(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式  Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ１２−Ｒ２（配列番号８）のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも２つの変異体を含んで成る組成物：
式中、Ｙ７は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｓｎから成る群から選択され；
Ｘ９は、ＧｌｕおよびＡｓｐから成る群から選択され；
Ｚ１２は、ＬｙｓおよびＡｓｎから成る群から選択され；
Ｒ１は、水素、低級アルキル、低級アルカノイル、１〜５個のアミノ酸の配列、およびアミノ末端のアミノ酸上で低級アルキルまたは低級アルカノイルで置換された１〜５個のアミノ酸の配列から成る群から選択され；
Ｒ２は、遊離ヒドロキシル、アミド、１〜５個のさらなるアミノ酸の配列、およびカルボキシ末端のアミノ酸上でアミドで置換された１〜５個のさらなるアミノ酸の配列から成る群から選択され；そして、
上記２つの変異体の少なくとも１つにおいて、Ｙ７はＡｒｇであり、Ｚ１２はＬｙｓであり、そして該２つの変異体の少なくとも第２において、Ｙ７はＡｓｎであり、Ｚ１２はＡｓｎである。
【請求項２】
Ｒ１がＶａｌであり、
配列  Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ１２（配列番号３７）を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり、ここでＸ２がＧｌｕおよびＡｓｐから成る群から選択され、配列  Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ１２（配列番号３８）、またはそのＮ末端のアミノ酸が低級アルキルまたは低級アルカノイルで置換された同様の配列を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ２が−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるか（配列番号１６）、またはそのカルボキシ末端のアミノ酸がアミドで置換された同様の配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも３個のアミノ酸配列を含んで成り、該配列が、
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｒ２（配列番号１７）および
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｒ２（配列番号１８）
そして、さらに：
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｒ２（配列番号１９）
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｒ２（配列番号２２）
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｒ２（配列番号２０）
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｒ２（配列番号２４）
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｒ２（配列番号２１）および
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｒ２（配列番号２３）
から成る群から選択される１以上の配列、
を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
さらに、上記アミノ酸配列の少なくとも７個を含んで成る、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記配列の８個すべてを含んで成る、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
上記ペプチドまたはポリペプチドが合成的に生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
上記ペプチドまたはポリペプチドが組換え的に生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
上記ペプチドの１以上が、キャリアータンパク質に結合した合成ペプチドとして発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
上記ペプチドの１以上が、多抗原性ペプチドとして、またはキャリアータンパク質に結合した多抗原性ペプチドとして発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
選択したペプチドの１以上が、組換え的に生産されたタンパク質内で発現する、またはキャリアータンパク質と枠内で融合した組換え的に生産されたタンパク質内で発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記キャリアータンパク質が、大腸菌ＤｎａＫタンパク質、ＧＳＴタンパク質、マイコバクテリア熱ショックタンパク質７０、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ガラクトキナーゼ、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１タンパク質から成る群から選択される、請求項１０ないし１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
式  Ｒ３−Ｌｙｓ−Ｘ４２−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｒ４（配列番号５）の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチド：
式中、Ｘ４２は、ＧｌｙまたはＡｌａから成る群から選択され；Ｒ３は、水素、低級アルキル、低級アルカノイル、１〜５個のアミノ酸の配列、およびアミノ末端のアミノ酸が低級アルキルまたは低級アルカノイルで置換された１〜５個のアミノ酸の配列から成る群から選択され；Ｒ４は、遊離ヒドロキシル、アミド、１〜５個のさらなるアミノ酸の配列（塩基性アミノ酸−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−を除く）、およびカルボキシ末端のアミノ酸がアミドで置換された１〜５個のさらなるアミノ酸の配列（塩基性アミノ酸−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−を除く）から成る群から選択される、
をさらに含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
１つの変異体が、Ｙ７がＡｓｎであり、Ｘ９がＡｓｐであり、Ｚ１２がＡｓｎである式を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれかに記載の組成物、製薬学的に許容されるキャリアーおよびアジュバントを含んで成る医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１または１６に記載の組成物を含む、種々のＨＩＶ−１株またはサブタイプに由来するＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と反応する抗体を誘導するために使用される医薬品。
【請求項１８】
式  −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ１２−（配列番号９）のエピトープ：
式中、Ｙ７はＡｓｎであり；Ｘ９はＡｓｐであり；Ｚ１２はＡｓｎである、
に特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
単離されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ファージディスプレイをスクリーニングすることにより生成した抗体、および抗体フラグメントから成る群から選択される、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１８に記載の抗体を少なくとも１つ含んで成る抗体組成物。
【請求項２１】
以下の（ａ）及び（ｂ）の抗体を含んで成る抗体組成物：
（ａ）式  Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｒ２（配列番号８）のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体：
式中、Ｘ９は、ＧｌｕおよびＡｓｐから成る群から選択され；Ｒ１は、１〜５個のアミノ酸の配列であり；Ｒ２は、１〜５個のさらなるアミノ酸の配列である；および
（ｂ）式  Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｒ２（配列番号８）のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２２】
多数のＨＩＶ−１株に由来するＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質エピトープに結合する別の抗体を含んで成る、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
上記抗体が、単離されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ファージディスプレイをスクリーニングすることにより生成した抗体、抗体フラグメントおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
アミノ酸配列  Ｌｙｓ−Ｘ４２−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（配列番号１０）（ここでＸ４２はＧｌｙおよびＡｌａから成る群から選択される）を有するエピトープに特異的に結合する抗体をさらに含んで成る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれかに記載の抗体または抗体組成物、および製薬学的に許容されるキャリアーおよびアジュバントを含んで成る医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物を含む、ＨＩＶ−１のウイルスレベルを下げるための医薬品。
【請求項２７】
式  Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ７−Ｌｅｕ−Ｘ９−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ１２−Ｒ２（配列番号８）のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも２つの変異体：
式中、Ｙ７は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＡｓｎから成る群から選択され；Ｘ９は、ＧｌｕおよびＡｓｐから成る群から選択され；Ｚ１２は、ＬｙｓおよびＡｓｎから成る群から選択され；Ｒ１は、１〜５個のアミノ酸の配列であり；Ｒ２は、１〜５個のさらなるアミノ酸の配列であり；そして、上記２つの変異体の少なくとも１つにおいて、Ｙ７はＡｒｇであり、Ｚ１２はＬｙｓであり、該２つの変異体の少なくとも第２において、Ｙ７はＡｓｎであり、Ｚ１２はＡｓｎである、
を連続的にコードする核酸配列を含んで成る合成遺伝子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の合成遺伝子および製薬学的に許容されるキャリアーを含んで成る、医薬組成物。
【請求項２９】
宿主細胞中で合成遺伝子産物の発現を支配しかつ制御する調節核酸配列に操作可能に連結された、請求項２７に記載の合成遺伝子を含んで成る合成分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載の合成分子および製薬学的に許容されるキャリアーを含んで成る、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２７に記載の合成遺伝子を含む、哺乳動物宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１ないし７のいずれかに記載の組成物を形成するペプチドまたはポリペプチドに結合する種々の抗体の混合物を含んで成り、それぞれの抗体が異なる該ペプチドまたはポリペプチドに結合する、抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、一般に症候的または無症候的な感染患者において、ヒト免疫不全症ウイルス-1（HIV-1）の増殖を阻害するために、ならびに以前に感染したことが無い個体において一次感染後のHIV-1増殖を弱めるために有用な組成物および方法、すなわちAIDSへの進行を最少とすることに関する。
発明の背景
１型ヒト免疫不全症ウイルス（HIV-1）の処置に対する様々な取り組みは、ウイルスの転写に必須なタンパク質（Tat）を生成するHIV-1のトランス活性化（tat）遺伝子に集中した。このtat遺伝子およびそのタンパク質は配列決定され、そしてHIVの推薦された処置への関与が調査された［例えば、米国特許第5,158,877号;同第5,238,882号;および同第5,110,802号明細書;それぞれ1992年5月14日、1991年7月25日、1991年7月11日、そして1987年5月21日に出願された国際公開第92/07871号、同第91/10453号、同第91/09958号および同第87/02989号明細書を参照にされたい］。Tatタンパク質は細胞外に放出され、別の感染細胞に取り込まれて細胞中のHIV-1の転写を強化し、そして非感染細胞により宿主細胞の遺伝子の活性化を改変させることに利用できる。Tatは細胞をウイルスに感染され易くする。細胞によるTatの取り込みは大変強力であり、そしてタンパク質の短い塩基性配列により媒介されることが報告された［S.Fawell et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:664-668(1994)］。
【０００２】
有力なAIDSワクチンとしてHIV-1 Tatタンパク質を用いた免疫感作が盛んに調査されている。報告された研究ではHXB/LAV HIV-1 Tat配列は、組換えタンパク質［A.Cafaro et al.,Nat.Med.,5:643-650(1999)］、DNAワクチン［S..Calarota et al.,Lancet.351:1320-5(1998)]、不活性化タンパク質（Tat トキソイド）［S.S.Cohen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(19):10842-10847(1999);A.Gringeri et al.,J.Hum.Virol.,1:293-8(1998)］、または不活性化Tatを発現するDNAワクチン［E.Caselli et al,J.Immumol.,162:5631-5638(1999)]のいずれかの免疫原として使用された。完全なTat配列を用いた免疫感作は、細胞性および体液性免疫の両方を誘導した。M.C.Rhe et al.,J.Acquir Immmune Defic.Syndr.Hum.Virol.10:408-416(1995);C.J.Li et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:8116-8120(1997);およびその他も参照にされたい]。
【０００３】
1992年9月3日に公開された国際公開第92/14755号明細書は、Tatタンパク質およびTatタンパク質に結合することができるインテグリン細胞表面レセプターに関する。インテグリンに結合する２つのTat配列が同定されている：-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-［配列番号１］ならびに-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-［配列番号２］。これらの配列はインテグリンに関して優勢な結合部位である塩基性領域またはドメインである。この明細書はこれらのTat配列に対応する多数のペプチドおよび対応するインテグリンが、抗体が適当なインテグリンに対するように、インビトロで細胞のTatコートプレートへの結合を遮断することを示す。しかしこの明細書は、これらの試薬が細胞による機能的Tatの取り込みを遮断しないことと示し（国際公開第92/14755明細書の実施例９を参照にされたい）、すなわちHIV感染における治療的利益に関して提案された作用機作を無効にする。この国際出願に記載されるTat配列は、本発明のペプチド免疫原とは異なる。
【０００４】
Tatタンパク質に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体は動物中で容易に生成され、そしてインビトロでTatタンパク質の取り込みを遮断することが示された［例えば、D.Brake et al,J.Virol.,64:962(1990);D.Mann et al,EMBO J.,10:1733(1991);J.Abraham et al.同上;P.Auron et al,同上;M.Jaye et al,同上;G.Zauli et al,同上を参照にされたい］。より最近の報告では、組織培養基に加えたTatタンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体が、インビトロのHIV-1感染を弱めることを示した［L.Steinaa et al,Arch.Virol.,139:263(1994);M.Re et al,同上;およびG.Zauli et al,J.Acq.Imm.Def.Syndr.Hum.Retrovirol.,10:306(1995)］。
【０００５】
発明者が所有する公開［G.Goldstein,Nature Med.,2:960(1996);および1995年11月30日に公開された国際公開第95/31999号明細書］は、感染細胞からのHIV-1 Tatタンパク質の分泌および感染および非感染細胞による取り込みがHIV-1の感染性に重要であったことを示す証拠を検討した。以前の研究では、Tatタンパク質に対する抗体がTatの取り込みをインビトロで遮断し、そしてインビトロの感染性を阻害することも示した。哺乳動物の能動免疫感作は、有力なAIDSワクチンとしてHIV-1 Tatタンパク質に対する抗体を誘導することを示唆した。G.Goldstein,et al、「合成HIV-1 Tatペプチドで免疫感作し、そしてキメラ サル／ヒト免疫不全症ウイルス（SHIV33）を感染させたアカゲザルにおける慢性ウイルス血症の最少化（Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus(SHIV33)）」、Vaccine,18:2789(2000)。
【０００６】
発明者による他の公開、1999年1月21日に公開された国際公開第99/02185号明細書および1999年4月6日に発効された米国特許第5,891,994号明細書（両方とも引用により本明細書に編入する）は、ウサギの免疫系によりエピトープと認識されたTat配列を使用したHIV-1感染の処置および防止における新たな概念を明らかにした。上記に検討したこれまでの開示とは異なり、これらの公開は、以下の:-Asp-Pro-X7-Leu-Glu-Pro-［配列番号３］またはR1-Val-Asp-Pro-X7-Leu-Glu-Pro-R2［配列番号４］（ここで、Ｘ7はArg、Lys、SerまたはAsnである）のようなTatアミノ酸残基４（または５）から10に広がる「エピトープＩ」配列を含んで成る少なくとも２つの、そして好ましくは４つのすべてのTatペプチドまたはポリペプチドを必要とする治療用および免疫原の組み合わせに関する。そのような組成物は、ほとんどのHIV-1 Tatタンパク質と反応する抗体を誘導し、そしてHIV-1の増殖を減じる。この公開によれば、式R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4［反応番号５］（式中、Ｘ42はGlyまたはAlaから成る群から選択される）のTatアミノ酸残基41−50に広がる「エピトープII」ペプチドまたはポリペプチドを含んで成るある種の他のTatタンパク質をこの組成物に加えることができる。あるいは式R5-Arg-Arg-X58-Z59-A60-Y61-Ser-R6［反応番号６］（式中、Ｘ58はAla、Pro、SerおよびGlnから成る群から選択され:式中、Ｙ61はAsp、Asn、GlyおよびSerから成る群から選択され；式中、Ｚ59はProおよびHisから成る群から選択され：式中、Ａ60はGlnおよびProから成る群から選択される）のTatアミノ酸残基56−62に広がる「エピトープIII」ペプチドまたはポリペプチドをこの組成物に加えることができる。さらに他には、式R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8［反応番号７］（式中、Ｘ64はAsnおよびThrから成る群から選択され:式中、Ｙ67はAlaおよびValから成る群から選択される）のTat AA残基62−73に広がる「エピトープIV」ペプチドまたはポリペプチドをこの組成物に加えることができる。この組成物自体を、HIV-1の多数の変異体に特徴的な多数のTat配列に対する抗体を誘導するために使用することができる。この組成物または生成した抗体を、これらの多数の変異体に対するワクチンまたは予防的処置として使用する。
【０００７】
HIV-1疾患の進行に関して増大する知識にもかかわらず、当該技術分野には予防的および治療的の両方でHIV-1を処置するための組成物および方法を開発する必要が存在し、これらはその後、多くは致命的なAIDS疾患の処置および可能であれば防止のために、HIV-1のウイルスレベルを下げるために有用である。
発明の要約
１つの観点では本発明は、式 R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 ［配列番号８］（式中、Ｙ7は、Arg、Lys、SerおよびAsnから成る群から選択され；式中、Ｘ9は、GluおよびAspから成る群から選択され；式中、Ｚ12は、LysおよびAsnから成る群から選択され；式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、低級アルカノイルおよび低級アルキルまたは低級アルカノイルで場合により置換された１〜約５個の間のアミノ酸配列から成る群から選択され；式中、Ｒ2は、遊離ヒドロキシル、アミドおよびアミドで場合により置換された１または最高約５個のさらなるアミノ酸の配列から成る群から選択される）のエピトープIのペプチドまたはポリペプチドの少なくとも２つの変異体を含んで成る組成物を提供する。この組成物において、２つの変異体の少なくとも１つは、Ｙ7がArgであり、そしてＺ12がLysである式を持たなければならず、そしてこの２つの変異体の少なくとも第２は、Ｙ7がAsnであり、そしてＺ12がAsnである式を持たなければならない。この組成物の各ペプチドは、HIV-1 Tat エピトープIとして霊長類の免疫系により認識される。この式は、種々のペプチドの組み合わせの構築および使用を可能とする。
【０００８】
別の観点では、上記組成物はHIV-1 Tatアミノ酸残基５からアミノ酸残基12に対応する他のアミノ酸配列を表す１以上のさらなるペプチドまたはポリペプチド（１つまたは複数）をさらに含む。これらの任意のアミノ酸配列を以下に詳細に記載する。これらの配列は好ましくはその位置にTatタンパク質変異体を含むHIV-1株に由来する。
【０００９】
別の観点では、本発明は１以上のHIV-1 TatエピトープII、IIIおよび／またはIVと組み合わせて、霊長類により認識される少なくとも２つの必要なエピトープIペプチド（および好ましくはさらなるエピトープIペプチド）を含んで成るペプチドまたはポリペプチドを含む上記組成物を提供する。エピトープII、IIIおよびIVは、引用により本明細書に編入する国際公開第99/02185号明細書に記載されたHIV-1 Tatペプチドの式である。そのような組成物は適当なHIV-1 Tatペプチドと組み合わせて、すべての既知のHIV-1 Tatタンパク質の約95％より多くと反応性の抗体を誘導する組成物を提供することができる。
【００１０】
さらなる観点では本発明は、式 R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 ［配列番号８］（式中、Ｙ7は、Arg、Lys、SerおよびAsnから成る群から選択され；式中、Ｘ9は、GluおよびAspから成る群から選択され；式中、Ｚ12は、LysおよびAsnから成る群から選択され；式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、低級アルカノイルおよび低級アルキルまたは低級アルカノイルで場合により置換された１〜約５個の間のアミノ酸配列から成る群から選択され；式中、Ｒ2は、遊離ヒドロキシル、アミドおよびアミドで場合により置換された１または最高約５個のさらなるアミノ酸の配列から成る群から選択される）のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する、好ましくは霊長類で生成される少なくとも１つの抗体を含んで成る抗体組成物を提供する。この抗体組成物は好ましくは少なくとも２つの抗体、すなわちＹ7がArgであり、そしてＺ12がLysであるエピトープI変異体に結合する１つの抗体、およびＹ7がAsnであり、そしてＺ12がAsnである第２のエピトープI変異体に結合する少なくとも第２の抗体を含んで成る。２つの特定した変異体以外の他の変異体に対する他の抗体も、この組成物に含むことができる。組成物中のこれらの抗体は霊長類の免疫系により認識されるエピトープI配列に結合し、このエピトープはHIV-1 Tat タンパク質の多数の変異体上に存在する。これらの抗体は以下に詳細に記載するモノクローナル抗体のような種々の抗体構築物を含む。
【００１１】
さらに別の観点では、本発明はHIV Tatタンパク質の霊長類が認識するエピトープに特異的に結合する抗体、特にモノクローナル抗体を提供し、このエピトープはアミノ酸配列-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-［配列番号９］（ここで、Ｙ7、Ｘ9およびＺ12は上記定義の通りである）を含んで成る。
【００１２】
さらに別の観点では、本発明は-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１１］のエピトープを認識するすでに記載した抗体とは異なるエピトープ、エピトープIIペプチド配列 -Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１０］（ここでＸ42はGlyまたはAlaである）を認識する少なくとも１つの抗体を含んで成る抗体組成物を提供する。好ましくは組成物は、Ｘ42がGlyであるペプチドおよびＸ42がAlaであるペプチドの両方を認識する１つの抗体を含んで成る。これらの抗体は好ましくは霊長類で生成される。組成物中のこれらの抗体は霊長類の免疫系により認識されるエピトープII配列に結合し、このエピトープは、HIV-1 Tatタンパク質の多数の変異体上に存在する。これらの抗体は以下に詳細に記載するように種々の抗体構築物を含む。
【００１３】
さらに別の観点では、本発明はすでに記載した抗体により認識される-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１１］のエピトープとは異なる、エピトープIIペプチド配列 -Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１０］（ここでＸ42はGlyまたはAlaである）を認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
さらなる観点では、本発明は上記定義の式 R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 ［配列番号８］のエピトープIのペプチドまたはポリペプチドの少なくとも２つの変異体を含むペプチドまたはポリペプチドを連続的にコードする組換え体または合成遺伝子を提供する。この合成遺伝子において、２つの変異体の少なくとも１つは、Ｙ7がArgであり、そしてＺ12がLysである式を持たなければならず、そしてこの２つの変異体の少なくとも第２は、Ｙ7がAsnであり、そしてＺ12がAsnである式を持たなければならない。場合によりこの合成遺伝子は霊長類の免疫系により認識されるようなカルボキシ末端エピトープIIペプチドを含んで成る。あるいは組換え体または合成遺伝子は、以下に同定する７または８個の好適な霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列を含む。この合成遺伝子はスペーサー配列により分けられた各アミノ酸配列を含むことができ、あるいはキャリアータンパク質を含むオープンリーディングフレイム中に各ペプチド／ポリペプチドを発現することができる。合成遺伝子はスペーサーが霊長類により認識されたエピトープI配列に融合している場合、スペーサーによりキャリアータンパク質から分けることができ、組換えタンパク質のカルボキシ末端にエピトープII配列を残す。さらなる態様には一緒に融合し、そしてキャリアータンパク質に融合した上記式の多数のエピトープIペプチドを含む。
【００１５】
さらなる観点では、本発明は宿主細胞中で合成遺伝子産物の発現を支配し、そして制御する調節核酸配列に操作可能に連結された上記合成遺伝子を含んで成る合成分子、例えばベクターを提供する。
【００１６】
別の観点では、本発明は上記合成遺伝子または合成分子を含む組換え微生物、例えばウイルスまたは片利共生細菌を提供する。この微生物は宿主中で遺伝子または分子の産物の複数のコピーを発現することができる
本発明のさらに別の観点は、多数の既知のHIV-1 Tatタンパク質、例えば約95％より多く、好ましくは99％より多くの既知のTatタンパク質と反応する抗体を誘導するために有用な医薬組成物である。これらの誘導された抗体は、HIV-1の増殖を減じることができる。医薬組成物は少なくとも１つの上記の組換えまたは合成ペプチド／ポリペプチド組成物；または上記の合成遺伝子／分子；または上記組換え微生物を製薬学的に許容されるキャリアー中に含んで成る。
【００１７】
本発明のさらなる観点は、HIV-1の増殖を減じるのに有用な医薬組成物であり、この組成物は上記抗体組成物またはモノクローナル抗体組成物を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の観点では、HIV-1のウイルスレベルを下げるための方法には、ヒトまたは他の霊長類を上記の抗体を誘導する医薬組成物に暴露し、ほとんどのHIV-1 Tatタンパク質と反応する抗体を活発に誘導し、そしてインビボでウイルスの増殖を減じることを含む。
【００１９】
この方法はコンピテントな免疫系(competent immune system)を持つHIV-1感染個体に、あるいは感染していないか、または慢性的に感染しているが無症候性の個体に適当である。この方法はHIV-1 Tatタンパク質と反応し、そしてHIV-1による初期の急性感染中にウイルス増殖を下げ、そしてさらにAIDSを導く慢性ウイルス血症を最少にする抗体を誘導する。
【００２０】
さらに別の観点では、本発明はHIV-1による感染に対する効果的な、または迅速な免疫応答を形成することができないヒトに、上記の抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することにより、HIV-1のウイルスレベルを減じる方法を提供する。この方法は、長期に組成物を投与することを含むことができる。
【００２１】
本発明の別の観点は、上記組成物の調製法およびそのような組成物でトランスフェクトした宿主細胞を含む。
【００２２】
本発明の別の観点は、上記組成物を用いた免疫感作により誘導される抗体の力価および特異性の測定および検出に有用なキットである。本発明のキットは好ましくは上記２つの必要なエピトープIペプチド、ならびに霊長類により認識されるエピトープIのさらなるペプチド、そしてエピトープIIからIVの可能なさらなるペプチド、およびコートされた固体支持体、これらの抗体のペプチドへの抗体の結合を検出するための標識試薬、および多種雑多な基質および標識により提供されるシグナルを引き出すか、または検出する装置、ならびに血液サンプル、適当なウイルスまたは他の診断アッセイ成分を採取するための通例の装置を含む。
【００２３】
さらなる観点では、本発明は本発明の組成物で免疫感作した個体中の抗体の力価および反応パターンを検出する方法を提供する。本発明は個体の生物学的流体、例えば血清の希釈物を、本発明のエピトープI配列および場合によりエピトープIIからIVの１以上のペプチドを結合したプレートまたはビーズとインキューベーションし、非結合生物材料を洗い出し、そして標識試薬、例えば酵素が付随した抗-ヒト免疫グロブリンを含むペプチドへの抗体の結合を測定する工程を含む。使用する標識の種類に依存して、標識により生成されるシグナルは、酵素と反応するさらに付加する基質により生成することができる（例えば色の変化を生じる）。他の通例の標識も本アッセイの計画に包含してよい。
【００２４】
本発明の他の観点および利点は、以下の詳細な説明およびそれらの好適な態様でさらに記載する。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫原に対する免疫応答を上げる（mounting）ことができる非感染または初期のHIV-1感染個体に抗体を誘導するさらなる組成物を提供することにより、上記の問題の解決を提供し、この抗体は多数の既知のHIV-1 Tatタンパク質変異体（すなわち95％より多い、好ましくは99％より多い）と反応する。用語「Tat配列（またはタンパク質）変異体」は、Tatタンパク質アミノ酸残基を含有するポリペプチドまたはペプチド、すなわち表I［配列番号１５］のコンセンサス配列と実質的に同じである別のHIV-1株 Tatタンパク質に由来する配列を意味する。各変異体はエピトープIからIVについて目的の残基中の少なくとも１つのアミノ酸変化により、コンセンサス配列および／または別の変異体とは異なり得る。この変化は、本発明の組成物に加えた時にその特定のTatエピトープに対して同じか、または異なる抗原性特異性を提供することができる。
【００２５】
本発明の組成物により誘導される抗体はHIV-1の増殖を阻害することができ、これにより疾患がさらにAIDSへ進行することを防止する。抗体組成物は、HIV-1感染に対する効果的または迅速な免疫応答を上げるとができない感染または非感染のヒトに使用するためにも提供することができる。これらの組成物は多数のTatタンパク質と反応することができ、これによりHIV-1のウイルスレベルを下げる。これらの抗体は、感染で免疫学的に異なるTatタンパク質を生成するHIV-1に暴露されるか、または感染した大きな集団において、AIDSの発症を制御するために、治療的および予防的内容の両方に有用である。
【００２６】
本発明の組成物には霊長類が抗体を生成するHIV-1 Tatタンパク質のエピトープにより提供されるペプチドに基づくペプチドまたはタンパク質、あるいは霊長類においてTatに対する抗体を誘導するペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸配列を含む。次にこれらの誘導された抗体はHIV-1の増殖を減じる。
【００２７】
HIV-1 Tatタンパク質は２つのエキソンから生成される；エキソン１は、スプライシング無しで、またはエキソン２によりコードされる約15〜32アミノ酸残を含むスプライシングされて発現され得る72アミノ酸（AA）タンパク質をコードする。HIV-1 Tat エキソンI配列は表１に表し、そして共通するＢサブタイプ［NIHロス アラモスデータベース］に見いだされる31の既知のHIV-1株のTatタンパク質配列に基づくコンセンサス配列である。変異体が現れるアミノ酸位置は、ロアーケースの文字である。表I［配列番号１５］で、73位のアミノ酸残基はHIV-1 Tatのエキソン２の最初のProである。エキソンIの72アミノ酸産物は、細胞性の取り込みおよび活性化を単独で行うことができるので、これは抗体が72アミノ酸ペプチドと反応し、細胞内の取り込みを阻止することに必須である。HIV-1 Tatは、Cys21とCys37との間に１つの共有結合を持つエキソン１［配列番号１５］のAA位22と37の間にシステイン-リッチ領域を含み、複雑な３次構造を生じる。科学文献は、この領域が免疫原性ではないらしいことを示した。Tatに対する主な抗体は、AA62-73に対して報告されたさらなる抗体とともに、直線状のＮ-末端Pro-リッチ領域(AA1-21)および直線状塩基性領域(AA44-65)に対するものである。
【００２８】
本発明者は以前にエピトープ、すなわちTat変異体のエキソン１［配列番号１５］のＮ-末端直線状の配列1-21（22AA）中のウサギ抗体（抗原性配列）により認識される領域を同定し、そしてHIV-1 Tat中の４つのＢ細胞エピトープを定めた。国際公開第99/02185号明細書に以前に記載したように、このより大きな配列の免疫原性領域は、ウサギの免疫系により認識された。これらの領域は以下の表IでエキソンIのコンセンサス配列中に同定された：エピトープIは、エキソン１のAA位2-10の９個のアミノ酸配列としてウサギ抗体により同定された。エピトープIIは、エキソン１のAA位43-50の８個のアミノ酸配列として同定された。エピトープIIIは、エキソン１のAA位56-62の７個のアミノ酸配列として同定された。エピトープIVは、TatのAA位62-73の12個のアミノ酸配列として同定され、エキソン２の最初のPro(AA73)およびエピトープIIIの重複Ser62を含んだ。
【００２９】
【表１】
0004282934.tif 000002
【００３０】
しかし本発明では、発明者は霊長類のＢ細胞により特に認識されるエピトープIのアミノ酸配列に驚くべきシフトを検出した。表Iでは霊長類が認識するエピトープIおよびII配列に下線を付す。霊長類が認識するエピトープIは、Tatアミノ酸残基５〜12に広がる。霊長類のＢ細胞により認識されるエピトープIIの配列は、アミノ酸41〜50に広がる。エピトープIIIおよびIVは、引用により本明細書に編入する国際公開第99/02185号明細書に報告されるように、ウサギで認識されるエピトープと同じである。
Ａ.霊長類が認識するエピトープIの免疫原性組成物
１つの態様では、本発明は霊長類の免疫系により認識され、そしてインビボでその配列に暴露された霊長類に特異的な体液性免疫応答（本発明の目的に関する）を誘導する少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチド変異体を含有する組成物を提供する。これらの霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列は、多数の“Tat配列変異体"に由来する表IのTatコンセンサス配列［配列番号１５］のアミノ酸残基５〜12に対応する。霊長類が認識するエピトープIは、一般式:R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 配列番号８（式中、Ｙ7は、Arg、Lys、SerまたはAsnであり；Ｘ9は、GluまたはAspであり；そしてＺ12は、LysまたはAsnである）のペプチドと定める。この式は種々の変異体哺乳動物エピトープIペプチドを可能にする。本発明の組成物は、Ｙ7はArgであり、そしてＺ12はLysである少なくとも１つのペプチド変異体、およびＹ7はAsnであり、そしてＺ12はAsnである少なくとも第２のペプチド変異体を含まなければならない。
【００３１】
上記の霊長類が認識するエピトープIの式において現れる特定のアミノ酸は、最少反応性の霊長類エピトープI配列である。最少エピトープI配列に対する抗体を生じるために、本発明の方法に使用される式により定められる各免疫原は、より大きなアミノ酸配列であることができる。例えば最少エピトープIアミノ酸は、全エピトープI免疫原性配列が８から約25の間のアミノ酸長となるように、別のアミノ酸により挟まれる。挟むアミノ酸の同一性はエピトープI免疫原の生物学的機能に必須ではない。特に霊長類が認識するエピトープI配列のＮ-末端上のさらなるアミノ酸は、免疫原性に影響しない。すなわち、霊長類が認識する各エピトープIペプチドについて、Ｎ-末端R1は非修飾Ｎ末端アミノ酸上の遊離水素、あるいは低級アルキル（例えばC1-C10アルキル）、またはアセチル基のような低級C1-C10アルカノイルであることができる。R1は、低級アルキルまたは低級アルカノイルで場合により置換された１から約５の間のアミノ酸の配列も含んでよい。好ましくはR1は２アミノ酸を表す。１つの態様では、Ｒ1がValであり、配列 Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12 ［配列番号３７］（ここでＸ7、Ｘ9およびＺ12は上記定義の通りである）を生じる。別の態様では、Ｒ1がX2-Pro-Valであり、配列 X2-Pro-Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12 ［配列番号３８］（ここでＸ2がGluまたはAspであり；ここでＸ7、Ｘ9およびＺ12は上記定義の通りである）を生じる。好ましくはR1は３アミノ酸を表す。
【００３２】
霊長類が認識するエピトープIの最少配列のＣ-末端上のさらなるアミノ酸は、抗体力価を強化することができる。Ｃ-末端R2はＣ末端アミノ酸上の単なる遊離ヒドロキシル基であることができるが、それはまたＣ末端アミドであることもできる。しかし力価を強化するために、R2は好ましくは１から約14個の間、好ましくはカルボキシル末端がアミド化された約４個のさらなるアミノ酸の配列である。好適な態様では、R2は-His-Pro-Gly-Ser-アミドであり、配列Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-His-Pro-Gly-Ser-［配列番号１６］（ここでＸ7、Ｘ9およびＺ12は上記定義の通りである）を生じる。
【００３３】
好ましくは本発明の組成物は、上記に同定した２つの必要なペプチドに加えて、霊長類が認識するエピトープIの式の少なくとも５または６個の異なる変異アミノ酸配列を含む。最も好ましくは、組成物は直ぐ下に同定する７または８個の変異アミノ酸配列を含んで成る。この組成物は、各々が異なるＸ9、Ｙ7およびＺ12の組み合わせを含む他のペプチドまたはポリペプチド配列を含んでもよい。以下の実施例で示すように、霊長類が認識するエピトープI中で抗原可変性の３つの部位を用いて、本発明の好適な組成物は既知のすべてのＢクレードおよび非-ＢクレードHIV-I Tat変異体の95％を含むための２つの「必要な」ペプチド：
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号１７および
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号１８
ならびに以下のさらなるエピトープIペプチド：
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号１９
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号２０
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号２１
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２２および
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２３
の１〜５個、ならびにさらに場合により稀な変異体 R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２４］を含むことにより、霊長類が認識するエピトープIの十分なペプチドを含むことができる。
【００３４】
本発明の霊長類が認識するエピトープIの組成物は、配列番号１５のAA５からAA12の間のアミノ酸残基に相当するが、霊長類が認識するエピトープI組成物に対する抗体とは十分に交差反応しない他のTat変異体に由来する他の配列を含むさらに多数のペプチドまたはポリペプチドを含んでもよい。本発明のエピトープIの組成物は、５以上の異なるエピトープIペプチドの複数のコピーを任意の順序で含むことができる。１つの態様では、上記の［配列番号１７〜２４］の７またはすべての８つのアミノ酸配列の少なくとも１コピーが存在する。
【００３５】
本発明のこれらのペプチドまたはポリペプチドは、合成的または組換え的に生成される。任意のアミノ酸（例えば-Gly-Ser-)または他のアミノ酸または化学的化合物のスペーサーをペプチドを一緒に、またはキャリアーに連結する目的でペプチドの末端に含むことができる。この組成物はキャリアータンパク質に結合した合成ペプチドとして発現する１以上の上記ペプチドの状態を取ることもできる。あるいは組成物は多数のエピトープIペプチドを含んでもよく、多抗原性ペプチドとして発現した各々を、場合によりキャリアータンパク質に結合する。あるいは選択したペプチドは連続的に連結し、そして組換え的に生産されるタンパク質中に発現させることができる。１つの態様として、上記の８つの特異的に特定された配列をその間にスペーサーアミノ酸を用いて、または用いずに連続的に連結してより大きな組換えタンパク質を形成する。あるいは組換えタンパク質はキャリアータンパク質と枠内で融合することができる。これらの霊長類エピトープI組成物は、HIV-1 Bおよび非-ＢクレードのTatタンパク質を含むHIV-1 Tatタンパク質の既知の変異体の95％より多くと反応性の抗体を誘導するように設計される。
【００３６】
霊長類が認識するエピトープI組成物は、免疫感作した、免疫的にコンピテントな(immune competent)霊長類、すなわち非−感染ヒト、または無症候性の感染したヒトに、HIV-1のTatタンパク質の既知の変異体の95％より多く、そして好ましくは99％より多くに対して向けられた活性な体液性免疫応答（すなわち抗体）を誘導する生物活性を示す。そのような処置の最終結果は、急性感染後のHIV-1の増殖を損なうことである。この減損は、AIDSへの進行に関係するHIV-1の高いポスト-血清変換血漿レベルを防止する。HIV感染の無症状期における抗体の活発な誘導は、ウイルスの増殖を減少させ、血漿ウイルス負荷量を下げ、そして同様にAIDSへの進行を減少させる。少なくとも２つの必要な霊長類が認識するエピトープI免疫原、そして好ましくは７または８個のそれらエピトープI配列［例えば配列番号１７〜２４］を含む組成物は、HIV-1の共通のＢサブタイプの294の既知のTat配列、およびすでに配列決定された56種の非-Ｂ HIV-1サブタイプのすべてのTatタンパク質の約95％に対して免疫応答を誘導することができる［Esther Guzman博士の好意による、ロスアラモス NIAID HIVデータベース；GeneBank データベース］。
Ｂ．さらなるエピトープを含有する免疫原組成物
別の態様では、本発明は少なくとも１つのエピトープII配列および場合により１以上のエピトープIIIまたはIVペプチドと組み合わせた、霊長類が認識する２以上のエピトープI配列を使用する他の組成物を提供する。ウサギの免疫系により認識されるこれらHIV-1 TatエピトープII、IIIおよびIVは、本明細書に編入する国際公開第99/02185号明細書に詳細に記載されている。
【００３７】
簡単に説明すると、エピトープII配列はインビボでエピトープII配列に暴露された霊長類に、特異的な体液性の免疫応答を誘導する。霊長類により認識されるエピトープIIは、式 R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4［配列番号５］（ここでＸ42はGlyまたはAlaである)のペプチドと定める。霊長類の免疫系により認識される最少エピトープは、式、すなわち-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-（配列番号１５のアミノ酸41〜50）の特異的に同定されたアミノ酸である。これはまた、エピトープIIの現在好適な免疫原の配列でもある。Ｘ42がGlyであるこの免疫原は、Ｘ42がAlaである配列と交差反応性の抗体を誘導する。これは既知のHIV-1 Tatタンパク質の95％より多くと反応／交差反応する。このエピトープII配列は多数の既知のHIV-1 Tat変異体中の抗原可変性をもたない。Ｎ末端のR3は非修飾Ｎ末端アミノ酸Lys上の水素を表すか、またはR3はLys上の置換基である低級アルキルまたはアセチル基のような低級アルカノイルであることができる。またR3は、低級アルキルまたは低級アルカノイルで場合により置換された１から５個の間のアミノ酸の配列を含んでもよい。Ｃ末端のR4は、Ｃ末端アミノ酸の遊離ヒドロキシルを表すか、またはR4はそのＣ末端アミノ酸上のアミドでもよい。R4はスペーサーのようなさらなる非極性アミノ酸を含んでもよい。スペーサーの例としてgly-ser-gly-ser-を使用することができ、配列 Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser［配列番号２５］（ここでＸ42はGlyまたはAlaである）を生じる。しかしR4はエピトープIIの式中の最後のアミノ酸後にTat配列中に自然に存在する塩基性アミノ酸-Lys-Arg-Arg-であることはできない。294ＢクレードTat変異体中に見いだされるエピトープII配列は、霊長類により認識される（国際公開第99/02185号明細書に報告されているように、ウサギの免疫系は配列番号１５のAA43−50に由来するエピトープを認識する）。
【００３８】
エピトープIIは他の配列中に存在する時、それほど免疫原性ではない。すなわち最適な免疫原性には、この配列をキャリアータンパク質に融合または結合した合成ペプチドとして、あるいは場合によりキャリアータンパク質に結合した多数の抗原性ペプチドとして調製する。あるいはエピトープIIを組換えタンパク質のＣ末端配列として発現させることができ、これは場合によりそのアミノ末端配列でキャリアータンパク質に枠内融合される。本発明の組成物では、エピトープIIペプチドは好ましくは単独、または１以上の霊長類が認識するエピトープIペプチドと組み合わせて提示される。
【００３９】
エピトープIIIは簡単に記載すると、そして国際公開第99/02185号明細書に同定されているように、式 R5-Arg-Arg-X58-Z59-A60-Y61-Ser-R6［配列番号６］（式中、Ｘ58はAla、Pro、SerまたはGlnであることができ:Ｙ61はAsp、Asn、GlyまたはSerであることができ；Ｚ59はProまたはHisであることができ；そしてＡ60はGlnまたはProであることができる）のペプチドと定める。エピトープIVは式:R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8［配列番号７］（式中、Ｘ64はAsnまたはThrであることができ:そしてＹ67はAlaまたはValであることができる）のペプチドと定める。
【００４０】
このように本発明の組成物、すなわち上記に同定したアミノ酸配列を含有するペプチド／ポリペプチドは、ヒト個体に提供した時、ほとんどのHIV-1株の細胞外Tatタンパク質の免疫学的阻止に有用である。これらの組成物はウイルスの長期の増殖を極めて下げるように機能し、そしてウイルスの効果的な免疫防御を可能とする。
【００４１】
各エピトープの免疫原は好ましくは、各エピトープの自然に存在する変異体の最高群と反応性の抗体を誘導するように設計する。霊長類が認識するエピトープIのようなエピトープには、免疫原の多数のコピーを合成または組換え免疫原に包含させて免疫原性を強化し、そしてより高力価の抗体を生成することができる。さらに、各エピトープの配列における変異は独立して生じるので、２以上のエピトープに関する免疫原を組み合わせて範囲を広げることができる。すなわち１例として、本発明の組成物は霊長類が認識する２つの必要なエピトープIペプチドならびにキャリアータンパク質に結合される末端上にCysを用いて上記のように特異的に同定される４または５の他のエピトープIペプチドを含む。あるいは場合によりキャリアータンパク質に結合された多数の抗原性ペプチドを調製し、そして本発明の組成物を形成するために合わせることができる。あるいは２以上の免疫原の混合物を使用することができる。
【００４２】
任意のエピトープII、IIIもしくはIVまたは他の任意の免疫原を含むか、または含まない本発明の霊長類が認識するエピトープI免疫原は、例えば化学的に合成された、または組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質または融合ペプチドとして様々な状態に調製し、そして免疫原性組成物中に使用することができる。
１．キャリアーに結合した組換えまたは合成ペプチド／タンパク質
１つの態様として、本発明の組成物は霊長類が認識する少なくとも２つの必要なエピトープI免疫原性アミノ酸配列（ならびにさらなる他のエピトープI配列）を含有し、そしてまた選択したキャリアータンパク質に結合された１以上のエピトープII／III／IV免疫原性アミノ酸配列を含有する合成または組換えで生成されるペプチドであることができる。本発明の組成物のこの態様では、フランキング配列を含むか、または含まない、多数の上記の霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列をポリペプチドに連続して連結し、そして同じキャリアーに結合することができる。あるいはエピトープI、II、IIIまたはIV免疫原をペプチドとして個別に同じかまたは異なるキャリアータンパク質に結合し、そして生成した免疫原キャリアー構築物を一緒に混合して、１つの組成物を形成することができる。そのような配列は化学合成の常法により合成的に、またはこれもまた現在では通例の手段により選択した宿主細胞中での発現により組換え的に作ることができる。
【００４３】
この態様に関して、キャリアータンパク質は望ましくは選択した免疫原の免疫原性を強化することができるタンパク質または他の分子である。そのようなキャリアーは、アジュバント効果を有するより大きな分子でよい。通例のタンパク質キャリアーの例には限定するわけではないが、大腸菌（E.coli）DnaKタンパク質、ガラクトキナーゼ（galK、これは細菌におけるガラクトース代謝の第１段階を触媒する）、ユビキチン、α-接合因子、β-ガラクトシダーゼおよびインフルエンザ NS-1タンパク質を含む。ジフテリア トキソイドおよび破傷風トキソイドのようなトキソイド（すなわち毒性活性を排除するために十分に修飾した自然に存在するトキシンをコードする配列）もキャリアーとして使用することができる。同様に種々の細菌の熱ショックタンパク質、例えばマイコバクテリアhsp-70を使用することができる。グルタチオンレダクターゼ（GST）は別の有用なキャリアーである。当業者は、適当なキャリアーを容易に選択することができる。
【００４４】
特に望ましい免疫原−キャリアータンパク質構築物では、２つの必要なエピトープI免疫原および霊長類が認識するび３〜６個のさらなるエピトープI免疫原および場合により免疫原性ペプチド／ポリペプチドを、マイコバクテリアの大腸菌（E.coli）熱ショックタンパク質70(hsp70)に共有的に連結することができる［K.Suzue et al,J.Immumol.,156:873(1996)］。別の望ましい態様では、組成物は免疫原を含有するペプチドまたはポリペプチド配列をジフテリアトキソイドに共有的に連結することにより形成される。
２．多抗原性ペプチド
さらに別の態様では、ペプチドまたはポリペプチドエピトープ免疫原および選択された任意の免疫原は多抗原性ペプチド（“MAP"、または８量体リシンコアペプチドとも呼ぶ）構築物の状態であることができる。そのような構築物は、Tam,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5409-5413(1988)により記載されているMAP系を使用して設計することができる。この系は記載されているように本発明の霊長類が認識する同じエピトープIの多数のコピーが中に合成されるリシン残基のコアマトリックスを使用する［D.Posnett et al.,J.Biol.Chem.,263(4):1719-1725(1988);J.Tam、「化学的に定めた合成免疫原および多抗原ペプチド法によるワクチン（Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Multiple Antigen Peptide Approach）」、ワクチンの研究開発（Vaccine Research and Developments)、第１巻、W.Koff and H.Six編集、pp51-87（マーセル デブラウ(Marcel Deblau)社、ニューヨーク、1992)］。各MAPは唯一のペプチドの多数のコピーを含む。したがってMAPを含有する組成物は少なくとも２つ、そして好ましくは約７個のMAPを含むだろう。１つのMAPは各リシンコアに結合した必要とされる第１のペプチドまたはポリペプチドエピトープI免疫原を含み；第２のMAPはMAPは各リシンコアに結合した必要とされる第２のペプチドまたはポリペプチドエピトープI免疫原を有するだろう。さらに、各々が上記で同定した霊長類により認識される異なるエピトープIアミノ酸配列を含む他のMAPも含むことができる。多数の異なるMAPは、エピトープI、II、IIIまたはIV配列の所望する組み合わせを得るために使用することができる。好ましくはこれらのMAP構築物は他のＴ細胞刺激配列を付随するか、または医薬組成物として既知のアジュバントのようなＴ細胞刺激剤と併せて投与される。
３．スペーサー
上記組成物のいずれにおいても、例えばペプチド／ポリペプチド−キャリアー構築物またはMAPとして、各ペプチド／ポリペプチド免疫原または免疫原中の各アミノ酸配列は、場合により「スペーサー」と呼ばれる任意のアミノ酸配列により分けることができる。スペーサーは、２つの配列の間に挟まれて免疫原の３次元的構造に悪影響を及ぼすことなくそれらの間の連結を可能とする１〜約４個の間のアミノ酸配列である。スペーサーは所望する場合、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含んでスペーサーの分離を可能とすることができる。適当なスペーサーまたはリンカーは当業者に知られており、そして容易に設計および選択され得る。好適なスペーサーは、Glyおよび／またはSerアミノ酸を含有する配列である。
Ｆ．合成または組換え的に生成した遺伝子を含有する本発明の核酸組成物
本発明の他の態様には、上記組成物のペプチドおよびポリペプチド免疫原を含み、そしてキャリアータンパク質に融合したそれらペプチドおよびポリペプチドを含む、上記の霊長類が認識するエピトープIペプチド／ポリペプチド組成物をコードする核酸配列を含む。核酸配列はキャリアータンパク質をコードする配列も含むことができる。
【００４５】
このように本発明の１つの好適な態様は、霊長類が認識する少なくとも２つの必要なエピトープI免疫原ペプチド／ポリペプチドを連続的にコードする「合成遺伝子」である。遺伝子は「合成」と言うが、これは所望により化学的合成または組換え手段により設計できることに注目されたい。合成遺伝子は好ましくは、特異的に同定される霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列［配列番号１７〜２４］の７またはすべての８個をコードする。また合成遺伝子は、エピトープIIまたはIIIペプチドが霊長類が認識するエピトープI配列のＣ末端に融合され、そしてそれが持つＣ末端でさらに修飾されないならば、場合により選択したエピトープIIまたはIII免疫原をコードすることもできる。合成遺伝子は２つの必要なエピトープIアミノ酸配列の複数のコピー、あるいはさらなる多数の異なる免疫原またはアミノ酸配列のコピー、あるいは多数の異なる免疫原またはアミノ酸配列の多数のコピーをコードすることができる。合成遺伝子は選択したアミノ酸配列を、キャリアータンパク質をコードする核酸配列を含む、または融合するオープンリーディングフレイム内にコードする合成遺伝子であることができる。さらに合成遺伝子の特徴は、それが免疫原をコードする各配列間に、かつ／または免疫原をコードする配列とキャリアータンパク質をコードする配列の間にスペーサーをコードすることである。
【００４６】
本発明の合成遺伝子は、合成または組換え分子の一部でもよい。合成分子は、プロモーター、終止シグナル等のような調節要素をコードする核酸配列の操作的制御下に、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または融合ペプチドをコードする合成遺伝子を含むベクターまたはプラスミドのような核酸構築物でよい。そのような合成分子は、ポリペプチド／ペプチド免疫原組成物を組換え的に生成するために使用することができる。合成遺伝子または合成分子は、化学合成法または好ましくは組換え技法の使用により調製することができる。例えば、合成遺伝子または分子は、示す宿主細胞種について特定の好ましいコドンを含むことができる。
【００４７】
好ましくはDNAの状態の合成遺伝子または分子は、種々の方法で使用することができる。例えばこれらの合成核酸配列は、宿主細胞培養においてインビトロで本発明のペプチド／ポリペプチドを発現するために使用することができる。発現した免疫原は、適当な精製後、医薬試薬またはワクチンに包含することができる。あるいは本発明の合成遺伝子または合成分子は、哺乳動物、好ましくはヒトにいわゆる「裸のDNA」として直接投与して、患者内にてインビボでタンパク質／ペプチド免疫原を発現することができる。例えば、J.Cohen,Science,259:1691-1692（1993年3月19日);E.Fynan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11478-11482(1993年12月）；およびJ.A.Wolff,et al.,Biotechniques,11:474-485(1992)を参照にされたい（すべては引用により本明細書に編入する）。合成分子、例えばベクターまたはプラスミドは、哺乳動物宿主に直接注射するために使用することができる。これは宿主細胞によるタンパク質の発現、そして続いてインビボで抗体形成を誘導するために免疫系に対する提示をもたらす。
Ｇ．合成遺伝子を発現する微生物
本発明のさらに別の観点では、本発明の合成遺伝子または分子を非−病原性微生物に取り込むことができる。生成した微生物は哺乳動物宿主に投与した時に発現し、そしてインビボで本発明の発現した組成物を複製して、特異的な抗体形成を誘導する。例えば本発明の組成物または合成遺伝子を運び、そして哺乳動物患者へ投与するために有用な非−病原性の組換えウイルスまたは片利共生細菌は、通例の方法により調製され、そして既知の非−病原性微生物の中から選択することができる。
【００４８】
合成分子を患者に外から送達するために、かつ／または合成遺伝子を患者のインビボに運ぶために有用であり得る片利共生細菌には、限定するわけではないが、ストレプトコッカス（Streptococcus)、例えばS.ゴルドニー（gordonii）、または大腸菌（E.coli）、バチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサッカロミセス（Saccharomyces）の種々の株を含む。
【００４９】
合成遺伝子を宿主の細胞に運ぶために工作できる適当な非病原性ウイルスは、ワクシニアのようなポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、カナリア痘ウイルス、レトロウイルス等を含む。そのような多数の非-病原性ウイルスは通常、ヒトの遺伝子療法に、そして他のワクチン剤のキャリアーとして使用され、そして当業者には既知であり、そして選択可能である。
Ｈ．本発明の組成物の調製または製造
本発明の組成物、および本発明の霊長類が認識するエピトープI免疫原および場合により１以上のエピトープII、IIIまたはIVを含有する個々のポリペプチド／ペプチド、本発明の合成遺伝子および合成分子は、Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)に記載されるように、既知の化学合成技法により通常に調製することができる。あるいは本発明の組成物は、任意の他の免疫原および任意のキャリアータンパク質を含む霊長類が認識する少なくとも２つの必要なエピトープI配列を含むペプチド／ポリペプチドをコードする配列を持つDNAフラグメントをクローニングし、そして宿主微生物または細胞内で発現させることにより、既知の組換えDNA法により調製することができる。エピトープIおよび任意の免疫原のコード配列は、合成的に調製することができるか［W.P.C.Stemmer et al.,Gene,164:49(1995)］、または既知の技法によりウイルスRNAから、または利用できるcDNA-を含有するプラスミドから誘導することができる。
【００５０】
これらの技法の組み合わせを使用してもよい。例えば通常の分子生物学的技法による連続的な免疫原の集成は合成遺伝子の生成に使用することができ、そして部位特異的突然変異誘発法を使用して所望の免疫原の配列を提供することができる。次いで合成遺伝子の産物を組換え的に生産する。これらの操作のすべては、通例の技法により行うことができる。
【００５１】
合成遺伝子または分子を使用した本発明のペプチド／ポリペプチド組成物のクローニングおよび発現に関する系には、組換え法で周知な種々の微生物および細胞の使用を含む。これらには例えば、大腸菌（E.coli）、バチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサッカロミセス（Saccharomyces）の種々の株、ならびに哺乳動物、酵母および昆虫細胞を含む。それらに適当なベクターは既知であり、そして私的および公的な研究室および寄託機関ならびに市販の売り主から入手することができる。現在、最も好適な宿主は、チャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）またはCOS-1細胞のような哺乳動物細胞である。これらの宿主はワクシニアまたはブタポックスのようなポックスウイルスベクターと一緒に使用することができる。形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の生産および精製のための他の適当な宿主細胞および方法の選択は、既知の技法を参照にすることにより当業者により行うことができる。例えば、中でもGething and Sambrook,Nature,293:620-625(1981)を参照にされたい。他の好適な系には、バキュロウイルス発現系およびベクターを含む。
【００５２】
通例の組換え手段により生成した時、本発明の組成物、すなわち霊長類が認識するエピトープI免疫原および任意の免疫原の示したコピーを含むポリペプチド／ペプチドは、細胞の内容物から通例の溶解技法により、またはクロマトグラフィーのような通例の方法によりいずれかで細胞媒質から単離することができる。例えばSambrook et al.、モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning.A Laboratory Manual.,）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989)を参照にされたい。DNAワクチンとしてペプチド／ポリペプチドのいずれかの成分の生産に使用する適当なプラスミドおよびウイルスベクターは当業者には周知であり、そして本発明を限定するものではない。タンパク質の生産についてはSambrook et al.同上および上記の技術文献を参照にされたい。または1994年1月20日に公開された国際公開第94/01139号明細書も参照にされたい。簡単に説明すると、選択したペプチド／ポリペプチドをコードするDNAを、他の任意のフランキング配列、プロモーター、mRNAリーダー配列、開始部位およびインビボまたはインビトロでその配列の増幅および発現を支配することができる他の調節配列を含むベクターまたはプラスミドに挿入する。これらのベクターは患者の細胞の感染およびインビボで合成遺伝子配列のタンパク質／ペプチドとしての発現、またはインビトロで融合タンパク質／ペプチドとしてその発現を可能とする。
【００５３】
調製した組成物は、任意の数の免疫原を含む霊長類が認識するエピトープI組成物に配合し、そしてインビボアッセイにより効力をスクリーニングすることができる。そのようなアッセイは、動物、例えばサルを組成物で免疫感作し、そしてHIV-1のTatタンパク質または変異体Tat配列に対応する合成の検出体（detector)ペプチドに対する抗体の力価の評価を使用する（以下の実施例で示すように）。
Ｉ.本発明の抗体組成物
本発明の抗体組成物またはリガンド-結合組成物は、式 -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-［配列番号９］（式中、Ｙ7は、Arg、Lys、SerおよびAsnから成る群から選択され；式中、Ｘ9は、GluおよびAspから成る群から選択され；式中、Ｚ12は、LysおよびAsnから成る群から選択される）のエピトープIに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を包含する。好ましくはそのような抗体組成物は、本明細書で定める少なくとも２つの必要なエピトープI配列に特異的に結合する少なくとも２以上の異なる抗体またはリガンドを含む。抗体（または他の結合リガンド）は、エピトープIの２つの必要な配列 R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2［配列番号１７］；および R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2［配列番号１８］に対して生成される。組成物の抗体はこのようにHIV-1 Tatタンパク質の多数の変異体上に存在するHIV Tatタンパク質に結合する。さらに上記のエピトープIの式内に入る（falling）他の配列に対する抗体またはリガンドを生成する。
【００５４】
１つの態様では、上記のように本発明のエピトープIペプチドまたはポリペプチドに結合するように向けられた単離された抗体も本発明の観点の中にある。そのようなポリクローナル抗体は、典型的には哺乳動物、好ましくは霊長類を上記の２つの必要なエピトープI免疫原、ならびに霊長類が認識する他のエピトープI免疫原および任意の免疫原の寄せ集めを含有するペプチド／ポリペプチド組成物で免疫感作することにより生成される。特に免疫原として望ましいのは、以下の実施例３に記載する合成遺伝子または融合タンパク質のような７価の霊長類が認識するエピトープI免疫原（すなわち稀な変異体無しの）または８価の免疫原、および／または一価のエピトープII免疫原（すなわち場合によりキャリアーに結合した単一のエピトープIIペプチド）である。霊長類で生成することに加えて、そのような抗体はいわゆる「ヒト化」トランスジェニックマウスを含むトランスジェニック動物でも生成することができる。しかし本発明の組成物に対してポリクローナル抗体を生じるために望ましい宿主にはヒトを含む。エピトープI組成物に対して暴露された哺乳動物で生成するそのようなポリクローナル抗体の力価は、酵素−結合免疫吸着アッセイを用いるような標準的な技法により監視することができる。所望により、抗体分子は哺乳動物から、例えば全血、血漿または血清から単離することができ、そしてさらに通例の技法により免疫感作した哺乳動物の血漿または血清から精製することができる。通例の回収法には、中でも血漿瀉血、プロテインＡクロマトグラフィーを含む。そのようなポリクローナル抗体組成物は、それら自体で本発明の医薬組成物として使用することができる。
【００５５】
あるいは抗体生産細胞を哺乳動物から得、そして他の形態の抗体およびリガンド、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ファージディスプレイ(phage display)をスクリーニングすることにより生成されるリガンド、それらの抗体フラグメントおよび混合物、および合成抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全なヒト抗体を調製することができる。これらの種類のリガンドを生成する調製的技法は既知であり、そしてリガンド自体は霊長類が認識するエピトープIおよび任意の免疫原の開示されたアミノ酸配列を使用して生成することができる。例えばKohler and Milstein (1975) Nature,256:495-497;Kozbor et al.,(1983) Immunol.Today, 4:72;Cole et al,1985,モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、アラン R.リス(Alan R.Liss)社、第77-96頁；Harlow et al.、抗体:ア ラボラトリーマニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、(1988)；Queen et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,86:10029-10032(1989)；Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421(1991)；国際特許出願PCT/GB91/01554号、国際公開第92/04381号明細書、および国際特許出願PCT/GB93/00725号、国際公開第93/20210号明細書を参照にされたい］。
【００５６】
例えば別の態様ではモノクローナル抗体は、上記に定める可変アミノ酸およびＲ基を含むエピトープIの式により定められる任意のより大きな免疫原を含んで成るHIV Tatタンパク質の-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-［配列番号９］により定められる最小のエピトープI配列に特異的に結合する。１つの態様として、モノクローナル抗体はアミノ酸配列-Asp-Pro-Asn-Leu-X9-Pro-Trp-Asn-［配列番号２６］（ここでＸ9はGluまたはAspである）に特異的に結合する。さらに上記式により定められる最小のエピトープI配列に特異的に結合する他のモノクローナル抗体は、本発明の一部である。
【００５７】
本発明の別の態様ではモノクローナル抗体は、すでに記載した抗体により認識される-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１１］のエピトープとは異なるエピトープとして、アミノ酸配列-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-［配列番号１０］（ここでＸ42はGluまたはAlaである）を含んで成る最小エピトープII配列に特異的に結合する。好ましくは抗体組成物は、Ｘ42がGlyであるペプチドおよびＸ42がAlaであるペプチドの両方に交差反応性である１つの抗体を含んで成る。これらの抗体は好ましくは霊長類で生成される。上記式により定める最小エピトープII配列に特異的に結合するさらに別のモノクローナル抗体は、本発明の一部である。
【００５８】
他の抗-Tat抗体は、HIV-1 Tatに結合する免疫グロブリンライブラリーの員を単離するために、本発明の霊長類が認識するHIV-1 Tatエピトープを用いて組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体展示ファージ）をスクリーニングすることにより開発することができる［W.D.Huse et al.,Science,246:1275-1281(1988)］。ファージディスプレイライブラリーの作成およびスクリーニングに関するキットは販売されており、例えばファルマシア（Pharmacia）の組換えファージ抗体系、カタログ番号27-9400-01;ストラテジーン(Strategene）展示ファージキット等。例えば米国特許第5,223,409号明細書、国際公開第92/09690号、同第90/02809号明細書等を参照にされたい。キメラ抗体も既知の技法を使用して同様に開発することができる［中でもMorrison et al,(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851;Takeda et al,Nature,313:452(1984)］。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。単鎖抗体は本発明により生成されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体の可変部分を使用して、通例の方法［例えば米国特許第4,946,778号および第4,704,692号明細書］により調製することもできる。Fab、F(ab')2およびFvフラグメントのような抗体フラグメントおよびそれらのライブラリーも、本発明の様々な観点で使用することができる。
【００５９】
これらの抗体／リガンド組成物は、望ましくはほとんどの既知のHIV-1 Tatタンパク質変異体（例えば既知のTatタンパク質変異体の95％より多く、そして好ましくは99％より多い）に結合し、そしてさらにTatタンパク質によるHIV-1増殖の支持を防止する。そのような組成物はHIV-1の多数の株に由来するHIV-1 Tatタンパク質のエピトープ配列に結合する多数の異なる抗体の混合物を含むことができる。すなわちこれらの抗体は以下に記載する製薬的方法および製剤に有用である。
Ｊ．本発明の医薬組成物
本発明の別の観点で、既知のHIV-1 Tatタンパク質のほとんど（例えば95％より多く、そして好ましくは99％より多い）と反応し、そしてHIV-1の増殖を減じる抗体を誘導するために有用な医薬組成物は、その活性剤として霊長類が認識する本発明の少なくとも２つの必要なエピトープIペプチドまたはポリペプチド、および好ましくはさらなるエピトープIペプチドを含んで成ることができる。幾つかの望ましい組成物には、以下の上記成分を含む：
（ａ）少なくとも２つの必要な、そしてより好ましくは少なくとも７つの霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列［配列番号１７〜２４］を含むペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｂ）さらに任意のエピトープII、IIIまたはIVのアミノ酸配列、好ましくは一価のエピトープII免疫原を含む（ａ）のペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｃ）霊長類が認識する２つの必要なエピトープI配列、および好ましくはエピトープI配列［配列番号１７〜２４］の７つおよび上記の任意の配列をコードする合成または組換え的に生成した遺伝子；
（ｆ）（ｃ）の合成遺伝子を含む合成分子；
（ｇ）合成遺伝子または上記の分子を持つ組換えウイルス；および
（ｈ）合成遺伝子または上記の分子を持つ片利共生細菌。
【００６０】
選択した活性成分（１つまたは複数）は製薬学的に許容されるキャリアー中に存在し、そして組成物はさらなる材料を含んでもよい。本発明の組成物を含有する医薬製剤は、タンパク質／ペプチド組成物にMAPのＴ細胞刺激剤、アジュバントおよびIL-12のような免疫刺激サイトカイン、および他の周知のサイトカインのような他の活性剤を含むことができる。これらすべての医薬組成物は、哺乳動物のウイルスレベルを下げるために作動することができる。
【００６１】
医薬組成物として、霊長類が認識するエピトープIペプチドまたは核酸配列および任意の免疫原配列を含んで成る組成物は、ウイルス感染の予防または処置のための哺乳動物への投与に適する製薬学的に許容される賦形剤と混合する。タンパク質／ペプチドは投与のための単一の医薬調製物中で合わせることができる。本発明の免疫原性タンパク質様組成物で使用するために適当な製薬学的に許容されるキャリアーは、当業者には周知である。そのようなキャリアーには例えば塩水、緩衝化塩水、水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液のような選択したアジュバント、リポソーム、水中油型乳液およびその他を含む。適当なアジュバントは、本発明のタンパク質-含有組成物中に使用することができる。DNA、プラスミド核酸または組換えベクターの投与に適当な賦形剤には、限定するわけではないが、塩水またはシュクロース、プロタミン、ポリブレン、ポリリシン、ポリカチオン、タンパク質、CaPO4またはスペルミジンを含む。例えば国際公開第94/01139号明細書および上記に引用した技術文献を参照にされたい。ペプチド／ポリペプチド組成物および合成遺伝子または分子はインビボで、免疫感作した宿主の哺乳動物、例えばヒトにHIV-1に由来する多数の（例えば約95〜約99％より多く）既知の細胞外Tatタンパク質変異体を阻止することができる免疫応答を誘導し、そしてこれによりウイルスレベルを下げる。
【００６２】
HIV-1の増殖を減損するために有用なさらに別の医薬組成物は、上に詳細に記載した１以上の抗体を含有する抗体組成物を含んで成る。医薬組成物では、抗体は塩水溶液または他の適当なキャリアー中で運ばれる。抗体組成物は即座の、外から提供されるTatの阻止を提供することができる。
【００６３】
本発明は通例の生理学的に許容されるキャリアー、アジュバント、または上記の種類の医薬調製物に有用な他の材料の選択に限定されない。適当なpH等張性、安定性および他の通例の特性を有する上記成分からのこれらの製薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術の範囲内である。
Ｋ．本発明の方法−HIV-1増殖の減損
本発明により、HIV-1のウイルスレベルを減少させる方法には、ヒトを上記のTat抗体−誘導医薬組成物に暴露し、多数のHIV-1 Tatタンパク質（例えば既知の95％より多く、そして好ましくは99％より多い）と反応する抗体を活発に誘導し、そしてインビボでウイルスの増殖を減じることを含む。この方法はコンピテントな免疫系を持つHIV-1に感染した個体に、あるいは非感染個体の能動免疫感作に適当である。この方法は、HIV-1 Tatタンパク質と反応する抗体を誘導し、HIV-1の初期の急性感染中にウイルス増殖を減少させ、そしてAIDSを導く慢性のウイルス血症を最小とする。またこの方法は、感染した個体の慢性的なウイルス増殖も下げ、ここでもAIDSへの進行を最小とする。これらの方法の使用は慢性のHIV-1感染を防御し、耐性の発生に供することなく新規な処置のメカニズムを提供する。細胞外Tatタンパク質はウイルス複製部分とは関係しないので、Tatに対する抗体は、生成されているTatとは無関係にHIV-1 準種（quasispecies）の複製を阻害する。よってどのメカニズムによりTat抗体が非反応性のエスケープTat変異体に関する選択圧を生じることができたのかは明らかではない。
【００６４】
この方法により、医薬組成物は好ましくはペプチド／ポリペプチド組成物、合成遺伝子または分子、組換えウイルスまたは片利共生細菌を含む。好ましくは組成物は７価の合成遺伝子または融合タンパク質（エピトープIの稀な変異体無しで）、あるいは実施例３の８価の合成遺伝子または融合タンパク質および任意に１価のエピトープIIペプチドを含む。医薬組成物のこれらの活性成分の各々は、感染細胞から他の感染または非感染細胞へのTatの輸送を遮断する抗-Tat抗体の形成を暴露したヒト中で活発に誘導する。この作用は感染の多重度を下げ、そしてHIV-1 ウイルス拡大のバーストを遮断し、すなわちウイルスレベルを下げる。すでに感染した患者では、このウイルスレべルの低下法は慢性ウイルス血症およびAIDSへの進行を下げることができる。非感染のヒトでは、本発明の組成物の投与は急性の感染を減じることができ、すなわち慢性ウイルス血症およびAIDSへの進行を最小にする。
【００６５】
さらに本発明の別の観点は、HIV-1による感染に対して効果的または迅速な免疫応答を上げることができないヒトに、上記の抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することにより、HIV-1のウイルスレベルを下げる方法である。この方法は組成物を長期に投与することを含むことができる。中でもこの方法を用いた処置に適するような患者は、疾患により免疫抑制になり、そして強力な免疫応答を上げることができないHIV-1感染患者である。HIV-1感染の後期では、疾患に付随する免疫傷害により抗体の効果的な力価生成の見込みは低い。また中でもそのような患者は、HIV-1に感染した妊婦、感染した母親から生まれた新生児、および暴露されたと推定される非免疫感作患者である（例えば、HIV-1感染したヒトにより使用された針で偶然「刺された」ヒト）。
【００６６】
そのような患者に関して、本発明の方法は好ましくは医薬組成物として本発明の抗体組成物を使用する。抗体組成物には他の哺乳動物、好ましくは正常なヒトで調製されたポリクローナル抗体組成物、あるいは上記の他の抗体形態、例えばモノクローナル等を含む。これらの抗体組成物は、受動免疫療法として投与してウイルス増殖を阻害し、そしてウイルス負荷量を下げる。HIV-1に由来する多数の既知のTatタンパク質と反応する外因性抗体は患者内に、ウイルス感染した細胞からのTatを他の感染または非感染細胞へ輸送することを直ちに阻止することを提供する。この方法により、患者は長期の処置養生中、抗体組成物で長期に処置することができる。
【００６７】
上記の各方法では、本発明の組成物を適当な経路、例えば皮下、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻内または吸入経路により投与する。現在好適な投与経路は、免疫感作（能動誘導）組成物には筋肉内であり、そして抗体（受動療法）組成物には静脈内（i.v.)、皮下（s.c.)または筋肉内(i.m.)である。組換えウイルスベクターまたは裸のDNAは好ましくは筋肉内に投与される；しかし他の特定の組換えウイルスベクターおよび／または生きている片利共生細菌を経口的に送達してもよい。
【００６８】
各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸配列の量は、患者の年齢、体重、性別、一般的な身体状態等を考慮して選択される。免疫応答、好ましくは防御応答を誘導するために、あるいは重大な副作用無しに患者に外因的効果を生じるために必要な活性成分の量は、使用する医薬組成物およびアジュバントの任意の存在（例えばタンパク質を含有する組成物について）に依存して変動する。
【００６９】
一般に、タンパク質／ペプチド、融合タンパク質、MAPまたは結合したタンパク質を含有する組成物、あるいは抗体組成物について、各々の用量は１mLの滅菌溶液あたり約50μg〜約20mgの間のペプチド／ポリペプチド免疫原を含んで成るだろう。より好適な投薬用量は、約500μgの免疫原である。他の投薬用量範囲も、当業者により企図される。初期用量は場合により望む場合は追加免疫により繰り返される。
【００７０】
本発明の抗体組成物は、針により刺されたり、または材料の感染により急性感染の危険性がある個体の長期処置に使用することができる。そのような「急性」感染に関する投薬頻度は、約６週間にわたり毎日の投薬から１週に１または２回のi.v.、s.c.またはi.m.の範囲でよい。本発明の抗体組成物は感染患者、または進行したHIV患者の長期の処置に使用することができる。感染患者では、長期投与の頻度は毎日の投薬から１カ月に１または２回のi.v.、s.c.またはi.m.の範囲でよく、そして免疫原の半減期（例えば約７〜21日）に依存するだろう。しかしそのような感染した患者の長期的処置の期間は定まらず、しかし長期になると思われる。
【００７１】
あるいは本発明の組成物は、「裸のDNA」として本発明の合成遺伝子または分子の直接投与を設計することができる。タンパク質免疫原組成物のように、DNAおよびベクター組成物中の成分の量および投与様式（例えば注射または鼻内）は、当業者により選択され、そして調整され得る。一般に各用量は１mLの滅菌溶液あたり約50μgから約１mgの間の免疫原をコードするDNAを含んで成る。
【００７２】
合成遺伝子または分子を含有する組換えウイルスについては、用量は約１×107〜１×1010pfu/mlの本発明の組換えウイルスの濃度を含有する約20から約50mlの塩溶液の範囲であり得る。好適なヒトへの投薬用量は、上記濃度で約20mlの塩溶液である。しかし当業者はそのような投薬用量が宿主に送達される組換えウイルスの独自性および免疫原の作りに依存して変わり得ると理解している。
【００７３】
患者に送達される合成遺伝子または分子を運ぶ片利共生細菌の量は、一般に約103から1012細胞／kgの間の範囲である。これらの投薬用量は、使用する細菌および生きている細菌により送達されるエピトープIおよび任意の免疫原を含有する特定の組成物に依存して、当業者により変えることができる。
【００７４】
このよう本発明の組成物は、選択したウイルスによる非感染哺乳動物、例えばヒトの感染を遅らせるか、または最小にするように設計する。そのような組成物は、このようにワクチンとしての用途を有する。抗-Tatタンパク質抗体は、感染後の血清変換を検出するために診断アッセイに使用されるHIV-1タンパク質と反応性ではない。すなわち本発明の組成物で処置された個体は、HIV-1感染について疑陽性試験の烙印を押されず、そして処置した患者がHIV-1に感染するようになった場合、血清変換を検出する可能性を残す。
【００７５】
たとえタンパク質／ペプチドを含有する組成物として、または免疫原をコードする新規核酸配列の投与によるいずれでも、哺乳動物に本発明の組成物を提供すると、これは望ましくはHIV-1の既知のTatタンパク質変異体の約95％より多く、そして好ましくは約99％より多くの生物学的阻止によりウイルスレベルを下げることが可能となり、HIV-1の多重度を下げるので、根本的に異なる方法のAIDS予防接種を可能とする。
【００７６】
Tat免疫原を含有する組成物の使用は、そのようなウイルスに対して使用される他の処置および予防法とは対照的に、特に望ましい利点を有する。細胞外でのTatタンパク質の阻止は、すべてのHIV準種または株の増幅を無差別に阻害するので、突然変異体ウイルス変異体の選択について親のウイルス自体に関する選択圧を生じない。すなわち、患者の細胞によるTatタンパク質の取り込みの遮断は、ウイルス血症のレベルを減少するだけではなく、「エスケープ変異体」の選択を排除する様式でもウイルス血症のレベルを減少する。
【００７７】
さらに疾患の経過中、細胞外Ｔタンパク質はHIV-1感染のその段階で存在する持続的感染および免疫異常に寄与するので、本発明はウイルス血症の無症状HIV-1感染患者を活発に処置する方法を含んで成る。本発明に従い免疫感作により誘導される抗体による細胞外Ｔタンパク質の阻止は、より効果的な免疫防御でウイルス血症を低下させ、そしてAIDSへの進行の遅れまたは防止をもたらす。
【００７８】
上記の本発明のメカニズムは、ウイルス感染の過程を妨げ、そして望ましい臨床結果を生じる。より具体的には、本発明の組成物は非感染細胞によるTatタンパク質のさらなる取り込みを遮断することにより、ウイルスにすでに感染した患者のウイルス血症を減少することができる。単独またはHIV感染患者のための他の治療的処方と一緒に使用される本発明の組成物は、ウイルス血症の減少および臨床的な悪化の防止を補助すると思われる。
【００７９】
そのような治療的使用については、投与の製剤および様式は上記に具体的に記載したものと実質的に同一であり、具体的なウイルス感染について他の通例の治療と同時（concurrently or simultaneously)に投与することができる。治療的使用または予防的使用のために、１年後の追加免疫または他の間隔の追加免疫のような免疫感作組成物の繰り返し投与が望ましいかもしれない。
Ｌ．本発明の診断キット
上記のペプチドおよびポリペプチドは、上記組成物の予防接種により誘導される抗体の力価および特異性を測定および検出するために有用なキットの試薬としても使用することができる。本発明のキットは上記に同定した少なくとも２つの必要なエピトープIペプチド、および好ましくは２以上の霊長類が認識するエピトープIおよび任意の免疫原を含むことができる。１つの態様では、各ペプチドはそのＮ末端にタンパク質ビオチンおよびスペーサー、例えば-Ser-Gly-Ser-Gly-［配列番号２７］を有する。あるいは、ペプチドはそのＣ末端にスペーサー、例えば-Gly-Ser-Gly-Ser-［配列番号３９］およびタンパク質ビオシチンを有する。これらの態様で、ペプチドがアビジン-コート固体支持体、例えばプレートまたはビーズに結合できるようになる。診断アッセイ分野で当業者に既知の他の結合剤は、同じ目的に使用することができる。またキットに提供されるのは、ヤギ抗-ヒト免疫グロブリン等のような固定化エピトープペプチドへの抗体の結合を検出する標識試薬である。試薬上の標識は、放射性化合物、蛍光化合物およびタンパク質、発色酵素等のような多くの既知の診断標識から選択することができる。キットはまた、標識を読むための種々雑多の試薬および装置、例えば発色シグナルを生成するために、このように酵素標識と相互作用する特定の基質、例えば血液サンプルを採取する装置ならびに適当なバイアルおよび他の診断アッセイ部品を含む。当業者はこのキットのために他の通例の診断成分も容易に選択することができる。
【００８０】
そのようなキットおよび試薬は本発明の組成物で予防接種した個体中の抗体の力価および反応性パターンを検出する方法に使用することができる。Tat免疫原に対する免疫感作により誘導される抗体の存在およびまたは力価を測定する方法には、免疫感作した個体に由来する生物サンプル（例えば体液、好ましくは血液、血清または血漿、しかしまた尿、唾液および他の流体または組織も可能）を、好ましくはプレートまたはビーズのような固体支持体上に固定化された霊長類が認識するエピトープIおよび任意の免疫原の１以上の結合配列と接触させる工程を含む。この方法で使用する霊長類が認識するエピトープIおよび任意の結合配列は、非修飾の最小エピトープ結合領域である。
【００８１】
いったん生物サンプルを固定化されたペプチドに十分な時間暴露したら、支持体を洗浄してペプチドに結合しない生物サンプルからのいかなる材料も排除する。そのような洗浄工程は診断アッセイでは通例であり、そして塩水を用いて行われる。エピトープIおよび任意の免疫原またはそれらの組み合わせに対する抗体が上記の処置により個体に誘導されれば、固定化されたペプチドは生物サンプルに由来する抗体に結合した。その後、標識試薬を支持体上の材料に加えて、支持体上のペプチドと該生物サンプル中の抗体との間の結合を検出する。好ましくはそのような試薬はヤギ抗-ヒト免疫グロブリンのような抗-ヒト免疫グロブリンである。この標識は、上記に検討したような通常使用される診断用標識の広い配列から選択される。１つの態様では、標識は基質と接触すると検出可能な色のシグナルを生成する発色酵素であることができる。色の存在および／または強度は、処置した個体中の抗体の誘導の証明を提供する。このアッセイは免疫感作の効力を測定するために、ならびに患者の免疫状態を監視するために使用することができる。
【００８２】
特定のアッセイ工程ならびに種々の検出可能な標識系の選択は、当該技術の範囲内である。そのような選択は日常的であり、そして本発明を限定しない。
Ｍ．本発明の利点
本発明の組成物の利点の１つは、共通するＢサブタイプのHIV-1の既知のTatタンパク質変異体の95から99％より多くと交差反応させるために、本発明の組成物に包含するために必要な少数の免疫原である。以下の実施例で具体的に説明するように、２つの必要な霊長類が認識するエピトープIアミノ酸配列ならびに６個のさらなるエピトープI配列を含む霊長類が認識するエピトープI免疫原性組成物は、共通するＢサブタイプのHIV-1の95％のTatタンパク質ならびにHIV-1の少ない非-Ｂサブタイプに由来するすべての56個のTatタンパク質配列と交差反応する。このように１つの組成物は、遭遇し得るほとんどのHIV-1株により引き起こされる感染に対して保護し、そして処置するために有用に使用され得る。
【００８３】
さらに結合が望まれるTatの正確なエピトープが同定されれば（すなわち、配列番号１５のAA5−12）、本明細書に記載した方法を使用して新しく発生したHIV-1株または新たに発見された株に由来する新しい望ましいTatペプチド免疫原を容易に同定し、そしてこの組成物に含めることができる。この柔軟性により、本発明の組成物を将来同定される任意の新規HIV-1株（１つまたは複数）に対して予防的に有用とすることができる。本明細書に教示する観点において、当業者はTat免疫原（およびそれらをコードする核酸構築物）の新規組み合わせを組成物に容易に包含できると予想される。
【００８４】
例えば、PCRおよび高密度オリゴヌクレオチド配列［M.J.Kozal et al,Nature Med.,2:753(1996)］のような通例の技法を使用して、当該技術分野の技術の１つでHIV-1株およびサブタイプの臨床的単離物の変異体を表すHIV-1 Tatタンパク質の大きな列のアミノ酸配列が得られるようになる。そのような技法の使用により、HIV-1 Ｂサブタイプの他の変異体ならびに今日までそれほど徹底的に研究されていない発展途上国での他のサブタイプの決定が可能となる。新規Tat配列の決定により、免疫原として対応するペプチドを本発明の組成物に直ちに含めることができ、他の稀なHIV-1のTatタンパク質に対する抗体応答の誘導を可能とする。
【００８５】
各Tat変異体に対応する合成ペプチドに対して生じる抗体との交差反応性の実験を使用して、配列の変化が免疫学的にサイレントなTat変異体を用いた免疫感作の必要性を排除することができる（これらのペプチドはコンセンサス配列または他の変異体に対する抗体により強力に結合するので）。
【００８６】
以下の実施例は、本発明の組成物を調製し、そしてこれら組成物を使用して免疫感作された宿主中のウイルスのTatタンパク質に対する抗体を誘導する好適な方法を具体的に説明する。これらの実施例は具体的説明のみであり、本発明の範囲を限定しない。
【００８７】
【実施例】
実施例１−HIV-1 Tatタンパク質中の霊長類が認識するエピトープIに関する抗体に結合するために必要な最小Tatタンパク質アミノ酸配列に関する免疫学的研究。配列変異およびこれらの配列に対する抗血清の免疫学的交差反応性
Ａ．合成ペプチドおよび結合物
合成ペプチドは固相合成により誘導化したポリエチレン支持体上で合成した［R.M.Valerio et al.,Int.J.Peptide Res.,44:158-165(1994)]。免疫感作するペプチドはキャリアータンパク質に結合し易くするために含めるアミノ末端Cysおよびアミド化Ｃ-末端を用いて合成した。検出体ペプチドはアミノ末端ビオチン-Ser-Gly-Ser-Gly-配列［配列番号７］および反応性および交差反応性を検出するためのELISAアッセイに使用するＣ-末端での遊離酸官能基を用いて合成した。ジフテリアトキソイド（DT）キャリアータンパク質にシステインの側鎖を介して結合した、５〜８のペプチド−キャリアー比を有する免疫感作ペプチド［A.C.J.Lee et al.,Molec.Immunol.,17:749(1980)］は、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により、分析用HPLCおよび質量分析で95％より高い純度に精製し、検出体ペプチドは50％より高い純度で使用した。
Ｂ．免疫感作
ペプチド結合体は精製水に溶解し、そして完全フロインドアジュバント（CFA）または不完全フロインドアジュバント（IFA）で１：１に乳化した［抗体−ア ラボラトリーマニュアル（ANTIBODIES-A LABORATORY MANUAL）、E.Harlow and P.Lane編集、コールドスプリングハーバーラボラトリー（1998)]。霊長類あたりの総容量は１mlであり、これはDTに結合した100μgのペプチドを含んだ。
【００８８】
ウイルス対抗実験の一部であったアカゲザルは、IFA/CFA中の抗原で以下のように免疫感作した。免疫感作ペプチドには数匹の霊長類を使用し、最初にCFA中の結合体で初期筋肉内(IM)注射、そして続いてIFA中の結合体を用いて２週目にIMで追加免疫した。前血液は最初の注射前に採取し、そしてより大量の血液は追加免疫注射から３および５週間後に採取した。
Ｃ．ELISA力価
ELISAアッセイは、H.M.Geysen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998(1983)に記載されているように行った。抗体力価はバックグラウンドより高い1.0ODの吸収を生じる血清希釈物の逆数である。２〜３血清の幾何平均力価（GMT）を各応答について計算するか、または１つの血清のみを数匹のサルの免疫感作に利用した。
【００８９】
ウサギ対サルにおけるこのアッセイに関するELISAの結果を、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。ELISAの結果はエピトープIを包含する免疫原に対する霊長類の抗体が、配列 -Asp-Pro-Arg7-Leu-Glu9-Pro-Trp-Lys12［配列番号１５のAA５〜12］と反応していたことを示した。以下に検討するように、７、９および12位は、霊長類により認識されるこのエピトープIペプチドの共通する変異を表す。
Ｄ．エピトープ内のアミノ酸配列多様性の分析
HIV-1 Tatの第１エキソン配列はGeneBankおよびロスアラモスのヒトレトロウイルスおよびAIDSデータベース［ニューメキシコ州、ロスアラモスのロスアラモス国立研究所の理論生物学および生物物理学グループにより公開された、ヒトレトロウイルスおよびAIDS 1996（HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996）、およびロスアラモス研究所のEsther Guzmanの好意によりGnenBankから得たさらなる配列］から引き出した。フレイムシフトを導く不完全配列および終結コドンまたは塩基欠失を持つ配列は、同じ単離物からの明らかな同一反復配列であったので削除した。エピトープ中のその位置でのアミノ酸の変化を記録し、そして表にした。
Ｅ．変異体間の抗原の交差反応性
エピトープのコンセンサス配列に対する抗血清は、コンセンサス配列および共通アミノ酸変異体を含む配列でELISAにより滴定して、抗原性に対するアミノ酸多形性の効果を決定した。
Ｆ．配列の変化
霊長類が認識するエピトープIコンセンサス配列は、最大頻度および霊長類の抗体による認識について評価した。294個のＢクレード(I)ウイルスに由来するHIV-1 Tatタンパク質および56個の非-Ｂクレード(II)ウイルスに由来するHIV-1 Tatタンパク質中の抗原性および配列保存をエピトープについて評価し、そして結果を以下の表IIからIVにまとめた。
【００９０】
表IIおよびIIIの上列は、最大頻度のコンセンサス配列を示す。中列は複数の場合に各位置で５％より高い配列に見いだされるアミノ酸の発生率を含む。各表の下列は複数の場合に５％より高い配列が生じるアミノ酸を含む総発生率である。表II中のこれらの選択のすべて；およびアミノ酸４に入る場合を除いて表IIIにおけるこの選択のすべてが抗原的に際立つエピトープ（＜25％交差反応性）を生成する。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
【表３】
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【００９３】
表IIおよびIIIに示すように、霊長類が認識するエピトープIは有力な16倍の抗原性多形を有するが、Ｂクレードに関しては１つの主要抗原が存在し、そして非-Ｂクレードに関しては別の主要抗原が存在する。５個の他の変異体は、既知のTat変異体の95％より多くの要因である。表IVおよびVを参照にされたい；アスタリスクで示す配列は、Ｂおよび非-Ｂクレードの両方で表される。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
表VIは、エピトープIの位置７の変異体の悪い抗原交差反応性、位置９の変異体の抗原的特徴、および位置７および12の両方に変異を含むGluProVAlAspProArg7LeuGlu9ProTrpLys12［配列番号１５のAA２〜12］を含むGluProVAlAspProAsn7LeuGlu9ProTrpAsn12［配列番号１３のAA225-235］に対する抗血清の極端に欠けた交差反応性を示す。これはさらにGlu9およびAsp9変異体の抗原的特徴を示す。
【００９７】
表VI−Tatアミノ酸７、９および12位に変異を有する検出体ペプチドに関するエピトープI免疫原に対するサル抗血清のELISA反応性
【００９８】
【表６】
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【００９９】
実施例２−HIV-1 Tatタンパク質中の霊長類が認識するエピトープIIに関する抗体への結合に必要な最小Tatタンパク質アミノ酸配列に関する免疫学的研究。配列変異およびこれらの配列に対する抗血清の免疫学的交差反応性
実施例１に概説した手順と同じ手順を使用して、294種のＢ細胞および56種の非-Ｂクレード HIV-1 Tat配列に関するアミノ酸配列変異の発生率を、サルにおける抗体結合のエピトープII境界内で定めた。結果を表VIIおよびVIIIに報告する。表の上段は、コンセンサス配列を含む。中段は多数ある場合に、各位置で５％より多い配列が見られるアミノ酸の発生率を含む。下段は多数ある場合に、５％より多い配列で発生するアミノ酸を含む全発生率を示す。Tat42位でのアミノ酸変異は、抗原的に交差反応性であった。
【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
表VIIおよびVIIIに示すように、エピトープIIはほとんど完全な抗原性の保存を示した。
【０１０３】
検出体配列内にTat Gly42またはAla42(変異体)を含む検出体ペプチドに関して、エピトープII免疫原に対するサルの抗血清のELISA反応性を測定し、そして以下の表IXに報告する。ウサギ対サルを対象とした結果のグラフ的比較に関しては、それぞれ図２Ａおよび２Ｂを参照にされたい。
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
実施例３：無症候性HIV-1感染に関するヒトモノクローナル抗体処置の開発
市販されているヒト化された抗体はマウスを、ジフテリアトキソイドキャリアータンパク質に結合させた適当量のエピトープII免疫原：Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-アミド［配列番号３４］で免疫感作する。ハイブリドーマは、ストレプトアビジンをコートしたプレート上で、ビオチン-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-OH［配列番号３５］およびナノモル以下の結合親和性を有するIgGモノクローナル抗体でスクリーニングし、そして相補的レセプターに対して結合しないものを選択する。特異性は組換えHIV-1 Tatタンパク質で確認する。
【０１０６】
モノクローナル抗体は非-自己抗原に向けられるので、通例の前−臨床生産、精製および自己試験が予想される。内部のCD3で徹底的に消費されるマウスモノクローナル抗体であるOKT3の18時間の半減期に対して、ヒトモノクローナル抗体はヒトで20日の半減期を有する。毎日５mgのOKTの用量は、ヒトで約１マイクログラム／mlまでのトラフレベル(trpugh level)を維持する。すなわち５mgの抗−Tatモノクローナル抗体の隔週の用量は、同様なトラフレベルを維持するために十分であり、感染した患者中のHIV-1 Tatタンパク質について最高１ng／mlの予想される最大循環レベルを50倍より高いモル過剰になると期待される。
【０１０７】
血漿ウイルス負荷量の対照は、今、HIV-1処置に関して許容される効力の基準である。抗-Tatモノクローナル抗体の効力は、最初の４週間の処置で無症候性HIV-1感染個体で迅速に決定することができる。このプロトコールは未処置患者、特に様々な理由からHAARTプロトコールで失敗した患者、またはHAART療法で管理されている患者に有用であり、この治療を４週間で離脱する（ウイルス負荷量はHAARTを止めれば急速にリバウンドする）。LOD(50ウイルスRNAコピー／mL）未満までの血漿ウイルス負荷量における２〜３log減少は、長期間にわたり評価されるモノクローナル抗体での単独療法を支持する。１log（90％）以上ではあるがLOD未満ではない減少は、治療の成分としてのモノクローナル抗体の使用を支持している。
実施例４−個体のAIDSへの進行を防止するための汎用的ワクチンの開発
Ａ．合成遺伝子の構築
図３Ａは、ウサギの抗体応答について検出されるエピトープIの各４つの多形の４つのコピーに加えて、大腸菌（E.coli) DnaK(HSP70)を含む線状融合タンパク質として大腸菌（E.coli)中で発現するエピトープIIの４つのコピーをコードする合成遺伝子を具体的に説明する。この発現タンパク質は、エピトープ特異的ウサギ血清を用いたELISAで試験した時に、すべての抗原性ペプチドを含んだ。しかしウサギまたはサルで免疫感作するために使用した時、すべてのエピトープI変異体は免疫原性であるが、エピトープIIは免疫原性ではなかった。すなわちエピトープIIは適当なキャリアータンパク質と結合した合成ペプチド結合体として最も良く使用される。
【０１０８】
図３Ｂは、霊長類で認識されるエピトープI境界内の多形性に基づき、霊長類が認識する８つのエピトープI多形を枠内に含むように構築された新規な８価の合成遺伝子を具体的に説明する：
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号１７
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号１９
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２２
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号２０
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２４
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2  配列番号２１
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号１８および
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2  配列番号２３。
【０１０９】
エピトープI配列は、Glyおよび／またはSer残基を含有するジペプチドスペーサーにより分けられている。この遺伝子はW.P.C.Stemmer et al.,Gene,164:49(1995)に記載されているように集成した。簡単に説明すると、上鎖の60-merオリゴヌクレオチド(オリゴ)および20ヌクレオチド（nt）を持つ底鎖オリゴの重複を、２つの末端50-merと一緒に合成する。60merをハイブリダイゼーション条件下で一緒にインキューベーションし、そしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を使用して配列を埋め、そしてそれを増幅する。ついで末端の50-merを付加し、そして集成体をPCRにより完成し、その完全長遺伝子をアガロースゲルで単離する。遺伝子を配列決定し、そして実際のエピトープ内に正しい配列を有することが分かる。類似の７価の遺伝子は、稀な変異体 R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 ［配列番号２４］を排除することにより構築することができる。
Ｂ．融合タンパク質の発現
上に記載の遺伝子を次いで制限酵素により切り出し、そして枠内にジフテリアトキソイド（HSP70）の配列を含有する適当な発現ベクターに挿入する。大腸菌(E.coli)をトランスフェクトし、そしてタンパク質を発現するコロニーを単離する。単離したコロニーを成長させ、そして発現を誘導する。融合タンパク質を発現しているコロニーに由来するタンパク質を同定する。生成したタンパク質は、常法を使用して精製する。
【０１１０】
図３Ｃは、類似の技術を使用してジフテリアトキソイドのようなキャリアータンパク質を持つ合成ペプチドの結合物として任意に調製した一価のエピトープII免疫原を具体的に説明する。
Ｃ．融合タンパク質内で正しいエピトープの発現および抗-Tat抗体の誘導における効力を評価するためのアッセイ
エピトープI（ここでＹ7はArg、Asn、LysまたはSerのいずれかであり、そしてＸ9はGluであり、そしてＺ9はLysである）の４つの変異体、およびエピトープIIの両変異体は合成遺伝子中で構築し、そしてＡおよびＢ章で記載したように融合タンパク質として発現させる。各エピトープが霊長類の抗血清により認識され得る状態の融合タンパク質で発現するかどうかを決定するために、エピトープI配列に対応する合成ペプチドに対して生成した霊長類の抗血清を、常法を使用してELISAにより試験する。最初にプレートを融合タンパク質で直接コートし、ついでエピトープIおよびIIに反応性であることが知られている100μg/mlの抗血清溶液（例えばウサギ抗血清）に暴露する。変異体のエピトープ配列は、各エピトープに関して32,000よりも大きな力価により示されるように、対応する合成ペプチドに対する抗体により認識される配列で発現される。
【０１１１】
多価免疫原の免疫原性を評価するために、サルをIFA中の融合タンパク質を用いて免疫感作した。サルの抗血清をエピトープIおよびIIの合成ペプチドで評価した。有意な力価がエピトープI変異体で発生し、すなわちエピトープI（Ｙ7がArgであり、そしてＺ12がLysである)に対して28,000の力価：エピトープI（Ｙ7がAsnであり、そしてＺ12がLysである)に対して16,000の力価；エピトープI（Ｙ7がLysであり、そしてＺ12がLysである)に対して37,000の力価；そしてエピトープI（Ｙ7がSerであり、Ｚ12がLysである)に対して4,000の力価。エピトープIIに対する力価は700であり、このエピトープが免疫感作に関してキャリアータンパク質に結合される合成ペプチドとして最高であることを表す。
実施例５：予防接種により誘導された抗体の力価および特異性を検出するための方法およびキット
本発明のワクチンを用いて免疫感作した後に誘導された抗体の力価および特異性を追跡するために、アッセイ法を使用することができる。そのようなアッセイ法の１態様では、実施例１で報告した霊長類が認識するエピトープI配列を含有するペプチド（免疫感作ワクチンの組成物による）を使用して、予防接種した個体中の抗体の力価および反応性パターンを測定するキットを開発する。
【０１１２】
これらのペプチドは、Ｎ-末端にビオチン-Ser-Gly-Ser-Gly-［配列番号３６］を用いて合成する。各ペプチドは、関連する配列がアビジンのビオチン結合ポケットの外であることを確実とするために、スペーサーとして役立つ配列-Ser-Gly-Ser-Glu-［配列番号２７］を用いて、別々のアビジンコートプレートに塗布する。次いでプレートを試験血清の希釈物とインキューベーションし、洗浄し、そして酵素で直接標識したヒト免疫グロブリン（例えばヤギ抗-ヒト免疫グロブリン）に対する試薬を用いて抗体結合を測定する。試薬は酵素と反応するように採用され、そして発色シグナルを生成する（Ｒ＆Ｄキット インサート)。
【０１１３】
本発明の多数の修飾および変更は、上記に同定された明細書に含まれ、そして当業者には明白であると期待される。本発明の組成物および方法に対するそのような修飾および変更は、前記特許請求の範囲に包含されると考える。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、短縮化された検出体ペプチドでのより大きな直線状エピトープIペプチドに対するウサギ抗血清のELISA力価のグラフであり、大きなペプチドに対する最大結合の割合として表す。対応する検出体ペプチドのＮ-またはＣ-末端アミノ酸を、１文字暗号で各カラムの下に示す。
図１Ｂは、短縮化された検出体ペプチドでのより大きな直線状エピトープIペプチドに対する霊長類抗血清のELISA力価のグラフであり、大きなペプチドに対する最大結合の割合として表す。対応する検出体ペプチドのＮ-またはＣ-末端アミノ酸を、１文字暗号で各カラムの下に示す。
【図２】  図２Ａは、短縮化された検出体ペプチドでのより大きな直線状エピトープIIペプチドに対するウサギ抗血清のELISA力価のグラフであり、大きなペプチドに対する最大結合の割合として表す。対応する検出体ペプチドのＮ-またはＣ-末端アミノ酸を、１文字暗号で各カラムの下に示す。
図２Ｂは、短縮化された検出体ペプチドでのより大きな直線状エピトープIIペプチドに対する霊長類抗血清のELISA力価のグラフであり、大きなペプチドに対する最大結合の割合として表す。対応する検出体ペプチドのＮ-またはＣ-末端アミノ酸を、１文字暗号で各カラムの下に示す。
【図３】  図３Ａは、５価のエピトープI／エピトープII HIV-1 Tat免疫原性構築物の設計を３文字アミノ酸暗号で具体的に説明する［配列番号１２］。
図３Ｂは、８価の汎用的エピトープIの設計を３文字アミノ酸暗号で具体的に説明する［配列番号１３］。
図３Ｃは、１価の汎用的エピトープII免疫原性構築物の設計を３文字アミノ酸暗号で具体的に説明する［配列番号１４］。
【配列表】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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