(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞内で下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによって、ｄｔｓＲ遺伝子の発現を抑制する活性が増強され、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌。
（Ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１記載のコリネ型細菌。
（ａ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１１１８〜１７１４で表される配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１１１８〜１７１４で表される塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブと６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下でハイブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ遺伝子の発現を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｄｔｓＲ遺伝子の発現を制御する遺伝子に関する。本遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸生産菌の育種、遺伝子の発現制御系の構築など、発酵工業において利用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸は、これらのアミノ酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。この方法では、コリネ型細菌は生育にビオチンを要求する一方、培地中に過剰量のビオチンが存在すると、Ｌ−グルタミン酸が蓄積しないことが知られている。従って、従来のＬ−グルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限した培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有する原料を使用する場合、培地に添加することが必要なビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となっていた。
【０００３】
これに対し、本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質（DTSR蛋白）をコードする遺伝子（dtsR遺伝子）の存在を突き止め、この遺伝子が破壊されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成すること、及び、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、dtsR遺伝子を増幅すると著量のＬ−リジンを生産する能力が付与されることを見出している（WO95/23224号国際公開パンフレット）。
【０００４】
また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定してＬ−グルタミン酸を発酵生産することができること、及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感受性株にＬ−リジン生産性を付与することにより、ビオチン存在下でも、安定してＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に発酵生産することができることを見出している（WO96/06180号国際公開パンフレット）。
【０００５】
さらに、dtsR遺伝子に類似する遺伝子として、dtsR2遺伝子が取得されている（特開平10-234371号公報）。dtsR遺伝子は、dtsR2遺伝子との対比から、現在ではdtsR1遺伝子と呼ばれている。したがって、以下、dtsR遺伝子をdtsR1遺伝子と呼ぶ。
【０００６】
【発明の概要】
上記のように、ビオチン濃度とコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産量とは負の相関があることが知られている。また、本発明者らは、DTSRタンパク質とＬ−グルタミン酸生産との間にも負の相関があることを見出している。そこで、dtsR遺伝子の制御因子の存在を予想し、dtsR1遺伝子のプロモーターにレポーター遺伝子を連結した融合遺伝子をマルチコピーでコリネ型細菌に導入し、形質転換株のＬ−グルタミン酸生産のタイムコースを調べたところ、同融合遺伝子が導入されていない株に比べてＬ−グルタミン酸の生産が遅れることを知見した。このことから、本発明者は、形質転換株の細胞中のdtsR1遺伝子のプロモーターのコピー数が増加したため、制御因子が希釈され、dtsR1遺伝子の発現量が増加したと考えた。そして、前記融合遺伝子が導入された株を用いて、同融合遺伝子産物の発現を制御する遺伝子のスクリーニングを行った結果、本発明の遺伝子を取得することに成功した。
【０００７】
すなわち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタンパク質。
（２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１１１８〜１７１４で表される配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号８に示す塩基配列において、塩基番号１１１８〜１７１４で表される塩基配列又は同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタンパク質。
（３）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（２）のＤＮＡ。
【０００８】
（４）ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性が増強され、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌。
（５）ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性の増強が、前記細菌細胞内のｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内の同遺伝子の発現を増強するように発現調節配列を改変することによるものである（４）のコリネ型細菌。
（６）前記ｄｔｓＲ１遺伝子の発現を制御する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、（１）〜（３）のいずれかのＤＮＡである（５）のコリネ型細菌。
【０００９】
（７）（４）〜（６）のいずれかに記載のコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【００１０】
以下、本発明のdtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有するＤＮＡを、dtsR1制御遺伝子ということがある。また、本発明において、「dtsR1遺伝子の発現を制御する活性」とは、本発明のＤＮＡ又はその発現産物がdtsR1遺伝子の発現を制御する活性、例えばdtsR1遺伝子の発現を抑制する活性をいい、「dtsR1発現制御活性」ともいう。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
＜１＞本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラリーから、dtsR1遺伝子プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子（lacZ）との融合遺伝子の発現を抑制する活性を有するＤＮＡ断片として単離された。以下に、上記融合遺伝子を利用して本発明の遺伝子を取得する方法を説明する。
【００１３】
プロモーター活性又はそれを制御する活性を簡便に測定するためには、レポーター遺伝子を用いて間接的にプロモーター活性を測定する方法が考えられる。レポーター遺伝子として望まれる性質として、活性測定が簡単であること、レポーター遺伝子産物のＮ末端側にある程度のアミノ酸が付加されても活性が著しく低下しないこと、バックグランドの反応がないこと、遺伝子操作をする上で適当な制限酵素切断部位があることが挙げられる。
【００１４】
エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシダーゼ（LacZ）をコードする遺伝子（lacZ）は、広くレポーター遺伝子として用いられており、またコリネ型細菌にはラクトース資化能がないことから（J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 399-416 (1972)）、レポーター遺伝子としてlacZを用いるのが好適であると考えられる。
【００１５】
dtsR1遺伝子プロモーターとlacZとの融合遺伝子を保持する細菌、例えばエシェリヒア・コリは、同プロモーターが機能すると、β−ガラクトシダーゼ活性が上昇する。β−ガラクトシダーゼ活性は、これを産生する細菌をX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-チオガラクトシド）を含む培地で生育させると、培地が青く呈色することによって検出することができる。したがって、前記融合遺伝子を保持する細菌、例えばエシェリヒア・コリを宿主に用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体遺伝子ライブラリーから、コロニーの色を指標として、本発明の遺伝子を選択することができる。
【００１６】
dtsR1遺伝子プロモーターは、同遺伝子配列は公知であるので（WO95/23224号国際公開パンフレット）、この配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって取得することができる。一方、lacZは、これを保持するプラスミド、例えばpMC1871（ファルマシアバイオテク）、pRS552（R.W.Simons et al., Gene, 53, 85-96 (1987)）等から取得することができる。これらのdtsR1遺伝子プロモーターとlacZを連結することにより、プロモーター活性測定用の融合遺伝子が得られる。
【００１７】
上記のような融合遺伝子をエシェリヒア・コリに保持させるには、例えば、該融合遺伝子を含むプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換すればよい。尚、この融合遺伝子は、染色体遺伝子ライブラリーの構築に用いるプラスミドと和合性であるプラスミドを用いてエシェリヒア・コリに導入するか、あるいは、エシェリヒア・コリ染色体に組み込む必要がある。エシェリヒア・コリとしては、β−ガラクトシダーゼを欠損した株、例えばJM109株等を用いる。
【００１８】
染色体遺伝子ライブラリーは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムから、例えば斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)）に従い染色体ＤＮＡを調製し、得られた染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断し、コリネ型細菌で機能するベクターに連結することによって取得することができる。
【００１９】
プロモーター活性測定用の融合遺伝子を含むプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、得られた形質転換体を染色体遺伝子ライブラリープラスミドで形質転換し、X-galを含む培地上でコロニーの色が白〜薄い青色を呈する株を選択することによって、dtsR1発現制御遺伝子を保持する候補株が得られる。得られた株をX-galを含む培地に植え継ぎ、白〜薄い青色を維持するコロニーを選択することによって、候補株を絞ることができる。さらに、候補株からプラスミドを調製し、再度エシェリヒア・コリを形質転換し、上記と同様の操作を繰り返すことによって、本発明の遺伝子を取得することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子は、塩基配列及びコードされるアミノ酸配列が明らかとなったので、その配列に基づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたＰＣＲ（polymerase chain reaction）法又はハイブリダイゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡ又は染色体遺伝子ライブラリーから取得することもできる。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、コードされるタンパク質のdtsR1発現制御活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むdtsR1発現制御活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。
【００２２】
上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。ＤＮＡの変異処理としては、ＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア・コリを、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２３】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２４】
上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物のdtsR1発現制御活性を調べることにより、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号1118〜1714からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、dtsR1発現制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離してもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
プローブとして、配列番号８の塩基番号1118〜1714からなる塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を有するＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ反応によって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００２６】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、発現ベクターにつなぎdtsR1発現制御活性を調べることによって容易に取り除くことができる。本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性は、前記のdtsR1遺伝子プロモーターとlacZとの融合遺伝子を用いることにより、評価することができる。
【００２７】
染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されている。
【００２８】
＜２＞本発明の遺伝子の利用
本発明の遺伝子は、dtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有するので、本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性を弱化もしくは欠損又は増強することにより、dtsR1遺伝子自体を弱化もしくは欠損、又は増強するのと同様の効果が期待できる。また、本発明の遺伝子を温度感受性にすることにより、dtsR1遺伝子を温度感受性にするのと同様の効果が得られる。
【００２９】
例えば、コリネ型Ｌ−グルタミン酸菌においてdtsR1発現制御活性を増強することにより、dtsR1遺伝子の発現が抑制され、過剰量のビオチンを含む培地であっても、ビオチン作用抑制物質を添加せずにＬ−グルタミン酸を生産させることができる。
【００３０】
また、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において本発明の遺伝子を破壊することによって、dtsR1遺伝子の発現を増強させると、Ｌ−リジンを生産能が向上すると考えられる。
【００３１】
さらに、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌において、本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性を制御することによって、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産させることができると考えられる（WO96/06180号参照）。
【００３２】
本発明でいうコリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
【００３３】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００３４】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ  ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム  ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム  ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４
dtsR1発現制御活性を増強するには、本発明の遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製し、同組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換すればよい。
【００３５】
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
【００３６】
pAJ655  エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)
コリネバクテリウム・グルタミクムSR8201(ATCC39135)
pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)
コリネバクテリウム・グルタミクムSR8202(ATCC39136)
pAJ611  エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148 コリネバクテリウム・グルタミクムSR8203(ATCC39137)
pAJ440  バチルス・ズブチリスAJ11901(FERM BP-140)
pHC4    エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
【００３７】
本発明の遺伝子をコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）も有効である。
【００３８】
dtsR1発現制御活性の増強は、本発明の遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上に本発明の遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、本発明の遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の本発明の遺伝子のコピー数が上昇する結果、dtsR1発現制御活性が増強される。
【００３９】
dtsR1発現制御活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上の本発明の遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、本発明の遺伝子の発現が強化されることによってdtsR1発現制御活性が増強される。
【００４０】
一方、本発明の遺伝子の破壊は、相同組換えを利用した遺伝子置換によって行うことができる。同遺伝子の内部を欠失し、dtsR1発現制御が正常に機能しないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法などがあるが、温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。
【００４１】
上記のようにして本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性が増強又は抑制されたコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸又はＬ−リジン等のアミノ酸の製造に利用することができる。このようなコリネ型細菌の培養及び培地に蓄積されたアミノ酸の採取は、通常と同様にして行うことができる。
【００４２】
例えば、Ｌ−グルタミン酸の生産に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００４３】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４４】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
【００４５】
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００４６】
また、dtsR1発現制御活性が増強されたコリネ型細菌に、界面活性剤やペニシリンを添加したり、ビオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率を更に向上させることができる場合がある。
【００４７】
発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４９】
【実施例１】
dtsR1制御遺伝子の取得
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラリーの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラリーを調製した（WO95/23224号国際公開パンフレット参照）。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869から、斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。この染色体ＤＮＡをSau3AIで部分分解した。一方、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターpSAC4をBamHIで切断し、前記染色体ＤＮＡのSau3AI断片と連結し、連結反応液でエシェリヒア・コリDH5を形質転換した。pSAC4は、以下のようにして得た。pHM1519由来の複製制御領域を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号）をBamHI及びKpnIで消化して、複製制御領域を含むＤＮＡ断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造(株)、Blunting kit）を用いて平滑末端化した後、SalIリンカー（宝酒造(株)）を結合し、これをpHSG399（宝酒造(株)）のSalIサイトに挿入した。
【００５０】
＜２＞dtsR1制御遺伝子のスクリーニング系の構築
上記のＤＮＡライブラリーから、dtsR1制御遺伝子を取得するために、スクリーニング系の構築を行った。
【００５１】
（１）プロモーター活性測定用プラスミドの構築
lacZをレポーター遺伝子として、プロモーターを搭載するためのプラスミドの構築を行なった。以下、その過程を詳細に説明する（図１）。
【００５２】
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（nptII）を保持するエシェリヒア・コリME8459（ME8459は、日本の国立遺伝学研究所から入手できる）から調製した染色体ＤＮＡを調製した。一方、nptIIをPCRにより増幅するためのプライマーとして、配列番号１、配列番号２に示す合成DNAを合成した。これらのプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行なった。PCRは、Pyrobest polymerase（宝酒造(株)）を用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、72℃ 3分を、30サイクル行った。
【００５３】
得られたPCR産物は、SmaI、BamHIで完全分解した後、SmaI、BamHIで切断したpGEM  ベクター（Promega）に挿入し、pGEMnpIIを得た。次に、pGEMnpIIをSmaI、BamHIで切断してnptII遺伝子断片を切り出した。クララムフェニコール耐性マーカーを保持するプラスミドpKF3（宝酒造(株)）をHindIIIで分解した後、平滑末端化し、前記nptII遺伝子断片と連結した。連結反応液でエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造(株)）を形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むＬ培地に塗布した。一晩培養した後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からプラスミドを調製し、pKF3nptIIとした。
【００５４】
一方、コリネ型細菌とエシェリヒア・コリとのシャトルベクターを作製した。既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（特開昭58-77895号参照）由来の複製制御領域を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号）を、制限酵素BamHI及びKpnIで消化して、複製制御領域を含むＤＮＡ断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造(株)、Blunting kit）を用いて平滑末端化した後、SalIリンカー（宝酒造(株)）を結合した。これをpHSG299（宝酒造(株)）のSalIサイトに挿入し、プラスミドpSAK4を得た。
【００５５】
pSAK4をSmaI、SalIで完全分解し、複製制御領域を含むＤＮＡ断片を、SalIで切断したpKF3nptIIと連結し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベクターpNEOを構築した。このプラスミドは宿主にクロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を付与する。
【００５６】
さらにpNEOをSmaI、Sse8387Iで完全分解した。これを、pMC1871（ファルマシアバイオテク）をPstI、SmaIで完全分解したものと連結し、pNEOLを構築した。pNEOLは、pMC1871由来のレポーター遺伝子として、Ｎ末端側の８アミノ酸を欠失したLacZをコードするlacZを保持し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベクターである。pNEOLの適当な部位、例えばSmaI部位にプロモーター活性を有する配列を挿入し、プロモーター活性を発現させると、LacZを産生させることができる。したがって、同プラスミドを保持する細菌をX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-チオガラクトシド）を含む培地で生育させ、LacZを発現させると、培地が青く呈色する。
【００５７】
（２）プロモーター活性制御遺伝子スクリーニング用プラスミドの構築
（ｉ）dtsR1プロモーター領域の取得
配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム13869株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRを行い、dtsR1遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を取得した。前記プライマーは、WO95/23224号の配列番号１に記載されているdtsR1遺伝子の塩基配列の塩基番号1〜24、及び、398〜421に相当する。これらの配列は、dtsR1遺伝子の開始コドンから数えて-358〜-335bp、及び、Ｎ末端から数えて１４番目のアミノ酸（Pro）〜２１番目のアミノ酸（Gly）に相当する。前記プライマーは、5'側に制限酵素NaeIサイトが付加されている。PCRは、Pyrobest polymerase（宝酒造(株)）を用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、72℃ 1分を、30サイクル行った。
【００５８】
（ii）dtsR1プロモーターとpNEOとの連結
前記のようにして得られた421bpの増幅断片をNaeIで切断し、SmaIで切断したpNEOと連結した。得られたプラスミドをpNEOLDR1と命名した（図２）。本プラスミドが導入されたエシェリヒア・コリJM109株及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムは、dtsR1プロモーターが機能すると、50μg/lカナマイシン（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの場合は25μg/l）及び45mg/l X-gal添加LB寒天培地（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの場合はCM-2B培地(ポリペプトン10g/L、酵母エキス 10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン 10μg/L)）で青く呈色する。
【００５９】
（２）pNEOLDR1のpACYC177ベクターへの繋ぎ変え
前記染色体ＤＮＡライブラリーの構築に用いたプラスミドpSAC4は、エシェリヒア・コリの複製制御領域としてpUC系のプラスミドpHSG399を用いており、プロモーター活性制御遺伝子スクリーニング用プラスミドpNEOLDR1も、エシェリヒア・コリの複製制御領域として、同じくpUC系のプラスミドpHSG299を用いている。これらのプラスミドはエシェリヒア・コリ細胞中で不和合性を示すので、pNEOLDR1のdtsR1プロモーターからレポーター遺伝子（lacZ）までの断片を、pACYC177に移し変えた。pACYC177は、p15A由来の複製制御領域を持ち、pUC系プラスミドと和合性を示す。
【００６０】
まず、pNEOLDR1を鋳型にし、配列番号５、６に示したプライマーを用いPCR法により、dtsR1プロモーター及びレポーター遺伝子（lacZ）を含む断片の取得を行った。これらのプライマーの5'側には、HindIIIサイトが付加されている。PCRは、Pyrobest polymerase（宝酒造(株)）を用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、72℃ 4分を、30サイクル行った。
【００６１】
上記PCRにより得られたプロモーターからlacZ構造遺伝子部分を含む約3.5kbの断片をHindIII処理した後、pACYC177のHindIIIサイトに連結した。このようにして作製したプラスミドをpACYCLDR1と命名した。以上、pACYCDR1プラスミドの作製手順は図３に示す。
【００６２】
＜３＞dtsR1制御遺伝子の取得
（１）dtsR1遺伝子制御遺伝子のスクリーニング
上記のようにして構築されたスクリーニング系を用いて、＜１＞で得られたＤＮＡライブラリーから、dtsR1制御遺伝子をスクリーニングした。
【００６３】
pACYCDR1プラスミドを保持しているエシェリヒア・コリJM109に、エレクトロポレーション法によってライブラリープラスミドを導入し、形質転換体をアンピシリン100μg/L、カナマイシン50μg/L、X-gal 45mg/lを含むLB寒天培地にて生育させた。約５万コロニーの中から、白及び薄い青を呈色したコロニーを200個選択した。これらの株を、前記と同様の培地に塗りつけ、白及び薄い青を呈色したコロニーを選択することにより２次スクリーニングを行い、140株に絞った。その中から白く呈色した８株と薄い青を示した20株、計28株からプラスミドを抽出した。その結果、プラスミドのパターンが大きく６つに分かれた。白く呈色する原因には、宿主そのものの変異も考えられたことから、これら６種類のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109を再び形質転換し、コロニーの色を調べたところ、白もしくは薄い青を再度示したプラスミドが３個に絞られた。これらプラスミドのうち、白を呈したコロニーをpSAC86、薄い青を呈したコロニーをpSAC72及びpSAC113を命名した。
【００６４】
（２）候補遺伝子の解析
pSAC72、pSAC86及びpSAC113の挿入断片のシークエンス解析を行った。それぞれ挿入断片は5668bp、2984bp、4444bpの長さであった。それぞれの塩基配列を、配列番号７、８、１０に示す。pSAC86の挿入断片にはオープン・リーディング・フレーム（ORF）が見出された（塩基番号1118〜1714）。このORFがコードし得るアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００６５】
【実施例２】
dtsR1制御遺伝子のコリネ型細菌への導入、及びＬ−グルタミン酸生産の誘導
pSAC72、pSAC86、pSAC113を、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869にエレクトロポレーション法により導入し、ATCC13869/pSAC72、ATCC13869/pSAC86、ATCC13869/pSAC113を得た。
【００６６】
ATCC13869/pSAC86、及びpSAC4を保持するATCC13869株を、下記に示す培地にて、31.5℃で22時間培養した。培養終了後、培地の620nmにおける吸光度（51倍希釈）、及び培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。結果を表１に示す。ATCC13869/pSAC4は、過剰量のビオチンを含む培地でＬ−グルタミン酸をほとんど蓄積しなかったが、ATCC13869/pSAC86はＬ−グルタミン酸を蓄積した。
〔培地組成〕
グルコース        80g
KH2PO4             1g
MgSO4              0.4g
(NH4)2SO4         30g
FeSO4 7H2O         0.01g
MnSO4 7H2O         0.01g
大豆加水分解液    15ml
サイアミン塩酸塩 200μg
ビオチン         300μg
CaCO3             50g
【００６７】
【表１】
0004304815.tif 000002
【００６８】
【発明の効果】
本発明により、dtsR1遺伝子の発現を制御する遺伝子が得られる。本遺伝子は、遺伝子の発現制御、あるいはＬ−グルタミン酸生産菌の育種等に利用することができる。
【００６９】
【配列表】
0004304815.tif 000003
【００７０】
0004304815.tif 000004
【００７１】
0004304815.tif 000005
【００７２】
0004304815.tif 000006
【００７３】
0004304815.tif 000007
【００７４】
0004304815.tif 000008
【００７５】
0004304815.tif 000009
【００７６】
0004304815.tif 000010
【００７７】
0004304815.tif 000011
0004304815.tif 000012
0004304815.tif 000013
0004304815.tif 000014
【００７８】
0004304815.tif 000015
0004304815.tif 000016
0004304815.tif 000017
0004304815.tif 000018
【００７９】
0004304815.tif 000019
0004304815.tif 000020
【００８０】
0004304815.tif 000021
0004304815.tif 000022
0004304815.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【図１】  lacZを持つプラスミドpNEOLの構築過程を示す図。
【図２】  dtsR1遺伝子制御下にレポーター遺伝子としてlacZが連結された融合遺伝子を持つプラスミドpNEOLDR1の構築過程を示す図。
【図３】  pNEOLDR1中の融合遺伝子をpACYC177に移し変えることによって得たプラスミドpACYCLDR1の構築過程を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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