(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
0004238728.tif 000015
で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する前立腺癌治療剤。
【請求項２】
式（Ｉ）で表される化合物が、式（ＩＩ）
0004238728.tif 000016
で表される化合物である請求の範囲１に記載の前立腺癌治療剤。
【請求項３】
インビボにおける抗腫瘍作用を有することを特徴とする、請求の範囲１に記載の前立腺癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤（Ｔ細胞リンパ腫を除く）、ならびにヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法に関する。
背景技術
近年、患者の個人差を考慮した「オーダーメイド医療」が重要視され、薬剤が効く癌、効かない癌を識別するためのマーカー探索が必要とされている。これは、薬剤が効くという可能性をあらかじめ検証してから患者に投薬することによって、薬剤の奏効率をあげるとともに毒性を回避し、無意味な薬剤使用を抑制することで倫理的・医療的に薬剤治療のコストパフォーマンスを上昇させる試みである。また、癌治療においては、基礎研究と臨床の間の溝を埋める重要な手段となりうるため、抗癌剤の薬効を予測する方法の開発が望まれていた。
また、一般的に抗腫瘍活性を有するという報告のある物質や化合物において、当該報告がインビトロのみに基づく結果である場合、かかる結果はインビボでの結果の予測に直接つながらないことが指摘されている。すなわち、インビトロで抗腫瘍活性を示す物質が、インビボでも抗腫瘍活性を示すとは限らず、インビトロで抗腫瘍活性を示す物質をそのまま抗癌剤として適用することは困難であるという問題である。
例えば、式（ＩＩ）
0004238728.tif 000002
で表される化合物は、ヒストンデアセチラーゼを選択的に阻害することにより、強力な抗腫瘍活性を誘導することが報告されている（当該物質はさらにまた、該物質で処理した細胞にヒストンの高アセチル化を引き起こし、結果として、各種遺伝子の転写調節活性、細胞周期阻害活性およびアポトーシス阻害活性を誘導する（特公平７−６４８７２号公報、Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４１，１２６−１３３（１９９８））ことも報告されている）。しかしながら、該化合物の抗腫瘍効果を予測できる因子を立証した報告はなく、インビトロでの結果がそのままインビボでも適用できるのか否か、どの腫瘍に対してもインビボで有用な効果を示すのか否か、等解決すべき点が多く残されているのが現状である。
ヒストンデアセチラーゼは、活性中心にＺｎを配位したメタロ脱アセチル化酵素である（Ｍ．Ｓ．Ｆｉｎｎｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０１，１８８−１９３（１９９９））。本酵素は、各種アセチル化ヒストンのＤＮＡに対する親和性を変化させると考えられている。これによってもたらされる直接的な生物現象は、クロマチン構造変化である。クロマチン構造の最小単位は、ヒストン８量体（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４、各２分子、コアヒストン）に、１４６ｂｐのＤＮＡが１．８回左巻きに巻き付いたヌクレオソームである。コアヒストンは、各ヒストンタンパク質のＮ末の正電価がＤＮＡと相互作用することにより、ヌクレオソーム構造を安定化している。ヒストンのアセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼの関与するアセチル化反応とヒストンデアセチラーゼの関与する脱アセチル化反応の平衡関係により調節されている。ヒストンのアセチル化は、ヒストンタンパク質Ｎ末の進化的に良く保存されたリジン残基において起こり、これにより、コアヒストンタンパク質は、Ｎ末の電価を失い、ＤＮＡとの相互作用が減弱され、ヌクレオソームの構造が不安定になると考えられている。従って、ヒストンの脱アセチル化は、この逆、すなわちヌクレオソーム構造の安定化に向かうと考えられている。しかしながら、アセチル化が、どの程度クロマチン構造を変化させるのか、また、それによって２次的に誘導される転写調節等とどの様に関係しているのかについては、不明な点が多い。
発明の開示
本発明の目的は、新規前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤を提供することにある。さらに本発明の別の目的は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を評価、予測する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究を行った結果、インビボでもその抗腫瘍効果を確認し得る前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤を見出した。さらに本発明者らは、腫瘍の種類によって、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果が変動すること、さらに当該変動がある特定の遺伝子や蛋白質の発現状況の変化に連動して観察されることを見出し、かかる観察をもとにヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を評価する方法を確立して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）式（Ｉ）
0004238728.tif 000003
で表される化合物（以下、ＦＫ２２８とも称する；配列表配列番号５）、特に式（ＩＩ）
0004238728.tif 000004
で表される化合物（以下、ＦＲ９０１２２８とも称する）、またはその塩を有効成分として含有する前立腺癌治療剤、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療剤。
（２）インビボにおける抗腫瘍作用を有することを特徴とする、上記（１）に記載の前立腺癌治療剤、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療剤。
（３）ＦＫ２２８、特に式ＦＲ９０１２２８と製剤上許容される担体とを含有する前立腺癌治療用医薬組成物、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療用医薬組成物。
（４）インビボにおける抗腫瘍作用を有することを特徴とする、上記（３）に記載の前立腺癌治療用医薬組成物、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療用医薬組成物。
（５）有効量のＦＫ２２８、特に式ＦＲ９０１２２８を患者に投与することを含む前立腺癌またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫の治療方法。
（６）前立腺癌治療剤、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療剤の製造の為のＦＫ２２８、特に式ＦＲ９０１２２８の使用。
（７）前立腺癌治療剤、またはＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療剤がインビボで抗腫瘍作用を有するものである、上記（６）記載の使用。
（８）上記（３）に記載の前立腺癌治療用医薬組成物および当該医薬組成物を前立腺癌の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
（９）上記（３）に記載のＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫治療用医薬組成物および当該医薬組成物をＴ細胞リンパ腫以外の悪性リンパ腫の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
（１０）少なくとも、試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する工程と、該阻害剤の処理前ならびに処理後で該試験細胞における特定の遺伝子（または特定の蛋白質）の発現変化を測定し、両者の発現量を比較する工程とを含むことを特徴とする、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法。
（１１）特定の遺伝子がｐ２１遺伝子および／またはｃ−ｍｙｃ遺伝子である上記（１０）に記載のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法。
（１２）特定の蛋白質がｐ２１および／またはｃ−ｍｙｃである上記（１０）に記載のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法。
（１３）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が式ＦＫ２２８、特にＦＲ９０１２２８で表される化合物、またはその塩である、上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の抗腫瘍効果の評価方法。
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の抗腫瘍効果の評価方法を用いることを特徴とする、部位特異的な抗腫瘍活性を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
（１５）ＦＫ２２８の薬効予測の指標となり得る遺伝子を得る方法であって、少なくとも、
▲１▼ＦＫ２２８感受性腫瘍細胞およびＦＫ２２８抵抗性腫瘍細胞をＦＫ２２８で処理する工程、
▲２▼上記工程▲１▼で発現が増加、あるいは減少する遺伝子を選択する工程、
▲３▼上記工程▲２▼で選択された遺伝子について、さらに
（ｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が増加し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、
（ｉｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が増加し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子、
（ｉｉｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が減少し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは
（ｉｖ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が減少し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子を選択する工程
を含む方法。
発明の詳細な説明
本発明の前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤は、有効成分として式（Ｉ）で表される化合物（ＦＫ２２８）またはその塩を含む。式（Ｉ）化合物の中でも、好ましくは式（ＩＩ）で表される立体異性体である化合物（ＦＲ９０１２２８）である。これらの化合物は強力なヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有し（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ら；上述（１９９８））、特にＦＲ９０１２２８の方がより強いヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有することから、好適に本発明の前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤に含められる。
本明細書中、特に断りのない限り、単にＦＫ２２８という場合には式（ＩＩ）で表される化合物も含む、立体異性を問わない化合物群を意味する。
ＦＫ２２８またはその塩は、公知の物質であり、入手可能である。例えば、ＦＫ２２８の立体異性体の一つであるＦＲ９０１２２８は、それを生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株を好気性条件下に培養、当該培養ブロスから当該物質を回収することによって得ることができる。ＦＲ９０１２２８を生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株としては、例えばクロモバクテリウム・ビオラセウムＷＢ９６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６８）が挙げられる。ＦＲ９０１２２８はより具体的には特公平７−６４８７２号（対応米国特許４９７７１３８号）公報に記載のとおりにして当該生産菌から得ることができる。ＦＲ９０１２２８は、より容易に入手できるという点で、ＦＲ９０１２２８を生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株からの回収が好ましいが、さらなる精製工程が不要あるいは少なくてすむという点で、合成あるいは半合成のＦＲ９０１２２８もまた有利である。同様にＦＲ９０１２２８以外のＦＫ２２８についても、従来公知の方法により半合成、全合成することができる。より具体的にはＫｈａｎ  Ｗ．Ｌｉ，らによって報告されている方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１１８，７２３７−７２３８（１９９６））に準じて製造することができる。
ＦＫ２２８の塩は生物学的に許容される通常無毒の塩であり、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸・スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩または酸付加塩が挙げられる。
ＦＫ２２８は、不斉炭素原子および二重結合に基づく光学異性体または幾何異性体等の立体異性体を有することがあるが（例えばＦＲ９０１２２８）、これらすべての異性体及びそれらの混合物もこの発明の範囲に含まれる。
さらに、ＦＫ２２８、ＦＲ９０１２２８またはそれらの塩の溶媒和化合物（例えば包接化合物（例えば水和物等））もこの発明の範囲に含まれる。
本発明において、インビボ、インビトロとは通常、当分野で用いられている用語どおりであり、すなわち、「インビボ」とは、対象とする生体の機能や反応が生体内で発現される状態を意味し、「インビトロ」とは当該機能や反応が試験管内（組織培養系、細胞培養系、無細胞系等）で発現されることを意味する。
本発明の対象となる腫瘍は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるＦＫ２２８が抗腫瘍効果を発揮する腫瘍であり、インビボでの効果が特に顕著な前立腺癌ならびに悪性リンパ腫が挙げられる。本発明の悪性リンパ腫治療剤が抗腫瘍効果を発揮する悪性リンパ腫は、好ましくはＢ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫等のＴ細胞リンパ腫以外のものである。本発明は特にこれらの腫瘍に対し、インビボで、良好な抗腫瘍効果を示す。
本発明の前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤は、有効成分としてのＦＫ２２８またはその塩を、経口または非経口適用に適した有機または無機の担体または賦形剤との混合物として含有する固体、半固体または液体形態の医薬製剤の形で使用できる。該活性成分は、例えば、散剤、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル剤、スプレー剤、その他の使用に適した形態用の、通常の、無毒性で、医薬として許容しうる担体と混ぜ合わせることができる。更に、必要ならば、助剤、安定剤、増粘剤等を使用してもよい。これらの担体、賦形剤は必要に応じて無菌化処理を施したものを使用してもよく、また製剤化した後に無菌化処理を行うこともできる。ＦＫ２２８またはその塩は、抗腫瘍効果を生じるのに十分な量を当該前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤に含ませればよい。
該薬剤をヒトに適用するには、静脈内、筋肉内または経口投与によってこれを適用するのが好ましい。有効成分であるＦＫ２２８またはその塩の治療上有効な用量は、処置すべき個々の患者の年齢および状態、ならびに癌の種類や、悪性リンパ腫の種類によっても相違するが、通常、静脈内投与の場合には、ヒトの体表面積ｍ２あたりＦＫ２２８の量で１日量０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇ、更に好ましくは５〜３０ｍｇを投与して腫瘍を処置する。
本発明はまた、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法を提供する。当該方法を用いれば、標的とする腫瘍細胞において抗腫瘍効果を発揮することができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、実際に人体に投与することなく見出すことが可能となる。
「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」とは、ヒストンデアセチラーゼの活性部位に基質と競合して結合する化合物、またはヒストンデアセチラーゼの活性部位とは別の部位に結合してヒストンデアセチラーゼの酵素活性を変える作用を有する化合物を意図し、既にヒストンデアセチラーゼ阻害剤として、その用途が公知の化合物を含め、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有することが報告されている全ての化合物（合成、天然を問わない）ならびに今後報告されるであろう全ての化合物を含む。具体的には、上述のＦＫ２２８またはその塩やその誘導体（例えば、ＦＫ２２８をアセチル化したものやＳ−Ｓ結合を還元したチオール体等）が挙げられる。さらにトリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）、ＭＳ−２７５、Ｃｙｃｌｉｃ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ−ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｔｒａｐｏｘｉｎ等もヒストンデアセチラーゼ阻害活性が報告されている化合物である。
本発明のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法は、少なくとも（ｉ）試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する工程と、（ｉｉ）該阻害剤の処理前ならびに処理後で該試験細胞における特定の遺伝子および／または蛋白質の発現変化を測定し、両者の発現量を比較する工程とを含む。以下各工程毎に詳細に説明する。
（ｉ）試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する工程
本工程はヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含有する溶液中で試験細胞を培養する工程である。
本発明において使用する試験細胞としては、ヒストンデアセチラーゼを有する細胞であれば特に限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果、特に該阻害剤の腫瘍部位特異性を評価することも本発明の課題の一つであることから、使用する試験細胞は、その効果を調べたい腫瘍由来の細胞であることが好ましい。例えば、前立腺癌への効果を評価する場合には、ヒト前立腺培養癌細胞であるＰＣ−３細胞等が用いられ、腎臓癌への効果を評価する場合には、ヒト培養腎臓癌細胞であるＡＣＨＮ細胞等が用いられる。これらの癌細胞を含め試験細胞として使用する各種培養ヒト癌細胞は、市販されているかあるいは、種々の細胞バンク等から入手可能である。また、長期的な治療効果、あるいは個々の患者に対する有効性、すなわちオーダーメイド医療を鑑みる上で、患者の腫瘍から得られ得る癌細胞を培養し、当該癌細胞を試験細胞として用いることも可能である。
本工程で使用するヒストンデアセチラーゼ阻害剤とは上述の通りである。
試験細胞とヒストンデアセチラーゼ阻害剤の処理条件は、当該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果が発揮されるに十分な条件下で実施されれば特に限定はなく、使用する試験細胞の種類や試験するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の種類や量等の要因により適宜設定される。
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を溶液にするための溶媒はヒストンデアセチラーゼ阻害剤を溶解することが可能で、且つ、試験細胞に対し毒性を示さない限り特に制限はなく、通常、エタノール、ＰＥＧ４００、１０％ＨＣＯ−６０溶液、ジメチルスルホキシド等、およびそれらの混合溶媒等で濃縮液を調製してから、培養液や生理的緩衝液等で所望の濃度に希釈して使用する。溶液中のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．００１〜１０００ｎＭ、好ましくは０．０１〜１００ｎＭ、特に好ましくは０．１〜１０ｎＭであり、場合によっては、段階的に希釈し、希釈系列を作成し、それを用いることもある。
本発明の評価方法において、試験細胞を播種する個数は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤との処理時間等により適宜増減可能であるが、通常、培養液１ｍＬあたり１×１０３〜１×１０６個、好ましくは１×１０４〜１×１０５個程度である。
試験細胞とヒストンデアセチラーゼ阻害剤の処理時間（培養時間）は、該試験細胞や、該阻害剤の種類や濃度、その他の培養条件により適宜設定され、また、評価の目的によっても異なり、通常１〜１００時間、好ましくは１〜７２時間である。また長期的な持続性のある抗腫瘍効果を確認したい場合には、比較的長めの処理時間が設けられる。該試験細胞は、通常、３７℃、５％ＣＯ２＋９５％Ｏ２存在下で処理（培養）される。
（ｉｉ）該阻害剤の処理前ならびに処理後で該試験細胞における特定の遺伝子および／または蛋白質の発現変化を測定し、両者の発現量を比較する工程
本工程は、試験細胞における特定の遺伝子および／または特定の蛋白質の発現量を観察することができるあらゆる方法により実施することができる。例えば以下のような手順が挙げられる。
▲１▼ヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する前の試験細胞から、遺伝子、特にｍＲＮＡ、または蛋白質を抽出する。
▲２▼上記（ｉ）試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する工程、の項で詳述したように、試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で所定時間処理培養した後、当該処理細胞から上記▲１▼と同様にして遺伝子、特にｍＲＮＡ、または蛋白質を抽出する。
▲３▼特定の遺伝子（または特定の蛋白質）に特異的に親和性を有する物質を用いて、該特定の遺伝子（または特定の蛋白質）の存在を検出する。ここで、特定の遺伝子（または特定の蛋白質）としては、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の処理前後でその発現量に変化があり、且つかかる発現量の変化と、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の有する抗腫瘍効果とに相関関係のあるものであり、具体的にはｐ２１遺伝子（蛋白質）やｃ−ｍｙｃ遺伝子（蛋白質）が挙げられる。ｐ２１遺伝子は細胞周期の進行抑制に関与する細胞周期の調節遺伝子であり、その産物はサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体の活性を阻害し、細胞周期の進行をブロックすることが知られている。ｃ−ｍｙｃ遺伝子は核内蛋白質をコードしており、その遺伝子発現は細胞増殖、細胞分化および癌化に伴い顕著に変化する。このことから、その遺伝子産物の細胞増殖への関与が注目されている。
本発明において測定する特定の遺伝子（または特定の蛋白質）は、１種類の測定でも充分に有用であるが、より詳細な抗腫瘍効果を知る必要がある場合には、２種以上の特定の遺伝子（または特定の蛋白質）を同時に測定することが好ましい。
特定の遺伝子または特定の蛋白質に特異的に親和性を有する物質としては、それらの試験細胞中での発現が検出できる程度の感度を有するものであれば特に制限されない。ここで、「特異的親和性」とは目的の遺伝子または蛋白質にのみハイブリダイズまたは結合する性質を意味する。特定の遺伝子を検出するための当該物質としては、当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいるものが挙げられる。具体的には当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。かかる物質は当該遺伝子との特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらはまた蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。特定の蛋白質を検出するための当該物質としては、例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体またはその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体またはその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。これらの抗体またはその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
試験細胞からの遺伝子、特にｍＲＮＡの抽出、ならびに蛋白質の抽出は、当分野で通常実施されている方法を用いて、また適宜組み合わせて実施することができる。ｍＲＮＡを抽出した場合には、上記した特定の遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いてノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ法等の当分野で通常行なわれる手法を用いてその発現状況を調べる。一方、蛋白質を抽出した場合には、上記した特定の蛋白質に特異的親和性を有する物質（抗体またはその断片等）を用いてイムノブロット、ウエスタンブロット等の当分野で通常行なわれる手法を用いてその発現状況を調べる。
かくして、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を処理する前と処理した後での試験細胞における特定の遺伝子（または特定の蛋白質）の発現状況の変化を測定し、両者を比較することにより、試験したヒストンデアセチラーゼ阻害剤が試験した試験細胞に効果的に抗腫瘍活性を示すか否かを判断することができる。ｐ２１遺伝子（または蛋白質）を指標とした場合、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理することによりその発現量が増加した場合に、該阻害剤はその試験細胞が由来する腫瘍に対し抗腫瘍効果を有すると判断する。また、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（または蛋白質）を指標とした場合、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理することによりその発現量が減少した場合に、該阻害剤はその試験細胞が由来する腫瘍に対し抗腫瘍効果を有すると判断する。臨床的に腫瘍細胞を患者から採取したものを試験細胞として用いた場合には、個々の患者による個体特異性をも反映した抗腫瘍効果の予測が可能となる。
本発明では、上述したようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法を利用して、腫瘍の部位（種類）特異的な抗腫瘍活性を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供することができる。対象となる腫瘍由来の試験細胞を用い、また、その効果を調べようとするヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理し、上述の方法に従ってその抗腫瘍効果の有無を調べることにより、個々の阻害剤の腫瘍の部位特異性を判断することができる。
さらに本発明はＦＫ２２８の薬効を予測する指標となる遺伝子を得る方法を提供する。かかる方法により得られる遺伝子（群）の発現状況を解析することにより、ＦＫ２２８がその治療に有用であるか否か、あるいは対象とする癌がＦＫ２２８に有効であるか否か等の情報を得ることができ、「オーダーメイド医療」に貢献することが可能となる。
当該方法は具体的には以下のようにして行う。
▲１▼ＦＫ２２８感受性腫瘍細胞およびＦＫ２２８抵抗性腫瘍細胞をＦＫ２２８で処理する工程
ここでＦＫ２２８感受性腫瘍細胞とは、ＦＫ２２８によって腫瘍細胞の増殖が抑制され得るタイプの腫瘍細胞をいい、例えば、後述する実施例からも示されるように前立腺癌細胞ＰＣ−３が挙げられる。また、他に胃癌の細胞であるＳＣ−６もＦＫ２２８感受性腫瘍細胞の１種である。一方ＦＫ２２８抵抗性腫瘍細胞とは、ＦＫ２２８による腫瘍細胞の増殖抑制が認められず、ＦＫ２２８では腫瘍への抑制効果が得られないタイプの腫瘍細胞をいい、例えば、後述する実施例からも示されるように腎臓癌細胞ＡＣＨＮが挙げられる。また、他に腎臓癌細胞であるＡ４９８もＦＫ２２８抵抗性腫瘍細胞の１種である。
かかる腫瘍細胞のＦＫ２２８での処理については、上記した「試験細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する工程」と同様な手順で行うことができる。
▲２▼上記工程▲１▼の処理によってその発現が増加、あるいは減少する遺伝子を選択する工程
当該遺伝子を選択する工程も、本明細書中に記載される各技術ならびに当分野で通常実施される方法を用いて行うことができる。。好ましくは、一度に大量の遺伝子の発現状況が解析できるという利点から遺伝子チップを用いた技術を用いる。
▲３▼上記工程▲２▼で選択された遺伝子について、さらに
（ｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が増加し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、
（ｉｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が増加し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子、
（ｉｉｉ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が減少し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは
（ｉｖ）ＦＫ２２８での処理によりその発現が減少し、且つＦＫ２２８感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子
を選択する工程
すなわち当該工程は、ＦＫ２２８で処理することによりその発現に増加、あるいは減少の何らかの変化を生じ、且つＦＫ２２８に感受性であるか否かでその発現状況が異なる遺伝子を選択する工程であって、かかる遺伝子（群）の発現状況を解析することは、ＦＫ２２８を投与することなくＦＫ２２８の薬効を予測する有力な手段となり得る。
遺伝子の発現の増減を調べる方法も当分野で通常実施される方法を用いて行うことができ、本明細書中にも記載される各技術を用いて行う。好ましくは、一度に大量の遺伝子の発現状況が解析できるという利点から遺伝子チップを用いた技術を用いる。
実施例
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）薬剤調製
ＦＲ９０１２２８を必要量計り、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）を加え、超音波をかけ溶解する。陽性対照物質パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）は、試験に先立って２４ｍｇ／ｍＬとなるようＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／ｅｔｈａｎｏｌ（１：１）液に溶解し、冷蔵保存した。用時、９倍量の生理食塩水を加えて希釈し２．４ｍｇ／ｍＬ（溶媒成分：５％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ−５％ｅｔｈａｎｏｌ−９０％ｓａｌｉｎｅ）とした。
（２）実験動物
薬剤の抗腫瘍試験には、日本チャールスリバーよりＢＡＬＢ／ｃＡＮｎＮＣｒｊ−ｎｕ／ｎｕマウス（雄、６週齢）を購入し、一週間以上の馴化飼育の後、実験に用いた。マウスはＳＰＦ環境下飼育し、水と餌を自由に摂取させた。
（３）実験腫瘍
ヒト培養前立腺癌細胞株（ＰＣ−３：財団法人癌研究会癌化学療法センター基礎部より入手）を２〜３×１０７個、ヌードマウス皮下に移植し、増殖した固形腫瘍を３代以上継代後、実験に用いた。
（４）実験移植および群分け
ヌードマウスで継代した固形腫瘍を、約３ｍｍ角の腫瘍組織片としてマウスの右背部皮下に移植した。腫瘍移植後、腫瘍体積（１／２×長径×短径２）が１００〜３００ｍｍ３に達した時点で、１群を６匹に、腫瘍のばらつきが無くなるように群分けした。
（５）投与
投与は群分け当目（Ｄａｙ０）に開始した。ＦＲ９０１２２８投与群には４日毎に３回（ｑ４ｄ×３）、ＦＲ９０１２２８を静脈内投与した（３．２および１．８ｍｇ／ｋｇ）。陽性対照物質パクリタキセル投与群は５日間連続（ｑｄ×５）でパクリタキセルを静脈内投与した（２４ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）のみを投与した（ｑ４ｄ×３）。各投与液量は０．１ｍＬ／１０ｇ体重を投与日に測定した体重をもとに算出した。なお、ＦＲ９０１２２８の３．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑ４ｄ×３）およびパクリタキセルの２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑｄ×５）はそれぞれの最大許容摂取量（ＭＴＤ；Ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）である。
（６）腫瘍サイズおよび体重の測定
腫瘍サイズ（長径、短径）および体重をＤａｙ０より週２回測定した。
（７）抗腫瘍効果の評価
腫瘍の増殖程度は腫瘍増殖率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）により評価した。増殖抑制率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。抗腫瘍効果の判定は薬剤の投与開始から１４目目（Ｄａｙ１４）について行い、対照群（溶媒投与）の腫瘍増殖率に対する薬剤投与群の比（Ｔ／Ｃ％）が５０％以下であり、かつ、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔで有意差（Ｐ＜０．０１）がある場合を有効とした。
結果を図１に示す。ＦＲ９０１２２８はインビボにおいて、ヒト前立腺癌に対する抗腫瘍効果を示した。
実施例２
（１）薬剤調製
ＦＲ９０１２２８を必要量計り、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）を加え、超音波をかけ溶解する。
（２）実験動物
薬剤の抗腫瘍試験には、日本クレアよりＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ＳＣＩＤ．Ｊｃｌマウス（雄、６週齢）を購入し、一週間以上の馴化飼育の後、実験に用いた。マウスはＳＰＦ環境下飼育し、水と餌を自由に摂取させた。
（３）実験腫瘍
ヒト培養リンパ腫細胞株（Ｕ９３７：蓑和田先生、林原生物化学研究所より入手）をＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ含有）で培養し、インビトロで継代した。
（４）実験移植および群分け
マウスにシクロホスファミド（塩野義製薬）を１５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与した。翌日インビトロで継代したリンパ腫をマウスの腹腔内に１×１０７個移植した。腫瘍移植翌日、１群を６匹（コントロール群１２匹）に、体重のばらつきがなくなるように群分けした。
（５）投与
投与は群分け当日（Ｄａｙ０）に開始した。ＦＲ９０１２２８投与群には週１または２回、ＦＲ９０１２２８を腹腔内に投与した（０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）のみを投与した。
（６）評価
抗腫瘍効果として、マウスの生存日数を測定した。
結果を図２に示す。図２（ａ）は、ＦＲ９０１２２８を週１で、図２（ｂ）はＦＲ９０１２２８を週２で投与した場合の結果である。ＦＲ９０１２２８はインビボにおいて、ヒトリンパ腫に対する抗腫瘍効果を示した。
実施例３
（１）薬剤調製
ＦＲ９０１２２８を必要量計り、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）を加え、超音波をかけ溶解する。陽性対照物質パクリタキセルは、試験に先立って２４ｍｇ／ｍＬとなるようＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／ｅｔｈａｎｏｌ（１：１）液に溶解し、冷蔵保存した。用時、９倍量の生理食塩水を加えて希釈し２．４ｍｇ／ｍＬ（溶媒成分：５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ−５％ｅｔｈａｎｏｌ−９０％ｓａｌｉｎｅ）とした。
（２）実験動物
薬剤の抗腫瘍試験には、日本チャールスリバーよりＢＡＬＢ／ｃＡＮｎＮＣｒｊ−ｎｕ／ｎｕマウス（雄、６週齢）を購入し、一週間以上の馴化飼育の後、実験に用いた。マウスはＳＰＦ環境下飼育し、水と餌を自由に摂取させた。
（３）実験腫瘍
ヒト培養腎臓癌細胞株１系（ＡＣＨＮ：ＡＴＣＣより入手）、ヒト培養前立腺癌細胞株１系（ＰＣ−３：ＡＴＣＣより入手）を２〜３×１０７個ヌードマウス皮下に移植し、増殖した固形腫瘍を３代以上継代後、実験に用いた。
（４）実験移植および群分け
ヌードマウスで継代した固形腫瘍を、約３ｍｍ角の腫瘍組織片としてマウスの右背部皮下に移植した。腫瘍移植後、腫瘍体積（１／２×長径×短径２）が１００〜３００ｍｍ３に達した時点で、１群を６匹に、腫瘍のばらつきが無くなるように群分けした。
（５）投与
投与は群分け当日（Ｄａｙ０）に開始した。ＦＲ９０１２２８投与群には４日毎に３回（ｑ４ｄ×３）、ＦＲ９０１２２８を静脈内投与した（３．２および１．８ｍｇ／ｋｇ）。陽性対照物質パクリタキセル投与群は５日間連続（ｑｄ×５）でパクリタキセルを静脈内投与した（２４ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）のみを投与した（ｑ４ｄ×３）。各投与液量は０．１ｍＬ／１０ｇ体重を投与日に測定した体重をもとに算出した。なお、ＦＲ９０１２２８の３．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑ４ｄ×３）およびパクリタキセルの２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑｄ×５）はそれぞれのＭＴＤ量である。
（６）腫瘍サイズおよび体重の測定
腫瘍サイズ（長径、短径）および体重をＤａｙ０より週２回測定した。
（７）抗腫瘍効果の評価
腫瘍の増殖程度は腫瘍増殖率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）により評価した。増殖抑制率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。抗腫瘍効果の判定は薬剤の投与開始から１４日目（Ｄａｙ１４）について行い、対照群（溶媒投与）の腫瘍増殖率に対する薬剤投与群の比（Ｔ／Ｃ％）が５０％以下であり、かつ、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔで有意差（Ｐ＜０．０１）がある場合を有効とした。
結果を図３に示す。ＦＲ９０１２２８は３．２ｍｇ／ｋｇの投与量でＰＣ−３に強い抗腫瘍作用を示した（図３（ａ））が、ＡＣＨＮ（図３（ｂ））に対して抗腫瘍作用を示さなかった。
実施例４
（１）薬剤調製
ＦＲ９０１２２８を必要量計り、溶媒（９９．５％エタノール）で１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。その後、培養液で希釈した。
（２）実験腫瘍
ヒト培養癌細胞（ＰＣ−３およびＡＣＨＮ）はＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）中で培養した。
（３）培養およびＲＮＡ抽出
細胞を培養皿あたり２×１０６個播種し、ＦＲ９０１２２８（５ｎｇ／ｍＬ）存在下で所定時間培養した。培養後、ＴＲＩＺＯＬ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、操作説明書に従いＲＮＡを抽出した。
（４）リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡはＴａｑ−ｍａｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用い操作説明書に従い逆転写した。その後、ｐ２１遺伝子はＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＡＴＴ−３’（ｐ２１  ｕｐｓｔｒｅａｍ）（配列表配列番号１）、５’−ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列表配列番号２）を用い操作説明書に従い増幅し、ＡＢＩ  ７７００  ＰＲＩＳＭ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で検出した。ｐ２１遺伝子の発現量は，標準曲線より算出し，さらにβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を内部標準として，β−ａｃｔｉｎ遺伝子発現量で除して標準化した相対発現量として表した。
結果を図４に示す。インビトロでＦＲ９０１２２８を接触させることにより経時的にＰＣ−３（図４（ａ））のｐ２１遺伝子発現上昇が見られた。一方ＡＣＨＮではｐ２１遺伝子の発現上昇が見られなかった（図４（ｂ））。また、無処置時において、ＰＣ−３においてはｐ２１遺伝子はほとんど発現していないが、ＡＣＨＮにおいてはｐ２１遺伝子の発現が見られた（図４（ｃ））。
実施例５
ヌードマウスの皮下にヒト前立腺癌ＰＣ−３または腎臓癌ＡＣＨＮを移植し腫瘍の大きさが１００〜３００ｍｇに達した時点でＦＲ９０１２２８  ３．２ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。経時的に腫瘍を摘出し、ＲＮＡを抽出後実施例４と同様、リアルタイムＰＣＲでｐ２１遺伝子およびｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を調べた。尚、ｃ−ｍｙｃ遺伝子はＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  Ａ−３’（ｈｕｍａｎ  ｃ−ｍｙｃ  ｕｐｓｔｒｅａｍ）（配列表配列番号３）、５’−ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  Ｔ−３’（ｈｕｍａｎ  ｃ−ｍｙｃ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）（配列表配列番号４）を用い操作説明書に従い増幅し、ＡＢＩ  ７７００  ＰＲＩＳＭ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で検出した。
結果を図５に示す。インビボにおいて、ＰＣ−３はＦＲ９０１２２８投与後３時間後をピークにｐ２１遺伝子の発現上昇が見られた（図５（ａ））。一方ＡＣＨＮではｐ２１遺伝子の発現上昇がみられなかった（図５（ａ））。ｃ−ｍｙｃ遺伝子はＰＣ−３で発現の低下が見られたが、ＡＣＨＮでは発現の上昇が見られた（図５（ｂ））。
実施例６：遺伝子チップによるＦＫ２２８の腫瘍細胞における遺伝子発現解析
（インビトロ）
ＦＫ２２８のヒト腫瘍細胞におけるインビトロでの遺伝子発現に及ぼす効果を、遺伝子チップを用い解析した。
〈材料・手順〉
（１）実験材料
0004238728.tif 000005
0004238728.tif 000006
（２）細胞調製とＲＮＡ抽出
Ｆ７５フラスコでコンフルエントになったヒト腫瘍細胞（ＰＣ−３、Ｕ９３７、ＡＣＨＮ）をトリプシン処理により単一細胞の懸濁液にし、Ｆ７５フラスコ５本に播種し２４時間培養した。培養液を捨てて、新鮮な培養液１８ｍＬおよび１０倍濃度（５０ｎｇ／ｍＬ）のＦＲ９０１２２８溶液２ｍＬを加え、所定時間（０、１、３、１２および２４時間）３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。培養終了後、培養液を捨ててＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを定量し、電気泳動で確認した。
（３）ｃＲＮＡの合成
ＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第２章〜第４章、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔおよびＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアルに従い、ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡの合成、ｃＲＮＡの断片化を行った。
（４）ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニング
ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニングはＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第５章〜第７章に従って行った。
（５）解析
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（マイクロアレイデータ解析ソフト：Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて解析を行った。
〈結果〉
ＦＫ２２８感受性腫瘍細胞であるヒト前立腺癌ＰＣ−３およびヒトリンパ腫Ｕ９３７、ならびにＦＫ２２８抵抗性腫瘍細胞であるヒト腎臓癌ＡＣＨＮをインビトロにおいてＦＫ２２８に経時的に接触させ、その後ＲＮＡを抽出し、ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて検索可能な７０７０遺伝子についてＦＫ２２８によって発現が変化する遺伝子を調べた。これらの遺伝子について以下の手順に従った解析を行った。
解析１：ヒストンデアセチラーゼ阻害によって発現が変化する遺伝子の選択
ＦＫ２２８によって発現が変化する遺伝子の絞込みの条件として発現が直線的に変化する遺伝子を選択した（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇの解析条件：全ての時間で０．５倍以上または０．５倍以下、その発現が変化する遺伝子）。
解析２：薬効に関与する遺伝子の選択
ＦＫ２２８と７２時間接触させた場合のＰＣ−３、Ｕ９３７およびＡＣＨＮに対する増殖抑制効果はＩＣ５０値でそれぞれ３．１７、３．２０および４．２５ｎｇ／ｍＬで、これらの腫瘍細胞に対してほぼ同程度の増殖抑制効果を示した。当該結果から増殖抑制に関する遺伝子は全ての細胞で共通に発現が変化することが考えられた。これら３種類のヒト腫瘍細胞で共通して発現が上昇する遺伝子を１０５遺伝子、共通して減少する遺伝子を１００遺伝子見出した。
実施例７：遺伝子チップによるＦＫ２２８の腫瘍細胞における遺伝子発現解析
（インビボ）
ＦＫ２２８のヒト腫瘍細胞におけるインビボでの遺伝子発現に及ぼす効果を、遺伝子チップを用い解析した。
〈材料・手順〉
（１）実験材料
0004238728.tif 000007
0004238728.tif 000008
0004238728.tif 000009
（２）細胞調製とＲＮＡ抽出
ヌードマウスの皮下に３ｍｍ角の腫瘍片（ＰＣ−３、ＳＣ−６、ＡＣＨＮ、Ａ４９８）を移植し、腫瘍の大きさがおよそ１００ｍｇ（長径９ｍｍ、短径８ｍｍ）になった時点でＦＲ９０１２２８  １０ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。ＦＲ９０１２２８投与後０、０．５、１、２および４時間後に腫瘍を摘出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを定量し、電気泳動で確認した。
（３）ｃＲＮＡの合成
ＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第２章〜第４章、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔおよびＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアルに従い、ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡの合成、ｃＲＮＡの断片化を行った。
（４）ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニング
ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニングはＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第５章〜第７章に従って行った。
（５）解析
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（マイクロアレイデータ解析ソフト：Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて解析を行った。
〈結果〉
ヒト前立腺癌ＰＣ−３、ヒト胃癌ＳＣ−６、ヒト腎臓癌ＡＣＨＮおよびヒト腎臓癌Ａ４９８担癌マウスにＦＲ９０１２２８  １０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し経時的（０、０．５、１、２および４時間）に腫瘍を摘出し、その後ＲＮＡを抽出しＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて検索可能な７０７０遺伝子についてＦＲ９０１２２８によって発現が変化する遺伝子を調べた。
ヒト前立腺癌ＰＣ−３、ヒト胃癌ＳＣ−６、ヒト腎臓癌ＡＣＨＮおよびヒト腎臓癌Ａ４９８の、ＦＲ９０１２２８  ３．２ｍｇ／ｋｇを投与した際の増殖抑制率はそれぞれ９８％、８４％、２０％および２９％であることから、ＰＣ−３およびＳＣ−６をＦＫ２２８感受性腫瘍、ＡＣＨＮおよびＡ４９８をＦＫ２２８抵抗性腫瘍とした。
実施例８：ＦＫ２２８感受性腫瘍ならびにＦＫ２２８抵抗性腫瘍における遺伝子発現様式
実施例７でその感受性あるいは抵抗性が確認された腫瘍における遺伝子発現様式とＦＫ２２８の薬効との相関関係を調べた。実施例６のインビトロ試験において判明したＦＫ２２８処理によりその発現が上昇する遺伝子（１０５個）と発現が減少する遺伝子（１００個）に注目し、それらの遺伝子と薬効に相関があるか検討した。さらに感受性腫瘍で発現が高く抵抗性腫瘍で発現が低い、または感受性腫瘍で発現が低く抵抗性腫瘍で発現の高い遺伝子があるかを調べた。その結果、インビトロでＦＲ９０１２２８処理により発現が上昇する１０５個の遺伝子のうち、感受性腫瘍で発現が高く抵抗性腫瘍で発現が低い遺伝子が６個、感受性腫瘍で発現が低く抵抗性腫瘍で発現の高い遺伝子を４個見出した（表１）。また、インビトロでＦＲ９０１２２８処理により発現が減少する１００個の遺伝子のうち、感受性腫瘍で発現が高く抵抗性腫瘍で発現が低い遺伝子が４個、感受性腫瘍で発現が低く抵抗性腫瘍で発現の高い遺伝子を９個見出した（表２）。
0004238728.tif 000010
0004238728.tif 000011
これらの遺伝子は、ＦＫ２２８の薬効との相関性、ならびにＦＫ２２８への感受性あるいは抵抗性との相関性が示唆される遺伝子であり、これらの遺伝子が薬効予測マーカーとして利用できる可能性が示された。
産業上の利用分野
ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有するＦＫ２２８（特にＦＲ９０１２２８）またはその塩を有効成分として含む、本発明の前立腺癌治療剤および悪性リンパ腫治療剤はインビトロのみならずインビボにおいても優れた抗腫瘍作用を有する。したがって、臨床での使用、特に癌治療に好適に使用し得る。また、本発明の評価方法あるいはスクリーニング方法を使用することで、標的とする腫瘍細胞特異的に抗腫瘍効果を発揮することができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、実際に人体に投与することなく見出すことが可能となる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：ｐ２１  ｍＲＮＡのＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２：ｐ２１  ｍＲＮＡのＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３：ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：Ｘａａは式ＮＨ２Ｃ（ＣＨＣＨ３）ＣＯＯＨで表されるアミノ酸である。
式ＣＯＯＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨＣＨＣ２Ｈ４ＳＨ）ＯＨのカルボキシル基が１番目のアミノ酸であるＶａｌのアミノ基と結合し、水酸基が４番目のアミノ酸であるＶａｌのカルボキシル基と結合し、ＳＨ基が２番目のアミノ酸であるＣｙｓのＳＨ基とジスルフィド結合している。
本出願は、日本で出願された特願２００１−２５０８４６を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
0004238728.tif 000012
0004238728.tif 000013
0004238728.tif 000014
【図面の簡単な説明】
図１は、ＦＲ９０１２２８のヒト前立腺癌に対する抗腫瘍効果を示すグラフである。縦軸は腫瘍増殖率を、横軸は初回投与後の経過日数を示している。腫瘍増殖率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。
図２は、ＦＲ９０１２２８のヒトリンパ腫に対する抗腫瘍効果を示すグラフである。縦軸は生存マウスの割合を、横軸は腫瘍細胞移植後の経過日数を示している。
図３は、ＦＲ９０１２２８のヒト前立腺癌（（ａ）；ＰＣ−３）および腎臓癌（（ｂ）；ＡＣＨＮ）に対する抗腫瘍効果を示すグラフである。縦軸は腫瘍増殖率を、横軸は初回投与後の経過日数を示している。腫瘍増殖率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。
図４は、ＦＲ９０１２２８のインビトロにおけるｐ２１遺伝子発現に対する作用を示すグラフである（ＰＣ−３細胞、ＡＣＨＮ細胞）。
（ａ），（ｂ）；縦軸はｐ２１遺伝子発現量を相対的に示したものであり、横軸はＦＲ９０１２２８との接触時間（ｈｒ）を示している。
（ｃ）；縦軸はｐ２１遺伝子発現量を相対的に示したものである。
図５は、ＦＲ９０１２２８のインビボにおけるｐ２１遺伝子発現およびｃ−ｍｙｃ遺伝子発現に対する作用を示すグラフである（ＰＣ−３細胞、ＡＣＨＮ細胞）。縦軸はｐ２１あるいはｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を相対的に示したものであり、横軸はＦＲ９０１２２８を投与してからの経過時間（ｈｒ）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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