(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示された核酸配列をもつ単離されたＤＮＡ分子を含むＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
配列番号：１に示された核酸配列の６６番目から１６９４番目の残基によって示されている核酸配列をもつ単離されたＤＮＡ分子を含むＤＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
請求項１または２のベクターによって形質転換、トランスフェクションまたは感染を受けた宿主細胞。
【請求項４】
細胞が真核生物または原核生物の細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞が昆虫細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
以下のタンパク質をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入細胞、組織または非ヒト生物体；配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列について１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入を含み、かつヒト細胞周期チェックポイント経路においてＣｄｃ２５タンパク質をリン酸化する能力を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項３から請求項７の何れかに記載の細胞から発現される以下のタンパク質；配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入を含み、かつヒト細胞周期チェックポイント経路においてＣｄｃ２５タンパク質をリン酸化する能力を有するタンパク質。
【請求項９】
単離された以下のタンパク質；配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入を含み、かつヒト細胞周期チェックポイント経路においてＣｄｃ２５タンパク質をリン酸化する能力を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項１０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
分裂中の細胞にとって、ゲノムの統合性が最も重要である。ＤＮＡ損傷への応答において、真核細胞は、細胞周期の進行を遅延させるためのチェックポイント制御を行なう複合システムに依存する。正常な真核生物の細胞周期は、細胞の形態および生化学的活性の違いに応じて４つの段階（順番に、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）に分けられ、また細胞周期から離脱した細胞をＧ０期、または非周期状態にあるという。細胞周期にある細胞が活発に複製しているとき、ＤＮＡ複製はＳ期に起こり、活発な細胞分裂はＭ期に起こる。一般的には、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  遺伝子ＶＩ（ＧＥＮＥＳ  ＶＩ）（３６章、１９９７年、英国オクスフォードにあるオクスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＧＢ））を参照。ＤＮＡは、真核細胞の中で次第に高いレベルの構造体となり、最後に染色体を形成する。性染色体以外の染色体は、通常対になって存在し、細胞分裂の間、各染色体のＤＮＡは複製して対になった染色分体になる（一般的には、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  遺伝子ＶＩ（ＧＥＮＥＳ  ＶＩ）（５章、１９９７年、英国オクスフォードにあるオクスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＧＢ））を参照。）。
【０００２】
チェックポイント遅延によって、Ｓ期における複製の前およびＭ期に染色分体が分離する前に、損傷を受けたＤＮＡを修復するための時間ができる（ＨａｒｔｗｅｌｌとＷｅｉｎｅｒｔ，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２４６：６２９−６３４）。多くの場合、ＤＮＡ損傷反応経路は、サイクリン依存型キナーゼの活性を阻害することによって細胞周期停止をもたらす（Ｅｌｌｅｄｇｅ，  １９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７４：１６６４−１６７１）。ヒトの細胞の中ではＤＮＡ損傷によって起こるＧ２期の遅延はＣｄｃ２の阻害的なリン酸化に大きく依存している（Ｂｌａｓｉｎａら、１９９７，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１−１１；  Ｊｉｎら、１９９６，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １３４：９６３−９７０）ことから、この遅延は、Ｃｄｃ２に作用する対抗キナーゼおよびＣｄｃ２に作用するホスファターゼの活性の変化から生じる可能性が高い。しかし、これらの酵素の活性がＤＮＡ損傷に応答して実質的に変化することの証拠はない（Ｐｏｏｎら、１９９７，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５７：５１６８−５１７８）。
【０００３】
ヒト細胞の中では、３種類のＣｄｃ２５タンパク質が発現している。Ｃｄｃ２５Ａは、Ｇ１期からＳ期に移行するのに特に必要である（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９４，  ＥＭＢＯ．  Ｊ．，  １３：４３０２−４３１０；  Ｊｉｎｎｏら、１９９４，  ＥＭＢＯ．  Ｊ．，  １３：１５４９−１５５６）が、Ｃｄｃ２５ＢとＣｄｃ２５Ｃは、Ｇ２期からＭ期に移行するのに必要とされる（Ｇａｂｒｉｅｌｌｉら、１９９６，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  ７：１０８１−１０９３；  Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖら、１９９１，  Ｃｅｌｌ，  ６７：１１８１−１１９４；  Ｍｉｌｌａｒら、１９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ，  ８８：１０５００−１０５０４；  Ｎｉｓｈｉｊｉｍａら、１９９７，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １３８：１１０５−１１１６）。Ｍ期の進行に対するＣｄｃ２５ＢとＣｄｃ２５Ｃの正確な関与は解っていない。
【０００４】
チェックポイントコントロールに関する最近の知見は、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））および分裂酵母（シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））を用いた研究から得られている。酵母および高等真核生物における細胞周期チェックポイントについて最近の理解を総説したものが多数出版されている（ＨａｒｔｗｅｌｌとＫａｓｔａｎ，  １９９４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２６６：１８２１−１８２８；  Ｍｕｒｒａｙ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６：８７２−８７６；  Ｅｌｌｅｄｇｅ，  １９９６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７４：１６６４−１６７２；  ＫａｕｆｍａｎｎとＰａｕｌｅｓ，  １９９６，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １０：２３８−２４７）。分裂酵母における６種の遺伝子産物ｒａｄ１＋，  ｒａｄ３＋，  ｒａｄ９＋，  ｒａｄ１７＋，  ｒａｄ２６＋，  およびｈｕｓ１＋が、ＤＮＡ損傷依存型チェックポイント経路とＤＮＡ複製依存型チェックポイント経路の両方の構成要素であるとして同定されている。さらに、酵母では、ｃｄｓ１＋がＤＮＡ複製依存型チェックポイントに必要であり、また、ｒａｄ２７＋／ｃｈｋ１＋が、ＤＮＡ損傷依存型チェックポイントが必要であると同定されている。
【０００５】
これらの遺伝子のいくつかは、出芽酵母の遺伝子と構造的に類似しており、さらに最近では、真核生物全体にわたっても保存されていることが、分裂酵母のｒａｄ３＋の２つのヒトにおける２つの相同遺伝子、すなわちＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調突然変異）（Ｓａｖｉｔｓｋｙら、１９９５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６８：１７４９−１７５３）およびＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調およびｒａｄ３＋関連）（Ｂｅｎｔｌｅｙら、１９９６，  ＥＭＢＯ．  Ｊ．，  １５：６６４１−６６５１；  Ｃｉｍｐｒｉｃｈら、１９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３：２８５０−２８５５）、ならびに分裂酵母ｒａｄ９＋のヒト相同遺伝子（Ｌｉｂｅｒｍａｎら、１９９６，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３：１３８９０−１３８８５）のクローニングによって示唆されている。
【０００６】
酵母のチェックポイントタンパク質と遺伝子について多くのことが解っているが、それらの知見によって、それらに相当するヒトの遺伝子またはタンパク質が存在すること、またはヒトの細胞周期の制御調節におけるそれらのエフェクターの役割を完全に予想できるわけではない。
【０００７】
ガンの影響を改善させるための、新規でより効果的な治療法および治療薬を開発するためには、ヒトチェックポイントタンパク質を同定してその特徴を調べ、それらの活性のメディエーターを同定することが重要である。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、新規のヒトチェックポイントキナーゼ遺伝子ｈＣＤＳ１、タンパク質、および、ｈＣＤＳ１を産生および使用するための構築物および方法を目的としている。
【０００９】
特に、本発明はｈＣＤＳ１をコードする核酸配列で、配列番号：１の核酸配列からなる核酸配列を含む。特に本発明は、配列番号：１の核酸配列の６６番目から１６９４番目の核酸配列で、ｈＣＤＳ１タンパク質に翻訳されるものを含む。本発明はまた、配列番号：１の核酸配列を含む核酸の構築物、ベクター、プラスミド、およびコスミドなどを含む。特に本発明は、配列番号：１の核酸配列を含む核酸ベクター構築物を提供しており、この核酸の配列からタンパク質を発現することができる。本発明は、真核細胞か原核細胞いずれかの宿主細胞の形質転換、ウイルスベクターへの組み込み、またはインビトロでのタンパク質発現を行なうのに適した核酸ベクターを含む。さらに、本発明は、配列番号：１の核酸がコードするタンパク質の少なくとも機能的部分を含む融合タンパク質産物を生成させるための付加的核酸を直列につなぐか、さもなければ結合させた配列番号１の核酸を具体化している。また、本発明は、標的細胞の中に取り込ませて発現させるための剥き出しのＤＮＡ形質転換体として用いるように調整した配列番号：１の核酸を含む。本発明は、また、配列番号：１の核酸配列の相補配列のアンチセンスＤＮＡ分子処方剤およびその断片で、配列番号：１の核酸配列の連続的または不連続な部分に相補的なアンチセンスＤＮＡ分子処方剤も提供する。また、本発明は、配列番号：１の核酸配列、その相補配列またはその断片をコードする修飾塩基またはバックボーンとなる成分を組み込む組成物を提供する。このような修飾塩基および核酸は、当技術分野において既知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７：９９−１３４  （１９９８））。すなわち、本発明は、例えば塩基結合間の修飾、塩基修飾、糖修飾、非放射性標識、核酸クロスリンキング、およびＰＮＡ（ポリペプチド核酸）を含んだ改変バックボーンなどの修飾核酸を含む。
【００１０】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列からなる新規のチェックポイントキナーゼタンパク質ｈＣＤＳ１を提供する。本発明は、組換えＤＮＡ技術によって作製され、インビボまたはインビトロで発現されたｈＣＤＳ１タンパク質を含む。したがって、本発明は形質転換した宿主細胞によって、小規模または大規模に産生されるｈＣＤＳ１タンパク質を含む。本発明は、真核生物または原核生物の細胞によって産生された、グリコシル化型または非グルコシル化型の全長ｈＣＤＳ１タンパク質を含む。本発明は、哺乳動物、昆虫、植物、バクテリア、菌類、またはその他の適当な宿主細胞から発現されたｈＣＤＳ１タンパク質を提供する。本発明は、融合タンパク質産物として産生されるｈＣＤＳ１タンパク質、固体支持体に結合したもの、または、化学的マーカー、放射性マーカー、蛍光マーカー、化学発光性マーカー、またはその他の検出マーカーによって標識されたｈＣＤＳ１タンパク質を含む。また、本発明は、天然資源から単離し、天然に見られるよりも精製度の高いｈＣＤＳ１タンパク質を提供する。また、本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質の薬学的処方剤および薬学的に許容される担体または賦形剤の中に入れたｈＣＤＳ１タンパク質の処方剤を提供する。
【００１１】
配列番号：２のアミノ酸配列をもつタンパク質をコードする核酸配列を作製するための核酸の暗号は、当業者にとって予測可能であるため、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸配列およびこれらの核酸配列の配列番号：１について説明したような実施形態を含む。
【００１２】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列またはその断片をもつタンパク質によって哺乳動物を免疫して作製された、ｈＣＤＳ１タンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。
【００１３】
また、本発明は、配列番号：２の配列中のアミノ酸置換で、同等であると合理的に予想できる置換をもつ同等のタンパク質、およびその実施形態で配列番号：２について説明したようなものも含む。例えば、非極性（疎水性側鎖）アミノ酸のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；非荷電性極性アミノ酸のグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；荷電性極性アミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性アミノ酸のリジン、アルギニン、およびヒスチジンが、置換されたときに機能的に予測可能な効果をもつものと当業者に理解されている。したがって、本発明は、このような同等のタンパク質をコードする同等の核酸、およびその実施形態で配列番号：１について説明したような実施形態も含む。
【００１４】
また、本発明は、組換えＤＮＡ技術と、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク質、またはその断片をコードする適当な核酸を用いて、ｈＣＤＳ１タンパク質を生成する方法も提供する。本発明は、適当な核酸配列を適当な発現ベクターの中に、誘導的または定常的に発現させるためのプロモーター、エンハンサーなどの適当な調節因子とともに組み込むことを提供する。本発明は、少なくとも１つの付加的な選抜マーカーまたは発現可能なタンパク質をもつ発現ベクター、またはそれをもたない発現ベクターを使用することを提供する。本発明は、適当に構築された発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換するか導入して、そのような細胞によってタンパク質を発現させる方法を提供する。したがって、本発明はまた、形質転換された宿主細胞でｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク質、またはその断片を産生することのできる細胞も提供する。
【００１５】
ＤＮＡ損傷チェックポイントにおいて、ｈＣＤＳ１はＣｄｃ２５と協調して働くという発見によって、ＤＮＡ損傷チェックポイントの異常な機能を含む病気を治療するための方法において、本発明の化合物の使用が可能になる。本発明はさらに、ガンを治療するための治療薬として本発明の化合物を使用することを提供する。特に本発明は、細胞中でｈＣＤＳ１−Ｃｄｃ２５ＤＮＡ損傷チェックポイントを特異的に改変することを可能にする。
【００１６】
また、本発明は、ｈＣＤＳ１による真核細胞のチェックポイント機能に影響を与える試験化合物の有効性をスクリーニングするための方法で、試験化合物を真核細胞に接触させること、およびｈＣＤＳ１の発現または機能の変化を検出することを含む方法も含む。したがって、本発明はさらに、ｈＣＤＳ１の発現または機能の変化検出を、ｈＣＤＳ１  ｍＲＮＡ産生のアッセイまたはｈＣＤＳ１タンパク質発現のアッセイにより行うことを特徴とするスクリーニング法を含む。特に本発明は、Ｃｄｃ２５リン酸化またはキナーゼ活性の変化をスクリーニングして、ＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾する効果をもつ候補物質をスクリーニングすることを可能にする。本発明のアッセイ法によって同定される化合物または物質、またはそのような化合物または物質に相当する化合物は、治療薬を製造するために用いることができる。
【００１７】
このように、一つの実施形態において、本発明はｈＣＤＳ１タンパク質、ｈＣＤＳ１核酸、ｈＣＤＳ１アンチセンス核酸を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明のアッセイ法によって治療薬として使用するのに適すると同定された化合物または物質を薬学的処方剤として提供する。これらの薬学的組成物はさらに、ガンを治療するときに用いるための化学療法剤または別の抗ガン剤の投与をともなう療法で投与される化学療法剤を含むことができる。本発明はしたがって、一つの実施形態において、ｈＣＤＳ１由来の薬剤を他の化学療法剤とは独立に、または一緒に組み合わせて使用する組み合わせ化学療法のための方法を含み、第２の実施形態においては、一回投与のための他の抗ガン治療剤との混合物を含む。
【００１８】
本発明の一つの局面において、図２（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列をもつｈＣＤＳ１タンパク質をコードする核酸、または該タンパク質の機能的に同等な断片またはこれらの生物学的前駆体をコードする核酸が提供されている。好ましくは、核酸はゲノムＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子であり、より好ましくはｃＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡでもよい。
【００１９】
好ましい実施形態において、ｈＣＤＳ１タンパク質をコードする核酸は、図１に示された核酸配列（配列番号：１）の６６番目から１６９４番目に示されている核酸配列、その相補配列またはそれらのいずれかに高い厳密度条件下でハイブリッド形成することのできる核酸配列を含む。
【００２０】
ここで特定された核酸配列は、低い緊縮条件下においても、ファミリーのメンバーに由来する核酸配列とハイブリダイズでき、それらからの相同遺伝子であるかあるいは別種に由来する核酸配列であるかを確認することができる。
【００２１】
当業者に公知なように、遺伝子暗号の縮重によって、本発明に記載された核酸配列は、その中に置換があるが、なお同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００２２】
有利には、本発明に記載された核酸は発現ベクターに組み込まれ、次いで適当な宿主細胞を形質転換トランスフェクションまたは感染させるために用いることができる。このような発現ベクターの中で、本発明による核酸は適当なプロモーターなどの調節配列に機能的に連結して、適当な宿主細胞内で本発明に記載されたタンパク質が確実に発現するようにする。発現ベクターは、有利にはプラスミド、コスミド、ウイルス、またはその他の適当なベクターである。この発現ベクターおよびこのベクターによって形質転換または感染を受けた宿主細胞も本発明の一部を構成する。好ましくは、宿主細胞は真核細胞または細菌細胞であるが、より好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞である。哺乳動物の宿主細胞は、本発明に記載された発現タンパク質に最適な生物学的活性を付与し、単離して診断キットなどに都合よく使用することのできるグリコシル化などの必要な翻訳後修飾を該タンパク質に行なうことができるため、とりわけ有利である。
【００２３】
本発明に記載された該核酸を含む発現ベクターはインビボで、例えば遺伝子治療などで適宜用いることができる。
【００２４】
本発明のさらなる局面では、ｈＣＤＳ１タンパク質で、図２（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列またはそれと機能的に同等なもの、または生物学的前駆体、またはその断片を含むタンパク質を発現することのできる導入遺伝子を含む遺伝子導入細胞、組織または生物が提供される。本明細書で使用されている「発現することのできる導入遺伝子」という語は、ｈＣＤＳ１またはこれと同一の機能、および／または活性をもつタンパク質の発現をもたらす適当な核酸配列を意味する。導入遺伝子には、例えば、ゲノムに組み込まれたまたは染色体外にあるＤＮＡを含んだ、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸または合成核酸を含む。好ましくは、導入遺伝子は、本明細書で説明されているような本発明に記載のタンパク質をコードする核酸または該核酸の機能的な断片を含む。該核酸の機能的な断片とは、本発明に記載のタンパク質、または該タンパク質の機能的同等物、派生物、もしくは優性の負の突然変異体などの非機能的派生物、または生物学的前駆体をコードする該核酸を含む遺伝子断片を意味するものである。例えば、該核酸によってコードされるタンパク質の配列を変えることなく、または本発明に記載の機能的なタンパク質をコードするように日常的な技術を用いて、塩基置換または欠失を行なうことができることは、当業者が容易に想到できよう。
【００２５】
該遺伝子導入細胞、組織または生物によって発現されるｈＣＤＳ１タンパク質、または該タンパク質の機能的同等物、または生物学的前駆体も、本発明の一部を構成するものである。
【００２６】
さらに本発明によって提供されているのは、本発明に記載の核酸とハイブリッド形成することのできるアンチセンス分子である。本発明に記載のアンチセンス分子は、適宜治療薬として、またはガンおよびその他の増殖性疾患の治療用の治療薬の調製に用いることができる。
【００２７】
また本発明は、少なくとも約１５ヌクレオチドからなる、好ましくは１５から５０ヌクレオチドからなる、本発明に記載の核酸の核酸配列を適宜提供する。これらの配列は、複製などを開始させるためのプローブまたはプライマーとして適宜用いることができる。このような核酸配列は、組換え法または合成法など、当技術分野において公知の技術によって作製することができる。これらは、本発明に記載の核酸が存在することを検出するための診断用キットなどで使用することもできる。これらの検査は、一般的に、ハイブリッド形成する条件下でプローブとサンプルとを接触させること、および、プローブとサンプル中の核酸との間に形成された二本鎖または三本鎖を検出することを含む。
【００２８】
本発明に記載の核酸配列は、有利には、例えば、クローニングしたい遺伝子の領域に対する約１５から５０ヌクレオチドからなる一組のプライマーを作り、このプライマーをヒト細胞由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡと接触させ、所望の領域（必要であれば最初に逆転写ステップを行うこと）の増幅を生じるような条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行ない、増幅された領域または断片を単離し、増幅されたＤＮＡを回収するということを一般的に含むＰＣＲクローニングのメカニズムなどの組換え法または合成法などを用いて作製することができる。一般的には、ここで定義されているような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９８９）に記載されているように、当技術分野において公知である。例えば、別個の集団に由来する個体範囲からのゲノムＤＮＡライブラリーのプローブ検索また他の遺伝子型決定技術を用いて、本発明に記載の核酸のヒト対立遺伝子変異体を得ることができる。さらに、本発明に記載の核酸およびプローブを用い、当技術分野において公知の技術、例えばサンガーのジデオキシチェーンターミネーション法を用いて、患者からのゲノムＤＮＡの配列を決定して、有利にはある種の増殖性疾患に対する患者の素因を確認することができる。
【００２９】
さらに、本発明によって提供されているのは、図２（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列をもつ単離タンパク質、または該タンパク質と機能的に同等な機能的断片、または生物学的前駆体のアミノ酸配列をもつ単離タンパク質、また、これらのタンパク質またはそれらの断片に結合することのできるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。当業者には公知であろうが、本発明は保存的置換、欠失、または挿入により図２に開示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含むタンパク質を含むが、そのような置換、欠失、または挿入は、本発明に記載のタンパク質の活性やヒト細胞周期チェックポイント経路における相互作用能力に影響を与えることはない。
【００３０】
好ましい断片は、本発明に記載のタンパク質のエピトープを含む断片である。エピトープは、例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２３：７０９−７１５  （１９８６）に記載されているペプチド走査技術などを用いて決定することができる。
【００３１】
本発明に記載の抗体は、当技術分野において既知の技術によって作製することができる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ＦとＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ  （１９８５），  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に記載されている通常のハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。ポリクローナル抗体も当業者に公知の従来の技術を用いて調製することができるが、これはマウスなどの宿主動物に本発明に記載のタンパク質またはエピトープを接種して、免疫された血液を回収することを含む。本発明は、また、結合活性を維持している抗体全体の断片、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）２断片ならびに一本鎖抗体も含む。
【００３２】
本発明に記載の核酸および／またはタンパク質は、適宜、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに薬学的組成物に入れることができる。本発明に記載の核酸を含む薬学的組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。本発明に記載のこのような核酸は、剥き出しのまま、または、タンパク質製カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜を基質とするカプセル、ウイルスタンパク質、ウイルスそのもの、細胞ベクター、細菌細胞宿主、改変された哺乳細胞宿主、またはその他の投与に適した方法でパッケージして投与することができる。
【００３３】
本発明によってさらに提供されているのは、生物サンプルにおいて本発明に記載の核酸の有無を検出するための方法であって、ａ）該サンプルをハイブリッド形成する条件下で本発明に記載の核酸またはプローブを含むプローブと接触させること、およびｂ）例えば、該プローブと該サンプル中に存在する核酸との間に形成される二本鎖または三本鎖を検出することによってハイブリッド形成を検出することを含む方法である。本発明に記載のタンパク質も、ａ）該サンプルを抗体と接触させて、抗原−抗体複合体が形成される条件下で本発明に記載のタンパク質のエピトープに結合させること、およびｂ）抗原−抗体複合体の存在を観察することによって検出することができる。
【００３４】
該核酸およびタンパク質を検出するためのキットも、本発明によって提供される。生物サンプルにおいて本発明に記載の核酸を検出するためのキットは、（ａ）サンプルを本発明に記載の核酸またはプローブを含むプローブと接触させる手段、および、該プローブとサンプル中に存在する核酸との間に形成される二本鎖または三本鎖の形成を検出するための方法とを含むであろう。
【００３５】
同様に、生物サンプル中に本発明に記載のタンパク質が存在することを検出するためのキットは、（ａ）抗原−抗体複合体が形成される条件下で該サンプルと本発明に記載のタンパク質のエピトープに結合する抗体とを接触させる手段、および該サンプルを観察して、抗原−抗体複合体の存在を調べる手段を含むであろう。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、ある化合物がヒト細胞周期チェックポイント経路タンパク質のいずれかのインヒビターであるかアクチベーターであるかを決定する方法であって、該経路でタンパク質を発現している細胞を該化合物と接触させること、および該細胞のいずれかのチェックポイント経路タンパク質の発現レベルを該化合物と接触させていない細胞と比較することを含む方法を提供する。そして、同定された化合物は、有利には、ガンまたは増殖性疾患を治療するための治療薬として、または治療薬の調製に用いることができる。あるいは、この化合物を薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに薬学的組成物に含ませることができる。細胞チェックポイント経路のインヒビターと同定された化合物は、有利にはＤＮＡ損傷化学療法剤などの細胞毒性因子、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに本発明に記載の薬学的組成物に含ませることができる。したがって、ヒト細胞周期チェックポイントインヒビターは、例えば、抗ガン療法に用いられる細胞毒剤の化学治療的効果を増強することができる。
【００３７】
抗ガン治療のための候補物質をスクリーニングするための方法で、ａ）キナーゼが基質に対して作用するような条件下で、キナーゼ活性を示す本発明に記載のタンパク質を該タンパク質に対する基質とともに提供すること、ｂ）タンパク質と基質を候補物質に接触させること、ｃ）タンパク質のキナーゼ活性の増加および減少の程度を測定すること、及びｄ）活性の増加または減少をもたらす候補物質を選択することを含む方法が、本発明によって提供されている。このような候補物質も、ガンまたは増殖性細胞疾患を治療するための治療薬として、または、治療薬の調製に用いることができる。
【００３８】
また、本発明は、細胞のチェックポイント経路で活性をもつ他のタンパク質を同定する方法において、ａ）適当な結合条件下で細胞抽出物を抗体と本発明に記載のタンパク質のエピトープに対する抗体とを接触させること、ｂ）抗原−抗体複合体を同定すること、および、ｃ）複合体を解析して、または本発明に記載のタンパク質以外の抗体またはタンパク質に結合したタンパク質を同定することを含む方法を含む。
【００３９】
細胞のチェックポイント経路に関与するタンパク質を同定するための別の方法は、Ｃｈｉｅｎら、前掲（１９９１）によって酵母で開発された２ハイブリッドシステムを利用する方法である。この技術は、レポーター遺伝子を活性化させる転写因子をインビボで機能的に再構成させることに基づく技術である。より特定すると、この技術は、ＤＮＡ結合部位と活性化部位をもつ転写因子によって制御されているプロモーターの調節下にあるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有する適当な宿主細胞を提出すること、宿主細胞の中で、本発明に記載の核酸配列の断片または全配列と転写因子の該ＤＮＡ結合部位または活性化部位のいずれかとの第１の融合配列をコードするハイブリッドＤＮＡ配列を発現させること、宿主細胞の中で、調べたい推定結合タンパク質と転写因子のＤＮＡ結合部位または活性化部位であって第一の融合配列に組み込まれなかった部位とをコードする、（少なくとも一つの）第二のハイブリッドＤＮＡ配列を発現させ；調べようとするタンパク質が本発明に記載のタンパク質と結合することを、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物を検出することによって検出し；任意には、結合タンパク質をコードする第二のハイブリッドＤＮＡ配列を単離することを含む。本発明のこの局面における一つの実施形態において、この方法は、
（ａ）一つのベクターが、本発明に記載のタンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合したＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド分節を含み、第２のベクターが、調べようとするタンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合したＧＡＬ４のタンパク質結合部位をコードする核酸配列を含む、少なくとも２種類のヌクレオチドベクターを構築すること、
（ｂ）該ベクターを、ガラクトースを代謝するタンパク質をコードする遺伝子の転写に欠損をもつ酵母細胞に同時形質転換することを含む、これにより該試験タンパク質と本発明記細のタンパク質との間の相互作用がガラクトース代謝遺伝子の転写をもたらす。
【００４０】
本発明は、実施例としてのみ示される以下の実施例から、添付の図面を参照して、より明確に理解することができよう。
【００４１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、新規のヒトチェックポイントキナーゼ遺伝子とｈＣＤＳ１と呼ばれるタンパク質を単離し、特徴を調べることを含む。ｈＣＤＳ１遺伝子とタンパク質は、分裂酵母に存在する相同遺伝子とタンパク質に類似性を示す。
【００４２】
分裂酵母のｃｄｓ１＋遺伝子は、それがＤＮＡポリメラーゼα変異体に相補できることから同定された（ＭｕｒａｋａｍｉとＯｋａｙａｍａ，  １９９５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７４：８１７−８１９）。分裂酵母ｃｄｓ１は、分裂酵母のｒａｄ１、ｒａｄ３、およびｒａｄ９変異菌株のヒドロキシウレア感受性（ＤＮＡ複製依存型チェックポイント）を抑制することもできたが、ＵＶ感受性（ＤＮＡ損傷依存型チェックポイント）を抑制することはできなかった。これは、分裂酵母ｃｄｓ１が、ＤＮＡ合成の間にそのチェックポイント機能を発揮することを示すものである。
【００４３】
分裂酵母ｃｄｓ１は、出芽酵母のチェックポイント遺伝子ＲＡＤ５３に７０％相同なプロテインキナーゼと推定されている。出芽酵母では、ＤＮＡ損傷型およびＤＮＡ複製型のチェックポイントは、ＤＮＡ損傷を検出するレベルで遺伝子的に分かれる。そして、２つの経路は、シグナル伝達経路において増幅因子として作用する可能性をもつＲａｄ５３プロテインキナーゼに収束する。これは、分裂酵母には当てはまらず、そこでは同じタンパク質がすべての型の損傷の検出に関与するが、シグナル伝達は、異なったプロテインキナーゼが関与する、ＤＮＡ複製型チェックポイントでは分裂酵母ｃｄｓ１、およびＤＮＡ損傷型経路ではＣｈｋ／Ｒａｄ２７といった異なった経路をたどる。ｃｄｓ１キナーゼのＳ期特異的活性化が、分裂酵母におけるチェックポイント応答の副次的経路が決定することが示唆されている（Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９８，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２：３８２−３９５）。
【００４４】
分裂酵母ｃｄｓ１は、ＤＮＡポリメラーゼαと相互作用を介してＤＮＡ複製の進行または複製複合体の完全性を監視する可能性がある。ＤＮＡポリメラーゼαと結合する適当な分子量のキナーゼについては、ショウジョウバエでその証拠が見られる（Ｐｅｃｋら、１９９３，  Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，  １９０：３２５−３３１）。あるいは、Ｇ１／Ｓ期サイクリン依存型キナーゼの活性に最終的な影響を与えるＣｈｋ１と同じような方法で、ｐ１０７ｗｅｅｌのリン酸化を通して作用するのかもしれない。
【００４５】
以下の実施例に記載した基礎的な分子生物学の実験を行うための方法と材料の多くは、当技術分野において既知のものであり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒら、分子クローニング技術への手引き（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），  Ｍｅｈｔｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １５２，  アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、（１９８７）；Ｄａｖｉｓら、分子生物学の基礎的方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、エスルヴィア・サイエンスパブリッシング（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．）（１９８６）；Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｍｅｈｔｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８５，  アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）（１９９１）；Ｇｕｔｈｒｉｅら、酵母の遺伝学および分子生物学への手引き（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｎｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｍｅｈｔｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １９４，  アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ第１巻（ＰＣＲ  Ｖｏｌｕｍｅ  １），  オクスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９１）などの参考文献で読むことができる。
【００４６】
本発明は、いくつかの局面において以下の実施例を概観することによって、より容易に理解することができる。
【００４７】
実施例１．ｈＣＤＳ１の単離
ＴＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、分裂酵母ｃｄｓ１＋に類似した配列を検索することから、ｈＣＤＳ１の単離を開始した。商標登録されたＬｉｆｅＳｅｑデータベース（米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）のインサイト・ファーマシューティカルズ社（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．））の中からヒトの発現配列（ＥＳＴ番号：８６４１６４）を同定した。１．３ｋｂの挿入配列を解析したところ、分裂酵母のｃｄｓ１に類似した不完全なオープンリーディングフレームが明らかになった。マラソン既製（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ）ヒト胎盤ｃＤＮＡ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用い、製造業者の指示にしたがって５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を行なって、約６５０ヌクレオチドの新規の５’側ＤＮＡ配列が得られた。
【００４８】
概要を説明すると、ネスティドＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応に使用したｈＣＤＳ１遺伝子に特異的な２種類のプライマーは、ＧＳＰ３  ５’−ＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣ−３’  （配列番号：３）、およびＧＳＰ４  ５’−ＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴ−３’  （配列番号：４）であった。その後、下記のＰＣＲプライマーを用いてヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽細胞ｃＤＮＡライブラリーからｈＣＤＳ１の完全なＯＲＦを増幅した。
５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＴＧＴ−３’（配列番号：５）
および
５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：６）。そして、この増幅産物をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングして、ＤＮＡ配列を決定した。
【００４９】
ｈＣＤＳ１の核酸配列は、分裂酵母ｃｄｓ１＋にＤＮＡレベルで４７．８％の同一性を示すことが分かった。ｈＣＤＳ１の開始コドンと思われるところから５’側に１２０塩基の中に３つの読み取り枠全部に終止コドンが存在したが、このことは完全長のコーディング領域が単離されたことを示している。配列の一部が、ＮＣＢＩのデータベース中の部分配列であるＥＳＴ  ＡＡ２８５２４９、ゲノム配列Ｈ５５４５１、および５４塩基の断片Ｈ５５６９８と一致することも分かった。
【００５０】
ｈＣＤＳ１の核酸配列をコードする同定されたヒト遺伝子とベクターは、プラスミドＨＣＤＳ１  ＯＲＦ／ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔとして寄託番号ＬＭＢＰ  ３７０８の下に、プラスミドＨＣＤＳ１  ５’ＲＡＣＥ断片／ｐＧＥＭ−Ｅａｓｙは寄託番号ＬＭＢＰ  ３７１０として、また、プラスミドＨＣＤＳ１  ３’断片Ｉｎｃｙｔｅクローン８６４１６４／ｐＳＰＯＲＴは寄託番号ＬＭＢＰ  ３７０９として、１９９７年４月２８日のブダペスト条約の規定にしたがって、ベルギー国ゲント（Ｇｅｎｔ）Ｂ−９０００の分子生物学用プラスミド受託研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  Ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｅ）（ＬＭＢＰ）３５にあるベルギー微生物共同受託機関（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＢＣＣＭ）に寄託されている。
【００５１】
ｈＣＤＳ１の組織発現分布を、ｈＣＤＳ１  ＯＲＦをプローブとして、複数組織ノザンブロット（クローンテック社）と、ガン細胞系ノザンブロット（クローンテック社）で調べた。約２．１ｋｂの単一の転写産物が見られた。通常のノザンブロットハイブリダイゼーション条件によっては、調査した正常なヒト組織のすべてで発現を検出することはできなかった。しかし、調査したガン細胞のすべてで発現が大きく上昇していることが分かった。
【００５２】
全長ＯＲＦをＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）解析用のプローブとして用いて決定したところ、ｈＣＤＳ１遺伝子は染色体の２２ｑ１１．２−ｑ１２に位置していた。ハイブリダイゼーションの効率は約６２％で、用いた条件下ではこの他の遺伝子座は検出されなかった。
【００５３】
概要を説明すると、ヒト血液から単離されたリンパ球を、１０％ウシ胎児血清とフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加したα最小必須培地（ＭＥＭ）の中で、３７℃で６８−７２時間培養した。細胞集団を同調させるために、リンパ球培養液をＢｒｄＵ（０．１８  ｍｇ／ｍｌ，  シグマ社）で処理した。同調した細胞を、無血清培地で３回洗浄してブロックを外し、チミジン（２．５μｇ／ｍｌ，  シグマ社）入りのα−ＭＥＭで３７℃６時間再培養した。細胞を回収して、低張処理、固定、および風乾などの標準的な手順を用いて、スライドを調製した。ｈＣＤＳ１の全長ＯＲＦを含むＤＮＡ断片をゲル精製し、ＢＲＬ  ＢｉｏＮｉｃｋ標識キットを用いて（１５℃で１時間）、ｄＡＴＰでビオチン化した（Ｈｅｎｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：９５０９−９５１３）。
【００５４】
そして、スライドを５５℃で１時間乾燥させ、ＲＮａｓｅ処理後、スライドを２×ＳＳＣ中７０％ホルムアミドで２分間７０℃で変性させた後、エタノールで脱水した。プローブは、５０％ホルムアミドおよび１０％デキストラン硫酸からなるハイブリダイゼーション混合液中で、７５℃で５分間変性させた。プローブを変性させた染色体スライドに載せた。一晩ハイブリダイゼーションを行なった後、スライドを洗浄してから検出を行なった。ＦＩＳＨシグナルとＤＡＰＩバンドパターンを、写真に撮って別々に記録した。染色体バンドによるＦＩＳＨマッピングデータの特定を、ＦＩＳＨシグナルをＤＡＰＩでバンド化した染色体と重ね合わせることによって行なった（ＨｅｎｇとＴｓｕｉ，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３３：３５−４９）。
【００５５】
実施例２．  ｈＣＤＳ１タンパク質の特徴づけ
ｈＣＤＳ１  ｃＤＮＡの核酸配列から、分子量約６１ｋＤａの５４３アミノ酸の翻訳産物が推定された。これは、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の内生Ｃｄｓ１タンパク質の見かけ上の分子量に近い。推定されたｈＣＤＳ１タンパク質は、分裂酵母のｃｄｓ１タンパク質と２８％、出芽酵母のＲＡＤ５３と２８％、ＤＵＮ１キナーゼと２７％それぞれ一致している。これらの見かけ上の相同遺伝子の配列アラインメントは、キナーゼ部位以外のところにフォークヘッド関連保存部位（Ｆｏｒｋ  Ｈｅａｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９５，  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０：３４７−９）など、いくつかの配列類似領域があることを示している。ヒトのタンパク質は、ＲＡＤ５３に見られる長いＣ末端配列をもたないという点で、分裂酵母のＣＤＳ１および出芽酵母のＤＵＮ１と全体的な構造が同一であることを示している。ｈＣＤＳ１によるノザンブロット解析によって、検査した精巣と８個のヒトのガンのサンプルから約２．２ｋｂの単一の転写産物を同定した。
【００５６】
概要を説明すると、２つの複数組織ノザンブロット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））とガン細胞系ノザンブロット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））が、ｈＣＤＳ１のｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。このプローブは、上記の全長ＯＲＦと一致する。ブロットを高厳密度条件（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃，２×２０分）で洗浄して、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ＯＭＡＴオートラジオグラフィーフィルムを増感スクリーンとともに−７０℃で用いて感光させた。
【００５７】
実施例３．  Ｃｄｃ２５の全活性アッセイ法
ＤＮＡ損傷の下でＣｄｃ２の脱リン酸化が下方制御されるという可能性を調べるためには、Ｃｄｃ２５の全活性の解析を可能にするアッセイ法が必要であった。ＥＤＴＡ存在下では、非同調ＨｅＬａ細胞抽出物から採取したＣｄｃ２／サイクリンＢは、そのままでは不活性化することが分かった。
【００５８】
簡単に言うと、細胞を氷冷した溶解バッファー（２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド、および５μｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、およびアプロチニンを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４）に溶解させた。１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して溶解液を清澄にし、ローリー法を用いて上清のタンパク質濃度を測定した。１０ｍＭのＥＤＴＡを上清に加え（６０μＬ中１００μｇ）、３０℃でインキュベートして反応を開始させた。抗サイクリンＢ免疫沈殿中に存在するヒストンＨ１キナーゼ活性を測定して、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性を測定時間毎に測定した（Ｂｌａｓｉｎａら、前掲）。免疫ブロットのために、抗サイクリンＢ抗体を用いて４００μｇの細胞溶解液を免疫沈殿させ、１１％アクリルアミド−ＳＤＳゲルで分析した。Ｃｄｃ２に対するＰＳＴＡＩＲＥモチーフに対するモノクローナル抗体を用いて、Ｃｄｃ２の異なったリン酸型を検出した。
【００５９】
活性化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の移動度の遅い分子種として見えるリン酸化により阻害されたＣｄｃ２の消失と比例する。活性化は、Ｃｄｃ２５やその他のチロシンホスファターゼのインヒビターであるバナジウム酸によって阻害された。さらに、Ｃｄｃ２５特異的な抗血清によって免疫涸渇させると、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化は大きく減少した。Ｃｄｃ２およびサイクリンＢのレベルは上昇せず、ＷＥＥ１およびＭｙｔ１によるリン酸化は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることによって阻害された。このような結果は、Ｃｄｃ２の活性化は脱リン酸化によって起こることを示している。非同調ＨｅＬａ細胞の細胞溶解液において、内生Ｃｄｃ２５のホスファターゼ活性は、利用可能なＣｄｃ２／サイクリンＢの８０％以上を３０分間でリン酸化して活性化するのに十分である。回収する１時間前に１０Ｇｙのτ線照射してＤＮＡ損傷を与えたＨｅＬａ細胞の細胞溶解液を解析したところ、Ｃｄｃ２の活性化の割合は有意に低下し、３０分間のインキュベーションでは利用可能なＣｄｃ２／サイクリンＢの２５％までしか活性化されなかった。複合体になっているＣｄｃ２／サイクリンＢの量はさほど変化せず、また外来性ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を加えた対照用Ｃｄｃ２／サイクリンＢと同程度に活性化された。１０Ｇｙの照射は、１０の経時点を調べたところ、Ｃｄｃ２の脱リン酸化の割合は３倍以上減少させた。上記で測定されたＣｄｃ２５の不活性化がヒト細胞におけるＤＮＡ損傷チェックポイント反応の一部であるならば、ＤＮＡ損傷チェックポイントを乗り越えられるような実験条件を設定することによって、放射線照射によって誘導されたＣｄｃ２５の阻害を防止することができると思われる。
【００６０】
実施例４．  ｈＣＤＳ１のＤＮＡ損傷チェックポイント効果
さまざまな細胞におけるＤＮＡ損傷反応には、構造的にはＰＩ−３キナーゼに似た、さまざまな関連キナーゼが必要なことが知られている。少なくともファミリーの１つであるＤＮＡプロテインキナーゼは、インビトロでウォルトマンニン感受性であることが示されている（Ｈａｗｌｅｙら、１９９６，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  １０：２３８３−８；  Ｈａｒｔｌｅｙら、１９９５，  Ｃｅｌｌ，  ８２：８４９−８５６）。このため、ウォルトマンニン感受性のキナーゼが放射線で誘導されるＭ期開始遅延の上流に作用する可能性を調べた（Ｐｒｉｃｅら、１９９６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５６：２４６−２５０）。ＨｅＬａ細胞は、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）によってＭ期で停止させることができ、放射線照射はノコダゾール感受性Ｍ期阻害点よりも前のＧ２期での遅延を生じさせる。したがって、ノコダゾール中で培養している細胞の有糸分裂指数を記録することによって、有糸分裂への進行が遅れているかどうかを判定することができる。ノコダゾール存在下で１４時間培養した対照用細胞は６０％の有糸分裂細胞を含んでいたが、ウォルトマンニンはこの数にはほとんど影響を与えなかった。しかし、放射線照射によって、ノコダゾール阻害点にまで到達する細胞数は１０％にまで減少した。これに対して、ウォルトマンニン存在下での照射はわずかな影響しかもたらさなかった。これらの結果は、ウォルトマンニンがＨｅＬａ細胞のＤＮＡ損傷によるＧ２チェックポイントを克服できることを示している。
【００６１】
次に、放射線誘導によるＣｄｃ２５の不活性化に対するウォルトマンニンの効果を調べた。放射線照射していない培養細胞から調製した抽出液中では、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化に対するウォルトマンニンの効果はほとんどなかったが、放射線照射によるＣｄｃ２５活性低下を大きく減少させた。
【００６２】
また、放射線照射によるＧ２チェックポイントは、遺伝性毛細血管拡張性運動失調症の患者に由来する細胞系でも無効化されている。毛細血管拡張性運動失調変異細胞は、Ｇ１およびＧ２チェックポイントに欠損があり、ＤＮＡを損傷する薬剤のすべてにではないが、その多くに曝される（Ｃａｎｍａｎら、１９９４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５４：５０５４−５０５８）。ＡＴ欠損細胞がＧ１遅延を生じることができなくなることは、ｐ５３の上方制御ができなくなることと相関があり（Ｋａｓｔａｎら、１９９２，  Ｃｅｌｌ，  ７１：５８７−５８９）、ｃＡｂ１をリン酸化して活性化できなくなることとも相関がある（Ｂａｓｋａｒａｎら、１９９７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８７：５１６−５１９；  Ｓｈａｆｍａｎら、１９９７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８７：５２０−５２３）。Ｇ２期を遅延できなくなることの分子的な原理は解っていない。ＡＴ欠損細胞では、電離性τ線などの染色体切断を生じさせる因子に対する反応が非常に鈍いことが分かる。特筆すべきは、ＵＶ源を用いた照射によって生じる塩基損傷後では、ＡＴ欠損細胞はほぼ正常な反応を示すことである（Ｃａｎｍａｎら、１９９４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５４：５０５４−５０５８；  Ｐａｉｎｔｅｒら、１９８０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：７３１５−７３１７；  Ｚａｍｐｅｔｔｉ−Ｂｏｓｓｅｌｅｒら、１９８１，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ３９：５４７−５５８）。ＡＴ＋またはＡＴ−のＳＶ４０で形質転換したヒト線維芽細胞系のＣｄｃ２５活性に対するＵＶとτ線照射の影響を調べた。ＡＴ−細胞は、ＵＶ照射に対して、Ｃｄｃ２が脱リン酸化される比率を確実に低下させて反応する。これに対し、τ線照射はＣｄｃ２の脱リン酸化の割合にはほとんど影響を与えなかった。ＡＴ＋細胞においては、イオン化照射後もしくはＵＶ照射後のいずれかで、Ｃｄｃ２の脱リン酸化比率は有意に低下した。これらのデータは、τ線照射後のＣｄｃ２５の効率的な不活性化にはＡＴＭ遺伝子産物が必要であることを示しており、またＤＮＡ損傷後のＣｄｃ２５の不活性化とＭ期への進行遅延との間に相関関係があることを示している。
【００６３】
ヒト細胞におけるＣｄｃ２５のチェックポイントに依存した不活性化のメディエーターは、抗ガン治療を促進し、正常細胞への副作用を低下させる治療薬や治療法を作り上げるための優れた標的である。
【００６４】
ｈＣＤＳ１の生化学的な特徴づけを容易に行うために、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１を昆虫細胞で発現させ、アフィニティー精製して、ＡＴＰ再生系存在下でＨｅＬａ細胞抽出液の中でインキュベートした。ＥＤＴＡを加えて抽出液中のキナーゼを阻害した。そして、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの脱リン酸化および活性化の割合を観察した。
【００６５】
概略を説明すると、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現システムを用いて、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１、６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２、およびＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃをコードする組換えウイルスを作製した。Ｋｕｍａｇａｉら、（１９９５），  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ６：１９９−２１３に記載されている方法にしたがって、６ｈｉｓ−融合タンパク質を精製した。ＧＳＨ−セファロースビーズをＳｆ９抽出液中で１５分間インキュベートし、遠心してビーズを集め、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％  ＮＰ４９，  ５％グリセロール、０．１％β−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼインヒビター）で３回洗浄した。リン酸化反応を行う前に、ビーズをキナーゼアッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４，  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回洗浄するか、ホスファターゼ反応前にホスファターゼアッセイバッファー（５０ｍＭイミダゾール  ｐＨ７．４，  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  および０．１％β−メルカプトエタノール）で３回洗浄した。
【００６６】
これらのアッセイにおいて、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１と６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１は、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化を有意に低下させることが分かった。Ｃｄｃ２の活性低下は、用量依存的でＡＴＰを必要とした。Ｃｄｃ２が６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１または６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によって非可逆的に阻害されるわけではないことは、キナーゼ処理後にＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を加えたときに活性化が生じることによって確認された。したがって、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１も６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１も、抽出液で見られる放射線照射によるＣｄｃ２５の下方制御を模倣することができるのである。これらの実験は、遠心分離によって清澄化されたＨｅＬａ細胞溶解液を用いたものであるから、細胞以外の場所での変化がＣｄｃ２５の不活性化をもたらした可能性はない（Ｐｅｎｇら、１９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１５０１−１５０５）
実施例５．  ｈＣＤＳ１のＣｄｃ２５に対する直接の効果
細胞溶解液アッセイ法では、ｈＣＤＳ１によってＣｄｃ２５を阻害する間接的な機構があるかもしれないという可能性を排除することはできないため、アフィニティー精製した試薬を用いて、ｈＣＤＳ１によるＧＳＴ−Ｃｄｃ２５活性の直接のリン酸化と阻害を測定した。
【００６７】
γ−３２Ｐ  ＡＴＰ存在下、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１、偽ビーズ、または６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１とともに１５分間３０℃でインキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、ラジオオートグラフィーで画像化した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１、および６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってリン酸化した。このリン酸化によってＣｄｃ２５ホスファターゼ活性が影響を受けるか否かを判定するためにアッセイを行なった。
【００６８】
ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を測定して、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ免疫沈殿物のヒストン−Ｈ１キナーゼ活性を活性化できるかを調べた。６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によるＧＳＴ−Ｃｄｃ２５のリン酸化は、Ｃｄｃ２／サイクリンＢを活性化するＧＳＴ−Ｃｄｃ２５の能力を阻害することが分かった。つまりこれらのデータは、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１がインビトロでＣｄｃ２５を不活性化し、またインビボではＤＮＡ損傷後にＣｄｃ２５が不活性化されることを明らかにしている。
【００６９】
６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１は、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５と結合して、インビトロでヒストン−Ｈ１キナーゼ活性をもつため（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：  １４９７−１５０１）、Ｃｄｃ２／サイクリンＢのキナーゼ活性の解析結果は不明瞭であった。ＧＳＴ−Ｃｈｋ１の影響を調べるために、ゲル移動度解析によって移動度の遅いＣｄｃ２分子種が消えることから、Ｃｄｃ２の脱リン酸化を観察するアッセイ法を用いた。
【００７０】
概略を説明すると、６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２、６ｈｉｓ−Ｗｅｅｌ、６ｈｉｓ−Ｍｙｔ１、およびＧＳＴ−サイクリンＢをコードする組換えバキュロウイルスを同時感染させたＳｆ９細胞から、脱リン酸化されたＣｄｃ２を精製した（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５７：１９５５−１９５７）。サイクリンＢと複合体を作る６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２を、溶解バッファーに１ｍＭ  ＶＯ４を加えた以外はＧＳＴ−Ｃｄｃ２５に対する条件と同じ条件でＧＳＨビーズを用いて精製した。ウエスタンブロット解析によって、この四重感染が、一つまたは二つの阻害部位で大部分のＣｄｃ２／ＧＳＴ−サイクリンＢをリン酸化することが明らかになった。これらのホスファターゼアッセイは、１０ｍＭ  ＥＤＴＡが存在しＡＴＰが存在しないという６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１がＣｄｃ２またはサイクリンＢを直接リン酸化するという可能性を排除する条件下で行なわれた。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、遅い移動度のリン酸化された型Ｃｄｃ２の還元を触媒する。６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１によって予めＧＳＴ−Ｃｄｃ２５をリン酸化することでＧＳＴ−Ｃｄｃ２５の活性は用量依存的に低下する。これらのデータによって、Ｃｈｋ１がＣｄｃ２５の活性を負に制御していることが確認される（Ｆｕｒｎａｒｉら、１９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１４９５−１４９７；  Ｗｅｉｎｅｒｔ，  １９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１４５０）、これを敷衍すれば、この負の制御が、ホスファターゼ活性の不活性化を含むことが示されているといえる。
【００７１】
実施例６．  ＤＮＡ損傷とｈＣＤＳ１の修飾
以前のデータによって、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１がＣｄｃ２５を不活性化することおよびＤＮＡ損傷がＣｄｃ２５の不活性化と関係することが示されていたため、ＤＮＡ損傷がｈＣＤＳ１に何らかの修飾または活性化をもたらすかを判定するためにアッセイを行なった。ＨｅＬａ細胞溶解液を用いた免疫複合体キナーゼアッセイ法において、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１に対して作製した抗血清を用いた。非同調ＨｅＬａ細胞由来のサンプルで、ｈＣＤＳ１に対応する弱いシグナルが検出され、放射線照射後にｈＣＤＳ１のリン酸化の上昇が見られた。
【００７２】
概略を説明すると、Ｓｆ９細胞から精製した６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってウサギを免疫して、ｈＣＤＳ１の抗体を作製した（Ｈａｒｌｏｗら、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８）。この結果できた抗血清は、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１ウイルスを感染させたＳｆ９細胞から得た予想分子量の活性キナーゼを免疫沈降させたが、非感染のＳｆ９細胞または６ｈｉｓ−ｈＣｈｋ１ウイルスを感染させた他の細胞からは予想分子量をもつ活性キナーゼを免疫沈降させなかった。
【００７３】
この結果は、４％ＳＤＳで変性させたタンパク質バンドを再沈殿させることによって、ｈＣＤＳ１によるものであることが確認された。インビトロでのリン酸化は自己リン酸化による可能性が最も高く、またシグナルの上昇は放射線照射後の活性の上昇を反映している。ｐ６４Ｃｄｓ１のインビトロでのリン酸化上昇は、ＲＡＤ５３やＤＵＮ１と同じように、ｈＣＤＳ１がＤＮＡ損傷に反応して修飾されることを示唆している。
【００７４】
さらにアッセイを行なって、ｐ６４Ｃｄｓ１のリン酸化に対するＤＮＡ合成停止の効果を調べた。複製期で停止した細胞からのｈＣＤＳ１は、非同調培養細胞から採取したタンパク質と同じような挙動をとり、ＤＮＡ複製を阻害するチミジンその他の薬剤に応答したリン酸化の有意な上昇は見られなかった。ｐ６４Ｃｄｓ１におけるリン酸化の上昇が、チミジンで停止させた細胞を放射線照射した後に検出された。主にＳ期以外で停止している細胞におけるＤＮＡ損傷の効果も調べた。放射線照射前に２０時間、ノコダゾール存在下で細胞を培養した。再び、非照射サンプルについて弱いが検出可能なシグナルが見られた。しかし、ノコダゾール停止細胞を放射線照射するとリン酸化の上昇が生じた。
【００７５】
これらの発見は、酵母で見られた結果と驚くほど対照的である。酵母では、分裂酵母のＣｄｓ１が不完全なＤＮＡ複製に応答して活性化されることが分かっている（Ｂｏｄｄｙら、１９９８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８０：９０９−１２；  Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９８，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  １２：３８２−９５）。ここでの結果は、以前酵母で発見された複製チェックポイントではなく、ＤＮＡ損傷チェックポイントにおけるヒトＣｄｓ１の役割を示している。
【００７６】
実施例７．  薬剤同定
上記のＣｄｃ２５アッセイ法は、活性が阻害されまたは活性化されることで、ｈＣＤＳ１およびＣｄｃ２５が調節するＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾する化学薬剤を同定するときに使用するのに適している。すなわち、一般的なスクリーニングアッセイ法では、上記と同じ条件と試験すべき薬剤を加えて用いる。アッセイする成分の活性の観察、すなわち上記したようなリン酸化の検出は、促進活性および阻害活性を検出するために対照用反応と比較して行なうことができる。
【００７７】
明らかに、このようなアッセイ法は、機械的／自動的な装置と検出に容易に応用することができる。公知アッセイ反応の基本的な要素とともに、このアッセイ法は、ＣＣＤ検出装置に連結させたセルバイオチップアレイまたは顕微鏡スライドアレイを組み込むことのできる自動高速大量低シグナル装置に使用することができ、また、リン酸化またはキナーゼ活性に対する他の反応によって生じる可視シグナルの使用に明らかに適している。
【００７８】
実施例８．  治療上の使用
ｈＣＤＳ１の特徴づけと、酵母に見られるような複製依存型チェックポイントにおいてではなく、ＤＮＡ損傷チェックポイントにおけるヒトＣｄｓ１の役割を明らかにすることによって、この知見を薬剤の調製およびガンの化学療法の付加剤として作用させるための治療法に応用することができる。
【００７９】
特に、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス分子、ｈＣＤＳ１タンパク質、ｈＣＤＳ１タンパク質に対する抗体、またはその他の本発明のアッセイ法によって同定された治療薬に相当するものを取り込んだ本発明の薬学的処方剤を、化学療法剤の主要な働きを補助薬として作用させるために、適当な化学療法剤とともに投与することができる。例えば、代謝拮抗剤、抗生物質、アルキル化剤、微小管阻害剤、ステロイドホルモン、その他の拮抗剤などの抗ガン剤の使用は、一般的に細胞複製に必須の代謝部位に向けられる。理想的には、これらの薬剤は悪性細胞に特異的な細胞プロセスにだけ介入するべきであるが、現在使用可能な抗ガン剤は、正常細胞であれ、悪性細胞であれ、すべての増殖細胞に作用する。このため、現行の化学療法は、毒性効果と治療効果の両方に関する急勾配の用量依存的な応答曲線によって阻害されている。したがって、本発明のｈＣＤＳ１を素材とする薬剤および本発明のｈＣＤＳ１アッセイによって同定された薬剤を、化学療法剤とともに同時投与すれば、悪性細胞の殺傷を促進することができよう。
【００８０】
殺傷を促進するための機構の一つは、悪性細胞のＤＮＡ損傷チェックポイントコントロールを不能にし、それによってＤＮＡ損傷化学療法剤の投与をより効果的にすることによってもたらされる。ＤＮＡ損傷チェックポイントコントロールを不能にすることは、上記のデータで示されているように、ｈＣＤＳ１応答を改変することによってもたらすことができる。
【００８１】
このように、ｈＣＤＳ１を素材とする新規の薬剤を一つ以上の抗ガン剤と組み合わせて同時に投与することが、本発明の意図するところである。例えば、シタラビン、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、メソトレキセート、６−チオグアニン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、プリカマイシン（Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、カルムスチン、イオムスチン、シクロホスファミド、イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、ストレプトゾトシン、ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ、登録商標）、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、インターフェロン、プロカルバジンなどの抗ガン剤をｈＣＤＳ１を素材とする適当な用量の薬剤とともに投与して、ａ）投与時間の長さを変える、ｂ）投与間隔時間を変える、ｃ）化学療法剤の悪性細胞に対する効果を変える、またはｄ）正常細胞に対する化学療法剤の副作用を変えることができる。ｈＣＤＳ１を素材とする薬剤を同時投与する効果は、他の効果に加えて、これらの効果の一つまたはその組み合わせたものとなりうる。
【００８２】
一般的には、化学療法剤によるガン細胞の破壊は、一次動力学に従って、対数殺傷効果（ｌｏｇ  ｋｉｌｌ  ｅｆｆｅｃｔ）をもたらす。したがって、ｈＣＤＳ１を素材とする薬剤の同時投与は、ログ殺傷効果を促進するように設計されるだろう。一般的には、化学療法のプロトコールには、代謝経路の異なった段階で作用する薬剤を組み合わせ、それによって、毒性レベル以下に保ったまま、殺傷作用を高めることが必要となる。したがって、ｈＣＤＳ１を素材とする薬剤の同時投与は、理想的には、そのようなプロトコールと組み合わせてその効果を向上させる。
【００８３】
究極として、最も効果的な治療法は、化学療法剤および／またはＭＤＲ（多剤耐性）阻害剤の標的投与をｈＣＤＳ１を素材とする薬剤と組み合わせて行ない、ＤＮＡ損傷回復なしに細胞自身の非制御的複製を行わせ、そして最終的に細胞死をもたらすことによって悪性細胞を特異的に狙った除去を行なうことであろう。
【００８４】
上記の考察と実施例は本発明を具体的に説明するためのものであるから、制約的なものと解されるべきではない。さらに別の変形形態を本発明の精神と範囲に含むことが可能であって、それらは当業者によって容易に想起できよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｈＣＤＳ１の核酸配列（配列番号：１）を示したもので、６６から１６９４番目の残基がコーディング配列であり、３’側および５’側非翻訳領域（ＵＴＲｓ）を含んでいる。開始コドンと終止コドンを太字で示す。
【図２】  ｈＣＤＳ１の推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示している。
【図３】  ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントプログラムを用いて行われたｈＣＤＳ１と分裂酵母のｃｄｓ１とのアミノ酸配列アラインメントと、ＧＥＮＥＤＯＣプログラムを用いたアノテーションを示す。黒く影をつけた残基が、２つのタンパク質で同一の残基であり、灰色で影を付けた残基が類似の残基である。
【配列表】
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0004261050.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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