(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のzvegf4タンパク質又はzvegf4タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る、哺乳類における腎細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存性を増強するための組成物において、前記zvegf4タンパク質が２個のポリペプチドのジスルフィド結合した２量体であり、前記ポリペプチド鎖のそれぞれが配列番号：２のアミノ酸残基19−370を含んでなることを特徴とする組成物。
【請求項２】
zvegf4タンパク質が前記哺乳類に投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
zvergf4タンパク質−コードのポリヌクレオチドが、前記哺乳類に投与される請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記鎖の個々が配列番号２の残基19−370から成る、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
腎不全は、外傷、ショック、中毒、急性膵炎、敗血症、一定の薬剤への慢性暴露、被毒、及び他の原因の合併症とそて生じることができる。急性尿細管壊死（ATN）、すなわち急性腎不全の最も共通する原因は通常、末梢器官への不適切な血流の期間の後に通常生じる。無酸素症又は中毒は、尿細管上皮細胞の死及び急性腎不全への進行を導く。フェナセチン、アスピリン及びアセトミノフェンの組合せへの長期の暴露に起因する慢性鎮痛薬性腎炎はまた、尿細管上皮細胞の壊死のためであることができる。Robbinsなど., Basic Pathology, Third Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1981, 421-456を参照のこと。
【０００２】
虚血症−及び腎毒素−誘発された腎損傷は、急性腎不全の主要原因であり、そして腎尿細管上皮細胞、主に近位尿細管への構造的及び機能的損傷により特徴づけられる（Oliverなど., J. Clin. Invest. 30: 1307-1439, 1951）。近位尿細管上皮への損傷は、複雑な再生工程により修復される。細胞剥離の後、脱分化された近位尿細管細胞が増殖し、そして新しい上皮を確立するために基底膜の露出された領域中に移動する（Wallinなど., Lab. Invest. 66: 474-484, 1992）。多くの観点においては、この腎形成修復工程は、胚間葉が尿細管上皮に転換する場合、ネフロンの発生の後期段階に類似する（Wallinなど., 前記；Hammermannなど., A. J. Physiol. 262: F523-532, 1992）。
【０００３】
機能的尿細管上皮は２週間で再生され得るが、ATNの臨床学的経路は多くの患者において延長され、そして処理は支持的医療、例えば透析から成る。適切な処理なしでは、ATNは死をもたらす。
腎尿細管上皮細胞のインビボでの増殖を刺激し、そしてそれにより腎機能を刺激するための組成物及び方法についての必要性が当業界において存続する。
【０００４】
発明の記載：
本発明は、哺乳類において腎機能を改良するか、又は腎尿細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存生を増強するための材料及び方法を提供する。
本発明の１つの観点においては、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のzvegf4タンパク質又はzvegf4タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における腎機能の改良方法が提供される。
【０００５】
本発明の第２の観点においては、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のzvegf4タンパク質又はzvegf4タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における腎細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存性を増強するための方法が提供される。
【０００６】
上記に開示される方法のある態様においては、zvegf4タンパク質は、前記哺乳類に投与される。選択された態様においては、前記zvegf4タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基258−370、配列番号２の残基250−370又は配列番号２の残基246−370を含んで成る。他の態様においては、前記zvegf4タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基X−370から成り、個々でXは246−258の整数であり、そして前記タンパク質が任意には、グリコシル化されている。
【０００７】
上記に開示される方法のある態様においては、zvergf4タンパク質−コードのポリヌクレオチドは、前記哺乳類に投与される。選択された態様においては、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２の残基258−370、配列番号２の残基19−370又は配列番号２の残基１−370を含んで成る。
【０００８】
本発明の他の態様においては、前記zvegf4タンパク質は２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基x-yから成り、ここで前記タンパク質は任意には、グリコシル化されており、そしてxが、16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 35, 52, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 246, 250, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262及び263から成る群から選択され；そしてyが、365、366、367、368、369、及び370から成る群から選択される。
上記に開示される方法の他の態様においては、哺乳類は、急性尿細管壊死を有する。
【０００９】
図式は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のHopp/Woods親水性プロフィールである。このプロフィールは、スライドする６−残基窓に基づかれている。隠されたG、S及びT残基及び暴露されたH, Y及びW残基は無視された。それらの残基は、小文字により図式に示される。
【００１０】
“保存性アミノ酸置換”はHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992のBLOSUM62評点マトリックス、すなわち関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスにより定義される。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【００１１】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約  10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
【００１２】
用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。従って、例えば15〜1500個のアミノ酸残基“から成る”タンパク質はさらに、１又は複数の炭水化物鎖を含むことができる。
【００１３】
用語“処理する”及び“処理”とは、病理学的状態を好ましく変更し、例えばその症状を緩解する治療及び予防介在性を示すために広く使用される。処理は、疾病の進行を減速するか又は逆転させ、疾病の重症度を低め、疾病を妨げ、又は治療する手順を包含する。
【００１４】
用語“zvegf4タンパク質”とは、zvegf4ポリペプチドの成長因子ドメイン（例えば、ヒトzvegf4 (配列番号２)又はマウスzvegf4（配列番号４）の残基258−370）を含んで成るタンパク質を示すために、本明細書において使用され、ここで前記タンパク質又はそのタンパク質分解的に活性化された形は、細胞表面PDGF α−及び/又はβ−受容体サブユニットを発現する細胞のためのマイトジェンである。zvegf4は、PDGF受容体のαα、αβ及びββイソフォームを活性化することが見出されている。zvegf4タンパク質は、下記に開示されるようなホモダイマー及びヘテロダイマーを包含する。当業界において知られている方法を用いて、zvegf4タンパク質は、初期メチオニン残基を伴なって又は伴なわないで、グリコシル化されているか又はグリコシル化されていない、ペルギレート化されているか又はペルギレート化されていない種々の形で、及び下記により詳細に開示されるような融合タンパク質として調製され得る。
【００１５】
“zvegf4タンパク質コードのポリヌクレオチド”とは、上記で定義されるようなダイマーzvegf4タンパク質を生成するために後−翻訳プロセッシングされるzvegf4ポリペプチドを、宿主細胞による発現に基づいて、コードするポリヌクレオチドである。後−翻訳プロセッシング現象は、ジスルフィド結合形成、タンパク質加水分解（分泌ペプチド除去を包含する）及び炭水化物付加を包含するが、但しそれらだけには限定されない。当業者は、zvegf4タンパク質コードのポリヌクレオチドの一次翻訳生成物は通常、最終タンパク質とは構造的に異なるであろうことを認識するであろう。さらに、zvegf4タンパク質コードのポリヌクレオチドは、操作可能的に連結された転写プロモーター、ターミネーター、及び宿主細胞内でのポリヌクレオチドの発現及び/又は維持を提供するか、又は宿主細胞中に供給する他の遺伝的要素を包含することができる。
【００１６】
本発明は、zvegf4を用いて、患者における腎機能を改良するための方法を提供する。zvegf4は、血小板由来の成長因子（PDGF）及び血管内皮成長因子（VEGF）に構造的に関連するタンパク質である。このタンパク質はまた、“PDGF-D”（WIPO公開WO 00/27879号）としても言及される。zvegf4は、PDGF/VEGFファミリーの成長因子に対して有意な相同性を有する多−ドメインタンパク質である。
【００１７】
zvegf4配列、及び他の成長因子に対するその相同性に基づいての構造的予測は、ポリペプチドが細胞増殖、移動、分化又は代謝を調節することによって、組織に対して作用するホモマルチマー又はヘテロマルチマーを形成することができることを示す。実験証拠がそれらの予測を支持する。Zvegf4ヘテロマルチマーは、PDGF/VEGFファミリーのタンパク質、例えばVEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, zvegf3/PDGF-C(WO 00/34474号), PIGF (Maglioneなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9267-9271, 1991), PDGF-A (Murrayなど., アメリカ特許第4,899,919号；Heldinなど., アメリカ特許第5,219,759号)、又はPDGF-B (Chiuなど., Cell37: 123-129, 1984; Johnssonなど., EMBO J. 3: 921-928, 1984) のもう１つのメンバーからのポリペプチドを含んで成る。
【００１８】
zvegf4ポリペプチド鎖は、成長因子ドメイン及びCUBドメインを含んで成る。成長因子ドメインは、システイン残基、及びPDGFファミリーの“システインノット（cystein knot）”構造の特徴を有するβ鎖の配置により特徴づけられる。CUBドメインは、ニューロピリン（Takagiなど., Neuron 7: 295-307, 1991; Sokerなど., Cell 92: 735-745, 1998）、ヒト骨形態発生プロテイン−１（Wozneyなど．、Science 243: 1528-1534, 1988）、ブタ精子血漿タンパク質及びウシ酸性精子流体タンパク質（Romeroなど., Nat. Struct. Bio. 4: 783-788, 1997）、及びアフリカツメガエルトロイド−様（tolloid-like）タンパク質（Linなど., Dev. Growth Differ. 39: 43-51, 1997）におけるCUBドメインに対して配列相同性を示す。
【００１９】
代表的なヒトzvegf4ポリペプチド配列は、配列番号２で示され、そして代表的なマウスzvegf4ポリペプチド配列は、配列番号４で示される。それらのポリペプチドをコードするDNAは、それぞれ配列１及び３で示される。配列番号２で示されるアミノ酸配列の分析は、残基１〜18が分泌ペプチドを形成することを示す。CUBドメインは、残基52から残基179に及ぶ。プロペプチド−様配列は、残基180から、残基245、残基249又は残基257のいずれかに及び、そしてそのカルボキシル末端で４個の可能性ある分解部位、残基245及び249で一塩基性部位、残基245−255で二塩基性部位、及び残基254−257でフリン又はフリン−様プロテアーゼのための標的部位を包含する。
【００２０】
バキュロウィルス発現システムにおいて生成されるタンパク質は、残基249と250との間での切断、及び残基19及び35でのアミノ末端を有する長い種を示した。成長因子ドメインは、残基258から残基370及び、そしてN−末端での追加の残基（例えば、残基250〜257又は残基246〜257）を包含することができる。当業者は、ドメイン境界がいくぶん不明確であり、そして特定された位置から±５個までの残基、異なることが予測され得ることを認識するであろう。マウス及び他の非ヒトzvegf4における対応するドメインは、配列一列整列から当業者により決定され得る。プラスミンによる十分な長さのヒトzvegf4の分解は、zvegf4ポリペプチドの活性化をもたらした。ウェスターン分析によれば、成長因子ドメインとおよそ同じサイズで移動するバンドが観察された。
【００２１】
シグナルペプチド分解は、残基18（±３個の残基）の後、ヒトzvegf4において存在することが予測される。ヒト及びマウスzvegf配列の比較に基づいて、他のシグナルペプチド分解部位が、残基23及び/又は24の後に予測される。この分析は、zvefg4ポリペプチド鎖が多くのモノマー種を生成するために分解され得ることを示し、それらのいくつかは表１に示される。ある宿主細胞においては、Lys−255の後の分解は、残基254−255の続く除去をもたらすことが予測されるが、但し、残基255でのカルボキシル末端を有するポリペプチドがまた調製され得る。Lys-257の後での分解は、残基257の続く除去をもたらすことが予測される。実際の分解パターンは、宿主細胞間で変化することが予測される。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
従って、zvegf4は、上記に開示されるようにzvegf4ポリペプチドを含んで成る種々のマルチマー形で調製され得る。それらのzvegf4ポリペプチドは、zvegf419-370, zvegf452-370, zvegf4246-370, zvegf4250-370及びzvegf4258-370を包含する。それらのポリペプチドの変異体及び誘導体はまた、本明細書に開示されるようにして調製され得る。
【００２４】
培養された哺乳類細胞におけるzvegf4ポリヌクレオチドの発現は、タンパク質加水分解的にプロセッシングされ得るジスルフィド−結合されたダイマータンパク質の生成をもたらす。有糸分裂的に活性的なタンパク質は、CUB及びドメイン間領域を除去するために、タンパク質加水分解プロセッシングに基づいて生成される。活性成長因子ドメインダイマーは、切断されたポリヌクレオチドを発現することによって直接的に生成され得る。
【００２５】
zvegf4タンパク質は、アミノ又はカルボキシル−末端延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、親和性標識又は標的化ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質として調製され得る。例えば、zvegf4タンパク質は、精製を促進するために、親和性標識との融合体として調製され得る。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,  EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など.,  Methods  Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど.,  Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質（Guanなど．，Gene67：21−30，1987）、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキチン、T7ポリメラーゼ、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。
【００２６】
例えばマルトース結合タンパク質又はグルタチオンSトランスフェラーゼへのzvegf4の融合は、細菌発現システムにおける収率を改良するために使用され得る。それらの場合、融合タンパク質の非−zvegf4部分が通常、使用の前、除去されるであろう。融合タンパク質のzvegf4及び非−zvegf4部分の分離は、それらの２種の部分間に特定の分解部位を提供することによって促進される。そのような方法は、当業界において良く知られている。zvegf4はまた、標的化ペプチド、例えば抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原−結合フラグメント、例えばF(ab’)2及びフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの）、又は標的組織に結合する他のペプチド成分に融合され得る。
【００２７】
変動は、zvegf4タンパク質の生物学的活性変異体を供給するために、配列番号２及び４で示されるzvegf4アミノ酸配列において行われ得る。そのような変動は、アミノ酸置換、欠失及び挿入を包含する。一般的に、保存性アミノ酸置換が好ましい。理論により結びつけられることは所望されないが、ヒトzvegf4（配列番号２）の残基273−295及び307−317内の残基はリガンド−受容体相互作用に包含され得ると思われる。zvegf4タンパク質における特定の位置でのアミノ酸配列変化の効果は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−調査突然変異誘発を用いて評価され得る（Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085, 1989；Bassなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 4498-4502, 1991）。
【００２８】
複数のアミノ酸置換が行われ、そして突然変異誘発及びスクリ−ニングの既知方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988) 又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989) により開示されるそれらの方法を用いて試験され得る。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowmanなど., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladnerなど., アメリカ特許第5,223, 409号；Huse, WIPO公開WO92/06204号）、領域−指図された突然変異誘発（Derbyshireなど., Gene 46: 145, 1986; Nerなど., DNA 7: 127, 1988）、及びStemmer（Nature 370: 389-391, 1994）及びStemmer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751, 1994）により開示されるようなDNAシャフリングを包含する。
【００２９】
得られる変異体分子は、受容体結合、マイトジエン活性又は他の性質（例えば、成長因子生成の刺激）について、それらの機能に対して決定的であるアミノ酸残基の同定するために試験される。突然変異誘発は、zvegf4変異体ポリペプチドの生物学的活性を検出するために、高体積又は高処理量スクリーニング方法と組み合わされ得る。
【００３０】
zvegf4変異体は、当業界において良く知られている種々の方法、例えば受容体競争アッセイ（Boweu−Pope and Ross, Methods Enzymol. 109: 69-100, 1985）により、及び可溶性受容体、例えばIgG融合タンパク質として生成される受容体（アメリカ特許第5,750,375号）の使用を通して、受容体結合活性について分析され得る。受容体結合アッセイは、評価のための既知細胞−表面受容体を含む細胞系に対して行われ得る。受容体は、細胞において天然に存在することができ、又は遺伝子工学的に構築された細胞により発現される組換え受容体であり得る。
【００３１】
zvegf4変異体の活性は、培養された細胞を用いて、インビトロで測定され得る。例えば、マイトジェン活性は、既知のアッセイ、例えば3H−チミジン組み込みアッセイ（例えば、Raines and Ross, Methods Enzymol. 109: 749-773, 1985及びWahlなど., Mol. Cell. Biol. 8:5016-5025, 1988により開示されるような）、色素組み込みアッセイ（例えば、Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983及びRazなど．、Acta Trop. 68: 139-147, 1997により開示されるような）、又は細胞計数を用いて測定され得る。
【００３２】
適切な有糸分裂誘発アッセイは、（１）増殖細胞をさらに刺激するzvegf4タンパク質の能力を調べるために、20％集密性培養物中への、及び（２）接触−誘発された増殖阻害を克服するzvegf4タンパク質の能力について調べるために48時間、集密性で維持される静止細胞中への3H−チミジンの組み込みを測定する。適切な色素組み込みアッセイは、標的細胞中への色素Alamarブルー（Razなど., 前記）の組み込みの測定を包含する。また、Gospodarowiczなど., J. Cell. Biol. 70: 395-405, 1976: Ewton and Florini, Endocrinol. 106: 577-583, 1980; 及びGospodarowiczなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7311-7315, 1989を参照のこと。活性はまた、標的細胞における代謝変化、例えば他のタンパク質の生成における変化（他の成長因子を包含する）を、免疫学的アッセイにより測定することによってアッセイされ得る。
【００３３】
zvegf4変異体の生物学的活性は、外因性タンパク質の投与又はzvegf4変異体ポリヌクレオチドの発現により非ヒト動物において研究され得る。ウィルス供給システム（下記に開示される）が使用され得る。zvegf4変異体は、他のzvegf4タンパク質と組合して、又は他の化合物は、例えば他の成長因子と組合して、個々に投与されるか又は発現され得る。試験動物は、臨床学的徴候、体重、血液細胞計数、臨床学的化学、組織病理学及び同様のもののようなパラメーターの変化についてモニターされる。
【００３４】
zvegf4タンパク質、例えば十分な長さのポリペプチド、変異体ポリペプチド、生物学的活性フラグメント及び融合タンパク質は、遺伝子工学的に構築された宿主細胞において、従来の技法に従って生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換されるか又はトランスフェクトされ得、そして培養物において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞（多細胞生物の培養された細胞を包含する）を包含する。クローン化されたDNA分子を操作し、そして外因性DNAを種々の宿主細胞中に導入するための技法は、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Sping Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusubelなど., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY, 1993により開示される。
【００３５】
一般的に、zvegf4ポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素、一般的に発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複数起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより提供され得ることを認識することであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常の企画のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして市販されている。例えば、WO 00/34474号を参照のこと。
【００３６】
典型的な発現システムは、次のものを包含する：酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces Cerevisiae）(例えば、アメリカ特許第5,527,668号を参照のこと)又はピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）(アメリカ特許第5,716,808号、第5,736, 383号、第5,854,039号及び第5,955,349号)； 哺乳類細胞、例えば子供ハムスター腎臓（BHK）細胞（ATCC No. CRL 1632又はNo. CRL10314）、COS−１細胞（ATCC No. CRL 1650）、COS−７細胞（ATCC No. CRL1651）、293細胞（ATCC No. CRL1573; Grahamなど., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977）又はチャイニースハムスター卵巣細胞（例えば、CHO−K1, ATCC No. CCL61又はCHO  DG44，Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986); バキュロウィルス（Luckowなど., J. Virol. 67: 456-4579, 1993；キット形で入手できる（Bac−to−BacTM キット；Life Technologies, Rockville, MD））；及び細菌細胞（例えば、E．コリ）。適切な細胞は、当業者において知られており、そして公的寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection, Manassas, VAから入手できる。
【００３７】
zvegf4は天然に存在しないアミノ酸を含有することができる。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【００３８】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。
【００３９】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００４０】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 1993)。
【００４１】
zvegf4ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、当業界において知られている方法、例えば排他的固相合成、部分固相法、フラグメント宿主又は従来の溶液合成に従っての化学合成により調製され得る。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963; Stewartなど., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp. Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986; 及びAthertonなど., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989を参照のこと。
【００４２】
zvegf4タンパク質は、従来のタンパク質精製方法、典型的には、クロマトグラフィー技法の組合せにより精製される。一般的には、Affinity Chramatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsale, Sweden, 1988; 及びScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参照のこと。ポリヒスチジン親和性標識（典型的には、約６個のヒスチジン残基）を含んで成るタンパク質は、ニッケルキレート樹脂上での親和性クロマトグラフィーによりより精製される。例えば、Houchuliなど., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988を参照のこと。glu-glu標識を含んで成るタンパク質は、従来の方法に従って、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。例えば、Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985を参照のこと。マルトース結合タンパク質融合体は、当業界において知られている方法に従って、アミロースカラム上で精製される。
【００４３】
zvegf4は、ノザンブロット及びPCR分析により示されるように腎臓において高く発現される。下記例においてより詳細に示されるように、zvegf4をコードするアデノウィルスベクターの注入によるマウスにおけるzvegf4の過剰−発現が、腎臓における尿細管上皮細胞増殖を誘発する。処理された動物における尿細管生成は、高められた好塩基球増加の尿細管上皮細胞の存在により特徴づけられた。それらの変化は、関連しないタンパク質を発現する対照アデノウィルスに暴露された動物においては観察されなかった。
【００４４】
それらの発現は、zvegf4タンパク質の上昇が、腎臓の糸球体及び血管疾患においてすべてのキープレイヤーである、糸球体間質（筋線維芽細胞のタイプ；Powellなど., Am. J. Physiol. 277 (Cell Physiol. 46): C1-C19, 1999を参照のこと）、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞及び介在性細胞の機能及び中でも、その相互作用を変性できることを示す。さらに、zvegf4は、インビトロで、それらの細胞の少なくともいくらかにおいて細胞増殖に影響を及ぼすことが見出された。実験はまた、zvegf4の活性が２種のPDGF受容体サブユニットα及びβ（PDGF−αR及びPDGF−βR）により介在されることを示している。
【００４５】
それらの受容体サブユニットはほとんどの腎細胞型において広く発現され、そしてそれらの発現は多くの腎臓病理学においてアップレギュレートされる（例えば、Iidaなど., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6560-6564, 1991）。上記に要約され、そして本明細書においてより詳細に開示される実験は、zvegf4タンパク質が腎尿細管生存性、再生及び/又は機能に対して正の効果を有することを示す。それらの結果は、zvegf4が一定の形の腎不全、例えば急性尿細管壊死又は慢性鎮痛性腎炎を逆転することにおいて有用であることを示す。この場合、zvegf4タンパク質は、直接的に哺乳類に供給され得るか、又はzvegf4タンパク質コードのポリヌクレオチドの哺乳類への供給に続いて、現場生成され得る。
【００４６】
理論にしばられることは望まないが、腎尿細管に対するzvegt4の発生効果は上皮細胞及び/又は上皮細胞前駆体に対する直接的な又は間接的な効果のためである。“間接的効果”は、影響される細胞に対して直接的に作用する他の因子の生成の刺激を包含する。zvegf4は、細胞増殖を刺激し、細胞生存性を増強するか、又は上皮細胞又は上皮細胞前駆体に対してそれらの効果を発揮する他の因子の生成を刺激することができる。例えば、筋線維芽細胞は、上皮細胞の増殖、分化及び移動を刺激するサイトカイン及び成長因子を分泌し、そして器官形成及び創傷治癒において主要役割を演じることが知られている。例えば、Powellなど., 前記；Nakagawaなど., Am. J. pathol. 155: 1689-1699, 1999; 及びMatsumoto and Nakamura, kidney Int. 59: 2923-2038, 2001を参照のこと。
【００４７】
zvegf4の成長因子ドメインは、分子の活性種であることが見出された。分子のN−末端部分を除去するためのタンパク質加水分解プロセッシングが、活性化のために必要とされる。本発明においては、zvegf4タンパク質は、単独で、活性成長因子ドメインとして、又はインビボでの活性化を必要とする前駆体として提供され得る。典型的な前駆体は、zvegf419-370及びzvegf432-370を包含するが、但しそれらだけには限定されない。融合タンパク質及び他の生物学的活性zvegf4変異体がまた使用され得る。
【００４８】
医薬的使用に関しては、zvegf4タンパク質は従来の方法に従って配合される。医薬タンパク質についての従来の供給路が使用され得る。急性腎不全の患者の通常、静脈注入、カテーテル法又は透析を包含する処理を受けるので、タンパク質は存在する静脈内ライン、カテーテル又はシャントを通して投与され得る。他の投与路は、静脈、筋肉内及び皮下注射を包含する。一般的に、医薬製剤は、Zcyto21ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共に含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【００４９】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示される。組成物の“治療的有効量”とは、疾病の進行において統計学的に有意な効果、例えば統計学的に有意な低下、又は器官機能における統計学的に有意な改良を生成する量である。急性腎不全の場合、器官機能の改良は、１又は複数の低められた尿毒症、高められたクレアチニン又はイヌリンクリアランス、電解質バランスの回復、及び高められた尿生成により示される。
【００５０】
zvegf4は通常、約10〜100μg/mlの合計体積の濃度で使用されるが、但し1ng/ml〜100μg/mlの範囲の濃度も使用され得る。正確な用量は、処理される症状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容される標準に従って医者により決定され；用量の決定は当業者のレベル内である。急性腎不全は生命を脅かす状態であるので、多くの用量が使用され得る。治療用製剤は一般的に、有益な効果を達成するために必要とされる期間、通常数時間〜数週間にわたって投与されるであろう。投与は、処理の期間、連続的又は断続的である。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間にわたって、ボーラス注射又は注入によってであろう。持効性製剤もまた使用され得る。
【００５１】
zvegf4治療は、他の剤、又は腎機能の回復に適切な臨床学的技法と組合され得る。例えば、zvegf4は、血管拡張薬と組合して、又は腎動脈における循環を回復するための血管形成と組合して投与され得る。
【００５２】
遺伝子治療は、患者にzvegf4を供給するために使用され得る。腎臓におけるzvegf4の発現を促進するためには、腎臓において高く発現される遺伝子（例えば、エリトロポイエチン遺伝子）からの転写プロモーターが使用され得る。治療用ポリヌクレオチドは、ウィルス供給システムにより、患者又は試験動物に供給されえる。このための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、及びアデノ随伴ウィルス（AAV）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである。
【００５３】
再考のためには、T. C. Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと。アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ i ）アデノウィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ；（ ii ）高い力価に増殖され得；（ iii ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ iv ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【００５４】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAの大きな挿入体（７kbまでの）が提供され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスDNA中に組み込まれ得る。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがE１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する)。
【００５５】
遺伝子供給の他の方法は、身体から細胞を除去し、そして裸DNAプラスミドとして細胞中にベクターを導入することを含んで成る。次に、形質転換された細胞が身体に再−移植される。裸DNAベクターは、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシュウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はDNAトランスポーター使用により宿主細胞中に導入される。Wuなど., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624, 1988; Wuなど., J. Biol. Chem. 267: 963-967, 1992; 及びJohnston and Tang, Meth, Cell. Biol. 43: 353-365, 1994を参照のこと。
本発明は次の非制限例によりさらに例示される。
【００５６】
実施例
例１：
zvegf4を、VEGFファミリーに対するその相同性により、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（K562）ライブラリーからクローンの配列から同定した。追加の配列を、下垂体ライブラリーからのクローンの長い配列読み取りから誘発した。zvegf4のアンチセンス発現配列標識（EST）（その5’パートナーが同定される）を見出した。この5’EST（EST448186；GenBank）は、zvegf4のための5’未翻訳配列を含むように思えた。プライマーを、配列におけるギャップを閉じることによりEST448186から企画した。
【００５７】
それぞれ20pmのオリゴヌクレオチドZC21,987（配列番号５）及びZC21,120（配列番号６）、及び1.93μgの甲状腺ライブラリーを、５％DMSO及び1/10体重の市販の試薬（GC-MeltTM; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）と共にPCR反応に使用した。反応を次の通りに行った：94℃で１分；次に、94℃で20秒（30サイクル）；67℃で１分；次に72℃での最終５分間のインキュベーション。得られる833−bpの生成物を配列決定し、そして開始METコドン、上流の停止コドン及び5’未翻訳配列を有するコード配列の残りを含むzvegf4フラグメントであることが見出した。その構成配列は、1,110bpの読み取り枠（配列番号１）を含んだ。
【００５８】
例２：
一部のマウスzvegf4配列を、完全なコード配列を含む、1,289bpのEcoRIヒトzvegf4制限消化フラグメントにより、マウスゲノムライブラリー（Clontech Laboratories, Inc. から得られた）をプローブすることによって得た。プローブを、市販のキット（RediprimeTM II ランダム−プライムラベリングシステム；Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England）を用いて、32Pによりラベルした。組み込まれなかった放射能を、市販のプッシュカラム（Nuctrap（商標）カラム；Stratagene, La Jolla, CA; アメリカ特許第5,336,412号を参照のこと）を用いて除去した。
【００５９】
24個のフィルターリフトを、５分間、煮沸し、次に氷冷却した0.1mg/mlのサケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液（ExpressHybTM Hybridization Solution; Clontech Laboratories, Inc.）において50℃で一晩、プレハイブリダイズした。フィルターを、1.0×106cpm/mlのzvegf4プローブ、0.1mg/mlのサケ精子DNA、及び５分間、煮沸され、次に氷冷却された0.5μg/mlのマウスcot-1 DNAを含むハイブリダイゼーション溶液（ExpressHybTM）において50℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターリフトを、２×SSC、0.1％SDSにおいて室温で２時間、洗浄し、次に温度を60℃に１時間にわたって上昇した。−80℃での一晩の暴露は、７種の推定上の一次ヒットを示した。
【００６０】
それらの主要ヒットの４個を、E．コリk802細胞（Clontech Laboratories, Inc. から得られた）上にプレートした。フィルターリフトを調製し、そしてヒトzvegf4プローブにより一晩ハイブリダイズした。試験された４個の推定上の一次ヒットのうち２個は陽性に近づいた。
【００６１】
DNAを、１つの陽性プラークから調製し、そしてBamHI及びPstIにより消化した。その消化物を、１％トリス−ボレート−EDTAゲル上で試験し、そして2.0kbのダブレット及び2.7kb/2.9kbのバンドをゲルから切除し、そして従来の方法によりアガロースから切除した。2.0kbの両フラグメントは、ヒトzvegf4プローブに対して強くハイブリダイズすることが見出された。それらのフラグメントを配列決定し、そしてマウスvegf4 CUBドメインの一部を含むことを見出した。プライマーを、PCR cDNAスクリーンへの使用のために前記配列から企画した。
【００６２】
マウスcDNAのパネルを、プライマーZC26,317（配列番号７）及びZC26,318（配列番号８）によるPCRによりスクリーンした。胚、唾液腺、新生児皮膚及び精巣は、予測される200bpのサイズの強い生成物を示した。
【００６３】
マウス精巣及び唾液腺ライブラリーを、プライマーZC26,317 (配列番号７)及びZC26,318 (配列番号８)を用いてPCRによりスクリーンした。精巣ライブラリーは、5’末端で不完全であり、そして5’末端でイントロンを含むと思われる１つのクローン、すなわち“zvegf4mpzp7x-6”を生成した。唾液腺ライブラリーは、クローンzvegf4mpzp7x-6に比較して、コードに225−bpの欠失を有した１つのクローン、すなわち“zvegf4mpzp7x-7”を生成した。zvegf4mpzp7x-6及びzvegf4mpzp7x-7に由来する配列を組合し、十分な長さのマウスzvegf4ポリヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスzvegf4ポリペプチド配列（配列番号４）を生成した。
【００６４】
十分な長さのcDNAクローンを、前記２種のクローンからのフラグメントの二段階連結により生成した。EcoRI/HindIII 3’フラグメントを、クローンzvegf4mpzp7x-6から調製した。528-bpのフラグメントを、ゲル精製し、そしてEcoRI及びHindIIIにより消化されたファゲミドベクター（pBluescript（商標）II KS(+); Stratagene）中に連結した。その得られる構成体3μgを、15単位のEcoRIにより消化した。線状化されたプラスミドを精製し、そしてクローンzvegf4mpzp7x-7からの754-bpの5’EcoRIフラグメントと連結した。
【００６５】
例３：
カルボキシル末端Glu−Glu親和性標識を有する組換えヒトzvegf4を、従来の方法に従ってバキュロウィルス発現システムにおいて生成した。培養物を収穫し、そして細胞を、0.02Mのトリス−HCl、pH8.3、1mMのEDTA, 1mMのDTT, 1mMの４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（Pefabloc（商標）SC; Boehringer-Mannbeim）、0.5μMのアプロチニン、4mMのロイペプチン、4mMのE−67、１％NP-40の溶液により、回転器上で4℃で15分間、溶解した。その溶液を遠心分離し、そして上清液を回収した。20mlの抽出物を、50μlの緩衝液中、誘導体化されたアガロースビーズ（Sepharose（商標）; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscatoway, NJ） に接合された抗−Glu−Glu抗体50μlと共に組合わした。
【００６６】
その混合物を、回転器上で４℃で一晩インキュベートした。ビーズを遠心分離により、回収し、そして４℃で３×15分間、洗浄した。ペレットを、還元剤を含むサンプル緩衝液と共に組合し、そして98℃で５分間、加熱した。タンパク質を、還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、続いて親和性標識に対する抗体を用いてPVDF膜上にウェスターンブロットした。２種のバンドを検出し、１つはMr＝約49kDで及び他の１つはMr＝約21kDで存在した。配列分析は、２種の配列を含んで成る大きなバンドを示し、１つは配列番号２のArg-19で開始し、そして他は配列番号２のAsn−35で開始する。アスパラギン残基は、アスパラギン酸へ脱アミド化されたように思えた。小さな方のバンドは、配列番号２のSer−２のSer−250で開始する。
【００６７】
例４：
組換えバキュロウィルス−感染された昆虫細胞から生成されたアミノ末端Glu−Glu（EYMPME；配列番号９）標識（zvegf4−nee−GFD）を有する、組換えアミノ末端Glu−Glu−標識されたzvegf4成長因子ドメインを、ならし培地から、カチオン−交換クロマトグラフィー、抗体親和性クロマトグラフィー及びサイズ−排除クロマトグラフィーの組合せにより精製した。28Lの培養物を収穫し、そして培養を0.4μmのフィルターを用いて濾過した。濾過された培地（pH7.0、9mSの導電率）を、25mlのカチオン交換カラム（Poros（商標）50HS; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）上に直接的に負荷した。
【００６８】
カラムを10カラム体積（cv）のPBSにより洗浄し、そして結合されたタンパク質を、PBS中、20−100％の750mMのNaClのグラジエント（緩衝液B）15cv、続いて5cvの100％緩衝液Bにより5ml/分で溶出した。5mlの画分を集めた。カラムからのサンプルを、zvegf4-nee-GFDの存在について、銀染色よるSDS−PAGE及びウェスターンブロットにより分析した。zvegf4-nee-GFD-含有画分をプール、そして8mlの抗−Glu−Glu抗体カラム上に負荷し、そしてPBS中、0.5mg/mlのEYMPID（配列番号10）ペプチド（Princeton Biomolecules Corporation, Langhome, PAから得られた）50mlにより溶出した。
【００６９】
1mlの画分をプールし、そしてBiomaxTM −５濃縮機（Millipore Corp., Bedford, MA）を用いて0.4mlに濃縮し、そして16×1000mmのゲル濾過カラム（SephacrylTM S-100HR: Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上に1.5ml/分で負荷した。精製されたzvegf4-nee-GFDを含む画分5mlをプールし、0.2μmのフィルターを通して濾過し、100μlのアリコートを等分し、そして−80℃で凍結した。精製された最終タンパク質の濃度をBCAアッセイ（Pievce chemical Co., Rockford, IL）により、0.4mg/mlであることを決定し、そして収量を8.4mgであると計算した。
【００７０】
組換えzvegf4-nee-GFDを、銀染色（FASTsilverTM, Geno Technology, Inc., Maplewood, MO）を用いてのSDS−PAGE（NupageTM 4-12%ゲル；Novex，San Diego, CA）、及びペプチド標識に対する抗体を用いてのウェスターンブロットにより分析した。ならし培地又は精製されたタンパク質を、電気泳動ミニ−セル（Xcell  IITM mini-cell; Novex）を用いて電気泳動し、そしてその装置マニュアルに提供される指針に従って、ブロットモジュール（XCell IITM; Novex）を用いて、室温でニトロセルロース（0.2μl；Novex）に移した。
【００７１】
前記移行を、25mMのトリス塩基、200mMのグリシン及び20％メタノールを含む緩衝液において500mAで１時間、行った。次に、フィルターを、PBS中、10％脱脂粉乳により室温で10分間ブロックした。ニトロセルロースをすばやくすすぎ、次に、マウス抗−ペプチド一次抗体（2.5％脱脂粉乳を含むPBSにおいて１：1000に希釈された）を添加した。ブロットを、室温で２時間、又は４℃で一晩、軽く振盪しながらインキュベートした。
【００７２】
インキュベーションに続いて、ブロットを、PBSにそれぞれ10分間、洗浄し、次に2.5％脱脂粉乳を含むPBSにおいて１：1000に希釈された二次抗体（ホースウディシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウスIgG）によりラベルし、そしてブロットを室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。次に、ブロットを、PBSによりそれぞれ10分間、３度洗浄し、次に水によりすばやくすすいだ。ブロットを、市販の化学ルミネセント基質試薬（１：１に混合されたSuperSignal（商標）ULTRA試薬；Pierce Chemical Co. から得られた試薬）を用いて進行せしめ、そしてシグナルを、イメージ分析ソフトウェア（Lumi−ImagerTM  Lumi Analyst 3.0; Boehringer Mannheim GmbH, Germany）を用いて、10秒〜５分間、又は必要時間、捕獲した。
【００７３】
精製されたzvefg4-nee-GFDは、非還元条件下で約31及び17kDaでの銀−染色されたゲル上に２種のバンドとして、及び還元条件下で17kDaの単一バンドとして出現した。これは、非還元条件下でのzvegf4-nee-GFDのダイマー形の存在を示した。精製されたタンパク質は、約90％のダイマー及び10％のモノマーから成った。
【００７４】
例５：
十分な長さのカルボキシル末端Glu−Glu標識されたzvegf4（zvegf4−cee）を、組換えバキュロウィルス−感染された昆虫細胞から生成した。2Lの培養物を収穫し、そして培地を、0.2μmのフィルターを用いて無菌濾過した。
タンパク質を、抗−Glu−Glu（抗−EE）ペプチド抗体親和性クロマトグラフィー及びS−200ゲル排除からクロマトグラフィーの組合せによりならし培地から精製した。培養培地（pH6.0、7mSの導電率）を、20×80mm（25mlの層体積）抗−EE抗体親和性カラム上に6ml/分の流速で直接的に負荷した。
【００７５】
カラムを10カラム体積のPBSにより洗浄し、次に結合されたタンパク質を、２カラム体積の0.4mg/mlのEYMPTDペプチド（配列番号10）（Princeton BioMolecules Corp., Langhome, PA） により溶出した。5mlの画分を集めた。抗−EE抗体親和性カラムからのサンプルを、zvegf4-ceeの存在について、銀染色を用いてのSDS−PAGE及びウェスターンブロット（抗−zvegf4ペプチド抗体及び抗−EE抗体、並びにHRP−接合されたヤギ抗−ウサギ二次抗体を用いて、実質的に上記に開示されているようにして）により分析した。
【００７６】
zvegf4-cee含有画分をプールし、そしてBiomayTM-5濃縮機（Millipore Corp.） を用いて、濾過により3.8mlに濃縮し、そして16×1000mmのゲル濾過カラム（SephacrylTM S-200NR; Amersham Pharmacia Biotech）上に負荷した。精製されたzvegf4-ceeを含む画分をプールし、0.2μmのフィルターを用いて濾過し、それぞれ100μlに等分し、そして−80℃で凍結した。精製された最終タンパク質の濃度を、比較アッセイ（BCAアッセイ試薬；Pierce Chemical Co.）及びHPLC−アミノ酸分析により決定した。
【００７７】
精製されたzvegf4-ceeは、銀染色に関して、非還元条件下で約85kDaでの単一のバンドとして、但し、還元条件下で約50kDaでのバンドとして出現し、このことは、非還元条件下でのzvegf4-ceeのダイマー形を示す。
【００７８】
例６：
アデノウィルスベクターを調製するために、zvegf4の領域をコードするタンパク質を、それぞれ5’及び3’末端でFseI及びAscI制限部位を付加するプライマーを用いて、PCRにより増幅した。PCRプライマーを次の通りにして、PCR反応において十分な長さのzvegf4 cDNAを含む鋳型と共に使用する：95℃で５分間のインキュベーション；続いて、95℃で１分、58℃で１分及び72℃で1.5分（15サイクル）；続いて72℃で７分；続いて４℃でのソーキング。反応生成物を、TAE緩衝液中、1.2％（低溶融）（SeaPlaque GTGTM; FMC, Rockland, ME）ゲル上に負荷する。
【００７９】
zvegf4 PCR生成物をゲルから切除し、そしてシリカゲル膜を含む回転カラム（QIAquickTM Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA）を用いて、そのキットの説明書に従って精製する。次に、zvegf4生成物を消化し、フェノール/クロロホルム抽出し、EtOH沈殿し、そして20mlのTE（トリス/EDTA, pH8）に再水和化する。次に、zvegf4フラグメントを、トランスジェニックベクターpTG12-8のクローニング部位中に連結する。ベクターpTG12-8は、NruI部位中へのラットインスリンIIイントロン（約200bp）及びポリリンカー（FseI/PmeI/AscI）の挿入により、p2999B4（Palmiterなど., Mol. Cell Biol. 13: 5266-5275, 1993）から誘導される。
【００８０】
前記ベクターは、マウスメタロチオネイン（MT−１）プロモーター（約750bp）及びヒト成長ホルモン（hGH）未翻訳領域、並びに10kbのMT−1 5’フランキング配列及び7kbのMT−1 3’フランギング配列を両端に有するポリアデニル化シグナル（約650bp）を含んで成る。その構成体を用いて、エレクトロポレーションによりE．コリ宿主細胞（Electromax DH10BTM 細胞；LifeTechnologies，Inc., Gaithersburg, MD）を形質転換する。zvegf4 DNAを含むクローンを、制限分析により同定する。陽性クローンを直接的な配列決定により確かめる。
【００８１】
zvegf4 cDNAを、FseI及びAscI酵素を用いて、pTG12-8ベクターから開放する。cDNAを１％低溶融アガロースゲル上で単離し、そして次に、ゲルから切除する。ゲルスライスを70℃で溶融し、等体積のトリス−緩衝されたフェノールにより２度、抽出し、そしてEtOH沈殿する。DNAを10μlの水に再懸濁する。
【００８２】
zvegf4 cDNAを、修飾されたpAdTrack CMV (Heなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998) のFseI−AscI部位中にクローン化する。この構造体は、緑色蛍光タンパク質（GFP）マーカー遺伝子を含む。GFP発現を駆動するCMVプロモーターを、SV40プロモーターにより置換し、そしてSV40ポリアデニル化シグナルを、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより置換した。さらに、生来のポリリンカーを、EseI、EcoRV及びAscI部位により置換した。pAdTrack
CMVのこの修飾された形は、pZyTrackと命名される。連結を、DNA連結及びスクリーニングキット（Fast-LinkTM; Epicentre Technologies, Madison, WI）を用いて行う。プラスミドを線状化するために、約５μgのpZyTrack zvegf4プラスミドを、PmeIにより消化した。
【００８３】
約１μgの線状化されたプラスミドを、スーパーコイルpAdEasy（Heなど., 前記）200ngと共にBJ5183細胞中に同時形質転換した。この同時形質転換は、Bio-Rad Geneパルサーを用いて、2.5kV，200オーム及び25μFで行われる。完全な同時形質転換体を、25μg/mlのカナマイシンを含む、４個のLBプレート上にプレートする。最少コロニーを取り、そしてLB/カナマイシンにおいて拡張し、そして組換えアデノウィルスDNAを、標準のDNA miniprep方法により同定する。FseI及びAscIによる組換えアデノウィルスDNAの消化は、zvegf4 DNAの存在を確かめる。DNAをE．コリDH10Bコンピテント細胞中に形質転換し、そしてDNAをそれから調製する。
【００８４】
約５μgの組換えアデノウィルスDNAを、20〜30UのPacIを含む100μlの反応体積において、37℃で３時間、PacI酵素（New England Biolabs）により消化する。その消化されたDNAを、等体積のフェノール/クロロホルムにより２度、抽出し、そしてエタノールにより沈殿する。DNAペレットを、10μlの蒸留水に再懸濁する。前日に接種され、そして60〜70％の集密性まで増殖された、T25フラスコのQBI−293A細胞（Quantum Biotechnologies, Inc．，Montreal, Canada）を、PacI消化されたDNAによりトランスフェクトする。PacI消化されたDNAを、無菌HBS（150mMのNaCl, 20mMのHEPES）により、50μlの合計体積まで希釈する。
【００８５】
別々の管において、20μlの1mg/mlのN−[１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル]−N, N, N−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート（DOTAP: Boehringer Mannheim）を、HBSにより100μlの合計体積に希釈する。DNAをDOTAPに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温で15分間、放置する。培地を293A細胞から除去し、そして1mMのピルビン酸ナトリウム（Life Technologies）、0.1mmのMEM非必要アミノ酸（Life Technologies）及び25mMのHEPES緩衝液（Life Technologies）を含む血清フリーのMEM−α（Life Technologies, gaithersburg, MD）5mlにより洗浄する。
【００８６】
5mlの血清フリーMEMを添加し、そして細胞を37℃で維持する。DNA/脂質混合物を、フラスコに滴下し、軽く混合し、そして37℃で４時間インキュベートする。４時間後、DNA/脂質混合物を含む培地を吸引し、そして5％ウシ胎児血清を含む完全MEM培地5mlにより置換する。トランスフェクトされた細胞を、GFP発現及び対象物（ウィルスプラーク）の形成についてモニターする。
【００８７】
組換えアデノウィルスDNAによる293A細胞のトランスフェクションの７日後、GFPを発現する細胞はウィルスプラークを形成し始める。粗ウィルス溶解物を、細胞スクレーパーにより集め、細胞を収集する。溶解物を、50mlの円錐形管に移す。細胞からほとんどのウィルス粒子を開放するために、３回の凍結/融解サイクルを、ドライアイス/エタノール浴及び37℃の水浴において行う。
【００８８】
ほぼ集密性（80〜90％）の293A細胞の10cmプレートを、感染の20時間前に設定する。粗溶解物を増幅し（一次増幅）、zvegf4 rAdV溶解物の研究ストックを得る。200mlの祖rAdV溶解物を個々の10cmプレートに添加し、そしてプレートを48〜72時間モニターし、白色光顕微鏡下で細胞変性効果（CPE）を、及び蛍光顕微鏡下でGFPの発現を調べる。すべての細胞がCPEを示す場合、この一次ストック溶解物を集め、そして凍結/融解サイクルを上記のようにして行う。
【００８９】
zvegf4 rAdVの二次増幅を、80〜90％の集密性の293A細胞の12の15cm組織培養皿から得る。すべての、但し20mlの５％MEM培地を除去し、そして個々の皿を、300〜500mlの一次増幅されたrAdV溶解物により接種する。48時間後、細胞をウィルス生成物から溶解し、その溶解物を250mlのポリプロピレン遠心分離用ポトル中に集め、そしてrAdVを精製する。
【００９０】
NP-40界面活性剤を、すべての細胞を溶解するために粗溶解物のボトルに添加し、0.5％の最終濃度にする。ボトルを、回転プラットフォーム上に10分間、置き、そして可能なだけ早く撹拌する。残骸物を、20,000XGで15分間の遠心分離によりペレット化する。上清液を、250mlのポリカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして0.5体積の20％PEG800/2.5MのNaCl溶液を添加する。ボトルを氷上で一晩、振盪する。ボトルを、20,000XGで15分間、遠心分離し、そして上清液を漂白溶液中に捨てる。白色沈殿物（沈殿されたウィルス/PEG）が、回転マークのいずれかの側にボトルの壁にそって２本の垂直線を形成する。無菌の細胞スクレーパーを用いて、２本のボトルからの沈殿物を2.5mlのPBSに再懸濁する。
【００９１】
そのウィルス溶液を2mlの微小遠心分離管に配置、そしていずれかの追加の細胞残骸を除去するために、微小遠心分離機により14,000XGで10分間、遠心分離する。2mlの微小遠心分離管からの上清液を、15mlのポリプロピレンスナップキャップ管に移し、そしてCsClにより、1.34g/mlの密度に調節する。ウィルス溶液の体積を評価し、そして0.55g/mlのCsClを添加する。CsClを溶解し、そしてこの溶液1mlの重量を計る。溶液を、ポリカーボネート製の厚壁の3.2mlの遠心分離管（Beckman）に移し、そして348.000XGで25℃で３〜４時間、回転する。ウィルスは白色バンドを形成する。広−内径ピペット先端を用いて、ウィルスバンドを集める。
【００９２】
グラジエントから回収されたウィルスは、細胞上で使用される前、除去されるべきである多量のCsClを包含する。SepHadex（商標）G-25M (Pharmacia) により予備充填されたPharmacia PD-10カラムを用いて、ウィルス調製物を脱塩した。カラムを20mlのPBSにより平衡化した。ウィルスを負荷し、そしてカラムの運転を可能にする。5mlのPBSをカラムに添加し、そして８〜10滴の画分を集める。個々の画分の１：50希釈溶液の光学密度を、分光計上で260nmで測定し、そして明白なピークを同定する。ピーク画分をプールし、そして１：25希釈溶液の光学密度（OD）を決定する。ODを、式（260nmでのOD）（25）（1.1×1012）＝ビリオン/mlを用いて、ウィルス濃度に転換する。
【００９３】
ウィルスを貯蔵するために、グリセロールを、精製されたウィルスに15％の最終濃度まで添加し、軽く混合し、そして−80℃で等分して貯蔵する。
Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) により開発されたプロトコールに従って、組換えウィルスの感染性を測定する。手短には、２つの96−ウェル組織培養プレートを、アッセイされる個々の組換えウィルスのための2％ウシ胎児血清を含むMEMにおける、ウェル当たり１×104個の293A細胞により接種する。24時間後、１×10-2〜1×10-14の個々のウィルスの10倍希釈溶液を、２％ウシ胎児血清を含むMEMにおいて製造する。個々の希釈溶液100μlを20ウェルの個々に配置する。37℃での５日後、ウェルをCPEについて、陽性又は陰性のいずれかを読み取り、そしてPFU/mlを計算する。
【００９４】
使用されるTCID50公式は、上記Quantum Biotechnologies, Inc. からである。力価（T）をプレートから決定し、ここで使用されるウィルスを、10-2〜10-14に希釈し、そして感染の５日後、読み取る。個々の希釈度で、ウェルの合計数当たりCPEについて正のウェルの比（R）を測定する。希釈されていないサンプルの力価は、T−10(1+F)＝TCID50/mlであり、ここでF＝１＋d（S−0.5）、Sは比率（R）の合計であり、そしてｄは希釈シリーズのLog10である（例えば、10倍の希釈シリーズについてd＝1）。TCID50/mlをpfu/mlに転換するために、0.7を力価（＋）についての計算における指数から除去する。
【００９５】
例７：
ヒトzvegf4 DNAのタンパク質コード領域を、それぞれ5’及び3’末端でPmeI及びAscI制限部位を付加するプライマーを用いてPCRにより増幅した。得られるzvegf4 cDNAを、pZyTrack (例６)のEcoRV−AscI部位中にクローン化した。組換えアデノウィルスを、293A細胞において生成し、そしてCsClグラジエント上で精製した。ウィルス粒子数を、分光計により決定し、そして感染性粒子数をTCID50アッセイにより決定した。ウィルスを、AdZyvegf4と命名した。
【００９６】
生後、８週目のC57BL/6マウスを、AdZyvegf4により感染せしめ、血清化学、完全な血液計数（CBC）、身体及び器官の重量変化、及び組織学に対する効果を決定した。−１日目、マウスを標識し、それぞれ重量を測定し、そしてグループを、処理グループへの分離のために標準化する（檻当たり４匹のマウス）。グループ１マウス（ｎ＝８匹の雌、７匹の雄）は、GFP（対照）アデノウィルス（１×1011個の粒子）を受けた。グループ２（ｎ＝８匹の雌、６匹の雄）は、zvegf4アデノウィルス（１×1011個の粒子）を受けた。グループ３（ｎ＝８匹の雌、８匹の雄）は、未処理の対照であった。
【００９７】
０日目で、マウスは適切なアデノウィルス溶液の注射を受けた。10日目で、血液を、CBC及び臨床学的化学測定のために集めた（エーテル麻酔下で）。20日目、マウスを計量し、そして、CBC及び臨床学的化学測定のために血液を集めた後（エーテル麻酔下で）、頸部脱臼により殺した。選択された組織を固定し、そして形態学的変化について評価した。次の病理学的発見は、AdZyvegfアデノウィルスにより処理された動物の大部分（80〜100％）において示され、そして他の２種のグループのいずれかにおいては観察されなかった。
【００９８】
肝臓においては、洞様毛細血管細胞、特に小さな卵形核を有し、そして肝小葉の静脈領域においてより群生する洞様毛細血管を被覆する観察できる細胞質を有さない細胞の適度な増殖が存在した。細胞は、肝線維症の開始及び進行の原因である主要細胞型である、紡錘Ito（星状）細胞であるように思われた。
【００９９】
すべてのAdZyvegf4処理された動物においては、腎臓の糸球体が拡大され、そして糸球体間質細胞の過細胞性により特徴づけられた。さらに、すべての６匹の雄マウス、及び７匹の雌マウスのうち４匹が、細尿管再生の徴候を示した。それらの変化は、関連しないタンパク質を発現する対照アデノウィルスに暴露された動物においては観察されなかった。細尿管再生は、高められた好塩基性を有する細尿管上皮細胞の存在により特徴づけられる。より詳細な組織学的試験は、細尿管間質増殖又は炎症性細胞浸潤の証拠をほとんど示さなかった。
【０１００】
高められた量の気管支肺胞リンパ様組織が、AdZyvegf4処理された動物の肺において示された。気管支肺胞リンパ様組織は、いくつかの形の肺線維症において重要な開始体及び関与体である、肺炎症応答の徴候である、肺実質内の血管のまわりのより少ない数の血漿細胞と共に混合されるリンパ球群から主に構成された。
【０１０１】
大腿骨においては、大部分の動物は、骨髄空間を満たす。最少〜重度の骨内膜骨、及び増殖する骨内膜骨のために骨髄空間の損失に起因する低められた量の造血要素を示した。さらに、６匹の雄のうち４匹及び８匹の雌動物のうち２匹が、高められた数の紡錘形状の細胞により特徴づけられた支質細胞の増殖を有した。
【０１０２】
例８：
腎機能の修復を、Nakagawaなど. (Am. J. Pathology 155: 1689-1699, 1999) のモデルを用いて評価した。虚血性尿細管損傷を、両側の腎動脈を正確に50分間、クランプすることによって、250〜300gの体重の雄Sprague−Dawleyラットにおいて誘発した。体温を、恒温動物表に基づいて動物を配置し、そして感温性腎プローブによりモニターすることによって、37±１℃で維持する。クランプを開放した後、腎臓を、種々の間隔で再灌流する。zvegf4を、損傷の後、種々の時点で投与する。手術後、１〜10日での動物死亡率は、永続的な腎不全の徴候である。腎機能はまた、タンパク尿、血清におけるクレアチニンレベル、及び当業者に知られている他の方法により評価され得る。
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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