(57)【要約】Ｊ３と指定されたジャガイモ品種が、開示される。本発明は、ジャガイモ品種Ｊ３の塊茎、ジャガイモ品種Ｊ３の種子、ジャガイモ品種Ｊ３の植物及び植物部分、ジャガイモ品種Ｊ３から生産される食品製品、並びにジャガイモ品種Ｊ３をそれ自体と、又は別のジャガイモ変種と交配することによってジャガイモ植物を生産するための方法に関する。本発明はまた、トランスジェニックジャガイモ植物を生産するための方法、及びそれらの方法によって生成されるトランスジェニックジャガイモ植物及び部分に関する。本発明はまた、ジャガイモ品種Ｊ３に由来するジャガイモ植物及び植物部分、ジャガイモ品種Ｊ３に由来する他のジャガイモ植物又は植物部分を生成するための方法、並びにそれらの方法の使用から得られるジャガイモ植物及びその部分に関する。
2016518139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャガイモ品種Ｊ３のジャガイモ塊茎又は塊茎の一部であって、前記塊茎の代表試料が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０３７１の下で寄託された、ジャガイモ塊茎又は塊茎の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の塊茎又は前記塊茎の一部を生長させることによって生産される、ジャガイモ植物又はその一部。
【請求項３】
請求項２に記載の植物の生理学的及び形態学的特徴の全てを有し、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ植物。
【請求項４】
請求項２に記載の植物から生産される細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞が、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、雌ずい、葯、花、茎、及び塊茎からなる群から選択される植物部分から生産され、前記組織培養細胞が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、組織培養物。
【請求項５】
請求項４に記載の組織培養物から再生されるジャガイモ植物であって、前記植物が、ジャガイモ品種Ｊ３の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する、ジャガイモ植物。
【請求項６】
請求項１に記載のジャガイモ塊茎又は前記塊茎の一部を生長させることによって生産されるジャガイモ種子であって、前記種子が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ種子。
【請求項７】
請求項６に記載の種子を生長させることによって生産される、ジャガイモ植物又はその一部。
【請求項８】
請求項７に記載のジャガイモ植物の組織培養物から再生されるジャガイモ植物であって、前記再生植物が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ植物。
【請求項９】
ジャガイモ種子を生産するための方法であって、２つのジャガイモ植物を交配することと、結果として得られるジャガイモ種子を収穫することと、を含み、少なくとも１つのジャガイモ植物が、請求項２に記載のジャガイモ植物である、方法。
【請求項１０】
ジャガイモ種子を生産するための方法であって、２つのジャガイモ植物を交配することと、結果として得られるジャガイモ種子を収穫することと、を含み、少なくとも１つのジャガイモ植物が、請求項７に記載のジャガイモ植物である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって生産されるジャガイモ種子であって、前記種子が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のジャガイモ種子を生長させることによって生産される、ジャガイモ植物又はその一部。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物から生産されるジャガイモ種子であって、前記種子が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ種子。
【請求項１４】
前記ジャガイモ植物のうちの１つが、ジャガイモ品種Ｊ３であり、前記第２のジャガイモ植物が、トランスジェニックである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ジャガイモ種子を生産する方法であって、２つのジャガイモ植物を交配することと、結果として得られるジャガイモ種子を収穫することと、を含み、前記ジャガイモ植物のうちの１つが、請求項７に記載のジャガイモ植物であり、前記第２のジャガイモ植物が、トランスジェニックである、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法によって生産される前記種子を生長させることによって生産されるジャガイモ植物又はその一部であって、前記植物が、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ植物。
【請求項１７】
所望の形質をジャガイモ品種Ｊ３に導入する方法であって、
（ａ）子孫植物を生産するために、塊茎の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０３７１の下で寄託されたＪ３植物を、所望の形質を含む別のジャガイモ品種の植物と交配することとであって、前記所望の形質が、雄性不稔性、除草剤耐性、虫害耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝、及び細菌性疾病、真菌性疾病、又はウイルス性疾病に対する耐性からなる群から選択される、交配することと、
（ｂ）前記所望の形質を有する１つ又は２つ以上の子孫植物を選択することと、
（ｃ）前記選択された子孫植物をＪ３植物と戻し交配し、戻し交配子孫植物を生産することと、
（ｄ）前記所望の形質を有する戻し交配子孫植物を選択することと、
（ｅ）前記所望の形質を含む選択される第３世代又はそれよりも先の世代の戻し交配子孫植物を生産するために、工程（ｃ）及び（ｄ）を連続して２回又はそれよりも多数回繰り返すことと、を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって生産されるジャガイモ植物であって、前記植物が、前記所望の形質を有し、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、ジャガイモ植物。
【請求項１９】
前記所望の形質が、除草剤耐性であり、前記耐性が、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グリホサート、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノトリシン、トリアジン、及びベンゾニトリルからなる群から選択される除草剤に対して与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２０】
前記所望の形質が、虫害耐性であり、前記虫害耐性が、バチルス・スリンギエンシスエンドトキシンをコードする導入遺伝子によって与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２１】
前記所望の形質が、改変された脂肪酸代謝又は改変された炭水化物代謝であり、前記所望の形質が、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ２、インベルターゼ、及びデンプン分枝酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸又はステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンスをコードするＤＮＡによって与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２２】
商品植物製品を生成する方法であって、請求項２に記載の植物又はその一部を得ることと、前記商品植物製品を前記植物又はその植物部分から生産することと、を含み、前記商品植物製品が、フライドポテト、ポテトチップス、脱水ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、及びジャガイモ顆粒からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって生産される商品植物製品であって、ホスホリラーゼ−Ｌ及びジキナーゼＲ１遺伝子に対する内因性ジャガイモプロモーターの逆位反復に加えて、内因性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及び内因性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現の阻害に有効なジャガイモＤＮＡの逆位反復を含有する、品種Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入領域を含む、商品植物製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年５月２日に出願された米国仮特許出願第６１／８１８，７５２号の優先権の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、Ｊ３と指定された新規のジャガイモ品種、並びにそのジャガイモ変種によって生成される塊茎、植物、植物部分、組織培養物、及び種子に関する。本発明は更に、ジャガイモ品種Ｊ３から生成される、フライドポテト、ポテトチップス、脱水ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、及びジャガイモ顆粒等の食品製品に関する。本出願に引用される全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ジャガイモは、世界で４番目に最も重要な食用作物であり、群を抜いて最も重要な野菜である。ジャガイモは現在、米国のほぼ全ての州で商用に生育されている。年間のジャガイモ生産は、米国で１．６×１０１０ｋｇ（１８百万トン）、世界規模では２．７２×１０１１ｋｇ（３００百万トン）を上回る。ジャガイモの人気は、主にその多用途性及び栄養価によるものである。ジャガイモは、生で、冷凍して、若しくは乾燥させて使用することができ、又は粉、デンプン、若しくはアルコールに加工することができる。それらは、複合糖質を含有し、カルシウム、ナイアシン、及びビタミンＣが豊富である。
【０００４】
食品分野におけるジャガイモの品質は、２つの極めて重要な要因によって悪影響を受ける。（１）ジャガイモは、油揚又は焼成時に、急速に酸化して発癌性生成物であるアクリルアミドを形成する非必須遊離アミノ酸であるアスパラギンを大量に含有し、並びに（２）ジャガイモは、酵素的褐変及び変色の影響を非常に受けやすく、これは、ポリフェノールオキシダーゼが傷付いたジャガイモの損傷したプラスチドから漏出するときに生じる望ましくない事象である。細胞質において、酵素はフェノールを酸化し、それは次いで、急速に重合して、濃い色素を生成する。塊茎は、大量のリン酸化デンプンを含有し、その一部は、貯蔵中に分解され、グルコース及びフルクトースを生成する。これらの還元糖は、１２０℃を超える温度で加熱されると、アミノ酸と反応し、アクリルアミドを含むメイラード生成物を形成する。デンプンリン酸化に関与する２つの酵素は、水ジキナーゼＲ１及びホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１及びＰｈＬ）である。褐変はまた、デンプンのグルコース及びフルクトースへの部分的分解の結果として、非酵素的に誘発される。
【０００５】
今まで、低いアクリルアミド含量、上昇した黒斑傷抵抗性、及び低減した甘味のセネッセンスを有する塊茎を生産するジャガイモ植物変種は存在しなかった。このため、低減したレベルの有毒化合物を有するが、未知の又は外来の核酸の使用を伴わない、ジャガイモ変種の開発の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たす。
【０００６】
関連技術の前述の例及びそれらによる関連する制限は、例示として意図され、排他的であるとは意図されない。関連技術の他の制限は、本明細書を読めば当業者に明らかとなるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施形態及びそれらの態様は、システム、ツール、及び方法と併せて記載され、それらは例示として意味され、範囲を制限するものではない。種々の実施形態では、上に記載された問題のうちの１つ若しくは２つ以上が低減又は排除されたが、他の実施形態では、他の改善点を対象とする。
【０００８】
この目的のため、本発明は、ジャガイモ植物ゲノムにネイティブであり、外来ＤＮＡ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ、ウイルスマーカー、又はベクター骨格配列を含有しない核酸配列でトランスフェクトされた新規のジャガイモ変種Ｊ３を提供する。むしろ、ジャガイモ変種Ｊ３のゲノムに挿入されるＤＮＡは、黒斑傷の発現、アスパラギン蓄積、及び甘味のセネッセンスに関与する遺伝子を発現停止させる他のジャガイモと受精可能な（ｓｅｘｕａｌｌｙ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）植物であるジャガイモにネイティブであるか、又は野生のジャガイモにネイティブである非コードポリヌクレオチドである。
【０００９】
このため、１つの実施形態では、本発明は、アンチセンス方向で、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子の断片（ｆＡｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’−未翻訳配列を含むＤＮＡセグメントの２つのコピーを含有する第１のサイレンシングカセット、並びにアンチセンス方向で、ジャガイモホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子の断片及びジャガイモＲ１遺伝子の断片を含む、ＤＮＡセグメントの２つのコピーを含有する第２のサイレンシングカセットを含む、ｐＳＩＭ２７８と称される植物ベクターを提供する。ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物形質転換の前に植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換時に植物細胞中に移入されない９，５１１ｂｐ骨格領域、並びに形質転換時に植物細胞のゲノムに安定して組み込まれるネイティブＤＮＡを含む１０，１４７ｂｐのＤＮＡインサート領域を含む。
【００１０】
異なる実施形態では、本発明は、本発明の植物ベクターで形質転換される植物細胞を提供する。更なる実施形態では、本発明は、本発明のベクターで形質転換される１つ又は２つ以上の細胞を含むジャガイモ植物変種を提供する。本発明の１つの態様では、ジャガイモ植物変種は、ベクターの２つのサイレンシングカセットのうちの少なくとも１つを発現し、そのサイレンシングカセットの発現は、遺伝子内植物の塊茎中のアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい態様では、少なくとも１つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種の塊茎は、形質転換されていない同じ変種の植物の塊茎には存在しない２つ又はそれよりも多くの望ましい形質を表す。本発明の最も好ましい態様では、２つ又はそれよりも多くの望ましい形質は、低いアスパラギン蓄積、低減された黒斑傷、及び熱誘導アクリルアミド形成の低減からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の異なる態様では、ジャガイモ植物変種は、植物ＤＮＡベクターの両方のサイレンシングカセットを発現し、サイレンシングカセットの発現は、ジャガイモ植物変種の塊茎中のアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子、及びジキナーゼＲ１遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい態様では、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種の塊茎は、形質転換されていない同じ変種の植物の塊茎には存在しない２つ又はそれよりも多くの望ましい形質を表す。好ましい実施形態では、２つ又はそれよりも多くの望ましい形質は、低いアスパラギン蓄積、低減された黒斑傷、貯蔵中の還元糖の蓄積の低減、及び熱誘導アクリルアミド形成の低減からなる群から選択される。本発明の１つの態様では、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種は、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｊ３変種である。
【００１２】
このようにして、本発明に従って、Ｊ３と指定されたＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌの属及び種の新しいジャガイモ品種が提供される。このため、本発明は、ジャガイモ品種Ｊ３、ジャガイモ品種Ｊ３の塊茎、ジャガイモ品種Ｊ３の植物、ジャガイモ品種Ｊ３の種子、ジャガイモ品種Ｊ３から生産される食品製品、及びジャガイモ品種Ｊ３を自配することによって、又はジャガイモ品種Ｊ３を別のジャガイモ品種と交配することによって生産される、ジャガイモ植物を生産するための方法、並びにジャガイモ品種Ｊ３の突然変異誘発又は形質転換による変異形の創出に関する。
【００１３】
このため、品種Ｊ３を使用する任意のそのような方法：自配、戻り交配、ハイブリッド生成、集団との交配等が、本発明の実施形態である。少なくとも１つの親としてジャガイモ品種Ｊ３を使用して生産される全ての植物が、本発明の範囲内である。有利なことに、本ジャガイモ品種は、優れた特徴を有する第１世代（Ｆ１）ジャガイモハイブリッド塊茎、種子、及び植物を生産するために、他の異なるジャガイモ植物との交配に使用することができる。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ品種Ｊ３の単一又は複数の遺伝子変換植物を提供する。１つの実施形態では、移入された遺伝子（複数可）は、優性又は劣性対立遺伝子（複数可）であってもよい。いくつかの実施形態では、移入された遺伝子（複数可）は、除草剤耐性、虫害耐性、細菌性、真菌性、又はウイルス性疾病への耐性、雄性稔性、雄性不稔性、強化した栄養品質、均一性、及びデンプン及び他の炭水化物の濃度の上昇、傷への傾向の減少、並びにデンプンから糖への変換の速度の減少等の形質を付与するだろう。遺伝子（複数可）は、天然に生じるジャガイモ遺伝子、又は遺伝子工学技術、戻し交配、若しくは突然変異を通して導入される導入遺伝子であり得る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ品種Ｊ３の組織培養物で使用するための再生可能な細胞を提供する。１つの実施形態では、組織培養物は、前述のジャガイモ植物の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する植物を再生すること、及び前述のジャガイモ植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるだろう。いくつかの実施形態では、そのような組織培養物において再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌ずい、子葉、胚軸、根、根端、花、種子、葉柄、塊茎、芽、又は茎であるだろう。なおも更に、本発明は、本発明の組織培養物から再生されるジャガイモ植物を提供する。
【００１６】
更なる実施形態では、本発明は、ジャガイモ植物変種Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｊ３の塊茎から作られた食品製品を提供する。好ましくは、食品製品は、加熱処理された製品である。更により好ましくは、食品製品は、フライドポテト、ポテトチップ、脱水ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、又はジャガイモ顆粒である。
【００１７】
上に記載された例示的態様及び実施形態に加えて、更なる態様及び実施形態が、以下の説明の研究により明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを描写する。左側のベクター骨格領域は、９，９５７ｂｐ位置で開始し、１９，４６８ｂｐ位置で終了する９，５１１ｂｐ長である。骨格ＤＮＡは主に、植物形質転換の前のＤＮＡインサートの維持の支持を提供する細菌ＤＮＡからなる。フランキング境界配列を含むＤＮＡインサート領域（右側）は、１０，１４７ｂｐ長である（１９，４６９ｂｐ〜１９，６６０ｂｐ及び１ｂｐ〜９，９５６ｂｐ）。ＤＮＡインサートは、ネイティブＤＮＡのみから構成され、形質転換時にジャガイモゲノムに安定して組み込まれた。
【図２】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター中の挿入されるＤＮＡインサート中のサイレンシングカセットの略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーで隔てられた２つの遺伝子断片の２つのコピーを含有する。４つの標的遺伝子、即ち、Ａｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、Ｐｈｌ、及びＲ１の断片を含むＤＮＡセグメントの２つのコピーが、Ｐｒｏとして示される、塊茎中で主に活性である２つの収束性プロモーターの間に逆位反復として挿入された。結果として得られるサイレンシングカセットを含有する植物は、塊茎中にＲＮＡ分子の多用な非ポリアデニル化アレイを生成し、所期の標的遺伝子を動的に及び盛んに発現停止させる。収束性転写が衝突転写をもたらすため、ＲＮＡ分子の大きさは、概して、用いられる２つのプロモーター間の距離よりも小さかった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
続く説明及び表において、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含めて、本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解をもたらすために、以下の定義が提供される。
【００２０】
対立遺伝子。対立遺伝子とは、ある形質又は特徴に関係する遺伝子のうちの１つ又は２つ以上の代替形態のうちのいずれかである。二倍体細胞又は二倍体生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【００２１】
アミノ酸配列。本明細書で使用される場合、植物から単離されるか、植物にネイティブであるか、若しくは植物中で天然に生じる、又は合成的に作製されるが、内因性相対物の核酸配列を含まない、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそれらの断片を含む。
【００２２】
人工的操作。本明細書で使用される場合、「人工的に操作される」とは、操作されていない天然に生じる相対物と比較して異なる生物学的、生化学的、形態学的、又は生理学的表現型及び／又は遺伝子型を有する植物又は植物細胞を生成するように、手動で、又は機械的手段によって、若しくは遺伝子工学技術によるもの等の組換え手段によって、植物又は植物細胞を動かす、配置する、作動する、又は制御することを意味する。
【００２３】
無性繁殖。配偶子の融合を伴わない葉挿し、茎挿し、根挿し、塊茎芽、匍匐枝、単一植物細胞のプロトプラスト、カルス等から全植物を生成することによって子孫を生産すること。
【００２４】
骨格。移入を意図したＤＮＡインサート配列を排除するバイナリーベクターの核酸配列。
【００２５】
戻し交配。戻し交配とは、育種者が、ハイブリッド子孫を親、例えば、第１世代ハイブリッドＦ１のうちの１つに戻して、Ｆ１ハイブリッドの親の遺伝子型のうちの１つと繰り返し交配する過程である。
【００２６】
細菌性輪腐病。細菌性輪腐病とは、細菌Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ亜種によって引き起こされる疾病である。細菌性輪腐病の名前は、塊茎内の維管輪の特徴的な崩壊に由来する。この輪は、しばしば、クリームのような黄色から明るい茶色のチーズのような腐食として現れる。ジャガイモの外表面上において、激しく罹患した塊茎は、若干窪んだ、乾燥し、ひび割れた領域を示し得る。感染した塊茎の維管組織における細菌性輪腐病の症状は、上述よりも明白でない場合があり、散発的に現れる暗色の破線のように、又は連続した黄色の変色のようにのみ現れる。
【００２７】
黒斑傷。傷付いた塊茎組織で見られる黒斑はメラニンと称される色素の結果であり、細胞の損傷後に生成され、組織に茶色、灰色、又は黒色の外観をもたらす。メラニンは、細胞損傷の結果として、フェノール基質及び適切な酵素が互いに接触するときに形成される。損傷は、細胞の破壊を必要としない。しかしながら、基質及び酵素の混合は、通常、組織が激突したときに生じるべきである。黒斑は、主に、維管輪の真下の髄質周囲の（ｐｅｒｉｍｅｄｕｌｌａｒｙ）組織中で生じるが、皮質組織の一部分を含むのに十分大きくてもよい。
【００２８】
境界様配列。「境界様」配列は、修飾される選択植物種から、又はその修飾される植物種と受精可能な植物から単離され、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの境界配列のように機能する。つまり、本発明の境界様配列は、そこに連結されるポリヌクレオチドの組み込みを促進し、容易にする。本発明のＤＮＡインサートは、好ましくは、境界様配列を含有する。ＤＮＡインサートの境界様配列は、５〜１００ｂｐ長、１０〜８０ｂｐ長、１５〜７５ｂｐ長、１５〜６０ｂｐ長、１５〜５０ｂｐ長、１５〜４０ｂｐ長、１５〜３０ｂｐ長、１６〜３０ｂｐ長、２０〜３０ｂｐ長、２１〜３０ｂｐ長、２２〜３０ｂｐ長、２３〜３０ｂｐ長、２４〜３０ｂｐ長、２５〜３０ｂｐ長、又は２６〜３０ｂｐ長である。ＤＮＡインサート左及び右境界配列は、修飾される植物のゲノムから単離されるか、及び／又はそれにネイティブである。ＤＮＡインサート境界様配列は、任意の既知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＴ−ＤＮＡ境界配列とヌクレオチド配列は同一ではない。このため、ＤＮＡインサート境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ等のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＴ−ＤＮＡ境界配列とは異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多くのヌクレオチドを持つ。つまり、本発明のＤＮＡインサート境界又は境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ等のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＴ−ＤＮＡ境界配列と、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有しない。本明細書で使用される場合、叙述的用語「ＤＮＡインサート境界」及び「ＤＮＡインサート境界様」は、交換可能である。境界様配列は、植物ゲノムから単離し、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列に組み込み可能な効率を変化させるように修飾又は変異することができる。他のポリヌクレオチド配列が、本発明の境界様配列に付加されるか、又はその中に取り込まれてもよい。このため、ＤＮＡインサート左境界又はＤＮＡインサート右境界は、５’−及び３’−多重クローニング部位又は追加の制限部位を有するように、修飾され得る。ＤＮＡインサート境界配列は、付随するベクターからの骨格ＤＮＡが、植物ゲノムに組み込まれない可能性を高めるように修飾され得る。
【００２９】
本質的になる。ある特定の要素「から本質的になる」組成物は、それらの要素の含有に制限され、並びに本発明の組成物の基本の及び新規の特徴に物質的に影響しないそれらの要素に制限される。このため、組成物が、本発明の基本の及び新規の特徴に影響しない、つまり、選択される植物種と受精可能な選択される植物種又は植物からではない外来ＤＮＡを含有しない限り、その組成物は、「本質的になる」という言語によって特徴付けられる成分の発明組成物と考えられ得る。
【００３０】
子葉。子葉とは、種子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）の一種である。子葉は、種子の食糧貯蔵組織を含有する。
【００３１】
縮重プライマー。「縮重プライマー」は、類似するが、厳密に相同ではない配列にハイブリダイズされる場合に、塩基ミスマッチに順応できる十分なヌクレオチド変形を含有するオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
双子葉植物（双子葉植物（ｄｉｃｏｔ））。その胚が２つの種子葉又は子葉を有する顕花植物。双子葉植物の例には、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファ及び大豆を含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、トウナス、デイジー、並びにサボテンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
ＤＮＡインサート。本発明に従って、植物のゲノムに挿入されるＤＮＡインサートは、その植物にネイティブであるポリヌクレオチド配列を含むか、又はその植物のネイティブ遺伝要素を有する。１つの例では、例えば、本発明のジャガイモ変種Ｊ３のＤＮＡインサートは、形質転換時に植物細胞のゲノムに安定して組み込まれ、黒斑傷の発現、アスパラギン蓄積、及び甘味のセネッセンスに関与する遺伝子を発現停止させる他のジャガイモと受精の可能な植物であるジャガイモ又は野生のジャガイモにネイティブである１０，１４７ｂｐの非コードポリヌクレオチドである。ＤＮＡインサートは、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクター中に挿入される。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆位反復として配置されるアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に、塊茎中で活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターを発現停止させることである。このカセットは、第１のカセットとして同じＡｇｐ及びＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結される、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から構成される。これらの発現カセットは、外来ＤＮＡを含有せず、選択される植物種又は選択される植物種と受精可能な植物のいずれかからのＤＮＡのみからなる。
【００３４】
胚。胚は、成熟した種子内に含有される未成熟植物である。
【００３５】
外来。核酸に関連する「外来」とは、核酸が、非植物有機体に由来するか、若しくは形質転換される植物と同じ種ではない植物に由来する、又は形質転換される植物と異種交配可能ではない植物に由来せず、標的植物の種に属さないことを意味する。本発明に従って、外来ＤＮＡ又はＲＮＡは、菌類、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類、又は鳥類の遺伝子構造中で天然に生じるが、形質転換される植物中で天然に生じない核酸を表す。このため、外来核酸とは、例えば、形質転換植物によって天然に生成されないポリペプチドをコードするものである。外来核酸は、タンパク質生成物をコードしなくてもよい。本発明に従って、所望の遺伝子内植物は、そのゲノムに組み込まれる任意の外来核酸を含有しないものである。
【００３６】
遺伝子。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、コード領域を指し、５’−又は３’−からその領域までのヌクレオチド配列を含まない。機能遺伝子は、プロモーター又はターミネーターに作動可能に連結されるコード領域である。遺伝子は、形質転換又は種々の育種方法を使用して異なる種から、又は同じ種から種のゲノムに導入され得る。
【００３７】
遺伝子変換（変換）。遺伝子変換（変換）植物とは、戻し交配と称される植物育種技法によって発育される植物を指し、戻し交配技法を介して、遺伝子工学を介して、又は突然変異を介して、その変種中に移入される１つ又は２つ以上の遺伝子に加えて、変種の所望の形態学的及び生理学的特徴の本質的に全てが取り戻される。１つ又は２つ以上の遺伝子座が、移入されてもよい。
【００３８】
遺伝子再配置。遺伝物質の新たな構成を導入するインビボ並びにインビトロで自然発生的に生じ得る遺伝要素の再会合を指す。例えば、異なる染色体遺伝子座でのポリヌクレオチドと一緒のスプライシングは、植物発育及び有性組換えの両方の間にインビボで自然発生的に生じ得る。したがって、インビトロでの天然ではない遺伝子修飾技法による遺伝要素の組換えは、インビボでの有性組換えを通しても生じ得る組換え事象と類似している。
【００３９】
ジャガイモシストセンチュウ。ジャガイモシストセンチュウとして一般に知られているＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓは、ジャガイモ植物の根及び塊茎に影響する植物寄生線虫である。症状には、植物生長不良、萎れ、水ストレス、及び栄養欠乏が挙げられる。
【００４０】
胚軸。胚軸は、胚又は子葉と根との間の実生苗の部分である。ゆえに、苗条と根との間の遷移部と考えられてもよい。
【００４１】
インフレーム。ヌクレオチドトリプレット（コドン）は、植物細胞中の所望の組換えタンパク質の新生アミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第２の核酸へのリーディングフレーム内に連結される第１の核酸を企図し、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子であり、第２のヌクレオチドは、プロモーター又は同様の制御要素である。
【００４２】
組み込む。選択植物種からの、又はその選択植物と同じ種の植物からの、又は選択植物種と受精可能な植物からの核酸配列の、選択植物種の細胞のゲノムへの挿入を指す。「組み込み」は、ネイティブ遺伝要素のみの植物細胞ゲノムへの取り込みを指す。相同組換え等によって、ネイティブ遺伝要素を組み込むために、本発明は、そのような過程における工程として非ネイティブＤＮＡを使用し得る。このため、本発明は、特定のＤＮＡ分子の使用と、特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノムへの「組み込み」とをはっきりと区別する。
【００４３】
導入。本明細書で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換、又は形質導入を含む方法による、細胞中への核酸配列の挿入を指す。
【００４４】
単離される。「単離される」とは、その正常なネイティブ環境から物理的に分離された任意の核酸又は化合物を指す。単離された物質は、例えば、溶媒、緩衝液、イオン、又は他の成分を含有する好適な溶液中で維持され得、精製された形態又は精製されていない形態であり得る。
【００４５】
リーダー。遺伝子に先行する（又は遺伝子から５’への）転写されたが、翻訳されていない配列。
【００４６】
遺伝子座。遺伝子座は、例えば、雄性不稔性、除草剤抵抗性、虫害耐性、疾病耐性、ロウデンプン、改変された脂肪酸代謝、修飾フィチン酸代謝、改変された炭水化物代謝、及び修飾タンパク質代謝等の１つ又は２つ以上の形質を付与する。形質は、例えば、戻し交配、天然若しくは誘発突然変異、又は遺伝子形質転換技法を通して導入される導入遺伝子によって、変種のゲノムに導入される天然に生じる遺伝子によって付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体位置で組み込まれる１つ又は２つ以上の対立遺伝子を含み得る。
【００４７】
市場性のある収量。市場性のある収量とは、直径５〜１０ｃｍ（２〜４インチ）の収穫される全ての塊茎の重量である。市場性のある収量は、ｃｗｔ（ハンドレッドウェイト）で測定され、ｃｗｔ＝４５ｋｇ（１００ポンド）である。
【００４８】
単子葉植物（単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ））。その胚が、１つの子葉又は種子葉を有する顕花植物。単子葉植物の例には、芝草、トウモロコシ、米、オート麦、小麦、大麦、サトウモロコシ、ラン、アイリス、ユリ、タマネギ、及びシュロが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ネイティブ。「ネイティブ」遺伝要素とは、形質転換される植物のゲノムに天然に存在する、それを起源とする、又はそこに属する核酸を指す。このため、形質転換される植物若しくは植物種のゲノムから単離されるか、又は形質転換される植物種と受精可能若しくは異種交配可能な植物若しくは種から単離される任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ分子は、その植物種に「ネイティブ」、即ち、在来のものである。換言すると、ネイティブ遺伝要素とは、植物育種者が古典的な植物育種を通して植物の改善のために入手可能な、全ての遺伝物質を表す。本発明においては、ネイティブ核酸の任意の変異形もまた、「ネイティブ」と考えられる。この点において、「ネイティブ」核酸は、植物若しくはその受精可能な種から単離されてもよく、結果として得られる変異形が、植物から単離された修飾されていないネイティブ核酸に対して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、又は６０％以上ヌクレオチド配列が類似するように、修飾又は変異させられ得る。ネイティブ核酸変異形はまた、約６０％未満、約５５％未満、又は約５０％未満ヌクレオチド配列が類似し得る。植物から単離された「ネイティブ」核酸はまた、その核酸から転写及び翻訳される天然に生じるタンパク質生成物の変異形をコードしてもよい。このため、ネイティブ核酸は、核酸が単離された植物中で発現された修飾されていないネイティブタンパク質と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、又は６０％以上アミノ酸配列が類似しているタンパク質をコードし得る。
【００５０】
ネイティブ遺伝要素。「ネイティブ遺伝要素」は、本発明に従って選択植物種ゲノムに取り込まれ、組み込まれ得る。ネイティブ遺伝要素は、選択植物種に属する植物から、又は選択される植物種と受精可能な植物から単離される。例えば、栽培ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）中に取り込まれるネイティブＤＮＡは、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍの任意の遺伝子型又はＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（例えば、Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ）と受精可能な野生ジャガイモ種の任意の遺伝子型に由来し得る。
【００５１】
天然に生じる核酸。天然に生じる核酸は、選択植物種のゲノム内で発見され、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。通常、植物種のゲノムに存在する制限部位の配列は、たとえ制限部位がそのゲノムから物理的に単離されたとしても、ベクター又はオリゴヌクレオチド等の外生的ＤＮＡ分子中に改変され得る。このため、本発明は、その配列が、選択植物種のゲノムで、又は形質転換される選択植物種と受精可能な植物で天然に生じる限り、制限酵素認識配列等のヌクレオチド配列の合成創出を可能にする。
【００５２】
作動可能に連結される。組み合わせてそれらが植物細胞中で適切に機能するような様式で、２つ又はそれよりも多くの分子を組み合わせること。例えば、プロモーターは、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御するとき、構造遺伝子に作動可能に連結される。
【００５３】
植物。本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、これらに限定されないが、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、テンサイ、キャッサバ、サツマイモ、大豆、トウモロコシ、芝草、小麦、米、大麦、モロコシ、オート麦、オーク、ユーカリ、クルミ、及びシュロ等の被子植物及び裸子植物が挙げられる。このため、植物は、単子葉植物又は双子葉植物であり得る。本明細書で使用される場合、「植物」という単語は、有性又は無性的に生成されるかを問わず植物細胞、種子、植物子孫、珠芽、並びに切穂又は種子等のこれらのいずれかの子孫も包含する。植物細胞は、懸濁培養物、カルス、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子、及び小胞子を含む。植物は、成熟期の種々の段階であってよく、液体若しくは固体培養物中で、又はポット、温室、若しくは田畑における土壌又は好適な培地中で生長され得る。植物中に導入されるリーダー、トレーラー、又は遺伝子配列の発現は、一時的又は永続的であり得る。「選択される植物種」は、限定されないが、これらの「植物」のうちのいずれか１つの種であり得る。
【００５４】
植物部分。本明細書で使用される場合、「植物部分」（又はジャガイモ植物若しくはその部分）という用語は、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌ずい、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
植物種。少なくとも多少の有性適合性を示す種々の公式に指名された植物種に属する植物の群。
【００５６】
植物形質転換及び細胞培養。それにより、植物細胞が、遺伝子学的に修飾され、維持、更なる生長、及び／又は更なる発育のために適切な植物培養培地に移入される過程を広範に指す。
【００５７】
精密育種。選択植物種から、又は選択植物と同じ種の別の植物から、又は選択植物種と受精可能な種から単離されるネイティブ遺伝子及び制御要素等の核酸の個々の植物細胞中への安定した導入、並びにこれらの遺伝子学的に修飾された植物細胞の全植物中への後続の再生による植物の改善を指す。未知の又は外来の核酸は、植物ゲノムに永続的に取り込まれないため、本発明の技術は、従来の植物育種を通しても入手可能である同じ遺伝物質を使用する。
【００５８】
子孫。本明細書で使用される場合、少なくとも１つの植物がジャガイモ品種Ｊ３を含み、子孫がこれらに限定されないが、反復親系統との後続のＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１０世代交配を含む２つのジャガイモ植物の交配から生成されるＦ１ジャガイモ植物を含む。
【００５９】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、通常、持続的に分配されるある程度数的に表現可能な形質を制御する遺伝子座を指す。
【００６０】
組換え。本明細書で使用される場合、それによって遺伝子がクローン化され得る、ＤＮＡが配列決定され得る、及びタンパク質生成物が生成され得る、種々の技術を広範に説明する。本明細書で使用される場合、本用語はまた、遺伝子の植物宿主系の細胞中への移入に続いて生成されたタンパク質も説明する。
【００６１】
再生。再生とは、組織培養物からの植物の発育を指す。
【００６２】
制御配列。対象とする遺伝子の転写若しくは植物系中で結果として得られるＲＮＡの翻訳を増加させる及び／又は最大化させるために発現ベクター中に含まれ得る、当業者にとって標準的であり、既知のそれらの配列を指す。これらには、プロモーター、ペプチド輸送シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、及び転写終結部位が挙げられるが、これらに限定されない。植物中の発現レベルを上昇させるために核酸構成物を修飾する方法もまた、一般的に当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３１〜３８，１９８５；Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２３  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６７：８１，１９９３を参照されたい）。タンパク質の転写の速度に影響するための植物系の改変において、正又は負に作用する配列、エンハンサー、及びサイレンサー等の制御配列、並びにクロマチン構造を含む当該技術分野で既知の種々の因子が、影響を与えることができる。本発明は、これらの因子のうちの少なくとも１つが、対象とするタンパク質を発現するための植物の改変において利用され得ることを定めている。本発明の制御配列は、ネイティブ遺伝要素である、すなわち、修飾される選択植物種から単離される。
【００６３】
選択可能なマーカー。「選択可能なマーカー」は、典型的には、抗生物質、除草剤、又は有毒化合物に対するある種の耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を特定するために使用される。選択可能なマーカーの例には、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−ホスフェートをフルクトース−６ホスフェートに変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子、カナマイシン及びジェネテシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ若しくはａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニルウレア系除草剤に対する耐性をコードするアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子、ホスフィノトリシン若しくはグルフォシネート（ｂａｓｔａ）等のグルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、又は当該技術分野で既知の他の同様の遺伝子が挙げられる。
【００６４】
センス抑制。トランスジェニック植物においてその遺伝子の全て又は部分の１つ又は２つ以上の追加のコピーの発現による内因性遺伝子の発現の低減。
【００６５】
比重。本明細書で使用される場合、「比重」とは、密度の表現であり、ジャガイモの品質の測定値である。塊茎の比重と乾燥物質又は全固形物のデンプン含有量及び割合との間には、高い相関性がある。より高い比重は、加工製品のより高い回収率及びより良い品質に寄与する。
【００６６】
Ｔ−ＤＮＡ−様。「Ｔ−ＤＮＡ−様」配列とは、選択植物種から、又は選択植物種と受精可能な植物から単離される核酸であり、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であるが、１００％ではないＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｔ−ＤＮＡとの配列同一性を共有する。Ｔ−ＤＮＡ−様配列は、それぞれがヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチドに組み込むことができる１つ又は２つ以上の境界又は境界様配列を含有し得る。
【００６７】
総収量。総収量とは、全ての収穫された塊茎の総重量を指す。
【００６８】
トレーラー。遺伝子に続く（又は３’から遺伝子）転写されるが、翻訳されない配列。
【００６９】
転写されるＤＮＡ。遺伝子並びにその遺伝子に関連付けられる未翻訳リーダー及びトレーラー配列の両方を含み、先行するプロモーターの作用によって単一ｍＲＮＡとして転写されるＤＮＡ。
【００７０】
植物細胞の形質転換。それによりＤＮＡが植物細胞のゲノムに安定して組み込まれる過程。「安定して」とは、永続的若しくは非一時的な、細胞ゲノムの及びそれによるポリヌクレオチドの保持及び／又は発現を指す。このため、安定して組み込まれるポリヌクレオチドは、形質転換された細胞ゲノム内の付属物であり、細胞又は結果として得られる形質転換植物の連続する子孫を通して複製及び増殖され得るものである。形質転換は、当該技術分野で周知の種々の方法を使用して、自然条件又は人工条件下で生じ得る。形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換プロトコル、ウイルス感染、ウィスカ、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処置、マイクロインジェクション、及び粒子衝撃を含む、核酸配列の原核又は真核宿主細胞中への挿入のための任意の既知の方法に依拠し得る。
【００７１】
導入遺伝子。タンパク質コード領域を含む宿主ゲノムに挿入される遺伝子。本発明に照らして、導入遺伝子を含む要素は、宿主ゲノムから単離される。
【００７２】
トランスジェニック植物。少なくとも１つの導入遺伝子を含有する遺伝子学的に修飾された植物。
【００７３】
変異形。本明細書で使用される場合、「変異形」とは、特定の遺伝子又はタンパク質の標準又は所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列から逸脱するヌクレオチド又はアミノ酸配列を意味すると理解される。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」、及び「類似体」という用語もまた、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の「変異形」形態を指す。１つ又は２つ以上のアミノ酸の付加、除去、若しくは置換、又はヌクレオチド配列の変化によって変更されたアミノ酸配列は、「変異形」配列と考えられ得る。変異形は、置換アミノ酸が、類似構造又は化学特性を有する「保存的」変化、例えば、イソロイシンでのロイシンの置換を有し得る。変異形は、「非保存的」変化、例えば、トリプトファンでのグリシンの置換を有し得る類似体の少数変形には、アミノ酸欠失若しくは挿入、又はその両方を含み得る。どのアミノ酸残基が置換、挿入、又は欠失され得るかの決定における誘導は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，ＭＤ）ソフトウェア等の当該技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して発見することができる。
【００７４】
蔓成熟。蔓成熟とは、炭水化物を用いて光合成を続けることができる植物の能力を指す。蔓成熟は、１＝死んだ蔓、及び５＝依然として花を咲かせる緑色の蔓の１〜５の尺度で評価される。
【００７５】
ジャガイモは、ヘテロ接合性の高い四倍体であり、近交弱勢の影響を受けやすいため、ジャガイモ植物のゲノムへの望ましい形質の挿入は、特定の困難を示す。ゆえに、従来の育種を使用する処理の間に、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロトリアミン（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７０：１０〜５，１９９５）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラール（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３８：８０１〜９，２０００）、及び突然変異誘発特性を有する他のメイラード反応生成物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３０４：３５９〜７６，１９８９）を含む、アクリルアミドがより少なく、より害の少ないメイラード反応生成物を生成するトランスジェニックジャガイモ植物を効率的に発育することは非常に困難である。
【００７６】
いくつかの方法が試され、過程の変更、ブドウ糖の低減、並びにアスパラギナーゼ、シトラート、及び競合アミノ酸等の添加物を介してアクリルアミドを低減するための研究が進行中である。ジャガイモ生産業全体にわたって過程変更を実施するために必要とされる資本支出は、数百万ドルかかるだろう。その支出に加えて、これらの過程変化は、アスパラギナーゼ又はシトラート等の添加物に関連付けられる潜在的な悪い風味を含む、著しい欠点を有する。典型的には、油揚げ食品製造業者は、所望の黄金色を生じさせるためにフライドポテトを加工する間にブドウ糖を添加するが、ブドウ糖もまた、メイラード反応を通してアクリルアミドの形成を増大させる。アクリルアミドの著しい低減は、その過程から単にブドウ糖を除くだけで起こるが、しかしながら、特徴的な黄金色は必要であり、いくつかの他の方法が開発されなければならない（アナトーのような色の添加を介する等）。代替の色の使用は、それらの褐変反応を通して発達される典型的な風味の欠如をもたらす。アスパラギンのような反応物質の低減するための添加物の使用による他の課題は、結果として生じるアスパラギンの表面への回帰及びアクリルアミドの増加を伴う冷凍貯蔵中に生じる水分移動である。最後に、ジャガイモが傷付いた後に生じる黒化は、フライドポテト及びチップスの加工における品質及び回収に影響する。損傷及び傷付いたジャガイモは、切り取られなければならないか、又は加工前に退けられ、品質課題又は経済的損失をもたらす。
【００７７】
本発明の「ネイティブ技術」戦略は、黒斑傷の原因となるポリフェノールオキシダーゼ−５（ＰＰＯ−５）の発現、アスパラギンの蓄積の原因となるアスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ−１）の発現、アクリルアミド形成の前駆体、並びに／又はアスパラギン等のアミノ酸と通常反応し、アクリルアミドを含む有毒メイラード生成物を形成する還元糖の蓄積に関連付けられる酵素であるホスホリラーゼ−Ｌ及びキナーゼ−Ｒ１の発現を低減することによって、ジャガイモの農学的特徴及び栄養価を改善するジャガイモ生産業の必要性に対処する。塊茎中でのこれらの遺伝子の部分的又は完全なサイレンシングは、アクリルアミドを生成する潜在性を減少させる。本発明のネイティブ技術の使用は、任意の外来遺伝物質を植物のゲノムに組み込まずに、非コード制御領域のみを含有するジャガイモ植物又はジャガイモ植物と受精可能な植物から得られる遺伝物質である「ネイティブ」遺伝物質のみを用いてジャガイモを形質転換することによって、商業的に価値のあるジャガイモ植物変種のゲノムへの望ましい形質の取り込みを可能にする。望ましい形質には、結果として生じるアクリルアミドを含む有毒メイラード生成物の蓄積の減少、品質及び食品色制御の改善を伴う、衝撃誘発黒斑傷に対する高い抵抗性、アクリルアミド前駆体アスパラギンの形成の低減、及び還元糖の蓄積の低減が挙げられる。ジャガイモは、ヘテロ接合性の高い四倍体であり、近交弱勢の影響を受けやすいため、既存のジャガイモ変種中へのこれらの望ましい形質の取り込みを、従来の育種を通して実現するのは不可能である。
【００７８】
本発明において使用される非コードジャガイモ植物ＤＮＡインサート配列は、ジャガイモ植物ゲノムにネイティブであり、いかなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡも含有しない。ＤＮＡインサートは、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクター中に挿入される。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆位反復として配置されるアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に、塊茎中で活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターを発現停止させることである。このカセットは、第１のカセットとして同じＡｇｐ及びＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結される、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から構成される。これらの発現カセットは、外来ＤＮＡを含有せず、選択植物種又は選択植物種と受精可能な植物のいずれかからのＤＮＡのみからなる。
【００７９】
本発明で使用される商業的に価値のあるジャガイモ植物変種は、Ａｔｌａｎｔｉｃである。Ａｔｌａｎｔｉｃ植物は、適度に大きく、太い直立茎を有し、若干膨らんでおり、軟毛のある節がまばらにある。葉は明るく、中間緑色、滑らかで、適度の軟毛があり、突き出た羽、大きく非対称の一次小葉、並びに多数の二次及び三次小葉を有する。花は多量で、緑色の千枚通しのような形状の軟毛で覆われた萼裂片、淡いラベンダー色の花冠、オレンジ色の葯、及び豊富で生育可能な花粉を有する。Ａｔｌａｎｔｉｃ品種は、腐敗病及びＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ枯れ病に抵抗性があり、ピンクアイ（ｐｉｎｋｅｙｅ）への耐性を示し、レースＡのジャガイモシストセンチュウ、ウイルス、塊茎網状壊疸、及び黒斑傷への高い耐性を示す。Ａｔｌａｎｔｉｃの塊茎は、特に温暖な乾燥時期の砂質土壌において、内部熱壊死に罹患しやすい。直径の大きい塊茎（０．８３ｍｍ超）における空洞病は、一部の生長地域において重篤になり得る。塊茎は、楕円から丸形であり、軽〜重度に鱗状で覆われた網状の皮、適度に浅い芽、及び白色の果肉を有し、塊茎休眠は、中程度の長さである。高収量潜在性、高い比重、並びに均一な塊茎の大きさ及び形状のため、Ａｔｌａｎｔｉｃは、田畑からの、又は非常に短期間の貯蔵からの、チップス製造に標準的な変種である（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）。この変種は、繁殖力が高く、特にチップスの製造のために、主に北東及び南東で育てられる。
【００８０】
本発明は、マーカーではなくむしろポリメラーゼ連鎖反応を用いて特定される形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８で形質転換され、上手く増殖される、著しい市場価値を持つジャガイモ変種、即ち、Ａｔｌａｎｔｉｃを提供する。本発明のジャガイモ植物変種Ｊ３の塊茎から作製される食品製品も提供される。ジャガイモ品種Ｊ３は、Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＯＥＣＤ）による次の固有の植物変種識別子を有する：ＳＰＳ−φφφＪ３−４。
【００８１】
ネイティブＤＮＡによる標的とされる遺伝子サイレンシングは、ジャガイモ植物変種Ｊ３の塊茎中の標的遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを低減させる。Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子サイレンシングは、デンプン関連遺伝子キナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）を更に阻害することなく、アクリルアミド形成を２〜４倍著しく低減させるのに十分である。このため、本発明の遺伝子内ジャガイモ植物変種Ｊ３の塊茎は、油揚又は焼成時のアクリルアミド形成の低減に関連付けられる遊離アミドアミノ酸アスパラギン及びグルタミンの割合の低減を含む、非常に望ましい形質を取り込む。具体的には、本発明のジャガイモ変種Ｊ３は、遊離アスパラギン含有の２〜４倍を超える低減によって特徴付けられる。更に、本発明のジャガイモ変種Ｊ３は、貯蔵中の還元糖グルコース及びフルクトースへのデンプンの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換の障害は、甘味のセネッセンス及びアクリルアミド形成を更に低減させ、熱誘導褐変を制限する。
【００８２】
したがって、本発明のジャガイモ変種Ｊ３は、その塊茎が、加熱加工時に著しく少ないアクリルアミドを生成し、いかなる潜在的に害のある外来遺伝子も担持しないため、ジャガイモ生産業及び食品市場において極めて有益である。
【実施例】
【００８３】
本発明は、ネイティブ技術を使用して、ネイティブ非コードＤＮＡを選択されるジャガイモ植物変種のゲノムに組み込み、新たな遺伝子内ジャガイモ植物変種を開発する。本方法は、形質特定、ベクターの設計、ベクターのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの取り込み、受容するジャガイモ変種の選択、植物形質転換、オープンリーディングフレームの欠如の証明、及び新たなジャガイモ植物変種がネイティブＤＮＡのみを含有することの確認を含む。本発明のジャガイモ品種Ｊ３は、その形質転換されていない相対物よりも低いアクリルアミドを形成する潜在性及びより少ない量のスクロースを含む。
【００８４】
実施例１．ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター
本発明で使用される形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８は、０．４ｋｂのジャガイモ植物ＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５６６５５５として寄託される）をｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の５．９ｋｂのＳａｃＩＩ−ＳｐｈＩ断片で結紮し、プラスミドｐＶＳ１及びｐＢＲ３２２からの複製の細菌起源並びにカナマイシンに対する細菌耐性のためのｎｐｔＩＩＩ遺伝子を担持することによって創出されたｐＳＩＭ１０６に由来した。Ｕｂｉ−３プロモーター（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｂｅｌｋｎａｐ，１９９４）が先行し、Ｕｂｉ−３ターミネーターが続くＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｐｔ遺伝子を含む発現カセットを２．６ｋｂのＳａｃＩＩ断片としてベクター骨格に導入した（Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｐＳＩＭ１０６のＤＮＡインサートへの２つのサイレンシングカセットを担持する１０ｋｂのネイティブＤＮＡセグメントの挿入は、ｐＳＩＭ１２７８を産生した。このベクターを全ての形質転換に使用した。ｐＳＩＭ１２７８ベクターマップを図１に示す。ベクター骨格領域は、９，９５７ｂｐ位置で開始し、１９，４６８ｂｐ位置で終了する９，５１１ｂｐである。骨格ＤＮＡは、主に細菌ＤＮＡで構成され、植物形質転換前のＤＮＡインサートの維持の支持を提供する。骨格位置は、植物細胞中に移入されない。骨格の種々の要素が、表１に記載される。
【００８５】
【表１】
2016518139.tif 000003
【００８６】
実施例２．植物ＤＮＡインサート及びそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
ｐＳＩＭ１２７８で使用されるフランキング境界配列を含むＤＮＡ挿入領域は、１９，４６９ｂｐ〜１９，６６０ｂｐ及び１ｂｐ〜９，９５６ｂｐの１０，１４７ｂｐ長である。ＤＮＡインサートは、ネイティブＤＮＡのみから構成され、ジャガイモゲノムに安定して組み込まれる。ＤＮＡインサート又はその機能部分は、本発明のジャガイモ植物変種に組み込まれるベクターｐＳＩＭ１２７８の遺伝物質のみである。ＤＮＡインサートが、図２及び以下の表２に記載される。
【００８７】
【表２】
2016518139.tif 000004
【００８８】
表２に記載される本発明のジャガイモ系統Ｊ３を創出するために使用されたＤＮＡインサートは、隣接する遺伝子を活性化させず、ジャガイモ植物変種Ｊ３の表現型に悪影響を与えない。加えて、本発明のジャガイモ植物変種Ｊ３は、ＤＮＡインサートでコードされるオープンリーディングフレームに関連付けられる新規のタンパク質を生成しない。
【００８９】
実施例３．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株及びトランスフェクション
過剰毒性プラスミドｐＴｉＢｏ５４２の移入ＤＮＡを正確に欠失することにより、Ｃ５８由来Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＡＧＬ１を発達させた（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。普遍的組換え遺伝子（ｒｅｃＡ）へのトランスポゾン挿入は、ｐＳＩＭ１２７８（図１）等の組換えプラスミドベクターを安定させる。ＡＧＬ１は、カルベニシリン及びリファンピシンに対する耐性を示し、形質転換されたジャガイモ組織からチメンチンを使用して排除される。
【００９０】
３％スクロースを含有する４０ｍｌの強度が半分のＭ５１６培地及び２ｇ／ｌゲルライト（繁殖培地）を入れたマゼンタボックス内でＡｔｌａｎｔｉｃ変種の母株を維持した。ｐＳＩＭ１２７８を担持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＡＧＬ１菌株に感染した４週齢の植物から４〜６ｍｍのジャガイモ節間区分セグメントを切り取り、３％スクロース及び６ｇ／ｌ寒天を含有する組織培養培地（共培養培地）に移動した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを排除するために、感染した外植片を２日後に３％スクロース、６ｇ／ｌ寒天、及び１５０ｍｇ／ｌチメンチンを含有するＭ４０４培地に移動した（ホルモンを含まない培地）。本方法の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に記載される。
【００９１】
１カ月後、感染した外植片をいかなる合成ホルモンも含まない新鮮培地に移動し、それらが苗条を形成し始める２４℃で１６時間の光周期の下で、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生長チャンバでインキュベートした。多くの苗条は、ｉｐｔ遺伝子を発現し、サイトカイニン過剰生産表現型を示した。これらの苗条は、更なる分析は考慮されなかった。ＰＣＲ遺伝子型決定は、残りの苗条の約０．３〜１．５％が、ｉｐｔ遺伝子を欠く一方、Ｐ−ＤＮＡの少なくとも部分を含有したことを実証した。このため、形質転換植物を選択するためにマーカーを使用しなかった。ｉｐｔベースのマーカーを含まない植物形質転換の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）によって公開された。
【００９２】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを排除する過程は、外植片感染の２日後に開始した。この目的のために、生存しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まないことが証明されるまで、組織を抗生物質チメンチン（１５０ｍｇ／Ｌ）に供した。２８℃で２週間、栄養ブロス−酵母抽出物（ＮＢＹ培地）上で形質転換された事象の茎断片をインキュベートすることによって、証拠を得た（２回繰り返される）。９７  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ３４０に従って、形質転換植物を輸送し、生存しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まない場合のみ、田畑に植栽した。
【００９３】
ジャガイモ植物変種Ｊ３をＤＮＡゲルブロット分析によって分析し、組み込まれたＤＮＡインサート配列の構造及びコピー数を決定し、ベクター骨格配列の欠如を確認した。加えて、分子の特徴付けを使用して、ＤＮＡインサートをフランキングする接合点の配列を決定し、挿入されるＤＮＡの安定性を示した。接合点の配列決定情報は、遺伝子内ジャガイモ植物変種Ｊ３の特定のＰＣＲ試験を発展するための基礎を提供した。種々のＤＮＡ分解産物をＡＧＰ、ＡＳＮ、ＰＨＬ、及びＧＢＳ分子プローブでハイブリダイズしたときのハイブリダイゼーション結果から推定されるように、ジャガイモ品種Ｊ３が、ＬＢ領域及び隣接するＡＧＰプロモーターの部分の欠失を有する左境界側で逆向きに接続された、１つのほぼ無傷のＤＮＡインサート及びＤＮＡインサートの１つの部分的コピーを含有することが分かった。
【００９４】
実施例４．ベクター骨格ＤＮＡの欠如の証明
多くの商業用のトランスジェニック作物とは異なり、本発明のジャガイモ品種Ｊ３は、ベクター骨格ＤＮＡ等の形質転換に使用されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＤＮＡ配列を含まないことが、３つの異なる方法によって確認された。１）まず、ｉｐｔ遺伝子発現カセットを含む骨格ＤＮＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物細胞への意図しない移入が、ｉｐｔ遺伝子発現、及び結果として、サイトカイニン型ホルモンイソペンテニルアデノシンの形成を誘起し得るため、ベクター骨格中の負に選択可能なイソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子の存在又は不在を確認した、２）次いで、第１のスクリーニング方法を通過した形質転換されるジャガイモ植物にサザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、骨格ＤＮＡの欠如を確認した、３）次いで、ＤＮＡインサート境界領域とフランキング骨格ＤＮＡ又はＤＮＡインサートをフランキングする骨格ＤＮＡ内の領域との間の接合点を示す断片を増幅するためのＰＣＲを設計した。ｐＳＩＭ１２７８ＤＮＡを陽性対照として使用することによって、この方法の有効性を確認した。本発明のジャガイモ品種Ｊ３は、ベクター骨格ＤＮＡの存在を示すＰＣＲバンドを生成しなかった。
【００９５】
実施例５．挿入されるＤＮＡの安定性
ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション及び形質評定の両方を使用して、起源となる形質転換体において、及び再び、増殖された植物材料において、ＤＮＡインサートの安定性を評定した。遺伝子内事象が取り込まれる形質を一貫した確かな挙動で発現したことを確実にするために、これらの研究を行った。不安定性は、稀な組換え事象によって誘起され得るか、又はメチル化によっても引き起こされ得る。ジャガイモは通常、クローン的に増殖するため、有性的に増殖する作物に対する標準的な評価は直接適用できず、種子よりもむしろ塊茎を使用して、後続の世代を定義した。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションの結果は、一貫したバンドが複数の世代において存在したことを示し、このため、安定性を実証する。１つ及び２つの塊茎種子の世代における形質の有効性を確認することによって、安定性に関する更なる証明を得た。
【００９６】
インビトロで増殖され、一度も土壌に植栽されていない植物の葉からＤＮＡを抽出し、評定することによって、最初に形質転換された材料（Ｇ０）におけるＤＮＡインサートの安定性を実証した。世代−１（Ｇ１）分析のため、各遺伝子内の変種からの２つの増殖される植物及び各対照からの１つの植物を温室に植栽した。各植物から収穫された塊茎のうちの１つを植栽し、Ｇ１植物からの葉を得て、ＤＮＡを単離し、Ｇ１世代を評定するために使用した。この世代からの塊茎を再び植栽し、結果として得られるＧ２植物の葉によってその世代の特徴付けをした。
【００９７】
ＧＢＳプローブを用いた、本発明のＡｔｌａｎｔｉｃジャガイモ品種Ｊ３から単離されるＤＮＡのハイブリダイゼーションは、全てのラインにおいて、３つの共通バンド（８．６、７．８、及び７．１ｋｂ）を明らかにし、ＡＧＰプローブを用いたハイブリダイゼーションは、４つのバンド（７．２、５．０、２．０、及び１．４ｋｂ）を明らかにした。これらのバンドは、非修飾ゲノムのＤＮＡ断片を示す。１つが内部ＤＮＡインサート断片を示す２．２ｋｂバンドであり、他の２つはＤＮＡインサート接合点断片を表す（ＧＢＳによる５．９及び約１３ｋｂ並びにＡＧＰによる１．６及び５．７ｋｂ）全ての遺伝子内材料から単離されるＤＮＡにおける３つの追加のバンドの存在は、最初の形質転換体（Ｇ０）のインサートが、第１及び第２の植物世代Ｇ１及びＧ２中で安定して残存したことを示した。
【００９８】
形質転換されていないＡｔｌａｎｔｉｃ変種の切断塊茎表面は、カテコールに曝露されると褐色沈殿を発達しないため、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｇ２−塊茎は、カテコールアッセイを使用してＰｐｏ活性に対して検定されなかった。形質転換されていないＡｔｌａｎｔｉｃジャガイモは、ポリフェノールの酸化に触媒作用を及ぼす酵素を生成しないことが可能である。代わりに、ＰＣＲ分析によって挿入されるＤＮＡの安定性を確認し、Ｊ３塊茎が、Ａｓｎ１／Ｐｐｏ５遺伝子の一部である増幅された０．８ｋｂ生成物を含有し、Ｇ２塊茎において不安定性を表さなかったことを実証した。
【００９９】
実施例６．接合点分析及び変種特異的検出
少なくとも１つのＤＮＡインサート／フランキング植物ＤＮＡ接合点をＡｄａｐｔｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ又はＴｈｅｒｍａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲのいずれかを使用して配列決定した。接合点配列を使用して、ジャガイモ品種Ｊ３のプライマーを設計し、これらのプライマーを変種特異的ＰＣＲベースの検出方法に適用した。プライマーを使用して、４６４ｋｂのＪ３特異的ＤＮＡ断片を増幅することができ、変種Ｊ３に対する系統特異的試験方法をもたらす。開発された方法を使用して、田畑及び貯蔵庫の植物及び塊茎を監視し、塊茎又は加工食品中の遺伝子内物質の欠如を確認し、有機種子の純度を保証した。
【０１００】
実施例７．遺伝子サイレンシングの有効性及び組織特異性
遺伝子サイレンシング方法を用いて、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、及びＲ１ネイティブタンパク質の活性を低下させ、タンパク質量ではなくむしろ転写レベルを評定し、分子レベルで変化する新たな表現型形質と結び付けた。
【０１０１】
葉及び茎におけるＡＳＮ（アスパラギン）形成に関与するＡｓｎ１遺伝子の強いサイレンシングは生長に悪影響を与え得るため、塊茎特異的及び匍匐枝特異的プロモーターであり、光合成的に活性の組織及び根においてはるかに不活性であるＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターを使用して、塊茎及び匍匐枝における遺伝子サイレンシングを推進した。植物変種Ｊ３の種々の組織における４つの標的遺伝子及びその形質転換されていない相対物の転写レベルを、ノーザンブロット分析によって決定した。
【０１０２】
形質転換されていない対照の塊茎において、Ａｓｎ１、ＰｈＬ、及びＲ１遺伝子に対する転写レベルは、「高く」（ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって容易に検出可能）、Ｐｐｏ５遺伝子に対しては「低かった」。ノーザンブロットの比較は、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、及びＰｈＬが、温室及び田畑からの塊茎中で同様のレベルで発現されたことを示した。対照的に、Ｒ１遺伝子は、田畑からの塊茎よりも、温室で生長した対照塊茎において若干より効果的に発現停止された。
【０１０３】
変種Ｊ３の塊茎中のＡｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の強力に低下された転写レベルは、低アクリルアミド潜在性に関連付けられた。
【０１０４】
ＰｈＬ遺伝子の転写レベルは、系統Ｊ３の塊茎中で部分的に低減された。この変化は、グルコース及びフルクトースの量の低減に結び付けられた。Ｒ１転写物は、Ｊ３の塊茎中で部分的に低減され（「囁かれ（ｗｈｉｓｐｅｒｅｄ）」）、デンプンの糖への分解を制限することを補助した。
【０１０５】
Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、及びＲ１遺伝子は、形質転換されていない植物の匍匐枝中で低レベルで発現された。対照的に、対照における高い転写レベルが、ＰｈＬ遺伝子に関連付けられた。ＰｈＬ遺伝子の発現はまた、遺伝子内変種Ｊ３の匍匐枝中で下方制御された。
【０１０６】
Ｒ１遺伝子の転写物の量は、変種Ｊ３の匍匐枝中で若干低減された（「囁かれた（ｗｈｉｓｐｅｒｅｄ）」）。この分子変化は、デンプンの糖への分解の制限に寄与した。
【０１０７】
葉組織において、Ａｓｎ１遺伝子の転写レベルは、系統Ｊ３及びその形質転換されていない相対物と同様であった。Ｐｐｏ５遺伝子発現の転写レベルは、全てのケースにおいて検出不可能であった一方、ＰｈＬ遺伝子のレベルは、起源となる変種Ａｔｌａｎｔｉｃ及び形質転換された誘導体Ｊ３の間で一貫して高かった。Ｒ１遺伝子の転写レベルは、変種Ｊ３において、その対照と比較して変化しなかった。
【０１０８】
茎組織では、Ａｓｎ１遺伝子の転写レベルは、事象Ｊ３及びその対照と同様であった。Ｐｐｏ５遺伝子の転写レベルは、本発明の変種Ｊ３において低減された。ＰｈＬ遺伝子発現は、系統Ｊ３及びその対照において酷似しており、Ｒ１遺伝子発現は、低減されなかった。
【０１０９】
根組織では、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の両方の転写レベルが、変種Ｊ３において低減された。これらの結果は、サイレンシングを推進するために使用されたプロモーターが、地下組織において部分的に機能的であることを示した。
【０１１０】
花の組織では、Ａｓｎ１遺伝子の転写レベルは、最初の変種Ａｔｌａｎｔｉｃよりも本発明の変種Ｊ３において低かった。転写物は、Ｐｐｏ５遺伝子に関して、検出可能ではなく、ＰｈＬ及びＲ１遺伝子の発現レベルは、対照と同様であった。
【０１１１】
これらの結果は、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の発現レベルが、ジャガイモ変種Ｊ３の塊茎及び匍匐枝中で下方制御されたこと、並びにＲ１及びＰｈＬ遺伝子が、変種Ｊ３の塊茎及び匍匐枝において少なくとも部分的に発現停止されたことを実証する。サイレンシングは、塊茎及び匍匐枝において最も有効であった。
【０１１２】
選択されるジャガイモ変種Ｊ３は、Ｒ１及びＰｈＬ遺伝子のものよりも、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の発現レベルにおいて、より強く影響された。これらの結果は、（１）Ｐｐｏタンパク質の形成及び遊離ＡＳＮが、より広い範囲に広がる可能性を防ぐこと、並びに（２）デンプンのグルコース及びフルクトースへの変換を部分的にのみ遮断することという発明者らの意図と一致した。
【０１１３】
塊茎及び匍匐枝以外の組織の転写レベルで偶発的に生じる変化は、塊茎／匍匐枝特異的プロモーターの一部の漏出を実証した。サイレンシングカセットの発現を通して塊茎中で生成される小さいＲＮＡは、他の組織、特に根及び茎に移動することが可能である（Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。塊茎及び匍匐枝以外の組織で変化した発現レベルの最も多いケースにおいて、その差は軽微である。遺伝子内ジャガイモ品種Ｊ３の特定の組織において下方制御された転写レベルの要約を表３に示す。表３において、Ａ＝Ａｓｎ１、Ｐ＝Ｐｐｏ５、Ｌ＝ＰｈＬ、及びＲ＝Ｒ１である。表３の下線文字は、下方制御された遺伝子の発現レベルを示す。
【０１１４】
【表３】
2016518139.tif 000005
【０１１５】
実施例８．田畑性能及び塊茎評定
収穫を容易にし、遺伝子内ジャガイモが非修飾物質から分離して保たれることを確実にするために、２００９、２０１０、及び２０１１試験物を機械的に植栽した。２００９評定のため、各事象及び対照変種からの「核種子」小塊茎（ｍｉｎｉｔｕｂｅｒ）を使用して、４又は５つの単列プロット（２０個の小塊茎／プロット）を植栽し、それにより、プロットが田畑を横断してブロック内に無作為に分配された。無作為完全ブロック設計（ＲＣＢ）は、新たなジャガイモ変種及び事象の評定において典型的である。２０１０及び２０１１においてこの手法を用いて、１事象当たり３つの無作為プロット及び１部位当たり１つの対照を使用し、ブロックの数と同一の数又は複製（１事象当たりのプロット）を用いたＲＣＢ設計も同様に使用した。２０１０の各プロットは、各々が、２００９年にＡｔｌａｎｔｉｃのためにＣｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＮＥで生産された「核種子」小塊茎からの２０個の種子片の３列で構成された。２０１１試験物のためのＡｔｌａｎｔｉｃ種子は、２０１０年にＣｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＮＥで生産された第１世代（Ｇ１）であった。全ての試験物において、遺伝子内系統の種子は、その非修飾対照と同様に処理された。田畑で生長した塊茎は、より高い塊茎収量及び品質を生産するより丈夫で均一な植物を生成するため、種子として小塊茎よりも望ましい。
【０１１６】
人工的に誘発されなかったが、生長時期に自然発生的に生じ得る昆虫、疾病、及び環境ストレスへの反応差に関して、いくつかのケースでは標準化監視尺度を使用して、各プロットを定性的に評定した。早期列閉鎖及び開花（４月に評定されたフロリダ試験物を除く、ほとんどの試験物に関して６〜７月）の直前又はその間に２００９、２０１０、及び２０１１の時期半ばの監視を行い、植物活力、葉の色、葉の大きさ、葉の曲がり具合、疾病症状（存在／不在）、及び昆虫に関連する植物損傷を評価した。２０１１において、生長領域に一般的な特定の昆虫、疾病、及び非生物的ストレス要因を評定した。疾病及び昆虫圧力は、一般的に、中期及び後期に最も高くなるが、７月〜９月（フロリダ試験物に関しては３月〜５月）に病原体及び昆虫によって引き起こされる症状に関して、植物を監視した。蔓の成熟及び疾病の後期監視を、塊茎の成熟及び後期皮成形を確実にするために意図される過程である蔓処理の前に、一度実施した。蔓処理は、蔓の刈り取り若しくは殻竿打ちによって、又は製造業者の推奨に従ってＲｅｇｌｏｎｅ（ＪＲ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅ，ＭＮ）等の認可された除草剤を使用して誘導される。この時点で、疾病症状及び昆虫被害に対して同様に植物を評価した。疾病症状が特定されたいくつかのケースでは、その発見を確認するために発芽試験も行った。
【０１１７】
平均、標準偏差、及び９０％信頼区間を、ＪＭＰ  ９．０．２を使用して計算した。本実験に含まれる全ての従来の変種の最小及び最大平均値（年×場所×項目）を得ることによって、従来の変種範囲を生成した。複数の年及び場所からのデータを組み合わせることによってＪＭＰ  ９．０．２において、Ａｔｌａｎｔｉｃ変種に対する全ての特徴を分析した。
【０１１８】
実施例９．ジャガイモ品種Ｊ３特徴付け概要
ジャガイモ変種Ｊ３は、反応物質、即ちアスパラギン及び還元糖の濃度を低下させることを通してアクリルアミドを低減させることによって、ジャガイモ生産業の品質を改善することの必要性に対処する。ジャガイモ植物ゲノムにネイティブであり、外来ＤＮＡ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ、ウイルス性マーカー、又はベクター骨格配列を含有しない核酸配列でジャガイモ変種Ｊ３を形質転換した。加えて、本事象が、その形質に関連付けられる特徴を除いて従来の対照と同じものを生長したことを確実にするために、農学的研究を行った。
【０１１９】
農学的特徴
２００９、２０１０、及び２０１１において生長したジャガイモ変種Ｊ３事象及び対照の農学的特徴の評定を表４〜７に示す。可能な統計的方法で結果を分析した。全体として、データは、Ａｔｌａｎｔｉｃ対照とＪ３  Ａｔｌａｎｔｉｃ事象との間に大きな差がないことを示唆する。
【０１２０】
表４は、変種Ｊ３に関して試験された各特徴の部位年数を示す。Ｊ３及びＡｔｌａｎｔｉｃ対照に関する農学的特徴を表５に示す。５つの農学的特徴に関してＪ３と対照との間に統計的に有意な差は検出されなかった。小葉の曲がり具合に関して、Ｊ３の平均値は対照と同じであり、Ｊ３の観測値は組み合わせた従来の変種範囲の外であったため、小葉の曲がり具合及び蔓成熟速度のデータは、統計的に比較することができなかった（それぞれ、２．８９対３．００〜３．５０）。植物１つ当たりの茎（３．４２対３．１４）及びセネッセンス（５２．３７対４７．３７）に関して、Ｊ３と対照との間に統計的に有意な差を検出したが、しかしながら、Ｊ３の値は、両方のケースに関して従来の変種範囲内であった。表５では、植物１つ当たりの茎及び最終出芽データは２０１１のみからであり、従来の変種（ＣｏｎＶ）範囲は、従来のＲａｎｇｅｒ、Ｂｕｒｂａｎｋ、及びＡｔｌａｎｔｉｃ変種の平均値の範囲と同じであり、ＮＡは、統計的比較が可能でなかったことを意味する。
【０１２１】
Ｊ３及びＡｔｌａｎｔｉｃ対照の収量及び粒度特徴を表６に示す。総収量、Ａ等級％、摘出％、又は総内部欠陥に対して検出された統計的に有意な差は存在しなかった。Ｂ等級％に関して統計分析は可能でなかったが、Ｊ３の平均は、従来の変種範囲内であった。米国１番（それぞれ、８４．７対８７．１）、サイズ超過％（５．４対８．３）、及び比重（１．０９４対１．０９２）に関して、Ｊ３と対照との間に３つの統計的に有意な差を検出した。これらの差に対するＪ３の全ての値は、従来の変種範囲内であった。表６では、従来の変種（ＣｏｎＶ）範囲は、従来のＲａｎｇｅｒ、Ｂｕｒｂａｎｋ、及びＡｔｌａｎｔｉｃ変種の平均値の範囲と同じであり、ＮＡは、統計的比較が可能でなかったことを意味する。
【０１２２】
Ｊ３及びＡｔｌａｎｔｉｃ対照の花の色を表７に示す。各項目に対する異なるプロットにおいて紫及び混合された花の色を観察した。
【０１２３】
【表４】
2016518139.tif 000006
【０１２４】
【表５】
2016518139.tif 000007
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【表７】
2016518139.tif 000009
【０１２７】
ジャガイモ品種Ｊ３に関する表４〜７に呈されるデータに基づき、形質転換されていないＡｔｌａｎｔｉｃ変種とジャガイモ品種Ｊ３との間に農学的特徴、花の色、収量、及び粒度、及び生態学的相互作用に大きな差はないことが結論付けられ得る。したがって、複数年のデータに基づき、Ａｔｌａｎｔｉｃ変種Ｊ３は、雑草性又は植物虫害潜在性の結果として、環境において持続的な著しい危険性をもたらさない。
【０１２８】
アスパラギン及びアクリルアミドレベル
アスパラギンシンテターゼ遺伝子のサイレンシングは、ジャガイモ変種Ｊ３において遊離アスパラギンの平均７７％の低減をもたらした。メイラード反応において還元糖と化合し、アクリルアミドを形成するアスパラギンの最も低いレベルは、油揚処理において平均６７％のアクリルアミドの低減をもたらす。Ａｔｌａｎｔｉｃ対照とジャガイモＪ３との間のアスパラギン及びアクリルアミドにおける差異は、表８に示される。アクリルアミドを試験する前に、対照及びＪ３をフライドポテトに加工した。全ての結果は、収穫時近くで分析された塊茎からのものである。
【０１２９】
【表８】
2016518139.tif 000010
【０１３０】
ジャガイモ品種Ｊ３は、低減されたアクリルアミドレベルを有する改善した品質のＡｔｌａｎｔｉｃ変種である。
【０１３１】
本発明の更なる実施形態
上述した有利な特徴と結び付くジャガイモ変種をもたらす研究は、大部分が実験に基づく。本研究は、時間、労力、及び費用の大きな投資を必要とする。ジャガイモ品種の発育は、温室から商用利用までに、多くの場合、最大８年以上かかることがある。育種は、最も重要な特徴を子孫に取り込むために、優れた親の慎重な選択から開始する。全ての所望の形質が、通常、ただ１つの交配では現れないため、育種は、累積的でなければならない。
【０１３２】
存在する育種技法では、親のクローンの制御された授粉を続ける。典型的には、花粉は、雌親の授粉において後で使用するためにゼラチンカプセル中に採取される。ハイブリッド種子が温室に播種され、塊茎が収穫され、何千もの個別の実生苗から留められる。各々の結果として得られる実生苗からの翌１〜４年の塊茎を、ウイルス及び疾病の蔓延を回避するための細心の注意が払われる田畑に植栽する。この１年目の実生苗作物から、選択過程を生き残った各ハイブリッド個体からのいくつかの「種子」塊茎が、翌年の植栽に保たれる。２年目以降、塊茎の商用利用に対する適合性を決定するための密度測定及び油揚試験のために、試料が採取される。油揚試験及び密度決定のより包括的な組のため、次いで、この時点まで選択過程を生き残った植物を、より拡張した量で３年目に植栽する。発育の４年目段階では、いくつかの状態で生存選択を田畑試験物に供し、異なる生長条件へのそれらの順応性を決定する。最終的に、優れた品質を有する変種が他の農場に移され、種子は商用規模に増大される。一般的に、この時までに、新たな改善されたジャガイモ品種の発育を試みて、植栽、収穫、及び試験に８年以上が費やされた。
【０１３３】
特定のタンパク質生成物をコードする遺伝子の単離及び特徴付けを可能にした分子生物学的技法の出現により、植物生物学の分野の科学者らは、特定の様式で植物の形質を変えるために、外来遺伝子、又はネイティブの又は内因性の遺伝子（恐らく異なるプロモーターによって駆動される）の追加の若しくは修飾されたバージョンを含有し、発現するための植物のゲノムの改変に強い関心を持った。そのような外来の追加の及び／又は修飾される遺伝子は、本明細書において、集合的に「導入遺伝子」と称される。ここ１５〜２０年にわたって、トランスジェニック植物を生産するためのいくつかの方法が開発され、本発明、具体的には実施形態もまた、特許請求される変種又は系統の形質転換されるバージョンに関する。
【０１３４】
植物形質転換は、植物細胞において機能するだろう発現ベクターの構造に関与する。そのようなベクターは、制御要素（例えば、プロモーター）の制御下の、又はそれに作動的に連結される遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つ又は２つ以上のそのような作動可能に連結される遺伝子／制御要素の組み合わせを含有し得る。ベクター（複数可）は、プラスミドの形態であってもよく、単独で又は他のプラスミドと組み合わせて使用し、導入遺伝子をジャガイモ植物（複数可）の遺伝物質中に取り込むための以下に記載される形質転換方法を使用して、形質転換されるジャガイモ植物を提供することができる。
【０１３５】
伝統的な植物育種は、典型的には、新たな改善された特徴を有する変種を創出するための植物染色体の無作為組換えに依拠する。標準的な周知の技法に従って、遺伝子及び制御要素を含む遺伝子「発現カセット」がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離された移入ＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の境界内に挿入され、植物ゲノムに組み込まれる。Ｔ−ＤＮＡ物質のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性移入は、典型的には、以下の標準的な手順を含む：（１）形質転換の選択のための発現カセットを生成するための、そのうちの少なくとも１つが外来起源のものである遺伝要素のインビトロ組換え、（２）しばしば、外来ＤＮＡを含有する少なくとも１つの他の発現カセットと一緒になって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によってフランキングされたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡの数百の塩基対から通常構成されるバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域へのこの発現カセットの挿入、（３）追加のバイナリーベクター配列のいくつか又は全てをしばしば伴う、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ境界間に位置する配列の移入、並びに（４）収量の増加、改善された活力、疾病及び昆虫に対する耐性の強化、又はストレス化でのより優れた生存能力等の所望の形質を表す安定して形質転換される植物細胞の選択。
【０１３６】
このため、遺伝子改変方法は、プロモーター及びターミネーター等の制御要素並びにウイルス、細菌、及び植物からの形質転換体の特定及び選択のためのマーカーとしての新たな形質又は機能の発現に関与する遺伝子を含む、外来の、非在来核酸の導入に依拠する。マーカー遺伝子は、典型的には、細菌源に由来し、抗生物質又は除草剤耐性を付与する。古典的な育種方法は、多くの労力を要し、時間がかかり、また新たな変種は、典型的には、比較的小規模な改善しか示さない。
【０１３７】
「アンチセンス」技術では、ネイティブ遺伝子の配列は、トランスジェニック植物における遺伝子の発現を発現停止させるように逆にされる。しかしながら、その逆ＤＮＡは、通常、それらが植物発育を妨げるか、及び／又はそれらの栄養価を低減させるため、望ましくない場合がある外来アミノ酸配列をコードする、プロモーターとターミネーターとの間に挿入される新たな、特徴付けされていないオープンリーディングフレームを含有する。
【０１３８】
ジャガイモ形質転換の発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、制御要素（例えば、プロモーター）作動可能に連結される少なくとも１つの遺伝子マーカーを含み、そのマーカーを含有する形質転換細胞が、負の選択、即ち、選択可能なマーカー遺伝子を含有しない細胞の成長の阻害、又は正の選択、即ち、その遺伝子マーカーによってコードされる生成物に対するスクリーニングのいずれかによって回収されることを可能にする。植物形質転換に対して多くの一般的に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換分野において周知であり、例えば、抗生物質若しくは除草剤であり得る選択的化学剤を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に対して非感受性である変化した標的をコードする遺伝子を含む。少数の正の選択方法もまた、当該技術分野で既知である。
【０１３９】
植物形質転換対して１つの一般的に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、植物制御シグナルの制御下ある場合、カナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子である。Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）。別の一般的に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２９９（１９８５）。
【０１４０】
抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源の更なる選択可能なマーカー遺伝子には、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、ブレオマイシン耐性決定因子が挙げられる。Ｈａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６：１２１６（１９８８）、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０：８６（１９８７）、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１９７（１９９０）Ｈｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１（１９８６）。他の選択可能なマーカー遺伝子は、グリホサート、グルホシネート、又はブロモキシニル等の除草剤に対する耐性を付与する。Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：７４１〜７４４（１９８５）、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０）、及びＳｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９〜４２３（１９８８）。
【０１４１】
細菌起源のものではない植物形質転換に対して選択可能なマーカー遺伝子には、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ、及び植物アセトラクテートシンターゼが挙げられる。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：６７（１９８７）、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８（１９８６）、Ｃｈａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．８：６４３（１９９０）。
【０１４２】
植物形質転換に対するマーカー遺伝子の別のクラスは、抗生物質等の毒性物質に対する耐性のために形質転換された細胞の直接的遺伝子選択ではなくむしろ推定に基づいて形質転換された植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織において遺伝子の発現の特別なパターンを定量化又は視覚化するために特に有用であり、遺伝子発現の調査のために遺伝子又は遺伝子制御配列に融合され得るため、頻繁にレポーター遺伝子と称される。推定に基づいて形質転換された細胞のスクリーニングに対して一般的に使用される遺伝子には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７（１９８７）、Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３４３（１９８９）、Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１３１（１９８７）、ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６８１（１９８４）。
【０１４３】
植物組織の破壊を必要としないＧＵＳ活性を可視化するためのインビボ方法が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２９０８，ＩＭＡＧＥＮＥ  ＧＲＥＥＮ，ｐ．１〜４（１９９３）及びＮａｌｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５：１５１ａ（１９９１）。しかしながら、これらのＧＵＳ活性を可視化するためのインビボ方法は、低感受性、高蛍光バックグラウンド、及び選択可能なマーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連付けられる制限により、形質転換細胞の回収に対して有用であるとは証明されていない。
【０１４４】
より最近になって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が、原核及び真核細胞における遺伝子発現のためのマーカーとして利用された。Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２（１９９４）。ＧＦＵ及びＧＦＵの突然変異体は、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。
【０１４５】
ジャガイモ形質転換の発現ベクター：プロモーター
発現ベクターに含まれる遺伝子は、制御要素、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。いくつかの種類のプロモーターが、単独で又はプロモーターと組み合わせて使用することができる他の制御要素として形質転換分野において周知である。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、転写の開始からＤＮＡ上流であり、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する領域への参照を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターである。発生制御下のプロモーターの例には、葉、根、種子、繊維、木部導管、仮道管、又は厚壁組織等のある特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と称される。ある特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と称される。「細胞型」特異的プロモーターは、１つ又は２つ以上の器官、例えば、根又は葉の血管細胞で、ある特定の細胞型において発現を主に推進する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによって転写を生じ得る環境条件の例には、嫌気条件又は光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、及び誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であるプロモーターである。
【０１４７】
Ａ．誘導性プロモーター
誘導性プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結される。任意に、誘導性プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。誘導性プロモーターを用いると、転写の速度は、誘導剤に応じて上昇する。
【０１４８】
任意の誘導性プロモーターが、本発明において使用され得る。Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１〜３６６（１９９３）を参照されたい。例示的誘導性プロモーターには、銅に応答するＡＣＥＩシステムからのもの（Ｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：４５６７〜４５７１（１９９３））、ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に応答するトウモロコシからのＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１）及びＧａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２〜３８（１９９４））、又はＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサー（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１））が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい誘導性プロモーターは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するプロモーターである。一例となる誘導性プロモーターは、その転写活性がグルココルチコステロイドホルモンによって誘導されるステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーターである。Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：０４２１（１９９１）。
【０１４９】
Ｂ．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるか、又は構成的プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
【０１５０】
多くの異なる構成的プロモーターが、本発明において利用され得る。例示的構成的プロモーターには、ＣａＭＶからの３５Ｓプロモーター等の植物ウイルスからのプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５））及び米アクチンのような遺伝子からのプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１（１９９０））、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９〜６３２（１９８９）及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５〜６８９（１９９２））、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８（１９９１））、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３〜２７３０（１９８４））、並びにトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３１：２７６〜２８５（１９９２）及びＡｔａｎａｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２（３）：２９１〜３００（１９９２））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
ＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’のＸｂａ１／Ｎｃｏｌ断片（又は前記Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌ断片と同様のヌクレオチド配列）は、特に有用な構成的プロモーターを代表する。ＰＣＴ出願国際公開第９６／３０５３０号を参照されたい。
【０１５２】
Ｃ．組織特異的又は組織優先的プロモーター
組織特異的プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結される。任意に、組織特異的プロモーターは、ジャガイモにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。組織特異的プロモーターに作動可能に連結される対象とする遺伝子で形質転換される植物は、排他的又は優先的に特定の組織において、導入遺伝子のタンパク質生成物を生成する。
【０１５３】
任意の組織特異的又は組織優先的プロモーターが、本発明において利用され得る。例示的組織特異的又は組織優先的プロモーターには、ファセオリン遺伝子からのもの等の根優先的プロモーター（Ｍｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６〜４８２（１９８３）及びＳｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３３２０〜３３２４（１９８５））、ｃａｂ又はｒｕｂｉｓｃｏからのもの等の葉特異的及び光誘導性プロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２７２３〜２７２９（１９８５）及びＴｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７９〜５８２（１９８５））、ＬＡＴ５２からのもの等の葯特異的プロモーター（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１７：２４０〜２４５（１９８９））、Ｚｍ１３からのもの等の花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４４：１６１〜１６８（１９９３））、又はａｐｇからのもの等の小胞子優先的プロモーター（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．６：２１７〜２２４（１９９３））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
タンパク質を細胞内区画に標的化するためのシグナル配列
クロロプラスト、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁、若しくはミトコンドリア等の細胞内区画への、又はアポプラストに分泌させるための導入遺伝子によって生成されるタンパク質の輸送は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子の５’及び／又は３’領域にシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって達成される。構造遺伝子の５’及び／又は３’末端における標的配列は、タンパク質の合成及びプロセシング中に、コードされたタンパク質が最終的にどこに区画化されるかを決定することができる。
【０１５５】
シグナル配列の存在は、細胞内の細胞小器官又は細胞内区画のいずれかに、又はアポプラストへの分泌のために、ポリペプチドを方向付ける。多くのシグナル配列が、当該技術分野で既知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４９（１９９２）、Ｃｌｏｓｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９３）、Ｋｎｏｘ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３〜１７（１９８７）、Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２４〜１２９（１９８９）、Ｆｒｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：４８３〜４９６（１９９１）、Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８３４（１９９１）、Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７（１９８９）、Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１２９（１９９１）、Ｋａｌｄｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３９：４９９〜５０９（１９８４）、Ｓｔｅｉｆｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：７８５〜７９３（１９９０）を参照されたい。
【０１５６】
外来タンパク質遺伝子及び農学遺伝子
本発明によるトランスジェニック植物を用いて、外来タンパク質を商業的な量で生成することができる。このように、当該技術分野で十分に理解されている形質転換植物の選択及び繁殖のための技法によって、通常の方法で収穫された複数のトランスジェニック植物を得て、次いで、外来タンパク質を対象とする組織から又は総バイオマスから抽出することができる。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、Ｈｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｒｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：９２〜６（１９８１）によって考察されている方法によって達成することができる。
【０１５７】
好ましい実施形態に従って、外来タンパク質の商業的産生のために提供されるトランスジェニック植物は、ジャガイモ植物である。別の好ましい実施形態では、対象とするバイオマスは、種子又は塊茎である。より高レベルの発現を示すそうたいてきに比較的少数のトランスジェニック植物について、主に従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲ、及びＳＳＲ分析により、組み込まれたＤＮＡ分子の概算的な染色体位置を特定する遺伝子地図を作成することができる。これに関する例示的方法論としては、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２６９：２８４（１９９３）を参照されたい。染色体位置に関する地図情報は、主題のトランスジェニック植物の所有権保護に有用である。未認可の繁殖が行われ、他の生殖質との交配が行われる場合、組み込み領域の地図を被疑植物についての類似の地図と比較して、後者が主題植物と共通の親子関係を有するかどうか決定することができる。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲ、及び配列決定を伴い、それら全ては従来の技法である。
【０１５８】
同様に、本発明によって、農学遺伝子を形質転換植物に発現させることができる。より具体的には、農学的関心対象の種々の表現型を発現させるように植物を遺伝子学的に改変することができる。これに関係する例示的遺伝子は、以下に分類されるものが挙げられるが、これらに限定されない：
【０１５９】
１．害虫又は疾病に対する耐性を付与する遺伝子であって、以下をコードする遺伝子：
Ａ．植物疾病耐性遺伝子。植物防御は、しばしば、植物中の疾病耐性遺伝子（Ｒ）の生成物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物との間の特定の相互作用によって活性化される。植物変種は、特定の病原体株に耐性のある植物を改変するようにクローニングされた耐性遺伝子（複数可）を用いて形質転換され得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（１９９４）（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍに対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（１９９３）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ病原型トマトに対する耐性のためのトマトＰｔｏ遺伝子はタンパク質キナーゼをコードする）、Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（１９９４）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅに対する耐性のためのアラビドプシスＲＳＰ２遺伝子）を参照されたい。
Ｂ．大豆シストセンチュウ等の害虫に対する耐性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願国際公開第９６／３０５１７号、ＰＣＴ出願国際公開第９３／１９１８１号を参照されたい。
Ｃ．バチルススリンギエンシスタンパク質、その誘導体、又はそれをモデルした合成ポリペプチド。例えば、Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を開示しているＧｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（１９８６）を参照されたい。更に、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５、及び３１９９８の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから購入可能である。
Ｄ．レクチン。例えば、いくつかのＣｌｉｖｉａ  ｍｉｎｉａｔａマンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示しているＶａｎ  Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４）を参照されたい。
Ｅ．アビジン等のビタミン結合タンパク質。昆虫の害虫に対する殺幼虫剤としてアビジン及びアビジンホモログの使用を教示するＰＣＴ出願米国第９３／０６４８７号を参照されたい。
Ｆ．酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ若しくはプロテイナーゼ阻害剤又はアミラーゼ阻害剤。例えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）（コメシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）、Ｈｕｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３）（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ  α−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）、及び米国特許第５，４９４，８１３号（Ｈｅｐｈｅｒ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ、１９９６年２月２７日出願）を参照されたい。
Ｇ．エクジステロイド若しくは幼若ホルモン等の昆虫特異的ホルモン又はフェロモン、それらの変異形、それらに基づく模倣薬、又はそれらのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼ（幼若ホルモンの不活性化因子）のバキュロウイルス発現に関するＨａｍｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８（１９９０）による開示を参照されたい。
Ｈ．発現時に、影響される害虫の生理機能を妨害する昆虫特異的ペプチド又は神経ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）（発現クローニングは昆虫利尿ホルモンレセプターをコードするＤＮＡをもたらす）及びＰｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）（アロスタチンがＤｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａにおいて特定される）の開示を参照されたい。また、昆虫特異的麻痺性神経毒をコードする遺伝子を開示しているＴｏｍａｌｓｋｉらの米国特許第５，２６６，３１７号も参照されたい。
Ｉ．ヘビ、ハチ等によって自然界で生成される昆虫特異的毒、例えば、サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示に関するＰａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１６：１６５（１９９２）を参照されたい。
Ｊ．モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、又は殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の過大蓄積の原因となる酵素。
Ｋ．翻訳後修飾を含む、生物学的活性分子の修飾に関与する酵素、例えば、天然又は合成を問わず、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、及びグルカナーゼ。カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＰＣＴ出願国際公開第９３／０２１９７号（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。キチナーゼをコードする配列を含有するＤＮＡ分子を、例えば、受託番号３９６３７及び６７１５２の下でＡＴＣＣから得ることができる。また、タバコイモムシキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を教示しているＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）及びパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供しているＫａｗａｌｌｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）も参照されたい。
Ｌ．シグナル形質導入を刺激する分子。例えば、緑豆カルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に関するＢｏｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）及びトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提供しているＧｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）による開示を参照されたい。
Ｍ．疎水性モーメントペプチド。真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体を開示するＰＣＴ出願国際公開第９５／１６７７６号及び疾病耐性を付与する合成抗微生物性ペプチドを教示するＰＣＴ出願国際公開第９５／１８８５５号を参照されたい。
Ｎ．膜パーミアーゼ、チャネル形成剤、又はチャネル遮断剤。例えば、トランスジェニックタバコ植物をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに耐性にするセクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現に関するＪａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８９：４３（１９９３）の開示を参照されたい。
Ｏ．ウイルス侵入タンパク質又はそこから得られる複合毒素。例えば、形質転換植物細胞中のウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染及び／又はコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、同様に関連ウイルスによって引き起こされる疾病発症に対する耐性を与える。Ｂｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照されたい。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介性耐性が形質転換植物に付与された。
Ｐ．昆虫特異的抗体又はそれから得られる免疫毒素。このように、昆虫の腸における重大な代謝機能を標的とする抗体は、影響を受けた酵素を不活性化して、昆虫を死滅させるだろう。Ｃｆ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃４９７，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）（１９９４）（一本鎖抗体断片の産生を介するトランスジェニックタバコの酵素的不活性化）。
Ｑ．ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物がウイルス攻撃から防御されることを示しているＴａｖｌａｄｏｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９（１９９３）を参照されたい。
Ｒ．病原体又は寄生生物によって自然界で産生される発育停止タンパク質。このように、真菌エンド−α−１、４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、真菌のコロニー形成と、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼ可溶化することによる植物栄養の放出を容易にする。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６（１９９２）を参照されたい。マメエンドポリガラクチュロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び特徴付けは、Ｔｏｕｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７（１９９２）に記載されている。
Ｓ．植物によって自然界で産生される発育停止タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（１９９２）が、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現しているトランスジェニック植物が真菌性疾病に対する耐性増加を有することを示した。
Ｔ．全身獲得耐性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子及び／又は病原性関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）（１９９５）。
Ｕ．対真菌遺伝子。Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０１：７０９〜７１２（１９９３）；Ｐａｒｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １８３：２５８〜２６４（１９９１）及びＢｕｓｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７〜１４９（１９９８）を参照されたい。
Ｖ．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及び他の耐性遺伝子等のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ胴枯れ病に対する耐性を付与する遺伝子。Ｎａｅｓｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ  ｉｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９７〜７０４及びＬｉ，Ｘ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ＡＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｔｈｅ  Ｒ２  ａｌｌｅｌｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｏｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：１１２１〜１１２８を参照されたい。
【０１６０】
２．除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、
Ａ．イミダゾリノン又はスルホニルウレア等の成長点又は分裂組織を阻害する除草剤。この分類の例示的遺伝子は、例えば、それぞれ、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１（１９８８）及びＭｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）によって記載されるような突然変異ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。
Ｂ．グリホサート（それぞれ突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）及びａｒｏＡ遺伝子によって弱められる耐性）並びにグルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）及びストレプトマイセスヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＰＡＴ  ｂａｒ遺伝子）、及びピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）等の他のホスホノ化合物。例えば、グリホサート耐性を付与することができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示するＳｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号を参照されたい。突然変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、その突然変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６号で開示されている。Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０  ３３３  ０３３号及びＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシン等の除草剤に対する耐性を付与するグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州出願第０  ２４２  ２４６号において提供されている。ＤｅＧｒｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生産を記載している。セトキシジム及びハロキシホップ等のフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンに対する耐性を付与する例示となる遺伝子は、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）によって記載されるＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２、及びＡｃｃ２−Ｓ３遺伝子である。
Ｃ．トリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）等の光合成を阻害する除草剤。Ｐｒｚｉｂｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（１９９１）は、突然変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドを用いたクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の形質転換を記載している。ニトリラーゼ遺伝子についてのヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１、及び６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）によって記載されている。
Ｄ．この酵素を発現する植物を多様な植物に導入される複数の種類の除草剤に耐性にすることが発見されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ。Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９，１９９５を参照されたい。除草剤に対する抵抗性を付与する他の遺伝子には、ラットシトクロームＰ４５０７Ａ１及び酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０オキシドレダクターゼのキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７，１９９４）、グルタチオンレダクターゼ及びスーパーオキシドジスムターゼに関する遺伝子（Ａｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：１６８７，１９９５）、並びに種々のホスホトランスフェラーゼに関する遺伝子（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６１９，１９９２）が挙げられる。
Ｅ．プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）は、全ての植物生存に必要であるクロロフィルの生産に必要である。プロトックス酵素は、多様な除草化合物に対する標的として役立つ。これらの除草剤はまた、存在する植物の異なる種の全ての生長を阻害し、それらの全破壊を引き起こす。これらの除草剤に耐性のある改変されたプロトックス活性を含有する植物の発育が、米国特許第６，２８８，３０６号、同第６，２８２，８３７号、同第５，７６７，３７３号、及び国際公開第ＷＯ  ０１／１２８２５号に記載されている。
【０１６１】
３．付加価値形質を付与するか又はそれに寄与する遺伝子、例えば、
Ａ．改変された脂肪酸代謝、例えば、ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる植物のステアリン酸含量の増加。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２５（１９９２）を参照されたい。
Ｂ．減少したフィチン酸塩−１）フィチン酸塩をコードする遺伝子導入は、フィチン酸塩の崩壊を強化し、より多くの遊離ホスフェートを形質転換植物に追加するだろう。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒフィチン酸塩遺伝子のヌクレオチド配列の開示に関してＶａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２７：８７（１９９３）を参照されたい。２）フィチン酸塩含量を減少させた遺伝子が、導入され得る。トウモロコシでは、例えば、これれは、クローニング、及び次いで、低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異の原因となる単一対立遺伝子に関連付けられるＤＮＡを再導入するによって達成され得るＲａｂｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３（１９９０）を参照されたい。
Ｃ．例えば、デンプンの分岐パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによって達成される改変された炭水化物組成物。Ｓｈｉｒｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（１９８８）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ突然変異フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（１９８５）（枯草菌レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（１９９２）（バチルスリケンニフォニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の生産）、Ｅｌｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２１２１：５１５（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｏｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（１９９３）（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位指向性突然変異誘発）、及びＦｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（１９９３）（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい。
Ｄ．ＦＡＤ−２遺伝子修飾によるオレイン酸の上昇及び／又はＦＡＤ−３遺伝子修飾によるリノレン酸の減少。米国特許第６，０６３，９４７号、同第６，３２３，３９２号、及び国際公開第ＷＯ  ９３／１１２４５号を参照されたい。
【０１６２】
４．雄性不稔性を制御する遺伝子
Ａ．タペータム特異的プロモーターの制御下、及び化学物質Ｎ−Ａｃ−ＰＰＴの適用を用いるデアセチラーゼ遺伝子の導入。国際公開第ＷＯ  ０１／２９２３７号を参照されたい。
Ｂ．種々の雄蕊特異的プロモーターの導入。国際公開第ＷＯ  ９２／１３９５６号及び同第ＷＯ  ９２／１３９５７号を参照されたい。
Ｃ．バルナーゼ及びバルスター遺伝子の導入。Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６１１〜６２２，１９９２）を参照されたい。
【０１６３】
ジャガイモ形質転換ための方法
生物学的及び物理的植物形質転換プロトコルを含む、植物形質転換ための多数の方法が開発された。例えば、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ６７〜８８を参照されたい。加えて、植物細胞又は組織形質転換及び植物の再生のための発現ベクター及びインビトロ培養方法が利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ８９〜１１９を参照されたい。
【０１６４】
Ａ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換−発現ベクターを植物に導入するための１つの方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然の形質転換系に基づく。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９（１９８５）を参照されたい。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、植物細胞を遺伝子学的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。それぞれ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴｉ及びＲｉプラスミドは、植物の遺伝子形質転換の原因となる遺伝子を担持する。例えば、Ｋａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１０：１（１９９１）を参照されたい。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子移入のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系及び方法の説明は、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８（１９８９）によって提供されている。１９９６年１０月８日出願の米国特許第５，５６３，０５５号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ）も参照されたい。
【０１６５】
Ｂ．遺伝子直接移入−集合的に遺伝子直接移入と称される植物形質転換のいくつかの方法が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換の代用として開発された。１〜４μｍと測定されるマイクロ噴出体の植物表面の一般的に適用可能な方法。発現ベクターは、植物細胞壁及び膜を貫通するのに十分な速度である３００〜６００ｍ／ｓまでマイクロ噴出体加速する微粒子銃装置を用いて植物組織に導入される。Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７（１９８７）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：２９９（１９８８）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：５５９〜５６３（１９８８）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：２０６（１９９０）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）。１９９１年５月１４日出願の米国特許第５，０１５，５８０号（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ  ａｌ．）及び１９９４年６月２１日出願の米国特許第５，３２２，７８３号（Ｔｏｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。
【０１６６】
ＤＮＡを植物に物理的に送達するための別の方法は、標的細胞の音波処理である。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９９６（１９９１）。あるいは、リポソーム及びスフェロプラスト融合を使用して、発現ベクターが植物に導入された。Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７３１（１９８５）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３９６２（１９８７）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール、又はポリ−Ｌ−オルニチンを使用するＤＮＡのプロトプラストへの直接取り込みもまた報告されている。Ｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１（１９８５）及びＤｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：４５１（１９８２）。プロトプラスト並びに細胞及び組織全体のエレクトロポレーションもまた記載されている。Ｄｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＶＩＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＩＡＰＴＣ，Ａ２−３８，ｐ  ５３（１９９０）、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５〜１５０５（１９９２）、及びＳｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：５１〜６１（１９９４）。
【０１６７】
ジャガイモ標的組織の形質転換に続く、上に記載の選択可能なマーカー遺伝子の発現は、当該技術分野で周知の再生及び選択方法を使用して、形質転換細胞、組織、及び／又は植物の優先的選択を可能にする。
【０１６８】
形質転換ための前述の方法は、典型的には、トランスジェニック変種を生成するために使用されるだろう。トランスジェニック変種は、次いで、新たなトランスジェニック変種を生成するために別の（形質転換されていないか又は形質転換された）変種と交配され得る。あるいは、前述の形質転換技法を使用して特定のジャガイモ系統に改変された遺伝子形質は、植物育種分野で周知の伝統的な戻し交配技法を使用して別の系統に移動され得る。例えば、戻し交配手法を使用して、改変された形質を公開されている非エリート変種からエリート変種に、又はそのゲノム中に外来遺伝子を含有する変種からその遺伝子を含有しない変種（複数可）に移動することができる。本明細書で使用される場合、「交配すること」とは、文脈により、単純なＸとＹとの交配又は戻し交配の過程を指し得る。
【０１６９】
当業者であれば、ジャガイモ植物という用語が本発明に関連して使用される場合、その用語は、その変種の遺伝子変換植物又はそこに取り込まれる１つ若しくは２つ以上の付加価値遺伝子（除草剤又は害虫耐性等）を有するトランスジェニック誘導体等のＪ３の本質的な際立った特徴を保持する誘導体変種も含むことを認識するだろう。戻し交配方法は、特徴を改良するか、又は特徴を変種に導入するために、本発明とともに使用され得る。本明細書で使用される場合、「戻し交配」という用語は、ハイブリッド子孫を反復親に１、２、３、４、５、６、７、８、９回以上繰り返し戻し交配することを指す。１つ又は２つ以上の所望の特徴に関して遺伝子（複数可）に寄与する親のジャガイモ植物は、非反復親又はドナー親と呼ばれる。この専門用語は、非反復親が戻し交配プロトコルにおいて一度使用されるという事実を指し、ゆえに、繰り返されない。非反復親から遺伝子（複数可）が移入される親のジャガイモ植物は、戻し交配プロトコルにおいて数ラウンド使用されるような反復親として既知である。典型的な戻し交配プロトコルにおいて、対象とする起源となる変種（反復親）は、移入される対象である遺伝子（複数可）を担持する第２の変種（非反復親）と交配される。この交配から結果として得られる子孫は、次いで、再び反復親と交配され、この過程は、非反復親から移入される１つ又は２つ以上の遺伝子に加えて、反復親の所望の形態学的及び生理学的特徴のうちの本質的に全てが、変換植物において回復されるジャガイモ植物が得られるまで繰り返される。
【０１７０】
好適な反復親の選択は、戻し交配手順の成功にとって重要な好適である。戻し交配プロトコルの目的は、起源となる変種における１つ又は２つ以上の形質又は特徴を変えるか、又は置き換えることである。この目的を達成するために、反復変種の１つ又は２つ以上の遺伝子は、非反復親からの所望の遺伝子（複数可）で修飾されるか、置換されるか、又は補われ、同時に所望の遺伝子の残りの本質的に全て、及びゆえに、起源となる変種の所望の生理学的及び形態学的構成が保持される。特定の非反復親の選択は、戻し交配の目的に左右されるだろう。主要な目的のうちの１つは、いくつかの商用的に望ましい、農学的に重要な形質を植物に追加することである。正確な戻し交配プロトコルは、適切な試験プロトコルを決定するために、変化又は追加される特徴又は形質に左右される。戻し交配方法は、移入される特徴が優性対立遺伝子である場合、簡略化されるが、劣性対立遺伝子が移入されてもよい。この事例においては、所望の特徴が無事に移入されたかどうかを決定するために、子孫の試験を導入することが必要であり得る。
【０１７１】
同様に、導入遺伝子は、Ｇｒｅｓｓｅｌ，１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｒｏｐｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｌ．ｖａｎ  Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ，（ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｕｔｔｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｒｅｖｉｓｉｎｇ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ＴＬ−ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  ５  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｌａｗｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍｉｘｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｘ  ａｎｄ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｔｓｋｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＬＲＶ．米国特許第５，５１０，２５３号、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．Ｃｖ．Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｏｔａｔｏｅｓ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｅｅｔｌｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ等の当業者に周知の多様な確立された組換え方法のうちのいずれかを使用して、植物に導入され得、これらの全ては本目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
多くの形質は、新たな変種の発育において通常は選択されないが、戻し交配及び遺伝子工学技術によって改善され得ることが特定されている。これらの形質は、トランスジェニックであるかを問わず、これらの形質の例には、除草剤耐性、細菌性、真菌、又はウイルス性疾病に対する耐性、虫害耐性、デンプン及び他の炭水化物の濃度の均一性又は上昇、栄養品質の強化、塊茎が傷付く傾向の減少、及びデンプンの糖への変換の速度の減少が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子は、一般的に、細胞核を通して遺伝する。これらの形質のいくつかは、米国特許第５，５００，３６５号、米国特許第５，３８７，７５６号、米国特許第５，７８９，６５７号、米国特許第５，５０３，９９９号、米国特許第５，５８９，６１２号、米国特許第５，５１０，２５３号、米国特許第５，３０４，７３０号、米国特許第５，３８２，４２９号、米国特許第５，５０３，９９９号、米国特許第５，６４８，２４９号、米国特許第５，３１２，９１２号、米国特許第５，４９８，５３３号、米国特許第５，２７６，２６８号、米国特許第４，９００，６７６号、米国特許第５，６３３，４３４号、及び米国特許第４，９７０，１６８号において記載されている。
【０１７３】
寄託情報
上に開示され、且つ添付の特許請求の範囲に列挙されるＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ所有のジャガイモ品種Ｊ３の塊茎寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０によって行われた。寄託日は、２０１３年５月２３日であった。微小塊茎の２５個のバイアル瓶の寄託は、本出願の出願日の前からＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙによって維持される同じ寄託から行われた。全ての制限は、特許の付与に応じて、取消不能の形で除去され、寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  １．８０１〜１．８０９の必要条件の全てを満たすことが意図される。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２０３７１である。寄託は、３０年間、又は最新の依頼から５年間、又は特許の強制可能期間のいずれか最長の期間にわたって寄託場所に維持され、その期間中必要に応じて交換されるだろう。
【０１７４】
いくつかの例示的態様及び実施形態が上で考察されたが、当業者であれば、それらの特定の修正、置換、追加、及び部分的組み合わせを認識するだろう。ゆえに、以下の特許請求の範囲及びこれ以降挿入される特許請求の範囲は、全てのそのような修正、置換、追加、及び部分的組み合わせをそれらの真の趣旨及び範囲内であるとして含むように解釈されることが意図される。
【図１】
2016518139.tif 000011
【図２】
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【国際調査報告】
2016518139.tif 000013