(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えＤＮＡ構築物であって、該構築物は、
（ｉ）ＡＡＶプロモーターおよび（ｉｉ）ＡＡＶ  ＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ構築物は、ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞にトランスフェクトされたときに組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの複製およびパッケージングを支援し；そしてここで該ＤＮＡ構築物を含む該宿主細胞は、野生型ＡＡＶ  ＲＥＰ７８またはＲＥＰ６８プロモーターの制御下で野生型ＲＥＰ７８またＲＥＰ６８タンパク質を発現する宿主細胞に比較して低下したレベルでＲＥＰ７８またＲＥＰ６８タンパク質を発現する、組み換えＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記ＡＡＶ  ＲＥＰ７８またはＲＥＰ６８タンパク質は、ＡＡＶｐ５プロモーターの制御下で発現される、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ構築物。
【請求項３】
ＲＥＰ７８またはＲＥＰ６８の発現の低レベルは、前記ＲＥＰ遺伝子の翻訳開始コドンにおける変異が原因である、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記翻訳開始コドンは、ＡＴＧからＡＣＧへ改変されたものである、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ構築物はプラスミドである、請求項１から４のいずれか１項に記載の組み換えＤＮＡ構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−２】
0004249239.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【数１−３】
0004249239.tif 000003
【０００３】
【数２】
0004249239.tif 000004
【０００４】
【数３】
0004249239.tif 000005
【０００５】
【数４】
0004249239.tif 000006
【０００６】
【数５−１】
0004249239.tif 000007
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって、以下が提供される： 
【数３８】
0004249239.tif 000008
【０００８】
【数５−２】
0004249239.tif 000009
【０００９】
【数６】
0004249239.tif 000010
【００１０】
【数７−１】
0004249239.tif 000011
【００１１】
【数９】
0004249239.tif 000012
【００１２】
【数１０】
0004249239.tif 000013
【００１３】
【数１１】
0004249239.tif 000014
【００１４】
【数１２】
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【００１５】
【数１３】
0004249239.tif 000016
【００１６】
【数１４】
0004249239.tif 000017
【００１７】
【数１５】
0004249239.tif 000018
【００１８】
【数１６】
0004249239.tif 000019
【００１９】
【数１７】
0004249239.tif 000020
【００２０】
【数１８】
0004249239.tif 000021
【００２１】
【数１９】
0004249239.tif 000022
【００２２】
【数２０】
0004249239.tif 000023
【００２３】
【数２１】
0004249239.tif 000024
【００２４】
【数２２】
0004249239.tif 000025
【００２５】
【数２３】
0004249239.tif 000026
【００２６】
【数２４】
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【００２７】
【数２５】
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【００２８】
【数２６】
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【００２９】
【数２７】
0004249239.tif 000030
【００３０】
【数２８】
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【００３１】
【数２９】
0004249239.tif 000032
【００３２】
【数３０】
0004249239.tif 000033
【００３３】
【数３１】
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【００３４】
【数３２】
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【００３５】
【数３３】
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【００３６】
【数３４】
0004249239.tif 000037
【００３７】
【数３５】
0004249239.tif 000038
【００３８】
【数３６】
0004249239.tif 000039
【００３９】
【数３７】
0004249239.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１：ＡＡＶ  ヘルパープラスミドの構築。プラスミドＡＡＶ／ＡＤおよびＡＣＧ−２は、内因性ｐ５プロモーター（白のボックスで示す）を含み、プラスミド  ＣＭＶ／ＡＡＶ、ＨＩＶ／ＡＡＶおよびＳＶ／ＡＡＶは、元のｐ５プロモーターに代わる異種プロモーター（影付きのボックスで示す）を含む。全ての構築体は、同じＡＡＶコード配列すなわちＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（影付きボックス中に図示）を含む。ただし、構築体ＡＣＧ−２は、Ｒｅｐの翻訳開始コドンにおいてＡＴＣがＡＣＧに変異している。
【図２】図２：種々のＡＡＶヘルパープラスミドからのＲｅｐ遺伝子発現のウエスタン分析。Ａｄ感染を行わずに（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行って（レーン６〜１０）、プラスミドＡＡＶ／ＡＤ（レーン１および６）、ＡＣＧ−２（レーン２および７）、ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン４および９）およ  びＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および１０）を２９３細胞にトランスフェクトした。細胞分解産物のサンプルを１０％ＰＡＧＥにより分離した。４種のＲｅｐタンパク質全てを認識する抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ｈｕｎｔｅｒら、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６：３１７−３２４）。
【図３】図３：ｒＡＡＶ  ＤＮＡ複製のサザン分析。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、アデノウイルス感染を行わずに（レーン１、２、５、６）またはアデノウイルス  感染を行って（レーン３、４、７、８）、ヘルパープラスミドＣＶＭ／ＡＡＶ（レーン１〜４）またはＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン５〜８）と共に２９３細胞に同時  トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡを細胞から回収し、予めＤｐｎＩで消化せずに（レーン１、３、５、７）またはＤｐｎＩで消化してから（レーン２、  ４、６、８）、１％アガロースゲルで分離した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ  ＣｌａＩ／ＮｄｅＩ断片）を用いてサザンブロットを行った。
【図４】図４：  異なるヘルパープラスミドでトランスフェクトした細胞におけるｒＡＡＶ  ＤＮＡ複製の比較。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って、ヘルパープラスミドＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および２）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン３および４）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および６）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン７および８）およびＡＣＧ−２（レーン９および０１）と共  に２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（レーン１、３、５、７および９）または４８時間後（レーン２、４、６、８お  よび１０）に細胞から低分子量ＤＮＡを回収した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ  Ｃｌａ  Ｉ／Ｎｄｅ  Ｉ断片）を用いてサザンブロットを行った。
【図５】図５：各種のＡＡＶヘルパープラスミドからのＣａｐ遺伝子発現のウェスタン分析。ＡＡＶ  ベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行わずに（レーン６〜１０）、ヘルパープラスミド  ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および６）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン２および７）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン４および９）および  ＡＣＧ−２（レーン５および１０）と共に２９３細胞に同時トランスフェクトした。１０％ＰＡＧＥにより細胞溶解産物のサンプルを分離した。３種のＣａｐタ  ンパク質全てを認識する抗−Ｃａｐポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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