(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液と未分化の培養細胞とを培養容器に封入することと、
前記培養液の中に前記培養細胞を浮遊した状態で保持しながら前記培養容器をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記培養細胞を培養し、これにより、３次元的な構造を有する組織を構築すること
とを備えた
細胞培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養方法において、
前記培養液の粘度は、前記培養容器がｎ軸回転されている間に前記培養細胞が前記培養容器に接触しないように調整された
細胞培養方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞培養方法において、
更に、前記培養細胞の培養の間に前記培養細胞の分化を促進すること
を備えた
細胞培養方法。
【請求項４】
培養液とアフリカツメカエルのＡ６細胞とを培養容器に封入することと、
前記培養液の中に前記培養細胞を浮遊した状態で保持しながら前記培養容器をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記培養細胞を培養し、これにより、３次元的な構造を有する組織を構築すること
とを備えた
細胞培養方法。
【請求項５】
未分化の培養細胞を培養容器に封入することと、
前記培養容器に外部から培養液を供給することと、
前記培養液の中に前記培養細胞を浮遊した状態で保持しながら前記培養容器をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記培養細胞を培養し、これにより、３次元的な構造を有する組織を構築すること
とを備え、
前記培養容器の内部は、穴が設けられた隔壁により、流路室と培養室とに分離されており、
前記培養細胞は前記培養室に収められ、
前記培養液は、前記流路室に接続された供給管により前記流路室に供給され、且つ、前記流路室に接続された排出管により前記流路室から排出される
細胞培養方法。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養方法であって、
前記培養細胞が、フラスコに付着された付着培養によって培養された後、前記フラスコから剥離されて前記培養容器に移される
細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及び人工臓器製造方法に関する。本発明は、特に、３次元的に組織を培養して構築する細胞培養装置、及び人工臓器製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工的に構築された組織及び器官、即ち、人工臓器を使用して、損傷した組織及び器官の機能を修復して再生する医療手法は、将来の再生医学を担う重要な技術である。この医療手法を実現する上では、細胞から３次元的な立体構造を有する組織及び器官を構築する細胞培養技術が必要不可欠である。
【０００３】
このような細胞培養技術として、培養液を満たした培養容器に培養される細胞塊を封入し、その培養容器に１軸回転を加える、振動を加える、気泡を導入する、又は羽根車によって水流を発生することによって細胞塊を浮遊させ、細胞塊を浮遊状態で成長する技術が知られている。しかし、これらの公知の技術では、細胞塊が分散し、更に、培養容器の内壁への接触により細胞が損傷を受けるため、３次元的な組織の構築が阻害されると推察されている。
【０００４】
また、他の細胞培養技術として、宇宙のような微小重力環境で細胞塊を培養する技術が検討されている。微小重力環境では、細胞塊の沈降がないため、３次元的な組織の構築が可能と考えられている。更に、微小重力環境では、高密度の細胞集合体の形成の可能性が示されている。しかし、宇宙で細胞塊を培養することは、実用性に欠ける。
【０００５】
更に、動植物育成装置が、特許公報（特公平７−８９７９８）に知られている。公知のその動植物育成装置は、育成される動植物を定置して収納する容器を２軸以上で回転し、動植物に多方向から重力を印加する。これにより、擬似的に無重力状態で動植物が育成される。特許公報（特公平７−８９７９８）には、動植物を育成することと共に、細胞を培養することが開示されている。しかし、細胞を培養するための具体的な方法は開示されていない。
【特許文献１】特公平７−８９７９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、細胞の培養によって３次元的な構造を有する組織を構築するための実用的な技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による細胞培養方法は、
培養液と培養細胞とを培養容器に封入することと、
前記培養液の中に前記培養細胞を浮遊した状態で保持しながら前記培養容器をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記培養細胞を培養し、これにより、３次元的な構造を有する組織を構築すること
とを備えている。
【０００８】
このとき、培養容器に封入される培養液の粘度は、前記培養容器がｎ軸回転されている間に培養細胞が培養容器に接触しないように調整されていることが好ましい。培養液の粘度の調整は、培養液にメチルセルロースやコラーゲンゲルのような増粘材を添加することにより可能である。
【０００９】
本発明による人工臓器製造方法は、
培養液と培養細胞とを培養容器に封入することと、
前記培養液の中に前記培養細胞を浮遊した状態で保持しながら前記培養容器をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記培養細胞を培養し、これにより、３次元的な構造を有する組織が構築された人工臓器を形成すること
とを備えている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞の培養によって３次元的な構造を有する組織を構築するための実用的な技術が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、添付図面を参照しながら、本発明による細胞培養方法の実施の形態を説明する。
【００１２】
実施の第１形態：
本発明による細胞培養方法の実施の第１形態では、図１に示された細胞培養装置１０が使用される。細胞培養装置１０は、３次元クリノスタット１と培養容器２とを含む。３次元クリノスタット１は、培養容器２を２軸回転する。培養容器２の内部には、培養液と、培養される培養細胞とが封入される。培養細胞は、培養容器２には固定されず、培養液の中に浮遊される。
【００１３】
３次元クリノスタット１は、本体３、モータ４、外側フレーム５、モーター６、及び内側フレーム７を含む。本体３は、静止系に設置される。本体３は、基部３ａと脚３ｂ、３ｃを含む。基部３ａには、脚３ｂ、３ｃが接続されている。脚３ｂには、モータ４が設けられている。モータ４は、外側フレーム５に接続され、回転軸４ａの回りに外側フレーム５を回転する。外側フレーム５には、モータ６が設けられている。モータ６は、内側フレーム７に接続され、回転軸６ａの回りに内側フレーム７を回転する。回転軸６ａは、回転軸４ａと概ね直交する。内側フレーム７には、既述の培養容器２が接続される。培養容器２は、回転軸４ａと回転軸６ａとの交点の近傍にある。培養容器２は、内側フレーム７と同体に回転する。外側フレーム５と内側フレーム７とがそれぞれ回転されると、培養容器２は、２軸回転する。
【００１４】
培養容器２が２軸回転されると、培養容器２に封入された培養細胞に働く重力の方向が分散され、各細胞があらゆる方向に向けて増殖・進展することができるようになり、培養細胞塊の３次元的な培養が可能になる。また、ｎ軸回転により培養容器２の内部に発生する液流による剪断力は小さく、培養細胞塊の剥離と個々の細胞の遊離を防ぐ。従って、培養容器２が２軸回転された状態で細胞塊を培養することにより、３次元的な構造を有する組織の構築が実現される。
【００１５】
このとき、アクチビンのような分化因子が培養液に添加されることは、所望の組織の構築を適切に行う上で好ましい。分化因子を培養液に添加することは、培養細胞の分化を促進し、組織の構築を適切に行うことを可能にする。
【００１６】
更に、培養液にメチルセルロースやコラーゲンゲルのような増粘材が添加され、培養容器２が２軸回転されたときに培養容器２の内壁に培養細胞が接触しないように培養液の粘度が調整されることが好ましい。これにより、培養細胞塊の沈降が防がれる。
【００１７】
図２及び図３は、実施の第１形態の細胞培養方法により培養された細胞塊の外観写真及び断面写真である。その細胞塊は、下記方法により培養された。まず、アフリカツメカエルの雄生体の正常腎由来のＡ６細胞が、培養フラスコにより２３℃環境下で２週間、付着培養された。続いて、付着フラスコの培養面に１層状態で増殖した培養細胞の一部が剥離され、上記の培養容器２に移された。培養容器２は、培養液で満たされた。続いて、培養容器２が３次元クリノスタット１により回転され、培養細胞が培養容器２の中で浮遊状態で培養された。培養は、２３℃環境下で２週間行われた。培養細胞が培養されて形成された細胞塊には、図２に示されているように、細胞球状化が認められた。更に、形成された細胞塊を切片化して内部状態を観察したところ、図３に示されているように、腎管様の構造が認められた。この実験事実は、実施の第１形態の細胞培養方法によって細胞の培養を行うことにより、３次元的な構造を有する組織を構築することができることを示している。
【００１８】
実施の第１形態の細胞培養方法は、人工臓器の製造に適用可能である。この場合、培養容器２に封入される培養細胞として、目的とする臓器に分化可能な細胞が封入される。封入された細胞が２軸回転されながら培養され、３次元的な構造を有する人工臓器が形成される。
【００１９】
なお、実施の第１形態では、培養容器２が２軸回転されているが、培養容器２は、更に多くの回転軸の回りに回転されることも可能である。この場合でも、２軸回転の場合と同様に、培養容器２の回転により培養細胞塊に働く重力の方向が分散され、各細胞があらゆる方向に向けて増殖・進展することができるようになり、培養細胞塊の３次元的な培養が可能になる。また、ｎ軸回転により、培養容器２の内部に発生する液流の剪断力が小さくなり、培養細胞塊の剥離と個々の細胞の遊離を防ぐ。培養容器２が２軸よりも多くの回転軸の回りに回転された状態で細胞塊を培養することにより、３次元的な構造を有する組織の構築が実現される。
【００２０】
実施の第２形態：
本発明による細胞培養方法の実施の第２形態では、実施の第１形態と同様に、培養液で満たされた培養容器が２軸回転され、その培養容器の内部で細胞塊が培養される。実施の第２形態では、新鮮な培養液が２軸回転される培養容器に逐次に供給された状態で培養が行われ、長期間の培養が可能である。
【００２１】
図４は、本発明による細胞培養方法の実施の第２形態で使用される細胞培養装置５０を示す。細胞培養装置５０は、３次元クリノスタット１１、培養容器１２、培養液タンク１３、及びポンプ１４を備えている。３次元クリノスタット１１は、培養容器１２を２軸回転する。培養容器１２の内部には、培養液と、培養される細胞塊とが封入される。培養される細胞塊は、培養容器１２には固定されず、培養液の中に浮遊される。
【００２２】
培養液タンク１３は、培養容器１２に供給されるべき培養液を蓄積する。ポンプ１４は、培養液タンク１３に蓄積された培養液を、培養容器１２に圧出して供給する。培養容器１２に供給された培養液は、培養液タンク１３に戻される。細胞塊を培養する培養液は、循環的に使用されることになる。
【００２３】
培養液タンク１３は、培養液に含まれる気体の濃度を調節する気体濃度調整機能を有することが好ましい。培養液に含まれる酸素及び二酸化炭素の濃度の最適化は、細胞塊の培養の上で重要である。培養液に含まれる気体、特に、酸素及び二酸化炭素の濃度を調整することにより、細胞塊をより好ましい環境で培養することが可能である。より具体的には、培養液タンク１３がガス交換可能な材質で形成され、且つ、培養液タンク１３の周囲の雰囲気が調整される。これにより、培養液に含まれる気体を所望の濃度に調節することが可能である。
【００２４】
３次元クリノスタット１１は、培養液を培養容器１２に供給するために、実施の第１形態の３次元クリノスタット１とは異なる構成を有する。３次元クリノスタット１１は、本体１５を備えている。本体１５には、支柱１６ａと支柱１６ｂとが接合されている。支柱１６ａは、外側フレーム１７を回転可能に支持する。支柱１６ｂには、ロータリージョイント１８とモータ１９とが接合されている。ロータリージョイント１８は、外側フレーム１７を回転可能に支持する。モータ１９は、ギア、ベルトのような動力伝達機構（図示されない）を介して外側フレーム１７を駆動し、外側フレーム１７を回転軸１８ａの回りに回転する。
【００２５】
外側フレーム１７には、ロータリージョイント２０とモータ２１とが接合されている。ロータリージョイント２０は、内側フレーム２２を回転可能に支持する。モータ２１は、ギア、ベルトのような動力伝達機構（図示されない）を介して内側フレーム２２を駆動し、内側フレーム２２を回転軸２０ａの回りに回転する。
【００２６】
内側フレーム２２には、既述の培養容器１２が接続される。培養容器１２は、回転軸１８ａと回転軸２０ａとの交点の近傍にある。培養容器１２は、内側フレーム２２と同体に回転する。外側フレーム１７と内側フレーム２２とがそれぞれ回転されると、培養容器１２は、２軸回転する。
【００２７】
ポンプ１４から培養容器１２への培養液の供給は、ロータリージョイント１８とロータリージョイント２０とを介して行われる。ポンプ１４が送り出す新鮮な培養液は、供給管２３を介してロータリージョイント１８に到達する。ロータリージョイント１８は、供給管２３から送られる培養液を、外側フレーム１７と同体に回転する供給管２４に導入する。更に、ロータリージョイント２０は、供給管２４に送られた培養液を、内側フレーム２２と同体に回転する供給管２５に導入する。供給管２５は培養容器１２に接続され、供給管２５から培養液が培養容器１２に供給される。
【００２８】
同様に、培養容器１２から培養液タンク１３への培養液の排出は、ロータリージョイント１８とロータリージョイント２０とを介して行われる。培養容器１２は、排出管２６に培養液を排出する。排出管２６に排出された培養液は、ロータリージョイント２０を介して、外側フレーム１７と同体に回転する排出管２７に導入される。排出管２７に導入された培養液は、ロータリージョイント１８を介して、静止系に置かれている排出管２８に導入される。排出管２８を介して培養液が培養液タンク１３に戻される。
【００２９】
図５は、ロータリージョイント１８を詳細に示す。ロータリージョイント１８は、固定部２９と回転部３０とを含む。固定部２９と回転部３０とは、径の異なる円柱体であり、回転部３０は、固定部２９に回転自在に挿入されている。固定部２９は支柱１６ｂに固着され、回転部３０は外側フレーム１７に固着されている。
【００３０】
固定部２９と回転部３０との間の空間には、シール３１、３２により、第１液導入室３３と第２液導入室３４とが形成されている。第１液導入室３３と第２液導入室３４とは、シール３１により分離されている。第２液導入室３４は、シール３２により外部からの気密が保たれている。第１液導入室３３には、ポンプ１４に接続されている供給管２４が接続され、第２液導入室３４には、培養液タンク１３に接続されている排出管排出管２７が接続されている。
【００３１】
回転部３０には、第１液導入室３３に開口する第１穴３５と、第２液導入室３４に開口する第２穴３６とが設けられている。第１穴３５は、供給管２４に接続され、第２穴３６は、排出管２７に接続される。
【００３２】
このような構造を有するロータリージョイント１８は、支柱１６ｂと外側フレーム１７とがなす角度に関わらず、供給管２３と供給管２４とを接続し、且つ、排出管２７と排出管２８とを接続する。
【００３３】
ロータリージョイント２０は、ロータリージョイント１８と同様の構成を有しており、外側フレーム１７と内側フレーム２２とがなす角度に関わらず、供給管２４と供給管２５とを接続し、排出管２６と排出管２７とを接続する。
【００３４】
このように、ロータリージョイント１８とロータリージョイント２０とを介して、３次元クリノスタット１１の外部から培養容器１２に培養液が供給され、更に、培養容器１２から３次元クリノスタット１１の外部に培養液が排出される。
【００３５】
培養容器１２に外部から培養液が供給される場合、培養液が流れ込むことにより、培養容器１２の内部で液流の乱れが発生し得る。液流の乱れは、細胞塊の分散を招き、３次元的な組織の構築の障害になり得る。これに対応するために、培養容器１２は、この液流の乱れによる影響を抑制するような構造を有している。
【００３６】
図６は、培養容器１２を示す。培養容器１２の内部は、隔壁３７により、流路室３８と培養室３９とに分離されている。流路室３８には、培養液を供給する供給管２５と、培養液を排出する排出管２６とが接続されている。隔壁３７には、多数の穴（図示されない）が設けられ、その穴を通じて、流路室３８と培養室３９とで培養液の交換が行われる。培養室３９には、細胞塊４０が浮遊状態で収められ、細胞塊４０の培養は、培養室３９の内部で行われる。
【００３７】
このような構造を有する培養容器１２では、細胞塊４０の培養が行われる培養室３９には、直接には培養液が流入しない。これにより、培養容器１２に培養液が流入することによる液流の乱れが、細胞塊４０の培養に及ぼす影響が抑制される。
【００３８】
本発明による細胞培養装置の実施の第２形態は、実施の第１形態と同様に、３次元的な構造を有する組織を構築することができる。実施の第２形態では、更に、長期間にわたる細胞の培養が可能である。
【００３９】
なお、実施の第２形態では、培養に使用される培養液は循環されているが、培養容器１２から排出された培養液が、そのまま捨てられることも可能である。この場合、培養容器１２から培養液が排出される排出管２８は、培養液タンク１３に接続されない。
【００４０】
実施の第３形態：
本発明による細胞培養方法の実施の第３形態は、人工臓器の製造に特に好適に適用される。
【００４１】
本発明による細胞培養方法の実施の第３形態は、培養液で満たされた培養容器が２軸回転され、その培養容器の内部で細胞が培養される点では、実施の第１形態及び第２形態と同じである。
【００４２】
実施の第３形態では、実施の第１形態及び第２形態と異なり、細胞塊は、培養容器に固定された人工基質に付着されて培養される。実施の第３形態では、３次元的に重力が印加され、３次元的構造をもつ人工基質に均一に細胞付着する等の３次元的な培養が可能になる。また、培養容器が２軸回転されて発生する流体攪拌による剪断力は小さく、付着・凝集した細胞がバラバラになることや、損傷することが防がれる。
【００４３】
人工基質の上に細胞が培養されることは、大型の人工臓器の構築を可能にする。大型の人工臓器を構築するためには、大型の細胞塊を培養することが必要である。しかし、大型の細胞塊を完全な浮遊状態に保つことは困難であり、細胞塊が大型化すると細胞塊に損傷が加わりやすい。細胞塊が、培養容器に固定された人工基質の上に培養されることにより、細胞塊の損傷が防がれ、大型の細胞塊の培養が可能になる。このとき人工基質は、細胞塊を固定的に支持すると共に、細胞塊の培養の骨格となり、人工臓器の一部を構成する。
【００４４】
実施の第３形態では、実施の第２形態で使用される培養容器１２の代わりに、図７に示された培養容器４１が使用される。培養容器４１は、隔壁４２により、流路室４３と培養室４４とに分離される。流路室４３には、培養液を供給する供給管２５と、培養液を排出する排出管２６とが接続される。隔壁４２には、多数の穴（図示されない）が設けられ、その穴を通じて、流路室４３と培養室４４とで培養液の交換が行われる。
【００４５】
培養室４４の内部には、人工基質４５と人工基質支持部４６、４７とが収納される。人工基質４５は、例えばスポンジコラーゲンにより形成される。人工基質４５は細胞塊（図示されない）を培養する骨格となり、細胞塊は、人工基質４５に付着した状態で培養される。人工基質支持部４６、４７は、人工基質４５を培養容器４１の内壁に固定的に保持する。人工基質４５と人工基質支持部４６、４７とにより、培養される細胞塊は、培養液中に固定的に保持される。
【００４６】
本発明による細胞培養装置の実施の第３形態の他の構成は、実施の第２形態と同一でありその詳細な説明は行われない。
【００４７】
実施の第３形態では、以下のようにして組織の構築が行われる。培養される細胞が、人工基質４５に付着される。人工基質４５が人工基質支持部４６、４７により培養室４４の内壁に固定され、更に、培養容器４１の内部は培養液で満たされる。培養容器４１が、３次元クリノスタット１１により２軸回転され、培養が開始される。培養の間、ポンプ１４は、培養液タンク１３から培養液を培養容器４１に供給し、培養容器４１から排出される培養液は、培養液タンク１３に戻される。培養室４４の内部では、培養液が三次元的に流れ、更に、重力が人工基質４５に対して全ての方向から印加される。これにより、細胞が人工基質４５の表面に３次元的に増殖する。
【００４８】
培養細胞と人工基質４５で構成された構造体は、人工臓器として培養容器４１から取り出される。構築された人工臓器を、体内に移植し、或いは、体外に設置することにより、臓器の機能の再生及び修復が可能である。
【００４９】
大型の人工臓器を構築するためには、図８に示されているように、人工基質管４８が人工基質４５に設けられることが好ましい。この人工基質管４８の一端は、図４に示された供給管２５に接続され、他端は、排出管２６に接続され、人工基質管４８の内部には、培養液が通される。人工基質４５に構築される組織が大型化すると、増殖に必要な物質を、組織の内部に供給することが困難になる。その内部に培養液が通された人工基質管４８は、人工血管として作用し、組織の内部に増殖に必要な物質が供給される。人工基質管４８が設けられる場合、人工基質管４８が人工基質４５を支持することが可能であり、図８に示されているように、人工基質支持部４６、４７は、必ずしも設けられる必要がない。
【００５０】
本発明による細胞培養装置の実施の第３形態は、実施の第１形態及び第２形態と同様に、３次元的な構造を有する組織を構築することができる。実施の第３形態では、更に、大型の組織の構築が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明による細胞培養装置の実施の第１形態を示す。
【図２】図２は、実施の第１形態の細胞培養装置により培養された細胞塊の外観写真である。
【図３】図３は、実施の第１形態の細胞培養装置により培養された細胞塊の断面写真である。
【図４】図４は、本発明による細胞培養装置の実施の第２形態を示す。
【図５】図５は、ロータリージョイント１８を示す。
【図６】図６は、培養容器１２を示す。
【図７】図７は、本発明による細胞培養装置の実施の第３形態で使用される培養容器４２を示す。
【図８】図８は、培養容器４２の変形例を示す。
【符号の説明】
【００５２】
１：３次元クリノスタット
２：培養容器
３：本体
３ａ：基部
３ｂ、３ｃ：脚
４：モータ
５：外側フレーム
６：モーター
７：内側フレーム
１１：３次元クリノスタット
１２：培養容器
１３：培養液タンク
１４：ポンプ
１５：本体
１６ａ、１６ｂ：支柱
１７：外側フレーム
１８：ロータリージョイント
１９：モータ
２０：ロータリージョイント
２１：モータ
２２：内側フレーム
２３、２４、２５：供給管
２６、２７、２８：排出管
２９：固定部
３０：回転部
３１、３２：シール
３３：第１液導入室
３４：第２液導入室
３５：第１穴
３６：第２穴
３７：隔壁
３８：流路室
３９：培養室
４１：培養容器
４２：隔壁
４３：流路室
４４：培養室
４５：人工基質
４６、４７：人工基質支持部
４８：人工基質管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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