(57)【要約】  本発明は、同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法に関し、ここで該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）ファミリーからの１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、それにより、該形質転換樹木において生長特性、機械的特性および／または糖化特性が向上する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法であって、該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）ファミリーからの１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、その際、該形質転換樹木は、同一種の野生型樹木に比べて、生長特性の向上および改善された機械的特性および／または糖化特性を示すものとする前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、次のステップ：
（ａ）樹木細胞に発現ベクターを導入するステップであって、ここで、該発現ベクターは次のものを含むものとする：
（ｉ）少なくとも１つのプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターの下流に作動可能に連結されたＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該第１のヌクレオチド配列と相補的であってかつ該第１のヌクレオチド配列の下流に作動可能に連結された、第２のヌクレオチド配列；
その際、これらの連結されたヌクレオチド配列は細胞内でＲＮＡへ転写され、それによってヘアピンＲＮＡが生成され、該ヘアピンＲＮＡが該細胞内でプロセシングされて干渉ＲＮＡ分子となり、該干渉ＲＮＡ分子が、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子の発現を低減することができるものとする；および
（ｂ）ステップ（ａ）における樹木細胞を培養して形質転換樹木とするステップ
を含む、前記方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、プロモーターが木質特異的プロモーターであり、該木質特異的プロモーターが二次壁生合成の間にアップレギュレートされる、前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、木質特異的プロモーターが、ＧＴ４３プロモーター；二次壁ＣｅｓＡプロモーター；ＲＷＡプロモーター、特にシロイヌナズナ属のＲＷＡ１プロモーター、ＲＷＡ３プロモーターまたはＲＷＡ４プロモーターに相同のプロモーター；シロイヌナズナ属のＩＲＸ１０プロモーターに相同のプロモーター；ＧＵＸ１プロモーターまたはＧＵＸ２プロモーター；ＡｔＦＲＡ８プロモーター、ＡｔＩＲＸ８プロモーター／またはＡｔＰＡＲＶＵＳプロモーター；ＡｔＸｙｎ１プロモーター；ＡｔＴＢＬ２９プロモーターからなる群から選択される、前記方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、木質特異的プロモーターが、配列番号２５として示されるヌクレオチド配列を含むＧＴ４３Ｂプロモーターであるか、または配列番号２３として示されるヌクレオチド配列を含むＧＴ４３Ｂ由来のＷＰプロモーターである、前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、形質転換樹木の木質の発達において、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルが、同一種の野生型樹木において転写されるｍＲＮＡの対応するレベルの２５％〜８５％である、前記方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法であって、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子が、次のもの：
（ａ）次のものからなるコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）遺伝子の群：
ＧＴ４３Ａ（配列番号１）、
ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）、
ＧＴ４３Ｃ（配列番号３）、
ＧＴ４３Ｄ（配列番号４）、
ＧＴ４３Ｅ（配列番号５）、
ＧＴ４３Ｆ（配列番号６）、
ＧＴ４３Ｇ（配列番号７）；
（ｂ）（ａ）におけるコットンウッド遺伝子とオルソロガスであってかつ（ａ）における遺伝子との配列同一性が少なくとも８０％である、遺伝子
から選択される、前記方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、（ｂ）におけるオルソロガス遺伝子が、ユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される種から選択される、前記方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法であって、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子が、次のもの：
ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）、
ＧＴ４３Ｃ（配列番号３）、および
ＧＴ４３Ｅ（配列番号５）
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子が、次のもの：
ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）、および
ＧＴ４３Ｃ（配列番号３）
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃの双方の発現の低減か、または、３つのＧＴ４３遺伝子、すなわちＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｅの発現の低減を含む、前記方法。
【請求項１２】
生長の増加を示す形質転換樹木を製造するための、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、生長の増加が、高さの増加、幹直径の増加、幹体積の増加、節間長の増加および葉数の増加から選択される１つ以上の特徴により特徴付けられる、前記方法。
【請求項１４】
改善された機械的特性を示す形質転換樹木を製造するための、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、改善された機械的特性が、弾性率の増加および／または曲げ強さの増加を含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法であって、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木を製造するための、前記方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、単糖類が、アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法により得られ得る、形質転換樹木。
【請求項１９】
請求項１８に記載の形質転換樹木であって、ポプラ属、アカシア属、ヤナギ属またはユーカリ属から選択される属の樹木である、前記形質転換樹木。
【請求項２０】
次のもの：
（ｉ）木質の発達において活性である木質特異的プロモーター；
（ｉｉ）少なくとも１つの遺伝子であって、任意にグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）遺伝子ファミリーから選択された少なくとも１つの遺伝子
を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターであって、
次のもの：
ｉ．少なくとも１つのプロモーター；
ｉｉ．ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列；および
ｉｉｉ．該第１のヌクレオチド配列と相補的な第２のヌクレオチド配列；
を含み、
その際、これらのヌクレオチド配列は樹木細胞内でヘアピンＲＮＡ構造へ転写されることが可能であり、該ヘアピンＲＮＡ構造が該細胞内でプロセシングされて干渉ＲＮＡ分子となり、該干渉ＲＮＡ分子はＧＴ４３遺伝子の発現を低減することができるものとする、前記発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターであって、プロモーターがＧＴ４３Ｂプロモーターである、前記発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２０から２２までのいずれか１項に記載の発現ベクターであって、該発現ベクターがさらに、転写因子結合部位、スプライス部位および終結部位からなる群から選択される１つ以上の調節要素を含む、前記発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２０から２３までのいずれか１項に記載の発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列が、ＧＴ４３ファミリーからの２つまたは３つの遺伝子を含む、前記発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクターであって、２つの遺伝子がＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃであるか、または３つの遺伝子がＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｅである、前記発現ベクター。
【請求項２６】
遺伝子の、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）遺伝子ファミリーから選択される遺伝子の、発現増加のためのまたはダウンレギュレーションのための、請求項２０から２５までのいずれか１項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２７】
請求項２０から２５までのいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、形質転換樹木。
【請求項２８】
請求項１８、１９または２７のいずれか１項に記載の形質転換樹木から得られる、木質。
【請求項２９】
次のこと：
（ａ）請求項２８に記載の木質を準備すること；
（ｂ）該木質を分解すること；および
（ｃ）遊離単糖類を得ること
を含む、木質から単糖類を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹木における特性向上の分野に関する。特に本発明は、生長の増加、改善された糖化および改善された機械的特性を伴う、キシラン生合成機構においてグリコシルトランスフェラーゼ４３遺伝子をダウンレギュレートする方法に関する。また本発明は、使用される発現ベクター、形質転換樹木および木質にも関する。そのような樹木および木質は森林植林において有用であり、またバイオエネルギーの使用にも有用である。
【０００２】
発明の背景
木質は、再生可能なバイオ燃料の豊富な原材料としての優れたエネルギー源の一つである。高等植物の細胞壁は、多糖類、例えばセルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびポリフェノール化合物、例えばリグニンを含む。これらの細胞壁成分の全てがリグノセルロース系バイオマスを構成しており、これはエネルギーの豊富な供給源である。
【０００３】
キシランは広葉樹における主要なヘミセルロースであり、木質バイオマスの約２０％を占める。広葉樹におけるキシラン主鎖の長さは、通常はある種についての長さの狭い範囲内にあるが、単離操作に応じて変わりうる。残基の数は５０〜２５０で変化する。恐らく、キシランの長さは広葉樹内において厳しく制御されているものと考えられる。
【０００４】
キシランは、ゴルジにおいて多数のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）で合成され、これが小胞において原形質膜に輸送され、この原形質膜において細胞壁に組み込まれ、かつ他の壁組成物で架橋される。ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、遺伝子ファミリーＧＴ８、ＧＴ４３およびＧＴ４７に属する。これらは、キシラン主鎖の開始、伸長および終結に必要とされる。
【０００５】
キシラン生合成は鋭意研究が行われている分野の一つであり、それというのも、キシラン生合成に関与する最初の遺伝子がシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において発見されたためである。
【０００６】
コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）のＧＴ４３群は、ＧＴ４３ＡからＧＴ４３Ｇで示される７つの遺伝子を含む。核酸配列は配列番号１〜７として示され；対応するアミノ酸配列は配列番号８〜１４として示される。コットンウッド、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）およびイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）における比較配列解析によって、ＧＴ４３遺伝子が３つの別個のクレードを形成し、これらが３つの異なる属において保存されることが示された（図１参照）。シロイヌナズナ核酸配列は、配列表において配列番号１５（ＡｔＩＲＸ９；クレードＩ）；配列番号１６（ＡｔＩＲＸ９−Ｌ；クレードＩＩ）；配列番号１７（ＡｔＩＲＸ１４；クレードＩＩＩ）および配列番号１８（ＡｔＩＲＸ１４−Ｌ；クレードＩＩＩ）として示される。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９〜２２として示される。
【０００７】
下等の維管束植物類およびトウヒは、クレードＩＩおよびクレードＩＩＩの２つのクレードしか有していない。
【０００８】
研究によって、キシランキシロシルトランスフェラーゼ活性には、クレードＩまたはＩＩのメンバーの１つとクレードＩＩＩのメンバーの１つとが必要であることが判明した。このことは、最近の研究（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７：  １−６）によって裏付けられている。この研究によって、キシラン生合成にはＰｔｒＧＴ４３ＢおよびＰｔｒＧＴ４３Ｃという２つのポプラグリコシルトランスフェラーゼが関与することが実証された。彼らの発見によって、ポプラのＧＴ４３メンバーが、キシラン主鎖の生合成時にキシロシル残基の連続的な転移の触媒作用において協調的に作用することが示された。このことはさらに、維管束植物類においてＧＴ４３遺伝子ファミリーメンバーの生化学的機能が進化的に保存されているという仮説を裏付けるものである。
【０００９】
ポプラ属のＧＴ４３メンバーは、キシラン主鎖の伸長に関与することが判明している。ＧＴ４３ＡおよびＧＴ４３Ｂは木質形成の間に高度に発現され、特に二次細胞壁が肥厚している細胞中で発現される。
【００１０】
ポプラ属のＧＴ４３Ｂ遺伝子の発現は、ＲＮＡｉにより形質転換ポプラ属において低減された（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  ４：  ７３０−７４７）。この低減された発現によって、これらのポプラ属の転写産物がＷＴレベルの２％〜１５％に減少する。その結果、繊維および道管における薄い細胞壁内に異常な木部が形成され、かつ不規則な木部表現型（潰れた道管）が形成される。さらに、キシロース含有量は、これらの株におけるＷＴキシロース含有量の５０％〜８０％に減少した。ＳリグニンおよびＧリグニンの含有量も減少した。
【００１１】
ペントース、例えばキシランは発酵のための貧基質と考えられ、従ってキシラン含有量の減少は発酵用途においては有益であろう。しかし、キシラン含有量が減少した植物は矮性であり、かつ／または、潰れておりかつ薄い細胞壁を有する木部を生成する。このような植物はまた脆弱であり、かつ脆い幹を有する。
【００１２】
ＧＴ４３Ｂ遺伝子の発現がＲＮＡｉにより低減された場合、リグニン含有量が減少した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  ４：  ７３０−７４７）。セルロース消化率は、同一のセルロース量を酵素消化に供したＷＴに比べて、ＧＴ４３Ｂ  ＲＮＡｉ株、ＧＴ４７Ｃ  ＲＮＡｉ株において増加した。リグノセルロースの乾燥質量あたりの糖化収率についての情報は、何ら提供されていない。キシランの不足を伴ういくつかのポプラ株は脆弱であり、かつ脆い幹を有する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｒｅｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３１：  ２２６−２３６）。ＧＴ４７Ｃが抑制された場合には、樹木の生長は影響を受けなかった。また、他の形質転換株の場合については報告されていない。
【００１３】
ＷＯ２０１２／１０３５５５には、低減されたキシラン含有量と、それに伴って低減された生長特性と低減された機械的特性とを招く、アンチセンスによるシロイヌナズナ属におけるＩＲＸ９遺伝子のダウンレギュレーションが記載されている。
【００１４】
ＵＳ２０１２／０１８５９７５には、シロイヌナズナ属のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子から単離されたプロモーターが開示されている。このプロモーターを、ストレス処理のために、植物、植物部分または植物細胞において使用できることが説明されている。
【００１５】
キシラン含有量の減少は、木質中のセルロース割合の増加につながる。キシラン由来の糖は、セルロース由来の糖とは対照的に発酵のための貧基質と考えられているという知識から判断すると、キシラン含有量の減少は有益であると考えられる。キシラン含有量が低減された樹木についての問題は、上記の議論に基づくと、こうした樹木が矮性であり、かつ／または、潰れたおよび／または薄い細胞壁を有する木部を生成するという点にある。このような樹木はまた脆弱であり、かつ脆い幹を有する。
【００１６】
従って、生長の増加を示すとともに機械的特性の保持または向上を示す形質転換樹木を製造するための方法および手段が求められている。さらに、より良好な糖化特性が求められている。この種の形質転換樹木は、一般用途での森林植林のための、そして特にバイオエネルギー作物のための、価値の高い材料を構成する。
【００１７】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法を提供し、ここで該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）ファミリーからの１つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、その際、該形質転換樹木は、同一種の野生型樹木に比べて、生長特性の向上および改善された機械的特性および／または糖化特性を示すものとする。
【００１８】
一実施形態では、本態様による方法は次のステップを含む：
（ａ）樹木細胞に発現ベクターを導入するステップであって、ここで、該発現ベクターは次のものを含むものとする：
（ｉ）少なくとも１つのプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターの下流に作動可能に連結されたＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該第１のヌクレオチド配列と相補的であってかつ該第１のヌクレオチド配列の下流に作動可能に連結された、第２のヌクレオチド配列；
その際、これらの連結されたヌクレオチド配列は細胞内でＲＮＡへ転写され、それによってヘアピンＲＮＡが生成され、該ヘアピンＲＮＡが該細胞内でプロセシングされて干渉ＲＮＡ分子となり、該干渉ＲＮＡ分子が、ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子の発現を低減することができるものとする；および
（ｂ）ステップ（ａ）の樹木細胞を培養して形質転換樹木とし、かつ前述の形質転換樹木を栄養繁殖させることにより形質転換樹木株を取得するステップ。
【００１９】
特に木質の発達において低減されたＧＴ４３遺伝子の発現を示す形質転換樹木株は、得られた多数の株から選択され、好ましくは２０以上の株から選択される。
【００２０】
好ましい一実施形態において、前述のプロモーターは木質特異的プロモーターであり、この木質特異的プロモーターは二次壁生合成の間にアップレギュレートされる。
【００２１】
他の好ましい実施形態において、前述の木質特異的プロモーターは、ＧＴ４３プロモーター、二次壁ＣｅｓＡプロモーター、ＲＷＡプロモーター、特にシロイヌナズナ属のＲＷＡ１プロモーター、ＲＷＡ３プロモーターまたはＲＷＡ４プロモーターに相同のプロモーター、シロイヌナズナ属のＩＲＸ１０プロモーターに相同のプロモーター、ＧＵＸ１プロモーターまたはＧＵＸ２プロモーター、ＡｔＦＲＡ８プロモーター、ＡｔＩＲＸ８プロモーター／またはＡｔＰＡＲＶＵＳプロモーター、ＡｔＸｙｎ１プロモーター、ＡｔＴＢＬ２９プロモーターから選択される。当技術分野においては、これらのプロモーターは主に維管束組織において発現されかつ二次壁形成に関与すること、そしてそれらの発現パターンは木質の発達からのデータを用いて追従し易いことが知られている。
【００２２】
その他の好ましい実施形態において、前述の木質特異的プロモーターは、配列番号２５として示されるヌクレオチド配列を含むＧＴ４３Ｂプロモーターであるか、または配列番号２３として示されるヌクレオチド配列を含むＧＴ４３Ｂ由来の木質特異的（ＷＰ）プロモーターである。ＧＴ４３ＢプロモーターとＷＰプロモーターとの相違点は、開始コドンの上流２４ヌクレオチドの欠失である。
【００２３】
他の実施形態によれば、前述の形質転換樹木の木質の発達において、ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルは、同一種の野生型樹木において転写されるｍＲＮＡの対応するレベルの２５％〜８５％である。
【００２４】
好ましくは、前述の形質転換樹木の木質の発達において、ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子、好ましくはＧＴ４３ＡまたはＧＴ４３ＢまたはＧＴ４３Ｃから転写されるｍＲＮＡのレベルは、低減されはするものの無くなるわけではない。前述のｍＲＮＡのレベルは、同一種の野生型樹木において転写されるｍＲＮＡの対応するレベルの、好ましくは２５％〜８５％、３５％〜７５％、３０％〜６０％であるか、またはさらに好ましくは５０％〜６０％である。抑制のレベルは、木質特異的プロモーター、すなわち主に維管束組織において発現されるプロモーターの使用による木質組織の発達を目的とすることができる。前述の低減された発現は、好ましくは、当技術分野においてよく知られているＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法によって達成される。
【００２５】
ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子は、好ましくは次のものから選択される：
（ａ）次のものからなるコットンウッド遺伝子の群：
ＧＴ４３Ａ（配列番号１）、
ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）、
ＧＴ４３Ｃ（配列番号３）、
ＧＴ４３Ｄ（配列番号４）、
ＧＴ４３Ｅ（配列番号５）、
ＧＴ４３Ｆ（配列番号６）、
ＧＴ４３Ｇ（配列番号７）；
（ｂ）（ａ）におけるコットンウッド遺伝子とオルソロガスであってかつ（ａ）における遺伝子との配列同一性が少なくとも８０％である、遺伝子。
【００２６】
前述の（ｂ）におけるオルソロガス遺伝子は、好ましくはユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される種に由来する。
【００２７】
前述のユーカリ属遺伝子は、以下のものからなる群から選択される：
ＧＴ４３Ａ（配列番号３１）、
ＧＴ４３Ｂ（配列番号３２）、
ＧＴ４３Ｃ（配列番号３３）、
ＧＴ４３Ｄ（配列番号３４）、
ＧＴ４３Ｅ（配列番号３５）、
ＧＴ４３Ｆ（配列番号３６）、
ＧＴ４３Ｇ（配列番号３７）。
【００２８】
好ましくは、ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子は、ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）、ＧＴ４３Ｃ（配列番号３）およびＧＴ４３Ｅ（配列番号５）からなる群から選択される。さらに好ましくは、これらの遺伝子は、ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）およびＧＴ４３Ｃ（配列番号３）からなる群から選択される。さらに好ましくは、本発明による方法は、ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃの双方の発現の低減か、または、３つのＧＴ４３遺伝子、すなわちＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｅの発現の低減を含む。
【００２９】
上述の通り、本発明の方法の一実施形態は、生長の増加を示す形質転換樹木の製造に関する。この文脈において、「生長の増加」という用語は、高さの増加、幹直径の増加、幹体積の増加、節間長の増加および葉数の増加から選択される１つ以上の特徴を意味する。
【００３０】
さらに、本発明の方法の一実施形態は、改善された機械的特性を示す形質転換樹木の製造に関する。この文脈において、「改善された機械的特性」という用語は、弾性率（ＭＯＥ）の増加および／または曲げ強さ（ＢＳ）の増加を意味する。
【００３１】
その他の実施形態において、本発明の方法は次のような形質転換樹木の製造を提供し、すなわち、該形質転換樹木の製造方法において、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木の製造を提供する。前述の単糖類は、好ましくはアラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される。
【００３２】
本発明の第２の態様は、第１の態様において上記で開示された方法によって得られる形質転換樹木に関する。前述の形質転換樹木は、好ましくはポプラ属、ユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される属の樹木である。さらに本発明は、本発明の第４態様の発現カセット（またはベクター）を含む形質転換樹木に関する。
【００３３】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による形質転換樹木から得られる木質にも関する。
【００３４】
前述の形質転換樹木の木質においては、同一種の野生型樹木からの木質と比較した場合に、ＧＴ４３からの１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡのレベルが低減されている。詳細には、ｍＲＮＡの前述のレベルは、低減されはするものの無くなるわけではない。好ましくは、ｍＲＮＡのレベルは、同一種の野生型樹木と比較した場合に、ｍＲＮＡの２５％〜８５％、さらに好ましくは３０％〜６０％に低減されている。
【００３５】
本発明の第４の態様は、次のものを含む発現ベクターに関する：
（ｉ）木質の発達において活性である木質特異的プロモーター；
（ｉｉ）少なくとも１つの遺伝子、または少なくとも１８のヌクレオチドを有する遺伝子の一部であって、任意にグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）遺伝子ファミリーから選択されたもの。
【００３６】
本態様の一実施形態において、本発明は次のもの：
（ｉ）少なくとも１つのプロモーター；
（ｉｉ）ＧＴ４３ファミリーからの１つ以上の遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該第１のヌクレオチド配列と相補的な第２のヌクレオチド配列；
を含む発現ベクターに関し、
その際、これらのヌクレオチド配列は樹木細胞内でヘアピンＲＮＡ構造へ転写されることが可能であり、該ヘアピンＲＮＡ構造が該細胞内でプロセシングされて干渉ＲＮＡ分子となり、該干渉ＲＮＡ分子はＧＴ４３遺伝子の発現を低減することができるものとする。
【００３７】
上述のように、プロモーターは、主に木部の発達において発現されるプロモーターであり、例えばＧＴ４３Ｂプロモーターである。前述の発現ベクターはさらに、転写因子結合部位、スプライス部位および終結部位からなる群から選択される１つ以上の調節要素を含むことができる。
【００３８】
ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子は、好ましくはＧＴ４３Ｂ（配列番号２）およびＧＴ４３Ｃ（配列番号３）からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、前述の第１のヌクレオチド配列は、ＧＴ４３ファミリーからの２つまたは３つの遺伝子を含む。好ましくは、前述の２つまたは３つの遺伝子は、ＧＴ４３Ｂ（配列番号２）およびＧＴ４３Ｃ（配列番号３）の双方を含む。
【００３９】
ＧＴ４３ファミリーからの前述の１つ以上の遺伝子は、好ましくは、ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃの双方から、または、３つの遺伝子、すなわちＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｅから、選択されることができる。
【００４０】
その他の態様において、本発明は、次のような形質転換樹木を製造するための前述の態様のいずれか１つに記載の方法を含み、すなわち、該形質転換樹木の製造方法において、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木を製造するための前述の態様のいずれか１つに記載の方法を含む。前述の単糖類は、好ましくはアラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のもう１つの態様は、遺伝子の、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ４３（ＧＴ４３）遺伝子ファミリーから選択される遺伝子の、発現増加のためのまたはダウンレギュレーションのための、本発明の発現ベクターの使用に関する。
【００４２】
その他の態様において、本発明は木質から単糖類を製造するための方法を提供する。前述の方法は、次のことを含む：（ａ）上記の通りの形質転換樹木からの木質を準備すること；（ｂ）該木質を分解すること；および（ｃ）遊離単糖類を得ること。木質は、酸性条件下での前処理を伴うかまたは伴わずに酵素によって分解される。前処理を行う場合には、様々な酸および酸濃度を用いて多くの方法で酸性条件を作り出すことができる。例えば好ましい一実施形態では、１％（質量／質量）の濃度の硫酸を添加することによって酸性条件を作り出すことができる。さらに、酸性条件には、この文脈においては、外部酸が添加されない前処理方法も包含されるものと意図される。酸性条件を得るために、前処理として温度上昇を用いることができる。例えば酸を添加しない蒸気爆発が酸性条件下で行われる。なぜならば、前処理中に酸が形成されるためである。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、本発明による木質から得られる単糖類を微生物発酵法のための基質として使用するための方法、およびこのような方法により得られる生成物に関する。このような方法の生成物は、バイオ燃料、他の化学物質および生体高分子でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】３つのクレード（Ｉ−ＩＩＩ）に分類される、コットンウッド（Ｐｔ）、シロイヌナズナ（Ａｔ）およびイネ（Ｏｓ）におけるＧＴ４３ファミリーのメンバーを示す系統樹。
【図２】構成的ＣａＭＶ３５Ｓ（３５Ｓ）プロモーターおよび木質特異的（ＷＰ）プロモーターにより駆動される個々または複数のＧＴ４３遺伝子を標的とするＲＮＡｉコンストラクトのマップ。
【図３】温室内での成長に対するＲＮＡｉコンストラクトの効果。様々なＲＮＡｉコンストラクト（Ｂ、Ｃ、ＢＥ、ＢＣおよびＢＣＥ）が３５ＳプロモーターまたはＷＰプロモーターのいずれかにより駆動され、かつそれぞれの組み合わせが３つの独立した株により表されている。ＷＴと比べた有意な効果を星＊により示す（Ｐ≦５％、テューキーのＨＳＤ検定）。交差する線は、プロモーター間での有意な差を示す。図３Ａ  野生型に対する高さ（％）；図３Ｂ  野生型に対する葉数（％）；図３Ｃ  野生型に対する節間長（％）；図３Ｄ  野生型に対する直径（％）；図３Ｅ  野生型に対する体積（％）。
【図４】酸前処理なしでの実験における糖収率。この図は、酵素による加水分解後の単糖類の収率を示す。
【図５】酸で前処理されたアスペンを用いた実験における糖収率。この図は、酵素による加水分解後の単糖類の収率と前処理液における単糖類の収率とを合一したものを示す。
【図６】ＧＴ４３Ｂプロモーター駆動型のＲＮＡｉコンストラクトＧＴ４３ＢＣを含む形質転換ハイブリッドアスペンの植物生長。Ａ  植物の高さ、幹直径および幹体積、Ｂ  節間数および節間長、Ｃ  葉長および葉幅。Ａ−Ｃのデータは、ｎ＝５のバイオロジカルレプリケートの平均値±ＳＥである。星は、ＷＴと有意に異なる値を示す（スチューデントのｔ検定、α＝０．０５）。
【図７】ＧＴ４３  ＲＮＡｉコンストラクトを含む形質転換ハイブリッドアスペン木質におけるＧＴ４３遺伝子の発現レベル。野生型に対する相対的発現（Ｙ軸）。
【図８】転写産物プロファイリング：低減されたＧＴ４３発現レベルを有する形質転換ハイブリッドアスペン木質におけるキシラン生合成遺伝子の発現。キシラン主鎖、グルクロン酸修飾および還元末端オリゴ糖に関与する遺伝子の発現、並びにキシランアセチル化遺伝子の発現。ＷＴ発現と比較した、個々の株（ＢＣ１およびＢＣ２）およびこれら２つの株をまとめたものにおいて発現された遺伝子の倍数変化を示す。平均ｐ値（ｐａｄｊ）を棒グラフのそばに示す。星は、０．１未満のｐ値を示している。
【００４５】
定義
２つの核酸の文脈における「配列同一性」という語句は、配列比較アルゴリズムを用いて、または視覚的検査によって測定した際に最大一致に関して比較しかつ整列した場合に、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、好ましくは８０％または８５％、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを上回る同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指すことができる。同一性とは、本発明においては、１つの遺伝子、２つの遺伝子または遺伝子の一群に個々に適用されることができ、かつその他の遺伝子に適用されることはできず、例えば、問題となる遺伝子に対して、ある遺伝子が７５％相同であり、もう１つの遺伝子が６０％相同であり、さらにはもう１つの遺伝子が９３％相同であることができる。特定の態様において、実質的な同一性とは、少なくとも約１５０の核酸残基の、例えば少なくとも約２００、２５０、３００、３３０、３６０、３７５、４００、４２５、４５０、４６０、４８０、５００、６００、７００、８００の、例えば少なくとも約９００のヌクレオチドの、または例えば少なくとも約１ｋｂ、２ｋｂ、または例えば少なくとも約３ｋｂの核酸配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、核酸配列は対応するコード領域の全長にわたって同一である。
【００４６】
「低減されたキシラン含有量」という用語は、木質から抽出されうるキシランの量に関するものであり、これはキシラン鎖の長さにも関連しうる。
【００４７】
「木質特異的プロモーター」という用語は、主に維管束組織において発現されるプロモーターである。
【００４８】
遺伝子の発現とは、ｍＲＮＡがタンパク質または酵素に翻訳される際のプロセスである。遺伝子発現は、転写開始からＲＮＡプロセシングまで様々なレベルに調節されることができる。発現を低減させることによって、タンパク質または酵素による刺激が低減されることが予想される。この文脈において、「発現の低減」という用語は、遺伝子から転写されるＲＮＡを減少させることを指し、これによって、ほとんどの場合、ｍＲＮＡの量がより少なくなる。この量は、ｍＲＮＡの定常状態レベルであることができる。
【００４９】
発明の詳細な説明
木質形成の研究において、ＲＮＡｉの遺伝的アプローチにより、ＧＴ４３ファミリーにおける全ての遺伝子の発現、または同ファミリーからのこれらの遺伝子の２つまたは３つのクレードの組み合わせの発現を低減させることによって、一連の形質転換ハイブリッドアスペンを作製した。そして予想外にも、これらの形質転換樹木が生長の増加を示し、かつ木質が、弾性率（ＭＯＥ）において認められるような改善された機械的特性、および以前に見られたものとは相反する３点曲げ試験における曲げ強さ（ＢＳ）を示すことが判明した。
【００５０】
これらの形質転換ハイブリッドアスペンからの木質からのリグノセルロースのさらなる試験において、驚くべきことに、そのような樹木のリグノセルロースは、前処理を行わない試験においてより良好な糖化特性を示すことが判明した。
【００５１】
組織特異的プロモーターの特定
高いレベルでの導入遺伝子の組織特異的発現は、ほとんどの場合、その組織の発達の代謝において望ましい変化を誘導するための最良の戦略である。
【００５２】
具体的には、木質の発達において特異的に発現され、かつしばしば用いられるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと同程度かまたはこれよりも良好な機能性を示す組織特異的プロモーターが求められている。
【００５３】
木質の発達において高度の発現を駆動する良好なプロモーターをＧＴ４３遺伝子ファミリーから特定するために、７種全てのＧＴ４３遺伝子の転写レベルを栄養気中組織においてｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、かつ検出を容易にするため、全ての遺伝子からのプロモーターをクローン化することによりＧＵＳ遺伝子を駆動した。形質転換アスペン株を生成させ、かつＧＵＳ発現パターンについて解析した。
【００５４】
木質の発達および師部繊維の発達において、３つのプロモーター、すなわちｐＧＴ４３Ａ、ｐＧＴ４３ＢおよびｐＧＴ４３ＣについてのＧＵＳ活性が認められ、かつ発現パターンは３５Ｓプロモーターと比較してより特異的であった。
【００５５】
全てのＧＴ４３プロモーターの配列を配列表に示す。配列番号２３〜３０における最後の６つの位置は、タンパク質中の２つの最初のアミノ酸に対応している。
【００５６】
ＧＴ４３遺伝子の選択
ＧＴ４３Ａ〜ＧＴ４３Ｇの遺伝子のコード配列は、異なる樹木において異なる長さを有する。ポプラ属においては、この長さは６６６（配列番号６）〜１５３３（配列番号３）の塩基対である。ユーカリ属においては、この長さは１００８（配列番号３７）〜１５０９（配列番号３６）の塩基対である。これらの遺伝子のいずれかからの断片を選択することができ、この断片は、２０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００または１４００〜１５００の塩基長からこれらの遺伝子のコード配列の全長までであってよく、さらに長いこともできる。
【００５７】
ＧＴ４３遺伝子は、キシランを合成する全ての植物において認められる。これらの遺伝子から発現されたタンパク質は、キシラン合成に対して同一の効果を示すことが予想される。
【００５８】
その後、７つ全てのＧＴ４３遺伝子の転写レベルを、形質転換ハイブリッドアスペンの栄養気中組織中でｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。結果を以下の第Ｉ表にまとめる。
【００５９】
【表１】
2016537970.tif 000002
【００６０】
これらのデータに基づき、栄養組織、木部における発現に基づいて各クレードから１つ、すなわち３つのＧＴ４３遺伝子を選択した。木部において高い特異性および／または高い発現レベルを有する遺伝子は、この組織におけるキシラン生合成に大きな影響を与えることが予想される。ハイブリッドアスペンについて、ＧＴ４３Ｂ（クレードＩ）、ＧＴ４３Ｅ（クレードＩＩ）およびＧＴ４３Ｃ（クレードＩＩＩ）を選択した。以下の第ＩＩ表に、本発明により使用されうるユーカリ属からのＧＴ４３遺伝子を示す。
【００６１】
【表２】
2016537970.tif 000003
【００６２】
形質転換樹木の世代
遺伝子発現を低減または阻害しかつ遺伝子機能を調べるために、遺伝的アプローチであるＲＮＡ干渉を用いて形質転換樹木を作製した。ＲＮＡｉコンストラクトは、通常はＲＮＡの発現を増強しかつ標的とするためにプロモーターによって駆動され、これはその後、活性ＲＮＡｉヘアピンを形成する。一般的に使用されるプロモーターは、構成的カリフラワー３５Ｓプロモーターである。
【００６３】
本発明において使用される全てのＧＴ４３  ＲＮＡｉコンストラクトは、３５Ｓプロモーターによって、または新たに特定された特異的な木質プロモーターによって駆動される。本発明においてはいずれのＧＴ４３プロモーターも使用されうるが、他のプロモーターも除外されない。好ましいプロモーターは、ＧＴ４３Ｂ由来のプロモーターである。
【００６４】
コンストラクトとも呼ばれる様々な発現ベクターの１セットを遺伝的に作製した。それらの各々は、ＧＴ４３遺伝子ファミリーから選択された遺伝子からの１つのプロモーター、１つ、２つまたは３つの断片を含む。同一の遺伝子断片を操作により逆方向にクローン化し、このクローン化された遺伝子断片の逆方向反復配列を形成した（図２）。
【００６５】
ＧＴ４３遺伝子のうちの３つ；ＧＴ４３Ｂ、配列番号２；ＧＴ４３Ｃ、配列番号３；およびＧＴ４３Ｅ、配列番号５、並びにそれらの二重（ＧＴ４３ＢＣ、ＧＴ４３ＢＥ、ＧＴ４３ＣＥ）および三重（ＧＴ４３ＢＥＣ）の組み合わせを選択し、これらをＲＮＡｉの標的とした。作製した全てのコンストラクトを構成的カリフラワー３５Ｓ（３５Ｓ）プロモーターまたは木質特異的（ＷＰ）プロモーターに作動可能に連結し、かつハイブリッドアスペン（ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ  ×  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））に形質転換した。
【００６６】
これらのコンストラクトを、一度に１つのクレード、２つのクレードまたは３つ全てのクレードが抑制されるように作製した。逆方向反復配列の７種全てを３５ＳプロモーターまたはＷＰプロモーターのいずれかによって駆動し、これにより１４のコンストラクトが生成され、これらをハイブリッドアスペンクローンＴ８９に移した。これらのコンストラクトについてはさらに、以下の実施例の部において説明する。
【００６７】
これらの１４のコンストラクトで形質転換された形質転換ハイブリッドアスペン株において発現されたＲＮＡを調べ、かつＧＴ４３遺伝子の転写レベルを、コンストラクト１つ当たり３つの株の木質からのサンプルにおいて、それぞれ３つのバイオロジカルレプリケートを用いてｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。結果（第ＩＩＩ表）は様々なコンストラクトによるＧＴ４３遺伝子の転写の低減を示しており、これは野生型レベルの３５〜７５％である。
【００６８】
【表３】
2016537970.tif 000004
【００６９】
様々な発現レベルについての詳細を、図７に示す。
【００７０】
ＷＰ：：ＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株における遺伝子調節ネットワークの解明と、これらの形質転換株において認められる形成層細胞分裂の増加についての説明とを目的として、ＲＮＡの塩基配列決定を用いた木質の発達におけるトランスクリプトーム解析を行った。標的となるＧＴ４３転写産物がＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株において野生型に比べて減少していること（図８）、そして本発明者らのｑＲＴ−ＰＣＲ実験において減少が認められること（図７）が確認された。ＩＲＸ９クレードおよびＩＲＸ１４クレードに属する４つ全ての遺伝子のメンバー、すなわちＧＴ４３Ａ、ＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｄが、ＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉコンストラクトを含む樹木において成功裏にダウンレギュレートされている（図８）。クレードＩＲＸ９−ＬからのＧＴ４３ＥおよびＧＴ４３ＧはＲＮＡ干渉に影響を受けなかった。これにより、ＲＮＡｉコンストラクトの特異性が立証される。キシラン主鎖、還元末端配列形成およびアセチル化に関与するＧＴ４３ファミリー以外のさらなるキシラン生合成関連遺伝子に着目すると、このような遺伝子は概して、野生型に比べＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株において転写レベルが低下した（図８）。
【００７１】
さらに、ＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株における最もダウンレギュレートされた遺伝子の中に、二次細胞壁形成に関連するいくつかの遺伝子、例えばＭＹＢ転写因子、セルロースおよびリグニン生合成遺伝子、並びに糖代謝に関与する遺伝子が存在することが判明した。対照的に、最もアップレギュレートされた遺伝子の中に、本発明者らは、形成層の維持および初期の木部分化に関与する因子を発見した。従って、ＧＴ４３発現の低減によって、細胞壁の生合成機構のダウンレギュレーションと、形成層の機能に関与する調節因子のアップレギュレーションとが生じる。
【００７２】
形質転換樹木の生長
形質転換株の生長を温室実験で評価した。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの１つであるＷＰ駆動型ＧＴ４３ＢＣにおいて生長が予想外に高く、これにより、非形質転換ハイブリッドアスペンと比較して１４０％の体積増加が生じた。この高度の生長の増加は、ユーカリ属、アカシア属およびヤナギ属にも該当することが予想される。
【００７３】
さらに、コンストラクトＧＴ４３Ｃは、植物の高さ、幹直径および体積への影響に関して、プロモーター間で有意な差を示した。ＷＰプロモーターによって駆動されるコンストラクトＧＴ４３Ｃによって、非形質転換ハイブリッドアスペンと比較して１２０％の増加が認められたが、これに対して３５Ｓプロモーターにより駆動される場合にはわずか８５％であった。これら全てのケースにおいて、３５Ｓ駆動型コンストラクトよりもＷＰ駆動型コンストラクトによって生長が刺激された。
【００７４】
木質生成の増加によって、ＷＰプロモーター株を有するコンストラクトＧＴ４３ＢＣにおいて生長の増加が生じるかどうかを調べるために、幹切片を顕微鏡で調べ、かつ髄の半径、木部および樹皮の半径方向の幅を測定した。これらの形質転換株は３つ全ての組織の増加された量を有していたが、木部の厚さにおいて最も高い増加が認められ、これは平均で２２％を上回る増加であった。
【００７５】
形質転換株における木質の機械的特性
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。
【００７６】
キシランが損なわれたポプラ、すなわち減少されたキシラン量を有するポプラは、低減された木質機械的強度を有することが知られている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｒｅｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３１：  ２２６−２３６）。従って、形質転換株の木質を、３点曲げ試験において曲げ弾性率（ＭＯＥ）および曲げ強さ（ＢＳ）について分析した。驚くべきことに、２つの異なる樹木株において試験した場合に、ＷＰプロモーターを有するコンストラクトＧＴ４３ＢＣからの木質は、双方の形質転換株においてＭＯＥがより高く、かつＢＳがより高いことが判明した。これらの改善された機械的特性は３点曲げ試験における曲げ強さによっても裏付けられ、これは野生型と比較して１１〜１８％増加した（詳細については実施例８を参照）。
【００７７】
高弾性率は、試験された材料がより高剛性であって、かつこれを弾性（非永続的に）変形させるのにより多くの力を必要とすることを意味する。一方で、曲げ強さは、破断の瞬間に材料に加えられた力を表す。従って、形質転換樹木における高い曲げ強さは、木質の高レジリエンスを示唆する。
【００７８】
形質転換株における細胞壁の分析
任意の細胞壁変化の性質を調べるために、形質転換株の木質およびＷＴをＦＴ−ＩＲにより分析した。有意な変化は検出されなかった。
【００７９】
形質転換株ＢＣ１、ＢＣ２およびＢＥＣ１の木質並びにＷＴにおける中性および酸性の糖組成を、単糖類組成の変化についてＴＭＳ分析により調べた。大きな変化は検出されなかった。
【００８０】
さらに、木質細胞壁からヘミセルロースを抽出し、これを特にキシランを分析するためにキシラナーゼで消化した。次いで、放出されたオリゴマーをポリアクリルアミド炭水化物ゲル電気泳動（ＰＡＣＥ）により分離し、かつ染色によりシグナルを定量化した。相対キシラン鎖長を、還元末端配列からのシグナルとキシロオリゴマーからのシグナルとの比により決定した。この分析によって、ＷＰプロモーター株を有するコンストラクトＧＴ４３ＢＣにおいて、キシラン鎖長がＷＴと比較して１０％減少していることが明らかになった。
【００８１】
形質転換ハイブリッドアスペン株の糖化分析
ＷＰプロモーターを有するコンストラクトＧＴ４３ＢＣを用いたアスペンの木質の糖化を、２つの異なるアプローチ用いて調べた：（ｉ）前処理なしでの酵素による加水分解、並びに（ｉｉ）前処理およびそれに続く酵素による加水分解。前処理を、高められた温度を用いかつ酸触媒［１％（ｗ／ｗ）硫酸］を添加して行った。単糖類の収率を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定した。形質転換アスペン株は、野生型と比較して改善されたグルコース生成速度および改善されたグルコース収率を示した。
【００８２】
図４に、前処理なしの糖化実験からの結果を示す。図４に、酵素による加水分解後の単糖類の収率（および標準偏差）を示す。これらの結果は、形質転換アスペン（ＢＣ１およびＢＣ２）のグルコース収率の有意な増加を示す（Ｐ≦５％、ｔ検定）。このグルコース収率の増加は、ＢＣ１については２７％に相当し、かつＢＣ２については４０％に相当し、これは予想外に高い。前処理とそれに続く酵素による加水分解からの結果を、図５に示す。野生型と形質転換アスペン（ＢＣ１およびＢＣ２）とを比較した場合に、有意な差は検出されなかった（Ｐ≦５％、ｔ検定）。
【００８３】
総括
これらのデータは、二次壁を形成する細胞において特異的に変化が誘導されることを前提条件として、木本植物におけるキシランの生合成のわずかな減少が植物に数多くの好影響をもたらすことを示している。このことは、遺伝子ＧＴ４３Ｂからの木質特異的プロモーター（ＷＰ）を使用することによって達成される。次のような形質転換ＲＮＡｉ株、すなわち、キシラン合成遺伝子ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３ＣがＷＴの約５０〜６０％にダウンレギュレートされているが、ただしこれはＷＰプロモーターの制御下に二次壁形成組織において特異的であるものとする形質転換ＲＮＡｉ株は、キシロース含有量のわずか約３〜５％の減少、およびキシラン鎖長の約１０％の減少を示した。そのような株は予想外により良好に生長し、３０〜４０％高い幹体積、約３０％増加された弾力率（ＭＯＥ）、および前処理なしでの糖化における約３０〜４０％高いグルコース収率を示した。このようなリグノセルロースの改善されたバイオプロセシング特性の発酵が期待されることができ、これは発酵において有用でありうる。
【００８４】
４つのＧＴ４３メンバー（ＧＴ４３Ａ、ＧＴ４３Ｂ、ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｄ）のダウンレギュレーションによって、成長の増加が引き起こされる
ＩＲＸ９（ＧＴ４３ＡおよびＧＴ４３Ｂ）クレードとＩＲＸ１４（ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｄ）クレードとの双方を標的とするＧＴ４３ＢＣ断片を含むｐＧＴ４３Ｂ駆動型ＲＮＡｉコンストラクトは、他のＲＮＡｉコンストラクトと比較して成長に最も好影響を与えた（図３）。各クレードにおける主要な遺伝子であるＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃの発現レベルは、２つの最良の株であるＧＴ４３ＢＣ１およびＧＴ４３ＢＣ２における野生型レベルのそれぞれ約３５％および５５％であった（図７）。これらの株の植物の高さおよび幹直径は野生型レベルの１０〜２０％増加し、これによって幹体積が５０〜６０％増加した（図６）。また、節間数、節間長および葉のサイズも約１０％増加した。温室内での成長実験を、類似の結果を有する２つのＧＴ４３ＢＣ株１および２について、ランダム化された植物位置で３回繰り返した。
【００８５】
より強力な木質およびより低い密度
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。しかし、そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃの低減された発現レベルを有する形質転換ハイブリッドアスペンの木質の機械的特性を、次のように試験した。キシラン生合成において十分な機能を果たさない植物の公開されている表現型に基づき、本発明者らは、成熟した木質から慎重に作製された試験体における３点曲げアプローチにおいて、木質の機械的強度が低いことを予想していた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。驚くべきことに、本発明者らは、試験されたＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株の木質が、野生型と比較してより高い弾性率とより高い曲げ強さのいずれをも有することを見出した（図５）。高弾性率は、試験された材料がより高剛性であって、かつこれを弾性（非永続的に）変形させるのにより多くの力を必要とすることを意味する。一方で、曲げ強さは、破断の瞬間に材料に加えられた力を表す。従って、形質転換樹木における高い曲げ強さは、木質の高レジリエンスを示唆する。
【００８６】
植物種
他の木質樹木からのＧＴ４３オルソロガス遺伝子の発現が低減される場合、これは、改善された生長、機械的特性および糖化をもたらすことが大いに予想される。
【００８７】
本発明によれば、形質転換樹木は、好ましくは木質樹木または木質種である。有用な一実施形態において、木質樹木は、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、ウォールナット、オーク、アッシュ、ヤナギ、ヒッコリー、カバノキ、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシの木およびスイートガムからなる群から選択されうる広葉樹木である。ヤナギ科ファミリーからの広葉樹木、例えばヤナギ、ポプラおよびアスペン（それらの変種を含む）が特に重要であり、それというのも、これら２つのグループは生長の早い樹木または木質低木の種を含んでおり、これらは特に材木またはバイオ燃料を提供するために生長されるためである。
【００８８】
さらなる実施形態において、木質樹木は、ヒノキ、ベイマツ、モミ、セコイア、ツガ、スギ、トショウ、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイからなる群から選択されうる針葉樹である。
【００８９】
有用な実施形態において、木質樹木は、リンゴ、プラム、ナシ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウおよびイチジクからなる群から選択されうる結実植物である。
【００９０】
実施例
実施例１：ＧＴ４３遺伝子ファミリーからの木質特異的プロモーターのクローン化
木質の発達において高度に発現されるＧＴ４３遺伝子ファミリーからの良好なプロモーターを特定するために、７つ全ての遺伝子の転写レベルを栄養気中組織においてｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。７つ全てのプロモーターおよびＷＰ（配列番号２３〜３０）をクローン化し、かつ３５ＳプロモーターをＧＡＴＥＷＡＹカセットベクターにクローン化し、検出を容易にするためにこれにＧＵＳ遺伝子が続き、それにより８つの異なるコンストラクトが生じた。クローン化されたプロモーターの配列は、配列番号２３〜３０として示されている。
【００９１】
９つのｐＧＴ４３：：ＧＵＳ融合コンストラクトをハイブリッドアスペンにおいて安定的に発現させ、かつ樹齢２カ月の温室生長樹木の幹を、ＧＵＳ活性について組織化学的に分析した。
【００９２】
ＧＴ４３Ａプロモーター、ＧＴ４３ＢプロモーターおよびＷＰプロモーターについての染色が、木部および師部繊維の発達において認められる。対照的に、ＧＴ４３Ｃプロモーター、ＧＴ４３ＤプロモーターおよびＧＴ４３Ｅプロモーターの活性は、師部柔組織中に存在する。それに対して３５Ｓプロモーターの活性は、樹皮において、並びに木質および放射組織細胞の発達において検出された。
【００９３】
コンストラクトＷＰ：：ＧＵＳが最も特異的なプロモーターを有することが判明し、かつこのプロモーターをさらなる研究のために選択した。
【００９４】
遺伝的に木質を変更するためのＷＰプロモーターの有効性を試験するために、ＷＰプロモーターまたは３５Ｓプロモーターのいずれかを使用したＲＮＡｉコンストラクトを、２つの異なる遺伝子ファミリーにおいて作製し、これにより特定のファミリーメンバーをダウンレギュレートした。
【００９５】
実施例２：非形質転換ハイブリッドアスペンにおける７つ全てのＧＴ４３遺伝子の転写レベル
７つ全てのＧＴ４３遺伝子についてのハイブリッドアスペン（ヤマナラシ）の栄養組織における転写レベルを、栄養気中組織においてｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。結果を上記の第Ｉ表にまとめる。
【００９６】
ｍＲＮＡ転写産物の７つ全ての遺伝子を、栄養気中組織においてｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。異なる遺伝子の発現レベルの比較を可能にする正規化されていない発現に基づいて次のことが判明し、すなわち、遺伝子ＧＴ４３ＣおよびＧＴ４３Ｅが木質の発達において最も高度に発現され、これに遺伝子ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ａが続くことが判明した。この組織においては、ＧＴ４３ＦおよびＧＴ４３Ｇの発現は検出されなかった。
【００９７】
高度に発現された遺伝子のうち、次の３つの遺伝子が特に木質、木部およびテンションウッドの発達において発現されることが判明した：ＧＴ４３Ａ、ＧＴ４３ＢおよびＧＴ４３Ｃ。ＧＴ４３ＡおよびＧＴ４３Ｂの発現は、ＧＴ４３Ｃの発現よりも、より木質特異的であった。
【００９８】
実施例３：ハイブリッドアスペンにおける形質転換株
各クレードに関して最も重要な遺伝子の、すなわちクレードＩについてはＧＴ４３Ｂ、クレードＩＩからはＧＴ４３Ｅ、およびクレードＩＩＩについてはＧＴ４３Ｃの、クレード特異的配列を使用して、ＧＴ４３クレードの各々を抑制するように設計されたハイブリッドアスペンにおいて形質転換株を作製した。その後、これらの断片を組み合わせることにより、一度に２つのクレードまたは３つ全てのクレードを抑制した。逆方向反復配列の７つ全ての種類をＣＭＶ３５ＳプロモーターまたはＷＰプロモーターのいずれかにより駆動し、これにより１４のコンストラクトが生じ、これらをクローンＴ８９に移した。
【００９９】
各コンストラクト当たり約２０の独立した株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで事前選別することによって、最も影響を受けた３つの株を選択し、これらをＷＴと一緒に繁殖させ、かつ温室内に植えた。
【０１００】
実施例４：形質転換株の木質におけるＧＴ４３遺伝子の発現の分析
選択された形質転換株の木質における様々なＧＴ４３遺伝子の発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。この分析によって、形質転換株の木質において標的遺伝子の発現が平均でＷＴレベルの３５％〜７５％に減少したこと、そして、コンストラクトにおいて使用されるプロモーターに応じたダウンレギュレーションレベルの差はなかったことが判明した。
【０１０１】
実施例５：形質転換株の成長
形質転換株の成長を温室実験で評価した。それぞれ５つの樹木により表される全ての形質転換株を、温室内で約３カ月間成長させた。形質転換植物およびＷＴ植物を温室の成長室に均一に分配し、かつこの室内の微小環境の影響を排除するためにローテーションを行った。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの全ての効果を考慮すると、３５Ｓプロモーター駆動型コンストラクトは、コンストラクトＢＣにおける葉数および節間長の増加を除いて、成長に影響を与えなかった（第ＩＶ表）。これとは対照的に、ＷＰ駆動型コンストラクトは、コンストラクトＢＣおよびＥＣにおける高さ、コンストラクトＥＣにおける葉数、コンストラクトＢ、ＢＣおよびＥＣにおける幹直径および幹体積を高めた。最大の効果はコンストラクトＢＣにおける体積において観察され、これはＷＴ体積の１４０％に達した。コンストラクトＣは植物の高さ、幹直径および幹体積に対する効果に関してプロモーター間で有意差を示し、かつコンストラクトＥＣは幹直径および幹体積に関してプロモーター間で有意差を示した。これら全てのケースにおいて、成長は３５Ｓ駆動型コンストラクトよりもＷＰ駆動型コンストラクトにより刺激された。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
個々の株における成長のばらつきについても調べたところ、ＷＰプロモーターを用いて作製されたほとんどの株はＷＴよりも優れていた。
【０１０４】
成長効果が経時的に安定していることを保証するため、別個の温室実験を、選択された２つの株であるＷＰ：ＲＮＡｉ  ＧＴ４３  ＢＣ１およびＷＰ：ＲＮＡｉ  ＧＴ４３  ＢＣ２を用いて２カ月間にわたって行った。成長において類似の変化が観察された。
【０１０５】
実施例６：形質転換ポプラにおける木質形成
木質生成の増加によって、ＷＰ：ＲＮＡｉ  ＧＴ４３ＢＣ株における幹直径の増加が生じるかどうかを調べるために、幹切片を顕微鏡で調べ、かつ髄の半径、木部および樹皮の半径方向の幅を測定した。これらの形質転換株は３つ全ての組織の増加された量を有していたが、木部の厚さにおいて最も高い増加が認められ、これは平均で＋２２％であった（第Ｖ表）。顕微鏡で半径方向の幅を幹横断面において測定した。Ｐ値は、ポストＡＮＯＶＡの対比に相当する。
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
実施例７：繊維幅
木部繊維が大きくなることによって木部幅の増加が生じるかどうかを調べるために、形質転換株およびＷＴの木質を離解させ、かつこの繊維を顕微鏡で測定した。これらの株のうちの一方においては繊維幅がわずかに増加し、すなわち株ＢＣ２において７％増加したが、このことは、この株において木部の半径方向の幅が２７％増加したことの要因とはなりえなかった（第Ｖ表および第ＶＩ表を比較）。より大きな木部、すなわち＋１７％の木部を有していたＢＣ１株においては、繊維幅の変化は認められなかった。本発明者らは、形質転換株がより多くの木部細胞を生成し、このことが幹直径の増加の主要因であると結論付ける。形質転換株において、光学顕微鏡法によって木部異常は検出されなかった。
【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
実施例８：形質転換株からの木質の機械的特性
キシランが損なわれたポプラは、低減された木質機械的強度を有することが知られている。従って、形質転換株の木質を、規格ＣＳＮ  ＥＮ  ３８４、標題”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｔｉｍｂｅｒ  −  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅｓ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ”（ｗｗｗ．ｅｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ．ｅｕ／ｃｓｎ−ｅｎ−３８４−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｔｉｍｂｅｒ−ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ−ｏｆ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ−ｖａｌｕｅｓ−ｏｆ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ−ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ−ａｎｄ−ｄｅｎｓｉｔｙ／）により曲げ弾性率（ＭＯＥ）および破壊強さについて、または３点曲げ試験（Ｅｓｔｅｖｅｓ，  Ｂ．  Ｍ，  Ｄｏｍｉｎｇｏｓ，  Ｉ．Ｊ．  ＆  Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ｈ．Ｍ．  ２００８．  Ｈｅａｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｉｎｅ  ｗｏｏｄ．  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ  ３（１），  １４２−１５４）において曲げ強さについて分析した。これによって、双方の形質転換株においてより高いＭＯＥが明らかとなり（第ＶＩＩ表）、かつ双方の株において総合してより高い曲げ強さが明らかとなった（第ＶＩＩＩ表）。パーセンテージは、ｔ検定によるＷＴとの有意な差を％で示したもの（Ｐ≦５％）である。確率値は、ポストＡＮＯＶＡの対比に相応する。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
実施例９：形質転換株における細胞壁の分析
任意の細胞壁の変化の性質を調べるために、形質転換株およびＷＴの木質をＦＴ−ＩＲにより分析した。ＷＰ：ＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉ株とＷＴとの間に有意な変化は検出されなかった（データ示さず）。
【０１１２】
形質転換株ＢＣ１、ＢＣ２およびＢＥＣ１の木質並びにＷＴにおける中性および酸性の糖組成を、ＴＭＳ分析により調べた。大きな変化は検出されなかった。キシロースおよびＭｅ−Ｇｌｃ  Ａにおいてわずかな差が認められ、最大で５％のキシラン含有量の減少が示され、これはＡｒａの減少およびＧｌｃの増加を伴っていた。
【０１１３】
実施例１０：キシラン分析
さらに、ＷＰ：ＧＴ４３ＢＣ  ＲＮＡｉコンストラクトからの２つの樹木株からの木質細胞壁からヘミセルロースを抽出し、かつ特にキシランを分析するためにキシラナーゼで消化した。次いで、放出されたオリゴマーをポリアクリルアミド炭水化物ゲル電気泳動（ＰＡＣＥ）により分離し、かつ染色によりシグナルを定量化した。相対キシラン鎖長を、還元末端配列からのシグナルとキシロオリゴマーからのシグナルとの比により決定した（第ＩＸ表）。この分析によってキシラン鎖長のわずかな減少が明らかとなり、この減少分は、より多くの影響を受けた株ＷＰ：ＧＴ４３ＢＣ２  ＲＮＡｉにおいて、ＷＴと比較して１３％であった。Ｐ値は、形質転換株とＷＴとの対比に相当する。
【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
実施例１１：形質転換株の糖化分析
アスペンの木質の糖化を、２つの異なるアプローチを用いて調べた：（ｉ）前処理なしでの酵素による加水分解（図４）、並びに（ｉｉ）前処理およびそれに続く酵素による加水分解（図５）。前処理を、高められた温度および酸触媒［１％（ｗ／ｗ）硫酸］を用いて行った。前処理後に、前処理液と呼ばれる液体画分を固体残渣から分離した。その後、この固体残渣を酵素調製物を用いて分解した。単糖類の収率（アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースの収率）を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて調べた。
【０１１６】
酸前処理なしでの結果（図４）は、形質転換アスペン（ＢＣ１およびＢＣ２）のグルコース収率の有意な増加（Ｐ≦５％、ｔ検定）を示す。グルコース収率の増加は、ＢＣ１については２７％に相当し、かつＢＣ２については４０％に相当する。酸前処理を行った場合には（図５）、形質転換アスペン（ＢＣ１およびＢＣ２）と野生型とを比較した場合に、有意差は検出されなかった（Ｐ≦５％、ｔ検定）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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