(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へ核酸を運搬するプラスミドであって、
複製開始配列を含みプラスミドコピー数を制御する５’隣接領域、前記５’隣接領域に対して３’のリンカー領域であって、核酸カセット挿入のためのマルチクローニング部位要素を含む前記リンカー領域、および
染色体オペロンの脱抑制が可能なオペレータ配列、
を含み、前記プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含まない、前記プラスミド。
【請求項２】
前記オペレータ配列が前記３’リンカー領域に対して３’に位置しかつ前記５’隣接領域に対して５’に位置する請求項１記載のプラスミド。
【請求項３】
前記オペレータ配列が前記５’隣接領域に対して３’にかつ前記リンカー領域に対して５’に位置する請求項１記載のプラスミド。
【請求項４】
前記プラスミドが前記リンカー領域に対して３’の３’隣接領域をさらに含み、前記３’隣接領域が転写終止要素および少なくとも１個の核酸制限酵素部位を含む請求項１記載のプラスミド。
【請求項５】
複数のオペレータ配列をさらに含む請求項１記載のプラスミド。
【請求項６】
前記オペレータ配列が前記５’隣接領域に対して５’にかつ前記３’隣接領域に対して３’に位置しており、かつ前記５’隣接領域に対して３’にかつ前記リンカー領域に対して５’に位置している請求項５記載のプラスミド。
【請求項７】
細胞への核酸カセット運搬のためにプラスミドを使用する方法であって、請求項１、２、３、４、５、または６に記載のプラスミドに前記細胞を十分時間接触させ、前記細胞を形質転換させる工程を含み、請求項１、２、３、４、５、または６に記載のプラスミドは前記核酸カセットをさらに含む前記方法。
【請求項８】
プラスミド選択方法であって、以下の工程：
細胞をプラスミドに十分時間接触させ前記細胞を形質転換させ、ここで前記プラスミドは、請求項１、２、３、４、５、または６に記載のプラスミドであり前記核酸カセットをさらに含み、前記細胞は、前記細胞の染色体中に染色体オペロンの制御下に取り込まれた少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子を保有し、前記オペロンは、前記プラスミド上の前記オペレータ配列による脱抑制が可能であり、
抗生物質耐性の前記形質転換された細胞を選択し、
前記選択された細胞から前記プラスミドを単離する、
を含む前記方法。
【請求項９】
プラスミド選択のための系であって、
Ａ．前記核酸カセットを含む以下のいずれかのプラスミド；
（１）細胞へ核酸配列を運搬するプラスミドであって、
複製開始配列を含みプラスミドコピー数を制御する５’隣接領域、
プラスミド保有細胞の選択を制御し前記５’隣接領域に対してさまざまに位置している３’隣接領域であって、抗生物質耐性をコードする核酸配列を含みかつ複数の核酸制限酵素配列に隣接している前記３’隣接領域、
前記５’隣接領域と前記３’隣接領域の間にあるリンカー領域であって、核酸カセット挿入のためのマルチクローニング部位要素、前記抗生物質耐性配列の転写が前記核酸カセットにまで確実に転写されないようにする転写終止要素、および染色体オペロンを脱抑制できるオペレータ配列からなる前記リンカー領域、
を含む前記細胞へ核酸配列を運搬するプラスミド；
（２）前記（１）記載のプラスミドであって、前記オペレータ配列が前記５’隣接領域に対して５’にかつ前記３’隣接領域に対して５’に位置し、それが多様に配向されている細胞へ核酸配列を運搬するプラスミド；
（３）前記（１）記載のプラスミドであって、前記オペレータ配列が前記５’隣接領域に対して３’にかつ前記リンカー領域に対して５’に位置する細胞へ核酸配列を運搬するプラスミド；
（４）前記（１）記載のプラスミドであって、前記プラスミドが複数の前記オペレータ配列をさらに含む細胞へ核酸配列を運搬するプラスミド；又は
（５）前記（１）記載のプラスミドであって、前記プラスミドが複数の前記オペレータ配列をさらに含み、前記オペレータ配列が前記５’隣接領域に対して５’にかつ前記３’隣接領域に対して３’に位置しており、かつ前記５’隣接領域に対して３’にかつ前記リンカー領域に対して５’に位置している細胞へ核酸配列を運搬するプラスミド、又は
Ｂ．前記核酸カセットを含む請求項１、２、３、４、５、または６に記載のプラスミド、及び
Ｃ．前記細胞の染色体中に染色体オペロンの制御下に取り込まれた少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子を保有する細胞であって、前記オペロンは、前記プラスミド上の前記オペレータ配列による脱抑制が可能である前記細胞、
を含む前記系。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、治療用核酸の細胞への運搬のためのプラスミド構築体に関する。さらに、本発明は、それらの構築体の使用方法ならびに所望のプラスミドの選択のための方法に関する。このような構築体および方法は、ヒトの遺伝子治療において有用である。
プラスミドは、遺伝子工学および遺伝子治療において必須の要素である。プラスミドは形質転換によって細菌細胞へ導入または移入可能な環状ＤＮＡ分子であり、前記細胞中において自己複製する。それらは、ベクターとしての利点をいくつか有し、その中で最も重要なのは、宿主細胞への抗生物質耐性付与能力である。これによって、組換えＤＮＡプラスミドを受け入れかつ保持する細胞の直接選択が可能となる。また、プラスミドは、クローニングされたＤＮＡの増幅を可能とする。一部のプラスミドは、細胞増殖時に２０個乃至５０個のコピーとして存在し、蛋白合成終止後に、プラスミド細胞１個当たり１０００個もの多くのコピーが産生できる。（Suzuki et al.,Genetic analysis,p.404（1989））。
ヒト遺伝子治療のウイルスによらない（非ウイルス性）現在の手法では、潜在的治療遺伝子をプラスミド上にクローニングすることを必要としている。前記プラスミドを保有している細菌宿主を大量に発酵させ、その後の使用のためにそのプラスミドＤＮＡを精製することもできる。プラスミドを利用した現在のヒト臨床治験では、この手法を利用している。（組換えＤＮＡ諮問委員会データ処理報告（Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report）、１９９４年１２月、ヒト遺伝子治療（Human Gene Therapy）、６：５３５−５４８）。通常、研究では、遺伝子治療プラスミドの設計と構築の際、治療遺伝子および患者におけるその発現を制御する要素に注目している。一般的に治療遺伝子と制御因子は、使いやすくかつ容易に入手可能な既存のクローニングベクター中に簡単に挿入される。
プラスミドの設計と構築では、２−３の重要なファクターを利用する。まず第一に、プラスミド複製開始点がプラスミド複製数を決定し、それは、生成収率に影響を及ぼす。より多くのコピー数に複製するプラスミドは、一定容量の培養物からのプラスミド収率を増大させることができるが、菌にとっては、あまりにコピー数が多いと障害となり得、望ましくない効果をもたらす（Fitzwaterら、Embo J.7:3289-3297（1988）;Uhlinら、Mol.Gen.Genet.165:167-179（1979））。人工的に構築したプラスミドは、時に維持が不安定となり、プラスミド非含有細胞を集積させ、生成効率を低下させることになる。
これを解決するため、抗生物質耐性表現型をコードする遺伝子がプラスミドに含まれ、プラスミド非含有細胞を死滅させるかまたは阻害するためにしばしば抗生物質が添加される。極めて一般的な目的のためのクローニングベクターはアンピリシン耐性（βラクタマーゼすなわちbla）遺伝子を含有している。アンピシリンの使用は、精製ＤＮＡ中に抗生物質が残留し、治療患者においてアレルギー反応を引き起こす可能性があるため、問題となりうる。さらに、βラクタム抗生物質は、疾患治療において臨床的に重要である。抗生物質耐性遺伝子を保有するプラスミドを使用すると、抗生物質耐性遺伝子が潜在的病原体に移行する可能性がある。
他の研究では、細菌トランスポゾンTn5由来のneo遺伝子を使用している。このneo遺伝子は、カナマイシンおよびネオマイシンに対する耐性をコードする（Smith,Vaccine 12:1515-1519（1994））。この遺伝子は、数種のヒト臨床試験を含めていくつかの遺伝子治療研究で使用されてきた（Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report,１９９４年１２月、Human Gene Therapy 6:535-548）。耐性を付与する機構により、残留抗生物質と前記遺伝子の潜在的病原体への移行は、βラクタムの場合よりも問題となることがある。
数件の研究では、抗生物質選択にかわる代替え措置を検討吟味している。１研究では、ＤＮＡ一重鎖結合蛋白質をコードするssb遺伝子のような大腸菌宿主の増殖に必須の遺伝子を利用した（Porterら、Bio/Technology 8:47-51（1990））。この遺伝子はプラスミドにクローニングされ、染色体ssb遺伝子を欠失している宿主株中において選択マーカーとして使用された。ssb遺伝子の生成物は増殖に必須であるので、プラスミド非含有細胞は生存できない。
第２群の研究では、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の使用を検討した（Lutzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4379-4383（1987）およびVillarreal and Soo、J.Mol.Appl.Genet.3:62-71（1985））。１種以上の抗生物質耐性遺伝子を変性させ、ノンセンス（終止）コドンを含有させた。これらの遺伝子を、その後、宿主染色体中に導入した。その後プラスミドを変性させ、抗生物質耐性遺伝子中においてノンセンス変異の抑制が可能な適当なサプレッサーｔＲＮＡを含有させた。変性宿主中へのプラスミドの導入によって、耐性遺伝子における変異が抑制され、抗生物質存在下において前記細胞を増殖可能とした。
検討した他のプラスミド要素として、分配要素がある。上記要素は、抗生物質選択と関係なく、プラスミド保持を安定化させることに役立つ（Hiraga,Ann Rev.Biochem.61:283-306（1992）;Williams and Thomas,J.Gen.Microbiol.138:1-16（1992））。さらに、他の要素も前記プラスミドの単量体化を促進する。一部のプラスミドは、ダイマー、トライマーおよびより高次のマルチマーの形成を受けやすく、収率が低下し保持が妨害され、さらに、より複雑な生成物特性（プロフィール）を生じ易い。マルチマー分解要素は、プラスミドの単量体化促進のために使用されてきた（Eberlら、Mol.Microbiol.12:131-141（1994）;Cornetら、J.Bacteriol.176:3188-3195（1994）;およびSummersら、Mol.Gen.Genet.201:334-338（1985））。
大腸菌のような宿主細菌中におけるプラスミドの挙動に影響を及ぼす要素の他に、プラスミドベクターも、また、真核細胞中における移入と発現に影響を及ぼすことが示されている。あるプラスミド配列がcisで保有されたときに真核細胞中において真核細胞遺伝子の発現を低下させることが明らかとされている（Petersonら、Mol.Cell.Biol.7:1563-1567（1987）;Yoder and Ganesan,Mol.Cell.Biol.3:956-959（1983）;Lusky and Botchan,Nature 293:79-81（1981）;およびLeiteら、Gene 82:351-356（1981））。また、プラスミド配列も、転写制御蛋白質の結合部位を、偶然にも有していることが明らかにされている。（Ghersaら、Gene 151:331-332（1994）;Tully and Cidlowski,Biochem.Biophys.Res.Comm.144:1-10（1987）;およびKushnerら、Mol.Endocrinol.8:405-407（1994））。このことは、治療患者において遺伝子発現を不適切なレベルで引き起こしうる。多くの場合、いつこうした意図せざる相互作用が起こるのかを予測するのは、経験的に検討し予測外の効果が明らかとならなければ、難しくあるいはほとんど不可能である。
発明の要約
出願人は、非ウイルス性遺伝子治療に使用するための種々の目標を達成するために、特定のプラスミド要素に基づいてプラスミドを構築することが有用であると決定した。特に、これらの要素は、細菌中で複製したときに制御された高コピー数をもたらし、プラスミド不安定性の潜在的原因を避け、さらに、ヒト治療用途に適合するプラスミド選択の手段を提供する。さらに、前記プラスミドの全ての要素は、必要に応じ容易に除去できまたは置き換えることができる。これらのプラスミドは、非ウイルス性ヒト遺伝子治療の促進に有用である。したがって、これらのプラスミドを標的にすることによって、前記プラスミドを疾患治療に使用することができる。これらのプラスミドは、また、形質転換動物の作製に用いることができる。
プラスミドとともに使用した際の上記要素の利点を生かして、本発明は、これらのプラスミドのオペレーター選択法における用途を特徴とする。特に、本発明は、抗生物質を用いて、それ自体抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドよりはむしろ、プラスミド中における選択可能な小（塩基対約２０個）要素の存在に基づいてプラスミド保持のために選択することを可能とする。このような要素は、プラスミドにクローニングされた抗生物質耐性遺伝子についての潜在的懸念を低下させるかまたは消失させるが、しかし、抗生物質が提供する利点、すなわち、低価格、プラスミド非含有細胞が生成されることを効率的に阻害することおよび使用の容易さを有している。直接または抗生物質耐性病原体出現の可能性を大きくすることによって抗生物質耐性遺伝子がヒト患者に移行した際に、潜在的に安全面から問題であるという懸念を、オペレータ選択は低減させる。オペレータ選択は、また、高コピー数プラスミド上に存在する抗生物質耐性遺伝子の発現に関係した宿主細胞にかかる潜在的代謝エネルギーを削減するかまたは消滅させる。
核酸を細胞の方に効率的に導く上記プラスミドの能力によって、プラスミドを数多くの疾患治療に使用できるようになる。前記治療は、一部ではあるが、核酸カセット内部、すなわち、前記治療遺伝子を保有する核酸中の治療遺伝子に依存する。さらに、上記プラスミドを同様に用いて、細胞を形質転換し、特定蛋白質、ポリペプチドおよびＲＮＡを産生できるし、ならびに、免疫応答を出現させるために使用することができる。
本発明は、第１に、核酸配列を細胞に運搬するためのプラスミドを特徴とする。上記運搬には、菌中、例えば大腸菌中におけるプラスミド核酸配列の産生が含まれる。前記プラスミドには、（１）プラスミドコピー数を制御する一定の核酸配列を有する５’隣接領域；（２）プラスミド保有細胞を選択しおよびプラスミド非含有細胞を選択しないようにすることを制御する一定の核酸配列を有する３’隣接領域が含まれる。この領域は、５’隣接領域に対してさまざまな位置づけにある。さらに（３）前記５’隣接領域を前記３’隣接領域に接続するリンカー領域が含まれる。前記５’隣接領域は、機能的複製開始点配列を有している。前記３’隣接領域は、抗生物質耐性をコードする核酸配列を有している。前記リンカー領域には、核酸配列カセット挿入のためのマルチクローニング部位配列と、前記抗生物質耐性配列の転写が前記核酸カセットまで転写されないようにする転写終止要素を有している。前記マルチクローニング部位すなわちポリリンカーは、他の核酸配列のプラスミド骨格中へのクローニングを可能とする核酸領域である。これらには、複数のクラスター制限酵素切断部位が含まれる。
本文では、用語“プラスミド”は、標的細胞の形質転換を指示するように設計された遺伝物質からなる構築体を称するものとして使用される。前記プラスミドは、プラスミド骨格から構成される。本文では、“プラスミド骨格”とは、核酸カセット中の核酸が転写されかつ必要に応じて形質転換細胞に翻訳できるように、他の必要な遺伝要素とともに位置的におよび配列を方向付けされた複数の遺伝要素を保有する。本文では、用語プラスミドは、例えばプラスミドベクター、コスミド、ファージミドまたはバクテリオファージ由来ＤＮＡのような核酸を称し、これらの中に１個以上の核酸断片が挿入またはクローニングされ、それが特定遺伝子をコードする。これには、染色体ＤＮＡと独立して複製できる環状二重鎖ＤＮＡである染色体外遺伝物質から通常構成される構築体が含まれる。
本文では、発現ベクターではなくプラスミドが遺伝子治療の中核的存在である。プラスミド骨格は、例えば大腸菌のような細菌ならびに他の細胞中でその主機能が発揮される要素によって規定される。当業者であれば上記要素が細菌並びに真核細胞の両者において表現型効果を有し得ることを理解するであろうが、このことは、いかなる意味でも、プラスミドまたはプラスミド骨格の範囲を細菌にのみ限定するものではない。プラスミド骨格は、プラスミドが核酸カセットおよびプラスミド骨格を保有する点において、プラスミドとは異なっている。核酸カセット（下記参照）は、治療遺伝子と関連制御要素を保有し、ヒト患者または動物の細胞という目標とした作用部位を有している。
プラスミド骨格は、骨格内部に１個以上の特異な制限酵素部位を有することができる。プラスミドは、クローニングされた配列が再産生される一定の宿主または生体中で自己複製が可能である。プラスミドは、選択可能であるかまたは容易に検出される宿主体に対してある明確な表現型を付与することができる。このプラスミドまたはプラスミド骨格は、直線または環状構造を有することができる。プラスミド成分は、（１）ＤＮＡ、（２）プラスミド骨格、（３）治療用または所望の産物をコードする配列、および（４）転写、翻訳、ＲＮＡ安定性および複製の制御要素を取り込んだＤＮＡ分子を保有することができるが、これに限定されない。
前記プラスミドの目的は、一般的に、細胞または組織に核酸配列を効率的に運搬しかつそこで治療遺伝子を発現させるためのヒト遺伝子治療に使用することである。特に、前記プラスミドの目的は、高コピー数を達成し、プラスミド不安定性の潜在的可能性を回避しかつプラスミド選択のための手段を提供することである。発現については、核酸カセットは、前記カセット内部に核酸発現のための必要な要素を保有している。発現には、プラスミドによる挿入遺伝子、核酸配列または核酸カセットの効率的転写が含まれる。発現産物は、蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡである。前記核酸配列は、核酸カセット中に含まれることができる。核酸発現は連続的であることも制御することもできる。
本文では、用語“プラスミド”はウイルスベクターを包含しないとして使用している。“ウイルスベクター”は、この意味で、例えばパッケージングシグナルのようなベクター内部にウイルスゲノムの一部を包含することによってウイルス粒子に物理的に取り込まれた物であり、単なるＤＮＡまたはウイルス核酸の一部から取られた局在遺伝子ではない。したがって、ウイルスゲノムの一部が本発明のプラスミドに存在していても、この部分がウイルス粒子中に前記プラスミドを取り込ませることがなく、従って、感染性ウイルス粒子を産生することはできない。
本文では、プラスミドは、その骨格内部に真核細胞中でＤＮＡを染色体外（エピゾーム性）で複製可能な要素を含むことができるとして使用されている。エピゾーム性複製ができるプラスミドは、染色体外物質として保持され複製できる。これらの配列は、単なる分解によっては除去されず、コピーされ続ける。これらの配列は、種々のゲノム由来であることもできる。これらは、下記にも述べるように、長期にわたりすなわち“持続性”発現を付与する。
本文では、用語“持続性発現”とは、エピゾーム（すなわち、染色体外）複製および／または細胞中における遺伝物質保持ができる遺伝要素とともに細胞中に遺伝子を導入することを意味するものとして使用している。これによって、見かけ上安定な細胞の形質転換が起こり、新規遺伝物質の宿主細胞染色体への組み込みが起こることはない。
本文では、“安定発現”とは、標的細胞染色体中への遺伝物質導入に関し、それはそこで組み込まれ、その細胞中の遺伝物質の永久成分となる。安定導入後の遺伝子発現は、細胞および複製によって生じたその子孫の特性を永久的に変化させることができ、安定形質転換につながる。
本文では、用語“核酸配列”、“遺伝子”、“核酸”、“配列”または“核酸カセット”は、細胞中に一過性に、永久的にまたはエピゾーム内に取り込まれた後、蛋白質、ペプチドまたはＲＮＡを発現できる問題の遺伝物質を称するものとして使用している。核酸は、転写されかつ必要に応じて細胞中で翻訳されるように、他の必要な要素とともにプラスミド中に位置的にも配列上からも配置される。
種々の蛋白質およびポリペプチドを、形質転換／移入組織または細胞中で核酸カセット中の配列、すなわち“治療遺伝子”によってコードできる。発現可能な蛋白質またはポリペプチドには、ホルモン、成長因子、制御因子、構造蛋白質、核蛋白質、細胞質蛋白質、ミトコンドリア蛋白質、分泌蛋白質、形質膜関連蛋白質、血清蛋白質、リポプロテイン、糖蛋白質、リン蛋白質、酵素、塞栓物質、アポリポプロテイン、レセプター、薬物、発癌遺伝子、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、ウイルス抗原、寄生体抗原、原生動物抗原および細菌抗原が挙げられる。更に、核酸カセットは、アンチセンスＲＮＡまたはリボゾームも同様にコードできる。これらは単に例示のためのみであり、いかなる意味でも限定することを意図していない。
取り込むことができる化合物は、前記核酸配列が取り込まれる蛋白質またはポリペプチドを利用できるかどうかによってのみ、限定される。当業者であれば、より多くの蛋白質およびポリペプチドが同定されれば、それらが本発明のプラスミド系に取り込まれ動物またはヒト組織において発現されることができるということを容易に理解するであろう。
本文では、用語“遺伝物質”は、ＤＮＡまたはＲＮＡの連続的断片を称するものとして使用している。標的細胞中に導入される遺伝物質は、いかなるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。たとえば、前記核酸は、（１）通常、標的細胞中に見られ、（２）通常、標的細胞中に観察されるが標的細胞中で生理的に適切なレベルで発現されず、（３）通常、標的細胞中で観察されるが、ある病理的条件下で最適レベルでは発現されず、（４）標的細胞中では、通常、観察されず、（５）標的細胞中で通常発現されるかまたは発現されない遺伝子の新規断片、（６）標的細胞内部で発現されるかまたは発現されない遺伝子の合成による変性物、（７）標的細胞中で発現のために変性させることができる他のあらゆるＤＮＡ、および（８）上記の全ての組み合わせであることができる。
本文では、用語“遺伝子発現”または“核酸発現”は、転写および翻訳プロセスによる遺伝子の遺伝物質の遺伝子産物の合成を称するものとして使用している。発現には、ｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖が含まれ、これは、遺伝子から転写されている。もし、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡのようなＲＮＡ転写物が翻訳されないならば、前記ＲＮＡ分子は遺伝子産物を示す。本発明では、上記発現は、核酸カセットの発現を示す。
本文では、“細胞（cells）”または“細胞（cell）”は、独立複製が可能な膜封入原形質体を称するものとして使用している。細胞は、インビボ、インビトロまたは組織培養物中において保持できまたは増殖させることができ、本文で説明したように、プラスミドによって形質転換されることができる。本文では、“組織”とは、同一機能を営む同一種の細胞からなる集団を称するものとして使用している。
用語“隣接領域”とは、本文では、関連遺伝子または核酸配列のいずれか一方の側におけるヌクレオチド配列を称する。隣接領域は、問題の特定遺伝子または配列に対して５’または３’であることができる。通常、隣接配列には、プラスミドの複製、選択および保持または挿入核酸カセットまたは遺伝子の発現に必要な要素を保有している。上記要素には、複製開始点のような配列、転写終止配列、オペレータ配列、抗生物質耐性遺伝子、マルチクローニング部位または制限酵素部位などを含んでいるが、これらに限定されない。これらは例示のためのみであり、限定されない。
用語“制御する”または“制御”とは、本文で、応答または作用の制御に関連する配列を言及するものとして用いている。これには、構造遺伝子の発現を制御し、コントロールし、または影響を及ぼし、またはプラスミドの複製、選択または保持に関連する配列が含まれている。例として、アテニュエータ、オペレータおよびプロモータが含まれる。これらは例示のためのみであり、限定することを意図していない。
用語“アテニュエータ（減弱剤）”とは、アミノ酸合成に関与する酵素をコードするオペロンの上流に位置するヌクレオチド配列を意味するものとして用いられている。上記オペロンの発現は、これらのオペロンに対する指令の転写を制御することによって、オンオフされる。用語“オペロン”については、下記で定義する。用語“プロモータ”とは、本文で、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始するＤＮＡ分子上の領域を示すものとして用いている。前記プロモータは、通常、オペロン中において、オペロン末端でオペレータに隣接するがその外側に位置している。プロモータのヌクレオチド配列は、それに結合する酵素の性質とＲＮＡ合成速度の両者を規定する。用語“コピー数”は、本文で、宿主中におけるプラスミド複製の結果である細胞中プラスミド数を称するものとして用いている。宿主細胞１個当たりのプラスミドコピー数は、１から１０００を越えるまでの範囲にわたる。
用語“複製開始点”は、本文では、核酸配列複製目的のＤＮＡ合成が開始する核酸配列を称するものとして使用している。これは、通常、ori部位と称される。環状の細菌は、通常、ori部位を１個しか有していないが、一方、各真核細胞染色体には多くのori部位がある。この用語にはレプリコンも含まれ、本文では、ＤＮＡ複製時に自己（複製）単位として挙動する遺伝的単位を称する。染色体は、細菌中では単一レプリコンとして機能し、一方、真核細胞染色体は、何百ものレプリコンを何群か有している。
用語“プラスミド含有細胞”または“プラスミド保有細胞”とは、本文では、プラスミドが移入したかまたはプラスミドで形質転換された細胞を称するものとして用いている。移入および形質転換については、さらに詳細に下記で規定する。
本文では、用語“種々に配向されている”とは、多様な転写を意味している。これには、転写が中心領域から反対方向に進行するような異なるＤＮＡセグメントの転写配向も含まれる。特に、これは、本発明の５’隣接領域および３’隣接領域を意味している。種々の配向は、複製開始点を横方向に移動させることによる抗生物質耐性遺伝子からの転写を回避することに役立つ。プラスミド開始点への隣接要素からの読みとり転写によって、プラスミドが不安定になることがある。
用語“抗生物質耐性”は、本文で、これまで特定抗生物質による悪影響を受けていた微生物が本薬剤に対して耐性を獲得することを意味するものとして、用いている。上記耐性は、通常、変異または微生物を形質転換する耐性遺伝子を含有するプラスミドによる耐性獲得の結果として生じる。
用語“リンカー領域”とは、本文で、プラスミドの隣接領域を接続するＤＮＡを称するものとして用いている。リンカー領域は、特定の制限エンドヌクレアーゼおよび転写終止配列の認識部位を有するマルチクローニング部位を有している。リンカー領域は、他のある酵素による切断によって調製したＤＮＡ断片の末端に連結することができる。１個のリンカー領域は、また、開始および終止コドンの位置に独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を有しており、前記５’隣接領域を連結し、更に、３’隣接領域を前記リンカーの核酸に連結する。特に、前記リンカー領域は、発現される特定核酸を保有する核酸カセットを挿入するための認識部位、すなわち“マルチクローニング部位”を提供する。これらの認識部位は、前記リンカー中、BamHI,EcoRI,HindIII,ClaI,NotI,XmaI,BglII,PacI,XhoI,NheI,SfiIのようなエンドヌクレアーゼ部位である。これらは、例示のためのみであり、限定することを意図していない。前記マルチクローニング部位は、プロモータ、治療遺伝子等のような発現要素の挿入を容易にする。たとえば、pBluescript KS+中のマルチクローニング部位は、発現要素または先に構築された核酸カセットの挿入に有用な特異な制限部位を１７−２３個、付与する。
用語“転写終止要素”とは、本文で、転写を終止させるように機能するヌクレオチド配列を称するものとして用いている。本発明では、この配列は、マルチクローニング配列に対して３’の位置でリンカー領域内部に位置しているが、プラスミド中の他の部位にも位置できる。１態様では、前記終止剤は、大腸菌rrnBオペロンに由来している。これらの配列は、核酸配列転写が前記プラスミドの他の機能領域にまで読みとられないようにしている。用語“転写”または“転写する”とは、本文では、相補的塩基対形成によってＤＮＡテンプレート上にＲＮＡ分子が形成されるプロセスを称するものとして用いている。このプロセスは、ＲＮＡポリメラーゼによって媒介されている。
前記プラスミドは、第１の面に加えて、また、複製開始点、抗生物質耐性核酸、リンカー領域および終止配列のような、プラスミドの要素に隣接する核酸制限酵素部位を含むことができる。さらに、プラスミドは、また、上記制限酵素部位に挿入可能な他の機能要素を含むことができる。上記機能性要素として、分配座またはマルチマー分割座を含む。前記プラスミドによって、上記の機能性でかつ転写制御性の要素が容易にかつ指令に基づきプラスミド骨格中にクローニングできる。さらに、前記骨格は、また、完全プラスミドの機能性要素を他の要素の影響から隔離する他の核酸配列を有する。
本文では、用語“核酸制限酵素部位”または“制限酵素部位”とは、特定制限エンドヌクレアーゼが前記分子を切断するデオキシリボ核酸配列を称するものとして用いている。
用語“機能性要素”とは、本文で、プラスミド上またはこのプラスミドを含む細胞上において検出可能な表現型を付与するいかなる核酸配列をも示すものとして用いている。機能性要素の例として、分配座、マルチマー分割座、複製開始点が挙げられる。
本文では、用語“分配座”とは、少なくとも１個のプラスミドコピーが細胞分割時の各新規細胞に確実に伝搬されるようにするか確実にするために役立つ核酸配列を称するものとして用いている。分配座の例として、プラスミドＰ１のparA parB parC複合体がある。
用語“マルチマー分割座”とは、本文で、プラスミドが単量体形態で確実に保持されるようにするかまたは確実にすることに有用な核酸配列を称するものとして用いている。
好適な態様では、上記のプラスミドは、プラスミドpMM1由来複製開始点、neo遺伝子含有抗生物質耐性核酸、pBluescript KS+由来のポリリンカー配列由来マルチクローニング部位、およびpKK223-3由来rrnBT1T2由来転写終止配列を有することができる。当業者であれば分かるであろうが、これらの要素を更に通常の手法で明確にし、それらの等価要素を求めることができる。
本発明は、第２の関連面において、上述のプラスミドを用いる方法を特徴としている。この手法は、細胞をプラスミドに十分時間接触させ細胞を形質転換する段階からなる。この第２の面のプラスミドは、また、核酸カセットを包含する。用語“接触させる”とは、本文で、下記に説明したように移入または形質転換することを意味している。
用語“形質転換”または“形質転換させる”とは、本文で、遺伝子伝達機構による細胞特性（発現表現型）の一過性、安定または永久的な変化を意味している。遺伝物質は、特定遺伝子産物を発現するかまたは内因性遺伝子産物の発現または効果を変化させる形態で細胞中に導入される。
用語“安定”とは、本文で、標的細胞染色体中への遺伝子導入を意味し、そこでそれは組み込まれ、その細胞中の遺伝物質の永久的成分となる。安定形質転換／移入後の遺伝子発現は、永久的に細胞特性を変化させ、安定形質転換をもたらすことができる。エピゾーム形質転換は安定形質転換の１変形例であり、導入遺伝子が宿主細胞染色体に導入されるではなくむしろ染色体外要素として複製される。これによって、細胞特性の安定形質転換が起こりうる。“一過性”とは、本文で、１個の遺伝子が細胞中へ導入されその核酸を発現することを意味し、例えば、前記細胞は特定蛋白質、ペプチドまたはＲＮＡ等を発現する。この導入遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれず、従って、時間が過ぎれば、細胞から除去される。一過性発現は、一過性移入時における遺伝子産物の発現に関連している。
形質転換は、下記に説明するようにインビボ技術によってまたは選択可能マーカーを含有するプラスミドとともに細胞を同時移入させるex vivo手法によって実施できる。この選択可能マーカーを用いて形質転換された細胞を選択する。これには、下記に記載するような抗生物質耐性系を含むことができる。当業者には、形質転換研究に使用される選択可能マーカーの種が周知である。形質転換は組織特異的で、主に問題の組織に核酸の発現を制御する。
細胞形質転換は、蛋白質およびＲＮＡを含む種々の遺伝子産物の産生に関連することがある。これらの産物は、細胞内または細胞外構造要素、リガンド、ホルモン、血清蛋白質、レセプター、低分子量化合物の担体、薬物、免疫修飾剤、発癌遺伝子、腫瘍サプレッサー、毒物、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、三重鎖形成阻害剤、リボザイムとして、または、細胞構造上の特定構造決定因子を認識するリガンドとして、それらの活性を修飾する目的で機能する。他の例は、上記の核酸カセット説明において見いだすことができる。形質転換細胞によって発現された産物は、核酸カセットの核酸に依存する。このリストは単に例示のためのみであり、限定することを意図していない。本発明では、発現される核酸は、前記カセット中にどの遺伝子がまたはどの配列が組み込まれたかに依存する。
形質転換は、移入、電気泳動または粒子衝撃のような種々のメカニズムによって起こる。本文では、用語“移入された”または“移入”とは、培養細胞を外来ＤＮＡに暴露することによる前記ＤＮＡのそれらへの組み込みを称するものとして用いている。これには、例えばベクターまたはプラスミドによってなど種々の運搬方法によるＤＮＡの導入も含まれるであろう。
移入方法には、微量注入、CaPO4沈殿、リポゾーム融合（例  リポフェクション）またはジーンガンの使用などが含まれるであろう。用語“移入”とは、本文で、細胞中にＤＮＡを導入するプロセスを意味している。細胞への侵入に伴い、移入ＤＮＡは、（１）宿主のそれと再度組換えし；（２）プラスミドまたは溶原性ファージとして独立して複製し；または（３）消失前に複製することなくエピゾームとして保持される。細胞は、当然ながらＤＮＡを取り込み可能である。ＤＮＡを自然には取り込むことができない特定細胞は、細胞膜を介したＤＮＡ移行を誘導するために、上記に述べたように種々の処理を必要とする。これには、また、取り込みも含まれる。
“取り込む”または“取り込み”とは、プラスミドが治療遺伝子産物の核酸を運搬し細胞中で発現できるように細胞中へのプラスミドの取り込みすなわち移行を称するものとして用いている。取り込みはＤＮＡ発現ベクターの組み込みまたはプラスミドのエピゾーム複製を伴うが、必要としているわけではないことが重要である。この意味において、取り込みには、分解または他のコンパートメントへの転座によって消失する前に細胞中においてＤＮＡ発現ベクターの短期持続が含まれる。
取り込みには細胞による核酸カセットの発現が含まれ、それは、一過性の発現、持続性発現または安定発現である。“一過性発現”とは、本文で、細胞中への遺伝物質の導入による特定蛋白質、ペプチドまたはＲＮＡ等の発現に関連している。導入された遺伝物質は、宿主細胞ゲノムに組み込まれずまたは複製されず、従って、分解または他のコンパートメントへの転座によって時間とともに前記細胞から消失する。これらの用語については、さらに詳細に上記で定義されている。
本発明は、第３の面において、特定転写リプレッサー蛋白質を結合しかつ染色体オペロンを脱抑制可能なオペレータ配列も含む上記のプラスミドに関する。前記オペレータ配列は、５’隣接領域に対して５’におよび３’隣接領域に対して５’に位置でき、上記にも述べたように多様に配向され存在している。さらに、また、前記オペレータ配列は、前記５’隣接領域に対して３’におよびリンカー領域に対して３’に位置することもできる。また、前記プラスミドは、１個を越えるコピー中に存在することができ、各コピーは同一または異なるオペレータ配列であってよい。上記の位置については、上記に述べた通りである。
本文では、用語“オペレータ配列”とは、特定レプレッサーと相互作用可能でそれによって隣接シストロンおよびレギュレータ遺伝子中の遺伝子の機能を制御する特定核酸配列を称するものとして用いられている。一般的に、レギュレータ遺伝子は、主要機能が他の遠位遺伝子の産物合成速度を制御することにある遺伝子である。レギュレータ遺伝子は、蛋白質リプレッサー合成を制御し、オペレータ遺伝子の作用を阻害し従ってそれが制御するオペロンを終止させる。前記リプレッサーは、少量存在する。それは部位を２個有しており、そのひとつは前記オペレータに結合でき、また、そのひとつは、エフェクター分子に結合できる。しかしエフェクター分子にいったん結合すると、前記リプレッサーは形状を変化させ、オペレータに結合できない。オペロンとは、オペレータ配列の制御下に協調的に機能する１個以上のシストロンから構成される核酸配列単位である。したがって、リプレッサーとはレギュレータ遺伝子によって合成される蛋白質であり、オペレータ座に結合し、このオペロンの転写を阻害する。前記リプレッサーは転写の抑制を起こし、すなわち、リプレッサー蛋白質がＤＮＡ上のオペレータ座に結合するかまたはｍＲＮＡ上の特定部に結合した際に転写または翻訳を阻害することになる。
用語“脱抑制する”とは、本文で、リプレッサーと問題のオペロンのオペレータ配列の相互作用を妨害することによって達成された遺伝子産物合成増大を意味する。誘導可能酵素系の場合、インデューサは、前記オペロンを脱抑制する。リプレッサー合成抑制制御遺伝子の変異または正常リプレッサーに対して非感受性とするオペレータ遺伝子の変異によっても、脱抑制が結果的に起こるであろう。
本発明では、抗生物質耐性遺伝子を上記にも述べたようにプラスミド骨格中かまたは本発明の別の面によって非相同プロモータ／リプレッサー系の制御下に大腸菌染色体中のいずれかに組み込む。プラスミドが存在しない場合、染色体がコードしたリプレッサーは、組み込まれた耐性遺伝子の転写を防止し、宿主は抗生物質感受性となる。耐性遺伝子の発現を誘導するため、リプレッサー蛋白質によって認識されるオペレータ配列を有するプラスミドを導入する。もし前記プラスミドが高コピー数で存在するならば、リプレッサー蛋白質はプラスミド分子上の部位に結合する。これによって、耐性遺伝子の転写を阻害するリプレッサーが少なくなり、細胞が抗生物質に耐性となる。高コピー数プラスミドに存在するオペレータ配列が染色体オペロンを脱抑制するこの現象は、“リプレッサー滴定”と称されている。
したがって、本特許に記載した当初のプラスミドは、プラスミド骨格中に抗生物質耐性遺伝子を有している。本発明の他の面では、プラスミドからの抗生物質耐性遺伝子の除去と菌ゲノム中への取り込みに関連し、プラスミド骨格中のオペレータ配列によるリプレッサー滴定によって制御されている。これによって、抗生物質遺伝子それ自体を含まない新しい選択可能プラスミド新種を産生できる。
本発明の第４の関連面は、本発明のプラスミドによる細胞の形質転換方法に関する。これらの方法は、本発明のプラスミドに十分時間細胞を接触させ細胞を形質転換する段階からなる。前記プラスミドは、遺伝子産物を細胞に運搬するために、上記にも述べたように核酸カセットを保有している。上記にも述べたように、形質転換は、インビボまたはエクスビボで行われる。
本発明の第５の関連面は、５’隣接領域、３’隣接領域およびオペレータ配列を含む核酸配列の細胞への運搬のためのプラスミドに関する。この５’隣接領域はプラスミドコピー数を制御し、複製開始点配列を有している。３’リンカー領域は５’隣接領域に対して３’にあり、核酸カセット挿入のためのマルチクローニング部位要素を有している。前記オペレータ配列は、染色体オペロンの脱抑制ができる。上記にも述べたように、オペレータ配列はプラスミド内の種々の位置に局在でき、１個を越えるコピーとして存在でき、各コピーは、同一または異なるオペレータ配列である。上記プラスミドは、また、リンカー領域に対して３’に位置する３’隣接領域を保有している。この領域には、転写終止要素と核酸制限酵素部位が含まれる。
本発明の第６の関連面では、プラスミド選択の方法に関する。本方法は、種々のプラスミドのひとつに細胞を十分時間接触させこの細胞を形質転換することによって、核酸カセットを有する複数のプラスミドから１個のプラスミドを選択する段階からなる。使用したプラスミドには、核酸カセットが含まれる。次に、プラスミドを適当に形質転換した細胞から選択する。抗生物質耐性核酸配列は、隣接核酸制限酵素部位においてプラスミドから除去される。このプラスミドをその後再環状化する。
選択プラスミドを次に用いて、第２の細胞に十分時間接触させ、この第２の細胞を形質転換する。第２の細胞は、染色体オペロン制御下（上記のように）に細胞染色体に取り込まれた少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子を保有している。オペロンは、選択されたプラスミドに存在するオペレータ配列によって脱抑制する。抗生物質耐性形質転換細胞を次に選択し、プラスミドを精製し、その後の用途に供する。
本文では、用語“選択”、“選択された”または“選択する”は、所望の特性または表現型を有する細胞のみを増殖させることができる適切な条件下で細胞を増殖させるかまたは保持することを称する。例として、大腸菌のような細菌をアンピシリンのような抗生物質存在下にアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌｇ）保有プラスミド含有大腸菌細胞が増殖でき一方このプラスミドを欠如している細胞が死滅するように増殖させることが、挙げられる。
本文では、用語“適当に形質転換された”とは、所望の特性を有するように形質転換された細胞を意味するものとして用いられている。
本文では、用語“除去”とは、プラスミドから核酸配列を切り出し、配列除去後にこのプラスミドを再配列するかまたは接続することを意味するものとして用いている。用語”再環状化された”とは、直線状プラスミドの再連結（relegation）を意味している。
本文では、用語“染色体オペロンの制御”とは、オペレータ配列および上記に定義したオペロンによって発現が制御されている遺伝子を意味するものとして使用されている。
プラスミドと関連し、用語“精製した”とは、核酸配列の精製を意味する。当業者であれば、当技術で使用される精製の意味を容易に理解するであろう。
本発明の第７の面では、上記のプラスミドに細胞を十分時間接触させ細胞を形質転換する段階を含むプラスミド選択方法に関する。前記細胞は、染色体オペロンの制御下に細胞染色体中に取り入れられた少なくとも１個の抗生物質耐性遺伝子を有する。オペロンは、上記にも述べたように、プラスミド上のオペレータ配列によりリプレッサー滴定によって脱抑制可能である。形質転換された抗生物質耐性細胞を次に選択する。このプラスミドをその後、選択された細胞から単離できる。
上記のほかにさらに、また、使用方法には、前記プラスミドの投与方法が含まれる。本文では、用語“投与”は、身体へのプラスミドすなわちＤＮＡ担体の導入経路を意味するものとして使用される。上記方法および下記に説明した方法のプラスミドは、種々の経路によって投与できる。投与は、静脈内、筋肉内、局所、経口またはジーンガンまたはハイポスプレイ機器によることができる。投与は、直接標的組織にまたは全身デリバリを介して行うことができる。
投与には、リポゾーム、プロテオリポゾーム、リン酸カルシウム共沈ＤＮＡ、高分子量複合体結合ＤＮＡ、ＤＮＡ運搬物質、微小射出物（projectiles）に被覆したＤＮＡ、被覆プラスミド、直接微量注入、並びに組織移植などによる組織への直接遺伝子移植のような種々の方法が含まれる。プラスミドの直接遺伝子伝達には、微量注入、電気泳動リポゾーム、プロテオリポゾーム、リン酸カルシウム共沈、組織移植、大分子量複合体被覆ＤＮＡ、ＤＮＡ運搬体、ジーンガンおよび微小射出物（projectiles）によって投与できる。たとえば、本文で参考として引用したＷＯ  ９３／１８７５９を参照。好適な態様は、直接注入による。投与経路には、筋肉内、エアゾール、経口、局所、全身、眼内、腹膜内、および／または鞘内が含まれる。
用語“有効量”とは、本文で、適切レベルのポリペプチド、蛋白質またはＲＮＡを生じるために十分なプラスミドをヒト、動物または組織培養物中に投与することを意味している。当業者であれば、蛋白質／ポリペプチドまたはＲＮＡが適切レベルであるかどうかは、特定ベクターの使用に依存するであろうということを理解するであろう。これらのレベルは、投与および治療の種またはワクチンの種によって異なるであろう。
本発明の他の特徴および利点は、付属の図面と関連させ下記の発明の詳細な説明と請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＣＶ０３９６の概略である。
第２図は、ＰＣＶ０３９６の構築の概略である。
第３図は、ｐＧＭ５０２構築の概略を示している。
第４図は、ｐＧＭ５０４構築の概略を示している。
第５図は、ｐＧＭ５０５構築の概略を示している。
第６図は、大腸菌ＧＭＳ００１構築の概略を示している。
第７図は、ｐＧＭ５０６、ｐＧＭ５０７およびｐＧＭ５０８構築の略図を示している。
第８図は、オペレータ選択機構の略図を示している。
第９図は、ｐＧＭ５０９構築の概略を示している。
第１０図は、ｐＧＭ５０９の使用の概略を示している。
前記図面は必ずしも実寸に従っておらず、本発明のある特性は、明確にするためおよび簡潔にするために、寸法を誇張しかつ略形状で示してある。
発明の詳細な説明
下記に、核酸を種々の組織に運搬するためのプラスミドの設計と構築のために種々のプラスミド要素を用いた本発明の実施例を示している。特に、下記に、プラスミド構築体ｐＶＣ０３９６とその誘導体の具体例を示してある。本発明のプラスミドの用途は、非ウイルス性ヒト遺伝子治療における用途によって、明確にしてある。これらの実施例は例示のために示されており、いかなる意味でも本発明を限定することを意図していない。
本発明では、プラスミドの具体的要素を用いて、核酸運搬用プラスミドへ機能性を付与し、従って、このようなプラスミドを含有する形質転換細胞または動物内部に機能性を付与している。種々のプラスミド要素は、遺伝子治療ベクターとしてのプラスミド用途に影響を及ぼす種々の効果を有している。これには、プラスミド要素の相対的位置と配向が含まれる。当業者であれば、これらの領域または要素の特定部分が所望の性質を付与する機能的側面を有するものとして、識別できることがわかるであろう。上記要素は、通常の手技またはその等価物などを用いて、容易に規定できる。非ウイルス性ヒト遺伝子治療において上記プラスミドが成果を挙げるためには、プラスミドの全要素を細心の注意を持って最適化することが必要になる。
プラスミド骨格の重要な機能のひとつは、細菌中においてプラスミドＤＮＡの産生／調製に影響を及ぼすことであり、すなわち、菌中プラスミドコピー数および菌発酵時におけるプラスミド保有菌細胞からの選択能力が影響を受ける。さらに、上記機能を制御するプラスミド要素がいかにしてプラスミド上で組織化されるかが、真核細胞中におけるプラスミドの挙動と治療のための蛋白質またはＲＮＡを前記プラスミドがどれだけ効率的に発現するかに影響を及ぼす。
したがって、本発明は、種々の核酸配列要素を用いて１群の新規プラスミド骨格を設計しかつ構築することを述べている。これらの骨格は、例えば、制御高コピー数の達成および細菌中におけるプラスミド不安定性の潜在的原因の回避、さらにヒト治療用途に適合するプラスミド選択のための手段を提供するなど、いくつかの目標を念頭に置き設計した。特に、遺伝子治療プラスミドに対しての二重の要件に注目した。第１に、それらは、大腸菌中における保持と発酵に適しており、その結果、大量のＤＮＡが産生され精製できなければならない。第２に、それらは、ヒト患者および動物において使用しても安全でかつ適していなければならない。第１の要件は、菌発酵時に比較的容易に選択されかつ安定して保持できる高コピー数プラスミドを必要としている。第２の要件は、選択可能マーカーおよび他のコード配列のようなヒトおよび動物において安全性問題の懸念を生ずる要素に注意することを要求している。
特に、下記の実施例では、ｐＶＣ０３９６の要素を記載している。このプラスミドは、（１）高コピー数複製開始点、（２）カナマイシンによる抗生物質選択のためのneo遺伝子、（３）転写終止配列、および（４）種々の核酸配列取り込みのためのマルチクローニング部位から構成される。このベクターがモジュールであるかまたは可撓性であるように設計されること、すなわち、プラスミド要素を容易に付加し、除去しかつ修飾する能力を有しており、前記ベクターの経験的（に確認されている）有用性を最大にすることが重要である。上記可撓性は、各要素に隣接する１個以上の特異な制限酵素部位を用いて、必要に応じて容易に除去し、置換しまたは修飾することができる。これらの特異な部位によって、また、もし所望であれば分配またはマルチマー分割座のような付加的プラスミド要素の取り込みが容易にできるようになる。
さらに、これらの骨格の全要素はモジュールであり、必要に応じて容易に除去できまたは置換できる。したがって、複製開始点、選択可能マーカー、およびポリリンカーのような他の要素も用いてこれらの骨格中に存在するものに容易に置換できる。さらに、分配座またはマルチマー分割部位のような付加的要素も既存の骨格に容易に付加でき、一部の構築体で生ずるかもしれない問題を解明できる。
さらに、下記の実施例では、高コピー数プラスミド上の短いオペレータ配列がプラスミド保持のために選択可能マーカーとして使用可能な系であるオペレータ選択の開発を説明する。この系は極めて可撓性であり、遺伝子治療プラスミドにおける未改変抗生物質耐性遺伝子の使用に伴ういくつかの潜在的問題を解決する。
オペレータ選択、すなわちリプレッサー滴定をこれらの骨格中で使用することは、ヒト遺伝子治療の分野で特に好都合である。この技術によって、抗生物質を用いて、プラスミドそれ自体中の塩基対約２０個の選択可能要素の存在に基づいて、治療目的用のプラスミドＤＮＡの製造時に菌中にプラスミドを保持するために選択できる。これによって、プラスミドにクローニングされた抗生物質耐性遺伝子についてのいくつかの問題を解消できるが、しかし、抗生物質が提供する利点、すなわち低コスト、プラスミド非含有細胞の効率的阻害または死滅および使用の容易さなどを保持できる。オペレータ選択は、抗生物質耐性遺伝子がヒト患者に対して、直接的にまたは抗生物質耐性病原体産生の可能性を増大させることによって移行されるときに、安全性からみて潜在的危害となるという懸念を消滅させる。また、オペレータ選択は、高コピー数プラスミドに存在する抗生物質耐性遺伝子の発現に関連した宿主菌にかかる潜在的代謝エネルギーを消失させることができる。
当業者であれば、本文で記載した手法の変形が可能であることが理解されるであろう。オペレータ選択は、抑制可能プロモータおよび抗生物質耐性遺伝子または他の選択可能要素の実質的にいかなる組み合わせに対しても、対応可能である。これまでリプレッサー滴定を受けることが明らかにされている広範囲のリプレッサーオペレータ系は、独自かつ適応可能な多くの系を構築可能であることを示唆している。本手法の魅力的面として、大腸菌宿主遺伝子のいかなるものについても全く効果を有していないリプレッサー／プロモータ／オペレータ系を使用することができることがあげられる。本文に記載したtetO系は、１例である。tetRに制御される天然由来遺伝子は大腸菌には全くない。したがって、tetプロモータPtetAを抑制することは、染色体組み込み耐性遺伝子の発現がそのように（影響を受けると）予測されるという明確な効果とは異なり、宿主の遺伝子発現に影響を及ぼさず、細胞代謝が変化を受けない。使用可能な他の系として、ファージまたはプラスミドリプレッサー／オペレータ系、または大腸菌中に対照物を有していない非大腸菌起源由来リプレッサー／オペレータ系が挙げられる。
ラムダ組み込み系では、いかなる所望の大腸菌株もオペレータ選択のために適切なものに容易に変換できる。唯一の要件は、前記株がラムダでなければならずかつattB部位を有していなければならないことである。本文に記載のプラスミドならびにそれらの種々の誘導体は、非ウイルス遺伝子治療分野で実質的用途を有している。
菌株およびプラスミド
下記は、使用した菌株およびプラスミドのリストである。
0004335309.tif 000002
0004335309.tif 000003
通常の菌増殖のため、Ｌ培地、“ＬＢ”培地を用いた。抗生物質は、業界で調達した。下記の濃度を実験全体で用いた。アンピリシン、５０μg/mL;カナマイシン、５０μg/mL;クロラムフェニコール、３０μg/mL;テトラサイクリン、１５μg/mL;アンハイドロテトラサイクリン、０．１μg/mL。クローニングした核酸断片を、大腸菌染色体のattB部位にDiederichら、Plasmid 28:14-24（1992）の操作に従って組み込んだ。
核酸操作
制限酵素、オリゴヌクレオチド、ならびに他の核酸操作に必要な酵素は、業界から購入し、製造業者の指示に従い使用した。形質転換、核酸調製、ゲル電気泳動、およびサザンブロッティングは、公表された操作に従って実施した（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版、１９８９、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York）。
ｐＶＣ０３９６の構築と特性解析
第１図にｐＶＣ０３９６の物理的および遺伝子地図を示した。関連する特性として、pMM1 oriとは、プラスミドpMMI由来温度誘導可能複製開始点；NEOとは、Tn5由来ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子；Pneoとは、neo遺伝子プロモータ；RRNB_T1およびRRNB_T2とは、大腸菌rrnBオペロン由来タンデム転写終止剤；PBS_MCSとは、pBluescript KS+由来ポリリンカー（または、マルチクローニング部位）である。また、ｐＶＣ０３９６の主要要素のそれぞれに隣接する特異な制限酵素認識部位を示した。これらの部位を用いて付加要素を挿入するかまたはｐＶＣ０３９６の既存の要素を置換または再度並べ換えできる。
第２図は、ｐＶＣ０３９６の構築を説明している。このオリゴアダプターは、下記の配列を有する２個の合成オリゴ体から構成されていた。
0004335309.tif 000004
これらのオリゴ体は相補的であり、アニーリングされると、NsiI末端１個とNheI末端１個が生成する。構築の各段階における関連反応は下記のようである。ＰＳＬ１１８０をNsiIおよびNheI制限酵素によって消化した。大きい断片をゲル精製した。示したＤＮＡを連結し、その後、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換した。ＰＶＣ０２０８をNsiIで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。ｐＮＥＯは、BfaIおよびDdeIによって消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。塩基対９６５個のこのneo断片をゲル精製した。ＰＶＣ０２０８をNheIで消化した。その後、それをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理し、EcoRIによって消化した。３２５８塩基対の大断片をゲル精製した。
ＰＶＣ０２１７は、NotIによって消化しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。その後、それをEcoRIによって消化した。neo含有塩基対１１３３個の断片をゲル精製した。ｐＶＣ０２２４を部分的にFspIによって消化した。neo含有塩基対１３０３個の断片をゲル精製した。ＰＭＭ１をSspIによって消化した。blaおよびori含有塩基対２６１１個の断片をゲル精製した。
ＰＶＣ０２５５は、BsmIで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。断片を再連結し、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。ＰＶＣ０３０４は、NdeIプラスSacIIによって消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。３８６３塩基対大断片をゲル精製した。ＰＫＫ２２３−３をNIaIIIによって消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。rrnBT1T2含有塩基対２８８個の断片をゲル精製した。ＰＶＣ０３２６は、HindIIIおよびAccIによって消化し、その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。２３９８塩基対大断片（bla欠失）をゲル精製し，
次いで連結し、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。
ＰＶＣ０３８６をSpeIによって消化し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理した。それを、SacIによって消化した。２３８５塩基対の大断片をその後ゲル精製した。pBluescript KS+を次にAcc65Iによって消化し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼプラス４×dNTPsによって処理し、次に、SacIによって消化した。１０６塩基対のポリリンカー保有断片をゲル精製した。
第２図に示した中間プラスミド全てを試験し、正確な大きさ、挿入方向および制限型を各段階で確認した。遺伝子記号については、oriは、プラスミド複製開始点であり、oriMMIとは、pMMI由来プラスミド複製開始点であり、Ｍ１３とは、バクテリオファージＭ１３由来配列であり、blaとは、βラクタマーゼ（Ampr）遺伝子であり、neoとは、Tn5由来ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子であり；rrnBT1T2とは、大腸菌rrnBオペロン由来タンデム転写終止剤であり、f1とは、バクテリオファージf1由来配列であり、MCSとは、ポリリンカー（マルチクローニング部位）配列である。
プラスミドｐＶＣ０３９６は塩基対２４９１個から構成されており、下記の要素を含有している；（１）プラスミドｐＭＭ１のプラスミド複製開始点、（２）トランスポゾンTn5由来neo遺伝子で、プラスミドpNEO由来でかつカナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性をコードする、（３）neo遺伝子に隣接する８個の塩基対の１連の制限酵素部位で、もし所望であれば容易に除去できる、（４）ｐＫＫ２２３−３由来終止要素であるrrnB T1T2（２０）、および（４）pBluescript KS+由来マルチクローニング部位である。ｐＶＣ０３９６は、プラスミドの大きさを最小にすること、要素間に起こりうる負の相互作用を回避すること、他のベクター由来発現カセットのサブクローニングを容易に起こさせること、プラスミド保持のため緊縮選択を可能にすること、およびヒト治療用途に対する潜在的安全性問題を最小にすることという総合的目標をもって設計された。さらに、ｐＶＣ０３９６はモジュールとして設計されており、所望に応じて既存の要素を容易に操作できかつ付加的要素を容易に付加できるようにしている。
ｐＶＣ０３９６の複製開始点は、ＣｏｌＥ１由来の温度感受性のコピーされた（copy-up）変異体であるプラスミドｐＭＭ１由来である。ｐＭＭ１は、３０℃に保持されたときに低コピー数であるが、３７℃またはそれ以上に保持されると高コピー数に増幅される。３７℃または４２℃において定常期まで増殖させた細胞中のｐＭＭ１のコピー数は、ｐＵＣをベースとするプラスミドpBluescript II KS-の場合よりも約２倍乃至５倍大きい。この高コピー数は、一定量の細菌培養物からプラスミドＤＮＡを大量に単離できることから、望ましい。ｐＭＭ１の高コピー数がｐＶＣ０３９６中において保持されていることを確認するため、ｐＶＣ０３９６およびｐＶＣ０２８９およびbla（Ampr）遺伝子が置換されているpBluescript KS+の誘導体をneo遺伝子と比較した。ｐＶＣ０３９６またはｐＶＣ０２８９を保有する大腸菌ＤＨ５αをＬＢ中において定常期まで増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離し、HindIIIによって直鎖にし、アガロースゲル電気泳動によって分析した。等量の細胞から回収したプラスミドＤＮＡの相対量と比較し、ｐＶＣ０３９６がｐＶＣ０２８９よりも約２倍以上のＤＮＡを生成することが示唆された。
高コピー数のプラスミドは細胞培養物からの潜在的なＤＮＡ収率を増大させるが、それらは、宿主細胞に顕著な代謝ストレスをもたらし、プラスミド非含有細胞に比較し増殖速度を低下させる。ｐＭＭ１およびｐＶＣ０３９６のコピー数は温度感受性であるので、当初は３０℃で細胞が増殖でき、コピー数が高いことによる有害な効果を最小とすることができ、その後、３７℃または４２℃まで移行させ高コピー数に誘導し、最大プラスミド収率を得ることができる。ｐＶＣ０３９６保有大腸菌ＤＨ５αは、ＬＢ中において３０℃でＯＤ約０．１まで増殖した。培養物の一部をその後３７℃に移行させ、一方、残りを３０℃に保持した。増殖が完了した後、等量の培養物を採取し、プラスミドＤＮＡを回収した。相対量のＤＮＡを比較したところ、温度移行の結果、コピー数が有意に増大したことが明らかになった。
プラスミドｐＶＣ０３９６は、Tn5のneo遺伝子を保有しており、カナマイシンを用いて大腸菌中のプラスミドを選択できるようになる。これが、２−３の理由に基づきアンピシリン耐性遺伝子治療ベクターに勝る利点である。アンピシリン耐性細胞はβラクタマーゼを分泌し、前記培地中でこの抗生物質を不活性化する。この結果、周知のフィーディング効果が生じ、細胞含有プラスミドが前記抗生物質を分解したのでプラスミド非含有細胞が生存できることになる。カナマイシン耐性細胞は、細胞内でこの抗生物質を不活性化し、従って、フィーディング効果は全く見られない。その結果、発酵時におけるプラスミド非含有細胞の集積がより効果的に防止される。
より大きな関心事として、前記抗生物質の臨床的重要性があげられる。患者によっては、少量のβラクタム剤にも極めてアレルギーであることが知られている。したがって、遺伝子治療プラスミド調製時におけるアンピリシンの使用は、最終製品がアンピリシンに汚染されアレルギー患者における使用には不適であるというリスクが生じることになる。さらに、βラクタム剤は、治療目的のため臨床において広く使用されている。βラクタマーゼ遺伝子保有遺伝子治療プラスミドの広範な使用は、抗生物質耐性菌による既存の問題をかなり深刻化させることになるかもしれないであろう。カナマイシンはβラクタム剤に時に見られる種のアレルギー応答を惹起させないので、neo遺伝子使用によってこれらの問題が解消され、さらに、カナマイシンおよび関連抗生物質の臨床的使用がより限定されることで潜在的に耐性な菌についての問題がより少なくなるであろう。最後の利点としては、neo遺伝子がこれまで数例のヒト遺伝子治療に使用されてきたが、明確な負の効果が見られないということである（Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report、１９９４年１２月、Human Gene Therapy、６：５３５−５４８）。
pMMI開始点およびｐＶＣ０３９６のneo遺伝子はさまざまに配向され、前記開始点中にneoの転写が移行することを防止する。これまでのＣｏｌＥ１誘導体および関連プラスミドによる研究で、前記プラスミド開始点への隣接要素からの読みとり転写がしばしばプラスミド不安定性および／またはコピー数低下につながることが示されている（Engels and Meyer,Biotechniques 14:324-325（1993））。ｐＶＣ０３９６中におけるoriおよびneoの相対的位置でこの問題が回避される。oriとneoの間にpBluescript KS+由来ポリリンカー配列が位置している。この配列は、プロモータ、治療遺伝子等の発現要素の挿入を容易にするために付与されている。pBluescript KS+中におけるこの配列に特異な部位の全てが、同様、PstIおよびEagIを例外としてｐＶＣ０３９６においても特異的である。これによって、発現要素またはこれまで構築された核酸カセット挿入に使用可能な特異部位が総計１７−２３個、マルチクローニング部位に付与される。
前記マルチクローニング配列とneo遺伝子を分離しているのは、ｐＫＫ２２３−３由来断片であり（Brosius andHoly,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6929-6933（1984））、この断片は、大腸菌rrnBオペロン由来の強力な転写終止剤を保有している。これらの終止剤は、neo遺伝子由来の転写が真核細胞遺伝子まで読みとられマルチクローニング部位に確実にクローニングされないようにすることを目的としている。大腸菌においてクローニングされた真核細胞遺伝子が偶然に発現すると、時として、細胞増殖に極めて阻害性となりうる（Brosius,Gene 27:161-172（1984）;Chenら、Gene 130:15-22（1993））。ｐＶＣ０３９６のこの特性がこの問題の回避に役立つ。
ｐＶＣ０３９６の要素全てを、独自の制限酵素部位によって互いから分離する（第１図参照）。この特性は、２つの目的に役立つ。第１に、これらの部位を用いて所望に応じて付加的機能要素を挿入できる。上記要素には、分配座が含まれ、選択不在の際にプラスミドの隔離安定性を増大させる（Hiraga,Ann Rev.Biochem.61:283-306（1992）;Williams and Thomas,J.Gen.Microbiol.138:1-16（1992））か、または、単量体状態にプラスミドを保持するのに役立つマルチマー分割座を含むことができる（Eberlら、Mol.Microbiol.12:131-141（1994）;Cornetら、J.Bacteriol.176:3188-3195（1994）;Summersら、Mol.Gen.Genet.201:334-338（1985））。第２に、これらの部位は、各要素が容易に除去、置換されまたは変化可能なモジュールプラスミドを産生するように、設計されている。特定の応用に必要となることがあるプラスミド変性の可能性が高いので、このことは、重要な特徴である。前記モジュール設計によって得られる可撓性は、上記変性を大いに促進するであろう。
オペレータ選択
neo遺伝子選択のひとつの理由がヒトにおける使用の可能性に根ざしていた一方で、別の選択系も、最終的にヒト使用のために市場にでるであろうプラスミドに対して望ましい。これによって、neo遺伝子が潜在的病原体に移行し、アミノグリコシド抗生物質に対してそれらを耐性にするという問題が解決されるであろう。neo遺伝子のプラスミドからの消失は、それによってプラスミドの大きさが実質的に低下されるであろうことから、同様に、望ましい。小さいプラスミドは、そもそも操作および精製が容易で、遺伝子治療プラスミド構築時に挿入されるかもしれない発現要素との予測もしなかった相互作用の機会をより少なくするであろう。さらに、抗生物質耐性コード領域を除去することは、細胞中に高コピー数で存在するプラスミドをコードした遺伝子の高レベルの転写と翻訳を排除することによって、細胞への代謝ストレスを低減するであろう。
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、他の選択系も使用されてきた。上記にも述べたように、ssb遺伝子またはサプレッサーｔＲＮＡを用いる系は、ある欠点を有している。第１の手法は、ssbのような機能的遺伝子がプラスミド中に存在しなければならず宿主から取り除かなければならないという要件の故に、不都合を生じる。このことは、特に設計された宿主株を構築するかまたは入手することを要し、所望の遺伝的背景を有するものを入手することは困難であろう。さらに、ssbまたは別の遺伝子がプラスミド上に存在することで高コピー数の遺伝子からｍＲＮＡおよび蛋白質の合成が起こることになり、実質的に代謝エネルギーを消費し増殖速度を低減させる。また、抗生物質耐性遺伝子をssbと置換することは、所望の大きさにプラスミドを小さくすることにはならない。最後に、ssb遺伝子は、neo遺伝子よりもヒト使用に対して有意に安全であるというわけではなく、ssb産物が核酸代謝において極めて活性であることが原因である。ヒト患者細胞におけるssbの偶然の発現は、予測せざる望ましくない効果をもたらすことがあるかもしれない。
第２の手法は、ｔＲＮＡ選択可能マーカーが２００ｂｐ未満と極めて小さく、蛋白質をコードしないという点において、利点を有している。しかし、この系の使用にも問題がある。前と同様、特に変性させた宿主株が必要である。宿主中にさらにサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が存在することが問題であろう。数種の抗生物質耐性遺伝子を同時に選択し十分に緊縮な選択を行うことが、通常、必要である。さらに、異なる抗生物質を使用して異なるプラスミドをそれぞれ選択できる系を作成することは、困難である。最後に、プラスミド上の選択可能ｔＲＮＡ遺伝子は蛋白質をコードしないが、にもかかわらず、それは、機能的ｔＲＮＡ産物をコードし、そのために、高コピー数プラスミドにクローニングされた時に代謝エネルギー消費と並びにヒト患者における偶然の発現という起こりうる結果に関して、問題が生じる。
抗生物質が分子生物学において一般的であることは、細菌中においてプラスミドを選択し保持するために使用する際に容易にできることの証しとなっている。抗生物質は、一般に安価かつ有効であり、ヒトに対して実質的に無毒である。こうしたことは、何十万リットルというスケールで非ウイルス性遺伝子治療産物を産生するために発酵を行い第Ｉ相臨床試験に進む際に考慮すべき重要な事項である。したがって、抗生物質を用いてプラスミド保持のために選択することが有用であろう。しかし、また、遺伝子治療プラスミドそれ自体に抗生物質耐性遺伝子を取り込まないようにすることが望ましく、その理由としては、環境中に抗生物質耐性を蔓延させないようにすることおよび抗生物質耐性遺伝子は通常プラスミドの大きさを約１ｋｂ以上大きくすることがあげられる。
本発明は、非相同プロモータ／リプレッサー系の制御下に大腸菌染色体中に抗生物質耐性遺伝子を取り入れる系を述べている。プラスミド不在下においては、染色体でコードされたリプレッサーは、組み込まれた耐性遺伝子の転写を妨害し、宿主は抗生物質に感受性となる。この耐性遺伝子の発現を誘導するため、結合部位またはリプレッサー蛋白質によって認識されるオペレータを保有するプラスミドを導入する。もしプラスミドが高コピー数で存在するならばそしてリプレッサー遺伝子が単一コピー染色体遺伝子によってコードされるならば、実質的に全てのリプレッサー蛋白質がプラスミド分子上の部位に結合するであろう。このために、耐性遺伝子転写を阻害するリプレッサーはほとんどまたは全く残らず、細胞が抗生物質に耐性となる。
この現象では高コピー数プラスミドに存在するオペレータ配列が染色体オペロンを脱抑制し、リプレッサー滴定とよばれている。数名の研究者は、細菌オペロンの抑制と脱抑制について研究するためにそれを使用してきた。これまで、２０を越えるリプレッサーオペレータ系が、大腸菌、ブドウ球菌（Staphylococcus），桿菌（Bacillus），クレブシエラ（Klebsiella），連鎖球菌（Streptomyces），サッカロマイセス（Saccharomyces）およびサルモネラ（Salmonella）中においてならびにR1のようなプラスミドおよびTn10のようなトランスポゾンにおいて、リプレッサー滴定を受けることが示されている（Simonsら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81:1624-1328（1981）;Straigierら、J.Bacteriol.156:1198-1203（1983）:Oskcuian and Stewart,J.Bacteriol.69:5459-5465（1987）;Danner,Gene 44:198-199（1986）;Bautista and Graham,Gene 87:201-208（1989）;Mata-Gilsingerら、Genetics 105:829-842（1983）;Fritzら、EMBO J.2:2129-2135（1983）;Brikunら、Genetika 25:1717-1724（1989）;Hammerら、Mol.Gen.Genet.237:129-133（1993）;Barkerら、Gene 13:89-102（1981）;Wray and Reznikoff、J.Bacteriol.156:1188-1191（1983）;Benner-Luger and Boos,Mol.Gen.Genet.214:579-587（1988）;Fujita and Fujita,Nucleic Acids Res.14:1237-1252（1986）;Latour and Weiner,Nucleic Acids Res.16:6339-6352（1988）;Kilstrupら、Eur.J.Biochem.176:421-429（1988）;Giza and Huang,Gene 78:73-84（1989）;Salmaronら、Mol.Cell.Biol.9:2950-2956（1989）;Aslandis and Schmitt,J.Bacteriol.172:2178-2180（1990）;Naik and Hassan,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:2618-2622（1990）;Huongら、J.Bacteriol.172:4392-4398（1990）;Brikinら、Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol.6:7-11（1990）;Sogaard-Andersenら、J.Mol.Microbiol.4:1595-1601（1990）;Jensenら、J.Mol.Biol.236:1299-1309（1994）;Linderら、Microbiolgy 140:753-757（1994）;Virolle and Gagnat,Microbiology 140:1059-1067（1994）;Osunaら、J.Bacteriol.176:5525-5529（1994）;およびWindass and Brammer、Mol.Gen.Genet.172:329-337（1979））。
ある状況では、この現象を用いて、マルチコピープラスミドにクローニングされたlacオペレータ配列の挿入不活性化に基づき、組換えプラスミドをスクリーニングする（Danner,Gene 44:193-199（1986）;Bautista and Graham、Gene 87:201-208（1989））。ここに述べた系は、プラスミドの導入または持続的存在のために選択する際に使用されるリプレッサー滴定を適応させる。
この系の利点は、プラスミドそれ自体上の小オペレータ配列の存在に基づいてのみそれが抗生物質をプラスミド選択に使用されるようにすることである。抗生物質耐性遺伝子は、宿主染色体に局在し、必然的に、この遺伝子が患者に移行したりまたは治療に使用中に病原体に移行されるリスクを全く呈しない。プラスミド上に選択可能な配列の大きさは小さく、約２０塩基対程である。さらに、２個以上の独立したオペレータ選択系を同時に同一細胞中に作用させ、２個の両立するプラスミドを同時選択するか、または、単一プラスミドについて二重に選択する。これらの特性については、下記に例示する。
プラスミドおよび宿主株のオペレータ選択のための構築
第３図、第４図および第５図は、プラスミドｐＧＭ５０２，ｐＧＭ５０４，およびｐＧＭ５０５の構築をそれぞれ示している。ｐＧＭ５０２構築のため、制限酵素部位の略語を下記に示した。C.ClaI;H.HindIII;P.PstI;A.AccI;X.XbaI;B BamHI;Sm.SmaI;Sc.ScaI;E.EcoRI;N.NotI;T.TaqI。遺伝子記号は下記のようである。tetRはテトラサイクリンリプレッサー遺伝子であり、PtetRは、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子プロモータであり、tetOは、テトラサイクリン耐性遺伝子プロモータであり、PtetAは、テトラサイクリン耐性遺伝子プロモータであり、tetAは、テトラサイクリン耐性遺伝子であり、attPは、ファージラムダ結合配列であり、catは、クロラムフェニコール耐性遺伝子である。他の遺伝子記号は、上記の第２図の記載でわかる。
ｐＧＭ５０４の構築について、制限酵素部位および遺伝子記号は、上記の第２図および第５図に示した。その他の記号としては、Bcは、BcII部位であり、lacIは、大腸菌由来ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子であり、lacPは、ラクトースオペロンプロモータであり、PlacIは、lacI遺伝子プロモータであり、lacOは、ラクトースオペロンオペレータ（LacIリプレッサー蛋白質の結合部位）である。
ｐＧＭ５０５の構築のため、遺伝子記号および制限酵素部位略語は、第２図、第３図および第４図で上記に述べたとおりである。
３種のプラスミド全ては、Diederichら、Plasmid28:14-24（1992）が大腸菌染色体中へのクローニングされたＤＮＡの組み込みを促進する系の一部として設計したプラスミドであるプラスミドｐＬＤＲ１１に基づいている。プラスミドｐＧＭ５０２（第３図）は、tetRリプレッサー遺伝子の負の制御を受けているTn10tetAプロモータ（PtetA）プラスミドの制御下にcat遺伝子を保有している。tetRおよびPtetAの制御系は他者も使用しており、原核細胞および真核細胞系において種々の遺伝子の発現の厳密な制御を達成した。テトラサイクリン不在の場合、TetRリプレッサー蛋白質は、オペレータ配列であるtetOに結合し、PtetAからの転写を阻害する。PtetAは、テトラサイクリンアナログでありTetRに結合して不活性化するアンハイドロテトラサイクリンを付加することによって、脱抑制できる。これによって、PtetA下流のcat遺伝子を発現させることになる。
プラスミドｐＧＭ５０４（第４図）は、大腸菌lacI-lacOP系の制御下にTn5 neo遺伝子を保有している。この系では、LacIリプレッサーは、オペレータlacOに結合することによって、lacプロモータであるlacPからの転写を阻害する。ＩＴＰＧ付加は、lacIのlacOへの結合を防止する。これは、lacPを脱抑制し、下流のneo遺伝子の転写を可能とする。プラスミドｐＧＭ５０５（第５図）は、単一プラスミドにクローニングされたこれらの系を両者とも保有している。
ｐＧＭ５０２，ｐＧＭ５０４およびｐＧＭ５０５由来の適切なＤＮＡセグメントを大腸菌染色体に移入させるため、Diedrichら、Plasmid 28:14-24（1992）の操作に従った。この操作については、第６図に要約した。大腸菌ＧＭＳ００１構築のため、プラスミドｐＧＭ５０２をNotIによって消化し、単一分子量反応が優勢である条件下で連結し、示した２種の産物を得た。ｐＬＤＲ８保有大腸菌ＤＨ５αは、形質転換細胞がせいぜい１個の連結ＤＮＡを受け取る条件下で、形質転換した。ｐＧＭ５０２のtetA/ori断片で形質転換された細胞を、テトラサイクリン耐性に基づきスクリーニングし、捨てた。形質転換体を３７℃でインキュベーションし、int発現を誘導し、ｐＧＭ５０２のattp保有断片を大腸菌染色体attB部位に組み込むことができた。同時に、上昇したインキュベーション温度はｐＬＤＲ８複製を不活性化し、細胞から消失させた。ｐＧＭ５０２の大NotI断片を有する生成した株を、染色体のattB部位に組み込み、大腸菌ＧＭＳ００１と命名した。遺伝子記号は、第２図、第３図および第４図で記載したように定義した。
上記にも述べたように、ｐＧＭ５０２はNotIで消化し、連結事象の大半が単一分子である条件下で再環状化した。この結果、第６図に示した２個の産物が生成した。所望の産物は、bla遺伝子、attP、およびリプレッサー／プロモータ／耐性遺伝子カセットを保有している。残りの連結産物は、プラスミド複製開始点とテトラサイクリン耐性遺伝子（tetA）から構成されている。
前記連結混合物を、NotI消化ｐＧＭ５０２の連結産物の両者による同時形質転換が起こり得ないような条件下で、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。この形質転換細胞を、次に、３７℃でインキュベーションした。これには、２つの効果がある。まず第１に、それは、ｐＬＤＲ８のcI857遺伝子産物を不活性化し、int遺伝子の発現を誘導する。Int発現は、示したように、attP保有ＤＮＡと染色体attB部位の組込みによる組換えを触媒する。同時に、３７℃における増殖は、温度感受性ｐＬＤＲ８の複製を防止し、細胞から迅速に消滅する。この結果、染色体のattB部位に組み込まれたｐＧＭ５０２の大NotI断片を保有する大腸菌ＧＭＳ００１と命名された大腸菌ＤＨ５αの誘導体となる。適切なクローンは、bla遺伝子の同時組み込みにより、アンピリシンを用いて選択できる。Amprコロニーを次にテトラサイクリン感受性についてスクリーニングし、tetA保有ｐＧＭ５０２断片が確実になくなるようにする。これらをさらにプラスミド解析によっておよびサザンブロッティングによって特性解析し、（ａ）組み込まれたＤＮＡの予測通りの構造；（ｂ）ｐＬＤＲ８とその他いかなる非組み込みプラスミドＤＮＡも存在しないことおよび（ｃ）ｐＬＤＲ１１の開始点およびテトラサイクリン耐性遺伝子断片の不在を確認した。同一手段およびプロトコールを用いて、ｐＧＭ５０４から大腸菌ＧＭＳ００２を生成させ、およびｐＧＭ５０５からＧＭＳ００３を生成させた。
組み込まれたＤＮＡ断片が機能的であることを確認するため、耐性遺伝子が抑制されるかまたは脱抑制される条件下で、各株の抗生物質耐性レベルを比較した。第１の実験では、大腸菌ＧＭＳ００１，ＧＭＳ００２およびＧＭＳ００３をＬＢ中において３７℃で対数期中期まで増殖させた。各培養物のアリコットを希釈し、下記の第２表に示した添加剤含有ＬＢプレートに植菌した。
0004335309.tif 000005
一晩インキュベーションした後、単一コロニーの増殖を数えた。第２表に示したように、３株全てが、各細胞に組み込まれた構造的bla遺伝子の存在の故にアンピシリン耐性であった（第８図参照）。ＧＭＳ００１は、クロラムフェニコールのみには感受性であったが、アンハイドロテトラサイクリン存在下においてクロラムフェニコールに耐性であり、cat下流のPtetAプロモータを脱抑制した。同様に、大腸菌ＧＭＳ００２は、ＩＰＴＧ不在下においてカナマイシン感受性であるが、ＩＰＴＧ存在下においてカナマイシン耐性であった。ＩＰＴＧの付加は、lacPプロモータを脱抑制し、neo遺伝子の発現を抑制する。ＧＭＳ０００３は、予測にたがわず、アンハイドロテトラサイクリン存在下においてクロラムフェニコール耐性で、ＩＰＴＧ存在下においてカナマイシン耐性であった。さらに、ＧＭＳ００３は、クロラムフェニコールおよびカナマイシン両者の存在下において増殖可能であるが、ただし、テトラサイクリンとＩＰＴＧの両者が添加され両系を脱抑制した時に限られていた。これらの結果は、前記２個の選択系が同様に作用すること、相互作用似のものまたは交差反応性が全くなかったことを示している。同様の研究を液体培地中で行い、固体または液体培地で各株について適切な選択が可能であることを示す同様の結果が得られた。
選択可能オペレータ配列を保有するプラスミドの構築と試験
上記大腸菌株に組み込まれた抗生物質耐性遺伝子が適切なオペレータ配列を保有するプラスミドによって誘導できるかどうかを試験するため、第７図に示したプラスミドを構築した。ｐＧＭ５０６，ｐＧＭ５０７およびｐＧＭ５０８の構築のため、プラスミドｐＧＭ５１０は、bla（Ampr）およびlacO要素を欠失しかつテトラサイクリン耐性の遺伝子を保有しているｐＵＣ１８の誘導体である。HindIII隣接tetOオペレータを保有する合成断片を、下記の配列の相補性オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、調製した。
0004335309.tif 000006
このアニーリングされたオリゴヌクレオチドをHindIII消化ｐＧＭ５１０に連結し、ｐＧＭ５０６を得た。同様に、EcoRI部位隣接lacOオペレータ保有合成断片を、配列：
0004335309.tif 000007
の自己相補性オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、調製した。アニーリングされたlacOオリゴを、EcoRI消化ｐＧＭ５１０に連結し、ｐＧＭ５０７を得た。プラスミドｐＧＭ５０８は、示したように、ｐＧＭ５０７のHindIII部位にtetOオペレータオリゴを挿入することによって、調製した。遺伝子記号および制限酵素部位略語は、第２図、第３図および第４図に記載したように定義した。
全３種のプラスミドは、高コピー数を特定するｐＵＧ複製開始点を保有し、さらにテトラサイクリン耐性遺伝子を保有していた。ＰＧＭ５０６は、合成１９塩基対tetオペレータコンセンサス配列を有している。ＰＧＭ５０７は、２１塩基対の合成lacプロモータコンセンサス配列を有し、一方、ｐＧＭ５０８は、両者のオペレータを有している。これらのプラスミドのそれぞれは、ＧＭＳ００１、ＧＭＳ００２、またはＧＭＳ００３のいずれかに形質転換され、抗生物質選択剤存在下に増殖を試験した。結果を第３表に示した。
0004335309.tif 000008
各株とプラスミドの組み合わせについて観察された耐性は予測どおりであった。tetオペレータ保有プラスミドｐＧＭ５０６はＧＭＳ００１においてcatの発現を脱抑制し、クロラムフェニコール耐性を生じる。これについては、第８図に概略を示した。一般的に、下記はオペレータ選択の作用メカニズムを示した。“Ａ”は、tetRによるcat発現制御のための制御回路を示している。“Ａ”で示した制御回路は、大腸菌染色体中に組み込まれる。プラスミド不在下において、tetR遺伝子の産物であるtetRリプレッサー蛋白質はtetOに結合し、PtetAからの転写を抑制し、cat発現を抑制し、前記細胞をクロラムフェニコール耐性にする。遺伝子記号は、上記で第２図、第３図および第４図に示した通りである。
同様に、lacオペレータを保有するｐＧＭ５０７は、ＧＭＳ００２においてneoの発現を脱抑制し、カナマイシン耐性となる。これらのプラスミドのそれぞれは、ＧＭＳ００３において適切な抗生物質耐性遺伝子を脱抑制することが可能である。さらに、tetおよびlacオペレータ両者ともに有するｐＧＭ５０８は、ＧＭＳ００１およびＧＭＳ００３においてcatを脱抑制し、かつ、ＧＭＳ００２およびＧＭＳ００３においてneoを脱抑制する。これらの結果は、約２０塩基対の長いオペレータ配列が選択可能要素として使用でき、大腸菌中におけるプラスミドの保持を確実にすることを示している。
このオペレータ選択体系は、いくつかの利点を有している。第１に、抗生物質耐性遺伝子を宿主染色体に移動させることによって、遺伝子をヒト患者に移行させる懸念が全くない。第２に、抗生物質耐性遺伝子が約８００個の塩基対であるのに比較して、プラスミド選択可能マーカーが約２０塩基対だけのオペレータ配列であることがある。さらに、前記プラスミド上のオペレータ配列は全くコード能力を有していない。
原核細胞コード配列が全く存在していないので、原核細胞蛋白質がヒトあるいは他の真核細胞系で不用意に発現される可能性は、コード能力がないので、全くない。さらに、前記コード配列が消失していることは大腸菌でも有益である。機能性遺伝子を保有する高コピー数プラスミドは、しばしば、遺伝子量効果により、それらの遺伝子から高レベルの蛋白質を産生する。これは、かなりの量の代謝エネルギーを消耗させ、増殖速度を低下させうる。（Brosius,Gene 27:161-172（1984）;Chenら、Gene 130:15-22（1993）;Bentleyら、Biotechnol.Bioeng.35:668-681（1990）;Parkら、Biotechnol.Bioeng.37:297-302（1991）;Peretti and Bailey、Biotechnol.Bioen.24:316-328（1987））。
オペレータ選択は、菌中で発現されたコード配列を全く有していない選択可能プラスミドの構築を可能とする。これによって、宿主細胞における代謝消費を低減させ、高増殖速度を可能とし、かつプラスミド非含有細胞が培養物を過大に増殖させる傾向を低下させる。これらの利点は、安全性と用途という両者の観点から、ヒト遺伝子治療構築体における使用にオペレータ選択を極めて適切なものとしている。ＧＭＳ００３におけるｐＧＭ５０６とｐＧＭ５０７について示したように、２つの独立した選択系に交差耐性がないことで、異なるオペレータ配列を有する２つの異なる両立するプラスミドの同時選択が可能となる。二重選択は、ＧＭＳ００３中のｐＧＭ５０８についてのように、２個のオペレータを有するプラスミドについて行うことができ、選択の緊縮度を増大できる。最後に、この系は、（ラムダcI/Pr/ORのような）他のリプレッサー／プロモータ／オペレータ系および（テトラサイクリン、エリスロマイシン等のような）その他の抗生物質に耐性の遺伝子にも容易に適応させることができる。新規オペレータ選択系をDiederichら、Plasmid 28:14-24（1992）のラムダ組み込み系を用いて大腸菌選択体に容易に組み込むことができる。したがって、種々の大腸菌株バックグランドを迅速かつ容易に、オペレータ選択に使用するために適応させることができる。
オペレータ選択のｐＶＣ０３９６誘導体における使用
本発明のオペレータ選択は、上記用途に加え、また、多数のプラスミド構築体を試験することができる。上記試験法は、遺伝子治療プラスミドを臨床試験用の製造過程に移行させるために最適化する上で重要である。治療遺伝子と制御要素の多数の組合せをしばしば構築し評価しなければならない。治療遺伝子と制御要素のプラスミド中への導入は、多数のクローニング段階を必要としている。各段階において、適切なプラスミドを識別し、培養で増殖させ、精製しなければならない。また、異なる大腸菌宿主を構築時に使用することも必要となるであろう。これらの操作は、もしオペレータ選択が、適切な形質転換体の選択とプラスミド保持のための選択の唯一利用可能な手段であるならば、妨害されることもあるであろう。
理想的には、前プラスミド構築体は、neo遺伝子を有するｐＶＣ０３９６のような完全な抗生物質耐性遺伝子を有する骨格を使用するであろう。これによって、所望のいかなる大腸菌宿主においても、オペレータ選択またはその他の非抗生物質選択系の制限を受けることなく、カナマイシンを用いて選択が可能となるであろう。しかし、いったんプラスミドが可能な臨床候補として選択されてしまえば、前記プラスミドから抗生物質耐性遺伝子を除去し代わりにオペレータ選択を使用することが望ましいであろう。
第９図は、tetおよびlac合成オペレータの両者を含むｐＶＣ０３９６の誘導体であるｐＧＭ５０９の構築を示している。ｐＧＭ５０９の構築のため、tetOおよびlacOオペレータ配列は、２段階でｐＶＣ０３９６のAf1IIおよびNheI部位にクローニングされた。オリゴヌクレオチド配列は、下記のようであった：
0004335309.tif 000009
（自己相補性）遺伝子記号は、第２図、第３図および第４図に記載のように定義した。
このプラスミドは、未改変、機能的neo遺伝子の存在により、カナマイシンを用いていかなる宿主中でも選択できる。前記合成オペレータは、また、大腸菌ＧＭＳ００１、ＧＭＳ００２またはＧＭＳ００３中におけるオペレータ選択の可能性を付与する。しかし、オペレータ選択の利点から恩恵を受けるため、ｐＧＭ５０９中のneo遺伝子を除去しなければならない。
ｐＧＭ５０９中（およびｐＶＣ０３９６中）のneo遺伝子は、塩基対８個のAscIおよびPacI制限酵素部位対に隣接している。第１０図は、ｐＧＭ５０９を用いて上記の目標、すなわち、予備的研究におけるプラスミド保有neo遺伝子に基づく選択とその後のneo除去と臨床用途可能性のためのtetまたはlacオペレータに基づく選択を達成する方法の詳細を示している。治療遺伝子と制御要素は、いくつかの段階を経てｐＧＭ５０９のポリリンカー中に挿入される。プラスミドは、neo遺伝子に基づいていかなる大腸菌宿主中でも選択される。それぞれのプラスミドを治療遺伝子の発現についてスクリーニングし、さらに研究するための適切な候補を選択する。
特に、種々のクローニング段階を用いて潜在的治療遺伝子、およびポリ−Ａシグナル配列および種々のプロモータ／エンハンサー断片（pro/enhA-C）をｐＧＭ５０９のポリリンカー中に導入する（図中でＭＣＳと表示）。これらの段階全体で、プラスミドはいかなる大腸菌宿主中でも形質転換できかつ保持されることができ、プラスミドがコードしたneo遺伝子に基づいてカナマイシン耐性を選択する。種々の試験を行い、どの候補プラスミドがそれ以上の前臨床および臨床開発に非常に適しているかを明らかにする。
いったん候補が選択されれば（中央左）、プラスミドをAscIまたはPacIによって消化する。AscIおよびPacIは８塩基対配列を認識するので、それらのうちの少なくとも１個は前記発現要素内で切断されないであろう。例えば、前記治療遺伝子がAscI部位を含有していると想定して、前記プラスミドをPacIによって消化する。大断片を再環状化し、neo遺伝子を欠如している誘導体を作成し、ＧＭＳ００１，ＧＭＳ００２およびＧＭＳ００３（または適当な染色体変性を受けオペレータ選択を支持する別の宿主）中に形質転換することおよび適当な抗生物質中で増殖させることによって、選択できる。これによって、抗生物質耐性遺伝子を全く含まず原核細胞をコードする配列を全く含まないプラスミドを潜在的ヒト用途のために産生できる。
同様の手法が、前記発現要素のひとつがPacI部位を含む場合に使用できる。消化がAscIによる場合を除いて、同一プロセスを適用する。neo遺伝子の各末端におけるAscIおよびPacI部位の相対的配置により、いずれかの酵素による消化とその後の再環状化でlacO上流にAscIおよびPacI部位を１個ずつ含む同じ骨格配列が生ずることになることに注意されたい。したがって、AscIまたはPacIの選択は、選択した酵素が発現カセット領域内部で切断しない限り、プラスミドの最終構造に無関係である。
当業者であれば、本発明を改良して、前記目的を実行しかつ記載の目標と利点を得ることができ、ならびに、本文に記載のそれも得ることができることを容易に理解するであろう。本文に記載のプラスミドは、このプラスミドを用いた方法、操作および処理とともに、現在好適な態様を代表するものであり、例示のためであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。その変更とその他の用途が当業者に明らかであろうが、それらは、本発明の主旨に包含されるかまたは請求の範囲によって規定される。
当業者であれば、本発明の範囲と主旨から逸脱しない限りにおいて、本文に開示された発明に対して種々の置換並びに変更を行うことができることを容易に理解するであろう。
明細書に記載の特許および刊行物は全て、本発明が関連する当業者の水準を示唆している。本文では、特許および刊行物は全て、各刊行物を具体的かつ個別に本文で参考として引用したと記載したと同程度に、参考として引用している。
配列表
（２）配列番号１の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：３１塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号１
0004335309.tif 000010
（３）配列番号２の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：３９塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号２
0004335309.tif 000011
（４）配列番号３の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２３塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号３
0004335309.tif 000012
（５）配列番号４の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２３塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号４
0004335309.tif 000013
（６）配列番号５の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２６塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号５
0004335309.tif 000014
（７）配列番号６の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２４塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号６
0004335309.tif 000015
（８）配列番号７の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２４塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号７
0004335309.tif 000016
（９）配列番号８の情報
（i）配列特性
（Ａ）長さ：２５塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）配列記載  配列番号８
0004335309.tif 000017
【図１】
0004335309.tif 000018
【図２ａ】
0004335309.tif 000019
【図２ｂ】
0004335309.tif 000020
【図３】
0004335309.tif 000021
【図４】
0004335309.tif 000022
【図５】
0004335309.tif 000023
【図６ａ】
0004335309.tif 000024
【図６ｂ】
0004335309.tif 000025
【図７】
0004335309.tif 000026
【図８ａ】
0004335309.tif 000027
【図８ｂ】
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【図８ｃ】
0004335309.tif 000029
【図９】
0004335309.tif 000030
【図１０ａ】
0004335309.tif 000031
【図１０ｂ】
0004335309.tif 000032