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望の発現プラスミド４つを取得した（図３）。
ＳｃＦｖ３−１  →  ｐＥＸｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＨＣＶ３−１
ＳｃＦｖ３−２  →  ｐＥＸｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＨＣＶ３−２
ＳｃＦｖ３−３  →  ｐＥＸｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＨＣＶ３−３
ＳｃＦｖ３−４  →  ｐＥＸｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＨＣＶ３−４
ｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ３−１、ｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ３−２、ｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ３−３、ｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ３−４のＤＮＡ１μｇをＳｐｅＩ，ＮｈｅＩ  １ユニットを用い５０μｌの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
ｐＥＸ  ｇａｍｍａ１  ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ  ＨＣＶＩ  ＤＮＡ１μｇをＮｈｅＩ  １ユニットを用い５０μｌの系Ｍにて３７℃、２時間反応させ切断する。
上記切断したプラスミドををリガーゼキット（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を用い連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った）を形質転換し、所望のプラスミドを得た（図４）。
ＳｃＦｖ発現ｖｅｃｔｏｒとの対応は以下の通りである。
ＳｃＦｖ３−１  →  ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−１  Ｗ  Ｋｍ
ＳｃＦｖ３−２  →  ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−２  Ｗ  Ｋｍ
ＳｃＦｖ３−３  →  ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−３  Ｗ  Ｋｍ
ＳｃＦｖ３−４  →  ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−４  Ｗ  Ｋｍ
６．ＣＨＯ細胞への抗体遺伝子の導入
（１）ＭＫａｍｐ１株の調製
ＭＫａｍｐ１株はＷＯ０１／９４５７１に記載の通り調製した。
５％ＦＢＳ（牛胎児血清；Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）で培養した対数増殖期のＣＨＯＤＧ４４株（コロンビア大学、Ｃｈａｉｓｎ教授より入手）を用い、導入前日に培地を交換しトランスフェクションに用いた。
導入するベクターｐＭＬＧＦＰ  Ｚｅｏは、ベクター内の構造遺伝子に無関係なところで一ヶ所切れる制限酵素Ｅｃｏ０１０９Ｉ（宝酒造）で切断し一本鎖とした。ｐＭＬＧＦＰ  Ｚｅｏ  ＤＮＡ４０μｇを４０ユニットのＥｃｏ０１０９Ｉを用いて５００μｌの系Ｍで３７℃で２時間反応させて切断する。切断後、０．８％アガロースゲル電気泳動し、完全に一本鎖となっていることを確認した。その後、反応液を同量のフェノール／クロロホルム溶液により抽出処理し、水層に２倍量のエタノールを加え、−８０℃にて１時間置いた後、毎分１５０００回転の遠心により沈殿を集め、沈殿を７０％エタノールでリンスし真空乾燥した後、１００μｌの無菌水にとかした。
細胞への遺伝子の導入はエレクトロポレーション法にて行った。
対数増殖期の細胞１×１０７個を０．８ｍｌのＰＢＳに懸濁し、用意したベクター溶液１００μｌと共にキュベットに入れ穏やかに混合した。
キュベットは、５分間氷冷し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いて電気パルスを印加した。印加条件は、１５００（Ｖ）、２５μＦ、１回印加とした。電気パルス印加後、さらに５分間キュベットは氷冷した。
エレクトロポレーションを行った細胞を上記培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌに１×１０５（ｃｅｌｌ／ｍＬ）から４×１０３（ｃｅｌｌ／ｍＬ）の細胞濃度で５０μＬづつ播種した。
９６ｗｅｌｌに細胞播種２日後、上記培地に２００ｍｇ／ｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を加えた培地に交換し、その後３日に一度の頻度で１００μＬづつ培地交換を細胞が立ち上がってくるまで（約３週間）行った。
細胞集落約３００個の発する蛍光はまず蛍光顕微鏡で視覚的に観察した。
その中から蛍光の強いもの（ＭＫａｍｐ候補株）を１６株選択した。
細胞総蛍光量の測定にはＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）を用いた（空冷アルゴンレーザー、励起波長＝４８８ｎｍ）。測定条件をあわせるため、測定はすべて同一条件の感度を用いて行った（ＰＡＲＡＭＥＴＥＲ：ＦＳＣ＝７．７７；ＤＥＴＥＣＴＯＲ：ＦＳＣ＝Ｅ−１，ＦＬ１＝４００Ｖ）。この結果、Ｍｋａｍｐ候補株１６株はいずれも平均値約１００〜３７０の相対蛍光強度を示していた。
Ｍｋａｍｐ候補株を上記培地にて培養し、対数増殖期の細胞を１０ｎＭのＭＴＸ（メトトレキセート；シグマ社より購入）を含む５％ＦＢＳ（牛胎児血清；Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）に細胞を懸濁し、ウエル当たり２×１０５個の細胞数になるように６穴プレートに捲く。その後、３日毎に半量の培地を交換し、生育したコロニーの蛍光強度をＦＡＣＳにて測定した。測定の結果、元株の蛍光強度が２５９であり、５ｎＭＭＴＸ耐性コロニーの蛍光強度が４０７である株を遺伝子増幅可能株として選択し、これをＭｋａｍｐ１株と称する。
（２）ＣＨＯ細胞への抗体遺伝子の導入
上記のＭＫａｍｐ１株にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）を用いてｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−１  Ｗ  Ｋｍ、ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−２  Ｗ  Ｋｍ、ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−３  Ｗ  Ｋｍ、ｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−４  Ｗ  Ｋｍ、をそれぞれトランスフェクトした（それぞれ２００万個の細胞対し１．０マイクログラムのＤＮＡを用いた）。５％ＦＢＳ（牛胎児血清：Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４８時間培養後、４００ｍｇ／ｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社より購入）を加えた同培地により、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２５日間選択培養し、Ｇ４１８耐性コロニーをそれぞれ選択した。
７．ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙを用いた抗体生産量の測定
抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ社より購入）溶液（溶液１で１０μｇ／ｍｌに希釈）を５０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに加え、３７℃で２時間処理した。その後、ｗｅｌｌの溶液をすて、各ｗｅｌｌに２５０μｌの溶液２を加え、４℃で１６時間以上保温した。溶液除去後、溶液３で各ｗｅｌｌを５回ずつ洗浄し、溶液４で希釈した抗体（スタンダード）もしくは試料溶液（培養上清を溶液４で任意に希釈したもの）を５０μｌ／ｗｅｌｌで加えて、３７℃で２時間保温した。溶液除去、溶液３で５回洗浄後、溶液５を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、２０℃で４０分間保温した。液除去、ＰＢＳで５回洗浄後、溶液９を１００μｌ／ｗｅｌｌで加えて室温で遮光して約５分間反応させた。等量の１０％硫酸を加えて反応を停止させた後、イムノリーダー（Ｉｎｔｅｒ  Ｍｅｄ社製、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅａｄｅｒ  ＮＪ−２０００）を用いて各ｗｅｌｌのｌ１＝４９０ｎｍ及びｌ２＝６５０ｎｍにおける吸光度Ａ１及びＡ２を測定し、（Ａ１−Ａ２）を求めた。希釈標準溶液を用いて検量線を作製し、サンプル中の１−３−１抗体（スタンダードとして用いた）の濃度を測定した。
各溶液の組成は以下の通りである。
溶液１：０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｚｉｄｅを含むＰＢＳ
溶液２：１％  ＢＳＡ、０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｚｉｄｅを含むＰＢＳ
溶液３：０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
溶液４：１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液５：ＨＲＰ標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ社より購入）原液２μｌを１０ｍｌの溶液４に溶かしたもの（用時調製）
溶液６：リン酸−水素ナトリウム１４．２ｇを取り、水を加えて５００ｍｌとする
溶液７：クエン酸１水和物１０．５ｇを取り水を加えて５００ｍｌとする
溶液８：溶液５  ２５７ｍｌに溶液６を２４３ｍｌ加え、水を加えて１０００ｍｌとする
溶液９：Ｏ−フェニレンジアミン（和光純薬より購入）４．０ｍｇを取り、溶液７を１０ｍｌ及び３０％（ｖ／ｖ）過酸化水素溶液５マイクロリットルを加えて溶かす（調製後１０分以内に用いた）
８．遺伝子導入株の抗体生産性の確認
上記ＥＬＩＳＡ法により以下の生産量が認められた。
0004221292.tif 000002
９．細胞融合アッセイ
細胞融合アッセイはＴａｋｉｋａｗａらの方法に従った（Ｔａｋｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，５０６６−５０７４，２０００）。組換えＥ１およびＥ２蛋白を細胞表面に発現するＣＨＯ細胞（Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ウエルに２万個ずつ接種し５％  ＣＯ２存在下３７Ｃで培養する。細胞を準備する際には、トリプシンを使用せず１０ｍＭ  ＥＤＴＡ添加リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に５分間浸してから、できるだけ細胞が分散するようにフラスコを震盪し、ゆっくりとピペッティングしながら剥がす。２４時間培養後、細胞を２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で２回洗い、Ｔ７プロモーターの下流にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだリポータープラスミドｐＴ７ＥＭＣＬｕｃ（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５０，１４０−１５０，１９９８）と遺伝子導入効率の標準化のためにＣＭＶプロモーターの下流に海椎茸のルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＴｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を用いて細胞へ導入する。１ｐｌａｔｅあたり以下の組成で用意し、１５分間静置後、１ｗｅｌｌあたり３０μＬずつ添加する。２時間後１０％血清添加Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を１５０μＬずつ添加し培養を継続する。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ            ３ｍｌ
Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１    ５０μＬ
ｐＴ７ＥＭＣＬｕｃ          ９μｇ
ｐＲＬ−ＣＭＶ              ０．６μｇ
細胞融合反応の受容細胞としては、ヒト肝細胞癌由来のＨｅｐＧ２細胞を用いる。ＨｅｐＧ２細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ウエルに８．０×１０５個ずつ接種し、５％  ＣＯ２存在下３７℃で培養する。２４時間培養後に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドｐＣＡＧＴ７ｐｏｌ（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）を各ウエルあたり、以下の組成で細胞に導入し、２時間後に１０％血清添加Ｄ−ＭＥＭを１．５ｍｌ添加する。２４〜３６時間培養後、細胞をトリプシンで剥がし、２５〜３０ｍｌの１０％血清添加Ｄ−ＭＥＭに浮遊後、５０ｍｌの遠心管に移し、５％ＣＯ２存在下３７℃で、震盪機の上で一晩浮遊培養する。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ            １００μＬ
Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１１      ５μＬ
ｐＣＡＧＴ７ｐｏｌ              １μｇ
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに用意したリポータープラスミドを導入したＨＣＶエンベロープ蛋白を発現するＣＨＯ細胞（トランスフェクト４８時間後）の上に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドを導入して一晩浮遊培養したＨｅｐＧ２細胞を、２×１０４／１００μＬずつ各ウエルに加える。５時間培養後、メディウムを捨て、１００μＬのｐＨ５．０のＰＢＳに２分間浸した後、直ちにその液を捨て、１０％血清添加Ｄ−ＭＥＭを２００μＬずつ各ウエルに加え培養を継続する。培養５時間後に細胞をｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｚｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、添付プロトコールに従いルシフェラーゼ活性を測定し、細胞融合活性を評価した。
１０．細胞融合阻止アッセイ
抗体による細胞融合阻止活性を調べる場合は、上記の細胞融合阻アッセイと基本的には同じであるが、ＣＨＯ細胞にＨｅｐＧ２細胞を加える前に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭでＨｅｐＧ２細胞を２回洗浄後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで段階希釈した被検抗体（ｗｈｏｌｅ抗体３−１、３−２、３−３、及び３−４）と６０分反応させてから共培養を行った。その後同様にルシフェラーゼ活性を測定し、細胞融合阻止活性を評価した。その結果、ＮＯＢ活性を示した単鎖抗体を基に作製した完全抗体の中に、ＨＣＶのエンベロープ蛋白による細胞融合を特異的に阻止するものが認められた。
１１．ＢＩＡＣＯＲＥによるアフィニティー測定
ＢＩＡＣＯＲＥによる取得ｗｈｏｌｅ抗体のアフィニティー測定は添付の説明書に従い行った。
Ｅ２ｔａｇを透析によりＰＢＳに置換した。このＥ２ｔａｇ（１００μｇ／ｍＬ、２０μＬ）をセンサーチップＣＭ５（ビアコア社より購入）のそれぞれ異なるレーンに５μＬ／ｍｉｎで送液することによりアミノカップリング法にて固定化し、Ｅ２ｔａｇ固定化センサーチップを得た。ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−１、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−２、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−４を透析によりＨＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に置換した。ＢＩＡＣＯＲＥＸ（ビアコア社）を用いて、先に作製したＥ２ｔａｇセンサーチップ上に、この各ｗｈｏｌｅ抗体溶液を５μＬ／ｍｉｎにて送液し結合時のセンサグラムを得た。その後、ＨＢＳ  ｂｕｆｆｅｒのみを５μＬ／ｍｉｎにてセンサーチップに送液し解離時のセンサグラムを得た。これらのセンサグラムの解析により以下のＥ２ｔａｇとｗｈｏｌｅ抗体の解離定数を得た。
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−２      ２５．３（ｎＭ）
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３      ９．２６（ｎＭ）
Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−４      １６．８（ｎＭ）
１２．スクリーニング例（競合アッセイ）１
（１）抗体のビオチン化
抗体のビオチン化はアマシャムファルマシア社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅを用いてプロトコールに従い行った。ビオチン化した抗体はアマシャルムファルマシア社のＰＤ−１０を用いて定法に従いＰＢＳにｂｕｆｆｅｒ置換し、以下の操作に使用した。
（２）ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１によるＥ２／ＮＳ１とｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３の結合阻止試験
５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）溶液に溶解した、３０μｇ／ｍｌのＥ２ｔａｇ  １ｍｌをＦＡＬＣＯＮの９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。各ｗｅｌｌの水分を切った後、アマシャムファルマシア社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅに添付されていたｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ５％と０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと呼ぶ）を各ｗｅｌｌに２００μＬづつ加え３７℃で１時間、または４℃で一晩キンキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ１−１およびｃｏｎｔｒｏｌ抗体をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒにて０〜１６００ｎｇ／ｍＬになるように希釈し各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。各ｗｅｌｌの水分を切った後、ビオチン化したｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３を最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるようにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒにて希釈し、各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。ＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをＰＢＳにて１５００倍希釈し、各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え室温で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。ＯＰＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５ｍＬにオルトフェニレンジアミン１０ｍｇ、３０％過酸化水素水１２．５μＬを加えた溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ加え十分に発色するまで室温でインキュベートし、４Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３のＥ２ｔａｇに対する結合がｗｈｏｌｅ  Ａｂ１−１およびｃｏｎｔｒｏｌ抗体により阻害されているか確認した。結果を図５に示す。
１２．スクリーニング例（競合アッセイ）２
５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）溶液に溶解した、３０μｇ／ｍｌのＥ２ｔａｇ  １ｍＬをＦＡＬＣＯＮの９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。各ｗｅｌｌの水分を切った後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを各ｗｅｌｌに２００μＬづつ加え、３７℃で１時間、または４℃で一晩インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ３−３およびｃｏｎｔｒｏｌ抗体をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒにて０〜１６００ｎｇ／ｍＬになるように希釈し各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。各ｗｅｌｌの水分を切った後、ビオチン化ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１を最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるようにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒにて希釈し、各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え３７℃で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。ＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをＰＢＳにて１５００倍希釈し、各ｗｅｌｌに５０μＬづつ加え室温で１時間インキュベートした。各ｗｅｌｌの溶液をデカンテーションで廃棄後０．１％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳを各ｗｅｌｌに２００μＬ加えデカンテーションで廃棄する操作を５回繰り返した。ＯＰＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５ｍＬにオルトフェニレンジアミン１０ｍｇ、３０％過酸化水素水１２．５μＬを加えた溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ加え十分に発色するまで室温でインキュベートし、４Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによりｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１のＥ２ｔａｇに対する結合がｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３およびｃｏｎｔｒｏｌ抗体により阻害されているか確認した。結果を図６に示す。
産業上の利用の可能性
本発明によると、ＨＣＶの感染阻止作用などの抗ウイルス効果を有する新規な医薬品が提供可能である。
なお、本出願は日本国特許出願番号：特願２００１−２４３９４７に基づく優先権を主張して出願されたものであり、特願２００１−２４３９４７の明細書に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用されるものとする。
【配列表】
0004221292.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の抗体のＮＯＢ活性を示す図である。
図２は、発現プラスミドｐＥＸ  ｇａｍｍａｌ  １Ｗ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶＩの構築を示す図である。
図３は、発現プラスミドｐＥＸ  ｋａｐｐａ  Ｋｍ  ＨＣＶ３−１〜３−４の構築を示す図である。
図４は、発現プラスミドｐＥＸ  ｌｏｘｐ−Ｈｙｇ  ＨＣＶ３−１Ｗ〜３−４Ｗ  Ｋｍの構築を示す図である。
図５は、Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１とｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３の競合アッセイの結果を示す図である。
図６は、Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  １−１とｗｈｏｌｅ  Ａｂ  ３−３の競合アッセイの結果を示す図である。
【図１】
0004221292.tif 000074
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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