(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定部位がマーカーにより選択的に修飾された生体分子を、基板上で伸張させるステップと、
前記マーカーを検出し、伸張させた前記生体分子の前記基板上の位置を特定するステップと、
前記生体分子における前記マーカーの配置状態を解析するステップと、
を含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の生体分子の解析方法において、マーカーの配置状態を解析する前記ステップは、前記生体分子上の複数の前記マーカーの間隔を計測し、前記マーカーの配置状態を解析するステップを含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載の生体分子の解析方法において、生体分子を基板上で伸張させる前記ステップは、前記生体分子を前記基板上に固定するステップと、前記生体分子が固定された前記基板の表面を洗浄するステップと、を含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項４】
請求の範囲第１項乃至第３項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上に伸張させる前記ステップは、前記基板に低周波電界を印加するステップを含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項乃至第４項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、前記マーカーが蛍光物質であることを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の生体分子の解析方法において、生体分子の基板上の位置を特定する前記ステップは、前記基板の表面に光照射するステップを含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項７】
請求の範囲第１項乃至第６項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、マーカーの配置状態を解析する前記ステップは、前記基板上に伸張した前記生体分子の表面の凹凸を計測することにより、前記マーカーの修飾位置を特定するステップを含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の生体分子の解析方法において、原子間力顕微鏡または走査型トンネル顕微鏡により前記凹凸を計測することを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項９】
請求の範囲第１項乃至第８項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上に伸張させる前記ステップに先立ち、前記生体分子を分離するステップをさらに含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項乃至第９項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、前記生体分子がタンパク質またはポリペプチドであって、前記マーカーは前記生体分子の特定のアミノ酸残基を修飾することを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項に記載の生体分子の解析方法において、前記マーカーは前記生体分子のリジン残基またはシステイン残基のいずれかを選択的に修飾する蛍光物質であることを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１０項または第１１項に記載の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上で伸張させる前記ステップに先立ち、前記生体分子を変性させるステップを含むことを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１０項乃至第１２項いずれかに記載の生体分子の解析方法において、前記マーカーが大きさの異なる二以上の蛍光物質であって、これらはそれぞれ前記生体分子中の異なるアミノ酸残基を選択的に修飾していることを特徴とする生体分子の解析方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項乃至第１３項いずれかに記載の生体分子の解析方法により生体分子を解析した後、さらに前記マーカーの前記配置状態に関する情報に基づいて前記生体分子を同定することを特徴とする生体分子の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生体分子の解析方法およびこれを用いた生体分子の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  特定の細胞、組織、または器官の中で生産されるタンパク質全体を解析するプロテオーム解析では、細胞等の中に存在する未知のタンパク質を同定しなければならない。【０００３】  従来、プロテオーム中に含まれるタンパク質の同定は、二次元電気泳動法によりタンパク質を分離し、分離したタンパク質を質量分析に供することにより行われていた。ここで、タンパク質などの高分子量物質の質量分析では、酵素消化により被測定対象を低分子化する必要がある。このため、分離したタンパク質を酵素消化し、精製したペプチド断片を質量分析に供していた。このような質量分析によるタンパク質の同定の精度を向上する方法が検討されていた（特許文献１）。【０００４】  ところが、質量分析を用いる同定方法では、酵素処理によるペプチド断片の生成について再現性が得られなかったり、酵素の残存によるバックグラウンドの上昇が生じたりすることがあった。また、検出感度が１０ｆｅｍｔｏモル程度であり、微量のタンパク質を高感度で検出し、同定することは困難であった。このため、微量のタンパク質を高感度で検出し、解析する技術が求められていた。
【特許文献１】特開平１１−９４８３７号公報
【発明の開示】
【０００５】
【０００６】  本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体分子を高い精度で解析する技術を提供することにある。また、本発明の別の目的は、生体分子を高い確度で解析する技術を提供することにある。
【０００７】  本発明によれば、特定部位がマーカーにより選択的に修飾された生体分子を、基板上で伸張させるステップと、前記マーカーを検出し、伸張させた前記生体分子の前記基板上の位置を特定するステップと、前記生体分子における前記マーカーの配置状態を解析するステップと、を含むことを特徴とする生体分子の解析方法が提供される。
【０００８】  本発明に係る解析方法は、マーカーを用いて基板上の生体分子の位置を検出する。このため、生体分子を一分子単位で確実に検出することができる。また、基板上で生体分子が伸張しているため、生体分子上のマーカーの修飾位置を確実に解析することができる。このため、生体分子上の特定の修飾部位について、精度および確度の高い解析を行うことが可能となる。
【０００９】  本発明の生体分子の解析方法において、マーカーの配置状態を解析する前記ステップは、前記生体分子上の複数の前記マーカーの間隔を計測し、前記マーカーの配置状態を解析するステップを含んでもよい。こうすることにより、マーカーの間隔に関する計測結果をマーカーの配置状態の解析に好適に利用することができる。このため、生体分子の解析をさらに高い精度および確度で行うことができる。
【００１０】  本発明の生体分子の解析方法において、生体分子を基板上で伸張させる前記ステップは、前記生体分子を前記基板上に固定するステップと、前記生体分子が固定された前記基板の表面を洗浄するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、基板上または生体分子上の不要な物質を洗浄除去することができる。このため、マーカーの配置状態の解析をさらに精度よく、また感度よく行うことができる。
【００１１】  本発明の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上に伸張させる前記ステップは、前記基板に低周波電界を印加するステップを含んでもよい。こうすることにより、基板の表面に生体分子を確実に伸張させることができる。
【００１２】  本発明の生体分子の解析方法において、前記マーカーが蛍光物質であってもよい。こうすることにより、基板上の生体分子の位置をさらに高感度で検出することができる。よって、生体分子を一分子単位で確実に検出することができる。
【００１３】  本発明の生体分子の解析方法において、生体分子の基板上の位置を特定する前記ステップは、前記基板の表面に光照射するステップを含んでもよい。こうすることにより、生体分子をさらに確実に検出することができる。
【００１４】  本発明の生体分子の解析方法において、マーカーの配置状態を解析する前記ステップは、前記基板上に伸張した前記生体分子の表面の凹凸を計測することにより、前記マーカーの修飾位置を特定するステップを含んでもよい。生体分子の表面の凹凸を計測することにより、基板上に伸張した生体分子におけるマーカーの修飾位置を高い精度および確度で解析することができる。
【００１５】  本発明の生体分子の解析方法において、原子間力顕微鏡または走査型トンネル顕微鏡により前記凹凸を計測してもよい。こうすることにより、生体分子の表面の凹凸を高感度で計測することができる。
【００１６】  本発明の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上で伸張させる前記ステップに先立ち、前記生体分子を分離するステップをさらに含んでもよい。こうすることにより、試料中に含まれる所定の生体分子についての解析を確実に行うことができる。
【００１７】  本発明の生体分子の解析方法において、前記生体分子がタンパク質またはポリペプチドであって、前記マーカーは前記生体分子の特定のアミノ酸残基を修飾してもよい。こうすることにより、マーカーの配置情報に基づいて、基板上に伸張したタンパク質またはポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基の配置情報を得ることができる。このため、簡便な操作でタンパク質またはポリペプチドの解析を行うことができる。
【００１８】  本発明の解析方法において、前記マーカーは前記生体分子のリジン残基またはシステイン残基のいずれかを選択的に修飾する蛍光物質であってもよい。こうすることにより、基板上に伸張した生体分子におけるリジン残基またはシステイン残基の配置情報を取得することができる。このため、生体分子の解析をさらに高い精度および感度で行うことができる。
【００１９】  本発明の生体分子の解析方法において、生体分子を前記基板上で伸張させる前記ステップに先立ち、前記生体分子を変性させるステップを含んでもよい。こうすることにより、生体分子をより一層確実に基板上で伸張させることができる。
【００２０】  本発明の生体分子の解析方法において、前記マーカーが大きさの異なる二以上の蛍光物質であって、これらはそれぞれ前記生体分子中の異なるアミノ酸残基を選択的に修飾していてもよい。こうすることにより、生体分子上のマーカーの配置状態について、さらに幅広い情報を得ることができる。このため、解析の精度および確度をさらに向上させることができる。
【００２１】  本発明によれば、前記生体分子の解析方法により生体分子を解析した後、さらに前記マーカーの前記配置状態に関する情報に基づいて前記生体分子を同定することを特徴とする生体分子の同定方法が提供される。
【００２２】  本発明に係る生体分子の同定方法では、上記の解析方法を用いて解析を行うため、マーカーの配置状態に関して精度および感度の高い解析が可能である。本発明では、この解析により得られた情報を用いて生体分子同定を行うため、精度および感度に優れた同定が可能となる。
【００２３】  なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を、方法、装置の間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【００２４】  本発明によれば、生体分子を高い精度で解析することができる。また、本発明によれば、生体分子を高い確度で解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】  上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００２６】
【図１】本実施形態に係る生体分子の解析方法の手順を示す図である。
【図２】本実施形態の生体分子の修飾について説明する図である。
【図３】図１の手順を詳細に説明するための図である。
【図４】本実施形態に係る生体分子の展開について説明する図である。
【図５】本実施形態に係る生体分子の伸張について説明する図である。
【図６】本実施形態に係る生体分子の伸張について説明する図である。
【図７】本実施形態に係る生体分子の伸張について説明する図である。
【図８】本実施形態に係る生体分子の解析方法の手順を示す図である。
【図９】図８の手順を詳細に説明するための図である。
【図１０】図８の手順を詳細に説明するための図である。
【図１１】図８の手順を詳細に説明するための図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】  以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。【００２８】  （第一の実施形態）
図１は、本実施形態に係る生体分子の解析方法の手順を示す図である。図１のフローでは、まず、解析対象となる生体分子を、その特定の部位にのみ結合または吸着するマーカーで修飾する（Ｓ１０１）。次に、マーカーで修飾された生体分子を基板上に展開する（Ｓ１０２）。そして、基板上のどの位置に生体分子が配置されているかを、マーカーを用いて検出する（Ｓ１０３）。ついで、検出された位置に存在する生体分子の形状に沿ったスキャンを行う（Ｓ１０４）。そして、スキャンによって取得される生体分子の配置状態または形状に関する情報や、生体分子上でのマーカーの配置状態に関する情報などに基づいて、生体分子の解析を行う（Ｓ１０５）。【００２９】  本実施形態において、生体分子は、たとえばタンパク質またはポリペプチド、核酸、多糖、あるいは脂質等とすることができる。また、これらの断片であってもよい。以下、タンパク質の解析を行う場合を例に説明する。【００３０】  図１のフローにおいて、ステップ１０１で生体分子を修飾するマーカーは、生体分子の特定の領域を選択的に修飾する物質である。生体分子がタンパク質である場合、マーカーは、たとえば特定のアミノ酸残基を特異的に修飾する。マーカーの大きさは、後述するステップ１０４において、修飾分子上での位置を特定することができる程度であれば特に制限はない。【００３１】  また、タンパク質の一つのアミノ酸残基を修飾するマーカーは一種類であってもよいし、複数種類であってもよい。また、マーカーは金属や高分子等の微粒子であってもよい。タンパク質の一つのアミノ酸残基を修飾するマーカーを一種類とすることにより、生体分子を修飾する複数のマーカーの大きさまたは形状を揃えることができるため、生体分子の解析精度を向上させることができる。また、スキャン（ステップ１０４）の操作をより容易とすることができる。マーカーが一種類の分子である場合、その分子量は、たとえば３００〜１０００程度とすることができる。【００３２】  マーカーとして、たとえば蛍光物質を利用することができる。マーカーとして蛍光物質を用いることにより、後述するステップ１０３において、修飾された生体分子の存在を分子レベルで容易に検出することができる。【００３３】  生体分子中のチオール基を修飾する物質として、たとえば、アルキルハライド、マレイミド、またはアリリジン等に各種蛍光色素を結合させた化合物を用いることができる。これらの化合物を用いることにより、たとえばｐＨ８以下程度の条件で安定なチオエーテルを形成させることができる。よって、これらの化合物を用いてタンパク質中のシステイン残基に選択的に蛍光色素を結合させることができる。具体的な化合物として、たとえばＮ−９−アクリジニルマレイミドや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＩＮＣ  社製Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ等を用いることができる。【００３４】  また、生体分子中のアミノ基を修飾する物質として、たとえば、スクシンイミドエステル、スルフォニルクロライド、またはジクロロトリアジン等に各種蛍光色素を結合させた化合物を用いることができる。これらの化合物を用いることにより、タンパク質中のリジン残基に選択的に蛍光色素を結合させることができる。また、解析対象のタンパク質のＮ末端がフリーである場合、アミノ基を修飾することにより、タンパク質のＮ末端を同時に修飾することができる。このため、後述するスキャン（Ｓ１０４）および解析（Ｓ１０５）において、タンパク質のＮ末端とＣ末端を区別することができるため、より一層解析精度および確度を向上させることができる。【００３５】  アミノ基に対する上述の修飾物質のうち、スクシンイミドエステルはアミノ基に対する特異性を向上させることができるため好ましく用いられる。具体的な化合物として、たとえば２’，７’−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒや、５−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ等を用いることができる。【００３６】  また、他の蛍光物質として、たとえばＦＩＴＣ（フロレセインイソチオシアネート）誘導体や、ＤＡＮＳＹＬ（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸）誘導体、フルオレスカミン、ｏ−フタルアルデヒド等を用いることもできる。【００３７】  タンパク質の蛍光ラベルは、マーカーの種類に応じて既知の方法を用いて行うことができる。なお、タンパク質を予め変性させたのち、マーカーと混合してもよい。図２Ａ〜図２Ｃは、タンパク質のアミノ基の修飾手順を模式的に示す図である。図２Ａは、未変性のタンパク質１０１を示す図である。タンパク質１０１をたとえば尿素や界面活性剤を含むバッファー中で変性させた状態で（図２Ｂ）、マーカー１０３と混合すれば、露出したアミノ基に確実にマーカー１０３を修飾することができる（図２Ｃ）。【００３８】  こうすれば、マーカーをさらに確実に特定のアミノ酸残基に結合または吸着させることができるため、解析精度を向上させることができる。なお、タンパク質の修飾に用いられなかった残存マーカーは、たとえば透析等の方法により除去することができる。【００３９】  ステップ１０２の展開は、たとえば以下の手順により行うことができる。図３は、図１におけるステップ１０２の手順を詳細に説明する図である。図３において、まず、マーカーを修飾したタンパク質を、伸張し（Ｓ１１１）、基板上に付着させる（Ｓ１１２）。そして、伸張させた状態で修飾タンパク質を基板上に固定する（Ｓ１１３）。その後、修飾タンパク質の固定された基板の表面を水等で洗浄し（Ｓ１１４）、基板上に残存する他の物質を除去する。【００４０】  図４Ａ〜図４Ｂは、ステップ１０２において基板上にタンパク質が展開される様子を模式的に示す図である。図４Ａは、基板１０７を示す図である。図４Ｂは、基板１０７上で修飾タンパク質１０５を伸張させた様子（Ｓ１１１〜１１２）を示す図である。また、図４Ｃは、図４ＢのＡ−Ａ’方向の拡大断面図である。【００４１】  基板１０７の材料は、シリコン、ガラス、石英、各種プラスチック材料、またはゴム等の弾性材料により構成される。プラスチック材料としては、成形加工が容易な材料が好ましく用いられ、たとえばＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）等の���可塑性樹脂や、エポキシ樹脂などの熱硬化性樹脂等のプラスチック材料が例示される。【００４２】  また、タンパク質１０１の解析においては、基板１０７の表面は、タンパク質が不可逆的に吸着する程度の疎水性を有することが好ましい。こうすれば、修飾タンパク質１０５の固定を容易に行うことができる。たとえば、基板１０７の表面に所定の疎水処理を施してもよい。また、基板１０７としてガラスを用いてもよい。基板１０７をガラスとすることにより、展開したタンパク質を後述するように容易な操作で表面に固定することができる。また、基板１０７の表面は親水性であってもよい。この場合、後述するように、基板１０７の表面に固定化試薬を導入することにより、修飾タンパク質１０５を固定化できる。【００４３】  また、基板１０７の表面は、金（Ａｕ）等の金属により被覆することもできる。基板１０７表面は、清浄な状態に保たれることが好ましい。基板１０７をシリコンにより構成した場合、基板１０７の表面はシリコン酸化膜（ＳｉＯ２）により被覆された状態とすることもできる。【００４４】  ステップ１１１〜１１２における修飾タンパク質１０５の伸張は、たとえば、基板１０７に低周波電界を印加した状態で、修飾タンパク質１０５を付着させることにより行うことができる。ここで、低周波電界とは、たとえば１００Ｈｚ以下の電界とすることができる。これにより、ランダムコイル状の修飾タンパク質１０５を一定の方向に伸張させることができる（図４Ｂ）。【００４５】  また、修飾タンパク質１０５を伸張させるために、たとえば、基板１０７に高電界を印加した状態で、基板１０７に修飾タンパク質１０５を導入することもできる。ここで、高電界とは、たとえば５００ｋＨｚ以上の電界とすることができる。これにより、修飾タンパク質１０５を伸張させることができる。【００４６】  ここで、修飾タンパク質１０５の付着は、たとえば修飾タンパク質１０５を含む液体を基板上に塗布することによって行うことができる。塗布は、たとえばスプレー塗布とすることができる。また、付着は、修飾タンパク質１０５を含む液体中に基板を浸漬し、引き上げる方法によって行ってもよい。なお、修飾タンパク質１０５を含む液体中には、尿素や界面活性剤等、修飾タンパク質１０５の立体構造を破壊する物質を展開しておくことが好ましい。こうすることにより、修飾タンパク質１０５を確実に伸張させることができる。【００４７】  また、修飾タンパク質１０５を伸張させるために、せん断応力を利用することもできる。たとえば、スプレーで修飾タンパク質１０５を噴霧して基板１０７表面に付着させる方法、基板１０７表面に流速を生じ、その中に修飾タンパク質１０５を導入して基板１０７表面に付着させる方法等がある。流速を生じさせるための方法の一つとして、たとえば基板１０７を回転させながら修飾タンパク質１０５を導入して基板１０７表面に付着させることができる。【００４８】  また、基板１０７として弾性部材を用いて修飾タンパク質１０５を伸張させることもできる。図５Ａ〜図５Ｃは、修飾タンパク質１０５の伸張方法を説明するための図である。【００４９】  図５Ａに示した基板１０７の表面に修飾タンパク質１０５を固定する（図５Ｂ）。ここでも、たとえば、低周波をかける、高電界をかける、せん断応力を利用する等の方法で修飾タンパク質１０５を伸張させた状態で基板１０７表面に固定する。【００５０】  そして、図５Ｂに示すように、基板１０７の側方に均等な力を加えて基板１０７を伸張させる。これにより、基板１０７が伸び、基板１０７表面に固定されていた修飾タンパク質１０５も伸張する（図５Ｃ）。基板１０７をこのように伸張させる場合、基板１０７は、均一に伸張するとともに伸張後に収縮しないような材料により構成されるのが好ましい。このような材料として、たとえばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を用いることができる。このようにすれば、簡便な方法で修飾タンパク質１０５を伸張させることができる。【００５１】  また、さらに、修飾タンパク質１０５を伸張させるために、メニスカス力を用いてもよい。図６は、メニスカス力を用いた修飾タンパク質１０５の伸張方法を説明する図である。図６Ａは、基板１０７の表面に、修飾タンパク質１０５が伸張している様子を示す斜視図である。基板１０７の材料は、たとえばガラスとする。【００５２】  図６Ｂおよび図６Ｃは、修飾タンパク質１０５の伸張過程を示す断面図である。まず、基板１０７を、修飾タンパク質１０５を含む液体中に浸漬する。すると、修飾タンパク質１０５が基板１０７表面に吸着する（図６Ｂ）。そこで、基板１０７を所定の速度で上方に引き上げる。すると、引き上げる過程で吸着した修飾タンパク質１０５が基板１０７の表面で伸張され（図６Ｃ）、図６Ａに示される状態となる。【００５３】  ステップ１１３の固定は、たとえば表面が疎水性の基板を用い、修飾タンパク質を付着させた後、これを乾燥させることによって行うことができる。伸張した修飾タンパク質では、疎水性領域が露出しているため、基板表面を疎水性とすることにより、容易に固定することができる。【００５４】  また、タンパク質のシステイン残基がマーカー１０３で修飾されない場合、基板１０７の表面を金とすれば、フリーのチオール基を介して金−チオール結合を形成することができる。【００５５】  また、基板１０７の表面に、修飾タンパク質１０５を固定するための固定化試薬を導入しておいてもよい。図７Ａ〜図７Ｃは、固定化試薬を導入した基板上に修飾タンパク質を伸張させる様子を模式的に示す図である。この場合、まず図７Ａに示した基板１０７上に固定化試薬１０９を導入する（図７Ｂ）。そして、上述の方法を用いて修飾タンパク質１０５を含む展開液を展開することにより、基板１０７表面に固定化試薬１０９を介して修飾タンパク質１０５を伸張させ、そのまま固定することができる（図７Ｃ）。【００５６】  ステップ１１４の洗浄は、一度乾燥させた基板１０７の表面を超純水等で洗浄するステップである。乾燥により基板１０７の表面に修飾タンパク質１０５は不可逆的に吸着しているのに対し、展開液中に存在する界面活性剤等の物質は水中に再溶解または再分散するため、これらの共存物質を除去することができる。【００５７】  図１に戻り、ステップ１０３の検出は、マーカーとして蛍光物質を用いた場合、基板上に蛍光物質の励起波長を含む光を照射することによって行うことができる。蛍光法で検��することにより、検出感度を向上させることができる。このため、基板上に展開した修飾タンパク質の存在位置を、一分子ごとに検出することが可能となる。【００５８】  ステップ１０４のスキャンは、たとえば修飾タンパク質の形状に沿って表面をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）またはＳＴＭ（走査型トンネル顕微鏡）で観察することによって行うことができる。タンパク質の特定のアミノ酸残基にマーカーが修飾されているため、タンパク質の一次構造に沿ってスキャンした際に、マーカーが修飾されている箇所は修飾されていない箇所よりもかさ高となり、修飾タンパク質１０５の上方や側方に凸部を形成している。このため、修飾タンパク質の凹凸をスキャンすることにより、マーカーの修飾位置や、マーカー間の間隔等の情報を得ることができる。【００５９】  ステップ１０５の解析は、ステップ１０４で得られた修飾タンパク質に関する情報に基づき、データベース等を参照して行うことができる。たとえば、マーカー間の間隔は、特定のアミノ酸残基間の間隔を反映しているため、タンパク質の一次構造に関するデータベースから、特定のアミノ酸残基の間隔がマーカーの間隔に一致するタンパク質を検索することにより、そのタンパク質を同定することができる。【００６０】  このような手順で解析を行うことにより、タンパク質をたとえば１ｚｅｐｔｏモルレベルで解析することが可能となる。【００６１】  タンパク質がたとえばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）である場合、尿素を含むバッファー中でリジン残基を２’，７’−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒで蛍光ラベルし、透析により未修飾の蛍光物質および塩類を除去する。そして、低周波電界を付与したガラス基板上に、得られた修飾ＢＳＡをスプレー噴霧により付着させる。修飾ＢＳＡは、基板表面で伸張した一本鎖の状態で付着する。その後、修飾ＢＳＡが付着した基板の表面を乾燥させる。基板表面を乾燥させることにより、修飾ＢＳＡが基板表面に不可逆的に吸着し、固定される。【００６２】  基板表面を蛍光顕微鏡で観察し、修飾ＢＳＡの存在位置を確認し、確認された位置に存在する修飾ＢＳＡの一本鎖に沿ってその表面の凹凸をＡＦＭ観察する。すると、蛍光物質が付着している部分が凸部として観察される。この凸部間の間隔を計測すれば、ＢＳＡのリジン残基間の間隔のいずれかに略等しい値が得られる。【００６３】  このように、本実施形態によれば、解析対象のタンパク質を修飾および変性させ、変性タンパク質１分子の存在位置を特定し、その骨格鎖に沿って顕微鏡観察をすることが可能となる。このため、タンパク質の一次構造等について、精度および確度の高い解析が可能となる。【００６４】  （第二の実施形態）
図８は、本実施形態に係る生体分子の解析方法の手順を示す図である。図８のフローは、図１のフローにおいて、ステップ１０１の修飾に次いで、試料中の複数の成分を分離する（Ｓ１０６）点、および、展開（Ｓ１０２）に先立ち前処理（Ｓ１０７）を行う点が異なる。試料として、たとえば組織抽出物や細胞抽出物等を用いることができる。【００６５】  図８において、ステップ１０６の分離は図９または図１０のように行うことができる。図９および図１０は、ステップ１０６の手順を詳細に示す図である。【００６６】  図９では、マーカーを修飾したタンパク質を二次元電気泳動により確認し（Ｓ１２２）、目的のスポットに含まれる修飾タンパク質を回収する（Ｓ１２３）。以上のステップは、タンパク質の二次元電気泳動に関する既知の方法を用いて行うことができる。たとえば、マーカーを蛍光物質とした場合、等電点および分子量の二次元でタンパク質をゲル電気泳動した後、蛍光物質の励起波長を含む光を照射し、スポット位置を確認することができる。そして、ゲルの厚さ方向に電圧を付与して修飾タンパク質を溶出するか、あるいは膜状に転写する等の方法で修飾タンパク質を回収すればよい。マーカーを蛍光物質とすることにより、スポットを確認するための染色が不要となるため、後のステップで染色に用いた物質を除去する必要がなく、簡便である。【００６７】  また、図１０は、図９において、二次元電気泳動の代わりにバイオチップを用いてタンパク質の分離を行う方法である。バイオチップを用いることにより、試料が微量である場合にも確実に成分を分離し、回収することができる。【００６８】  図８に戻り、ステップ１０７の前処理はたとえば図１１の手順で行うことができる。図１１は、ステップ１０７の手順を詳細に説明する図である。図１１において、分離、回収されたスポット中には、バッファー由来の塩等が含まれているため、脱塩を行う（Ｓ１３１）。【００６９】  また、修飾タンパク質中にジスルフィド結合が存在すると、後のステップ１０２において基板上に展開する際の伸張の妨げとなる場合がある。そこで、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元剤を添加して、ジスルフィド結合を還元する（Ｓ１３２）。なお、ここで添加した還元剤は、修飾タンパク質を基板上に固定した後、前述したステップ１１４において洗浄除去することができる。【００７０】  本実施形態の解析方法は、試料を分離するステップを含むため、複数のタンパク質を含む試料中の各成分を分離し、それぞれについて解析を行うことができる。また、分離によりタンパク質の等電点や分子量等の情報を取得することができるため、これらの情報と基板上の修飾タンパク質の情報とを組み合わせることにより、より一層解析の幅や精度を向上させることができる。【００７１】  （第三の実施形態）
以上の実施形態ではマーカーを一種類用いる場合を例に説明したが、複数のマーカーを組み合わせて用いてもよい。複数のマーカーとして、解析対象のタンパク質の異なるアミノ酸残基をそれぞれ特異的に修飾する物質を用いる。複数のマーカーを用いる解析方法として、
（ｉ）一つの生体分子を複数のマーカーにより修飾し、これを用いて解析する方法、
（ｉｉ）複数のマーカーのいずれかにより修飾された生体分子のセットを用いて解析する方法、
が挙げられる。以下、これらについて順に説明する。【００７２】  （ｉ）一つの生体分子を複数のマーカーにより修飾し、これを用いて解析する方法
この場合、異なるアミノ酸残基を修飾する複数のマーカーとして、大きさまたは形状が異なる物質を用いる。こうすれば、修飾タンパク質をスキャンした際に、どの位置がどのマーカーにより修飾されているかを知ることができる。このため、試料が微量である場合にも、マーカーの配置状態に関する多くの情報を取得することができる。このため、解析の精度および確度を向上させることができる。【００７３】  具体的には、たとえば、リジン残基に特異的に結合または吸着する蛍光物質とシステイン残基に特異的に結合または吸着する蛍光物質とを用いて、タンパク質一分子のリジン残基とシステイン残基を同時に修飾することができる。こうすれば、基板上の修飾タンパク質について、リジン残基間の間隔、システイン残基間の間隔、リジン残基とシステイン残基との間隔に関する情報が得られるため、より一層精度良くタンパク質の同定を行うことができる。【００７４】（ｉｉ）複数のマーカーのいずれかにより修飾された生体分子のセットを用いて解析する方法
この場合、解析対象のタンパク質を含む試料をマーカーの数の組に分け、それぞれの組を異なるマーカーで修飾する。そして、得られたそれぞれの修飾分子について上述の方法により解析を行う。【００７５】  マーカーごとに試料を分けることにより、それぞれのマーカーにより修飾されるアミノ酸残基が隣接している場合にも、確実にそれぞれの組については修飾を行うことができる。また、マーカーの分子サイズを異にする必要もない。【００７６】  具体的には、たとえば、解析に供するタンパク質を含む試料を予め二分し、一方のリジン残基を修飾し、他方のシステイン残基を修飾することができる。こうすれば、リジン残基とシステイン残基が隣接して存在している場合にも、精度良く解析を行うことができる。【００７７】  なお、本実施形態において、タンパク質のＮ末端あるいはＣ末端を修飾するマーカーと、特定のアミノ酸残基を修飾するマーカーとを組み合わせて用いてもよい。こうすれば、修飾タンパク質をスキャンした際に、Ｎ末端とＣ末端の識別が可能となる。また、これらの末端と特定のアミノ酸残基との位置関係に関する情報を取得することが可能となる。このため、より一層解析の確度および精度を向上させることができる。【００７８】  以上、本発明を実施形態に基づいて説明した。これらの実施形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組み合わせにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。【００７９】  たとえば、タンパク質にマーカーを修飾する前に、予め酵素処理等によりタンパク質を断片化してもよい。こうすれば、各断片の長さと特定のアミノ酸残基の存在部位を組み合わせて解析することができる。このため、解析対象のタンパク質についてより一層多くの情報を取得することができる。このため、解析の確度および精度をさらに向上させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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