(57)【要約】【課題】サラシア組成物、それを投与することによる治療方法及びその製造方法の提供。【解決手段】本開示のサラシア組成物は、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理する。本開示のサラシア組成物は、抽出物である該組成物の重量に対して、少なくとも、１２重量％のポリフェノール類と、２重量％のマンギフェリンと、１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する。上記組成物は、食品用非水性溶媒を用いて連続溶媒抽出することにより得られる。本開示のサラシア組成物は、投与を必要とする対象に有効量投与した場合、食欲を通常の食物量より約１８％抑制する。このように、エネルギー摂取の抑制と、ホルモン感受性リパーゼの活性化と、コレステロール代謝に関与するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害とが相乗的に組み合わさることによって、健全な脂質プロファイルを効果的に管理することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有するサラシア組成物であって、食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持する活性を示す組成物。
【請求項２】
抽出物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記抽出物は、その重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとから本質的になる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記抽出物は、サラシアの地上部、地表部、地下部及び／又はそれらの混合物を溶媒抽出して得られる、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
上記抽出物は、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）及び／又はサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）の茎、葉、根及びそれらの混合物から製造される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
上記抽出物は、食品用非水性極性溶媒を使用して得られる、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
上記食品用非水性極性溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、アセトン又はそれらの混合物から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記食品用非水性極性溶媒はエタノールである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記抽出物を得るのに使用される上記食品用非水性極性溶媒に対するサラシア植物の重量体積比は、１：２〜１：３０である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する方法であって、有効量のサラシア組成物を投与を必要とする対象に投与することを含み、
上記組成物は、その重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有するものである、方法。
【請求項１１】
投与を必要とする対象に投与した場合、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
投与を必要とする対象に投与した場合、ＩＣ５０値４００μｇ／ｍｌ以上でＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
投与を必要とする対象に投与した場合、食物摂取量を抑制することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
投与を必要とする対象に投与した場合、糞便中脂肪排泄量を増加させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
組成物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する新規サラシア組成物の製造方法であって、
上記組成物は、食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、健全な脂質プロファイルを管理するものであり、上記方法は、
（ｉ）サラシア植物部位を乾燥及び粉砕する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の上記植物部位と食品用非水性極性溶媒とを高温で撹拌する工程と、
（ｉｉｉ）上記系の上記食品用非水性極性溶媒を濾過する工程と、
（ｉｖ）上記植物部位と食品用非水性極性溶媒とを高温で再撹拌する工程と、
（ｖ）上記食品用非水性極性溶媒を濾過する工程と、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）及び工程（ｖ）で得られた濾液を合わせ、蒸発させて、サラシア組成物を抽出物として得る工程と、
（ｖｉｉ）得られた抽出物を食品用溶媒で分画して更に精製する工程とを含む方法。
【請求項１６】
上記植物部位は、サラシア植物の地上部、地表部、地下部及びそれらの混合物から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記植物部位は、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）及び／又はサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）の茎、葉、根及びそれらの混合物から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記食品用非水性極性溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、アセトン及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記食品用非水性極性溶媒に対する上記植物部位の重量体積比は、１：２〜１：３０である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
上記食品用非水性極性溶媒はエタノールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
上記植物部位は、周囲温度〜約８５℃の高温で上記食品用非水性極性溶媒と撹拌される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
サラシア組成物、その製造方法及びそれを用いた治療方法を開示する。該サラシア組成物は、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理する。本開示のサラシア組成物は、抽出物である該組成物の重量に対して、少なくとも、１２重量％のポリフェノール類と、２重量％のマンギフェリンと、１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する。上記組成物は、食品用非水性溶媒を用いて製造されたものであり、投与を必要とする個体に有効量で投与した場合、著しく食欲を抑制する。サラシア組成物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害し、ホルモン感受性リパーゼを活性化することによって健全な脂質プロファイルを管理する。本開示の新規サラシア組成物は、食用として安全であり、従来の設備を用いて経済的な方法で製造され、脂質代謝に関与する酵素を制御して健全な脂質プロファイルを管理するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
エネルギーの摂取量と消費量の不均衡が生じると、体重が過剰に増加して、若年成人においては脂質異常症や心血管疾患を発症する。エネルギー摂取量は食物摂取量と直接的に相関しており、体が必要とする量よりも多くの食物を摂取すると、エネルギー利用のバランスが乱れる。肥満が原因で罹患率及び早期死亡率が高くなるのは明らかであり、この問題は、先進国及び発展途上国において最も急速に拡大している最大の医療及び公衆衛生問題として広く認識されている。成人における当該疾患の有病率は、過去１０年間で３倍以上になっており、現在、アメリカ合衆国では人口の約３０〜３５％、英国では約２５％に影響を及ぼしている。肥満と疾患リスクとの関係は幼少期に始まり、調査結果によれば、肥満の人や脂質プロファイルに異常がある人には高血圧や冠動脈の脂肪沈着も見られる。このような主な併存疾患としては、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧症、脂質異常症、心筋梗塞、脳卒中、特定の癌、睡眠時無呼吸及び変形性関節症が挙げられる。これらの知見は、おそらく国民全体の傾向を反映していると考えられ、間違いなく、上記患者を適時治療して更なる体重増加を防止したり、減量したりして脂質プロファイルを管理するためにより一層着目すべきである。
【０００３】
指導したり、肥満の原因となる環境を変えたりすることで予防することが長期的な目標ではあるが、既に肥満である人には、体重及び脂質プロファイルを管理する治療が必要である。しかしながら、驚くべきことに、治療の選択肢は非常に限られたままである。食事制限及び／又は運動によって生活習慣を変えたとしても、通常それだけでは体重及び脂質プロファイルを顕著に又は持続的に管理できない。よって、体重管理及び脂質プロファイル管理には、合成医薬品としての薬の使用が重要になってくる。脂質管理に現在利用できる選択肢としてスタチン類があり、これらは、低比重リポタンパク質コレステロール、総コレステロール及びトリグリセリドを減少させ、高比重リポタンパク質コレステロールをわずかに増加させる。しかしながら、このような医薬品を長期間投与すると、腎毒性、肝毒性及び筋肉痛が生じるため、このような副作用によって患者の服薬コンプライアンスが妨げられる。体重を管理するための更なる治療法としては、アンフェタミン誘導体、オルリスタット、シブトラミン、リモナバン及び他の複合薬があるが、これらは心血管リスク、肺高血圧症及び乱用の可能性に関連する副作用を示すため、長期間の使用が制限される。そのため、より良い代替品として、健全な脂質プロファイルを管理するとともに、食欲に対処し、体重を維持する天然由来の薬剤などが求められている。サラシアは、インド西部やスリランカの雨林に生息する大型の木本性つる植物である。該植物のうち健康に良いとして主に知られている２種類が、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）とサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）であるが、他にも、サラシア・フィンブリセパラ（Ｓａｌａｃｉａ  ｆｉｍｂｒｉｓｅｐａｌａ）、サラシア・マンバ（Ｓａｌａｃｉａ  ｍａｍｂａ）、サラシア・ミーゲイ（Ｓａｌａｃｉａ  ｍｉｅｇｅｉ）、サラシア・ペテネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｐｅｔｅｎｅｎｓｉｓ）、サラシア・キネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）等が存在する。今日まで、サラシアは、糖尿病、代謝疾患、便秘、皮膚病、細菌感染症、胆汁酸調節などの様々な病状の治療における使用や、栄養補助食品としての使用が評価されており、公知である。一般にサラシア抽出物は、水性溶媒系、有機溶媒系又は混合溶媒系を用いて根及び地上部から得られ、特に糖尿病の管理に有用である。このようなサラシアの抽出法や健康用途の評価に関するいくつかの特許文献及び研究出版物がある。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６及び特許文献７等には、α−グルコシダーゼ酵素阻害のメカニズムを用いてサラシア抽出物により糖尿病を治療することが記載されている。
【０００４】
特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４及び特許文献１５は、サラシア抽出物と他の植物抽出物とを併用して相乗効果により糖尿病や他の代謝疾患を治療することに関する。
【０００５】
また、いくつかの非特許文献には、サラシアによっていくつかの病気を治療することが記載されている。マンギフェリンは、サラシア種の主要成分の１つであり（非特許文献１）、血清グルコース量の増加を阻害することが示されている強力なα−グルコシダーゼ阻害剤であると報告されている（非特許文献２）。正常マウスにサラシア・レティキュラータ（Ｓ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の茎の水抽出物を投与すると、肥満が抑制されたため、２型糖尿病を含む関連疾患のリスクを抑制できる可能性がある（非特許文献３）。しかしながら、これらの文献は、肥満の管理においてサラシアの非水抽出物が食物摂取量や食欲に及ぼす効果については教示していない。
【０００６】
根皮から調製したサラシア・レティキュラータ（Ｓ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の水抽出物をストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットに経口投与すると、サラシア・レティキュラータ（Ｓ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）による血糖降下作用が示された（非特許文献４）。このような生薬の従来の抗糖尿病特性は、腸管内のα−グルコシダーゼ阻害活性によるものである（非特許文献５）。非特許文献６では、サラシア・レティキュラータ（Ｓ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の根の水抽出物によって、雌Ｚｕｃｋｅｒラットの体重増加が抑制されたことが確認されている。これらの文献は全て、サラシアの水抽出物に関するものであるが、いずれの文献も、該抽出物が食欲やＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害に及ぼす効果に関するものではない。
【０００７】
特許文献１６は、サラシアの抽出生成物、バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｅａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）の抽出生成物、フレンチマリタイムパインバークの抽出生成物、プテロカルプス・マルスピウム（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）の抽出生成物及びムラサキフトモモ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ  ｃｕｍｉｎｉ）の抽出生成物を含有する栄養補助食品に関するものであり、該組成物は、投与対象の健康増進及び体重減少の促進に効果的な量で投与される。
【０００８】
特許文献１７は、肥満患者を治療するための医薬組成物に関するものであり、該医薬組成物は、それぞれ有効量の（１）イワベンケイ（Ｒｈｏｄｉｏｌａ  ｒｏｓｅａ）抽出物と、（２）バナバ葉抽出物と、（３）ガーデニア・フラクタス（Ｇａｒｄｅｎｉａ  ｆｒｕｃｔｕｓ）抽出物、りんご抽出物、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）抽出物及びそれらの混合物からなる群から選択される抽出物とから本質的になる。本文献は、サラシアとともに様々な植物を含む組成物の相乗効果を開示している。
【０００９】
特許文献１８は、サラシア属植物の抽出物とフラボノイドを含有し、肥満、食後血糖値の上昇及び脂肪を抑制する食品に関する。特許文献１９は、α−グルコシダーゼ活性阻害剤組成物と脂質合成阻害成分とを含む体重増加抑制組成物を提供する。上記α−グルコシダーゼ活性阻害剤は、サラシア属植物、トウチ及び桑から選択される少なくとも１種の植物に由来し、上記脂質合成阻害成分は、大豆ペプチド、海洋動物性ペプチド及びゴマリグニンから選択される。これらの特許文献では、α−グルコシダーゼ阻害剤としてのサラシアと、α−グルコシダーゼ及び脂質合成酵素を阻害することよって体重増加を制御するフラボノイドや大豆等の他の植物成分とを併用することに着目している。しかしながら、食欲やＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害に対するサラシア単独での効果に関する研究はない。
【００１０】
特許文献２０は、食欲の抑制、満腹感の増進、炭水化物の代謝分解抑制及び炭水化物の吸収抑制を一緒に同時に行うことによって体重減少を促す栄養組成物に関するものであり、該組成物は、それぞれ有効量の桑葉抽出物と、ピノレン酸と、サラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）抽出物とを含有する。
【００１１】
特許文献２１は、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）から調製したα−アミラーゼ阻害剤と、サラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）等から得られたα−グルコシダーゼ阻害剤との併用に関する。上記α−アミラーゼ阻害剤には、食事に含まれるでんぷん由来のグルコース量を減少させる多量のレクチンが添えられており、繰り返し投与することで食欲を大幅に抑制する。サラシア抽出物やサラシアに含まれるチオ糖等のα−グルコシダーゼ阻害剤と併用することで、相乗的な作用により血糖が更に低下し、その結果、炭水化物からの脂肪合成が低下する。
【００１２】
特許文献２２は、レティキュラノールを含有するサラシアから調製された水抽出物に関するものであり、血糖値の制御に効果的であり、結果として糖尿病患者の肥満を予防するのに効果的である。
【００１３】
特許文献２３は、ムードエンハンサーと、インスリン減量剤（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｐａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と、末梢エネルギー遮断薬（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂｌｏｃｋｅｒ）とを含む肥満治療用組成物に関するものであり、上記ムードエンハンサーは、イノシトール、イワベンケイ（ｒｈｏｄｉｏｌａ  ｒｏｓｅａ）、マグネシウム及び亜鉛を含有し、上記インスリン減量剤は、ベルベリン、バナバ葉及びイノシトールを含有し、上記末梢エネルギー遮断薬は、リパーゼと、サラシア等のグルコシダーゼ阻害剤との混合物を含有する。上記組み合わせは、肥満の訴え（ｏｂｅｓｉｔｙ  ｃｌａｉｍ）に対してＢＭＩを低下させ、体重を減少させると評価されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第８２４１６７７号明細書
【特許文献２】米国特許第８３３７９１１号明細書
【特許文献３】欧州特許第２０５４０７０号明細書
【特許文献４】欧州特許第２３９７０３９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２−０１００２４８号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２−０００４１９０号明細書
【特許文献７】国際公開第２００８−１３６０１３号
【特許文献８】国際公開第２００１−７２３１６号
【特許文献９】国際公開第２００８−１４２７０２号
【特許文献１０】国際公開第２０１２−０２４２７０号
【特許文献１１】米国特許第７５５３５０２号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１４−０１８６４６６号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１１−０２３６４８８号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００９−０２６３５０５号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００８−０１０２１４４号明細書
【特許文献１６】米国特許第８１１４４４５号明細書
【特許文献１７】米国特許第８４２０１３１号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１０−０２４７５０１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１２−０２７６０８１号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００８−０２４１２９２号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００８−０２２００９８号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００７−００３７８７０号明細書
【特許文献２３】国際公開第２０１３／０１６７４２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｉら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７５：１７３５〜１７４６、２００４
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、薬学雑誌  １２３：８７１〜８８０、２００３
【非特許文献３】Ｉｍら、２００８
【非特許文献４】Ｓｅｒａｓｉｎｇｈｅら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２０５〜２０６、１９９０
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｄａら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２０５〜２０６、２００２）
【非特許文献６】Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ  Ｎｕｔｒ．１３２：１８１９〜１８２４、２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
サラシア組成物は、根や地上部を水抽出、水アルコール抽出又はメタノール抽出することで作製されており、その健康上の利益は主に糖尿病患者の血糖を低下させる点である。血糖を低下させて糖尿病を効果的に管理する製品が数多く市販されている。血糖降下特性のメカニズムは解明されており、サラシア抽出物の特定の成分が、酵素であるα−グルコシダーゼを阻害することによって糖摂取量を抑制することが分かっている。また、サラシアの相乗効果を他の天然物と組み合わせて、肥満治療などの様々な用途に用いられている。上記抽出物のなかには、非食品用のエーテル、クロロホルム、メタノールなどの溶媒が用いられているため、栄養補助食品としては有用でないものもある。しかしながら、上記文献はいずれも、著しく体重を減少させたり、体重増加を防止したりし得るという、サラシアが脂肪の合成又は分解に関与する酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素等）に及ぼす効果や、食欲に及ぼす効果に関するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
出願人は、本開示のサラシア組成物に関して鋭意研究を行い、驚くべきことに、非水性溶媒を用いて製造したサラシア抽出物が、ポリフェノール類と、マンギフェリンと、２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを特定の重量パーセントで組み合わせた新規組成物となることを見出した。該組成物は、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理する。これらの効果は、脂質異常症や血管のトリグリセリド沈着などの病気にかかりやすく、冠動脈疾患になりやすい肥満者にとって非常に重要である。本開示のサラシア組成物は、食用として安全であり、著しく体重増加を遅延させ、食物摂取量を抑制し、脂肪体の塊を減少させ、糞便中脂肪排泄量を増加させることにより、総合的な体重管理に貢献した。本開示のサラシア組成物は経済的な方法で製造され、抽出に用いた溶媒が栄養補助食品用途として安全である。該組成物は、冠動脈性心疾患及び関連する心血管合併症の予防及び治療に有用である。
【００１８】
一実施形態において、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理するサラシア組成物が開示される。
【００１９】
一実施形態において、本質的に抽出物であるサラシア組成物は、該抽出物組成物に対して特定の重量パーセントのポリフェノール類と、マンギフェリンと、２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとからなる。
【００２０】
一実施形態において、組成物は、該抽出物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノールと、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとからなる。いくつかの実施形態において、組成物は、該抽出物の重量に対して１２重量％又は約１２重量％のポリフェノールと、２重量％又は約２重量％のマンギフェリンと、１重量％又は約１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する。
【００２１】
一実施形態において、サラシア抽出物組成物は、食品用の非水性溶媒を用いて特定の抽出法により製造される。
【００２２】
一実施形態において、有効量のサラシア組成物を投与を必要とする個体に投与することを含む治療方法が開示される。上記投与を必要とする個体としては、脂質異常症を患い、冠動脈性心疾患のリスクがある肥満者又は過体重者が挙げられる。
【００２３】
一実施形態において、特にコレステロールの生合成に関与する酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することによって、健全な脂質プロファイルを維持しやすくする組成物が開示される。
【００２４】
一実施形態において、ホルモン感受性リパーゼを活性化することによって著しい脂肪分解活性を示すサラシア組成物が開示される。特に、いくつかの実施形態において、ホルモン感受性リパーゼのリン酸化によって脂肪分解による実質的な体重減少を引き起こすサラシア組成物が提供される。
【００２５】
一実施形態において、著しく体重増加を遅延させ、脂肪体の塊を減少させ、糞便中脂肪排泄量を増加させることにより、総合的な体重管理に貢献するサラシア組成物が提供される。
【００２６】
一実施形態において、著しく食欲を抑制し、したがって著しくエネルギー摂取量を抑制することにより、通常食又は高脂肪食による体重増加を防止するサラシア組成物が提供される。
【００２７】
一実施形態において、経済的に製造され、栄養補助食品として安全であり、冠動脈性心疾患及び関連する心血管合併症のリスクを抑制することによって、体重及び健全な脂質プロファイルを管理するためのサラシア組成物が提供される。
【００２８】
サラシア組成物、その製造方法及びそれを用いた治療方法は、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理する。上記組成物は、食品用溶媒系を用いてコスト効率のよい抽出法により抽出物として製造される。上記組成物は、該組成物の重量に対して、少なくとも、約１２重量％のポリフェノール類と、約２重量％のマンギフェリンと、約１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとからなる。本開示のサラシア組成物は、有効量で投与した場合、例えば著しく食欲を抑制する効果を示す。上記組成物は、ホルモン感受性リパーゼを活性化することで脂肪分解を増加させ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することで健全な脂質プロファイルを管理する。食欲の抑制及び脂質代謝に関与する酵素の制御という相乗効果によって、上記組成物は、健全な脂質プロファイルを管理すると同時に、肥満者等の体重管理を行う上で有用となる。本開示のサラシア組成物は、食用として安全であり、著しく体重増加を遅延させ、食物摂取量を抑制し、脂肪体の塊を減少させ、糞便中脂肪排泄量を増加させることにより、冠動脈性心疾患及び関連する心血管合併症の抑制に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１で得られたサラシア組成物の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）フィンガープリント画像を示す。
【図２】サラシア組成物が膵リパーゼに及ぼす効果を示すグラフである。
【図３】サラシア組成物がα−グルコシダーゼ酵素に及ぼす効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書に記載されるサラシア組成物、その製造方法及びその投与による治療方法は、例えば、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理する。
【００３１】
本明細書において、「サラシア組成物」とは、サラシア属植物の地上部、地表部又は地下部から抽出されるもののことをいう。該抽出物は食品用非水性溶媒を用いて製造されるため、食用として安全である。上記組成物は、該組成物に対して特定の重量パーセントのポリフェノール類と、マンギフェリンと、２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとからなる。いくつかの実施形態において、上記組成物は抽出物の形態であり、ポリフェノール類と、マンギフェリンと、２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとが上記抽出物に対して特定の重量パーセントで存在する。
【００３２】
本明細書において、「約」とは、例えば整数、分数及び百分率を含む明確に示されていてもいなくてもよい数値のことをいう。「約」は、通常、記載された値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と当業者がみなすであろう数値範囲（例えば、記載された値の＋／−５〜１０％の値）のことをいう。場合によっては、「約」は、有効桁数で四捨五入した数値を含んでいてもよい。
【００３３】
「食欲の抑制」とは、一定期間にわたって個体に有効量のサラシア組成物を投与した際に見られる効果をいい、その結果、通常の食事に比べて食物摂取量が抑制される。この効果は、過食による肥満傾向の個体に有益である。食欲が抑制されると、エネルギー摂取量が抑制されやすくなる。
【００３４】
さらに、「健全な脂質プロファイル」とは、個体の血中脂質量をいい、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、総コレステロール及びトリグリセリドの量に関するものである。ＬＤＬは悪玉コレステロールとして、ＨＤＬは善玉コレステロールとして知られている。ＬＤＬは冠動脈に沈着することにより、アテローム性動脈硬化及び関連する冠動脈性心疾患を引き起こす。ＨＤＬは血管に脂肪が沈着するのを妨げることから、健全な脂質プロファイルのためにはＨＤＬ量がより多いことが望ましい。食べる量が多い傾向の個体ほど、エネルギーが不均衡となり、肥満になる傾向があり、またＬＤＬ及びトリグリセリドの量が増加して脂質異常症を発症する傾向がある。食物摂取量を抑制するとともに、健全な脂質プロファイルを管理するためには、このような病状の治療が必要である。
【００３５】
本開示のサラシア組成物を投与を必要とする個体に有効量で投与すると、著しい食物摂取量の低下、ホルモン感受性リパーゼの活性化及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害という効果が見られる。また、上記組成物は、膵リパーゼ及びα−グルコシダーゼ酵素を阻害することも分かっている。
【００３６】
本明細書において、「有効量」とは、投与を必要とする個体に特定の期間にわたって投与した際に望ましい有益な結果が得られるサラシア組成物の量をいう。これに関して、上記投与を必要とする対象又は個体とは、脂質異常症を患う過体重者又は肥満度指数（ＢＭＩ）が高く、肥満傾向にある者である。このように脂質プロファイルに異常があり、高体重の個体は、心筋梗塞、虚血性心疾患及び心停止のリスクが高い。
【００３７】
Ｉ．サラシア組成物の製造
一実施形態によると、サラシア組成物は、乾燥させたサラシア属植物部位を用いて非水性溶媒で抽出する方法により製造される。
【００３８】
一実施形態によると、新規サラシア組成物の製造方法は、サラシア植物の地上部、地表部又は地下部を乾燥及び粉砕し、サラシア植物部位を食品用非水性極性溶媒と周囲温度〜高温で撹拌し、上記非水性溶媒を濾過することからなる。濾過後に残ったサラシア植物材料は、再び、高温になるまで食品用非水性溶媒と撹拌し、上記非水性溶媒を再び濾過して系から除く。濾液を合わせ、蒸発させて、サラシア組成物を抽出物として得る。別の実施形態よれば、各種サラシア植物として、例えば、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、サラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、サラシア・フィンブリセパラ（Ｓａｌａｃｉａ  ｆｉｍｂｒｉｓｅｐａｌａ）、サラシア・マンバ（Ｓａｌａｃｉａ  ｍａｍｂａ）、サラシア・ミーゲイ（Ｓａｌａｃｉａ  ｍｉｅｇｅｉ）、サラシア・ペテネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｐｅｔｅｎｅｎｓｉｓ）、サラシア・キネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）等が挙げられる。
【００３９】
一実施形態において、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）及び／又はサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）は、抽出上好ましい品種である。いくつかの実施形態では、サラシア組成物を得るために、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の乾燥した根が選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の乾燥させて粗く粉砕した植物部位を食品用非水性極性溶媒で抽出することにより、組成物を得る。この組成物は食用として安全である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の根を、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、アセトン等の食品用非水性溶媒又はそれらの混合物で抽出する。別の実施形態において、上記溶媒はエタノールであることが好ましく、サラシアと溶媒との重量体積比が、例えば１：２又は約１：２〜１：３０又は約１：３０で使用される。一例として、重量体積比が１：２である場合、例えば、サラシア部位（例えば根）１００ｇｍに対して溶媒（例えばエタノール）２００ｍｌであってもよい。
【００４２】
例えば粉末状のサラシア乾燥根を溶媒と混合し、周囲温度〜８５℃の高温で２〜１６時間撹拌する。その後、ブフナー漏斗等を使用して真空下で上記溶媒を濾過する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、残ったサラシア根は、周囲温度〜高温で撹拌することによって適当な体積のエタノールで再抽出できる。これらの抽出工程で得られた濾液を合わせ、サラシア抽出物の乾燥粉末を得る処理を行って、サラシア組成物を得る。
【００４４】
ＩＩ．サラシア組成物の特性評価
一実施形態において、抽出物であるサラシア組成物の特性評価を行って、該抽出物組成物を構成する成分を特定する。好適な溶媒系を使用してサラシア組成物の分画を行う。一実施形態において、極性溶媒及び非極性溶媒の系を用いて、サラシア組成物を各画分に分離できる。サラシア抽出物の分画工程で用いる溶媒は、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、エタノール、ジクロロメタン、メタノール、水及びそれらの混合物等からなる群から、好ましくは、アセトン、エタノール、ジクロロメタン及びイソプロピルアルコール、より好ましくはジクロロメタン及びイソプロピルアルコールから選択してもよいが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、サラシア抽出物の分画に使用できる非極性溶媒としては、石油エーテル（低沸点）、石油エーテル（高沸点）、ヘキサン等又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態において、上記工程で使用できる極性溶媒としては、イソプロピルアルコール、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリル又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
適当な溶媒で処理して得られた画分を合わせ、適当な手法で精製することにより、濃縮成分が得られる。これらの成分は、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、シリカゲルを使用した高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）等の様々な分析手法で特定できる。このように特定することで、サラシアの化学組成を理解できる。
【００４６】
ＩＩＩ．サラシア組成物のインビトロ試験
本開示の組成物は、体重管理及び脂質管理を必要とする個体に該組成物を有効量で経口投与することを含む本開示の方法に従って用いてもよい。
【００４７】
これらの有益な効果は、体の代謝に関与する特定の酵素を活性化及び阻害することによって達成できる。上記組成物は、著しく食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理しやすくする。
【００４８】
上記方法は、特に、高脂血症患者、２型糖尿病患者、過体重者又は肥満者、耐糖能異常者、冠動脈性心疾患のリスクがある個体の他、それ以外の体重や血中脂質を制御することによって恩恵を受け得る個体に有用である。このような恩恵は全て、本開示の方法及び組成物によって達成できる。
【００４９】
本開示の方法に従って、サラシア組成物が脂肪代謝に関与する酵素に及ぼす効果をインビトロで試験する。本試験は酵素アッセイにより行う。本試験で検討する酵素としては、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ホルモン感受性リパーゼ、膵リパーゼ等が挙げられる。
【００５０】
一実施形態では、サラシア組成物を試験して、そのＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ）還元酵素に対する活性を評価できる。この酵素は、コレステロールや他のイソプレノイドを体内に産生する代謝経路であるメバロン酸経路の律速酵素である。この酵素を阻害することによって、コレステロールの過剰産生を防いで健全な脂質プロファイルを維持しやすくすることが可能である。
【００５１】
ホルモン感受性リパーゼは、脂肪組織における脂肪の分解に関与する酵素である。この酵素がリン酸化という形で活性化されると、その結果、脂肪の分解量が増加し得る、すなわち著しい脂肪分解が起こる。
【００５２】
これら両酵素に対する活性について本開示のサラシア組成物を評価することができ、著しくホルモン感受性リパーゼの活性化を高め、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することが分かっている。また、脂肪分解メカニズムによってトリグリセリドをグリセロール及び遊離脂肪酸に分解する分解能について上記組成物を評価できる。上記組成物は、ＩＣ５０値４００μｇ／ｍｌ以上でＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持する。したがって、該組成物を用いてその体重及び脂質を管理する効果を得ることができる。
【００５３】
また、膵リパーゼ酵素に対する活性について本開示のサラシア組成物を試験して、脂肪吸収を防止する能力を評価し、ポジティブコントロールと比較してその効果を確認することができる。
【００５４】
α−グルコシダーゼ酵素に対する本開示のサラシア組成物の活性を調べて、その炭水化物の吸収を防止する効果を評価し、ポジティブコントロールと比較することができる。上記活性を適当なアッセイ法を用いて測定して、阻害効果をＩＣ５０値として確認できる。
【００５５】
また、抗酸化活性及び抗炎症活性についてサラシア組成物をインビトロで評価できるが、これらの活性は、血管の脂肪沈着による脂質異常症及びアテローム性動脈硬化が原因でリスクがある個体に有益である。抗酸化活性は、サラシア組成物がフリーラジカルと直接反応してフリーラジカルを消去する能力として評価できる。フリーラジカルは、１以上の不対電子を有する（独立して存在できる）任意の化学種である。フリーラジカルは、ラジカルを開裂して別のラジカルを生成することによって、各フラグメントが電子を１個保持するように化学結合が切断されることで分子から形成され、最終的には酸化還元反応により形成される。酸化ストレスとは、活性酸素種の発生と抗酸化防御の活性との不均衡のことをいう。いくつかの慢性及び急性変性疾患の病因に酸化ストレスが関わっていることから、抗酸化物質療法は有望な治療手段であると示唆される。抗酸化物質療法は、心血管疾患の治療介入及び予防に非常に重要な役割を果たしており、合成抗酸化物質、食用植物及び薬用植物由来の食物抗酸化因子で治療した場合、上記疾患の促進や進行を予防したりくい止めたりできる可能性がある。
【００５６】
ＩＶ．サラシア組成物のインビボ評価
食欲を制御し、健全な脂質プロファイルを管理する上での効果について本開示のサラシア組成物をインビボで評価できる。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、エタノール抽出物等の抽出物からなり、体の代謝に関与する酵素に作用できる。以下に限定されないが、例えば任意の食品用溶媒（例えば、食品用極性溶媒）等の他の溶媒を用いて抽出物を得ることもでき、エタノールを含んでいてもいなくてもよいことが理解されよう。インビトロ実験から、本開示のサラシア組成物によってＨＭＧ−ＣｏＡ酵素が阻害されることが確認できるため、望ましい血中脂質プロファイルを管理する上でその効果は明らかである。さらに、これらの有益な効果は、本開示のサラシア組成物が示す抗酸化活性及び抗炎症活性により裏付けられるため、肥満者の心臓病に適用できる根拠となる。
【００５７】
体重減少の誘発又は体重増加の防止、食物摂取量（満腹感）、食餌効率及び糞便中脂肪排泄量に及ぼす効果について本開示のサラシア組成物を評価する。肥満マウスに対して７．５週間にわたって有効量のサラシア組成物を与えて試験を行い、ポジティブコントロールとして未処理の肥満マウスと比較して効果を観察した。サラシア組成物を高用量及び低用量で投与した場合の結果を記録する。これらの評価結果から、著しい体重増加の抑制、食物摂取量の低下及び糞便中脂肪排泄量の増加が確認されるため、脂肪吸収の抑制に寄与している。本開示のサラシア組成物の満腹感の低下に対する効果は、過食による肥満であるため、体重増加や脂質異常症という形で明らかなように過剰な脂肪が蓄積されている個体に有益である。このような過剰な脂肪やコレステロールが、重要臓器に血液を供給する血管に沈着すると、炎症やアテローム性動脈硬化の問題が生じて、心臓血管系に過度の負荷をかける。インビボ評価の知見は、インビトロでの効果とも一致する。
【００５８】
本開示のサラシア組成物は、食欲を抑制し、健全な脂質プロファイルを管理する上で効果的であり、食用として安全である。上記組成物は、投与を必要とする個体に有効量で７．５週間にわたって投与した場合、食物摂取量を約１２〜１８％抑制する。インビボ評価で確認されたように、上記組成物は、体細胞及び臓器に悪影響を及ぼさない。本開示の組成物が代謝に関与する酵素に及ぼすインビトロでの効果を評価し、さらに、得られた結果は、体重、食物摂取量、食餌効率及び糞便中脂肪排泄量に対する効果についてのインビボ評価として確認した。一実施形態において、本開示の組成物は、食品用非水性溶媒を用いてサラシア植物部位を抽出する方法により製造される。いくつかの実施形態において、上記組成物は乾燥粉末状であり、極性及び中極性成分を含有し、これらの成分は化学的手法やクロマトグラフ法で特性評価される。
【００５９】
上記組成物は、投与を必要とする個体に対して粉末状で、又は、投与前に好適な媒体を用いて再構成して投与してもよく、あるいは経口又は非経口投与に便利な好適な固体又は液体剤形に製剤化してもよい。本発明によれば、該組成物は、体重管理及び脂質管理に有益であることを確認するためにインビトロ実験やインビボ実験により評価する。得られた結果は、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害や、ホルモン感受性リパーゼの活性化による脂肪分解活性化の観点から望ましく、動物実験における体重の減少、食物摂取量の低下及び糞便中脂肪排泄量の増加へと反映されるものである。
【００６０】
実施形態の具体例を記載するが、特定の変形例及び同等物は当業者に明らかであり、後述の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内に含まれることを意図している。以下に、本開示の組成物及び方法の詳細及び利点を非限定的な具体例に基づいてより詳細に説明する。
【実施例】
【００６１】
実施例１：サラシア組成物の製造
サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の根を乾燥させ、粉砕し、６０〜６５℃で３時間撹拌することによって５倍体積のエタノールで抽出する。次に、溶媒を真空下で濾過し、濾液をとっておく。得られた材料を６０〜６５℃で１時間撹拌することによって３倍体積のエタノールで再抽出する。溶媒を濾過し、濾液を合わせた後、ロータリーエバポレーターを用いて５０℃で蒸発させて、赤茶色の乾燥粉末状抽出物を得る。
【００６２】
本明細書における結果は、本開示のサラシア組成物の一実施形態である実施例１で得られた組成物に基づく。実施例１の組成物は、該組成物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとからなる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、実施例１に基づく組成物は、例えば同じ方法に従って製造した複数バッチの平均として算出した場合、該組成物の重量に対して、合計で１６重量％又は約１６重量％のポリフェノール類と、３重量％又は約３重量％のマンギフェリンと、２．６重量％又は約２．６重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、該組成物の重量に対して、ポリフェノール類を合計で約３９重量％又は最大３９重量％まで、マンギフェリンを約７．３６重量％又は最大７．３６重量％まで、２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンを約３．１７重量％又は最大３．１７重量％までも含有できることが理解されよう。
【００６５】
実施例２Ａ：サラシア組成物の単離及び特性評価
ＵＶによる総ポリフェノール含量の測定（没食子酸換算）
メタノールにサラシア組成物を所望の濃度で分散させ、試験管に各試料を１．０ｍｌ投入し、１０倍希釈フォーリン・チオカルト試薬５ｍｌ及び７．５％炭酸ナトリウム４ｍｌと混合する。試験管をパラフィルムで覆い、室温で５０分間放置する。その後、没食子酸を基準として７６５ｎｍの吸光度を分光計で読み取った。
【００６６】
マンギフェリン及びその誘導体の測定
サラシア組成物由来のマンギフェリン及びその誘導体をＨＰＬＣにより見積もる。カラムは、メルク製ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ１８（２５０×４ｍｍ、５μｍ）を使用する。流量は毎分１．０ｍＬであり、検出波長は２６０ｎｍである。移動相Ａとして０．０５％オルトリン酸（ＯＰＡ）、移動相ＢとしてＭｅＯＨ：ＡＣＮ（メタノール：アセトニトリル）（３：２）を使用して勾配をつけて送液する。抽出物約２５〜３０ｍｇをメタノール２５ｍｌに溶解して試料を調製する。０．４５μ濾紙を使用して溶液を濾過する。マンギフェリンの保持時間は２０分である。
【００６７】
２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンの単離及び特性評価
さらに、実施例１のサラシア組成物をアセトンに溶解し、溶解部分のＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）パターンを取得する。溶離液としてヘキサン：酢酸エチル（９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０）を使用してシリカゲル（１００〜２００メッシュ）によるクロマトグラフィーを行う。画分を合わせて濃縮し、ヘキサン／ジクロロメタン混合物を用いて更に精製し、ヘキサンを用いて再結晶することにより、純粋な２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンを得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンの含量を測定し、更に高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）フィンガープリント法で特性評価する。
【００６８】
２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンの見積もり方法
サラシア組成物由来の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンをＨＰＬＣにより見積もる。カラムは、メルク製ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ１８（２５０×４ｍｍ、５μｍ）を使用する。流量は毎分１．０ｍＬであり、検出波長は２６０ｎｍである。移動相Ａとして０．１％ギ酸：メタノール：水（８０：２０）、移動相Ｂとして０．１％ギ酸メタノール溶液を使用した勾配で送液する。抽出物約２５〜３０ｍｇをメタノール２５ｍｌに溶解して試料を調製する。０．４５μ濾紙を使用して溶液を濾過する。２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンの保持時間は３０分である。
【００６９】
２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオン及びマンギフェリンを含有するサラシア組成物のＨＰＴＬＣプロファイル
本発明のサラシア組成物のＨＰＴＬＣプロファイルを確認し、非極性溶媒系（移動相ヘキサン：酢酸エチル）を使用して２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオン画分と、極性溶媒系（酢酸エチル：アセトン：ギ酸：水［６：２：０．５：０．５］）を使用してマンギフェリンと比較すると、波長２５４ｎｍにバンドが検出される（図１参照）。
【００７０】
実施例３：酵素アッセイによるサラシア組成物のインビトロ評価
サラシア組成物がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に及ぼす効果についてインビトロで評価して、健全な脂質プロファイルを維持するための適用性を評価する。さらに、ホルモン感受性リパーゼや膵リパーゼ等の酵素に対する効果も評価する。
【００７１】
ａ．ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素アッセイ
方法：ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール合成の律速段階である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素アッセイキット（シグマ社製、ＣＳ１０９０）を使用してＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を評価する。これにより、基質ＨＭＧ−ＣｏＡの存在下、吸光度３４０ｎｍでＨＭＧ還元酵素の触媒サブユニットによるＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の酸化を測定する。
【００７２】
結果：実施例１等のサラシア組成物は、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＭＧ−ＣｏＡを阻害し、ＩＣ５０値は４０１．３μｇ／ｍｌである（表１）。
【００７３】
【表１】
2016537385.tif 000002
【００７４】
ｂ．膵リパーゼアッセイ
方法：本アッセイは、サラシア組成物が脂肪吸収を防止する能力を評価することを目的とする。膵リパーゼ活性は、豚膵リパーゼと基質としてオレイン酸４−メチルウンベリフェリル（オレイン酸ＭＵ）を使用して評価する。ポジティブコントロールとしてオルリスタットを使用する。リパーゼ活性は、蛍光カイネティックアッセイで測定する。
【００７５】
結果：サラシア組成物は、オルリスタットに比べて、膵リパーゼに対する著しい阻害効果を示した（表２）。
【００７６】
【表２】
2016537385.tif 000003
【００７７】
膵リパーゼは、トリアシルグリセロールをモノアシルグリセロールに加水分解する重要な酵素である。インビトロ試験から、実施例１等のサラシア組成物は強い膵リパーゼ阻害活性を有することが分かった（図２参照）。サラシア組成物のＩＣ５０値は、リパーゼ阻害剤として臨床的に承認された薬剤であるオルリスタットに匹敵する。本開示のサラシア組成物は、膵リパーゼを阻害することによって食餌性脂肪吸収を阻害してエネルギー摂取量を抑制する。
【００７８】
ｃ．脂肪分解アッセイ
方法：本アッセイによって、抽出物がトリグリセリドをグリセロール及び遊離脂肪酸に分解する能力を評価する。３Ｔ３Ｌ１細胞モデルにおける脂肪分解について、実施例１等のサラシア組成物のスクリーニングを行った。１０％新生仔ウシ血清、２５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３Ｔ３Ｌ１前駆脂肪細胞を３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下、１００％コンフルエントに達するまで１週間培養した。
【００７９】
コンフルエントに達してから２日後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン及び分化誘発物質（０．５ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１０μｇ／ｍｌインスリン及び１μＭデキサメタゾン）を添加したＤＭＥＭを用いて３Ｔ３Ｌ１の脂肪細胞への分化を４８時間開始させた（０日目〜２日目）。その後、同培地に１０μｇ／ｍｌインスリンのみ添加したものを用いて更に４８時間、細胞を培養し（２日目〜４日目）、その後、上記培地のみを用いて培養した（４日目〜６日目）。実施例１等のサラシア組成物を上記培地に１００ｕｇ／ｍｌの濃度で２４時間加え、脂肪分解を評価した。実施例１等のサラシア組成物の効果をポジティブコントロールのイソプロテレノール（１０ｕＭ）と比較した。
【００８０】
２４時間後、細胞培地に放出されたグリセロールをグリセロール試薬（シグマ社製）を使用して評価し、細胞タンパク質含量に対する比で表した。タンパク質含量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）ＰｉｅｒｃｅＴＭキットを使用して評価した。抽出物が示すグリセロール／タンパク質比が１．４０より大きい場合、抽出物が脂肪分解を増加させると考えられる。
【００８１】
サラシア組成物又はイソプロテレノールで２４時間処理した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞の細胞溶解物からタンパク質を回収した。タンパク質試料をブロットし、全ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）及びセリン５６３がリン酸化されたホルモン感受性リパーゼを検出した。その後、全ＨＳＬに対するリン酸化ＨＳＬの比を処理試料と未処理試料とで比較した。
【００８２】
結果：実施例１等のサラシア組成物が示す比は１．４０より大きく、サラシア組成物が３Ｔ３Ｌ１細胞における脂肪分解を増加させることを示唆している（表３）。
【００８３】
【表３】
2016537385.tif 000004
【００８４】
また、インビトロ試験から、サラシア組成物で処理すると、３Ｔ３Ｌ１細胞において強い脂肪分解が誘発されることが分かった。この脂肪細胞に対する脂肪分解効果は、脂肪分解活性を有することが知られるβ−アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールの効果と同等であった。
【００８５】
ｄ．ホルモン感受性リパーゼアッセイ
実施例１等のサラシア組成物は、ホルモン感受性リパーゼのリン酸化を著しく増加させ、これはポジティブコントロールのイソプロテレノールとほぼ同程度であった。これにより、グリセロールの増加によって示されたサラシア組成物の脂肪分解効果が確認された（表４）。
【００８６】
【表４】
2016537385.tif 000005
【００８７】
サラシア組成物で処理することによって、トリグリセリドを非エステル化脂肪酸及びグリセロールに加水分解するホルモン感受性リパーゼのリン酸化が増加した。実施例１等のサラシア組成物で処理した脂肪細胞におけるグリセロール増加量は、ポジティブコントロールのイソプロテレノールとほぼ同程度であった。これにより、サラシア組成物で急性処理することで脂肪分解が増加することが確認された。このように、サラシア組成物の脂肪分解効果は、ホルモン感受性リパーゼリン酸化の著しい増加（２．４３倍）と相関していた。
【００８８】
ｅ．α−グルコシダーゼアッセイ
方法：本アッセイは、炭水化物吸収の防止を評価することを目的とする。α−グルコシダーゼは、炭水化物を吸収性単糖類に分解する酵素である。ラット小腸アセトン粉末（シグマ社製）から抽出した哺乳類α−グルコシダーゼと、人工基質としてｐ−ニトロフェニルＬ−Ｄグルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を使用してα−グルコシダーゼの活性を評価する。ポジティブコントロールとしてアカルボースを使用する。比色カイネティックアッセイにより、マイクロプレートリーダー「ＳｙｎｅｒｇｙＨ１」を使用して吸光度４００ｎｍでＰＮＰＧの放出をモニタリングすることによってα−グルコシダーゼ活性を測定する。
【００８９】
結果：実施例１等のサラシア組成物は、α−グルコシダーゼに対して著しい阻害効果を示した。アカルボース（ＩＣ５０値：１９μｇ／ｍｌ）に対して、サラシア組成物のＩＣ５０値は３．４７μｇ／ｍｌであった（図３参照）。
【００９０】
インビトロ試験から、実施例１等のサラシア組成物は、α−グルコシダーゼ活性に対して強い阻害効果を示し、既存の市販されているα−グルコシダーゼ阻害剤であるアカルボースに匹敵することが明らかとなった。α−グルコシダーゼを阻害することによって、グルコースの血中への吸収が遅れ、食後高血糖が抑制される。このような知見から、サラシア組成物は、炭水化物吸収を阻害することによって抗肥満効果を示し得ると示唆される。
【００９１】
実施例４：細胞株を用いたサラシア組成物のインビトロ評価
ａ．ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）アッセイによる抗酸化活性の測定
上述の通り、植物抽出物又は植物画分がフリーラジカルと直接反応してフリーラジカルを消去する能力を評価した（Ｃｈｅｎｇら、２００６）。エタノールを用いてＤＰＰＨ（２００μＭ）の原液を調製した。アッセイは、９６ウェルプレートを用いて行った。ＤＰＰＨ１００μＬと試料１００μＬを含む反応混合物を３７℃で３０分間培養した。吸光度を５１５ｎｍで測定した。ポジティブコントロールとして没食子酸を使用した。以下のようにして、ＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）を算出した（Ｃｈｅｎｇ  Ｚ、Ｍｏｒｒｅ  Ｊ、Ｙｕｂ  Ｌ（２００６）Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ、５４：７４２９〜７４３６参照）。
ラジカル捕捉活性（％）＝［１−（試料−ブランク）／（コントロール−ブランク）］×１００
【００９２】
没食子酸は、２０μＭで８６％のラジカル捕捉活性を示した。実施例１等のサラシア組成物は８４．３％のラジカル捕捉活性を示し、これは極めて著しい値であり、ポジティブコントロール活性に匹敵する。
【００９３】
抗炎症活性の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞において一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）活性の阻害を測定した。サラシア組成物はＩＣ５０＞５０というｉＮＯＳ活性を示すことが分かった。
【００９４】
このように、インビトロアッセイから、サラシア組成物がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することが示されるため、必要とする個体において健全な脂質プロファイルを維持するためにサラシア組成物を適用できることが示唆される。また、上記組成物は、ホルモン感受性リパーゼ酵素を活性化して脂肪分解を増加させ、膵リパーゼ酵素を阻害して脂肪の吸収を阻害することが分かっている。また、サラシア組成物は、α−グルコシダーゼ酵素を阻害して炭水化物の吸収を抑制することにより、エネルギー摂取量の低下に寄与した。また、上記組成物は、抗酸化活性及び抗炎症活性を示す。
【００９５】
また、実施例１等のサラシア組成物に対してインビボ試験を行って、肥満ラットモデルにおける役割を調べた。
【００９６】
実施例５：サラシア組成物のインビボ試験
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス５６頭をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社から購入した。温度管理された部屋のマウスケージにマウスを１頭ずつ収容し、１２時間の明暗周期とし、通常のげっ歯類用飼料及び水を自由に摂取させた。一週間順応させた後、マウスを８頭ずつの７つの群に分けた。全てのマウスに高脂肪食（脂肪からのエネルギーが６０％）を与えて、肥満させた。０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁させた低用量（１００ｍｇ／ｋｇ／日）及び高用量（５００ｍｇ／ｋｇ／日）のサラシア組成物をそれぞれ７．５週間（正確には５２日間）６つの群に強制経口投与した。
【００９７】
１群を肥満対照群として用い、溶媒対照を強制経口投与した。体重測定は毎日行い、食物摂取量は一週間に３回記録した。マウスを代謝ケージに３日間入れて、６週目から７週目にかけて糞便試料を採取した。試験終了時、麻酔したマウスの血液試料を心臓穿刺により採取して、凝固促進剤（ｃｌｏｔ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含む血清試験管に入れ、血清の遠心分離を行うまで氷上に置いた。肝臓及び精巣上体脂肪体を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、計量した。肝臓、胃、筋肉及び脂肪組織を採取し、直ちに液体窒素で凍結させ、血清とともに−８０Ｃで保管した。
【００９８】
７．５（５２日間）にわたって実験を行ったため、７週間まで体重及び食物摂取量を記録した。他の結果は、糞便中脂肪排泄量を除き、試験終了時（５２日間の処理後）に得た。
【００９９】
ａ．サラシア組成物が食物摂取量（食欲）に及ぼす効果
【０１００】
【表５】
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【０１０１】
一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により反復測定を行ってデータを分析した。処理方法による差は、最小二乗平均法を用いて一対比較により決定した。ここでは、ｐ＜０．０５を有意とみなした。結果は標準誤差（ｎ＝７〜８）を添えた値で示す。インビボ試験から、サラシア組成物で処理すると、高脂肪食マウスにおいて食物摂取量が約２０％と著しく減少することが分かった。これらの結果から、実施例１等のサラシア組成物が、カロリー摂取量を抑制することによって体重減少を促進し得ることが示唆される。サラシア組成物がエネルギー摂取量に及ぼす効果は、シブトラミンと類似している。
【０１０２】
実施例５に示すように、サラシア組成物を２つの異なる投与量（１００ｍｇ／ｋｇ／日（低用量）及び５００ｍｇ／ｋｇ／日（高用量））で実験動物に投与したところ、高用量のサラシア組成物によって統計的に有意な結果が得られたが、この量は場合によっては有効量であると考えられる。このような結果は、高用量と低用量の間（又は高用量及び低用量の範囲外）の別の投与量でも見られ得るものであり、この量は、望ましい又は統計的に有意な結果であるなど、本明細書における有利な結果を達成するのに有効であり得るということが理解されよう。
【０１０３】
ｂ．サラシア組成物が体重に及ぼす効果
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
一元配置分散分析により反復測定を行ってデータを分析した。処理方法による差は、最小二乗平均法を用いて一対比較により決定した。ここでは、ｐ＜０．０５を有意とみなした。結果は標準誤差（ｎ＝７〜８）を添えた値で示す。
【０１０６】
ｃ．サラシア組成物が食餌効率に及ぼす効果
摂取された食餌１００ｇに対する体重増加量のグラムあたりでＦＥ（食餌効率）を算出した。一元配置分散分析を用いてデータを分析した。結果は標準誤差（ｎ＝７〜８）を添えた値で示す。
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
一元配置分散分析を用いてデータを分析した。処理方法による差は、最小二乗平均法を用いて一対比較により決定した。ここでは、ｐ＜０．０５を有意とみなした。結果は標準誤差（ｎ＝７〜８）を添えた値で示す。
【０１０９】
ｄ．糞便中粗脂質の分析
Ｆｏｌｃｈ変法によって、４８時間にわたって採取した糞便から粗脂質を抽出した。簡単に言えば、糞便試料をガラス培養管に計量し、メタノール存在下で均質化した。振とう水槽に１５分間置いた後、培養管を室温まで冷却し、ヘキサン：クロロホルム混合液（４：１（ｖ／ｖ））を加えた。１０分間振とう後、０．８８％塩化ナトリウム溶液を加えた。培養管をボルテックスにかけ、遠心分離した。上澄みを清浄なガラス試験管に回収した。抽出を２回繰り返し、上澄みを集めた。得られた上澄みを乾燥させ、総粗脂質量から脂肪排泄率（４８時間の糞便採取期間中に食餌から摂取された総脂肪量に対する割合（％））を算出した。
【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
一元配置分散分析を用いてデータを分析した。処理方法による差は、最小二乗平均法を用いて一対比較により決定した。ここでは、ｐ＜０．０５を有意とみなした。結果は標準誤差（ｎ＝７〜８）を添えた値で示す。
【０１１２】
結果：実施例１等のサラシア組成物は、７．５週間の処理期間において４週目、５週目及び７週目に著しく体重増加を遅延させ、食物摂取量を抑制し、また糞便中脂肪排泄量を増加させた。サラシア組成物で処理したラットの平均体重は、肥満対照群よりも１４％軽かった。
【０１１３】
ｅ．組織学的試験
試験終了時、麻酔をかけた状態で血液を採取した直後に、肥満対照群マウス及びサラシア組成物（高用量）摂取マウスから腎臓、肝臓、脾臓、胸腺、心臓、肺、胃、小腸、大腸、骨格筋及び精巣上体脂肪を回収し、１０％中性緩衝ホルマリンで４８時間以上固定した。適宜切り取った組織（厚さ２〜５ｍｍ）を加工し、パラフィン包埋し、４〜５ミクロンの薄片を切り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。
【０１１４】
本試験において、処理に伴う変化は見られなかった。７．５週間にわたって実施例１等のサラシア組成物を投与した場合、腎臓、脾臓、胸腺、心臓、胃、小腸、大腸、骨格筋及び精巣上体脂肪の病理組織検査の記録に際して異常は認められなかった。
【０１１５】
結果：実施例１のサラシア組成物は、５００ｍｇ／ｋｇ／日投与量で著しく体重増加を遅延させ、食物摂取量を抑制し、糞便中脂肪排泄量を増加させた。これらインビボでの知見は、サラシア組成物が、オルリスタットと比較して、膵リパーゼ活性に対して強い阻害効果を示す（サラシア組成物及びオルリスタットのＩＣ５０値は、それぞれ１０．１２μｇ／ｍｌ、０．５３μｇ／ｍｌ）というインビトロでの結果と一致する。高用量のサラシア組成物で長期間処理することによって、体重減少効果が見られ、体重増加が防止され、脂肪体の塊が減少した。
【０１１６】
サラシア組成物は、食物摂取量を抑制し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを管理することによって体重増加を遅延させる可能性のある生理活性化合物として、５００ｍｇ／ｋｇ／日で投与できる。このように、サラシア組成物は、複数の標的酵素制御活性を有し、肥満治療法としての有効性を示す新たな天然物である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月17日(2016.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有するサラシア組成物であって、上記各成分は、サラシア属植物部位から抽出されたものであり、上記組成物は、食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持する活性を示し、上記各成分は、溶媒を用いて６０℃〜６５℃で３時間第１抽出を行ってから濾過し、溶媒を用いて６０℃〜６５℃で１時間第２抽出を行ってから濾過することによって抽出物として得られるものである、組成物。
【請求項２】
上記抽出物は、その重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとから本質的になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記抽出物は、サラシアの地上部、地表部、地下部及び／又はそれらの混合物を溶媒抽出して得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記抽出物は、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）及び／又はサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）の茎、葉、根及びそれらの混合物から製造される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記抽出物は、食品用非水性極性溶媒を使用して得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記食品用非水性極性溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、アセトン又はそれらの混合物から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記食品用非水性極性溶媒はエタノールである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
上記抽出物を得るのに使用される上記食品用非水性極性溶媒に対するサラシア植物の重量体積比は、１：２〜１：３０である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害する方法であって、有効量のサラシア組成物を投与を必要とする対象に投与することを含み、
上記組成物は、その重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有するものであり、上記各成分は、サラシア属植物部位から抽出されるものであり、溶媒を用いて６０℃〜６５℃で３時間第１抽出を行ってから濾過し、溶媒を用いて６０℃〜６５℃で１時間第２抽出を行ってから濾過することによって得られるものである、方法。
【請求項１０】
投与を必要とする対象に投与した場合、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
投与を必要とする対象に投与した場合、ＩＣ５０値４００μｇ／ｍｌ以上でＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害して健全な脂質プロファイルを維持することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
投与を必要とする対象に投与した場合、食物摂取量を抑制することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
投与を必要とする対象に投与した場合、糞便中脂肪排泄量を増加させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
組成物の重量に対して少なくとも１２重量％のポリフェノール類と、少なくとも２重量％のマンギフェリンと、少なくとも１重量％の２５，２６−オキシドフリーデラン−１，３−ジオンとを含有する新規サラシア組成物の製造方法であって、
上記各成分は、サラシア植物部位から抽出されるものであり、上記組成物は、食欲を抑制し、ホルモン感受性リパーゼを活性化し、及び／又は、健全な脂質プロファイルを管理するものであり、上記方法は、
（ｉ）サラシア植物部位を乾燥及び粉砕する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の上記植物部位と食品用非水性極性溶媒とを６０℃〜６５℃で３時間撹拌する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の上記食品用非水性極性溶媒を濾過する工程と、
（ｉｖ）上記植物部位と食品用非水性極性溶媒とを６０℃〜６５℃で１時間再撹拌する工程と、
（ｖ）上記食品用非水性極性溶媒を濾過する工程と、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）及び工程（ｖ）で得られた濾液を合わせ、蒸発させて、サラシア組成物を抽出物として得る工程と、
（ｖｉｉ）得られた抽出物を食品用溶媒で分画して更に精製する工程とを含み、
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｖ）の上記食品用非水性極性溶媒及び工程（ｖｉｉ）の上記食品用溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、アセトン及びそれらの混合物からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】
上記植物部位は、サラシアの地上部、地表部、地下部及びそれらの混合物から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記植物部位は、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）及び／又はサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）の茎、葉、根及びそれらの混合物から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記食品用非水性極性溶媒に対する上記植物部位の重量体積比は、１：２〜１：３０である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
上記食品用非水性極性溶媒はエタノールである、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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