(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列I.D.No:47：
0004233604.tif 000100
からなり、プリオンタンパク質の少なくとも１つの抗原性部位を有する合成ポリペプチドに対して生成した抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する、プリオンタンパク質を検出するためのキット。
【請求項３】
サンプルを、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと共にインキュベートすることを含む、プリオンタンパク質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、合成ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、海綿様脳症の分子病理学に関連すると考えられるタンパク質の特定領域の三次元構造および／または静電表面および／または他の物理的、化学的および構造的特性と等しいか、或いは類似する合成ポリペプチドに関する。本発明は、ヒト、ウシおよびヒツジの海綿様脳症に関する免疫学的診断剤、ワクチン、並びに他の医薬、獣医薬または科学的物質を設計するのに特に重要である。
海綿様脳症は、一群の変質神経性疾患である。ヒツジ（スクラピーとして知られている）、畜牛（BSE）およびヒト（クロイツフェルド−ヤコブ病（CJD）およびクル）を含む数多くの種において、症例が見出されている（参考資料、Taylor，D.M. Veterinary Record 125，413-415（1989））。同様の状況は、野性ミンクの集団および捕獲されたクーズー（レイヨウの一種）およびトラにも見出されている。BSEは、実験室的条件下でマウスおよびブタに感染しうることが種々報告されている。感染性物質による種の障壁がこのように交叉することは、ヒトへの感染が発生しうるという懸念の増大を招いている。
これらの疾患は、４〜５年の緩慢な潜伏期間によって特徴付けられ、その後、攻撃性と協調性の欠如とを含む精神状態の進行性変性の臨床的症候が現れる。死体解剖は、神経細胞の破壊による脳組織中の空胞化の特徴的パターンと、異常なタンパク質繊維の沈渣とを現する。
ヒツジに見出される疾患（スクラピー）の形態は長年知られていたが、海綿様脳症は、牧場におけるBSEの発生に続いて、この１０年間で顕著になってきた。英国におけるBSEの発生率は、この期間に、著しく増大しており、この疾患がヒトに感染する可能性に関する公衆の懸念は、牛肉市場における暴落を導いている。従って、獣医学的および経済的理由の両者から、感染を検出するための診断剤および感染を防止するためのワクチンが緊急に必要とされている。
スクラピーの原因物質および他の動物におけるその等価物質は、いわゆる“プリオン（prion）”であり、これはタンパク質のみからなり、核酸を含まない感染性粒子である。従来のウイルスの場合には後者の存在が必要である。スクラピーにおいて、一つの特別なタンパク質（プリオンタンパク質、PrPscと呼ぶ）は、感染性を伴って精製されることが見出されており、実験室的条件下で、ハムスターのような他の動物からの脳細胞培養物中でスクラピー様状態を生じさせることができる。PrPscは、スクラピーに感染したヒツジの脳組織中に沈渣した特徴的タンパク質繊維の唯一知られた成分である。ここで用いられる“PrPsc”なる用語は、ヒツジにおいて同定される特殊なプリオンタンパク質のみならず、以下に述べるような構造的変性を受けるとみられる他の多くの種において見出される相同タンパク質をも指すものと解釈するべきである。“PrPc”なる用語は、PrPscに対する正常な細胞等価物質について用いられる。
スクラピー物質PrPscに対する特殊な診断剤あるいは合成ワクチンの研究において、それが天然形態のタンパク質PrPcと殆ど同じであることが大きな問題である。このタンパク質の本質的機能はまだ理解されていないが、異なった種からの相同タンパク質間で一次構造が極めて強く保存されることは、それが生体内で必須の構造的または機能的役割を有することを示唆している。
プリオンの形態が天然タンパク質と殆ど同一であるにもかかわらず、我々は、少なくとも一つの抗原性特性、例えばエピトープ部位を含む合成ペプチド構造物を演繹した。そしてこれら合成ペプチドは、診断剤およびワクチンの製造に使用できよう。
免疫系のＢ細胞およびＴ細胞の応答は、タンパク質全体の包括的認識によって明示されるのではなく、むしろエピトープ部位として知られているタンパク質表面の小さい領域の認識によって明示される。このような部位は、ペプチド鎖の連続部分（section）または不連続部分によって形成することができ、この場合、ペプチド鎖の分離された部分は、鎖の折り畳みのため、タンパク質表面で結びつけられる。合成ペプチドワクチンを製造する目的の一つは、特別なエピトープの構造を模倣することであり、これにより、メモリーＢ細胞の生成に導く一次免疫応答を引き起こし、このメモリーＢ細胞は、次に親タンパク質に曝されたときに抗体を分泌し、従って、二次感染に対して大いに増強された応答を生じるであろう。細胞毒性Ｔ細胞の感作（priming）を介して、特別な抗原に対して更に強力に応答するようにした同様のメカニズムも起こる。
しかしながら、核酸配列よりはむしろタンパク質プリオンの分子構造がプリオンにおける感染性を有すると信じられているので、ワクチン製造の伝統的方法をこの疾患に適用するには問題がある。ウイルス性ワクチン製造の常法は、エピトープ部位を保存しつつ感染性を破壊するために、何らかの手法でウイルスを不活性化することを含む。熱処理あるいは培養によるウイルスの連続継代などの技術が用いられるが、これらのアプローチでは、タンパク質の変性を起こすような条件にしないかぎり、プリオンの感染力の減少につながらない。もし条件がプリオンタンパク質を不活性化するのに充分に厳しいものであれば、タンパク質の変性が起こり、全てのエピトープ部位が失われる。従って、従来の経路により、抗原性であるが非感染性のプリオンタンパク質を得る試みには、大きな問題がある。例えば、ヒツジにおけるスクラピー物質は、化学的または物理的不活性化に対して特に耐性であることが知られている（Hodgson，J. Bio/Technology 8，990（1990））。
一つの態様において、我々の発明は、プリオンタンパク質の少なくとも１つの抗原性部位を有する合成ポリペプチドを提供する。プリオンタンパク質は、海綿様脳症に罹患した哺乳動物の神経組織内にのみ存在する形態のものが好ましい。
我々は、上記のタイプのプリオンタンパク質が６つの重要な領域（Ａ〜Ｆという）、並びに２つの関連したフレームシフトペプチド配列、即ち１）+1（FSa）の核酸暗号化配列フレームシフトを受けた領域Ｅ中の繰り返し部分、および２）-1（FSb）の核酸暗号化配列フレームシフトを受けた領域Ｅ中の繰り返し部分を有することを見出した。
領域Ａについて、我々の発明は、一般式（Ｉ）で表される合成ペプチド配列を提供する：
0004233604.tif 000002
ここで、Ｒ1はMet、LeuおよびPheから選択されるアミノ酸残基であり、
Ｒ2はMetまたはValであり；
Ｒ3はAlaであるか、または存在せず；
Ｒ4およびＲ5は独立して、Leu、IleおよびMetから選択されるアミノ酸残基であり、括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
例えば、配列のＮ−末端の残基が、“Ｒ2-”または“His-Ｒ2-”または“Lys-His-Ｒ2-”または“Ｒ1-Lys-His-Ｒ2-”として存在しうることは明かであろう。同様に、Ｃ−末端の好ましい残基は、“-Arg”または“-Arg-Pro”または“-Arg-Pro-Ｒ4”または“-Arg-Pro-Ｒ4-Ｒ5”として存在している。
好ましくは、Ｒ1は、もし存在する場合にはMetであり、Ｒ3はAlaであり、Ｒ5は、もし存在する場合にはIleである。また、もしＲ2がMetである場合には、Ｒ4は、もし存在するならばIleである。下記に、各々ウシとヒツジ、およびヒトのプリオンタンパク質に関連する式Ｉの好ましい配列（Seq. I.D. No: 1およびSeq.I.D. No: 2）を示す。
0004233604.tif 000003
式Ｉで表される特に好ましい配列は、下記のSeq. I.D. No: 51である。
0004233604.tif 000004
当然のことながら、我々の発明は上記式Ｉで表される配列の重要なサブフラグメントを包含し、好ましいサブフラグメントは、下記のものである。
0004233604.tif 000005
ここで、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、ＸおよびＹは、式Ｉで規定したとおりであり、括弧内の残基は、式Ｉの場合と同様に存在しても存在しなくてもよい。
上記のことから明かなように、ウシおよびヒツジの両者に関連する好ましいサブフラグメントは、下記のものである。
0004233604.tif 000006
同様に、ヒトの好ましいサブフラグメントは、下記のものである。
0004233604.tif 000007
領域Ｂについて、我々の発明は、一般式IIで表される合成ペプチド配列を提供する。
0004233604.tif 000008
ここで、Ｒ4およびＲ5は、式Ｉの場合と同様であり；
Ｒ6はAsnまたはSerであり；
Ｒ7はTyrまたはTrpであり；
Ｒ8はHis、TyrおよびAsnから選択されるアミノ酸残基であり；
括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
好ましくは、式IIで表される配列において、Ｒ5はIleであり、Ｒ7はTyrであり、Ｒ8はHisまたはTyrである。下記に、各々ウシ、ヒツジおよびヒトのプリオンタンパク質に関連する式IIの好ましい配列を示す。
0004233604.tif 000009
特に好ましい配列は、下記のものから選択される。
0004233604.tif 000010
再び、我々の発明は、式IIで表される配列の重要なサブフラグメントを包含することが明らかであり、好ましい一般的サブフラグメントは、下記の配列を有する。
0004233604.tif 000011
ここで、Ｒ4〜Ｒ7、ＸおよびＹは、式IIで規定したとおりであり、括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよい。好ましくは、Ｒ5はIleであり、Ｒ7はTyrである。ウシ、ヒツジおよびヒトに関連する好ましいサブフラグメントは、各々下記のものであることがわかる。
0004233604.tif 000012
領域Ｃについて、我々の発明は、一般式IIIで表される合成ペプチド配列を提供する。
0004233604.tif 000013
ここで、Ｒ8はHis、TyrおよびAsnから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ9はValまたはMetであり；
Ｒ10はGln、GluおよびArgから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ11はSerまたはAsnであり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
好ましくは、式IIIで表される配列において、Ｒ8はHisまたはTyrであり、Ｒ11はSerである。下記に、各々ウシ、ヒツジおよびヒトのプリオンタンパク質に関連する式IIIの好ましい配列を示す。
0004233604.tif 000014
特に好ましい配列は、下記のものから選択される。
0004233604.tif 000015
式IIIで表される配列の重要なサブフラグメントは、本発明の一部を形成し、好ましいサブフラグメントは、次の配列を有する。
0004233604.tif 000016
ウシ、ヒツジおよびヒトに関連する好ましいサブフラグメントは、各々下記のものである。
0004233604.tif 000017
領域Ｄについて、我々の発明は、一般式IVで表される合成ペプチド配列を提供する。
0004233604.tif 000018
ここで、Ｒ12はAspまたはGlnであり；
Ｒ13はGlyであるか、または存在せず；
Ｒ14はGlyまたはArgであり；
Ｒ15はAlaまたはSerであり；
Ｒ16はSerであるか、または存在せず；
Ｒ17はAla、Thr、MetおよびValから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ18はValまたはIleであり；
Ｒ19はIleまたはMetであり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
好ましくは、式IVで表される配列において、Ｒ12はGlnであり、Ｒ13は存在せず、Ｒ14はGlyであり、Ｒ16は存在せず、Ｒ17はValまたはMetであり、Ｒ19はIleである。
ウシとヒツジ、およびヒトのプリオンタンパク質に関連する式IVの好ましい配列は、下記のものである。
0004233604.tif 000019
0004233604.tif 000020
明かに、本発明はその範囲内に、式IVで表される配列の重要なサブフラグメントを包含するものと認められるであろう。好ましい一般的サブフラグメントは、次の配列を有する。
0004233604.tif 000021
ここで、Ｒ14〜Ｒ18、ＸおよびＹは、式IVで規定したとおりであり、括弧内の１つ以上の残基は、式IVの場合と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
上記のサブフラグメントにおいて、Ｒ14はGlyであり、Ｒ16は存在せず、Ｒ17はValまたはMetであることが好ましい。下記に、各々ウシとヒツジ、およびヒトに関連する好ましいサブフラグメントを示す。
0004233604.tif 000022
我々の発明は、領域Ｅについて、一般式Ｖａ、ＶｂおよびＶｃで表される３つの合成ペプチド配列を提供する。
0004233604.tif 000023
ここで、Ｒ20、Ｒ21、Ｒ23およびＲ24は各々独立して、Glyであるか、または存在せず；
Ｒ22はGlyまたはThrであり；
Ｒ25はThrまたはSerであり；
Ｒ26はGly、SerおよびAsnから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ27およびＲ28は各々独立して、AsnまたはSerであり；
Ｒ29はMet、LeuおよびPheから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ30はValまたはMetであり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
上記した式Ｖａ〜Ｖｃについて、好ましくは、Ｒ22はGlyであり、Ｒ23は存在せず、Ｒ26はGlyまたはSerであり、Ｒ27はSerであり、Ｒ28はAsnであり、Ｒ29はMetである。
式Ｖａ〜Ｖｃで表されるウシのプリオンタンパク質の好ましい配列は、下記のものである。
0004233604.tif 000024
ヒツジのプリオンタンパク質に関連する式Ｖａ〜Ｖｃの好ましい配列は、下記のものである。
0004233604.tif 000025
ヒトのプリオンタンパク質に関連する式Ｖａ〜Ｖｃの好ましい配列は、下記のものである。
0004233604.tif 000026
式Ｖａ〜Ｖｃの特に好ましい配列は、次のものである。
0004233604.tif 000027
我々は、領域Ｅに対応する核酸配列において、式Ｖｂの繰り返し配列が+1または-1の何れかのフレームシフトを受け得ることに注目した。このようなフレームシフトは、プリオンタンパク質の領域Ｅ内で変化した配列を引き起こし、そして我々の発明は、領域Ｅ内の１つの繰り返しが、式VIで示される-1のフレームシフトを受けている配列を有する合成ペプチドを提供する。
0004233604.tif 000028
ここで、Ｒ31およびＲ35は各々独立して、AlaまたはThrであり；
Ｒ32およびＲ36は各々独立して、Ser、ProおよびThrから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ33およびＲ37は各々独立して、TrpまたはArgであり；
Ｒ34およびＲ38は各々独立して、Ala、Ser、ProおよびThrから選択されるアミノ酸残基であり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
ウシにおける領域Ｅに関する-1フレームシフトについて、Ｒ31はAlaであり、Ｒ32、Ｒ34、Ｒ36およびＲ38は各々独立して、SerまたはProであり、Ｒ33およびＲ37はArgであり、Ｒ35はAlaであることが好ましい。
ヒツジの領域Ｅにおける-1フレームシフトに関する好ましい配列は、ウシについて示した配列と幾つかの点で異なり、ヒツジの好ましい配列において、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ35、Ｒ36およびＲ37は、上記式VIで述べた定義に対応し、Ｒ34およびＲ38は各々独立して、Ser、ProおよびThrから選択される。
式VIの好ましいヒトの配列において、Ｒ31、Ｒ34、Ｒ35およびＲ38は各々Alaであり、Ｒ32およびＲ36は各々独立して、SerまたはProであり、Ｒ33およびＲ37は両方ともTrpである。
上記のように、フレームシフトは、領域Ｅの繰り返し部分において＋１であってよく、これは異なったアミノ酸配列を生じさせる。従って、我々の発明は、領域Ｅの繰り返しにおいて、＋１のフレームシフトに関連する下記式VIIで表される合成ポリペプチドを提供する。
0004233604.tif 000029
ここで、Ｒ39およびＲ43は各々独立して、SerまたはAsnであり；Ｒ40およびＲ44は各々独立して、Pro、LeuおよびHisから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ41およびＲ45は各々独立して、ValまたはGluであり、Ｒ42およびＲ46は各々独立して、Val、Ala、AspおよびGlyから選択されたものであり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上の追加のアミノ酸残基である。
式VIIで表される好ましいウシの配列は、各々がSerであるＲ39およびＲ43と、各々が独立して、ValまたはAlaであるＲ42およびＲ46と、ProまたはLeuであるＲ44とを含み、他のＲ基は、式VIIで規定したとおりである。
ヒツジに関連する式VIIの好ましい配列は、Ｒ42およびＲ46が各々独立して、Val、AlaおよびAspから選択される以外は、一般式VIIで示されるものと同一である。
式VIIで表される好ましいヒトの配列について、Ｒ39およびＲ43はSerであり、Ｒ40およびＲ44は各々独立して、ProまたはLeuであり、Ｒ41およびＲ45はValであり、Ｒ42およびＲ46は各々独立して、AspまたはGlyである。
我々の発明はまた、領域Ｆに関連し、かつ一般式VIIIａまたはVIIIｂを有する合成ペプチド配列を提供する。
0004233604.tif 000030
ここで、Ｒ47はIleまたはValであり；
Ｒ48およびＲ52は各々独立して、GlnまたはGluであり；
Ｒ49はValまたはThrであり；
Ｒ50はValまたはIleであり；
Ｒ51はIle、ThrおよびValから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ52はGlnまたはGluであり；
Ｒ53はArgまたはLysであり；
Ｒ54はAspまたはGlnであり；
Ｒ55はGlyであるか、または存在せず；
Ｒ56はGlyまたはArgであり；
Ｒ57はAlaまたはSerであり；
Ｒ58はSerであるか、または存在せず；
Ｒ59はAla、Thr、MetおよびValから選択されるアミノ酸残基であり；括弧内の１つ以上の残基は、存在しても存在しなくてもよく、ただし、これらの残基が存在する場合には、これらは残余のペプチドに順次結合しており；ＸおよびＹは各々独立して、存在しないか、または独立して、１つ以上、例えば３つの追加のアミノ酸残基である。
式VIIIａにおいて、Ｒ49はThrであることが好ましく、式VIIIｂにおいて、Ｒ51はIleであり、Ｒ53はArgであり、Ｒ54はGlnであり、Ｒ55は存在せず、Ｒ56はGlyであり、Ｒ57はAlaであり、Ｒ58は存在しないことが好ましい。
式VIIIａおよびVIIIｂで表される最も好ましいウシ、ヒツジおよびヒトの配列を、以下にその順に示す。
0004233604.tif 000031
式VIIIａおよびVIIIｂで表される特に好ましい配列は、下記のものから選択される。
0004233604.tif 000032
上記式Ｉ〜VIIIｂのいずれかで表され、ＸおよびＹが存在しない合成ポリペプチドは、勿論、例えば抗体の製造等に有用であろう。しかしながら、ＸまたはＹが存在する場合には、これらはどの様な長さであってもよいが、好ましくはアミノ酸２０個未満、より好ましくは１０個未満、例えば３〜６個である。勿論、式Ｉ〜VIIIｂのいずれかで表される配列は、ＸおよびＹが、抗原性配列（例えば球状タンパク質上の露出ループの一部である）を有するタンパク質の主要部分であるタンパク質を構成してもよいことが認められよう。
ＸまたはＹが存在する場合には、これらは比較的短い配列、典型的には１〜３個の残基の長さであることが好ましい。大抵の場合には、Ｘが好ましくは欠如しており、Ｙが１個または２個の残基の長さ、例えば-Cysまたは-Gly-Cysである。
本明細書において、全ての配列は、標準I.U.P.A.C命名法の以下の３文字コード略語：Gly-グリシン、Ala-アラニン、Val-バリン、Leu-ロイシン、Ile-イソロイシン、Ser-セリン、Thr-トレオニン、Asp-アスパラギン酸、Glu-グルタミン酸、Asn-アスパラギン、Gln-グルタミン、Lys-リジン、His-ヒスチジン、Arg-アルギニン、Phe-フェニルアラニン、Tyr-チロシン、Trp-トリプトファン、Cys-システイン、Met-メチオニンおよびPro-プロリン、を用いて述べられている。
本発明に係るポリペプチドは、広範な生物において産生されるプリオンタンパク質類と交差反応可能な抗体を生成させるのに用いることができる。本発明に係るポリペプチドの配座的特性、極在的特性および静電的特性は、幾つかの、あるいは多数の生物からのプリオンタンパク質と交差反応する抗体の産生を高い確率で誘発するようなものであり、幾つかの変異体ポリペプチドをより大きなポリペプチド内に組み込むことから、更なる利益を得ることができる。このようなポリペプチドは、以下の式（IX）：
0004233604.tif 000033
（式中、ＦおよびＧは、各々独立して、式Ｉ〜VIIIｂのいずれかで表されるポリペプチドまたはサブフラグメントであってよく、Ｌは結合配列であり、ａ、ｂおよびｃは、各々独立して、０または１であり、ｍおよびｎは各々正の数、例えば１〜１０である）で表すことができる。Ｌは、好ましくは短く、ポリペプチド鎖の配座的に自由な部分、例えば、（Seq. I.D. No: 38）Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、（Seq. I.D. No: 39）Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Proまたは（Seq. I.D. No: 40）Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala等であるが、これらに限定されるものではない。各々の繰り返し部分が、所望により、本発明に係るポリペプチドの異なる変異体を持ち得ることは、明らかである。
Ｃ−末端のあるものはＮ−末端に対応すること、個々には式Ｖａが式Ｖｂに、式Ｖｃが式Ｉに、式Ｉが式IIに、式IIが式IIIに、式IIIが式VIIIａに、そして式VIIIｂが式IVに対応することは、注目すべきことである。式IXで表されるより大きなポリペプチドを製造する際に、この対応関係を利用することができる。Ｘ部分およびＹ部分の各々と一緒になった結合配列は省略することができ、括弧内の残基は、対応する領域が重複するか、または幾つかのあるいは全ての重複残基が省略されるように選択することができる。後者の場合には、１つのポリペプチドのＣ−末端が、他のポリペプチドのＮ−末端と合体することがわかる。
式IXで定義されるような多価の抗原決定基類似体は、本質的に同一な抗原決定基類似体の変異体が、１つのポリペプチド鎖内で繰り返されるプソイドホモポリバレントと称されるものであってもよく、および／または異なる抗原決定基が１つのポリペプチド鎖内に含まれているヘテロポリバレントと称されるものであってもよい。加えて、式Ｉ〜VIIIｂの何れかで表される１つの抗原決定基類似体の同一変異体の複製を複数含む単純なホモポリバレントポリペプチド免疫原もまた、効果的であると考えられ、本発明の範囲に包含される。
抗原的に重要なサブフラグメントおよび／または抗原的に重要な変異体が、親ペプチドの全般的形態および機能を保持していれば、これらのものは何れも本発明の範囲内に包含されると理解されるべきである。特に、特定残基の何れかが、匹敵する配座的特性および／または物理的特性を有する残基により置換されたもの、例えば稀少アミノ酸残基類似体（ただし天然に存在する：例えばＤ−立体異性体）または合成アミノ酸残基類似体により置換されたものが、本発明に包含される。例えば、１つの残基が、以下に示す同一セット内で他の残基により置換されたものは、本発明の範囲内である：セット１-Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、TrpおよびMet；セット２−Ser、Thr、AsnおよびGln；セット３−AspおよびGlu;セット４−Lys、HisおよびArg；セット５−AsnおよびAsp；セット６−GluおよびGln；セット７−Gly、Ala、Pro、SerおよびThr。全てのアミノ酸タイプのＤ−立体異性体、例えばD-Phe、D-TyrおよびD-Trpは置換されていてもよい。
本発明の好ましい態様において、ＸおよびＹは、もし存在する場合は、各々独立して、Ｔ細胞エピトープとして作用する能力を有するタンパク質配列のセグメントを１個または２個以上含んでいてもよい。例えば、一般式１−２−３−４（式中、１はGlyまたは荷電アミノ酸（例えばLys、His、Arg、AspまたはGlu）であり、２は疎水性アミノ酸（例えば、Ile、Leu、Val、Met、Tyr、Phe、TrpまたはAla）であり、３は疎水性アミノ酸（上述したとおり）または無荷電極性アミノ酸（例えば、Asn、Ser、Thr、Pro、GlnまたはGly）であり、４は極性アミノ酸（例えばLys、Arg、His、Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、ThrまたはPro）である）のアミノ酸配列のセグメントは、少なくとも幾つかの場合に、Ｔ細胞エピトープとして作用するようである（Rothbard, J.B. & Taylor, W.R.（1988）A sequence pattern in common to T-cell epitopes. The EMBO Journal 7（1）：93-100参照）。同様に、セグメントは、配列１’−２’−３’−４’−５’（式中、１’は前述した１と同様であり、２’は２と、３’および４’は３と、かつ５’は４と各々同様である）であり得る（同書参照）。両方の形態は本発明の範囲内に包含され、そして１個または２個以上のＴ−細胞エピトープス（好ましくは５個未満）であり、このエピトープは前記で定義したタイプのものでも他の構造のものであってもよく、あるいは任意の長さまたは組成、好ましくは５個未満のアミノ酸残基の長さであり、例えばGly、Ala、Pro、Asn、ThrおよびSerから選ばれた残基、または非−α−アミノ酸のような多官能性リンカーを含むスペーサセグメントによって隔てられても良い。Ｃ−末端またはＮ−末端のリンカーは完全なタンパク質を表すことが可能であり、従って、担体タンパク質への結合の必要性がないようにする。
本発明の範囲にはまた、式Ｉ〜VIIIｂで表され、式中のＸまたはＹが“レトロ−逆位（retro-inverso）”アミノ酸、即ち、アミノ酸に対応する官能性基を有する２官能性アミンであるか、あるいはこれを含むポリペプチドの誘導体も包含される。例えば、本発明に従い、かつレトロ−逆位アミノ酸を含有する類似体は、下記式：
0004233604.tif 000034
（式中、Ｒは任意の官能性基、例えばグリシン側鎖であり、Ａ１およびＡ２は各々好ましくは、本明細書で定義した類似体（必ずしも同一でなくてもよい）の１つであってそのＮ−末端またはＣ−末端によって結合したもののコピーである）の構造を有しうる。先に論じたように、所望により、Ｔ−細胞エピトープが含まれていてもよい。
ペプチドのレトロ−逆位修飾は、１個または数個のペプチド結合を逆転して、元の分子よりも酵素分解に対する耐性が優れた類似体を生成させ、かつ中程度ないし大きな免疫原性物質のためにエピトープを高濃度で含有している分岐した免疫原性物質を生成させる便利な経路を提供することを含む。生物学的に活性な短鎖ペプチドのレトロ−逆位類似体の大規模な溶液合成において、これらの化合物を使用することは、大いに可能である。
本発明のペプチドは、標準的ペプチド合成技術により、例えば標準の9-フルオレニルメトキシカルボニル（F-Moc）化学（例えばAtherton, E. and Sheppard, R.C.（1985）J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165参照）、または標準的ブチルオキシカーボネート（T-Boc）化学を用いて合成することができるが、Sheppard et alによって開発されたフルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）／第３級ブチルシステムが、より最近になって、益々広く応用されるようになってきたことが注目される（Sheppard, R.C. 1986 Science Tools, The LKB Journal 33, 9）。構造の正確さおよび純度のレベル（これは通常は85%を超える）は、注意深く検討すべきであり、もし存在する場合には、内部ジスルフィド橋の配置の正確さに注目されるべきである。この目的のために、例えば、高速液体クロマトグラフィーを含む種々のクロマトグラフィー分析、およびラマン分光法を含む分光分析を採用できる。
本発明のポリペプチドは、任意の従来法、前記のようなマニュアルまたは自動化ペプチド合成技術を用いて直接に、あるいはRNA合成もしくはDNA合成、または分子生物学および遺伝子工学の従来技術により間接的に、合成しうるものと理解すべきである。このような技術を用いて、他のポリペプチド配列中に挿入された１個または２個以上のポリペプチドを含有するハイブリッドタンパク質を製造することができる。
従って、本発明のもう一つの態様は、本発明に係る少なくとも１つの合成ポリペプチドをコード化するDNA分子を提供し、この分子は、微生物細胞または哺乳動物細胞内で複製可能な好適な発現ベクター中に挿入されていることが好ましい。このDNAは、より長い生成物のDNA配列の一部であってもよく、例えばポリペプチドは、これらが遺伝子工学によって挿入されている他のタンパク質の部分として発現されてもよい。このような技術についての一つの実用的な手引は、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.による“Molecular cloning: a laboratory manual”（第２版、1989）である。
類似体である挿入用レトロ−逆位アミノ酸誘導体は、組み換えDNAシステムを用いて直接に作成することはできないことに注目すべきである。しかしながら、基礎的な類似体を作成することができ、次いでこれらのものを精製し、そして標準的なペプチド／有機化学を用いてレトロ−逆位アミノ酸に化学的に結合することができる。ポリアミド型樹脂上でレトロ−逆位ペプチドを固相合成するための実用的かつ好都合な新規な手順が、最近記載された[Gazerro, H., Pinori, M. & Verdini, A.S.（1990）、A new general procedure for the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides, In“Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis”, Ed. Roger Epton, SPCC（UK）Ltd, Birminghan, UK]。
ポリペプチドは、任意に、ポリペプチドそれら自体中の化学基を介して、またはＣ−末端またはＮ−末端の何れかで付加された追加のアミノ酸を介して、担体分子に結合されていてもよく、この担体分子は、ポリペプチドをその免疫学的機能にとって最適にするために、１個または２個以上の追加のアミノ酸によってポリペプチドから隔てられていてもよく、またはこれら追加のアミノ酸によって取り囲まれていてもよい。多くの結合が好適であり、例えばTyr、CysおよびLys残基の側鎖の使用が含まれる。好適な担体としては、例えばツベルクリン（PPD）の精製タンパク誘導体、破傷風変性毒素（TT）、コレラ毒素およびそのＢサブユニット、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン（BSA）、大豆トリプシン阻害物質（STI）、ムラミルジペプチド（MDP）およびその類似体、ジフテリア毒素（DPT）、鍵穴カサガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン（KLH）およびブラウンのリポタンパク質等が挙げられるが、他の好適な担体は、当業者に容易に明らかであろう。例えば、複抗原性ペプチドは、例えばヘプタリジル等の反応性アミン末端を有するポリリジルコアを含むものであってよい。本発明に係るポリペプチド抗原は、アミノ末端と反応させるかまたはアミノ末端上で合成することができ、そして異なるペプチド抗原を同じコアまたは担体と反応させることができる。例えば、本発明に係るポリペプチドのための担体としてPPDを用いる場合には、ポリペプチド-PPD結合体のレシピエントが、例えば以前のBCGワクチン接種のために、既にツベルクリン感受性であるならば、より高い力価の抗体を得ることができる。ヒトのワクチンの場合には、英国および他の多くの国において、市民は、BCGワクチン接種を決まりきって受けるので、大いにPPD感受性である。従って、PPDは、これらの国において使用するのに好ましい担体である。
ポリペプチドを担体に結合させる様式は、結合すべき物質の性質に依存するであろう。例えば、担体中のリジン残基を、N-γ-マレイミドブチリルオキシ-サクシンイミドで処理することにより、ポリペプチド中のＣ−末端または他のシステイン残基に結合させることができる（Kitagawa, T. & Ackawa, T.（1976）J. Biochem. 79, 233）。あるいは、担体中のリジン残基を、イソブチルクロロホルメートを用いて、ペプチド中のグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基に結合させることができる（Thorell, J.I. De Larson, S.M.（1978）Radioimmunoassay and related techniques: Methodology and clinical applications, p.288）。他の結合反応および試薬は、文献に記載されている。
ポリペプチドは、単独でまたは担体分子に結合して、従来のアジュバント（例えば水酸化アルミニウムまたはフロイントの完全または不完全アジュバント）および／または他の免疫増強剤と共にまたはこれら無しで、任意の経路（例えば非経口、鼻内、経口、直腸内、膣内）により投与することができる。本発明は、例えばリポゾーム（Allison, A.C. & Gregoriadis, G.（1974）Nature（London）252, 252）を含むか、または乳酸とグリコール酸との共重合体から製造された生体分解可能なマイクロカプセル（Gresser, J.D. and Sanderson, J.E.（1984）in”Biopolymer Controlled Release Systems”pp 127-138, Ed. D.L. Wise）を含む皮下インプラントまたはデポー剤のような徐放性形態の本発明に係るポリペプチドの製剤を包含する。
本発明に係るポリペプチドは、単独でまたは適切な担体分子に結合して、次のものとして使用することができる：
（a）  例えば患者または動物からの血清のアッセイにおけるリガンドとして；
（b）  予防に使用するためのペプチドワクチン；
（c）  例えばポリペプチドに対して生成した抗体の結合レベルを調べる際の質コントロール剤として；
（d）  適正な動物の免疫によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための抗原性物質として、これらの抗体は、（i）プリオンタンパク質の科学的研究のため、（ii）例えば免疫組織化学的試薬の一部としての診断剤として、（iii）脳障害の処置剤として、または他の剤と組み合わせて、動物または患者を受動免疫するために、（iv）他の物質（このような他の物質は、共有結合しているか、あるいは例えばこのような物質を含有し、かつ任意の抗原性ポリペプチドに対して生成した抗体を組み込んでいるリポゾーム内などで会合している）を、プリオンタンパク質を含む領域に集中させる手段として、および（v）抗−イディオタイプ抗体を生成するための免疫原として使用するため；このような抗−イディオタイプ抗体はまた、本発明の一部を形成する。本発明は、本ポリペプチドに対して生成した抗体の遺伝子工学的に処理した形態またはサブ成分、特にＶH領域、並びに文献に記載された技術を用いて、他の動物内で本ポリペプチドに対して最初に生成した抗体のヒツジ化形態、ウシ化形態またはヒト化形態の前記のような遺伝子工学的処理形態またはサブ成分のため；および
（e）  プリオンタンパク質のヒト細胞または動物細胞への結合を置換するか、またはタンパク質のインビボでの３次元的構築を妨害することによる、脳障害の処置；並びにプリオンタンパク質のインビトロでの科学的研究の補助のために提供される。
プリオンタンパク質またはプリオンタンパク質に対して生成した抗体の検出および診断に関し、当業者には、この分野で公知の種々の免疫アッセイ技術、特にサンドイッチアッセイ、競合的アッセイ、非競合的アッセイ、直接および間接の標識の使用等が判明しているであろう。
本発明の更なる態様は、本発明に係る少なくとも１つの合成ポリペプチドを含む、プリオンタンパク質またはプリオンタンパク質に対して生成した抗体を検出するためのキットを提供する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、このような抗体のヒト化形態（例えばThompson K.M. et al（1986） Immunology 58, 157-160参照）、単一ドメイン抗体（例えばWard, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P. and Winter, G.（1989）Nature 341, 544-546参照）、および血液−脳障壁を越えるかもしれず、本発明に係る合成ポリペプチドと特異的に結合する抗体の製造は、従来の手段により行なうことができ、このような抗体は、本発明の一部を形成するものと考えられる。本発明に係る抗体は、特に、哺乳動物の組織または体液のサンプルを、本明細書に記載した抗体のある量と共にインキュベートし、そして前記のサンプルと前記の抗体との間で交叉反応が起きるかどうかを測定し、そして所望により、この交叉反応が起きる程度および／または速度を測定することからなる、哺乳動物の脳障害の診断方法に使用される。前記の抗体の少なくとも１つを含む診断キットもまた、本発明の一部を形成する。
本発明のもう一つの態様は、哺乳動物の脳障害の治療または予防および／または哺乳動物の免疫系の刺激および／またはプリオンタンパク質の細胞結合または凝集のブロッキングに使用するための合成ポリペプチド、並びにこのような用途に適する医薬を製造するための合成ポリペプチドを提供する。また、活性成分として、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド−担体結合体の少なくとも１つを、１種または２種以上の製剤上許容されるアジュバント、担体および／または賦形剤と一緒に含有する製剤組成物も包含される。これらの組成物は、経口投与、直腸内投与、鼻内投与または特に非経口投与（中枢神経系内投与を含む）のために処方することができる。
本発明は更に、前記で定義したポリペプチドのある量を、単独でまたは脳障害を処置するための他の薬剤と組み合わせて投与することからなる、哺乳動物の脳障害を治療または予防する方法および／または哺乳動物の免疫系を刺激する方法および／またはプリオンタンパク質の細胞結合または凝集をブロッキングする方法を提供する。
PrPcが正常検体に認められ、PrPcおよびPrPscの両者は罹患検体に認められるので、天然のPrPcとPrPscとを識別することは、著しく望ましい。我々は、本発明に係るペプチド配列、好ましくは領域Ａ、ＢおよびＣに関連する配列、およびこれらの重要なサブフラグメントを、天然PrPcと感染PrPscとを識別するのに使用できることを見出した。また、これらのペプチド配列およびサブフラグメントに対して生成した抗体、並びにこのようなペプチド配列およびサブフラグメントをコードするヌクレオチド配列も、PrPcとPrPscとを識別するのに使用することができる。従って、本発明は、サンプルを、本発明に係るペプチド配列、好ましくは領域Ａ、ＢおよびＣに関連する配列およびこれらの重要なサブフラグメント、これらの配列およびサブフラグメントに対して生成した抗体から選ばれた物質と接触させ、そしてPrPscの存在または不在を決定することからなる、PrPcとPrPscとを識別する方法を提供する。
ある場合には、サンプルの前処理により、例えば酵素、例えばプロテイナーゼＫで前消化するか、または強アルカリ、例えば6Mグアニジン塩酸塩で変性させるか、またはこのような処理を組み合わせることにより、識別を増強することができる。
試験される検体に関連するペプチド配列、抗体およびヌクレオチド配列、例えばウシのためのウシの配列または抗体、ヒツジのためのヒツジの配列および抗体の使用が好ましいであろう。
（i）２種類以上の担体分子に結合させた所定の類似体、および／または（ii）同じ担体分子に結合させた２種類以上の類似体を含有するカクテルで免疫することが有利な場合がある。更に、任意のペプチド類似体、それらの結合体およびそれらのカクテルを、好適なアジュバント系または放出系にて投与することができ、そして２つ以上のアジュバント系または放出系を組み合わせて、いわゆる“スーパーカクテル”を形成できる。好ましいアジュバントおよび放出系としては、水酸化アルミニウム（alum）、リポゾーム類、ミセル類、ニオゾーム類、ISCOMS、ブラウンのリポタンパク質、および微生物による動物ワクチンの全細胞または成分が挙げられる。
実施例１
Ｃ−末端Ｙの延長部が、本発明によるGly-Cysである式IIの好ましいウシの形態（Seq. I.D. No: 41）Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg-Gly-Cys（Seq. I.D. No: 7に関連）は、標準的な固相Fmoc方法を用いて合成される。このペプチドをトリフルオロ酢酸の存在下で樹脂から切り離し、次いでゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。このペプチドを、公知のヘテロ−２官能性試薬であるMBS（m-マレイミド-ベンゾイル-N-ヒドロキシサクシンイミドエステル）により、種々の担体に結合させる。
担体の例としては、Ｂ細胞エピトープに必要な免疫強化特性を与えることが示されているKLH、BSAおよびTTが挙げられる。
ペプチド担体結合物をフロイントの完全アジュバント中で乳濁化し、マウスに筋肉内投与する。続く追加免疫注射は、フロイントの不完全アジュバント中の液として与える。
確実な血清抗体応答を、BSAに結合した固定化抗原（式II）、試験される血清サンプルおよび酵素で標識した抗−マウス抗体を用いて、酵素免疫アッセイ（ELISA）により、免疫スケジュールの間中モニターする。
この実施例では、抗−式II抗体を産生させるのに最適なプロトコールを決定するために、担体、アジュバントおよびデリバリシステムの使用、および追加免疫注射を行う。
実施例２
式IIに対する抗体は、血清中、血清中の“細胞担体（cell carriers）”中、および感染した動物種の組織バイオプシー中にプリオンタンパク質が存在するかどうかをアッセイするための診断試薬として用いられる。
抽出されたプリオンタンパク質の存在は、直接の酵素免疫アッセイ（ELISA）によって、このタンパク質を固体基質上に固定化することにより検出することができる。式IIに対して生じさせたマウス抗血清と天然プリオンタンパク質との反応は、酵素で標識した抗−マウス抗血清を用いて検出される。この反応は、好適な基質の添加および生じた色の光学密度の読み取りにより定量化される。
更に、組織バイオプシー中のプリオンタンパク質の免疫組織化学的診断は、抗−式II抗体とパラフィンワックス埋め込み組織または凍結組織との反応により行なうことができる。反応は、標準的な間接的免疫パーオキシダーゼ技術を用いて検出できる。
実施例３
物質および方法
ペプチドの合成
下記のペプチドを、標準的な固相Fmoc方法を用いて合成した。
0004233604.tif 000035
（式IIの好ましいヒツジのサブフラグメント）
0004233604.tif 000036
（式IIの好ましいウシのサブフラグメント）
0004233604.tif 000037
（式IIIの好ましいヒツジの配列（p8, ln 30-32））
0004233604.tif 000038
（式IIIの好ましいウシの配列（p8, ln 26-28））
0004233604.tif 000039
（式Ｖｂの好ましいヒツジ／ウシの配列）
0004233604.tif 000040
（式Ｖｃの好ましいヒツジの配列）
0004233604.tif 000041
（式VIIIｂの好ましいヒツジ／ウシの配列）
0004233604.tif 000042
（式VIIIａの好ましいヒツジの配列）
0004233604.tif 000043
ペプチドＩ、II、ＢII、III、ＢIII、Ｖａ、Ｖｂ、ＶｃおよびVIIIａを、本発明によるＣ−末端延長により合成した。これらのペプチドを、トリフルオロ酢酸の存在下で樹脂から切り離し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。全てのペプチドは、85%以上の純度を有していた。
ペプチドのオボアルブミンへの結合
ペプチドを、それらのＣ−末端（ペプチドII、ＢII、III、ＢIII、ＶｂおよびＶｃ）、またはＮ−末端（ペプチドVIIIｂ）のCys残基を介して結合させた。ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して10mg/mlの濃度にした。前活性化したオボアルブミン（Pierce, Imject Kit）を蒸留水１ml中に再懸濁し、等容量の前活性化オボアルブミンとペプチドとを混合し、この溶液を室温で３時間放置した。結合物を燐酸塩緩衝食塩水（PBS）に対して一昼夜透析して、DMSOおよび未結合ペプチドを除去した。
Ellmannのアッセイを用いて遊離チオール含有量を測定し、そしてSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により結合物の分子量の増加をモニターすることにより、結合の程度を決定した。
ウサギ抗血清の産生
２匹の雌性ニュージーランド白色ウサギ内で、それぞれのペプチド結合物に対して抗血清を生じさせた。各ウサギは、一次接種および追加免疫の両方のために、40μgに等しい量の結合物を投与された。各ウサギには、次のように注射した。
0日目：フロイントの完全アジュバント中の結合物（1:1 v/v）を筋肉内注射。
21日目：フロイントの不完全アジュバント中の結合物（1:1 v/v）を筋肉内注射。
31日目：結合物それ自体を腹腔内注射。
41日目に動物から瀉血し、ELISA（コーティング抗体として遊離ペプチドを使用）により、血清を抗−ペプチド抗体についてアッセイした。これらの血清は、脳ホモジネートからのタンパク質を認識できるかどうかを調べるために、免疫ブロットアッセイおよびドットブロットアッセイにも使用した。
脳ホモジネートの調製
スクラピー非感染脳物質は、検疫所のニュージーランドヒツジの群れから得られた。
スクラピー感染脳物質は、農業部から得られ、スクラピーに感染していることが組織病理学的に診断された。
BSE感染脳物質は、政府農業部を介して得られ、BSEに感染していることが組織病理学的に診断された。
BSE非感染物質は、私的ソースから得られた。
Ha27-30は、高レベルのスクラピー感染性物質を含有することが示されている近交（inbred）ハムスタースクラピーモデルから得られた。これは、陽性コントロールとして用いられた。
感染脳および非感染脳の少量のサンプルを秤量し、25 mM Tris-HCl pH7.4（ホモジナイズ緩衝液）中のSarkosylの10%（v/v）溶液中で、10%（w/v）ホモジネートにした。このホモジネートを４℃で30分間インキュベートし、次いで6000 ｘ gで30分間遠心した。上澄み液を回収し、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いてタンパク質含有量を測定した。ホモジナイズ緩衝液でタンパク質濃度を３ mg/mlに調整した。
ELISA（酵素結合免疫ソーベントアッセイ）
PBS中の遊離タンパク質の８μM溶液を、コーティング抗原として用いた。各ウェルに抗原濃度が50μlになるように添加し、次いで37℃で１時間インキュベートして結合を生じさせることにより、マイクロタイタープレートをコーティングした。各ウェルを、0.05％のTween 20を含有するPBS 300μlで２分間５回洗浄した。洗浄後、0.3％のTween 20および３％の脱脂乳を含有するPBSと共に37℃で１時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。PBS中で希釈した一次抗体（即ち、抗血清）50μlのアリコートを適切なウェルに加え、プレートを37℃で１時間インキュベートした。プレートを前記のように洗浄し、次いでPBS中希釈率1:1000のホースラディッシュ（Horseradish）パーオキシダーゼ結合ブタ抗−ウサギ免疫グロブリン（抗Ig/HRP）と共に37℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、各ウェルに50μlのOPD（クエン酸塩緩衝液中のO-フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質（10mg/ml））を加え、硫酸の添加により反応を停止する前に、室温で10分間反応を進行させた。各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダーを用いて492nmで測定した。背景の光学密度（OD）の読み取りの３倍以上の陽性の光学密度読み取りを与えた希釈率として、力価を記録した。背景は、抗原でコーティングされていないウェルからのOD読み取りとみなした。
脳ホモジネート中のPrPのドットブロット検出
前記のようにして調製した脳ホモジネートを、PBS中で10倍に希釈し、100μlのホモジネート（総タンパク質30μg含有）を、BRL 96ウェル真空マニホールドを用いて、ニトロセルロースフィルターに施した。フィルターを室温で１時間乾燥した。次いでフィルターを、TBST（10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20）で湿らせて、免疫ブロットで説明したようにしてPrPを検出するか、あるいはタンパク質サンプルを更に処理した。サンプルのこの更なる処理には、TBST中のプロテイナーゼＫ 100μg/mlを用いてフィルター上のタンパク質を室温で90分間消化することが含まれていた。PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）をTBST中の濃度が5mMになるように加えて、プロテイナーゼＫを不活性化た。タンパク質の消化後、5 mM PMSF含有6MグアニジンHCl中で１０分間フィルターをインキュベートすることにより、幾つかのサンプルを変性させた。一次抗体と共にインキュベートする前に、TBSTで３回洗浄することにより、グアニジンを除去した。
免疫ブロット（ウェスタンブロット）
前記のようにして調製した脳ホモジネートについて、標準的技術を用いてSDS-PAGEを行なった。ゲル内のサンプルを、Towbin Buffer（25 mM Tris, 190 mMグリシンおよび0.1% SDS）を用いて、Bioradトランスブロットのニトロセルロース上に70mAにて一昼夜で移行させた。ニトロセルロースフィルターを、５％脱脂乳を用いて室温で30分間ブロックした。TBST中で希釈した一次抗体（即ち、抗血清）を、室温で３時間施し、フィルターをTBST中で10分間３回洗浄し、1:2000の希釈率で希釈したアルカリホスファターゼ−結合ブタ抗−ウサギ免疫グロブリンと共に、フィルターを室温で２時間インキュベートした。洗浄後、NBT/BCIP（ニトロ−ブルーテトラゾリウム；5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート）基質（Boeringer Mannheim）を用いてタンパク質バンドを検出した。
結果
１）抗体の力価：  力価のレベルは大きく変動するが、全ての場合に、ペプチドに対する良好な抗体の力価が得られた。最高の力価を与えたペプチドは、ドットブロットにおいても最良の結果を与えた。
２）ドットブロットデータ：  非感染組織は、正常プリオンタンパク質（PrPc）のみを含むものと予想される。感染組織は、PrPの正常形態および罹患（PrPsc）形態の両方を含むものと予想される。
PrPcは、約33〜35kDの分子量を有する。PrPscは、約27〜30kDの分子量を有し、PrPc形態には存在しているＮ−末端セグメントが欠如している。これ以外は、PrPscのアミノ酸配列はPrPcの配列と全く同一である。PrPscの最も重要な特徴は、多分、非特異タンパク質消化酵素の一つであるプロテイナーゼＫによる酵素分解に対する耐性である。
タンパク質サンプルをプロテイナーゼＫで処理すると、どのPrPcも完全に消化されるはずである。従って、PrPcだけを含むサンプルでは、プロテイナーゼＫ処理後には、どの形態のPrPも残らないだろう。しかし、PrPcおよびPrPscを含むサンプル（即ち、罹患サンプル）では、処理後にPrPscが残るだろう。
PrPscを認識する現在利用可能な抗体はあるが、これらの抗体は変性したタンパク質だけを認識する。従って、プロテイナーゼＫ処理後、ドットブロット試験のサンプルを、変性剤としてのグアニジンHClで処理した結果、このような抗体を、PrPscの検出のために使用することができた。
そのデータを表Ｉ〜Ｖに示す。
ペプチドII：
良好な力価。ドットブロットは、何らかの識別が生じていることを示しているようである。陰性の結果は、ウェスタンブロットから得られた。
ペプチドIII：
適度の力価。プロテイナーゼＫおよびグアニジンで処理したサンプル中には、非特異的な（恐らく、非タンパク質の）成分の認識があるかもしれない。陰性の結果は、ウェスタンブロットから得られた。
ペプチドＶb：
良好な力価。何らかの識別が生じているかもしれないようであるが、Ｖbペプチドは実際に、PrPscには欠如しているＮ−末端領域内で生じる。従って、プロテイナーゼＫおよびグアニジンで処理した感染性物質における認識があるとは予想されないだろう。しかし、一つの可能な説明は、感染性物質中に存在するPrPcが、プロテイナーゼＫによって完全には消化されていないということである。陰性の結果は、ウェスタンブロットから得られた。
ペプチドＶc：
優れた力価。これらの結果は、全く予想したとおりである。前記のように、PrPscを認識する抗体は、一般にタンパク質をその変性した形態でのみ認識する。感染サンプルおよび非感染サンプル、並びにPrPscおよび／またはPrPcをそれらの“生得の（native）”形態で含有するサンプルはまた、細胞内での天然タンパク質のターンオーバーによる種々の変性段階にある両方のPrP形態をも含有するであろう。この理由のため、抗体は三つの全ての未処理サンプルを検出するものと予想される。しかし、プロテイナーゼＫ処理はPrPcを消化し、部分的に変性されたPrPscは全てのサンプルにおいて抗体認識の低下を来すであろう（抗体が変性PrPだけを認識すると推定して）。グアニジンの添加は、最初にPrPscを含有していた物質中での抗体認識を回復させるはずである。ウェスタンブロットは、正しい分子量において予想したタンパク質バンドを示した。
ペプチドVIIIｂ：
適度の力価。非特異的成分の認識があるかもしれない。陰性の結果は、ウェスタンブロットから得られた。
ペプチドＢII&ＢIII
力価は適度であり、未処理の正常ウシ脳物質および感染ウシ脳物質から、強い陽性の結果が生じる。
要約すると、全ての場合に、良好な抗−ペプチド力価が得られ、ウェスタンブロットはペプチドＶcの場合にのみ良く機能し、このペプチドはまた最高の力価を与え、そしてドットブロットは、ペプチドＶcについて、PrPcとPrPscとの間に、ある識別が生じていることを示している。ペプチドIIからのデータも、識別が生じていることを示唆している。
0004233604.tif 000044
0004233604.tif 000045
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配列のリスト
５１個の配列
（1）Seq. I.D. No：1の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：1
0004233604.tif 000049
（2）Seq. I.D. No：2の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：2
0004233604.tif 000050
（3）Seq. I.D. No：3の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：3
0004233604.tif 000051
（4）Seq. I.D. No：4の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：4
0004233604.tif 000052
（5）Seq. I.D. No：5の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：5
0004233604.tif 000053
（6）Seq. I.D. No：6の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：6
0004233604.tif 000054
（7）Seq. I.D. No：7の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：7
0004233604.tif 000055
（8）Seq. I.D. No：8の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：8
0004233604.tif 000056
（9）Seq. I.D. No：9の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：9
0004233604.tif 000057
（10）Seq. I.D. No：10の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：10
0004233604.tif 000058
（11）Seq. I.D. No：11の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：11
0004233604.tif 000059
（12）Seq. I.D. No：12の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：12
0004233604.tif 000060
（13）Seq. I.D. No：13の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D No：13
0004233604.tif 000061
（14）Seq. I.D. No：14の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：14
0004233604.tif 000062
（15）Seq. I.D. No：15の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：15
0004233604.tif 000063
（16）Seq. I.D. No：16の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：16
0004233604.tif 000064
（17）Seq. I.D. No：17の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：17
0004233604.tif 000065
（18）Seq. I.D. No：18の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：18
0004233604.tif 000066
（19）Seq. I.D. No：19の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：19
0004233604.tif 000067
（20）Seq. I.D. No：20の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：20
0004233604.tif 000068
（21）Seq. I.D. No：21の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：21
0004233604.tif 000069
（22）Seq. I.D. No：22の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：22
0004233604.tif 000070
（23）Seq. I.D. No：23の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：23
0004233604.tif 000071
（24）Seq. I.D. No：24の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：24
0004233604.tif 000072
（25）Seq. I.D. No：25の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２８個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：25
0004233604.tif 000073
（26）Seq. I.D. No：26の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：26
0004233604.tif 000074
（27）Seq. I.D. No：27の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：27
0004233604.tif 000075
（28）Seq. I.D. No：28の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２８個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：28
0004233604.tif 000076
（29）Seq. I.D. No：29の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：29
0004233604.tif 000077
（30）Seq. I.D. No：30の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：30
0004233604.tif 000078
（31）Seq. I.D. No：31の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：31
0004233604.tif 000079
（32）Seq. I.D. No：32の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：32
0004233604.tif 000080
（33）Seq. I.D. No：33の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：33
0004233604.tif 000081
（34）Seq. I.D. No：34の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：34
0004233604.tif 000082
（35）Seq. I.D. No：35の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：35
0004233604.tif 000083
（36）Seq. I.D. No：36の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：36
0004233604.tif 000084
（37）Seq. I.D. No：37の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：37
0004233604.tif 000085
（38）Seq. I.D. No：38の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：５個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：38
0004233604.tif 000086
（39）Seq. I.D. No：39の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：39
0004233604.tif 000087
（40）Seq. I.D. No：40の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：40
0004233604.tif 000088
（41）Seq. I.D. No：41の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：41
0004233604.tif 000089
（42）Seq. I.D. No：42の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：42
0004233604.tif 000090
（43）Seq. I.D. No：43の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：43
0004233604.tif 000091
（44）Seq. I.D. No：44の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：44
0004233604.tif 000092
（45）Seq. I.D. No：45の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２７個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：45
0004233604.tif 000093
（46）Seq. I.D. No：46の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：46
0004233604.tif 000094
（47）Seq. I.D. No：47の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：47
0004233604.tif 000095
（48）Seq. I.D. No：48の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：48
0004233604.tif 000096
（49）Seq. I.D. No：49の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２８個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：49
0004233604.tif 000097
（50）Seq. I.D. No：50の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：50
0004233604.tif 000098
（51）Seq. I.D. No：51の情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９個のアミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：Seq. I.D. No：51
0004233604.tif 000099