(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ポリヌクレオチドの調製方法であって、
二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位（定常部位の配列は同一リンカー群では共通し、かつ定常部位は、１つ以上の制限酵素サイト、組換えサイト、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグの配列を有する）及び式（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、ｎが５〜１０の整数であり、かつｍは１〜３の整数であり、かつ、ヌクレオチド類（Ｎ）は、同一でも、互いに異なっても良く、（Ｎ）ｎ−ｍはランダムに合成された配列を有する）で表される一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位からなり、前記一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位が二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の外側に突出し、かつ前記可変部位の（Ｇ）ｍが定常部位側にあるオリゴヌクレオチドリンカーの群であるリンカー群(（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群という)を用い、
ｉ）前記リンカー群に含まれるオリゴヌクレオチドリンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド群に含まれる標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端の相補的な特異的オリゴヌクレオチド部位にアニールし、
ｉｉ）前記アニールした標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端を前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせ、かつ
ｉｉｉ）前記リンカーをライゲートした標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチド（類）を合成して前記二本鎖ポリヌクレオチドを得る段階を含む方法。
【請求項２】
前記式（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍで表される一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位が、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、またはＧ２Ｎ４である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位および二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の一方の鎖からなるオリゴヌクレオチドが配列番号１又は配列番号３の配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位および二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の一方の鎖からなるオリゴヌクレオチドが配列番号１又は配列番号３の配列を有し、かつ二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の他方のオリゴヌクレオチドが配列番号２の配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リンカー群は、1のサブリンカー群においては定常部位の配列は共通する少なくとも２つのサブリンカー群を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群に加えて（Ｎ）ｎリンカー群を用いてｉ）の段階を実施し、前記（Ｎ）ｎリンカー群は
二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位（定常部位の配列は同一リンカー群では共通し、かつ定常部位は、１つ以上の制限酵素サイト、組換えサイト、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグの配列を有する）及び式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、ｎが５〜１０の整数であり、かつ、ヌクレオチド類（Ｎ）は、同一でも、互いに異なっても良く、（Ｎ）ｎはランダムに合成された配列を有する）で表される一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位からなり、前記一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位が二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の外側に突出するオリゴヌクレオチドリンカーの群である、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群は、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、及びＧ２Ｎ４からなる群から選ばれる可変部位のいずれかを有するリンカー群であり、前記（Ｎ）ｎリンカー群は、Ｎ５及びＮ６からなる群から選ばれる可変部位のいずれかを有するリンカー群である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群は、可変部位がＧＮ５であるリンカー群であり、かつ前記（Ｎ）ｎリンカー群は、可変部位がＮ６であるリンカー群であるか、または前記（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群は、可変部位がＧ２Ｎ４であるリンカー群であり、かつ前記（Ｎ）ｎリンカー群は、可変部位がＮ６であるリンカー群である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
可変部位がＮ６である（Ｎ）ｎリンカー群と可変部位がＧＮ５である（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群との比（Ｎ６／ＧＮ５混合比）が１：３〜１：５である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
可変部位がＮ６である（Ｎ）ｎリンカー群と可変部位がＧＮ５である（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群との比（Ｎ６／ＧＮ５混合比）が１：４である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ライゲーションがリガーゼにより行われる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガーゼがＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡリガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ライゲーションがリガーゼ刺激剤の存在下で行われる請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リガーゼ刺激剤がＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカー及び前記標的第一鎖ポリヌクレオチド及び／又は前記標的に相補的な第二鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的第一鎖ポリヌクレオチド又は前記二本鎖ポリヌクレオチドが長鎖、完全コード及び／又は完全長ｃＤＮＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一鎖ｃＤＮＡがｍＲＮＡの５’末端でのＣａｐトラッピングから得られる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣａｐトラッピングされたｃＤＮＡがリンカーとのライゲーションの前または後に、さらにノーマライゼーションまたはサブトラクションされる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンカーを標的第一鎖ポリヌクレオチドにアニールする前、及び／又はポリヌクレオチド第二鎖の合成の後、温度を上昇させる段階を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記温度が２５〜１００℃の範囲である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記温度が６５℃である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
可変部位と反対側の、前記リンカーの定常部位の少なくとも一端が、保護基によってタグされる請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記保護基がＮＨ２である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカー定常部位の２つの鎖の末端が、ループを作ることにより一緒に結合する請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記二本鎖ポリヌクレオチドが、制限酵素サイトにおいて両方の末端で切断され、かつベクターに挿入される段階をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記二本鎖ポリヌクレオチドが平滑末端を残して切断され、かつベクターに挿入される段階をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的一本鎖ポリヌクレオチド群がポリヌクレオチドライブラリーであり、
前記リンカー群を構成するオリゴヌクレオチドリンカーの定常部位は特異的又は特定の組織又は種を示す少なくとも１つのマーカーを含み、
得られた二本鎖ポリヌクレオチドを前記特異的又は特定のマーカーにより前記ライブラリーを選択及び分離する前記ライブラリーを識別する段階をさらに含む、請求項1〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー群並びに前記リンカー群の使用を含むポリヌクレオチドライブラリーの調製方法に関する。更に、本発明は特異的ライブラリーのためのマーカーとして改善されたリンカーに関する。
【０００２】
背景技術
オリゴヌクレオチドリンカー及びプライマーは、一本鎖ポリヌクレオチドのプライミング、結合又はアニーリングの従来技術において使用され、かつ、第ニポリヌクレオチド相補鎖合成を可能にする。
カルニンシ(Carninci)ら、1996、ゲノミクス（Genomics）、37、327-336;カルニンシ（Carninci）ら、1997、DNAリサーチ(DNA Research) 4:61-66; カルニンシ（Carninci）ら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci USA、95:520-4; カルニンシ（Carninci）及び ハヤシザキ（Hayashizaki）、1999, Methods Enzymol. 303:19-44は、cDNAライブラリーの調製方法を開示している。これらのプロトコルにより、mRNA/cDNAハイブリッドは調製され、かつ、Capトラッパー技術を用いて完全コーディング／完全長cDNAsが選択され、次いで、それぞれの一本鎖cDNAはG-テールとライゲートされ、cDNA第二鎖が合成される。
しかし、G-テーリング法は、例えば、cDNAクローンをタンパク質発現に使用する場合の配列決定(sequencing)効率及び翻訳効率において、幾つかの欠点を示す。
【０００３】
G-テーリングは、ターミナル  デオキシヌクレオチジル  トランスフェラーゼを用いてdGTPのターミナル付加により行われる。しかし、付加されるGの数を調節することは難しく、それは、一般的に10から30の間で変化し得る。長いG-テールは、長鎖シーケンス解読(long read sequencing)を悪化させ、かつ配列決定効率を低減させるという欠点を有し、一方、短いG-テールは、プライミング効率の低下をもたらし、その結果サンプルが損失し、その再調製の必要が生じるという欠点を有する。
【０００４】
長いG-ストレッチ（長いG-テール）は、配列決定反応中に周囲の配列と相互に作用し、非常に強固な第二次構造を形成する。これは、典型的にはGCリッチである5'UTR類との相互作用において、問題を起こすことがある。実際、典型的なcDNAは、制御部位として働くと考えられている5'-UTR内に60%のGC含有量を有する。同様の問題は、クローニングサイトの隣にSfiI又はNotI制限酵素サイトを含むGCリッチ部位を有するクローニングベクターにおいても観察された。
【０００５】
更に、テイリング反応に使用されるターミナル  デオキシヌクレオチジル  トランスフェラーゼは、重金属、例えば、MnCl2又はCoCl2を必要とする。しかし、これらの重金属は、cDNA類の分解を引き起こすことがあり、長鎖、完全コーディング／完全長cDNAの生成率を低減させてしまうことがある。
【０００６】
本発明の目的は、従来技術における幾つかの問題を解決し、かつ、効率のよい新たなcDNAライブラリー調製方法を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は、cDNAライブラリー調製方法において利用可能なG-テーリングに代わる新たなリンカーの提供、及び前記リンカーを用いたcDNAライブラリー調製方法を提供することにある。
【０００７】
発明の説明
本発明は、
二本鎖ポリヌクレオチドの調製方法であって、
二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位（定常部位の配列は同一リンカー群では共通し、かつ定常部位は、１つ以上の制限酵素サイト、組換えサイト、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグの配列を有する）及び式（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、ｎが５〜１０の整数であり、かつｍは１〜３の整数であり、かつ、ヌクレオチド類（Ｎ）は、同一でも、互いに異なっても良く、（Ｎ）ｎ−ｍはランダムに合成された配列を有する）で表される一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位からなり、前記一本鎖オリゴヌクレオチド可変部位が二本鎖オリゴヌクレオチド定常部位の外側に突出し、かつ前記可変部位の（Ｇ）ｍが定常部位側にあるオリゴヌクレオチドリンカーの群であるリンカー群(（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカー群という)を用い、
ｉ）前記リンカー群に含まれるオリゴヌクレオチドリンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド群に含まれる標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端の相補的な特異的オリゴヌクレオチド部位にアニールし、
ｉｉ）前記アニールした標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端を前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせ、かつ
ｉｉｉ）前記リンカーをライゲートした標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチド（類）を合成して前記二本鎖ポリヌクレオチドを得る段階を含む方法に関する。
【００２７】
図面の簡単な説明
図1は、1例として可変部位GNNNNNを含むリンカー群を用いた完全長cDNAライブラリー調製工程の例を示す。
PolyA+RNAは転写(A)され、次いで酸化され、ビオチンへ結合される。Rnase I処理後(B)、完全長cDNAのみがビオチンを有し、アビジンコートされた磁気ビーズに捕獲される(C)。
【００２８】
図2は、図1の続きで、1例として可変部位GNNNNNを含むリンカー群を用いた完全長cDNAライブラリー調製工程の例を示す。
cDNAは、アルカリ処理によりビーズからはずされ、回収され(D)、リンカーがライゲートされる(E)。GN5リンカーが示されている。N6リンカーの場合、可変部位は、GNNNNNに代えてNNNNNNである。第二鎖cDNAが合成され(F)、制限酵素により消化され(G)、ラムダファージベクターヘライゲートされ(H)、かつ、パッケージされる(I)。
【００２９】
図3はテストcDNAとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
5μgの7.5kbポリ(A)-テールド(tailed) RNA(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))から調製されたテスト第一鎖cDNAが出発材料として使用された。リンカー(GN5-、レーン1-3;N6、レーン4-6)は、アニーリングされ、50ngの7.5kbテストcDNAとライゲートされた。その後、10ngのリンカー結合材料のサンプルは、第二鎖cDNA合成に用いられ、次いでO.8%アルカリゲル電気泳動に掛けられた。
異なる量のリンカーが使用された:レーン1及び4は200ng;レーン2及び5は500ng並びにレーン3及び6は2μg。参照として、リンカーなしのcDNAは、第二鎖合成のテンプレートとして使用された(レーン7)。レーン8は、リンカーをなしの第一鎖cDNAを含む。レーン9は、λ/HindDIIIサイズマーカーを含む。
【００３０】
図4は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内cDNAのリンカーライゲーションcDNAとリンカーとの比を調べた結果を示す。
2μgのN6/GN5が混合されたリンカー(N6:GN5=1:4)は、様々な分量のcDNA(レーン1は1000ng、レーン2は500ng及びレーン3は200ng)とライゲートされた。それらは、第二鎖cDNA合成に供給され、O.8%ゲル電気泳動により分析された。レーン4はマーカーを含む。
図左側の個々のレーンは、第一鎖cDNAを表している。
【００３１】
図5は、従来技術に記載のG-テールを有する cDNA配列の配列決定チャートを示している。
第二鎖cDNA配列におけるC反復の存在下(第一鎖へG-テールと共に導入)、チャートに示されているように配列決定効率は低減した。
【００３２】
図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。図６の配列決定されたクローンＤ０５＃０４２＃２−５Ｆ−ａｂ２は表１のサンプル２．０５と対応している。
【００３３】
図7は、GN5リンカーとライゲートされたcDNA配列の配列決定チャートを示す。図7の配列決定されたクローンG07#052#3-7F.ab1は、表1のサンプル3.07に対応している。
【００３４】
図8は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。図８(A)ではバイアスを説明している。一本鎖リンカーの定常又は一定部位の一末端は、二本鎖リンカーから他方の一本鎖除去後、一本鎖cDNAと相互作用してループを形成することがあり、続く第二鎖cDNA合成をブロックすることがある。
【００３５】
図８(B)に示されているように、保護基としてのNH2は、一定又は定常下鎖(lower strand)の一末端の場合3'末端へ結合する。ループ形成の可能性はなく、かつ、第二鎖cDNA合成は阻害されない。
【００３６】
図８(C)では、リンカーの定常又は不変第二鎖（図では下鎖）の3'末端と定常又は不変第一鎖（図では上鎖(upper strand)）の5'末端は、ループを形成するために共に結合される。これは、一本鎖cDNAによるループ形成の可能性を妨げ、かつ、第二鎖cDNA合成は阻害されない。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明はオリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群を提供することにより、従来技術における上記問題を解決する。このようなリンカー及びリンカー群は、標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチド群の末端に結合することができ、かつ、第二ポリヌクレオチド鎖合成を可能にする。
【００３８】
本発明の態様によれば、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群が提供される。定常部位は、好ましくは、リンカー群のいずれのリンカーにおいて不変のオリゴヌクレオチド部位である。リンカー定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができ、好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。定常部位は、好ましくは下記の内少なくとも1つを含む：制限サイト、組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグ。
【００３９】
可変部位は、好ましくはランダムに合成される。この結果得られるリンカー群のリンカーは、不変部位、好ましくはその群内で共通の部位及び、群内のそれぞれのリンカー毎に異なる可変部位を有する。
【００４０】
本発明によるリンカー群は、可変部位として、標的一本鎖ポリヌクレオチドの3'末端又は5'末端に特異的なオリゴ配列を有する1つ以上のリンカーも含むことができる。前記オリゴ配列は、特に、標的ー本鎖ポリヌクレオチド群から1つ以上の特異的ターゲットポリヌクレオチドを結合及び単離するために選択される。
【００４１】
本発明によるリンカー可変部位は、例えば、長鎖完全コーディング又は完全長cDNAのような第二鎖ポリヌクレオチド合成において、プライマーとして働くこともできる。
【００４２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドのランダムな可変部位は、どのような種類のヌクレオチドも含むことができる。好ましくは、可変部位は、式(N)n（式中、Nは、A、C、G、T若しくはU、又はその誘導体であり、かつ、nは1以上である）を有する。nが2以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチドは、お互いに、同一でも、互いに異なっても良い。
整数ｎは、有利には１〜１０であり、好ましくは４〜８であり、より好ましくは、nは5又は6である。
【００４３】
一法としては、可変部位において、(N)nの第一から第三ヌクレオチド（図２に示すように、定常部位の側からフリー末端へ向かって数え始める）は、Gであることができる。鎖の長さ（即ちnの長さ）が異なり、かつGを含むか又は含まない混合物も本発明の対象に含まれる。好ましくは、それは、異なる比率のN6/GN5の混合物であり、その比率は好ましくは1:4である。
【００４４】
本発明は、更に、本発明によるリンカー、並びに前記リンカーの可変部位とアニーリング及び／又はライゲートする一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物、そして前記リンカー−ポリヌクレオチド生成物を含むベクターに関連している。
【００４５】
好ましくは、前記一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長cDNAである。
【００４６】
従って、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング及び／若しくはライゲートする本発明によるリンカーを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物又はポリヌクレオチドライブラリーの調製方法を開示する。
【００４７】
本発明は、更に、二本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング／ライゲートされた本発明によるリンカーを含むポリヌクレオチド生成物又はライブラリーの調製方法、好ましくは、長鎖、完全コーディング／完全長cDNAライブラリーの調製方法に関する。
【００４８】
本発明は、更に、定常部位にマーカーを含む本発明によるリンカー群を提供することによるポリヌクレオチドライブラリーのマーキング方法にも関する。このマーキングシステムは、異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、イネ等）のライブラリーを識別又は認識することを可能にし、かつ、それは、それぞれの種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリーを識別するために使用することができる。
【００４９】
本発明によれば、以下に記載されているリンカー又はリンカー群及び前記リンカー又はリンカー群と標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群との結合方法であって、
i)    オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製；
ii)   標的一本鎖ポリヌクレオチド(類)と前記リンカーの可変部位（類）とのアニーリング、
の段階を含む方法が提供される。
【００５０】
以下、幾つかの場合、本発明は、簡潔化のため、リンカー群（リンカー群又は単にリンカー類としても記載されている）、並びに前記群の標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び二本鎖ポリヌクレオチド合成方法について記載される。しかし、本発明は、前記リンカー群に含まれる個々のリンカー及びそのような個々のリンカーの使用を含む方法も包含していることは明らかである。
【００５１】
本発明によるリンカー群に含まれる各リンカーの定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。
好ましくは、リンカーと同様に定常部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、従って、その方法は以下の工程を含む：
i)  オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、前記二本鎖定常部位の外側に突き出している(従って、可変定常部位は粘着突出末端を形成する);
ii)  標的一本鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング、及び、好ましくは前記標的一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングされた末端と、リンカーの隣接する定常部位とのライゲーション（図2の段階(F)から(G)参照）。
【００５２】
前記リンカー又はリンカー類は、従来技術において知られているいずれかの方法、例えば、5'部位に定常核酸配列を、3'部位に可変核酸配列末端を含む5'-3'方向を有する一方のオリゴヌクレオチド鎖を用いて調製することができる。その後、定常核酸配列を含む他方のオリゴヌクレオチド鎖が調製される。最後に、一方の鎖の可変部位が二本鎖定常部位の外側に突き出すように、一方の鎖の定常部位及び他方の鎖の定常部位がアニーリングされる。リンカーは、もちろん工程の順序を逆さにして調製することができ、かつ、他の方法によっても調製することができる。
【００５３】
本発明発明によるリンカーが二本鎖リンカーである場合、本出願の目的のために、定常部位及び可変部位を含む鎖は、“第一鎖”とも呼ばれ、一方、第一鎖の定常部位に相補的な他方の鎖は、“第二鎖”と呼ばれる。
【００５４】
本発明は、更に、定常部位及び可変部位を含む一方のオリゴヌクレオチド鎖(“第一鎖”のみを含み、“第二鎖”を含まない)のみを含むリンカーに関する。リンカーが5'-3'方向を有する場合、この一本鎖オリゴヌクレオチドの末端の可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの3'末端にアニーリングする。次いで、この標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的である第二鎖ポリヌクレオチドが合成される。
【００５５】
１つ又はそれ以上のリンカーは、可変部位を含む鎖が3'-5'の方向を有するように調製され得る。この結果、可変部位は5'末端に位置する。このように調製されたリンカーの5'末端可変部位は、標的ポリヌクレオチドの5'末端ヘアニーリングする。他方の鎖が存在する場合、その下鎖は、標的ポリヌクレオチドの5'末端ヘライゲートすることができる。
【００５６】
本発明は、本発明によるリンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
i)    オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、二本鎖定常部位の外側に突き出している（従って、可変部位は粘着突出末端を形成する）；
ii)   標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカー群の可変部位とのアニーリング、及び前記標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカーの隣接する（第二鎖）定常部位とのライゲーション;並びに
iii)  可変部位をプライマーとして使用することによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
を含む方法も提供する。
【００５７】
ポリヌクレオチド配列は、本発明のによるリンカーの一方の鎖のみを用いて調製することも可能である。この場合、
i)    オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含む一本鎖リンカー群の調製;
ii)   標的第一鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング;
iii)  リンカーの可変部位をプライマーとして用いることによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
の段階が含まれる。
【００５８】
リンカー又はリンカー群の定常オリゴヌクレオチド部位は、どのようなオリゴヌクレオチド配列でもよい。この定常配列は、好ましくは不変部位であり、従って、それは、同じ群のリンカーの全てについて共通する。この定常部位は、1つ以上のグループから成るオリゴ配列も含むことができ、そのため、この場合、定常部位は、同じ群内で幾つかの相違を示すことができる。しかし、本発明の目的のためには、任意の1つ以上のグループからなるこれらオリゴ配列は、定常部位のおおよその(general)構造を変化させないため、1つ以上のグループからなる可変オリゴ配列を含む定常部位も、含まない定常部位も、簡略化のために、定常部位として記されている。
【００５９】
定常部位は、リンカー群においても不変部位であることができる。すなわち、それは、群に含まれるいずれのリンカーについても同一のものとすることができる。
【００６０】
定常部位は、どのような種類のオリゴヌクレオチド配列(DNA又はRNA)であることができ、それは、特定の実験又は特定のライブラリーに使用されるリンカー又はリンカー群について、同じであるか又はほぼ同じであることが好ましい。
【００６１】
リンカー定常部位は、従って、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの両方を意味することができ、好ましくは、それは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。この場合、一本鎖可変部位は突出末端を形成する。可変部位は、第二鎖ポリヌクレオチド合成過程においてプライマーとして作用することができる。
【００６２】
定常(又は不変)部位は、好ましくは1つ以上の制限サイト、相同組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー及び／又はタグを含む。好ましい制限サイトは、例えば、BamHI、XhoI、SstI、SaII、又はNotI、その他、例えばHyone-myong Eum、“制限エンドヌクレアーゼ及び改質メチラーゼ(Restriction endonuoleases and modification methylases)”の章に開示されているものである。
【００６３】
相同組換えサイトの例は、attB、Gateway(商標)(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))、Cre-lox(キングハ  ルー(Qinghua Liu)ら、1998、カレント・バイオロジー(Current  Biology)、8:1300-1309)Flp/FRT (J.ワイルド(Wild)ら、1996、ジーン(Gene)、179:181-188)である。
【００６４】
更に、ポメラーゼプロモーターサイトについては、それは、RNAポリメラーゼプロモーターサイト、例えば、Hyone-Myong Eun、521ページに開示されたものの1つであることができる。好ましくは、それは、T3、T7、SP6、K11及び/又はBA14 RNAポリメラーゼプロモーターサイトであることができる。
【００６５】
マーカーは、いずれのヌクレオチド配列であることもでき、例えば、特定組織又は種について特異的な配列であることができる。
【００６６】
タグとしては、一方の鎖又は他方の鎖の定常部位の先端に結合することができるいずれの基又は分子でも使用することができる。実際、例えば温度の上昇により、リンカーの一本鎖が除去される場合、他方の一本鎖の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成する可能性がある（図8）。定常部位のみからなる鎖の末端が、主にこの鎖とライゲートした標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成し、かつ第二鎖ポリヌクレオチド合成を阻害することを避けるため、保護基は、好ましくは、この定常部位のみからなる鎖の3'末端へ結合する(図8 A)。従って、3'-OHを持たず、ライゲートもDNAポリメラーゼにより伸長することもできないいずれの基でも、本発明の目的のために使用することができる。
【００６７】
保護基としては、例えば、ddNTP類を使用することができる。好ましくは、NH2基も保護基として使用される(図8、B)。
【００６８】
ループバイアスの問題を避けるために、更に特別な解決法として、可変部位の反対に位置するリンカーの定常部位の両鎖の末端がループを形成するように、両末端を一緒に結合させることができる(図8、C)。この解決法により、定常部位の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成することができず、第二鎖ポリヌクレオチド合成は阻害されない。
【００６９】
リンカー又はリンカー群のオリゴヌクレオチド可変部位は、好ましくは、ランダムにに合成される。従って、リンカー群内では、いずれのリンカーの可変部位が、好ましくはランダムに合成され、それぞれのリンカーが有する可変部位の配列及び/又は塩基数は、お互いに異なっている。従って、リンカー群は多数の異なる配列を有する突出末端を含む。このようなリンカー群は、多種のランダムな突出末端を含む。これらは、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の相補末端を認識、アニール及び／又はライゲートする。これは、すなわちリンカー及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する完全長cDNA群である(図1及び2参照)。
従って、本発明は、本発明により調製される少なくとも２つのリンカーを含むリンカー群にも関する。好ましくは、本発明は、少なくとも２つのサブリンカー群(subpopulations of linkers)を含むリンカー群に関する。
【００７０】
リンカー群は、すべてのリンカーに含まれる定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるものであることができる。リンカー群は、２つ以上のサブリンカー群を含むこともあり、その中の１つのサブリンカー群は、定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるリンカーを含み、他のサブリンカー群の定常部位配列は相互に異なる。
【００７１】
好ましくは、リンカー群又はサブリンカー群において、リンカーの可変部位は、ランダムに合成される。好ましくは、その群又はサブ群において、リンカーの可変部位の配列は、相互に異なる。
【００７２】
可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端(好ましくは3'末端)に相補的である特異的オリゴヌクレオチド配列であることもできる。
【００７３】
好ましくは、本発明のリンカー群は、可変部位のうち、標的ポリヌクレオチド群から選択しようとしている特異的標的ポリヌクレオチドの末端（類）を認識及びアニールすることができる1つ以上の特定の(specifically determined)部位を含む。
【００７４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端は、リンカーの可変突出末端ヘア二一リングする。標的一本鎖ポリヌクレオチド群ヘリンカー群が付加される場合、好ましくはランダムに合成された、リンカー中の可変部位(突出末端)は、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の末端を認識し、かつアニールする。
【００７５】
好ましくは、本発明によるリンカーは、定常部位(好ましくは、群のリンカーすべてについて不変の部位である)及び群のどのリンカーについても異なっている可変部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。第一の態様より、標的一本鎖ポリヌクレオチドの3'末端は、可変部位の突出末端の3'末端へアニールし、前記標的一本鎖ポリヌクレオチドの3'末端に隣接する他方の鎖の定常部位の5'末端ヘライゲートする。
【００７６】
リンカーは、第二の態様によれば、3'-5'方向を有する一方の鎖及び他方の鎖の定常部位により、構成されることもできる。この場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの5'末端は、リンカーのこの可変部位ヘアニールしライゲートする。
【００７７】
リンカーの可変一本鎖オリゴヌクレオチド部位は、どのような種類の核酸をも含むことができる。好ましくは、前記可変部位は、式(N)n(式中、Nは、A、C、G、T若しくはU又はそれらの誘導体であり、nは1以上であり、nが2以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチド(N)は同一でも、互いに異なっても良い)を有する。好ましくは1≦n≦10であり、より好ましくは4≦n≦8である。特に好ましいリンカーとしては、nは5又は6であり、すなわち、N6又はN5である。
【００７８】
定常部位に最も隣接している第一、第二及び／又は第三N（即ち、第一の態様の場合、リンカーの5'末端からくる可変部位のヌクレオチド）は、式(G)m(N)n-m（式中、m=1〜3）によるGであることもできる。好ましくは、リンカー可変部位は、GN4、GN5、G2N3、G2N4、G3N2、G3N3、N5、N6又はそれらの混合物であることができる。
【００７９】
より具体的には、本発明によるリンカー群は、(N)nリンカーと(G)m(N)n-mとの混合物であり、好ましくは異なる比率を有するN6/GN5、N6/G2N4又はN6/G3N3である。N6/GN5混合リンカーの比率は、O:1-1:Oであり、好ましくは1:3-1:5、より好ましくは1:4であることができる。ライゲーションは、従来技術において知られているいずれのライゲーション方法を用いても行うことが可能であり、好ましくはDNAリガーゼ、より好ましくはT4 DNAリガーゼ若しくは大腸菌DNAリガーゼ(例えば、Hyone-Mong Eun、「リガーゼ」の章参照)を用いるか、又はRNAリガーゼ(マルヤマ(Maruyama)ら、1995)を用いて行うことができる。
【００８０】
好ましくは、本発明によるライゲーション反応は、リガーゼ刺激剤(ligase stimulating agents)の添加を含む。好ましくは、リガーゼ刺激剤としては、PEG(ポリエチレングリコール)、好ましくは分子量6000-8000のものが使用される。
【００８１】
アニーリング及び／又はライゲーション工程後、リンカーの可変部位（即ち、第一の態様のリンカーの突出又は遊離3'末端）は、本発明によるリンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する第二鎖ポリヌクレオチド合成のためのプライマーとして作用することができる。
【００８２】
本発明によるリンカーの標的一本鎖ポリヌクレオチドヘのライゲーションは、オリゴ−キャッピング技術(K.マルヤマ(Maruyama)ら、1995、ジーン(Gene)、138:171-174;及びS.カトー(Kato)ら、1995、ジーン(Gene)、150:243-250)を用いて行うことも可能である。オリゴ−キャッピングは基本的に下記の工程を含む：i)完全長でない(non full-length)mRNA類からホスフェート(phosphates)を除去するために、細胞から抽出されたmRNA類は、脱リン酸酵素(phosphatase enzyme)、好ましくは、バクテリアアルカリフォスファターゼにより処理される(即ち、5'末端に水酸基を有するキャップされていないRNAの5'末端を形成するが、キャップされた完全長RNAのCAP構造は除去しない);ii) i)において得られた混合物は、完全長mRNA類からCAP構造を除去し、リン酸基を完全長5'末端に残すピロフォスファターゼ、好ましくはタバコ酸性ピロフォスファターゼ(TAP)により処理される；iii)5'末端にリン酸基を有する完全長mRNAに、RNAリガーゼにより特異的RNA又はDNAアダプターをライゲートする。；iv)オリゴdTが添加され相補鎖が合成される。
【００８３】
本発明によるリンカーの標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び／又は本発明によるポリヌクレオチド配列の調製方法は、オリゴ−キャッピング法の変法をライゲーション工程として用いて下記のように行うことも可能である。
【００８４】
従って、標的一本鎖ポリヌクレオチド（オリゴ−キャッピング法として記載されたように調製されたRNA、mRNA、又はcDNAであることができる）は、リガーゼ存在下、本発明によるリンカーヘライゲートすることができる。
【００８５】
特に、本発明のリンカーが二本鎖リンカーである場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの一末端は、第二鎖（定常部位のみからなる）にライゲートし、かつ、そのリンカーの第一部位の可変部位ヘアニールする。
【００８６】
もう一つの可能性としては、標的ポリヌクレオチドは、リンカー（一本鎖又は二本鎖のいずれであることもできる）の可変部位ヘライゲートする。いずれの場合においても、オリゴdTが付加され、かつ、相補性ポリヌクレオチド、好ましくはcDNAが合成される。
【００８７】
RNAリガーゼの使用は、上記RNA又はmRNAに限定されることなく、DNAをライゲートするためにも使用することができる。
【００８８】
従って、本発明によるリンカーと標的一本鎖ポリヌクレオチドを結合するためのRNAリガーゼを用いたライゲーション方法は、
i)一本鎖DNAを一本鎖DNAへ;ii)一本鎖RNAを一本鎖RNAへ;そして、iii)一本鎖DNAを一本鎖RNAへ、又は、一本鎖RNAを一本鎖DNAへ
結合することができる。
【００８９】
１つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長mRNAであり、リンカーは、DNA（但し、RNAであることもできる）であり、第一制限酵素サイトを含む。
【００９０】
従って、一本鎖又は二本鎖cDNAの調製方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(I)ポリAを含む、長鎖、完全コーディング／完全長mRNAの提供；
(II)第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
(III) mRNAの5’末端の（リガーゼ、例えばRNAリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への5’末端のアニーリング；
(IV)第二制限酵素サイトを含むオリゴdTプライマーの提供、およびオリゴdTプライマーのmRNAのポリAへのアニーリング；
(V)逆転写酵素及びNTP類の添加によるcDNAの合成、この段階中、新たに合成されたcDNAは、リンカーの第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
(VI)mRNAの除去及び一本鎖cDNAの獲得。
【００９１】
更に、プライマーは、cDNAの3'末端へ付加することができ、かつ、ポリメラーゼの存在下、相補DNAが合成され、二本鎖cDNAが形成される。従って、形成された二本鎖は、一方の末端に第一制限酵素サイトを含み、他方の末端に第二制限酵素サイトを含む。
【００９２】
段階VI)でのmRNAの除去は、RNase H若しくはRNAをフラグメントに切断し、それらを除去する他の酵素の添加によって、又は従来技術（サンブロック(Sambrook)ら、1989）で知られている方法に従ってアルカリ（例えばNaOH）を添加することによって行うこともできる。
【００９３】
次いで、二本鎖ポリヌクレオチド配列が、特異的制限酵素の使用によって、特別にリンカーにより導入された第一及び第二制限酵素サイトにおいて切断され、その結果、突出末端が形成される。次いで、突出末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドがプラスミド若しくはファージ発現ベクター、又は配列決定ベクター（例えばサンブロック(Sambrook）ら、1989、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory);インビトロゲン・カタログ(Invitrogen Catalog) 1999;ストラジーン・カタログ(Stragene Catalog) 1999等に例えば記載されている）に挿入される。二本鎖ポリヌクレオチドは、部位特異的(site-specific)組換え(例えば、attB-attP)又は平滑末端方法(サンブロック(Sambrook)ら、1989)によりクローニングされることもできる。
【００９４】
ファージベクターの例としては、lambda-ZAP、lambda-Dash (ストラタジーン(Stratagene))を挙げることができる。
【００９５】
本発明は、従って、本発明によるポリヌクレオチド配列を含むファージ若しくはプラスミド発現又は配列決定ベクターにも関するが、これに限られるものではない。
【００９６】
本発明による一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、RNA若しくはDNAであり、又はDNA/RNAハイブリッドでもある。好ましくは、長鎖完全コーディング及び／又は完全長cDNAである。前記長鎖完全コーディング／完全長cDNAの3'末端は、mRNAの5'Cap末端に対応している。
【００９７】
本発明の目的のためには、完全長cDNAという用語は、5'及び3'UTR配列及びオリゴdTプライマー(即ち、ポリAを含むmRNAに相補的である)を含むcDNAを意味する。それは、クローニングのための付加的な配列、例えば、制限酵素サイトも含むこともできる。完全コーディングcDNAにおいては、cDNA配列は少なくとも開始及び終止コドンを含む。長鎖cDNAについては、cDNA配列は、ほぼ完全コーディング／完全長であり、3'末端(mRNAの5'末端に相当)、又はcDNA鎖がmRNAに相補的なcDNAに相補的である（すなわち、同じ遺伝子方向を有する）と考えるならば、5'末端において、１つ若しくは数個のヌクレオチドが欠損しているものと理解される。このようなcDNA合成途中における合成反応の停止はmRNAの二次構造形成、例えばCap構造のレベルに起因する可能性がある。しかし、遺伝子、ヌクレオチド、cDNA類、RNA又はmRNAのフラグメントも、本発明の応用の目的から除外されない。
【００９８】
DNA/RNAハイブリッドは、
(I)ポリAを含む長鎖、完全コーディング又は完全長mRNAの提供；
(II)第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
(III)mRNAの5'末端の（リガーゼ、例えばRNAリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への5’末端のアニーリング；
(IV)第二制限酵素サイトを含むオリゴdTプライマーの提供、及びオリゴdTプライマーのmRNAのポリAへのアニーリング；
(V)逆転写酵素及びNTP類の添加によるcDNAの合成；この段階中、新たに合成されたcDNAは、リンカー第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
(VI)オリゴdTプライマーの第二制限酵素サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの添加、及びこのオリゴヌクレオチドのポリAとのライゲーション；次いで、ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドが形成される、
によって調製され得る。
ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドは、上記のような特異的制限酵素によって切断されることができ、かつ上記のようなベクターへ挿入され得る。
【００９９】
リンカーの可変部位とアニールし、及び／又は隣接するリンカーの定常部位とライゲートする標的一本鎖ポリヌクレオチドは、従来技術において知られているいずれの技術を用いても調製することができる。
【０１００】
好ましくは、長鎖完全コーディング／完全長一本鎖cDNA類は、カルニンシ(Carninci)ら、1996、ゲノミクス(Genomics)、37、327-336;カルニンシ(Carninci)ら、1997、DNAリサーチ(DNA Research) 4:61-66;カルニンシ(Carninci)ら、1998、Proc.Narl.Acad.Sci. USA、95:520-4;カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999、Methods Enzymol.303:19-44に開示されている5'mRNA Capトラッピング技術により調製される。
【０１０１】
好ましくは、上記従来技術文献に記載されている全ての工程を行うが、例外としてG-テーリング工程の代わりに本発明によるリンカー群が提供される。
【０１０２】
好ましくは、図1及び2に記載されているCapトラッピング法が使用されるが、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、この技術により調製されるものに限られるものではない。例えば、他の第一鎖cDNAの単離方法、例えば、エデリー(Edery)ら、1995、Mol.Cell Biol.、15:3363-71に記載されているもの、又はオリゴキャッピング法(K.マルヤマ(Maruyama)ら、1995、ジーン(Gene)、138:171-174;及びS.カトー(Kato)ら、1995、ジーン(Gene)、150:243-250)も使用することができる。
【０１０３】
本発明による標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ノーマライズ(normalized)及び／又はサブトラクト(subtracted)（例えば、ソアレス(Soares)ら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci. 91:9228-9232及びボナルド(Bonaldo)ら、1996、6:791-806）されることもできる。回収されたノーマライズ及び／又はサブトラクトされたポリヌクレオチド、好ましくはcDNA類、より好ましくは長鎖完全コーディング／完全長cDNA類は、好ましくはCapトラッピング技術により調製され、次いで本発明によるリンカー群ヘライゲートされるか、又は、前記単離されたcDNA類は、本発明のリンカー群へ初めにアニール及び／又はライゲートされ、次いでノーマライズ及び／又はサブトラクトされる。
【０１０４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ループ又はヘアピンループ形成によるバイアスを示すことがある。例えば、合成された細胞内cDNAの3'末端は、それ自身の内部部位(internal portion)とループを形成することがあり、続く本発明によるリンカーとのアニーリング及びライゲーションを妨げる。
【０１０５】
この問題を解決するために、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、本発明によるリンカーとのアニーリング及び／又はライゲーションの前に、高温、25℃から溶液の沸点（約100℃）、好ましくは65℃で任意に処理され(subjected)、次いで好ましくは氷上で冷却される。
【０１０６】
変法として、二次構造は、化学試薬、例えば、NaOH(例えば0.1N)、ホルムアミド50-99%、尿素6-8Mからなる溶液又は核酸の二次構造を消失／低減するか、若しくは二本鎖核酸を変性することで知られている同様の試薬により消失させることができる。この場合、そのような試薬は、続く酵素的反応の前に通常エタノール沈殿を用いて除去する必要がある。
【０１０７】
さらなる変法として、リンカーヘアニール及び／又はライゲートされた標的ポリヌクレオチドは、ヘアピン−ループ形成の可能性を除去するために、高温で（ホットスタート(hot start)）処理されることができる。温度範囲は、25℃から溶液の沸点（約100℃)までであり、好ましくは65℃である。
【０１０８】
しかし、温度上昇により、リンカーの一方の鎖（即ち、定常部位及び可変部位を含む鎖）が除去されることがあるため、後に同一鎖リンカー又はどのようなプライマーも、リンカーの他方の鎖及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列に付加することができる。ヘアピン−ループ形成の可能性があるが、それは、図8、B及びCに記載されている解決法を用いて回避することができる。
【０１０９】
本発明による方法を用いると、アニーリング及びライゲーション工程は非常に効率的であり、そのため、続くクローニング工程は、PCR増幅なしで高力価(high-titer)ライブラリーの調製を可能にする。
【０１１０】
本発明による方法は、従来技術における方法に比べ、特にG-テーリング法に比べ、ライブラリー調製をより有利にする。
【０１１１】
G-テーリング法は、実際、図5に示されるように配列決定過程における重大な欠点を有している。第二鎖cDNAは、G-テール配列に相補的なCの反復(その長さは簡単に調節することができないため、長さ20-30Gまで達することがある)を含む。このCの著しい(excessive C strength)反復は、配列決定過程を停止させ、DNA配列決定を妨げる。
【０１１２】
本発明によるリンカーを用いた方法は、この欠点を有さず(ランダム可変部位がGを含む場合であっても、それらは統計的には少数である)、図6及び7に記載されているように効率のよい配列決定を可能にすることができる。
【０１１３】
図6のクローンは、配列番号3のヌクレオチド12から49に対応するリンカーN6の部位(図6の四角内にマークされている)を含む。ヌクレオチド1から11(含有)は、図2の段階Gに示されているように切断された。図6のリンカーの可変部位は、GGCGAAである(マークされた四角内に示されている)。
【０１１４】
図7のクローンは、配列番号1のヌクレオチド12からヌクレオチド49に対応するリンカーGN5の部位(図7の四角内にマークされている)を含む。配列番号1のヌクレオチド1から11（含有）は、図2の段階G)に示されているように切断された。図7のリンカーの可変部位はGGCGAA(マークされた四角内に示されている)である。
【０１１５】
続いて、G-テーリング法の長いGストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがあり、この現象は配列決定、転写及び翻訳効率に影響を与える。一方、本発明によるリンカーはこれらの欠点を有さない。
【０１１６】
更に、G-テーリング反応に使用されるターミナル  デオキシヌクレオチジル  トランスフェラーゼは、重金属、例えばMnCl2又はCoCl2の存在を必要とする。これらの重金属は、cDNA類の分解を起こし、長鎖完全コーディング／完全長cDNA含有率を低減する。この問題も、重金属を必要とせず、低温、例えば、4-37℃、好ましくは12-20℃、又は好ましくは16℃で用いることができる本発明によるリンカーを用いることにより解決される。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様によれば、本発明のリンカーの一定部位は、マーカーを含むことができる。例えば、容易に認識することができる特異的オリゴヌクレオチド配列、特異的配列又は配列の組み合わせである。
【０１１８】
このマーカーの存在は、同一若しくは異なる種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリー又は異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、イネ等）のライブラリーを識別するため、及び混同しないために非常に有用である。
【０１１９】
実際、異なる組織及び／又は種から得られた多種のライブラリーが、同一実験室内で構築され、大量配列決定に使用される場合、コロニーピッキング(colony picking)、DNA調製、配列決定研究、クローンバンキング、再アレーイング(re-arraying)等のどの段階においてもライブラリー又はクローンを取りちがえたり、混入させたりする危険性がある。
【０１２０】
cDNA類の個々のマーキングは、幾つかの組織からの異なるマークされたcDNA類の調製を可能にし、混合されたcDNAライブラリーの3'末端(5'mRNA末端と相補的である)を配列決定することにより組織発現プロファイリングを可能にする。
【０１２１】
【実施例】
本発明による方法及び態様を、下記実施例を参照して説明する。
実施例１
テストcDNAを用いたリンカー評価
リンカー調製
リンカーオリゴヌクレオチド群は、ギブコ-BRL ライフ・テクノロジーズ(Gibco-BRL  Life  technologies)から購入した。オリゴヌクレオチドは、一方の一本鎖(一本上鎖(single upper strands))(可変部位を含むA及びCと表されている)並びに他方の一本鎖(一本下鎖(single lower strands))(Bと表されている)に区別された。次いで、AとCのうちの1つとBを、2つの異なる二本鎖群を形成するために一緒に結合させた。リンカーAの群は、定常部位オリゴヌクレオチド(この場合、配列番号1の塩基1-43)、及び、第一塩基がGであり(即ち、塩基番号44)そして続く塩基が、群のそれぞれのリンカーについて異なりランダムに調製されたNNNNN(塩基45-49)である可変部位(GN5)を有するリンカーを含む。
【０１２２】
リンカーCの群は、一定部位オリゴヌクレオチド(配列番号３の塩基1-43)及び群内のそれぞれのリンカー毎に異なり、ランダムに調製された可変部位NNNNNN(塩基44-49)を含む。
【０１２３】
A)GN5 A鎖、
5'-AGAGAGAGAGCTCGAGCTCTATTTAGGTGACACTATAGAACCAGNNNNN-3' (配列番号:１)；
B)B鎖、
5'-TGGTTCTATAGTGTCACCTAAATAGAGCTCGAGCTCTCTCTCT-3' (配列番号:２)；
B鎖は、合成されたときに５'末端においてもリン酸化された。
C)N6 C鎖、
5'-AGAGAGAGAGCTCGAGCTCTATTTAGGTGACACTATAGAACCANNNNNN-3' (配列番号:３)。
【０１２４】
国際規則(International convention)及びパテンチン・スタンダード2.1マニュアル(Patentin Standard 2.1Manual)に基づき、縮重(degenerate)ヌクレオチドの場合には、VはA、G又はCを示し、Nは全ての種類のヌクレオチドを示す。
【０１２５】
これらのオリゴヌクレオチドは、非特異的サイトを有するか又はアニーリングサイトを欠く可能性のある不純物を除去するために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(サンブロック(Sambrook)、J.、フリッチェ(Fritsch)、E. F.、及びマニアチス(Maniatis)、T. (1989) 「モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Mannual)」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、NY.)により精製された。GN5及びN6と名付けられた２つのリンカー群を調製した。リンカーGN5は、オリゴヌクレオチドA/B(配列番号:１／配列番号:２)により調製され、リンカーN6は、オリゴヌクレオチドC/B(配列番号:３／配列番号:２)により調製された。それらは、オリゴヌクレオチドをNaCl(最終濃度、100mM)と混合し、かつ、65℃で5分間、45℃で5分間、37℃で10分間及び25℃で10分間インキュベートすることにより調製された。
【０１２６】
調製されたリンカーは、次いで、一本鎖DNA(類)にアニールし、かつ、一本鎖DNA(類)とライゲートするために使用された。
【０１２７】
テストcDNA
cDNAライブラリー調製時に適当なリンカーを構築するために、テスト第一鎖cDNAが、カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999に記載されている方法からCAPトラッピング工程を除いた方法により5  μgの7.5kb  ポリ(A)-テールドRNA(ライフ・テクノロジーズ(Life  Technologies))から生成された。[α‐32P]dGTPは、逆転写工程において取込ませた。調製された第一鎖cDNAの量は、放射能取り込み率により評価した。次いで、50ngの7.5-kb  cDNA及び実施例１の上記段階において調製した様々な量の(200ngから2μg)(図3の説明も参照)リンカー(N6又はGN5)を混合し、反応体積を30μlとしてライゲーションを行った。反応は、終夜10℃でインキュベートすることにより行なった。
【０１２８】
ライゲーション後、過剰リンカーを除去するために、リンカー結合一本鎖cDNAサンプルを、10mMのEDTA/0.2%SDS(反応体積、40μL)中の0.2mg/mLのプロティナーゼKと共に45℃で15分間インキュベートした。反応生成物は、フェノール／クロロホルム40μLを用いて抽出した。次いで、フェノール／クロロホルム混合物を、フェノール／クロロホルム混合物の界面に残っている反応生成物を抽出するために、60μLのカラム緩衝液(10 mM トリス-HCl、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、0.1％ SDS; pH 7.5)により処理した。抽出した反応生成物を、ゲル濾過カラム セファクリル（商標）(SephacrylTM)-300(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech))に載せ、400 x gで2分間の遠心分離により精製した。抽出したフラクション(精製されたリンカー第一鎖cDNAサンプルを含む)は、イソプロパノールを用いて沈殿した。
【０１２９】
コントロールサンプル(一本鎖テストcDNAを含むがリンカーを含まない)を、第二鎖cDNA合成に使用した。第二鎖cDNA合成を補助するための本発明の方法の能力を評価するために、10ngの精製されたリンカーをライゲートしたサンプル(図3のレーン1-6)及びコントロールとしてライゲートされていない7.5-kbの第一鎖cDNA(図3のレーン7)を、1μLの10X ExTaqTM緩衝液、1μlの2.5mM dNTP類、0.5μLの[α-32P]dGTP、及び0.5μL のEx-TaqTM(タカラ(Takara))を含む10μLの反応溶液にそれぞれ混合した。得られたサンプルを、65℃で5分間、68℃で30分間及び72℃で10分間インキュベートし、次いでアルカリゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１３０】
アルカリゲル電気泳動は、5μlのサンプルを1μlの６x アルカリ色素(サンブロック(Sambrook)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、6.7、6.12 )へ添加することにより行なった。電気泳動ゲルは、0.8％アガロース、50mMのNaOH、5mMのEDTAを含むものを用い、緩衝液は50mMの NaOH及び5mMのEDTA(サンブロック(Sambrook)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning))を含むものを用いた。
【０１３１】
結果
レーン1-3は、50ngの一本鎖テストcDNAとそれぞれ200ng、500ng及び2μgのリンカーGN5とのライゲーションを示している。
レーン4-6は、50ngの一本鎖テストcDNAとそれぞれ200ng、500ng及び2μgのリンカーN6とのライゲーションを示している。
レーン7はコントロールである。10 ngの一本鎖第一鎖cDNAを、1μLの10X ExTaqTM緩衝液、1μLの2.5 mM dNTP類、0.5 μlの[α-32P]dGTP、及び0.5 μLのEx-TaqTM (タカラ(Takara))を含む10μLの反応溶液へ添加した。サンプルを、65℃で5分間、68℃で30分間、及び72℃で10分間インキュベートした。一本鎖cDNAは、ヘアピン構造を形成することにより伸長され、第二鎖cDNAを形成した。これは、アルカリゲル電気泳動において15 kbの位置に検出された。
レーン8は、第一鎖cDNA(23ng)(リンカーなし)を含む。これは、7.5kbの位置に検出される。
レーン9は、マーカーを表す。
図3の電気泳動は、レーン1-6においてライゲーションは特に効果的であり（7.5kbのレベルのスポット）、かつ、ライゲーションが起こらなかったものの量は無視できる程度であった(15kbのレベルのスポット)ことを示す。
【０１３２】
実施例２
完全長cDNAライブラリー調製及びcDNA分析
リンカー調製
リンカーは、実施例１に記載されているように調製した。
【０１３３】
RNA調製
マウス肝臓組織のスライス(0.5-１g)を、10mlの懸濁液中でホモジナイズし(homogenized)、１mlの2M酢酸ナトリウム(pH4.0)及び同量のフェノール／クロロホルム混合物(体積比５:１)により抽出した。抽出後、同量のイソプロパノールを、RNAを沈殿させるために水相に添加した。このサンプルを、氷上で１時間インキュベートし、それら沈殿物を回収するために4000rpmで15分間冷却しながら遠心分離した。得られた沈殿物を、70％エタノールで洗浄し、8mlの水に溶解した。2mlの5M NaClを1％CTAB(セチルトリエチルアンモニウムブロミド)、4M尿素、及び50mMトリスを含む16mlの水溶液(pH7.0)に添加することにより、RNAを沈殿させ、多糖類を除去した(CTAB沈殿)。4000rpmで15分間室温で遠心分離した後、RNAを4mlの7Mグアニジン-Cl中に溶解した。次いで、2倍量のエタノールを溶液に添加し、1時間氷上でインキュベートし、4000rpmで15分間遠心分離した。得られた沈殿物を、70％エタノールで洗浄し、回収した。沈殿物を、水に再溶解し、OD比260/280(>1.8)及び230/260(<0.45)を測定することによりRNAの純度を決定した。このようにして得られた全RNAは、続いて、全RNAのためのmRNA単離キット MACSTM(ミルテニイ・バイオテク(Miltenyi Biotech)、ドイツ)を用いて精製され、ポリA+を有するものを凝縮した。
【０１３４】
cDNA合成
5から10μgのこのポリA＋リッチRNA、5μgのBamHIサイトを含む第一鎖プライマー5'-(GA)5AGGATCCAAGAGCTC(T)16VN-3' (配列番号:4)及び11.2μlの80％グリセロールを、総体積が24μlになるように混合した。RNA/プライマー混合物を、65℃で10分間変性させた。並行して、最終体積が76μlになるように、18.2μlの5X第一鎖合成緩衝液、9.1μlの0.1M DTT、6.0μlの10mM(それぞれ)ｄTTP、dGTP、dATP、及び5-メチル-dCTP(dCTPの代替)、29.6μlの飽和トレハロース〔約80％、低金属含有量；フルカ・バイオケミカ(Fluka Biochemika)〕、及び10.0μlのスーパースクリプト(Superscript) II逆転写酵素(200U/μl)を混合した。1.0μlの[α-32P]dGTPを第三チューブへ入れた。mRNA、グリセロール、及びプライマーは、氷上でスーパースクリプト(Superscript)を含む溶液と混合し、そのアリコット(20％)を、 [α-32P]dGTPを含むチューブへ即座に添加した。第一鎖cDNA合成は、加熱蓋を有するサーモサイクラー(thermocycler)（例えばMJリサーチ(Research)）内で下記のように設定したプログラムに従い、行われた：段階1、45℃で2分間；段階２、勾配アニーリング：35℃へ冷却1分以上；段階3、完全アニーリング：35℃で2分間；段階4、50℃で5分間；段階5、0.1℃/秒で60℃へ上昇；段階6、55℃で2分間；段階7、60℃で2分間；段階8、段階6に戻り更に10サイクル。放射能取り込みにより、cDNA収量を評価することができた。 (カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999)。cDNAは、プロティナーゼK、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により処理され、かつ、酢酸アンモニウムを塩として用いエタノール沈殿させた(カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999)。
【０１３５】
mRNAビオチン化
ビオチン化の前に、キャップ(cap)のジオール基及びmRNAの３'末端を、第一鎖cDNAを含む mRNA／cDNAの再懸濁物、66mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)、及び５mM NaIO4を含む最終体積50μlの反応液内で酸化した。サンプルを、氷上で暗条件下、45分間インキュベートした。mRNA／cDNAハイブリッドを、次いで、0.5μlの10％ SDS、11μlのNaCl、及び61μlのイソプロパノールを添加することにより沈殿させた。暗条件下、氷上で45分間インキュベートした後、サンプルは、10分間15,000rpmで遠心分離された。最後に、mRNA／cDNAハイブリッドを、70％エタノールで2回洗浄し、50μlの水に再懸濁した。続いて、キャップを、5μlの1M 酢酸ナトリウム(pH6.1)、5μlの10％ SDS、及び150μlの10 mMビオチンヒドラジドロングアーム(long-arm)(ベクター・バイオシステム(Vector Biosystem))を添加することにより、最終体積210μlの反応液中でビオチン化した。室温で終夜(13時間)インキュベート後、mRNA／cDNAハイブリッドを、75μlの１M酢酸ナトリウム(pH6.1)、5μlの５M NaCl、及び750μlの無水エタノールの添加により沈殿させ、かつ、氷上で1時間インキュベートした。mRNA／cDNAハイブリッドを、15,000 rpmで10分間の遠心分離によりペレット化し、次いで、ペレットを70％エタノールで1回、80％エタノールで1回洗浄した。mRNA／cDNAハイブリッドを、次いで70μlの0.1X TE(1 mM トリス[pH 7.5]、0.1 mM EDTA)中に再懸濁した。
【０１３６】
完全長cDNAの吸着及び解離
500μlのMPGストレプトアビジンビーズ及び100μgのDNAを含まないtRNAを混合し、得られた混合物を、氷上で３０分間時々攪拌しながらインキュベートした。ビーズは、３分間、磁気スタンドを用いることにより分離し、上清を除去した。ビーズを、次いで500μLの洗浄／結合溶液(2M NaCl、50 mM EDTA[pH 8.0])を用いて3回洗浄した。
【０１３７】
同時に、出発材料としたmRNA１μg当たり1単位のRNase I(プロメガ(Promega))が、製品の付属の緩衝液中のmRNA／cDNAハイブリッドサンプルへ添加された(最終体積、200μl)；サンプルを、37℃で15分間インキュベートした。反応を終止させるために、サンプルを氷上に置き、100μgのtRNA及び100μlの5 M NaClを添加した。完全コーディング／完全長mRNA／cDNAハイブリッドを吸着するために、400 μlの洗浄／結合溶液に再懸濁したRNase I処理されたビオチン化mRNA／cDNA及び洗浄したビーズを混合した。混合後、チューブを30分間室温で穏やかに回転させた。完全コーディング／完全長cDNAは、ビーズに吸着され、短いcDNA類は吸着されなかった。ビーズを、磁気スタンドを用いて上清から分離した。非特異的吸着cDNA類を除去するために、ビーズを穏やかに洗浄した。洗浄／結合溶液による２回の洗浄を行なった。1回目は0.4％ SDS、50 μg/ml tRNAを含むもの、２回目は10 mMトリス-HCl(pH7.5)、0.2mM EDTA、40 μg/ml tRNA、10mM NaCl、及び20％グリセロールを含むのもを用い、かつ、50μg/ml tRNA水溶液を用いた。
【０１３８】
cDNAは、50μlの50mM NaOH、5mMのEDTAを添加し、10分間室温で時々攪拌しながらインキュベートすることによりビーズから解離した。次いで、磁気を用いてビーズを除去し、抽出したcDNAは、氷上の50μlの1M トリス-HCl、pH7.0を含むチューブに移した。溶出サイクルは、大部分のcDNA(小型(hand-held)モニターを用いた放射性モニタリング測定により80から90％)がビーズから回収されるまで、50mM NaOH、5mM EDTAの50μlアリコットを用いて、1回又は2回繰り返された。
【０１３９】
RNAの残さを除去するために、回収したcDNAに１μlの RNase1(10U/μl)を氷上で直ちに添加した；次いで、サンプルを、37℃で10分間インキュベートした。cDNAを、プロティナーゼK処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出、かつ、再抽出(back-extracted)した。その後、サンプルは、ミクロコン(Microcon) 100(ミリポア(Millipore))を用い、40-60分間、2000 rpmの限外濾過を1ラウンドで行い濃縮された。
【０１４０】
cDNAのCL-4Bスピンカラム分画(fractionation)
cDNAサンプルは、次いで、マニュアル(S-400スピンカラム、例えば、アマシャム-ファルマシア(Amersham-Pharmacia)のものも使用することができる)に沿って、CL-4Bクロマトグラフィー(カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999)により処理された。
【０１４１】
cDNA類-リンカーライゲーション
上記のように調製したCap-トラッパー(Trapper)完全長一本鎖cDNA類を、3つの異なるチューブに分注した。１つはG-テーリング用、第二のチューブはGN5リンカー用、更に、最後のチューブはN6／GN5混合リンカー用とした。200ngのcDNAのアリコットは、従来技術に記載されているようにdGホモポリマーを用いて末端処理(tailed)し、かつ、コントロールcDNAライブラリー調製のために使用した(カルニンシ(Carninci)ら、ゲノミクス(Genomics)、1996)。
【０１４２】
300ngのCap-トラッパー完全長第一鎖cDNA類を、ギブコ(Gibco)-BRL/ライフ・テクノロジーズ(Life Technoogies)により上記のように調製されたリンカーを用いたリンカーライゲーションのための基質として使用し、cDNAライブラリー構築を行った（図１及び2に示す）。
【０１４３】
300ngの一本鎖cDNAを、800ngの比率1:4のN6/GN5リンカー混合物及び800ngのGN5リンカーへ添加した。
【０１４４】
ライゲーション基質(上記のように調製されたcDNA／リンカー)、溶液I及び溶液II(ライゲーションキット、タカラ(Takara))を、1:2:1の比率で混合した。全ての工程を、製品に付属の説明書に従って行った。よって、反応体積は30μlであり、7.5μlのサンプル、15μlの溶液I及び7.5μlの溶液IIを含んでいた。反応は10℃で終夜行なった(図2E)。
【０１４５】
過剰リンカーからの単離
cDNAとリンカーとの間のアニーリング及びライゲーションの後、ゲル濾過を行なった。上記のように、30μlのリンカー−ライゲーションサンプルは、10mMのEDTA及び0.2%のSDS存在下、0.2mg/mlのプロティナーゼKにより処理した。それらを、45℃で15分間インキュベートし、次いで、フェノール／クロロホルム抽出した。サンプルは、60μlのカラム緩衝液(10mM トリス-HCl、1mM EDTA、0.1M NaCl、0.1％ SDS、pH7.5)を用いて再抽出(back extracted)した。続いて、サンプルを、ゲル濾過セファクリル(Sephacryl) S300(アマシャム・ファルマシア。バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech))用のスピンカラムに掛けた。スピンカラムの段階では、400X gで2分間、遠心分離を行なった。溶出フラクションを回収し、イソプロパノールで沈殿した。
【０１４６】
精製段階後、第二鎖cDNA合成を行なった(図2F)。
第二鎖cDNAを合成するために、全ての精製されたリンカーとライゲートしたサンプルを使用した。6μlの10 x ExTaq緩衝液 タカラ(Takara)、並びに6μlの10mM dNTP類及び0.5μlの[α-32P]dGTPを、60μlのチューブ(the tubes in 60μl)に添加した。サンプルを、72℃で15秒間予めインキュベートし、次いで、0.5μlのExTaqを添加した。続いて、それらを72℃で30分間インキュベートした。
【０１４７】
サンプルを、アルカリゲル電気泳動で分析した。即ち、合成された第二鎖を含む0.5μlのサンプルに、最終体積6μlになるように１μlの６xアルカリ色素(サンブロック(Sambrook)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、6.7、6.12)を添加し、電気泳動を行なった。
【０１４８】
電気泳動は、0.8%のアガロース、50mM NaOH、5mM EDTAを含むアガロースゲルを用い、かつ50mM NaOH及び5mM EDTA(サンブロック(Sambrook)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning))を含む電気泳動バッファーを用いて行なった。
【０１４９】
サンプルは、フェノール／クロロホルムにより精製し、次いで、標準条件下、エタノール沈殿を行なった(サンブロック(Sambrook)、J.、 フリッチェ(Fritsch)、 E. F.、及びマニアチス(Maniatis)、T. （1989）「モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning9:ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Mannual)」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、NY.)。
【０１５０】
続いて、cDNAを、BamHI（25U/μgのcDNA類）及びXho I（25U/μgのcDNA類）を用いて37℃で1時間切断し、かつ、フェノール／クロロホルムにより抽出した。水相は、CL4Bゲル濾過スピンカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)）を用いて精製し、次いで2 μgのグリコーゲンの存在下、記載されているようにエタノール沈殿を行なった（カルニンシ(Carninci)及びハヤシザキ(Hayashizaki)、1999）。
【０１５１】
pBS IVベクター構築
10ngのｐBS SK+（ストラタジーン(Stratagene)）、20μlの10x NEB緩衝液2（ニュー・イングランド・バイオラボズ社(New England Biolabs,Inc)）、20μlの10mg/ml ウシ血清アルブミン（NEB）、30単位のNot I（NEB）、30単位のKpn I(NEB)及び10単位のXho I（NEB）を、体積が200μlになるように混合し、37℃で2時間インキュベートした。次いで、長いプラスミド部分を短いDNA断片から分離するために、この混合物を1x TAE/0.5μg/mlのエチジウム ブロミド緩衝液中の0.8% シープラーク(SeaPlaque)アガロースゲル(FMC バイオプロダクツ(Bioproducts))/ 1x TAE緩衝液/ 0.5 μg/ml エチジウム ブロミド (8 cm x 8 cm)において、50Vで1時間電気泳動に付した(分子クローニング)。長いプラスミド部分は、ゲルから切り出され、そのゲルをチューブへ移した。切断されたプラスミドを抽出し、ジーンクリーン(GENECLEAN) II(商標)キット(バイオ101社(Bio 101 Inc.))により精製した。プラスミドの濃度及び純度はアガロースゲル電気泳動を用いて、既にその濃度が分かっている標準プラスミドとの比較により確認した。
【０１５２】
二本鎖オリゴヌクレオチド調製
使用されたオリゴヌクレオチドは、ライフテクノロジー・ライフテックオリエンタル社(Life Technologies-Life Tech Oriental)（東京、日本）に合成を依頼し(custom-synthesized)、次いで、不純物を除去するために変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製した(マニアチス(Maniatis)等)。Not/Kpn 二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記の２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを混合することにより調製した：
【０１５３】
一方の鎖(上鎖(Upper-strand))
(5'GGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGATCAGGCCAAATCGGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGAGAGACTGCAGGAGAGAGGATCCGGTAC-3')(配列番号:６)；及び
他方の鎖(下鎖(Lower-strand))
NaCl中の
(5'CGGATCCTCTCTCCTGCAGTCTCTCGTCGACGAATTCGAGCTCGGCCGATTTGGCCTGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGC -3')(配列番号:７)(最終濃度、100mM)。
【０１５４】
この混合物は、次いで、65℃で５分間、45℃で５分間、37℃で10分間、かつ、25℃で10分間インキュベートされた。
【０１５５】
ベクターオリゴヌクレオチドライゲーション
100ngのKpn I及びNot Iサイトを末端に有するこのプラスミドと、3ngのNot/Kpn二本鎖オリゴヌクレオチド、1μl 10 x ライゲーション緩衝液(NEB)及びT4 DNA リガーゼ(NEB)を、10μl中で混合した。
【０１５６】
細胞形質転換
ライゲーションサンプルを含むチューブを、次いで、終夜１６℃でインキュベートした。ライゲーションサンプルは、250mMのNaCl、1μgのグリコーゲン及びイソプロパノールと混合し、次いで緩衝液を除去するために沈殿させた。続いて、それを、10μlの滅菌水に溶解した。得られたサンプルのうち1μlを、エレクトロポレーション(製造者のプロトコルに従う)により大腸菌細胞DH10B(ライフ・テック・オリエンタル(Life Tech Oriental))の懸濁液へ形質転換するために添加した。形質転換された細胞は、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上で選択された。アンピシリン耐性クローンは、100μg/mlアンピシリンを含む LB液体培地中で、37℃で16時間攪拌しながら培養した。合成した二本鎖オリゴヌクレオチドの挿入に使用した組換えプラスミドは、アルカリSDS法(分子クローニング)により精製した。挿入した配列はM13前プライマー(forward primer)(配列番号:5)及びビッグダイキット(Big dye kit)を用い、ABI377 DNAシーケンサー(PE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied BioSystems))により確認された。
【０１５７】
ベクター調製
上記のようにして得られた10μgの改変pBS SK(+)プラスミド(pBS IVと呼ばれる)に、20μlの10x Bam HI緩衝液、20μlの10mg/mlウシ血清アルブミン(ニュー・イングランド・バイオラボズ社(New England Biolabs,Inc))、30単位のBamH I(ニュー・イングランド・バイオラボズ社(New England Biolabs,Inc))、30単位のSal I(ニュー・イングランド・バイオラボズ社(New England Biolabs,Inc))を添加し、体積が200μlになるように調整し、37℃で1.5時間インキュベートした。続いて、10単位のPst I(ニュー・イングランド・バイオラボズ社(New England Biolabs,Inc))を、チューブ中の混合物に添加し、30分間インキュベートした。更に、0.5単位の温度感受性アルカリフォスファターゼTsAP(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))によってプラスミド末端の脱リン酸化を行った。TsAPは、部分的に切断されたプラスミドによるバックグラウンド(backgraound)を低減する。脱リン酸化された末端は、お互いにライゲートすることができない。チューブは、37℃で30分間インキュベートされた。TsAPを不活性化するために、EDTA(最終濃度20mM)を添加し、65℃で30分間インキュベートした。制限酵素／TsAP処理されたプラスミドは、ベクター構築段階において前述のように分離した。Bam HI及びSal Iサイトを末端に有する線状プラスミドに対応するバンドを、ゲルから切り出し、このゲルをスライスして小断片とした。それを500μlの1x βアガラーセ(β‐agarase)緩衝液(NEB)を含むチューブへ入れ、氷上で30分間放置した。緩衝液を1度交換し、更に氷上で30分間放置した。
【０１５８】
このチューブを、ゲルを溶解するために65℃で10分間インキュベートした。溶液を100μlにするために、β‐アガラーセ緩衝液を添加した。次いで、それを、３分間45℃にて冷却し、β‐アガラーセ (NEB)を、3U/100μl反応溶液の濃度になるように(the concentration of 3U/100μl reaction)添加した。この反応液を、45℃で6時間インキュベートした。10μlの5M NaCl及び100μlのフェノール／クロロホルムをチューブへ添加した。チューブを、5分間静かに上下を逆にするように振り、15 krpmで3分間室温で遠心分離した。水相を回収し、次いで、クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行なった。チューブは、15krpmで10分間4℃で遠心分離し、得られたペレットを、80%エタノールで2回洗浄した。最終的に、ペレットを、最終濃度が100 ng/μlになるように滅菌水に溶解した。アガロースゲル電気泳動により、濃度が既にわかっている標準プラスミドと比較することによって、ベクターの濃度及び純度を確認した。
【０１５９】
クローニング
前段階で得られた10ngのcDNAと、190ngの上記改変ベクターpBluescript KS(+)(PbsIV)(ストラタジーン(Stratagene))とを終夜ライゲートした。
cDNA-ベクターライゲーションは、2.5倍体積のEtOHを用いて沈殿させた。サンプルは、エレクトロポレーション(electroporation)により大腸菌DH10B(ギブコ(Gibco) BRL)へ導入した。形質転換された細胞を、100μg/mlアンピシリンを含むLBプレート上に塗布し、終夜37℃で培養した。36コロニーを無作為に採取し、LBアンピシリン(100μg/ml)液体培地中、終夜37℃で培養した。3つの培養物から組換えプラスミドを抽出した(サンブロック(Sambrook)ら、1989)。これらの3つの精製されたプラスミドは、キットマニュアル指示書に従ってABI3700 DNAシーケンサー(PE-アプライド・バイオシステム(PE-Applied BioSystem))を用いることにより、ビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット(Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(PE-ABI)及びM13前プライマーTGTAAAACGACGGCCAGT (配列番号:5)を用いて5'末端から配列決定された。
【０１６０】
実施例３
ライゲーション効率
上記のように調製したリンカーと、マウス肝臓由来のcDNA類とのライゲーションにおいて、２μgの混合リンカー(N6:GN5 ＝ 1:4 )を、様々な量のcDNA類(1μg、0.5μg及び0.2μg、それぞれ図4のレーン1、2及び3)とライゲートした。その後、50ngのライゲートされたcDNA類を第二鎖合成に使用し、かつ、アルカリゲル電気泳動で分析した。全ての電気泳動パターン及び取込み率は、同じであり(レーン1-3)、2μgのリンカーは、いずれの異なる量のcDNA類にも効率的にライゲートされたことを示している。リンカーの量が適当でない場合、過剰発現cDNAバンドは、ヘアピン構造を形成することにより2倍のサイズに変化し得る。しかし、第一鎖cDNA及び全ての第二鎖cDNA類は同様のパターン（同じサイズ）を示した。
【０１６１】
実施例４
完全長cDNA類調製のリンカーライゲーション効率
肝臓マウスcDNAライブラリーは、CAPトラッパー技術を用いて上記と同様の方法により調製された。
上記実施例に記載されたリンカー法を用いることにより調製されたものが、完全長cDNAであるか否かは、配列決定段階後、ATG開始コドンの存在を確かめることによりチェックした。実際、開始ATGからの完全コーディング配列を含むそれらのcDNA類は、完全長cDNA類としてみなされた(accepted)。５'配列を、BLASTを用いて公共のヌクレオチドデータベースと比較した。(アルツシュル(Altschul)、S.F.、ギシュ(Gish)、W.、ミラー(Miller)、W.、マイヤーズ(Myers)、E.W.及びリプマン(Lipman)、D.J.、1990、「ベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール(Basic local alignment search tool．)」 J. Mol. Biol. 215:403-410)。
【０１６２】
塩基配列は、キットマニュアルに従いビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット(PE-ABI)及びパーキン・エルマー-アプライド・バイオシステムズ(Perkin Elmer-Applied Biosystems) ABI 3700を用いて決定された。
【０１６３】
使用したシークエンシングプライマーは、５'側M13プライマー(配列番号:5)である。
データは、表1に示されている。ATGの存在(転写が始まる位置)に、対応する位置を記した。例えば、サンプル2.01を参照にすると、ATGコドンのアデノシンは位置63であり、これは、このcDNA配列が62bp 5'-UTRを有することを示している。
【０１６４】
【表１】
0004340779.tif 000002
【０１６５】
これらのデータは、本発明によるリンカー法を用いてcDNA類が効率よく調製され、配列決定されることを示している。
表１のクローン2.05の配列決定は、図6のチャートに示されている。
表１のクローン3.07の配列決定は、図7のチャートに示されている。
【０１６６】
従来のG-テーリング CAP-トラッピング に対するCAPトラッピング‐リンカーの利点
I) G-テールの長さの調節は、何年もの間困難であった。第二鎖プライマーをアニールするために、cDNAクローンは少なくとも11のdG類、平均13-15のdG類を有している。G-テーリング反応は15-30ntに自ら制限されているけれども(Hyone-Myong Eun、1996、エンジモロジー・プライマー・フォー・リコンビナント・DNAテクノロジー(Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology)、477ページ)、約20塩基より長いGストレッチが得られることがしばしばあり、配列決定収率を著しく低減させ、又、最悪の場合失敗を招いていた。一方、短いGストレッチの場合は、長い配列を読むことが困難だった（図5参照）。配列決定中、長いGストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがある。これは、典型的にはGCリッチである5'UTR類との相互作用において問題を起こすことがある。これは、特に、Cap-トラッピングライブラリーの場合のように、完全長cDNA類合成において深刻な問題である。
【０１６７】
本発明によるリンカーを用いた方法は、従来法とは異なり、このような欠点がなく(無作為可変部位がGを含む場合でも、それらは統計的に少数に留まる)、効率の良い配列決定を可能にする(図6及び7)。
II)  G-ストレッチは、機能的研究、例えば、発現クローニングのようにタンパク質発現を必要とする場合、翻訳効率に影響を与えると予測される(キング(King) RW、 ラスチグ(Lustig) KD、スツケンバーグ(Stukenberg) PT、 マクガリ(McGarry) TJ、キルシェナー(Kirschner) MW. エクスプレッション・クローニング。イン・ザ・テスト・チューブ(Expression cloning in the test tube.) サイエンス(Science.)1997；277:973-4)。一方、本発明のリンカー配列は、転写及び翻訳を阻害しない。
【０１６８】
産業上の利用可能性
本発明は、cDNAライブラリーの調製のための新規かつ効率的な方法を提供する。より具体的には、本発明は、cDNAライブラリーの調製方法において利用可能なG-テーリングに代わる新規リンカーを提供し、かつ前記リンカーを用いるcDNAライブラリーの調製方法を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図２】図２は、図１の続きで、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図３】図３はテストｃＤＮＡとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
【図４】図４は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内ｃＤＮＡのリンカーライゲーションｃＤＮＡとリンカーとの比を調べた結果を示す。
【図５】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図６】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図７】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図８】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図９】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図１０】図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１１】図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１２】図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１３】図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１４】図６は、Ｎ6／ＧＮ5リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１５】図７は、ＧＮ5リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１６】図７は、ＧＮ5リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１７】図７は、ＧＮ5リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１８】図７は、ＧＮ5リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１９】図７は、ＧＮ5リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図２０】図８は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。上記のようなベクターへ挿入され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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