(57)【要約】細胞のゲノム中への遺伝子操作されたヌクレアーゼおよびドナー分子の送達のための方法および組成物が、本明細書に開示される。具体的には、記載されている方法および組成物は、ＤＮＡミニサークル組成物および細胞への核酸（例えば、治療核酸）の送達のためのＤＮＡミニサークル（「ＭＣ」）の使用に関する。これらのＤＮＡ  ＭＣによって改変された細胞もまた提供される。本明細書に記載されるＤＮＡ  ＭＣは、１種もしくは複数の外因性配列（例えば、導入遺伝子）および／または１種もしくは複数のヌクレアーゼコード配列を含み得る。
2016518142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みのための方法であって、
前記細胞に少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを投与するステップであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ステップと、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）を前記細胞に投与するステップであって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列に隣接する、前記選択された遺伝子に対して相同性の領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外因性配列が、タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列またはｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質コード配列が、抗体、抗原、酵素、増殖因子、細胞表面受容体、核受容体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターまたはそれらの組合せをコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列の発現を駆動するプロモーターを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ  ＭＣ、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記選択された遺伝子がセーフハーバー遺伝子である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって作製された細胞または細胞株。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞から作製された遺伝子導入生物。
【請求項１３】
外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の組込みを介した改変を受けている細胞において、毒性効果を低下させるための方法であって、請求項１に記載の方法に従って前記外因性配列を組み込むステップを含み、それによって、前記毒性効果が、前記外因性配列がプラスミドまたはウイルスベクターを使用して送達される細胞と比較して低下される、方法。
【請求項１４】
対象において外因性配列を発現させる方法であって、
外因性配列を、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法に従って細胞中に組み込むステップと、
前記細胞が前記対象において前記外因性配列を発現するように、前記対象に前記細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記細胞が幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、前記細胞が骨髄移植において投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、前記細胞を投与する前に、骨髄破壊的前処理を受ける、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、前記外因性配列を含む前記ＤＮＡ  ＭＣを含むキット。
【請求項１９】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチド、細胞、試薬およびそれらの組合せをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列およびｍｉＲＮＡ配列からなる群から選択される配列を含む、ＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記配列には、内因性遺伝子に対して相同性の領域が隣接する、ＤＮＡミニサークル。
【請求項２１】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする配列を含むＤＮＡ  ＭＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／８２１，８７２号の利益を主張し、その開示はその全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、ゲノム遺伝子操作、特に、細胞のゲノムの標的化された改変の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための種々の方法および組成物が説明されてきた。かかる標的化された開裂事象を使用して、例えば、標的化された突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；第２００６００６３２３１号；第２０１０００２１８２６４号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号ならびに米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等、エラープローン過程による切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための遺伝子操作された開裂系の使用に関与する。遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等、特異的ヌクレアーゼの使用により、あるいは特異的開裂をガイドするための遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、開裂を生じることができる。遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用して改変された細胞を使用する臨床試験は、治療的有用性を実証している（例えば、Ｔｅｂａｓら（２０１４年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい）。
上述のヌクレアーゼ系の１つを使用する標的化された開裂は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ媒介性の過程のいずれかを使用して、特異的標的位置に核酸を挿入するために利用できる。しかし、細胞にヌクレアーゼ系およびドナーの両方を送達することは、問題であり得る。例えば、細胞中へのプラスミドの形質導入によるドナーまたはヌクレアーゼの送達は、レシピエント細胞、特に、初代細胞であり、したがって細胞株由来の細胞ほどには頑強でない細胞に対して、毒性であり得る。プラスミドＤＮＡは、細菌におけるその産生に必要ないくつかのエレメントを含有し、哺乳動物細胞にとって外来であるとしてこのプラスミドをマークする修飾に供される。したがって、プラスミドＤＮＡのヒト細胞中へのトランスフェクションまたはヌクレオフェクションは、毒性を引き起こし得る。実際、ゲノムの遺伝子操作およびトランスジェニック挿入は、多くの場合、ＤＮＡ構築物の毒性に少なくとも一部起因して、不十分な過程である。
ＤＮＡミニサークル（ＭＣ）は、複製起点も抗生物質選択マーカーも有さない、非ウイルス性遺伝子移入に使用され得るスーパーコイルＤＮＡ分子である。これらのＤＮＡは、細菌ＤＮＡを欠き、したがって、細菌ＤＮＡにおいて見出される非メチル化ＣｐＧモチーフを欠く。これらのＣｐＧモチーフは、抗原提示細胞上のＴｏｌｌ様受容体９受容体に結合することによって、哺乳動物において自然免疫応答を活性化することが示されている。したがって、細菌由来のＤＮＡ配列を含有する遺伝子療法のためのＤＮＡの使用は、細菌配列を欠くＤＮＡよりも炎症性であり得る。ＭＣは、一部の遺伝子療法適用において使用される標準的なプラスミドよりも小さく、標準的なプラスミド（Ｄａｒｑｕｅｔら（１９９９年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６巻：２０９〜２１８頁）およびＴ細胞（Ｓｈａｒｍａら（２０１３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２巻  ｅ７４頁）よりも、両方の細胞株中により効率的にトランスフェクトされる。さらに、ＤＮＡ  ＭＣは、植物細胞による直接的ＤＮＡ取り込み、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換もしくは受動的取り込み；エレクトロポレーションの使用；ポリエチレングリコールによる処理；電気泳動；リポソームまたはスフェロプラストとの細胞融合；マイクロインジェクション、シリコンカーバイドウィスカーおよび微粒子銃等の標準的な技術の使用のいずれかによる、植物細胞形質転換に有用である（米国特許出願公開第２０１２００４２４０９号）。ＭＣは、ａｔｔＢ部位とａｔｔＦ部位との間のファージインテグラーゼφＣ３１媒介性の部位特異的組換えの利用によって作製され得（Ｄａｒｑｕｅｔ、同書を参照されたい）、大規模で産生され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献３】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献５】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献６】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献７】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１２／００４２４０９号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｂａｓら（２０１４年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０巻（１０号）：９０１頁
【非特許文献２】Ｄａｒｑｕｅｔら（１９９９年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６巻：２０９〜２１８頁
【非特許文献３】Ｓｈａｒｍａら（２０１３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２巻  ｅ７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、毒性が低く、現在利用可能な方法よりも効率的な、細胞へのヌクレアーゼ媒介性のゲノム遺伝子操作に必要な核酸の送達のための組成物および方法が、いまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子療法およびゲノム遺伝子操作における使用のための組成物および方法を記載する。具体的には、記載されている方法および組成物は、ＤＮＡミニサークル組成物および細胞への核酸（例えば、治療核酸）の送達のためのＤＮＡミニサークル（「ＭＣ」）の使用に関する。これらのＤＮＡ  ＭＣによって改変された細胞もまた提供される。本明細書に記載されるＤＮＡ  ＭＣは、１種もしくは複数の外因性配列（例えば、導入遺伝子）および／または１種もしくは複数のヌクレアーゼコード配列を含み得る。任意選択で、相同性の領域が、外因性配列（複数可）および／またはヌクレアーゼコード配列と隣接する。ＤＮＡ  ＭＣによって送達される核酸は、宿主細胞における標的ＤＮＡの部位特異的開裂のためのヌクレアーゼ系を含み得る。ＤＮＡ  ＭＣを使用して標的細胞に送達され得るドナー（外因性）核酸、およびこれらのＤＮＡ  ＭＣドナーを使用してゲノム中に組み込まれた配列を含む細胞もまた、本発明によって想定される。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、標的遺伝子座において開裂を生じるための、標的細胞へのヌクレアーゼの送達を含む。一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ  ＭＣを使用した、１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする核酸の送達を含む。適切な標的細胞との接触の際に、このＤＮＡ  ＭＣは、その細胞によって取り込まれ、標的ＤＮＡが、発現されたヌクレアーゼによって開裂される。
【０００９】
他の態様では、本発明は、標的細胞への送達のためのドナー核酸を含む。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば内因性遺伝子座中に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含む。ある特定の態様では、ドナーは、任意の細菌プラスミドＤＮＡ骨格のほとんどまたは全てを欠く（例えば、欠如する）ミニサークルＤＮＡ（ＤＮＡ  ＭＣ）、即ち、環状発現カセット上に保有される。一部の実施形態では、ドナーは、標的化された開裂部位との相同性の領域（相同性アーム）が隣接する、全長遺伝子を含む。一部の実施形態では、ドナーは、相同な領域を欠き、相同性非依存的機構（即ち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座中に組み込まれる。他の実施形態では、ドナーは、細胞における使用のため（即ち、遺伝子補正のため）の相同な領域が隣接する、核酸のより小さい一片を含む。一部の実施形態では、ドナーは、機能的または構造的構成成分、例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどをコードする遺伝子を含む。ヌクレアーゼを使用して標的部位中に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞もまた、提供される。
【００１０】
ドナー分子の目的の配列は、プロモーターありまたはなしで、機能的ポリペプチドをコードする１種または複数の配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含み得る。ある特定の実施形態では、核酸配列は、抗体、抗原、酵素、増殖因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、上記のいずれかの機能的断片、および上記の組合せをコードする配列を含む。機能的ポリペプチドコード配列がプロモーターなしである実施形態では、組み込まれた配列の発現は、次いで、目的の領域中の内因性プロモーターまたは他の制御エレメントによって駆動される転写によって確実にされる。他の実施形態では、「タンデム」カセットが、選択された部位中にこの様式で組み込まれ、カセットの第１の構成成分は、上記のようにプロモーターなし配列を含み、その後転写終結配列、および自律的発現カセットをコードする第２の配列が続く。２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳ等をコードする配列が含まれるがこれらに限定されないさらなる配列（コード配列または非コード配列）が、相同性アーム間で、ドナー分子中に含まれ得る。
【００１１】
別の態様では、相同性非依存的機構によって細胞のゲノム中にドナー核酸を組み込む方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、細胞のゲノム中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じるステップと、ヌクレアーゼを使用してドナー分子を開裂させるステップとを含み、その結果、ドナー核酸は、ＤＳＢの部位において組み込まれる。ある特定の実施形態では、ドナー核酸は、相同性非依存的方法（例えば、ＮＨＥＪ）によって組み込まれる。上述のように、ｉｎ  ｖｉｖｏ開裂の際に、これらのドナー配列は、ＤＳＢの位置において、細胞のゲノム中に標的化された様式で組み込まれ得る。ドナー配列は、ＤＳＢを生じさせるために使用される１種または複数のヌクレアーゼと同じ１つまたは複数の標的部位を含み得る。したがって、ドナー配列は、組込みが望まれる内因性遺伝子を開裂させるために使用されるのと同じ１種または複数のヌクレアーゼによって開裂され得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ＤＳＢを誘導するために使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム中のＤＳＢは、任意の機構によって生じ得る。ある特定の実施形態では、ＤＳＢは、１種または複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、目的の領域内の配列に結合するように遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、および開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインによって生じる。他の実施形態では、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメインに融合された１つまたは複数のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン（天然起源または非天然起源）（ＴＡＬＥＮ）によって生じる。なおさらなる実施形態では、ＤＳＢは、遺伝子操作された単一ガイドＲＮＡまたはその機能的相当部分がゲノム中の標的化された部位にこのヌクレアーゼをガイドするために使用される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して生じる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）および／またはドナーは、ＤＮＡ  ＭＣを使用して細胞に送達される。
【００１２】
他の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、セーフハーバー遺伝子、例えば、哺乳動物細胞におけるＣＣＲ５遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子またはＲｏｓａ遺伝子、および植物におけるＺｐ１５遺伝子座に結合および／またはそれらを開裂する。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号および第８，３２９，９８６号；米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号；第２０１０００２１８２６４号；第２０１００２９１０４８号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号ならびに米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、導入遺伝子（例えば、アルブミン）の発現を指向するための部位に結合および／またはそれを標的化する。例えば、米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号を参照されたい。
【００１３】
一態様では、ＤＮＡ  ＭＣは、目的の遺伝子に結合、および／またはその発現をモジュレートするために、目的の調節タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＴＦ、ＴＡＬＥ  ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ）を送達するために使用される。一実施形態では、調節タンパク質は、ＤＮＡ配列に結合し、他の調節因子の結合を防止する。別の実施形態では、調節タンパク質の結合は、標的ＤＮＡの発現をモジュレート（即ち、誘導または抑制）し得る。
【００１４】
別の一態様では、外因性配列（ドナー）のヌクレアーゼ媒介性の組込みによって改変された細胞における毒性効果（毒性）を低下させるための方法であって、ＤＮＡ  ＭＣを使用してヌクレアーゼコード配列および／または外因性配列（ドナーまたは導入遺伝子）を投与するステップであって、それによって、細胞における毒性は、外因性配列がプラスミドベクターまたはウイルスベクターを使用して導入される細胞と比較して、低下されるステップを含む方法が、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、ドナー配列は、ＤＮＡ  ＭＣ上に保有され、ヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ形態で送達される。他の実施形態では、ドナー配列は、ＤＮＡ  ＭＣ上に保有され、ヌクレアーゼは、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ等）上に保有される。なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）およびドナーの両方が、ＤＮＡ  ＭＣ上に保有される。
【００１５】
なお別の態様では、本明細書に記載されるＤＮＡ  ＭＣを含む細胞もしくは細胞株、または本明細書に記載される１種もしくは複数のＤＮＡ  ＭＣを使用して作製された遺伝子改変を含むかかる細胞の子孫が、本明細書に記載される。
【００１６】
本明細書に記載される方法および組成物（例えば、細胞）のいずれかでは、細胞は、任意の真核生物細胞、例えば、植物細胞もしくは哺乳動物細胞、またはＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞を含む細胞株、ならびに昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、あるいは真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであり得る。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。適切な細胞には、例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）、神経幹細胞および間葉系幹細胞などの幹細胞も含まれる。
【００１７】
他の態様では、動物モデルの生成のためおよび／または状態の処置もしくは予防のために本明細書に記載される細胞を使用する方法が、記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変された血液細胞前駆体（「ＨＳＣ」として公知の造血幹細胞）が、骨髄移植において与えられ、これらのＨＳＣは、対象（例えば、動物モデルまたはヒト）において、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化および成熟する。一部の実施形態では、これらのＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ誘導された動員の後に単離され、他の実施形態では、これらの細胞は、ヒト骨髄または臍帯から単離される。一部の態様では、これらのＨＳＣは、特定の遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理によって編集される。他の態様では、これらのＨＳＣは、野生型遺伝子もしくは他の目的の遺伝子が挿入および発現され、ならびに／または内因性の異常な遺伝子が補正されるように、遺伝子操作されたヌクレアーゼとドナー核酸とで改変される。一部の実施形態では、これらの改変されたＨＳＣは、穏やかな骨髄破壊的前処理の後に対象（患者）に投与される。他の態様では、移植後に、造血細胞の１００％が改変されたＨＳＣに由来するように、これらのＨＳＣは、完全な骨髄破壊後に投与される。さらに、細胞は、細胞周期のＧ２期において停止され得る。
【００１８】
本明細書に記載される方法および組成物の一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞など、効率的な相同性ベースのＤＮＡ修復を欠く細胞であり得る。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路を優先的に使用する初代細胞または非分裂細胞であり得る。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、植物細胞を含む。一部の実施形態では、これらの植物細胞は、本発明のヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、これらの植物細胞は、導入遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）および／または導入遺伝子は、ＤＮＡ  ＭＣによって植物細胞中に導入される。なお別の態様では、植物細胞のゲノム中に１種または複数の外因性配列を導入するための方法であって、（ａ）細胞を、１種または複数の外因性配列（ドナーベクター、導入遺伝子またはＧＯＩ）と接触させるステップと；（ｂ）本明細書に記載される１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を細胞において発現させるステップであって、１種または複数のヌクレアーゼは、染色体ＤＮＡを開裂するステップとを含み；その結果、ステップ（ｂ）中の染色体ＤＮＡの開裂は、相同組換えによるゲノム中へのドナーベクターの取り込みを刺激する方法が本明細書に記載されている。複数の導入遺伝子が、同時に（並行して）組み込まれ得、またはこれらのステップは、導入遺伝子の連続的付加（導入遺伝子スタッキング）のために反復され得る。
【００２０】
本明細書に記載される組成物（細胞または植物）または方法のいずれかでは、植物細胞は、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、植物細胞は、作物植物、例えば、トマト（または他の果実作物）、ジャガイモ、トウモロコシ、ダイズ、アルファルファ等である。
【００２１】
なおさらなる一態様では、本明細書に記載された方法のいずれかに従って得られた動物細胞または植物細胞もまた提供される。
【００２２】
別の態様では、本明細書に記載される植物細胞を含む植物が、本明細書で提供される。さらに別の態様では、本明細書に記載される動物細胞を含む動物が、本明細書で提供される。
【００２３】
別の態様では、本明細書に記載されるように得られた植物細胞を含む植物由来の種子が、本明細書で提供される。
【００２４】
別の態様では、本明細書に記載されるように得られた植物細胞を含む植物由来の果実が、本明細書で提供される。
【００２５】
一部の実施形態では、トランスジェニックの細胞、植物および／または動物は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。一部の例では、トランスジェニック動物は、外因性導入遺伝子に対応する内因性遺伝子座においてノックアウトを含み、それによって、ヒトタンパク質が単離状態で研究され得るｉｎ  ｖｉｖｏ系の開発を可能にする。かかるトランスジェニックモデルは、小分子もしくは大きい生体分子または目的のヒトタンパク質と相互作用し得るもしくは目的のヒトタンパク質を改変し得る他の実体を同定するために、スクリーニング目的で使用され得る。一部の態様では、導入遺伝子は、本明細書に記載される方法のいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞等）または動物胚中に、選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）中に組み込まれ、次いで、胚は、生きた動物が出生するように移植される。次いで、動物は、性的成熟になるまで育てられ、子孫を生じるようになり、ここで、子孫の少なくとも一部は、編集された内因性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む。
【００２６】
本発明のＤＮＡ  ＭＣを含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ  ＭＣ（例えば、ＲＮＡ分子、または適切な発現ベクター中に含有されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。これらのＤＮＡ  ＭＣは、キット中での使用のための目的のドナー分子もまた含み得る。
【００２７】
これらおよび他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１のパネルＡ〜Ｅは、使用したドナー構築物（Ａ〜Ｅ）の模式図である。構築物を、ＭＣドナーを標準的なプラスミドドナーまたはＰＣＲ産物と比較するために作製した。図１Ａは、ヒトＣＣＲ５遺伝子中の標的化された部位にＧＦＰ導入遺伝子（「ＧＦＰ」）を送達するための、８．２Ｋｂである、「Ｐ２Ｕ」と称されるプラスミドドナーを示す模式図である。このプラスミドは、ヒトＣＣＲ５遺伝子と相同な、ＣＣＲ５  ＺＦＮ対の標的部位に隣接する、２つの領域を有する。ＧＦＰの右側の相同性領域は、１．５Ｋｂであるが、ＧＦＰの左側の相同性領域は、０．５Ｋｂである。ＧＦＰの発現は、ＵｂＣプロモーターによって駆動され、この構築物は、ポリアデニル化シグナル配列（「ｐＡ」）もまた含む。細菌複製起点およびアンピシリン抵抗性遺伝子を含むプラスミド骨格配列は、実線の曲線によって示される。図１Ｂは、約４．５Ｋｂである、コンパレーターＭＣドナーＭ２Ｕを示す。このＭＣは、Ｐ２Ｕプラスミドと同じ導入遺伝子およびＣＣＲ５相同性アーム特徴を有するが、最終産物中には細菌プラスミド骨格を欠如する。その代わり、このＭＣは、破線によって示される、Ｍ２Ｕの構築後に残留するおよそ１５０塩基対の非細菌起源の残存するプラスミド配列（例えば、およそ３６塩基対のａｔｔＲ組換え部位、および特異的ＭＣの構築を促進する「マルチクローニング部位」と呼ばれる変動する長さの配列）を含有する。図１Ｃは、およそ４．３Ｋｂである、ドナー送達にも使用される直鎖状ドナーＰＣＲ産物（「ＰＣＲ２Ｕ」）を示す。ＰＣＲ２Ｕは、Ｐ２ＵおよびＭ２Ｕについて上記したのと同じ導入遺伝子およびＣＣＲ相同性アーム特徴を有するが、細菌配列も残存するプラスミド配列も含有しない。図１Ｄは、右の相同性アームがおよそ０．５Ｋｂまで短縮されており、ＰＧＫプロモーターがＧＦＰを駆動するために使用されることを除いて、図１Ａに示されるプラスミドドナーと類似した、「Ｐ１Ｐ」と称されるプラスミドドナー構築物（６．１Ｋｂ）を示す。図１Ｅは、細菌骨格配列が除去されており、破線によって示される、およそ１５０ｂｐのＤＮＡの残存する領域のみがＭＣを作製する過程から残留する、２．６Ｋｂである「Ｍ１Ｐ」と称されるＰ１ＰのＭＣ相当部分を示す。
【００２９】
【図２−１】図２のパネルＡ〜Ｃは、ＭＣドナーと比較して、標準的なプラスミドドナーを使用したエレクトロポレーション後のヒトＨＳＣにおける細胞毒性に関する結果を示す。ＺＦＮは、存在する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡから発現させた。図２Ａは、エレクトロポレーション後の毒性に対する標準的なプラスミドドナーＰ２Ｕ対Ｍ１Ｐの比較を示す。示される値は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）排除によってアッセイした、培養物中に維持された未処理のＨＳＣにおいて生じる細胞死のレベルと比較して、ＨＳＣ中への示された構築物の導入によって引き起こされる細胞死におけるパーセント増加を示す。７−ＡＡＤは、二本鎖核酸内にインターカレートし、生細胞によって排除されるが、瀕死または死細胞の細胞膜を浸透し得る。独立した実験の数もまた示される（ｎ＝）。図２Ｂは、プラスミドドナーＰ２Ｕと、Ｍ２Ｕおよび直鎖状ＰＣＲ産物ドナーＰＣＲ２Ｕとの比較を示す。示される値は、未処理のＨＳＣと比較した細胞死におけるパーセント増加を示す。図２Ｃは、プラスミドドナーＰ２ＵまたはＭＣドナーＭ２Ｕの投与の２時間後の、示された遺伝子（ＩＦＮβ、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５６、ＩＳＧ５４およびＣＸＣＬ１０）の発現の増加倍率を示す。これらの遺伝子の発現の迅速な誘導は、導入された核酸の外来としての感知から生じ、細胞毒性をもたらす。
【図２−２】図２のパネルＡ〜Ｃは、ＭＣドナーと比較して、標準的なプラスミドドナーを使用したエレクトロポレーション後のヒトＨＳＣにおける細胞毒性に関する結果を示す。ＺＦＮは、存在する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡから発現させた。図２Ａは、エレクトロポレーション後の毒性に対する標準的なプラスミドドナーＰ２Ｕ対Ｍ１Ｐの比較を示す。示される値は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）排除によってアッセイした、培養物中に維持された未処理のＨＳＣにおいて生じる細胞死のレベルと比較して、ＨＳＣ中への示された構築物の導入によって引き起こされる細胞死におけるパーセント増加を示す。７−ＡＡＤは、二本鎖核酸内にインターカレートし、生細胞によって排除されるが、瀕死または死細胞の細胞膜を浸透し得る。独立した実験の数もまた示される（ｎ＝）。図２Ｂは、プラスミドドナーＰ２Ｕと、Ｍ２Ｕおよび直鎖状ＰＣＲ産物ドナーＰＣＲ２Ｕとの比較を示す。示される値は、未処理のＨＳＣと比較した細胞死におけるパーセント増加を示す。図２Ｃは、プラスミドドナーＰ２ＵまたはＭＣドナーＭ２Ｕの投与の２時間後の、示された遺伝子（ＩＦＮβ、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５６、ＩＳＧ５４およびＣＸＣＬ１０）の発現の増加倍率を示す。これらの遺伝子の発現の迅速な誘導は、導入された核酸の外来としての感知から生じ、細胞毒性をもたらす。
【００３０】
【図３−１】図３のパネルＡ〜Ｄは、ヒトＨＳＣの引き続く生着およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４５＋白血球への分化に対する、プラスミドおよびＭＣドナーの影響を示す。図３Ａは、ＮＳＧマウスにおけるＨＳＣの生着後に生じたヒトＣＤ４５＋細胞レベルを示し、前駆体ＨＳＣは、ＺＦＮ  ｍＲＮＡ単独、または標準的なプラスミドドナーＰ２ＵもしくはＭＣ  ＤＮＡドナーＭ１Ｐと組み合わせたＺＦＮ  ｍＲＮＡのいずれかで処理されている。各点は、生着後のＮＳＧマウスの末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞数を示し、測定値は、生着の４、８、１２、１６および２０週間後の時点で取得し；ならびに２０週目の剖検時におけるマウスの骨髄および脾臓において取得した。図３Ｂは、別々のコホートのマウスを用いた、図３Ａで示したのと類似のデータを示す。図３Ｃは、細胞の導入の８週間後または１２週間後のいずれかの時点においてＮＳＧマウスの血液において測定した、Ｐ１ＰまたはＭ１Ｐのいずれかと組み合わせてＺＦＮ  ｍＲＮＡでヌクレオフェクトされたＨＳＣを用いたマウスの生着から生じたヒトＣＤ４５＋白血球集団の全体的生着レベルを示す。図３Ｄは、これらのヒトＣＤ４５＋細胞集団内の、それぞれ、分化したＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を示す。５％よりも高いヒトＣＤ４５＋細胞を有する血液試料だけが、これらのサブセット分析において合理的に使用されるのに十分な細胞を提供し、図３Ｃ中に示されるように、Ｐ１Ｐ血液試料はこの閾値を満たさない。
【図３−２】図３のパネルＡ〜Ｄは、ヒトＨＳＣの引き続く生着およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４５＋白血球への分化に対する、プラスミドおよびＭＣドナーの影響を示す。図３Ａは、ＮＳＧマウスにおけるＨＳＣの生着後に生じたヒトＣＤ４５＋細胞レベルを示し、前駆体ＨＳＣは、ＺＦＮ  ｍＲＮＡ単独、または標準的なプラスミドドナーＰ２ＵもしくはＭＣ  ＤＮＡドナーＭ１Ｐと組み合わせたＺＦＮ  ｍＲＮＡのいずれかで処理されている。各点は、生着後のＮＳＧマウスの末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞数を示し、測定値は、生着の４、８、１２、１６および２０週間後の時点で取得し；ならびに２０週目の剖検時におけるマウスの骨髄および脾臓において取得した。図３Ｂは、別々のコホートのマウスを用いた、図３Ａで示したのと類似のデータを示す。図３Ｃは、細胞の導入の８週間後または１２週間後のいずれかの時点においてＮＳＧマウスの血液において測定した、Ｐ１ＰまたはＭ１Ｐのいずれかと組み合わせてＺＦＮ  ｍＲＮＡでヌクレオフェクトされたＨＳＣを用いたマウスの生着から生じたヒトＣＤ４５＋白血球集団の全体的生着レベルを示す。図３Ｄは、これらのヒトＣＤ４５＋細胞集団内の、それぞれ、分化したＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を示す。５％よりも高いヒトＣＤ４５＋細胞を有する血液試料だけが、これらのサブセット分析において合理的に使用されるのに十分な細胞を提供し、図３Ｃ中に示されるように、Ｐ１Ｐ血液試料はこの閾値を満たさない。
【００３１】
【図４−１】図４のパネルＡ〜Ｃは、導入遺伝子がＭ１Ｐ、Ｐ２Ｕ、Ｐ１Ｐ、Ｍ２ＵまたはＰＣＲ２Ｕによって提供される場合の、ＨＳＣにおける相同組換えを介した導入遺伝子組込みの比率を示すグラフである。図４Ａは、ＺＦＮの共発現ありおよびなしの両方の、Ｐ２ＵプラスミドとＭＣドナーＭ１Ｐとの比較を示し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセントを、ヌクレオフェクションの後経時的にＦＡＣＳによって測定した。遺伝子付加は非常に稀な事象であるので、ＺＦＮの非存在下では、培養物中で４日目までに、背景レベルのＧＦＰ発現のみが存在する。かなり高いレベルのＧＦＰ遺伝子付加は、ＺＦＮもまた存在する場合に生じ、ＭＣドナーＭ１Ｐは、平均して、プラスミドドナーＰ２Ｕと比較して、３倍超高い比率を生じる（右側のグラフ）。図４Ｂは、Ｐ１ＰとＭ１Ｐとの比較を示すが、図４Ｃは、Ｐ２ＵとＭ２ＵおよびＰＣＲ２Ｕとの比較を示す。全ての場合において、これらのＤＮＡ  ＭＣドナーは、プラスミドまたはＰＣＲドナーよりも、より良いレベルの標的化された組込みを生じた。
【図４−２】図４のパネルＡ〜Ｃは、導入遺伝子がＭ１Ｐ、Ｐ２Ｕ、Ｐ１Ｐ、Ｍ２ＵまたはＰＣＲ２Ｕによって提供される場合の、ＨＳＣにおける相同組換えを介した導入遺伝子組込みの比率を示すグラフである。図４Ａは、ＺＦＮの共発現ありおよびなしの両方の、Ｐ２ＵプラスミドとＭＣドナーＭ１Ｐとの比較を示し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセントを、ヌクレオフェクションの後経時的にＦＡＣＳによって測定した。遺伝子付加は非常に稀な事象であるので、ＺＦＮの非存在下では、培養物中で４日目までに、背景レベルのＧＦＰ発現のみが存在する。かなり高いレベルのＧＦＰ遺伝子付加は、ＺＦＮもまた存在する場合に生じ、ＭＣドナーＭ１Ｐは、平均して、プラスミドドナーＰ２Ｕと比較して、３倍超高い比率を生じる（右側のグラフ）。図４Ｂは、Ｐ１ＰとＭ１Ｐとの比較を示すが、図４Ｃは、Ｐ２ＵとＭ２ＵおよびＰＣＲ２Ｕとの比較を示す。全ての場合において、これらのＤＮＡ  ＭＣドナーは、プラスミドまたはＰＣＲドナーよりも、より良いレベルの標的化された組込みを生じた。
【００３２】
【図５】図５のパネルＡ〜Ｃは、「ｉｎ−ｏｕｔ」ＰＣＲアッセイによってアッセイした、ドナーがＰ２Ｕ、Ｍ１Ｐ、Ｐ２ＵまたはＭ２Ｕを介して送達される場合の、ＺＦＮの存在下での標的化された組込みの量を示し、標的化された組込みは、ＧＦＰ導入遺伝子中の１つのプライマー、およびＺＦＮ標的部位に隣接するが、ドナー中に含有される相同な配列の範囲を超える、ゲノム中の１つのプライマーを使用することによって、測定する。結果として、ＰＣＲ産物は、導入遺伝子がＺＦＮによって標的化される遺伝子座において特異的に組み込まれた場合にのみ、生成される。図５ＡおよびＢは、プラスミドドナーＰ２ＵおよびＭＣドナーＭ１Ｐによって達成される特異的組込みのレベルを比較する。図５Ａは、各ドナーについて検出されたＰＣＲ産物のパーセントを示すが、図５Ｂは、ＤＮＡ  ＭＣドナー対プラスミドドナーからの組込みにおける相対的増加倍率を示す。これらの結果は、標準的なプラスミドドナー送達と比較して、ドナーがＤＮＡ  ＭＣを介して送達される場合の標的化された組込みにおいて、２．５倍の増加が存在することを実証している。図５Ｃは、ＭＣドナーＭ２ＵをプラスミドドナーＰ２Ｕと比較する２つの独立した実験についてのｉｎ−ｏｕｔ  ＰＣＲ分析の結果を示す。Ｍ２Ｕドナーで観察された産物のより濃いバンドは、標的化されたＣＣＲ５遺伝子座におけるより高いレベルの特異的遺伝子付加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
導入遺伝子の、ヌクレアーゼ媒介性の（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ捕捉）標的化された組込みのための組成物および方法が、本明細書に開示される。特に、外因性配列の、ヌクレアーゼ媒介性の（即ち、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）標的化された組込みは、ＤＮＡ  ＭＣを使用して効率的に達成される。これらのより小さいＤＮＡサークルは、細菌配列を本質的に欠如し、したがって、標的細胞に対する毒性が低い。実際、本発明者らは、ドナーがＤＮＡ  ＭＣによって送達される場合に、組込みがおよそ２．５倍増加することを、本発明で実証している。さらに、ヌクレアーゼおよびドナーの両方が、１種または複数のＤＮＡミニサークルを使用して目的の細胞に送達できる場合、毒性における低下は、ヌクレアーゼをコードするＤＮＡの送達にも同様に拡張される可能性が高い。
【００３４】
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
【００３５】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３７】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
【００３８】
「結合タンパク質」は、別の分子と結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００３９】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００４０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
【００４１】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子操作（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作され」得る。したがって、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，７４６，８３８号；第７，２４１，５７３；第６，８６６，９９７号；第７，２４１，５７４号；および第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
【００４２】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；第６，２４２，５６８号；第６，７３３，９７０号；第７，２９７，４９１号；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００４３】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指し、限定するものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組み換えによるドナー捕捉を含む。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連する過程に関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００４４】
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
【００４５】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
【００４６】
本明細書に記載される方法のいずれかは、任意のサイズのドナーの挿入、および／または目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞および細胞株もまた提供される。
【００４７】
さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１種または複数の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１種もしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、および１種もしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１種または複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
【００４８】
細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合に、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。他の実施形態では、標的化された変更は、相同性非依存的機構、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介してである。例えば、米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号および第２０１１０２８７５４５号を参照されたい。
【００４９】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
【００５０】
「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
【００５１】
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
【００５２】
「遺伝子操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号；第８，６２３，６１８号および米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号もまた参照されたい。
【００５３】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１００，０００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１０ヌクレオチド長と１００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００ヌクレオチド長と２０，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の値）、より好ましくは、約５ｋｂと１５ｋｂとの間、さらにより好ましくは０．５ｋｂと２ｋｂとの間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。ドナー配列は、一本鎖および／または二本鎖であり得る。
【００５４】
「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない第１の配列を指す。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同かつ非同一である。ある特定の実施形態において、２種の配列の間の相同性の程度は、正常な細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするために十分なものである。２種の相同非同一配列は、いかなる長さであってもよく、それらの非相同性の程度は、単一のヌクレオチドほどに小さくても（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、１０キロベースまたはそれを超えるほどに大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２種のポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（即ち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【００５５】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技法は、本技術分野において公知である。典型的には、かかる技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれにコードされるアミノ酸配列の決定、ならびに第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とのこのような配列の比較を含む。この様式でゲノム配列を決定および比較することもできる。一般に、同一性は、それぞれ２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸の一致を指す。２種またはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することにより比較することができる。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００５６】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間に安定的二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化した断片のサイズ決定により決定することができる。当該分野で公知の方法を使用して決定される通り、配列が、定義される長さの分子にわたり少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を提示する場合、２種の核酸または２種のポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知のものである。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対するより低い耐容能と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は、当業者に周知のものであり、その例として、温度、ｐＨ、イオン強度ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度が挙げられるがこれらに限定されない。当業者に公知の通り、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増加する。
【００５７】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００５８】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
【００５９】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００６０】
「到達できる領域」は、核酸に存在する標的部位が、該標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、到達できる領域が、ヌクレオソーム構造へとパッケージされない領域であることが考えられる。到達できる領域の明確な構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。
【００６１】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
【００６２】
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
【００６３】
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリー過程によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。植物細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃（例えば、「遺伝子銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。
【００６５】
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。
【００６７】
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００６８】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
【００６９】
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００７０】
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
【００７１】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム突然変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００７２】
「植物」細胞には、単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｍｏｎｏｃｏｔｓ）または双子葉（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｄｉｃｏｔｓ）植物の細胞が含まれるがこれらに限定されない。単子葉の非限定的な例には、穀物植物、例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナおよびココナツが含まれる。双子葉の非限定的な例には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、サトウダイコン、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）およびアルファルファが含まれる。植物細胞は、植物の任意の部分由来および／または植物の任意の発生段階由来であり得る。
【００７３】
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００７４】
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、ならびに哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、幹細胞）を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００７５】
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
【００７６】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
【００７７】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００７８】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
【００７９】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、慣用的なアッセイにおいてである必要はないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
【００８０】
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対する任意の有害な影響なしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。哺乳動物細胞におけるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例には、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子、アルブミン遺伝子またはＲｏｓａ遺伝子が含まれる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および第８，１１０，３７９号；米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号；第２０１００２９１０４８号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号を参照されたい。植物細胞における例示的なセーフハーバーは、ＺＰ１５遺伝子座である（米国特許第８，３２９，９８６号）。
【００８１】
用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギおよび他の動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳動物の患者または対象を意味する。
ヌクレアーゼ
【００８２】
導入遺伝子が標的化された様式でゲノム中に組み込まれるように、導入遺伝子と細胞のゲノムの開裂のためのヌクレアーゼとを保有するドナー分子のｉｎ  ｖｉｖｏ開裂に有用な組成物、特にヌクレアーゼが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、これらのヌクレアーゼの１種または複数は、天然起源である。他の実施形態では、これらのヌクレアーゼの１種または複数は、非天然起源である、即ち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または開裂ドメインにおいて遺伝子操作されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
【００８３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子に結合するためおよび／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の開裂部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへと一般に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。
【００８４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子操作された（非天然起源の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号および第８，０２１，８６７号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように遺伝子操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：４９〜６６頁を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。
【００８５】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用される１種または複数のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは遺伝子操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ、ら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ  ４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００８６】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデムリピート中に見出される配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２ｂｐを含み、これらのリピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらのリピートの多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し；ＮＩがＡに結合し；ＨＤがＣに結合し；ＮＮがＡまたはＧに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよびリピート数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じている（プラスミドベースの標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０年）＜  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。
【００８７】
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ  ｖｉｖｏ開裂および／または標的化された開裂に使用される１種または複数のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように遺伝子操作されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号を参照されたい。
【００８８】
遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００８９】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；第６，２４２，５６８号；第６，７３３，９７０号；第７，０２９，８４７号；第７，７００，５２３号；および第８，６１８，０２４号中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００９０】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【００９１】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；第６，７３３，９７０号；第６，７４６，８３８号；第６，８６６，９９７号；第７，０２９，８４７号；第７，２４１，５７３号；第７，２４１，５７４号；第７，７００，５２３号；第８，６１８，０２４号およびＷＯ０２／０９９０８４に詳細に記載されている。
【００９２】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【００９３】
系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【００９４】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれる過程における、さらなる攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
【００９５】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００９６】
したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれる任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点で、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
Ｂ．開裂ドメイン
【００９７】
任意の適切な開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結されて、ヌクレアーゼを形成し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ−その遺伝子操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにする、機能的実体−を生じている。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。より最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００６００６３２３１号；ならびに国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００９８】
上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。
【００９９】
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、遺伝子操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼドメインおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含み、ＴＡＬＥＮとも呼ばれる。使用者が選択する標的配列との頑強な部位特異的相互作用のためにこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を遺伝子操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ開裂ドメインは、一量体として活性であり、活性のために二量体形成を必要としない（Ｂｏｉｓｓｅｌら（２０１３年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ：  １〜１３頁、ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照されたい）。さらに、このヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性もまた示し得る。
【０１００】
なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結している単鎖融合タンパク質である。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがメガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに依存して、融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を生じ得る（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３年）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１〜８頁  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照されたい）。任意のＴＡＬＥＮは、さらなるＴＡＬＥＮと組み合わせて使用され得る（例えば、１種または複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）と、１種または複数のメガＴＡＬと）。
【０１０１】
異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【０１０２】
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
【０１０３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
【０１０４】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。
【０１０５】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
【０１０６】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００９０３０５３４６号および第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または防止する１種または複数の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
【０１０８】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な遺伝子操作された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において突然変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において突然変異を含む、対が含まれ、例えば、一方の開裂ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生する、遺伝子操作された開裂ハーフドメイン。本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える突然変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい）。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」突然変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。
【０１０９】
本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；第２００８０１３１９６２号；および第２０１１０２０１０５５号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指定突然変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。
【０１１０】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１１１】
ヌクレアーゼは、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３および第２００９００６８１６４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該分野で公知の方法を使用して容易に設計され得る。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００６００６３２３１号；および第２００７０１３４７９６号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
【０１１２】
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム遺伝子操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照されたい）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、遺伝子操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ同書およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。
標的部位
【０１１３】
上に詳細に記載したように、ＤＮＡドメインは、選択された任意の配列に結合するように遺伝子操作され得る。遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１１４】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１１５】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号に詳細に記載されている。
【０１１６】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号もまた参照されたい。
【０１１７】
上述のように、これらのヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、任意の遺伝子へと標的化され得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ結合ドメイン構成成分）は、例示のみとしてＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第８，１１０，３７９号を参照されたい）、ＣＣＲ５遺伝子（米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号を参照されたい）、Ｒｏｓａ遺伝子座（ＷＯ２０１０／０６５１２３を参照されたい）および／またはアルブミン遺伝子座（米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号を参照されたい）を含む、「セーフハーバー」遺伝子座を含む、「セーフハーバー」遺伝子座へと標的化される。
ドナー
【０１１８】
本願の開示は、ＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）ベクターを使用した、細胞のゲノムへの外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の標的化された組込みに関する。ＤＮＡ  ＭＣは、細菌性プラスミドＤＮＡ骨格のほとんどまたは全てを欠く環状発現カセットとして産生される、エピゾームＤＮＡベクターである。したがって、ＤＮＡ  ＭＣは、典型的には、プラスミドベクターより小さなサイズを有する。ＤＮＡ  ＭＣは、当技術分野に公知の方法を使用して、例えば、親プラスミドから作製することができる。Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら（２００８年）、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、１０巻（１１号）：１２５３〜６９頁、ｄｏｉ：  １０．１００２／ｊｇｍ．１２４３を参照されたい。本明細書に記載されているようなＤＮＡ  ＭＣは、親プラスミド由来のいくつかの残存するプラスミド骨格配列を含むが、これは、残存する配列が細菌を起源としない限りにおいてであって、その結果、ＤＮＡ  ＭＣでは、細菌由来の配列が欠如している。例えば、ＭＣは、特異的なＭＣの構築を容易にするａｔｔＲ組換え部位および／または「複数のクローニング部位」を保持していてもよい。典型的には、本明細書に記載されているようなＤＮＡ  ＭＣは、３００塩基対未満の残存する（非細菌性の）プラスミド配列を含み、このような配列としては、残存するプラスミド骨格の０から３００塩基対の間（またはこの間にある任意の塩基対の数）、残存するプラスミド骨格の０から２００塩基対の間（またはこの間にある任意の塩基対の数）、または残存するプラスミド骨格の０から１００塩基対の間（またはこの間にある任意の塩基対の数）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
上述した通り、例えば、変異遺伝子を補正するための、または野生型遺伝子の発現を増加させるための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも言う）の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同な領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、常態では目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同な領域を隣接させることができる。
【０１２０】
本明細書に記載されているのは、選択された位置内へ挿入するための、任意のポリヌクレオチドの標的化された挿入の方法である。挿入に用いるポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。米国特許第８，６２３，６１８号ならびに米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号および第２０１１／０２０７２２１号を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、好ましくはＤＮＡ  ＭＣ内に含有されており、細胞内へ環状または直鎖状の形態で導入されてもよい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に添加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法としては、末端アミノ基（複数可）の追加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソームやポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、二本鎖のドナーは、１ｋｂ超の長さの配列（例えば、コード配列であり、導入遺伝子とも呼ばれる）、例えば、２から２００ｋｂの間、２から１０ｋｂの間、．５から２ｋｂの間もしくは．１から２ｋｂの間（またはこれらの間にある任意の値）を含む。二本鎖ドナーもまた、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位を含む。ある特定の実施形態では、ドナーは少なくとも２つの標的部位を含み、例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの対のためのものである。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の開裂に用いるために、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子に対して５’および／または３’にある。ヌクレアーゼの開裂部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）のためのものである。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されているヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、内因性の標的を開裂するために使用されるのと同じヌクレアーゼ（複数可）のためのものであり、その内因性の標的に、開裂されたドナーが相同性非依存的な方法を介して組み込まれる。
【０１２３】
ドナーは、一般に、組込み部位の内因性プロモーター、即ちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えば、グロビン、アルブミン、ＡＡＶＳ１など）の発現を駆動するプロモーターによって、発現が駆動されるように挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成性のプロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることは明らが明らかである。
【０１２４】
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てもしくはいくつかが発現するか、または発現しないように、内因性遺伝子内に挿入されていてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（グロビンをコードする遺伝子があるものまたはないもの）は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。例えば、米国特許第８，１１０，３７９号、第７，９５１，９２５号および米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。
【０１２５】
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。
【０１２６】
本明細書に記載されているドナー配列に保有されている導入遺伝子は、プラスミド、細胞または他の供給源から、ＰＣＲなど当技術分野で公知の標準的な技法を使用して単離され得る。使用するドナーとしては、環状スーパーコイル型、環状リラックス型、線型などを含めて様々な種類のトポロジーを挙げることができる。あるいは、それらを、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成してもよい。さらに、ドナーをメチル化してもよいし、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体であってもよい（ＢＡＣまたはＹＡＣ）。
【０１２７】
本明細書に記載されている二本鎖のドナーポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含んでいてもよい。具体的には、本明細書に記載されている方法を使用して、メチル化シトシンを伴うドナー分子の挿入を行い、目的の領域での転写的に静止した状態を達成することができる。
【０１２８】
外因性の（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的の配列（外因性配列）を含んでいてもよい。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位、および様々な種類の発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、発色性または蛍光性または発光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖の増強および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、デヒドロ葉酸レダクターゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、例えば、１コピーまたは複数のＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。
【０１２９】
好適な実施形態では、外因性配列（導入遺伝子）は、細胞での発現が望ましい任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そのようなポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面のまたは核の）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子および前出のいずれかの機能性断片が挙げられるが、これらに限定されない。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡであってもよい。
【０１３０】
例えば、外因性配列は、遺伝性疾患に罹っている対象内で欠失しているか機能しないポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよく、そのような遺伝性疾患としては、軟骨形成不全、赤緑色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１０２７００）、副腎白質萎縮症、エカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファ地中海貧血、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈性右心室異形成、毛細管拡張性運動失調、バルト症候群、ベータ地中海貧血、青色ゴムまり様母斑症候群、キャナヴァン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ泣き症候群、嚢胞性繊維症、ダーカム病、外胚葉性異形成、ファンコーニ症候群、進行性骨化性繊維形成異常症、脆弱Ｘ染色体症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、血色素症、ベータグロビンの第６コドンのヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、フルラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メービウス症候群、ムコ多糖沈着症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎原発性尿崩症、神経繊維症、ニーマン・ピック病、骨形成不全、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球病（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マジェニス症候群、スティックラー症候群、テイ・ザックス病、血小板減少性橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素回路障害、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッヒ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．３０８２４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
標的組込みによって治療され得る追加的な疾患の例としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ・ザックス病）、ムコ多糖沈着症（ハンター病、フルラー病）、ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α−地中海貧血、β−地中海貧血）ならびに血友病が挙げられる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的組込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）と、追加的な機能をコードする連結された配列とを含むことができる。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）などが挙げられる。
【０１３３】
挿入することのできる追加的な遺伝子配列としては、例えば、変異配列を置き換える野生型遺伝子が挙げられ得る。例えば、野生型の第ＩＸ因子の遺伝子配列を、内因性の遺伝子コピーが変異している幹細胞のゲノム内へ挿入してもよい。野生型コピーは、内因性遺伝子座へ挿入してもよいし、代替的にセーフハーバー遺伝子座へ標的化してもよい。
【０１３４】
本願の明細書の教示に従うそのような発現カセットの構築物は、分子生物学の分野で周知の方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。発現カセットを使用してトランスジェニック動物を生成する前に、選択された制御要素に関連があるストレス誘導物質に対する発現カセットを安定な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞または不死化細胞株）内へ導入することによって、発現カセットの応答性を試験することができる。
【０１３５】
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。また、目的の遺伝子の制御要素を、レポーター遺伝子へ作動可能に連結して、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作り出すことができる。
【０１３６】
非コード核酸配列の標的挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的挿入のために使用され得る。
【０１３７】
追加的な実施形態では、ドナー核酸は、追加的なヌクレアーゼの設計のために、特異的な標的部位である非コード配列を含んでいてもよい。その後、元のドナー分子が開裂されて、別の目的のドナー分子を挿入されることによって改変されるように、追加的なヌクレアーゼを細胞で発現してもよい。このようにして、ドナー分子の反復的な組込みを生じ、目的の特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で、形質を積み重ねることを可能とし得る。
送達
【０１３８】
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって、任意の細胞型へｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達してもよい。
【０１３９】
適当な細胞としては、真核（例えば、動物または植物）および原核の細胞および／または細胞株が挙げられる。かかる細胞またはかかる細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞、ならびに単子葉または双子葉植物由来の植物細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。適当な細胞としては、例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞などの幹細胞が挙げられる。
【０１４０】
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５０３，７１７号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，６０７，８８２号、第６，６８９，５５８号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【０１４１】
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、処置に求められる１種または複数の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい（ＤＮＡ  ＭＣ）。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。
【０１４２】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ  ＭＣ、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達の総説については、Ｒｅｂａｒ（２００４年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｒｕｇｓ、１３巻（７号）：８２９〜８３９頁、Ｒｏｓｓｉら（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５巻（１２号）：１４４４〜１４５４頁、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，  ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）などの一般的な遺伝子送達の文献を参照されたい。
【０１４３】
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【０１４４】
追加的な例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
【０１４５】
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１４６】
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
【０１４７】
遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１４８】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
【０１４９】
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。
【０１５０】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
【０１５１】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）
【０１５２】
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１巻：９１１７号  １７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
【０１５３】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、遺伝子操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
【０１５４】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
【０１５５】
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを遺伝子操作して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを遺伝子操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
【０１５６】
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。
【０１５７】
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
【０１５８】
本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードするおよび／または二本鎖のドナー）の導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９０１１１７６１７号を参照されたい。
【０１５９】
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
【０１６０】
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーを同じＤＮＡ  ＭＣによって保有することができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドをＭＣによって保有することができ、一方、１種または複数のヌクレアーゼを標準的なプラスミドまたはＡＡＶベクターによって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内注射および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
【０１６１】
そのため、本開示は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に適応し易い疾患および状態のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの処置を含み、例えば、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）などの凝固因子のヌクレアーゼ媒介性組込みを介した血友病の処置などを含む。組成物は、血清または標的器官もしくは標的細胞で所望の濃度の治療ポリペプチドを得るために、有効量でヒト患者へ投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段に依る。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方の方法が意図される。門脈への静脈内注射は、好ましい投与方法である。他のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の様式としては、例えば、肝動脈を通じることを含めて肝臓葉もしくは胆汁管への直接注射および肝臓遠位への静脈注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射ならびに／または胆管を通じた逆行注射が挙げられる。ｅｘ  ｖｉｖｏ投与の様式としては、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入し、続いて形質導入された切除肝細胞をヒト患者の門脈脈管、肝実質または胆汁管へ戻して注入することが挙げられる。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６巻：３３５〜３４１頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１６２】
投与する有効量のヌクレアーゼ（複数可）およびドナーは、患者に応じておよび目的の治療ポリペプチドによって変化することになる。したがって、有効量は、その組成物を投与する臨床医によって最適に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。十分な時間で組込みおよび発現させた後（例えば、典型的には４〜１５日間）、治療ポリペプチドの血清または他の組織のレベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較によって、投与されている量が少なすぎるのか、適正な範囲内であるか、または多すぎるのかを決定する。また、初期投与およびそれに引き続いての投与に適したレジメンも変化し得るが、初期投与と、必要であればそれに引き続いての投与とを行うのが典型的である。引き続いての投与は、種々の間隔で投与されてもよく、毎日から毎年まで数年に１回までの範囲に及ぶ。当業者は、適切な免疫抑制技法が、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁（１９９５年）を参照されたい。
【０１６３】
ｅｘ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
【０１６４】
上述したように、ＤＮＡ構築物（例えば、ＤＮＡ  ＭＣ）を、種々の従来の技法によって、所望の植物宿主（例えば、そのゲノム）内に導入することができる。そのような技法の総説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）、第８節、４２１〜４６３頁およびＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、第２版）、Ｂｌａｃｋｉｅ、ロンドン、第７〜９章を参照されたい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９９，２１８号、第８，３２９，９８６号、第８，３２９，９８６号、およびに米国特許出願公開第２０１１０１８９７７５号も参照されたい。
【０１６５】
例えば、ＤＮＡ構築物を、植物プロトプラストのエレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの技法を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡへ直接的に導入することができ、または、ＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子衝撃などの遺伝子銃法を使用して、植物組織に直接的に導入することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０〜７３頁を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ構築物（複数可）を、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞内へ導入することができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０１０４７００号を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ構築物を、適当なＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域と組み合わせて、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターへ導入することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性トランスフェクション技法は、癌遺伝子の無害化ならびにバイナリーベクターの開発および使用を含めて、科学文献に詳しく記載されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻：４９６〜４９８頁およびＦｒａｌｅｙら（１９８３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻：４８０３頁を参照されたい。
【０１６６】
また、遺伝子移入を、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスならびに／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム細菌またはウイルスを使用して達成することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇら（２００６年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１１巻（１号）：１〜４頁を参照されたい。
【０１６７】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主の病原性機能は、バイナリーＴ−ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４年）、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻：８７１１〜８７２１頁）または共培養手法（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻：１２２９〜１２３１頁）を使用して細胞を細菌に感染させる際に、構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖が植物細胞のＤＮＡに挿入されるように誘導する。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を遺伝子操作するために使用される（Ｂｅｖａｎら（１９８２年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、１６巻：３５７〜３８４頁、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１８巻：６２７〜６４１頁）。アグロバクテリウム形質転換系はまた、ＤＮＡを単子葉植物および植物細胞に形質転換および移入するために使用することができる。米国特許第５，５９１，６１６号、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら（１９８４年）、ＥＭＢＯＪ３巻：３０３９〜３０４１頁、Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１１巻：７６３〜７６４頁、Ｇｒｉｍｓｌｅｙら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２５巻：１６７７〜１７９頁、Ｂｏｕｌｔｏｎら（１９８９年）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１２巻：３１〜４０頁およびＧｏｕｌｄら（１９９１年）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９５巻：４２６〜４３４頁を参照されたい。
【０１６８】
代替的な遺伝子移入および形質転換の方法としては、ネイキッドＤＮＡのカルシウム媒介性、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性またはエレクトロポレーション媒介性の取り込みを介したプロトプラストの形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４年）、ＥＭＢＯＪ３巻：２７１７〜２７２２頁、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５年）、Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．、１９９巻：１６９〜１７７頁、Ｆｒｏｍｍら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：５８２４〜５８２８頁およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８巻：２７４〜２７６頁を参照のこと）、および植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、４巻：１４９５〜１５０５頁）が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の形質転換に用いる追加的な方法としては、マイクロインジェクション、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介性ＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、９巻：４１５〜４１８頁）および微粒子銃（Ｋｌｅｉｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：４３０５〜４３０９頁およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２巻：６０３〜６１８頁を参照されたい）が挙げられる。
【０１６９】
上記の任意の形質転換技法によって作製された形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型と、それゆえ所望の表現型とを具えている全植物体を再生することができる。そのような再生技法は、組織培養増殖培地中のある特定の植物ホルモンを操作することに依り、典型的には、所望のヌクレオチド配列と共に導入されている殺生物剤マーカーおよび／または除草剤マーカーに依る。培養プロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら、「Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１２４〜１７６頁、Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９８３年、およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、２１〜７３頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９８５年に記載されている。また、再生を、植物のカルス、外植片、器官、花粉、胚またはそれらの一部から得ることもできる。そのような再生技術は、Ｋｌｅｅら（１９８７年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．、３８巻：４６７〜４８６頁に概ね記載されている。
【０１７０】
植物細胞内へ導入される核酸は、本質的に任意の植物に、所望の形質を付与するために使用することができる。実に様々な植物および植物細胞系を、本開示の核酸構築物および上述の様々な形質転換方法を使用して、本明細書に記載されている所望の生理学的および農学的特徴のために遺伝子操作することができる。好適な実施形態では、遺伝子操作のための標的植物および植物細胞としては、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）を含む作物；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、トウヒ）；ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）や実験目的のために使用される植物（例えば、アラビドプシス）などの、単子葉植物および双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されない。そのため、開示されている方法および組成物は、以下に限定されないが、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ムカシヨモギ属（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オオアラセイトウ属（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に由来する種（これらに限定されない）を含めて、広範な植物にわたって使用されている。
【０１７１】
植物細胞への核酸の導入を、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するために使用することができる。ある特定の実施形態では、植物細胞中の変更されたＭＤＨ発現／機能は、果実の収量の増加、植物（またはその植物の果実）のバイオマスの増加、より高い果肉含量、着果の集中、より大きな植物体、新鮮重の増加、乾燥重の増加、固体肉質の増加、より高い収穫時総重量、作物の色合いの強度および／または均一性の向上、化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タンパク質）の特性の変更などを有する植物をもたらす。
【０１７２】
当業者は、外因性の配列を植物細胞内へ一過的に組み入れることができることを認識することになる。外因性ポリヌクレオチド配列の導入は、当該配列が導入されている植物細胞の細胞機構を利用することができる。植物細胞内へ一過的に組み入れられたＺＦＮを含む外因性のポリヌクレオチド配列の発現は、標的配列のゲノムＤＮＡを解析することによってアッセイされて、任意のインデル、逆位または挿入を同定し決定することができる。これらの再編成の種類は、ゲノムＤＮＡ配列内の標的部位の切断、およびそれに続くＤＮＡ修復に起因する。さらに、当業者に公知のマーカー遺伝子発現の試験を可能にする方法を使用して、外因性ポリヌクレオチド配列の発現をアッセイすることができる。種々の植物、組織およびＤＮＡ送達系を使用したマーカー遺伝子の一過的発現が、報告されている。一過的解析系としては、目的の任意の植物種を使用した任意の一過的な植物アッセイに際しての、エレクトロポレーションまたは組織の粒子衝撃を介した直接的な遺伝子送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような一過的な系としては、種々の組織源由来のプロトプラストのエレクトロポレーション、または目的の特異的な組織の粒子衝撃が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、部位特異的なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を評価するための、およびＭＤＨ標的遺伝子内に変異を導入するための、任意の一過的発現系の使用を包含する。適切な送達系を介した一過的発現体を試験することが想定される植物組織の例としては、葉脚組織、カルス、子葉、根、内胚乳、胚、花組織、花粉および表皮組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
当業者は、外因性ポリヌクレオチド配列を形質転換植物に安定に組み入れることができるということを認識する。外因性ポリヌクレオチド配列は、作動可能であることが確認されると、雌雄間交配によって他の植物体へ導入することができる。交配させる種に応じて、多くの任意の標準的な育種技法を使用することができる。
【０１７４】
形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物体は、形質転換しているＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされている形質について、遺伝子操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって、同定または単離されてもよい。例えば、形質転換している遺伝子構築物が抵抗性を付与する、阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上に、遺伝子操作した植物材料を増殖させることによって、選択を行うことができる。さらに、形質転換された植物体または植物細胞は、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性をスクリーニングすることによって、同定することもできる。そのような選択またはスクリーニングの方法論は、当業者に周知である。
【０１７５】
また、物理学的または生化学的な方法を、安定に挿入された遺伝子構築物を含有する植物体もしくは植物細胞の形質転換体、または部位特異的なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）の一過的発現によって生じる標的遺伝子を変更したゲノムＤＮＡを含有する植物細胞を同定するために、使用することができる。これらの方法としては、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出して決定するためのサザンブロット解析またはＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出して調べるためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅、３）酵素またはリボザイム活性を検出するための、当該遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている酵素アッセイ、４）遺伝子構築物の産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技法、免疫沈降または酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色や免疫染色などの追加的な技法もまた、特異的な植物器官および組織での組換え構築物の存在または発現を検出するために、使用することができる。全てのこれらのアッセイを行うための方法は、当業者に周知である。
【０１７６】
本明細書に開示されている方法を使用した遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットによって、観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するか、またはｍＲＮＡ量が増える場合に、対応の導入遺伝子が発現していることが推察され得る。遺伝子および／またはコードされたポリペプチドの活性を測定する他の方法を使用することができる。使用された基質に応じて、および、反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。発現されているポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および電気泳動検出アッセイによる（または染色もしくはウェスタンブロッティンングを用いてのどちらか）などの抗体に基づく当業者に周知の他のアッセイなどで測定することもできる。非限定的な一例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８３８，７３３号に記載されている。導入遺伝子は、植物の一部の組織中でもしくは一部の生育ステージで選択的に発現するか、または、導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織中で、実質的に全ての生活サイクルに合わせて、発現する場合がある。しかし、任意の組合せの発現様式もまた利用可能である。
【０１７７】
本願の開示は、先に記載されている形質転換植物の種子をも包含し、ここで、種子は導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。本開示は、さらに、先に記載されている形質転換植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含し、ここでは、前記子孫、クローン、細胞株または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
【０１７８】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子調節、標的化された切断および／または組換えに用いる植物に、直接的に投与することができる。ある特定の実施形態では、植物は、複数のパラロガスなＭＤＨ標的遺伝子を含有する。そのため、植物中のこれらの１種または複数のパラロガスな遺伝子を標的化するために、１種または複数の異なる融合タンパク質または融合タンパク質をコードする発現ベクターを、植物に投与することができる。
【０１７９】
有効量の投与は、処理する植物細胞に最大に接触させるよう融合タンパク質を導入するために通常使用される任意の経路に依る。ＺＦＰは、任意の適当な方式で、好ましくは許容可能な担体を用いて投与される。そのようなモジュレーターを投与する適当な方法は利用可能であり、当業者に周知であり、そして、特定の組成物を投与するために、１種よりも多い経路を利用することができるものの、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供する。
【０１８０】
また、担体が使用されてもよく、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用する特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、利用可能な担体の実に様々な適当な製剤が存在する。
【０１８１】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼが使用され得ること、例えば、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）とＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物が使われ得ることであることは理解されよう。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）：ＣＤ３４＋ＨＳＣのヌクレオフェクション
標準的なプラスミドに比較した場合のＤＮＡ  ＭＣの毒性を評価するために、ＧＦＰをコードするドナーを使用して、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにて実験を行った。端的に述べれば、組織の単一細胞の懸濁液を得るステップと、次いでＨＳＣを含有するＣＤ３４＋画分を、磁性ビーズ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離するステップとを含む標準的な方法を使用して、新鮮な胎仔肝のＨＳＣを単離した。ＨＳＣのヌクレオフェクションを、Ａｍａｘａ  ４Ｄヌクレオフェクターを使用し、ＣＤ３４プログラムを使用して行った。ＣＣＲ５特異的なＺＦＮをコードするｍＲＮＡは、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ  Ｔ７転写キットなどの標準的な方法を使用して、および製造業者のプロトコール（Ａｍｂｉｏｎ）を使用することによって作製し、次いで、プラスミドドナーとＭＣ  ＤＮＡのどちらかと併せて、細胞内へヌクレオフェクトした。
【０１８３】
プラスミドドナー試料には、３．７５μｇの各ＣＣＲ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡを５μｇのプラスミドＤＮＡドナーと共に使用し、一方、ＤＮＡ  ＭＣ試料には、３．７５μｇの各ＣＣＲ５  ＺＦＮ  ｍＲＮＡを０．５μｇのＭＣドナーと共に使用した。異なるＤＮＡドナーの使用量は、各種類のドナーに最適化された量に基づいており、ＭＣ  ＤＮＡをより少ない量としたことは、そのドナー配列としてのより大きな活性から実行可能であった。ＣＣＲ５  ＺＦＮは、米国特許第７，９５１，９２５号および第８，５２４，２２１号に記載されており、プラスミドおよびＤＮＡ  ＭＣドナーの地図は、図１に図説されている。
【０１８４】
ヌクレオフェクションに続いて、細胞を３０℃で一晩回復させて、次いで、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙに記載されているように、７−ＡＡＤ排除によって生存率を分析した。
【０１８５】
プラスミドＰ２ＵをＤＮＡ  ＭＣ  Ｍ１Ｐと比較することによって、ミニサークルは、プラスミドドナーに比べて、細胞に対し毒性が大幅に低いことが示された（図２Ａを参照）。この同じ傾向は、プラスミドＰ２ＵをＤＮＡ  ＭＣ  Ｍ２ＵまたはＰＣＲ産物ＰＣＲ２Ｕと比べた場合に、ＺＦＮの存在下と非存在下との両方で見出された（図２Ｂを参照）。
【０１８６】
さらに、ＺＦＮ  ｍＲＮＡを用いて、プラスミドＰ２ＵまたはミニサークルＭ２Ｕのどちらかと共に、ＨＳＣをヌクレオフェクトした。使用した方法は、既出の実験に記載されている通りである。ヌクレオフェクション後２時間で、ＩＦＮβ、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５４、ＩＳＧ５４またはＣＸＣＬ１０に対応する転写物のレベルを、定量的逆転写酵素ＰＣＲによって測定し、その結果を、無処理の対照ＨＳＣについて記録したベースラインを超えたレベルにおける増加倍率としてプロットした。
【０１８７】
図２Ｃに示すように、プラスミドＤＮＡは、インターフェロン刺激性遺伝子（ＩＳＧ）と、プラスミドＤＮＡによって引き起こされる毒性全体に寄与し得るＩＦＮβとを、高度に誘導した。これに対して、ミニサークルＤＮＡドナーＭ２Ｕは、大幅に少ないＩＳＧの発現を誘導した。
【０１８８】
（実施例２）：遺伝子操作したＣＤ３４＋ＨＳＣのＮＳＧマウスへの生着
例えば、Ｈｏｌｔら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２８巻：８３９〜４７頁に記載されているような標準的なプロトコールを使用し、上述のような様々なプラスミドおよびミニサークルドナー構築物を用いてヌクレオフェクトされたヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、ＮＳＧマウスに使用して生着させ、「ヒト化マウス」を作製した。生着後４週目、８週目、１２週目、１６週目および２０週目に、標準的な方法論によって、またＨｏｌｔら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２８巻：８３９〜４７頁に記載されているように、試料をマウスの末梢血から採取した。
【０１８９】
マウスに順調に生着し、続いてヒトＣＤ４５＋子孫血液細胞を生じるためのヒトＨＳＣの能力を、ＦＡＣＳ分析により白血球上のヒトＣＤ４５の発現を評価することによって、またＨｏｌｔら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２８巻：８３９〜４７頁に記載されているように、分析した。実験によって、ＤＮＡ  ＭＣを用いて形質転換された細胞が生存率の向上を示したこと、およびプラスミドドナーを用いて処理された集団よりも長期間にわたって生着したことが示された（図３Ａを参照）。さらに、２０週間で動物を屠殺し、上述のようなＦＡＣＳ分析によって、血液、骨髄および脾臓中のヒトＣＤ４５陽性細胞の百分率を決定するために分析を行った。
【０１９０】
その結果、ＤＮＡ  ＭＣを用いてヌクレオフェクトされた細胞は、プラスミドＤＮＡドナーを受けたヒトＨＳＣよりも高い程度にまで、ＮＳＧマウスの骨髄や脾臓などの組織中でそれ自体を確立することが可能であったことが示された。図３Ａを参照されたい。
【０１９１】
ＮＳＧマウスの第２のコホートを用いて、実験を繰り返したところ、結果は同様であった。図３Ｂを参照されたい。
【０１９２】
さらに、ＺＦＮと、Ｐ１ＰまたはＭ１Ｐのどちらかとを用いた、ヒトＨＳＣのヌクレオフェクションとの比較実験を実施したが、この実験では、ヒトＨＳＣを新生仔ＮＳＧマウスに注射し、このことによって、ＨＳＣがその後異なる系譜のヒト血液細胞、例えば、Ｃｄ１９＋Ｂ細胞ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を分化させて産生する能力を、より良好に分析できるようにした。８週目および１２週目に、生着の基準として総ヒトＣＤ４５＋集団の存在について、血液試料を分析し、ヒトＣＤ４５＋細胞が５％超であったあらゆる試料については（図３Ｃ）、ＦＡＣＳによって、異なる系譜（Ｂ細胞、ならびにＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞）のマーカーに関して細胞をさらに分析することもできた。その結果、ＭＣ  ＤＮＡを用いて処理した細胞は、分化し、これらの異なるサブセットを産生することが示された。図３Ｄを参照されたい。これに対して、Ｐ１Ｐプラスミドを用いて処理した細胞は、生着レベルが極めて低く（図３Ｃを参照）、このことは、系譜の分析を実施することができなかったことを意味した。
【０１９３】
（実施例３）：導入遺伝子の挿入
ＭＣ上に保有されたＧＦＰ導入遺伝子ドナーが、ヌクレオフェクトされたヒトＨＳＣに組み込まれていることを確認するために、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙに記載されているものなどの標準的なプロトコールを使用して、ヌクレオフェクション後１０日目まで、ＧＦＰ＋細胞を検出するために、ＦＡＣＳ分析を用いてＧＦＰの発現を分析した。培養４〜１０日目までに、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を受けなかった細胞は、ＧＦＰ発現がバックグラウンドレベルにのみ戻った。一方、ＺＦＮとドナーとの共トランスフェクションは、ＧＦＰ導入遺伝子の組込みに起因して、高いレベルでＧＦＰを安定に発現させた。全ての場合において（図４を参照）、ＤＮＡ  ＭＣ上のＧＦＰ導入遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞は、最も高くＧＦＰ導入遺伝子を発現した。
【０１９４】
また、特異的な標的部位での導入遺伝子の組込み（ＣＣＲ５遺伝子座でのこれらの例における）を、プライマー５’−ＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号２）ならびに以前に記載されている方法（Ｌｏｍｂａｒｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００７年）を使用した「イン／アウトＰＣＲ」によって測定し、その結果、ＤＮＡ  ＭＣを受けた試料では、ドナープラスミドを受けた試料よりもおよそ２．５倍多くプラスミドが組み込まれたことが示された（図５を参照）。これらの結果は、ＭＣの形状が、プラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＰＣＲ  ＤＮＡ産物のいずれかよりも毒性が少なく、優れたドナー鋳型であることを示す。
【０１９５】
本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
開示は、理解を明確にする目的で、説明および実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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