(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドＡＡ１−Ｇｌｎ−ＡＡ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２であって、
式中、ＡＡ１は式
【化１】
0004295921.tif 000028
の環状アミノ酸であり、
ＡＡ３は、Ａｒｇ、
【化２】
0004295921.tif 000029
および
【化３】
0004295921.tif 000030
からなる群より選択される、ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドであって、ＡＡ１は、Ｐｒｏ、Ｐｉｐ、ｈＰｉｐ、Ｍｏｃ、およびＭｔｃからなる群より選択され、そしてＡＡ３は、Ａｒｇ、ｇＰｈｅ、ｇｍＰｈｅ、ｇｅＰｈｅ、ｇＣｐａ、ｇｍＣｐａ、ｇｐＣｐａ、ｇＣｈａ、ｇｍＣｈａ、ｇｅＣｈａ、ｇｐＣｈａ、ｇＣｐｈａ、ｇｍＣｈｐａ、ｇｅＣｈｐａ、およびｇｐＣｈｐａからなる群より選択される、ペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドであって、ＡＡ１は、Ｌ−Ｈｉｓ−ＡＡ１、Ｄ−Ｈｉｓ−ＡＡ１、Ｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＡＡ１、およびＤ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＡＡ１からなる群より選択される、ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドであって、前記環状環が、Ｏ、Ｓ、およびＮ−Ｒからなる群より選択へテロ原子をさらに含み、式中、Ｒ＝ノルマルまたは分枝のＣ１−Ｃ６アルキル基である、ペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドであって、前記−ＣＯ−基が、ヘテロ原子介在をともなうかまたは伴わない分岐またはノルマルのアルキル鎖、および反応性基で置換され、ここで、該反応性基は、ＣＯＯＨ、ＮＣＳ、ＮＣＯ、およびＯＣＯＸからなる群より選択され、式中、Ｘは反応性部分である、ペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドであって、キレート剤によって該ペプチドに結合される診断用または治療用放射核種をさらに含む、ペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のペプチドであって、前記診断用放射核種が、１３３ｍＩｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、２０３Ｐｂ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１３３ｍＩｎ、５１Ｃｒ、１５７Ｇｄ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、および８２Ｂｒからなる群から選択される、ペプチド。
【請求項８】
請求項６に記載のペプチドであって、前記治療用放射核種が、１８６Ｒｅ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１３１Ｉ、１２９Ｉ、および１７７ｍＳｎからなる群から選択される、ペプチド。
【請求項９】
請求項６に記載のペプチドであって、前記キレート剤が、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ’、ＤＯＴＡ、およびＮｔＳ４−ｔからなる群から選択される、ペプチド。
【請求項１０】
ヒトの乳癌もしくは前立腺癌またはそれらの腫瘍の転移診断用キットであって、
（ａ）請求項１に記載のペプチド；
（ｂ）放射性同位元素；および
（ｃ）放射性同位元素をペプチドに結合させ、さらに生成する結合物をヒトに投与するのに適した添加物、
を含むキット。
【請求項１１】
診断における使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＧＲＰレセプター陽性腫瘍の診断用の医薬の製造のための、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
前立腺癌、乳癌、およびそれらの癌の転移の診断用の医薬の製造における、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
以下
【化４】
0004295921.tif 000031
【化５】
0004295921.tif 000032
【化６】
0004295921.tif 000033
からなる群から選択される、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、乳癌および前立腺癌、さらにはまた、そのような腫瘍の転移の診断および処置用化合物および方法に関する。
【０００２】
多くの腫瘍は、ある種の分子、典型的には、ペプチドまたはタンパク質を腫瘍に結合するようにする生化学的レセプターを有する。腫瘍を診断する方法の１つは、ある特定の腫瘍に結合する化合物を同定し、その化合物を適当な放射性核種で放射能標識し、その化合物を(一般的には、静脈内注射によって)患者に投与し、その化合物が腫瘍に結合するようにした後、放射性崩壊が起こる位置をイメージすることである。このように提示される概念は幾分簡単であるが、実際には、極めて困難である。最初の難関は、候補化合物を同定することである。化合物が、非常に強固に、そして十分な時間、腫瘍に結合しないならば、適切な診断を得ることは不可能であろう。その上、たとえ化合物が腫瘍に結合するとしても、周辺の健全な組織にも結合するならば、診断は困難または不可能であろう。さらに、化合物の放射性核種への結合が化合物に対する腫瘍の親和性を妨げないことが必要である。もう１つの問題点は、患者における化合物の毒性の可能性である。結合の観点では非常に適当である化合物が、しばしば毒性が強すぎて使用することができない。
【０００３】
腫瘍療法でも同様の方法を採択することができ、この方法では、適当な化合物を同定し、その化合物を適当な放射性核種で放射能標識して、その化合物を(一般的には、静脈内注射によってであるが、腫瘍塊への直接注射によることもあり得る)患者に投与する。次いで、その放射性核種が崩壊し、エネルギーを放出して、腫瘍の増殖を止めるか、または減退させるであろう。これもまた、概念は簡単であるが、実際には、多くの難点がある。上述の問題に加えて、健全な組織に対する高エネルギー放射の危険性から、身体の腫瘍以外の部分にはどこにも、その化合物がほとんどないことが必要である。これは、化合物が腫瘍へ非常に強固に結合しなければならないだけでなく、たとえ腫瘍付近ではなくても、健全な組織への結合が全くかまたはほとんどあってはならないことを意味する。
【０００４】
適当な化合物を突きとめようという試みは、困難に満ちたものであった。多数の可能性のある化合物を迅速に選別するのが望ましいことから、様々な「ショートカット」アッセイおよびモデルが開発されてきた。残念ながら、これらの技術の多くは、不正確であるか、または判断を誤らせるデータを与えてきた。
【０００５】
多くの研究者達は、セルライン培養物を使用して、化合物を選別してきた。スクリーニング技術としてのセルラインの使用は有利であるが、セルライン培養物は、しばしば実際の腫瘍では示されない化合物に対する結合親和性を有することが見出されている。このように、この技術から得られるデータは、擬陽性を示す。
【０００６】
他の研究者達は、腫瘍の試料を実験室用ブレンダーで高度のせん断にかけた腫瘍のホモジネートを使用してきた。この技術がもつ問題の１つは、腫瘍だけでなく、腫瘍に結合した周辺組織もホモジネートに含まれてしまうことで、結合親和性が腫瘍からのものか、または周辺組織からのものかを知ることが不可能になることである。さらに、ホモジナイゼーションのせん断は、細胞膜を破り開け、無傷の細胞では起こらない結合の可能性を生ずる。
【０００７】
疑わしくない結果を与えるスクリーニング方法は、腫瘍および周辺組織の切片(薄片)を、写真フィルムを露光するのに適す放射性核種で標識した候補化合物と接触させる形態学的試験である。この技術は、腫瘍中に存在するレセプターと周辺組織中に存在するレセプターとを明瞭に識別する。残念ながら、この技術は、非常に力を要し、かつ適切な腫瘍組織試料を入手できるかによって左右される。
【０００８】
ペプチド、その他の化合物が、放射能標識せずに、腫瘍の増殖に影響を与えるために使用されてきた。そのような化合物の幾つかは、放射能標識すればイメージングや放射線療法にも有用となり得るが、化学療法に有用な化合物と放射線療法に有用な化合物との間の相互関係は非常に少ない。
【０００９】
ボンベシンは、元来、カエルの皮膚から単離されたペプチドである。それは、ＧＲＰ(ガストリン放出ペプチド)レセプターに結合する化合物の一例である。ボンベシンは、構造：
pＧｌｕ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-Ａｌａ-
Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ＮＨ2
を有する。
【００１０】
腫瘍および非腫瘍ＧＲＰレセプターを同定しようとして、相当な数の研究が行われている。残念ながら、それらの研究の大半は、不正確であるか、または判断を誤らせる結果をもたらしている。
【００１１】
Ｂreemanら，“「[111Ｉn−ＤＴＰＡ0，Ｐro1，Ｔyr4]bombesin：Ｓtudies Ｉn Ｖitro and in Ｒats”，ＪＮＭ ３９（１９９８）６２頁は、高度かつ特異的な取り込みが膵臓およびＧＩ管の組織において見出されたことを教示している。取り込みは、Ｔyr4−ＢＮ １００ugを放射能標識化ペプチドと同時にiv注射すると阻止されたが、放射性トレーサーが放射性リガンドの内部移行を示してから１時間後に投与した場合は、阻止されなかった。
【００１２】
Ｈoffman，Ｌi，Ｓieckman，およびＶolkert，“Ｕptake and Ｒetention of a Ｒh−１０５ Ｂombesin Ａnalogue in ＧＲＰ Ｒeceptor Ｅxpressing Ｎeoplasms：Ａn Ｉn Ｖitro Ｓtudy”，ＪＮＭ ３８（１９９７）１８８頁−１８９頁（要約）は、ＧＲＰレセプターに対するＲh−１０５で標識したボンベシンアナログの親和性を、ＰＣ−３ ヒト前立腺癌セルライン(２時間で６５％)およびＣＦ−ＰＡＣ１ ヒト膵臓セルライン(２時間で４１％)における細胞内滞留の延長によって調査したことを教示している。Ｒh−１０５ アナログは、調査した両方のセルラインにおいて迅速に細胞内にインターナライズされた。著者は、新生物性細胞における選択的親和性および滞留延長により、この放射能標識化ペプチドが有望な放射線療法用剤の候補になると述べている。
【００１３】
Ｈoffman，Ｌi，Ｖolkert，Ｓieckman，Ｈigginbotham，およびＯchrymowycz，“Ｓynthesis and Ｃharacterization of Ｒh−１０５ Ｌabelled Ｂombesin Ａnalogues：Ｅnhancement of ＧＲＰ Ｂinding Ａffinity Ｕtilizing Ａliphatic Ｃarbon Ｃhain Ｌinkers”，Ｊournal of Ｌabelled Ｃompounds and Ｒadiopharmaceuticals ４０（１９９７）４９０−４９２（要約）は、(Ｓwiss ３Ｔ３ 線維芽細胞を使用しての)ＩＣ50値を一連の４つのペプチドに関して測定して、非金属化硫黄大環状アナログが、もとのＢＢＮペプチドよりＧＲＰレセプターに対して同様の親和性を発現したことを教示している。Ｒh(III)複合体を形成すると、ＢＢＮの結合領域へのＲh(III)Ｃl2−１６およびＳ4複合体の接近が減少し、ＧＲＰレセプターに対する最終金属化ペプチドの親和性が増大する。このデータは、新生物性細胞上で発現させたＧＲＰレセプターに対して特異性および高い和性を維持する他の金属化ＢＢＮアナログを製造する際に密接な関係を有し得る。
【００１４】
Ｈoffman，Ｓieckman，Ｏchrymowycz，Ｈigginbotham，Ｖolkert，およびＫetring，“Ｉn Ｖitro and Ｉn Ｖivo Ｃharacterization of a Ｒh−１０５−Ｔetrathiamacrocycle Ｃonjugate of a Ｌabelled Ｂombesin Ａnalogue”，ＪＮＭ ３７（１９９６）６１頁は、正常なマウスにおけるＲh−１０５ アナログの生体分布試験が、尿への優位なクリアランス、および腎臓での低い滞留を示したことを教示している。データは、ＢＢＮ２レセプターを発現する新生物性細胞を特異的に標的化する有望な治療物質として、ＢＢＮアナログとのＲh−１０５ コンジュゲートを形成する可能性を示している。
【００１５】
Ｈoffmanら，“Ｒh−１０５ Ｂombesin Ａnalogs：Ｓelective Ｉn Ｖivo Ｔargeting of Ｐrostate Ｃancer with a Ｒadionuclide”，ＪＮＭ ３９（１９９８）９８２頁は、硫黄大環とＱアミノ酸との間に４炭素スペーサーをもつＲh−１０５ ＢＢＮ(７−１４)アナログを、ＰＣ−３ 前立腺癌を有するヌードマウスにおいて評価したことを教示している。腫瘍／筋肉の比率は、４、２４、および４８時間のp.i.で各々、７.８、７.７、および１３.６であった。結論は、前立腺癌細胞内での選択的な親和性および滞留延長により、この放射能標識化ペプチドが放射線療法剤の魅力ある候補になるということである。
【００１６】
Ｔ. Ｊ. Ｈoffman，Ｇ. Ｌ. Ｓieckman，およびＷ. Ａ. Ｖolkert，
“Ｉodinated Ｂombesin Ａnalogues：Ｅffect of Ｎ−terminal vs. Ｓide Ｃhain Ｉodine Ａttachment on ＢＢＮ−ＧＲＰ Ｒeceptor Ｂinding”，ＪＮＭ３７（１９９６）１８５頁は、ヨウ素化ＢＢＮアナログを可能性のあるＳＣＬＣ標的ベクターとして評価したことを教示している。全ての場合において、特異的な結合領域であるＢＢＮ(８−１３)またはＷ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｈ−Ｌ、さらにはまた、カルボキシ末端のアミド化が維持された。[125Ｉ][Ｔyr4]ＢＢＮをもつＳwiss ３Ｔ３ 細胞を利用して、ＩＣ50値の測定を行った。mＩＰ−Ｌys7がコンジュゲートしたペプチドによるレセプター親和性の損失は、ＢＢＮ(１−６)の間でのＬysの取り込みがペプチド−レセプター親和性の増大を促進し得ることを示唆している。データは、これらのアナログのＮ末端ヨウ素化が、高い親和性のＢＢＮヨウ素化ペプチドを得るための実行可能な経路を与え得ることを示している。
【００１７】
Ｓchibli，Ｈoffman，Ｖolkertら，“Ａ Ｔc−９９m ＤＩＴＨＩＡ−ＤＩ(Ｂis−Ｈydroxymethylene) Ｐhosphine conjugate of Ｂombesin Ｉn Ｖivo Ｓtudies”，ＪＮＭ ３９（１９９８）２２５頁は、ヒト前立腺癌 ＰＣ−３ 細胞膜を使用して、２つの異なったＤＡＤＴ ＢＦＣから誘導されるボンベシンのＴc−９９アナログおよび１４のアミノ酸ペプチドのＬys−３−ボンベシンを、[125Ｉ][Ｔyr4]ボンベシンに対する競合的結合アッセイで評価したことを教示している。その結果は、前立腺癌のボンベシン／ＧＲＰレセプターの特性決定において、Ｔc−９９m複合体がインビボで非侵襲的に使用される可能性を有することを示している。
【００１８】
Ｂaidooら，“Ｓynthesis and Ｅvaluation of Ｈigh Ａffinity Ｔechnetium Ｂombesin Ａnalogs”，ＪＮＭ ３８（１９９７）８７頁は、前立腺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、およびscl癌を述べている。ＤＡＤＴキレート(１および２、中性コアまたは陽性コアが得られる)を、強力なＢnアナログ Ｐｙｒ-Ｑ-Ｋ-Ｌ-Ｇ-Ｎ-Ｑ-Ｗ-Ａ-Ｖ-Ｇ-Ｈ-Ｌ-Ｍ-ＮＨ2のＮ末端領域でリジン残基に結合させる。ＤＡＤＴペプチドをＴc−９９mまたはＴc−９９で標識した場合、２つの異性体が得られた。Ｔc−９９アナログは、[125Ｉ][Ｔyr4]ボンベシンに対するラット皮質膜結合アッセイにおいて高い親和性を示した。
【００１９】
Ｂ. Ｒogers，Ｄ. Ｃuriel，Ｋ. Ｌaffoon，Ｄ. Ｂuchsbaum，“Ｓynthesis and Ｒadiolabeling of Ｂombesin Ｄerivatives with Ｃopper−６４ and Ｂinding to Ｃells Ｅxpressing the Ｇastrin Ｒeleasing Ｐeptide Ｒeceptor”，Ｊournal of Ｌabelled Ｃompounds and Ｒadiopharmaceuticals ４０（１９９７）４８２（要約）は、Ｃu−６４−ＴＥＴＡ−Ａoc−ＢＢＮ(７−１４)が、ＧＲＰ陽性腫瘍を処置するために使用することができる強力な治療用放射性医薬品であるという結論を下している。
【００２０】
Ａ. Ｓafavy，Ｍ. Ｋhazaeli，Ｈ. Ｑin，およびＤ. Ｂuchsbaum，“Ｓynthesis of Ｂombeisin Ａnalogues for Ｒadiolabeling Ｒhenium−１８８”，Ｃancer ８０（１９９７）２３５４−２３５９は、ＢＢＮの７つのアミノ酸アナログを合成して、ヒドロキサム酸リガンドトリスクシン(trisuccin)にコンジュゲートさせたことを教示している。Ｒe−１８８での放射能標識を収率９０％以上で行った。細胞結合をＢＮＲ−１１(３Ｔ３マウス線維芽細胞)で行って、ＰＣ−３ ヒト前立腺癌 ＧＲＰＡ陽性細胞が陽性結合で得られた。
【００２１】
Ｂ. Ｒogersら，“Ｔumor Ｌocalization of a Ｒadiolabeled Ｂombesin Ａnalog in Ｍice Ｂearing Ｈuman Ｏvarian Ｔumors Ｉnduced to Ｅxpress ＧＲＰ Ｒeceptor by an Ａdenoviral Ｖector”，Ｃancer ８０（１９９７）２４１９−２４２４は、試験を行って、腫瘍における[125Ｉ／131Ｉ]−mＩＰ−ボンベシンの局在化レベルを測定したことを示している。
【００２２】
Ｒogers，Ｂuchsbaumら，“Ｌocalization of Ｉ−１２５−mＩＰ−Ｄes−Ｍetl４−bombesin(７−１３)ＮＨ2 in Ｏvarian Ｃarcinoma Ｉnduced to Ｅxpress the ＧＲＰr by Ａdenoviral Ｖector−Ｍediated Ｇene Ｔransfer”，ＪＮＮ ３８（１９９７）１２２１−１２２９は、[125Ｉ][Ｔyr4]ボンベシンを、インビトロでの結合および腫瘍細胞への内部移行に関して、並びにインビボでの腫瘍の局在化に関して、[125Ｉ]−mＩＰ−ボンベシン(a ７ aa ＢＮアナログ)と比較したことを教示しており、結果は、後者が、腫瘍の局在化および細胞内部移行および滞留に関して、より有利な特性を有することを示した。
【００２３】
Ｚinn，Ｂuchsbaumら，“Ｉmaging Ａdenoviral−Ｍediated Ｇene Ｔransfer of ＧＲＰr Ｕsing a Ｔc−９９m−Ｌabelled Ｂombesin Ａnalogue”，ＪＮＭ ３９（１９９８）２２４頁−２２５頁は、ＢＢＮアナログ(ＱＷＡＶＧＨＬＭ)が、トリシンをトランスキレーターとして使用して、Ｔc−９９mで修飾および放射能標識されたＨＹＮＩＣであったことを教示している。ＧＲＰrを発現する細胞への特異的で高い親和性結合は、スキャッチャード分析により実証された。有利な生体分布およびイメージングが観察された。
【００２４】
Ｍ. Ｅ. Ｒosenfeldら，“Ａdenoviral Ｍediated Ｄelivery of ＧＲＰr Ｒesults in Ｓpecific Ｔumor Ｌocalization of a Ｂombesin Ａnalogue Ｉn Ｖivo”，Ｃlin. Ｃancer Ｒes. ３（１９９７）１１８７−１１９４は、上の以前の公開と同様の研究を教示している。
【００２５】
Ｔ. Ｊ. Ｈoffman，Ｇ. Ｌ. Ｓieckman，およびＷ. Ａ. Ｖolkert，“Ｔargeting Ｓmall Ｃell Ｌung Ｃancer Ｕsing Ｉodinated Ｐeptide Ａnalogs”は、５つのアナログを、ＳＰＰＳを使用して製造したこと、そしてインビトロでのＢＢ２レセプター結合を、Ｓwiss Ｔ３Ｔ 線維芽細胞を使用してアッセイしたことを教示している。アミノ酸 ナンバー１−６またはＣ末端のＭet残基はいずれも、レセプターの特異性を維持するために必要ではない。結果は、Ｉ−１２３またはＩ−１３１のm−ヨードフェニル部分としての取り込みを使用して、sclcを診断または処置し得ることを意味する。
【００２６】
ＵＳ ５,６８６,４１０ Ｎovartis Ａlbertは、腫瘍のイメージングおよび療法のための使用が含まれる、放射能標識化ボンベシンおよびアンタゴニストを教示している(実施例１１および１２)。
【００２７】
ＳＣＬＣ(小さな細胞肺癌)、並びに下垂体(petuitary)癌、副腎癌、および皮膚癌といったような、様々な組織への非放射性ボンベシンアナログの結合を論じている多数の文献および特許がある。
【００２８】
発明の概要
ＧＲＰレセプターは、前立腺癌、乳癌および癌転移で、過剰発現することが判明した。数種の新規な等比体積修飾を、キレート基の挿入を可能にするために、Ｎ-末端およびボンベシン分子の第３位で導入する。これは、アゴニストの滞留および分子特性の内部移行をもたらす。イメージングおよび治療用同位元素による、これらの分子の放射能標識化は、ＧＲＰおよびボンベシンレセプター陽性腫瘍の検出および処置への適用性がある。
【００２９】
ある態様では、本発明は、ＧＲＰレセプター陽性腫瘍の診断および/または治療用の、放射能識別化したかまたはしていない、３種類のペプチドまたは擬似ペプチドに関する。
【００３０】
ａ．ボンベシンおよびその類似体の放射能識別には、ペプチド鎖のＮ-末端のp-Ｇｌｕの存在は、以下に述べる常法または固相法のどちらによってキレート部分を付着させるにも向いていない。
【化１】
0004295921.tif 000002
本発明は、結合特性を失うことなく、p-Ｇｌｕ部分を環状アミノ酸に置換することに関する。置換する部分としては、同じ第三級構造をＮ-末端に与える、特にプロリン(Ｐｒｏ)および、他の環状類似体が含まれる。このような置換は、ポリアミノカルボキシレートキレート基、ＮtＳ4-tキレート剤その他の付着に対する、反応性部分を付与する。
環状類似体の例：
【化２】
0004295921.tif 000003
このようなpＧｌｕからＰｒｏへの等比体積置換は、ペプチドの結合特性を保存する。他の置換としては、ピペコリン酸およびその同族体、およびその異性体、および、それにキレート剤が付着する、少なくとも一つの反応性アミンを含む環状化合物、を含む。
【化３】
0004295921.tif 000004
pＧｌｕとの置換用の他の環状化合物は、炭素環中の他のヘテロ原子の存在、および、-ＣＯＯＨ、ＮＣＳ(イソチオシアネート)、ＮＣＯ(イソシアネート)、カルボモイル基(ＯＣＯＸ、Ｘはハロゲンまたは他の反応性部分などの反応性部分)などの存在を含む。これらの反応性基をスペーサー基で環部分から離すこともできる。
【化４】
0004295921.tif 000005
ｎ=１−６
Ｚ=Ｏ、Ｓ、Ｎ-Ｒ(Ｒ＝ノルマルまたは分枝のＣ1-Ｃ6アルキル基)
スペーサー=ヘテロ原子介在を伴うかまたは伴わない、分枝またはノルマ
ルのアルキル鎖
指定のペプチド鎖へ付着させるための反応性基は、環の任意の位置に配置でき、またスペーサーで離しておくこともできる。
反応性基の付着を、キレート部分またはヘテロ原子(Ｚ)を含むＮ原子の隣りに配置するときは、付着物はＬ-またはＤ-配置どちらを有してもよい。
上述でのキレート剤は、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ’、ＤＯＴＡ、ＮtＳ4-tである。
【００３１】
ｂ．他の態様では、本発明は、配列の三番目のアミノ酸、Ａｒｇを化学的均等物で置換することに関する。これらの化学的均等物は次のものを含むが、それに限定されるものではない。
【化５】
0004295921.tif 000006
【化６】
0004295921.tif 000007
g-Ｃｐａ(ｎ=１、n’=１)、gm-Ｃｐａ(ｎ=１、n’=１)、ge-Ｃｐａ(ｎ=１、n’=２)、gp-Ｃｐａ(ｎ=１、n’=３)、
g-Ｃｈａ(ｎ=２、n’=０)、gm-Ｃｈａ(ｎ=２、n’=１)、ge-Ｃｈａ(ｎ=２、n’=２)、gp-Ｃｈａ(ｎ=２、n’=３)、
g-Ｃｈｐａ(ｎ=２、n’=０)、gm-Ｃｈｐａ(ｎ=２、n’=１)、ge-Ｃｈｐａ(ｎ=２、n’=２)、gp-Ｃｈｐａ(ｎ=２、n’=３)、
【００３２】
ｃ．本発明の他の態様では、ボンベシンのpＧｌｕを、Ｌ-またはＤ-Ｈｉｓ-ＡＡ1またはＬ-Ｈｉｓ-b-Ａｓｐ-ＡＡ1またはＤ-Ｈｉｓ-Ａｓｐ-ＡＡ1に置換する(注1ＡＡ1は上述のａ部の場合と同じ)。
Ｌ-(Ｄ)-Ｈｉｓ-ＡＡ1-Ｇｌｎ-ＡＡ3-ＡＡ4-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-
Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-ＡＡ14-ＮＨ2
Ｌ-(Ｄ)-Ｈｉｓ-b-Ａｓｐ-ＡＡ1-Ｇｌｎ-ＡＡ3-ＡＡ4-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-
Ｔｒｐ-Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-ＡＡ14-ＮＨ2
【００３３】
ｄ．他の態様では、本発明は、放射性ハロゲンの付着に関する。次の化合物を、ボンベシン類似体のレセプターへの結合特性を損失することなく使用することができる。
上述の化合物全てにおいて、キレート剤は、o-、m-またはp-ヨウ素(イメージング用123Ｉ、124Ｉ、131Ｉ、および治療用125Ｉ、129Ｉ、131Ｉ)置換することもできる。
【化７】
0004295921.tif 000008
【００３４】
発明の詳細な説明
本明細書および請求の範囲で、数値および範囲は別に記さないかぎり、臨界値ではない。即ち、数値および範囲には好ましくは“約”または“実質的に”の語が前置されているかのように読むことができる。
本発明は、ボンベシンの類似体であるペプチドを提供するものである。“ボンベシンの類似体”とは、ＧＲＰレセプターと結合する任意の化合物を意味する。特に好ましいボンベシンの類似体は式：
pＧｌｕ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ＮＨ2
を有する。この化合物は、Ｔｙｒ４-ボンベシンとしても知られている。
【００３５】
ペプチドの合成は、よく知られている技術で行なうことができる。適切な技術は、一般に、保護アミノ酸の連続縮合を含む。これらの技術は当業者によく知られている。
【００３６】
適当なペプチドの例は以下の化合物を含む。これらの化合物では、キレート剤を例示としてのＤＴＰＡで表わしている。ＤＴＰＡはＤＴＰＡ'、ＤＯＴＡ、Ｉ、Ｂｒ-Ｂｎ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ-Ａｓｐ等に置き換えることができる。
【００３７】
【化８】
0004295921.tif 000009
【化９】
0004295921.tif 000010
化８の続き
【化１０】
0004295921.tif 000011
化９の続き
【化１１】
0004295921.tif 000012
化１０の続き
【化１２】
0004295921.tif 000013
化１１の続き
【化１３】
0004295921.tif 000014
化１２の続き
【化１４】
0004295921.tif 000015
化１３の続き
【００３８】
これらのペプチドを適当な放射核種と結合させる。診断用に適切な核種は、133mＩｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、111Ｉｎ、97Ｒｕ、203Ｐｂ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、52Ｆｅ、52mＭｎ、51Ｃｒ、157Ｇｄ、123Ｉ、124Ｉ、131Ｉ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、77Ｂｒ、および82Ｂｒを含み、99mＴｃ、67Ｇａ、111Ｉｎ、および123Ｉが好ましい。治療用に適切な核種は、186Ｒｅ、188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、169Ｅｒ、121Ｓｎ、127Ｔｅ、142Ｐｒ、143Ｐｒ、198Ａｕ、199Ａｕ、161Ｔｂ、109Ｐｄ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、149Ｐｍ、151Ｐｍ、153Ｓｍ、159Ｇｄ、172Ｔｍ、169Ｙｂ、175ＹＢ、177Ｌｕ、105Ｒｈ、111Ａｇ、131Ｉ、129Ｉ、177mＳｎを含み、186Ｒｅ、188Ｒｅ、90Ｙ、153Ｓｍ、177Ｌｕ、および131Ｉが好ましい。
【００３９】
放射性核種とペプチドとは一緒に結合させなければならない。放射性核種が放射性ハロゲンのときは、放射性ハロゲンを、ペプチドのＴｙｒまたはＴｒｐ部分への化学反応などで直接ペプチドへ結合させることができる。
放射性核種が放射性金属のときは、放射性金属を、キレート剤などを使ってペプチドへ結合させることができる。キレート基を、アミド結合またはスペーサーを介して、ペプチドに付着させることができる。
【００４０】
該金属原子をキレート化するのに適したキレート基は、ＮtＳ4-t四座配位キレート剤、但し、ｔ＝２−４、または他の下記化合物由来の基である。それらの化合物とは、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、シクロヘキシル１,２-ジアミン四酢酸(ＣＤＴＡ)、エチレングリコール-０,０'-ビス(２-アミノエチル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ',-四酢酸(ＥＧＴＡ)、Ｎ,Ｎ-ビス(ヒドロキシベンジル)-エチレンジアミン-Ｎ,Ｎ'-二酢酸(ＨＢＥＤ)、トリエチレンテトラミン五酢酸(ＴＴＨＡ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸(ＨＥＤＴＡ)、１,４,８,１１-テトラ-アザシクロテトラデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＥＴＡ)、置換ＤＴＰＡ、置換ＥＤＴＡ、または一般式
【化１５】
0004295921.tif 000016
式中、Ｒは、分枝または非分枝であり、所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される一つまたはそれ以上のヘテロ原子、および/または、一つまたはそれ以上のＮＨ基が介在していてもよいヒドロカルビルラジカルで置換されており、Ｑは、ペプチドのアミノ基と反応できる基であり、好ましくはカルボニル、カルブイミドイル、Ｎ-(Ｃ1-Ｃ6)アルキルカルブイミドイル、ヒドロキシカルブイミドイルおよびＮ-(Ｃ1-Ｃ6)アルコキシカルブイミドイルから選択される基、
である。
【００４１】
ＮtＳ(4-t)キレート剤、但し、t＝２−４、は、好ましくは、以下から選択される：
【化１６】
0004295921.tif 000017
【化１７】
0004295921.tif 000018
【化１８】
0004295921.tif 000019
【化１９】
0004295921.tif 000020
【化２０】
0004295921.tif 000021
【化２１】
0004295921.tif 000022
【化２２】
0004295921.tif 000023
式中：
Ｒ6−Ｒ20は、それぞれ個々が水素原子または(Ｃ1-Ｃ4)アルキル基であるが、但し、Ｃ6ないしＣ9の少なくとも一つは記号Ｙであり；
Ｒ21は、水素原子またはＣＯ2(Ｃ1-Ｃ4)アルキル基であり；
Ｒ22およびＲ23は、それぞれ個々が(Ｃ1-Ｃ4)アルキル基またはフェニル基であり；
ｖは０または１であり；
ｔは２または３であり；
Ｒ24は、ＣＨ2ＣＯＯＨまたはその官能性誘導体であり；
Ａは、所望によりＣＯ2アルキル、ＣＨ2ＣＯアルキル、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯ2アルキルで置換されている(Ｃ1-Ｃ4)アルキレン；フェニレン、ＣＯ2アルキル置換フェニレンであり、ここでアルキル基は１から４の炭素原子を有する；
Ｇは、ＮＨまたはＳであり；
Ｙは、ペプチドの遊離アミノ基またはスペーサー基と結合することができる官能基であり；さらに
ＺはＳまたはＯである。
【００４２】
該官能基Ｙは、好ましくは、イソシアナート、イソチオシアナート、ホルミル、o-ハロニトロフェニル、ジアゾニウム、エポキシ、トリクロロ-Ｓ-トリアジニル、エチレンイミノ、クロロスルホニル、アルコキシカルブ-イミドリル、(置換または非置換)アルキルカルボニルオキシカルボニル、アルキルカルボニルイミダゾリル、スクシンイミド-オキシカルボニルを含み；該基は、(Ｃ1−Ｃ10)炭化水素二価基と結合している。炭化水素二価基の好適な例は、ベンゼン、(Ｃ1−Ｃ6)アルカン、(Ｃ2−Ｃ6)アルケンおよび(Ｃ1−Ｃ4)アルキルベンゼンから誘導される二価基である。
【００４３】
一般式IIの好適なキレーターの例は、国際特許出願 WO 89/07456に記載されており、それは置換または非置換の２-イミノ-チオランおよび２-イミノ-チアシクロヘキサン、特に、２-イミノ-４-メルカプトメチルチオランなどである。
【００４４】
金属標識化ペプチド分子中に存在する場合の、スペーサー基の好適な例は、下記一般式の基である：
【化２３】
0004295921.tif 000024
式中、Ｒ3はＣ1−Ｃ10のアルキレン基、Ｃ1−Ｃ10のアルキリデン基またはＣ2−Ｃ10のアルケニレン基であり、Ｘはチオカルボニル基または下記一般式の基である。：
【化２４】
0004295921.tif 000025
式中、ｐは１−５である。
【００４５】
アビジンまたはビオチンとの共役は、Paganelli et al.(Int. J. Cancer 1988, 2. 121)、Kalofonos et al. (J. Nucl. Med. 1990, 31, 1791)およびAnderson et al.(FEBS LETT. 1991 282/1, 35-40)に叙述のように形成する。
【００４６】
標識化ペプチドは、塩水などの担体物質、およびｐＨを変化させるために加える酸または塩基、緩衝液などの添加物、および保存剤などと混合することができる。担体または添加物の使用は、当業者によく知られている。
【００４７】
本発明は、本発明の適切な放射能標識したペプチドを、添加物とともにまたは添加物なしで担体中に入れて、または必要な成分のいくつかまたは全てをキットに入れて、使用者に提供することができる。成分のいくつかは、特に混合されている場合、貯蔵期間が限られるので、キットの使用は特に便利である。好適なキットは、以下の成分のひとつまたはいくつかを含み得る：(ｉ)ペプチド、(ii)キレート剤、(iii)担体溶液、(iv)放射性アイソトープ、(ｖ)還元剤および、(vi)それらの配合仕様書。放射性核種の形態によっては、ペプチドと反応させる放射性核種を調整するのに還元剤が必要である。好適な還元剤としては、Ｃｅ(III)、Ｆｅ(II)、Ｃｕ(I)、Ｔｉ(III)、Ｓｂ(III)およびＳｎ(II)がある。これらの中で、特にＳｎ(II)が好ましい。
【００４８】
安定性の理由で、ペプチドは、一般的に、凍結乾燥で乾燥した状態にあるのが好ましい。使用者は担体溶液を乾燥ペプチドに加えて、再び元に戻すことができる。ペプチドを溶液形態で供給することを望む場合は、乾燥形態より低温で保存することが必要であろう。
【００４９】
上述したとおり、ペプチドとキレート剤は、キット中で別々に含ませることもできる。あるいは、ペプチドをキレート剤と既に混ぜた状態にしておいてもよい。
【００５０】
適した放射性核種の半減期が短いので、ユーザーにに放射性核種を含めないキットを提供することが、時として最も都合がよく、ユーザーは、操作に必要なとき、別途、放射性核種を注文する。放射性核種をキットに含める場合は、必要となる直前にユーザーのもとへキットを届けるのが最も適当である。
【００５１】
腫瘍診断には、放射能標識した化合物を、腫瘍のイメージングに有効量投与する。その量は、腫瘍による化合物の吸収、選択した放射性同位元素、および検出装置(例えば、ガンマカメラ)の感度に応じて変る。化合物が少なすぎると、診断できるだけの十分な放射が得られない。化合物が多すぎると、血液や非標的器官中の化合物濃度が高くなり、患者を不必要な毒性による危険性にさらしかねない。有効量の選択は当業者が熟達によりなし得る範囲内である。
【００５２】
腫瘍の治療には、放射能標識した化合物を治療的有効量投与する。“治療的有効量”が意味する量は、少なくと腫瘍の成長または拡大を阻害する量であり、好ましくは腫瘍を萎縮させるか、完全に排除する量である。その量は、腫瘍による化合物の吸収および選択した放射性同位元素に応じて変る。化合物が少なすぎると、十分な効果が得られない。化合物が多すぎると、患者に不必要な放射線を照射することとなり、毒性による危険性にさらすことになる。有効量の選択は当業者が熟達によりなし得る範囲内である。
【００５３】
実施例１
ペプチド
pＧｌｕ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ＮＨ2
は、([Ｔｙｒ4]ボンベシン)を、通常の固相技術を用い合成した。それは、Greenwood, et al., Biochemical Journal 1963, 89, 114-123の通りに、クロラミンＴヨウ素化法によって125Ｉで標識した。得られた化合物
pＧｌｕ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ*-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ＮＨ2
([125Ｉ-Ｔｈｙ4]ボンベシン、“放射性リガンド”)をＨＰＬＣで精製し、１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの特異活性を得た。
【００５４】
実施例２
周辺組織を含む様々な腫瘍組織サンプルを、ヒトの患者および／またはヒトの死体から回収し、冷凍した。サンプルをクリオスタット上で切り、顕微鏡のスライドにのせ、次いで少なくとも３日間-２０℃で保存し、組織のスライドへの接着性を改善した。スライドにのせた組織切片を室温になるまで放置し、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１３０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、４．７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、１ｍｍｏｌ／ｌ グリコール-バイ(ｂ-アミノエチルエーテル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラ酢酸エチレン、および０．５％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４(プレインキュベーション溶液)中で３０分間２５℃でプレインキュベーションした。次いでスライドを、プレインキュベーション溶液と同じ媒質(但し、ウシ血清アルブミンは除いている。)を含む溶液中でインキュベーションし、以下の化合物を加える：実施例１の放射性リガンド２００００ｄｐｍ／１００ｍｌ、０．０２５％バシトラシン、１ｍｍｏｌ／ｌ ジチオスレイトール、２ｍｇ／ｍｌキモスタチン、および４ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン、ｐＨ＝６．５。Mantyh et al.(Gasteroenterology 1994, 107, 1019-30)に記載の通りに、スライドを室温で放射性リガンドと共に１５０ｍｉｎインキュベーションする。インキュベーション後、スライドを４回、各３０秒間、それぞれ氷冷プレインキュベーション溶液、ｐＨ７．４で洗浄し、氷冷水にちょっと浸し、次いで冷却装置中で冷風の気流で素早く乾燥させる。続いて、切片に3Ｈ−Ｕｌｔｒｏｆｉｌｍを１週間、露光させ、放射能の正確な位置を検出する。
【００５５】
フィルムは、腫瘍と周辺組織との識別能を測定し評価した。結果を表１に示す。
【００５６】
表１
【表１】
0004295921.tif 000026
【００５７】
表１では、(１)組織の通常の組織学的検査が腫瘍の存在を証明しているか、(２)フィルムが周辺組織と識別できる腫瘍の明瞭なイメージを示しているか、そして(３)組織がペプチドの放射能非標識化サンプルで最初に遮られている場合にフィルムが腫瘍のイメージを示さないならば、腫瘍を“陽性”とみなしている。
【００５８】
データが示すところによると、(１)ガストリノーマ、神経膠芽細胞腫、前立腺癌、前立腺癌転移、乳癌、および乳癌転移には、ボンベシンレセプターの高い発生率がみられ(ガストリノーマ、前立腺癌、前立腺癌転移、および乳癌転移の場合、１００％)、(２)ボンベシンレセプター陽性であると文献に明言されている多くのヒト腫瘍では、陽性結果が全く見られないか、極めて僅かしか見られない。
【００５９】
表１の陰性データが、本発明の理解に重要である。小細胞肺癌がボンベシンレセプターを有することは広く報告されている(例えば、Moody et al., Peptides, 683-686 (1993)参照)。しかし、表１のデータは、そのような腫瘍の２０％だけが検出できたことを示している。表１のデータ作成に使用した方法が高度に特異性のあるものであるため、そのデータは、従前この分野で使用されていた技術には根本的な欠点があったことを示唆している。
【００６０】
実施例３
ペプチド
ＤＴＰＡ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｔｒｐ-Ａｌａ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｍｅｔ-ＮＨ2
[ＤＴＰＡ0-Ｐｒｏ1、Ｔｙｒ4]ボンベシン)を、通常の固相技術を用いて合成した。ＤＴＰＡは、トリ-ｔ-ブチルＤＴＰＡを用いて固相合成中に導入した。111Ｉｎ標識化は、W. H. Bakker, et al., Life Sciences, Vol 49, 1583(1991)に記載された方法に従って行ない、１００ＭＢｑ／μｇの特異活性を有する[111Ｉｎ-ＤＴＰＡ0-Ｐｒｏ1、Ｔｙｒ4]ボンベシンを生成させた。
【００６１】
実施例４
ガストリン放出ペプチドレセプターは、１４アミノ酸ペプチドボンベシンに高い親和性を有する。ボンベシン類似体、[111Ｉｎ-ＤＴＰＡ0、Ｐｒｏ1、Ｔｙｒ4]ボンベシンは、ボンベシンレセプターと完全な高い親和性を示し、８ｎＭのＩＣ５０で７３１５ｂ細胞上でボンベシン刺激プロラクチン分泌に拮抗活性を示した。μｇあたり１００Ｍｂｑのレベルに達するまでＩＮ-１１１でラベルした後は、放射性リガンドは、放射化学的に２時間安定であることがＨＰＬＣで明らかになった(＞９５％)。ラットで、高度かつ特異的な吸収が、膵臓およびGI管の組織中に見られた。放射能の吸収が、放射性リガンドをＴｙｒ4ボンベシン１００μｇとの静脈内同時注射すれば阻止されるが、放射性リガンドを１時間後に投与したときは阻止されなかったことは内部移行を示している。注射したマスとボンベシンレセプター陽性組織ｇあたりの％ＩＤとの間のベル形関数は、０．０２５-０．１μｇ付近にあることが判明した。動的ガンマカメラは、血液画分からの放射能の急速クリアランスを示し、総体内滞留が１０％であって腎吸収および尿排泄が１時間で約３５％、２０時間で７０％であることを示す。メスLewisラットに接種したボンベシンレセプター陽性プロラクチノーマ７３１５ｂに特異的な吸収が見られ、シンチグラフィーで可視化することもできた。放射能の残留時間は、類似ＤＴＰＡ結合ペプチドと同程度であった。それゆえ、放射性リガンド[111Ｉｎ-ＤＴＰＡ0、Ｐｒｏ1、Ｔｙｒ4]ボンベシンは、インビボのボンベシンレセプターのシンチグラフィーに適している。
【００６２】
表２  ラット(ｎ＞３)に、２ＭＢｑ Ｉｎ-１１１ラベルした[111Ｉｎ-ＤＴＰＡ0、Ｐｒｏ1、Ｔｙｒ4]ボンベシンを０．０１-０．０５μｇ注入後４８時間の％ＩＤ／ｇの組織ＲＡ、および血液に対する割合()
【００６３】
【表２】
0004295921.tif 000027