(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖ＤＮＡから成るサンプル中の標的核酸の検出方法において、
(ａ)  上記サンプルを順行および／または逆行プライマーと接触させ、この場合、少なくとも１種のプライマーは標的核酸に関して上記プライマーの３′末端の故意にミスマッチさせた部分に標識または標識系部分を有し、上記ミスマッチ部分は２〜５個またはそれ以上のヌクレオチドからなり、上記標的核酸が存在する場合に、そのそれぞれの相補性ＤＮＡ配列に上記順行および／または逆行プライマーがアニーリングされるハイブリダイゼーション条件時に二重鎖混合物が創成され、
(ｂ)  工程(ａ)の混合物を、３′→５′校正読み取り活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼまたはこのような校正読み取り活性を有する酵素の混合物と、上記ポリメラーゼまたは酵素混合物の３′→５′ヌクレアーゼ活性がアニーリングしたプライマーをその３′ミスマッチ部分において切断して標識または標識系部分を放出させるのに適当な条件下に維持し、
(ｃ)  標識または標識系部分の放出を検出および／または測定する方法。
【請求項２】
標的核酸を増幅させてさらに多量の標識または標識系部分を放出させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅はＰＣＲで、また標的核酸がＲＮＡの場合にはＲＴ−ＰＣＲで実施する請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
標識は順行および／または逆行プライマーの３′および５′末端領域に連結されたレポーター／クエンチャー分子対である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
レポーター分子は、プライマーのミスマッチ３′部分に存在し、クエンチャー分子は、上記プライマーのマッチ部分にレポーター分子から適当な距離をおいて存在する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
クエンチャー分子はプライマーのミスマッチ３′部分に存在し、レポーター分子は上記プライマーのマッチ部分の５′末端に存在する請求項４記載の方法。
【請求項７】
上記核酸ポリメラーゼまたは上記酵素混合物は熱安定性である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
プライマーおよび標識または標識系を適当に選択することにより多重標的を同時に検出する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サンプルは動物またはヒト体液または血漿である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸増幅反応（たとえばポリメラーゼ連鎖反応）のための標識プライマー、および標識プラーマーを使用する核酸増幅過程によりＤＮＡ配列を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
周知のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はサンプル中の少量の既知の核酸配列を検出するのにきわめて効果的な方法である［Erlich, H.A., Gelfand,D., Sninsky, J.J.（1991), Science, 252：1643-1651（この報告の記載は引用により本明細書に導入する); PCR Products. Current metods and applications (1993), B.A.White編, Humana Press, Totowa, New Jersey, IBBN 0-89603-244-2（この記載は引用により本明細書に導入される)］、たとえばウイルスＤＮＡの配列が既知であれば、相対する一本鎖上の領域に相補性であり、求めるＤＮＡ配列に隣接する１対のプライマーを合成することが可能である。ついでそれ自体周知のＰＣＲ条件下に、通常は３０回以上の反応サイクルを連続的に用い、特異的ＤＮＡを大量にインビトロで増幅させることができる。ＰＣＲサイクルは、求めるたとえばウイルスＤＮＡがサンプル中に存在すると、特定のサイズを有し２つのプライマーとそれらの間のたとえばウイルスＤＮＡの長さからなるＤＮＡフラグメントを増幅させる。ＰＣＲ法はきわめて高感度であり、したがって、きわめて少量のＤＮＡを高い信頼度をもって検出するために使用することができる。
【０００３】
国際特許出願 WO 92／02638（引用により本明細書に導入される）には、検出すべきＤＮＡ（一本鎖として）、すなわち標的ＤＮＡを含有するまたはその含有が疑われるサンプルを、２つの異なるプライマーすなわち、増幅すべきＤＮＡ鎖すなわち標的ＤＮＡに隣接する順行プライマーおよび逆行プライマーとハイブリダイズさせるＤＮＡ配列の検出方法が開示されている。WO 92／02638 の好ましい実施態様において提供される標識オリゴヌクレオチドプローブは、その５′末端およびその３′末端の両者における標識としての蛍光染料システムとともに、さらに反応に使用される。この標識プローブは、増幅すべきＤＮＡセグメント内すなわち標的ＤＮＡ内の２つのプライマーの間にハイブリダイズするように選択される。好ましい標識としてプローブに結合される２種の蛍光染料は一方の染料すなわちレポーター染料の蛍光が第二の分子すなわちクエンチャーの接近によって、蛍光共鳴エネルギー転移（Stryer，L. 1978；Fluorescence energy transferas a spectroscopic ruler. Ann．Rev．Biochem. 47: 819-845；引用により本明細書に導入される）として知られる過程により低下（「クエンチング」）するという特徴的な性質を有する。上述の配列によって特徴づけられる２種のプライマーの間のＤＮＡに結合するこの標識プローブは、たとえば以下の配列を有する。
5′FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA 3′
【０００４】
この性質の配列は、多くの会社から注文して入手することが可能であり、５′−ヌクレアーゼアッセイ、すなわち TaqMan（登録商標）アッセイにおける使用が意図される。上述の方法は Livak K. J., Flood S. J. A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends providesystem useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Metod and Appl. 1995; 4: 357-362（引用により本明細書に導入される）に詳細に記載されている。
【０００５】
このプローブの特異的な性質は、染料（ＦＡＭ）すなわちプローブの５′末端に結合するレポーター染料の蛍光が、第二の蛍光染料（ＴＡＭＲＡ）すなわちプローブの３′末端に配置されるクエンチャー染料の接近によって低下することである（上記参照）。
【０００６】
新たなＤＮＡ鎖が増幅の過程で、適当な好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼたとえばＴaqＤＮＡポリメラーゼの影響下に形成されたとすると、それは一本鎖からの標識プローブを置換するのみでなく、その５′→３′ヌクレアーゼ活性によってプローブを分解し、それにより２種の蛍光染料が放出される。これによりレポーター染料の蛍光は最早、クエンチャー染料によって抑制されず増大する。この場合、蛍光分光光度計を使用してレポーター染料の波長で蛍光を測定すれば新たに形成されたＤＮＡの量に相当する蛍光の増大を観察することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
検出すべきＤＮＡセグメントの増幅の観察または測定を可能にするためには、順行プライマーおよび逆行プライマーに加えて標識プローブが要求されるという事実はこの方法の欠点として考えざるを得ない。したがって、この既知の方法の単純化という目的が生じた。
【０００８】
２種のプライマーの少なくとも１種を、たとえば本発明の好ましい実施態様におけるレポーター分子およびクエンチャー分子（一般的な用語では相互作用性の標識系）で標識し、同時に、標識されたプライマーは増幅すべきＤＮＡ鎖と完全にはハイブリダイズしないことが保証されるように注意を払えば、ポリメラーゼ連鎖反応に付加的な標識プローブを使用する必要はないことが見出された。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、核酸増幅反応（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応）のための標識プライマーに関し、このプライマーは、好ましい実施態様においてはそのプライマーの３′末端またはその近傍で標識系により、好ましい実施態様においてでレポーター染料分子およびクエンチャー分子により標識され、この方法で標識されるプライマーの３′末端の少なくとも１個好ましくは少なくとも２〜５個またはそれ以上の塩基（すなわち３′末端の故意にミスマッチさせた部分）は増幅すべきＤＮＡ配列と相補性ではない。標識または標識系部分は、３′末端ミスマッチ部分好ましくは３′末端ヌクレオチドに結合させる。非対合領域の長さは、使用される特定の標識および特定のポリメラーゼに応じて、本技術分野の熟練者には周知のように選択および／または至適化される。このような標識プライマーはその３′末端において増幅すべきＤＮＡ配列と完全な塩基対を形成することはできない。増幅に用いられ、校正読み取り活性（proof-reading properties）を有していなければならないポリメラーゼの影響下に、標識プライマーの非対合塩基は、実際の伸長反応が起こる前にポリメラーゼの３′→５′核酸分解活性により、使用された標識たとえばレポーター染料分子またはクエンチャー分子に応じてそれとともに放出される。これはしかしながら、クエンチャーがレポーター染料に対し空間的に近位にはも早存在せず、したがってレポーター染料の蛍光が増大する例示のような場合を生じて、標的核酸の存在および／または標的核酸の増幅を指示することになる。
【００１０】
したがって、本発明はまた核酸増幅によってＤＮＡ標的核酸を検出する方法において、プライマーの１種が上述の特徴を有する方法に関する。１種または２種以上の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することが可能であり、その少なくとも１種は校正活性をもっていなければならない増幅において、標識プライマーの非対合塩基はついで、標識または標識系部分たとえばそれに結合したレポーター染料とともに放出され、シグナルの増大たとえばレポーター染料の波長における蛍光の増大を生じる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この新規な方法においては、順行プライマーもしくは逆行プライマーまたはその両者をレポーターおよびクエンチャー分子によってそれぞれ上述のように標識することができる。クエンチャー染料は反応溶液中に放出されるが、新たに形成されたＤＮＡセグメントもプライマーの残部に加えて蛍光レポーター染料をもっている。これは定量的適用に好ましい操作である。しかしながら、クエンチャーおよびレポーター染料による標識化は、逆の様式でも、すなわちレポーター染料が溶液中に放出され、新たに形成されたＤＮＡセグメントがクエンチャーをもつように行うことも同様に可能である。数種のパラメーターを同時に平行して検出（多重検出）する場合は、平行して検出可能なレポーター染料の選択が好都合であり、本発明は多重検出にきわめて適していることを以下に開示する。
【００１２】
一般的な方法では、分光光度的、光化学的または化学的方法によって検出できる残基を導入することにより、以下に記載するように、プライマーの３′末端を標識するかまたは標識系部分に結合させる。標識をプライマーに連結または接合させる方法はもちろん、使用する標識の種類およびプライマー上の標識の位置に依存する。
【００１３】
本発明における使用に適した様々な標識ならびにそれらをプライマー中に包含させる方法は本技術分野において周知であり、それらに限定されるものではないが、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ）と酵素基質、放射性原子、蛍光染料、発色原、化学ルミネッセンス標識、電子化学ルミネッセンス標識、たとえば Origen（登録商標，Igen)、特異的結合パートナーを有するリガンドまたは互いに相互作用してシグナルを増強、変化もしくは減弱できる任意の他の標識が包含される。もちろん、増幅がＰＣＲを介して行われ、温度サイクル装置を用いて実施されなければならない場合は、標識はこの自動化過程に要求される温度サイクルに安定でなれればならない。
【００１４】
放射性原子としては32Ｐが好ましい。核酸に32Ｐを導入する方法は本技術分野において周知であり、たとえば、キナーゼによる５′標識またはニックトランスレーションによるランダム挿入が包含される。酵素は通常それらの活性によって検出される。「特異的結合パートナー」とはそれに特異的なリガンドモノクローナル抗体を結合できるタンパク質を意味する。他の特異的結合パートナーには、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および本技術分野において周知の多数の受容体−リガンドカップルが包含される。
【００１５】
同じ標識が幾つかの異なる様式で働くことが可能であるように、以上の記述は各種標識の異なるクラスへの類別を意味するものではない。たとえば、125Ｉは放射性標識としてもまた電子稠密試薬としても作用できる。ＨＲＰは酵素としてもまたモノクローナル抗体に対する抗原としても働くことができる。さらに所望の効果を得るために、様々な標識を組み合わせることもできる。たとえば、プライマーをビオチンで標識し、そのプライマーの存在は125Ｉ標識アビジンまたはＨＲＰ標識抗−ビオチンモノクローナル抗体で検出される。本技術分野の熟練者には他の交換および可能性は自明の通りであり、それらは本発明の範囲内において均等物とみなされるものである。
【００１６】
本発明の標識プライマーの構築において標識として使用するための蛍光原にはローダミンおよび誘導体、たとえばテキサスレッド、フルオレセインおよび誘導体、たとえば５−ブロモメチルフルオレセイン、ルシフェルイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ2Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ3−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ2−４−ＣＨ3−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビメイン、ピレントリスルホネート、たとえばカスケードブルーならびにモノブロモトリメチルアンモニオビメインが包含される。一般的に、広いストークス・シフトを有する蛍光原が好ましく、モノクロモメーターよりもフィルター付きの蛍光光度計の使用を可能にし、検出効率を増大させる。しかしながら、選択される特定の標識（単数または複数）は均一アッセイ系での検出を可能にする特性（たとえばレポーター／クエンチャー関係）を有することが好ましい。
【００１７】
開示される過程における標識の検出または確認は様々な方法で達成され、使用される標識（単数または複数）の起源に依存する。本発明の好ましい実施態様においては、蛍光の増大が適当な蛍光光度計で測定される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様においては、単一のプライマー上に２種の相互作用する標識がレポーター／クエンチャー標識システムとして使用される（上記記載および実施例参照）。
【００１９】
レポーター分子の例は、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−カルボキシ−テトラメチルローダミン（ＲＯＸ）である。クエンチャー分子の例は、６−カルボキシ−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）または４−（４′−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）である。ＴＡＭＲＡは蛍光染料であるが、ＤＡＢＣＹＬは蛍光染料ではない。
【００２０】
新規な増幅反応には様々なＤＮＡポリメラーゼを使用できる。使用するＤＮＡポリメラーゼが校正読み取り活性を有する場合には、１種の単一のポリメラーゼ［たとえば ＵＬＴma（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Perkin Elmer 用 Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA 製］を用いて反応を実施することができる。そうでなければ、数種のポリメラーゼの混合物を使用する必要があり、たとえば、Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼに加えて３′→５′ヌクレアーゼ活性を有する他のポリメラーゼも使用される。Ｔli ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corporation,Madison, WI, USA）、またはＶent ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）は、３′→５′ヌクレアーゼ活性を有する適当な熱安定性ポリメラーゼである。本発明には、Sigma Corp. によって販売されている ＡccuＴaq（登録商標）ＬＡ ＤＮＡポリメラーゼミックス（添付資料１）がきわめて適している。このようなミックスおよび関連酵素組成物は米国特許第5,436,149号の実施例６に記載されている。この特許の開示はその全体が引用により本明細書に導入される。
【００２１】
新規な方法は、プライマーの非対塩基が校正読み取り機能を有するポリメラーゼの攻撃点であるという事実の認識に基づくものである。使用する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、非ハイブリダイズ塩基を場合に応じてクエンチャーまたはレポーター分子とともに放出させる３′→５′ヌクレアーゼ活性、好ましくは３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００２２】
新規方法において使用されるプライマーは、平均的Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ比について標的核酸に関連する対合またはマッチ領域の１８〜２５塩基のオリゴヌクレオチドから構成されることが好ましいが、Ａ／Ｔ塩基対合が多い場合には、多少長くて、ＰＣＲについて上に開示された一般的方法に一致することが好ましい。
【００２３】
開示された方法は、核酸の増幅たとえばＰＣＲの実行に２種のオリゴヌクレオチド（プライマー）しか要求しないので、たとえば WO 92／02638 に比べ単純化されている点でとくに価値がある。これはウイルスの配列または数種のウイルスパラメーターを同時に検出する場合のように、様々な標的配列の検出のためたとえば保存的核酸セグメントを増幅しなければならない場合に有利である。
【００２４】
これに加えて、本明細書に記載の方法は、蛍光の増大は増幅されたＤＮＡの量に正比例するので、定量的な増幅にきわめて適している。
【００２５】
本発明のもっとも好ましい実施態様は、核酸の増幅法としてＰＣＲを使用し、３′ミスマッチプライマーを消光可能な蛍光染料分子によって標識し、上記分子の少なくとも１種が上記プライマーのミスマッチ３′末端にまたはその範囲内に存在する方法である。ＲＮＡ標的を検出する場合には、ＰＣＲによる増幅に先立って標的ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を行う。標的核酸が豊富である場合は、標識プライマーを使用する以外は、本技術分野の熟練者に周知のプロトコールに従う単一正常ＰＣＲとすることが好ましい（実施例２）。高感度の標的検出が所望の場合には、非標識の完全にマッチしたプライマーを使用して標的を増幅する第一の増幅を、本発明の標識プライマーを用いる入れ子ＰＣＲ（nested PCR）による標的核酸の第二の増幅に先行して実施する。特に第二の増幅（入れ子ＰＣＲ）では、３′ミスマッチ部分またはテイルを有するまたは有しない非標識プライマーの添加はそれが増幅をさらに効率的にし、標識プライマーの減量を可能にする点で有利となることが見出された。
【００２６】
本発明の方法で使用する試薬は診断用キットにパッケージすることができる。診断用キットは別個の容器中に標識プライマーを包含する。プライマー（単数または複数）が標識されていない場合には、特異的な標識試薬をキット中に包含させることができる。キットにはまたサンプルの調製および増幅に必要な他の適当なパッケージ試薬および材料、たとえば標的核酸の抽出溶液、緩衝液、ｄＮＴＰおよび／または重合手段、検出分析のためのたとえば酵素および固相抽出剤、ならびにアッセイの実施の指示書を含有させることができる。本発明の他の目的は開示された方法に有用なサンプル中の標的核酸の検出用の様々な反応混合物である。サンプルはヒトまたは動物起源の体液、または関心のある生体成分の抽出液である。好ましいサンプルは血液、血漿またはそれらから得られる任意の生成物である。
【００２７】
以下に本発明を実施例によって例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２８】
【実施例】
実施例１
この実施例は高感度を要求する適用についてのものである。この場合は増幅の第一ラウンドを標識プライマーから構成される入れ子ＰＣＲの前に実施する。
Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出には、それをまず最初に標準方法を用いて抽出し（たとえば、Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19: 5792 参照。この記載は引用により本明細書に導入される）、単離されたＲＮＡをついで逆転写し、標準方法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅する。入れ子増幅および検出反応は以下のようにセットアップする。
【００２９】
５μlの１０×ＵＬＴma緩衝液（100mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-Elmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマー１（配列表の配列番号：１参照；10pmpl／μl）、４μlのプライマー２（配列表の配列番号：２参照；10pmpl／μl）、０.２５μlのプライマー３（配列表の配列番号：３参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlのＲＴ−ＰＣＲ反応液に加え、ついで全体を１８.２５μlの水と混合して以下の温度サイクルに付す。
１．初期変性、９０℃において１分間、
２．各場合、５６℃において２８秒間の変性ならびに５６℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サイクル、
３．評価まで４℃に冷却。
【００３０】
ＰＣＲ反応は蛍光光度計で評価する。このためには、蛍光をレポーターの波長（FAMについては518nm）で測定する。標的核酸を含まない陰性対照の蛍光に基づく閾値を計算し、未知の値を評価するために使用する。
【００３１】
実施例２
この実施例は高感度を要求しない適用についてのものである。この場合、単一の増幅反応は標識プライマーを含有する。
Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅にはそれをまず最初に標準方法を用いて抽出した（たとえば、Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19: 5792参照）。増幅は以下のようにセットアップする。
【００３２】
５μlの１０×ＵＬＴma緩衝液（100mM Tris-HCl，pH 8.8，100mM KCl，0.02％Tween 20，Perkin-Elmerより）、７μlの２５mM ＭgＣl2、８μlのプライマー４（配列表の配列番号：４参照；10pmpl／μl）、４μlのプライマー５（配列表の配列番号：５参照；10pmpl／μl）、０.２５μlのプライマー６（配列表の配列番号：６参照；10pmpl／μl）、２μlのｄＮＴＰ（10mM）および校正機能を有するＵＬＴma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，６単位／μl）０.５μlを５μlの抽出されたＤＮＡ（すなわち標的核酸）に加え、ついで全体を１８.２５μlの水と混合して以下の温度サイクルに付す。
１．初期変性、９０℃において１分間、
２．各場合、９４℃において２８秒間の変性ならびに５８℃において１分間のアニーリングおよび伸長を３５サイクル、
３．評価まで４℃に冷却。
【００３３】
結果の評価は実施例１の記載と同様に実施する。実施例１および２のいずれにおいても、レポーターはＦＡＭとし、クエンチャーはＴＡＭＲＡとした。
【００３４】
【配列表】
0004331812.tif 000002
0004331812.tif 000003
0004331812.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法（Taq Womanアッセイ）のサイクルを示す図である。Ａは非対合３′末端を有する順行プライマー、Ｂは逆行プライマー、Ｒはレポーター分子、そしてＱはクエンチャー分子を示す。
いわゆるアニーリングは１で行われ、その３′末端は相補性ではないので非対合のままである。
いわゆる校正読み取りは２において、校正読み取り活性を有する酵素によって行われ、非対合３′末端が矯正すなわち除去される。
いわゆる鎖伸長（伸長相）は３で行われ、ついでこの相は４で完了する。
【図１】
0004331812.tif 000005