(57)【要約】  被検体を検出するナノセンサーは、基板、ホトルミネセントナノ構造、及びホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを含むことができる。このナノセンサーは、インビボにおける生物医学適用に使用することができる。【選択図】図１
2016537644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を検出するためのナノセンサーであって：
支持体上に配置された基板ヒドロゲル；
基板ヒドロゲル上に配置されたセンサーヒドロゲル；
センサーヒドロゲル中に包埋されたホトルミネセントナノ構造；及び
ホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマー：を備える、前記ナノセンサー。
【請求項２】
前記被検体が、分子量100g/mol未満を有する、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項３】
前記被検体が、一酸化窒素である、請求項2記載のナノセンサー。
【請求項４】
前記ホトルミネセントナノ構造が、カーボンナノチューブを含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項５】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブである、請求項4記載のナノセンサー。
【請求項６】
前記単層カーボンナノチューブが、半導体単層カーボンナノチューブである、請求項5記載のナノセンサー。
【請求項７】
前記ポリマーが、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7を含む、請求項7記載のナノセンサー。
【請求項９】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の非存在下で、近赤外線を放出する、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１０】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の存在下で、近赤外線を放出する、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１１】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(2-ビニルピリジン)、又はポリ(マレイン酸)を含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１２】
前記被検体の濃度が、1μM未満である、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１３】
前記被検体とナノセンサーの間の相互作用が、被検体とホトルミネセントナノ構造の間の相互作用を含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１４】
前記基板ヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１５】
前記センサーヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１６】
前記ポリマーが、親水性ポリマーとオリゴヌクレオチドのコポリマーを含む、請求項1記載のナノセンサー。
【請求項１７】
前記親水性ポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)である、請求項16記載のナノセンサー。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7である、請求項16記載のナノセンサー。
【請求項１９】
前記コポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)とds(AAAT)7を含む、請求項16記載のナノセンサー。
【請求項２０】
対象において被検体を検出する方法であって：
センサーを対象へ導入すること（ここで該センサーは：
支持体上に配置された基板ヒドロゲル；
基板ヒドロゲル上に配置されたセンサーヒドロゲル；
センサーヒドロゲル中に包埋されたホトルミネセントナノ構造；及び
ホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマー：を備える）：並びに、
対象における該センサーからの輻射線の放出をモニタリングすることを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記ホトルミネセントナノ構造からのホトルミネセンスを検出することを更に含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記センサーの導入が、対象の組織へのセンサーの注入を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記基板ヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
前記センサーヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体が、分子量100g/mol未満を有する、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
前記被検体が、一酸化窒素である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記ホトルミネセントナノ構造が、カーボンナノチューブを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記単層カーボンナノチューブが、半導体単層カーボンナノチューブである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーが、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、請求項20記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(2-ビニルピリジン)、又はポリ(マレイン酸)を含む、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリマーが、親水性ポリマーとオリゴヌクレオチドのコポリマーを含む、請求項20記載の方法。
【請求項３４】
前記親水性ポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
前記コポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)とds(AAAT)7を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の非存在下で、近赤外線を放出する、請求項20記載の方法。
【請求項３８】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の存在下で、近赤外線を放出する、請求項20記載の方法。
【請求項３９】
前記被検体の濃度が、1μM未満である、請求項20記載の方法。
【請求項４０】
被検体を検出するセンサーを製造する方法であって：
支持体上に基板ヒドロゲルを配置すること；
基板ヒドロゲル上のセンサーヒドロゲル前駆体組成物からセンサーヒドロゲルをキャストすることを含み：
ここで、該センサーヒドロゲル前駆体組成物が、センサーヒドロゲル中のホトルミネセントナノ構造；及び、
ホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記基板ヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記センサーヒドロゲルが、アルギン酸ヒドロゲルを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
前記被検体が、分子量100g/mol未満を有する、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
前記被検体が、一酸化窒素である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記ホトルミネセントナノ構造が、カーボンナノチューブを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記単層カーボンナノチューブが、半導体単層カーボンナノチューブである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリマーが、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(2-ビニルピリジン)、又はポリ(マレイン酸)を含む、請求項40記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリマーが、親水性ポリマーとオリゴヌクレオチドのコポリマーを含む、請求項40記載の方法。
【請求項５２】
前記親水性ポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドが、ds(AAAT)7である、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
前記コポリマーが、ポリ(エチレンオキシド)とds(AAAT)7を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５５】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の非存在下で、近赤外線を放出する、請求項40記載の方法。
【請求項５６】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の存在下で、近赤外線を放出する、請求項40記載の方法。
【請求項５７】
前記被検体の濃度が、1μM未満である、請求項40記載の方法。
【請求項５８】
被検体を検出するためのナノセンサーであって：
液体媒体中のホトルミネセントナノ構造；及び
細孔を持つハウジング：を備え、ここで該ホトルミネセントナノ構造は、ハウジング内に含まれ、且つ細孔を通じて輸送される、前記ナノセンサー。
【請求項５９】
前記被検体が、グルコースである、請求項58記載のナノセンサー。
【請求項６０】
前記ホトルミネセントナノ構造が、カーボンナノチューブを含む、請求項58記載のナノセンサー。
【請求項６１】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブである、請求項60記載のナノセンサー。
【請求項６２】
前記単層カーボンナノチューブが、半導体単層カーボンナノチューブである、請求項61記載のナノセンサー。
【請求項６３】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の非存在下で、近赤外線を放出する、請求項58記載のナノセンサー。
【請求項６４】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の存在下で、近赤外線を放出する、請求項58記載のナノセンサー。
【請求項６５】
前記被検体とナノセンサーの間の相互作用が、被検体とホトルミネセントナノ構造の間の相互作用を含む、請求項58記載のナノセンサー。
【請求項６６】
対象において被検体を検出する方法であって：
センサーを対象へ導入すること（ここで該センサーは：
液体媒体中のホトルミネセントナノ構造；及び
細孔を持つハウジング：を備え、ここで該ホトルミネセントナノ構造は、ハウジング内に含まれ、且つ細孔を通じて輸送される）；並びに
対象における該センサーからの輻射線の放出をモニタリングすることを含む、前記方法。
【請求項６７】
前記ホトルミネセントナノ構造からのホトルミネセンスを検出することを更に含む、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
前記センサーの導入が、対象の組織へのセンサーの注入を含む、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
前記被検体が、グルコースである、請求項66記載の方法。
【請求項７０】
前記ホトルミネセントナノ構造が、カーボンナノチューブを含む、請求項66記載の方法。
【請求項７１】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブである、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
前記単層カーボンナノチューブが、半導体単層カーボンナノチューブである、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の非存在下で、近赤外線を放出する、請求項66記載の方法。
【請求項７４】
前記ホトルミネセントナノ構造が、被検体の存在下で、近赤外線を放出する、請求項66記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の請求）
本出願は、2013年9月16日に出願された、米国特許出願第61/878,303号の優先権を主張するものであり、この出願の全体は引用により組み込まれている。
【０００２】
（米国政府の助成した研究開発）
本発明は、米国立衛生研究所により拠出された助成金第ES007020号で、米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、ホトルミネセントナノ構造を含む、光学ナノセンサーに関連したシステム及び方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
小型分子は、ヒト体内のシグナル伝達経路の細胞内メッセンジャーとして役割を果たすことができる。例えば、一酸化窒素(NO)は、心臓血管系及び神経系におけるシグナル伝達に参加することができ、且つヒト免疫応答システムにおいて利用されることができる。小型分子の検出は、従来よりかなり困難であり、且つ低濃度では更により困難となり始める。かかる種を検出するために使用することができるツールの例としては、例えば、可視-蛍光プローブ、化学発光-ベースの装置、及びX-線光電子及び電子常磁性共鳴(EPR)分光法が挙げられる。例えば、NOの場合、一連のジアミノフルオレセイン及び金属-フルオロフォア錯体が、細胞のNOを検出するために広範に適用されている。しかしかかる方法は、著しい制限を含むことがある。例えば、ジアミノフルオレセインは一般に、分子を間接的に検出する(例えば、酸化生成物を介して)。他の制限は、金属-フルオロフォア錯体に関する光退色及び生物学的組織を通る光透過の欠如である。従って、比較的小型の分子の生物学的検出に関するより堅固なスキームの設計は、依然研究の活発な分野である。ナノ技術は、バイオセンサーのいくつかの新規クラスを作製するが、インビボ適用へのそれらの拡大は限定されている。
【発明の概要】
【０００５】
（概要）
概して、被検体を検出するためのナノセンサーは、支持体上に配置された基板ヒドロゲル、基板ヒドロゲル上に配置されたセンサーヒドロゲル、センサーヒドロゲル中に包埋されたホトルミネセントナノ構造、及びホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを備えることができる。
【０００６】
この被検体は、分子量100g/mol未満を有することができる。例えば、被検体は、一酸化窒素であることができる。被検体の濃度は、1μM未満であることができる。
【０００７】
前記ナノセンサーのホトルミネセントナノ構造は、カーボンナノチューブを含むことができる。このカーボンナノチューブは、単層(single-walled)カーボンナノチューブであることができる。一実施態様において、単層カーボンナノチューブは、半導体単層カーボンナノチューブであることができる。ホトルミネセントナノ構造は、被検体の非存在下、又は被検体の存在下のいずれかにおいて、近赤外線を放出することができる。
【０００８】
前記ナノセンサーのポリマーは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことができる。一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ds(AAAT)7を含むことができる。別の実施態様において、該ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(2-ビニルピリジン)、又はポリ(マレイン酸)を含むことができる。更に別の実施態様において、該ポリマーは、親水性ポリマーとオリゴヌクレオチドのコポリマーを含むことができ、ここで親水性ポリマーは、ポリ(エチレンオキシド)であることができ、且つオリゴヌクレオチドは、ds(AAAT)7であることができる。このコポリマーは、ポリ(エチレンオキシド)とds(AAAT)7で形成されることができる。
【０００９】
一態様において、対象において被検体を検出する方法は、センサーを対象へ導入することであって、ここで該センサーが、支持体上に配置された基板ヒドロゲル、基板ヒドロゲル上に配置されたセンサーヒドロゲル、センサーヒドロゲル中に包埋されたホトルミネセントナノ構造、及び、ホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを備えること、並びに、対象における該センサーからの輻射線の放出をモニタリングすることを含む。一実施態様において、被検体を検出する方法は、ホトルミネセントナノ構造からのホトルミネセンスを検出することを更に含む。このセンサーは、対象の組織へのセンサーの注入により、対象へ導入されることができる。
【００１０】
別の態様において、被検体を検出するセンサーを製造する方法は、支持体上に基板ヒドロゲルを配置すること、基板ヒドロゲル上のセンサーヒドロゲル前駆体組成物からセンサーヒドロゲルをキャストすることであって、ここで、該センサーヒドロゲル前駆体組成物は、センサーヒドロゲル中にホトルミネセントナノ構造及びこのホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを含むことができる。
【００１１】
別の態様において、被検体を検出するためのナノセンサーは、液体媒体中のホトルミネセントナノ構造、及び細孔を持つハウジングを備え、ここで該ホトルミネセントナノ構造は、ハウジング内に含まれ、且つ細孔を通じて輸送されることができる。
【００１２】
別の態様において、対象において被検体を検出する方法は、センサーを対象へ導入することであって、ここで該センサーは、液体媒体中のホトルミネセントナノ構造及び細孔を持つハウジングを備え、ここでホトルミネセントナノ構造はハウジング内に含まれ、且つ細孔を通じて輸送されること、並びに対象におけるセンサーからの輻射線の放出をモニタリングすることを含むことができる。
【００１３】
他の態様、実施態様及び特徴は、下記の説明、図面及び請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1は、DNAが巻き付けられたSWNT複合体の特徴決定及び2Dλ画像解析を描いている。図1Aは、d(AAAT)7を伴う複合体の化学組成、並びに巻き付けられた(AAAT)7-SWNT及びPEG-(AAAT)7-SWNTを示す。図1B-1Cは、RNS化合物及びROS化合物(図1B)並びにNO(図1C)への曝露後の当初の蛍光の消光率により定量された、(AAAT)7-SWNT(赤色)及びPEG-(AAAT)7-SWNT(青色)センサーの消光活性を描くグラフである。図1Dは、PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入後摘出されたマウス肝臓内の(AAAT)7-SWNTの画像解析である。
【００１５】
【図２】図2A-2Cは、尾静脈注入されたSWNTに関するPEG化の効果を描いている。図2Aは、左尾静脈、次に右尾静脈への注入後に、尾内に残留する(AAAT)7-SWNTを描く画像である。図2Bは、FBSの添加により変更されなかったPEG-(AAAT)7-SWNT(青色)とは対照的な、FBSと混合した場合の(AAAT)7-SWNT(赤色)の電気泳動移動度の差異を示す、ゲル電気泳動データを描くグラフである。図2Cは、左尾静脈へのPEG-(AAAT)7-SWNTの注入後のマウス尾を描く画像である。
【００１６】
【図３】図3A-3Gは、マウス(特異系統129X1/SvJ)におけるPEG-(AAAT)7-SWNTの体内分布及び生体適合性を描いている。PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入後様々な時点で屠殺したマウスからのデータ。図3Aは、対照マウス及びPEG-(AAAT)7-SWNTを受け取ったマウスに関する肝臓組織切片の組織像(H&E染色)のセットである。図3Bは、屠殺及び摘出後の、血液、尾(注入部位)、肺、肝臓、腎臓及び尿中のSWNT存在(+)又は非存在(-)を表している表である。図3Cは、図3BにおけるSWNT局在化を決定するために使用されるものの代表的ラマンスペクトルを描いているグラフである。図3Dは、2Dλ技術によりデコンボルーションされた摘出された肝臓の一連の画像である。図3Eは、PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入後様々な時点で摘出されたマウス肝臓内のSWNT蛍光の定量を描くグラフである。図3Fは、図3Eに示されたマウス肝臓内のSWNT蛍光分布を描くグラフである。図3Gは、経時的なマウス肝臓内のPEG-(AAAT)7-SWNT濃度の数学モデルを描くグラフである。
【００１７】
【図４】図4A-4Cは、炎症に起因したインビボセンサー消光を描いている。図4Aは、PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入後に露出されたそれらの肝臓、その後直ちに屠殺された画像化された炎症性(RcsX処置)及び健常(対照)マウスを描く一連の画像である。図4Bは、SWNT蛍光の定量を描くグラフである。図4Cは、図4A-4Bに示されたマウス肝臓内のSWNT蛍光分布を描くグラフである。
【００１８】
【図５】図5A-5Fは、広範なインビボ局在化の可能性及び長期に渡るセンシング能力を持つ追加のセンサー構築体を描いている。図5A-5Bは、RNS化合物及びROS化合物(図5A)並びにNO(図5B)への曝露後の、(AAAT)7-SWNT(赤色)及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNT(緑色)センサーの消光活性を示すグラフである。図5Cは、蛍光が回復した後0日目(ゲル2移植直後)及び4日目の2つのアルギン酸-(AAAT)7-SWNTゲルの移植後のマウスの画像である。図5Dは、皮下移植前及び様々な時点での、アルギン酸-(AAAT)7-SWNTゲルの一連の画像である。図5Eは、SWNTシグナルの長期の一貫性を示す、試験したマウス1匹に関するピークSWNT蛍光の定量を描くグラフである。図5Fは、アルギン酸-(AAAT)7-SWNTの皮下移植後3つの異なる時点で屠殺されたマウスからの一連の組織像(H&E染色)である。
【００１９】
【図６】図6は、一酸化窒素の検出限界を描くグラフである。
【図７】図7は、PEGコンジュゲートを伴う及び伴わない(AAAT)7のゲル電気泳動を描く画像である。
【図８】図8は、マウスにおけるPEG-(AAAT)7-SWNTの生体適合性を描く一連の画像である。
【００２０】
【図９】図9は、蛍光強度とSWNT濃度の間の直線関係を描くグラフである。
【図１０】図10は、SJLマウス由来の組織における炎症のレベルを描く一連の画像である。
【図１１】図11は、移植後の皮下ゲルを伴うマウスに関する蛍光強度分布を描くグラフである。
【００２１】
【図１２】図12は、代替ゲル組成物によるSWNTの蛍光消光を描くグラフである。
【図１３】図13は、液体形状のSWNTセンサーの移植を描く一連の画像である。
【図１４】図14は、グルコース負荷試験を描くグラフである。
【００２２】
【図１５】図15は、溶液中の、アルギン酸と混合した、又はアルギン酸ヒドロゲル中のSWNTのグルコースに対する反応能の比較を描くグラフである。
【００２３】
【図１６】図16Aは、ゲルの一貫したサイズ及び形状を示す、SWNT濃度が0、2、5、10、及び25mg/Lと増加している(左側から右側)、アルギン酸ヒドロゲル(左)及びPEGヒドロゲル(右)の画像である。図16Bは、濃度が0、2、5、10、及び25mg/Lの、(GT)15-SWNT溶液(青色)、アルギン酸-(GT)15-SWNT(赤色)、及びPEG-(GT)15-SWNT(緑色)の蛍光放出スペクトルである。図16Cは、(6,5)キラリティの(GT)15-SWNT(青色)、アルギン酸-(GT)15-SWNT(赤色)、及びPEG-(GT)15-SWNT(緑色)のピーク蛍光であり、比較的低い濃度の2、5及び10mg/Lの点線のSWNT蛍光の増加は、直線にフィットするが、比較的高い濃度(25mg/L)では、蛍光が下落することを示している。図16Dは、(GT)15-SWNT溶液(青色)、アルギン酸-(GT)15-SWNT(緑色)、及びPEG-(GT)15-SWNT(赤色)の(6,5)キラリティピーク蛍光に対応する波長であり、非封入のSWNTシグナルと比べた場合、これらのヒドロゲルは赤色シフトを示している。
【００２４】
【図１７】図17は、アルギン酸ヒドロゲル及びPEGヒドロゲルの流動学的特性である。図17Aは、アルギン酸の歪み掃引である。図17Bは、一定の1Hz周波数によるPEGゲルである。図17C及び17Dは、0.1％歪み下でのアルギン酸ゲルの周波数掃引(図17C)、及び0.01％歪み下でのPEGゲルの周波数掃引(図17D)である。
【００２５】
【図１８】図18Aは、リボフラビンとの1時間インキュベーション後にnIRアレイで測定された、(GT)15-SWNT溶液(青色)、アルギン酸-(GT)15-SWNT(赤色)、及びPEG-(GT)15-SWNT(緑色)の蛍光シグナル消光であり、これはSWNT懸濁液及びアルギン酸封入されたSWNTの一貫した消光を示すが、PEG封入された試料についてはシグナル消光の欠如を示す。図18B-18Dは、動物全体の造影システムで測定した、リボフラビン曝露6時間の、アルギン酸-(GT)15-SWNTに関する、SWNT蛍光消光の割合の比較であり、これらは濃度(図18B)、サイズ(図18C)及び形状/表面積(図18D)の変化は、消光率にほとんど影響を及ぼさないことを示している。
【００２６】
【図１９】図19Aは、アルギン酸-(GT)15-SWNT(青色)及びPEG-(GT)15-SWNT(赤色)の短期安定性試験であり、これは4時間レーザー光へ曝露した場合に、光退色を示さなかった。スケールバー＝2mm。図19Bは、アルギン酸-(GT)15-SWNTゲルの長期安定性であり、これは90日の試験期間にわたり、良好な蛍光シグナル保持を示す。実線は、2項指数関数フィットを表している。図19Cは、PEG-(GT)15-SWNTゲルが合成後短期間で蛍光シグナル喪失を経験することを示す。実線は、2項指数関数フィットを表している。図19Dは、動物全体の造影システムで獲得された、アルギン酸-(GT)15-SWNT及びPEG-(GT)15-SWNTの画像であり、これは経時的なシグナルのゲルの保持(アルギン酸)又は喪失(PEG)を示している。スケールバー＝2mm。図19Eは、各々、アルギン酸ヒドロゲル及びPEGヒドロゲルの観察された寿命及び分解に対応している、図19B及び19Cのフィット関数により概算したアルギン酸ゲル及びPEGゲルの貯蔵寿命である。
【００２７】
【図２０】図20Aは、nIR分析のための組織分光測定の設定の略図である。図20B及び20Cは、ハウスnIRアレイによりニワトリの胸部組織を通じて造影された(図20B)及び動物全体の造影システムによる(図20C)、アルギン酸ゲル及びPEGゲルの正規化された蛍光シグナルである。図20Dは、移植後14日目の、PEGゲル(赤色円)及びアルギン酸ゲル(青色円)中に封入された(GT)15-SWNTのインビボ蛍光造影であり、これはマウスは、これらのゲルに対し負の反応を示さないこと及び蛍光は生存動物において明確に可視できることを示している。
【００２８】
【図２１】図21は、(GT)15-SWNT(図21A)及びニワトリ胸部(図21B)の吸収スペクトルである。
【図２２】図22は、(GT)15-SWNT励起-放出プロファイルであり、(6,5)SWNTの大きい濃度は、顕著な996nmピークに対応している。
【００２９】
【図２３】図23は、様々なナノチューブのキラリティに対する、SWNT濃度10mg/Lでの(GT)15-SWNT、アルギン酸-(GT)15-SWNT、及びPEG-(GT)15-SWNTの蛍光スペクトルのデコンボルーションであり、図22に示した結果を確認している。
【００３０】
【図２４】図24は、動物全体の造影システムからの長期の貯蔵寿命分析に関するデータである−図19に認められる結果に対する並行試験及び結果。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
電磁スペクトルの近赤外線領域は、血液及び組織の自己蛍光及び吸収が微小であるために、インビボ蛍光造影に関して利点がある。Frangioni, J. V.の文献、「インビボ近赤外蛍光造影(In vivo near-infrared fluorescence imaging)」、Curr Opin Chem Biol 7, 626-634 (2003)、並びにWray, S.、Cope, M.、Delpy, D.、Wyatt, J.及びReynolds, Eの文献、「脳酸素化の非侵襲的モニタリングのためのシトクロムaa3及びヘモグロビンの近赤外吸収スペクトルの特徴決定(Characterization of the near infrared absorption spectra of cytochrome aa3 and haemoglobin for the non-invasive monitoring of cerebral oxygenation)」、Biochimica et Biophysica Acta, 933, 184-192 (1988)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。一般的nIR蛍光剤としては、有機nIRフルオロフォア、例えばインドシアニングリーン(ICG)、半導体量子ドット(Qdot)、及び単層カーボンナノチューブ(SWNT)などが挙げられる。ICG色素は、肝臓癌の実時間検出、及び乳癌患者におけるセンチネルリンパ節マッピングのために利用された。生体機能化されたCdSe/ZnS Qdot及びInAs/InP/ZnSe Qdotは、マウスにおける腫瘍標的化及び蛍光造影のために使用された。Schaafsma, B. E.らの文献、「画像支援癌手術のための近赤外蛍光造影剤としてのインドシアニングリーンの臨床使用(The clinical use of indocyanine green as a near-infrared fluorescent contrast agent for image-guided oncologic surgery)」、Journal of Surgical Oncology, 104, 323-332, doi: 10.1002/jso.21943 (2011)、Michalet, X.らの文献、「生存細胞、インビボ造影及び診断のための量子ドット(Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics)」、Science 307, 538-544, doi: 10.1126/science.1104274 (2005)、Medintz, I. L.、Uyeda, H. T.、Goldman, E. R.及びMattoussi, H.の文献、「造影、標識及びセンシングのための量子ドットバイオコンジュゲート(Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing)」、Nat Mater 4, 435-446, doi: 10.1038/nmat1390 (2005)、Pinaud, F.らの文献、「量子ドット生体プローブによる蛍光造影の進歩(Advances in fluorescence imaging with quantum dot bio-probes)」、Biomaterials 27, 1679-1687, doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.11.018 (2006)、Bachilo, S. M.らの文献、「単層カーボンナノチューブの構造帰属の光学スペクトル(Structure-Assigned Optical Spectra of Single-Walled Carbon Nanotubes)」、Science 298, 2361-2366, doi: 10.1126/science.1078727 (2002)、Ishizawa, T.らの文献、「インドシアニングリーン蛍光造影の使用による肝臓癌の実時間同定(Real-time identification of liver cancers by using indocyanine green fluorescent imaging)」、Cancer, 115, 2491-2504, doi: 10.1002/cncr.24291 (2009)、Troyan, S. L.らの文献、「FLARE術中近赤外蛍光造影システム：乳癌センチネルリンパ節マッピングにおける最初のヒト臨床試験(The FLARE intraoperative near-infrared fluorescence imaging system: a first-in-human clinical trial in breast cancer in sentinel lymph node mapping)」、Ann Surg Oncol, 16, 2943-2952, doi:10.1245/s10434-009-0594-2 (2009)、Gao, X.、Cui, Y.、Levenson, R. M.、Chung, L. W.及びNie, S.の文献、「半導体量子ドットによるインビボにおける癌標的化及び造影(In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots)」、Nat Biotechnol 22, 969-976, doi:10.1038/nbt994 (2004)、並びにGao, J.らの文献、「近赤外非カドミニウム量子ドットを使用するインビボにおける腫瘍-標的化蛍光造影(In Vivo Tumor-Targeted Fluorescence Imaging Using Near-Infrared Non-Cadmium Quantum Dots)」、Bioconjugate Chemistry 21, 604-609, doi:10.1021/bc900323v (2010)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれて��る。更にマウス及びブタへ皮内注射されたnIR蛍光ホスフィンでコートされたCdTe/CdSe Qdotは、センチネルリンパ節マッピングのために利用された。Kim, S.らの文献、「センチネルリンパ節マッピングのための近赤外蛍光II型量子ドット(Near-nfrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping)」、Nat Biotechnol 22, 93-97, doi:10.1038/nbt920 (2004)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。これらの文献は、第一のnIRウインドウ(＜950nm)を利用しているが、第二のnIRウインドウ(950〜1400nm)は、たとえ水吸収が高いとしても、更に低下された自己蛍光及びより低い光子散乱から恩恵を受ける。Yi, H.らの文献、「標的化された腫瘍の第二の近赤外ウインドウ蛍光造影のためのナノプローブとしてのM13ファージ機能化された単層カーボンナノチューブ(M13 Phage-Functionalized Single-Walled Carbon Nanotubes As Nanoprobes for Second Near-Infrared Window Fluorescence Imaging of Targeted Tumors)」、Nano Lett 12, 1176-1183, doi:10.1021/nl2031663 (2012)、並びにWelsher, K.らの文献、「マウスにおける近赤外造影のための明るい蛍光カーボンナノチューブへの道(A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice)」、Nature Nanotechnology 4, 773-780 (2009)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。量子ドットの特性は、それらの放出ピークをより長い波長に同調するように変更され得るが、無機前駆体の利用可能性及びそれらの毒性は依然制約である。Ma, Q.及びSu, X.の文献、「近赤外量子ドット：合成、機能化及び分析応用(Near-infrared quantum dots: synthesis, functionalization and analytical applications)」、Analyst 135, 1867-1877, doi:10.1039/c0an00233j (2010)、並びにRogach, A. L.、Eychmuller, A.、Hickey, S. G.及びKershaw, S. V.の文献、「赤外放出コロイド状ナノ結晶：合成、集成、分光、及び応用(Infrared-Emitting Colloidal Nanocrystals: Synthesis, Assembly, Spectroscopy, and Applications)」、Small 3, 536-557, doi:10.1002/smll.200600625 (2007)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【００３２】
単層カーボンナノチューブは、それらの独自の光学特性及びそれらの900〜1400nmのnIR範囲で蛍光を発する能力のために、生体医学適用に関して大きい潜在力を有する。更に、これらは適切な表面巻き付きと生体適合性となることができるので、並びに有機色素及びQdotとは対照的に、それらの光退色を欠いているために、これらは好ましいインビボ造影剤である。Schipper, M. L.らの文献、「マウスの小型試料における単層カーボンナノチューブのパイロット毒性試験(A pilot toxicology study of single-walled carbon nanotubes in a small sample of mice)」、Nature nanotechnology 3, 216-221 (2008)、Liu, Z.、Tabakman, S.、Welsher, K.及びDai, H.の文献、「生物学及び医学におけるカーボンナノチューブ：インビトロ及びインビボにおける検出、造影及び薬物送達(Carbon Nanotubes in Biology and Medicine: In vitro  and in vivo Detection, Imaging and Drug Delivery)」、Nano Research 2, 85-120 (2009)、Cherukuri, P.、Bachilo, S. M.、Litovsky, S. H.及びWeisman, R. B.の文献、「食細胞における単層カーボンナノチューブの近赤外蛍光顕微鏡(Near-infrared fluorescence microscopy of single-walled carbon nanotubes in phagocytic cells)」、Journal of the American Chemical Society 126, 15638-15639 (2004)、Graff, R. A.らの文献、「単層カーボンナノチューブ複合体における個々のナノチューブの高負荷での分散の実現(Achieving individual-nanotube dispersion at high loading in single-walled carbon nanotube composites)」、Advanced Materials 17, 980-984 (2005)、並びにBarone, P. W.、Parker, R. S.及びStrano, M. S.の文献、「単層カーボンナノチューブ光センサーを使用するグルコースのインビボにおける蛍光検出：デザイン、フルオロフォア特性、利点、及び欠点(In vivo fluorescence detection of glucose using a single-walled carbon nanotube optical sensor: Design, fluorophore properties, advantages, and disadvantages)」、Analytical Chemistry 77, 7556-7562 (2005)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。生体内のSWNTの造影の第一の実証は、ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中に懸濁されたSWNTが供給されたキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)において明白にされた。Leeuw, T. K.らの文献、「無傷の生物における単層カーボンナノチューブ：ショウジョウバエにおける近赤外造影及び生体適合性試験(Single-walled carbon nanotubes in the intact organism: near-IR imaging and biocompatibility studies in Drosophila)」、Nano Lett 7, 2650-2654, doi:10.1021/nl0710452 (2007)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。ポリエチレングリコール(PEG)でコートされたSWNTは、生体適合性であるが、これはマウスにおいて尾静脈注入後蛍光造影され、体からの異物の排泄において役割を果たしている肝臓及び脾臓内に明らかに局在化される。マウスにおけるSWNTの循環時間は、1日の桁であり、ここで総クリアランスには2ヶ月かかることがわかった。Liu, Z.らの文献、「ラマン分光法により探索されたマウスにおける機能化された生体適合性単層カーボンナノチューブの循環及び長期運命(Circulation and long-term fate of functionalized, biocompatible single-walled carbon nanotubes in mice probed by Raman spectroscopy)」、Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 1410 (2008)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。
【００３３】
SWNTの追加の利点は、ナノチューブの表面の目的に合わせた機能化は、特異的被検体との相互作用時に選択的蛍光変調を生じることができ、SWNTを光センサーとすることである。Barone, P. W.、Baik, S.、Heller, D. A.及びStrano, M. S.の文献、「単層カーボンナノチューブを基にした近赤外光センサー(Near-infrared optical sensors based on single-walled carbon nanotubes)」、Nat Mater 4, 86-U16 (2005)、Kruss, S.らの文献、「光生体医学センサーとしてのカーボンナノチューブ(Carbon nanotubes as optical biomedical sensors)」、Advanced Drug Delivery Reviews 65, 1933-1950 (2013)、並びにZhang, J.らの文献、「カーボンナノチューブ上に吸着された人工ポリマーで製造されたコロナ複合体を使用する分子認識(Molecular recognition using a corona complex made of artificial polymers adsorbed on carbon nanotubes)」、Nature Nanotechnology 8, 959-968 (2013)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。しかし、一旦SWNTが送達されると関心対象の領域におけるSWNTのインビボ局在化及びシグナルの安定性は、任意の造影応用について極めて重要である。SWNT局在化の変動を最小化する一つの可能性は、動物内に移植され得る生体適合性ヒドロゲル内にナノ粒子を封入することである。Iverson, N. M.らの文献、「組織局在化可能な近赤外蛍光単層カーボンナノチューブによるインビボバイオセンシング(In Vivo Biosensing Via Tissue Localizable Near Infrared Fluorescent Single Walled Carbon Nanotubes)」、Nature Nanotechnology 8, 873-880 (2013)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。
【００３４】
光センサーとしての単層カーボンナノチューブは、光安定性であり且つ近赤外(n-IR)において蛍光を発し、n-IRでは血液及び組織の吸収及び自己蛍光は微小である。Wray, S.、Cope, M.、Delpy, D.、Wyatt, J.及びReynolds, E.の文献、「脳酸素化の非侵襲的モニタリングのためのシトクロムaa3及びヘモグロビンの近赤外吸収スペクトルの特徴決定」、Biochimica et Biophysica Acta 933, 184-192 (1988)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。SWNTは、単分子感受性を明らかにし、且つ様々な分子の選択的検出のために機能化することができ(Heller, D. A.らの文献参照、「単層カーボンナノチューブを使用するマルチモードの光センシング及び被検体特異性(Multimodal optical sensing and analyte specificity using single-walled carbon nanotubes)」、Nature Nanotechnology 4, 114-120 (2009)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)、これは、化学療法薬、過酸化水素のアルキル化(Jin, H.、Heller, D. A.、Kim, J. H.及びStrano, M. S.の文献、「単層カーボンナノチューブ上の段階的蛍光消光反応の確率論的分析：単分子センサー(Stochastic Analysis of Stepwise Fluorescence Quenching Reactions on Single-Walled Carbon Nanotubes : Single Molecule Sensors)」、Nano Letters 8, 4299-4304 (2008)、並びにJin, H.らの文献、「蛍光単層カーボンナノチューブを使用する上皮細胞増殖因子受容体由来の単分子H2O2シグナリングの検出（Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes）」、Nature Nanotechnology 5, 302-309 (2010)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)、並びにNOのアルキル化(Kim, J. H.らの文献、「生物学的検出のための単層カーボンナノチューブ近赤外蛍光センサーにおける一酸化窒素選択性の論理的設計(The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection)」、Nature Chemistry 1, 473-481 (2009)、並びにZhang, J. Q.らの文献、「近赤外蛍光単層カーボンナノチューブに吸着されたd(AT)(15)DNAにより可能にされた一酸化窒素の単分子検出(Single Molecule Detection of Nitric Oxide Enabled by d(AT)(15) DNA Adsorbed to Near Infrared Fluorescent Single-Walled Carbon Nanotubes)」、Journal of the American Chemical Society 133, 567-581 (2011)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。)を含む。SWNTは、生体適合性のために機能化されており、このことは長い循環時間(Liu, X.らの文献、「インビボにおける腫瘍の光熱アブレーションのための単層カーボンナノチューブ上の表面化学の最適化(Optimization of surface chemistry on single-walled carbon nanotubes for in vivo photothermal ablation of tumors)」、Biomaterials 32, 144-151 (2011)、Liu, Z.らの文献、「マウスにおけるカーボンナノチューブのインビボにおける生体内分布及び高効率の腫瘍標的化(In vivo biodistribution and highly efficient tumour targeting of carbon nanotubes in mice)」、Nature Nanotechnology 2, 47-52 (2007)、Liu, Z.らの文献、「インビボにおける癌治療のためのカーボンナノチューブによる薬物送達(Drug delivery with carbon nanotubes for in vivo cancer treatment」、Cancer Research 68, 6652 (2008)、Liu, Z.らの文献、「ラマン分光法により探索されたマウスにおける機能化された生体適合性の単層カーボンナノチューブの循環及び長期運命」、Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 1410 (2008)、並びにLiu, Z.らの文献、「インビボ癌療法のためのカーボンナノチュ��ブ上のドキソルビシンの超分子スタッキング(Supramolecular stacking of doxorubicin on carbon nanotubes for in vivo cancer therapy)」、Angewandte Chemie International Edition 48, 7668-7672 (2009)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。)、いくつかの哺乳動物モデルにおける好ましい生体内分布(Cherukuri, P.らの文献、「固有の近赤外蛍光を使用するカーボンナノチューブの哺乳動物の薬物動態(Mammalian pharmacokinetics of carbon nanotubes using intrinsic near-infrared fluorescence)」、Proceedings of the National Academy of Sciences 103, 18882-18886 (2006)、並びにSingh, R.らの文献、「静脈内投与されたカーボンナノチューブ放射性追跡物の組織生体内分布及び血液クリアランス率(Tissue biodistribution and blood clearance rates of intravenously administered carbon nanotube radiotracers)」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 3357-3362 (2006)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。)、並びにインビボ利用に関する高度に好ましい毒性プロファイルを実証している。Liu, Z.、Tabakman, S.、Welsher, K.及びDai, H.の文献、「生物学及び医学におけるカーボンナノチューブ：インビトロ及びインビボ検出、造影及び薬物送達」、Nano Research 2, 85-120 (2009)、Liu, Z.、Tabakman, S. M.、Chen, Z.及びDai, H.の文献、「生体医学適用のためのカーボンナノチューブバイオコンジュゲートの調製(Preparation of carbon nanotube bioconjugates for biomedical applications)」、Nature protocols 4, 1372-1381 (2009)、Robinson, J. T.らの文献、「カーボンナノチューブによる高性能インビボ近赤外造影(＞1μm)及び温熱癌療法(High performance in vivo near-IR (> 1 μm) imaging and photothermal cancer therapy with carbon nanotubes)」、Nano Research 3, 779-793 (2010)、Sato, Y.らの文献、「インビトロにおけるヒト急性単球性白血病株化細胞THP-1及びインビボにおけるラットの皮下組織に対する多層カーボンナノチューブの細胞毒性に対する長さの影響(Influence of length on cytotoxicity of multi-walled carbon nanotubes against human acute monocytic leukemia cell line THP-1 in vitro and subcutaneous tissue of rats in vivo)」、Molecular BioSystems 1, 176-182 (2005)、Schipper, M. L.らの文献、「マウスの小型試料における単層カーボンナノチューブのパイロット毒性試験」、Nature nanotechnology 3, 216-221 (2008)、並びにWelsher, K.らの文献、「マウスにおける近赤外造影のための明るい蛍光カーボンナノチューブへの道」、Nature Nanotechnology 4, 773-780 (2009)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。提唱されたSWNTのインビボ用途には、生体造影のための造影剤及び薬物送達物質があるが、しかしインビボにおける診断センサーとしてのそれらの使用は、未だ明らかにされていない。そのような使用は、生体適合性、分子認識、高量子効率及び被検体結合の光学転写を組み込む合成戦略を必要としている。
【００３５】
これらの制約は、インビボにおいて複合組織及び臓器内からの被検体検出を可能にする複合体の合成及び操作を明らかにすることにより、対処される。場合によっては、ナノセンサーが、比較的小さい被検体の決定において有用であることがある。例えば一部の実施態様において、被検体は、分子量約1000g/mol以下、約500g/mol以下、約100g/mol以下、又は約30g/mol以下を有することができる。例えばナノセンサーを使用し、分子量約30g/molを有する一酸化窒素を決定することができる。本明細書記載のシステム及び方法を使用し決定することができる被検体の例としては、例えば、一酸化窒素、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、セリン、g-アミノ酪酸、グリシン、ドパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、アセチルコリン、アデノシン、アナンダミド、ヒスタミンなどが挙げられる。
【００３６】
一部の実施態様において、本明細書記載のシステム及び方法は、被検体の比較的低濃度を決定することが可能であり得る。低濃度の被検体を決定する能力は、例えば、対象内での微量の汚染物質又は微量の毒素の検出において有用である。一部の実施態様において、ナノセンサーは、約100μM未満、約10μM未満、約1μM未満、約100nM未満、約10nM未満、又は約1nM未満の被検体濃度を決定することができる。場合によっては、ナノセンサーは、被検体の単独の分子を決定するために使用することができる。
【００３７】
一酸化窒素は、アポトーシス、神経伝達、血圧管理及び先天性免疫などの、多様な生物学的プロセスに関与したフリーラジカルであるので、一酸化窒素(NO)のインビボ検出がモデルとして利用され(Moncada, S.、Palmer, R. M.及びHiggs, E. A.の文献、「一酸化窒素：生理学、病態生理学、及び薬理学(Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology)」、Pharmacology Review 43, 109-142 (1991)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)、並びに、これは腹腔内組織においては探索されていない。最新技術は、ラットの脳に手術時に移植される電気化学的プローブを介して、インビボにおけるNO検出を可能にしている(Park, S. S.らの文献、「アンペロメトリック二重マイクロセンサーを使用する一酸化窒素及び酸素の実時間インビボ同時測定(Real-Time in Vivo Simultaneous Measurements of Nitric Oxide and Oxygen Using an Amperometric Dual Microsensor)」、Analytical Chemistry 82, 7618-7624 (2010)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)が、これは長期間の又は非侵襲的NO検出を可能にはしていない。NO機能の極めて重要なことは、組織内でのその定常状態濃度であり、生物学的に関連する濃度は1000倍を上回る範囲である。文献の推定を基に、Thomasらは、下記のNO機能に関する濃度区分を提唱した：(a) 1〜30nMでのGMP-媒介型シグナル伝達プロセス；(b) 30〜400nMでのキナーゼ活性及び転写因子活性の調節；並びに、(c) 500nM以上での病的ニトロソ化ストレス及び酸化ストレス。Thomas, D. D.らの文献、「一酸化窒素の化学生物学：細胞シグナル伝達における関り(The chemical biology of nitric oxide: implications in cellular signaling)」、Free Radical Biology and Medicine 45, 18-31 (2008)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。活性化されたマクロファージは、病理学的に高レベルのNOの主な給源であり(Lewis, R. S.、Tamir, S.、Tannenbaum, S. R.及びDeen, W. M.の文献、「インビトロにおいてマクロファージにより合成される一酸化窒素の運命の速度論的分析(Kinetic analysis of the fate of nitric oxide synthesized by macrophages in vitro)」、The Journal of Biological Chemistry 270, 29350-29355 (1995)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)、これは1μMに達する局所的に安定状態の濃度を生じる(Dedon, P. C.及びTannenbaum, S. R.の文献、「炎症の化学生物学における反応性窒素種(Reactive nitrogen species in the chemical biology of inflammation)」、Archives of Biochemistry and Biophysics 423, 12-22 (2004)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)。NOは、スーパーオキシドアニオン(O2・-)と迅速に反応し、強力なオキシダントであるペルオキシ亜硝酸イオン(ONOO-)を生成する。ペルオキシ亜硝酸イオンは更に、CO2と反応し、ニトロソペルオキシカーボネートイオン(ONOOCOO-)を生成し、これは二酸化窒素ラジカル(NO2・)とカーボネートラジカル(CO3・-)に分解し、これらも非常に強力なオキシダントである。慢性炎症でのこれらの反応性種の過剰生成は、全ての型の細胞生体分子に損傷を引き起こし得、結果的に炎症と癌などの疾患の間の機構的関連に寄与する。Coussens, L. M.及びWerb, Z.の文献、「炎症及び癌(Inflammation and cancer)」、Nature 420, 860-867 (2002)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。
【００３８】
様々なポリマーを、本明細書記載の実施態様と関連して使用することができる。一部の実施態様において、ポリマーは、例えば、デキストラン、アミロース、キチン、又はセルロースなどの、多糖を含むことができる。一部の実施態様において、ポリマーは、タンパク質を含むことができる。好適なタンパク質の例は、グルコースオキシダーゼ、ウシ血清アルブミン及びアルコールデヒドロゲナーゼを含むが、これらに限定されるものではない。このポリマーは、一部の実施態様において、合成ポリマー(例えば、ポリビニルアルコール、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(2-ビニルピリジン)、ポリ(マレイン酸)など)を含むことができる。一部の実施態様において、ポリマーは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含むことができる。例えば、ポリマーは、一連の塩基対反復(例えば、アデニン−チミン(AT)塩基対反復、グアニン−チミン(GT)塩基対反復など)、三塩基反復(例えば、AAA、CCC、TTT、GGGなど)、又は四塩基反復(例えば、AAAT、TTTA、CCCA、GGGA、AAAC、AAAG、TTTC、TTTG、GGGC、又はGGGCなど)を含むことができる。各反復は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの列内に2、3、4、5、6、7、8、9又は10回存在することができる。一部の実施態様において、ポリマーは、連続して少なくとも約5、少なくとも約15、少なくとも約25、少なくとも約50、又は少なくとも約100、5〜30の間、又は10〜20の間、又は約15個の塩基対反復(例えば、AT、GTなど)を含むことができる。いくつかの実施態様において、ポリマーは、合成ポリマーにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００３９】
別の態様において、ホトルミネセントナノ構造を含むナノセンサーを用いて被検体をセンシングする方法が、提供される。本方法は、ホトルミネセントナノ構造、及びこのホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを含む、ホトルミネセントナノセンサーを提供することを含むことができる。このポリマーは、例えば前述の機序のいずれかを介して、ホトルミネセントナノ構造と相互作用することができる。本方法は更に、ホトルミネセントナノセンサーを、被検体(例えば、例として一酸化窒素を含む前述の被検体のいずれか)を含有する組成物へ、曝露することを含むことができる。本方法はまた、被検体とホトルミネセントのナノセンサーの間の相互作用を基に被検体を決定することを含むこともできる。一部の実施態様において、本方法は、比較的低分子量(例えば、約1000g/mol以下、約500g/mol以下、約100g/mol以下、又は約30g/mol以下)の被検体を決定することを含むことができる。場合によっては、この被検体の濃度は、かなり低くてよい(例えば、約100μM未満、約10μM未満、約1μM未満、約100nM未満、約10nM未満、約1nM未満、又は被検体の約1個の分子)。
【００４０】
概してセンサーは、ヒドロゲル及びホトルミネセントナノ構造を備えることができる。一態様において、被検体を検出するためのセンサーは、支持体上に配置された基板ヒドロゲル、基板ヒドロゲル上に配置されたセンサーヒドロゲル、センサーヒドロゲルに包埋されたホトルミネセントナノ構造、ホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを備えることができる。センサーは、基板ヒドロゲルを支持し、これは次にセンサーヒドロゲルを支持する支持体を備えることができる。センサーヒドロゲルは、ヒドロゲルネットワーク、ホトルミネセントナノ構造及び会合された連結ポリマー、連結ポリマー間の光学架橋、並びにホトルミネセントナノ構造と相互作用するポリマーを備えることができる。センサーヒドロゲルは典型的には、被検体の非存在下で形成され、且つ被検体は、形成後のセンサーヒドロゲルと接触され得る。従って一部の状況において、センサーゲルは、被検体を含まず、且つ別の状況においては、被検体を含む(例えば、被検体−結合している化合物と会合される)。この被検体の存在は、ホトルミネセントナノ構造のホトルミネセンス特性を変更する。
【００４１】
様々なナノ構造は、本明細書記載のナノセンサーと関連して、使用することができる。一部の実施態様において、炭素ベースのナノ構造が説明されている。本明細書において使用される「炭素ベースのナノ構造」とは、芳香環の縮合されたネットワークを含み、ここでナノ構造は主に炭素原子を含む。場合によっては、ナノ構造は、円柱状、偽-円柱状、又は角状の形状を有する。炭素ベースのナノ構造は、少なくとも約10、少なくとも約50、少なくとも約100、少なくとも約1000、少なくとも約10,000個の、又は場合によっては少なくとも約100,000個の芳香環の縮合ネットワークを含むことができる。炭素ベースのナノ構造は、実質的に平面又は実質的に非平面であることができるか、あるいは平面又は非平面の部分を含むことができる。炭素ベースのナノ構造は任意に、そこで縮合ネットワークが終結する境界を含むことができる。例えば、グラフェンシートは、そこで縮合ネットワークが終結する境界を含む平面の炭素含有分子を含む一方、カーボンナノチューブは、いずれかの末端に境界を伴う非平面炭素ベースのナノ構造を含む。場合によっては、境界は、水素原子により置換されてよい。場合によっては、境界は、酸素原子を含む基(例えばヒドロキシル)により置換されてよい。他の場合において、境界は、本明細書記載のように置換されてよい。
【００４２】
一部の実施態様において、本明細書記載のナノ構造は、ナノチューブを含むことができる。本明細書において使用される用語「ナノチューブ」は、当該技術分野におけるその本来の意味が与えられ、且つ主に6-員環の縮合ネットワーク(例えば、6-員芳香環)を含む実質的に円柱状の分子又はナノ構造をいう。場合によっては、ナノチューブは、継ぎ目のない円柱状構造へと形成されるグラファイトのシートに類似することができる。ナノチューブはまた、6-員環以外の環構造又は格子構造を含むこともできることは、理解されるべきである。典型的には、ナノチューブの少なくとも一端は、すなわち曲面の又は非平面の芳香基により、キャップされ得る。ナノチューブは、ナノメーターの桁の直径及びミクロンの桁、数十ミクロン、数百ミクロン、又はミリメーターの長さを有することができ、結果的に約100超、約1000超、約10,000超、又はそれよりも大きい縦横比を生じる。一部の実施態様において、ナノチューブは、約1ミクロン未満、約500nm未満、約250nm未満、約100nm未満、約75nm未満、約50nm未満、約25nm未満、約10nm未満、又は場合によっては約1nm未満の直径を有することができる。
【００４３】
一部の実施態様において、ナノチューブは、カーボンナノチューブを含むことができる。用語「カーボンナノチューブ」とは、主に炭素原子を含むナノチューブをいう。カーボンナノチューブの例は、単層カーボンナノチューブ(SWNT)、二層カーボンナノチューブ(DWNT)、多層カーボンナノチューブ(MWNT)(例えば、同心のカーボンナノチューブ)、それらの無機誘導体などを含む。一部の実施態様において、カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブである。場合によっては、カーボンナノチューブは、多層カーボンナノチューブ(例えば二層カーボンナノチューブ)である。
【００４４】
本明細書記載のホトルミネセントナノ構造は、場合によっては、ドーパント、不純物、又は他の非-ナノ構造原子を実質的に含まないことができる。例えば、一部の実施態様において、ナノ構造は、実質的にドーパントを含まないカーボンナノ構造を含むことができる。具体例として、一部の実施態様において、ナノ構造は、ナノチューブのシェル部分内に芳香環(その各々は、炭素原子のみを含む)のみを含む単層カーボンナノチューブからなることができる。
【００４５】
一部の実施態様において、本明細書記載のホトルミネセントナノ構造は、所望の波長範囲内の輻射線を放出することができる。例えば場合によっては、ホトルミネセントナノ構造は、約750nm〜約1600nm、又は約900nm〜約1400nmの間の波長(例えば、近赤外範囲の波長)の輻射線を放出することができる。一部の実施態様において、ホトルミネセントナノ構造は、可視スペクトルの範囲(例えば、約400nm〜約700nm)内の波長の輻射線を放出することができる。
【００４６】
一部の実施態様は、ヒドロゲルの生体適合性の性質のために、特に有利であることができる。ヒドロゲルは、生物学的付着に対し特に抵抗性である。センサーがインビトロにおいて使用される場合、生物学的実体(例えば、内皮細胞、タンパク質など)は、センサーに付着し、且つ検出されるべき化合物(例えば、グルコース)を妨害及び／又は消費し得る。これが生じる場合、センサーは、化合物の存在を検出し損なうことがあるか、又は周囲の流体(例えば血液)中の量よりも低い化合物の濃度を検出することがあり、結果的にそのセンサーは不正確又は使用不能となる。ヒドロゲルは生物学的付着に対し抵抗性であることができるので、そのような欠点は軽減され得る。加えて、ヒドロゲルが生分解性ではない一部の実施態様においては、望ましくないナノ構造の浸出を防ぐことができる。
【００４７】
本明細書において使用される用語「ヒドロゲル」は、当該技術分野におけるその本来の意味が与えられ、且つ水を捕獲し且つ含有することができるポリマーネットワークを含む物質をいう。ヒドロゲルは、直接又は架橋剤を介してのいずれかにより架橋されるポリマー鎖を含むことができる。架橋度は、場合によっては、ゲルが流体を吸収若しくは保持する程度を調整するために、変動することができる。ヒドロゲルの形成が可能なポリマーの例としては、コラーゲン、ケイ素-含有ポリマー、ポリアクリルアミド、架橋型ポリマー(例えば、ポリエチレンオキシド、ポリAMPS及びポリビニルピロリドン)、ポリビニルアルコール、アクリル酸系ポリマー(例えば、ポリアクリル酸ナトリウム)、並びに大量の親水基を持つコポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒドロゲルは、アルギン酸ヒドロゲルであることができる。
【００４８】
このヒドロゲルは、多孔質構造であることができる。多孔質構造内の細孔サイズは、ポリマーの濃度及びヒドロゲル中の架橋を含む要因により決定することができる。所望の細孔サイズ又は所望の細孔サイズ分布を有するヒドロゲルは、ヒドロゲルを形成するための重合時に存在するモノマー及び架橋剤の濃度を選択することにより、調製することができる。ヒドロゲル細孔が、ヒドロゲル中に包埋された成分、例えばホトルミネセントナノ構造への被検体の自由なアクセスが可能であるのに十分に大きいことは、利点であり得る。細孔サイズは、例えば、10nm〜1,000nm、20nm〜500nm、50nm〜250nm、又は10nm〜100nmの範囲であることができる。被検体が、高分子(例えば、免疫グロブリンなどのタンパク質)である場合には、10nmよりも大きい、20nmよりも大きい、30nmよりも大きい、40nmよりも大きい、50nmよりも大きい、60nmよりも大きい、70nmよりも大きい、80nmよりも大きい、90nmよりも大きい、又は100nm以上の細孔サイズが、望ましいことがあり得る。
【００４９】
PEGヒドロゲルは、官能基の均等な分布及び大きい柔軟度を可能にする、それらの変動性及び使用の容易さのために、広範に使用される。Arshady, R.の文献、「ビーズ化ポリマー支持体及びゲル：II.物理化学基準及び機能化(Beaded polymer supports and gels: II. Physico-chemical criteria and functionalization)」、Journal of Chromatography A 586, 199-219 (1991)、並びにMeldal, M.の文献、「固体支持体の特性(Properties of Solid Supports)」、Methods in Enzymology 289, 83-104 (1997)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。PEGはまた、その親水性及び生体適合性、抗原性及び免疫原性について公知であり、これをSWNTセンサーの封入のための理想的な候補としている。マイクロビーズ形成のために最も広範に使用される物質であるアルギン酸は、褐藻類に由来する天然の陰イオン性多糖であり、且つSWNT封入に関する別の良好な候補である。Wei, X.らの文献、「薬物送達系としての生分解性ポリ(e-カプロラクトン)-ポリ(エチレングリコール)コポリマー(Biodegradable poly(e-caprolactone)-poly(ethylene glycol) copolymers as drug delivery system)」、International Journal of Pharmaceutics 381, 1-18 (2009)、並びにHall, K. K.、Gattas-Asfura, K. M.及びStabler, C. L.の文献、「スタウディンガー連結により架橋されたアルギン酸/ポリ(エチレングリコール)ゲル内の組織塊のマイクロカプセル化(Microencapsulation of islets within alginate/poly(ethylene glycol) gels cross-linked via Staudinger ligation)」、Acta Biomaterialia 7, 614-624 (2011)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。アルギン酸は、その毒性の欠如のために、創傷包帯のため及び細胞担体として承認されているが、イオン結合されたヒドロゲルは、頻繁に分解を受け、移植の機械的及び化学的歪み並びに生理的条件において生じる陽イオン交換に耐えることができないことがわかっている。Cho, W. J.、Oh, S. H.及びLee, J. H.の文献、「新規術後組織接着障壁としてのアルギン酸フィルム(Alginate film as a novel post-surgical tissue adhesion barrier)」、Journal of Biomaterials Science Polymer、第21版, 701-713 (2010)、Lee, K. Y.及びMooney, D. J.の文献、「アルギン酸：特性及び生体医学応用(Alginate: properties and biomedical applications)」、Progress in Polymer Science 37, 106-126 (2012)、Ulery, B. D.、Nair, L. S.及びLaurencin, C. T.の文献、「生分解性ポリマーの生体医学応用(Biomedical applications of biodegradable polymers)」、Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics 49, 832-864 (2011)、Benson, J. P.、Papas, K. K.、Constantinidis, I.及びSambanis, A.の文献、「バイオ人工膵臓開発の方向性：BTC3細胞を伴うアルギン酸ビーズへのポリ-L-リジンの作用(Towards the development of a bioartificial pancreas: effects of poly-L-lysine on alginate beads with BTC3 cells)」、Cell Transplant 6, 395-402 (1997)、並びにThu, B.らの文献、「アルギン酸ポリカチオンマイクロカプセルII.ある機能特性(Alginate polycation microcapsules II. Some functional properties)」、Biomaterials 17, 1069-1079 (1996)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【００５０】
センサー移植が成功するために必須のことは、生きている無傷の動物内から分子検出を検出し且つ伝達する能力である。最近の研究は、皮下でのアルギン酸封入されたSWNTの検出を示しているが、しかし深部組織移植は研究されなかった。Iverson, N. M.らの文献、「組織局在化可能な近赤外蛍光単層カーボンナノチューブによるインビボバイオセンシング」、Nature Nanotechnology 8, 873-880 (2013)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。以下の研究の目的は、それから様々な種類の移植可能な蛍光センサーを工作するための定量的物質-ベースのフレームワークを提供することである。この目的のために、アルギン酸ゲル及びPEGゲルの両方における具体例として、組織深さとSWNTのシグナル検出の間の関係が分析され、且つインビボ蛍光造影が、マウス内で明らかにされ、これは将来のかかるセンサーのインビボ使用を促進し、且つ深部組織造影のためのこれらのゲル封入能力を決定する。
【００５１】
一部の実施態様において、被検体を検出するためのナノセンサーは、液体媒体中のホトルミネセントナノ構造、及び細孔を伴うハウジングを備えることができ、ここでホトルミネセントナノ構造は、ハウジング内に含まれ、細孔を通じて輸送される。ハウジングは、被検体が自在に通過するのに十分に大きいが、ナノセンサーが通過するのを制限するのに十分に小さい細孔を有することができる。ハウジングは、外部周辺から、ナノ構造を閉じ込めることができるが、被検体はナノセンサーと相互作用することが可能である。ハウジングは、ナノセンサーをハウジング内に閉じ込めるが、被検体はハウジングを通過することが可能であるのに適したサイズの細孔を伴う、膜又は高分子構造であることができる。例えばハウジングは、透析膜などの膜を含むことができる。液体媒体は、ナノセンサーの環境と適合性がある任意の溶液、例えば、PBSなどの生理的適合性がある緩衝液であることができる。例えば、緩衝液中にSWNTセンサーが充填された透析チューブが、対象内に配置されることができる。
【００５２】
一態様において、被検体を検出するためのセンサーは、任意の効果的経路により、対象へ導入することができる。導入経路の例は、注射(皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内)、経口、舌下、経直腸、経皮、鼻腔内、膣内及び吸入経路を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
炎症検出のために皮下に移植されたセンサー及びNOから誘導される反応性窒素種の検出のために肝臓内に局在化する循環センサーを含む、いくつかの状況において試験される単層カーボンナノチューブを含むセンサーが、本明細書において開示される。この型のプラットフォームを使用するインビボ検出は、生物とセンサーの間の化学的干渉を具体的にデザインすることにより、可能である。ポリエチレングリコール連結されたds(AAAT)7コポリマーは、溶液中の近赤外蛍光単層カーボンナノチューブ(SWNT)センサーを安定化し、マウスへの静脈内注射、及び検出限界1μMでの局所的一酸化窒素(NO)濃度の選択的検出を可能にする。肝臓滞留半減期は4時間であり、センサーは、注入後2時間以内に肺を通過し、インビボナノ毒性の主要経路を回避する。新規2Dλ空間的-スペクトル造影アプローチは、化学的センシング及び空間的情報をデコンボルーションするために導入された。肝臓内の局在化後、これらのプローブは、マーカーとしてのNO及びシグナル伝達分子を使用し、一過性炎症の研究を可能にする。あるいは、アルギン酸封入されたds(AAAT)7-SWNTは、NOに関する移植可能な炎症センサーとして機能することが示されており、400日間よりも長く、固有の免疫反応性又は他の有害な反応を伴わない。これらの結果は、生物医学応用のためのインビボにおけるかかるナノセンサーの使用に関する新たな道を開く。
【００５４】
（インビボセンシングの化学的及び光学的制約）
インビボにおける蛍光センサーとしてのSWNTの使用は、受動送達剤又は造影フルオロフォアの複雑さを超える更なる複雑さを導入する。SWNTは、機能化され、その結果選択的分子認識が可能になり、且つその認識は、SWNTにより光学的に変換されるはずである。しかし選択的コーティングはまた、使用することができる利用可能なインターフェースを著しく限定する制約である、インビボにおける生体適合性及び安定性を可能にする必要がある。SWNT又は他のナノ粒子を基にした蛍光センサーは、干渉分子を上回る特定の被検体の変調の程度及び選択性を必ず最適化する。Barone, P. W.、Baik, S.、Heller, D. A.及びStrano, M. S.の文献、「単層カーボンナノチューブを基にした近赤外線光センサー(Near-infrared optical sensors based on single-walled carbon nanotubes)」、Nature Materials 4, 86-U16 (2005)、Heller, D. A.らの文献、「単層カーボンナノチューブ上のDNAコンホメーション多型の光学検出(Optical Detection of DNA Conformational Polymorphism on Single -Walled Carbon Nanotubes)」、Science 311, 508-511 (2006)、Ahn, J. H.らの文献、「無細胞合成により製造された近赤外蛍光単層カーボンナノチューブ/タンパク質マイクロアレイ上の非標識単一タンパク質検出(Label-free, single protein detection on a near-infrared fluorescent single-walled carbon nanotube/ protein microarray fabricated by cell-free synthesis)」、Nano Letters 11, 2743-2752 (2011)、並びにChoi, J. H.、Chen, K. H.及びStrano, M. S.の文献、「アプタマー-キャップしたナノ結晶量子ドット：非標識タンパク質検出の新規方法(Aptamer-capped nanocrystal quantum dots: a new method for label-free protein detection)」、Journal of the American Chemical Society 128, 15584-15585 (2006)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。しかし、インビボにおける操作は、適切な量子収量(QY)は、組織内からの検出を可能にする一方で、インビボ生体適合性に必須の成分を安定化することによりコンジュゲート後操作可能でありつづけるように、維持されなければならないという制約を追加する。
【００５５】
これらの制約に対処するために、DNAオリゴヌクレオチドds(AAAT)7は、5kDa MWポリエチレングリコール(PEG)セグメントへの連結後に維持される一酸化窒素選択性を可能にする(図1A)。図2B-2Cは、標準誤差を表すエラーバーを伴う、RNS化合物及びROS化合物への曝露後(添加時点後10分間連続して及び12時間後に1回分析される)(図2B)並びにNOへの曝露後(連続して30分間分析される)(図2C)に、785nmフォトダイオードを使用し当初の蛍光の消光率(％)により定量される、(AAAT)7-SWNT(赤色)及びPEG-(AAAT)7-SWNT(青色)センサーの消光活性を描くグラフである。SWNTは、PEG-連結した及び連結していないDNA版の両方を用いて、分散され、且つ30μM一酸化窒素及び一群の共通の可能性のある干渉分子への曝露時の蛍光変調について試験し、各々25％及び17％の任意の他の被検体よりもNOに対するより大きい反応性を示している(図1B)。興味深いことに、PEGの付加は、HNOに対するSWNT反応を減少し、且つNOに対する全般的選択性は、NOの酸化生成物のみを測定し且つ被検体を直接測定しないジアミノ蛍光標準よりも実質的により高く、NO検出限界は1μM未満である(図6)。図6は、異なる濃度のNOの添加後の(AAAT)7-SWNTの蛍光消光を示し、0.5μMのNOからの消光を示す。PEG付着されたセンサー及び機能化されないセンサーの両方に関する動的反応及び可逆性は、図1Cに示している。急激な最初の消光率は、いずれの構築体についても不変であり、その後NOの溶液分解のために、比較的遅い回復が続く。この反応の可逆性及び迅速性は、最初の時点についてこのプローブを、インビボにおけるNOシグナル伝達の動力学を試験するために利用することができることを意味する。
【００５６】
（化学センサーのための空間及び組織分光造影）
光センサーは、不変の蛍光又は放射測定プローブとは異なり、強度又は波長変調のいずれかを介して、組織内のその位置及びその化学的環境の両方を報告しなければならない。従って、インビボにおいて蛍光測定プローブの2D静的画像又は動的画像を提供し、且つ位置を明らかにするために強度情報を必ず利用するスキームは、化学的センシングのために使用することができない。液晶同調可能な格子(grading)及びフィルター技術の開発は、技術的解決を提供する。狭い波長空間を選択するために格子を連続して同調することにより、画像スタックI(x,y, λ)rawは、2つの空間座標及び波長軸を含む迅速な走査を介して効果的に得ることができる。950〜1050nmの波長検出をもたらすCRi社からの液晶フィルターを利用し、暗-ボックス画像構成(imaging configuration)における視野の慣習的動物全体野の上に積層した。2Dλ画像スタックは、バックグラウンド成分及びセンサー成分に対する生のスタックのデコンボルーションにより明らかにされるように、空間的情報及び化学的情報の両方を容易にコード化し、比較上の蛍光消光を可能にする(図1D)。図1Dは、白色光励起及び10nmの幅及び20秒の累積時間で950〜1050nmの放出スペクトルにより画像化された、PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入後30分で摘出されたマウス肝臓内の(AAAT)7-SWNTの画像解析である(スケールバー4mm)。
【００５７】
PEG SWNTセンサーの狭い蛍光半値全幅(100nm)は、典型的には天然媒体及び合成媒体中で遭遇される勾配のついた自己蛍光バックグラウンドから、容易にデコンボリューションされる。特注のMatlabアルゴリズムを使用し、生画像強度スタックI(x,y,λ)rawは、SWNT蛍光成分、バックグラウンド成分及び自己蛍光ノイズ成分へ迅速に換算された：
I(x, y, λ)raw = I(x, y, λ)SWNT + I(x, y, λ)bkgd + I(x, y, λ)auto = k-1*CNO(x, y) + I(x, y, λ)bkgd + I(x, y, λ)auto
ここで、kは、SWNTプローブのモル吸光係数(4400±1000 M-1 cm-1)(Schoppler, F.らの文献、「単層カーボンナノチューブのモル吸光係数(Molar Extinction Coefficient of Single-Wall Carbon Nanotubes)」、Journal of Physical Chemistry 115, 14682-14686 (2011)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)、その局所的濃度、及び組織光学特性を含む検量線の比例定数である。このスキームは、波長帯中の蛍光センサーの多重化(multiplexing)、又はSWNTセンサープローブによる同時の自己蛍光バックグラウンド若しくは組織吸収の分析に容易に役立つことに留意する。別に記載しない限りは、本研究中の蛍光画像は、蛍光強度が一旦正規化された消光を介して相対NO濃度に対応しているI(x,y)SWNT 空間マップである。有機蛍光測定プローブは、ターンオン又はターンオフのいずれかのモードで、定量的な空間的情報及び化学的情報を同時に伝達するために、参照を必要とし、並びにこれらのSWNTプローブには、この点で差異がない。各時点でのSWNT蛍光、バックグラウンド及び自己蛍光ノイズの相対寄与を見つけるために、蛍光スペクトルの線形フィットの最小二乗法の最小化が行われる。
【００５８】
（尾静脈注入への安定性）
PEGのセンサーインターフェースへの連結は、インビボにおける循環がうまくいくために重要である。例えば、(AAAT)7-SWNTは循環せず、代わりに図2Aにおいて近赤外線造影を使用し示されるように、注入部位近傍に蓄積する。図2Aは、(AAAT)7-SWNTの、最初にマウスの左尾静脈へ、次に右尾静脈への投与を示している。この手順は繰り返し行われ、同様の結果を示した；(AAAT)7-SWNTは、尾静脈をブロックし、溶液注入及び血流を阻害する。挿入画像は、周辺組織ではなく、静脈内に配置された(AAAT)7-SWNTを伴う尾の横断面を示す。従って静脈閉塞は、(AAAT)7-SWNTの不安定性に起因し得るが、誤った注入には起因しない。更なる実験は、尾静脈ブロックは、(AAAT)7-SWNTに吸着された血清タンパク質の凝集体により引き起こされることを示している。図2Bのゲル電気泳動は、4種の試料(装加前に5分間ウシ胎仔血清(FBS)又は緩衝液のいずれかと共にインキュベーションされた(AAAT)7-SWNT及びPEG-(AAAT)7-SWNT試料)並びに位置に対する蛍光放出により測定されるそれらの移動距離を示している。ゼロ点はウェル端であり、全ての試料について蛍光強度は、1mm距離間隔で測定される。(AAAT)7-SWNTの電気泳動移動度は、11×109〜14×109 m2/Vであるのに対し、そのFBS含有対応物の移動度は、2×109〜4×109 m2/Vであり；これは、FBSの(AAAT)7-SWNTへの吸着を確認している。FBSを含む及び含まないPEG-(AAAT)7-SWNTの両方の溶液は、電気泳動移動度10×109〜14×109 m2/Vを有し、これら2つの間にはっきりわかる差異はなく、このことはPEG-(AAAT)7-SWNT上のPEG部分は、FBS吸着を防止することを確認している。尾静脈閉塞は、(AAAT)7-SWNTへ結合しているタンパク質により引き起こされるという仮説は、図2Cに示されるように、静脈への注入後のPEG-(AAAT)7-SWNTのクリアランスの目視検査により確認された。図2Cは、左尾静脈へのPEG-(AAAT)7-SWNT(50 mg/L)の注入後のマウス尾を描く画像であり、横断面像は、血管からのSWNTのクリアランスを示している(n＝3、スケールバー2mm)。PEG部分の付加は、この型のセンサーのインビボ循環のための安定した調製品の作製に必要であることが示されている。
【００５９】
（循環時間及び生体内分布）
SWNTの生体内分布及び生体適合性を、それが注入され且つ組織内に局在化される時に調べ、結果を図3及び図8に示した。動物には、PEG-(AAAT)7-SWNTを尾静脈を介して注入し、次に注入後5、15、30、60及び120分で屠殺した(n＝3〜5匹マウス/時点、50mg/L SWNTの200μLを注入)；0分時点は、PEG-(AAAT)7-SWNTを受け取っていない対照動物を表している。図3Aは、PEG-(AAAT)7-SWNTの注入前及び注入後の、肝臓組織の組織像を表し(60×倍率、スケールバー10μm)、且つ炎症反応の証拠は示していない。図8は、PEG-(AAAT)7-SWNT尾静脈注入(50mg/L SWNTの200μLを注入)後の様々な時点で屠殺されたマウスからの組織切片の組織画像(H&E染色、肺について10×、尾、肝臓及び腎臓について20×、スケールバー10μm)を示しており；時点間の有意差は認められなかった(n＝3〜5匹マウス/時点)。
【００６０】
ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色された肝臓組織の組織学的実験は、いずれの時点においても尾、肺、肝臓又は腎臓における炎症の検出可能な証拠を示さず、SWNTの生体適合性を明らかにしている。図3Bは、ラマン分光法により決定された(n＝3匹マウス/時点)、組織試料中のPEG-(AAAT)7-SWNTの存在(+)又は非存在(-)を示している(図3Cに示された試料スペクトル)。血液及び尿試料の共鳴ラマン分光法は、全ての時点での血液中のSWNTの存在を示しているが、各時点で膀胱から収集された尿試料中にはSWNTは存在せず、このことは、SWNTはインビボにおいて少なくとも2時間留まることを確認している。PEG-(AAAT)7-SWNTはまた、全体で2時間の時間間隔について、肝臓及び腎臓において検出されたが、尾注入部位では1時間以内にクリアランスされた。SWNTの肺からのクリアランスは、特に注目に値する。肺組織の高度に血管化された性質及び全身循環内のその位置のために、肺は、ナノ粒子を非常に捕獲し易い。Donaldson, K.らの文献、「カーボンナノチューブ：肺毒性及び作業環境安全性との関連におけるそれらの特徴の総説(Carbon Nanotubes: A Review of Their Properties in Relation to Pulmonary Toxicology and Workplace Safety)」、Toxicological Sciences 92, 5-22 (2006)、Lacerda, L.、Bianco, A.、Prato, M.及びKostarelos, K.の文献、「ナノ医薬としてのカーボンナノチューブ：毒性学から薬理学まで(Carbon nanotubes as nanomedicines: From toxicology to pharmacology)」、Advanced Drug Delivery Reviews 58, 1460-1470 (2006)、並びにPoland, C. A.らの文献、「パイロット試験におけるアスベスト様病原性を示すマウス腹腔へ導入されたカーボンナノチューブ(Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestoslike pathogenicity in a pilot study)」、Nature Nanotechnology 3, 423-428 (2008)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【００６１】
驚くべきことに、目視検査は、注入後5分の肺組織は暗色化したが、組織は30分以内に処置前の色に回復したことを明らかにした。この知見は、ラマン組織分光法により定量的に報告され、このことは、PEG-(AAAT)7-SWNTは注入後5分の肺において検出可能であったが、2時間以内にクリアランスされたことを確認した。この証拠は、閉塞を引き起こすことなく限定的な毛細管ネットワークに浸透するPEG-(AAAT)7-SWNTの能力を直接支持する。
【００６２】
複数の組織中でPEG-(AAAT)7-SWNTの蓄積が認められるが、しかし肝臓において最高濃度であった。図3Dは、2Dλ技術によりデコンボルーションされた摘出された肝臓の一連の画像であり、これは最初に肝臓におけるPEG-(AAAT)7-SWNT局在化を示し、次に蛍光のヒートマップを示している(スケールバー4mm)。eは、PEG-(AAAT)7-SWNTの50mg/Lの200μLの尾静脈注入後様々な時点で摘出されたマウス肝臓中のSWNT蛍光の定量の図である(n＝3〜5匹マウス/時点、エラーバーは平均標準誤差(s.e.m.))。図3D-3Eは、先に説明された生体内分布試験におけるような、注入後5、15、30、60及び120分で屠殺されたマウスの摘出された肝臓中のPEG-(AAAT)7-SWNT蓄積の定性的及び定量的証拠をまとめている。肝臓の代表的画像は、30分までのSWNT蛍光の増加、その後のわずかな減少を明確に示している。図1に説明された2Dλ手段により実行される定量的分析は、肝臓に関する平均蛍光は、最大30分間増加し、次にわずかに減少し、且つ最大60分及び120分までは一定であることを示している。図10に示したように、消光された試料は、消光されない試料と比べ、より大きい標準偏差及びより低いピーク値を伴う蛍光分布を示している。図10は、PEG-(AAAT)7-SWNTの尾静脈注入(50mg/L SWNTの200μL注入)後、30分で屠殺された健常(対照)マウス及び炎症性(RcsX処置)マウスからの組織切片の組織画像(H&E染色、40×、スケールバー10μm)を示す。対照マウスと炎症性マウスの肝臓試料間に、識別できる差異は存在しないのに対し、RcsX処置した動物からの脾臓は、対照マウスには存在しないリンパ腫を示している(n＝10)。
【００６３】
図3Fに示されるように、図3Eのデータの蛍光分布は、全ての時点について、類似したピーク値(10.5、11.2、8.1、9.6及び10.4)並びに標準偏差(73.19、56.43、63.07、48.92及び49.51任意単位(a.u.))を示しており、これは30分時点後のSWNT消光とは対照的に、肝臓内のPEG-(AAAT)7-SWNT濃度の増加と、その後の減少を暗示している。
【００６４】
肝臓内のPEG-(AAAT)7-SWNTの蓄積は、下記のようにモデル化することができ、血液(ポイントA)から肝臓(B)への循環半減期、並びに様々なシンク(sinks)への分布(C、胆汁、分解など)を説明している。
【００６５】
【数１】
2016537644.tif 000003
ここで、k1は、循環から肝臓への移行の速度定数であり、並びにk2は、支配的なシンク速度である。従って濃度A(t)、B(t)及びC(t)に関して下記であり：
【数２】
2016537644.tif 000004
式中、A0は、時点tでの血液濃度である。図3Eのデータの回帰は、k1＝0.1169、k2＝0.00288、及び[A0]＝337.96/秒を生じ、結果的に：
【数３】
2016537644.tif 000005
である。
【００６６】
従って、図3Eのデータの回帰は、肝臓内のSWNT濃度B(t)＝-346.51(e＾(-0.1169t)-e＾(-0.00288t))、及び半減期およそ4時間を生じる。
【００６７】
より正確な肝臓半減期値は、より長い時点の情報を持つより詳細なモデルを必要とし、今後の研究の中心である。また血流の半減期決定を可能にする血液濃度研究も興味深い。
【００６８】
（炎症性マウス肝臓における一酸化窒素の検出）
前記センサーのインビボにおける炎症時に生じたNOを検出する能力を評価した。この目的のためには、先に説明したように、その強力な炎症反応のために、RcsX腫瘍細胞の注入による誘導後予測可能な時間経過にわたりNOの多大な過剰生成を生じるSJLマウスモデルを選択した。Gal, A.、Tamir, S.、Tannenbaum, S.及びWogan, G.の文献、「RcsXリンパ腫を持つSJLマウスにおける一酸化窒素生成：NOのインビボ毒性評価のためのモデル(Nitric oxide production in SJL mice bearing the RcsX Lymphoma: A model for in vivo toxicological evaluation of NO)」、Proceedings of the National Academy of Sciences 93, 11499-11503 (1996)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。従って、マウスには、RcsX細胞又は食塩水が腹腔内注入された(n＝10、1回にn＝5で繰り返し)。12日後、PEG-(AAAT)7-SWNT(50mg/L SWNTの200μLを注入)を、麻酔をかけたマウスの尾静脈へ注入し、30分後、インサイチュ造影を可能にするように、肝臓を腹腔に露出させるように切開した(図4A、スケールバー4mm)。その後直ちに、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、単離した臓器を2回目造影した。インサイチュ画像の比較は、対照動物の肝臓は、蛍光を明確に提示したのに対し、RcsX処置したマウスの炎症性臓器において蛍光は検出不可能であったことを示している。対照的に、摘出された肝臓の画像は、SWNT蛍光の同様のレベルが、RcsX動物及び対照動物の両方において存在することを示している。インサイチュ画像に存在しない蛍光は、炎症時に生成されたNOに起因することができ、その理由は、摘出された臓器中の蛍光により示されるように、SWNTは臓器中に明確に存在したからであった。NOへの曝露後のPEG-(AAAT)7-SWNT蛍光の迅速な回復(図1C)は、この解釈と一致している。これらのデータの定量を行い(図4B、n＝10、エラーバーはs.e.m.)、食塩水の尾静脈注入を受け取った対照における屠殺前及び屠殺後の蛍光の間の3％差異と比べ、炎症性組織においては55％差異を示した。蛍光分布データは、SWNTを伴わない対照マウスの組織と注入されたSWNTを伴う炎症性動物において検出されたシグナルの間の類似性を示す(SWNTを伴う非炎症性マウスの153 a.u./mm2と比べ、39及び54 a.u./mm2)のに対し、炎症性及び非炎症性の両方のマウスに関する摘出された肝臓試料は、類似した標準偏差(48.14及び43.41 a.u.)並びにピーク値(148及び158 a.u.)を有した。この研究の限界は、インサイチュ造影のために肝臓の露出を必要とすることであり、これは、より深部組織造影を可能にするためのSWNTの更なる最適化、又は現在使用されるものよりも更に小さい切開による造影を可能にするための腹腔鏡用プローブの使用により、対処することができる。
【００６９】
（表皮組織炎症に関する一酸化窒素モニター）
(AAAT)7-SWNTの組織-特異的局在化の可能性はまた、移植され得るアルギン酸-封入されたセンサープラットフォームを使用して調べ、且つ静脈内に注入されたPEG-(AAAT)7-SWNTにより利用された比較的短い時間スケールに対して、複数日/月の時間スケールで実行した。図5A-5Bは、RNS化合物及びROS化合物への曝露後785nmフォトダイオードを使用する当初の蛍光の消光率により定量される(AAAT)7-SWNT(赤色)及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNT(緑色)センサーの消光活性を描くグラフであり(図5A、追加時点後10分間連続して及び12時間後に1回分析される)、エラーバーは、標準誤差NOを表す(図5B、(AAAT)7-SWNTについて連続して30分間及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNTについては45時間弱)(n＝3)。図5Aは、アルギン酸-(AAAT)7-SWNTセンサーは、そのNO特異性を保持していることを示している。興味深いことに、蛍光シグナルは、NOにより余り迅速でなく消光され、NO曝露の30分後には93％消光に達する(図5B)。このシグナルは、24時間消光され続け、その後41時間後に25％に回復する。いくつかの可能性のある機序は、遅延された蛍光回復に係わっているであろう。アルギン酸-(AAAT)7-SWNTに吸着されたNOは、遊離NOよりもより安定しており、その半減期を有意に延長し、NOがアルギン酸ヒドロゲル中で濃縮されることを引き起こすことは、可能である。NOの長期存在する反応性誘導体は、アルギン酸-(AAAT)7-SWNTシステムの消光の原因となることも可能である。これは、NOが、アルギン酸ヒドロゲルに侵入し、且つアルギン酸マトリクス中に捕獲された別の負帯電した被検体と反応する場合に、もっともらしく見える。別の可能性は、NOは、SWNTを消光するアルギン酸中間体を形成することである。
【００７０】
皮下移植及びNO検出は、アルギン酸封入された(AAAT)7-SWNTにより実行され、図5に示された結果を伴った。最初の研究(図5C、スケールバー4mm)は、マウスの左右両方の側腹上の2種のアルギン酸-(AAAT)7-SWNTゲルの皮下(SQ)配置に関与した。ゲル1の総シグナル消光が、ゲルを配置した後およそ20分で撮影された最初の画像において認められたのに対し、ゲル2は、その蛍光を保持した。後続の画像において、ゲル2をおよそ20分間動物内に存在させた後、ゲル2も消光された。4日目までに、両方のゲルは、それらの蛍光を再度獲得した。数回の定量データは、NOのインビボレベルを入手することができ、これは非炎症性組織において非常に低い(すなわちnM)と考えられる。しかし、Leeらによる創傷治癒試験の間に、ラット創傷滲出液中のNOレベルは、14日間にわたり27μMから107μMまで一貫して増加し、一酸化窒素合成酵素活性は損傷後24時間でピークに達したことが示された。Lee, R. H.、Efron, D.、Tantry, U.及びBarbul, A.の文献、「創傷治癒における一酸化窒素：時間経過試験(Nitric Oxide in the Healing Wound: A Time-Course Study)」、Journal of Surgical Research 101, 104-108 (2001)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。従って、創傷床中のNOの濃度は、移植後短期間にSWNTを消光するのに十分に高いことができる。Leeらが、ラットにおいてポリビニルアルコールスポンジにより観察した、延長されたNOの存在は、マウスにおけるアルギン酸ゲルによる本試験においては認められなかったが、NO産生者として公知のマクロファージ細胞の動員、又はポリビニルアルコールスポンジと関連している異物反応も、本試験において認められなかった。Davidson, J. M.の文献、「創傷修復に関する動物モデル(Animal Models for Wound Repair)」、Archives of Dermatological Research 290, S1-S11 (1998)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。これらの知見は、実験の0日目に観察されたシグナルの非存在は、組織の蛍光との干渉ではなく、ゲル移植に起因したNOバーストに関連した蛍光消光から生じたという解釈を裏付けている。この急速消光及び数日でのシグナル回復は、図5Bに示されるデータに対応している。動物の組織は、4日目に屠殺した後に収集し、且つH&Eにより染色した(図5F、10×(4日目及び400日目)並びに20×(180日目)、スケールバー10μm)。無視できる炎症が、移植部位に存在し、これもまた観察された蛍光シグナル回復に関する仮説を裏付けている。
【００７１】
図11は、移植後の皮下ゲルを伴うマウスに関する蛍光強度分布を描くグラフである。アルギン酸-(AAAT)7-SWNT蛍光分布の定量は、移植により引き起こされた消光後の、ゲルのシグナル回復は、ガウス曲線に関する標準偏差の減少(64.95が46.43 a.u.へ)及び増加するピーク(336ポイントが733ポイントへ)につながることを示している。
【００７２】
図5D-5Fは、アルギン酸-(AAAT)7-SWNTの前例のない長期耐性試験の結果を示している。ここでは、右側腹への単独の皮下ゲル移植を、最新の技術である移植可能な電気化学センサーがNOをモニタリングすることを示しているよりもはるかに長く、60〜400日間モニタリングし且つ蛍光造影した。Griveau, S.及びBedioui, F.の文献、「生物環境における一酸化窒素及び関連種の検出のために設計された電気化学センサーアレイ重要例の概要(Overview of significant examples of electrochemical sensor arrays designed for detection of nitric oxide and relevant species in a biological environment)」、Analytical and Bioanalytical Chemistry 405, 3475-3488 (2013)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。図5Dにおいて、ゲルは、移植前、及びその後インビボにおいて300日間の試験期間中の複数の時点で示されている。顕著な蛍光を、本試験の300日間を通じて認めることができる。ゲルの形態は、動物の運動による経時的にわずかな変化を明らかにしているが、ゲルは無傷で有り続け、且つ図5Fに認められるように、シグナルは大きく変化しない。実験の時間経過にわたる蛍光強度の定量は、図5Fに図示している(移植後のシグナル回復は図11に示した)。シグナルは全期間にわたり保持され、強度の変動は14％であった。この小さい変動は、局所的NO濃度は、10ヶ月間にわたりわずかに変化し得るが、移植時に認められた最初の上昇よりも低く維持され、恐らく手術手技に関与した組織損傷により引き起こされることを示唆している。この解釈と一致して、長期試験の結論時に、ゲル移植部位を取り囲む組織において、炎症は認められなかった(図5E)。これらの知見の特に説得力のある態様は、アルギン酸ゲル内のSWNT濃度の変化又はゲル組成の変更(図12)は、シグナル消光の時間スケール及び程度を変化させることである。図12は、PAAm封入された(AAAT)7-SWNTのNOによる蛍光シグナル消光は、そのアルギン酸対応物よりもより短い時間を示すことを示している。
【００７３】
従って、センサーライブラリーは、関心対象の疾患又は状態に直接関連した規格を可能にするように、異なるNO濃度限界を持つゲルを含有するように構築されることができる。
【００７４】
結論として、この研究は、半導体SWNTにより製造された検出限界約1μMを持つインビボNO検出のための直接型光センサーを示し、且つ半導体単層カーボンナノチューブが、化学検出のためにインビボにおいて利用される可能性を強調し、且つインビボ操作が可能なNOのための最初の可逆的直接型光センサーを作製している。数年にわたるインビボにおけるかかるセンサーの明らかにされた安定性(少なくとも400日間にわたり、活性の無視できる変化を認める)は、前例がなく、且つ光退色が存在しないために、更により長い期間にわたり可能性がある。二つの操作様式：注入とそれに続く肝臓内での局在化、並びに組織内の直接移植は、両方共明らかにされ；組織炎症、癌及び細胞シグナル伝達に関連する知識を増大させている。Bredt, D. S.及びSnyder, S. H.の文献、「一酸化窒素：生理的メッセンジャー分子(Nitric Oxide: A Physiologic Messenger Molecule)」、Annual Review of Biochemistry 63, 175-195 (1994)、並びにMantovani, A.、Allavena, P.、Sica, A.及びBalkwill, F.の文献、「癌-関連炎症(Cancer-related inflammation)」、Nature 454, 436-444 (2008)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【００７５】
（液体SWNT溶液を利用するグルコースのインビボ検出）
センサーの感度がヒドロゲルの存在のために損なわれている特定の状況において、SWNTセンサーは、それらの液体形状でインビボに配置されることができる。そのような場合、SWNTセンサーは、液体媒体中に配合される。多孔質ハウジングは、液体媒体中のSWNTセンサーにより充填され、その後対象に配置されることができる。例えば、グルコースセンサーなどのある種のSWNTセンサーは、ヒドロゲル内に封入される場合、これらは関心対象の被検体と特異的に反応するそれらの能力を喪失する。これらの問題点を克服するために、SWNTセンサーは、それらの液体形状でインビボに配置されることができる。グルコースセンシングSWNTは、縫合材により両端が結紮された透析チューブ内に充填されることができる。その後透析チューブは、マウスの皮下に配置されることができる(図13参照)。
【００７６】
図13は、移植前の6-ウェルプレート内の透析チューブ及び透析バッグインプラントを伴うマウスを示している(両方共、透過光、次にSWNTの蛍光を伴う)。動物がSWNT配置から治癒した後、このインプラントがインビボにおいてグルコースと反応するかどうかを調べるために、グルコース負荷試験を行った。図14は、グルコース負荷試験の結果を示している。時点0で、グルコースをIP注入し、マウスを造影した。マウスの血中グルコースレベルを決定し、これらの読み値を蛍光消光と比較するために、血糖測定器を使用した。グルコース濃度及び蛍光消光の傾向は、平行していた。
【００７７】
その移植のためにヒドロゲルマトリクスの形状でSWNTセンサーを封入するために、アルギン酸を、ヒドロゲルの封入材として使用した。アルギン酸は、アニオン性多糖であり、その生体適合性及び簡単なゲル化工程のために、これは医薬適用において広範に使用されている。ここでゲルは、アルギン酸とSWNT溶液の混合物の架橋により作製した。図15は、グルコースに対する反応のまとめを示している。赤色バーと青色バーのグラフを比較することにより、SWNTセンサーは、アルギン酸と混合した後であってもグルコースと反応するその能力を維持することが明らかである。水の添加時にシグナルの若干の変動が存在するが、全般的反応は、SWNT溶液のそれに類似している。しかし、アルギン酸-SWNT混合物は、塩化バリウムを用いて架橋されたので、このSWNTセンサーは、グルコースと反応するその能力を完全に喪失している。
【００７８】
（ヒドロゲル特徴決定）
様々な濃度の(GT)15-SWNTを封入するアルギン酸ヒドロゲル及びPEGヒドロゲルを調製し、各々、塩化バリウム浴中での架橋又はUV照射のいずれかにより架橋した(図16)。2秒間曝露による(GT)15-SWNT、アルギン酸-(GT)15-SWNT及びPEG-(GT)15-SWNTの蛍光シグナルは、図1bに示している。これらのスペクトルは、様々なSWNTキラリティに対しデコンボルーションされ(図23)、且つ(6,5)チューブの蛍光シグナルのピーク値は、図16Cにまとめている。蛍光シグナルは、このSWNT試料の漸増濃度により、線形に増加し(図16Cの点線)、且つ10mg/L以上でプラトーであるのに対し、PEG-(GT)15-SWNT及びアルギン酸-(GT)15-SWNTヒドロゲルについては、25mg/L 試料は蛍光放出の減少を示す。試験した全ての濃度について、アルギン酸ゲルは、PEGヒドロゲルと比べ、より明るいシグナルを示す。更に、アルギン酸ゲル及びPEGゲルの(6,5)ピーク蛍光は、SWNT試料と比べて赤色シフトされる(2〜6nmだけ)(図16D)。
【００７９】
アルギン酸ゲル及びPEGゲルの流動学的特性は、パラレルプレートジオメトリー流動計(parallel plate geometry)による振動測定により決定された。ナノ粒子を伴わないヒドロゲルの線形粘弾性領域(LVR)は、一定の1Hz周波数による歪み掃引により評価した。歪み百分率の関数としての貯蔵弾性率(G')及び損失弾性率(G")は、アルギン酸及びPEGについて、各々、図17A及び図17Bに示している。ナノ粒子を伴わず、且つ2、5、10、及び25mg/L SWNTを伴うゲルの粘弾性反応は、アルギン酸及びPEGについて、各々、定数0.1％及び0.01％の歪みで、LVRにおける周波数掃引により評価した(図16C及び図16D)。G'値は、全ての場合において、G”値よりもほぼ一桁大きかった。更に粘弾性特性は、最高SWNT濃度(25mg/L)を伴うPEGヒドロゲルを除いて、封入されたナノ粒子の濃度に関して大きく変動せず、これはより低い濃度に対し、はるかに低い貯蔵弾性率を有した。これは、この場合UV-開始された架橋プロセスと干渉し得る、UV領域におけるSWNTの高い吸収に起因し得る。
【００８０】
架橋密度ρxは、ゴム弾性理論41-43を使用し、ヒドロゲルの貯蔵弾性率(G')から概算することができ：
G'=ρxRT      (1)
式中、Rは気体定数であり、Tは温度である。LVR領域のG'値を使用し(図16A及び16B)、アルギン酸ヒドロゲル及びPEGヒドロゲルの架橋密度は、48mol/m3及び363mol/m3であり、これは各々、架橋間の平均距離3.2nm及び1.7nmを示唆している。ゴム弾性理論は、PEGなどの化学的に架橋されたヒドロゲルについて発展されているが43、式(1)は、周波数に対する貯蔵弾性率G'の有意でない依存及び低い損失比(G'/G")44など、特定条件下での物理的に架橋されたアルギン酸に適用することができ、これは本発明者らの場合にあてはまる。
【００８１】
（様々なヒドロゲル幾何における封入されたナノ粒子の蛍光消光）
封入されたナノ粒子センサーをシミュレーションし特徴決定するために、リボフラビンの添加に反応する(GT)15-SWNT、PEG-(GT)15-SWNT及びアルギン酸-(GT)15-SWNTの蛍光変調を、nIRアレイにおいて測定し、且つ図18Aに示した。リボフラビンは、DNAが巻き付けられたSWNTの既知の蛍光消光剤であるので、これをモデル標的被検体として選択した。Zhang, J.らの文献、「カーボンナノチューブ上に吸着された人工ポリマーで製造されたコロナ複合体を使用する分子認識」、Nature Nanotechnology 8, 959-968 (2013)、並びにZhang, J. Q.らの文献、「近赤外蛍光単層カーボンナノチューブに吸着されたd(AT)(15)DNAにより可能な一酸化窒素の単分子検出」、Journal of the American Chemical Society 133, 567-581 (2011)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。1時間のインキュベーション後、SWNT溶液のシグナルは、2、5、10、及び25mg/Lの濃度に関して、各々、90％、85％、80％、及び70％だけ消光されたのに対し、アルギン酸ヒドロゲルは、各々50％、44％、48％、及び33％だけ消光された。PEGヒドロゲルは、全ての濃度に関して5％未満の変化を示し、ここで最大6時間の比較的長いインキュベーション時間は、有意な変化を示さなかった(データは示さず)。
【００８２】
6時間の期間にわたり濃度2、5、10及び25mg/Lのアルギン酸ヒドロゲルの消光を調べることにより、ナノ粒子濃度の作用を調べた。2項指数関数フィットを用い、2種の特徴的消光時間スケールがわかり(図18B)、ここで濃度2、5、10及び25mg/Lに関して、各々、短いのは14.2、14.5、14.1、及び15.4分間であり、並びに長いのは6.18、5.6、5.8、及び5.7時間であった。最初の強度は、4種の濃度間で変動するが、消光率は、全てについて類似しており、これは共通の機序を示唆している。
【００８３】
消光率及び程度に対するゲル幾何の作用を、ナノ粒子濃度10mg/Lを伴う、アルギン酸-(GT)15-SWNTシステムにより調べた。容積200μl及び600μlの円形の形状のアルギン酸ゲルの蛍光シグナルを、6時間モニタリングした(図18C)。小型(200uL)及び大型(600uL)の両方の円形ゲルは、2項指数関数フィットで、2種の特徴的消光時間を示し、その一方は20分間の桁であり(各々、20.7分及び26.2分)、ここで第二のものは数時間の桁であった(各々、6.5時間及び10.8時間)。この同等な時間スケールは、ゲル(get)の基本表面積の最小化は、高さがゲル直径(各々、7mm及び15mm)に対し小さいならば、固定されたゲルの高さ(3mm)について、消光率の増加に対し小さい作用を有することを明らかにしている。
【００８４】
全て同じ容積の星型、長方形、及び円形の形状のゲルに関して、2項指数関数フィットで長い特徴的消光時間(図18D)は、各々、15.6、9.9、及び9.5時間であり、これはより小さい側方表面積に関するわずかな減少を示している。短い特徴的消光時間は、全ての形状について同等であり、星型、長方形、及び円形の形状のゲルに関して、各々、34.9、19.3、及び26.8分間であった。これらの結果は、このサイズ範囲のゲルに関して、ゲル表面での物質移動制限(mass transfer limitations)は存在せず(形状不変)、且つ内部物質移動制限も存在しない(サイズ不変)ことを指摘している。
【００８５】
（ヒドロゲルの化学安定性）
2種のヒドロゲルモデルシステムの光熱及び光化学安定性を、封入されたナノ粒子の蛍光シグナルを経時的にモニタリングすることにより試験した。SWNTは、光退色を示さない(Liu, Z.、Tabakman, S.、Welsher, K.及びDai, H.の文献、「生物学及び医学におけるカーボンナノチューブ：インビトロ及びインビボでの検出、造影、薬物送達」、Nano Research 2, 85-120 (2009)、Cherukuri, P.、Bachilo, S. M.、Litovsky, S. H.及びWeisman, R. B.の文献、「食細胞における単層カーボンナノチューブの近赤外蛍光顕微鏡」、Journal of the American Chemical Society 126, 15638-15639 (2004)、並びにGraff, R. A.らの文献、「単層カーボンナノチューブ複合体中の個々のナノチューブの高負荷での分散の実現」、Advanced Materials 17, 980-984 (2005)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。)ので、それらの蛍光は、ヒドロゲルマトリクスの分解のインジケーターとして役立つ。これらのゲルは、焦点面で14mWの連続レーザー励起下で4時間造影し、5分間隔で画像収集した。シグナルの安定性は、試料を試験期間中は湿潤状態に維持した場合、アルギン酸ゲル及びPEGゲル(SWNTは10mg/L)の両方について、図19Aにおいて明確に認めることができる。しかし、試料を乾燥した場合、これらはそれらの形状及び蛍光を不可逆的に喪失し、これは再水和時に回復しなかった。
【００８６】
ナノ粒子が封入されたゲルの長期間化学安定性を評価するために、異なる濃度の封入されたSWNTを伴うアルギン酸ヒドロゲル及びPEGヒドロゲルの両方を、動物全体及びnIRアレイの造影システムにおいて、60〜90日間分析した。アルギン酸及びPEGのヒドロゲルプラグのピーク蛍光を、SWNT濃度2、5、10及び25mg/Lを伴うnIRアレイにおいて複数の時点で測定し、且つこれらのゲルと同じ条件で各時点で測定された標準SWNT懸濁液のピーク蛍光シグナルにより正規化した。PEGゲル及びアルギン酸ゲルのデータポイントは、各々、指数関数崩壊モデル及び2項指数関数崩壊モデルによりフィットされ、各々、1及び2種の特徴的崩壊時間スケールを示した(図19B及び図19C)。これらのゲルの特徴的崩壊時間は、図19Eに示しており、且つアルギン酸ゲルに関する1日の桁の速い崩壊(t1)、並びにアルギン酸ゲルの場合2年の桁、及びPEGヒドロゲルの場合10〜100日の桁である遅い崩壊(t2)を示す。アルギン酸ゲルの短い崩壊時間スケールは、典型的には24時間以内で到達する平衡に達するまで造影に使用される96-ウェルプレート内での膨潤が原因であり得るのに対し、PEG-ジアクリレートゲルは、およそ20分以内に平衡に達することが示されている。Davidovich-Pinhas, M.及びBianco-Peled, H.の文献、「アルギン酸膨潤の定量分析(A quantitative analysis of alginate swelling)」、Carbohydrate Polymers 79, 1020-1027、並びにMellott, M. B.、Searcy, K.及びPishko, M. V.の文献、「UV重合により製造されたポリ(エチレングリコール)ジアクリレートの高度に架橋されたヒドロゲルからのタンパク質の放出(Release of protein from highly cross-linked Hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization)」、Biomaterials 22, 929-941を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。これらのヒドロゲルの長期分解時間スケールは、PEGの場合、主に加水分解によるものであり、アルギン酸の場合は二価の陽イオンの拡散によるものである。Reid, B.らの文献、「PEGヒドロゲル分解及び周囲組織環境の役割(PEG hydrogel degradation and the role of the surrounding tissue environment)」、Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, n/a-n/a, doi: 10.1002/term.l688 (2013)、Lin, C.-C.及びAnseth, K.の文献、「再生医療における生体分子の制御放出のためのPEGヒドロゲル(PEG hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine)」、Pharm Res 26, 631-643, (2009)、Metters, A. T.、Bowman, C. N.及びAnseth, K. S.の文献、「PLA-b-PEG-b-PLAヒドロゲルネットワークのバルク分解の統計学的速度論モデル(A Statistical Kinetic Model for the Bulk Degradation of PLA-b-PEG-b-PLA Hydrogel Networks)」、The Journal of Physical Chemistry B 104, 7043-7049, (2000)、Lee, K. Y.、Bouhadir, K. H.及びMooney, D. J.の文献、「多官能性架橋分子を使用するヒドロゲルの制御分解(Controlled degradation of hydrogels using multi-functional cross-linking molecules)」、Biomaterials 25, 2461-2466 (2004)、並びに、Kong, H. J.、Kaigler, D.、Kim, K.及びMooney, D. J.の文献、「分子量分布を介したアルギン酸ヒドロゲルの制御された剛性及び分解(Controlling Rigidity and Degradation of Alginate Hydrogels via Molecular Weight Distribution)」、Biomacromolecules 5, 1720-1727, (2004)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【００８７】
加えて、950〜1050nmの範囲の蛍光シグナルを統合する動物全体の造影システムに従い、アルギン酸ゲルは、全試験期間にわたって、それらの形状及びそれらの蛍光をより良く保持したのに対し、PEGゲルは、それらの蛍光及びそれらの形状の両方を経時的に喪失した(図19D及び図24)。
【００８８】
（検出深度限界）
組織内の最大検出深度を推定するために、ナノ粒子蛍光シグナルを、組織の疑似模型(phantom)試料を通して収集した。一次元吸収及び散乱モデルを想定し、厚さdの組織を通じて造影されたヒドロゲルについて、検出された蛍光強度Fは、下記式であり：
【数４】
2016537644.tif 000006
式中、I0は、励起レーザー強度であり、μex及びμemは、各々、励起波長及び放出波長に関する組織吸光係数であり、ρは、ヒドロゲル中の蛍光ナノ粒子濃度であり、φは量子収量であり、且つAは、比例定数である。
【００８９】
PEGヒドロゲル及びアルギン酸ヒドロゲル内に封入された(GT)15-SWNTが、様々な厚さのニワトリ胸部組織を通して造影された(図20A)。組織厚さの関数として、アルギン酸-(GT)15-SWNT及びPEG-(GT)15-SWNTのnIRアレイにより測定された正規化された蛍光シグナルは、この試験において使用した様々な濃度に関して図5bに示している。蛍光強度は、SWNT濃度及び曝露時間により正規化された(6,5)キラリティ放出ピークで評価し、結果的にこれらのデータ点は、単独の曲線に折り畳まれ(collapse to)、曝露時間に対する蛍光シグナルの線形の依存を想定している。蛍光強度は、SWNT濃度に対し、わずかに10mg/Lまでは、線形依存性であるので、2、5、及び10mg/Lに関する結果のみが、指数減衰関数にフィットされた。指数係数の絶対値は、アルギン酸ゲル及びPEGゲルについて、各々、1.325±0.095 mm-1及び1.257±0.103 mm-1であった。
【００９０】
最大検出深度を決定するために、検出限界を、nIRアレイ造影システムのバックグラウンドノイズシグナルの二乗平均平方根を3回、最大曝露時間30秒で規定した。この計算は、SWNT濃度2、5、及び10mg/Lに関する指数フィット関数を基に行った。検出限界は、表1にまとめている。
【００９１】
【表１】
2016537644.tif 000007
表1.  ヒドロゲル内に封入されたナノ粒子の3つの比較的低い濃度に関する指数フィット関数(式(2))により決定されたアルギン酸ヒドロゲルシステム及びPEGヒドロゲルシステムに関する検出限界
【００９２】
式(2)に示された1Dモデルに従い、指数係数は、励起波長及び放出波長の吸光係数の合計と等しく、これは、対応するスペクトル範囲で、ニワトリ胸部組織の吸収スペクトルの測定(図21B)により、独立して評価された。励起レーザー波長(785nm)及び放出された蛍光波長(996nm)に対応する吸光係数の合計は、このスペクトルに従い2.121±0.022 mm-1であり、これは指数フィットにおいて認められた係数に匹敵している。
【００９３】
最大検出限界は更に、深度2、4、6及び8mmで動物全体の造影システムで造影することにより分析した。このデータ(図20C)は、nIR結果を確認し、深度2mm及び4mmでの10mg/Lゲルに関して明確なシグナルを示しているのに対し、深度6mm及び8mmの試料の読み値は、その装置のバックグラウンドノイズと同等であった。
【００９４】
（インビボ検出）
インビボにおけるゲルの変動性を確実にするために、PEGゲル及びアルギン酸ゲルの両方を、マウス内の蛍光ナノ粒子の封入を実行し(n＝3)、且つ動物全体の造影システムにおいて蛍光シグナルを試験した。図20Dに認められるように、PEGゲル及びアルギン酸ゲルの両方は、移植後14日間視認できた。マウスは、インプラントを60日間保持し続け、且ついずれのヒドロゲルに対しても有害反応を示さなかった。
【００９５】
2つの型のヒドロゲルにおける組織深度とシグナル検出の間の関係は、将来の蛍光センサーのインビボ使用のためのモデルを作製し、且つこれらのゲルがインビボにおいて利用され得る程度を決定することにより分析した。様々な幾何のヒドロゲル製造のための一貫した再現可能な方法が、開発された。アルギン酸ゲルは、それらのPEG対応物よりも、はるかにより明るい蛍光シグナルを示し、典型的には1.5〜3倍より強力に放出し、SWNTの場合に10mg/Lの両方のシステムに関する最適ナノ粒子濃度が認められ、これを上回ると蛍光シグナルが減少する。封入されたSWNTの赤色シフトした蛍光シグナルは、水性懸濁液中のSWNT蛍光に関して、ゲル内のSWNT凝集を指摘しており、これは高濃度での蛍光放出の減少に寄与する。O'Connell, M. J.らの文献、「個別の単層カーボンナノチューブからのバンドギャップ蛍光(Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes)」、Science 297, 593-596 (2002)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。ナノ粒子濃度の増加は自己消光に繋がり得るので、この作用は、ヒドロゲル封入型蛍光センサーのあらゆるシステムにおいて考察されるべきである。Resch-Genger, U.、Grabolle, M.、Cavaliere-Jaricot, S.、Nitschke, R.及びNann, T.の文献、「蛍光標識としての量子ドット、対、有機色素(Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels)」、Nat Meth 5, 763-775 (2008)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。
【００９６】
アルギン酸ヒドロゲルは、それらのPEG対応物よりも堅さが少なく、且つ機械的破損を受ける前に、より高度な歪変形を維持することができる。自然の組織の運動は、規格準拠ゲルが患者への不快を避けることを必要とするので、PEGゲルの剛性は、インビボ適用の限定要因であり得る。PEG濃度の低下又は架橋のためのUV照射期間の短縮は、剛性を減少し、且つインビボ適用のためにゲル特性を改善することができる。
【００９７】
リボフラビンは流体力学半径が0.58nmであるが、これは本ヒドロゲル内に封入されたナノチューブの蛍光放出を消光するので、リボフラビンをモデル標的被検体として使用した。Tao, X.の文献、「スマートファイバー、布及び衣料品(Smart Fibres, Fabrics and Clothing)」(Woodhead Publishing, 2001)、並びにZhang, J. Q.らの文献、「近赤外蛍光単層カーボンナノチューブに吸着されたd(AT)(15)DNAにより可能な一酸化窒素の単分子検出」、Journal of the American Chemical Society 133, 567-581 (2011)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。アルギン酸ゲル中の架橋点の間の平均距離は、PEG中のそれのほぼ2倍であり(各々、3.2nm及び1.7nm)、このことはその中の被検体のより迅速な拡散を可能にする。従って、リボフラビンにt＝0分で曝露した場合、アルギン酸ゲル中のSWNTの蛍光シグナルは有意に減少し、ここでPEGヒドロゲル中のナノ粒子は、反応をほとんど又は全く示さなかった。アルギン酸におけるより短い拡散時間は、同様の流体力学半径の被検体による迅速なシグナル変調を可能にし、ここでこの作業に使用したPEGゲル封入は、封入にとってこれを余り好ましくないものにするシグナル消光を妨げる。アルギン酸ヒドロゲルシステムの場合における、2種の特徴的消光時間は、各々、急速なリボフラビン-SWNT反応及び遅い拡散率が原因である。溶液中のリボフラビン拡散係数DRのおおまかな概算(3.23×10-10 m2/s、Sen, F.らの文献、「単独のカーボンナノチューブ蛍光分光法を使用するリボフラビン、タロロックス、及び一重項酸素の振動性表面反応の観察(Observation of Oscillatory Surface Reactions of Riboflavin, Trolox, and Singlet Oxygen Using Single Carbon Nanotube Fluorescence Spectroscopy)」、ACS Nano 6, 10632-10645, doi: 10.1021/nn303716n (2012)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)は、3mmゲル厚に関する8時間の拡散時間の上限を生じ、実験結果と一致した。
【００９８】
両方の型のヒドロゲルは、拡散で限定された消光反応を明らかにするので、これらのゲルの幾何的特徴は、拡散率を変調することができるかどうかを調べた。しかし結果は、厚さは一定に保ちながらの、ヒドロゲルの横寸法のサイズ及び形状の変化は、消光率に対しごくわずかな作用しか有さないことを指摘している。ゲルの厚さは、それらの直径に対し小さいので、その拡散は、z-軸に沿った横断成分により支配される(図18C及び18D)。加えて、ゲルの形状、従って表面積も、消光率に関してごく小さい作用を有することがわかった。
【００９９】
アルギン酸及びPEGの両方の特性は、架橋前のゲル溶液の最終濃度を変更することにより、調節することができ、且つゲルの規格は、被検体特性及び必要とされる検出時間スケールに従い調製されるべきである。ヒドロゲル細孔サイズの変調は、関心対象の被検体よりもより低い拡散率又はより高い流体力学半径を持つ分子を排除することにより、増大した特異性のために利用され得る。
【０１００】
長期安定性実験は、PEGヒドロゲルと比べアルギン酸ゲルのより長い化学安定性を有意に明示し、これらを長期間インビボセンシング及び検出により適切なものとし、並びにヒドロゲルのより大きいバッチを作製する機会をもたらし、製造時間及び試料変動性を減少した。アルギン酸に対しPEGヒドロゲルの損なわれた安定性は、スペクトルのUV部分を利用するPEGヒドロゲルの光誘導した架橋と干渉し得る、この試験において使用されるナノ粒子の有意なUV吸収に部分的に起因し得る。より低いナノ粒子濃度を封入しているヒドロゲルは、より長い貯蔵寿命を発揮することが示されているので、長期間適用のために、シグナルの信頼できる検出を依然可能にするであろう可能な最低濃度を使用することは好ましい。
【０１０１】
PEGヒドロゲル及びアルギン酸ヒドロゲル中に封入された(GT)15-SWNTは、曝露時間に応じて、深度4mm以上で、nIRアレイにおいて及び動物全体の造影システムにおいて、組織内で造影されることができ、そこではシグナルは、PEG及びアルギン酸について、各々、およそ0.55mm及び0.52nmを過ぎて(after)その最大値の半分にまで減少する。従って、そのような構築体の皮下又は腹腔内インプラントは、非侵襲的様式の外部装置により、光学的に造影することができ、被検体の実時間インビボ検出及びセンシングが可能である。動物研究目的のために、このようなプラットフォームは、例えば、外部で関心対象のバイオマーカーをモニタリングすることにより、腫瘍収集のために屠殺される動物の数を潜在的に減少することができる。骨及び脂肪などの異なる組織は、本試験の対象である骨格筋組織よりも、より高い又はより低い検出深度限界を有し得ることは考慮されなければならない。代替の組織を通じたヒドロゲルの検出は、組織透過性及び組織化(organization)に応じて変動することが予想され、これは光散乱及び吸収の特性を変更することができる。
【０１０２】
4〜5mmの大きさであることがわかっている本発明者らの具体的検出時間、出力及びシグナル捕獲に関する最大検出深度は、特に大型動物又はヒトにおける深部組織検出に関する限定要因であるが、可能性のある設定の最適化は、作業範囲を拡大することができる。レーザー波長及び組織の色素沈着に特異的である生体安全限界内で、励起レーザー強度を14mWから増加することにより、増強された放出シグナルは、より厚い組織へ浸透することができる。シグナルが獲得される時間の延長及びより進歩した放出シグナル収集技術もまた、これらのセンサーに関する実行可能な検出深度を広げるであろう。あるいは、検出深度限界は、励起光及び検出光チャネルを移動するための実施領域への内視鏡用光ファイバーの外科的挿入の最小侵襲的手技により、克服することができる。
【０１０３】
最後に、ナノ粒子蛍光シグナルの検出は、PEGヒドロゲル又はアルギン酸ヒドロゲルのいずれかにより封入され、マウス内に皮下移植された場合に、明らかであった。これは、インビボセンシング及び検出適用に使用されるべき本発明者らのヒドロゲル-センサーシステムの可融性(fusibility)を確認する。
【０１０４】
(GT)15 DNAが巻き付けられた単層カーボンナノチューブにより明らかにされたこのモデルは、SWNTを懸濁し且つセンサー特異性を変更する他のポリマーに並びに任意の他の蛍光ナノ粒子に適用することができる。更に、ここで実行された網羅的実験は、かかるヒドロゲル封入されたnIR蛍光センサーを製造し、それらの性能を評価し且つ検出深度限界を推定するための価値のあるツールをもたらす。
【０１０５】
ヒドロゲル内のナノ粒子センサー封入は、インビボ検出適用のための有望なプラットフォームであることができる。このヒドロゲル組成物は、蛍光シグナル強度及び安定性の決定において、重要な役割を果たす。このゲルの物理特性に加え、ヒドロゲル内の蛍光ナノ粒子の濃度は、シグナル検出限界に影響を及ぼし、入射特異的センサーアッセイのための金型を作製する。最後に、ナノ粒子センサーの最大組織検出深度と蛍光強度の間の相関関係が明らかにされ、インビボ使用のための最適ゲルパラメータを決定する式を提供する。
【実施例】
【０１０６】
（材料及び方法）
（DNAオリゴヌクレオチドナノチューブ懸濁液）
SWNTは、先に公表された方法に類似した方法を使用し、d(AAAT)7オリゴヌクレオチドと共に懸濁した。簡単に述べると、SouthWest NanoTechnologies社から購入したSWNT(SG65i、チューブ直径0.77±0.02nm、＞1,000の高い縦横比、炭素含量＞95重量％、＞40％の(6,5)キラリティSWNT及びSWNTの＞95％は半導体である)を、ssDNAの28-塩基(dAdAdAdT)7配列(Integrated DNA Technologies社)と懸濁した。DNA及びSWNTは、ナノ純水に溶解した0.1M NaClへ、DNA：SWNT質量比2：1で添加した。この試験において使用した典型的DNA濃度は、2mg/mLであった。氷上で、3mmプローブチップのソニケーター(Cole Parmer社)により10分間電力10Wで、DNA/SWNT溶液を音波処理し、その後16,100 RCFで180分間、卓上で遠心した(Eppendorf社遠心分離機5415D)。上清の上側2/3を収集し、ペレットを廃棄した。
【０１０７】
（PEG-DNAコンジュゲート及びPEG-DNA-CoMoCAT懸濁）
10mM(0.5Mストック溶液10μL)のTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液)(Sigma Aldrich社)及び5'チオール-修飾されたd(AAAT)7(Integrated DNA Technologies社)4.49μLを、水485.5μL中で1時間混合し、DNA鎖上のジスルフィド結合を破壊した。メトキシPEG(5kDa)マレイミドを、PBS(1×リン酸緩衝食塩水)中に、濃度100mg/mLで溶解した。次に等量の還元したDNA溶液及びmPEG-マレイミド溶液を、20分間混合し、PEG-DNAコンジュゲートを完了させた。PEG-DNAコンジュゲーションは、ゲル電気泳動により確認した(図7参照)。SWNTのPEG-DNAとの懸濁は、先に示したものと類似の手順に従った。簡単に述べると、SWNT 1mgを、PEG-DNA溶液1mLと一緒にし、その後氷上で、3mmプローブチップのソニケーター(Cole Parmer社)により40分間10Wで音波処理した。得られた溶液を、16,100 RCFで180分間遠心し(Eppendorf社遠心分離機5415D)、上清の上側2/3を収集し、ペレットを廃棄した。遠心分離後、遊離のPEG-DNAを、ナノ純水の代わりに前記溶媒を用い、遠心濾過(Amicon社、Ultra-4 100K遠心フィルターユニット)を用いて除去した。遠心濾過は、全ての残留DNAを完全に除去するために、4回行った。
【０１０８】
（アルギン酸-(AAAT)7-SWNT調製）
(AAAT)7-SWNTは、通常の食塩水中に溶解した2％PRONOVA SLM 20アルギン酸(NovaMatrix社)と混合し、1cmガラス底のペトリ皿(MatTek社)内に配置した。アルギン酸は、過剰な0.1M塩化バリウムにより、架橋した。移植前に、試料を、通常の食塩水ですすいだ。
【０１０９】
（PAAm-(AAAT)7-SWNT調製）
(AAAT)7-SWNTは、3％T5％Cポリアクリルアミドヒドロゲル(PAAm)中に、濃度1.5mg/mLでキャストした。このヒドロゲルの重合は、1容積％の過硫酸アンモニウム開始剤100mg/mLにより開始し、そのラジカル反応は、1容量％のテトラメチルエチレンジアミンにより安定化した。架橋後、ヒドロゲルを、PBS中に浸漬し、最大膨潤させ、及び試験緩衝液とSWNTのpHを平衡化させた。
【０１１０】
（他の反応性酸素種及び窒素種に対する(AAAT)7-SWNT、PEG-(AAAT)7-SWNT及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNTのスクリーニング）
ペルオキシ亜硝酸ナトリウム及びAngeli塩を、Cayman Chemical社から購入した。本実験に使用した他の化学物質は、Sigma社から購入した。NO2-、NO3-、H2O2、及びClO-のストック溶液は、それらを水中に6mMで溶解することにより調製し；Angeli塩及びONOO-は、各々、0.3M NaOH及び0.01M NaOHの溶液中に、6mMで溶解した。O2-は、文献41の手順に従い調製した。簡単に述べると、過剰なKO2を、DMSOと混合し、ボルテックスし、その後遠心分離し、ペレットを除去した。得られた上清は、3.6mM O2-ストック溶液を生じた。SWNT溶液は、50mM PBS(pH7.4)中に2mg/Lになるよう希釈した。特注の近赤外線(nIR)蛍光顕微鏡(以下に説明)を使用しSWNT蛍光をモニタリングしながら、最終濃度が60μMになるよう被検体溶液を添加し、SWNT蛍光反応を、10分間モニタリングした。ヒドロキシラジカルを、Fenton反応を用い発生させ、ここで、H2O2及びFeSO4(最終濃度として60/0.6、300/3、及び1000/10μM)を、SWNT溶液へ添加した。SWNT蛍光反応は、試薬添加後、最初の10分間、及び12時間にモニタリングした。一重項酸素は、先に報告した類似の手順を用いてローズベンガルを使用し発生させた4,24。簡単には、ローズベンガル60μMを、SWNT溶液(2mg/L)へ添加し、560nmで励起させ、一重項酸素を発生させた。毎分単位のSWNT蛍光反応は、励起光源785nmレーザーに3秒間迅速にスイッチすることにより、記録した。10分後、560nm励起光源を消し、3種の追加のスペクトルを、785nmレーザーを用い、毎分撮影した。
【０１１１】
（NO溶液）
飽和NO溶液を、先に報告した方法6に類似した方法を用いて調製した。簡単には、PBS 3mLを、5mLの丸底フラスコに投入し、入口針及び出口針を備える栓で密封した。アルゴンガス(Airgas社)を、PBSへと2時間泡立たせ、溶解した酸素を除去した。次にNO気体(99.99％、Electronicfluorocarbons社)を、出口圧2psiで20分間泡立たせた。最終NO濃度は、ホースラディッシュペルオキシダーゼアッセイ43,44を用いて決定した。
【０１１２】
（消光及びシグナル回復のためのnIR蛍光）
(AAAT)7-SWNT、PEG-(AAAT)7-SWNT及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNTに関するSWNT nIR蛍光スペクトルを、特注の近赤外蛍光顕微鏡により測定した。簡単には、Zeiss社AxioVision倒立顕微鏡を、PI-Acton SP150分光写真器を介して、Princeton Instruments社のInGaAs 1-Dアレイ検出装置と組合せた。SWNT溶液を、785nmフォトダイオード(B&W Tek社)を用いて励起させ、得られた蛍光を、顕微鏡及び組合せた光学素子により収集した。NO消光実験は、以下のように行った。(AAAT)7-SWNT又はPEG-(AAAT)7-SWNTの試料150μL(NO添加後の最終濃度2mg/Lについて2.66mg/L溶液)を、96-ウェルプレートに配置し、785nmフォトダイオードで励起させ、スペクトルを、毎秒、10秒間記録した。NO溶液120μMを、これらのウェルに添加し(ウェル中のNO濃度30μMとする)、試料収集を30分間継続した。同様に、150μLのアルギン酸-(AAAT)7-SWNTゲル(25mg/L)を、96-ウェルプレートに配置し、785nmフォトダイオードにより励起させ、蛍光スペクトルを、NO添加後ほぼ45時間記録した。
【０１１３】
（PAAm-(AAAT)7-SWNTのnIR蛍光消光）
5μLのPAAm-(AAAT)7-SWNT(1.5mg/mL)ゲルを、特注の卓上検出器上のガラスウェル内に配置した。試料を、565nmで励起させ、NO添加後、30分間の990nmの(6,5)SWNT放出ピークについてデータを収集した。
【０１１４】
（皮下ゲル移植）
マウスには、本試験全般について、最大5％イソフルランガスにより麻酔をかけた。無菌の非接触技法を使用し、ゲルを配置した。動物に、滅菌ドレープで覆いをかけ、小さい1cm未満の切開を作製し、筋肉から皮膚の鈍的剥離を行った。アルギン酸ゲルのベースライン造影後、これを挿入し、ナイロン結紮糸又は手術用糊の塗布により固定した。その後動物を、造影し(Maestro(商標)、Cambridge Research & Instrumentation社)、且つ加熱ランプ下に配置し、覚醒させた。動物を、試験期間中、モニタリングし、造影し、予め決定された時点で、組織学的分析のために、CO2により屠殺した。
【０１１５】
（CRi社のMaestro(商標)による造影）
インビボ造影を、Cambridge Research & Instrumentation社のMaestro装置上で行った。Maestroは、透過光が電気的に同調されることを可能にする液晶同調要素を備える。この試験において利用される液晶フィルターは、最大波長範囲650〜1050nm及び帯域通過40nmを有する。Maestroソフトウェアは、シグナル、バックグラウンド及び自己蛍光のスペクトルの放出波長に注目し、且つこれらを3つの成分に分離し(図1D)、関心対象のシグナルの分析を可能にする。10nmの段階サイズ及び各段階20秒間の読みでの、950nmから1050nmまでの放出ウインドウを、この試験において使用した。
【０１１６】
（組織像）
組織試料を、10％中性-緩衝されたホルマリン中で、一晩固定し、通常処理及びパラフィン包埋のために、Division of Comparative Medicine(マサチューセッツ工科大学)へ送った。厚さ4μmの切片を、治療群については知らされていない有資格の病理学者(N.P.)による顕微鏡試験のために、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)により染色した。
【０１１７】
（アガロースゲル調製）
分析用ゲル電気泳動を、Powerpac Basic(Bio-Rad Laboratories社)電源を200Vで1時間使用し、TBE緩衝液中、0.75％DNA等級高融点アガロースゲルにおいて行った。(AAAT)7-SWNT及びPEG-(AAAT)7-SWNTの分散液を、ウシ胎仔血清(FBS)及びトリス-ホウ酸エステル-EDTA(TBE)緩衝液(50mMトリス-ホウ酸エステル、1mM Na-EDTA、pH8.4)と混合し、次にグリセロールを補充した後、電気泳動ゲル内の個別のウェルに装加した。ゲル内のSWNTの空間的位置を、特注したnIR蛍光顕微鏡を用いて測定した。ゲルは、各スペクトル撮影間で1mm移動する自動化されたx-yトランスレーションステージ上に配置した。これは、ゲルの長さにわたり、nIRスペクトルの空間解析されるセットを生じた。
【０１１８】
（SWNT局在化のためのPEG-(AAAT)7-SWNTの注入）
マウスは、本試験全般について、最大5％イソフルランガスにより鎮静させた。新たに調製したPEG-(AAAT)7-SWNTを、通常の食塩水中に50mg/Lになるよう希釈し、完全に混合させ、マウス尾静脈へ0.3cc、29ゲージ0.5インチのインスリン注射器により注入した(200μL)。その後マウスを、適切な時点(注入後0、5、15、30、60又は120分)で、CO2投与により屠殺し、直ちに剖検及び試料造影した。血液を心穿刺により収集し、尿を膀胱から収集し、その後尾、肺、肝臓及び腎臓を摘出した。液体及び組織を直ちに造影し(Maestro(商標)Cambridge Research & Instrumentation社)、引き続き組織像及び／又はラマン分析した。
【０１１９】
（SWNT局在化のラマン検出）
ラマン散乱測定を、LabRam-IR(jobin Yvon Horiba)ラマン顕微鏡を用いて行った。試料を、633nmフォトダイオードにより励起させ、10×対物レンズで試料上に焦点を当てた。散乱した光を、180°コンフィギュレーションで収集し、Si CCDカメラ上で焦点を当てた。試料での励起電力は、12.6mWであり、最終電力密度〜550kW/cm2であった。
【０１２０】
（炎症検出のためのPEG-(AAAT)7-SWNT注入）
SJLマウス(Charles River社)を、下記の2群に分けた；(1)IP注射により、食塩水200μL中1×106個のRcsX細胞を受け取る炎症性、並びに(2)食塩水200μLのIP注射を受け取る非-炎症性。12日後、マウスを、最大5％イソフルランガスにより鎮静させ、通常の食塩水中に50mg/Lまで希釈した新たに調製したPEG-(AAAT)7-SWNTの200μLを、0.3cc 29ゲージ0.5インチのインスリン注射器により、尾静脈へ注入した。30分後、マウスを、それらの肝臓を露出するために開き、Cri社Maestroを用いて造影し、その後直ちにCO2投与により屠殺した。剖検及び組織摘出(肝臓、肺、腎臓、及び脾臓)を速やかに行い、引き続き組織造影(Maestro(商標)、Cambridge Research & Instrumentation社)を行い、組織像のために固定した(炎症性マウス及び非炎症性マウスの炎症及び健康を確認するため、図9)。図9は、濃度に対する(AAAT)7-SWNT(赤色)、PEG-(AAAT)7-SWNT(青色)及びアルギン酸-(AAAT)7-SWNT(緑色)蛍光の定量を示している(n＝3)。
【０１２１】
（ゲル金型）
ゲルを架橋するための金型を、水噴射により、厚さ3.175mmのシリコーン小片(HT-6240透明な.125”の性能が信頼できる固形シリコーン、Rogers社)を切断することにより作製した。この金型のために選択された形状は、総容積を一定に保ちながらゲルの表面積を変更するように設計された。
【０１２２】
（アルギン酸-(GT)15-SWNT調製）
(GT)15-SWNT懸濁液を、通常の食塩水中に溶解した2％PRONOVA SLM 20アルギン酸(NovaMatrix社)と混合し、底から伸ばした透析チューブ(10,000MWCO)を伴う特別に切断した金型(前記)へピペッティングし、これを深皿の底から2mm上昇させた。アルギン酸は、金型の表面を覆わないように深皿に添加した過剰な0.1M塩化バリウム(BaCl2)により、24時間架橋させた。その後試料を、試験時まで、0.1M BaCl2浴に移した。
【０１２３】
（PEG-(GT)15-SWNT調製）
(GT)15-SWNT懸濁液を、ポリエチレングリコール-ジアクリレート(700g/mol、Sigma-Aldrich社、25℃で1.12g/mL)、2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン(7mg/mL、Sigma-Aldrich社)及び水の、容積比1：0.05：0.95の溶液と混合し、底に接着したテープを伴う特別に切断した金型(前記)へピペッティングした。PEGは、UV-B光(365nm)への15分間の曝露により架橋させ、試験時まで水浴に移した。Kruss, S.、Erpenbeck, L.、Schon, M. P.及びSpatz, J. P.の文献、「動的細胞接着試験のための円形のナノ構造で生体機能化されたヒドロゲルマイクロチャネル(Circular, nanostructured and biofunctionalized hydrogel microchannels for dynamic cell adhesion studies)」、Lab Chip 12, 3285-3289, doi: 10.1039/c2lc40611j (2012)、並びにKruss, S.、Srot, V.、van Aken, P. A.及びSpatz, J. P.の文献、「ガラス及び高分子支持体上の同調可能なサイズ及び密度のAu-Agハイブリッドナノ粒子パターン(Au-Ag hybrid nanoparticle patterns of tunable size and density on glass and polymeric supports)」、Langmuir 28, 1562-1568, doi: 10.1021/la204395d (2012)を参照し、これらの各文献はその全体が引用により組み込まれている。
【０１２４】
（SWNTゲルの光学特徴決定）
アルギン酸-(GT)15-SWNT溶液及びPEG-(GT)15-SWNT溶液を、先に記載したように調製し、ここでアルギン酸溶液の150μLアリコートを、2kDa分子量カットオフスライド-A-レーザー(lyzer)ミニ透析ユニットにキャストし、架橋のために0.1M塩化バリウム浴中に配置し、並びにPEG溶液の150μLアリコートを、直径4.5mm及び高さ9mmのチューブにキャストし、UV-B光により架橋した。架橋されたPEG及びアルギン酸のヒドロゲルプラグを、96-ウェルプレートの各ウェル中の、各々、水150μl及び0.1M塩化バリウム150μl中へ配置し、試験前に24時間平衡化させた。
【０１２５】
SWTNヒドロゲルの蛍光放出は、特注の近赤外蛍光顕微鏡(nIRアレイ)において測定した。簡単には、Zeiss社AxioVision倒立顕微鏡を、PI-Acton SP150分光写真器を介して、Princeton Instruments InGaAs 1-Dアレイ検出装置と組合せた。SWNT溶液を、785nm、150mW(試料面上で80mW)のフォトダイオードレーザー(B&W Tek社)を用いて励起させ、得られた蛍光を、×20対物レンズの顕微鏡及び組合せた光学素子により収集した。
【０１２６】
（SWNTゲルの流動学的特徴決定）
アルギン酸-(GT)15-SWNT溶液及びPEG-(GT)15-SWNT溶液を、前述のように調製し、ここで1.25mlのアリコートを、直径20mmの環状金型において架橋のためにキャストし、ヒドロゲルディスクを形成した。流動学的特徴決定を、AR2000流動計(TA Instruments社)において、20mmのパラレルスチールプレートジオメトリーで行った。接着剤のついたサンドペーパーを使用し、ゲルの上面及び下面の適切で一定の接触を確実にした。最初の歪み掃引を、周波数1Hzで行い、引き続きアルギン酸ゲル及びPEGゲルについて、各々、周波数掃引0.1％及び0.01％の歪みで行った。
【０１２７】
（組織造影）
インビボ造影を、液晶同調可能な帯域通過フィルター及びCCDカメラ(Maestro(商標)、CRi社)を使用し、先に説明された動物全体の造影プラットフォームで行った(Iverson, N. M.らの文献、「組織局在化可能な近赤外蛍光単層カーボンナノチューブによるインビボバイオセンシング(In Vivo Biosensing Via Tissue Localizable Near Infrared Fluorescent Single Walled Carbon Nanotubes)」、Nature Nanotechnology 8, 873-880 (2013)を参照し、これはその全体が引用により組み込まれている。)。この試験で利用したフィルター波長は、40nm帯域通過で650〜1050nmの範囲であった。スペクトルの2D画像−波長スタックは、先に説明したように3成分へ分離した任意の自己蛍光から減算したバックグラウンドであった(Iversonの文献、Nanotechnology, 2013参照)。具体的画像は、放出ウインドウ950〜1050nmで、各段階で、10nmの増分及び20秒の積分時間で収集した。
【０１２８】
（SWNT蛍光消光）
PEG-(GT)15-SWNT及びアルギン酸-(GT)15-SWNTのSWNT nIR蛍光スペクトルは、先に説明したnIR顕微鏡上で96-ウェルプレート内において測定した(Iversonの文献、Nanotechnology, 2013参照)。(GT)15-SWNT試料150μLを、濃度2、5、10、及び25mg/Lで調製し、更に96-ウェルプレート内で試験した。モデル消光実験は、10mMリボフラビン(Sigma社)1.5μlを各ウェルに添加し、水1.5μlを添加した対照試料と比較することにより、実行した。試料は、振盪機上で室温で1時間インキュベーションし、その後nIRアレイにおいて造影した。
【０１２９】
（SWNTゲルの光退色）
PEG-(GT)15-SWNT及びアルギン酸-(GT)15-SWNTを、湿った濾紙小片(BioRad社mini Trans-Blot)上に配置し、651nm 14mWレーザーに曝露し、動物造影システムにより、4時間の間隔で、各回5分造影した。試料は、光退色試験の全過程について、レーザー照射に連続曝露した。
【０１３０】
（SWNTゲルの長期安定性）
PEG-(GT)15-SWNT及びアルギン酸-(GT)15-SWNTを、nIRアレイ及び動物全体の造影システムにおいて60〜90日間分析した。ゲルは、先に説明したように造影し、造影の間は、それらの緩衝溶液(PEGゲル及びアルギン酸ゲルについて、各々、水及びBaCl2) 中に、25℃で貯蔵した。
【０１３１】
（疑似模型組織による組織深度検出）
組織疑似模型(ニワトリ胸部)を、2cmの均一な半径で、厚さ2、4、6、8又は10mmに切り出した。組織の厚さ1cmの切片を、動物全体の造影プラットフォーム上に配置し、ゲル試料をこの組織上の中央に置き、且つ特定された厚さの試料組織を、造影のためにこのスタックの上面に配置した。これは、試験した各厚さについて、3種の異なるゲル、及び3種の異なる試料組織で繰り返した。nIRアレイ造影システムに関して、様々な厚さのニワトリ胸部組織の薄片を、顕微鏡スライド上に配置し、ゲルプラグを、この組織試料の上面に配置した。PEGヒドロゲルの曝露時間は、0、1、2、3、及び4mmの厚さの試料について、各々、9、14、16、24、及び36秒であり、並びに同じニワトリ胸部試料に関して、アルギン酸ゲルについて4、6、8、12、及び20秒であった。ニワトリ胸部組織の吸収は、UV-可視-nIR分光計(UV-3101 PC Shimadzu)を使用し、測定した。
【０１３２】
（生データのデコンボルーションに使用される数式）
Maestroにより提供される画像データは、3D画像スタックの形であり、各レイヤーは、特定波長で検出された光子数の通常の2D画像である。これらの画像は、処理前に、maestroにより縮小拡大される。分析前に、これらの画像スタックは、デコンボルーションされ、ナノチューブ、バックグラウンド組織、及び自己蛍光ノイズの相対貢献を表す画像を提供する。これは、蛍光スペクトルの線形フィットの最小二乗の最小化を行うことにより実施される。下記のモデルを使用した：
測定値 = ix, モデル = B * bx N * nx + A * ax
式中、ixは、特定のピクセル(1に正規化)に関して測定されたスペクトルであり、bx及びnxは、各々、バックグラウンド及びナノチューブのスペクトルであり、並びにaxは、白色ノイズ自己蛍光スペクトルである。bx及びnxスペクトルは、Maestro.cslファイルから直接得られる。これらのファイルは、最初に、特異値分解又は他のユーザー支援方法を通じて、Maestroソフトウェアにより計算された。axスペクトルは、xに関して一定である。全てのスペクトルは、平均値1を有するように、正規化される。最小化を規定する式の下記のシステムは、正の係数を持つ各ピクセルについて解いた：
【数５】
2016537644.tif 000008
。引き続き、関心対象の画像の白色領域上の黒色を作製し、肝臓を包含する領域を規定し、後続のデータ解析を、これらの領域について行う。
【０１３３】
各ピクセルに関して、測定されたスペクトルにベストフィットを提供する蛍光スペクトルの線形の組合せを見つけるためには、下記の和を、最小化しなければならない：
【数６】
2016537644.tif 000009
。式中、bx、nx、ax、ixは、平均1を持つよう正規化された、バックグラウンド、ナノチューブ、自己蛍光、及び画像のスペクトルである。A、B、Nは、線形係数である。しかし、ナノチューブ、バックグラウンド、及び自己蛍光は、わずかな蛍光給源であると仮定されるので、以下の制約が存在する：
A + B + N = 1, O ≦ A,B,N ≦ 1
。
【０１３４】
これらの制約は、問題を単純化するために使用することができる。ここで下記が、最小化されなければならない：
【数７】
2016537644.tif 000010
B及びNに関する偏導関数及びゼロへの等化を考慮し、本発明者らは下記を得る：
【数８】
2016537644.tif 000011
。これら2式の解は、以下を生じる：
【数９】
2016537644.tif 000012
。これは、本発明者らが、下記の値：
【数１０】
2016537644.tif 000013
及び下記のベクターも再計算することを可能にする：
【数１１】
2016537644.tif 000014
。
【０１３５】
しかし、非負制約のために、計算された定数のいずれかが負である場合、これは0とみなされ、且つ計算が再度行われる(最適化のために同様の最小化及び再計算された定数及びベクターを使用し)。これが、負である別の値を生じる場合、両方を0と設定し、残りの値はデフォルトにより1となり始める。
【０１３６】
この問題は、3つの給源について経験的に解決されるが、存在する給源よりもスペクトル中により長い波長(χ)が存在する限りは、望ましいように多くの給源について解決されることが可能である(そうでなければこの問題は独自の解決を有さない)。非負制約及び1への総和は、依然認められなければならない。
【０１３７】
（生データをデコンボルーションするために使用されるMatlabコード）
【化１】
2016537644.tif 000015
2016537644.tif 000016
2016537644.tif 000017
2016537644.tif 000018
2016537644.tif 000019
2016537644.tif 000020
2016537644.tif 000021
2016537644.tif 000022
【０１３８】
他の実施態様は、以下の請求項の範囲内である。
【図１−１】
2016537644.tif 000023
【図１−２】
2016537644.tif 000024
【図２Ａ−Ｂ】
2016537644.tif 000025
【図２Ｃ】
2016537644.tif 000026
【図３Ａ】
2016537644.tif 000027
【図３Ｂ−Ｃ】
2016537644.tif 000028
【図３Ｄ−Ｅ】
2016537644.tif 000029
【図３Ｆ−Ｇ】
2016537644.tif 000030
【図４Ａ−Ｂ】
2016537644.tif 000031
【図４Ｃ】
2016537644.tif 000032
【図５Ａ】
2016537644.tif 000033
【図５Ｂ−Ｃ】
2016537644.tif 000034
【図５Ｄ−Ｅ】
2016537644.tif 000035
【図５Ｆ】
2016537644.tif 000036
【図６】
2016537644.tif 000037
【図７】
2016537644.tif 000038
【図８】
2016537644.tif 000039
【図９】
2016537644.tif 000040
【図１０】
2016537644.tif 000041
【図１１】
2016537644.tif 000042
【図１２】
2016537644.tif 000043
【図１３】
2016537644.tif 000044
【図１４】
2016537644.tif 000045
【図１５】
2016537644.tif 000046
【図１６Ａ】
2016537644.tif 000047
【図１６Ｂ】
2016537644.tif 000048
【図１６Ｃ−Ｄ】
2016537644.tif 000049
【図１７Ａ−Ｂ】
2016537644.tif 000050
【図１７Ｃ−Ｄ】
2016537644.tif 000051
【図１８Ａ−Ｂ】
2016537644.tif 000052
【図１８Ｃ−Ｄ】
2016537644.tif 000053
【図１９Ａ】
2016537644.tif 000054
【図１９Ｂ−Ｃ】
2016537644.tif 000055
【図１９Ｄ−Ｅ】
2016537644.tif 000056
【図２０Ａ】
2016537644.tif 000057
【図２０Ｂ】
2016537644.tif 000058
【図２０Ｃ】
2016537644.tif 000059
【図２０Ｄ】
2016537644.tif 000060
【図２１Ａ−Ｂ】
2016537644.tif 000061
【図２２】
2016537644.tif 000062
【図２３】
2016537644.tif 000063
【図２４】
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【国際調査報告】
2016537644.tif 000065