(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上の共生微生物と、この１種類以上の共生微生物を大腸または消化管の他の領域に輸送する働きをするキャリヤーであって、共生微生物が、大腸または消化管の他の領域に通過する際にこの微生物を保護するやり方で不可逆的に結合している高アミロース澱粉の形態の未修飾耐性澱粉を含んでなり、大腸または消化管の他の領域における微生物の成長または維持媒質として作用するキャリヤーとを含んでなる、改良された共生組成物。
【請求項２】
高アミロース澱粉が、アミロース含量が５０％（重量／重量）以上のトウモロコシ澱粉を包含する、請求項１に記載の改良された共生組成物。
【請求項３】
アミロース含量が８０％（重量／重量）以上のトウモロコシ澱粉である、請求項２に記載の改良された共生組成物。
【請求項４】
高アミロース澱粉が、アミロース含量が２７％（重量／重量）以上の米または小麦澱粉を包含する、請求項１に記載の改良された共生組成物。
【請求項５】
高アミロース澱粉が、トウモロコシ、大麦、小麦、米、マメ類、バナナ、およびジャガイモからなる群から選択される植物から誘導される、請求項１に記載の改良された共生組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトを含む動物の消化管の選択された部位の微生物の個体数を増加させるまたは好ましくない微生物の個体数を抑制する方法に関する。本明細書で用いられる共生生物または共生微生物とは、宿主動物の腸内の微生物バランスを改良することによって宿主動物に有益な影響を与える生微生物飼料追加（live microbial feed supplement）である。これは、R. Fuller（AFRC Institute of Food Research, Reading Laboratory, 英国）によってJournal of Applied Bacteriology, 1989, 66, 365-378「ヒトおよび動物における共生生物−概説（Probiotics in Man and Animals - A Review）」に与えられた定義であり、続いてヒトについての追加および食料を包含するように拡張された。
背景技術
健康な被験者の消化管の微生物叢は、宿主を病原体の侵襲から保護する。しかしながら、幼い、年老いたおよび傷害を受けた患者では、この防御バリヤーは余り効果的ではない。個人は、例えば食事の変化、感情的および栄養上のストレスのような小さなストレスや関連の出来事から、免疫の低下した患者や放射線および化学療法を行っている患者のような極端な場合までの様々な程度に傷害を受けることがある。
共生細菌は、消化管で他の微生物または微生物群に対する共生調製物（probiotic preparation）の作用に関連する抗微生物作用を示すことが報告されている。これらは、腸病原体に対する耐性の向上、下痢や便秘の予防のための共生生物の使用に直接応用することができる。相互作用の種類としては、競合的コロニー形成並びに付着および成長の阻害が挙げられる。
競合的コロニー形成は、共生菌株が栄養物またはコロニー形成の部位について病原体とアウト・コンピート（out-compete）に成功することを指している。多くの消化器病原体は、感染の第一段階として腸粘膜に付着するので、この付着を阻害することができれば宿主にとって有益となる。lactobacilliは、腸毒素産生性Escherichia coliが腸粘膜へ付着するのを阻害する成分を産生するという報告がある。更に、共生生物の成長中に産生される各種の化合物が、病原菌の成長を阻害することが示されている。これらには、乳酸や酢酸のような有機酸、リウテリン（reuterin）およびバクテリオシンが挙げられる。有機酸は、ｐＨを低下させることによって、病原体の成長に間接的に影響することができる。更に、乳酸および酢酸は、微生物にとって毒性を有することがある。極めて広汎な細胞の成長を阻害するリウテリンは、Lactobacillus reuteriをグリセロールの存在下で成長させるときに産生される。多数のバクテリオシン、例えばアシドフィリン、アシドリン、ラクトシジン、バクテリオシン、ブルガリカン、ラクトリン、ラクトバシリンおよびリクトブレビンがlactobacilliによって産生されることが報告されている。それらは、極めて広範囲の活性を有することができ、または極めて限定された範囲の密接に関連した微生物の成長を特異的に阻害することができる。例えば、Lactobacillus spは、Clostridum ramnosumに対して特異的な拮抗薬作用を示すことができる。
ヒトや動物の消化管の様々な領域における特異的な細菌の個体数には様々なレベルがある。更に、様々な属および種の特異的菌株は消化管の一つの領域から別の領域までで変化することも示されている。食物繊維は、ブタの消化管の様々な領域における微生物の活性およびガス産生に影響することが示されている。
ヒトにおいて、結腸での細菌成長のための主要な炭水化物源は、食物および内因性手段によって提供され、結腸基部の細菌は食物栄養を比較的多量に供給され、速やかな速度で成長して、末端領域で利用可能な栄養が減少して、細菌の成長が一層遅くなりかつｐＨが中性に近くなることが多いことが知られている。これらの様々な物理化学的条件により、結腸の右または左側の常在菌の間に大まかな代謝上の差が生じるものと思われる。結腸基部と末端部におけるそれぞれの癌などの疾患の発生率を伴う細菌成長の速やかなおよび遅い速度の間には相関がある。速やかな成長の領域では、結腸末端部におけるよりも疾患の発生率が低い。
人々の健康と安寧は、消化管、特に大腸に住み着いている微生物によって肯定的にまたは否定的に影響されることがあることが、多くの科学者の論点になっている。これらの微生物は、毒素、代謝副生成物、短鎖脂肪酸などの産生により、宿主の生理条件に影響を与える。
消化管微生物叢の構成および量は、疾患、生活様式、旅行および他の要因によって誘発される条件やストレスによって影響されることがある。個人の健康や安寧に肯定的影響を与える微生物が大腸に住み着きやすくなれば、これにより宿主の生理学的安寧が改善される。
有益な微生物または共生生物の導入は、通常は飲料、ヨーグルト、カプセルおよび他の形態で生物を摂取し、生物が成長可能な条件で大腸に到着するやり方で行われる。
大腸での耐性澱粉の細菌発酵により、高濃度の短鎖脂肪酸、特にプロピオネートおよびブチレートのような有益な種類のものが産生されることが、Englyst H.N. et al（１９８７年）「多糖類はヒト糞便細菌の混合個体群によって分解する」FEMS Mcrobiology Ecol 95: 163-71によって示されている。
本発明者等は、共生微生物を大腸に送達するだけでなく、微生物が大腸に到達したときに微生物の成長を促進する働きを行う培地を提供することも望ましいことを示した。
意外なことには、修飾または未修飾の耐性澱粉は、共生微生物を大腸へ輸送する手段としても、また大腸の標的領域へ送達された微生物の成長培地としても働くことができることを見出だした。耐性澱粉は、徐々に破壊され、窪みを生じて関連の共生微生物を保護し、この微生物はこれらの澱粉顆粒に付着することもあることが、国際公表番号ＷＯ９６／０８２６１号公報に示されており、その内容は、好都合なクロス・リファレンスの目的で本明細書に引用される。しかしながら、共生生物を更に効率的かつ経済的な方法で送達することができることが必要とされている。
また、基質を消化管の特異的部位に送達して、他の部位における他の微生物の個体数に実質的に影響を与えることなく、この部位における微生物の特定の個体数の成長を増強しまたは抑制することができるようにすることも望ましい。本発明者らは、ヒトを包含する動物の消化管の微生物個体数を変更しまたはこれに影響を与える改良法を開発した。
発明の開示
第一の態様では、本発明は、動物の消化管の選択された部位における微生物の常在個体数を増加させる方法であって、選択された修飾または未修飾の耐性澱粉またはその混合物を１種類以上の共生微生物と組合わせて動物に提供し、摂取時に、澱粉が実質的に利用されないまま消化管を通過した後、それが選択された部位に到達し、常在および／またはその共生微生物によって利用されて、微生物の数および／または活性を増加させることを含んでなる、方法にある。
第二の態様では、本発明は、動物の消化管の選択された部位における微生物の望ましくない常在数を抑制する方法であって、修飾または未修飾の耐性澱粉またはその混合物を１種類以上の共生微生物と組合わせて動物に提供し、摂取時に、澱粉が実質的に利用されないまま消化管を通過した後、それが選択された部位に到達し、別の常在および／またはその共生微生物によって利用されて、他の微生物の数および／または活性を増加させかつ望ましくない微生物の成長および／または活性を抑制することを含んでなる、方法にある。
耐性澱粉または耐性澱粉の特異修飾物を１種類以上の共生製剤（probiotic preparation）と組合わせて選択することによって、他の部分よりは結腸の一部の微生物によって余り用いられない基質を送達することが可能である。例えば、結腸基部の微生物は、選択された耐性澱粉を結腸末端の微生物よりも用いないことがある。同様に、消化管の特異的部位で微生物の１個体群を成長させ、残りの常在個体群は静止状態のままであるかまたは選択された個体群および／または共生微生物の成長または活性の増加によって抑制することが可能である。
本発明は、小腸または胃における所望な共生および／または固有の微生物の成長を促進するのに用いることもでき、固有の生物の濃度は低くくなり、病原体、例えば胃におけるH. pylori、または小腸における腸毒素産生性のEscherichia coliが定着することが多い。
第三の態様では、動物の消化管の微生物病原体を抑制する方法であって、１種類以上の共生微生物と、この１種類以上の共生微生物を消化管の大腸または他の領域に輸送する働きをするキャリヤーであって、修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物を含んでなり、微生物病原体の成長および／または活性を抑制するのに十分な程度まで消化管の大腸または他の領域における非病原性微生物の成長または維持培地として作用するキャリヤーを動物に投与することを含んでなる方法にある。
第四の態様では、本発明は、１種類以上の共生微生物と、この１種類以上の共生微生物を消化管の大腸または他の領域に輸送する働きをするキャリヤーであって、消化管の大腸または他の領域への通過の際に共生微生物を保護するようなやり方でこの微生物が結合している修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物を含んでなり、消化管の大腸または他の領域における微生物の成長または維持培地として作用するキャリヤーを含んでなる改良された共生組成物にある。
第五の態様では、本発明は、動物の消化管に共生微生物を提供する改良法であって、１種類以上の共生微生物と、この１種類以上の共生微生物を消化管の大腸または他の領域に輸送する働きをするキャリヤーであって、消化管の大腸または他の領域への通過の際に共生微生物を保護するようなやり方でこの微生物が結合している修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物を含んでなり、消化管の大腸または他の領域における微生物の成長または維持培地として作用するキャリヤーを含んでなる改良された共生組成物にある。
好ましい形態では、共生微生物は、修飾または未修飾耐性澱粉に不可逆的に結合している。
第六の態様では、本発明は、動物の結腸癌または結腸委縮の発生率を減少させる方法であって、共生微生物を産生する１種類以上のＳＣＦＡと、１種類以上の共生微生物を消化管の大腸または他の領域に輸送する働きをするキャリヤーであって、修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物を含んでなり、消化管の大腸または他の領域における微生物の成長または維持培地として作用し、動物の消化管における共生および／または常在微生物によるＳＣＦＡ産生を高めるようにするキャリヤーを動物に提供することを含んでなる方法にある。
本発明の好ましい形態では、ＳＣＦＡはブチレートであり、消化管における微生物はCl. butyricumおよび／またはEubacteriumである。ＳＣＦＡの濃度を更に高めるには、共生組成物は、Cl. butyricumおよびEubacteriumを包含する。
修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物は、消化管の大腸または他の領域における微生物の成長または維持培地として作用し、動物の消化管における微生物による短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生を高めることもできることが分かるであろう。
本明細書で用いられる「耐性澱粉」とは、Brown, McNaughtおよびMoloney（１９９５年）Food Australia 47: 272-275に定義されているＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３およびＲＳ４として定義されている形態を包含する。修飾または未修飾耐性澱粉またはその混合物のいずれも、本発明で用いられる。選択された耐性澱粉の利点は、それらが消化管の選択された部位に到達するまで消化されないことである。従って、共生生物と組合わせて用いるときには、それらが消化管の選択された部位に到達したならば直ちに共生微生物による容易に利用可能な発酵の基質も提供する。耐性澱粉の好ましい形態は、高アミロース澱粉、特にＷＯ９４／０３０４９号公報およびＷＯ９４／１４３４２号公報に開示されかつ教示されている高アミロース澱粉であり、上記特許明細書の内容は、好都合なクロス・リファレンスの目的で本明細書に引用される。
ＷＯ９４／０３０４９号公報およびＷＯ９４／１４３４２号公報には、耐性澱粉であり、アミロース含量が５０％（重量／重量）以上、特に８０％（重量／重量）以上のトウモロコシ澱粉、アミロース含量が２７％（重量／重量）以上の米および小麦澱粉、特にアミロース含量が５０％以上である澱粉の粒度範囲のもの、および耐性澱粉含量が増強された高アミロース澱粉が開示されており、これらの澱粉としては、トウモロコシ、大麦、小麦およびマメ類が挙げられる。しかしながら、本発明は、耐性澱粉のこれらの形態の使用に限定されない。例えば、他の形態の耐性澱粉が、バナナ、果実およびジャガイモなどの供給源から誘導される。
澱粉を化学的に修飾すること、例えば顆粒および／または顆粒表面の電荷密度または疎水性を変化させて、微生物と耐性澱粉との付着適合性を増すことも有利なことがある。エーテル化、エステル化、酸性化などの化学的修飾は、当該技術分野で好ましい化学処理としてよく知られている。同様に、他の修飾を、物理的、酵素的または当該技術分野で知られている他の手段によって誘導することができる。
澱粉の配座または構造を変化させることによって耐性澱粉の酵素感受性の程度を修飾することも有用であることがある。例えば、酸または酵素シンニング（thinning）および二官能性試薬を用いる架橋が挙げられる。
一つの有用な修飾は、高アミロース澱粉のアミロース分解による、澱粉顆粒の表面から内部へ伸びることができる窪み（pits）または浸蝕を特徴とする顆粒の生成である。これらの窪みにより、澱粉顆粒の一層酵素感受性の高いコアに酵素が入ることができ、可溶化される。
本明細書で用いられるHi-トウモロコシ澱粉TM（商品名）は、Starch Australasia Limited製の高アミロース澱粉を表す。
本発明を更に明確に理解することができるようにするため、本発明の好ましい形態を、下記の図および実施例に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、BifiobacteriumのX8AT2株の澱粉の利用を示す。
第２図は、Bif. pseudolongumによる澱粉１〜１０の利用を示す。
第３図は、Bif. bifidumによる澱粉１〜１０の利用を示す。
第４図は、Bact. vulgatusによる澱粉１〜１０の利用を示す。
第５図は、Bact. fragilisによる澱粉１〜１０の利用を示す。
第６図は、Cl. butyricumによる澱粉１〜１０の利用を示す。
第７図は、Bif X13AT2およびLactobacillus acidophilusを接種して２４時間培養した後のSalmonella typhimuriumを示す。
第８図は、Bif X13AT2およびLactobacillus sppを接種して２４時間培養した後のSalmonella typhimuriumを示す。
第９図は、大腸菌個体数を示す。
第１０図は、マウスの体重を示す。
第１１図は、澱粉が付着したタンパク質の実証を示す。
第１２図は、様々な細菌によるプロピオネートの産生の濃度を示す。
第１３図は、様々な細菌によるアセテート産生の濃度を示す。
第１４図は、４８時間インキュベーションした後の様々な細菌によるブチレートの産生の濃度を示す。
第１５図は、連続給餌の後のマウス糞便中のブチレート濃度を示す。
本発明の実施の態様
実施例１
第１表に記載の定義された成長培地を、Hi-トウモロコシTM澱粉およびその修飾物を含むものを調製し、接種の後、０、８、２２および５８時間後に炭水化物総濃度を測定した。様々な澱粉の使用を、第２表に示す。第１〜６図から分かるように、幾つかの修飾物は、他のものよりも幾つかの菌株によって好まれ、例えば澱粉１および８は、B. fragilis（第５図）の成長に一層好ましく、一方澱粉３および５は、Clostridium butyricumによって利用され、消費は澱粉２に比較して遅かった（図６）。第１、２および３図は、Bifidobacteriumの個々の種の変動可能性を示し、ある種の澱粉は一つの菌株によって速やかに消費されるが、ある種の澱粉、例えば３は、Bifidobacteriumによっては十分に消費されない。
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０〜８時間と８〜２２時間の間の澱粉の利用率を計算したとき、幾つかの澱粉は他のものよりも腸内起源の特異的な細菌によって一層速やかに使用されることが分かった（第３表）。
従って、消化管の特異的部位で細菌を選択的に増強する目的で澱粉を適応させることができることは明らかである。これを用いて、固有の細菌並びに共生細菌を増強し、これらを澱粉と一緒に、または澱粉の前または後に投与することができる。消化管の様々な領域は、細菌の様々な属、または様々な種、または同一種の菌株によってコロニー形成することができ、または既にコロニー形成されているので、ヒトおよび動物の消化管において部位または領域特異的な微生物の成長を操作することが可能である。これは、例えば下痢や細菌の過剰成長のような望ましくない微生物の微生物成長を抑制することが望ましく、または腸末端部における有益な細菌、例えばCl. butyricumの成長を増強することによって、ブチレートの濃度を高め、上皮粘膜の結腸癌や委縮の危険性を減少させることが望ましい幾つかの疾患の場合に重要であることがある。
これらのパラメーターを、最初に糞便スラリーの培養物、消化管の様々な部位をサンプリングすることができる齧歯類モデルまたはブタを用いて説明することができる。本発明を応用することができる下記の様々な疾患症状を研究するのに、多くの動物モデルが既に利用可能である。
用途
腸における部位特異的細菌発酵の制御、
腸の下部領域における発酵を増強することによる結腸癌の発生率の減少、
特異的な共生菌株と、細菌菌株によって選択的に利用される適当に修飾された耐性澱粉を用いて過剰成長の部位を標的とすることができるので、細菌過剰成長の予防的または治療的制御、および
耐性澱粉の修飾物を単独でまたは共生生物または共生菌株の混合物と組合わせて用いて、特定の部位の微生物の成長を操作することができる。これを、便秘、下痢、渋り腹症候群、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、並びに胃および十二指腸潰瘍および癌のような疾患症状に応用することができる。
方法
様々な澱粉を含む培地を含む血清管におけるLactobacillus fermentum KLDまたはLactobacillus acidophilusを含む／含まないBifidobacterium X8AT2およびX13AT2のヒト単離物のS. typhimuriumおよびE. coliに対する拮抗作用の検討。
実験手続き：
Lact. acidohpilusまたはLact. fermentumの定常相培養物を、ＭＲＳ、ＴＳＢブロス（＋５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩）中で成長させたS. typhimurium、MacConkeysブロスで成長させたE. coli、および試験培地（第１表）２０ｍｌを含む嫌気性血清管に接種したＰＹＧで成長させたBif. X8AT2またはX13AT2で一晩成長させた。培地の基本組成は、アミロース培地と同一であり、個々の澱粉（１％）を単一の炭素験として用いた。本明細書で用いられる澱粉としては、Goodman Fielder Company製の１０種類の澱粉、およびSigma Chemical Company製アミロース、アミロペクチン、およびBDH製の可溶性澱粉が挙げられる。Goodmena Fielder Company製の澱粉を、第２表に示す。
接種    血清管を３群に分けた。
群（1）は、１ｍｌのBifidobacterium培養物＋１ｍｌのLactobacillus培養物を加えた後、S. Typhimuriumの０．１ｍｌ培養物と、それぞれＴＳＢとMacConkeyブロスで×１０４に希釈した０．１ｍｌのE. coliを加えた。
群(2）は、１ｍｌのBifidobacterium培養物に０．１ｍｌのそれぞれS. TyphimuriumおよびE. coliの希釈物。
成育可能なSalmonellaを２４時間発酵後に計数した。第７および８図から分かるように、幾つかの澱粉、すなわち８および１０は、BifidobacteriumおよびLactobacillusを組合わせるとSalmonellaの減少を誘発した。bifidobacteriumとLactobacillusとの混合物によるこの相乗効果により、病原体阻害の増強した方法が提供される。
実施例２
耐性澱粉および耐性澱粉の修飾物を単独でまたは系にSalmonellaを接種したときにはbifidobacteriaと一緒にしたものの存在下で、大腸菌およびサルモネラ菌をイン・ビトロで計数することによって、多数の共生組成物の効果を検討した。更に具体的には、ヒト糞便ホモゲネート（１０ｇ／１００ｍｌ希釈剤）の一部（１ｍｌ）を、希釈したＷＣブロス（０．０５Ｍリン酸緩衝液で５０：５０に希釈）に加え、これに耐性澱粉および澱粉１〜１０と表されるその修飾物を加えた。それぞれの澱粉について、平行した管を調製し、一組に各種のBifidobacterium sppを接種した。次いで、総ての混合物にサルモネラ菌を接種して、０、２、６および９時間のインキュベーションの後に採取した。MacConkey No. 1寒天（第９ａ、ｂおよびｃ図）を用いてコロニー形成単位／ｍｌとして計数したときには、結果を大腸菌の数として表す。耐性澱粉（第９図）をbifidobacteriaと共に加えるときには、澱粉単独の場合と比較して大腸菌の数は減少する。更に、この効果は、それぞれカルボキシメチル化およびスクシン化耐性澱粉に相当するＡ９５５およびＡ９６０についての第１０図および第９ｃ図に示される耐性澱粉の修飾物によって増強される。個々の修飾物は、様々な増強を示す。
実施例３
病原体の指標としての大腸菌数の減少を検討するため、耐性澱粉および耐性澱粉の修飾物を単独でまたは系にSalmonellaを接種したときにはbifidobacteriaと一緒にしたものの存在下で、宿主に対する病原体の効果をイン・ビボで検討した。検討したパラメーターは、サルモネラ菌を投与した後の体重減少であった。実験デザインは、下記の通りである。マウスに、定義した食餌を与え、群Ａ、Ｂ、ＣおよびＥにbifidobacteria（２００μｌ／日）を経口投与した。総ての群は、Salmonella sp（約ｌｏｇ８個の成長可能な細胞を含む０．１ｍｌ）を単回経口投与し、体重減少を毎日監視した。
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結果は、第１０図に示されており、耐性澱粉とbifidobacteriaを組合わせて投与したところ、サルモネラ菌の経口投与によって誘導された体重減少が防止された。この効果は、試験した修飾物すなわちカルボキシメチル化物は、顕著な有害効果を示したので耐性澱粉の特定の修飾物によって影響された。興味深いことには、bifidobacteriaの非存在下での耐性澱粉は、最初は肯定的効果を示したが、その後は体重減少は一層速やかであった。
用途
本発明は、病原体が同定されているか、またはヒトおよび動物の両方における腸疾患の起因菌として提案されている総ての症状に応用することができる。感染性下痢は共生生物の投与によって改善されることが示されているので、本発明を用いて共生生物の効果を単独で増強することができる。更に、本発明は、共生生物単独では影響されないことが示されていない非感染性下痢の改善にも効果的に用いることができる。これは、食事に関連した下痢の問題の影響を効果的に減少するのにも用いることができる。
感染性下痢は、急性および慢性の総ての下痢の場合に当てはまり、起因剤が細菌、ウイルスおよび原生動物のような微生物であることを示すことができる。このような感染性下痢は、例えば（a）ウイルス薬剤およびサルモネラ菌に関連することが多い幼児性下痢、（b）抗生物質に関連した下痢、（c）旅行者の下痢のような多くの様式で現れる。
本発明の方法の予防的および治療的使用が考えられる。前者は、例えば（i）腸が汚染されており、次に望ましくない微生物個体群によって再コロニー形成されることがある調査上の消化器検査、（ii）病原体の変化や、消化管の生態系の変化により個人が低感染量の病原体を投与される傾向があるものに暴露された旅行者のような潜在的な問題に個人が暴露される可能性があるときの予防に関するものである。治療的使用は、消化管の微生物叢の望ましくない部分または発症した病原体の感染に関する発症した症状の治療に関する。
共生菌株による抗微生物性物質の産生の増強。このような抗微生物性物質としては、病原体の成長、または病原体はコロニー形成の初期段階として付着する必要があることが多く、また病原体の付着は共生菌株の代謝物によって阻害することができるので、病原体がコロニー形成する可能性を阻害する物質が挙げられる。本発明は、これらの抗微生物効果を直接的または間接的に増強する。
実施例４
澱粉顆粒への付着の結腸細菌および共生細菌のスクリーニング
緩衝液ｐＨ６．８での付着試験
結腸細菌菌株および共生菌株のアミロース澱粉顆粒への付着は、光学顕微鏡法によって直接検出された。細菌菌株としては、Bif. X8AT1、Bif. X8AT2、Bif. X13AT2、Bif. bifidum、Bact. vulgatus、Lact. fermentum KLD、Lact. casei、Lact. bulgaricusおよびLact. sp. B49が挙げられた。実験に用いた澱粉を、第２表に示す。
細菌細胞を、ＰＹＧ培地で一晩培養したもの２ｍｌを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収した。上清を廃棄した後、ペレットを２ｍｌのＰＢＳ緩衝液（１２．１ｇＫ２ＨＰＯ４、３．４ｇＫＨ２ＰＯ４、８５ｇＮａＣｌを１リットルの蒸留水に溶解したもの、ｐＨ６．８）で洗浄し、最後にＰＢＳおよびｐＨ２．５緩衝液１ｍｌに再分散した。澱粉溶液は、下記のようにして調製した。総ての種類の澱粉１０％を、個々に５ｍｌＰＢＳ緩衝液に懸濁した。混合物を９０℃で３０分間加熱して、食料加工の手順を模した後、室温まで冷却した。それぞれの予備加熱した澱粉溶液の試料（０．５ｍｌ）を細胞懸濁液０．５ｍｌと緩やかに混合して、３７℃の水槽で３０分間インキュベーションした。上清を慎重に除去し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で洗浄した。混合物をベンチに５分間放置して、澱粉顆粒を沈澱させた。次に、上清を取り去り、可逆的に結合した細菌を除いた。澱粉顆粒に付着した細菌の数を位相差光学顕微鏡法によって検討した。
加熱した澱粉顆粒への付着は、Bif. X8AT1、X8AT2、X13AT2およびBif. bifidumで観察された（第５および６図）。付着の変動は、試験を行った菌株および澱粉によって検出された。Bif. X13AT2は、澱粉顆粒と結合する最良の菌株と思われたが、Bif. X8AT2も同等に付着に十分であることが分かった。澱粉番号４および１１は、結合に最良の基質であったが、澱粉番号１および３は中程度と思われた。
実施例５
様々な培養条件下でのBifidobacteriumの生存数の結果については第７〜９表を参照されたい。
実施例６
Bifidobacteriumの成長培地およびマウス食餌中のBifidobacteriumのイン・ビボでの生存数に対するHi-トウモロコシの効果。通常のマウス食餌をあらかじめ与えた３群のマウスを用いた。２群は、通常のマウス食餌を与え、１群はHi-トウモロコシTMを基剤とした食餌を与えた。Hi-トウモロコシTM食餌の組成物は、下記のものを含んでいた（ｇ／ｋｇ）：
Hi-トウモロコシTM澱粉                   ４００ｇ
カゼイン                                ２００ｇ
カノラ油                                ２５ｇ
ヒマワリ油                              ２５ｇ
スクロース                              １５０ｇ
小麦フスマ                              １００ｇ
ゼラチン                                ２０ｇ
メトリン                                ５ｇ
鉱物およびビタミン混合物                ５ｇ
２種類の細菌培養物を、実験で用いた。第一の種類では、Bif. X8AT2をグルコース含有培地で成長させ、第二の種類としては、成長期のHi-トウモロコシTM含有培地を報告した。マウスは、実験中は１匹ずつ飼育し、総てに最初にBifidobacterium X8AT2２００μｌを経口投与した。群１は、グルコースで予め成長させた細菌培地２００μｌを投与した通常の食餌を与え、Hi-トウモロコシTM澱粉培地で成長させた細菌を第二および第三群のマウスに与えた。群２のマウスは通常の食餌を続け、群３のマウスにはHi-トウモロコシTM澱粉食餌を与えた。細菌を投与した後の次の１０時間に産生された糞便ペレットの総てをそれぞれのマウスから逐次回収し、即時に秤量した。それぞれの糞便ペレットのBifidobacterium X8AT2の個体群を数えた。経口投与に用いた細菌懸濁液中の成育可能な細胞を、ＣＦＵ／ｍｌとして数えた。３群のマウスにおけるBifidobacterium X8AT2の回収率を、マウス当たりの一日総産生量および経口投与した数に対する糞便中の生存率として表した。
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Bifidobacteriumの生存に対する胆汁酸の影響を、グルコースおよびHi-トウモロコシTM澱粉を含む培地で予め成長させた。３種類のヒトbifidobacteria単離物は、胆汁酸溶液で良好な生存を示した（第１０、１１および１２図）。培地から予め回収された細胞は、Hi-トウモロコシTM澱粉を含まない培地から得たものと比較して高濃度の胆汁酸中で一層耐性を有するHi-トウモロコシTM澱粉を含んでいた。
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マウス結腸におけるグルコースおよびHi-トウモロコシTM澱粉で予め成長したBifidobacterium X8AT2の相対生存率
マウス糞便中のBifidobacterium X8AT2の相対的一日産生量を、第１３表に示した。通常の食餌を投与し、Hi-トウモロコシTM澱粉培地で成長した細菌を投与したマウスの群では、グルコースで成長した細胞を供給したマウスの通常の食餌群と比較してBif. X8AT2の高回収率が認められた。Hi-トウモロコシTM澱粉食餌は、Bif. X8AT2の排泄数を更に増加させた。糞便の一日湿重量も、食餌によって影響された。Hi-トウモロコシTM澱粉食餌では、食餌の高摂取量のため、最高の糞便排出量を生じた（第１３表）。
澱粉顆粒への細菌表面タンパク質の付着は、ドット・ブロットを用いて検出され、消費した培養物上清の画分と塩化リチウムエキスを、アミロース澱粉顆粒（Sigma）に対する付着について分析した。残留澱粉顆粒は、ヨウ素によって検出した。Bifidobacteria X13AT2の消費した培養物上清ＬｉＣｌ２エキスを、Sephacryl S-300（Pharmacia）およびBiologicクロマトグラフィー装置（Biorad）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって抽出した。澱粉顆粒に親和性を示したタンパク質（第１１図）の相対分子量を、分子量標準を用いて計算した。この成分の分子量は、５０，０００〜６０，０００であった。
上記の結果から、修飾は付着率に影響し、同じ属の異なる種および異なる菌株は、幾つかの修飾物に様々な程度に結合することが分かる。従って、選択された共生微生物の付着に好都合な構造について予測が可能である。更に、付着（所望ならば、不可逆的結合が可能）に関与する構造を決定することができる。
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付着した細菌は、抗生物質に対して一層耐性を有することが知られており、従って、耐性澱粉の修飾により結合を行うことができるので、澱粉の様々な修飾物に結合した細菌は、
ａ．消化管での条件、すなわち低ｐＨ、胆汁酸および消化酵素に一層耐性である。これは、成長可能な共生細菌を胃、小腸または大腸に送達するようにデザインされた送達系にとって極めて有利となる。
ｂ．処方された生成物ての環境条件に対して一層耐性を有するので、製剤中で一層良好に生存する。
ｃ．不可逆的結合に関与する澱粉顆粒上の微生物表面および構造での付着の同定は、共生微生物の送達を改良するためだけでなく、澱粉およびその誘導体への成分の結合のための別の応用範囲においても、応用範囲を有する。
本発明者らは、耐性澱粉の特定の修飾が、特定の微生物の澱粉粒子への結合に好都合であることを示した。これは、特定の細菌の付着が関与しており、これらの付着は、澱粉上での構造に結合していることを示している。試験を行った様々な修飾物から、特異的および非特異的結合に関与し、最も耐性の大きい構造を予測することができる。更に、幾つかの修飾または処理は、顆粒を浸蝕して、窪みを生じ、生成した窪みが過酷な環境から共生生物を物理的に保護する。
澱粉顆粒への結合は、顆粒へ結合することにより、更に安定な微生物製剤を生じるので共生製剤の安定性および送達に有利である。従って、これは消化管中を通過する際に当てはまり、結合した微生物が、例えば低ｐＨ、胆汁酸および消化酵素のような消化管の過酷な条件に対して一層耐性を有するので、更に効率的な送達系が可能である。これは、様々なｐＨ水準のまたは消化酵素を含む緩衝液または成長培地で結合した共生菌株の生存を検討することによってイン・ビトロで示すことができる。イン・ビボでの確認は、ヒト、ブタまたは齧歯類に経口投与の後に生存数を検討することによって得ることができる。
実施例６
第１表に含まれる培地を用いて、一定範囲の腸内単離物の成長およびこれによる短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）産生の検討を行った。培養物を嫌気的に４８時間インキュベーションし、培養物中のＳＣＦＡ濃度を測定した。様々な単離物についてのプロピオネート、アセテートおよびブチレートの濃度を、それぞれ第１２、１３および１４図に示す。
耐性澱粉が唯一の炭水化物の供給源であるときには、高濃度のアセテートがBifidobacterium spp.によって産生され、高濃度のプロピオネートがBacteroides vulgatusおよびBact. fragilisによって産生されたが、ブチレートはEubacterium linosumによって限定された程度まで産生され、Clostridium butyricumによって多量に産生された。
実施例７
マウスに通常のマウス用食餌、またはワキシー澱粉、Hi-トウモロコシTMまたは修飾したHi-トウモロコシTMを含む調製した食餌を与え、Bifidobacterium sp菌株X8AT2またはBif. bifidum培養物２００μｌを経口投与した。マウスに調製した食餌の組成は、第１４表に示されている。食餌にbifidobacteriaを加えたものを３日目から８日目まで連続供給した後、糞便試料を０日および８日目に回収した。試料を凍結保存した後、ＳＣＦＡの分析を行った。糞便中のブチレート濃度の結果を、第１５図に示す。高濃度のブチレートは、耐性澱粉またはカルボキシメチル化耐性澱粉をBifidobacterium sp菌株X8AT2と一緒に供給したマウスで認められた。これらのブチレート濃度は、耐性澱粉とBifidobacterium bifidumを投与したマウスで認められた濃度より高く、この上昇は、耐性澱粉だけによるものではなく、用いたBifidobacterium sp菌株との組合わせによるものと結論された。
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耐性澱粉を含む定義された実験室培地において成長させた後、優性ヒト腸バクテリアの発酵産物を試験した。耐性澱粉が炭水化物の単一源あるとき、高レベルのアセテートがBifidobacterium sppにより生産され、高レベルのプロピオネートがBacteroides vulgatusおよびBacteroides fragilisにより生産されたが、ブチレートはEubacterium linosumにより限定されて生産され、Clostridium butyricumにより大量に生産された。その結果、耐性澱粉とCl. Butyricumの選択的増強を可能とするその修飾物とを含む食餌成分は結腸直腸癌の予防に用いることができる。この効果は、Cl.butyricumおよびEubacterium、高レベルのブチレートを生産することが知られている腸起源の微生物の経口投与により増強される。
更に、耐性澱粉をBifidobacterium sppとともにマウスに経口投与したとき、糞便中のブチレートの上昇が認められた。修飾された耐性澱粉をBifidobacteriumu sp.とともに経口投与したときの増加レベルも認められた。上昇したブチレートレベルは、しかしながら、Bifidobacteriumの一つの菌に対しては認められず、これは澱粉のみよりむしろ耐性澱粉とBifidobacteriumとの組み合わせがブチレートの上昇したレベルに寄与する要因であることを示している。
それゆえ、本発明は、耐性澱粉またはその修飾物とBifidobacterium spp、Cl. Butyricum、Eubacterium並びにブチレートを含む他のＳＣＦＡ生産腸内細菌のような微生物との組み合わせを含む。さらに、プロピオネートが吸収され肝臓に到達し、そこでコレステロールのデノボ合成が減少するので、耐性澱粉および／またはBacteroides sppの経口投与がコレステロールレベルを減少させるということが仮定できる。
用途
本発明を用いて結腸直腸癌の発生を減少させおよび結腸萎縮を減少させることができる。本発明の精神および範囲から乖離することなく、具体的な態様に記載されたように、多くの変更および／または改変が本発明になされうることは当業者に理解されるであろう。従って、この具体例は総て例示であって、本発明を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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