(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選ばれるいずれかの塩基配列を含む遺伝子：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞癌化能を有しているポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている塩基配列
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ細胞癌化能を有しているポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている塩基配列。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選ばれるいずれかのポリヌクレオチドである遺伝子：
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列又はその相補鎖配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドと0.1×SSC/0.1％SDS中65℃で30分間の洗浄条件下でハイブリダイズし、且つ細胞癌化能を有しているポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ細胞癌化能を有しているポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子によってコードされているタンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載のタンパク質に結合性を有する抗体。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、ヒトの疾患の予防、診断及び治療の指針として有用な遺伝子、より詳しくは、ヒトのｌａｍｐ−１及び−２〔Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；  Ｓａｉｔｏ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，５７００−５７１１（１９９２）；  Ｓａｗａｄａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２６８，１２６７５―１２６８１  ８１９９３）；  Ｓａｗａｄａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２６９，１４２５−１４３１（１９９４）〕と相同性を有し、癌遺伝子として働くと考えられる新規な肺特異的ヒト遺伝子に関する。
また本発明はラット、マウス、酵母、線虫、公知のヒト遺伝子等と類似性を有する新規なヒト遺伝子であって、該遺伝子のｃＤＮＡ解析、染色体へのマッピング及びｃＤＮＡの機能解析により、該遺伝子を用いた遺伝子診断並びに新しい治療薬の開発に利用可能な新規なヒト遺伝子に関する。
更に本発明は、かかる遺伝子によってコードされる新規な蛋白質及びその特異抗体にも関する。
背  景  技  術
生物の遺伝情報は、細胞の核内に存在するＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの４種の塩基の並び（ＤＮＡ）として蓄積され、この遺伝情報は個々の生物の系統維持と個体発生のために保存されている。ヒトの場合、その塩基数は約３０億（３×１０９）といわれ、その中に５〜１０万の遺伝子があると推測されている。これらの遺伝情報は、遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡが転写され、次に蛋白質に翻訳されるという流れに沿って調節蛋白質、構造蛋白質、酵素等の創製を通して、生命現象の維持に関与している。
上記遺伝子から蛋白質翻訳までの流れの異常は、細胞の増殖・分化等の生命維持システムの異常を惹起し、各種疾患の原因となるとされている。これまでの遺伝子解析の結果から、インスリン受容体やＬＤＬ受容体等の各種受容体、細胞の増殖・分化に係わる例えばプロテアーゼやＡＴＰａｓｅ、スーパーオキシドディスムターゼのような代謝酵素等の遺伝子が、医薬品開発にとって有用な素材となると考えられた。
しかしながら、ヒト遺伝子の解析や、かかる解析された遺伝子の機能と各種疾患との関わり等についての研究は、まだ始まったばかりであり、不明な点が多く、更なる新しい遺伝子の解析、それらの遺伝子の機能解析及び疾患との関わりの研究、ひいては解析された遺伝子の利用による遺伝子診断や該遺伝子の医薬用途への応用研究等が当業界で望まれている。
また、膵臓癌は、日本人及び西側諸国の癌関連死亡順位において４位及び５位を占める消化器系の悪性腫瘍の中でも最も予後不良な癌のひとつである（Ｐｏｓｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ．，３２，８００−８１２（１９９１））。癌研究における最も重要なゴールの一つは、癌化に至る早期の遺伝子変化を見分けることである。この変化の見極めは、早期診断のための遺伝子的なツールの開発と、この致死的な疾患をより効果的に治療するための新規な治療的アプローチとを導くことができる。
かかる遺伝子の生理的役割の解明とそれにより得られる情報は、癌化乃至癌の発症機能の解明に重要であり、これらは、基礎科学研究の分野はもとより、医薬品分野においても上記癌の解明やその処置法等の開発面からも望まれているところである。
発  明  の  開  示
上記の如く、新たなヒト遺伝子が提供できれば、各細胞での発現レベルやその構造及び機能を解析でき、またその発現物の解析等により、之等の関与する疾患、例えば遺伝子病、癌等の病態解明や診断、治療等が可能となると考えられる。本発明は、かかる新たなヒト遺伝子の提供を目的としている。
本発明者らは、上記目的より以下の如く鋭意研究を重ねた。即ち、本発明者らは、まずヒト胎児脳、成人血管、胎盤の各種組織より抽出したｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これをベクターに組込んでライブラリーを構築し、該ライブラリーでトランスフォームした大腸菌コロニーを寒天培地上に形成させ、該コロニーをランダムにピックアップしてマイクロプレートに移し、各種のヒト遺伝子を含む大腸菌クローンを作製、登録した。次いで、之等の各クローンを培養後、ＤＮＡを抽出精製し、得られるｃＤＮＡを鋳型としてデオキシターミネーター法により４種の塩基特異的に停止する伸長反応を行い、自動ＤＮＡシークエンサーにより、登録された各クローンの有するヒト遺伝子の５’末端から約４００塩基配列を決定した。かくして得られたヒト遺伝子の塩基配列情報より、公知のバクテリア、酵母、線虫、マウス、ヒト等の各種動植物種に類似性を有する新規なファミリー遺伝子を検索した。尚、上記ｃＤＮＡ解析方法については、藤原らの文献に細述されている（藤原  力，細胞工学，１４，６４５−６５４（１９９５））。
その結果、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローン中に、腫瘍抑制蛋白質と考えられるｐ３３ＩＮＧ１〔ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ００１９５４，Ｇａｒｋａｖｅｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｇｅｎｅｔ．，１４，４１５−４２０（１９９６）；Ｇａｒｋａｖｅｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，２０１４−２０１９（１９９７）；ｒｅｗｒｏｔｅ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ０４４０７６〕と高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする新規な遺伝子を有するクローンを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
また、本発明者らは、斯界で要望される前記の情報、殊にｌａｍｐ−１遺伝子及びｌａｍｐ−２遺伝子と相同性を有する新規な蛋白相同物をコードする遺伝子を提供することを目的として、各種ヒト組織由来の遺伝子につき検索を重ねた結果、該目的に合致する新しい肺特異的遺伝子の単離、同定に成功し、ここに本発明を完成するに至った。
即ち、まず第一に、本発明によれば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子（以下「ＴＳＣ４０３遺伝子」という）、特にヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。
また、本発明によれば、ＴＳＣ４０３遺伝子によってコードされる蛋白質（以下「ＴＳＣ４０３蛋白質」という）及びこれに結合性を有する抗体が提供される。
更に、本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＴＳＣ４０３遺伝子、特にヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列又はその相補鎖を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド
更に、本発明によれば、配列番号：３に示される塩基配列であるＴＳＣ４０３遺伝子が提供される。
加えて、本発明によれば、配列番号：２で示される塩基配列の少なくとも１５の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドを有する遺伝子検出用の特異プローブ又は特異プライマーとして使用されるＤＮＡ断片が提供される。
次いで、本発明によれば、配列番号：４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヒト遺伝子（以下「ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子」という）が提供される。
また、本発明によれば、ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子によってコードされる蛋白質（以下「ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質」という）及びこれに結合性を有する抗体が提供される。
更に、本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなるヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子が提供される。
（ａ）配列番号：５で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド
更に、本発明によれば、配列番号：６で示される塩基配列であるヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子が提供される。
加えて、本発明によれば、配列番号：５で示される塩基配列の少なくとも１５の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドを有する遺伝子検出用の特異プローブ又は特異プライマーとして使用されるＤＮＡ断片が提供される。
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
以下、本発明ＴＳＣ４０３遺伝子につき詳述する。
本発明ＴＳＣ４０３遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＴＳＣ４０３」と名付けられたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号：３に示されるとおりである。
該遺伝子は、配列番号：１に示される４１６アミノ酸配列の新規な肺特異的蛋白質（以下「ＴＳＣ４０３蛋白質」という）をコードするヒトｃＤＮＡであり、全長３１９８塩基からなっている。
本発明ＴＳＣ４０３蛋白質は、本発明遺伝子の発現産物として得られる。これは、ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８５，２４４４−２４４８（１９８８））を利用したＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデーターベースの検索の結果、ヒトのｌａｍｐ−１遺伝子及びｌａｍｐ−２遺伝子（前記文献参照）と相同性を有することが確認された。
しかして、上記ヒトｌａｍｐ遺伝子は、高転移性の大腸癌細胞株においてその発現が上昇し、血管内皮細胞上のＥ−セクレチンと結合することが知られている。このことから、癌の悪性化に関与するものと考えられている（前記文献参照）。
本発明ＴＳＣ４０３遺伝子も、癌に関連する遺伝子であり、癌のマーカーとして有用であると考えられる。
また、本発明遺伝子の染色体上の位置は、種々の癌において染色体異常が認められる第３染色体ｑ２７である。このことからも、本発明遺伝子は、種々の癌との関連が強く示唆される。
更に、本発明ＴＳＣ４０３遺伝子は、試験した種々の癌標本においてその発現の上昇が認められることからも、癌化及び癌の悪性度を予測できるものとして価値があると考えられる。
以上のとおり、本発明ＴＳＣ４０３遺伝子及びその遺伝子産物の提供は、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、膵癌等の各種癌の解明、把握、診断、予防及び治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記各種癌の処置に利用される本発明遺伝子の発現を誘導する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現又はその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検出は、上記各種の癌の解明や診断において好適に利用できる。
以下、本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子につき詳述する。
本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＧＥＮ−１４６Ｆ１１」と名付けられたクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列表に示される通りである。即ち、このクローンの有する遺伝子は、配列表に配列番号：４として示される２８０アミノ酸残基をコードする８４０ヌクレオチド（核酸）のオープンリーディングフレーム（推定アミノ酸翻訳領域、その配列は配列番号：５に示す）を有しており、全長ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：６に示すとおり１０７８ヌクレオチドからなっている。
該配列番号：６に示される配列において、開始コドンは９２−９４番目に位置しており、停止コドンは９３２−９３４に位置している。また、ポリアデニレーションシグナル様の配列（ＡＴＴＡＡＡ）は１０５８−１０６３に位置している。
本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子は、上述した通り、ｐ３３ＩＮＧ１と高い相同性を有しており、その遺伝子情報に基づくヒト遺伝子の解析と、解析された遺伝子の機能と各種疾患との関わりについての研究に利用でき、該遺伝子と関連する疾患への遺伝子診断、遺伝子治療並びに該遺伝子の医薬用途への応用研究に用いることが可能である。即ち、本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子によりコードされる蛋白質（遺伝子産物）の機能は、既知の相同性遺伝子のそれより類推でき、また本発明遺伝子の提供によれば、その候補遺伝子を発現ベクターに組込んでリコンビナント蛋白質を作製して、その酵素活性や結合活性等の機能を調べることもできる。殊に、本発明遺伝子は、癌遺伝子として機能すると考えられるため、この機能を利用して抗癌剤等の医薬品の開発に有用である。
本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子がコードする蛋白質（以下これを「ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質」という）は、そのＣ末端付近の領域にＺｎフィンガーモチーフ様の配列を有しており、しかもこの領域は殊に上記ｐ３３ＩＮＧ１と高い相同性を有すると認められる。
しかして、上記ｐ３３ＩＮＧ１は、乳癌などのいくつかの癌由来細胞株において、その不活性化が報告されている〔前記文献参照〕。また近年、上記ｐ３３ＩＮＧ１が癌抑制遺伝子産物として知られているｐ５３を介して、細胞の増殖を負に調節していることが明らかにされた〔Ｇａｒｋａｖｅｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２９５−２９８（１９９８）〕。更に、各種ヒト癌組織においてヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の発現が特異的に増加している。之等のことから、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質は、ｐ５３と相互作用することによって、細胞の増殖を正に調節している可能性が考えられる。
また、本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子は、ノーザンブロット分析の結果、試験した各種臓器由来の１６のヒト成人組織の全てにおいて、その発現が認められ、大腸癌、食道癌、卵管癌、胃癌などのいくつかの癌組織においては、正常組織と比較して、その発現の増加が認められた。これらのことから、本発明遺伝子は、各種組織でのその発現の検出によって、これが関与する例えば癌などの診断を行うことができ、惹いては細胞増殖抑制剤、制癌剤などの化合物のスクリーニングなどに有用であると考えられる。
本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１及び４で示される各アミノ酸配列をコードする配列番号：２及び５の各塩基配列を含むポリヌクレオチド、該配列番号：２及び５で示される各塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び配列番号：１及び４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチドとして示される。
従って、本発明遺伝子には、例えば上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定の塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子が包含される。
即ち、本発明遺伝子には、配列番号：１又は：４に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む遺伝子が包含される。該改変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子が検出できるものであればよい。
尚、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行うこともできる。
上記の人為的改変手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：３５０，３６７−３８２（１９８７）；同  １００：４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９：４８０１（１９６７）；同９１：３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０：１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９（１９８１）；同２４：２４５（１９８３）〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。
本発明遺伝子のひとつの態様としては、配列番号：２又は５で示される塩基配列又はその相補鎖配列を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子を例示できる。この塩基配列は、上記アミノ酸配列（配列番号：１又は４）の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例である。本発明遺伝子はこれらに限らず、上記各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ選択した塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は、常法に従うことができる。該選択に当たっては、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔Ｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：４３（１９８１）〕。
また、本発明遺伝子は、例えば配列番号：３又は６の具体例に示されるように、一本鎖ＤＮＡの塩基配列として示されるが、本発明はかかる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドやこれらの両者を含むコンポーネントも当然に包含し、またｃＤＮＡ等のＤＮＡに限定されることもない。
更に、本発明遺伝子には、前記のとおり、配列番号：２又は５に示される塩基配列又はその相補鎖配列を含むポリヌクレオチドからなるものに限定されず、之等塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものが包含される。より詳しくは、配列番号：１又は４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチドからなるものが包含される。
また上記一定の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子には、少なくとも、下記に掲げるようなストリンジェントな条件下で、配列番号：２又は５で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、一定の条件下で洗浄してもこれより脱離しないものも包含される。
その例としては、配列番号：２及び５の各塩基配列を有するＤＮＡと、６×ＳＳＣ中、６５℃一夜の条件下或は５０％ホルムアミドを含む４×ＳＳＣ中、３７℃一夜の条件下においてハイブリダイズし、２×ＳＳＣ中、６５℃での３０分間の洗浄条件下においても各ＤＮＡから脱離しない塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。ここで、ＳＳＣは、標準食塩−クエン酸緩衝液（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ；１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）である。また、上記遺伝子のより好ましい例としては、配列番号：２及び５の各塩基配列を有するＤＮＡと、７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中６５℃一夜の条件下においてハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃での３０分間の洗浄条件下においても各ＤＮＡから脱離しない塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
本発明遺伝子は、例えば配列番号：３又は６に示される具体例についての配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照〕。
具体的には、本発明遺伝子を保有する適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより製造できる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８：６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：７７８（１９８３）等〕。
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等、特に本発明ＴＳＣ４０３遺伝子の場合は肺組織が例示される。これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。尚、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもいる。本発明においてはそれら市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）より入手される各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
本発明遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡにより産生される蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。
ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報を元にして化学合成されたＤＮＡ等を用いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝子そのものやその断片等もかかるプローブとして良好に利用できる。
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列には、配列番号：２又は５に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基配列、好ましくは２０〜３０の範囲の連続した塩基配列を有するものが含まれる。また前記各配列を有する陽性クローンそれ自体もまた該プローブとして用いることができる。
上記スクリーニングは、また、各細胞、組織より抽出、単離精製された天然抽出物の部分アミノ酸配列情報に基づき、センス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いる方法によることができる。
更に、上記スクリーニングは、上記特異抗体に代えてＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を利用した蛋白質相互作用クローニング法（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｌｏｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によることもできる。
本発明においては、またディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｄ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，９６７−９７１（１９９２））によって、異なる条件下の細胞もしくは複数の異なる細胞群間のｍＲＮＡの発現を直接比較、検討することができる。
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０（１９８５）〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法も好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、レース法（ＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６）：３５（１９９４））、殊に５’−レース（５’−ＲＡＣＥ）法〔Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８：８９９８（１９８８）〕等の採用が好適である。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従い合成できる。
尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記のとおり常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法等によればよい。
上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４：５４６３（１９７７）〕、マキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８０）〕等に従って、また簡便には市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
本発明遺伝子の利用によれば、一般の遺伝子工学的手法を用いることにより、その遺伝子産物を容易に大量に安定して製造することができる。
本発明は、本発明にかかるＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）及び該ベクターによって形質転換された宿主細胞並びに該宿主細胞を培養することによりＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を製造する方法をも提供するものである。
該ＴＳＣ４０３蛋白質及びとトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の製造は、通常の遺伝子組換え技術〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０：６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０：５９９０（１９８３）及び前記引用文献等参照〕に従うことができる。
ここで宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができる。原核生物の宿主としては、例えば大腸菌や枯草菌等の一般的に用いられるものが広く挙げられる。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株に含まれるものが例示できる。
また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７７：４２１６（１９８０）〕等が例示でき、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞等が好適なものとして例示できるが、これらに限定される訳ではない。
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等がよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＭＡＬ−０２，ｐＭＡ１−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を例示できる。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：８５４（１９８１）〕等が例示できる。
上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−Ｈｉｓ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の昆虫細胞用ベクター等が挙げられる。
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０：１（１９８３）〕等が例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が包含される。
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合には、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を好適に利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、例えばＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を好適に利用できる。また動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオルインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター等を例示できる。
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等を例示できる。
上記所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入方法（形質転換法）も特に制限はなく、一般的な各種方法を採用できる。得られる形質転換体の培養も常法に従うことができる。該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的の蛋白質が発現・産生され、形質転換体の細胞内、細胞外若しくは細胞膜上に蓄積若しくは分泌される。
上記培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
かくして得られる組換え蛋白は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作に従って分離、精製することができる（「生化学データブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５）：８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３：３１３（１９８７）等参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフイー、透析法、これらの組合せ等が挙げられる。特に好ましい上記方法としては、本発明ＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。
本発明は、上記の如くして得られる新規ＴＳＣ４０３蛋白質及びヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質並びに之等各蛋白質の製造技術をも提供するものである。本発明蛋白質は、前記のとおり医薬分野において有用である。
また、本発明蛋白質は、該蛋白の特異抗体を作成するための免疫抗原としても利用できる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、例えば上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生きれた蛋白質或はそのフラグメントであることができ、これら抗原の利用により、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を収得することができる。
之等抗体の製法自体は、当業者によく理解されている所であり、本発明における抗体の製法もこれら常法に従うことができる〔続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（１９８６）等参照〕。
例えば、抗血清の取得に際して利用される免疫動物としては、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ等の通常動物を任意に選択でき、上記抗原を使用する免疫方法や採血等もまた常法に従い実施できる。
モノクローナル抗体の取得も、常法に従い、上記免疫抗原で免疫した動物の形質細胞（免疫細胞）と形質細胞腫細胞との融合細胞を作成し、これより所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培養により実施することができる。免疫動物は、一般に細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択され、通常マウスやラット等が有利に用いられる。免疫は、上記抗血清の場合と同様にして実施でき、所望により通常のアジュバント等を抗原と併用することもできる。
尚、融合に使用される形質細胞腫細胞としても、特に限定なく、例えばｐ３（ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１５（１９７６）〕、ＳＰ２／０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７１（１９７８）〕等、ラットにおけるＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３（１９７９）〕等及びそれらに由来する細胞等の各種の骨髄腫細胞をいずれも使用できる。
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に公知の方法に準じて行なうことができる。所望のハイブリドーマの分離もまた同様に公知の方法に準じて行ない得る〔Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３（１９８１）；上記続生化学実験講座等〕。
目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化も常法により実施される。例えば抗体産生株の検索は、本発明蛋白質を抗原として利用したＥＬＩＳＡ法〔Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０：４１９−４３９（１９８０）〕、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法に従い実施することができる。
かくして得られるハイブリドーマからの本発明抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法により培養してその培養上清として得る方法、ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水として得る方法等により実施される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。このようにして得られる抗体は、更に塩析、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフイー等の通常の手段により精製することができる。
かくして得られる抗体は、本発明蛋白質に結合性を有することによって特徴付けられる。これは、本発明蛋白の精製及びその免疫学的手法による測定乃至識別等に有利に利用できる。本発明は、かかる新規な抗体をも提供するものである。
また、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の検出を行うことができる。
本発明によれば、癌組織において発現量が増加しているＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の存在を検出するために、血液、血清などの生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、之等試料中にＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の感受性遺伝子が存在する否かを分析することが可能である。
また、本発明によれば、細胞又は組織における新生物、悪性の前駆障害への進行、又は予後指標の存在を検出するために、障害を有する生物学的な試料を調製し、ＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の新生物遺伝子が存在するか否かを分析できる。この方法を用いることにより細胞又は組織における新生物、悪性の前駆障害への進行又は予後指標の存在を検出することが可能である。従って、例えば癌の診断、癌治療効果の判定、予後の予測などが可能である。
該検出方法は、次のようにして実施できる。例えば、腫瘍患者サンプルから得られたＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子に関する情報を基に、まずＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子のスクリーニング及び／又はその増幅に用い得るように設計したＤＮＡ断片を作成する。該ＤＮＡ断片には、次のようなものが含まれる。
（１）プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、（２）核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の全部又は一部のＤＮＡ断片を得るためのプローブとしての性質を有するもの。
これらＤＮＡ断片の作成のために、まずＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子と同じ配列を持つプライマーを作成する。このプライマーをスクリーニング用プローブとして用いて、生物学的試料（核酸試料）と反応させて、ＴＳＣ４０３遺伝子配列又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子配列を有する遺伝子の存在を確認する。
上記核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動又はドットブロッティングで調製することができる。
前記スクリーニング方法としては、ＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましい。該方法は、ＴＳＣ４０３遺伝子断片又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されず、従来公知の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））や新たに開発され或いは将来使用されるＰＣＲ変法（榊  佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊，８（９）（１９９０）；蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版（株），３５（１７）（１９９０））のいずれであってもよい。
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡは自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ：ファルマシア社製）を使用して合成できる。合成されるプライマー（センスプライマー又はアンチセンスプライマー）の長さは、約１０〜５０ヌクレオチド程度、より好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。
上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常標識したプローブであるが、非標識のものであってもよい。スクリーニングはまた直接的又は間接的に標識したリガンドとの特異的結合によることもできる。プローブ及びリガンドを標識する方法は、従来技術分野として知られており、該技術にはニック・トランスレーション、ランダム・プライミングム、キナーゼ処理等が包含される。標識として用いられる物質には、このような既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などが包含される。
上記検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｅ．Ｓ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，２１−２７（１９９１）〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロット解析〔Ｍｏｌｅｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．（１９８９）〕、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ〔Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：３１５９−３１６６（１９９３）〕やｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の細胞レベルでのそれら測定、ＮＡＳＢＡ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，３５０：９１−９２（１９９１）〕及び当該分野で知られている之等の変法、その他の各種方法によりいずれも良好に実施し得る。
本発明測定法は、試料中のＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。本発明は上記ＴＳＣ４０３遺伝予断片又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝予断片を含有するＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の検出用試薬キットをも提供する。
該試薬キットは、少なくとも配列番号：２又は５に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部又は全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を、それぞれ必須構成成分として含むことが重要である。その他の成分としては、標識剤、ＰＣＲ法に必要な試薬、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなどを含ませることができる。
標識剤としては、放射性同位元素や蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられる。これらはＤＮＡ断片自身を予め該標識剤でコンジュゲートした形態であってもよい。
更に本発明試薬キットには、測定の実施の便益のために、適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
本発明は、上記測定方法を利用した癌の診断方法及び該診断方法に用いられる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
また、前記本発明測定法を利用して得られる被検試料中のＴＳＣ４０３遺伝子配列又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子配列を、常法に従い直接的もしくは間接的に決定すれば、野生型ＴＳＣ４０３遺伝子又は野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子と相同性の高い相同物である、ＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子に関連する、新たな関連遺伝子（変異遺伝子）を見出すことができる。従って、本発明はかかる測定と被検試料中のＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の配列決定とによって、被検試料中のＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
また、本発明の配列番号：１又は４で示されるＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子がコードする蛋白質、該配列番号：１又は４において１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質又はこれらの断片に対する抗体（ポリクローナル又はモノクローナル抗体、以下これらを「ＴＳＣ４０３抗体又はヒトＩＮＧ１Ｌ抗体」という）を利用すれば、上記野生型ＴＳＣ４０３遺伝子、野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子、変異ＴＳＣ４０３遺伝子及び変異ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の測定が可能となる。
本発明は、かかる野生型ＴＳＣ４０３遺伝子、野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子、変異ＴＳＣ４０３遺伝子及び変異ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の測定法をも提供するものである。
該測定法によれば、新生物状態の障害の程度、或いは悪性腫瘍の悪性度を、野生型ＴＳＣ４０３遺伝子又は野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の配列分析によっても決定、検出できるが、より好ましくは上記ＴＳＣ４０３抗体又はヒトＩＮＧ１Ｌ抗体を用いた測定法によって検出できる。かくして、被検試料におけるＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の相違（変異）又はＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の存在の有無を検出することができる。
ＴＳＣ４０３抗体又はヒトＩＮＧ１Ｌ抗体を利用する本発明測定法によれば、該抗体は、例えば血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液から該試料に含まれるＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を免疫沈降させ得、またポリアクリルアミドゲルのウエスタン・ブロット又はイムノブロット上でＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質と反応し得る。
また、ＴＳＣ４０３抗体又はヒトＩＮＧ１Ｌ抗体は、免疫組織化学的技術にこれを利用することによって、パラフィン又は凍結組織切片中のＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を検出することができる。尚、上記ＴＳＣ４０３抗体又はヒトＩＮＧ１Ｌ抗体の産生技術及び精製技術は、当該分野においてよく知られている。かかる抗体の製造、精製にはこれらの技術を適宜採用することができる。
野生型ＴＳＣ４０３遺伝子、野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子又はそれらの変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法が包含される。また他の好ましい具体例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）などを例示することができる。
本発明は、ＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質に対して結合活性を有する、細胞膜画分又は細胞表面上に存在するＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターをも提供するものである。該ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターは、例えば、これらのレセプターを含む細胞膜画分又はこれらを含む生体材料試料中に、標識したＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を添加し、得られるレセプターと蛋白質とのコンジュゲート（ＴＳＣ４０３蛋白質結合反応物又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質結合反応物）を抽出、単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって製造、取得することができる。かかる該ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターの取得及び配列決定は、この分野で慣用される手段に従い、当業者に容易に実施できる。
本発明に係わるＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター或いはこれらの断片は、これらを種々の薬剤のスクリーニング技術に利用することができる。該技術によって、これらレセプターと反応性を有する化合物（低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、抗体など）をスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングに用いられるレセプター又はその断片は、適当な固体支持体に付着させて利用することができ、また細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物として利用することもできる。
上記薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、ＴＳＣ４０３蛋白質、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質又はそれらの断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物又は真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイに利用する方法を例示することができる。また、遊離の又は固定した形態のかかる宿主細胞を、標準結合アッセイに利用する方法によることもできる。より具体的には、試験する薬剤の共存下で、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はそれらの断片と、ＴＳＣ４０３蛋白質、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質又はそれらの断片とを反応させて複合体を形成させ、該複合体の形成が上記試験する薬剤によって阻害される程度を検出することによって、上記薬剤スクリーニングを行うことができる。
かくして、本発明によれば、当該分野で既知の方法によって、供試薬剤とＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はこれらの断片とを接触させ、次いで、得られる複合体の存在、又はＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はそれらの断片と各々のリガンドとの複合体の存在、を測定する薬剤スクリーニング方法が提供できる。
さらに、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター活性又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター活性を測定して、供試薬剤がＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターを阻害でき、かくしてＴＳＣ４０３蛋白質の活性又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の活性、例えば細胞増殖活性、の抑制ができるか否かを判断する。
かかる競合結合アッセイにおいて、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はそれらの断片は標識される。遊離のＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はそれらの断片を、各々、複合体として存在するものと分離し、該遊離（複合体非形成）物の標識量を測定することによって得られる測定値が、供試薬剤のＴＳＣ４０３蛋白質レセプターに対する結合又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターに対する結合の尺度となる。またこの測定値は、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターと、ＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質との結合の阻害の尺度ともなる。ＴＳＣ４０３蛋白質の又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の小さなペプチド（ペプチド疑似体）をこのようにして分析して、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター阻害活性又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター阻害活性を有するものとして測定することができる。
本発明における薬剤スクリーニングのための他の方法は、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターに対して適当な結合親和性を有する化合物のスクリーニング法である。この方法は、概略すると、多数の異なる供試ペプチド化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いで該供試化合物をＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターと反応させ、洗浄後、既知の方法にて、結合した反応物を検出する方法である（例えば、ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号参照）。
精製されたＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターは、直接、前記薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に被覆することができる。また、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターを固相上に固定することができる。
さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とする。ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター、ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプター又はそれらの断片に対する結合性につき、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターに特異的に結合できる中和抗体と、試験化合物とを競合させる。かかる上記中和抗体による競合反応によれば、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターの１又はそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性ＴＳＣ４０３遺伝子又は非機能性ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を供試薬剤の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該供試薬剤が例えば、細胞増殖を抑制することができるかどうかを確認する。上記増殖速度を測定する１手段には、ＴＳＣ４０３蛋白質レセプター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質レセプターの生物活性を測定する手段が包含される。
また本発明によれば、より活性な又は安定した形態のＴＳＣ４０３蛋白質の誘導体又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の誘導体、又は例えば、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質又は構造アナログ、例えばＴＳＣ４０３蛋白質アゴニスト又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質アゴニスト、ＴＳＣ４０３蛋白質アンタゴニスト又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質アンタゴニスト、ＴＳＣ４０３蛋白質インヒビター又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質インヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは、例えばＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質と、他の蛋白質との複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学、コンピューター・モデリング又はこれらの組み合わ方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
上記のより活性な又は安定した形態のＴＳＣ４０３蛋白質の誘導体又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の誘導体を得る方法としては、また例えばアラニン・スキャンによる分析法を挙げることができる。該方法は、上記各蛋白質を構成するある種のアミノ酸残基をアラニン残基で置換し、得られる蛋白質の活性に対する、その影響を測定する方法である。蛋白質のあるアミノ酸残基を、このように置換し、分析して、当該蛋白質の活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性なまたは安定なＴＳＣ４０３蛋白質の誘導体又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の誘導体を設計することができる。
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得ることができる。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり、単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
かくして、改善されたＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の活性もしくは安定性等を有するＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を、設計・開発することができる。
クローン化ＴＳＣ４０３遺伝子又はクローン化ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子を用いて、十分な量のＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究を行うこともできる。さらに、本発明の配列番号：１又は４に示されるアミノ酸配列よりなるＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるか又はこれに加えて、コンピューターモデリング技術も提供可能である。
本発明によれば、ＴＳＣ４０３遺伝子含有ノックアウト・マウス（変異マウス）又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子含有ノックアウト・マウス（変異マウス）を作成することができる。これによってＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子のどの配列部位が生体内で上記したような多様なＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の活性に影響を与えるのか、即ち、ＴＳＣ４０３遺伝子産物、ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子産物、改変ＴＳＣ４０３遺伝子産物又は改変ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子産物が、生体内でどのような機能を有するのかを確認することができる。
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた方法が知られている（Ｃａｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２（１９８９））。
尚、上記変異マウスの作製は、この分野で既知の技術であり、この改変技術（野田哲生編、実験医学，増刊，１４（２０）（１９９６）、羊土社）に本発明の野性型ＴＳＣ４０３遺伝子、野生型ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子、変異ＴＳＣ４０３遺伝子又は変異ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子が適用でき、これによって容易に各々の変異マウスを作製することができる。該技術の適用により、改善されたＴＳＣ４０３蛋白質活性又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質活性もしくはそれらの安定性を有する、ＴＳＣ４０３蛋白質又はヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
このように本発明は、本発明ＴＳＣ４０３遺伝子又はヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の検出用の特異プライマー及び／又は特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片並びにそれらを用いる癌の診断法法及びそのための診断キットをも提供するものである。
例えば本発明に係わる上記ＴＳＣ４０３遺伝子プローブは、本発明ＴＳＣ４０３遺伝子に特異的な２種のプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を用いて、一般的ＰＣＲ法に従って製造、取得することができる。かくして得られるプローブによれば、癌等の種々の組織での本発明遺伝子の発現を検出することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
実施例１
ＴＳＣ４０３遺伝子
（１−１）〔γ−３３Ｐ〕ＡＴＰで標識した表出方法
組織特異的な手法において発現したヒト遺伝子を確認するために〔γ−３３Ｐ〕ＡＴＰで標識した表出方法を用いた。該方法の手順は本質的に以下に示すリアングの方法（Ｌｉａｎｇ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，９６７−９７１（１９９２））によった。
即ち、１３のヒト組織（成人脳、胎児脳、肺、肝臓、胃、膵臓、脾臓、乳腺、前立腺、胎盤、精巣、腎臓及び心臓：クローンテック社製）の各々から単離したポリＡ  ＲＮＡ（０．２μｇ）を、ジエチルピロカーボネート処理された水８μｌ中で、３’−アンカード・オリゴｄＴプライマーＧ（Ｔ）１５ＭＡ（ＭはＧ、Ａ及びＣの混合液である）の２５ｐｍｏｌと混合し、６５℃で５分間加熱した。この溶液に４μｌの５×ファースト・ストランド緩衝液（ＢＲＬ社製）、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＢＲＬ社製）、１μｌの２５０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、１μｌのリボヌクレアーゼ・インヒビター（４０単位；ＴＯＹＯＢＯ社製）及び１μｌのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（２００単位；ＢＲＬ社製）を加えた。各反応液の最終容量は２０μｌとした。各溶液を３７℃で１時間培養した後、３０μｌの蒸留した水の付加により２．５倍までに希釈し、使用時まで−２０℃で貯蔵した。
ｃＤＮＡは、〔γ−３３Ｐ〕ＡＴＰで標識した（アマシャム社製）３’−アンカード・プライマーの存在下でのＰＣＲにより増幅させた。このｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、以下のとおり実施された。
即ち、各２０μｌのＰＣＲ混合液は、２μｌのＲＴ反応混合液、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラ社製）、４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍｌ：タカラ社製）、〔α−３３Ｐ〕ＡＴＰで標識した２５ｐｍｏｌの３’−アンカード・オリゴ−ｄＴプライマー及び２５ｐｍｏｌの５’−プライマー（Ｎｏ．２０、配列番号：７に示す配列の任意配列を有する１０−ｍｅｒデオキシオリゴヌクレオチド・プライマー）を含んでいた。また、ＰＣＲ反応は以下の条件で行なった。即ち、９５℃で３分間、４０℃で５分間及び７２℃で５分間を１サイクルとして行ない、それから９５℃で０．５分間、４０℃で２分間及び７２℃で１分間を４０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間反応させた。
ＰＣＲ反応サンプルをエタノールで抽出し、フォルムアミド・シークエンシング染料中に再懸濁して、６％アクリルアミド７．５Ｍウレア・シークエンシング・ゲル上で反応させた。ゲルは固定することなしに乾燥させ、一晩オートラジオグラフィーを実施した。
（１−２）増幅されたｃＤＮＡ断片のサブ・クローニング
予め乾燥ゲルを載せた３ＭＭ濾紙上にラジオアクティブインクで印を付けておき、これとオートラジオグラムをあわせることにより、目的のｃＤＮＡを含むバンドが含まれるゲルを、３ＭＭ濾紙ごと切り出した後、３００μｌのｄＨ２Ｏにて１時間攪袢した。ポリアクリルアミド・ゲルと濾紙を取り除いた後、ｃＤＮＡを担体として１μｌの１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンと０．３Ｍ  ＮａＯＡｃの存在下に、エタノール沈澱によって再回収し、１０μｌのｄＨ２Ｏに再溶解した。再増幅のために、５μｌのこの溶液が用いられた。ＰＣＲの条件とプライマーは最初のＰＣＲに対してと同じとした。適当な大きさの再増幅産物を第一のＰＣＲ産物として再回収し、それからそのＰＣＲ産物をｐＵＣ１１８ベクター（タカラ社製）のＨｉｎｃ  ＩＩ部位にクローンニングした。核酸配列はＡＢＩ３７７自動シークエンサー（アプライド・バイオ・システムズ社製）によって決定した。
上記方法にて、１３のヒト組織から単離したｍＲＮＡを用いて異なる表出パターンを比較した結果、肺に特異的に発現した一つのＰＣＲ産物を確認した。これをＴＳＣ４０３ＤＤと命名した。
この産物は、２５２ヌクレオチドからなっていた。ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８））を使用するＧｅｎＢａｎｃｋ／ＥＭＢＬデータ・ベース中のＤＮＡ配列とこのヌクレオチドのデータとの比較より、このＰＣＲ産物が他の如何なる公知のＤＮＡ配列とも相同性を有しないことが明らかとなった。
（１−３）ｃＤＮＡのスクリーニング
ヒト正常肺ｃＤＮＡライブラリーは、オリゴ（ｄＴ）＋ランダムヘキサマー−プライムド・ヒト正常肺ｃＤＮＡとＵｎｉ−ＺＡＰＴＭ  ＸＲ（ストラタジーン社製）を用いて、構築した。１×１０６個のクローンの全体を上記方法によって単離し、〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰにて標識されたｃＤＮＡ断片を用いてそのスクリーニングを行なった。陽性クローンを選択し、それらの挿入ｃＤＮＡ部をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）中のイン・ビボに切り出した。
その結果、上記ＴＳＣ４０３ＤＤに対して約１００のプラークを確認した。この結果より、全ＲＮＡ間の転写量は、およそ０．０１％であると計算された。ＴＳＣ４０３ＤＤに相同する集合したｃＤＮＡ配列（ＴＳＣ４０３）は、計算された分子量４４３１６Ｄａを有する４１６アミノ酸の蛋白をコードする１２４８ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームを含む３１９８ヌクレオチドを含んでいた。
一次配列からこの遺伝子の産物（ＴＳＣ４０３蛋白質）は、膜貫通ドメインを含む蛋白であることが明らかとなった。
その染色体上の位置は、各種癌において染色体異常が認められる第３染色体ｑ２７であった。
また、本発明遺伝子ＴＳＣ４０３は、ヒトｌａｍｐ−１及びｌａｍｐ−２と約３０％のホモロジーを有していた。
（２）組織における発現
組織におけるＴＳＣ４０３の発現プロファイルを調べるため、各種のヒト組織を用いたノーザンブロット分析を行った。
ノーザン・ブロット分析には、ヒトＭＴＮ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロットＩとＩＩ（クローンテック社製）を使用した。ｃＤＮＡ断片は、Ｔ３とＴ７プロモーター配列のプライマー・セットを用い、ＰＣＲによって〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識した。増幅産物を含むメンブランをプレハイブリダイズ（条件は製品のプロトコールに従った）し、それから製品のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、洗浄した膜を−８０℃で２４時間オートラジオグラフに露光した。その結果は図１に示すとおりである。
該図において、用いたヒト組織は、心臓（Ｈｅａｒｔ）、脳（ｂｒａｉｎ）、胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、骨格筋（Ｓ．ｍｕｓｃｌｅ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、卵巣（Ｏｖａｒｙ）、小腸（Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、結腸（Ｃｏｌｏｎ）及び末梢血白血球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ；  Ｐ．Ｂ．Ｌ．）である。
該図より、ＴＳＣ４０３に相同する転写体が肺（Ｌｕｎｇ）において特異的に観察された。
（３）ＦＩＳＨ
染色体の整列のためのＦＩＳＨは、公知の方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，８６，１４−１６（１９９０））に従って、各コスミドＤＮＡの０．５μｇをプローブとして使用して実施した。ＦＩＳＨはプロビア１００フィルム（フジ社製、ＩＳＯ１００）又はＣＣＤカメラ・システム（アプライド・イメージング、サイトビジョン社製）によって捕えられた。
その結果、１００の典型的なＲ−バンド（前）分裂中期の細胞を試験したシグナルは、第３染色体のバンドｑ２７に局在していた。従って、ＴＳＣ４０３の染色体の局在部位は、３ｑ２７と同定できた。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ分析による癌細胞株と癌組織における転写物の発現
ＴＳＣ４０３遺伝子の発現がヒト癌細胞株と癌組織において変異するかどうかを調べるために、４つの細胞株（Ａｓｐｃ１（転移性腺癌，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，６７，５６３−５６９（１９８１）），Ｂｘｐｃ３（腺癌・未分化，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，４，１５−２３（１９８６）），ＭｉａＰａｃａ２（腺癌，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９，１２８−１３５（１９７７））及びＰＡＮＣ１（類上皮性、膵管癌、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１５，７４１−７４７（１９７５））と９の癌組織（東京大学医科研究所、中村先生より供与）のＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。
即ち、全ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（和光社製）を使用して細胞株と癌組織から単離した１０μｌの全ＲＮＡを１０単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ  Ｉベーリンガー・マインハイム社製）で１５分間処理し、フェノール−クロロフォルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄ（Ｔ）とランダムプライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＴＭ  ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ライフ・テクノロジー社製）によって合成した。２μｌの各産物をＰＣＲ増幅のために用いた。
配列番号：８及び配列番号：９として示す塩基配列のプライマーＰ１及びＰ２を、２５サイクルのＰＣＲ増幅のために使用した。
尚、ＰＣＲ反応は２５ｎｇｃＤＮＡ、１０μＭ各プライマー、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ及び０．２５ＵのＥｘ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）を含む２０μｌ溶液中で行なった。ＰＣＲ産物は、エチジウム・ブロマイト染色した１．５％アガロースゲル中に溶解させた。
上記に従い、４種の細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ；レーン１＝ＡｓＰｃ−１，レーン２＝ＢｘＰｃ−３，レーン３＝ＭＩＡｐａｃａ，レーン４＝ＰＡＮＣ−１）、正常膵臓組織（Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、レーン１及び２）、膵癌組織（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ；レーン１〜１１）及び正常肺組織（Ｎｏｒｍａｌ  Ｉｕｎｇ）をＲＴ−ＰＣＲ分析した結果は、図２に示す通りである。
該図より、ＴＳＣ４０３発現は、正常膵臓組織（Ｎｏｒｍａｌ  ｐａｎｃｒｅａｓレーン１及び２）においては見当らず、膵癌組織（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒレーン１〜１１及びＣｅｌｌ  Ｉｉｎｅｓレーン１〜４）にのみ認められることが判った。
尚、上記で利用した４種の細胞株は、それぞれＡＴＣＣに寄託されたものであり、その寄託番号は次の通りである。
Ａｓｐｃ−１；ＣＲＬ−１６８２
ＢｘＰｃ−３；ＣＲＬ−１６８７
ＭＩＡｐａｃａ；ＣＲＬ−１４２０
ＰＡＮＣ−１；ＣＲＬ−１４６９
（５）各種の癌におけるＴＳＣ４０３遺伝子の発現（ノーザンブロット解析）
ＴＳＣ４０３遺伝子の発現を、下記に示す種々の癌組織及び正常組織ｍＲＮＡサンプルを載せたプロット（インビトロゲン社製）にＴＳＣ４０３遺伝子をハイブリダイズさせて調べた（腫瘍ノーザンブロット解析）。尚、用いた各癌組織及び正常組織はいずれもインビトロゲン社より購入したものである。
得られた結果を図３、図４及び図５に示す。尚、各図において用いた癌組織及び正常組織はそれぞれ次のとおりである。
図３；
ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ（脳癌組織）、ｂｒａｉｎ  ｎｏｒｍａｌ（正常脳組織）、ｋｉｄｎｅｙ  ｔｕｍｏｒ…腎臓癌組織）、ｋｉｄｎｅｙ  ｎｏｒｍａｌ（正常腎臓組織）、ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｒ（肝臓癌組織）、ｌｉｖｅｒ  ｎｏｒｍａｌ（正常肝臓組織）、ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ（肺癌組織）、ｌｕｎｇ  ｎｏｒｍａｌ（正常肺組織）、ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ（胸癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｂｒｅａｓｔ（正常胸組織）、ｕｔｅｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ（子宮癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｕｔｅｒｉｎｅ（正常子宮組織）、ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅ  ｔｕｍｏｒ（卵管（ファロピアン）癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅ（正常卵管組織）、ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ（卵巣癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｏｖａｒｙ（正常卵巣組織）。
図４：
ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｔｕｍｏｒ（食道癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ（正常食堂組織）、ｓｔｏｍａｃｈ  ｔｕｍｏｒ（胃癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｓｔｏｍａｃｈ（正常胃組織）、ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ（大腸癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｏｎ（正常大腸組織）、ｒｅｃｔｕｍ  ｔｕｍｏｒ（直腸癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｒｅｃｔｕｍ（正常直腸組織）、ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ（甲状腺癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｔｈｙｒｏｉｄ（正常甲状腺組織）、ａｄｒｅｎａｌ  ｔｕｍｏｒ（副腎癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ａｄｒｅｎａｌ（正常副腎組織）、ｐａｒｏｔｉｄ  ｔｕｍｏｒ（耳下腺癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｐａｒｏｔｉｄ（正常耳下腺組織）、ｌｙｍｐｈｏｍａ（リンパ腫）、ｎｏｒｍａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ（正常リンパ腺）。
図５：
ｋｉｄｎｅｙ  ｔｕｍｏｒ（腎臓癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｋｉｄｎｅｙ（正常腎臓組織）、ｕｒｅｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ（尿管癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｕｒｅｔｅｒ（正常尿管組織）、ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒ（膀胱癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ（正常膀胱組織）、Ｓｔｏｍａｃｈ  ｔｕｍｏｒ（胃癌組織）、ｎｏｒｍａｌ  ｓｔｏｍａｃｈ（正常胃組織）、ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ（卵巣癌組織、４例）、ｏｖａｒｉａｎ  ｎｏｒｍａｌ（正常卵巣組織、４例）。
各図より、正常肺におけるＴＳＣ４０３の有意な発現が観察された。また、乳癌（図３）、卵管癌（図３）、食道癌（図４）、大腸癌（図４）、直腸癌（図４）、甲状腺癌（図４）、耳下腺癌（図４）、尿管癌（図５）及び卵巣癌（図５、４例中２例）において、ＴＳＣ４０３遺伝子の発現が認められた。
（６）ＴＳＣ４０３遺伝子発現によるフォーカス形成試験
ＴＳＣ４０３遺伝子のオープンリーディングフレーム全長を、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（インビトロゲン社）ベクターのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩサイトに導入してＴＳＣ４０３遺伝子発現ベクターを得た。
次いで、上記で得られた発現ベクターを用いて、ＴＳＣ４０３遺伝子が細胞癌化能を持つか否かを検討するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたフォーカスアッセイを文献記載の方法に従い実施した（Ｓｈｉｎ，Ｃ．，Ｓｈｉｌｏ，Ｂ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７６，５７１４−５７１８（１９７９））。
結果を図６（ＴＳＣ４０３遺伝子を導入していないコントロール細胞）及び図７（ＴＳＣ４０３遺伝子導入細胞）に示す。
各図の対比より明らかなとおり、ＴＳＣ４０３遺伝子を導入して細胞に該遺伝子を強制発現させたときには、図７に示されるとおり、フォーカスが明らかに形成された。このことから、ＴＳＣ４０３遺伝子は、その遺伝子を過剰発現させることにより、細胞の悪性形質転換の一つである接触阻止現象への感受性喪失を起こし、癌化に深く係わっていることが明らかである。
実施例２
ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子
（１）ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子のクローニング及びＤＮＡ
シークエンシング
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデーターベース検索により、腫瘍抑制蛋白質と考えられるｐ３３ＩＮＧ１に高い相同性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを有する一つのクローン（ＧＥＮ−１４６Ｆ１１）を、次の通り単離した。
即ち、ヒト胎児脳より抽出したｍＲＮＡをクローンテック社より購入して出発材料とした。上記ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、ベクターλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した（大塚ＧＥＮリサーチ・インスティチュート、大塚製薬株式会社）。インビボ・エキシジョン法（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ：Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，７５８３−７６００（１９８８））によって寒天培地上にヒト遺伝子を含む大腸菌コロニーを形成させ、ランダムにそのコロニーをピックアップし、９６ウエルマイクロプレートにヒト遺伝子を含む大腸菌クローンを登録した。登録されたクローンは、−８０℃にて保存した。
次に登録した各クローンを１．５ｍｌのＬＢ培地で一昼夜培養し、プラスミド自動抽出装置ＰＩ−１００（クラボウ社製）を用いてＤＮＡを抽出精製した。尚、コンタミした大腸菌のＲＮＡは、ＲＮａｓｅ処理により分解除去した。最終的に３０μｌに溶解し、２μｌはミニゲルによりおおまかにＤＮＡのサイズ及び量をチェックした。その７μｌをシークエンス反応用に用い、残りの２１μｌは、プラスミドＤＮＡとして４℃に保存した。
続いてＴ３、Ｔ７、或は合成オリゴヌクレオチド・プライマーを用いるサンガーらのジデオキシターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７））或はジデオキシターミネーター法にＰＣＲ法を加味した方法であるサイクルシークエンス法（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４−４９９（１９８９））を実施した。之等の方法は少量のプラスミドＤＮＡ（およそ０．１−０．５μｇ）をテンプレート（鋳型）として４種の塩基を特異的に停止する伸長反応させる方法である。
シークエンスプライマーとして、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光標識したものを使用し、Ｔａｑポリメラーゼにより約２５サイクル反応させた。蛍光標識したＤＮＡ断片につき、自動ＤＮＡシークエンサー、ＡＬＦＴＭＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）によりｃＤＮＡの５’末端側から約４００塩基の配列を決定した。
３’非翻訳領域は、各遺伝子の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が高く、個々の遺伝子を区別するのに適しているので、場合によっては、３’側のシークエンスも行った。
ＤＮＡシークエンサーで得られた膨大な塩基配列情報を、６４ビットのコンピューターＤＥＣ３４００に転送し、コンピュターによるホモロジー解析を行なった。該ホモロジー解析は、ＵＷＧＣＧのＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８５，２４４４−２４４８（１９８８））によるデーターベース（ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ）検索により行った。
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーについての上記解析方法は、藤原ら〔Ｆｕｊｉｗａｒａ，ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，２，１０７−１１１（１９９１）〕に詳述されている。
上記に従い、構築されたヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択したおよそ５０４０のＥＳＴｓ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ：発現遺伝子断片の部分ＤＮＡ配列）の配列決定を実施した。
ＦＡＳＴＡプログラムによるＧｅｎｅ  ＢａｎｋとＥＭＢＬの配列検索の中で、ＧＥＮ−１４６Ｆ１１と命名したクローンが、ｐ３３ＩＮＧ１〔ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ００１９５４〕に高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有することを発見した。
上記ＧＥＮ−１４６Ｆ１１クローンの持つ全長配列を明確にするため、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼと合成プライマーとを使用するＤＮＡシーケンスシングを行い、また、テンプレート（鋳型）としてベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｖｅｃｔｏｒ：ストラタジーン社製（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））内に挿入された二本鎖ＤＮＡと、プライマーとしての合成オリゴヌクレオチドとを使用して、サンガーらのジデオキシ・チェーン・ターミネェーション法によって、全コード領域を含むｃＤＮＡの塩基配列を決定し、他のいくつかの関連遺伝子のＤＮＡ配列と比較した。
配列番号：６に、ＧＥＮ−１４６Ｆ１１クローン（ｃＤＮＡ）の核酸配列を、配列番号：５に、該クローンのコーディング領域の核酸配列を、また配列番号：４に、該核酸配列でコードされる推定アミノ酸配列を示す。
上記核酸配列中、開始シグナル配列は９２−９４番目の核酸残基の位置に見つけられ、これが翻訳開始コドンと推定された。推定終始コドンは、９３２−９３４番目の核酸残基の位置に見つけられた。
ｃＤＮＡは、１０７８ヌクレオチドの長さであり、２８０アミノ酸の推定蛋白質をコードする８４０塩基対のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
ＦＡＳＴＡプログラムでの相同性検索により、この遺伝子が、ｐ３３ＩＮＧ１〔ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ０４４０７６〕と高い相同性を有するアミノ酸配列をコードすることが判った。その塩基配列の相同性は、６０．０％であった。
また、アミノ酸配列レベルにおいて、本発明遺伝子によりコードされる蛋白の推定アミノ酸配列と、上記ｐ３３ＩＮＧ１〔ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ０４４０７６〕との相同性を調べた結果を図８に示す。
図８は、アミノ酸配列を一文字表記してあり、上段は本発明遺伝子によりコードされるヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の配列（「ｈＩＮＧ１Ｌ」と表示）を、下段はｐ３３ＩＮＧ１の配列（Ｇａｒｋａｖｅｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｇｅｎｅｔ．，１４，４１５−４２０（１９９６）；Ｇａｒｋａｖｅｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，２０１４−２０１９（１９９７）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ００１９５４，但し、この配列はその後訂正がなされており、訂正後の配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ０４４０７６に示されている。図中、「ｐ３３ＩＮＧ１」と表示）を示す。
また、該図における黒塗り（黒箱）は、同一アミノ酸残基であり、網掛け（綱掛け箱）は、類似アミノ酸残基である。ｈＩＮＧ１Ｌにおける−−−−はギャップを示す。
該図より本発明遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、ｐ３３ＩＮＧ１のアミノ酸配列と５８．９％（訂正されたｐ３３ＩＮＧ１配列に基づいて計算）の相同性を有することが判る。
（２）ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるヒトＩＮＧ１ＬｍＲＮＡの発現を、ランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング法によって、標識したヒトｃＤＮＡクローンをプローブとするノーザンブロットにより評価した。
ノーザンブロット分析は、製品使用法に従い、ヒトＭＴＮブロット（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ；クローンテック社製）を用いて実施した。
即ち、上記クローンＧＥＮ−１４６Ｆ１１の全配列をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ増幅産物を［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識してプローブとした。
ブロットを４時間プレハイブリダイズ後、４２℃で一晩、５０％ホルムアミド／５×ＳＳＣ／１０×デンハルツ溶液／２％ＳＤＳ溶液（１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有）の溶液中でハイブリダイズした。２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて室温下にて２回洗浄後、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて６５℃下に１５分間で２回洗浄した。フィルターは−７０℃下で、Ｘ線フィルム（コダック社製）に対して露光した。
１８時間の露光の結果を図９に示す。
図９より、試験した１６のヒト成人臓器由来の組織の全て（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血及びリンパ球、図中それぞれ「Ｈｅａｒｔ」、「Ｂｒａｉｎ」、「Ｐｌａｃｅｎｔａ」、「Ｌｕｎｇ」、「Ｌｉｖｅｒ」、［Ｓｋｅｌｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ」、「Ｋｉｄｎｅｙ」、「Ｐａｎｃｒｅａｓ」、「Ｓｐｌｅｅｎ」、「Ｔｈｙｍｕｓ」、「Ｐｒｏｓｔａｔｅ」、「Ｔｅｓｔｉｓ」、「Ｕｔｅｒｕｓ」、「Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」、「Ｃｏｌｏｎ」、「Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ」及び「Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ」と表示）において発現が認められ、約１．５ｋｂ及び１．３ｋｂの二つの転写体が検出された。
また、大腸癌、食道癌、卵管癌、胃癌などのいくつかの癌組織についても、ヒトＴＰブロット（Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｎｅｌ  Ｂｌｏｔ；インビトロ−ジェン社製）を、製品仕様書に従って用いて、同様のノーザンブロット分析を行った。
大腸癌患者組織についての結果を図１０に示す。
図中、Ｔは大腸由来の腫瘍組織（図中Ｔ：Ｔｕｍｏｒと表示）を、Ｎは大腸由来の正常組織（図中Ｎ：Ｎｏｒｍａｌと表示）を示す。また、一組のＴ及びＮは１人の患者由来の組織であり、図は４名の患者由来の組織の結果を示している。
該図より、各患者とも、正常組織と比較して癌組織において、ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子発現量が増加していることが明らかである。
このことから、本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子は、癌の研究や治療分野において有用であり、特に癌診断への応用ができ、またヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の発現産物に対する拮抗阻害剤を開発できれば、これは抗癌剤として利用できると考えられる。
（３）ＦＩＳＨ、ラジエーションハイブリッド法による染色体マッピング
染色体の整列のためのＦＩＳＨは、公知の方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，８６，１４−１６（１９９０））に従って、各コスミドＤＮＡの０．５μｇをプローブとして使用して実施した。ＦＩＳＨはプロビア１００フィルム（フジ社製、ＩＳＯ１００）又はＣＣＤカメラ・システム（アプライド・イメージング、サイトビジョン社製）によって捕えられた。
その結果、１００の典型的なＲ−バンド（前）分裂中期の細胞を試験したシグナルは、ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子の染色体座位は、４ｑ３５．１の位置にあることが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、新規な肺特異的遺伝子ＴＳＣ４０３及びこれによりコードされる蛋白質が提供される。これらの利用によれば、肺癌、膵臓癌等の癌や癌化の解明、その診断、予防及び治療等に有用な技術が提供される。
また本発明によれば、新規なヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出、該遺伝子の発現産物であるヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質の遺伝子工学的製造及び該蛋白質に対する特異抗体の作製が可能であり、これらにより、前述したように、細胞周期や細胞増殖抑制及び活性化の研究、細胞の加齢やアポトーシスなどの研究、之等が関与する疾患、例えば癌の研究や治療、診断が可能となる。また、上記ヒトＩＮＧ１Ｌ蛋白質に対する拮抗阻害剤、即ち、細胞増殖抑制剤、抗癌剤などの開発やスクリーニングも可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は実施例１の（２）に従うノーザンブロット分析により調べた本発明ＴＳＣ４０３遺伝子のヒト組織における分布を示す図面代用写真である。
図２は実施例１の（４）に従う、各種正常組織及び癌組織のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す図面代用写真である。
図３は実施例１の（５）に従う、ノーザン解析によるＴＳＣ４０３遺伝子のヒト組織における発現を示す図面代用写真である。
図４は実施例１の（５）に従う、ノーザン解析によるＴＳＣ４０３遺伝子のヒト組織における発現を示す図面代用写真である。
図５は実施例１の（５）に従う、ノーザン解析によるＴＳＣ４０３遺伝子のヒト組織における発現を示す図面代用写真である。
図６は、実施例１の（６）に従う、フォーカス形成試験におけるコントロール細胞の図面代用写真である。
図７は、同実施例１の（５）に従うフォーカス形成試験における本発明ＴＳＣ４０３遺伝子導入細胞の図面代用写真である。
図８は、本発明ヒトＩＮＧ１Ｌ遺伝子によりコードされる蛋白の推定アミノ酸配列と、ｐ３３ＩＮＧ１のそれ〔ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ．Ｃ．Ｎｏ．ＡＦ０４４０７６〕との相同性を調べた結果を示す。
図９は、実施例２の（２）に従う１６のヒト成人臓器由来組織についてのノーザンブロット分析結果を示す図面代用写真である。
図１０は、実施例２の（２）に従う大腸癌患者組織についてのノーザンブロット分析結果を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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