(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ベースのアッセイを用いて試料中の生細胞の核酸と死細胞の核酸とを区別する方法であって、
（ａ）前記試料内の前記死細胞の核酸に選択的に結合し、それゆえ、以下の工程（ｂ）において前記核酸が検出されないように修飾するための生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）前記試料中の前記生細胞からの核酸を検出する段階であって、該検出が生細胞からの核酸内の標的配列に１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合させることを伴う段階とを含み、且つ、段階（ａ）の後に、前記試料中の全細胞を溶解し、及び前記細胞を溶解した後に、段階（ｂ）を行う前に生細胞及び死細胞由来の核酸を混合することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記段階（ｂ）において、生細胞由来の核酸内の標的配列に結合した前記オリゴヌクレオチドプローブの量に比例して信号が生成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生死判別プローブが死細胞中のＤＮＡを選択的に修飾することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記段階（ｂ）において用いられる検出方法が、前記生死判別プローブの標的となる核酸配列を標的とすることを特徴とする、請求項１項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出方法が前記試料中の細胞からの核酸領域を増幅することを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
核酸ベースのアッセイを用いて試料中の生細胞の核酸と死細胞の核酸とを区別する方法であって、
（ａ）前記試料内の前記死細胞の核酸を選択的に標識する生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）細胞からの核酸を、標識および非標識フラクションに分離する段階、及び
（ｃ）前記フラクションの一方または両方の中の核酸を検出する段階とを含み、且つ
前記段階（ａ）の後に、前記試料中の全細胞を溶解し、及び細胞を溶解した後に、前記段階（ｂ）を行う前に、生細胞及び死細胞からの核酸を混合することを特徴とする、方法。
【請求項７】
前記生死判別プローブが死細胞の核酸に共有結合的に結合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記生死判別プローブが染料、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸分解酵素であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記生死判別プローブが臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、４’−ＡＭＤＭＩＰ、ＡＭＩＰ、５−ＭＩＰ（５−メチルイソプソラーレン）およびＤＮａｓｅから選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生死判別プローブにより引き起こされた修飾が非可逆的であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生死判別プローブが前記試料中に存在する遊離核酸も修飾し、それにより、以下の工程（ｂ）において前記遊離核酸も検出されないように修飾することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記死細胞の核酸に選択的に結合し、それゆえ、以下の工程（ｂ）において前記核酸が検出されないように修飾するための染料、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸分解酵素から選択される生死判別プローブと、
（ｂ）核酸検出のための手段とを含み、前記手段が核酸検出を行うための１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、且つハイブリダーゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅、ＬＡＲ、３ＳＲ、Ｑ−ベータレプリカーゼシステム、ＰＣＲ、シークエンシングアプローチ、及びこれらの任意の組合せから選択される、手段である、試料中の生細胞の核酸と死細胞の核酸とを区別するためのキット。
【請求項１３】
前記生死判別プローブが前記試料中に存在する遊離核酸も標識することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、生物学的試料中の細胞のアッセイ方法に関し、とりわけ生細胞と死細胞を区別できる方法に関する。
【０００２】
背景技術
多くの状況において、試料中の細胞集団を、その集団中の生細胞のみについての定性的または定量的情報を得たり、生細胞と死細胞の総集団と生細胞のみとの比較ができるように調査することが望ましい。これは、命にかかわる感染または細菌感染あるいは癌性細胞の存在について患者を監視する場合ならびにそのための処置計画の有効性を評価する場合、あるいは汚染されていることがある環境試料、例えば水試料の分析に特に当てはまる。
【０００３】
生存可能な細菌集団の定量化は、公衆衛生、バイオテクノロジー、食品、水および医薬産業を含む微生物学の多くの領域、ならびに環境研究において重要である。Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｇ．Ｅ．Ｃ．らが、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ  １９９８  ｐｐ．１３１３−１３１８で論じているように、細菌性病原体を検出するための従来の方法は、微生物の選択的培地中での培養、およびそれらの形態学的、生化学的および／または免疫学的特性による分離物の識別を伴うのが典型的である。これらの方法の実行にはいずれにせよ数日を要し、表現型特性に基づく識別方法はあまり信頼性が高くない。さらに、細菌は、生存可能で感染性もあるが培養可能ではなく、したがってこれらの従来方法では検出できない状態にあることがある。
【０００４】
フローサイトメトリーは、細胞死の際に観察される細胞膜透過性の劇的増加に基づいて死細胞識別を実行するために用い得る。この手法は、物理的分離方法を伴ったり、差分光散乱または蛍光性プローブによる染色に基づくことができる。これらのケースにおいては、識別は全細胞レベルにおいて行われる。
【０００５】
しかしながら、例えばオリゴヌクレオチドプローブを含む直接的な核酸アッセイを基にする細胞集団の検出および同定方法は、非常に特異的になる可能性があり、例えばＰＣＲと結びつけると、極めて敏感にもなり得る。しかしながら、上記のＳｈｅｒｉｄａｎらが述べているように、ＤＮＡベースの方法の重大な欠点は、これらの方法が、生きている微生物と死んだ微生物とを区別できないことである。これは、たとえ微生物が死んでいてもＤＮＡはかなり安定でそのままで存続し、したがって、例えばＰＣＲ用のテンプレートとしての機能を果たし得るからである。試料に直接適用して、特定の細胞集団、例えば微生物、の生存能力の目安を与えることができる核酸ベースの方法は、多くの産業的、環境的および医療的用途にとり大きな価値があるであろう。
【０００６】
一般にＤＮＡよりはずっと不安定で、したがって試料中の生細胞数の指針となり得るＲＮＡの検出を基にするアッセイを考案しようとする試みがなされてきた。しかしながら、これらの実験の結果は、細胞が生きているか死んでいるかについての正確な情報をＲＮＡが実際にはもたらすことができないことを示唆している。ＲＮＡ分子の安定性は、配列に依存し、大きさが数桁変動し得る。さらに、安定性および表現双方のレベルは、環境条件により影響される（ＭｃＫｉｌｌｉｐ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．［１９９８］６４  ｐｐ  ４２６４−４２６８およびＮｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．［１９９９］６５  ｐｐ  ２１２２−７）。
【０００７】
したがって、対象となる細胞集団内の生細胞および死細胞の識別を可能にする一方で、核酸ベースのアッセイの特異性および感度を利用できる検出方法に対するニーズが依然としてある。
【０００８】
発明の開示
本発明者らは、死細胞からの核酸と選択的に相互作用し、したがって死細胞と生細胞との識別を核酸レベルで、典型的には核酸ベースのアッセイにおける信号生成に影響を与えることにより、可能にする特定の生死判別プローブを用い得ることを見出した。生細胞中の核酸は保護されており、生死判別プローブにより修飾されずに残るのに対して、死細胞中の細胞膜の透過性のため、死細胞の核酸は効果的に露出される。
【０００９】
したがって、本発明の１つの側面により、試料中の細胞の検出方法が提供され、該方法は、
（ａ）試料内の死細胞の核酸を修飾する生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）試料中の細胞からの核酸を検出する段階とを含む。
【００１０】
一般に、本発明の方法は、試料内の生細胞のみが実際に検出されるように実行される。本発明の方法により、試料中の死細胞と生細胞との区別が可能になり、したがって、別の見方をすると、本発明により、試料中の生細胞と死細胞とを識別する方法が提供され、該方法は、
（ａ）試料内の死細胞の核酸を修飾する生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）試料中の細胞からの核酸を検出する段階とを含む。
【００１１】
以下でより詳細に論じるように、「修飾」は、典型的に、核酸の標識および／または核酸の不活性化による。この方法の間に、すべての死細胞中のすべての核酸が必ずしも修飾されるわけではない。同様に、生細胞核酸のいくらかが修飾されることがある。試料内の特定の細胞集団に対して選択的な生死判別プローブが選ばれ得る。生死判別プローブは、例えばＲＮＡよりはＤＮＡを修飾することにより、任意の細胞中の核酸の間で選択的とし得る。核酸検出方法は、特定の生死判別プローブにより死細胞中で著しく修飾されたであろう核酸配列を標的とするようにデザインされるのが典型的である。核酸は、選択された検出方法に従って信号を生成するその能力が妨げられるか又は著しく減少させられるという点で不活性化され得る。
【００１２】
とりわけ、本発明の方法により、核酸ベースのアッセイを用いて、生細菌および死細菌を別個に検出するための単純な方法が提供される。この方法は、複雑な群集を分析するために自然条件のもとで適用できる。
【００１３】
別の見方をすると、本発明により、試料内の細胞集団の分析から死細胞を除外する方法が提供され、該方法は、
（ａ）前記細胞集団を含む試料を、前記細胞集団内の死細胞の核酸を修飾する生死判別プローブに接触させる段階と、
（ｂ）細胞集団からの核酸を検出する段階とを含む。
【００１４】
「細胞集団」の用語は、検出するためにこの方法が実行されている細胞タイプを指す。これは、試料中に存在するすべての細胞、試料中に存在するすべての原核細胞または調査が望まれているその他の任意の細胞グループとし得る。細胞集団は、核酸検出方法によって同定できる任意の識別可能な細胞のクラスまたはグループである。よって、対象となる細胞集団がどれほど特異的であるかに基づいて特定の検出方法が選ばれる。したがって、この検出方法にとっての標的となる核酸内の領域は、対象となる細胞集団内のすべての細胞について共通である。標的領域は、アッセイ方法の特異性および検出するためにこの方法がデザインされている細胞タイプ／微生物に応じて、すべての原核細胞または微生物の特定株だけについて共通であり得る。
【００１５】
「生死判別プローブ」は、死細胞には入り込めるが生細胞には入り込めない任意の作用物質を意味する。適切な作用物質は、１００％選択的である必要はないこと、すなわち少量の作用物質が生細胞に入り込めるのでもよいことが理解されるであろう。好ましくは、典型的な死細胞中にその量の生死判別プローブの量が存在、すなわち死細胞中の作用物質の平均濃度を値１００とすれば、典型的な生細胞中に存在する量、すなわち生細胞中の平均濃度は、３０未満、好ましくは２０未満、さらに好ましくは１０未満、例えば５未満である。
【００１６】
適切な生死判別プローブは技術的に公知であり、文献中に記載されている。本発明によると、生死判別プローブは、死細胞中の核酸と、例えば共有結合的にまたは水素接合、あるいは任意の他の方法で結合することにより、相互作用できなければならない。以下でより詳細に論じるように、生死判別プローブは、死細胞由来核酸を不活性化または標識することによって作用するのが典型的である。
【００１７】
適切な作用物質は、核酸または酵素、例えばＤＮＡｓｅ、ＲＮａｓｅまたは制限酵素と結びつく染料のような化学薬品とし得る。非酵素的生死判別プローブ、例えば化学薬品は、生細胞膜を突破できないけれども、より小さくかつ死細胞膜をよりうまく通過できるために好まれる。
【００１８】
ペプチドおよびオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンス配列またはＰＮＡプローブは、適切な生死判別プローブのさらなる例である。これらは一般に小さく、したがって、酵素よりも容易に死細胞中に入り込める。これらの分子は、例えばＰＣＲを阻害することにより、核酸検出を直接的に妨げまたは低下し得るが、より普通には、これらの分子は、次に死細胞核酸を生細胞由来の核酸から分離するために利用できるように死細胞核酸を標識するために用いられる。あるいは、一部を、例えば光誘導共有結合後に信号生成を阻害するために核酸を修飾できるペプチド／オリゴヌクレオチドと結合させ得る。したがって、ペプチド／オリゴヌクレオチドはキャリアとして働いており、核酸の標的領域の特定の結合および修飾を考慮に入れ得る。適切な阻害部分にはＥＭＡおよび４’−ＡＭＤＭＩＰが含まれる。
【００１９】
生／死マーカーとして働く染料は技術的に公知であり、臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、４’−ＡＭＤＭＩＰ、ＡＭＩＰ、５−ＭＩＰ（５−メチルイソプソラーレン）（Ｃｉｍｉｃｏ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）Ｖｏｌ．１９．Ｎｏ．１  ｐｐ  ９９−１０７）、ＳＹＴＯ５９赤色蛍光性核酸染色液およびＳＹＴＯ緑色核酸染色液、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ、ＶｉａＧｒａｍ  Ｒｅｄ＋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒａｍ  ＳｔａｉｎおよびＶｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれる。さらなる作用物質には、ＢＯＤＹＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、フルオレシンコンカナバリンＡ、ヨウ化プロピジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１染料、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ、Ｃ４−ＢＯＤＩＰＶ５００／５１０ＣＹおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれ、これらは、細胞のいくつかがアポトーシスを受けた真核細胞のアッセイと関連する方法での使用においてとりわけ適している。
【００２０】
多くの適切な生死判別プローブは、蛍光染料であるが、本発明の方法に従って、生細胞および死細胞を区別するために主として利用されるのは蛍光発生能力ではない。その代わりに、識別を可能にしているのは、死細胞からの核酸と結び付きさらに何らかの方法でこの核酸の特性を変えるこれらの作用物質の能力である。生死判別プローブは、核酸と結合したままでいることができ（すなわち、死細胞由来核酸が標識される）、生死判別プローブと核酸との間のこの結合が、死細胞由来核酸を生細胞由来核酸から分離するために利用される。
【００２１】
これは、好ましくは生死判別プローブに、典型的には固相坦体に付着させた結合パートナーを提供することによって達成される。例えば、生死判別プローブに対する抗体を固相坦体上で提供することができ、固相坦体と接触させた試料からの核酸により、生死判別プローブ／死細胞核酸複合体を固相坦体に付着させた抗体に特定的に結合することができる。生死判別プローブが全く結びついていない生細胞由来核酸は結合せず、単に流出してアッセイし得る。この方法には、生死判別プローブおよびこれに対する抗体を介して固相坦体に付着させられた核酸は、別々に溶出およびアッセイし得るという利点があり、このようにして、試料内の死細胞集団のサイズに関する情報を生成し得る。
【００２２】
したがって、本発明の１つの実施形態に従って、試料中の細胞の検出方法が提供され、該方法は、
（ａ）試料内の死細胞の核酸を標識する生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）細胞から核酸を、標識フラクションおよび非標識フラクションに分離する段階と、
（ｃ）一方または双方のフラクション中の核酸を検出する段階とを含む。
【００２３】
本発明により、試料中の生細胞と死細胞とを区別する方法も提供され、該方法は、
（ａ）死細胞の核酸を標識する生死判別プローブに試料を接触させる段階と、
（ｂ）細胞から核酸を、標識フラクションおよび非標識フラクションに分離する段階と、
（ｃ）一方または双方のフラクション中の核酸を検出する段階とを含む。
【００２４】
上で論じた染料のような化学薬品はこのように作用し得、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質およびそれらのフラグメントも同様に作作用し得る。
【００２５】
しかしながら、好ましい実施形態において、生死判別プローブは、死細胞核酸を不活性化し、したがって、「不活性化剤」と呼ぶのが便利である。「不活性化する」とは、生死判別プローブが、核酸検出段階の間に核酸により生成されているどのような信号も防止または大きく減少させることを意味する。これは、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを用いて死細胞核酸を分解するか制限酵素を用いて特定領域を切断することにより達成できた。化学薬品は、何らかの方法で核酸アッセイを阻害、すなわち検出段階において死細胞核酸がテンプレートとして働かないようにする、分解または代替的修飾によって核酸を不活性化するために、生死判別プローブとして用い得る。そのような不活性化剤の代表的なものはＥＭＡであり、これは光活性化と同時にＤＮＡに共有結合的に結合する能力があり、ＤＮＡと共有結合的に結合または他の形で結びついた場合にＰＣＲを阻害できる。４’−ＡＭＤＭＩＤＰも、ＤＮＡに共有結合的に付着することによってＰＣＲを抑制することが示されている（前述のＣｉｍｉｎｏ，Ｇ．Ｄ．ら）。
【００２６】
核酸を検出するための多くの種々の手法が公知であって文献中に記載されており、これらのうちのいずれも本発明に従って用いることができる。最も単純には、核酸はプローブへのハイブリダイゼーションにより検出でき、非常に多くのそのようなハイブリダイゼーションプロトコルが記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。最も一般的には、検出は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション段階、および／または文献に記載のいずれかの方法を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅段階を伴う。したがって、言及したように、ＬＡＲ、３ＳＲおよびＱ−β−レプリカーゼシステムのような手法を用い得る。しかしながら、ＰＣＲおよびその様々な改良、例えばネステッドプライマーの使用が、一般的に最適の方法である（核酸増幅技術の総説について、例えばＡｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：４１−４７を参照）。
【００２７】
他の検出方法は、シーケンシングアプローチ、例えばＳｙｖａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ，１９９０，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８：６８４−６９２に記載されるようなミニシーケンシングアプローチに基づくことができる。
【００２８】
ＰＣＲまたは他の検出段階の結果は、技術的に開示されている多くの方法によって検出または視覚化できる。例えば、ＰＣＲまたは他の増幅産物は、公知手法を用いて、電気泳動ゲル、例えば臭化エチジウム染色したアガロースゲル上で流すことができる。あるいは、ＤＩＡＮＡシステムを用いることができ、これはネステッドプライマー法の改良である。ＤＩＡＮＡ（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：固定化増幅核酸検出）システム（Ｗａｈｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ４：２８５（１９９０）参照）、内側の第２のプライマーペアはそれぞれ、増幅されたＤＮＡの捕獲を可能にする固定化手段と、ラベルすなわち認識を可能にする標識の取付けを可能にする手段とを保持する。これにより、バックグラウンド信号の減少と、増幅されたＤＮＡ検出のための迅速かつ容易な手段という二重の利点がもたらされる。
【００２９】
例えば、標準シーケンシング、固相シーケンシング、サイクリックシーケンシング、自動シーケンシングおよびミニシーケンシングなどの現在利用可能な多くの種々のシーケンシング技術のいずれかを用いて、シーケンシングにより、増幅された核酸の検出、または結果の確認がなされる。
【００３０】
核酸検出の段階は、好ましくは、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ（便宜上、本明細書中では検出プローブと呼ぶ）を標的核酸配列に結合させる段階を伴う。これらのプローブは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、等温増幅、リガーゼ連鎖反応等のような核酸増幅反応用プライマーとし得る。あるいは、標識したプローブを用い、直接的にアッセイできる。好ましくは、核酸検出段階は増幅反応を伴う。検出プローブの使用は、対象となる細胞集団、例えば微生物の特定の種または株に特異的な標的核酸配列を選択し得ることを意味している。
【００３１】
明らかに、例えばＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅによって、又は制限酵素による関連領域での切断によって核酸が分解された場合、検出プローブは、標的核酸配列に結合することができなくなり、したがって、死細胞由来核酸は、テンプレートとして働き信号を生成することができなくなる。したがって、例えば増幅およびゲル電気泳動による分離に続いて生成されたすべての信号は、生細胞の核酸に由来する。このように、試料中の生細胞集団についての情報が生成される。そのような情報は、上で論じたように、生細胞と死細胞とを含んでいる細胞集団のサイズを知るよりも往々にして価値がある。
【００３２】
核酸を他の経路で修飾する不活性化剤は、生死判別プローブを介しての信号生成も防止し得る。核酸への不活性化剤の結合により、検出プローブの結合または検出方法に伴う酵素、例えばポリメラーゼ、の作用を物理的に妨げ得る。ポリメラーゼのような酵素は、生死判別プローブにより阻害でき、例えば、ＥＭＡは、これが核酸に共有結合的に結合していな場合であっても、ＰＣＲを阻害できることが示されている。生死判別プローブは核酸と結びついたままでいることができ、不活性化剤または標識（例えば、共有結合的に結合したＥＭＡ）として働く。
【００３３】
あるいは、生死判別プローブは、核酸を修飾してこれを不活性化および／または標識することができるが、それ自身は核酸と結びついたままでいることはない（例えば、核酸を分解する酵素または化学薬品）。メチルトランスフェラーゼ（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８）２２，１７，ｐｐ  ３６４０−３６５９）は、死細胞核酸を標識することができる。生死判別プローブにより生じる修飾は、好ましくは、例えば死細胞核酸への共有結合またはその分解の結果として、非可逆的である。それ自身で核酸を標識する生死判別プローブは、好ましくは核酸と強く結び付く。それ自身は核酸と結び付いたままでいない生死判別プローブにより生じる修飾は、少なくとも検出方法の条件の下で、好ましくは本質的に非可逆的になる。
【００３４】
生死判別プローブは好ましくは、核酸に結合し、この結合はＤＮａｓｅのケースのように、一時的なものになる。結合には、水素結合またはその他の形の会合だけでなく共有結合も含まれる。
【００３５】
典型的には、死細胞に選択的に入り込み、したがって、その中の核酸を修飾することができる生死判別プローブに試料を接触させた後、細胞を溶解し、検出方法実行のために試料全体から核酸を分離する。したがって、好ましい実施形態において、試料中の全細胞からの核酸は、核酸検出方法に先がけて混合される。生死判別プローブにより生じた生細胞核酸と死細胞核酸との間の物理的差異により、生細胞集団だけ、または特定の状況においては死細胞集団だけについての情報を得ることができる。上で論じたように、生死判別プローブがＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅである場合、「差異」は、死細胞核酸は分解されているのでそれ自体では存在しないということである。典型的には、生死判別プローブ酵素、例えばＤＮａｓｅは細胞溶解の際に変性され、そのため生細胞からの核酸を分解するためには利用できない。
【００３６】
したがって、本方法は、全体の細胞が死んでいるか生きているかの視覚的評価に一般的に依存する細胞レベルでの区別に頼るフローサイトメトリーによる識別方法と対比することができる。したがって、フローサイトメトリーの間に、生細胞および死細胞のソーティングすなわち物理的分離が行われることになる。試料を生死判別プローブと接触させることができ、死細胞から生細胞を区別する必要なく、試料について核酸検出段階が実行されるという事実は、本発明の方法を非常に便利なものにしている。さらに、この方法は完全に自動化でき、いずれか任意の細胞が生きているか死んでいるかについて、フローサイトメトリーの間に細胞をゲーティングする場合にどのような判断も要しない。また、低粒子量の液体試料のみがフローサイトメトリーで処理できる。
【００３７】
上で言及したように、増幅段階を伴う核酸検出方法が好ましい。増幅プライマーを試料に添加し、選択された周知の増幅プロトコルのサイクルを実行する。死細胞由来核酸は酵素的に分解されていることがあり、したがって生細胞由来核酸のみが増幅し得る。あるいは、死細胞核酸は化学的に修飾されていることがあり、そのためプライマー結合または酵素機能を妨げることにより、増幅反応が阻害される。いずれにせよ、増幅産物は、生細胞核酸のみにまたは本質的にこれに由来し、従来手法により分析して、オリジナル試料中の標的核酸量、したがって試料中の任意の細胞集団内の生細胞数の推定量を得ることができる。簡便に、増幅産物は、例えば臭化エチジウムを用いて染色し、次に、例えばアガロースゲル上で分離される。
【００３８】
本発明の方法は、ＷＯ９８／５１６９３に記載のプロトコルを利用して実行するのが便利である。したがって、試料中の細胞は、固相坦体に結合させることにより捕獲され、細胞を生死判別プローブと接触させ、次いで細胞を溶解する。放出された核酸は次に、分析される前に同じ固相坦体に結合させる。引用により本明細書にその内容が組み込まれるＷＯ９８／５１６９３で論じられているように、結合した核酸は、固相坦体へ結合したままでまたは検出方法を実行するために固相坦体から溶出して分析できる。固相坦体は好ましくは、粒子状材料、好ましくは磁性ビーズを含む。細胞および核酸は、沈殿により固相坦体と結合させるのが便利である。
【００３９】
特に好ましい実施形態において、例えば食品試料からの細菌は固相坦体上で捕獲され、次に細菌は、生死判別プローブ、例えばＥＭＡと接触させられ、次いで露光される。次にＤＮＡを精製して分析する。磁性または磁化可能な固体坦体の使用により、本方法の間の細胞／核酸の操作が便利になる。
【００４０】
本明細書中で用いられる「細胞」の用語は、すべての原核細胞（古細菌を含む）および真核細胞ならびにウイルスおよびマイコプラズマのような他の生存可能な存在物を含む。すべての細胞は、細胞死の際に、外膜、カプシド等を通過する特定の作用物質の能力の大きい増加を必ず示す。したがって、代表的な「細胞」には、哺乳動物および非哺乳動物細胞、植物細胞（選択された生死判別プローブがセルロース細胞壁を通過できるのであれば）、藻類、菌類、プロトプラスト、細菌、バクテリオファージ、マイコプラズマ、原生動物およびウイルスの全タイプが含まれる。
【００４１】
したがって、試料は、そのような細胞内の核酸を含む任意の物質とすることができ、例えば、食品および関連製品、臨床および環境試料を含む。したがって、試料は、ウイルス性または上で論じたような他の細胞性物質を含み得る生物学的試料とし得る。したがって、代表的試料は、全血または血漿のような血液製剤、軟膜、尿、糞便、脳脊髄液またはその他任意の体液、組織、細胞培養物、細胞懸濁液等、および特に土、水または食品試料などの環境試料が含まれる。
【００４２】
試料は、細胞分離プロセスにより得られる半純粋製剤のような、選択的に純粋な又は部分的に精製した出発物質も含み得る。
【００４３】
生細胞と死細胞との間の差異は、すべての細胞について一般論として定義するのは容易ではないが、本発明の目的上、区別は、死細胞が生死判別プローブに対して大きく向上した透過性を示すという事実を基にしている。一般に、生細胞は培養可能、すなわち増殖して寒天プレート上でコロニーを形成したり、培養液中で目に見える濁りを生じたりし得る。そのような定義は、すべての状況、例えば自己複製するのに宿主細胞を必要とするウイルスのケースでは適切ではないことがある。それでもやはり、対象となる任意の標的細胞について、生細胞を示すものとしてパラメーターを容易に設定でき、生死判別プローブの細胞に入り込む能力が決定にあたり重要であろう。細菌のケースでは、生存可能であるが非培養可能な状態にある細菌（すなわち、特定条件下で正常な培養可能状態に「蘇生」できる）は、生きていると見なされ、それらの膜は透過性が高くない。
【００４４】
生死判別プローブにより修飾される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの自然に生じる修飾ないしは合成的修飾、およびそれらの組み合わせとすることができる。しかしながら、好ましくは、核酸はＤＮＡであって、これは一本鎖または二本鎖重あるいは他の任意の形状、例えば直線状もしくは環状であってもよい。
【００４５】
生死判別プローブは、例えばＥＭＡによる結合に続いて無差別に、または例えば制限エンドヌクレアーゼを用いて核酸の特定領域を標的とすることにより差別的に核酸を修飾し得る。一般に、生死判別プローブレベルでは、生細胞と死細胞との間以外の区別は全くないであろう。生死判別プローブは、典型的には、対象となる細胞集団が一部分にすぎない種々のタイプの死細胞に入り込むことができる。あるいは、対象となる死細胞に他の死細胞よりも容易に入り込むことができる生死判別プローブが選択され、すなわち、生死判別プローブは対象となる細胞を標的とすることができる。これにより、使用する生死判別プローブの全体的な濃度をより低くすることができ、本方法の選択性を向上できる。
【００４６】
核酸検出により、生細胞の種々の集団を区別できる特異性レベルが導入できる。例えば、アッセイしようとする特定の微生物に特有の核酸の標的領域に結合するプローブを用い得る。同様に、対象となる真核細胞は、特定の細胞タイプ、例えば癌細胞に特異的な核酸の標的領域にハイブリダイズするプローブを選択することによりアッセイできる。上で論じたように、そのようなプローブは、標識したり、増幅反応において便利に用い得る。
【００４７】
本発明の方法のさらなる利点は、試料中に存在する遊離核酸、すなわち、生細胞中にも死細胞中に含まれていない核酸、を修飾できる生死判別プローブの能力である。修飾は、上記方法のいずれかにより行うことができ、酵素分解、検出方法におけるテンプレートとして働く核酸を阻害するための化学的修飾および生細胞からの核酸を試料中の他の核酸からの隔離を可能にするための標識が含まれる。したがって、試料中の遊離核酸は、アッセイから除外できる。これらの方法により、試料内の生細胞集団を正確に決定し、死細胞または遊離核酸により生成された信号のため、生細胞集団を誇張しすぎることがない。したがって、本発明の好ましい実施形態において、生死判別プローブは、試料内の死細胞の核酸および遊離核酸を修飾する。
【００４８】
本発明の方法は、特にネクローシスおよびアポトーシスによる細胞死自体を分析するのに適している。ネクローシスは典型的には、細胞外条件により引き起こされ、早期の膜透過化という結果になり、アポトーシスは、プログラムされた細胞死と関連しており、細胞膜における透過性がかなり遅れる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｍ．ａｎｄ  Ｂｏｌｔｏｎ，Ｗ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９５）１９，ｐｐ  ２４３−２５５）。死細胞の数は、生細胞および死細胞を区別せずかつ生死判別プローブを全く用いない方法と本発明の方法の結果とを比較することによって分析できる。あるいは、生死判別プローブにより生じた修飾が、生細胞集団から死細胞集団を分離するために用いられるように本発明が実行される場合、死細胞集団についての定性的および定量的情報を直接得ることができる。
【００４９】
本発明の方法を実行するために必要な種々の反応体および成分は、キットの形で供給するのが便利である。そのようなキットは、発明のさらなる側面を表している。
【００５０】
最も単純には、本発明のこの側面は、試料中の細胞を検出するためのキットを提供するもので、該キットは、
（ａ）生死判別プローブと、
（ｂ）核酸検出を実行するための手段とを含む。
【００５１】
したがって、本発明により、試料中の生細胞と死細胞とを識別するためのキットも提供され、該キットは、
（ａ）生死判別プローブと、
（ｂ）核酸検出を実行するための手段とを含む。
【００５２】
手段（ａ）および（ｂ）は、本発明の方法に関連して、上記で説明し、論じた通りのものである。（ｂ）は典型的には、本明細書で定義されるように１つ以上の検出プローブを含んでいる。このキットは、細胞を溶解するための手段（ｃ）を任意に含んでいる。核酸検出に先がけて、生細胞および死細胞の核酸フラクションが分離される方法において、このキットは、好ましくは固相坦体に結合された生死判別プローブへの結合パートナー（ｄ）を任意に含み得る。
【００５３】
発明を実施するための最良の形態
以下の非限定的な実施例において図面を参照しつつ、本発明をより詳細に説明する。
【００５４】
実施例１
光活性化による、ＤＮＡに共有結合したＥＭＡのＰＣＲ阻害効果
光活性化ＥＭＡおよび未活性化ＥＭＡ双方のＰＣＲ阻害効果を、純粋なＤＮＡについて調べた。ＰＣＲ増幅は、１０００、１００および１０μｇ／ｍｌＥＭＡの希釈系列で行った。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子を、フォワードプライマー５’ＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣ３’およびリバースプライマー５’ＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡ３’の適用によって増幅した。これらのプライマーサイトは、真正細菌の１６ＳｒＤＮＡ用に、一般に保存される。
【００５５】
ＰＣＲ増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲ増幅システム（ＰＥ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて行った。５０μｌＰＣＲ反応は、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを２００μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００、ＤｙｎａＺｙｍｅ（登録商標）熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ，Ｅｓｐｏｏ，フィンランド）１Ｕおよびテンプレートを２ｎｇ含んでいた。サイクルパラメータは、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間であった。サイクリング段階を２５回繰り返した。増幅前に、試料を９４℃まで５分間加熱し、増幅反応完了後に、７２℃で７分間の拡張段階が含まれた。
【００５６】
各希釈系列について、Ｌｕｘｏｒ１８ＷタイプＦＬ−１８５ランプ（Ｌｕｘｏｒ  ＡＳＡ、オスロ、ノルウェー）を用いた５ｃｍで１５分間の照明によってＥＭＡをＤＮＡに共有結合的に光活性化させた試料、及びＥＭＡを暗所でＤＮＡに添加した試料の双方についてＰＣＲを用いた。最高濃度（１０００μｇ／ｍｌ）の場合には、光活性化ＥＭＡおよび非活性化ＥＭＡの双方がＰＣＲ反応を阻害した。１００および１０μｇ／ｍｌの場合には、光活性化したＥＭＡがＰＣＲを阻害したのに対し、非活性化ＥＭＡの場合のＰＣＲは阻害されなかった（図１）。１０μｇ／ｍｌ増幅産物を、１％アガロースゲル上で４５分間１００ボルトで分離した。これらの実験からの結論は、ＤＮＡに共有結合的に結合しているＥＭＡはＰＣＲ増幅を阻害するのに十分であること、およびＥＭＡは単独で高濃度においてＰＣＲに対して単に阻害性があるということである。
【００５７】
実施例２
生きたＥ．ｃｏｌｉからのＤＮＡの選択的ＰＣＲ増幅のためのＥＭＡの適用
ＥＭＡの効果を生／死染色液として試験するため、Ｅ．ｃｏｌｉをエタノール、熱、およびホルムアルデヒドで殺した。この実験においては、Ｅ．ｃｏｌｉの約１０８個の細胞のアリコートを、ミクロ遠心分離において８０００ｒｐｍで５分間ペレット化し、上澄みを取り去り、細胞を水、９６％エタノール、および２％ホルムアルデヒドの各液体５０μｌ中に再懸濁した。エタノール処理およびホルムアルデヒド処理した試料は室温でインキュベートしたのに対し、水試料は室温と９５℃の双方でインキュベートした。すべての試料はそれぞれの温度で５分間インキュベートした。
【００５８】
続いて、細菌を遠心分離によりペレット化し、上澄みを取り去り、細胞を水５０μｌ中に再懸濁した。試験試料にはＥＭＡを１０μｇ／ｍｌの濃度で加えたのに対し、対照にはＥＭＡを全く添加しなかった。
【００５９】
すべての試料を１０分間露光した。続いて、試料は、５００μｌ４グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）および１ＵのＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡ  ＤＩＲＥＣＴビーズ（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、オスロ、ノルウェー）を含む１％サルコシル中に再懸濁した。インキュベーションは室温でさらに５分間継続した。９６％エタノール１ｍｌを添加し、５分後に、試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗った。次に、ビーズおよびＤＮＡ複合体を、水５０μｌ中に再懸濁し、最後に６５℃まで１０分間加熱し、残留エタノールを除去した。精製したＤＮＡの２％を、上記で説明したような各増幅反応において用いた。
【００６０】
対照と、すべての致死手段についてのＥＭＡ試料との間で、ＰＣＲ信号強度には有意な差があったの対して、生細菌については全く差がなかった（図２）。処理した試料と対照との間の信号強度の差は、エタノールで殺した細菌および熱殺菌した細菌の双方について約１００％であったの対して、ホルムアルデヒド処理した試料については８５％であった。効果におけるこの差は、致死作用物質が細胞膜をどのように透過化するかにおそらく関係しているのであろう。アルコールおよび熱は、細胞膜を破壊することにより作用するのに対して、ホルムアルデヒドは、細胞膜への深い効果を全く持たないアルキル化剤である。ＤＮＡが一本鎖か二本鎖かどうかに関連するＥＭＡの効果に差があるようには思われなかった。ＰＣＲ阻害は、エタノール殺菌（二本鎖ＤＮＡ）、および熱殺菌（一本鎖ＤＮＡ）の双方について１００％であった。ＥＭＡの量を１００μｇ／ｍｌまで増大しても、生存可能細菌および死細菌の間でのよりよい区別は得られなかった。しかしながら、このＥＭＡ濃度により、生細菌についての増幅効率が低下した。
【００６１】
対照について信号強度を比較すると、ＤＮＡ精製収率および／または増幅効率が処理の仕組みにより影響されることが示される。未処理試料および９６％エタノール処理試料と比較すると、熱処理試料およびホルムアルデヒド処理試料はどちらも収率がより低かった。
【００６２】
実施例３
熱処理したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ型株ＤＳＭＺ４６８８（登録商標）（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｌｏｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｎ  ＧｍｂＨ．Ｂｒａｕｎｓｈｗｅｉｇ，ドイツ）に対するＤＮａｓｅの効果
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉは、主要な食品媒体病原体と認められている。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉについての従来の診断試験は、特殊な生育要件およびこの細菌が生存可能であるが培養できない状態（ＶＮＣ）に入り得るので信頼性がない。以下の実験は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの定量検出についての５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイを説明するもので、遊離ＤＮＡおよび死細菌の露出ＤＮＡからのＰＣＲ信号を低減するために外部ＤＮａｓｅが添加される。
【００６３】
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株を血液寒天培地上に置き、４８時間培養液１．５ｍｌを、４℃で７分間、６０００ｘｇでペレット化し、洗い、水中に再懸濁し、ミクロ遠心分離チューブ内に移した。
【００６４】
培養液の熱処理後およびＤＮａｓｅ添加後の、室温でのＤＮＡ安定性への効果を調べた。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ型株の細胞１．７±０．８×１０７個（ＤＮａｓｅ有り）および５．０±０．６×１０７個（ＤＮａｓｅ無し）をこれらの実験において用いた。培養液は、２０℃、５５℃、７２℃および１００℃で５分間、および１２１℃で５分間インキュベートした。次に、１セットのチューブを室温でさらにインキュベートし、ＰＣＲ分析用の試料を、５分、１５分、３０分、１時間、６時間、２４時間、および５日間の間隔で取り去った。１０ＵのＲＱｌ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）と１ｘ  ＤＮａｓｅバッファを、室温でのインキュベーション前に別のチューブセットに添加した。アリコートは、５分、１５分、３０分、１時間、６時間および２４時間後に分析した。ＰＣＲ分析用に、それぞれの時点からの１０μｌアリコートからＤＮＡを精製し、それに続く５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイを以下で説明するように実行した。
【００６５】
ＤＮＡ単離
次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ  ＤｉｒｅｃｔＩ（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ，オスロ、ノルウェー）２００μｌを、細菌懸濁液に添加し、細菌−ビーズ懸濁液を６５℃で２０分間インキュベートし、続いて室温で２分間インキュベートした。次に、磁性ビーズと結合したＤＮＡを、磁石（ＭＰＣ（登録商標）−Ｅ，Ｄｙｎａｌ  ＡＳ，オスロ、ノルウェー）により２分間、マイクロ遠心チューブ壁に引き付けた。塩類、洗浄剤および細胞破壊片を含む上澄みを、Ｄｙａｎａｂｅａｄｓ／ＤＮＡ複合体を壊さないように慎重に取り去った。ビーズは洗浄バッファ（キットのバッファ２）で２回洗った。最後に、４０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０（キットのバッファ３）中に再懸濁し、６５℃で５分間インキュベートしてビーズからＤＮＡを取り去った。ＤＮＡから解放されたビーズを磁石で集め、ＤＮＡを含む上澄みを新しいチューブに移し、そのままＰＣＲにおいて用いた。
【００６６】
ＴａｑＭａｎプローブとプライマーデザイン
プローブ領域は、完成されたＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＮＣＴＣ１１１６８ゲノム配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ．Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ  ｊｅｊｕｎｉ．）中で位置決定した。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（商標）（バージョン１．０）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，  ＵＳＡ）を、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのガイドラインと共に、プライマー−プローブデザイン用に使用した。ＦａｓｔＡのＧＣＧバージョンは、他の既知の配列に対する配列類似を探すために用いた。
【００６７】
ＰＣＲフラグメント特異性
特定のＰＣＲプライマーおよびプローブを、Ｃ．Ｊｅｊｕｎｉ用にデザインした。プローブ領域は、特異性と増幅効率とを最適化するように選択した。第１に、推定プローブを、プライマー・エクスプレス・プログラムを用いて構築し、次に、これらのプローブを、ＥＭＢＬデータベース（リリース６０）中でＦａｓｔＡサーチ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９９１，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）の対象とした。公表されているＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＮＣＴＣ  １１１６８ゲノム配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ．Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ  Ｊｅｕｎｉ／）と関連する３８１１２１−３８１２０５の部位に位置する８６ｂｐフラグメントを、これらのスクリーニングにおいて同定した。このプローブ領域に対して有意な相同性を有する既知の配列は、ＥＭＢＬデータベース中には皆無であった。最も密接に関連する配列は５７．７％の同一性を有し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８の完全配列中の推定遺伝子ＹｏｎＯに位置していた。ＰＣＲプライマーは、部位３８１１２１−３８１１４４（フォワード）、および３８１２０５−３８１１８５（リバース）から構成される一方で、プローブは部位３８１１４６−３８１１８１に置かれる（表１）。
【００６８】
理論に基づいてプローブ領域を同定した後、選択したプライマーおよびプローブの特異性を実証的スクリーニングにかけた。基準株を含む、全部で３２のＣ．ｊｅｊｕｎｉの隔離集団を試験し、選択されたプライマーおよびプローブに対して特異的であることが見出された。プライマーおよびプローブの特異性を、１１の他の種の１３のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ株、および系統発生的に関係のあるまたは共通の食品媒介微生物および病原体の他の属に属する４１種の組に対して対照したところ、すべてネガティブであった。これらの実験において、精製したＤＮＡの品質は、一般的な１６５ｒＤＮＡ  ＰＣＲプライマーを用いた増幅により検証した。さらに、増幅プライマーのみによる定性的ＰＣＲを、選択した株について行った。これらの実験により、増幅プライマーがＣ  ｊｅｊｕｎｉについて特異的であることが確認された。非特異的ＰＣＲ産物は検出されなかった。試験した３２の隔離集団の間で偽ネガティブは全く記録されず、他のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、または他の属に属する株の間で偽ポジティブは全く記録されなかった。このことは、デザインされたプライマー−プローブセットの高い特異性を示している。さらに、増幅プライマー単独でもＣ．Ｊｅｊｕｎｉについて特異的であり、他の細菌からの標的の増幅による増幅プライマーについての競合に起因する混合集団中の潜在的なアーチファクトを回避している。
【００６９】
５’−ヌクレアーゼベースのＰＣＲアッセイ
増幅反応（５０μｌ）には、ＤＮＡ試料（１μｌ）、１ｘＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および４００μＭ  ｄＵＴＦ、０．０２μＭ  Ｃ．Ｊｅｊｕｎｉ特異的プローブ、０．３μＭ  Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的プライマー−下記の表１参照（各々）、１Ｕ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、および２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【００７０】
【表１】
0004340734.tif 000002
＊  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）プログラムによる最近隣アルゴリズムによって計算（プライマー濃度  ３００ｎＭ、プローブ濃度  ２０ｎＭ、塩濃度５５ｎＭ）。
【００７１】
ＰＣＲ試料および対照を３組調製した。反応チューブはＭｉｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌチューブで、チューブキャップはＭｉｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌキャップであった。すべての消耗品は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により供給された。
【００７２】
増幅前に、ＰＣＲ混合物を５分で５０℃まで加熱し、ＵＮＧに汚染ＰＣＲ産物をできるだけ破壊させ、さらに９５℃で１０分間加熱してテンプレートＤＮＡを変性した。増幅プロファイル：９５℃で２０秒間と６０℃で１分間を４０サイクル。反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００配列検出システム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で実行した。反応条件をプログラムし、データは、ＡＢＥプリズム（登録商標）７７００配列検出システムに直結させたパワー・マッキントッシュ４４００／２０（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で、製造メーカーにより記載されるようにＳＤＳ１．６．３アプリケーションソフトウェア（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。
【００７３】
ＰＣＲ産物は、染料標識したＣ．ｊｅｊｕｎｉ特異的ＤＮＡプローブからの蛍光増加を監視することにより直接検出した。ＴａｑＭａｎプローブは、５’−レポーター色素と３’−クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドで構成されていた。レポーター色素、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）はオリゴヌクレオチドの５’末端と共有結合されていた。レポーターの蛍光は、３’末端に位置するＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）によりクエンチされた。プローブが損なわれない場合には、クエンチャー色素へのリポーター色素の近接により、レポーター蛍光の抑制が生じた。もしプローブが切断されれば、レポーター色素およびクエンチャー色素は分離され、レポーター蛍光の増加が生じた。
【００７４】
増幅は、サイクル数に対してΔＲｎ（これは規格化したレポーター信号（レポーター信号からバックグラウンドを引いたもの）であった）としてプロットした。半対数プロットの直線領域の増幅曲線と交差するしきい信号を選択した。これによりしきいサイクル（ＣＴ）が与えられ、これは、各増幅プロットについて蛍光増加が最初に生じる場合のＰＣＲサイクルとして定義される。次に、種々の増幅を、それらの各々のしきいサイクルにより比較できた。ＣＴ値を対数入力ＤＮＡ／細胞に対してプロットすることにより、未知試料定量化用の検量線と、反応における増幅効率評価の可能性がもたらされた（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  １９９６，Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９６８−９９４；ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９７，Ｕｓｅｒ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００７５】
ＰＣＲ産物は、臭化エチジウム染色した２％アガロースゲルで検証した（ＳｅａＰｌａｑｕｅｓ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）、Ａｇａｒｏｓｅ、ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ，ＵＳＡ）。アガロースゲル電気泳動は本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋらが分子クローニング：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載している通りに実行した。
【００７６】
熱処理細胞中のＤＮＡ安定性に対する、外部添加ＤＮａｓｅの効果
外部添加したＤＮａｓｅの効果を、２０℃、５０℃、７２℃および１００℃で５分間、ならびに１２１℃で１５分間インキュベートした培地にＤＮａｓｅを全く添加しなかった対照試料と比較した。熱処理後の室温（２０℃）でのインキュベーションの時系列は、図３に示してある。
【００７７】
２０℃および５５℃でＤＮａｓｅ処理した試料と対照との間には違いがほとんど無かった（図３ＡおよびＢ）。５５℃でインキュベートした試料については、信号は、入力信号の１〜３％のところで比較的急速に安定化した（図３Ｂ）。７２℃、１００℃および１２１℃については、ＤＮａｓｅ添加の結果、ＤＮａｓｅ無しの対照と比較して、信号はほとんど瞬間的に１対数目盛減少した。信号のさらなる減少は、熱処理の２４時間後まで、対照についても、ＤＮａｓｅ処理試料についても全く観察されなかった（図３Ｃ、ＤおよびＥ）。
【００７８】
ＤＮａｓｅ処理の効果を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉからの精製ＤＮＡについても調査した。このＤＮＡは非常に速やかに分解され、３０分後には、投入材料の約０．０１％しか残らなかった。しかしながら、このフラクションは、処理後少なくとも２４時間安定と思われた（図３Ｆ）。
【００７９】
遊離ＤＮＡを選択的に分解するＤＮａｓｅの能力と、死細胞から生成された信号をさらに減少させる熱殺菌したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ中のＤＮＡの能力とをさらに調べた。２０または５５℃で、ＤＮａｓｅ処理試料と未処理試料との間に有意な差異は全くなかった。２０℃の実験により、無傷の細胞内のＤＮＡが外部添加されたＤＮａｓｅにより分解されず、信号減少を生じないことが示された。５５℃処理後に生存可能な細胞は全く回復できなかったけれども、この温度は、ＤＮＡを外部添加ＤＮａｓｅに曝露するのに十分であるとは思われなかった。７２、１００および１２１℃に加熱した試料については、ＤＮａｓｅ添加により、未処理試料と比較して、テンプレートの量がほとんど瞬間的に１対数目盛減少した。これらの温度については、殺した細胞中のＤＮＡの主要フラクションは、アッセイでは検出されなかった。結論として、死んだ細菌から生成されたノイズ信号を減少させるためにＤＮａｓｅ処理を適用することは、７２℃以上の温度で処理され、５分以上の適切な生死判別プローブのさらなる例である試料にとり有望と思われる。有機体が低温殺菌で殺され、低温殺菌後に導入された集団を分析することが望まれる場合には、これは特に有用であり得る。試験した他の温度では、煮沸、１００℃および缶詰製造、１２１℃のような、微生物を殺すための食品処理の代替的方法をシミュレーションした。
【００８０】
実施例４
さらなる一連の実験を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）を用いて行った。
【００８１】
ＴａｑＭａｎベースのＰＣＲアッセイ
増幅反応（５０μｌ）には、ＤＮＡ試料（１−５μｌ）、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファＡ、ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および４００μＭ  ｄＵＴＰ、０．１μＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プローブ、０．３μＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマー（各々）、および２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。ＰＣＲ試料と対照は、３組調製した。反応チューブはＭｉｃｒｏＡｍｐｓ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌチューブであり、チューブキャップはＭｉｃｒｏＡｍｐｓ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌキャップであった。すべての消耗品は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により供給された。増幅前に、ＰＣＲ混合物を９５℃まで１０分間加熱し、テンプレートＤＮＡを変性した。増幅プロファイル：９５℃で２０秒間と６０℃で１分間を４０サイクル。反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００配列検出システム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で実行した。
【００８２】
増幅は、サイクル数に対してΔＲｎ（これは規格化したレポーター信号（レポーター信号からバックグラウンドを引いたもの）であった）してプロットした。次に、半対数プロットの直線領域の増幅曲線と交差するしきい信号を選択した。これによりしきいサイクル（ＣＴ）が与えられ、これは、各増幅プロットについて蛍光増加が最初に生じる場合のＰＣＲサイクルとして定義される。次に、種々の増幅を、それらの各々のしきいサイクルにより比較できた。光活性化は、氷上で、６５０Ｗハロゲン電球を備えるＯＳＲＡＭ  ＳＬＧ１０００ランプ（ＯＳＲＡＭ、ノルウェー）を用い、１０ｃｍの距離で行った。
【００８３】
結果
ＤＮＡへのＥＭＡの共有結合のための時系列
２ｎｇ／μｇ、２０ｎｇ／μｇおよび１００ｎｇ／μｇの濃度のＥＭＡを、精製ＤＮＡに添加し、５秒、１５秒、４５秒、１分および３分間露光した。次に、テンプレートとして働き得るＤＮＡ量をリアルタイム定量ＰＣＲにより試験した。結合反応は約３０秒で完了し、試験した全濃度について、検出可能信号が約１２で得られるまで、ＰＣＲサイクル（ΔＣＴ）に差異があり、ＤＮＡへのＥＭＡの共有結合後に１／２１２＝０．０００２４４のフラクションがＰＣＲテンプレートとして働き得たことを示している。
【００８４】
ＥＭＡを光不活性化する時間
ＤＮＡに結合する前に、ＥＭＡを、５秒、１５秒、３０秒、４５秒、１分、３分および５分間露光した（１分間の光活性化）。２ｎｇ／μｌ、２０ｎｇ／μｌおよび１００ｎｇ／μｌのＥＭＡ濃度を試験した。対照と、ＤＮＡに結合する前に３０秒以上露光したＥＭＡについての試験試料との間には、有意な差異は全くなかった。このことは、ＥＭＡのＰＣＲ阻害能力が露光により急速に破壊されることを示す。
【００８５】
これは非常に有用な特性であり、ＥＭＡが死細胞に入り込んで核酸に結合するのに十分な時間の後に反応を露光することにより、その時点でシステムを効果的に「フリーズ」できることを意味する。これにより、結果をゆがめる遊離ＥＭＡに伴うと考えられるどのような問題も未然に回避される。
【００８６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５４株７５６［Ｍａｔｆｏｒｓｋ、ＡＳ、ノルウェー］についての生／死研究
この株は、７０％イソプロピルエタノールを用い３０分かけて殺した。１０ｎｇ／μｌおよび１００ｎｇ／μｌのＥＭＡを、生存可能対照および殺した細菌の双方に添加した。細菌を、３０秒、１分、５分、１０分、および１５分間、ＥＭＡに曝露した。１００ｎｇ／μｌに５分間曝露することにより最良の識別がもたらされ、生存可能細菌については約１サイクルの差異、殺した細菌については１０サイクル（１／２１０）の差異であった。未処理、すなわち生存可能細菌の場合、ＣＴはＥＭＡに曝露されなかった細菌については２０ＰＣＲサイクルであり、ＥＭＡに曝露された細菌については２１サイクルであったことを結果は示している。処理した、すなわち死細菌の場合、ＣＴはＥＭＡに曝露されなかった細菌については２０ＰＣＲサイクルであったが、ＥＭＡに曝露された細菌については３０であった。生存可能集団の染色の顕微鏡検査により、死細菌のフラクションがあったことが示され、対照とＥＭＡ処理細菌との間のわずかな差異がこれにより説明される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＥＭＡと接触させたＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の、ＥｔＢｒ染色アガロースゲル電気泳動分離の結果を示す。ｐｏｓ＝ＥＭＡ無し試料、ｎｅｇ＝ＤＮＡ無し試料、ｍｗ＝ラムダＢｓｔｅＩＩ切断分子量マーカー。
【図２】  ＥＭＡ処理した生菌からのＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の、ＥｔＢｒ染色アガロースゲル電気泳動分離の結果（Ａ）と、未処理試料に関してのＥＭＡ処理試料についての信号強度（Ｂ）とを示す。（Ｌ）＝未曝露かつ生菌、（Ｅ）＝エタノール処理、（Ｈ）＝熱処理および（Ｆ）＝ホルムアミド処理。（＋）＝ＥＭＡ添加、（−）＝ＥＭＡ無添加。
パネルＡ：臭化エチジウム染色（１０μｇ／ｍｌ）した増幅産物を、１％アガロースゲル上で、４５分間、１００ボルトで分離した。ｎｅｇ＝ＤＮＡ無し試料、ｍｗ＝ラムダＢｓｔｅＩＩ切断分子量マーカー。
パネルＢ：プログラムＧｅｌ−ＰｒｏＡＮＡＬＹＺＥＲソフトウェア（Ｍｅｄｉｃａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ．Ｍｄ．）を用い、信号強度を８ビットグレースケールのピクセル値として求めた。ＥＭＡ処理した試料についての相対的な信号強度は、未処理試料の百分率として与えられる。
【図３】  熱処理した細胞中のＤＮＡの安定性に対する、外部添加ＤＮａｓｅの効果を図示する。細胞は、ＤＮａｓｅ添加前に、（Ａ）２０℃、（Ｂ）５５℃、（Ｃ）７２℃、（Ｄ）１００℃、（Ｅ）１２１℃で、５分間（Ａ〜Ｄ）ないし１５分間（Ｅ）インキュベートした。ＤＮＡは、５’−ヌクレアーゼＰＣＲにより、ＤＮａｓｅ処理およびネガティブコントロールにおいて、５分、１５分、３０分、１時間、６時間、２４時間後に定量化した。ＤＮａｓｅ処理した精製ＤＮＡの安定性を調べた（Ｆ）。ＤＮａｓｅ処理有り（◆）および処理無し（□）のＤＮＡの量は、熱処理前の量に関して与えられている。エラーバーは標準偏差である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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