(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖混合体によって構成されるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンであって、前記鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ
【化１】
0004267916.tif 000003
（式中、
ウロン酸単位の４０〜６０％がイズロン酸のものであり；
ｎは３〜100の整数であり；
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は水素原子又はＳＯ3-基であって、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の約６５〜約５０％は水素であり、残りは、次のように分布するＳＯ3-基であり：
‐Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９５％であり、
‐Ｒ2はＳＯ3-基約１７〜約２１％であり、
‐Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約１５〜約３５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり、
‐Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約２０〜約４０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり、
‐Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計は３〜７％である；
Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の２５〜４５％において、共に水素であり；
硫酸化度は約２.３〜約２.９であり；及び
対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）
で表されるものであることを特徴とするＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項２】
対応するカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム又は亜鉛イオンである請求項１記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項３】
対応するカチオンが、ナトリウム又はカルシウムイオンである請求項１記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項４】
硫酸化度約２.４〜約２.７について、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及Ｒ3の約６０〜約５５％が水素であり、残りがＳＯ3-基である請求項１記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項５】
鎖混合体における鎖の少なくとも８０％が、式Ｉ（式中、ｎは３〜１５である）で表されるものである請求項１記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項６】
鎖混合体における鎖が、分子量分布約2,000〜約10,000及び平均分子量約4,000〜約8,000を有するものである請求項５記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項７】
鎖混合体における鎖が、平均分子量約6,000〜約8,000を有し、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり；Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９０％であり、Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり、Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５〜約３０％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５０％であり、Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０〜約３５％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり、Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約３０〜約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.５〜約２.７である）を有するものである請求項６記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項８】
鎖混合体における鎖が、平均分子量約7,000を有し、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり；Ｒ3はＳＯ3-基約８５％であり、Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり、Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり、Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり、Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約2.55である）を有するものである請求項７記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項９】
鎖混合体が平均分子量7,400を有するものである請求項８記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項１０】
鎖混合体における鎖の少なくとも８０％が、式Ｉ（ここで、ｎは２０〜100である）で表されるものである請求項８記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項１１】
鎖混合体が、分子量分布約9,000〜約60,000、平均分子約12,000〜約30,000を有するものである請求項１０記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項１２】
鎖混合体における鎖が、平均分子量14,000〜16,000を有し；及び鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり、Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９０％であり、Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり、Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５〜約３０％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり、Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０〜約３５％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり、Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約３０〜約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.５〜２.７である）を有するものである請求項１１記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項１３】
鎖混合体が平均分子量15,700を有するものである請求項１２記載のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン。
【請求項１４】
請求項１に記載のＣ５-エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンを製造する方法であって、
(ｉ)多糖体Ｋ５をＮ-脱アセチル化剤と反応させ、ついで、Ｎ-脱アセチル化生成物をＮ-硫酸化剤と反応させ；
(ii)このようにして得られたＮ-硫酸Ｋ５を、グルクロノシルＣ５エピメラーゼによってＣ５エピマー化して、イズロン酸／グルクロン酸の比が６０／４０〜４０／６０であるＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を生成し；
(iii)総ウロン酸に対するイズロン酸の含量４０〜６０％を有するＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を、その第３級又は第４級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、非プロトン性の極性溶媒中、温度４０〜６０℃において、１０〜２０時間処理し；
(iv)このようにして得られたＯ-過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド／メタノール混合物にて、５０〜７０℃において135〜165分間処理し；
(ｖ)このようにして得られた部分的Ｏ-脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、温度０〜５℃において処理し；
(vi)このようにして得られた生成物をＮ-硫酸化剤にて処理し；
工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化する
ことを含むＣ５-エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンの製法。
【請求項１５】
原料物質として、予め精製したＫ５を使用する請求項１４記載の製法。
【請求項１６】
工程(ｉ)において、Ｎ-脱アセチル化剤として、ヒドラジン又はその塩又はアルカリ金属水酸化物を使用し、Ｎ-硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物又はトリメチルアミン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項１４記載の製法。
【請求項１７】
工程(ii)において、Ｃ５エピマー化を、水溶液中の又は不動化型の酵素グルクロノシルＣ５エピメラーゼを使用して行い、少なくとも４０％のエピマー化を達成する、請求項１４記載の製法。
【請求項１８】
工程(ii)において、Ｃ５エピマー化を、２価カチオンの存在下、溶液中の又は不動化型の酵素グルクロノシルＣ５エピメラーゼを使用して行い、前記酵素が、組み換えグルクロノシルＣ５エピメラーゼ、マウス肥満細胞腫からのグルクロノシルＣ５エピメラーゼ及びウシ肝臓から抽出されたグルクロノシルＣ５エピメラーゼを含む群から選ばれものであり、前記２価カチオンが、Ｂａ、Ｃａ、Ｍｇ及びＭｎでなる群から選ばれるものである請求項１４記載の製法。
【請求項１９】
不動化型の酵素によるＣ５エピマー化を、Ｎ-硫酸Ｋ５ 0.001〜１０ｇ及びカチオンの１つを１０〜６０mMの濃度で含有するｐＨ６〜７.４の２５mM Hepes溶液２０〜1,000mlを、不活性支持体上に不動化させた酵素１.２×１０7〜３×１０11cpmを収容するカラムを通して再循環させることによって行う請求項１４、１７又は１８記載の製法。
【請求項２０】
酵素が組み換え酵素である請求項１４、１７〜１９のいずれかに記載の製法。
【請求項２１】
ｐＨが約７であり、Ｃ５エピマー化を、組み換え酵素を使用して、温度約３０℃、流速約200 ml/時間で、溶液を約２４時間再循環させることによって行う請求項１９記載の製法。
【請求項２２】
工程(iii)において、Ｏ-硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項１４記載の製法。
【請求項２３】
工程(iv)において、反応を、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１(V/V)混合物中、約６０℃において、約150分間行う請求項１４記載の製法。
【請求項２４】
原料物質として、予め精製したＫ５を使用し、工程(iv)において、反応を、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１(V/V)混合物中、約６０℃において、約150分間行う請求項１４又は２３記載の製法。
【請求項２５】
工程(ｖ)において、６-Ｏ-硫酸化を、Ｏ-硫酸化剤としてピリジン・三酸化イオウ付加物を使用して、０〜５℃において行う請求項１４記載の製法。
【請求項２６】
工程(vi)において、Ｎ-硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物又はトリメチルアミン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項１４記載の製法。
【請求項２７】
工程(vi)の終了時に得られた生成物を、亜硝酸によって低分子化し、続いて、水素化ホウ素ナトリウムによって還元する請求項１４記載の製法。
【請求項２８】
原料物質として、予め精製したＫ５を使用し、工程(iv)において、反応を、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１(V/V)混合物中、約６０℃において、約150分間行い、工程(vi)の終了時に得られたＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンを、亜硝酸によって低分子化し、続いて、水素化ホウ素ナトリウムによって還元する請求項１４記載の製法。
【請求項２９】
得られたＣ５-エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンを、ナトリウム塩の形で単離する請求項１４記載の製法。
【請求項３０】
ナトリウム塩を、さらに、他の塩に変換する請求項２９記載の製法。
【請求項３１】
他の塩が、他のアルカリ金属又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛の塩である請求項３０記載の製法。
【請求項３２】
薬学上許容されるキャリヤーと共に、有効成分として、請求項１〜１３のいずれかに記載のＣ５-エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を、その薬学上許容される塩の形で含有することを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の如きグリコサミノグリカンは、各種の動物の臓器から産業的に抽出される生体高分子である。
【０００２】
特に、主にブタの腸粘膜又はウシの肺からの抽出によって得られるヘパリンは、α-１→４又はβ-１→４結合によって結合されたウロン酸（Ｌ-イズロン酸又はＤ-グルクロン酸）及びアミノ糖（グルコサミン）により形成された繰り返し二糖体単位でなる鎖混合体である。ウロン酸単位は、２位において硫酸化されていてもよく、グルコサミンは、Ｎ-アセチル化又はＮ-硫酸化及び６-Ｏ硫酸化されていてもよい。さらに、グルコサミン単位は、３位において約０.５％の量で硫酸基を含有できる。ヘパリンは、分子量約3,000〜約30,000Ｄをもつ多分散コポリマーである。
【０００３】
哺乳動物におけるヘパリンの自然の生合成及びこの生成物の特性は、Lindahlらにより、1986年に、Lane D. 及びLindahal U. (編集), ヘパリン−化学的及び生物学的特性；Clinical Applications, Edward Arnold, London, p.159-190 及びLindahal U., Feingold, D.S. 及びRoden L. (1986) TIBS, 11, 221-225 に記載されている。
【０００４】
活性五糖体と名付けられたアンチトロンビンIII（ATIII）用の結合の五糖体領域によって形成される配列（ATIIIへのヘパリンの高親和性結合に必要な構造体である）は、ヘパリン活性にとって必須である。この配列は、３位で硫酸化された１つのグルコサミン単位（ヘパリン鎖の他の部分には存在しない）を含有する。ATIIIを介する活性以外に、ヘパリンは、ヘパリン共同因子II（HCII）の活性化を介する抗凝固及び抗血栓活性及びトロンビンの選択的阻害性を発揮する。HCIIの活性化に必要な最少の糖配列は、少なくとも２４個の単糖を含有する鎖であることが知られている（Tollefson D.M., 1990, 血栓症及止血に関するセミナー 16, 66-70）。
【０００５】
大腸菌（Escherichia Coli）の菌株から単離されたきょう膜多糖体Ｋ５（Vann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. によってEupopean Journal of Biochemistry 116, (1981) 359-364に開示されている）は、ヘパリン及びヘパラン硫酸前駆体（Ｎ-アセチルヘパロサン）の同じ配列、すなわち、二糖体グルコロニル-β-１→４-グルコサミン構造体を繰り返すことによって構成される鎖混合体を示すことが知られている。この化合物は、Lormeauらによって米国特許第5,550,116号に、及びCasuらによってCarbohydrate Research, 1994, 263, 271-284に開示されているように化学的に変性され、あるいは、動物の臓器から抽出されたものと同じタイプのヘパリンの凝固に関するインビトロ生物学的活性を示す生成物を得るために化学的及び酵素的に変性されている。
【０００６】
多糖体Ｋ５の化学的及び酵素的変性は、初めて、イタリー国特許第1,230,785号に開示されており、この変性法は、多糖体Ｋ５（以後、単に「Ｋ５」と表示する）を、(ａ)Ｎ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化；(ｂ)グルクロン酸単位の酵素的Ｃ５エピマー化；(ｃ)２-Ｏ及び／又は６-Ｏ硫酸化；及び(ｄ)任意の酵素的３-Ｏ硫酸化するものであるが、この方法は、動物の臓器から抽出されたヘパリン（以後、「市販ヘパリン」又は「標準ヘパリン」と称する：後者の表現は、ヘパリンの第４の国際基準を表示する）のものに対して満足できる活性を有する生成物を提供することができない。
【０００７】
WO 92/17507は、(ａ)Ｎ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化、(ｂ)Ｃ５エピマー化、及び(ｃ)Ｏ-硫酸化（工程(ｃ）に続いて、任意に、Ｎ-再硫酸化が行われる）による、Ｋ５を原料とするヘパリン様生成物の製造方法を開示している。この製法によれば、得られる生成物のイズロン酸含量が少ない（ウロン酸の全含量の約２０％）。
WO 96/14425及び米国特許第5,958,899号は、(ａ)Ｎ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化、(ｂ)Ｃ５エピメラーゼによるエピマー化（工程(ｂ)は、制御された条件下で行われる）、及び(ｃ)少なくともいくつかの遊離ヒドロキシ基の硫酸化による、Ｋ５を原料とする高イズロン酸含量を有するヘパリン様生成物の製法を開示している。この方法に従って得られた生成物は、Ｎ-硫酸基がかなりの量欠乏している（Ｏ-硫酸化の間に失われるため）。
【０００８】
WO 97/43317及び米国特許第6,162,797号は、高い抗凝固活性を有するＫ５の誘導体を開示しており、この誘導体は、Ｋ５を、(ａ)Ｎ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化、(ｂ)Ｃ５エピマー化、(ｃ)予め有機酸との塩に変換したエピマー化生成物のＯ-過硫酸化及び透析、及び(ｄ)Ｎ-再硫酸化に供することによって調製される。この方法に従って得られた生成物は、非常に高い全体的抗凝固活性を発揮する。
【０００９】
WO 98/42754は、高い抗血栓活性を有するグルコサミノグリカン（Ｋ５の誘導体を含む）の製法を開示しており、この方法は、Ｋ５の場合、(ａ)Ｎ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化、(ｂ)Ｃ５エピメラーゼによるエピマー化、(ｃ)Ｏ-過硫酸化、(ｄ)過硫酸化生成物の塩の部分的ソルボリシスＯ-脱硫酸化、(ｅ)Ｎ-再硫酸化、及び、任意に、(ｆ)Ｏ-再硫酸化でなる。この任意の６-Ｏ再硫酸化（完全な６-Ｏ硫酸化を回復する）は、抗-Ｘａ活性をさらに増大させることを期待するものである（A. Naggiら, 血栓症及び止血に関するセミナー, 2001, 27/5, 437-443）。実際には、この方法に従って得られた生成物は、任意の工程(ｆ)が行われない場合には、Ｏ-硫酸基が欠乏するか、あるいは、工程(ｆ)を行った場合に失われるＮ-硫酸基が欠乏するとの欠点を有する。このように、不完全なＮ-又はＯ-、特に６-Ｏ硫酸化（常に６０％以下）は、Ｃ５エピマー化Ｋ５多糖体の場合、非常に低い抗-Ｘａ値を伴い、不完全なＮ-硫酸化の場合には、非常に低い抗-Ｘａ／aPPT比を与え、あるいは不完全な６-Ｏ硫酸化の場合には、低いアンチトロンビン又はHCIIを与え、このように、低い抗-IIa／aPTT比及び／又はHCII／aPTT比を与える。
【００１０】
発明者らは、分子量3,000〜30,000を有し、ATIIIに対する高い親和性をもつ鎖２５〜５０％を含有し、高い抗凝固及び抗血栓活性を有する、大腸菌からの多糖体Ｋ５から誘導された新規なグリコサミノグリカンを見出し、本発明に至った。
【００１１】
前記グリコサミノグリカンは、実質的に、次の一連の工程：(ｉ)多糖体Ｋ５のＮ-脱アセチル化／Ｎ-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分的Ｃ５エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)選択的Ｏ-脱硫酸化、(ｖ)任意の６-Ｏ硫酸化、及び(vi)Ｎ-硫酸化を含む方法を介して合成される。
【００１２】
さらに、工程(iii)の終了時に得られた生成物のＯ-脱硫酸化を135〜165分の時間で行うことによって、最良の抗血栓活性及び他のいずれのヘパリン様グリコサミノグリカンのものよりも低い出血性を示す新規な化合物が得られるとの知見を得た。
【００１３】
特に、高いアンチトロンビン活性及びヘパリンのものよりも低い出血性を有する新規なグリコサミノグリカンが、実質的に、(ｉ)多糖体Ｋ５のＮ-脱アセチル化／Ｎ-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分的Ｃ５エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)時間及び温度を制御した選択的Ｏ-脱硫酸化、(ｖ)６-Ｏ硫酸化、(vi)Ｎ-硫酸化の工程を含み、工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時における任意の低分子化工程を含む方法によって得られるとの知見を得た。この反応の配列のため、これらの新規なグリコサミノグリカンは、ほぼ完全にＮ-硫酸化され、かつ高度に６-Ｏ硫酸化されており、このため、従来の方法によって得られるものとは異なるものである。
【００１４】
さらに詳述すれば、驚くべきことには、上記方法の工程(iv)において、工程(iii)の終了時に得られた生成物の選択的Ｏ-脱硫酸化を、ジメチルスルホキシド／メタノール混合物中において、時間135〜165分及び温度５０〜７０℃で行う場合には、ヘパリンタイプの新規なグリコサミノグリカンが得られ、このグリコサミノグリカンは、標準ヘパリンと少なくとも同程度の抗-Ｘａ活性、標準ヘパリンよりも低い全体的抗凝固活性（例えば、aPTTとして表示される）、標準ヘパリンのものと少なくとも同様の高さのヘパリン共同因子II（HCII）活性及び標準ヘパリンよりもかなり高い抗-IIa（アンチトロンビン）活性を有し、さらに、この新規なグリコサミノグリカンは、市販ヘパリンと比べて低減された出血の危険性を有するものであるとの知見が得られた。さらに、工程(iv)を上述の条件下で行うことによって、工程(vi)の終了時に得られる化合物の生物学的活性が、低い出血の危険性と共に、低分子化の後でも保持される（低分子化生成物の活性は、非常に高いアンチトロンビン活性、標準ヘパリンのものと同程度の抗-Ｘａ及びHCII活性及び標準ヘパリンのものよりも低い全体的抗凝固活性によって表される）との知見を得た。このように、工程(iv)をこれらの制御された条件下で行うことによって、公知の方法の上記欠点を解消でき、改善されかつ選択的なアンチトロンビン活性を有し、特殊な凝固制御剤及び抗血栓剤として有用な新規なグリコサミノグリカンが得られる。
【００１５】
以下の記載では、多糖体Ｋ５の誘導体を、Ｎ-脱アセチル化多糖体Ｋ５については「脱アセチル化Ｋ５」、Ｎ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化多糖体Ｋ５については「Ｎ-硫酸Ｋ５」、Ｃ５エピマー化、Ｎ-脱アセチル化、Ｎ-硫酸化多糖体Ｋ５については「Ｃ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５」、上記工程(vi)の終了時に得られるＣ５エピマー化、Ｎ-脱アセチル化、Ｎ,Ｏ-硫酸化多糖体Ｋ５（低分子化を行ったもの又は行っていないもの）については「Ｃ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５」と表示する。他に表示しない限り、原料のＫ５及びその誘導体は、そのナトリウム塩の形のものである。
【００１６】
本発明は、(ｉ)多糖体Ｋ５のＮ-脱アセチル化／Ｎ-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分Ｃ５エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)選択的Ｏ-脱硫酸化、(ｖ)任意の選択的６-Ｏ硫酸化、及び(vi)Ｎ-硫酸化の工程を含むＫ５グリコサミノグリカンを製造する方法であって、工程(iv)が、工程(iii)の終了時に得られた過硫酸化生成物を、メタノール／ジメチルスルホキシド混合物にて、135〜165分間処理することからなることを特徴とするＫ５グリコサミノグリカンの製法に関する。
【００１７】
好ましくは、処理時間は約150分である。
【００１８】
工程(ii)〜(vi)で得られた本発明の生成物は、好ましくは工程(vi)後に、WO 82/03627に記載されているように化学的に低分子化される。
【００１９】
好適な具体例によれば、工程(iii)の終了時に得られた過硫酸化生成物のメタノール／ジメチルスルホキシド混合物による処理は、温度約６０℃において、時間約150分で行われる。この有利な方法によれば、工程(ｉ)〜(iii)に従って調製された過硫酸化生成物から、最良の抗血栓活性及び他の各種のヘパリン様グリコサミノグリカンのものよりも低い出血性を示す新規なグリコサミノグリカンが得られる。
【００２０】
さらに、工程(ii)の部分的エピマー化がイズロン酸部少なくとも４０％を与えるものであり、工程(iii)の過硫酸化を、非プロトン性溶媒中、温度４０〜６０℃において、１０〜２０時間行い、及び工程(ｖ)の選択的６-Ｏ硫酸化を実際に行う場合には、この有利な方法に従って、特に興味深いＫ５グリコサミノグリカンが得られる。
【００２１】
このように、本発明の他の目的は、新規なグリコサミノグリカンを製造する方法であって、(ｉ)多糖体Ｋ５をＮ-脱アセチル化剤と反応させ、ついで、Ｎ-脱アセチル化生成物をＮ-硫酸化剤と反応させ；(ii)このようにして得られたＮ-硫酸Ｋ５を、グルクロノシルＣ５エピメラーゼによってＣ５エピマー化して、イズロン酸／グルクロン酸の比が６０／４０〜４０／６０であるＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を生成し；(iii)総ウロン酸に対するイズロン酸の含量４０〜６０％を有するＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を、その第３級又は第４級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、非プロトン性の極性溶媒中、温度４０〜６０℃において、１０〜２０時間処理し；(iv)このようにして得られたＯ-過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド／メタノール混合物にて、５０〜７０℃において、135〜165分間処理し；(ｖ)このようにして得られた部分的Ｏ-脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、温度０〜５℃において処理し；(vi)このようにして得られた生成物をＮ-硫酸化剤にて処理し；工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化することを含むことを特徴とするグリコサミノグリカンの製法を提供することにある。
【００２２】
原料として使用されるＫ５は、野生又はクローン化されたＫ５産生大腸菌の菌株の培養によって得られる各種の生成物である。特に、上述のＫ５の１つを使用でき、有利には、M. Manzoniら, Journal Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311又はWO 01/02597に記載されたものの１つを使用できる（好ましくは、予め精製したもの）。
【００２３】
有利なＫ５原料は、低分子量（特に約1,500〜15,000、有利には約2,000〜約9,000の分布（平均分子量約5,000）をもつ）、又はより大きい分子量（特に約10,000〜約50,000、有利には約20,000〜約40,000の分布（平均分子量約30,000）をもつ）を有する。好ましくは、原料Ｋ５は、約1,500〜約50,000の分子量分布（平均分子量20,000〜25,000）を有する。分子量はすべてドルトン(Ｄ)で表される。Ｋ５及び後述のその誘導体の分子量は、基準として既知の分子量を有するヘパリンフラクションを使用することによって算定されたされたものである。
【００２４】
代表的には、大腸菌からの多糖体Ｋ５の製造のため、初めに、イタリー国特許出願第MI99A001465号（WO 01/02567）に従い、下記の培地を使用して、フラスコ内での培養を行う。
脱脂大豆                      ２      (ｇ/Ｌ)
K2HPO4                         ９.７   (ｇ/Ｌ)
KH2PO4                         ２      (ｇ/Ｌ)
MgCl2                          0.11    (ｇ/Ｌ)
クエン酸ナトリウム            １      (ｇ/Ｌ)
硫酸アンモニウム              １      (ｇ/Ｌ)
グルコース                    ２      (ｇ/Ｌ)
水                        1,000       (ml)
ｐＨ                          ７.３
【００２５】
培地を120℃において２０分間殺菌する。別に、グルコースを溶液として調製し、これを120℃において３０分間殺菌し、溶液を無菌的に培地に添加する。フラスコに、トリプティック大豆寒天を含有する斜面培地から採取した大腸菌細胞 Bi 8337/41（O10:K5:H4）の懸濁液を接種し、制御して攪拌しながら（160rpm、ラン６cm）、３７℃において２４時間培養する。顕微鏡を使用して細胞数を計数することによって、細菌の生育を測定する。さらなる工程では、上記ものと同じ培地を収容するChemap-Braun発酵装置（容積１４Ｌ）に、上記フラスコの培養物０.１％を接種し、給気１vvm（vvm：液体の容量、分当たりの空気の容量）、撹拌400rpm、温度３７℃において、１８時間発酵を行う。発酵の間、ｐＨ、酸素、残留グルコース、生成した多糖体Ｋ５及び細菌の生育を測定する。
【００２６】
発酵の終了時、温度を８０℃に１０分間上昇させる。10,000rpmでの遠心分離によって、細胞を培地から分離し、上澄みを、公称カットオフ800〜10,000ＤをもつPES膜を具備するSS 316（MST）モジュールを介して限外濾過して、容積を１／５に減少させる。ついで、４℃のアセトン４容を添加して多糖体Ｋ５を沈殿させ、沈降させるため、４℃において１夜放置し、最後に、10,000rpmで２０分間遠心分離するか、又は濾過する。
【００２７】
ついで、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus Orizae）からのタイプIIのプロテアーゼを使用して、０.５％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)(１０mg／濾液１Ｌ）を含有するｐＨ８の０.１Ｍ NaCl及び0.15Ｍ エチレンジジアミン四酢酸（EDTA）中、３７℃、９０分間で除タンパクを行う。10,000Ｄの公称カットオフ膜をもつSS 316モジュール上で溶液を限外濾過し、１Ｍ NaClにて２回抽出を行い、限外濾液において吸光度が消失するまで、水で洗浄する。ついで、多糖体Ｋ５をアセトンにて沈殿させ、850mg／発酵装置１Ｌの収率を得る。多糖体の純度を、ウロン酸の測定（カルバゾール法）、プロトン及び炭素NMR、ＵＶ及びタンパク質含量によって測定する。純度は８０％以上である。
【００２８】
このようにして得られた多糖体は、異なる分子量、30,000及び5,000Ｄ（75 HR Pharmaciaカラムを使用するHPLCによって測定）を有する２つのフラクション、及び直列の２個のBio-sil SEC 250カラム（BioRad）及び可動相としてNa2SO4を使用し、室温及び流速０.５ml/分で測定して保持時間約９分をもつ１つのシングルフラクションからなる。測定を、既知の分子量をもつヘパリンフラクションを使用して得られた曲線に対して行う。プロトンNMRを図２に示す。
【００２９】
このような多糖体Ｋ５は、その純度が本発明の方法の実施に充分なものであるため、本発明の方法の原料物質として使用される。この原料物質を予め精製することは有利である。
【００３０】
多糖体Ｋ５の好適な精製は、Triton X-100での処理によって達成される。代表的には、既に充分な純度の上記多糖体Ｋ５の１％水溶液に、Triton X-100を濃度５％で添加する。溶液を、５５℃において、２時間、撹拌下に維持する。温度を７５℃に上昇させ、室温に冷却する間に、２つの相が形成される。上相（有機相）について、２つの相を形成させる熱的処理を２回繰り返し行う。多糖体を含有する水相を、最後に、減圧下で濃縮し、エタノール又はアセトンにて沈殿させる。有機相を廃棄する。サンプルの純度はプロトンNMRによって制御され、９５％となる。
【００３１】
この処理の収率は９０％である。
【００３２】
工程(ｉ)では、原料のＫ５を、Ｎ-脱アセチル化及び続いてＮ-硫酸化（これらは公知の方法によって行われる）に供する。代表的には、精製したＫ５ １０ｇを２Ｎ水酸化ナトリウム100〜2,000mlに溶解し、４０〜８０℃において、完全なＮ-脱アセチル化を行うために必要な時間（３０時間を超えない）反応させる。この溶液を室温に冷却し、６Ｎ塩酸によってｐＨを中性とする。
【００３３】
Ｎ-脱アセチル化Ｋ５を含有する溶液を２０〜６５℃に維持し、炭酸ナトリウム１０〜４０ｇを、ピリジン・三酸化イオウ付加物、トリメチルアミン・三酸化イオウ付加物等の如き入手可能な試薬から選ばれる硫酸化剤１０〜４０ｇと共に添加する。硫酸化剤の添加を、１２時間までの変更可能な時間で行う。反応の終了時、必要であれば、溶液を室温とし、５％塩酸溶液にてｐＨを７.５〜８とする。
【００３４】
生成物を、公知の技術、例えば、1,000Ｄカットオフをもつスパイラル膜（プレプスケールカートリッジ；Millipore）を使用するダイアフィルトレーションによって、塩から精製する。このプロセスは、透過物の伝導度が1,000μS未満、好ましくは100μS未満である時点で終了する。得られる生成物の容積を、濃縮器として同じ濾過システムを使用して、多糖体濃度が１０％となるまで濃縮する。必要であれば、濃縮溶液を公知の技術にて乾燥させる。
【００３５】
Ｎ-硫酸／Ｎ-アセチル比は、13炭素NMRによって測定して１０／０〜７／３である。
【００３６】
本発明によるＣ５エピマー化の工程(ii)は、溶液中又は不動化した形の酵素グルクロノシルＣ５エピメラーゼ（Ｃ５エピメラーゼと称する）を使用して行われ、例えば、特殊な２価カチオンの存在下において、少なくとも４０％のエピマー化を達成する。WO 01/72848に開示されているように、酵素は、組み換えグルクロノシルＣ５エピメラーゼ、マウス肥満細胞腫からのグルクロノシルＣ５エピメラーゼ及びウシ肝臓から抽出されたグルクロノシルＣ５エピメラーゼを含む群から選ばれ、前記２価カチオンは、Ｂａ、Ｃａ、Ｍｇ及びＭｎでなる群から選ばれる。
【００３７】
溶液中の酵素によるＣ５エピマー化
天然又は組み換えＣ５エピメラーゼ１.２×１０7〜１.２×１０11cpm（１分当たりの個数)(Campbell P.ら, Analytical Biochemistry 131, 146-152 (1983)に記載の方法に従って算定）を、Ｎ-硫酸Ｋ５ 0.001〜１０ｇ及びバリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンの中から選ばれる１以上のイオンを濃度１０〜６０mMで含有するｐＨ５.５〜７.４の２５mM Hepes緩衝液２〜2,000mlに溶解する。反応を、温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃において１〜２４時間で行う。反応の終了時、100℃において、１０分間で酵素を不活性化させる。
生成物を、ジメチルアミノエチル樹脂（DEAE樹脂）又はDEAE装置Sartobind上を通過させ、２Ｍ NaClにて結合を開放し、最後にSephadex G-10樹脂上で脱塩することによって精製するか、又はエタノール２容による沈澱及びナトリウム塩を形成させるためのIR 120 H+樹脂上の通過によって精製する。
【００３８】
得られた生成物は、WO 96/14425に既に記載されているように、1H-NMRによって算定して、４０／６０〜６０／４０のイズロン酸／グルクロン酸の比を示す。
【００３９】
不動化酵素によるＣ５エピマー化
天然又は組み換えの酵素Ｃ５エピメラーゼを、酵素の結合に関する最も一般的な技術を使用して、臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミドの如き反応性官能基をもつ樹脂、膜又はガラスビーズを含む各種の不活性支持体上に不動化させるか、又は、酵素をイオン交換樹脂と反応させるか、又は膜上に吸着させることによって不動化させる。本発明によれば、酵素の不活性支持体上への結合反応は、酵素の活性サイトへの結合（活性をロスさせる）を回避するため、基質Ｎ-硫酸Ｋ５の存在下で行われる。不動化酵素の活性の測定は、不動化酵素のカラムに、２５mM Hepes、０.１Ｍ KCl、0.01％ Triton X-100及び0.15Ｍ EDTA緩衝液（ｐＨ７.４）の存在下、３７℃において、流速０.５ml/分で、不動化酵素の量（cpm）によって理論的にエピマー化される量のＮ-硫酸Ｋ５を再循環させることによって行われる。DEAEクロマトグラフ法及びSephadex G-10での脱塩によって精製した後、生成物を凍結乾燥し、イズロン酸の含量をプロトンNMRによって算定する。
【００４０】
イズロン酸／グルクロン酸の比は約３０／７０であろう。
【００４１】
バリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンの中から選ばれる１以上のイオン（濃度１０〜６０mM）及びＮ-硫酸化Ｋ５ 0.001〜１０ｇを含有する温度３０〜４０℃に維持したｐＨ６〜７.４の２５mM Hepes緩衝液２０〜1,000mlを、不活性支持体に不動化させた酵素１.２×１０7〜３×１０11cpm当量を収容し、温度３０〜４０℃に維持したカラムにおいて、流速３０〜160ml/時間で、１〜２４時間再循環させる。反応の終了時、溶液中におけるエピマー化に関して記載したものと同じ方法を使用してサンプルを精製する。
【００４２】
得られた生成物のイズロン酸／グルクロン酸の比は、４０／６０〜６０／４０の範囲である。
【００４３】
好適な具体例によれば、前記Ｃ５エピマー化は、不動化型の酵素を使用して行われ、Ｎ-硫酸Ｋ５ 0.001〜１０ｇ及び濃度１０〜６０mMの前記カチオンの１つを含有するｐＨ６〜７.４の２５mM Hepes溶液２０〜1,000mlを、不活性支持体上に不動化させた酵素１.２×１０7〜３×１０11cpmを収容するカラムを通して再循環させることを包含してなり、前記ｐＨは、好ましくは約７であり、前記Ｃ５エピマー化は、好ましくは、温度約３０℃、流速約200ml/時間で、前記溶液を約２４時間循環させることによって行われる。
【００４４】
Ｏ-過硫酸化でなる工程(iii)は、予め、Ｃ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を、その第３級又は第４級塩に変換し、ついで、この塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、温度４０〜６０℃において１０〜２０時間処理することによって行われる。代表的には、工程(ii)のエピマー化生成物を濃度１０％で含有する溶液を１０℃に冷却し、IR 120 H+カラム又は均等物（３５〜100ml）を通過させる。カラム及び生成物の容器の両方を１０℃に維持する。溶液の通過後、樹脂を、貫流液のｐＨが６より大となるまで脱イオン水で洗浄する（脱イオン水約３容）。酸性溶液を、水酸化テトラブチルアンモニウムの如き第３級又は第４級アミン（１５％水溶液）にて中性に維持して、多糖体のアンモニウム塩を得る。溶液を最少容量に濃縮し、凍結乾燥する。得られた生成物を、ジメチルホルムアミド（DMF）又はジメチルスルホキシド（DMSO）２０〜500mlに懸濁させ、ピリミジン・ＳＯ3付加物の如き固体状又はDMF又はDMSO溶液中の硫酸化剤１５〜300ｇを添加する。溶液を、２０〜７０℃に２〜２４時間、好ましくは、４０〜６０℃に１５〜２０時間維持する。反応の終了時、溶液を室温に冷却し、完全な沈澱が生ずるまで、塩化ナトリウム飽和アセトンを添加する。濾過によって、沈殿物を溶媒から分離し、最少量（例えば、100ml）の脱イオン水に溶解させ、塩化ナトリウムを添加して、０.２Ｍ溶液を得る。２Ｎ水酸化ナトリウムにて、溶液をｐＨ７.５〜８とし、完全な沈澱が生ずるまでアセトンを添加する。濾過によって、沈澱物を溶媒から分離する。得られた固体を脱イオン水100mlに溶解させ、上記工程(ｉ)において記載したように、限外濾過によって残留塩から精製する。
【００４５】
得られた生成物の一部を、13C-NMRによる過硫酸化生成物の構造分析のため、凍結乾燥する。得られた生成物の多糖体当たりの硫酸塩の含量は、Casu B.ら, Carbohydrate Research 1975, 39, 168-176に従って算定して２.８〜３.５である。グルコサミンの６位が８０〜９５％硫酸化されており、２位は全く硫酸化されていない。他の硫酸基は、アミノ糖の３位及びウロン酸の２及び３位に存在する。
【００４６】
選択的Ｏ-脱硫酸化でなる工程(iv)は、本発明の方法の鍵となる工程である。これは、工程(vi)の終了時に、低分子化の後、実質的に高いアンチトロンビン活性を保持している低分子量生成物を生成するグリコサミノグリカンの調製を可能にするためである。代表的には、工程(iii)の生成物を含有する溶液を、カチオン性交換樹脂IR 120 H+又は均等物（３５〜100ml）を通過させる。溶液の通過後、貫流液のｐＨが６より大となるまで、樹脂を脱イオン水にて洗浄する（脱イオン水約３容）。酸性溶液をピリジンにて中性とする。溶液を最少容量に濃縮し、凍結乾燥する。得られた生成物を、DMSO／メタノールの９／１（V/V）溶液２０〜2,000mlにて処理し、溶液を５０〜７０℃に135〜165分間、好ましくは、約６０℃に約150分間維持する。最後に、溶液に、脱イオン水１０〜200mlを添加し、塩化ナトリウム飽和アセトンにて処理して、完全な沈澱を達成する。
【００４７】
選択的Ｏ-脱硫酸化により、グルコサミンの６位の硫酸基が初めに除去され、ついで、ウロン酸の３位及び２位の硫酸基が、最後に、アミノ糖の３位の硫酸基が除去される。得られたサンプルの13C-NMRスペクトル（図８）は、グルコサミン残基の完全なＮ-脱硫酸化（５６ppmにおけるシグナル）及びほぼ完全な６-Ｏ脱硫酸化（67.6ppmにおけるシグナルの減少及び62.2ppmにおけるシグナルの出現）を示している。６５及び８６ppmにおけるシグナルは、それぞれ、２-Ｏ硫酸化イズロン酸及び３-Ｏ硫酸化グルクロン酸を表している。得られた固体を、公知の方法によるダイアフィルトレーションによって、例えば、1,000Ｄカットオフをもつスパイラル膜（プレプスケールカートリッジ；Millipore）を使用することによって精製する。このプロセスは、透過物の伝導度が1,000μS未満、好ましくは100μS未満である時点で終了する。得られる生成物の容積を、濃縮器として同じ濾過システムを使用して、多糖体濃度が１０％となるまで濃縮する。必要であれば、濃縮溶液を公知の技術にて乾燥させる。
【００４８】
６-Ｏ硫酸化でなる工程(ｖ)も、後述の工程(vi)に続く低分子化の後、高いアンチトロンビン活性、ヘパリンのものと同様に高い抗-Ｘａ及びHCII活性、及び低いaPTTを有する化合物が望まれる場合には、実施されなければならない。選択的６-Ｏ硫酸化は、選択的にＯ-脱硫酸化された生成物を、その第３級又は第４級塩に変換させ、この塩を、低温、さらに詳しくは０〜５℃において、０.５〜３時間、Ｏ-硫酸化剤にて処理することによって行われる。代表的には、６-Ｏ硫酸化は、Ｏ-硫酸化の工程(iii)に関して説明したようにして行われる。得られた固体を、工程(iv)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製する。13C-NMRによる構造分析のため少量を凍結乾燥する。Casuら, Arzneimittel-Forschung Drug Research, 1983, 33, 135-142に記載の如くNMRによって算定した６-Ｏ硫酸基の含量が約８５％未満である場合には、工程(ｖ)を繰り返す。
【００４９】
工程(vi)は、Ｏ-過硫酸化工程の間に、無視できない量のＮ-硫酸基が失われるため、実施されなければならない。このように、工程(ｖ)において得られた溶液を、本発明のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を単離するため、Ｎ-硫酸化のための工程(ｉ)において記載のように処理する。
【００５０】
工程(ii)〜(vi)のいずれか１つの工程の終了時に得られた高分子量生成物について、最終生成物として、高いアンチトロンビン活性、標準ヘパリンのものと同程度の抗-Ｘａ及びHCII活性、及び標準ヘパリンのものよりも低いaPTT活性を有する低分子量グリコサミノグリカンを得るために、化学的に低分子化を行う。
【００５１】
一般に、本発明の方法は、工程(ｉ)〜(vi)を連続して行い、工程(vi)の終了時に得られた高分子量のＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を低分子化することによって実施される。もちろん、原料として、任意に予め精製したＫ５の低分子量フラクションを使用する場合、低分子量Ｃ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を調製するためには、このよう低分子化は不要である。
【００５２】
低分子化は、最終生成物として、鎖の少なくとも８０％が約2,000〜約10,000の分子量分布（平均分子量約4,000〜約8,000）を有するものである鎖混合体でなるグリコサミノグリカンを得るために、ヘパリンの低分子化に関する公知の方法に従って、例えば、亜硝酸及び続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元（WO 82/03627, EP 37319）により、過ヨウ素酸ナトリウム（EP 287477）により、フリーラジカル（EP 121067）により又はβ-除去（EP 40144）により行われる。
【００５３】
本発明の方法によって得られたグリコサミノグリカンについて、プロトンおよび13炭素NMRによって及び抗-Ｘａ、aPTT、HCII、抗-IIa及びATIIIに関する親和性のような生物学的テストよって、その特性を決定する。既に述べたように、硫酸化度、すなわち、多糖体単位当たりの硫酸基の数（硫酸基／カルボキシル基の比（SO3-／COO-）として表される）は、Casuら, Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176に記載のようにして決定される。
【００５４】
工程(vi)の終了時に得られた生成物を、何ら低分子化を行うことなく、樹脂上でのクロマトグラフィー又は限外濾過によって分画して、2,000〜8,000Ｄの低分子量フラクション及び25,000〜30,000Ｄの高分子量フラクションを得る。
【００５５】
本発明の方法の終了時に得られる新規なＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンは、一般に、ナトリウム塩の形で単離される。このナトリウム塩は、他の塩に変換される。このような他の塩は、他のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(Ｃ1−Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛塩である。
【００５６】
本発明の方法によって得られた生成物は、抗-Ｘａテストにおいて、抽出ヘパリンに匹敵する活性及び低減された全体的抗凝固活性（aPTT法）を示すと共に、トロンビンの阻害性、ヘパリン共同因子II（HCII）及び抗-IIa活性を含むテストの値は標準ヘパリンのものと同程度か、又は明らかに高いものである。得られた生成物のこれらの特性は、市販ヘパリン及び他の公知の抗凝固グリコサミノグリカンのものよりも良好な凝固制御特性及び抗血栓特性、及びより小さい副作用（例えば、出血性）を予測させるものである。
【００５７】
このように、本発明の他の目的は、(ｉ)Ｋ５をＮ-脱アセチル化剤と反応させ、ついで、Ｎ-脱アセチル化生成物をＮ-硫酸化剤と反応させ；(ii)このようにして得られたＮ-硫酸Ｋ５を、グルクロノシルＣ５エピメラーゼによってＣ５エピマー化して、イズロン酸／グルクロン酸の比が６０／４０〜４０／６０であるＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を生成し；(iii)総ウロン酸に対するイズロン酸の含量４０〜６０％を有するＣ５エピマー化Ｎ-硫酸Ｋ５を、その第３級又は第４級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、Ｏ-硫酸化剤と、非プロトン性の極性溶媒中、温度４０〜６０℃において、１０〜２０時間反応させ；(iv)このようにして得られたＯ-過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド／メタノール混合物にて、５０〜７０℃において135〜165分間処理し；(ｖ)このようにして得られた部分的Ｏ-脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、Ｏ-硫酸化剤にて、０〜５℃において処理し；(vi)このようにして得られた生成物をＮ-硫酸化剤にて処理し；工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化し、最終生成物のナトリウム塩を、任意に、他の塩に変換することを包含してなる方法によって得られる新規なＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンを提供することにある。
【００５８】
特に有利なＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンは、工程(iv)を、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１(V/V)混合物中、約６０℃において約150分間で行う上記方法によって得られるものである。
【００５９】
Ｋ５から誘導される好ましい種類のグリコサミノグリカンは、予め精製したＫ５について上記工程(ｉ)〜(vi)を行い（これによって、工程(iv)は、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１混合物中、約６０℃において約150分間加熱することによって行われる）、このようにして得られたＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を、任意に、亜硝酸での低分子化及び続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元に供することによって得られる。
【００６０】
好適には、上記の他の塩は、他のアルカリ金属又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又亜鉛塩である。
【００６１】
上記工程(ｉ)〜(vi)でなり、任意の低分子化及び塩の形成を含む方法に従って得られるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンは、下記に示す構造（Ｉ）を有する。
【００６２】
このように、本発明の他の目的は、鎖混合体によって構成されるグリコサミノグリカンであって、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ
【化２】
0004267916.tif 000002
（式中、ウロン酸単位の４０〜６０％がイズロン酸のものであり；ｎは３〜100の整数であり；Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は水素原子又はＳＯ3-基であって、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の約６５〜約５０％は水素であり、残りは、次のように分布するＳＯ3-基であり：Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９５％であり：Ｒ2はＳＯ3-基約１７〜約２１％であり：Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約１５〜約３５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり：Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約２０〜約４０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり：Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計は３〜７％であり；Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の２５〜４５％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.３〜約２.９であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）で表されるものである新規なグリコサミノグリカンを提供することにある。
【００６３】
この明細書において、表現「化学的に許容される」とは、例えば、アンモニウム又はトリ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウムイオンのような化学合成に有用な又は生成物の精製に有用なカチオンをいう。
【００６４】
好適には、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の約６０〜約５５％が水素であり、残りが、硫酸化度約２.４〜約２.７のためのＳＯ3-基である。
【００６５】
有利な低分子量グリコサミノグリカンは、鎖の少なくとも８０％が、式Ｉ（式中、ｎは３〜１５である）を有するものである鎖混合体で構成される。
【００６６】
これらの低分子量グリコサミノグリカンの中でも、鎖混合体が約2,000〜約10,000の分子量分布（平均分子量約4,000〜約8,000）を有するものであるグリコサミノグリカンが特に好適である。
【００６７】
この種の好適なグリコサミノグリカンは、平均分子量約6,000〜約8,000をもつ鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり、Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９０％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５〜約３０％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０〜約３５％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約３０〜約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.５〜約２.７であり；対応するカチオンが化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものである）で構成される。
【００６８】
この種の特に好適な低分子量グリコサミノグリカンは、平均分子量約7,000をもつ鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり、Ｒ3はＳＯ3-基約８５％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約2.55であり；対応するカチオンが化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものである）で構成される。
【００６９】
グルクロン酸部の３位及びイズロン酸部の２位における硫酸基の百分率は、工程(iv)後に得られる化合物について13C-NMRを行い、それぞれ、３-Ｏ-スルホ-グルクロン酸単位及び２-Ｏ-スルホ-イズロン酸単位による８３及び６２ppmにおけるピークの面積を測定し、硫酸基の総量に関して、工程(vi)において添加されたＳＯ3-基の百分率が無視できるものであることを考慮することによって決定される。
【００７０】
有利な化学的及び薬学上許容されるカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又亜鉛に由来のものであり、ナトリウム及びカルシウムイオンが特に好適である。
【００７１】
有利な高分子量グリコサミノグリカンは、鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも８０％が、式Ｉ（式中、ｎは２０〜100である）を有するものである）で構成される。
【００７２】
これらのグリコサミノグリカンの中でも、鎖混合体が分子量分布約9,000〜約60,000（平均分子量約12,000〜約30,000）を有するものあるグリコサミノグリカンが好ましい。
【００７３】
この種の特に好適な高分子量グリコサミノグリカンは、平均分子量14,000〜16,000をもつ鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり、Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９０％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５〜約３０％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０〜約３５％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲ2は、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約３０〜約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.５〜２.７であり；対応するカチオンは化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものである）で構成される。好適な平均分子量は約15,700である。
【００７４】
連続する上記工程(ｉ)〜(vi)を包含してなり、任意の低分子化及び塩の形成を含む方法によって得られる新規なグリコサミノグリカン、特に、鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、上記に定義したとおりである）を有するものであり、対応するカチオンが、化学的又薬学上許容されるもの、好ましくは、ナトリウム又はカルシウムイオンである）を有するものである）で構成されるグリコサミノグリカンは、凝固パラメーターに関する興味深い生物学的活性を示す。特に、前記の新規なグリコサミノグリカンは、標準ヘパリンと少なくとも同程度の抗-Ｘａ及びHCII活性、標準ヘパリンよりも高い抗-IIa（アンチトロンビン）活性、及び標準ヘパリンよりも低い全体的抗凝固活性（aPTT力価として表示）を発揮する。さらに詳述すれば、新規なグリコサミノグリカンは、１.５〜３の抗-Ｘａ／aPTT比、HCII／aPTT比及び抗-IIa／抗-Ｘａ比及び１〜３のHCII／抗-Ｘａ比を示す。
【００７５】
その特性のため、本発明のグリコサミノグリカンは、凝固の制御及び血栓症の治療、特に血栓症の予防又は治療のために、単独で又は許容されるキャリヤー又は稀釈剤と組み合わせて使用される。
【００７６】
従って、本発明の他の目的は、有効成分として、上記のように、任意の低分子化及び薬学上許容される塩の生成を含め、上記工程(ｉ)〜(vi)を実行する方法に従って得られるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンの薬理的に有効な量を、薬学上許容されるキャリヤー又は稀釈剤と組み合わせて含有してなる医薬組成物を提供することにある。
【００７７】
好ましくは、有効成分は、上記工程(ｉ)〜(vi)に従い、予め精製したＫ５を出発原料として、工程(iv)を、ジメチルスルホキシド／メタノールの９／１(V/V)混合物中、約６０℃において約150分間で行い、工程(vi)の終了時に得られるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を低分子化する共に、薬学上許容される塩を形成することによって得られる。好ましくは、このようにして得られるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカン有効成分は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は亜鉛塩の形である。
【００７８】
特に、本発明は、鎖混合体（ここで、鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の４０〜６０％がイズロン酸のものであり；ｎは３〜100の整数であり；Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は水素原子又はＳＯ3-基であって、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の約６５〜約５０％は水素であり、残りは、次のように分布するＳＯ3-基であり：Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９５％であり：Ｒ2はＳＯ3-基約１７〜約２１％であり：Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約１５〜約３５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり：Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約２０〜約４０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり：Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計は３〜７％であり；Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の２５〜４５％において共に水素であり；硫酸化度は約２.３〜約２.９であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものである）で構成されるグリコサミノグリカンの薬理的に有効な量を有効成分とし、及び薬学上許容されるキャリヤーを含有してなる医薬組成物を提供する。
【００７９】
さらに詳述すれば、上記組成物は、凝固の制御又は血栓症の予防又は治療に使用される。
【００８０】
上記医薬組成物において、静脈内、皮下又は局所適用のために、グリコサミノグリカン有効成分は、凝固システムの障害によって生ずる疾患、例えば、動脈又は静脈血栓症の予防又は治療、血腫の治療、又は外科手術の間における凝固調節剤として有効な用量で存在する。
【００８１】
静脈内又は皮下適用のための調製物では、グリコサミノグリカン有効成分は、必要であれば緩衝剤の存在下、水に溶解され、この溶液は、殺菌条件下、バイアル又は注射器内に導入される。
【００８２】
医薬組成物の単位用量は、水０.１〜２mlに溶解した有効成分５〜100mg、有利には２０〜５０mgを含有する。
【００８３】
局所適用のための組成物では、グリコサミノグリカン有効成分は、ゲル、クリーム、軟膏、噴霧されるローション又はスプレー用溶液の調製に関して当分野で公知の薬学上許容されるキャリヤー又は稀釈剤と混合される。この組成物では、グリコサミノグリカン有効成分は、好ましくは、0.01〜１５質量％の濃度で存在する。
【００８４】
有利な医薬組成物は、有効成分として、既に説明したような式Ｉで表される鎖混合体（ここで、対イオンが薬学上許容されるもの、有利には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム及び亜鉛イオンでなる群から選ばれるカチオン、好ましくは、ナトリウム又はカルシウムイオンである）で構成されるグリコサミノグリカンの薬理的に有効な量、及び薬学上許容されるキャリヤーを含有してなる。
【００８５】
これらの有利なグリコサミノグリカンの中でも、式Ｉ（式中、ｎは３〜１５又は２０〜100である）を有する鎖少なくとも８０％を含有するものが好ましい有効成分であり、特に、鎖混合体が、分子量分布約2,000〜10,000（平均分子量約4,000〜約8,000）、又は分子量分布約9,000〜約60,000（平均分子量約12,000〜約30,000）を有するものであるグリコサミノグリカンが好ましい。
【００８６】
特に有利な医薬組成物は、低分子化された鎖混合体で構成され、前記鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の４０〜６０％がイズロン酸のものであり；ｎは３〜100の整数であり；Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は水素原子又はＳＯ3-基であり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の約６５〜約５０％は水素であり、残りは、次のように分布するＳＯ3-基であり：Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９５％、好ましくは約８５％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約１７〜約２１％、好ましくは約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約１５〜約３５％、好ましくは約２５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約２０〜約４０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計は３〜７％であり；Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の２５〜４５％において共に水素であり；硫酸化度は約２.３〜約２.９、好ましくは約２.４〜約２.７であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）で表されるものであるグリコサミノグリカンであって、前記低分子化された鎖の混合体が、分子量分布約2,000〜約10,000及び平均分子量約4,000〜約8,000をもつ鎖少なくとも８０％を含有するものであるグリコサミノグリカンを有効成分として含有する。
【００８７】
有利な医薬組成物は、平均分子量約6,000〜約8,000をもつ鎖混合体で構成され、前記鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり；Ｒ3はＳＯ3-基約８５〜約９０％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５〜約３０％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０〜約３５％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計は約５％であり；Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約３０〜約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約２.５〜約２.７であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものであるグリコサミノグリカンを有効成分として含有する。
【００８８】
この種の好適な低分子量グリコサミノグリカン有効成分は、平均分子量約7,000を有する鎖混合体であって、前記鎖の少なくとも９０％が、式Ｉ（式中、ウロン酸単位の約５５％がイズロン酸のものであり；Ｒ3はＳＯ3-基約８５％であり；Ｒ2はＳＯ3-基約２０％であり；Ｒ1は、イズロン酸単位においてＳＯ3-基約２５％及びグルクロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒは、グルクロン酸単位においてＳＯ3-基約３０％及びイズロン酸単位においてＳＯ3-基０〜約５％であり；Ｒ1、グルクロン酸単位における及びＲ、イズロン酸単位におけるＳＯ3-基の百分率の総計が約５％であり；Ｒ1及びＲは、同時にＳＯ3-基であることはなく、ウロン酸単位の約４０％において、共に水素であり；硫酸化度は約2.55であり；対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである）を有するものである鎖混合体で構成される。特に好適なグリコサミノグリカン有効成分は、これら特性を有するものであって、平均分子量約7,400をもつ。
【００８９】
最後に、本発明は、凝固の制御及び血栓症の治療のための前記グリコサミノグリカンの有効量に関する。
【００９０】
このように、本発明の他の目的は、哺乳動物において凝固を制御する、又は血栓症を予防又は治療する方法において、凝固の制御又は血栓症の予防又は治療が必要な哺乳動物に、任意の低分子化及び薬学上許容される塩の形成を含め、上記工程(ｉ)〜(vi)が行われる方法に従って得られるＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を投与することを特徴とする哺乳動物における凝固の制御又は血栓症の予防又は治療の方法を提供することにある。
【００９１】
さらに詳述すれば、上記方法は、前記哺乳動物に、鎖混合体で構成されるグリコサミノグリカンであって、前記鎖の少なくとも９０％が、既に説明し、定義した式Ｉを有するものであるグリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を投与することを包含する。
【００９２】
好ましくは、本発明の方法は、哺乳動物に、上述の医薬組成物の薬理学的に有効な用量を投与することを包含する。
【００９３】
下記の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明はこれらに限定されない。
【００９４】
実施例において、グリコサミノグリカンの分子量及び生物学的活性の代表的な特性を、分別していないヘパリン（第４の国際基準）及び低分子量ヘパリン（第１の国際基準）と比較して説明する。
【００９５】
分子量、特に平均分子量は、Harenberg及びDe Vries, J. Chromatography, 1983, 261, 287-292に従い、シングルカラム（Pharmacia 75HR）又は２個のカラム（BioRad Bio-sil SEC 250）を使用して算定した。最終生成物の分子量は、本発明の方法の反応条件のため、原料の多糖体のものと相違していてもよい。
【００９６】
抗-Ｘａ活性については、ヘパリンの第４の国際基準に対して、D.P. Thomasら, Thrombosis and Haemosatasis, 1981, 45, 214に従って測定した。
【００９７】
全体的抗凝固活性に関するaPTTテストについては、Anderssonら, Thrombosis Reserach, 1976, 9, 575に従って実施した。
【００９８】
HCII活性に関するテストを、水に溶解したHCII（Stago）の0.05PEU（血漿当量単位）/mlの溶液２０μlを、異なる濃度の検査サンプルの溶液８０μl、及び0.15Ｍ HCl及び０.１％ PEG-6,000を含有する0.02Ｍ tirs緩衝液（ｐＨ７.４）におけるトロンビン（0.18 Ｕ/ml；Boehringer）５０μlと混合することによって実施した。溶液を、３７℃において６０秒間培養し、ついで、１mM 色素産生基質 Spectrozyme（American Diagnostic）５０μlを添加する。自動凝固計 ACL 7000（Instrumentation Laboratory）を使用し、405nmにおいて毎秒毎に測定して、反応を180秒間連続して記録する。
【００９９】
抗-IIaテストについては、０.１Ｍ tris緩衝液（ｐＨ７.４）に溶解したATIII（Chromogenix）０.５Ｕ/mlの溶液３０μlを、異なる濃度の検査サンプルの溶液３０μl、及び０.１Ｍ tirs緩衝液（ｐＨ７.４）におけるトロンビン６０μl（５.３nKat（酵素活性の単位）/ml；Chromogenix）と混合することによって実施した。溶液を、３７℃において７０秒間培養し、ついで、０.５mM 色素産生基質 S-2238（Chromogenix）水性液６０μlを添加する。自動凝固計 ACL 7000（Instrumentation Laboratory）を使用し、405nmにおいて毎秒毎に測定して、反応を９０秒間連続して記録する。
【０１００】
ATIIIに関する親和性を、Hookら, FEBS Letters, 1976, 66, 90-93に従って測定した。
【０１０１】
【実施例１】
イタリー国特許出願第 MI 99A001465号（WO 01/02597）に記載の発酵によって得られた純度８０％（図２）の多糖体Ｋ５  １０ｇを脱イオン水に溶解して、１％溶液を得た。Triton X-100を添加して濃度５％とし、撹拌下、溶液を５５℃に２時間に維持した。溶液を７５℃とし、均質な濁った系が得られるまで、この温度に維持し、ついで、液を室温に迅速に冷却させた。冷却の間に、２相が形成された。上相（有機相）について、前記熱的処理を２回繰り返し実施した。Ｋ５を含有する水性相を、減圧下、最終的に１／１０に濃縮し、アセトン又はエタノールによって沈澱処理した。有機相については廃棄した。
【０１０２】
得られた生成物は、純度９０％（基準のスペクトル（図１）と比較してプロトンNMR（図３）によって検出した）及び２個のカラム（BioRad Bio-sil SEC 250）を使用するHPLC分析における保持時間９分をもつＫ５であった。
【０１０３】
方法を下記の工程に従って実施した：
【０１０４】
（ｉ）予め精製したＫ５を、２Ｎ水酸化ナトリウム1,000mlに溶解し、６０℃に１８時間維持した。溶液を室温に冷却し、ついで、６Ｎ塩酸にてｐＨを中性とした。Ｎ-脱アセチル化Ｋ５が得られた。
【０１０５】
Ｎ-脱アセチル化Ｋ５を含有する溶液を４０℃に維持し、炭酸ナトリウム１０ｇを一度に添加し、ピリジン・三酸化イオウ付加物２０ｇを１０分間で添加した。反応終了時、溶液を室温に冷却し、ついで、５％塩酸溶液にてｐＨを７.５〜８とした。
【０１０６】
得られた生成物（Ｎ-硫酸Ｋ５）を、1,000Ｄカットオフスパイラル膜（プレプスケールカートリッジ；Millipore）を使用するダイアフィルトレーションによって塩から精製した。透過物の伝導率が100μS未満となった時点で精製プロセスを停止した。膜によって保持された生成物を、同じダイアフィルトレーションシステムを使用して１０％多糖体に濃縮し、ついで、凍結乾燥させた。
【０１０７】
得られた生成物におけるＮ-硫酸／Ｎ-アセチルの比は、13C-NMRによって測定して９.５／０.５であった（図４）。
【０１０８】
（ii）１．不動化Ｃ５エピメラーゼの調製
WO 98/48006に従って得られた組み換えＣ５エピメラーゼ５ｇ（０.１Ｍ KCl、０.１％ Triton X-100及び１５mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する２５mM Hepes緩衝液（ｐＨ７.４）200mlに溶解した１.２×１０11cpm（分当たりの個数）に相当する）に、工程(ｉ)に記載のようにして得られたＮ-硫酸Ｋ５ 100mgを添加した。溶液について、透過物においてＮ-硫酸Ｋ５が消失するまで、４℃において、30,000Ｄ膜にてダイアフィルトレーションを行った。膜によって保持された溶液について、ｐＨ７での200mM NaHCO3に対するダイアフィルトレーションによって緩衝液を交換し、５０mlに濃縮した後、CNBr活性化 Sepharose 4B樹脂５０mlを添加し、４℃において一夜反応させた。反応終了時、上澄みにおける残留酵素の量を、遠心分離後、Quantigold法（Diversified Biotec）によって測定した。上澄み中には酵素は存在しておらず、これは、上記方法によって、酵素の100％が不動化されたことを示す。なお利用可能なサイトを塞ぐため、樹脂を、100mM tris（ｐＨ８）にて洗浄した。不動化酵素の活性を測定するため、理論的に１.２×１０7cpmに相当する量の不動化酵素をカラムに負荷した。得られたカラムにおいて、０.１Ｍ KCl、0.015Ｍ EDTA、0.01％ Triton X-100を含有する２５mM Hepes緩衝液（ｐＨ７.４）中に溶解させた上記工程(ｉ)に記載のようにして得られたＮ-硫酸Ｋ５ １mgを、前記カラム内を、３７℃において、流速０.５ml/分で一夜再循環させることによって溶解させた。
【０１０９】
DEAEクロマトグラフィーシステムによる精製及びSephadex G-10上での脱塩の後、サンプルを凍結乾燥し、WO 96/14425に既に記載されているようなプロトンNMRによって、イズロン酸におけるその含量を分析した。
【０１１０】
イズロン酸／グルクロン酸の比は３０／７０であった（図５）。
【０１１１】
２．エピマー化
Ｎ-硫酸Ｋ５ １０ｇを、５０mM CaCl2を含有する２５mM Hepes緩衝液（ｐＨ７）600ml中に溶解した。得られた溶液を、不動化酵素をもつ樹脂を収容するカラム（５０ml）内で再循環させた。
【０１１２】
この反応を、３０℃において、流速200ml/時間で２４時間行った。得られた生成物を、限外濾過又は沈殿によって精製した。ペレットを濃度１０％で水に溶解させた。
【０１１３】
イズロン酸／グルクロン酸の比５４／４６（原料では０／100）をもつエピマー化生成物が得られた。
【０１１４】
エピマー化の百分率を1H-NMRによって算定した（図６）。
カルバゾール法（Bitter及びMuir, Anal. Biochem., 39, 88-92(1971)）によって、基準に対してウロン酸含量を測定して算定した収率は９０％であった。
【０１１５】
（iii）工程(ii)において得られたエピマー化生成物を含有する溶液を、冷却浴によって１０℃に冷却し、ついで、IR 120 H+カチオン交換樹脂（５０ml）上に負荷した。カラム及び溶離された溶液の容器の両方を１０℃に維持した。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水３容にて洗浄した。通過流体のｐＨは６より大である。酸性溶液を、１５％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液にて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中、溶液を１／１０の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。生成物を、ジメチルホルムアミド（DMF）200ml中に懸濁化させ、DMF 200ml中に溶解したピリジン・ＳＯ3付加物150ｇを添加した。溶液を４５℃に１８時間維持した。反応終了時、溶液を室温に冷却し、塩化ナトリウム飽和アセトン1,200mlを添加した。得られたペレットを、濾過によって溶媒から分離し、脱イオン水100mlで溶解させ、塩化ナトリウムを濃度０.２Ｍとなるように添加した。溶液を、２Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ７.５〜８とし、アセトン300mlを添加した。ペレットを濾過によって分離した。得られた固体を、脱イオン水100mlにて溶解させ、工程(ｉ)において記載のようなダイアフィルトレーションによって残留塩から精製した。
【０１１６】
乾燥させた少量の過硫酸化生成物に関する13C-NMR分析を図７に示す。
【０１１７】
（iv）工程(iii)の生成物を含有する溶液を、IR 120 H+カチオン交換樹脂（５０ml）上を通過させた。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水３容にて洗浄した。通過流体のｐＨは６より大であった。酸性溶液を、ピリジンにて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中、４０℃で、溶液を１／１０の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。ピリジン塩として得られた生成物に、DMSO／メタノール（９／１；V/V）溶液500mlを添加した。溶液を６０℃に２.５時間維持し、ついで、脱イオン水５０mlを添加し、最後に、塩化ナトリウム飽和アセトン1,650mlにて処理した。得られた固体を、工程(ｉ)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製し、濃度１０％の溶液を得た。
【０１１８】
図８に示した乾燥させた少量のサンプルについての13C-NMR分析は、アミノ糖の６位における硫酸基の含量が２０％であることを示した。
【０１１９】
（ｖ）工程(iv)の生成物を含有する溶液を、IR 120 H+カチオン交換樹脂（５０ml）上を通過させた。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水３容にて洗浄した。通過流体のｐＨは６より大であった。酸性溶液を、１５％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液にて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中で、溶液を１／１０の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。テトラブチルアンモニウム塩として得られた生成物を、DMSO 200ml中に懸濁化させた。懸濁液を０℃に冷却し、DMF 100mlに溶解したピリジン・ＳＯ3付加物４０ｇにて処理した。硫酸化剤を一度で添加した。溶液を０℃に１.５時間維持し、ついで、塩化ナトリウム飽和アセトン750mlにて処理した。
【０１２０】
得られた固体を、工程(ｉ)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製した。
【０１２１】
（vi）工程(ｖ)の溶液を、Ｎ-硫酸化のため、工程(ｉ)に記載のように処理した。得られた生成物の乾燥した少量のサンプルに関する13C-NMRを図９に示す。得られた化合物は、平均分子量（Harenberg及びDe Vries, J. Chromatographyに従い、２個のカラム（BioRad Bio-sil SEC 250）を使用して測定）15,700、硫酸基／カルボキシル基の比2.55、イズロン酸含量５４％、Ｎ-硫酸含量＞９０％、６-Ｏ硫酸含量８５％、３-Ｏ硫酸グルコサミン含量２０％、イズロン酸２-Ｏ硫酸含量２５％、グルクロン酸３-Ｏ硫酸含量３０％、Ｏ-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約４０％を示した。硫酸基／カルボキシル基の比2.55を考慮すると、差によって、２-Ｏ硫酸グルクロン酸及び３-Ｏイズロン酸単位に硫酸基約５％が存在することが算定される。さらに、得られた化合物は、ATIII高親和性フラクション５５％を含有し、次のインビトロ抗凝固活性（標準ヘパリンのもの（100として）と比較して）：抗-Ｘａ 157；aPTT ７８；抗-IIa 373；HCII 161を有する。
【０１２２】
【実施例２】
実施例１の工程(vi)の終了時に得られたＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５を、WO 82/03627に記載のように、制御した条件下、亜硝酸にて低分子化した。さらに詳述すれば、サンプル５ｇを水250mlに溶解し、恒温浴にて４℃に冷却した。予め４℃に冷却した１Ｎ塩酸にてｐＨを２とし、ついで、１％亜硝酸ナトリウム溶液１０mlを添加し、必要であれば、１Ｎ塩酸にてｐＨを２とする。混合物を緩やかな撹拌下に１５分間維持し、予め４℃に冷却した１Ｎ NaOHにて溶液を中性とし、ついで、脱イオン水１３mlに溶解した水素化ホウ素ナトリウム250mgを添加し、緩やかな撹拌を４時間続けた。混合物のｐＨを１Ｎ塩酸にて５とし、ついで、混合物を１０分間撹拌下に放置して、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させ、最後に、１Ｎ NaOHにて中和させた。生成物を、エタノール３容での沈澱及び真空オーブンでの乾燥によって回収した。図１０に、このようにして得られた化合物の13C-NMRスペクトルを示す。化合物は、平均分子量 7,400、硫酸基／カルボキシル基の比2.55、イズロン酸含量５４％、Ｎ-硫酸含量＞９０％、６-Ｏ硫酸含量８５％、３-Ｏ硫酸グルコサミン含量２０％、イズロン酸２-Ｏ硫酸含量２５％、グルクロン酸３-Ｏ硫酸含量３０％、Ｏ-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約４０％を有する。硫酸基／カルボキシル基の比2.55を考慮すると、差によって、２-Ｏ硫酸グルクロン酸及び３-Ｏイズロン酸単位に硫酸基約５％が存在することが算定される。さらに、このようにして得られたグリコサミノグリカンは、ATIII高親和性フラクション３４％を含有し、次のインビトロ抗凝固活性（標準ヘパリンのもの（100として）と比較して）：抗-Ｘａ ９９；aPTT ５２；抗-IIa 203；HCII 108を有する。低分子量ヘパリン（LMWH）の第１の国際基準の活性（100とする）との比較では、このようにして得られた低分子化したＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５グリコサミノグリカンは、次の抗凝固活性：抗-Ｘａ 117；aPTT 173；抗-IIa 615（LMWHについては、HCIIは測定されていない）を示した。これらの結果は、このようにして得られたＣ５エピマー化Ｎ,Ｏ-硫酸Ｋ５に関して、
−抗-IIa／aPTT及び抗-IIa／抗-Ｘａの比は、標準ヘパリンのものの、それぞれ、約４倍及び約２倍であること；
−抗-IIa／aPTT及び抗-IIa／抗-Ｘａの比は、標準LMWHのものの、それぞれ、約３.５倍及び約５倍であること；
−HCII／aPTT及びHCII／抗-Ｘａの比は、標準ヘパリンのものの、それぞれ、約２倍及びほぼ同程度であること；
−抗-Ｘａ及びHCII活性は、標準ヘパリンのものとほぼ同程度であり、aPTT活性は、標準ヘパリンのものの約１／２であることを示している。
【０１２３】
【実施例３】
工程(ii)において、Jin-Ping L.らによって記載された（ヘパリン及びヘパリン硫酸塩の生合成に関与するＤ-グルクロノシル-Ｃ５エピメラーゼの特徴付け, Journal Biological Chemistry, 2001, Vol. 276, 20069-20077）ようにして得られた組み換え酵素を使用して、実施例１の各工程を再度行った。得られた化合物は、平均分子量（Harenberg及びDe Vries, J. Chromatographyに従い、２個のカラム（BioRad Bio-sil SEC 250）を使用して測定）14,900、硫酸基／カルボキシル基の比２.７、イズロン酸含量５４％、Ｎ-硫酸含量＞９０％、６-Ｏ硫酸含量９０％、３-Ｏ硫酸グルコサミン含量２０％、イズロン酸２-Ｏ硫酸含量３０％、グルクロン酸３-Ｏ硫酸含量３５％、Ｏ-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約３０％を示した。硫酸基／カルボキシル基の比２.７を考慮すると、差によって、２-Ｏ硫酸グルクロン酸及び３-Ｏイズロン酸単位に硫酸基約５％が存在することが算定される。さらに、得られた化合物は、次のインビトロ抗凝固活性（標準ヘパリンのもの（100として）と比較して）：抗-Ｘａ 166；aPTT ７６；抗-IIa 400；HCII 283を示す。
【０１２４】
さらに詳細に述べなくとも、上記の記述を使用することによって、当業者であれば、本発明を充分に活用できるものと確信する。上述の好適な具体例は、単なる説明のためのものであって、いずれにしても、発明を限定するものではない。
【０１２５】
上記の記載から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確信でき、その精神及び範囲を逸脱することなく、各種の利用及び条件に適合するように、本発明の各種の変化及び変更をなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Vann W.F.ら, 1981 European Journal of biochemistry 116, 359-364に従って得られたものであって、1H-NMRスペクトルの４.９〜５.２ppm領域にけるピークがほぼ完全に消失するまで繰り返し精製を行った基準として機能する多糖体Ｋ５の1H-NMRスペクトルを示す。
【図２】  実施例１の原料多糖体Ｋ５の1H-NMRスペクトルを示す。
【図３】  実施例１の(ｉ)において原料として使用する精製多糖体Ｋ５の1H-NMRスペクトルを示す。
【図４】  実施例１の(ｉ)において得られたＮ-硫酸Ｋ５の13C-NMRスペクトルを示す。
【図５】  実施例１の(ii-１)における不動化Ｃ５エピメラーゼの効率を表す1H-NMRを示す。
【図６】  実施例１の(ii)の終了時に得られたエピマー化生成物の1H-NMRスペクトルを示す。
【図７】  実施例１の(iii)において得られた過硫酸化化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図８】  実施例１の(iv)において得られたジスルフィド化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図９】  実施例１の(vi)において得られた化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図１０】  実施例２において得られた低分子量化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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