(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，  以下ＣＤＲと記す）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、および軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗体断片であって、ヒトＩＧＦ−Ｉに対する結合活性とヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性とが同程度であり、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０９（ｍｏｌ／Ｌ）−１以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
抗体が、ヒト以外の動物の抗体または遺伝子組換え抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
ヒト以外の動物の抗体のＶＨが配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０〜１３７番目、およびＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目を含む、請求項２項に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
ヒト以外の動物の抗体が、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）により生産される請求項２または３に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項５】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体から選ばれる、請求項２に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項６】
ヒト型キメラ抗体のＶＨが配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０〜１３７番目、およびＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項７】
ヒト型キメラ抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）より生産される抗体のＶＨおよびＶＬを含む、請求項５または６に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項８】
ヒト型キメラ抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、請求項５、６および７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項９】
ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる請求項８に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１０】
ヒト型キメラ抗体が、形質転換株ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９６）により生産される請求項５〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、およびＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＨのＣＤＲおよびＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＬのＣＤＲを含む、請求項５または１１に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１３】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、請求項５、１１および１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１４】
ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる請求項１３に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１５】
ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
【請求項１６】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項２０】
請求項１９に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする抗体またはその抗体断片の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の治療薬。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００２】
本発明は、インスリン様成長因子（insulin-like growth factor; 以下、IGFと表記する）に対する抗体およびそれら抗体に由来する抗体断片に関する。本発明はさらに、該抗体および抗体断片をコードするDNAに関する。本発明は、該DNAを含んでなる組換えベクター、および該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体に関する。本発明はさらに、該形質転換体を用いた該抗体および抗体断片の製造方法、ならびに該抗体および抗体断片の診断、予防および治療上の用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
IGFは、乳房、前立腺、肺、結腸などの器官の上皮系細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）の制御において非常に重要な役割を果たしている因子であり、その作用は、細胞表面に存在するIGF受容体（IGF receptor; 以下、IGF-Rと表記する）を介して行われている（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995）。また、IGF結合蛋白質（IGF-binding protein; 以下、IGFBPと表記する）と呼ばれる蛋白質が存在し、IGFの作用を促進的あるいは抑制的に制御していることが知られている（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995）。
【０００４】
IGFには、IGF-IとIGF-IIの2種類が存在し、いずれも一本鎖のポリペプチドからなっており、インスリンの前駆体であるプロインスリンとアミノ酸レベルで約40%の相同性を有している（Advances in Cancer Research, 68, 183-223, 1996）。IGF-Rには、インスリン受容体、IGF-I受容体（以下、IGF-IRと表記する）、IGF-II受容体（以下、IGF-IIRと表記する）の3種類が存在する。インスリン受容体とIGF-IRは、いずれもチロシンキナーゼ型受容体ファミリーに属しており、一本鎖の前駆体から蛋白質分解酵素による切断の結果生じる135kDaのαサブユニットと95kDaのβサブユニットがS-S結合を形成し、さらにα2β2のヘテロ4量体の構造をとり、細胞膜上に存在している（Endocrine Reviews, 16, 143-163, 1995、Breast Cancer Research & Treatment, 47, 235-253, 1998）。インスリン受容体とIGF-IRは、約60%の相同性を有しており、インスリンとIGF-IR、IGFとインスリン受容体も弱いながらも結合し、作用する（Journal of Biological Chemistry, 263, 11486-11492, 1988、Journal of Biological Chemistry, 268, 7393-7400, 1993）。インスリン受容体のαβサブユニットとIGF-IRのαβサブユニットからなるハイブリッド受容体の存在も確認されており、ハイブリッド受容体は、インスリンよりもIGF-Iに対する結合親和性が高く、IGF-IRとして機能していると考えられているが、生体内での役割は不明である（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995、Endocrine Reviews, 16, 143-163, 1995）。IGF-IIRは、単鎖構造をしており、細胞外領域には、3箇所のリガンド結合領域が存在する。リガンド結合領域の1箇所は、IGF-II結合領域であり、他の2箇所は、マンノース-6-リン酸を含む蛋白質［レニン、プロリフェリン、サイログロブリン、潜在型トランスフォーミング増殖因子(transforming growth factor-β; TGF-β)など］と結合する領域である（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995）。潜在型TGF-βは、IGF-IIRへの結合により活性化されることが報告されている（Breast Cancer Research & Treatment, 52, 175-184, 1998、Hormone & Metabolic Research, 31, 242-246, 1999）。IGF-IIRは、チロシンキナーゼ活性を有しておらず、IGFのうち、IGF-IIのみと結合する。IGF-IIは、IGF-IIRへの結合により分解されることから、IGF-IIRは、IGF-IIのアンタゴニストとして機能していると考えられている（Breast Cancer Research & Treatment, 52, 175-184, 1998）。
【０００５】
IGFBPは、これまでに10種類（IGFBP-1からIGFBP-10）が知られているが、そのうち6種類（IGFBP-1からIGFBP-6）がIGFに対して高い結合親和性を有している（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94, 12981-12986, 1997）。IGFBP-1からIGFBP-6は、アミノ酸レベルで40〜60%の高い相同性を有している。IGFBPは、分解やリン酸化などの様々な翻訳後修飾を受け、IGFの運搬、分解の抑制、受容体への結合に影響を与え、IGFの機能を調節していることが明らかとなっている（International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996、Endocrine Reviews, 18, 801-831, 1997）。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5は、IGFの作用を促進する場合と抑制する場合があり、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5のIGFに対する作用はIGFBPの分解によって、IGFBP-1の作用はIGFBP-1のリン酸化によって、それぞれ制御されている（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995、International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996、Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996）。また、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5は、細胞膜上に存在するの特異的な受容体に結合すると、IGFとの結合親和性が低下する。その結果、IGFBP とIGFとが解離し、遊離のIGFが生じる（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995、International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996、Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996）。一方、IGFBP-4、IGFBP-6は、IGFの作用を抑制する活性を有している（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995、Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996）。生体内では、血中IGFの90%以上は、IGFBP-3および酸不安定サブユニットと結合し、約150kDaの高分子量複合体の形で存在しており、IGFの分解と血管外への流出が抑制されている（Journal of Biological Chemistry, 264, 11843-11848, 1989）。
【０００６】
IGF-IおよびIGF-IIは、ともに多数の癌細胞（肉腫、白血病、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌）に対して強い増殖促進作用を示し（British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992、Anticancer Research, 11, 1591-1595, 1991、Annals of Internal Medicine, 122, 54-59, 1995、Oncology, 54, 502-507, 1997、Endocrinology, 137, 1764-1774, 1996、European Journal of Haematology, 62, 191-198, 1999）、多くの癌細胞においてIGFの過剰発現が確認されている（British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992）。また、高転移性癌細胞では、IGF-IIおよびIGF-IRの発現が低転移性癌細胞よりも高いことが報告されている（International Journal of Cancer, 65, 812-820, 1996）。このようなIGFの作用は、主としてIGF-IRを介しているが（Endocrinology, 136, 4298-4303, 1995、Oncogene, 28, 6071-6077, 1999）、乳癌細胞では、IGF-IIがインスリン受容体を介して作用することも明らかにされている（Oncogene, 18, 2471-2479, 1999）。
【０００７】
前立腺上皮細胞でIGF-Iを過剰発現するトランスジェニックマウスは、約6ヶ月で約50%が前立腺癌を発症することが報告されている（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 3455-3460, 2000）。また、マウスでのヒト前立腺癌細胞移植モデルにおいて、アンドロゲン非依存性増殖能の獲得に伴い、IGF-IおよびIGF-IRの発現が上昇することが示されている（Cancer Research, 61, 6276-6280, 2001）。
【０００８】
IGFは、また、他の因子と相互作用し、癌細胞の増殖に関与している。乳癌細胞では、エストロゲンにより、IGF-Iの作用が増強され、かつ、IGF-IおよびIGF-IRの発現が誘導されることが報告されている（Endocrinology, 136, 1296-1302, 1995、Journal of Biological Chemistry, 265, 21172-21178, 1990、Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 41, 537-540, 1992、British Journal of Cancer, 75, 251-257, 1997）。また、エストロゲンは、乳癌細胞におけるIGFBPの産生を抑制すること、IGF-IIRの発現を減少させること、IGFBP分解酵素の発現を増加させることが知られている（Biochemical & Biophysical Research Communications, 193, 467-473, 1993、Molecular Endocrinology, 5, 815-822, 1991）。
【０００９】
逆に、IGF-Iがエストロゲン受容体の発現を増強させること（Endocrinology, 127, 2679-2686, 1990、Journal of Cellular Biochemistry, 52, 196-205, 1993）、乳癌細胞において、IGF-I、IGF-IIがエストロンスルフェイトをエストロンに加水分解するエストロンスルファターゼ活性を増加させることも報告されている（International Journal of Molecular Medicine, 4, 175-178, 1999）。
【００１０】
さらに、IGFは上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor; 以下、EGFと表記する）と協調的に作用する。頚癌細胞では、EGFは、IGF-IIの発現を増加させ、さらに、IGFは、EGFの増殖促進作用を増強させる（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92, 11970-11974, 1995、Cancer Research, 56, 1761-1765, 1996）。EGFはIGFBP-3の発現を抑制することで遊離のIGF量を増加させ、増殖促進作用を増強することも知られている（Cancer Research, 54, 3160-3166, 1994）。
【００１１】
いくつかの抗細胞増殖活性を有する因子の作用が、IGFの増殖促進作用を抑制することにより、発揮されていることが知られている。TGF-βやレチノイン酸による乳癌細胞の増殖抑制作用は、IGFBP-3の発現誘導の結果、IGFの作用が抑制されることによって発揮される（Journal of Biological Chemistry, 270, 13589-13592, 1995、Cancer Research, 56, 1545-1550, 1996、Endocrinology, 136, 1219-1226, 1995）。また、ビタミンDおよびその合成誘導体は、IGFの乳癌細胞や前立腺癌細胞に対する増殖促進作用を抑制するが、その作用はIGFBPの発現上昇およびIGF-IR、IGF-IIの発現抑制に基づいている（Journal of the National Cancer Institute, 89, 652-656, 1997、Journal of Molecular Endocrinology, 20, 157-162, 1998、Journal of Endocrinology, 154, 495-504, 1997、International Journal of Oncology, 13, 137-143, 1998）。
【００１２】
腫瘍抑制遺伝子産物もIGFの作用に影響を与えることが報告されている。例えば、肉腫細胞などでは、野生型p53蛋白質はIGFBP-3の発現を誘導する一方、IGF-IIおよびIGF-IRの発現を抑制する（Nature, 377, 646-649, 1995、Cancer Research, 56, 1367-1373, 1996、DNA & Cell Biology, 17, 125-131, 1998、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 8318-8323, 1996、Endocrinology, 139, 1101-1107, 1998）。逆に、乳癌細胞では、IGF-Iの作用によりp53蛋白質がリン酸化されて、核から細胞質へ移行することにより、p53蛋白質の機能が損なわれることが知られている（International Journal of Cancer, 55, 453-458, 1993）。その他、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子産物WT1により、IGF-IRの発現が抑制されること（Journal of Biological Chemistry, 269, 12577-12582, 1994、Endocrinology, 140, 4713-4724, 1999）、IGF-Iにより、乳腺由来増殖阻害因子（mammary-derived growth inhibitor; MDGI）の発現が抑制されること（International Journal of Oncology, 13, 577-582, 1998）が報告されている。
【００１３】
エネルギー摂取などのライフスタイルと発癌との関係は、古くから注目されてきたが、種々の動物実験から、エネルギー摂取とIGFの発現、さらに発癌が密接な関係を有していることが明らかにされつつある。前立腺癌を移植されたラットでは、エネルギー摂取を制限すると癌の増殖が抑制され、さらにアポトーシスが誘導される。この効果は、血中IGF-I濃度の減少と相関している（Journal of the National Cancer Institute, 91, 512-523, 1999）。同様の結果は、乳癌移植マウスでも報告され、さらに、IGF-Iの投与により増殖抑制作用が認められなくなることからも、エネルギー摂取の制限による癌の増殖抑制においては、IGF-Iが主要な役割を果たしていることが示唆されている（Cancer Research, 57, 4667-4672, 1997）。
【００１４】
IGFと癌との関連性は、臨床的および疫学的な研究からも検討されている。乳癌患者では、血漿および血清中のIGF-I濃度が健常者に比べて高いこと（European Journal of Cancer, 29A, 492-497, 1993、Tumori, 80, 212-215, 1994）、乳癌組織では、正常組織に比べて、IGF-IRの量が10倍高いこと（Cancer Research, 53, 3736-3740, 1993）が報告されている。また、乳癌患者の約30%では、IGF-IIR遺伝子にヘテロ接合性の消失（Loss of heterozygosity）が認められ、IGF-IIR遺伝子は癌抑制遺伝子としての機能が示唆されている（Breast Cancer Research & Treatment, 47, 269-281, 1998）。結腸癌患者では、血清中のIGF-II、IGFBP-2、IGFBP-3の濃度が健常者に比べて高いことが報告されている（International Journal of Cancer, 57, 491-497, 1994）。また、結腸癌に進行することが知られている結腸腺腫の患者は、IGF-IIおよびIGFBP-2の血清中濃度が高いが、腺腫の切除により、それらの濃度が低下することが示されている（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 85, 3402-3408, 2000）。胃癌組織では、IGF-IIの過剰発現が報告されている（European Journal of Cancer, 37, 2257-2263, 2001）。閉経後の子宮内膜癌患者では、健常者に比べて血清中のIGF-I濃度が高く、IGFBP-1濃度が低い。一方、IGFBP-3濃度には差は認められなかったことが報告されている（Endocrine Journal, 44, 419-424, 1997）。前立腺癌患者では、血清中のIGF-IおよびIGFBP-2濃度が高く、IGFBP-3濃度が低いこと（British Journal of Cancer, 76, 1115-1118, 1997、Urology, 54, 603-606, 1999、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 76, 1031-1035, 1993、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 77, 229-233, 1993）、癌組織においては、IGF-II、IGFBP-2、IGFBP-4、IGFBP-5の産生が亢進しており、IGFBP-3の産生が抑制されていること（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81, 3774-3782, 1996、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81, 411-420, 1996、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81, 3783-3792, 1996）が報告されている。IGF-IおよびIGFBP発現の同様の変化は、卵巣癌患者の血清および癌組織においても観察されている（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 78, 271-276, 1994、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82, 2308-2313, 1997、British Journal of Cancer, 73, 1069-1073, 1996）。
【００１５】
いくつかの疫学的研究から、IGFおよびIGFBPと癌の罹患危険率に関連性があることが明らかとなっている。乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肺癌などの固形癌においては、罹患危険率の高さと血中のIGF-I濃度の高さおよびIGFBP-3濃度の低さが正の相関を示すこと、小児性白血病では、罹患危険率の高さとIGFBP-3濃度の低さが正の相関を示すこと、さらに、乳癌では、罹患危険率の高さとIGF-IとIGFBP-3の濃度比（IGF-I/IGFBP-3）の高さが正の相関を示すことが報告されている（Lancet, 351, 1393-1396, 1998、Science, 279, 563-566, 1998、Journal of the National Cancer Institute, 91, 620-625, 1999、Journal of the National Cancer Institute, 91, 151-156, 1999、International Journal of Cancer, 62, 266-270, 1995、Epidemiology, 9, 570-573, 1998、Breast Cancer Research & Treatment, 47, 111-120, 1998、International Journal of Cancer, 83, 15-17, 1999、International Journal of Cancer, 80, 494-496, 1999、British Journal of Cancer, 76, 1115-1118, 1997）。
【００１６】
IGFと癌の予後の関連性についても、報告がある。乳癌では、エストロゲン受容体あるいはプロゲステロン受容体が陽性の組織においてIGF-IRの発現が増加していることが報告されている（Cancer Research, 52, 1036-1039, 1992）。また、IGF-IRの発現により、予後が不良となることを報告している例もある（Cancer Research, 57, 3079-3083, 1997、Cancer, 58, 1159-1164, 1998）。組織内のエストロゲン受容体発現とIGFBP-3発現が逆相関することも報告されている（Cancer Research, 52, 5100-5103, 1992、Journal of Cellular Biochemistry, 52, 196-205, 1993）。
【００１７】
また、糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などのような、糖尿病性合併症においては、IGF作用の異常亢進が認められている（Science, 276, 1706-1709, 1997、American Journal of Physiology, 274, F1045-F1053, 1998）。
さらに、リウマチ滑膜においてIGF-Iの局所的発現が認められること、リウマチ性関節炎の病態形成にIGF-Iが関与していることも報告されている（Arthritis & Rheumatism, 32, 66-71, 1989、Journal of Rheumatology, 22, 275-281, 1995、Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81, 150-155, 1996、Arthritis & Rheumatism, 39, 1556-1565, 1996）。
【００１８】
以上のようにIGF-IおよびIGF-IIを含めたIGFファミリー蛋白質（IGF、IGF-R、IGFBP）は、癌の発生、増殖、さらには、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎などにおいても重要な役割を果たしている。これらの事実は、IGFファミリー蛋白質を標的とした癌、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎などの診断、予防、治療の可能性を示唆している。
【００１９】
実際、IGF-IRに対するアンチセンスRNAを発現させることで、高転移性のヒト乳癌細胞のマウスでの造腫瘍性および転移性が低下し、生存期間の延長が認められること（Cancer Gene Therapy, 7, 384-395, 2000）、抗IGF-IR抗体により、マウスに移植されたヒト横紋筋肉腫細胞やヒト乳癌細胞の増殖が抑制されること（Cancer Research, 54, 5531-5534, 1994、Journal of Clinical Investigation, 84, 1418-1423, 1989、Breast Cancer Research & Treatment, 22, 101-106, 1992）、などIGF作用を抑制することによる抗腫瘍効果が報告されている（Biochimica et Biophysica Acta, 1332, F105-F126, 1997）。その一方で、抗IGF-IR抗体では、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着は抑制するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖は抑制されないことが示されており、IGF-IRの作用阻害のみでは、充分な抗腫瘍効果が得られないことも示唆されている（Breast Cancer Research & Treatment, 22, 101-106, 1992）。
【００２０】
IGFに対する抗体（以下、抗hIGF抗体と表記する）としては、既にいくつかの抗体が知られている。代表的なヒトIGF-Iに対する抗体（以下、抗hIGF-I抗体と表記する）としては、sm1.2が報告されている（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 2389-2392, 1984）。sm1.2は、hIGF-IIと40%程度の交差反応性を有していること、1〜2μg/mLの濃度でウェスタンブロッティング法により、100ngのhIGF-Iを検出可能であること、10〜30μg/mLの濃度で20ng/mLのhIGF-Iによるマウス繊維芽細胞株BALB/c3T3の増殖を阻害することが明らかとなっている（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 2389-2392, 1984、Journal of Clinical Investigation, 99, 2961-2970, 1997）。
【００２１】
その他、抗hIGF-I抗体としては、Val59-SmC121があり、該抗体は、ヒトインスリンおよびhIGF-IIとは反応しないこと、hIGF-Iの10〜12番目のLeu-Val-Aspを含むペプチドを認識すること、125I-hIGF-Iを用いたラジオイムノアッセイでは、1ng/mLのhIGF-Iの検出感度を示したことが報告されている（Journal of Endocrinology, 125, 327-335, 1990）。
【００２２】
抗hIGF-I抗体41/81は、hIGF-IIとは3%の交差反応性を有しており、また、125I-hIGF-Iを用いたラジオイムノアッセイでは、1ng/mLのhIGF-Iの検出感度を示した（FEBS Letters, 149, 109-112, 1982）。
抗hIGF-I抗体35I17は、hIGF-IIと0.5%程度の交差反応性を有していること、1μg/mLの濃度でウェスタンブロッティング法により、1μgのhIGF-Iを検出可能であること、12μg/mL以上の濃度でhIGF-Iによるマウス繊維芽細胞株BALB/c3T3の増殖を完全に阻害すること、30μg/mLの濃度で1μg/mLのhIGF-IによるhIGF-IRの自己リン酸化を阻害すること、また、125I-hIGF-Iを用いたラジオイムノアッセイでは、0.1nmol/LのhIGF-Iの検出感度を示すことが報告されている（Hybridoma, 16, 513-518, 1997）。
【００２３】
抗hIGF-I抗体BPL-M23は、hIGF-Iに対して10.5×109(mol/L)-1の結合活性を示し、一方、hIGF-IIおよびヒトインスリンには、それぞれ0.8%および0.0001%の交差反応性を示すこと、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウサギのIGFとは反応性を示すが、ラットおよびマウスのIGFとは反応しないこと、ラット脂肪細胞に対するhIGF-Iによる脂肪形成を抑制することが報告されている（Journal of Molecular Endocrinology, 2, 201-206, 1989）。
【００２４】
抗hIGF-I抗体7A1、1B3、4C1、5A7は、hIGF-IのCおよびDドメインの異なるエピトープを認識すること、hIGF-IIとはそれぞれ6.6%、0.83%、12%、1.2%の交差反応性を示すことが報告されている（Hybridoma, 12, 737-744, 1993）。
3D1/2/1は、ヒトおよびモルモットのIGF-Iとは反応を示すが、ウサギ、ラット、マウスのIGF-Iとは反応しないこと、hIGF-IIとは、7%の交差反応性を示すことが報告されている（Journal of Clinical and Metabolism, 54, 474-476, 1982）。
【００２５】
代表的なヒトIGF-IIに対する抗体（以下、抗hIGF-II抗体と表記する）としては、S1F2が報告されている。S1F2は、hIGF-Iと10%程度の交差反応性を有していること、1μg/mLの濃度でウェスタンブロッティング法により、10〜100ngのhIGF-IIを検出可能であること、100μg/mLの濃度で100ng/mLのhIGF-IIによるヒト繊維芽細胞のDNA合成促進作用を阻害することが明らかとなっている（Diabetes Research and Clinical Practice, 7, S21-S27, 1989、Endocrinology, 124, 870-877, 1989）。
【００２６】
抗hIGF-II抗体2H11、2B11、ID5、ID9は、hIGF-IIと反応し、hIGF-Iとは反応しないこと、競合酵素免疫測定法（以下、ELISAと表記する）により、1ng/mLのhIGF-IIを定量可能であることが報告されている（特開平5-252987）。
また、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Human Anti Mouse Antibody：以下、HAMAと表記する）が誘導されることが知られている。HAMAは投与されたマウス抗体と反応して、副作用を惹起することや（Journal of Clinical Oncology, 2, 881-891, 1984; Blood, 65, 1349-1363, 1985; Journal of the National Cancer Institute, 80, 932-936, 1988; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82, 1242-1246, 1985）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速め（Journal of Nuclear Medicine, 26, 1011-1023, 1985; Blood, 65, 1349-1363, 1985; Journal of the National Cancer Institute, 80, 937-942, 1988）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（Journal of Immunology, 135, 1530-1535, 1985; Cancer Research, 46, 6489-6493, 1986）。
【００２８】
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、CDRと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、V領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、C領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 6851-6855, 1984）、ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のV領域中のCDRのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Nature, 321, 522-525, 1986）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約6倍伸びたことが報告されている（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 4220-4224, 1989）。ヒト型CDR移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Cancer Research, 56, 1118-1125, 1996; Immunology, 85, 668-674, 1995）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、H鎖と表記する）C領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定、かつ、抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Cancer Research, 56, 1118-1125, 1996）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合には、極めて有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のH鎖C領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Journal of Experimental Medicine, 166, 1351-1361, 1987; Journal of Experimental Medicine, 168, 127-142, 1988）、副作用を回避でき、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Immunology, 85, 668-674, 1995）。さらに、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、ヒト化抗体を含めた抗体からFab、Fab'、F(ab')2、scFv（Science, 242, 423-426, 1988）、dsFv（Molecular Immunology, 32, 249-258, 1995）、CDRを含むペプチド（Journal of Biological Chemistry, 271, 2966-2971, 1996）などのより分子量の小さい抗体断片の作製が可能となっている。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Cancer Research, 52, 3402-3408, 1992）。
【００２９】
以上のことから、癌の発生、増殖、さらには、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎において、重要な役割を果たしているIGFファミリー蛋白質はインスリン、IGF-IおよびIGF-IIの増殖因子とインスリン受容体、IGF-IRおよびIGF-IIRの受容体、ならびにIGFBPが複雑に絡み合って疾患を制御している。すなわち、これらの相互作用の一部を阻害しても疾患を完全に抑制することは困難である。治療薬として有用と考えられるIGF-Iおよび／あるいはIGF-IIを認識する抗体は、多数報告があるが、IGF-IおよびIGF-IIと強く結合して、IGF-IおよびIGF-IIの機能を同時に阻害できる抗体の報告はない。
【００３０】
また、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、ヒト化抗体の方がマウス抗体などのヒト以外の動物の抗体より望ましい。しかし、抗hIGF抗体に関してヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体の作製の報告、さらには、それらの抗体断片の報告はない。
【発明の開示】
【００３１】
hIGFファミリーが介在する細胞増殖は、多くの癌細胞で機能していることが知られており、hIGFが介在する情報伝達を阻害できれば、ヒトにおける固形腫瘍の増殖、転移形成、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎等の疾患の治療に有用であることが期待される。
本発明の目的は、hIGFファミリーが介在する情報伝達を遮断し、IGFによる細胞増殖を阻害する物質を取得し、さらに該物質の利用方法を提供することである。
【００３２】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、以下の（1）〜（24）に関する。
（1）    ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109 (mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片。
【００３３】
（2）  ヒトIGF-Iに対する結合活性とヒトIGF-IIに対する結合活性とが同程度である（1）に記載の抗体またはその抗体断片。
（3）  抗体またはその抗体断片の重鎖可変領域（VH）のCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号5、6および7、および／または軽鎖可変領域（VL）のCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号8、9および10で示されるアミノ酸配列を含む、（1）または（2）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３４】
（4）  抗体が、ヒト以外の動物の抗体または遺伝子組換え抗体である、（1）〜（3）のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片。
（5）  遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる、（4）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３５】
（6）  ヒト以外の動物の抗体のVHが配列番号2で示されるアミノ酸配列の20〜137番目、および／またはVLが配列番号4で示されるアミノ酸配列の23〜128番目を含む、（4）に記載の抗体またはその抗体断片。
（7）  ヒト以外の動物の抗体が、ハイブリドーマKM1468（FERM BP-7978）により生産される（3）または（6）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３６】
（8）  ヒト型キメラ抗体のVHが配列番号2で示されるアミノ酸配列の20〜137番目、および／またはVLが配列番号4で示されるアミノ酸配列の23〜128番目を含む、（5）に記載の抗体またはその抗体断片。
（9）  ヒト型キメラ抗体が、KM1468（FERM BP-7978）より生産される抗体のVHおよび／またはVLを含む、（5）または（8）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３７】
（10）  ヒト型キメラ抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、（5）、（8）および（9）のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片。
（11）  ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG1クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる（10）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３８】
（12）  ヒト型キメラ抗体が、形質転換株KM3002（FERM BP-7996）により生産される（5）、（8）〜（11）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（13）  ヒト型CDR移植抗体のVHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号5、6および7、および／またはVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号8、9および10で示されるアミノ酸配列を含む、（4）に記載の抗体またはその抗体断片。
【００３９】
（14）  ヒト型CDR移植抗体が、KM1468（FERM BP-7978）により生産される抗体のVHのCDRおよび／またはKM1468（FERM BP-7978）により生産される抗体のVLのCDRを含む、（5）または（13）に記載の抗体またはその抗体断片。
（15）  ヒト型CDR移植抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、（4）、（13）および（14）のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片。
【００４０】
（16）  ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG1クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる（15）に記載の抗体またはその抗体断片。
（17）  ハイブリドーマKM1468（FERM BP-7978）から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、（１）〜（16）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（18）  抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（1）〜（17）のいずれか1項に記載の抗体断片。
【００４１】
（19）  （1）〜（18）のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするDNA。
（20） （19）に記載のDNAを含有する組換えベクター。
（21） （20）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【００４２】
（22） （21）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（1）〜（18）のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする抗体またはその抗体断片の製造方法。
（23）  （1）〜（18）のいずれか1項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する医薬。
【００４３】
（24）  （1）〜（18）のいずれか1項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有するヒトIGF介在性疾患または異常なヒトIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の治療薬。
（25）  （1）〜（18）のいずれか1項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも1種を含有するヒトIGF介在性疾患または異常なヒトIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬。
【００４４】
本発明の抗hIGF抗体は、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体があげられるが、そのなかでもhIGF-Iに対する結合活性およびhIGF-IIに対する結合活性が同程度である抗体であって、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する抗体が好ましい。
【００４５】
hIGF-Iに対する結合活性およびhIGF-IIに対する結合活性が同程度とは、抗体が、hIGF-IおよびhIGF-IIに同等に結合できることをいう。同等に結合できるとは、hIGF-IあるいはhIGF-IIに対する抗体の結合活性を数値化し、その相対値で比較することができる。同等の結合活性とは、抗体のhIGF-Iに対する結合活性を1としたとき、hIGF-IIに対する結合活性が0.1〜10、好ましくは0.2〜5、さらに好ましくは0.5〜2、最も好ましくは1であるものがあげられる。結合活性の指標としては、表面プラズモン共鳴の原理などを利用したバイオセンサー法（以下、バイオセンサービアコアと表記する）などで測定される結合定数（以下、KAとも表記する）などがあげられる。
【００４６】
本発明の抗体としては、天然型のhIGF-IおよびhIGF-IIに存在するエピトープを認識する抗体、天然型のhIGF-IおよびhIGF-IIの立体構造を認識する抗体などがあげられる。また、ヒト以外の他の生物種のIGFと交差反応性を示してもよい。
hIGF-IおよびhIGF-IIの機能としては、乳房、前立腺、肺、結腸などの上皮系細胞の増殖、分化またはアポトーシスの制御などhIGF-IおよびhIGF-IIが関与している機能であればいかなるものでもよい。
【００４７】
本発明の抗hIGF抗体としては、ヒト以外の動物の抗体および遺伝子組換え抗体ならびにそれらの抗体断片などがあげられる。
ヒト以外の動物の抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体があげられるが、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
【００４８】
本発明のヒト以外の動物のモノクローナル抗体は、hIGFをヒト以外の動物に免疫し、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製し、次いで単一細胞化したハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清から精製し、得ることができる。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００４９】
本発明の抗体としては、好ましくはVHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号5、6、および7、および／またはVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号8、9および10で示されるアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
【００５０】
本発明のヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマKM1468(FERM BP-7978)が生産するラット抗体KM1468があげられる。
本発明の遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体およびヒト抗体などがあげられる。
【００５１】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLとヒト抗体のCHおよびCLとからなる抗体をいう。
【００５２】
本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５３】
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５４】
本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合するヒト型キメラ抗体（以下、抗hIGFキメラ抗体と表記する）としては、配列番号5、6、7で示されるアミノ酸配列からなるVHのCDR1、CDR2、CDR3、および／または配列番号8、9、10で示されるアミノ酸配列からなるVLのCDR1、CDR2、CDR3、を含む抗hIGFキメラ抗体、ハイブリドーマKM1468から生産されるモノクローナル抗体のVHおよび／またはVLを含む抗hIGFキメラ抗体、抗体のVHが配列番号2で示されるアミノ酸配列の20〜137番目、および／またはVLが配列番号4で示されるアミノ酸配列の23〜128番目を含む抗hIGFキメラ抗体、抗体のVHが配列番号2で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のCHがhIgG1サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のVLが配列番号4で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のCLがκクラスのアミノ酸配列からなる抗hIGFキメラ抗体、具体的には形質転換株KM3002（FERM BP-7996）が生産する抗hIGFキメラ抗体KM3002があげられる。これらのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体も本発明の抗体に包含される。
【００５５】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体をいう。
【００５６】
本発明のヒト型CDR移植抗体は、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有するヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５７】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５８】
本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合するヒト型CDR移植抗体（以下、抗hIGF CDR移植抗体と表記する）としては、配列番号5、6、7で示されるアミノ酸配列からなるVHのCDR1、CDR2、CDR3、および／または配列番号8、9、10で示されるアミノ酸配列からなるVLのCDR1、CDR2、CDR3、を含む抗hIGF CDR移植抗体、ハイブリドーマKM1468から生産されるモノクローナル抗体のVHのCDRおよび／またはVLのCDRを含む抗hIGF CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号15で示されるアミノ酸配列の1〜118番目、および／またはVLが配列番号16で示されるアミノ酸配列の1〜107番目を含む抗hIGF CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号15で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のCHがhIgG1サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のVLが配列番号16で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のCLがκクラスのアミノ酸配列からなる抗hIGF CDR移植抗体があげられる。これらのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体も本発明の抗体に包含される。
【００５９】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
【００６０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００６１】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００６２】
本発明の抗体断片としては、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、diabody、dsFvおよびCDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００６３】
本発明のFabは、hIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
【００６４】
F(ab')2は、IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００６５】
本発明のF(ab')2は、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００６６】
本発明のFab'は、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合するF(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab'断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することができる。
【００６７】
scFvは、1本のVHと1本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Pと表記する）を用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のscFvは、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、scFvを製造することができる。
【００６８】
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のdiabodyは、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、diabodyを製造することができる。
【００６９】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００７０】
本発明のdsFvは、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、dsFvを製造することができる。
【００７１】
CDRを含むペプチドは、VHまたはVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、CDRを含むペプチドを製造することができる。
【００７２】
また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体および抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【００７３】
本発明の抗体の誘導体は、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体および抗体断片のH鎖あるいはL鎖のN末端側あるいはC末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、1994）により結合させることにより製造することができる。
【００７４】
また、本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに結合する抗体および抗体断片をコードするDNAと、結合させたい蛋白質をコードするDNAを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、131I、125Iなどがあげられ、例えば、クロラミンT法などにより抗体に結合させることができる。
【００７５】
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、5-フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、1996）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、1982）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
【００７６】
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、PEGと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（1）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2）血中半減期の顕著な延長、（3）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、1993）。例えば、PEGと抗体を結合させる方法としては、PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、1993）。PEG化修飾試薬としては、リジンのε-アミノ基の修飾剤（特昭61-178926）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭56-23587）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平2-117920）などがあげられる。
【００７７】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン2（以下、hIL-2と表記する）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、hGM-CSFと表記する）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、hM-CSFと表記する）、ヒトインターロイキン12（以下、hIL-12と表記する）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体および抗体断片をコードするcDNAに蛋白質をコードするcDNAを連結させ、融合抗体をコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００７８】
本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIに対する抗体および抗体断片は、ELISA（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988；Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）、バイオセンサービアコアで測定されるKA（Journal of Immunological Methods, 145, 229-240, 1991）、およびhIGF-IおよびhIGF-IIによる細胞増殖に対する阻害活性（Cancer Research, 48, 4083-4092, 1988）などを測定することにより、hIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合活性、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する活性を評価することができる。
【００７９】
本発明のhIGFが介在する疾患または異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患としては、軽度・重度に関わらず、hIGFによる異常な細胞増殖により病態が進行する疾患であればいかなる疾患も包含し、具体的には癌、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎などがあげられる。
【００８０】
以下に、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片の作製方法および活性評価について記す。
【００８１】
1．hIGFに対するヒト以外の動物のモノクローナル抗体の作製
（1）抗原の調製
hIGFをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型hIGF蛋白質を得る。あるいは、hIGF部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
【００８２】
抗原用部分ペプチドとしては、5〜30残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、Genetyx Macなど市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。すなわち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のN末端、C末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
【００８３】
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのN末端はアセチル化、C末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; ペプチド合成の基礎と実験、丸善、1985; 続医薬品の開発、第 14 巻、ペプチド合成、廣川書店、1991; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990）。
【００８４】
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Applied Biosystems, Inc.社（以下、ABI社と表記する）製ペプチド合成機、Advanced ChemTech Inc.社（以下、ACT社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護した Nα-Fmoc-アミノ酸あるいは Nα-Boc-アミノ酸などを用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
【００８５】
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI社、島津製作所、国産化学（株）、Nova Biochem社、渡辺化学（株）、ACT社またはペプチド研究所（株）などから入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; ペプチド合成の基礎と実験、丸善、1985；続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、廣川書店、1991; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990）。
【００８６】
（2）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例を説明する。
【００８７】
3〜20週令のマウスまたはラットに、上記１（1）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ウシ血清アルブミン（以下、BSAと表記する）やKeyhole Limpet Hemocyanin（以下、KLHと表記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることができる。各抗原の投与後3 〜7日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたhIGFに対する反応性をELISAなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後3 〜7 日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
【００８８】
（3）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である8-アザグアニン耐性骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1）（European Journal of Immunology, 6, 511-519, 1976）、SP2/0-Ag14（SP-2）（Nature, 276, 269-270, 1978）、P3-X63-Ag8653（653）（Journal of Immunology, 123,1548-1550, 1979）、P3-X63-Ag8（X63）（Nature, 256, 495-497, 1975）など、invitroで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に従い、細胞融合時までに2×107個以上の細胞数を確保する。
【００８９】
（4）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール-1000（以下、PEG-1000と表記する）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄にはModified Eagle's Medium（以下、MEMと表記する）またはPhosphate Buffered Saline（以下、PBSと表記する）などを用いる。また、融合細胞を懸濁する培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、HAT培地｛通常培地［RPMI-1640培地に1.5mmol/Lグルタミン、50μmol/L 2-メルカプトエタノール、10μg/mLジェンタマイシンおよび10% 牛胎児血清（以下、FCSと表記する）を加えた培地］に0.1mmol/L ヒポキサンチン、15μmol/L チミジンおよび0.4μmol/L アミノプテリンを加えた培地｝を用いる。
【００９０】
培養後、培養上清の一部を取り、ELISAにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行い、ELISAにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【００９１】
（5）ハイブリドーマの選択
抗hIGFモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、公知の方法（Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に従い、以下に述べるELISAにより行う。これらの方法により、後述する抗hIGFキメラ抗体、抗hIGF CDR移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗体あるいはすべての精製抗体の結合活性を測定することができる。
【００９２】
ELISA
抗原を96穴ELISAプレートに固定化し、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を、あるいはハイブリドーマ作製の際にラットを用いたのであれば、第二抗体としてはラット抗体を認識できる抗体を用いる。
【００９３】
反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマKM1468などがあげられる。ハイブリドーマKM1468は、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第６  郵便番号 ３０５−８５６６）にFERM BP-7978として寄託されている。
【００９４】
（6）モノクローナル抗体の精製
0.5mLのプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、2週間飼育した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、1（4）で得られた抗hIGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞5×106〜2×107細胞/匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、40〜50% 飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、DEAE- セファロースカラム、プロテインA-カラムあるいはセルロファインGSL2000（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、IgG あるいはIgM 画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
【００９５】
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは280nmでの吸光度より算出することができる。
【００９６】
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことであり、例えば、マウスでは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、ヒトでは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4があげられる。
【００９７】
（7）モノクローナル抗体の活性評価
培養上清中あるいは精製した抗hIGFモノクローナル抗体のhIGFに対する結合活性は、上記1（5）の結合ELISA、競合ELISA、およびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。
結合ELISAとは、抗原を96ウェルELISAプレートに固定化し、第一抗体として反応させ、第一抗体を認識することができる標識した二次抗体を反応させて、標識物を検出することにより、抗原と抗体との結合活性を測定する方法である。具体的には、固定化する抗原としては、hIGF-IやhIGF-IIの精製蛋白質や部分配列を有するペプチドがあげられる。第一抗体としては、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体などの測定対象物があげられる。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体があげられる。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ラットイムノグロブリン（以下、rIgと表記する）マウス抗体などがあげられる。
【００９８】
競合ELISAとは、あらかじめhIGF-IあるいはhIGF-IIをELISAプレートに固定化し、測定対象物である抗体と、hIGF-IあるいはhIGF-IIとを同時に添加して、反応させ、プレートに固定化した抗原と反応対象物である抗体の反応を、反応液中に添加したもう一種あるいは同一の抗原が阻害することを、プレートに結合する一次抗体の量の変化で測定する方法である。抗体の結合量の変化は抗体に対する二次抗体により検出する。また、天然型のhIGFおよびhIGFの部分ペプチドを用いた競合ELISAにより、天然型のhIGFとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がhIGFの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる構造的解析法により調べることができる。構造的解析法としては、例えば、X線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。
【００９９】
バイオセンサービアコアによる測定とは、2分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、SPRシグナルとして検出するものである。本法での測定から導きだされた結合速度定数（以下、Kassと表記する）、解離速度定数（以下、Kdissと表記する）から、KA＝Kass/Kdissで計算される結合定数（以下、KAと表記する）が算出される。KAは、(mol/L)-1の単位で表される。バイオセンサービアコアでの測定は、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で行うことができる。至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化するリガンドの量は、式1により算出される最小値と式２で算出される最大値の間の範囲であることが好ましい。また、アナライトの結合量は、式3で算出される最大結合量以下であることが好ましい。式１、式2および式3において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Sとはリガンドの結合部位数を示す。RUとは、Resonance Unitの略であり、センサーチップ表面での単位面積あたりの質量の変化量を示し、１RU＝１pg/mm2に相当する。バイオセンサービアコアでの測定では、最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った結合定数の解析を行うことができる。
【０１００】
（式1）
最小固定化量(RU)=200×1/S×（リガンドの分子量/アナライトの分子量）
（式2）
最大固定化量(RU)=1000×1/S×（リガンドの分子量/アナライトの分子量）
（式3）
最大結合量=アナライトの分子量×リガンドの固定化量(RU)/リガンドの分子量×S
【０１０１】
また、hIGF依存的な増殖を示す細胞株のin vivoあるいはin vitroの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、hIGFの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
【０１０２】
hIGF依存的な増殖を示す細胞株の増殖に対する影響とは、hIGF依存的な増殖を示す細胞株のhIGF存在下でのin vitroでの細胞増殖、あるいはマウスなどの動物に移植したhIGF依存的な増殖を示す細胞株のin vivoでの細胞増殖に対する、本発明の抗体あるいは抗体断片の影響をいう。
【０１０３】
hIGF依存的な増殖を示す細胞株のhIGF存在下でのin vitroでの細胞増殖としては、hIGF 非添加の基礎培地にhIGFを添加した培地で細胞を培養したときの細胞増殖などがあげられる。hIGF 非添加の基礎培地としては、TF/BSA培地[D-MEM/F-12（Gibco BRL社製）に10μg/mLのヒトトランスフェリン（Gibco BRL社製）、200μg/mLのBSAを添加した培地]などがあげられる。細胞の増殖を測定する方法としては、細胞増殖試薬WST-1（Roche社製）を使用して測定することができる。
【０１０４】
hIGF依存的な増殖を示す細胞株のinvivoでの細胞増殖としては、マウスなどの動物に細胞を移植したときの動物体内での細胞の増殖などがあげられる。細胞の増殖を測定する方法としては、例えば、腫瘍塊としてマウス体内に生着する場合には、腫瘍塊の体積を測定して細胞の増殖の指標とすることができる。
【０１０５】
hIGF依存的な増殖を示す細胞株としては、ヒト乳癌細胞株MCF7（ATCC HTB-22）、ヒト大腸癌細胞株HT-29（ATCC HTB-38）、ヒト骨肉腫細胞株MG63（ATCC CRL-1427）などがあげられる。また、hIGF-I遺伝子を導入した形質転換株などがあげられる。
【０１０６】
IGF-I遺伝子を導入した形質転換株としては、クローン化されたhIGF-I遺伝子が導入されて、hIGF-I遺伝子非導入時と比べてhIGF-Iの発現量が増大した細胞株があげられる。具体的には、ヒト肺癌細胞株A549細胞（ATCC CCL-185）にhIGF-I遺伝子を導入した形質転換体などがあげられる。hIGF-I遺伝子は、文献（Molecular Endocrinology, 4, 1914-1920, 1990）に記載の配列をPCRなどの方法により、クローニングすることができる。
【０１０７】
2．ヒト化抗体の作製
（1）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のCHおよび／またはCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１０８】
ヒト抗体のC領域は任意のヒト抗体のCHおよびCLであることができ、例えば、ヒト抗体のH鎖のIgG1サブクラスのC領域（以下、hCγ1と表記する）およびヒト抗体のL鎖のκクラスのC領域（以下、hCκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。
【０１０９】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）、pAGE103（Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987）、pHSG274（Gene, 27, 223-232, 1984）、pKCR（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981）、pSG1βd2-4（Cytotechnology, 4, 173-180, 1990）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー（Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーターとエンハンサー（Biochemical & Biophysical Research Communications, 149, 960-968, 1987）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Cell, 41, 479-487, 1985）とエンハンサー（Cell, 33, 717-728, 1983）などがあげられる。
【０１１０】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、pKANTEX93（WO97/10354）、pEE18（Hybridoma, 17, 559-567, 1998）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１１１】
（2）ヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得する。
【０１１２】
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分あるいはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
【０１１３】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987）、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）などがあげられる。また、ハイブリドーマからmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Amercham Pharmacia社製）などがあげられる。
【０１１４】
cDNAの合成およびcDNAライブラリー作製法としては、常法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）、あるいは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（GIBCO BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）やTimeSaver cDNA Synthesis Kit（Amersham-Pharmacia社製）を用いる方法などがあげられる。
【０１１５】
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express（Strategies, 5, 58-61, 1992）、pBluescript II SK(+)（Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989）、λZAP II（Stratagene社製）、λgt10、λgt11（DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985）、Lambda BlueMid（Clontech社製）、λExCell、pT7T3 18U（Amersham-Pharmacia社製）、pcD2（Molecular & Cellular Biology, 3, 280-289, 1983）およびpUC18（Gene, 33, 103-119, 1985）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
【０１１６】
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF'（Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992）、C600（Genetics, 59, 177-190, 1968）、Y1088、Y1090（Science, 222, 778-782, 1983）、NM522（Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983）、K802（Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966）およびJM105（Gene，38, 275-276, 1985）などが用いられる。
【０１１７】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識、あるいは酵素標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction（以下、PCR法と表記する；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）によりVHおよびVLをコードするcDNAを調製することもできる。
【０１１８】
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素等で切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）などを用いて解析することで該cDNAの塩基配列を決定することができる。
【０１１９】
決定した塩基配列からVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびN末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、VHおよびVLの各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することによって見出すことができる。
【０１２０】
さらに、VHおよびVLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、SWISS-PROTやPIR-Proteinなどに対してBLAST法（Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
【０１２１】
（3）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。      例えば、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLの3'末端側の塩基配列とヒト抗体のCHおよびCLの5'末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを含むプラスミドを鋳型として、5'末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてPCR法によりVHおよびVLをコードするcDNAを増幅し、それぞれを上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１２３】
（4）ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも60%以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから、VH、VLとも6本の合成DNAを設計することが好ましい。
【０１２４】
また、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記2（1）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。PCR反応後、増幅産物をpBluescript SK(-)（Stratagene社製）などのプラスミドにクローニングし、上記2（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
【０１２５】
（5）ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLでは、CDRのみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がCDRの移植に伴い、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やCDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991）。ヒト型CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにX線結晶解析（Journal of Molecular Biology, 112, 535-542, 1977）あるいはコンピューターモデリング（Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
【０１２６】
ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成DNAを用いて上記2（4）に記載のPCR法を行うことにより、達成できる。PCR後の増幅産物について上記2（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０１２７】
（6）ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、上記2（4）および（5）で構築したヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１２８】
例えば、上記2（4）および（5）でヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
【０１２９】
（7）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記2（3）および（6）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、サル腎臓由来細胞株COS-7細胞（ATCC CRL1651）が一般に用いられる（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991）。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991）、リポフェクション法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413-7417, 1987）などがあげられる。
【０１３０】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はELISA（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）などにより測定できる。
【０１３１】
（8）ヒト化抗体の安定発現
上記2（3）および（6）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）などがあげられる。
【０１３２】
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと表記する）が欠損したCHO細胞（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、YB2/0細胞と表記する）などがあげられる。
【０１３３】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418 sulfate（以下、G418と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地（日水製薬社製）、GIT培地（日本製薬社製）、EX-CELL302培地（JRH社製）、IMDM（GIBCO BRL社製）、Hybridoma-SFM（GIBCO BRL社製）、またはこれら培地にFCSなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ELISAにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、dhfr増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
【０１３４】
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、PAGEと表記する：Nature, 227, 680-685, 1970）やウエスタンブロッティング法（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）などで測定することができる。
【０１３５】
（9）ヒト化抗体の活性評価
培養上清中あるいは精製した抗hIGFヒト化抗体のhIGFに対する結合活性は、上記1（7）に示したELISAおよびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記1（7）に示したhIGF依存的な増殖を示す細胞株のin vivoあるいはin vitroの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、hIGFの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
【０１３６】
3．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および2に記載の抗hIGF抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
【０１３７】
（1）Fabの作製
Fabは、蛋白質化学的にはIgGを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインA結合性を有するIgGサブクラスであれば、プロテインAカラムに通すことで、IgG分子やFc断片と分離し、均一なFabとして回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995）。プロテインA結合性を持たないIgGサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995）。また、Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab発現用ベクターにクローニングし、Fab発現ベクターを作製することができる。      Fab発現用ベクターとしては、Fab用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pIT106（Science, 240, 1041-1043, 1988）などがあげられる。Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にFabを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFabとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったFabが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なFabを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992）。
【０１３８】
（2）F(ab')2の作製
F(ab')2は、蛋白質化学的にはIgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Fabと同様の精製操作により、均一なF(ab')2として回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995）。また、下記3（3）に記載のFab'をo-PDMやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]で処理し、S-S結合させる方法によっても作製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
【０１３９】
（3）Fab'の作製
Fab'は、上記3（2）に記載のF(ab')2をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Fab'は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab'発現用ベクターにクローニングし、Fab'発現ベクターを作製することができる。Fab'発現用ベクターとしては、Fab'用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pAK19（BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992）などがあげられる。Fab'発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にFab'を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFab'とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインGカラムなどを用いることにより、均一なFab'を精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
【０１４０】
（4）scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、scFv発現用ベクターにクローニングし、scFv発現ベクターを作製することができる。scFv発現用ベクターとしては、scFvのDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E（Amersham-Pharmacia社製）、pHFA（Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994）などがあげられる。scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にscFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にscFvを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるscFvとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なscFvを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
【０１４１】
（5）diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のVHとVLをリンカーがコードするアミノ酸残基が8残基以下となるように連結したDNAを作製し、diabody発現用ベクターにクローニングし、diabody発現ベクターを作製することができる。diabody発現用ベクターとしては、diabodyのDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E（Amersham Pharmacia社製）、pHFA（Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994）などがあげられる。diabody発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にdiabodyを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdiabodyとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なdiabodyを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
【０１４２】
（6）dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のVHおよびVLをコードするDNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたDNAを作製する。作製した各DNAをdsFv発現用ベクターにクローニングし、VHおよびVLの発現ベクターを作製することができる。dsFv発現用ベクターとしては、dsFv用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pULI9（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）などがあげられる。VHおよびVLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からVHおよびVLを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdsFvとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）。
【０１４３】
（7）CDRペプチドの作製
CDRを含むペプチドは、Fmoc法あるいはtBoc法等の化学合成法によって作製することができる。また、CDRを含むペプチドをコードするDNAを作製し、作製したDNAを適当な発現用ベクターにクローニングし、CDRペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、CDRペプチドをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pLEX（Invitrogen社製）、pAX4a+（Invitrogen社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からCDRペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）。
【０１４４】
（8）抗体断片の活性評価
精製した抗体断片のhIGFに対する結合活性は、上記1（7）に示したELISAおよびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記1（7）に示したhIGF依存的な増殖を示す細胞株のin vivoあるいはin vitroの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、hIGFの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
【０１４５】
4．抗hIGF抗体を用いたhIGFの検出および定量法
本発明は、本発明の抗体を用いて、hIGFを免疫学的に検出および定量する方法に関する。従って、本発明の抗体は、後述するhIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の診断に用いることができる。
【０１４６】
本発明の抗体を用いて、hIGFを免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、ELISA、放射性物質標識免疫法（以下、RIAと表記する）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ABC法、CSA法など）、サンドイッチELISA（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、1987；続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986）などがあげられる。
【０１４７】
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレセインイソチオシアネート（以下、FITCと表記する）などの蛍光物質で標識した抗Ig抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【０１４８】
RIAとは、分離した細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗Ig抗体あるいは抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
【０１４９】
免疫組織染色法、免疫細胞染色法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗Ig抗体あるいは抗体断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【０１５０】
サンドイッチELISAとは、本発明の抗体で、抗原認識部位の異なる2種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体はELISAプレートに吸着させ、もう一方の抗体はFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、分離した細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識した抗体を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【０１５１】
5．hIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の診断および治療
本発明の抗hIGF抗体およびその抗体断片は、hIGF-IおよびhIGF-IIと特異的に結合し、かつ、その機能を阻害するため、hIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患などの診断、治療において有用であると考えられる。また、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、かつ、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
【０１５２】
hIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の診断方法としては、被験者の細胞、組織あるいは血清等の生体試料中に存在するhIGFを上記4に記載した免疫学的に検出する方法があげられる。
本発明の抗hIGF抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１５３】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、蛋白質またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０１５４】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【０１５５】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【０１５６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
【０１５７】
また、噴霧剤は該抗体および抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体および抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および抗体断片、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１５８】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり10μg/kg〜10mg/kgである。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
第１図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体のhIGF-Iに対する特異的な反応性を示す（結合ELISA）。
第２図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するhIGF-Iに対する反応性を示す（競合ELISA）。
第３図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のhIGF-Iに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示す。横軸が各種ペプチド濃度（μg/mL）、縦軸が結合活性（%）を示す。用いた各種ペプチドについては、図中に示した。
【０１６０】
第４図は、抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IおよびhIGF-IIへの結合に対する、hIGF-I、hIGF-IIおよびヒトインスリンでの阻害活性を示した図である。AがKM1468とhIGF-Iとの結合、BがKM1468とhIGF-IIとの結合に対する各因子による阻害をそれぞれ示す。横軸が各種因子濃度（μg/mL）、縦軸が因子非添加時を100％としたときの結合活性（%）を示す。■がhIGF-I、○がhIGF-II、△がヒトインスリンを添加したときの反応性をそれぞれ示す。
【０１６１】
第５図は、抗hIGF抗体KM1468、sm1.2およびS1F2のhIGFおよびヒトインスリンによるヒト乳癌細胞株MCF7の増殖に対する影響を示す。Aが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（μg/mL）、縦軸が増殖（OD450）を示す。○がhIGF-I、●がhIGF-II、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。BがhIGF-I、CがhIGF-II、Dがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が増殖（OD450）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がKM1468、□がsm1.2、■がS1F2の活性をそれぞれ示す。
【０１６２】
第６図は、抗hIGF抗体KM1468、sm1.2およびS1F2のhIGFおよびヒトインスリンによるヒト大腸癌細胞株HT-29の増殖に対する影響を示す。Aが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（ng/mL）、縦軸が増殖（OD450）を示す。○がhIGF-I、●がhIGF-II、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。BがhIGF-I、CがhIGF-II、Dがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が増殖（OD450）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がKM1468、□がsm1.2、■がS1F2の活性をそれぞれ示す。
【０１６３】
第７図は、抗hIGF抗体KM1468、sm1.2およびS1F2のhIGFおよびヒトインスリンによるヒト骨肉腫細胞株MG63の増殖に対する影響を示す。Aが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（ng/mL）、縦軸が増殖（OD450）を示す。○がhIGF-I、●がhIGF-II、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。BがhIGF-I、CがhIGF-II、Dがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が増殖（OD450）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がKM1468、□がsm1.2、■がS1F2の活性をそれぞれ示す。
【０１６４】
第８図は、プラスミドpBS(II)SK(-)/hIGF-1およびpKANTEX93/hIGF-Iの造成工程を示した図である。
第９図は、A549/hIGF-I細胞におけるhIGF-Iの発現を示した図である。Ａは、組換えhIGF-I蛋白質による阻害度を示す。横軸は添加した組換えhIGF-I蛋白質の濃度、縦軸は発色（OD415）を示す。Ｂは、A549細胞およびA549/hIGF-I細胞の培養上清中に含まれるhIGF-Iを示す。白抜きはA549細胞、網掛けはA549/hIGF-I細胞をそれぞれ示す。
【０１６５】
第１０図は、KM1468のhIGF-I発現細胞に対する細胞増殖阻害効果を示す。破線は抗hIGF抗体KM1468非添加のA549/hIGF-I細胞の増殖性を、実線は抗hIGF抗体KM1468非添加のA549細胞の細胞増殖をそれぞれ示す。■は抗hIGF抗体KM1468を添加したA549/hIGF-I細胞の増殖性を、○は抗hIGF抗体KM1468を添加したA549細胞の増殖性をそれぞれ示す。
【０１６６】
第１１図は、KM1468の足場非依存性増殖阻害効果を示した図である。図中の白抜きのカラムはA549細胞のコロニー形成数を、網掛けのカラムはA549/hIGF-I細胞の形成数を、黒塗りのカラムは抗hIGF抗体KM1468を添加したA549/hIGF-I細胞の形成数をそれぞれ示す。
【０１６７】
第１２図は、抗hIGF抗体KM1468の抗腫瘍効果を示した図である。横軸は腫瘍移植後の経過日数を、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ示す。A549細胞を移植したマウスのうち、●は抗hIGF抗体KM1468非添加時を、○は抗hIGF抗体KM1468添加時をそれぞれ示す。A549/hIGF-I細胞を移植したマウスのうち、■は抗hIGF抗体KM1468非添加時を、□は抗hIGF抗体KM1468添加時をそれぞれ示す。
【０１６８】
第１３図は、プラスミドpKM1468VHおよびpKM1468VLの造成工程を示した図である。
第１４図は、プラスミドpKANTEX1468Chiの造成工程を示した図である。
第１５図は、精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンMが非還元時は高分子量マーカーおよび還元時は低分子量マーカー、レーン1がKM3002の泳動パターンをそれぞれ示す。
第１６図は、抗hIGFラット抗体KM1468および抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGF-Iに対する反応をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が結合活性（OD415）をそれぞれ示す。○がKM1468、●がKM3002の反応性をそれぞれ示す。
【０１６９】
第１７図は、抗hIGF抗体KM1468、sm1.2、S1F2および抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGFによるヒト大腸癌細胞株HT-29の増殖に対する影響を示す。AがhIGF-I、BがhIGF-IIによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が増殖（OD450）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。 ○がKM1468、●がKM3002、△がsm1.2、▲がS1F2の活性をそれぞれ示す。
【０１７０】
以下に実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例1】
【０１７１】
hIGF-Iに対する抗体の作製
（1）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
組換え型hIGF-I（R&D社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化BSA（SIGMA社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、2回蒸留水に溶解したメチル化BSAを、メチル化BSA:hIGF-I=1:4（重量比）になるように4℃で混合し、10秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比1:1で混合し、免疫原（以下、メチル化BSA-hIGF-Iアジュバンドと表記する）とした。
【０１７２】
5週令雌SDラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化BSA-hIGF-Iアジュバンド（100μgのhIGF-I相当量）を投与し、2週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を1週間に1回、計4回投与した。
【０１７３】
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を実施例1（4）に示す結合ELISAで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
脾臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200 rpm、5分間）した後、上清を捨て、トリス-塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し、赤血球を除去し、MEMで3回洗浄し、細胞融合に用いた。
【０１７４】
（2）マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を通常培地で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保して、細胞融合に使用した。
【０１７５】
（3）ハイブリドーマの作製
実施例1（1）で得られたラット脾細胞と（2）で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（1200 rpm、5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に37℃で攪拌しながら、1.0×102個のラット脾細胞あたり0.2〜1.0mLの融合培地（2gのPEG-1000、2mLのMEM、0.7mLのジメチルスルホキシドの混液）を加え、1〜2分間毎に1〜2mLのMEMを数回加えた後、さらに、MEMを加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離（900 rpm、5分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、100mLのHAT培地｛通常培地［RPMI-1640培地に1.5mmol/Lグルタミン、50μmol/L 2-メルカプトエタノール、10μg/mLジェンタマイシンおよび10% 牛胎児血清（以下、FCSと表記する）を加えた培地］に0.1mmol/Lヒポキサンチン、15μmol/Lチミジンおよび0.4μmol/Lアミノプテリンを加えた培地｝に懸濁した。
【０１７６】
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。この培養上清を実施例1（4）に示す結合ELISAを用いて、メチル化BSA-hIGF-Iに反応して、陰性対照であるメチル化BSA-BSA[BSAを用いて上記実施例1（1）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート]に反応しないウェルを選び、さらにHT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）と通常培地に換え、2回の単一細胞化を行い、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
【０１７７】
その結果、第１図に示した反応性を有するKM1468、KM1469、KM1470、KM1471、KM1472およびKM1473の6クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたELISAにより検討した結果、いずれもIgG2bであった。
【０１７８】
（4）モノクローナル抗体の選択（結合ELISA）
ELISAプレートに固定化する抗原としては、実施例1（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-Iおよび陰性対照としてメチル化BSA-BSAを用いた。96ウェルELISAプレート（Greiner社製）に、上述の抗原をhIGF-IあるいはBSAの濃度として10μg/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSAを含むPBS（以下、BSA-PBSと表記する）を100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。BSA-PBSを捨て、被免疫ラット抗血清、抗hIGF-Iモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体を50μL/ウェルで分注し、室温で2時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween 20を含むPBS（以下、Tween-PBSと表記する）で洗浄後、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を二次抗体として50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、415nmの吸光度（以下、OD415と表記する）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１７９】
（5）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令Balb/cヌード雌マウスに実施例1（3）で得られたハイブリドーマクローンを5〜20×106細胞/匹でそれぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（1〜8mL/匹）し、遠心分離（3000 rpm、5分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）によりIgG画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
【実施例2】
【０１８０】
抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の反応性の検討
（1）hIGF-Iの天然の立体構造に対する反応性
実施例1（3）で選択された抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つhIGF-Iに対する反応性を、以下に示す競合ELISAで調べた。
【０１８１】
実施例1（4）に示した、実施例1（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-Iを固定化したプレートを準備し、20μg/mLより5倍希釈で段階的に希釈したhIGF-Iを50μL/ウェルで分注後、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（KM1468:6.0μg/mL、KM1470:1.0μg/mL、KM1471:0.16μg/mL、KM1472:7.0μg/mL、KM1473:1.2μg/mL）を50μL/ウェルで分注し、混合して室温で2時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１８２】
第２図に示したように、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体はいずれもhIGF-Iの液層中の天然の立体構造と反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示したKM1468では、液相系に含まれる16ng/mLまでの濃度の天然の立体構造を有するhIGF-Iを検出可能であった。
【０１８３】
（2）抗hIGF抗体KM1468のhIGF-Iの競合的ELISAでの反応性
抗hIGF抗体KM1468は、実施例2（1）においてhIGF-Iの立体構造を認識している可能性が示唆された。しかしながら、KM1468は、アミノ酸一次配列を認識している可能性も考えられるため、hIGF-I部分ペプチドとの反応性を解析した。
【０１８４】
（2−1）hIGF-Iの部分ペプチドの合成
WO01/64754に記載の方法に従って、hIGF-Iの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、hIGF-Iの1-18番目（配列番号17、以下、p1-18と表記する）、14-30番目（配列番号18、以下、p14-30と表記する）、24-35番目（配列番号19、以下、p24-35と表記する）、29-41番目（配列番号20、以下、p29-41と表記する）、36-47番目（配列番号21、以下、p36-47と表記する）、41-56番目（配列番号22、以下、p41-56と表記する）、52-70番目（配列番号23、以下、p52-70と表記する）、53-61番目（配列番号24、以下、p53-61と表記する）、61-70番目（配列番号25、以下、p61-70と表記する）に相当するペプチドであり、hIGF-Iの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するCysについては、SerあるいはAlaに置換した配列を合成した。また、41-56番目に相当する配列については、内部のCysを有する配列（配列番号26、以下、p41-56Cと表記する）も合成した。
【０１８５】
（2−2）抗hIGF抗体KM1468の抗原認識部位の解析
上記（2-1）で合成した各種ペプチドを用いて、抗hIGF抗体KM1468の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ELISAで検討した。
実施例1（4）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、4.0μg/mLに希釈した抗hIGF抗体KM1468を50μL/ウェルで分注後、50μg/mLより3倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはhIGF-Iを50μL/ウェルで分注し、混合して室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、二次抗体として4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のOD415を100とした相対値（%）で表示した。
【０１８６】
第３図に示したように、抗hIGF抗体KM1468のhIGF-Iに対する結合は、hIGF-Iにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、KM1468が、hIGF-Iの単なるアミノ酸一次配列ではなく、hIGF-Iの立体構造を認識していることを強く示唆する。
【０１８７】
（3）抗hIGF抗体KM1468の競合的ELISAによる交差反応性の確認
精製した抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IIおよびヒトインスリンに対する交差反応性を、以下に示した競合ELISAで検討した。抗原としては、hIGF-I（Pepro Tech社製）、hIGF-II（Pepro Tech社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
【０１８８】
実施例1（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-I抗原、あるいは実施例1（1）と同様に作製したメチル化BSA-hIGF-II抗原を、実施例1（4）に示した方法に従って、メチル化BSA-hIGF-I抗原は0.1μg/mLの濃度で、メチル化BSA-hIGF-II抗原は1.0μg/mLの濃度でそれぞれ固定化したプレートを準備し、0.6μg/mLに希釈したKM1468を25μL/ウェルで分注後、20μg/mLより4倍希釈で段階的に希釈したhIGF-I、hIGF-IIあるいはヒトインスリンを25μL/ウェルで分注し、混合して室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、二次抗体として抗hIGF抗体KM1468の場合は、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて使用した。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のOD415を100として相対値（%）で表示した。
【０１８９】
結果を第４図に示した。第４図Aに示したように、抗hIGF抗体KM1468のhIGF-Iに対する結合は、hIGF-IおよびhIGF-IIで強く阻害された。同様に、第４図Bに示したように、抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IIに対する結合は、hIGF-IおよびhIGF-IIで強く阻害された。また、これらの阻害はhIGF-IあるいはhIGF-IIでそれぞれ同程度であった。すなわち、抗hIGF抗体KM1468は、hIGF-IとhIGF-IIの両方に同程度の強さで反応できることを示している。一方、抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IあるいはhIGF-IIへの結合は、ヒトインスリンでは阻害されなかった。
【実施例3 】
【０１９０】
抗IGF抗体とIGFとの反応性の確認
KM1468と二種類の市販抗hIGF抗体との、抗原への反応性の比較を以下のようにして検討した。抗体としては、抗hIGF抗体KM1468、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2（Upstate biotechnology社製）および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2（Upstate biotechnology社製）を用いた。抗原としては、hIGF-I（Pepro Tech社製）、hIGF-II（Pepro Tech社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
【０１９１】
（1）表面プラズモン共鳴を用いた結合強度の測定
抗hIGF抗体KM1468と、抗原であるhIGF-IあるいはhIGF-IIに対する結合活性を解析するために、抗hIGF抗体KM1468、市販の抗hIGF-I抗体sm1.2、および市販の抗hIGF-II抗体S1F2の3種の抗体の、hIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合強度を表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）を利用したバイオセンサーBiacore2000（ビアコア社製）を用いて以下のように測定した。アナライトの希釈並びに測定中の反応緩衝液としては、HBS-EP（10mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0.005% Tween20 pH7.4）（ビアコア社製）を用いた。
【０１９２】
センサーチップCM-5（ビアコア社製）に、アミンカップリング（ビアコア社製）を用いて、36.0pg/mm2でhIGF-Iをあるいは41.7pg/mm2 でhIGF-IIを固定化し、測定物として20μg/mLより2倍希釈で6段階に希釈した3種類の抗体を、流速20μL/ 分で2分間添加した後、5分間にわたって測定物の解離を観察した。反応は25℃で行った。各濃度における結合反応曲線から、結合速度定数Kass、並びに解離速度定数Kdissを算出し、これから各抗体の結合定数KA (mol/L)-1を算出した。結合定数KAは、KA＝Kass/Kdissで計算される。
【０１９３】
第１表
KM1468
sm1.2
S1F2
KA ( hIGF-I )
7.86×109
1.86×108
4.62×108
KA ( hIGF-II )
8.63×109
7.35×107
2.40×109
【０１９４】
結果を第１表に示した。抗hIGF抗体KM1468のhIGF-Iに対する KAは7.86×109(mol/L)-1であり、hIGF-IIに対するKAは8.63×109(mol/L)-1であった。KM1468のhIGF-IおよびhIGF-IIに対するKAの比は、ほぼ1:1であり、KM1468はhIGF-IおよびhIGF-IIの両者に同程度に強力に結合できることが示された。一方、市販の抗hIGF-Iモノクローナル抗体sm1.2のhIGF-Iに対するKAは1.86×108(mol/L)-1、hIGF-IIに対するKAは7.35×107(mol/L)-1であった。抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IおよびhIGF-II に対するKAは、市販の抗hIGF-I抗体sm1.2のKAと比較してhIGF-Iに対しては約42倍、hIGF-IIに対しては約120倍であった。また、市販の抗hIGF-II抗体S1F2のhIGF-Iに対するKAは4.62×108(mol/L)-1、hIGF-IIに対するKAは2.4×109(mol/L)-1であった。抗hIGF抗体KM1468のhIGF-IおよびhIGF-II に対するKAは、市販の抗hIGF-II抗体S1F2のKAと比較してhIGF-Iに対しては約18倍、hIGF-IIに対しては約3.6倍であった。すなわち抗hIGF抗体KM1468は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2と比較して、hIGF-I、hIGF-IIのそれぞれに強い結合力を有していることが示された。
【０１９５】
（2）抗hIGF抗体のhIGF依存性増殖に対する影響
ヒト乳癌細胞株MCF7（ATCC HTB-22）、ヒト大腸癌細胞株HT-29（ATCC HTB-38）あるいはヒト骨肉腫細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）をTF/BSA培地[D-MEM/F-12（Gibco BRL社製）に10μg/mLのヒトトランスフェリン（Gibco BRL社製）、200μg/mLのBSAを添加した培地]で0.5〜1×105細胞/mLに調製し、96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルで分注した。さらに、TF/BSA培地で各濃度に希釈したhIGF-I（Pepro Tech社製）、hIGF-II（Pepro Tech社製）あるいはヒトインスリン（和光純薬社製）の各因子を50μL/ウェルで、TF/BSA培地で各濃度に希釈した各抗体を50μL/ウェルで添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で5日間培養した。培養後、細胞増殖試薬WST-1（Roche社製）を20μL/ウェルで分注し、さらに、37℃、5%CO2インキュベーター内で2.5〜4時間培養した後に、OD450nmの吸光度（以下、OD450と表記する）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１９６】
第５図Aには、ヒト乳癌細胞株MCF7の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第５図Bには、40ng/mLのhIGF-I存在下、第５図Cには、100ng/mLのhIGF-IIの存在下、第５図Dには、100ng/mLのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。第５図に示したように、抗hIGF抗体KM1468は、hIGF-IおよびhIGF-IIによる細胞増殖を強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例3（1）および（2）の競合ELISAで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能が阻害されることを明確に示したものである。
【０１９７】
第６図Aには、ヒト大腸癌細胞株HT-29の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第６図Bには、10ng/mLのhIGF-I存在下、第６図Cには、10ng/mLのhIGF-IIの存在下、第６図Dには、20ng/mLのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。
【０１９８】
第６図に示したように、抗hIGF抗体KM1468は、hIGF-IおよびhIGF-IIによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例3（1）および（2）の競合ELISAで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能が阻害されることを明確に示したものである。さらに、第６図Bに示されるhIGF-I添加時のHT-29細胞の培養にKM1468を添加した場合、および第６図Cに示されるhIGF-II添加時のHT-29細胞の培養にKM1468あるいはS1F2を添加した場合には、それぞれ点線で示される各種抗体および各種増殖因子を添加しない場合よりも、細胞の増殖は抑制された。すなわち、HT-29細胞は、自らhIGF-IあるいはhIGF-IIを産生して増殖しており、このように細胞自らが産生した増殖因子による細胞の増殖効果も、抗hIGF抗体は阻害できる。
【０１９９】
第７図Aには、ヒト骨肉腫細胞株MG-63の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第７図Bには、20ng/mLのhIGF-I存在下、第７図Cには、20ng/mLのhIGF-IIの存在下、第７図Dには、20ng/mLのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。第７図に示したように、抗hIGF抗体KM1468は、hIGF-IおよびhIGF-IIによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例3（1）および（2）の競合ELISAで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能が阻害されることを明確に示したものである。
【０２００】
以上の3種類の細胞での、hIGF-IあるいはhIGF-II依存的な細胞増殖の阻害活性は、抗hIGF抗体KM1468あるいは市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2あるいは抗hIGF-II抗体であるS1F2抗体のいずれにも認められた。この細胞増殖の阻害活性は、hIGF-I依存的な増殖活性の場合には、抗hIGF抗体KM1468が最も高く、次いで、抗hIGF-I抗体sm1.2、抗hIGF-II抗体S1F2であった。また、hIGF-II依存的な増殖活性の場合には、抗hIGF抗体KM1468が最も高く、次いで、抗hIGF-II抗体S1F2、抗hIGF-I抗体sm1.2であった。この結果は、実施例3（1）の表面プラズモン共鳴を用いて得られた結合強度の結果とよく一致しており、抗hIGF抗体KM1468は、hIGF-IとhIGF-IIの両方に対する結合活性およびhIGF-IあるいはhIGF-II依存的な細胞の増殖阻害効果において、市販抗体と比較して優れていることを、明確に示している。
【実施例4】
【０２０１】
hIGF-I発現細胞の増殖に対する抗hIGF抗体KM1468の影響
（1）hIGF-I発現細胞の構築
以下のようにしてヒト肺癌細胞株A549細胞（ATCC CCL-185）にhIGF-I遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
【０２０２】
（1−1）hIGF-I遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
1×107個のヒト肺癌細胞株PC-9細胞（British Journal of Cancer, 39, 15, 1976）から、RNA調製キットRNeasy（QIAGEN社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、45.6μg の全 RNAを調製した。調製した全 RNAのうち5μgを使用して、Superscript II（GIBCO-BRL社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、cDNAを合成した。
【０２０３】
合成したcDNAを鋳型として、PCRによってhIGF-I遺伝子をクローニングした。hIGF-I遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号27と28に示した塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを設計した。それぞれの合成DNAは5’末端にプラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、並びにpKANTEX93（WO97/10354）へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、上述で得られたヒト肺癌細胞株PC-9細胞から合成したcDNAの20ngを50μLのKOD(+) DNA Polymerase添付KOD(+) Buffer #1（東洋紡績社製）、0.2mmol/L dNTPs、2mmol/L塩化マグネシウム、1μmol/Lの配列番号27と28に示した塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて、94℃にて1分間加熱した後、2.5単位のKOD DNA Polymerase（東洋紡績社製）を添加し、94℃にて30秒間、62℃にて30秒間、72℃にて30秒間のサイクルを30サイクル行った。それぞれの反応液50μLを制限酵素Eco RI（Takara Shuzo社製）およびSal I（Takara Shuzo社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、約0.5kbのhIGF-1をコードする遺伝子のPCR産物を回収した。
【０２０４】
次に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）を制限酵素Eco RIおよびSal Iで消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（以下、CIAPと表記する；Takara Shuzo社製）で末端を脱リン酸化して得られたDNA0.1μgと、上記で得られたそれぞれのPCR産物約0.1μgを滅菌水に加えて7.5μLとしLigation high（東洋紡績社製）7.5μLを加えて16℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、目的であるhIGF-Iをコードする遺伝子配列を有する第８図に示したプラスミドpBS(II)SK(-)/hIGF-Iを得た。
【０２０５】
次に、上記で得られたpBS(II)SK(-)/hIGF-IのhIGF-Iをコードする遺伝子を含む制限酵素断片（EcoRI-KpnI）とpKANTEX93のEcoRI-KpnI断片とを連結して、第８図に示したプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを構築した。プラスミドpKANTEX93/hIGF-Iの塩基配列を上記と同様に塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377を用いて決定した。その結果、目的のhIGF-Iをコードする遺伝子を含むプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを得た。
【０２０６】
（1−2）hIGF-I形質転換体の作製
実施例４（1−1）で得られたプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを動物細胞に導入して、hIGF-I発現細胞を以下のよう作製した。
プラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを制限酵素AatII（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、8μgを4×106細胞のヒト肺癌細胞株A549細胞（ATCC CCL-185）へエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、15mLのRPMI培地［10 % FCS、50μg/mL ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むRPMI1640培地（Invitrogen社製）］に懸濁し、T75フラスコ（スミロン社製）に移した。37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した後、G418を0.2mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示すA549/hIGF-I形質転換株（以下、A549/hIGF-Iと表記する）が取得された。
【０２０７】
（1−3）A549/hIGF-I細胞の培養上清に産生されたhIGF-Iの定量
実施例４（1−2）で作製したA549/hIGF-I細胞内において導入したhIGF-I遺伝子が発現して、該細胞がhIGF-Iを産生しているかを確認するために、以下の実験を行った。
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養を行った後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるhIGF-I量を以下のELISA法により測定した。
【０２０８】
実施例1（4）に示した、メチル化BSA-hIGF-Iを固定化したプレートを準備し、陽性対象として2μg/mLより５倍希釈で段階的に希釈したhIGF-I、あるいはA549/hIGF-I細胞またはA549細胞の培養上清を25μl /ウェルで分注後、BSA-PBSで0.6μg/mLに希釈した抗hIGF抗体KM1468の精製抗体を分注し、混合して室温で2時間反応させた。反応後Tween-PBSで洗浄後、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL /ウェルで分注し、室温1時間で反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、1000倍希釈した抗ラットIgG-HRP（DAKO社製）を50μL/ウェルで分注し、室温で１時間反応させた。反応後、Tween-PBSで５回洗浄した後、ABTS基質溶液［2, 2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/ mLで添加した溶液］を50μl/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmaxを用いて測定した。
【０２０９】
結果を第９図に示す。第９図Aに示したように、hIGF-I遺伝子が導入されていないA549細胞の培養上清に対してhIGF-I遺伝子が導入されたA549/hIGF-I細胞の培養上清では、明らかに結合活性は低下していることから、A549/hIGF-I細胞はhIGF-Iを発現していることが示された。
【０２１０】
（1−4）抗hIGF抗体KM1468のhIGF-I発現細胞の増殖に対する影響
細胞自身が産生するhIGF-Iに依存した細胞増殖（以下オートクリン細胞増殖と表記する）をKM1468が阻害できるかを、実施例４（1−2）で作製したhIGF-I遺伝子導入細胞A549/hIGF-I細胞を用いて、調べた。
【０２１１】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞を10% FCS、50μg/mL ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むRPMI1640培地（Invitrogen社製）（以下、RPMI培地と表記する）で培養した後、それぞれ2×105個/mLの細胞密度になるように10μg/mLのヒトトランスフェリン（GIBCO社製）、200μg/mL BSA（Invitrogen社製） を含むDMEM/F12培地(-FCS, -Phenol red)（Invitrogen社製）（以下、無血清培地と表記する）に懸濁した。
【０２１２】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液を96ウェルプレート（スミロン社製）に100μL/ウェルで分注した後、各ウェルに無血清培地で200μg/mLより５倍希釈系で段階的に希釈した抗hIGF抗体KM1468を100μL/ウェルで添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で5日間培養した。培養後、細胞増殖試薬WST-1（Roche社製）を20μL/ウェルで分注し、さらに、37℃、5%CO2インキュベーター内で4時間培養した後に、OD450nmの吸光度（以下、OD450と表記する）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０２１３】
結果を第１０図に示した。横軸は、培養時の各ウェル中の抗hIGF抗体KM1468濃度を示した。破線に示される抗hIGF抗体KM1468非添加のA549/hIGF-I細胞の増殖性は、実線に示されるhIGF-Iを産生しないA549細胞の増殖性と比較した場合、明らかに増加している。これは、A549/hIGF-I細胞が自己産生するhIGF-IによってA549/hIGF-I細胞自身の増殖を促すオートクリン増殖を示しているものである。この第１０図に表されるようなオートクリン増殖は、A549/hIGF-I細胞の培養時に抗体KM1468を添加した場合に、濃度依存的に阻害された。一方、A549細胞の増殖性には、抗体KM1468は影響を及ぼさなかった。すなわち、抗hIGF抗体KM1468は、細胞自身が生産するhIGF-Iによるオートクリン細胞増殖を阻害できることが示された。
【０２１４】
（1−5）抗hIGF抗体KM1468のhIGF-I発現細胞の足場非依存性増殖への影響
癌化した細胞は、軟寒天中などの細胞接着のない浮遊状態にも関わらず増殖することができる足場非依存性増殖能を有している。この足場非依存性増殖能は、細胞の造腫瘍性と非常に密接に関連しており、hIGF-Iが関与していると考えられている。KM1468が細胞の足場非依存性増殖を阻害できるかを、実施例４（1−2）で作製したA549/hIGF-I細胞を用いて、以下のようにして調べた。
暖めた0.3% agar noble（Difco社製）を含む、RPMI培地（以下、agar-RPMI培地と記す）を、12ウェルプレート（Costar社製）に1 mL/ウェルで分注し、数十分室温で放置してゲル化させたプレートを準備した。A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養した後、1×103 個/mLの細胞密度になるように暖めたagar-RPMI培地に懸濁した。
【０２１５】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液を、1 mL/ウェルで各ウェルに層積した。数分間室温で放置し、ゲル化させた後、37℃、5%CO2インキュベーター内で4週間培養した。培養後、各ウェル内に形成されたコロニー数を顕微鏡下で測定した。
【０２１６】
結果を第１１図に示した。第１１図に示したようにhIGF-Iを生産しているA549/hIGF-I細胞の足場非依存性の細胞増殖性は、A549細胞の足場非依存性の細胞増殖性と比較して上昇していた。また、A549/hIGF-I細胞の軟寒天中での培養時に10μg/mLの抗hIGF抗体KM1468を添加した場合には、足場非依存性の細胞増殖は、KM1468の添加により完全に阻害された。すなわち、足場非依存性の細胞増殖にはhIGF-Iが関与しており、hIGF-I依存的な足場非依存性の細胞増殖は、抗hIGF抗体KM1468により阻害されることが示された。
【０２１７】
（1−6）抗hIGF抗体KM1468のhIGF-I発現細胞に対する腫瘍増殖阻害効果
実施例４（1−2）で作製したA549/hIGF-I細胞を用いて、hIGF-Iが関与するin vivo腫瘍形成に対する、抗hIGF抗体KM1468の腫瘍増殖阻害効果を、以下のように検討した。
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養した後、それぞれ1×108個/mLの細胞密度になるようにPBSに懸濁した。
【０２１８】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液の100μLを6週齢、ヌードマウス Balb/c Ajc-1 nu（メス）の右胸部に皮下移植した。マウス1匹当たりの移植した細胞数は、1×107個となる。移植直後から、マウス1匹につき500μgの抗hIGF抗体KM1468を1週間に2回、合計8回にわたって尾静脈から投与した。陰性対象として、同一の腫瘍皮下移植マウスに対してPBS投与を同時に行った。細胞移植から5日間経過時点から、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（mm3）は、腫瘍の長径、短径および高さから、長径×短径×高さ×0.5236の式を用いて、算出した。
【０２１９】
結果を第１２図に示した。hIGF-Iを生産しないA549細胞とhIGF-Iを生産しているA549/hIGF-I細胞を移植したマウスの間で、皮下腫瘍の増殖性を比較したとき、A549/hIGF-I細胞を移植したマウスの皮下腫瘍の方が、腫瘍の増殖は亢進していた。また、A549/hIGF-I細胞を移植したマウスでは、抗hIGF抗体KM1468を投与した場合、皮下腫瘍の増殖は、顕著に阻害された。このことは、抗hIGF抗体KM1468が、hIGF-Iの阻害によりiv vivoにおいても腫瘍の増殖を阻害できることを明確に示している。
【実施例５】
【０２２０】
抗hIGF-Iキメラ抗体の作製
（1）抗hIGF抗体KM1468のV領域をコードするcDNAの単離、解析
（1−1）抗hIGF抗体KM1468産生ハイブリドーマからのmRNAの調製
抗hIGF抗体KM1468産生ハイブリドーマ細胞KM1468（FERM BP-7978）の5×107個より、mRNAの調製キットであるFast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、KM1468由来のmRNAを27μg調製した。
【０２２１】
（1−2）抗hIGF抗体KM1468のH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
実施例５（1−1）で取得したKM1468のmRNAの5μgから、TimeSaver cDNA Synthesis Kit（Amersham Pharmacia社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にEcoRI-NotIアダプター配列を有するcDNAを合成した。合成したcDNAの全量を20μLの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgGクラス抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とκクラスのL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてそれぞれ約1.0μg回収した。次に、λZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit（Stratagene社製）を用いて、各々の約1.5kbのcDNA断片0.1μg および約1.0kbのcDNA断片0.1μgと、キットに添付されている制限酵素EcoRIで消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphataseで末端を脱リン酸化されたλZAPIIベクターの1μgを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後の各々の反応液のうち2.5μLをGigapack III Gold Packaging Extracts （Stratagene社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、KM1468のH鎖cDNAライブラリーとして5.0×104個、L鎖cDNAライブラリーとして4.0×104個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）に従い、ナイロンメンブレンフィルターHybondN+（Amersham Pharmacia社製）上に固定した。
【０２２２】
（1−3）抗hIGF抗体KM1468のH鎖およびL鎖のcDNAのクローニング
実施例5（1−2）で作製したKM1468のH鎖cDNAライブラリー、L鎖cDNAライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems（Amersham Pharmacia社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のC領域のcDNA[H鎖はマウスCγ2bcDNAの断片（Nature, 283, 786-789 1980）、L鎖はマウスCκcDNAの断片（Cell, 22, 197-207, 1980）]をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをH鎖、L鎖各10クローン取得した。次に、λZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit（Stratagene社製）の使用説明書に従い、in vivo excision法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるcDNAの塩基配列をBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて決定した。その結果、cDNAの5'末端に開始コドンと推定されるATG配列が存在する完全長の機能的なH鎖cDNAを含むプラスミドpKM1468H5-2およびL鎖cDNAを含むプラスミドpKM1468L5-1を得た。
【０２２３】
（1−4）抗hIGF抗体KM1468のV領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドpKM1468H5-2に含まれていたKM1468のVHの全塩基配列を配列番号１に、それから推定されたKM1468のVHの全アミノ酸配列を配列番号2に、プラスミドpKM1468L5-1に含まれていたKM1468のVLの全塩基配列を配列番号3に、それから推定されたKM1468のVLの全アミノ酸配列を配列番号4にそれぞれ示した。なお、配列番号2および4に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号1および3に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知の抗体の配列データ（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）との比較および精製した抗hIGF抗体KM1468のVHおよびVLのN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ-10（Shimadzu社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗hIGF抗体KM1468のH鎖およびL鎖をコードする完全長cDNAであり、VHについては、配列番号2に示したアミノ酸配列の１から１９番目が、VLについては、配列番号4に示したアミノ酸配列の１から２２番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
【０２２４】
次に、抗hIGF抗体KM1468のVHおよびVLのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてGCG Package（version 10.0、Genetics Computer Group社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース[SWISS-PROT (Release 39.0)、PIR-Protein (Release 65.0)]をBLAST法（Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990）により検索した。その結果、VHおよびVLともに完全に一致する配列は認められず、抗hIGF抗体KM1468のVHおよびVLは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
【０２２５】
また、抗hIGF抗体KM1468のVHおよびVLのCDRを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。KM1468のVHのCDR1、2および3のアミノ酸配列を配列番号5、6および7に、VLのCDR1、2および3のアミノ酸配列を配列番号8、9および10にそれぞれ示した。
【０２２６】
（2）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒトIgG1、κクラスの抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と実施例5（1−3）で得られたKM1468のH鎖およびL鎖cDNAを含むプラスミドを用いて抗hIGF抗体KM1468に由来する抗hIGF-Iキメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
【０２２７】
まず、KM1468のVHおよびVLcDNAをアミノ酸配列が変化しないように発現ベクターpKANTEX93に挿入するため、PCRによってKM1468のVHおよびVLcDNAを再構築した。プライマーとして、VHcDNA用に配列番号11と12の塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを、VLcDNA用に配列番号13と14の塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを設計した。それぞれの合成DNAは5'末端にpKANTEX93へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、実施例5（1−3）で得られたプラスミドpKM1468H5-2の20ngを50μLのKOD DNA Polymerase添付PCR Buffer #1（東洋紡績社製）、0.2mmol/L dNTPs、1mmol/L塩化マグネシウム、0.5μmol/Lの配列番号11と12に示した塩基配列を有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて、94℃にて3分間加熱した後、2.5単位のKOD DNA Polymerase（東洋紡績社製）を添加し、98℃にて15秒間、65℃にて2秒間、74℃にて30秒間のサイクルを25サイクル行った。同様に、実施例5（1−3）で得られたプラスミドpKM1468L5-1の20ngを50μLのKOD DNA Polymerase添付PCR Buffer #1（東洋紡績社製）、0.2mmol/L dNTPs、1mmol/L塩化マグネシウム、0.5μmol/Lの配列番号13と14に示した塩基配列を有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でPCRを行なった。それぞれの反応液10μLをアガロースゲル電気泳動した後、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、約0.5kbのVHのPCR産物、約0.43kbのVLのPCR産物をそれぞれ回収した。
【０２２８】
次に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）を制限酵素SmaI（Takara Shuzo社製）で消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（以下、CIAPと表記する；Takara Shuzo社製）で末端を脱リン酸化して得られたDNA0.1μgと、上記で得られたそれぞれのPCR産物約0.1μgを滅菌水に加えて7.5μLとし、TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2のsolution I（Takara Shuzo社製）7.5μL、制限酵素SmaI（Takara Shuzo社製）0.3μLを加えて22℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。 こうして目的の塩基配列を有する第１３図に示したプラスミドpKM1468VHおよびpKM1468VLを得た。
【０２２９】
次に、上記で得られたpKM1468VHのVHcDNAを含む制限酵素断片（NotI-ApaI）をヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93のNotI-ApaI部位に挿入し、第１４図に示したプラスミドpKANTEX1468Hを構築した。さらに、上記で得られたpKM1468VLのVLcDNAを含む制限酵素断片（EcoRI-BsiWI）をプラスミドpKANTEX1468HのEcoRI-BsiWI部位に挿入し、第１４図に示したプラスミドpKANTEX1468Chiを構築した。プラスミドpKANTEX1468Chiを用いて、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いてVHおよびVLcDNAの塩基配列を決定した結果、目的のVHおよびVLcDNAがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
【０２３０】
（3）抗hIGFキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
実施例５（2−1）で得られた抗hIGFキメラ抗体発現ベクターpKANTEX1468Chiを用いて抗hIGFキメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
プラスミドpKANTEX1468Chiを制限酵素AatII（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、10μgを4×106細胞のラットミエローマ細胞株YB2/0細胞（ATCC CRL1581）へエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、40mLのH-SFM（5）培地［ FCSを5%含むH-SFM（Gibco BRL社製）］に懸濁し、96ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に200μL/ウェルずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗hIGFキメラ抗体の濃度を実施例６（1）に示す結合ELISAにより測定した。
【０２３１】
培養上清中に抗hIGFキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、dhfr遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、MTXと表記する；SIGMA社製）を50nmol/L含むH-SFM(5)に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェル培養プレート（Greiner社製）に1mLずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗hIGFキメラ抗体の濃度を実施例6（1）に示す結合ELISAにより測定した。培養上清中に抗hIGFキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nmol/L、200nmol/Lと順次上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むH-SFM(5)で増殖可能かつ、抗hIGFキメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、2回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗hIGFキメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞株を得た。KM1468に由来する抗hIGFキメラ抗体産生形質転換細胞株としては、KM3002があげられる。なお、形質転換細胞株KM3002は、平成１４年4月2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第６  郵便番号 ３０５−８５６６）にFERM BP-7996として寄託されている。
【０２３２】
（4）抗hIGFキメラ抗体の培養上清からの精製
実施例５（3）で得られた抗hIGFキメラ抗体を発現する形質転換細胞株KM3002を、G418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/L、Daigo's GF21（和光純薬社製）を5%の濃度で含むH-SFMに1〜2×105細胞/mLとなるように懸濁し、175cm2フラスコ（Greiner社製）に100mLずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約1LよりProsep-A（Bioprocessing社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗hIGFキメラ抗体KM3002を精製し、約10.2mgの精製蛋白質を取得した。得られた抗hIGFキメラ抗体KM3002の約4μgを、公知の方法（Nature, 227, 680-685, 1970）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１５図に示した。精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002は、非還元条件下では分子量が約150キロダルトン（以下、Kdと表記する）の1本のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、IgGクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS-S結合が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）と一致し、抗hIGFキメラ抗体KM3002が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ-10（Shimadzu社製）を用いて解析した結果、抗hIGF抗体KM1468のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
【実施例６】
【０２３３】
抗hIGFキメラ抗体KM3002の反応性の検討
（1）抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGFに対する反応性
抗hIGFラット抗体KM1468および実施例５（2−3）で精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGF-Iに対する反応性を実施例１（4）に示したELISAにより検討した。ただし、ELISAプレートに固定化したメチル化BSA-hIGF-Iの濃度は、0.5μg/mL、二次抗体として、ラット抗体の場合は、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）、キメラ抗体の場合は、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトIgG1抗体（Southern Biotechnology社製）を用いて行った。第１６図に示したように、抗hIGFキメラ抗体KM3002は、hIGF-Iに対する抗体濃度依存的な結合活性を示した。また、その活性は、二次抗体が異なるため、直接の比較は困難であるが、抗hIGFラット抗体KM1468と同等であることが示唆された。
【０２３４】
（2）抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGF依存性細胞増殖に対する影響
抗hIGFラット抗体KM1468、実施例５（2−3）で精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2（Upstate biotechnology社製）および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2（Upstate biotechnology社製）のhIGF依存性細胞増殖に対する影響を実施例３（4）と同様の方法により検討した。ヒト癌細胞株としては、大腸癌細胞株HT-29（ATCC HTB-38）を用いた。
【０２３５】
第１７図Aには、2ng/mLのhIGF-I存在下、第１７図Bには、10ng/mLのhIGF-IIの存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１７図に示したように、KM3002は、KM1468と同様、hIGF-IおよびhIGF-IIによる細胞増殖を強く阻害し、その活性は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2よりも高かった。また、キメラ抗体であるKM3002と同一の可変領域を有する抗hIGF抗体KM1468は、同等の増殖阻害活性を示した。以上の結果は、KM1468に由来する抗hIGFキメラ抗体KM3002は、キメラ化後も元のラット抗体KM1468と同等の抗原結合活性および抗原結合特異性を保持していることを示している。
【実施例７】
【０２３６】
抗hIGF CDR移植抗体の作製
（1）抗hIGF CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAの構築
（1−1）抗hIGF CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
まず、抗hIGF CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。実施例５（1−4）で同定した抗hIGF抗体KM1468のVHのCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を選択した。公的データベースより、抗hIGF抗体KM1468のVHのFRと最も高い相同性を有するヒト抗体のFRを検索した結果、CAM（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 3239-3243, 1980）が最も高い相同性（81.6%）を有していた。そこで、CAMのFRを基に抗hIGF CDR移植抗体のVHを設計した。CAMのFRには、アミノ酸配列が一義的に決定されていない箇所が4箇所（13番目、74番目、77番目、90番目）存在し、また、ヒト抗体の配列において、一般的でないアミノ酸残基が、3番目と40番目に認められた。そこで、これらのアミノ酸残基については、免疫原性をより低下させるため、ヒト抗体で高い頻度で認められるアミノ酸残基（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）へ改変した。このようにして設計したCAM由来のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗hIGF抗体KM1468のVHのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号15に記載の抗hIGF CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0を設計した。
【０２３７】
次に、抗hIGF CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。実施例５（1−4）で同定した抗hIGF抗体KM1468のVLのCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVLをそのアミノ酸配列の相同性から4種類のサブグループ（HSG I〜IV）に分類し、さらに、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗hIGF CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗hIGF CDR移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のVLの4種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、KM1468のVLのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。第２表には、相同性の検索結果を示した。第２表に示したように、KM1468のVL領域のFRのアミノ酸配列はサブグループIVと最も高い相同性を有していた。
【０２３８】
第２表
HSGI    HSGII    HSGIII    HSGIV
66.3%    61.3%    66.3%     67.5%
【０２３９】
以上の結果から、ヒト抗体のVLのサブグループIVの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗hIGF抗体KM1468のVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号16に記載の抗hIGF CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV.0を設計した。
【０２４０】
上記で設計した抗hIGF CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0およびVLのアミノ酸配列LV.0は、選択したヒト抗体のFRのアミノ酸配列に抗hIGF抗体KM1468のCDRのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般に、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト以外の動物の抗体のCDRのアミノ酸配列の移植のみでは活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とヒト以外の動物の抗体で異なっているFRのアミノ酸残基のうち、活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をCDRのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、活性に影響を与えると考えられるFRのアミノ酸残基を同定することを検討した。まず、上記で設計した抗hIGF CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0およびVLのアミノ酸配列LV.0よりなる抗体V領域（HV0LV0）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアAbM（Oxford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアPro-Explore（Oxford Molecular社製）あるいはRasMol(Glaxo社製)を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗hIGF抗体KM1468のV領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、HV0LV0のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列において、抗hIGF抗体KM1468と異なっている残基について順次、抗hIGF抗体KM1468の相当する位置に見られる残基へ改変したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、抗hIGF抗体KM1468、HV0LV0および改変体のV領域の三次元構造を比較した。その結果、HV0LV0のFRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、HV.0では1番目のGln、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgを、LV.0では1番目のAsp、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValを選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも1つ以上をラット抗体KM1468に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLを設計した。
【０２４１】
（1−2）抗hIGF CDR移植抗体のVHをコードするcDNAの構築
実施例６（1−1）で設計した抗hIGF CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV.0をコードするcDNAをPCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号2に記載の抗hIGF抗体KM1468のH鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体V領域のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、更に5'末端と3'末端にPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を5'末端側から約100塩基ずつ計6本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した(GENSET社製)。
【０２４２】
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が0.1μmol/Lとなるように50μLの反応液に加えて、0.5μmol/L M13 primer RV（Takara Shuzo社製）、0.5μmol/L M13 primer M4（Takara Shuzo社製）および1単位のKOD polymerase（東洋紡績社製）を用いて、KOD polymeraseに添付の使用説明書に従い、PCRを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（94℃ 30秒間、50℃ 30秒間、74℃ 60秒間のサイクルを30サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換株の株よりプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit （Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
【０２４３】
次に、実施例６（1−1）で設計したFRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のPCRを行うか、上記で作製したHV.0をコードするcDNAを含むプラスミドDNAを鋳型として変異を有する合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、増幅断片を単離することで達成した。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、ラット抗体KM1468で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
【０２４４】
（1−3）抗hIGF CDR移植抗体のVLをコードするcDNAの構築
実施例６（1−1）で設計した抗hIGF CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV.0をコードするcDNAをPCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号4に記載の抗hIGF抗体KM1468のL鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体V領域のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、更に5'末端と3'末端にPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を5'末端側から約100塩基ずつ計6本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した(GENSET社製)。
【０２４５】
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が0.1μmol/Lとなるように50μLの反応液に加えて、0.5μmol/L M13 primer RV（Takara Shuzo社製）、0.5μmol/L M13 primer M4（Takara Shuzo社製）および1単位のKOD polymerase（東洋紡績社製）を用いて、KOD polymeraseに添付の使用説明書に従い、PCRを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（94℃ 30秒間、50℃ 30秒間、74℃ 60秒間のサイクルを30サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit （Applied  Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
【０２４６】
次に、実施例６（1−1）で設計したFRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のPCRを行うか、上記で作製したLV.0をコードするcDNAを含むプラスミドDNAを鋳型として変異を有する合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、増幅断片を単離することで達成した。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗hIGF抗体KM1468で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
【０２４７】
（2）抗hIGF CDR移植抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の適当な位置に実施例６（1−2）および実施例６（1−3）で得られたHV.0およびLV.0をコードするcDNAおよびそれらの改変体をコードするcDNAを挿入し、各種抗hIGF CDR移植抗体発現ベクターを構築した。
【０２４８】
（3）抗hIGF CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
抗hIGF CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、上記実施例5（3）に記載の方法に従い行った。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
本発明は、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が5×109(mol/L)-1以上の結合活性を有する抗体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該抗体を用いるヒトIGF介在性疾患または異常なヒトIGFの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬、予防薬および治療薬を提供することを目的とする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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