(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡチップ上のスポットの位置を検出するスポット位置検出機構によって検出した所望のスポット上のみに、微量の溶液を吐出及び吸引する吐出吸引機構並びに前記吐出吸引機構の吐出吸引部を位置決めする位置決め機構を用いてＤＮＡ分解試薬を塗布して、その所望のスポットに固定化されたオリゴヌクレオチドを分解除去するＤＮＡチップ補修方法。
【請求項２】
ＤＮＡチップ上のスポットの位置を検出するスポット位置検出機構によって検出した既製のＤＮＡチップ上の任意の領域に、微量の溶液を吐出及び吸引する吐出吸引機構並びに前記吐出吸引機構の吐出吸引部を位置決めする位置決め機構を用いてオリゴヌクレオチドを含む溶液を既存するスポットに重複しないように塗布して、その任意の領域に新たにオリゴヌクレオチドを固定化するＤＮＡチップ補修方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多数のオリゴヌクレオチドが固相表面に整列して固定化されたＤＮＡチップの補修を行なう方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の発現の様子をモニタする方法として、ＤＮＡチップを用いる方法がある。ＤＮＡチップは、種々遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡプローブともいう）が固相表面に整列して固定化されてオリゴヌクレオチドマトリックスが形成された素子である。通常、１枚のＤＮＡチップ上には、数千から数万のオリゴヌクレオチドが固定化されている。
ＤＮＡチップを用いる方法では、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）法を用いて、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成すると同時に増幅する。増幅された各ＤＮＡ断片に蛍光標識をつけて標識断片とする。これらの標識断片をＤＮＡチップに接触させ、ＤＮＡチップに固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる。標識断片は配列が相補的なオリゴヌクレオチドに保持され、過剰量の標識断片は洗浄操作で除去される。その後、蛍光顕微鏡を用いて保持された標識断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴヌクレオチドの種類を調べる。この方法は配列既知の遺伝子の発現をモニタするのに適している。
【０００３】
現在のＤＮＡチップ作製装置では、スライドガラスなどの基板上に、配列が既知のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を、針先に付着させてスポッティングしたり、インクジェットノズルに吸引して微量に吹付けを行なってスポッティングしたりすることにより、オリゴヌクレオチド溶液を１つ１つスポッティングして多数のスポットをマトリックス状に形成した後、オリゴヌクレオチド溶液を乾燥させてオリゴヌクレオチドを基板上に固定化し、ＤＮＡチップの作製を行なっている。通常、スポットの寸法は８０〜１０００μｍであり、隣接するスポットの間隔は１００〜１０００μｍである。また、スポットの寸法が４０μｍ、スポットの間隔が５０μｍのＤＮＡチップもあり、スポットの寸法が１０μｍ、スポットの間隔が１５μｍのものまで実現可能と考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡチップでは、固定化したオリゴヌクレオチドの品質や量の確認はほとんど行なっていなかった。そのため、用いたオリゴヌクレオチドの品質が劣悪であったり、作製装置の不良などによって、オリゴヌクレオチドの品質が劣化していたり、オリゴヌクレオチドの量が不足又は過剰で他のスポットとのバランスが悪かったり、スポットが大きすぎて隣接するスポットに重なっていたり、スポットが小さすぎて検出が困難であったり、スポットの形状が不定形で検出が困難であったりするなど、ＤＮＡチップ上に不良なスポットが存在することがあった。そのような不良なスポットを確認した場合でも、ＤＮＡチップ作製装置ではその補修ができないので、使用に耐え得るのであれば品質が不十分なままＤＮＡチップを使用していた。
【０００５】
また、ＤＮＡチップ作製装置では、基板を装置に装着しＤＮＡチップを作製している間しっかり固定することで位置を決定しているため、ＤＮＡチップを装置から取り外した後、再度装着すると位置がずれる。そのため、既製のＤＮＡチップに新規のスポットを追加するのは困難であり、スポットを追加する場合は新たにＤＮＡチップを作製していた。
また、ＤＮＡチップ作製装置では、既存の特定のスポット上のみにオリゴヌクレオチド洗浄液やオリゴヌクレオチド分解液を塗布することはできない。そのため、既製のＤＮＡチップ上のスポットの一部が必要でなくなった場合でも、そのスポットのみを除去することは困難なため、必要のないスポットを残したしたままＤＮＡチップを使用していた。
【０００６】
そこで本発明は、ＤＮＡチップ上の所望のスポットを除去し、そこに新たなスポットを形成したり、さらにＤＮＡチップ上の任意の領域に新たにスポットを形成できるようにすることにより、既製のＤＮＡチップを補修できるＤＮＡチップ補修方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明のＤＮＡチップ補修方法の一態様は、ＤＮＡチップ上のスポットの位置を検出するスポット位置検出機構によって検出した所望のスポット上のみに、微量の溶液を吐出及び吸引する吐出吸引機構並びにその吐出吸引機構の吐出吸引部を位置決めする位置決め機構を用いてＤＮＡ分解試薬を塗布して、その所望のスポットに固定化されたオリゴヌクレオチドを分解除去する。
【０００８】
本発明のＤＮＡチップ補修方法の他の態様は、ＤＮＡチップ上のスポットの位置を検出するスポット位置検出機構によって検出した既製のＤＮＡチップ上の任意の領域に、微量の溶液を吐出及び吸引する吐出吸引機構並びにその吐出吸引機構の吐出吸引部を位置決めする位置決め機構を用いてオリゴヌクレオチドを含む溶液を既存するスポットに重複しないように塗布して、その任意の領域に新たにオリゴヌクレオチドを固定化する。
【００１０】
ＤＮＡチップ上の既存する所望のスポットを除去する場合、スポット位置検出機構によって、固定機構に固定されたＤＮＡチップ上の所望のスポットの位置を検出する。吐出吸引機構の吐出吸引部にＤＮＡ分解試薬を吸引した後、位置決め機構によって所望のスポットの位置に吐出吸引機構の吐出吸引部を移動させ、吐出吸引機構を作動させて所望のスポット上のみにＤＮＡ分解試薬を塗布する。その所望のスポットに固定化されているオリゴヌクレオチドは分解される。分解されたオリゴヌクレオチド残渣を含むＤＮＡ分解試薬を吐出吸引機構によって吸引して除去する。
ＤＮＡチップ上の任意の領域に所望のオリゴヌクレオチドを固定化する場合は、吐出吸引機構によってその任意の領域に所望のオリゴヌクレオチドを含む溶液を塗布してその所望のオリゴヌクレオチドを固定化する。
【００１１】
【実施例】
図１は、一実施例を示す概略構成図である。
装置本体２にＤＮＡチップ１を固定する固定板（固定機構）４が設けられている。本体２の側部にマイクロマニピュレータ（位置決め機構）６が設けられている。ここで用いたマニピュレータ６は例えば分解能０．１μｍの動きをするものである。
微量の溶液をノズル８ａの先端から吐出及び吸引するセルインジェクタ（吐出吸引機構）８がマニピュレータ６の近傍に配置されており、マニピュレータ６のアクチュエータ６ａにインジェクタ８のノズル（吸引吐出部）８ａが取り付けられている。ここで用いたインジェクタ８は容量が例えば数十フェムトリットルの溶液まで扱えるものであり、溶液の吐出によって形成されるスポットの最小直径は約５μｍである。ノズル８ａはマニピュレータ６によってＤＮＡチップ１上の領域及びその周辺を移動される。ノズル８ａの先端の移動範囲内に、図示は省略するが、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を収容する容器、オリゴヌクレオチドを分解する酵素を含むＤＮＡ分解酵素液（ＤＮＡ分解試薬）を収容する容器、ＤＮＡ分解酵素を変性させるタンパク質変性剤を含むタンパク質変性剤溶液を収容する容器、洗浄液としての界面活性剤溶液又はＤＮＡ変性剤溶液を収容する容器及び廃液を収容するドレイン容器が配置されている。
本体２の上部には、固定板４に固定されたＤＮＡチップ１のスポットを検出する顕微鏡（位置検出機構）１０が設けられている。
【００１２】
図２はＤＮＡチップを概略的に示す平面図である。
ＤＮＡチップ１は、基板としての例えばスライドガラス１ａ上に、配列既知のオリゴヌクレオチドが固定化されたスポット１ｂがマトリックス状に形成されており、スポット１ｂごとに異なる種類のオリゴヌクレオチドが固定化されている。例えばスポット１ｂの寸法は１０μｍであり、隣り合うスポット１ｂ間の間隔Ａは１５μｍである。
【００１３】
例えば１つのスポット１ｂのオリゴヌクレオチドが何らかの原因で不良又は不調を起こし、そのＤＮＡチップ１を補修する場合、ＤＮＡチップ１を固定板４に固定し、顕微鏡１０によって不良を起こした対象スポットを検出する。
マニピュレータ６を作動させてノズル８ａの先端をＤＮＡ分解酵素液を収容した容器に移動させ、インジェクタ８を作動させてノズル８ａにＤＮＡ分解酵素液を吸引する。
【００１４】
マニピュレータ６により、ノズル８ａの先端を顕微鏡１０で検出した対象スポット上に移動させて位置決めし、インジェクタ８を作動させてその対象スポット上にＤＮＡ分解酵素液を塗布する。このとき吐出されるＤＮＡ分解酵素液の量は、対象スポットに隣接するスポットにＤＮＡ分解酵素液が及ばないように、例えば２５０フェムトリットルである。ＤＮＡ分解酵素液の作用により、対象スポットに固定化されたオリゴヌクレオチドは分解される。
ＤＮＡ分解酵素液の塗布量は、例えばＤＮＡチップ１のスポット１ｂの寸法が４０μｍのときは約１７０００フェムトリットルのＤＮＡ分解酵素液、スポット１ｂの寸法が２０μｍのときは約２６００フェムトリットルのＤＮＡ分解酵素液を塗布するのが適当である。
【００１５】
対象スポットのオリゴヌクレオチドが分解された後、そのオリゴヌクレオチド残渣を含むＤＮＡ分解酵素液をノズル８ａに吸引し、ノズル８ａをドレイン容器位置に移動させてそのＤＮＡ分解酵素液を排出する。
洗浄液によってノズル８ａを洗浄した後、タンパク質変性剤溶液をノズル８ａに吸引し、オリゴヌクレオチドを除去した対象スポットの位置にタンパク質変性剤溶液を塗布して残留するＤＮＡ分解酵素を変性させ、対象スポットの領域を洗浄する。その後、対象スポットの領域のタンパク質変性剤溶液をノズル８ａに吸引し、ドレイン容器に排出する。
【００１６】
洗浄液によってノズル８ａを洗浄した後、所望のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液をノズル８ａに吸引し、対象スポットの領域にそのオリゴヌクレオチド溶液を塗布する。塗布されるオリゴヌクレオチド溶液の量は、対象スポットの領域に隣接するスポットにオリゴヌクレオチド溶液が及ばないように、例えば２５０フェムトリットルである。その後、オリゴヌクレオチド溶液を乾燥させて対象スポットにオリゴヌクレオチドを固定化する。
オリゴヌクレオチド溶液の塗布量は、例えばＤＮＡチップ１のスポット１ｂの寸法が４０μｍのときは約１７０００フェムトリットルのオリゴヌクレオチド溶液、スポット１ｂの寸法が２０μｍのときは約２６００フェムトリットルのオリゴヌクレオチド溶液を塗布するのが適当である。
このようにして不良を起こしたスポットを除去し、そのスポット領域に新たに正常なオリゴヌクレオチドを固定化してＤＮＡチップを補修することにより、ＤＮＡチップは何度も繰り返し使用できるようになり、実験効率の大幅向上及びコストの削減を図ることができる。
【００１７】
セルインジェクタ８の動作は自動又は手動のどちらでもよいが、自動であることが好ましく、さらに、顕微鏡１０によって検出した対象スポットの位置を指定することによりマニピュレータ６及びインジェクタ８が上記の動作を全自動で行なう構成とすることが好ましい。
この実施例では、スポットを除去した後、その領域に新たにスポットを形成しているが、新たにスポットを形成する必要がない場合はスポットを形成しなくてもよい。さらに、元のＤＮＡチップ上のスポットが形成されていない領域に、新たにスポットを追加することもできる。その結果、ＤＮＡチップの品質の向上、再現性の向上及び項目の最適化による性能の向上を図ることができる。
【００１８】
この実施例では、ＤＮＡ分解酵素液、タンパク質変性剤溶液及びオリゴヌクレオチド溶液の吸引及び吐出を１組のマニピュレータ及びインジェクタによって行なっているが、本発明はこれに限定されるものではなく、複数組のマニピュレータ及びインジェクタを用いて、ＤＮＡ分解酵素液、タンパク質変性剤溶液又はオリゴヌクレオチド溶液の吸引及び吐出をそれぞれ異なるマニピュレータ及びインジェクタによって行なってもよい。さらに、各試料ごとにマニピュレータ及びインジェクタを設置する用にすれば、作業が効率的になる。
また、オリゴヌクレオチドの代わりに、ＤＮＡのホスホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸（ペプチド核酸ともいう）を用いてもよい。
【００１９】
また、複数の種類のオリゴヌクレオチドがマトリックス状に配列された既製のＤＮＡチップをマスターＤＮＡチップとし、そのマスターＤＮＡチップ上でオリゴヌクレオチドの増幅を行ない、増幅したオリゴヌクレオチドをマスターＤＮＡチップのオリゴヌクレオチドマトリックスに対応させて他の基板に固定化して、レプリカＤＮＡチップを作製する方法が考えられている。その方法では同じオリゴヌクレオチドマトリックスをもつレプリカＤＮＡチップを量産する。
マスターＤＮＡチップを繰り返し使用した場合、スポットの劣化が起こる。マスターＤＮＡチップのスポットに不具合があると、作製したレプリカＤＮＡチップすべてが不良となり、影響が大きく、マスターＤＮＡチップの補修及び改良が必要となる。
本発明によれば、マスターＤＮＡチップの補修及び改良も行なうことができ、その結果、マスターＤＮＡチップ、ひいてはレプリカＤＮＡチップの品質の向上、項目の最適化による性能の向上、ＤＮＡチップの品質の向上を図ることができる。
なお、本明細書におけるＤＮＡチップの語は、遺伝子の発現などをモニタするために使用されるテスト用ＤＮＡチップの他、マスターＤＮＡチップも含むものとして使用している。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡチップ補修方法では、吐出吸引機構のノズルにＤＮＡ分解試薬を吸引した後、位置検出機構によって検出したＤＮＡチップ上の所望のスポット上へ位置決め機構によってノズルを移動させ、その所望のスポット上のみにＤＮＡ分解試薬を塗布して、その所望のスポットに固定化されたオリゴヌクレオチドを分解除去したり、吐出吸引機構のノズルにオリゴヌクレオチドを含む溶液を吸引した後、位置検出機構によって検出したＤＮＡチップ上のスポット除去後の領域又はスポットのなかった領域へ位置決め機構によってノズルを移動させ、吐出吸引機構によってその領域にオリゴヌクレオチドを含む溶液を既存するスポットに重複しないように塗布して、その領域に新たにオリゴヌクレオチドを固定化したりすることができるようにしたので、既存のＤＮＡチップを補修でき、ＤＮＡチップの品質の向上、項目の最適化による性能の向上、ＤＮＡチップの品質の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  一実施例を示す概略構成図である。
【図２】  ＤＮＡチップを概略的に示す平面図である。
【符号の説明】
１      ＤＮＡチップ
１ａ    スライドガラス
１ｂ    スポット
２      装置本体
４      固定板
６      マイクロマニピュレータ
６ａ    アクチュエータ
８      セルインジェクタ
８ａ    ノズル
１０      顕微鏡
【図１】
0004292662.tif 000002
【図２】
0004292662.tif 000003