(57)【要約】  本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む眼科炎症疾患治療用組成物及びその製造方法に関する。また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法に関する。
2016518312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物。
【請求項２】
前記親水性スルファサラジンは、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）されたスルファサラジンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記親水性スルファサラジンの濃度が０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
水溶液を含む担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記水溶液を含む担体は、蒸溜水、リン酸緩衝液、平衡塩溶液及び生理食塩水から成る群から選択された１種以上の薬学的に許容される担体であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
塩酸、塩化ナトリウム及び塩化カリウムから成る群から選択された１種以上の薬学的に許容される塩をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記眼科炎症疾患は、外眼部及び前眼部の炎症疾患を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記眼科炎症疾患は、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、眼科乾燥症候群、眼瞼炎、強膜炎、上強膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記眼科炎症疾患は、
乾燥性角結膜炎またはこれと関連した眼炎症、涙液不足による眼炎症、または眼球乾燥症と関連した角結膜上皮障害を含む眼球乾燥関連炎症疾患；
外部損傷により発生する角結膜炎、アレルギー性角結膜炎、浮腫と血管を伴う充血がある急慢性非感染性結膜炎、前眼部の非感染性炎症疾患、または眼科手術後の角結膜炎を含む非感染性角結膜炎；または
ウイルス性角結膜炎、細菌性角結膜炎、真菌性角結膜炎、クラミジア性角結膜炎、リケッチア角結膜炎、または寄生虫性角結膜炎を含む感染性角結膜炎であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）スルファサラジンを親水化させる段階；及び
（ｂ）前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階を含む、
請求項１の眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記（ａ）段階は、スルファサラジンをＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）させる段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スルファサラジンをＰＥＧ化させる段階は、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加する段階を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ａ）段階は、親水化されたスルファサラジンの濃度が０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階は、ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む眼科炎症疾患治療用組成物及びその製造方法に関する。また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
目は、生活に必要な大部分の情報を受け入れる重要な感覚器官である。目は、外膜、中膜、内膜及び屈折媒質で構成されるが、外膜は、黒い瞳を覆っている前表面である角膜または結膜とその後につながった強膜からなり、中膜は、虹彩と毛様体、そして脈絡膜で構成され、内膜は網膜から成る。水晶体と硝子体及び眼房水は屈折媒質に該当する。目の機能的障害または喪失は生活の質を低下させる大きい要因の一つであり、老化、疾患及び視力に良くない影響を与え得るその他の要因のため、目の健康を維持することが重要になっている。
【０００３】
眼球炎症疾患は、充血、浮腫、感染、刺激または外傷と関連した疾患を意味する。眼球の構造中、前眼部または外眼部は眼球の前部分及び近接組織を含んでいて、環境に持続的に露出されるため、特に炎症疾患の発生する可能性が高い。
【０００４】
外眼部及び前眼部の炎症性疾患は、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、眼球乾燥症候群、眼瞼炎、強膜炎、上強膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含む。この中で角結膜炎は、細菌、ウイルス、アレルギー、または環境的要因により角膜と結膜に発生する炎症疾患として、最も一般的に発病する眼疾患であり、普通はよく治るが場合によっては致命的であるため、組織損傷による失明をもたらすこともある。このような眼球炎症性疾患の治療方法として現在は、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイドなどのステロイド剤またはアレルギー予防、遮断剤などを使用している。
【０００５】
しかし、眼球炎症疾患を治療するための抗生剤の使用は、感染した細菌に対する殺菌力はあるが、角膜内の炎症細胞に対する活性抑制と減少に対する効果は期待しにくいという問題がある。また、ステロイド性抗炎症薬物の場合、長期間使用時、または長期間使用後の使用中断時に、急性副腎機能不全により全身衰弱感、発熱、筋肉痛、関節痛及び食欲減退などの症状が現れ、細菌、ウイルスなどに対する感染の危険性が増加し、体重が増えて体型が変わり、不眠症を伴いやすいという問題がある。特に、グルココルチコイドの点眼剤または軟膏は、患者の恣意的な判断により長期的に使用する場合、眼圧上昇による緑内障、白内障または細菌性感染などの副作用を誘発しやすい。
【０００６】
よって、過去数年間で、眼球炎症疾患の治療及び予防に関する技術が大幅に進歩したが、相変らず眼球炎症疾患を予防及び治療する向上した方法及び組成物が求められている状況である。
【０００７】
本発明においては、眼球炎症疾患の治療のために使用される抗生剤、またはステロイド性抗炎症点眼剤の問題点である角膜上皮細胞の損傷回復力弱化の問題を改善するため、細胞の再生が重要な角膜上皮の損傷回復に対する治療剤としてスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を開発した。
【０００８】
これと関連し、韓国登録特許第０４９０２８６号は、スルファサラジンまたはその水溶性塩を活性成分とする、緑内障による網膜の虚血、糖尿病性網膜症による網膜損傷、ぶどう膜炎による網膜神経の退化などを治療することができる網膜損傷治療用目薬組成物を提供している。
【０００９】
また、韓国登録特許第０８９４０４２号は、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を用いて後発性白内障を抑制することができる組成物を提供している。
【００１０】
しかし、前記特許文献を含めた先行文献のどこにも、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合剤を眼科炎症疾患、特に外眼部及び前眼部の炎症性疾患の治療に適用する技術が知らされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、角膜炎症動物モデルを用いて親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤の炎症抑制、角膜浮腫抑制効果及び眼球乾燥治療効果を確認して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの目的は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物を提供することである。
【００１３】
また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法を提供することである。
【００１４】
本発明のまた一つの目的は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患の治療用点眼剤組成物の製造方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤は、眼科炎症疾患治療剤として、従来の抗生剤またはステロイド性薬物を基盤とした治療剤による副作用の発生を低める非ステロイド性治療剤として安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤の製造過程を示す模式図である。
【図２】図２は、角膜上皮細胞に対するスルファサラジンの濃度別ヒアルロン酸複合点眼剤の細胞毒性を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、可溶化したスルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ０．０１％）、または可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤（Ｓｕｌｆａ−ＨＡ０．０１％）を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の組織写真とマクロファージマーカーであるＦ４／８０抗原に対する組織染色写真とを示す。
【図４】図４は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、可溶化したスルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ０．１ｍｇ／ｍｌ）、または可溶化したスルファサラジンの濃度別（０．１ｍｇ／ｍｌまたは０．５ｍｇ／ｍｌ）ヒアルロン酸複合点眼剤を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜浮腫に対する治療効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、可溶化したスルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ０．１ｍｇ／ｍｌ）、または可溶化したスルファサラジンの濃度別（０．１ｍｇ／ｍｌまたは０．５ｍｇ／ｍｌ）ヒアルロン酸複合点眼剤を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜炎症細胞減少効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ０．０５％）、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤（Ｓｕｌｆａ−ＨＡ０．０１％）を乾燥性角結膜炎症（Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷（黄色に染色された領域）を２％フルオレセイン染色薬で染色した写真である。
【図７】図７は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ０．０５％）、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤（Ｓｕｌｆａ−ＨＡ０．０１％）を乾燥性角結膜炎症（Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷に対する薬物の効果を数値で示すグラフである。
【図８】図８は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ０．０５％）、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤（Ｓｕｌｆａ−ＨＡ０．０１％）を乾燥性角結膜炎症（Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜を冷凍切削（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）し、角膜内の炎症細胞を観察するためにヘマトキシリン−エオジンで染色した写真である。
【図９】図９は、ヒアルロン酸（ＨＡ０．１％）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ０．０５％）、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤（Ｓｕｌｆａ−ＨＡ０．０１％）を乾燥性角結膜炎症（Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷に対する薬物の効果を数値で示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一つの様態として、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物に関する。
【００１８】
また一つの様態として、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患治療方法に関する。
【００１９】
本発明において、スルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）は、スルファピリジン（Ｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ）と５‐アミノサリチル酸（５−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、５−ＡＳＡ）がアゾ結合（ａｚｏ  ｂｏｎｄ）して形成された化合物を称する。
【００２０】
前記スルファサラジンは、水溶液に対して難溶性のため、薬剤として使用するためには親水性スルファサラジンに可溶化する必要がある。このような親水性スルファサラジンは、スルファサラジンに塩酸、塩化ナトリウム、または塩化カリウムなどを添加して酸付加塩またはアルカリ付加塩の形態で得ることができ、より好ましくは、スルファサラジンをＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）して得ることができる。
【００２１】
好ましくは、本発明の親水性スルファサラジンは、ＰＥＧ化されたスルファサラジンを含むことができる。前記ＰＥＧ化されたスルファサラジンは、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加して得ることができる。このような平衡塩溶液は、多様な分子量及び濃度のポリエチレングリコールを含むことができるが、例えば、３００〜５００、好ましくは３８０〜４２０の重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを０．１％〜５％（ｖ／ｖ）、好ましくは、１％（ｖ／ｖ）以上の濃度で含むことができる。
【００２２】
本発明において、前記親水性スルファサラジンの濃度は、０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）であり得る。前記範囲未満の場合、角結膜炎治療に対する有効な薬効を具現しにくいことがあり、前記濃度範囲を超過する場合、角膜上皮細胞に対する毒性が現れることがあるためである。
【００２３】
一方、本発明において、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）は、結合組織内の細胞間質に広く分布されて生理条件下で粘着性及び弾力性溶液を形成することにより、虹彩、網膜などの組織、血管内皮細胞、上皮細胞などを機械的に保護して緩衝役割を提供するものと知られている、細胞外のマトリックスの主要成分である。
【００２４】
本発明において、前記ヒアルロン酸は、物性、形態、大きさなどに制限はなく、無菌処理されたものが好ましいが、より好ましくは、１.０ｘ１０６〜４.０ｘ１０６ｇ／モルの重量平均分子量を有するヒアルロン酸を使用することができる。
【００２５】
また、前記ヒアルロン酸は、薬剤学的に許容可能な塩の形態で使用されてもよく、前記薬剤学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含み、好ましくはナトリウム塩を含む。
【００２６】
好ましくは、本発明においては、前記ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５〜０．２％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。前記範囲未満で使用される場合、粘弾性が非常に低くて湿潤及び潤滑作用に不適切な問題が発生することがあり、前記範囲を超過する場合、過多な高粘弾性により侵透性に不適切な問題が発生して点眼剤としての適合した流動性を確保しにくいという問題がある。
【００２７】
本発明者らは、韓国登録特許０８９４０４２号において、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を用いて後発性白内障を抑制することができる組成物を提供したことがある。前記先行技術においては、後発性白内障手術時にスルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を注入して眼球内のボリュームを維持させなければならないため、２．０％（ｗ／ｖ）の高濃度のヒアルロン酸が混合された高粘弾性組成物で製造する必要があった。
【００２８】
これに反して、本発明においては、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物が眼科炎症疾患の治療に効能を持つことを新たに発見し、眼科炎症疾患治療のための点眼剤組成物として提供するためにヒアルロン酸の濃度を０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）に低めてヒアルロン酸が完全に溶解された組成物に製剤化した特徴がある。
【００２９】
本発明において、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸混合物は、眼科炎症疾患の治療、改善及び／または緩和のために使用され得る。
【００３０】
本発明の点眼剤は、薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な添加剤とは、生物体を大きく刺激せず、投与有効成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希薄剤を言う。前記薬学的に許容可能な添加剤の例としては、等張化剤、緩衝剤、安定剤、ｐＨ調節剤などがある。
【００３１】
本発明による点眼剤は、液剤の剤形であることが好ましいため、水溶液を含む担体をさらに含むことができる。
【００３２】
前記水溶液を含む担体は、蒸溜水、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、平衡塩溶液（Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）から成る群から選択された１種以上の薬学的に許容される担体を含むことができる。このとき、使用される担体の含量は、製造しようとする点眼液の総用量に必要な量に合わせて使用量を調節することができる。
【００３３】
また、本発明の点眼剤は、薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。前記薬学的に許容される塩の具体的な例としては、塩酸、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはこれらの混合物を例示することができる。
【００３４】
本発明において、用語、「投与」は、ある適切な方法で患者に本発明の成分を導入することを意味し、本発明の投与経路は、眼球に局所的に投与することである。本明細書において「治療」とは、発病症状を示す客体に使用されるとき、疾病の進行を中断、遅延または改善させることを意味する。本発明の治療方法は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を治療学的有効量で投与することを含む。適合した１日の総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医により決定されることは当業者に自明なことである。特定患者に対する具体的な治療学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、治療期間、共に使用される薬物を含めた多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子に従って異なるように適用することができる。
【００３５】
本発明において、眼科炎症疾患は、眼球に関連した炎症疾患をすべて含むことができる。前記炎症とは、眼球の充血、浮腫、感染、刺激または外傷と関連した症状を意味することができる。
【００３６】
一例において、本発明の眼科炎症疾患は、外眼部及び前眼部の炎症性疾患を含むことができる。
【００３７】
例えば、前記外眼部及び前眼部の炎症性疾患は、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、眼球乾燥症候群、眼瞼炎、強膜炎、上強膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含むことができる。
【００３８】
他の一例において、本発明の眼科炎症疾患は、角膜、結膜または角結膜に関連した炎症疾患を含むことができ、例えば、次のような疾患を例示することができる：
１）眼球乾燥関連炎症疾患：乾燥性角結膜炎またはこれと関連した眼炎症、涙液生成が抑制された患者において涙液不足による眼炎症、または眼球乾燥症と関連した角結膜上皮障害。
２）非感染性角結膜炎：外部損傷により発生する角結膜炎（例えば、直接角膜に損傷を被った場合、酸または塩による損傷による場合、火傷による損傷による場合、またはコンタクトレンズ着用による場合など）、アレルギー性角結膜炎（例えば、枯草熱性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、フリクテン性角結膜炎、接触性眼瞼炎による結膜炎など）、ひどい浮腫と血管を伴う充血がある急慢性非感染性結膜炎、前眼部の非感染性炎症疾患（例えば、全ぶどう膜炎、上強膜炎、強膜炎）、または眼科手術（例えば、斜視切開術、白内障、緑内障手術）後の角結膜炎、または
３）感染性角結膜炎：ウイルス性角結膜炎、細菌性角結膜炎、真菌性角結膜炎、クラミジア性角結膜炎、リケッチア角結膜炎、または寄生虫性角結膜炎。
【００３９】
また一つの様態として、本発明は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法に関する。
【００４０】
好ましい様態として、本発明は、
（ａ）スルファサラジンを親水化させる段階；及び
（ｂ）前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階を含む、角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法に関するものである。
【００４１】
前記（ａ）段階は、スルファサラジンを親水化させる段階であり、難溶性化合物を可溶化させるために通常に使用されるものとして知られた方法及び装置を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、スルファサラジンをＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）させる段階を含んでもよい。
【００４２】
具体的に、スルファサラジンをＰＥＧ化させる段階は、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加する段階を含むことができる。前記平衡塩溶液に含まれるポリエチレングリコールは、スルファサラジンをＰＥＧ化して親水化させることができる。このように、スルファサラジンをＰＥＧ化して親水化させると、化学的構造の変更なく水溶性の液体として使用することができ、点眼剤として容易に製作することができる。前記スルファサラジン及びポリエチレングリコールに関する具体的な内容は上述した内容のとおりである。
【００４３】
好ましくは、前記（ａ）段階は、親水化されたスルファサラジンの濃度が０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことができる。
【００４４】
前記（ｂ）段階は、前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階であり、親水化されたスルファサラジンが含まれた平衡塩溶液に適切な量のヒアルロン酸を添加して濃度を調節することができ、前記ヒアルロン酸の物性、形態、大きさなどには制限がなく、無菌処理されたものが好ましい。
【００４５】
好ましくは、前記（ｂ）段階は、ヒアルロン酸の濃度が０．０１から０．５％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことができる。
【００４６】
また、親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を混合する段階は、親水化されたスルファサラジン及びヒアルロン酸を２０〜３５℃で６時間〜２４時間混合することが好ましい。前記混合時の温度範囲未満の場合には、点眼剤の成分が均質に混合されないこともあり、前記温度範囲超過の場合には、製剤の安定的な調剤が容易でないため好ましくない。また、前記混合時間範囲未満の場合には、点眼剤の成分が均質に混合しないこともあり、前記時間を超過する場合には、ヒアルロン酸の粘度に変化が生ずることがある。
【００４７】
一方、前記角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法においては、薬学的に許容される添加剤、担体または塩を添加する段階をさらに含むことができる。このような薬剤学的に許容される担体または塩は、前記角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造する過程で特に制限なく添加することができるが、前記親水化されたスルファサラジン及びヒアルロン酸が完全に混合された後に添加することが好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するのみであり、本発明が下記実施例により限定されるものではない。
【００４９】
実施例１.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の製造
スルファサラジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を３０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（分子量４００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）が混合された平衡塩溶液（ｐＨ７.４）１０ｍｌに５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、攪拌機で６時間混合してＰＥＧ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）して可溶化し、可溶化されたスルファサラジンを製造した。
次に、１０ｍｌの平衡塩溶液に０．１％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸パウダー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を混合し、スルファサラジンが０．０５％（０．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度となるように前記ＰＥＧ化されたスルファサラジンを含んだ溶液をヒアルロン酸と混合した。スルファサラジンの濃度は、ＰＥＧ化段階で調節した。すべての溶液が均質化されるように常温で６時間攪拌した。均質化されて透明で澄んだ溶液になると、点眼剤として使用した（図１）。
【００５０】
実施例２.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の濃度別角膜上皮細胞毒性確認
角膜上皮細胞に対する細胞毒性を観察するために、人の角膜上皮細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＨＣＥＴ）を培養し、培養された細胞に対する毒性は、ＣＣＫ  ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＮＣ）を用いて確認した。
より詳細に、本発明において使用された角膜上皮細胞は、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０）を感染させて作った細胞であるＨＣＥＴ細胞を使用した。本細胞は、日本大阪大学医科部のＫａｏｒｕ  Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉ教授から分譲を受けた。角膜上皮細胞は、５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、５ｍｇ／ｍｌインシュリン、０．１ｍｇ／ｍｌコレラトキシン、１０ｎｇ／ｍｌｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び０．５％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を添加した細胞培養液（ＭＥＭ：Ｈａｍ  Ｆ１２＝１：１）を使用して５％ＣＯ２が維持できる３７℃の恒温恒湿器で培養した。本実施例において、角膜上皮細胞（ＨＣＥＴ）は６−ウェルプレートに各ウェル当たり２ｘ１０４（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で培養した。
上の条件で培養されたＨＣＥＴ細胞の培養２４時間後に、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤をスルファサラジン濃度だけ異なるようにして（０．００５〜５.０ｍｇ／ｍｌ）血清がない培養液に培養液対点眼剤を５：１で処理した。対照群は血清が含まれない培養液を使用した。薬物処理１２時間後にＣＣＫ  ａｓｓａｙをして細胞毒性を確認した。
その結果、スルファサラジンヒアルロン酸複合点眼剤は、スルファサラジンの濃度を５ｍｇ／ｍｌ（０．５％、ｗ／ｖ）まで上げたとき、７０％以上の細胞生存率を示した。（図２）
【００５１】
実施例３.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の角結膜炎症抑制効果
動物は、ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙ、３００ｇ、ｍａｌｅ）を使用し、ＮａＯＨを用いた化学薬物による角膜損傷モデル（ａｌｋａｌｉ  ｂｕｒｎ）を用いた。３ｍｍ  ｐａｐｅｒ  ｄｉｓｋに０．１ＭのＮａＯＨ溶液（５０ｕｌ）を浸し、角膜を３０秒間覆って角膜損傷を誘導した。角膜で、炎症反応は、ヘマトキシリンエオジン染色とＦ４／８０抗原に対する免疫染色を行い確認した。角膜浮腫に対する分析は、角膜上皮細胞層（ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）と角膜基質層（ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｔｒｏｍａ）との比で分析した。
角膜損傷後、実施例１において製造して可溶化したスルファサラジン、及びスルファサラジン−ヒアルロン酸点眼剤をそれぞれ一日に二度投与した。対照群はヒアルロン酸０．１％を投与した。
角膜損傷後、３日後に眼球を摘出してパラフィンブロックを作って組織切片を作った後、ヘマトキシリンエオジン染色とマクロファージマーカーであるＦ４／８０抗原で免疫染色を行い観察した結果、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）においては、角膜の浮腫と炎症細胞の角膜浸透が観察されたが、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を投与した群においては浮腫及び炎症細胞の数が減っていた。また、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は、ヒアルロン酸と混合されなかった同じ濃度のスルファサラジン溶液より炎症抑制及び浮腫抑制効果に優れていた。（図３）
定量的な結果を見ると、正常の角膜上皮細胞（ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）と基質層（ｓｔｒｏｍａ）との比は４.６±１であったが、角膜炎症誘導後には１０±２.５に増加した。スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を投与した実験群の場合、０．０５ｍｇ／ｍｌ（０．００５％）投与群においては７.６±１.８が、０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１％）投与群においては５.６±１.４が観察され、角膜浮腫が抑制されたことを確認することができた。また、０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１％）のスルファサラジン溶液を投与した実験群においては７.１±２.１が観察され、結果的にスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤がヒアルロン酸と混合されなかった同じ濃度のスルファサラジン溶液より角膜浮腫抑制効果に優れていた。（図４）
炎症細胞に対する分析は、角膜に存在するマクロファージ（Ｆ４／８０  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）の数で実施し、結果は、角膜炎症誘導後には３１.５±４.９個が観察され、ヒアルロン酸がないスルファサラジン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１％））を投与した群においては２１.３±５.５個が、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤投与群の場合、０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１％）投与群において１６.２±３.３個のマクロファージが観察された。（図５）
【００５２】
実施例４.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の乾燥性角結膜炎において炎症抑制効果
乾燥性角結膜炎（Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）に対する実験のために乾性眼（ｄｒｙ  ｅｙｅ）動物モデルを製作した。動物はラット（ｓｄ  ｒａｔ）を使用し、乾燥性角結膜炎の誘導は、１％の硫酸アトロピン（１％ａｔｒｏｐｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）と０．１％の塩化ベンザルコニウム（０．１％ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）とを一日に二度ずつ２週間点眼して誘導した。
スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤（０．１ｍｇ／ｍｌ）の投与は、１％のアトロピン（１％ａｔｒｏｐｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）と０．１％の塩化ベンザルコニウム（０．１％ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）との投与一週間後から、一週間一日に二度点眼投与した。比較薬物として０．１％のヒアルロン酸と０．０５％のシクロスポリン点眼剤とを使用した。
乾燥性角結膜炎動物モデルにおいて、角膜上皮損傷の確認は、２％のフルオルセイン溶液で角膜上皮が損傷された部位を染色して確認し（図６）、角膜の炎症は、角膜を冷凍切削（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）してヘマトキシリンとエオジン染色を実施して確認した。（図８）
乾燥性角結膜炎（乾性眼）が誘導された角膜において、乾燥による角膜上皮細胞の状態をフルオレセイン染色を行い、乾燥による角膜上皮細胞の損傷があることを確認した（図６）。フルオレセイン染色薬は、健康な正常角膜上皮細胞は染色されず、損傷されたり、角膜上皮がない角膜部位が染色される特徴を有している（黄色に染色された領域）。フルオレセイン染色の後、染色された面積は全体角膜面積に対して％で示した。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ、薬物非処理群）においては、７６±６.５％と角膜表面の大部分が染色されたが、ヒアルロン酸（０．１％）５４±７.４％、シクロスポリン（０．０５％）２９±４.２％、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤（０．０１％）においては、３７±５.７％に角膜表面の蛍光染色が著しく減ったことを確認することができた（図６、７）。これにより、製造されたスルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤（０．０１％）が角膜上皮細胞の損傷を抑制し、保護効果があるものと観察された。
乾燥性角結膜炎（乾性眼）において、角膜内の炎症細胞を確認するためにヘマトキシリン−エオジン染色を行った結果、乾性眼の角膜で丸くて多核（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ）を有した細胞（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅｓ）が観察された（図８）。乾燥性角結膜炎モデルにおいて、炎症細胞の角膜侵入抑制効果は、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ、薬物非処理群）に対して比率で示した。炎症抑制効果は、ヒアルロン酸（０．１％）０．７６±０．１、シクロスポリン（０．０５％）０．３５±０．０７、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤（０．０１％）においては、０．４８±０．０９が観察された（図９）。上の動物実験結果でスルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤（０．０１％）が乾燥性角結膜炎に対して炎症抑制効果があることを確認した。
上の実施例の結果は、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は角膜炎症の緩和に効果があり、スルファサラジン単独投与より効果が大きいということを意味する。
上の結果に照らして見ると、本発明のスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は、眼球、特に前眼部または外眼部の炎症治療に効果的に使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年11月10日(2015.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物。
【請求項２】
前記親水性スルファサラジンは、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）されたスルファサラジンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記親水性スルファサラジンの濃度が０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
水溶液を含む担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記水溶液を含む担体は、蒸溜水、リン酸緩衝液、平衡塩溶液及び生理食塩水から成る群から選択された１種以上の薬学的に許容される担体であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
塩酸、塩化ナトリウム及び塩化カリウムから成る群から選択された１種以上の薬学的に許容される塩をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記眼科炎症疾患は、外眼部及び前眼部の炎症疾患を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記眼科炎症疾患は、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、眼科乾燥症候群、眼瞼炎、強膜炎、上強膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記眼科炎症疾患は、
乾燥性角結膜炎またはこれと関連した眼炎症、涙液不足による眼炎症、または眼球乾燥症と関連した角結膜上皮障害を含む眼球乾燥関連炎症疾患；
外部損傷により発生する角結膜炎、アレルギー性角結膜炎、浮腫と血管を伴う充血がある急慢性非感染性結膜炎、前眼部の非感染性炎症疾患、または眼科手術後の角結膜炎を含む非感染性角結膜炎；または
ウイルス性角結膜炎、細菌性角結膜炎、真菌性角結膜炎、クラミジア性角結膜炎、リケッチア角結膜炎、または寄生虫性角結膜炎を含む感染性角結膜炎であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）スルファサラジンを親水化させる段階；及び
（ｂ）前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階を含む、
請求項１の眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記（ａ）段階は、スルファサラジンをＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）させる段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スルファサラジンをＰＥＧ化させる段階は、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加する段階を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ａ）段階は、親水化されたスルファサラジンの濃度が０．００５〜０．１％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階は、ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
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