(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合により連結された連続したヌクレオシドの配列を有する単離されたオリゴヌクレオチドであって、該結合は５０％と１００％の間で、以下の式のＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート結合であり、
３’−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）−５’
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり；Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、またはアラルキルであり；Ｒには１０個より多い炭素の炭素鎖は含まれず、そして該オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチド長の所定の非ホモポリマー性配列を有し、そして、ジヌクレオチド反復からならない、オリゴヌクレオチドであるが、ただし該結合は１００％はＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート結合ではない、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、６〜１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート結合により連結されている少なくとも３つの連続したヌクレオシドを有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート結合と、該Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート結合とは異なる第二結合とが交互である結合を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記第二結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホロアミデートおよびホスホロチオエートからなる群より選択される、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記第二結合は、ホスホジエステル結合である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドとタンパク質との相互作用をブロックするためのインビトロでの方法または非ヒトのインビボでの方法であって、該ポリヌクレオチドと請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの複合体の形成を可能にする条件下で、該ポリヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、方法。
【請求項８】
３つの核酸鎖を有する三重鎖分子であって、
２つの相補鎖を有する二重鎖ＤＮＡ分子と、該二重鎖に結合し、請求項１〜５のいずれか１項に記載の第三鎖のオリゴヌクレオチドとを含む、三重鎖分子。
【請求項９】
二本の相補鎖を有する二重鎖オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１本の鎖は、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
アンチセンス治療またはアンチジーン治療のための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、；および
（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、
薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートの化合物および組成物、合成法ならびにオリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを用いるハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ抵抗性方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴヌクレオチドは強力な診断化合物および新規の合理的に設計された治療剤として提唱されてきた（Ｕｈｌｍａｎ、１９９０；Ｈｅｌｅｎら、１９９０；Ｈｅｌｅｎ、１９９１）。これらの化合物の作用機構は、目的のＲＮＡまたはＤＮＡ領域との特異的な相互作用に基づく。
【０００３】
天然のホスホジエステルのヌクレオシド間結合の種々の改変物｛ホスホモノ−（Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、１９８５；Ｃｏｈｅｎ、１９９３）またはジチオエート（Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９９３）メチルホスホネート（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９１）、ホスホジエステルアミデート（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８；Ｆｒｏｅｆｌｅｒら、１９８８）｝が導入され、（ｉ）生物学的媒体におけるオリゴマーの安定性および（ｉｉ）オリゴマーのハイブリダイゼーション特性を改良している。
【０００４】
しかし、これらのアナログの大多数は、２重鎖または３重鎖の形成を介する標的ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖との結合を減少することが示されている（Ｋｉｂｌｅｒ−Ｈｅｒｚｏｇら、１９９１）。さらに、これらのアナログのいくつかのリンにおける立体異性体の存在により、相補的な核酸との結合パターンが複雑になる可能性がある（ＬａＰｌａｕｃｈｅら、１９８６；Ｂｏｗｅｒら、１９８７；Ｔｉｄｄら、１９８８）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートの化合物および組成物、合成法ならびにオリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを用いるハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ抵抗性方法を提供することである。詳細には、ホスホジエステラーゼ消化に対する著しく高められた抵抗性を有する改変されたオリゴヌクレオチド、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートを固体支持体上で合成することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の式を含むヌクレオシドサブユニット：
【０００７】
【化２】
0004383720.tif 000002
であって、ここで、ＤＭＴはジメトキシトリチル基であり、そしてＢｚはベンゾイル基である、ヌクレオシドサブユニットである。
【０００８】
本発明はまた、以下の式を含むヌクレオシドサブユニット：
【０００９】
【化３】
0004383720.tif 000003
であって、ここで、ＤＭＴはジメトキシトリチル基であり、そしてＩＢＵはイソブチリル基である、ヌクレオシドサブユニット。
【００１０】
本発明はまた、５’−ＤＭＴ−Ｎ６−ベンゾイル−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンまたは５’−ＤＭＴ−Ｎ２−イソブチリル−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシンの合成方法であって、以下の工程を包含する方法：
Ｘの５’ベンゾイル化、
３’ヒドロキシ基の反転、
トリチル化、
３’の脱ベンゾイル化、
３’トレオアジド基の３’エリトロアジド基への転換、および
３’エリトロアジド基の還元、
ここで、Ｘは５’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンまたはＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシンである、方法である。
【００１１】
本発明はまた、以下の式のサブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを包含する、オリゴデオキシリボヌクレオチド：
【００１２】
【化４】
0004383720.tif 000004
であって、
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、Ｒには１０個より多い炭素の炭素鎖は含まれず、サブユニット間結合は少なくとも６から１００塩基の長さのオリゴヌクレオチド内に散在し、ｎは４から１００であり、そしてＢは塩基である、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００１３】
好適な実施形態においては、上記オリゴデオキシリボヌクレオチドが、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合によって連結している少なくとも３個の連続するサブユニットを有する。
【００１４】
さらに好適な実施形態においては、５’および３’末端にＯＨ基を有し、そして上記連続する結合が３’末端のヌクレオシドサブユニットで始まる。
【００１５】
好適な実施形態においては、サブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００１６】
好適な実施形態においては、上記サブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合と第２の結合とを交互に連結する。
【００１７】
さらに好適な実施形態においては、サブユニット間結合の少なくとも５０％がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００１８】
さらに好適な実施形態においては、上記第２の結合がホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートＰ３’→Ｎ５’およびホスホロチオエートからなる群から選択される。
【００１９】
さらに好適な実施形態においては、上記第２の結合がホスホジエステル結合である。
【００２０】
本発明はまた、２重鎖の核酸分子の生成方法であって：
サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、少なくとも３個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり、
【００２１】
【化５】
0004383720.tif 000005
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、オリゴデオキシリボヌクレチドは標的核酸分子との２重鎖の形成に効果的なヌクレオシドサブユニットの配列を有する工程、およびオリゴデオキシリボヌクレオチドと標的核酸分子との間の２重鎖の形成が可能な条件下でオリゴデオキシリボヌクレオチドと標的核酸分子とを接触させる工程を包含する、方法である。
【００２２】
本発明はまた、タンパク質とポリヌクレオチドとの相互作用を阻止する方法であって：
サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、ここで、以下に示される、少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり、
【００２３】
【化６】
0004383720.tif 000006
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、オリゴデオキシリボヌクレオチドはポリヌクレオチドとの複合体の形成に効果的なヌクレオシドサブユニットの配列を有する工程、およびオリゴデオキシリボヌクレオチドとポリヌクレオチドとの間の複合体の形成が可能な条件下でオリゴデオキシリボヌクレオチドとポリヌクレオチドを接触させる工程を包含する、方法である。
【００２４】
本発明はまた、３重鎖分子の生成方法であって：
サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、ここで、以下に示される、少なくとも２個の連続するサブユニットがＡＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり、
【００２５】
【化７】
0004383720.tif 000007
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなるより選択され、オリゴデオキシリボヌクレチドは標的２重鎖ＤＮＡとの３重らせん構造の形成に効果的なヌクレオシドサブユニットの配列を有する工程、およびオリゴデオキシリボヌクレオチドと２重鎖の標的ＤＮＡとの間の３重鎖の形成が可能な条件下でオリゴデオキシリボヌクレオチドと２重鎖ＤＮＡとを接触させる工程を包含する、方法である。
【００２６】
好適な実施形態においては、上記サブユニット間結合の５０％またはそれよりも多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００２７】
好適な実施形態においては、上記サブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合と第２のサブユニット間結合とを交互に連結する。
【００２８】
好適な実施形態においては、上記残存サブユニット間結合が、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートＰ３’→Ｎ５’、およびホスホロチオエートからなる群より選択される。
【００２９】
好適な実施形態においては、上記サブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００３０】
好適な実施形態においては、上記接触が細胞内で行われる。
【００３１】
本発明はまた、３本の核酸ストランドを有する３重鎖分子であって：
２本の相補的ストランドを有する２重鎖ＤＮＡ分子、および２重鎖と結合するサブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有する第３のストランドオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であるオリゴデオキシリボヌクレオチド：
【００３２】
【化８】
0004383720.tif 000008
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択される、３重鎖分子である。
【００３３】
好適な実施形態において、上記第３のストランドのサブユニット間結合の５０％またはそれよりも多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００３４】
好適な実施形態において、上記第３のストランドのサブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００３５】
本発明はまた、オリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレアーゼ切断に対する抵抗性を増強する方法であって、
サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、少なくとも３個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり：
【００３６】
【化９】
0004383720.tif 000009
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択される工程、および
オリゴデオキシリボヌクレオチドをヌクレアーゼに曝露される工程であって、
ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドが、ホスホジエステルサブユニット間結合のみを有する対応するオリゴデオキシリボヌクレオチドより、ヌクレアーゼ切断に対して抵抗性である工程を包含する、方法である。
【００３７】
好適な実施形態において、上記オリゴデオキシリボヌクレオチドのサブユニット間結合の５０％またはそれより多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００３８】
好適な実施形態において、上記オリゴデオキシリボヌクレオチドのサブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００３９】
好適な実施形態において、上記曝露が細胞内で行われる。
【００４０】
本発明はまた、以下を含む、サンプルから標的核酸を単離するためのキットであって：
（ｉ）サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドであって、ここで、少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合である、オリゴデオキシリボヌクレオチド：
【００４１】
【化１０】
0004383720.tif 000010
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、
（ｉｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドが標的核酸配列に対してハイブリダイズするに効果的であり、そして
（ｉｉｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドが固体支持体に接着される、
キットである。
【００４２】
本発明はまた、サンプル中の標的配列を有する核酸の検出方法であって：
サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、ここで、少なくとも３個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり、
【００４３】
【化１１】
0004383720.tif 000011
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、そしてオリゴデオキシリボヌクレオチドが標的配列とのハイブリッド複合体の形成に効果的である、工程、オリゴデオキシリボヌクレオチドと標的配列との間のハイブリッド複合体を形成し得るに効果的な条件下でオリゴデオキシリボヌクレオチドとサンプルとを接触させる工程、および
ハイブリッド複合体の存在を検出する工程を包含する、方法である。
【００４４】
好適な実施形態において、上記オリゴデオキシリボヌクレオチドがリポーター部分を有し、そして上記検出がリポーター部分の検出を包含する。
【００４５】
好適な実施形態において、上記リポーター部分が、放射性標識、ビオチン標識、および蛍光標識からなる群より選択される。
【００４６】
好適な実施形態において、上記接触が細胞内で行われる。
【００４７】
好適な実施形態において、上記核酸が１本鎖である。
【００４８】
本発明はまた、サンプル中の標的配列を有する２重鎖ＤＮＡの検出方法であって：
連続するヌクレオシドサブユニットおよびサブユニット間結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する工程であって、ここで、
（ｉ）少なくとも３個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または、全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり、
【００４９】
【化１２】
0004383720.tif 000012
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、そしてオリゴデオキシリボヌクレオチドが標的配列とのハイブリッド複合体の形成に効果的である、工程、オリゴデオキシリボヌクレオチドと標的配列との間のハイブリッド複合体を形成し得るに効果的な条件下でオリゴデオキシリボヌクレオチドとサンプルとを接触させる工程、および
ハイブリッド複合体の存在を検出する工程を包含する、方法である。
【００５０】
好適な実施形態において、上記オリゴデオキシリボヌクレオチドがリポーター部分を保有し、そして上記検出がリポーター部分の検出を包含する。
【００５１】
好適な実施形態において、上記ハイブリッド複合体がゲルバンドシフトにより同定される。
【００５２】
好適な実施形態において、上記接触が細胞内で行われる。
【００５３】
本発明はまた、２重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドであって、２本の相補的なストランドを有し、そして（ｉｉ）少なくとも１本のストランドがサブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有し、ここで、少なくとも２個の連続するサブユニットはＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結するか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり：
【００５４】
【化１３】
0004383720.tif 000013
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択される、２重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００５５】
好適な実施形態において、少なくとも１本のストランドの上記サブユニット間結合の５０％またはそれより多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００５６】
好適な実施形態において、少なくとも１本のストランドの上記サブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００５７】
好適な実施形態において、上記相補的なストランドがフレキシブルなヒンジ領域によって連結される。
【００５８】
本発明はまた、それぞれの相補的なストランドが５’および３’末端を有し、そして上記フレキシブルなヒンジ領域が相補的なストランド末端と、５’から３’、３’から５’、３’から３’、および５’から５’からなる群より選択される方向のうち１つで連結する、２重鎖分子である。
【００５９】
本発明はまた、薬学的組成物であって、サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり：
【００６０】
【化１４】
0004383720.tif 000014
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、そして（ｉｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドが、標的２重鎖ＤＮＡを伴う３重鎖および薬学的に受容可能なキャリアの形成に有効なヌクレオシドサブユニットの配列を有する、薬学的組成物である。
【００６１】
本発明はまた、薬学的組成物であって、サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み、ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドが、ＲＮＡと２重鎖を形成し得、ここで、少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くが以下のようなＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり：
【００６２】
【化１５】
0004383720.tif 000015
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲまたは−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、そしてオリゴデオキシリボヌクレオチドが、ＲＮＡ標的を伴う２重鎖構造、および治療的に受容可能なキャリアの形成に有効なヌクレオシドサブユニットの配列を有する、薬学的組成物である。
【００６３】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
本発明の方法、化合物および組成物は、連続するヌクレオシドサブユニットがサブユニット間結合により連結したサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドに関する。本オリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも２個の連続するサブユニットはＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットにより連結されるか、あるいは全サブユニット間結合の３個より多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合である。
【００６４】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の例は：
【００６５】
【化１６】
0004383720.tif 000016
であり、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲ、または−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択される。
【００６６】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの例は：
【００６７】
【化１７】
0004383720.tif 000017
式１
であり、
ここで、Ｘは−Ｏ−、−ＯＲ、または−Ｒであり、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択され、ｎは４から１００であり、そしてＢは塩基である。通常、５’位の酸素には１個の水素またはオリゴヌクレオチド中の別のヌクレオチドのいずれかが結合し、そして３’位の酸素にはオリゴヌクレオチド中の別のヌクレオチドが結合する。これらの例示の置換基の定義については、後述の定義の節を参照のこと。
【００６８】
本発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドを構成しているヌクレオシドサブユニットは、定義された配列内にあるように選択し得る。例えば、１本鎖核酸の標的配列に対して相補的な塩基の配列あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチドと標的２重鎖との間の３重鎖の形成を可能にする配列である。
【００６９】
１つの実施態様において、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合により連結される少なくとも３個の連続するサブユニットを有する。この群の結合は、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端に存在し得る。この位置におけるＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合はオリゴデオキシリボヌクレオチドに対してヌクレアーゼ抵抗性を付与する。
【００７０】
本発明の別の実施態様において、サブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００７１】
本発明は、オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成するために用いられる中間体およびそのような中間体の合成方法を含む。中間体としては、以下の式で表される：
【００７２】
【化１８】
0004383720.tif 000018
および
【００７３】
【化１９】
0004383720.tif 000019
本発明は、サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの形成による２重鎖の核酸分子の生成方法を包含する。ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは式１のサブユニット間結合または本明細書中で考察する他の結合と組合わさせたそのような結合を含む。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、２重鎖の効果的な形成を可能とする条件下で標的核酸分子と接触する場合、標的核酸分子と２重鎖を形成する一連のヌクレオシドサブユニットを有する。
【００７４】
本発明はまた、オリゴデオキシリボヌクレオチドの形成によるポリヌクレオチドとの蛋白質の相互作用をブロックする方法も含む。本オリゴデオキシリボヌクレオチドは、式１のサブユニット間結合または本明細書中で考察する他の結合と組合わせたそのような結合により連結した連続するヌクレオシドサブユニットを含む。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、２重鎖または３重鎖の効果的な形成を可能とする条件下で標的核酸と接触する場合、標的核酸分子と２重鎖または３重鎖を形成する一連のヌクレオシドサブユニットを有する。この方法は細胞内で用い得る。
【００７５】
また、本発明には、サブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合と第２の結合とを交互に連結するオリゴデオキシリボヌクレオチドも含まれる。第２の結合は、１つまたはそれ以上の異なる型の結合から選択され得る。例えば、ホスホジエステル結合またはホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合である。第２の結合は、例えば、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートＰ３’→Ｎ５’およびホスホロチオエートからなる群より選択される。１つの実施態様において、サブユニット間結合の少なくとも５０％がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。
【００７６】
本発明は、上記のようなオリゴデオキシリボヌクレオチドの形成による、３重鎖ＤＮＡ分子の生成方法を包含する。ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは標的２重鎖ＤＮＡを伴う３重鎖らせん構造の形成に有効な一連のヌクレオシドサブユニットを有する。次いで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドと２重鎖の標的ＤＮＡ間の３重鎖の形成を可能にするのに効果的な条件下で２重鎖ＤＮＡと接触する。この方法は、種々の条件下で、例えば、細胞内または溶液内で行われ得る。
【００７７】
本発明はまた、以下の３本のＤＮＡストランドを有する３重鎖のＤＮＡ分子も含む：（ｉ）２本の相補的なストランドを有する２重鎖のＤＮＡ分子および（ｉｉ）２重鎖と結合した、上記のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有する第３のストランドオリゴデオキシリボヌクレオチドである。１つの実施態様において、第３のストランドオリゴデオキシリボヌクレオチドのサブユニット間結合の５０％またはそれ以上がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合であり、十分に改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００７８】
さらに、本発明は、ヌクレアーゼ切断に対するオリゴデオキシリボヌクレオチドの抵抗性を増強する方法を包含する。本方法において、オリゴデオキシリボヌクレオチドが形成され、これは上記のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有する。オリゴデオキシリボヌクレオチドはヌクレアーゼに曝される。そのようなオリゴデオキシリボヌクレオチドは、ホスホジエステルのサブユニット間結合のみを有する対応するオリゴデオキシリボヌクレオチドよりもヌクレアーゼ切断に対してより抵抗性である。ヌクレアーゼの抵抗性は細胞内でも同様に観察される。
【００７９】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドは、上記のように、優れたハイブリダイゼーション特性を有する。本発明はまた、ＲＮＡの標的配列に対する最初のオリゴデオキシリボヌクレオチドのハイブリダイゼーションを増強する方法を包含する。ここで、本オリゴデオキシリボヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有する。本方法において、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を有する第２のオリゴデオキシリボヌクレオチドが形成され、これは第１のオリゴデオキシリボヌクレオチドと同様な連続するヌクレオシドサブユニット配列を有する。第２のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、該標的ＲＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションに効果的である。第２のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、次いで、オリゴデオキシリボヌクレオチドとＲＮＡとの間での複合体の形成を可能とする効率的な条件下でＲＮＡと接触する。そのような接触は、細胞内を含め、種々の条件下で行われ得る。
【００８０】
本発明はまた、サンプルからの標的ＲＮＡの単離方法およびキットを含む。キットには、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有する上記のようなオリゴデオキシリボヌクレオチドが含まれる。ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションに効果的である。典型的に、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、磁気ビーズのような固体支持体に付着され、単離を容易にする。
【００８１】
別の実施態様において、本発明は、選択された標的配列を有するＲＮＡのサンプル中の存在を検出するための診断的方法を包含する。本方法において、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが作製され、これは標的配列とのハイブリダイゼーション複合体の形成に効果的である。次いで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドと標的配列との間のハイブリッド複合体の形成を可能とする効率的な条件下において、サンプルと接触される。次いで、ハイブリッド複合体の存在が検出される。ハイブリッド複合体の検出は、リポーター部分を伴うオリゴデオキシリボヌクレオチドを標識することによって達成され得る。ここで、検出はリポーター部分の検出を包含する。多くのリポーター部分が利用され得、放射性標識、ビオチン標識、および蛍光標識を包含するが、これらに限定されない。本検出方法は、細胞内を含む、種々の条件下で行われ得る。
【００８２】
同様の診断方法が、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて行われ得る。ここで、標的配列は２重鎖のＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡである。２重鎖ＤＮＡの検出の場合、ハイブリダイゼーション複合体の検出はゲルバンドシフトアッセイを用いて達成され得る。１本鎖ＤＮＡの検出には、一般的にオリゴデオキシリボヌクレオチドは全サブユニット間結合の５０％より多くをＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合として含む。
【００８３】
本発明はまた、以下を有する２重鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む：（ｉ）２本の相補的なストランドおよび（ｉｉ）サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットであって、ここで少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合である（上記）。１つの実施態様において、少なくとも１つのストランドのサブユニット間結合の５０％またはそれ以上がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。別の実施態様において、少なくとも１つのストランドのサブユニット間結合のすべてがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合である。そのような２重鎖のＤＮＡ分子はまた、相補的なストランドに連結しているフレキシブルなヒンジ領域も含み得る。ヒンジ領域は任意の所望の極性でストランドを連結し得る。例えば、５’から３’へ、３’から５’へ、３’から３’へ、および５’から５’へである。
【００８４】
さらに、本発明は、標的領域を含む２本の相補的なＤＮＡストランドおよび１本のＲＮＡストランドを有する３重鎖の核酸複合体の形成方法およびそれらの組成物を含む。本方法において、サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが形成される。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、以下を有する２重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを形成し得る：（ｉ）５’および３’を有する２本の相補的なストランド、（ｉｉ）サブユニット間結合により連結される連続するヌクレオシドサブユニットであって、ここで少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合で連結されるか、または全サブユニット間結合の３個より多くがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合であり（上記）、（ｉｉｉ）ここで、フレキシブルなヒンジ領域によって１つのストランドの末端から他方のストランドの末端までストランドが連結され、そして（ｉｖ）ＲＮＡ標的を伴う３重らせん構造の形成に効果的な一連のヌクレオシドサブユニットを有する相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドのストランド。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、次いで、オリゴデオキシリボヌクレオチドとＲＮＡとの間の３重鎖の形成を可能とする効率的な条件下でＲＮＡ標的と接触される。本方法は、細胞内を含め、種々の条件下で行われ得る。
【００８５】
本発明はまた、上記のように、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの薬学的組成物を含む。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、抗原およびアンチセンスの適応のようなハイブリダイゼーションに基づく治療適応に有用である。
【００８６】
本発明のこれらのおよび他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読むと、より十分に理解し得る。
【００８７】
（参考文献）
【００８８】
【表１】
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（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
「アルキル基」は、１から２０個の炭素原子を有するアルキル基または置換されたアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピルなど）をいう。低級アルキルは、典型的に、Ｃ１からＣ５をいう。中級アルキルは、典型的に、Ｃ６からＣ１０をいう。同様に、「シクロアルキル基」は、アルキル、アリール、アラルキル置換基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど、）を有し得る飽和炭素環式環基、またはそれらの置換形態をいう。
【００８９】
「アルケニル基」は、炭素−炭素の２重結合を含む炭化水素基（例えば、ビニル、アリル、シクロペンテニルなど）をいう。「アルケニル基」はまた、置換されたアルケニルも含む。低級アルケニルは、典型的に、Ｃ１からＣ５をいう。中級アルケニルは、一般的に、Ｃ６からＣ１０をいう。
【００９０】
「アリール基」は、５〜２０個の炭素原子を有する芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、または置換されたアリール基で、トリル、エチルフェニル、ビフェニルなどのようなアルキル置換基またはアリール置換基）をいう。環内に１個またはそれ以上の窒素原子、酸素原子またはイオウ原子を有する複素環式芳香環基も含まれる。
【００９１】
「アラルキル基」は、アリール置換基のような置換されたアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ナフチルなど）をいう。アルキルは上記のように定義される。
【００９２】
「置換される」は、一般に前記の基が１個またはそれ以上の小さな化学部分（例えば、メトキシ、エトキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アミド、アミノ、およびエチレンオキシド）で誘導体化されることを意味する。上記で定義される基のいずれも置換され得る。例えば、（−ＣＦ３）。
【００９３】
「オリゴヌクレオチド」は、典型的に、ヌクレオシドサブユニットのポリマーをいい、約４から約５０個の連続するサブユニットを有する。ヌクレオシドサブユニットは、種々のサブユニット間結合により連結され得、図２Ａから２Ｅに示されるサブユニットを含むが、これらには限定されない。さらに、「オリゴヌクレオチド」は、糖骨格（例えば、リボースまたはデオキシリボースサブユニット）、糖（例えば、２’置換体）、塩基および、３’および５’末端に対する当業者に公知の改変を含む。「オリゴデオキシリボヌクレオチド」は、そのような改変（例えば、２’がフッ素の糖置換体）を含む。式１において、ｎは、典型的に、４から１００または５〜１００であり、好ましくは６から６０、より好ましくは６から４０、そして最も好ましくは６から３０である。一般的に、オリゴヌクレオチドの全長は、６から１００ヌクレオチドまで変化し、好ましくは６から５０ヌクレオチド、そしてより好ましくは１０から３０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにおいて、一般的に、少なくとも２個の連続するサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート中間サブユニットによって連結され、好ましくは少なくとも３個の連続するサブユニットであり、より好ましくは少なくとも４個の連続するサブユニットであり、最も好ましくは少なくとも５個の連続するユニットである。一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドは標的配列に対するミスマッチを有さない。オリゴヌクレオチドが約２０から３０ヌクレオチドより長い場合、１または２または３塩基のミスマッチは許容される。
【００９４】
「ヌクレオシド」は、本明細書においてペントース糖（リボース、デオキシリボース、またはそれらの改変物）として定義される。これらの糖は、水素結合を形成し得る塩基（典型的に、プリンまたはピリミジン）に結合する。
【００９５】
「塩基」は、本明細書において、（ｉ）典型的なＤＮＡおよびＲＮＡ塩基（ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびシトシン）、および（ｉｉ）改変された塩基または塩基アナログ（例えば、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、またはイノシン）を包含して定義される。塩基アナログは、その構造が典型的なＤＮＡまたはＲＮＡ塩基の構造に類似する化学物質である。
【００９６】
「３重鎖」は、３本の核酸ストランドを有する。典型的に、本発明のオリゴヌクレオチドは標的配列に対するミスマッチを有さない。オリゴヌクレオチドが約２０から３０ヌクレオチドより長い場合、１または２または３塩基のミスマッチは許容される。
【００９７】
（ＩＩ．本発明）
本発明の支持において実施された実施例は、アキラルなヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ切断に対してより抵抗性であり、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を含まないオリゴヌクレオチドと比較してＲＮＡおよびｄｓＤＮＡのハイブリダイゼーション特性を改善している。Ｎ３’→Ｐ５’結合を含むオリゴヌクレオチドは、インビトロの細胞の生長阻害アッセイにおいて相補的なｍＲＮＡ標的に対して優れたアンチセンス活性を有する。さらに、オリゴヌクレオチドは低い細胞傷害性を示す。
【００９８】
（Ａ．ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴヌクレオチドの合成および特徴付け）
１つのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドを、本質的には、Ｓｈａｂａｒｏｖａ（１９８８）に記載のように水性媒体中で化学的連結により合成した。あるいは、２つのサブユニット間のＮ３’→Ｐ５’結合を有し、隣接のサブユニット間結合が少なくとも１つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを、先に形成されたホスホルアミデートダイマーブロックのカップリングを介して固体支持体上で合成した（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９９２；Ｍａｇら、１９９２）。ランダムなサイズのリボオリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを、ダイマーブロックの自己重合を介して得た（Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉら、１９８７）。Ａｚｈａｙｅｒらは所定の配列のオリゴリボヌクレオチドの合成を記載している。
【００９９】
本発明は、オリゴデオキシリボヌクレオチドの生成のための固体支持体合成方法を包含し、このオリゴデオキシリボヌクレオチドは、連続するヌクレオシドサブユニットがＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合（ｎｐ）で連結されている（実施例１、図１）。オリゴデオキシリボヌクレオチドの連続合成において、５’−ジメトキシトリチル−３’−アミノ−デオキシリボヌクレオチドサブユニットが利用される。これらのサブユニットのそれぞれの調製を実施例１に示し（例えば、図２０参照）、以下に概略を示す：
【０１００】
【化２０】
0004383720.tif 000024
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合で連結されている連続するサブユニットを有するオリゴヌクレオチド（例えば、一様に改変されている）を、実施例１に概略を示し、かつ以下に示すような段階的伸長手順を用いて固体支持体上で合成した：
【０１０１】
【化２１】
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１つのアミノヌクレオシドの付加についての合成サイクルは、本質的には以下の操作からなる：脱トリチル化（図１、工程ｉ）；５’−ヒドロキシル基のホスフィチル化による、５’−Ｈ−リン酸ジエステルを支持するポリマーの生成（図１、工程ｉｉ、ｉｉｉ）；四塩化炭素存在下での５’−ジメトキシトリチル−３’−アミノ−ヌクレオシド（Ｇｌｉｎｓｋｉら、１９７０）と５’−Ｈ−リン酸塩とのＡｔｈｅｒｔｏｎ−Ｔｏｄｄ型カップリング（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９４５；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９９２；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９８６；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９９０）（図１、工程ｉｖ）。このサイクルを数回繰り返すことによって、アンモニアでの脱保護後、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを生じ得る（図１、工程ｖ、ｖｉ）。平均カップリング収率は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）カチオンアッセイによる判定で１工程当たり９４〜９６％であった。
【０１０２】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合（「ｎｐ」）を含む例示的なオリゴデオキシリボヌクレオチドを図３および本明細書中に示す。
【０１０３】
本発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合（例えば、５’−Ｔ−ｎｐ−Ｇ−ｎｐ−Ａ−３’）で連結される少なくとも２個の連続するサブユニット、または３個より多いすべてのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を含む。１つの実施態様では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、十分に改変されたＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を含んでいる（例えば、図３、実験１３、オリゴヌクレオチド６）。別の実施態様では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、サブユニット間交互のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を有し、代表的には、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合が交互である（例示的な結合については、以下および図２を参照）。交互の結合を有するこのようなオリゴデオキシリボヌクレオチドの例を、図３、実験３、オリゴヌクレオチド２に示す。オリゴヌクレオチド２の合成は実施例１に記載されている。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドをイオン交換高速液体クロマトグラフィーによって単離した（ＩＥ  ＨＰＬＣ；実施例２、図４Ａ）。単離したオリゴヌクレオチド調製物の純度を、キャピラリー電気泳動およびスラブゲル電気泳動分析により評価した（実施例２、図４Ｂ）。
【０１０５】
精製したオリゴヌクレオチドのホスホルアミデート結合の存在を、３１Ｐ−ＮＭＲ（実施例２、図４Ｃ）およびホスホルアミデート結合の選択的な酸触媒による加水分解（実施例２）によって確認した。
【０１０６】
図１（工程ｉ、ｉｉｉ）のシアノエステル基は、他のペンダント基と置き換えられ得、これにはアルキル基（通常、低級または中級アルキル基）、アルケニル基、アリール基およびアラルキル基（または前述の基の任意の置換体）が含まれる。代表的には、そのようなペンダント基は、オリゴヌクレオチドの合成またはオリゴヌクレオチドが標的とハイブリダイズする能力を妨害しない。ペンダント基の一例は、−ＣＨ３（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９９２）である。代表的な繰り返しユニットを図２Ａに示す。ここで、「Ｘ」は、「−Ｏ−」、「−ＯＲ」または「−Ｒ」であり、そして「Ｒ」は、例えば、以下のペンダント基群またはそれらの置換体の任意のものである：アルキル、アルケニル、アリール、およびアラルキル。
【０１０７】
ホスホルアミデートアナログおよびキメラのホスホルアミデート／ホスホジエステルアナログ（図２Ｃ）に加え、ヌクレオシド間Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合は、１つまたはそれ以上の他の改変されたサブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドに組み込まれ得（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０により総説されている）、そのようなものとして、ホスホトリエステル（図２Ｄ）、メチルホスホネート（図２Ｂ）、ホスホルアミデート（図２Ｆ）、ホスホルアミデートＰ３’→Ｎ５’、およびホスホロチオエート（図２Ｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
（Ｂ．アキラルなヌクレオシド間３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性）
ヘビ毒液のホスホジエステラーゼによる加水分解に対するオリゴヌクレオチドホスホルアミデートの安定性を、天然のホスホジエステル化合物との比較によって評価した（材料および方法の節参照）。ホスホジエステルデカマーのオリゴヌクレオチド１（図３）をヘビ毒液のホスホジエステラーゼで処理した。このオリゴヌクレオチド１は１０分後には完全に加水分解され、これは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって判断した。
【０１０９】
これとは対照的に、ホスホルアミデートアナログのオリゴヌクレオチド３は、ヘビ毒液のホスホジエステラーゼでの処理の５０分後でも本質的にそのままであった。４．５時間後、約５０％のオリゴヌクレオチド３を、末端の３’−アミノ基を有する推定９マーの（ＴｎｐＴ）４ＴＮＨ２に変換した。末端の３’−アミノ基の存在はこのオリゴマーのさらなる切断を遅らせた。２２時間の加水分解後、最初の１０マーのオリゴヌクレオチド３は、完全に３’−アミノ末端の９マー｛（Ｔｎｐ）８ＴＮＨ２｝に変換された。この｛（Ｔｎｐ）８ＴＮＨ２｝化合物の約２０％だけのさらなる切断が観測された。
【０１１０】
これらの結果は、標準のホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドと比較して、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合（「ｎｐ」）を含むオリゴヌクレオチドの増大したヌクレアーゼ抵抗性を示す。本発明の１つの実施態様によれば、オリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性は、このオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端にＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合により連結され約３つの連続するサブユニットを配置することにより生成する。
【０１１１】
（Ｃ．Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性）
ホスホルアミデートアナログのハイブリダイゼーション特性を、標準のホスホジエステルのサブユニット間結合を有する相補的なＤＮＡまたはＲＮＡストランドに関して評価した。ホスホルアミデートアナログおよびホスホジエステルオリゴマーから生成する２重鎖の熱安定性データを図３に要約する（実施例１）。
【０１１２】
ホスホジエステルおよびホスホルアミデートアナログオリゴマーにより形成される２重鎖の融解曲線データの例（実施例４Ａ）を図５Ａおよび５Ｂに示す。この図において、曲線（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）、および（Ｄ）は、それぞれ、図３における実験８、９、１３および１４に対応する。
【０１１３】
ヌクレオシド間のホスホジエステルのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合についての置換は、このオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を劇的に変化させた。完全に改変された１０マーのオリゴヌクレオチド３とポリＤａ（すなわち、ＤＮＡ）およびポリＡ（すなわち、ＲＮＡ）とにより形成される２重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、それぞれ、３６．０℃および５１．５℃であった（図３、実験５および６）。これらのＴｍは、ホスホジエステルの相対物のオリゴヌクレオチド１とポリＤａおよびポリＡとにより形成される２重鎖よりも、６．３℃および２４．５℃高い（図３、実験１および２）。
【０１１４】
同じ傾向が混合塩基のウンデカヌクレオチド６についても当てはまり（図３）、この場合、相補的なＤＮＡストランドおよびＲＮＡストランドとの２重鎖のＴｍは、それぞれ、４９．２℃および７２．４℃であった（図３、実験１３、１４）。これらの値は、親のホスホジエステル化合物のオリゴデオキシリボヌクレオチド４についての値よりも１１．７℃および２２．９℃高い（図３、実験８および９）。また、ホスホルアミデートの１１マーのオリゴデオキシリボヌクレオチド６により形成される同一ＲＮＡ標的との２重鎖は、相同なＲＮＡオリゴマー５により形成される２重鎖よりも（１８．０℃）安定である（図３、実験１１）。
【０１１５】
オリゴデオキシリボヌクレオチド２はまた、ホスホジエステル−ホスホルアミデート結合が交互になっており、対応するホスホジエステル化合物（オリゴデオキシリボヌクレオチド１、図３、実験２）より、ＲＮＡストランドと一層堅く結合し、そのＴｍは３３．７℃である（図３、実験４）。しかし、オリゴデオキシリボヌクレオチド２は、そのホスホジエステルの相対物（オリゴデオキシリボヌクレオチド１、図３、実験１）と比較して、ＤＮＡテンプレートに対してはあまり強く結合せず、Ｔｍは２５．８℃である（図３、実施例３）。相補的な核酸とのホスホルアミデートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、配列特異的であり、適切なワトソン−クリック型塩基対形成により決定される。ホスホルアミデートオリゴデオキシリボヌクレオチド６と１つのミスマッチのＲＮＡ標的とにより形成される２重鎖（図３、実験１５）は、完全な相補的ＲＮＡオリゴマーとともに形成される２重鎖より実質的に安定でない（−１２．２℃のΔＴｍ）（図３、実験１３）。ほぼ同様のミスマッチの相違がホスホジエステルのデオキシリボ−オリゴヌクレオチドおよびリボ−オリゴヌクレオチドで測定され、その場合のΔＴｍは、それぞれ−１４．４℃および−１２．４℃であった（図３、実験１０、１２）。
【０１１６】
ホスホルアミデートアナログを用いた以前の研究において、３つのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合の導入により、このような２個の結合と比較して、不安定化傾向になることが示され、それはデオキシリボ−オリゴヌクレオチド標的とともに形成されるヘテロ２重鎖によるものであった（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、１９９２）。先行技術の傾向とは対照的に、上記の結果は、ホスホルアミデート結合としての５０％までのサブユニット間結合を有する場合、代表的にはＤＮＡ／ＤＮＡヘテロ２重鎖の安定性が低下することを示す。しかし、ＤＮＡ２重鎖の１本のストランドの５０％より多いホスホルアミデートサブユニット間結合は、この２重鎖関連物の安定性を向上させ始める。
【０１１７】
ＤＮＡ２重鎖が、正常なホスホジエステルオリゴヌクレオチドとＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合で十分に改変されているオリゴヌクレオチドとの間で形成される場合、この２重鎖の熱安定性は、両方のストランドにホスホジエステル結合のみを有する対応する２重鎖よりさらに高い（図３、比較実験１および５）。
【０１１８】
Ｇｒｙａｚｎｏｖら（１９９２）は、一方のストランドが３つまでのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合（連続していない）を含むＤＮＡ／ＤＮＡ２重鎖のハイブリダイゼーション特性に関するデータを含むだけである。ＤＮＡ標的に関する先行技術の教示との明確な対比により、本発明の支持のために実施された実験は、オリゴデオキシリボヌクレオチドに存在しているホスホルアミデートアナログの結合の数の増加により、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２重鎖の安定性が増大することを示す。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２重鎖の安定化を成し遂げるために、本発明の好ましい実施態様は、少なくとも２つの連続する中間サブユニット、または３つより多いすべてのサブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するように改変されているオリゴデオキシリボヌクレオチドを包含する。さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、  Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有する少なくとも５つの連続する中間サブユニットを有する。
【０１１９】
実験はまた、両方の相補的なストランドにおけるホスホルアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドにより形成される２重鎖の安定性を評価するために実施された。チミジンを含むヒンジ部（Ｔ４、図６）を有する幾つかのキメラホスホルアミデート−ホスホジエステルのヘアピンオリゴマー（図６）を合成した（図６、実施例４Ｂ）。これらの化合物に対して得られた融解曲線は、最も安定な２重鎖がオリゴヌクレオチド９および１２のヘアピンにより形成されたことを示し、その場合、両方のストランドは相対する位置にホスホルアミデート結合を含む（図６、実験３、６）。
【０１２０】
また、単鎖のＤＮＡ分子から形成される２重鎖（すなわち、ヘアピン）は、一方のストランドが交互するホスホルアミデート−ホスホジエステル結合を含み、ここでその相補鎖がホスホジエステル結合のみを有し、それらの単なるホスホジエステルの相対物よりも安定である（図６、実験１、４）。
【０１２１】
これらの結果は、ＤＮＡ／ＤＮＡ２重鎖の両方のストランドがホスホルアミデートアナログ結合を含む場合、この２重鎖がそれぞれのストランドのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合の存在により安定化されることを示唆する。安定な２重鎖はそれぞれのストランドの１つのホスホルアミデート結合で形成され得る。すなわち、１つの実施態様では、ホスホルアミデート結合はそれぞれのストランドの同一の位置にある。
【０１２２】
ＤＮＡ／ＤＮＡ２重鎖の安定化を成し遂げるために、代表的には、オリゴヌクレオチドを形成する２重鎖のそれぞれのＤＮＡストランドにおける２つまたはそれ以上のサブユニット間結合は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するように改変される。１つの実施態様では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを形成するヘアピンの一方のストランドは、約５０から１００％のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を有するように改変され得る。
【０１２３】
（Ｄ．ホスホルアミデートアナログを用いる３重鎖の形成）
２本鎖ＤＮＡと３重鎖を形成するホスホルアミデートアナログの能力もまた、評価した（実施例４）。融解曲線を、デカチミジンホスホルアミデートオリゴデオキシリボヌクレオチド６とヘアピンＤＮＡ標的のｄ（Ａ１０Ｃ４Ｔ１０）のｄＡ１０：ｄＴ１０の２重鎖領域とにより形成される３重鎖について得た（図３、実験７）。この３重鎖は生理学的条件の近くで３２℃のＴｍを有した。さらに安定な３重鎖（４２．２℃のＴｍ）がマグネシウム含有緩衝液中で観測された（図３、実験７）。
【０１２４】
同じＴｍ値が、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３とポリｄＡ：ポリｄＴ２重鎖とにより形成される３重鎖について得られた。この３重鎖の熱解離を、２６０ｎｍ（図７Ａおよび７Ｃ）、および２８４ｎｍ（図７Ｂおよび７Ｄ）における吸光度の変化によりモニターした。これはＴ：ＡＴ３重鎖に特徴的である（Ｒｉｌｅｙら、１９６６）。
【０１２５】
未変性条件下でのゲルシフト実験の結果はまた、ホスホルアミデートデカマー３およびｄｓｄｎａ標的による安定な３重鎖の形成（図８）、ならびにオリゴヌクレオチド６による安定な３重鎖形成（図９）示す。
【０１２６】
同じハイブリダイゼーション条件下で、ホスホジエステルデカチミジン酸のオリゴヌクレオチド１またはオリゴヌクレオチド４のいずれも同じ２本鎖ＤＮＡ標的との３重鎖を形成しなかった。これは、融解曲線およびゲルシフト実験により判断した（図８）。すなわち、対応する３重鎖はホスホジエステルサブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドにより形成されなかった。このことは、ホスホルアミデートアナログが、相対物を含むそれらのホスホジエステルよりも容易に３重鎖を形成し得ることを示唆する。
【０１２７】
同様の結果が、オリゴヌクレオチド６およびオリゴヌクレオチド１が、２重鎖ＤＮＡ標的との３重鎖構造を形成する能力を評価する場合に得られた（実施例５、図９）。
【０１２８】
上記の結果は、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、標準のホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりも、２重鎖基質との３重鎖形成についてより効果的であることを示唆する。
【０１２９】
（ＩＩＩ．  中間ヌクレオシド３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴヌクレオチドの適用）
オリゴヌクレオチド３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートを合成した。これらの化合物はヌクレアーゼ耐性であり、ｓｓＲＮＡおよびＤＮＡ標的と、驚くほどに安定な複合体を形成する。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートアナログは、アンチセンスおよび抗遺伝子診断／治療の適用に対して大いなる可能性を有する。本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【０１３０】
（Ａ．アンチセンス適用）
アンチセンス治療は、細胞内に存在する標的核酸、代表的にはＲＮＡ分子に結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を包含する。用語「アンチセンス」は、オリゴヌクレオチドが、代表的には、細胞産生物をコードするｍＲＮＡ分子（「センス鎖」）に相補的であるのでそう示される。
【０１３１】
本明細書に記載のホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現のアンチセンス阻害に有用である（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、１９８９；  Ａｇｒａｗａｌら、１９８９；Ｚａｍｅｃｎｉｋら、１９８６；  ＲｉｔｔｎｅｒおよびＳｃｚａｋｉｅｌ，１９９１；  ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ，１９９３）。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を有するオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ガン細胞増殖および感染性ウイルスによる干渉の阻害を包含する、医学上重要な多くの標的に対する治療の適用性を有する。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、家畜およびヒトへの適用の両方に有用である。これらの化合物の低細胞毒性、およびアンチセンス分子としての低濃度での有効な作用能力（下記を参照のこと）は、これらのオリゴヌクレオチドを、治療用アンチセンス薬剤として高度に望ましくする。
【０１３２】
アンチセンス薬剤は代表的には、それらを不活性化するか、あるいは内因性リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性に対する基質を提供するように、全標的ＲＮＡ分子に連続的に結合することを必要とする本発明の方法により生成されるＲＮＡ／オリゴヌクレオチド複合体のＲＮａｓｅＨに対する感受性は、標準的な方法により評価され得る（Ｄｏｎｉａら、１９９３；  Ｋａｗａｓａｋｉら、１９９３）。
【０１３３】
本発明の方法は、より多くの従来のアンチセンス薬剤を超える数個の利点を提供する。第一に、ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、対応のホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりも、ＲＮＡ標的に強く結合する。第二に、ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解に対してより耐性である。
【０１３４】
さらに、ＲＮＡが、２重鎖標的配列のほとんどのプリン鎖によってコードされるときは、その２重鎖に標的づけられるホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡを不活性化する可能性、すなわち、１本鎖および２本鎖両形態の病原体を不活性化する能力を有する（下記の抗遺伝子治療の考察を参照のこと）。
【０１３５】
配列特異的ホスホルアミデートアナログ結合分子は、何らかの点でＲＮＡに関連する本質的ないかなる疾患または症状に対する、潜在的に有力な治療法である。このような配列が、治療適用のために標的づけられ得る実施様式は、下記の（ａ）から（ｄ）を包含する：
（ａ）細菌、ウイルス、酵母、およびその他の真菌類のような、感染因子の増殖および／または維持に関連する産生物を発現するＲＮＡ配列、例えば、感染因子によってコードされる特異ｍＲＮＡの標的付け；
（ｂ）ＲＮＡ切断（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド２重鎖分子のＲＮａｓｅ切断）を結果として誘導する２重鎖分子の形成；
（ｃ）  ＲＮＡ配列とのタンパク質の相互作用（例えば、ＴＡＴとＴＡＲとの相互作用、下記を参照のこと）のブロック；および
（ｄ）細胞遺伝子の不適切な発現あるいは増殖を引き起こす配列の標的付け：例えば、細胞サイクル調節；炎症過程；平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖、移動およびマトリックス形成（Ｌｉｕら、１９８９）；ある種の遺伝子疾患；およびガン（ガン原遺伝子）に関連する遺伝子。ある実施態様において、不適切に発現された細胞性遺伝子の翻訳またはＲＮＡプロセシングがブロックされる。
【０１３６】
典型的な潜在標的配列は、以下のものに限定されないが、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｋｉｔ、ｒａｓ、およびＢＣＲ／ＡＢＬを含むガン原遺伝子（例えば、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ；  Ｚａｌｅｗｓｋｉら、１９９３；  Ｃａｌａｂｒｅｔｔａら、１９９２，１９９３；）、ガン遺伝子／腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３，  Ｂａｙｅｖｅｒら）、転写因子（例えば、ＮＦκＢ、Ｃｏｇｓｗｅｌｌら、１９９３）、およびウイルス遺伝子（例えば、パピローマウイルス、Ｃｏｗｓｅｒｔら；単純ヘルペスウイルス、Ｋｕｌｋａら）である。さらに説明すると、本発明の方法によって標的され得るＨＩＶ−１タンパク質の２つのＲＮＡ領域は、ＲＥＶタンパク質応答エレメント（ＲＲＥ）およびＴＡＴタンパク質トランス活性化応答エレメント（ＴＡＲ）である。ＲＥＶ活性は、ＨＩＶエンベロープ遺伝子中に位置される、ＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ；  配列番号２３）の存在を必要とする（Ｍａｌｉｍら、１９８９ａ，  １９８９ｂ）。
【０１３７】
ＲＲＥは、４つのステム−ループ構造および１つの分枝ステム−ループ構造を形成すると考えられている、２３４ヌクレオチド領域にマッピングされる（Ｍａｌｉｍら、１９８９ａ）。フットプリント法から得られるデータ（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９０；  Ｋｊｅｍｓら、１９９１）は、ＲＥＶが、ＲＲＥの１つのステム構造中の６つの塩基対および隣接するステム−ループ構造中の３つのヌクレオチドに結合することを示唆している。ステム−ループＩＩ中の約４０ヌクレオチドの最小ＲＥＶ結合領域は、Ｃｏｏｋらによって同定された（１９９１；  配列番号２４）。この結合領域は、本発明の方法に従い、１つ以上のオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖（例えば、Ｌｉら、１９９３）を形成するために標的され得る。
【０１３８】
ＨＩＶ−１  ＴＡＴは、ウイルス複製に不可欠であり、そして長い末端繰り返し（ＬＴＲ）に特異的なウイルスの遺伝子発現の強力なトランス活性化因子である（Ｄａｙｔｏｎら、１９８６；  Ｆｉｓｈｅｒら、１９８６）。ＴＡＴタンパク質に誘導されるトランス活性化は、ウイルスのｍＲＮＡエレメントの非翻訳５’末端に存在する、ＴＡＲエレメント（配列番号２５）の存在を必要とする。
【０１３９】
ＴＡＲエレメントは、安定なステム−ループ構造を形成し得る（Ｍｕｅｓｉｎｇら、１９８７）。ＴＡＲのステムの完全なステムおよび３ヌクレオチド（ｎｔ）のバルジ（ｂｕｌｇｅ）は、ＴＡＲエレメントへのＴＡＴタンパク質の特異的および高親和性の結合に不可欠であることが実証された（Ｒｏｙら、１９９０；Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら、１９９０；Ｄｉｎｇｗａｌｌら、１９８９；  Ｗｅｅｋｓら、１９９０）。この領域は、以下の本発明の方法に従ってアンチセンス治療用に標的され得る。
【０１４０】
ＲＥＶ、ＲＲＥ、およびＴＡＴタンパク質のＲＮＡ結合部位を標的化することに加えて、ＲＥＶおよびＴＡＴタンパク質自身に関するＲＮＡコーディング配列は、タンパク質の発現をブロックするために標的され得る。
【０１４１】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ＲＲＥのステム−ループ構造のような、自己アニールし、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡ領域に対して特有の標的化能力を与える。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの１つの鎖に対するＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの高親和性結合によって、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを取り外す（ｄｉｓｐｌａｃｅ）。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドへの第１のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの結合が、ＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖（１つの鎖がＲＮＡであり、１つの鎖がＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドである）の形成をもたらし、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの再会合を阻み、そして、タンパク質によるＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの結合あるいは認識を阻害し得る。第１のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの結合はまた、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの切断を増大する。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドと比較して、ＲＮＡ／Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート２重鎖のより高度な安定性は、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡの再アニーリングの機会を最小限にする。あるいは、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの１つの鎖へのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの結合は、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを開裂し、それによって、第２のオリゴヌクレオチドが結合するための第２のＲＮＡ部位を曝露させる。自己アニールし、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡ領域は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが公知のＲＮＡ結合タンパク質を取り外すことを実証することにより、経験的に同定され得る。ステムループ構造のような、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを有するＲＮＡ領域はまた、ＲＮＡ二次構造のコンピュータ補助予測により同定され得る。Ｓｉｘｏｕ，  Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：６６２−６６８  （１９９４）（この方法は本明細書に参考として援用されている）のようなプログラムは、少なくとも３〜７塩基対によって分離されるパリンドローム配列のような、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡ領域を同定するのに、特に有用である。
【０１４２】
潜在的なアンチセンス標的部位への結合に特異な、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの最初のスクリーニングは、代表的には、得られるＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖の熱安定性を試験することを包含する。選択されたＲＮＡ標的配列に結合するホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドが同定されると、このアナログは、インビトロにおけるＲＮＡ機能の阻害についてさらに試験される。細胞培養アッセイシステムは、このようなインビトロ分析に使用される（例えば、単純ヘルペスウイルス、Ｋｕｌｋａら；ＨＩＶ−１，  Ｌｉら、Ｖｉｃｋｅｒｓら；再狭窄における冠平滑筋細胞増殖、Ｚａｌｅｗｓｋｉら；ＩＬ−２Ｒ，  Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖら；ｃ−ｍｙｂ、Ｂａｅｒら；ｃ−ｆｏｓ，  Ｃｕｔｒｙら；ＢＣＲ／ＡＢＬ，  Ｓｚｃｚｙｌｉｋら、１９９１）。
【０１４３】
実施例５は、このような細胞培養系の１つにおける、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの試験の結果を示す。このアッセイは、ＢＣＲ−ＡＢＬアンチセンスオリゴヌクレオチドによる白血病細胞増殖の選択的阻害を測定する（Ｓｚｃｚｙｌｉｋら、１９９１）。ＢＣＲ−ＡＢＬ転写物は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者、およびＰｈ＋急性リンパ球性白血病患者の大多数に認められ、白血病の表現型の維持に必要であると考えられる（Ｇａｌｅら；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８４；  Ｄａｌｅｙら）。ＢＣＲ−ＡＢＬ転写物は、ガン原遺伝子ＡＢＬ（第９染色体）のブレークポイントクラスター（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｃｌｕｓｔｅｒ）領域（ＢＣＲ）（第２２染色体）へのトランスロケーションの結果であり、ＢＣＲ−ＡＢＬハイブリッド遺伝子形成を生じる。
【０１４４】
同定されたＢＣＲ−ＡＢＬ接合部Ｂ２Ａ２（細胞株ＢＶ１７３）に相補的な、完全に改変したＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートアンチセンスオリゴヌクレオチド１１マー（配列番号６）を、合成および精製した。（ｉ）上記の１１マー配列を有し、（ｉｉ）完全に改変したホスホロチオエートサブユニット間結合を有する、対応するオリゴヌクレオチド１６マー（配列番号２６）もまた調製した。このオリゴヌクレオチドを、図１０から１５、１６、および１８に示されている濃度で、３日間（０日、１日、および２日）２４時間間隔で細胞に投与した。図中の濃度は、以下のように示されている：４０／２０／２０は、細胞培養物に添加されたオリゴヌクレオチドのμｇ／ｍｌ濃度に対応する（実施例５）。
【０１４５】
図１７および１８は、完全に改変したホスホロチオエートサブユニット間結合を有し、ＢＶ１７３  ＢＣＲ／ＡＢＬスプライス接合部に対してミスマッチな配列を有する１６マーを用いて実施された実験の結果を示す。
【０１４６】
図１０、１２、および１４に示されている結果は、オリゴヌクレオチドが投与されたときの濃度に関係なく、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、ＢＶ１７３白血病細胞の増殖を阻害することにおいて、非常に有効的であったことを示す。
【０１４７】
図１１、１３、および１５に示されている結果は、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが無視できるほどの細胞毒性を有することを示す。これらの実験では、細胞株は、ＢＣＲ／ＡＢＬブレークポイントを有さないＨＬ６０か、あるいはＢ３Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬブレークポイント（部分的にＢ２Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬブレークポイントに対して非相同である）を有するＫ５６２のいずれかである。
【０１４８】
一方で、ホスホロチオエート１６マーを用いて同様の実験を実施した場合、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドと比較し得る濃度で投与されたときには、このオリゴヌクレオチドは、ＢＶ１７３白血病細胞増殖を阻害することにおいて有効ではなかった（図１６および１８）。詳細には、白血病細胞は、０．０１９６／０．００９８／０．００９８のホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを使用したときに認められる同様の阻害の解放に比較して、約１．２５／０．６２５／０．６２５の濃度でホスホロチオエート１６マーによる阻害から解放され始めるようである。従って、この結果は、ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドが、広く使用されているホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりもかなり低濃度で、有効なアンチセンス薬剤であることを示す。
【０１４９】
さらに、ホスホロアミデートオリゴヌクレオチド処置で認められる阻害曲線は、阻害の部分的な解放後でさえ、より遅い時点で下向きの変化を有する（図１４）。一方では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド処置で認められる阻害曲線は、阻害の部分的な解放後に、より遅い時点で急勾配の上向きの変化を有する（図１８）。これらの結果は、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドに比較した場合、阻害からの解放が、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについてはより劇的であることを示唆する。
【０１５０】
ホスホロチオエート１６マーに関する細胞毒性の非存在性を、同じ濃度で適用されたホルホルアミデートオリゴヌクレオチドに関して認められる細胞毒性と比較した。
【０１５１】
上記に示されている結果により、上記のハイブリダイゼーション調査によって示されたＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの優れた性質が細胞培養物中で確認される。これらの結果は、インビボでのアンチセンスおよび抗遺伝子治療におけるＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの有用性および有効性を支持する。
【０１５２】
さらに、この結果は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより、インビトロで優れたアンチセンス機能を提供することを示す。今日まで、オリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート骨格の改変が、アンチセンス適用に関して標準的になっており、１９９３年には約２５００のアンチセンス定期刊行物中の９５％を超える中に、目的アナログが示されている。
【０１５３】
多くのｍＲＮＡ標的を含む多種のアッセイシステムにおいて、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的な阻害効果を達成するために、１−１５μＭ濃度で必要とされた。それにもかかわらず、そのレベルでの阻害活性は、３つの異なるｍＲＮＡを標的化する３つの疾患においてＵＳ  ＦＡＤ承認の臨床試験を開始するに十分であった：ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病），ＩＮＤ  ＃４２９７４、およびＡＭＬ（急性骨髄性白血病），ＩＮＤ  ＃４０４５３（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  Ｖｏｌ．５，  Ｎｏ．６．  ｐｐ１６１−１６２  （１９９２），  ＩＳＳＮ  ０８９７−９８７１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）。
【０１５４】
実施例５に示されているデータは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、相当するホスホロチオエートより非常に低濃度で有効なアンチセンス薬剤であることを示す。さらに、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、アンチセンス活性に要求される濃度を十分に超える、用いられる最高濃度においてさえ、明らかな細胞毒性を有さない。この結果は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、治療適用に優れた薬剤であることを示す。
【０１５５】
選択されたホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドのインビトロ効果は、インビボ系で確認され得る。このようなインビボ系は、限定されないが、下記を包含する（標的ーモデルシステム）：肝炎ウイルスーチンパンジーまたはサルモデル；ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ−ＳＣＩＤマウスモデル（例えば、Ｒａｔａｊｃｚａｋら）；ＮＦ−κＢ−マウス（Ｈｉｇｇｉｎｓら）：およびｐ１２０−マウス（Ｐｅｒｌａｋｅｙら）。
【０１５６】
（Ｂ．抗遺伝子適用）
３重鎖形成を介しての遺伝子発現阻害は、以前に示されている（Ｃｏｏｎｅｙら、１９８９；  Ｏｒｓｏｎら、１９９１；  Ｐｏｓｔｅｌら、１９９１）。第３鎖のホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドを用いて形成された３重鎖構造の増大された安定性は、家畜およびヒトの治療適用を含む、抗遺伝子適用のより強力な手段を提供する。
【０１５７】
最良の標的領域は、３重鎖形成に関する標準的な規則によって、既知配列に基づいて選択される（ＨｅｌｅｎｅおよびＴｏｕｌｍｅ，  １９９０）。代表的には、ホスホルアミデートアナログ核酸配列は、１つの鎖が優先的にプリンを含有し、もう１つの鎖が優先的にピリミジンを含有する２本鎖遺伝子配列に対して標的づけられる。
【０１５８】
本発明のホスホルアミデートアナログオルゴヌクレオチドを、バンドシフトアッセイを用いて、選択２重鎖標的配列に対しての３重鎖形成について試験する（実施例４）。代表的には、高パーセンテージポリアクリルアミドゲルをバンドシフト分析用に使用し、変性条件レベル（Ａｕｓｕｂｅｌら；  Ｓａｕｅｒら；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら）を、あらゆる非特異バックグラウンド結合を減じるように調整する。
【０１５９】
２重鎖標的を（例えば、放射活性ヌクレオチドを使用して）標識し、第３鎖のオリゴヌクレオチドと混合して、標的の２重鎖と３重鎖構造を形成する能力について試験する。標識２重鎖オリゴヌクレオチドの移動度のシフトは、オリゴヌクレオチドが３重鎖構造を形成する能力を示す。
【０１６０】
３重鎖の形成は、バンドシフトアッセイにおいて標識２重鎖構造と比較して、ゲルでの標識３重鎖構造の移動度が減少することにより示される。
【０１６１】
長さおよび複雑さの異なるＤＮＡ配列の全範囲から選択される標的部位を含む多くの潜在的な標的部位が、この方法により評価され得る。配列特異的ホスホルアミデートアナログ結合分子は、なんらかの点でＤＮＡに関与する本質的に任意の疾患または症状に対する潜在的に強力な治療薬である。このような治療薬のための典型的な標的配列は、（ａ）細菌、ウイルス、酵母、およびその他の真菌類のような感染性因子の増殖および／または維持に関与する（例えば、感染性因子の代謝を中断させる）ＤＮＡ配列；および（ｂ）ガン遺伝子のような細胞遺伝子の不適切な発現あるいは増殖を引き起こす配列、例えば、不適切に発現された細胞遺伝子（例えば、特定の遺伝疾患に関連する遺伝子）の転写をブロックまたは減少させる配列を包含する。
【０１６２】
遺伝子発現または複製は、必要な調節タンパク質（または分子）が結合することが知られている領域（例えば、ＨＩＶ転写関連因子は、プロモーター開始部位およびＳＰ１結合部位を好む、ＭｃＳｈａｎら）において、３重鎖構造を生成することによりブロックされ得る。あるいは、遺伝子（例えば、ガン遺伝子）のタンパク質コーディング領域内の特異配列も同じように標的され得る。
【０１６３】
ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、選択された２重鎖標的配列試験体を結合することが、例えば上記のゲルバンドシフト移動度アッセイによって同定される場合、そのアナログはさらに、インビトロにおいて安定な３重鎖構造を形成する能力について試験される。上記の「アンチセンス適用」に記載されているような、細胞培養およびインビボアッセイシステムが使用される。
【０１６４】
標的部位は、遺伝子の制御領域（例えば、調節タンパク質の転写開始部位または結合領域）において選択され得る（ＨｅｌｅｎｅおよびＴｏｕｌｍｅ，  １９９０；  Ｂｉｒｇら、１９９０；  Ｐｏｓｔｅｌら、１９９１；  Ｃｏｏｎｅｙら、１９８８）。さらに、標的部位は、その標的がｍＲＮＡ配列（すなわち、転写された配列）中にも存在するように選択され得、その部位に対するオリゴヌクレオチドがアンチセンスメディエーターとしても同様に機能し得る（上記を参照のこと）。
【０１６５】
さらに、ホスホルアミデート改変ＤＮＡ分子は、第３鎖標的（すなわち、１本鎖核酸）と３重鎖分子を生成するために使用され得る。例えば、選択標的の第３鎖分子と３重鎖構造を形成し得る２つの領域を有するＤＮＡ分子が合成され得る。代表的には、２つの領域は、その２つの領域が第３鎖と会合して３重鎖を形成し得る可動部により連結される。このようなＤＮＡ分子の１例は、Ｔ１０（全てホスホルアミデート改変）−Ｃ４（ヒンジ部）−Ｔ１０（ホスホジエステル結合）である。この分子は、ポリＡ  ＲＮＡ標的と３重鎖構造を形成する。Ｔ１０（ホスホジエステル結合）−Ｃ４（ヒンジ部）−Ｔ１０（ホスホジエステル結合）を有する対応のＤＮＡ分子は、ポリＡ  ＲＮＡ標的と３重鎖を形成しない。
【０１６６】
ヒンジ部は、２つの３重鎖形成領域を一緒に維持し、この領域と第３鎖とを会合させて３重鎖を形成し得る任意の可動性の結合を含有し得る。第３鎖標的は、３重鎖分子を形成し得る適切なプリン／ピリミジン含量を有するように選択される。
【０１６７】
可動性の結合は、２つの３重鎖形成領域（典型的には、相補的なＤＮＡ鎖）を、標的の塩基配列の特性に依存して任意の選択された方向で連結し得る。例えば、２つの３重鎖形成領域の各々は、５’末端および３’末端を有し、これらの末端は、以下の方向で可動性ヒンジ部によって連結され得る：５’から３’、３’から５’、３’から３’、５’から５’。
【０１６８】
さらに、各鎖に少なくとも１つのホスホルアミデート結合を有する２重鎖ＤＮＡ分子は、転写因子あるいはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｃ−ｍｙｂ）に対するおとり分子として使用され得る。
【０１６９】
１本鎖ＤＮＡはまた、例えば、ホスホルアミデートサブユニット間結合を含有するヘアピン構造（例えば、図６）を用いて本発明のオリゴヌクレオチドに対する標的核酸として使用され得る。２つのホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡの標的特異的結合により選択され得る。２つのホスホルアミデートアナログ鎖と１本鎖ＤＮＡ標的との結合により、３重鎖の形成がもたらされる。
【０１７０】
（Ｃ．薬学的組成物）
本発明は、アンチセンス治療および抗遺伝子治療に有用な薬学的組成物を包含する。組成物は、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの有効量を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含有する。１種以上の（異なる塩基配列を有する）Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、任意の所定の処方剤に含有され得る。
【０１７１】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、治療適用に使用される場合、純粋なままで処方され得るか、または薬学的キャリアが添加されて処方され得る。薬学的キャリアは、固体または液体であり得る。次いで、処方剤は、必要に応じて治療に有効な投与量で被験体に投与される。
【０１７２】
液体キャリアは、溶液、エマルジョン、懸濁液、および加圧組成物の調製に使用され得る。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、水、有機溶媒、その両方の混合物、あるいは薬学的に受容される油または脂質のような薬学的に受容可能な液体キャリア中に、溶解あるいは懸濁される。液体キャリアは、以下のものを包含するがそれに限定されない他の適切な薬学的添加物を含有し得る：溶解補助剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝液、肥厚（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｉｇ）剤、着色剤、粘度調節剤、保存剤、安定剤、および浸透圧調節剤。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド調製物の非経口投与用の液体キャリアの適切な例は、水（部分的に添加物、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含む）、アルコール（１価アルコールおよび多価アルコール、例えば、グリコールを包含する）、およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分留ココナッツ油およびピーナッツ油）を包含する。
【０１７３】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの非経口投与用には、キャリアはまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような油性エステルであり得る。滅菌キャリアは、非経口投与用の滅菌液体型組成物において有用である。
【０１７４】
滅菌液体薬学的組成物、溶液、または懸濁液は、例えば、腹腔内注射、皮下注射、静脈あるいは局所投与により利用され得る。例えば、網膜サイトメガロウイルス感染に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、点眼により局所投与され得る。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドはまた、脈管内に、またはミコフェノール酸を充満させた脈管ステントを通して、例えば、損傷直後に局所的な抗再狭窄効果を提供するためのバルーンカテーテル法の間に投与され得る。
【０１７５】
加圧組成物用の液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に受容可能な高圧ガスであり得る。このような加圧組成物はまた、吸入法による送達用に脂質カプセル化され得る。鼻腔内あるいは気管支内の吸入法またはガス注入法による投与用に、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、水溶液あるいは部分的に水性の溶液に処方され得、次いで、これは、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉのような肺の感染症を処置するためにエアロゾル形態で利用され得る。
【０１７６】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、活性な化合物を含有する薬学的に受容可能なビヒクルとの処方により、溶液、クリーム、あるいはローションとして局所投与され得る。例えば、性器疣の処置用である。
【０１７７】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、リポソームキャリア中で投与され得る。細胞への取り込みを促進するためのリポソームの使用は、例えば、米国特許第４，８９７，３５５号（１９９０年１月３０日発行、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ，Ｄ．ら）および同第４，３９４，４４８号（１９８３年７月１９日発行、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら）に記載されている。多数の刊行物に、リポソームの処方および調製法が記載されている。
【０１７８】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドでの治療のために必要な投与量は、使用される特定の組成物、投与経路、現れている症状の重篤度、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの形態、および処置される特定の被験体により変化する。
【０１７９】
一般に、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、いかなる有害あるいは危険な副作用も伴わずに有効な結果をもたらす濃度（例えば、有効な量）で投与される。このような濃度は、単回単位用量での投与、あるいは一日を通して適切な間隔で、都合のよいサブユニットに分割した用量での投与のいずれかにより達成され得る。
【０１８０】
（Ｄ．診断適用）
ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドはまた、所定の標的配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡの検出のための診断アッセイに有用である。１つの一般的な適用では、ホスホルアミデートアナログは標識され（例えば、アイソトープ性のまたは他の検出可能なレポーター基）、そして固体支持体（例えば、ナイロンメンブレン）に結合されたＤＮＡあるいはＲＮＡサンプルのためのプローブとして使用される。
【０１８１】
あるいは、ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、固体支持体（例えば、磁気ビーズ）に結合され得、そして固定化ホスホルアミデートアナログへのハイブリダイゼーションに基づいて、サンプルの他の成分からサンプル中の相同ＲＮＡまたはＤＮＡ分子が分離される。ホスホルアミデートアナログの固体支持体への結合は、従来法により行われ得る。結合ＲＮＡまたは結合ＤＮＡの存在は、標準的な方法（例えば、第２標識レポーターまたはポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ；  Ｍｕｌｌｉｓ，ら）の使用）により検出され得る。
【０１８２】
診断アッセイは、ホスホルアミデートアナログの標的領域へのハイブリダイゼーションを可能にするようにハイブリダイゼーション条件を適切に調整して標準的な手順に従って行われ得る。また、ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドが上昇した温度で結合する能力は、ホスホルアミデートアナログプローブと、診断サンプル中に存在する任意の対応する１本鎖ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとの間の、標的配列への結合についての競合を最小にする助けとなり得る。
【０１８３】
（Ｅ．その他の適用）
１つの局面では、ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、サンプルからのＲＮＡまたはＤＮＡの単離を増強する方法に使用され得る。例えば、上記で論じているように、ホスホルアミデートアナログは、固体支持体に固定され、そして相補的な核酸配列の単離（例えば、ポリＡ画分からの特定ｍＲＮＡの精製）に使用され得る（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら）。ホスホルアミデートアナログは、標準的なホスホジエステルオリゴヌクレオチドとよりもＲＮＡおよび２重鎖ＤＮＡと、より安定な相互作用を形成し得るので、このような適用に有利である。
【０１８４】
レポーター標識ホスホルアミデートアナログについて、特にサンプル中のＲＮＡ検出について、分子生物学における多数の適用が見いだされ得る。ホスホルアミデートアナログは、放射活性レポーター（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、または３５Ｓヌクレオシド）、ビオチン、または蛍光標識で標識され得る（Ｇｒｙａｚｎｏｖら）。標識ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡハイブリダイゼーション反応において、効率の良いプローブとして使用され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。
【０１８５】
さらに、各鎖が少なくとも１つのホスホルアミデート結合を有する２本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ２重鎖結合タンパク質の単離に使用され得る。この実施態様では、ホスホルアミデートサブユニット間結合を含有する２重鎖を、代表的には固体支持体に付着させる。次いで、予測される結合タンパク質を含有するサンプルを、タンパク質のＤＮＡ標的への結合を促進する緩衝条件下で、その支持体を通過させる。タンパク質は代表的に、緩衝条件を変えることによりカラムから溶出される。
【０１８６】
ホスホルアミデート改変結合を有する上記の３重鎖形成ＤＮＡ分子は、例えば、サンプル中のＲＮＡ分子の存在を検出するための診断薬としても同様に使用され得る。
【０１８７】
さらに、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートサブユニット間結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む複合体は、有用な低分子または有用な結合タンパク質をスクリーニングするために使用され得る：例えば、２重鎖ＤＮＡを有するＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴデオキシリボヌクレオチド複合体が、３重鎖構造をさらに安定化し得る低分子をスクリーニングするために使用され得る。同様のスクリーニングが、１本鎖ＤＮＡとＲＮＡ分子により形成されるＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴデオキシリボヌクレオチド複合体についても有用である。
【０１８８】
（Ｆ．変形物）
本発明の方法に使用されるホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドの変形物は、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するための改変（例えば、コレステロール部分の付加（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  １９９０））；他のサブユニット間結合を用いてのキメラオリゴヌクレオチドの生成（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）；挿入剤による改変（例えば、３重鎖安定化挿入剤、Ｗｉｌｓｏｎら、１９９３）；およびデオキシリボースサブユニットに代えてのリボースの使用；を包含する。
【０１８９】
さらなる改変は、オリゴヌクレオチドに対する５’および３’末端の改変（例えば、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、ＮＨ２、およびコレステロール）を包含する。さらに、リボース２’位は、ハロゲン化（例えば、−Ｆ）を含むがそれに限定されない多くの改変の部位であり得る。
【０１９０】
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドはまた、特定の細胞に取り込まれるポリペプチドとの結合により改変され得る。このような有用なポリペチドは、ペプチドホルモン、抗原、および抗体を包含する。例えば、ポリペプチドは、腫瘍性細胞により特異的に取り込まれ、その細胞タイプへのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの特異的な送達を生じるように選択され得る。ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の方法により結合され得る（例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒ，Ｋ．らによる、１９８９年１２月１４日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３６３号、第ＷＯ８９１２１１０号を参照のこと）。
【０１９１】
このような改変ホスホルアミデートアナログオリゴヌクレオチドの特性は、本発明の方法に適用される場合、本明細書に記載の方法により決定され得る。
【０１９２】
本発明の実施の好ましい実施態様、使用、および方法を、詳細に記載してきたが、本明細書に示されているような、種々の他の使用、処方、および実施方法は、本発明の範囲内にあることが認識される。
【０１９３】
（材料および方法）
メチルホスホルアミデートおよびシアノエチルホスホルアミデートおよびＨ−リン酸ヌクレオシド試薬を、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から購入した。ヌクレオシドメチルホスホノアミダイト試薬をＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、そしてＤＭＴ−ｄＴ−ＬＣＡＡ  ＣＰＧ，  ５００  Åは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドの酵素による加水分解では、０．２  Ａ２６０単位の選択オリゴヌクレオチドと、Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）から入手した０．２２  Ｕのホスホジエステラーゼとを、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中でインキュベートした。サンプルを、ホスホジエステラーゼを添加後の０分、１０分、４０分、４．５時間、および２２時間に、分析用に取り出した。生成物は、本質的には実施例２Ｄに記載のように、ＲＰ  ＨＰＬＣにより分析した。
【０１９５】
核酸の化学合成を含む、標準的な核酸化学は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）により概説されている。
【０１９６】
化学薬品は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から購入した。
【０１９７】
ＨＰＬＣは代表的に、Ｄｉｏｎｅｘクロマトグラフ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用して実施した。「ＨＹＰＥＲＳＩＬ  ＯＤＳ」カラム（４．６×２００ｍｍ、粒子の大きさ  ５μ；Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，  ＰａｌｏＡｌｔｏ，  ＣＡ）、および０．０５Ｍ  ＴＥＡＨ緩衝液（ｐＨ  ７．０）中のＣＨ３ＣＮの０．５％／分のグラジエントを、ＲＰ  ＨＰＬＣに使用した。イオン交換クロマトグラフィーでは、Ｄｉｏｎｅｘ「ＯＭＮＩ  ＰＡＫ」ＮＡ  １００カラム（４×２５０ｍｍ）を、水中の１．５Ｍ  ＮａＣｌの１％／分グラジエントで使用した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した「ＮＡＰ  ５」カラムを、オリゴヌクレオチドの脱塩に使用した。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析を、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ  ９．０）中で、１０％  ＭＩＣＲＯＧＥＬＴＭキャピラリー（０．１×５００ｍｍ）を用いてＡＢＩ  ２７０Ａシステムで実施した。熱解離実験を、Ｖａｒｉａｎ  ＩＥ分光光度計および温度調節機で行った。２６０ｎｍまたは２８４ｎｍでの吸光値を、１．０℃／分の加熱速度で１分間隔で得た。
【０１９８】
【実施例】
（実施例１）
（オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを含有するオリゴヌクレオチドの合成）
（Ａ．一般的方法）
ホスホルアミデートアナログの合成を、シリンジ中手動で、あるいはＡＢＩ  ３８４合成機（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で自動的に行った。
【０１９９】
段階的伸長手順を用いる固体支持体上での一定に改変されたオリゴヌクレオチドの合成のスキーム表示を以下に示す：
【０２００】
【化２２】
0004383720.tif 000026
ここでＲは、スクシニルＣＰＧ（制御細孔ガラス）であり、Ｂは塩基であり、ｎは４〜１００であり、そしてＣＥＯはβ−シアノエチル基である。
【０２０１】
所定のサイクルについての化学工程、試薬、および反応時間は、（ｉ）脱トリチル化、ジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸、１．５分（図１、工程ｉ）；（ｉｉ）ホスファイト化、ジクロロメタン中の０．２Ｍ  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスフィンおよび０．２Ｍ  ジイソプロピルエチルアミン、１０分（図１、工程ｉｉ）；（ｉｉｉ）加水分解、アセトニトリル／水（９／１  ｖ／ｖ）中の０．４Ｍ  テトラゾール、５分（図１、工程ｉｉｉ）；（ｉｖ）カップリング、四塩化炭素／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）中の０．２Ｍ  ５’−ＤＭＴ−３’−アミノヌクレオシドおよび０．２Ｍ  トリエチルアミン、２０分（図１、工程ｉｖ）であった。
【０２０２】
ホスホジエステルサブユニット間結合を有する標準オリゴヌクレオチドを、標準の方法（ＡＢＩ  ３８４合成器）により合成した。
【０２０３】
キメラオリゴマーを構築するために、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＥ）Ｏ−５’ホスホルアミデートヌクレオシド間結合基を有する５’−ＤＭＴ−Ｎ−保護３’−ホスホルアミデートダイマービルディングブロックを、通常のホスホルアミデート法（本質的にＧｒｙａｚｎｏｖらにより前述された通り、本明細書中に参考として援用される）を用いて合成に使用した。
【０２０４】
本発明の方法により合成される典型的なオリゴヌクレオチドを図３に示す。合成のさらなる詳細を以下に続ける。
【０２０５】
（Ｂ．オリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートの手動合成）
１μｍｏｌの５’−ＤＭＴ−Ｎ−保護ヌクレオシドを含む制御細孔ガラス（ＣＰＧ）ポリマー支持体を、底部にガラスウールのプラグを備えた１ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎ気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｇａｓ  ｔｉｇｈｔ  ｓｙｒｉｎｇｅ）に配置した。
【０２０６】
所定の合成のサイクルについて、試薬をシリンジに吸い込み、そして以下のプロトコルに従ってシリンジから押し出した：
１．脱トリチル化−−ジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸、５×０．５ｍｌ：１．５分。
２．洗浄−−アセトニトリル、６×０．５ｍｌ。
３．ホスファイト化−−ジクロロメタン中の０．２Ｍ  ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスフィンおよび０．２Ｍ  ジイソプロピルエチルアミン、０．５ｍｌ、周期的な振とうで１０分。
４．加水分解−−アセトニトリル／水（９／１  ｖ／ｖ）中の０．４Ｍ  テトラゾール、周期的な振とうで５分。
５．洗浄−−無水アセトニトリル、１０×０．５ｍｌ。
６．カップリング−−四塩化炭素／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）中の０．２Ｍ  ５’−ＤＭＴ−３’−アミノヌクレオシドおよび０．２Ｍ  トリエチルアミン、振とうしながら２０分。カップリング後、溶液を集めて未反応ヌクレオシドを回収した。
７．洗浄−−アセトニトリル、６×０．５ｍｌ。
【０２０７】
所望のオリゴヌクレオチドを調製するまで、工程１〜７を繰返した。平均カップリング収率は、ＤＭＴ−カチオンアッセイにより判断して、９４％〜９６％であった。サイクルの完了の際に、支持体結合オリゴマーを脱トリチル化した。濃水酸化アンモニウムを用いて支持体から切断およびＮ−脱保護して、粗オリゴヌクレオチドを得、これをイオン交換ＨＰＬＣにより精製した。
【０２０８】
（Ｃ．交互にＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートＯ３’→Ｐ５’ホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド２の手動合成）
５’−ＤＭＴ−３’−アミノチミジンおよび５’−ＤＭＴ−チミジン−３’−ホスホルアミデートサブユニットを用いて、交互にＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートとＯ３’→Ｐ５’ホスホジエステル結合とを有するオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２０９】
オリゴヌクレオチド２（配列番号２）の合成のために、１マイクロモルのＴ−ＣＰＧ（チミジン結合ＣＰＧ）を１ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎ気密シリンジに入れた。上述の通りに５’−ＤＭＴ−３’−アミノチミジンサブユニットを添加した。５’−ＤＭＴ−チミジン−３’−ホスホルアミデートサブユニットの添加を、標準の合成手順（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）により行った。
【０２１０】
９回目のカップリング反応の後、ポリマー支持体を濃水酸化アンモニウムで処理して、粗オリゴマーを遊離させた。オリゴヌクレオチドをイオン交換ＨＰＬＣにより精製した（例えば、実施例２）。オリゴヌクレオチド２をＣＥおよび３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した（例えば、実施例２）。
【０２１１】
（Ｄ．５’−ＤＭＴ−Ｎ−イソブチリル−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシンの合成）
以下の工程は、アデノシンサブユニットについて本明細書中に記載される方法に類似した、５’−ＤＭＴ−Ｎ−イソブチリル−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシンの合成方法を記載する。
【０２１２】
１．５’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンを、生成物を以下のように精製した以外は、Ｎｉｓｈｉｎｏら（１９８６）の方法（この方法は本明細書中に参考として援用される）に本質的に従って、Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンから調製した：ＣＨ２Ｃｌ２と水との間に分配し、減圧下でＣＨ２Ｃｌ２層を濃縮し、そして生成物をエーテルで結晶化した。濾過により回収した後、生成物を新たなエーテル中で一晩撹拌し、そして濾過により再び集めた。５’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンの全収率は、５０％〜８０％であった。
【０２１３】
２．５’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシンを、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎおよびｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ（１９８９）の方法（この方法は本明細書中に参考として援用される）に本質的に従って、５’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンから調製した。生成物を、減圧下で粗混合物を乾燥することにより精製し、次いでＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。３’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン生成物が自然に沈澱し、そして濾過により得た。
【０２１４】
３．５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン。乾燥３’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン（７．３ｇ）および７．９ｇの塩化４，４’−ジメトキシトリチルを、１５０ｍＬの無水ピリジンに溶解した。２４時間後、１ｍＬの水を混合物に加えた。次いで、混合物を５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン生成物を含有するフォームまで減圧下で濃縮した。フォームを３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、２５０ｍＬの水で洗浄し、そして減圧下で再び濃縮した。
【０２１５】
４．５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン。粗５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ベンゾイル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシンを、１．２Ｌの５：４：１  ジオキサン：メタノール：水に溶解し、そして氷浴で冷却した。この混合物に１２０ｍＬの２Ｎ  ＮａＯＨを加えた。得られた混合物を、０℃で２５分間撹拌し、そしてピリジニウムＨ＋型Ｄｏｗｅｘ  ５０イオン交換樹脂で中性化した。２〜３分後、樹脂を濾過により除去し、そして生成物を減圧下でスラリーまで濃縮した。スラリー中の白色沈殿物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシン）を濾過により除去し、水で洗浄し、空気乾燥し、そして減圧下、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。
【０２１６】
５．５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−アミノ−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−ジデオキシグアノシン。粗５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシキシログアノシンに、７．９ｇのトリフェニルホスフィンおよび４．８ｇのＬｉＮ３を加えた。混合物を、減圧下、Ｐ２Ｏ５で３時間さらに乾燥した。これらの乾燥化合物を、４５０ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、５．３ｍＬのジエチルアゾジカルボキシレートを加えた。混合物を一晩撹拌し、１ｍＬの水を加え、そして溶媒を減圧下で除去した。
【０２１７】
１リットルのＣＨ２Ｃｌ２を乾燥した混合物に加え、そして得られた混合物を毎回１Ｌの水で２回洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２層を減圧下で淡褐色オイルまで濃縮し、次いでこのオイルを６００ｍＬのピリジン中の１０％トリエチルアミンに溶解した。この混合物を氷浴で冷却し、そしてＨ２Ｓを通気により加えた。３０分後、氷浴を除去し、そしてＨ２Ｓ流動をさらに３時間続けた。溶液を減圧下で淡褐色オイルまで濃縮した。
【０２１８】
ＣＨ２Ｃｌ２中の０．５％ピリジンで前処理したシリカゲルカラムでオイルをフラッシュクロマトグラフィーにかけ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中の０％〜５％メタノールの勾配で溶出して、３．５ｇの５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−アミノ−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−ジデオキシグアノシン（図１Ｃ）を得た。
【０２１９】
（Ｅ．５’−ＤＭＴ−Ｎ−ベンゾイル−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシンの合成）
３’−アミノ−Ｎ６−５’−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジデオキシ−アデノシンの合成の工程を以下に示す：
【０２２０】
【化２３】
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１．Ｎ６  ５’−ジベンゾイル−２’−デオキシアデノシンの調製。塩化ベンゾイル（２．４５ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）のピリジン（１５０ｍＬ）溶液を、室温で約１時間かけてＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン（化合物１、図２０）（５ｇ、１４ｍｍｍｏｌ）のピリジン（４５ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を室温でさらに１時間撹拌した。反応混合物をメタノール（５ｍＬ）でクエンチし、そしてエバポレートして乾固させた。
【０２２１】
残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液およびＨ２Ｏで洗浄した。次いで、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレートして乾固させた。この残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そしてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、７０〜２３０メッシュ、２００ｇ）にかけて５％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出し、そして溶媒をエバポレートして除去し、６ｇ（９３％）の所望のＮ６５’−ジベンゾイル−２’−デオキシアデノシン生成物（化合物２、図２０）を得た。
【０２２２】
２．Ｎ６−ベンゾイル−９−（３’−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペンテオフラノシル）アデニンの調製。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（４．２ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を、０℃でＮ６５’−ジベンゾイル−２’−デオキシアデノシン（７．５ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）の１０％ピリジン／ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ＭＬ）懸濁液に加えた。反応物を０℃で３０分撹拌し、続いてＨ２Ｏ（２６ｍＬ）を加えた。次いで、反応混合物を室温で一晩撹拌し、そしてエバポレートして乾固させた。
【０２２３】
残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ２水溶液、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。有機層をエバポレートして乾固させ、Ｎ６−ベンゾイル−９−（３−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペンテオフラノシル）アデニン生成物（化合物３、図２０）を含有する褐色オイルを得、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２２４】
３．Ｎ６−ベンゾイル−９−（３’−Ｏ−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニンの調製。Ｎ６−ベンゾイル−９−（３−Ｏ−ベンゾイル−２’−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペンテオフラノシル）アデニンを、ピリジン（６０ｍＬ）に溶解した。次いで、塩化ジメトキシトリチルを室温で一晩撹拌した。反応物をＣＨ３ＯＨでクエンチした。混合物をエバポレートして乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレートした。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そしてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、７０〜２３０メッシュ、４００ｇ）にかけて４％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出した。Ｎ６−ベンゾイル−９−（３−Ｏ−ベンゾイル−５−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニン生成物（化合物４、図２０）を含有する所望の画分を集め、そしてエバポレートして乾固させた。生成物の収量は７ｇ（Ｎ６５’−ジベンゾイル−２’−デオキシアデノシンから５６％）であった。
【０２２５】
４．Ｎ６−ベンゾイル−９−（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニンの調製。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、４０ｍＬ）を、０℃で、Ｎ６−ベンゾイル−９−（３−Ｏ−ベンゾイル−５−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニン（７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）のｐ−ジオキサン（２００ｍＬ）、ＣＨ３ＯＨ（１６０ＭＬ）およびＨ２Ｏ（４０ｍＬ）の混合物溶液に加えた。反応混合物を０℃で２５分間撹拌した。反応をＤｏｗｅｘ  ５０×２−１００イオン交換樹脂（ピリジニウム型）を加えることにより停止して、溶液をｐＨ７まで中性化した。固形物を濾過により除去し、そして溶媒をエバポレートして乾固させた。
【０２２６】
残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレートして乾固させ、Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニン生成物（化合物５、図２０）を含有する淡黄色の固体を得た。この生成物をさらに精製せずに使用した。前工程からの生成物の収量は６ｇ（９９％）であった。
【０２２７】
５．３’−アミノ−Ｎ６−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジデオキシ−アデノシンの調製。ジエチルアゾジカルボキシレート（１．４２ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を、Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）アデニン（２ｇ、３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍＬ）懸濁液（この懸濁液はトリフェニルホスフィン（２．４ｇ、９ｍｍｏｌ）およびＬｉＮ３（４．１ｇ、８３．８ｍｍｏｌ）をさらに含有する）に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、そしてエバポレートして乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレートして褐色オイルを得た。褐色オイルをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そしてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、７０〜２３０メッシュ、１００ｇ）にかけて３％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して、化合物６（図２０）を淡褐色オイルとして得た。
【０２２８】
このオイルを１５％トリエチルアミン／ピリジン（３６ｍＬ）に溶解した。次いで、硫化水素を０℃で３０分間溶液に通気した。溶液を室温で３０分以上撹拌した。溶媒をエバポレートして乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ２水溶液、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてエバポレートして乾固させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そしてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、７０〜２３０メッシュ、１００ｇ）にかけて５％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して、最終生成物３’−アミノ−Ｎ６−５’−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン（化合物７、図２０；図１ｅ）を得た。前工程からの生成物の収量は１．６ｇ（８０％）であった。あるいは、還元はＰｔ／炭素触媒上でＨ２を用いて達成され得る。
【０２２９】
（Ｆ．他のＤＭＴ−サブユニットの合成）
Ｇｌｉｎｓｋｉら（１９７０）に従って、５’−ＤＭＴ−３’アミノチミジンおよび５’−ＤＭＴ−Ｎ−ベンゾイル−３’−アミノシチジンの合成を行った。
【０２３０】
（実施例２）
（Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドの
キャラクタリゼーション）
実施例１に記載したように合成したオリゴヌクレオチドを、以下の方法により評価した。
【０２３１】
（Ａ．イオン交換クロマトグラフィーによる精製）
オリゴヌクレオチドを、イオン交換（ＩＥ）ＨＰＬＣにより過剰の反応成分から精製した。ＩＥ  ＨＰＬＣ分析をＤｉｏｎｅｘ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）クロマトグラフで行った。Ｄｉｏｎｅｘ「ＯＭＮＩＰＡＣ  ＮＡ１００」、４×２５０ｍｍカラムを、０．０３Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．０）中の１．０ＭＮａＣｌの１％／分または２％／分の勾配；流速、１．０ｍｌ／分で使用した。
【０２３２】
図４Ａは、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３（図３）の合成後の反応混合物の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図の最大ピークはオリゴヌクレオチド３生成物に対応する。ＩＥ  ＨＰＬＣカラムでの３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートの保持時間は、対応するホスホジエステル化合物の保持時間より１．０〜１．５分短かった。次いで、生成物をエタノールを用いた沈澱により濃縮し、そして水に再懸濁した。
【０２３３】
（Ｂ．オリゴヌクレオチドの純度）
合成したオリゴヌクレオチドの純度を、代表的にはキャピラリーゲル電気泳動により評価した。キャピラリー電気泳動を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ２７０Ａ機を用い、「ＭＩＣＫＲＯＧＥＬ」キャピラリーチューブで、本質的に製造者の指示に従って行った。
【０２３４】
図４Ｂは、ウンデカホスホルアミデート６（図３）の合成後の反応混合物の典型的なキャピラリーゲル電気泳動プロフィルを示す。
【０２３５】
あるいは、単離したオリゴヌクレオチドの純度を、高いパーセントのポリアクリルアミドゲル（例えば、２０％アクリルアミド、５％ビス−アクリルアミド）中のサンプルの電気泳動分離により評価する（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら）。オリゴヌクレオチドを臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ光に曝すことにより可視化した。３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートの電気泳動分離の際のポリアクリルアミドゲルにおける相対的移動度は、対応するホスホジエステル化合物に対する移動度よりも１０〜１５％低かった。
【０２３６】
（Ｃ．核磁気共鳴分析）
ＮＭＲスペクトルを、外部標準としてＤ２Ｏ中の８５％リン酸を用いる３１Ｐスペクトルについて１６２ＭＨｚで、そして外部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いる１Ｈスペクトルについて４００ＭＨｚでＶａｒｉａｎ  ＸＬ−４００（Ｖａｒｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）分光器で記録した。
【０２３７】
典型的な結果を図４Ｃに示す。図４Ｃは精製されたデカホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３（図３）の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す。スペクトルはホスホルアミデート基に特徴的なδ７．１２ｐｐｍのピークを示す。
【０２３８】
（Ｄ．加水分解生成物の逆相高性能液体クロマトグラフィー分析）
精製したホスホルアミデート１０マーオリゴヌクレオチド３（図３）を、２５℃で４８時間８０％酢酸で処理することにより加水分解した。加水分解生成物を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣにより評価した。ＲＰ  ＨＰＬＣ分析をＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）製の「ＨＹＰＥＲＳＩＬ  ＯＤＳ」５μ、４．６×２００ｍｍカラムのＤｉｏｎｅｘクロマトグラフで、０．０３Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．０）中のアセトニトリルの１％／分の勾配；流速、１ｍｌ／分を用いて行った。加水分解生成物は、３’アミノ−５’−チミジル酸、５’−チミジル酸、および３’−アミノチミジンとして同定された。さらに、加水分解生成物（合計ピーク）の約７％は少量の副生成物であった。これらの結果により、オリゴヌクレオチド中のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合の存在が確認される。
【０２３９】
（実施例３）
（熱解離）
（Ａ．２重鎖溶融）
熱解離曲線を、温度制御器（Ｖａｒｉａｎ）を備えたＣａｒｒｙ  １Ｅ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて得た。反応溶液は、ｐＨ７．０５の１５ｍＭリン酸緩衝液中に等濃度のオリゴマーおよび補体（オリゴマー鎖中に約６μＭ）を含んでおり、そして全Ｎａ＋濃度が１００ｍＭになるようにＮａＣｌが加えられた。
【０２４０】
オリゴ（ｄＴ）、ポリ（ｄＡ）およびポリ（Ａ）について用いられたモル吸光係数は、それぞれ８．２Ａ２６０×１０３、８．４Ａ２６０×１０３、および１０．２Ａ２６０×１０３であった。１０９Ａ２６０ユニット／μＭの吸光係数は、混合ベースオリゴマーについて用いられた。吸光係数は、Ｐ．Ｎ．Ｂｏｒｅｒ（１９７５）により編集された表から計算した。
【０２４１】
反応溶液を０℃で平衡化し、そしてその後２６０ｎｍでの吸光度を、温度が５分当たり３℃の増加量で増加するようにして調べた。所定の温度での結合状態（α）におけるオリゴマーの画分を、Ａｂｅｒｇｏら（１９８１）により記載されるように、上部基準線および下部基準線（ｕｐｐｅｒ  ａｎｄ  ｌｏｗｅｒ  ｂａｓｅ  ｌｉｎｅｓ）の使用により決定した。Ｔｍ値を、α＝０．５での温度として定義した。Ｉｎｋ（Ｍａｒｋｙら、１９８７）対１／Ｔのプロットは、これらの化合物に関して直線であった。
【０２４２】
熱変性研究の結果もまた、２６０ｎｍでの標準化吸光度  対  温度（℃）としてプロットした。図５Ａおよび５Ｂは、ホスホジエステルおよびホスホルアミデートオリゴマーにより形成した２重鎖に関する典型的な溶融曲線を示す。図において：（Ａ）、（Ｃ）および（Ｂ）、（Ｄ）は、それぞれ、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド４）を用いる図３、実験８、９；およびホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６）を用いる図３、実験１３、１４に対応する。
【０２４３】
熱安定性データを図３｛Ｔｍ（℃）｝に要約する。表において、Ｔｍは溶融曲線の中点での温度であり；ｎｐは３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合についての略語である。
【０２４４】
オリゴヌクレオチドの濃度は、代表的には５μＭオリゴマー鎖であった。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０２）を、２重鎖熱安定性研究に使用した。
【０２４５】
（Ｂ．オリゴヌクレオチドヘアピン）
相補的な鎖の両方にホスホルアミデート結合を含むオリゴヌクレオチドにより形成された２重鎖の安定性を、本質的に上述のように評価した。図６に示すキメラホスホルアミデート−ホスホジエステルヘアピンオリゴマーを合成した。
【０２４６】
図６の全ての分子を、２’−デオキシリボヌクレオチドを用いて構築した。
【０２４７】
熱解離実験を、本質的に上述のように行ったが、以下の反応条件であった：オリゴヌクレオチド濃度２．５μＭで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０２。
【０２４８】
これらの実験から得られたＴｍ値を図６に要約する。
【０２４９】
（Ｃ．３重鎖溶融）
３重鎖熱安定性を、本質的には２重鎖について上述したように評価した。緩衝液条件は、上記（緩衝液Ａ）または第２の緩衝液である緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０２）のいずれかを用いた。
【０２５０】
図７Ａ〜７Ｄは、典型的な３重鎖溶融曲線を示す。図７Ａおよび７Ｃは、温度に対してプロットした２６０ｎｍでの標準化した吸光度を示す。図７Ｂおよび７Ｄは、温度に対してプロットした２８４ｎｍでの標準化した吸光度を示す。図において：２重鎖ＤＮＡとホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３とにより形成した３重鎖は黒丸線に対応し；ホスホジエステルオリゴヌクレオチド１を用いて形成した３重鎖は開いた白四角線に対応する。
【０２５１】
データは図３、実験７に対応し、ここで曲線（Ａ）および（Ｃ）は、２６０ｎｍでモニターした濃色性を用いて、それぞれ緩衝液ＡおよびＢを用いて行った熱安定性研究であった。曲線（Ｂ）および（Ｄ）は、それぞれ、濃色性を２８４ｎｍでモニターした（Ａ）および（Ｃ）である。
【０２５２】
図７Ａ〜７Ｄに示すデータは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド１が、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３が形成するのと同様の２重鎖ＤＮＡ標的を有する３重鎖を形成しないことを示す。
【０２５３】
（実施例４）
（ゲルバンド移動度シフトアッセイ）
３重鎖構造を、ゲルバンド移動度シフトアッセイを用いてさらに評価した。
【０２５４】
（Ａ．ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３）
ゲルバンド移動度シフトアッセイ条件は、以下の通りであった：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）中の２０％アクリルアミド、５％ビスアクリルアミド、１０℃。ゲルを、代表的にはネイティブ（非変性）条件下で移動させた。このようなゲルバンド移動度シフトアッセイの典型的な結果を、図８に示す。図において、レーンは以下の通りである：１−１０マーホスホジエステルオリゴヌクレオチド１；２−１０マーホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３；３−２４マーヘアピン標的ｄ（Ａ１０Ｃ４Ｔ１０）（図３、実験７）。レーン３において、遅く移動する薄いバンドは、ｄ（Ａ１０Ｃ４Ｔ１０）の２分子２重鎖に対応すると思われる；４−ヘアピン標的およびオリゴヌクレオチド１；５−ヘアピン標的およびオリゴヌクレオチド３。
【０２５５】
ゲルを、ＳＴＡＩＮＳ−ＡＬＬＴＭ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）で染色し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）デンシトメーターで映像化した。ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３染色の効率は、ホスホジエステル化合物（オリゴヌクレオチド１および２重鎖）とは異なる。
【０２５６】
図において、３重鎖構造の移動度を矢印で示す。図に示した結果から分かり得るように、ゲルバンド移動度シフトアッセイの結果は、熱変性研究から得られた結果を確認する。すなわち、オリゴヌクレオチド１は、オリゴヌクレオチド３と同様の標的を有する３重鎖を形成しない。
【０２５７】
（Ｂ．ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６）
２本鎖ＤＮＡ標的を有するホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６アナログの３重鎖形成もまた、ゲルバンド移動度シフトアッセイにより確認した。
【０２５８】
ゲルバンド移動性シフトアッセイの条件は、本質的に上述の通りであった。分析の結果を図９に示す。図において、レーンは以下の通りであった：１−１１マーのホスホジエステルオリゴヌクレオチド４；２−１１マーのホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６；３−２６マーのヘアピン標的（配列番号２２）；４−ヘアピン標的およびオリゴヌクレオチド４；５−ヘアピン標的およびオリゴヌクレオチド６。
【０２５９】
図において、３重鎖構造の移動度を矢印で示す。上記で分かるように、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド４は、オリゴヌクレオチド６と同様の標的を有する３重鎖を形成しない。
【０２６０】
（実施例５）
（ホスホルアミデートアナログのインビトロでの評価）
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。これは白血病細胞株ＢＶ１７３におけるＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部（Ｂ２Ａ２）に相補的であった。以下のアッセイは、白血病細胞増殖を測定し、そして本質的にＡｎｆｏｓｓｉら（１９８９）により記載された通りに行う。
【０２６１】
簡潔には、図１０は、Ｂ２Ａ２型ブレークポイントを有するＢＶ１７３細胞の白血病細胞増殖に対するＢＣＲ−ＡＢＬオリゴマーの効果を示す。ＢＶ１７３は、Ｂ２Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部を有する白血病細胞株である（Ｐｅｇｏｒａｒｏら、１９８３）。ＨＬ６０は、正常なｃ−ａｂｌ座を有する前骨髄細胞白血病細胞株である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９７７）。Ｋ５６２は、Ｂ３Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部を有する白血病細胞株である（Ｓｅｅｌｉｇら、１９９３）。
【０２６２】
細胞（５×１０４個）を０．２ｍｌの液体懸濁液培地（２％ヒトＡＢ血清を有するＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ改変培地−−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）に置いた。
【０２６３】
オリゴヌクレオチドを２４時間間隔で３日間（０日、１日および２日目）培地に与え、図１０〜１９の凡例（全てμｇ／ｍｌの濃度である）に示す増加濃度、例えば、図１０−−４０／２０／２０；２０／１０／１０；１０／５／５；および５／２．５／２．５を達成した。例えば、４０／２０／２０は、最後のオリゴヌクレオチド添加後の細胞培養培地における最終全濃度が８０μｇ／ｍｌであることを反映することに注意されたい。細胞数計測を標準の方法により行った。
【０２６４】
図１０は、図の凡例に示す濃度で、十分に改変したＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６（配列番号６）を用いたアッセイの結果を示す。標的細胞はＢＶ１７３であった。結果は、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、白血病細胞の増殖の阻害に（使用した最低濃度でも）極めて有効であることを示す。
【０２６５】
図１１は、ＨＬ６０細胞、非ＢＲＣ−ＡＢＬ発現細胞株とオリゴヌクレオチド６との処理の結果を示す。結果は、全ての濃度のオリゴヌクレオチドに対して細胞は十分に耐性があったことを示す。明らかな細胞障害性はなかった。
【０２６６】
図１２および１３は、それぞれ図１０および１１に示した結果と同様の実験の結果を示す。最低濃度（０．３１２５／０．１５６２５／０．１５６２５）でも、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６は、白血病細胞増殖の阻害（図１２）に極めて有効であったが、無視し得る程度の毒性しか保持していなかった（図１３）。
【０２６７】
図１４および１５は、それぞれ図１０および１１に示した結果と同様の実験の結果を示す。しかし、図１５に示したデータに対応する実験において、標的細胞は、Ｂ３Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部を含むＫ５６２であった。図１４に示した実験からのデータに、培地中のＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６の効果に対する移行濃度を示す。特に、０．０１９８／０．００９８／０．００９８の濃度で、増殖の阻害がいくぶん解除されることがオリゴヌクレオチド６により見られ得る。
【０２６８】
さらに、図１５に示すデータは、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６が、Ｂ３Ａ２融合接合部を有するＫ５６２細胞の増殖に対して本質的に影響しなかったことを示す。これらの結果は、抗増殖効果が、特にＢ２Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部に関連することを示し、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６は、この融合接合部に相補的である。
【０２６９】
対照的に、図１６〜１９は、十分に改変したホスホロチオエートサブユニット間結合を有する１６マー（配列番号２６）についての同様のデータを示す。図１６は、図の凡例に示す濃度で、十分に改変したホスホロチオエート１６マー（配列番号２６）を用いたアッセイの結果を示す。ここで標的細胞株はＢＶ１７３であった。結果はオリゴヌクレオチド６で見られた結果（図１０）と同様であるが、データは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが白血病細胞の増殖の阻害にオリゴヌクレオチド６ほど効果的ではないことを示す。
【０２７０】
図１７は、Ｂ３Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部に相補的な配列を有する１６マーのホスホロチオエート（配列番号２７）を有するＢＶ１７３  ＢＲＣ／ＡＢＬ細胞株の処理の結果を示す：Ｂ３Ａ２は、Ｂ２Ａ２  ＢＣＲ／ＡＢＬ融合接合部にミスマッチな２つの塩基対配列を有する。結果は、全ての濃度のオリゴヌクレオチドに対して細胞は耐性があったことを示す。
【０２７１】
図１８および１９は、それぞれ図１６および１７に示した結果と同様の実験の結果を示す。これらの実験からのデータにおいて、細胞増殖の阻害の解除が、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド６に対して見られた濃度よりも、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対してより低い濃度で見られる。
【０２７２】
これらの結果は、インビトロでのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドが、低濃度で有効なアンチセンス化合物であることを示す。さらに、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも良好なアンチセンス剤である。
【０２７３】
（実施例６）
（ｃ−ｍｙｃを用いるアンチセンス阻害）
ヒトｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡに相補的なＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを、ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現を阻害するためにも使用し、そしてＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの効果をホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較した。ＨＬ６０細胞を以下のｃ−ｍｙｃオリゴヌクレオチドの１つとインキュベートした：
配列番号２８    ＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴ  ＴＴＣＣＡ  （アンチセンス）
配列番号２９    ＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴ  ＴＴＣＣＡ  （ネガティブコントロール；ミスマッチ）
配列番号３０    ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧ  ＧＧＣＡＴ  （アンチセンス；第２エクソン）
配列番号３１    ＡＡＣＧＡＧＴＴＧＧ  ＧＧＣＡＴ  （ネガティブコントロール；ミスマッチ）
配列番号３２    ＵＵＵＣＡＵＵＧＵＵ  ＵＵＣＣＡ  （アンチセンス；ＴをＵで置換した）
ｃ−ｍｙｃオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合は、他に示さない限り、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合であった。各タイプのｃ−ｍｙｃオリゴヌクレオチドを、指示した濃度で７２時間、培地中でＨＬ−６０細胞を用いて個別にインキュベートした後、細胞を、当該分野で公知の顕微鏡技術により増殖についてか、またはＨｏｌｔら、Ｍｏｌ．  ａｎｄ  Ｇｅｎ  Ｂｉｏ．  ８：９６３−９７３（１９８８）に記載されているウエスタンブロットによりｃ−ｍｙｃ発現についていずれかをアッセイした。これらの方法は、本明細書中に参考として援用される。結果を表３に示す：
（表３）
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを用いる、ＨＬ６０細胞におけるｃ−ｍｙｃ発現の、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して改善された阻害
【０２７４】
【表２】
0004383720.tif 000028
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド配列番号２９はまた、０．１μＭ、０．５μＭ、および１μＭで、累進的にＨ６０細胞増殖のより大きな阻害（ここで増殖は各濃度で、０日、３日および６日目に測定された）を、０．１μＭ、０．５μＭ、および１μＭでのＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３１（ネガティブコントロール；ミスマッチ）と比較して示した。このネガティブコントロールはＤＮＡを有さないコントロールに匹敵する増殖レベルを示した。０日目で、各培地は約１０，０００個の細胞を有した。６日目までに、両方のコントロール培地は、培地当たり約５０，０００個の細胞を有し、そしてＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート１μＭ培地は、培地当たり約２５，０００個の細胞を有した。
【０２７５】
この結果は、用量および配列に依存する方法における細胞増殖を阻害するｃ−ｍｙｃ  Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドの能力、およびｃ−ｍｙｃ発現の阻害においてホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較してＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドがより大きな効果を有することを示す。このデータは、ウエスタンブロットにより示されるｃ−ｍｙｃ阻害と相関する。
【０２７６】
本発明を特定の方法および実施態様に関して記述してきたが、本発明から逸脱することなく種々の改変および変化がなされ得ることが理解される。
【０２７７】
改変されたオリゴヌクレオチド、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートを固体支持体上で合成した。該ホスホルアミデートアナログは、ホスホジエステラーゼ消化に対する著しく高められた抵抗性を有することを見出した。熱解離の実験により、これらの化合物は相補的ＤＮＡおよび特定のＲＮＡストランドを有するホスホジエステルよりさらに安定な２重鎖を形成することが示された。さらに、ホスホルアミデートアナログはまた、２本鎖ＤＮＡ標的を伴う安定な３重鎖を形成し得るが、類似の条件下で元のホスホジエステル化合物は３重鎖を形成し得なかった。
【０２７８】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートの化合物および組成物、合成法ならびにオリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートを用いるハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ抵抗性方法が提供される。
【０２７９】
【配列表】
【０２８０】
【化２４】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を有するオリゴヌクレオチドの合成に有用なサブユニットの構造を示す。図１Ｅは、一様に改変されたオリゴヌクレオチドの段階的合成の概略図を示す。図中、ＣＥはシアノエチルを、ＣＰＧは制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を有するオリゴヌクレオチドの合成に有用なサブユニットの構造を示す。図１Ｅは、一様に改変されたオリゴヌクレオチドの段階的合成の概略図を示す。図中、ＣＥはシアノエチルを、ＣＰＧは制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を有するオリゴヌクレオチドの合成に有用なサブユニットの構造を示す。図１Ｅは、一様に改変されたオリゴヌクレオチドの段階的合成の概略図を示す。図中、ＣＥはシアノエチルを、ＣＰＧは制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を有するオリゴヌクレオチドの合成に有用なサブユニットの構造を示す。図１Ｅは、一様に改変されたオリゴヌクレオチドの段階的合成の概略図を示す。図中、ＣＥはシアノエチルを、ＣＰＧは制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ヌクレオシド間の３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）を有するオリゴヌクレオチドの合成に有用なサブユニットの構造を示す。図１Ｅは、一様に改変されたオリゴヌクレオチドの段階的合成の概略図を示す。図中、ＣＥはシアノエチルを、ＣＰＧは制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）である。
【図２Ａ】図２Ａ、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、他の、交互の結合を有する３’−ＮＨＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−５’ホスホルアミデートサブユニット間結合の組合わせ例を示す。図２Ｄおよび２Ｆにおいて、例えば、Ｒ’は低級アルキル基であり、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）により記載されるように、他の置換基も可能である。
【図３】図３は、オリゴヌクレオチドの例および２重鎖および３重鎖のＴｍ値を示す。図において、ａ＝緩衝液Ａ中の複合体のＴｍ値。ｂ＝緩衝液中のＴｍ値；ヘアピン２重鎖のＴｍ値は緩衝液ＡおよびＢで、それぞれ５５．７℃および６１．５℃であった。ｃ＝ミスマッチのヌクレオチドには下線で付す。
【図４Ａ】図４Ａは、ホスホルアミデートオリゴヌクレオチド３の合成後の反応混合物のＩＥ  ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ウンデカホスホルアミデート６の合成後の反応混合物のキャピラリーゲル電気泳動のプロファイルを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、デカホスホルアミデート３の３１Ｐ−ＮＭＲの結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ホスホジエステルおよびホスホルアミデートオリゴマーにより形成される２重鎖の融解曲線を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ホスホジエステルおよびホスホルアミデートオリゴマーにより形成される２重鎖の融解曲線を示す。
【図６】図６は、オリゴヌクレオチドのヘアピンの例およびそれらのＴｍ値を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、３重鎖の融解曲線を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、３重鎖の融解曲線を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、３重鎖の融解曲線を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、３重鎖の融解曲線を示す。
【図８】図８は、オリゴヌクレオチド３重鎖形成物の未変性条件下におけるゲル電気泳動分析を示す。
【図９】図９は、オリゴヌクレオチド３重鎖形成物の未変性条件下におけるゲル電気泳動分析を示す。
【図１０】図１０は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１１】図１１は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１２】図１２は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１３】図１３は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１４】図１４は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１５】図１５は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１６】図１６は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１７】図１７は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１８】図１８は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図１９】図１９は、ホスホルアミデート（Ｎ３’→Ｐ５’）（図１０〜１５）またはホスホロチオエート（図１６〜１９）サブユニット間結合のいずれかを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、種々のＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞株および対照細胞株についての白血病細胞の増殖に関する結果を示す。
【図２０】図２０は、３’−アミノ−Ｎ６−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’，３’−ジデオキシアデノシンの調製を概略的に示す。
【図１Ａ】
0004383720.tif 000044
【図１Ｂ】
0004383720.tif 000045
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
0004383720.tif 000047
【図１Ｅ】
0004383720.tif 000048
【図２Ａ】
0004383720.tif 000049
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
0004383720.tif 000051
【図２Ｄ】
0004383720.tif 000052
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
0004383720.tif 000055
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
0004383720.tif 000059
【図５Ｂ】
0004383720.tif 000060
【図６】
0004383720.tif 000061
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0004383720.tif 000063
【図７Ｃ】
0004383720.tif 000064
【図７Ｄ】
0004383720.tif 000065
【図８】
0004383720.tif 000066
【図９】
0004383720.tif 000067
【図１０】
0004383720.tif 000068
【図１１】
0004383720.tif 000069
【図１２】
0004383720.tif 000070
【図１３】
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【図１４】
0004383720.tif 000072
【図１５】
0004383720.tif 000073
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0004383720.tif 000078