(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有し、さらに助剤として単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加してなる哺乳類細胞の保存液。
【請求項２】
精製アルブミンがウシ由来のものである請求項１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項３】
単糖がグルコースであるところの請求項１又は請求項２に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項４】
精製アルブミンの濃度が０．０１〜２５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項５】
精製アルブミンの濃度が０．１〜５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項６】
ジメチルスルフォキシドの濃度が０．１〜５０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項７】
ジメチルスルフォキシドの濃度が１〜２０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項８】
単糖の濃度が０．１〜１０％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項９】
単糖の濃度が１〜５％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の哺乳類細胞の保存液を用い、これに哺乳類細胞を懸濁させるとともに、これを複数の細胞保存用容器に分注し、急速に−８０℃で凍結保存するようにしたことを特徴とした哺乳類細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有する細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法に関し、保存後における復活した有効細胞率の向上をはかることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の保存液や保存方法については、その由来する細胞の種類などによって一様ではない。  例えば微生物のような細胞の場合には、一般的に１０％程度のグリセロールを含む微生物培養用培地中に微生物を懸濁させるとともに、これを低温下にて保存し、あるいは微生物自体を凍結乾燥状態にて保存することがおこなわれている。  また哺乳類細胞の場合においては、一般的には１０％程度のジメチルスルフォキシドを添加したウシ胎児血清を含む培養液中に懸濁し、これを予備冷却した後、液体窒素保管庫内に格納して保存することがおこなわれている。
【０００３】
さらに精子などの生殖細胞の場合にあっては、アルブミン単体を含ませたリン酸緩衝液が保存液として用いられる。  また前記した哺乳類細胞保存の場合には保存液中に血清を含むタイプと含まないタイプとがあり、血清を含むタイプのものとしては、例えば培養液に血清およびジメチルスルフォキシドを含有させた細胞保存液が知られる。  また血清を含まないタイプでは、細胞保存液中に、血清に代えてカルボキシメチルセルロースを含有させたものが知られる（特開平６−４６８４０号）。
【０００４】
しかし血清を含まないものは、細胞保存性能が低く、また通常の培養液には血清が含まれるところから、多くの場合血清を含ませた細胞保存液が使用される。また、一般的に哺乳類細胞は微生物細胞や生殖細胞よりも保存が困難であることから、哺乳類細胞に比して保存が容易な微生物細胞や生殖細胞の保存に際し、哺乳類細胞の保存液を代用使用することもおこなわれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血清を含有する保存液にあっては、特に培養する細胞毎に異なった培養液が使用されるのみならず、血清についても細胞毎に異なったロットが使用されることになることから、自家調製した細胞保存液を他の細胞の保存液として使用することは困難である。  またそればかりでなく、血清含有の細胞保存液にあっては、血清含有成分として各種サイトカインや増殖因子、ホルモン等も含まれるのみならず、アミノ酸や各種イオン等をはじめとした、本来細胞保存に不必要な多くの成分を含む培養液を用いる結果、保存細胞の性質を変えるおそれがあり、さらに血清に含まれる可能性のある未知のウイルスによる影響の問題をも内在している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記したように血清含有の細胞保存液にあっては、保存している細胞の性質を変えるおそれがあること、および未知ウイルス混入の危険性、ならびに保存液成分が不明瞭であることから品質安定を期することが難しい、といった種々の課題を有するところから、本発明においてはこれらの問題が全く生じないよう、血清および培養液共に含まず、しかも成分が明瞭かつ優れた細胞保存性能を有する細胞保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法を開発し、種々の実験を重ねた。
【０００７】
その結果、意外にもこれまで血清含有保存液への添加剤として用いられてきたジメチルスルフォキシドに対し、これまで生殖細胞の保存に用いられているリン酸緩衝液中に含まれるアルブミンを混合したものを主剤とし、これに必要に応じてリン酸イオンや二価金属イオン、単糖などの助剤を添加したところの、血清および培養液非含有型の細胞保存液が、哺乳類細胞をはじめとし、微生物細胞や生殖細胞などの保存について優れた細胞保存性能を有することを見出した。
【０００８】
具体的には、請求項１の発明は、精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有し、さらに助剤として単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加してなる哺乳類細胞の保存液に関する。また請求項２の発明は、精製アルブミンがウシ由来のものである請求項１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【０００９】
さらに請求項３の発明は、単糖がグルコースであるところの請求項１又は請求項２に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１０】
さらに請求項４の発明は、精製アルブミンの濃度が０．０１〜２５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項５の発明は、精製アルブミンの濃度が０．１〜５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項６の発明は、ジメチルスルフォキシドの濃度が０．１〜５０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項７の発明は、ジメチルスルフォキシドの濃度が１〜２０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１１】
さらに請求項８の発明は、単糖の濃度が０．１〜１０％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。  さらに請求項９の発明は、単糖の濃度が１〜５％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１２】
また請求項１０の発明は、請求項１〜９に記載の哺乳類細胞の保存液を用い、これに哺乳類細胞を懸濁させるとともに、これを複数の細胞保存用容器に分注し、急速に−８０℃で凍結保存するようにしたことを特徴とした哺乳類細胞の保存方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
さらに本発明の具体的な内容について説明すると、本発明は細胞の保存液として精製アルブミンとジメチルスルフォキシド、および単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加して用いるものであるが、ここで使用されるジメチルスルフォキシドは一般的に知られている市販のものを用いることができる。  ジメチルスルフォキシドの使用量については、濃度が０．１％(w/w)を下回ると細胞の保存能力が薄れ、また反対に保存液全量に対して５０％(w/w)を超えても効果が変わらないので、効果と経済性の面からみて０．１％(w/w)〜５０％(w/w)の範囲内、さらに好ましくは１〜２０％(w/w)の範囲内であるのが好ましい。
【００１４】
さらにジメチルスルフォキシドに添加して使用されるアルブミンとしては、保存する細胞の種類如何によってアルブミンの種類も選択できるが、一般的にはヒト治療用のヒト細胞の保存にはヒトアルブミンの使用が最良である。  しかし必ずしもこれに限られるものではなく、この他にもウシあるいは他の種に由来するものであっても使用できる。  またアルブミンはどのような方法で精製されたものであっても使用できる。  精製アルブミンとしては、純度がフラクションＶ程度で使用可能である。
【００１５】
アルブミンの使用濃度については、０．００１％(w/w) を下回ると効果がなく、また逆に２５％(w/w) を超えても効果は変わらない。  したがって０．００１％〜２５％(w/w) の範囲で使用でき、さらに好ましくは０．１〜５％(w/w) の範囲が経済性や取り扱い性の面で良好である。
【００１６】
また金属イオンは、これを添加することにより細胞を復元した際の生細胞率（有効細胞率）およびその後の培養効率が良好となる。  この場合に使用される金属イオンとしては、二価あるいは三価の各種金属イオンであり、とりわけて二価の金属イオンの使用が好ましいが、これ以外にも例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオン等の使用が考えられる。  またその使用濃度については、微量でよいが、０．００００００１％（w/w）を下回ると効果が無く、また反対に１％（w/w）を超えても効果に変わりがない。  したがって０．００００００１〜５％（w/w）の濃度範囲、さらに好ましくは０．１〜５％（w/w）の濃度範囲での使用が経済的である。
【００１７】
さらに糖は、これを添加することにより、やはり細胞を復元した際の生細胞率（有効細胞率）およびその後の培養効率が向上する。  ここで使用される糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、トレハロース、ブドウ糖等をはじめとした各種の単糖類、二糖類、三糖類が考えられ、なかでもグルコースが経済性や扱い易さの点で推奨できる。  添加量については、０．１％（w/w）に満たないと効果がなく、また１０％（w/w）を超えても効果が変わらないところから、０．１〜１０％（w/w）の濃度範囲、さらに好ましくは１〜５％（w/w）の濃度範囲がよい。
【００１８】
さらにリン酸イオンは、リン酸緩衝液として用いることができ、ダルベッコリン酸緩衝液、リン酸緩衝液などの使用が可能である。  また既述した二価あるいは三価の金属イオンやリン酸緩衝液の代わりに各種の培養液を使用することも可能である。  さらに細胞の保存としては、一例を挙げれば低温保存用のチューブ中に細胞を１×１０３から１×１０８個／ｍｌとなるように細胞保存液中に懸濁し、これを摂氏ー８０度あるいは液体窒素中に保存する。  なおこの場合、保存が短期間であれば−４℃〜−２０℃程度でもよい。  また前記した細胞の保存液を用い、これに細胞を懸濁させるとともに、これを複数の細胞保存用容器に分注し、予備凍結無しで凍結保存することができる。
【００１９】
また保存に際し、細胞保存液に懸濁した細胞は、プログラムフリーザーなどにより徐々に温度を下げることもできるが、直接急速に低温化して保管することも可能である。  さらに凍結保存された細胞の復元について述べると、低温保存された細胞を室温あるいは３７℃の恒温槽内にて融解させ、さらにこれを遠心分離機を用いた遠心分離などの操作により、細胞と細胞保存液とを分離して復元させることができる。  また分離した細胞は適当な培養液などで洗浄後、通常の方法により培養をおこなうことができる。
【００２０】
なお細胞の保存性能について評価する方法について述べれば、細胞保存液中に細胞を懸濁し、これを凍結した後、数時間から数日間、また場合によっては数年にわたって凍結のまま保存するとともに、本凍結保存細胞を室温に戻した後、培養し、この時に生きている細胞数を計測することによりおこなうことができる。
【００２１】
【実施例】
以下において実施例により本発明をさらに詳しく説明する
〔１．細胞保存液の調製〕
電子天秤（東京硝子器機株式会社、416-65-81-01）により、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社、191-01305 試薬特級）を１．８ｇ、Ｄ(+) グルコース（和光純薬工業株式会社、041-00595 試薬特級）を３００ｇ、ＨＥＰＥＳ（株式会社同仁化学研究所、324-01375 試薬特級）を３．６ｇ、ＰＢＳ(-) 粉末（日水製薬株式会社、05913 ）を９６ｇそれぞれ秤量し、１０リットルのビーカー（旭テクノグラス株式会社、1000BK10000） に入れた。
【００２２】
さらに１０リットルメスシリンダー（株式会社サンプラテック、1079）で注射用水（光製薬株式会社）８リットルを秤量し、前記した１０リットルのビーカー内に加え、これをマグネティクスターラー（旭テクノグラス株式会社、BS-38） で攪拌、溶解した。  さらに２リットルメスシリンダー（旭テクノグラス株式会社、3022CYL2000S）でＤＭＳＯ（ナカライテスク株式会社、134-07）１リットルを秤量し、これを前記した１０リットルのビーカー内に加え、マグネティクスターラーで撹拌した。
【００２３】
溶解後、電子天秤で、塩化カルシウム（和光純薬工業株式会社、039-00475 ）を１g 、塩化マグネシウム六水和物（和光純薬工業株式会社、135-00165 ）を１g それぞれ秤量し、これらを前記１０リットルのビーカー内に加え、マグネティックスターラー（旭テクノグラス株式会社、BS-38 ）で撹拌し、溶解した。  ＢＳＡ（シグマアルドリッチジャパン株式会社、A-2934）を１００ｇ秤量し、これを前記１０リットル のビーカー内に入れた。  溶解後、注射用水で１０リットル までメスアップして十分に溶解した後、スパイラルキャップＰＦ（日本ジェネティクス株式会社、12981 ）でろ過し、細胞保存液を調製した。
【００２４】
〔２．P3U1細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、マウスミエローマ由来の細胞であるP3U1細胞を、培養用炭酸ガスインキュベータ（株式会社ヒラサワ、CPD-300A）内で、RPMI1640＋7S（株式会社日研生物医学研究所、GM1104）４５０mlとウシ胎児血清（ライフテックオリエンタル株式会社、26140-079 ）を５０ml混ぜた培地を培養用培地とし、培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社、MS-2080R）で培養しておいた。
【００２５】
そのP3U1細胞浮遊液から１０μｌをピペット（株式会社ニチリョー、NPX-20）で取り出し、あらかじめトリパンブルー溶液（シグマアルドリッチジャパン株式会社、T-8154）20μl を入れておいた５００μｌチューブ（旭テクノグラス株式会社、12301MTB0.5 ）に入れ、軽く撹拌したあと、血球計算版（エルマ販売株式会社、03-202-2）に溶液の一部を乗せ、倒立顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、CK-2）下で細胞数を数えた。
【００２６】
細胞数は生細胞数が７．０×１０５個／ml であった。  その細胞浮遊液５０mlづつを遠心管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2070）２本にそれぞれ移し、１５００ｒｐｍで１０分間、２０℃の条件下で遠心し（株式会社コクサン、H700FR）、P3U1細胞を沈殿させた。  上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサー（旭テクノグラス株式会社、MS-1）を用いて細胞を均一にほぐし、細胞濃度が４．４×１０６個／ｍｌになるように〔１．〕で作製した細胞保存液で、細胞が均一になるように懸濁し、セラムチューブ（旭テクノグラス株式会社、2722-002 ）に総細胞数が ４．４×１０６個／チューブとなるように分注した。その後、チューブラック（旭テクノグラス株式会社、9791-081）に入れ、−８０℃フリーザー（三洋電機株式会社、MDF-382 ）に保存した。
【００２７】
〔３．凍結保存したP3U1細胞の取り出しと復活化〕
〔２．〕で保存した P3U1 細胞を保存してから１年後に、−８０℃フリーザーから取り出し、あらかじめ３７℃に温めておいたヒートブロック（タイテック株式会社、TAL-1G）に４分間入れて溶解した。  クリーンベンチ内（三洋電機株式会社、MCV-131BNF）で１５ml遠沈管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2095）に洗浄用培地（株式会社日研生物医学研究所、CM1101）を無菌的に１０ml入れ、そこにヒートブロックで温めて溶解した P3U1 細胞をスポイト（旭テクノグラス株式会社、SM251-1S）で移し、雰囲気温度２０℃、回転数１２００ｒｐｍの条件下で５分間遠心した。
【００２８】
遠心後、上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサーを用いて細胞を均一にほぐし、培養用培地２mlに懸濁後、２４ウエル培養用シャーレ（旭テクノグラス株式会社、1820-024N ）に移した。  P3U1細胞浮遊液から１０ｍｌをピペットで取り出し、あらかじめトリパンブルー溶液２０ｍl を入れておいた５００ｍl チューブに入れ、軽く撹拌したあと、血球計算版に溶液の一部を乗せ、倒立顕微鏡下で細胞数を数えた。
【００２９】
その結果、保存した P3U1 細胞の生細胞数（有効細胞数）は４．２×１０６個であり、細胞保存直前の細胞数が４．４×１０６個／チューブであったことから生細胞率は９６％であることが確認された。  培養３日後に顕微鏡下で観察したところ、P3U1細胞が増殖している事を確認した。  これらの結果から本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有することがわかった。
【００３０】
〔４．K562細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、ヒト白血病由来の細胞であるK562細胞を、〔２．〕と同様の操作により培養し、細胞数を数えたところ、細胞数は生細胞数が７．０×１０５個／mlであった。  その細胞浮遊液、５０mlを遠心管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2070）２本に移し、雰囲気温度２０℃、回転数１５００ｒｐｍ、の条件で遠心分離機（株式会社コクサン、H700FR）により１０分間遠心し、K562細胞を沈殿させた。
【００３１】
上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサー（旭テクノグラス株式会社、MS-1）を用いて細胞を均一にほぐし、細胞濃度が３．０×１０６個／mlになるように細胞保存液で、細胞が均一になるように懸濁し、セラムチューブ（旭テクノグラス株式会社、2722-002）に総細胞数が３．０×１０６コ／チューブとなるようにした。  その後、チューブラック（旭テクノグラス株式会社、9791-081）に入れ−８０℃フリーザー（三洋電機株式会社、MDF-382）に保存した。
【００３２】
〔５．凍結保存したK562細胞の取り出しと復活化〕
〔４・〕で保存したK562細胞を、保存してから１年後に、〔３．〕と同様に、取り出しと復活化をおこなった。  その結果、K562細胞の生細胞数は２．９×１０６個であり、細胞保存直前の細胞数が３．０×１０６個／チューブであったことから生細胞率は９５％であることが確認された。  次いで２４ウエル培養用シャーレにK562細胞を移して培養した。  培養３日後に顕微鏡下で観察したところ、K562細胞が増殖している事を確認した。  これらの研究結果から、本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有することがわかった。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明は細胞保存液として精製アルブミンとジメチルスルフォキシドを含有し、さらに助剤として単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加するものであるために、血清および培養液共に含ませる必要が無く、その結果自家調製した細胞保存液を他の細胞の保存液として使用することも可能になり、また血清含有の細胞保存液のように、血清含有成分として各種サイトカインや増殖因子、ホルモン等のほか、アミノ酸や各種イオン等をはじめとした、本来細胞保存に不必要な多くの成分を含む培養液を用いる必要がないことから、特に培養する細胞毎に異なった培養液を使用して細胞の性質を変え、あるいは未知ウイルスの混入を許容したりする危険がなく、さらには細胞毎に異なったロットの血清を使用する必要がない。
【００３４】
しかも保存液成分が明瞭で品質的にきわめて安定であり、かつ細胞保存性能に優れた保存液および細胞保存方法を提供することができる。  また本発明の細胞保存液は、とくに哺乳類細胞の保存に適するが、このほかにもプロトプラストをはじめとする植物細胞や生殖細胞の保存等にも使用することができる。  さらに本発明の細胞保存液を使用して各種細胞バンクを効率的に構築することも可能である。