(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式  化１
0004304732.tif 000010
[式中、Ｒ1は水素原子を表し、Ｒ2およびＲ3は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基、ベンジル基またはＣ１−Ｃ６アシル基を表し、nは0を示す。］で示されるベンゾ[b]チオフェン化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
有効成分として、一般式  化１で示されるベンゾ[b]チオフェン化合物またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤。
【請求項３】
有効成分として、一般式  化２
0004304732.tif 000011
[式中、Ｒ6およびＲ7は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基またはベンジル基を表す。]で示されるベンゾ[b]チオフェン誘導体またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤。
【請求項４】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が水素原子、nが0である、請求項１記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項５】
有効成分として、請求項４記載の化合物またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤。
【請求項６】
Ｒ６およびＲ７が水素原子である、請求項３記載のエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はベンゾチオフェン誘導体およびその塩、ならびに有効成分としてベンゾチオフェン誘導体、ベンゾピラン誘導体、またはその塩を含むエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
エストロゲンレセプターは子宮、膣、輸卵管、肝臓、下垂体、血管、骨等の組織中のエストロゲンの標的細胞に存在し、エストロゲンと結合すると活性化されて、特定の遺伝子に依存するタンパク質の合成を惹起することが知られている。また、血中エストロゲン濃度が減少すると種々の疾患が誘起されることも知られており、例えば、閉経後女性においては骨粗鬆症、ホットフラッシュ、心血管系疾患などの閉経後症候群が問題となっている。このような血中エストロゲン濃度の低下に伴う疾患の治療のため、欧米においてはエストロゲンを投与するホルモン補充療法が実施され、効果をあげているが、一方でエストロゲン投与によりエストロゲン依存性の子宮内膜癌、乳癌等の発生率が高まるといわれ、治療を困難にしている。
最近、エストロゲンレセプターに於いて、従来のαアイソフォームとは別異のβアイソフォームが発見され（Proc. Natl. Acad. Sci. USA  第93巻、5925〜5930(1996)）、各々のレセプターに異なる役割が存在する可能性が示唆された。このような知見の基に、αアイソフォームとβアイソフォームに対し異なる親和性を示し、一方のアイソフォームを選択的に活性化する薬剤を開発することにより、他方のアイソフォームを活性化することによって生じ得る望ましくない作用の軽減の可能性があることから、エストロゲンレセプターに対してアイソフォーム選択的に活性化作用を示す物質の探索が切望されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、ある種のベンゾチオフェン誘導体およびベンゾピラン誘導体化合物が、エストロゲンレセプターβアイソフォームに対し選択的に活性化作用を示すことを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１）一般式  化５
【化５】
0004304732.tif 000002
[式中、Ｒ1は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいフェノキシ基、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシカルボニル基、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基、ベンゼン環上に置換基を有していてもよいフェニルチオ基、置換されていてもよい２、３、もしくは４−ピリジル基、置換されていてもよい２もしくは３−フリル基、置換されていてもよい２もしくは３−チエニル基または置換されていてもよい２もしくは３−ピロリル基を表し、
Ｒ2およびＲ3は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基、ベンジル基、Ｃ３−Ｃ６アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６アルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、−ＣＯＮ（Ｒ4）Ｒ5基または−ＣＨ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）ＣＯＮ（Ｒ4）Ｒ5基（ここで、Ｒ4およびＲ5は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基またはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基を表す）を表し、nは0から2の整数を示す。］
で示されるベンゾ[b]チオフェン化合物（以下、本発明化合物と記す。）および本発明化合物の医薬上許容される塩、
２）有効成分として、本発明化合物またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤、
３）有効成分として、一般式  化６
【化６】
0004304732.tif 000003
[式中、Ｒ6およびＲ7は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、−ＣＯＮ（Ｒ8）Ｒ9基（ここでＲ8およびＲ9は同一または相異なり、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキル基を表す。）、ベンジル基またはベンゾイル基を表す。]で示されるベンゾ[b]チオフェン誘導体またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤、
４）有効成分として、一般式  化７
【化７】
0004304732.tif 000004
[式中、Ｒ14およびＲ15は同一または相異なり、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、−ＣＯＮ（Ｒ16）Ｒ17基（ここでＲ16およびＲ17は同一または相異なり、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキル基を表す。）、ベンジル基またはベンゾイル基を表す。]で示されるベンゾピラン誘導体またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤、
５）一般式  化８
【化８】
0004304732.tif 000005
[式中、Ｒ14およびＲ15は同一または相異なって水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、−ＣＯＮ（Ｒ16）Ｒ17基（ここでＲ16およびＲ17は同一または相異なり、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキル基を表す。）、ベンジル基またはベンゾイル基を表す。]で示されるベンゾピラン誘導体またはその医薬上許容される塩を含有するエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤を提供する。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明化合物において、
Ｒ1で示される
ハロゲン原子とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味し、
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基としては、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基としては、トリフルオロメトキシ基、ブロモジフルオロメトキシ基、１−フルオロエトキシ基、１−クロロエトキシ基、１−ブロモエトキシ基、パーフルオロエトキシ基、２−ブロモ−１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ基、１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ基、２−クロロ−１，１，２−トリフルオロエトキシ基、２−ブロモ−１，１，２−トリフルオロエトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、２，２，２−トリクロロエトキシ基、２，２，２−トリブロモエトキシ基、２−フルオロエトキシ基、２−クロロエトキシ基、２−ブロモエトキシ基、２−ヨードエトキシ基、２，２−ジフルオロエトキシ基、２，２−ジクロロエトキシ基、２，２−ジブロモエトキシ基、３−フルオロプロピルオキシ基、３−クロロプロピルオキシ基、３−ブロモプロピルオキシ基、３−ヨードプロピルオキシ基、３，３，３−トリフルオロプロピルオキシ基、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピルオキシ基、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピルオキシ基、２−フルオロプロピルオキシ基、２−クロロプロピルオキシ基、２−ブロモプロピルオキシ基、２−ヨードプロピルオキシ基、２，３−ジブロモプロピルオキシ基等があげられ、
Ｃ２−Ｃ６アルケニル基としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、３−ブテニル基、２−ブテニル基、３−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−３−ブテニル基等があげられ、
Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基としては、２−クロロ−２−プロペニル基、３，３−ジクロロ−２−プロペニル基等があげられ、
Ｃ２−Ｃ６アルキニル基としては、エチニル基、２−プロピニル基、３−ブチニル基等があげられ、
Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基としては、３−ブロモ−２−プロピニル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基等があげられ、
置換されていてもよいフェニル基としては、４−ヒドロキシフェニル基、２，４−ジヒドロキシフェニル基、４−メトキシフェニル基等があげられ、
置換されていてもよいフェノキシ基としては、４−ヒドロキシフェノキシ基、２，４−ジヒドロキシフェノキシ基、４−メトキシフェノキシ基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシカルボニル基としては、２，２，２−トリクロロエチルカルボニル基等があげられ、
ベンゼン環上に置換基を有していてもよいフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基としては、ベンジル基、４−メトキシベンジル基等があげられ、
ベンゼン環上に置換基を有していてもよいフェニルチオ基としては、フェニルチオ基、４−メトキシフェニルチオ基等があげられ、
置換されていてもよい２，３，または４−ピリジル基としては、２−ピリジル基、４−ヒドロキシ−２−ピリジル基、４−メトキシ−２−ピリジル基、４−クロロ−２−ピリジル基等があげられ、
置換されていてもよい２または３−フリル基としては、２−フリル基、４−メチル−２−フリル基、２−(５−ヒドロキシ)フリル基、２−(５−メトキシ)フリル基などがあげられ、
置換されていてもよい２または３−ピロリル基としては、２−ピロリル基、２−(４−メチル)ピロリル基、５−ヒドロキシ−２−ピロリル基等があげられ、
【０００５】
Ｒ2およびＲ3で示される
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基としては、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ６アルケニル基としては、アリル基、イソプロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、３−ブテニル基、２−ブテニル基、３−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−３−ブテニル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ６ハロアルケニル基としては、２−クロロ−２−プロペニル基、３，３−ジクロロ−２−プロペニル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ６アルキニル基としては、２−プロピニル基、３−ブチニル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ６ハロアルキニル基としては、３−ブロモプロパルギル基等があげられ、
Ｃ１−Ｃ６アシル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基等があげられ、
【０００６】
Ｒ4およびＲ5で示される
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等があげられる。
【０００７】
一般式  化６で示される化合物において、
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9で示されるＣ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｒ6およびＲ7で示されるＣ１−Ｃ６アシル基としては、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基等があげられる。
【０００８】
一般式  化７で示される化合物において、
Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13で示されるＣ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｒ10およびＲ11で示されるＣ１−Ｃ６アシル基としては、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基等があげられる。
【０００９】
一般式  化８で示される化合物において
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16およびＲ17で示されるＣ１−Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基等があげられ、
Ｒ14およびＲ15で示されるＣ１−Ｃ６アシル基としては、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基等があげられる。
【００１０】
次に、一般式  化５、化６および化７で示される化合物を製造する方法について説明する。
化５、化６および化７で示される化合物は以下のスキームに従って合成できる。
【００１１】
0004304732.tif 000006
［式中Ｒ18およびＲ19は同一または相異なり、フェノール性水酸基の保護基を表す。ここで、フェノール性水酸基の保護基としては、メチル基、ベンジル基、tert−ブチル基、tert−ブチルジメチルシリル基などがあげられる。］
【００１２】
即ち、特公昭６１−３４３の記載に準じ、適当な３−アルコキシベンゼンチオール（例えば３−メトキシベンゼンチオール）と２−ブロモ−４’−アルコキシアセトフェノン（例えば２-ブロモ−４’−メトキシアセトフェノン）をピリジン中で加熱（還流）すると３−アルコキシフェニルチオ−４’−アルコキシアセトフェノンが得られる。この３−アルコキシフェニルチオ−４’−アルコキシアセトフェノンをポリリン酸中、室温〜120℃で環化反応を行い、得られた異性体をシリカゲル等クロマトグラフィーで分離・精製することにより、４−アルコキシ−３−(４−アルコキシフェニル）ベンゾ[b]チオフェン、６−アルコキシ−３−(４−アルコキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン、および６−アルコキシ−２−(４−アルコキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェンが得られる。
【００１３】
４−アルコキシ−３−(４−アルコキシフェニル）ベンゾ[b]チオフェン誘導体の２位に置換基を導入する場合は、特開平９―１８３７７６記載の方法に準じ、まず次に示すスキームのようにして２位にヨウ素を導入し、次いで、該ヨード体から以下のようにして各種誘導体に導くことができる。
【００１４】
0004304732.tif 000007
ここでＲ18およびＲ19はベンジル基、tert−ブチルジメチルシリル基などの適当な保護基を示す。
【００１５】
該ヨード体をアルキルリチウム、アルケニルリチウム、アルキニルリチウムまたはフェニルリチウム（例えばメチルリチウム等）と置換反応させることにより２−アルキル体、２−アルケニル体、２−アルキニル体または２−フェニル体が得られる。
同様にアルコキシ（メトキシ, エトキシ, またはプロポキシなど）ナトリウムと置換反応させることにより、2-アルコキシ体が得られる。
酢酸ナトリウムと反応させると、2-アセトキシ体が得られ、これを加水分解すると2-ヒドロキシ体が得られる。
シアン化カリウムと反応させると2-シアノ体が得られる。シアノ基を官能基変換すると2-カルボン酸体が得られる．2-カルボン酸体を酸クロリドに置換後、メタノール、エタノールなどアルコールと反応すると2-カルボン酸エステル体（2-アルコキシカルボニル体）が得られる。
【００１６】
一般式  化８に示される化合物は、既知化合物ダイゼインのジメチルエーテル体を、Ｐ2Ｓ5やLawesson試薬を用いてカルボニル基をチオカルボニル基に変換後、脱メチル化反応に処すことにより得られる。
【００１７】
一般式  化５、化６、化７および化８で示される化合物の例をそれぞれ次式に示す。
【００１８】
0004304732.tif 000008
一般式  化５、化６、化７もしくは化８に示される化合物またはその医薬上許容される塩はエストロゲンレセプターβアイソフォームに対して選択的なエストロゲン作用を有し、血中エストロゲン濃度の減少に伴う疾患の治療剤として有用である。
【００１９】
一般式  化５、化６、化７もしくは化８で示される化合物またはその医薬上許容される塩を医薬または獣医用治療薬として用いる場合、薬学上慣用の製剤方法によって適当な製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、坐剤など）とする。これらの剤形の製剤化には、通常知られた方法が適用され、例えば、各種の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、等張化剤等を含有していてもよい。その投与方法については必ずしも制限はなく、経口投与、静脈注射、筋肉内注射、静脈内点滴、直腸内投与などの方法で使用する。投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、通常０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与範囲で、１日１〜数回または隔日もしくは数回おきに１回の範囲で投与する。ただし、必要に応じて適宜増減し得る。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例および試験例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１［4-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン（化合物１）および6-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン（化合物２）の製造］
フラスコに3-メトキシベンゼンチオール（1.50g, 10.7mmol）、2-ブロモ-4'-メトキシアセトフェノン（2.45g, 10.7mmol）およびピリジン6mlを加え、約9時間加熱還流した。反応液を冷却後、冷2N硫酸25mlを加え、酢酸エチル25mlで2回抽出し、有機層を2N硫酸20mlで1回、飽和食塩水25mlで2回洗浄した。次に、この有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を溜去して残渣2.78gを得た。これをシリカゲル（54g）カラムクロマトグラフィーで精製し、3-メトキシフェニルチオ-4'-メトキシアセトフェノン0.812 gを得た（収率；26.3%）。
フラスコに3-メトキシフェニルチオ-4'-メトキシアセトフェノン0.204 g（0.707 mmol）およびポリリン酸2.0 g（P2O5分として75%）を入れ、室温（27℃）で35分間攪拌した。次いで、この反応液に氷水20 mlを加え、酢酸エチル20 mlで2回抽出した。この有機層を飽和食塩水20 mlで2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を溜去して残渣0.2 gを得た。これをシリカゲル分取ＴＬＣに供し（展開液；ヘキサン-酢酸エチル, 3/1（v/v））Rf=0.65のバンドをかき取り、酢酸エチルで溶出した後、溶媒を溜去し、6-メトキシ-3-(4-メトキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェンおよび4-メトキシ-3-(4-メトキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェンの混合物80 mgを得た（収率；40%）。
フラスコに該混合物41 mg（0.151 mmol）、乾燥二塩化エチレン0.1 mlを入れ、0℃まで冷却して3臭化ホウ素0.06 mlを加え、0℃で1.5時間攪拌した後、さらに室温で1時間攪拌した。次に反応液に水15 mlを加え、酢酸エチル15 mlで2回抽出し、有機層を飽和食塩水で2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を溜去して残渣45 mgを得た。この残渣をシリカゲル分取ＴＬＣに供し（展開液；ヘキサン-酢酸エチル, 2/1(v/v)）、Rf=0.4のバンドをかき取り、酢酸エチルで溶出した後、溶媒を溜去し、６-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン28 mgを得た（収率；76%）
1H NMR[270 MHz, (CD3)2CO, TMS, δ(ppm)] 6.77-6.88 (3H, m), 7.17-7.44(5H, m), 8.18-8.37(2H, m)
EI-MS, m/z 242(M+)
また、同分取ＴＬＣでRf=0.5のバンドをかきとり、酢酸エチルで溶出した後、溶媒を溜去し、残渣を再度シリカゲル分取ＴＬＣに供し（展開液；ヘキサン-酢酸エチル,3/1(v/v), 3回展開）Rf=0.6のバンドをかき取り、酢酸エチルで溶出した後、溶媒を溜去し、4-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン（12 mg）を得た（収率；24.5%）
1H NMR[270 MHz, CD3OD, TMS, δ(ppm)] 6.87-6.91(3H, m), 7.11(1H,s), 7.25(1H, d, J=2.3 Hz), 7.36-7.40（2H, m）, 7.66(1H, d, J=8.6 Hz)
EI-MS, m/z 242(M+)
【００２２】
実施例２ [6-ヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン（化合物３）の製造]
フラスコに、3-メトキシフェニルチオ-4'-メトキシアセトフェノン0.164 g（0.107 mmol）およびポリリン酸1.15g（P2O5分として75%）を入れ、120-125℃で１時間１５分間攪拌した。放冷後、これに水30 mlを加え、酢酸エチル30mlで2回抽出し、有機層を飽和食塩水25mlで2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去して得られた残渣0.110 gにメタノール2mlを加え溶解した後、室温で1時間放置した。析出した結晶を濾集し、これをメタノール0.5mlで2回およびヘキサン2 mlで1回洗浄して粗6-メトキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン75mgを得た（収率；70%）。
次いで、上記で得られた6-メトキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン73 mg（0.27mmol）および乾燥二塩化エチレン0.15 mlをフラスコに入れ、0℃まで冷却して3臭化ホウ素0.10 mlを滴下し、0℃で1.5時間攪拌した後、さらに室温で1時間攪拌した。次に反応液に氷水15 mlを加え、酢酸エチル20 mlで2回抽出し、有機層を飽和食塩水で2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を溜去して残渣80 mgを得た。この残渣にクロロホルム2 mlを加え溶解した後、室温で1時間放置し、析出した結晶を濾集し、これを冷クロロホルム2mlで2回およびヘキサン2mlで2回洗浄した。この結晶をさらにシリカゲル分取ＴＬＣに供し（展開液；ヘキサン-酢酸エチル, 2/1(v/v)）Rf=0.3のバンドをかき取り、酢酸エチルで溶出した後、溶媒を溜去し、６-ヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)ベンゾ[b]チオフェン48 mgを得た（収率；74%）。
1H NMR[270 MHz, CD3OD, TMS, δ(ppm)] 6.79-6.85 (3H, m), 7.17(1H, d, J=2.0 Hz), 7.31（1H, s）, 7.47-7.55(3H, m)
EI-MS, m/z 242(M+)
【００２３】
実施例3 [7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-チオン（化合物４）の製造]
フラスコにレゾルシノール2.75 g（25 mmol）および4-ヒドロキシフェニル酢酸3.80 g（25 mmol）を入れ、これに３ふっ化ホウ素ジエチルエーテル錯体10 mlを滴下し、60〜70℃で２時間攪拌した。この反応液を、酢酸ナトリウム6.0 gおよび氷水50 gからなる溶液に加え、酢酸エチル40 mlおよび20 mlで2回抽出した後、25mlの飽和重曹水および飽和食塩水で各2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去して粗4-(2,4-ジヒドロキシフェナシル)フェノール6.05 gを得た（収率；99%）。
次いで、上記で得られた4-(2,4-ジヒドロキシフェナシル)フェノール6.03 g（24.9 mmol）、N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール4.17 g（33.9 mmol）およびDMF6 mlをフラスコに入れ、150℃で３時間攪拌した。反応液を放冷後、これに水40 mlおよび酢酸エチル40 mlを加え、抽出し、さらに水層を酢酸エチル40 mlで2回抽出した。有機層を併せ、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を溜去して粗7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-オン0.949 gを得た（収率；15.1%, LC純度；88%）。
上記で得られた粗7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-オン0.380 g（1.32 mmol）、Lawesson試薬0.86 g（2.13 mmol）およびベンゼン4 mlをフラスコに入れ、80℃で30分攪拌した。次いで、この反応液に氷水30 mlおよび酢酸エチル30 mlを加え攪拌した後、濾過し、分液した。水層を酢酸エチル20 mlで2回抽出し、有機層を併せ、これを飽和食塩水30 mlで2回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去して粗7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-チオン0.813 gを得た。この粗7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-チオンの0.75 gをシリカゲル24 gを用いたカラムクロマトグラフィーに供し（溶出液；ヘキサン-酢酸エチル, 1/1(v/v)、14 ml／１フラクション）、フラクション7-13の画分に精製7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-チオン42 mgを得た。また、フラクション4-6および14-18の画分をシリカゲル分取ＴＬＣに供し、総計で77 mgの精製7-ヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ベンゾピラン-4(4H)-チオンを得た。
1H NMR[270 MHz, CD3OD, TMS, δ(ppm)] 6。80-6.83(3H,m), 6.94(1H,dd,J=2.3, 8.9 Hz), 7.23-7.26(2H, m), 7.89(1H, m), 8.53(1H, d, J=8.9 Hz)
EI-MS, m/z 270(M+)
【００２４】
試験例１（エストロゲン作用）
ヒトエストロゲンレセプターのαアイソフォームおよびβアイソフォームのｃＤＮＡは、以下に示す配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるRT-PCR法により、ヒト肝cDNA（東洋紡社販売）からクローニングした。αアイソフォームのクローニングにはオリゴヌクレオチド5'-cgggaagccaatctgtacct-3'および5'-cagggattcgcagaaccttg-3'、βアイソフォームのクローニングには5'-atgaattacagcattcccag-3'および5'-aaatgagggaccacacagca-3'を用いた．該RT-PCR法によって得られたαアイソフォームおよびβアイソフォームのｃＤＮＡ断片の末端を平滑化し、各々を発現用ベクターpRc/RSV（Invitrogen社）の平滑化したHinｄ切断部III位に挿入し、発現プラスミドpRc-RSV-hERαおよびpRc-RSV-hERβを得た。また、エストロゲン応答配列5'-aaagtcaggtcacagtgacctgatca-3'を、ベクターpGV-P（東洋インキ社）のSma I部位に挿入して、ルシフェラーゼレポータープラスミドpGV-EREを得た。
他方、イーグルMEM培地（フェノールレッドフリー、活性炭処理後の血清を10％（v/v）含有）で継代培養したHeLa細胞を40,000細胞／ウェルの密度で24ウェルプレート（φ16 mmウェル）に植え、37℃、5％CO2存在下24時間培養した後、該培地を無血清イーグルMEM培地に交換した。
上記発現プラスミドpRc-RSV-hERαまたはpRc-RSV-hERβ、エストロゲン応答配列を組み込んだホタルルシフェラーゼレポータープラスミドpGV-ERE、および内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドpRL-TK（東洋インキ社）をリポフェクション法で上記のHeLa細胞に導入した。すなわち、発現プラスミドpRc-RSV-hERαまたはpRc-RSV-hERβ0.3μg、 pGV-ERE0.1μg、ｐRL-TK0.05μgおよびリポフェクチン0.35μlを混合し、これを上記のHeLa細胞に添加して5%CO2存在下37℃にて5時間培養してプラスミドを導入した。次いで、培地を10%活性炭処理済血清含有イーグルMEM培地に交換し、5%CO2存在下37℃で一晩培養を続けた。培地を除き、供試化合物のDMSO溶液を添加した10％活性炭処理済血清含有イーグルMEM培地を加えてさらに48時間培養した。なお、対照として、供試化合物のDMSO溶液に替えてDMSOを同量添加した培地を用いて同様に培養した。培地を除き、細胞をPBS(−)で2回洗浄後、ピッカジーンデュアル細胞溶解液（東洋インキ社）を50μl／ウェル加え、室温で細胞を溶解した。この細胞の溶解液の一部をホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ基質液（東洋インキ社）と混合し、ルミノメーターで発光量を測定した。夫々につき、DMSOのみを添加した場合の発光量を求め補正した。供試化合物に替えて17β-エストラジオールを添加（終濃度、αアイソフォームの場合1 nM、βアイソフォームの場合10 nM）したときの同様にして求めた発光量を１００とし、各供試化合物を添加して試験した場合の発光量の相対値をもとめた。次いで、このようにして求めたβアイソフォームについての相対値をαアイソフォームについての相対値で除して、エストロゲン活性（β／α）を算出した。
【００２５】
【表１】
0004304732.tif 000009
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、ベンゾチオフェン誘導体およびその塩、ならびに有効成分としてベンゾチオフェン誘導体、ベンゾピラン誘導体、またはその塩を含むエストロゲンレセプターβアイソフォーム活性化剤が提供することができる。