【手続補正書】
【提出日】平成25年5月2日(2013.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする核酸リンカー。
【請求項２】
前記ポリｄＡ配列は、塩基数が２０以上４０以下である請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に結合している光反応架橋剤により架橋されている請求項１または２に記載の核酸リンカー。
【請求項４】
前記光反応架橋剤は、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項５】
前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項６】
前記アーム部が、前記アーム部を切断するための光切断部位または１本鎖核酸切断酵素部位を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項７】
前記一方のポリヌクレオチド鎖が、標識物質を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項８】
前記他方のポリヌクレオチド鎖は、５’末端に前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項９】
ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリデオキシヌクレオチドを有していることを特徴とする核酸リンカー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とするｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されている核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されているｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されていることを特徴とするプロテインアレイ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のプロテインアレイを標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体との相互作用を解析することを特徴とする解析方法。
【請求項１８】
標的分子と結合するタンパク質を同定する方法であって、
（ｇ）請求項１２に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、
を有することを特徴とする標的分子結合タンパク質の同定方法。
【請求項１９】
前記工程（ｈ）が、表面プラズモン共鳴法により行われる工程である請求項１８に記載の標的分子結合タンパク質の同定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記一方のポリヌクレオチド鎖が、標識物質を有することが好ましい。
（８）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記他方のポリヌクレオチド鎖が、５’末端に前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を有することが好ましい。
（９）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリデオキシヌクレオチドを有していることを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様における核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とする。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（１４）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されている核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１５）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されているｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１６）本発明の一実施態様におけるプロテインアレイは、先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されていることを特徴とする。
（１７）本発明の一実施態様における解析方法は、先に記載のプロテインアレイを標的分子と接触させ、前記標的分子とタンパク質複合体との相互作用を解析することを特徴とする。
（１８）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、標的分子と結合するタンパク質を同定する方法であって、
（ｇ）先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする。
（１９）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、前記工程（ｈ）が、表面プラズモン共鳴法により行われる工程であることが好ましい。