(57)【要約】本発明は、発現がｃ−ＭＡＦ発現の増加によって調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの決定に基づいた、がん患者において転移を生じる可能性を決定するための方法、ならびにがん患者、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、および甲状腺がんに罹患した被験体のための個別対応の治療をデザインするための方法に関する。本発明はまた、ｃ−ＭＡＦ発現の調整の誘導に基づいたがん転移への素因を同定するマーカー遺伝子の同定方法に関する。本発明はさらに、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんの転移の処置および／または予防におけるＰＴＨＬＨ阻害剤およびＰＯＤＸＬ阻害剤およびＲＥＲＧ活性化剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における乳がんの転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測する方法であって、該被験体から採取した腫瘍性組織のサンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現が該腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、基準値と比較した該１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が転移発生リスクの高さを示す、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子が、表１に取り上げた遺伝子および表２中に示す遺伝子から形成される群から選択され、該１つ以上の遺伝子の発現レベルの調整が表１に取り上げた１つ以上の遺伝子の発現の増加および／または表２中に示す１つ以上の遺伝子の発現の減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子が、ＰＴＨＬＨ、ＰＯＤＸＬ、およびＲＥＲＧの群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
乳がんに罹患した被験体のための個別化治療をｉｎ  ｖｉｔｒｏでデザインする方法であって、該被験体から採取した腫瘍性組織サンプルの、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの決定を含み、基準値と比較した該１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、該被験体が転移予防のための処置を受けるのに適切であること示す、方法。
【請求項５】
前記１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子が、１つ以上の表１中に含まれる遺伝子および／または１つ以上の表２中に示された遺伝子によって形成される群から選択され、１つ以上の表１由来の遺伝子の発現レベルの調整が発現の増加を示し、そして／または１つ以上の表２由来の遺伝子の発現レベルの調整が発現の減少を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子が、ＰＴＨＬＨ、ＰＯＤＸＬ、およびＲＥＲＧの群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乳がんが、ＥＲ＋がんおよびトリプルネガティブがんからなる群から選択される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記転移が骨転移である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記骨転移が骨溶解性転移である、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの決定を、該遺伝子のＲＮＡｍの発現レベルの決定中に実施する／行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して調整される前記１つ以上の遺伝子の発現レベルの決定を、該遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現レベルの決定中に実施する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
乳がんの転移の処置および／または予防のための医薬の調製のための、遺伝子の発現または該遺伝子の発現産物の活性を阻害するための薬剤の使用であって、乳がん腫瘍細胞中での該遺伝子の発現が、該細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して増加するか、前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して減少することによって該遺伝子が特徴づけられる、使用。
【請求項１３】
遺伝子発現を阻害する前記薬剤が、該遺伝子に特異的なsiＲＮＡ、該遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、該遺伝子に特異的なリボザイムから選択されるか、該遺伝子の発現産物の活性を阻害する薬剤が、該発現産物に特異的なインヒビター抗体、該発現産物のドミナントネガティブバリアント、および該発現産物由来の阻害性ペプチドによって形成される群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記遺伝子であって、その発現が乳房腫瘍内のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して増加するか、その発現が乳房腫瘍内のｃ−ＭＡＦの発現レベルの低下に応答して減少する遺伝子が、表１中に記載の遺伝子から選択される、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記遺伝子であって、その発現が乳房腫瘍内のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して増加する遺伝子が、ＰＨＴＬＨ遺伝子またはＰＯＤＸＬ遺伝子である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
乳がんの転移の処置および／または予防のための医薬の調製のための、遺伝子の発現または該遺伝子の発現産物の活性を刺激するための薬剤の使用であって、乳がん腫瘍細胞中での該遺伝子の発現が、該細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、該遺伝子の発現が、該細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加することによって該遺伝子が特徴づけられる、使用。
【請求項１７】
前記遺伝子の発現を刺激する前記薬剤が、該遺伝子のコード配列を含むポリヌクレオチドであるか、前記遺伝子産物の活性を刺激する前記薬剤が該遺伝子によってコードされるポリペプチドである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記遺伝子であって、その発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、その発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加する遺伝子が、表２中に記載の遺伝子から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記遺伝子であって、その発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少する遺伝子がＲＥＲＧ遺伝子である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記乳がんが、ＥＲ＋がんおよびトリプルネガティブがんによって形成される群から選択される、請求項１２〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
転移が骨転移である、請求項１２〜２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記骨転移が骨溶解性転移である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
乳がんに罹患している被験体における転移性向についての遺伝子マーカーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定する方法であって、
（ｉ）乳がんの原発性腫瘍サンプル中の候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦの発現レベルを決定する工程、および
（ｉｉ）該ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の調整に応答した乳がん細胞集団中の該遺伝子の発現レベルの変化を決定する工程を含み、
ここで、該遺伝子の発現レベルが該乳がんの原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦの発現に統計的に有意に相関し、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した発現レベルの変化が該遺伝子のレベルの変化に統計的に有意に相関する場合、これは、該遺伝子が被験体における転移の性向についてのマーカーであることを示す、方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）で決定された所与の遺伝子の発現が前記原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦレベルと直接相関し、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した発現レベルの変化が該調整に直接相関する場合、これは、該遺伝子のレベルの高さが転移性向を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｉ）で決定された所与の遺伝子の発現が前記原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦレベルと逆相関し、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した発現レベルの変化が該調整に逆相関する場合、これは、該遺伝子レベルの低下が転移性向を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ｃ−ＭＡＦ発現の前記調整が前記発現の増加である、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
発現の前記増加が前記ｃ−ＭＡＦの短いアイソフォームおよび／または長いアイソフォームの前記細胞集団の発現により達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｃ−ＭＡＦ発現レベルの前記調整が前記発現の減少である、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ｃ−ＭＡＦの短いアイソフォームおよび／または該ｃ−ＭＡＦの長いアイソフォームの発現が減少する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記乳がん細胞および／または前記原発性腫瘍がＥＲ＋またはトリプルネガティブである、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記転移が骨転移である、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記乳がん細胞が樹立細胞株に由来する、請求項２３〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記樹立細胞株がＭＣＦ７株である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的
本発明は、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんに罹患した被験体が転移を生じる可能性を決定する方法、さらに、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんに罹患した被験体のための個別対応の治療を生み出す方法に関する。かかる方法は、発現がｃ−ＭＡＦ遺伝子発現に関連する一群の遺伝子の発現レベルを決定する工程からなる。本発明はまた、転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんの処置および／または予防におけるＰＴＨＬＨインヒビターおよびＰＯＤＸＬインヒビターならびにＲＥＲＧアクチベーターの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乳がんは、全世界で２番目に一般的ながんタイプであり（１０．４％；肺がんに次ぐ）、且つ５番目に一般的ながんによる死因である（肺がん、胃がん、肝臓がん、および結腸がんに次ぐ）。乳がんは女性における最も一般的な死因でしょうか？２００５年、乳がんによる全世界の死亡者数は５０２，０００人であった（がん関連死の７％；全死亡率のほぼ１％）。世界的な症例数は、１９７０年代以来有意に増加しており、この現象の一部は西洋の現代的な生活様式による。
【０００３】
全ての細胞は、その表面に、その細胞質および核に受容体を有する。ホルモンなどの一定の化学伝達物質はこれらの受容体に結合し、それにより、細胞が変化する。以下の３つの主な受容体が乳がん細胞に影響し得る：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕ。これらの受容体の１つを含む細胞を命名する目的で、以下のように受容体が存在する場合に正符号を使用し、存在しない場合に負符号を使用する：ＥＲ陽性（ＥＲ＋）、ＥＲ陰性（ＥＲ−）、ＰＲ＋（陽性）、ＰＲ陰性（ＰＲ−）、ＨＥＲ２＋（陽性）、およびＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）。受容体の状態はタモキシフェンまたはトラスツズマブなどの特定の処置薬の使用の適合性を決定づけるので、受容体の状態は乳がんの全ての形態の重要な評価となりつつある。エストロゲン受容体（ＥＲ）のαアイソフォームは、乳がんと診断された症例のおよそ６５％で過剰発現される。この乳がん型を「ＥＲ陽性」（ＥＲ＋）という。この場合、エストロゲンおよびＥＲの結合ががん性哺乳動物細胞の増殖を促進させる。がん性ＥＲ＋細胞の広がりはこの刺激に高度に依存しており、このことが、ＥＲが治療標的として現在使用されている理由である。
【０００４】
固形腫瘍を有するがん患者のほとんどの死亡が後期の転移に原因するという事実があるので、腫瘍を転移させることができる分子の機構および細胞の機構を理解することは極めて重要である。最近の刊行物は、種々の転移性細胞型が一定の器官に指向性を示す方法に加えて、どのようにして転移がほとんど未知の複雑な機構によって引き起こされるかを例示している。これらの組織特異的転移性細胞は、これらの細胞が特定の器官に転移増殖することができるようにする一連の機能を獲得している。
【０００５】
特許出願ＥＰ１９６１８２５−Ａ１号は、がん性組織サンプル中の１つ以上のマーカーの発現レベルをｃ−ＭＡＦを含むコントロールサンプル中の対応する発現レベルと比較して定義する工程からなる、転移性乳がんの骨、肺、肝臓、および脳への出現を予測する方法を記載している。さらに、この文書は、乳がん患者の生存を決定するためにいくつかの遺伝子の同時の定義を必要とし、遺伝子サインが骨転移のない生存を予測する能力の間の関係が統計に有意でなかった。
【０００６】
Ｂｏｓ，Ｐ．Ｄ．ら（Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５９：１００５−１００９）は、乳がんの脳への転移に関与する遺伝子を記載している。
【０００７】
特許出願ＵＳ２００５／０１８１３７５号は、転移性腫瘍、特に、脳に転移する腫瘍を上方制御または下方制御するいくつかの遺伝子の発現レベルの検出に基づく転移性乳がんの検出方法を記載している。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ２０１０／０００９０７号は、乳がん患者における遠隔転移のゲノム予測因子として有用な遺伝子サインを記載している。
【０００９】
しかし、特定の乳がん（ＥＲ−またはＥＲ＋乳がんなど）に罹患した患者に転移が発生するか否かを診断および／または予測し、それにより、前記がんに罹患した被験体に適切な治療を使用することを可能にする遺伝子マーカーが当該分野で必要である。新規の予後因子の同定は、最も適切な処置の選択における指針として役立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１８１３７５号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／０００９０７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
本発明者らは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の変化の結果として発現が乳房腫瘍サンプル中で増加または減少する遺伝子群を同定した。機能獲得型実験および相関する臨床データを使用して、本発明者らは、これらの遺伝子、特に、発現がｃ−ＭＡＦの発現に逆に関連するＲＥＲＧ遺伝子ならびに発現がｃ−ＭＡＦ発現に直接関連するＰＴＨＬＨ遺伝子およびＰＯＤＸＬ遺伝子（ＥＲ＋乳がんの骨転移の予後マーカーなど）の役割を確認した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
それ故、第１の態様では、本発明は、被験体における転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、および甲状腺がんであるが、具体的には乳がんをｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測する方法であって、１つ以上の遺伝子であって、その発現が前記腫瘍のｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の、がん性組織のサンプル中の発現レベルを決定する工程からなり、ここで、標準値と比較した上記の１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が転移性がんの発生リスクの高さを示す、方法に関する。
【００１３】
本発明の第２の態様は、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんであるが具体的には乳がんに罹患した被験体のための個別対応の治療を生み出すためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１つ以上の遺伝子であって、その発現が前記腫瘍のｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の、がん性組織のサンプル中の発現レベルを決定する工程からなり、ここで、標準値と比較した上記の１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、問題の被験体が転移予防に適合する治療を受け入れることが可能であることを示す方法に関する。
【００１４】
本発明の第３の態様は、転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんであるが具体的には乳がんの処置および／または予防のための薬物の調製のための、遺伝子の発現またはこの遺伝子の発現産物の活性を阻害する薬剤の使用であって、前記遺伝子が、腫瘍性細胞、特に乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および甲状腺細胞であるが具体的には乳がん細胞中での遺伝子の発現がこれらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの低下に応答して減少するという事実によって特徴づけられる使用に関する。
【００１５】
本発明の第４の態様は、転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、および甲状腺がんであるが具体的には乳がんの処置および／または予防のための薬物の調製のための、遺伝子の発現またはこの遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤の使用であって、前記遺伝子が、腫瘍性細胞、特に乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および甲状腺細胞であるが具体的には乳がん細胞中での遺伝子の発現がこれらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの低下に応答して減少するという事実によって特徴づけられる使用に関する。
【００１６】
本発明の最後の態様は、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんであるが具体的には乳がんに罹患している被験体においてマーカー遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定する方法であって、
（ｉ）原発性がん腫瘍サンプル中、特に乳がんサンプル中の候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルを定義する工程、および
（ｉｉ）ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答したがん細胞集団、特に乳房細胞集団中の前記候補遺伝子の発現レベルの変化を決定する工程
を含み、
ここで、前記遺伝子の発現レベルが原発性がん腫瘍サンプル中、特に乳がんサンプル中のｃ−ＭＡＦ発現に関して統計的に有意であり、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した発現の変化が前記遺伝子のレベルの変化に関して統計的に有意である場合、前記遺伝子が、転移を生ずる被験体の性向についてのマーカーであることを示す、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】（Ａ）ＭＢＰ遺伝子の増加（左）または減少（右）の、ＥＲ＋乳がんを有する患者の骨転移の表現型との関連（「ＧＳＥＡ」アルゴリズム）。（Ｂ）原発性乳がん腫瘍から誘導される骨、肺、肝臓、および脳への一連の転移における、ＭＢＰ遺伝子の増加（左）または減少（右）の、骨転移の表現型との関連（「ＧＳＥＡ」アルゴリズム）。増加した遺伝子についてと同様の近似を、肺、脳、および肝臓への転移について行った。
【図１Ｂ】（Ａ）ＭＢＰ遺伝子の増加（左）または減少（右）の、ＥＲ＋乳がんを有する患者の骨転移の表現型との関連（「ＧＳＥＡ」アルゴリズム）。（Ｂ）原発性乳がん腫瘍から誘導される骨、肺、肝臓、および脳への一連の転移における、ＭＢＰ遺伝子の増加（左）または減少（右）の、骨転移の表現型との関連（「ＧＳＥＡ」アルゴリズム）。増加した遺伝子についてと同様の近似を、肺、脳、および肝臓への転移について行った。
【図２Ａ】（Ａ）中程度の転移性（親）ＥＲ＋のＭＣＦ７乳がん細胞および骨への高転移性を示す、その派生物（ＢｏＭ２）を使用した異種移植片型の実験マウスモデルにおける転移性病変における、増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現レベルの分析。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＭＡＦ発現とＲＥＲＧ遺伝子との間の関係の確認。（Ｃ）ＭＡＦを含むか含まないＢｏＭ２細胞を使用したマウスにおける骨転移。Ｋｉ−６７シグナルおよびカスパーゼ−３活性を、免疫組織化学によって定量する。（Ｄ）骨への転移性が高い細胞においてＲＥＲＧの増加が誘導される。ＲＥＲＧを発現する細胞派生物をマウスの左心室に注射し、骨の転移増殖を、生物発光画像化技術を使用してライブおよびリアルタイムで分析して、ＥＲ＋乳がんの骨転移におけるＭＡＦの存在下でのＲＥＲＧの寄与を確認する。
【図２Ｂ】（Ａ）中程度の転移性（親）ＥＲ＋のＭＣＦ７乳がん細胞および骨への高転移性を示す、その派生物（ＢｏＭ２）を使用した異種移植片型の実験マウスモデルにおける転移性病変における、増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現レベルの分析。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＭＡＦ発現とＲＥＲＧ遺伝子との間の関係の確認。（Ｃ）ＭＡＦを含むか含まないＢｏＭ２細胞を使用したマウスにおける骨転移。Ｋｉ−６７シグナルおよびカスパーゼ−３活性を、免疫組織化学によって定量する。（Ｄ）骨への転移性が高い細胞においてＲＥＲＧの増加が誘導される。ＲＥＲＧを発現する細胞派生物をマウスの左心室に注射し、骨の転移増殖を、生物発光画像化技術を使用してライブおよびリアルタイムで分析して、ＥＲ＋乳がんの骨転移におけるＭＡＦの存在下でのＲＥＲＧの寄与を確認する。
【図２Ｃ】（Ａ）中程度の転移性（親）ＥＲ＋のＭＣＦ７乳がん細胞および骨への高転移性を示す、その派生物（ＢｏＭ２）を使用した異種移植片型の実験マウスモデルにおける転移性病変における、増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現レベルの分析。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＭＡＦ発現とＲＥＲＧ遺伝子との間の関係の確認。（Ｃ）ＭＡＦを含むか含まないＢｏＭ２細胞を使用したマウスにおける骨転移。Ｋｉ−６７シグナルおよびカスパーゼ−３活性を、免疫組織化学によって定量する。（Ｄ）骨への転移性が高い細胞においてＲＥＲＧの増加が誘導される。ＲＥＲＧを発現する細胞派生物をマウスの左心室に注射し、骨の転移増殖を、生物発光画像化技術を使用してライブおよびリアルタイムで分析して、ＥＲ＋乳がんの骨転移におけるＭＡＦの存在下でのＲＥＲＧの寄与を確認する。
【図２Ｄ】（Ａ）中程度の転移性（親）ＥＲ＋のＭＣＦ７乳がん細胞および骨への高転移性を示す、その派生物（ＢｏＭ２）を使用した異種移植片型の実験マウスモデルにおける転移性病変における、増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現レベルの分析。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＭＡＦ発現とＲＥＲＧ遺伝子との間の関係の確認。（Ｃ）ＭＡＦを含むか含まないＢｏＭ２細胞を使用したマウスにおける骨転移。Ｋｉ−６７シグナルおよびカスパーゼ−３活性を、免疫組織化学によって定量する。（Ｄ）骨への転移性が高い細胞においてＲＥＲＧの増加が誘導される。ＲＥＲＧを発現する細胞派生物をマウスの左心室に注射し、骨の転移増殖を、生物発光画像化技術を使用してライブおよびリアルタイムで分析して、ＥＲ＋乳がんの骨転移におけるＭＡＦの存在下でのＲＥＲＧの寄与を確認する。
【図３Ａ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図３Ｂ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図３Ｃ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図３Ｄ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図３Ｅ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図３Ｆ】（Ａ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする異なる細胞型を注射したマウスにおける、Ｘ線を使用した骨溶解性骨転移数の定量。（Ｂ）異なるＭＡＦレベルを特徴とする細胞に原因する病変中の転移性病変の周界上の、破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ）細胞の数の定量。（Ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したＭＡＦ発現とＰＴＨＬＨ遺伝子との間の関係の確認。（Ｄ）１つの幹細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞の分化実験。ＲＡＮＫリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、および異なる集団由来の媒体の存在下で分化プロセスを実施する。親細胞、短いＭＡＦのアイソフォームおよび長いＭＡＦのアイソフォームを発現する親細胞、および、ＰＴＨＬＨ機能を中和するペプチドの存在下の後者の細胞。（Ｅ）マウスの実験的転移モデルにおける骨転移実験。ｃ−ＭＡＦを発現するか発現しない細胞を注射し（後者の場合、腹腔内アンタゴニストＰＴＨＬＨペプチドをマウスの左心室に１日２回（１２μｇ／マウス／日）接種した群）、それにより、骨への病変の出現および成長を定量する。左側のグラフは、エンドポイントシグナルの強度を示す。右側のグラフは、各群内の骨溶解性病変数を特定する。（Ｆ）左側のパネルは、（Ｅ）に記載の群を代表する骨におけるＸ線画像（白色領域は骨を欠く骨溶解性病変を示す）およびＴＲＡＰ＋染色（破骨細胞マーカー）を示す。白色の三角は破骨細胞を示す。右側のパネルは、周界によって標準化されたＴＲＡＰシグナル領域を示す。
【図４Ａ】（Ａ）骨髄由来の細胞（ＢＭＳＣ）層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ）細胞の数の蛍光による定量。（Ｂ）フィブロネクチンなどの細胞外肺基質タンパク質層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ番号１または番号２）細胞数の蛍光による定量。このケースでは、骨髄細胞の結合とは逆の効果が明らかである。（Ｃ）ｃ−ＭＡＦ発現の変化と共に発現が変化し、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した遺伝子のパネル。それらの中には、一過性で弱い細胞内結合過程に関与し得るセレクチンファミリー由来のタンパク質（糖タンパク質）を発現する遺伝子である、ＰＯＤＸＬがある。（Ｄ）骨髄細胞に結合するｃ−ＭＡＦを発現するがん性乳房細胞が担うＰＯＤＸＬ遺伝子機能の確認。インテグリン媒介接着の中性（ＲＧＥＳ）またはブロッキング（ＲＧＤＳ）ペプチドの競合効果との比較。この過程は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で再現されないので特異的である。
【図４Ｂ】（Ａ）骨髄由来の細胞（ＢＭＳＣ）層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ）細胞の数の蛍光による定量。（Ｂ）フィブロネクチンなどの細胞外肺基質タンパク質層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ番号１または番号２）細胞数の蛍光による定量。このケースでは、骨髄細胞の結合とは逆の効果が明らかである。（Ｃ）ｃ−ＭＡＦ発現の変化と共に発現が変化し、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した遺伝子のパネル。それらの中には、一過性で弱い細胞内結合過程に関与し得るセレクチンファミリー由来のタンパク質（糖タンパク質）を発現する遺伝子である、ＰＯＤＸＬがある。（Ｄ）骨髄細胞に結合するｃ−ＭＡＦを発現するがん性乳房細胞が担うＰＯＤＸＬ遺伝子機能の確認。インテグリン媒介接着の中性（ＲＧＥＳ）またはブロッキング（ＲＧＤＳ）ペプチドの競合効果との比較。この過程は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で再現されないので特異的である。
【図４Ｃ】（Ａ）骨髄由来の細胞（ＢＭＳＣ）層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ）細胞の数の蛍光による定量。（Ｂ）フィブロネクチンなどの細胞外肺基質タンパク質層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ番号１または番号２）細胞数の蛍光による定量。このケースでは、骨髄細胞の結合とは逆の効果が明らかである。（Ｃ）ｃ−ＭＡＦ発現の変化と共に発現が変化し、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した遺伝子のパネル。それらの中には、一過性で弱い細胞内結合過程に関与し得るセレクチンファミリー由来のタンパク質（糖タンパク質）を発現する遺伝子である、ＰＯＤＸＬがある。（Ｄ）骨髄細胞に結合するｃ−ＭＡＦを発現するがん性乳房細胞が担うＰＯＤＸＬ遺伝子機能の確認。インテグリン媒介接着の中性（ＲＧＥＳ）またはブロッキング（ＲＧＤＳ）ペプチドの競合効果との比較。この過程は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で再現されないので特異的である。
【図４Ｄ】（Ａ）骨髄由来の細胞（ＢＭＳＣ）層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ）細胞の数の蛍光による定量。（Ｂ）フィブロネクチンなどの細胞外肺基質タンパク質層に結合するｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルが高い（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）または低下した（ｓｈＭＡＦ番号１または番号２）細胞数の蛍光による定量。このケースでは、骨髄細胞の結合とは逆の効果が明らかである。（Ｃ）ｃ−ＭＡＦ発現の変化と共に発現が変化し、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した遺伝子のパネル。それらの中には、一過性で弱い細胞内結合過程に関与し得るセレクチンファミリー由来のタンパク質（糖タンパク質）を発現する遺伝子である、ＰＯＤＸＬがある。（Ｄ）骨髄細胞に結合するｃ−ＭＡＦを発現するがん性乳房細胞が担うＰＯＤＸＬ遺伝子機能の確認。インテグリン媒介接着の中性（ＲＧＥＳ）またはブロッキング（ＲＧＤＳ）ペプチドの競合効果との比較。この過程は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で再現されないので特異的である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
一般的な表現および用語の定義
「ｃ−ＭＡＦインヒビター」は、本発明中で使用する場合、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現を部分的または完全に阻害すること（前記遺伝子の発現が引き起こされることからの予防（ｃ−ＭＡＦ遺伝子の転写の破壊および／またはｃ−ＭＡＦ遺伝子発現に由来するｍＲＮＡの翻訳の遮断）およびｃ−ＭＡＦタンパク質活性の直接的阻害の両方）が可能な任意の分子をいう。ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現インヒビターを、国際特許出願ＷＯ２００５／０４６７３１号に例示の推定インヒビターがｃ−ＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖促進能力を遮断する能力に基づいた、ＷＯ２００８０９８３５１号に記載のｃ−ＭＡＦを発現する細胞中でサイクリン−Ｄ２プロモーターまたはｃ−ＭＡＦ応答領域（ＭＡＲＥまたはｃ−ＭＡＦ応答エレメント）を含むプロモーターの調節下で推定インヒビターがレポーター遺伝子の転写能力を遮断する能力に基づいた、またはＵＳ２００９０４８１１７Ａ号に記載のＮＦＡＴｃ２およびｃ−ＭＡＦを発現する細胞中でＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激に応答したＩＬ−４プロモーターの調節下で推定インヒビターが遺伝子の発現を遮断する能力に基づいた方法を使用して同定することができる。
【００１９】
本発明の文脈では「インヒビター抗体」は、特異的様式で発現産物に結合し、そのタンパク質の１つ以上の機能を阻害することができる抗体を意味する。
【００２０】
用語「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）は、ＲＮＡ干渉を誘導する二重鎖の小さなＲＮＡインヒビターをいう。これらの分子は長さが異なり（一般に、１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖内のその標的ｍＲＮＡとの相補性の程度が異なり得る。全てではないがいくつかのｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端上の顕著な不対塩基を特徴とする。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２つの個別の鎖の二重鎖を含む。本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ分子に制限されないが、モルホリンなどの１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを有する核酸も含まれる。
【００２１】
用語「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、２本の鎖が一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドを破壊することなく鎖によって結合されて二重鎖構造を形成するｄｓＲＮＡをいう。
【００２２】
用語「遺伝子発現の増加」は、遺伝子の発現レベルが、コントロールサンプル中の同一遺伝子の発現レベルに対応する標準値または対照値と比較して高いという事実をいう。本発明によれば、遺伝子の発現レベルは、患者サンプルのレベルが、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％：少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて増加した場合に、標準値と比較して高いと見なされる。
【００２３】
「ｃ−ＭＡＦ」は、本発明中で使用される場合、ホモ二量体またはヘテロ二量体に作用する、ロイシンジッパーを含む転写因子である「ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫がん遺伝子ホモログ」（トリ）、ＭＡＦまたはＭＧＣ７１６８５）としても公知の遺伝子をいう。ＤＮＡ結合部位に応じて、コードされたタンパク質は、転写アクチベーターまたは転写リプレッサーであり得る。ｃ−ＭＡＦをコードするＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセス番号ＮＧ＿０１６４４０（２０１１年１２月１８日に一致するＮＣＢＩのバージョン）に記載されている。前述のＤＮＡ配列に２つの伝令ＲＮＡの転写が続き、これら２つの各々によりｃ−ＭＡＦタンパク質のアイソフォームであるアイソフォームαまたは１（長いｃ−ＭＡＦのアイソフォームに対応する）およびアイソフォームβまたは２（短いｃ−ＭＡＦのアイソフォームに対応する）のうちの１つに取って代わられる。前述の各アイソフォームの相補ＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセス番号ＮＭ＿００５３６０．４およびＮＭ＿００１０３１８０４．２（２０１１年１２月１８日に一致するＮＣＢＩのバージョン）にそれぞれ記載されている。
【００２４】
用語「がん」または「癌」または「腫瘍」は、隣接組織に侵入して遠隔器官に広がることができる異常細胞の調節されない増殖によって特徴づけられる疾病をいう。この用語には、乳房、心臓、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、肝胆道系および肝臓のがん；さらに、腫瘍（腺腫、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、膠芽細胞腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、肝胆道がん、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、および奇形腫などが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、この用語には、末端部黒子黒色腫、日光角化症腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド、癌、癌肉腫、胆管癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質部肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫、ユーイング肉腫、限局性結節性過形成、胚細胞腫瘍、膠芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌、肝胆道がん、インスリノーマ、上皮内新形成、扁平上皮細胞上皮内新形成、侵襲性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、粘表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、下垂体腫瘍、プラズマ細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小球性癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮がん、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、疣状癌、ビポーマ、ウィルムス腫瘍、脳内がん、頭頸部がん、直腸がん、星状細胞腫、膠芽細胞腫、小球性がんおよび非小球性がん、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺がん、アンドロゲン依存性転移性前立腺がん、および乳がんが含まれる。特定の発明に関して、がんは、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんをいうが、具体的には乳がんをいう。
【００２５】
表現「結腸がん」は、結腸、直腸、および虫垂の細胞の任意の悪性増殖性障害をいう。結腸がんという用語には、以下の疾病の病期のいずれかが含まれる。
−病期０：腸最内層中の初期のがん
−病期１：腸内層中のがん
−病期２：結腸筋肉壁を介して進行したがん
−病期３：リンパ節に進行したがん
−病期４：がんが他の器官に進行している。
【００２６】
表現「乳がん（ｃａｎｃｅｒ  de mama）」、「乳がん（ｃａｎｃｅｒ mamario）」、または「乳房がん（ｃａｎｃｅｒ de seno）」は、乳房組織に由来するがん型をいう。用語「乳がん」には、ＴＮＭシステムにしたがって任意の期に分類されたがんが含まれる。予後は期分類の結果と密接に関係し、期分類は、臨床試験および医療行為の両方において患者の処置を割り当てるためにも使用される。期分類に関する情報を以下に示す。
【００２７】
・ＴＸ：原発性腫瘍の評価不可能。Ｔ０：原発性腫瘍の証拠なし。Ｔis:上皮内癌、非侵襲性  Ｔ１：腫瘍は２．０ｃｍまたはそれより小さい。Ｔ２：腫瘍は２ｃｍを超えるが、５ｃｍ以下である。Ｔ３：腫瘍は５ｃｍを超える。Ｔ４：胸壁または皮膚上に成長した任意のサイズの腫瘍、炎症性乳がん。
・ＮＸ：隣接リンパ節転移の評価不可能。Ｎ０：がんがリンパ節へ広がっていない。Ｎ１：がんが１〜３つの腋窩リンパ節または１つの内胸リンパ節へ広がっている。Ｎ２：がんが４〜９つの腋窩リンパ節または複数の内胸リンパ節へ広がっている。Ｎ３：以下のうちの１つを適用する：
・１０またはそれを超える腋窩リンパ節にがんが広がっているか、鎖骨直下のリンパ節にがんが広がっているか、鎖骨上部のリンパ節にがんが広がっているか、腋窩リンパ節ががんに侵され、且つ内乳房リンパ節に広がっているか、４つまたはそれを超える腋窩リンパ節ががんに侵され、且つ内胸リンパ節生検またはセンチネルリンパ節生検で最少量のがんが見いだされる。
【００２８】
・Ｍｘ:遠隔進展（転移）の存在の評価が不可能。Ｍ０：遠隔進展なし。Ｍ１：鎖骨上リンパ節が含まれない遠隔器官への進展が起こっている。
【００２９】
表現「肺がん」または「肺のがん」または「肺癌」は、任意の肺のがんをいい、非小細胞肺がん、非小球性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および小細胞肺がんが含まれる。
【００３０】
表現「腎臓がん」または「腎がん」または「腎癌」は、腎臓細胞の任意の悪性増殖性障害をいう。
【００３１】
表現「甲状腺がん」または「甲状腺癌」は、甲状腺の任意の増殖性障害をいい、甲状腺乳頭癌および濾胞性甲状腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
「統計的に有意な相関」は、２つの事象（候補遺伝子の発現レベルおよびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベル）について言及するために本明細書中で使用される場合、これらの事象が関連し、変化が無作為でない確率が高いことを意味する。
【００３３】
表現「がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんに罹患した被験体、好ましくは乳がんに罹患した被験体における転移性がん発症の可能性を決定する」は、前記被験体に影響を及ぼすがんが将来的に転移するようになるか否かを決定するための証拠の使用をいう。本発明の文脈では、指標は、標準値と比較してｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して発現が調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化である。「遺伝子の発現レベルの変化」は、標準値と比較した遺伝子の発現レベルの上方または下方のいずれかの変動をいう。それ故、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんであるが、具体的には乳がんに罹患した被験体の転移の発生が「高い」、「増加した」、または「増強した」可能性は、標準値と比較したｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して発現が調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化に起因する。
【００３４】
用語「遺伝子発現の減少」は、遺伝子の発現レベルが、コントロールサンプル中の同じ遺伝子の発現レベルに対応する標準値または対照値と比較して低下または減少した場合をいう。本発明の目的のために、標準値と比較した遺伝子の発現レベルは、患者サンプル中のレベルが、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％：少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて下がる場合に低下したと見なされる。
【００３５】
用語「マーカー遺伝子」または「情報遺伝子（gen informativo）」は、本発明中で使用される場合、遺伝子自体が異なる表現型を有する集団中で、差次的様式で発現する遺伝子をいい、個別または他の遺伝子と組み合わせたその差次的発現が、無作為で期待されるよりも高い程度で特異的な表現型に関連する。
【００３６】
ポドカリキシン様遺伝子としても公知の「ＰＯＤＸＬ遺伝子」は、シアロムチンファミリーの一部を形成するタンパク質をコードし、糸球体足細胞の重要成分である遺伝子をいう。足細胞は、糸球体基底膜の外面を覆う指状突起を有する高度に分化した上皮細胞である。このタンパク質をコードさせる他の生物学的活性には、以下が含まれる：膜−タンパク質複合体中のこのタンパク質の細胞内細胞骨格要素のＮａ＋／Ｈ＋交換体の調節因子との結合およびＬ−セレクチンへの結合。２つの転写ＰＯＤＸＬバリアントの記載は、ＮＣＢＩデータベース（２０１３年３月３日バージョン）においてアクセス番号ＮＭ＿００１０１８１１１．２（バリアント１）およびＮＭ＿００５３９７．３（バリアント２）のもとで提出されている。ＰＯＤＸＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の配列は、ＮＣＢＩデータベース（２０１３年３月３日バージョン）においてアクセス番号ＮＰ＿００１０１８１２１．１（アイソフォーム１）およびＮＰ＿００５３８８．２（アイソフォーム２）のもとで提出されている。
【００３７】
「ＰＴＨＬＨ」（副甲状腺ホルモン様ホルモン遺伝子）は、ヒト１２番染色体中に存在し、ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質）として公知の副甲状腺ホルモンファミリーに属するタンパク質をコードする。このタンパク質は、軟骨内性骨発生、さらに、乳腺および歯の形成中の上皮と間葉との間の相互作用を制御する。このホルモンの受容体を、ＰＴＨＲ１と命名する。ＰＴＨＬＨに関するＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセス番号ＮＧ＿０２３１９７（２０１１年１１月６日バージョン）のもとで提出されている。４つのＰＴＨＬＨ転写物バリアントの記載は、ＮＣＢＩデータベース（２０１１年１１月２０日）においてアクセス番号ＮＭ＿１９８９６５．１（バリアント１）、ＮＭ＿００２８２０．２（バリアント２）、ＮＭ＿１９８９６４．１（バリアント３）、およびＮＭ＿１９８９６６．１（バリアント４）のもとで提出されている。同様に、ＰＴＨＬＨ遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベース（１９９５年１月１０日バージョン）においてアクセス番号ＡＡＡ６０３６０．１（フォームＡ）、ＡＡＡ６０３５８．１（フォームＢ）、およびＡＡＡ６０３５９．１（フォームＣ）のもとで提出されている。
【００３８】
Ｒａｓ様エストロゲン制御成長阻害因子としても公知の「ＲＥＲＧ遺伝子」は、ＲＡＳ  ＧＴＰアーゼスーパーファミリーの一部を形成するタンパク質をコードし、細胞増殖および腫瘍形成の阻害因子として作用する遺伝子をいう。２つの転写ＲＥＲＧバリアントの記載は、ＮＣＢＩデータベース（２０１１年１１月２８日バージョン）においてアクセス番号ＮＭ＿０３２９１８．２（バリアント１）およびＮＭ＿００１１９０７２６．１（バリアント２）のもとで提出されている。ＲＥＲＧ遺伝子によってコードされるタンパク質の配列は、ＮＣＢＩデータベース（２０１１年１１月２８日）においてアクセス番号ＮＰ＿１１６３０７（アイソフォーム１）およびＮＰ＿００１１７７６５５（アイソフォーム２）のもとで提出されている。
【００３９】
「転移」は、がんの源の最初の部位から別の器官への広がりをいう。これは、通常、血液系またはリンパ系を介して生じる。がん性細胞が広がって新規の腫瘍を生じる場合、これを続発性腫瘍または転移性腫瘍と呼ぶ。続発性腫瘍を形成するがん細胞は、元の腫瘍中のがん細胞に類似する。例えば、乳がんが肺に広がる（転移する）場合、続発性腫瘍は悪性乳がん細胞を含む。肺内の疾患を転移性乳がんと呼ぶ（肺がんではない）。この特定の発明の場合、転移は、骨に広がった（転移した）乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんである。なおさらなる特定の発明に関して、転移は、骨に広がった（転移した）ＥＲ＋乳がんである。
【００４０】
「骨溶解性骨転移」は、腫瘍細胞による破骨細胞活性の刺激に起因して転移付近に骨吸収（骨密度の進行性の消失）を生じ、激痛、病的骨折、低カルシウム血症、脊髄の圧迫、および神経圧迫に起因する他の症候群によって特徴づけられる転移の型をいう。
【００４１】
用語「ミクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、短い一本鎖ＲＮＡ分子（典型的にはおよそ２１〜２３ヌクレオチド長）をいい、遺伝子発現を制御することができる。ｍｉＲＮＡは、合成（換言すれば、組み換え）または天然であり得る。天然ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされ、一次転写物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」）から短いステム−ループ構造（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）、および、最後に成熟ｍｉＲＮＡにプロセッシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のｍＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、ＲＮＡ干渉またはｍＲＮＡの翻訳阻害に類似の過程によって遺伝子発現を低下させる。
【００４２】
「腫瘍組織サンプル」は、原発性腫瘍、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より具体的にはＥＲ＋またはＥＲ−Ｈｅｒ２−乳がん由来の組織サンプルである。前記サンプルを、従来の方法（例えば、関連する医学的技術の専門家に周知の方法を使用した生検）によって得ることができる。生検サンプルを得る方法には、腫瘍を大きな部分に分割すること、または顕微解剖もしくは当該技術で公知の他の細胞分離方法が含まれる。腫瘍細胞を、さらに、小さなゲージの針を用いた吸引による細胞学によって得ることができる。サンプルの保存および取り扱いを簡潔にするために、サンプルをホルマリン中で固定し、パラインに浸漬するか、最初に凍結し、次いで急速凍結が可能な高度に低温の媒体中への浸漬によってＯＣＴコンパウンドなどの組織凍結媒体に浸漬することができる。本発明によれば、サンプルはまた、腫瘍を起源とする組織、腫瘍を起源とするＲＮＡ、腫瘍を起源とするＤＮＡ、または腫瘍を起源とするタンパク質を含む任意の体液（血漿または血清（腫瘍を起源とするエキソソームまたはＤＮＡが存在する血漿または血清など）が含まれるが、これらに限定されない）も含む。
【００４３】
遺伝子発現産物の「ドミナントネガティブ変異体」という表現は、本発明で使用される場合、天然の発現産物の活性を干渉することができる前記発現産物のバリアントをいう。
【００４４】
用語「インヒビターペプチド」は、本明細書中で使用される場合、発現産物に結合してその活性を阻害することができるペプチドをいう。
【００４５】
用語「転移予測」を、本明細書中で、患者が転移を生じ得る確率をいうために使用する。本発明の予測方法を臨床的に使用して、特に各患者に最も適切な処置の選択について決定することができる。本発明の予測方法は、患者が化学療法などの処置レジメンに好ましく応答するかどうかを予測するための有益なツールである。予測は、予後因子を含むことができる。当該分野の専門家が理解するように、これが好ましいわけではないが、予測は診断または評価することができる１００％の被験体に対して正確である必要はない。しかし、この用語は、被験体のかなりの部分を、決定された結果を有する確率がより高い被験体として同定することができることが必要である。被験体が統計的に有意である場合、これを、異なる公知の統計的評価ツール（例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、分類および詳細の交差検証率など（ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３に示すとおり））を使用して当該分野の専門家が決定することができる。推奨信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは０．０１、０．００５、またはそれ未満である。
【００４６】
用語「確率」は、本明細書中で使用される場合、十分に安定な条件下で全ての可能な結果が公知の無作為化実験を行うことによって結果（または結果のセット）が得られる頻度を測定する。確率は「高い」かまたは「低い」可能性がある。当該分野の専門家が理解するように、確率は評価される全被験体について１００％である必要はないが、好ましくはそうあるべきである。相関関係が統計的に有意であるか否かを、異なる公知の統計的評価ツールを使用して（例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデント検定、マン・ホイットニー検定などによる）当該分野の技術者が大きな問題なく決定することができる。これらの統計ツールについてのさらなる情報を、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３に見出すことができる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０２、０．０１、またはそれ未満である。
【００４７】
「乳房組織特異的プロモーター」は、本発明で使用される場合、プロモーターとして機能し、他の組織中で有意な発現を観察することなく乳房組織中で特異的に前記プロモーターに作動可能に会合した核酸の発現が可能な核酸の配列をいう。
【００４８】
用語「被験体」または「患者」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物として分類されるすべての動物をいい、飼いならされた動物および家畜、霊長類およびヒト（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、被験体は、任意の年齢または民族の男性または女性である。
【００４９】
「原発性腫瘍」は、腫瘍が見出された組織または器官を起源とし、別の場所からその位置に転移していない腫瘍をいう。
【００５０】
「ＥＲ＋腫瘍」は、所定のレベルを超えるＥＲを発現する腫瘍をいう。１０ｆｍｏｌ／ｍｇを上回るかまたはそれと等しいＥＲレベル（免疫組織化学媒体による、１０％を超える核の陽性検出）が乳房腫瘍をＥＲ＋と見なす通常の基準である。
【００５１】
「ＥＲ−腫瘍」は、本発明で使用される場合、免疫組織化学的技術（例えば、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈら，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２８：２７８４−２７９５に記載の方法を使用）を使用して５％未満の腫瘍細胞の核がＥＲ発現を示す腫瘍をいう。
【００５２】
「Ｈｅｒ２−腫瘍」は、細胞がＨＥＲ２遺伝子の増幅を示さない腫瘍をいう。腫瘍細胞は、ポリクローナル抗ＨＥＲ２抗体を使用した半定量的免疫組織化学アッセイ（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔキット（Ｃｏｄｅ  Ｋ５２０４），Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，（Ｃｏｄｅ  Ｋ５２０４））を使用して得た値が０、１＋、または２＋である場合にＨＥＲ２について陰性であると見なされる。あるいは、腫瘍は、核あたりのＨＥＲ２遺伝子コピー数が４未満である場合か、ＦＩＳＨによって決定された１７番染色体コピー数と比較したＨＥＲ２遺伝子コピー数の比率が１．８未満である場合にＨｅｒ２−と見なされる。腫瘍がＨｅｒ２＋またはＨｅｒ２−であるかどうかを決定するための標準的アッセイは、例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ｗｏｌｆｆ  ＡＣ，ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２００７，２５：１１８−１４５；Ｗｏｌｆｆ  ＡＣ，ら，２００７，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３１：１８−４３）に記載されている。
【００５３】
「ＰＲ−腫瘍」は、プロゲステロン受容体を検出可能に発現しない腫瘍をいう。この文脈では、１０ｆｍｏｌ／ｍｇ未満のプロゲステロン受容体レベルおよび／または１０％未満の陽性核の免疫組織化学的所見をＰＲ陰性と見なす。
【００５４】
「トリプルネガティブ腫瘍」は、ＥＲ−、ＰＲ−、およびＨＥＲ２−であることによって特徴づけられる乳がんをいう。
【００５５】
表現「基準値」は、患者から得たサンプルを用いて得た値／データの基準として使用される臨床検査値をいう。基準値または基準レベルは、絶対値、相対値、上限および／または下限を有する値、一連の値、平均値、中央値、平均の値、または対照値もしくは基準値に言及することによって示される値であり得る。基準値は、個別のサンプルから得た値（例えば、以前の時点に得た値ではなく研究対象の患者由来のサンプルから得た値など）に基づき得る。基準値は、多くのサンプル数（研究対象患者の暦年齢と一致する暦年齢群由来の被験体集団で得られた値など）に基づき得、または分析すべきサンプルのうちの組み込み／除外サンプルセットに基づき得る。
【００５６】
表現「遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本発明で使用される場合、配列が前記遺伝子の領域、前記遺伝子によってコードされたプレ−ｍＲＮＡの領域、または前記遺伝子のｍＲＮＡの領域に部分的または完全に相補的であり、その結果、前記遺伝子、プレ−ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡと特異的にハイブリッド形成し、それによって遺伝子の転写またはｍＲＮＡ翻訳を遮断することができるオリゴヌクレオチドをいう。
【００５７】
アンチセンス核酸は、従来の塩基によって相補的に（すなわち、例えば、バイカテナリーＤＮＡへの結合の場合、二重らせんの深い方の溝における特異的相互作用によって）薬物の潜在的標的に結合することができる。一般に、これらの方法は、技術でしばしば使用される技術範囲をいい、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に基づいた任意の方法が含まれる。
【００５８】
本発明のアンチセンス構築物を、例えば、細胞内で転写される場合、標的遺伝子をコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの単一部分と相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして提供することができる。あるいは、アンチセンス構築物は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されたオリゴヌクレオチドプローブであり、細胞に導入した場合に標的核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリッド形成して遺伝子発現を阻害する。前記オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に耐性であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定な修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチド用の例示的な核酸分子は、ホスホルアミダイト、ホスホチオナートおよびメチルホスホチオナートＤＮＡアナログである（米国特許第５１７６９９６号；同第５２６４５６４号；および同第５２５６７７５号も参照のこと）。さらに、アンチセンス治療で有用なオリゴマーの一般的な構築アプローチは、例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６，１９８８；およびＳｔｅｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８：２６５９−２６６８，１９８８で概説されている。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドの領域（例えば、標的遺伝子の−１０と＋１０との間）が好ましい。アンチセンスアプローチは、標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドのデザイン（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物に結合して翻訳を防止する。
【００６０】
ｍＲＮＡの５’末端（例えば、５’非翻訳配列）に相補的であり、且つＡＵＧ開始コドンを含むオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害に最も効率的な様式で機能するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列もｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが最近示されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３，１９９４）。したがって、相補オリゴヌクレオチドを、このｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチで遺伝子の非コード５’または３’非翻訳領域のいずれかに対して使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対する相補オリゴヌクレオチドを、ＡＵＧ開始コドンの相補物中に含むべきである。ｍＲＮＡのコード領域に対する相補オリゴヌクレオチドは、あまり有効な翻訳インヒビターではないが、本発明にしたがって使用することもできる。相補オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの５’領域、３’領域、またはコード領域とハイブリッド形成するようにデザインされる場合、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長を有するべきであり、好ましくは、およそ１００ヌクレオチド長未満、より好ましくは、およそ５０、２５、１７、または１０ヌクレオチド長未満を有するべきである。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその化学的混合物、誘導体、もしくは改変バージョンに由来し得る。例えば、分子の安定性、そのハイブリッド形成能力などを改善するために、オリゴヌクレオチドの塩基の基、糖の基、またはリン酸骨格を改変することができる。オリゴヌクレオチドは、他の結合基（ペプチド（例えば、オリゴヌクレオチドを宿主細胞受容体に導くため）など）または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６，１９８９；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２，１９８７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０号を参照のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）による輸送を容易にするための薬剤、挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９，１９８８を参照のこと）を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、別の分子（例えば、ハイブリッド形成によって誘発されるペプチド、輸送剤、切断剤など）にコンジュゲートすることができる。
【００６２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された塩基の基を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが含まれるが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された糖の基を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチドに類似の骨格を含むことができる。前記分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼ばれ、例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０，１９９６およびＥｇｌｏｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６，１９９３に記載されている。
【００６３】
別の合成形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。さらなる合成形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。
【００６４】
標的ｍＲＮＡ配列のコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができるが、非翻訳転写領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドも使用することができる。
【００６５】
いくつかの場合、アンチセンスを内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる細胞内濃度に到達させることが困難であり得る。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたは強力ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの調節下に置かれた組み換えＤＮＡ構築物を使用することである。
【００６６】
あるいは、標的遺伝子発現を、遺伝子制御領域（すなわち、プロモーターおよび／またはポテンシエーター）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列に、体内の標的細胞内での遺伝子転写を予防する三重らせん構造を形成するように指示することによって低下させることができる（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４，１９９１を参照のこと）。一定の合成形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスモルホリノである。
【００６７】
表現「ＲＮＡ干渉」またはＲＮＡｉは、真核細胞で起こり得る遺伝子発現の配列特異的な転写後抑制過程である。一般に、この過程は、前記配列に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される特定のｍＲＮＡ配列の分解を含む。このｄｓＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩ（ダイサー）型によりＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換することによって遺伝子発現サイレンシングを行うことができる。
【００６８】
用語「核酸」は、本明細書中で使用される場合、２つまたはそれを超えるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはヌクレオチドのアナログ分子、ならびに天然の核酸と構造的に類似するが、核酸骨格（例えば、天然の核酸中のリン酸）、核酸糖（例えば、天然のＤＮＡについてのデオキシリボースおよび天然のＲＮＡ中のリボース）、および核酸塩基（例えば、天然の核酸中のアデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、またはプリン）のうちの１つ以上が（例えば、化学修飾によって）天然の核酸と異なる分子を有するポリマーをいう。
【００６９】
「アンチセンス配列」は、本明細書中で使用される場合、標的ＤＮＡ（アンチセンス）配列またはｍＲＮＡ（センス）配列に結合することができるモノカテナリー核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを作製する能力については、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，（１９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，（１９８８）に記載されている。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「リボザイム」または「ＲＮＡ酵素」または「触媒ＲＮＡ」は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子をいう。多数の天然リボザイムは、１つ以上のそれ自体のホスホジエステル結合の加水分解または他のＲＮＡ中の結合の加水分解を触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼのライゲーション活性、および従来のタンパク質酵素によって行われる多数の他の化学反応を触媒することも見出されている。
【００７１】
処置という用語は、疾患を緩和または排除するか、前記疾患に関連する１つ以上の症状を軽減または排除するか、患者が以下に広範に定義された臨床的利益を得ることができるような薬物の投与をいう：腫瘍サイズの低下、転移の発生またはサイズの低下、腫瘍成長の低下または阻止、寛解の誘導、再発前の期間の延長、腫瘍に関連する疼痛の軽減、腫瘍細胞分裂の阻害、腫瘍細胞の根絶、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導、腫瘍再発の低下、低下、および／または患者の生存率の増加。
【００７２】
がん、具体的には乳がんに罹患した被験体におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転移の予測方法
本発明者らは、発現がｃ−ＭＡＦ発現と正または負に相関する遺伝子の群を同定した。具体的には、本発明者らは、以下の理由によって特徴づけられる一連の遺伝子を同定した（ｉ）原発性腫瘍中のそれらの発現がＭＡＦ発現と有意に相関すること、および（ｉｉ）ＭＣＦ７細胞内でのそれらの発現がＭＡＦを発現するＭＣＦ７から誘導された、骨に高度に転移した細胞中のｃ−ＭＡＦ過剰発現（長いアイソフォームまたは短いアイソフォーム）またはｃ−ＭＡＦサイレンシングによって改変されること。これらの条件を満たす遺伝子は、ｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムのメンバーであると考えられる。これらの遺伝子を、表１（ｃ−ＭＡＦプログラムによって増加する遺伝子）および表２（ＭＡＦプログラムによって抑制される遺伝子）に示す。機能獲得型実験および臨床相関データを使用して、本発明者らは、ＥＲ＋乳がんの骨転移過程の原因となる標的遺伝子としての、およびｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムの一部としてのＰＴＨＬＨ、ＰＯＤＸＬ、およびＲＥＲＧの役割を機能的に確認した。
【００７３】
したがって、最初の問題として、本発明は、被験体におけるがん、具体的には乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より具体的には乳がんの転移のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの予測方法（以後、本発明の第１の方法）であって、前記被験体の腫瘍組織サンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、ここで、基準値と比較した１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が転移発生リスクの高さを示す方法に関する。
【００７４】
本発明の第１の方法は、第１の工程として、がん、具体的には乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より具体的には乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。
【００７５】
表現「発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子」は、本発明で使用される場合、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの変化に応答して有意に改変される遺伝子をいう。発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子には、原発性腫瘍サンプル中の発現がｃ−ＭＡＦ発現と有意に相関する遺伝子および／またはｃ−ＭＡＦ発現レベルの変化に応答して乳がん細胞中で発現が改変される遺伝子が含まれる。
【００７６】
好ましい形態で実施する場合、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子には、高ｃ−ＭＡＦ発現を示す原発性腫瘍サンプル中で発現が増加する遺伝子および／またはがん細胞、好ましくは乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または甲状腺細胞、さらにより好ましくは乳房細胞中でｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して発現が増加する遺伝子および／またはがん細胞、好ましくは、乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または甲状腺細胞、さらにより好ましくは乳房細胞中でｃ−ＭＡＦ発現のサイレンシングに応答して発現が減少する遺伝子が含まれる。
【００７７】
好ましい形態で実施する場合、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子には、高ｃ−ＭＡＦ発現を示す原発性腫瘍サンプル中で発現が減少する遺伝子および／またはがん細胞、好ましくは乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または甲状腺細胞、さらにより好ましくは乳房細胞中でｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して発現が減少する遺伝子および／またはがん細胞、好ましくは乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または甲状腺細胞、さらにより好ましくは乳房細胞中でｃ−ＭＡＦ発現サイレンシングに応答して発現が増加する遺伝子が含まれる。
【００７８】
本発明では、「増加した」または「増大した」発現レベルは、基準値レベルより高いレベルをいう発現レベルと理解される。特に、被験体サンプル中の発現レベルが基準値と比較して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれをさらに超える場合に、被験体由来のサンプルが発現レベルの増加を示すと見なすことができる。
【００７９】
さらに、本発明では、「減少した」または「低下した」発現レベルは、基準値より低いレベルをいう発現レベルである。特に、基準サンプル中の発現レベルが被験体のサンプルと比較して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれを超える場合に被験体由来のサンプルが発現レベルの減少を示すとみなすことができる。
【００８０】
好ましい形態で実施する場合、本発明の第１の方法は、がん、具体的には乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプル中での、表１に示す遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子および／または表２に示す遺伝子の群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。
【００８１】
【表１−１】
2016518815.tif 000002
【００８２】
【表１−２】
2016518815.tif 000003
【００８３】
【表１−３】
2016518815.tif 000004
【００８４】
【表１−４】
2016518815.tif 000005
【００８５】
【表２−１】
2016518815.tif 000006
【００８６】
【表２−２】
2016518815.tif 000007
表１は、（ｉ）発現のレベルが原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦ発現レベルと直接相関すること、および（ｉｉ）発現のレベルが、ｃ−ＭＡＦ発現が乳がん細胞株において誘導される場合に増加するか、ｃ−ＭＡＦがサイレンシングされる場合に減少することによって特徴づけられる７６種の遺伝子の群に対応する。
【００８７】
本発明の第１の方法によれば、基準値と比較した１つ以上の表１に示す遺伝子の発現レベルの増加は、被験体において転移を発症する確率が高いことを示す。
【００８８】
本発明の第１の方法によって実施することが好ましい場合、ＰＴＨＬＨ遺伝子の発現レベルを定量し、その結果、ＰＴＨＬＨ遺伝子の発現レベルが基準値と比較して増加する場合、被験体において転移を発症する確率が高いことを示す。本発明の第１の方法別の好ましい実施では、ＰＯＤＸＬ遺伝子の発現レベルを定量し、その結果、ＰＯＤＸＬ遺伝子の発現レベルが基準値と比較して増加する場合、被験体において転移を発症する確率が高いことを示す。
【００８９】
表２は、（ｉ）発現のレベルが原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦ発現レベルと逆相関すること、および（ｉｉ）発現のレベルが、ｃ−ＭＡＦ発現が乳がん細胞株において誘導される場合に減少するか、ｃ−ＭＡＦが乳がん細胞株においてサイレンシングされる場合に増加することによって特徴づけられる３３種の遺伝子の群に対応する。
【００９０】
本発明の第１の方法によれば、基準値と比較した１つ以上の表２に示す遺伝子の発現レベルの減少は、被験体において転移を発症する確率が高いことを示す。
【００９１】
本発明の第１の方法によって実施することが好ましい場合、ＲＥＲＧ遺伝子の発現レベルを定量し、その結果、ＲＥＲＧ遺伝子の発現レベルが基準値と比較して減少する場合、被験体において転移を発症する確率が高いことを示す。
【００９２】
当業者が理解するように、遺伝子発現レベルを、前記遺伝子の、または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の伝令ＲＮＡレベルの測定によって決定することができる。
【００９３】
この目的のために、生物学的サンプルを処理して組織または細胞の構造を物理的または機械的に脱凝集し、それによって水溶液または有機溶液中に細胞内成分を放出させて核酸を調製することができる。核酸を、当業者に公知の手順および市販の手順によって抽出する（Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ，Ｊ．，ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１−３．）。
【００９４】
したがって、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の転写に起因するＲＮＡ（伝令ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）あるいは前記遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から定量することができる。したがって、本発明の特定の実施では、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の遺伝子発現レベルの定量は、前記遺伝子の伝令ＲＮＡ、前記ｍＲＮＡのフラグメント、前記遺伝子に相補的なＤＮＡ、前記ｃＤＮＡのフラグメント、またはその混合物の定量を含む。
【００９５】
実際的に、任意の従来の方法を本発明の文脈下で使用して、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡレベルを検出および定量することができる。例として、制限されないが、前記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡレベルを、従来の方法（例えば、ｍＲＮＡを増幅させる工程および前記ｍＲＮＡ増幅の産物を定量する工程（電気泳動および染色など）を含む方法、または、あるいは、サザンブロットおよび適切なプローブの使用、ノーザンブロットおよびｃ−ＭＡＦによって調整される目的の遺伝子のｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡの特異的プローブの使用、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＴ−ＬＣＲ、ハイブリッド形成、マイクロアレイなどを使用したマッピング、好ましくは適切なマーカーを使用したリアルタイム定量ＰＣＲによって定量することができる。同様に、遺伝子ｃ−ＭＡＦによってコードされる前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルを、従来の技術を使用して定量することもでき、この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）による対応ｃＤＮＡの合成、それに続く増幅および前記ｃＤＮＡ増幅の産物の定量工程を含む。発現レベルを定量する従来の方法を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１．（上に引用したとおり）に見出すことができる。
【００９６】
特定の実施形態では、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の発現レベルの定量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡアレイもしくはＲＮＡアレイを使用して行う。さらに、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の発現レベルの定量を、この遺伝子によってコードされるタンパク質またはそのタンパク質の任意の機能的に等価なバリアントの発現レベルの定量によって行うこともできる。発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の発現レベルの定量を、上記タンパク質の任意のアイソフォームの発現レベルの定量によって行うこともできる。したがって、特定の実施形態では、発現レベルがｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子によってコードされるタンパク質レベルの定量は、そのタンパク質の定量を含む。
【００９７】
タンパク質の発現レベルを、被験体のサンプル中の前記タンパク質を検出および定量することができる任意の従来の方法の使用によって定量することができる。例として、制限されないが、前記タンパク質のレベルを、例えば、タンパク質（または抗原決定基を含むそのフラグメント）に結合することができる抗体を使用し、その後に形成された複合体を定量することによって定量することができる。これらのアッセイで使用した抗体を、標識してもしなくても良い。使用することができるマーカーの例示的な例には、放射性同位体、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、粒子、色素などが含まれる。非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を使用する本発明で使用することができる広範な種々の公知のアッセイが存在し、これらの技術には、ウェスタンブロットまたはウェスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（放射免疫アッセイ）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫アッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的技術および免疫組織化学的技術、特異的抗体を含むバイオチップまたはタンパク質マイクロアレイの使用に基づく技術、またはディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイが含まれる。前記タンパク質の他の検出および定量方法には、アフィニティクロマトグラフィ技術、リガンド結合アッセイなどが含まれる。免疫学的方法を使用する場合、タンパク質の量を検出するために高い親和性でそのタンパク質に結合することが公知の任意の抗体または試薬を使用することができる。しかし、抗体（例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、およびヒト化抗体）の使用が好ましい。本発明の文脈で使用することができるＰＴＨｒＰタンパク質またはＲＥＲＧタンパク質に対する市販抗体が市場に存在する。ＰＴＨｒＰタンパク質に特異的な抗体には、ＡｂｃａｍのヒトＰＴＨｒＰを認識するマウスモノクローナル抗体３Ｈ１−５Ｇ８（ａｂ１１５４８８）、Ａｂｂｉｏｔｅｃｈのラット、マウス、およびヒトのＰＴＨｒＰを認識するウサギポリクローナル抗体Ｐ１２２７２（カタログ番号２５１４７８）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎのヒトＰＴＨｒＰを認識するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号５６５２−１００）、またはＮｏｖｕｓ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのヒトＰＴＨｒＰを認識するマウスモノクローナル抗体（カタログ番号ＮＢＰ１−２６５４２）などが含まれるが、これらに限定されない。ＲＥＲＧタンパク質に特異的な抗体には、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚのヒトＲＥＲＧを認識するヤギポリクローナル抗体（ｓｃ−１０９００８およびｓｃ−１０９００９）、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈのヒト、ラット、およびマウスのＲＥＲＧを認識するウサギポリクローナル抗体（１０６８７−１−ＡＰ）、ＡｂｃａｍのラットＲＥＲＧを認識するウサギポリクローナル抗体（ａｂ１１５８０６）、およびＮｏｖｕｓ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのヒトＲＥＲＧを認識するマウスポリクローナル抗体（Ｈ０００８５００４−Ｂ０１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
具体的には、本発明において、タンパク質レベルを、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはタンパク質アレイによって定量する。
【００９９】
第２段階では、本発明の第１の方法は、第１段階で分析した遺伝子について得られた発現レベルの基準範囲に対する比較を含む。
【０１００】
がん、好ましくは乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより好ましくは乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの測定および基準範囲との比較の後、この（これらの）遺伝子の発現レベルが基準範囲と比較して増加する場合、被験体において転移を発症する確率が高いと結論付けることができる。
【０１０１】
本発明の第１の方法を具体的に実施する場合、がん、具体的には乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより具体的には乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプルにおける表１に含まれる１つ以上の遺伝子の発現レベルが基準範囲と比較して増加する場合、および／または、がん、具体的には乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより具体的には乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプルにおける表２に含まれる１つ以上の遺伝子の発現レベルが基準範囲と比較して減少する場合、被験体において転移を発症する確率が高い。
【０１０２】
発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子発現レベルの決定には、基準範囲に相関する必要がある。分析下での腫瘍タイプに依存して、基準範囲の厳密な性質は変化し得る。したがって、転移を発症する確率を決定する場合、基準範囲は、転移していないがん、特に乳がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんを有する被験体の腫瘍組織サンプルから導かれるか、その基準範囲は、転移していないがん、具体的には乳がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんを有する被験体の生検サンプル中に回収された腫瘍組織で測定される発現レベルの中央値に相当する。
【０１０３】
この基準サンプルを、典型的には、対象集団由来の等量のサンプルの組み合わせによって得る。典型的な基準サンプルを、一般に、臨床的に十分報告されている被験体および転移の非存在が十分定義された被験体から得る。かかるサンプルでは、正常（基準）濃度のバイオマーカーを、例えば、基準集団の平均濃度を提供することによって決定することができる。マーカーの基準濃度を決定する際、いくつかの検討事項を考慮する。これらの検討事項の中に、年齢、体重、性別、患者の全身的健康状態などがある。例えば、少なくとも２人、少なくとも１０人から好ましくは１００人超、１０００人超の被験体の群由来の等量を基準群として採用し、好ましくは前述の検討事項（例えば、種々の年齢カテゴリー）にしたがって分類する。基準レベルに由来して回収されたサンプルは、好ましくは、研究中の患者と同一タイプのがんを有する被験体で構成される。
【０１０４】
一旦中央値が確立されると、患者の腫瘍組織中のこのマーカーのレベルをこの中央値と比較することができ、このような方法で、発現レベルの「増加」に割り当てることができる。被験体間の変動（例えば、年齢、人種などに関する態様）に起因して、遺伝子発現の絶対基準範囲を確立することは非常に困難である（事実上不可能ではないにせよ）。したがって、具体的には、本発明で、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子発現の、発現の「増加」または「減少」の基準範囲を、疾患が任意の前述の方法によって十分に報告されている１つまたはいくつかの単離サンプル中の、発現がｃ−ＭＡＦによって調整される遺伝子発現レベルをアッセイする工程を含む従来の手段によってパーセンタイルを計算することによって決定する。次いで、レベルの「低下」を、好ましくは、発現レベルが正常集団中で５０パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満（例えば、正常集団中で６０パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満、正常集団中で７０パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満、正常集団中で８０パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満、正常集団中で９０パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満、正常集団中で９５パーセンタイルに等しいかまたはそれ未満の発現レベルが含まれる）であるサンプルに割り当てることができる。次いで、発現レベルの「増加」を、好ましくは、発現レベルが正常集団中で５０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える（例えば、正常集団中で６０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団中で７０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団中で８０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団中で９０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団中で９５パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える発現レベルが含まれる）サンプルに割り当てることができる。
【０１０５】
具体的には、本発明では、がんは、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、および甲状腺がんによって形成される群から選択される。本発明において好ましいがんは乳がんである。任意のタイプのＥＲ＋乳がんまたはトリプルネガティブ乳がんがさらにより好ましい。
【０１０６】
本発明の第１の方法を実施する場合、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんに罹患した被験体における好ましい転移は骨転移である。本発明の第１の方法を実施する場合、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんに罹患した被験体におけるなおさらに好ましい転移は骨溶解性骨転移である。
【０１０７】
がん、特に乳がんに罹患した被験体のための個別化治療をデザインする方法
技術の現状が公知である場合、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんなどのがんに罹患した被験体に施される処置は、転移を発症する確率の高さが関連することに基づいて異なり得る。転移を有する確率が高い場合、最適な処置には、化学療法のような全身処置が含まれる。
【０１０８】
したがって、本発明で説明される事項にしたがって、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が転移を発症する確率に関連することを考慮して、ｃ−ＭＡＦによって調整されたこれらの遺伝子のレベルの決定は、がんを有する被験体のための最も適切な治療に関する決定の一助となる。
【０１０９】
したがって、他の態様では、本発明は、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらに特に乳がんに罹患した被験体のための個別化治療をデザインするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（以後、本発明の第２の方法）であって、被験体の腫瘍組織サンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、基準範囲と比較した１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、被験体が転移予防のための治療を受けることが可能であること示す、方法に関する。
【０１１０】
本発明の第２の方法は、第１段階で、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプルの、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。
【０１１１】
本発明の第２の方法を具体的に実施する場合、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つまたは複数の遺伝子は、被験体の腫瘍組織サンプルにおける表１中に含まれる遺伝子および／または表２中に含まれる１つ以上の遺伝子から形成される群から選択され、ここで、１つ以上の表１由来の遺伝子の発現レベルが基準範囲と比較して増加し、そして／または１つ以上の表２由来の遺伝子の発現レベルが基準範囲と比較して減少する場合、被験体は転移予防のための治療を受けることが可能である。
【０１１２】
本発明の第２の方法を実施する場合、ＰＴＨＬＨ遺伝子の好ましい発現レベルを定量し、その結果、ＰＴＨＬＨ遺伝子発現レベルが基準範囲と比較して増加する場合、被験体は転移予防のための治療を受けることが可能である。
【０１１３】
本発明の第２の方法を実施する場合、ＰＯＤＸＬ遺伝子の好ましい発現レベルを定量し、その結果、ＰＯＤＸＬ遺伝子発現レベルが基準範囲と比較して増加する場合、被験体は転移予防のための治療を受けることが可能である。
【０１１４】
本発明の第２の方法を実施する場合、ＲＥＲＧ遺伝子の好ましい発現レベルを定量し、その結果、ＲＥＲＧ遺伝子発現レベルが基準範囲と比較して減少する場合、被験体は転移予防のための治療を受けることが可能である。
【０１１５】
本発明の第２の方法を具体的に実施する場合、がんは、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんによって形成される群から選択され、好ましくは乳がんである。本発明の第２の方法をさらにより具体的に実施する場合、乳がんは、任意のタイプのＥＲ＋またはＥＲ−ＨＥＲ２−（ＥＲ−ＨＥＲ２−ＰＲ＋またはＥＲ−ＨＥＲ２−ＰＲ−）乳がんであり得る。
【０１１６】
本発明の第２の方法を具体的に実施する場合、転移は骨転移である。本発明の第２の方法をさらにより具体的に実施する場合、骨転移は骨溶解性転移である。
【０１１７】
本発明の第２の方法の場合、サンプルは、被験体の原発性腫瘍組織サンプルである。
【０１１８】
第２段階では、被験体の腫瘍サンプルにおける、１つ以上の遺伝子であって、その発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子の発現を基準範囲と比較する。この基準範囲を、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される遺伝子の、コントロールサンプル中の発現レベルから得る。分析中の腫瘍タイプに依存して、コントロールサンプルの厳密な性質は変化し得る。したがって、好ましいコントロールサンプルは、転移していない乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんを有する被験体の腫瘍組織サンプルである。コントロールサンプルが、転移を発症していないＥＲ＋乳がんを有する被験体の腫瘍組織サンプルであることがさらにより好ましい。あるいは、基準範囲は、転移を発症していない、がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、なおさらに特にＥＲ＋乳がんを有する被験体の生検で回収された腫瘍組織サンプルで測定されたｃ−ＭＡＦ発現レベルの中央値に相当する。
【０１１９】
本発明の第２の方法の第２段階では、がん、具体的には乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより具体的には乳がんに罹患した被験体の腫瘍組織サンプル（ｓｉｍｐｌｅ）において、発現がｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して調整される１つ以上の遺伝子について得た発現レベルを基準範囲と比較し、その結果、これらの遺伝子の１つ以上の発現レベルが基準範囲と比較して変化する場合、被験体が転移予防（被験体が依然として転移を発症していない場合）および／または転移の処置（被験体が既に転移を発症している場合）のための治療を受けることが可能であると結論付けることができる。
【０１２０】
がんが転移を起こした場合、全身処置（化学療法、ホルモン処置、免疫療法、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）。さらに、放射線療法および／または手術を使用することができる。処置の選択は、一般に、原発性がんの型、サイズ、転移の位置、年齢、患者の一般的な健康状態、および以前に使用した処置の型に依存する。
【０１２１】
乳がんなどのがんを有する被験体において転移の予防および／または処置を目的とした処置には、化学療法、ホルモン療法、および免疫療法が含まれる。
【０１２２】
化学療法は、がん細胞を死滅させるための薬物を使用する。アンフェタミンを、典型的には、経口または静脈内に摂取する。時折、化学療法を放射線処置と共に使用する。乳がんに適切な化学療法上の処置には、アントラサイクリン（ドキソルビシン、エピルビシン、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル）、５−フルオロウラシル、ビンカアルカロイド（ビノレルビン、ビンブラスチン）、ゲムシタビン、白金塩（シスプラチンおよびカルボプラチン）、シクロホスファミド、エトポシド、および１つ以上の上記のレジメンの組み合わせ（シクロホスファミド−アントラサイクリン＋／−５−フルオロウラシル（例えば、ドキソルビシン−シクロホスファミド（ＡＣ）、エピルビシン−シクロホスファミド、（ＥＣ）シクロホスファミド−エピルビシン−５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）、シクロホスファミド−ドキソルビシン−５−フルオロウラシル（ＣＡＦ）、５−フルオロウラシル−エピルビシン−シクロホスファミド（ＦＥＣ））、シクロホスファミド−メトトレキサート−５−フルオロウラシル（ＣＭＦ）、アントラサイクリン/タキサン（例えば、ドキソルビシン−パクリタキセルまたはドキソルビシン−ドセタキセル）、ドセタキセル−カペシタビン、ゲムシタビン−パクリタキセル、タキサン−白金塩（例えば、パクリタキセル−カルボプラチンまたはドセタキセル−カルボプラチン）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
ホルモン療法は、いくつかのホルモンがいくつかのがんの成長を促進するという事実に基づく。例えば、女性において卵巣によって産生されるエストロゲンは、時折、乳がんの成長を促進する。これらのホルモンの産生を停止させる種々の方法が存在する。１つの方法は、ホルモンを産生する器官（女性の場合は卵巣、男性の場合は精巣）を外科的に除去することによる。より頻繁には、これらの器官のホルモン産生を防止するか、これらのホルモンのがん細胞に対する作用を防止するための薬物を使用することができる。
【０１２４】
免疫療法は、免疫系自体が患者のがんと戦うことを補助する処置である。転移を有する患者を処置するために使用される免疫療法にはいくつかの型が存在する。これらには、サイトカイン、モノクローナル抗体、および抗腫瘍ワクチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
発現がｃ−ＭＡＦ発現と正に相関する遺伝子の阻害に基づく治療方法
本発明者らは、乳房腫瘍の異種移植片によって生じる骨転移の転移増殖モデルにおけるＰＨＴＬＨの阻害により転移内の骨溶解性病変の数が減少することを述べた。これは、発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦ発現の増加に応答して増加する（または発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦ発現の減少に応答して減少する）遺伝子がＥＲ＋乳がんからの骨転移過程における原因標的遺伝子であり、したがって、それを阻害することは、乳がん転移の出現の停止に有用であり得ることを示す。
【０１２６】
他方では、本発明者らは、精製マウス骨髄細胞に基づいた実験モデルにおける骨髄細胞への接着アッセイにおいて転移性遺伝子ＰＯＤＸＬ発現の相関を機能的に確認した（実施例５）。ＰＯＤＸＬ発現は、ＰＯＤＸＬ遺伝子の内因性レベルの増加を担うｃ−ＭＡＦの高発現レベルを示す高転移性骨細胞ＭＣＦ７においてｉｎ  ｖｉｖｏで低下した。したがって、この遺伝子は、ＥＲ＋乳がんにおける骨転移過程での予後マーカーおよび原因標的遺伝子として、ならびにｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムの一部として有益である。
【０１２７】
したがって、他の態様では、本発明は、転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんの処置および／または予防のための薬物の調製のための、遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤の使用であって、遺伝子が、腫瘍細胞、特に乳房、結腸、肺、腎臓、または甲状腺、さらにより特には乳房で見出される腫瘍細胞でのその発現によって特徴づけられ、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの低下に応答して減少する、使用に関する。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんの処置および／または予防で用いる遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤であって、遺伝子が、腫瘍細胞、特に乳房、結腸、肺、腎臓、または甲状腺、さらにより特には乳房で見出される腫瘍細胞でのその発現によって特徴づけられ、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの低下に応答して減少する、薬剤に関する。
【０１２９】
別の態様では、本発明は、被験体における転移性がん、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、さらにより特に乳がんを処置および／または予防する方法であって、遺伝子発現または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤を投与することを含み、遺伝子発現または遺伝子産物の活性が、腫瘍細胞、特に乳房、結腸、肺、腎臓、または甲状腺、さらにより特には乳房で見出される腫瘍細胞でのその発現によって特徴づけられ、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、これらの細胞におけるｃ−ＭＡＦ発現レベルの低下に応答して減少する、方法に関する。
【０１３０】
表現「遺伝子発現を阻害する薬剤」は、遺伝子転写の減少をもたらすこと、ｍＲＮＡを不安定化すること、および／またはｍＲＮＡ翻訳を減少させることが可能な任意の分子をいう。
【０１３１】
発現の阻害剤を、化合物の以下の能力を決定するための標準的な方法によって同定することができる：一定の遺伝子の転写を阻害する能力（ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットおよびハイブリッド形成、ランオンアッセイなど）、ｍＲＮＡを不安定化するかｍＲＮＡの翻訳を阻害する能力（網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセートにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイ）。本発明では、化合物が、遺伝子のｍＲＮＡ量を減少させる、遺伝子の転写を減少させる、および／または遺伝子の翻訳を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（この発現産物の完全な不活化）減少させることができる場合に、その化合物が遺伝子発現のインヒビターであると見なす。
【０１３２】
本発明で用いる遺伝子発現の阻害剤の例には、遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子特異的干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および遺伝子特異的触媒ＲＮＡまたはリボザイムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明で用いる遺伝子発現のための好ましい阻害剤は、遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１３４】
遺伝子発現の阻害にも好ましい薬剤は、遺伝子特異的干渉ＲＮＡである。低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子発現を阻害することができる薬剤である。ｓｉＲＮＡを化学合成することができるか、転写によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで得ることができるか、標的細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで合成することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは、１５ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間の二本鎖ＲＮＡからなり、１〜６ヌクレオチドの３’および／または５’突出領域を含み得る。突出領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長と無関係である。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーの分解または転写後サイレンシングによって作用する。
【０１３５】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＰＴＨＬＨをコードする遺伝子のｍＲＮＡと、ＰＯＤＸＬをコードする遺伝子と、またはタンパク質をコードするゲノム配列と実質的に相同である。「実質的に相同な」は、上記ｓｉＲＮＡが干渉ＲＮＡを手段として標的ｍＲＮＡを分解させることができる方法で、該ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡと十分に相補的であるか類似する配列を有すると理解される。この干渉を生じさせるのに適切なｓｉＲＮＡには、ＲＮＡによって形成されたｓｉＲＮＡおよび以下などの異なる化学修飾を含むｓｉＲＮＡが含まれる。
【０１３６】
−ヌクレオチド間の連結が天然で生じる連結と異なる（ホスホロチオアート連結など）ｓｉＲＮＡ、
−ＲＮＡ鎖のフルオロフォアなどの機能的反応物との結合体、
−異なる２’位のヒドロキシル官能基での修飾によるＲＮＡ鎖の末端、特に３’末端の修飾物、
−２’−Ｏ−メチルリボースｐ２’−Ｏ−フルオロリボースなどの２’位でＯ−アルキル化された残存物などの修飾糖を有するヌクレオチド、
−ハロゲン化塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）、アルキル化塩基（例えば、７−メチルグアノシン）などの修飾塩基を有するヌクレオチド。
【０１３７】
ｓｉＲＮＡを、そのままで（上記特徴を有する二本鎖ＲＮＡの形態を意味する）使用することができる。あるいは、目的の細胞中での発現に適切なプロモーターの調節下でｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むベクターを使用することが可能である。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡ発現に適切なベクターは、転写の際にループを形成する分離領域によって分離された１つの単一ＤＮＡ鎖がタンデムに配置されたｓｉＲＮＡの２つの鎖をコードするＤＮＡの２つの領域に存在し、単一のプロモーターがＤＮＡ分子を転写させてｓｈＲＮＡを生じるベクターである。
【０１３９】
あるいは、ｓｉＲＮＡを形成する各鎖が異なる転写単位の転写から形成されるベクターを使用することが可能である。これらのベクターは、次に、収束および分岐転写ベクターに分けられる。分岐転写ベクターでは、ｓｉＲＮＡを形成するＤＮＡ鎖の各１つをコードする転写単位は、各ＤＮＡ鎖の転写が同一でも異なっていてもよい適切なそれ自体に依存する方法でベクター中にタンデムに局在する（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１００：５１０３−５１０６  ｙ  Ｌｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ら，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５００−５０５）。収束転写ベクターでは、ｓｉＲＮＡを生じるＤＮＡ領域は、２つの逆位プロモーターが隣接したＤＮＡ領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖を形成することが見出されている。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の転写後、鎖はハイブリッド形成して機能的ｓｉＲＮＡを形成する。ベクターは、２つのＵ６プロモーター（Ｔｒａｎ，Ｎ．ら，２００３，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：２１）、マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター（Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，ら，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１３５−１４０  ｙ  ＷＯ２００５０２６３２２号）、ならびにヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーター（Ｋａｙｋａｓ，Ａ．ｙ  Ｍｏｏｎ，Ｒ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１６）を使用するベクターにおいて逆位プロモーター系として記載されている。
【０１４０】
収束ベクターおよび分岐ベクター由来のｓｉＲＮＡ発現での使用に適切なプロモーターには、ｓｉＲＮＡを発現するのに望ましい細胞に適合する任意のプロモーターまたはプロモーター対が含まれる。したがって、本発明の開発に適切なプロモーターには、構成性プロモーター（真核生物ウイルス（ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉種ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど）のゲノム由来のプロモーター、メタロチオネインプロモーター遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域、免疫グロブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ−１αプロモーターなど）、ならびにタンパク質の発現が分子または外因性シグナルの付加に依存する誘導性プロモーター（テトラサイクリン系、ＮＦ−ｋＢおよびＵＶ光系、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、熱ショックプロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６号に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩ制御プロモーターなど）、ならびに組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ２００６０１２２２１号に記載のＰＳＡプロモーター）が含まれるが、これらに限定される必要はない。構成性に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが本発明に好ましいプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、５Ｓ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、７ＳＬ  ＲＮＡ、およびＵ６  ｓｎＲＮＡなどの限られた数の遺伝子中にある。他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと異なり、タイプＩＩＩプロモーターは、いかなる遺伝子内配列を必要としないが、−３４位および−２４位のＴＡＴＡボックス、−６６位と−４７位との間の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、および、いくつかの場合、−２６５位と−１４９との間の遠位配列エレメント（ＤＳＥ）を含む５’方向の配列を必要とする。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩＩＩは、ヒトまたはマウスのＨ１遺伝子およびＵ６遺伝子の好ましいプロモーターである。２つのヒトまたはマウスのＵ６プロモーター、１つのマウスＵ６プロモーターおよび１つのヒトＨ１プロモーター、または１つのヒトＵ６プロモーターおよび１つのマウスＨ１プロモーターがさらにより好ましい。本発明の文脈では、乳房腫瘍、好ましくはＥＲ＋乳房腫瘍中で目的の遺伝子を特異的に発現させるのに特に適切であり、したがって好ましいプロモーターは、αＥＲまたはサイクリンＤ１プロモーターである。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡを、ループ領域またはヘアピン領域によって連結されたｓｉＲＮＡを形成す逆平行鎖によって特徴づけられるいわゆるｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）から細胞内に生成することができる。ｓｉＲＮＡは、プラスミドまたはウイルス、特にレトロウイルスによってコードされ得、プロモーターの調節下にある。ｓｈＲＮＡの発現に適切なプロモーターは、ｓｉＲＮＡ発現についての前述の段落中に示すプロモーターである。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現に適切なベクターには、原核生物発現ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよび派生物、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ  、ｐＣＲｌ  、ＲＰ４など）、ファージベクターおよびシャトルベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）、酵母発現ベクター（２−ミクロンプラスミド、組込みプラスミド、ＹＥｐベクター、セントロメアプラスミドおよび類似のベクターなど）、昆虫細胞の発現ベクター（ｐＡＣシリーズおよびｐＶＬシリーズのベクターなど）、植物細胞の発現ベクター（ｐＩＢＩシリーズ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ、および類似のベクターなど）、ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、およびレトロウイルス、特にレンチウイルス）および非ウイルスベクター（ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、およびｐＴＤＴｌなど）に基づく巨大真核細胞発現ベクターが含まれる。レンチウイルスベクターは、開発に好ましいベクターである。
【０１４３】
本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを、当業者に公知の一連の技術の使用によって得ることができる。ｓｉＲＮＡをデザインするための塩基として使用されるヌクレオチド配列領域は制限されず、コード配列の領域（開始コドンと終結コドンとの間）を含むことができるか、あるいは、５’または３’非翻訳領域（好ましくは２５ヌクレオチド長と５０ヌクレオチド長との間）の配列および開始コドンと比較してセンス３’位中の任意の位置の配列を含むことができる。ｓｉＲＮＡをデザインする方法は、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴモチーフ（式中、Ｎは、遺伝子配列、特にＰＴＨＬＨまたはＰＯＤＸＬ中の任意のヌクレオチドであり得る）の同定およびＧＣ含量が高いモチーフの選択を含む。かかるモチーフが見出されない場合、ＮＡ（Ｎ２１）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）を同定することが可能である。
【０１４４】
遺伝子特異的ＤＮＡ酵素は、遺伝子発現阻害に好ましい薬剤である。ＤＮＡ酵素には、アンチセンステクノロジーおよびリボザイムのいくつかの機械的特徴が組み込まれている。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに類似するが、リボザイムに類似しない特定の核酸の標的配列を認識するようにデザインされ、標的核酸を触媒的および特異的に切断する。
【０１４５】
遺伝子発現を阻害するのに好ましい薬剤は、標的ｍＲＮＡの転写物を触媒的に切断して、その活性が阻害されることが望ましいＰＴＨＬＨまたはＰＯＤＸＬをコードするｍＲＮＡの翻訳を防止するようにデザインされたリボザイムである。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができるＲＮＡ酵素分子である（概説については、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：４６９−４７１，１９９４を参照のこと）。リボザイム作用機構は、相補的標的ＲＮＡへの特異的分子配列ハイブリッド形成、その後の内ヌクレオチド結合分解性切断事象を含む。リボザイム分子の組成は、好ましくは、１つ以上の標的ｍＲＮＡに相補的な配列およびｍＲＮＡ分解を担う周知の配列または機能的に等価な配列を含む（例えば、米国特許第５０９３２４６号を参照のこと）。
【０１４６】
本発明で使用されるリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイム、エンドリボヌクレアーゼＲＮＡ（以後、「Ｃｅｃｈリボザイム」（Ｚａｕｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５７４−５７８，１９８４）が含まれる。
【０１４７】
リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、誘導などを改善するため）から構成することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子を発現する細胞に分布させるべきである。好ましい分布方法は、トランスフェクトされた細胞が内因性標的メッセンジャーを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生する方法で、強力ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩ構成性プロモーターの調節下にてリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。リボザイムは、他のアンチセンス分子と異なり、触媒性であるので、必要とする細胞内有効濃度は低い。
【０１４８】
遺伝子産物の活性を阻害する化合物の場合、これらの化合物を、かかる産物の活性を決定することができる特異的アッセイの使用によって同定することができる。必要に応じて、遺伝子産物の活性を阻害する化合物を、転移増殖能力の高い乳がん転移の動物モデルにおいて阻害剤が骨溶解性病変の形成を減少させ、そして／または転移性病変中の破骨細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる能力の決定に基づいて特徴づけられる、本発明の実施例３に説明されたアッセイの使用によって同定することができる。本発明では、化合物が遺伝子産物の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％（遺伝子産物の完全な不活化）減少させることができる場合、化合物は、遺伝子産物の活性のインヒビターであると見なす。
【０１４９】
本発明で用いる遺伝子産物の活性を阻害する薬剤の例には、遺伝子産物の特異的インヒビター抗体、遺伝子産物のネガティブドミナントバリアント、および遺伝子産物の阻害性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
別の好ましい遺伝子産物の活性を阻害する薬剤は、この産物の特異的インヒビター抗体である。抗体を、当業者に公知の任意の方法を使用して調製することができ、これらの方法のいくつかは、既に述べられている。したがって、ポリクローナル抗体を、阻害されることが望ましいタンパク質を用いた動物の免疫によって調製する。モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎらに記載の方法（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５）の使用によって調製する。本発明の文脈で適切な抗体には、抗原を結合する可変領域および定常領域を含むインタクトな抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ダイアボディ、ならびに二重特異性抗体が含まれる。特にＰＴＨＬＨまたはＰＯＤＸＬへのタンパク質結合能力を有する抗体を同定した後、このタンパク質の活性を阻害することができる抗体を、薬剤インヒビターを同定するアッセイを使用して選択する。
【０１５１】
遺伝子産物の活性を阻害するための別の好ましい薬剤は、産物の阻害性ペプチドである。
【０１５２】
遺伝子産物の活性を阻害するための別の好ましい薬剤は、この遺伝子産物の「ネガティブドミナント変異体」である。本発明は、遺伝子産物のネガティブドミナント変異体および該変異体をコードするポリヌクレオチドの使用を考慮する。本発明のポリヌクレオチドの転写を制御するために使用することができるプロモーターは構成性プロモーターであり得る。これは、構成性プロモーターが、転写活性が外部シグナルを必要とする転写プロモーターまたは誘導性プロモーターを基本的に誘導することができることを意味する。転写の制御に適切な構成性プロモーターは、とりわけ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡ１プロモーター、ケラチンプロモーター、ＣＤ３プロモーター、免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター、ニューロン特異性エノラーゼプロモーター、Ｌ７プロモーター、ＣＤ２プロモーター、ミオシン軽鎖プロモーター、ＨＯＸプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＭｙｏＤプロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）、低密度リポタンパク質プロモーター、アクチンプロモーターである。トランス活性化因子発現を制御する好ましいプロモーターは、ＰＧＫプロモーターである。本発明のポリヌクレオチド転写を制御するのに好ましいプロモーターは、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１５３】
好ましくは、本発明の文脈で使用することができる誘導性プロモーターは、誘導剤に応答し、誘導剤の非存在下で基礎発現を全く示さないか僅かしか示さず、３’位に局在した遺伝子の活性化を促進することができるプロモーターである。誘導剤のタイプに基づいて、誘導性プロモーターを、Ｔｅｔオン／オフプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｙ  Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．Ｍ．Ｖ．  ｙ  Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５１−４５６）；Ｐｉｐオン／オフプロモーター（米国特許第６２８７８１３号）；抗プロゲスチン依存性プロモーター（米国特許出願公開第２００４１３２０８６号）、エクジソン依存性プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６３１４−６３１８；Ｎｏら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１，Ｓｕｈｒら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：７９９９−８００４  ｙ  ＷＯ９７３８１１７号）、メタロチオネイン依存性プロモーター（ＷＯ８６０４９２０号）、およびラパマイシン依存性プロモーター（Ｒｉｖｅｒａら，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−３２）として分類する。
【０１５４】
ｃ−ＭＡＦのドミナントネガティブバリアントをコードするポリヌクレオチドの発現に適切なベクターには、原核生物の発現ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその派生物、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ、ｐＣＲａ、ＲＰ４など）、ファージベクターおよび「シャトル」ベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）、酵母の発現ベクター（２ミクロンプラスミドベクター、組込みプラスミド、ＹＥｐベクター、セントロメアおよび類似のプラスミドなど）、昆虫細胞発現ベクター（ｐＡＣおよびｐＶＬシリーズのベクターなど）、植物発現ベクター（ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズのベクターおよび類似のベクターなど）、ならびにウイルスベクター（アデノウイルスまたはアデノウイルス随伴ウイルス（レトロウイルス、特にレンチウイルスなど）および非ウイルスベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ  ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴｒａｃｅｒ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１など）のいずれかに基づく高等真核細胞の発現ベクター、から誘導されたベクターが含まれる。
【０１５５】
１つの好ましい実施形態では、発現が腫瘍、特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加するか、発現が腫瘍、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特に乳がん中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応じて減少する遺伝子（表１に記載の遺伝子）を選択する。
【０１５６】
なおさらに好ましい実施形態では、発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加する遺伝子はＰＨＴＬＨ遺伝子である。１つの別の好ましい実施形態では、発現が乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦ発現レベルの増加に応答して増加する遺伝子はＰＯＤＸＬ遺伝子である。
【０１５７】
したがって、ＰＨＴＨＬ発現またはこの遺伝子の発現産物の活性を阻害する薬剤には、ＰＨＴＨＬ遺伝子の特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＨＴＨＬ遺伝子の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＨＴＨＬ遺伝子の特異的リボザイム、ＰＨＴＨＬタンパク質の特異的抗体インヒビター、前記発現産物のドミナントネガティブＰＨＴＨＬバリアント、およびＰＨＴＨＬインヒビターペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
ＰＯＤＸＬ発現またはこの遺伝子の発現産物の活性の阻害剤には、ＰＯＤＸＬ遺伝子の特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＯＤＸＬ遺伝子の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＯＤＸＬ遺伝子の特異的リボザイム、ＰＯＤＸＬタンパク質の特異的インヒビター抗体、発現産物のＰＯＤＸＬドミナントネガティブバリアント、およびＰＯＤＸＬインヒビターペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
ＰＴＨＬＨ特異的ｓｉＲＮＡには、とりわけ、市販のｓｉＲＮＡ（ＡｂｇｅｎｔのＰＴＨＬＨ用プレデザインｓｉＲＮＡ（カタログ番号ＲＩ１４３１８）、ＱｉａｇｅｎのマウスＰＴＨＬＨ用ｓｉＲＮＡ（ＧＳ１９２２７）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのヒトＰＴＨＬＨ用ｓｉＲＮＡ二重鎖（カタログ番号ＳＲ３０３８７４）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ＰＯＤＸＬ特異的ｓｉＲＮＡには、とりわけ、市販のｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのｓｃ−４４７６５  ｓｉＲＮＡ  、ＯｒｉＧｅｎｅのヒトＰＯＤＸＬ用ｓｉＲＮＡ二重鎖（ＳＲ３０３６１１）、またはＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのヒトＰＯＤＸＬ用ｓｉＲＮＡ二重鎖（カタログ番号ＳＲ３０３６１１）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
本発明の使用に有効なＰＴＨＬＨインヒビター抗体には、とりわけ、ＡｂｃａｍのヒトＰＴＨＬＨを認識する３Ｈ１−５Ｇ８マウスモノクローナル抗体（ａｂ１１５４８８）、Ａｂｂｉｏｔｅｃｈのラット、マウス、およびヒトのＰＴＨＬＨを認識するＰ１２２７２ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号２５１４７８）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎのヒトＰＴＨＬＨを認識するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号５６５２−１００）、またはＮｏｖｕｓ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌのヒトＰＴＨＬＨを認識するマウスモノクローナル抗体（カタログ番号ＮＢＰ１−２６５４２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
本発明の使用に有効なＰＯＤＸＬインヒビター抗体には、ヒトＰＯＤＸＬのＮ末端領域を認識するａｂ６２５９４ウサギポリクローナル抗体、またはヒトＰＯＤＸＬを認識するｓｃ−２３９０３マウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
ＰＴＨＬＨ阻害ペプチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
−ＰＴＨＬＨ短縮バリアント（配列ＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡ（配列番号８）を有するｈＰＴＨｒＰ（７−３４）、ＰＴＨｒＰ（３−３４）、ＰＴＨｒＰ（８−３４）、ＰＴＨｒＰ（９−３４）、ＰＴＨｒＰ（１０−３４）など）ならびにアミド化バリアント、ならびにＰＴＨＬＨの１０位、１１位、および１２位に対応するアミノ酸のそれぞれＡｓｎ（Ａｓｎ１０バリアント）、Ｌｅｕ（Ｌｅｕ１１バリアント）、およびＤ−Ｔｒｐ（Ｄ−Ｔｒｐ１２バリアント）による置換により生じるバリアント、および特に、ペプチド［Ｎｌｅ８，１８、Ｔｙｒ３４］ｂＰＴＨ（７−３４）ＮＨ２、［Ｔｙｒ３４］  ｂＰＴＨ（７−３４）ＮＨ２、ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）、［Ｌｅｕ１１、Ｄ−Ｔｒｐ１２］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）２、［Ａｓｎ１０Ｌｅｕ１１］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）−ＮＨ２、および［Ａｓｎ１０、Ｌｅｕ１１、Ｄ−Ｔｒｐ１２］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）−ＮＨ２（Ｎｕｔｔら，１９９０，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２７：４９１−４９３  ，Ｄｏｐｐｅｌｔら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７５５７−７５６０ならびに米国特許第６３６２１６３号および同第５５２７７７２号に記載）。
【０１６４】
−ＴＩＰペプチド（１−３９）（隆起漏斗ペプチド１−３９）としてのＴＩＰ（隆起漏斗ペプチド）短縮誘導体およびその誘導体（Ｈｏａｒｅら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３：９８９−９９８，２００２に記載）
−ペプチドＮＣＴ０００５１７７９（Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
−米国特許出願公開第２００７２０３０７１ＡＡ号の表１〜５に記載のペプチド
−その構造がＷＯ０４１０３２７３Ａ２号の式１に示されるペプチド
−Ｏｌｓｔａｄら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９５，１６：１０３１−１０３７）およびＲｏｕｂｉｎｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，３１：４０２６−４０３３）による記載のペプチド
−Ｎｕｔｔら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９０，１２７：４９１−３）に記載のペプチド［Ａｓｎ１０Ｌｅｕ１１］−ＰＴＨｒＰ（７−３４）−ＮＨ２および［Ａｓｎ１０，ｌｅｕ１１，Ｄ−Ｔｒｐ１２］−ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−ＮＨ２
−任意の前述のペプチドのＦｃ結合体（ＷＯ０４０６０３８６号による記載のペプチドなど）
−これらのペプチドの機能的に等価なバリアント。
【０１６５】
用語「機能的に等価なバリアント」は、本発明で使用される場合、１つ以上のアミノ酸の修飾、挿入、および／または欠失によって本発明のペプチド配列から誘導されたペプチドであり、但し、前記ペプチドの機能が、修飾、挿入、および／または欠失のない対応する本発明のペプチドの機能と比較して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％維持されることを条件とする。本発明での使用に適切なバリアントには、上記のペプチド配列と比較して少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示すバリアントが含まれる。２つのアミノ酸配列間の同一度を、従来の方法、例えば、先行技術の既知の配列の標準的なアラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３−１０）など）によって決定することができる。
【０１６６】
他のＰＴＨＬＨインヒビターには、ＷＯ２０１１００３９３５号に記載のＰＴＨＬＨ  Ｎ末端領域に特異的に結合するポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【０１６７】
本発明の第１の使用の特定の形態では、がんは、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、好ましくは乳がんのがんである。
【０１６８】
本発明の第２の使用のさらにより特定の形態では、乳がんは、ＥＲ＋型またはトリプルネガティブ型である。
【０１６９】
本発明の使用の特定の形態では、がん転移、特に乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、好ましくは乳がんの転移は骨転移である。さらにより特定の形態では、骨転移は骨溶解性転移である。
【０１７０】
ｃ−ＭＡＦ発現と逆相関する発現を使用した遺伝子活性化に基づいた治療方法
本発明者らは、ＲＥＲＧ遺伝子発現レベルがｃ−ＭＡＦ発現レベルと逆相関し、乳房腫瘍ＲＥＲＧ発現の増加が転移細胞数を低下させることができることを示した。したがって、これは、発現がｃ−ＭＡＦによって下方制御される遺伝子発現の調整を乳がん転移の処置および／または予防のために使用することができることを証明している。この場合、本発明者は、ＲＥＲＧ活性化剤の使用により転移細胞数を低下させることができることを示した。
【０１７１】
したがって、１つの態様では、本発明は、がん転移、特に乳がん転移、結腸がん転移、肺がん転移、腎臓がん転移、または甲状腺がん転移、より特に乳がん転移の処置および／または予防のための医薬の調製のための、遺伝子の発現または前記遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤の使用であって、前記遺伝子が、腫瘍細胞でのその発現、特に、乳がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞、または甲状腺がん細胞、より特に乳がん細胞中でのその発現が前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、その発現が前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加するという点で特徴づけられる、使用に関する。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、がん転移、特に乳がん転移、結腸がん転移、肺がん転移、腎臓がん転移、または甲状腺がん転移、より特に乳がん転移の処置および／または予防のための医薬の調製で用いる遺伝子の発現またはこの遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤であって、前記遺伝子が、腫瘍細胞でのその発現、特に、乳がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞、または甲状腺がん細胞、より特に乳がん細胞中でのその発現が前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、その発現がこれらの細胞におけるｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加するという点で特徴づけられる、薬剤に関する。
【０１７３】
別の態様では、本発明は、被験体におけるがん転移、特に、乳がん転移、結腸がん転移、肺がん転移、腎臓がん転移、または甲状腺がん転移、より特に乳がん転移の処置および／または予防のための方法であって、遺伝子の発現または前記遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤を前記被験体に投与することを含み、前記遺伝子が、その腫瘍細胞発現、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特に乳がんの細胞発現が前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、その発現が前記細胞中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加することにより特徴づけられる、方法に関する。
【０１７４】
１つの好ましい実施形態では、前記遺伝子の発現を刺激する薬剤は前記遺伝子のコード配列を含むポリヌクレオチドであるか、前記遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤は前記遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１７５】
別の態様では、この遺伝子の発現を刺激するポリヌクレオチドは、遺伝子構築物の一部になることができる。好ましくは、遺伝子構築物は、本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの発現の制御に適切な領域（プロモーター、転写ターミネーター、非翻訳５’および３’領域、ポリアデニル化シグナル、および類似物が含まれる）と共に含む。
【０１７６】
原則として、プロモーターが、ポリヌクレオチドを発現することが望まれる細胞と適合することを条件として、本発明の文脈中のクローニングベクターのために任意のプロモーターを使用することができる。したがって、本発明の実施形態に適切なプロモーターには、構成性プロモーター（真核生物のウイルスゲノムの派生物（ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉種ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域など）、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１α遺伝子プロモーターなど）ならびにタンパク質の発現が分子の付加または外因性シグナルの付加に依存する誘導性プロモーター（テトラサイクリン系、ＮＦκＢ／ＵＶ光系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系、および熱ショック遺伝子プロモーター、制御性ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＷＯ／２００６／１３５４３６号に記載）など）が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
【０１７７】
１つの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドを、乳房組織特異的プロモーターに作動可能に連結する。本発明での使用に適切な乳房組織の特異的プロモーターの例には、以下が例示的に含まれる：
−ストロメライシン３プロモーター（Ｂａｓｓｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８．：６９９，１９９０）
−ムチン様糖タンパク質（ＤＦ３，ＭＵＣＩ）のプロモーター（（Ａｂｅら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２８２，１９９３）
−ｃ−ｅｒｂＢ−３プロモーター、ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター、またはｃ−ｅｒｂＢ−４プロモーター
−マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモーター，
−ホエイ酸性タンパク質のプロモーター
−ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター
−ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター。
【０１７８】
１つの好ましい実施形態では、遺伝子の発現を刺激する薬剤はベクターの一部である。したがって、本発明は、以下から誘導されるベクターの使用を意図する：原核生物の発現ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその派生物、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４など）、ファージベクターおよび「シャトル」ベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）、酵母の発現ベクター（例えば２−ミクロンプラスミド型ベクター、組込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなど）、昆虫細胞発現ベクター（例えばｐＡＣおよびｐＶＬシリーズのベクターなど）、植物発現ベクター（ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、およびｐＯＲＥシリーズのベクターなど）、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのいずれかに基づく高等真核細胞の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＬ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、およびｐＴＤＴｌなど）。
【０１７９】
１つの好ましい実施形態では、遺伝子発現を刺激する薬剤は、ウイルスベクターの形態で送達される。本発明の使用に適切なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルス由来ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明は、培養哺乳動物細胞中に発現構築物を移入するためのいくつかの非ウイルス法を含む。これらには、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、直接微量注入、ＤＮＡ負荷リポソームおよびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速微小発射体を使用した遺伝子銃、および受容体媒介トランスフェクションが含まれる。これらの技術のうちのいくつかを応用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで正確に使用することができる。
【０１８１】
本発明のさらなる実施形態では、遺伝子の発現を刺激する薬剤を、リポソーム中に封入することができる。リポソームは、リン脂質二分子層の膜および内部水性媒体によって特徴づけられる小胞構造物である。
【０１８２】
本発明は、遺伝子の発現または前記遺伝子の発現産物の活性を局所、局部、または全身で促進する薬剤の投与を意図する。薬剤の投与を局在化の様式で行うことができ、この場合、薬剤を腫瘍、腫瘍脈管構造、腫瘍関連リンパ管、腫瘍に関連する管に直接投与する。投与は、腹腔内、胸膜内、小胞内、または髄腔内であり得る。遺伝子療法は、腫瘍関連メンバーの脈管構造中への局部投与を含み得る。
【０１８３】
ポリペプチドを遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤として使用する場合、本発明は、細胞内部へのタンパク質の移動を促進することができるペプチド（ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来のＴａｔペプチド、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３のヘリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、およびアルギニンオリゴマーなど）で改変したポリペプチドのバリアントの使用を意図する（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍら，２００３，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）。
【０１８４】
より好ましい実施形態では、発現が腫瘍、特に、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、発現が腫瘍、特に、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加する遺伝子は、表２に記載の遺伝子から選択される。
【０１８５】
なおさらに好ましい実施形態では、発現が腫瘍、特に、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少する遺伝子は、ＲＥＲＧ遺伝子である。
【０１８６】
本発明の第２の使用の特定の実施形態では、ＲＥＲＧ活性化剤は、
（ｉ）ＲＥＲＧをコードする核酸またはＲＥＲＧの機能的に等価なバリアントおよび
（ｉｉ）ＲＥＲＧタンパク質または機能的に等価なバリアントＲＥＲＧ
からなる群から選択される。
【０１８７】
１つの好ましい実施形態では、ＲＥＲＧをコードする核酸は、ＮＣＢＩデータベース（２０１１年１１月２８日バージョン）の受入番号ＮＭ＿０３２９１８．２（バリアント１）およびＮＭ＿００１１９０７２６．１（バリアント２）から収集した２つの転写バリアントのうちのいずれかに対応する。
【０１８８】
用語「ＲＥＲＧタンパク質の機能的に等価なバリアント」は、配列が１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失によってＲＥＲＧタンパク質から誘導され、ＲＥＲＧタンパク質と実質的に同一の機能を保持する（細胞増殖および腫瘍形成のインヒビターとして作用することを意味する）ポリペプチドを意味すると理解される。ＲＥＲＧタンパク質バリアントを、ＲＥＲＧが細胞増殖を阻害する能力に基づいた方法（本発明の実施例４に記載の方法など）を使用して同定することができる。
【０１８９】
本発明によれば、バリアントは、好ましくは、任意のＲＥＲＧ遺伝子バリアントのヌクレオチド配列または任意のＲＥＲＧタンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。上記バリアントと上記定義の遺伝子またはＲＥＲＧタンパク質の特定の配列との間の同一性の程度を、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定する。２つの核酸配列間の同一性を、好ましくは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して決定し、２つのアミノ酸配列間の同一性を、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰを使用して決定する（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ  ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｙ  ｃｏｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。
【０１９０】
１つの好ましい実施形態では、がんは、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特に乳がんである。１つの好ましい実施形態では、乳がんは、ＥＲ＋がんおよびＥＲ−Ｈｅｒ２−がんからなる群から選択される。１つの好ましい実施形態では、骨転移は骨転移である。なおさらに好ましい実施形態では、骨転移は骨溶解性転移である。
【０１９１】
薬学的組成物および投与方法
発現が腫瘍、特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して増加するか、発現が腫瘍、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特に乳がん中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して減少する遺伝子の発現を阻害する薬剤、発現が腫瘍、特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して増加するか、発現が腫瘍、特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して減少する遺伝子の発現産物の活性を阻害する薬剤、発現が腫瘍、特に、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、発現が腫瘍、特に、乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加する遺伝子の発現を刺激する薬剤、および／または発現が腫瘍、特に乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、または甲状腺腫瘍、より特に乳房腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加に応答して減少するか、発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの減少に応答して増加する遺伝子の発現産物の活性を刺激する薬剤を、典型的には、薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせて投与する。
【０１９２】
用語「キャリア」は、有効成分と共に投与される希釈剤または賦形剤をいう。かかる薬学的キャリアは、無菌の液体（水および油（石油、動物、植物または合成起源の油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、および類似物など）が含まれる）など）であり得る。これらを、好ましくは、特に注射液のための水キャリアまたは生理食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液として使用する。適切な薬学的キャリアは、ＥＷ  Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９５に記載されている。好ましくは、本発明のキャリアは、動物、より特にはヒトでの使用のため連邦政府の規制当局によって認可されているか、米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されている。
【０１９３】
本発明の薬学的組成物の投与に望ましい医薬形態を製造するために必要なビヒクルおよび補助物質は、とりわけ、選択された薬学的投与形態に依存する。薬学的組成物の前記薬学的投与形態を、当業者に公知の従来の方法にしたがって製造する。使用すべき有効成分、賦形剤の異なる投与方法およびこれらの生成手順の概説を、“Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”，Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，１９９３中に見出すことができる。薬学的組成物の例には、経口投与、局所投与、または非経口投与のための任意の固体組成物（錠剤、丸薬、カプセル、顆粒など）または液体（溶液、懸濁液、または乳濁液）が含まれる。さらに、薬学的組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁化剤、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。
【０１９４】
医薬品で用いるために、本発明のインヒビター／アクチベーター剤は、単独またはさらなる活性剤と組み合わせたプロドラッグ、塩、溶媒和物または包接体の形態であってよく、薬学的観点から許容され得る賦形剤とともに製剤化することができる。本発明での使用に好ましい賦形剤には、糖、デンプン、セルロース、ゴム、およびタンパク質が含まれる。特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、薬学的な固体投薬形態（例えば、錠剤、カプセル、糖剤、顆粒、坐剤、無菌結晶、または再構成して液体形態を得ることができる無定形固体など）、液体（例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル、ローション、軟膏など）または半固体（ゲル、膏薬、およびクリームなど）に製剤化するものとする。本発明の薬学的組成物を、任意の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるが、これらに限定されない）によって投与することができる。使用すべき有効成分、賦形剤の異なる投与形態、およびその製造プロセスの概説を、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ，Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，１９９３（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＲ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ），２０版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）中）中に見出すことができる。薬学的に許容され得るキャリアの例は先行技術で公知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液（油／水乳濁液など）、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。かかるキャリアを含む組成物を、先行技術で公知の従来の方法によって製剤化することができる。
【０１９５】
核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、またはドミナントネガティブをコードするポリヌクレオチド）を投与する場合、本発明は、特に前記核酸の投与のために調製された薬学的組成物を意図する。薬学的組成物は、前記核酸を裸の形態で（すなわち、生物のヌクレアーゼによる分解から核酸を防御する化合物の非存在下で）含むことができ、これは、トランスフェクションのために使用する試薬に関連する毒性を排除するという利点を伴う。裸の化合物の適切な投与経路には、血管内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所、および経口経路が含まれる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，２００２，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２１：８５７−８６７）。あるいは、核酸は、コレステロールに結合させるか、細胞膜を通した移動を促進することができる化合物（ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来のＴａｔ（Ｔａｔペプチド）、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３のヘリックス、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマー、およびＷＯ０７０６９０９０号に記載のペプチドなどのペプチド）に結合させ、リポソームの一部を形成して、投与することができる（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍら，２００３，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）。あるいは、ポリヌクレオチドは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルスなど）に基づいたベクターの一部を形成して、投与することができる。
【０１９６】
インヒビター／アクチベーターまたはこれらを含む薬学的化合物を、１０ｍｇ／キログラム体重未満、好ましくは、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重未満の用量で投与することができる。単位用量を、注射、吸入によるか、局所投与を介して投与することができる。
【０１９７】
用量は、処置すべき状態の重症度および応答に依存し、状態が寛解に向かうことが認められるまで数日間または数ヶ月間の間で変動し得る。至適投薬量を、患者の系内の薬剤の濃度の定期的測定の実施によって決定することができる。至適用量を、動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの予備試験によって得たＥＣ５０の値を使用して決定することができる。単位用量を、１日１回または少なくとも１日１回、好ましくは、少なくとも１日１回を２、４、８、または３０日間投与することができる。あるいは、初回用量を投与し、その後は一般に初回用量より少量の１回または数回の維持量を投与することが可能である。維持レジメンは、０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の用量（例えば、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日）で患者を処置することを含むことができる。維持量を、好ましくは、最大で５、１０、または３０日毎に１回投与する。処置を、患者が被っている苦痛のタイプ、その重症度、および患者の状態（ｓｔａｔｕｓ）／状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に応じて変動する期間継続すべきである。処置後、患者の進展を、疾患が施した処置に応答しない事象において用量を増加させるべきかどうか、または、疾病の改善が認められた事象または望ましくない副作用が認められた事象で用量を減少させるべきかどうかを決定するために、モニタリングすべきである。
【０１９８】
転移性向を示すマーカー（ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ）遺伝子の同定方法
本発明者らは、乳がんに罹患した患者が転移を生じる性向／感受性に関する遺伝子を同定することが可能である方法を開発した。この方法論は、乳房腫瘍中の発現がｃ−ＭＡＦの発現に相関し、乳がん細胞株中の発現がｃ−ＭＡＦの発現レベルの変化に応答して変化することが認められる遺伝子の同定に基づく。
【０１９９】
そのような方法で、別の態様では、本発明は、がん、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんであるが、特に乳がんに罹患した患者の転移性向の遺伝子マーカーの同定のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法（以後、本明細書では本発明の遺伝子同定方法）であって、
（ｉ）原発性乳がん腫瘍サンプル中の候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルを決定する工程、および
（ｉｉ）ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した乳がん細胞の集団中の前記候補遺伝子の発現レベルの変化を決定する工程
を含み、
ここで、前記遺伝子の発現レベルが原発性がん腫瘍サンプル、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特には乳がんの腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦの発現と統計学的に有意に相関することが証明され、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の改変の結果としての発現レベルの変化が前記遺伝子レベルの変化と統計的に相関することが証明され、このことは、前記遺伝子が患者の転移の性向／傾向のマーカーであることを示す、方法に関する。
【０２００】
第１相では、本発明における遺伝子の同定方法は、原発性がん腫瘍サンプル、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特には乳がんの腫瘍サンプルにおける候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む。
【０２０１】
原発性組織サンプル中の前記候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルを、がん、特に乳がんを有する患者の転移発生を予測するために、本質的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の文脈に記載のように決定することができる。好ましい方法では、前記候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に基づいた前記遺伝子（ＲＮＡメッセンジャーまたはｍＲＮＡ）の転写に起因するＲＮＡを使用するか、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの定量によって行うことができる。
【０２０２】
第２段階では、本発明の遺伝子の同定方法は、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の調整に応答したがん細胞の集団、特に、乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんの集団、より特には乳がんの集団中の前記候補遺伝子の発現レベルの変化を決定する工程を含む。
【０２０３】
候補遺伝子の発現レベルの変化の決定には、２つの特定の時点の間にｃ−ＭＡＦの発現レベルの変化がもたらされたそれらの時点で腫瘍細胞中の発現レベルが決定される必要がある。前記第１の時点と前記第２の時点との間でのｃ−ＭＡＦの発現レベルの前記変化は、ｃ−ＭＡＦ発現の増加またはｃ−ＭＡＦ発現レベルの減少を示し得る。
【０２０４】
好ましい方法では、段階（ｉｉ）中に行われるｃ−ＭＡＦレベルの調整により、ｃ−ＭＡＦレベルが増加する。これを達成するために、この段階で、ｃ−ＭＡＦまたはｃ−ＭＡＦのいくつかの部分をコードするポリヌクレオチドが細胞中に導入される必要がある。細胞中への目的の遺伝子の適切な導入方法および細胞中での目的の遺伝子の発現に適切な配置は、発現がｃ−ＭＡＦ発現に対して逆相関を示し、本方法で同一の形態で使用される遺伝子の活性化に基づいた治療方法の文脈で記載されている。
【０２０５】
標的／所与の細胞集団中でのｃ−ＭＡＦの発現レベルの増加を誘導する目的で、ｃ−ＭＡＦをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによってその細胞を改変することが可能であり、このポリヌクレオチドは、腫瘍（乳がん、結腸がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がんなどであるが、好ましくは乳がん）の細胞発現を容易にするプロモーターに作動可能に連結されている。前記ポリヌクレオチドを、通常、前記ポリヌクレオチドに加えて、宿主原核生物中でのその増殖を保証するためのさらなる配列（例えば、適用起源）および選択マーカーを含むベクターの一部を形成することによって作製する。例として、乳がん腫瘍細胞中での目的遺伝子の発現に適切な以下のプロモーターを使用することができる：
−ストロメライシン３のプロモーター（Ｂａｓｓｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６９９，１９９０）
−ムチンに類似する糖タンパク質（ＤＦ３，ＭＵＣＩ）のプロモーター（（Ａｂｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２８２，１９９３）
−プロモーターｃ−ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂＢ−２、またはｃ−ｅｒｂＢ−４
−マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモーター
−ホエイ酸性タンパク質のプロモーター
−ヒトα−ラクトアルブミンのプロモーター
−ウシβ−ラクトグロブリンのプロモーター  。
【０２０６】
ｃ−ＭＡＦをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを、科学分野の当業者に公知の任意のトランスフェクション法を使用して研究の対象である細胞に導入する（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，２００３の  ９．１節〜９．５節を参照のこと）。特に、細胞を、リン酸カルシウムでのＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン（ｐｏｌｉｂｒｅｏｎ）、エレクトロポレーション、微量注入、リポソームによって媒介される融合、リポフェクション、レトロウイルスによる感染、および遺伝子銃トランスフェクションを使用してトランスフェクトすることができる。
【０２０７】
あるいは、細胞を、その細胞中へのｃ−ＭＡＦタンパク質の導入によって改変することができる。これのために、本発明は、細胞内部への（細胞内レベル）タンパク質の移動を促進することができるペプチド（ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質由来のＴａｔ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３のヘリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、およびアルギニンオリゴマーなどのペプチド）によって改変されたｃ−ＭＡＦのバリアントの使用を提供する（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍら，２００３，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０  ｙ  Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）。
【０２０８】
より特異的なモデルでは、ｃ−ＭＡＦ発現は、ｃ−ＭＡＦの短いアイソフォームの、がん細胞、特に、乳がん細胞、ならびに結腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞、または甲状腺がん細胞、より特には乳がん細胞での発現中に増加する。別のさらにより特定のモデルでは、ｃ−ＭＡＦ発現は、ｃ−ＭＡＦの長いアイソフォームの、がん細胞、特に、乳がん細胞、ならびに結腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞、または甲状腺がん細胞、より特には乳がん細胞中での発現中に増加する。さらにより特定のモデルでは、ｃ−ＭＡＦ発現は、ｃ−ＭＡＦの長いアイソフォームおよび短いアイソフォームの、がん細胞、特に、乳がん細胞、ならびに結腸がん細胞、肺がん細胞、腎臓がん細胞、または甲状腺がん細胞、より特には乳がん細胞中での共発現中に増加する。
【０２０９】
第２の工程中に起こるｃ−ＭＡＦレベルの調整がｃ−ＭＡＦレベルの減少に関与する事象では、この工程は、ｃ−ＭＡＦをサイレンシングすることができる薬剤の細胞への導入が必要である。完全ではないが例として、ｃ−ＭＡＦレベルを低下させるのに適切な薬剤の例には、前記遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、前記遺伝子に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）プロセス、前記遺伝子のための触媒ＲＮＡまたは特異的なリボ核酸酵素、ｃ−ＭＡＦ阻害剤、およびインヒビター抗体が含まれる。
【０２１０】
ｃ−ＭＡＦのためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）プロセスには、１つの鎖がＡＣＧＧＣＵＣＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡ（配列番号１）であるＷＯ２００５０４６７３１号に記載のＲＮＡｉが含まれる。ｃ−ＭＡＦに特異的なＲＮＡｉの他の配列には、ＣＵＵＡＣＣＡＧＵＧＵＧＵＵＣＡＣＡＡ（配列番号２）、ＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧＡＵＧ（配列番号３）、ＡＵＵＵＧＣＡＧＵＣＡＵＧＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号４）、ＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＵＡＣＧＡＧＡＡＧＵ（配列番号５）、ＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＵＡＣＧＡＧＡＡＧ（配列番号６）ｙ  ＡＣＣＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧ（配列番号７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明の文脈で使用することができるｃ−ＭＡＦのドミナントネガティブには、ｃ−ＭＡＦと二量体化することができるが、ホモ二量体化およびＡＰ−１ファミリーの他のメンバー（ＦｏｓおよびＪｕｎなど）とのヘテロ二量体化が不可能である場合に転写を活性化する能力を欠く変異体が含まれる。そのようなものとして、ｃ−ＭＡＦのネガティブドミナントは、細胞中に存在し、且つトランス活性化のドメインを含むアミノ末端の２／３を欠く任意の小ｍａｆタンパク質であり得る（例えば、ｍａｆＫ、ｍａｆＦ、ｍａｆｇ、およびｐｉ８）（Ｆｕｊｉｗａｒａら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８，２３７１−２３８０；Ｉｇａｒａｓｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，７６１５−７６２４；Ａｎｄｒｅｗｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１１４８８−１１４９２；Ｋａｔａｏｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２１８０−２１９０）（Ｋａｔａｏｋａら（１９９６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２，５３−６２）。
【０２１２】
あるいは、ｃ−ＭＡＦのドミナントネガティブタンパク質には、他のタンパク質との二量体化能力を維持するが、転写を活性化する能力を欠くｃ−ＭＡＦのバリアントが含まれる。これらのバリアントは、例えば、タンパク質のＮ末端に存在するｃ−ＭＡＦのトランス活性化のためのドメインを欠くバリアントである。そのようなものとして、ｃ−ＭＡＦドミナントネガティブバリアントには、例として、少なくともアミノ酸１〜１２２、少なくともアミノ酸１〜１８７、または少なくともアミノ酸１〜２５７（米国特許第６２７４３３８号に記載のヒトｃ−ＭＡＦのナンバリングを考慮）が除かれたバリアントが含まれる。
【０２１３】
本発明の方法の特定のモデルでは、工程（ｉ）で使用される腫瘍サンプルを、乳がん腫瘍、または結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、腎臓がん腫瘍、または甲状腺がん腫瘍、より特には乳がん腫瘍から採取する。本発明の方法のより特定のモデルでは、工程（ｉ）で使用される腫瘍サンプル、特に、乳がん腫瘍のサンプルを、ＥＲ腫瘍およびトリプルネガティブ腫瘍から採取する。好ましいモデルでは、工程（ｉｉ）で使用されるがん細胞、特に、乳がん腫瘍由来のがん細胞はＥＲ＋であるか、トリプルネガティブ腫瘍から採取された。さらにより特定のモデルでは、転移は骨転移である。
【０２１４】
本発明での使用に適切な他のｃ−ＭＡＦ化合物インヒビターには、以下が含まれる：
【０２１５】
【表３−１】
2016518815.tif 000008
【０２１６】
【表３−２】
2016518815.tif 000009
【０２１７】
【表３−３】
2016518815.tif 000010
【０２１８】
【表３−４】
2016518815.tif 000011
【０２１９】
【表３−５】
2016518815.tif 000012
【０２２０】
【表３−６】
2016518815.tif 000013
ｃ−ＭＡＦの他のインヒビターは、以下の表（表４）に示すように特許出願ＷＯ２００５０６３２５２号に記載されている。
【０２２１】
【表４−１】
2016518815.tif 000014
【０２２２】
【表４−２】
2016518815.tif 000015
【０２２３】
【表４−３】
2016518815.tif 000016
【０２２４】
【表４−４】
2016518815.tif 000017
【０２２５】
【表４−５】
2016518815.tif 000018
【０２２６】
【表４−６】
2016518815.tif 000019
さらにより特定の（特異的な）別のモデルでは、ｃ−ＭＡＦの発現レベルは、ｃ−ＭＡＦの短いアイソフォームの、乳がん腫瘍細胞、または結腸、肺、腎臓、または甲状腺由来のがん細胞であるが、より特には乳がん由来のがん細胞のサイレンシングによって減少する。別のモデルでは、ｃ−ＭＡＦレベルは、ｃ−ＭＡＦの長いアイソフォームの、乳がん腫瘍細胞、または結腸、肺、腎臓、または甲状腺由来のがん細胞であるが、より特には乳がん由来のがん細胞のサイレンシングによって減少する。さらにより特定の別のモデルでは、ｃ−ＭＡＦレベルは、ｃ−ＭＡＦの長いアイソフォームおよび短いアイソフォームの、乳がん腫瘍細胞、または結腸、肺、腎臓、または甲状腺由来のがん細胞であるが、より特には乳がん由来のがん細胞のサイレンシングによって減少する。がん細胞、特に乳がん細胞、または結腸、肺、腎臓、または甲状腺のがん細胞、より特には乳がん由来のがん細胞の集団をこれらのがん型に罹患した患者から採取した生検サンプルから得ることができるか、乳がん細胞株などのこれらのがん型の細胞株（ＭＣＦ−７、Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ２０、ＳｋＢｒ３、ＨＣＣ−１９３７、ＢＴ−４７４およびＺＲ７５．１からの細胞株が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。好ましいモデルでは、工程（ｉｉ）を、ＭＣＦ７乳がん細胞株由来の細胞を使用して行う。結腸がん細胞株には、ＨＣＡ−７、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ、ＫＭ１２ｌ４ａ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０が含まれるが、これらに限定されない。肺がん細胞株には、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＰＣ１４、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＬＵ６１、ＬＸ１、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＤＭＳ２７３、およびＤＭＳ１１４が含まれるが、これらに限定されない。肺がん細胞株には、７８６−０、７６９−Ｐ、Ａ−４９８、ＳＷ−１５６、ＳＷ−８３９、Ａ−７０４、ＡＣＨＮ、ＣａＫｉ−１、およびＣａＫｉ−２が含まれるが、これらに限定されない。肺がん細胞株には、ＢＣＰＡＰ、ＫＴＣ−１、Ｋ１、ＴＣＰ１、ＦＴＣ１３３、ＭＬ１、８５０５Ｃ、ＳＷ１７３６、Ｃａｌ−６２、Ｔ２３５、Ｔ２３８、Ｕｈｔｈ−１０４、Ｕｈｔｈ−１０４、ＨＴｈ７４、ＫＡＴ１８、ＴＴＡ１、ＦＲＯ８１−２、ＨＴｈ７、Ｃ６４３、ＢＨＴ１０１、およびＫＴＣ−２が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２７】
一旦以下：（ｉ）乳がん腫瘍細胞、または結腸がん腫瘍細胞、肺がん腫瘍細胞、腎臓がん腫瘍細胞、もしくは甲状腺がん腫瘍細胞、より特には乳がん腫瘍細胞など由来の原発性がん腫瘍サンプル中の候補遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベル、および（ｉｉ）ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答したがん細胞（乳がん、肺がん、腎臓がん、または甲状腺がん、より特には乳がんなどのがん細胞）の集団中の前記候補遺伝子の発現レベルの変化が決定されると、転移の性向（傾向）の同定のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでマーカー遺伝子を同定する方法は、
（ｉ）原発性がん腫瘍サンプル中の前記遺伝子およびｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルの比較、および
（ｉｉ）ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の調整に応答した発現レベルの、前記遺伝子レベルの変化との比較
を含む。
【０２２８】
行われたモデルでは、工程（ｉ）で同定／決定した前記遺伝子の発現が原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦのレベルと直接相関する場合、および、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の調整に応答した発現レベルの変化が前記調整と直接相関する場合、これは、前記遺伝子レベルの上昇が転移性向を示すことを示す。
【０２２９】
別の好ましいモデルでは、工程（ｉ）で決定した前記遺伝子の発現が原発性腫瘍サンプル中のｃ−ＭＡＦのレベルと逆相関する場合、および、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の調整に応答した発現レベルの変化が前記調整と負に相関する場合、これは、前記遺伝子レベルの低下が転移性向を示すことを示す。
【０２３０】
原発性腫瘍サンプル中の候補遺伝子の発現とｃ−ＭＡＦの発現との間の相関は、基準値に関連する両方の遺伝子の発現レベルの比較によって得られ、両方の遺伝子が同一サンプル中で基準値と比較してその発現の変動を示す場合に両遺伝子の発現間に相関関係があると見なされる。相関は、直接相関（基準値と比較した候補遺伝子の発現の増加が前記遺伝子の基準値と比較したｃ−ＭＡＦ発現の増加と相関するか、基準値と比較した候補遺伝子発現の低下が前記遺伝子の基準値と比較してｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の減少と関連する）または逆相関（基準値と比較した候補遺伝子の発現の増加が前記遺伝子の基準値と比較してｃ−ＭＡＦ発現の減少増加と関連するか、基準値と比較した候補遺伝子の発現の低下が前記遺伝子の基準値と比較してｃ−ＭＡＦ遺伝子発現の増加と関連する）であり得る。
【０２３１】
ｃ−ＭＡＦ遺伝子の調整に応答した候補遺伝子の発現レベルの変化の間の相関は、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現の調整の誘導前の前記遺伝子の発現レベルおよびｃ−ＭＡＦ遺伝子発現が調整された後の同一サンプル中の前記遺伝子の発現レベルの決定によって実現され、ｃ−ＭＡＦ発現の変化に付随する様式で候補遺伝子の発現が変動した場合に相関すると見なされる。相関は、直接相関（候補遺伝子発現がｃ−ＭＡＦ発現の増加に伴って増加するか、遺伝子発現の減少がｃ−ＭＡＦ発現の減少に伴って減少する）または逆相関（候補遺伝子発現がｃ−ＭＡＦ発現の減少に伴って増加するか、候補遺伝子発現が、基準値と比較して、この遺伝子の基準値と比較したｃ−ＭＡＦ発現の増加に伴って減少する）であり得る。
【０２３２】
候補遺伝子の発現レベルがｃ−ＭＡＦ発現が変化する前のレベルと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％：少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて増加する場合、ｃ−ＭＡＦ発現の変動に関して付随する様式で候補遺伝子の発現が増加すると見なされる。
【０２３３】
候補遺伝子の発現レベルがｃ−ＭＡＦ発現が変化する前のレベルと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％：少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて減少する場合、ｃ−ＭＡＦ発現の変動に関して付随する様式で候補遺伝子の発現が減少すると見なされる。
【０２３４】
好ましい様式では、転移は骨転移である。
【０２３５】
本発明を以下の実施例を用いて記載する。実施例は、例示のみを目的とすると見なすものとし、本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【０２３６】
Ｉ．材料および方法
実験研究モデル
乳がんＥＲ＋およびＥＲ−ＰＲ−Ｈｅｒ２−の転移研究のための新規の実験モデルを開発した。この目的を達成するために、ＭＣＦ７として公知の乳がんＥＲ＋のヒト細胞株（ＧＦＰ／ルシフェラーゼを発現させるベクターを使用して安定な形態でトランスフェクトされたもの）を使用した。種々の器官で転移能力を有する細胞を選択することができるように、この細胞株を、室内または（尾）尾静脈への注射によって免疫不全マウス（Ｂａｌｂ−ｃ／ヌード）に接種した。ラットにエストロゲンの皮下移植を行って、実験期間中これらのホルモンの存在を保証した。
【０２３７】
転移集団の選択
異なる組織中の転移性集団を、転移性病変由来の細胞の同定および単離によって選択した。これのために、異なる時間で目的の器官内の腫瘍細胞の確立および成長を検出し、腫瘍性細胞の存在数を定量することが可能であるテクノロジーを導入した生物発光画像化技術を使用した。このテクノロジーの適用のために、ルシフェラーゼおよびＧＦＰの遺伝子を発現するように細胞に形質導入したが、これらについて非侵襲性の方法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏにてリアルタイムでモニタリング／観察が可能である。その感度および速度のレベルに起因する好ましい方法としてＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳタイプの装置およびＬｉｖｉｎｇｉｍａｇｅソフトウェアを使用して、全身麻酔下の動物についての発光画像（ルシフェラーゼ活性）をキャプチャーする。転移性細胞を単離するために、腫瘍病変を切開し、次いで、レーザー誘起蛍光（ＧＦＰ）（緑色蛍光タンパク質）での掃引を使用した細胞数測定技術を使用して宿主生物の転移性細胞を他の細胞から単離する。一旦これらの細胞が単離されると、特異的組織を介するその向性を富化／供給するためにこのプロセスを繰り返す。これらの手順を使用して、組織特異性を有する特異的転移性集団（骨および脳への転移が含まれる）を単離した。
【０２３８】
一旦転移性集団が同定および単離されると、高性能の転写分析を行った。概して、このストラテジーにより、転写が増強される遺伝子（予後不良のがん性細胞における代謝過程のメディエーターとして作用するいくつかの遺伝子が含まれる）が同定可能であった。特異的な組織および器官内の転移性細胞による転移増殖において発現が変化する遺伝子の関連を、不偏ｉｎ  ｖｉｖｏ選択手順によって確認した。骨への転移増殖能力が高い選択された細胞集団をＢｏＭ２と呼んだ。
【０２３９】
発現がｃ−ＭＡＦの発現に相関する遺伝子群の同定
３４９個の原発性乳房腫瘍のゲノムワイドな転写プロフィールの比較により、発現がｃ−ＭＡＦの発現と良好に正に（直接）相関する遺伝子を同定し、または良好に負に（逆）相関する遺伝子を同定した。この様式で得た遺伝子を、所定の細胞モデルにおけるｃ−ＭＡＦ発現と比較したその発現の分析によって確認した。ＭＣＦ７  ＥＲ＋乳がん細胞株を、これらの細胞株がｃ−ＭＡＦ遺伝子の長いアイソフォームまたは短いアイソフォームを十分に発現するように改変し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ２Ｐｌｕｓを使用してＲＮＡｍの発現プロフィールを決定した。日常的なテクノロジーを使用して、ｃ−ＭＡＦが枯渇したＭＣＦ−７骨転移細胞の派生物を得た。前述の細胞集団の遺伝子発現プロフィールを決定し、ｃ−ＭＡＦの発現の機能として有意に改変された遺伝子を選択した。これらの結果により、骨へのｃ−ＭＡＦの転移プログラムを得ることが可能となり、それには９９個の遺伝子が含まれ（これらのうちの７６個の遺伝子が過剰発現され（表１）、３３個の遺伝子が抑制された（表２））、その発現は原発性乳がん腫瘍内のｃ−ＭＡＦの発現レベルと有意に相関し、使用される少なくとも１つの細胞条件下でｃ−ＭＡＦの機能によって変化する。骨へのｃ−ＭＡＦの転移プログラムには、サイトカイン、細胞接着分子、膜に係留したプロテアーゼ、シグナル伝達メディエーター、および転写因子が含まれる。
【０２４０】
ＥＲ＋乳がん細胞における発現レベルの変化が観察されたこの遺伝子群を、確認作業に供した。このために、候補遺伝子の発現レベルを、原発性乳がん腫瘍および転移性コホート（乳がんに罹患した患者由来の５６０個の原発性乳がん腫瘍および４６個の転移性細胞を含む）を使用して得た遺伝子発現プロフィールと比較した。
【０２４１】
バイオインフォマティクスおよび計算生物学
転移が豊富な遺伝子群を得てその臨床相関を検証するために、Ｒ統計パッケージおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを使用した。データ処理のための特定の機能および構造をインポートし、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇにて公的オープンアクセス可能である。
【０２４２】
実施例１
関連遺伝子の選択
ｃ−ＭＡＦの発現レベルの変化に応答して単一のＥＲ＋乳がん細胞株由来の細胞において差次的様式で発現する遺伝子を選択することを目的とする分析を行った（表１、図１Ｂ）。ｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムを決定づける遺伝子および機能を、以下の基準にしたがって選択した：
ｉ）原発性腫瘍中での発現がｃ−ＭＡＦの発現に有意に相関する遺伝子、
ｉｉ）ｃ−ＭＡＦがＭＣＦ７細胞中で過剰発現される場合（長いアイソフォームまたは短いアイソフォーム）またはｃ−ＭＡＦを発現するＭＣＦ７に由来する高転移性骨細胞中のｃ−ＭＡＦ発現が低下する場合に、発現がｃ−ＭＡＦ発現で改変される遺伝子、および
ｉｉｉ）原発性腫瘍およびｉｉ）中の言及された細胞条件の１つにおけるＭＡＦの発現に相関する遺伝子が、ｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムのメンバーと見なされること。
【０２４３】
これらの基準に基づいて、発現レベルがｃ−ＭＡＦの発現レベルに相関する遺伝子を同定し、発現レベルの変動がＥＲ＋原発性乳がん腫瘍中のｃ−ＭＡＦの発現とどのように関連するのかを決定した（表１）。
【０２４４】
実施例２：
骨転移の発症で富化される遺伝子の治療的価値および予後的価値
本明細書中で開発した転移性細胞集団の選択のための実験系によって骨転移で富化した遺伝子を、乳がんに罹患した患者由来の５６０個の原発性乳がん腫瘍および５８個の転移物の発現プロフィールおよび臨床記録を含む２つの異なるデータベースの比較によって評価した。これらの腫瘍は、乳がんの全てのサブタイプおよび転移の局在を代表する。データベースおよび関連する臨床記録の両方を公的に入手可能である（ＧＳＥ  ２６０３、２０３４、１２２７６、および１４０２０）。
【０２４５】
骨転移物から採取した遺伝子のＥＲ＋原発性腫瘍中での遺伝子発現は、骨での再発と有意に相関し、骨への転移とも相関したが（図１Ａ）、他の組織への転移と相関しなかった（図１Ｂ）。
【０２４６】
実施例３
ｃ−ＭＡＦによって媒介された骨転移についてのプログラムのメンバーのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能確認：ＰＴＨＬＨ遺伝子
先の分析中に陽性を示し、且つｃ−ＭＡＦの発現に直接相関する転移性ＰＴＨＬＨ遺伝子（表１および図３）を、マウスの乳がん転移の異種移植片実験モデルにおける骨転移増殖試験で機能的に確認した。候補遺伝子が転移のプロセスを指示することを確認するための標準的な近似／アプローチは、ｃ−ＭＡＦを発現する低転移性細胞におけるＰＴＨＬＨ機能の損失のサンプルであった。ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨への転移が中程度の細胞ＭＣＦ７で誘導され、この細胞は遺伝子ｃ−ＭＡＦの低レベルの発現を示す。ｃ−ＭＡＦの過剰発現は、ＰＴＨＬＨ遺伝子の内因性レベルの増加を担っていた（図３）。この文脈では、次いで、サイトカインＰＴＨＬＨの活性を、アンタゴニストペプチドを使用して遮断した（図３）。
【０２４７】
遺伝子の形質導入のプロセスでは、レンチウイルス系を使用して、腫瘍細胞に感染させ、該細胞中で候補遺伝子の発現を導入した。ｃ−ＭＡＦ遺伝子およびそのエフェクターＰＴＨＬＨの転移を促進する機能を、マウスの心臓内に接種した転移性細胞の生物発光画像化を組み込んだモニタリングテクノロジーを使用して決定した。全ての場合、空のレンチウイルスベクターを感染させた対応する対照細胞を、比較を目的として免疫不全ラットの並行コホートに注射した（図３）。骨溶解性病変の形成能力を評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移性病変中の破骨細胞の分化、およびこの過程におけるＰＴＨＬＨの原因となる機能も評価した（図３）。
【０２４８】
機能獲得実験および臨床相関に関連するデータにより、ＥＲ＋乳がんの場合の骨転移過程において有効に因果のある予後マーカーおよび標的遺伝子としての、ならびにｃ−ＭＡＦ遺伝子によって媒介される骨転移プログラムの一部としてのＰＴＨＬＨの役割を機能的に確認することが可能となった。
【０２４９】
実施例４
ｃ−ＭＡＦ遺伝子によって媒介される骨転移プログラムのメンバーのｉｎ  ｖｉｖｏ機能確認；ＲＥＲＧ遺伝子
転移抑制遺伝子ＲＥＲＧは、増殖に関与する。実施した先の分析は、ＲＥＲＧ遺伝子の発現がｃ−ＭＡＦの発現と逆相関することを実証した（表２および図２）。ＲＥＲＧ遺伝子を、ラットの乳がん転移異種移植実験モデルにおいて骨における転移増殖試験で機能的に確認した。
【０２５０】
転移におけるＲＥＲＧ遺伝子の関与を、高転移性細胞における機能獲得試験によって確認した。ｉｎ  ｖｉｖｏで選択した骨への高転移性細胞（ＢｏＭ２）中でＲＥＲＧの発現が誘導され、これはｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルの上昇を示し、ＲＥＲＧの内因性レベルの抑制を担っていた（図２）。
【０２５１】
遺伝子形質導入過程では、レンチウイルス系を使用して、腫瘍細胞に感染させ、該細胞中の候補遺伝子の発現を導入した。ＲＥＲＧを抑制して転移を容易にする機能を、マウスの心臓内に接種した転移性細胞をモニタリングするための生物発光画像化技術を使用して決定した。全ての場合、空のレンチウイルスベクターを感染させた対応する対照細胞を、比較を目的として免疫不全ラットの並行コホートに注射した（図２）。ｃ−ＭＡＦの損失は、より高いＲＥＲＧ発現および転移性細胞増殖の減少に関与する（図２）。高レベルのｃ−ＭＡＦを発現する骨への高転移性を示す細胞（ＢｏＭ２）中のＲＥＲＧの過剰発現により、これらの細胞が骨に転移増殖する能力を低下させた（図２）。この低下は、マーカーＫｉ−６７によって測定した場合に増殖率の低下を伴った（図２）。
【０２５２】
ｃ−ＭＡＦ過剰発現の文脈での機能獲得実験および臨床相関に関連するデータにより、ＥＲ＋乳がんの場合の骨転移過程において有効に因果のある予後マーカーおよび標的遺伝子としての、ならびにｃ−ＭＡＦ遺伝子によって媒介される骨転移プログラムの一部としてのＲＥＲＧの役割を機能的に確認することが可能となった。
【０２５３】
実施例５
ｃ−ＭＡＦによって媒介される骨転移プログラムのメンバーのｉｎ  ｖｉｖｏ機能確認：ＰＯＤＸＬ遺伝子
先の分析で陽性であり、且つｃ−ＭＡＦの発現に直接相関するＰＯＤＸＬ転移性遺伝子（表１および図４）を、マウス由来の精製骨髄細胞に基づいた実験モデルにおける骨髄由来の細胞への接着試験で機能的に確認した。脈管構造から採取した内皮細胞または肺の細胞外基質由来のタンパク質を使用して接着過程を繰り返した場合に、ＰＯＤＸＬの存在下でのより高い接着およびより高レベルのｃ−ＭＡＦのいずれも認められないが、むしろ正反対であることを考慮すると、この接着過程は骨細胞特異的である（図４）。候補遺伝子が転移過程を指示することを確認するための標準的な近似は、高転移性細胞（骨細胞または内皮細胞のいずれか）における機能喪失試験であった。ＰＯＤＸＬ遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨への転移性が高い細胞ＭＣＦ７で低下し、高レベルのｃ−ＭＡＦ遺伝子発現がＰＯＤＸＬ遺伝子の内因性レベルの増加を担うことを示していた。
【０２５４】
干渉ＲＮＡの形質導入の過程では、腫瘍細胞に感染してＲＮＡｉ候補の発現を導入するレンチウイルス系を使用した。ＰＯＤＸＬ遺伝子の転移を促進する機能を、内皮細胞層上の転移性細胞または骨髄由来の細胞に適用した蛍光画像化技術（テクノロジー）を使用して決定した。全ての場合、空のレンチウイルスベクターを感染させた対応する対照細胞を、比較を目的として使用した（図４）。２つのペプチドＲＧＥＳおよびＲＧＤＳ（１番目はインテグリンに結合せず、２番目はこれらと競合して細胞接着を予防する）を使用してこの過程がインテグリン活性に関連するかどうかを評価した。結論として、この過程におけるＰＯＤＸＬの原因となる機能が、インテグリンを介した相互作用によって潜在的に確認された（図４）。
【０２５５】
機能喪失および相関データに関連する実験により、ＥＲ＋乳がんの骨への転移過程の原因である予後マーカーおよび標的遺伝子としての、ならびにｃ−ＭＡＦ遺伝子によって媒介される骨転移プログラムの一部としてのＰＯＤＸＬの役割を機能的に確認することが可能となる。
【０２５６】
配列表由来の用語「配列表」および「人工配列」を、それぞれ、「配列表」および「人工配列」として解釈する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年11月16日(2015.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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