【手続補正書】
【提出日】平成25年1月24日(2013.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本出願人は、細胞又は細胞小器官内等のプロトン濃度を調節する働きを担うプロトンポンプ阻害剤が、メラノサイト内の酸性化作用（プロトンポンプ阻害作用）を介するチロシナーゼ活性の低下によるメラニン産生抑制効果を発揮することにより、美白効果をはじめとする皮膚色素異常関連疾患に有用であることを見出している。プロトンポンプ阻害剤は、細胞内における環境的な要因、即ち、細胞内酸性化作用によりチロシナーゼ活性を抑制することによりメラニン産生を抑制し美白効果を発揮する点において、従前のメラニン産生抑制剤に属するチロシナーゼの酵素活性を低下させるチロシナーゼ直接阻害剤、チロシナーゼファミリータンパク質を減少させるチロシナーゼファミリータンパク減少剤等とは全く異なる作用機序を有する美白剤であると言える。言い換えれば、従前のメラニン産生抑制剤とプロトンポンプ阻害剤は、メラニン産生抑制作用を有する物質としては共通するが、その作用機作により明確に区別されるものである。加えて、従前のメラニン産生抑制剤とは異なった作用機序によりメラニン産生抑制作用を発揮するので、プロトンポンプ阻害作用を有するメラニン産生抑制剤と、従前のメラニン産生抑制剤との併用は、少なくとも相加的効果を奏する。この様な背景からも、プロトンポンプ阻害剤は、高い効果が期待出来る新たな作用機作を有するメラニン産生抑制剤である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
一方、ショウガ科に属する植物には、ジンゲロール誘導体又はショウガオール誘導体が含有され、該誘導体が、角層修復促進作用（例えば、特許文献３を参照）、皮膚角質層水分量増加作用（例えば、特許文献４を参照）、血行促進作用（例えば、特許文献５を参照）、メラニン産生抑制作用（例えば、特許文献６を参照）を有することが知られている。また、前記誘導体とは別に、化学合成されたショウガオール及びジンゲロールと類似構造を有する化合物が、チロシナーゼ阻害作用（例えば、特許文献７を参照）を有することも既に知られている。しかしながら、ショウガオール誘導体が、プロトンポンプ阻害作用を有することは知られていない。さらに、ショウガオール誘導体のプロトンポンプ阻害作用に関する構造活性相関は全く明らかにされておらず、プロトンポンプ阻害作用の発現が、ショウガオール誘導体の化学構造に制約を受けることも知られていなかった。加えて、前記のプロトンポンプ阻害作用を有するショウガオール誘導体を含有する皮膚外用剤が、プロトンポンプ阻害作用を介し、美白をはじめとする色素異常疾患の予防又は治療に有効であることも全く知られていなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図１】実施例１で単離した本発明のプロトンポンプ阻害剤（化合物１〜４）及び化合物５のメラノサイト内酸性化作用（プロトンポンプ阻害作用）を示す図である。
【図２】本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物のメラノサイト内酸性化作用（プロトンポンプ阻害作用）を示す図である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
＜製造例１： 本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物、及び、前記一般式（１）に表される化合物（化合物１〜４）の単離精製方法＞
本発明のショウガ科ショウガ属ショウガ（ショウキョウ）より得られる植物抽出物の製造方法を示す。本抽出物は、ショウガZingiber officinale Roscoe( Zingiberaceae ) の根茎をエタノールに浸漬し製造した。具体的には、ショウガ科ショウガ属ショウガ（ショウキョウ）を粗粉末にしたもの２００ｇに、薄めたエタノール（３７〜５０％）約６００ｍLを加え、時々かき混ぜながら可溶性成分が充分に溶けるまで放置し、布ごしし、残留物を薄めたエタノール（３７〜５０％）少量で洗い、圧搾し、浸出液及び洗液をあわせ、２日間放置し、濾過し、さらに薄めたエタノール（３７〜５０％）を加え、本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物全量１０００ｍLを製造した。本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、上記の製造例に記載の方法に準じ製造することも出来るし、丸善株式会社、一丸ファルコス株式会社などにより市販されている抽出物を購入し、使用することも出来る。
前記一般式（１）に表される化合物の内の化合物１〜４と化合物５の単離精製を行った。市販のショウキョウ（乾燥品、刻み、ウチダ和漢薬）１．８ｋｇを９リットルのメタノール中で２時間加熱還流抽出を２回行い、ろ過後２回分の濾液をあわせたものを減圧下濃縮、乾燥し、ショウキョウメタノールエキス１５９ｇを得た。ショウキョウメタノールエキス１５９ｇを１０％の水を含んだメタノール溶液に溶解させ、ｎ−ヘキサンで液液分配抽出を行い、得られたｎ−ヘキサン画分を減圧下濃縮・乾燥し、ｎ−ヘキサンエキス６１．８ｇを得た。ｎ−ヘキサンエキス６１．８ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia PSQ100B、６００ｇ）に付し、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液の比率を変えながら溶出させ、２８のフラクションに分画した。このうち２０番目のフラクション４ｇをさらにTSK-gel ODS-80Ts（東ソー株式会社）カラムを装着した分取ＨＰＬＣにて分画、精製を行い、化合物１〜４を得た。各化合物はNMRスペクトルデータ解析を行い、それぞれ４−ショウガオール（４−shogaol、化合物１）、６−ショウガオール（６−shogaol、化合物２）、８−ショウガオール（８−shogaol、化合物３）、１０−ショウガオール（１０−shogaol、化合物４）、メチル−６−ショウガオール（化合物５）と同定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
＜試験例２： 本発明のプロトンポンプ阻害剤である化合物１〜４、植物抽出物のメラニン産生抑制作用の検討＞
前記化合物１〜５及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。同時に、陽性対象としてハイドロキノンを用い、メラニン産生抑制作用を評価した。２４穴プレートにヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を２２５００（cells/ｃｍ２）播種する。翌日、評価物質を含有する培地 ０．５（mL／well）に交換し、０．２５（μCi）２−[２−１４C]チオウラシル（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を添加し培養を継続した。播種４日後、培地を除去しPBSで１回プレートを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、３時間呈色反応を行った。反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレートリーダーBenchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用い測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで１回プレートを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水 を加え溶液をバイアルに移した。氷上に放置後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに１０％ＴＣＡ５００（μＬ）を添加し、氷上１５分間放置した。１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾール−２（パーキンエルマー社）１（ｍＬ）を添加し、液体シンチレーションカウンター ＬＳＣ−６１００（アロカ社製）にて放射線量を測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量（％）とした。メラニン産生量の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は、細胞毒性の認められない範囲でＳＡＳ software version 9.1.3（SAS Institute Inc.）を用い算出した。結果を表１及び表２に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
前記化合物１〜４及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、細胞毒性を示さない濃度において顕著なメラニン産生抑制作用を示した。このことは、本発明の前記一般式（１）に表される化合物（化合物１〜４）及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物が示すメラニン産生抑制作用は、前記のメラノソーム内酸性化検出（プロトンポンプ阻害作用）に特異的に作用することによるものであると考えられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
＜製造例２： 本発明のプロトンポンプ阻害剤を含有する皮膚外用剤の製造１＞
表３及び表４に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である、エッセンス化粧料を作製した。即ち、イ、ロ及びハの成分をそれぞれ７５℃に加熱し、イにロを徐々に加え乳化し、更に、ハを加え中和、増粘させ、攪拌冷却してエッセンスエマルション（化粧料）を得た。また、表３の処方成分中、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を「アルブチン」に置換した比較例１、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を水に置換した比較例２を作製した。