(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイを行うための検査製品であって、該検査製品が、
固相マトリクス、
固相マトリクス上又は固相マトリクス内に固定した乾燥精製トロンボプラスチンであって、該乾燥精製トロンボプラスチンが、再脂質化組換えトロンボプラスチン又は再脂質化合成トロンボプラスチンである、乾燥精製トロンボプラスチン、および
固相マトリクスと液体サンプルとの接触の際にトロンボプラスチンの再水和を助長する凝固中性剤であって、該凝固中性剤がタンパク質、ポリマー又は糖類であり、一つ以上の凝固中性剤がウシ血清アルブミンおよびポリビニルアルコールである凝固中性剤、
を含む検査製品。
【請求項２】
乾燥精製トロンボプラスチンが、再脂質化組換えトロンボプラスチンである、請求項１記載の検査製品。
【請求項３】
乾燥精製トロンボプラスチンが、再脂質化合成トロンボプラスチンである、請求項１記載の検査製品。
【請求項４】
血液又は血漿サンプルを固相マトリクスに塗布して、乾燥精製トロンボプラスチンと接触させて、検知可能な反応を開始するタイプの改良プロトロンビン時間アッセイであって、該改良が、マトリクス内に、固相マトリクスと血液又は血漿サンプルとの接触の際にトロンボプラスチンの再水和を助長する、タンパク質、ポリマー又は糖類である凝固中性剤を配置し、そして再脂質化組換えトロンボプラスチン又は再脂質化合成トロンボプラスチンである乾燥精製トロンボプラスチンと接触させ、ここで一つ以上の凝固中性剤がウシ血清アルブミンおよびポリビニルアルコールである、改良プロトロンビン時間アッセイ。
【請求項５】
乾燥精製トロンボプラスチンが、再脂質化組換えトロンボプラスチンである、請求項４記載の改良プロトロンビン時間アッセイ。
【請求項６】
乾燥精製トロンボプラスチンが、再脂質化合成トロンボプラスチンである、請求項４記載の改良プロトロンビン時間アッセイ。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.  発明の分野
本発明は一般に、プロトロンビン時間血液凝固検査に関し、特に乾燥試薬プロトロンビン時間検査製品、及び血液又は血漿の存在下の乾燥トロンボプラスチンの再水和によるプロトロンビン時間検査法に関する。
外科手術を行う患者の出血感受性（bleeding susceptibility）を決定すること、及び血塊予防のための抗凝血療法を行う患者をモニターすることを含めて、さまざまな目的のために血液凝固検査は行われる。種々の凝固検査が現在用いられている。最もポピュラーなものの１つとして、『プロトロンビン時間（ＰＴ）』検査があり、これは検査を行う血液サンプル中のトロンボプラスチンによるプロテアーゼVII因子の活性による外因性凝固経路の誘発に依存している。
外因性凝固経路は、トロンビンの生成という結果を生じ、このトロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンへの転換を触媒化するタンパク分解酵素である。このような転換は、凝血メカニズムにおいて本質的な作用である。
ここで、このような血液凝固検査は、一般的に臨床実験室に限定される作業を伴い、複雑でありがちである。このような一点集中の検査は、外科患者には十分であるが、抗凝血療法をモニターするのに規則的に医院又はクリニックに通院するのは、より許容できない。よって、簡便で、実用的な家庭用凝固モニター検査の必要性が生じてくる。
家庭用血液検査の成功により、その他の化学物質、例えばコレステロール及びグルコースに対して工夫がなされている。家庭用の最も好適な装置の中には、予混合された検査成分をすべて含む乾燥試薬検査装置があり、長期間の保管に好適な乾燥した形態で保存されている。これらの乾燥試薬検査装置には、検査片及び小さなプラスチック容器などが含まれている。
乾燥試薬アッセイは、典型的には液相アッセイより正確さに欠ける。これは、２者間の形態上の相違によるものである。液相アッセイは、反応が生じる容器の壁で形成される非常に単純かつ均一な反応ゾーンを有する。一方、乾燥試薬アッセイは、乾燥反応化学物質と支持マトリクスとの表面により形成される複雑な反応ゾーンを有している。典型的には、乾燥試薬支持マトリクスは、多孔膜であるか又はキャピラリーギャップチャンバー（capillary gap chamber）であり、液相アッセイで典型的に用いられる反応キュベットより高い表面積／体積比を有している。よって、乾燥試薬アッセイに入れる検査サンプルは、さまざまな方法でアッセイ成分と相互作用する、非常に多くの機会を得て、正確さの損失となる。乾燥試薬アッセイの正確さが非常に低ければ、この検査は実用的な臨床応用に本質的に無意味になるであろう。
検査の正確さは、分散係数によって最もうまく表現される。これは、同じサンプルを非常に多く検査して得られた検査結果を、オーバーオールの検査シグナルの大きさで割った、分散の比率である。複数の検査実験における分散が、オーバーオールの検査シグナルと比較して大きいとき、この検査は正確さに欠けている。逆に、検査結果の分散が、オーバーオールの検査シグナルと比較して小さいとき、この検査は正確さに富んでいる。よって、検査の正確さを向上するのに２つの方法がある。第１の方法は、シグナルの大きさを維持して検査結果の分散を減少させる方法であり、第２の方法は、分散を本質的に定常に維持しつつシグナルの大きさを増大させる方法である。しばしば、検査シグナルの大きさを増大させる第２の方法が、正確さを向上させるのに最も実用的な方法である。
血液及び血漿は、凝血プロセスを調節するセリンプロテアーゼの科（family）を含んでいる。これらのセリンプロテアーゼは、凝固『因子』と呼ばれており、典型的にはローマ数字で示されており（因子が酵素活性状態であるならばａの添字が付いている）、正確に調節された増幅カスケードで作用して組織が損傷した部位で血塊を形成する。これらの血塊は、損傷部位で止血するように作用する。この血液凝固の特定のモードを、『外因性』凝固経路という。
通常の組織は、組織因子と呼ばれる、グリコプロテインで区切られる膜を含んでおり、組織が損傷すると作用する。外因性凝固プロセスは、この組織因子が凝固因子VII及び／又はVII（a）と複合体を形成するときに始まる。次に、この組織因子−因子VII（a）複合体は因子Ｘを活性化し、補因子（co-factor）Ｖと共に、不活性プロトロンビンプロテアーゼを活性トロンビン酵素に転換する。その後トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに転換し、実際の血塊を形成する。このプロセスは、『組織因子及びヘモスタシス（Tissue Factor and Hemostasis）』、Y. Nemerson, Blood 71（1）, 1-8頁（1988年）に詳細に説明してあり、これらの開示内容すべてが参考として本明細書に含まれる。本明細書での術語は、ネメルソンに追随する。プロトロビン時間検査は、この凝固経路を開始するトロンボプラスチンと呼ばれる組織抽出物を用いて、インビトロで凝固経路を刺激する。
従来のＰＴアッセイは通常、アセトン乾燥脳組織の水性抽出物から精製したトロンボプラスチンを使用していた。この原抽出物（crude extract）は多くの成分を含んでいる。通常のトロンボプラスチンの有効成分は、因子VII反応性分子複合体の特性が不完全である混合物であり、各々は『組織因子』タンパク質と抽出後に存在する脳脂質の混合物との相互作用により形成されている。一方、合成組換えトロンボプラスチン（ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチン）は、比較的簡単で、精製組換え組織因子タンパク、及び精製人工脂質群（lipid population）で形成された、特性を明確にした複合体からなる。
液相アッセイにおいて、異なるトロンボプラスチン配合物により、異なるプロトロンビン時間を有する血液サンプル間の識別力を向上させるか又は減少させる。より大きな識別力を有するトロンボプラスチンは、『感受性がよい』と呼ばれる。トロンボプラスチン配合物の液相感受性は、国際感受性指標（international sensitivity index）、即ちＩＳＩを用いることによって段階付けされる。このＩＳＩ値は、問題となるトロンボプラスチンのロットに観測されるプロトロンビン時間と、トロンボプラスチンの標準化ロットに観測されるプロトロンビン時間（ＩＳＩ値が１を有すると標準的に定められる）とを、対数スケールでプロットすることにより見出される。ＩＳＩ値は、得られた線の傾きであり、参照トロンボプラスチンのＩＳＩを掛ける。
測定尺度自身は多少直観的でない。感受性のよいトロンボプラスチンは、典型的には1.0近辺の低いＩＳＩ数を有し、感受性の悪いトロンボプラスチンのロットは、典型的には２〜３近辺の高いＩＳＩ数を有する。ロット間差の分子レベルでの説明は、現在完全にはなされていない。
プロトロンビン時間アッセイの場合、高い正確性が臨床的には非常に重要である。分散の簡素化（severity）に依存して、国際標準化比率（International Normalized Ratio）（ＩＮＲ）2.5は、不明確な検査で、ＩＮＲ2.0又は3.0を有するものとして報告されるであろう。そのような不明確さにより、異なる臨床決定をもたらすであろう。ＩＮＲ2.0という結果を得たのであれば、物理学者は抗凝固投与量を増加するように決定するであろうし、ＩＮＲ3.0という結果を得たのであれば、抗凝固投与量を減少するように決定するであろう。ＩＮＲ2.5という『間違った』検査結果が、抗凝固投与量を全く調節しない決定を生じるので、双方の決定は、良好になろうとしている患者に著しい衝撃を与えるであろうし、間違いが多いであろう。
これらの臨床の問題のため、乾燥試薬プロトロビン時間アッセイの正確さを向上させる方法が、この分野でかなり重要である。
2.  背景技術の説明
組換えＤＮＡ技術で製造したトロンボプラスチン及び組織因子は、米国特許第5,110,730号及び同第4,966,852号に記載されている。液相アッセイのための高感受性を有するトロンボプラスチンの調製方法は、米国特許第5,270,451号及び同第4,416,812号に記載されている。プロトロビン時間検査での組換え組織因子の使用は、トリポジ（A. Tripodi）、アービニ（A. Arbini）、シャンタランクル（V. Chantarangkul）、マニッチ（P. Mannucci）、“Recombinant Tissue Factor as Substitute for Conventional Thromboplastin in the Prothrombin Time Test”、Thrombosis and Haemostasis 67（1）巻、41〜45頁（1992年）に記載されている。トロンボプラスチンの型間の感受性の相違を説明する国際標準化比率（ＩＮＲ）は、カークウッド（T. Kirkwood）、“Calibration of Reference Thromboplastins and Standardization of the Prothrombin Time Ratio”、Thromb. Haemostasis 49（3）巻、238-244頁（1983年）、及び“Requirements for Thromboplastins and Plasma used to Control Oral Anticoagulant Therapy”、WHO Expert Committee on Biological Standardization, 33rd Report, WHO Tech Rep. Ser 1983; 687:81-105に記載されている。組織因子がプロトロンビン時間凝固カスケードで因子VIIaを活性化するメカニズムは、カーシュナスワミー（S. Kirshnaswamy）、“The Interaction of Human Factor VIIa with Tissue Factor”、The Journal of Biological Chemistry 267（33）巻、23696-23706頁（1992年）に記載されており、これらの開示内容は参考として本明細書に含まれる。
乾燥トロンボプラスチンを有する検査片を用いる乾燥試薬プロトロンビン時間検査は、共に係属中の出願、出願番号07/874,667号及び同08/003,791号に記載されており、これらの開示内容すべてが本明細書に参考として含まれる。
発明の概要
本発明にしたがって、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイを行うための改良検査製品及び方法は、高精製で、特性を明確にしたトロンボプラスチン配合物を使用する。このようなトロンボプラスチン配合物は、検査サンプル中の凝固因子VII（a）の活性に高程度で感受性及び特異性を維持するように選択される一方、トロンボプラスチンは乾燥状態から水和状態に転換する。組換えＤＮＡ技術で調製した人工再脂質化（relipidating）組織因子で調製したトロンボプラスチンである（以下、『組換えトロンボプラスチン』という）のが、特に有用で良い。
驚くべきことに、液相ＩＳＩ値とほとんど同じ値を有するトロンボプラスチン配合物を乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイに組み込んだとき、ＩＳＩ値を著しく異なるものにできることを見出した。精製天然トロンボプラスチンを用いて、この効果は、周辺臨床利用での乾燥試薬プロトロンビン時間検査において結果として得られる。一方、組換えトロンボプラスチンがこの効果により耐性を示すことがわかった。組換えトロンボプラスチンは、液相及び乾燥試薬検査の双方においてほとんど同じ感受性（ＩＳＩ）を有し、かつ優秀な臨床利用性を有する乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイをもたらす。
この相違点の説明として、トロンボプラスチン反応の生化学から生じるものがあげられる。組織因子及びトロンボプラスチンの活性は、組織因子タンパクとその周囲の脂質群（lipid population）との相関により大いに影響を受ける。溶液中の組織因子タンパクそれ自身は、本質的に不活性である。このタンパクは、活性化するには脂質マトリクス内でなければならない。脂質及び脂質タンパクは、単層、ミセル、及び２重層の形態での規則的な集合体として水相に存在する。これらの集合体は、疎水性の脂質構成物間の相互作用、及びその周囲の水性マトリクスに大いに依存する構造を有する。この効果のより完全な議論が、デービッド・ローン（J. David Rawn）、Biochemistry、第９章219-232頁“The structure of biological membranes”（Neil Patterson Publishers, North Carolina）になされており、この開示内容は本明細書に参考として含まれる。
液相プロトロビン時間アッセイにおいて、精製天然トロンボプラスチン及び組換えトロンボプラスチンの双方は、液相で平衡に存在するであろう。特に、トロンボプラスチンの組織因子部分及び脂質因子部分は、比較的安定なミセル分布であり、比較的矛盾のない状態でサンプル（因子VII）と相互作用する。一方、乾燥試薬アッセイにおいて、トロンボプラスチンは、サンプルで再水和する間、多くの劇的な構造再配列を経験する。特に、トロンボプラスチンの脂質及びタンパク成分は、イオン性相互作用が支配しており、疎水性効果が存在しない乾燥相間から、疎水性相互作用が著しい液相に転移しなければならない。これらの２層間内で、多くの短命の遷移状態が形成される。これらの遷移状態は短命であるが、それら自体独特の特性を有する。水を乾燥洗浄剤に添加すると、同様な遷移が観察される。即ち、溶液は、最終的に『清澄な』安定相に落ちつく前に、『濁った』中間相を通過する。
液相ＰＴアッセイと乾燥試薬ＰＴアッセイとのキーとなる相違点は、凝固検査サンプルの因子VII（a）成分が、液相検査では中間体トロンボプラスチン遷移状態に暴露されておらず、よってそれらの影響を受けない点である。その一方、乾燥試薬プロトロンビン時間検査において、凝固検査サンプルの因子VII（a）成分は、これらの中間体状態に暴露されている。
従来の液相ＰＴアッセイと乾燥試薬ＰＴアッセイとの第２の相違点は、乾燥試薬検査製品が典型的には、可溶性ポリマー又はタンパク剤を１種以上含んでいる点である。これらは、液体アッセイでの検査化学薬品に関していわゆる不活性である（プロトロビン時間検査に対して凝固『中性』である）が、乾燥試薬検査を適切に作用させる役割を有している。このような薬剤を用いて、液体サンプルの乾燥試薬キャリヤへの吸い上げ（uptake）を調節し、検査成分の拡散を制御し、乾燥試薬検査化学物質の溶解を助長するか、又は乾燥試薬検査成分の長期貯蔵安定性を助長することができる。そのような薬剤として、単純なポリマー、例えばヒドロキシルプロピルセルロース、ガントレズ（gantrez）、ポリビニルアルコール、及びポリエチレングリコールなどがあげられる。タンパク質、例えばウシ血清アルブミンなども用いる。グルコースのような糖、トレハロース、スターチ又はデキストランのようなポリサッカライドも、これらの目的で用いられる。トリトンX-100（登録商標Triton X-100）などのような洗浄剤も用いられる。
そのような凝固『中性』薬剤は適切な乾燥試薬検査作用に必要であるが、再水和プロセスの間、トロンボプラスチンの構造状態に影響を与えることができる。特に、そのような薬剤は、再水和プロセスの間、トロンボプラスチン感受性（凝固因子VII（a）との相互作用能）に負の方向に衝撃を与えることができる。不幸なことに、精製天然トロンボプラスチンについて、初期の再水和後に数分間形成される中間遷移状態のいくつかは、異常な感受性を示す機能的なトロンボプラスチンとしてのプロトロンビン時間サンプルであるようである。これは、乾燥試薬アッセイの臨床的な利用を減少させる。
しかし、予期せぬことに、組換えトロンボプラスチンを使用する乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイが異常にうまく作用することがわかった。ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチンをベースとする乾燥試薬アッセイは、従来のトロンボプラスチンを用いて典型的に得られる感受性における特有の変化を示さない。結果として、これらのアッセイは、内部サンプル分散を増加させずに、異なるプロトロビン時間でのサンプル間の向上した識別力をもたらす。これにより、アッセイの正確さが増大する。
組換えトロンボプラスチンを使用するプロトロンビン時間アッセイの向上した性能は、ｒ−ＤＮＡ試薬の純粋な特性に直接関連するようである。精製天然トロンボプラスチンの複合体組成物は、再水和の際に生じる非常に多くの中間遷移状態を生じる。一方、比較的単純で、特性が明確となっている、組換えトロンボプラスチンの組成物は、再水和の際、ほとんど中間遷移状態とならない。結果として、異常な感受性を有するトロンボプラスチンの中間遷移形態をもたらす確率が減少する。
また、トロンボプラスチンは、乾燥及び液体状態の相転移を行うものとして概説されている。より純粋で、より均一な出発材料（組換えトロンボプラスチン）は典型的に、純粋さが欠け、均一でない材料（従来のトロンボプラスチン）より、一層鋭く、よりはっきりした相転移を行うであろう。
トロンボプラスチンが再水和されるとき、異常な中間遷移状態を生じる物質がない乾燥トロンボプラスチン、特に、脳抽出物から精製したトロンボプラスチンに見出されるそのような異常なトロンボプラスチン遷移状態物質がない乾燥トロンボプラスチンをプロトロンビン時間検査に用いたとき、検査サンプルがより小さなさまざまな中間トロンボプラスチン遷移状態に暴露され、初期『不活性』無水和トロンボプラスチンとその後の活性で完全に水和したトロンボプラスチンとの間でより鋭い遷移が生じるという、ともかく、驚くべき、信じがたい結果が得られる。双方の効果は好ましく、かつ双方の効果により異なるプロトロンビン時間値を有するサンプル間で、より大きな識別力を有する乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイをもたらす。このような検査を、正確さを増大させて行う。
【図面の簡単な説明】
図１は、液相プロトロンビン時間アッセイの感受性における異なるトロンボプラスチンによる効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常のトロンボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92である組換えトロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相対感受性を示し、レベルII制御血漿とレベルＩ制御血漿とで得られたプロトロンビン時間差を秒で表している。ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチンの感受性は、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線となる。
図２は、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイにおける異なるトロンボプラスチン配合物による効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常のトロンボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92である組換えトロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相対感受性を示し、レベルII制御血漿とレベルＩ制御血漿とで得られたプロトロンビン時間差を秒で表している。組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線からはずれていることに注意を要する。
図３は、反応キュベット内の凍結乾燥トロンボプラスチンからなる、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合物による効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常のトロンボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92である組換えトロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相対感受性を示し、レベルII制御血漿とレベルＩ制御血漿とで得られたプロトロンビン時間差を秒で表している。組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線上にあることに注意を要する。
図４は、液相プロトロンビン時間アッセイと、乾燥試薬プロトロンビン時間検査片アッセイとの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合物による効果を直接比較している。『Ｘ』軸には、液相アッセイにおいて、３つの通常のトロンボプラスチン及び１つの組換えトロンボプラスチンを用いる、レベルＩ制御とレベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。『Ｙ』軸は、同じトロンボプラスチンを用いる、乾燥試薬検査片アッセイにおける、レベルＩ制御とレベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。再度、組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線からはずれていることに注意を要する。
図５は、液相プロトロンビン時間アッセイと、単純化乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイとの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合物による効果を直接比較している。『Ｘ』軸には、液相アッセイにおいて、３つの通常のトロンボプラスチン及び１つの組換えトロンボプラスチンを用いる、レベルＩ制御とレベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。『Ｙ』軸は、同じトロンボプラスチンを用いる、単純化乾燥試薬アッセイにおける、レベルＩ制御とレベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。再度、単純化乾燥試薬アッセイに対する、組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線上にあることに注意を要する。
特定の態様の説明
本発明の改良検査製品は、未希釈化血液又は血漿を塗布するのに好適な検査製品に固定した乾燥合成トロンボプラスチン配合物を有する。検査製品は通常、サンプルの吸い上げ（uptake）及び分散を助長するのに用いる乾燥凝固中性剤も含んでおり、サンプル塗布と、検査製品内での凝固の開始との間で経過する時間を検知する検知メカニズムで使用することができる。
トロンボプラスチンが検査サンプルで再水和される間、乾燥合成トロンボプラスチンは、プロトロンビン時間反応についての高感受性及び高特異性を維持するように選択される。特に、トロンボプラスチンを再水和するとき、異常な中間遷移状態を引き起こす物質を実質的に存在しておらず、より特に、脳抽出物から精製したトロンボプラスチンに見出される異常作用トロンボプラスチン遷移状態物質を存在していない。水性媒体での組織因子−脂質トロンボプラスチン複合体の溶解を促進する脂質フラクションを用いて、純粋組織因子配合物の再脂質化（relipidation）により、トロンボプラスチンを調製するのが好ましい。最も好ましい態様としては、組換えＤＮＡ合成ヒト組織因子を用いて、トロンボプラスチンを調製する。例示の乾燥合成トロンボプラスチンは、バクスターヘルスケア社（Baxter Healthcare Corporation, Dade Davision, Miami, Florida）から購入可能なイノヴィン（Innovin商標）トロンボプラスチンのような再脂質化（relipidated）組換えヒト組織因子である。
固相は、非吸水又は吸水構造であってもよい。非吸水構造は典型的には、検査する血液又は血漿サンプルを受け入れる、不連続キャピラリー流通経路を有する非透過性構造であろう。乾燥トロンボプラスチン及び任意に含めてもよい凝固天然剤を、キャピラリー流通経路の壁にコートし、それにより、サンプルがキャピラリー作用で吸い上げられると、トロンボプラスチンが再水和される。
吸水構造は、液体を吸収でき、所望のアッセイを行うのに必要な試薬を乾燥形態で含むことができる材料からなっていてもよい。紙、メチルセルロース、及び多孔性ポリマー等を含む、広範な吸水マトリクス材料を用いることができる。小さなサンプルを分析する好ましい態様として、吸水マトリクスは、血液細胞、特に赤血球（赤血球）を排除するが血液血漿及びタンパクを侵入させる孔の寸法を有する、親水性（吸水性）、非膨潤ポリマー性マトリクス材料からなる多孔性膜構造であろう。膜は、ミクロン（μｍ）オーダーの幅を有する曲がりくねった網目状チャネルからなる発泡状構造を有する単一の、連続ポリマー性材料からなる。曲がりくねった網目状チャネルは、チャネルの空隙により占められる『孔体積』が全膜体積のかなりのパーセンテージ、典型的には10％以上で、『密に充填され』ている。すべての反応化学、及び次のシグナル発生が孔体積で生じるので、強いシグナルを得るのに高い孔体積が望ましい。平均チャネル長が長いと、反応化学が生じる膜のゾーンと、膜の表面上にある過剰のサンプルとの間で増大した隔離をもたらす傾向にあるので、（核孔（nucleopore）膜で得られる短くて直接の孔のような）直線状で直接的な孔より、曲がりくねった網目状チャネルが望ましい。これにより、適用するサンプルの体積変化に対して、系を感受性の少ないものとすることができる。
多孔質膜構造は、多孔質マトリクスの内部に入っている血漿の凝固を引き起こし、血液の凝固能の指標としての検知信号をもたらすのに必要な試薬を組み込むことになるであろう。多孔質膜のポリマー性マトリクス材料が誘発される凝固経路と実質的に相互作用がないことは、本発明にとって特に重要である。特に、ポリマー性マトリクス材料は、表面効果、相互作用、及び初期化経路の凝固又は不活性成分を誘発するであろう人工物からフリーであるべきである。凝固経路の意図しない初期化は、間違った正の決定をもたらし、酵素不活性は、間違った負の決定をもたらすであろう。よって、ポリマー性マトリクス材料は、膜内に発生する凝固反応での効果を推進しないか又は減衰させることが重要である。膜が凝固検査での使用に許容できるか否かを決定するのに用いる基準が、共に係属中の出願、出願番号07/874,667号に詳細に記載してあり、この開示内容すべてが参考として本明細書に含まれる。血液凝固アッセイを行うのに特に好ましいポリマー性マトリクス材料は、フィルトライト−メンテック社（Filterite-Memtec, 9690 Deeveco Road, Suite 7, Timonium, Maryland 21093,カタログ番号BTS-25）から購入可能な0.45μｍ非対称ポリスルホン膜材料である。
凝固中性剤は、液体サンプルが固相に吸い上げられるのを増大する一方、測定したプロトロンビン時間に効果をほとんど又は全く示さないように選択される。好適な薬剤には、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質；ヒドロキシルプロピルセルロース、ガントレズ、ポリビニルアルコール、及びポリエチレングリコールのようなポリマー；グルコース及びトレハロースのような糖類；スターチ及びデキストランのようなポリサッカライド；及びポリオキシエチレンエーテルのような界面活性剤が挙げられる。
膜をさらに加工して検査片にする。この検査片は、膜のサンプル塗布面側に、典型的にはギャップにより離れた、空間的に離隔した電極の形態のカバー構造、及び膜のその反対側に透明片支持体を有する。
使用の際、サンプルを膜のサンプル塗布面に塗布するとき、37℃にする検査片保持ステージを備え、かつ電極間の抵抗降下をモニターするのに付いている手段を備えた蛍光検知器内に検査片を置く。その後、蛍光検知器は、膜の下方面上に観察される蛍光について一連の蛍光測定を行う。そのような検査製品及び検知器を作る、より詳細な基準は、共に係属中の出願、出願番号08/003,771号に詳細に記載してあり、この開示内容すべてが参考として本明細書に含まれる。
トロンボプラスチン配合物は、存在又は不存在に関して、もしくは機能検査で異常作用中間トロンボプラスチン遷移状態物質に関して検査することができる。これを行うために、トロンボプラスチンのサンプルを水溶液に溶解し、異なる外因性凝固経路活性（プロトロンビン時間）を有する、因子VII／VII（a）を含む血液又は血漿を用いて、トロンボプラスチンの完全に水和化挙動を液相プロトロンビン時間検査で特徴づけ。次に、問題となるトロンボプラスチン配合物の水和化サンプルを乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイに組み込む。それには、１種以上の凝固中性剤をさらに含んでおり、乾燥試薬アッセイの作用を助長する。乾燥試薬アッセイでの水和化トロンボプラスチンサンプルの挙動を、異なる外因性凝固経路活性を有する、因子VII／VII（a）含有血液又は血漿サンプルでそれを再水和することにより、評価する。異なるプロトロンビン時間のサンプル間で不連続とする乾燥試薬アッセイの能力が、液相プロトロンビン時間アッセイに比較して減ずるならば、トロンボプラスチンサンプルが、異常作用中間トロンボプラスチン遷移状態物質を有するとみなされる。
実験
トロンビン基質：Boc-Val-Pro-OH及びTos-Gly-Pro-OHをバケム・バイオサイエンス（Bachem Bioscience, Philadelphia, PA）から購入した。マンゲルら（Mangel, et al.（米国特許第4,557,862号及び同第4,640,893号））の方法にしたがって、Boc-Val-Pro-OH及びTos-Gly-Pro-OHをそれぞれローダミン110に結合させることにより、（Boc-Val-Pro-Arg）2-ローダミン110及び（Tos-Gly-Pro-Arg）2-ローダミン110を調製した。
膜：非対称ポリスルホン膜を、メンテック社（Memtec Corporation, Timmonium, MD）から得た。
トロンボプラスチン：デード（Dade）トロンボプラスチンＣ、Ｃプラス、ＩＳ、及びイノヴィン（Innovin）（組換えＤＮＡ源から調製したヒトトロンボプラスチン）をバクスターヘルスケア社（Baxter Healthcare Corporation, Miami, Florida）から得た。
制御血漿：市販入手可能な制御血漿を、シグマ（Sigma）から得た。これらは、C-7916レベルＩ凝固制御（活性化部分的トロンボプラスチン時間及び通常限界内のプロトロンビン時間）、C-8916レベルII擬固制御（活性化部分的トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間に対する穏やかに上昇した値）、及びシグマC-9916レベルIII凝固制御（活性化部分的トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間に対する厳しく上昇した値）であった。
用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、シグマA 3294、プロテアーゼ−フリーフラクションＶパウダーであった。
膜調製：特記しない限り、試薬溶液、即ち『ディップス（“dips”）』は、0.1M HEPES pH7.4、10mM CaCl2、20mg/Mlシグマプロテアーゼフリーウシ血清アルブミン、87-89%加水分解ポリビニルアルコール50mg/Ml（MW 13,000-23,000, Aldrich Chemical Company）、40%標準溶液の等価物を得るために調製した凍結乾燥トロンボプラスチン、及び蛍光トロンビン基質2x10-4Mからなっていた。溶解を促進するために、ローダミン-110ベースの蛍光トロンビン基質を50%イソプロパノールの10Xストック溶液に予溶解した。典型的には、まずＢＳＡ及びＰＶＡ成分を溶解することにより、溶液を製造した。これら生物学的に活性な成分に対して可能な限りダメージを与えないために、トロンボプラスチン及びトロンビン基質を最後に添加した。
膜の片面（大きな孔、透過側）を試薬ディップ表面に約５秒間優しく接触させることにより、膜をコートした。過剰物を優しく拭い、その後、コートした膜を、機械的対流式オーブン内で50℃で15分間、即座に空気乾燥した。その後、乾燥した膜を使用するまで、室温又は４℃でシリカゲル乾燥剤を備える密封した容器に入れて保存した。
測定基礎研究の間、蒸発を防止するために、３Ｍ 415両面テープを用いて、調製した膜を１ｍｍ厚のアルミホイルでカバーした10ｍｍ厚の透明スチレン上に置いた。サンプルを透明スチレン層側から観た。
測定器：乾燥試薬プロトロンビン時間膜を、25ナノメーター帯幅を有する550ナノメーターのフィルターを備えた装置で観察した。試料を、25ナノメーター帯幅を有する550ナノメーターのフィルターを通したタングステンランプで照明した。この装置は、加熱試薬ステージをさらに有し、アッセイの間、膜を37℃に保持した。
装置双方は、ジーメンス（Siemens）BPW-34Bフォトディテクターを用いた。フォトディテクターからの出力をアンプで増幅し、12ビットアナログデジタル変換器で編集し、ＩＢＭコンパチブルパーソナルコンピュータに記録した。
参照装置：参照プロトロンビン時間値をＭＬＡエレクトラ（Electra）750凝固メーターを用いて得た。
実施例１：液体及び乾燥試薬プロトロンビン時間検査における異なるトロンボプラスチン型の効果。この実験において、ＩＳＩ評価点が1.2〜2.9の３つの通常のトロンボプラスチン、及びＩＳＩ評価点が0.92の１つの組換えトロンボプラスチンを用いて、プロトロンビン時間検査を行った。トロンボプラスチンを少量に分け、１つ目を液相プロトロンビン時間アッセイを行うのに用い、２つ目を乾燥プロトロンビン時間検査片を調製するのに用いた。その後、プロトロンビン時間反応を、これらの検査片を用いて行った。用いたトロンボプラスチンを表１に示す。
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その後、液相アッセイ及び乾燥試薬アッセイの双方を、シグマレベルＩ凝固制御（公称ＩＮＲが1.0）とシグマレベルII凝固制御（公称ＩＮＲが約3.0）とでテストした。液相アッセイを、検査管型反応キュベットでの濁度変化をモニターすることにより光学的に血餅形成を測定するＭＬＡエレクトラ750装置で行った。
共に係属中の出願、出願番号第08/003,771号に記載されているように、サーモスタット制御の光学的蛍光測定で乾燥試薬アッセイを行った。その他の実験（示していない）は、サンプルの初期塗布と、標準化蛍光強度が最大値（時間０での蛍光強度をゼロとし、最大蛍光の蛍光強度を１とする）の10％を最初に越えた時間との間で経過した時間、Time10%Max又は（Ｔ10%）とする、その時間が、古典的な、液相、プロトロンビン時間値と本質的に等価である結果を得たことを示している。言及しない限り、乾燥試薬のすべての結果は、このＴ10%値をベースとしている。
液相及び乾燥試薬プロトロンビン時間検査で得られた、制御レベルIIとレベルＩプロトロンビン時間値との差を、その後、トロンボプラスチン試薬の公称液相ＩＳＩ評価値に対してプロットした。液相の結果を図１に示し、乾燥試薬の結果を図２に示す。見ればわかるように、液相プロトロンビン時間の結果は、古典的なＩＳＩ感受性計算に追従している。ＩＳＩが2.9から0.92に減少すると、（より感受性がよくなり）、レベルIIとレベルＩとのプロトロンビン時間値を区別する試薬系の能力が連続的に増大する。通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線を、ＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンはほとんど正確にこの曲線と合致する。
一方、乾燥試薬の結果は全く異なっている。液相の結果と比較して、通常のトロンボプラスチンがＩＳＩ 1.2〜2.9の間で変化するとき、試薬の感受性においてほんの少しの増加しか存在しない。通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンは予期した挙動から鋭い偏差を示す。通常のトロンボプラスチン活性の外挿をベースとして、予期したもの以上の感受性である。
実施例２：単純化乾燥試薬アッセイにおける異なるトロンボプラスチン型の効果。理想の挙動からの乾燥状態でのトロンボプラスチンの偏差が、すべて再水和効果によるものであるのか、又は乾燥トロンボプラスチンとその他の乾燥試薬検査成分との間の相互作用によるのかを決定するために、この実験を行った。
これを行うのに、凍結乾燥トロンボプラスチンのサンプルを、再水和せずに、かつ乾燥試薬プロトロビン時間検査で典型的に用いられるその他の検査化学物質（ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール等）に暴露させずに、ＭＬＡエレクトラ750反応キュベットに直接置いた。これら凍結乾燥トロンボプラスチンパウダーを、制御Ｉ及び制御II血漿で直接再水和し、希釈して、トロンボプラスチンが通常の液相形態で用いると通常得られるであろう有効な濃度を達成した。サンプルの存在下で再水和したトロンボプラスチンで得られたプロトロンビン時間値を、その後測定した。結果を図３に示す。
単純化乾燥試薬アッセイにおいて、レベルIIとレベルＩプロトロンビン時間値を区別するのに試薬系の能力が連続的に増加することが、この結果からわかる。通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンはこの曲線にほとんど正確に合致している。
この結果は、通常のトロンボプラスチンと、乾燥試薬片に通常組込まれているその他の化学物質又は片マトリクスそれ自身との間で生じる相互作用が、この乾燥試薬アッセイでの通常のトロンボプラスチンの比較的低い性能に依ることを示唆している。
実施例３：異なる型のトロンボプラスチンを用いて得られた乾燥試薬アッセイと液相アッセイとの速度論における直接比較。
トロンボプラスチンの型による差異を直接観測できるかを見るために、実施例１及び実施例２を繰り返した。このとき、液相アッセイでのレベルＩ及びレベルII制御血漿間のプロトロンビン時間速度論での差を、乾燥試薬検査片プロトロンビン時間アッセイで得られた同じ差、及び実施例２で用いた単純化乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイで得られた同じ差と直接比較した。乾燥検査片アッセイを液相アッセイと直接比較して得られた結果を図４に示す。また、単純化乾燥試薬アッセイと液相アッセイとを直接比較して得られた結果を図５に示す。
この結果は初期の発見を確信させる。乾燥検査片アッセイでの、通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンは予期した挙動から鋭い偏差を示す。通常のトロンボプラスチン活性をベースとした、予期したもの以上の感受性である。
同様に、単純化乾燥試薬アッセイでの、通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線を、ＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンは、この曲線にほぼ正確に合致する。
これらの結果は再度、通常のトロンボプラスチンと、乾燥試薬片に通常組込まれているその他の化学物質又は片マトリクスそれ自身との間に生じる相互作用が、この乾燥試薬アッセイでの通常のトロンボプラスチンの比較的低い性能に依ることを示唆している。
実施例４：乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイの正確性におけるトロンボプラスチンの異なる型の効果。この実験で、試薬片を製造し、シグマレベルＩ及びレベルIIの制御血漿で10回検査した。これらのアッセイから得られた、予想ＩＮＲ値を、その後次の式を用いて算出した。
ＩＮＲ＝（Time10%Max／Timeref）ISI
式中、Time10%Maxは、レベルII制御血漿で蛍光強度がその最大レベルの10％に最初に達成するのに要した時間（このアッセイにおける古典的なＰＴ時間に密接に対応する）であり、Timerefは、通常レベルＩ制御血漿で蛍光強度がその最大レベルの10％に達成するのに要した時間（このアッセイにおける制御ＰＴ時間に密接に対応する）であり、ＩＳＩ値は、既知のＩＮＲ値を有する参照血漿に対する特定の片のロットの性能を適正に算出するのに選択される。
４つの片のロットで得られたＩＮＲ結果の変数係数（ＣＶ）を以下に示す。これは、制御II血漿を10回用いて得た。効果がアウトライアーによって歪まないかを見るために、各々のサンプルから最も極端なアウトライアーを無視して、ＣＶ値を再度計算した。これを表２に示す。
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組換えトロンボプラスチンの液相ＩＳＩの評価値は、Dade IS配合物の液相ＩＳＩの評価値とほとんど同じであるが、組換えトロンボプラスチンを用いる乾燥試薬アッセイは、通常のトロンボプラスチンを用いた乾燥試薬アッセイと比較して、著しく正確であったということに注意を要する。
実施例５：  臨床検査において、乾燥試薬プロトロンビン時間検査片で得られた、正確さにおける、トロンボプラスチンの異なる型の効果。この実験において、Dade Innovin（商標）組換えトロンボプラスチン、又はDade C通常トロンボプラスチンをそれぞれ用いて、プロトロンビン時間検査片の２つのバッチを先述のように製造した。その後、これらの片を、25人の患者の臨床検査に用いた。各々のトロンボプラスチン配合物について、各々の患者から２回のサンプルを行い、各々の繰り返しのサンプル間の一致を算出した。組換えトロンボプラスチン試薬に対して、２つの繰り返し間のＲ2相関係数は、0.965であった。それに対して、通常のトロンボプラスチン配合物を用いて得られた２つの繰り返し間のＲ2相関係数は、たったの0.663であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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