(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
摘出された所望の臓器の脈管系又は尿管を介した注入領域に所望の遺伝子を導入する方法であって、該所望の遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を目的とする臓器の脈管系又は尿管に注入し、該臓器全体にエレクトロポレーションを行なうことにより該注入領域に該発現ベクターをex vivoで導入する工程を含む方法。
【請求項２】
該臓器全体にエレクトロポレーションを行なう工程が、両側に電極を装備したタブに臓器全体を溶液で浸した状態でエレクトロポレーションを行なう工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脈管系又は尿管を介した注入領域が、血管近傍、間質領域、上皮細胞周囲である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
脈管系又は尿管を介した注入領域が、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、間質系細胞を含む領域である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
所望の臓器が腎臓である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
臓器移植時の拒絶反応を抑制することができる移植臓器を準備する方法であって、臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を、摘出されたドナーの移植臓器の脈管系又は尿管に注入し、該臓器全体にエレクトロポレーションを行なうことにより該注入領域に該発現ベクターをex vivoで導入する工程を含む方法。
【請求項７】
臓器移植時の移植臓器を長期に生着させることができる移植臓器を準備する方法であって、臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を、摘出されたドナーの移植臓器の脈管系又は尿管に注入し、該臓器全体にエレクトロポレーションを行なうことにより該注入領域に該発現ベクターをex vivoで導入する工程を含む方法。
【請求項８】
該臓器全体にエレクトロポレーションを行なう工程が、両側に電極を装備したタブに臓器全体を溶液で浸した状態でエレクトロポレーションを行なう工程である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
移植臓器が腎臓である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
臓器障害抑制作用を有する蛋白がＨＧＦである、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法により準備された、移植用臓器。
【請求項１２】
摘出された所望の臓器の脈管系又は尿管に所望の遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を注入し、該臓器全体にエレクトロポレーションを行なうことにより、該注入した領域に該発現ベクターをex vivoで導入する工程を含む、該遺伝子が導入された臓器の製造方法。
【請求項１３】
該臓器全体にエレクトロポレーションを行なう工程が、両側に電極を装備したタブに臓器全体を溶液で浸した状態でエレクトロポレーションを行なう工程である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所望の臓器が腎臓である、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脈管系又は尿管を介して遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、該方法を用いて移植臓器の拒絶反応を抑制する方法、および移植臓器の長期生着を促進する方法に関する。
背景技術
ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；肝細胞増殖因子）は成熟肝細胞に対する強力な増殖因子として発見され、既にその遺伝子もクローニングされ、アミノ酸配列も明らかになっている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１２２，１４５０（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４８９，（１９８６），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，２２４，３１１（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３２００（１９９０））。さまざまな研究により、ＨＧＦは、肝再生因子として肝障害の修復再生に働くだけでなく、種々の薬理作用のあることが明らかとなっており、肝障害治療剤の他に、腎疾患治療剤としても期待されている。実際、ネフローゼ自然発症マウスに対して、ＨＧＦの腹腔内投与が強力な線維化因子であるＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；トランスフォーミング成長因子−β）の抑制を介して、腎の線維化の治療薬として薬効を示すことが明らかとなっている（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，５７，９３７，（２０００））。
現在の腎移植における最大の問題は慢性拒絶反応による腎機能廃絶（腎死）である。この慢性拒絶反応は阻血など移植時のダメージによって引き起こされることが既に明らかになっている（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４：１９０，１９９７）。一方、わが国の死体腎移植では心停止後に腎を摘出するため、結果的に長時間の阻血となり、その結果慢性拒絶反応を引き起こし、腎機能の長期予後が不良となっている。また生体腎移植においても、提供者の半数以上は６０才以上であり、このような高齢の腎臓は当然予備力も少なく、やはり慢性拒絶反応に繋がっている。慢性拒絶反応による腎機能廃絶を阻止し、移植腎生着率の改善を目的とした新たな治療薬としてＨＧＦが期待されている。移植腎の慢性拒絶モデルであるＦｉｓｈｅｒラットの腎を移植したＬｅｗｉｓラットは、３２週後には約半数の移植腎が廃絶するが、このモデルラットに対してＨＧＦを、移植後４週間連日静脈内投与を行うことにより、その後、ＨＧＦを投与せずとも３２週まで全例移植腎が保たれており、ＨＧＦが移植腎保護作用を有することが明らかとなっている（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３１：８５４，（１９９９））。この報告は、移植時の初期ダメージをＨＧＦにより抑制すれば、その後無治療でも移植腎の生着率を改善させるという点で意義深い。
一般的に蛋白質の投与には、静脈内投与など全身投与が行われている。しかしながら、ＨＧＦは血中半減期の短い蛋白質であり、しかも、全身投与ではＨＧＦの持つ多彩な薬理作用が他臓器に及ぼす影響は少なくないと考えられる。したがって、ＨＧＦを腎臓に最も効果的に作用させる方策としては、腎臓局所にしかも持続的に作用させる方法が望ましいと考えられる。この問題を解決する方法として、腎臓のみにＨＧＦ遺伝子を導入し、ＨＧＦを腎臓局所のみで持続的に作用させる方法が考えられる。ＨＧＦは肝において速やかに代謝されることから、この方法は筋肉などの他臓器にＨＧＦ遺伝子を導入し、産生されたＨＧＦ蛋白を腎臓に作用させるという方法に比べて、（１）必要とされる導入遺伝子が少量でよい、（２）他臓器への影響を軽減できるという点で優れていると考えられる。また、遺伝子導入は、蛋白製剤に必要とされる多段階の精製工程を必要としないというメリットがある。蛋白製剤の持続注入は、一定の血中濃度を維持できるという長所はあるが、長期間のカテーテル留置が必要であり、煩雑な手技や感染の危険性を伴うこと、患者の行動を抑制しなければならないという短所がある。
腎臓をターゲットとした遺伝子導入法は、これまでに、本発明者らが報告したＨＶＪリポソーム法を用いて腎動脈から注入する方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５９７（１９９３）；Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０：１４８，（１９９６））やアデノウイルスベクターを用いて腎臓を還流する方法（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ  ３：２１，（１９９６））が報告されているが、いずれも遺伝子導入法としてウイルスを用いることから、安全性の面での問題が残されている。一方、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法はこれまでｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遺伝子導入法として用いられてきたが、最近になり、エレクトロポレーション法をｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に用いることが報告され、有効な遺伝子導入法であることが明らかにされつつある（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，８６７，（１９９８））。しかしながら、これまでの報告では、筋肉や腫瘍などの局所に遺伝子を注入し、その近傍に針型の電極を用いて電気刺激を与えるものであり、組織障害がみられるなどの欠点がある。また、遺伝子発現部位が遺伝子を注入した局所に限局するため、移植腎全体に所望の遺伝子を発現させることはできない。一方、ＨＧＦを用いた遺伝子治療方法としては、肝硬変モデルラットにＨＶＪリポソームを用いて筋肉に遺伝子を導入し、肝硬変に治療効果があったとする報告（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２２６，（１９９９））があり、またｂａｌｏｏｎ  ｉｎｊｕｒｙモデルに治療効果があったことが報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１６６４，（２０００））されているが、移植腎に対して、ＨＧＦ遺伝子を導入し、移植腎の生着率を検討した報告はない。また、エレクトロポレーション法を用いてｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入を行い、効果を検討したものもない。
発明の開示
本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて脈管系又は尿管を介して遺伝子を導入する方法に関する。特に好ましい態様として、本発明は、臓器移植に際し、エレクトロポレーション法を用いて所望の遺伝子を臓器全体に導入し、発現させる方法を提供する。特に、移植腎の保護作用を目的として、エレクトロポレーション法を用いるＨＧＦのｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療法を提供する。本発明の移植腎に対するエレクトロポレーション法を用いたＨＧＦのｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療法は、遺伝子が移植腎のみに導入され、目的とする腎臓局所に持続的にＨＧＦを作用させることが可能であるため、静脈投与などの全身投与に比べて副作用が軽減できるという効果を有する。また、本発明ではウイルスベクターを用いる必要がないことから安全性であり、蛋白製剤の投与に比べて、コスト面でも有利である。
上記の問題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明者らは、摘出した腎臓の動脈および／または静脈内あるいは尿管内に所望の遺伝子を含む溶液を満たして該遺伝子を導入することに成功した。特に摘出した腎臓の動脈および／または静脈内あるいは尿管内に所望の遺伝子を含む溶液を満たし、摘出腎全体にエレクトロポレーションを行うと、所望の遺伝子がすべての糸球体ならびに間質細胞に高率に導入されることを明らかとした。本方法は、糸球体ならびに間質細胞に均一に所望の遺伝子を導入する方法として安全かつ有効な方法である。
本方法を用いてＨＧＦ遺伝子等の臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を摘出腎に導入した後、遺伝子導入を行った腎臓を移植すれば、腎移植における拒絶反応の抑制に有効である。本ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入方法は、腎臓に直接遺伝子を導入するｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入方法に比べていくつかの長所がある。第１に、移植時に腎臓を摘出した後ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子を導入することが可能であるために、他の臓器へ遺伝子導入が回避可能である。第２に、エレクトロポレーションによる導入を行った場合に、エレクトロポレーションのパルス波により生じる電気ショックのヒトへの影響（熱傷や筋攣縮など）が回避可能である。第３に移植手術時等の操作が可能であるため、腎動脈への穿刺およびカニューレの挿入など煩雑な手技は不要である。また、本発明の方法を用いる移植法は、ブタ腎のヒトへの異種移植へも十分応用可能である。
また、本発明を用いた遺伝子導入方法は、対象臓器において望ましくない蛋白、例えば臓器の細胞増殖抑制による線維化等を引き起こす蛋白に対するＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅの導入にも使用することができる。
すなわち、本発明は、脈管系又は尿管を介して遺伝子を導入する方法に関し、より具体的には、
（１）所望の臓器の脈管系又は尿管を介した注入領域に所望の遺伝子を導入する方法であって、該所望の遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を目的とする臓器の脈管系又は尿管に注入し、該注入領域に該発現ベクターを導入する工程を含む方法、
（２）注入領域への該発現ベクターの導入をエレクトロポレーションにより行う、（１）に記載の方法、
（３）脈管系又は尿管を介した注入領域が、血管近傍、間質領域、上皮細胞周囲である、（１）又は（２）に記載の方法、
（４）脈管系又は尿管を介した注入領域が、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、間質系細胞を含む領域である、（１）又は（２）に記載の方法、
（５）所望の臓器が腎臓である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の方法、
（６）臓器移植時の拒絶反応を抑制する方法であって、
（ａ）臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を、ドナーの移植臓器の脈管系又は尿管に注入し、該注入領域に該発現ベクターを導入する工程、および
（ｂ）該移植臓器をレシピエントに移植する工程、を含む方法、
（７）臓器移植時の移植臓器を長期に生着させる方法であって、
（ａ）臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を、ドナーの移植臓器の脈管系又は尿管に注入し、該注入領域に該発現ベクターを導入する工程、および
（ｂ）該移植臓器をレシピエントに移植する工程、を含む方法、
（８）工程（ａ）における注入領域への該発現ベクターの導入をエレクトロポレーションにより行う、（６）又は（７）に記載の方法、
（９）移植臓器が腎臓である、（６）から（８）のいずれか一項に記載の方法、
（１０）臓器障害抑制作用を有する蛋白がＨＧＦである、（６）から（９）のいずれか一項に記載の方法、
（１１）ＨＧＦをコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、（６）に記載の方法により臓器移植時の拒絶反応を抑制するための医薬組成物、
（１２）ＨＧＦをコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、（７）に記載の方法により臓器移植時の移植臓器を長期に生着させるための医薬組成物、
（１３）（６）又は（７）の工程（ａ）における注入領域への該発現ベクターの導入をエレクトロポレーションにより行う、（１１）又は（１２）に記載の医薬組成物、
（１４）臓器が腎臓である、（１１）から（１３）のいずれか一項に記載の医薬組成物、
（１５）（１１）から（１４）のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット、
（１６）さらに、ＨＧＦをコードする遺伝子を含むベクターを移植腎に導入する方法を記載した指示書とを含む、（１５）に記載のキット、を提供するものである。
導入する遺伝子は、摘出臓器を構成する細胞内で発現させ得る限り特に制限はなく所望の遺伝子であってよいが、摘出する臓器を構成する細胞内で作用するプロモーターおよび／またはエンハンサーと機能的にリンクしていることが好ましい。特にアクチンプロモーターを組み込んだｐＡＣＴベクター、サイトメガロウィルスエンハンサーおよびアクチンプロモーターを組み込んだｐＣＡＧＧＳベクターが特に好ましいが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに適当な細胞特異的に発現するプロモーターを組み込んで使用してもよい。遺伝子発現期間の延長を目的としてＥｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒウィルスのＥＢＮＡ−１遺伝子、またはｏｒｉＰ配列を組み込んだベクターを使用してもよい。また、所望の蛋白をコードするｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡであってもよい。また、ｒｉｂｏｚｙｍｅをコードする核酸や、ＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ、またはａｎｔｉｓｅｎｓｅ核酸などであってもよい。好適には、導入遺伝子はウィルスの潜伏感染装置を組み込んだベクターに組み込んで用いられる。特にＥＢＮＡ−１遺伝子とｏｒｉＰを組み合わせることにより、単独で用いるよりも有意に高い遺伝子発現を達成することができることが判明した。臓器移植に伴う導入遺伝子としては、臓器移植による組織障害を抑制あるいは修復する分子、たとえば、線維化抑制、アポトーシス抑制、または免疫抑制などに関わる分子をコードする遺伝子を用いることができる。臓器移植による組織障害を抑制あるいは修復する作用を有する蛋白を、本発明において「臓器障害抑制作用を有する蛋白」と称す。特に、腎移植においてはＨＧＦを好適に使用することができる。
所望の遺伝子を含む溶液は、滅菌された水系溶液であれば使用することができる。好ましくは、浸透圧が生理的条件に調整された水系溶液であり、例えば生理食塩水を用いることができる。また、種々の緩衝液も用いることができ、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液を用いることができる。例えば、所望の遺伝子を滅菌された生理的食塩水に溶解した後、フィルター等で濾過して再度滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。
遺伝子は所望の臓器の脈管系又は尿管を介して注入される。脈管系としては、動脈および静脈等が含まれる。目的の臓器を支配する動脈、静脈、および／または尿管等に所望の遺伝子を含む溶液を注入し、好ましくは下記のようにエレクトロポレーションを行うことにより、該遺伝子を注入領域全体に導入することができる。注入領域としては、血管近傍、間質領域、および／または上皮細胞周囲等が挙げられる。これらの領域には、例えば血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、および／または間質系細胞等が含まれうる。本発明の方法により、このような細胞に所望の遺伝子を導入することができる。
特に本発明により、腎動脈から注入された核酸は、腎のメサンギウム細胞に特異的に導入されることが判明した。本発明は、メサンギウム細胞に所望の遺伝子を導入する方法であって、該所望の遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を腎動脈に注入し、該注入領域に該発現ベクターを導入する工程を含む方法を提供する。特にエレクトロポレーションにより発現ベクターを効率的に導入することができる。
本発明の方法は、異種臓器の移植であっても、同種臓器の移植であっても用いることができる。また、本発明の方法が使用できる臓器は、臓器を支配する動脈、静脈、または尿管等が明らかである限り特に制限はなく、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、および肺等に使用することができる。好適には腎臓を用いることができる。臓器は、摘出する前に遺伝子を導入し、その後摘出することもできるが、摘出した後にｅｘ  ｖｉｖｏで所望の遺伝子を導入することが好ましい。摘出前に遺伝子を導入する場合には、動脈、静脈、および／または尿管等から所望の遺伝子を含む溶液を注入することにより当該臓器に所望の遺伝子を満たし、次いで、当該臓器をピンセット型電極で固定し、エレクトロポレーションをすればよい。また、摘出後に遺伝子を注入する場合には、摘出した臓器の動脈、静脈、および／または尿管等にカテーテル等を留置した後、所望の遺伝子を含む溶液を満たし、体外で臓器を電極間にはさみ、エレクトロポレーションをすればよい。その際、適当な溶液で満たしたバスタブ型電極に浸した状態でエレクトロポレーションを行ってもよい。
遺伝子導入法としては、「エレクトロポレーション法」を用いることができる。エレクトロポレーション法用の装置は既に市販されており、これらの装置を適宜用いることができる。好ましくは、トキワサイエンス社スクエアーエレクトロポレーターＣＵＹ２１あるいはＢＴＸ社エレクトロスクエアーポレーターＴ８２０および同等品を用いることができる。
本発明の方法は、生体内（インビボ）または生体外（インビトロ）で実施することができ、例えばヒトおよびその他の哺乳動物の生体外、あるいは非ヒト哺乳動物の生体内において用いられる。
ピンセット型電極を用いてエレクトロポレーションを行う場合、電圧は２５Ｖから１００Ｖまで電圧が高くなるほど導入遺伝子発現の上昇が認められた。高電圧による熱傷を避けるために、電圧は好ましくは２０〜１００Ｖ、より好ましくは４０〜９０Ｖ、さらに好ましくは６０〜７５Ｖで行う。電圧は好ましくはスクエア型で１００ｍ秒程度とし、例えば９００ｍ秒程度の休止をおいて複数回行うことができる。バスタブ型電極を用いてエレクトロポレーションを行うことにより、臓器全体に遺伝子を導入することができる。本発明は、所望の臓器の脈管系又は尿管を介して臓器全体に所望の遺伝子を導入する方法であって、該所望の遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を目的とする臓器の脈管系又は尿管に注入し、エレクトロポレーションにより臓器全体に電気刺激を与えて該発現ベクターを導入する工程を含む方法を提供する。バスタブ型電極を用いる場合には、電圧は３０〜５０Ｖにすることが好適である。
本発明の遺伝子導入法は、特に遺伝子を臓器に導入後、導入遺伝子を長期間持続的に発現させるすぐれた効果を有する。本発明は、所望の遺伝子を臓器で長期間発現させる方法であって、該遺伝子を含む発現ベクターを含む水溶液を目的とする臓器の脈管系又は尿管に注入し、該注入領域に該発現ベクターを導入する工程を含む方法を提供する。この方法により該遺伝子は、注入された脈管系又は尿管を介して、例えば血管近傍、間質領域、および／または上皮細胞周囲に導入される。注入領域への該発現ベクターの導入は、特にエレクトロポレーションにより行うことが好ましい。エレクトロポレーションは、例えばピンセット型電極あるいはバスタブ型電極等を用いることができる。本方法は特に生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での遺伝子導入に適しており、この場合はバスタブ型電極を用いてエレクトロポレーションによりベクターを臓器に導入することが好適である。エレクトロポレーションは、具体的には上記に記載した条件にて実施することができる。導入対象となる臓器としては、上記と同様特に制限はなく腎臓、肝臓、膵臓、心臓、および肺等が挙げられるが、特に腎臓が好ましい。臓器は例えば所望の哺乳動物の臓器であってよいが、ヒトへの移植目的の非ヒト臓器としては例えばブタの臓器が好ましい。本発明に使用されるブタ臓器は、例えばヒト移植時に免疫反応を抑制するために遺伝子改変されたブタの臓器も含まれる。この長期間発現させる方法により、導入遺伝子を例えば３日以上、好ましくは１週間（７日）以上、より好ましくは２週間（１４日）以上、より好ましくは１ヶ月（３０日）以上、より好ましくは２ヶ月（６０日）以上、より好ましくは３ヶ月（９０日）以上にわたって発現させることができる。発現ベクターとしては、特にウィルスの潜伏感染装置を組み込んだベクターあるいは強力な発現ベクターが適している。ウィルスの潜伏感染装置としては、具体的にはＥＢウイルスの潜伏感染装置であるＥＢＮＡ−１遺伝子またはｏｒｉＰ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが好ましい。強力な発現ベクターとしては、ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ  ｖｉｒｕｓエンハンサーおよびｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプロモーターを有する発現ベクターが好ましい。導入する遺伝子に特に制限はないが、臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を導入することにより、臓器の組織障害を長期にわたって抑制することが可能となる。これにより、臓器移植において移植臓器を細胞障害から保護し、長期に生着させることが可能となる。
本発明の遺伝子導入法は、特に臓器移植時の拒絶反応の抑制および／または臓器移植時の移植臓器の長期生着のために有用である。ドナーの移植臓器の脈管系又は尿管を介した注入領域に臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子を導入することにより、移植時の拒絶反応が抑制され、長期生着が可能な臓器を調製することができる。得られた臓器をレシピエントに移植することによって、臓器移植時の拒絶反応を抑制し、また臓器移植時の移植臓器を長期に生着させることが可能になる。本拒絶反応抑制および長期生着の方法は、特に腎移植において好適に用いられる。臓器障害抑制作用を有する蛋白をコードする遺伝子としては特にＨＧＦ遺伝子が挙げられる。「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦを発現しうる遺伝子を指し、当該遺伝子には、発現される蛋白がＨＧＦと実質的に同等の効果をもつ限り、その遺伝子配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていたり、他の塩基配列が一部挿入されていたり、５’末端及び３’末端に他の塩基が結合したような遺伝子も含まれる。かかる「ＨＧＦ遺伝子」としては、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，９６７（１９８９）などに記載の「ＨＧＦ遺伝子」が例示され、これらの遺伝子を本発明で使用することができる。
「ＨＧＦ遺伝子」製剤の投与方法としては、移植腎摘出後、腎動脈から適当な還流液（例えば、緩衝液あるいは生理的食塩水）で還流後、腎動脈あるいは尿管から「ＨＧＦ遺伝子」製剤を注入することができる。また、「ＨＧＦ遺伝子」製剤注入時には、同時に腎静脈を結紮してもよい。還流液あるいは「ＨＧＦ遺伝子」製剤の温度は、４℃から３７℃の適当な温度とするが、３７℃が好ましい。「ＨＧＦ遺伝子」製剤を注入した移植腎は、好ましくはエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行った後、レシピエントの患者に「ＨＧＦ遺伝子」が導入された腎臓を移植することが行われる。「エレクトロポレーション法」は、患者の年齢、体重などにより、適宜調製することができる。「エレクトロポレーション法」に用いる電極としては、適切な溶剤（例えば滅菌された緩衝液あるいは生理的食塩水）で満たした「バスタブ型電極」あるいはピンセット型電極等を用いることができるが、「バスタブ型電極」が特に好ましい。また、「バスタブ型電極」を用いる場合には、腎臓を適当な保護材（例えば、滅菌したガーゼ等）によりカバーすることができる。「エレクトロポレーション法」に用いる電圧は、スクエアー型の電圧を用い、１Ｖから２００Ｖ、とくに３０Ｖから１００Ｖの電圧を１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄかけ、９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止期間をおいて、６回繰り返すことにより、遺伝子導入を行うことが好ましいが、これらの条件は、腎臓のサイズにより、適宜調節することができる。遺伝子導入を行った移植腎は、遺伝子導入後、速やかに４℃に冷却した適当な溶液（例えば、ＵＷ液）にて還流したのち、レシピエントに移植することが好ましい。
製剤中の「ＨＧＦ遺伝子」の含量は、患者の年齢、体重などにより、適宜調製することができるが、通常「ＨＧＦ遺伝子」として、０．１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇから３０ｍｇであり、これを腎移植時に投与するのが適当である。
ＨＧＦをコードするベクターを有効成分とする上記ＨＧＦ遺伝子製剤は、腎移植等の臓器移植時の拒絶反応の抑制および／または移植臓器の長期生着のために使用される医薬組成物となる。本発明はこれら医薬組成物、および該医薬組成物を含むキットを提供する。キットには、ＨＧＦをコードする遺伝子を含むベクター以外に、例えば他の臓器障害抑制作用を有する遺伝子、具体的には線維化抑制、アポトーシス抑制、または免疫抑制などに関わる分子をコードする遺伝子を含むベクターが含まれていてもよい。あるいは、臓器障害抑制作用を有する低分子化合物等が含まれていてもよい。また、キットには例えばＨＧＦをコードする遺伝子を含むベクターを移植臓器に導入するための上記のような投与方法等の記載を含む指示書を添付することができる。
また、本発明を用いた遺伝子導入方法は、対象臓器において望ましくない蛋白、例えば臓器の細胞増殖抑制による線維化等を引き起こす蛋白に対するＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅの導入にも使用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。なお、本明細書に記載された文献は、全て本明細書に組み込まれる。
［実施例１］  ラット腎臓へのＦＩＴＣラベルオリゴＤＮＡの導入（１）
５’端をＦＩＴＣ蛍光でラベルした１２塩基のオリゴＤＮＡ（５’−ＦＩＴＣ−ＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧ−３’／配列番号：１）を、５０μｇ／５００μｌの濃度で緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６；以下ＢＳＳと称す）に融解し、遺伝子導入に供した。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（以下ＳＤと称す）ラット（雄性６週齢）を、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により、麻酔を行った。開腹後、腎を露出し、腎動脈に２４Ｇカテーテル（テルモ社）を挿入し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記オリゴＤＮＡを注入した。オリゴＤＮＡ注入直後に腎静脈をクリップにて結紮した。遺伝子を導入した腎臓をピンセット型電極で挟み、スクエアー型電圧（７５Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、カテーテルを抜去し、刺入部は生体用アロンアルファにて止血した。遺伝子導入１０分後に腎臓を摘出し、蛍光顕微鏡にて観察した。また、腎臓糸球体におけるオリゴＤＮＡの局在を確認するために、ラットメサンジウム細胞のマーカーであるＴｈｙ−１抗原に対する抗体を用いて検討した。図１に示されるように、ＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡは、全ての糸球体と少数の間質細胞の核に導入されていた。尿細管細胞には、全く導入されなかった。また、図２に示したように遺伝子導入を行った腎臓をローダミンラベルした抗Ｔｈｙ−１抗体を用いて染色すると、メサンジウム領域は赤く染色されるが、導入されたＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡの蛍光が黄色に変わっていることから、オリゴＤＮＡが導入された細胞はメサンジウム細胞であることが明らかとなった。
［実施例２］  ラット腎臓へのＦＩＴＣラベルオリゴＤＮＡの導入（２）
５’端をＦＩＴＣ蛍光でラベルした１２塩基のオリゴＤＮＡ（５’−ＦＩＴＣ−ＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧ−３’／配列番号：１）を、５０μｇ／５００μｌの濃度のＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ＳＤラット（雄性６週齢）を、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により、麻酔を行った。開腹後、左腎および左尿管を露出し、尿管に３０Ｇ針（テルモ社）を挿入し、腎動静脈をクリップでクランプした後、上記オリゴＤＮＡを注入した。遺伝子を導入した腎臓をピンセット型電極で挟み、スクエアー型電圧（７５Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入１０分後に腎臓を摘出し、蛍光顕微鏡にて観察した。図３に示されるように、ＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡは、間質細胞の核に導入されていた。
［実施例３］  ラット腎臓へのルシフェラーゼ遺伝子の導入（１）
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウイルスの潜伏感染装置を組み込んだ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作成し、２００μｇ／５００μｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ＳＤラット（雄性６週齢）を、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により、麻酔を行った。開腹後、腎を露出し、腎動脈に２４Ｇカテーテルを挿入し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記発現ベクターを注入した。発現ベクター注入直後に腎静脈をクリップにて結紮した。遺伝子を導入した腎臓をピンセット型電極で挟み、スクエアー型電圧（２５，５０，７５，１００Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、カテーテルを抜去し、刺入部は生体用アロンアルファにて止血した。遺伝子導入４日後に腎臓を摘出し、シービング法にて腎糸球体を単離し、糸球体のルシフェラーゼ活性を測定した。また、同時に糸球体蛋白量を測定し、糸球体におけるルシフェラーゼ発現量を蛋白量にて補正し、遺伝子発現量に対する電圧および電流の影響を検討した。図４に示されるように、２５Ｖから１００Ｖまで電圧が高くなるほどルシフェラーゼ活性は上昇する傾向が見られたものの有意差は認められなかった。また、図５に示されるように電流と遺伝子発現量の間には相関関係は認められなかった。なお、腎糸球体及び尿細管細胞には組織学的な変化は認めなかったが、１００Ｖの電圧では、腎被膜表面に熱傷をみとめたため、以下の検討は７５Ｖの電圧で検討した。
［実施例４］  ラット腎臓へのルシフェラーゼ遺伝子の導入（２）
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウイルスの潜伏感染装置を組み込んだ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作成し、２００μｇ／５００μｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ＳＤラット（雄性６週齢）を、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により、麻酔を行った。開腹後、腎を露出し、腎動脈に２４Ｇカテーテルを挿入し、生理的食塩水で腎臓を潅流後、上記発現ベクターを注入した。発現ベクター注入直後に腎静脈をクリップにて結紮した。遺伝子を導入した腎臓をピンセット型電極で挟み、スクエアー型電圧（７５Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。また、２００μｇの発現ベクターをＨＶＪリポソームに封入したリポソーム溶液を作成し、同様に、リポソーム溶液を腎動脈から注入し、１０分間遺伝子をインキュベートした。遺伝子導入後、カテーテルを抜去し、刺入部は生体用アロンアルファにて止血した。遺伝子導入４日後に腎臓を摘出し、シービング法にて腎糸球体を単離し、糸球体のルシフェラーゼ活性を測定した。また、同時に糸球体蛋白量を測定し、糸球体におけるルシフェラーゼ発現量を蛋白量にて補正し、エレクトロポレーション法とＨＶＪリポソーム法で遺伝子導入効率について検討した。図６に示されるように、エレクトロポレーション法ではＨＶＪリポソーム法に比べて、約６倍の遺伝子導入効率を認めることが明らかとなった。
［実施例５］  ラット腎臓へのルシフェラーゼ遺伝子の導入（３）
エレクトロポレーションにおける遺伝子導入において、導入遺伝子のコンビネーションによる効果が得られるかを検討するために、ＥＢウイルスの潜伏感染装置の１つであるｏｒｉＰ配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクター（ｐｏｒｉＰ−ｃＬｕｃ）、およびもう一つの潜伏感染装置であるＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する発現ベクター（ｐｃＥＢＮＡ）を作成し、ｐｏｒｉＰ−ｃＬｕｃ  １６３μｇとｐｃＥＢＮＡ  １２１μｇを５００μｌのＢＳＳに融解したＤＮＡ溶液あるいは、ｐｏｒｉＰ−ｃＬｕｃ  １６３μｇを５００μｌのＢＳＳに融解したＤＮＡ溶液を遺伝子導入に供した。ＳＤラット（雄性６週齢）を、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により、麻酔を行った。開腹後、腎を露出し、腎動脈に２４Ｇカテーテルを挿入し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記発現ベクターを注入した。発現ベクター注入直後に腎静脈をクリップにて結紮した。遺伝子を導入した腎臓をピンセット型電極で挟み、スクエアー型電圧（７５Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、カテーテルを抜去し、刺入部は生体用アロンアルファにて止血した。遺伝子導入４日後に腎臓を摘出し、シービング法にて腎糸球体を単離し、糸球体のルシフェラーゼ活性を測定した。また、同時に糸球体蛋白量を測定し、糸球体におけるルシフェラーゼ発現量を蛋白量にて補正し、注入遺伝子のコンビネーションによる効果を検討した。図７に示されるように、ｐｏｒｉＰ−ｃＬｕｃ遺伝子単独に比べて、ｐｏｒｉＰ−ｃＬｕｃ遺伝子とｐｃＥＢＮＡ遺伝子のコンビネーションにより、約７倍の遺伝子発現量が認められることが明らかとなった。
［実施例６］  ラット腎臓へのルシフェラーゼ遺伝子の導入（４）
ＥＢウイルスの潜伏感染装置を組み込んだ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクター、あるいは潜伏感染装置を組み込んでいないルシフェラーゼ発現ベクターを作成し、２００μｇ／５００μｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ＳＤラット（雄性６週齢）をＳＬＣより購入し、上記方法にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、カテーテルを抜去し、刺入部は生体用アロンアルファにて止血した。遺伝子導入４，７，１４，２１，２８，４２，５６，６３，７０，および８４日後に腎臓を摘出し、シービング法にて腎糸球体を単離し、糸球体のルシフェラーゼ活性を測定した。また、同時に糸球体蛋白量を測定し、糸球体におけるルシフェラーゼ発現量を蛋白量にて補正し、遺伝子発現期間を検討した。図８に示されるように、遺伝子導入４日後におけるルシフェラーゼ遺伝子発現量は、ＥＢウイルスの潜伏感染装置の有無に関わらず、同程度であったが、ＥＢウイルスの潜伏感染装置を組み込んでいない発現ベクターでは１週間後から発現レベルが減少し、４週目にはほとんど発現を認めないのに対し、ＥＢウイルスの潜伏感染装置を組み込んだ発現ベクターでは、８週目まで４日後と同程度の遺伝子発現量が保たれ、１０週目まで発現量が保たれた。
［実施例７］  ブタ腎臓へのＦＩＴＣラベルオリゴＤＮＡの導入
５’端をＦＩＴＣ蛍光でラベルした１２塩基のオリゴＤＮＡ（５’−ＦＩＴＣ−ＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧ−３’／配列番号：１）を、３ｍｇ／５０ｍｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ミニブタを、麻酔下で開腹後、腎を摘出し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記オリゴＤＮＡを注入した。オリゴＤＮＡを２５ｍｌ注入した後、腎静脈をクリップにて結紮し、さらに２５ｍｌ注入した。遺伝子を導入したブタ腎臓を生理的食塩水で満たしたバスタブ型電極（図１０）に浸し、スクエアー型電圧（３０Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った（図１１）。遺伝子導入後、腎臓を生理的食塩水で潅流し、蛍光顕微鏡にて観察した。図９に示されるように、ＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡは、糸球体と間質細胞の核に導入されていた。
［実施例８］  ブタ腎臓への尿管からのＦＩＴＣラベルオリゴＤＮＡの導入
５’端をＦＩＴＣ蛍光でラベルした１２塩基のオリゴＤＮＡ（５’−ＦＩＴＣ−ＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧ−３’／配列番号：１）を、３ｍｇ／５０ｍｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ミニブタを、麻酔下で開腹後、腎を摘出し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記オリゴＤＮＡを尿管から注入した。オリゴＤＮＡを２５ｍｌ注入した後、腎静脈をクリップにて結紮し、さらに２５ｍｌ注入した。遺伝子を導入したブタ腎臓を生理的食塩水で満たしたバスタブ型電極（図１０）に浸し、スクエアー型電圧（３０Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った（図１１）。遺伝子導入後、腎臓を生理的食塩水で潅流し、蛍光顕微鏡にて観察した。図１２に示されるように、ＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡは、間質細胞の核に導入されていた。
［実施例９］  ブタ腎臓へのルシフェラーゼ遺伝子の導入
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウイルスの潜伏感染装置を組み込んだ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作成し、２４ｍｇ／５０ｍｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ミニブタを、麻酔下で開腹後、腎を摘出し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記発現ベクターを注入した。発現ベクターを２５ｍｌ注入した後、腎静脈をクリップにて結紮し、さらに２５ｍｌ注入した。遺伝子を導入したブタ腎臓を生理的食塩水で満たしたバスタブ型電極に浸し、スクエアー型電圧（３０Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったブタ腎臓を移植し、遺伝子導入４日後に腎臓を摘出し、腎皮質のルシフェラーゼ活性を測定した。また、同時に皮質蛋白量を測定し、腎皮質におけるルシフェラーゼ発現量を蛋白量にて補正し、遺伝子発現量の有無を検討した。図１３に示されるように、ブタ腎皮質において遺伝子発現が明らかとなった。
［実施例１０］  Ｅｇｒ−１  ＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ導入による腎間質障害進展の抑制
Ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ−１（Ｅｇｒ−１）は細胞増殖などに関わる多くのサイトカインの転写を制御し、腎間質線維化の進展に関与する。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法（ＥＰ）を用いた間質細胞へのＥｇｒ−１に対するＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ導入が、腎間質障害進展を抑制し得るか検討した。
ラットＥｇｒ−１  ｍＲＮＡに対するＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ（ＥＤ５）を作成し、ＥＤ５がＥｇｒ−１の発現を抑制し得るかをＮＲＫ細胞を用いて検討した。ラット一側尿管結紮（ＵＵＯ）モデルにおいて、ＥＤ５及びｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＤＮＡ（ＳＣＲ）を経尿管的にＥＰを用いて腎間質細胞に導入し、Ｅｇｒ−１、αＳＭＡのｍＲＮＡ発現及び組織学的検討を行った。
その結果、ＮＲＫ細胞において、ＥＤ５は血清刺激によるＥｇｒ−１発現を抑制した。蛍光ラベルしたオリゴＤＮＡを尿管よりＥＰにて導入し、間質線維芽細胞へのオリゴＤＮＡ導入が確認された。ラットＵＵＯモデルにおいて、ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＤＣ）及びＳＣＲ導入群では間質のＥｇｒ−１及びαＳＭＡ  ｍＲＮＡの強い発現を認めたが、ＥＤ５導入により抑制された。Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｒｏｍｅ染色において、ＤＣ及びＳＣＲ導入群に認められた間質の線維化がＥＤ５導入により抑制された。したがって、ＥＰを用いた腎間質細胞へのＥＤ５等のＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ導入による腎間質障害進展抑制の可能性が示唆された。
［実施例１１］  ブタ腎臓へのＨＧＦ遺伝子の導入
強力な発現ベクターであるｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ  ｖｉｒｕｓエンハンサーおよびｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎプロモーターにＨＧＦ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作成し、２４ｍｇ／５０ｍｌの濃度でＢＳＳに融解し、遺伝子導入に供した。ミニブタを、麻酔下で開腹後、腎を摘出し、生理的食塩水で腎臓を還流後、上記発現ベクターを注入した。発現ベクターを２５ｍｌ注入した後、腎静脈をクリップにて結紮し、さらに２５ｍｌ注入した。遺伝子を導入したブタ腎臓を生理的食塩水で満たしたバスタブ型電極に浸し、スクエアー型電圧（３０Ｖ，１００ｍ  ｓｅｃｏｎｄ）を９００ｍ  ｓｅｃｏｎｄの休止をおいて、６回行い、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったブタ腎臓を移植し、反対側の腎臓を摘出した。まず、遺伝子導入７日後に腎臓を摘出し、ＨＧＦ遺伝子発現の有無を検討した。図１４に示されるように、ブタ腎皮質において腎糸球体に遺伝子発現が確認された。そこで、ＨＧＦ遺伝子導入による移植腎保護効果の検討を行うために、移植後、１，３，および６ヶ月後に、腎臓を摘出し、組織学的な検討を加えた。図１５に示されるように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したコントロール群では、間質の線維化を認めたが、ＨＧＦ遺伝子を導入した群では、間質の線維化が抑制されていた。さらに、間質の形質転換のマーカーであるαｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）にて染色を行ったところ、図１６に示されるように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したコントロール群では、間質のαＳＭＡ発現を認めたが、ＨＧＦ遺伝子を導入した群では、間質の間質のαＳＭＡ発現が抑制されていた。また、移植後、１日後および３，６ヵ月後に腎臓、肝臓、肺、脾臓を回収し、各臓器でのＨＧＦ遺伝子をＰＣＲ法により確認したところ、ＨＧＦ遺伝子を導入したブタの腎臓のみにＨＧＦ遺伝子が６ヶ月目まで確認されたが、他の臓器、肝臓、肺、脾臓にはＨＧＦ遺伝子は確認されなかった（図１７）。また、コントロール群では、ＨＧＦ遺伝子は確認されていない。以上の点から、エレクトロポレーション法によるＨＧＦ遺伝子導入により、ＨＧＦ遺伝子は移植した腎臓のみに発現し、他の臓器での発現を認めなかった。また、ＨＧＦ遺伝子導入により、移植腎保護効果を持つことが示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明におけるエレクトロポレーション法を用いた移植腎に対する遺伝子導入法はＨＧＦ蛋白の投与に比べて、治療効果が持続的であり、また、移植腎のみに作用させることが可能となり、全身投与から生じるＨＧＦによる副作用を軽減させることが可能となり、より安全である。また、本発明を用いた遺伝子導入方法は、対象臓器において望ましくない蛋白、例えば臓器の細胞増殖抑制による線維化等を引き起こす蛋白に対するＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅの導入にも使用することができる。本発明の方法は、将来的にブタからヒトへの異種移植を考える上でも有効な手段となりうる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１におけるＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡをラット腎動脈から注入し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行い、導入されたオリゴＤＮＡの腎臓における局在を蛍光顕微鏡で観察した写真である。（ａ；×１００，ｂ；×４００）
図２は、糸球体に導入されたオリゴＤＮＡの局在を、ローダミンラベルしたラットメサンギウム細胞に対する抗体である抗Ｔｈｙ−１抗体を用いて検討した写真である。
図３は、実施例２におけるＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡをラット尿管から注入し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行い、導入されたオリゴＤＮＡの腎臓における局在を蛍光顕微鏡で観察した写真である。（ａ；×１００，ｂ；×４００）
図４は、実施例３におけるルシフェラーゼ遺伝子を腎動脈から注入しｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行った後、４日後の腎糸球体におけるルシフェラーゼ発現と電圧の関係を示す図である。培養細胞へのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを用いた遺伝子導入では、２００−１０００Ｖの電圧が用いられるが、腎臓への遺伝子導入では１００Ｖを越えると臓器障害が見られ、７５Ｖ以下が望ましいことが明らかとなった。
図５は、実施例３におけるルシフェラーゼ遺伝子を腎動脈から注入しｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行った後、４日後の腎糸球体におけるルシフェラーゼ発現と電流の関係を示す図である。
図６は、実施例４におけるルシフェラーゼ遺伝子をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎあるいはＨＶＪリポソーム法により腎動脈から注入し遺伝子導入を行った後、４日後の腎糸球体におけるルシフェラーゼ発現と遺伝子導入法の関係を示す図である。
図７は、実施例５におけるルシフェラーゼ遺伝子とＥＢＮＡ−１遺伝子のコンビネーションによる遺伝子導入の効果を検討した図である。
図８は、実施例６におけるＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウイルスの潜伏感染装置であるｏｒｉＰとＥＢＮＡ−１を組み込んだ発現ベクターを用いて遺伝子発現期間を検討した図である。
図９は、実施例７におけるＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡをブタ腎動脈から注入し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行い、導入されたオリゴＤＮＡの腎臓における局在を蛍光顕微鏡で観察した写真である。バスタブ電極を用いた遺伝子導入では３０−５０Ｖの電圧が適当であった。（ａ，ｃ；×１００，ｂ，ｄ；×４００，ａ，ｂ；糸球体を中心とした像，ｃ，ｄ；間質を中心とした像）
図１０は、ブタ腎臓に対し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った際の電極の写真である。バスタブの両側にステンレス電極を装着してある。
図１１は、ブタ腎臓に対し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った際の電圧の矩形波の一例を示す図である。
図１２は、実施例８におけるＦＩＴＣラベルしたオリゴＤＮＡをブタ尿管から注入し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行い、導入されたオリゴＤＮＡの腎臓における局在を蛍光顕微鏡で観察した写真である。（ａ；×１００，ｂ；×４００）
図１３は、実施例９におけるルシフェラーゼ遺伝子をブタ腎動脈から注入しｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより遺伝子導入を行った後、移植し、４日後に摘出した腎皮質におけるルシフェラーゼ発現を検討した図である。ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した試料（ＣＡＧ−Ｌｕｃ）とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した試料（対照）を示す。
図１４は、ＨＧＦ遺伝子導入後、１週間後のＨＧＦの発現を酵素抗体法により確認した写真である。糸球体にＨＧＦの発現を認めた。
図１５は、ＨＧＦあるいはコントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子導入後、６ヵ月後のマッソントリクロム染色による腎臓の組織の写真である。コントロール群では間質の線維化を認めるが、ＨＧＦ遺伝子導入群では、間質の線維化は抑制されていた。
図１６は、ＨＧＦあるいはコントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子導入後、６ヵ月後のαＳＭＡ発現を酵素抗体法を用いて染色した腎臓の組織の写真である。コントロール群では間質のαＳＭＡ発現を認めるが、ＨＧＦ遺伝子導入群では、間質のαＳＭＡ発現は抑制されていた。
図１７は、移植後、１日後（１ｄ）、並びに３および６ヵ月後（それぞれ３Ｍおよび６Ｍ）に腎臓、肝臓、肺、脾臓を回収し、各臓器でのＨＧＦ遺伝子をＰＣＲ法により確認した写真である。ＨＧＦ遺伝子を導入したブタの腎臓のみにＨＧＦ遺伝子が６ヶ月目まで確認されたが、他の臓器、肝臓、肺、脾臓にはＨＧＦ遺伝子は確認されなかった。（Ｋ；腎臓、Ｌｉ；肝臓、Ｌｕ；肺、Ｓ；脾臓）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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