(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を３’末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの３’側に隣接して位置して該染色体又は核酸断片とハイブリダイズし、５’末端の１塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、特定核酸とハイブリダイズさせ、(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチドが結合することにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法。
【請求項２】
試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼが、Tth、Taq、KODまたはPfu由来の耐熱性酵素である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定するためのキットであって、(i)該塩基多型の部位を３’末端に有する、野生型第一オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の多型第一オリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一オリゴヌクレオチド、(ii)該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの３’側に隣接して位置して、該染色体又は核酸断片とハイブリダイズし、５’末端の１塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、(iii)ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び(iv)検出プローブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるキット。
【請求項１０】
塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸配列の分析法に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれる塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生物学及びこれらに関連する産業分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。また体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, pp87-96; Balantら, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554、1989）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
他の方法として、サザンハイブリダイゼーション法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工学 増補版」丸善株式会社発行、第７０〜７５頁）。この方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロースやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフィー等により検出する。
【０００５】
サザンハイブリダイゼーション法によれば、目的とする核酸断片の電気泳動位置や分子量を決めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことができないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プローブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出するための類似配列を識別することが困難である等の問題があった。
【０００６】
近年、酵素を用いた核酸配列の識別方法として、ligaseを用いた方法（特公平６−４４８８０号公報、特許第２６２２２５５号）や、ヌクレアーゼを用いた方法（特開平２−２０２９８号、特開平３−４３０９８号）が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、リガーゼ活性と、ヌクレアーゼ活性を逐次及び／又は同時に用いることによって、塩基多型を容易に検出することができることを見出した。
【０００９】
具体的には、特定の塩基多型部位を含む染色体又は核酸断片（以下、単に核酸ということがある。）の１つのストランドに相補的で、（１）塩基多型部位で野生型の塩基と相補的な配列（塩基）を有する第一野生型オリゴヌクレオチドと、第一野生型オリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズし、塩基多型部位で野生型の塩基と相補的でない塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチドと、（２）塩基多型部位で多型の塩基と相補的な配列（塩基）を有する一種以上の第一多型オリゴヌクレオチドと、第一多型オリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズし、塩基多型部位で多型の塩基と相補的でない塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチドとを、特定の塩基多型を含む染色体又は核酸断片とハイブリダイズさせ、ヌクレアーゼ活性とリガーゼ活性を同時に用い、それを検出することによって、塩基多型を検出することができることを見出した。
【００１０】
より具体的には、第二オリゴヌクレオチド中の塩基多型部位の相補的でない部分のみを５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼで正確に削除したときにのみリガーゼで結合できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．  試料中に含まれる塩基多型を検出する方法において、ヌクレアーゼ活性と、リガーゼ活性を逐次及び／又は同時に用いる方法。
項２．  試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列の塩基多型を検出する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いる項１に記載の方法。
項３．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一である項１または２記載の方法。
項４．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．  リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項２〜４のいずれかに記載の方法。
項６．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項１〜３のいずれかに記載の方法。
項７．  耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来する項６に記載の方法。
項８．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼである項１〜７のいずれかに記載の方法。
項９．  ＤＮＡポリメラーゼが、Tth、Taq、KODまたはPfu由来の耐熱性酵素である項８に記載の方法。
項１０．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、
(1)該染色体又は核酸断片の野生型及び／又は塩基多型の配列部分を含む第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、該染色体又は核酸断片とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法。
項１１．  各々のオリゴヌクレオチドが結合することによって得られる１本のオリゴヌクレオチドを、検出用プローブを用いて検出する項１０に記載の方法。
項１２．  該塩基多型の配列部分が、１塩基であって、該塩基が塩基多型が予測されるものである項１０又は１１に記載の方法。
項１３．  各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に生じる塩基多型の配列部分で塩基対を形成しない塩基をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチドが結合することにより１本のオリゴヌクレオチドとすることを、繰り返して行う項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
項１４．  第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、予め標識されている項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
項１５．  標識が酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団および特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法である項１４に記載の方法。
項１６．  第二オリゴヌクレオチドの塩基多型配列部分で塩基対を形成しない配列部分と標的配列にハイブリダイズしている第一オリゴヌクレオチドに各異なる標識が結合してあり、ヌクレアーゼ活性により塩基対を形成していない部分の配列が除去されたとき、該２種類の標識により除去されたか否かを検出できる第２オリゴヌクレオチドを含む項１１に記載の方法。
項１７．  塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む項１〜１６のいずれかに記載の方法。
項１８．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、
(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を３‘末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの３’側に隣接して位置して該染色体又は核酸断片とハイブリダイズし、５‘末端の１塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、特定核酸とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチドが結合することにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法。
項１９．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いる項１８に記載の方法。
項２０．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一である項１８または１９記載の方法。
項２１．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
項２２．  リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
項２３．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
項２４．  耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来する項２３に記載の方法。
項２５．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼである項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
項２６．  ＤＮＡポリメラーゼが、Tth、Taq、KODまたはPfu由来の耐熱性酵素である項２５に記載の方法。
項２７．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、
(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を５‘末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの５’側に隣接して位置して、該染色体又は核酸断片とハイブリダイズし、３‘末端の１塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、特定核酸とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチドが結合することにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法。
項２８．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いる項２７に記載の方法。
項２９．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一である項２７または２８記載の方法。
項３０．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
項３１．  リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素である項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
項３２．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
項３３．  耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来する項３２に記載の方法。
項３４．  ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼである項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
項３５．  ＤＮＡポリメラーゼが、Tth、Taq、KODまたはPfu由来の耐熱性酵素である項３４に記載の方法。
項３６．  試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定するためのキットであって、(i)野生型第一オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の多型第一オリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一オリゴヌクレオチド、(ii)該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、(iii)ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び(iv)検出プローブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるキット。
項３７．  塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む項１８〜３５のいずれかに記載の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ遺伝子が挙げられる。
【００１３】
本発明において、染色体又は核酸断片の多型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される多型を有しているか否かを検査する方法である。
【００１４】
本発明における塩基多型を検出する方法においては、ヌクレアーゼ活性とリガーゼ活性を逐次及び／又は同時に用いることを特徴とする。該活性は、例えば、酵素によって行うことができ、両活性を備えた酵素を使用することも可能である。
【００１５】
具体的には、ヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、Mung beanヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VII等を例示することができ、リガーゼ活性を含む酵素としては、T4DNA リガーゼ、Ecoli  DNA リガーゼ、RNA リガーゼ等を例示することができる。
【００１６】
上記ヌクレアーゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素は、耐熱性酵素であることが好ましい。好ましくは、耐熱性酵素がTth、Taq、KOD、Pfuに由来するのがよい。
【００１７】
また、ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼ、より具体的には、ＤＮＡポリメラーゼが、Tth、Taq、KOD、Pfu由来の耐熱性酵素であるのが好ましい。
【００１８】
本発明の塩基多型の検出方法の具体的態様としては、試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、
(1)該染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を含む第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分が重なる配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、該染色体又は核酸断片とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に生じる塩基多型の配列部分で塩基対を形成しない塩基をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法である。
【００１９】
具体的には、第一オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的な塩基を含むオリゴヌクレオチドである。好ましくは、該塩基多型が予想される部分は、第一ヌクレオチドの３’又は５’末端がよい。
【００２０】
第一オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドよりも５‘側にある場合には、該塩基多型の部位は、第一オリゴヌクレオチドの３’末端にあり、第一オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドよりも３’側にある場合には、該塩基多型の部位は、第一ヌクレオチドの５’末端にあり、更に、５’にリン酸基を有する。
【００２１】
第二オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的でない塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１塩基で第一オリゴヌクレオチドとオーバーラップする。
【００２２】
本発明における各オリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基である。
【００２３】
例えば、第一オリゴヌクレオチドの３’末端塩基が塩基多型部位の予想されるオリゴヌクレオチドになるように設計し、野生型第一オリゴヌクレオチドは野生型核酸の該塩基と相補的な塩基、及び多型第一オリゴヌクレオチドは多型核酸の該塩基と相補的な塩基を配置させる。さらに、第二オリゴヌクレオチドの５’末端が第一オリゴヌクレオチドと１塩基オーバーラップするよう設計する場合は、該第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする塩基は、野生型、多型とも、相補的な塩基以外のもの選択する。野生型、多型共に相補的でない塩基を選択することによって、第二オリゴヌクレオチドは１種類調製するのみでよい。その組み合わせの例は以下の通りである。
【００２４】
【表１】
0004310599.tif 000002
【００２５】
この原理によって、このように設計した場合野生型第一オリゴヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び多型第一ヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／多型核酸の組合せにおいてのみ、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする部分を除いて、完全に一致する為ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性によって、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは連結して１本になるが、野生型第一オリゴヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／多型核酸及び多型第一ヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいては、第一オリゴヌクレオチドの３‘末端が相補的にならないので、ヌクレアーゼ活性が働かず、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップ部分が除去されないので、リガーゼ活性による連結が起こらない。
【００２６】
ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性
本発明においては、上記野生型第一オリゴヌクレオチドと多型第一オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
【００２７】
i)上記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを塩基多型を含む染色体又は核酸断片にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズさせる条件は、通常行われる条件でよい。例えば、モレキュラークローニングに記載の方法に従って、行うことができる。
【００２８】
ii)次に第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップした部分を、ヌクレアーゼ活性を用いて切断する。使用できる酵素活性としては、上述したとおりである。好ましくは、エキソヌクレアーゼ活性が好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ等のエキソヌクレアーゼが好ましい。
【００２９】
第二オリゴヌクレオチドの５‘末端が第一オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている場合には、５’エキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップしている部分を切断し、リン酸基が突出する。
【００３０】
一方、第二オリゴヌクレオチドの３’末端が第一オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている場合には、３’エキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップしている部分を切断する。
【００３１】
iii)同時に、５’側にあるオリゴヌクレオチドと３’側にあるオリゴヌクレオチドをリガーゼ活性を用いて結合させ、１本のオリゴヌクレオチドにする。
【００３２】
本発明において、第一オリゴヌクレオチド中の塩基多型に対応する部位が相補的でないと、エンドヌクレアーゼで切断されても、塩基多型に対応する部位が相補的でないため、リガーゼ活性によって１本のオリゴヌクレオチドに結合することができない。
【００３３】
野生型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を用いた場合、試料核酸が野生型であれば１本鎖となるが、多型では反応が起きない。逆に、多型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を用いた場合、試料核酸が多型であれば１本鎖となるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型を用いて反応を行い、他方は多型を用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか多型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、多型のホモか、ヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と多型遺伝子が共に存在するから野生型を用いた場合も多型を用いた場合も反応が起きる。
【００３４】
野生型と多型第一オリゴヌクレオチドに別々に異なる標識を付加しておくことで、試料を二つに分ける必要はない。
【００３５】
標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、上記ハイブリダイゼーションをする前に、前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。
【００３６】
上記増幅法としては特に限定されるものではないが、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction；特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（WO89/12696、特開平2-2934号など）、ＳＤＡ（Strand Displacment Amplification；Nucleic Acids Res.  第二０巻、第一６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（WO90/01069  ）、ＴＭＡ（Transcription Mediated amplification Method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。
【００３７】
検出
上記反応によって得られる１本鎖のオリゴヌクレオチドを、プローブを用いて以下の様にして検出する。
【００３８】
本発明で使用されるプローブは、塩基多型を含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好ましくは連続した少なくとも１５塩基以上、より好ましくは連続した少なくとも１８塩基以上からなる塩基配列が必要である。好ましくは、第一オリゴヌクレオチドの塩基多型部位と含む一部と第二オリゴヌクレオチドの一部共に相補的な配列を含むものがよい。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生物学的な方法により調製することができる。例えば、パーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。
【００３９】
また、第一オリゴヌクレオチド又は第二オリゴヌクレオチドに予め標識を賦することが好ましい。その場合は、合成時にビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入しても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から32P、35Sなどの放射性物質、ALP、PODなどの酵素、FITC、HEX、6-FAM、TETなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入しても良い。
【００４０】
具体的には、例えば、ビオチン等で標識した第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを用いて特定核酸とハイブリダイズさせた後、解離させ、例えば、マイクロタイタープレートのような固相に結合させた多型特異的プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった核酸を洗いだし、プローブとハイブリダイズした核酸の第一オリゴヌクレオチドの標識によりハイブリダイズしたか否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により塩基多型が野生型か変異型もしくは混合型であるのかを同定する方法が挙げられる。
【００４１】
野生型と多型のオリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば色の異なる蛍光標識を付与することで、野生型及び多型の検出を１つのプレートのウエルで行うことができる。
キット
本発明において、キットとしては、(i)野生型第一オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の多型第一オリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一オリゴヌクレオチド、(ii)該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、(iii)ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び(iv)検出プローブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるという特徴を有する。
【００４２】
該第一及び第二オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  ACE遺伝子の塩基多型検出
（１）ACE遺伝子断片増幅用プライマー及び多型検出用オリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相同な配列を有する配列番号１及び２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１、２）および配列番号３、４及び５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（検出用プローブ３、４、５）を合成した。検出用プローブ３及び４は、ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有するが、各々３’末端に塩基多型部位に対応する野生型又は多型に対応する塩基を有し、各々５’側にビオチンを連結している。検出プローブ５は、検出用プローブ３及び４の３’末端に隣接するヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的な配列を有するが、その５’末端の１塩基が塩基多型部位に対応し、野生型又は多型とも相補的でない塩基を有する。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
【００４５】
（２）リンカーアームを有するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Aプローブ）および配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Tプローブ）を合成した。Ａプローブ及びＴプローブとも、ヒトＡＣＥ遺伝子の配列と相補的であり、塩基多型部位で特異的である
この際、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調製した、５位にリンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、パーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
【００４６】
（３）プローブオリゴヌクレオチドのマイクロタイタープレートへの結合
上記（２）で合成したプローブオリゴヌクレオチドについて、そのリンカーアームを介して、マイクロタイタープレート内面へ結合した。オリゴヌクレオチドを５０ｍＭ硼酸緩衝液（ｐＨ１０）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2 の溶液に０．０５ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック社）に各１００μｌずつ分注し、１５時間程度室温に放置することで、リンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥させた。
【００４７】
（４）ＰＣＲ法によるヒトACE遺伝子断片の増幅
ヒト白血球より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＡＬＤＨ２遺伝子断片を増幅した。
試薬：以下の試薬を含む２５μl溶液を調製した。
【００４８】
プライマー１  １０ｐｍｏｌ
プライマー２  １０ｐｍｏｌ
×１０緩衝液  ２．５μl
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μl
Tth  ＤＮＡポリメラーゼ  １Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
増幅条件
９４℃・２分
９４℃・１分、５７℃・２分、７５℃、１．５分（３５サイクル）。
【００４９】
（５）検出用オリゴヌクレオチドによる検出反応
（４）の増幅反応液を５μlにエビ由来アルカリフォスファターゼ  U添加し３７℃で１５分、８０℃で１５分保温した後、以下の試薬を含む２０μl溶液を調製した。
【００５０】
検出用オリゴ３または４  １０ｐｍｏｌ
検出用オリゴ５          １０ｐｍｏｌ
×１０緩衝液              ２μl
Tth  ＤＮＡポリメラーゼ  １Ｕ
Tth  ＤＮＡリガーゼ      １Ｕ
増幅反応溶液              ５μl
検出条件
９４℃・２分
９４℃・１分、６５℃・２分（５サイクル）。
（６）マイクロタイタープレート中でのハイブリダイゼーション
（５）の検出反応液を１０μｌに、０．６Ｎ  ＮａＯＨを１０μl添加してＤＮＡを変性させ、２００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０)、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3 の溶液８０μｌに加えて、上記（３）の捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５０℃で３０分間振盪させた。これによって、検出反応で核オリゴヌクレオチドがハイブリし、一部ヌクレアーゼで除去されたのち、リガーゼにより結合された核酸断片が、固定化されたプローブによって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
【００５１】
次に、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、１％ＳＤＳに置換し同様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５５℃で２０分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼを標識したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ製:D0396）を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１％ＢＳＡの溶液で２０００倍に希釈した溶液１００μｌと置換し、３７℃で１５分間振盪させた。これによって、捕捉されたＤＮＡのビオチンにアルカリ性ホスファターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合した。２５０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０２５％  Tween20溶液で３回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：Lumiphos480；Lumigen社）５０μｌを注入し、３７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測定した。
【００５２】
これらの工程はすべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌  第２０巻、第７２８頁（１９９５年）を参照）により自動で行われ、所要時間は約２.５時間であった。
【００５３】
（７）ヒトＡＣＥ遺伝子塩基多型測定検討結果
上記（５）にて反応し、（６）にて検出されたヒトACE遺伝子の塩基多型検出結果を表１に示す。数値は発光量（cps：count/second）で表示される。ＡsignalはＡプローブと反応した増幅核酸断片の検出シグナルを、ＴsignalはＴプローブと反応した核酸断片の検出シグナルを示す。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
表１から判るように各プローブで得られたシグナルによりＡＣＥ遺伝子の1塩基多型が同定できる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、試料核酸中の多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、偽陽性が生じず、従来法では困難であったホモ接合とヘテロ接合の識別も容易になった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例で使用したオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図１】
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