(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尋常性天疱瘡患者自己抗体に認識される融合蛋白質であって、
尋常性天疱瘡抗原蛋白質の細胞外領域である配列番号１に表される蛋白質のＣ末端に、IgGの定常領域がヒンジ部を介して結合され、
動物細胞又は昆虫細胞を宿主として発現することを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の融合蛋白質を有効成分として含有する尋常性天疱瘡
の治療薬。
【請求項３】
請求項１記載の融合蛋白質を担体に固定した吸着剤を有することを
特徴とする尋常性天疱瘡の治療器具。
【請求項４】
請求項１記載の融合蛋白質を免疫診断の抗原として用いることを特徴とする尋常性天疱瘡の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、尋常性天疱瘡患者自己抗体に認識される融合蛋白質、並びに、尋常性天疱瘡の治療薬、治療器具、診断剤及び診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尋常性天疱瘡（以下、ＰＶという）は皮膚、粘膜に水疱を生じ、ときには致死的に至る水疱性自己免疫疾患である。臨床的には、ＰＶの初期の水疱は弛緩性水疱で、その疱膜は容易に破れ、大きなびらん面を呈するようになる。びらん面は滲出性で出血しやすい。重篤な例では、びらん面からの体液喪失、２次感染を伴い、致死的になることがある。ＰＶ患者の健常部を指でこすると、表皮上層部がずれ落ちる、いわゆるニコルスキ−現象がみられる。病変部の病理組織像では表皮細胞の細胞間結合が矢われ、遊離した表皮細胞が認められる。
【０００３】
また病変部皮膚を、蛍光抗体法で調べてみると、表皮細胞膜表面にIgGの沈着が認められる。さらにＰＶ患者血中には、表皮細胞膜表面に結合するIgGが検出される。
この患者血中のIgGを新生マウスに注射すると、マウス皮膚にＰＶに特徴的な組織像を持つ水疱が誘導される。またＰＶ患者IgGを培養液に入れた状態で皮膚を器官培養すると、その皮膚にＰＶと同様の表皮融解が認められることなどから、ＰＶ患者に認められるIgGは、水疱形成において病因的な役割を担っていると考えられていた。
【０００４】
天谷らは、正常ヒト培養表皮細胞より作製されたcDNA発現ライブラリーを、ＰＶ患者血清よりアフィニティー精製された抗13OkＤ天疱瘡抗原蛋白質認識IgGを用いて免疫スクリーニングし、特異的に反応するクローンを得て尋常性天疱瘡抗原蛋白質のcDNA配列を決定した（Cell, 1991年第67巻, 869-77頁）。
【０００５】
DNA配列をもとに得られたアミノ酸からなる蛋白質は、重層偏平上皮に発現の見られる新しいタイプのカドヘリン分子であることを発見した。同様に別のタイプの抗表皮細胞膜抗体を持つ自己免疫性水疱症疾患である落葉状天疱瘡、ブラジル落葉状天疱瘡のcDNA配列も決定された（European Journal of Cell Biology 1990年第53巻, 10-12頁, Amagaya et al.）。
【０００６】
このようにＰＶ患者では、上皮中にある細胞接着因子力ドヘリンの１種である尋常性天疱瘡抗原蛋白質に対する自己抗体が産生される。その抗体が尋常性天疱瘡抗原蛋白質と反応することにより、接着因子としての尋常性天疱瘡抗原蛋白質の機能を阻害し、２次的にプラスミン、補体などを活性化し、表皮の遊離に至ると考えられた（Journal of Investigative Dermatology 1995年第104巻, 146-152頁, Amagaya）。
【０００７】
現在ＰＶ患者に対する治療の試みは、ステロイドや免疫抑制剤による一次的な症状の軽減を期待する対症療法のみであり、副作用も強く、根本的なものはなく、疾患の病態を考慮した上での特異的な治療法は存在しない。
一方、天疱瘡の診断は、専門医による臨床的所見、病変部の病理組織学的所見、及び患者血清を用い、正常表皮切片を基質とした蛍光抗体法による免疫組織学的所見に基づき、なされている。これらの診断法は簡便性、客観性に欠ける。
【０００８】
最近、尋常性天疱瘡抗原蛋白質を大腸菌の発現系を用い遺伝子組換えにより人工的に合成し、この蛋白質を用いた抗原型診断薬の試みがなされているが、陽性率は約５〜６割と低く（Journal of Clinical Investigation 1992年第90巻、919-926頁, Amagaya et al.）、実用的ではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように現在の免疫抑制剤による治療は、すべての免疫反応を一様に抑制するものであり、副作用も強く、その効果も一次的であるという問題があった。
【００１０】
従って本発明は、従来の全ての免疫反応を一様に抑制するという問題点に鑑みてなされたものであって、尋常性天疱瘡に関係する免疫反応のみを選択的に抑制するものである。すなわち、原因物質である尋常性天疱瘡自己抗体の除去あるいは、自己抗体産生細胞の破壊をおこなうものである。
【００１１】
また、従来有効な診断法がない尋常性天疱瘡は、特異性、感度に優れ、早期の診断に役立ち、かつ病勢と相関する実用的な診断薬の開発が課題とされていた。よって本発明は、尋常性天疱瘡患者自己抗体に認識される融合蛋白質を提供すると共に、副作用の影響の少ない尋常性天疱瘡の治療薬や治療器具を提供すること、更に尋常性天疱瘡の有効な診断剤及び診断方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段、作用及び発明の効果】
上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、本発明者らは以下の発明を完成させた。
請求項１の融合蛋白質は、尋常性天疱瘡患者自己抗体に認識される融合蛋白質であって、尋常性天疱瘡抗原蛋白質の細胞外領域である配列番号１に表される蛋白質のＣ末端に、IgGの定常領域がヒンジ部を介して結合されたものである。
【００１３】
尋常性天疱瘡抗原蛋白質は膜貫通蛋白質であり、自己抗体はin vivoの状態で細胞膜を通過できないため、本発明者らは自己抗体の認識する領域を細胞外領域と考え、この細胞外領域（配列番号１）のみをコードする遺伝子を調製した（以下、特にことわりのない限り細胞外領域を単にPVAgと呼ぶ）。このように細胞外領域であるPVAgのアミノ酸配列を用いたため、請求項１の融合蛋白質をコードする遺伝子を動物細胞または昆虫細胞に導入して該融合蛋白質を発現させた際、発現された融合蛋白質が細胞内に閉じ込められることなく細胞外に確実に排出されるという作用効果を奏する。また、請求項１の融合蛋白質ではPVAgにIgGの定常領域のヒンジ部を結合したため、該融合蛋白質を安定に生産すると共にPVAgの高次構造が天然のものと同等になるという作用効果を奏する。更に、請求項１の融合蛋白質ではＣ末端側の切断部分にIgGを結合したため、もとの蛋白質（尋常性天疱瘡抗原蛋白質）のＮ末端からはじまりＣ末端に向かう途中で切断されている細胞外領域は、より確実に自己抗体に認識されるという作用効果を奏する。更にまた、請求項１の融合蛋白質にIgGを存在させたため、細胞導入後の発現の有無を市販の抗IgG抗体を用いることにより容易に検出が可能となり、また、発現後の融合蛋白質の精製においてIgGと親和性のあるプロテインＡをリガンドとして持つセファロースカラムクロマトグラフィーを行うことにより容易に精製が行えるという作用効果を奏する。尚、請求項１の融合蛋白質の原料となるIgGは種類、動物種により限定されるものではない。
【００１５】
請求項１の融合蛋白質（以下、本発明の融合蛋白質という）を製造する方法としては、例えば、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子を動物細胞または昆虫細胞に導入して該融合蛋白質を発現させ、培養上清を回収した後、適当なカラムクロマトグラフィーにより精製する方法が挙げられる。この場合、従来の大腸菌を宿主とした発現系と異なり、COS7細胞のような動物細胞、あるいはバキュロウイルスをべクターとして利用し昆虫細胞を宿主とした発現系を用いることが好ましい。
【００１６】
請求項２の尋常性天疱瘡の治療薬は本発明の融合蛋白質を有効成分として含有するものである。例えば、本発明の融合蛋白質とコレラトキシン、マイトマイシンＣ等の毒素とを共有結合などで結合した結合体を尋常性天疱瘡患者に投与することにより自己抗体産生細胞の選択的破壊を行うことができるため、該結合体を尋常性天疱瘡の治療薬として用いることができる。この際、マウスを用いた急性毒性実験の結果は、融合蛋白質1000mg/kgを腹腔に注射した投与群で50％の致死毒性が発現したが、それ以下の投与量では２週間後でも影響はみられなかった。この融合蛋白質は本来、生体に存在する組織結合蛋白質であり、毒性は極めて低い。このＬＤ50値は、成人一人当たりの治療における最大投与量の約100000倍量であり問題とならない。また、本発明の融合蛋白質に毒素、例えばコレラトキシン、マイトマイシンＣなどを結合したものでもＬＤ50は10mg/kgであるが、この値も成人一日当たりの治療における最大投与量の約1OO倍量であり問題とならない。 かかる尋常性天疱瘡の治療薬の成人一日当たりの投与量は投与方法および病状によっても異なるが、通常の投与量は本発明の融合蛋白質の量で３×1O-9Ｍないし３×10-10Ｍ程度であり、投与経路は主として静脈注射または筋肉注射が好ましい。また、具体的な製剤例として、生理食塩水またはクエン酸緩衝液中に３×10-3Ｍないし３×10-6Ｍ含むものを挙げることができる。また、これに加えてその他の任意成分として、医薬上許容可能な安定剤、崩壊剤、溶解補助剤なども適宜添加し得る。
【００１７】
請求項３の尋常性天疱瘡の治療器具は、本発明の融合蛋白質を担体に固定した吸着剤を有するものである。例えば、本発明の融合蛋白質を水不溶性の担体に固定化して、尋常性天疱瘡患者IgGを選択的に吸着する抗原とし、血漿交換による天疱瘡自己抗体の選択的除去を行うことにより、尋常性天疱瘡の治療に用いることができる。使用される担体としては、アガロース系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系、等の有機高分子、コラーゲン、キトサン等の生体由来の天然有機高分子あるいは活性炭素、セラミック等の無機物が挙げられ、その形態として平板状、粒子状等様々な形態を使用し得るが、表面積を大きく採れるものが好ましい。PVAg-IgG融合蛋白質と担体との固定化は共有結合によって行われる。例えば、担体がその表面に有するエポキシ基やアルデヒド基等の反応性官能基に水性溶液中で直接結合することによって実施される。また、アミノ基等の官能基を表面に有する担体を用いる場合は、PVAg-IgG融合蛋白質と担体との混合水性溶液にジアルデヒドやジエポキシ化合物等の反応性多官能基を有する化合物を添加し、反応させることによっても実施することができる。
【００１８】
請求項４の尋常性天疱瘡の診断剤は、本発明の融合蛋白質を免疫診断の抗原として用いるものである。例えば、本発明の融合蛋白質は、ウェスタンブロット法、RIA法、EIA法などの免疫診断方法の抗原蛋白質として用いられ、患者血液中の自己抗体の測定を行うことができる。これにより、従来有効な診断剤がなかった尋常性天疱瘡において、特異性、感度に優れ、早期の診断に役立つ診断剤を提供することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について詳細に説明する。尚、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り、種々の態様で実施できることはいうまでもない。
［実施例１］PVAgにIgGが結合された融合蛋白質（PVAg-IgG）
［１−１］動物細胞COS7細胞によるPVAg-IgGの発現
PVAg-IgG蛋白質発現領域（シグナルペプチド領域−プロシークエンス領域−細胞外蛋白領域（配列番号１）−ヒトIgG ヒンジ部−ヒトIgG CH2部−ヒトIgG CH3部）を含むpcDNA1-PVAg-IgG発現プラスミドDNAを作製した（尚、pcDNA1はインビトロゲン(Invitorogen)社の商品名である）。以下にpcDNA1-PVAg-IgG発現プラスミドDNAの作製法を説明する。
【００２１】
基本的に、必要なcDNAは増幅されるcDNAの両側の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって増幅した。オリゴヌクレオチドは制限酵素の切断位置もしくは付加されるペプチドのコーディング領域を作り出すようにデザインされた。PCRは、94℃１分、55℃２分、72℃３分を20乃至25サイクル繰り返した。
【００２２】
COS7細胞用の発現ベクターを構築するために、まず、PVAgをコードするcDNAを、PVAgとマウスＥカドヘリンの細胞質領域からなるキメラ蛋白質を含む哺乳動物の発現ベクターであるpcDNA1-PVECIII（Journal of Investigative Dermatology 1994年第102巻, 402-408頁, Amagaya et al.）上でPCR増幅した。5'プライマーとしてはベクター配列中のT7プライマーを用い、3'プライマーとしては以下の配列を用いた。
【００２３】
5'-CCTGCTCGAGCCTCCCTGAGTGCGGCCT-3'（PVAgのEC5領域の末端のすぐ上流にあるアンチセンス配列及びXhoI切断部位を含む）
このPCR産物は5'非コード領域及びシグナルペプチド、プロシークエンス及びPVAg（ヌクレオチド1-1929）をカバーするコード領域を持っていた。
【００２４】
一方、ヒトIgG1の定常領域をコードするcDNAは、pTJ5（Journal of Biotechnology 1988年第８巻, 141-148頁, Nakamura et al.）上でPCR増幅によってつくられた。プライマーとしては以下の配列のものを用いた。
5'プライマー：5'-CCTGCTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA-3'（全ヒンジ領域及びXhoIサイトを含む）
3'プライマー：5'-CCATCTAGATCATTTACCCGGGGACAG-3'（ストップコドン直上のアンチセンス配列及びXhoIサイトをコードする）
以上のようにして得られたPVAgのPCR産物及びIgG1のPCR産物はNotI-XhoI及びXhoI-XbaIでそれぞれ消化し、NotI-XbaIでカットしたサイトメガロウイルス(CMV)プロモータを有する真核生物の発現ベクターであるpcDNA1/Amp（インビトロゲン社製）と結合させた。これをpcDNA1-PVAg-IgGと命名した。
【００２５】
このpcDNA1-PVAg-IgG発現プラスミドDNAを、リポソーム（商品名：リポフェクチン、ギブコ社製）を使用して一時的にCOS7細胞へトランスフェクションした。すなわち、直径1OOmmの大きさのCOS7細胞を培養したプレートに、1Oμgの発現プラスミドDNAと、血清を含まないDMEM5mlとリポフェクチン5Oμ1の混合液を入れてトランスフェクションを行い、37℃で４時間インキュベーションした後に牛胎児血清を2O％含むDMEMを５ml加え、一昼夜インキュベーションを行った。
【００２６】
翌日、その培養上清を除き、血清を含まないDMEM６mlで置き換えた。インキュベーションは37℃で３日間続け、培養上清を採取し、血清を含まないDMEM６mlに置き換えた。更に37℃で３日間インキュベーションし、上清を採取して細胞を捨てた。
【００２７】
採取した上清は遠心分離して非付着性細胞や残骸を除き、２回分を一ケ所に集めて使用時まで-70℃で保存した。平均して上清中には約O.1〜O.5μg/mlのPVAg-IgG蛋白質が含まれていることが、蛋白質測定キット（プロテインアッセイキット、BioRad社製）による測定でわかった。
【００２８】
図３は、PVAg-IgGの分子構造を表す説明図である。PVAg-IgGは、シグナルペプチド(S)、プロシークエンス(P)、PVAg（EC1〜EC5）、及びヒトIgG1の定常領域（ヒンジ(H)、CH2、CH3領域を含む）を含む。図１の下段には融合位置周辺のアミノ酸配列が示されているが、新たな制限酵素位置を構築するために一つのロイシンが導入された。
［１−２］昆虫細胞Sf9によるPVAg-IgGの発現
pcDNA-PVAg-IgGと同様にPVAg-IgG蛋白発現領域を含むプラスミドであるpEVmod-PVAg-IgGのDNA（尚、pEVmodはPharmingen社の商品名である）と、バキュロウイルスであるバキュロゴールド（Pharmingen社製）のDNAの両者をSf9昆虫細胞にコトランスフェクションすることにより、組換え型のPVAg-IgG-Sf9を生成する組み換えバキュロウイルスを得た。
【００２９】
すなわち、常法により、約３×1O6個のSf9細胞を直径6Ommの大きさの培養用ディッシュに1O％牛胎児血清を含むGrace's昆虫細胞用培地1Omlとともに入れ、細胞が付着するように27℃で15分間インキュベーションを行った。
その間に、pEVmod-PVAg-IgGのDNA2μg、バキュロゴールドDNA 0.5μg、DNA導入用リポソーム（商品名：リポフェクチン、ギブコ社製）3Oμlを、血清を含まないGrace's 昆虫細胞用培地 1.5mlに溶かし、室温で15分間インキュベーションしてDNA-リポソーム混合物を調製した。
【００３０】
培養ディッシュ上でインキュベーションを行ったSf9細胞に先に調製したDNA-リポソーム混合物を含み血清を含まないGrace's培地を徐々に1.5ml加え、トランスフェクションした細胞を27℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞は血清を含まないGrace's培地で一度洗い、1O％の牛胎児血清を含むGrace's培地に置き換えて27℃で４日間インキュベーションした。
【００３１】
その後、培養上清を採取し直径1OOmmのディッシュのセミコンフルエント状態のSf9細胞に感染させ、３〜５日間インキュベーションした。この操作を３回繰り返し、高力価のPVAg-IgG-Sf9を生成するバキュロウイルスを含む上清を得た。高力価の組換え型バキュロウイルスで感染したSf9細胞を５日間培養した上清は、遠心分離して細胞残骸を除いた後、-70℃で保存した。平均して、上清中には約５〜10μg/mlのPVAg-IgG蛋白質が含まれていることが蛋白質測定キット（プロテインアッセイキット、バイオラッド社製）での定量によりわかった。
［１−３］PVAg-IgG融合蛋白質の精製濃縮
PVAg-IgG融合蛋白質の精製濃縮するため、常法通り、プロテインＡセファロース（ファルマシア社製）5OμlをCOS7またはSf9細胞の上清5mlに加え、４℃で一昼夜インキュべーションし、PBSで２度洗いした後、２×SDSサンプル緩衝液（125mM Tris-HCl pH7.5, 2%SDS, 0.005% bromophenol blue, 2O% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol）5O-1OOμlで再懸濁した。
［１−４］PVAg-IgG融合蛋白質の発現の確認
濃縮されたPVAg-IgG融合蛋白質はSDS-PAGEで分離され、PVDF膜（ミリポア社製、商品名：Immobilon）に転写された。PVAg-IgG融合蛋白質を検出するため、３％スキムミルク溶液でブロッキングを行い、PVDF膜はアルカリホスファターゼと結合したヤギの抗ヒトIgG抗体（Zymed Labaratories lnc.製）の1OOO倍希釈溶液と、室温で１時間インキュベーションした。その後アルカリホスファターゼ発色キット（BioRad社）により一本のバンドとして検出され、その分子量は約11OkDであった。
［１−５］イムノブロット解析
患者または健常人の血清中PVAg抗体とCOS7細胞またはSf9細胞によって得られたPVAg-IgGの反応性を見るため、PVAg-IgGを転写したPVDF膜は、まずヒト血清の5O倍希釈溶液とインキュベーションし、次にマウスの抗ヒトIgG4抗体（Oxoid社製）の3O倍希釈溶液、アルカリホスファターゼと結合したヤギの抗マウス抗体（Zymed Laboratories Inc. 社製）の1000倍希釈溶液とインキュベーションし、その発色を調べた。用いた血液は、35人の尋常性天疱瘡患者（ＰＶ）、1O人の落葉状天疱瘡患者（ＰＦ）、16人のブラジル落葉状天疱瘡患者（ＢＰＦ）、1O人の水疱性類天疱瘡患者（ＢＰ）、５人の健常人血清（Ｎ）である。35人の尋常性天疱瘡患者の血清は全てCOS7細胞で生成したPVAg-IgGと反応は陽性であったが、36人の水疱症患者対照群、または５人の健常人からは全く反応か認められなかった（図１）。
【００３２】
Sf9細胞で生成したPVAg-IgGもまた、35人の天疱瘡の患者血清は全て反応は陽性であったが、36人の水疱症患者対照群、または５人の健常人からは、全く反応が認められなかった（図２）。
［１−６］新生児マウスを用いたPVAgによる自己抗体吸収実験
次に新生児マウスを用いたPVAgによる自己抗体吸収実験を行った。天疱瘡患者血清1Omlに、PVAg-IgG組換えバキュロウイルスを感染させたSf9細胞の上清5Omlと室温で４時間インキュベーションし、４℃、13000×gで3O分間遠心分離して沈澱を除いた。その後、IgG画分は40％硫酸アンモニウムで沈澱させ、PBS-Ca溶液で透析して小型濃縮器CentriconlOO（アミコン社製）で１ml（元の容量の1/1O）まで濃縮した。これらの濃縮されたIgGs（マウス１匹当たり100-15Oμ1）は文献（N.Engl.J.Med., 1982年第3O6巻 1189-1196頁、J.Clin.lnvest., 1992年第9O巻 919-926頁）を参考にして新生児BALB/cマウス（生誕24時間以内）に皮下注射した。新生児マウスは注射後18〜24時間の間、生検を実施した。
【００３３】
コントロール実験として、上記の実験系においてPVAg-IgG組換えバキュロウイルスを感染させたSf9細胞にかえてバキュロウイルスを感染させていないSf9細胞の上清5Omlを加えた系では、新生児マウスに広範囲の水疱、びらんが観察されたがPVAg-IgG組換えバキュロウイルスを感染させたSf9細胞の上清をインキュベ一ションした系においては、水疱の形成は肉眼的にも、病理組織学的にも認められず水疱症を誘発する病原活性は失われたことが明らかになった。
［１−７］尋常性天疱瘡の治療器
上記知見に基づき天疱瘡の治療器を作製した。液体流入口および排出口を上下端にそれぞ設けた筒状のポリカーボネート製ハウジング内に、表面にPVAg-IgGを介して共有結合せしめた球状担体（商品名：ＥＡＨ Sepharose４Ｂ、平均粒径45〜165μm、Pharmacia社製）を充填し、流入口及び排出口にはそれぞれ150メッシュのポリエステル製フィルターを固定したものを作製した。
【００３４】
この治療器が有効に機能することを確認するため、天疱瘡患者血清1Omlをペリスタルティックポンプを用い、約１ml/minの流速で注入した。排出口より流出する血清を集め、イムノブロット解析を行い、自己抗体の存在を調べたが、その存在は全く確認できず、この治療器が天疱瘡患者自己抗体を有効に吸収することが明らかになった。
【００３５】
従って、この治療器によれば、従来の免疫抑制剤を使用した場合には全ての免疫反応が抑制されるため副作用が強かったのに対して、尋常性天疱瘡に関係する免疫反応のみが選択的に抑制されるため副作用が軽減されるという効果が得られる。
［実験例２］PVAgにHis tagが結合された融合蛋白質（PVAg-His）
［２−１］PVAg-His発現プラスミドの構築
以下のようにXho1切断部位及びE tagをコードするプライマーと、His tag及びKpn1切断部位をコードするプライマーを調製し、PCR法によりE tag及びHis tagをコードするcDNAの構築を行った。
【００３６】
［Xho1切断部位及びE tag をコードするプライマー］
5'プライマー(DN516)GCCCTCGAGGGTGCGCCGGTGCCGTATA
［His tag及びKpn1切断部位をコードするプライマー］
3'プライマー(DN517)CGGGGTACCTCAATGATGATGATGATGGCC
PCRは94℃で１分処理した後94℃１分、55℃１分、72℃１分を20サイクル繰り返し、72℃７分処理して、クロロホルムを加えた後エタノールを加えてPCR産物を沈殿した。これらのPCR産物は制限酵素Xho1及びKpn1で37℃２時間処理後、ゲル内電気泳動により目的とするHis tag及びE tagをコードするDNAを採取し、QIAEX kit（キアゲン社製）でDNAを精製した。精製したDNAは制限酵素Xho1及びKpn1で消化し、IgGをコードする領域を除いたpEVmod-PVAg-IgGと結合させることにより、PVAg-His発現プラスミドpEVmod-PVAg-Hisを作製した。このpEVmod-PVAg-Hisは配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む。
［２−２］昆虫細胞Sf9によるPVAg-Hisの発現
pEVmod-PVAg-Hisとバキュロゴールド（ファーミンゲン社）のDNAの両者を、上記［１−２］と同様にしてSf9細胞にコトランスフェクトすることにより、組換え型のPVAg-His-Sf9を生成するバキュロウイルスを含む上清を得た。
［２−３］PVAg-His融合蛋白質の精製濃縮
PVAg-His融合蛋白質を精製濃縮するため、1mlのNi2+-NTA- アガロース（キアゲン社製）に0.22μmのフィルターでろ過した上記培養上清を添加し、8mlの結合バッファー（20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.8）で洗浄した後さらに洗浄バッファー（20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH6.3）で２回洗浄した。次いで溶出バッファー（200mMイミダゾールを含む洗浄バッファー）0.6mlで溶出しさらに溶出バッファー1.2mlで２回溶出した。
【００３７】
イムノブロッティングによりPVAg-Hisを含む分画を確認し、Ca加生理的トリス塩酸緩衝液（TBS）で十分透析し、４℃で保存した。
尚、PVAg-Hisの分子構造は、シグナルペプチド(S)、プロシークエンス(P)、PVAg（EC1〜EC5）、及びPVAgのEC5に結合した６つのヒスチジンを含む。
［２−４］ELISA法によるＰＶ診断
尋常性天疱瘡患者であるか否かの診断は以下のようにして行うことができる。
【００３８】
９６穴平底マイクロタイタープレート（タイターテック社製）の各ウエルに50μlのPVAg-His溶液を加え、４℃で一晩インキュベイトした後、PVAg-His溶液を除き、1%BSA,0.005% tween20を含むCa加TBS（ブロッキングバッファー）200μlを加え、室温で１時間ブロッキングし、0.005%ツイーン20を含むCa加TBS（洗浄バッファー）で洗浄する。これにブロッキングバッファーで100倍希釈した患者血清50μlを加え室温で１時間反応させる。洗浄バッファーで４回洗浄し、50μlのペルオキシダーゼ標識抗体を加え室温で１時間反応させ、再度洗浄した後100μlの発色基質（オルトフェニレンジアミン4mg、31%過酸化水素6μl を含む0.1Mクエン酸／0.2Mリン酸２ナトリウム溶液(pH4.8-5.0)）を加え、室温で30分反応させ発色させた後、50μl の4N硫酸を加えて反応を停止し、波長492nmの吸光度を測定する。  この際、尋常性天疱瘡患者５０例の血清を測定し、その平均値に相当する患者血清を集めて標準血清とし、この標準血清と患者血清につき測定を行い、以下の式から患者血清のインデックス値を求める。
【００３９】
【数１】
0004297519.tif 000002
【００４０】
別に正常人の血清２００例を測定し、そのインデックス値の平均値＋３×標準偏差を正常範囲として、これを越えた場合ＰＶ抗体を持っていると判断する。
かかる診断法によれば、従来のように正常表皮切片を基質とする必要がないため簡便性、客観性に優れるという効果が得られ、また、特異性及び感度に優れるため尋常性天疱瘡の早期発見に役立つという効果も得られる。
【００４１】
また、ＰＶ抗体の濃度を測定する方法としては、高力価の患者血清を標準品として倍々希釈により検量線を作製し、診断対象となる患者血清中のＰＶ抗体の濃度を求めることもできる。このようにしてＰＶ抗体の濃度を測定することにより治療効果の判定、患者の臨床症状の推移を追うことができるという効果が得られる。
【００４２】
尚、PVAg-IgGを含む溶液を抗原溶液に用いると、ペルオキシダーゼ標識抗体はＰＶ抗体に結合するばかりでなく、PVAg-IgGのIgG部位にも結合してしまうため、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いて上記ELISA法により診断することはできない。
【００４３】
【配列表】
0004297519.tif 000003
0004297519.tif 000004
0004297519.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】  動物細胞（COS7）によって得られたPVAg-IgGと各種血清のイムノブロット解析の結果を表す説明図である。
【図２】  昆虫細胞（SF9）によって得られたPVAg-IgGと各種血清のイムノブロット解析の結果を表す説明図である。
【図３】  PVAg-IgGの分子構造を表す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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