(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５及び６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）受容体をコードする核酸を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を、被験化合物およびヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）と接触させる工程；及び
前記被験化合物のうち、前記ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）受容体とヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）の相互作用を減少させる化合物を選別する工程
を含む、ヒスタミン放出を調節できる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
ヒスタミン放出抑制効果を有し、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２２からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
有効成分として、請求項２記載のペプチドを含有するアレルギー治療用組成物。
【請求項４】
前記アレルギーは、喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒冷じん麻疹；及びアトピー性皮膚炎からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
有効成分として、配列番号１４のアミノ酸配列からなるペプチドを含有するドーパミン又はヒスタミンの放出抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（以下、「ＨＲＦ」と称する）の受容体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびこれらをコードする核酸、並びにこれらの用途に関する。より詳細には、本発明は喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮膚炎等のようなアレルギー疾患を誘発するＨＲＦの新規な受容体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびそれらをコードする核酸、並びにそれらの医薬分野における用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アレルギーは、アレルゲンに対して遺伝的に過敏にＩｇＥを生成するか、ＩｇＥの分泌を増加させるインターロイキン−４（ＩＬ−４）とＩｇＥの分泌を減少させるγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の均衡が破れて起こると考えられている。アレルゲンに曝されると、即時反応が起こり、炎症と関連した様々な細胞が集まってきて、その数時間後には好塩基球、好酸球およびリンパ球から、ヒスタミン又は他のサイトカインが分泌されることによる後期反応（「ＬＰＲ」と略記する）が起こる。該ＬＰＲでは好塩基球からヒスタミンが分泌されるが、この時には反応を誘発したアレルゲンがない。そして、アレルギー患者のおよそ半分だけがＬＰＲにまで進展するため、何が好塩基球よりヒスタミンを遊離させているのか、その原因物質が何であるのかということが大きな関心事であった。これまでに、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−１またはランテス（ＲＡＮＴＥＳ）等のようなサイトカインがヒスタミンを分泌させることが知られており、ＩｇＥ−依存性ＬＰＲでは、「ＨＲＦ」と呼ばれる物質だけが、好塩基球よりヒスタミンを分泌させる物質であることが明らかになっている［マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、１９９５］。しかしながら、ＨＲＦがどういう作用機構によって、好塩基球よりヒスタミン分泌を誘導しているかはいまだ知られていない。
【０００３】
ＨＲＦは諸細胞質に存在する、１７２個のアミノ酸よりなる公知のタンパク質である［ボーム（Ｂｏｈｍ）ら、１９８９］。そのうち、Ｃ末端の４５個のアミノ酸は塩基性ドメインを形成しており、この部位は微小管結合タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＭＡＰ−１Ｂと約４６％の相同性を示すことから、微小管結合タンパク質の一種と推定されている。ゴーセ（Ｇａｃｈｅｔ、１９９７）らは、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いてＨＲＦの分布と細胞骨格網分布がある程度一致していることを観察したが、これはＨＲＦが細胞骨格と結合していることを示唆するものである。一方、サンチェス（Ｓａｎ-ｃｈｅｚ、１９９７）らは、ＨＲＦが一般的なＣａ結合タンパク質ファミリーに属していないにもかかわらず、Ｃａ2+と結合することを発表した。また酵母サカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で、ＨＲＦ遺伝子を欠失させても酵母は生存できることも確認した。これらの結果は、ＨＲＦが重複経路（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）を有する遺伝子ファミリーに属することを暗示するものである。
【０００４】
このように、ＨＲＦは細胞質内に存在するタンパク質であるにもかかわらず、マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９９５）らは細胞外で該ＨＲＦを発見した。また、ＨＲＦが細胞外に存在しながらＩｇＥ感作好塩基球を刺激し、ヒスタミンを遊離させていると知られていた。しかしながら、ＩｇＥとＨＲＦの明確な相互作用はいまだ究明されていない（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら（１９９７）は、ＩｇＥが存在していない時にも、抗ＩｇＥ抗体で誘導されるヒスタミンを好塩基球から放出する反応が調節されることを観察し、ＨＲＦがＩｇＥに結合して作用するものではなく、特異な細胞膜受容体に結合して作用することを提示した。したがって、細胞質タンパク質であるＨＲＦがどういう経路で細胞外に出られるのか、どういう作用機構でＨＲＦがＩｇＥ感作好塩基球を刺激しヒスタミンを放出させるのかは大切な問題である。
【０００５】
ＨＲＦは親水性で細胞内に存在するタンパク質であるが、ＬＰＲアレルギー患者の血漿から多量に検出される。このことから、アポトーシスや他の作用機構により細胞外に放出され、好塩基球の細胞膜に存在するＨＲＦ受容体を介してヒスタミンを遊離させるものと推定されていた。
【０００６】
また、ＨＲＦは大部分の組織に存在するため、炎症関連細胞以外の組織細胞においてもその機能を発揮するものと推定される。しかしながら、炎症関連細胞以外の他組織、とりわけ脳組織や神経細胞でのＨＲＦの機能については殆ど報告されていない。但し、最近２−Ｄゲル電気永動およびプロテオミックス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）を用いて、ヒトの脳に存在している各種タンパク質の分析中に、ＨＲＦが見出されており［ランゼン（Ｌａｎｇｅｎ）ら、１９９９］、次いで同一グループの研究陣らによって、ダウン症候群やアルツハイマー病で死亡した患者の脳よりＨＲＦタンパク質が減少していることが観察されたという報告があっただけである［キム（Ｋｉｍ）ら、２００１］。
【０００７】
一方、細胞の安定膜電位形成および浸透性の均衡調節に係わるＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼは神経細胞、とりわけ神経末端またはシナプトゾーム（ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅ）の膜にも高濃度で存在し、神経活性に重要な役割を果たしている。神経細胞膜に存在しているＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの活性が阻害され又は活性が消失すると、色々な神経病理学的変化やアポトーシスが誘発されると報告されている［リーズ（Ｌｅｅｓ）、１９９１］。これは、脳の虚血や酸素欠乏状態でＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの酵素活性に必須的な細胞内ＡＴＰが枯渇するという報告［マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、１９９４；サントス（Ｓａｎｔｏｓ）ら、１９９６］にも関連している。したがって、このような脳疾患状態では該酵素の活性も阻害されるとされている。また、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性が阻害される時、神経伝達物質の放出が増加することが、マウス脳組織切片、シナプトゾームおよび試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養システムにより証明された。なお、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での研究より、虚血または酸素欠乏と似た状態で神経伝達物質の放出が増加し、その結果、シナプス後膜受容体の活性化が神経損傷について重要な過程であると提示された［チェ（Ｃｈｏｉ、１９９０）、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４）］。
【０００８】
脳のＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性は、ドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン、グルタメート等の神経伝達物質だけでなく、インスリン、酸化窒素（ＮＯ）等の内因性物質によっても調節される。脳に、植物から抽出された配糖体のウワバインと構造的に類似した内因性Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害物質である「脳ウワバイン」が存在することが見出された［バドジカウスキー（Ｂｕｄｚｉｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９８］が、ロードリゲスら［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ．ａｌ、１９９２］は、脳の可溶性分画に、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの活性を特異的に阻害し、ウワバインとは構造も特性も異なる内因性ウワバイン様因子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｕａｂａｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）が存在し、これにより高親和性3Ｈ−ウワバイン結合が遮断されて神経伝達物質の放出が誘導され、また、該神経伝達物質によるＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の調節にも関与すると報告した。最近、この物質はエンドバイン（ｅｎｄｏｂａｉｎ）Ｅ［ヴァッタ（ｖａｔｔａ）ら、１９９９］と命名されたが、その実体については依然明らかにされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＨＲＦの新規受容体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびそれらの用途を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ｉ）ＨＲＦが親水性タンパク質であるにもかかわらず、細胞膜を通過できることと、ii）酵母の２ハイブリッド分析（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）によりＨＲＦ受容体がＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの第３細胞質ドメイン（ＣＤ３）であるという驚くべき事実を見出した。なお、細胞外に分泌されたＨＲＦが好塩基球内で、ヒスタミンの分泌を促進する明確な作用機構も本発明者により最初に究明された。
【００１１】
ひいては、上記の研究結果に基づいて、本発明者はｉ）ＨＲＦが細胞内に入る段階を遮断することにより、あるいはii）ＨＲＦがＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼに結合する段階を遮断してＨＲＦのヒスタミン分泌を阻害することにより、アレルギー疾患の予防または治療ができると考えた。その一環として、ドデカマーおよびヘプタマーファージディスプレーライブラリーをスクリーニングし、ＨＲＦに結合するペプチドを研究していたところ、ある特定配列を有するペプチドのヒスタミン分泌阻害率が極めて優れていることを確認し、本発明の完成に至った。
【００１２】
第１の発明は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）１、２および３よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有する、ラットＨＲＦ受容体に関する。
【００１３】
第２の発明は、配列番号４、５および６よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有する、ヒトＨＲＦ受容体に関する。
【００１４】
第３の発明は、前記アミノ酸配列と８５％以上の配列相同性を有するＨＲＦ受容体に関する。
【００１５】
本発明のＨＲＦ受容体は、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ α１、α２、またはα３サブユニットの大型細胞質ループ［ＣＤ３（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ  ３］で有り得る。
【００１６】
第４の発明は、ＨＲＦ受容体をコードする核酸に関する。本発明の核酸は配列番号７、８および９よりなる群から選ばれた塩基配列（ラットＨＲＦ）、または配列番号１０、１１および１２（ヒトＨＲＦ）よりなる群から選ばれた塩基配列を含有し得る。
【００１７】
第５の発明は、前記核酸を含有する組替えベクターに関する。
【００１８】
第６の発明は、前記ベクターによって形質転換された形質転換体に関する。
【００１９】
第７の発明は、前記形質転換体を、被験化合物および前記受容体と相互作用すると知られている化合物と接触させる工程；前記被験化合物のうち、前記受容体と相互作用すると知られている化合物の相互作用を減少させる化合物を選別する工程を含む、ＨＲＦ受容体と相互作用する化合物の同定方法である［競合結合分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）］。
【００２０】
第８の発明は、下記のアミノ酸配列を有するＨＲＦ結合ペプチドに関する：
（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）
｛ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示す｝。
【００２１】
本発明のＨＲＦ結合ペプチドは、好ましくはアミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−（Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）を有するものであり、より好ましくは、アミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−（Ｖ，Ｙ，ＥまたはＡ）−（Ｔ，Ｖ，ＦまたはＡ）−（Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）、例えば、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。さらに好ましくは、アミノ酸配列（ＡまたはＷ）−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−（ＭまたはＡ）、例えば、配列番号１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。最も好ましくは、アミノ酸配列Ｗ−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−Ｍ、例えば、配列番号１４、１７、１８、１９、２０、及び２１よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。
【００２２】
本発明のＨＲＦ結合ペプチドは、構成アミノ酸がＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又はＤＬ−アミノ酸であってもよく、さらに修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸誘導体またはアルキル化、とりわけメチル化アミノ酸を１つ以上含んでもよい。
【００２３】
第９の発明は、前記ＨＲＦ結合ペプチドをコードする核酸に関する。
【００２４】
第１０の発明は、前記核酸を含有する組変えベクターに関する。
【００２５】
第１１の発明は、前記組変えベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００２６】
第１２の発明は、有効成分として前記ＨＲＦ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有するアレルギー、とりわけ、喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症、寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮膚炎の診断、予防または治療用組成物に関する。
【００２７】
第１３の発明は、有効成分としてＩｇＥ−依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）またはそれをコードする核酸を含有する神経伝達物質、例えば、ドーパミン放出誘導剤に関する。
【００２８】
第１４の発明は、有効成分として前記ＨＲＦ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有する神経伝達物質、例えば、ドーパミン放出抑制剤、とりわけ脳卒中、アルツハイマー病またはパーキンソン病等のようなアポトーシス関連神経疾患の診断、予防または治療用組成物に関する。
【００２９】
第１５の発明は、有効成分として前記ＨＲＦ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有するマラリアの診断、予防または治療用組成物に関する。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明者は、まず酵母の２ハイブリッド法を利用し、ＨＲＦがＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ αサブユニットのうち、大型細胞質ループ（ＣＤ３）に結合することを始めて見出した。なお、共同免疫沈澱法（ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いて酵母細胞および哺乳細胞で、ＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ αサブユニットのＣＤ３が相互作用することを確認し、その結合親和度を測定した。さらに、ＨＲＦの受容体がＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ αサブユニットのＣＤ３であることを共焦点顕微鏡で確認した。
【００３２】
また、ＨＲＦが水溶性タンパクであるにもかかわらず、細胞内に侵入できることを共焦点顕微鏡とウエスタンブロッティング法で立証し、該ＨＲＦが細胞内のＮａ+およびＣａ2+濃度を増加させ、この際、Ｎａ／Ｃａ交換体により細胞外のＣａ源が消耗されることを明らかにした。また、ＨＲＦがＩｇＥの存在下で、反応性酸素源（ＲＯＳ）を生成し、その結果細胞内により多くのＣａ2+が流入されることを明らかにした。
【００３３】
以上の結果より、好塩基球からのヒスタミン放出を、ＨＲＦが促進する作用機構が明らかにされた。即ち、細胞外に分泌されたＨＲＦが好塩基球内に入り込み、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ αサブユニット中の第３細胞質ドメイン（ＣＤ３）と結合し、ウワバインの様に、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの作用を阻害し、その結果、細胞内のＮａ+濃度は増加し、次いでＮａ／Ｃａ交換体が活性化されることによって細胞内のＣａ2+濃度も増加する。また、ＩｇＥが存在すると、ＲＯＳの生成により細胞内のＣａ2+が一層増加するため、結局ヒスタミン分泌が促進される。以上の結果は、ＨＲＦの受容体がこのＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼのＣＤ３であり、ＨＲＦがＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの細胞質リプレッサーであることを意味する。
【００３４】
したがって、本発明者は、ＨＲＦ受容体の実体を始めて究明し、これにより、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するＨＲＦ受容体を提供できる。ＨＲＦ受容体は夫々ラットから分離されたＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ α１、α２およびα３サブユニットのＣＤ３に属するものであり、該当技術分野で通常の知識を有した者であれば誰でもヒトＨＲＦ受容体を容易に同定することができる。従って、ヒトＨＲＦ受容体も同様に本発明の範囲内に属する。ヒトＨＲＦ受容体は、配列番号４（α１）、５（α２）または６（α３）に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３５】
ラットのＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ α１ ＣＤ３とα２ ＣＤ３との間での配列相同性は８７．６％であり、α２ ＣＤ３とα３ ＣＤ３との間での配列相同性は８９．４％であった。一方、ラットとヒトの間でのＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼα ＣＤ３の配列相同性は、α１同士で９７．５％、α２同士で９９．３％、α３同士で９８．８％を示した（図１８〜２１参照）。従って、本発明は前記配列番号に記載の夫々のアミノ酸配列と８５％以上の配列相同性を有するＨＲＦ受容体を提供する。
【００３６】
また、本発明はＨＲＦ受容体をコードする核酸、例えば、配列番号７（ラットα１）、配列番号８（ラットα２）および配列番号９（ラットα３）のいずれか一つ、又は配列番号１０（ヒトα１）、配列番号１１（ヒトα２）および配列番号１２（ヒトα３）のいずれか一つに記載の塩基配列を有する核酸を提供する。同時に、本発明は前記核酸を含有する組換えベクターおよび該ベクターで形質転換された形質転換体をも提供する。
【００３７】
なお、本発明は前記細胞を競合結合分析に使用することを含む、ＨＲＦ受容体と相互作用する化合物を同定する方法を提供する。本発明の競合結合分析では、ＨＲＦ受容体及びＨＲＦタンパクをコードする核酸を含有した組換えベクターで形質転換された細胞を、被験化合物および前記受容体と相互作用すると知られている化合物と接触させ、前記被験化合物の中より、前記受容体と相互作用すると知られている化合物の相互作用を減少させる化合物を選別する。以上より、最終的には細胞内でヒスタミン分泌が効果的に調節できる新規な化合物をスクリーニングすることができる。
【００３８】
また、本発明はＨＲＦに特異的に高親和度で結合し、ヒスタミンの分泌を阻害するペプチドを提供する。一例として、本発明のＨＲＦ結合ペプチドはアミノ酸配列を有する。
（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）
｛ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示す｝
ＨＲＦ結合ペプチドのアミノ酸配列の例は下記のものを含有する。
【００３９】
（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−（Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）；
好ましくは、（Ａ，ＬまたはＷ）−（Ｖ，Ｙ，ＥまたはＡ）−（Ｔ，Ｖ，ＦまたはＡ）−（Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）であり、例えば、配列番号１３〜２２が挙げられる；
より好ましくは、（ＡまたはＷ）−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−（ＭまたはＡ）であり、例えば、配列番号１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２が挙げられる；
最も好ましくは、Ｗ−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−Ｍであり，例えば、配列番号１４、１７、１８、１９、２０および２１が挙げられる。
【００４０】
本発明者は、前記ペプチドをファージディスプレーライブラリースクリーニングを通じて得、次いで合成ペプチドを用いて実験を繰返し行った。本発明のペプチドは化学的に合成されるか遺伝子組変え技術を用いて製造することができる。好ましくは、本発明のぺプチドを構成するドメインを生体内に存在するタンパク質若しくはその一部により製造してもよい。他の方法としては、本発明のペプチドは、それをコードする塩基配列を有するＤＮＡを挿入した発現ベクターを用いて組変えＤＮＡ技術で製造してもよい。
【００４１】
前記ベクターは生体内で標的にできるように製造され、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により適当な宿主細胞で形質転換され、適当な条件下で発現されるように製造される。また、本発明のアミノ酸配列を包む融合タンパク質を用いて本発明のペプチドを製造することもできる。
【００４２】
一方、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、当業界で公知の通常の技術により変更してもよい。例えば、本発明のペプチドは、アミノ酸の数を変えることによって変更することができる。また、本発明のペプチドの活性を低下させない範囲内で、結合に直接的に関与、または保存されるべき残基を除いた特定残基成分の置換、或いはその順番を換えることにより変更され得る。天然に存在するＬ−α−アミノ酸に変更する場合だけでなく、β、γ、δ−アミノ酸は勿論、Ｄ−α−アミノ酸誘導体に変更することもできる。
【００４３】
アミノ酸を１つだけ置換したペプチドを用いて、静電気力や親水性が結合に及ぼす影響を調べた結果、典型的には、正に帯電されるアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）や負に帯電されるアミノ酸（例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）が置換される場合に、その敏感度が変化することが分かる。このように、置換または付加される残基の数と形態は、必須的な結合点との間に必要な空間、親水性または疎水性のように要求される機能により適宜決定される。このような置換により、本発明のペプチドの目的タンパク質に対する親和度をより増加させることができる。
【００４４】
置換により、機能においても重要な変化が見られる。置換される残基として何を選択するかということは、目的の位置に存在する分子の電気度、疎水性、側鎖の変化またはらせん構造の変化等、ペプチドの基本骨格を維持するのに大きな影響を及ぼす。一般的に、ペプチドの性質に重大な変化をもたらすのは、セリンのような親水性残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、アラニンのような疎水性残基で置換される場合；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような電気的に陽性の残基がグルタミン酸やアスパラギン酸のような電気的に陰性の残基で置換される場合；グリシンのような側鎖を持たないアミノ酸が嵩高い側鎖の残基で置換される場合である。
【００４５】
上述したことを考慮すれば、前記特定ペプチドを、該ペプチドのＨＲＦに対する結合力およびそれに従うヒスタミン分泌阻害活性を維持又は増加する範囲、すなわち、ＨＲＦに対する結合力およびそれに従うヒスタミン分泌阻害活性を損傷しない範囲内で、当業者は通常の技術を利用して変更できる。従って、かかる範囲で変更されたものは、本発明の範囲内に属する。
【００４６】
本発明のペプチドは、ＨＲＦが関与する全てのアレルギー疾患、例えば、喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー;アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮膚炎の診断、予防または治療に有用である。前記のようなアレルギー疾患をわずらっている患者の血液では、例外なくＨＲＦが検出されるので（図２２参照）、前記アレルギー疾患の診断、予防または治療に本発明のペプチドが有効であることは当業者に自明なことである。
【００４７】
従って、本発明は有効成分として前記ペプチドを含有する、アレルギーの予防または治療用組成物を提供する。前記ペプチドの有効量は、体重１ｋｇ当り約０．１〜５ｍｇ、好ましくは０．３〜２．５ｍｇであってもよい。本発明の組成物は、溶液またはミセルの形で、ヒト又は動物に直接注入されるか製剤化して使用できる。本発明の組成物は非経口または局所投与により人体に適用してもよいが、静脈注射、皮下注射、内皮注射、筋肉注射等の注射により投与することが好ましい。このために、本発明のペプチドを薬剤学的に許容可能な担体に懸濁、または溶解させるが、このとき、とりわけ水溶性担体を使用することが好ましい。
【００４８】
また、本発明のペプチドはアレルギー診断キットにも効果的に用いることができる。よって、ＨＲＦが結合するペプチド（ＨＲＦ結合ペプチド）と抗ＨＲＦモノクローナル抗体を含む診断キットを用いた試験で、血液反応で陽性と判定されると、アレルゲンがなくてもアレルギーを起こし得る疾患を保有していると判断される。即ち、ＬＰＲアレルギー患者の血液にはＨＲＦが浮遊しているため、血液検査の際、本キットを使用すれば、血液中でのＨＲＦの存在有無が分かり、この結果ＬＰＲ患者であるかどうかが判断できる。本発明では、容器の底にＨＲＦ結合ペプチドを付着させた後、血液サンプルを反応させ、さらに複合抗ＨＲＦモノクローナル抗体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＲＦ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を加える方法を用いてもよい。
【００４９】
さらに、本発明者らは、ＨＲＦが神経細胞内でＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼを阻害することにより、神経伝達物質の放出を増加させるか否かを次の様にして調べた。すなわち、細胞内の神経伝達物質の分泌顆粒を含有していて、特にカテコールアミンの放出調節の研究に適しているとされている神経細胞株のＰＣ１２（Ａｂｕ−Ｒａｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９９）の培養液にＨＲＦを加え、[3Ｈ]−標識ドーパミンの放出変化を測定した。ＰＣ１２細胞でドーパミンの基底およびＫ+濃度の増加により誘導される脱分極時のＫ+興奮性放出（Ｋ+−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）がＨＲＦの濃度に依存して増加することを確認した。また、前記ＨＲＦ結合ペプチドが神経細胞においてもＨＲＦにより誘導された神経伝達物質の放出を効果的に遮断することが明らかになった。
【００５０】
以上述べたように、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の細胞内調節に関与するＨＲＦは、神経細胞においても神経活性に重要な役割を果たすＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼを阻害して神経伝達物質の放出を促進させる。従って、ＨＲＦは、神経細胞および脳より現われる病体生理学的効果に重要な役割を演じると確信される。こうした理由から、ＨＲＦの神経伝達物質の放出増加作用を遮断できるＨＲＦ結合ペプチドは脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病等のような種々のアポトーシスに関連する神経疾患の診断、予防または治療剤として有用である。
【００５１】
従って、本発明は有効成分としてＨＲＦ結合タンパク質を含有する脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病等のアポトーシス関連性神経疾患の診断、予防または治療用組成物を提供する。この場合、前記の投与経路と投与量を適用してもよい。
【００５２】
一方、ＨＲＦは、翻訳により調節される腫瘍タンパク質とも言われており、ビスティバン（Ｂｈｉｓｕｔｔｈｉｂｈａｎ）ら（１９９８）によって、すでに抗マラリア剤のアルテミシニンがマラリアタンパク質のＨＲＦに結合し作用することが明らかにされている。従って、本発明のペプチドもＨＲＦとの結合親和性を有するため、アルテミシニンと同様に、マラリアの予防および治療に用いられることができる。この場合、前記の投与経路と投与量を適用してもよい。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げより詳しく説明するが、これは本発明の理解を深めるだけであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００５４】
実施例 １：酵母の２ハイブリッド法を利用したＨＲＦのＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ大型細胞質ループに対する結合実験
ラットの骨格筋より全細胞質ＲＮＡを抽出した後、ｐＪＧ４−５ベクターを用いて、酵母の２ハイブリッド分析用のｃＤＮＡライブラリーを製作した。Ｎａ+、Ｋ+−ＡＰＴａｓｅ α２サブユニットを用いてＣＤ３部位をＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（ｐＥＧ２０２ベクター）に挿入した後、これをスクリーニング用のバイト（ｂａｉｔ）として使用した。リポーター遺伝子を活性化させた陽性クローンを選択し、塩基配列分析、制限酵素マッピングとＢＬＡＳＴサーチを利用して配列分析を行った。これらのうち、一つのクローンがＩｇＥ依存性ＨＲＦの配列と完全に一致した。
【００５５】
Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ α１およびα２サブユニットのＣＤ３部位をｐＥＧ２０２ベクターに挿入した後、イソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）による相互作用を調べた。前記製造したすべての作製物で、ＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺリポーター遺伝子を含有する酵母細胞（ＥＧＹ４８／ｐＳＨ１８−３４）を形質転換した後、選択培地プレートで増殖させた。
【００５６】
結果を図１に示す。図１より、ＨＲＦの受容体がＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループ（ＣＤ３）であることを確認した。
【００５７】
実施例 ２：共同免疫沈澱法を用いた酵母およびＣＯＳ−７細胞における、ＨＲＦと（Ｎａ，Ｋ）ＡＴＰアーゼの相互作用の実験
グルコシルＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−およびガラクトシルＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−培地で、実施例１で調製した前記作製物で形質転換された酵母細胞を増殖させた後、３０００×ｇで５分間遠心分離を行い細胞を集めた。集められた細胞を再び酵母溶菌緩衝液（ｙｅａｓｔ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＺｎＣｌ2、プロテアーゼ阻害剤カクテル）で懸濁させた後、グラスビーズに加え、攪拌した。この混合物に、ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＮＰ4Ｏ，０．５％ デオキシコレートナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を加えた後、１０,０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。
【００５８】
以上により製造された細胞抽出物にＩｇＧ ｓｏｒｂ（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｉｎｃ）を加えた後、４℃で３０分間培養した後、１０,０００×ｇで５分間遠心した。この混合物にまた親和性の精製抗−ＨＡ １２ＣＡ５モノクローナル抗体を加えた後、４℃で３時間、または一晩培養した。生成された免疫複合体に５０％タンパク質Ａアガロース溶液（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）を加え、４℃で４時間培養した。次いで５秒間遠心してから、ペレットをＲＩＰＡ緩衝液と洗浄緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、０．１％ ＮＰ4Ｏ）で夫々洗浄した。
【００５９】
ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。相互作用するタンパク質を調べるため、ウサギポリクロナールＬｅｘＡ抗体を使用した。その結果を図２に示す。図２よりＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループが相互作用することを確認した。
【００６０】
次いで、哺乳細胞での相互作用を調べるために、ＣＯＳ−７細胞をＤＭＥＭ+培地（１０％牛胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌストレプトマイシン含有のＤｕｌｂｅｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ 培地）で増殖させた。ｐＣＤＮＡｎｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した、Ｎ末端ＨＡ−タッグ（ｔａｇ）のＨＲＦ作製物をトランスフェクションさせた。ＣＯＳ−７細胞抽出物の免疫沈澱をフロルキエヴィツ（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ）ら（１９９８）の方法により行い、相互作用するタンパク質を調べるため、ウサギポリクローナル抗Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ抗体を使用した。その結果を図３に示す。図３より、哺乳細胞のＣＯＳ−７細胞においても、ＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループが相互作用することを確認した。
【００６１】
実施例３：バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析を用いたＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼとＨＲＦの結合親和度の測定実験
ＣＭ５センサーチップに、組換えラットＨＲＦをｐＨ４．０、１０ｍＭアセテートに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で固定させた後、ＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を流し補正した。この混合液に５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と２００ｍＭ ＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド］を流し活性化させた後、Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼを流し結合親和度を測定した。その結果を図４に示した。図４中、Ｋｄの値は８．５×１０-7Ｍである。
【００６２】
実施例４：共焦点顕微鏡を用いたＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼとＨＲＦの相互作用の実験
ＣＯＳ−７細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含有する３．７％ホルムアルデヒドで10分間固定させた後、０．１％サポニンを含有するマウスモノクローナル抗ＨＲＦ抗体（１：１００）（梨花女子大学抗体センター）および／またはウサギポリクローナル抗Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ抗体（１：１００）を1時間、室温で加え染色した。次いで、抗マウス−ＦＩＴＣ（１：１００）及び２次抗体の抗ウサギ−ローダミン抗体（１：１００）と３０分間培養した。その後、抗漂白剤溶液を加えてから、レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳＮＴ ｓｙｓｔｅｍ）で観察した。その結果を図５に示した。
【００６３】
実施例５：ＨＲＦの細胞膜透過能の測定実験
ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅したラットＨＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）をクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ内で過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた。発現された組換えタンパク質をＨｉｓ−結合Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い精製し、ＣＯＳ−７細胞培養液に加えた後、ＣＯＳ−７細胞を、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含有する３．７％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。その後、０．１％サポニンを含有する抗Ｈｉｓモノクロナール抗体（１：１００）を１時間、室温で加え染色した。次いで、２次抗体の抗マウス−ＦＩＴＣ（１：１００）とともに３０分間培養した。その後、抗漂白剤溶液を加えレーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳＮＴ ｓｙｓｔｅｍ）で観察した。
【００６４】
また、１００ｍｍ培養プレートで培養したＣＯＳ−７細胞を前記の方法で処理した後、夫々細胞質と細胞膜部分に分離し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
【００６５】
その結果を図６（ａ）および図６（ｂ）に示す。図６より、ＨＲＦを加えて１分後にＨＲＦが細胞内で検出されることを確認した。
【００６６】
実施例６：ＨＲＦが細胞内のＮａ+濃度に及ぼす影響の測定実験
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を３．０×１０5〜１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４ウエルプレートにローディングした後、３７℃で１８時間培養した。各ウエルに、最終濃度が８Ｍになるように、Ｈａｍｓ Ｆ−１２培地（フェノールレッドまたは血清欠乏２ｍＭ炭酸水素ナトリウムおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）と染料のナトリウムグリーンテトラアセテート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を混合し、細胞にローディングした（Ａｍｏｒｉｎｏ ａｎｄ Ｆｏｘ、１９９５）。その後、ラットＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を０．２ｇ／ｍｌで４５〜６０分間感作させた後、約２０〜６０分間、室温で培養してからＦ−１２培地で３回洗浄した。次いで、ヒスタミン放出緩衝液に含まれたＨＲＦ（１０〜２０ｇ／ｍｌ）を加えた後、４８５／５３０ｎｍで１５分間、マイクロタイターリーダー（ＦＬ６００、Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で蛍光強度を測定した。その際、目盛り用に、Ｓｉｇｍａ社のグラミシジンＤ（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ Ｄ）を用いて、Ｎａ+とＫ+を適正濃度に混合した溶液を測定した（Ａｍｏｒｉｎｏ ａｎｄ Ｆｏｘ，１９９５）。その結果を図７に示す。図７より、ＨＲＦが細胞内Ｎａ+濃度を増加させることを確認した。
【００６７】
実施例７：ＨＲＦによるＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の阻害実験
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を前記実施例６と同様の方法で培養および感作させた後、クレプス−リンガー緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ；ＫＲＰ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１ｍＭ ＭｇＳＯ4、１．４ｍＭ ＣａＣｌ2、２．５ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、細胞を３７℃で１５分間培養した後、１ｍＭウワバインを含有した０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有のＫＲＰ緩衝液を加えた。86Ｒｂ+（０．５Ｃｉ／ｍｌ，ＮＥＮ）をトレーサーとして用いて５〜１０分間培養し、１０〜２０ｇ／ｍｌのＨＲＦを加えた後、５、１０、１５分後のＫ+の消費を夫々測定した。その結果を図８に示す。図８より、ＨＲＦがＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの活性度を、夫々１０．８％、４０．４％、５０．７％に減少させることを確認した。
【００６８】
実施例８：ＨＲＦが細胞内Ｃａ2+濃度に及ぼす影響の測定実験
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を前記実施例６と同様の方法で培養した後、クレプス−リンガー緩衝液（ＫＲＰ，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，１．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ4，６ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、２μＭ Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と０．２％ＢＳＡを含有したＫＲＨ緩衝液で３０分間培養した後、ＤＭＥＭ完全培地で１０〜３０分間補正した。次いで、ＫＲＨ緩衝液で洗浄し、前記実施例６に記載の方法で感作させた。感作後、ＨＲＦ、抗ＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、各阻害剤をヒスタミン放出緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ グルコース、０．１％ＢＳＡ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）と共にカルシウムイオンの存在下又は不在下で処理した。なお、４８８／５１５ｎｍにおけるｆｌｕｏ−３ＡＭの蛍光強度を、レーザースキャーニング共焦点顕微鏡で測定し、その結果を図９（ａ）に示した。
【００６９】
また、細胞内のＲＯＳを２′，７′−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を用いてレーザースキャーニング共焦点顕微鏡で測定した。即ち、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＩｇＥの存在または不在下で、完全ＤＭＥＭ培地で１時間培養した。次いで、クレプス−リンガー溶液で洗浄した後、５μＭ ＤＣＦＨ−ＤＡを含有したクレプス−リンガー溶液中で５分間培養した。その後、４８８／５１５ｎｍで蛍光をスキャーニングしながら観察した。その結果を図９（ｂ）および図９（ｃ）に示した。
【００７０】
以上の結果より、ＨＲＦにより細胞内のＣａ2+濃度が増加し、その際、Ｎａ／Ｃａ交換体により細胞外のＣａ2+が消費され（図９（ａ）参照）、ＩｇＥの存在下ではＲＯＳが生成され、それにより細胞内Ｃａ2+が一層増加する（図９（ｂ）および図９（ｃ）参照）ことを確認した。
【００７１】
実施例９：ＨＲＦによるＣａ2+の増加とヒスタミン分泌との関係の確認実験
ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲで増幅したラットＨＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）をクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉで過発現させた。発現された組換えタンパク質をＨｉｓ−結合Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて精製し、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を刺激するのに使用した。ＲＢＬ−２Ｈ３を１×１０6細胞を２４−ウエルプレート上で増殖させた後、ラットＩｇＥ抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）で４５〜６０分間感作させ、組換えＨＲＦタンパク質２０μｇ／ｍｌと前記阻害剤で夫々処理した。以上より得られたサンプルを、ＲＩＡ−分析キット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，フランス）を用いてアシル化ヒスタミンに調製した後、125Ｉ−アシル化ヒスタミン及びモノクローナル抗体に競合的に結合させた。その後、該サンプルを再びγ−計数器で測定し、その結果を図１０に示した。図１０より、ＩｇＥの存在下、細胞内Ｃａ2+濃度が増加すると、ＨＲＦによりヒスタミンが放出されることを確認した。
【００７２】
実施例１０：ＨＲＦに結合するファージディスプレーペプチドクローンの分離ＨＲＦをウエルに固定した後、ＨＲＦ−ヘプタマーランダムリピートペプチドライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）から、親和性に基づくスクリーニングによりＨＲＦに結合できるペプチドを分離した。
【００７３】
すなわち、コーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解したＨＲＦ５０μｌずつをポリスチレンマイクロタイタープレートに加え、４℃で一晩コーティングした後、ＢＳＡで非特異的結合を遮断した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で６回洗浄してから、ファージディスプレーペプチドライブラリーの原液１０μｌを３％ＢＳＡ／ＴＢＳ４０μｌで希釈した溶液を加え、静置した。５分間放置後、ＴＢＳＴを用いて、次の要領で洗浄（ｐａｎｎｉｎｇ）した。第一洗浄では一回、第2および第３洗浄では５回、第４洗浄では１０回行った。 次いで、グリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）５０μｌを加えて５分間放置した後、ファージを溶出してから、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）８μｌで中和した。
【００７４】
溶出してきたファージ溶液を２０ｍｌのＥＲ２５３７培養液（ＯＤ600＝０．５〜１）に添加し、３７℃の攪拌インキュベータ（２００ｒｐｍ）上で２時間培養した後、ＳＢ培地１００ｍｌを加え２５０ｒｐｍで一晩培養した。この培養液を１０,０００ｒｐｍ（４℃）で５分間遠心して得られた上清液１００ｍｌに、３０ｍｌの５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ［２０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）、１５％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］を加え５分間溶解させてから氷中に３０分間静置した。次いで、１０,０００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心し、その上清液をすべて取り除き、ペレットを３％ＢＳＡ／ＴＢＳ １ｍｌに浮遊させた。その後、１４,０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清液を次の洗浄（ｐａｎｎｉｎｇ）に使用した。親和性による精製とファージクローニングを４回繰り返し、溶出ファージの滴定プレートより、夫々のファージクローンを得た。ＥＬＩＳＡ分析で特異的親和度を示したファージクローンのみについて配列分析し、そのアミノ酸配列を同定した。 図１１に前記ＨＲＦ結合ペプチドをコードする遺伝子の分離過程を概略的に示した。また、ＨＲＦに対して優勢的な結合を示すファージディスプレーペプチドを下記の表１に示す。
【００７５】
【表１】
0004295449.tif 000002
【００７６】
実施例１１：ファージＥＬＩＳＡ分析
下記の通り、実施例１０より得られたファージの結合親和度を、以下の様にしてＥＬＩＳＡで比較した。
【００７７】
即ち、ＳＢ培地で培養したＥＲ２５３７培養液（ＯＤ600＝０．５〜１）１ｍｌずつ分取した後、各ファージプラークを移し、３７℃インキュベータ（２５０ｒｐｍ）で５時間培養した。各培養液を１００μｌずつ９００μｌのＳＢ培地に加え一晩培養した後、１４,０００ｒｐｍで５分間、２回続けて遠心して得られた上清液をＥＬＩＳＡ分析のために使用した。
【００７８】
分離した各ファージ溶液を同量の６％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した後、該希釈溶液を５０ｍｌずつ、ＨＲＦまたはＢＳＡ（対照群）でコーティングしたウエルに加え２時間静置した。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄してから、３％ＢＳＡ／ＰＢＳに、１：５,０００の割合で希釈したＨＲＰ−複合抗Ｍ１３抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−Ｍ１３ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１００ｍｌずつ加え１時間静置した。次いで、ＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで１回洗浄した後、パーオキシダーゼ基質溶液を１００μｌずつ加え、その発色度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。その結果を図１２に示す。、図１２より、本発明のファージｐｈ１、ｐｈ２およびｐｈ４、とりわけｐｈ２およびｐｈ４がＨＲＦに特異的に結合することを確認した。
【００７９】
実施例１２：濃度によるＨＲＦとファージクローンの結合親和性の測定
ＨＲＦの濃度を２０μｇ／ｍｌから１／５倍に連続希釈した後（即ち、夫々２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍｌ）、各希釈液を５０μｌずつとりプラスチックウエルに固定した。また、このウエルに前記同様に、１／５倍で連続希釈したファージｐｈ２溶液（原液の１／２、１／１０、１／５０、１／２５０、１／１２５０）を加え、ＥＬＩＳＡ分析を行い、４０５ｎｍでその発色度を測定した。その結果を図１３に示す。図１３より本発明のファージｐｈ２クローンが、ＨＲＦを０．４，０．０８，０．０１６，０．０３２μｇ／ｍｌまで希釈した場合でも、ＨＲＦと特異的な結合親和性を維持していることを確認した。
【００８０】
実施例１３：競争結合分析
ａ）  ＥＬＩＳＡ分析を通じて、特異的親和度を示すファージクローン（ｐｈ２およびｐｈ４）の配列を分析し、その配列を確認した後、ヘプタマーペプチド（ｐ２およびｐ４）を製造した。なお、陰性対照群として、ランダムペプチド（ｒａｎ，アミノ酸配列：ＬＭＥＧＣＲＡ）を合成した。ＨＲＦでコーティングしたウエルに、１,０００ｎＭ ペプチド溶液を６％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した溶液（１／１０倍で連続希釈；１,０００、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１ ｎＭ）を３０μｌずづ加え室温で３０分間静置した後、各ウエルに１／２５倍で希釈したファージ溶液（原液）を加え、さらに２時間静置した。その後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄してから、各ウエルにＨＲＰ−複合抗Ｍ１３抗体を１００μｌずつ加え１時間静置した。再び、ＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで１回洗浄した後、各ウエルにパーオキシダーゼ基質溶液を１００μｌずつ加え、その発色度より競合の有無を確認した。その結果を図１４（ａ）および１４（ｂ）に示す。図１４（ａ）及び図１４（ｂ）より、合成ペプチドｐ２およびｐ４は、ＨＲＦとの結合において、夫々ファージクローンｐｈ２およびｐｈ４と競合していることを確認した。
【００８１】
ｂ）  ｐ１、ｐ２およびｐ４がＨＲＦの同一部位に結合するか否かを試験するため、前記ａ）と実質的に同一の方法により、各ウエルをＨＲＦでコーティングし、ｐｈ２に対するｐ１、ｐ２およびｐ４の競争結合の分析を行った。その結果を図１４（ｃ）に示す。図１４（ｃ）より、ｐ１、ｐ１およびｐ４がすべてＨＲＦの同一部位に結合することを確認した。
【００８２】
実施例１４：ＨＲＦ結合ペプチドのアミノ酸配列変位
本発明のヘプタマーペプチドのＨＲＦ結合親和度に関与する残基を確認するため、ｐ２のアミノ酸配列を１個ずつアラニン（Ａ）で置換した。但し、ｍ５の場合のみリジン（Ｋ）で置換した（表２参照）。
【００８３】
【表２】
0004295449.tif 000003
【００８４】
前記ペプチドのＨＲＦ結合親和度を、実施例１１と実質的に同一の方法で測定した。その結果を図１５に示す。図１５より、ＨＲＦ結合親和度が、ｐ２、ｍ６＞ｍ７＞ｍ３＞ｍ２＞ｍ５＞ｍ１＞ｍ４であることを確認した。
【００８５】
実施例１５：ヒスタミン分泌の測定
ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲで増幅したラットＨＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）をクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉで過発現させた。発現された再組換えタンパク質をＨｉｓ−結合Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製し、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を刺激するのに使用した。ＲＢＬ−２Ｈ３を２４−ウエルで増殖（１×１０6細胞）させた後、ラットＩｇＥ抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）で４５〜６０分間感作した後、２０μｇ／ｍｌの組換えタンパク質で処理した（陽性対照群）。 その後、前記細胞にヘプタマーペプチドｐ１およびｐ２を容量依存的方法で処理した。また、組換えＨＲＦタンパク質とペプチドｐ１、ｐ２、ｐ４およびｍ１〜ｍ７を、夫々ＨＲＦと同様に２０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。
【００８６】
得られたサンプルを、ＲＩＡ−分析キット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，フランス）を用いて、アシル化ヒスタミンに調製した後、125Ｉ−アシル化ヒスタミンと共にモノクローナル抗体に競合結合させた。このサンプルを再びγ−計数器で測定し、その結果を図１６および図１７に示した。図１６から、配列番号１４のペプチド（ｐ２）をＲＢＬ−２Ｈ３細胞に加えた場合、０．０１μｇ／ｍｌ以上の濃度より、配列１４のペプチド（ｐ２）がＨＲＦによるヒスタミンの放出を阻害することがわかった。また、図１７に示された通り、ｐ１、ｐ２、ｐ４およびｍ１〜ｍ７を２０μｇ／ｍｌ加えた際、ｍ２＞ｍ５＞ｍ４＞ｐ２＞ｍ３＞ｐ１=ｐ４＞ｍ１＞ｍ７の順でＨＲＦによるヒスタミン分泌を阻害し、ｍ６の場合は、逆にヒスタミン分泌を増加させていることを確認した。
【００８７】
実施例１６：神経伝達物質の放出に対するＨＲＦの影響の分析
ＨＲＦが酵素Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの抑制物質として作用し、神経伝達物質の放出を増加させることが可能であるかを調べた。まず、ＰＣ１２細胞（Ａｂｕ−Ｒａｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９９）の培養液にＨＲＦを加え、基底状態およびＫ+−脱分極状態で誘導される［3Ｈ］−標識ドーパミンの放出変化を測定した。ＰＣ１２細胞としては、パッセージナンバー５〜１５より得られた細胞を用い、該細胞を１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で５％ＣＯ2の供給下、３７℃で培養した。
【００８８】
［3Ｈ］−ドーパミンの放出を測定するため、実験一日前、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた１２ウエルプレートに、細胞（１×１０―6細胞／ウエル）を培養し、［3Ｈ］−ドーパミン（０．５μＣｉ／ｍｌ）が含まれた新たな培地にローディングし、さらに３７℃で３時間培養した。各ウエルをＰＢＳ（１×）１ｍｌで２〜３回洗浄した後、クレプスリンガー（ＫＲ）緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１．２mM ＫＨ2ＰＯ4、６ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＮａＨＣＯ3）にアスコルビン酸（０．２ｍｇ／ｍｌ）、パルジリン（０．６ｍｇ／ｍｌ）およびデスピラミン（ｄｅｓｐｉｒａｍｉｎｅ）（２μＭ）を加え、該混合液をＨＲＦと共に１ｍｌずつローディングした後、３７℃で２０分間反応させた。脱分極状態での放出は５０ｍＭのＫＣｌが含有されたＫＲ緩衝液で測定した。また、Ｃａ2+欠乏培地はＣａＣｌ2を取り除き、０．５ｍＭのＥＧＴＡを加えて調製したＫＲ緩衝液で測定した。
【００８９】
反応の終了後、培養液を４℃、１,０００×ｇで１０分間遠心し、放出されたドーパミンの放射能を測定し、細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで可溶化した後、組織内の放射能を測定した。ドーパミンの放出率（％）は、下式により計算した。
［上精液の放射能／（上精液の放射能＋組織内の放射能）×１００］
【００９０】
結果を図２３に示す。図２３より、神経類似細胞のＰＣ１２細胞で、ドーパミンの基底放出が、ＨＲＦの濃度に依存して増加することがわかる。すなわち、１０μｇのＨＲＦで処理した場合には、細胞外のＫ+濃度の増加によって誘導される脱分極時の興奮性放出と同等程度にドーパミンの放出を促進させた。また、３０μｇ以上のＨＲＦで処理した場合には、ドーパミンの放出が急激に増加し、細胞が培養容器の底に付着せず、死滅することが観察された。一方、ＨＲＦは高濃度の細胞外のＫ+により誘導される脱分極時の興奮性放出も濃度依存的に増加させ、ＨＲＦ濃度に従ったドーパミンの放出増加反応が基底放出増加反応と比べて、左側にシフトする様子を示したが、ドーパミン放出の増加の程度は、ＨＲＦによる基底放出増加の度合と比べ相対的に小さかった。
【００９１】
実施例１７：ＨＲＦ結合ペプチドのＨＲＦによる神経伝達物質放出抑制実験
前記ＨＲＦによるヒスタミンの放出を遮断するペプチドが、神経細胞においてもＨＲＦにより誘導された神経伝達物質の放出を遮断するか否かを確認するために、実施例１６と実質的に同様の方法で、ＨＲＦにより増加したドーパミンの放出に対する配列番号１４のペプチドｐ２の影響を分析した。
【００９２】
その結果を図２４に示す。図２４から、配列番号１４のペプチド６０μｇ／ｍｌ存在下では、ＨＲＦ１５μｇ／ｍｌにより約１１０％程度増加したドーパミンの放出が、約６０％程度抑制されたことがわかる。従って、前記ＨＲＦ結合ペプチドは、神経細胞内で、ＨＲＦにより増加された神経伝達物質の放出を効果的に遮断することを確認できた。
【００９３】
【発明の効果】
本発明により、ＨＲＦ受容体の実体とＨＲＦの好塩基球におけるヒスタミン放出を促進する作用機構を始めて究明できた。したがって、本発明のＨＲＦの受容体の作用機構と優れた薬物動態学的安定性を示すＨＲＦ結合ペプチドを用い、細胞内でのヒスタミン分泌を効果的に阻害することにより、動物を含めてヒトの喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮膚炎等のようなアレルギー疾患を予防、治療および診断することができる。
【００９４】
また、Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の細胞内調節に関与するＨＲＦは、神経細胞においても神経活性に大切な役割を果たすＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼを抑制することにより神経伝達物質の放出を促進させ、その結果、神経細胞および脳で現れる病態生理学的効果に大きい働きをすると信じられる。したがって、ＨＲＦによる神経伝達物質の放出増加作用を遮断する本発明のペプチドは、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病等の様々なアポトーシス関連神経疾患の診断、予防および治療剤として有用に用いられる。
【００９５】
さらに、ＨＲＦ受容体またはＨＲＦ結合ペプチドは、マラリアの診断、予防及び治療にも用いることができる。さらにまた、ＨＲＦ受容体やＨＲＦ結合ペプチドを前駆体にして様々な非ペプチド誘導物質を製造することもできる。
【００９６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＲＦの受容体がＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループであることを酵母の２ハイブリッド法で確認した結果を示した図である。
【図２】  ＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループが相互作用することを、酵母細胞で共同免疫沈澱法を用いて確認した結果を示した図である。
【図３】  ＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループが相互作用することを、ＣＯＳ−７細胞で共同免疫沈澱法を用いて確認した結果を示した図である。
【図４】  ＨＲＦとＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループの親和度をバイアコア（ｂｉａｃｏｒｅ）法で測定した結果を示したグラフである。
【図５】  ＨＲＦの受容体がＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループであることを、共焦点顕微鏡で確認した結果を示した写真である。
【図６】  図６（ａ）及び図６（ｂ）は、水溶性タンパク質のＨＲＦが、細胞内に侵入できることを共焦点顕微鏡及びウエスタンブロッティング法で確認した結果を示した写真である。
【図７】  ＨＲＦが細胞内のＮａ+濃度を上昇させることを示したグラフである。
【図８】  ＨＲＦがＮａ+，Ｋ+−ＡＴＰアーゼの活性を低下させることを示したグラフである。
【図９】  図９（ａ）〜（ｃ）は、ＨＲＦによって細胞内のＣａ2+濃度が上昇し、Ｎａ／Ｃａ交換体により細胞外のＣａ2+源が消費され、ＩｇＥの存在下でＲＯＳが生成し、その結果、細胞内のＣａ2+濃度が一層上昇することを示したグラフである。
【図１０】  ＩｇＥの存在下で細胞内のＣａ2+濃度が上昇すると、ＨＲＦによってヒスタミンが分泌されることを示したグラフである。
【図１１】  ＨＲＦ結合ペプチドをコードする遺伝子の分離過程の概略を示した図である。
【図１２】  本発明のファージがコードするペプチドがＨＲＦに特異的に結合することを示したグラフである。
【図１３】  本発明のファージがコードするペプチドとＨＲＦタンパク質の結合親和度を示したグラフである。
【図１４】  図１４（ａ）〜（ｃ）は、ＨＲＦ結合ファージでディスプレーされたペプチドと、該ペプチドと同一アミノ酸配列を有する合成ペプチドが、同一であることを示したグラフである。
【図１５】  本発明のペプチドのＨＲＦ結合能を比較したグラフである。
【図１６】  ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株を用いて、本発明のペプチドがヒスタミン放出を抑制するのに必要な量を測定した容量−反応関係を示したグラフである。
【図１７】  ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株を用いて、本発明のＨＲＦ結合ペプチドの、ＨＲＦによるヒスタミン放出に対する阻害を比較したグラフである。
【図１８Ａ】  ラットＨＲＦ受容体間で保存されたアミノ酸配列を示した図である。
【図１８Ｂ】  ラットＨＲＦ受容体間で保存されたアミノ酸配列を示した図である。
【図１９Ａ】  ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図１９Ｂ】  ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図１９Ｃ】  ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図１９Ｄ】  ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図２０Ａ】  ヒトＨＲＦ受容体のアミノ酸配列間の配列保存性を示した図である。
【図２０Ｂ】  ヒトＨＲＦ受容体のアミノ酸配列間の配列保存性を示した図である。
【図２１Ａ】  ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図２１Ｂ】  ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図２１Ｃ】  ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図２１Ｄ】  ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配列間の配列保存性を示した図である。
【図２２】  様々なアレルギー患者の血液からＨＲＦが検出されたことを示す図である。
【図２３】  ＰＣ１２細胞で、ＨＲＦの濃度に依存してドーパミンの放出が上昇することを示したグラフである。
【図２４】  ＰＣ１２細胞で、本発明のＨＲＦ結合ペプチドが、ＨＲＦによるドーパミン放出を抑制することを示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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