(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されたＤＮＡ（ｂＩＡＰ II）。
【請求項２】
請求項１に記載されたｃＤＮＡを含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む真核または原核細胞。
【請求項４】
請求項１に記載されたＤＮＡを用いることを特徴とする、3000 U/mgより高い比活性を有する高活性組換えアルカリ性ホスファターゼを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、3000U/mg以上の比活性を有する真核生物高活性アルカリ性ホスファターゼをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、本発明のＤＮＡの産生方法、本発明のＤＮＡを含むベクター、ならびにかかるベクターを含む細胞系に関する。本発明は、さらに、本発明のＤＮＡによってコードされる、3000U/mg以上の比活性を有する組換え高活性アルカリ性ホスファターゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）は、E.coliから哺乳動物に至る全ての生物において見出される、二量体、亜鉛含有の非特異的ホスホモノエステラーゼである（McCombら, 1979）。種々のアルカリ性ホスファターゼの一次構造を比較したところ、高度に相同性があることが示された（E.coliと哺乳動物ＡＰの間の相同性は25〜30％）（Millan, 1988；Harris, 1989）。
【０００３】
ヒトおよび高等動物においては、ＡＰファミリーは異なる遺伝子座においてコードされる４つのメンバーからなる（Millan, 1988；Harris, 1989）。アルカリ性ホスファターゼファミリーとしては、組織特異的ＡＰ（胎盤ＡＰ（ＰＬＡＰ）、生殖細胞ＡＰ（ＧＣＡＰ）および腸ＡＰ（ＩＡＰ））ならびに主に肝臓、腎臓および骨に局在する非組織特異的ＡＰ（ＴＮＡＰ）が挙げられる。
【０００４】
従来公知のＡＰの決め手となる特性は、比活性がE.coliＡＰよりも10〜100倍高い哺乳動物ＡＰの触媒活性の大きな変動性である。哺乳動物ＡＰの中で、ウシ腸由来のＡＰ（ｂＩＡＰ）が最も高い比活性を示す。この特性により、ｂＩＡＰは診断試薬またはＤＮＡの脱リン酸化のための酵素抱合体などのバイオテクノロジー用途に対して魅力的である。1985年、BesmanおよびColemanは、ウシ腸に２つのＩＡＰイソ酵素、すなわち子ウシ腸由来のＩＡＰおよび成熟ウシの腸由来のＩＡＰ（ｂＩＡＰ）が存在することを、クロマトグラフィーにて精製したＡＰ画分のアミノ末端配列決定によって立証した。アミノ末端における明確な相違が、成熟ウシのｂＩＡＰ（LVPVEEED）と子ウシ腸由来のｂＩＡＰ（LIPAEEEN）の間に示されている。1993年、Weissigらは、比活性約3000U/mgでN-末端がLVPVEEEDである組換えｂＩＡＰ（ｂＩＡＰＩ）をクローニングすることによって正確な生化学的特性付けを行った。しかしながら、最大8000U/mgまでの比活性を有する子ウシ由来のｂＩＡＰも市販されているが（Boehringer Mannheim, Biozyme, Oriental Yeast）、さらなる特性付けは未だなされていない。これらの高活性アルカリ性ホスファターゼをクローニングする試みはすべてうまくいかなかった。したがって、組換え高活性アルカリ性ホスファターゼを産生することはできなかった。しかしながら、組換え体産生の可能性は、高活性アルカリ性ホスファターゼの経済的な産生には絶対必須である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、クローニングすることもできる組換え手段による高活性アルカリ性ホスファターゼを提供することである。本発明の意味に含まれる「高活性」は、本発明によるアルカリ性ホスファターゼが従来公知のアルカリ性ホスファターゼと比べて少なくとも10％高い活性を有することを意味するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本発明にしたがって、322位のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基よりも小さく、3000U/mg以上、好ましくは少なくとも3500U/mgの比活性を有する真核生物高活性アルカリ性ホスファターゼをコードするＤＮＡの提供によって達成された。本発明の意味においては、真核生物ＤＮＡが好ましい。もはやイントロンを含まないＤＮＡを意味する真核生物ｃＤＮＡが特に好ましい。「アスパラギン酸残基よりも小さいアミノ酸残基」という用語は、アミノ酸であるアスパラギン酸残基の構造よりも小さい空間的寸法を有するあらゆるアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸もしくは天然アミノ酸から誘導されるアミノ酸と理解される。本発明のＤＮＡは、アミノ酸残基322がグリシン、アラニン、トレオニン、バリンまたはセリンであるものが好ましい。本発明のＤＮＡは、アミノ酸残基322がグリシンまたはセリンであるのものが特に好ましい。配列番号(SEQ ID NO.)１、３および５（図１、３、５）に記載のＤＮＡならびに配列番号２、４および６（図２、４、６）に記載の関連アミノ酸配列は、本発明の一部である。また、本発明は、Ｎ末端が配列番号２、４および６に記載のｃＤＮＡと比べて長いか短いということのみが前述と異なるｃＤＮＡにも関する。そのような場合、配列番号２、４および６の322位に対する名称はそれに応じて変化する。例えば、Ｎ末端が配列番号２、４および６よりもＸアミノ酸長いか短い場合、関連する322位もＸアミノ酸の分だけシフトする。
【０００７】
配列番号１は、高活性ｂＡＩＰ IIイソ酵素の配列をコードするＤＮＡを含む。天然酵素は公知であるが、特性付けされておらず、クローニングすることができない。したがって、高活性ｂＩＡＰ IIイソ酵素のアミノ酸配列決定が本発明の主題である。子ウシ腸由来の、高比活性を有する高度に精製された画分（Boehringer Mannheim）を用いて配列を決定した。高活性ＡＰのペプチド地図をエンドプロテイナーゼLysC、AspN、GluC、トリプシンによる切断ならびにブロムシアンによる化学的切断によって作製した。この手法で産生させたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分離し、単離した。各ペプチドをエレクトロスプレー質量分光法によって分析し、エドマン分解によって配列決定した。この方法で得られた配列を、刊行物に記載されたｂＩＡＰＩの配列（Weissigら, 1993）と比較した。予想どおり、ｂＩＡＰ IIのアミノ末端はBesmanおよびColeman（J. Biol. Chem. 260, 11190-11193(1985))によって記載されたような出発配列LIPAEEENを有している。ｂＩＡＰ IIの完全アミノ酸配列を配列番号２に示す（図２）。この配列番号２によれば、ｂＩＡＰ IIはｂＩＡＰＩと比べて合計24個のアミノ酸置換を有する。単離された高活性ｂＩＡＰ IIイソ酵素のアミノ酸数は、480アミノ酸である。1798bpのヌクレオチド配列（図１）は、514アミノ酸のコード領域を含む。481位から514位までの可能なアミノ酸は、広い制限範囲内で変動し得る。
【０００８】
以下、本発明は従来知られていない２つの新規ｂＩＡＰ（ｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IV）のクローニングおよび完全特性付けを記載する。ウシ腸の異なる切片由来のＲＮＡ試料においてノーザンブロット分析を行った。最も強いハイブリダイゼーションシグナルを有するプローブのｃＤＮＡバンクを、ベクターIZAP II（Stratagene、サンディエゴ、CA、USA）においてオリゴｄＴプライマー（Stratagene、サンディエゴ、CA、USA）を用いて準備した。完全なバンク（1.0×106 組換えクローン）をｂＩＡＰＩ遺伝子のエキソンＩ〜VIIIの領域をカバーするｂＩＡＰＩの1075bp HindIII断片を用いてスクリーニングした。65クローンを単離して配列決定した。このプロセスにおいて、２つの新規ｂＩＡＰが同定された（ｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IV）。その特性付けをさらに下記に記載する。これらはｂＩＡＰＩともｂＩＡＰ IIとも完全に相同ではなかった。ｂＩＡＰ IIIおよびIVのヌクレオチド配列を図３および５に示す。ｂＩＡＰＩ〜IVの配列の相違を図７に示す。しかしながら、新規ｂＩＡＰはどれも予想したＮ末端LIPAEEENを有しておらず、従来記載されていない新規のＮ末端を有していた（図７参照）。２つの新規ｂＩＡＰイソ酵素のｃＤＮＡを適当な制限酵素を用いて再切断し、ＣＨＯ発現ベクターpcDNA-3（例えば、Invitrogen社、サンディエゴ、CA、USA製）にライゲーション（連結）によって挿入した。新規ｂＩＡＰイソ酵素を含むクローンをInvitrogenによって記載された方法にしたがって発現させ、イソ酵素の特性付けを行った。種々の宿主におけるｂＩＡＰ遺伝子の発現は、WO93/18139に記載されている（ＣＨＯ細胞、E.coli、バキュロウイルス系）。この特許文献に記載されている方法、ベクターおよび発現系は、本出願の開示の一部である。本発明は、さらに、天然および組換え高活性アルカリ性ホスファターゼｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IVに関する。配列番号４および６に記載のアルカリ性ホスファターゼが特に好ましい。ｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IV遺伝子を含むＣＨＯ細胞系はＤＳＭＺ、すなわち「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH」、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweigに寄託した（DSM ACC 2349、DSM ACC 2350）。
【０００９】
以下、本発明は、ｂＩＡＰＩ、IIIおよびIVの突然変異断片および野生型断片のライゲーションによるｂＩＡＰ II配列の構築を記載する。このプロセスによって機能的イソ酵素をコードする一連の中間産物（Ｌ１Ｎ８、ＩＮＴ１、ＩＮＴ２およびＩＮＴ３）を作製した。これらの中間産物を構築するために、各場合において、改変されるｂＩＡＰ−ｃＤＮＡの一部を適当な制限酵素を用いて切り出し、制限酵素を用いた消化による適合末端を有する、所望の突然変異を含む別のｂＩＡＰ−ｃＤＮＡのセグメントで置換した。異なるｂＩＡＰ−ｃＤＮＡセグメントのライゲーションによって導入することができない突然変異は、部位特異的突然変異誘発によって導入した。その後、突然変異断片を適当な制限酵素を用いて再切断し、同様に切断した、適合末端を有するｂＩＡＰ−ｃＤＮＡに連結した（図８）。次いで、この方法において導入された突然変異を制限分析および配列決定によって調べた。
【００１０】
したがって、本発明の主題は、１つまたは複数のアルカリ性ホスファターゼのＤＮＡの突然変異断片および野生型断片が連結されていることを特徴とする、本発明のＤＮＡの産生方法である。さらに、本発明は、機能的イソ酵素をコードし、本発明の上記方法において中間産物として形成されるｃＤＮＡに関する。さらに、本発明は、本発明のｃＤＮＡを含むベクターに関する。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、本発明のベクターを含む細胞系である。適当な細胞は、例えば、ＣＨＯ、Pichia、HansenulaもしくはSaccharomyces cerevisiaeのような真核細胞およびAspergillus、E.coliのような原核細胞であり、E.coli、酵母およびＣＨＯ細胞が特に好ましい。E.coli株に適した出発ベクターは、例えば、pTE、pTaq、bPL、pBluescriptである。適当なE.coli株は、例えば、XL1-Blue、HB101、RR1 Δ M15、BL21(DE)、MC 1000などである。適当なPichiaベクターは、例えば、pGAPZαおよびpPICZα（Invitrogen、サンディエゴ、CA、USA）である。ＣＨＯ細胞系に適したベクターは、例えば、pcDNA-3（Invitrogen、サンディエゴ、CA、USA）である。ｂＩＡＰ II遺伝子を含むＣＨＯ細胞系は、ＤＳＭＺ、すなわち「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH」、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweigに寄託した（DSM ACC 2348）。
【００１２】
組換えｂＩＡＰＩ、II、IIIおよびIVイソ酵素の速度論的特性付けにより、触媒特性に関してかなりの相違が示された（図９）。例えば、ｂＩＡＰ II（約8600U/mg）はｂＩＡＰＩ（約2700U/mg）よりも比活性が300％以上、すなわち３倍以上高い。また、ｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IVも、ｂＩＡＰＩよりもそれぞれ約1.8倍（約4700U/mg）および約2.6倍（＞6700U/mg）高い活性を示し（図９）、百分率では、それぞれ約170％および250％の増加に相当する。さらに、イソ酵素の熱安定性においてかなりの測定可能な相違が存在した。ｂＩＡＰＩは、最も熱安定性のあるイソ酵素であり、ｂＩＡＰ IIおよびIIIのＴm 値はｂＩＡＰＩよりも７℃低く、ｂＩＡＰ IVのＴm 値はｂＩＡＰＩよりも13℃低い（図９）。Ｔm 値は、10分間のインキュベーション後に50％残留活性が測定される温度として理解される。
【００１３】
以下、本発明は、ｂＩＡＰの比活性に影響を及ぼすアミノ酸残基の同定を記載する。これは、中間産物によって促進される。中間キメラ(chimers)Ｌ１Ｎ８、ＩＮＴ１、ＩＮＴ２およびＩＮＴ３の発現により、24アミノ酸の中の11が活性の増大のためのエフェクターから除外することができた（図７）。
・Ｌ１Ｎ８突然変異酵素は、ｂＩＡＰＩに匹敵する比活性を有しており；したがって、この場合において導入された突然変異V2I、V4AおよびD8Nは比活性の増大には関連していない。V2Iという表記は、2位のアミノ酸バリンがイソロイシンによって置換されることを意味する。
【００１４】
・ＩＮＴ１突然変異体はｂＩＡＰ IIに匹敵する比活性を有しており、したがってこの領域は重要である。
・ＩＮＴ２突然変異体はＩＮＴ１およびｂＩＡＰ IIに匹敵する比活性を有しており、したがって、ＩＮＴ２由来の突然変異S380G、D411G、D416E、Q420R、Q427L、E453QおよびT480Aも除外することができる。
【００１５】
・ＩＮＴ３突然変異体の作製において、高比活性における変化は観察されず、したがって突然変異N192Yの効果が除外された。
13個の残りの残基の中のどれが高比活性にとって重要であるかを同定するために、本発明においては、ｂＩＡＰ II ｃＤＮＡをｂＩＡＰＩの対応するアミノ酸に対する単一突然変異のための鋳型として用いた。単一突然変異体N122K、I133M、A142S、K180M、M205K、E210V、E236A、G322DおよびI332G、ならびに結合したA289Q-A294V-Q297R-L299V ｂＩＡＰ II突然変異体が構築された（図９）。
【００１６】
驚くべきことに、主に、突然変異G322Dは、ｂＩＡＰ IIの高比活性（約8600U/mg）を３分の１以下（2817U/mg）に低下させ得るものであり、よって、ｂＩＡＰ IIをｂＩＡＰＩと同程度の低さの比活性に変換し得るものであることがわかった。
この結果を検証するために、本発明において、復帰突然変異D322GをｂＩＡＰＩに導入した。驚くべきことに、この場合、逆の効果、すなわち、10148U/mgという３倍以上の比活性の増大が測定され、したがってｂＩＡＰ IIに匹敵する値が得られた（図９）。比較的活性の高いｂＩＡＰ III（約4700U/mg）とより高活性のｂＩＡＰ IV（＞6700U/mg）のアミノ酸配列の比較により、再び、この結果が裏付けられる。ｂＩＡＰ IIIは322位にセリンを有し、ｂＩＡＰ IVはグリシンを有する。
【００１７】
さらに、本発明においては、作製された突然変異体を熱安定性について調べた。その結果、ｂＩＡＰＩとｂＩＡＰ IIの間の熱安定性の相違は、１以上の置換の組み合わせ効果によるものである。［Ｇ322］ｂＩＡＰＩならびに［Ｄ322］ｂＩＡＰ II突然変異体は、ｂＩＡＰＩイソ酵素とｂＩＡＰ IIイソ酵素の間にある安定度値を示す（図９）。D322G突然変異は、ｂＩＡＰＩイソ酵素においてわずかな不安定化作用を有する（Ｔ50においてほぼ４℃）のに対して、ｂＩＡＰ IIにおける置換G322Dにより、この突然変異酵素の安定性において対応する増大が生じる。しかしながら、野生型ｂＩＡＰＩの熱安定性は得られない。
【００１８】
したがって、本発明の主題は、特に、真核生物ｃＤＮＡによってコードされる、3000U/mg以上の比活性を有する高活性組換えアルカリ性ホスファターゼを提供することである。本発明による高活性組換えアルカリ性ホスファターゼは、322位にグリシン、アラニン、トレオニン、バリンまたはセリンがあるものが特に好ましい。本発明によるアルカリ性ホスファターゼは、322位にグリシンがあることが特に好ましい。
【００１９】
本発明の高活性組換えアルカリ性ホスファターゼは、好ましくは、さらに、下記の位置の１つまたは複数に突然変異を有することが可能である：
その突然変異が活性の増大をもたらす１、108、125、149、181、188、219、221、222、223、224、231、252、258、260、282、304、321、330、331、354、383、385、400、405、413、428、431および461位のアミノ酸残基。さらに、本発明は、本発明の高活性アルカリ性ホスファターゼの産生方法に関する。また、本発明のアルカリ性ホスファターゼは、例えば、それらの熱安定性に関して特異的に突然変異誘発することによって改良することもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の高活性アルカリ性ホスファターゼの活性は、E.Mossnerら, Z. Physiol. Chem. 361(1980), 543-549にしたがって測定した。ただし、試験は、この論文に記載されている25℃ではなく37℃で行った。37℃での測定は、ジエタノール緩衝液中で活性を測定する際の世界的な通常の温度である（ＢＭ試験法5426）。
【００２１】
本発明のＡＰおよび公知のＡＰのタンパク質測定は、280nmにおける水に対するタンパク質溶液の吸光度を測定することによって行われる。１mg／mlの濃度の低活性および高活性ＡＰ溶液の吸光度は280nmで1.0である（A280nm（１mg／ml）は１に等しい）。
比活性は、活性とそれに伴うタンパク質の量の商を計算することによって決定される。
【００２２】
【実施例】
本発明は、さらに、下記の実施例によって説明される：
実施例１：クローニング
成熟ウシの腸から調製したλgt 11ｃＤＮＡバンク（Clontech Laboratories,パロアルト（Palo Alto）、CA、USA）を、プローブとしてｂＩＡＰＩｃＤＮＡの 5'末端から1075bpのHind III断片を用いてスクリーニングした（Weissigら, 1993）。このｃＤＮＡバンク由来のクローンを用いて成熟ウシの肝臓から調製されたEMBL-3 SP6/T7ゲノムｃＤＮＡバンク（Clontech Laboratories,パロアルト、CA、USA）をスクリーニングした。成熟ウシの小腸からTrisolv（商標名）試薬を用いて単離されたｍＲＮＡ由来のオリゴｄＴプライマー（Stratagene、サンディエゴ、CA、USA）によって非増幅λZAP IIｃＤＮＡバンクを準備し、プローブとしてｂＩＡＰＩｃＤＮＡの1075bpのHind III断片を用いてスクリーニングした。プローブをランダムプライムした(primed)ＤＮＡ標識キット（Boehringer Mannheim）を用いて放射能標識した。ファージＤＮＡをλgt 11およびEMBL-3 SP6/T7クローンについて記載したようにして調製した（Tsonis & Manes, 1988）。λZAP IIクローンのin vivo切断を製造業者（Stratagene、サンディエゴ、CA）の指示にしたがって行った。ゲノムクローンを記載されているようなサザンブロット分析によって特性付けした（Sambrookら, 1989）。λgt 11クローンのEcoRI ｃＤＮＡ断片およびその他のバンクのクローン由来の種々の制限断片をKS+ベクター（Stratagene、サンディエゴ、CA、USA）にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解によって調製した（Sambrookら, 1989）。Sequenaseを製造業者プロトコル（Amersham）にしたがって用いて配列決定を行った。ｂＩＡＰ IIIおよびIVの配列決定に使用したオリゴヌクレオチドを下記に記載する：
【００２３】
0004295386.tif 000002
【００２４】
核酸配列は、MacVector配列分析プログラム（International Biotechnologies社、ニューヘブン、CT、USA）を用いて分析した。
実施例２：ｂＩＡＰ IIのアミノ酸配列の決定
約500μｇの精製した高活性（約6000U/mg）子ウシ腸ＡＰを、450μｌの６Ｍ塩酸グアニジン、0.25ＭのTris、１mMのＥＤＴＡ、pH8.5に溶解し、次いで30μｌのメルカプトエタノールを加えた。100℃で30分間還元した後、35μｌのビニルピリジンを加えることによってシステインをアルキル化し、この混合物を暗所で室温にて45分間インキュベートした。次いで、短い逆相ＨＰＬＣ Aquapore RP300カラム（30×2.1mm、Applied Biosystems、Weiterstadt）上で反応混合物をただちに脱塩した。0.1％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの段階グラジエントを用いて結合した酵素を溶離させた。タンパク質を含む画分を蒸発乾固した。酵素を脱グリコシル化するために、125μｇのＡＰを15μｌの蒸留水および６μｌのインキュベーション緩衝液（250mMのNa2HPO4、50mMのＥＤＴＡ、pH7.2）および15ＵのEndoF/PNGアーゼ（Boehringer Mannheim、Penzberg）に溶解した。混合物を一晩37℃に維持し、その後、切断に用いた。還元され、アルキル化されたＡＰを、種々の酵素（エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼAspN、エンドプロテイナーゼGluCおよびトリプシン（Boehringer Mannheim、Penzberg））を用いて個々の酵素のデータシートの指示にしたがって酵素的に切断した。臭化シアン分解を、70％(v/v)ギ酸中10％（w/w)CNBrを用いて８時間行った。水を用いて溶解した後、溶液の容量をSpeedVac濃縮器（Savant）を用いて減らし、逆相ＨＰＬＣに使用した。Ｃ−末端トリプシンペプチドをカルボキシペプチダーゼＹ（８ng／μl）を用いて４分間消化し、放出されたペプチドを、Bruker Reflex III機器を用いるマトリックス支持レーザー脱着／イオン化質量分析法により製造業者の指示にしたがって分析した。アセトニトリル／水（50/50、v/v）に2,5ジヒドロキシ安息香酸を加えたもの（10mg／ml）をマトリックスとして使用した。酵素的または化学的切断から得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって、LiChrospher C18 selBカラム125×２mm（Merck、Darmstadt）上で、0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶媒系を用いて分離した。流量は300μｌ／分であった。溶離剤を206nmにおけるＵＶモニタリングによって検出し、画分を手動で回収した。ペプチドの質量測定を、ＡＰＩ IIIエレクトロスプレー質量分析計（PE-Sciex、Langen）を用いて、製造業者の指示にしたがって行った。アミノ酸配列を492Aタンパク質シークエンサー（Applied Biosystems、Weiterstadt）を用いて、製造業者の指示にしたがって決定した。
実施例３：ｂＩＡＰ II ｃＤＮＡの調製およびｂＩＡＰ II突然変異誘発
ｂＩＡＰ IIをコードするｃＤＮＡを調製するために、野生型制限断片ならびにｃＤＮＡｂＩＡＰＩ、IIIおよびIVの部位特異的突然変異誘発ＰＣＲ断片を互いにライゲートして、Ｌ１Ｎ８（３断片）およびＩＮＴ１（９断片）ｃＤＮＡ中間構築物を作製した。次いで、ＩＮＴ１およびｂＩＡＰ IIIを部位特異的突然変異誘発用の鋳型として使用し、これにより得られた断片を組み立てて完全ＩＮＴ２（８断片）ｃＤＮＡを形成させた。次に、ＩＮＴ２の制限断片およびＩＮＴ２の部位特異的突然変異誘発断片を組み立ててＩＮＴ３（５断片）ｃＤＮＡを形成させ、最後にｂＩＡＰ II（４断片）ｃＤＮＡを形成させた。部位特異的突然変異誘発は、Tomicら(1990)の方法にしたがって、その認識配列（GGTCTCN1/N5）からの距離で切断する制限酵素としてBsa I（II型）を用いて行った。二次的な突然変異が無いことを確認するために、ＰＣＲ産物全てを配列決定した。全ての構築物を配列決定および制限消化によって確認した。部位特異的突然変異誘発断片の増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーの配列は下記のとおりである。プライマーの名称を最初に記載し、その後に配列を記載する（突然変異を示す位置に下線を引く）。
【００２５】
0004295386.tif 000003
【００２６】
種々のＰＣＲ反応を１〜１６と番号付けし、鋳型は、野生型ｃＤＮＡｂＩＡＰＩ、IIIもしくはIVまたはキメラ構築物ＩＮＴ１もしくはＩＮＴ２のいずれかである。オリゴヌクレオチドプライマー（括弧内）は上記で述べられている。１．ｂＩＡＰ IV（KS、1L）；２．ｂＩＡＰ IV（8N、122）；３．ｂＩＡＰ III（1S、M133I）；４．ｂＩＡＰＩ（S142A、180）；５．ｂＩＡＰＩ（M180K、K205M）；６．ｂＩＡＰＩ（V210E、A236E）；７．ｂＩＡＰＩ（236、289）；８．ｂＩＡＰ IV（E289A、330）；９．ｂＩＡＰ III（330E、V332I、XIa）；１０．ＩＮＴ１（N192Y、S380G）；１１．ＩＮＴ１（N192Y、D411G）；１２．ｂＩＡＰ III（D416E、S428A）；１３．ＩＮＴ１（D416E、T480S）；１４．ＩＮＴ１（480、SP6）；１５．ＩＮＴ２（236、Q304R-）；１６．ＩＮＴ２（Q304R+、E321D）。下記のライゲーション反応を、全ての場合においてpcDNA-3（Invitrogen、サンディエゴ、CA）発現ベクターを用いて行った。断片を、上記のＰＣＲ反応番号にしたがって番号付けし、または野生型もしくはキメラｃＤＮＡの名称を付けて、その後制限酵素を用いてこの断片の付着末端を形成させた。Ｌ１Ｎ８＝pcDNA-3／EcoRI-XbaI＋１／EcoRI-BsaI＋２／BsaI-BamHI＋ｂＩＡＰ I／BamHI-XbaI。ＩＮＴ１＝pcDNA-3／EcoRI-XbaI＋Ｌ１Ｎ８／EcoRI-NcoI＋３／NcoI-BsaI＋４／BsaI+５／BsaI＋６／BsaI＋７／BsaI＋８／BsaI＋９／BsaI-StuI＋ｂＩＡＰＩ／StuI-XbaI。ＩＮＴ２＝pcDNA-3／EcoRI-NotI＋ＩＮＴ１／EcoRI-PstI＋10／PstI-StuI＋11／StuI-BsaI＋12／BsaI＋13／BsaI＋14／BsaI＋ｂＩＡＰＩ／BsaI-NotI。ＩＮＴ３＝pcDNA-3／EcoRI-XbaI＋ＩＮＴ２／EcoRI-NcoI＋ＩＮＴ２／NcoI-PvuII＋10／PvuII-EagI＋ＩＮＴ２／EagI-HindIII＋ＩＮＴ２／HindIII-XbaI。ｂＩＡＰ II＝pcDNA-3／EcoRI-XbaI＋ＩＮＴ３／EcoRI-EagI＋15／EagI-SmaI＋16／SmaI-HindIII＋ＩＮＴ３／HindIII-XbaI。
【００２７】
10個のさらなる構築物をｂＩＡＰＩおよびIIの種々の動力学的特性の原因である残基を同定するために調製した。全構築物をpcDNA-3／EcoRI-XbaIにサブクローニングした。５個の構築物をＬ１Ｎ８またはｂＩＡＰＩ（Ｉ）およびｂＩＡＰ II（II）間の制限断片の交換によって調製した。Ｌ１Ｎ８ EcoRI-Pm1Iおよび（II）Pm1I-XbaIを[N122K]ｂＩＡＰ II突然変異ｃＤＮＡを調製するためにライゲートした。（II）EcoRI-BstEII、（Ｉ）BstEII-PvuII、（II）PvuII XbaIを[K180M]ｂＩＡＰ II突然変異ｃＤＮＡに対して結合した。（II）EcoRI-EagI、（Ｉ）EagI-BstEII、（II）BstEII-XbaIを[A289Q、A294V、Q297R、L299V]ｂＩＡＰ II突然変異体に対してライゲートした。（II）EcoRI-EagI、（II）EagI-BstEII、（Ｉ）BstEII-HindIII、（II）HindIII-XbaIを[G322D]ｂＩＡＰ II突然変異体に対してライゲートした。（II）EcoRI-HindIII、（Ｉ）HindIII-SacI、（II）SacI-XbaIを［I332G]ｂＩＡＰ II突然変異体に対してライゲートした。５個のその他の位置は新たな部位特異的突然変異誘発が必要であった。下記のオリゴヌクレオチドをこれに用いた：
【００２８】
0004295386.tif 000004
【００２９】
鋳型としてｂＩＡＰ IIを用いる下記の８個のＰＣＲ反応（ａ〜ｈ）を、これらのオリゴヌクレオチドおよび前に挙げたオリゴヌクレオチドを用いて行った：ａ．1s，I133M-；ｂ．S142A+，M205K-；ｃ．1s，A142S-；ｄ．V210E+，330-；ｅ．E210V+，330-；ｆ．M180K+，E236A-；ｇ．236+，330-；ｈ．S142A，K205M-。これから形成された産物をサブクローニングし、配列決定し、次いで断片を下記のライゲーションのために単離した：I133Mに対して（II）EcoRI-NcoI、（ａ）NcoI-BsaI、（ｂ）BsaI、PvuII、（II）PvuII-XbaI。A142Sに対して（II）EcoRI-NcoI、（ｃ）NcoI-BstEII、（II）BstEII-PvuII、（II）PvuII-XbaI。M205Kに対して（II）EcoRI-BstEII、（ｂ）BstEII-BsaI、（ｄ）BsaI-HindIII、（II）HindIII-XbaI。E210Vに対して（II）EcoRI-BstEII、（ｈ）BstEII-BsaI、（ｅ）BsaI-HindIII、（II）HindIII-XbaI。E236Aに対して（II）EcoRI-NcoI、（II）NcoI-PvuII、（ｆ）PvuII-BsaI、（ｇ）BsaI-HindIII、（II）HindIII-XbaI。
実施例４：組換え酵素の産生および特性付け
全ｃＤＮＡ（ｂＩＡＰＩ、ｂＩＡＰ II、ｂＩＡＰ III、ｂＩＡＰ IVおよび対応する突然変異体）を、pcDNA-3発現ベクター（Invitrogen、サンディエゴ、CA、USA）にクローニングし、チャイニーズハムスターの卵細胞（ＣＨＯ細胞）に移入し、安定なトランスフェクタントを500μｇ／mlのジェネティシン（Gibco、BRL）の存在下で細胞を増殖させることによって選択した。組換えＡＰを、安定に移入されたＣＨＯ細胞から記載されたようにして抽出した（Hoylaertsら, 1997）。0.1μg/mlの高親和性抗子ウシＡＰモノクローナル抗体（Scottish Antibody Production Unit、Lanarkshire、スコットランド）で被覆したマイクロタイタープレートを、ｋcat を測定するために酵素濃度を高めながらインキュベートした。結合酵素の活性を、基質としての30mMのp-ニトロフェニルホスフェートを含む1.0Ｍジエタノールアミン緩衝液（pH9.8）、１mM MgCl2、および20μＭ ZnCl2を添加した後の、405nm、20℃における経時的な吸光度の変化として測定した。生成したp-ニトロフェノールの濃度を、吸光係数 10,080リットル／モル／cmを用いて計算した。比活性既知の市販の調製物（Biozyme Laboratories、7822U/mgおよびBoehringer Mannheim、3073U/mg）ならびに精製ｂＩＡＰ II（8600U/mg）を標準として用いた。抗体を飽和させたこれらの溶液の酵素濃度（Ｅ0 ）を、同一試験条件下での既知の酵素濃度に対する活性の標準曲線から計算した。次いで、最大基質転化（Ｖmax ）をＥ0 で割ってｋcat を計算した。Ｋm を計算するために、基質濃度を0.25〜2.0mMのp-ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）間で変化させ、20℃における初期反応速度を10分間以上測定した。［ｐＮＰＰ］／ｖ対Ｘ軸としての［ｐＮＰＰ］の回帰曲線（Hanes曲線）により−Ｋm が得られた。回帰において各ｘ値に対して計算したｙ値の標準偏差の、Ｋm ・Ｖmax ±標準偏差の標準偏差を得た回帰の勾配による割り算は、Ｋm ±標準偏差をｙ切片±標準偏差で割ることによって適当な方程式を用いて計算した。比活性を、抗体飽和活性に基づいて、Biozymeに対して計算した。熱安定性曲線を、前に記載されたように（Weissigら, 1993）、10分毎に５℃ずつ上昇させながら45〜75℃で抽出物をインキュベーションすることによって確立した。次いで、各試料の活性を上記のようにして測定し、残留活性を、非加熱試料に対する残留割合として計算した。50％残留活性が残る温度（Ｔ50）を、温度曲線に対する残留活性から計算した。
【００３０】
【配列表】
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【００３１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号7：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号８：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号９：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１０：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１１：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１２：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１３：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１４：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１５：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１６：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１7：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１８：bIAP IIIおよびIVを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチド
配列番号１９：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４５：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４６：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４７：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４：部位特異的突然変異断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】  (A)配列番号１：ｂＩＡＰ IIのヌクレオチド配列（1798bp）。108位が成熟ｂＩＡＰ IIのコード領域の開始位置。1649位が末端。
(B)配列番号１：ｂＩＡＰ IIのヌクレオチド配列（1798bp）。108位が成熟ｂＩＡＰ IIのコード領域の開始位置。1649位が末端。
【図２】配列番号２：切断部位を有するｂＩＡＰ IIのアミノ酸配列（480アミノ酸）。
【図３】  (A)配列番号３：ｂＩＡＰ IIIのヌクレオチド配列（2460bp）。123位が成熟ｂＩＡＰ IIIのコード領域の開始位置。1655位が末端。
(B)配列番号３：ｂＩＡＰ IIIのヌクレオチド配列（2460bp）。123位が成熟ｂＩＡＰ IIIのコード領域の開始位置。1655位が末端。
【図４】配列番号４：ｂＩＡＰ IIIのアミノ酸配列（511アミノ酸）。
【図５】  (A)配列番号５：ｂＩＡＰ IVのヌクレオチド配列（2542bp）。122位が成熟ｂＩＡＰ IVのコード領域の開始位置。1654位が末端。
(B)配列番号５：ｂＩＡＰ IVのヌクレオチド配列（2542bp）。122位が成熟ｂＩＡＰ IVのコード領域の開始位置。1654位が末端。
【図６】配列番号６：ｂＩＡＰ IVのアミノ酸配列（511アミノ酸）。
【図７】ｂＩＡＰＩ、ｂＩＡＰ II、ｂＩＡＰ IIIおよびｂＩＡＰ IVイソ酵素間のアミノ酸の相違。異なる残基のみを示す。アステリスクは、ｂＩＡＰ IIの触媒活性の増大の原因である残基を同定するために個々の突然変異誘発に対して選択された位置を特定するものである。
【図８】  (A)ｂＩＡＰ II ＤＮＡのライゲーション戦略。
(B)ｂＩＡＰ II ＤＮＡのライゲーション戦略。
【図９】組換え野生型およびキメラｂＩＡＰ酵素、ならびに部位特異的突然変異誘発によって変化させた該ｂＩＡＰ酵素の突然変異体の動力学的パラメーターおよび熱安定性。*［ＱＶＲＶ］ｂＩＡＰ IIは［Ｑ289、Ｖ294、Ｒ297、Ｖ299］ｂＩＡＰ II突然変異体の略語である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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