(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物、酸化還元酵素、およびRu化合物を使用した電子伝達物質を含む反応系を構築し、電気化学的手法を利用して測定対象物の濃度を測定する方法であって、
上記反応系において、Ru化合物の還元体を生成させる第１ステップと、
上記反応系に対して100〜300mVの範囲から選択される定電圧を印加して上記還元体を酸化するとともに、そのときに上記還元体が放出した電子の量に相関する応答電流値を測定する第２ステップと、
この第２ステップにおいて測定された応答電流値に基づいて、測定対象物の濃度を演算する第３ステップと、
を含み、
上記Ru化合物は、下記化学式に示す酸化型Ru(III)錯体であり、その還元体は、還元型Ru(II)錯体であることを特徴とする、測定対象物の濃度測定方法。
【化１】
0004385219.tif 000010
（上記化学式におけるＸは、NH3またはハロゲンイオンであり、上記化学式におけるn＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ru(III)錯体の価数を表している。）
【請求項２】
上記第１ステップでは、上記酸化還元酵素により触媒される測定対象物の酸化反応および上記酸化型Ru(III)錯体の還元反応の２つの反応のみにより、上記還元型Ru(II)錯体が生成される、請求項１に記載の測定対象物の濃度測定方法。
【請求項３】
上記反応系は、相対的に量の多い上記酸化型Ru(III)錯体に対して、相対的に量の少ない上記酸化還元酵素を略均一に分散させた均一または略均一な液相反応系である、請求項１に記載の測定対象物の濃度測定方法。
【請求項４】
上記測定対象物はグルコースである、請求項１に記載の測定対象物の濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、試料液（たとえば血液などの生化学的試料またはこれの調整液）から、測定対象物（たとえばグルコースやコレステロール）の濃度を測定する技術に関する。
【０００２】
【背景技術】
グルコース濃度を定量する方法としては、酵素反応を利用したものがある。その代表的なものとして、酵素としてグルコースオキシダーゼ(GOD)を使用するものがある。GODは、補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)が結合した糖タンパク質であり、GODを使用した場合のグルコースの酵素反応は下記化学式に示したように進行する(式中においては、FADH2は、FADの還元型を表している)。
【０００３】
【化３】
0004385219.tif 000002
【０００４】
臨床医学的に血糖値を測定する場合には、グルコース濃度の変化による吸光度の変化を測定してグルコース濃度を定量することもあるが、アンペロメトリー法によりグルコース濃度を測定する方法が一般的である。アンペロメトリー法は、携帯型の血糖値測定装置におけるグルコース濃度測定方法として広く採用されているものである。
【０００５】
アンペロメトリー法を利用した血糖値測定手法は、酸化電流を測定する場合を例にとれば次の通りである。まず、第１ステップとして、血液、酵素、酸化型電子伝達体(メディエータ)を共存させ反応系を構築する。そうすると、上記酵素反応が進行する一方で、この酵素反応により生じたFADH2とメディエータとの間の酸化還元反応により、還元型のメディエータが生成される。メディエータとしては、フェリシアン化カリウムが汎用されており、その場合の反応式は下記化学式に示した通りである。
【０００６】
【化４】
0004385219.tif 000003
【０００７】
次いで、第２ステップとして、一対の電極を用いて反応系に電圧を印加することにより、フェロシアン化カリウムを酸化して(電子を放出させて)、下記化学式に示したようにフェリシアン化カリウムとする。フェロシアン化カリウムに由来する電子は、陽極に供給される。
【０００８】
【化５】
0004385219.tif 000004
【０００９】
続いて、第３ステップとして、電圧印加に起因する酸化電流値を測定するとともに、その測定値に基づいてグルコース濃度が演算される。
【００１０】
携帯型血糖値測定装置を用いて血糖値を測定する場合には、電極間に酵素とメディエータとを含む試薬層が形成されたグルコースセンサを用いるとともに、試薬層に血液を供給することにより電極間に反応系が構成される。このグルコースセンサでは、これを携帯型血糖値測定装置に装着することにより電極間に電圧を印加するとともに酸化電流値を測定し、この酸化電流値に基づいて血液中のグルコース濃度が定量される。
【００１１】
上述した通り、酵素としてはGODが使用され、メディエータとしてはフェリシアン化カリウムを使用するのが通常である。しかしながら、GODとフェリシアン化カリウムとを組み合わせた反応系において、アンペロメトリー法に代表される電気化学的方法によりグルコース濃度を測定する方法では、次に説明するような問題があった。
【００１２】
その１つは、還元性物質の影響である。たとえば血液中のグルコース濃度を測定する場合を考えてみると、血液中にはグルコース以外の還元性物質（たとえばアスコルビン酸、グルタチオン、Fe(II)2+）が共存している。反応系に電圧を印加するときにフェロシアン化カリウム以外の還元性物質が共存していれば、電極に対してはフェロシアン化カリウムに由来する電子以外に、電圧印加に伴う還元性物質の酸化に由来する電子も供給されることとなる。その結果、測定される電流値には、還元性物質の電子伝達に由来するバックグラウンド電流(ノイズ)も含まれることとなる。そのため、測定されるグルコース濃度は、実際のグルコース濃度よりも大きくなってしまう。このような測定誤差は、電極間に印加する電圧値が大きいほど、酸化される還元性物質の種類や量が多くなるため、より顕著に現れる。したがって、メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いる場合には、実測値を補正してから最終的な濃度を決定しなければ、精度良く血糖値の測定を行うことができない。還元性物質の影響は、血糖値を測定する場合に限らず、酸化電流値に基づいて濃度演算を行う場合には、他の成分についても同様に生じ得るものである。
【００１３】
他の問題は、携帯型血糖値測定装置およびグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する場合において、グルコースセンサの保存安定性の面での問題である。フェリシアン化カリウムは光や水に弱く、これらによる曝露によってグルコース以外から電子を受け取って還元型であるフェロシアン化カリウムになってしまうことがある。このような事態が生じたなら、反応系には、酵素反応により還元型とされたフェロシアン化カリウムと、曝露により還元型とされたフェロシアン化カリウムが共存することとなる。その結果、先に説明した還元性物質の場合と同様に、電圧印加時の酸化電流は、曝露によるフェロシアン化カリウムに由来するバックグラウンド電流をも含むものとなる。そのため、測定されるグルコース濃度は、実際のグルコース濃度よりも大きな値となってしまう。このような不具合を抑制するためには、グルコースセンサの試薬層が曝露しないように、光不透過性の材料により形成された包装袋などにグルコースセンサを封入する必要がある。しかも、グルコースセンサの寿命を長く保つためには、水分による影響を回避するために窒素置換処理などにより湿度を小さくした状態で密封する必要があり、グルコースセンサを工業的に量産する場合には製造が不便でコスト的に不利である。
【００１４】
【発明の開示】
本発明は、低コストでバックグラウンド電流による影響を低減し、正確に試料液中の測定対象物の濃度を測定することができる技術を提供することを目的としている。
【００１５】
本発明により提供される測定対象物の濃度測定方法は、測定対象物、酸化還元酵素、およびRu化合物を使用した電子伝達物質を含む反応系を構築し、電気化学的手法を利用して測定対象物の濃度を測定する方法であって、上記反応系において、Ru化合物の還元体を生成させる第１ステップと、上記反応系に対して100〜300mVの範囲から選択される定電圧を印加して上記還元体を酸化するとともに、そのときに上記還元体が放出した電子の量に相関する応答電流値を測定する第２ステップと、この第２ステップにおいて測定された応答電流値に基づいて、測定対象物の濃度を演算する第３ステップと、を含み、
上記Ru化合物は、下記化学式に示す酸化型Ru(III)錯体であり、その還元体は、還元型Ru(II)錯体であることを特徴としている。
【化６】
0004385219.tif 000005
【００１７】
本発明の濃度測定方法においては、反応系を非印加状態として第１ステップを行った後に、反応系を印加状態として第２ステップを行ってもよいし、少なくとも測定対象物を含む試料液の供給時から継続して反応系を印加状態として、第１ステップと第２ステップとを同時的に行ってもよい。
【００１９】
第１ステップの時間は０〜10秒とし、第３ステップにおいてグルコース濃度の演算の基礎とする演算用電流値として、第２ステップ開始から起算され、かつ３秒以上である定時間経過後に測定された電流値を採用するのが好ましい。さらに好ましくは、第１のステップの時間が０〜３秒であり、演算用電流値として上記第２ステップ開始から３〜５秒の範囲の定時間に測定された電流値を採用する。
【００２４】
上記化学式におけるＸとしては、NH3、ハロゲンイオン、CN、ピリジン、ニコチンアミド、またはH2Oが挙げられるが、NH3またはハロゲンイオンが好ましい。化学式におけるn＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ru(III)錯体の価数を表している。
【００２５】
なお、好ましくは、酸化還元酵素により触媒される測定対象物の酸化反応および酸化型Ru(III)錯体の還元反応の２つの反応のみにより、還元型Ru(II)錯体が生成するように電子伝達系統が選択される。
【００２６】
反応系は、たとえば相対的に量の多い酸化型Ru(III)錯体に対して、相対的に量の少ない酸化還元酵素を均一または略均一に分散させた均一または略均一な液相反応系として構成される。この場合、反応系の各所において、略均一に還元型Ru(II)錯体が生成される。
【００２７】
測定対象物としては、グルコース、コレステロール、乳酸、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００２８】
酸化還元酵素は、測定対象物の種類によって選択されるが、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)(後述するαGDHおよびCyGDHを含む)、グルコースオキシダーゼ(GOD)、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸デヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ(ウリカーゼ)、ウレアーゼ、およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(ジアホラーゼ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを選択するのが好ましい。
【００２９】
本発明では、GDHとして、たとえばピロロキノリンキノン(PQQ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP）などを補酵素とするものの他、αGDHやCyGDHなどを使用することができる。GDHとしては、PQQを補酵素とするもの(PQQGDH)、αGDH、あるいはCyGDHを使用するのが好ましい。
【００３０】
αGDHは、グルコース脱水素活性を有するサブユニットとして、還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約60ｋＤａであるGDH活性タンパク質を含んだものである。一方、CyGDHは、上記GDH活性タンパク質と、還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約43kDaである電子伝達タンパク質(チトクロムC)と、をサブユニットとして含むものである。GDHとしては、GDH活性タンパク質とチトクロムC以外のサブユニットをさらに有するものを使用することもできる。
【００３１】
CyGDHは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、αGDHは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したαGDHの発現をコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。
【００３２】
ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物としては、たとえばブルクホルデリア・セパシアKS1株を使用することができる。このKS1株は、平成12年９月25日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６)に微生物受託番号第FERM  BP−7306として寄託されている。
【００３７】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して具体的に説明する。本実施の形態においては、試料液中のグルコース濃度を測定するように構成されたグルコース濃度測定装置およびグルコースセンサを例にとって説明する。ただし、本発明は、グルコース濃度を測定する場合には限定されず、他の成分を測定する場合にも適用できる。
【００３８】
図１に示したように、グルコース濃度測定装置１は、グルコースセンサ２を用いて、血液などのグルコース溶液中のグルコース濃度を測定するものである。このグルコース濃度測定装置１は、電圧印加部３、電流値測定部４、検知部５、制御部６、演算部７および表示部８を備えている。
【００３９】
グルコースセンサ２は、図２および図３に良く表れているように、カバー板20、スペーサ21および基板22を有しており、これらによって流路25が規定されている。
【００４０】
カバー板20には穴部23が設けられており、スペーサ21には穴部23に連通するとともに先端部24ａが開放したスリット24が設けられている。流路25は、スリット24の先端開放部24ａおよび穴部23を介して外部と連通している。先端開口部24ａは試料液導入口25ａを構成しており、この試料液導入口25ａから供給されたグルコース溶液は、毛細管現象により穴部23に向けて流路25内を進行する。
【００４１】
基板22の上面22ａには、第１電極26、第２電極27、および試薬層28が設けられている。
【００４２】
第１および第２電極26，27は、全体として基板22の長手方向に延びている。第１および第２電極26，27の一端部26Ａ，27Ａは、基板22の短手方向に延びる作用部26ａおよび対部27ａを有している。
【００４３】
基板22の上面22ａは、第１電極26の作用部26ａ、第２電極27の対部27ａ、第１および第２電極26，27の他端部26ｂ，27ｂが露出するようにして絶縁膜29により覆われている。第１および第２電極26，２７の端子部26ｂ，27ｂは、後述するグルコース濃度測定装置１の第１および第２接触子３ａ，３ｂ(図１参照)と接触させるための端子部を構成している。
【００４４】
試薬層28は、たとえば固形状であり、作用部26ａと対部27ａとの間を橋渡すようにして設けられている。この試薬層28は、たとえば相対的に多量のメディエータ（電子伝達体）および相対的に少量の酸化還元酵素を含んでいる。試薬層28は、たとえばメディエータおよび酸化還元酵素を略均一に分散させた塗布材を第１および第２電極26，27を橋渡すように塗布し、その後に乾燥させることにより形成される。このようにして試薬層28を形成する場合には、メディエータに対して酸化還元酵素が略均一に分散した単一固体層とされ、グルコース溶液の供給により容易に溶解するものとされる。
【００４５】
酸化還元酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)またはグルコースオキシダーゼ(GOD)を使用するのが好ましい。GDHとしては、ピロロキノリンキノン(PQQ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)などを補酵素とするもの、αGDHやCyGDHを使用することができる。これらのGDHのうち、PQQを補酵素とするもの(PQQGDH)、αGDHおよびCyGDHを使用するのが好ましい。αGDHおよびCyGDHについては、上述した通りである。
【００４６】
メディエータとしては、たとえばRu錯体が使用される。このRu錯体は、電子伝達体として機能すればその配位子の種類はとくに限定されないが、酸化型のものが下記化学式で示されるものを使用するのが好ましい。
【００４７】
【化７】
0004385219.tif 000006
【００４８】
化学式におけるＸとしては、NH3、ハロゲンイオン、CN、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはH2Oが挙げられるが、NH3またはハロゲンイオンが好ましい。一方、化学式におけるn+は、Ｘの種類により決定される酸化型Ru(III)錯体の価数を表している。
【００４９】
Ru錯体は、還元型(II)が不安定なために通常は酸化型(III)として存在する。そのため、グルコースセンサ２の試薬層28にRu錯体を混在させた状態で光や水に曝露されたとしても、容易に還元してしまうことはない。また、Ru錯体は結晶化しにくく、微粉末状態を適切に維持することができるといった特性を有している。さらには、Ru錯体とPQQGDHとの組み合わせについていえば、電子伝達速度が大きいといった利点もある。
【００５０】
図１に示した電圧印加部３は、第１電極26の端子部26ｂと第２電極27の端子部27ｂとの間に定電圧を印加するものである。電圧印加部３は、グルコースセンサ２をグルコース濃度測定装置１に設けられた装着部(図示略)に装着することにより、第１および第２接触子３ａ，３ｂを介して、グルコースセンサ２の端子部26ｂ,27ｂと導通するようになっている。電圧印加部３としては、たとえば乾電池あるいは充電池などの直流電源が使用される。
【００５１】
電流値測定部４は、第１および第２電極26,27間への電圧印加時に試薬層28の還元型Ru(II)錯体から放出された電子の量に相関する応答電流値を測定するものである。
【００５２】
検知部５は、グルコース濃度測定装置１にグルコースセンサ２が装着された後において、試薬層28にグルコース溶液が供給され、グルコース濃度の測定が可能になったか否かを検知するものである。
【００５３】
制御部６は、電圧印加部３を制御し、第１および第２電極26,27間に電圧が印加される状態(閉回路)と印加されない状態(開回路)とを選択するものである。制御部６はさらに、電流値測定部４における電流値測定タイミングを制御する。
【００５４】
演算部７は、電流値測定部４により測定された応答電流値に応じて、グルコース溶液中のグルコース濃度の演算を行うものである。
【００５５】
なお、検知部５、制御部６および演算部７のそれぞれは、たとえばCPUおよびROMやRAMなどのメモリにより構成されるが、検知部５、制御部６および演算部７の全てを、１つのＣＰＵに対して複数のメモリを接続することにより構成することもできる。また、演算部７による演算結果は、表示部８により表示される。表示部８は、たとえばLCDなどにより構成される。
【００５６】
次に、グルコース溶液中のグルコース濃度測定の手順を、図１ないし図３に加えて、図４および図５をも参照しつつ説明する。
【００５７】
図１に良く表れているように、まずグルコース濃度測定装置１にグルコースセンサ２をセットする。そうすると、グルコースセンサ２の第１および第２電極26，27の端子部26ｂ，27ｂがグルコース測定装置１の第１および第２接触子３ａ，３ｂと接触する。先にも触れたように、この状態では第１および第２電極26,27が電圧印加部３に導通可能とされている。実際の測定においては、グルコースセンサ２にグルコース溶液を供給する以前から、制御部６の制御に基づいて、電圧印加部３により第１および第２電極26,27間に定電圧が印加されている。
【００５８】
第１および第２電極26,27間に印加する定電圧は、たとえば100〜500mVの範囲に設定される。好ましくは、定電圧は、還元型Ru(II)錯体と酸化型Ru(III)錯体との間の標準酸化還元電位(vs.標準水素電極)以上で、フェロシアン化イオンとフェリシアン化イオンとの間の標準酸化還元電位(vs.標準水素電極)よりも小さいものとされる。Ru錯体の標準酸化還元電位は、配位子の種類により多少異なるが、概ね＋100mVであり、フェリシアン化イオンのそれは＋360mVである。したがって、電圧印加部３により第１および第２電極26,27間に印加する定電圧は、たとえば100〜350mVの範囲から選択される。Ru錯体としては、酸化型が[Ru(NH3)6]3+(還元型が[Ru(NH3)6]2+)で示されるものが最も好適に使用されるのは上述した通りである。この場合にも、定電圧は100〜350mVとするのが好ましく、さらに好ましくは100〜300mVとされる。
【００５９】
次いで、グルコースセンサ２の試料液導入口25ａを介して血液などのグルコース溶液を供給する。グルコース溶液は、毛細管現象によりグルコースセンサ２の流路25内を進行する。その過程において、グルコース溶液が試薬層28を溶解させる。
【００６０】
先にも触れたように、Ru錯体は結晶化しにくく微粉末状態を適切に維持できるから、Ru錯体を微粉体の状態で試薬層28に含ませておけば、グルコース溶液の供給時に容易かつ即時に試薬層28の全体が溶解する。試薬層28は、酸化還元酵素にRu錯体を分散させた構成とされているから、試薬層28の各所において均一に酵素反応が起こり、短時間で確実なグルコース濃度の測定が可能となる。
【００６１】
一方、試薬層28にグルコース溶液が供給されれば、酸化還元酵素によりグルコースがグルコンラクトンに酸化されるとともにメディエータが還元型とされる。メディエータは、試薬層28において略均一に分散されているため、試薬層28の各所において略均一に、かつ電圧を印加するまでもなく自発的に還元型のメディエータが生成される。なお、グルコンラクトンは、非酵素的にグルコン酸となる。
【００６２】
ここで、メディエータとして[Ru(III)(NH3)6]3+を用いるとともに酸化還元酵素としてPQQGDHを用いた場合の電子伝達系統図を図４(ａ)に、メディエータとして[Ru(III)(NH3)6]3+を用いるとともに酸化還元酵素としてGODを用いた場合の電子伝達系統図を図４(ｂ)に示した。
【００６３】
図４(ａ)および(ｂ)に示した例では、２つの端子部26ｂ,27ｂを介して第１および第２電極26，27間に定電圧を印加した状態では、試薬層28に存在する還元型Ru(II)錯体が第１電極26の作用部26ａ側に移動し、この作用部26ａに電子を放出して酸化型Ru(III)錯体となる。したがって、電圧印加部３により第１および第２電極26，27間に定電圧を供給した状態では、還元型Ru(II)錯体から付与された電子量が第１電極26および第１接触子３ａを介して電流測定部４において応答電流として測定される。この応答電流値は、電圧印加によって試薬層28を移動した還元型Ru(II) 錯体に由来する電子量に相関するものであり、いわゆる拡散電流と呼ばれるものである。
【００６４】
一方、電流値測定部４において測定された応答電流値は、検知部５においてモニタリングされており、図５に示したように、応答電流値が閾値Ｉ1（たとえば２〜３μA）を超えた時点ｔ0で、検知部５は試薬層28にグルコース溶液が供給され、試薬層28が溶解したことを検知する。
【００６５】
検知部５がグルコース溶液が供給されたことを検知した場合には、制御部６が電圧印加部３を制御して、第１および第２電極26，27間への電圧の印加を中止する。電圧印加を中止した状態では、還元型Ru(II)錯体は酸化されないから、酸化還元酵素によるグルコースの酸化反応およびメディエータの還元反応により、還元型Ru(II)錯体が蓄積されていく。一定時間（たとえばｔ1−ｔ0＝０〜10秒、さらに好ましくは０〜３秒）の経過時点ｔ1において、制御部６の制御に基づいて、電圧印加部３により再び第１および第２電極26，27間に定電位Ｖを印加する。なお、検知部５がグルコース溶液が供給されたことを検知してからも電圧の印加を継続し、生成した還元型Ru(II) 錯体を逐次、作用部26ａに移動させて拡散電流を測定してもよい。
【００６６】
このとき、図４(ａ)，(ｂ)に例示したように、還元型Ru(II)錯体が電子ｅ-を放出して酸化型Ru(III)錯体となる。グルコース溶液中に還元型Ru(II)錯体の他に還元型物質が共存している場合には、これらの物質も印加電圧の値に応じた成分種ないしその量だけ電子を放出して酸化型となる。
【００６７】
還元型Ru(II)錯体および他の還元型物質が放出した電子は、第１電極26の作用部26ａに供給され、これが第１接触子３ａを介して電流値測定部４において応答電流として測定される。したがって、実際に測定される応答電流値は、電圧印加時に還元型となっていた共存物質に由来する電子によるものを含んでいる。還元型とされた共存物質が電子を放出して酸化型となる確率（割合）は、第１および第２電極26，27に印加する電圧の大小に依存しており、印加電圧が大きいほど電子を放出する共存物質の種類や個々の共存物質が放出する電子の総量が多くなる。また、還元型Ru(II)錯体には酸化還元酵素との間の酸化還元反応により電子が与えられたものばかりでなく、水や光の曝露により還元型Ru(II) 錯体とされたものも含まれ得る。このため、実際に測定される応答電流値は、共存物質によるバックグラウンド電流や酵素反応以外からの電子に由来する還元型Ru(II) 錯体に起因したバックグラウンド電流が含まれていることが想定される。
【００６８】
これに対して、本実施の形態では、第１および第２電極26，27に印加される定電位Ｖは、図５から明らかなように、検知部５が試薬層28にグルコース溶液が供給されたことを検知するまでに印加されていた定電位Ｖと同じ値である。すなわち、再印加の定電位Ｖは、フェリシアン化イオンの標準酸化還元電位よりも小さい100〜350mVとされ、さらに好ましくは100〜300mVとされる。本実施の形態では、第１および第２電極26，27間（試薬層28）に印加される電圧の値が、メディエータとしてフェリシアン化イオン（カリウム）を使用する場合に比べて小さくなされている。このため、グルコース溶液として血液などを使用した場合に含まれるアスコルビン酸やグルタチオンなどといった還元型共存物質が、電圧印加によって酸化（電子を放出）してしまうことを抑制することができるようになる。これにより、還元型共存物質の影響によるバックグラウンド電流を小さくできる。その結果、還元型共存物質による影響を考慮して実測値を補正しなくとも、精度良く濃度演算を行うことが可能となる。
【００６９】
また、Ru錯体は、還元型(II)に比べて酸化型(III)のほうが著しく安定であるため、光照射や水分の存在下においても分解しにくく、その大部分は酵素反応により電子が付与されるまでは酸化型(III)として存在する。したがって、酵素反応以外からの電子により還元型とされたRu(II)錯体の割合が著しく小さく、この点からもバックグラウンド電流を小さくできる。このため、グルコースセンサ２を保存する際に水分の影響をさほど考慮する必要がなくなるため、窒素置換処理などを施して水分量を低減する必要がなくなる。その結果、グルコースセンサ２を工業的に量産する場合には、その分だけ製造が容易でコストに有利となる。
【００７０】
さらに、本実施の形態では、試薬層28の全体で生成された還元型Ru(II)錯体に基づく拡散電流を応答電流として測定している。つまり、図４(ａ)および(ｂ)に示したような２つの酸化還元反応の双方が試薬層28の各所において起こるため、グルコース溶液を供給してから即時に、グルコース反応が終了する。そのため、グルコース濃度が600mg/dL程度であれば、応答電流値を測定する時点、たとえばグルコースを供給してから５秒も経てば、グルコース濃度に応じた量の酸化型Ru(III)錯体が還元型Ru(II) 錯体とされる。したがって、グルコース濃度が100mg/dLレベルであっても、応答電流値がμAレベルと相対的に大きいため、電磁波などのノイズの影響を受けにくい。このため、電極面積を大きく確保するなどの工夫を講じるまでもなく、感度良くグルコース濃度を測定することができる。また、たとえばメディエータや酵素を電極に固定化して、電極の表面でのみ酵素の触媒反応を起こさせ、メディエータと電極との間で電子の授受を行って、そのときの電子移動量(触媒電流)を測定する場合では、高濃度の測定が困難となる。つまり、グルコースと電極との間の電子の授受に関与する複数の反応のうち、１つでも他の反応に比べて反応が遅いものがあれば、その反応が律速段階となり、一定濃度以上のグルコースを供給したとしても、応答電流値が一定以上とはならない。そのため、グルコース濃度が比較的に大きな範囲での応答電流値が一定値に漸近し、高濃度の測定が困難となる。これに対して、拡散電流を測定する場合には、グルコース反応が事実上終了した時点で応答電流値を測定するため、相対的に高濃度領域においても、適切にグルコース濃度を測定することができるようになる。
【００７１】
一方、演算部７では、第１および第２電極26，27間に電圧を再印加して一定時間（たとえばｔ2−ｔ1＝３秒以上、さらに好ましくは３〜５秒）の経過時点ｔ2に電流値測定部４において測定された応答電流Ｉ2に基づいて、グルコース溶液中のグルコース濃度を演算する。グルコース濃度の演算は、応答電流値を電圧値に換算した後に、この電圧値を、予め作成しておいた電圧値とグルコース濃度との関係を示す検量線に当てはめることにより演算される。検量線は、たとえばデータ化され、演算を実行するプログラムとともにROMに格納されており、このROMに格納されたプログラムをCPUやRAMを利用して実行することによりグルコース濃度の演算が行われる。
【００７２】
【実施例】
以下においては、実施例１〜８により、酵素反応を利用したグルコース濃度の測定において、メディエータとしてRu錯体を用いた場合に、低電圧かつ短時間でグルコース濃度の測定が可能であること、グルコース溶液中に含まれる還元物質の影響が少ないこと、光や水に対する曝露耐性が高いこと、および試薬層の溶解性が高いことについて実証する。
【００７３】
（グルコースセンサの作成）
実施例１〜８においては、基板上に図２および図３に示したような第１電極、第２電極、試薬層、および流路が形成されたグルコースセンサを使用した。第１および第２電極は、カーボンペーストを用いたスクリーン印刷により基板上に形成した。
【００７４】
実施例１〜６では、２つのグルコースセンサについて比較した。一方は、本案グルコースセンサ１であり、他方は比較グルコースセンサ１である。これらのグルコースセンサでは、下記表１に示すように試薬層の処方が異なっている。これらの試薬層は、メディエータ、酸化還元酵素およびリン酸カリウム緩衝液からなる試薬１μLを基板上に点着した後に乾燥させることにより形成した。
【００７５】
【表１】
0004385219.tif 000007
【００７６】
実施例７では、下記表２に示すように実施例１〜６とは酸化還元酵素の種類の異なる２つ本案グルコースセンサ２，３を用いた。試薬層以外の構成は、実施例１〜６のグルコースセンサと同様である。なお、αGDHおよびCyGDHについては上述した通りである。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
実施例８では、下記表３に示すように酸化還元酵素としてGODを使用した本案グルコースセンサ４および比較グルコースセンサ２を用いた。試薬層以外の構成は、実施例１〜６のグルコースセンサと同様である。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
[実施例１]
本実施例では、CV波形を調べることによりグルコースセンサの電極応答特性を評価した。CV波形は、グルコースセンサの試薬層にグルコース溶液を点着した後に、掃引速度を50mV/secとし、印加電圧が０mV→＋800mV→０mV→−800mV→０mV→＋800mVとなるように掃引し、掃引時の応答電流を測定することにより調べた。グルコース溶液としては、濃度が200mg/dLの標準液(グルコースを生理食塩水(0.9wt%NaCl)で溶解させて調整したもの)を使用した。試薬層へのグルコース溶液の点着量は１μLとした。CV波形は図６に示した。
【００８１】
図６のCV波形からは、印加電圧が２回目に０mV→＋800mVとされる範囲では、メディエータとして[Ru(III)(NH3)6]Cl3を使用した本案グルコースセンサ１では印加電圧が約100mVで応答電流値が最大となっているのに対して、K3[Fe(III)(CN)6]を使用した比較グルコースセンサ１では印加電圧が300mV弱で応答電流値が最大となっていることが分かる。図６のCV波形は、メディエータとして[Ru(III)(NH3)6]Cl3を使用する場合には印加電圧を100mV以上に設定すれば還元型の略全てを酸化型に酸化でき、同様にK3[Fe(III)(CN)6]を使用する場合には印加電圧を300mV以上にする必要があることを意味している。各メディエータの応答電流値が最大値となる印加電圧値は、各メディエータの標準酸化還元電位に略一致している。
【００８２】
したがって、メディエータとして標準酸化還元電位の小さいRu錯体を用いれば、印加電圧を小さくしても適切なグルコース濃度の測定が可能であり、その場合には還元型共存物質によるバックグラウンド電流を小さくして精度良い測定が可能になるといえる。
【００８３】
[実施例２]
本実施例では、低電圧(200mV)でグルコース濃度を正確に測定できるか否か検討した。この検討に際して、本案グルコースセンサ１および比較グルコースセンサ１のそれぞれに対して、グルコース濃度が０mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dLの４種類の標準液を用いて、印加電圧を500mVおよび200mVとした場合のそれぞれについて応答電流値を測定した。応答電流値は、第１および第２電極間に電圧を印加した状態を継続し、試薬層に対して標準液１μLを点着してから５秒経過後に測定した。その結果を図７に示した。
【００８４】
図７から分かるように、印加電圧が500mVの場合には、本案グルコースセンサ１は、プロット点の群が高い直線性を示し、グルコース濃度が高い場合(400mg/dL以上)でも適切にグルコース濃度を測定できることを示している。これに対して、比較グルコースセンサ１では、グルコース濃度が高い場合(400mg/dL以上）に直線性が若干乱れているものの、全体としては直線性に優れている。
【００８５】
一方、印加電圧が200mVの場合には、本案グルコースセンサ１は、グルコース濃度が高い場合(400mg/dL以上)に直線性が若干乱れているものの、プロット点の群が高い直線性を示している。本案グルコースセンサ１の200mVでの直線性の乱れは、比較グルコースセンサ１の500mVの直線性の乱れよりも小さい。
【００８６】
このように、メディエータとしてRu錯体を用いた場合には、印加電圧が200mVという低電位でも、少なくともグルコース濃度が０〜600mg/dLの範囲で適切にグルコース濃度の測定が行えることが確認された。したがって、メディエータとしてRu錯体を用いれば、濃度測定装置を低電圧に駆動することが可能となって、消費電力を低減してランニングコストの低減を図ることができるようになるといえる。
【００８７】
[実施例３]
本実施例では、グルコース濃度を適切に測定するのに必要な時間について検討した。この検討に当たっては、試薬層にグルコース濃度が400mg/dLの全血を１μL点着した後から０秒、１秒、２秒または10秒経過した後に第１および第２電極間に対して500mVの電圧印加を開始し、電圧印加を継続した場合に測定される応答電流の経時的変化を測定した。その結果を図８および図９に示した。
【００８８】
図８からは、本案グルコースセンサ１では、電圧を印加する前の時間（非印加状態の時間）の長短にかかわらず、電圧印加開始から３秒後には個々の測定値が一致していることが分かる。したがって、本案グルコースセンサ１では、印加時間を３秒以上とすれば安定した測定結果が得られ、図９をも参照すれば分かるようにメディエータとしてFe錯体を使用する場合よりも印加時間を短くできるといえる。また、非印加状態の時間を余りに大きくしても実益がないことから、図８の結果を勘案すれば、本案グルコースセンサ１では非印加状態の時間は10秒以下で足り、グルコース溶液供給からグルコース濃度演算用の応答電流を測定するまでの時間は10〜15秒も確保すれば十分であるといえる。したがって、図８および図９に示した結果からは、メディエータとしてRu錯体を使用した場合には、Fe錯体を使用する場合よりも測定時間が短くてよいことが分かる。
【００８９】
[実施例４]
本実施例では、還元型の共存物質の影響（バックグラウンド電流の影響）について検討した。本案グルコースセンサ１および比較グルコースセンサ１のそれぞれに対して、グルコース濃度が０mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dLである４種類の全血(グルコース濃度以外の成分は人血中の平均的な濃度に調整したもの)を用いて、印加電圧を500mVおよび250mVとした場合のそれぞれについて応答電流値を測定した。試薬層に対して全血１μLを点着してから10秒間は非印加状態とし、その後、第１および第２電極間に対する電圧印加を開始してから５秒後に応答電流値を測定した。その結果を図10および図11に示した。
【００９０】
図10および図11から分かるように、比較グルコースセンサ１のほうが本案グルコースセンサ１よりも全体的に応答電流値が高くなっている。これは、比較グルコースセンサ１のほうが本案グルコースセンサ１よりも血液中の還元性共存物質の影響を大きく受け、そのバックグラウンド電流により応答電流値が大きくなっているものと考えられる。
【００９１】
ここで注目すべき点は、比較グルコースセンサ１についてはグルコース濃度が０mg/dLの場合であっても、応答電流が正の値として測定されていることである。この点からも、比較グルコースセンサ１の応答電流値が大きくなっている理由として、還元性共存物質によるバックグラウンド電流の影響によることが伺える。
【００９２】
ここで、グルコース濃度が０mg/dLの場合の応答電流値について、図12に棒グラフを示した。同図から分かるように、比較グルコースセンサ１では、グルコース濃度が０mg/dLでも比較的に大きな応答電流が測定されており、還元性共存物質の影響を大きく受けているものと考えられる。これに対して、本案グルコースセンサ１では、グルコース濃度が０mg/dLの場合には、測定される応答電流が小さく、還元性共存物質による影響が著しく低減されているといえる。したがって、メディエータとしてRu錯体を使用すれば、還元性共存物質による影響を考慮して補正するまでもなく、精度良く濃度演算を行うことが可能となる。
【００９３】
[実施例５]
本実施例では、曝露耐性について評価した。この曝露耐性は、同時期に作成された本案グルコースセンサ１および比較グルコースセンサ１を相対湿度50％、温度25℃に維持された恒温恒湿室内に放置した後に、グルコース濃度が０mg/dLである標準液を用いて応答電流値を測定することにより評価した。応答電流値は、試薬層に標準液を点着してから10秒後に電極間に対する500mVの電圧印加を開始するとともに、電圧印加開始から５秒後に測定した。恒温恒湿室内への放置時間は、１日および４日とし、また恒温恒湿室内に放置する直前のもの(初期)およびモレキュラーシーブ(除湿剤)６ｇ入りのデシケータ(内容積0.2L、初期設定相対湿度50％、温度25℃)に密閉した状態で相対湿度50％、温度25℃に維持された恒温恒湿室内に４日間放置した後のもの(密閉４日)についても同様な条件で応答電流値を測定した。その結果を図13に示した。
【００９４】
図13から分かるように、全ての環境設定において、本案グルコースセンサ１のほうが比較グルコースセンサ１よりも応答電流が著しく小さく、その値は全ての環境設定において同じ程度である。したがって、メディエータとしてRu錯体を使用した場合には、曝露環境下でも試薬層の劣化（還元）が少なく保存安定性に優れ、長期間劣化しにくいものと予想される。したがって、メディエータとしてRu錯体を使用すれば、グルコースセンサを保存するために水分による暴露の影響をさほど考慮する必要がなくなる。そのため、グルコースセンサを工業的に量産し、それを包装する場合には、包装内に窒素置換処理などを施す必要がなくなるために、製造が容易となってコストの低減を図ることができるようになる。
【００９５】
[実施例６]
本実施例では、試薬層の溶解性を検討した。試薬層の溶解性の検討に際して、本案グルコースセンサ１および比較グルコースセンサ１のそれぞれに対して、グルコース濃度が０mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dLの４種類の標準液を用いて、印加電圧を500mVとした場合について応答電流値を測定した。応答電流は、試薬層に対して標準液１μLを点着してから10秒間は非印加状態とし、その後、第１および第２電極間に対する電圧印加開始してから５秒後に測定した。その結果を図14に示した。図14には、比較グルコースセンサ１に対して、分散剤としての無機ゲルをFe錯体100重量部に対して１重量部となるように添加した場合の結果も同時に示した。
【００９６】
図14から分かるように、本案グルコースセンサ１は、グルコース濃度が大きい場合であっても直線性に優れている。このことは、グルコース濃度の如何にかかわらず、標準液の供給から15秒という時間内に試薬層が良好に溶解していることを意味している。
【００９７】
したがって、メディエータとしてRu錯体を使用すれば、試薬層の溶解性に優れ、試薬層全体が均一な反応系を形成することができる結果、グルコース濃度が相対的に高いグルコース溶液についても、分散剤を用いるなどして対応するまでもなく、短時間で精度良くグルコース濃度を測定できるようになる。
【００９８】
[実施例７]
本実施例では、上記表２に示した処方で形成された試薬層を有する本案グルコースセンサ２および本案グルコースセンサ３について、濃度の異なる４種類(０mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL）の全血での応答電流値を測定した。その結果を図15に示した。図15には、実施例１〜６と同様な構成の本案グルコースセンサ１について、同一の条件により応答電流値を測定した結果を同時に示した。
【００９９】
図15から分かるように、酸化還元酵素としてCyGDHあるいはαGDHを用いた本案グルコースセンサ２および本案グルコースセンサ３においても、200mVという低電圧の印加で、しかも印加開始から５秒という短時間に、比較的に低濃度から高濃度に至るまで適切に濃度測定を行うことができる。また、図15からは、これらのグルコースセンサでは、バックグランド電流が小さいことも伺える。したがって、メディエータとしてRu錯体を用いれば、種々のGDHについて、実施例１ないし６で記載した効果を享受できるといえる。
【０１００】
[実施例８]
本実施例では、酸化還元酵素としてGODを用いるとともにメディエータとしてRu錯体を用いた本案グルコースセンサ４と、酸化還元酵素としてGODを用いるとともにメディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いた比較グルコースセンサ２について、実施例７と同様にして応答電流値を測定した。その結果を図16に示した。
【０１０１】
図16から分かるように、GODとRu錯体とを組み合わせた場合であっても、実施例１ないし６で使用した本案グルコースセンサ１と同様に、比較的にグルコース濃度が高い場合であっても直線性に優れ、バックグラウンド電流が小さいといえる。したがって、GODとRu錯体とを組み合わせた場合であっても、実施例１ないし６で記載した効果を享受できるといえる。
【０１０２】
以上に説明したように、本発明では、短い測定時間で、比較的に測定対象物の濃度が低い試料液から比較的に濃度が高い試料液に至るまで、還元性共存物質の影響を低減しつつ、試薬層の溶解性を十分に確保して正確に試料液中の測定対象物の濃度を測定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明を実施するためのグルコース濃度測定装置の一例の概略構成を示す模式図である。
【図２】  図２は、図１のグルコース濃度測定装置に用いられるグルコースセンサの一例を示す全体斜視図である。
【図３】  図３は、図２のグルコースセンサの分解斜視図である。
【図４】  図４Ａはグルコース、PQQ−GDHおよびRu錯体を含む反応系での電子伝達系統図であり、図４Ｂはグルコース、GODおよびRu錯体を含む反応系での電子伝達系統図である。
【図５】  図５は、グルコース濃度の測定において、第１および第２電極間に印加する電圧値、および応答電流値の経時的変化を示すグラフである。
【図６】  図６は、本案グルコースセンサ１と比較グルコースセンサのCV波形である。
【図７】  図７は、印加電圧値の影響を示すグラフである。
【図８】  図８は、Ru錯体を用いた試薬層に全血を供給してから一定時間開回路とした後に試薬層に電圧を印加したとき(閉回路)の応答電流の経時的変化を示すグラフである。
【図９】  図９は、Fe錯体を用いた試薬層に全血を供給してから一定時間開回路とした後に試薬層に電圧を印加したとき(閉回路)の応答電流の経時的変化を示すグラフである。
【図１０】  図10は、グルコース濃度の異なる複数種の全血について、試薬層に全血を供給してから10秒後に500mVの印加電圧を付与したときの電圧印加開始５秒後の応答電流値を示すグラフである。
【図１１】  図11は、グルコース濃度の異なる複数種の全血について、試薬層に全血を供給してから10秒後に250mVの印加電圧を付与したときの電圧印加開始５秒後の応答電流値を示すグラフである。
【図１２】  図12は、図10および図11に示したグラフにおいて、グルコース濃度が０の全血についての応答電流値(バックグラウンド電流)を、Fe錯体およびRu錯体について個別に示した棒グラフである。
【図１３】  図13は、水分による曝露の影響を、試薬層に標準液を供給したときの応答電流値から評価したグラフである。
【図１４】  図14は、Ru錯体の分散能を、試薬層に標準液を供給したときの応答電流値から評価したグラフである。
【図１５】  図15は、試薬層の処方(酸化還元酵素)の異なるグルコースセンサについて、グルコース濃度と応答電流値との相関性を示すグラフである。
【図１６】  図16は、酸化還元酵素としてGODを使用したグルコースセンサについて、グルコース濃度と応答電流値との相関性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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