(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は生物学的に活性な分子を哺乳動物に移植するための組成物であって：
（a）非凝集細胞及び／又は生物学的に活性な分子；
（b）（i）共有結合的に架橋可能な第一のポリマー；及び（ii）共有結合的に架橋可能な第二のポリマー；を含む注射可能なポリマー溶液；並びに
（c）光開始剤；
を含み、
前記光開始剤が、電磁線に暴露した際に、（i）及び（ii）が自身とは架橋するが、互いには架橋せずに相互侵入網目構造を形成するように架橋を開始する、前記組成物。
【請求項２】
細胞又は生物学的に活性な分子を哺乳動物に移植するための組成物であって：
（a）非凝集細胞及び／又は生物学的に活性な分子；
（b）（i）電磁線に暴露した時に共有結合的に架橋して多孔質網目構造を形成する第一のポリマー；及び（ii）電磁線に暴露した時に架橋せず、第一のポリマーの多孔質網目構造内に取り込まれる第二のポリマー；を含む注射可能なポリマー溶液；並びに
（c）光開始剤；
を含み、
前記光開始剤が、電磁線に暴露した際に、（i）及び（ii）がセミ相互侵入網目構造を形成するように架橋を開始する、前記組成物。
【請求項３】
線源から発生し、組織を通過する電磁線に暴露することで架橋が起こる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
生物学的に活性な分子が、蛋白質、多糖類、核酸分子、合成有機又は無機分子、抗生物質、抗ウイルス薬、化学療法剤、抗血管形成剤、ホルモン、血管作動薬、抗炎症薬、血管新生因子、成長因子、及び細胞分化誘導化合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
架橋が、X線、超音波、赤外線、遠赤外線、紫外線、長波長紫外線、又は可視光によって引き起こされる、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
光開始剤が、エリスロシン、フロキシム、ローズベンガル、トニン、カンファーキノン、エチルエオシン、エオシン、メチレンブルー、リボフラビン、2,2-ジメチル-2-フェニルアセトフェノン、2-メトキシ-2-フェニルアセトフェノン、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン、及び他のアセトフェノン誘導体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
共触媒をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
共触媒が、N-メチルジエタノールアミン、N,N-ジメチルベンジルアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、N-ベンジルエタノールアミン、及びN-イソプロピルベンジルアミンからなる群から選択される請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
共有結合を形成することができる少なくとも１種のポリマー又は複数種のポリマーが、エチレン性不飽和基、不飽和モノカルボン酸、アリル基、不飽和ジカルボン酸、及び不飽和トリカルボン酸からなる群から選択される少なくとも１つのフリーラジカル架橋可能な基を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１０】
共有結合を形成することができる少なくとも１種のポリマー又は複数種のポリマーが、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、ジメタクリレート、及びオリゴメタクリレートからなる群から選択される少なくとも１つのフリーラジカル架橋可能な基を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１１】
架橋可能なポリマーが10重量％〜90重量％を占める、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
ポリマーが生分解性である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞が、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、島細胞、腸起源の細胞、及び幹細胞からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１４】
細胞が間葉系幹細胞である、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞が遺伝子操作された細胞である、請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
アメリカ合衆国政府は、Robert S．Langer氏に対する承認番号AR08387 NIH研究奨励金第23464号により、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、1997年4月11日出願の米国出願第  号であり、速達ラベル番号第EM290166797US号の優先権を主張する。
本発明は、一般に、医療処置、特に関節表面再生（joint resurfacing）及び形成外科及び薬物送達における、重合性セミ相互侵入及び相互侵入ポリマー網目構造組成物及び光架橋性重合性ヒドロゲルの使用の分野に関する。
先天性欠陥
多くの先天性欠陥、特に尿生殖器の領域における欠陥は、外科的矯正を必要とする。例として、逆流（reflux）及び尿失禁（urinary incontinence）治療が挙げられる。Massachusetts Institute of Technologyによる国際公開第WO94/25080号には、単離された細胞の注射による送達のための注射可能な多糖類−細胞組成物の使用が記載されており、そしてそれは、増容試薬（bulking agent）として有効な新しい組織を形成する。記載されているポリマーは、イオン強度、温度、ｐH、又はこれらの組み合わせの機能に従って、イオン的に架橋する。Reprogenesisによる国際公開第WO96/40304号は、共有結合（covalent crosslinking）によって形成される重合性ヒドロゲルの同様の適用が記載されており、例えば、カテーテルを用いて又は外科手術の間に、注射されたポリマー−細胞懸濁液の光重合による共有結合である。
脳顔面頭蓋輪郭変形（deformities）
外傷性、先天性、又は審美的のいずれであろうと、脳顔面頭蓋輪郭変形は、矯正のために侵入的な（invasive）外科的技術を一般に必要とする。さらに、増強を必要とする変形は、感染及び突き出し（extrusion）の問題があるアロプラストの（alloplastic）人工補装具（prostheses）の使用をしばしば必要とする。これらの欠陥及び不ぞろい（irregularities）の矯正は、困難であり、且つ議論の余地のある問題を残す。Simsらは、Plastic Reconstructive Surgery98:845（1996）中で、注射されたポリエチレンオキシド細胞懸濁液からの新しい軟骨の形成を報告し、この技術が形成外科において有用であることを示唆した。
軟骨表面の置換又は修復
高齢者（aging population）、特に関節にストレスを与えるスポーツ及び仕事に積極的な高齢者は、軟骨の修復又は置換のためのこの時に殆ど頼るものがない。関節鏡手術（Arthroscopic surgery）は、剥離した軟骨の除去に用いることはできるが、軟骨の殆ど残されていない関節の修復又は置換のためには、かなり侵入的且つ痛みを伴う手術が必要である。殆どの場合、関節全体を置換するために、補てつデバイスを使用しなければならず、これを使用する前には、隣接する関節表面の自由な動きを正常に行わせる、滑らかな軟骨表面を破壊しなければならない。Vacantiらに対する米国特許第5,514,378号に記載されているように、軟骨細胞が播かれた合成重合体製のメッシュ（mesh）を用いて新しい関節表面を作り出すことが提案されており、そしてそれは、ポリマーが分解するに従って新しい軟骨を形成する。これは期待できそうであるが、この軟骨細胞が播かれたメッシュはやはり外科的に移植されなければならない。
単離された細胞を注射によって送達するための生体適合性且つ生分解性の、改良された注射可能なポリマー−細胞組成物が必要である。さらに、注射に続いてポリマー−細胞懸濁液を共有結合的に架橋する、より侵入的でない手段が必要である。
従って、本発明の目的は、合成ポリマーの相互侵入網目構造に基づく、細胞組織及び軟骨構造体を形成する細胞の注射のための方法及び組成物を提供することである。
本発明の目的は、さらに、自然に生成された組織又は軟骨と組織学的及び化学的に同じである、分解除去されて組織又は軟骨を残す、非細胞性物質（material）を含む細胞組織及び軟骨構造体を形成するための、改善された組成物を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、注射に続く新しい組織の形成のための、ポリマー−細胞懸濁液を共有結合させる組成物及び方法を提供することである。
発明の概要
組織工学及び薬物送達用の組成物は、それを必要とする患者の部位への注射に続く活性種（active species）への暴露時に、セミ相互侵入又は相互侵入ポリマー網目構造を形成する、2種以上のポリマーの溶液に基づいて開発されている。複数種のポリマーは同種の間で架橋するが、互いには架橋せず、セミ相互侵入網目構造は、ポリマーのうちの1種のみが架橋するときに形成される。得られる粘性の溶液は、それぞれ放出又は組織形成が起きるまで、注射部位において生物学的に活性な分子又は細胞を保持する。
ポリマー−細胞懸濁液に相互侵入ポリマー網目構造を形成させる研究の結果として、ポリマー溶液は、活性種、典型的には電磁線、好ましくは光、の外因源にポリマー溶液を暴露することによって活性種が提供され、製剤化できることがわかっている。研究により、光は皮膚、体液（骨髄液など）及び膜を通して侵入し、ポリマー溶液を重合させることが実証されている。ポリマー溶液は、イオン的又は共有結合的に架橋され、ヒドロゲル、セミ相互侵入ポリマー網目構造又は相互侵入ポリマー網目構造を形成し得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、光活性開始剤及び紫外光による、重合速度（Ａ）、及び重合性溶液のポリマーマトリックスへの変換（％）（Ｂ）を経時的に示したグラフである。
図2は、ラット皮膚の、皮下（Ａ）、皮下及び脂肪（Ｂ）、並びに皮下及び脂肪及び筋（Ｃ）の各層の下における、これらの層を通じての光の浸透に基づく重合性溶液の光重合の計算された速度（時間を分で表わす）を示したグラフである。
図3は、分子量1000及び3400のポリマーについての、ポリマーの平衡膨潤容積（equilibrium swelling volume）へのコハク酸（SAD）濃度の影響を示したグラフである。
図4は、ポリマーからの血清アルブミン（％）の放出へのコハク酸濃度（17％、43％、51％、及び0％SAD）の影響を、時間（日）に対して示したグラフである。
図5は、ポリマーからのローダミン放出へのコハク酸濃度（19％及び21％SAD）の影響（日で表わされた時間に対する％）を示したグラフである。
発明の詳細な説明
生体適合性ポリマースカホールド（scaffolds）を使用する組織工学技術は、置換された、病気の、奇形の、又は損傷した組織と同等な器官の形成法（formation）としてだけでなく、形成外科及び関節修復又は置換で一般的に用いられる補てつ材の代替物の創造手段として期待されている。
相互侵入網目構造（「IPN」）は、2種の成分が架橋するが、互いには架橋しない網目構造として定義される。本明細書中で記載するように、1つの実施形態においては、合成及び／又は天然ポリマーのセミ相互侵入網目構造は、注射されるべき細胞のポリマー支持体として用いられる。セミ相互侵入網目構造は、2種の独立した成分を含む溶液として定義され、ここで、一方の成分は架橋ポリマーであり、他方の成分は非架橋ポリマーである。架橋ポリマーは、好ましくはセミ相互侵入網目構造組成物の約10〜90重量％を占める。
セミ相互侵入ポリマー網目構造は、好ましくは親水性ポリマーから調製される。1つの実施形態においては、ポリマー網目構造は、活性種によって架橋し得る基及び／又はイオン的架橋性基を有する親水性ポリマー、並びに活性種又はイオン的架橋性基を持たない親水性ポリマーを含む。
第2の実施形態においては、細胞は、活性種生成、好ましくは光活性化によって架橋され得るポリマー溶液中に懸濁されている。該懸濁液は、新しい組織が形成されるべき部位に注射される。そして光が外部から皮膚に当てられ、注射されたポリマーが架橋する。この方法は、ポリマーと光開始剤との組み合わせ（細胞に対して毒性がない、開始剤の0.1重量％未満、より好ましくは0.05〜0.01重量％で）は、1〜3mWatts/cm2の光をヌードマウスの皮膚に当てたのと同等な光への暴露によって架橋するという発見に基づいている。本明細書中では主に皮膚の外部の光源の適用に関して考察しているけれども、これは、組織を通して適用される光、例えば、ポリマー−細胞懸濁液が注射された組織に隣接する血管中のカテーテルからの光、又は注射されたポリマー−細胞懸濁液によって修復又は置換される軟骨表面に隣接する骨髄空間中の光に同等に適用できるものと解釈すべきである。
ポリマー組成物
ポリマー組成物は、国際公開第WO96/40304号に記載されているように、共有結合的架橋性ポリマーのみからなることができ、有効であるが毒性のない量の光開始剤との組み合わせで、外部源によって与えられる照射を用いて架橋を行わせるか、又は照射に暴露されたときに、その中に懸濁されている細胞を有するセミ相互侵入網目構造を形成する、共有結合的及びイオン的架橋性ポリマー又は親水性ポリマーのブレンドである。
イオン的架橋性親水性ポリマー
本明細書中で用いるように、「親水性ポリマー」は、約0〜50℃の温度で、少なくとも水性溶液中10g/リットルの溶解性を有するポリマー類として定義される。水性溶液は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アルコール類、アセトン、及び／又はグリムス（glymes）などの少量の水溶性有機溶媒を含むことができる。
好適な親水性ポリマー類としては、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、部分的又は完全に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマー類（poloxamers）及びメロキサポール類（meroxapols））、ポロキサミン類（poroxamines）、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロース及びメチルヒドロキシプロピルセルロースなどのヒドロキシアルキル化セルロース類などの合成ポリマー類、並びにポリペプチド類、多糖類又はFicoll（登録商標）ポリシュークロース、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン又はアルギン酸塩などの炭水化物類、及びゼラチン、コラーゲン、アルブミン、若しくはオボアルブミンなどのタンパク質類又はコポリマー類、又はそれらのブレンドなどの天然ポリマー類が挙げられる。本明細書中で用いられるように、「セルロース類」は、セルロース及び上記タイプの誘導体を含み；「デキストラン」は、デキストラン及び同様の誘導体を含む。
ヒドロゲルを形成するのに用いることができる物質（material）の例としては、修飾されたアルギン酸塩類が挙げられる。アルギン酸塩は、海草から単離された炭水化物ポリマーであり、例えば国際公開第WO94／25080号（その開示は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されているような、カルシウムなどの2価の陽イオンへの暴露によって架橋されて、ヒドロゲルを形成できる。アルギン酸塩は、水中、室温で、2価の陽イオンの存在下にイオン的に架橋され、ヒドロゲルマトリックスを形成する。ヒドロゲルを形成する改善された能力を有する、修飾されたアルギン酸塩誘導体を合成することもできる。出発物質としてのアルギン酸塩の利用は、1つ以上の供給源から入手可能であり、そして良好な純度及び特性で入手可能なので、有利である。本明細書中で用いるように、用語「修飾されたアルギン酸塩」とは、修飾されたヒドロゲル特性を有する化学的に修飾されたアルギン酸塩をいう。天然に存在するアルギン酸塩を化学的に修飾し、より速く分解するアルギン酸塩ポリマー誘導体を製造できる。例えば、アルギン酸塩は、化学的に開裂されて、ゲル化し得るオリゴ糖類ブロック（blocks）のより小さいブロックを製造することができ、線状コポリマーをもう１つのあらかじめ選択された部分、例えば、乳酸又はε−カプロラクトン、によって形成することもできる。得られるポリマーは、イオン的に触媒されたゲル化を可能とするアルギン酸塩ブロック、及び合成デザインに依存して、より迅速な分解を起こすオリゴエステルブロックを含む。あるいは、アルギン酸塩ポリマーは、グルロン酸（guluronic acid）に対するマンヌロン酸（mannuronic acid）の割合が、堅いゲルを与えず、そしてそれは疎水性の水−不安定性鎖、例えば、ε−カプロラクトンのオリゴマーによって誘導される場合に使用できる。疎水性相互作用は、それらが生体中で分解するまでゲル化を起こさせる。
さらに、ゲランガム（gellan gum）などの細菌性多糖類、カラゲナン（carrageenants）などの植物多糖類を含む、1価の陽イオンへの暴露によってゲル化する多糖類は、上記アルギン酸塩の架橋に利用し得る方法に類似の方法を用いて架橋して、ヒドロゲルを形成できる。1価の陽イオンの存在下にゲル化する多糖類は、例えば、生理学的濃度のナトリウムを含む溶液への暴露によってヒドロゲルを形成する。ヒドロゲル前駆体溶液はまた、マンニトールなどの非イオン（nonion）によって浸透圧的に調整され、そして注射されてゲルを形成できる。
非常に粘性の液体又は揺変性（thixotropic）であり、時間に対して（over time）遅い構造展開（evolution of structure）によってゲルを形成する多糖類も有用である。例えば、ヘアーゲル様の固さ（consistency）を有する注射可能なゲルを形成する、ヒアルロン酸が利用できる。修飾されたヒアルロン酸誘導体は、特に有用である。本明細書中で用いるように、用語「ヒアルロン酸」とは、天然及び化学的に修飾されたヒアルロン酸類をいう。修飾されたヒアルロン酸は、予め選択された化学的修飾によってデザインされ、合成されて、架橋及び生分解の速度及び程度を調整することができる。例えば、プロピオン酸又はベンジル酸（benzylic acid）などの比較的疎水性の基によってエステル化され、ポリマーをより疎水性にし、ゲル形成させるか、又はアミン類によってグラフト化されて、静電気的自己積層（electrostatic self-assembly）を促進する、修飾されたヒアルロン酸をデザインし、合成できる。このように、注射可能であり、ストレス下で流動するが、無ストレス下ではゲル様構造を保持する、修飾されたヒアルロン酸を合成できる。ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体は、Genzyme，Cambridge，MA及びFidia，Italyから入手可能である。
他の重合性ヒドロゲル前駆体としては、Steinleitnerら、Obstetrics & Gynecology，77:48-52（1991）；及びSteinleitnerら、Fertility and Sterility，57:305-308（1992）中に記載されているように、水素結合及び／又は温度変化によって架橋される、PluronicsTM又はTetronicsTMなどのポリエチレンオキシドポリプロピレングリコールブロックコポリマー類が挙げられる。利用できる他の物質としては、フィブリン、コラーゲン及びゼラチンなどのタンパク質が挙げられる。また、ポリマー混合物（mixtures）を利用できる。例えば、混合したときに水素結合によってゲル化する、ポリエチレンオキシド及びポリアクリル酸からなる混合物を利用できる。１つの実施形態においては、ポリアクリル酸の5％（重量／重量）溶液とポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、分子量100,000）の5％（重量／重量）混合物は、組み合わせることができ、時間経過に従ってゲルを形成し、例えば2、3秒内という速さでゲルを成形できる。
荷電側鎖基（charged side group）を有する水溶性ポリマーは、反対の電荷のイオン、そのポリマーが酸性側鎖基を有するならば陽イオン、又はそのポリマーが塩基性側鎖基を有するならば陰イオンのいずれか、を含む水性溶液とそのポリマーとを反応させることによって架橋され得る。ポリマーと酸性側鎖基とを架橋し、ヒドロゲルを形成するための陽イオンの例は、ナトリウムなどの1価の陽イオン、カルシウムなどの2価の陽イオン、及び銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム及び錫などの多価陽イオン、並びにアルキルアンモニウム塩などのジ−、トリ−又はテトラ−官能性有機陽イオンである。これらの陽イオンの塩の水性溶液は、ポリマーに加えられて、柔軟で非常に膨潤したヒドロゲル及び膜を形成する。陽イオンの濃度が高ければ高いほど、又は価数が高ければ高いほど、ポリマーの架橋度は大きくなる。さらに、ポリマーは、酵素的に、例えば、フィブリンとトロンビンのように、架橋され得る。
好適なイオン的架橋性基としては、フェノール、アミン、イミン、アミド、カルボン酸、スルホン酸及びリン酸基が挙げられる。脂肪族水酸基は、本明細書中で開示されている化学のための反応性基であるとは考えられない。カルボン酸塩、スルホン酸塩及びリン酸塩イオンなどの、マイナス荷電基は、カルシウムイオンなどの陽イオンによって架橋できる。カルシウムイオンによるアルギン酸塩の架橋は、このタイプのイオン的架橋の例である。アンモニウムイオンなどの、プラス荷電基は、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン及びリン酸イオンなどのマイナス荷電イオンによって架橋できる。好ましくは、マイナス荷電イオンが、1個より多いカルボン酸基、スルホン基またはリン酸基を含む。
修飾されたアルギン酸塩及び展性のヒドロゲルを形成できる他の陰イオン性ポリマーが、細胞をカプセル化するのに使用される１つの実施形態においては、ヒドロゲルは、ポリマーを適当な陽イオンによって架橋することで製造され、ヒドロゲル結合の強度は、陽イオンの濃度を増大するか又はポリマーの濃度を増大するかのいずれかによって増大する。0.001Mほどの低い濃度でも、アルギン酸塩の架橋が示された。より高い濃度は、その塩の毒性によって制限される。
ポリマーを架橋してヒドロゲルを形成するために好ましい陰イオンは、低分子量のジカルボン酸、例えば、テレフタル酸、硫酸イオン及び炭酸イオン、などの1価、2価又は3価の陰イオンである。これらの陰イオンの塩の水性溶液は、ポリマーに加えられ、陽イオンに関して記載したように、柔軟で非常に膨潤したヒドロゲル及び膜を形成する。
多様なポリ陽イオン（polycations）は、ポリマーヒドロゲルを半透性表面膜中に複合体化し（complex）、それによって安定化させるのに使用できる。使用できる物質（material）の例としては、アミン基又はイミン基などの塩基性反応基を有し、ポリエチレンイミン及びポリリジンなどの、3,000〜100,000の間の好ましい分子量を有するポリマーが挙げられる。これらは商業的に入手可能である。1つのポリ陽イオンがポリ（L−リジン）であり；合成ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、及びポリ（アリルアミン）である。多糖類、キトサンなどの天然のポリ陽イオンもある。
ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基との反応によって半透性膜を形成するのに使用できるポリ陰イオンとしては、アクリル酸、メタクリル酸、及びアクリル酸の他の誘導体のポリマー及びコポリマー、スルホン化ポリスチレンなどのペンダント（pendant）SO3H基を有するポリマー、並びにカルボン酸塩基を有するポリスチレンが挙げられる。これらのポリマーは、活性種である重合性基及び／又はイオン的架橋性基を含むように修飾できる。これらの基を含むように親水性ポリマーを修飾する方法は、当業者に周知である。
ポリマーは、本質的に生分解性であり得るが、（溶解の予測のために）好ましくは低生分解性であり、排出されるのに十分な低分子量のものである。ヒト（又はその利用が意図される他の種）において排出され得る最大分子量は、ポリマーのタイプによって変化するであろうが、多くは約20,000ダルトン以下であろう。使用可能であるが、本質的な生分解性故に一般の使用に好ましくないものは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び分解性多糖類などの、水溶性の天然ポリマー及び合成のその同等物又は誘導体である。
ポリマーは、少なくとも600、好ましくは2000以上、より好ましくは少なくとも3000の分子量を有する単一ブロックであり得る。あるいは、ポリマーは、他の基によって結合される2個以上の水溶性ブロックであり得るものを含むことができる。そのような結合基は、生分解性結合（linkages）、重合性結合又はその両者を含むことができる。例えば、マレイン酸、フマル酸又はアコニチン酸などの、不飽和ジカルボン酸は、ポリエチレングリコールなどの、水酸基を含む親水性ポリマーによってエステル化され得るか、又はポロキサミンなどの、アミン基を含む親水性ポリマーによってアミド化され得る。
共有結合的架橋性ポリマー溶液
共有結合的架橋性ヒドロゲル前駆体も有用である。例えば、キトサンなどの、水溶性ポリアミンは、ポリエチレングリコールジイソチオシアネートなどの水溶性ジイソチオシアネートによって架橋され得る。イソチオシアネートは、アミンと反応して、化学的に架橋されたゲルを形成するであろう。アミンによる、例えば、ポリエチレングリコールジアルデヒドによるアルデヒド反応も利用できる。水酸化された水溶性ポリマーも利用できる。
あるいは、ラジカル開始剤の接触によってラジカル反応によって架橋される置換基を含むポリマーも利用できる。例えば、光化学的に架橋され得るエチレン性（ethylenically）不飽和基を含むポリマーは、その開示は参照によって本明細書中に組み入れられる、国際公開第WO93／17669号に開示されているように、利用できる。この実施態様においては、少なくとも1つの水溶性領域、生分解性領域、及び少なくとも2つのフリーラジカル−重合性領域を含む水溶性マクロマー（macromers）が提供される。マクロマーは、その重合性領域の、例えば、感光性化学薬品及び／又は光によって発生したフリーラジカルへの暴露によって重合される。これらのマクロマーの例は、アクリレート基は、エオシン染料などのラジカル開始系を用いて、又は紫外光若しくは可視光にわずかに暴露することによって重合される、PEG−オリゴラクチル−アクリレートである。さらに、光化学的に架橋され得るシンナモイル基を含む水溶性ポリマーも、Matsudaら、ASAID Trans.，38:154-157（1992）に開示されているように、利用できる。
用語「活性種重合性基」は、活性種への暴露によってポリマー連結の結果として、追加的な共有結合を形成する能力を有する反応性官能基として定義される。活性種は、フリーラジカル、陽イオン及び陰イオンを含む。好適なフリーラジカル重合性基は、ビニルエステル、アリル基、不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸及び不飽和トリカルボン酸などのエチレン性不飽和基（すなわち、ビニル基）を含む。不飽和モノカルボン酸は、アクリル酸、メタクリル酸及びクロトン酸を含む。不飽和ジカルボン酸は、マレイン酸、フマール酸、イタコン酸、メサコン酸又はシトラコン酸を含む。1つの実施態様においては、活性種重合基は、好ましくは親水性ポリマーの1個以上の末端に位置する。もう1つの実施態様においては、活性種重合基は、個々のブロックを形成する1種以上の親水性ポリマーを有するブロックコポリマー内に位置する。好ましい重合基は、アクリレート基、ジアクリレート基、オリゴアクリレート基、ジメチタクリレート基、オリゴメタクリレート基、及び他の生物学的に受容可能な光重合性基である。アクリレートが最も好ましい活性種重合基である。
一般に、ポリマーは、少なくとも部分的に、水、緩衝された塩溶液又は水性アルコール溶液などの、水性溶液に溶解されている。上記他のポリマーの合成方法は、当業者に公知である。例えば、Concise Encyclopedia of Polymer Science及びPolymeric Amines and Ammonium Salts，E．Goethals編（Pergamen Press，Elmsford，NY 1980）を参照。ポリ（アクリル酸）などの、多くのポリマーは、商業的に入手可能である。天然に存在するポリマー及び合成ポリマーは、当業界で利用可能な、そして、例えば、3月、「Advanced Organic Chemistry」第4版、1992、Wiley-Interscience Publication，New Yorkに記載されている化学反応を用いて修飾され得る。
好ましくは、活性種又は架橋性基を含む親水性ポリマーは、平均で少なくとも1.02個の重合性基又は架橋性基を含み、より好ましくは、それぞれ平均で2個以上の重合性基又は架橋性基を含む。各重合性基が鎖中に重合されるであろうから、架橋ヒドロゲルは、ポリマーに対して1個よりわずかに多い反応基（すなわち、平均で約1.02個の重合性基）を用いて製造され得る。しかしながら、より高いパーセンテージが好ましく、優れたゲルは、殆どの又は全ての分子が2個以上の反応性二重結合を有するポリマー混合物中で得られる。親水性ポリマーの例である、ポロキサミンは、4個の腕を有し、それゆえ4個の重合基を含むように容易に修飾できる。
光開始剤
重合は、好ましくは光開始剤を用いて開始される。UV光への暴露によって活性種を発生させる光開始剤は、当業者に周知である。活性種は、ある染料及び化学化合物の光子吸収による比較的マイルドな方法でも形成され得る。
これらの基は、UV光への暴露によって、好ましくは長波長紫外光（LWUV）又は可視光を用いて、活性種を発生させる光開始剤を用いて重合できる。UV光よりも組織及び他の生物学的物質にダメージを起こすことがより少ないので、LWUV及び可視光が好ましい。有用な光開始剤は、細胞毒性のないマクロマーの重合を、短い時間枠（time frame）、最大で分、最も好ましくは秒の枠内で、開始するのに使用できるものである。
染料及びアミンなどの共触媒の可視光又はLWUV光への暴露は、活性種を発生させることができる。染料による光吸収は、染料を三重項状態（triplet state）にさせ、三重項状態が続いてアミンと反応し、重合を開始する活性種を形成する。重合は、約200〜700nm、より好ましくは長波長紫外領域又は可視領域、320nm以上、最も好ましくは約365nmと514nmとの間の波長の光を照射することによって開始できる。
多数の染料が、光重合に用い得る。好適な染料は、当業者に周知である。好ましい染料は、エリスロシン（erythrosin）、フロキシム（phloxime）、ローズベンガル、トニン（thonine）、カンファーキノン、エチルエオシン、エオシン、メチレンブルー、リボフラビン、2,2−ジメチル−2−フェニルアセトフェノン、2−メトキシ−2−フェニルアセトフェノン、2,2−ジメトキシ−2−フェニルアセトフェノン、他のアセトフェノン誘導体及びカンファーキノンを含む。好適な共触媒は、N−メチルジエタノールアミン、N,N−ジメチルベンジルアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、N−ベンジルエタノールアミン、N−イソプロピルベンジルアミンなどのアミン類を含む。トリエタノールアミンが好ましい共触媒である。
これらのポリマー溶液の光重合は、ポリマーと光開始剤との組み合わせ（開始剤が、細胞に毒性を有しない、0.1重量％未満、より好ましくは0.05〜0.01重量％の濃度で）が、ヌードマウスの皮膚に1〜3ミリワット（mWatts）/cm2の光を適用するのと同等の光への暴露によって架橋するという発見に基づいている。
図1は、重合速度と比較した時間に対するポリマー溶液の変換度を示す。
細胞の供給源
細胞は、ドナーから直接、ドナー由来の細胞の細胞培養物から、又は樹立された細胞培養系から得ることができる。好ましい実施態様においては、同じ種及び好ましくは免疫学的プロフィールの細胞は、患者又は近親者のいずれかからの生検によって得られ、そしてそれは、標準状態の培養においてコンフルエンスまで生育され、必要に応じて使用される。もし免疫反応を引き出しやすい、免疫学的に異なる個体由来のヒト筋肉細胞などの細胞が用いられるならば、そのときは、移植を受ける者（recipient）は、例えばステロイド及びシクロスポリンなどの他の免疫抑制薬の予定表（schedule）を用いて、必要に応じて免疫抑制され得る。しかしながら、最も好ましい実施態様においては、細胞は自系である。
好ましい実施態様においては、細胞はドナーから直接得られ、洗浄され、重合性物質（material）との組み合わせで直接に移植される。細胞は組織培養の当業者に公知の技術を用いて培養される。生検によって得られた細胞は、収穫され、混入細胞を除去する必要に従って継代しながら培養される。軟骨細胞及び筋細胞の単離は、その開示が本明細書に組み入れられる、国際公開第WO94/25080号に説明されている。
細胞接着及び生存性は、走査型電子顕微鏡、組織学及び放射性同位体による定量的評価を用いて評価することができる。移植細胞の機能は、上記技術及び機能アッセイの組み合わせを用いて測定できる。例えば、肝細胞の場合、in vivoでの肝機能研究は、カニューレを移植を受ける者の共通胆管（common bile duct）中に配置することによって行うことができる。そして胆汁は、増加量で（in increments）集めることができる。胆汁色素は、誘導されていないテトラピロールを捜す高圧液体クロマトグラフィーによって、又はP−グルクロニダーゼによる処理によって又は処理なしのいずれかで、ジアゾ化アゾジピロールエチルアントラニレートとの反応によってアゾジピロールに変換された後での薄層クロマトグラフィーによって分析できる。ジ複合（diconjugated）及びモノ複合（monoconjugated）ビリルビンは、複合胆汁色素のアルカリ性メタノール分解（alkalinemethanolysis）後の薄層クロマトグラフィーによっても測定できる。一般に、機能を有する移植肝細胞の数は増加するので、複合ビリルビンの濃度は増大する。単純な肝機能検査は、アルブミン生産などの血液サンプルに関して行うこともできる。
類似の器官機能研究は、移植後の細胞機能の程度を測定するために必要とされる、当業者に公知の技術を用いて行うことができる。例えば、膵臓の小島細胞は、移植肝細胞に特異的に用いられる方法に類似の方法で送達され、糖尿病を治療するインシュリンの適当な分泌によってブドウ糖制御が達成できる。他の内分泌組織も移植できる。標識ブドウ糖を用いる研究並びに蛋白質アッセイを用いる研究は、ポリマースカホールド上の細胞重量を定量することによって行うことができる。これらの細胞重量についての研究は、適切な細胞重量がどのくらいかを決定するための細胞機能研究と関連付けることができる。軟骨細胞の場合、機能は周囲の付着組織に適当な構造的支持体を提供することと定義される。
この技術は、多数の細胞を効率的な移送及び新しい組織又は組織同等物を作り出すための移植片植付けの促進のための三次元スカホールド内で、遺伝的に変化した細胞を含む複数の細胞系を提供するのに使用される。それは、細胞移植の免疫保護のためにも使用しながら、新しい組織又は組織同等物が宿主免疫系を排除することによって生育され得る。
本明細書中に記載されている移植され得る細胞の例は、軟骨細胞及び軟骨を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨を形成するその他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞及び器官細胞を含む。本明細書中で用いるように、「器官細胞」は、肝細胞、小島細胞、腸起源の細胞、腎由来の細胞、及び主として、物質を合成及び分泌又は代謝するのに働く他の細胞を含む。
ポリマー懸濁液に添加される生物学的に活性な物質
ポリマー溶液は、薬物送達のために使用することができる。ポリマー溶液に導入される物質の例は、蛋白質、多糖類、核酸分子、及び合成有機又は無機分子である。これらは、治療的、予防的又は診断的目的に有用であり得る。薬物は、抗生物質、抗ウイルス薬、化学療法剤、抗脈管形成剤、ホルモン、血流に影響を有する薬物、抗炎症薬及び多くの他の日常的に用いられるものを含むことができる。
重合性マトリックスは、細胞移植及び植付けを促進するために体液性因子と組み合わせることができる。例えば、重合性マトリックスが脈管因子、抗生物質、抗炎症薬、成長因子、分化を誘導する化合物、及び細胞培養の当業者に公知の他の因子と組み合わされ得る。
例えば、体液性因子は、移植片の形成又は移植の前に、細胞−ポリマー懸濁液による徐放形態中に混合され得る。あるいは、ヒドロゲルは、単離された細胞懸濁液と組み合わせる前に、体液性因子又はシグナル認識配列を結合するように修飾され得る。
イオン的及び共有結合的架橋性ポリマーのブレンド
好ましい実施態様においては、ポリマー溶液は2種以上のポリマーから形成され、そしてそれは架橋してセミ相互侵入網目構造を形成する。例えば、ブレンドは、イオン的に架橋可能であるPEO、及びジメタクリル化PEOを、好ましい実施態様においては共有結合的架橋性ポリマー重量の10〜40％の範囲で含むことができる。あるいは、2種の共有結合的架橋性ポリマーのブレンドを用いることができ、それらが架橋ホモポリマーの網目構造を形成するが、互いには架橋網目構造を形成しないことに基づいて選択できる。セミ相互侵入網目構造の利点は、非架橋ポリマーの放出が有利な分解特性を提供でき、特に形成外科における使用のための機械的特性を高めることができることを含む。
細胞懸濁液
好ましくは、ポリマーは水性溶液、好ましくは0.1Mリン酸カリウム溶液に、生理学的pHで、重合性ヒドロゲルを形成する濃度まで溶解される。単離された細胞は、ポリマー溶液中に、100万〜5000万細胞/ml、最も好ましくは1000万〜2000万細胞/mlの濃度で懸濁される。
移植方法
好ましい実施態様においては、送達される分子又は細胞は、ポリマー溶液と混合され、ヒドロゲルマトリックスを形成するポリマーの架橋の前に、分子又は細胞の移植が望まれる部位に直接注射される。
分子又は細胞が注射されるべき部位又は部位群は、必要な分子の量又は細胞数に従って、個々の必要に基づいて決定される。器官機能を有する細胞、例えば、肝細胞又は小島細胞に対しては、混合物は、腸間膜、皮下組織、腹膜後腔、腹膜前空間、及び筋肉内空間中に注射され得る。軟骨形成のためには、細胞は、軟骨形成が望まれる部位中に注射される。また、注射された溶液に形をつける外部鋳型を適用することもできるであろう。さらに、重合速度のコントロールによって、粘土に形をつけるのと同様に、細胞−ヒドロゲル注射移植片に形をつけることができる。あるいは、混合物を鋳型中に注射し、ヒドロゲルを固まらせ、そしてその物質を移植することができる。
懸濁液は、注射器及び針によって、増量剤が望まれる場所ならどこでも、すなわち、先天的又は後天的の疾患によるか、又は傷害、火傷などの二次的な筋萎縮部位で見られるような軟組織変形の存在する特定の場所に直接注射できる。この例は、神経損傷の二次的筋萎縮を有する患者の上部胴体中の懸濁液の注射であろう。
懸濁液は、骨欠損又は軟骨欠損、先天的又は後天的疾患状態のいずれか又は傷害又は火傷などの二次的な硬組織欠損のための増量剤としても注射され得る。この例は、傷害による骨ばった変形のある頭蓋周辺の場所への注射であろう。これらの例における注射は、局所又は全身麻酔下に針及び注射器を使用して必要な場所に直接なすことができる。
懸濁液は、輸精管内部に針を置き、注射された増量物質によってそれを閉塞し、このようにして患者の生殖能力をなくすなどの直接触診によって経皮的に注射され得る。懸濁液は、透視診断法、音波検査法、コンピューター連動断層撮影法（CT）、磁気共鳴イメージング法又は他のタイプの放射線学的ガイダンスによってカテーテル又は針を通して注射され得る。これは、特定の器官又は身体の他の組織部位、増量剤を必要とする場所ならどこでも、血管によるアクセス又は経皮的アクセスのいずれかによって、この物質の配置又は注射を可能にするであろう。
さらに、この物質は、腹腔鏡又は胸腔鏡を通して、いずれの腹腔内若しくは腹膜腔外又は胸の器官にも注射され得る。例えば、懸濁液は、胃食道逆流の矯正のために胃−食道連結の部位に注射され得る。これは、胸腔鏡を用いて胃食道部位の食道部分に物質を注射するか、又は腹腔鏡を通して胃食道部位の胃部分に物質を注射するか、又は組み合わせのアプローチのいずれかによって行うことができる。
物質も、膀胱尿管逆流の治療に用いることができる。逆流の内視鏡治療のためのその使用に加えて、注射可能な自系の筋細胞の系も、尿失禁及び直腸失禁などの他の医学的障害（condition）、発声障害、形成復元（plastic reconstruction）及び注射可能な永久的な生体適合性物質を必要とする場所ならどこでも、治療のために適用し得る。単離された細胞を注射によって送達するための注射可能なポリマーの使用方法は、例えば国際公開第WO94/25080号に記載されている。
逆流及び失禁の治療のための細胞−ポリマー懸濁液の使用に加えて、懸濁液は、生体適合性の永久的な注射可能物質を必要とするヒト身体のいずれの場所にも適用できるだけでなく、復元手術（reconstructive surgery）にも適用できる。懸濁液は、内視鏡的に注射でき（例えば発声障害の治療のために声帯中への喉頭鏡を通しての注射、又は患者を生殖不能にする方法としてファロピウス管内への子宮鏡を通しての注射、直腸鏡を通じての直腸周囲の括約筋領域中の物質の注射）、それによる括約筋領域における抵抗性の増加及び患者に便通の自制をさせる。
この技術は、他の目的にも使用され得る。例えば、注文成形の（custom-molded）細胞移植片は、三次元組織変形を復元するのに使用でき、例えば、ヒトの耳の鋳型を作ることができ、軟骨細部−ヒドロゲルレプリカが形作られ、移植されて、失った耳を復元することができる。細胞は、注射によって送達され得る三次元構造の形態で移植され得る。
活性種発生体の適用
光重合性ポリマーを用いる好ましい実施態様においては、光がポリマー懸濁液が注射された組織に外部から当てられる。生物学的に活性な分子又は細胞は、活性種発生、好ましくは光活性化によって架橋され得るポリマー溶液中に懸濁される。懸濁液は、新しい組織が形成されるべき部位又は薬物が放出されるべき部位に注射される。そして、光が外部から皮膚に当てられ、注射されたポリマーを架橋させる。この方法は、ポリマー及び光開始剤の組み合わせ（細胞に毒性がない濃度、開始剤の0.1重量％未満、より好ましくは0.05〜0.01重量％で）が、ヌードマウスの皮膚に対して1〜3ミリワット（mWatts）/cm2の光が適用されるのと同等の光への暴露によって架橋するという発見に基づいている。本明細書中では、主に皮膚外部の光源の適用に関して考察しているけれども、これは、組織を通して適用される光にも同様に適用可能であると解釈すべきであり、例えば、ポリマー−細胞懸濁液が注射された組織に隣接する血管中の、又は注射されたポリマー−細胞懸濁液によって修復又は置換されるべき軟骨表面に隣接する骨膜空間中のカテーテルからの光である。
浸透の深さは、光重合を起こすために用いられる光の波長によってコントロールされ得る。例えば、可視光は、組織を通して紫外光よりも深く浸透する。組織を通しての浸透は、ミクロンから1cmの範囲に及ぶことができ、1cmは可視光による。好ましい実施態様においては、200〜700nmの波長の照射は、活性種の生成及び網目構造の重合に使用される。
最小の0.01mW/cm2強度が、重合を起こさせるために必要である。最大の光強度は、照射波長によって1〜1000mW/cm2に及び得る。より高い光強度は、例えば、より長い波長である、短波長のUV光よりも組織／細胞損傷を起こさない可視光によって、組織に暴露され得る。歯科適用においては、青色光（470-490nm）が、100〜400mW/cm2の強度で臨床的に用いられている。
照射の強度は、ポリマー−細胞懸濁液の注射の場合に細胞暴露を最小化するようにコントロールされる。ヌードマウスにおいては、細胞は1〜3mW/cm2のUVA光に暴露される。組織の厚さ及びそれが組織を通過するに従って照射強度が低下することを知ることによって、細胞が暴露される光強度を予測しコントロールできる。活性種の形成及び重合を起すのに必要な最小強度の光に細胞−ポリマー懸濁液を暴露させるのが望ましい。
引用出版物の教示は、当業者の技術のレベル及び一般的知識を示している。必要な程度において、出版物は参照によって特定的に本明細書中に組み入れられる。
適当な箇所で、以下の定義が用いられるべきである。
「電磁照射（Electromagnetic Radiation）」は、本明細書中で用いられるように、これらに限定されないが、X線、紫外、可視、赤外、遠赤外、マイクロ波及びラジオ周波数（radio-frequency）を含む電磁スペクトルのエネルギー波をいう。
「可視光」は、本明細書中で用いられるように、少なくとも約4.0×10-5cmの波長を有するエネルギー波をいう。
「紫外光」は、本明細書で用いられるように、少なくとも約1.0×10-5cmであるが、7.0×10-5cm未満の波長を有するエネルギー波をいう。
「紫外光」は、本明細書中で用いられるように、少なくとも約1.0×10-5cmであるが、4.0×10-5cm未満の波長を有するエネルギー波をいう。
「青色光（blue light）」は、本明細書中で用いられるように、少なくとも約4.5×10-5cmであるが、4.9×10-5cm未満の波長を有するエネルギー波をいう。
「線源（radiation source）」は、本明細書中で用いられるように、（上記定義のような）放射線の発生源をいう。例えば、これらに限定されないが、ランプ、太陽、青色ランプ、及び紫外線ランプを含む。
本発明は、以下の非限定的な実施例の参照によってさらに理解されるであろう。
実施例1：ex vivo実験
重合速度及び皮膚、脂肪及び筋の下の重合の深度に関する定量的データを得るためにex vivo実験を行った。
まず、光強度を皮膚中で測定した。皮膚は、ラットから収穫され、光重合は、皮下脂肪のない上皮及び真皮、皮下脂肪のある上皮及び真皮並びに皮膚及び脂肪の下の筋肉内で試験された。
0004343274.tif 000002
光強度を測定した後、種々の厚さの皮膚層下での光重合を誘導する能力を評価した。メタクリレート基によって両端をふさがれた（Shearwater Polymers，Huntsville，AL）ポリ（エチレングリコール）（分子量3400、Polysciences，Warrington，PA）は、参照によって本明細書中に組み入れられる、Hubbelらに対する米国特許第5,567,435号に記載されているように、紫外光、青色光及び可視光によって重合された。光熱量アクセサー（phtocalorimeter accessor）（Perkin Elmer，Norwalk，CT）を備えた示差走査熱量計（differential scanning calorimeter）を用いて、皮膚層の下で光重合させ、重合速度を得た。
図２は、皮下をA、皮下及び脂肪をB、並びに皮下及び脂肪及び筋をC、のラット皮膚の層における重合溶液の光重合速度を予測する。従って、重合時間は光の波長、注射の深さ、投射する光の強度並びに開始剤のタイプ及び濃度によって秒から分まで変動し得る。最少の光透過率（例えば、皮膚表面では100mW/cm2であるが、筋肉内層では約0.6mW/cm2）によってさえ、重合は起きる。本質的には、注射されたポリマー溶液に到達する光強度が少なくとも0.01mW/cm2であれば、重合は可能である。光減衰の主な影響は、重合時間の増大及び重合速度の低下である。
実施例2：in vivo実験
実施例１に記載したDMAを含む重合溶液をヌードマウスに注射し、3〜5mW/cm2の強度で4分間日焼けベッド（tanning bed）からのUVA光に暴露した。得られたヒドロゲルを触診し、液体から固体に重合したことを確定した。光に暴露しない対照は重合しなかった。重合のさらなる確認のために、マウスを犠牲にし、ヒドロゲル及び周囲の皮膚及び組織を切り取った。重合は、水中でのヒドロゲルの膨潤によって確認された。
実施例3：薬物送達ビヒクル
メタクリル化され、混合されたコハク酸無水物並びにポリ（エチレンオキサイド）及びジメタクリレート（PEOD）の共同ゲル化（cogelation）は、ヒドロゲルの放出を延長するのに有用である。これはPEO網目構造の架橋密度を増大させる。PEOのメタクリレート基に結合するエステル結合に加えて不安定な無水物結合が、加水分解が起こることによるメカニズム及び速度を増大させる、得られたヒドロゲル中に存在する。
この実施例は、光重合されたコハク酸無水物／PEOポリマーの生成及びこのポリマーからの化合物の放出を記載する。実施例は、次のように分割される：A）コハク酸と重合性メタクリレート基との混合、B）放出化合物と、コハク酸ジメタクリレート及びPEODの重合性溶液との混合、C）膨潤の試験、及びD）時間に対する放出の測定。PEODは、1,2−（ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド及びジアリル−酒石酸ジアミドとも共同ゲル化した。
A．  コハク酸ジメタクリレート（SAD）の調製
コハク酸を無水ジメチルスルホキシド（DMSO，Aldrich，Steizenhofen，Germany）中に溶解し、過剰の無水メタクリル酸（Aldrich，Steizenhofen，Germany）を加えた。反応混合物をアルゴンでパージし、40℃で24時間過熱した。反応混合物を室温まで冷却し、10倍過剰のジエチルエーテルを添加して沈殿させた。沈殿物を減圧濾過し、真空乾燥した。
赤外分光学を用いてコハク酸のカルボン酸基の置換をモニターした。無水メタクリル酸との反応前後のコハク酸の赤外スペクトルの比較は、3100cm-1に中心をもつ広い酸のピークの消失を示す（すなわち、コハク酸のカルボン酸基の消失を示す）。
B．  放出化合物の重合性溶液中への混合
分子量1000のPEOD（Polysciences，Warrington，PA）及び分子量3400のPEOD（Shearwater Polymers，Huntsville，AL）を重合性溶液として利用した。様々なパーセンテージのPEOD及びコハク酸ジメタクリレート（SAD）を水に溶解し、約100mgの重合性溶液を用いて50/50％（w/v）の重合性溶液を形成した。40％以上のコハク酸ジメタクリレートを含む重合性溶液を、SADを溶解するために光重合する前に、ホットプレート上で2〜4秒加熱した。
ウシ血清アルブミン（BSA，Sigma，Steizenhofen，Germany）を50/50％（w/v）の重合性溶液に添加し、攪拌した。ポリマー溶液を、続いて3mLのPBS中、HPK（ラジカル光活性開始剤）の存在下にUV線（EFOS Ultracure）に約10秒間暴露した。
ゲルを37℃でインキュベートした。種々の時点で、PBSを取り出し、凍結させながら、3mLの新たなPBSを添加した。ローダミンを同様にカプセル化した。
C．  膨潤容積の測定
平衡膨潤容積Qは、ヒドロゲルの架橋密度に関係する。ヒドロゲルの架橋密度が高ければ高いほど、網目構造が吸収できる水（又は他の溶媒）の容積は小さくなる。ゲルを、3mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で膨潤させた。膨潤重量は増加し、2日後に安定した。平衡膨潤容積Qは、2日の膨潤重量を用いて計算した。
Qは、分子量3400及び分子量1000のPEODを用いた0〜70％のSADの範囲のヒドロゲルに対して計算した。予測されたとおり、SAD濃度が増大するに従って、Qは減少した。より低い分子量のPEOD（1000）から合成されたヒドロゲルは、より低いQ値を有していた（図3）。
D．  化合物の放出の測定
アルブミンのコントロールされた放出に対する種々のSADヒドロゲル濃度の影響を試験した。BSAレベルは、ミクロ−BSAアッセイ（Pierce）を用いて定量し、放出は蛍光測定法によって観察した。図4は、40日までの0、15、17、43及び51％のヒドロゲルの放出プロフィールを示す。全てのゲルが、最初の10日間に初期急速放出（initial fast release）を示した。10日時点で放出されたアルブミンのパーセントはSADによって変動した。43％及び51％SADゲルは、カプセル化されたアルブミンの25％しか放出しなかったのに対し、0％SADゲルは、50％を放出した。10日後、0％SADゲルは、非常に低い濃度のアルブミンを放出したのに対し、SADを有するゲルは、40日までの間1日当たり平均1％のアルブミンを放出した。
ローダミン（分子量479）を用いて、10日の初期急速放出相に対する小分子の放出を試験した。20％SADを有するヒドロゲルは、この期間の間にカプセル化されたローダミンを70〜90％放出した（図5）。
このように、ジメタクリル化されたコハク酸とポリ（エチレンオキサイド）との共同ゲルは、ローダミン及びアルブミンなどの分子をゆっくり放出できるヒドロゲルを与える。ヒドロゲル中のコハク酸濃度の変動は、ヒドロゲル膨潤及び放出特性をさらにコントロールする手段である。
実施例4：ex vivo及びin vivo組織工学
本実施例では、組織工学のための光重合性溶液の使用をex vivo及びin vivoで試験した。ex vivo及びin vivoの両者での試験のために、ブタの膝関節、股関節及び肩関節からの関節軟骨を下層の骨について解剖し、小さなチップに切り、コラーゲンと共にインキュベートして単離した。軟骨細胞を分別遠心分離によって単離した。単離された軟骨細胞を洗浄し、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。
A．  ex vivo
ポリマーPRO及びPEODはin vivoで用いることができ、良好な生体適合性を示すが、開始剤の生体適合性を、in vivoでウシ軟骨細胞を用いて試験した。開始剤PHKは歯科適用には認められているが、この開始剤を、光重合を開始させるために生産されるラジカルの毒性を確かめるため、ポリマーの不存在下に試験した。PEODはラジカルに対して非常に活性が高く、そのためポリマーの不足は、全てのラジカルが細胞を損傷するのに利用できるようにする（最悪の場合）。3つの開始剤濃度（0.1、0.05及び0.01％（w/w））を試験した。
仔ウシ肩から単離された軟骨細胞を37℃、5％CO2の細胞培養培地（DMEM）中でex vivoに維持した。細胞をおよそ週に1度継代した。8ウェルの組織培養プレートに、ウエル当たり約10,000個の細胞を播いた。1−ヒドロキシシクロヘキシル−フェニル−ケトン（HPK）をDMEMに加え、濃度を0.1、0.05及び0.01％（w/w）の濃度にした。細胞を開始剤不存在下に24時間インキュベートし、起こりうる急性細胞毒性を試験した。そして、細胞をUVA線（2mW/cm2）に3分間暴露し、光活性開始剤を活性化した。
光に暴露する前の細胞に対する光活性開始剤濃度の影響を測定するために、細胞を0％（w/w）、0.1％（w/w）、0.05％（w/w）、及び0.01％（w/w）の濃度に暴露した。全ての場合で違いは殆ど観察されず、これは、開始剤は光に暴露する前に毒性を現さないようである。
4日間の光への暴露後の細胞への光活性開始剤濃度の影響を、0％（w/w）、0.1％（w/w）、0.05％（w/w）、及び0.01％（w/w）の濃度に細胞を暴露することによって測定した。細胞を、形態学的に、4日間の細胞増殖について比較した。in vivoで重合を起こさせるのに必要な光暴露（1〜3mW/cm2で3分間）に匹敵する光暴露の後、0.1％の開始剤濃度で、多数の細胞死が観察された。不定の損傷が0.05％で観察され、対照と0.01％細胞の間では、損傷は形態学的にみられなかった。光暴露の4日後、0.01％細胞及び対照細胞は、類似の増殖を示した。
a）開始剤又はUVAに暴露されない、b）UVAのみに暴露された細胞、及びc）0.01％のPHKの存在下にUVAに暴露された細胞であるコントロールの間でさらなる分析を行った。光又は光活性開始剤に暴露されなかった、光のみに暴露された、0.01％の光及び開始剤に暴露されたときの、並びに光暴露後24時間のときの光活性開始剤の細胞への影響を測定した。開始剤のこの用量は、増殖及び形態学を変えることはないようである。
B．  in vivo
組織工学にとってポリマー骨格の分解時間は重要である。正確なメカニズムを理解することは必要ないが、増殖する細胞は、増えて組織を形成する場所を必要とし、また若い組織は形態を保持するために機械的な力からの保護を必要とすると信じられている。軟骨細胞は、単独で又はPEGと共に注射されたときにほんの1週間で新軟骨を形成する。従って、組織工学骨格の速い分解又は崩壊は望ましい。
成長する組織には空間が必要である一方、皮膚を含む周囲の組織の種々の機械的力の存在下における構造物形態を維持するために、構造的支持体が必要である。急速分解成分を有する骨格及び注射可能な構造的完全性を維持する骨格を希望し、セミ相互侵入網目構造（semi-IPN）を使用した。
本実施例では、用いたポリマーは、ともに共有結合的に反応して光の存在下に多孔性の網目構造を形成する35％PEODからなっていた。残りの65％は、化学的に反応せずに網目構造を形成するが、PEODが形成するsemi-IPNによって形成される網目構造内にトラップされる分子量100,000のPEOからなっていた。
この系は、2倍の分解性を与える。PEOは網目構造形成を広げることができるが、共有結合的につながれたPEODは、PEOD鎖が放出され、排出され得る前にエステル結合が壊されなければならない。この化学分解は遅いが、新軟骨によるエステラーゼなどの酵素の生産によって促進され得る。
in vivo試験のために軟骨細胞を遠心分離し、900μl中に50×106個の細胞濃度になる容量にした。非メタクリル化ポリマーに対し35％の割合でメタクリル化されたポリマー（Shearwater Sciences，Huntsville，AL）を用いた。70mgのPEOD（分子量3400、Shearwater Polymers，Huntsville，AL）及び130mgのPEO（分子量100,000、Sigma Chemical，Steizenhofen，Germany）を900μlの細胞（50×106個）及び培地、並びに1mg/mlのPHK100μl中に溶解し、20％のポリマー溶液を調製した。
3匹のathymic雌マウス（Massachusetts General Hospital，Boston，MA）をメトキシフルラン（methoxyflurane）によって麻酔し、0.1mlのポリマー／軟骨細胞溶液を、22ゲージ針を用いて4箇所の皮下に注射した。なお、細胞が注射及び経皮重合から生き残ったことを示すことが必要だった。ヌードマウスに、下記の細胞／ポリマー移植片での注射液と類似の注射液を2回注射した。そして、マウスをUVA線を発するランプの下に置いた。マウスは、3分間の光量計で測定されたように1〜3mW/cm2の光強度を受けた。ポリマー／軟骨細胞構築物は、触診でき、重合の進行が観察できた。
マウスをそれぞれ1、2及び3週間で犠牲にし、4つの構築物を取り出し、10％リン酸緩衝ホルマリン中24時間で固定した。標本をパラフィンを塗った切片中に包埋した。続いて切片を、標準組織学的技術に従って、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）及びサフラニン0で染色した。
1、2及び3週間において、マウス1匹当たり4つの構築物を得た。1週間後の移植片のH&E染色及びサフラニン0染色は、1週間で、増殖した軟骨細胞の島が観察されることを示す。サフラニン0染色は、分化した軟骨細胞の生産物であるGAGの生産を示す。2週間では、細胞が新軟骨の好塩基性組織と類似の好塩基性組織によって囲まれている。サフラニン0染色は、1週間と比較したときのGAGのさらなる産生を示す。
当業者であれば、修飾及び変化は、前記の詳細な説明から自明であろう。そのような修飾及び変化は、添付の請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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