(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚発生中の鶏卵のみに含有され、分子量が４３，０００〜４７，０００であって、１％濃度の水溶液を９０℃で１０分間加熱した場合に、セリンプロテアーゼ及びチロシナーゼの阻害効果が付加されることを特徴とする、ＨＳ−オボアルブミン。
【請求項２】
無精卵に含有されるオボアルブミンの構造に対して、α−ヘリックス構造が２５％減少し、β−シートが３０％増加している構造を有することを特徴とする、請求項１のＨＳ−オボアルブミン。
【請求項３】
請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの水溶液を、８０〜１００℃の範囲内で３〜３０分間加熱することにより得られる、セリンプロテアーゼ及びチロシナーゼの阻害効果を有することを特徴とする機能性蛋白質。
【請求項４】
胚発生中の卵白を中性緩衝液及び硫酸アンモニウムを用いて、グロブリン画分を除去した後、硫酸アンモニウムを更に加えて沈殿物を生成し、回収することを特徴とする、請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの含有物の製造方法。
【請求項５】
請求項４で得られた沈殿物に、水透析及び遠心分離を行って硫酸アンモニウム及び不純物を除去する工程と、硫酸アンモニウムを更に加えて沈殿物を再度生成して回収する工程により純度を高めることを特徴とする、請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの含有物の製造方法。
【請求項６】
請求項４若しくは５の沈殿物の回収後の上澄液に対し、硫酸アンモニウムの添加及び酸性の水溶液のｐＨ調整によって、沈殿物を生成して回収することを特徴とする、請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの含有物の製造方法。
【請求項７】
請求項５の方法により得られた沈殿物に対し、水透析及び遠心分離を行って硫酸アンモニウム及び不純物を除去する工程と、硫酸アンモニウムを更に加えて沈殿物を再度生成して回収する工程を順次繰り返すことにより、純度を高めることを特徴とする、請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの含有物の製造方法。
【請求項８】
請求項６の方法により得られた沈殿物に対し、水透析及び遠心分離を行って硫酸アンモニウム及び不純物を除去する工程と、硫酸アンモニウムの添加及び酸性の水溶液のｐＨ調整により沈殿物を再度生成して回収する工程を順次繰り返すことにより、純度を高めることを特徴とする、請求項１若しくは２のＨＳ−オボアルブミンの含有物の製造方法。
【請求項９】
請求項４〜８の製造方法によって得られたＨＳ−オボアルブミンを含有する物質からＨＳ−オボアルブミンを精製する方法において、
オボアルブミンを吸着する陽イオン交換吸着工程と、
前記の陽イオン交換吸着工程により得られたオボアルブミンを陰イオン交換担体を用いてオボアルブミンを吸着する陰イオン交換担体工程と、
前記の陰イオン交換吸着工程より得られたオボアルブミンからＮ−オボアルブミンを除去し、ＨＳ−オボアルブミンのみを回収する工程、
前記のオボアルブミン回収工程を経て不純物を除去する工程、とを有することを特徴とする、ＨＳ−オボアルブミンの精製方法。
【請求項１０】
チロシナーゼ活性阻害剤として、請求項３の機能性蛋白質を含有することを特徴とする化粧品。
【請求項１１】
請求項３の機能性蛋白質を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胚発生中の鶏卵より得られるＨＳ−オボアルブミンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニワトリ卵白蛋白質の５４％は、分子量約４万５千の糖蛋白質であるオボアルブミンによって占められており、その構造からserpin superfamilyに属するが、プロテアーゼインヒビター活性を示さないことから、アミノ酸供給源以外の機能は不明である。
これまでの研究から、オボアルブミンを含む卵白蛋白質の胚の利用形態は、発生中に卵黄嚢へ移行し、卵黄嚢膜から吸収される経路と、羊膜内に入り、羊水成分となり、胚へ飲食された後、利用される経路の２つがあると思われ、いずれも分解後に吸収されるものと考えられている。
【０００３】
しかし、胚血清には分解されない状態のオボアルブミンなどの卵白蛋白質が検出されていることから、一部には分解を受けずに胚へ吸収されていることが予想される。
新鮮な無精卵より精製したオボアルブミン（Ｎ−オボアルブミン）は８０℃で変性凝固するが、ｐＨ９〜１１で５０〜６０℃で１〜３日間攪拌しながらインキュべートすると８０℃でも凝固しないオボアルブミン（Ｓ−オボアルブミン）を作製することができる。
【０００４】
また、鶏卵あるいは卵白を長時間貯蔵するとＳ−オボアルブミンが生じてくる。
この変化はタンパク構造の変化として考えられ、二次構造にはほとんど変化が見られないとされ、三次構造の変化に基づくと推定されている。
前記のごとくＳ−オボアルブミンは耐熱性を有するが、機能性が不十分であり、その他の有効な効果を見出し得ていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、卵白に含有される蛋白質から食品加工分野のみならず、化粧品、医薬品等の分野にも使用しうる、新規な特性を有する機能性蛋白質を製造することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明において、ニワトリの胚発生中の卵白にもオボアルブミンは熱安定型（ＨＳ−オボアルブミン）として存在することを確認した。
発生１１日目の卵白、１４日目以降の卵黄、１４日目以降の羊水及び胚血清のオボアルブミンの８０〜９０％は熱安定型に変化していることがわかった。
前記のＨＳ−オボアルブミンの構造はＮ−オボアルブミンや人工的に作製したＳ−オボアルブミンとはα−ヘリックス構造が２５％減少し、β−シートが３０％増加している。
【０００７】
ＨＳ−オボアルブミンとＳ−オボアルブミンとは、蛋白質の一次構造には違いはないが、糖鎖構造の違いによる分子量の違いが見られる。
また、分子量や示差熱容量計の測定パターンも異なっている。
オボアルブミンはセリンプロテアーゼインヒビターのserpin superfamilyに属しているがプロテアーゼインヒビター活性はない。
【０００８】
serpinは一般にＣ末端側のcenter rative loopがプロテアーゼによって切断されたとき、切断されたループが速やかに構造中心へインサートされることによりプロテアーゼインヒビターとして機能を発揮すると考えられているのに対し、オボアルブミンは切断されたループの構造中心へのインサートが非常に遅いことからプロテアーゼインヒビター活性を有さないとされている。
未発生の鶏卵の卵白のオボアルブミンはいわゆるＮ−オボアルブミンであり、８０℃で熱凝固する。
【０００９】
しかし、Ｎ−オボアルブミンを高ｐＨと高温度下で処理すると８０℃でも熱凝固しないいわゆるＳ−オボアルブミンに変化させることができる。
この変化の詳細なメカニズミは解明されていないが、２次構造上の変化は少ないとされている。
胚発生中に得られるＨＳ−オボアルブミンは、前述したようにこれらのＮ−若しくはＳ−オボアルブミンに比べて２次構造のα−ヘリックス構造が２５％減少し、β−シートが３０％増加している。
また、ＨＳ−オボアルブミンを処理するとプロテアーゼインヒビターなどの機能が付加される。
【００１０】
これは、図１の（ａ）と（ｂ）に示すように、２次構造の変化したＨＳ−オボアルブミンの蛋白質の構造が高温により更に構造変化を起こし、プロテアーゼによって切断されたcenter rative loopが蛋白質の構造中心にあるβ−シートへ速やかにインサートされるため、プロテアーゼがブロックされるものと考える。
この現象は人工的に作られたＳ−オボアルブミンには見られない。
ＨＳ−オボアルブミンは構造変化を起こしており、これがこの蛋白質の機能に関係していると推定される。
【００１１】
以上のことからＨＳ−オボアルブミンとＳ−オボアルブミンとは同じオボアルブミンであると思われるが、その性質、潜在的機能は大きく異なっていると思われる。
実際、ＨＳ−オボアルブミンとＳ−オボアルブミンは、次のような性状の差異があることが確認された。
第一に、ＨＳ−オボアルブミンには幾つかの種類があり、種類によって耐熱性が異なるが、耐熱性に関しては、いずれも８０℃では全く変性凝固しない。
後述する精製方法によって、９０℃あるいは１００℃でも変性凝固しないものを分離することができる。
【００１２】
第二に、ＨＳ−オボアルブミンはＮ−オボアルブミンやＳ−オボアルブミンに比べ、ペプシンに対して抵抗性を示すが、キモトリプシンに対してはそれらより分解されやすい。
しかし、ＨＳ−オボアルブミンを８０℃以上で加熱するとキモトリプシン等の酵素に対して強い阻害作用を発揮するようになる。
Ｎ−オボアルブミンやＳ−オボアルブミンではこのような作用はない。
【００１３】
更に第三として、加熱したＨＳ−オボアルブミンはキモトリプシンだけでなく、トリプシンなどのプロテアーゼを阻害し、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、チロシナーゼなども阻害する性質を有する。また、抗菌作用もある。
【００１４】
第四として、ＨＳ−オボアルブミンはＮ−オボアルブミンをＨＳ−オボアルブミンに変換することができる。Ｓ−オボアルブミンはＮ−オボアルブミンをＳ−オボアルブミンに変化させる能力はあるが、ＨＳ−オボアルブミンに変化させる能力はない。
【００１５】
本発明の機能性蛋白質は、胚発生中の卵白に含有される特定のオボアルブミンを出発原料とし、これに熱処理を加える工程によって製造されることを特徴とし、また、キモトリプシンやトリプシン等のプロテアーゼ阻害作用、ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅの阻害作用、チロシナーゼ等の阻害作用及び抗菌作用を有し、１００℃で３０〜６０分間加熱しても変性凝固若しくは機能が失われないことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の機能性蛋白質の製造方法は、胚発生中の卵白から特定のオボアルブミンを含有する水溶液を卵白から調製する工程と、かかる水溶液から前記の特定のオボアルブミンを精製する工程と、これに熱処理を加えて本発明の機能性蛋白質を製造する工程からなることを特徴とする。
【００１７】
まず、本発明の機能性蛋白質の原料となる特定のオボアルブミン（以下、ＨＳ−オボアルブミン）を調製する工程について説明する。
ＨＳ−オボアルブミンの調製には、胚発生中の卵の卵白を用いる。
胚発生中の卵としては孵卵１５日目以前のものを用いるが、孵卵７日〜１２日目のものが好ましい。それ以降の孵卵には、不純物が多く生じており、本発明の機能性蛋白質の原料を精製できる量が乏しいためである。
【００１８】
前記の卵白からＨＳ−オボアルブミンを調製するための第一の工程として、まず、卵白からグロブリン画分を除去する。
グロブリン画分を除去する方法は、次のようにおこなう。
前記の卵白に対して１〜３倍量のリン酸生理食塩水等の中性緩衝液を加えて希釈してホモジネートし、卵白と中性緩衝液が均一に混合されているのを確認した後、遠心分離若しくは濾過等の方法により、沈殿物を除去する。
ついで、沈殿物を除去した上澄液に、硫酸アンモニウムを上澄液の３０％飽和濃度にまで徐々に加えて攪拌し、静置する。
攪拌は、混合状態が均一になるまで行い、１０分〜４時間程度行う。
静置後、遠心分離若しくは濾過等の方法で沈殿物を除去することによってグロブリン画分が除去され、前記のＨＳ−オボアルブミンが含有された上澄液が残される。
【００１９】
前記第１工程によりグロブリン画分等の沈殿物を除去した上澄液からは、下記の第２工程及び第３工程により、アルブミン画分が回収される。
第２工程として、前記の上澄液に対し、硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度まで徐々に加えて攪拌し、静置する。
攪拌は、混合状態が均一になるまで行い、１０分〜４時間程度行う。
かかる工程により、前記のＨＳ−オボアルブミンが含有される沈殿物が生じるので、かかる沈殿物を遠心分離若しくは濾過等の方法で回収し、これをＨＳ−アルブミン画分Ｉとする。
【００２０】
次いで、第３工程として、第２工程を経て残った上澄液に対し、酢酸等の酸性の水溶液を加えて、ｐＨを４．５に調整する。
前述の酸性の水溶液として、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸の水溶液及び塩酸、硝酸等の無機酸の水溶液を使用することができる。
前述のごとく、上澄液のｐＨを４．５に調整することによって沈殿が生じるが、このとき沈殿が生じない場合は、更に硫酸アンモニウムを６５％飽和濃度まで徐々に加えて攪拌する。
攪拌は、混合状態が均一になるまで行い、１０分〜４時間程度行う。
かかる工程により、前記のＨＳ−オボアルブミンが含有される沈殿物が生じるので、かかる沈殿物を遠心分離若しくは濾過等の方法で回収し、これをＨＳ−アルブミン画分IIとする。
【００２１】
前述のごとく得られたＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びＨＳ−アルブミン画分IIについて、ＨＳ−オボアルブミンの含有率を高め、不要な蛋白質を除去するべく、更に次のような処理を施す。
前述のＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びＨＳ−アルブミン画分IIは、熱安定性等の性質が異なるので、それぞれ別々に処理をするのが好ましい。
ＨＳ−アルブミン画分Ｉに対しては、不純物を除去し、含有されるＨＳ−オボアルブミンの純度を上げるため、次の処理を行う。
【００２２】
第４工程として、ＨＳ−アルブミン画分Ｉに対して水透析及び遠心分離を行い、硫酸アンモニウム及び不純物を除去する。
前記の水透析は、セロハン膜或いはビスキングチューブ等を使用した一般的な方法により行う。
前記の水透析は、８〜３６時間の範囲内で行う。水透析時間が８時間に満たないと、硫酸アンモニウムの除去が不十分であるが、３６時間程度の水透析で硫酸アンモニウムの除去が十分に行われ、それ以上水透析を行っても硫酸アンモニウムの除去がほとんど進まない。
【００２３】
水透析後、濾過若しくは遠心分離等の方法により沈殿物を除去する。
残った上澄液に対し、ＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びIIを回収するために行った前記の第２工程及び第３工程を再度行う。
このとき、第２工程の処理を施して得られた沈殿物をＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉとし、第２工程を経て残った上澄液に対し、第３工程の処理を施して得られた沈殿物を、ＨＳ−アルブミン画分Ｉ−IIとする。
ＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉに対しては、前記の第４工程を施して硫酸アンモニウム及び不純物を除去し、前記の第２工程の処理と第４工程をもう一度繰り返す。
【００２４】
このように、前記のＨＳ−アルブミン画分Ｉに対し、前記の第２工程の処理と第４工程を順次２回繰り返して行って最終的に得られたものをＨＳ−アルブミン画分Ａとする。
前記のＨＳ−アルブミン画分IIに対しては、不純物を除去し、含有されるＨＳ−オボアルブミンの純度を上げるため、下記の処置を行う。
まず前記のＨＳ−アルブミン画分IIに対して前記の第４工程を行い、硫酸アンモニウム及び不純物を除去する。
残った上澄液に対し、ＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びIIを回収するために行った前記の第２工程及び第３工程を再度行う。
このとき、第３工程により生成する沈殿物をＨＳ−アルブミン画分II−IIとする。
このＨＳ−アルブミン画分II−II及び前記のＨＳ−アルブミン画分Ｉ−IIに対し、それぞれ前記の第４工程を施し、硫酸アンモニウム及び不純物を除去する。処理後の水溶液は、いずれもほぼ同等の性質を有するので、混合して一緒に処理する。
【００２５】
かかる混合物を、ＨＳ−アルブミン画分II−IIMixとする。
ＨＳ−アルブミン画分II−IIMixに対して、前記の第３工程の処理と第４工程を順次施し、最終的に得られたものをＨＳ−アルブミン画分Ｂとする。
前述したように、ＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びＨＳ−アルブミン画分IIは、熱安定性等の性質が異なるので、それぞれ別々に処理をするのが好ましいが、これらを混合して同時に処理することもできる。
この場合は、ＨＳ−アルブミン画分Ｉ及びＨＳ−アルブミン画分IIをそれぞれ前記の第４工程を施し、硫酸アンモニウム及び不純物を除去する。
第４工程を施した後のそれぞれの水溶液は混合され、前述の第２工程、第３工程及び第４工程の処置を２回繰り返す。
このような処置を施して最終的に得られたものを、ＨＳ−アルブミン画分Ｃとする。
【００２６】
ＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣはいずれもＨＳ−オボアルブミンを含んでおり、その性質には差がないと思われる。但し、ＨＳ−アルブミン画分Ｂが最も純度が高い。
ＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣを保存する場合、０℃で保存すれば性質を損なうことなく１ヶ月間安定に保存できる。また、凍結乾燥は性質が損なわれるので避ける。１ヶ月以上の長期間保存する場合は、ＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣを硫酸アンモニウム５０％飽和の状態で保存する。
前記のＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣには高い濃度で、本発明の機能性蛋白質の原料となる特定のオボアルブミンが含有されている。
【００２７】
しかしながら、８０℃程度で変性凝固するオボアルブミン（Ｎ−オボアルブミン）も含有される。そこで、前記のＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣに対し次の精製工程を施し、目的とするＨＳ−オボアルブミンの純度を高め、Ｎ−オボアルブミンを除去する。
【００２８】
精製工程は、前記の調製工程により得られたＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣの水溶液、若しくはこれらの混合液を一定のｐＨに平衡化する平衡化工程と、前記平衡化工程により平衡化された水溶液から陽イオン交換担体を用いてオボアルブミンを吸着する陽イオン交換吸着工程と、
前記の陽イオン交換吸着工程により得られたオボアルブミンを陰イオン交換担体を用いてオボアルブミンを吸着する陰イオン交換担体工程と、
前記の陰イオン交換吸着工程より得られたオボアルブミンからＮ−オボアルブミンを除去し、目的のＨＳ−オボアルブミンを回収する工程、
前記のＨＳ−オボアルブミン回収工程より得られたＨＳ−オボアルブミンから不純物を除去する工程よりなる。
【００２９】
まず、平衡化工程において、ＨＳ−アルブミン画分Ａ、Ｂ及びＣの水溶液、若しくはこれらの混合液に酢酸ナトリウム緩衝液を混合して、ｐＨ４．５に平衡化する。
次いで、陽イオン交換吸着工程において、前述の緩衝液を用いてｐＨ４．５にて平衡化された陽イオン交換担体を用意し、これを用いて前述の平衡化された水溶液からオボアルブミンを吸着する。
陽イオン交換担体は、カルボキシルメチルセルロース系の交換体など、陽イオン交換担体であれば、いずれも使用することができる。
オボアルブミンを吸着した陽イオン交換担体は、ｐＨを４．５に調製した酢酸ナトリウム緩衝液でよく洗浄した後、ｐＨ４．８〜５．０に調製した酢酸ナトリウム緩衝液にイオン交換担体を浸漬し、オボアルブミンを溶出させる。
陽イオン交換担体に吸着したオボアルブミンは、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）でオボアルブミンを溶出され、これを限外濾過で濃縮する。
限外濾過は、一般的な方法により行われる。例えば、分子量１００００以下の分子ふるい能力を有するメンブランを用いて行うことができる。
【００３０】
前記の陽イオン交換吸着工程によって集められ、限外濾過で濃縮されたオボアルブミンを、トリス塩酸緩衝液を混合して、ｐＨ７．５に平衡化する。
次いで、陰イオン交換吸着工程において、トリス塩酸緩衝液を用いてｐＨ７．５にて平衡化された陰イオン交換担体を用意し、これを用いて前述の平衡化されたオボアルブミン水溶液から、オボアルブミンを吸着する。
陰イオン交換体は、ＤＥＡＥセルロース系の交換体など、陰イオン交換体であれば、いずれも使用することができる。
オボアルブミンを吸着した陰イオン交換担体は、ｐＨを７．５に調製したトリス塩酸緩衝液でよく洗浄した後、０．１モル／Ｌ濃度の塩化ナトリウムを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にイオン交換担体を浸漬し、Ｎ−オボアルブミンを溶出させる。
【００３１】
次に、０．１５〜０．５モル／Ｌ濃度の塩化ナトリウムを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にイオン交換担体を浸漬し、ＨＳ−オボアルブミンを溶出させる。
ＨＳ−オボアルブミンを溶出させる時の塩化ナトリウムの濃度は、０．１５〜０．３モル／Ｌ濃度で行うのが好ましい。
このとき回収が悪ければ、前記の塩化ナトリウム濃度を０．５モル／Ｌまで上げることによってＨＳ−オボアルブミンの回収を高めることができる。
このようにして回収されたＨＳ−オボアルブミンは、限外濾過で濃縮される。
限外濾過は、一般的な方法により行われる。例えば、分子量１００００以下の分子ふるい能力を有するメンブランを用いて行うことができる。
以上の操作により、ＨＳ−オボアルブミンを精製できる。
【００３２】
確認のため、電気泳動等の方法によって、精製物に含有されるＨＳ−オボアルブミンの純度を測定する。
このとき、分子量が４５０００の単一バンドでなければ、ゲル濾過工程においてＨＳ−オボアルブミンを精製することができる。
ゲル濾過は、分子量１００００〜１０００００の分子ふるい能力を有するゲル濾過クロマトグラフィーによって行い、溶出部分のうち４５０００にピークを有するもののみを採取する。
このとき、分子量が４３，０００〜４７，０００の範囲内の蛋白質を採取する。
このように、ゲル濾過工程を加えると、極めて純度の高いＨＳ−オボアルブミンを抽出することができる。
【００３３】
ＨＳ−オボアルブミンを用いて、次の方法により、Ｎ−オボアルブミンをＨＳ−オボアルブミンに転換させることができる。
滅菌したＮ−オボアルブミンを水に溶解し、１％濃度の水溶液を調製する。
Ｎ−オボアルブミン水溶液に前述のＨＳ−オボアルブミンを加える。
このとき必要なＨＳ−オボアルブミンの量は、Ｎ−オボアルブミンの１〜１０％の範囲内である。
そして、かかる水溶液を３８℃にて５〜１０日間インキュベートする。
【００３４】
インキュベート期間が、５日間より短いと、Ｎ−オボアルブミンの転換が不十分であり、インキュベート期間が長すぎるとＮ−オボアルブミンに戻ってしまうからである。インキュベート期間は、７日間が好ましい。
水溶液のｐＨは、酸性及び中性でも行うことができるが、８〜１０程度が好ましい。
【００３５】
本発明の機能性蛋白質は、前記の精製工程により精製されたＨＳ−オボアルブミン、若しくは前記のごとくＮ−オボアルブミンから製造されたＨＳ−オボアルブミンを使用して、次の製造工程の処理を施すことにより、本発明の機能性蛋白質が製造される。
ＨＳ−オボアルブミンの濃度が０．０１〜５％の水溶液を調整し、これを８０〜１００℃の範囲内で加熱する。加熱時間は３〜３０分間が好ましい。
このように、加熱処理を施したＨＳ−オボアルブミンはキモトリプシンだけでなく、トリプシンなどのプロテアーゼを阻害し、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、チロシナーゼ等に対して、幅広いプロテアーゼ活性阻害スペクトルを有する。
また、抗菌性も有する。
キモトリプシンやトリプシンは動物、植物または微生物に含まれる蛋白質の消化酵素である。
正常な状態ではこれらの酵素による自己消化の危険性はないが、疾病やストレス、疲労等の原因でその活性が異常に高まったりする。
そして、発癌の初期の段階で、これらのプロテアーゼが何らかの重大な関わりを有することが示唆されてきた。
【００３６】
なお、本発明の機能性蛋白質は、次の方法によっても製造することができる。すなわち、孵卵７〜１２日目の胚発生中の鶏卵より採取した卵白を、３〜２０倍の水で希釈して、ホモジネートする。これを、遠心分離若しくは濾過して沈殿物を除去し、上澄液を８０〜１００℃の温度で１０〜３０分間加熱する。次いで、遠心分離若しくは濾過して沈殿物を除去する。このときの上澄液は、前述の加熱したＨＳ−オボアルブミンであり、本発明の機能性蛋白質として使用できる。ここで、純度を高くするには、硫安分画、ＣＭ−セルロファイン、ＤＥＡＥ−セルロファイン等の方法を行って純度を高めることができる。
なお、機能性蛋白質を含有する水溶液のｐＨは、酸性、中性、アルカリを問わないので、本発明の機能性蛋白質は、幅広い分野に応用することができる。
【００３７】
本発明の機能性蛋白質は、これらのセリンプロテアーゼに対し、強力な阻害効果を有するので、胃腸の粘膜保護剤として、ストレスによる潰瘍形成、腫瘍、血液凝固等のセリンプロテアーゼに基づく疾患を治療若しくは予防するための医薬品の成分として、或いは健康食品の素材として利用することができる。
また、食品の加工中及び貯蔵中において、食品自体に含有されるセリンプロテアーゼによって品質劣化が生じるが、食品に本発明の機能性蛋白質を使用することにより、食品の品質劣化の防止に役立てることができる。
また、前記のチロシナーゼは、皮膚のメラニン形成に深く関与しており、皮膚などの結合組織の主成分であるヒアルロン酸とコラーゲンを分解する酵素でもある。
【００３８】
本発明の機能性蛋白質はチロシナーゼの活性を強力に阻害するので、化粧品に用いることによって、肌の黒ずみやシミなどの美白効果が期待できるだけでなく、皮膚の保湿及びシワの発生予防効果が期待される。
このように、本発明の機能性蛋白質は、皮膚を若々しく保つための成分として、化粧品に配合することもできる。
本発明の機能性蛋白質は、前述したように抗菌効果を有するので、口腔用組成物に配合して口腔内細菌の繁殖を防止するのに好適である。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
［１１日目卵白からの機能性蛋白質の製造］
図６に示すように、１１日目卵より採取した卵白を１０倍水で希釈して、ホモジネートする。これを１０，０００Ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿物を除く。上清液を８０℃で１０分間加熱する。同様に１０，０００Ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿物を除く。上清液は加熱したＨＳ−オボアルブミンであり、このまま機能性蛋白質として使用できる。
【００４１】
［ＨＳ−オボアルブミンの製造］
▲１▼（グロブリン画分の除去）
孵卵１１日の卵白を回収し、３倍量のリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、ホモジネートし、遠心分離（５，０００rpm／min，１０min，０℃）し、沈殿物を除去した。
【００４２】
▲２▼（ＨＳ−アルブミン画分Ｉの調製）
グロブリン画分除去後の上澄液に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるように徐々に加え、３０分ほど攪拌して静置した。
遠心分離（５，０００rpm／min）して沈殿のグロブリン画分を除いた。
上澄液に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加え、２時間攪拌した。
静置後、遠心分離（１０，０００rpm，１０min，０℃）して回収した。
遠心分離により回収した沈殿物をＨＳ−アルブミン画分Ｉとした。
ＨＳ−アルブミン画分Ｉについて水透析を行なって硫酸アンモニウムを除去し、残留する沈殿物を不純物として遠心分離で除去した。
【００４３】
▲３▼（ＨＳ−アルブミン画分IIの調製）
ＨＳ−アルブミン画分Ｉを回収した後の上澄液に１モルの酢酸を加えてｐＨを４．５に調製し、次いで硫酸アンモニウム濃度を１０％程度上げた。
このとき生じた沈殿物を遠心分離（１０，０００rpm，１０min，０℃）して回収した。
遠心分離により回収した沈殿物をＨＳ−アルブミン画分IIとした。
ＨＳ−アルブミン画分IIについて水透析を行なって硫酸アンモニウムを除去し、残留する沈殿物を不純物として遠心分離で除去した。
【００４４】
▲４▼（ＨＳ−アルブミン画分Ａの調製）
水透析及び不純物除去後のＨＳ−アルブミン画分Ｉについて、下記の処理を行った。
硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加え、２時間攪拌して沈殿物を生成させ、かかる沈殿物を遠心分離（１０，０００rpm／min，１０min，０℃）で回収した。
かかる沈殿物をＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉとする。
次いで、前記のＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉ回収後の上澄液に酢酸を加え、ｐＨを４．５に調製した。
更に、硫酸アンモニウム濃度を６５％飽和になるように加え、沈殿物を遠心分離で回収した。
この処理工程で回収した沈殿物をＨＳ−アルブミン画分Ｉ−IIとする。
ＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉ及びＨＳ−アルブミン画分Ｉ−IIを、それぞれ水に溶解し、水透析して硫酸アンモニウムを除去した。
水透析後のＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉに対して、ＨＳ−アルブミン画分ＩからＨＳ−アルブミン画分Ｉ−Ｉを回収するまでの前記の工程を再度施し、得られた液状物質をＨＳ−アルブミン画分Ａとする。
【００４５】
▲５▼（ＨＳ−アルブミン画分Ｂの調製）
水透析及び不純物除去後のＨＳ−アルブミン画分IIについて、下記の処理を行った。
硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加えて２時間攪拌した後、酢酸を加え、ｐＨを４．５に調製した。
更に、硫酸アンモニウム濃度を６５％飽和になるように加え、沈殿物を遠心分離で回収した。
この処理工程で回収した沈殿物を水に溶解し、水透析したものをＨＳ−アルブミン画分II−IIとする。
ＨＳ−アルブミン画分II−II及び前記の水透析後のＨＳ−アルブミン画分Ｉ−IIを混合し、かかる混合物についてＨＳ−アルブミン画分IIからＨＳ−アルブミン画分II−IIを回収するまでの前記の工程を再度施し、得られた液状物質をＨＳ−アルブミン画分Ｂとする。
【００４６】
［ＨＳ−オボアルブミンの精製］
ＨＳ−アルブミン画分Ａ及びＨＳ−アルブミン画分Ｂのそれぞれの水溶液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を混合して、ｐＨ４．５に平衡化した。
次いで、前述の緩衝液でｐＨ４．５に平衡化されたＣＭ−セルロースのカラムに吸着させ、前記のカラムを５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）で良く洗浄した。
次いで、ｐＨ４．８に調製した酢酸ナトリウム緩衝液にイオン交換担体を浸漬し、オボアルブミンを溶出させた。
前記の溶出されたオボアルブミンを、分子量１００００以下の限外濾過で濃縮した。
前記の陽イオン交換吸着工程によって集められ、限外濾過で濃縮されたオボアルブミンを、トリス塩酸緩衝液を混合して、ｐＨ７．５に平衡化した。
【００４７】
次いで、トリス塩酸緩衝液を用いてｐＨ７．５にて平衡化されたＤＥＡＥセルロースカラムカラムを用意し、これを用いて前述の平衡化されたオボアルブミン水溶液から、オボアルブミンを吸着した。
オボアルブミンを吸着した前記カラムを、ｐＨ７．５のトリス塩酸緩衝液でよく洗浄した後、０．１モル／Ｌ濃度の塩化ナトリウムを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に前記カラムを浸漬し、Ｎ−オボアルブミンを溶出させた。
次に、０．２モル／Ｌ濃度の塩化ナトリウムを含有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に前記カラムを浸漬し、ＨＳ−オボアルブミンを溶出させた。
このようにして回収されたＨＳ−オボアルブミンを、分子量１００００以下の限外濾過で濃縮した。
限外濾過を行い、濃縮されたものをＳＤＳ−電気泳動で純度を確認したところ、４５Ｋの単一バンドであることが確認された。
【００４８】
［ＨＳ−オボアルブミンの切断パターン］
ＨＳ−オボアルブミンを幾つかのプロテアーゼで消化したときの切断パターンを図２に示す。また、比較のため、Ｎ−オボアルブミンの切断パターンも示す。ブタペプシン、サーモライシンに対してＨＳ−オボアルブミンは消化され難くなっているが、逆にキモトリプシンに対して消化されやすくなっていることがわかる。
【００４９】
［機能性蛋白質の作製］
ＨＳ−オボアルブミンの機能付加は、１％濃度のＨＳ−オボアルブミン水溶液を９０℃にて１０分間加熱することによって行った。
以下、かかる機能性蛋白質を含有する水溶液を試料溶液として、次のごとく試験を行った。
【００５０】
［チロシナーゼ阻害作用試験］
まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０5個／ｍｌで含有する培養溶液を、凍結融解及び遠心分離を行うことにより、チロシナーゼ粗酵素液を抽出した。
次いで、前述のチロシナーゼ粗酵素液１ｍｌを、０．１％ｄｏｐａ添加５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌ、前述の試料溶液を混合し、３７℃に保持しながら経時的に、吸光度（λ＝４７５ｎｍ）測定を行った。
共存する機能性蛋白質がチロシナーゼに対して所定の阻害活性を発揮すれば、その阻害の程度に応じてｄｏｐａ（３，４−ジオキシフェニルアラニン）の分解が低減され、吸光度が低下する。
【００５１】
比較のため、Ｎ−オボアルブミン及び加熱していないＨＳ−オボアルブミンの水溶液についても、同様の手法にて吸光度測定を行った。その結果を図３の（ａ）及び（ｂ）に示す。
図３の（ａ）は、Ｎ−オボアルブミンについて行ったチロシナーゼ阻害作用試験結果である。
Ｎ−オボアルブミンの濃度を０．００２５％〜０．１％に調製したもの、及び加熱したＮ−オボアルブミンを用いて行ったが、いずれもチロシナーゼの阻害効果はごく僅かであり、明確な効果は認められなかった。
図３の（ｂ）は、ＨＳ−オボアルブミン及び本発明の機能性蛋白質について行ったチロシナーゼ阻害作用試験結果である。
【００５２】
ＨＳ−オボアルブミンを使用した場合は、含有量を高める程、チロシナーゼの阻害効果が明確になることがわかった。
しかしながら、濃度が０．１％及び０．２％ではチロシナーゼ阻害効果が殆ど同程度であり、濃度をこれ以上高めてもチロシナーゼ阻害効果の向上は期待できない。
【００５３】
一方、本発明の機能性蛋白質の場合、濃度が０．０１％であってもチロシナーゼ阻害効果は極めて高いことがわかった。
Ｎ−オボアルブミン及びＨＳ−オボアルブミンについては、０．０１％の濃度ではチロシナーゼ阻害効果は認められないか、同程度のものであるが、本発明の機能性蛋白質の場合、濃度が０．０１％であってもチロシナーゼ阻害効果は極めて高い。
また、濃度を０．０２％に高めることによって、更にチロシナーゼ阻害効果が高められることがわかった。
【００５４】
［キモトリプシン阻害作用試験］
（１）基質溶液及び酵素溶液の調製
キモトリプシン活性はＤｅｌｍａｒら（Anal. Biochem. 99, 316, 1979）の方法に準じて行った。
つまり、基質溶液として、N-succinyl-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide  ６３ｍｇを１ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、これに２０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて全容量が１００ｍｌなるように調製した。
酵素溶液として、Ｓｉｇｍａ社製ウシ膵臓α−キモトリプシンを０．２％となるように１ｍＭ 塩酸水溶液で溶解したものを調製した。
【００５５】
（２）ＨＳ−オボアルブミンのキモトリプシン阻害作用試験
１００μｌの酵素溶液と１００μｌの０．１％のＨＳ−オボアルブミン水溶液を混合し、室温下で１０分間インキュベートした。
１００μｌの基質溶液及び８００μｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、蒸留水８０μｌを３８℃でプレインキュベートし、これに前述のＨＳ−オボアルブミンを含有する酵素溶液を２０μｌ添加して反応を開始した。
反応速度を分光光度計で可視４１０ｎｍでスキャンして１分間あたり直線で増加する吸光度から反応速度を求めて、キモトリプシンの残存活性を測定した。
なお、コントロールとして、酵素溶液のみを用いて反応させた場合について反応速度を測定し、その結果を比較に用いた。
【００５６】
（３）加熱ＨＳ−オボアルブミンのキモトリプシン阻害作用試験
ＨＳ−オボアルブミンを８０、９０及び９７℃で１０分間加熱したものをサンプルとして、それぞれのキモトリプシン阻害作用試験を行った。
１００μｌの基質溶液及び８００μｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、蒸留水８０μｌ、加熱したＨＳ−オボアルブミンの水溶液を１０ｍｌの混合液を３８℃でプレインキュベートし、これに１０μｌの酵素溶液を添加して、トリプシンの残存活性を測定した。
加熱ＨＳ−オボアルブミンの水溶液として、濃度が０．１％のものと０．２％のものについて、上記試験に使用した。
【００５７】
（４）キモトリプシン阻害作用試験結果
キモトリプシン阻害作用の試験結果を図４に示す。
非加熱のＨＳ−オボアルブミンのキモトリプシン阻害作用は、酵素のみの場合（コントロール）と比較してほとんど差がなく、キモトリプシン阻害作用は認められなかった。
一方、加熱したＨＳ−オボアルブミンの場合、８０〜９０℃の範囲内においては、加熱温度が高い程、キモトリプシンの活性阻害効果が高いことがわかった。また、加熱ＨＳ−オボアルブミンの濃度を高くした場合についても、効果が高まることがわかった。
【００５８】
［トリプシン阻害作用試験］
（１）基質溶液及び酵素溶液の調製
トリプシン活性は、Ｅｒａｎｇｅｒらの方法に準じて行った。
すなわち、基質溶液として、ＢＡＮＡ（Nα-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide）４４ｍｇを１ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、これに２０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて全容量が１００ｍｌになるように調製した。
【００５９】
（２）ＨＳ−オボアルブミンのトリプシン阻害作用試験
１００μｌの酵素溶液と１００μｌの０．１％のＨＳ−オボアルブミン水溶液を混合し、室温下で１０分間インキュベートした。
１００μｌの基質溶液及び８００μｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、蒸留水８０μｌを３８℃でプレインキュベートし、これに前述のＨＳ−オボアルブミンを含有する酵素溶液を２０μｌ添加して反応を開始した。
反応速度を分光光度計で可視４１０ｎｍでスキャンして１分間あたり直線で増加する吸光度から反応速度を求めて、トリプシンの残存活性を測定した。
なお、コントロールとして、酵素溶液のみを用いて反応させた場合について反応速度を測定し、その結果を比較に用いた。
【００６０】
（３）加熱ＨＳ−オボアルブミンのトリプシン阻害作用試験
ＨＳ−オボアルブミンを８０、９０及び９７℃で１０分間加熱したものをサンプルとして、それぞれのトリプシン阻害作用試験を行った。
１００μｌの基質溶液及び８００μｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、蒸留水８０μｌ、加熱したＨＳ−オボアルブミンの水溶液を１０ｍｌの混合液を３８℃でプレインキュベートし、これに１０μｌの酵素溶液を添加して反応させ、トリプシンの残存活性を測定した。
加熱ＨＳ−オボアルブミンの水溶液として、濃度が０．１％のものと０．２％のものについて、上記試験に使用した。
【００６１】
（４）トリプシン阻害作用試験結果
トリプシン阻害作用の試験結果を図５に示す。
非加熱のＨＳ−オボアルブミンのトリプシン阻害作用は、酵素のみの場合（コントロール）と比較してほとんど差がなく、トリプシン阻害作用は認められなかった。
一方、加熱したＨＳ−オボアルブミンの場合、８０〜９０℃の範囲内においては、加熱温度が高い程、トリプシンの活性阻害効果が高いことがわかった。
また、加熱ＨＳ−オボアルブミンの濃度を高くした場合についても、効果が高まることがわかった。
【００６２】
［ＨＳ−オボアルブミンの加熱による影響］
ＨＳ−オボアルブミンは、８０℃で１時間加熱してもプロテアーゼインヒビター活性は失われない。
９０℃では３０分間加熱では活性の低下は認められないが、１時間以上加熱すると、２０％程度の活性の低下が認められた。
１００℃付近の加熱では、２０分間加熱では活性の低下が認められないが、１時間加熱すると３０％程度の活性の低下が認められた。
【００６３】
［化粧品原料としての利用］
本発明の機能性蛋白質を用いて、次の処方により常法に従って洗顔クリームを調製した。
【００６４】
0004304267.tif 000002
【００６５】
［口腔用組成物原料としての利用］
本発明の機能性蛋白質を用いて、次の処方により常法に従って口腔用組成物を調製した。
【００６６】
0004304267.tif 000003
【００６７】
［製剤原料としての利用］
次の組成にて、十分に混合し、懸濁剤液とした。
【００６８】
0004304267.tif 000004
【００６９】
［飲料原料としての利用］
次の組成にて、十分に混合し、ドリンク剤を調製した。
【００７０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はＮ−オボアルブミン、（ｂ）はＨＳ−オボアルブミンの構造変化を示す図である。
【図２】ＨＳ−オボアルブミンを幾つかのプロテアーゼで消化したときの切断パターンを示す図である。
【図３】（ａ）はＮ−ＯＶＡが加熱してもチロシナーゼ阻害効果が認められないことを示すグラフ図であり、（ｂ）はチロシナーゼ阻害効果を示すグラフ図である。
【図４】キモトリブシン阻害作用の試験結果を示すグラフ図である。
【図５】トリプシン阻害作用の試験結果を示すグラフ図である。
【図６】オボアルブミンの精製方法の手順を表したフローチャート図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004304267.tif 000008
【図４】
0004304267.tif 000009
【図５】
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【図６】
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