(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞におけるコネキシン26遺伝子の発現レベルを正常細胞のコネキシン26遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む、癌転移能の検査方法。
【請求項２】
コネキシン26遺伝子の発現レベルを、コネキシン26をコードするmRNAの定量によって評価する請求項1に記載の検査方法。
【請求項３】
少なくともコネキシン26のギャップ結合活性を示す領域をコードしているmRNAを定量する請求項2に記載の検査方法。
【請求項４】
コネキシン26遺伝子の発現レベルを、癌細胞に含まれるコネキシン26タンパク質の定量によって評価する請求項1に記載の検査方法。
【請求項５】
コネキシン26遺伝子の発現レベルを、コネキシン26タンパク質を特異的に認識する抗体による免疫学的な定量方法によって評価する請求項4に記載の検査方法。
【請求項６】
コネキシン26遺伝子の発現レベルを、体液中のコネキシン26タンパク質を指標として評価する工程を含む癌転移能の検査方法。
【請求項７】
癌転移が肺への癌転移である、請求項1から6のいずれかに記載の検査方法。
【請求項８】
癌が肺癌である、請求項1から7のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
配列番号：1に示す塩基配列を持つDNAと特異的にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を持つDNAを含む、癌転移能の検査用試薬。
【請求項１０】
配列番号：2に示すアミノ酸配列を持つタンパク質と特異的に結合する抗体を含む、癌転移能の検査用試薬。
【請求項１１】
癌転移が肺への癌転移である、請求項9または10に記載の検査用試薬。
【請求項１２】
癌が肺癌である、請求項9または10に記載の検査用試薬。
【請求項１３】
次の工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニング方法。
A)  コネキシン26の少なくともギャップ結合活性を示す領域を含むタンパク質を提供する工程
B)  候補化合物をA)のタンパク質に接触させる工程
C)  A)のタンパク質に結合する候補化合物を選択する工程、および
D)  さらに、A)のタンパク質のギャップ結合活性を阻害する化合物を選択する工程
【請求項１４】
候補化合物がランダムな塩基配列からなるRNAライブラリーである請求項9に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
転移が肺への転移である、請求項13または14に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
癌が肺癌である、請求項13または14に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の転移能の試験方法、ならびに癌の転移を抑制する活性を持つ化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の進行にともなって、癌の転移が起きる。癌の転移は、ある組織で増殖した癌が、その組織を離れて他の部位に浸潤し増殖を開始する現象を言う。転移した癌を治療しえない場合には、いずれ何らかの形で患者の命を奪う原因につながる。癌が転移する能力を持つことは、一般に癌の悪性化と呼ばれている。癌の悪性化の程度を把握し、その転移を防ぐことは、癌の早期発見を可能とする診断方法や、発見された癌を取り除く治療方法と並んで、癌を克服するための重要な研究テーマである。
【０００３】
癌の転移は、原発巣からの離脱、癌細胞の組織間の移動、そして再増殖という複数のステップからなっている。実際には、この一連の過程には複雑な機構が関与しているとされており、その全体像は未だに解明されていない。たとえば、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)と呼ばれる一群のプロテアーゼの活性化は、癌の発生や悪性化と密接に関連しているといわれている。原発巣から離脱して血管内に侵入するとき、そして転移先に浸潤していくとき、細胞外基質(Extracellular matrix; ECM)の分解活性は重要な要素である。MMPは、このECMの分解に深く関与しているとされている。そのためMMP阻害剤には、抗癌剤として開発を進められているものもある。また細胞接着分子であるインテグリンは、癌の転移において、転移活性と転移先の臓器特異性に関与するとする報告がある。
しかし先に述べたように、癌の転移には未解明の部分が多く残されており、上記のようなこれまでに明らかにされた機構のみでは、その全体像の説明は不可能である。また、癌の転移を防ぐ治療薬の開発においても、更に詳細な転移のメカニズムの解明が必要である。癌の転移をいくつかの異なったステップの積み重ねの結果とするなら、各ステップの達成に必要な因子を明らかにし、それらの活性を総合的に把握することが癌の転移能を正確に評価することにつながる。また転移の予防においては、各ステップを構成する主要な因子を個別に阻害することにより、確実な転移の防止が達成されることになる。特に、一般に転移の危険が大きいとされているメラノーマや、肺小細胞癌において、その転移能を支えている因子を解明することができれば、診断や治療におおいに貢献するものと思われる。
【０００４】
現在までに報告されている癌転移関連因子のほとんどはディファレンシャル・ディスプレー法(differential display)によって発見されている。本発明の実施例において用いたF10細胞とBL6細胞を利用し、ディファレンシャル・ディスプレー法によって癌の転移に関連する遺伝子の単離を試みた報告もある(Cancer Res. 56, 875-879, 1996)。しかし単離された遺伝子の多くは、いわゆるハウスキーピング遺伝子であり、ディファレンシャル・ディスプレー法の弱点である効率の低さを表している。
【０００５】
一方、細胞間の結合様式の一つとして、ギャップ結合(Gap junction)が知られている。ギャップ結合は、動物の組織の多くで見られる細胞間の結合様式である。ギャップ結合では、隣接する細胞が互いに隙間を維持して結合し、結合部分にはコネクソンによって構成された細胞間を連絡する通路が形成されている。例えばcAMPのような分子量が1000Da以下の低分子量の物質は、この連絡通路を介して細胞間での移動が可能となっている。一方、通常のタンパク質や核酸は通過することはできない。この現象を利用して、ギャップ結合アッセイと呼ばれる分析方法が開発されている。すなわち、一方の細胞に分子量1000-1500程度の蛍光色素を保持させ、他の細胞と接触させる。両者の間でギャップ結合が形成された場合には、蛍光色素が他方の細胞に移動する（これを共役と言う）現象が観察される。ギャップ結合アッセイの中でも、マーカーとして蛍光色素を用いる場合には、特に色素トランスファーアッセイと呼ばれることもある。
【０００６】
コネクソンは、コネキシン(connexin)と呼ばれる互いに構造が類似したタンパク質群で構成されている。現在までに１２種のコネキシンが同定されており、αタイプとβタイプとに分類されている。特定の細胞には特定のコネキシンが発現していることが知られている一方、コネキシン自体は多くの異なる種類の細胞で発現しており、進化的にも良く保存されていることから、細胞社会の成立に重要な機能を担っていると考えられている。近年の分子遺伝学の進歩により、いくつかの遺伝性疾患とコネキシンの関係が明らかになった。たとえば、β1コネキシン/ コネキシン32 (Cx32) は遺伝性神経変性疾患であるX-linked Charcot-Marie-Tooth disease (CMTX) の原因遺伝子である(Science 1993 Dec 24; 262 (5142): 2039-2042)。またα1コネキシン/ コネキシン43 (Cx43) は、心臓の逆位などの症候を呈する遺伝性疾患であるvisceroatrial heterotaxia syndrome (VAH) の原因遺伝子とされている (N Engl J Med 1995 May 18; 332 (20): 1323-1329)。そしてβ2コネキシン/ コネキシン２６ (Cx26) は、遺伝性難聴疾患である autosomal recessive non-syndromic deafness (DFNB1) (Nature 1997 May 1; 387 (6628): 80-83)とautosomal dominant non-syndromic deafness (DFNA) (Nature 1998 May 28; 393 (6683): 319-320) の原因遺伝子であることが明らかになった。
【０００７】
ところで細胞増殖の抑制シグナルは、ギャップ結合を通って直接隣あった細胞に伝えられるいう仮説が提唱されてきた。この仮説を裏付けるように正常乳腺細胞と乳癌細胞とのサブトラクション法により、正常乳腺細胞には発現しているが乳癌細胞には発現していない遺伝子として、コネキシン２６（以下、Cx26と省略する場合もある）が単離された(Proc Natl Acad Sci USA 1991 Apr 1; 88 (7): 2825-2829)。実際、実験的に Cx26 を乳癌細胞株に強発現させることにより増殖は抑制され、ヌードマウスにおいての造腫瘍活性も顕著に低下し、Cx26は乳癌において癌抑制遺伝子としての機能があることが報告された。さらにHeLa 細胞においてもCx26は細胞増殖を抑制すると同時に、癌の遺伝子治療時に遺伝子が導入された細胞のみならず、周辺の細胞も殺すというバイスタンダー効果を増強することが報告された (Cancer Res 1997 Jul 15; 57 (14): 2929-2932)。しかし原発性の脳腫瘍ではCx26とCx43 が発現しており (Neurosurgery 1999 Feb; 44 (2): 361-369)、正常乳腺ではCx26 の発現は非常に低い一方、非定形型の乳癌の56%ではCx26 の発現が増強していた (J Pathol 1998 Jan; 184 (1): 37-43) という報告があるなど、人為的な実験から得られた結果と臨床サンプルを用いた結果とは必ずしも一致していないのが現状である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、癌の転移能を反映する新たな指標を提供することである。そして本発明は、この指標を利用して、癌の転移能の検査方法、並びに癌の転移を抑制するための薬剤をスクリーニングする方法の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、転移能決定因子を同定するため、マウス由来のBL6 細胞（自然高転移性）と F10 細胞（自然低転移性）との間で cDNA ライブラリーのサブトラクションを行い、BL6 細胞において高発現する２０数種の遺伝子を単離した。サブトラクション法には、転写標的遺伝子群の包括的、かつ能率的なクローニングが可能な、厳密な方法を採用した。この方法は本発明者らが開発した (Kobori M, Ikeda Y, Nara H, Kumegawa M, Nojima H and Kawashima H: Large scale preparation of a subtracted cDNA library. Genes Cells  3, 459-475, 1998)もので、高品質なcDNAライブラリーを同じドライバーmRNAに対して繰り返し差分化を行う。この方法によって癌転移に関連する遺伝子は濃縮され、単離効率が著しく向上する。
マウス・メラノーマ細胞株 B16 の亜株には、実験的転移能（静脈注射）と自然転移能（皮下注射）のいずれをも有する BL6 細胞と、実験的転移能は有するが自然転移能は有しない F10 細胞とがある。実験的転移能に比べて自然転移能はヒトの悪性癌により近い性質を持っていると考えられ、本発明のサブトラクションには好適な組み合わせである。そして、単離された遺伝子のうち、コネキシン２６をはじめとするいくつかの遺伝子と転移性の間に一定の関係があることを発見した。
更に、これらの遺伝子の全長cDNAをクローニングしF10細胞に導入してその自然転移能を検定したところ、コネキシン２６を導入した細胞においてのみ、BL6 細胞相当の高い転移性が確認された。また、この効果が本当に コネキシン２６の過剰発現によるものかどうかを確認するためコネキシン２６のドミナント・ネガティブ・フォームを BL6 細胞に導入してBL6 細胞が本来持っている自然転移能を阻害するか否かについて調査した。その結果、ドミナント・ネガティブ・フォームの発現量が、もともと BL6 細胞に存在する内在性のコネキシン２６量を凌駕するにつれて自然転移能を阻害した。
【００１０】
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の癌転移能検査方法と、癌転移抑制薬のスクリーニング方法に関する。
〔１〕癌細胞におけるコネキシン２６遺伝子の発現レベルを正常細胞のコネキシン２６遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む、癌転移能の検査方法。
〔２〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシン２６をコードするmRNAの定量によって評価する〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕mRNAにおける、少なくともコネキシン２６のギャップ結合活性を示す領域をコードしている領域を定量する〔２〕に記載の検査方法。
〔４〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、癌細胞に含まれるコネキシン２６タンパク質の定量によって評価する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシン２６タンパク質を特異的に認識する抗体による免疫学的な定量方法によって評価する〔４〕に記載の検査方法。
〔６〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、体液中のコネキシン２６タンパク質を指標として評価する工程を含む癌転移能の検査方法。
〔７〕配列番号：１に示す塩基配列を持つDNAと特異的にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を持つDNAを含む、癌転移能の検査用試薬。
〔８〕配列番号：２に示すアミノ酸配列を持つタンパク質と特異的に結合する抗体を含む、癌転移能の検査用試薬。
〔９〕次の工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニング方法。
ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示す領域を含むタンパク質を提供する工程
ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、および
ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する工程
〔１０〕候補化合物がランダムな塩基配列からなるRNAライブラリーである〔９〕に記載のスクリーニング方法。
〔１１〕〔９〕または〔１０〕に記載の方法により単離しうる化合物を主成分として含有する癌の転移抑制薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、癌細胞におけるコネキシン２６遺伝子の発現レベルを正常細胞のコネキシン２６遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む、癌転移能の検査方法である。
本発明において、癌転移能の検査方法とは、具体的には以下のような検査を意味する。第一に、ある癌がどの程度の転移能を有するか、定量的な評価を与える。第二に、癌の転移が起きている可能性を知るための指標を与える。第三に、コネキシン２６を標的とする癌の転移の防止が可能かどうかの指標を与える。本発明の癌の転移能の検査方法とは、これらの検査方法のいずれをも含むものである。
コネキシン２６とは、ヒトにおいては配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。ヒト・コネキシン２６は、配列番号：１に示す塩基配列を持つ遺伝子によってコードされていることが明らかされている(J. Cell Biol. 118, 1213-1221, 1992)。なお、コネキシン２６のような真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば多型現象が認められることがある。多型現象は遺伝子の塩基配列に見出される小規模な塩基の置換で、通常、塩基の置換がタンパク質の活性に与える影響は小さい。このような多型等によって塩基配列やアミノ酸に小規模な変異を生じたコネキシン２６も、それが癌の転移能に相関している限り、本発明におけるコネキシン２６に含まれる。
本発明において、コネキシン２６はヒト由来のものに限定されない。ヒト以外では、マウス(Eur. J. Cell Biol. 58, 81-89, 1992)、あるいはラット(J. Cell Biol. 109 (6 Pt 2), 3391-3401, 1989)におけるホモログが公知である。これら、コネキシン２６のホモログは、それぞれの種において癌の悪性度の指標とすることができる。
【００１２】
本発明において、コネキシン２６遺伝子の発現レベルは、mRNAの転写量、タンパク質量、あるいはコネキシン２６の生物学的な活性などに基づいて評価することができる。これらの手法は、いずれも公知の方法にしたがって実施することができる。たとえばmRNA量は、RT-PCR、FISH法、あるいはノーザンブロッティングによって定量することができる。これらの手法に必要なプライマーやプローブは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列（ヒトの場合）に基づいて、当業者に公知の方法で設計することができる。以下にRT-PCRに用いることができるコネキシン２６をコードする遺伝子を増幅するためのプライマーを例示する。
センス側プライマー:
5'-GCGAATTCAGGTGTAAATTTACCAAAAATA-3'（配列番号：３）
アンチセンス側プライマー：
5'-GCGCTCGAGCACCCAAGCTTTCCATCCTGG-3'（配列番号：４）
試料が癌細胞である場合には、細胞からmRNAを抽出し、RT-PCRを実施することができる。あるいは、インサイチュ RT-PCRやFISH法により、細胞内のmRNAレベルを直接的に評価することもできる。
【００１３】
次に、タンパク質量は、コネキシン２６に特異的な抗体を利用したイムノアッセイによって知ることができる。コネキシン２６に特異的な抗体は、たとえばZymed社などから商業的に供給されている。あるいは配列番号：２のアミノ酸配列を持つタンパク質を免疫原として、公知の方法によりポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を得ることもできる。免疫原として、配列番号：２のアミノ酸配列から選択した、コネキシン２６に特異的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを用いることもできる。イムノアッセイには様々なバリエーションが知られているが、抗原性物質のイムノアッセイであれば操作性、必要な感度、あるいは試料の特徴等を考慮して任意の方法を採用することができる。たとえば癌細胞を直接試料として用いる場合、固定した細胞標本に対して免疫染色を施すことにより、コネキシン２６の発現レベルの比較が可能である。あるいは、癌細胞の細胞ライゼートを試料としてELISA法やウエスタンブロッティング法を行い、コネキシン２６の発現レベルを把握することができる。
【００１４】
コネキシン２６の発現レベルは、癌細胞のみならず、体液中においても比較することが可能である。すなわち、たとえば血中におけるコネキシン２６のmRNAやタンパク質レベルを測定することにより、コネキシン２６の発現レベルを知ることができる。癌の転移において、血流中への癌細胞の離脱は重要なステップとなっている。この離脱した癌細胞に由来するコネキシン２６を血中において比較することは、癌の転移の検査において重要な情報を与える。血中のmRNAの量は、RT-PCRにより知ることができる。またタンパク質レベルについては、ELISAのようなイムノアッセイにより測定することができる。得られたコネキシン２６のmRNA（またはタンパク質）量は、健常者の測定値と比較することにより、癌の転移能が評価される。
【００１５】
以上のような、コネキシン２６の発現レベルを知るために必要な成分は、癌の転移能検査用試薬として有用である。すなわち、配列番号：１に示す塩基配列を持つDNAと特異的にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を持つDNAは、ヒトのコネキシン２６のmRNA量を測定するためのプライマーやプローブとして利用することができる。オリゴヌクレオチドは、検出を容易にするために予め標識しておくことができる。オリゴヌクレオチドを、フルオレセインイソチオシアネートのような蛍光色素、32P等の放射性同位元素、あるいはジゴキシンのような間接標識によって標識する方法は公知である。あるいは配列番号：２に示したアミノ酸配列を持つタンパク質と特異的に結合することができる抗体は、ヒト・コネキシン２６タンパク質の免疫学的な検出に利用することができる。この抗体についても、検出を容易とするために予め標識しておくことができる。抗体を、ぺルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインイソチオシアネートのような蛍光色素、125I等の放射性同位元素、あるいはビオチンのような間接標識によって標識する方法は公知である。
本発明による癌転移能の検査用試薬には、コネキシン２６を既知濃度で含む標準試料、試料の希釈や洗浄に用いる反応用緩衝液、標識成分の検出のために必要な付加的な試薬等を組み合わせてキットとすることができる。
【００１６】
本発明は、癌の転移能の検査方法に加えて、コネキシン２６を標的とする癌の転移抑制薬のスクリーニング方法をも提供する。すなわち本発明は、次の工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニング方法である。
ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示す領域を含むタンパク質を提供する工程
ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、および
ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する工程
本発明において、コネキシンとは配列番号：２のアミノ酸配列を持つヒト由来のコネキシン２６の他、マウスやラット等のような他の主に由来するものであることもできる。しかし、ヒト由来のものを用いることにより、ヒトにおけるより高度な有効性を持つ化合物のスクリーニングが期待できる。コネキシン２６は、完全な分子のみならず、そのギャップ結合形成領域のみを用いることもできる。ヒト・コネキシン２６においては、細胞外ループE1（N末端から数えて４１−６７位のアミノ酸配列）とE2（N末端から数えて１５９−１８９位のアミノ酸配列）がコネクソンどうしの結合に必要である(Cell 1996 Feb 9; 84 (3): 381-388)。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法において、コネキシン２６または候補化合物のいずれかを固相に固定化し、他方を標識することにより、スクリーニングを効率的に行うことができる。すなわち、たとえばコネキシン２６（またはギャップ結合ドメイン）を固定化した担体に、標識した候補化合物を接触させ、担体への標識の結合に基づいて両者の結合を検出することができる。あるいは、たとえばコンビナトリアルケミストリーによって固相上に合成された候補化合物ライブラリーに対して、標識したコネキシン２６（またはギャップ結合ドメイン）を接触させることによって、コネキシン２６に結合する化合物をスクリーニングすることができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法において利用することができる候補化合物には、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、RNAライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、あるいは合成低分子化合物のライブラリーなどが挙げられるが、これらに制限されない。これらの候補化合物の中でも、RNAライブラリーは、きわめて多様性に富むライブラリーを比較的簡単な操作で合成することができるので、候補化合物として望ましい。RNAライブラリーの合成と、このライブラリーのスクリーニングは、一般に次のように行われる。
(1)まずDNA合成機を用いT7RNAポリメラーゼのプライマー配列(34塩基)と任意の18塩基に挟まれたランダムな配列を持つオリゴヌクレオチドを合成する。25塩基を挟めば425≒1015  程度のランダム性を持つオリゴヌクレオチドの集団を容易に合成できる。
(2)これを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼを働かせ、ランダムな塩基配列を持つRNA分子集団を合成する。
(3)これを標的蛋白質を結合させたカラムを塩濃度を高めた状態で通過させ、次に吸着したRNA画分を低塩濃度の条件下で溶出させる。
(4)溶出したRNAを鋳型にし、18塩基部分をプライマーとして逆転写酵素を働かせてDNAに転換する。
(5)このDNAをPCR法により再び増幅する。
(6)増幅されたDNAを用い(1)-(5)のプロセスを何回も繰り返して特異的に結合するRNA分子を純化してゆく。
【００１９】
このような工程を経てRNAライブラリーから選択された、コネキシン２６に結合することができるRNA分子は、アプタマーとして機能する。アプタマーとは、標的蛋白質に特異的に結合して作用する機能性 RNA を意味する用語である。ラテン語で適合(fit)するという意味を持つ語(aptus)に因んでアプタマーと呼ばれる。実際に色素、蛋白質(T4DNAポリメラーゼ)などを標的にしたアプタマーが単離されてきた。RNAに転換せずDNAのままこの過程を繰り返してもよいが多様な立体構造を取りうるRNAのほうが遥かに高い確率でアプタマー分子が採取できる。本発明によってスクリーニングされたコネキシン２６に結合する化合物は、コネキシン２６に結合してそのギャップ結合を阻害する機能を有することから、この化合物を主成分として含有する癌の転移抑制薬とすることができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング法により単離される化合物を、薬剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕差分化cDNAライブラリーからのクローンの単離
自然高転移性のマウス由来メラノーマ細胞株BL6と、自然低転移性のF10細胞株を用い、サブトラクション法による転移関連遺伝子の単離を行った。操作は次のとおりである。
F10 とBL6 細胞株からグアニジンチオシアネイト/CsTFA法を用いて全RNA を抽出し、その後オリゴdT セルロースを用いてpoly (A)+ RNA を精製した。 リンカー- プライマー法を用いてcDNA ライブラリーを作製し、プラスミドベクター pAP3 neoに挿入した。公知の方法 (M. Kobori et al. Genes Cells Vol.3, 459-475, 1998) に従って、 BL6 細胞株から得られたcDNA ライブラリーから、F10細胞株から得られたcDNA ライブラリーを差し引いた差分化cDNA ライブラリーを構築した。４回、差分化の工程を繰り返した後、約1500 クローンを単離した。これらのクローンの中からBL6 細胞株においてF10細胞株と比較して転写が亢進しているクローンをノーザンブロット法により選別し、塩基配列を決定した。
得られたcDNAの塩基配列はBLASTN アルゴリズムを用いて、htgs データベースを検索した。その結果、BL6で特に高度な発現が確認された遺伝子はCx26であることが確認された。
【００２２】
〔実施例２〕コロニーハイブリダイゼーション
2 x 106 コロニーをナイロンメンブレンにトランスファーし、Cx26、PP2AB’alpha、ファキニン、TIB23 の［α-32P］dCTP 標識したそれぞれの3’ 端部分塩基配列を含む cDNAをプローブとして用いてスクリーニングを行なった。陽性コロニーからプラスミドを精製し翻訳領域に突然変異がないことを塩基配列を決定して確認した。
【００２３】
〔実施例３〕ウエスタンブロット解析
細胞抽出にあたっては、Hertzberg とSkibbents (E. L. Hertzberg and R. V. Skibbens Cell Vol.39, 61-69, 1984) の方法に準じて膜タンパク質を濃縮するためにアルカリ処理を行った。1 μg の細胞全抽出物を10 %SDS-PAGE で展開後、イモビロンメンブレン（ミリポア社製）にトランスファーした。メンブレンを300倍希釈した抗Cx26マウスモノクローナル抗体 (Zymed 社製）と２時間反応させ、PBSで洗浄後、1000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG (Cappel 社製）と反応させた。さらにPBSで洗浄後、メンブレンを化学発光試薬 Renaissense (NEN 社製) と反応させ、X線フィルムに露光した。同じ試料を展開した10 %SDS-PAGEゲルを銀染色試薬 (第一化学社製）の説明書に従って銀染色を行なった。
【００２４】
〔実施例４〕F10 とBL6 細胞における様々なコネキシンの発現
（１）細胞株と細胞培養
マウス・メラノーマ細胞株B16のF10亜株とBL6亜株は、テキサス大学Fidler I.J. 博士より提供された。NIH/3T3 細胞株はATCC (American Type Culture Collection ) より購入した。すべての細胞は10 % 仔牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（増殖培地）で維持した。形質転換体は２mg/mlの G-418含有増殖培地で維持した。
【００２５】
（２）ノーザンブロット解析
メラノーマのさまざまなクローン、マウスの組織およびヒト癌組織から抽出した全RNA 5μgを1% アガロース-ホルムアルデヒド上で展開し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。これをランダムヘキサマー法で［α-32P］dCTP 標識したDNAプローブとハイブリダイズさせた。Cx26のプローブとしては翻訳領域のcDNA断片を用いた。PCR法によって以下のコネキシンを検出するためのプローブを作製した。コネキシン32 (Dev. Biol., 146, 117-130, 1991、塩基番号50-582)、 コネキシン37 (J.Cell.Biol., 114, 1049-1057, 1991、塩基番号73-940) 、コネキシン40 (J.Cell.Biol., 117, 1299-1310, 1992、塩基番号154-826)、コネキシン43 (GenBank accession no. X61576、塩基番号458-1075) 。mRNA量を標準化するために用いるプローブβ-アクチンとGAPDHは上述と同様の方法で調製した。ブロッティング膜は最終的に50℃、0.1ｘ SSC、0.1% SDS で洗浄して露光した。定量化は BAS 2000 システム（フジフィルム株式会社製）を用いて行った。
図１ａで示すように、F10およびBL6細胞において、Cx26のmRNAの発現が検出でき、BL6細胞において、発現が５〜１０倍上昇していることが分かった。これに対して、他のコネキシンの発現レベルは検出限界以下だった。
【００２６】
（３）F10とBL6細胞におけるCx26タンパク質の発現
抗Cx26抗体を用いて単一な24kDa のCx26タンパク質が検出された(図１ｂの右のパネルにおいて矢印で表示した)。等量のタンパク質が展開されていることはゲルの銀染色によって確認された(図１ｂの左のパネル)。この抗Cx26抗体を用いた実験から、F10およびBL6細胞におけるCx26タンパク質の発現は、mRNAの発現と相関するといえる。
【００２７】
〔実施例５〕下大静脈断片とメラノーマ細胞により構成される共培養系
（１）メラノーマと血管細胞とのギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）活性の差異
新鮮なネズミ下大静脈断片を切開し、カバーガラスに貼り付け、F10またはBL6細胞をその上に播いて共培養した。４時間後、F10 (図２ａの左のパネル)またはBL6(図２ａの右のパネル)との共培養物を抗Cx26 抗体と反応させ、蛍光顕微鏡により観察した。矢印は細胞膜近くのCx26の局在を示している。BL6細胞において顕著な免疫染色像が見られたが、F10細胞では観察されなかった。免疫染色の大部分はBL6細胞の細胞質に広く分布していたが、BL6の細胞膜にも観察された。これらの結果から、BL6と静脈細胞との間の異常なギャップ結合が形成されたことが示唆された。
【００２８】
（２）色素−トランスファーアッセイ
色素−トランスファーアッセイは以下の手順で行った。
細胞膜透過性蛍光色素 BCECF acetoxymethyl ester (同仁社製) を最終濃度 1μMとなるように増殖期のメラノーマ細胞を培養している培地に添加し、３時間培養後、新鮮な増殖培地に取り換え、さらに１時間培養する。この細胞を集め、３回PBS で洗浄し後、色素−トランスファーアッセイに用いた。ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)能 はMesnil等の方法(M. Mesnil et al. Vol.55, 629-639, 1995) に従い評価した。メラノーマ細胞 と静脈片との共培養を行なうために、屠殺直後のマウスから胸郭部位の下大静脈を摘出した。静脈を縦方向に切開してその内面を露出させた。液状接着剤（小西社製)を周囲の組織に滴下することにより、この切開した静脈片の内面を上方にしてカバーグラスに接着させた。つぎにこのカバーグラスを培養皿の底面に置き、 BCECF標識した1 x 106個のメラノーマ細胞を含む増殖培地で満たした。共培養物を一定時間経過後に、4 % パラホルムアルデヒド・0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2 を用いて固定し、直接、コンフォーカル・レーザー走査型顕微鏡を用いて、暗視野における蛍光を観察した。組織学的な観察にはBCECF標識していないメラノーマ細胞を用いて同様な手順で共培養を行った。
BCECFでラベルしたF10およびBL6細胞を下大静脈断片上へ播いた上記の色素−トランスファーアッセイにより、BL6と静脈細胞との間の異常なギャップ結合形成の確認を行った。４時間後、共培養物を蛍光顕微鏡により観察した。 BCECFの転移は矢印で示す(図２ｂ)。BL6細胞からは色素が転移し、血管表面が染色されたが、F10細胞からの色素の転移は見られなかった。２時間後(図２ｃの上のパネル)と４時間後(図２ｃの下のパネル)の色素の拡がりを共培養上で共焦点レーザー走査型顕微鏡により観察した。矢印の先は BCECF標識 F10細胞とBL6細胞を示す。２時間後は、F10またはBL6のいずれからも色素の転移はほとんど見られなかった。４時間後は、いくつかのBL6細胞は周囲の細胞へ、色素を転移させていることが分かった(図２ｃの右下のパネル)。転移したBCECFで染色された細胞は、丸石状に配置し、BL6細胞から血管内皮細胞への効率的な色素の転移が起こったことが示された。４時間後500個のBCECF標識細胞を観察した時、血管内皮細胞と色素の共役を認める細胞数を計測した。約20の細胞が色素を周囲の血管内皮細胞に転移させていた(図３)。一方、観察したすべてのF10細胞は、４時間後でさえもBCECFを、細胞質中に保持していた(図２ｃ左下のパネル)。
【００２９】
（３）野生型および変異Cx26、コネキシン32のトランスフェクションによって得られた変異F10のGJIC活性の測定
Cx26とGJIC能との関連性を明らかにするために、野生型Cx26に対しドミナントネガティブの効果を示すことが知られている(A. Duflot-Dancer et al. Oncogene Vol.15, 2151-2158, 1997)、次の変異体を発現するベクターをF10（あるいはBL6）に形質転換し、G-418 耐性株を選択して形質転換体を得た。
F10-Cx26C60F
（６０位のシステインをフェニルアラニンへ置換）
F10-Cx26P87L
（８７位のプロリンをロイシンへ置換）
F10-Cx26R143W
（１４３位のアルギニンをトリプトファンへ置換）
野生型および変異Cx26、コネキシン32のトランスフェクションによって得られたF10変異体について、（２）に記載した方法によりGJIC活性を測定した。野生型Cx26(F10-Cx26WT-1および-2)でトランスフェクションしたF10細胞の２つの独立したクローンはBL6と同じく効率的に色素を血管内皮細胞へ転移させた（図３）。これに対してF10-Cx26C60FおよびF10-Cx26R143W細胞は、血管内皮細胞のGJIC活性を持たないことが確認された。F10-Cx26P87L細胞はわずかに活性が見られた(図３)。
この系におけるドミナントネガティブ効果をテストするために、Cx26R143WのcDNAを、BL6細胞へ導入した(BL6-Cx26R143W-1および-2)。その結果、予想どおり、血管内皮細胞のGJIC活性がほとんど見られなかった(図３)。Cx26とコネキシン32との間でヘテロ型ギャップ結合能を示すことから、コネキシン32cDNAでトランスフェクションしたF10クローンは、血管内皮細胞のギャップ結合形成能があると思われたが、F10-Cx32WT-1および-2の両クローンともギャップ結合形成能が見られなかった（図３）。このことからCx26が、血管内皮細胞とのギャップ結合能に特別な役割を果たしていることが確認された。
【００３０】
（４）BCECFで標識した細胞との共培養６時間経過後の観察結果
共培養を６時間に延長すると、F10細胞の細胞質における蛍光強度は、４時間時に観察したときと同じであったことから、F10細胞は、色素結合能欠損であることが示唆された(図４ａ)。対照的に、下部大静脈（ＩＶＣ）表面に接着しているBL6の大部分の蛍光強度は、弱くなったことから、BL6と血管内皮細胞との間の効率的な色素結合能が示唆された(図４ｂ)。特に、ＩＶＣ表面にある扁平な形のBL6細胞では、蛍光強度が、大きく減少した。いくつかのBL6細胞は血管内皮細胞上に浸入する表現型を示した。血管内皮細胞の下に浸入したBL6細胞は、完全に蛍光を失うので、蛍光顕微鏡では検知することができなかった(図４ｃ)。
【００３１】
〔実施例６〕形質転換細胞の自然転移の解析
（１）自然転移アッセイ
2.5 x 105 個の細胞 (F10, BL6 およびそれらのトランスフェクタント細胞株)を、４週齡のオスの C57BL/6 マウス( 7匹/ 1 クローン) のフットパッドに皮下注射した。腫瘍の大きさは２日ごとに直接直径を計測してモニターした。３週後、（その時腫瘤は直径 8-10 mm に達している）腫瘤のある方の脚を切断する。その後マウスを４週間生かしたのち、解剖を行ない、両側の肺に形成された転移性のコロニー数を計測した。
【００３２】
（２）解析結果
図３で使用したメラノーマ細胞、およびそのトランスフェクションした細胞を、マウスのフットパッドへ皮下注射した。二ヶ月後、もとのBL6細胞は高度に転移したが、もとのF10およびベクターでトランスフェクションしたF10細胞(F10-pAP3neo-1および-2)は、ほとんど転移していなかった(図５)。色素結合能のあるF10クローン(F10-Cx26WT-1および-2)は、BL6細胞と同じく高い転移を示した。２つの転移性F10クローンによって作られたコロニーは、無色に見え、BL6細胞によって作られた全てのコロニーが、濃い黒色であったのとは対照的であった(図６)。色素結合能欠損F10クローンであるF10-Cx26C60F、F10-Cx26P87L、F10-Cx26R143W、F10-Cx32WT-1および-2は、ほとんど転移しなかった(図５)。しかし、色素結合能欠損BL6クローンであるBL6-Cx26R143W-1および-2は、もとのBL6細胞と同じくらいの転移性のコロニーを形成した(図５)。
【００３３】
〔実施例７〕ヒト肺小細胞癌におけるCx26のRNA の発現
（１）ヒト肺癌サンプル
兵庫成人病センターにおいて1991年から1997年において、標準的な手術（第一次と第二次リンパ節の完全廓清手術を含めた）を受けた肺小細胞癌の23人の患者を対象とした。再切除された標本は慎重にInternational Staging System for Lung Cancer (C. F. Mountain and C. M. Dresler Chest Vol.111, 1718-1723, 1997) にしたがって癌の進行ステージが決定された。癌組織はRNA 抽出に用いるまで凍結保存した。
（２）ヒト肺小細胞癌におけるCx26のRNA の発現量の測定結果
実際にCx26がヒトの癌において転移を促進するかどうかを調べるために、ヒト肺小細胞癌（ＳＣＣ）でのCx26のmRNAの発現を調べた。２３人のＳＣＣの患者は、リンパ節の切開を含む類似の手術を受けた。臨床病理的な段階では、全ての患者でＭ値は０であった。ＴおよびＮ値に基づいて、患者を３つの群、低転移群(T2N0; n=11)、中転移群(T2N1; n=4)、高転移群(T2N2; n=8)に分けた。原発性の腫瘍から抽出した全ＲＮＡを、ノーザンブロットによって解析した（図７）。高転移群へ属する８つのケース中２つのケースにおいて、顕著なCx26のmRNAの発現を検出した。発現量のレベルは、GAPDHの発現を利用した濃度補正後、BL6細胞の発現量レベルに匹敵した。対照的に、低および中転移群に属する全てのケースでは、Cx26のmRNA発現量は、F10細胞における発現量よりも低かった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、癌の転移能を評価するための新しい指標が提供される。コネキシン２６が細胞同士の結合に関与するタンパク質であることから、癌の転移を構成する複数の段階の中で、特に癌細胞の他組織への付着と浸潤の過程に関与していることが推測される。したがって、コネキシン２６を指標とすることにより、転移における重要なステップについて、癌の持つ転移能を定量的に把握することが可能となる。
一方、本発明による癌転移抑制薬のスクリーニング方法においては、癌にとっては転移のために不可欠なステップを支える重要な要素の一つと思われるコネキシン２６を標的とすることにより、癌の転移を効果的に抑制することができる化合物の探索が可能となる。本発明のスクリーニングによってもたらされるコネキシン２６の結合活性を阻害する化合物は、癌の転移を抑制する薬剤として有用である。この薬剤は、本発明の癌転移能の検査方法と組み合わせて、コネキシン２６の発現レベルの高い癌に対して用いることによって、転移の予防を効果的に達成することができる。
本発明によって、コネキシン２６は癌細胞の中でも転移能の非常に高いメラノーマの皮下移植モデル（自然転移系）において直接的に転移に関与していることが示された。またヒト肺小細胞癌のなかでコネキシン２６の発現が亢進している例が認められた。以上のことより、コネキシン２６は迅速な治療を必要とする高転移性の癌細胞において静脈内への浸潤に関与していることを示唆しており、従来癌治療成績がもっとも悪いタイプの癌の早期診断や抗転移治療に結びつくと考えられる。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】F10およびBL6細胞におけるCx26の発現レベルを示すノーザンブロット法の結果を示す図。
（a） Cx26、Cx32、Cx43、Cx37、およびCx40の転写を検出するノーザンブロット解析の結果を示す。マウスの肝臓、心臓、それに肺組織から抽出した全RNAも陽性対照としてブロットした。
（b） F10およびBL6細胞におけるCx26タンパク質の発現を示す。抗Cx26抗体は、約24kDaのモノマーCx26タンパク質を検出した（右パネルの矢印が示している）。同等のタンパク質がローディングされていることが、ゲルの銀染色から確認された（左の写真）。
【図２】血管内皮組織から成る共培養システム、および血管内皮組織上に蒔いたメラノーマ細胞の顕微鏡観察画像を示す図。バーは20μmを示す。
（a） ４時間後、F10細胞（左の写真）あるいはBL6細胞（右の写真）との共培養は、抗Cx26抗体によって免疫反応が起こり、蛍光顕微鏡で観察された。矢印は細胞膜付近のCx26を示している。
（b） BCECFで標識したF10細胞（左の写真）あるいはBL6細胞（右の写真）を血管内皮組織に蒔いた。共培養は4時間後に打切り、蛍光顕微鏡で観察を行った。BCECFの共役をくさびで表す。
（c） 共培養の2時間後（上段の写真）と4時間後（下段の写真）に、染色の広がりを共焦点レーザー走査顕微鏡により観察した。蛍光強度は色で表示し、赤は青よりも強いことを示している。くさびは、BCECFで標識されたF10細胞およびBL6細胞を示す。
【図３】ギャップ結合アッセイの結果をまとめたグラフ。
共培養開始後4時間でBCECFで標識した細胞500個が観察され、そのとき内皮細胞に色素の共役を示す細胞数を計測した。データは３回の独立した試験の平均を示した。バーは標準誤差を表す。＊は、F10細胞から得た値と比較した場合のｔ検定によるp<0.01を示す。
【図４】共培養開始後6時間目にBCECFで標識した細胞との共培養を観察した顕微鏡観察画像を示す図。血管内皮組織は、蛍光顕微鏡（左の写真）、およびH&E染色後に光学顕微鏡（右の写真）で直接観察した。バーは20μmを示す。
（a） BCECFで標識したF10細胞との共培養の結果を示す。F10細胞のいくつかが血管内皮組織表面に広がっているが観察された（くさびで示す）。F10細胞の蛍光強度は、共培養4時間後でも強く観察された。
（b） BCECF標識したBL6細胞との共培養を示す。BL6細胞の蛍光強度は4時間の共培養の場合に較べ、段々と弱くなっていった。これは特に血管内皮組織表面にある扁平な形のBL6細胞に顕著に現れた（ｂにくさびで示す）。ｃの右の写真のくさびは、内皮細胞の直ぐ下に侵入しているBL6細胞を示している（矢印で示す）。しかし、H&Eで染色する前に蛍光顕微鏡で、同様なBL6細胞を発見するのは困難である（ｃの左の写真にくさびで示す）。
【図５】Cx26 形質転換細胞の自然転移の解析結果をまとめたグラフ。
マウスをF10細胞あるいはBL6細胞、またはそれぞれ異なる形状のCx26やCx32でトランスフェクトした細胞で処理したときに、肺で作られた転移コロニーの数を示す。肺の重量も計測した。データは１クローンあたり７マウスの平均を示している。バーは標準誤差を表す。＊はF10細胞から得た値と比較した場合のｔ検定によるp<0.05を示す。
【図６】Cx26 形質転換細胞の自然転移病巣を示す顕微鏡観察画像を示す図。
F10細胞（上段の写真）、BL6細胞（中段の写真）それにF10-Cx26WT-1細胞（下段の写真）によって、肺に転移したコロニーの例を示す。
【図７】ヒト肺小細胞癌におけるコネキシン２６mRNAの発現を分析したノーザンブロット法の結果を示す図。癌試料は、ぞれぞれのN値に基づいて3グループに分割した。F10細胞およびBL6細胞から得た全RNAもブロットした。RNA量は、GAPDHプローブで標準化した。分化の病理上の程度はW,良好；M、適切；P、不良、と表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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