(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３，４，２’，４’−テトラアセチルブテイン（３，４，２’，４’−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌ ｂｕｔｅｉｎ）、３，４−ジヒドロキシ−２’，４’−ジクロロカルコン（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２’，４’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ）、１−アダマンチル−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ〕、１−アダマンチル−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ブテン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎｅ−１−ｏｎｅ〕、１−アダマンチル−３−ヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ブタン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎｅ−１−ｏｎｅ〕、ブテイン（Ｂｕｔｅｉｎ）、および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤。
【請求項２】
請求項１において記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強剤。
【請求項３】
請求項１において記載の化合物を、ヒトを除く動物に投与することを特徴とする神経成長因子産生の増強方法。
【請求項４】
３，４，２’，４’−テトラアセチルブテイン（３，４，２’，４’−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌ ｂｕｔｅｉｎ）、３，４−ジヒドロキシ−２’，４’−ジクロロカルコン（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２’，４’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ）、１−アダマンチル−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ〕、１−アダマンチル−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ブテン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎｅ−１−ｏｎｅ〕、又は１−アダマンチル−３−ヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ブタン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎｅ−１−ｏｎｅ〕。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は神経成長因子産生増強作用を有する医薬、試薬、食品、飲料、または飼料に関する。
従来の技術
ヒトの知的機能、記憶、感情、行動などの精神活動の維持には神経細胞が主要な役割を担っている。これら精神活動の基になっている神経細胞の分化、生存、機能発現には、それぞれの神経細胞に特異的な神経栄養因子が必要であると考えられている。神経栄養因子のうち最初にその存在および機能が明らかにされたのが神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、以下ＮＧＦと略する）であり、現在では脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ−ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３、ニューロトロフィン−４／５などが見出されている。
ＮＧＦは前脳基底部の大細胞性コリン作動性神経細胞の神経栄養因子であることから、アルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている〔ファルマシア、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２、１４７〜１５１（１９８６）、老年精神医学、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．６、７５１〜７５８（１９８６）〕。
アルツハイマー型痴呆症とは発育障害、巣症状、下肢の強直拘攣、てんかん様発作などの臨床を伴い、老人性プラーク、アルツハイマー原線維変化などの病理学的所見を見る疾患であり、老人性痴呆の一病型である。近年の高齢化社会で増加の傾向が見られ、重大な社会的関心が払われているが、これといった症状の改善法、治療法が見つかっていない。
アルツハイマー型痴呆症患者脳には、マイネルト基底核を中心とする前脳基底部に顕著な変性、コリンアセチル基転位酵素（ＣＡＴ）活性の著しい低下が認められている〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３，７７（１９８０）〕。１９８５年にラット脳を用いた研究で、ＮＧＦが脳のこの部位での神経栄養因子であることが明らかにされ〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．４，１３８９（１９８５）〕、ＮＧＦと本疾患との関連が注目された。またハンチントン舞踏疾患者の脳の線条体では、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の脱落と共にコリン作動性神経細胞の脱落が著しく、ＮＧＦが線条体の内在性コリン作動性神経細胞にも作用することが明らかにされ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３４，１３４１（１９８６）〕、本疾患がＮＧＦと関連している可能性が指摘されている。各種の神経疾患のモデルとなり得るラットなどの動物でＮＧＦの効果が研究され、ラットでは神経細胞の変性が顕著になる以前にＮＧＦを脳内投与すれば、変性を食い止めることができ、ＣＡＴ活性の低下も防げることが報告されている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６，２１５５（１９８６）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２９３，３０５（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３５，２１４（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，９２３１（１９８６）〕。末梢の交感神経支配組織および脳でＮＧＦが生合成されていること、このＮＧＦの生合成に末梢組織あるいは脳組織の間質細胞である線維芽細胞あるいはアストログリア細胞が各々重要な役割を担っていることも証明されている〔Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５９，１２５９（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，，Ｖｏｌ．１３６，５７（１９８６）〕。また、この線維芽細胞やアストログリア細胞の産生するＮＧＦの抗原性、分子量、等電点、生物活性は、従来よく研究されていた顎下腺ＮＧＦと同一であることが明らかにされるとともに、線維芽細胞（Ｌ−Ｍ細胞）およびアストログリア細胞の培養液に種々の神経伝達物質を加える実験によって、カテコールアミン類（ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン）がＮＧＦ産生増強作用を示すことが見出されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１，６０３９（１９８６）〕。
ＮＧＦは、ＮＧＦが神経栄養因子として作用する部位が変性する神経疾患において、変性を食い止める治療薬として用いることができるのではないかと期待される。また、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒など脳神経細胞が一旦変性に陥れば、生涯回復することがなく、その結果、知的機能低下、記憶障害のみならず、感情障害、行動異常など様々な障害を引き起こすが、神経線維には可塑性があり、損傷を受けると、その付近の健常な線維から発芽が起こり、傷害されたシナプスに変わって新しいシナプスが形成されるので、この時ＮＧＦを神経機能の修復再生を促す治療剤として用いることができるのではないかと期待される。
しかしながら、ＮＧＦを各種神経疾患の治療に応用しようとした場合、ＮＧＦはＮＧＦを必要とする神経細胞の極く近傍に達していなければならないし、中枢神経疾患の場合も脳細胞の患部にＮＧＦを送り届けなければならないが、血管系を通してＮＧＦを脳内に送り込むことはできない。なぜならば、脳内の血管内皮細胞は、互いに密着結合で結合しており（脳血液関門という）、水、ガス、脂溶性物質以外の物質の血液から脳組織への移行は制限を受けているからであり、高分子物質であるタンパク質（ＮＧＦも含む）はまったく脳血管関門を通ることが出来ないからである。このＮＧＦを直接脳内に外科的手法を用いて投入することは、現在の技術をもってしても危険が大き過ぎる。
一方、直接、ＮＧＦを投与するのではなく、ＮＧＦの産生を増強する物質の開発も行われている。ＮＧＦ産生増強作用を示す物質としては前記カテコールアミン類以外にもカフェイン酸や、４位に置換基が導入されたカテコール類、たとえば、代表的な化合物として４−メチルカテコールが知られており（特公平第５−２９２０７号公報）、その他、特開平第２−１０４５６８号公報、日本国特許第２７１９０４２号明細書、特開平第８−２７０８６号公報および特公平第７−１１０８１２号公報にＮＧＦ産生増強活性を有する化合物が開示されている。しかしながら、その多くは、急性毒性を示すなど、強い毒性を有する物質、毒性が出る濃度と有効な濃度が非常に接近した物質、または神経興奮作用など神経系に対して重大な副作用を生じる物質（たとえば、前記カテコールアミン類は代表的なアドレナリン作動薬として知られている）であり、また、ＮＧＦ産生増強活性を示す有効な濃度範囲が狭く投与量のコントロールも難しいなど、多くの問題点を抱えている。たとえば、特公平第７−１１０８１２号公報に開示された物質についてはＮＧＦ産生増強活性と化合物濃度との間には二峰性の関係が示されており、医薬として使用するには投与量のコントロールが難しい。また、特開平第２−１０４５６８号公報、日本国特許第２７１９０４２号明細書、特開平第８−２７０８６号公報で開示された化合物のＮＧＦ産生増強活性が確認された濃度はそれぞれ１点のみであり、活性を示す有効濃度範囲については不明である。このように種々の問題が存在しており、ＮＧＦ産生増強作用を示す物質は未だ実用化には至っていない。
発明の開示
本発明者らは鋭意検討した結果、下記一般式（１）で表される化合物が、公知のＮＧＦ産生増強作用を有する化合物より、１）低濃度でより強い増強活性を示す、２）増強活性を示す濃度領域が広い、および／または３）低毒性である、との特徴を有することを見出し本発明を完成した。
本発明を概説すれば、本発明は
〔１〕  下記一般式（１）で表される化合物：
0004249926.tif 000002
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は各々同じであっても異なってもよく、水素原子、水酸基、アルコキシ基またはアシルオキシ基であり；
Ｘは、下記一般式（２）：
0004249926.tif 000003
（式中、Ｚは水素原子または特性基が導入されていてもよい脂肪族基、芳香族基もしくは芳香脂肪族基であり、Ｙは水素原子または水酸基であり、ｍおよびｎは各々０または１である。）、
下記一般式（３）：
0004249926.tif 000004
（式中、Ｚ’は水素原子または特性基が導入されていてもよい脂肪族基、芳香族基もしくは芳香脂肪族基であり、Ｙ’は水素原子または水酸基であり、ｍおよびｎは各々０または１である。）、
または下記一般式（４）：
0004249926.tif 000005
（式中、Ｒ６およびＲ７は各々同じであっても異なってもよく、水素原子、糖残基、または特性基が導入されていてもよい脂肪族基、芳香族基もしくは芳香脂肪族基である。）
で表される。ただし、前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子、Ｒ２およびＲ３が共に水酸基、Ｘが前記一般式（２）であり、かつ該一般式（２）において、ｎが１、ｍが０、ＺおよびＹが水素原子である場合を除く。〕
および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤、
〔２〕  前記〔１〕において記載の一般式（１）で表される化合物および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強剤、
〔３〕  前記〔１〕において記載の一般式（１）で表される化合物および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を動物に投与することを特徴とする神経成長因子産生の増強方法、
〔４〕  前記〔１〕において記載の一般式（１）で表される化合物およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強用食品、飲料または飼料。
〔５〕  神経成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、神経成長因子産生増強剤、または神経成長因子産生増強用食品、飲料もしくは飼料の製造における前記〔１〕において記載の一般式（１）で表される化合物およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用、ならびに
〔６〕  下記式（５）〜（１２）で表わされる化合物：
0004249926.tif 000006
0004249926.tif 000007
からなる群より選択される化合物、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明で有効成分として使用される化合物は、上記一般式（１）で表される化合物およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であり、ＮＧＦ産生増強作用を有していれば特に限定されない。かかる塩としては薬理学的に許容される塩が好ましい。また、後述するようにプロドラッグとして機能し得る当該化合物の誘導体であってもよい。従って、本発明に係る有効成分とは、前記一般式（１）で表わされる化合物およびそれらの塩、ならびに本発明の所望の効果が得られ得る限り前記一般式（１）で表わされる化合物の誘導体ならびにそれらの塩をも包含するものである。
なお、本明細書において、「ＮＧＦ産生増強活性」および「ＮＧＦ産生増強作用」はそれぞれＮＧＦ産生を増強する機能およびＮＧＦ産生増強をもたらすことをいうが、その意味において特に厳密に区別するものではない。また、「増強」には、本発明に係る有効成分の作用前に比し、作用後において目的物質の量が増加するという態様と共に、本発明に係る有効成分を作用させることにより目的物質を生起せしめるという態様（誘導）を含む。
有効成分として用いられる前記一般式（１）で表わされる化合物の好適な例としては、３−フェニル−２−プロペン−１−オン骨格を有する化合物、３−フェニルプロパン−１−オン骨格を有する化合物、４−フェニル−３−ブテン−１−オン骨格を有する化合物および４−フェニルブタン−１−オン骨格を有する化合物などが挙げられる。なお本明細書では、３−フェニル−２−プロペン−１−オン骨格または４−フェニル−３−ブテン−１−オン骨格を有する化合物、たとえば、前記式（５）または式（１１）に記載の化合物の構造を、その二重結合部位の立体配置をトランス体として表しているが、本発明において使用される化合物は特にトランス体に限定されず、ＮＧＦ産生増強活性を有していればシス体であってもよい。また、ＮＧＦ産生増強活性を有する限り、その他の前記一般式（１）で表わされる化合物の光学異性体、ケト−エノール互変異性体、幾何異性体などの各種異性体も全て本発明において使用することができ、さらに、各異性体の単離されたものであっても、その混合物であってもよい。
前記一般式（１）〜（４）における各置換基について説明する。本明細書において、アルコキシ基とはＲｉＯ−で表すことができる。ここで、当該Ｒｉとしては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などの炭素数１〜３０の直鎖状アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基などの分枝状アルキル基、エテニル基、アリル基、トランス−１−プロペニル基、シス−１−プロペニル基、シス−８−ヘプタデセニル基、シス−８−シス−１１−ヘプタデカジエニル基、シス−８−シス−１１−シス−１４−ヘプタデカトリエニル基、シス−５−シス−８−シス−１１−ヘプタデカトリエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−ノナデカトリエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−シス−１３−ノナデカテトラエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−シス−１３−シス−１６−ノナデカヘプタエニル基、シス−１２−ヘンイコセニル基、シス−３−シス−６−シス−９−シス−１２−シス−１５−シス−１８−ヘンイコヘキサエニル基などの直鎖状アルケニル基、イソプロペニル基、シス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−エチル−１−プロペニル基などの分枝状アルケニル基、後述の芳香族基などが挙げられる。本発明の所望の効果の発現の観点から、かかるアルコキシ基の好適な例としては、メトキシ基、エトキシ基、アリルオキシ基、フェノキシ基などが挙げられる。
また、本明細書において、アシルオキシ基とはＲｉｉＣＯＯ−で表すことができる。ここで、当該Ｒｉｉとしては前記Ｒｉとして例示した基を挙げることができる。かかるアシルオキシ基の好適な例としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ベンゾイルオキシ基などが例示される。
本明細書において、脂肪族基の好適な例としては前記Ｒｉとして例示した基を挙げることができる。
本明細書において、芳香族基の好適な例としては、たとえば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基の他、ピロリル基、ピリジル基、インドリル基、イミダゾリル基、トリル基、キシリル基などが挙げられる。
本明細書において、芳香脂肪族基の好適な例としては、たとえば、アルキル基の炭素数が１〜１５であるフェニルアルキル基（例、ベンジル基、フェネチル基）、スチリル基、シンナミル基などが挙げられる。
なお、ＮＧＦ産生増強活性を有していれば、上記脂肪族基、芳香族基、芳香脂肪族基には水酸基、チオール基、オキソ基、チオキソ基、アミノ基、ニトロ基、硫酸基、リン酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオキシ基などの特性基が導入されていても構わない。
さらに、本明細書において、糖残基としては糖の水酸基を１つ除去した構造式で表わすことができる基を挙げることができる。当該糖として好ましくは、単糖の他、たとえば、２〜２０残基の単糖からなるオリゴ糖または２１残基以上の単糖からなる糖鎖であっても構わない。また、糖を構成する単糖成分に限定はなく、たとえば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルコトース、Ｌ−ラムノース、ガラクトース、マンノースの他、Ｄ−ガラクトサミン、２−デオキシ−Ｄ−リボースなどが挙げられる。なお、糖を構成する単糖成分において、Ｄ体、Ｌ体などの立体構造による限定は特にない。
本発明で使用される化合物は上記一般式（１）で表すことができるが、好適には表１および表２に示す化合物および式（２６）で表すキサントフモール、式（２７）で表すサフロミンＡが例示される。かかる表において例示される化合物は、前記一般式（１）においてＸが前記一般式（２）または（３）である化合物である。なお、表１および表２中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＸは上記一般式（１）に対応するものである。また、式（Ｎ）の化合物を化合物（Ｎ）という。たとえば、表１において、式（５）の化合物は化合物（５）という。
0004249926.tif 000008
0004249926.tif 000009
また、本発明で有効成分として使用される好適な化合物としては、前記一般式（１）において、Ｘが前記一般式（４）である、その構造中にフラボノール（ｆｌａｖｏｎｏｌ）骨格を有する化合物を挙げることができる。かかる化合物としては、たとえば、前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７が共に水素、Ｒ２およびＲ３が共に水酸基ならびにＲ６がα−Ｌ−ラムノース残基で表わされるクエルシトリン（Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が共に水素、ならびにＲ２およびＲ３が共に水酸基で表わされるクエルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ：３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボンとも呼ばれる）、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が共に水素、ならびにＲ２、Ｒ３およびＲ４が共に水酸基で表わされるミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ：３，３’，４’，５，５’，７−ヘキサヒドロキシフラボンとも呼ばれる）、Ｒ１、Ｒ５およびＲ７が共に水素、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が共に水酸基ならびにＲ６がα−Ｌ−ラムノース残基で表わされるミリシトリン（Ｍｙｒｉｃｉｔｒｉｎ）を挙げることができる。
本発明において使用される化合物は、市販の化合物を利用できるほか、カルコン類、ベンズアルデヒド、ベンゼン環上の置換基として水酸基を有するベンズアルデヒド（たとえば２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド）などのベンズアルデヒド類、クロマン類、桂皮酸、桂皮アルデヒドまたはカフェイン酸などを出発原料として公知の方法により適宜合成することができる。また、天然物として存在する場合は、たとえば植物（たとえば、明日葉、ベニバナ、ホップなど）などより常法に従って抽出し、精製することにより得ることができる。
特に、上記の表１および表２に示した化合物のうち、化合物（５）、化合物（６）、化合物（７）、化合物（８）、化合物（９）、化合物（１０）、化合物（１１）、化合物（１２）は、本発明において新たに合成された新規化合物である。すなわち、本発明は、ＮＧＦ産生増強活性を有する、これらの新規化合物をも提供するものである。これらの化合物は前記するようにいずれも公知の方法により合成することができる。
化合物（６）、（７）、（８）、（９）の合成法としては、特に限定はないが、たとえば、日本国特許第２９１３７０６号明細書に記載された公知の方法を用いることができる。すなわち、水酸化バリウムなどの塩基存在下、水酸基をテトラヒドロピラニルオキシ基で保護したヒドロキシベンズアルデヒドとメチルケトン基を有する化合物とをクライゼン縮合反応により縮合し、得られた縮合体のテトラヒドロピラニルオキシ基を酸触媒存在下、脱保護することにより得ることができる。なお、クライゼン縮合反応に際しては、テトラヒドロピラニルオキシ基による保護基の導入は行わなくてもよい。また、クライゼン縮合反応の触媒としては、塩基以外に塩化水素などの酸を用いることもできる。
化合物（１２）の合成法としては、特に限定はないが、メチルケトン化合物をリチウムジイソプロピルアミド存在下、低温にてアルデヒド化合物とアルドール縮合させる方法を用いることができる。更に、化合物（１２）のβ位の水酸基に適切な脱離基導入後、塩基などにより脱離反応させることにより、化合物（１１）を合成することができる。また、上記に示すような、化合物（１２）を経て、化合物（１１）を合成する方法と同様の方法で、化合物（６）、（７）、（８）、（９）についても合成することもできる。
化合物（５）の合成法としては、特に限定はないが、化合物（１３）をアセチル化することにより合成することができ、たとえば化合物（１３）と無水酢酸とをアルカリ存在下で反応させることにより得ることができる。また、この時のアセチル基の供与体としては、酢酸クロライドなどの酢酸のハロゲン化物でもよい。
化合物（１０）の合成法としては、特に限定はないが、たとえばパラジウムなどの触媒存在下、化合物（１３）を含有するメタノールなどの溶媒に、水素ガスを添加することにより合成することができる。
前記一般式（１）で表わされる化合物の塩としては、たとえば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩などが例示される。かかる塩としては薬理学的に許容される塩が好ましい。なお、本発明において使用される薬理学的に許容される塩とは、生物に対して実質的に無毒であって、かつＮＧＦ産生増強活性を有する化合物の塩を意味する。当該塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムまたはプロトン化されたベンザチン（Ｎ，Ｎ′−ジ−ベンジルエチレンジアミン）、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグラミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ピペラジンもしくはトロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）との塩が挙げられる。これらの塩は、たとえば前記一般式（１）で表される化合物においてＸが前記一般式（２）または（３）であって、ｎが１、ｍが０、ＺまたはＺ’が水素原子、ＹまたはＹ’が水素原子で表されるカルボン酸を公知の方法により変換することにより得られる。また、たとえば、前記一般式（１）で表わされる化合物においてＸが前記一般式（４）である場合には、当該化合物中のフェノール性水酸基を公知の方法により塩に変換することで得られる。
さらに、本発明において使用される前記一般式（１）で表わされる化合物は、たとえば、エステルとすることができるなど、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る誘導体（プロドラッグ）を形成可能である。かかるプロドラッグの調製は公知の方法に従えばよい。なお、かかる誘導体は、それらの塩であってもよい。
本発明において有効成分として使用される前記一般式（１）で表わされる化合物およびそれらの塩は、前記するように、いずれのものもＮＧＦ産生増強活性を有するものである。当該活性は、たとえば、後述の参考例１に示す方法に準じて評価することができる。また、後述の実施例から明らかなように、有効成分としての化合物は、公知のＮＧＦ産生増強活性を有する化合物より１）低濃度でより強い増強活性を示す、２）増強活性を示す濃度領域が広い、および／または３）低毒性である、との特徴を有している。本発明において有効成分として使用する化合物によれば、そのＮＧＦ産生増強活性により、たとえば、後述の実施例１８において明らかにされているように、ＮＧＦ産生増強を介して神経突起の伸長を促すという効果が奏され得、その他、活性酸素や栄養飢餓または物理的損傷などにより引き起こされる神経細胞死を抑えるという効果が奏される。それゆえ、たとえば、後述するようなＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療または予防に有用であると考えられる。
本発明において有効成分として使用される前記一般式（１）で表わされる化合物は後述の参考例１として示す方法に準ずるスクリーニングの結果から見出されたものであり、それゆえ、本発明の一態様としては、ＮＧＦ産生増強活性を有する化合物のスクリーニング方法も提供する。
本発明において有効成分として使用される化合物およびそれらの塩は、そのＮＧＦ産生増強活性にとっての有効量を生体に投与しても毒性は認められない。たとえば、経口投与の場合、たとえば、カルコン骨格を有する化合物であるブテイン〔化合物（１３）〕または薬理学的に許容されるその塩のいずれかを１０００ｍｇ／ｋｇでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。また、フラボノール骨格を有する化合物であるミリセチンまたは薬理学的に許容されるその塩のいずれかを１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。
本発明の第１の態様であるＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤としては、本発明に係る前記有効成分を公知の医薬用担体と組合せて製剤化したものが挙げられる。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が用いられる。
なお、本明細書においてＮＧＦ産生増強を必要とする疾患とは、たとえば、痴呆症、神経障害、末梢神経痛、脳虚血、糖尿病性ニューロパシーなどを挙げることができる。
本発明の治療剤または予防剤の製造は、通常、前記有効成分を薬理学的に許容される液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などを加え、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤などの固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。
医薬用担体は、治療剤または予防剤の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤などとすることができ、たとえばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、など張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製される。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体ないし半固体状、半固体または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。
以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の治療剤および予防剤は、その剤形に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法には特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用剤では、たとえば、座剤をその適する投与方法により投与すればよい。
本発明の治療剤または予防剤の投与量は、その剤形、投与方法、使用目的および当該治療剤または予防剤の投与対象である動物（たとえば、患者）の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。たとえば、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される前記有効成分の投与量が、好ましくは成人１日当り０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇとなるような量である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。
ＮＧＦは神経細胞に働き、神経突起の伸長、神経突起細胞の維持を行う。従って、本発明において使用される有効成分によりＮＧＦの産生増強を行うことで、生体の神経系の維持と活性化をもたらすことができる。それゆえ、本発明の治療剤または予防剤は前記各種疾患の治療または予防に有用である。
本発明の第２の態様である本発明に係る前記有効成分を含むＮＧＦ産生増強剤は、前記有効成分そのものであってもよく、また、前記有効成分を含む組成物であってもよい。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が用いられる。ＮＧＦ産生増強剤は、たとえば、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分などと配合し、上記治療剤または予防剤の製造方法に準じて通常使用される試薬の形態に製造すればよい。かかる増強剤における前記有効成分の含有量は、増強剤の投与方法、使用目的などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。また、該増強剤の使用量も、本発明の所望の効果の発現が得られ得るようであれば特に限定されるものではない。特に、生体に投与して使用する場合、好ましくは前記治療剤または予防剤における有効成分の投与量範囲内で有効成分を投与できるような量で、該増強剤を使用すればよい。
本発明のＮＧＦ産生増強剤は、神経細胞活性化（たとえば、学習記憶能力の向上など）に使用することができる。また、該増強剤を用いて、後述のＮＧＦ産生増強方法により、神経細胞機構に関する生化学的研究や、痴呆症、神経障害薬のスクリーニングを行うこともできる。
本発明の第３の態様として、本発明に係る前記有効成分を動物に投与するＮＧＦ産生の増強方法を提供する。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が用いられる。かかる方法は、ＮＧＦ産生の増強が必要であると予想される、または、その必要のある動物に対し、前記有効成分を、好ましくは、本発明のＮＧＦ産生増強剤として投与することにより行うことができ、かかる投与により、ＮＧＦの産生を増強せしめる。有効成分の投与方法、投与量などは、好ましくは前記ＮＧＦ産生増強剤に準じればよい。なお、本発明の治療剤または予防剤、後述の食品、飲料または飼料をＮＧＦ産生増強剤と同様にして用いることもできる。
かかるＮＧＦ産生増強方法によれば、たとえば、当該方法により神経細胞を活性化させて、細胞内外の関連因子の動向の解析を行うことにより神経細胞機構に関する生化学的研究を行うことができる。また、かかるＮＧＦ産生増強方法により、痴呆症、神経障害薬等のスクリーニングを行うことができる。
本発明の第４の態様として、ＮＧＦ産生増強用食品、飲料または飼料を提供する。かかる食品、飲料または飼料は、本発明に係る前記有効成分を含有してなるものである。本発明の態様においては、有効成分としての塩に、薬理学的に許容される塩、またはそれと同等の安全性を有する塩を好適に用いることができる。本発明の食品、飲料または飼料は、そのＮＧＦ産生増強作用により、当該有効成分に感受性を示す前記するようなＮＧＦ産生増強を要する各種疾患の症状改善、予防に極めて有用である。
なお、本発明の食品、飲料または飼料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、飲料または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。
本発明の食品、飲料または飼料の製造法に特に限定はない。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品、飲料または飼料のものに従えばよく、かかる食品、飲料または飼料の製造法により製造することができ、得られた食品、飲料または飼料にＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に係る有効成分が含有されていれば良い。
本発明の食品または飲料とは、特に限定はないが、たとえば、本発明に係る前記有効成分が含有されてなる、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餠など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餠菓子、米菓類など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなど）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、調味料（しようゆ、ソース、酢、みりんなど）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体食品（スープなど）、香辛料類などの農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品などが挙げられる。
本発明の食品または飲料中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と活性発現の観点から適宜選択できるが、たとえば、食品１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部であり、たとえば、飲料１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部である。また、本発明の食品または飲料は、好ましくは、それらに含有される有効成分が、たとえば、成人１日当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇとなるように摂取すればよい。
また、本発明により、ＮＧＦ産生増強活性を有する、本発明に係る前記有効成分を含有してなる生物用の飼料が提供される。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法が提供される。さらに、本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。
これらの発明において、生物とはたとえば養殖動物、ペット動物などであり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類または貝類が例示される。飼料としては体調の維持および／または改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明に使用される前記有効成分のＮＧＦ産生増強活性に基づき、本発明の前記治療剤または予防剤によるのと同様の効果の発現が期待できる。すなわち、当該生物における痴呆症、神経障害の治療または予防効果の発現が期待できる。
本発明に使用される前記有効成分は通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ投与される。投与は、たとえば、当該有効成分を、対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合することで行うことができる。また、前記有効成分の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、０．００１〜１５重量％の割合が適当である。
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油などの動物性油脂、大豆油、菜種油などの植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤などを原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチなどの魚類用飼料が挙げられる。
本発明の飼料の製造方法に特に限定はなく、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中にＮＧＦ産生増強活性を有する本発明に係る有効成分が含有されていればよい。
また、ＮＧＦ産生増強活性を有する本発明に係る前記有効成分をプール、水槽、保持タンクまたは飼育領域の水、海水などに直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。水または海水中のＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に係る有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは０．００００１〜１重量％の割合が適当である。
また、ＮＧＦ産生増強活性を有する本発明に係る前記有効成分を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。該飲料中のＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に使用される有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．０００１〜１重量％の割合が適当である。
ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分を含有する生物飼育用剤、たとえば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の配合および製造方法で作製すれば良い。該生物飼育用剤における有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られ得る限り特に限定されるものではない。
本発明が適用できる生物としては限定は無いが、養殖動物としては、馬、牛、豚、羊、山羊、らくだ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズなどの魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミなどの甲殻類など、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキなどの貝類、ペット動物としてはイヌ、ネコなどが挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分を含有する飼料を摂取させること、またはＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物などの体調を良好に維持し、または、改善させたりすることができる。
本発明の食品、飲料または飼料には本発明に係る前記有効成分が含有されており、そのＮＧＦ産生増強活性を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はない。たとえば、タブレット状、顆粒状、カプセル状などの形状の経口的に摂取可能な形状物も包含される。
さらに、本発明の第５の態様として、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、ＮＧＦ産生増強剤、またはＮＧＦ産生増強用食品、飲料もしくは飼料の製造における本発明に係る前記有効成分の使用を提供する。かかる使用の態様としては、本発明の前記治療剤もしくは予防剤、ＮＧＦ産生増強剤、またはＮＧＦ産生増強用食品、飲料もしくは飼料の製造における前記有効成分の使用の態様を挙げることができる。たとえば、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、またはＮＧＦ産生増強剤の製造における、前記有効成分の使用としては、前記のような錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤などの固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品の製造においての使用が例示される。
本発明に係る有効成分は、後述の実施例から明らかであるように、公知のＮＧＦ産生増強活性を有する化合物と比較して、１）より低濃度でより強い増強活性を示す、２）増強活性を示す濃度領域が広い、および／または３）低毒性である、との特徴を有するものである。従って、当該有効成分を含有してなる、本発明の治療剤もしくは予防剤、または食品、飲料もしくは飼料は、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療または予防に有用である。また、前記有効成分を含有してなるＮＧＦ産生増強剤は、神経細胞機構に関する生化学的研究や、痴呆症、神経障害薬等のスクリーニングに有用である。
実施例
以下、製造例、実施例などを挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、製造例、実施例などにおける％は特段の事情がない限り重量％を意味する。
製造例１  ブテイン（Ｂｕｔｅｉｎ）〔化合物（１３）〕の合成
２’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン（２’，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）１ｇ（６．６ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ；東京化成製）９１２ｍｇ（６．６ｍｍｏｌ）およびピリジニウム  ｐ−トルエンスルホネート（Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ；東京化成製）８０ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２６ｍＬに溶解し室温で３０分間撹拌した後、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎｅ；東京化成製）１０ｍＬを添加し、室温で更に３時間撹拌した。反応液を水で２回洗浄し、減圧濃縮した後、得られた油状物質をメタノール２６ｍＬに溶解し、水酸化バリウム八水和物２．１５ｇを添加して４０℃で約２０時間撹拌した。反応液をメタノール２６ｍＬで希釈した後、１規定の塩酸でｐＨを中性付近にした。反応液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和重曹水、１０％クエン酸水、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮物をヘキサン：酢酸エチル（容量比）＝５：１を展開溶媒としたシリカゲル系カラム（富士シリシア化学（株）製）を用いたクロマトグラフィー（以下、シリカクロマトという）に供することにより化合物（１３）のテトラハイドロキシピラン（ＴＨＰ）化体を得た。化合物（１３）のＴＨＰ化体をメタノール２６ｍＬに溶解し、スルホサリチル酸無水物（Ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）６７ｍｇ（０．２６４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮物からヘキサンと酢酸エチルにより化合物（１３）１ｇ（収率５６％）を再結晶した。化合物（１３）の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル、質量スペクトルをそれぞれＪＮＭ−Ａ５００（日本電子社製）、ＭＳ（ＤＸ３０２）質量分析計（日本電子社製）で分析し、その構造を決定した。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ  ＮＭＲ：δ６．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ３’，５’  ２Ｈｚ，Ｈ−３’），６．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’  ９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６  ８Ｈｚ，Ｈ−５），７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６  ２Ｈｚ，Ｈ−６），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．６４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−α，β），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７３（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例２  ３，４，５，２’，４’−ペンタヒドロキシカルコン（３，４，５，２’，４’−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（１７）〕の合成
２’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン０．５ｇ（２．９ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド０．４ｇ（２．９ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（１７）６００ｍｇ（収率７２％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ３’，５’２Ｈｚ，Ｈ−３’），６．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７８（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２，６），７．５４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−α，β），８．０７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２８９（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例３  ３，４，２’，５’−テトラヒドロキシカルコン（３，４，２’，５’−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（１８）〕の合成
２’，５’−ジヒドロキシアセトフェノン（２’，５’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）４９７ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド４５１ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（１８）７６０ｍｇ（収率８５％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ３’，４’９Ｈｚ，Ｈ−３’），６．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４’，６’３Ｈｚ，Ｈ−４’），７．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１５Ｈｚ，Ｈ−α），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７３（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例４  ３，４，３’，４’−テトラヒドロキシカルコン（３，４，３’，４’−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（１９）〕の合成
３’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン（３’，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）５１５ｍｇ（３．４ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド４６８ｍｇ（３．４ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（１９）２７２ｍｇ（収率３０％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’８Ｈｚ，Ｈ−５’），７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ２’，６’２Ｈｚ，Ｈ−２’），７．４８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−α，β），７．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７３（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例５  ３，４，３’，５’−テトラヒドロキシカルコン（３，４，３’，５’−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（２０）〕の合成
３’，５’−ジヒドロキシアセトフェノン（３’，５’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）８１６ｍｇ（５．４ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド７４１ｍｇ（５．４ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（２０）６０５ｍｇ（収率４１％）を得た。ＮＮＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２’，４’２，Ｊ４’，６’２Ｈｚ，Ｈ−４’），６．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．８７（２Ｈ，ｄ，Ｈ−２’，６’），７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），７．５１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７２（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例６  ３，４，２’−トリヒドロキシカルコン（３，４，２’−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（２１）〕の合成
２’−ヒドロキシアセトフェノン（２’−Ｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）８９０ｇ（６．５ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド９０２ｍｇ（６．５ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（２１）７１５ｍｇ（収率４３％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．９８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，５’），７．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６８Ｈｚ，Ｈ−６），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．５３（１Ｈ，Ｊ３’，４’８，Ｊ４’，５’８，Ｊ４’，６’２Ｈｚ，ｔｄ，Ｈ−４’），７．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−α，β），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’８Ｈｚ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２５７（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例７  ３，４，２’，３’４’−ペンタヒドロキシカルコン（３，４，２’，３’，４’−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（２２）〕の合成
２’，３’，４’−トリヒドロキシアセトフェノン（２’，３’，４’−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）６０５ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド５００ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（２２）６２２ｍｇ（収率６０％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ５’，６’９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ．Ｈ−５），７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．６４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−α，β），７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２８９（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例８  キサントアンゲロール（Ｘａｎｔｈｏａｎｇｅｌｏｌ）〔化合物（２４）〕の調製
明日葉乾燥品（阪本漢方堂）４８０ｇをフードプロセッサで粉砕し、酢酸エチル約１Ｌで２回抽出し、得られた有機層画分を減圧濃縮した後、濃縮物をシリカクロマトに供した。次いで、クロロホルム：メタノール＝１００：１（６００ｍＬ）、１２：１（６００ｍＬ）を順に用いて吸着物を段階的に溶出し、１フラクションに８ｍＬずつ分取した。得られたフラクションのフラクション番号７６以降を集めて減圧濃縮し、濃縮物をヘキサン：酢酸エチル＝１．８：１を展開溶媒としたシリカクロマトに供することによりフラクション番号２５〜５０に化合物（２４）を高濃度に含む画分を得た。この画分から、酢酸エチルとヘキサンにより再結晶することで、高純度の化合物（２４）約２００ｍｇを得た。ＮＭＲスペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．５８（３Ｈ，ｓ，−Ｍｅ），１．６６（３Ｈ，ｓ，−Ｍｅ），１．８１（３Ｈ，ｓ，−Ｍｅ），２．０８（４Ｈ，ｍ），３．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ７Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｍ），５．２９（１Ｈ，ｍ），６．４０（１Ｈ，ｄ  Ｊ５’，６’９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ５，６９，Ｊ２，３９Ｈｚ，Ｈ−２，６），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１５Ｈｚ，Ｈ−α），７．５４（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３，５），７．７１（１Ｈ．ｄ，Ｈ−６’），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重クロロホルムに溶解し、残留クロロホルムの化学シフト値を７．２４ｐｐｍとして表した。
製造例９  α−ヒドロキシブテイン（α−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｅｉｎ）〔化合物（２５）〕の合成
後述の実施例１で合成した化合物（５）２００ｍｇ（０．４５５ｍｍｏｌ）を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液４５５ｍＬに溶解し室温、５時間反応させた。反応液を濃縮し、逆相系カラムを用いたクロマトグラフィー（以下、逆相クロマトという）に供した。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（径２１．５ｍｍ×長３０ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）と溶媒Ｂ（蒸留水とアセトニトリルを容量比１対１で混合したもので０．１％トリフルオロ酢酸を含む）の溶出比は０分から１２０分にかけて溶媒Ｂ比を直線的に０％から１００％に、続く２０分間は溶媒Ｂ比を１００％保持とした。溶出速度は５ｍｌ／分、検出は２１５ｎｍで行った。
保持時間６６．０分のピークを含むフラクションを採取し濃縮乾固することにより、化合物（２５）５．０ｍｇ（収率２．５％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．５９（１Ｈ，ｓ，−Ｈ−β），６．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３’，５’１．５，Ｊ５’，６’８．５Ｈｚ，Ｈ−５’），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３’），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８．５Ｈｚ，Ｈ−５），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２．０Ｈｚ，Ｈ−６），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７１（Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
製造例１０  キサントフモール（Ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）の調製
キサントフモールの精製を目的とし、ホップ由来キサントフモールフラクション（ホップスタイナー社製）１．９ｍｇを逆相クロマトに供した。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ（径４．６ｍｍ×長２５ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒Ａ（蒸留水とアセトニトリルを容量比３：１で混合したもので０．１％トリフルオロ酢酸を含む）と溶媒Ｂ（蒸留水とアセトニトリルを容量比１：３で混合したもので０．１％トリフルオロ酢酸を含む）の溶出比は０分から２０分にかけて溶媒Ｂ比を直線的に５０％から１００％に、続く５分間は溶媒Ｂ比を１００％に保持、最後に溶媒Ｂ比を５０％にし５分間保持とした。溶出速度は１ｍｌ／分、検出は２１５ｎｍで行った。保持時間１２．８分のピークを含むフラクションを採取し濃縮乾固することにより約０．３ｍｇの化合物を得た。得られた化合物をＮＭＲにより解析し、化合物が式（２６）に示すキサントフモールであることを確認した。
0004249926.tif 000010
ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．６０（３Ｈ，ｓ，−Ｍｅ），１．６９（３Ｈ  ｓ，−Ｍｅ），３．１２（２Ｈ，ｄ，７Ｈｚ，Ｈ−１’’ａ，ｂ），３．８６（３Ｈ，ｓ，−ＯＭｅ），５．１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２’’），６．０７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５’），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ２，３９Ｈｚ，Ｊ５，６９Ｈｚ，Ｈ−２，６），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｈ−３，５），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊａ，ｂ１６Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ），１０．０５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−４），１０．５５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−４’），１４．６３（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−２’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第９図に、得られたキサントフモールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第９図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３５５（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例１  ３，４，２’，４’−テトラアセチルブテイン（３，４，２’，４’−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌ  ｂｕｔｅｉｎ）〔化合物（５）〕の合成
製造例１で合成した化合物（１３）１ｇ（３．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５０ｍＬに溶解し、氷冷下、無水酢酸（１８．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１８．５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応液を飽和重曹水、１０％クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮物からヘキサンとクロロホルムにより化合物（５）（１．５ｇ、収率９０％）を再結晶した。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ２．２３（３Ｈ，ｓ，−ＯＡｃ），２．２９（３Ｈ，ｓ，−ＯＡｃ），２．３０（３Ｈ，ｓ，−ＯＡｃ），２．３１（３Ｈ，ｓ，−ＯＡｃ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ３’，６’２，Ｈ−３’），７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’８Ｈｚ，Ｈ−５’），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），７．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−２），７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６），７．５２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β），７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重クロロホルムに溶解し、残留クロロホルムの化学シフト値を７．２４ｐｐｍとして表した。第１図に、化合物（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第１図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ４４１（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例２  ３，４−ジヒドロキシ−２’，４’−ジクロロカルコン（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２’，４’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（６）〕の合成
２’，４’−ジクロロアセトフェノン（２’，４’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；シグマ社製）６８０ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド５００ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（６）３２０ｍｇ（収率２９％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），７．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β），７．５５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，６’），７．７４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第２図に、化合物（６）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第２図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３０９（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例３  ３，４−ジヒドロキシ−２’，４’−ジメトキシカルコン（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２’，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）〔化合物（７）〕の合成
２’，４’−ジメトキシアセトフェノン（２’，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；東京化成製）６４８ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド５００ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（７）６００ｍｇ（収率５６％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ４．１０（３Ｈ，ｓ，−ＯＭｅ），４．４０（３Ｈ，ｓ，−ＯＭｅ），６．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３’，６’２，Ｊ５’，６’９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３’），６．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），６．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．０８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β），７．６７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第３図に、化合物（７）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第３図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３０１（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例４  ４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ブテン−２−オン〔４−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎｅ−２−ｏｎｅ〕〔化合物（８）〕の合成
アセトン（ナカライテスク社製）１ｍＬと、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド１ｇ（７．２ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（８）１８０ｍｇ（収率１４％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ２．２６（３Ｈ，ｓ，−Ｍｅ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第４図に、化合物（８）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第４図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １７９（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例５  １−アダマンチル−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ〕〔化合物（９）〕の合成
１−アダマンチルメチルケトン（１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ；シグマ社製）６４０ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）と、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド５００ｇ（３．６ｍｍｏｌ）を出発材料とし、製造例１と同様の方法により、化合物（９）５００ｍｇ（収率４６％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．６５−２．０４（１５Ｈ，ｍ，−ａｄａｍａｎｔｙｌ），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−５），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊα，β１６Ｈｚ，Ｈ−α），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｈ−β）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第５図に、化合物（９）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第５図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２９９（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例６  ジヒドロブテイン（Ｄｉｈｙｄｒｏｂｕｔｅｉｎ）〔化合物（１０）〕の合成
製造例１で合成した化合物（１３）２００ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）をメタノール１５ｍＬに溶解し、パラジウム（ナカライテスク社製）２００ｍｇ存在下、水素ガスを通じながら室温で１．５時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧濃縮した後、クロロホルム：メタノール＝１５：１を展開溶媒としたシリカクロマトに供することにより化合物（１０）１３０ｍｇ（収率６５％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ２．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊα，β７．５Ｈｚ，Ｈ−β），３．１６（１Ｈ，ｔ，Ｈ−α），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ３’，５’２．５Ｈｚ，Ｈ−３’），６．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５’，６’９Ｈｚ，Ｈ−５’），６．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５，６９，Ｊ２，６２Ｈｚ，Ｈ−６），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５），６．６１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−６’）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第６図に、化合物（１０）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第６図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７５（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例７  １−アダマンチル−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ブテン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｂｕｔｅｎｅ−１−ｏｎｅ〕〔化合物（１１）〕の合成
後述の実施例８で合成した化合物（１２）９００ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）を実施例１〔化合物（５）の合成〕と同様の方法でアセチル化した後、ジクロロメタン４０ｍＬに溶解し、１，８−ジアザビシクロ（５，４，０）−７−ウンデセン〔１，８−Ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ（５，４，０）−７−ｕｎｄｅｃｅｎｅ：ＤＢＵ〕４ｍｍｏｌを加えて室温で２時間反応させた。反応液を１０％クエン酸水溶液で洗浄、乾燥した後、濃縮乾固し、濃縮物をヘキサン：酢酸エチル＝５：１を展開溶媒としたシリカクロマトに供することにより化合物（１１）のＴＨＰ化体を得た。化合物（１１）のＴＨＰ化体をメタノール１０ｍＬに溶解し、スルホサリチル酸無水物４０ｇ（０．１５７ｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮物からヘキサンと酢酸エチルにより再結晶し、化合物（１１）２２０ｍｇ（収率４４％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．６６−２．００（１５Ｈ，ｍ，−ａｄａｍａｎｔｙｌ），３．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊα，α’，７，Ｊα，β１Ｈｚ，Ｈ−α），５．９３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊβ，δ１１Ｈｚ，Ｈ−β），６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−δ），６．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−６），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５），６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第７図に、化合物（１１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第７図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３１３（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
実施例８  １−アダマンチル−３−ヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ブタン−１−オン〔１−Ａｄａｍａｎｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎｅ−１−ｏｎｅ〕〔化合物（１２）〕の合成
氷冷、アルゴン気流下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２ｍＬ中でジイソプロピルアミン（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ；和光純薬製）２２４μＬ（１．６ｍｍｏｌ）に１．６Ｍブチルリチウム（Ｂｕｔｙｌ  ｌｉｔｈｉｕｍ）ヘキサン溶液（ナカライテスク社製）１ｍＬを徐々に添加し、３０分間撹拌した。反応液をメタノール／ドライアイスで−７０℃に冷却し、１−アダマンチルメチルケトン２８５ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）／５００μＬ  ＴＨＦ溶液を添加し、３０分間撹拌した。この反応液に、３’，４’−ジヒドロキシフェニル酢酸（３’，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ナカライテスク社製）を完全ＴＨＰ化した後、１Ｍ  ＤＩＢＡＬヘキサン溶液（ナカライテスク社製）で還元することにより得られた、３’，４’−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（３’，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）のＴＨＰ化体５００ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）／ＴＨＦ  ５００μＬを徐々に添加し、−７０℃で１０分間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、次いでエーテル抽出により得られた有機層画分をヘキサン：酢酸エチル＝４：１を展開溶媒としたシリカクロマトに供することにより化合物（１２）のＴＨＰ化体を得た。化合物（１２）のＴＨＰ化体をメタノール１０ｍＬに溶解し、スルホサリチル酸無水物４０ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮物からヘキサンと酢酸エチルにより再結晶し、化合物（１２）２６０ｍｇ（収率５７％）を得た。ＮＭＲスペクトル、質量スペクトルの測定結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．５８−１．９８（１５Ｈ．ｍ，−ａｄａｍａｎｔｙｌ），２．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊα，β４．５，Ｊα，α’，１６．５Ｈｚ，Ｈ−α），２．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊβ，δ６．０，Ｊδ，δ’，１３．５Ｈｚ，Ｈ−δ），２．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊα’，β４．５Ｈｚ，Ｈ−α’），３．９９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−β），６．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，６２，Ｊ５，６８Ｈｚ，Ｈ−６），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２），６．５７（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２）
但し、サンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第８図に、化合物（１２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第８図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３３１（Ｍ＋Ｈ）＋（但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）
参考例１  カフェイン酸を用いたＮＧＦ産生増強活性測定方法の検討
マウス線維芽細胞Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）に１．５×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に培養した。３日間培養後、培地をとり除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。細胞を含む各ウェルに対しＮＧＦ産生増強活性を有する公知の物質であるカフェイン酸〔Ｃａｆｆｅｉｃ  Ａｃｉｄ：シグマ社製、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液〕を最終濃度が０、５０、１００、２００μＭになるように添加し、２４時間培養した。なお、カフェイン酸濃度が０μＭのものを陰性対照とした。また、各ウェルのＤＭＳＯの最終濃度は０．１％になるようにした。培養終了後、培養液中のＮＧＦの濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。各添加量でのカフェイン酸のＮＧＦ産生増強の度合いは、各添加量での細胞培養液中のＮＧＦ濃度を、陰性対照の細胞培養液中のＮＧＦ濃度を１００％として１００分率により増強率（％）として表した。その結果を表３に示す。実験は２連で行い、その平均値を採用した。本方法によりカフェイン酸のＮＧＦ産生増強活性を測定できることが明らかとなった。また本参考例により、カフェイン酸はその濃度依存的にＮＧＦ産生を増強させることも明らかとなった。
0004249926.tif 000011
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．１４２７８ｎｇ／ｍｌであった。
実施例９  化合物（１３）によるＮＧＦ産生の増強
参考例１と同様の方法で、化合物（１３）（フナコシ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。化合物（１３）は、最終濃度が０、０．５、１、２、５、１０、２０、５０μＭになるように添加した。その結果を表４に示す。化合物（１３）は、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強し、高いＮＧＦ産生増強活性を示すとともにまたその作用有効濃度領域が広いことが明らかとなった。
0004249926.tif 000012
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０７０９１ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１０  化合物（１４）によるＮＧＦ産生の増強
参考例１と同様の方法で、化合物（１４）（シグマ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。化合物（１４）は、最終濃度が０、５０、１００、２００μＭになるように添加した。その結果を表５に示す。化合物（１４）は、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強し、高いＮＧＦ産生増強活性を示すとともにその作用有効濃度領域が広いことが明らかとなった。
0004249926.tif 000013
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０７０９１ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１１  化合物（１５）によるＮＧＦ産生の増強
参考例１と同様の方法で、化合物（１５）（シグマ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。化合物（１５）は、最終濃度が０、１２．５、２５、５０μＭになるように添加した。その結果を表６に示す。化合物（１５）は、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強し、高いＮＧＦ産生増強活性を示すとともにまたその作用有効濃度領域が広いことが明らかとなった。
0004249926.tif 000014
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．１４２７８ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１２  化合物（１６）によるＮＧＦ産生の増強
参考例１と同様の方法で、化合物（１６）（和光純薬社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。化合物（１６）は、最終濃度が０、２５、５０、１００μＭになるように添加した。その結果を表７に示す。化合物（１６）は、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強し、高いＮＧＦ産生増強活性を示すとともにまたその作用有効濃度領域が広いことが明らかとなった。
0004249926.tif 000015
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．１４２７８ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１３  化合物（５）〜（１２）および（１７）〜（２５）によるＮＧＦ産生の増強
参考例１と同様の方法で、製造例２〜９および実施例１〜８で合成した化合物（５）〜（１２）、（１７）〜（２２）、（２４）および（２５）、化合物（２３）（ロスマリン酸：フナコシ社製）または従来よりＮＧＦ産生増強物質として知られているカフェイン酸（ＣＡ）、４−メチルカテコール（４ＭＣ）およびエピネフリン（ＥＮ）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。各化合物は、表８〜１０に示す最終濃度になるように添加した。また、化合物添加後の細胞培養時間は２０時間とした。これらの結果を表８〜１０に示す。各化合物の試験ごとに陰性対照を設け、それぞれ実験は２連で行い、その平均値を採用した。
0004249926.tif 000016
0004249926.tif 000017
0004249926.tif 000018
なお、表中のＮＣは陰性対照のＮＧＦ濃度を示す。また、Ｎ．Ｔ．は試験していないことを示す。
これらの結果から、本発明に使用される化合物（５）〜（１２）および（１７）〜（２５）は、従来よりＮＧＦ産生増強物質として知られているカフェイン酸、４−メチルカテコールおよびエピネフリンよりもＮＧＦ産生増強活性の強さ、もしくはＮＧＦ産生増強活性を示す濃度領域が広域である点で高い有用性を持つことが示された。
実施例１４
（１）マウス線維芽細胞Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）で１．５×１０５細胞／ｍｌに懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に培養した。３日間培養後、培地を取り除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。これにキク科ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  ＬＩＮＮＥ）の花より抽出して得られた黄色色素（粉末サンエローＮｏ．２、三栄源エフ・エフ・アイ社製）を試料として最終濃度が０、１．２５、２．５、５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、２０時間培養した。培養終了後、培養液中のＮＧＦの濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。ＮＧＦ産生増強の度合いを、陰性対照としての、試料を添加していない細胞培養液中のＮＧＦ濃度を１００％とし１００分率により増強率（％）として表した。実験は２連で行い、その平均値を採用した。その結果、ベニバナ黄色色素は濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。その結果を表１１に示す。
0004249926.tif 000019
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は０．５０７ｎｇ／ｍｌであった。
（２）実施例１４−（１）に記載のベニバナ黄色色素中の活性成分を逆相クロマトを用いて精製単離した。以下にその条件について示す。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（径２１．５ｍｍ×長３０ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）と溶媒Ｂ（蒸留水とアセトニトリルを容量比１対１で混合したもので０．１％  トリフルオロ酢酸を含む）の溶出比は０分から５０分にかけて溶媒Ｂ比を直線的に０％から１００％に、続く１５分間は溶媒Ｂ比を１００％に保持、最後に溶媒Ｂ比を０％にし１５分間保持とした。溶出速度は５ｍｌ／分、検出は２１５ｎｍで行った。３分間ごとにフラクションを採取し、各フラクションのＮＧＦ産生増強活性を実施例１３と同様の方法で測定した。その結果、保持時間３２．５分と４１．８分の検出のピークを含むフラクションに、活性があることが明らかになった。保持時間３２．５分のフラクションについて質量スペクトル解析を行ったところ、分子量が６１３のシグナルが検出された。さらに、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（第９図）、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル解析の結果、活性成分は式（２７）に示す化合物（２７）のサフロミンＡ（分子量６１２．５３）であることを確定した。
0004249926.tif 000020
このようにして得られた精製サフロミンＡのＮＧＦ産生増強活性を実施例１３と同様の方法で測定した。精製サフロミンＡは最終濃度が０、２．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。その結果、精製したサフロミンＡはＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。サフロミンＡの結果については表１２に、保持時間４１．８分のフラクション中に含まれた物質についての結果については表１３に示す（該物質の添加量は表１３に示す）。
0004249926.tif 000021
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は０．７３９ｎｇ／ｍｌであった。
0004249926.tif 000022
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は０．７３６ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１５  キサントフモールによるＮＧＦ産生の増強
実施例１３と同様の方法で製造例１０で調製したキサントフモールのＮＧＦ産生増強活性を測定した。キサントフモールは、最終濃度が０、１５．６、３１．３、６２．５、１２５μＭとなるように添加した。その結果を表１４に示す。キサントフモールは、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強し、高いＮＧＦ産生増強活性を示すと共に、また、その作用有効濃度領域が広いことが明らかとなった。
0004249926.tif 000023
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は０．０５７５ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１６
（１）ミリセチンによるＮＧＦ産生の増強
ラット線維芽Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）で１．５×１０５細胞／ｍｌに懸濁し９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に培養した。３日間培養後、培地をとり除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。
細胞を含む各ウェルに対しミリセチン（シグマ社製）を最終濃度が０、３１．３、６２．５、１２５、２５０μＭになるように添加し、２４時間培養した。陰性対照として蒸留水を添加したものを用いた。培養終了後、培養液中のＮＧＦの濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。各添加量でのＮＧＦ産生増強の度合いは、各添加量での細胞培養液中のＮＧＦ濃度を陰性対照の細胞培養液中のＮＧＦ濃度を１００％として１００分率により増強率（％）として表した。その結果を表１５に示した。実験は２連で行い、その平均値を採用した。ミリセチンは、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。
0004249926.tif 000024
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０３８ｎｇ／ｍｌであった。
（２）クエルセチンによるＮＧＦ産生の増強
実施例１６−（１）と同様の方法で、クエルセチン（シグマ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。クエルセチンは、最終濃度が０、３１．３、６２．５、１２５、２５０μＭになるように添加した。その結果を表１６に示す。クエルセチンは、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。
0004249926.tif 000025
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０５３ｎｇ／ｍｌであった。
（３）ミリシトリンによるＮＧＦ産生の増強
実施例１６−（１）と同様の方法で、ミリシトリン（フナコシ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。ミリシトリンは、最終濃度が０、３１．３、６２．５、１２５、２５０μＭになるように添加した。その結果を表１７に示した。ミリシトリンは、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。
0004249926.tif 000026
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０５３ｎｇ／ｍｌであった。
（４）クエルシトリンによるＮＧＦ産生の増強
実施例１６−（１）と同様の方法で、クエルシトリン（シグマ社製）のＮＧＦ産生増強活性を測定した。クエルシトリンは、最終濃度が０、３１．３、６２．５、１２５、２５０μＭになるように添加した。その結果を表１８に示した。クエルシトリンは、濃度依存的にＬ−Ｍ細胞のＮＧＦ産生を増強した。
0004249926.tif 000027
ただし、陰性対照のＮＧＦ濃度は、０．０５３ｎｇ／ｍｌであった。
実施例１７
雄性ＳＤラットを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用いた。ストレプトゾトシン（ナカライテスク社製）を、体重１ｋｇあたり１００ｍｇ腹腔内に投与して糖尿病を惹起した。ストレプトゾトシン投与５日後の血糖値によって群分けを行った。次いで、ブテイン〔化合物（１３）〕を生理食塩水に溶解して体重１ｋｇあたり１００μｇの割合で腹腔内に投与した。対照群には生理食塩水のみを同様に投与した。投与は連日行い、投与開始から４週間後に坐骨神経（約３５ｍｇ）を摘出した。摘出した神経をホモジナイズして、ＮＧＦを抽出し、含有量をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。
その結果を表１９に示す。表中の数字は、６例の平均値±標準誤差を表す。また、＊印はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、対照群に対して５％以下の危険率で有意な差を有することを意味する。すなわち、対照群に対しブテイン投与群では神経中のＮＧＦ含有量が増加していた。このように、ブテインの生体への投与により、ＮＧＦ産生が増強することが明らかになった。
0004249926.tif 000028
実施例１８
（１）マウス線維芽細胞Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）で２．５×１０５細胞／ｍｌに懸濁し６穴プレートに２ｍｌずつまき無菌的に培養した。３日間培養後、培地を取り除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地１ｍｌに置き換えた。これにジメチルスルホキシドに溶解したブテイン〔化合物（１３）〕を最終濃度が２０μＭ（ＤＭＳＯの最終濃度０．１％）となるように添加し２０時間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、２０％のウシ胎仔血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むＤＭＥ培地（バイオウィッタカー社製）をなど容量添加し、０．２２μｍの滅菌フィルターに通し、ブテイン処理調製培地を得た。また、ブテインの代わりにＤＭＳＯのみを最終濃度０．１％となるように添加した培養上清についても、同様の操作を行い、対照調製培地を得た。
（２）実施例１８−（１）で調製したブテイン処理調製培地ならびに対照調製培地中に含まれるＮＧＦの生化学的な活性の評価を以下の方法で調べた。
まず、あらかじめラット副腎褐色細胞腫ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）を１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥ培地で２．０×１０４細胞／ｍｌに懸濁しコラーゲンコートした９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に２４時間培養しておいた。次に、０．５％のウシ血清アルブミンを含むＭ１９９培地と２０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥ培地をなど量ずつ混合した培地（以下、アッセイ用培地）を用いて、ブテイン処理調製培地ならびに対照調製培地について２倍希釈系列（原液、２分の１希釈液、４分の１希釈液、８分の１希釈液、１６分の１希釈液、３２分の１希釈液）を調製した。培養しておいたＰＣ−１２細胞から培地を取り除き、ブテイン処理調製培地ならびに対照調製培地の前記段階希釈液を１００μｌ添加し、無菌的に４８時間培養した。なお、比較として調製培地の代わりに、アッセイ用培地のみを１００μｌ添加し、無菌的に４８時間培養した。培養終了後、顕微鏡（オリンパス社製）観察下で無作為に視野を選び細胞の写真（倍率：１００倍）をとった。写真中の３００〜５００個の細胞を対象に、神経突起伸長陽性のＰＣ−１２細胞の数をカウントし、下式により神経突起伸長率（％）を算出した。
神経突起伸長率（％）＝神経突起陽性の細胞数（個）÷総細胞数（個）×１００
なお、神経突起の長さが細胞の長径よりも長いものを神経突起伸長陽性とした。ブテイン処理調製培地ならびに対照調製培地について求めた神経突起伸長率（％）の結果を表２０に示す。実験は３連で行いその平均値を採用した。ブテイン処理調製培地は対照調製培地にくらべ強い神経突起伸長活性を示した。
0004249926.tif 000029
アッセイ用培地のみを添加した場合の神経突起伸長率は３．６６％であった。
実施例１９  治療剤の製造１
注射剤
Ｉ．  生理食塩水にブテイン〔化合物（１３）〕を１％濃度で加え、注射剤を作製した。
ＩＩ．  生理食塩水にブテイン〔化合物（１３）〕およびグリシルリチン酸をそれぞれ０．５％および０．１％濃度で加え、注射剤を作製した。
また、化合物（５）〜（１２）、（１４）〜（２５）についても上記Ｉ、ＩＩと同様の方法で注射剤を作製した。
錠剤
ＩＩＩ．ブテイン〔化合物（１３）〕１００ｍｇと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、各錠剤を作製した。
ＩＶ．ブテイン〔化合物（１３）〕０．１ｍｇ、グリシルリチン酸ジカリウム１０ｍｇおよび微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。
また、化合物（５）〜（１２）、（１４）〜（２７）についても上記ＩＩＩ、ＩＶと同様の方法で錠剤を作製した。
実施例２０  治療剤の製造２
注射剤
Ｉ．  生理食塩液にミリセチンを１％濃度で加え、注射剤を作製した。
ＩＩ．  生理食塩水にミリセチンおよびグリシルリチン酸をそれぞれ０．５％および０．１％濃度で加え、注射剤を作製した。
錠剤
Ｉ．  ミリセチン１００ｍｇと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、各錠剤を作製した。
ＩＩ．  ミリセチン０．１ｍｇ、グリシルリチン酸ジカリウム１０ｍｇおよび微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。
試験例１  毒性試験
雄性ＳＤラットを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後６週齢より実験に用いた。ブテイン〔化合物（１３）〕を生理食塩水に溶解して腹腔内投与、または０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁して強制経口投与した。投与濃度は、腹腔内投与の場合は体重１ｋｇあたり３００ｍｇ（Ｎ＝３）、１０ｍｇ（Ｎ＝３）、１ｍｇ（Ｎ＝３）、０．１ｍｇ（Ｎ＝３）とし、また、強制経口投与の場合は体重１ｋｇあたり１ｇ（Ｎ＝２）、０．１ｇ（Ｎ＝３）とした。対照群にはそれぞれの溶媒のみを同様に投与した。投与後、いずれの投与群においても、死亡例、一般症状の変化、体重増加の抑制、解剖時の異常所見は認められなかった。
また、本発明で有効成分として使用する化合物をＣＤＦ１マウス（雄性、７週齢、日本ＳＬＣ社）に経口投与して同様に試験を行ったところ、毒性なしまたは低毒性であることが確かめられた。
試験例２  毒性試験
実施例１６で用いた各化合物を前述の試験例１と同様にマウスに経口投与したところ、低毒性であることが確かめられた。
産業上の利用可能性
本発明によりＮＧＦ産生増強活性を有する前記有効成分を含有する医薬が提供される。かかる医薬は、ＮＧＦ産生増強を要する疾患の治療剤または予防剤として生体の恒常性の維持に有用なものである。また本発明では、前記有効成分を含有するＮＧＦ産生増強剤が提供される。かかる増強剤は、神経細胞機構に関する生化学的研究や、痴呆症、神経障害薬等のスクリーニングに有用である。さらに本発明では、ＮＧＦ産生増強用食品、飲料または飼料も提供される。これらの食品、飲料または飼料は、本発明に使用される有効成分に感受性を示すＮＧＦ産生増強を要する疾患の症状改善、予防に極めて有用である。また、本発明においてはＮＧＦ産生増強作用を有する新規化合物についても提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、化合物（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第２図は、化合物（６）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第３図は、化合物（７）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４図は、化合物（８）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第５図は、化合物（９）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第６図は、化合物（１０）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第７図は、化合物（１１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第８図は、化合物（１２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第９図は、化合物（２７）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
0004249926.tif 000030
【図２】
0004249926.tif 000031
【図３】
0004249926.tif 000032
【図４】
0004249926.tif 000033
【図５】
0004249926.tif 000034
【図６】
0004249926.tif 000035
【図７】
0004249926.tif 000036
【図８】
0004249926.tif 000037
【図９】
0004249926.tif 000038