(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Jcl:ICR系統の遺伝的背景を有し、かつClock遺伝子が変異を有し機能不全となり、日周期リズムが夜型を示すマウスであって、Clock遺伝子の変異が、該遺伝子のイントロンのスプライス供与部位の３番目のヌクレオチドにおける、AからTへのトランスバージョン(CAGgtaac→CAGgttac；小文字はイントロンの配列を示す)であり、該遺伝子のエキソン１９が翻訳の際に読み飛ばされ、体温、自発的活動量および／または覚醒時間の日周期リズムが夜型である、上記マウス。
【請求項２】
レム睡眠の日周期リズムが朝型を示す、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
恒暗条件下で２週間以上飼育した場合に飲水行動の長周期リズムが消失しない、請求項１または２に記載のマウス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウス同士を交配させて得られる受精卵。
【請求項５】
受精卵FERM P-18430である、請求項４に記載の受精卵。
【請求項６】
以下の（ａ）のマウスに（ｂ）のマウスを戻し交配することを特徴とする、日周期リズムが夜型を示す請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウスの作製方法；
（ａ）Clock遺伝子が変異を有し機能不全となっているマウスであって、該Clock遺伝子の変異が、該遺伝子のイントロンのスプライス供与部位の３番目のヌクレオチドにおける、AからTへのトランスバージョン(CAGgtaac→CAGgttac；小文字はイントロンの配列を示す)であり、該遺伝子のエキソン１９が翻訳の際に読み飛ばされ、かつBalb/c系統の遺伝的背景を有する前記マウス、
（ｂ）Jcl:ICR系統の遺伝的背景を有するマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、日周期リズム(circadian rhythm)の分子機構の解明を目的とした研究において有効なモデル動物、より詳しくは、体温、自発的活動量、覚醒時間および睡眠等の日周期リズムが夜型を示す動物に関する。また本発明は、本発明の動物同士を交配させて得られる受精卵、本発明の動物の作製方法およびClockタンパク質またはmRNAの安定性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物に内在する約２４時間の日周期リズムは、体内時計(または生物時計)と呼ばれる機構によって制御されていると考えられている。ヒトを対象とした臨床研究においては、睡眠相前進症候群や睡眠相後退症候群、不規則型睡眠覚醒障害、躁鬱病、あるいは身近なところでは時差ぼけ、シフトワークによる睡眠障害など、様々な疾病が体内時計の異常によって引き起こされていると考えられている。
【０００３】
ヒトにおいては、体温や血圧、心拍数等の生理学的パラメーターにおいて日周期リズムが認められるが、それらの日周期リズムの位相には個人差が報告されており、大きく分けて２つのパターンがあることが報告されている。一方のパターンは、日周期リズムの位相が朝の早い時刻にピーク値に達する「朝型」であり、他方は夕方の時刻にピーク値に達する「夜型」である(1939年Kleitman,Sleep and wakefulness, University of Chicago press）。こうした「朝型」「夜型」の違いが児童生徒の不登校等の一因であると考えられていることから、その違いが生じるメカニズムの解明が強く望まれている。近年、分子生物学の急速な進歩に伴い、かかる分子メカニズムが次第に明らかになりつつあるが、未だその詳細なリズム発振機構については不明な点が多く残っている。
【０００４】
従って、日周期リズムに関わる体内時計の全体像、その詳しいメカニズム等の情報を提供することは、基礎研究はもとより、睡眠や恒常性の維持、投薬間隔や薬効の至適時間帯等をはじめとするヒトの生体リズムの関与する各種臨床的な観点からも極めて重要な課題となっている。
【０００５】
最近になって、哺乳動物の最初の体内時計遺伝子であって、体内時計のフィードバックループの構成因子であるClock遺伝子の3'側の遺伝子多型がヒトの「朝型」「夜型」の嗜好性と関連しているかもしれないという論文が発表された（A clock polymorphism associated with human diurnal preference, Sleep, 21,569-576(1997)）。従って、もしげっ歯類においても「朝型」「夜型」がClock遺伝子と関連しているのであれば、「朝型」「夜型」モデル動物を作製することが可能であると考えられる。
【０００６】
こうした考えに伴い、現在、Clock変異モデル動物として、Balb/c系統、C57/BL6系統およびC3H/HeJ系統のClock変異マウスが開発されている（これらのマウスについては、Mutagenesis and Mapping of Mouse Gene, Clock Essential for circadian behavior, Science 264,719-725(1994)に記載されている）。しかしながら、これらのClock変異マウスは、明暗条件下で朝型や夜型の日周期リズムを示さないばかりか、恒暗条件下で数週間飼育すると無周期となってしまう。このため、これらのマウスは体内時計そのもの研究には適しているものの、「朝型」「夜型」の研究用モデル動物としては使用できない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、ヒトを含む哺乳動物における日周期リズムの分子機構を明らかにすべく、斯界で要望される前記所望の情報を提供する事を目的とする。具体的には、本発明の目的は、ヒトにおける日周期リズム異常のメカニズムを解明するための手段として有効な、日周期リズムが夜型を示すモデル動物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、従来から日周期リズム異常のモデル動物として知られていたClock変異マウスをJcl:ICR系統に置換することにより、得られたマウスがこれまでに全く報告の無い「夜型」の日周期リズムを示すことを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち本発明は、日周期リズムが夜型を示し、かつClock遺伝子が変異を有することを特徴とする動物である。
また本発明は、前記動物同士を交配させて得られる受精卵である。
【０００９】
さらに本発明は、以下の（ａ）のマウスに（ｂ）のマウスを戻し交配することを特徴とする、日周期リズムが夜型を示すマウスの作製方法である；
（ａ）Clock遺伝子が変異を有するマウスであって、かつJcl：ICR系統以外の系統の遺伝的背景を有する前記マウス、
（ｂ）Jcl：ICR系統の遺伝的背景を有するマウス。
【００１０】
また本発明は、Clockタンパク質の安定性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法である；
（ａ）本発明の動物からClockタンパク質を単離する工程、
（ｂ）単離したClockタンパク質と候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）Clockタンパク質の分解の有無を確認する工程。
【００１１】
また本発明は、Clock mRNAの安定性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法である；
（ａ）本発明の動物からClock mRNAを単離する工程、
（ｂ）単離したClock mRNAと候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）Clock mRNAの分解の有無を確認する工程。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の動物は、日周期リズムが夜型を示し、かつClock遺伝子が変異を有することを特徴とする動物である。
「日周期リズム」とは、ほぼ24時間周期で繰り返す生理現象を意味する。
【００１３】
「夜型」とは、対象とする動物を明期12時間：暗期12時間の明暗サイクル下で飼育し、特定の生理学的パラメーターの日周期リズムを測定した場合に、そのピーク値が、該動物の活動期の開始時刻を０時として6.0〜12.0時、好ましくは7.0〜7.9時の間で示されることを意味する。ここでいう「活動期」とは、明期および暗期のうち、その動物が主に活動している(覚醒している)いずれか一方の期間を指す。従って、日中に行動する動物の活動期は明期であり、夜中に行動する（いわゆる夜行性）動物の活動期は暗期である。尚、動物の活動期が明期および暗期のいずれであっても、該動物がその期間中常に活動している(覚醒している)わけではないことに注意されたい。
【００１４】
特定の生理学的パラメーターとしては、限定するものではないが、例えば体温、自発的活動量および覚醒時間を挙げることができる。これらの生理学的パラメーターの日周期リズムは、以下に示すようにして測定することができる。
【００１５】
体温；動物の腹腔内に体温の電波遠隔測定装置（TA10TA-F20; Data Sciences Int., USA）を埋め込み、これを介して測定する。得られた測定値を1時間ごとに平均化する。
【００１６】
自発的活動量；動物の首の両側の筋肉に筋電図（EMG）測定のためのテフロン（登録商標）コートされたステンレスワイヤーを埋め込み、該動物の動きに伴うシグナル強度の変化をモニターすることによって測定する。得られた測定値を１時間ごとに平均化する。
【００１７】
覚醒時間；動物の首の両側の筋肉に筋電図（EMG）測定のためのテフロン（登録商標）コートされたステンレスワイヤーを、また該動物の頭蓋骨中に脳波（EEG）測定のためのステンレス小型ねじ式電極を埋め込み、コンピューター画面上で５秒間ごとの脳波および筋電図のパターンを視覚的に同定することによって定量化する。得られた値を１時間ごとに平均化する。
【００１８】
本発明の動物がマウスである場合、上記測定に使用するマウスの週齢は、限定するものではないが、例えば10〜13週齢のものとすることができる。使用するマウスの性別は雄であることが望ましい。何故なら、雌は性周期による影響を受けるからである。
【００１９】
従来のClock変異マウス(Balb/c系統、C57/BL6系統およびC3H/HeJ系統)は、その生理学的パラメーター（体温、自発的活動量および覚醒時間）の日周期リズムが昼型を示すことが知られている（Mutagenesis and Mapping of Mouse Gene, Clock Essential for circadian behavior, Science 264,719-725[1994]）。すなわち、これらのClock変異マウスを本発明の動物同様に12時間:12時間の明暗サイクル下で飼育した場合、その日周期リズムにおけるピーク値は、活動期、すなわち暗期の開始時刻を0時として3.0〜7.0時の間で示される。これに対し、本発明の動物における日周期リズムのピーク値は、既に記載したように、活動期の開始時刻を０時として6.0〜12.0時、好ましくは7.0〜7.9時の間で示される（夜型）。
従って、本発明の動物は、従来のClock変異マウスとは明らかに異なる特性を有するものである。
【００２０】
「Clock遺伝子が変異を有する」とは、Clock遺伝子の遺伝子配列中に特定の変異が生じた結果、該遺伝子の本来の機能が発揮されない状態にあることを意味する。本発明の動物がマウスの場合、かかる変異として、該遺伝子のイントロンのスプライス供与部位の３番目のヌクレオチドにおける、AからTへのトランスバージョン(CAGgtaac→CAGgttac；小文字はイントロンの配列を示す)を挙げることができる。このトランスバージョンが生じた結果、転写活性化部位が機能不全となり、エキソン19が翻訳の際に読み飛ばされる。この場合、Clock遺伝子が変異を有するかどうかは、例えば、Jin X.によって紹介されたPCRによる突然変異検出法(A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock., Cell 96,57-68[1999])に従って上記トランスバージョンの有無を判定することにより確認できる。
【００２１】
本発明の動物のClock遺伝子における前記変異は、該動物が所望の特性を示す限りホモ型でもヘテロ型でもよいが、好ましくはホモ型である。
上記特性を示す本発明の動物としては、ヒトを除く哺乳動物であれば特に限定されないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ハムスターを挙げることができる。また、マウスの好ましい例としては、Jcl:ICR系統の遺伝的背景を有するマウスを挙げることができる。
【００２２】
本発明の動物はさらに、恒暗条件下で２週間以上飼育した場合に、飲水行動の長周期リズムが消失しないことを特徴とする。
「長周期リズム」とは、日周期リズム(ほぼ24時間周期)よりやや長い、27〜28時間周期で繰り返す生理現象を意味する。
飲水行動は、通常の明暗環境条件下では日周期リズムを呈し、通常は各動物の活動期において最も頻繁に見られる行動である。
【００２３】
本発明者らは、従来のClock変異マウス(Balb/c系統、C57/BL6系統)を恒暗条件下で長期間飼育したところ、最初の２週間位で27〜28時間周期(長周期)の飲水行動を示し、その後周期が消滅することを確認した（Mutagenesis and Mapping of Mouse Gene, Clock Essential for circadian behavior, Science 264,719-725[1994]）。
【００２４】
一方、本発明の動物(Jcl:ICR系統のマウス)を同様の恒暗条件下で飼育すると、最初のうちは従来のClock変異マウスと同様に28時間周期(長周期)の飲水行動を示すものの、この周期は飼育開始後２週間を過ぎても消失せず、最長で３ヶ月位までこの長周期が持続した（データは示さず）。このことはすなわち、本発明の動物において、従来のClock変異マウスとは異なる分子機構が日周期に影響を与えていることを示唆している。さらにこの異なる分子機構は本発明の動物の夜型行動にも影響を及ぼしていると予測される。特に注目される点は、この夜型行動を示す本発明の動物が早朝に深いレム睡眠を示す点である。この点は、従来のClock変異マウスでは全く見られなかった新しい性質である。
従って、本発明の動物は、従来のClock変異マウスとは明らかに異なる特性を有するものである。
【００２５】
本発明の動物がマウスである場合、該マウスは、例えば、後述の「日周期リズムが夜型を示すマウスの作製方法」に従って作製することができる。具体的には、本発明のマウスは、実施例１に記載した通りにして作製できる。あるいは、本発明のマウス同士を交配させて得られた受精卵を直接入手し、これを仮親マウスの子宮内に挿入して出産させることによっても得られる。尚、Jcl:ICR系統の遺伝的背景を有する本発明のマウス(Clock遺伝子の変異はホモ型)の受精卵は、平成13年7月25日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号FERM P-18430）。
【００２６】
本発明の動物はさらに、レム睡眠の日周期リズムのピーク値が朝型を示すことを特徴とする。
「朝型」とは、前述の「夜型」とは逆に、対象とする動物を12時間：12時間の明暗サイクル下で飼育した際に、該動物のレム睡眠時間の日周期リズムにおけるピーク値が、該動物の活動期（明期または暗期）の開始時刻を０時として0〜6.0時の間で示されることを意味する。
【００２７】
レム睡眠の日周期リズムは、次のようにして測定する。すなわち、動物の首の両側の筋肉に筋電図（EMG）測定のためのテフロン（登録商標）コートされたステンレスワイヤーを、また該動物の頭蓋骨中に脳波（EEG）測定のためのステンレス小型ねじ式電極を埋め込む。次いで、コンピューター画面上で５秒間ごとの脳波および筋電図のパターンを視覚的に同定することによって定量化し、得られた値を１時間ごとに平均化する。脳波の上でシータ波の出現と筋活動の停止によりレム睡眠と判断した。
【００２８】
従来のClock変異マウス(Balb/c系統、C57/BL6系統およびC3H/HeJ系統)は、そのレム睡眠時間の日周期リズムが昼型(前述)を示すことが知られている（Mutagenesis and Mapping of Mouse Gene, Clock Essential for circadian behavior, Science 264,719-725[1994]）。
従って、本発明の動物は、従来のClock変異マウスとは明らかに異なる特性を有するものである。
【００２９】
本発明の受精卵は、本発明の動物同士を交配させて得られたものであることを特徴とする。本発明の受精卵の具体例としては、Jcl:ICR系統の遺伝的背景を有する本発明のマウス同士を交配させて得られた受精卵があり、該受精卵は、平成13年7月25付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号FERM P-18430）。
【００３０】
本発明の日周期リズムが夜型を示すマウスの作製方法は、以下の（ａ）のマウスに（ｂ）のマウスを戻し交配することを特徴とする；
（ａ）Clock遺伝子が変異を有するマウスであって、かつJcl：ICR系統以外の系統の遺伝的背景を有する前記マウス、
（ｂ）Jcl：ICR系統の遺伝的背景を有するマウス。
【００３１】
ここでいう「夜型」および「Clock遺伝子が変異を有する」の意味は、本発明の動物の説明箇所において記載したものと同様とする。また、日周期リズムが夜型を示すことの確認方法、Clock遺伝子が変異を有することの確認方法については、本発明の動物の説明箇所において既に説明してある。
【００３２】
（ａ）のマウスとしては、Jcl：ICR系統を除く系統のマウスであれば特に限定するものではないが、例えばBalb/c系統、C57/BL6系統、C3H/HeJ系統のマウスを挙げることができる。各系統のマウスは全て、ノースウェスタン大学実験動物リソースセンターから入手することができる。これらのマウスにおけるClock遺伝子の変異は、ホモ型でもヘテロ型でもよいが、好ましくはホモ型のものを用いる。
（ｂ）のマウスはノースウェスタン大学実験動物リソースセンターから入手することができる。（ｂ）のマウスはJcl:ICR系統の遺伝的背景を提供することのみを目的としている為、そのClock遺伝子は上記変異を有するものであってもそうでなくてもよい。
【００３３】
本発明の日周期リズムが夜型を示すマウスの作製方法（以下、「本発明の方法」と記す）は、（ａ）のマウスに（ｂ）のマウスを１０代以上戻し交配し、Clock遺伝子の系統置換を行うことにより実施することができる。各世代におけるClock遺伝子の遺伝子型は、Jin X.によって紹介されたPCRによる方法(A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock., Cell 96,57-68[1999])で確認することができる。より具体的には、本発明の方法は、実施例１に記載した通りにして実施する。
【００３４】
本発明の方法により得られるマウスは、その特定の生理学的パラメーターの日周期リズムが夜型を示し、（ａ）のマウスに由来するClock遺伝子を有し、かつ（ｂ）のマウスに由来するJcl:ICR系統の遺伝的背景を有するマウスである。該マウスのClock遺伝子における変異は、該マウスが所望の特性を有する限りヘテロ型でもホモ型でもよいが、好ましくはホモ型である。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法（１）は、Clockタンパク質の安定性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする；
（ａ）本発明の動物からClockタンパク質を単離する工程、
（ｂ）単離したClockタンパク質と候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）Clockタンパク質の分解の有無を確認する工程。
【００３６】
「Clockタンパク質の安定性」とは、Clockタンパク質の分解に対する抵抗性を意味する。一般に、生体内では、Clockタンパク質中の安定性に関与する事が知られている領域がリン酸化され、該リン酸化領域に特定の酵素が結合し、それによりClockタンパク質が分解または合成されることが知られている。従って、Clockタンパク質のリン酸化、または分解を阻害することができる化合物を同定できれば、該化合物はClockタンパク質の寿命を延長させることができるため有用である。尚、前記の特定の酵素としては、例えばマルチカタリティックタンパク質分解酵素複合体(2OS)を挙げることができ、この酵素はClockタンパク質の分解事象を触媒する。
【００３７】
工程（ａ）では、本発明の動物からClockタンパク質を単離する。Clockタンパク質の単離は、限定するものではないが、例えばゲルカラムクロマトグラフィーやHPLCにより実施することができる。
工程（ｂ）では、工程（ａ）で単離したClockタンパク質と候補化合物とを接触させる。
【００３８】
Clockタンパク質と候補化合物との接触は、該Clockタンパク質および該候補化合物の物性等に応じて、当業者が適宜選択した条件下で実施することができる。「候補化合物」とは、Clockタンパク質の安定性に及ぼす影響を調べようとする任意の化合物を意味する。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で候補化合物と接触させたClockタンパク質の分解の有無を確認する。
【００３９】
Clockタンパク質の分解の有無は、限定するものではないが、例えばそのリン酸化特異的抗体を用いるウェスタンブロット法により該抗体の結合性の有無を確認することで判断できる。該抗体の結合が確認された場合、Clockタンパク質はリン酸化されており、このことはClockタンパク質が分解されていることを意味する。すなわち、前記候補化合物は、Clockタンパク質の分解を阻止しないことがわかる。あるいは、Clockタンパク質がリン酸化されればその分子量が増加するので、この分子量の増加の有無をSDSページゲル電気泳動等で確認することにより、分解の有無を確認することができる。分子量が増加している場合、Clockタンパク質の分解が前記候補化合物により阻止されたことがわかる。また逆に、Clockタンパク質が分解されたことは、電気泳動上のバンドの低分子量化により確認することができる。ここで、前記候補化合物が、本発明の動物からのClockタンパク質特異的にその分解を阻止した場合、該候補化合物を、本発明の動物からのClockタンパク質を特異的に保護する機能を有する化合物または結合タンパク質として同定することができる。尚、Clockタンパク質の分解の阻止が認められない場合、Clockタンパク質の安定性の差を司る要因を検討する。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法（１）で同定される化合物は、上記したように、本発明の動物からのClockタンパク質を特異的に保護する、すなわち該Clockタンパク質の分解を阻害する機能を有する。Clockタンパク質の分解を阻止できれば夜型動物の行動の改善、すなわち昼型行動への移行等が期待できるため、前記化合物は有用である。かかる化合物としては、限定するものではないが、例えばタンパク質リン酸化分解酵素阻害剤（リチウムクロライド）、タンパク質分解阻害剤（MG132）が考えられる。尚、前者はGSK3-β(Glycogen Synthase Kinase 3 βの略；ショウジョウバエでTIMELESSタンパク質の分解に関わることが知られているSer/Thrキナーゼの1種)の活性を阻害する化合物であり、後者はプロテオソーム依存的タンパク質分解を阻害する化合物である。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法（２）は、Clock mRNAの安定性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする；
（ａ）本発明の動物からClock mRNAを単離する工程、
（ｂ）単離したClock mRNAと候補化合物とを接触させる工程、
（ｃ）Clock mRNAの分解の有無を確認する工程。
【００４２】
「Clock mRNAの安定性」とは、Clock mRNAの分解に対する抵抗性を意味する。一般に、生体内では、Clock mRNAの5'または3'非翻訳領域部分と、該Clock mRNAに結合するタンパク質とが結合することにより、Clock mRNAが分解されるかまたはその翻訳が制御されることが知られている。従って、Clock mRNAの分解または翻訳制御を阻害することができる化合物を同定できれば、該化合物はClock mRNAの寿命を延長させることができるため有用である。尚、ここでいう「Clock mRNAに結合するタンパク質」としては、例えば、RNA分解酵素やルシフェリン結合タンパク質-3'非翻訳領域結合タンパク質を挙げることができる。
【００４３】
工程（ａ）では、本発明の動物からClock mRNAを単離する。Clock mRNAの単離は、限定するものではないが、例えばオリゴd(T)セルロースカラムによりmRNA特異的に精製を行い、mRNAを低塩濃度下で溶出させることにより実施することができる。
工程（ｂ）では、工程（ａ）で単離したClock mRNAと候補化合物とを接触させる。
【００４４】
Clock mRNAと候補化合物との接触は、該Clock mRNAおよび該候補化合物の物性等に応じて、当業者が適宜選択した条件下で実施することができる。
「候補化合物」とは、Clock mRNAの安定性に及ぼす影響を調べようとする任意の化合物を意味する。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で候補化合物と接触させたClock mRNAの分解の有無を確認する。
【００４５】
Clock mRNAの分解の有無は、限定するものではないが、例えばノーザンブロット法により確認することができる。ここで、Clock mRNAが分解されたことは、ホルムアミドゲル上のバンドの消失により確認することができる。ここで、前記候補化合物が、Clock mRNAの分解を阻止した場合、該候補化合物を、本発明の動物からのClock mRNAを特異的に保護する機能を有する化合物または結合タンパク質として同定することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法（２）により同定される化合物は、上記したように、本発明の動物からのClock mRNAを特異的に保護する、すなわち該Clock mRNAの分解を阻害する機能を有する。Clock mRNAの分解を阻止できれば夜型動物の行動の改善、すなわち昼型行動への移行等が期待できるため、前記化合物は有用である。かかる化合物としては、限定するものではないが、例えばRNA分解酵素阻害剤が考えられる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法（１）および（２）によりスクリーニングされた化合物は、本発明の日周期リズムが夜型を示す動物のClockタンパク質またはClock mRNAの安定性に影響を及ぼす化合物である。本発明の動物からのClockタンパク質またはClock mRNAは、生体の日周期行動を安定した夜型に維持するという機能を有するため、該Clockタンパク質または該Clock mRNAの安定性を変化させることで、日周期行動を朝型や昼型へと変化させることができると考えられる。従って、前記化合物は、日周期リズムに異常を示す動物のリズムを変更する、すなわち治療するのに有用であると考えられる。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  本発明のマウスの作製
従来Clock変異マウスとして知られているBALB/c系統、C57/BL6系統のホモ型Clock変異マウスは、いずれもそのClock遺伝子の転写活性化部位の一部が欠失しており、このためClock遺伝子産物により正の転写制御を受けるperiod遺伝子群等の時計遺伝子が転写されず、表現型上Clock遺伝子の機能不全となっているマウスである。
【００４９】
本発明者らは、これら２系統のClock変異マウス（いずれもNorthwestern大学のTakahashi, JSから供与された）を恒暗条件下で飼育した場合、いずれの系統においても最初の２週間位は飲水行動の周期が異常に長くなり(27〜28時間)、その後この長周期が消失する事を確認した（データは示さず）。
【００５０】
これらのClock変異マウスのうちBalb/c系統のマウスを使用し、これに野生型のClock遺伝子を有するJcl:ICR系統のマウスを１０代以上戻し交配することによって、変異型Clock遺伝子の系統置換を行った。各世代における遺伝子型は、Jin X.によって紹介されたPCRによる突然変異検出法(A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock., Cell 96,57-68[1999])を用いて確認した。尚、該方法は、PCR法により増幅したDNA断片上の制限酵素切断部位の有無により判定する。すなわち、野生型Clock遺伝子は制限酵素HincIIで切断されるが、変異型Clock遺伝子ではこの切断が生じないことを利用したものである。
【００５１】
交配によって得られた野生型マウス(変異型Clock遺伝子をもたない；遺伝子型：-/-)と、ホモ型Clock変異マウス(遺伝子型：Cl/Cl)を以下の操作に用いた。
マウスは10〜13週齢のものを使用し、12時間：12時間の明暗サイクル下で飼育した。各種生理学的パラメーター（体温、自発的発動量、覚醒時間）の測定は、以下の方法により実施した。
【００５２】
（体温および自発的活動量の測定方法）
まず、各マウス（10〜13週齢、体重32〜38g、雄）は、ネンブタール（50〜60mg/kg）で麻酔した。
体温は、マウスの腹腔内に体温の電波遠隔測定装置（TA10TA-F20; Data Sciences Int., USA）を埋め込み、これを介して測定した。
自発的活動量は、マウスの首の両側の筋肉に筋電図（EMG）測定のためのテフロン（登録商標）コートされたステンレスワイヤーを埋め込み、マウスの動きに伴うシグナル強度の変化をモニターすることによって測定した。
各測定値を１時間ごとに平均化した。
【００５３】
（覚醒時間および睡眠時間の測定）
覚醒時間および睡眠時間(ノンレム睡眠時間とレム睡眠時間)の定量化は、マウスの頭蓋骨中に脳波（EEG）測定のためのステンレス小型ねじ式電極を埋め込み、コンピューター画面上で５秒間ごとの脳波および筋電図のパターンを視覚的に同定することによって行った。
【００５４】
さらに、ノンレム睡眠と判断できる脳波のパワースペクトルは、Fast Fourier Transformによって計算し、睡眠の深さを示す脳波のδ頻度帯は0.5〜4.0 Hzに設定した。
各測定値を1時間ごとに平均化した。
ノンレム睡眠は脳波上の高振幅徐波の出現と筋活動の低下をその判断基準とし、レム睡眠は脳波上のシータ波の出現と筋活動の完全な停止をその判断基準とした。覚醒の判断は脳波上の低振幅速波と活発な筋活動によった。
【００５５】
その後、体温や自発的活動量、覚醒時間および睡眠時間（レム睡眠時間、ノンレム睡眠時間）の各リズムにおける振幅やアクロフェーズ（コサインカーブにおけるピーク時刻として決定）を比較するために、個々のマウスの一つのコサインカーブを統計学的にフィットさせた。脳波δパワーについては、各マウス個体の一日の平均値に対するパーセンテージによって表わした。
【００５６】
体温および自発的活動量の経時変化を図１に、睡眠(覚醒時間、ノンレム睡眠時間、レム睡眠時間および脳波δパワー)を図２に示す。Clock変異マウスは黒丸(●)で、野生型マウスは白丸(○)で示す。また、各図中下部の黒いバーは暗期を示している。また、各生理学的パラメーターの測定値の一日平均量、振幅およびアクロフェーズを下記表１にまとめて記す。
【００５７】
【表１】
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アクロフェーズは消灯時刻を０として経過した時間で示す。
ｐは各群を比較したt検定における有意差の確率を示す。
【００５８】
（結果）
各生理学的パラメーターの経時変化(日周期リズム)について、野生型マウスとClock変異マウスとの間に以下のような有意なリズムパターンの違いが認められた。
【００５９】
野生型マウスでは、暗期の前半に体温が高いレベルで維持されており、明期から暗期に移る直前に体温の上昇が認められた(図１ａ)。さらに野生型マウスでは、体温や自発的活動量および覚醒リズムの二峰性（夜明けと夕暮れにおいて）が認められた。また、野生型マウスでは、体温や自発的活動量および覚醒のアクロフェーズが、消灯から5.2〜5.7時間後に認められた（図１ａ，ｂ,および２ａ）。
【００６０】
一方、Jcl:ICR系統のClock変異マウスでは、体温や自発的活動量および覚醒時間が暗期の前半で次第に増加してゆき、暗期の後半でピーク値となっていた。また、Clock変異マウスにおける体温や自発的活動量および覚醒時間のアクロフェーズは、消灯後7.0〜7.9時間後に認められた（表１および図１ａ,ｂ,および２ａ）。
また、野生型マウスとClock変異マウスとの間では、体温や自発的活動量および覚醒時間のアクロフェーズに2〜3時間の違いが認められるものの、それぞれの振幅に関しては有意差が認められなかった。
【００６１】
具体的には、Jcl:ICR系統の野生型マウスでは、その体温の日周期リズムが夜間の前半にピークを示すのに比べて、同系統のClock変異マウスにおいては、その体温の日周期リズムが夜間の後半にピークを示し、野生型に比べて約３時間の位相の後退が認められた。一方、他の系統においてClock変異マウスを作製したところ、このような体温リズムの位相のずれは認められず、「朝型」「夜型」と呼ばれる体温の日周期リズムの位相の違いを研究する上で、Jcl:ICR系統のClock変異マウスが有用であることが示された。
【００６２】
これらの結果は、明らかに、体温や自発的活動量および覚醒時間の日周期リズムパターンが、明暗条件下では、野生型マウスで「朝型」なのに対して、Jcl:ICR系統のClock変異マウスで「夜型」であることを示している。ただし、野生型マウスでも変異マウスでも体温や自発的活動量および覚醒時間が完全に外部の明暗環境に同期している（図１および図２）ことから、Jcl:ICR系統のClock変異マウスでも、外部環境の明暗に対して同期する機構については正常であると思われる。
【００６３】
睡眠(レム睡眠およびノンレム睡眠)の日周期リズムに関しては、体温や自発的活動量とは異なった形でClock遺伝子の変異が影響していた。
興味深いことに、Jcl:ICR系統のClock変異マウスではレム睡眠の主なピークが暗期（活動期）の最初の1時間の間に認められた（図２ｃ）。それに対して、野生型マウスのレム睡眠のピークは、暗期の遅い時間帯に認められた。これらのレム睡眠時間の高い値は、両グループ共に、自発的活動量の低下や体温の低下と非常によく相関していた。そしてこれは、Jcl:ICR系統のマウスの「夜型」が、活動期の前半における睡眠時間の増加や覚醒時間の減少に関連していることを示唆している。
【００６４】
また、両グループ間の、ノンレム睡眠のアクロフェーズの違いは比較的小さい（0.8時間）にもかかわらず、レム睡眠のアクロフェーズの違いは、野生型マウスに比べてClock変異マウスで4.4時間の遅れが認められた。Clock変異マウスでは、ノンレム睡眠とレム睡眠のアクロフェーズに3.5時間の違いが認められたが、野生型マウスでは、ノンレム睡眠とレム睡眠との間に有意な差が認められなかった（表１）。
【００６５】
さらに、ノンレム睡眠の脳波δパワーのピークは、Clock変異マウスでは明期に入ってすぐに見られたが、野生型では、最初のピークが暗期の遅い時間帯に見られ、次のピークが明期の始めに見られた（図２ｄ）。Clock変異マウスにおける点灯時の脳波δパワーの大きなピークは、暗期の遅い時間帯における覚醒時間の増大によるノンレム睡眠の減少によるものかも知れない。
【００６６】
さらに、本発明のClock変異マウスを恒暗条件下で飼育した場合、飼育開始後２週間では従来のClock変異マウス同様に28時間周期(長周期)の飲水行動を示すものの、この周期は飼育開始後２週間を過ぎても消失せず、最長で３ヶ月位までこの長周期が持続していた（データは示さず）。
【００６７】
【発明の効果】
本発明の日周期リズムが夜型を示す動物は、ヒトにおける「朝型」「夜型」の相互関係や概日時計、そして心筋梗塞や心疾患による突然死や発作等の様々な疾患のタイミングに関する研究に有用なモデル動物であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Clock変異マウス（●）および野生型マウス（○）の明暗各12時間サイクル飼育下における、体温（ａ）と自発的活動量（ｂ）の経時変動。図１Ｂにおける縦軸の単位「CPH(×100)」は、ある強度以上のマウスの行動により赤外線ビームを横切った回数を１時間単位で統計した数値である。また、各図中下部の黒いバーは暗期を示す。
【図２】  Clock変異マウス(●)および野生型マウス(○)の明暗各12時間サイクル飼育下における、覚醒時間（ａ）、ノンレム睡眠時間（ｂ）、レム睡眠時間（ｃ）、および脳波δパワー（ｄ）の経時変動を示す。各図中下部の黒いバーは暗期を示す。
【図１】
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【図２】
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