(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に、ヒドロキシスクシンイミドクロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）から選ばれる少なくとも１種の化合物を含む支持体活性化剤を反応させて、前記支持体に活性化部位を形成した後、この活性化部位にリポソームのリン脂質のリン酸基を共有結合させて、前記支持体に前記リポソームを固定するリポソーム固定方法。
【請求項２】
前記リポソームのリン脂質が、アミノ基を有しないリン脂質である請求項１に記載のリポソーム固定方法。
【請求項３】
前記支持体がゲル状の多孔質体である請求項１又は２に記載のリポソーム固定方法。
【請求項４】
支持体に、ヒドロキシスクシンイミドクロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）から選ばれる少なくとも１種の化合物を含む支持体活性化剤を反応させて、前記支持体に活性化部位を形成し、この活性化部位にリポソームのリン脂質のリン酸基を共有結合させたリポソーム固定支持体。
【請求項５】
前記リポソームのリン脂質が、アミノ基を有しないリン脂質である請求項４に記載のリポソーム固定支持体。
【請求項６】
前記リポソームが、アミノ基を有しないリン脂質のみで構成される請求項５に記載のリポソーム固定支持体。
【請求項７】
前記支持体がゲル状の多孔質体である請求項４〜６のいずれか１項に記載のリポソーム固定支持体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポソームを支持体に対して固定する技術に関する。尚、「リポソーム」とは、リン脂質２分子膜からなる小胞をいい、特に、リン脂質２分子膜の一枚膜からなる小胞を「ユニラメラリポソーム」という。以下、特に記載のない限り、「リポソーム」とは、このユニラメラリポソームのことを示す。
【０００２】
【従来の技術】
前記リポソームを固定化した支持体（例えば、ゲルビーズ）は、溶質と膜または膜タンパク質との相互作用についてのクロマトグラフィー分析に用いる担体やタンパク質の分離、および固定された膜結合酵素によるバイオリアクターを構築するために用いられる。
【０００３】
従来、前記リポソームをゲル状の多孔質体に固定する方法としては、所謂、凍結−融解法が知られている。前記凍結−融解法は、微細なリポソームを高濃度に調製し、これを前記多孔質体と混合して、前記多孔質体の多孔質構造内に複数のリポソームを導入すると共に、その混合物に対して凍結−融解を繰り返すものである。このように処理を施すことによって、前記多孔質構造中のリポソームが融合して、前記多孔質構造から抜け出せないような大きなリポソームを形成し、これによって、リポソームを多孔質体に固定することができる。
【０００４】
又、本願発明者らは、前記リポソームを構成する脂質を修飾・改変して第二結合部位を導入した改変リポソームを作成すると共に、支持体に前記第二結合部位に結合可能な第一結合部位を設けて、両結合部位を介して前記改変リポソームを前記支持体に固定させる方法を提案している。例えば、前記第一、第二結合部位のいずれか一方としてビオチン、他方としてアビジンを導入したリポソーム固定支持体（特願平第８−１９０４１３号）、アミノ基を有するリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン）を添加したリポソームを、クロロホルメート誘導体で活性化したゲルと共有結合したリポソーム固定支持体（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７１２、５９−７１、１９９８）が得られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の凍結−融解法によれば、前記リポソームを効率よく多孔質構造中に導入するためには、高濃度のリポソームが必要とされ、取り扱いが困難であるという問題点があった。又、本法は、前記多孔質構造による物理的な拘束力を利用するものであるために、複数のリポソームが夫々の孔部に導入されなければ強固に固定化することができない。そのため、固定化率が低く、例えば、前記クロマトグラフィーの担体として利用する場合には、高い分離性能が期待できないという問題点があった。
【０００６】
一方、リポソームと支持体に、夫々結合部位を導入して両者を結合する方法を採用した場合にも、やはり、煩雑な操作が必要であるという問題点があった。又、前記リポソームに結合部位を導入したことに伴って、或いは、前記第一、第二結合部位の組み合わせによっては、前記リポソームの物理的、化学的特性が変化し、これによって、例えば、リポソームの安定性、一枚膜性（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｉｔｙ）、形状、強度、膜透過性、薬物−膜分配性（ｄｒｕｇ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）等が変化して、支持体に固定されたリポソームが所望の性質を保有していない虞れがあるという問題点があった。
【０００７】
従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑み、固定前後でリポソームの特性に変化が生じ難く、更に、簡便かつ固定化率の高いリポソームの固定方法を提供することにある。又、更には、リポソームが高い固定化率で固定された支持体を用いることによって、高度な性能を発揮することができるクロマトグラフィー用担体、バイオリアクター等を形成可能にする技術を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するための本発明のリポソーム固定方法の特徴手段は、
支持体に、クロロホルメート誘導体を含む支持体活性化剤を反応させて、前記支持体に活性化部位を形成した後に、この活性化部位とリポソームを構成するリン脂質とを結合させて、前記支持体に前記リポソームを固定する点にあり、
更に、前記支持体活性化剤が、ヒドロキシスクシンイミド  クロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）から選ばれる少なくとも１種の化合物であることが好ましく、更に、前記支持体がゲル状の多孔質体であることが好ましい。
【０００９】
又、この目的を達成するための本発明のリポソーム固定支持体の特徴構成は、支持体に、クロロホルメート誘導体を含む支持体活性化剤を反応させて、前記支持体に活性化部位を形成し、この活性化部位とリポソームを構成するリン脂質とを結合させた点にあり、又は、前記支持体に前記リポソームが共有結合で結合した点にあり、
更に、前記支持体活性化剤が、ヒドロキシスクシンイミド  クロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）から選ばれる少なくとも１種の化合物であることが好ましく、
更に、前記支持体がゲル状の多孔質体であることが好ましい。
【００１０】
そして、これらの作用効果は、以下の通りである。
【００１１】
発明者らは、図７（ａ）に示すように、遊離水酸基を有する支持体２にクロロホルメート誘導体２３が結合することによって、前記支持体２を活性化し（図７（ｂ）参照）、更に、活性化した支持体２に、アミノ基を有する化合物２４（ここでは、ＮＨ2Ｒと表わし、Ｒは任意）を反応させることにより（図７（ｃ）参照）、前記支持体２に、共有結合によって前記アミノ基を有する化合物が固定される（図７（ｄ）参照）という従来の知見を利用して、アミノ基を有するリン脂質を含有させたリポソームを支持体に固定する方法を提唱した。
【００１２】
そして、更に、鋭意研究の結果、膜を構成するリン脂質にアミノ基を有しないリン脂質のみを有するリポソームであっても、前記クロロホルメート誘導体を活性化剤として用いることによって、支持体に固定することができるという新知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【化１】
0004273201.tif 000002
【００１４】
つまり、支持体に、上記化学式（１）で表わされるクロロホルメート誘導体（Ｒはアリール基又は置換アリール基誘導体）を含む支持体活性化剤を反応させて、前記支持体に活性化部位を形成した後に、この活性化部位とリポソームを構成するリン脂質とを結合させて、前記支持体に前記リポソームを固定することによって、前記リポソームの膜組成に左右され難いリポソームの固定方法を提供することができる様になった。前記リポソームの膜を構成する主成分はリン脂質であって、その種類・構成比が種々変化させたものを作成することが可能であるが、本法にあっては、リン脂質のリン酸基が支持体に結合すると考えられるので、リン脂質のリン酸基以外の構成のバリエーションに関わらず、前記リポソームを支持体に固定することができる。又、本法によれば、リポソームの表面を化学修飾したり、特定の化合物を含ませることなく支持体と結合させることができるので、従来のリポソーム固定方法と比較して、固定前後でリポソームの特性に変化が生じ難く、又、簡便に固定化を行なうことができる。更に又、後述するように、高い固定化率でリポソームを支持体に固定することができるので、リポソームが高い固定化率で固定された支持体が得られ、これによって、高度な性能を発揮することができるクロマトグラフィー用担体、バイオリアクター等を提供することができる。
【００１５】
尚、後述するように、本願発明に係るリポソーム固定支持体の性質は、アミノ基含有リン脂質を含んで構成されるリポソームを結合した支持体の性質と比較して、例えば、支持体の選択性、固定リポソームの捕捉量、薬物−膜分配性等で異なる点があり、従来のリポソーム固定化方法とは異なる作用機構でリポソームを支持体に固定していると考えられる。
【００１６】
更に、前記支持体活性化剤が、クロロホルメート誘導体の中でも、ヒドロキシスクシンイミド  クロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）から選ばれる少なくとも１種の化合物を含む場合に、固定化反応が進行しやすいので、リポソーム固定支持体を高い固定率で得ることができる。
【００１７】
ここで、前記支持体がゲル状の多孔質体であると、その表面のみならず、内部の多孔質構造に多くのリポソームを固定することができるので、リポソーム固定支持体を高い固定率で得ることができる。
【００１８】
このようにして得られたリポソーム固定支持体にあっては、後述する実験結果とクロロホルメート誘導体の活性化剤としての作用機構から推測するに、図１（ａ）に示すように、前記活性化剤によって活性化された支持体２の活性化部位２２に、図１（ｂ）に示すように、前記リポソーム３のリン脂質３１のリン酸基３２が共有結合で結合していると考えられ、これによって、強い結合力が生じて、保存性・安定性の高いリポソーム固定支持体１が得られるものと考えられる。
【００１９】
【実施例】
以下、本願発明品であるリポソーム固定支持体（支持体として多孔質ゲルを使用）の作成方法等について図面に基づいて説明する。
【００２０】
尚、本実施例で使用した材料の購入先は以下の通りである。
【００２１】
ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷ、ＴＳＫ  Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍは東ソー（日本、東京）から購入した。ＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂおよび調製段階のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（スウェーデン、ウプサラ）から購入した。１、２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−カプロイルアミン（ｃａｐ−ＰＥ）、卵黄由来またはウシ心臓由来、のホスファチジルコリン（ＥＰＣまたはＨＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、脳ホスファチジルセリン（ＢＰＳ）、および卵黄ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール（ＥＰＧ）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（米国アラバマ州アラバスター）から購入した。これらのリン脂質は全て９９％以上の純度である。Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ＬｉｐｉｄｓでＨＰＬＣ分析を行ったところ、ＰＣ製品の純度は９９．９〜１００％であることが確認された（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｗ．  Ｂｕｒｇｅｓｓ博士からの私信）。（−）−イソプロテレノール、（±）−イソプロテレノール、サルブタモール、ＤＬ−オクトパミン、（±）−シネフリン、ブピバカイン、ジソピラミド、クレンブテロール、（±）−メトプロロール、アテノロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、、ピンドロール、アセブトロール、ＤＬ−プロプラノロール、Ｆｉｓｋｅ  ＆  Ｓｕｂｂａｒｏｗ還元剤、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、純度９９％）はＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）および３,３−ビス（Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノメチル）フルオレセイン（カルセイン）は同人堂（日本、熊本）から購入した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートおよび４−ジメチルアミノピリジンはＡｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。
【００２２】
（１）クロロホルメート誘導体によるゲルの活性化
前記ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷまたは前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のゲルは、Ｙａｎｇらの方法（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）、Ｂａｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８４、１７４−１８７、１９９０）に従って、クロロホルメート誘導体で活性化した。
【００２３】
具体的には、まず、ガラス製ロートに１０μｍフィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を置き、２０〜２５ｇの湿ったゲルを水および２０〜１００％のアセトン（いずれも５００ｍｌ）で洗浄し、クロロホルメート誘導体であるｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１００％アセトン３０ｍｌに１．２５ｇを溶解）と混合した。この混合物（ゲルスラリー）を静かに撹拌しながら、ジメチルアミノピリジン（１００％アセトン３０ｍｌに１．３ｇを溶解）をゆっくり添加し、この混合液を２３℃で１〜３時間撹拌し続けた後、９９．５％アセトン（５００ｍｌ）および１００％アセトン（２００ｍｌ）で洗浄し、４℃で保存した。
【００２４】
前記活性化した支持体とリポソームが結合するとｐ−ニトロフェニルクロロホルメートのＮａＯＨ加水分解産物であるｐ−ニトロフェニレート（４００ｎｍ、ε=１７０００）が生じるので、この化合物の４００ｎｍにおける吸光度に基づいて活性基の量を算出したところ、ＴＳＫまたはＳｕｐｅｒｄｅｘと結合した活性基の密度は、それぞれ湿潤ゲル１ｇ当り１７〜２３μｍｏｌ、または４０〜５０μｍｏｌであった。
【００２５】
（２）ユニラメラリポソームの調製
種々のリン脂質で構成される大小のサイズのユニラメラリポソーム（小サイズのものをＳＵＶｓ、大サイズのものをＬＵＶｓという。）を、プローブ超音波法または高圧限外濾過法（エクストルーダー法）（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）によって調製して、平均直径が３３±８ｎｍのＳＵＶｓ、平均粒径が９２±２８ｎｍＬＵＶｓが得られた。前記リポソームのサイズは、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を備えたＤＬＳ−６０００ＡＳ（大塚電子、日本、大阪）を用いて、動的光散乱法によって測定した。
【００２６】
尚、以下に説明する固定化実験においては、前記リポソームは、特に記載のない限り、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ  ８．１（緩衝液Ｃ）の懸濁液として供した。緩衝液Ｈまたは１００ｍＭカルセイン溶液中のカルセイン含有リポソームを用いた実験においては、前記緩衝液Ｃの代わりに、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４（緩衝液Ｈとする）または１００ｍＭカルセイン溶液（ｐＨ  ７．５）を用いた。カルセイン含有リポソームは、ｐＨ  ７．５の１００ｍＭカルセイン溶液の存在下で調製し（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）、捕捉されなかったカルセインは、緩衝液Ｈで平衡化にしたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（２．３ｃｍ×３５ｃｍ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
【００２７】
（３）クロロホルメート活性化ゲルへのリポソームの固定
前記クロロホルメート活性化ゲル（１００％アセトン中で保存）の一定量を、１０μｍフィルター上で、（それぞれ５０〜２００ｍｌの）２−プロパノール、２−プロパノール−水（１：１）、水、および冷却した緩衝液Ｃで洗浄した。これらのゲルの一部はアスピレーターで乾燥させ、一定量のゲル（０．２〜１ｇ）を２３℃で１〜３時間または４℃で一昼夜、前記リポソーム懸濁液（０．５〜２．５ｍｌ）と充分に混合した。その後、未反応活性基は０．１Ｍ  ＮａＯＨで５分間ずつ加水分解を行った後に緩衝液Ｈで洗浄する操作を２回行って除去した。このようにして、本願発明品であるリポソーム固定支持体が得られた。
【００２８】
（４）その他の支持体へのリポソームの固定
ＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、ＴＳＫ  Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍのゲル粉末は、２３℃で少なくとも３０分間、１ｍＭ  ＨＣlまたは水で膨潤させ、冷却した緩衝液Ｃで洗浄した。これらのゲルの一部はアスピレーターで乾燥させ、一定量のゲル（０．２〜１ｇ）を２３℃で１〜３時間または４℃で一昼夜、前記方法によって調製したリポソーム懸濁液（０．５〜２．５ｍｌ）と充分に混合した。
【００２９】
結合していないリポソームは７００ｇで３分間の遠心分離を３回行うか、または１０μｍ孔径のフィルターを用いて緩衝液で濾過して除去した。固定化後に残っている過剰な活性基は、０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ  ８．２）を用いて、２３℃で最低３時間または４℃で一昼夜かけてブロックした。このようにして、比較例である従来のリポソーム固定支持体が得られた。
【００３０】
（５）固定リポソーム中の脂質量の測定
前掲の方法で作成した本願発明品のリポソーム固定支持体としてのゲルビーズ中に固定された夫々のリポソームに含まれるリン脂質量を、Ｂａｒｔｌｅｔｔの方法（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３４、４６６−４６８、１９５９）を用いて、ゲルビーズのリン酸含有量として直接測定した。
【００３１】
具体的には、先ず、膜の構成リン脂質としてＥＰＣのみを有するリポソーム（ＥＰＣリポソーム）を結合したＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷ（実施例１）を、緩衝液に懸濁して（通常、２〜３ｍｌの緩衝液に対してゲルを０．２ｇ）、よく混合した懸濁液を、２検体適量（１０〜３０μｌ）分析用に採取した。その後、試料およびゲル基質内の加水分解した炭素に由来する黒色を消すために、少なくとも１時間の間隔をあけて、Ｈ2０2を２回（それぞれ１００μｌ）加えた。
【００３２】
又、前掲の方法によってＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、及び、ＴＳＫ−ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｔｒｅｓｙｌ−６５０ＭにＥＰＣリポソームを結合して得られたリポソーム結合湿潤ゲル（夫々比較例１〜４とする）についても、前記実施例と同様にして、リン酸含有量を直接測定した。更に、前記ＥＰＣリポソームに代えて２ｍｏｌ％ｃａｐ−ＰＥ（アミノ基含有リン脂質）とＥＰＣにより構成されるリポソーム（ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソーム）を、クロロホルメート誘導体で活性化したＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷ、ＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、及び、ＴＳＫ−ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍに結合して得られたリポソーム結合湿潤ゲル（夫々比較例５〜９とする）についても、前記実施例と同様にして、リン酸含有量を直接測定した。
【００３３】
尚、リポソームを含まないブランクのゲルを用いた参照試料では、リン酸は検出されなかった。
【００３４】
（６）固定リポソームの収量の測定
前記ゲルに固定されたリポソームの収量は、固定されたリポソームまたは固定されていないリポソーム中に捕捉されたカルセインを、界面活性剤である１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて可溶化して前記リポソーム外に溶出して、励起波長を４９０ｎｍ、発光波長を５１９ｎｍとして蛍光分光光度計（日立  Ｆ−４５００、日本、東京）を用いて計測して算出した。
【００３５】
尚、リポソームの比内部体積は既に報告した方法（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８及びその参考文献参照）に従って計算した。
【００３６】
従来知られていたように、アミノ基を有するリン脂質であるｃａｐ−ＰＥを含むＳＵＶｓにあっては、図２に示すように、使用した全ての活性化ゲルに効果的に固定された（比較例５〜９）。又、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂから成るゲル基質では、ＣＮＢｒで活性化したゲル中のＳＵＶｓの量は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＣＨゲル中の量より多く、このことは、共有結合がゲル中の反応基の化学的性質によっても影響されることを示している。
【００３７】
ここで、ＰＥのみを膜の構成リン脂質とするＬＵＶｓは、従来、これ自身が、活性化したゲルに結合することは知られていなかった。しかし、図２に示すように、前記ＰＥのみを膜の構成リン脂質とするリポソームは、クロロホルメート誘導体で活性化されたＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷのゲル（実施例１）に大量に固定することが可能であり、収率も高いことが明らかになった。尚、実験に用いたゲルのうち、ＴＳＫのゲルは約１００ｎｍ以上の大きなポアサイズを持ち（脂質販売会社Ａｖａｎｔｉ社の製品分析資料およびＯｌｌｉｖｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５２、２６２−２７４、１９８６）、大きなサイズのリポソームの混合取込み固定化に適しているとされている（Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８、２１０−２２１、１９９４）（Ｙａｎｇら、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）。
【００３８】
図２に示す実験結果から、膜を構成するリン脂質としてＰＣのみを含むリポソームも活性化ゲルに直接結合させることが可能であることが明らかとなったので、更に、高純度（９９〜１００％）のさまざまな種類の合成ＰＣおよび天然ＰＣを用いてユニラメラリポソームを調製して、活性化ゲルへの結合能について検討した。この結果を図３に示す。
【００３９】
クロロホルメート誘導体で活性化したＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷゲルでは、夫々ＥＰＣ、ＨＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣより構成される５種のリポソームの全てにおいて、同程度の量のリポソームが前記クロロホルメート活性化ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷゲルに結合し、同程度の収量が得られた（実施例３）。又、Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲルでは、ＥＰＣリポソーム又はＨＰＣのみから構成されるリポソームを夫々結合したリポソーム結合ゲル（活性基密度は４０μｍｏｌ／ｇ  ｇｅｌ）が得られた（実施例２）。これらのリポソーム結合ゲルにあっては、前記クロロホルメート誘導体で活性化したＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷゲル（活性基密度は２３μｍｏｌ／ｇ  ｇｅｌ）よりも多くのリポソームがゲルに結合して、その吸着量は２７％多かった。
【００４０】
クロロホルメート誘導体以外の活性化剤で活性化したゲルについても同様にリポソームの固定量を測定したが、前記クロロホルメート活性化ゲルの固定量には及ばず（比較例１１〜１４）、膜を構成するリン脂質としてアミノ基を含まないリン脂質のみを含むリポソームを固定する担体の活性化には、クロロホルメート誘導体を用いることが好ましいことが明らかとなった。
【００４１】
（７）固定化に対する活性基およびリポソームの濃度の影響
図４は、前記クロロホルメート活性化ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷゲルに固定されるＥＰＣリポソームの脂質濃度が５ｍＭから２０ｍＭに増加するにつれて固定される量が徐々に増加するものの、濃度がさらに２０ｍＭから２７ｍＭに増加しても、固定される量はわずかであることを示している。多くの濃度で実験したところ、結合するＳＵＶｓの量はＬＵＶｓよりも多かった。これはおそらく、小さなサイズのリポソーム（例えばＳＵＶｓ）は大きなサイズのもの（例えばＬＵＶｓ）よりも効果的に拡散し、ゲルビーズの小孔（ポア）に入りやすいためであると考えられる。従って、リポソームと活性化されたゲルの組合せを考える場合、前記リポソームの径と前記ゲルのポアサイズを考慮しなければならない。
【００４２】
リポソーム吸着に対する活性基密度の影響については、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームとクロロホルメート活性化ゲルについて調べたものがあり、これによれば、前記クロロホルメート誘導体で活性化したゲルを、０．０１〜０．１ＭのＮａＯＨによって２３℃で最低５分間加水分解を行い、連続的な活性基密度とした。ゲル中の活性基密度が減少すると、固定されるリポソーム量は減少した。不活性化ゲル中でリポソーム結合が最低となるのは、０．１Ｍ  ＮａＯＨで１５分間加水分解することによって活性基の大半を除去した場合であった。クロロホルメート誘導体による活性化は、リポソームの吸着に必要不可欠なものであると思われる。又、この制御実験では、ゲル基質中へのリポソームの非特異的結合はないこともわかった。殺菌剤として作用する強アルカリ溶液は、疎水性吸着リポソームまたは脂質をゲルから除去する可能性があることが知られているので、固定されたＰＣリポソームについてその影響を調べたところ、アルカリ溶液による処理、保存、およびクロマトグラフィー操作に関して、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームと非常によく似た固定化安定性を示した。
【００４３】
（８）固定リポソームの捕捉量と膜透過性
カルセインを包含したＥＰＣリポソームと、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームを用いて、固定リポソームの捕捉量を測定すると共に、４℃で３日間保存した後の前記カルセインの漏洩について調べた。図５に示すように、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームの比捕捉体積は、文献（Ｈｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｉｐｉｄｓ  ４０、８９−１０７、１９８６）（Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ８５８、１６１−１６８、１９８６）のデータおよび著者らが以前報告したアビジン−ビオチンで固定したリポソームのデータ（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）と同じであった。これらの値は、ＬＵＶｓ（９２±２８ｎｍ）またはＳＵＶｓ（３３±８ｎｍ）の平均サイズとともに、固定されたリポソームがユニラメラ（一枚の膜）であることを示すものである。しかし、固定したＰＣリポソームでは、捕捉されたカルセインの三分の二以上が結合と洗浄の操作中にリポソームから遊離した。このような漏洩の結果が、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームと比較して低い比捕捉体積となっている。
【００４４】
ゲルビーズに固定した前記ＥＰＣリポソーム、ｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームを数日間保存すると、捕捉された色素の１１〜１６％は漏出した。これは、共有結合後のリポソーム膜が疎水性分子を幾分透過させるようになったことを意味する。ここで、前記ＥＰＣリポソームの活性基密度は２３μｍｏｌ／ｇ  ｇｅｌから１１μｍｏｌ／ｇ  ｇｅｌに減少しているが、カルセイン漏洩は減少せず、固定化されたＥＰＣリポソームの膜透過性は安定していると考えられる。
【００４５】
（９）固定リポソーム膜内への薬品の分配
続いて、１５種類の基礎薬品（（−）−イソプロテレノール、（±）イソプロテノール、サルブタモール、オクトパミン、シネフリン、ブピバカイン、ジイソピラミド、クレンブテロール、メトプロロール、アテノロール、アルプレノロール、オクシプレノロール、ピンドロール、アセブトロール、プロプラノロール）が、共有結合によって固定されたＥＰＣリポソームまたはｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームの膜内に分配された場合のＫｓ値を、アビジン−ビオチン固定ＥＰＣリポソームの分配の場合と比較した。
【００４６】
ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷゲルに固定した前記２種のリポソームを、５×５０mmのガラス製カラム（ＨＲ  ５／５、Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にゲルベッドとして詰めた。前記１５種の薬物（５％エタノールを含む緩衝液Ｈ  ５μｌに、薬物５μｇ）を、前記２種のリポソームを固定したカラムに入れ、２３℃において流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで緩衝液Ｈによって溶出した。クロマトグラフィーの実験は、インジェクター、ポンプ（ＣＣＰＭ−ＩＩ）およびＩＢＭコンピュータを接続した２２０ｎｍに設定した検出器（ＵＶ−８０１０）を備えた保温装置（カラムオーブン）（Ｃ０−８０２０）付きＨＰＬＣシステム（東ソー）を用いて行った。各種薬物の溶出され易さは各薬物に特異的なリテンションファクター、Ｋｓによって表わした（Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２９、２９１−２９８、１９９５）（Ｙａｎｇら、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ７０７、１３１−１４１、１９９８）。
【００４７】
アビジン−ビオチン固定リポソームはユニラメラ性、完全性、および安定性に優れた性質をもつことが知られている。さらに、水溶液中でのビオチン化リポソームのストレプトアビジンを媒介にした凝集から推定されるように、このような固定リポソームは球形になりやすく、応力を受けにくい。従って、これらを標準として他の固定リポソーム膜と比較し、クロマトグラフィーによる溶質分配に関する膜特性の評価に利用した。
【００４８】
図６に示すように、共有結合したＰＥリポソームにおける、１５種類の基本薬品の分配は、アビジン−ビオチンリポソームにおける薬品の分配と非常に良い相関性と比例性を示した（ｒ＞０．９９５で勾配は約１である）。しかしＫｓ値は、アビジン−ビオチン−リポソームに比べて共有結合による固定リポソーム、特にＰＣ  ＬＵＶｓの方がやや高い値であった。
【００４９】
又、ＰＣリポソームに加え、夫々、アミノ基含有リン脂質であるＢＰＳ、並びに非アミノ基含有リン脂質であるＥＰＧ、ＤＰＰＧのみで構成された負の荷電をもつ３種のリポソームについても検討したところ、ＢＰＳリポソーム（平均サイズ５０ｎｍ）では１９±４μｍｏｌ  ｌｉｐｉｄ／ｍｌ  ｇｅｌ（ｎ＝２）、ＥＰＧまたはＤＰＰＧのＬＵＶｓ（平均サイズ９８±２６ｎｍ）では３４±５μｍｏｌ  ｌｉｐｉｄ／ｍｌ  ｇｅｌ（ｎ＝２）の量がクロロホルメート活性化ゲルに結合することが分かった。０．１Ｍ  ＮａＯＨ処理による固定されたＰＧリポソームの損失は１４±４％（ｎ＝２）であり、理由は不明であるが、ＰＣリポソームの場合の損失よりもやや高い値であった。
【００５０】
これらの結果から、アミノ基を含まないリン脂質のみから構成される膜を有するリポソームであっても、前記クロロホルメート誘導体で活性化したゲル、特に、前記ＴＳＫゲル及び前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲルに高収率で固定化することができ、その結合能は、リン脂質の組成に左右されるものの、広く結合可能であることは明らかである。
【００５１】
〔別実施形態〕
以下に別実施形態を説明する。
【００５２】
実施例として種々のホスファチジルコリン（ＰＣ）から構成されるリポソームを例示したが、本願発明に係るリポソームの固定化方法は、活性化剤の作用によって、リン脂質の必須構成要素であるリン酸と支持体とが結合するものであるため、前記ＰＣ以外のリン脂質を含むリポソームの固定化にも利用可能であることは勿論である。例えば、前記リン脂質としては、ＥＰＧ、ＤＰＰＧを含めたフォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミン等を用いることができる。そして、活性化剤としては、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートと同様の作用機構を有する活性化剤が利用可能であって、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．  Ｊａｋｏｂｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１０４、１２−１４、１９８４）に記載されているヒドロキシスクシンイミド  クロロホルメート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリクロロフェニルクロロホルメート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）等を用いることができる。又、支持体としては、前記クロロホルメート誘導体によって活性化される支持体であれば制限されるものではないが、特に、前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（一般名：デキトラン系ゲル）、ＴＳＫと同様にゲル状の多孔質体であるアガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル等を用いると、高い固定化率が得られるので好ましい。
【００５３】
又、本願実施例においては、脂質二重膜からなる一枚膜（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ）リポソームを例に説明したが、多重膜のリポソームであっても、同様に、前記リポソームの膜を構成するリン脂質と支持体の活性化部位との間で結合を生じさせて、前記支持体に前記リポソームを固定することが可能である。
【００５４】
尚、本願発明に係るリポソーム固定方法にあっては、狭義のリポソームのみならず、タンパク質を含んでいるプロテオリポソーム等も含めた、リン脂質を構成成分とする膜構造を有する小胞であれば適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明に係るリポソーム固定支持体の作成方法を表わす概略図
【図２】種々の活性化ゲルに固定したＥＰＣリポソーム及びｃａｐ−ＰＥ／ＥＰＣリポソームの固定量及び収率を表わす表図
【図３】種々の活性化ゲルに固定した種々のアミノ基非含有脂質組成を有するリポソームの固定量及び収率を表わす表図
【図４】リポソーム濃度と固定化されたリポソーム量の関係を表わすグラフ
【図５】クロロホルメート活性化ゲルに捕捉されたリポソーム量及び保存後のリポソーム封入物の漏洩率を表わす表図
【図６】クロロホルメート活性化ゲルに固定されたリポソームと、アビジンービオチンによってゲルに固定されたリポソームの薬物−膜分配性を比較したグラフ
【図７】従来のリポソーム固定方法を示す概略図
【符号の説明】
２  支持体
３  リポソーム
２２  活性化部位
３１  リン脂質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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