(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞においてUVDEを発現させることを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項２】
UVDEが発現している植物細胞にUV-B照射を行うことを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項３】
UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、請求項１または２に記載の植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法。
【請求項５】
UVDEを発現させた植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
【請求項６】
UV-Bが照射されたUVDEが発現している植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
【請求項７】
UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、請求項５または６に記載のジーンターゲティング法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１０】
ノックアウト植物である、請求項９に記載の形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンであって、任意の遺伝子が改変された形質転換植物体。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料であって、任意の遺伝子が改変された繁殖材料。
【請求項１３】
UVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物における相同組換え促進剤。
【請求項１４】
UVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤。
【請求項１５】
UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、請求項１３または１４に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導することで、植物における相同組換え頻度を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等植物におけるジーンターゲティング効率が極めて低い理由として、高等植物における相同組換え頻度が極めて低いことが指摘されていた。従ってこれまでも相同組換え頻度を向上させるために相同組換えに関与する遺伝子を植物体に導入する試み等（非特許文献１および２）が行われてきたが、顕著な組換え頻度の向上は報告されていない。
【０００３】
アラビドプシスを用いたこれまでの研究において、紫外線（UV-B）の照射によって相同組換え頻度が向上する事、またUV光産物の除去を行うphotolyaseの欠損株においては組換え頻度向上程度がさらに高くなる事が報告されていた（非特許文献３および４）。従って高等植物のUV光産物の除去にはヌクレオチド除去修復（NER）、組換え修復(HR)の関与する事が示唆されていた。
【０００４】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】
Hanin M, Mengiste T, Bogucki A, Paszkowski J. Elevated levels of intrachromosomal homologous recombination in Arabidopsis overexpressing the MIM gene. Plant J. 2000 Oct;24(2):183-9.
【非特許文献２】
Gherbi H, Gallego ME, Jalut N, Lucht JM, Hohn B, White CI. Homologous recombination in planta is stimulated in the absence of Rad50. EMBO Rep. 2001 Apr;2(4):287-91.
【非特許文献３】
Ries G, Heller W, Puchta H, Sandermann H, Seidlitz HK, Hohn B. Elevated UV-B radiation reduces genome stability in plants. Nature. 2000 Jul 6;406(6791):98-101.
【非特許文献４】
Ries G, Buchholz G, Frohnmeyer H, Hohn B. UV-damage-mediated induction of homologous recombination in Arabidopsis is dependent on photosynthetically active radiation. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Nov 21;97(24):13425-9.
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高等植物における相同組換え頻度を向上させる方法を提供することにある。より具体的には、ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導することで、高等植物における相同組換え頻度を向上させる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはUV光産物を認識して一本鎖DNA切断を行うUV Damage Endonuclease（UVDE）をアカパンカビや分裂酵母より発見し、この酵素をNER欠損株のヒトXPA細胞株に導入したところ、XPAの紫外線感受性が回復することを見いだした。このことから、本来NERで修復される損傷が、UVDEによる一本鎖DNA切断とそれに続く複製による2本鎖DNA切断を経て相同組換えにより修復されている可能性が示された。
【０００７】
そこで、本発明者らはUVDEを高等植物において発現させることにより、一本鎖DNA切断を誘起し、結果的に相同組換え頻度を向上させる試みを行った。具体的には、相同組換え頻度を評価するために、組換え基質が導入されたアラビドプシスにおいてアカパンカビUVDE遺伝子を導入したところ、アカパンカビUVDEの発現によって染色体内相同組換え頻度はコントロールと比較して最高45倍まで上昇することが示された。この結果、高等植物においてUVDEを発現させる事により、相同組換え頻度を著しく上昇できることが明らかとなった。
【０００８】
即ち、本発明は、ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導することで、植物における相同組換え頻度を向上させる方法に関し、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕  ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導することを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔２〕  植物細胞においてUVDEを発現させることを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔３〕  UVDEが発現している植物細胞にUV-B照射を行うことを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔４〕  UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、〔２〕または〔３〕に記載の植物における相同組換え頻度を上昇させる方法。
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法により、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法。
〔６〕  ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導した植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔７〕  UVDEを発現させた植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔８〕  UV-Bが照射されたUVDEが発現している植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法。
〔９〕  UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、〔７〕または〔８〕に記載のジーンターゲティング法。
〔１０〕  〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞。
〔１１〕  〔１０〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１２〕  ノックアウト植物である、〔１１〕に記載の形質転換植物体。
〔１３〕  〔１１〕または〔１２〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１４〕  〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１５〕  UVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物における相同組換え促進剤。
〔１６〕  UVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤。
〔１７〕  UVDEがアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、もしくは枯草菌UVDEである、〔１５〕または〔１６〕に記載の促進剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、UV Damage Endonuclease（UVDE）を植物において発現させることにより、一本鎖DNA切断を誘起し、結果的に相同組換え頻度を上昇できることを見出した。これにより、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させることが可能となった。本発明は、この知見に基づくものである。
【００１０】
本発明は、ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導することを特徴とする、植物における相同組換え頻度を上昇させる方法を提供する。このような方法は、植物におけるジーンターゲティング効率を上昇させる方法として利用できる。
【００１１】
本発明における植物としては、好ましくは高等植物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
本発明において、一本鎖DNA切断の誘導方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、UVDEを植物細胞に発現させることで実施できる。
【００１３】
本発明におけるUVDE（UV Damage Endonuclease）とは、紫外線で生じるシクロブタン型二量体、6-4光産物、Dewar型光産物など全てのメジャーなDNA損傷の5'側の3-OHを残すようにニックを入れる酵素を指す。本発明におけるUVDEはまた塩基が無くなった部位（APサイト）を認識して切るAPエンドヌクレアーゼの活性（Shin-ichiro Kanno et al. Nucleic Acids Res. 27, 3096-3103, 1999）も有する。
【００１４】
本発明におけるUVDEとしては、例えば、アカパンカビUVDE（アクセッション番号 D11392、BAA74539）、分裂酵母UVDE（アクセッション番号 D78571、BAA11415）、枯草菌UVDE（アクセッション番号 Z49782、CAA89865.1）が挙げられる。また、これらの配列は、Nucleic Acids Res.(Vol. 24, 1267-1271, 1996)にも開示されている。
【００１５】
本発明においては、アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEと同等な機能を有する蛋白質もまた利用することができる。
【００１６】
アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEと同等な機能を有する蛋白質をコードするDNAの単離方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki et. al., Science 230: 1350-1354, 1985、Saiki et. al., Science 239: 487-491, 1988）を利用して行うことができる。即ち、当業者であれば、アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEをコードするDNAの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の所望の生物からアカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEと高い相同性を有する蛋白質をコードするDNAを単離し、その配列を決定することができる。上記プライマーは、アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEのC末側に存在する高度に保存されている領域（Nucleic Acids Res.(Vol. 24, 1267-1271, 1996)を参照）をコードするDNA配列を基に設計することが好ましい。
【００１７】
別の単離方法としては、アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEをコードするDNAの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって単離する方法が挙げられる。該DNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離したDNAの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。
【００１８】
別の単離方法としては、紫外線損傷の修復欠損の大腸菌や酵母に検索をしたい生物のcDNA libraryを発現させ、紫外線抵抗性になった細胞からその生物種のUVDEを単離する方法が挙げられる。本発明者らは、この方法により、アカパンカビ、分裂酵母のUVDE遺伝子を単離した（Nucleic Acids Res.Vol. 24, 1267-1271, 1996）。
【００１９】
上記PCRやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるDNAにコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、アカパンカビUVDE、分裂酵母UVDE、または枯草菌UVDEのアミノ酸配列と、配列全体で少なくとも36％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を示す。
【００２０】
上記PCRやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるDNAが、UVDEをコードするDNAであるかは、該DNAからコードされる蛋白質の作用により、紫外線を当てたプラズミドにニックが入り、スーパーコイル型からリラックス型に変わるか否かで判定できる（Nucleic Acids Res.(Vol. 24, 1267-1271, 1996）。具体的には、EMBO J. 14, 2393-2399, 1995に記載のように、紫外線損傷、例えば5'末端を32Pで標識した50ヌクレオチドほどの合成DNAの中央にシクロブタン型ピリミジン二量体を入れた基質とその相補鎖をアニールして二本鎖DNAを準備し、測るべき蛋白質を作用させて損傷の部位で切られたかどうかをアクリルアミドゲル上で電気泳動して調べることにより、どこでどのように切られたかの情報を得ることができる。
【００２１】
また、上記PCRやハイブリダイゼーション等の方法によって単離されるDNAが、UVDEをコードするDNAであるかは、配列の相同性からも判定することができる。配列の相同性は、BLASTn（核酸レベル）やBLASTx（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic. Acids. Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２２】
植物細胞におけるUVDEの発現は、上記本発明のUVDEをコードするDNAが挿入されたベクターを植物細胞に導入することで実施できる。このように、本発明のUVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターは、植物における相同組換え促進剤としての用途を有する。また、後述するように、本発明のUVDEをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターは、植物におけるジーンターゲティング効率促進剤としての用途も有する。
【００２３】
植物細胞へのベクターの導入方法としては、当業者に周知の方法、例えばin planta法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、組織培養系を用いたアグロバクテリウム法などを用いる事ができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入DNAを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、葉の切片や花序における細胞などが含まれる。
【００２５】
UVDEを発現させることにより相同組換え頻度が上昇するか否かは、実施例に記載のように組換え基質を用いることで評価することができるが、この方法に限定されるものではない。
【００２６】
また、UVDEが発現している植物細胞に、UV-B照射を行うことによって、UV-B非照射時と比べ相同組換え頻度をさらに上昇させることが可能である。本発明は、このような高効率な方法も提供するものである。
【００２７】
植物にDNA導入を行うと通常外来DNAはゲノム上にランダムに組みこまれる。これに対し、相同組換えを介してゲノム上の特定の部位に外来DNAが組みこまれる場合をジーンターゲティングという。ジーンターゲティングによって特定の遺伝子の機能を破壊する事だけでなく、アミノ酸置換を誘起する変異等を遺伝子に導入する事も可能である。
【００２８】
本発明は、ゲノムDNAに一本鎖DNA切断を誘導した植物細胞に対して、ジーンターゲティングベクターを導入することを特徴とする、ジーンターゲティング法を提供する。本発明のジーンターゲティング法により、例えば、作物から望ましくない遺伝子（アレルゲン遺伝子等）を破壊する事や特定の遺伝子の発現を向上させ作物の生産性の向上や特定の成分を増加させる事が可能になる。本発明のジーンターゲティング法は、例えば、UVDEを発現させた植物細胞に対してジーンターゲティングベクターを導入することで実施できる。また、UVDEが発現している植物細胞にUV-B照射を行った後に、ジーンターゲティングベクターを導入することによって、UV-B非照射時と比べてさらに効率的なターゲティングを行う事も期待できる。ジーンターゲティングベクターはターゲティングを行う所望の遺伝子の配列を有し、かつジーンターゲティングを起こした細胞、個体のみを選抜するドミナントネガティブマーカーを保持しているものが望ましい。また、本発明のターゲティングベクターの骨格となるベクターは、当業者に周知のベクターを使用することができる。
【００２９】
また、本発明は、本発明のジーンターゲティング法により任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞、該形質転換細胞を含む形質転換植物体を提供する。該植物体としては、特定の遺伝子の機能が破壊されたノックアウト植物体や特定の遺伝子にアミノ酸置換を誘起する変異が導入された植物体が挙げられる。また、このような植物体としては、例えば、作物から望ましくない遺伝子（アレルゲン遺伝子等）が除去された植物体、作物の生産性が向上した植物体、および特定の成分が増加した植物体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明における任意の遺伝子が改変された形質転換植物細胞は、例えばUVDEをコードするDNAが挿入されたベクターを植物細胞に導入した後、ジーンターゲティングベクターを導入し任意の遺伝子が改変された細胞を回収することで製造できる。また、当業者は、UVDEをコードするDNAが挿入されたベクターが導入された植物細胞に、UV-B照射を行った後に、ジーンターゲティングベクターを導入し、任意の遺伝子が改変された細胞を回収することもできる。
【００３１】
UVDE遺伝子の発現はジーンターゲティングが実際に生じる組織細胞において行われなければならない。従って形質転換に用いる植物組織において特異的に発現するプロモーターか、あるいは恒常的に発現するプロモーターの下流にUVDE遺伝子を接続しベクターに導入しなければならない。この際アグロバクテリウム法による形質転換の場合はpBI121系やpPZP系等のバイナリーベクターを用い、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等で植物細胞へ導入する場合は通常の遺伝子操作研究に用いるpUC系等のベクターを用いる。また、プロモーターとUVDEの接続やベクターへの導入等は通常の制限酵素やDNAライゲース等を用いる。
【００３２】
以下、本発明の形質転換植物細胞の製造方法を例示するが、該形質転換植物細胞の製造方法は、これに限定されるものではない。
【００３３】
ジーンターゲティングにはまず前述のようにターゲティングを行う遺伝子を保持し、且つジーンターゲティングを生じた細胞、植物体のみを効率的に選抜するマーカー遺伝子を有するジーンターゲティングベクターを構築し、これをアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、in planta法等で植物細胞へ導入する。導入後は遺伝子の導入された細胞をポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現等を利用して選抜すると共に、ジーンターゲティング以外の方法で遺伝子導入された細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現を利用して排除する。ポジティブ選抜マーカーとしてはハイグロマイシン抵抗性遺伝子等の抗生物質抵抗性遺伝子を用いる事ができ、ネガティブ選抜マーカーとしてはジフテリア毒遺伝子、シトシンデアミネース遺伝子等を好適に用いる事ができる。また、ジーンターゲティングがおきた最終的な確認は植物体においてサザン法やPCR法によって行う。
【００３４】
本発明における任意の遺伝子が改変された形質転換植物体は、例えば、本発明の形質転換植物細胞から植物体を再生させることで作製できる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S, et al., Plant Physiol., 100: 1503, 1992）。
【００３５】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作製する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg,G Eds） pp.66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al., Plant Physiol., 100: 1503, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al., Biotechnology 9: 957, 1991）、およびAgrobacteriumを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（例えば、単子葉植物の超迅速形質転換法（特許第3141084号））など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３６】
一旦、任意の遺伝子が改変された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、任意の遺伝子が改変された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）pPKM NcUVDEの構築
アカパンカビ（N. crassa）由来のUV damage endonuclease遺伝子（NcUVDE）(Yajima H, et al., EMBO J, 1995 May 15, 14(10), 2393-2399.)の過剰発現ベクターを作製するために、pCY4B-UVDE (Okano, S., et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 32635-32641.) を鋳型としてプライマーNcUVDE/Nhe (5'-CTCAgCTAgCgAATTCACCATgCCTTCCCgTA-3'(配列番号：１)、下線部分はクローニングのためにデザインしたNhe Iサイトを示した)及びNcUVDE/SnaB I(5'-TCCTACgTAATCACCCgTCAAACTCCCCTTC-3'(配列番号：２）、下線部分はクローニングのためにデザインしたSnaB Iサイトを示した)を用いてPCRを行い、2kbの完全なNcUVDEのコード領域を含む遺伝子断片を増幅した。PCRはKOD Plus (TOYOBO)を用い、次の条件で行った。（50 pg of pCY4B-UVDEP DNA, 15 pmol of NcUVDE/Nhe, 15 pmol of NcUVDE/SnaB I, 5 microL of 10X Buffer, 5 microL of 4 dNTPs, 2 microL of 25mM MgSO4, 5 units of KOD Plus in 50 microL reaction mixture. 95℃, 2min; 30 cycles of (95℃, 15sec; 60℃, 15sec; 72℃, 2min); 72℃, 7min）。増幅したPCR 断片はNhe I及びSnaB I処理し、Nhe I及びSnaB I処理したpMCS5ベクターにクローン化した（pMCS NcUVDE）。塩基配列の確認を行った後、pMCS NcUVDEからNhe I及びHpa I処理により切り出した2kb NcUVDE遺伝子断片をXba I及びSma I処理したpPKMベクター（Hajdukiewicz P., et al., Plant Mol Biol., 1994 Sep, 25(6), 989-994.）にクローン化し、NcUVDE過剰発現のためのバイナリーベクターとした（pPKM NcUVDE、図１）。
【００３８】
（２）アラビドプシスの形質転換
得られたpPKM NcUVDEをエレクトロポレーション法によりAgrobacterium tumefaciens EHA105 へ導入した。pPKM NcUVDEを保持するA. tumefaciens EHA105を用いて、Floral dip法 (Clough, S.J. and Bent, A.F., Plant J, 1998, 16, 735-743.) により、GUS 組換え基質1406系統及び1415系統(Gherbi, H., et al., EMBO rep., 2001, 2, 287-291.)が既に導入されているArabidopsis thaliana を形質転換した。1406系統はGU-USの形でGUSが分断され、1415系統はU'G'-USの形でGUSが分断されている（図２）。得られた形質転換種子は25mg/Lの濃度のカナマイシンを含む0.8% 寒天を固化剤としたMS培地 (Murashige, T. and Skoog, F., Physiol. Plant, 1962, 15, 473-497.) 上に播種し、カナマイシンを含む培地上で生育してきた植物体を、NcUVDE過剰発現植物体の候補として実験に用いた。生育条件は22℃、24時間明所とした。
【００３９】
（３）GUS アッセイ
（２）で得られたカナマイシン耐性植物体の自殖種子（T2種子）をカナマイシンを含むMS寒天培地上に播種し、次世代植物体（T2植物体）を選抜した。発芽後1週間程度で本葉が展開してきた植物体を耐性個体としカナマイシンを含まないMS培地上に移植しさらに2週間生育させた。この植物体約20個体を用いてGUS アッセイを行い、組換えの起こった細胞数を青色のスポットとして数えた。GUSアッセイはSwobodaらの方法 (Swoboda, P., et al., EMBO J., 1994, 13, 484-489.)に従い行った。約20個体の植物体を50 mLのGUS染色液(100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 0.7 mM X-Gluc, and 20% methanol) に浸積し、37℃で48時間反応させた。反応終了後GUS染色液を捨て去り、メタノールを用いてクロロフィルを取り除き、植物体上の青色スポットを実体顕微鏡を用いて数えた。コントロールとして形質転換に用いた1406及び1415植物体についても同様の実験を行った。
【００４０】
[実施例１]
組換え修復活性を評価するために、組換え基質が導入されたアラビドプシスにおいてNcUVDE遺伝子を発現させた。ここで、組換え基質とは、レポーター遺伝子GUS遺伝子を一部重複させて分断したものであり、一部重複した部分を利用して相同組換えが起これば機能的なGUS遺伝子が作られ、組換えが生じた細胞はGUS基質を与える事により青く染まる（図２）。
【００４１】
NcUVDE過剰発現バイナリーベクターpPKM NcUVDEを作製し、GUS recombination substrate lines 1406, 1415を形質転換した結果、７系統の1406-NcUVDE過剰発現植物体の候補（1406/UVDE-2, 3, 4, 5, 6, 8, 10）と18系統の1415-NcUVDE過剰発現植物体の候補（1415/UVDE-1〜10, 12〜19）を得た。これらのT2世代の植物体を用いてWestern blotting解析を行い、NcUVDEの発現を確認した。これらの植物体の内1406/UVDE-2, 3, 4, 5,10を用いてGUSアッセイを行い、相同組換えの頻度を青色のスポットとして数えたところ、顕著な相同組換え頻度の上昇が認められた（表１）。
【００４２】
【表１】
0004312478.tif 000002
【００４３】
特に1406/UVDE-10ではコントロールと比べ45倍の組換え頻度の上昇が認められた。このことからNcUVDEはアラビドプシスゲノムDNA上に存在するUV光産物（CPD及び6-4 光産物）またはAPサイトを認識し１本鎖DNA切断を形成し、さらにDNA複製過程において２本鎖DNA切断が生じ、結果的に相同組換えによる２本鎖DNA切断修復機能を上昇させたと考えられる。また、上記の植物体にUV-B照射を行いより多くの光産物を生じさせることによって、定常状態よりも多くの１本鎖DNA切断を誘発することが可能であると考えられ、UV-B非照射時と比べ相同組換え頻度をさらに上昇できると考えられる。
【００４４】
従って高等植物においてNcUVDEを発現させる事により、組換え修復に対する依存度を著しく高める事が可能であると判明した。この知見は高等植物においてジーンターゲティングを行う際直ちに適用可能であると考えられる(図３）。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、植物細胞において、標的とする改変対象遺伝子のみを高効率で置換できるようになった。この手法を活用することにより、アレルゲン遺伝子の特異的不活性化、耐病性や除草剤耐性の付与、高必須アミノ酸含量を高めた蛋白質の生産等が、種々の作物において可能になると考えられる。また本発明は、遺伝子組換え作物において標的とする既知の植物遺伝子以外は改変しないため、消費者により受け入れられやすく、かつ安全性の高い組換え作物を供給可能となり、植物バイオテクノロジーの発展に寄与できると期待される。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pPKM NcUVDEの構築を示す図である。
【図２】  GUS遺伝子組換え基質を示す図である。
【図３】  UVDE酵素の作用機作と、同酵素の植物細胞における過剰発現の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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