(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列TGGAGGGGCTTTCCCCATAGからなるＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、くも膜下出血に伴う脳血管攣縮の治療及び予防剤。
【請求項２】
大槽内に投与することを特徴とする、請求項１記載の脳血管攣縮の治療及び予防剤。
【請求項３】
１回あたり10〜10,000nmoleを投与することを特徴とする、請求項１または２記載の脳血管攣縮の治療及び予防剤。
【請求項４】
ＮＦ−κＢデコイ含有カチオン性リポソームであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項記載の脳血管攣縮の治療及び予防剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＮＦ−κＢのデコイを含有する脳保護剤、特に脳疾患に起因する脳障害に対する脳保護剤に関するものである。詳細には、ＮＦ−κＢのデコイを含有する脳疾患に起因する脳障害に対する脳保護剤および、該デコイを含有する脳保護剤を使用する脳保護方法に関する。
背景技術
転写調節因子ＮＦ−κＢは、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患等の様々な疾患に関与していると考えられており、そのデコイの投与がそれらの疾患の治療および予防に有効であると考えられている（ＷＯ９６／３５４３０参照）。転写調節因子ＮＦ−κＢは、ｐ６５とｐ５０のヘテロダイマーからなっている。通常は、細胞質内に阻害因子ＩκＢが結合した形で存在し、核移行が阻止されている。ところが、何らかの原因でサイトカインや、虚血、再潅流といった何らかの刺激が加わるとＩκＢがリン酸化され、分解されることにより、ＮＦ−κＢが活性化されて核内に移行する。ＮＦ−κＢは染色体のＮＦ−κＢ結合部位に結合することにより、その下流にある遺伝子の転写を促進する。ＮＦ−κＢにより制御される遺伝子には、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８などのサイトカイン類や、ＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１などの接着因子がある。
一方、脳疾患において、脳神経細胞死等の様々な原因により脳障害が起こることが知られており、近年、脳保護の必要性が認識されている。
例えば、破裂脳動脈瘤によるくも膜下出血の治療成績は、手術用顕微鏡の導入以後、動脈瘤クリッピング術が安全に行われるようになり、飛躍的に向上した。しかし、くも膜下出血に伴い出現する脳血管攣縮などの脳障害に対しては、その発生機序についても解明されておらず、さらに確実な治療法の確立もない。
発明の開示
本発明者等は、ＮＦ−κＢの制御下にあるサイトカイン類や細胞接着因子の生産の活性化が、脳疾患に起因する脳障害（例えば、くも膜下出血後の脳血管攣縮や、脳血管障害や重傷頭部外傷の予後の脳神経細胞死）を引き起こす一つの原因となっていると予測し、鋭意研究の結果、脳疾患に起因する脳障害に対する脳保護には、ＮＦ−κＢのデコイ、すなわちＮＦ−κＢが結合する核酸と特異的に拮抗する化合物を投与することが特に有効であることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＮＦ−κＢのデコイを含有する脳保護剤さらに詳しくはＮＦ−κＢのデコイを含有する脳疾患に起因する脳障害に対する脳保護剤および保護方法を提供するものである。
本発明の脳保護剤の対象とする疾患は、特に限定されないが、特に、脳組織において、転写調節因子ＮＦ−κＢが制御する遺伝子の所望しない活性化に起因する脳障害に有効であり、例えばくも膜下出血後の脳血管攣縮や、脳血栓症および脳塞栓等の脳梗塞、脳出血後後遺症、脳血管性痴呆、水頭症、脳動脈奇形・血管腫、各種脳腫瘍、パーキンソン症候群、脳動脈硬化症、髄膜炎（細菌性、無菌性、術後等）、脳炎、エイズ、各種の脳症（ベーチェット脳症、多発性硬化症）や重傷頭部外傷による脳神経細胞死による脳障害が含まれる。特に本発明により得られるＮＦ−κＢのデコイを含有する脳保護剤は、くも膜下出血に伴い出現する脳血管攣縮の治療および予防には好適である。
本発明で用いられるＮＦ−κＢのデコイとしては、ＮＦ−κＢによる遺伝子の活性化を阻害する物質であり、具体的には染色体上に存在するＮＦ−κＢの核酸結合部位と特異的に拮抗する化合物であればよく、例えば核酸およびその類似体が含まれる（ＷＯ９６／３５４３０、ＪＰ０７−２９１８６０Ａ参照）。好ましいＮＦ−κＢのデコイの例としては、ＮＦ−κＢ結合部位のコンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物があげられる。オリゴヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体または／および擬核酸を含むものであってもよい。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は１本鎖でも２本鎖であってもよく、線状であっても環状であってもよい。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、ＮＦ−κＢが結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を示す。さらに好ましいＮＦ−κＢのデコイしては、上記核酸配列を１つまたは数個含む２本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体があげられる。本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、または、リン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等の生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチド等が含まれる。
本発明で用いられるＮＦ−κＢのデコイの製造方法としては、一般的な化学合成法または生化学合成法を用いることが出来る。例えばＮＦ−κＢのデコイとして核酸を用いる場合、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることが出来、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のデコイヌクレオチドを直接合成してもよいし、またこれらの核酸、それを含む核酸またはその一部を合成した後、ＰＣＲ法またはクローニングベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断、ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なデコイヌクレオチドを得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分を例えばアルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。
本発明により得られるＮＦ−κＢのデコイを主成分として含有する製剤は、主薬が患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような製剤であれば特に限定されるものではなく、ＮＦ−κＢのデコイ単独で、もしくは慣用の担体と混合して、経口投与、非経口投与、局所投与ないしは外用の形で投与される。これらの製剤は溶液、懸濁液、シロップ、リポソーム製剤、乳剤、シロップ等の液体の投与形態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などの固形の投与形態であってもよい。必要に応じ、上記製剤には各種の担体、助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコールなどを添加することができる。
特に、ＮＦ−κＢのデコイとして核酸またはその修飾体を用いる場合の好ましい製剤としては、一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態、例えばセンダイウイルス等を用いた膜融合リポソーム製剤やエンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン（ライフテックオリエンタル社製）やＴｆｘ５０等のカチオン性脂質を含有する製剤またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利である。
リポソーム製剤は、そのリポソームの構造体が、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重層リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００から１０００nm、ＭＬＶでは４００から３５００nm、ＳＵＶでは２０から５０nm程度の粒子系をとり得るが、センダイウイルス等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系２００から１０００nmのＭＬＶを用いるのが好ましい。
リポソームの製造方法は、デコイが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば逆相蒸発法（Szoka,F.,et al:Biochim.Biophys.Acta,Vol.601 559（1980））、エーテル注入法（Deamer,D.W.:Ann.N.Y.Acad.Sci.,Vol.308 250（1978））、界面活性剤法（Brunner,J.,et al:Biochim.Biophys.Acta,Vol.455 322（1976））等を用いて製造することができる。
リポソーム構造を形成するための脂質としてはリン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般的にはリン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン、等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質等を使用することができる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることもできるが、２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に持つものを用いることにより、電気的に陰性なデコイヌクレオチドの結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。
このようにして得られるリポソームは患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばセンダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイルスより精製された膜融合促進蛋白質、ポリエチレングリコール等を加えることができる。
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、たとえば前記したリポソーム形成物質をコレステロール等と共にテトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにＮＦ−κＢのデコイを含有する緩衝液を加えて撹拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記した膜融合促進物質を加えた後、リポソームを単離する。このようにして得られるＮＦ−κＢのデコイを含有するリポソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、或いはいったん凍結乾燥したものを適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリポソーム単離後、使用までの間に加えてもよい。
この様にして得られたＮＦ−κＢのデコイを主成分として含有する製剤における、デコイの含有割合は、適用疾患、適用部位、投与形態および投与方法に応じて種々設定することができる。
この様にして得られるＮＦ−κＢのデコイを含有する脳保護剤は、疾患の種類、使用するデコイの種類等により各種の方法で投与することができ、例えば、大槽（くも膜下）内等に投与すればよい。
ＮＦ−κＢのデコイの投与量は、年齢その他患者の条件、疾病の種類、使用するデコイの種類等により適宜選択されるが、例えば大槽内投与等では一般には１回あたり１０から１０、０００nmoleを適時投与する事ができる。
以下に本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例
モデル動物の作成
実験動物として、２−２．５ｋｇの雄性ニュージーランド白ウサギを用いた。実験動物はペントバルビツールを２０ｍｇ／ｋｇ静脈内に注射し麻酔した。耳介動脈にカニューレを挿入し動脈血を採取した。頭部を定位フレームで固定し、項部筋を収縮させることにより、環椎後頭骨膜を露出させた。脳脊髄液を１ｍｌ除いた後、大槽（くも膜下）に１ｍｇ／ｋｇの自家血を２７ゲージのニードルを用いて３分以上かけて注意深く注入した。その後、動物の脳底動脈を自家血で覆うように動物の頭部を３０分間、下げた状態に置き、くも膜下出血モデルを作成した。
デコイの投与
ウサギＮＦ−κＢ結合認識配列（２０mer;TGGAGGGGCTTTCCCCATAG）（ＮＦ−κＢデコイ群）およびスクランブルＮＦ−κＢ結合認識配列（２０mer）（スクランブルデコイ群）を合成し（Ray,A.,Gao,X.& Ray,B.J.Biol.Chem.270,29201-29208（1995）参照）、カチオン性リポソーム投与システム（Tfx50 promega,WI,U.S.A.）を用いて、くも膜下出血作成２日前に大槽内に投与した。
評価はくも膜下出血作成３日前、及び４日後に血管撮影を施行し、脳底動脈の血管径の変化率を測定した。また、ヘマトキシリン−エオシン（Hematoxylin-eosin）染色にて組織学的検索を行った。ＮＦ−κＢの活性に関しては、ゲルシフト法を用いて評価した。
結果
脳血管撮影上、コントロール群、スクランブルデコイ投与群では６９％まで狭小化を認めたが、ＮＦ−κＢ投与群では約９０％と著明な血管収縮の抑制を認めた。組織学的にも、コントロール群、スクランブルデコイ投与群では著しい血管径の狭小化を認めたが、ＮＦ−κＢデコイ投与群では、正常血管とほとんど同様の組織像であった。また、ゲルシフト法ではコントロール群に較べ、ＮＦ−κＢデコイ投与群で明らかに活性が抑制された。