(57)【要約】  本発明は、ミニタンパク質Mcotl-llから誘導される超強力マトリプターゼ阻害剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸モチーフ、X1-X-X-C-P-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X-X-X-X-C-X-X-X-C-X-C-X-X25-X-X-X-C-Xを含むか、又は前記モチーフから成るタンパク質であって、式中、X1はI、N、K又はWを表すがWがもっとも好ましく、X6は塩基性アミノ酸を表し好ましくはR又はKであるがKがもっとも好ましく、X7及びX8は疎水性アミノ酸を表し好ましくはV、I、L、MであるがV及びLがもっとも好ましく、X9は塩基性アミノ酸を表し好ましくはR又はKであるがRがもっとも好ましく、X10は親水性アミノ酸を表し好ましくはK、R又はNであるがNがもっとも好ましく、X12は塩基性アミノ酸を表すが好ましくはR又はKであり、さらにX25は小さな側鎖を有する非極性アミノ酸を表すがG、A又はMがもっとも好ましい、前記タンパク質。
【請求項２】
長さが30から40アミノ酸である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号：1−4から成る群から選択される、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号:6に示される、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質の医薬の製造のための使用。
【請求項６】
炎症、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、脈管形性、感染症及び／又は癌から成る群から選択される疾患の治療に使用される、請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプシン様セリンプロテアーゼマトリプターゼの新規で超強力なペプチド性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリプシンは、脊椎動物の小腸に普遍的に見出されるもっとも重要な消化酵素の1つである。その興味深い分子フレームワークは、周知の触媒三残基Asp-His-Serをそのタンパク分解活性を実行する中核的特色として含む。このタンパク分解性構造及び塩基性残基の後ろでペプチド結合を切断する能力は、トリプシン様セリンプロテアーゼと称される生物性触媒の全クラスの構造的及び機能的下地を構成する。この酵素ファミリーのメンバーは多様な生物学的プロセスに必要であり、可溶形態又は膜固着物として存在する。II型トランスメンブレンセリンプロテアーゼ（TTSP）は、例えばN-末端を介して細胞表面と結合し、多様なエフェクター分子の細胞周囲の前進及び活性化の重要な媒介因子として特徴付けられている[Antalis, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 99 (2011), 1-50; Antalis, Biochem. J., 428 (2010), 325-346; Bugge, J. Biol. Chem., 284 (2009) 23177-23181]。ペプチドホルモン、増殖及び分化因子、受容体、酵素及び接着分子の活性形は、特異的TTSPによる内部タンパク分解切断を介して不活性前駆体から生成される。したがって、TTSPは細胞の発達及び恒常性の維持に決定的な役割を果たす。
【０００３】
医薬的に関係がある膜固着トリプシン様セリンプロテアーゼで研究が進んでいる例はマトリプターゼである。マトリプターゼは、健康な組織の上皮細胞表面で広範囲に発現され、そこでは、マトリプターゼのタンパク分解活性は天然のプロテアーゼ阻害因子（例えば肝細胞増殖因子阻害因子-1及び2（HAI-1、HAI-2））によって厳密に調節される。しかしながら、この生理学的な阻害因子-プロテアーゼ均衡の調節不全は病理学的プロセスを進行させると考えられる。実際、多くの研究が、マトリプターゼの過剰発現を上皮性腫瘍や変形性関節症及びアテローム性動脈硬化症の発生及び進行と結びつけて考えている。さらにまた、Nappらは、ネズミの正常位膵臓腫瘍モデルで顕著なin vivoマトリプターゼ活性を観察し、活性部位阻害剤投与が当該基質分析物のタンパク分解を顕著に低下させることを示した。したがって、強力で選択的なマトリプターゼ阻害剤は治療的に極めて重要であり、それらの開発は野心的な仕事である。今日まで、一桁のナノモル濃度からナノモル濃度未満の阻害定数を示す多数の小さな合成有機化合物が大きな抗体フラグメントと同様に報告されている。本出願は、マトリプターゼ活性を阻害することによって治療若しくは予防され得る疾患の治療若しくは予防用医薬組成物の調製のための微小タンパク質、好ましくはシスチンノット形成微小タンパク質（すなわち阻害因子シスチンノット（ICK）ポリペプチドのファミリーに属する）の使用又は前記微小タンパク質をコードするポリペプチドの使用とともに対応する治療方法に関する。本発明はまた、マトリプターゼ活性を阻害するため、マトリプターゼを精製するため、マトリプターゼのための担体分子として、及びサンプルでマトリプターゼを検出又は定量するために（対応する診断的用途を含む）微小タンパク質を使用することに関する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の化合物はマトリプターゼの阻害剤として活性を有し、特異的にマトリプターゼと結合する。
これらの化合物は、癌症状がマトリプターゼの活性によって悪化する当該癌症状の予防又は治療に有用であろうと考えられる。
本発明の化合物の別の使用は、癌症状の進行及び同時に発生する細胞マトリックスの分解の抑制のための使用である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明の化合物はマトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性の阻害剤として活性を有する。したがって、固体/ゲル支持体と連結するために適切な部位を含むこれら化合物は親和性クロマトグラフィーのためにin vitroで用いて、通常の親和性クロマトグラフィーの手順によりサンプルからマトリプターゼを精製するか、又はサンプルからマトリプターゼを除去することができる。これらの化合物は、直接的に又は適切なリンカー支持体を介して、通常的方法により親和性クロマトグラフィーに結合又は連結される。例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons （J.E.Coligan et al., eds, 1997）；及びProtein Purification Protocols, Humana Press（S.Doonan, ed., 1966）並びにそれらの引用文献。
マトリプターゼ又はMTSP1セリンプロテアーゼ阻害活性を有する本発明の化合物は、サンプル中のマトリプターゼ又はMTSP1の活性及びマトリプターゼ又はMTSP1の複合体対非複合体比を測定するin vitroアッセイで有用である。これらのアッセイはまた、組織サンプル（例えば生検由来）でマトリプターゼ又はMTSP1の活性レベルを追跡監視するために、又は任意の臨床状況（マトリプターゼ又はMTSP1活性の測定が助けとなる状況）のためにマトリプターゼ活性及びマトリプターゼの複合体対非複合体比を追跡監視するために用いることができる。サンプルでセリンプロテアーゼ活性を決定するアッセイはELISAと組み合わせて用いることが可能である。前記ELISAは、マトリプターゼの複合体対非複合体比を決定するために、マトリプターゼ又はMTSP1の総量（複合体又は非複合体に関係なく）を決定する。
多様な動物モデルを用いて本発明の化合物の能力を評価して、原発性腫瘍の増殖を低下させるか、又は転移の発生を低下させることができる。
*これらのモデルには、遺伝的に改変させたげっ歯類（トランスジェニック動物）、最初にげっ歯類又はヒトから誘導されてシンジェニック又は免疫低下宿主に移植された移植可能腫瘍細胞が含まれ得る。又はそれらモデルには特殊化モデル、例えば下記に記載するCAMモデルが含まれ得る。前記CAMモデルは、1つの化合物又は複数の化合物の血管増殖（血管形成）を阻害する能力を評価するために設計された（血管増殖は腫瘍の増殖に必須であると考えられる）。
他のモデルもまた利用することができる。
【０００６】
適切な動物モデルを選択して、本発明に記載した化合物のin vivo抗腫瘍活性を一組の関連基準に基づいて評価する。例えば、ある基準は、試験される対象腫瘍によるマトリプターゼ又はMTSP1及び／又はマトリプターゼ又はMTSP1 mRNAの発現であり得る。この基準を満たす2つのヒト前立腺由来腫瘍はLnCap及びPC-3細胞株である。別の基準は、腫瘍が、通常高レベルのマトリプターゼ又はMTSP1を発現する腫瘍由来であるということであり得る。
ヒト結腸癌はこの基準に適合する。第三の基準は、腫瘍の増殖及び／又は進行が、マトリプターゼ又はMTSP1の基質（例えばsc-u-PA）のプロセッシングに依存するということであり得る。ヒトの類上皮癌Hep-3はこの基準に適合する。別の基準は、腫瘍の増殖及び／又は進行が、マトリプターゼ又はMTSP1活性を必要とする生物学的又は病理学的プロセスに依存するということであり得る。別の基準は、対象腫瘍が、周囲組織によるマトリプターゼ又はMTSP1の発現を誘発するということであり得る。
他の基準もまた固有の動物モデルの選択に用いることができる。
【０００７】
いったん適切な腫瘍細胞を選択したら、被検化合物を該選択腫瘍細胞を保持する動物に投与し、該選択モデルに固有の所定の増殖期間の後で、腫瘍サイズ及び／又は転移拡散のその後の測定を実施する。
最初にOssowski（J.Cell Biol., 107: 2437-2445, 1988）が報告したCAMモデル（ニワトリ胚漿尿膜モデル）は、ある化合物の抗腫瘍及び抗血管形成活性を評価する別の方法を提供する。
多様な起源の腫瘍細胞を10日齢のCAM上に置き、一晩定着させることができる。続いてBrooksら（Brooks et al., Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）が記載したように、被検化合物を静脈内注射することができる。腫瘍増殖又はCAM侵襲を阻害する化合物の能力を、化合物を投与してから7日後に測定する。
化合物の血管形成阻害能力を測定するモデルとして用いるときは、血管形成性因子（例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）又は血管内皮細胞増殖因子（VEGF））を含むフィルターディスクを文献（Brooks et al., Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）の記載にしたがって10日齢CAM上に置く。一晩のインキュベーション後に、被検化合物を静脈内に投与する。化合物を投与してから48時間後に血管の分枝量を計数することによって、血管形成量を測定する（(Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）。
【０００８】
本発明の化合物は、マトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性の低下によって緩和される病理学的状態の治療のためにin vivoで有用である。
これらの化合物は、転移の低下又は阻害、並びに腫瘍及び他の新形成の細胞外マトリックスの分解で有用であろうと考えられる。これらの化合物は、細胞外マトリックスの病理学的分解を特徴とする症状（本発明の背景及び序文で上記に記載したものを含む）の治療で治療薬剤として有用であろう。
本発明は、マトリプターゼ又はMTSP1のセリンプロテアーゼ活性の阻害によって軽減される症状を有すると疑われる哺乳動物で症状を予防又は治療する方法を含み、前記方法は、マトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害する本発明の化合物又は医薬組成物の治療的有効量を前記哺乳動物に投与する工程を含む。
本発明の化合物は、in vivoで通常は哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される。それらをin vivoで用いるとき、該化合物は、多様な態様で（経口、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経結腸、経直腸、経鼻、又は腹腔内を含む）、多様な剤形を用いて哺乳動物に投与できる。
本発明の方法を実施するとき、本発明の化合物は、単独で又は互いに組み合わせて、又は他の治療薬若しくはin vivo診断薬と組み合わせて投与される。
医療分野の業者には明白なように、本発明の化合物の“治療的に有効な量”は、治療される年齢、体重及び哺乳動物種、治療される疾患又は病理学的状態の病期、用いられる個々の化合物、個々の投与態様、並びに所望される効果及び治療指標に応じて変動するであろう。これらの要件及びこの量の決定とそれらとの関係は医療分野では周知であるので、治療的に有効な投薬用量レベル、マトリプターゼ又はMTSP1セリンプロテアーゼ活性を阻害する所望の結果の達成に必要な量の決定は当業者の領域内であろう。
典型的には、本発明の化合物の投与はより低い投薬レベルで開始され、投薬レベルは、所望のマトリプターゼ活性阻害効果が所望の程度に達するまで増加されるであろう（前記が治療的に有効な量を規定するであろう）。本発明の化合物にとって、そのような用量は約0.01mg/kg体重から約100mg/kg体重、好ましくは約0.01から約10mg/kg体重である。
【０００９】
上記解説を考慮すれば、マトリプターゼの有効な阻害剤がなお希求されていることは明白である。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、マトリプターゼ活性を阻害することによって予防又は治療可能な疾患の予防又は治療に用いることができるさらに別のマトリプターゼ阻害剤を手に入れることである。好ましくは、そのような阻害剤は、従来技術のマトリプターゼ阻害剤に付随する欠点（例えば望ましくない副反応、不十分な選択性、高い毒性、低い安定性、低い生物利用性及び／又は不十分な結合親和性）を克服するはずである。
この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施態様の提供によって解決される。
したがって、本発明は、マトリプターゼ活性を阻害することによって治療又は予防できる疾患の治療又は予防用医薬組成物の調製のために、微小タンパク質又は前記微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用することに関する。
本発明は、微小タンパク質がマトリプターゼに効果的に結合する能力を有するという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明の使用は、マトリプターゼの活性を顕著に阻害する能力を有する微小タンパク質の使用を指す。
【００１０】
“微小タンパク質”という用語は、一般的に50を超えないアミノ酸の比較的小さいサイズ及び分子内ジスルフィド結合に基づく所定の構造を有するポリペプチドを指す。微小タンパク質は、典型的には高度に安定でありかつ熱、pH及びタンパク分解性分解に耐性を有する。微小タンパク質に関する新しい情報、特にそれらの構造及び出現に関しては例えば以下で概説される：Craik, Toxicon, 39 (2001) 43-60；Pallaghy, Protein Sci. 10 (1994) 1833-9；Reinwarth, Molecules 17 (2012),12533-52。
好ましい実施態様では、本発明で使用する微小タンパク質は少なくとも6つのシステイン残基を含み、そのうちの6システイン残基はジスルフィド結合を介して接続され、シスチンノットを形成する。
そのような微小タンパク質はまた阻害因子シスチンノット（ICK）ポリペプチドとしても知られ、また下記の説明のポリペプチドのように称される。
【００１１】
“シスチンノット”という用語は、小さな三重ベータ-シートを特徴とするICKポリペプチドによって形成される三次元構造を指す。前記三重ベータ-シートは3つのジスルフィド結合フレームワークによって安定化され、前記フレームワークは2つのジスルフィド結合及びそれら結合が接続する骨格セグメントによって形成される包埋環を含み、前記環を第三のジスルフィド結合が貫く。好ましくは、シスチンノットは6つの保存されたシステイン残基及び接続骨格セグメントによって形成され、ここで第一のジスルフィド結合は第一及び第四のシステイン残基の間、第二のジスルフィド結合は第二及び第五のシステイン残基の間、第三のジスルフィド結合は第三及び第六のシステイン残基の間にあり、前記第三のジスルフィド結合は、他の2つのジスルフィド結合及びそれらが接続する骨格セグメントによって形成される環を貫く。適切と考えられる場合、ジスルフィド結合は、シスチンノットの全体的トポロジーの形成を同様に担保する化学的等価物と取り替えることができる。ある微小タンパク質が正確なシスチンノットを形成しているか否かを試験するために、当業者はどのシステイン残基が互いに接続されているかを決定することができる。前記は例えば以下の文献に記載されている技術にしたがって実施することができる：Goransson, J. Biol. Chem. 278 (2003), 48188-48196；及びHorn, J. Biol. Chem. 279 (2004), 35867-35878。シスチンノットを有する微小タンパク質は例えば以下に記載されている： Craik (2001)；Pallaghy (1994)；及びCraik（J. Mol. Biol. 294 (1999), 1327-1336）。
【００１２】
本発明の関係で使用される微小タンパク質は、開放又は環状構造のペプチド骨格を有することができる。開放構造は、好ましくはN-末端にアミノ基及びC-末端にカルボキシル基を有する微小タンパク質を指す。しかしながら、当該末端の改変もまた、生成微小タンパク質がマトリプターゼ阻害活性を示すかぎり、ペプチド化学の最新技術に基づいて当業者が想定する改変と併せて意図される。閉鎖構造では、微小タンパク質のペプチド骨格の末端は、好ましくは共有結合、より好ましくはアミド（すなわちペプチド）結合を介して接続される。シスチンノットトポロジーを有する閉鎖構造の微小タンパク質は、従来技術では“サイクロチド”として知られ、そのノットは“環状シスチンノット（CCK）”として知られている。そのようなシクロチドは、例えばWO 01/27147及びCraik（Curr. Opinion in Drug Discovery & Development 5 (2002), 251-260）に記載されている。
さらに好ましいことは、本発明で使用される微小タンパク質はアミノ酸モチーフX3-CX6-CX5-CX3-CX1-CX5-CX1を含むということである（式中、Xは互いに別個に任意のアミノ酸残基を意味する）。Cは、標準的な命名法にしたがえばシステインを意味する。好ましくは、アミノ酸Xはシステインではない。さらに好ましいことは、当該配列のシステイン残基Cは上記に規定のシスチンノットを形成するということである。
本発明のさらに好ましい実施態様にしたがえば、微小タンパク質は30から40アミノ酸の長さを有する。
【００１３】
本発明に関連して実施した実験で、一定の最大サイズを超えない微小タンパク質は特に良好な性能を示すことが示された。したがって、特に好ましいことは、本発明に関連して使用される微小タンパク質は、35までのアミノ酸、より好ましくは32までのアミノ酸の長さを有するということである。
さらにまた好ましいことは、本発明に関連して使用される前述の規定の微小タンパク質は、以下から成る群から選択されるアミノ酸配列であるということである：
（a）配列番号:1から4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号:5に示されるアミノ酸配列；
（c）（a）又は（b）のアミノ酸配列のフラグメントであって、前記フラグメントがマトリプターゼ活性を阻害する能力を有するもの；
（d）（a）から（c）のいずれか1つのアミノ酸配列又はそのフラグメントの少なくとも1つの残基が置換され、付加され及び／又は欠失されてある機能的等価物であって、前記機能的等価物がマトリプターゼ活性を阻害する能力を有するもの。
配列番号:1から4のいずれか1つのアミノ酸配列を有する（a）に規定の微小タンパク質は、効率的にマトリプターゼを阻害することが実験的に示された。
（b）に記載の配列番号:5のコンセンサス配列は、微小タンパク質oMCoTI-IIのアミノ酸配列（配列番号:6）から誘導された。
【００１４】
本発明はまた、（a）又は（b）に規定するアミノ酸配列のフラグメントを含む微小タンパク質の使用に関するが、ただし前記フラグメントはマトリプターゼ阻害活性を有することを条件とする。“フラグメント”という用語は、当業者にとって明確な意味を有し、当該フラグメントが参照して規定されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の部分的な連続配列を指す。したがって、参照アミノ酸配列と比較して、フラグメントは、N-末端、C-末端又は両末端で少なくとも1つのアミノ酸残基を欠く。環状の参照配列の場合には、フラグメントは前記配列の1つの位置で少なくとも1つのアミノ酸残基を欠き、それによってフラグメントは環状でも直線状でもあり得る。好ましくは、フラグメントは6つの保存されたシステイン残基を保持し、それらの存在によってシスチンノットトポロジーを形成する能力を有する。
“機能的等価物”という用語は、（a）から（c）のいずれか1つに規定された微小タンパク質の変種を指し、前記変種では（a）から（c）のいずれか1つのアミノ酸配列又はそのフラグメントの少なくとも1つの残基が置換され、付加され及び／又は欠失されてあり、前記変種はマトリプターゼ活性を阻害する能力を有する。好ましくは、機能的等価物は、6つのシステイン残基を含むアミノ酸配列を有し、前記システイン残基はジスルフィド結合を介して接続されシスチンノットを形成する。
【００１５】
本発明で使用される機能的フラグメントは、例えば、その相補鎖が（a）から（c）のいずれか１つに既定される微小タンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであることができ、ここで前記ポリペプチドはマトリプターゼ活性を阻害する活性を有する。
本関係では、“ハイブリダイゼーション”という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、例えば以下の文献に記載の条件下におけるハイブリダイゼーションを意味する：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA。特に好ましい実施態様では、“ハイブリダイゼーション”という用語は、ハイブリダイゼーションが以下の条件下で生じることを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：2ｘSSC；10ｘデンハルト溶液（Fikoll 400＋PEG＋BSAの比が1：1：1）；0.1％SDS；5mM EDTA；50 mM Na2HPO4；250μg/mLのニシン  精子DNA；50μg/mLのtRNA；又は0.25M のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）；1mM EDTA、7％SDSハイブリダイゼーション温度T＝60℃、洗浄緩衝液：2ｘSSC；0.1％SDS、洗浄温度T＝60℃。
【００１６】
（a）から（c）のいずれか1つで規定される微小タンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする機能的等価物をコードするポリヌクレオチドは、原則としてそのようなタンパク質を発現する任意の生物に由来するか、又はその改変型をコードすることができる。そのようなハイブリダイズポリヌクレオチドは、例えば細菌、カビ、植物又は動物のゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーから単離することができる。
そのようなハイブリダイズポリヌクレオチドは、本明細書に記載の微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその部分若しくは逆相補物を用いて、例えば標準的方法のハイブリダイゼーションによって同定及び単離することができる（例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA）。
そのようなハイブリダイズポリヌクレオチドはまた、（a）から（c）のいずれか1つで規定される微小タンパク質をコードするヌクレオチドの1つのフラグメント、誘導体及び対立遺伝子変種を含むが、ただし当該ポリヌクレオチドが、マトリプターゼを阻害する能力を有するポリペプチドをコードする場合に限られる。本関係では、“誘導体”という用語は、これらポリヌクレオチドの配列が上記で規定される微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドの1つの配列と1つ以上の位置で異なり、かつこれらの配列と好ましくはタンパク質機能に必須の配列域内で高度な相同性を示すことを意味する。特に好ましいことは、誘導体は6システイン残基を含むアミノ酸配列をコードし、前記残基はジスルフィド結合を介して接続されてシスチンノットを形成するということである。
【００１７】
あるポリヌクレオチドのあるヌクレオチド配列とハイブリダイズする特性は、上記の（a）から（c）のいずれか1つで規定される微小タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、特に好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％の相同性を有する（すなわち配列同一性である）ポリペプチドを当該ポリヌクレオチドがコードすることを同様に意味し得る。さらにまた、あるポリヌクレオチドのあるヌクレオチド配列とハイブリダイズする特性は、上記の（a）から（c）のいずれか１つで規定される微小タンパク質をコードするヌクレオチド配列と比較したとき、当該ポリヌクレオチドが、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは65％を超えて、特に少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％の相同性を有する（すなわち配列同一性である）ことを同様に意味し得る。
【００１８】
好ましくは、相同性の程度は、対応する配列を配列番号:1から5のいずれか1つのアミノ酸配列と比較することによって決定される。比較される配列が同じ長さではないとき、相同性の程度は、好ましくは長い配列中の対応する残基と同一である短い配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基のパーセンテージを指す。相同性の程度は、既知のコンピュータプログラム、例えばClustalW分析によるDNAstarプログラムを用いて簡便に決定することができる。このプログラムは以下から入手でき（DNASTAR, Inc.（1228 South Park Street, Madison, WI 53715）又はDNASTAR, Ltd.（Abacus House, West Ealing, London W13 0AS UK (support@dnastar.com)）、EMBL支所のサーバーでアクセスできる。
個々の配列が参照配列と例えば80％同一であるか否かを決定するためにClustal分析を用いるとき、設定は好ましくは以下のとおりである：マトリックスはblosum 30、空白ギャップペナルティーは10.0、延長ギャップペナルティーは0.05、ディレイダイバージェントは40、ギャップの分離距離はアミノ酸配列比較については8。ヌクレオチド配列比較のためには、延長ギャップペナルティーは好ましくは5.0に設定される。好ましくは、ハイブリダイズポリヌクレオチドの相同性の程度は、そのコード配列の全長にわたって計算される。さらにまた好ましいことは、そのようなハイブリダイズポリヌクレオチド、特に前記に含まれるコード配列は少なくとも75ヌクレオチド及び好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの長さを有するということである。
好ましくは、本発明に関連して用いられる微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする配列は、具体的に開示した微小タンパク質をコードするヌクレオチドと少なくとも90％、好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも98％、特に好ましくは少なくとも99％同一性の相同性領域を含み、この相同性領域は少なくとも75ヌクレオチド、好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの長さを有する。
【００１９】
さらにまた、相同性は、比較されるポリヌクレオチド又は前記によってコードされるポリペプチド間で機能的及び／又は構造的な等価性が存在することを意味する。上記に記載した分子及びこれら分子の対応する誘導体に対して相同性であるポリヌクレオチドは、通常は同じ生物学的機能を有するこれら分子の変種である。それらは、天然に存在する変種、好ましくは（a）から（c）のいずれか1つで規定される微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドのオルトローグ（例えば他の対立遺伝子、変異体、種などから誘導される配列）であるか、又は変異を含むことができる（前記変異は天然に形成されてあっても意図的な変異導入によって生成されてあってもよい）。変種（例えば対立遺伝子変種）は、天然に存在する変種でも、化学的合成によって生成された変種でも、又は組換えDNA技術によって又は前記の組み合わせによって生成された変種でもよい。上記に記載の具体的な微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導される逸脱物は、例えば欠失、置換、挿入及び／又は組換えによって、例えば2つ以上の異なる微小タンパク質の部分の融合によって生成され得る。核酸の改変（DNA又はRNAに対して実施され得る）は、当業者に公知の標準的技術にしたがって実施できる（例えばSambrook and Russell,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”（CSH Press, Cold Spring Harbor, 2001）又はHiggins and Hames (eds.)“Protein expression. A Practical Approach.”Practical Approach Series No. 202. Oxford University Press, 1999）。好ましくは、DNAの増幅はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いることによって実施され、さらに改変はプライマーオリゴヌクレオチド（例えば鋳型配列に対して変異を含む）の適切な選択によって用いられる（例えば以下を参照されたい：Landt, Gene 96(1990), 125-128）。
【００２０】
本明細書に開示する実際の微小タンパク質の変種であるポリペプチドは、前記微小タンパク質に共通する一定の特徴を有する。それら特徴には、例えば生物学的活性、分子量、免疫学的反応性など、及び物理的特性（例えばゲル電気泳動での泳動態様、クロマトグラフィーにおける態様、沈降係数、溶解性、分光特性、安定性、至適pH、至適温度など）が含まれる。
本発明に関連して使用される微小タンパク質の生物学的活性、特にマトリプターゼを阻害する活性は、従来技術及び実施例で記載される方法によって試験することができる。
マトリプターゼ阻害活性のための適切なアッセイは以下に記載されている：Avrutina et al. and Glotzbach et al.（Avrutina, Biol. Chem., 386 (2005), 1301-1306）；Glotzbach（Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr. 69 (2013), 114-120）。
【００２１】
本発明に関連して使用される微小タンパク質は、もっぱらアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から成り得る。しかしながら、当業者に周知の技術及びポリペプチド化学にしたがって誘導体化される微小タンパク質もまた包含される。そのような誘導体は、例えば、1つ以上のアミノ酸のアナローグ（例えば化学的に改変されたアミノ酸）による取替え、N-及びC-末端での環状化、又は当該微小タンパク質の例えば治療効果を改善し得る機能的部分との複合化を含むことができる。誘導体化部分を含むことによって、例えば安定性、溶解性、生物学的半減期又は当該ポリペプチドの吸収を改善することができる。当該部分はまた、微小タンパク質の望ましくない一切の副作用を軽減又は排除することができる。適切な部分に関する概説は例えば以下で見出すことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin（18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990）。ポリエチレングリコール（PEG）は、治療タンパク質の調製に用いることができるそのような化学的部分の例である。PEGのタンパク質への付加はタンパク分解作用からそれらを保護することが示されている（Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71 (1991), 137-139）。多様な方法が、ある種のPEG部分のタンパク質への付加のために利用可能である（概説には以下を参照されたい：Abuchowski et al., in“Enzymes as Drugs”；Holcerberg and Roberts, eds. (1981), 367-383）。一般的には、PEG分子は、当該タンパク質で見出される反応基を介して当該タンパク質に接続される。当該タンパク質の例えばリジン上のアミノ基又はアミノ末端がこの付加のためにとりわけ都合よい。治療薬として有用な微小タンパク質の調製に用いることができるさらに別の化学的改変には以下が含まれる：架橋試薬（例えばグルタルアルデヒド）の添加、アルコール（例えばグリコール又はエタノール）の添加、又はスルヒドロキシド封鎖若しくは改変試薬の添加、例えば側鎖残基のリン酸化、アセチル化、酸化、リボシル化、重金属原子及び／又は10までのN-末端若しくはC-末端追加アミノ酸残基の結合。好ましくは後者の残基はヒスチジン、より好ましくは残基RGS-(His)6である。
【００２２】
さらに別の適切な誘導体化は、1つ以上の追加のアミノ酸配列との融合であり得る。そのような融合タンパク質では、追加のアミノ酸配列は、共有結合又は非共有結合、好ましくはペプチド結合によって微小タンパク質配列と連結され得る。前記連結は、当業界で公知の方法の遺伝的融合に依るか、又は例えばWO94/04686に記載された化学的架橋連結によって実施することができる。追加のアミノ酸配列は、好ましくは可撓性リンカー（有利にはポリペプチドリンカー）によって連結され得る。この場合、前記ポリペプチドリンカーは、追加の配列によって形成される三次元構造のC-末端と微小タンパク質のN-末端（或いはその逆）の間の距離の全長にわたるに足る長さを有する複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含むことができる。融合タンパク質は、切断可能リンカー又はプロテイナーゼ切断部位（例えばCNBr切断又はトロンビン切断部位（上掲書の実施例4を参照されたい））を含むことができる。
発現ベクターは文献に広く記載されている。一般に、それらは、選別マーカー遺伝子及び選別宿主での複製を担保する複製起点だけでなく、細菌又はウイルスプロモーター及びほとんどの事例で転写終了シグナルもまた含む。プロモーターと終了シグナルの間には、一般的に少なくとも1つの制限部位又はコードDNA配列の挿入を可能にするポリリンカーが存在する。
【００２３】
遺伝子の構成的発現を担保するプロモーター及び遺伝子の意図的発現制御を可能にする誘導性プロモーターを使用することが可能である。これらの特性を保有する細菌性及びウイルス性プロモーターは文献に詳細に記載されている。微生物（例えば大腸菌、S.セレビシアエ（S. cerevisiae））での発現のための調節配列は文献に十二分に記載されている。下流配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えばT7プロモーター（Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89）、lacUV5、trp、trp-lacUV5（DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25）、lp1、rac（Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100）である。誘導性プロモーターは、好ましくはタンパク質の合成のために用いられる。これらのプロモーターは、構成的プロモーターよりも高いタンパク質収量をしばしばもたらす。最適なタンパク質量を得るために、二段階プロセスがしばしば用いられる。最初に、宿主細胞は比較的高い細胞密度まで最適な条件下で培養される。第二の工程では、用いられたプロモーターのタイプに応じて転写が誘導される。これに関しては、ラクトース又はIPTG（＝イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド）によって誘導することができるtacプロモーターがとくに適切である（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写終了シグナルもまた文献に記載されている。
【００２４】
適切な宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションは、上記に記載した方法の1つにしたがって実施できる。用いられる個々の宿主細胞の要求、特にpH値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量成分などに関して適合する栄養培地で宿主細胞を培養する。微小タンパク質は以下を含む方法によって組換え細胞培養から回収及び精製することができる：硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折畳み工程をタンパク質の立体構造の完成で用いることができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
組換え体の製造手順で用いられる宿主細胞に応じて、発現ポリペプチドはグリコシル化されても、又はグリコシル化されなくてもよい。ポリペプチドはまた最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことができる。
【００２５】
対象動物への投与のために、微小タンパク質は医薬組成物として処方することができる。そのような医薬組成物は、治療的に有効な量の微小タンパク質及び場合によって医薬的に許容できる担体を含む。当該医薬組成物は、本明細書に記載するように生理学的に許容できる担体とともに対象動物に投与することができる。具体的な実施態様で、“医薬的に許容できる”という用語は、規制庁又は動物（より具体的にはヒト）での使用のために一般的に認められた局方による承認を意味する。“担体”という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は治療薬がそれとともに投与されるベヒクルを指す。そのような医薬的担体は無菌的液体、例えば水及び油（鉱油、動物、野菜又は合成起源のものを含み、例えば落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）であり得る。医薬組成物が静脈内に投与されるときは、水は好ましい担体である。食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた液体担体（特に注射用）として用いることができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、シュクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望される場合には、組成物はまた少量の湿潤剤、乳化剤又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、散剤、持続放出処方物などの形態を有することができる。当該組成物は、慣例的な結合剤及び担体（例えばトリグリセリド）を用い座薬として処方することができる。経口処方物は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適切な医薬担体の例は以下に記載されている：“Remington's Pharmaceutical Sciences”（E.W. Martin）（上記参照）。そのような組成物は、治療的に有効な量の前述の微小タンパク質を、好ましくは精製形で適切な量の担体と一緒に含み、患者への適切な投与のための形態を提供するであろう。当該処方物は投与態様に適切であるはずである。
【００２６】
別の好ましい実施態様では、本組成物は、人間の静脈内投与に適応させた医薬組成物として日常的な手順にしたがって処方される。典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌的な等張の水性緩衝剤の溶液である。必要な場合には、組成物はまた可溶化剤及び注射部位の痛みを軽減する局所麻酔剤（例えばリグノカイン）を含むことができる。一般的には、成分は、別々に又は単位剤形中に一緒に混合して、例えば凍結乾燥散剤又は無水濃縮物として活性物質の量を示した密閉容器（例えばアンプル又はサシェ）中で供給される。組成物が輸液によって投与される場合には、無菌的な医薬等級の水又は食塩水を含む輸液ビンを用いて分配できる。組成物が注射によって投与される場合は、注射用無菌水又は食塩水のアンプルが提供され、成分を投与前に混合することができる。本発明の関係で使用される医薬組成物は中性又は塩の形態として処方できる。医薬的に許容できる塩には、陰イオンにより形成されるもの（例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの）及び陽イオンにより形成されるもの（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるもの）が含まれる。
【００２７】
場合によってin vitroアッセイを用い、最適な投薬量範囲の特定を助けることができる。処方物に用いられるべき厳密な用量はまた投与経路及び疾患又は異常の重篤性に左右されるであろうし、医師の判断及び各患者の環境に応じて決定されるべきである。有効な用量は、in vitro又は動物モデル試験系から導かれる用量-応答曲線から推定できる。好ましくは、医薬組成物は直に又はアジュバントと一緒に投与される。
本発明の関係では、“対象動物”という用語は、マトリプターゼの活性を阻害する必要がある個体を意味する。好ましくは、対象動物は脊椎動物であり、さらに好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。
【００２８】
“投与される”という用語は、微小タンパク質を含む前述の医薬組成物の治療的に有効な用量の投与を意味する。“治療的に有効な量”とは、そのために当該用量が投与される効果を生み出す用量を意味する。正確な用量はその治療目的に左右され、当業者は公知の技術を用いて付き止めることができるであろう。当業界で公知であり上記にも記載したように、全身デリバリー対局所デリバリー、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与期間、薬剤の相互作用及び症状の重篤度に関する調整は必要であり得るし、当業者は日常的な実験により確かめることができる。当該方法は人間の治療及び獣医的応用の両方に適用できる。所望の治療的活性を有する本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載するように生理学的に許容できる担体中で投与することができる。導入の態様に応じて、当該化合物は、下記で考察する多様な方法で処方することができる。治療的に活性な化合物の処方物中の濃度は約0.1−100wt％で変動し得る。薬剤は単独で又は他の治療と併用して投与できる。医薬組成物の投与は上記で考察した以下を含む多様な方法で実施できる：経口、皮下、静脈内、動脈内、結節内、脊髄内、髄腔内、心室内、鼻内、気管支内、皮内、結節内、直腸内、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、経直腸又は眼内。いくつかの事例では、例えば創傷及び炎症の治療では、医薬的に有効な薬剤は溶液乾燥スプレーとして直に適用することができる。
【００２９】
担当医師及び臨床的要因が投薬量の範囲を決めるであろう。医療分野で周知のように、いずれの患者の投薬量も多くの要因（患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき個々の化合物、性別、投与期間及び経路、一般的な健康状態及び同時に投与される他の薬剤を含む）に左右され得る。典型的な用量は例えば0.001から100μgの範囲であり得るが、この例示的範囲より低い又は高い用量も特に前述の要因を考慮して想定される。
投薬は、好ましくは週に1回与えられるが、しかしながら治療進行中にははるかに長い間隔で投薬を与えることができ、さらに必要な時にははるかに短い間隔で（例えば毎日）与えることができる。好ましい事例では、当業者に公知の方法を用いて免疫応答を追跡監視し、投薬量は例えば時間的に量的に及び／又は組成物的に最適化される。定期的評価によって進行を追跡監視することができる。医薬組成物は局所的又は全身的に投与できる。投与は、好ましくは非経口的、例えば静脈内であろう。非経口投与のための調製物には無菌的な水性若しくは非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、及び注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性担体には、水、アルコール溶液/アルコール水溶液、エマルジョン又は懸濁液（食塩水及び緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ベヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ベヒクルには、水分栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲルデキストロース液を基剤とするもの）などが含まれる。保存料及び他の添加物もまた存在し得る（例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなど）。
【００３０】
好ましい実施態様では、医薬組成物は吸入用エーロゾルとして処方される。
さらに別の好ましい実施態様では、医薬組成物は経口投与のために処方される。
好ましい実施態様では、本発明は上記に記載した使用に関し、ここで微小タンパク質は、当該微小タンパク質を発現する遺伝子デリバリーベクターの形態で患者に投与される。さらに好ましいことは、細胞はex vivoでベクターにより形質転換され、当該形質転換細胞が患者に投与されるものである。
これらの実施態様にしたがえば、本発明に関係して使用される医薬組成物は、上記記載の微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ前記ポリヌクレオチドを発現する能力を有するベクターである。そのようなベクターは発現ベクター及び／又は遺伝子デリバリーベクターであり得る。発現ベクターは、本関係ではex vivo遺伝子治療技術での使用のために意図される（すなわち、身体外で適切な宿主細胞をトランスフェクトし、続いて前記宿主細胞を対象動物に投与する）。遺伝子デリバリーベクターは、本明細書ではin vivo遺伝子治療の応用に適切なベクターとして言及される（すなわち、ベクターは対象動物に直接（全身的に又は局所的に）投与される）。本明細書で言及するベクターは核酸のみから成るか、又は追加の化合物と複合化されてもよい（前記追加の化合物は、例えば標的細胞への移転、標的到達、安定性及び／又は生物利用性（例えば循環系において）を強化する）。
【００３１】
そのような追加の化合物の例は、脂質性物質、ポリカチオン、膜破壊性ペプチド若しくは他の化合物、抗体若しくはそのフラグメント、又は特異的に標的細胞を認識する受容体結合分子などである。発現又は遺伝子デリバリーベクターは、好ましくはウイルス（例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシパピローマウイルス）から誘導され、標的として狙いを定めた細胞集団への（例えば気道の細胞への）デリバリーに用いることができる。当業者に周知の方法を用いて、組換え発現ベクター又は遺伝子デリバリーベクターを構築することができる。例えば以下に記載の技術を参照されたい：Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989。また別には、ベクターは標的細胞へのデリバリーのためのリポソームに再構成することができる。微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを周知の方法によって宿主細胞に移転することができる（前記方法は細胞宿主のタイプに応じて変動する）。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般的には原核細胞のために利用され、一方、リン酸カルシウム処置又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主のために用いることができる（上掲書（Sambrook）参照）。
【００３２】
ex-vivo又はin-vivo遺伝子治療に適切なベクター及び方法は文献に記載されてあり、当業者に公知である。例えば以下を参照されたい：Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；WO 94/29469; WO 97/00957；又はSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640；及び前記に引用された参考文献。本発明のこの実施態様で使用されるベクターは、細胞内への直接導入用に、又はリポソーム若しくはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介する導入用に設計され得る。好ましい遺伝子デリバリーベクターにはバキュロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルス系ベクターが含まれる。これらは好ましくは複製不能である。
本発明の使用は、好ましくは炎症、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、脈管形性、感染症及び癌から成る群から選択される疾患に関する。
マトリプターゼを阻害するそれらの能力のために、上記に記載の微小タンパク質は、マトリプターゼが病変媒介因子である疾患若しくは異常を予防又は治療するために、本発明にしたがって用いられる。
【００３３】
さらに別の特徴では、本発明は、マトリプターゼの活性を阻害する必要がある個体を治療する方法に関し、前記方法は、上記に規定した微小タンパク質又は前記微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び場合によって医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物の有効量を前記個体に投与する工程を含む。
この実施態様に関しては、上記説明（特に医薬処方物の処方、投与態様及び疾患に関する説明）が同様に当てはまる。
前述の記載にしたがって、本発明はまた、上記に規定の微小タンパク質又は前記微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドのマトリプターゼ活性の阻害のための使用に関する。この実施態様は、in vivo又はin vitro（好ましくはin vivo）におけるマトリプターゼの阻害に関する。
本発明の別の実施態様は、上記に規定の微小タンパク質のマトリプターゼ精製のための使用に関する。
この目的のために、微小タンパク質は好ましくは固相に結合される。“精製する”という用語は本関係では、マトリプターゼの除去、単離又は抽出を含む。当該固相は、任意の適切な不活性素材を含み、前記素材にはゲル、磁性及び他のビーズ、微小球、結合カラム及び樹脂が含まれ得る。本実施態様を実施するために、当業者に公知のタンパク質の親和性精製のための標準的なプロトコルを適用することができる。
【００３４】
さらにまた、本発明は、ある細胞、組織、器官又は生物で異常な量のマトリプターゼを伴う疾患を診断する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
（a）細胞、組織、器官又は生物由来のサンプルを上記に規定の微小タンパク質と、マトリプターゼと微小タンパク質との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；
（b）マトリプターゼと結合した微小タンパク質の量を決定する工程；及び
（c）上記決定された量が標準量より高い又は低いときに疾患を診断する工程。
この関係では、微小タンパク質は診断組成物の形態で使用することができ、前記診断組成物は場合によって検出のための適切な手段を含む。上記に記載の微小タンパク質は液相で用いられるか、又は固相担体に結合させることができる。対応する親和性アッセイは競合的又は非競合的態様で実施できる。
そのような親和性アッセイは、放射性免疫アッセイ（RIA）、サンドイッチ（免疫測定アッセイ）又はウェスタンブロットアッセイと類似の手段で考案することができる。微小タンパク質は多くの異なる担体に結合させるか、又は前記ポリペプチドと特異的に結合する細胞の単離に用いることができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに磁鉄鉱が含まれる。該担体の性質は可溶性でも不溶性でもよい。
【００３５】
当業者に公知の多くの異なる標識及び標識方法が存在する。本発明で用いることができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物及び生物発光化合物が含まれる。
“異常な量”という用語はある細胞、組織、器官又は生物のマトリプターゼの濃度を指し、前記濃度は、健常な個体の前記細胞、組織、器官又は生物の標準的な濃度より有意に低いか又は高く、その結果、前記は診断されるべき疾患（好ましくは上述の疾患の1つ）に付随する。好ましくは異常な量であるときのマトリプターゼ濃度は、標準的濃度の75％を超えない、好ましくは50％を超えない、より好ましくは25％を超えない、特に好ましくは10％を超えないところに減少する。また別には、異常な状態のマトリプターゼ濃度は、好ましくは標準的濃度の少なくとも150％、より好ましくは少なくとも200％、さらに好ましくは少なくとも500％に増加する。
上記にしたがえば、本発明はまた、マトリプターゼの異常発現に関連する疾患の診断のための上記規定の微小タンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
【００３６】
さらに別の特徴では、本発明はまたあるキットに関し、前記キットは、上記規定の微小タンパク質及び上記規定の診断方法又は対応する使用を実施するためのマニュアル、並びに場合によって検出手段又は標準マトリプターゼサンプルを含む。
本発明のキットの構成要素は、容器（例えばバイアル）中に場合によって緩衝剤及び／又は溶液中に包装され得る。適切な場合には、前記構成要素の1つ以上が1つの同じ容器に包装され得る。追加されて或いはまた別に、前記構成要素の1つ以上が固相（例えばニトロセルロースフィルター又はナイロン膜）に吸着されてあるか、又はマイクロタイタープレートのウェルに存在することができる。
微小タンパク質は当業者には公知である。本関係では、好ましい微小タンパク質は、微小タンパク質のマトリプターゼ阻害機能に関係して上記に規定したものである。
【００３７】
しばしばノッチンと称されるシスチンノットペプチドは天然のコンビナトリアルライブラリーの1つと考えられる。これらのペプチドは、多様な生物（とりわけカビ、植物、海綿動物、軟体動物、節足動物及び脊椎動物）で同定されている。それらは共通の折り畳みを共有するが、一方、それらはフランキングループの一次構造に極めて広範囲の多様性を示す（前記一次構造の多様性はまた生物学的活性の多様性と相関性を有する）。約30から40アミノ酸残基のそれらのアミド骨格は、特徴的な機械的に連結した構造を形成する3つのジスルフィド結合によって圧縮される。3つのジスルフィド結合を介して連結された3つのβ鎖はそれらの構造中心を規定し、ここで環を構成するCysIとCysIV及びCysIIとCysVとの環形成接続は、CysIIIとCysIVの間の第三のシスチンによって貫かれる。骨格NH基の動力学のNMRによる測定は高度な構造的剛直性を示した。内部中心に特にβ鎖を介して広がる（したがって実質的な熱力学的安定性を付加する）水素結合の広範囲なネットワークを考慮すると、シスチンノットモチーフは格別な構造的及び熱的強靭さを示す。ゴーヤ（モモルディカ・コキンキネンシス（Momordica cochinchinensis））から単離されたトリプシン阻害剤（McoTI）及びテッポウウリ（エクバリウム・エラテリウム（Ecballium elaterium））から単離されたトリプシン阻害剤（EETI）はICK（阻害剤シスチンノット）ファミリーの主要なメンバーである。両メンバーはICKペプチドの典型的な構造を共有し、CysIとCysIIとの間に位置する6アミノ酸を含む機能的ループを有する。対照的に、最近報告されたホウレンソウ（スピナシア・オレラセア（Spinacia oleracea））から単離されたミニタンパク質は、公知の植物プロテアーゼ阻害剤との類似性は示さなかったが、ミラビリス・ジャラパ（Mirabilis jalapa）の種子由来の抗菌ペプチドとの類似性を示し、CysVとCysVIとの間に位置する阻害性ループを有する。構造に関する情報は、両阻害剤ファミリーのメンバーについて利用可能である。それぞれのミニタンパク質ファミリーのメンバーの配列及び構造のアラインメントによって、保存された構造中心が明らかにされ、一方、表面露出ループは一次構造に関して高度な融通性を有する。したがって表面露出残基の置換を介して、診断及び治療への適用に潜在的能力を有するテーラーメイド化合物として供することができる生物活性変種を作出することができる。いくつかのノッチンが、合理的設計又はコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって医療関連の標的との結合に向けて既に最適化されている。例えば、非天然ヒドラゾン大環状化モチーフを含むMCoTI-II誘導ミニタンパク質が、ヒトマスト細胞マトリプターゼβ（アレルギー性喘息に対して臨床的関連性を示すプロテアーゼ）の4つのモノマー全てを同時に阻害することが報告された。サソリ由来未のミニタンパク質レイウロトキシンI（Leiurotoxin I）（レイウルス・キンケストリアツス・ヘブラエウス（Leiurus quinquestriatus hebraeus）由来）の数回の指向性進化及び合理的設計によって、HIVのウイルス粒子のgp120との前記ミニタンパク質の結合強化（したがって細胞侵入の阻害）が得られた。さらにまた、癌関連インテグリンが、インテグリン結合RGDモチーフを含むノッチンによる選択的標的到達を介して放射性64Cu及び111Inで首尾よくin vivoで標識され、PET（ポジトロン放射断層撮影法）及びSPECT（単一光子放射断層撮影法）画像化のために用いられた。
ノッチンは、組換え製造及びSPPS（固相ペプチド合成）の両方で容易にアクセス可能である。実際、固相連鎖アッセンブリーで生じる明白な問題が最新のペプチド合成の広範囲のレパートリーを用いて容易に克服でき、重大な工程、トリジスルフィドパターンの位置選択的形成が最適化された酸化条件を用いて効率的に制御することができる。
【００３８】
マトリプターゼ-1（約855アミノ酸のTTSP（II型トランスメンブレンセリンプロテアーゼ））は、S1トリプシン様プロテアーゼのファミリーに属する。前記は、アミノ末端の疎水性トランスメンブレン領域を、いくつかのドメインを含む細胞外部分、それらの中ではトリプシン様触媒性低密度リポタンパク質領域と合体させる。ザイモゲンの自己触媒活性は、その同族阻害因子HAI-1（肝細胞増殖因子アクチベーター阻害因子-1）によって補助され、他のプロテアーゼには依存しない。今日まで、このプロセスのメカニズムは完全には理解されてなかった。興味深いことには、マトリプターゼ-1はまた当該酵素の酸性化を介して活性化され、したがって細胞のアシドーシスにおけるその役割を示している。ノックアウトマウスでの研究によって、マトリプターゼ-1は、上皮の障壁機能、毛嚢の成長及び胸線の恒常性のために必須であり、したがって生後生存に必須であることが示された。さらにまた、マトリプターゼ-1は、上皮細胞だけでなくマスト細胞、B細胞及び血液単球でも発現されることが報告された。その大半が細胞接着及び組織の再形成に重要な前記の多数の基質の中で、プロ-uPA（プロ-ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター）及びプロ-HGF（プロ-肝細胞増殖因子）のプロセッシングは、腫瘍増殖及び転移に大いに必要であることが示された。マトリプターゼ-1の発現速度は、いくつかのタイプの癌細胞で腫瘍進行度を反映することが報告され、したがって腫瘍の転移におけるこのプロテアーゼの決定的な役割を示している。前記は、当該酵素が阻害される、in vitro及びin vivoの両方における多様な実験によって証拠立てられた。特にマトリプターゼ-1及びHAI-1の比（癌細胞ではマトリプターゼ-1側にシフトする）は、腫瘍の侵襲性についてもっとも重要である。さらにまた、マトリプターゼ-1は、多数の他の疾患、それらの中では変型性関節症及びアテローム性動脈硬化症に関与すること、及び癌それ自体を誘発することが報告された。結論すれば、マトリプターゼ-1は薬剤開発の有望な標的となった。
【００３９】
今日まで、ピコモルのKiを有するただ1つのペプチド系マトリプターゼ-1阻害剤が報告されていただけである。マトリプターゼ-1に対するその優れた阻害定数にもかかわらず、配列H-R-Q-A-R-Bt（Btはカルボキシ末端ベンゾチアゾール置換基を表す）を有する、この4アミノ酸ペプチドは低い選択性を示す。in vivo実験のためには高い選択性及び血清半減期は不可欠であるので、この阻害剤は、腫瘍をin vivoで標的とする実験にはおそらく適切ではない。さて、我々は、情報を基盤にしたミニタンパク質のコンビナトリアルライブラリーからの高度に親和性で（affine）選択的なシスチンノットペプチドの単離並びにin vitro及び細胞培養におけるそれらの機能的特徴を記載する。
【００４０】
特に本発明は以下の好ましい実施態様に関する：
マトリプターゼの活性を阻害することによって治療及び予防できる疾患の治療又は予防に使用される微小タンパク質又は前記微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
マトリプターゼの異常発現に関連する疾患の診断のための微小タンパク質又は前記微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
ある細胞、組織、器官又は生物で異常な量のマトリプターゼを伴う疾患を診断する方法であって、以下の工程を含む前記方法：
（a）細胞、組織、器官又は生物由来のサンプルを微小タンパク質と、マトリプターゼと当該微小タンパク質との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；
（b）マトリプターゼと結合した微小タンパク質の量を決定する工程；及び
（c）決定された量が標準量より高い又は低いときに疾患を診断する工程。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は前記の使用、又は先行パラグラフの方法であって、前記疾患又は異常が、炎症、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、脈管形性、感染症及び癌から成る群から選択されるもの。
微小タンパク質又は微小タンパク質をコードするポリヌクレオチドの以下のための使用：（i）マトリプターゼ活性の阻害、（ii）マトリプターゼの精製、（iii）マトリプターゼ又はその誘導体の担体物質として、又は（iv）サンプル中のマトリプターゼの検出及び／又は定量。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記に記載の使用又は方法であって、当該微小タンパク質が少なくとも6つのシステイン残基を含み、そのうちの6システイン残基がジスルフィド結合を介して接続されてシスチンノットを形成するもの。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記に記載の使用又は方法であって、当該微小タンパク質が開放又は環状構造を有するペプチド骨格をもつもの。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記に記載の使用又は方法であって、当該微小タンパク質が該アミノ酸残基を含み、ここでXが互いに別個に任意のアミノ酸残基を意味するもの。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記に記載の使用又は方法であって、当該微小タンパク質が28から40アミノ酸の長さを有するもの。
微小タンパク質若しくは微小タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記に記載の使用又は方法であって、当該微小タンパク質が以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むもの：
（a）配列番号:1から4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号:5に示されるアミノ酸配列；
（c）（a）又は（b）のアミノ酸配列のフラグメントであって、前記フラグメントがマトリプターゼ活性を阻害する能力を有するもの；
（d）（a）から（c）のいずれか1つのアミノ酸配列又はそのフラグメントの少なくとも1つの残基が置換され、付加され及び／又は欠失されてある機能的等価物であって、前記機能的等価物がマトリプターゼ活性を阻害する能力を有するもの。
【００４１】
マトリプターゼ-1の結合に関する重要な残基の説明（開放鎖MCoTI-IIミニタンパク質（天然の配列を示す）のスキャホールドに基づく）：
【００４２】
2016526010.tif 000002
【００４３】
残基5      Proは必須である（変更不可）
残基6      塩基性アミノ酸Arg及びLysが好ましい（最良の阻害剤はこの位置にLys）
残基7＆8   疎水性残基が好ましい（Val、Ile、Leu、Met）
最良の阻害剤はこの位置にVal及びLeu
残基9      塩基性アミノ酸Arg及びLysが好ましい（もっとも好ましいものはArg）
（最良の阻害剤はこの位置にArg）
残基12     塩基性アミノ酸Arg又はLys
残基25     小さな側鎖を有する非極性アミノ酸、例えばGly、Ala及びMet
【実施例１】
【００４４】
MCoTI-IIライブラリースクリーニング
任意抽出スキームで30残基のうち17残基を含むライブラリー設計の実現可能性を評価するために、2つの比較的小さな酵母ライブラリー（それぞれ2ｘ106及び2ｘ107クローンの多様性を有する）を同じ合成ライブラリーDNAから別個に構築し、さらに別個にスクリーニングした。2から4巡りのスクリーニングの後で、マトリプターゼ-1結合集団を濃縮した。フローサイトメトリーを用いて個々のマトリプターゼ-1結合クローンを同定した。DNA配列を入手した（2ｘ106クローンの多様性を有するライブラリーのスクリーニングから10、2ｘ107クローンを含むライブラリーの3巡目のスクリーニングから12及び4巡目のスクリーニングから16）。これらから、4つの結合物を詳細な調査のために選択した。これらは3巡及び4巡のスクリーニングで別個に何度も同定されており、酵母細胞表面親和性タイトレーションで高い親和性結合を示した。
阻害定数を決定するために、以前に報告されたように、推定阻害シスチンノットペプチドの化学合成及び酸化的フォールディングを実施した。低いナノモル及びナノモル未満の範囲の阻害定数が得られた（表1）。最良のMCoTI系阻害剤候補物7についてさらに別に実施した選択性試験によって、トロンビン、uPA及びヘプシンに対する阻害定数Kiは10μMを超えることが明らかになった（表2）。さらにまた、マトリプターゼ-1のための阻害活性はトリプシンに対するよりも約40倍高かった（表1）。
【００４５】
【表１】
2016526010.tif 000003
【００４６】
【表２】
2016526010.tif 000004
【実施例２】
【００４７】
uPA活性化の阻害
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）は、細胞外マトリックスの分解を引き起こし、腫瘍侵襲及び転移で決定的な役割を果たす。受容体結合プロ-uPAの活性化はマトリプターゼ-1によって影響を受けることが示された（前記はuPA発現腫瘍細胞の細胞外マトリックス層の侵襲能力を低下させる）。新規に単離したマトリプターゼ-1阻害剤のプロ-uPA活性化に対する阻害活性を精査するために、SPTI系変種2及びもっとも強力なMCoTI系阻害剤7をヒト前立腺癌癌細胞（PC-3）で用いて細胞培養でuPA活性の用量応答アッセイを実施した（なぜならば、マトリプターゼ-1発現レベルの脱調節が前記細胞株について報告されたからである）。これらの癌細胞の表面での7及び2のIC50の間接的測定のために、uPAの基質回転（uPAは非阻害マトリプターゼ-1により活性化される）を追跡監視し、以前に報告されたマトリプターゼ-1の小分子阻害因子S1と比較した。この実験設定では、MCoTI系阻害剤7（Ki＝0.83nM）は213nMのIC50を示し、一方、SOTI-III由来阻害剤2は極めてわずかな活性を示した。S1（強力なマトリプターゼ-1阻害剤として最近同定された小分子阻害剤で、一桁のナノモル濃度範囲のKiを有する）が参照化合物として用いられ、この化合物はこのアッセイではMCoTI系阻害剤7よりも10倍高いIC50を示した。
【実施例３】
【００４８】
実験設定
培地及び試薬：YPD培地は20g/Lのペプトン、20g/Lのデキストロース、及び10g/Lの酵母抽出物を含んでいた。選択SD-CAA培地は、6.7g/Lのアミノ酸非含有酵母窒素ベース、20g/Lのデキストロース、8.6g/LのNaH2PO4・H2O、5.4 g/LのNa2HPO4及び5g/Lのバクト（Bacto）カザミノ酸を含んでいた。SG-CAA培地は、100mL/Lのポリエチレングリコール（PEG8000）の添加及びデキストロースのガラクトースによる代用以外は同様に調製された。DYT培地は、10g/Lの酵母抽出物、16g/Lのトリプトン、5g/L及び100mg/Lのアンピシリンを含んでいた。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は8.1g/LのNaCl、0.75g/LのKCl、1.13g/LのNa2HPO4及び0.27g/LのKH2PO4を含んでいた（pH7.4）。RPMI細胞培養培地（フェノールレッド含有又は非含有）には10％(v/v)のウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質を補充した。これらの材料はシグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入した。ヒトマトリプターゼ-1は、以前に報告されたように、組み換え生成し自己触媒的に活性化して精製した。ウシ膵臓トリプシン、トロンビン及びuPAはシグマアルドリッチから購入し、ヘプシンはR&Dシステムズ（R&D Systems）から購入した。
【００４９】
変種のクローニング及びライブラリーの合成：MCoTI-II及びSOTI-IIIスキャホールドを土台にするSOTI-III野生型及び酵母ライブラリーの最初のディスプレー実験のために、Taqポリメラーゼを用いるPCRによってコード遺伝子フラグメントを増幅させた。それぞれNheI及びBamHI制限部位の上流又は下流でpCTプラスミドに対して50bpのオーバーラップを有するプライマーを使用した。SOTI-IIIライブラリーの場合のランダム化のための位置はNNK縮退コドンを含んでいた。ライブラリーのためには、記載のように予め作製したコドン混合物を合成に際して用いて対応する残基の偏向ランダム化を達成した。増幅PCR生成物はフェノール/クロロフォルム抽出によって精製した。酵母での相同組換えのために、ベクターをNheI及びBamHIで制限処理しシュクロース濃度勾配で精製した。エレクトロポレーション反応のために、直線化プラスミドの1−4μg及び挿入物10−12μgを用いた。1時間のインキュベーション（YPD培地、30℃）後に、希釈物をプレートすることによってライブラリーサイズを概算した。この酵母細胞を選択SD-CAA培地に移し、30℃でOD600＝10−12に増殖させ、新しいSD-CAA培地に分割した。ライブラリーストックを-80℃で保存した。酵母細胞はSG-CAA培地で誘導した（0.1から0.2のOD600で出発、20℃、48時間、220rpm）。
【００５０】
表面結合アッセイ及びライブラリースクリーニング：ミニタンパク質の表面提示はフローサイトメトリーで追跡監視した。1：20稀釈の抗cMyc抗体（モノクローナル、マウス、Abcam）、抗マウスIgGビオチン結合物（ポリクローナル、ヤギ、シグマアルドリッチ）及びストレプトアビジン、R-フィコエリトリン結合物（SAPE）を連続して用いて、1ｘ107細胞を10分間氷上で標識した。
ノッチン提示酵母細胞を対応するビオチニル化プロテアーゼと30分間氷上でインキュベートすることによって、組換えノッチンライブラリーのプロテアーゼ結合アッセイ及び一次元スクリーニングを実施した。続いて、当該細胞を1：20稀釈のSAPE中に10分間再懸濁した。この細胞をAccuri C6（Becton Dickinson）で分析するか、又はMoFloセルソーターを用いて分類した。分類パラメーターは以下のとおりであった：トリッガーサイドスキャター650、PMT FL2 600；ex.488nmフィルターFL2 570/40。FCSファイルはCFlowソフト又はSummit4.3をそれぞれ用いて解析した。
二次元スクリーニングのために、所望の濃度のビオチニル化プロテアーゼを含む各抗cMyc抗体の1：20稀釈とともにSAPEの混合物、及び抗マウスIgG FITCと連続して0℃で30分酵母細胞をインキュベートした（パラメーター：トリッガーサイドスキャター650、FL1 600、FL2 600）。
第一巡の分類では約2ｘ108の酵母細胞をフローサイトメーターで流した。SD-CAA培地での各巡のスクリーニングの後で選別された細胞を培養した。次の巡のスクリーニングは、先の巡で収集された酵母細胞の少なくとも10倍の数を用いて実施してライブラリーの多様性を担保した。分類のストリンジェンシーは、後に続くスクリーニングの巡でプロテアーゼの濃度を減少させることによって高められた。
陽性クローンのプラスミドDNAを単離し、プラスミド増幅のためにDH5αコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。DNA配列決定はオリゴヌクレオチドpCT-seq-loを用いて実施した。
【００５１】
細胞阻害アッセイ：ヒト前立腺癌細胞（PC-3、Merck KGaA）を10％FCS含有DMEM培地で37℃及び5％CO2下で培養し、陽イオンを含まないPBSで洗浄し、こすり落として採集した。その後で、250μMのBz-β-Ala-Gly-Arg-pNA・AcOH（American Diagnostica）及び所定の希釈の問題の阻害剤の存在下で1ｘ105細胞を一晩インキュベートした。生成物の形成をインキュベーションの前後で405nmにてマイクロプレートリーダーで追跡監視した。SigmaPlot11を用いて非線形回帰によってIC50を計算した。
【００５２】
シスチンノットミニタンパク質の合成：完全自動マイクロ波支援GEM Liberty(商標)ペプチド合成装置で標準的なFmoc-SPPS化学反応を用いてペプチドをアッセンブリングした。ペプチド酸はFmoc-GlnプレロードTentaGel樹脂を用いて生成し、一方、ペプチドアミドはChemMatrix Fmoc-Rinkアミド樹脂上で合成した。固相から切断した後、最近報告されたように酸化折り畳みを実施した。約40mgの対応する凍結乾燥粗ペプチドを500μLのアセトニトリルに懸濁し、超音波浴で5分間処理した。その後、リン酸ナトリウム緩衝水溶液（50mM、pH７）中に10％（v/v）のDMSO、10％（v/v）のTFE及び塩酸グアニジン（GuHCl）（1M）から成る折り畳み混合物の3500μLを添加した。反応の進行は分析用HPLC及びESI-MSにより追跡監視した。反応の終了及び生物活性ミニタンパク質の精製のために、前記混合物を半調製用HPLC系に直接注入した。
【００５３】
RP-HPLC及びLC-ESI-MS：フェノメネックスサイナジー（Phenomenex Synergi）4μハイドロ-RP80Å（250ｘ4.6mm、4μm）カラム（アセトニトリルの直線状グラジエントを適用）を搭載したバリアン（Varian）LC 920系を用い、流速1mL/分で分析RP-HPLCを実施した。半調製用RP-HPLC精製は、アキシア充填フェノメネックスルナ（Phenomenex Luna）C18（250ｘ21.2mm、5μm、100Å）カラム（アセトニトリルの直線状グラジエントを適用）を搭載したバリアンLC 940系を用い、流速18mL/分で実施した。定組成溶離（10％溶離液Bに2分（分析用規模）又は5分（半調製用規模）を要す）の後に、20分かけてそれぞれ10から60％へのB（MCoTI変種）の直線状グラジエント又は10から80％へのB（SOTI変種）の直線状グラジエントが続いた。
LC-MSは、フェノメネックスジュピター（Phenomenex Jupiter）C4（50ｘ1mm、5μm、300Å）カラムを搭載したシマズLC-MS 2020を用い、直線状アセトニトリルグラジエントで流速0.2mL/分により実施した。定組成溶離（2％溶離液Bに2分）の後に10分かけて2から100％のBへの直線状グラジエントが続いた。4、6及び7のシスチンノットジスルフィド結合はMS3テクノロジー（AB Sciex, 4000 QTRAP(商標) LC/MS/MS System；データは示されていない）を用いて確認した。
【００５４】
阻害アッセイ：プロテアーゼ阻害アッセイ(基質非依存阻害定数をもたらす)を以前に記載されたように実施した（Avrutina, Biol. Chem., 386(2005), 1301-1306；Glotzbach, Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr., 69(2013), 114-120；Reinwarth, ChemBioChem, 14(2013), 137-146；Boy, Mol. Imaging Biol. 12(2010), 377-385）。測定は、テカンゲニオス（Tecan Genios）Elisaリーダーを用いてトリプリケートで実施した。プロテアーゼの標準化残基のタンパク分解活性（v/v0）は、基質Boc-QAR-pNA（250μM）、Boc-QAR-AMC（250μM）又はスペクトロザイム（Spectrozym）tPA（250μM）を用いて決定した。生成物形成は、種々の濃度の阻害剤との30分にわたるプレインキュベーション（30分、RT）の後で、それぞれ405nmでの吸収又は蛍光発光（ex. 360 nm、em. 465 nm）を測定することによって追跡監視された。選択性データは、最終プロテアーゼ濃度5nMのuPA及びトロンビンを用いてデュープリケートで実施された。ヘプシンの場合には、アッセイ緩衝液として50mMトリス/HCl（pH9.0）を用いた。外見的阻害剤定数（Kiapp）は、相対的反応速度に対する強固結合の阻害剤のためには非線形回帰（Marquardt-Levenbergアルゴリズム、SigmaPlot11）を用いてMorrison等式に適合させることによって計算した。
【００５５】
2016526010.tif 000005
【００５６】
基質非依存阻害定数Kiは、（2）にしたがって当該酵素のKiapp及びKmから計算された。当該基質及びプロテアーゼのミハエリス-メンテン定数Kmは以前に決定された。
【実施例４】
【００５７】
コンセンサス配列
2つのスクリーニングサイクルから単離されたMCoTi変種の配列アラインメント
MultAlinを用いて多数の配列アラインメントを実施した。赤色でマークしたアミノ酸はMCoTI-wt3のアミノ酸と同一であり、赤色のハイライトを施したアミノ酸は全てのアラインメント実施配列で保存されている。青色枠は少なくとも2つのアミノ酸のコンセンサスを示す。コンセンサス配列（最終行）は0.5の閾値を用いて計算された。コンセンサス配列：大文字は連続的同一性を示し、小文字はコンセンサスを表す。ドットは可変を示す。MCoTI-wt3をアラインメントのためのリード配列として採用した。化学的ペプチド合成及び更なる試験のために選択した配列は右側に示されている。
【００５８】
【表３】
2016526010.tif 000006
【配列表】
2016526010000001.app
【国際調査報告】
2016526010.tif 000007
2016526010.tif 000008
2016526010.tif 000009