(57)【要約】本開示は、種々の核酸操作におけるバックグラウンド減少のための分解可能なアダプターの使用に関するシステム、プロセス、製品および組成物を提供する。特に、分解生成物が次に続く反応（例えば、ライゲーション、プライマー伸長、増幅およびシークエンシング反応）に関与することができない程に、または実質的にできない程に分解され得るアダプターを提供する。分解可能なアダプターは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、一本鎖オリゴヌクレオチドアダプター、ステムループオリゴヌクレオチドアダプター、またはライゲーションおよび／もしくはプライマー伸長によって二量体を形成し得る任意のタイプのオリゴヌクレオチドアダプターであり得る。
2016537003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの切断可能な塩基を有する核酸をプロセシングするための方法であって：
（ａ）該少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製する工程；
（ｂ）該脱塩基部位において該核酸の骨格にニックを作製する工程；および
（ｃ）該ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記核酸が、分解可能なアダプターを含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記分解可能なアダプターが、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターである、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターが：
（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；
（ｂ）該５’セグメントの３’末端に連結された中間セグメント；および
（ｃ）該中間セグメントの３’末端に連結された３’セグメント
を含み、該５’セグメントおよび該３’セグメントが、少なくとも８０％相補的である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記３’セグメントが、切断可能な塩基を含まない、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記中間セグメントが、少なくとも１つの切断可能な塩基を含む、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの前記５’セグメントおよび前記中間セグメントが、３〜６塩基ごとに切断可能な塩基を含む、方法。
【請求項８】
請求項１および４〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記切断可能な塩基が、デオキシウリジンである、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製する工程が、前記少なくとも１つの切断可能な塩基を有する核酸を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いて処理する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記脱塩基部位にニックを作製する工程が、工程（ａ）の前記核酸を、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼを用いて処理する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去する工程が、工程（ｂ）の前記核酸を、エキソヌクレアーゼを用いて処理する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼが、ＡＰＥ  １である、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記エキソヌクレアーゼが、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉである、方法。
【請求項１４】
核酸分子を調製するための方法であって：
（ａ）二本鎖の核酸分子を提供する工程：
（ｂ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む分解可能なアダプターの３’末端を、該二本鎖の核酸分子の５’末端にライゲーションし、オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子を生成する工程；
（ｃ）該少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製する工程；
（ｄ）該脱塩基部位にニックを作製する工程；および
（ｅ）該ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法に記載であって、前記分解可能なアダプターが、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターである、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターが：
（ｉ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；
（ｉｉ）該５’セグメントの３’末端に連結された中間セグメント；および
（ｉｉｉ）該中間セグメントの３’末端に連結された３’セグメント
を含み、該５’セグメントおよび該３’セグメントが少なくとも８０％相補的である、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記３’セグメントが、切断可能な塩基を含まない、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記中間セグメントが、少なくとも１つの切断可能な塩基を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの前記５’セグメントおよび前記中間セグメントが、３〜６塩基ごとに切断可能な塩基を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１４および１６〜１９のいずれか一項に記載の方法であって、前記切断可能な塩基が、デオキシウリジンである、方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の方法であって、前記ライゲーションする工程が、前記オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子にニックを生成する、方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法であって、前記二本鎖の核酸分子が、二本鎖のＤＮＡ分子である、方法。
【請求項２３】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子の少なくとも一部の増幅をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の方法であって、前記ステムループオリゴヌクレオチドが、公知の配列を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子が、さらに改変される、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記さらなる改変がクローニングを含む、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、クローニングが、前記改変された分子のベクターへの組み入れを含むとさらに規定され、該組み入れが、逆位反復内のエンドヌクレアーゼ切断によって生成される該改変された分子の末端で起こる、方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載の方法であって、該方法が単一の適切な溶液中で起こるとさらに規定され、前記プロセスが、外因的な操作の非存在下で起こる、方法。
【請求項３０】
請求項１４に記載の方法であって、該方法の前記工程が、連続的に行われる、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、前記溶液が、以下：
リガーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＡＴＰおよびｄＮＴＰ
のうちの１以上を含む、方法。
【請求項３２】
請求項１４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子が、固体支持体に固定される、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記分子が、非共有結合的に固定される、方法。
【請求項３４】
（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む核酸；
（ｂ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ；
（ｃ）脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ；および
（ｄ）エキソヌクレアーゼ
を含む、キット。
【請求項３５】
請求項３４に記載のキットであって、前記核酸が、分解可能なアダプターを含む、キット。
【請求項３６】
請求項３５に記載のキットであって、前記分解可能なアダプターが、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターである、キット。
【請求項３７】
請求項３６に記載のキットであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターが：
（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；
（ｂ）該５’セグメントの３’末端に連結された中間セグメント；および
（ｃ）該中間セグメントの３’末端に連結された３’セグメント
を含み、該５’セグメントおよび該３’セグメントが、少なくとも８０％相補的である、キット。
【請求項３８】
請求項３７に記載のキットであって、前記３’セグメントが、切断可能な塩基を含まない、キット。
【請求項３９】
請求項３７に記載のキットであって、前記中間セグメントが、少なくとも１つの切断可能な塩基を含む、キット。
【請求項４０】
請求項３９に記載のキットであって、前記ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの前記５’セグメントおよび前記中間セグメントが、３〜６塩基ごとに切断可能な塩基を含む、キット。
【請求項４１】
請求項３４および３７〜４０のいずれか一項に記載のキットであって、前記切断可能な塩基が、デオキシウリジンである、キット。
【請求項４２】
請求項３４に記載のキットであって、前記脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼが、ＡＰＥ  １である、キット。
【請求項４３】
請求項３４に記載のキットであって、前記エキソヌクレアーゼが、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／９０５，５４６号の利益を主張し、その全体は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、分解可能なアダプター、プライマーおよび他のオリゴヌクレオチド試薬を使用する、核酸の調製および増幅に関係する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
ライゲーション、増幅およびシークエンシング反応を含む種々の核酸操作に共通する１つの問題は、所望されない反応のバックグラウンドを低く維持すること、およびバックグラウンド生成物の形成を防止することまたは減少させることである。これらのバックグラウンド反応および生成物は、例えば混入、異常なライゲーション反応、プライマー二量体、ミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）、および最適でない反応条件の使用に起因し得る。しばしば、所望されない反応からのバックグラウンド生成物、または前工程からの求められていない反応物の持ち越しが、核酸試料の有効な分析を邪魔し、もしくは妨害し、そして当該核酸試料のさらなる操作を不可能にし得る。それほど重度でない場合には、バックグラウンドは核酸試料の分析を偏らせ得、またはシークエンシング結果の信用もしくは正確さを制限し得る。
【０００４】
例えば周知のＰＣＲ増幅法において、２つのオリグヌクレオチド伸長プライマーによって、または二本鎖のオリグヌクレオチドアダプターを両末端に加えることによって定義される境界を有する標的ＤＮＡのセグメントは、複数の酵素サイクルを介して指数関数的に増幅されて、連続的なサイクルにおいて鋳型として働く標的ＤＮＡのさらなる複製が形成される。ＰＣＲの主要な制限はバックグラウンドの発生にあり、そのバックグラウンドとしては、自己ライゲーションしたアダプター分子および非特異的なプライミング事象（例えば、核酸鋳型の無作為なプライミング、および伸長プライマーの自己プライミング）の増幅の結果として形成される副生成物が挙げられる。つまり、相対的に低い濃度で存在する標的ＤＮＡを増幅するために多数の増幅サイクルが必要とされる場合、非特異的プライミング事象のバックグラウンドは、ＰＣＲ増幅の有効性を有意に妨げ得、その次の操作および増幅された生成物の分析を妨害さえし得る。
【０００５】
種々の核酸操作に起因するバックグラウンド反応および生成物の存在は、標的核酸の検出の前に分離工程を使用することによって、しばしば克服され得る。いくつかの例では、核酸操作の生成物は、ある工程中に核酸を操作するために、当該ある工程中に意図的に加えられた試薬を含み得る；しかしながら、それらの試薬は、次の１以上の反応に有害であり得る。ＰＣＲに関して、例えば、増幅された標的ＤＮＡの生成物を、非特異的プライミング事象の生成物から分離することは、増幅された標的ＤＮＡの配列を首尾よく検出および分析するために不可欠であり得る。ＰＣＲに関して、第一のＰＣＲ反応用のオリゴヌクレオチドプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを除去することは、第二のＰＣＲ反応用のプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを加える前に必要とされ得る。しかしながら、ある反応の後でかつ次の反応もしくはアッセイ前に分離工程を使用することは、プロセスの全体効率を低下させ得、反応収率が損害を被り得、偏りまたは混入が試料に導入され得、そして標的核酸の分析に関してまたは標的核酸を更なる操作に供することに関して、全体の時間および費用が増加する。例えば、分離工程は、標的核酸の分離および回収の間、核酸生成物に分子の喪失をもたらし得、または混入を生じさせるかもしくは導入させ得、標的核酸の種々の診断に役立つ核酸分析をそこなう。それゆえ、ある例では、バックグラウンド生成物の分離の必要がない、核酸増幅および検出が同一の容器で起こる反応を有し、それによって、移動ならびに非効率的な結合および遊離に起因する試料の喪失を排除することが好ましくなり得る。複雑な分子手順の間、複数の中間分離工程が検出前に必要とされ得、そのことが、試料の多重的な喪失および結果の遅延を引き起こす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、いくつかのアダプター分子（例えば、増幅可能なアダプター二量体を形成する性質を有するもの）の制限を回避するアダプターを使用することによって、少なくとも１つの二本鎖領域を有する分子の増幅を可能にする。ある局面では、本発明は、二本鎖分子への付着のための不活性のオリゴヌクレオチドを提供し、その結果、当該オリゴヌクレオチドがライゲーションした分子が、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって改変（例えば増幅）され得るようにする。不活性アダプターが分子へ付着すると、付着したオリゴヌクレオチドは活性化し、そして増幅のために利用可能な少なくとも部分的に１以上の配列を提供するために適した状態となり、一方で、付着しない、遊離しているアダプターおよび任意のアダプター二量体は破壊される。結果として、ポリメラーゼ連鎖反応の間、遊離している、付着しない不活性のアダプターおよび任意のアダプター二量体は、プライミングされ得ることも、ＰＣＲプライマーとして使用され得ることもない。このことは、アダプターを用いるＤＮＡ分子の改変およびその次の増幅のための新規な条件を提供する。これらの条件は、アッセイにおけるバックグラウンドを大いに減少させ、ナノグラム、ピコグラム、フェムトグラムまたはアトグラム量の注入ＤＮＡの使用を可能にする。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの切断可能な塩基を有する核酸をプロセシングするための方法を提供し、その方法は、（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製すること；（ｂ）脱塩基部位において核酸の骨格にニックを作製すること；および（ｃ）ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去することを含む。この方法は、所望されない反応に起因するバックグラウンドを減少させるために使用され得る。いくつかの局面では、ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドは、ニックの３’であり得る。他の局面では、ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドは、ニックの５’であり得る。種々の局面では、核酸分子は、デオキシリボ核酸および／またはリボ核酸であり得る。
【０００８】
実施形態のある局面では、核酸は、分解可能なアダプターを含み得る。例えば、分解可能なアダプターは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターであり得る。分解可能なアダプターがステムループオリゴヌクレオチドアダプターである局面では、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターは、（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；（ｂ）５’セグメントの３’末端に連結された中間セグメント；および（ｃ）中間セグメントの３’末端に連結された３’セグメントを含み得、５’セグメントおよび３’セグメントは少なくとも８０％相補的である。ある局面では、５’セグメントおよび３’セグメントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的であり得る。いくつかの局面では、３’セグメントは切断可能塩基を含み得ない。いくつかの局面では、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの５’セグメントおよび中間セグメントは、３〜６塩基ごとに切断可能塩基を含み得る。
【０００９】
一局面では、切断可能塩基は、デオキシウリジンであり得る。この局面では、少なくとも１つの切断可能塩基に脱塩基部位を作製することは、少なくとも１つの切断可能塩基を有する核酸を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いて処理することを含み得る。一局面では、脱塩基部位にニックを作製することは、脱塩基部位を含む核酸を、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ  １）を用いて処理することを含み得る。一局面では、ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去することは、ニックを含む核酸を、エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ）を用いて処理することを含み得る。
【００１０】
いくつかの局面では、方法は、第一の反応の所望の生成物または構成要素を伴う第二の反応(例えば、第二のＰＣＲ反応、シークエンシング反応など）を行う前に、第一の反応において使用される核酸をプロセシングする方法（例えば、第一のＰＣＲ反応において使用されるプライマーを分解すること）であり得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、核酸分子を調製するための方法を提供し、その方法は（ａ）二本鎖の核酸分子を提供すること；（ｂ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む分解可能なアダプターの３’末端を、二本鎖の核酸分子の５’末端にライゲーションし、オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子を生成すること；（ｃ）少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製すること；（ｄ）脱塩基部位にニックを作製すること；および（ｅ）ニックに隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを除去することを含む。一局面では、ライゲーションは、オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子にニックを生成し得る。種々の局面では、核酸分子は、デオキシリボ核酸および／またはリボ核酸であり得る。一局面では、オリゴヌクレオチドが付着した核酸分子は、固体支持体に固定（例えば、非共有結合的に）され得る。
【００１２】
実施形態のある局面では、核酸は、分解可能なアダプターを含み得、そのアダプターはＲＮＡ、ＤＮＡまたはその両方を含み得る。例えば、分解可能なアダプターは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターであり得る。ステムループオリゴヌクレオチドは、１以上のヘアピンを有し得る。分解可能なアダプターがステムループオリゴヌクレオチドアダプターである局面では、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターは、（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；（ｂ）５’セグメントの３’末端に連結された中間セグメント；および（ｃ）中間セグメントの３’末端に連結された３’セグメントを含み得、５’セグメントおよび３’セグメントが少なくとも８０％相補的である。一定の局面では、５’セグメントおよび３’セグメントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的であり得る。いくつかの局面では、３’セグメントは、切断可能塩基を含み得ない。いくつかの局面では、中間セグメントは、少なくとも１つの切断可能な塩基を含み得る。ある局面では、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの５’セグメントおよび中間セグメントは、３〜６塩基ごとに切断可能な塩基を含み得る。つまり、アダプターは、アダプターの長さに依存して、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたはそれより多い切断可能な塩基を含み得る。いくつかの局面では、切断可能な塩基は、デオキシウリジンであり得る。一局面では、ステムループオリゴヌクレオチドは、公知の配列を含み得る。特定の局面では、ステムループオリゴヌクレオチドの５’末端は、ホスフェートを欠く。
【００１３】
実施形態の一局面では、少なくとも１つの切断可能な塩基に脱塩基部位を作製することは、少なくとも１つの切断可能な塩基を有する核酸を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いて処理することを含み得る。一局面では、脱塩基部位にニックを作製することは、脱塩基部位を含む核酸を、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼを用いて処理することを含み得る。一局面では、ニックの３’の少なくとも１つのヌクレオチドを除去することは、ニックを含む核酸を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することを含み得る。別の局面では、ニックの５’の少なくとも１つのヌクレオチドを除去することは、ニックを含む核酸を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することを含み得る。脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼは、ＡＰＥ  １であり得る。エキソヌクレアーゼは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩまたはラムダエキソヌクレアーゼであり得る。実施形態の一局面では、酵素または化学的処理は、切断工程中またはその次の工程中のいずれかにおいて、所望の分子生成物の使用に適合（例えば、干渉しない）しなければならない。
【００１４】
一局面では、実施形態の方法は、プロセシングされたおよび／または調製された核酸分子の少なくとも一部の増幅を含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を含み得る。
【００１５】
一局面では、本実施形態に従ってプロセシングされたおよび／または調製された核酸分子は、さらに改変され得る。例えば、核酸は、クローニング、すなわち、改変された分子のベクターへの組み入れに供され得る。前記組み入れは、逆位反復内のエンドヌクレアーゼ切断によって生成される改変された分子の末端で起こり得る。
【００１６】
一局面では、本実施形態の方法は、単一の適切な溶液中で、および／または外因的な操作の非存在下で起こり得る。この局面では、当該溶液は、１以上のリガーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＡＴＰ、およびｄＮＴＰを含み得る。別の局面では、本実施形態の方法の２以上の工程が、連続的に実施され得る。
【００１７】
一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む核酸；（ｂ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ；（ｃ）脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ；および（ｄ）エキソヌクレアーゼを含むキットが存在する。一局面では、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼは、ＡＰＥ  １であり得る。一局面では、エキソヌクレアーゼは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩまたはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩであり得る。
【００１８】
いくつかの局面では、核酸は、分解可能なアダプターを含み得、そのアダプターは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、またはステムループオリゴヌクレオチドアダプターであり得る。ある局面では、切断可能な塩基は、デオキシウリジンであり得る。
【００１９】
分解可能なアダプターがステムループオリゴヌクレオチドアダプターである局面では、アダプターは、（ａ）少なくとも１つの切断可能な塩基を含む５’セグメント；（ｂ）５’セグメントの３’末端に連結する中間セグメント；および（ｃ）中間セグメントの３’末端に連結する３’セグメントを含む。５’セグメントおよび３’セグメントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。一局面では、３’セグメントは、切断可能な塩基を含み得ない。一局面では、中間セグメントは、少なくとも1つの切断可能な塩基を含み得る。一局面では、ステムループオリゴヌクレオチドアダプターの５’セグメントおよび中間セグメントは、３〜６塩基ごとに、または４〜５塩基ごとに切断可能な塩基を含み得る。つまり、アダプターは、アダプターの長さに依存して、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれより多い切断可能な塩基を含み得る。一局面では、ステムループオリゴヌクレオチドは、公知の配列を含み得る。特定の局面では、ステムループオリゴヌクレオチドの５’末端は、ホスフェートを欠く。
【００２０】
ライゲーションの実施形態は、以下のことを含むとさらに規定され得る：二本鎖の核酸分子にライゲーション可能な末端を生成すること；ステムループオリゴヌクレオチドにライゲーション可能な末端を生成すること；およびステムループオリゴヌクレオチドのライゲーション可能な末端の一方の鎖を、核酸分子の末端の一方の鎖にライゲーションし、それによって非共有結合の接合（例えば、ニック、ギャップ、または５’フラップ構造）をオリゴヌクレオチドが付着した核酸分子を生成すること。さらなる局面では、方法は、核酸分子に平滑末端に生成すること；ステムループオリゴヌクレオチドに平滑末端を生成すること；およびステムループオリゴヌクレオチドの平滑末端の一方の鎖を、核酸分子の平滑末端の一方の鎖にライゲーションし、それによって、オリゴヌクレオチドをライゲーションされた核酸分子にニックを生成することを含む。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態としては、本発明の方法によって調製されたＤＮＡ分子のライブラリーが挙げられる。
【００２２】
特定の局面では、本発明は、分子（特に増幅に適切な分子）のコレクションの調製のためのシステムおよび方法（例えば、分子の公知の配列を利用する増幅）に関する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、公知の配列を含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明の１以上の組成物を含み、および／または本発明の少なくとも１つの方法に適切な１以上の組成物を含む、適切な容器に入れられたキットが存在する。
【００２４】
本明細書中において使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または１より多い量を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併せて使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、１または１より多い量を意味し得る。
【００２５】
特許請求の範囲において「または（ｏｒ）」という用語の使用は、二者択一のみ、または選択肢は互いに排他的であることをいう明示的に示されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用されるが、本開示は、二者択一のみおよび「および／または」をいうものとする定義を支持する。本明細書中において「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第二の、またはそれ以上を意味し得る。
【００２６】
本願を通して、「約」という用語は、ある値が、当該値を決定するために利用される装置、方法、または研究主題に存在する変量に関する誤差の固有の変量を含むことを示すために使用される。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明の趣旨および範囲から逸脱することのない種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者にとって明らかになるため、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本発明のある局面をさらに実証するために含有される。本発明は、これらの図面の１以上と本明細書中で提供される特定の実施形態の詳細な記載とを組み合わせて参照することによって、よりよく理解され得る。
【００２９】
【図１】本願の技術のプロセスの概観。（１）脱塩基部位は、ライゲーションされるアダプター分子および遊離しているアダプター分子中の切断可能塩基（例えば、ｄＵ；丸形で示される）に作製される。（２）ニックは、脱塩基部位に作製される。（３）核酸は、ニック部位で分解される。
【００３０】
【図２Ａ】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの協調した活性。図２Ａ  −  ＡＰＥ  １およびＥｘｏ  Ｉの両方を用いて処理した試料。
【図２Ｂ】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの協調した活性。図２Ｂ  −  Ｅｘｏ  Ｉのみを用いて処理した試料。
【図２Ｃ】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの協調した活性。図２Ｃ  −  ＡＰＥ  １のみを用いて処理した試料。
【００３１】
【図３】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理した試料の熱誘導による分解。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、種々の核酸操作におけるバックグラウンド減少のための分解可能なアダプターの使用に関するシステム、プロセス、製品および組成物を提供する。特に、分解生成物が次に続く反応（例えば、ライゲーション、プライマー伸長、増幅およびシークエンシング反応）に関与することができない程に、または実質的にできない程に分解され得るアダプターを提供する。分解可能なアダプターは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドアダプター、一本鎖オリゴヌクレオチドアダプター、ステムループオリゴヌクレオチドアダプター、またはライゲーションおよび／もしくはプライマー伸長によって二量体を形成し得る任意のタイプのオリゴヌクレオチドアダプターであり得る。
【００３３】
本発明は、いくつかの利益および利点を提供し、それらの利益および利点としては、以下の局面が挙げられる。本明細書中に記載される分解可能なアダプターおよび酵素的切断方法は、標的核酸へのライゲーションのために使用されるアダプターの設計における切断可能な塩基の用途を、当該アダプターをより短いオリゴヌクレオチドにまで単純に分解すること以上に拡大する。特に、本願の技術は、ライゲーションしないアダプターおよびアダプター二量体の両方を個々のヌクレオチドにまで分解することを包含する。このことは、アダプター二量体、および不完全なアダプター分解によって放出されるオリゴヌクレオチドが引き起こすバックグラウンドに有意な影響を与え、それによって末端逆位反復によって引き起こされる抑制を必要とせずに、完全に関連のない配列の使用を可能にする。本願の技術は、結果として生じるライゲーション生成物の増幅において、独立した方法として利用され得るか、または抑制ＰＣＲの抑制原理と組み合わせて利用され得る。重要なことは、本明細書中に記載される方法は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用することで、後で不要なプライマーを破壊し得るように、デオキシウリジンを当該プライマーに組み入れることによって、当該不要なプライマーによるＰＣＲ混入を減少させるようにオリゴヌクレオチドを破壊することで、バックグラウンドを減少させる方法と区別できることである。
【００３４】
定性的な観察および定量的な実験は、ライゲーション部位に隣接する共通配列を含むように設計された単一のアダプターまたは２つの異なるアダプターのライゲーションが、制御されたサイズの標的挿入を含む分子を優先的に増幅する能力、および挿入を保持しないアダプター二量体、または情報価値をほとんど有さないかもしくは全く有さない短い挿入を含む分子を識別する能力に有益な効果を有し得ることを示す。この現象を、抑制または抑制ＰＣＲという。抑制とは、両側が末端逆位反復である一定サイズ未満の分子が、増幅に使用されるプライマーが当該反復全体または反復の一部と一致する場合に、それらが非効率的に増幅される結果、選択的に排除されることをいう（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｕｋｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｉｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓｈａｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。このことの理由は、生産的なＰＣＲプライマーアニーリングと、断片の相補的な末端の非生産的な自己アニーリングとの間の平衡にある。両端の末端逆位反復のサイズが一定のとき、挿入が短いほど、抑制効果が強くなり、そして逆もまた同様である。同様に、挿入のサイズが一定のとき、末端逆位反復が長いほど、抑制効果が強い（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｕｋｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｉｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓｈａｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ライゲーションおよび／またはプライマー伸長によって核酸分子の両末端に末端逆位反復を付加することによって、米国特許第７，８０３，５５０号に記載されるような、所望されないアダプター二量体または短い挿入副生成物に対する、所望される最小限のサイズの標的挿入のプライマーアニーリングおよび伸長の効率に関する正確なコントロールを達成し得る。
【００３５】
例として、分解可能なアダプターは、核酸ライブラリー（例えば、大規模並行（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）（ＮｅｘｔＧｅｎ）シークエンシングのための核酸ライブラリー）の調製において使用され得、その調製では標的核酸試料は１以上の切断可能な塩基（例えば、デオキシウラシル（ｄＵ））を含むステムループオリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションされる。本願の技術を使用して改変され得るアダプターの例としては、Ｍａｋａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，４４０，４０４号に記載されるものが挙げられ、当該米国特許は本明細書中に参考として援用される。形成された大量のライゲーションしないステムループオリゴヌクレオチドアダプターおよび任意のアダプター二量体の完全な分解または実質的に完全な分解は、同時または連続的な様式で酵素を組み合わせて利用することで、脱塩基部位を生成し、脱塩基部位にニックまたはギャップを作製し、そして結果として生じる短くなったオリゴヌクレオチドの全てまたは実質的に全てを個々のヌクレオチドにまで分解することによって達成され得る。
【００３６】
前記プロセスは、以下の酵素的工程を連続的にまたは同時に行うことを包含し得る（図１参照）：
１）グリコシラーゼ（例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ））を使用して、切断可能な塩基（例えば、ｄＵ）に脱塩基部位を作製する工程、
２）脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ  １）を使用して、脱塩基部位にニックを作製する工程、
３）エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏ  ＩまたはＥｘｏ  ＩＩＩ）を使用して、ニック部位で核酸を分解する工程。
【００３７】
図１に関して、標的核酸分子の５’末端にライゲーションするステムループアダプターの３’末端は、結果として生じるライゲーション生成物中に切断可能な塩基（例えば、ｄＵ）を欠くため、分解から保護される。酵素的切断およびライゲーションの後、アダプターの残った３’末端が、その次に続く増幅または他の核酸操作のためのプライマー結合部位として働き得る。反対に、アダプター二量体およびライゲーションしないアダプターは、酵素的切断の後に分解され、その結果、それらは有効に増幅され得ず、そして種々の核酸操作に関与し得ない。
Ｉ．定義
【００３８】
本明細書中において使用される場合、「増幅」は、１または複数のヌクレオチド配列の複製の数を増加させるための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロセスをいう。核酸増幅は、ヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに組み入れられるという結果になる。本明細書中において使用される場合、単一の増幅反応は、ＤＮＡ複製の多数の繰り返しからなり得る。例えば、単一のＰＣＲ反応は、３０〜１００「サイクル」の変性および複製からなり得る。
【００３９】
本明細書中において使用される場合、「ヌクレオチド」は、塩基−糖−ホスフェートの結合物をいう技術用語である。ヌクレオチドは、核酸ポリマーの（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡの）モノマー単位である。この用語は、リボヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、またはｒＵＴＰ）およびデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰ）を包含する。
【００４０】
「ヌクレオシド」は塩基−糖の結合物、すなわち、ホスフェートを欠くヌクレオチドである。ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語の使用において、一定の互換性があることが、当該分野において認識される。例えば、ヌクレオチドであるデオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートである。ｄＵＴＰは、ＤＮＡに組み入れられた後、ＤＮＡモノマー（形式的にはデオキシウリジレートである）、すなわちｄＵＭＰつまりデオキシウリジンモノホスフェートとして働く。結果として生じるＤＮＡにはｄＵＴＰの部分は存在しないが、ｄＵＴＰをＤＮＡに組み入れると言い得る。同様に、基質分子の一部分に過ぎないが、デオキシウリジンをＤＮＡに組み入れると言い得る。
【００４１】
本明細書中において使用される場合、「組み入れること」は、核酸ポリマーの一部になることを意味する。
【００４２】
本明細書中において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」の２つの技術用語を集合的かつ互換的にいう。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは異なる技術用語であるが、それらの間に厳格な分け目はなく、そして本明細書中においてそれらの用語は互換的に使用されることに留意されたい。「アダプター」という用語もまた、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され得る。
【００４３】
本明細書中において使用される場合、「プライマー」は、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドをいい、それは増幅中にヌクレオチドモノマーを共有結合的に付加することによって伸長される。しばしば、核酸増幅は、核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づく。そのようなポリメラーゼの多くは、伸長され、核酸合成を開始し得るプライマーの存在を必要とする。
【００４４】
本明細書中において使用される場合、「ヘアピン」および「ステムループオリゴヌクレオチド」という用語は、５’末端領域および３’末端領域に含まれるオリゴヌクレオチド（二本鎖のステムを形成する逆位反復）、および一本鎖ループを形成する自己相補的でない中央領域によって形成される構造をいう。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「外因的な操作の非存在下で」という用語は、ＤＮＡ分子が改変されている溶液を変更することなく、ＤＮＡ分子の改変を行うことをいう。特定の実施形態では、溶液の状況（緩衝液の状況とも言われ得る）を変更する人の手、または機械の非存在下で起こる。しかしながら、温度の変化は、改変中に起こり得る。
ＩＩ．切断可能な塩基
【００４６】
本明細書中において使用される場合、「切断可能な塩基」は、ＤＮＡ配列中に一般的に見出されないヌクレオチドをいう。ほとんどのＤＮＡ試料に関して、デオキシウリジンは切断可能な塩基の一例である。デオキシウリジンのトリホスフェート形態（ｄＵＴＰ）は、生存する生物中に代謝中間物として存在するが、ＤＮＡにはめったに組み入れられない。ｄＵＴＰがＤＮＡに組み入れられる場合には、結果として生じるデオキシウリジンはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、通常のプロセス（例えば、酵素であるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）が関係するプロセス）によって即座に除去される（米国特許第４，８７３，１９２号；Ｄｕｎｃａｎ，１９８１；両方の参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。したがって、デオキシウリジンは天然のＤＮＡ中にめったに生じないか、または全く生じない。他の切断可能な塩基の非限定的な例としては、デオキシイノシン、ブロモデオキシウリジン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロ−５，６ジヒドロキシデオキシチミジン（５，６−ｄｉｈｙｒｏ−５，６  ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、３−メチルデオキシアデノシン（３−ｍｅｔｈｙｌｄｅｏｘａｄｅｎｏｓｉｎｅ）など（Ｄｕｎｃａｎ，１９８１を参照）が挙げられる。他の切断可能な塩基は、当業者にとって明白である。
ＩＩＩ．ＤＮＡグリコシラーゼ
【００４７】
「ＤＮＡグリコシラーゼ」という用語は、グリコシラーゼ活性を伴う任意の酵素であって、ヌクレオチドの改変された窒素を含む複素環の構成部分の、ポリヌクレオチド分子からの切除を引き起こし、それによって脱塩基部位を作製する酵素をいう。
【００４８】
本明細書中において使用される場合、「脱塩基ＤＮＡ」または「脱塩基部位を伴うＤＮＡ」という用語は、少なくとも１つの脱塩基ヌクレオチド（時には「脱塩基部位」と呼ばれる）を含む一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ分子をいう。「脱塩基ヌクレオチド」は、デオキシリボースの１位の塩基を欠くヌクレオチドである。
【００４９】
ＤＮＡ  Ｎグリコシラーゼとしては、以下の酵素および高等真核生物におけるそれらのホモログ（ヒトホモログを含む）が挙げられる：ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ（例えば、ＡｌｋＡ）（Ｎａｋａｂｅｐｐｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。さらなるＤＮＡ  Ｎグリコシラーゼとしては、ＴａｇＩグリコシラーゼおよびＭＵＧグリコシラーゼ（Ｓａｋｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が挙げられる。
【００５０】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ中に存在するウラシルを認識し、そしてウラシル塩基とＤＮＡの糖−ホスフェート骨格のデオキシリボースとの間のＮ−グリコシド結合を切断し、脱塩基部位を残す。例えば、米国特許第６，７１３，２９４号を参照。ウラシルの喪失は、ＤＮＡ中に脱ピリミジン部位を作製する。しかしながら、この酵素は、ＤＮＡ分子のホスホジエステル骨格を切断しない。
【００５１】
「ＵＤＧ］または「ＵＮＧ」と略記されるウラシルＤＮＡグリコシラーゼとしては、ミトコンドリアのＵＮＧ１、核のＵＮＧ２、ＳＭＵＧ１（一本鎖選択的ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）、ＴＤＧ（ＴＵミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ）、ＭＢＤ４（メチル結合ドメインを伴うウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）、ならびに他の真核生物および原核生物の酵素（Ｋｒｏｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照）が挙げられる。この活性を持つ酵素は、遊離しているｄＵＴＰ、遊離しているデオキシウリジンまたはＲＮＡには作用しない（Ｄｕｎｃａｎ、１９８１）。
【００５２】
１以上の脱塩基部位を作製するためのＵＤＧ酵素のさらなる例は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＥ．ｃｏｌｉ  ＵＤＧの熱安定性ホモログである。Ａｆｕ  ＵＤＧは、ウラシルを含むＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。Ａｆｕ  ＵＤＧは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡからウラシルを効率的に加水分解する。他の例としては、南極の熱不安定性のＵＤＧが挙げられ、この酵素はウラシルを含む一本鎖または二本鎖のＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。南極の熱不安定性ＵＤＧ酵素は、熱に対して感受性があり、そして５０℃を超える温度で急速かつ完全に不活性化され得る。
【００５３】
さらなる切断可能な塩基およびそれらのそれぞれのニッキング剤の非限定的な例は、以下の通りである：ＡｌｋＡグリコシラーゼは、ＤＮＡからデオキシイノシン残基を認識し、そして切断する；ＤＮＡ−７−メチルグアニングリコシラーゼは、ＤＮＡから７−メチルグアニン残基を認識し、そして切断する；ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ＮＤＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）は、ＤＮＡからヒポキサンチン残基を認識し、そして切断する；３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩ（例えば、ＴａｇＩ）および３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ（例えばＡｌｋＡ）は、ＤＮＡから３−メチルアデニン残基を認識し、そして切断する；Ｆｐｇは、ＤＮＡから８−オキソ−グアニン残基を認識し、そして切断する；ならびにＭｕｇは、ＤＮＡから３，Ｎ（４）−エテノシトシン残基およびウラシル残基を認識し、切断する。
ＩＶ．脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ
【００５４】
本明細書中において使用される場合、「ＡＰエンドヌクレアーゼ」または「ＡＰリアーゼ」という用語は、脱塩基部位で核酸のホスホジエステル骨格を破壊し得る酵素を意味する。この用語は、脱塩基部位の５’および３’の両方で骨格を破壊し得る酵素を包含する。
【００５５】
例えばグリコシド結合のＵＤＧ切断後に残存するＤＮＡの糖−ホスフェート骨格は、次いで、例えばアルカリ加水分解、温度上昇、塩基性残基の間に芳香族の残基を含むトリペプチド（例えばＬｙｓ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｄｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０））、ならびにＡＰエンドヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩ、ヒトエンドヌクレアーゼＩＩなど）によって切断され得る。したがって、ＡＰＥ  １などの酵素は、ＵＤＧと併せて使用され、核酸分子からｄＵ残基を除去し、そして核酸分子にニックをいれ得る。
【００５６】
脱塩基部位にニックを作製するための酵素の例としては、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ（例えばＡＰＥ  １（ＨＡＰ  １またはＲｅｆ−１としても知られる））であって、Ｅ．ｃｏｌｉのエキソヌクレアーゼＩＩＩタンパク質とホモロジーを持つエンドヌクレアーゼが挙げられる。ＡＰＥ  １は、加水分解機構を介して、ＡＰ部位のすぐ近くの５’でホスホジエステル骨格を切断し、一本鎖ＤＮＡの破壊を起こして、３’−ヒドロキシル末端および５’−デオキシリボースホスフェート末端を残す。
【００５７】
人工のニッキング剤は、ＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼとを組み合わせることによって（例えば、ＵＤＧグリコシラーゼとＡＰＥ  １エンドヌクレアーゼ、またはＡｌｋＡグリコシラーゼとＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼとを組み合わせることによって）作製され、改変されたヌクレオチドにおいて一本鎖切断を達成し得る。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、２以上の位置で標的分子に連続的にニックを入れるために、様々なタイプの改変されたヌクレオチドが、複数の選択された位置に導入され得る。例えば、デオキシウリジン、８−オキソ−グアニン、およびデオキシイノシンが、標的分子の選択した位置に導入され得る。組み入れられた、改変されたヌクレオチドにしたがって、１より多い特異性の構成要素を含む単一のニッキング剤が、処方され得る。あるいは、別個のニッキング剤が処方され得、そして標的分子に連続的に適用され得る。例えば、デオキシイノシンおよびデオキシ８−オキソ−グアニンに選択的にニックを入れるＡｌｋＡおよびＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼは、デオキシウリジンに選択的にニックを入れるＵＤＧおよびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを含むニッキング剤と組み合わされ得、または連続的に使用され得る。
【００５９】
本明細書中に記載される、改変されたヌクレオチドを切除し得るニッキング剤の例としては以下が挙げられる：デオキシウリジンを切除するための  −  ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを伴う混合物中のＵＤＧグリコシラーゼ；ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを伴う混合物中のＵＤＧグリコシラーゼ；ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを伴う混合物中のＵＤＧグリコシラーゼ；ＵＤＧグリコシラーゼ、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼ、およびＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを含む混合物；８−オキソ−グアニンおよびデオキシウリジンを切除するための  −  ＵＤＧグリコシラーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼおよびＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼを含む混合物、またはＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを伴う混合物中のＵＤＧグリコシラーゼ；ならびに、デオキシイノシンを切除するための  −  ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを伴う混合物中のＡｌｋＡグリコシラーゼ、またはＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼを伴う混合物中のＡｌｋＡグリコシラーゼ。
【００６０】
Ｅ．ｃｏｌｉからのＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩは、Ｎ−グリコシラーゼおよびＡＰ−リアーゼの両方として働く。当該Ｎ−グリコシラーゼ活性は、分解されたピリミジンを二本鎖のＤＮＡから放出し、ＡＰ部位を生成する。当該ＡＰ−リアーゼ活性は、ＡＰ部位の３’を切断し、５’ホスフェートおよび３’ホスフェートを残す。Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩによって認識され、そして除去される分解された塩基としては、尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミンおよびメチルタルトロニル尿素（ｍｅｔｈｙｌｔａｒｔｒｏｎｙｌｕｒｅａ）が挙げられる。Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩはＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩに類似するが、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩは、βおよびδリアーゼ活性を有する一方で、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩはβリアーゼ活性を有する。
【００６１】
Ｆｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）は、Ｎ−グリコシラーゼおよびＡＰリアーゼの両方として働く。当該Ｎ−グリコシラーゼ活性は、分解されたプリンを二本鎖のＤＮＡから放出し、脱プリン（ＡＰ部位）を生成する。当該ＡＰリアーゼ活性は、ＡＰ部位の３’および５’の両方を切断し、それによってＡＰ部位を除去し、そして１塩基ギャップを残す。Ｆｐｇによって認識され、そして除去される分解された塩基のいくつかとしては、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン，ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシン  Ｂ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシンおよび５−ヒドロキシ−ウラシルが挙げられる。
【００６２】
デオキシウリジンにおいて標的分子に特異的にニックを入れるＵＳＥＲＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ、ならびにデオキシウリジンおよび８−オキソ−グアニンの両方において標的分子に特異的にニックを入れるＵＳＥＲＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ２というニッキング剤は、両方がニックの位置に５’ホスフェートを残すニッキング剤であり、これらの薬剤もまた意図される（米国特許第７，４３３，５７２号を参照）。ＵＳＥＲＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼであるＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩとの混合物である。ＵＤＧは、ウラシル塩基の切除を触媒し、脱塩基（脱ピリミジン）部位を形成するが、ホスホジエステル骨格は無傷のまま残す。Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩのリアーゼ活性は、脱塩基部位の３’側および５’側でホスホジエステル骨格を破壊し、その結果、塩基を含まないデオキシリボースが放出される。
Ｖ．エキソヌクレアーゼ
【００６３】
ニック部位で核酸を分解するための酵素の例としては、種々のエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｅｘｏ  Ｉ）およびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ））が挙げられる。Ｅｘｏ  Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、３’から５’の方向に、一本鎖ＤＮＡからのヌクレオチドの除去を触媒する。例えば、Ｅｘｏ  Ｉは、二本鎖の核酸生成物を含む反応混合物中の一本鎖オリゴヌクレオチドを分解し得る。Ｅｘｏ  ＩＩＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、二本鎖のＤＮＡの３’ヒドロキシ末端からの、モノヌクレオチドの段階的な除去を触媒する。限定的な数のヌクレオチドが、それぞれの結合事象中に除去され、その結果として協調的に進行する削除がＤＮＡ分子の集合の中に生じる。好ましい基質は、平滑な、または陥凹な３’末端であるが、当該酵素は二重鎖のＤＮＡのニックでも働き、一本鎖ギャップを生成する。ラムダエキソヌクレアーゼは、核酸をニック部位で５’から３’の方向に酵素的に分解するために使用され得る。
ＶＩ．アダプターおよびＤＮＡプロセシングのためのアダプターの使用
【００６４】
ＤＮＡ末端にさらなる短いポリヌクレオチド配列（アダプターまたはリンカーという）を追加することは、分子生物学の多くの分野で使用される。適合されたＤＮＡ分子の有用性は、いくつかの例（例えばライゲーション媒介遺伝子座特異的ＰＣＲ、ライゲーション媒介全ゲノム増幅、アダプター媒介ＤＮＡクローニング、ＤＮＡアフィニティタギング、ＤＮＡラベリングなど）によって例証されるが、それらに限定されない。
Ａ．公知のＤＮＡ配列にはさまれる未知の領域のライゲーション媒介増幅
【００６５】
ＤＮＡ断片化および一方または両方のＤＮＡ末端にユニバーサルアダプターを追加することによって生成されるライブラリーは、以前に確立されたＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡ領域を増幅し（ＰＣＲによる）、そして配列決定するために使用された（例えば、米国特許第６，７７７，１８７号およびその参考文献を参照。これらの全ては、その全体が本明細書に参考として援用される）。アダプターは、ＤＮＡの５’末端、３’末端または両方の鎖にライゲーションし得る。アダプターは、３’または５’に突出（オーバーハング）を有し得る。特にＤＮＡの末端が酵素的、機械的、または化学的ＤＮＡ断片化の後に「加工される」場合、ＤＮＡは平滑末端を有し得る。ライゲーション媒介ＰＣＲ増幅は、遺伝子座特異的プライマー（または、いくつかのネステッドプライマー）およびアダプターの配列に相補的なユニバーサルプライマーを使用することによって達成される。
Ｂ．ライゲーション媒介全ゲノム増幅
【００６６】
ＤＮＡ断片化、そしてその次の両方のＤＮＡ末端へのユニバーサルプライマーの付加によって生成されるライブラリーは、全ゲノムＤＮＡを増幅する（全ゲノム増幅、またはＷＧＡ）ために使用された（例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９２９９号および米国特許第７，７１８，４０３号およびそれらの参考文献を参照。これらのすべては、その全体が本明細書に参考として援用される）。アダプターは、ＤＮＡの両方の鎖、またはその後伸長する３’末端にのみライゲーションし得る。アダプターは、制限酵素またはＤＮＡを消化するために使用される他の酵素によって生成されるＤＮＡ末端の構造に依存して、３’または５’に突出（オーバーハング）を有し得る。例えば酵素的ＤＮＡ切断後のＤＮＡ末端が平滑である場合、または酵素的、機械的もしくは化学的ＤＮＡ断片化の後に末端が修復され、そして「加工される」場合、ＤＮＡ末端はまた、平滑末端を有し得る。全ゲノムＰＣＲ増幅は、特定の実施形態では、アダプター配列に相補的な１つまたは２つのユニバーサルプライマーを使用することによって達成される。
アダプター媒介ＤＮＡクローニング
【００６７】
アダプター（またはリンカー）は、ＤＮＡクローニングのためにしばしば使用される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。超音波処理、噴霧化、または水力せん断（ｈｙｄｒｏ−ｓｈｅａｒｉｎｇ）プロセスによって生成されるＤＮＡ断片への二本鎖のアダプターのライゲーション後の、アダプター内の制限酵素消化は、３’または５’の突出末端を伴うＤＮＡ断片の生成を可能にし、それはベクター配列に効率よく導入され、そしてクローニングされ得る。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例において開示する技術は、本発明の実施において十分に機能することを発明者が見出した技術を表し、したがって本発明の実施のための好ましい態様を構成するものとみなされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示と照らして、開示される特定の実施形態において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更がなされ得、そしてなお同様のまたは類似の結果を獲得し得ることを、認識すべきである。
＜実施例１  バックグラウンド減少のための分解可能なアダプター  −  熱分解＞
【００６９】
以下の実施例は、分解可能なアダプターの使用を示し、そのアダプターはライゲーションしない鎖の中に分解可能な脱塩基部位（ｄＵ）を含むことで、熱誘導による分解を使用して遊離しているアダプターおよびアダプター二量体を小さなオリゴヌクレオチドにまで分解することを可能にする。
【００７０】
鋳型調製。１０マイクロリットルのそれぞれのＤＮＡ試料（２００ｐｇのＣｏｖａｒｉｓで断片化した（Ｃｏｖａｒｉｓ−ｓｈｅａｒｅｄ）ヒトｇＤＮＡ）を、ＰＣＲプレートウェルに加えた。鋳型を含まないコントロール（ｎｏｎ−ｔｅｍｐａｌｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ：ＮＴＣ）として、１０μＬのヌクレアーゼを含まない水を、ＤＮＡ試料の代わりに用いた。２μＬ／試料のＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（３２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、６５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．２５ｍＭ  ＤＴＴを含む６．５×ＡＴＰ−ｆｒｅｅ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＡＴＰを含まないリガーゼ緩衝液）であって、ｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭの、それぞれのｄＮＴＰ）を添加したもの）と１μＬ／試料のＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｉｘ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｙ９１４−ＬＣ−Ｌ）とのプレミックスを、別のチューブに調製し、そしてピペットによって混合した。次いで、３μＬのプレミックスを、ＰＣＲチューブまたはウェル中の１０μＬのＤＮＡ試料に加え、そして８μＬに調節したピペットを用いて、４〜５回混合した。反応成分の最終濃度は、以下の通りであった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、３８５μＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅ。このＰＣＲプレートを遠心分離し、そしてサーマルサイクラーにおいて、以下の条件を使用してインキュベートした：２２℃で２５分を１サイクル；５５℃で２０分間を１サイクル；２２℃で保持。
【００７１】
ライブラリー合成。１μＬ／試料のＬｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＤＴＴを含む２×ＡＴＰ−ｆｒｅｅ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒであって、１５ｍＭ  ＡＴＰおよび１５μＭのそれぞれのステムループアダプターオリゴ−（表１；配列番号５および配列番号６）を添加したもの）と１μＬ／試料のＬｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（１μＬあたり１．２Ｕ  Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  ＃  Ｇ５０１０Ｌ）および８Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  ＃  Ｌ６０３−ＨＣ−Ｌ）を含む）とのＦｒｅｓｈ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓプレミックスを、別のチューブに調製し、ピペットによって混合した。次いで、２μＬのＬｉｂｒａｒｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓプレミックスを、それぞれの試料に加え、そして１０μＬに調節したピペットを用いて、４〜５回混合した。反応成分の最終濃度は以下の通りであった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、３３４μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１．２Ｕ  Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、８Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、１μＭのそれぞれのアダプターオリゴ。このプレートを遠心分離し、そしてサーマルサイクラーにおいて、以下の条件を使用してインキュベートした：２２℃で４０分間を１サイクル；４℃で保持。
【００７２】
ＴｈｒｕＰＬＥＸ−ＦＤライブラリー増幅。４．２５μＬ／試料のヌクレアーゼを含まない水と、３．７５μＬ／試料のＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）：フルオレセイン（ＦＣ；９：１）と、５０．５μＬ／試料のＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（２５℃でｐＨ８．５）、１２０ｍＭ  ＴＭＡＣ、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０６％  ｗ／ｖのＧｅｌａｔｉｎを含み、０．３７５μＭのそれぞれのＰＣＲオリゴ（表１；配列番号７および配列番号８）を添加したもの）とのＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎプレミックスを、使用の直前に別のチューブに調製した。
【００７３】
ポリメラーゼを追加した後に加熱する試料に関して、１．５μＬ／試料のＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｕ／μＬのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＫ２１０２））を、プレミックスに加えた。次いで、６０μＬのＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎプレミックスを、それぞれのライブラリーに加え、そして６０μＬに調節したピペットを用いて３〜４回混合した。
【００７４】
ポリメラーゼを追加する前に加熱する試料に関して、５８．５μＬ／試料のＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含まないＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎプレミックスを、それぞれのライブラリーに加え、そして６０μＬに調節したピペットを用いて３〜４回混合した。試料を８５℃で５分間加熱し、次いで１．５μＬのＬｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｕ／μＬのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＫ２１０２））を、それぞれの試料に加えた。
【００７５】
全ての反応に関して、反応成分の最終濃度は以下の通りであった：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（２５℃でｐＨ８．５）、８０ｍＭ  ＴＭＡＣ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０４％  ｗ／ｖのＧｅｌａｔｉｎ、１×ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）  蛍光レポーター色素、１×キャリブレーション色素（フルオレセイン）、１．５Ｕ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２５μＭのそれぞれのＰＣＲオリゴ。プレートを遠心分離し、次いでリアルタイムサーマルサイクラーにおいて、以下のようにインキュベートした：７２℃で３分間を１サイクル、８５℃で２分間を１サイクル；９８℃で２分間を１サイクル；９８℃で２０秒間；６７℃で２０秒間；７２℃で４０秒間を４サイクル；９８℃で２０秒間および７２℃で５０秒間を４〜２１サイクル。
【００７６】
結論。アダプターおよびアダプター二量体の熱分解によって、約６．５サイクル分（１００倍）の右へのシフトが生じ、そしてシグナルノイズ比が改善した（図３）。
＜実施例２  バックグラウンド減少のための分解可能なアダプター  −  酵素的分解＞
【００７７】
以下の実施例は、本願の分解可能なアダプター技術おいて使用される組み合わせた酵素活性、すなわち、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの協調した活性の間の驚くべき、予期しない、そして相乗的な効果を示す。
【００７８】
健常な提供者からのプール（ｐｏｏｌｅｄ）ヒトリンパ球ＤＮＡをＴＥ緩衝液で２３．８ｐｇ／μＬまで希釈し、そして同時に断片化および末端修復に供した。１０マイクロリットルの希釈したＤＮＡのアリコートまたはＴＥ緩衝液を含む１０マイクロリットルの鋳型を含まないコントロール（ＮＴＣ）に、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む。２５℃でｐＨ７．５）を添加し、最終容量で１３μＬ（１μＬのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ  ＃  Ｍ０３４８Ｓ）および０．５μＬのＥｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｉｘ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｙ９１４０−ＬＣ−Ｌ）を含む）とした。試料を２２℃で３０分間、続いて５５℃で２０分間そして２２℃で２分間インキュベートした。
【００７９】
次に、最終濃度がそれぞれ１μＭのステムループオリゴヌクレオチドアダプター（表１、配列番号１および配列番号２）と、２４０ＵのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｌ６０３０−ＨＣ）と、６ＵのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｇ５０１０Ｌ）との混合物をそれぞれの試料に加えて最終容量を１５μＬとし、そして試料を２２℃で４０分間、続いて５５℃で１５分間そして３７℃で２分間インキュベートした。
【００８０】
遊離しているアダプター分子およびアダプター二量体の分解を試験するため、１５Ｕのヒト脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼであるＡＰＥ  １（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｍ０２８２Ｓ）、または１０ＵのＥ．ｃｏｌｉのＥｘｏ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ  ＃  Ｍ０２９３Ｓ）を、ＤＮＡを含む試料またはＮＴＣコントロールに加え、そして３７℃で１５分間、４２℃で３分間、４５℃で３分間そして５５℃で１０分間インキュベートした。ヌクレアーゼの潜在的な、相乗的な効果を調べるために、ＡＰＥ  １およびＥｘｏ  Ｉの両方を含むコントロールもまた、並行して実施した。
【００８１】
ライブラリーを増幅するために、１×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ＵのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ  ＃  ＫＫ２１０１）、１×ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光レポーター色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ  ＃  ３１０００）、１×キャリブレーション色素（フルオレセイン）、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、および０．３５μＭのそれぞれのＰＣＲプライマー（表１、配列番号３および配列番号４）を含む、６０μＬのＰＣＲマスターミックスを、全ての試料およびＮＴＣコントロールに加えた。ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ装置を使用し、以下のサイクリングプロトコルを用いて、増幅を行った：７２℃で３分間を１サイクル；８５℃で２分間を１サイクル；９８℃で２分間を１サイクル；９８℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で４０秒間を４サイクル；９８℃で２０秒間および７２℃で５０秒間を２５サイクル。リアルタイムデータを、最後の２５サイクルの７２℃の伸長工程で得た。
【００８２】
図２Ａに示されるように、ＡＰＥ  １およびＥｘｏ  Ｉが同時に存在することによって、アダプター二量体によって引き起こされるバックグラウンドの、５より多いサイクル分の右へのシフト（３２倍超の減少）が生じたのに対して、個々のヌクレアーゼのいずれも、２つのアダプター分子が互いにライゲーションすることに起因するダイマーを、有意に分解し得なかった（図２Ｂおよび図２Ｃ）。
【表１】
2016537003.tif 000003
【００８３】
本願において開示し、そして特許請求する全ての方法は、本開示に照らして、過度な実験を伴うことなくなされ得、および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されたが、本明細書中に記載される方法および工程または方法の工程の順序に、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、変更が適用され得ることは当業者にとって明らかである。より具体的には、化学的および生理的の両方において関連するある薬剤が、同一または類似の結果が達成される限りにおいて、本明細書中に記載される薬剤の代わりになり得ることは明らかである。当業者にとって明らかな、そのような類似の代替物および改変の全ては、添付する特許請求の範囲に規定されるように、本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に示されたものを補足する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、参考として本明細書に特に援用される。
米国特許第４，８７３，１９２号
米国特許第６，７１３，２９４号
米国特許第６，７７７，１８７号
米国特許第７，４３５，５７２号
米国特許第７，７１８，４０３号
米国特許第７，８０３，５５０号
米国特許第８，４４０，４０４号
米国特許出願公開第２００４／０２０９２９９号
【化１】
2016537003.tif 000004
【化２】
2016537003.tif 000005
【図１】
2016537003.tif 000006
【図２Ａ】
2016537003.tif 000007
【図２Ｂ】
2016537003.tif 000008
【図２Ｃ】
2016537003.tif 000009
【図３】
2016537003.tif 000010
【配列表】
2016537003000001.app
【国際調査報告】
2016537003.tif 000011
2016537003.tif 000012
2016537003.tif 000013