(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性凝集体の量が0.5％未満であるシステイン置換フォン・ブィレブランド因子（vWF）フラグメントの水溶液の製造方法であって、以下の工程：
（A）システイン置換vWFフラグメント、変性剤及び望ましくない細菌性汚染物質を含む酸性水溶液を提供する工程；
（B）前記水溶液を、前記vWFフラグメントに付着するヘパリンを含む親和性クロマトグラフィーの媒体に接触させることにより、前記水溶液から前記汚染物質を分離する工程；
（C）変性剤の存在下で、前記親和性クロマトグラフィーの媒体から前記vWFフラグメントを溶出させる工程；
（D）2.5から5.5未満のpHに該水溶液を維持し、前記フラグメントの単量化を促進し、かつその凝集体を減らす間に、該変性剤から、溶出されたフラグメントを分離し、それにより可溶性凝集体の量が0.5％未満であるシステイン置換vWFフラグメントの水溶液を製造する工程、
を含み、前記フォン・ブィレブランド因子フラグメントが、445位アミノ酸残基にアミノ末端残基を有し、かつ733位アミノ酸残基にカルボキシ末端残基を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記vWFフラグメントの供給源が、宿主細菌細胞において発現された組換えDNA分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記システイン置換vWFフラグメントが、組換えvWFフラグメント及び変性剤の水溶液を、アルキル化条件におき、これによりアルキル化vWFフラグメントを形成することによって調製される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記変性剤が尿素である請求項１記載の方法。
【請求項５】
pHが2.5から5.5未満のフラグメントの水溶液で、総イオン濃度が75mM未満である請求項１記載の方法。
【請求項６】
親和性クロマトグラフィーで単離された単量体システイン置換フォン・ブィレブランド（vWF）フラグメントの二量体化を制限する方法であって、該親和性クロマトグラフィーの媒体が前記vWFフラグメントに付着するヘパリンを含み、該フラグメントが、445位アミノ酸残基にアミノ末端残基を、733位アミノ酸残基にカルボキシ末端残基を有し、前記二量体化が、インビボで、２以上の成熟vWFサブユニットの結合を促進する、１以上のイオン性、疎水性、又は水素結合を有し、該方法が、pHが2.5から5.5未満で、10mg/mlまでの該フラグメントを含む水溶液を調製することを含み、かつ該溶液中のイオン種の総濃度が存在するときは75mM未満である方法。
【請求項７】
可溶性凝集体の量が0.5％未満であるシステイン置換フォン・ブィレブランド因子（vWF）フラグメントの水溶液の製造方法であって、以下の工程：
（A）細菌性汚染物質を含む、尿素、及び組換え手段により調製したシステイン置換vWFフラグメントの水溶液を提供する工程、該水溶液はpHが6.5未満である；
（B）前記水溶液を、前記vWFフラグメントに付着するヘパリンを含む親和性クロマトグラフィーの媒体に接触させることにより、前記水溶液から前記汚染物質を分離する工程；
（C）前記vWFフラグメントと、該vWFフラグメントを親和性クロマトグラフィーのヘパリンから解離させるのに十分な濃度の塩水溶液とを、接触させることにより、変性剤の存在下で、前記親和性クロマトグラフィーの媒体から前記vWFフラグメントを溶出させる工程；
（D）2.5から5.5未満のpHに該水溶液を維持し、前記フラグメントの単量化を促進し、かつその凝集体を減らす間に、該変性剤から、溶出されたフラグメントを分離し、それにより可溶性凝集体の量が0.5％未満であるシステイン置換vWFフラグメントの水溶液を製造する工程、
を含み、前記フォン・ブィレブランド因子フラグメントが、445位アミノ酸残基にアミノ末端残基を有し、かつ733位アミノ酸残基にカルボキシ末端残基を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は治療用ポリペプチドに関するものである。さらに詳細にいうと、本発明は、例えば、血栓症のような血管障害の治療に用いることができる、フォン・ブィレブランド因子の精製フラグメントに関するものである。
用語「止血」とは、血管の傷によって起きる循環している血液が失われることに対する、体の防御機構を含むプロセスをいう。本発明は、止血機構のタンパク質の１種である、フォン・ブィレブランド因子（“vWF”）を基礎とする治療上有用なタンパク質１種を提供するものである。
血管傷害に対する通常の生理的応答としてのプロセスは、例えば、アテローム硬化型の血管病又は慢性うっ血性心臓機能不全に苦しむ患者のような、病的な症状をもたらし、その結果として血管閉塞を伴う望ましくない血栓（凝血塊）を形成する。
このような状況下では、臓器への血流障害が、心筋梗塞を含む重度の病的障害をもたらし、先進国における死亡の主な原因となっている。傷に対する応答又は血管病状態の結果として、循環器系内の血液流の減少又は停止は、第１及び第２止血という、２つのプロセスに分けることができる複雑な一連の反応である。第１の止血とは、血小板血栓又は軟い凝血塊の形成をいう。血小板は、巨核球細胞由来の直径約２〜５ミクロンの非核円板状構造である。有効な第１止血は、血小板の接着により達成される。この血小板は、内在性のコラーゲン繊維、及び／又は血小板が結合するプロテオグリカン及びグリコスアミノグリカンのような他の接着性高分子を露出した、障害を受けた血管内皮細胞の表面と相互作用する。
第２の止血は、軟い血小板の凝血塊の強化又は架橋を含むものである。この第２プロセスは、血漿中を循環するタンパク質（血液凝固因子）により開始される。該因子は、傷又は血管病状態のいずれかの応答における第１止血の間に活性化される。これらの因子を活性化することにより、最終的に軟い凝血塊を強化する、タンパク質フィブリノーゲン（以下、”フィブリン”という。）の高分子マトリックスを作り出す。
しかし、例えば、血栓症又は脳卒中の予防及び治療において、血管中における血小板の枕積を妨げること、及び動脈移植部の閉塞を妨げることが好ましい場合がある。また、手術中に起きる血小板血栓も、既存の欠陥閉塞を軽減しようとする試みに干渉することがある。
坑血小板剤には、血小板に置き代わり、又は他の循環器系成分と相互作用することにより、第１止血を抑制する化合物がある。坑血小板剤として使用すると記載されている化合物には、分子量が約52,000で、vWFのトリプシン消化により誘導された、vWFのアルキル化フラグメントがあり、これは、該フラグメントのほぼ449〜728残基を含んでいる。この治療用フラグメントは、欧州特許出願第87304615号（1987年５月22日出願）の対象であり、1988年２月３日に第25 5206号として公開されている。この刊行物の記載は、引用により本明細書に組み入れられている。
背景として、先に記載したフラグメントをベースとする、vWFは、血液中を循環する高分子量多量体タンパク質であり、血液の凝塊に含まれていることに注意しなければならない。vWFは、血小板と損傷した血管の間に架橋を形成することにより、血小板と該血管を結合させると認められている。また、vWFの血小板結合部位は前記449〜728残基の中に含まれている。
坑血小板剤としての前記vWFフラグメントの機能に関し、該フラグメントは、血小板の糖タンパク質Ibαレセプターに結合することにより機能し、それにより、血液中の該vWFの血小板への結合を阻害すると考えられている。事実、前記vWFフラグメントは、通常、血液のvWFに占められるGPIbの表面レセプターを占拠している。そして、それは由来となる大きなvWF分子の架橋活性を欠くので、それは、血小板接着、すなわち結果として生じる凝血塊形成が始まらないのである。
実際には、血漿から、治療に有効な量のvWFのこの又は他のフラグメントを誘導することは難しい。その困難さには、例えば、トリプシン消化のような、他の部分から449〜728残基を有効に分離すること、及び肝炎ウイルス及びHIVのようなヒトウイルスにより潜在的に汚染されている血液誘導成分の有効な滅菌に関する要求がある。したがって、vWFのこのフラグメントを、例えば細菌性宿主細胞などの、宿主細胞中の組換えDNAを用いて製造のが好ましいと判っていた。
不運なことに、細菌発現系により産生されたvWFフラグメントは、多量の不溶性凝集体（インクルージョンボディ）として、宿主細胞中に蓄積することが判った。該フラグメント（449〜728残基）の治療上有用な製剤を調製する目的から、宿主細胞に含まれているインクルージョンボディから溶解性形態で該フラグメントを抽出することが必要である。
本発明はその範囲に、宿主細菌細胞中の組換えDNA分子から発現したvWFの治療上有効なフラグメントの回収を含んでいる。また、該発明は、純粋で、かつ非凝集形態のこのようなフラグメント、そして実質的に凝集体を含んでいない治療用製剤を提供する。
発明の要約
本発明は、実質的に凝集体を含まないシステイン置換フォン・ブィレブランド因子（vWF）フラグメントの水溶液を製造する方法を提供する。該方法は次の工程を含む：
（A）システイン置換vWFフラグメント及び変性剤の水溶液を提供する工程；
（B）該フラグメントの凝集体をその二量体及び／又は単量体に転換することを促進する条件下で、該フラグメントと変性剤を精製し、精製フラグメントを提供する工程；
（C）約2.5から約5.5未満のpHに該フラグメントの水溶液を維持し、前記フラグメントの単量化を促進し、かつその凝集体を減らす間に、該変性剤から、溶解、精製された前記フラグメントを分離し、それにより実質的に凝集体を含まないシステイン置換vWFフラグメントの水溶液を調製する工程。
好ましい実施態様において、工程（A）のシステイン置換vWFフラグメントを、アルキル化フラグメントとして提供し、工程（A）及び（B）において用いた変性剤が尿素であり、かつ前記pHを約３〜約４に維持する。
血小板の結合部位としての役割に加えて、変異体vWFサブユニットの445〜733残基フラグメントは、大きなvWF多量体を形成するvWFサブユニットの非共有及び共有結合に関し、インビボで応答するサブユニットドメインを含む。したがって、このポリペプチドは二量体化及び／又は凝集体を形成する傾向がある。該フラグメントの最も生物学的に活性な形態は単量形態であるから、このことは望ましくない。したがって、本発明の一面はシステイン置換vWFフラグメントの製剤において、凝集体の形成を阻止することであり、このような凝集体は、心臓血管障害及び有害な臨床的結果をもたらす危険が潜在的にある場合の治療には、治療上ほとんど有効性はない。
本発明の他の面は、単量体システイン置換フォン・ブィレブランド（vWF）フラグメントの二量体化を制限する方法を提供することにある。該二量体化には、インビボで、2以上の成熟vWFサブユニットの結合を促進する、１以上のイオン性、疎水性、又は水素結合が含まれている。当該方法は、pHが約2.5から約5.5未満で、約10mg／mlまでの該フラグメントを含む、単量体システイン置換vWFフラグメントの水溶液を調製することを含み、かつ（もし、あるならば、）該溶液中のイオン種の総濃度が約75mM未満である。
さらに本発明の他の面には、患者に投与する前かなりの期間、効果的に保存できる、非凝集システイン置換vWFフラグメントを含む、水性製剤を提供することがある。したがって、凍結乾燥し、次いで再水和しても、その後、実質的に非凝集形態、すなわち、凝集体が実質的にない、非凝集システイン置換vWFフラグメントを含む水性製剤を提供する。
さらに本発明の他の面には、例えば、宿主DNA及び／又はタンパク質、又はエンドトキシンのような汚染性高分子を完全に除去するように、インクルージョンボディから純粋なアルキル化vWFフラグメントを誘導する能力を開発することがある。これを達成するために特に有用な精製工程が含むのは：（A）アルカリ性pHの、アルキル化vWFフラグメント及び変性剤の水溶液を、前記汚染物質が付着するアニオン交換物質と接触させることにより、当該溶液から前記タイプの汚染物質を分離し、（B）汚染物質を除去した前記水性溶液を、アルキル化vWFフラグメントが付着するカチオン交換樹脂と接触させ；かつ（C）該カチオン交換樹脂をイオン化クエン酸及びノニオン性変性剤を含む水溶液と接触させ、前記樹脂からアルキル化vWFフラグメントを溶出させることである。ここで、移動相のクエン酸イオンへの溶出フラグメントの親和性は、固定相からの溶解を促進する。
本発明のさらに他の面は、親和性クロマトグラフィーを用いる他の精製方法を採用するものである。この方法に特に有用な精製工程は次のものを含む；pHが酸性で、vWFフラグメント及び変性剤の水溶液を、前記vWFフラグメントを付着する、親和性クロマトグラフィーの媒体に接触させることにより、前記水溶液から汚染物質を分離すること；親和性クロマトグラフィー媒体からvWFフラグメントを溶出させること；及び約2.5から約5.5未満のpHに該フラグメントの水溶液を維持し、それにより該フラグメントの単量化を促進し、かつそのフラグメントの凝集体を減らす間に、該変性剤から、溶出されたフラグメントを分離し、実質的に凝集体を含まない該フラグメントの水溶液を提供することである。
本発明の他の面は、本発明の治療用製剤を用いて患者の血栓を治療する方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、アルキル化フォン・ブィレブランド因子フラグメントの総濃度により影響される、単量体／二量体平衡のプロフィールである。
図２は、アルキル化フォン・ブィレブランド因子フラグメントの特定濃度で引き起こされる、血小板アグルチネーション（凝集）の阻止の記録である。
図３は、血小板アグルチネーションを阻止する、非凝集及び凝集アルキル化フォン・ブィレブランド因子フラグメントの比較した能力の記録である。
図４は、pH3.5及びpH4..5における非凝集アルキル化vWFフラグメントの円偏光二色性のプロフィールを示す。
定義
本明細書中では他に示さない限り、下記の用語は定義に示された意味を有する。
CDNA  mRNAの鋳型にある配列から酵素的に合成されたDNA分子又は配列。
発現  構造遺伝子により起きる、生成物の産生のプロセス。タンパク質産生の場合、転写と翻訳の組み合わせである。
組換えDNA分子  末端と末端とを結合させ、かつ何らかの宿主細胞に入りこみ、その中で持続する能力を有し、又は有するように改良され得る、異なるゲノム由来のセグメントから成る分子。
クローニング  無性生殖又はDNA複製により、ある種の生物又は配列由来の、一群の生物、又はDNA配列又は他の巨大分子を得るプロセス。
生物学的活性  生物学的背景（すなわち、生物における、又はインビトロの複製）において、ある分子により、なされる又は引き起こされる活性の１種以上の機能、効果。成熟フォン・ブィレブランド因子サブユニットの445〜733位残基単量体フラグメントの特徴的生物学的活性とは、血小板のGPIbαレセプターに結合し、それにより血小板のアグルチネーションを阻止する潜在的能力である。
成熟フォン・ブィレブランド因子サブユニットの445〜733位残基単量体フラグメントの特徴的生物学的活性の付加的な面は、ただ１箇所の血小板GPIbαレセプターに結合し、それにより該分子が、血小板に対する多量体vWFのボトロセチン誘導結合を阻止する能力である。単量体445〜733位の分子の他の得られる又は関連する効果には、血小板活性化、すなわち表面との付着を阻止することがある。したがって、このようなフラグメントは、坑血栓剤として治療上有用性がある。
還元条件  フォン・ブィレブランド因子、該因子由来のポリペプチドを含む溶液中に還元剤が含まれていることをいう。該薬剤は、前記vWFのジスルフィド結合を分裂させるものである。
フォン・ブィレブランド因子（vWF）  本明細書中に言及されている、すべてのフォン・ブィレブランド因子はヒトvWFをいうものと考える。この用語「フォン・ブィレブランド」は、後に定義する用語「成熟vWF」をその範囲内に含むことを意図するものである。
成熟vWF  血漿中に見出される、又は内皮下層に結合している循環性vWFをいう。通常、多くの種類のポリペプチドの多量体に会合している、一群のポリペプチドの単量体からなり、該単量体のサブユニット（単量体）は、長さが2050残基である。加えて、哺乳類の細胞で発現した場合、成熟vWFは、通常、グリコシル化されている。フォン・ブィレブランド因子は、内皮下のマトリックスの成分として、活性化された血小板のα−顆粒の成分として、及び循環性血漿タンパク質として見出される。
単量体  システイン置換vWFフラグメントとの関係で用いられる場合、「単量体」は、他のポリペプチドに共有性、又は非共有性のリンクもしていない単純ポリペプチドをいう。「二量体」とは、２個の単量体の非共有性結合をいう。「凝集した」システイン置換vWFフラグメントとは、構造が二量体よりも大きいことをいう。
精製された又は実質的な精製形態  vWF誘導ポリペプチドに関し用いる場合、この及び類似の用語は、該組成物に細胞原形質が実質的にほとんどないこと、無vWF−タンパク質で、すなわち通常、体内でポリペプチドが生成されるときに生じる細胞外物質がほとんど含まれていないことを意味する。
親和性クロマトグラフィー  特定の分子には強く結合するが、非共有性であるというタンパク質の能力を利用する、クロマトグラフィー法をいう。親和性クロマトグラフィーを実施するために、例えば、ヘパリンのようなリガントといわれる分子をクロマトグラフィー用の物質、通常、多孔性で不活性なマトリックスに共有性の結合をさせる。精製されたタンパク質、本件ではvWF、及び各種他の望ましくない物質を含む溶液を、クロマトグラフィー物質に通す。所望のタンパク質が、該クロマトグラフィー物質に結合しているリガンドと選択的に結合し、他の物質が溶出される間、保持される。次いで、該vWFフラグメントを、前記リガンドと結合性相互反応から該タンパク質を放出するように溶出条件を変えることにより、高度に精製された形態で回収することができる。
ヘパリン  D-グルクロネート-2-スルフェート及びN-スルホ-D-グルコスアミン-6-スルフェートの置換性α（１→４）リンク残基から主としてなる可変性硫酸化グリコスアミノグリカンをいう。
表１は、本件出願において用いるアミノ酸の標準的３文字指定を示している。
0004233114.tif 000002
発明の詳細な説明
本発明が関連する坑血栓ポリペプチドは445位残基445（セリン）から始まり、733位残基（バリン）で終わる、見かけ分子量が約33,000の成熟vWFサブユニットのアミノ酸配列ドメインを含む、システイン置換vWFフラグメントである。そのシステイン残基（位置は、459，462，464，471，474，509及び695である。）は、他のシステイン残基と相互反応する傾向を、システインに基づく結合が、単一フラグメント又はフラグメント間において形成できないように、阻止するように置き換えられている。このような結合の形成は、不溶性で、又は生物学的に活性であるような物質を形成する傾向がある。利便を図るため、このようなフラグメントを、本明細書中では「システイン置換vWFフラグメント」という。この用語は、445〜733位残基配列を含む又は重なる範囲にあるフラグメントを含み、そのGPIbα結合ドメインのすべて又は一部を含むものである。また、該用語「システイン置換vWFフラグメント」は、坑血栓に有用な前記445〜733位ドメインの変異アミノ酸配列を表わすポリペプチドを含む。このような変異配列はシステイン残基を含んでいても、いなくてもよい。
また、有核生物宿主細胞における、適当なcDNA又は他の組換えDNA分子の発現により得られるポリペプチドの形成により、効果的に単量体を産生でき、かつ本発明のプラクティスに従い、製剤できるものであると予想できるものである。
システイン置換vWFフラグメントはvWFのフラグメントに依存するので、このタンパク質並びに、止血及び血栓におけるその役割に関する情報を、この後に記載する。フォン・ブィレブランド因子は、30個までのグリコシル化サブユニットの一連の高分子量多量体として、ヒトに存在する。このサブユニットは、約270,000（270kDa）の分子量を有しそれぞれ同一と考えられている。各循環する「成熟」ヒトサブユニットは、2,050アミノ酸残基からなる。
傷付いた内皮表面を覆う血小板の最初の単層の形成は、架橋性機能であると考えられている。そこでは表面に結合した多量体vWFが、例えばコラーゲン又はプロテオグリカンのような内皮下層の成分と一方のサイドで結合し、かつ血小板膜のGPIb-IXレセプターと他方のサイドで結合する。多量体vWFと糖タンパク質GPIb-IX複合体（GPIb（α）で）の相互反応により、血小板の活性化が起き、かつ血栓を大きくするよう機能する追加の血小板の補充を促進する。また、急速に蓄積される血小板は、フィブリノーゲンの結合により架橋される。このプロセスで特に重要なことは、循環性vWFの多量体化及び多価特性であり、この性質が、該高分子化合物にその結合及び架橋機能を有効に発揮させる。
本発明が関連するシステイン置換vWFフラグメントは、実質的に、GPIbαに関連するvWF因子と競合し、vWFと相互反応に用いられないように、該レセプターと不活性化する。該フラグメントの性質に関し、研究の結果明らかになったことは、血小板膜糖タンパク質GPIb-IXレセプター（GPIbα）と結合する2,050残基成熟フォン・ブィレブランド因子のドメインは、循環性サブユニットのほぼ449位残基（バリン）からそのほぼ728位（リジン）にあるそのフラグメントである。該フラグメントは、見かけ分子量が約52,000であり、vWFのトリプシンによる消化、及びそれに続くジスルヒドの還元により調製することができる。vWFの前記GPIb（α）結合性ドメインは、該フラグメント中の２種の非連続配列Cys474-Pro488及びLeu694-Pro708に含まれる残基を有する（Mohri,H.らの論文、J.Bio Chem.263（34）、17901〜17904頁（1988年））。通常、該分子量52,000のフラグメントは「52/48」フラグメントと呼ばれ、ヒト酵素系が該フラグメントをグリコシル化し、その分子量に寄与するという事実を反映するものである。このグリコシル化の量は、２種の分子量52,000及び48,000の分子毎に変化するが、ほとんど共通である。組換え細菌宿主細胞から発現された場合、該フラグメントは哺乳類の細胞における発現に伴う翻訳後のグリコシル化に欠けることになる。グリコシル化による付加的分子量がない場合、該ポリペプチドは分子量が約33,000である。「52/48」及び「33」の双方のフラグメントは、フォン・ブィレブランド因子の血小板への結合を競合的に阻止する。
前記のとおり、血漿から治療上有用な量のvWFフラグメントを調製するのは困難である。したがって、宿主細胞において組換えDNAを用いvWFのこのフラグメントを産生するのが好ましいのは明らかである。広範囲の組換え系を該フラグメントをコードするDNA配列の発現に用いることができる。この後に３種の系の例を記載する。これらの系は成功理に用いられてきたものであり、細菌宿主細胞を用い、かつ僅かに大きい445〜733位残基フラグメントをコードするものである。該付加的アミノ酸及びカルボキシ末端残基配列は、坑血栓剤としてのフラグメントの有効性に関し十分な効果を有していないと判断されている。
（I）pMMB3と名付けられたベクターは、バクテリオファージλ由来の高度に有効なPRプロモータを組込んでいる。E.ColiにおけるvWFフラグメント発現の誘導を、該細胞を中対数期まで30℃で、次いで該温度を42℃に変えて培養することにより達成した。
（II）pMMB5と名付けられたベクターは、lacリプレッサーにより調節されたハイブリッドtrp-lac（tac）プロモータ系を組込んでいる。この系における誘導は、該細胞を中対数期まで37℃で、次いでラクトース類似物IPTGを添加して培養することにより達成した。
pMMB3及びpMMB5を用いて得た結果は非常に似ている。要約すると、各16時間前記プラスミドで形質転換したE.Coli細胞を、中対数期まで培養し、１〜誘導し、回収し、かつ溶解性及び不溶性成分を分画した。該vWFフラグメントは、双方の細胞の溶解物に次いで著しい不溶性を示した。
（III）カナマイシン（KmR）を付与されている、vWFフラグメントの発現に用いる第３のベクターは、バクテリオファージT7由来のプロモータを含んでいる。該ベクターは、Brookhaven National LaboratoriesのDr.F.William Studierが提供してくれたものであり、次のように構築された。該プラスミドを、BspHI-EcoRIフラグメント（pBR322bp 3195-4361）を切除することにより、pET-8c由来のアンピシリン耐性遺伝子を除去し、それをカナマイシン耐性（KmR）をコードする869bpフラグメントで置き換えることにより構築した。該KmR遺伝子はベクター中で時計様に配向されている。該KmR遺伝子はTn903に由来するものであり（Okaらの論文、J.Mol.Biol.147:217〜226頁（1981年））、かつpUC4KISSを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応により得られたものである（Barany F.の論文、Gene 37:111-123頁（1985年））。KmR遺伝子を担持するフラグメントは、KmR開始コドンの50ヌクレオチド先から始まり、正確に終結コドンで終わる。
前記vWFフラグメントを発現し、かつカナマイシン耐性を付与するプラスミドは、pET-8c52k及びpET-8c（KmR）と命名されたベクターから構築された。要約すると、vWFフラグメントをコードするXbaI/BamHIフラグメントはpET-8c52kから切り出したものであり、XbaI/BamHI切断pET-8c（KmR）に結合させたものである。得られたプラスミドDNA（pET-8c52k9KmR）をE.Coli DH-1細胞に導入して、形質転換し、かつ単一単離体が、Xba/BamHIで消化することにより、適当なサイズのフラグメントを放出することを同定した。次いでこの単離物から得たDNAを用いて、E.Coli BL21（DE3）pLysSで形質転換した。次いで、この形質転換体から得た単一単離物をvWFフラグメントの発現に用いた。
この系において、前記vWFDNAを、プロモータ及びバクテリオファージT7のTΦタンパク質に対する翻訳開始シグナルを含むベクターに挿入した。次いで、T7RNAポリメラーゼを、誘導又はインフェクションにより前記宿主細胞に導入する。本件の具体的なケースにおいて、該vWF発現ベクターをlac UV5プロモータのコントロール下にあるT7 RNAポリメラーゼに関する遺伝子を含むプロファージを担持する細胞に入れた。ラクトース類似体IPTGを細胞の成育培地に加えることにより、T7RNAポリメラーゼを誘導した。そこでは順次、プラスミド中の標的DNAを転写した。T7RNAポリメラーゼによる転写は、標的RNAがリボゾームRNAに匹敵する量まで蓄積するほど活発であり、標的タンパク質を主要な画分の細胞タンパク質に構築する。vWFフラグメントの合成の最初の特徴として、細胞を誘導し、誘導後0.5〜16時間の間の時点で試料を取ることである。これらのデータは、誘導４時間後までに、vWFフラグメントが総細胞タンパク質の約25％になるほど構築されることを示している。この水準は、前記tac又はPRベクター系のいずれかで産生されるよりもかなり高いものである。
組換え系から治療用ポリペプチドを提供する具体的な有効性は、治療薬の医薬として有用な量の発現を起こす能力にかかっている。前記３種の系に関し、系（III）が好ましい。その理由は、該系が多量のフラグメントを産生するからである。
例えば系（III）のような、細菌発現系により産生されるvWFフラグメントは、不運なことに、宿主細胞内に不溶性の凝集体（インクルージョンボディ）として、かなりの量で蓄積する。該宿主細胞には、そこから有効な分泌を引き起こす機構はない。例えば、一般に、哺乳類のシグナルペプチドは細菌系において認識されない。発現されたペプチド（インクルージョンボディ）のこのような不溶性凝集は、組換え細菌系から大量の有用なタンパク質を製造しようと試みることの周知の結果であり（Williams,D.C.らの論文、Science 215,687〜689頁（1982年））、不適当に折り重なったポリペプチドを反映したものであろう。
インクルージョンボディの形成は、その部分の、システイン残基の高い有効濃度の存在に関連すると理論付けられている。不適切なジスルフィド結合がインクルージョンボデイ内における、又はそこからポリペプチドの溶解するを試みる間のいずれかに、形成を促進し、かつ行なうと考えられている。フラグメント内に（鎖間結合）形成する場合、このような結合は、分子の生物学的に不活性な高次構造をもたらすのであろう。フラグメント間（鎖間結合）に形成される場合、このような結合は、不溶性又は生物学的に不活性な二量体又は凝集体をもたらすであろう。445〜733位残基を含むvWFフラグメントは、459，462，464，471，474，509及び695の位置に７個のシステイン残基を含むものである。したがって、組換え細菌系から発現された哺乳類タンパク質の操作を成功させるには、一般に、そのシステイン残基を他のシステイン残基と反応できないように置き換えることを必要とする。この処置を行なわない場合、通常、そのシステイン残基の望ましくない反応が起き、治療薬として有効に用いるには不適当な不溶性又は生物学的に不活性なポリペプチド凝集体を形成する。
システイン残基をうまく置き換えるために用いることができる多くの周知の方法がある。１種のこのような技術には、システイン残基を、例えば、6-メルカプトエタノール又はジチオトレイトール「DDT」のような還元剤を用いてシステイン残基を処理し、次いで該フラグメントの７個のシステイン残基を永久的にアルキル化（例えば、ヨーダミド）するものがある。多くの共有結合性ラベルを標的システイン残基に付けることができ、そのときの唯一の要求事項は、該ラベルを標的タンパク質を不可逆的に変性させないpH条件で適用しなければならないことである。この付着が、該フラグメントをさらに処理又は貯蔵する間に晒す条件下に置くことで、他のシステイン残基と化学反応できなくするのである。このような共有結合性ラベル法は、一般に当技術分野で知られており、また、（A）ヨード酢酸又は（B）ヨードフルオレセインのようなヨード化剤を用いるものである。加えて、システイン残基は亜硫酸化のような方法により化学的に置き換えることができる。また、その置き換えは、コードDNAの変異誘発性部位によって達成することができる。それは、システイン残基を、グリシン又はアラニンのような「不活性」残基と置き換え、又はシステインと対応する配列部位に欠失を起こさせることにより行なうことができる。十分な数のシステイン残基を置き換え、その存在により引き起こされる問題を避けるのである。
以下の実施例１に示すように、不正ジスルフィド結合により起こされる凝集効果は、本発明の治療処方について、化学的還元（ジチオスレイトール、「ＤＴＴ」、による）及び後続の永久アルキル化（ヨードアセタミドによる）により無くすことができる。この処理にもかかわらず、得られたポリペプチド（以下本発明の「アルキル化ｖＷＦフラグメント」という）は、凝集し、従って、治療的に有効でない形態で蓄積したままであることがわかった。他の型のシステイン置換フラグメントも等しく治療処方に対して溶解抵抗性であり得、その凝集挙動は、システインに関連していない。
従って、本発明は、凝集したシステイン置換フラグメントを溶解する有効な処置工程を提供するものである。本発明は、凝集していない、治療的に有効な形態の溶解フラグメントを含有する溶液等の、例えば、患者に注射することができる、フラグメントの水溶液を提供するものである。
従って本発明は、インクルージョンボディを含む発現ｖＷＦフラグメントを、まず、変性剤含有溶液中で安定化した、凝集していないシステイン置換フラグメントとして提供し、次に、ヒトに注射できる治療的に許容できる物質のみを含有する溶液中で安定化した凝集していないフラグメントとして提供できる条件を確認することをその範囲内に包含する。
フラグメントを調製する組換え系からｖＷＦフラグメントを回収するのにいかなる好適な手段も使用できる。第一工程として、フラグメントの不溶性凝集体、すなわち、インクルージョンボディを、他の細胞成分から分離する。これは、宿主細胞の破砕、不溶化蛋白質からの破砕細胞材料の分離（インクルージョンボディとして）を含む。これを実施するのに利用可能な手段の例としては、超音波処理及びホモジネーションの使用を含む操作がある。代表的な操作には、米国特許第4,828,929号及び4,673,641号記載の操作がある。
宿主細胞からインクルージョンボディを抽出する好ましい操作は、以下の実施例１に記載され、１種以上の洗剤の存在下で細胞の破砕を行う機械的ホモジネーション、及び破砕細胞材料を、ｖＷＦフラグメントから遠心により分離することの使用を繰り返して実施することを含む。他の利用可能な操作も使用できることを理解すべきである。
組換え系から回収した凝集ｖＷＦフラグメントは、フラグメントの可溶性三量体から、数千のこのような個別のポリペプチドフラグメントが結合した巨視的な不溶性構造物に至るポリペプチドの広いスペクトルを含む。しかし、典型的には、約10〜20、又はそれより少ないフラグメントから構成され、200,000〜400,000の分子量を有するこれらの凝集体は、可溶性である。「可溶性凝集体」と呼ばれるこのようなフラグメントは、インビトロアッセイで測定される、比較的低い治療的有用性を有する（実施例３及び図３参照）。ある種のより大きなコンプレックスも可溶性であるが、比較的低い治療的有用性を有する。
ここに説明するプロセスから得られる「凝集していないフラグメント」（又は実質的に凝集体を含まない」フラグメント）は、単量体フラグメント、及び非共有結合した二量体フラグメントの集合である。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いた実験により、このような試料中に存在する「可溶性凝集体」の量は、約0.5％未満である。事実、殆どの調製物について、％汚染はより低く、大いに、ＨＰＬＣ系の塩環境の人口産物であることが期待される。以下に説明するように、このように単離された二量体は、単量体と平衡状態で存在し（図１）重量基準で、単量体の平均して半分の抗血小板凝集活性を有することが測定された。このことは、二量体内の２個の結合サイトの一方がマスキングされていることを示唆する。非凝集フラグメントの治療的に有用な試料の製造に関連して、多量の単量体と少量の二量体を含有する試料の調製が好ましい。
本発明の実施に際し、可溶化した非凝集フラグメントの調製法は、不溶性凝集体を可溶性凝集体に変換する工程から始まる。これは、システイン置換ｖＷＦフラグメントと変性剤を含む水溶液の調製を含む。
本発明の好ましい形態は、変性剤がフラグメントの可溶性凝集体の生成を促進するような条件下で水溶液中でフラグメントを永久アルキル化する工程を含む。凝集材料の解離は、サイズによる排除を基本とするゲルクロマトグラフィ及び超遠心等の幾つかの周知の技術のいずれかによりモニターできる。
フラグメントのアルキル化に先立ち、インクルージョンボディ凝集体中の鎖内及鎖間ジスルフィド結合の還元を行う。続いて、還元システイン残基の永久アルキル化を行う。フラグメントの還元及びアルキル化はいずれも、蛋白質処理工程として既知の、任意の好適な手段により実施できる。
還元は、蛋白質凝集体のジスルフィド結合をチオール基に変換するような条件下で凝集体の水溶液を好適な還元剤と反応させる工程を含む。使用できる還元剤の例には、６−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールがあり、後者が好ましい。
次に還元生成物をアルキル化する。このアルキル化は、アルキル化剤が作用して、蛋白質フラグメントが後続の操作を受け又は保存される際に、それらが不活性であるように、フラグメントの遊離スルフヒドリル基を永久的にかつ共有結合的にラベルするような条件下で行われる。如何なる好適なアルキル化剤も使用できる。このよなアルキル化剤の例には、ヨード酢酸、及びヨードアセタミドがあり、後者が好ましい。
本発明では、アルキル化された形態のものを含むシステイン置換ｖＷＦフラグメント、及び後続の非凝集フラグメントの製造は、変性剤を含有する水溶液中で、フラグメントを処理することにより行われる。ここで使用する「変性剤」という用語は、適当な濃度で、典型的には、以下の代表的なメカニズムの１つ以上のものにより、フラグメントのコンフォメーションを変えることができる物質をいう：溶媒環境を変えること、すなわち、ある種の溶媒表面相互作用を与えることにより、又はフラグメント内又はフラグメント間のイオン性又は水素結合接触又は他の相互作用を阻害することにより、フラグメントのある種の基の水和状態を変えること。一般に、変性剤の効果は可逆的である。例えば、変性剤を含まない溶液に対して透析すると、変性剤により誘導された効果は逆戻りする。本発明の実施に使用する変性剤の性質及び処理条件は、変性剤の使用効果が可逆的であるようなものである。従って、付加逆的な効果を起こす材料や条件の使用は避ける必要がある。例えば、フラグメントに対して高度の親和性をもって、実用的な意味において除去不可能な程度に結合するような物質の使用や高温の使用は避けなければならない。
ここに使用する「変性剤」及び「洗剤」という用語は、上記規準が満足される限りにおいて、同等のものと見做される。本発明において変性剤として使用するのに適した材料の例としては、尿素、グアニジン塩酸塩、及び、洗剤、例えば、ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール（Nonidet・P40）、ポリオキシエチレン（9-10）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール（Triton-X-100）、及びデオキシコレートナトリウムが挙げられる。
本発明に使用するのに適した最も好ましい変性剤は、尿素である。尿素は、水溶液に極めて溶解性であり、透析によって溶液から速やかに除去される。尿素は非イオン性の物質であるため、以下に説明するような、ＤＮＡ及びエンドトキシン等の細菌由来の汚染物を除去するのにこのプロセスで使用することがあるイオン交換材料を妨害することがない。推奨できる尿素濃度範囲は、約４Ｍ〜約８Ｍである。
本発明の実施は、システイン置換ｖＷＦフラグメントから、細菌由来の汚染物、例えば、細菌性ＤＮＡ、細菌性エンドトキシン（リポポリサッカライド）及び細菌性蛋白質を除去するのに特に有用な工程も含み得る。このような汚染物を除去すると、このフラグメントを、治療処方に使用することが可能になる。一般的にいえば、このプロセスは、不純なアルキル化ｖＷＦフラグメントと変性剤の水溶液をアニオン交換材料、続いてカチオン交換材料で処理する工程を含む。
汚染物含有溶液のアニオン交換材料処理は、アルカリ性ｐＨで行われ、溶液から、アニオン交換材料に接着する細菌性ＤＮＡ及びエンドトキシンを除去するのに有効である。この目的のために、溶液は、細菌性成分がアニオン交換材料に接着し、ｖＷＦフラグメントは接着しないような量の塩を含むことが必要である。
次いで、上記溶液を、フラグメントが結合し、従って、細菌タンパク質からフラグメントが分離される陽イオン交換材料と酸性のｐＨで接触させる。溶液の酸性ｐＨは陽イオン交換材料のカルボキシル基のいくつかがイオン化し、フラグメント上のカルボキシル基のいくつかがプロトン化されるものであるべきである。陽イオン交換材料からのフラグメントの溶出は、適当な溶出バッファー、例えば、そして好ましくはイオン化クエン酸及び非イオン性変性剤を含む水性溶液で実施される。
後述する実施例１は、工程の全ての目標が達成された条件の下におけるフラグメントの細菌混入物を効果的に分離する方法の代表−システインが変化したvWFフラグメンの集合を非凝集フラグメントに変換する−を記述する。
塩酸グアニジンが好ましい変性剤であるが、イオン交換材料に干渉し、前述のタイプの混入物を取り除くイオン交換工程よりも前に実質的に取り除かなければならない。推奨される塩酸グアニジンの濃度は、約４〜約８Ｍである。
後述する実施例５は、親和性クロマトグラフィー法によりフラグメントを細菌混入物から分離する、本発明の特に好ましい態様を示す。この方法は、ヘパリンに対するvWFのアフィニティーに基づく、迅速且つ能率的な大規模のvWFの精製方法を提供する。
部分的に、この態様は、本発明の工程により精製されたvWFフラグメントがヘパリンに結合することが知られている２３アミノ酸残基（Tyr565〜Ala587）の配列を含むという理解に基づく。ヘパリンに対するフラグメントのアフィニティーは、イオン交換クロマトグラフィー法でしばしば観察される同一電荷のタンパク質の同時分離を回避する親和性クロマトグラフィーの使用を促進する。
本実施態様において用いられる親和性クロマトグラフィーの媒体は、クロマトグラフィーマトリックスと結合するヘパリン分子を含む。この媒体を含むクロマトグラフィーカラムにvWFフラグメントをのせる場合、フラグメントがヘパリン分子に可逆的に結合し、所望でない混入物がクロマトグラフィーカラムを通過する間、選択的に保持される。次いで、vWFフラグメントは、vWFとヘパリン分子との非共有結合に打ち勝つのに十分なイオン強度の塩溶液によって溶出されるかもしれない。次いで、溶出されたvWFを更なるクロマトグラフィー工程を用いて精製してもよい。
この態様の実施において用いられる親和性クロマトグラフィー媒体は、当業界で公知の技術を用いて容易に調製され、又は購入してもよい。所望であれば、ヘパリンを、臭化シアンを用いたプロトコール等の当業界で公知のプロトコールを用いてセファロース又はアガロース等の所望のクロマトグラフィーマトリックスに結合してもよい。また、商業的に利用できる親和性クロマトグラフィー媒体、例えばファルマシア（Pharmacia）から購入できるヘパリン−セファロースCL-6B等を用いてもよい。好ましい態様において、商業的に利用できる親和性クロマトグラフィー材料を用いる。
本発明の親和性クロマトグラフィー法は、広いｐＨ範囲で実施されるが、約６未満のｐＨで実施された場合に優れた結果が得られる。尿素等の変性剤、及び低ｐＨ条件の組み合わせは、vWFの親和性クロマトグラフィー媒体への高い選択的結合及び非特異的相互作用の最小化を結果として生じる。低ｐＨ条件の利用はフラグメントの選択的結合に寄与するだけでなく、vWFフラグメントを非凝集状態に保存し、それによってそれに続くフラグメントの再生を促進する。従って、好ましい態様において、請求の範囲に記載された親和性クロマトグラフィー法は、尿素等の変性剤の存在下、約６未満のｐＨで行われる。
上述したイオン交換又は親和性クロマトグラフィー法の後に、フラグメントを約2.5〜約5.5未満のｐＨで変性剤の存在下に更なる可溶化に維持することが重要である。vWFフラグメントのアミノ酸側鎖と酸での滴定は、フラグメントがｐＨ3.5で完全にプロトン化し、次いでポリペプチドフラグメントは（+）41の実行電荷を帯びる。実行電荷を最大にする環境におけるフラグメントの維持は、フラグメントの溶解性を維持することが重要であり、溶解性の凝集体のより小さい凝集体及び非凝集材料への解離を促進し、フラグメントの再会合を防止する。約３〜約４のｐＨ値が好ましい。ｐＨ3.5における変性剤の存在における可溶化が最も好ましい。どのような適当な酸もｐＨを調整するために用いることができる。用いることのできる酸の例としては、塩酸又は乳酸が含まれる。しかし、約３〜約５のｐＨ範囲において緩衝能を与える酸を使用することが好ましい。クエン酸を使用することが最も好ましい。
凝集したインクルージョンボディタンパク質を変性剤の存在下に可溶化するための多数の手順が知られているが、得られた生成物の臨床的な使用は、その中に含まれる変性剤を無毒及び非刺激性である臨床的に許容される材料に置き換えることを必要とし、得られた溶液は、人間への注射についての法的基準を遵守しなければならない。システインが変化したvWFフラグメント、及びインクルージョンボディから再構成したアルキル化形態におけるフラグメントを、生理的ｐＨを有し又は血液の塩分を反映するイオン濃度を有する溶液中に配合する試みは、不溶性凝集タンパク質を含む生成物のみを生産する。
従って、変性剤によるシステインが変化したフラグメントの単量化は、フラグメントが実質的に解離した組成物を生成するが、変性剤のない臨床的な使用のためのポリペプチドの成功した配合物は、従来は不可能であることが判明した。pH3.5においてvWF上で+41の実行電荷が得られ、このような電荷が比較できるサイズの多くのタンパク質において発生する実行電荷よりも代表的であるか実質的であるけれど、単量体の分子は天性剤の不存在下で再凝集を起こした。以下に、システインが変化したvWFフラグメントの可溶性形態の臨床的処方を調整し、貯蔵し調剤する工程について議論する。
本発明の重要な面は、溶液が相対的に低濃度のイオン性基質を含む場合に酸性pHの溶液中のシステインが変化したvWFフラグメントの溶解性が向上することの認識である。このような基質は、有機又は無機の形態の塩、バッファー、アミノ酸又は他の帯電した分子であってもよい。後に詳しく述べるように、ｐＨ及びイオン濃度の生理的値を有する溶液に関連して、このような水溶液中におけるシステインが変化した断片は、水性溶液によってフラグメントの半極性又は疎水性基の可溶化を促進する。従って、このような溶液を、臨床的処方の保存のために上述した変性剤含有溶液と置き換えるために用いる。
本発明の実施においては、フラグメントによって供給される帯電した基の寄与に加えて陽イオン及び陰イオンの濃度の総計として定義されるイオン基質濃度は、フラグメントの水性溶液中で約７５ｍＭを超えるべきではない。変性剤が存在せずにこの濃度が過剰である場合、材料が溶液である場合、臨床的使用のために長期保存に適当でない材料、凍結した貯蔵物から溶かした場合、凍結乾燥形態から再構成した場合、又は以下に詳しく述べる場合にせよ、臨床的な使用のための長期保存には適当でなく、更なる工程の前の一時的な保存にとっても適当でない。
実質的に凝集体を含まない、本発明の水性製剤中のシステイン置換vWFフラグメントの濃度は、比較的広い領域、例えば、約１〜約30mg／mlの範囲に渡り変わり得る。したがって、システイン置換フラグメントは、例えば、好ましい製剤において、溶解性凝集体を含まず、少なくとも約30mg／mlまでは溶解性とすることができる。「非凝集」システイン置換フラグメントの単量体及び二量体が存在する平衡及び該単量体の高特異性阻止活性（実施例２及び図１）に基づいて、その濃度は、単量体で、例えば、約15mg／mlまで、さらに約５〜約10mg／mlが好ましい範囲であり、効果的な投与に特に適した濃度が最も好ましい。
本発明の実施で好ましいのは、無機塩を約10mMまで、例えば、アミノ酸塩酸塩のような付加イオン性化合物を約15mMまで、及び緩衝剤を約10mMまで含む治療用製剤である。前記又は類似化合物の好ましい濃度範囲を論ずることに関し、「mM」とは化合物の濃度であり、個々のイオンの濃度ではなく、その総計は約75mMを超えるものであってはならない、と理解する。
加えて、例えば、マンニトール、スクロース、又はマルトースなどの糖類又は糖誘導体のようなイオン性緊張改善剤を本発明の製剤に加えてもよく、それも液状形態で貯蔵する前、又はその凍結乾燥を行なう前のいずれかにに加えるのがよい。その量は約０〜15％（w/v）とするこのような調製物を凍結し、次いで治療に用いるため解凍することができる。
好ましい、水性製剤は、NaCl又は他の無機塩を約0.5〜約10mM、クエン酸又は他の適当な緩衝剤を約0.5〜約５mM、及びリジンモノ塩酸塩又は他のアミノ酸を約0.5〜約15mM含んでいる。
本発明の特に好ましい実施態様では、この溶液でpHが約3.5で、NaClを約1.5mM、クエン酸を約１mM、及びリジンモノ塩酸塩を約１mM含んでいる。例えば、マンニトールのような非イオン性緊張改善剤を約５％（w/v）を添加することにより、本発明の製剤を生理的溶液とほぼ同じ等張性にする。
ここに記載する処理工程に従い、凝集体を実質的に含まない、システイン置換vWFフラグメントの水溶液を調製することが可能である。該用語「凝集体を実質的に含まない。」とは、治療に必要な量を投与するときに、患者に不利な臨床的結果を生じさせることがない量の、溶解性凝集体及び不溶性凝集体を含む、システイン置換vWFフラグメントの治療用溶液又は他の医薬組成物をいう。本発明を実施することにより、凝集体を実質的に含まない、システイン置換フラグメントの水溶液を製造する。この場合、その溶液中における該フラグメントの濃度を、約１〜30mg／ml、好ましい約５〜約15mg／ml、かつ最も好ましくは約10mg／mlとする。
また、本発明を実施することにより、凝集体を実質的に含まない、システイン置換フラグメントの水溶液を製造することができ、この場合、単量体の重量％を少なくとも約40〜約100％、好ましくは少なくとも約65〜80重量％、かつ最も好ましくは少なくとも約75％にする。
システイン置換vWFフラグメントを貯蔵するために、パイロジェンを含まない脱イオン水中に非凝集形態で製剤することができ、これは、pHは約3.5に調節し、該配合物を滴定するのに必要な成分を除き、付加的な緩衝剤、塩又はイオン性化合物を含まない。このような場合、非イオン性緊張改善剤の添加が好ましい。また、このような配合物は凍結乾燥又は凍結し、次いで治療に用いるために解凍することができる。したがって、本発明は、凍結乾燥され、又は凍結され、かつ次いで再生又は解凍されて、このような治療に用いるため、本来の活性を回復するような治療剤を提供するものである。
本発明の実施により製造される組成物は、４℃で少なくとも１月間保存でき、その間、該組成物は凝集体を実質的に含まない状態を維持する。
溶液を保存するために、又はそれを凍結乾燥又は凍結するのに、好ましいpHの選択に関し、システイン置換フラグメントのアミノ酸側鎖の酸度を滴定し、それにより、全（+）41荷電フラグメントを生成させ、pH約3.5にする。したがってpHの範囲が約３〜約５である配合物が好ましい。酸度が高過ぎると該タンパク質を変性させることがあり、一方、pH価が高いと該タンパク質の等電点（pH5.5）に近過ぎ、そのpHでは凝集が起きるであろう。
また、好ましい範囲外のpHを有し、又は好ましい範囲外のイオン濃度である配合物は、それでもなお、長期貯蔵前の中間的期間（例えば、付加的処理をする前）で、アルキル化フラグメントの水溶液の貯蔵に適しているであろう。
また、循環器系又は組換え哺乳類系から単離されたvWFから得たシステイン置換vWFフラグメントを、溶解性及び安定特性を強化するように、本発明のプラクティスに従い、調剤することができる。このように調製された製剤は血液と等張性にすることができ、又は血液に対し高浸透圧性あるいは低浸透圧性にしてもよい。
本発明の単量体化及び製剤方法は、少なくとも部分的には有効であると考えられる。その理由は、本明細書中に記載した処理条件は、システイン置換vWFフラグメント内のある種の疎水性及び親水性アミノ酸残基、及び得られたドメインの特性を利用して利益を得ることを可能にする。これまで記載したように、システイン置換フラグメントをpH3.5に維持することにより、その親水性を増し、その結果、溶解性を向上させると考えられている+41の実効荷電を、該ポリペプチドに与える。pH約4.5以下でのグルタミン酸及びアスパラギン酸の側鎖の滴定（プロトン化）は、また、pH3.5で貯蔵することによる、vWFフラグメントに関連する凝集に対する安定性を説明できるタンパク質構造の潜在的に十分な修飾因子である。
アミノ酸ホモポリマーの荷電側鎖はα−ヘリックスを不安定にし得る。非荷電ポリ-L-グルタミン酸及びポリ-L-リジンは、例えば、安定なα−ヘリックス構造を形成し、一方、その荷電形態は、ランダムコイル領域としてのみ安定である。（Urnes,P.及びDozy,P.の論文、Adv.Protein Chem.,16,401頁（1961年）,Lehninger,A.L.,Biochemistry,113頁，Worth Publishing Company（1970年））。
適切に配置されたグルタミン酸及びアスパラギン酸残基は、陰荷電している場合、また、システイン置換vWFフラグメント内でα−ヘリックス領域を不安定にする。しかし、例えばpH3.5で、プロトン化された形態では、これらは規則構造のビシナル形成、又は近接化を含み、又は許容するように適応するようである。
このような規則構造領域の拡大される広がりに対し、すなわちpH3.5アスパラギン酸エステル又グルタミン酸エステルのプロトン化による形成で、これらはどの領域（pH約7.0において疎水性残基を含むランダムコイルとして以前に存在したもの）に結合できる能力をも制限されるであろう。このような効果は、疎水性会合に必要となる活性化エンタルピーの増加により測定できると予想される。
また、このような凝集が、生理的溶液と比べ、実質的に濃度が低い溶解イオン性物質を含む水溶液で最小化されることが予想される。pHを3.5に維持することにより、単量体化が促進されるか否か、及び凝集が阻止されるか否かは、特定のタンパク質が、ポリペプチド構造におけるアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の総数、並びに、その規則構造に関与する潜在性が、近位のグルタミン酸及びアスパラギン酸のプロトン化状態に部分的に一部依存する、特定アミノ酸残基のサブドメインに関するそのスペーシングに依存することが予想される。したがって、システイン置換組換え産生ポリペプチドをpH3.5にすることにより、その単量体化を促進し、又は安定させるか否かが、種を基準とするポリペプチド種について関心が向けられなければならない問題である。
生理的pH７の貯蔵条件下における、他の明らかな凝集挙動を避けるための、低pH製剤の潜在的有用性の評価において有用な具体的因子を、モデルとしてシステイン置換vWFフラグメントを用いて、以下に記載する。
（A）該システイン置換、445〜733位vWFフラグメントは、全289配列位置に、グルタミン酸残基21個及びアスパラギン酸残基15個を有し、これは、規則二次構造がpH７で不安定になる、十分な数の部位が、特定のグルタミン酸及びアスパラギン酸残基のプロトン化に関し、規則的になり得ることを示すものである。
（B）多くの古典的疎水性残基が、α−ヘリックス又はσ−ひだ状シートドメインに好ましい、又は、を許容することが知られており、かつ、pH3.5で規則構造サブドメインにおいてゼクエストレーションするので、疎水性凝集に加わることはできないであろう。このような残基にはアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びバリンがある。Asp又はGlu残基に近接する特定の亜領域は、それにグルタミン酸又はアスパラギン酸のプロトン化により許容され得る、規則二次構造を付与するのに有用であるような疎水特性であるか否かを、次の文献が参照により部分的に答えるあろう：Kyte,J.らの論文，J.Mol.Biol.,157,105〜132頁（1982年）。Kyteモデルは、大きなペプチドがある場合に、特定のペプチド配列が示す疎水性（又は親水性水）の範囲を予測する。全体的な疎水性／親水性指数が、個々の残基の寄与、及び標的配列における、それぞれ他のアミノ酸残基に関する特定アミノ酸の位置に基づいて指定することができる。
（C）445〜733位残基フラグメント内において、規則構造がpH７近くでできる規則構造と関連して、pH3.5〜4.0領域においてグルタミン酸及びアスパラギン酸のプロトン化により規則構造が強化されるであろうと予測される、５以上の多くの配列がある。そのα−ヘリックス特性がpH3.5で強化され得る代表的なドメインには、次の配列がある（公開されている配列を参照している。）：
（1）Cys464-Leu469（Aspを第465位に含む。）;
（2）Cys471-Glu476（またGluを第472位に含む。）;
（3）Leu494-Ile499（Glu及びAspをそれぞれ第497位、第498位に含む。）;
（4）Leu512-Asp520（また、Aspを第514位に含む。）;
（5）Glu527-Leu533（また、Gluを第529位、第531位に含む。）;
（6）Val537-Glu542（また、Aspを第539位に含む。）;
（7）Val553-Tyr558（Gluを第557位に含む。）;
（8）Val680-Gln686（Aspを第681位に、かつGluを第682位、第684位）；及び
（10）Tyr693-Ala698（Aspを第696位に含む。）
4.5から3.5へのpHシフトにより、非凝集システイン置換vWFフラグメントにおいて産生され得る規則構造における増加は、その実施例４及び図４に記載されている。
凝集体を実質的に含まないシステイン置換vWFフラグメントの製剤を治療に用いることに関し、血栓を予防又は阻止するために投与する量は、患者が血栓症に侵されている重症度に依存するが、どの患者に対しても容易に決めることができる。溶液、又は再懸された凍結乾燥物質を含む本発明の製剤は、患者に直接注射してもよく、また注射を行なう前に、非イオン性緊張改善剤のような生理的に適応する物質と混合してもよい。
実施例
実施例１ 非凝集型アルキル化フォン・ブィレブランド因子フラグメントの調製
下記の方法を次記事項実施のため計画する：（1）下記に帰属するようなVWFフラグメントのインクルージョンボディペレットから溶解した溶解性凝集体（代表例として200kDa以上）を溶液中に移す；（2）治療製剤への混入が容認されない不純物（細菌性DNAおよび菌体内毒素等）の除去；（３）凝集体の微少化過程におけるフラグメント”の単量体化”開始；および（４）再凝集に対しフラグメントを安定化させる製剤緩衝液中に、生成した非凝集物質を存在させる。
インクルージョンボディペレット物質は、下記のようにE.coli BL21（DE3）pLysSの適切な培養により得た。細胞は50リットルの通気培養および中空繊維製のミクロフィルター膜カートリッジを使用した濃縮により得た。２ケのAmicon HSMP01-43濾過カートリッジをリサイクル方式で使用した。細胞はAmicon濾過により２乃至４リットルの容積に濃縮した。その後、細胞はAmicon濾過装置内の濾液を細胞に対し５倍容の10乃至20リットル、若しくは同量のトリスバッファー（0.025Mトリス、3.03gms/L H2O,0.2M Nacl,11.7gms/L H2Oインクルージョンボディ,最終pH7.5±0.2,25℃；後出のA-1参照）を用いて洗浄した。
細胞は濾液から４リットルのトリスバッファー液（A-1）に回収した。細胞分解処理工程において、デオキシコール酸ナトリウムを細胞懸濁液の最終濃度が0.5g/Lになるように添加する。細胞は採取直後に、Microfluidizer（Microfluidics Corp.,M-110Y Microfluidizer）を通過させて機械的に粉砕した。細胞はMicrofluidizerを一度通過させた後、処理した細胞懸濁液に第二の洗浄剤としてTween 80を、１リットルのTBS液に2.5％（v/v）Tween 80を25ml溶解したものを添加し、これにより最終の細胞濃度を0.025％に到達させた。この操作は緩衝液A-1を加温し、Tween 80を溶液中に滴下し、さらに溶液が目で見て均一になるまで攪拌する方法により実施した。この溶液を室温まで冷却後、分解した細胞懸濁液に添加し最終濃度を0.025％（v/v）に到達させた（以降、A-2と呼称）。Tweenが最初の通過処理段階で存在する場合はMicrofluidizerの機能が妨害されるので、細胞を分解する前にMicrofluidizerの通液系統の清浄化が必要となる。細胞は分解後、懸濁液を遠心分離器にかけ（10,000×ｇ；35分間、４℃）、細胞溶解分解物の最初の生成物であるインクルージョンボディを分離する。この段階でインクルージョンボデイは一夜−２０℃で保存する。
インクルージョンボディはインクルージョンボディの単位（ｇ）湿潤重量当たり、35mlのトリスバッファーA-3に再懸濁させた。猶、この場合の湿潤重量は遠心管重量差により求めた。また、トリスバッファーA-3の成分組成は、0.05Mトリス（6.06g/L・H2O）、1.21mMデオキシコール酸ナトリウム（0.5g/L・H2O）、２mMジチオスレイトール（DDT）（0.31g/L・H2O）、２mM EDTA（0.74g/L・H２O）、５％（v/v）グリセリン（50ml/L・H2O）、0.025％（v/v）Tween 80（10ml・2.5％ Tween 80（A-2）/L・H2O）で、最終pHは9.0±0.2とした。インクルージョンボディペレットはPolytronホモジナイザー（Brinkmann）を用いて常行的にバッファー中に再懸濁させた。再懸濁インクルージョンボディはMicrofluidizerを通過させることにより、バッファーとの混合性をより確実なもににした。Microfluidizer通過後、封入帯は遠心分離器にかけて単離した。洗浄操作はトリスバッファーA-3を用いて計３回実施した。３回目の洗浄終了時に、ペレット化したインクルージョンボディは、洗浄剤のデオキシコール酸塩乃至はTweenを含有しないトリスバッファーA-4に再懸濁した。トリスバッファーA-４の成分組成は、0.05Mトリス（6.06g/L・H2O）、２mMジチオスレイトール（DDT）（0.31g/L・H２O）、２mM EDTA（0.74g/L・H２O）、５％（v/v）グリセリン（50ml/L・H2O）で、最終pHは9.0±0.2とした。４回目および最終回の洗浄にはトリスバッファーA-4を用いて実施した。粗製物は遠心分離器にかけて採取し、水を切って乾燥した後、-70℃で貯蔵する。
インクルージョンボディペレットの各１ｇを7.5mlのバッファー（成分組成：尿素６M、トリス・塩酸0.05Mおよび食塩１M、pHは8.8）に溶解した。得られた”可溶化”VWF物質は、一般的に約200kDa以上の各種分子量をもつ可溶性凝集体の多成分系物質である。
混合物は窒素雰囲気下におき、ジチオスレイトール（DDT）の最終濃度液が0.01Mになるように攪拌しながら添加し、フラグメントのダイサルファイド結合を還元した。混合物の攪拌は37℃の暗黒下で１時間継続した。ヨードアセトイミド（Sigma Chemical Co.,St.LouisMO）の最終濃度液が0.05Mになるように添加した。暗黒下でのインキュベーションは37℃で１時間継続した。追加のDDTを添加し、DDTの最終濃度を0.03Mに上昇させた。アルキル化VNFフラグメントを含有する溶液を0.2ミクロンフィルターを通過させた後、４±２℃に保持された低温室に移した。つづいての試薬を用いる精製は４℃の低温室で実施し、一方、試薬は予冷してその室温に合わせてから使用した。
アルキル化した物質は、成分組成が尿素６M、トリス・塩酸0.05MおよびEDTA２ナトリウム塩５mM、pHは8.0のバッファーを添加して５倍に希釈した。得られた溶液は、アルキル化溶液から随伴した0.2Mの食塩を含有する。希釈VNF液はアニオン交換に適した側鎖のある四級アンモニウム塩をもつ45-165ミクロンのビード形成アガロース粒子製の252mm×150mmのカラム（Q-Sepharose、Pharmacia、Uppsala,Sweden）を用いてクロマトグラムにかけた。またカラムは、組成が尿素６M、トリス・塩酸25mM、塩化カリウム0.02M、EDTA２ナトリウム塩0.1mM、DDT 0.1mM、pHが8.0のバッファーにより前処理した。この条件下ではフォンビレブランド因子のフラグメントは、Q-Sepharoseに結合しなかった；しかし、リポポリサッカライドを含めた陰電荷に荷電したDNAおよび細菌の菌体内毒素等の不純物は結合した。
可溶性凝集体内の各単量体ポリペプチドの正味電荷はこれらの条件下では凡そ（2）である。高塩濃度の使用サンプルとの結合下でのこの低い正味電荷は、変化のない相への凝集体結合を妨害していると考えられている。第一の可溶性凝集体である、非結合フラクションを含有しているVWFフラグメントは、0.2ミクロンフィルターで濾過し、その濾液に、成分組成が尿素６M、クエン酸ナトリウム0.01M、pHは3.5のバッファーを添加して10倍に希釈した。得られた液は４℃に約１時間保持した。この間に可溶性凝集体の解離が始まり、フラグメントは、より小さな凝集体ならびに単量体乃至は二量体へ移行した。
非緩衝性のクエン酸ナトリウムを1.0M生成物に添加して、生成物のpHを4.8に調整する。その後、ビード型アガロースゲル製の45-165ミクロン粒子上を通過させた。上記粒子は分子内にカチオン交換性のカルボキシメチルの側鎖をもち（CM-Sepharose、Pharmacia、Uppsala,Sweden）、また、該粒子は前処理した。このpH値の設定根拠は、樹脂分子内のカルボキシメチル基を非プロトン化状態に保持することと、一方、フラグメント成分がフラグメントの等電点（約5.5）に異常に近く接近して、凝集状態に再度戻ることの防止の両者を勘案しての折衷した値である。一方、pH値の3.0はフラグメント成分の単量体乃至は二量体への移行促進に好ましかった。
この条件にした場合は、VWFフラグメント成分の約80-100％がCM-Sepharoseに結合した。カラムは、溶出液中にUV吸収物質（280nmで測定）が検出されなくなるまで、成分組成が尿素６M、ならびにクエン酸ナトリウム0.01Mで、pH4.8のバッファーで洗浄した。溢流用バッファーはその後、成分組成が尿素６M、ならびにクエン酸ナトリウム0.01M、食塩0.15M、pH4.8のバッファーに変更した。このバッファーによるカラム溶出液に少量のUV吸収物質が再度検出された。細菌の菌体内毒性物質の実質的残存量は、この方法により除去された。溢流はこのようなUV吸収物質が全く検出されなくなるまで継続して実施した。CM-Sepharoseに結合したフラクションは、成分組成が尿素６M、ならびにクエン酸ナトリウム0.01Mで、pH4.8のバッファーで、前記バッファー中に存在した食塩が完全に置換されるまで洗浄した。
カラムに結合したVWFフラクションの精製品は最終的に、成分組成が尿素６M、ならびにクエン酸0.01Mで、pH3.0のバッファーで洗浄し、さらなる少量のUV吸収物質が溢流させた。洗浄はこの物質が溶出液中に検出されなくなるまで継続した。3.0のpH値は未使用状態のカラム充填物分子内のカルボキシル基pKa値より明らかに低いが、陽に荷電したVWFフラグメントと陰に荷電した樹脂間で作用した複合体は、指定された時間のこのpH値では、実質的に変化せずに残っている。この低いpHでのVWFフラグメントの処理は、現時点で単量体および二量体が主成分で、また、実質的には還元された可溶性凝集体であるフラグメント成分の単量体化をさらに促進するため継続する。単量体、二量体および凝集体の組成率は、実施例２の検査法により測定する。
組換えVWF因子フラグメントは最終的に、成分組成が尿素６M、ならびにクエン酸0.2Mで、pH3.0のバッファーを用いてCM-Sepharoseカラムから溢流させた。溢流ピークはUV吸収フラクション部として採取し、0.2ミクロンフィルターにより濾過した。溶出液の主成分は単量体および二量体がそれぞれ50％を構成し、可溶性凝集体は実質的に検出されなかった。pH3.0でのクエン酸イオンは、平均して2.5のプロトン化カルボキシル基（クエン酸塩のpKa1は3.08）を有し、また、平均して−0.5の正味陰電荷支持していることが見いだされる。クエン酸イオンはさらなる”安定”相の役割を果たす効果として、陽に荷電したフラグメントと競合してフラグメント-樹脂複合体の分解を促進すると考えられる。
溶出生成物は限外濾過法により、タンパクを約10mg/mlに濃縮した。濃縮物は適切なサイズの0.2ミクロン使い捨て型フィルターを用いて再度濾過する。その後、リジン１塩酸塩１mM、食塩1.5mM、クエン酸１mM、マンニトール５％（v/v）、pH3.0の”製剤バッファー”50容により透析した。透析バッファーは２−３日間に３回交換した。一方、この間に単量体化が更に進行した。透析品（凡その組成は単量体が70％、二量体が30％：実施例２参照）は、適切なサイズの0.2ミクロンフィルターにより濾過し、バイアル瓶に採るまで４℃で保管した。
精製VWF溶液中の残留DNAおよび菌体内毒素の含有量はそれぞれ、約0.94Eu/mgタンパクおよび約0.15pg/mgタンパクと測定された。DNA量の分析は、E.coli DNAサンプルへのハイブリッド化により実施した。菌体内毒素の含有量はLimulus amebocyte溶菌液検査法により分析した。
無菌化したバルク溶液を、Ｉ型フリントガラスバイアル（Wheaton Scientific,Millville,NJ）の20mlの全容量に対し約4mlを充填し、その後、凍結乾燥用のシリコン化したブチル灰色ゴム栓（West Co.）を、前記バイアル瓶に載せた。バイアル瓶は真空凍結乾燥機（Hull Corporation,Hatboro,Pa）にセットし、-42℃に冷凍した後、60ミクロンの真空下に12時間暴露した。12時間後、サンプルの温度を漸次上昇させ（２４時間かけて）、約30℃に到達させた。この温度及び真空度はその後16時間保持した。滅菌した乾燥窒素ガスを用いて室内を大気圧に戻し、その後、バイアル瓶に蓋をした。発熱物質のない（パイロゲンフリー）の水４mlを用いて再溶解するまで、バイアル瓶は４℃で保管した。
実施例２ 非凝集性アルキル化VWFフラグメント生成物は二量体および単量体間の平衡状態を反映することに関する説明
異なるフラグメント濃度の全てを含有する非凝集性アルキル化VWFフラグメントを実施例１の方法により調製し、標準製剤バッファー（リジン１塩酸塩１mM、食塩1.5mM、クエン酸１mM、マンニトール５％（w/v）、pH3.5）に添加し、４℃で１夜インキュベートした。サンプルは、交差結合構造をもつデキストランゲル（Sephadex G-100、Pharmacia、Uppsala,Sweden）を充填した分子量分別型クロマトグラフィーカラムにかけた。これにより、非凝集生成物を構成する単量体および二量体の構成率を測定した。
一般に、フラグメントサンプル中の可溶性凝集体の如何なる量も、G-100カラムの空隙容積の検出により測定出来る。少量の凝集体の量に関しては（例えば、三量体、四量体）、G-50カラムが使用できる。
２mlのサンプル（1-11mg/ml）を４℃の1.5×88のG-100カラムにかけた。３mlの溶出液フラクションを採取し、280nmでタンパク濃度を測定した。単量体フラグメントのピークはフラクション24にほぼ中心があり、二量体についてはフラクション31にあった。
図１には、サンプル中のフラグメントの全mg/mlの関数として、製剤バッファー中で１夜インキュベーションした後、サンプル中に検出された単量体含有率（％）のプロットを示す。図１に示された直線部よりの外挿結果より、約20mg/mlの濃度のVWFフラグメントを貯蔵した場合は、二量体が生成物の主成分になる。主成分が単量体である治療用生成物は、2mg/mlのフラグメント貯蔵濃度をもつサンプルから調製可能である。したがって、患者への投与に適切な単量体／二量体間の平衡は、貯蔵溶液中の非凝集アルキル化フラグメント濃度の低下により、調整可能である。同様な結果は、試験液が冷凍乾燥タイプの先の貯蔵品から、発熱性物質のない水の適当量により溶解されたか否かによっても得られる。
単量体フラグメントは体重当たりの血小板凝固阻止作用が、二量体フラグメントより大きいので、製剤バッファー中に溶解して注射用に調製したVWFフラグメントの治療上の有用性は、約２mg/mlのようなフラグメントの希釈濃度で貯蔵するか、若しくは前記濃度に溶解することにより、向上可能である。本発明の好適貯蔵溶液中のフラグメントの製剤は、凍結乾燥および再溶解により、製品中の単量体および二量体の構成率に、実質的な影響を与えない製品を提供することが認められた。
実施例３ アルキル化VWFフラグメントの生物活性に対する凝集の影響
Bothrops jararacの毒液から抽出したタンパクのBotrocetinは、血小板への多数のフォン・ビレブランド因子のin vitro結合を促進する（Read,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,4514-4518（1978））。仕上がったVWFサブユニット内Botrocetinへの結合部位は、アミノ酸シーケン位置445−733に含まれる領域内及びGPIb結合領域に存在する：Andrews,R.K.et al.,Biochemistry,28,8317-8326（1989）。VWFへのBotrocetinの結合は、構造的変化をVWF分子内において誘発する。またこの構造的変化は血管系への障害を随伴する徴候によりin vivoで誘発される。したがって、多数のVWFにより仲介される血小板の凝集阻害生に対するアルキル化フラグメントの効果は、Botrocetin−誘因試験法で評価した。
非凝集性アルキル化VWFは単量体および二量体の合算濃度を示す。実際の二量体の％は算出しなかった。図１への参照文は、実施例１の方法により精製した非凝集性アルキル化フォン・ビレブランド因子サンプルが２から８mg/mlの間で製剤バッファー中で貯蔵された場合に、上記サンプルはアルキル化フォン・ビレブランド因子フラグメントの単量体を約70％ならびに二量体を30％含有することを示している。この実施例の試験で用いた条件下では、二量体は単量体と同様に十分可溶化しているが、血小板凝集阻害に対する単量体の体重当たりの効果と比較すると、二量体フラグメントのそれは約半分である。
したがって、アルキル化フラグメントの凝集阻害性は、単量体および二量体濃度の関数として測定し（凝集物質を含有しない製品から）、凝集製品が示す応答性と比較した。凝集用プロトコールは、Brinkhous,K..M.and Read,M.S.,Blood,55（3）,517-520（1980）and Fugimura,et al.,J.Biol.Chem.,261,381-385（1986）から採用した。
この試験においては、Botrocetinおよび多数のVWFの特定量を血小板の特定量を凝集させるために用いた。これにより100％凝集の参考値を明らかにするためである。アルキル化VWFフラグメントの特定量を、マルチサブユニットのVWF、Botrocetin、および血小板よりなる反応混合物作るため用いた。このことにより、IC５０（Botrocetin-誘導血小板凝集を50％阻害するのに有効なVWFフラグメントの濃度）を測定できた。
試験用の血小板は、Marguerieの方法によるゲル濾過技術を用いて調製した、et al.,J.Biol.Chem.,254,5357-5363（1979），かつ、Allain,et al.,J.Lab.Clin.Med.,85,318-328（1975），の方法についての下記修正版を確定した。上記の修正版を下記に示す：
（1）固定液として0.5％パラフォルムアルデヒドを使用；（2）その後、固定は室温下30分で終了した。更に、変化のないIIb/IIIaレセプター複合体を解離させるため、血小板の懸濁液をpH8.5の５mM EDTAを用いて処理する（37℃で30分間）ことにより、グリコプロテインIIb/IIIaレセプター部位を不活性化するため、血小板を処理した。血小板凝集の阻害性は、血小板凝集測定器、型式PAP-4（製造業者から提供された手順書にしたがい操作：BioData Co.,Hatboro,PA）にセットされた、定速攪拌下（1000rpm）37℃に保持したシリコン化処理のガラスキュベットで測定した。
アッセイ（測定）は下記のように実施した。37℃のアッセイインキュベーションで使用する前に、アッセイ成分を氷上に保持した。0.4mlの固定化ヒト血小板（2×108ml）をキュベットに添加し、37℃で４分間インキュベーションした後、アッセイを開始した。製剤バッファー（0.1％ヒト血清アルブミンも含有）に溶解したVWFフラグメントの少量μl、若しくは、製剤バッファー-HSA（対照用）の等量をキュベットに添加し、37℃で１分間インキュベーションした。図２に示した凝集性に関しては、30μlの製剤バッファー-HSAサンプルを対照として用い、また、精製したアルキル化フラグメント（フラグメントの最終アッセイ濃度：17.0，8.5,および4.3μg/ml）の系統的希釈系列の30μlを測定用に用いた。Newman,et al.Br.J.Hematol.,21,1-20（1971）,の方法より調製した、多数の天然VWFを各キュベットに添加し、37℃で１分間インキュベーションした。適当量のVWFを反応混合物に添加し、最終のVWF濃度を6.3μg/mlにした。最後に適宜濃縮したbotrocetin溶液の12.5μl（Read,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,4514-4518（1978））を反応混合物に添加し、反応混合物中のbotrocetinの最終濃度を8.2μg/mlにした。その後、反応混合物は最終的に37℃で１分間インキュベーションした。凝集反応はその後２分間調査した。図２に示したように、精製し非凝集化したアルキル化VWFフラグメント（およその成分組成、単量体70％および二量体30％）は、血小板凝集阻害剤として用量依存性の作用形式で有効である。
図３に同様な実験を示す。ここでは、非凝集フラグメント（およその成分組成、単量体70％および二量体30％）の凝集阻害性力価を、凝集フラグメント物質と比較した。アッセイは、潜在的凝集阻害性物質の最終濃度として7.3μg/mlを示す濃度の30μlを用いて上記のように実施した。非凝集物質は血小板凝集阻害に対し実質的に有効であったが、凝集したVWF-誘導物質には効果がなかった。図３への参照文は、このサンプルのアッセイ条件下での50％の凝集阻害効果は、非凝集物質の約7.3μg/ml（その物質の0.22μMと当量）のフラグメント濃度（IC50）において得られる。一方、凝集体はこの条件下での凝集阻害効果は５％以下である。
実施例４ 非凝集アルキル化VWFフラグメントの溶解度に対するα-ヘリカルおよびδ-シート複合成分の効果
図４には、マンニトールの存在しない標準製剤バッファーよりなる溶液中の、アルキル化VWFフラグメント（pH3.5と4.5で対比）の円偏光二色性の比較を示す。スペクトルは、同一濃度に調製したサンプルについて25℃で、分光光度計（Jasco,Inc.（Easton,MD,model 500A））を約350nmから走査して測定した。
アルキル化フラグメントのスペクトルは、pH7.5の１mM燐酸バッファー中では、フラグメントが沈殿したため測定できなかった。222nm近傍の全回転に対する、α-ヘリックス、6-プリーツシートおよびランダムコイル領域成分のそれぞれの寄与性は測定しなかった；しかし、アルキル化フラグメントはpH4.5より3.5において、整った配列構造をもつことが明らかになった。
実施例  ５ 親和性クロマトグラフィーを用いる非凝集型アルキル化フォンビレブランド因子フラグメントの調製
VWFフラグメントの精製と、含有するプロテインおよびDNAの不純物を除去するため、本方法ではヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いる。方法は下記のように計画した：（1）以下に示すようなVWFフラグメントのインクルージョンボディから溶解した、可溶性凝集体（通常200kDa以上）を溶液に入れる；（2）治療製剤への混入が容認されない不純物（細菌性DNAおよび菌体内毒素等）の除去；（3）凝集体の微少化過程におけるフラグメント”の一量体化”開始；および（4）再凝集に対しフラグメントを安定化させる製剤緩衝液中に、生成した非凝集物質を存在させる。
インクルージョンボディペレット物質は、下記のようにE.coli BL21（DE3）pLysSの適切な培養により得た。細胞は50リットルの通気培養および中空繊維製のミクロフィルター膜カートリッジを使用した濃縮により得た。２ケのAmicon HSMP01-43濾過カートリッジをリサイクル方式で使用した。細胞はAmicon濾過により２乃至４リットルの容積に濃縮した。その後、細胞はAmicon濾過装置内の濾液を細胞に対し５倍容の10乃至20リットル、若しくは同量のトリスバッファー（0.025Mトリス、3.03gms/L H2O,0.2M Nacl，11.7gms/L H2O,最終pH7.5±0.2,25℃；後出のA-1参照）を用いて洗浄した。
細胞は濾液から４リットルのトリスバッファー液（A-1）に回収した。細胞分解処理工程において、デオキシコール酸ナトリウムを細胞懸濁液の最終濃度が0.5g/Lになるように添加する。細胞は採取直後に、Microfluidizer（Microfluidics Corp.,M-110Y Microfluidizer）を通過させて機械的に粉砕した。細胞はMicrofluidizerを一度通過させた後、処理した細胞懸濁液に第二の洗浄剤としてTween 80を、１リットルのTBS液に2.5％（v/v）Tween 80を25ml溶解したものを添加し、これにより最終の細胞濃度を0.025％に到達させた。この操作は緩衝液A-1を加温し、Tween 80を溶液中に滴下し、さらに溶液が目で見て均一になるまで攪拌する方法により実施した。この溶液を室温まで冷却後、分解した細胞懸濁液に添加し最終濃度を0.025％（v/v）に到達させた（以降、A-2と呼称）。Tweenまたは同様な洗浄剤が最初の通過処理段階で存在する場合はMicrofluidizerの機能が妨害され、るので、細胞を分解する前にMicrofluidizerの通液系統の清浄化が必要となる。
細胞は分解後、懸濁液を遠心分離器にかけ（10,000×ｇ；35分間、４℃）、細胞溶解分解物の最初の生成物であるインクルージョンボディを分離する。精製の次の段階に進む前に必要に応じてインクルージョンボディは一夜−２０℃で保存する。
インクルージョンボディはインクルージョンボディの単位（ｇ）湿潤重量当たり、35mlのトリスバッファーA-3に再懸濁させた。猶、この場合の湿潤重量は遠心管重量差により求めた。また、トリスバッファーA-3の成分組成は、0.05Mトリス（6.06g/L・H2O）、1.21mMデオキシコール酸ナトリウム（0.5g/L・H2O）、２mMジチオスレイトール（DDT）（0.31g/L・H2O）、２mM EDTA（0.74g/L・H2O）、５％（v/v）グリセリン（50ml/L・H2O）、0.025％（v/v）Tween 80（10ml・2.5％ Tween 80（A-2）/L・H2O）で、最終pHは9.0±0.2とした。インクルージョンボディペレットはPolytronホモジナイザー（Brinkmann）を用いて常行的にバッファー中に再懸濁させた。再懸濁インクルージョンボディはMicrofluidizerを通過させることにより、バッファーとの混合性をより確実なものにした。Microfluidizer通過後、インクルージョンボディは遠心分離器にかけて単離した。洗浄操作はトリスバッファーA-3を用いて計３回実施した。３回目の洗浄終了時に、ペレット化したインクルージョンボディは、洗浄剤のデオキシコール酸塩乃至はTweenを含有しないトリスバッファーA-4に再懸濁した。トリスバッファーA-4の成分組成は、0.05Mトリス（6.06g/L・H２O）、２mMジチオスレイトール（DDT）（0.31g/L・H2O）、２mM EDTA（0.74g/L・H2O）、５％（v/v）グリセリン（50ml/L・H2O）で、最終pHは9.0±0.2とした。４回目および最終回の洗浄にはトリスバッファーA-4を用いて実施した。粗製物は遠心分離器にかけて採取し、水を切って乾燥した後、-70℃で貯蔵する。
インクルージョンボディペレットの各１ｇを7.5mlのバッファー（成分組成：尿素６M、トリス・塩酸0.05Mおよび食塩１M、pHは8.8）に溶解した。得られた”可溶化”VWF物質は、一般的に約200kDa以上の各種分子量をもつ可溶性凝集体の多成分系物質である。混合物は窒素雰囲気下におき、ジチオスレイトール（DDT）の最終濃度液が0.01Mになるように攪拌しながら添加し、フラグメントのダイサルファイド結合を還元した。混合物の攪拌は37℃の暗黒下で１時間継続した。ヨードアセトイミド（Sigma Chemical Co.,St.LouisMO）の最終濃度液が0.05Mになるように添加した。暗黒下でのインキュベーションは37℃で１時間継続した。追加のDDTを添加し、DDTの最終濃度を0.03Mに上昇させた。アルキル化VNFフラグメントを含有する溶液を0.2ミクロンフィルターを通過させた後、４±２℃に保持された低温室に移した。ひきつづいての精製は４℃の低温室で実施し、一方、試薬は予冷してその室温に合わせてから使用した。
該アルキル化物質を６M尿素、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.5の溶液で、５倍に希釈し、150mM NaClと等しい伝導度とした。必要ならば、１Mクエン酸ナトリウムを用いて、pHを5.5に調節する。次いで、該物質を、pH5.5で、６M尿素、10mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムを含む溶液で平衡化した、ヘパリンセファロースカラム（Heparin Sepharose CL-6B，販売元Pharmacia，製造コード0467-01）に充填した。該カラムを６M尿素、10mMクエン酸ナトリウム、250mM塩化ナトリウムを含むpH5.5の溶液で洗浄した。該生成物を、６M尿素、10mMクエン酸ナトリウム、700mM塩化ナトリウムを含むpH5.5の溶液で溶出させた。
次いで、６M尿素、10mMクエン酸ナトリウムを含むpH3.5の溶液でほぼ７倍に希釈した。pHを3.5に調整した後、この溶液を１時間、４℃で保持した。次いで、１Mクエン酸ナトリウム溶液で、そのpHを4.8に調整し、かつ該生成物を、pH4.8で、６M尿素、10mMクエン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウムを含む溶液で平衡化した、ＣＭスフェロデックスカラム（CM Spherodex M，販売元IBF，カタログ番号262010）に充填した。該カラムを６M尿素、500mMクエン酸を含むpH3.0の溶液で洗浄した。次いで該生成物を６M尿素、700mMクエン酸を含むpH3.0の溶液で溶出した。
溶出した生成物を限外ろ過によりタンパク質濃度約10ml/mlまで濃縮した。濃縮した生成物を、再び適当な大きさの0.2μｍの使い捨てフィルターでろ過し、その後、材料を、1mMリジンモノ塩酸塩、1.5mM塩化ナトリウム、1mMクエン酸、5％（W/V）マンニトールを含む、pH3.5の「配合バッファー」で透析した。単量化も完了した時点で、透析バッファーを２〜３日の間に３回取り替えた。得られた生成物（約70％の単量体及び30％の二量体を含む、実施例２を参照）を、適当な大きさの0.2μｍのフィルターでろ過し、瓶に入れるまで４℃に保存した。
生成したvWF溶液中の残りのDNA及びエンドトキシンは、それぞれ約0.94Eu/mgタンパク質、及び約0.15pg/mgタンパク質であると定量された。ＤＮＡ解析は、大腸菌DNA試料に対するハイブリダイゼーションにより行った。エンドトキシンは、カブトガニ変形細胞溶解物検定により解析した。
無菌の大量の溶液をタイプＩフリントガラス瓶（Wheaton Scientific,Millville,NJ）に、20ml容量の瓶に約4ml容量まで装填し、シリコン処理したブチルグレーのゴム凍結乾燥栓（West Co.）を充填した瓶に使用した。次いで、ガラス瓶を進級凍結乾燥機（Hull Corporation,Hatbor,PA）に置き、−42℃で凍結し、60ミクロンの真空に12時間さらした。12時間後、試料の温度を徐々に（24時間で）約30℃に上昇させた。この温度及び吸引を更に16時間維持した。無菌乾燥窒素を用いてチャンバー内を大気圧に戻し、ガラス瓶にキャップをした。ガラス瓶を、4mlの発熱物質を含まない水を用いて再構成する時点まで４℃に保存した。
本発明の実施に有用な株の寄託
以下の株の生物学的に純粋な培養株の寄託は、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ、12301、アメリカンタイプカルチャーコレクションにブダペスト条約に基づいて行った。表示した受託番号は、生存試験で生存が確認され、所定の料金が支払われた後、付与された。
この培養株の分譲は、37C.F.R. 1.14条及び35 U.S.C.122条の規定により権利を有する者と米国特許商標庁長官が認めた者に対して、又はブダペスト条約により分譲が要求された場合に、この特許出願の存続期間中、可能である。この培養株の入手可能性に関し公衆に対するすべての制限は、この出願に対して特許が許可された場合に取り払われ、その取消はできない。また、この培養株は、この試料の分譲要求が最後になされたときから少なくとも５年間、及び寄託の日から少なくとも３０年間はいかなる場合にも、永続的に入手可能である。培養株が生存していない場合、又は不注意により死滅した場合には、同一の分類学的特性を有する生存株により置き換えられる。
株／プラスミド            ATCC番号          寄託日
BL-21（DE3）
pLysS/pET-8c52K（KmR）    68306             1990.4.17
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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