(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（Ａ）又は（Ｂ）の性質を有する蛋白質。
（Ａ）配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する。
（Ｂ）配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性を有する。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
遺伝子が、配列表の配列番号：４に示す塩基配列を有するものである請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性、即ち、セラミダーゼ活性を有する新規な蛋白質及びそれをコードする遺伝子に関する。
セラミダーゼはスフィンゴ脂質の代謝産物であるセラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解し、スフィンゴシンと脂肪酸を生成させる酵素である。スフィンゴシンは生体膜に微量に存在するが、生体内では新生合成されず、その生成はすべてセラミダーゼに依存している。また、セラミダーゼにはその酵素活性の至適ｐＨが酸性で、リソソームに局在する酸性セラミダーゼと、細胞質あるいは形質膜に存在し、中性またはアルカリ性域に至適ｐＨをもつ中性・アルカリ性セラミダーゼがある。セラミド、スフィンゴシン、及びそのリン酸化物であるスフィンゴシン−１−リン酸は、細胞増殖、および分化、細胞死、特にアポトーシスを制御する情報分子であること、また神経細胞においては細胞の生命維持、突起伸張に不可欠であり、生体の機能維持に重要な役割を担っている物質である。
【０００２】
【従来の技術】
セラミダーゼ活性を有する蛋白質は、ファーバー病患者に欠損している蛋白質として、ヒト尿より最初に単離された（Ｂｅｒｎａｒｄｏ，K ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１１０９８−１１１０２，１９９５）。この蛋白質は酵素活性の至適ｐＨを酸性域に持つ酸性セラミダーゼであった。このアミノ酸配列をもとにヒト（Ｋｏｃｈ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３３１１０−３３１１５，１９９６）、及びマウス（Ｌｉ，Ｃ−Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５０，２６７−２７４，１９９８）からこの蛋白質をコードするｃＤＮＡがクローニングされている。
【０００３】
また、モルモットの皮膚からはアルカリ性セラミダーゼ蛋白質が単離精製されている（Ｙａｄａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２６７７−１２６８４，１９９５）。マウス肝臓からは中性域に至適ｐＨを持つ中性セラミダーゼが単離、精製されており（谷  元洋ら：平成１０年度日本生化学会）、そのｃＤＮＡもクローニングされている（谷  元洋ら：平成１１年度日本生化学会発表予定）。さらに、ほ乳類以外では緑膿菌からアルカリ性セラミダーゼ蛋白質が単離、精製されており（Ｏｋｉｎｏ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１４３６８−１４３７３，１９９８）、そのｃＤＮＡもクローニングされている（沖野  望ら：平成１０年度日本生化学会）。このセラミダーゼを産生する緑膿菌はアトピー性皮膚炎患者の皮膚から採取されたものであり、この場合、産生されたセラミダ―ゼやそれにより分解生成されたスフィンゴシンがアトピー性皮膚炎の症状を引き起こす原因の１つとなっていると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なセラミダーゼ及び、それをコードする遺伝子を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラット由来の細胞の摩砕懸濁上清に含まれるセラミダーゼ活性を有する蛋白質について検索を進めた結果、その腎臓細胞の摩砕懸濁上清より、従来報告されているセラミダーゼとは至適ｐＨや生体内での存在状態が異なり、またアミノ酸配列においても、公知のセラミダーゼやそれ以外の蛋白質と一致しない蛋白質を見いだし、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、次の（Ａ）又は（Ｂ）の性質を有する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、及び該組換えベクターにより形質転換された形質転換体を提供するものである。
（Ａ）配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する。
（Ｂ）配列表の配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性を有する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子は、例えば次の様にして調製される。
先ず、（１）ラットの腎臓や心臓などの各臓器を摩砕した細胞懸濁液中で、セラミダーゼ蛋白を可溶化し、（２）可溶化された蛋白質の中から、セラミダーゼ活性を測定しながら、（３）セラミダーゼ蛋白質を分離、精製する。次に、（４）得られたセラミダーゼ蛋白質を酵素により消化し、それぞれのアミノ酸配列を解析し、（５）このアミノ酸配列を蛋白質およびＤＮＡデータベースを検索し、既知のアミノ酸配列又は塩基配列との相同性を解析する。続いて、（６）このアミノ酸配列より、これをコードする塩基配列を推定し、その塩基配列と、共通にｍ−ＲＮＡの３' 末端に付加されるポリ−Ａ配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をプローブとし、ラットの腎臓などのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、目的とする塩基配列のｃＤＮＡを有するクローンを得て、このクローンの該ｃＤＮＡの塩基配列を解析すればよい。また、（７）このｃＤＮＡを適当なプロモーターと共にベクターに組み込んだ組替えベクターを作成し、該ベクターで適当な宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を作成する。
以下、本発明の蛋白質、遺伝子、組換えベクター及び形質転換体について更に詳細に説明する。
【０００７】
（１）セラミダーゼ蛋白質の可溶化
ラットセラミダーゼはラットの生体膜中の成分であるので、腎臓、心臓、肝臓などの臓器や、皮膚組織などから得ることができる。これらの臓器の中では特に腎臓でセラミダーゼ活性が高いことから腎臓を用いることが好ましい。この臓器、あるいは組織を摩砕したのち、例えばＡ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｔｏ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｇｅｂｈａｒｄ  ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｓｅｈａｅｇｇｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４の記載に準じて、遠心分離や、界面活性剤を用いて、セラミダーゼ蛋白質を可溶化する。
【０００８】
（２）セラミダーゼ活性の測定
セラミダーゼ蛋白質の可溶化、精製工程では、各画分のセラミダーゼ活性を測定しながら行う必要がある。活性の測定は、公知の方法（谷ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１８３−１８８，１９９８；光武ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７，５２−５７，１９９７）を用いて放射線同位体、14Ｃなどや蛍光物質、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）などでラベルされたセラミドを基質として用い、セラミダーゼ蛋白質画分の一部を一定時間反応させた後、その反応液中の基質と分解生成物をゲルろ過クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分離する。セラミドのラベルはＮＢＤを、分離は薄層クロマトグラフィーを用いるのが好ましい。残存した基質と分解生成物のそれぞれのラベル量を薄層クロマトスキャナーや、イメージングアナライザーを用いて測定することにより、測定しようとする画分中のセラミダーゼ活性を求めることができる。セラミダーゼ活性の単位は、１分間に１μｍｏｌの基質を分解するセラミダーゼの量を１Ｕと定義した。
【０００９】
（３）セラミダーゼ蛋白質の精製
可溶化されたセラミダーゼ蛋白質は、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動法などを組み合わせて分離精製することができる。特に、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、Ｃｕ2+キレーティングセファロースクロマトグラフィー、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動法等の組み合わせが好ましい精製法である。また、電気泳動にかける画分の濃縮、脱塩には、セラミダーゼ蛋白質のように生体内での存在量が非常に少ない蛋白質の場合は、特にＹ字型ゲル（一ノ瀬ら：平成１０年度日本生化学会）を用いるのが好ましい。
【００１０】
（４）セラミダーゼ蛋白質のアミノ酸配列解析
精製されたセラミダーゼ蛋白質は、例えば細胞工学別冊８、新細胞工学実験プロトコール（監修・豊島久眞男、山本  雅）ｐ．３０４−３０９，１９９３（秀潤社）に示されるようにＩｎ  Ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法により酵素消化を行う。消化に使われる蛋白質分解酵素はリジルエンドプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシンなどがあるが、これらのなかで基質特異性、安定性、界面活性剤の存在下での活性などの点から、リジルエンドペプチダーゼを用いるのが好ましい。消化して得られたモノまたはポリペプチドの分離法には、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、キャピラリー電気泳動などがあるが、精度や再現性の点から特に逆相ＨＰＬＣを用いるのが好ましい。分離されたペプチドはアミノ酸配列分析器を用いてそのアミノ酸配列を分析し、その結果を市販の解析ソフトを用いて解析し、配列を特定する。解析ソフトで解析不可能であった部分については解析者の目視による解析でまかなう。かくして得られるセラミダーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列として、例えば配列番号：１〜３に示す配列を挙げることができる。
【００１１】
（５）蛋白質およびＤＮＡデータベースの検索
得られたアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列のデータベース中に同一配列を含むものが存在するかどうか解析する。アミノ酸配列のデータベースには、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）や、ＮＢＲＦ（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）などがあるが、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴを用いるのがが好ましい。またＤＮＡ配列のデータベースについては、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの相補鎖を含め両鎖について３フレーム、計６フレームについて検索する。これに用いるＤＮＡデータベースとしては例えばＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が挙げられる。検索に用いるソフトは例えばＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社製）、ＩＧ−Ｓｕｉｔｅ、ＥＵＧＥＮＥ、ＵＷＧＣＧ、Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（富士通社製）等が用いられる。
【００１２】
（６）セラミダーゼ蛋白質ｃＤＮＡの単離とその塩基配列の決定
上記（４）で得られたアミノ酸配列からそれをコードする塩基配列を推定し、その塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーにより合成する。このオリゴヌクレオチドプライマーと、共通にｍ−ＲＮＡの３' 末端に付加されるポリ−Ａ配列のアンチセンスであるポリ−Ｔ配列等の市販のプライマーを用いて、ラット腎臓等のｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物（例えば、配列番号：７に示す塩基配列）をプローブとして同ライブラリーをスクリーニングし、ｃＤＮＡ全長を含むクローンを得る。このクローンについて、塩基配列を既知の方法で解析する。かくして得られるセラミダーゼ蛋白質及びそれをコードする遺伝子として、例えば配列番号：４に示す配列を有するものを挙げることができる。なお、配列番号：４のセラミダーゼ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。
【００１３】
本発明の蛋白質は、配列番号：５に示すアミノ酸配列を有するものに制限されるものではなく、上記したセラミダーゼ活性を有するものであれば、配列番号：５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
また、本発明の遺伝子も、配列番号：４に示す塩基配列を有するものに制限されるものではなく、上記した蛋白質を構成し得るポリペプチドをコードするものであれば如何なる塩基配列であってもよい。
上記配列の改変は、それ自体既知の部位特異的変異誘発法等（例えばＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，４８８，１９８５、Ｄｅｎｇ，Ｗ．Ｐ．ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００，８１，１９９２）の記載に準じて行うことができる。
【００１４】
（７）セラミダーゼ蛋白質ｃＤＮＡを含む組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形質転換体の作成
前記（６）で述べたラット腎臓等のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングされ、目的とする塩基配列を含むクローンは、セラミダーゼ遺伝子の全長を有するプラスミドを保有している。このセラミダーゼ遺伝子またはこれを含むＤＮＡ断片は、これを適当な発現用ベクター、若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入して形質転換体を調整し、該形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現させることができる。
【００１５】
組換えベクターの作成に用いるベクターは、宿主微生物または培養細胞内で複製可能で、本発明の遺伝子またはそれを含むＤＮＡ断片が適当な宿主微生物形質転換体または培養細胞の遺伝子誘導株により発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主微生物または培養細胞に適したプロモ―ターが挿入されている市販の蛋白質発現用ベクターを用いる。またプラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
蛋白質発現用ベクターとしては、宿主微生物が大腸菌の場合では、例えばｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社製）等が、昆虫細胞の場合では、例えばＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また動物細胞の場合では、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００１６】
本発明のセラミダーゼ遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主微生物又は培養細胞が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７プロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。また、ほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明のセラミダーゼ遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。
これらのベクターへのセラミダーゼ遺伝子の挿入は、該遺伝子またはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子のコーディング領域の５' 末端がフレームをあわせて連結されるようにして行う。
【００１７】
かくして得られたセラミダーゼ組換え発現ベクターは、ヒートショック法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４，１９７０）、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１，１９８３）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，１９８２）、電気パルス法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，７１６１，１９８４）、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２，５８１，１９７５）、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，１９８４）等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。
【００１８】
このとき、セラミダーゼ遺伝子を導入する宿主としては、該遺伝子を含む発現ベクターが体内で複製可能であり、かつ該遺伝子がコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物培養細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，１９８８）とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，１９８８）等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，１９７８）やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，１９８０）やアフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ：アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）等が挙げられる。
【００１９】
上記したような発現ベクターを用いた発現方法の他に、プロモーターを連結したセラミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，１９９３）、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９，１９９４）等を用いて発現させることができる。
得られた形質転換体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（日水製薬）等、酵母の場合には、例えばＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，１１７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、例えば２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）等を挙げることができる。形質転換体の培養は、通常、温度２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育し、挿入された遺伝子がコードする蛋白質が生成されれば如何なるものであってもよい。
【００２０】
このようにして得られた形質転換体の培養上清、あるいは形質転換体、又は遺伝子導入細胞を破壊して得た蛋白質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、適当な蛋白質の検出法、例えばＣＢＢ（シグマ社製）等の色素で染色することによりセラミダーゼ蛋白質の生成が確認できる。この形質転換体の培養物から、前記したセラミダーゼ蛋白質の分離、精製法に準じた方法により、本発明の蛋白質を取得することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１
１．ラットセラミダーゼ蛋白質の可溶化
ラット５３匹の腎臓（計１０６個、１４１ｇ）を０．２５ｍＭ蔗糖、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む溶液、３００ｍｌの中で摩砕し、その摩砕懸濁液を６００×ｇで５分間遠心し、核画分を沈殿させた。この上清をさらに２７，０００×ｇで３０分遠心した後、沈殿に１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ２０）２００ｍｌを加え、氷冷しながら摩砕した。氷上で２時間放置した後、さらに、超音波粉砕を２分間ずつ、３回行った。この懸濁液をさらに粉砕し、１０５，０００×ｇで１時間遠心した。
【００２２】
２．セラミダーゼ活性の測定
基質としてＮＢＤ（和光純薬社製）でラベルしたＣ１２−ＮＢＤセラミドを用いた。Ｃ１２−ＮＢＤセラミド５００ｐｍｏｌ／（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、２０μｌと各セラミダーゼ蛋白質を含む溶液の１部を３７℃で３０分間反応させた。クロロフォルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）１００μｌを加え反応を止めた後、この反応混合液を真空遠心濃縮器（サヴァント社製）を用いて乾燥させ、再びクロロフォルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）１５μｌに溶解した。これを薄層クロマトプレート（メルク社製）にスポッティングし、展開液（クロロフォルム／メタノール／２５％アンモニア（９０：２０：０．５、ｖ／ｖ／ｖ））で展開した。これをＴＬＣクロマトスキャナー（島津製作所社製：ＣＳ−９３００）を用いて、エキサイテーション４７０ｎｍ、エミッション５２５ｎｍで残存した基質と分解生成物のラベル量を測定し、セラミダーゼ活性をユニット数で表した。上記１で得られたラット腎臓細胞の可溶化懸濁液中のセラミダーゼ活性は総量で１．１Ｕであった。
【００２３】
３．ラットセラミダーゼ蛋白質の精製
（１）陰イオン交換クロマトフラフィーによる精製
上記１で得られた上清をあらかじめ緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）０．１％Ｌｕｂｒｏｌ−ＰＸ）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製：カラムサイズ内径３．０ｃｍ、高さ２５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄後、１Ｍ  ＮａＣｌによる直接濃度勾配（全量４４０ｍｌ）で吸着物を溶出し、これをＤＥＡＥ−セファロース溶出液とした。この溶出液中のセラミダーゼ活性を前記２の方法で確認した。
【００２４】
（２）疎水性クロマトグラフィーによる精製
ＤＥＡＥ−セファロース溶出液を、あらかじめ緩衝液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したフェニル−セファロース６ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製：カラムサイズ内径３．０ｃｍ、高さ１２ｃｍ）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１％Ｌｕｂｒｏｌ−ＰＸ緩衝液、９１０ｍｌでＮａＣｌ濃度０％に下げて溶出し、フェニル−セファロース溶出液とした。このフェニル−セファロース溶出液中のセラミダーゼ活性を前記２の方法で確認した。
【００２５】
（３）アフィニティクロマトグラフィーによる精製
フェニル−セファロース溶出液をＢ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．１％Ｌｕｂｒｏｌ−ＰＸ）で平衡化したＣｕ2+でキレートしたキレーティング−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製：カラムサイズ内径１．５ｃｍ、高さ１５ｃｍ）に添加した。Ｂ緩衝液でカラムを洗浄後、セラミダーゼ活性成分は２Ｍ  ＮＨ4 Ｃｌを加えたＢ緩衝液１７０ｍｌで溶出した。このキレーティング−セファロース溶出液中のセラミダーゼ活性を同様の方法で測定したところ８６０ｍＵであった。
【００２６】
（４）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
キレーティング−セファロース溶出液を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＭ  ＭｎＣｌ2 、１ｍＭ  ＣａＣｌ2 、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化したレクチン−アフィニティクロマトグラフィー（アマシャムファルマシアバイオテク社製：ハイトラップ  レンチル  レクチン、１ｍｌ）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５Ｍ  ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅで吸着物を溶出した。この溶出液中のセラミダーゼ活性を同様の方法で測定したところ１４８ｍＵであった。
【００２７】
（５）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
レクチン−アフィニティクロマトグラフィー溶出液をゲル濾過カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ）に添加し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％Ｌｕｂｒｏｌ−ＰＸ緩衝液により流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。各画分についてセラミダーゼ活性を同様にして測定したところ９１．７ｍＵであった。これをセラミダーゼ蛋白質粗精製標品とした。
【００２８】
（６）分子量測定
同じゲル濾過カラムに、蛋白質のサイズマーカーを添加し、同条件で溶出された蛋白質のサイズと溶出時間との検量線を引いた。この結果をもとに、セラミダーゼ蛋白が含まれる画分の平均分子量を求めたところ約２００ｋＤａであった。
【００２９】
（７）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製度の確認
このセラミダーゼ蛋白質粗精製標品を２−メルカプトエタノール還元下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけたところ、多くのバンドがみられたが、目的のセラミダーゼ蛋白質は他のバンドと区別できるバンドとして確認できた。そこで、さらに分離、精製するためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからの切り出し法を利用することとした。
【００３０】
（８）濃縮、脱塩
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードするために、以下の要領で濃縮と脱塩を行った。
ロート型ゲル（Ｗ．Ｓｔａｕｄｅｍａｎｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｍｐｌｅ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９，９０１−９０８，１９９８）を一部変更したＹ字型ゲル（一ノ瀬ら；平成１０年度日本生化学会発表）により上記（５）で得られたセラミダーゼ蛋白質粗精製標品を電気泳動した後、蛋白が濃縮された部分のゲルをかみそりを用いて切り出した。切り出したゲルはサンプリングチューブ（１．５ｍｌ）に移し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥの試料用緩衝液（１７．５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３１．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．５％ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１．５％ＳＤＳ）６０μｌを加え、マイクロ乳棒を用いて摩砕した。
【００３１】
（９）セラミダーゼの分離、取得
上記摩砕液を、濃縮ゲル厚３ｍｍ、分離ゲル厚１ｍｍのＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、セラミダーゼ蛋白質のバンドをかみそりを用いて切り取った。
【００３２】
実施例２
１．アミノ酸配列分析
（１）酵素消化
切り取ったゲルをサンプリングチューブ（１．５ｍｌ）に入れ、これに２５％イソプロパノール、１．０ｍｌを加え、室温で３０分間振とう攪拌した。上清を捨て、さらに２５％イソプロパノール、１．０ｍｌを加え、室温で３０分間振とう攪拌した。上清を捨て、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）、０．５ｍｌ加え、室温で１５分間振とう攪拌した。これをもう１度繰り返した後、上清を捨てた。蛋白質消化酵素（和光純薬社製：リジルエンドプロテアーゼＡＰ−１）を０．２μｇ加え、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）をゲルが浸るほど加えた。マイクロ乳棒でゲルを摩砕した後、一晩３７℃で激しく振とう攪拌した。
【００３３】
（２）ペプチドの溶出
酵素消化した反応液を遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集めた。これを上清１とした。沈殿に１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）、０．１ｍｌ加え、３７℃で２０分間振とう攪拌した後、遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集めた。これを上清２とした。沈殿に６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、０．１ｍｌ加え３７℃で２０分間振とう攪拌した後、遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集めた。これを上清３とした。さらに沈殿に６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を０．１ｍｌ加え３７℃で２０分間振とう攪拌した後、遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集め、これを上清４とした。集めた上清１〜４は再度遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）した後、真空遠心濃縮器（イワキガラス社製：ＶＥＣ−５０）で０．１ｍｌまで濃縮した。
【００３４】
（３）逆相ＨＰＬＣによる分離
０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ2 Ｏ（ｖ／ｖ％）で平衡化したＣ８  ＲＰ−３００カラム（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：内径１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に上記濃縮ペプチド溶液を添加し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、０％から７０％へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。流速は０．０５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃で行った。波長２１５ｎｍの吸光度を測定し、ポリペプチドを含む各画分をアミノ酸配列分析の試料とした。
【００３５】
（４）アミノ酸配列分析
上記ＨＰＬＣで得た各ポリペプチド画分を、アミノ酸配列分析装置（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ４９２）、分析用プログラム（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：６１０Ａ）を用いて、アミノ酸配列を分析した。その結果を配列表の配列番号：１〜３に示す。
２．データベース解析
得られた配列番号：１〜３に示したアミノ酸配列を、蛋白質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）、ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対し、検索ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ、ソフトウェア開発株式会社）を用いて解析した結果、いずれもデータベース中に登録されていなかった。
【００３６】
実施例３  ｃＤＮＡクローニング
１．ラットセラミダーゼＤＮＡプローブ作成
（１）ＰＣＲプライマー作成
配列番号：３のアミノ酸配列の１部をコードするオリゴヌクレオチド（配列番号：６）をＤＮＡシンセサイザー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：３８１Ａ）を用いて合成した。
【００３７】
（２）ＰＣＲとＰＣＲ産物の解析
ラット腎臓ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造社製）から得たＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチド（配列番号：６）１０ｐｍｏｌと、共通にｍ−ＲＮＡの３’末端に付加されるポリ−Ａ配列のアンチセンスであるポリ−Ｔ配列（アマシャムファルマシアバイオテク社製：ＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８プライマー）１０ｐｍｏｌをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ＤＮＡ合成酵素はアンプリタックゴールド（パーキンエルマー社製）を用いた。
【００３８】
上記ＰＣＲで５３９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応混合液を1 ％アガロースゲル中で電気泳動し、ゲルから上記５３９ｂｐのＤＮＡ断片のバンドを切り出し、セファグラスバンドプレップキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてＤＮＡ断片を抽出した。得られたＤＮＡ断片はＴＡ−クローニングキット（プロメガ社製）を用いてｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にライゲーシヨンした。これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）にコールドショック法を用いて形質転換し、目的のＤＮＡ断片が挿入されているクローンをＢｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅセレクションにより選択した。得られたプラスミドはＭ１３シーケンスプライマー及びＭ１３リバースシーケンスプライマー（パーキンエルマー社製）を用いたＰＣＲによって反応させ、オートＤＮＡシークエンサー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：プリズム３７７）を用いて塩基配列を決定した。この配列を配列表の配列番号：７に示す。この配列番号：７のＤＮＡ断片をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用のプローブとして用いた。
【００３９】
２．ラット腎臓ｃＤＮＡライブラリーからのセラミダーゼｃＤＮＡのスクリーニング
ラット腎臓ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造社製）から上記１．（２）で得られたＤＮＡ断片（配列番号：７）をプローブとして、クローンキャプチャー（クロンテック社製）を用いて、目的遺伝子を含むプラスミドの濃縮を行った。この濃縮したプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（宝酒造社製）にエレクトロポレーター（バイオラッド社製：ジーンパルサー）を用いて電気的に形質転換を行った。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ナカライ社製）を含むＬＢ培地（日水製薬）プレートにまいた。１．（２）で得られたＤＮＡ断片（配列番号：７）をランダムプライミングキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製：Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏ）を用いて［32Ｐ］−ｄＣＴＰで標識し、これをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行った。得られた目的遺伝子を含むクローンは約２．５ｋｂのＤＮＡが挿入されていた。このプラスミドに挿入された塩基配列をＴ３およびＴ７シーケンスプライマー（パーキンエルマー社製）を用いたＰＣＲによって反応させ、ＤＮＡシークエンサー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製：プリズム３７７）を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列には一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、セラミダーゼ蛋白質のコーディング領域の配列が全て含まれていることが確認できた。この配列を配列番号：４に示す。
【００４０】
【発明の効果】
セラミダーゼ蛋白質はヒト、マウスおよび緑膿菌より単離、同定されているが、その活性至適ｐＨの違いや、アミノ酸配列の相同性の低さ等からさまざまな種類が存在すると考えられている。このセラミダーゼ活性を、研究、医療などに有効に利用するためにはその活性の作用機構についての研究が必須である。しかし、生体内ではセラミダーゼは膜に微量に存在するのみでその解析は非常に困難であった。本発明の新規蛋白質は公知のセラミダーゼとはその至適ｐＨや生体内での存在状態（可溶化されにくい）が異なることから、この蛋白質に特異の性質を利用することにより、より有利に産業に利用できる可能性がある。また本発明においてこの蛋白質の遺伝子を同定し、大量に合成できるようになったことで本蛋白質の解析が非常に容易となった。また本蛋白質はスフィンゴシンの産生系及びそれを介したシグナル伝達系の研究に有用であるとともに、癌をはじめとする細胞増殖異常による疾患治療薬、脳・神経系疾患治療薬への利用が期待できる。また、ファーバー病のようなスフィンゴ脂質代謝異常疾患への遺伝子治療にも利用可能である。
【００４１】
【配列表】
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