(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にする。または、ターゲットＤＮＡおよびドライバーＤＮＡを一本鎖にした後、混合する。
（ｃ）ハイブリダイゼーションを行い、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。
（ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｃ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の操作を１または複数回行う。
【請求項２】
微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを切断する。但し、このときドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるようにする。
（ｃ）ドライバーＤＮＡを標識する。
（ｄ）ターゲットＤＮＡと過剰量の標識されたドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にしたのち、ハイブリダイゼーションを行う。
（ｅ）ドライバーＤＮＡの標識によって、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。
（ｆ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｅ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて（ｄ）と（ｅ）の操作を１または複数回行う。
【請求項３】
（ｃ）において、さらに、ターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着することを特徴とする請求項２に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項４】
ドライバーＤＮＡの混合量（ｄ）とターゲットＤＮＡの混合量（ｔ）との比ｄ／ｔが、１を超えて１０００以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項５】
ドライバーＤＮＡが、ビオチン、ジゴキシン、フルオレセインまたはローダミンで標識されることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項６】
ドライバーＤＮＡの平均鎖長が２００〜３００塩基対であり、ターゲットＤＮＡの平均鎖長が１０００塩基対以上であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項７】
ＤＮＡの切断が、ドライバーＤＮＡ画分では４塩基認識制限酵素により、ターゲットＤＮＡ画分では５〜８塩基認識制限酵素により行われることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項８】
ＤＮＡの切断が、ドライバーＤＮＡ画分ではMsp Iにより、ターゲットＤＮＡ画分ではSse 8387Iにより行われることを特徴とする請求項７に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項９】
ＤＮＡの切断が、超音波または機械的剪断力により行われることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項１０】
微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを切断する。但し、このときドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるようにする。
（ｃ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを一本鎖にする。
（ｄ）一本鎖にしたドライバーＤＮＡを担体に固定する。
（ｅ）一本鎖ドライバーＤＮＡが固定化された担体を、一本鎖にしたターゲットＤＮＡの溶液に接触または混合し、ハイブリダイゼーションを行う。
（ｆ）担体と溶液を分離することによって、ドライバーＤＮＡと二本鎖を形成したターゲットＤＮＡを除去する。
（ｇ）ターゲットＤＮＡの溶液の代わりに、（ｆ）で得られるターゲットＤＮＡの溶液を用いて、（ｅ）と（ｆ）の操作を１または複数回行う。
【請求項１１】
（ｂ）において、さらに、ターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着することを特徴とする微量に存在する請求項１０に記載の遺伝子の濃縮方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ試料が、少なくとも２種類以上の微生物、生物、生物組織もしくは細胞が混在する標品から抽出したＤＮＡ試料、または生物個体、生物組織もしくは細胞から抽出した核酸および／もしくはその核酸より調製したＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法で微量に存在する遺伝子（以下、「微量遺伝子」という）を濃縮する工程、得られた微量遺伝子が濃縮されたＤＮＡ試料から微量遺伝子を取得する工程および微量遺伝子の塩基配列を解析する工程よりなることを特徴とする微量遺伝子を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物の混合物から調製したＤＮＡ試料中の稀少微生物ないし培養が不可能な微生物に由来する微量遺伝子、または動植物の細胞で微量しか発現していない微量遺伝子を濃縮する方法、および当該濃縮方法によって取得された微量遺伝子、該微量遺伝子の解析方法、微量遺伝子の濃縮装置、ならびに微量遺伝子濃縮用キットに関する。
なお、本明細書において、ＤＮＡ試料中に最初微量にしか存在しなかった遺伝子を「微量遺伝子」と、最初多量に存在していた遺伝子を「多量遺伝子」という。
背景技術
微生物の生産する有用物質は、工業用酵素や抗生物質などとして広く利用されているが、自然界に存在する微生物の９５〜９９％は培養が不可能であり、これら培養が不可能な微生物は今だ工業的に利用されていない。しかし、培養が不可能な微生物から工業的に有用な酵素の遺伝子を取得し、または抗生物質など微生物が生産する有用物質の生合成系の遺伝子を取得して、当該遺伝子を適切な宿主で発現させれば、新規な工業用酵素や抗生物質などの有用物質を大量に生産することができるので、その産業上の有用性は計り知れない。
微生物から上記のような有用遺伝子を取得するためには、通常、有用遺伝子を持つ微生物を単離、培養し該微生物からＤＮＡを抽出して、遺伝子ライブラリーを作成することから始まる。原理的には、当該遺伝子ライブラリーを適当な宿主で導入・発現させて、適当な方法で活性を持つ形質転換体をスクリーニングし、選別すれば良い。しかし、この方法では、種々の微生物が混合した標品中の一部を占めるに過ぎない微生物または単離・培養することが不可能な微生物から、有用遺伝子を取得するには多大の時間と労力を要する。特に、有用遺伝子を有する微生物の混合体に占める割合がごく僅かであり、そのうえ該微生物が培養不可能な微生物である場合には、当該微生物から有用遺伝子を取得することは、事実上不可能となる。微生物の標品中に僅かしか存在しない微生物および標品中の培養が不可能な微生物に由来する遺伝子、すなわち微量遺伝子ないし僅少遺伝子を相対的に濃縮することができれば、その後の有用遺伝子のスクリーニングが効率化され、労力、時間および費用が大幅に節減される。
一方、ヒトの体を構成している細胞は２００以上の種類に分けられ、それぞれの細胞は約１０万種の遺伝子を持つ共通のゲノムをもち、細胞型に応じて数万種類の遺伝子を発現していると考えられている。このような遺伝子の発現を調べることは、個々の遺伝子の機能に関する知見を得るためだけではなく、生命現象を解明するうえでますます重要になりつつある。また、これまで少数の比較的限られた遺伝子を対象にした詳細な解析が行われてきた結果、多くの生命現象は複数の遺伝子が協調的に働くことが分かってきた。
遺伝子発現は、その発現量から３つのクラスに大きく分けられる。細胞あたり約１０３〜４コピー程度のＡｂｕｎｄａｎｔクラス、約１０２コピー程度のＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅクラス、そして約１０１コピー程度しかないＲａｒｅクラスである。一方、発現遺伝子の種類に関しては、哺乳類においては細胞当たり数万種類に及び、ほとんどの遺伝子はＲａｒｅクラスに属する。つまり、細胞内における発現遺伝子は、発現量の多い（１０３〜４コピー）Ａｂｕｎｄａｎｔクラスの遺伝子が極少数種存在し、ごく微量しか発現していない（１０１コピー）Ｒａｒｅクラスの遺伝子が膨大な種類存在する状態にある（例えば、Alberts,B., et al.（1989）Molecular biology of the cell， 2nd edition. Garland Publishing Inc.）。このような状況下にあり、微量遺伝子を含めた多数種の遺伝子をより詳細に解析する技術の必要性がうたわれ、これらの解析を行うことにより遺伝子診断など医療面での利用も期待されている。
現在、微量遺伝子解析には、正準化法（Minoru S.H.Ko (1990) Nucleic Acids Res.,18,  5705-5711）、ディファレンシャル・ディスプレー法（Liang,P., and Pardee,A.B. (1992) Science 257, 967-971）もしくはモレキュラー・インデックス法（Kikuya Kato (1995) Nucleic Acids Res.,23,3685-3690）等）などのmultiplex ＰＣＲをベースにした方法、およびＤＮＡチップを使用する方法などが知られている。正準化法では、ある高分子核酸混合物をハイブリダイゼーション条件下に置き、適当な時間に二本鎖になった核酸と一本鎖で残っているものとを分離すると、微量遺伝子を多量遺伝子と同程度の量にまで濃縮することができる。しかし、正準化法では、処理後に微量遺伝子の方が多量遺伝子に比して多くなることは有り得ないので、濃縮の効果は限定的である。ディファレンシャル・ディスプレー法などのmultiplex ＰＣＲを用いた解析を行った場合、競合的なＰＣＲ反応が起こり、遺伝子の存在量に強いバイアスがかかるため通常のＰＣＲに比べ検出感度が低下し、Ｒａｒｅクラスの遺伝子を検出することが難しくなることが知られている（David J. Bertioli, et al. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 4520-4523）。こうした問題点を克服する方法として、特開２０００−３７１９３号では核酸試料中に多く存在する既知の遺伝子を除去して微量遺伝子を濃縮する方法が開示されているが、多量に存在する遺伝子が既知でないとこの方法は利用できない。
一方、ある生物種の変異遺伝子を同定する方法として、所謂サブトラクション法およびその変法がある（Ellen E. Lamar and E. Palmer (1984) Cell, 37, 171-177、Ilse Wieland et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2720-2724、Anne Kallioniemi et al. (1992) Science 258, 818-821、 Nikolai Lisitsyn et al. (1993) Science 259, 946-951）。これらは同一生物種の２個体においてその大部分が同一な遺伝子（ＡとＢとする）の中で質的もしくは量的に異なっている遺伝子、または二つの異なった状態にある同一型細胞におけるｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの中で存在量が異なっている遺伝子（ＡとＢとする）を濃縮し単離する方法であって、何らかの方法でＡ（Ｂ）の中のＢ（Ａ）と同一の遺伝子をＢ（Ａ）の遺伝子を用いて除去すれば、Ａ（Ｂ）にのみ存在する特異的な遺伝子を取得できることを原理としている。したがって、該方法においては必然的に含まれる遺伝子の大部分が同一である２種類のＤＮＡ試料を必要とする。
しかし、自然界のある標品（土壌、湖水、河水など）中には非常に多種類の微生物が存在し、それらの微生物組成は標品によって異なるのが一般であり、それぞれが固有の組成を持つ。したがって、その中の稀少微生物に由来する微量遺伝子を濃縮する場合、引かれるものと引くものという、含まれる遺伝子の大部分が同一である２種類のＤＮＡ試料を用意することが不可能であるから、上記サブトラクション法を用いて該微量遺伝子を濃縮することはできない。また、ｃＤＮＡ試料中の微量遺伝子を濃縮するため、含まれる遺伝子の大部分が同一であり、該微量遺伝子を含むｃＤＮＡ試料と含まないｃＤＮＡ試料の２種類のｃＤＮＡ試料を用意することは、極めて困難であるから、該微量遺伝子を上記サブトラクション法により濃縮することは困難である。
発明の開示
本発明は、標品中に僅かしか存在しない稀少微生物もしくは培養不可能微生物に由来する微量遺伝子を濃縮する方法、および生物個体、生物組織もしくは細胞中で発現している多数種の遺伝子のなかで、多量遺伝子について未知であっても、微量遺伝子を濃縮することができる方法、ならびに当該微量遺伝子濃縮のための装置およびキットを提供することを目的とする。
発明者は鋭意研究を重ねた結果、ゲノムサイズの解析および反復配列の解析に用いられてきたＣｏｔ解析において、二本鎖再形成反応速度はゲノムサイズに反比例し、同一配列の濃度に比例することから、微量遺伝子と多量遺伝子を含むＤＮＡ試料中の微量遺伝子を濃縮できることを想到し、大腸菌ＤＮＡ、枯草菌ＤＮＡおよび仔ウシ胸腺ＤＮＡの混合溶液から、該混合溶液中の微量遺伝子を濃縮できることを確認して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にする。または、ターゲットＤＮＡおよびドライバーＤＮＡを一本鎖にした後、混合する。
（ｃ）ハイブリダイゼーションを行い、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。
（ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｃ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の操作を１または複数回行う。
（２）微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを切断する。但し、このときドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるようにする。
（ｃ）ドライバーＤＮＡを標識する。また、所望によりターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着する。
（ｄ）ターゲットＤＮＡと過剰量の標識されたドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にしたのち、ハイブリダイゼーションを行う。
（ｅ）ドライバーＤＮＡの標識によって、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。
（ｆ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｅ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて（ｄ）と（ｅ）の操作を１または複数回行う。
（３）ドライバーＤＮＡの混合量（ｄ）とターゲットＤＮＡの混合量（ｔ）との比ｄ／ｔが、１を超えて１０００以下であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（４）ドライバーＤＮＡが、ビオチン、ジゴキシン、フルオレセインまたはローダミンで標識されることを特徴とする前記（２）または（３）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（５）ドライバーＤＮＡの平均鎖長が２００〜３００塩基対であり、ターゲットＤＮＡの平均鎖長が１０００塩基対以上であることを特徴とする前記（２）〜（４）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（６）ＤＮＡの切断が、ドライバーＤＮＡ画分では４塩基認識制限酵素により、ターゲットＤＮＡ画分では５〜８塩基認識制限酵素により行われることを特徴とする前記（２）〜（５）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（７）ＤＮＡの切断が、ドライバーＤＮＡ画分ではMsp Iにより、ターゲットＤＮＡ画分ではSse 8387Iにより行われることを特徴とする前記（６）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（８）ＤＮＡの切断が、超音波または機械的剪断力により行われることを特徴とする前記（２）〜（５）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（９）微量に存在する遺伝子と多量に存在する遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量に存在する遺伝子を多量に存在する遺伝子から分離することを特徴とする微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。
（ｂ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを切断する。但し、このときドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるようにする。所望によりターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着する。
（ｃ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを一本鎖にする。
（ｄ）一本鎖にしたドライバーＤＮＡを担体に固定する。
（ｅ）一本鎖ドライバーＤＮＡが固定化された担体を、一本鎖にしたターゲットＤＮＡの溶液に接触または混合し、ハイブリダイゼーションを行う。
（ｆ）担体と溶液を分離することによって、ドライバーＤＮＡと二本鎖を形成したターゲットＤＮＡを除去する。
（ｇ）ターゲットＤＮＡの溶液の代わりに、（ｆ）で得られるターゲットＤＮＡの溶液を用いて、（ｅ）と（ｆ）の操作を１または複数回行う。
（１０）ＤＮＡ試料が、少なくとも２種類以上の微生物、生物、生物組織もしくは細胞が混在する標品から抽出したＤＮＡ試料、または生物個体、生物組織もしくは細胞から抽出した核酸および／もしくはその核酸より調製したＤＮＡ試料であることを特徴とする前記（１）〜（９）に記載の微量に存在する遺伝子の濃縮方法、
（１１）処理前において存在量の少なかった微量遺伝子の処理前において存在量の多かった遺伝子に対する存在比が、処理後に増加していることを特徴とする前記（１）〜（１０）に記載の方法で得られるＤＮＡ試料。
（１２）前記（１）〜（１０）に記載の方法で微量に存在する遺伝子（以下、「微量遺伝子」という）を濃縮する工程、得られた微量遺伝子が濃縮されたＤＮＡ試料から微量遺伝子を取得する工程および微量遺伝子の塩基配列を解析する工程よりなることを特徴とする微量遺伝子を解析する方法、
（１３）前記（１）〜（１０）に記載の方法で得られる微量に存在する遺伝子が濃縮されたＤＮＡ試料から取得された遺伝子、
（１４）（ａ）ターゲットＤＮＡと標識されたドライバーＤＮＡの混合溶液中のＤＮＡを一本鎖にする手段と、（ｂ）ハイブリダイゼーションを行う手段と、（ｃ）ドライバーＤＮＡの標識によって、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを除去する手段と、（ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｃ）で得られる２本鎖ＤＮＡが除去されたＤＮＡ溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の手段を繰り返す手段とを含むことを特徴とする微量遺伝子濃縮装置、
（１５）（ａ）一本鎖にしたドライバーＤＮＡを担体に固定する手段と、（ｂ）一本鎖ドライバーＤＮＡが固定化された担体を、一本鎖にしたターゲットＤＮＡの溶液に接触または混合し、ハイブリダイゼーションを行う手段と、（ｃ）担体と溶液を分離することによってドライバーＤＮＡと二本鎖を形成したターゲットＤＮＡを除去する手段と、（ｄ）ターゲットＤＮＡの溶液の代わりに、（ｃ）で得られるターゲットＤＮＡの溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の手段を繰り返す手段とを含むことを特徴とする微量遺伝子濃縮装置、及び
（１６）ＤＮＡを切断する手段、標識物質または担体、ＤＮＡを標識するための試薬またはＤＮＡを担体に固定化するための試薬、ハイブリダイゼーション用試薬およびドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡを除去する手段を含むことを特徴とする微量遺伝子濃縮用キット、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下に詳細に説明するが、まず本発明の理論的背景となったＣｏｔ解析（沢田幸治他、新生化学実験講座・核酸Ｉ、第１０章  ハイブリダイゼーションによる核酸の分画、１９３〜２３８頁）について述べる。
高分子核酸のハイブリッド形成反応は相補鎖分子間の有効な衝突を律速とする下記の二次反応式（１）に従い、反応速度は一本鎖ＤＮＡの濃度［Ｃ］の２乗に比例する。
ｄ［Ｃ］／ｄｔ  ＝  −ｋ［Ｃ］２         (１）
（式中、［Ｃ］は一本鎖ＤＮＡの濃度を表し、ｔは反応時間を表し、ｋは反応速度定数を表す。）
動物細胞のＤＮＡのように反復配列を含む場合は、配列によって初濃度が異なるために反応の進行は多相性となる。相補鎖の一方が大過剰（２０倍以上）の場合は擬一次反応として取り扱うことができる。
液相における核酸ハイブリダイゼーション反応の速度論的考察を土台として、核酸の一次構造を解析する事ができる。これがＣｏｔ、Ｃｒｔ解析である。Ｃｏｔ解析はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、Ｃｒｔ解析はＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションの解析であり、後者はＲｏｔ解析ともいう。１９６８年にBrittenとKohne（R. J. Britten and D. E. Kohne, Science, 161, 529）は動物細胞ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ再形成反応を速度論的に解析し、（１）ゲノムサイズの解析（ゲノムＤＮＡの塩基配列の多様性）、（２）塩基配列の繰り返しの解析にＣｏｔ解析が利用できることを最初に示した。Ｃｏｔ、Ｃｒｔ解析は、核酸の分画の際の指標としても用いられる。
（１）Ｃｏｔ解析とゲノムサイズ
式（１）を積分して初濃度を［Ｃ０］とすると、
［Ｃ］／［Ｃ０］＝1／（１＋ｋ［Ｃ０］ｔ）   （２）
（式中、［Ｃ０］は一本鎖ＤＮＡの初濃度を表す。［Ｃ］、ｔおよびｋは上記定義に同じ。）
となり、［Ｃ０］ｔを横軸に［Ｃ］／［Ｃ０］を縦軸にプロットするとＣｏｔ曲線が得られる（図１）。
Ｃｏｔの単位としてはヌクレオチドｍｏｌ・ｓｅｃ／ｌが用いられる。ヌクレオチドの平均分子量を３１４とすると、１μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ は３．１９×１０−６ヌクレオチドｍｏｌ／ｌとなるから、
［Ｃ０］ｔ＝ＤＮＡ（μg/ml)×1.15 ×１０−２ × 時間（ｈｒ）  （３）
となる。これを近似すると、
［Ｃ０］ｔ=ＤＮＡ（Ａ２６０）×時間（ｈｒ）／２   （４）
（式中、Ａ２６０は２６０ｎｍにおける吸光度を表す。）
ＤＮＡ分子内に反復配列の無い場合、Ｃｏｔ曲線は一次シグモイド曲線となる（図１）。
（２）から、
（［Ｃ０］―［Ｃ］）／［Ｃ］＝ｋ［Ｃ０］ｔ    （５）
（式中、［Ｃ０］、［Ｃ］、ｔおよびｋは上記定義に同じ。）
となり、［Ｃ０］ｔを横軸に、（［Ｃ０］―［Ｃ］）／［Ｃ］を縦軸にプロットすると直線となる。その勾配の逆数が［Ｃ０］ｔ１／２である。
［Ｃ０］ｔ１／２＝１／ｋ                      （６）
（式中、ｔ１／２は一本鎖ＤＮＡの５０％が二本鎖ＤＮＡになったときの時間を表す。［Ｃ０］およびｋは上記定義に同じ。）
ＤＮＡ濃度をヌクレオチドｍｏｌ濃度でそろえると、二本鎖再形成反応速度はゲノムサイズに反比例し、従って［Ｃ０］ｔ１／２と比例する。このことから、各種生物のゲノムサイズが算出できる（図１）。
（２）反復（繰り返し）配列
ＤＮＡ分子内に反復配列が有る場合、Ｃｏｔ曲線はユニーク配列の一次シグモイド曲線と各反復配列の一次シグモイド曲線とをそれぞれ合成したものとなる。仔ウシ胸腺ＤＮＡの場合、反応は２段階に分けられ、約４０％は［Ｃ０］ｔ１／２値が０．０３、６０％は［Ｃ０］ｔ１／２値が３０００を示す一次シグモイド曲線の合成として近似される。後者はユニーク配列、前者は１０万コピーある高度反復配列であるといえる（図２）。なお、適当な時間で反応を停止し、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡを分離することによって、ユニーク配列と反復配列とを分離することが可能である。
ここで、例えば、土壌、湖水、河水などの少なくとも２種類以上の微生物、生物、生物組織または細胞が混在する標品から抽出したＤＮＡは、一つの高等生物のゲノムと同等と考えることができ、メタゲノムと定義される。メタゲノムの中では、最少量の微生物等に由来する遺伝子をユニーク配列、それ以上存在する微生物等に由来する遺伝子は反復配列であるとみなせる。該反復配列はその存在数によって高度反復配列、中度反復配列、低度反復配列と分類される。
また、生物個体、生物組織もしくは細胞から抽出した核酸および／もしくはその核酸より調製したＤＮＡにも、ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡように、その存在量に大きな多様性があり、ユニーク配列と反復配列という分類が可能である。
上記のＣｏｔ解析の理論に拠って、コピー数が多いＤＮＡほど二本鎖になるのが速いから、本発明において用いるＤＮＡ試料を適当な条件で一本鎖にした後、二本鎖を再形成させ、形成した二本鎖ＤＮＡを適当な方法で分離・除去すれば、残った一本鎖ＤＮＡの試料中では、微量遺伝子が相対的に濃縮されることとなる。しかし、ここで注意しなければならないのは、この場合の濃縮とはあくまでも相対的なものであって、微量遺伝子が最終的に多数派になることは有り得ず、最高でたかだか多量遺伝子と同程度の量となるのみであることである。上に述べたように、これは正準化法として実際に用いられている方法である。
しかし、以下のような方法で、微量遺伝子の存在量を多量遺伝子よりも、処理後に多量にすることが可能であることを着想し、本発明を完成させるに到った。
具体的には、本発明に係る遺伝子濃縮方法は、微量遺伝子と多量遺伝子を含むＤＮＡ試料を、以下の操作に付して微量遺伝子を多量遺伝子から分離することにより、微量遺伝子を濃縮することを特徴とする。（ａ）ＤＮＡ試料を２分する。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。（ｂ）ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にする。または、ターゲットＤＮＡおよびドライバーＤＮＡを一本鎖にした後、混合する。（ｃ）ハイブリダイゼーションを行い、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。（ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｃ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の操作を１または複数回行う。
その原理を以下に説明する。ここで、多量遺伝子を遺伝子Ａと、微量遺伝子を遺伝子Ｂとする。ドライバーＤＮＡ中の遺伝子Ａの部分配列および／もしくはその周辺配列を含む特有の配列をＡ、遺伝子Ｂの部分配列および／もしくはその周辺配列を含む特有の配列をＢとする。ＡおよびＢは、ターゲットＤＮＡ断片中にも同一の配列が存在する。また、［Ｘｎ］はｎ回ハイブリッド・非ハイブリッド分離の操作を行ったときのＸの濃度を示す。「＝〜」は同量または同程度の量であることを示す。
最初のハイブリダイゼーションとハイブリッド・非ハイブリッド分離の操作で、Ａは大幅に除去され、その濃度は［ターゲットＡ１］（［ターゲットＡ０］＞［ターゲットＡ１］）となる。一方、［ターゲットＡ０＋ドライバーＡ０］>>［ターゲットＢ０＋ドライバーＢ０］であるから、Cotが適当で有る場合、［ターゲットＢ１］は殆ど変化がない。次のハイブリダイゼーションの時、［ターゲットＡ１＋ドライバーＡ０］＝〜［ドライバーＡ０］>>［ターゲットＢ１＋ドライバーＢ０］であるから、その反応は殆どドライバーＤＮＡの濃度のみに依存する擬一次反応となる。すなわち、Ａに比べてＢのハイブリダイゼーションはほとんど無視でき、ハイブリッド・非ハイブリッド分離操作後、ターゲットＡはさらに除去されて［ターゲットＡ２］となる（［ターゲットＡ１］＞［ターゲットＡ２］）が、［ターゲットＢ２］はほとんど変化が無い。これを繰り返す事により［ターゲットＡｎ］<<［ターゲットＢｎ］＝〜［ターゲットＢ０］となって、ターゲットＤＮＡ中にはＢを持った遺伝子Ｂばかりが残ることになる。
つまり、本発明に係る微量遺伝子濃縮方法の特長は、ハイブリダイゼーションの度に新たに供給されるドライバーＡが、常にハイブリダイゼーション系の中で際立って濃度が高く、したがってＡのハイブリダイゼーション速度が際立って速いということである。従来の正準化法においては、ＡとＢの濃度が同程度になると、各々がハイブリダイズする確率は等しくなるので、それ以上一方を優先的に濃縮することができない。しかし、本発明においては、常にドライバーＡの濃度が際立って高いために、以下のようにして遺伝子Ｂの方を遺伝子Ａよりも多量になるまで濃縮することが可能となる。
（ｉ）［ターゲットＡ］>>［ターゲットＢ］のとき（１回目の操作のとき）
この場合は、ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡを混合したハイブリダイゼーション系においてドライバーＡが多量に存在するので、ドライバーＡがターゲットＡと有効に衝突しハイブリダイズする確率はＢの場合よりもはるかに高い。ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡが形成する二本鎖ＤＮＡを選択的に除去することにより効率よくターゲットＡが除去され、一方でターゲットＢは殆ど除去されることなく系に残る。ゆえに遺伝子Ａ（多量遺伝子）と遺伝子Ｂ（微量遺伝子）を分離して、遺伝子Ｂ（微量遺伝子）を濃縮することができる。
（ii） ［ターゲットＡ］＝〜［ターゲットＢ］（操作を繰り返したとき）
さらに濃縮を繰り返し、［ターゲットＡｎ］と［ターゲットＢｎ］とが同程度になっても、この溶液とドライバーＤＮＡとを混合した新たなハイブリダイゼーション系においては、新たに供給されたドライバーＡの濃度が際立って多いので、ターゲットＡとドライバーＡが有効に衝突する確率のほうが、ターゲットＢとドライバーＢが有効に衝突する確率よりもはるかに高い。よって、ドライバーＡとハイブリダイズしたターゲットＡが除去され、殆どのターゲットＢは系に残る。ゆえに遺伝子Ａ（多量遺伝子）よりも多量になるまで遺伝子Ｂ（微量遺伝子）を濃縮することができる。
本発明において用いるＤＮＡ試料は特に限定されずいかなるものでもよい。例えば、少なくとも２種類以上の微生物、生物、生物組織または細胞が混在する試料から抽出したＤＮＡ試料が挙げられる。したがって、土壌、湖水、河水など自然界において得られる固有の微生物組成を持つ試料から微生物を分離、培養することなしに、該試料から抽出したＤＮＡを用いることができる。本発明に係る微量遺伝子の濃縮方法は、このように固有の微生物組成を持つ試料に対しても適用できるという利点がある。
本発明において用いるＤＮＡ試料としては、生物個体、生物組織もしくは細胞から抽出した核酸および／もしくはその核酸より調製したＤＮＡ試料であってもよい。例えば、炎症を起こした組織と正常な組織とが混合した組織、ガン化した細胞と正常細胞とが混合した細胞、または微生物、ウイルス等が感染した細胞と非感染細胞の混合物から抽出されるＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。さらに、細胞内で多種類の遺伝子が発現しているｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ試料であってもよい。
ＤＮＡの抽出方法としては、例えば、アルカリＳＤＳ法もしくは遠心法、またはこれらの組み合わせなど自体公知の方法を用いてよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを適宜用いることができる。
本発明の一実施態様としては、（１ａ）ＤＮＡ試料を２分し（一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。）、（１ｂ）ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にするか、または、ターゲットＤＮＡおよびドライバーＤＮＡを一本鎖にした後、混合し、（１ｃ）ハイブリダイゼーションを行い、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去し、（１ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（１ｃ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて、（１ｂ）と（１ｃ）の操作を１または複数回行うことにより、微量遺伝子を多量遺伝子から分離し微量遺伝子を濃縮するという方法が挙げられる。
上記操作（１ａ）において、ＤＮＡ試料は任意に２分すればよい。一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。ただし、ＤＮＡ試料が微量しかない場合は、操作（１ｂ）におけるターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとの混合比を鑑みて、ドライバーＤＮＡ画分の方が多くなるように２分することが好ましい。さらに、全ＤＮＡ量が十分でない時、予めＰＣＲによって増幅してから、ターゲットＤＮＡ画分とドライバーＤＮＡ画分に分離して、以降の操作を行っても良い。ここで、ドライバーＤＮＡのみ画分をＰＣＲ法で増幅すると、配列による増幅程度の相違が、後に濃縮される配列に複雑な偏向を与える。
操作（１ｂ）においては、ターゲットＤＮＡに対し、ドライバーＤＮＡを過剰量混合するのが好ましい。ドライバーＤＮＡを過剰量加えることにより、効率よく多量遺伝子を除去することができるためである。より具体的には、ドライバーＤＮＡの混合量（ｄ）とターゲットＤＮＡの混合量（ｔ）との比ｄ／ｔが、１を超えて約１０００以下、好ましくは約１０〜１０００程度、より好ましくは約１００〜１０００程度が好適である。特に、ドライバーＤＮＡの混合量が多いほうがハイブリダイゼーションの時間を短くできる。ただし、ドライバーＤＮＡの混合比を多くすればそれだけＤＮＡ試料が多量に必要になる。したがって、本発明においては、ＤＮＡ試料が十分にない状況などの場合は、上記混合比ｄ／ｔが１を超えて１０程度、より好ましくは約１０程度であっても好適である。
ＤＮＡを一本鎖にする方法としては、自体公知の方法を用いてよく、例えば約９４℃程度の熱を約１分程度加えること、またはアルカリ処理することなどにより一本鎖にすることができるが、実施例に記載の条件が好ましい。また、ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡを混合した後一本鎖にしてもよいし、混合する前にターゲットＤＮＡ、ドライバーＤＮＡそれぞれを一本鎖にしておいてもよい。
上記操作（１ｃ）において、ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡをハイブリダイズさせる。このときのハイブリダイゼーションの条件は自体公知の方法に従ってよいが、実施例に記載の条件が好ましい。ここで、ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとのハイブリダイズとしては、ターゲットＤＮＡの一部分にドライバーＤＮＡがハイブリダイズしている状態、またはターゲットＤＮＡに複数のドライバーＤＮＡがハイブリダイズしている状態も含まれる。
ついで、ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを除去する。同時に、ドライバーＤＮＡ同士がハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ドライバーＤＮＡも除去されることがある。ターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを除去する方法としては、自体公知の方法を用いてよく、例えば、ハイドロキシアパタイトを用いたバッチ法あるいはカラムクロマトグラフィー法、ＣｓＣｌ等を用いた比重遠心法などの方法が挙げられる。
上記操作（１ｃ）によって、多量遺伝子が除去され、微量遺伝子が濃縮される。しかし、多量遺伝子を十分に取り除くために、操作（１ｄ）、すなわちターゲットＤＮＡの代わりに、（１ｃ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて、（１ｂ）と（１ｃ）の操作を行うことが好ましく、また、少なくとも操作（１ｄ）を１回以上繰り返して行うことがより好ましい。
本発明の好ましい態様としては、（２ａ）ＤＮＡ試料を２分し（一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。）、（２ｂ）ドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるように、ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいてＤＮＡを切断し、（２ｃ）ドライバーＤＮＡを標識し、所望により、ターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着し、（２ｄ）ターゲットＤＮＡと過剰量の標識されたドライバーＤＮＡとを混合し、混合した溶液中のＤＮＡを一本鎖にしたのち、ハイブリダイゼーションを行い、（２ｅ）ドライバーＤＮＡの標識によって、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを上記混合溶液から除去する。また、このときに、ドライバーＤＮＡ同士が形成した二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ドライバーＤＮＡも除去される。ついで、（２ｆ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（２ｅ）で得られる二本鎖ＤＮＡを除去したＤＮＡ溶液を用いて（２ｄ）と（２ｅ）の操作を１または複数回行うことにより、微量遺伝子を多量遺伝子から分離し微量遺伝子を濃縮するという方法が挙げられる。
上記（２ｂ）の操作において、ＤＮＡを切断する方法としては、自体公知の方法を用いることができ、具体的には、制限酵素処理、超音波処理または物理的剪断力などを用いることができる。制限酵素を用いて切断する場合は、認識する塩基対数の異なる制限酵素を用いることにより、所望のサイズのＤＮＡ断片に切断することができる。例えば、８塩基認識Not Iを用いた場合、予想断片長は平均65,536塩基対で細菌の遺伝子６０個分ぐらいの長さになる。もう少し短いものが所望される場合は、例えば７塩基認識のCpo Iを用いると、１塩基対がＡまたはＴであるので、４６×２＝8,192塩基対が予想平均長で、７〜８個の遺伝子を含む長さとなる。
一般に、ターゲットＤＮＡを大きくすれば、遺伝子が複数連なったものが取得できる。したがって、ターゲットＤＮＡとしては、平均鎖長が約１０００塩基対程度以上ものが好ましい。ある代謝系に関係する遺伝子は該遺伝子が複数連なった遺伝子クラスターを作る事が多いから、本発明に係る方法はクラスター遺伝子の取得に有用である。この時、ドライバーＤＮＡのサイズはターゲットＤＮＡと同程度でも良いが、小さい方がハイブリダイゼーションの効率および特異性が上がるため好ましい。具体的には、Cot解析をするときに通常用いられているＤＮＡのサイズ（鎖長）である約２００〜３００塩基対程度にすればよい。ＤＮＡのサイズ（鎖長）があまりにも長いと、それだけ、ある部分は類似配列があり、ある部分はユニークであるというような一本鎖ＤＮＡ上の配列の構成が複雑になるから、上記サイズが好ましい。
このようにドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるようにするためには、ドライバーＤＮＡ画分では４塩基認識制限酵素により、ターゲットＤＮＡ画分では５〜８塩基認識制限酵素により操作（３ｂ）におけるＤＮＡの切断を行うことが好ましい。また、ドライバーＤＮＡ画分では４塩基認識のMsp Iにより、ターゲットＤＮＡ画分では８塩基認識のSse 8387IによりＤＮＡの切断を行うことがより好ましい。
ドライバーＤＮＡは、ハイブリダイゼーションを行う前に予め標識しておくのが好ましい（操作（２ｃ））。標識しておくことにより、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを効率よく除去できるという利点がある。ドライバーＤＮＡの標識には、標識ＤＮＡと非標識ＤＮＡとが分離出来るものであれば自体公知のものを用いることができる。実施例において用いているアビジン以外にも、例えばジゴキシン、フルオロセイン、ローダミン等を用いることができる。
ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを混合溶液から除去（操作（２ｅ））は、その標識に応じた自体公知の方法にしたがって除去することができる。例えば、標識としてビオチンを用いた場合は、アビジンを結合させたダイナビーズでターゲットＤＮＡとドライバーＤＮＡとがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを除去することができる。また、抗標識抗体を用いる方法も挙げられる。
また、ターゲットＤＮＡを断片化した後、リンカー・アダプターを付加してもよい（操作（２ｃ））。こうすることにより、濃縮操作の後でＰＣＲ法による増幅、クローニング・ベクターへの組み込みを容易にすることができる。
なお、他の操作については、上述の操作（１ａ）〜（１ｄ）と同様である。
本発明の他の好ましい態様としては、（３ａ）ＤＮＡ試料を２分し（一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。）、（３ｂ）ドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるように、ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいてＤＮＡを切断し、所望によりターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着し、（３ｃ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを一本鎖にし、（３ｄ）一本鎖にしたドライバーＤＮＡを担体に固定し、（３ｅ）一本鎖ドライバーＤＮＡが固定化された担体を、一本鎖にしたターゲットＤＮＡの溶液に接触または混合し、ハイブリダイゼーションを行い、ついで（３ｆ）担体と溶液を分離することによって、ドライバーＤＮＡと二本鎖を形成したターゲットＤＮＡを除去し、（３ｇ）ターゲットＤＮＡの溶液の代わりに、（３ｆ）で得られるターゲットＤＮＡの溶液を用いて、（３ｅ）と（３ｆ）の操作を１または複数回行うことにより、微量遺伝子を多量遺伝子から分離し微量遺伝子を濃縮するという方法が挙げられる。
ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを効率よく除去できるようにするために、ドライバーＤＮＡを標識する代わりに、ドライバーＤＮＡを、ハイブリダイゼーションを行う前に予め担体に固定しておくのも好ましい（操作（３ｃ））。ドライバーＤＮＡを担体に固定する方法としては、自体公知の方法を用いることができる。例えば、ニトロセルロース膜やナイロンメンブレンなどに吸着させる方法、ポリリジンでコーティングしたガラス表面ないしシラン処理したガラス表面に物理的に吸着させる方法などが挙げられる。また、ストレプトアビディンを固相化した担体に上記ビオチンで標識したドライバーＤＮＡを固定化する方法も挙げられる。
このようにドライバーＤＮＡを担体に固定しておけば、担体とターゲットＤＮＡの溶液を分離することによって、ターゲットＤＮＡの溶液中からドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡ、すなわち多量遺伝子の大部分を容易に除去することができる（操作（３ｆ））。
ここで、多量遺伝子を精度よく取り除くためには、多量遺伝子の除去状態を検出しながら取り除くことも有効である。そこで、本発明においては、例えば、除去された二本鎖ＤＮＡ溶液を用いてまたは回収された一本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、多量遺伝子の除去の程度をモニターし、所望により残存する多量遺伝子を除去する操作（２ｆ）または（３ｇ）を行う方法を用いてもよい。かかる方法は自体公知の方法を組み合わせればよいが、具体的な一態様を図６に示す。ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡを除去するまでは、上記と同様に行う。除去された二本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、その中の多量遺伝子を、自体公知の方法を用いて検出する。その結果、例えば、多量遺伝子が実質的に検出されなかったり、またはその量が初めに除去された二本鎖ＤＮＡ溶液中の多量遺伝子の濃度に比べて十分に減少している場合は、溶液中に多量遺伝子が少ないということなので、さらに繰り返して操作（２ｆ）または（３ｇ）を行う必要がなく、微量遺伝子の取得の工程に移ることができる。一方、その逆の結果が出た場合は、上記操作（２ｆ）または（３ｇ）を行うのが好ましい。
かかる多量遺伝子の除去の程度をモニターするために、多量に存在する生物種のゲノムに共通する配列（共通配列）をマーカーとして用いて、多量遺伝子の量を推定することができる。共通配列の存在量を測定するためには、共通配列をプローブとしたハイブリダイゼーション法、あるいは共通配列をプライマーとしたPCR法を利用することができる。共通配列としては、多種類の生物が混合している標品から抽出したＤＮＡの場合は、ｒＲＮＡをコードしている遺伝子（ｒＤＮＡ）に存在する共通配列が望ましい。数多くの生物種についてｒＤＮＡの塩基配列が知られているからｒＤＮＡの共通配列を見出すことが容易であること、およびゲノムあたりのｒＤＮＡのコピー数が多いことがｒＲＮＡ中の共通配列をマーカーとして好適であることの理由である。多量に存在する生物種が限定される場合、例えば原核生物に限られる場合は、より多くの共通配列が存在する。さらに生物種が限定される場合、例えば放線菌に限定される場合は、さらに数多くの共通配列が存在する。共通配列はｒＤＮＡに限定する必要はなく、多量に存在する生物種のゲノムにある共通配列、例えば当該生物種に共通して存在するタンパク質をコードする遺伝子中に存在する共通配列であってもよい。例えば、シトクロームＣ遺伝子は全ての生物種に存在し、多くの生物種についてその塩基配列が知られているから、シトクロームＣ遺伝子中に存在する共通配列はマーカーとして好適である。
ＤＮＡ試料中の多量遺伝子が同一生物種の生物固体、生物組織・細胞に由来する場合は、その生物種に特異的な遺伝子を多量遺伝子の量を推定するマーカーとすることができる。また、ＤＮＡ試料が同一生物種の生物固体、生物組織・細胞に由来するｃＤＮＡの場合は、発現量の多い遺伝子をマーカーとして用いることができる。
この操作（２ｆ）または（３ｇ）の繰り返し回数は一義的には決めず、Ｃｏｔ値との兼ね合いで、１回、２回、・・・Ｎ回操作して得られた各回収ＤＮＡ画分のうちの複数の回収ＤＮＡ画分を遺伝子の取得操作に供する事が望ましい。それによって、最初の試料中において存在数の異なる微生物／生物の遺伝子それぞれについて存在濃度の異なる複数のＤＮＡ画分から有用遺伝子を取得できる可能性が有るからである。操作を繰り返すにつれ、最少量の遺伝子がより容易に取得できるようになる。
本発明のより好ましい態様としては、（４ａ）ＤＮＡ試料を二分し（一方のＤＮＡ試料をドライバーＤＮＡ画分、他方のＤＮＡ試料をターゲットＤＮＡ画分とする。）、（４ｂ）制限酵素を用いてターゲットＤＮＡ画分では平均鎖長が約１０００塩基対程度以上の長いＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）に、一方は平均鎖長が約２００〜３００塩基対程度の短いＤＮＡ（ドライバーＤＮＡ）に切断する。（４ｃ）ドライバーＤＮＡを化学的にビオチン化する。（４ｄ）該ビオチン化したドライバーＤＮＡ（その混合量をｄとする）とターゲットＤＮＡ（その混合量をｔとする）とを、その混合比ｄ／ｔが１を超えて１０００以下、好ましくは１０程度となるように混合し、該混合溶液中のＤＮＡを一本鎖にしたのち、液相中でハイブリダイゼーションさせる。（４ｅ）混合溶液にアビジン・ダイナビーズを加え、それを用いてドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズして形成した二本鎖ＤＮＡを除去する。すなわち、ドライバーＤＮＡに付着しているビオチンは、アビジンと複合体を形成する。したがって、ドライバーＤＮＡとハイブリダイズしたターゲットＤＮＡは、ダイナビーズに捕獲される。ダイナビーズは遠心分離によって容易に除去できるから、ダイナビーズとともにドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズして形成した二本鎖ＤＮＡも容易に除去できる。また、このときに、ドライバーＤＮＡ同士が形成した二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ドライバーＤＮＡも除去される。（４ｆ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（４ｅ）で得られる上清を用いて、（４ｄ）および（４ｅ）の操作を１または複数回行うという方法が挙げられる。
上述のような本発明に係る遺伝子濃縮方法を用いれば、処理前における微量遺伝子の多量遺伝子に対する存在比が、処理後に増加していることを特徴とするＤＮＡ試料が得られる。かかるＤＮＡ試料から微量遺伝子を取得することができる。取得に際しては、例えば、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning, 2nd ed.）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）(1989)に記載されている方法など自体公知の方法を用いてよい。また、市販のキットを用いることもできる。この際、付加したアダプター・リンカーの配列を用いれば、自体公知の方法で、容易にクローニングをすることができる。取得した微量遺伝子は、そのまま塩基配列を解読することもできるし、例えば適当なベクターに組み込んでサブクローニングしてから塩基配列の解読を行うこともできる。塩基配列の解読は、Maxam-Gibert法やSangar法を原理とした自体公知の方法を用いて行われてもよく、また市販のＤＮＡシークエンサーを使用してもよい。
本発明は、上記ＤＮＡ試料中の微量遺伝子の濃縮キットも提供する。具体的には、ＤＮＡを切断するための手段、標識物質または担体、ＤＮＡを標識するための試薬またはＤＮＡを担体に固定化するための試薬、ハイブリダイゼーションのための試薬、およびドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを除去する手段を有するキットが好ましい。ここで、標識物質または担体は、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズして形成した二本鎖ＤＮＡを容易に除去すべく、ドライバーＤＮＡを標識し、またはドライバーＤＮＡを固定するために用いる。また、「ＤＮＡを標識するための試薬」は、ドライバーＤＮＡを標識するために用いる試薬であり、「ＤＮＡを担体に固定化するための試薬」は、ドライバーＤＮＡを固定するために用いる試薬である。具体的には、上記微量遺伝子の濃縮方法に記載したものを好適に用いることができる。また、キットの構成または形態等に関しては、自体公知の技術を用いてよい。
本発明は、ＤＮＡ試料中の微量遺伝子の濃縮装置も提供する。より具体的には、（ａ）ターゲットＤＮＡと標識されたドライバーＤＮＡの混合溶液中のＤＮＡを一本鎖にする手段と、（ｂ）ハイブリダイゼーションを行う手段と、（ｃ）ドライバーＤＮＡの標識によって、ドライバーＤＮＡとターゲットＤＮＡとが形成する二本鎖ＤＮＡを除去する手段と、（ｄ）ターゲットＤＮＡの代わりに、（ｃ）で得られる２本鎖ＤＮＡが除去されたＤＮＡ溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の手段を繰り返す手段とを含むことを特徴とする微量遺伝子濃縮装置が挙げられる。各々の手段については、上記微量遺伝子の濃縮方法に関する記載と同様である。また、それぞれの手段の組み合わせは、自体公知の方法に従ってよい。さらに、（ａ）ドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるように、ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいてＤＮＡを切断する手段、（ｂ）ドライバーＤＮＡを標識する手段、または（ｃ）ターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着する手段などがさらに組み合わされていてもよい。
本発明は、ＤＮＡ試料中の微量遺伝子の濃縮装置の他の態様としては、（ａ）一本鎖にしたドライバーＤＮＡを担体に固定する手段と、（ｂ）一本鎖ドライバーＤＮＡが固定化された担体を、一本鎖にしたターゲットＤＮＡの溶液に接触または混合し、ハイブリダイゼーションを行う手段と、（ｃ）担体と溶液を分離することによってドライバーＤＮＡと二本鎖を形成したターゲットＤＮＡを除去する手段と、（ｄ）ターゲットＤＮＡの溶液の代わりに、（ｃ）で得られるターゲットＤＮＡの溶液を用いて、（ｂ）と（ｃ）の手段を繰り返す手段とを含むことを特徴とする微量遺伝子濃縮装置が挙げられる。各々の手段については、上記微量遺伝子の濃縮方法に関する記載と同様である。また、それぞれの手段の組み合わせは、自体公知の方法に従ってよい。さらに、（ａ）ドライバーＤＮＡの分子量がターゲットＤＮＡに対して低分子量となるように、ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいてＤＮＡを切断する手段、（ｂ）ターゲットＤＮＡにリンカー・アダプターを付着する手段、または（ｃ）ドライバーＤＮＡ画分およびターゲットＤＮＡ画分それぞれにおいて、ＤＮＡを一本鎖にする手段などがさらに組み合わされていてもよい。
実施例
以下に、実施例を記述して本願発明を具体的に詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
大腸菌Ｂ株のＤＮＡはSigma Co. USAから、ヒトゲノムＤＮＡはCLONTECH Laboratories Inc., USAから購入した。枯草菌Bacillus pumilusのＤＮＡは菌体より、Ｇｅｎとるくん（商品名  宝酒造株式会社製）を用いて調製した。
なお、本実施例において以下のような制限酵素、緩衝液、試薬などを用いた。また、各制限酵素や試薬などの使用に際しては、製品の取り扱い説明書にしたがった。
（ａ）Msp I（宝酒造株式会社製）：10単位/μl〔溶媒 10mM KPO4, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM Dithiothreitol (DTT), 0.02% ウシ血清アルブミン(以下、BSAという), 50%グリセロール(glycerol) (pH7.5)〕
（ｂ）Sse 8387I（宝酒造株式会社製）：10mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM DTT, 50mM NaCl, 100μg/ml BSA
（ｃ）TE：10mM Tris-HCl, pH 7.5
（ｄ）10 x M：100mM Tris-HCl, pH7.5, 100mM MgCl2, 10mM DTT, 500mM NaCl
（ｅ）10 x Mirus Labeling Buffer A(Mirus社)：200mM MOPS, pH 7.5
（ｆ）20 x SSC：3M NaCl, 0.3M Na3-citrate
（ｇ）ホルムアミド：AG501-x8, 20-50 mesh, fully regenerated（BioRad Lab. USA）を1/10量（重量／容量）加え一晩回転混合させたものの上清を用いた。
（ｈ）W x B：5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 1 M NaCl
（ｉ）ダイナビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin, Japan Dynal K.K.）：ダイナビーズの懸濁液1 mlをDynal MPCを用いてダイナビーズと液相とに分離、再びダイナビーズをtRNA(20 μg/ml)含有W x Bに懸濁、Dynal MPCでビーズと液相を分離する。これをもう一度繰り返して、最後にダイナビーズをtRNA(20 μg/ml)含有W x Bに懸濁し、必要量の懸濁液を試験管に分注した。
〔操作１  DNA混合液の作製〕
80μgの大腸菌DNAと8 ngの枯草菌DNAを440 μlのTEに溶解して、A液とした。
80μgのヒトDNA、80ngの大腸菌DNA、0.8ngの枯草菌DNAを700μlのTEに溶解してB液とした。
〔操作２  ドライバーDNAの調製（DNAの断片化とビオチン化）〕
75μgの大腸菌DNAと7.5ngの枯草菌DNAを含むＡ液に、120μlの10 x B、600単位のMsp I、水を加えて1.2mlにして37℃で2時間保温してＤＮＡを切断し、次いで60℃、15分間の処理でMsp Iを失活させた。反応液を３等分し、DNA断片をエタノール沈殿させ、遠心分離機にかけ回収した（以下、これをE/BミックスDNA断片と呼ぶ）。
75μgのヒトDNA、75ngの大腸菌DNA、0.75ngの枯草菌DNAを含むＢ液に、120μlの10 x B、600単位のMsp I、水を加えて1.2mlにして37℃で2時間保温してＤＮＡを切断し、次いで60℃、15分間の処理でMsp Iを失活させた。反応液を３等分し、DNA断片をエタノール沈殿させ、遠心分離機にかけ回収した（以下、これをH/E/BミックスDNA断片と呼ぶ）。
各試験管中の沈殿（それぞれ１／３当量のミックスＤＮＡ断片を含む）を、200μlの水＋25μlの10 x Mirus Labeling Buffer Aに溶かし、25μlのMirus Label IT試薬を加えて37℃、2時間反応させ、ＤＮＡをビオチンで標識した。25μlの5M NaCl、550μlのエタノールを加え−20℃で保存した（以下、ビオチン化されたE/BミックスDNA断片をE/BドライバーDNA、ビオチン化されたH/E/BミックスDNA断片をH/E/BドライバーDNAという）。
〔操作３  ターゲットDNAの調製（DNAの断片化）〕
2.5μgの大腸菌DNA、0.25ngの枯草菌DNAを含むＡ液に、10μlの10 x M、10μlの0.1% BSA、20.4単位のSse 8387Iと水を加え100μlとして、37℃で2時間保温してＤＮＡを切断し、次いで60℃、15分間の処理でSse 8387Iを失活させた。20μgのtRNA、10 μlの3M酢酸ナトリウム、220μlのエタノールを加えて−20℃で保存した（以下、この断片化DNAをE/BターゲットDNAと呼ぶ）。
2.5μgのヒトDNA、2.5ngの大腸菌DNA、0.025ngの枯草菌DNAを含むＢ液に、10μlの10 x M、10μlの0.1% BSA、20.4単位のSse 8387Iと水を加え100μlとして、37℃で2時間保温してＤＮＡを切断し、次いで60℃、15分間の処理でSse 8387Iを失活させた。20μgのtRNA、10μlの3M酢酸ナトリウム、220μlのエタノールを加えて−20℃で保存した（以下、この断片化DNAをH/E/BターゲットDNAと呼ぶ）。
〔操作４  ハイブリダイゼーション〕
E/BターゲットDNAのエタノール沈殿を含む試験管を15,000 rpm x 20分間の遠心にかけ、上清を捨てた。同じ試験管に E/BドライバーDNAのエタノール沈殿の懸濁液400μlを加え、15,000 rpm x 20分間の遠心にかけた。上清を捨て、さらに425μlのE/BドライバーDNAのエタノール沈殿の懸濁液を加えて遠心し、上清を捨てた。最後の沈殿を室温で9.28μlの水＋0.96μlの３N NaOHに溶かし、氷上で急冷し、0.96 μlの３N HCl＋50mM Tris-HCl, pH7.2を加え、次いで8μlの20 x SSC、20.8μlのホルムアミドを加えて良く混合した。1滴のミネラルオイルを滴下し、蓋で密閉して、37℃で保温してハイブリダイゼーション反応を進行させた。
H/E/BのターゲットDNAおよびH/E/BのドライバーDNAも、同様に処理してハイブリダイゼーション反応を進行させた。
Ｎ０はハイブリッド・非ハイブリッド操作をＮ回行ったＤＮＡ溶液を示す。
24時間後、ハイブリダイゼーション反応液の20μlを取り出し、1ml当量のダイナビーズ懸濁液を入れた試験管に加えた。残り（10と20）はそのまま保温を継続した。当該試験管を43 ℃の保温槽で保温しながら50分間、頻繁に混和した。Dynal MPCに掛け、数分放置して液相を二等分してそれぞれ1mlの−20℃に冷やしたエタノールを入れた二本の試験管に加え、−80℃冷凍庫に35分間静置後、15,000 rpm x 20分間の遠心で沈殿を得た。一方の試験管（A）の沈殿を80μlの水+10μlの3N NaOHに溶解して、その全量をもう一方の試験管（B）に移して沈殿を溶解した。一方、１／３当量のドライバーDNAを同条件にて遠心し沈殿を分離し、80μlの水+10μlの3N NaOHに溶解、その45μlで試験管（A）を洗浄し、その全量を（B）に洗い入れた。（B）に15μlの3N HCl＋50mM Tris pH7.2を加えてから300 μlの−20℃のエタノールを加え混和して、−80℃の冷凍庫に30分以上静置した。遠心によって得た沈殿に4.64μlの水+0.48μl 3N NaOHを加え室温で十分に溶かし、氷上で急冷してから 順次0.48μlの3N HCl+50mM Tris-HCl, pH7.2、4μlの20 x SSC、10.4μlのホルムアミドを加え、1滴のミネラルオイルを重層して、37℃に保温した。
20時間後、40 μlのtRNA(20μg/ml)含有W x Bを加え混和した後、ミネラルオイルを出来るだけ除き、TEで飽和したクロロホルムを加えて常法にしたがって、クロロホルム抽出を行った。水相をtRNA(20μg/ml)含有W x Bで1mlとし、1ml当量の洗浄ダイナビーズを入れた試験管に加えた。43℃で50分間保温、その間１，２分おきに混和した。Dynal MPCに掛け、数分間放置後、液相を二分しそれぞれを1mlの−20℃に冷やしたエタノールを入れた試験管に加え、−80℃冷凍庫に35分間以上静置後、15,000 rpm x 20分間の遠心で沈殿を得た。沈殿を室温でそれぞれ50μlの水+5μlの3N NaOHに溶解して、1本分のドライバーDNAの沈殿に加え、10 μlの３N HCl＋50 mM Tris pH7.2を加えてから220μlの−20℃のエタノールを加えて−80℃の冷凍庫に50分間以上静置した。遠心して得た沈殿に、4.64μlの水+0.48μl 3N NaOHを加え室温で十分に溶かし、氷上で急冷してから順次0.48μlの3N HCl+50mM Tris-HCl, pH7.2、4μlの20 x SSC 、10.4μlのホルムアミドを加え、1滴のミネラルオイルを重層して、37℃に保温した。
213時間50分後に10μlを取り、40μlのtRNA(50 μg/ml)含有W x Bを添加後、上記の様にミネラルオイルを除き、500μl当量の洗浄ダイナビーズを入れた試験管に移して、回転器に取り付け室温で一晩回転混合させた。Dynal MPCに掛け液相を分離して、0.05 ml当量の洗浄ダイナビーズで処理して最終液相を得、これよりエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した（30）。
一方、（10と20）より119時間5分後に10 μlを取り出した。残りは保温を継続した。取り出した10μlは0.5 ml当量の洗浄ダイナビーズで処理し、上述と同様に1/6当量のドライバーDNAと共に、エタノール沈殿物として回収した。沈殿に9.28μlの水+0.96μl 3N NaOHを加え室温で十分に溶かし、氷上で急冷してから 順次0.96μlの3N HCl+50mM Tris-HCl, pH7.2、 8μlの20 x SSC 、20.8 μlのホルムアミドを加え、1滴のミネラルオイルを重層して、37℃に87時間10分保温した。脱ミネラルオイル後、1ml当量の洗浄ダイナビーズ処理で得た液相を、さらに0.1 ml当量の洗浄ダイナビーズで処理して最終液相を得、これよりエタノール沈殿により核酸を回収した（20）。
保温を継続した残りを総計289時間20分37℃保温後、同様にして0.5 ml、次いで0.05 mlの洗浄ダイナビーズで処理して最終液相を得、これよりエタノール沈殿により核酸を回収した（10）。
最後に、全ての回収された核酸の沈殿に0.5μlのエタチンメートと20μlの0.3N NaOHを加え37℃、1.5時間処理する事によって余分なｔRNAを分解除去し、20μlの0.3N HCl+5mM Tris-HCl, pH7.2を加えた後、エタノール沈殿でDNAを回収、TEに溶解した。
以上の実験の流れを表示した（図３）。また、各画分の保温時間と、それから計算されたCotを下記表にまとめた。
第１表
0004304318.tif 000002
〔試験例１  各核酸画分中の遺伝子の検索〕
沈殿をTEに溶解し、その溶液の一部を加えて25μl PCR反応液（2.5μl 10 x PCR Buffer、2μl dNTP、0.25μl rTaq、1μlプライマーセット、テンプレートDNA、H2Oを加えて25μlとする）を調製し、ミネラルオイルを一滴加えて密閉し、94℃１分間、60℃１分間、72℃２分間のＰＣＲを３５サイクル行い、72℃で8分間静置し、23℃まで降温した。プライマーセットはそれぞれ0.5μlの、EfとEr（大腸菌遺伝子用）、BfとBr（枯草菌遺伝子用）、HfとHr（ヒト遺伝子用）を混ぜたものを用いた。
以下のそれぞれのオリゴヌクレオチドをTEに溶解して100 μM溶液をつくり、上記プライマーとして用いた。
（ａ）大腸菌：ompA  ecompa.gb_bal, 1−2271 CDS 172−669の以下の部分をプライマーとした。
Ef  1102-1119:  5' TCCGAAAGATAACACCTG 3'（配列番号１）
Er  1892-1908:  5' GGGATACCTTTGGAGAT 3'（配列番号２）
ＰＣＲによる増幅産物は807塩基対となる。
（ｂ）枯草菌：xynA  bpxyna.gb_bal, 1−1070 CDS 61−747の以下の部分をプライマーとする。
Bf   243-260:   5' ATTTAGTGCAGGCTGGAA 3'（配列番号３）
Br   650-672:   5' CGTTTCATACATTTTCCCCATTG 3'（配列番号４）
ＰＣＲによる増幅産物は430塩基対となる。
（ｃ）ヒト：IL5h j03478.gb_pr2, 1−3230の以下の部分をプライマーとした。
Hf  1600-1629:  5' ACTTTTTGAAAATTTTATCTTAATATGTGG 3'（配列番号５）
Hr  1981-2007:  5' TGGCCGTCAATGTATTTCTTTATTAAG 3'（配列番号６）
ＰＣＲによる増幅産物は408塩基対となる。
その他溶液としては、以下のものを用いた。
（ｉ）10 x PCR Buffer: 100mM Tris-HCl, pH8.3 +500mM KCl + 15mM MgCl2
（ii）dNTP mix: dATP + dGTP + dCTP + dTTP  各2.5mM
（iii）Taq: 5 units/ μl (溶媒：20mM Tris-HCl + 100mM KCl + 0.1mM EDTA + 1mM DTT + 0.5% Tween 20 + 0.5% Nonidet P-40 + 50% グリセロール（Glycerol））
（iv）DNAテンプレート
〔結果１〕
図４Aに見るようにE/B DNA混合液の大腸菌遺伝子と枯草菌遺伝子のPCR産物のバンドはそれぞれのDNAの量をよく反映していた。これをハイブリダイゼーションに1回（10）かけると、大腸菌遺伝子と枯草菌遺伝子がほぼ同量になった。さらに2回（20）、3回（30）かけると、大腸菌遺伝子<<枯草菌遺伝子となった（図５A)。即ち、大部分を占めていた大腸菌DNAが優先的に除去された。これは相対的濃縮度は10,000倍を遥かに越えるものである事を示していた。
図４Bに見るようにH/E/B DNA混合液のヒト遺伝子、大腸菌遺伝子、枯草菌遺伝子のPCR産物のバンドはそれぞれのDNAの量をよく反映していた。枯草菌の遺伝子はDNA混合物の中で非常に少量しか存在しないので、枯草菌DNAのみが極微量存在する場合と比較して、非特異的なバンドが多く、特異的な430塩基対のバンドは僅かに観察された。これをハイブリダイゼーションに3回（30）かけると、ヒト遺伝子と比較して、大腸菌遺伝子が顕著に濃縮されることがわかった（図５B）。コントロールPCR（図４B）との比較により、ヒト遺伝子は数１０分の１、大腸菌遺伝子は5〜10倍であるから、おおよそ数100倍濃縮されたと算定された。枯草菌遺伝子も非特異的なバンドが消え、特異的なバンドがはっきりと同定出来るようになり、莢雑DNAに比して大幅な濃縮が達成されたことが分かる。この時、大腸菌遺伝子と比較しては、特に濃縮が顕著でないことは、最初過剰に存在していたヒトDNAが特異的に除去された事を支持するものと解釈できる。
実施例２
稀少微生物として、好熱好酸性細菌であるSulfolobus shibataeを選び、S. shibataeのＤＮＡと大腸菌のＤＮＡを混合して、実施例１と同様の実験を行い、大腸菌ＤＮＡが選択的に除去されることにより、大腸菌DNAに対して千分の１しか存在しないS. shibataeのDNAが相対的に濃縮されることを確認した。S. shibataeのＤＮＡは菌体より、Ｇｅｎとるくん（商品名  宝酒造株式会社製）を用いて調製した。
なお、実施例２においては実施例１と同様の制限酵素、緩衝液、試薬などを用いたが、実施例１に記載していないものとして以下のようなものを用いた。
(a) 10 x Mirus Labeling Buffer A (Mirus社) : 200mM MOPS, pH7.5
(b) グリコーゲン : 20mg/ml
(c) MAGNOTEX−SA（宝酒造株式会社） :ハイブリダイズしたＤＮＡはMAGNOTEX−SAキットを用い、本キットのマニュアルに記載の方法で除去した。 すなわち、MAGNOTEX−SA 50μl（1mg）を1．5mlチューブに入れ、チューブを磁気スタンドで1分間静置後、上清を除去した。ビオチン標識DNA溶液と等量の本キットに添付の2 x Binding Bufferを混合し、チューブに加えて混和後、室温で10分間静置した。チューブを磁気スタンドに１分間静置後、上清を回収した。さらに1 x Binding Buffer 200μlをMAGNOTEX−SAに添加し洗浄し、洗浄をもう1回繰り返した。混和後、チューブを磁気スタンドに１分間静置後、上清を回収した。
〔操作１  DNA混合液の作製〕
80μgの大腸菌DNAと80ngのS.shibatae  DNAを440μｌのTEに溶解して、A液とした。
〔操作２  ドライバーDNAの調製（DNAの断片化とビオチン化）〕
75μgの大腸菌DNAと75ｎｇのS.shibatae DNAを含むＡ液に、120μｌの10 x B、 600単位のMsp Iと水を加えて1.2mlにして37℃で2時間保温してDNAを切断し、次いで60℃、15分間の処理でMspIを失活させた。反応液を3等分し、DNA断片をエタノール沈殿させ、遠心分離機にかけ回収した（以下、これをE/SミックスＤＮＡ断片と呼ぶ）。
各試験管中の沈殿（それぞれ１/３等量のE/SミックスＤＮＡ断片を含む）を、200μｌの水+25μｌの10 x Mirus Labeling BufferAに溶かし、25μｌのMirus Label IT試薬を加えて37℃、2時間反応させ、ＤＮＡをビオチンで標識した。25μｌの5M NaCl、550μｌのエタノールを加え−20℃で保存した。
〔操作３  ターゲットＤＮＡの調製（ＤＮＡの部分分解）〕
2.5μgのS.shibatae DNAを含むA液に、10μlの10 x M、10μlの0.1% BSA、20.4単位のSse 8387Iと水を加え100μlとして、37℃で2時間保温してＤＮＡを切断し、次いで60℃、15分間の処理でSse 8387Iを失活させた。10μgのNaOAc、220μｌのエタノール、1μｌのグリコーゲンを加えて−20℃で保存した（以下、これをE/SターゲットDNA断片と呼ぶ）。
〔操作４  ハイブリダイゼーション〕
E/SターゲットＤＮＡのエタノール沈殿を含む試験管を15000ｒｐｍ x 20分間の遠心にかけ、上清を捨てた。同じ試験管にE/SドライバーＤＮＡのエタノール沈殿の懸濁液400μｌを加え、15000ｒｐｍ x 20分間の遠心にかけた。上清を捨て、さらに425μｌのE/SドライバーＤＮＡのエタノール沈殿の懸濁液を加えて遠心し、上清を捨てた。最後の沈殿を室温で9.28μｌの水＋0.96μｌの3Ｎ NaOHに溶かし、氷上で急冷し、0.96μｌの3N HCl＋50mM Tris-HCl, pH 7.2を加え、次いで8μｌの20 x SSC、20.8μｌのホルムアミドを加えて良く混合し、これを00とした。１滴のミネラルオイルを滴下し、蓋で密閉して、37℃で保温してハイブリダイゼーション反応を進行させた。24時間後、ハイブリダイゼーション反応液の10μｌを取り出し、1mgのMAGNOTEX−SＡによりビオチン標識ＤＮＡの除去を行った。回収した上清に20μｌのNaOAc、500μｌの−20℃のエタノール、1μｌのグリコーゲンを加え、15000ｒｐｍ x 15分間の遠心で沈殿を得て、これを10とした。
また、残りのハイブリダイゼーション反応液の10μｌ（20）、20μｌ（30）それぞれについてもMAGNOTEX−SＡによりビオチン標識ＤＮＡの除去を行った。回収した上清に20μｌのNaOAc、500μｌの−20℃のエタノール、1μｌのグリコーゲンを加え、15000ｒｐｍ x 15分間の遠心で沈殿を得た（20沈殿：A、30沈殿：B）。一方、1/3当量（20）および1本分（30）のドライバーＤＮＡを同条件にて遠心し沈殿を分離し、80μｌの水+10μｌの3N NaOHに溶解した後、その全量でA、Bそれぞれを溶解した。15μｌの3N HCl+50mM Tris-HCl pH 7.2を加えてから300μｌの−20℃のエタノールを加え混合して、−80℃の冷蔵庫に30分間以上静置した。遠心によって得た沈殿に4.64μｌの水+0.48μｌ  3N NaOHを加え室温で十分に溶かし、氷上で急冷してから順次0.48μｌの3N HCl+50mM Tris-HCl  pH 7.2、4μｌの20 x SSC、10.4μｌのホルムアミドを加え、1滴のミネラルオイルを重層して、37℃に保温した。24時間後、Aの試験管からハイブリダイゼーション反応液の10μｌを取り出し、先と同様の手順によりターゲットDNAの回収を行い、20とした。
Bについても同様の手順でビオチン標識DNAの除去、上清の回収し、15000rpm x 15分間の遠心で沈殿を得た（30沈殿：C）。1/3当量のドライバーDNAを遠心し沈殿を分離し、50μｌの水+10μｌ 3N NaOHに溶解した後、その全量でCを溶解した。10μｌの3N HCl+50mM Tris pH 7.2を加えてから300μｌの−20℃のエタノールを加え混合して、−80℃の冷蔵庫に50分間以上静置した。遠心によって得た沈殿に4.64μｌの水+0.48μｌ  3N NaOHを加え室温で十分に溶かし、氷上で急冷してから順次0.48μｌの3N HCl+50mM Tris-HCl pH 7.2、4μｌの20 x SSC、10.4μｌのホルムアミドを加え、1滴のミネラルオイルを重層して、37℃に保温した。24時間後、Cの試験管からハイブリダイゼーション反応液10μｌを取り出し、同様の手順によりターゲットDNAの回収を行い、30とした。最後に、すべての回収されたＤＮＡの沈殿を50μｌの1 x TEに溶解した。
〔試験例１  ＤＮＡ画分中の遺伝子の検索〕
25μｌの PCR反応液（2.5μｌ 10 x PCR Buffer，2μｌ dNTP，0.25μｌ rTaq，1μｌプライマーセット，3μｌテンプレートDNA，H2Oを加えて25μｌとする）を調製し、Thermal cycler（宝酒造株式会社）により、94℃1分間、60℃1分間、72℃2分間のPCRを35サイクル行い、72℃で8分間静置し、4℃まで降温した。プライマーセットはそれぞれ0.5μｌの、EfとEr（E.coli遺伝子用）、SfとSr（S.shibatae遺伝子用）を用いた。
以下のそれぞれのオリゴヌクレオチドをTEに溶解して100μM溶液をつくり、上記プライマーとして用いた。
（a）大腸菌 ：ompA 遺伝子（ecompa.gb_bal）の以下の部分をプライマーとした。
Ef2      5’-TCCGAAAGATAACACCTG-3’（配列番号７）
Er2      5’-GGGATACCTTTGGAGAT-3’（配列番号８）
PCRによる増幅産物は８０７塩基対となる。
（b）S.shibatae ：エステラーゼ遺伝子（EstI）の以下の部分をプライマーとした。
Sf        5’-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3’（配列番号９）
Sr        5’-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3’（配列番号１０）
PCRによる増幅産物は９１８塩基対となる。
その他溶液としては、以下のものを用いた。
（i）10 x PCR Buffer： 100mM Tris-HCl，pH8.3 + 500mM KCl + 15mM MgCl2
（ii）dNTPmix： dATP + dGTP + dCTP + dTTP 各2.5ｍM
（iii）Taq： 5 units/μｌ（溶媒：20mM Tris-HCl + 100mM KCl + 0.1mM EDTA + 1mM DTT + 0.5%Tween20 + 0.5%Nonidet P-40 + 50%グリセロール）
（iv）DNAテンプレート
〔試験例２  リアルタイムPCR法による定量〕
DNA混合液中の各遺伝子の存在比を解析するため，リアルタイムPCR法により，サイクル毎の増幅の様子を解析した。上記のＰＣＲ法では各遺伝子の存在比を解析することは不可能であるため、LightCyclerクイックシステム330（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて大腸菌遺伝子およびS.shibatae遺伝子の存在比を解析した。
ＰＣＲ反応液組成は、5μｌ テンプレートDNA、2μｌ LightCycler−DNAマスターSYBR GreenI、1μｌ プライマーセット、1.6μｌ 25mM MgCl2（終濃度3mM）で、水を加えて20μｌとした。
以下のそれぞれのオリゴヌクレオチドをTEに溶解して10μM溶液をつくり、上記プライマーとして用いた。
（a）大腸菌 ：ompA 遺伝子（ecompa.gb_bal）の以下の部分をプライマーとした。
Ef2      5’-TCCGAAAGATAACACCTG-3’（配列番号７）
Er2      5’-GGGATACCTTTGGAGAT-3’（配列番号８）
PCRによる増幅産物は８０７塩基対となる。
（b）S.shibatae ：エステラーゼ遺伝子（EstI）の以下の部分をプライマーとした。
Sf        5’-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3’（配列番号９）
Sr        5’-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3’（配列番号１０）
PCRによる増幅産物は９１８塩基対となる。
〔結果２〕
図７に示すように、大腸菌遺伝子のバンドは濃縮するに従ってしだいに減少しており、30においては完全に除去されていることが分かる。一方、S.shibatae遺伝子は一連の行程を通じてほぼ同量であることが確認できる（なお、低分子側のバンドはプライマーがダイマーになったものと考えられる）。全体的に非特異的バンドが多いのはターゲットDNAをSau3A1で部分消化したためと考えられる。
E．coli DNAの増幅曲線はターゲットDNAが18.2サイクル、10DNAが20.74サイクル、20DNAが23.31サイクル、30DNAが23.80サイクルにおいて指数関数増殖期に入っており、このことからコピー数はターゲットDNAがもっとも多く、10、20、30の順に減少しており、大部分を占めていたE.coli DNAが優先的に除去されたことが分かる。
一方、S.shibatae DNAの増幅曲線はターゲットDNA、10DNAが19.22サイクル、20DNAが20.58サイクル、30DNAともに20.65サイクルとなっており，10→20において減少がみられるものの、大腸菌の減少率と比較すると、一連の濃縮過程を経た後でも存在比はほとんど変化していないといえる。また、２回のハイブリダイゼーションによって、E.coli DNAとS.shibatae DNAはほぼ同量になり、さらに３回のハイブリダイゼーションによって、E.coli DNA<<S.shibatae DNAとなった。以上の結果から、リアルタイムPCR法を用いてDNA混合液中の各遺伝子の存在比を解析することによって、図７の電気泳動の結果に示されているE.coli DNAが選択的に除去されることが、定量的に確認された。
産業上の利用可能性
本発明に係る微量遺伝子の濃縮方法、微量遺伝子の濃縮用キットまたは微量遺伝子濃縮装置を用いれば、ＤＮＡ試料中の微量遺伝子を多量遺伝子よりも多量となるまで濃縮することができる。しかも、ＤＮＡ試料中の除去すべき多量遺伝子が既知である必要もない。したがって、例えば土壌、湖水または河水などの自然界の標品から抽出したＤＮＡ等を試料として用いることができるという利点がある。
このように微量遺伝子を濃縮することにより、その遺伝子をクローニングをする為にスクリーニングするべき遺伝子ライブラリーの総クローン数を大幅に減少させることができる。その結果、人的労力、費用および時間の大幅な削減を可能とする。したがって、化学工業的に重要な酵素の遺伝子または医薬・農薬のリード化合物、抗生物質の合成遺伝子群などの有用遺伝子を従来の方法よりも容易かつ迅速に取得できるようになる。そのほかにも、本発明に係る微量遺伝子の濃縮方法などを用いて細胞表面抗原の遺伝子を取得して、その遺伝子ないし遺伝子情報を用いて抗体を作製して、その抗原を持つ細胞ないし微生物を同定し、また例えばＦＡＣＳのようなセルソーターを用いて該細胞ないし微生物を単離することもできる。さらに、この単離した細胞ないし微生物の全ゲノムの塩基配列を解析する事により新たに有用な遺伝子を取得できる。また、ヒトを含む動植物に寄生または感染している微生物の遺伝子を本発明に係る方法または装置などで濃縮することにより、寄生・感染微生物の同定を可能とし、さらに、その遺伝子の機能を明らかにして利用することを可能とするなどの多種多様な応用が可能である。
【配列表】
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0004304318.tif 000005
【図面の簡単な説明】
第１図は、ゲノムサイズとＣｏｔ１／２との関係を示す。より具体的には、種々の二本鎖核酸の再形成を示す。ゲノムサイズは図上部にヌクレオチド対として示した（新生化学実験講座、核酸Ｉ  ２００頁）。
第２図は、仔ウシ胸腺ＤＮＡの再形成を示す。△（白抜き三角）は仔ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が２μｇ／ｍｌの試料を表し、●は仔ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が１０μｇ／ｍｌの試料を表し、○は仔ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が６００μｇ／ｍｌの試料を表し、△（塗りつぶし三角）は仔ウシ胸腺ＤＮＡの濃度が８，６００μｇ／ｍｌの試料を表し、＋は放射線標識大腸菌ＤＮＡ４３μｇ／ｍｌを内部標準として８，６００μｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡを加えた試料を表す（新生化学実験講座、核酸Ｉ  １９９頁）。
第３図は、実施例の操作の流れを表す。
第４図（Ａ）は、Ｅ／ＢターゲットＤＮＡ  Ｓｓｅ８３８７Ｉ処理画分４μｌをＰＣＲによりそれぞれの遺伝子を増幅し、１０μｌを常法により、１００ボルト、４０分間、３％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジュームブロマイドで染色したときの電気泳動ゲルを示す。レーン１：大腸菌遺伝子、レーン２：枯草菌遺伝子、レーン３：酵母遺伝子（参考）、レーン４：サイズマーカーＤＮＡ（下より１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２００、１，５００塩基対。以下同じ。）
第４図（Ｂ）は、Ｈ／Ｅ／ＢターゲットＤＮＡ  Ｓｓｅ８３８７Ｉ処理画分４μｌをＰＣＲによりそれぞれの遺伝子を増幅し、１０μｌを常法により、１００ボルト、４０分間、３％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジュームブロマイドで染色したときの電気泳動ゲルを示す。レーン１：サイズマーカーＤＮＡ、レーン２：ヒト遺伝子、レーン３：大腸菌遺伝子、レーン４：枯草菌遺伝子
第５図（Ａ）は、アルカリ処理しエタノール沈殿させた核酸を１８μｌ水＋１μｌ  ＴＥに溶解、１０ｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｘ１０、ｄＮＴＰ、ｒＴａｑ、プライマーセットを加えて２５μｌの反応液とし、ＰＣＲを行い、反応液の一部を常法により、１００ボルト、４０分間、３％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジュームブロマイドで染色したときの電気泳動ゲルを示す。レーン１，２，４，５，７，８は３μＬ、レーン３，６は９μＬの反応液の一部を用いた。レーン１：１０大腸菌遺伝子、レーン２：１０枯草菌遺伝子、レーン３：２０大腸菌遺伝子、レーン４：２０大腸菌遺伝子、レーン５：２０枯草菌遺伝子、レーン６：３０大腸菌遺伝子、レーン７：３０大腸菌遺伝子、レーン８：３０枯草菌遺伝子、レーン９：サイズマーカーＤＮＡ
第５図（Ｂ）は、アルカリ処理しエタノール沈殿させた核酸を１８μｌ水＋１μｌ  ＴＥに溶解、１０ｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｘ１０、ｄＮＴＰ、ｒＴａｑ、プライマーセットを加えて２５μｌの反応液とし、ＰＣＲを行い、当量の反応液の一部を常法により、１００ボルト、４０分間、３％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジュームブロマイドで染色したときの電気泳動ゲルを示す。レーン１：サイズマーカーＤＮＡ、レーン２：３０ヒト遺伝子、レーン３：３０大腸菌遺伝子、レーン４：３０枯草菌遺伝子
第６図  本発明に係る微量遺伝子濃縮方法の一態様における操作の流れを示す。なお、点線は、多量遺伝子の除去状態を検出する場合の操作の流れを示す。
第７図は、実施例２の試験例１の結果を示す。ターゲットＤＮＡ（００）、１０、２０、３０をＰＣＲによりそれぞれの遺伝子を増幅した。８μｌを、１００Ｖ、３０分間、０．８％アガロース（株式会社ニッポンジーン製）で電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色した。サイズマーカーにはλ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔを用いた。レーン１：サイズマーカーＤＮＡ（λ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、レーン２：００大腸菌遺伝子、レーン３：００Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ遺伝子、レーン４：１０大腸菌遺伝子、レーン５：１０Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ遺伝子、レーン６：２０大腸菌遺伝子、レーン７：２０Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ遺伝子、レーン８：３０大腸菌遺伝子、レーン９：３０Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ遺伝子、レーン１０：大腸菌のテンプレートＤＮＡを含まないＰＣＲ反応液、レーン１１：Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅのテンプレートＤＮＡを含まないＰＣＲ反応液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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