(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープウィルスに基づくベクターであって、そのエンベロープに生体由来の膜融合タンパク質を取り込ませ、該膜融合タンパク質がsyncytinであり、該膜融合タンパク質の細胞質領域が６９アミノ酸未満であり、該エンベロープウィルスがラブドウイルスであることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
前記ベクターに外来遺伝子が組み込まれている請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記生体がヒトである請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
細胞質領域が６９アミノ酸未満である生体由来の膜融合タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞に導入する段階、別途エンベロープウィルスに基づくベクターに所望の外来遺伝子を組み込む段階、前記動物細胞に該ベクターを感染させる段階、該感染させた動物細胞において増殖した該ベクターを回収する段階から成り、該膜融合タンパク質がsyncytinであり、該エンベロープウィルスがラブドウイルスであるウイルスべクターの製法。
【請求項５】
前記生体がヒトである請求項４に記載のウイルスベクターの製法。
【請求項６】
請求項２に記載のウイルスベクター又は請求項４に記載の製法により得られたウイルスベクターを生体（ヒトを除く）に感染させて外来遺伝子を生体に導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、エンベロープウィルスに基づくベクターに関し、より詳細には、そのエンベロープに生体由来の膜融合タンパク質を有するエンベロープウィルスに基づくベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アデノウイルス、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは遺伝子治療などに用いられるが、ウイルスベクターはその表面にウイルス膜融合タンパク質を持っているため、免疫原として認識される。そのため、2回目以降の投与では生体の免疫機能により異物として排除される可能性が常に存在する（非特許文献１）。
従来、このような問題を回避するために、投与ごとに異なるセロタイプの膜融合タンパク質を持ったウイルスベクターを使用するなどの方法が採用されていた（非特許文献２，３）。
一方、VSV（ブタ水泡性口炎ウイルス）などのエンベロープウイルスはGタンパク質というウイルス膜融合タンパク質をウイルス表面に持っており、他のウイルスの膜融合タンパク質を取り込むことができることが知られている（非特許文献４）。この論文では、CD4を過剰発現させた細胞にVSVを感染させ、その細胞から出てきたウイルスのタンパク質を解析した。その結果、CD4がウイルスに取り込まれており、CD4が細胞内に過剰量発現しているとVSVに取り込まれると結論された。
生体では、横紋筋形成、マクロファージの形成、胎盤形成、受精などの際に細胞融合が起こる。つまり、生体にも膜融合タンパク質が存在している。近年、ヒトの胎盤形成に重要な細胞膜融合タンパク質が報告された。このタンパク質はSyncytinといい、ヒト内在性レトロウイルス（HERV-W）の1型膜融合タンパク質である（非特許文献５）。
【０００３】
【非特許文献１】
Nat. Rev. Genetics. 1, 91-99, 2000
【非特許文献２】
J. Virol 74, 1524-1532, 2000
【非特許文献３】
J. Virol, 74, 10903-10910）2000
【非特許文献４】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11359-11365 1996
【非特許文献５】
Nature 403, 785-789, 2000
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エンベロープウイルスのエンベロープに生体由来の膜融合タンパク質を導入したベクター、及び生体に対して免疫原性を有しないエンベロープウイルスに基づくベクターを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、タンパク質を過剰発現させた細胞にVSVを感染させると、そのタンパク質がVSVに取り込まれること（非特許文献４）を考慮して、このタンパク質として、生体細胞に対して膜融合の機能をもつ膜タンパク質をVSVに取り込ませることにより、VSVに生体に対する感染性を持たせることができる手段を見出し、更に、この膜融合タンパク質の細胞質領域の大きさがその感染性に大きく影響していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、エンベロープウィルスに基づくベクターであって、そのエンベロープに生体由来の膜融合タンパク質を取り込ませたことを特徴とするウイルスベクターである。この膜融合タンパク質の細胞質領域は、６９アミノ酸未満、好ましくは２５アミノ酸以下である。
このベクターには外来遺伝子が組み込まれていることが好ましい。このベクターに外来遺伝子を組み込む方法はこの分野で公知の方法により行えばよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.94, p14764-14769, 1997等）。組み込むことのできる外来遺伝子及びその大きさは、そのベクターに応じて適宜選択すればよい。また、この外来遺伝子として遺伝子ではないDNA断片を用いてもよい。
【０００７】
このようなウイルスベクターはこの生体に対して抗原性が無いと考えられる（Current Opinion in Immunology 1996, 8:815-821）。即ち、自己抗原と反応するリンパ球を抑えるメカニズムは色々存在するが、胸腺内でT細胞が発生して抗原特異的受容体を発現する段階において、自己抗原に強く反応するT細胞は胸腺内で除かれる。その結果、自己に対する反応が弱いT細胞や抗原に反応しない受容体を持つT細胞が胸腺内で成熟していき、抹消に循環していく。これらのT細胞は各組織に存在する自己抗原とは反応しない。また同様に、骨髄では、抗体を発現しているB細胞も抗体の編集により自己抗原に対しての反応性が弱まる、もしくは無くなると考えられる。そして自己抗原への反応性が弱いB細胞が抹消へと循環していくことで自己抗原への反応が抑えられる。
【０００８】
また、本発明は、細胞質領域が６９アミノ酸未満、好ましくは２５アミノ酸以下である生体由来の膜融合タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞に導入する段階、別途エンベロープウィルスに基づくベクターに所望の外来遺伝子を組み込む段階、前記動物細胞に該ベクターを感染させる段階、該感染させた動物細胞において増殖した該ベクターを回収する段階から成るウイルスべクターの製法である。
更に、本発明は、上記のウイルスベクター又は上記の製法により得られたウイルスベクターを生体に感染させて外来遺伝子を生体に導入する方法である。この方法については、当該技術分野の知られている方法を利用して行うことができる（Cell. Vol.106, p539-549, 2001等）。
【０００９】
【発明の実施の形態】
エンベロープウイルスのエンベロープにタンパク質を取り込ませるには一般にウイルスゲノムから発現されたものを取り込ませる(Journal of Virology. Vol.71, p5060-5068, 1997）、本発明においては簡便な方法を見出した。
本発明で用いることのできるエンベロープウィルスとして、例えば、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス等が挙げられる。
本発明の対象である生体は、ヒトを含む動物一般をいう。
本発明で用いる動物細胞は、哺乳類、特にヒトやサルのものを用いることが好ましい。
また、本発明で用いることのできる生体由来の膜融合タンパク質として、現時点ではヒト由来のsyncytinが知られているが、これに限定される必要は無い。
膜融合タンパク質の細胞質領域とは、細胞質側に存在するアミノ酸領域であり、膜融合活性に影響を与えるものもある。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、生体由来の膜融合タンパク質であるSyncytinをVSV（ブタ水泡性口炎ウイルス）に取り込ませたモデルを作製し、このウイルスベクターがこの生体に対して感染性のあることを確認した。
【００１１】
１．膜融合タンパク質（Syncytin）をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを作製した。
（１）ヒト胎盤cDNAを鋳型として、プライマーSCTUP-1（配列番号１、4-9はEcoRIサイト）、SCTDW-1（配列番号２、4-9はXhoIサイト）でPCRを行った。得られたDNA断片をゲルから精製し、EcoRIとXhoIで処理した後、発現ベクターであるpCAGGS/MCSのEcoRIとXhoIサイトに挿入した。この発現ベクター（pCAGGS/MCS）はNiwa博士から分与されたものを改良したものであり(Gene 108, 193-200, 1991)、その制限酵素地図を図１に示す。このベクターをpCAGGS/Syncytinと呼ぶ。
【００１２】
このpCAGGS/Syncytinの塩基配列を配列番号３に示す。この配列中の各遺伝子の位置は以下のとうりである。pCAGGS/syncytin cytomegarovirus immediate early enhancer : 18 - 381, chiken beta-actin promoter : 382 - 662, intron chiken beta-actin : 663 - 1625, intron rabbit beta-globin : 1626 - 1670, syncytin gene : 1725 - 3341（この内、細胞質領域は3132-3338）, rabbit beta-globin poly A signal : 3359 - 3800, SV40 replication origin : 4002 - 4344, ampcillin resistance gene : 6201 - 5341
【００１３】
（２）このpCAGGS/Syncytinを鋳型としてプライマーSCTUP-4（配列番号３、4-15はEcoRI、10-15はBamHIサイト）、SCTcyt16-DW（配列番号５、3-8はXbaIサイト）でPCRを行った。得られたDNA断片をEcoRIとXbaIで処理し、pCAGGS/MCSのEcoRIとNheIサイトに挿入した。このベクターをpCAGGS/SyncytinCyt16と呼ぶ。
【００１４】
（３）pCAGGS/Syncytinを鋳型としてプライマーSCTUP-4、SCT-DW4（配列番号６、3-8はXbaIサイト）でPCRを行った。得られたDNA断片をゲルから精製し、BamHIとXbaIで処理しpPolI-HA:VSVG（VSVのＧタンパク質）のBamHIとXbaIサイトに挿入した。このプラスミドをBbsIで処理して得られた断片をゲルから精製し、VSVのGタンパク質の細胞質領域の配列を持つ合成オリゴVSVGcyt-UP1（配列番号７）とVSVGcyt-DW1（配列番号８）をアニーリングしたものと連結（ライゲーション）した。この合成オリゴはVSVのGタンパク質の細胞質領域の配列をもつオリゴである。
このプラスミドをKpnIとXhoIで処理したDNA断片を、KpnIとXhoIで処理したpCAGGS/Syncytinに挿入した。このベクターをpCAGGS/SyncytinTM1Gと呼ぶ。このpCAGGS/syncytinTM1GはSyncytinの細胞質領域をVSVのGタンパク質の細胞質領域に置き換えたものを発現するプラスミドである。
【００１５】
これら３種の発現ベクターの膜融合タンパク質の細胞質領域は、それぞれ６９アミノ酸（Syncytin、配列番号９）、２９アミノ酸（SyncytinTM1G、配列番号１０）、１６アミノ酸（Syncytincyt16、配列番号１１）から成る（Journal of virology vol.73 p.1175-1185, 1999）。
【００１６】
これらの３種のベクターを各制限酵素で処理した後のゲル電気泳動を図３に示す。
レーン１，５はpCAGGS/MCS、レーン２、６はpCAGGS/Syncytin、レーン３，７はpCAGGS/SyncytinCyt16、レーン４，８はpCAGGS/SyncytinTM1Gを示す。
EcoRIとXhoIで処理した場合、pCAGGS/Syncytinは両酵素の切断部位を持つため約1600bpと4800bpの二本のバンドが見られる（レーン２，４）。pCAGGS/SyncytinCyt16にはXhoI切断部位がないためEcoRIのみで切断され、単一バンドが得られる（レーン３）。
一方、EcoRIとNheIで処理した場合、pCAGGS/SyncytinとpCAGGS/SyncytinTM1Gは両酵素の切断部位を持つため約1600bpと4800bpの二本のバンドが見られる（レーン６，８）。pCAGGS/SyncytinCyt16にはＮｈｅＩ切断部位がないためEcoRIのみで切断され、単一バンドが得られる（レーン７）。
これらの結果から、これら３種の発現ベクターは膜融合タンパク質（Syncytin）をコードするＤＮＡを有していることが確認された。
【００１７】
２．上記３種の発現ベクターにより動物細胞(Cos7細胞)に膜融合タンパク質（Syncytin）を導入した。
6穴シャーレに1 × 105のCos-7細胞を蒔き、一晩5%のCO2、37℃で培養した。Trans-IT 293（Mirus Corporation製）を使って4μgのプラスミドDNA（pCAGGS/Syncytin、配列番号３）を細胞に導入した。24、48時間後に細胞をメタノールで10分間処理し、固定した。固定した細胞をギムザ染色した。その写真を図４に示す。図４において、丸で囲った部分が融合した細胞であり、紫色に染まった核が一つの細胞にいくつも存在するのがわかる。
【００１８】
３．ＧＦＰ遺伝子を組み込んだＶＳＶで動物細胞(Cos-7細胞)を感染させた。
VSVはラブドウイルス科に属するウイルスで、一本鎖のマイナス鎖RNAをゲノムとして持つ。このゲノムからGタンパク質を含む5種類のウイルスタンパク質が合成される。この実施例では、VSVのGタンパク質遺伝子の代わりに緑色蛍光発色タンパク質（GFP）を持つVSVΔG*-Gを用いた。これはテネシー大学のMichael Whitt博士が作製したものを分与して用いた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 4477-4481 1995；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 14764-14769, 1997）。  6穴シャーレに、Cos-7細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）を10%FCSを含むDMEM培地で継代したもの1 x 105を蒔き、一晩5%のCO2、37℃で培養した。Trans-IT 293（Mirus Corporation製）を使って2μgのプラスミドDNA（配列番号３）を細胞に導入した。
【００１９】
24時間培養後、VSVΔG*-GをMOI=1で1時間感染させた。感染後、細胞を5回PBSで洗い、２mlの1 × MEM/BSAを加えて２４時間培養した。２４時間後、上澄を遠心（3000rpm、10分）し、ストックウイルスとした。
得られた培養上清液を次のCos-7細胞にかけ、蛍光顕微鏡でGFPの発色を観察した。Syncytincyt16の様子を図５に示す。GFP陽性細胞がControlと比べて優位に多いことがわかる。これは、Syncytincyt16がVSVΔG*-Gに取り込まれたため感染性を持ったものと考えられる。
ストックウイルス液をCos-7細胞に感染させ、24時間後、GFP陽性細胞の数を数えた（感染価）。結果を図６に示す。
Syncytincyt16（細胞質領域のアミノ酸数が１６）やsyncytinTM1G（細胞質領域のアミノ酸数が２９）の感染価がSyncytin（細胞質領域のアミノ酸数が６９）や野生型(ＷＴ)のものに比べて顕著に高く、該膜融合タンパク質の細胞質領域が６９アミノ酸未満の場合に感染価が高いことを示している。
Syncytincyt16などのウイルスベクターがこの生体（Cos-7細胞）に対して感染性のあることから、このウイルスベクターはその生体由来のエンベロープタンパク（Syncytin）を有しているといえる。その結果このウイルスベクターはその生体に対して免疫原性が無いと考えられる。
【００２０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクターpCAGGS/MCSの制限酵素地図を示す図である。
【図２】作製した３種のウイルスベクターを示す図である。
【図３】３種のウイルスベクターの各制限酵素で処理した後のゲル電気泳動を示す図である。レーン１，５はpCAGGS/MCS、レーン２，６はpCAGGS/Syncytin、レーン３，７はpCAGGS/SyncytinCyt16、レーン４，８はpCAGGS/SyncytinTM1Gを示す。
【図４】プラスミドDNA（配列番号３）を導入したCos-7細胞の細胞融合アッセイを示す図である。
【図５】VSVΔG*-G感染させたCos-7細胞の蛍光顕微鏡写真（GFPの発色）を示す図である。
【図６】各ウイルスベクターの感染価を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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