(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリペプチドの発現および分泌をするように遺伝的に形質転換された細胞を有する植物から異種ポリペプチドを回収する方法であって、以下の工程、すなわち：
(ａ) 当該植物、または当該異種ポリペプチドを発現している当該植物の無傷の部分を、外部から水性培地と接触させて、当該培地と当該植物の滲出物とを混合させ、および
(ｂ) 工程(ａ)で得た混合物から当該ポリペプチドを回収する、
工程を含む、ことを特徴とする異種ポリペプチドを回収する方法。
【請求項２】
前記滲出物が、滴状液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程(ａ)が、水耕栽培、空中栽培、および、土壌栽培からなる群から選択される培養系で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(ａ)および工程(ｂ)が、継続して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記植物が、タバコ、トマト、アブラナ、ライグラス、アルファルファ、シバクサ、アマモ、ウィルギオングラス、ウキクサ、アカウキクサ、浮稲、および、ホテイアオイからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
異種ポリペプチドの発現および分泌をするように遺伝的に形質転換された細胞を有する植物から異種ポリペプチドを回収するための方法であって、当該植物の滲出物から当該ポリペプチドを回収する工程を含む、ことを特徴とする異種ポリペプチドを回収する方法。
【請求項７】
前記滲出物が、滴状液である請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物からの産物を回収するための方法に関する。詳細には、本発明は、植物及びその無傷部分から異種ポリペプチドを発現及び回収するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
化学物質の生物学的生産方法は、特に、ポリペプチドやタンパク質などの複雑な生化学物質の製造において、従来の化学合成法に代わるものとして有望であることが示されている。しかし、これらの生物学的方法の可能性は、化学製品としての自己再生する生命体に依存することになるが、まだ完全には理解されていない。さまざまな化学物質の供給源となりうるものとして、いくつかの生物系を探すことに成功したが、どの系にもそれぞれ限界があることが分かっている。
【０００３】
化学物質を生物学的に生産する方法として、もっとも簡単かつ徹底的に調べられているのは微生物系である。原始的な原核細胞は、調査しやすく、さまざまな有機および無機の低分子化合物、および、同種および異種由来のポリペプチドおよびタンパク質などのさまざまな複雑な生体分子を産生することが分かっている。もっともよくその性質が解っている原核生物である大腸菌（Escherichia coli）は、最小の発現調節因子と間断のないコーディング領域とを必要とする、比較的単純な遺伝子発現プロセスを用いて複雑な生体分子を合成する。さらに、大した手間をかけずに、異種由来のポリペプチドをコードする遺伝的因子を導入して、大腸菌の中で発現させることもできる。このような利点があるため、多様なポリペプチドが、この生物の中で制御を受けつつ発現されてきた。しかしながら、大腸菌を培養するには、高価なエネルギーと栄養分を供給する必要がある。また、所望の化合物を単離するのに時間と費用がかかることに加えて、この生物は、簡単には、産生したポリペプチドを分泌しない。例えば、バチルス属の生物種など、他の微生物は、増殖培地中にポリペプチドを分泌するが、これらの生物の培養にも、高価なエネルギーと栄養分の供給が必要となる。さらに、これらの原始的な原核生物系はすべて、培地の汚染を防止するために費用がかかることや、これらの生物では、発現されたポリペプチドの多くを充分な生物活性型になるよう適正に加工ないし誘導体化することが不可能であるなどという別の短所をもっている。
【０００４】
非常に原始的な真核細胞である酵母も、異種由来ポリペプチドなどの化学物質を産生するために用いられてきた。商業上最も望ましい（すなわち、真核生物の）ポリペプチドの自然な誘導体化を再現するという仕事をより上手に行なうことができるが、その再現は不完全なものである。さらに、酵母細胞の培養も汚染に弱く、細胞自体も、高価なエネルギー源および栄養源を必要とする。異種由来ポリペプチドなど、所望の化学物質を得ようとすると、細胞から頻繁に化学物質を抽出して、抽出中に放出される化学的に複雑な酵母細胞内容物から該化合物を精製する必要があるということも負担となる。
【０００５】
植物細胞も、天然の異種由来ポリペプチドなどの化学物質を産生するとのことである。現在の遺伝子組換え技術では、多様な植物細胞系に遺伝子導入することが可能になっている。また、多くの調節因子およびシグナル配列が、植物細胞の中で異種由来の遺伝子産物の発現を促進させることが解っている。さらに、植物細胞培養では、異種由来タンパク質が低量分泌されることが示されている。Penら、Bio/Technology 10:292-296 (1992)は、バクテリアのα-アミラーゼのシグナル配列によって、このタンパク質がタバコ細胞から直接分泌されるらしいことを報告している。このように、植物細胞壁が、150 kDaの大きさのポリペプチドを透過させえることが明らかになっている。Esakaら、Phytochem. 28:2655-2658 (1989), Esakaら、PhsiologiaPlantanum 92:90-96(1994), Esakaら、Plant Cell Physiol. 36:441-446 (1995),およびLiら、Plant Physiol. 114:1103-1111 (1997)の記載によれば、これらの手段を用いて植物細胞を改造し、さまざまな異種由来ポリペプチドを産生および分泌させたとのことである。植物細胞の中で産生された他のポリペプチドには、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、大腸菌由来のエンテロトキシンB（LT-B）サブユニット（下痢の誘導因子）、さまざまな抗体、ヒト成長因子、およびホルモンなどがある。これらの細胞は、所望のポリペプチドを分泌するが、これらの系でも、ポリペプチド回収に必要となる費用を増加させることになる、エネルギーおよび栄養分の供給が必要となる。
【０００６】
哺乳動物細胞は、重要なポリペプチドの多く（例えば、ヒトのポリペプチド）の本来の起源に非常に近縁だと考えられるが、汚染に弱く、エネルギー、ガス、および栄養に対する要求性が高く、また、生存期間が短いため、培養するのに非常な費用がかかる。また、一般的には、哺乳動物細胞は産物を分泌することができないこと、および、これらの細胞内環境の化学的な複雑性が相対的に高いことを考えると、産生された化学物質を単離するにも、想定的に費用がかかることになろう。
【０００７】
組織のような、より複雑な生命形態が、異種由来ポリペプチドなどの化学物質の実際的な供給源となることは明らかになっていない。簡単に言うと、組織培養には、細胞培養について考察した上記文中部分で指摘した短所による問題がある。同様に、器官培養も、商業的規模での化学物質生産の中心となったことはない。一般的に、多細胞生物の細胞、組織、および器官では、それらの生存と生産能力を確実にするための費用のかかる介入が必要となる。
【０００８】
また、導入遺伝子から発現される異種由来ポリペプチドなど、所望の化学物質を生産するために、生物が採用されたこともある。生物自体を用いる方法には、上記の方法の制約となる制限のいくつかがない。例えば、比較的限られた化学物質を一組供給すれば、生物がもつ合成能力によって、生存増殖するのに必要な化学物質の完全なセットに変換することができる。おそらく、この理由で、生物自体を用いる方法が、細胞、組織、または器官を用いる方法よりも難しいと思われるのであろう。それにもかかわらず、生物、特に、動物のような従属栄養生物は、エネルギー源および必須栄養源を具備するために、化学物質の供給を必要とする。また、しばしば、感染などから生じる病気を防ぐ努力もしなければならない。
【０００９】
植物は、光独立栄養生物として、化学物質の生産を行うための、従属栄養動物に代わる生命体を提供する。一般的には、その植物自体の性質を改良するため（例えば、病気に対する抵抗性を付与したり、食用部分の収量を向上させるため）にではあるが、遺伝子導入植物が作出されている。それにもかかわらず、遺伝子導入植物には、異種由来ポリペプチドなどの化学物質を生産させるために用いられてきたものもある。上記したように、さまざまな発現調節配列（例えば、制御因子、シグナルペプチド配列）が、植物細胞の中で一般的に機能するか、または、特定の植物組織・器官の細胞内で選択的に機能することが分かっている。例えば、Sijmonsら（米国特許第5,650,307号）は、ヒト血清アルブミン（HSA）のコーディング領域を、アルファルファモザイクウイルスのリーダー配列と融合させて、HSAを発現させた。この融合コーディング領域は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとノパリン合成酵素ターミネーターの調節下に置いた。HSAは、遺伝子導入ジャガイモと遺伝子導入タバコ細胞の中で発現した。さらに、Sijmonsらは、ジャガイモの細胞からHSAが分泌され、これらの植物の細胞間領域から異種由来のHSAが回収されたことを開示している。勿論、この回収法は、ジャガイモの植物体を破壊することを含んでいる。
【００１０】
また、米国特許第5,580,768号も、異種由来タンパク質の植物による産生および分泌を開示している。特に、'768号特許は、遺伝子導入ゴムの木を、乳液の一部として切り口から採集される、導入遺伝子の発現タンパク質とともに開示している。この系は、パラゴムノキ属（Hevaea）の植物種（生育の遅い多年生樹木種）において利用できるよう、高度に特殊化されており、異種由来のポリペプチドを乳液混合物の形で回収するためには、切り口を付けて、樹木を損傷しなければならない。
【００１１】
また、形質転換された植物材料を用いて、異種由来のポリペプチドが発現されている。Wongsamuthら、Biotech. and Bioengineer,54:401-415 (1997)は、マウスIgG1モノクローナル抗体を発現させるために、毛根培養を用いたことを報告している。さらに、高価なエネルギーや栄養の供給を必要とする従属栄養生物のバイオマスとして、無菌条件下で維持された毛根培養培地において、抗体活性が見られた。
【００１２】
このように、当技術分野においては、異種由来のポリペプチドなど、さまざまな化学物質を、大量、かつ生物生産者を破壊することなく、経済的に生産および回収するための生物学的方法に対する必要性が継続して存在する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、周囲の培地へと所望の産物を合成及び滲出している植物または植物の部分の滲出物に由来するポリペプチド産物の効率良い回収を提供することにより、当該技術分野における前記要求を満足させるものである。  光合成生物として、植物は生育のために自由太陽エネルギーを利用することができ、そして、所望の化学薬品を製造できる。  光合成に伴い、植物は生育と化学合成に必要な生化学物質の多くを合成し、これらの化合物のための高価な外的供給源を余り必要としない。  低価格であることに加え、本発明の方法により、簡便性及び万能性という点から生じる利点が得られる。  例えば、異種ポリペプチドの製造において、オペレーター発明は、植物または植物の部分へと発現可能な組換えコーディング領域を導入すること、生存性及び発現に必要な最小限の条件を確立すること、そして、植物または植物の部分からの滲出後に、発現されたポリペプチドを収集することに限定されてしまう。  かように、本発明の方法は、植物の創傷または植物バイオマスの維持を欠かすことのできない従来の方法に比較して顕著に遊離なものである。  本発明の方法は、開放系または閉鎖系、そしてコンテナ方式または非拘束方式である、土壌ベース、水性液体ベース(水耕)、および、不活性基質ベース(空中栽培)環境などの、多様な製造システムに適用可能である点において万能である。  本発明の方法の万能性は、使用可能な植物と製造可能な化学薬品の範囲が広く多様であることからも明らかである。
【００１４】
本発明の一つの特徴はこのように、異種ポリペプチドを発現及び分泌するように遺伝的に形質転換された細胞を有する植物から異種ポリペプチドを回収するための方法における改良にあり、係る改良とは、その植物、または発現が起こっている当該植物の無傷の部分を、水性培地と外部から接触させ、当該培地と植物の滲出物とを混合させ、そして、その混合物からポリペプチドを回収する工程を含むことにある。
【００１５】
本発明の方法で使用されるのに好ましいのは、完全体の(無傷な)植物である。  本発明の方法において、広い範囲の浮水、沈水、および、土壌ベースの植物が有用であり、これらには、ライグラス、アルファルファ、シバクサ、アマモ、ウキクサ、およびウィルギオン(wilgeon)グラスなどの単子葉植物、そして、タバコ、トマト、アブラナ、アカウキクサ(Azolla)、浮稲およびホテイアオイなどの双子葉植物、さらに、種々の開花植物が包含される。  組換えポリペプチド発現および滲出を行うことができるさらなる植物もまた、本発明の方法にて使用可能である。  本発明の接触工程には、土壌ベースの栽培、または水耕などの水ベースの栽培、または、空中栽培に依存した培養系が包含されうる。  組換えポリペプチドは、滲出物から回収され、この滲出物は、根茎の滲出物、葉の排水組織を介した滲出物として植物から滲出している滴状(guttation)液、または、他の供給源からの滲出物(木部圧に無関係なもの)であってよい。  本発明の方法における接触および回収工程は、継続的に行われても、またはバッチ方式で行われてもよい。
【００１６】
本発明の他の特徴において、方法の改良は、ポリペプチドを回収するための方法で植物の部分を使用することにある。本発明の方法で使用されるための植物の部分は、無傷且つ生存中の植物構造体である。植物の部分は、明確な植物構造体、例えば、茎、葉、及び根茎であるとよい。あるいは、植物の部分は、その物体が無傷で生存しておれば、植物の器官または組織の部分または全体であってもよい。
【００１７】
本発明のさらなる特徴において、本発明は、植物または植物の部分の、集められた滲出物（好ましくは滴状液）から直接ポリペプチドを回収する工程を含む。回収は継続的に行われてもよい。
【００１８】
本発明の数多くの他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明の内容を考慮すれば明らかになるはずである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、種々の異種ポリペプチドの製造及び回収に容易に適用可能な方法を提供するという点において万能といえる。ポリペプチドとは本明細書中、種々の鎖長及び配列を有するペプチドを包含するものとして定義され、当該技術分野で知られているあらゆる方法にて誘導されたものであってよい。さらには、本明細書中でのポリペプチドの定義は、１本鎖もしくは複数鎖、そして誘導の有無を問わず、タンパク質及びその断片にまで及ぶものである。これらのポリペプチドは、組織特異的植物プロモーター、エンハンサー、分泌シグナル配列及びターミネーターを含めた種々の発現制御配列に連結されうる。これらの発現制御配列は、様々な遺伝子産物の発現に適用可能であることに加えて、製造の時期及び程度に対する制御の水準が得られることとなる。無傷の植物及びその部分の細胞における、このような製造を集中させることにより、本発明では製造時の高価なエネルギー、栄養及び防腐の必要性が排除される。
【００２０】
製造され細胞外に分泌されたポリペプチドは、植物滲出物から回収される。「滲出物」なる語は、滲出することの一般的な意味に該当する。植物生態学的に、本明細書中で「滲出物」は、木部圧、拡散、または輸送の促進（すなわち、分泌）の結果として、植物またはその部分から頻繁に流出または滲出する（している）液体のことである。このように、本発明は製造された化学薬品を単離するための高価な製造後操作も低減させる。さらに、本発明は無制限に持続可能なシステムの実体にあるこれらの利点をも提供するのである。
【００２１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を例証したものである。実施例１には、植物での異種ポリペプチドの発現のための組換えポリヌクレオチドの構築を記載する。実施例２には、組換えポリヌクレオチドを用いた形質転換による、トランスジェニック植物の作製を開示する。実施例３〜６には、キシラナーゼ（原核生物の酵素）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）、緑色蛍光タンパク質（GFP、真核生物のタンパク質）及びＢ型肝炎表面抗原（HbsAg）のそれぞれの、トランスジェニックタバコ植物を用いた製造、分泌／滲出、及び回収を示す。実施例７は、トランスジェニックトマト植物（すなわち、双子葉植物）を用いた、異種ポリペプチドの製造、分泌／滲出、及び回収を示す。実施例８には、トランスジェニックシバクサ（すなわち、単子葉植物）を用いた、異種ポリペプチドの製造、分泌／滲出、及び回収について記載する。実施例９には、土壌ベースの栽培システムを用いて、滴状液の形態にある滲出物から異種ポリペプチドを回収する工程を示すものである。
【００２２】
［実施例１：ポリヌクレオチド］
本発明の方法において使用するために設計されたプラスミド構築体を図１に模式的に示すが、ここで「プラスミド」とはプラスミド本体を示し；「プロモーター」とは特定のプロモーター（すなわち、mas2'は、マンノピンシンターゼプロモーターであり、2xEn35Sは、２つのエンハンサーを含めたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターであり、そしてユビキチンとはトウモロコシユビキチンプロモーターである）のことを称し；「シグナルペプチド」は、プラスミドによってコードされるシグナルペプチドのことを称し；そして制限酵素地図は、コーディング領域及び発現エレメント（すなわち、TL−TEV 5'非翻訳配列、SPは関連シグナルペプチドに対するコーディング領域であり；GFPは緑色蛍光タンパク質であり、SEAPはヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼであり、そしてキシラナーゼはクロストリディウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）由来の酵素である）を示すプラスミドの模式的な物理的地図を提供するものである。制限部位は、以下のとおりに示される：Ｂ−BamHI、Ｂｇ−BglII、Ｂｓ−BstBI、Ｅ−EcoRI、Ｈ−HindIII、Ｋ−KpnI、Ｎ−NotI、Ｎｃ−NcoI、Ｎｈ−NheI、Ｐ−PstI、Ｓ−SalI、Ｓｐ−SphI。
【００２３】
プラスミドpNBmas-CAR-GFPは、mas2'の制御下にGFPを組換え発現させるために使用され（Ni ら、Plant Mol. Biol. 30:77-96(1996)）、このmas2'は根茎における発現に対して強い優先性を呈するマンノピンシンターゼプロモーターである。pNBmas-CAR-GFPの構築は、図２に示すようにいくつかの工程を経て進められたが、最初はHeim ら、Nature 373:663-664(1995)に記載のとおり、修飾されたGFPコーディング配列を含む、pUCベースのプラスミドpCK GFP S65Cから開始された。その修飾とは、コドン６５の変更であり、結果的にシステインをセリンに置換させる（S65C）もので、それによってReichel ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:5888-5893(1996)により報告されるとおり、緑色蛍光の強度が６倍増大する結果をもたらすのである。
【００２４】
GFPを分泌経路に向かわせるために、GFPコーディング領域を、タバコシグナルペプチド、すなわち小胞体常在タンパク質であるカルレティキュリン（Calreticulin）に対するコーディング領域に融合させた。２７アミノ酸のカルレティキュリンＮ−末端シグナルペプチドをコードするcDNA断片は、２１塩基対の上流5'非翻訳配列と共に、
正方向Clamplb:5'-GGTTCGAATTCGATCTCACAACAGTGGGCATGG-3'（配列番号：１）
及び逆方向Clamprev:5'-CTCTTTAAACCATGGAGACCTCAGCGGAGACGAC-3'（配列番号：２）プライマーと、増幅用鋳型として全長のカルレティキュリンcDNA（GenBank受託番号Z71395）を含むプラスミドCal1-Nplを使用し、PCRによって増幅された。増幅された断片は、5'端に制限部位SfuI及びEcoRIが近接するカルレティキュリン（CAR）シグナルペプチド含有領域と、3'端にNcoI及びDraI部位を含んでいた。正方向プライマーであるClamplbは、Cal1-Np1の5'非翻訳領域に位置するNcoI部位（5'-CCATGG-3'）が、5'「Ｃ」を「Ｇ」に置換することにより破壊されるように設計されていた。逆方向プライマーは、カルレティキュリンシグナルペプチドコーディング配列中、コードされたシグナルペプチド（SP）切断部位から２つのコドン下流の位置にNcoI部位が配置されるように設計され、これによりGFPコーディング領域などの異種ポリペプチドコーディング領域へ、カルレティキュリンシグナルペプチドコーディング領域を融合するうえで有用なNcoI部位が作出された。カルレティキュリンmRNAの5'非翻訳領域の−９〜−１２位は、植物で効率よく翻訳開始が行われるためのAACA配列である。
【００２５】
図２に示すように、カルレティキュリンシグナルペプチドをコードする、PCRによって増幅されたDNA断片は、プラスミドpNBCARを作製すべく、SureClone Ligationキット（Pharmacia, Inc.）を使用してSmaI部位にて脱リン酸化されたpUC18へクローニングされた。カルレティキュリンシグナルペプチド−GFPの融合は、pNB-CAR-GFPを作製すべく、pNBCARのNcoI及びXbaI部位へとプラスミドpCK GFP S65CのNcoI−XbaI断片をクローニングすることによって行われた。融合ポイントは、pNBCAR-GFPの配列分析によって確認した。CAR-GFPが融合されたコーディング領域を、mas2'プロモーターの制御下に置くために、pNBCAR-GFPをEcoRI及びSalIで消化し、そして融合されたコーディング領域を含む断片を、アガロースゲル電気泳動を行って単離した。この断片は次いで、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及びDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いた標準フィルイン反応によって平滑末端化された。マンノピンシンターゼプロモーター、mas2'のための供給源として、プラスミドpATC940を使用した。プラスミドpATC940は、5'-3'方向に選択可能マーカー発現カセット（nosプロモーター、NPTII、及び終止配列）、mas2'プロモーター、独自のXbaI部位、ならびにターミネーターを含むものである。このプラスミドは、XbaIで消化し、次に直線化されたpATC940の端部を平滑化するためにリョクトウ（Mung Bean、ヤエナリ）ヌクレアーゼ消化が行われた。CAR-GFPを含むDNA断片は次いで、pNBmas-CAR-GFPを作製すべく、直線化されたpATC940へと挿入された。pNBmas-CAR-GFPは、5'-3'のｐ進行方向に、選択可能マーカー、mas2'プロモーター、CARシグナルペプチドコーディング領域、GFPコーディング領域、及びGFP発現ユニットに対するターミネーターを含んでいる。
【００２６】
SEAPの組換え発現もまた、mas2'マンノピンシンターゼプロモーターによって導かれた。この発現のために用いられるプラスミド、pNBmas-SEAPは、図３に模式的に示すように、プラスミドpATC940へとSEAPコーディング領域を挿入することにより構築された。SEAPコーディング領域は、XhoI及びXbaIを用いてpSEAP2-エンハンサープラスミドから切り出した。やはり、張り出した端部は、クレノウと標準的なデオキシヌクレオシドトリホスフェートを使用してフィルインされた。ベクターpATC940は、XnaIでの制限酵素切断、リョクトウエキソヌクレオリティック消化、及び脱リン酸化によって調製された。pATC940の平滑化されたXbaI部位へとSEAPコーディング領域を含む断片を挿入して、本発明の方法を実施するために使用されたpNBmas-SEAPを作製した。
【００２７】
カリフラワーモザイクウイルスプロモーターCaMV 35Sを使用して、植物細胞におけるSEAP、GFP及びキシラナーゼの組換え発現を導いた。
【００２８】
SEAPは、プラスミドpNB35S-SEAPを使用し、CaMV 35Sプロモーターの制御下に発現させた。SEAPコーディング領域（SEAPタンパク質の４９２アミノ酸をコードするもの）は、シグナルペプチドに対するコーディング領域（H2N-MLLLLLLLGLRLQLSL（配列番号：３））と共に、KpnI及びXbaIを用いてpSEAP2-エンハンサープラスミド（Great EscAPe System: Clontech、Inc.）から切り出された。この断片は次いで、Herbers ら、Bio/Technology 13:63-66(1995)により記載されているとおりに、KpnI-XbaIで消化された植物形質転換ベクターpBinAR-XynZへとクローニングされた。このベクターは5'-3'方向に、前記のNPTII選択可能マーカー発現カセット、CaMV 35Sプロモーター、独自のKpnI部位、シグナルペプチドコーディング領域（すなわち、ポテト由来の液胞プロテイナーゼ阻害剤IIのＮ−末端部分、von Scharwen ら、EMBO J. 9:3033-3044(1990)を参照されたい）、キシラナーゼコーディング領域、独自のXbaI部位、及びOCS（すなわち、オクトピンシンターゼ）ターミネーターを、図４に示すように含んでいる。BinAR-XynZをKpnI及びXbaIで消化すると、シグナルペプチド配列及びキシラナーゼコーディング領域を保有する断片が遊離された。遊離された断片は、pSEAP2-エンハンサープラスミドから、SEAPに対するコーディング領域を保有するKpnI-XbaI断片によって置換され（SEAPシグナルペプチドが成熟型SEAPタンパク質に融合され）、それによってpNB35S-SEAPが作製された（図４）。この結果得られたプラスミドは、シグナルペプチド−SEAP融合型コーディング領域を、植物の構成性CaMV 35SプロモーターとOCSターミネーターとの間に含んでいた。
【００２９】
CaMV 35SプロモーターからGFPを発現させるために使用された１つのプラスミドは、pNB35S-GFPであった（図５参照）。このプラスミドは、最初に        HindIIIでpCK GFP S65Cを制限酵素切断し、近接するGFPコーディング領域を含む断片をそれによって切り出して、CaMV 35Sプロモーター（２つのエンハンサー配列及びTEV 5'非翻訳配列（TL））ならびにターミネーター配列によって構築された。前記NPTII選択可能マーカー発現カセットを含んでいるベクターpBin19は、HindIIIで消化し、そしてGFP含有断片を挿入し、それによりpNB35S-GFPを作製した（図５）。GFPはまた、プラスミドpNBmono-GFPを用いてトウモロコシユビキチンプロモーターの制御下に発現させてもよい。pNBmono-GFPの構築は、図６に模式的に示すとおりである。先ず、カルレティキュリンシグナルペプチド及びGFPをコードするDNA断片を、BamHI及びSacIを用いてpNBCAR-GFPから切り出し、そしてプラスミドNt-68のBamHI部位へと連結し、それにより単子葉植物特異的なトウモロコシユビキチンプロモーターとE9 3'と命名された単子葉植物ターミネーターとの間に、図６に示すとおり融合されたこれらのコーディング領域を配置した。
【００３０】
キシラナーゼの発現は、植物細胞で機能を有するCaMV 35Sプロモーターの制御下にも置かれた。CaMV 35Sプロモーターの制御下に、クルストリディウム・サーモセラムのキシラナーゼコーディング領域を含むPBinAR-XynZの構築は、Herbers ら、1995に記載されており、そして図４に模式的に示されている。
【００３１】
本発明は前記のプラスミドを包含するプラスミドが関わる方法を企図するものである。さらに、植物に異種ポリペプチドのコーディング領域を挿入するための他の手段も本発明によって企図される。ウイルス、細菌ゲノム、プラスミド、ファージミド、コスミド、及び他のベクターが、所望の細胞へと興味の対象であるコーディング領域を配するうえで機能する限りにおいて、使用可能である。好ましいベクターには、異種ポリペプチドを発現するうえでの制御の測定を可能とする発現制御配列が包含される。また、好ましいのは、組換え植物細胞の同定を容易ならしめる選択可能マーカーをコードするベクターである。本発明はまた、例えば、ポリヌクレオチドの導入、ならびに、一過性に発現されるか、または常在ポリヌクレオチドに統合されて発現されるかのいずれかである、ポリヌクレオチドを含む植物細胞プロトプラストの形質転換のための弾道的（ballistic）などの、異種ポリペプチドのコーディング領域を導入するための、ベクターを用いない方法にも関するものである。
【００３２】
［実施例２：トランスジェニック植物の作製］
実施例１に記載の組換えポリヌクレオチドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用して、別々に植物に導入された。ストレプトマイシン耐性のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4044が、Hood ら、J. Bacteriol. 168:1291-1301(1986)により報告された、凍結−融解法を用い、組換えポリヌクレオチドで形質転換された。アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4044の形質転換は、サザンDNAハイブリダイゼーションによって確認された。pBin19（植物形質転換ベクター）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4044が、本発明を実施するうえで用いるには好ましいが、従来の既知及び入手可能な植物形質転換ベクター及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のあらゆるものを使用することができる。
【００３３】
タバコ植物（例えば、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum、ウイスコンシン産（cv）及びサムソンMN産）の形質転換は、Plant Molecular Biology-Technique（Academic Press, Inc. 1988）で、Weissbach らにより報告されているとおり、葉リーフディスク共栽培によって実施した。健常な、傷のない葉を無菌の若い植物から採集し、５〜１０ｍｍの幅の切片に切り分けた。これらの外植片組織を、ストレプトマイシン及びカナマイシンをそれぞれ50mg/L含有する液体ＹＭ培地中で２８℃にて４０〜４８時間生育しておいた、実施例１に記載のごとき（例えば、pBinAR-XynZ）適切な２成分ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム細胞の懸濁液に浸すことによって感染させた。１リットルのＹＭ培地は、０．４ｇの酵母エキス（自家融解、低ナトリウム）；１０ｇのマンニトール；０．１ｇのNaCl；０．２ｇのMgSO4及び０．５ｇのK2HPO4を含んでいる。ＹＭ培地（Gibco BRL）は、アグロバクテリウムの生育及び発現のために特別に調剤されている。外植片組織は次いで、無菌の濾紙上に乾燥状態でブロッティングされ、反転され、そして組織培養プレートに入れられたＭＳ培地上に入れられて、３６〜４８時間の共栽培のためにインキュベートされた。（ＭＳ培地は、植物のイン・ビトロ培養のための旧来の培地である。Murashige ら、Plant Physiol. 15:473-497(1962)）続いて、外植片は再生培地（ＭＳ塩、３０g/Lスクロース、１mg/L BAP（すなわち、6-ベンジルアミノプリン、植物のサイトカイニン）、細菌の生育を排除するために５００mg/Lのカルベニシリン、及びトランスジェニック植物に対する選択試薬としてのカナマイシン１００mg/L）を含有する寒天プレートに移された（８g/L）。形質転換体は、ホルモンをまったく含まない同様の培地にて選択された。根茎が形成されるまで、インキュベーションを継続した。
【００３４】
双子葉植物を形質転換するために、アグロバクテリウムを用いた形質転換プロトコルの従前の使用を超えて、継続的な努力により、アグロバクテリウムを用いた方法が、本発明の方法において使用するためのトランスジェニック植物の作製で単子葉種に異種（すなわち、本来のものでない）核酸を形質転換するためにも使用可能であることが示されている。Smith ら、Crop Science 2:301-309(1995)を、引用することにより本明細書に組み込むこととする。
【００３５】
他の形質転換の方法論もまた、当該技術分野で理解されるとみられるように、トランスジェニック植物を作製するために使用することができる。例えば、植物細胞プロトプラストへの直接的なDNA移送は、リン酸カルシウム共沈、ポリ-L-オルニチン、リポソームを媒介する形質転換、エレクトロポレイション、フサゲン（fusagen）を媒介した（例えば、ポリエチレングリコールによる）形質転換、及び形質転換されたプロトプラストから再生された植物の使用などといった、従来の技術によって行うことができる。PCT/US84/00050及びChristou、Euphytica 85:13-27(1995)を、引用することにより本明細書に組み込むこととする。他の移送のための方法論、例えば微粒子銃（biolistic）形質転換（すなわち、微粒子または粒子銃）では、植物細胞プロトプラストを必要とせず、それによりトランスジェニック植物を再生する方法が簡素化されるものである。結果的に、微粒子銃形質転換は、単子葉及び双子葉の双方を含めた、広範囲の植物へ異種ポリペプチドに対するコーディング領域を導入するために使用することができるのである。Christou(1995); Jahne ら、Euphytica 85:35-44(1995)を、引用することにより本明細書に組み込むこととする。
【００３６】
形質転換されたプロトプラストを含めて形質転換細胞からのトランスジェニック植物の再生は、なかんずく、当該技術分野で知られている種々の技術を使用して完遂することができる。トランスジェニック植物の再生のための様々な手法が、EP-A-0 243 553に記載されており、これを引用することにより本明細書に組み込むこととする。これらの手法には、胚形成または器官形成経路のいずれかを介した再生が包含される。あるいは、生殖系列に寄与するトランスジェニック細胞の機会を改善させるべく成長点の再組織化を誘導するための工程、次いで成長点の分化を促進する条件を提供する工程を組み込んだ方法による形質転換の後に、植物を再生してもよい。PCT/US95/08977を、引用することにより本明細書に組み込むこととする。一般的に、当該技術分野において知られている形質転換及び再生の方法論のあらゆるものを、本発明の方法において使用するための形質転換植物を作製することを目的として使用することができる。
【００３７】
［実施例３：トランスジェニックタバコ植物を使用した、キシラナーゼの製造及び回収］
根茎の形成の後、トランスジェニック植物を、１５g/Lのスクロース、５００mg/Lのセフォタキシム及び１００mg/Lのカナマイシンを含有する無菌のＭＳ培地へ設置することにより、水耕を開始した。野生型の対照植物（すなわち、形質転換されていない植物）は、抗生物質を含有しない同様の培地にて栽培した。残りの植物（すなわち、正常な重力培養条件下に胚軸よりも上の領域にある植物）が解放且つ非無菌環境にある間は、根茎が無菌条件下に培地に接触することを可能とすべく合成ストッパーの中に植物を配置した。
【００３８】
発根後およそ２〜３週間から始めて、無菌シリンジで培地を吸引することにより滲出物を定期的にサンプリングした。細胞間液のタンパク質含量も調べた。細胞間液は、Parent ら、Can. J. Bot. 62:564(1984)により報告された方法に若干の修飾を加えて単離した。水で洗浄した後、採集したての根茎または葉を、適切な氷冷緩衝液（５０mM 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．９）に真空下に浸透させた。浸透後の組織を、３５０ ｘ ｇにて１５分間遠心分離して、細胞間液を単離した。細胞間タンパク質は、限外濾過（１０ kD排除能を有する、Microcon 10膜、Amicon, Inc.）によって濃縮した。試料は熱に不安定なタンパク質を変性させるために６５℃にて３０分間インキュベートし（GFP、SEAP及びキシラナーゼは熱安定性である）、速やかに氷冷して−２０℃に保存した。
【００３９】
キシラナーゼのアッセイは、本質的にBiely ら、Methods Enzymol. 160:536-542(1988)に記載のとおりに実施した。簡単に説明すると、RBB-キシラン（１１．５mg/ml、Sigma Chamical Co.）を最終容量２４０μlの５０mM酢酸ナトリウム（NaOAc）、ｐＨ ５．４中で、タンパク質抽出物と６０℃にて２０分間インキュベートした。反応は、９６％エタノール４８０μlを添加することによって停止した。室温にて３０分間放置した後、１５，０００ ｘ ｇにて３分間遠心分離することにより沈殿を除いた。上清に認められる青色に染色された小さな断片が、キシラナーゼ活性を示すものであった。合計５０の別個の形質転換体を分析し、それらのうちの３５が、根茎の滲出物及び細胞間液の双方にキシラナーゼ活性を示した。
【００４０】
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によるキシラナーゼの検出を、Biely ら (1988)に従って行った。分画したタンパク質を用いた未変性ゲルを、予め３５〜４０℃に加熱しておいた寒天−RBB-キシランゲルを覆うように積層して、産物が完全に目視可能となるまで室温にてインキュベートした。次いで、寒天層を分離ゲルから剥がし、そしてエタノール−０．０５M酢酸緩衝液（２：１、ｐＨ ５．４）の中に浸漬した。キシラナーゼ活性は、多糖の加水分解に起因する、染色された断片の拡散の程度の増大として検出された。
【００４１】
根茎から滲出されたキシラナーゼの可視化は、RBB-キシランを含有する寒天培地上でトランスジェニック植物を生育することによって実施した。タバコの種子を、２．５mg/mlのRBB-キシランを含有する寒天培地にて発芽させ、そして根茎の生育を３０日間、目視監査した。滲出されたキシラナーゼ活性の結果として、トランスジェニック植物の根茎の周りに透明ゾーンが形成された。Sethu ら、Phytochemistry、42:961-966(1996)を参照のこと。
【００４２】
エトキシラナーゼ活性の定量は、Grepinet ら、J. Bacteriol. 170:4582-4588(1988)により報告された、還元糖等価法を用いて行った。簡単に説明すると、野生型（対照）及びトランスジェニック植物の根茎の滲出物を、６５℃にて２０分間加熱処理し、そして限外濾過により１０倍に濃縮した。各試料の３００μlのアリコートを、１００mM酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）中にて調製した０．１５重量／容量％キシラン（Birchwood；Sigma Chamical Co.）０．２mlに添加して、その混液を高温振盪機で３７℃にてインキュベートした。３０分後、室温にまで迅速に冷却することによりインキュベーション反応を停止し、次いで０．６mlのジニトロサリチル酸試薬を添加した。標準曲線を作製するために、グルコースを使用した。二重の対照反応液は、インキュベーションを行う前に反応を停止させたものとした。試料を１０分間煮沸し、５００nmにおける吸光度を分光光度法によって定量した。酵素活性は、キシロースの当量濃度を用いてアッセイした。１単位のキシラナーゼ活性は、１分当たり１ミクロモルの還元基の形成を触媒する酵素の量として定義された（Achmed ら、Plant Physiol. 65:1014-1016(1980)）。このアッセイを用いて、トランスジェニック植物からは、９６０mgの根茎から３．６単位の総分泌キシラナーゼ活性が認められ、野生型植物は、バックグラウンドレベルのキシラナーゼ活性（すなわち、１，３００mgの根茎から０．１単位未満の分泌キシラナーゼ活性）を呈した。キシラナーゼ特異活性は、トランスジェニック植物に対しては３．８単位／ｇＦＷで、野生型対照に対しては０．０１単位／ｇＦＷ未満であった。これらの活性レベルに等価のタンパク質量として、トランスジェニック植物はおよそ２０mgのキシラナーゼを製造しており、一方野生型の植物は０．１mg未満のタンパク質しか製造していなかった。（Trichoderma virdis から精製されたキシラナーゼは、１８２U/mgタンパク質の比活性を有している（Sigma Chamical Co.））
本発明の方法で、広範囲の植物を使用することができる。例えば、根茎、葉等によって製造される滲出物を、本発明を実施するのに使用するとよい。植物または植物の部分によって外向的とされて、滲出物は、液体と共に、植物の部分（無傷の植物から単離されたものでも、その部分のいずれでも可）を間欠的または継続的にベイジング（bathing）させること含めた、あらゆる旧来の方法により容易に入手される。好ましくは、植物または植物の部分を、生育培地または水などの水星溶液と接触させることによって、滲出物が得られる。液体−滲出物の混合液は次いで、所望のポリペプチドを単離するために旧来のポリペプチド精製技術に付されるとよい。
【００４３】
［実施例４：トランスジェニックタバコ植物を用いたSEAPの製造及び回収］
ヒト分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）コーディング領域をCaMV 35Sプロモーターまたは根茎優先的mas2'プロモーターの制御下に導入するタバコ植物（line SN-27）の形質転換は、実施例１〜２に記載のとおりに実施した。CaMV 35Sプロモーターの制御下にヒト分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子で形質転換されたトランスジェニックタバコ植物もまた、発根されて液体培地中で３３日間無菌的に栽培された。トランスジェニック植物は、葉及び根茎組織から総RNAを単離するためにChomczynskiら、Anal. Biochem. 162:156(1987)の方法を用いて、ノザンハイブリダイゼーションにより特異的mRNAの存在について試験された。形質転換された植物は、SEAP特異的なmRNAの発現を示した。CaMV 35Sプロモーターの制御下にヒトSEAP遺伝子で形質転換された植物は、葉及び根茎組織双方に同様のmRNA発現レベルを示した。これと対称的に、mas2'プロモーターからSEAPを発現するトランスジェニック植物では、葉の組織よりも根茎組織により高いmRNAレベルが認められた。
【００４４】
分析用のタンパク質の回収は、実施例３に記載のとおりに実施された。SEAP活性は、根茎の成長及びSEAPを回収するための根茎の取り出しを行った３３日までの液体培地で、そして細胞間液についても定量した。化学発光基質であるCSPD（Great EscAPe SEAP 化学発光検出キット（Clontech Inc.）にて提供）を用いて、分泌されたホスファターゼ活性を測定することによりSEAPの発現を監査した。SEAP活性の化学発光検出は、Turner TD-20e Liminometer を用いて、または反応が行われている９６ウェルのミクロタイタープレートをＸ線フィルムに露光することのいずれかによって行った。
【００４５】
アッセイは、細胞間液または根茎滲出物のいずれかの試料２５μlを用いて実施した。これらの試料は、７５μlの登録済み希釈用緩衝液（Clontech Inc.）に入れ、そして６５℃にて３０分間インキュベートして、内在性のホスファターゼ活性を不活性化した。続いて、Cullenら、Methods Enzymol. 216:362-368(1992)により記載のとおりに、試料をCSPD及び化学発光エンハンサーと共に、内在性ホスファターゼの阻害剤としてL-ホモアルギニンを含有する反応緩衝液中で１０分間インキュベートした。形質転換されていないタバコ植物由来の試料を負の対照とし、精製された胎盤型アルカリホスファターゼを含有する試料を正の対照として用いた。
【００４６】
ホスファターゼ活性は、CaMV 35Sまたはmas2'プロモーターのいずれかの制御下に、SEAP遺伝子で形質転換された５０の別々のタバコ植物にて監査した。いずれかのプロモーターからSEAPを発現するトランスジェニック植物が、酵素活性を示した。野生型植物でホスファターゼ活性が検出されたものはなかった。
【００４７】
CaMV 35S発現カセットで形質転換された植物により、根茎滲出物中、さらに葉及び根茎細胞間液中に安定なSEAP活性があることが明らかになった。総タンパク質は、およそ１．４mg/根茎の最終濃度（第３３日には、平均４００mgの新鮮根茎重量）まで、直線的に増大することが認められた。この期間の間のSEAPの生産は、１０日の遅延を呈し、次いでおよそ０．１１mg/根茎の最終濃度になるまで直線的に蓄積していった。３３日目のタバコ植物における総可溶性タンパク質及びSEAPの分布も調べた。根茎抽出物中の総可溶性タンパク質は、およそ６５mg/g新鮮根茎であり、その重量の４．０％がSEAPであった。細胞間液中には、新鮮根茎１グラムにつきおよそ２mgの総可溶性タンパク質が認められ、そしてSEAPはこの量の１．６％に相当していた。成育中の植物と接触している水性培地から得られた根茎滲出物で、総可溶性タンパク質はおよそ２７０mg/g新鮮根茎であり、そのタンパク質の７．５％がSEAPに帰するものであった。これら植物における組換えSEAPの分布に関しては、２０．９％のタンパク質が根茎抽出物中に認められ、０．２９％が細胞間液中、そしてほとんど大部分である７８．８％が根茎滲出物に見出された。
【００４８】
CaMV 35Sプロモーターを使用して発現されたSEAPの分布とは対照的に、mas2'プロモーターの制御下でのSEAPの発現は、根茎試料に優位に認められ、葉の試料中見出される活性はさらに小さかった。結果を以下の表１に示す。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
次いで、組換え発現されたタンパク質（SEAP）を、植物に損傷を与えることなく、または所望の産物を単離するための高価でわずらわしい精製プロトコルを行うことなくトランスジェニックタバコ植物の滲出物から回収した。
【００５１】
本発明は、性的または植物的に増殖される広範囲の植物、さらに切除された葉、幹、根茎、花等の無傷の植物部分を包含する方法を企図するものである。本発明の方法での使用のために好ましいのは、タバコ、トマト、ナタネ、アルファルファ及びシバクサなどの、相違する科の植物である。他の好ましい植物には、レムナ（Lemna）及びその他のウキクサ、アカウキクサ、浮稲、ホテイアオイならびにアマモ及びウィルギオングラスなどの水中に沈んで生育する開花植物等、植物的増殖を行うことができる水生植物が挙げられる。
【００５２】
本発明の方法に付される植物または植物の部分は、無傷であり生存している植物または植物の部分であって、有機的な栄養補給を用いなくとも、且つ植物を無菌状態に維持しなくとも維持され得るものである。しかしながら、本発明の方法で無菌状態または無機成分補給を用いてもよいことはもちろんである。
【００５３】
本発明において使用される植物は、成熟植物、苗等の未成熟植物、または種子から発芽している植物であってもよい。種子は天然水中で発芽させても、あるは調製液剤中または解放発酵槽中で発芽させてもよい。前述のとおり、植物の部分を用いることもできる。好ましい植物部分は、有機栄養補給がなくても維持でき、また無菌状態を必要としないものである。
【００５４】
本発明の方法において使用するための植物または植物の部分は、例えば、野生型または組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスでの形質転換などによって遺伝的に修飾されていてもよい。一般に、植物または植物の部分は、天然に存在する植物のあらゆるものの遺伝形質と相違する遺伝形質を呈するとよい。さらに、遺伝的修飾は、当該技術分野において理解されるような、細胞の遺伝子含量を変えるための旧来の方法のあらゆるものによって成し遂げられ得る。典型的な遺伝的修飾は、異種コーディング領域の導入；１以上の発現制御配列の導入、再編成もしくは修飾；分泌／滲出に関わる遺伝的エレメントの修飾、または遺伝的に制御された調節機構の変更を包含するであろう。
【００５５】
当業者であれば、本発明の方法が植物または植物の部分を必ずしも破壊するものでないことも正当に評価するはずである。従って、本発明の方法は継続的に行われても、またはバッチ方式で行われてもよい。
【００５６】
［実施例５：トランスジェニックタバコ植物を用いたGFPの生産と回収］
実施例１及び２で述べたように植物の形質転換、水耕栽培及びサンプルの採集を実施した。ノーザンハイブリダイゼーションにより、トランスジェニックGFP植物を特異的mRNAの存在に関して試験した。Chomczynskiら（1987）の方法を使用して葉と根の組織から全RNAを分離した。形質転換した植物すべてがGFP特異的mRNAを発現した。
【００５７】
ＧＦＰの独特の生物発光特性（475nmでの励起、510nmでの発光）を用いて、植物組織及び液体サンプル中のこのタンパク質を顕微鏡下で検出し、位置確認した。0.05M Tris‐HCl、pH 8.0中で新鮮調製した植物の根を、蛍光顕微鏡（Nikon,Inc.）で電磁スペクトルの長UV範囲内で照射した。トランスジェニック根を経験的に至適とみなされた30秒間UVに暴露し、それによってトランスジェニック植物の明るい蛍光を発する根と野生型植物の蛍光を発しない根の識別を最大化した。
【００５８】
GFPが分泌及び滲出された可能性を調べるため、細胞間液と培地をDEAE‐Sephacel陰イオン交換ビーズ（Sigma Chemical Co.）に暴露してタンパク質を固定した。細胞間液あるいは対照植物の滲出物と共にインキュベートした陰イオン交換ビーズは蛍光顕微鏡下で微黄色であり、一方GFP形質転換体のアポプラスチック液あるいは根の培養基は明るい緑色の蛍光を示し、分泌されたGFPの存在を示唆した。
【００５９】
マウスハイブリドーマ細胞によって産生された抗GFPモノクローナル抗体（Clontech,Inc.）を使用し、同じ供給者から入手したWestern Exposure Chemiluminescent System PT1600‐1を用いて、ウエスタンブロッティング法によりGFPの免疫学的検出を行った。根の滲出物と根の細胞間液から単離したタンパク質を12％PAGEで分離し、Bio‐Rad Mini‐Protein Systemを使用して電気泳動によりPVDF膜に移した（4℃で100Vの定電圧、1時間半）。あらかじめ染色しておいた低分子量のSDS‐PAGE標準品（Bio‐Rad Laboratories,Inc.）を分子量マーカーとして使用した。一次抗体を1:500に希釈し、二次抗体‐アルカリホスファターゼ複合体を1:15,000に希釈した。トランスジェニック植物の根滲出物及び根細胞間液のタンパク質サンプルにおいて、27kDaタンパク質に相当する単一の鋭いバンドを検出した。野生型植物の対応するサンプル中では特異的シグナルは検出されなかった。
【００６０】
［実施例６：トランスジェニック植物を用いたHbsAgS及びHbsAgMの生産と回収］
B型肝炎ウイルス（HBV）は、世界中で3億人以上に感染するヘパドナウイルス科のウイルスのヒト成員である。HBVゲノムはL、M及びSと称される3つの関連エンベロープタンパク質をコードする。3種類のタンパク質は選択的翻訳開始部位を通して1つのオープンリーディングフレームから産生される。3つのタンパク質すべてがSコード領域によって特定される共通のN結合グリコシル化部位を持つが、Ｍタンパク質だけはプレS2ドメインの4位のアミノ酸に付加的なグリコシル化部位を含む。最近になって、Mehtaら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94：1822‐1827（1997）は、Ｍ蛋白のグリコシル化は動物細胞からのその分泌に必須であることを開示した。
【００６１】
Ｂ型肝炎表面抗原の産生のためには、Ｓ蛋白コード領域とＭ蛋白コード領域を別々にCalreticulinシグナルペプチドコード領域に融合し、植物形質転換ベクターpNB‐CARに挿入し、それぞれpNB‐CAR‐HBsAgSpNB‐CAR‐HBsAgMを生成させる。S蛋白とM蛋白をコードするDNA断片を、Bichkoら、FEBS Lett.185:208‐212（1985）が述べたようにして、特異的プライマーとpHB320を鋳型として使用してPCRによって増幅した。このプラスミド、pHB320は、Ｂ型肝炎のaywサブタイプの完全なゲノムを含む。
【００６２】
形質転換及び形質転換した植物の分析を実施例1及び2で述べたように実施する。トランスジェニック植物の根（すなわち根滲出物）あるいは葉（すなわち排水組織から滲出した排水液）から滲出したタンパク質を、HBV表面タンパク質に対する市販の抗体を用いて分析する。
【００６３】
［実施例７：トランスジェニックトマト植物を用いた異種ポリペプチドの生産と回収］
それぞれリポーターとしてGFPとSEAPをコードするプラスミド、pNBmas‐CAR‐GFPとpNBmas‐SEAPを使用してトマト植物（Dinasty品種）を形質転換する。トマトの形質転換は、実施例2で述べた葉ディスクとA.tumefaciensの同時栽培プロトコールの修正を用いて実施する。約107細胞／mlのA.tumefaciens力価を使用し、それを液体LB培地中でひと晩増殖させることによりプロトコールを修正する。保護プレートについては、保護培養としてN.tabacumの懸濁培養を使用し、Weissbach,1988が述べたようにMS塩を通常濃度の10％に低減する。N.tabacum細胞を、MS塩、B6ビタミン、スクロース（30g/L）及びp‐クロロフェノキシ酢酸（2mg/L）を含む液体培地中で増殖させる。N.tabacum培養物の1‐1．5ｍｌアリコートをプレートに加え、Whatman No.1濾紙の8.5cmディスクでアリコートをおおってて保護プレートを調製する。感染した外植片を濾紙の上にのせてインキュベートする。25‐50mg/lのカナマイシンを補足した選択培地で形質転換体の選択と再生を行う。
【００６４】
形質転換した植物の分析を上述したように実施し、やはり上述したように、例えば根及び葉の滲出物から異種ポリペプチドを回収する。
【００６５】
［実施例８：トランスジェニック芝草を用いた異種ポリペプチドの生産と回収］
pCK GFP S65C(Reichelら、(1996))のGFPコード配列を含み、Calreticulinシグナルペプチドに融合したプラスミド、pNBCAR‐GFPを使用して、単子葉植物である芝草におけるＧＦＰ発現のための形質転換ベクターを構築する。
【００６６】
パーティクルガン形質転換法を用いて芝草の形質転換を実施する。Christoer,Euphytica 85:13‐27（1995）とJohneら、Euphytica 85:35‐44(1995)参照。形質転換体の分析とポリペプチドの回収を上述したように行う。
【００６７】
［実施例９：トランスジェニックトマト植物を用いた排水液からの異種ポリペプチドの生産と回収］
それぞれリポーターとしてGFPとSEAPをコードするプラスミド、pNBmas‐CAR‐GFPとpNBmas‐SEAPを使用して、実施例2及び7で述べたようにトマト植物（Dinasty品種）を別々に形質転換する。形質転換したトマト植物を、不透水障壁でおおった土壌において発育させる。障壁の孔からトマト植物の茎を土壌の上に伸長させる。不透水障壁に適合する、水を導入するための従来の手法によって水を土壌に供給する、例えば従来のパイピングあるいはチュービングを用いてポンプで水を土壌に送り込むことができる。トマト植物の葉と茎の部分を水性媒質‐これは水でもよい‐に接触させ、水性媒質と排水液のような植物滲出物の混合物中で異種ポリペプチドを回収する。不透水障壁の表面から混合物を採集することもできる。その後液を従来の精製法に供して異種ポリペプチドを回収する。
【００６８】
本発明のもうひとつの局面に従って、水性媒質との接触段階を省略して、希釈していない植物滲出物、例えば排水液を回収する。ひとつの実施態様では、排水液を重力により障壁上で受動的に回収する。他の実施態様では、植物あるいはその部分を機械的に撹拌して滲出物の積極的な回収を行う。機械的撹拌は、例えば植物又はその部分が流れ落ちる、あるいは滴又はミストの形態で空気を通して移動することにより、障壁から最も遠い方向への滲出物の移動を誘発するのに役立つ。撹拌装置は滲出物の移動を誘発するための常套的な手段であろう。例としては、植物あるいはその部分を物理的に動揺させ、その結果滲出物の移動を生じさせるのに十分な接触をもたらすロッドあるいはケーブルを含む。もちろん、撹拌は滲出物に直接接触し、それが植物あるいはその部分と接触する。機械的な撹拌装置に加えて、本発明は加圧ガス、例えばエアコンプレッサーなどの従来のソースから送達される空気のような非機械的撹拌装置を想定する。さらに他の実施態様では、撹拌装置と採集装置の両方として機能する装置を用いて異種ポリペプチド含有滲出物を回収する。例えば、例えば不透水性器具を植物又はその部分を横切って引っ張ることにより、植物又はその部分を装置と接触させることができる。接触は滲出物の移動を誘発するのに十分であり、装置は植物又はその部分から分離された滲出物を採集する。その代わりに、吸収あるいは吸取り装置（例えば紙、布等）を使用して、異種ポリペプチド含有滲出物を有する植物あるいはその部分に接触させる。
【００６９】
重力あるいはポンプ駆動給水パイピングあるいはチュービングの使用を含めて、土壌潅水のための従来の手法が本発明の方法において使用できる。その代わりに、土壌が当該技術において既知の何らかの用水系統を含んでいてもよい。さらに本発明は、隣接区域から土壌に受動的に水を供給する毛細管作用に頼ることも想定している。当業者は、滲出物から異種ポリペプチドを回収するための土壌ベースの方法に加えて、本発明の方法が水耕や空気栽培のような他の形態の植物栽培を用いて実施できることを認識するであろう。
【００７０】
不透水性障壁は、障壁の化学成分を放出することによる溶液の不純物混和を伴わずに水溶液の通過を防ぐのに適したどのような物質でもよい。好ましくは、障壁は温度、風当の代表的な環境条件に耐えうるものである。既存のあるいは構築された土壌外形に合わせて容易に成形される柔軟な障壁も好ましい。
【００７１】
土壌はその自然の地勢のまま残してもよいし、あるいは本発明の方法に適合するように再成形してもよい。例えば、土壌を小丘の採集に合わせて成形することができ、これは、柔軟な障壁と組み合わせると、滲出物を含む水性液体を、植物の茎を通過させるために作られた障壁の孔から離れた方向に導くことにより、滲出したポリペプチドの回収を最大にする。
【００７２】
本発明を特定実施態様に関して述べたが、当業者にはバリエーションや修正が想定されることは明白である。それ故、本発明には付属の特許請求の範囲に示すような制限だけしか適用されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本願発明の方法で用いたＤＮＡ分子の関連部分の概略を示した図である。
【図２】  本願発明の方法で用いたＤＮＡ分子の関連部分の概略を示した図である。
【図３】  本願発明の方法で用いたpNBmas-SEAPの概略を示した図である。
【図４】  本願発明の方法で用いたpNB35S-SEAPの概略を示した図である。
【図５】  本願発明の方法で用いたpNB35S-GFPの概略を示した図である。
【図６】  本願発明の方法で用いたpNBモノ-CAR-GFPの概略を示した図である。
【配列表】
0004343430.tif 000003
0004343430.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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