(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒性ニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶ）であるMET95株を抗原として含有することを特徴とするＮＤＶワクチン。
【請求項２】
当該MET95株が生ウイルスである請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
当該MET95株が不活化ウイルスである請求項１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な弱毒性のニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及び該ウイルスを含有するワクチン及び診断用抗原に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は鳥類のニューカッスル病（ＮＤ）の原因ウイルスであるが、歴史は古く、これまでに多くの性状が明らかにされている（堀内貞治編，鶏病診断，家の光協会，pp.21−46(1982)：B.W. Calnek ed., Diseases of Poultry, Iowa State Univ., pp.541-569(1997)）。主要な性状を示せば、このＮＤＶはパラミキソウイルスに属するＲＮＡウイルスで、エンベロープを有し、その表面にはノイラミニダーゼ及び赤血球凝集素（ＨＡ素）を持つ。 ＮＤＶは発育鶏卵あるいは鶏胚線維芽細胞などの培養細胞で良く増殖し、ウイルスを含む尿腔液あるいは培養液上清は室温で赤血球凝集能（ＨＡ能）を示す。
【０００３】
ＮＤＶは鳥類に感染し、その病原性はウイルス株によって異なり、大きく弱毒株、中等毒株、及び強毒株に分けられる。強毒株では90％以上の致死率を示すため、ＮＤはわが国では法定伝染病に指定されている。古くから、ＮＤ予防の為、不活化ワクチン及び生ワクチンが開発され、広く使用されてきたために、現在ではＮＤの発生頻度は低くなっている。しかしながら、宿主域が広い為に鶏以外の鳥類（シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びウズラなど）も本ウイルスに感染しており、またワクチン非接種の愛玩鶏等でのウイルス感染もあるため、ワクチンによる免疫が不十分な鶏群があると、そのような場所からのウイルス侵入が原因となってＮＤが発生することがある。
【０００４】
前述のようにＮＤＶはＨＡ能を持っており、そのＨＡの有無を調べてウイルスの増殖が確認できるため、ＨＡは間接的な感染価測定の指標とされている（(社)動物用生物学的製剤協会，ニューカッスル病生ワクチンのウイルス含有量試験III-2-2，動物用生物学的製剤基準，p.150）。さらに、ＮＤＶ感染あるいはＮＤワクチン接種後、鶏は赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を産生する。そのため、このＨＩ抗体を測定することで、ＮＤＶの感染状況あるいはＮＤワクチンの接種状況が把握されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
わが国では、ＮＤの感染防御が可能な弱毒生ワクチンとして、Ｂ１、TCND、VG/GA及びLasotaC30株がそれぞれＮＤ生ワクチン株として許可されている（1998年12月現在）。このうち、最も古くから、かつ広く使用されているワクチン株はＢ１株である。Ｂ１株の病原性は低く、点鼻、点眼、飲水、噴霧などのルートで投与することができる。しかしながら、ワクチン接種が飲水投与で行われた場合には、しばしば投与鶏の抗体産生が低いため、このような場合には免疫が不十分であることが懸念される。
【０００６】
従って、弱毒でかつ十分な抗体産生が可能なＮＤＶ株は、ＮＤ免疫にとってさらに有効なワクチンになると考えられることから、当該性状を有する新規なワクチン株の入手が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような状況において、本発明者らは野外から新規なＮＤＶを分離し、その諸性状を検査したところ、当該新規なＮＤＶは既知のワクチン株あるいは野外株と明らかに区別できるＨＡ反応を有するウイルスであること、さらに、当該ＮＤＶを鶏雛に接種すると、既知の弱毒性ＮＤＶよりも優れたＨＩ抗体産生性を有することを見出した。本発明者らはこのような性状を有するＮＤＶの代表株をMET95株と称する。
【０００８】
当該MET95株を医薬に許容可能なキャリアまたは希釈剤等と共に含有させることにより、鶏等をＮＤＶ感染から有効に防御することができる生ワクチンを提供することができる。さらに、当該MET95株を不活化させることにより、不活化ワクチン抗原あるいはＮＤＶ感染診断用抗原を提供することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規なＮＤＶは、下記実施例において詳述されるように、急速法において鶏赤血球を凝集させる能力（ＨＡ能）が既知のＮＤＶと比較して明らかに弱いという特徴的な性状を有するものである。詳細には、ウイルス調製液をスライドグラス又はホーロー凝集板上に0.1mlずつ滴下し、これに５％鶏赤血球液を等量滴下し、ガラス棒を用いてすばやく良く攪拌した後、室温（20〜25℃）で1〜３分間静置しＨＡ反応を肉眼で観察する急速法（堀内貞治編，鶏病診断，家の光協会，pp.595−606(1982)）において、本発明のＮＤＶは既知のＮＤＶと比較して明らかにＨＡ価が低いという性質を有する（表２及び表３参照）。
【００１０】
さらに、当該ＮＤＶを鶏雛に接種すると既知のＮＤ生ワクチン株と比較して高い赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体産生性を示すという特長を有するものである。このような性状を有する代表株をMET95株と称する。なお、当該MET95株は本出願人により保管されており、分譲することが可能である。
【００１１】
MET95株のウイルスは、MET95株に由来するウイルス及び発育鶏卵や培養細胞における連続継代によりMET95株から派生した継代ウイルスを含む。
【００１２】
MET95株のウイルスは、発育鶏卵、鶏胚線維芽細胞や鶏腎細胞、あるいはその他の培養細胞で培養増殖が可能である。中でも発育鶏卵が好ましく、高いウイルス濃度の培養液を得ることが可能である。
【００１３】
このようにして増殖された培養液から回収されたMET95株のウイルスは、生きたウイルスとしてワクチンに含有させ得る。
【００１４】
生きたウイルスを含有する生ワクチンは、懸濁液の形態で、または凍結乾燥の状態で製造可能であり、ワクチンに通常使用される医薬に許容可能な保存安定剤、防腐剤及び緩衝剤、または希釈剤等が含有される。また、必要に応じ、アジュバントを含有させることも可能である。
【００１５】
保存安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメートまたはグルコースなどの炭水化物やアルブミン、粉乳血清またはカゼインなどのタンパク質などが使用される。防腐剤としては、チメロサール、メルチオラート及びゲンタマイシンなどが使用される。緩衝剤としては、アルカリ金属リン酸塩などが使用される。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールなどが含まれる。
【００１６】
本発明による生ワクチンの接種経路としては、飲水接種、噴霧接種、点眼接種、点鼻接種等が挙げられる。
【００１７】
また、本発明のMET95株のウイルスは、不活化されたウイルスとしてワクチンに含有させることも可能である。不活化ワクチンの場合は、非経口的に、例えば筋肉内または皮下投与する。
【００１８】
さらに、MET95株はＨＡ能を有していることから、この性質を利用してＨＩ抗体を定量的に測定することもできる。従って、当該ウイルスは、ＮＤＶ感染の有無あるいはＮＤ免疫状態の診断用抗原としても使用可能である。
【００１９】
本発明によるワクチンはニワトリに有効に使用できるが、シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びウズラなど、他の家禽を本発明で有効に予防接種することも可能である。ニワトリにはブロイラー、繁殖鶏及び採卵鶏が含まれる。
【００２０】
さらに本発明は、上記MET95株のウイルスに加えて、鶏に感染する他の病原体に由来する１種以上の免疫原を含有する混合ワクチンも含む。混合可能な免疫原の例としては、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスまたはレオウイルスのワクチン株やヘモフィルス・バラガリナーラムまたはマイコプラズマ・ガリナーラムなどの１種以上が挙げられる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明について実施例により具体的に記載するが、本発明は本記載内容に何ら限定されるものではない。
【００２２】
《実施例１：ニューカッスル病ウイルスの分離》
大型ブロイラー農場で飼育されていたＮＤワクチン未接種の健康と思われる28日齢ブロイラー２羽を解剖し、その気管及び肺を無菌的に採取した。この気管及び肺を抗生物質（ペニシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン及びファンギゾン）を加えたリン酸緩衝食塩液で10％混合乳剤とし、さらにその遠心上清を0.45μmのフィルターでろ過した後、試験管に培養された鶏腎（ＣＫ）培養細胞に接種した。その後、37℃で５日間培養したところ、培養細胞に大型癒合性の細胞病原性変化（ＣＰＥ）が出現し、ウイルスの分離が確認された。その培養液をシャーレに培養されたＣＫ培養細胞に接種し、常法どおりにプラック法でのクローニングを３回繰り返すことで、ウイルス株（代表株をMET95株と称する）を得た。なお、当該MET95株は本出願人により保管されており、分譲することが可能である。このクローニングされたMET95株を10日齢ＳＰＦ発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、37℃で２日間培養して得られた腔液をウイルス液（腔液中に109 EID50/ml以上のウイルス量を含む）として−70℃に保存し、以下の試験に使用した。
【００２３】
《実施例２：血清学的性状》
特定病原体不在（ＳＰＦ）の鶏群から生産された９〜11日齢の発育鶏卵を用いて、37℃で２日間培養されたMET95株及び既知のNDV・B1株（腔液中に109 EID50/ml以上のウイルス量を含む）を生理食塩液又はリン酸緩衝食塩液でそれぞれ２倍階段希釈した後、Ｕ字型96穴マイクロプレートに0.05ml/穴ずつ分注し、これに等量の0.5％鶏赤血球液を混合し良く攪拌した後、室温（20〜25℃）に40〜60分間静置し、赤血球凝集（ＨＡ）の有無を肉眼で確認した。ＨＡの認められた最高希釈倍数をＨＡ価としたとき、MET95株は1,024倍の、及びＢ１株は2,048倍のHA価を示した。
【００２４】
一方、２週齢のＳＰＦ鶏２羽に対して上記ＮＤＶのMET95株及びＢ１株をそれぞれ0.1ml/羽ずつ点眼接種し、その後２週間の隔離飼育後に採血して両ウイルス株に対する抗血清を得た。この抗血清及び上記両ウイルス株のＨＡ価を生理食塩液又はリン酸緩衝食塩液で希釈して４単位にそろえたウイルス液（ＨＡ抗原）を用いて、交差ＨＡ抑制試験（ＨＩ試験）を常法の定量法（堀内貞治編，鶏病診断，家の光協会，pp.595−606(1982)）に従い、Ｕ字型96穴マイクロプレートを用いて室温（20〜25℃）で実施した。すなわち、抗血清を生理食塩液又はリン酸緩衝食塩液で２倍階段希釈し、これに４単位ＨＡ抗原を等量づつ加えて10〜15分間感作した後、この混合液に等量になるようにさらに0.5％鶏赤血球を加えて攪拌した。その後40〜60分間反応させた後判定した。陰性対照血清として、４週齢ＳＰＦ鶏血清を使用した。この交差ＨＩ試験の結果を表１に示した。すなわち、ＨＩ抗体価は両ウイルス株のＨＡ抗原で同値を示し、MET95株が血清学的に既知のNDV・B1株と同一であることが示された。すなわち、このMET95はＮＤＶであることが確認された。
【００２５】
【表１】
0004283362.tif 000002
【００２６】
《実施例３：急速赤血球凝集反応によるＨＡ能》
生理食塩液又はリン酸緩衝食塩液で２倍階段希釈した上記MET95株及びＢ１株の各ウイルス液をスライドグラス又はホーロー凝集板上に0.1mlずつ滴下し、これに５％鶏赤血球液を等量滴下し、ガラス棒を用いてすばやく良く攪拌した後、室温（20〜25℃）で1〜３分間静置しＨＡ反応を肉眼で観察した（以下、これを急速法とする：堀内貞治編，鶏病診断，家の光協会，pp.595−606(1982)）。一方、同希釈ウイルス液を市販のＵ字型96穴マイクロプレートのウェルに0.05 mlずつ滴下した後、上記0.5％鶏赤血球液を0.05mlずつ加えて良く攪拌し、室温（20〜25℃）で40〜60分間反応させ、同様にＨＡ反応を観察した（以下、これを定量法とする。上記「鶏病診断」参照）。ＨＡの認められた最高希釈倍数をＨＡ価として、その結果を表２に示した。 定量法での両ウイルスのＨＡ価はいずれも、1,024倍を示したが、急速法では異る成績が得られた。すなわち、Ｂ１株では８倍希釈までＨＡが認められたが、MET95株では原液でもＨＡは認められなかった。このように、定量法では両株間に差を認めなかったが、急速法でのＨＡ能は少なくとも８倍（３管）の差があった。
【００２７】
【表２】
0004283362.tif 000003
【００２８】
《実施例４：急速凝集反応を指標とした発育鶏卵感染価測定》
ＮＤＶであるMET95、Ｂ１、VG/GA、富士、熱海、佐藤、及び石井株（いずれも発育鶏卵で培養増殖させたウイルス液で、106 EID50/ml以上の感染価をもつ）を生理食塩液又はリン酸緩衝食塩液で10倍階段希釈し、その0.1mlずつを１希釈あたり５〜７個の10〜11日齢ＳＰＦ発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、37℃の孵卵器内で３日間培養した。その後それぞれの卵から腔液を取り出し、前述の定量法及び急速法でＨＡ反応を検査した。ＨＡの認められたものはＮＤＶの胚への感染・増殖があったものと判定し、各ウイルスの感染価を算出した。試験は繰り返し行われた。その結果を表３に示した。 すなわち、MET95株以外のＮＤＶは定量法及び急速法でのＨＡの結果はほぼ等しく、そのため両方法での感染価はほぼ同値であった。しかし、MET95株は急速法において、低希釈ウイルス液を接種した卵でのみＨＡは陽性を示し、そのため感染価は低値となった。このことはMET95株のＨＡ能が他のＮＤＶに比べて弱いことを示している。
【００２９】
【表３】
0004283362.tif 000004
* logEID50/ml
【００３０】
《実施例５：発育鶏卵及び培養細胞での増殖能》
（１）発育鶏卵での増殖
MET95株及びＢ１株をリン酸緩衝食塩液で103 EID50/mlに調整し、その0.1mlずつを10日齢のＳＰＦ発育鶏卵尿膜腔内に接種し、37℃のフラン機内で６日間孵卵し、その間毎日腔液を採取し、そのウイルス量を卵に対する感染価（前述の定量法での判定を採用）で測定した。卵は各ウイルス20個使用し、毎日３〜４個から採液した。その結果を表４に示した。MET95株はＢ１株と同様に良く増殖し、２日目にはほぼピークに達した。このように当該ウイルスは従来のＮＤＶと同様に、発育鶏卵で良く増殖することが判った。
【００３１】
（２）培養細胞での増殖
培養フラスコに10日齢の発育鶏卵胚から得た鶏胚線維芽細胞を培養し、単層培養細胞となったものに、moi（細胞一個あたりの感染ウイルス量）が0.001となるように調製したMET95株あるいはＢ１株を接種し、37℃のCO2フラン機内で７日間培養した。この間、毎日培養液の一部を採取して、−70℃以下に保存した。その後、保存した培養液を一斉に融解し、その中に含まれるウイルス量を、卵に対する感染価（前述の定量法での判定を採用）で測定した。その結果を表４に示した。両ウイルスともに鶏胚線維芽細胞内で良く増殖し、接種後４から５日目にほぼピークに達したが、発育鶏卵での増殖よりも低かった。なお、両ウイルス共に２日目から明瞭な大型癒合性の細胞病原性変化（CPE）を認めた。
【００３２】
【表４】
0004283362.tif 000005
* logEID50/ml
【００３３】
《実施例６：培養細胞、発育鶏胚及び鶏雛に対する病原性》
（１）培養細胞
ＳＰＦ発育鶏胚（10日齢）から得た鶏胚線維芽細胞を直径約５cmのシャーレに24時間培養し、単層の培養細胞を作製した。これに約10〜50 EID50/0.1mlのウイルス量が含まれるように調製されたMET95株及びＢ１株を接種した後、寒天を１％含むイーグルＭＥＭ培地（DEAEデキストランを200μg/ml含有又は不含の２種類を使用）を重層して37℃で２日間培養した。その後、フェノールレッドを0.1％含む同寒天培地を更に重層し、翌日プラックの形成を観察した。その結果を表５に示した。 MET95株及びＢ１株共に、DEAEデキストラン含有培地で培養した場合にプラックが形成されたが、DEAEデキストラン不含培地では形成されなかった。
【００３４】
（２）発育鶏胚
MET95株及びＢ１株の発育鶏卵内培養液の10-1〜10-10希釈液をＳＰＦ発育鶏卵（９日齢）の尿腔内に、各希釈液あたり10個を用いて、0.1mlずつ接種し、37℃のフラン機内で培養しながら、毎日朝夕の２回以上、胚の死亡を128時間後まで観察した。接種卵の100％が死亡した最高希釈倍数列の胚の平均死亡時間（MDT/MLD）を計算で求めた（Hitchner et al. ed., Isolation and Identification of Avian Pathogens, American Association of Avian Pathologists, pp.63-65(1975)）。その結果を表５に示した。 MET95株のMDTはＢ１株のそれとほぼ同様であった。すなわち、MET95株の発育鶏胚に対する病原性はＢ１株と同程度と思われた。
【００３５】
（３）鶏雛
初生雛に対する病原性は、脳内接種法に従った（上記 Hitchnerら編集の文献参照）。すなわち、MET95株及びＢ１株を10日齢の発育鶏卵尿腔内に接種し２日間培養し、その培養腔液の0.1mlをそのまま1日齢ＳＰＦ雛の脳内に接種した。その後８日間臨床症状を観察し、死亡雛＝２、発病雛＝１、正常雛＝０の各スコアを与えて病原性指数（ICPI）を求めた。一方、静脈内接種での病原性についても評価した（Alexander et al., Vet. Rec., 114, pp.466-469(1984)）。MET95株及びＢ１株の発育鶏卵培養腔液（前述と同じ方法で作成）の1.0mlを、６週齢のSPF鶏の静脈内に接種し、その後10日間の臨床観察を行い、上述のICPIと同じスコアと計算式から病原性指数（IVPI）を求めた。その結果を表５に示した。ICPI及びIVPIともに、MET95株の病原性指数はＢ１株のそれとほぼ同等であり、鶏に対する病原性は低く、弱毒ウイルスであることが示された。
【００３６】
【表５】
0004283362.tif 000006
【００３７】
初生雛に対する点眼接種での病原性を調べた。MET9株及びＢ１株の106 EID50/0.03mlをＳＰＦ雛３日齢の17羽ずつに点眼接種し、その後２週間の臨床観察及び２週後の体重を測定した。臨床観察の結果、いずれの株においても、死亡、開口呼吸、鼻汁、流涙、神経症状、沈鬱あるいは下痢などの症状は全く認められなかった。しかし、MET95株では８羽に、Ｂ１株では３羽に、それぞれ軽い一過性のくしゃみが接種後３〜10日目まで観察された。一方、２週齢時の平均体重はMET95群で156.9g、Ｂ１群は160.8g，及び対照群は146.0gであり、両群ともに対照群と有意差がなかった。これらの結果を表６に示した。
【００３８】
このように、MET95株はB1株よりもくしゃみを発現させる羽数はわずかに多かったものの、初生雛に接種しても安全であることが示された。
【００３９】
【表６】
0004283362.tif 000007
【００４０】
《実施例７：移行抗体保有鶏雛での抗体産生性》
移行抗体保有雛にMET95株を経口投与した場合の免疫能を、Ｂ１株と比較しながら検討した。ＮＤＶに対するＨＩ移行抗体が幾何平均で28.1又は27.3である市販の20日齢あるいは27日齢のレイヤー雄雛を各３群（１群あたり13〜15羽）に分け、それぞれの１群にはMET95株の103 EID50/羽を、また別の１群（13〜15羽）にはＢ１株の103 EID50/羽を経口投与し、残りの１群は無処置対照群とした。投与後４、７、11及び14日目に全羽から採血し、血清中のＨＩ抗体価を測定した。その結果を表７に示した。MET95株投与群のＨＩ抗体価はＢ１株投与群よりも早く上昇する傾向を示し、14日目の抗体価はMET95群のほうがＢ１投与群より明らかに高かった。なお、無処置群ではＨＩ価は減少のみで、上昇は認められなかった。このように、移行抗体保有雛ではMET95株の方が優れたＨＩ抗体産生性を示した。
【００４１】
【表７】
0004283362.tif 000008
* HI抗体価（幾何平均）
【００４２】
《実施例８：免疫に必要な最小有効ウイルス量》
MET95株のウイルス量別ＨＩ抗体産生性及び防御能についてＳＰＦ鶏を用いて検討した。すなわち、MET95株の102、103及び104 EID50/羽ずつを２週齢のＳＰＦ鶏に、各ウイルス量あたり12〜13羽を設定して経口投与し、その後３、７、10及び14日目に全羽から採血し、ＨＩ抗体を測定した。さらに最終採血後に、強毒ＮＤＶ佐藤株の104MLD（最小致死量）で筋肉内攻撃し、その後14日間呼吸器症状、神経症状、下痢の発症有無を観察し防御能をみた。なお、同羽数の無処置群を設け、同様に採血、攻撃した。その成績を表８に示した。ＨＩ抗体価はすべての投与群で７日目から上昇が認められた。ウイルス量が高いほどＨＩ抗体価も高い傾向を示したが、102EID50/羽投与群でもほとんどの鶏においてＨＩ価が８倍以上を示した。またその後の攻撃試験においても、MET95接種群ではいずれのウイルス量でも呼吸器症状、神経症状または下痢などの発症は全くみられず、100％の発症防御が認められた。従って、MET95株の最小有効ウイルス量は102EID50/羽以下であると考えられた。
【００４３】
【表８】
0004283362.tif 000009
*  HI抗体価のバラツキ範囲（幾何平均）
**  呼吸器症状、神経症状又は下痢を発症した羽数／観察羽数（％）