【手続補正書】
【提出日】平成24年12月12日(2012.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、第一のヌクレオチド配列を第一のシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、第二のヌクレオチド配列を第二のシャトルベクターに導入する工程；及び、
ｄ）前記第一のヌクレオチド配列と前記第二のヌクレオチド配列を、同時に、前記シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項２】
トランスジーンを作成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、プロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターに導入する工程；及び、
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、調節シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。
【請求項３】
トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法であって、
ａ）第一、及び第二のドッキングポイントを有する一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程；
ｂ）トランスジーンに包含される、少なくとも一のプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターに導入する工程；
ｃ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターに導入する工程；
ｄ）トランスジーンに包含される、少なくとも一の調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターに導入する工程；
ｅ）前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、及び調節シャトルベクターから、前記クローニングプラスミドの前記第一及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程；及び、
ｆ）一のプロモーターモジュール、一の発現モジュール、及び一の調節モジュールのうち少なくとも二つが、それぞれの一次クローニングベクター分子に移行する方法。
【請求項４】
トランスジーン、又は他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するためのモジュラークローニングベクターを作成するための方法であって、
ａ）骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は第一、及び第二のドッキングポイントを含み、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定されていて、エンドヌクレアーゼに対する少なくとも一の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含む工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを、前記第一のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第一のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、３’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを、前記第二のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第二のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、５’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程；
ｄ）第一、及び第二のインサートを用意する工程であって、それぞれのインサートは５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有し、前記第一のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第二のインサートの３’末端は、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能であって、前記第一のインサートの３’末端と前記第二のインサートの５’は適合可能であって、第三のエンドヌクレアーゼ酵素に対する第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を形成する工程；及び、
ｅ）インサートと切断したクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一、及び第二のインサートの、骨格内の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での自己配向、前記第一、及び第二のドッキングポイントの再形成、及び、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項５】
修飾したクローニングベクタープラスミド分子を提供する請求項４に記載の方法であって、更に、
ｆ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第一、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第一のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第一のインサートを除去し、切断された第一のドッキングポイントにおける３’末端と、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における５’末端を生成する工程；
ｇ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第三のインサートを用意する工程であって、前記第三のインサートの５’末端は切断された第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能であって、前記第三のインサートの３’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｈ）前記第三のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼ部位との間における前記第三のインサートの自己配向、及び、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼサイトの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項６】
修飾したモジュラークローニングベクタープラスミドを提供する請求項４に記載の方法であって、更に、
ｉ）次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第二、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第二のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第二のインサートを除去し、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における３’末端と、切断された第二のドッキングポイントにおける５’末端を生成する工程；
ｊ）５’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び３’末端を有する第四のインサートを用意する工程であって、前記第四のインサートの５’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位と適合可能であって、前記第四のインサートの３’末端は切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｋ）前記第四のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第三のエンドヌクレアーゼ部位と前記第二のドッキングポイントとの間における前記第四のインサートの自己配向、及び前記第三のエンドヌクレアーゼ部位、及び前記第二のドッキングポイントの再形成を行う工程を含む方法。
【請求項７】
インサートがｄｅ  ｎｏｖｏ合成、組換え、及びＰＣＲターミネーター突出クローニングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトを合成するための方法であって、
ａ）骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを有し、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定され、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の希少制限部位を有する工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントを前記第一のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第一の非可変性希少制限酵素で切断し、３’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントを前記第二のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第二の非可変性希少制限酵素で切断し、５’末端を有する切断された骨格を生成する工程；
ｄ）目的とするプロモーター配列、前記第一のドッキングポイントの３’末端に適合可能な５’末端、及び３’末端を有するプロモーターインサートを用意する工程；
ｅ）目的とする発現配列、プロモーターインサートの３’末端と適合可能で、第三の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び３’末端を有する発現インサートを用意する工程；
ｆ）目的とする調節配列、発現インサートの３’末端と適合可能で、第四の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する５’末端、及び、工程「ｃ」で切断された、切断された第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能な３’末端を有する調節インサートを用意する工程；
ｇ）前記プロモーター、発現、及び調節インサートと切断されたクローニングプラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間におけるプロモーター、発現、及び調節インサートの自己配向と、連鎖配置と、を引き起こし、第一、及び第二のドッキングポイントを再形成し、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。
【請求項９】
修飾したモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項８に記載の方法であって、更に、
ｈ）モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを一対の希少制限酵素を用いて、プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも一が有する一対の希少制限部位で切断し、３’末端と５’末端を有する切断されたベクタープラスミドを生成する工程；
ｉ）プロモーターインサート、発現インサート、調節インサートから選択される一の第五のインサートを用意する工程であって、前記第五のインサートは切断されたベクタープラスミドの３’末端に適合可能な５’末端、及び切断されたベクタープラスミドの５’末端に適合可能な３’末端を有する工程；及び
ｊ）前記第五のインサートと切断されたベクタープラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、同じ配列で、前記モジュラー一次クローニングベクタープラスミドでの前記第五のインサートの自己配向と、及び一対の制限部位の再形成とを行う工程を含む方法。
【請求項１０】
更に、工程ｈ、ｉ、及びｊをプロモーターインサート、発現インサート、及び調節インサートから選ばれる、一又はそれ以上の追加のインサートを用いて、繰り返す工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トランスジーン、又はその他の複雑なＤＮＡコンストラクトのアレイを同時に合成する方法であって、
ａ）５’末端、目的のヌクレオチド配列、及び３’末端を含むインサート挿入することができる骨格を含む少なくとも一の一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は、連続した配置のプロモーター、発現、及び調節インサートを受容可能であって、第一、及び第二のドッキングポイントを含み、各ドッキングポイントは骨格内に固定されており、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の制限部位を有している工程；
ｂ）前記第一のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第一のドッキングポイントを切断する工程；
ｃ）前記第二のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第二のドッキングポイントを切断する工程；
ｄ）プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一のプロモーターインサートを用意する工程であって、少なくとも一のプロモーターインサートの５’末端は、工程「ｂ」で切断された、前記第一のドッキングポイントの３’末端と適合可能である工程；
ｅ）発現ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の発現インサートを用意する工程であって、少なくとも一の発現インサートの５’末端は、少なくとも一のプロモーターインサートの３’末端と適合可能であり、第三の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成する工程；
ｆ）調節ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の調節インサートを用意する工程であって、少なくとも一の調節インサートの５’末端は、少なくとも一の発現インサートの３’末端と適合可能であり、第四の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し、少なくとも一の調節インサートの３’末端は、工程「ｃ」で切断された、前記第二のドッキングポイントの５’末端と適合可能である工程；及び
ｇ）その後、少なくとも一の前記プロモーター、発現、及び調節インサートとの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する工程を含む方法。
【請求項１２】
工程「ｇ」において、少なくとも二つの前記プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程「ｇ」において、前記プロモーター、発現、及び調節インサートのそれぞれの少なくとも異なる二種と、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
修飾されたモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項１１、１２、又は１３に記載の方法であって、更に、
ｈ）ハイスループットスクリーニングにより工程「ｇ」の生成物を検査する工程；
ｉ）一次クローニングベクタープラスミドである、工程「ｇ」の特定の生成物を単離する工程；
ｊ）工程「ｉ」の一次クローニングベクタープラスミドの骨格を、前記プロモーター、発現、調節インサートの一つの５’端と３’端において、これに対応する一対の希少制限酵素により切断する工程；
ｋ）第六のインサートを用意する工程であって、前記第六のインサートの５’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の３’末端と適合可能であって、前記第六のインサートの３’末端は工程「ｊ」で切断された骨格の５’末端と適合可能である工程；及び、
ｌ）その後、前記第六のインサートと工程「ｊ」で切断された骨格とを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第六のインサートの前記骨格への自己配向を行う工程を含む方法。
【請求項１５】
前記骨格において、連続的に一つのインサートをもう一つのインサートに置き換えるため、更に、任意の数のインサートについて、工程ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、及びｌを繰り返し行う工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
インサートがｄｅ  ｎｏｖｏ合成、組換え、ＰＣＲターミネーター突出クローニング技術、及び制限エンドヌクレアーゼマッピングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項４、８、又は１１のいずれかに記載の方法であって、前記骨格が更に、前記第一のドッキングポイントの５’末端の上流に位置する順方向のユニークなＨＥ部位、及び前記第二のドッキングポイントの３’末端の下流に位置する逆方向のユニークなＨＥ部位を有し、前記方法は、更に、
ｍ）前記骨格をユニークなＨＥ制限酵素を用いて、それぞれのユニークなＨＥ部位で切断する工程；
ｎ）インサートを含む切断片を精製する工程；及び、
ｏ）前記切断片を目的のゲノム宿主に挿入する工程を含む方法。