(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン、その分解物、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを有効成分として含有することを特徴とするインスリン様増殖因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
プロスタグランジンＥ１又はＩＬ−１をさらに含有してなることを特徴とする請求項１記載の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
フコイダン、その分解物、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを有効成分として含有することを特徴とするインスリン様増殖因子産生調整剤。
【請求項４】
フコイダン、その分解物、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項５】
プロスタグランジンＥ１又はＩＬ−１をさらに含有してなることを特徴とする請求項４記載の治療剤又は予防剤。
【請求項６】
フコイダン、その分解物、及びこれらの塩からなる群より選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生調整剤。
【請求項７】
以下の化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子産生調整剤、
(a)アルギン酸、ペクチン酸、カラギーナン、アガロペクチン、フコイダン、硫酸化フコガラクタン、デキストラン硫酸ナトリウム、硫酸化スターチ、硫酸化カードラン、及び硫酸化ペクチンからなる群より選択される酸性多糖、
(b)フコイダンの酸分解物、硫酸化マルトース、硫酸化ラクトース、硫酸化スクロース、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクツロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルトース、硫酸化ツラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトヘキサオース、硫酸化マルトヘプタオース、硫酸化ドデシル−マルトヘキサオース、下記式（Ｉ）で表される化合物、及び下記式（ＩＩ）で表される化合物からなる群より選択される酸性オリゴ糖、
0004261071.tif 000099
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004261071.tif 000100
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
(c)硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化タロース及び硫酸化マンノースからなる群より選択される酸性単糖、
(d)硫酸化グルシトール、並びに
(e)これらの塩。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は生理活性を有する酸性糖化合物の医薬、食品、飲料、飼料、又は化粧料としての用途に関する。
背景技術
海藻由来の酸性多糖としては、緑藻類由来のラムナン硫酸、紅藻類由来の硫酸化ガラクタン、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖等の硫酸化多糖が知られている。例えば、フコイダンは褐藻類、棘皮動物等に含まれている硫酸化フコース含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。またサメ軟骨等も硫酸化多糖を含有している。
硫酸化多糖、例えばフコイダンの生理作用としてはがん増殖抑制活性、がん転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウイルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている。
肝細胞増殖因子産生誘導作用を有する物質としてはヘパリン、ヘパラン硫酸、平均分子量４４００〜５６００の低分子化ヘパリンが知られているが（特開平６−３１２９４１号公報）、その他の硫酸化多糖、例えばフコイダン、合成硫酸化多糖等の成長因子産生誘導作用についての報告はない。
発明の開示
本発明は種々の酸性糖化合物、例えば酸性多糖、例えばフコイダン等の新たな生理作用を見出すことにあり、その目的は種々の酸性糖化合物、例えば酸性多糖、例えばフコイダン等の成長因子産生誘導作用、特に肝細胞増殖因子産生誘導作用、インスリン様増殖因子産生誘導作用又は神経成長因子産生誘導作用を利用した医薬、食品、飲料、飼料又は化粧料を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるもの（但し、ヘパリン、ヘパラン硫酸を除く）を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤に関する。
本発明の第２の発明は、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の食品、飲料（以下、飲食品という場合がある）又は飼料に関する。
本発明の第３の発明は、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の化粧料に関する。
本発明の第４の発明は、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生調整剤に関する。
本発明において、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖としては、好ましくは硫酸化多糖が例示され、硫酸化多糖としては藻類由来の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、例えば棘皮動物由来の硫酸化多糖、例えばナマコ由来の硫酸化多糖、魚類由来の硫酸化多糖、例えばサメ軟骨由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖、植物由来の硫酸化多糖、例えばヨモギ由来の硫酸化多糖、合成硫酸化多糖が好適に使用できる。
また、成長因子産生誘導作用を有する藻類由来の硫酸化多糖としてはラムナン硫酸、硫酸化ガラクタン、又は硫酸化フコース含有多糖が好適に使用することができる。合成硫酸化多糖としてはデキストラン硫酸ナトリウム、硫酸化スターチ、硫酸化カードラン、硫酸化ペクチン等が例示され、更に硫酸化多糖の硫酸化により得られる高硫酸化硫酸化多糖が好適に使用できる。また硫酸化フコース含有多糖としてはフコイダンが好適に使用することができる。酸性オリゴ糖としては好ましくは硫酸化オリゴ糖であり、例えば硫酸化マルトース、硫酸化ラクトース、硫酸化スクロース、硫酸化トレハロース、硫酸化ラクツロース、硫酸化メリビオース、硫酸化セロビオース、硫酸化イソマルトース、硫酸化ツラノース、硫酸化パラチノース、硫酸化マルトトリオース、硫酸化マルトヘキサオース、硫酸化マルトヘプタオース、硫酸化ドデシル−マルトヘキサオース、下記式（Ｉ）で表される化合物又は下記式（ＩＩ）で表される化合物が使用できる。
0004261071.tif 000002
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004261071.tif 000003
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
また酸性単糖としては、好ましくは硫酸化単糖であり、例えば硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化タロース及び硫酸化マンノースが使用できる。また酸性糖アルコールとしては、糖アルコールの硫酸化物、例えば硫酸化グルシトール等も使用できる。これらの硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖、硫酸化糖アルコールはそれらの一般的な合成方法にて調製しても良い。これらの糖化合物中の硫酸基の位置、硫酸基の数は、これらの硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖、硫酸化糖アルコールが成長因子産生誘導作用を示す限り、特に限定はない。
本発明においては成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物も使用することができる。当該分解物には成長因子産生誘導作用を有する、分子量４０００以下のヘパリン分解物、ヘパラン硫酸分解物も包含される。
前記酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコールに例示される物質は、各々単独で若しくは２種以上混合して用いることができ、またそれらの塩も好適に使用できる。
本発明において、成長因子としては肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、及び神経成長因子が例示される。
本発明の第１の発明の治療剤又は予防剤、第２の発明の食品、飲料又は飼料、及び第３の発明の化粧料には、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質をさらに含有させることができ、当該物質としてはサイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、ミノキシジル、及び塩化カルプロニウムから選択される物質が例示される。
また、本発明の第２の発明の食品、飲料又は飼料は、好適には肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用又は神経成長因子産生誘導用の食品、飲料又は飼料である。
また、本発明の第３の発明の化粧料は、好適には肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用又は神経成長因子産生誘導用の化粧料である。
本発明の第３の発明の化粧料としては、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン又は浴用洗剤が例示される。
尚、本発明にかかる「酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるもの」を本明細書において単に「有効成分」という場合がある。
発明を実施するための最良の形態
本発明において成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖とは、成長因子産生誘導作用を有すれば良く、特に限定はないが、アルギン酸、ペクチン、ペクチン酸、ヒアルロン酸等の酸性多糖、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化多糖、動物由来の硫酸化多糖、例えば棘皮動物由来の硫酸化多糖、魚類由来の硫酸化多糖、例えばサメ軟骨由来の硫酸化多糖、植物由来の酸性多糖、例えばヨモギ由来の硫酸化多糖、ニガウリ由来の硫酸化多糖、アロエ由来の硫酸化多糖、菊葉由来の硫酸化多糖、微生物由来の硫酸化多糖、例えばクロレラ由来の硫酸化多糖、スピルリナ由来の硫酸化多糖、藻類由来の硫酸化多糖等が好適に使用することができる。
藻類由来の硫酸化多糖としては藻類由来のラムナン硫酸、紅藻類由来の硫酸化ガラクタン、例えばマクサ、オゴノリ、ジャイアントケルプ、プテロクラディア  カピラセア、カラギーナン、寒天類、アガロース、アガロペクチン、ポルフィラン、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖、例えばフコイダン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコグルクロノマンナン、グルクロノキシロフカン、サルガッサン、グルクロノマンノガラクタン、キシロフコグルクロナン、アスコフィラン、グルクロノガラクトフカン、硫酸化グルクロノフカン等が使用することができる。特に、フコイダン、硫酸化フコガラクタン、λ−カラゲナン、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｄ、アルギン酸、アガロペクチン等が本発明に好適に使用することができる。また藍藻類由来の酸性多糖、例えばスピルリナ由来の硫酸化多糖、緑藻類由来の酸性多糖、例えばクロレラ由来の硫酸化多糖を使用することができる。特にスピルリナ由来の硫酸化多糖はその肝細胞増殖因子産生誘導作用により、肝機能の改善に有用であり、例えばＣ型肝炎の症状改善に著効を有する。またリン酸化多糖類、例えば核酸も本願発明の酸性多糖に包含される。
本発明に使用する硫酸化フコース含有多糖としては、好ましくは前出の藻類由来のフコイダンが例示されるが、硫酸化フコースを構成成分とする多糖で成長因子産生誘導作用を有するものであれば特に限定はなく、棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等由来のフコイダンを使用してもよい。
これらは単独で若しくは２種以上混合して用いることができる。また、これら例示される酸性多糖の分解物や塩も成長因子産生誘導作用を示す限り、特に限定なく使用することができる。
これらの酸性多糖の調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該酸性多糖含有物等を本発明に使用することができる。酸性多糖含有物としては硫酸化多糖画分が好適に使用でき、当該画分としては藻類由来硫酸化多糖画分、サメ軟骨由来の硫酸化多糖画分が好適に使用できる。また硫酸化多糖含有物の原料として藻類、ナマコ、サメ軟骨等が使用できる。例えばガゴメ昆布、マ昆布、トロロ昆布、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア  ニグレセンス、アスコフィラム  ノドッサム等の昆布目、ながもつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。
本発明に使用される合成硫酸化多糖としては、成長因子産生誘導作用を有するものであれば良く特に限定はないが、これまでに医薬品として使用されてきた硫酸化多糖の使用が好適である。当該合成硫酸化多糖としてはデキストラン硫酸ナトリウムが例示される。当該化合物はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍによるショ糖の発酵によって生産されたデキストランの部分分解物を硫酸化して得た硫酸化エステルのナトリウム塩である。
また本発明においては硫酸化スターチ、硫酸化カードラン、硫酸化ペクチン等の合成硫酸化多糖が使用でき、更に硫酸化多糖の硫酸化により得られる高硫酸化硫酸化多糖が好適に使用できる。
本発明に使用する硫酸化多糖の硫酸基の位置は、成長因子産生誘導作用を発現すれば特に限定はないが、構成糖の２位が硫酸化された硫酸化多糖、フコイダン、λ−カラゲナン、コンドロイチン硫酸Ｄ、それらの分解物が本発明に好適に使用することができる。また、硫酸化多糖の硫酸含量（若しくは硫酸基数）は、成長因子産生誘導作用を発現すれば特に限定はない。なお、酸性多糖の分解物はオリゴ糖、単糖も包含し、本発明において２位が硫酸基を有するオリゴ糖、単糖、例えばフコース−２−硫酸、グルコース−２−硫酸を使用することができる。これらの硫酸化単糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化多糖はそれらの一般的な合成法により調製しても良く、調製物、精製物を本発明に使用することもできる。なお本発明においてオリゴ糖とは単糖が２個から１０個の範囲でつながった糖化合物、多糖とは単糖が１１個以上つながった糖化合物と定義する。
例えばガゴメ昆布からフコイダンを調製し、該フコイダンをグルクロン酸含有フコイダン（Ｕ−フコイダンと称す）とグルクロン酸非含有フコイダン（Ｆ−フコイダンと称す）に分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコイダンを使用することが出来る。またガゴメ昆布から硫酸化フコガラクタンを調製し、使用することができる。
更に寒天からアガロペクチンを調製し、使用することができる。
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンはガゴメ昆布からフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ昆布由来のＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は約１：２であり、Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約２０％、Ｆ−フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約５０％、分子量は両物質共に約２０万を中心に分布している（第１８回糖質シンポジウム要旨集、第１５９頁、１９９６年）。
例えばガゴメ昆布から調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、ＮａＣｌ含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンに分離することができる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
また例えばマクサ由来硫酸化多糖、オゴノリ由来硫酸化多糖、プテロクラディア由来硫酸化多糖、他の藻類由来の硫酸化多糖、ヒバマタ由来フコイダン、モズク由来フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン、ワカメ由来フコイダン、レッソニア由来フコイダン、アスコフィラム由来フコイダン、他の藻類由来のフコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。
フコイダンを含有するナマコとしては、例えば特開平４−９１０２７号公報に記載のナマコがあり、当該公報記載の方法にてナマコよりフコイダンを調製することができる。
また本発明の成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物、例えば硫酸化多糖、フコイダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて調製し、目的の成長因子産生誘導作用を有する分解物を選択し、使用することができる。
尚、分解物とは、分解対象とする酸性多糖にもよるが、酸性多糖を分解して得た、概ね分子量が好ましくは１０万〜２００、より好ましくは３万〜１０００の範囲のものをいう。
本発明で使用する酸性多糖の分解物の好適な調製方法としては酸分解法があり、当該酸性多糖を酸分解することにより、成長因子産生誘導作用を有する分解物を調製することができる。
本発明で使用する酸性多糖の酸分解条件は、成長因子産生誘導作用を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はない。
例えば酸性多糖を酸水溶液等に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。
酸性多糖を溶解又はけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機塩、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．０１〜１規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定は無いが好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明に使用する分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、フコイダンの分解物の製造に際しては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は５０〜１１０℃、好適には７０〜９５℃、加熱時間は数分〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としてはガゴメ昆布由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物は成長因子産生誘導作用、特に肝細胞増殖因子産生誘導作用の強い新生理機能を有する食物繊維として使用することができる。
本発明の分解物は成長因子産生誘導作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳＯ３８２を使用することにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することにより分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を使用することにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。
本発明で使用できる成長因子産生誘導作用を有する、酸性多糖の分解物、例えばフコイダンの分解物としては、式（Ｉ）で表される化合物、式（ＩＩ）で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット記載の方法で調製することができる。なお、式（Ｉ）で表される化合物の繰返し構造を有する硫酸化多糖、及びオリゴ糖も本発明の成長因子産生誘導作用を有する硫酸化多糖として使用することができる。
式（Ｉ）で表される化合物は前出Ｆ−フコイダンを、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（Ｉ）で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＩＩ）で表される化合物は前出Ｕ−フコイダンを、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するエンド硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）で、処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお式（Ｉ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩ）で表される化合物がある。また式（ＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩＩ）で表される化合物がある。
またガゴメ昆布由来フコイダンを有機酸存在下で、加熱処理することによりグルクロン酸とマンノースの重合体を得ることができ、この重合体も本発明の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖として使用することができる。また加熱処理条件、加熱時間を調整することにより任意の重合度の重合体を調製することができる。
本発明における成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖としては、合成硫酸化多糖が包含され、セルロース、デンプン、マンナン、キシラン、アルギン酸、ペクチン、ペクチン酸、フラクタン、アラビナン、キチン、プルラン、キシログルカン、デキストラン、スターチ等の硫酸化物を使用することができる。さらに例えば、リボフラナン硫酸、キシロフラナン硫酸、レンチナン硫酸、カードラン硫酸、マンノピラナン硫酸等の合成硫酸化多糖やパルミトイル基を有するリボフラナン硫酸等の合成硫酸化アルキル多糖を使用することができる。更に硫酸化多糖やその分解物を硫酸化することにより、高硫酸化硫酸化多糖又は高硫酸化分解物を調製することができる。これらの硫酸化多糖、高硫酸化硫酸化多糖、高硫酸化分解物はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、その分解物も公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。また市販のデキストラン硫酸、硫酸化セルロースを使用でき、それら合成硫酸化多糖等の塩等を使用しても良い。
酸性オリゴ糖としては、好ましくは硫酸化オリゴ糖を挙げることができ、また、酸性単糖としては、好ましくは硫酸化単糖を挙げることができ、それぞれ具体的には、前記と同様のものが挙げられる。かかる硫酸化オリゴ糖又は硫酸化単糖は、それぞれ対応するオリゴ糖、単糖を原料として、それぞれ公知の方法にて硫酸化して調製することができる。また、これらの塩も好適に使用できる。さらにまた硫酸化多糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖の脂肪酸誘導体等も本発明の硫酸化多糖、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖に包含される。これらは各々単独で若しくは２種以上混合して使用できる。
本発明における産生誘導を所望する成長因子とは細胞の成長を促進する活性を有していれば特に限定はないが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、上皮成長因子、ミルク由来成長因子、線維芽細胞成長因子、脳由来線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板塩基性タンパク、結合組織活性化ペプチド、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー形成刺激因子、エリスロポエチン、スロンボポエチン、Ｔ細胞成長因子、インターロイキン類（例えばインターロイキン２、３、４、５、７、９、１１、１５）、Ｂ細胞成長因子、軟骨由来因子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、骨格成長因子、内皮細胞成長因子、内皮細胞由来成長因子、眼由来成長因子、精巣由来成長因子、セルトリ細胞由来成長因子、乳腺刺激因子、脊髄由来成長因子、マクロファージ由来成長因子、リサイクル間葉成長因子、形質転換増殖因子−α、形質転換増殖因子−β、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、アンフィレグリン、ＳＤＧＦ、ベーターセルリン、エピレグリン、ニューレグリン１，２，３、血管内皮増殖因子、ニューロトロフィン、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６、ＮＴ−７、グリア細胞株由来神経栄養因子、幹細胞因子、ミッドカイン、プレイオトロフィン、Ｅｐｈｒｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、アクチビン、腫瘍壊死因子、インターフェロン類等が例示される。
これらの中では、肝疾患の予防・治療、神経性疾患の予防・治療、糖尿病の予防・治療という観点から、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種を本発明にかかる有効成分を用いて産生誘導するのが好ましい。
ＨＧＦは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。またＨＧＦのｍＲＮＡは脳、腎臓、肺等でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮細胞等にも増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因子である。従って、肝細胞増殖因子の産生を誘導することにより、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変及び肝内胆汁うっ滞、慢性腎炎、肺炎、創傷の治療又は予防を行うことができる。
ＩＧＦは種々の細胞に多彩な生理作用を有する。ＩＧＦの産生を誘導することによって、ＩＩ−型糖尿病（インスリン非依存性）や成長障害疾患（小人症）の治療又は予防を行うことができる。
ＮＧＦは神経細胞の生存や機能を維持したり、ＮＧＦの濃度勾配に従って神経細胞を伸長させたりする内因性の成長因子であり、ＮＧＦの産生を誘導することにより、アルツハイマー病等の老人痴呆症や末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒などによる神経機能の修復再生を要する疾患の治療又は予防を行うことができる。また本発明の治療剤又は予防剤は神経栄養因子の産生誘導作用を示し、さらに本発明の治療剤又は予防剤はＮＧＦ・神経栄養因子の産生誘導作用により、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、黄斑変性症等の治療、予防に有用である。
本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩は成長因子産生誘導作用を有し、これらの化合物を有効成分として成長因子産生を要する疾患の治療剤又は予防剤を製造することができる。
本発明の成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤は、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば良い。当該製剤の製造は一般的には、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
医薬用担体は、上記剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い、本発明の有効成分である、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものを希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
本発明の治療剤又は予防剤は、剤形に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮肉等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
本発明の治療剤又は予防剤としての投与量は、その剤形、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状等によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明で使用される酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの量が成人１日当り好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇとなる量である。もちろん投与量は、前記のように種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。経口剤の場合、本発明の治療剤又は予防剤は所望の投与量の範囲内において、そのまま経口投与できるほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また本発明で使用される酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを成長因子産生誘導用の飲食品の原料として用いても良い。
部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中にＨＧＦが見出され、その患者血漿から、単離、精製された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８  ４１４−４１９，１９８８）。さらに、ヒトＨＧＦのｃＤＮＡもクローニングされ、ＨＧＦの１次構造も明らかにされた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３  ９６７−９７３，１９８９）。また、細胞の運動性を亢進させるｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＦ）及び、腫瘍細胞障害因子であるｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）とＨＧＦが同一物質であることも明らかになった（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８  ７００１−７００５，１９９１：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８０  １１５１−１１５８，１９９１）。
ＨＧＦは肝細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導し、ＨＧＦは極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器において、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖の促進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を行う。
ＨＧＦは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症肝炎、肝硬変及び肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待されている。しかしながら、ＨＧＦそのものを治療薬として実用化するには至っていない。さらに、遺伝子治療でＨＧＦの遺伝子を導入する方法も試みられているが、不必要な時期、場所で作用することによる副作用により、これも実用化には遠い。このように、ＨＧＦを外から投与するのではなく、任意に誘導できるのであれば、肝炎、肝硬変、肝内胆汁うっ滞等のＨＧＦ発現増強を必要とする疾患の治療及び予防に有効であると考えられ、これまでにも、ＩＬ−１、プロスタグランジンＥ１、Ｅ２、ヘパリン等に誘導作用が確認されている。ＩＬ−１、プロスタグランジンＥ１、Ｅ２は、ＨＧＦ遺伝子の転写を誘導することにより、ＨＧＦの産生を誘導する。
一方で、ヘパリンにはＨＧＦ産生誘導作用が知られているが、ＨＧＦ遺伝子の転写は誘導せず、ｍＲＮＡの翻訳以降のステップを促進してＨＧＦの産生を誘導する。つまり、ＨＧＦ遺伝子の転写が誘導されていない状態では、ＨＧＦ産生誘導効果はない。反対に、ＨＧＦ遺伝子の転写が誘導されている状態においては顕著な産生誘導が見られる。
また、本発明にかかる有効成分は、必ずしもＨＧＦ等の成長因子の転写誘導を直接的に行うものではないが、それらの転写が誘導される際に、かかる転写を有意に促進し、さらに翻訳等の転写以降の段階をも促進することができるものと推定され、結果として成長因子の産主の増強を誘導するという作用を有する。すなわち、本発明にいう「成長因子産生誘導作用」とは、成長因子の産生の増強を誘導する作用を意味し、かかる作用は、例えばヒトへの有効成分の投与前後における成長因子の増強により判断する。ここで、「転写が誘導される際に」とは、例えばＨＧＦの転写はそれが必要な時期に行われており、前記有効成分によれば、ＨＧＦの転写が促進されている初期にその転写が更に促進され、その後ＨＧＦが過剰生産とはならず、従ってＨＧＦの生産が体内に必要な時に増強されるということを意味しており、これにより極めて安全にＨＧＦの産生誘導を行い得る。
本発明の治療剤又は予防剤においては、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質を更に含有させることができる。
本発明にいう「相乗的に増加させる物質」とは、本発明にかかる有効成分と該物質を併用すれば、該物質により転写誘導が積極的に行われ、結果として本発明にかかる有効成分の成長因子産生誘導作用が相乗的に増加されるものである。
本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質としては、かかる酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる作用を有する物質であれば特に限定はなく、例えばサイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、ミノキシジル、及び塩化カルプロニウムから選択される物質が例示される。また生姜等に含まれるショーガオール、ジンジャーオール等、ウコン等に含まれるクルクミン等も、ＨＧＦ産生誘導作用を増加する物質であり、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩のＨＧＦ産生誘導作用を相乗的に増加する物質として使用することができる。
サイトカイン類としては、前記ＩＬ−１等を挙げることができ、プロスタグランジン類としては、前記プロスタグランジンＥ１、Ｅ２等を挙げることができる。
また、シクロペンテン環を有する化合物としては下記式（ＩＩＩ）で表される化合物及びその誘導体が例示される。
これらは各々単独で若しくは２種以上混合して使用することができる。
例えば、下記式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）でそれぞれ表されるシクロペンテン環を有する化合物は、プロスタグランジンＥ１、Ｅ２と同様に、ＨＧＦ遺伝子の転写を誘導することができ、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩との相乗作用によりＨＧＦの産生を顕著に増加させることができる。すなわちＨＧＦの転写誘導作用を有するサイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物、生姜由来化合物、ウコン由来化合物から選択される物質と、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものとを混合物として併用することにより、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用が相乗的に増加され、非常に高いＨＧＦの産生誘導効果が得られる。
また当該混合物を成長因子産生誘導用の飲食品、又は飼料の原料として用いても良い。
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例えば、式（ＩＩＩ）で表される化合物の製造方法は国際公開第９８／１３３２８号パンフレット、式（ＩＶ）で表される化合物は国際公開第９８／３９２９１号パンフレット、式（Ｖ）で表される化合物は国際公開第９８／４０３４６号パンフレットにそれぞれ記載されており、これらに記載の方法により製造することができる。
式（ＩＩＩ）で表される化合物の製造方法はいかなる方法でもよく、化学合成法〔カーボハイドレートリサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．）、第２４７８巻、第２１７〜２２２頁（１９９３）、ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ）、第５５巻、第２８３８〜２８４４頁（１９７２）〕で合成しても良く、また、ウコン酸、ウロン酸誘導体、ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物、ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物含有物から選択される少なくとも１種の物の加熱処理物中に生成するシクロペンテノン、その精製物を使用することもできる。式（ＩＶ）で表される化合物は、例えば式（ＩＩＩ）で表される化合物とグルタチオンを反応させることにより得ることができる。また、式（Ｖ）で表される化合物は、例えば式（ＩＩＩ）で表される化合物と無水プロピオン酸と反応させることにより得ることができる。
本発明の治療剤又は予防剤において、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール又はこれらの塩の成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の含有量は、当該誘導作用を相乗的に増加させることができる程度であれば良く、特に限定はないが、通常、成人１日当たり、好ましくは０．００１〜２０００ｍｇ／ｋｇとなる量である。当該誘導作用を相乗的に増加させる物質は、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものと合わせて製剤化しても良く、又別に製剤化しても良い。製剤化の方法、投与の態様は、本明細書に記載の方法に準じて行えば良く、成長因子産生誘導が相乗的に増加するというような本発明の所望の効果が得られる。
本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩はまた、ヘパラナーゼ阻害活性を有し、がん転移抑制活性、血管新生抑制活性を有する。従って、これらのものから選択されるものを有効成分としてがん転移抑制剤、血管新生抑制剤を製造、提供することができる。特にフコイダン由来の式（Ｉ）で表される化合物は強力なヘパラナーゼ阻害作用とがん転移抑制作用を有し、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物はがん転移抑制剤として極めて有用である。また当該化合物を含有してなる飲食品はがん転移抑制用、血管新生抑制用の飲食品として価値の高いものである。
成長因子産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる成長因子産生誘導用の食品、飲料又は飼料は、その成長因子産生誘導作用により、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール又はこれらの塩に感受性を示す成長因子産生誘導を要する疾患の症状改善、予防若しくは後述のように生物の体長改善に極めて有用である。
尚、本発明の食品、飲料又は飼料、或いは後述の化粧料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料又は飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、飲料又は飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料又は飼料の原料を添加するという態様をいうものである。
また、成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる前記物質、例えば、サイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物から選択されるものをさらに含有させることが、前記疾患の症状改善、予防若しくは体長改善に資する観点から好ましい。
尚、本発明の飲食品においても、前記有効成分、成長因子、又は成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の好ましい態様は、前記治療剤又は予防剤の場合と同様である。特に本発明の飲食品又は飼料としては、肝疾患改善、神経性疾患改善、糖尿病改善という観点から、肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子産生誘導用の飲食品又は飼料が好ましい。
本発明の食品又は飲料の製造法は、成長因子産生誘導作用を有する当該食品又は飲料が得られる限り特に限定はない。例えば、配合、調理、加工等は一般の食品のものに従えばよく、かかる食品又は飲料の製造法により製造することができ、製造された食品又は飲料に成長因子産生誘導作用を有する本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるものが有効成分として含有されていれば良い。
本発明の食品又は飲料とは、特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料としては、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものが含有されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、成長因子産生誘導作用を有する藻類由来の硫酸化多糖及びその分解物、例えばフコイダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能を合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。
本発明の食品又は飲料中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるもの（有効成分）の食品又は飲料中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択できるが、有効成分の含有量は、例えば食品１００重量部当たり１０−９重量部以上、好ましくは１０−７〜２重量部であり、例えば飲料１００重量部当たり１０−９重量部以上、好ましくは１０−７〜２重量部である。
又、成人１日当たり、有効成分が０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇとなるように摂取すれば良く、経口的に成長因子産生誘導が行われるという本発明の所望の効果が得られる。
また本発明により、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有してなる生物用飼料が提供される。
さらに該飼料を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法が提供される。
また成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。
これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ペット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。
飼料としては成長因子産生誘導作用に基づく体調改善用飼料が例示される。
生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明において、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものは、生物の飼育効率、例えば生存率、肥育率、産卵率、産仔率、離乳率等を向上させる効果を有する。
成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものは通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ投与され、人工配合飼料の原料中に添加混合させるか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合させることができる。
成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの、最終的に得られた対象生物用飼料中の含有量は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．００１〜１５重量％の割合が適当である。例えば、肝機能を改善するということを目的とする場合には、０．０１〜１０重量％の割合が適当である。
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油、などの動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤等を原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。
本発明の飼料の製造方法に特に限定は無く、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中に成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール及びこれらの塩から選択されるもの有効量が含有されていればよい。
また成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものをプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。
水又は海水中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは０．００００１〜１重量％の割合が適当である。
また成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。
該飲料中の成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは０．０００１〜１重量％の割合が適当である。
成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とする生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の配合及び製造方法で作製すれば良い。
本発明が適用できる生物としては限定は無いが、養殖動物としては、馬、牛、豚、羊、山羊、らくだ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、駝鳥等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてはイヌ、ネコ等が挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを含有する飼料を摂取させること、又は成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものの含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物等の体調が改善され、その結果、対象生物の細菌性感染症、ウイルス性感染症が予防又は治療され、感染生物においてはその症状が顕著に改善される。また対象生物の健康が保持され、その生存率、成長率、産卵率、産仔率、離乳率、生育率等の改善が顕著である。
またこれらの養殖動物は（１）細菌感染による疾病が頻繁に発生し、限られた領域での養殖のために、伝染病が発生するとたちまちに感染して全滅する、（２）寄生虫病、栄養性疾病、環境性疾病、腫瘍等が発生し易い、（３）狭い飼育領域での養殖動物はストレスが大きく、飼育施設に体表をこすりつけ擦り傷を発生させ、個々に細菌や寄生虫が付着し易い、（４）またストレスにより餌食いが低下して、成長が遅くなる等の問題があったが、本発明の飼料はその体調改善作用により、狭い領域で飼育されている養殖動物のストレスを大幅に低減させ、飼育施設への体表のこすりつけが発生せず、食欲が旺盛になり、成長率、産仔率、産卵率、離乳率、疾病予防率等を顕著に向上させることができる。
成長因子産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩は化粧料の有効成分として有用であり、本発明により本発明で使用する酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分とする成長因子、例えばＨＧＦ産生誘導用の化粧料が提供される。
また、成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる前記物質、例えば、サイトカイン類、プロスタグランジン類、シクロペンテン環を有する化合物から選択されるものを含有させることが、所望の効果に資する観点から好ましい。
尚、本発明の化粧料においても、前記有効成分、成長因子、又は成長因子産生誘導作用を相乗的に増加させる物質の好ましい態様は、前記治療剤又は予防剤の場合と同様である。特に本発明の化粧料としては、上皮細胞の活性化という観点から、肝細胞増殖因子産生誘導用、インスリン様増殖因子産生誘導用、又は神経成長因子産生誘導用の化粧料が好ましい。
当該化粧料の有効成分としてはフコイダン及びその分解物が特に好適であり、例えばＦ−フコイダン及び／又はその分解物、又は式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする成長因子産生誘導作用、例えばＨＧＦ産生誘導作用を有するバイオ化粧品が提供できる。成長因子産生誘導用の化粧料における酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩の含有量は通常好ましくは０．０００１〜２０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％である。
本発明の成長因子産生誘導用、例えばＨＧＦ産生誘導用の化粧料は、公知の配合に準じて常法に従って製造することができる。本発明の成長因子産生誘導用の化粧料としては、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン又は浴用洗剤等を包含するものである。
本発明の化粧料を、それぞれの用途形態に応じて所望の量、例えばローション類であれば、例えばヒトの顔面全体に適用するような場合、１回の使用当たり好ましくは０．０１〜５ｇ、より好ましくは０．１〜２ｇ程度を用いれば、上皮細胞が活性化され、美肌効果が得られるという本発明の所望の効果が得られる。
本発明はまた、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する成長因子産生誘導剤を提供するものであるが、当該産生誘導剤は成長因子の機能研究、成長因子に関連する疾病用医薬のスクリーニングにも有用である。
さらに本発明は、酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、及びこれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する成長因子産生調整剤を提供する。
本発明の成長因子産生誘導剤、成長因子産生調整剤は、上記の有効成分を使用し、公知の製剤化方法にて製剤を製造すればよい。成長因子産生誘導剤としては、前記治療剤等もその一例として挙げることができる。また、本発明の成長因子産生調整剤とは、生体内において、成長因子の転写誘導初期に成長因子の転写を促進する製剤を意味する。本発明の成長因子産生調整剤により、成長因子の産生が必要な状態時にのみ、成長因子の産生が増強され、成長因子の産生が過剰とならないという著効を有する。
本発明に使用されるフコイダン及び／又はその分解物は特に強い成長因子産生誘導作用、成長因子産生調整作用を有し、本発明の製剤に使用する有効成分として極めて有用である。
従来ＨＧＦ産生誘導作用が知られていたヘパリンはＨＧＦのｍＲＮＡの転写は促進しないが、フコイダン及びその分解物は、ＨＧＦのｍＲＮＡの転写が促進されている初期段階で、そのｍＲＮＡの転写を更に促進する。生体内ではＨＧＦのｍＲＮＡは常には転写されておらず、必要な時期に転写されている。フコイダン及びフコイダン分解物、例えば後述の７−１２ＳＦｄ−Ｆは、生体内でＨＧＦの転写が促進されている初期にのみその転写を更に促進し、その後ＨＧＦが過剰生産とはならず、ＨＧＦの生産状況が体内に必要な時にのみ促進されるという点において極めて安全なＨＧＦ産生調整物質である。
従って、本発明の別の態様においては、前記治療剤又は予防剤、飲食品等を、そのまま成長因子産生誘導を調整する目的で使用することもできる。成長因子産生調整剤の投与量としては、成長因子産生を調整することが可能であれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる有効成分の投与量、例えばヒトに対する有効成分の投与量が、好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）となるような量を挙げることができる。
尚、本発明に使用する成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、例えばフコイダン及び／又はその分解物はラットへの経口投与において１ｇ／ｋｇを経口単回投与しても死亡例は認められない。またデキストラン硫酸ナトリウムも安全な化合物である。また本発明で使用するその他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖、酸性糖アルコール、又はこれらの塩は、その生理的有効量をラットに経口投与しても毒性は認められない。
また、別の態様として、本発明においては、成長因子産生誘導作用を有するヨモギ抽出物、ニガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分とする成長因子産生誘導を要する疾患の治療剤又は予防剤を提供してもよい。
また、成長因子産生誘導作用を有するヨモギ抽出物、ニガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分として含有する成長因子産生誘導用の飲食品、又は飼料を提供してもよい。
さらにまた、成長因子産生誘導作用を有するヨモギ抽出物、ニガウリ抽出物、アロエ抽出物、菊菜抽出物、クロレラ抽出物、及びスピルリナ抽出物から選択される抽出物を有効成分として含有する成長因子産生誘導用の化粧量を提供してもよい。
かかる植物、微生物からの前記抽出物のの抽出精製は、次のような公知の方法で行うことができる。原料である植物の果実、種子、葉、茎、根、根茎等、また微生物を、適当な時期に採取し、そのままか、通常空気乾燥等の乾燥工程を行った後、抽出原料とする。原料が植物の搾汁液や樹液の場合はそのまま抽出原料として用いることもできる。
上記の乾燥した植物体、微生物からの前記有効成分を含有する抽出物の抽出は、公知の方法により以下のように行う。原料を粉砕もしくは細切した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式の抽出方法で行うことができる。抽出溶媒としては、水、クロロホルムまたはエタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトンメチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等の親水性もしくは親油性の溶媒が、単独で、もしくは混合液として用いることができる。抽出温度は通常０〜１５０℃、好ましくは５〜１２０℃で行う。
抽出をバッチ式で行う場合、抽出時間は１０分〜２０日間程度であり、溶媒量は乾燥原料当たり通常１〜３０倍重量、好ましくは２〜２０倍重量用いる。抽出操作は、攪拌によっても浸漬放置によってもよく、また組み合わせてもよい。抽出操作は必要に応じて２〜３回繰り返してもよい。連続抽出法としては、還流冷却器とサイフォンを組み合わせたソックスレー抽出器を用いた方法等があげられ、溶媒量、抽出時間等は前記のバッチ式抽出法の条件と同様である。
本発明に使用される抽出物には、前期の操作で得た粗抽出液から不溶性残査をろ過もしくは遠心分離により取り除いたものも含まれる。また不溶性残査を活性成分として使用する場合もある。
粗抽出液からの活性成分の精製は、公知の植物由来の活性成分の精製方法であればどのようなものでもよいが、二相溶媒分離法、カラムクロマトグラフィー法等を単独または組み合わせて用いることが好ましい。
得られた抽出物を有効成分とし、目的に応じ薬剤、飲食品、飼料及び化粧料等を製造することができる。それらの製造は、本発明の第１〜第３の発明にかかる前記方法に準じて行なえばよい。
各目的に応じた製品中の抽出物の含有量はその成長因子産生誘導作用より決定することができるが、概ね通常製品中に好ましくは０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．０１〜３０重量％、さらに好ましくは０．１〜２０重量％である。
尚、本発明にかかる、これら抽出物は、その有効量をラットに経口投与しても毒性は認められない。
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。尚、実施例における各成分の配合についての％は重量％を意味する。
参考例１
（１）ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。
水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いで攪拌下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。
次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液２５リットルを調製した。
該抽出液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物１３ｇを得た。
上記方法に準じ、マ昆布乾燥粉砕物からマ昆布由来フコイダン乾燥物を調製した。また同様に、レソニア  ニグレセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｃｅ）の乾燥粉末（商品名シーウィード  パウダー：アンデス貿易株式会社販売）からレソニア  ニグレセンス由来フコイダン乾燥物を調製した。
（２）参考例１−（１）記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍｌ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜４９より１画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
第１図にガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。
参考例２
（１）アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース  ０．２５％、ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０２％、下記参考例２−（２）に記載の硫酸化多糖  ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌの硫酸化多糖に選択的に作用するエンド型硫酸化多糖分解酵素液を調製した。
（２）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々攪拌しながら９５℃で２時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間攪拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過機により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
（３）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記参考例２−（１）で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素液、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間攪拌した。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間攪拌し、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（樹脂量２００ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器にまり脱塩し、脱塩液５０５ｍｌを得た。
得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器にまり脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの下記式（ＶＩ）で表される化合物の乾燥品を得た。以下、該化合物を７−１２ＳＦｄ−Ｆと称す。
0004261071.tif 000005
（４）参考例１−（２）で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）の２．５％水溶液８０ｍｌに１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を１６ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２水溶液を１６ｍｌ、４Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を２４ｍｌ、参考例２−（１）で得たエンド型硫酸化多糖分解酵素液を８ｍｌ、蒸留水を１７６ｍｌ添加し、３０℃で３時間加熱した。この酵素処理Ｆ−フコイダン溶液を酵素処理Ｆ−フコイダンの最終濃度が２％になるようにロータリーエヴァポレーターで濃縮し、その後蒸留水中で透析操作を行い、２％酵素処理Ｆ−フコイダン水溶液を調製した。この試料をＨＰＬＣ（カラム：ＳＢ８０２．５、カラム温度：３５℃、移動相：５０ｍＭ  ＮａＣｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＲＩ  ＡＴＴ＝８）で分析した。その結果、試料中の約４０％が７−１２ＳＦｄ−Ｆであることが明らかになった。
参考例３
（１）乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残さを５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び参考例２−（１）で調製したアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）エンド型硫酸化多糖分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日攪拌し、次いで穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭの塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を培養し、該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
参考例４
参考例２−（２）で調製した硫酸化多糖１２０ｇを２０ｍＭの塩化カルシウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び１０Ｕの参考例２−（１）で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素を含む８リットルの２０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、２５℃で３日間攪拌し、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用い、上記緩衝液を添加しながら限外ろ過した。
限外ろ過内液に３４Ｕの参考例３−（２）で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素を添加して、２５℃で２日間攪拌し、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過を行い、水を添加しながら限外ろ過した。
ろ液を集め、エバポレーターで１．５リットルに濃縮後、脱塩装置により完全に脱塩し、あらかじめ３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した３リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、６リットルの同緩衝液で洗浄後、３０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に要した液量は４８リットルであった。溶出液は１８０ｍｌずつ分取し、その糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。また、２３２ｎｍにおける吸光度も同時に測定した。１３０ｍＭから１７０ｍＭの塩化ナトリウム溶出画分が一つのピークを形成したので、これらの画分を集め、脱塩装置により脱塩後、凍結乾燥し、５．８５ｇのオリゴ糖を得た。このオリゴ糖は質量分析により、分子量１１２８でありＮＭＲ分析により下記式（ＶＩＩ）で表される化合物であることを確認した。以下、該化合物を６−２Ｓと称す。
0004261071.tif 000006
参考例６
市販のワカメ  メカブの乾燥物１ｋｇを穴の径が１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残査を得た。残査を５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１０％となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ−生化学工業社製）を１２０００Ｕ添加後、室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、９０．５ｇのワカメ  メカブ由来フコイダンを得た。
参考例７
粉砕したヒバマタ（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）の乾燥物１ｋｇを、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残査を得た。残査を１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１００ｇの活性炭を添加し３０分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼＫを３０００Ｕ添加後、１０％となるようにエタノールを添加し室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、７１ｇのヒバマタ由来フコイダンを得た。
上記方法に準じ、アスコフィラム  ノドスム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）の乾燥粉末（商品名アルギンゴールド：アンデス貿易株式会社販売）からアスコフィラム  ノドスム由来フコイダンを調製した。
参考例８
参考例１−（１）記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダン２ｇを１００ｍｌの水に溶解し、そのｐＨをクエン酸にてｐＨ３に調整後、１００℃で３時間処理し、当該フコイダンの酸分解物を調製した。この加水分解物をセルロファインＧＣＬ−３００、又はセルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過で分子量分画し、分子画２５０００超（Ａ画分）、２５０００〜１００００超（Ｂ画分）、１００００〜５０００超（Ｃ画分）、５０００〜２０００超（Ｄ画分）、２０００〜５００超（Ｅ画分）、５００以下（Ｆ画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物及び酸分解物の各分画物を調製した。
参考例９
市販の塩蔵モズク５ｋｇを２０リットルのエタノールと混合し、はさみで細断した。１晩放置後ろ紙でろ過し、得られた残査を１２．５リットルの水に懸濁し、９５℃で２時間処理した。処理液をろ紙によりろ過後、３５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２．５％の塩化セチルピリジニウム溶液を２６００ｍｌ添加し３日放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に２．５リットルの３５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。得られた沈殿に４００ｍｌの４００ｍＭ  塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、８０％となるようにエタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。得られた残渣に５００ｍｌの塩化ナトリウム飽和８０％エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、１リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の２６０ｎｍの吸光度がゼロになるまで繰り返した（通常５回）。得られた残査を１．５リットルの２Ｍの塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離により除去し、あらかじめ２Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥセルロファインＡ−８００のカラムを素通しさせた。素通り画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、限外ろ過により溶液を２ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、２２．９ｇのモズク由来フコイダンを得た。
参考例１０
（１）乾燥したマクサ５０ｇをはさみで細断し、５００ｍｌの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを１リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に上記のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、３リットルとし、５ｇの活性炭を添加し、２５℃で１晩攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２００ｍｌに濃縮後、限外ろ過機により溶液交換して１０ｍＭ塩化ナトリウム溶液とした。溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、マクサ由来硫酸化多糖画分の乾燥物を２．３ｇ得た。
（２）参考例１０−（１）記載の方法により乾燥オゴノリ５０ｇよりオゴノリ由来硫酸化多糖４．４ｇを調製した。また、同様に乾燥ペテロクラディア  キャピラセラより、ペテロクラディア由来硫酸化多糖１．０ｇを調製した。
（３）−▲１▼  市販の乾燥レソニア  ニグレセンスの粉末１ｋｇを１０リットルの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを２０リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に１００ｇの活性炭、２．４リットルのエタノール、６，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫを添加し、２５℃で２２時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で１．２リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶液交換して１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液とした。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．０とし、２リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍＭの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、レソニア由来フコイダン画分の乾燥物を４１ｇを得た。
（３）−▲２▼  上記の凍結乾燥物６ｇを１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む６００ｍｌの２０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化した５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、１０リットルの同緩衝液で洗浄後、１００〜１６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に使用した液量は１３リットルで、分取は１本あたり５００ｍｌで行った。溶出画分のうち２５０ｍＭ、５３０ｍＭ、及び７００ｍＭ付近の塩化ナトリウム溶出画分をそれぞれ５００ｍｌずつ純水で透析し、凍結乾燥して凍結乾燥物をそれぞれＤＥＡＥ３３画分、ＤＥＡＥ３７画分、ＤＥＡＥ４０画分と命名し、それぞれ５７ｍｇ、２４ｍｇ、及び６２ｍｇ得た。
参考例１１
マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％のセチルピリジニウムクロリドを沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、攪拌しながら４リットルのエタノールを添加し、１時間攪拌後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのナマコ由来フコイダンを得た。
参考例１２
寒天末（ナカライテスク株式会社製）５００ｍｇを１００ｍｌの蒸留水に懸濁後、加熱し、寒天を溶解させた。その後、４５℃まで冷却し４５℃で保温した。
この寒天溶解液にＸ５０  βアガラーゼバッファー（ＦＭＣ社製：βアガラーゼに付属）を２ｍｌ添加し、１Ｕ／μｌ  βアガラーゼ（ＦＭＣ社製）１００μｌを添加した。この溶液を４５℃で２４時間保温後、２．５倍量のエタノールを添加し、冷却後遠心分離して、沈澱を回収した。この沈澱を乾燥し、２０ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶解液を凍結乾燥してパウダー状のアガロペクチン画分を調製した。
参考例１３
（１）スピルリナ  プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の乾燥菌体１０ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を５回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、遠心分離して上清を得た。この上清をさらにろ過し、濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のスピルリナ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
（２）乾燥スピルリナ粉末（発売：（株）スピルリナ研究所）２０ｇをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、４００ｍｌのアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。残渣を前記の操作と同じようにアセトン洗浄を３回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、９０％エタノールで４回、８０％エタノールで４回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。
エタノール洗浄残渣に６００ｍｌの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、室温で１８時間攪拌した。この混合物を１００００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を得た。上清に混入した不溶物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で３００ｍｌまで濃縮した後、２リットルの１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、１０％エタノール及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶媒置換し、スピルリナ高分子画分を２４０ｍｌを得た。
スピルリナ高分子画分を１０％エタノール及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（Φ３ｘ  １４．２ｃｍ）に添加して、同じ緩衝液３６０ｍｌでカラムを洗浄した後、０．０５Ｍ（２００ｍｌ）から２Ｍ（２００ｍｌ）までの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出液は一本あたり１０ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクションＮｏ．１４から３０までをスピルリナ硫酸化多糖画分−Ｉ（ＳＳＰ−Ｉ）、フラクションＮｏ．６９から７７までをスピルリナ硫酸化多糖画分−ＩＩ（ＳＳＰ−ＩＩ）、フラクションＮｏ．７８から８３までをスピルリナ硫酸化多糖画分−ＩＩＩ（ＳＳＰ−ＩＩＩ）、フラクションＮｏ．８４から９９までをスピルリナ硫酸化多糖画分−ＩＶ（ＳＳＰ−ＩＶ）とそれぞれ名付けた。ＳＳＰ−Ｉ、ＳＳＰ−ＩＩ、ＳＳＰ−ＩＩＩ及びＳＳＰ−ＩＶを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ２００ｍｇ、２６０ｍｇ、１００ｍｇ及び６０ｍｇであった。
（３）クロレラ  ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の乾燥菌体１０ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のクロレラ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
（４）乾燥クロレラ粉末（発売：（株）クロレラ・センター）２０ｇをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、４００ｍｌのアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。残渣を以上の操作と同じようにアセトン洗浄を３回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、９０％エタノールで４回、８０％エタノールで４回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。
エタノール洗浄残渣に６００ｍｌの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、室温で１８時間攪拌した。この混合物を１００００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を得た。上清に混入した不溶物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で３１０ｍｌまで濃縮した後、３リットルの１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、１０％エタノール及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶媒置換し、クロレラ高分子画分を２０３ｍｌを得た。
クロレラ高分子画分を１０％エタノール及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（Φ３ｘ  １４．２ｃｍ）に添加して、同じ緩衝液２９７ｍｌでカラムを洗浄した後、０．０５Ｍ（２００ｍｌ）から２Ｍ（２００ｍｌ）までの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出液は一本あたり１０ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクションＮｏ．６３から６８までをクロレラ硫酸化多糖画分−Ｉ（ＣＰＳ−Ｉ）と名付け、フラクションＮｏ．６９から７５までをクロレラ硫酸化多糖画分−ＩＩ（ＣＰＳ−ＩＩ）と名付けた。ＣＳＰ−Ｉ及びＣＳＰ−ＩＩを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ１４０ｍｇ及び２００ｍｇであった。
（５）市販のヨモギ（Ａｌｔｅｍｉｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ  ｐａｍｐａｎ：阪本漢方堂製）を粉砕したヨモギ粉末１０ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を５回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿とヨモギ上清画分を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のヨモギ由来の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
（６）乾燥ヨモギ葉（発売：阪本漢方堂）５０ｇをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、５００ｍｌのアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過して、残渣を得た。以上の操作を２度行い、得られた１００ｇのヨモギ葉の残渣をホモジナイザーに入れ、５００ｍｌのアセトンを加えて、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした。ホモジネートを濾紙で濾過し、残渣を得た。この操作を４回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、９０％エタノールで４回、８０％エタノールで４回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。
エタノール洗浄残渣に５リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、室温で１９時間攪拌した。この混合物を濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で２リットルまで濃縮した後、１０リットルの１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、５００ｍｌまで濃縮し、１０％エタノール及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶媒置換した。この液をビーカーに移し、１ｇの活性炭を入れ、室温で４０分間攪拌した後、１００００ｒｐｍ、４０分間遠心分離した。上清に混入した活性炭は濾紙で濾過して、除去した。このようにして、ヨモギ葉高分子画分を５６０ｍｌを得た。
ヨモギ葉高分子画分を１０％エタノール及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（Φ３．５  ｘ  ３１ｃｍ）に添加して、同じ緩衝液９４０ｍｌでカラムを洗浄した後、０．０５Ｍ（６００ｍｌ）から２Ｍ（６００ｍｌ）までの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出液は一本あたり１０ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクションＮｏ．１８０から２０２までをヨモギ葉酸性多糖画分（ＹＡＰ）と名付け、フラクションＮｏ．２０３から２７０までをヨモギ葉硫酸化多糖画分（ＹＳＰ）と名付けた。ＹＡＰを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥したところ、２５０ｍｇであった。
ヨモギ硫酸化多糖画分をさらに分画するために、ヨモギ葉硫酸化多糖画分を３リットルの１０％エタノール及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。透析した硫酸化多糖画分（３２７ｍｌ）を同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（Φ３ｃｍ  ｘ  １４．２ｃｍ）に添加した。カラムを２７３ｍｌの緩衝液で洗浄した後、０．１Ｍ（２００ｍｌ）−２Ｍ（２００ｍｌ）の塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。溶出液は１本あたり５ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクションＮＯ．１４０から１５４までをヨモギ葉硫酸化多糖画分−Ｉ（ＹＳＰ−Ｉ）と名付け、フラクションＮｏ．１５５から２００までをヨモギ葉硫酸化多糖画分−ＩＩ（ＹＳＰ−ＩＩ）と名付けた。ＹＳＰ−ＩとＹＳＰ−ＩＩをそれぞれ蒸留水に対して、充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ２０ｍｇ及び１３０ｍｇであった。
ＹＳＰ−ＩＩ（１１９．４ｍｇ）に１０％エタノールを５９．７ｍｌ及び０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、室温で一晩攪拌して溶解した。溶解したＹＳＰ−ＩＩは同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（φ２．５  ｘ  １０．２ｃｍ）に添加した。カラムを２００ｍｌの緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ（１００ｍｌ）−１Ｍ（１００ｍｌ）の塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。溶出液は１本あたり５ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクションＮｏ．５４から７０までをヨモギ葉硫酸化多糖画分−ＩＩ−２（ＹＳＰ−ＩＩ−２）と名付け、フラクションＮｏ．７１から９０までをヨモギ葉硫酸化多糖画分−ＩＩ−３（ＹＳＰ−ＩＩ−３）と名付け、フラクションＮｏ．９１から１２０までをヨモギ葉硫酸化多糖画分−ＩＩ−４（ＹＳＰ−ＩＩ−４）と名付けた。ＹＳＰ−ＩＩ−２、ＹＳＰ−ＩＩ−３及びＹＳＰ−ＩＩ−４をそれぞれ蒸留水に対して、充分透析し、凍結乾燥したところ、それぞれ３９．５ｍｇ、６１ｍｇ、５７．３ｍｇであった。
（７）市販の食用ニガウリをミキサーで粉砕した粉砕物を凍結乾燥し、ニガウリ乾燥物を得た。ニガウリ乾燥物１０ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を５回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状の硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
（８）市販のキダチアロエの葉５枚から透明状の葉肉部分を回収し、凍結乾燥した。このアロエ葉肉凍結乾燥物０．４８１ｇを１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のアロエ葉肉由来硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
一方、上記方法で透明状の葉肉部分を回収した残りの緑色の葉表面部分を粉砕後、凍結乾燥した。その凍結乾燥物３．４３ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状のアロエ葉表面物由来硫酸化多糖を含有する画分を調製した。
参考例１４
（１）Ｄ−（＋）−グルコース２００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆｅｒ  Ｔｒｉｏｘｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｐｙｒ・ＳＯ３：東京化成）１．０５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌した。反応液を水で希釈し、飽和水酸化バリウム水溶液でｐＨを中性付近に調整してから減圧乾固した。得られた濃縮物に再度水を添加し再び減圧乾固した。この操作をもう一度繰り返した。得られた濃縮物に少量の水を添加し遠心で硫酸バリウムの沈澱を除去し、得られた上清を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供した。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化Ｄ−（＋）−グルコース  ナトリウム塩７００ｍｇを調製した。
（２）Ｄ−（＋）−ガラクトース２４０ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．０５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化Ｄ−（＋）−ガラクトース  ナトリウム塩４０６ｍｇを調製した。
（３）Ｄ−（＋）−マンノース２００ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．０５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化Ｄ−（＋）−マンノース  ナトリウム塩７００ｍｇを調製した。
（４）マルトース２０５ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３８１６ｍｇ（５．２ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０度１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化マルトース  ナトリウム塩５２０ｍｇを調製した。
（５）マルトトリオース２００ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３７００ｍｇ（４．４ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０度１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化マルトトリオース  ナトリウム塩４２０ｍｇを調製した。
（６）トレハロース２５０ｍｇ（０．７３ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．１ｇ（７ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化トレハロース  ナトリウム塩７５０ｍｇを調製した。
（７）ラクトース２２２ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３７８５ｍｇ（４．９ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化ラクトース  ナトリウム塩４７６ｍｇを調製した。
（８）スクロース２２０ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３７８５ｍｇ（４．９ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化スクロース  ナトリウム塩４８１ｍｇを調製した。
（９）ラクツロース３７０ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．３８ｇ（８．８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化ラクツロース  ナトリウム塩１ｇを調製した。
（１０）メリビオース３７９ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．４３ｇ（９．０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化メリビオース  ナトリウム塩９５０ｍｇを調製した。
（１１）Ｄ−（＋）−キシロース１５０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３７７０ｍｇ（４．８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化Ｄ−（＋）−キシロース  ナトリウム塩３５０ｍｇを調製した。
（１２）２−デオキシ−グルコース２００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３９２０ｍｇ（５．８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化２−デオキシ−グルコース  ナトリウム塩５００ｍｇを調製した。
（１３）Ｄ−グルシトール１５０ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３９５５ｍｇ（６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化Ｄ−グルシトール  ナトリウム塩５７０ｍｇを調製した。
（１４）セロビオース１４７ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）をジメチルスルフォキシド５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３６５７ｍｇ（４．１３ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化セロビオース  ナトリウム塩２３０ｍｇを得た。
（１５）イソマルトース６２ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）をピリジン５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３２７５ｍｇ（１．７３ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化イソマルトース  ナトリウム塩１６２ｍｇを得た。
（１６）ツラノース２９３ｍｇ（０．８６ｍｍｏｌ）をピリジン５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１３１０ｍｇ（８．２２ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化ツラノース  ナトリウム塩８３５ｍｇを得た。
（１７）パラチノース３１５ｍｇ（０．８７５ｍｍｏｌ）をピリジン５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．３４ｍｇ（８．４ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化パラチノース  ナトリウム塩８４５ｍｇを得た。
（１８）α−Ｄ−タロース５６ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）をピリジン５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３３００ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）を添加した後、室温数分、６０℃１時間攪拌し、以下、参考例１４−（１）と同様の操作で、硫酸化Ｄ−タロース  ナトリウム塩１５０ｍｇを得た。
（１９）α−サイクロデキストリン７ｇの完全アセチル化体を無水酢酸と硫酸の混合液（４９：１）により処理することによりマルトヘキサオースの完全アセチル化体を得、これをメタノール中、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）  で脱アセチル化することにより、マルトヘキサオース１．５ｇを得た。マルトヘキサオース７９ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）、ピペリジン硫酸１．３３ｇをジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌに溶解し、８０℃２時間攪拌した。反応液を冷却後、分子量１０００カットの透析膜にて２日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供した。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化マルトヘキサオースナトリウム塩１６７ｍｇを調製した。
（２０）β−サイクロデキストリン２．２ｇの完全アセチル化体を無水酢酸と硫酸の混合液（４９：１）により処理することによりマルトヘプタオースの完全アセチル化体得、これをメタノール中、ＮａＯＭｅで脱アセチル化することにより、マルトヘプタオース０．５ｇを得た。マルトヘプタオース２０ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）、ピペリジン硫酸３２５ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、８０℃２時間攪拌した後、以下、参考例１４−（１９）と同様の操作で、硫酸化マルトヘプタオースナトリウム塩４５．６ｍｇを調製した。
（２１）マルトヘキサオースの完全アセチル化体をジクロロメタン中、トリクロロアセトニトリル、炭酸カリウム存在下攪拌することにより、アセチル化マルトヘキサオースのイミデート体を得た。アセチル化マルトヘキサオースのイミデート体とドデカノールをジクロロメタン中、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルを触媒として反応し、得られた反応物を脱アセチル化することによりドデシル−マルトヘキサオースを得た。ドデシル−マルトヘキサオース３７０ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１０ｍｌに溶解し、８０℃にて２時間攪拌した後、以下、参考例１４−（１９）と同様の操作で、硫酸化ドデシル−マルトヘキサオースナトリウム塩７００ｍｇを調製した。
（２２）スターチ２７６ｍｇをＤＭＳＯ１０ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３２．７６ｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、アセトンを添加し、生じた不溶画分をメタノールで数回洗浄した後、水で希釈して陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供じた。その結果得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し、硫酸化スターチナトリウム塩３５０ｍｇを調製した。
（２３）カードラン１１１ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３１．１１ｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、アセトンを添加し、生じた不溶画分を水で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水でｐＨ中性付近に中和した後、分子量１０００カットの透析膜にて１日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供じた後、減圧乾固することにより硫酸化カードランナトリウム塩１８０ｍｇを調製した。
（２４）ペクチン２６７ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、室温にてＰｙｒ・ＳＯ３２．６７ｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、参考例１４−（２３）と同様の操作で、硫酸化ペクチンナトリウム塩３８４ｍｇを調製した。
実施例１
（１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ１７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料として参考例１−（１）に記載のガゴメ昆布由来フコイダンを最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに２４時間培養した後、培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。
コントロールとして試料と同量の蒸留水を添加した。コントロールのＨＧＦ量は７．２ｎｇ／ｍｌであり、この値を１００％とした、各試料添加区のＨＧＦ産生量を表１に示す。なお、実験は全て２連で行い、その平均値を採用した。
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ガゴメ昆布由来フコイダン添加群は、蒸留水添加のコントロールより、有意にＨＧＦの産生量が増加していた。またヘパリン、あるいは低分子化ヘパリンを添加した場合に比べ、顕著にＨＧＦの産生量が増加することにより、ガゴメ昆布由来フコイダンはこれまでＨＧＦの産生誘導が確認されているヘパリンあるいは平均分子量約５０００の低分子化ヘパリンより高いＨＧＦ産生を促進する活性を有ることが示された。
（２）実施例１−（１）と同一の条件で、参考例１−（２）記載の方法で調製したＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、参考例２記載の方法で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ、参考例４記載の方法で調製した６−２Ｓ、参考例６記載の方法で調製したワカメ  メカブ由来フコイダン、及び参考例７記載の方法で調製したヒバマタ由来フコイダンのそれぞれのＨＧＦ産生誘導作用を測定した。その結果を表２〜４に示す。
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ガゴメ昆布由来フコイダンの分画物、即ち、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン、ヒバマタ由来フコイダン、ワカメ  メカブ由来フコイダン、Ｆ−フコイダン由来の７−１２ＳＦｄ−Ｆ、Ｕ−フコイダン由来の６−２Ｓにそれぞれ強いＨＧＦ産生誘導作用が認められた。また、参考例１−（１）記載のマ昆布由来フコイダン、レソニア  ニグレセンス由来フコイダン、参考例７記載のアスコフィラム  ノドスム由来フコイダン、参考例８記載の酸分解物、及びＡ〜Ｆ画分もそれぞれ強いＨＧＦ産生誘導作用が認められた。
（３）−▲１▼  参考例１−（１）記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダンの２％溶液をクエン酸又は硫酸でｐＨ３に調製し、それぞれを１００℃で加熱し、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後にそれぞれの加水分解液を調製し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）と同一の条件で測定した。なお試料は酸分解液の１０倍希釈液を用いた。
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（３）−▲２▼  実施例１−（３）−▲１▼で調製したガゴメ昆布由来フコイダンのクエン酸存在下での４時間加熱処理物をゲルろ過により分画した。
すなわちトヨパールＨＷ４０Ｃ  １．５リットルを充填したカラムを水で平衡化し、このカラムにガゴメ昆布由来フコイダンの加熱処理物１０ｍｌをアプライし、その後流速１ｍｌ／分で水で溶出した。最初の６８０ｍｌは、そのまま溶出し、その後１４ｍｌづつ分画し、加熱処理物のゲルろ過分画物を得た。
この分画物をＴＬＣ（溶媒、酢酸ブチル：酢酸：水＝３：４：３、検出剤オシオノール硫酸）で分析し、スポットのパターンより、分画１２〜１３、１６〜１７、２６〜４０等のゲルろ過分画として集め、凍結乾燥した。得られた各画分のの凍結乾燥物を、１００ｍｇ／ｍｌになるように水に再溶解し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）と同一の条件で測定した。
その結果、分画１２〜１３、及び分画１６〜１７の各々の分画物にＨＧＦ産生誘導活性が認められた。
分画１２〜１３の分画物は構造決定を行い、その分析値は、国際公開第９７／２６８９６号パンフレットに記載の下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物の分析値と一致し、グルクロン酸とマンノースの重合体にＨＧＦ産生誘導活性が認められた。
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（４）市販のデキストラン硫酸ナトリウム（シグマ社製）溶液を調製し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）記載の方法にしたがって測定した。表６に示すように、デキストラン硫酸ナトリウムはＨＧＦ産生誘導作用を示した。
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（５）市販のλ−カラギーナン（ナカライテスク社製）の溶液を調製し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）の方法に従って測定した。表７に示すようにλ−カラギーナンはＨＧＦ産生誘導作用を示した。
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（６）−▲１▼  市販のアルギン酸（和光純薬社製：膨潤性）の溶液を調製し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）の方法に従って測定した。表８に示すようにアルギン酸はＨＧＦ産生誘導作用を示した。
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（６）−▲２▼  同様に、アルギン酸（膨潤性、和光純薬社製：試料▲１▼）、アルギン酸（非膨潤性、和光純薬社製：試料▲２▼）、アルギン酸（１００〜１５０ｃｐ、和光純薬社製：試料▲３▼）、アルギン酸（３００〜４００ｃｐ、和光純薬社製：試料▲４▼）、アルギン酸（５００〜６００ｃｐ、和光純薬社製：試料▲５▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。表９に示したように、試料▲１▼から▲５▼は全てＨＧＦの産生を誘導した。以上のことより、酸性多糖であるアルギン酸にもＨＧＦ産生誘導活性があることが明らかになった。
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（６）−▲３▼  同様に、ペクチン酸（ナカライテスク社製）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。表１０に示したように、ペクチン酸はＨＧＦの産生を誘導した。
以上のことより、酸性多糖であるペクチン酸にもＨＧＦ産生誘導活性があることが明らかになった。
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（７）サケ精子ＤＮＡ（株式会社ニチロ社製）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。ＤＮＡは最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表１１に示したように、サケ精子ＤＮＡはＨＧＦ産生誘導活性を示した。
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（８）参考例９、１１で調製したモズク由来フコイダン、ナマコ由来フコイダンの溶液を調製し、そのＨＧＦ産生誘導作用を実施例１−（１）の方法に従って測定した。表１２に示すように各フコイダンはＨＧＦ産生誘導作用を示した。
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（９）参考例１０で調製したマクサ由来硫酸化多糖（試料▲１▼）、オゴノリ由来硫酸化多糖（試料▲２▼）、ペテロクラディア由来硫酸化多糖（試料▲３▼）の溶液を調製し、実施例１−（１）と同様の方法で、ＨＧＦ産生誘導活性を検討した。試料▲１▼、▲３▼は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように、試料▲２▼は最終濃度が１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表１３に示したように、試料▲１▼から▲３▼は全てＨＧＦの産生を誘導した。
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（１０）実施例１−（１）と同様の方法で、参考例１０−（３）で調製したレソニア由来フコイダン（試料▲１▼）、ＤＥＡＥ３３画分（試料▲２▼）、ＤＥＡＥ３７画分（試料▲３▼）、ＤＥＡＥ４０画分（試料▲４▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表１４に示したように、試料▲１▼から▲４▼は全てＨＧＦの産生を誘導した。
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（１１）実施例１−（１）と同一の条件で参考例３−（２）記載の硫酸化フコガラクタン、参考例１２記載のアガロペクチン、コンドロイチン硫酸Ｂ（生化学工業社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（生化学工業社製）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表１５〜１７に示したように、硫酸化フコガラクタン、アガロペクチン、コンドロイチン硫酸はＨＧＦの産生を誘導した。
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（１２）実施例１−（１）と同一の方法で参考例１３−（１）、１３−（３）、１３−（５）、１３−（７）、１３−（８）でそれぞれ調製したスピルリナ由来硫酸化多糖、クロレラ由来硫酸化多糖、ヨモギ由来硫酸化多糖、ニガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、及びアロエ葉表面物由来硫酸化多糖のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。スピルリナ由来硫酸化多糖、ヨモギ由来硫酸化多糖は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。クロレラ由来硫酸化多糖、ニガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、アロエ葉表面物由来硫酸化多糖はそれぞれ最終濃度が１、１０、１００、１０００μｇ／ｍｌになるように添加した。表１８〜２０に示したように、スピルリナ由来硫酸化多糖、クロレラ由来硫酸化多糖、ヨモギ由来硫酸化多糖、ニガウリ由来硫酸化多糖、アロエ葉肉由来硫酸化多糖、アロエ葉表面物由来硫酸化多糖はＨＧＦの産生を誘導した。
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（１３）実施例１−（１）と同様の方法で、参考例１３−（２）で調整したスピルリナ分画物ＳＳＰ−Ｉ（試料▲１▼）、ＳＳＰ−ＩＩ（試料▲２▼）、ＳＳＰ−ＩＩＩ（試料▲３▼）、ＳＳＰ−ＩＶ（試料▲４▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表２１に示したように、試料▲１▼から▲４▼は全てＨＧＦの産生を誘導した。
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（１４）実施例１−（１）と同様の方法で、参考例１３−（４）で調整したクロレラ抽出物のＣＳＰ−Ｉ画分（試料▲１▼）、ＣＳＰ−ＩＩ画分（試料▲２▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。試料▲１▼は最終濃度が１０、１００μｇ／ｍｌ、試料▲２▼は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表２２に示したように、試料▲１▼、▲２▼はＨＧＦの産生を誘導した。
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（１５）実施例１−（１）と同様の方法で、参考例１３−（６）で調整したヨモギ抽出物のＹＡＰ画分（試料▲１▼）、ＹＳＰ−Ｉ画分（試料▲２▼）、ＹＳＰ−ＩＩ画分（試料▲３▼）、ＹＳＰ−ＩＩ−２画分（試料▲４▼）、ＹＳＰ−ＩＩ−３画分（試料▲５▼）、ＹＳＰ−ＩＩ−４画分（試料▲６▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。表２３、表２４に示したように、試料▲１▼から▲６▼は全てＨＧＦの産生を誘導した。特に、ＹＳＰ−ＩＩ画分（試料▲３▼）、ＹＳＰ−ＩＩ−３画分（試料▲４▼）、ＹＳＰ−ＩＩ−４画分（試料▲５▼）に強いＨＧＦ産生誘導活性が確認された。
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（１６）実施例１−（１）と同一の方法で参考例１４で調製した硫酸化マルトース  ナトリウム塩、硫酸化マルトトリオース  ナトリウム塩、硫酸化ラクトース  ナトリウム塩、硫酸化スクロース  ナトリウム塩、硫酸化トレハロース  ナトリウム塩、硫酸化グルコース  ナトリウム塩、硫酸化ラクツロース  ナトリウム塩、硫酸化メリビオース  ナトリウム塩、硫酸化ガラクトース  ナトリウム塩、硫酸化マンノース  ナトリウム塩、硫酸化キシロース  ナトリウム塩、硫酸化２−デオキシ−グルコース  ナトリウム塩、硫酸化グルシトール  ナトリウム塩、硫酸化セロビオース  ナトリウム塩、硫酸化イソマルトース  ナトリウム塩、硫酸化ツラノース  ナトリウム塩、硫酸化パラチノース  ナトリウム塩、硫酸化タロース  ナトリウム塩、硫酸化マルトヘキサオース  ナトリウム塩、硫酸化マルトヘプタオース  ナトリウム塩、硫酸化ドデシル−マルトヘキサオース  ナトリウム塩、硫酸化スターチ  ナトリウム塩、硫酸化カードラン  ナトリウム塩、硫酸化ペクチン  ナトリウム塩のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌ、又は１０、１００、１０００μｇ／ｍｌ、又は１００μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。また、硫酸化していないそれぞれの糖もそれぞれの硫酸化糖と同濃度でＨＧＦ産生誘導活性を測定した。
表２５〜３４に示したように、硫酸化オリゴ糖、硫酸化単糖はＨＧＦの産生を誘導した。なお、硫酸化されていないそれぞれの糖は、ＨＧＦを誘導しなかった。
更に硫酸化ドデシル−マルトヘキサオース  ナトリウム塩の結果より、糖が脂質により修飾を受けていてもＨＧＦ産生誘導活性は保持されることが明らかになった。
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実施例２
（１）実施例１−（１）と同一の方法で参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンとプロスタグランジン、ＩＬ−１とのＨＧＦ産生誘導作用に対する相乗効果について検討した。
すなわち当該フコイダンとＰＧＥ１（和光純薬社製）、ＩＬ−１α（ジェンザイム社製）を同時に添加し、ＨＧＦ産生誘導活性の相乗効果を検討した。
フコイダン試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ＰＧＥ１は０．１、１μＭ、ＩＬ−１αは１ｎｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。
それぞれ、フコイダン試料あるいはＰＧＥ１、ＩＬ−１αの単独添加時の産生量と比較して、その相乗効果について検討した。
その結果を表３５、３６に示す。表３５、３６において、コントロールのＨＧＦ産生量を１００％として表した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。表３５、３６に示すようにフコイダンと、ＰＧＥ１又はＩＬ−１αの同時添加により、ＨＧＦの産生誘導に対する相乗効果が認められた。
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（２）実施例２−（１）と同様の方法で参考例２の７−１２ＳＦｄ−Ｆとプロスタグランジン、ＩＬ−１とのＨＧＦ産生誘導作用に対する相乗効果について検討した。７−１２ＳＦｄ−ＦとＰＧＥ１、ＩＬ−１αを同時に添加し、ＨＧＦ産生誘導活性の相乗効果を検討した。それぞれの７−１２ＳＦｄ−Ｆは最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。それぞれの７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加細胞にさらに同時にＰＧＥ１、ＩＬ−１αを添加した。ＰＧＥ１は、０．１、１μＭ、ＩＬ−１αは、０．１、１ｎｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。それぞれ、７−１２ＳＦｄ−ＦあるいはＰＧＥ１、ＩＬ−１αの単独添加の産生量と比較して相乗効果について検討した。ＨＧＦの産生量は、蒸留水のみを添加したネガティブコントロール１００％として表した。その結果を表３７、３８に示した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。
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実施例３
（１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁したＫＧ−１−Ｃ細胞（グリオーマ：ヒューマンサイエンス振興財団販売）を５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換した。その後、被検試料を添加し、さらに２０時間培養した後、培地を回収し、実施例１記載のＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ  キットを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。
被検試料はそれぞれ最終濃度が、参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるよう、ヘパリン（和光純薬社製）は１、１０μｇ／ｍｌになるように添加した。またコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行い、その平均値を採用した。結果は表３９に示す。表３９において、コントロールのＨＧＦ産生量を１００％として表した。
フコイダン試料を添加した細胞群は全て、蒸留水添加のコントロールより有意にＨＧＦの産生量が増加していた。さらに、ヘパリン添加よりも顕著にＨＧＦの産生量が増加していた。このことより、当該フコイダンには、これまでＨＧＦの誘導が確認されているヘパリンより高いＨＧＦの産生を促進する活性があることが示された
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（２）１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨＬ−６０細胞（前骨髄性白血病細胞：ＡＴＣＣ  ＣＣＵ−２４０）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れた。その後、１０ｎＭの１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ：ギブコＢＲＬ社製）を添加し、さらに、被検試料を同時に添加した。添加後２０時間培養した後、培地を回収し、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ  キットを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。
被検試料はそれぞれ最終濃度が、参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ヘパリンは、１、１０μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行い、その平均値を採用した。結果は表４０に示す。表４０においてコントロールのＨＧＦの産生量を１００％として表した。
フコイダン試料を添加した細胞群は全て、蒸留水添加のコントロールより有意にＨＧＦの産生量が増加していた。さらに、ヘパリン添加よりも顕著にＨＧＦの産生量が増加していた。このことより、当該フコイダンには、これまでＨＧＦの誘導が確認されているヘパリンより高いＨＧＦの産生を促進する活性があることが示された。
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実施例４
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞液５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに２４時間培養した。この培地を回収し、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ  キットを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。
被検試料である、参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。その結果を表４１に示す。表４１に示すように、当該フコイダン添加群の培地中のＨＧＦは、蒸留水添加のコントロールより有意に、フコイダンの濃度依存的にＨＧＦ量が増加していた。一方、細胞内のＨＧＦ量はフコイダンの濃度依存的に減少していた。次に、細胞内外のトータルＨＧＦ量は濃度依存的に増加していた。このことより、当該フコイダンには、ＨＧＦの産生を促進する活性があることと細胞中からのＨＧＦの遊離を促進する働きがあることが示された。
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実施例５
（１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞液５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに０、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間培養した後、培地を回収し、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ  キットを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。その結果を表４２に示す。表４２に示すように、フコイダン添加群は、コントロールより有意に時間依存的にＨＧＦの産生量が増加していた。
このことより、フコイダンには、高いＨＧＦの産生促進活性があり、ＨＧＦの産生量は、経時的に増加することが示された。
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（２）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間培養した後、培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、培地を回収した後、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。当該フコイダン添加群の培地中のＨＧＦ濃度は、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に時間依存的に増加していた。一方、当該フコイダン添加群の細胞内のＨＧＦ量は、添加後、４時間まで減少するが、その後は一定の低い値になった。蒸留水添加のネガティブコントロールでは、このような変化はなく、常に増加傾向にあった。このことより、当該フコイダンには、細胞からＨＧＦを遊離させる効果とＨＧＦの産生を促進する活性があり、ＨＧＦの産生量は、経時的に増加することが示された。これらの結果を表４３〜４５に示す。
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（３）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間培養した後、培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、培地を回収した後、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加群の培地中のＨＧＦ濃度は、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に時間依存的に増加していた。一方、７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加群の細胞内のＨＧＦ量は、添加後、しばらくは減少するがその後増加に転じた。蒸留水添加のネガティブコントロールでは、このような変化はなく、常に一定であった。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆには、細胞からＨＧＦを遊離させる効果と高いＨＧＦの産生を促進する活性があり、ＨＧＦの産生量は、経時的に増加することが示された。その後は一定の低い値になった。これらの結果を表４６〜４８に示す。
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（４）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに２４時間培養した。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＰＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果、表４９に示すように、７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加群の培地中のＨＧＦは、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意に７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的にＨＧＦの産生量が増加していた。一方で、細胞内のＨＧＦ量は７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に減少していた。さらに、細胞内外のトータルＨＧＦ量も濃度依存的に増加していた。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆには、細胞からＨＧＦを遊離させる効果とＨＧＦの産生を促進する活性があることが示された。この結果を表４９に示す。
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実施例６
（１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞液５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、最終濃度が０、１、１０μｇ／ｍｌになるようにシクロヘキシミド（タンパク合成阻害剤：ナカライテスク社製）を添加し、さらに、被検試料を添加した後、２４時間培養した。この培地を回収し、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。その結果を表５０に示す。表５０においてコントロールのＨＧＦの産生量を１００％として表した。
表５０に示すように、シクロヘキシミドを添加することにより、当該フコイダン添加群の培地中のＨＧＦ濃度はシクロヘキシミド濃度依存的に減少しており、その阻害率は、フコイダン無添加のコントロール群のシクロヘキシミドによる阻害と同程度にシクロヘキシミドの濃度に依存して阻害されていた。これらのことより、フコイダンによるＨＧＦの産生誘導にはタンパク合成が関与することが明らかになった。
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（２）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、最終濃度が０、１、１０μｇ／ｍｌになるようにシクロヘキシミド（タンパク合成阻害剤：ナカライテスク社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、２４時間培養した。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。また、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭＰＭＳＦ、  １μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。ＨＧＦの産生量は、ネガティブコントロール１００％として表した。阻害率は、各濃度の７−１２ＳＦｄ−Ｆのみを添加した際のＨＧＦの産生量を基準にし、シクロヘキシミド添加画分の阻害率（％）を算出した。７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果、表５１、５２に示すように、シクロヘキシミドを添加することにより、７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加群の培地中、細胞中と培地中の合計のＨＧＦ量はどちらもシクロヘキシミド濃度依存的に減少しており、これらのことより、７−１２ＳＦｄ−ＦによるＨＧＦの産生誘導は、単なる細胞からのＨＧＦの遊離ではなく、タンパク合成が関与することが明らかになった。
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（３）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、最終濃度が０、０．１、１μｇ／ｍｌになるようにアクチノマイシンＤ（ＲＮＡ合成阻害剤：シグマ社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、２４時間培養した。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。ＨＧＦの産生量は、ネガティブコントロール１００％として表した。阻害率は、各濃度のフコイダンのみを添加した際のＨＧＦの産生量を基準にし、アクチノマイシンＤ添加画分の阻害率（％）を算出した。参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。その結果、表５３に示すように、アクチノマイシンＤを添加することにより、当該フコイダン添加群の培地中のＨＧＦ濃度はアクチノマイシンＤ濃度に依存して阻害された。これらのことより、フコイダンによるＨＧＦの産生誘導にはＲＮＡ合成が関与する可能性が示唆され、単なる細胞からのＨＧＦの遊離ではないことが明らかになった。
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（４）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、最終濃度が０、０．１、１μｇ／ｍｌになるようにアクチノマイシンＤ（ＲＮＡ合成阻害剤：シグマ社製）を添加し、さらに、試料を添加した後、２４時間培養した。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。また、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。ＨＧＦの産生量は、ネガティブコントロール１００％として表した。阻害率は、各濃度の７−１２ＳＦｄ−Ｆのみを添加した際のＨＧＦの産生量を基準にし、アクチノマイシンＤ添加画分の阻害率（％）を算出した。７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果、表５４、５５に示すように、アクチノマイシンＤを添加することにより、７−１２ＳＦｄ−Ｆ添加群の培地中、細胞中と培地中の合計のＨＧＦ量はどちらもアクチノマイシンＤ濃度に依存して阻害された。これらのことより、７−１２ＳＦｄ−ＦによるＨＧＦの産生誘導にはＲＮＡ合成が関与する可能性が示唆され、単なる細胞からのＨＧＦの遊離ではないことが明らかになった。
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実施例７
（１）７週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラットを用い、外科的処置により部分肝切除を次のように行った。すなわちエーテル麻酔下でラットを開腹し、肝臓の約３０％部分を外科用縫合糸で根元の血管を結さつした後、切除した。開腹部は縫合針により縫合した。
参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンは切除の直後を一回目とし、１２時間間隔で腹腔内投与した。コントロール群には生理食塩水を腹腔内投与した。
肝切除後、２４時間あるいは７２時間目にラットを麻酔下で腹大動脈より採血し、０．１％エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムによる血漿を遠心にて分離した。血漿中のＨＧＦ量は、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ  キット（株式会社  特殊免疫研究所製）を用いて測定した。
結果を表５６示す。表中の数字は平均値±標準誤差を表し、（  ）内は一群あたりのラットの匹数を示す。また表中の＊はコントロール群と比較して５％以下の危険率で有意な差を有することを意味する。
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フコイダン投与群はコントロール群に比べ、肝切除２４時間後で、血漿中のＨＧＦ量が上昇する傾向がみられ、７２時間後では有意な上昇がみられた。
以上、フコイダンはＨＧＦ産生を誘導することにより、外科的手術を必要とする肝疾患において術後の速やかな再生を促すとともに、残存肝の機能回復に有用である。
（２）７週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラットを用い、外科的処置により部分肝切除を行った。エーテル麻酔下で開腹し、肝臓の約３０％部分を外科用縫合糸で根元の血管を結さつした後切除した。開腹部は縫合針により縫合した。参考例２−（４）で調製した酵素処理Ｆ−フコイダンは切除の直後を一回目とし、朝夕二回に分けて経口投与した。コントロール群には生理食塩水を投与した。肝切除２４時間後にラットを麻酔下で腹大動脈より採血し、０．１％エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムによる血漿を遠心にて分離した。血漿中のＨＧＦ量は、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（株式会社  特殊免疫研究所）を用いて測定した。
結果を表５７に示す。表中の数字は平均値±標準誤差を表し、（  ）内は一群あたりのラットの匹数を示す。また表中の＊は対照群と比較して１％以下の危険率で有意な差を有する群を意味する。
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酵素処理Ｆ−フコイダン投与群はコントロール群に比べ、肝切除２４時間後で有意な上昇がみられた。
以上、フコイダン、７−１２ＳＦｄ−Ｆ高含有のＦ−フコイダンはＨＧＦ産生を誘導することにより、外科的手術を必要とする肝疾患において術後の速やかな再生を促すともに、残存肝の機能回復に有用である。
実施例８
インスリン様増殖因子の一種であるｈ−ＩＧＦ−１を高発現するヒト新生児包皮上皮細胞株のＨｓ６８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３５）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：バイオウイタッカー社製）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を３×１０３個／ウェルとなるように上記培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が培養器に飽和になった時点で培地を捨て、０、１２．３、３７、１１１、３３３、１０００、又は３０００μｇ／ｍｌの参考例１−（２）記載のＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、又は参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンを含有する上記培地を２００μｌ／ウェルで加えた。２４時間のタイムコースを取って、１、４、１２、２４時間目に経時的に培養上清を回収し、Ｈｓ６８細胞に対するｈ−ＩＧＦ産生誘導活性を、ｈ−ＩＧＦ−１  ＥＬＩＳＡ  キット（ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。結果を表５８〜６１に示す。なお対照は試料無添加である。
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表５８〜６１に示すようにガゴメ昆布由来フコイダン、Ｉ画分、ＩＩ画分、及びＩＩＩ画分はｈ−ＩＧＦ−１産生誘導活性を示した。ｈ−ＩＧＦ−１産生誘導活性は、１２〜１００μｇ／ｍｌの試料添加により、１時間目で最高値を示した。なお各試料においてＨｓ６８細胞に対する毒性、増殖抑制活性は認められなかった。参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩についても同様のｈ−ＩＧＦ−１産生誘導活性を認めた。
実施例９
ラット繊維芽Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）で１．５×１０５細胞／ｍｌに懸濁し９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に培養した。
３日間培養後、培地をとり除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。これに参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダン例を終濃度が０、６２．５、２５０、１０００μｇ／ｍｌになるように添加し、２４時間培養した。コントロールとして蒸留水を添加したものを用いた。培養終了後、培養液中のＮＧＦの濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。ＮＧＦの産生量は、コントロールのＮＧＦの産生量を１００％として表した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。その結果、表６２に示す。表６２に示すように、ガゴメ昆布由来フコイダンは濃度依存的にＬ−Ｍ細胞の神経増殖因子産生を促進した。更にその分画物も同様の活性を示した。また参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩も同様のＮＧＦ産生誘導作用を示した。
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同様に、参考例１−（２）に記載のＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分について神経増殖因子産生の促進活性を測定し、各画分に活性を認めた。その結果を表６３に示す。また、参考例に記載の他の酸性多糖、その分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩も同様にＮＧＦ産生誘導作用を示した。
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実施例１０
（１）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用いた。参考例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μｌづつ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日８日間行った。投与開始９日目に皮膚を剥離し、皮膚中のＨＧＦ活性をＥＬＩＳＡキット（株式会社特殊免疫研究所）にて測定した。
結果を表６４に示す。表中の数字は、５例の平均値±標準誤差を表す。
皮膚中より抽出したＨＧＦ活性は、フコイダン塗布群では対照群より明らかに上昇し、フコイダン塗布によるＨＧＦ産生誘導作用が認められた。
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（２）後述の実施例２６−（１）記載の本発明の化粧水と、フコイダンを含有しない対照の化粧水とを比較して、２０〜３５才の成人女性２５人に対しブラインドで官能検査を行った。その結果、より有効と判定した人数を表６５に示す。
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以上の結果、フコイダンのＨＧＦ産生誘導作用により、フコイダン配合の本発明の化粧水は肌のしっとりさ、なめらかさ、はりのいずれも優れていることが示された。
実施例１１
（１）参考例１−（２）記載の方法で調製したＦ−フコイダン９８ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、室温にてピペリジン硫酸９８０ｍｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、分子量１０００カットの透析膜にて２日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）〕に供じた後、減圧乾固することによりＦ−フコイダンの高硫酸化体９８ｍｇを調製した。
（２）参考例２記載の方法で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ３４ｍｇをＤＭＳＯ４ｍｌに溶解し、その後、実施例１１−（１）と同様の操作で、７−１２ＳＦｄ−Ｆの高硫酸化体９８ｍｇを調製した。
（３）実施例１と同様の方法で、実施例１１−（１）で調製したＦ−フコイダンの高硫酸化体（試料▲１▼）、実施例１１−（２）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆの高硫酸化体（試料▲２▼）、参考例１−（２）で調製したＦ−フコイダン（試料▲３▼）、及び参考例２で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ（試料▲４▼）のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。それぞれの試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。
その結果を表６６に示す、表６６において、コントロールのＨＧＦ生産量を１００％として表した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。表６６に示したように、試料▲１▼〜▲４▼はＨＧＦの産生を誘導した。さらに、高硫酸化体において、そのＨＧＦ産生誘導活性は、未高硫酸化処理のものより上昇した。このことより、既に存在する天然の硫酸化糖もさらに硫酸化処理を施すことにより、そのＨＧＦ産生誘導活性が増強することが明らかになった。
なお、硫酸含量の定量は、それぞれの試料の１Ｎ  ＨＣｌ０．２ｍｌ（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を、１０５℃にて４時間加熱し、うち０．１ｍｌに０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液１．９ｍｌと１％塩化バリウム−０．５％ゼラチン溶液０．２５ｍｌを添加し２０分間放置後、５００ｎｍの吸光度を測定することにより行った。検量線は、０、１、３、５、７、１０、１５、２０ｍＭ硫酸ナトリウムの１Ｎ  ＨＣｌ溶液を標準試料として作成し、この検量線から各試料の硫酸含量（ＳＯ３換算）を求めた。この検量線は第２図に、各試料の硫酸含量は表６７に示す。
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実施例１２
１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞：Ｂｉｏ  Ｗｉｔｔａｋｅｒ社製）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れ、２４時間培養した。その後、１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換し、１０ｎＭのＴｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ：ギブコＢＲＬ社製）と試料を添加した。添加後２０時間培養した後、培地を回収し、Ｑｕｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製、Ｃｏｄｅ．ＲＳ−０６４１−００）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。ＨＧＦの産生量は、ネガティブコントロール１００％として表した。試料はそれぞれ最終濃度が、参考例１−（１）記載のフコイダンは１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ヘパリンは１、１０μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。誘導実験の培養は、試料添加と同時に１０ｎＭのＴＰＡを添加して行った。実験は全て３連で行い、その平均値を採用した。その結果を表６８に示す。フコイダンを添加した細胞群は全て、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意にＨＧＦの産生量が増加していた。さらに、ヘパリン添加よりも顕著にＨＧＦの産生量が増加していた。このことより、参考例１−（１）記載のフコイダンには、これまでＨＧＦの誘導が確認されているヘパリンより高いＨＧＦの産生を促進する活性があることが示された。
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実施例１３
１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＨｓ６８細胞（ヒト新生児包皮細胞：大日本製薬社製  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３５）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れ、２４時間培養した。その後、１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換し、１０ｎＭのＴＰＡと試料を添加した。また、ＴＰＡを添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果を表６９〜７１に示す。  ＴＰＡ無添加において顕著なＨＧＦの産生は認められなかった。しかし、ＴＰＡを添加した場合は、細胞中のＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に低下し、培地中のＨＧＦ量とトータルＨＧＦ量は７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に増加し、さらにトータルＨＧＦ量は、無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このようにｍＲＮＡが増加している場合のＨＧＦ量の増加は、ＴＰＡ無処理でｍＲＮＡ量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ｍＲＮＡの転写が促進され、大量のＨＧＦが必要とされている場合は、ＨＧＦの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。
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実施例１４
１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ  １７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０２−０２１）を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、６穴の細胞培養プレートに入れ、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２４時間培養を行った。その後、１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２２時間培養を行った。その後、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを、１μｇ／ｍｌになるようにＬＭヘパリン（Ｃｅｌｓｕｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、１μＭになるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かしたプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）（和光純薬工業社製）を添加したそれぞれの培養液に交換した。対照群として、ＤＭＳＯを添加した培地を使用した。尚、前記各添加物の溶媒がすべて１％になるように添加した。さらに培養を行い、０、２、４、６、８、１０、１２、２４時間目に全ＲＮＡの抽出を行った。全ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製、Ｒ０１９Ａ）を使用した。逆転写反応は全ＲＮＡに熱変性処理を行った後、ランダムプライマー（Ｎ６）（宝酒造社製、３８０１）を使用して３０℃で１０分、４２℃で３０分、９９℃で５分で行った。ＨＧＦのｍＲＮＡを検出するために、センスプライマーとして配列表の配列番号１に記載のプライマーを、アンチセンスプライマーとして配列表の配列番号２に記載のプライマーを用いた。このプライマーにより増幅される産物は４１５ｂｐである。また半定量的な実験を行うためにハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの検出も行った。プライマーは、センスプライマーとして配列表の配列番号３に記載のプライマーを、アンチセンスプライマーとして配列表の配列番号４に記載のプライマーを用いた。このプライマーにより増幅される産物は２７５ｂｐである。ＰＣＲは、ＰＪ９６００（パーキンエルマー社製）により行った。ＰＣＲサイクルは熱変性を９４℃で２分行った後、熱変性を９４℃で３０秒、アニーリングを５９℃で３０秒、伸長反応を７２℃で６０秒のサイクルを２４サイクル行った。反応後、２％アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶ照射下でゲルを観察した。  すべてのサンプルにおいてＨＧＦのｍＲＮＡが検出された。コントロールに比べて、ＰＧＥ１によるｍＲＮＡの誘導は認められたが、７−１２ＳＦｄ−Ｆ及びＬＭヘパリンによるｍＲＮＡの誘導は認められなかった。このことより、常にＨＧＦのｍＲＮＡを転写しているような状態においては、７−１２ＳＦｄ−Ｆ及びＬＭヘパリンの添加によるＨＧＦのｍＲＮＡの転写の促進は起こらないことが明らかになり、７−１２ＳＦｄ−Ｆ及びＬＭヘパリンは、過剰なＨＧＦの産生誘導を起こさないことが明らかになった。
実施例１５
実施例１３で用いたＨＳ６８細胞の代わりにＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞：Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を用い、その他は実施例１３と同様にして、ＮＨＤＦ細胞における７−１２ＳＦｄ−ＦによるＨＧＦ産生誘導活性について調べた。その結果を表７２〜７４に示す。
ＴＰＡ無添加において、細胞中のＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に低下し、培地中のＨＧＦ量とトータルＨＧＦ量は７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に増加し、さらにトータルＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆ無添加のコントロールより有意に増加していた。このことから、ＴＰＡ無処理のようなＨＧＦのｍＲＮＡが少ない場合でも、細胞表面のＨＧＦの遊離とＨＧＦの合成の両方を促進することが明らかになった。さらに、ＴＰＡを添加した場合は、細胞中のＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に低下し、培地中のＨＧＦ量とトータルＨＧＦ量は７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に増加し、さらにトータルＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆ無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このようにｍＲＮＡが増加している場合のＨＧＦ量の増加は、ＴＰＡ無添加でｍＲＮＡ量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ｍＲＮＡが少量の場合は少ないなりにＨＧＦの遊離と産生を促進し、さらに、ｍＲＮＡの転写が促進され、大量のＨＧＦが必要とされている場合は、ＨＧＦの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。
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実施例１６
１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞）を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、２ｍｌずつ６穴の細胞培養プレートに入れ、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２４時間培養した。その後、１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換し、１０ｎＭのＴｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ：ギブコＢＲＬ社製）と参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また、ＴＰＡを添加せず、７−１２ＳＦｄ−Ｆのみを添加する区分も同様に行った。さらに培養を行い、４、６、８、１０時間目に全ＲＮＡの抽出をおこなった。全ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲはＰＣＲのサイクルを２８サイクルにしたこと以外は、すべて実施例１４と同様に行った。反応後、２％アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶ照射下でゲルを観察した。
その結果、ＴＰＡ無添加の場合、ＨＧＦのｍＲＮＡの転写量は非常に少ないが、７−１２ＳＦｄ−Ｆの添加により、添加後、４時間で、若干のｍＲＮＡの転写量の上昇が見られた。一方、ＴＰＡの添加により、ＨＧＦのｍＲＮＡ量は、どの時間においても、顕著に上昇した。ＴＰＡと７−１２ＳＦｄ−Ｆを添加した場合は、ＴＰＡだけを添加した場合と比較して、ＨＧＦのｍＲＮＡ量が、添加後、４時間で、増加していることが明らかになったが、６時間では、７−１２ＳＦｄ−Ｆの添加による差は無かった。つまり、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ＨＧＦを必要として、ｍＲＮＡの転写が活発に行われはじめた初期において、顕著にその転写を促進するが、その後、その促進効果は、消失することが明らかになった。このことより、７−１２ＳＦｄ−ＦはＨＧＦが必要とされた瞬時のＨＧＦ産生を誘導し、その後過剰なＨＧＦ産生を誘導することは無いことが明らかになった。
実施例１７
１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れた。その後、１０ｎＭのＴＰＡを添加し、さらに試料を添加した。添加後２４時間培養した。また、ＴＰＡを添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄後、５００μｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に溶解した。さらに完全に溶解させるために超音波処理してから、遠心分離して上清（細胞抽出液）を調製し、細胞内のＨＧＦ量を培地中のＨＧＦ濃度と同様に測定した。参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆは、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果を表７５〜７７に示す。
ＴＰＡ無添加において、細胞中のＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度による変化は無かった。培地中のＨＧＦ量も、１００μｇ／ｍｌで増加が見られたものの、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度による顕著な変化は無かった。また、ＴＰＡを添加した場合は、細胞中のＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度による変化は無かったが、全体的に低い値になっていた。一方、培地中のＨＧＦ量とトータルＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に顕著に増加し、さらにトータルＨＧＦ量は、７−１２ＳＦｄ−Ｆ無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このようにｍＲＮＡが増加している場合のＨＧＦ量の増加は、ＴＰＡ無処理でｍＲＮＡ量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ｍＲＮＡの転写が促進され、大量のＨＧＦが必要とされている場合は、ＨＧＦの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。
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実施例１８
１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２ｍｌずつ６穴の細胞培養プレートに入れた。その後、１０ｎＭのＴＰＡと参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また、ＴＰＡを添加せず、７−１２ＳＦｄ−Ｆのみを添加する区分も同様に行った。さらに培養を行い、４、６、８、１０時間目に全ＲＮＡの抽出をおこなった。全ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲはＰＣＲサイクルを３２サイクルにしたこと以外は実施例１４と同様に行った。反応後、２％アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶ照射下でゲルを観察した。
その結果、ＴＰＡ無添加の場合、ＨＧＦのｍＲＮＡの転写量は非常に少ないが、７−１２ＳＦｄ−Ｆの添加により、添加後４時間で、若干のＨＧＦのｍＲＮＡ量の上昇が見られた。一方、ＴＰＡの添加ににより、ＨＧＦのｍＲＮＡ量は、どの時間においても、顕著に上昇した。ＴＰＡと７−１２ＳＦｄ−Ｆを添加した場合は、ＴＰＡだけを添加した場合と比較して、ＨＧＦのｍＲＮＡ量が、添加後、４時間で増加していることが明らかになったが、６時間では、７−１２ＳＦｄ−Ｆの添加による差は無かった。つまり、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ＨＧＦを必要としてｍＲＮＡの転写が活発に行われはじめた初期において、顕著にその転写を促進するが、その後その促進効果は、消失することが明らかになった。このことより、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ＨＧＦが必要とされた瞬時のＨＧＦ産生を誘導し、その後過剰なＨＧＦ産生を誘導することは無いことが明らかになった。
実施例１９
（１）市販の菊菜を凍結乾燥し菊菜凍結乾燥物を得た。この菊菜凍結乾燥物を粉砕した菊菜粉末１０ｇを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、ろ過して不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。その後、１００ｍｌのエタノールに懸濁してろ過し、不溶画分を回収する操作を３回繰り返した。この操作で得た不溶画分からエタノールを完全に除去し、１００ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１時間６０℃で保温した後、ろ過した。濾液に２．５倍量のエタノールを添加して、−２０℃で冷却した後、低温で遠心分離して沈殿を得た。この沈殿を蒸留水に溶解し、凍結乾燥してパウダー状の糖を含有する画分、菊菜抽出物を得た。
（２）実施例１−（１）と同様の方法で、実施例１９−（１）で調製した菊菜抽出物のＨＧＦ産生誘導活性を検討した。試料は最終濃度が１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。ＨＧＦの産生量は、ネガティブコントロール１００％として表した。その結果を表７８に示した。実験は全て２連で行いその平均値を採用した。表７８に示したように、菊菜抽出物はＨＧＦの産生を誘導した。
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実施例２０
実施例１−（１）と同様の方法で、参考例１３−（５）で調製したヨモギ上清画分のＨＧＦ産生誘導活性を測定した。ただし、ヨモギ上清画分は培地量の１０００分の１量を添加した。その結果を表７９に示した。その結果、ヨモギ抽出物は、エタノール沈殿で沈殿しない画分にもＨＧＦ産生誘導活性があることが明らかになった。このことより、エタノール沈殿で沈殿しない低分子画分にも活性があることが考えられた。
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実施例２１
（１）乾燥ヨモギ葉（発売：阪本漢方堂）５０ｇをホモジナイザー（日本精機社製）に入れ、５００ｍｌのアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズし、濾紙で濾過して、残渣を得た。以上の操作を２度行い、得られた１００ｇのヨモギ葉の残渣をホモジナイザーに入れ、５００ｍｌのアセトンを加えて、８０００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズし、濾紙で濾過し、残渣を得た。この操作を４回繰り返し、アセトン洗浄残渣を得た。アセトン洗浄残渣をアセトン洗浄と同じように、９０％エタノールで４回、８０％エタノールで４回洗浄し、エタノール洗浄残渣を得た。以上の操作を最初からもう一回行い、合わせて２００ｇのヨモギ葉のエタノール洗浄残渣を得た。
（２）エタノール洗浄残渣に１０リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、室温で１９時間攪拌し、濾紙で濾過して、粗抽出物（濾液）を得た。得られた粗抽出物を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外濾過装置で２リットルまで濃縮した後、２０リットルの１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムを加えながら限外濾過した。この後、６６８ｍｌまで濃縮し、１ｇの活性炭を入れ、室温で３０分攪拌した後、１００００ｒｐｍ、４０分遠心分離し、活性炭を除去した。上澄みに残った微量の活性炭はＮｏ．５ｃのフィルターで除去した。活性炭処理液から６６．８ｍｌを取り、蒸留水で充分に透析した後、凍結乾燥し、６７０ｍｇの乾燥物を得た。この乾燥物をヨモギ高分子画分（ＹＰＳ）と名付けた。残った６０１．２ｍｌの活性炭処理液を限外ろ過装置に入れ、１０％エタノール及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶媒置換して、溶媒置換ヨモギ高分子画分を得た。
（３）溶媒置換ヨモギ高分子画分を１０％エタノール及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイン  Ａ−８００カラム（Φ４．０５ｘ  ３７．８ｃｍ）に添加して、同じ緩衝液１２００ｍｌでカラムを洗浄した後、０．１Ｍ（１０００ｍｌ）から２Ｍ（１０００ｍｌ）までの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出液は一本あたり３０ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクション１３から３３までをヨモギ葉高分子画分−Ｉ（ＹＰＳ−Ｉ）と名付け、フラクションＮｏ．６９から７８までをヨモギ葉高分子画分−ＩＩ（ＹＰＳ−ＩＩ）と名付け、フラクションＮｏ．７９から１３７までをヨモギ葉高分子画分−ＩＩＩ（ＹＰＳ−ＩＩＩ）と名付け。ＹＰＳ−Ｉ、ＹＰＳ−ＩＩ、ＹＰＳ−ＩＩＩを蒸留水に対して充分透析し、凍結乾燥した。それぞれの凍乾物を５３０ｍｇ、４２０ｍｇ、３８０ｍｇを得た。
（４）ＹＰＳ−ＩＩＩをさらに分画するために、２００ｍｇのＹＰＳ−ＩＩＩを５０ｍｌの４Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、同じ緩衝液で平衡化したフェニル−セルロファインカラム（Φ３．１  ｘ  １４．３  ｃｍ）に添加した。２００ｍｌの同じ緩衝液で洗浄した後、それぞれ２００ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍｌの蒸留水、２００ｍｌのエタノールで溶出した。
溶出液は一本あたり１０ｍｌで分画した。溶出画分のうち、フラクション１から３２までをヨモギ葉高分子画分−ＩＩＩ−１（ＹＰＳ−ＩＩＩ−１）と名付け、フラクションＮｏ．３３から５３までをヨモギ葉高分子画分−ＩＩＩ−２（ＹＰＳ−ＩＩＩ−２）と名付け、フラクションＮｏ．５４から６６までをヨモギ葉高分子画分−ＩＩＩ−３（ＹＥＳ−ＩＩＩ−３）と名付けた。ＹＰＳ−ＩＩＩ−１、ＹＰＳ−ＩＩＩ−２、ＹＰＳ−ＩＩＩ−３を水に対して充分に透析後、凍結乾燥して、それぞれの凍乾物を２０．１１ｍｇ、３２．５９ｍｇ、１１３．７５ｍｇを得た。
（５）実施例１−（１）と同様の方法で、実施例２１−（２）、２１−（３）で調製したヨモギ抽出物の分画物、ＹＰＳ（試料▲１▼）、ＹＰＳ−Ｉ（試料▲２▼）、ＹＰＳ−ＩＩ（試料▲３▼）、ＹＰＳ−ＩＩＩ（試料▲４▼）のＨＧＦ産生誘導活性を測定した。その結果を表８０に示した。その結果、これらのヨモギ抽出物の分画物はＨＧＦ産生誘導活性を示した。
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（６）実施例１−（１）と同様の方法で、実施例２１−（４）で調製したヨモギ抽出物の分画物、ＹＰＳ−ＩＩＩ―１（試料▲１▼）、ＹＰＳ−ＩＩＩ―２（試料▲２▼）、ＹＰＳ−ＩＩＩ―３（試料▲３▼）のＨＧＦ産生誘導活性を測定した。その結果を表８１に示した。その結果、これらのヨモギ抽出物の分画物はＨＧＦ産生誘導活性を示した。
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実施例２２
参考例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダン３０ｇを蒸留水１２Ｌに室温で３０分間攪拌溶解した。この懸濁液を１００００×ｇで４０分間遠心分離し、その上液を集めた。これをメンブレンフィルター（０．２２μｍ）（ミリポア社製）で無菌ろ過し、凍結乾燥品２１．４ｇを得た。これをＴａｋａｒａコンブフコイダンＢｆ（以下、フコイダンＢｆと称す）とした。
実施例１−（１）と同様の方法で、フコイダンＢｆ（試料▲１▼）のＨＧＦ産生誘導活性を測定した。その結果を表８２に示した。ただし、実験は２連で行い、その平均値を採用した。その結果、フコイダンＢｆはＨＧＦ産生誘導活性を示した。
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実施例２３
（１）乾燥ガゴメコンブ５００ｇを細断し、１０Ｌの８０％エタノールで洗浄後、５０Ｌの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて、２５℃で３日間攪拌し、網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過してろ液約４５Ｌを得た。このろ液３４Ｌを８０℃で３時間加熱した後、５０℃まで冷却した。これを分子量１万カットの限外ろ過ＯＭＥＧＡカセット（フィルトロン社製）で液温５０℃に保ちながら濃縮した。さらに５０℃に加温した蒸留水５Ｌで脱塩を行い、同蒸留水２００ｍＬを加えて流路を２回洗浄して回収し濃縮液１．５Ｌを得た。これを凍結乾燥し、８．２ｇのＦ−ｒｉｃｈフコイダンを得た。
（２）実施例１−（１）と同様の方法で、実施例２３−（１）で調製したＦ−ｒｉｃｈフコイダン（試料▲１▼）のＨＧＦ産生誘導活性を測定した。その結果を表８３に示した。その結果、Ｆ−ｒｉｃｈはＨＧＦ産生誘導活性を示した。
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実施例２４
１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚繊維芽細胞）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、５００μｌずつ４８穴の細胞培養プレートに入れ、２４時間培養した。その後、１％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に交換し、１０μｇ／ｍｌまたは、１００μｇ／ｍｌのミノキシジル（和光純薬工業社製）と試料を添加した。なお、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダン添加時については、ミノキシジル１μｇ／ｍｌ添加についても試験を行った。また、ミノキシジルを添加せず、試料のみを添加する区分も同様に行った。この培地を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔを用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。試料として、実施例２２で調製したフコイダンＢｆ、実施例２３で調製したＦ−ｒｉｃｈフコイダン、参考例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。なお、フコイダンＢｆについては最終濃度が０．１μｇ／ｍｌ添加についても試験を行った。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。実験は全て３連で行いその平均値を採用した。その結果を表８４〜８６に示す。
ミノキシジル無添加において、培地中のＨＧＦ量は、フコイダンＢｆ、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダン、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に増加し、無添加のコントロールより有意に増加していた。このことから、ミノキシジル無処理のようなＨＧＦのｍＲＮＡが少ない場合でも、細胞表面のＨＧＦの遊離とＨＧＦの合成の両方を促進することが明らかになった。さらに、ミノキシジルを添加した場合は、培地中のＨＧＦ量は、フコイダンＢｆ、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダン、７−１２ＳＦｄ−Ｆの濃度依存的に増加し、無添加のコントロールより有意に増加していた。また、このようにｍＲＮＡが増加している場合のＨＧＦ量の増加は、ミノキシジル無処理でｍＲＮＡ量が少ない場合と比較して、非常に著しいものであった。このことより、フコイダンＢｆ、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダン、７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ｍＲＮＡが少量の場合は少ないなりにＨＧＦの遊離と産生を促進し、さらに、ｍＲＮＡが大量に存在し、大量のＨＧＦが必要とされている場合は、ＨＧＦの遊離と産生を顕著に促進することが明らかになった。
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実施例２５
マウス（ＣＤＦ１系雌性７週齢、体重：約２０ｋｇ）に、ガラクトサミン（２０ｍｇ／マウス）とＬＰＳ（リポポリサッカライド：０．０３μｇ／マウス）を同時に腹腔内投与し劇症肝炎による致死モデルを作製し、参考例１−（１）記載のフコイダンによる延命効果を検討した。フコイダンは蒸留水で１０％に調整し、１０ｍｌ／ｋｇ体重（フコイダンとして１ｇ／ｋｇ）の用量で、ガラクトサミンとＬＰＳ同時投与の１時間前および１時間後の２回強制経口投与した。コントロール群には同様に蒸留水を投与した。
実験開始７２時間後の生存率はコントロール群で８例中１例、フコイダン投与群で８例中７例であり、フコイダン投与により顕著な延命効果が認められた。さらに、生存例における血清生化学値にも改善効果が認められた。その結果を表８７に示した。
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実施例２６
（１）ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分当り１２０回転の速度で攪拌し、フコイダンを抽出し、抽出物を網目３２μｍのステンレス金網でろ過し、フコイダン溶液を調製した。
該フコイダン溶液４６リットルに、１ｇのパームオイル（花王社製：化粧品用）を１リットルのエタノールに溶解し調製した、パームオイル溶液１リットルを攪拌しながら添加し、更に１リットルのグリセロールを添加し、化粧水を調製した。
（２）実施例２６−（１）で調製したフコイダン溶液に、終濃度が０．０２％となるようにゼラチン及び香料を添加しゼラチン使用の化粧水を得た。また同様にコラーゲンを添加しコラーゲン使用の化粧水を得た。
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産業上の利用可能性
本発明により成長因子産生誘導活性を示す物質を有効成分として含有する成長因子産生を要する疾患に有効な医薬が提供される。該医薬は、生体内におけるＨＧＦ産生誘導活性、ｈ−ＩＧＦ産生誘導活性、ＮＧＦ・神経栄養因子産生誘導活性等を有し、肝炎、糖尿病、がん、神経性疾患等のこれらの成長因子の産生を必要とする疾患の治療剤又は予防剤として有用である。
更に、成長因子産生誘導作用を有する酸性多糖、硫酸化多糖、例えばフコイダン、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸高含有サメ軟骨抽出物、それらの分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩から選択されるものを用いて飲食品を製造することが可能になり、日常の飲食品として摂取することにより、成長因子の産生を要する疾患の症状改善等が可能となる。また同様の生理機能を有する飼料が提供される。
従って、ＨＧＦ産生誘導作用を有する、本発明で使用する酸性多糖、硫酸化フコース含有多糖、例えばフコイダン、それらの分解物、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩から選択されるものを有効成分とする機能性飲食品、機能性飼料は、その成長因子産生誘導作用により、生体の恒常性の維持に有用な機能性飲食品、又は飼料である。
本発明によりＨＧＦ産生誘導用バイオ化粧料も提供され、これらは肌の健康管理等に極めて有用である。更にがん転移抑制剤も提供される。
また成長因子の産生誘導剤も提供され、当該誘導剤は成長因子の機能研究、成長因子に関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。
第２図は、硫酸ナトリウム溶液を標準試料とした硫酸含量の検量線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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