(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式の化合物から選んだシクロペンテン誘導体
【化１】
0004335314.tif 000039
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。）
を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる微生物、ならびにこの微生物からの酵素エキストラクトであって、
前記微生物は、アルカリゲネス／ボルデテラＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、またはゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）の種から選択され、
前記酵素エキストラクトは、Ｎ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ活性を有し、前記微生物から得られ、かつ下記の一般式の化合物から選んだシクロペンテン誘導体を加水分解する能力を有する
【化２】
0004335314.tif 000040
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。）
ことを特徴とする微生物ならびに酵素エキストラクト。
【請求項２】
Ｎ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ活性を有する酵素であって、請求項１の微生物から得られ、かつ下記の一般式の化合物から選んだシクロペンテン誘導体
【化３】
0004335314.tif 000041
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。）
を加水分解する能力を有し、下記の事項を特徴とする酵素： ａ）ｐＨ７．０±１．０を最適ｐＨとすること、ｂ）ｐＨ７．０において２５℃から３０℃の間の温度を最適温度とすること、およびｃ）基質として１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを用いたときのＫMが、２２．５ｍＭ±７．５ｍＭ（３０℃、１００ｍＭリン酸緩衝液）であること。
【請求項３】
請求項２に記載の酵素であって、さらに下記の事項を特徴とする酵素： ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列が、Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asnであること、およびｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される分子量が５０ｋＤであること。
【請求項４】
下記の一般式Ｉおよび／またはIIの、（１Ｒ，４Ｓ）−および／または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン
【化４】
0004335314.tif 000042
、および／または下記の一般式IIIおよび／またはIVの、（１Ｓ，４Ｒ）−および／または（１Ｒ，４Ｓ）−アミノアルコール誘導体
【化５】
0004335314.tif 000043
（式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、アリールまたはアリロキシである。）
を製造する方法であって、
一般式
【化６】
0004335314.tif 000044
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
のシクロペンテン誘導体を、請求項１の微生物および／または酵素エキストラクト、請求項２の酵素、および／またはペニシリンＧアシラーゼを使用して、式Ｉおよび／またはIIの化合物に転化し、適切であれば、この転化の結果生成したそれらの化合物および／または式IIIおよび／またはIVのアミノアルコール誘導体を単離することからなる製造方法。
【請求項５】
一般式
【化７】
0004335314.tif 000045
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
のシクロペンテン誘導体を、第一工程で、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン
【化８】
0004335314.tif 000046
をアシル化して、下記一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体とし、
【化９】
0004335314.tif 000047
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
第二工程で、この化合物を還元して一般式VIIのシクロペンテン誘導体とすることを特徴とする請求項４の製造方法。
【請求項６】
第一工程のアシル化を、下記の一般式のカルボン酸ハロゲン化物
【化１０】
0004335314.tif 000048
（式中、Ｘはハロゲン原子をあらわし、Ｒ1は上記した意味を有する。）
を使用して行なうか、または下記の一般式のカルボン酸無水物
【化１１】
0004335314.tif 000049
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
を使用して行なうことを特徴とする請求項５の製造方法。
【請求項７】
第一工程のアシル化を、アプロティックな溶媒の中で実施することを特徴とする請求項５または６の製造方法。
【請求項８】
第二工程の還元を、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のボロハイドライド、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のアルミニウムハイドライドおよび／またはビトライドVitride（登録商標）を用いて実施することを特徴とする請求項５ないし７のいずれかの製造方法。
【請求項９】
第二工程の還元を、プロティックな溶媒の中で実施することを特徴とする請求項５ないし８のいずれかの製造方法。
【請求項１０】
一般式VIIのシクロペンテン誘導体の反応を、ロドコッカス、ゴルドナ、アースロバクター、アルカリゲネス、アグロバクテリウム／リゾビウム、バチルス、シュードモナスまたはアルカリゲネス／ボルデテラ属から選んだ微生物を使用して行なうことを特徴とする請求項４ないし９のいずれかの製造方法。
【請求項１１】
一般式VIIのシクロペンテン誘導体の反応を、バチルス・メガテリウムまたはエシェリチア・コリの種の微生物から得たペニシリンＧアシラーゼを使用して行なうことを特徴とする請求項４ないし９のいずれかの製造方法。
【請求項１２】
一般式VIIのシクロペンテン誘導体の反応を、温度２０ないし４０℃、ｐＨ５ないし９において実施することを特徴とする請求項４ないし１１のいずれかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、下記の式の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン
0004335314.tif 000002
および（または）下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミノアルコール誘導体
0004335314.tif 000003
の製造方法に関し、さらに、下記の一般式のシクロペンテン誘導体を、
0004335314.tif 000004
唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる微生物に関する。
本発明はさらに、これらの微生物から得られる、Ｎ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ活性を有する酵素および酵素エキストラクトにも関する。
式Ｉの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンは、炭素環式のヌクレオサイドたとえばカルボビルCarbovir▲Ｒ▼製造のための、重要な中間体である（Cambell et al., J. Org. Chem. 1995, 60, 4602-4616）。
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造方法は、キャンベルCambell et al.（前掲書）およびパークPark K.H.およびラポポートRapoport H.（J. Org. Chem. 1994, 59, 394-399）に記載されている。
これらの方法で使用する先駆体は、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンまたはＤ−セリンであって、（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンに至るまでに約１５の合成工程が必要であり、これを、次に保護基を離脱させて、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンとする。これら二つのプロセスはコストが高く、労力を要し、工業的に実施できるものではない。
ＷＯ９３／１７０２０は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造方法を開示しており、その方法は、（１Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−２−シクロペンテン−１−カルボン酸をリチウムアルミニウムハイドライドで還元して所望の製品とする。
このプロセスの欠点は、一方ではシクロペンテン環の二重結合もまた還元されること、リチウムアルミニウムハイドライドは取り扱い難いこと、そして他方では、あまりにコストが高いことである。
テイラーら（Taylor, S.J. et al., Tetrahedron: Asymmetry Vol.4, No.6, 1993, 1117-1128）は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンを、（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを前駆物質として、そこから出発する製造方法を記述している。この場合、前駆物質は、シュードモナス・ソラナセアルムPseudomonas solanacearumまたはシュードモナス・フルオレッセンスP. fluorescens種の微生物を利用して（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンに転化し、それを次にジ−tert−ブチルジカーボネートを用いて（１Ｒ，４Ｓ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンに転化し、これをナトリウムボロハイドライドおよびトリフルオロ酢酸によって還元し、所望の製品にする。このプロセスもまた、あまりにコストが高い。
このほかには、マルチネら（Martinez et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 7963-7966）は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの、ジエチルジアルキルマロネートから出発する、１０段階の合成法を記述している。このプロセスにも、工程が面倒であるという不利益があって、工業的には実施し難い。
本発明の目的は、簡単なプロセスで（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンを製造する技術を提供することにある。
この目的は、請求項１に従う本発明の微生物、およびそれから抽出した酵素すなわち請求項４に従う本発明の酵素、ならびに請求項７に従う本発明の方法によって達成される。
本発明の微生物は、土壌のサンプルの中から、常用の微生物工学的方法によって、土壌、汚泥または排水のサンプルの中から分離することができる。
微生物は、本発明に従って、下記の一般式をもつシクロペンテン誘導体の１種または２種以上を、
0004335314.tif 000005
（式中、Ｒ1はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ、アリールまたはアリロキシ基をあらわす。）
・唯一の炭素源および窒素源として、
・適当な炭素源とともに、唯一の窒素源として、または
・適当な窒素源とともに、唯一の炭素源として
含有する栄養培地中で、微生物を培養することによって単離される。
Ｃ1-4アルキルとしては、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはブチルが挙げられる。Ｃ1-4アルコキシとしては、たとえばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシまたはtert−ブトキシが挙げられる。アリールとしては、たとえばフェニルまたはベンジルが挙げられる。ベンジルが好適に使用される。アリロキシとしては、たとえばベンジロキシまたはフェノキシが挙げられる。従って、下記の例は、一般式VIIのシクロペンテン誘導体として適当である。
１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、
１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、または
１−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン。
培養によって得た培養物から、式VIIのシクロペンテン誘導体の（１Ｒ，４Ｓ）異性体を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の炭素源および窒素源として資化する微生物を選択することが好都合である。
それらの微生物は、適当な窒素源として、たとえば、アンモニア、硝酸塩、アミノ酸または尿素を、成長の基質として使用することができる。微生物はまた、適当な炭素源として、たとえば、糖類、糖アルコール、Ｃ2-4カルボン酸またはアミノ酸を、成長の基質として使用することができる。糖類として、グルコースのようなヘキソース、またはペントースが使用できる。糖アルコールとして、たとえばグリセロールが使用できる。Ｃ2-4カルボン酸として、酢酸またはプロピオン酸が使用できる。アミノ酸としては、ロイシン、アラニン、アスパラギンが使用できる。
使用できる選択の培地および培養の培地は、当業者の間に常用されているものであって、たとえば、表１に記載のもの、または完全培地（イーストエキスを含有する培地）が使用できるが、表１に記載のものを使用することが好ましい。
培養および選択の間、微生物からの活性な酵素が好都合に誘導される。一般式VIIのシクロペンテン誘導体が、酵素インデューサーとして使用できる。
培養および選択は、通常、２０℃から４０℃の温度で、好ましくは３０℃から３８℃の温度で、５．５から８．０までのｐＨで、好ましくは６．８から７．８までのｐＨで行なわれる。
好適な微生物は、ロドコッカスRhodococcus、ゴルドナGordona、アースロバクターArthrobacter、アルカリゲネスAlcaligenes、アグロバクテリウム/リゾビウムAgrobacterium/Rhizobium、バチルスBacillus、シュードモナスPseudomonasまたはアルカリゲネス/ボルデテラAlcaligenes/Bordeteraなどの属、とりわけ、ロドコッカス・エリスロポリスRhodococcus erythropolis ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、アルカリゲネス/ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８），ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンスAlcaligenes xylosoxydans ssp.デニトリフィカンスdenitrificans ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム・リゾビウム ＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスBacillus simplex Ｋ２、シュードモナス・プチダPseudomonas putida Ｋ３２，またはゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）、およびその機能的に等価な変異種および突然変異種である。ブダペスト条約に従う寄託を、ドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツエルクルトゥーレン ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、マシュローダヴェク１ｂ，Ｄ−３８１２４，ブラウンシュヴァイクに、微生物ＤＳＭ１０６８６および１０６８７は１９９６年５月２０日に、微生物ＤＳＭ１０３２８および１０３２９は１９９５年１１月６日に、微生物ＤＳＭ１１２９１は１９９６年１０月８日に、そして微生物ＤＳＭ１１１７２は１９９６年９月２０日に、それぞれ行なった。
「機能的に等価な変異種および突然変異種」は、当初の微生物と本質的に同じ特性と機能を有する微生物を意味する。このような変異種および突然変異種は、偶然に、たとえばＵＶ照射などによって作ることができる。
アルカリゲネス／ボルデテラ（Alcaligenes/Bordetella）ＦＢ  １８８（ＤＳＭ１１１７２）の分類学的記述
0004335314.tif 000006
ロドコッカス・エリスロポリスRhodococcus erythropolis ＣＢ  １０１（ＤＳＭ１０６８６）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：  短く分岐した線状で、成長すると桿状および球状に分裂する。コロニーは光り輝き、部分的に合流していて，ピンク色がかったベージュ色である。  ＲＡＬ  １００１
２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：  メソジアミノピメリン酸
３．菌類酸：  ロドコッカス菌酸；  菌酸の鎖長（Ｃ32−Ｃ44）の測定、およびＤＳＭ菌酸データバンクに入っているデータとの比較により、ロドコッカス・エリスロポリス株のパターンとの大きな類似性が見出された（類似度：０．５８８）。
４．脂肪酸パターン：  非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステアリン酸
５．菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分的な配列は，ロドコッカス・エリスロポリスの特定の領域におけるそれとの間で、高度（１００％）の一致が見出された。
同定の結果は、相互に独立な３種の方法（菌酸、脂肪酸、１６Ｓ ｒＤＮＡ）により、この菌株がロドコッカス・エリスロポリスとされたので，不明瞭ではない。
ゴルドナGordona ｓｐ．ＣＢ  １００（ＤＳＭ１０６８７）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：  短く分岐した線状で、成長すると桿状および球状に分裂する。コロニーは薄いオレンジ色である。（ＲＡＬ  ２００８）
２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：  メソジアミノピメリン酸
３．メナキノン・パターン：  ＭＫ−９  （Ｈ2）１００％
４．菌類酸：  ゴルドナ菌酸；  菌酸の鎖長（Ｃ50−Ｃ60）は、高温ガスクロマトグラフィーにより測定された。このパターンは、ゴルドナ属の代表的なものに見出されるパターンに対応する。
５．脂肪酸パターン：  非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステアリン酸
６．菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列に関して、ゴルドナ・ルブロペルチンクタの特定の領域における配列との間で、比較的低い９８．８％の一致が見出されただけであった。
入手できた結果（メナキノン、菌類酸、脂肪酸、１６Ｓ ｒＤＮＡ）に基づき、菌の区分は不明瞭でなくゴルドナ属への帰属を与えたが、これらの結果に基づいて，ゴルドナ属の既知の種に分類することは不可能であった。それゆえ、菌株ＤＳＭ１０６８７は、ゴルドナ属の中で、新規であってこれまで記述されたことのない種であると推測される。
アルカリゲネス・キシロソキシダンスAlcaligenes xylosoxydans ssp.デニトリフィカンスdenitrificans ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）の分類学的記述菌株の特性：
0004335314.tif 000007
アースロバクターArthrobacter sp. ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）の分類学的記述
0004335314.tif 000008
アグロバクテリウム／リゾビウムAgrobacterium/Rhizobium ＨＳＺ３０の分類学的記述
0004335314.tif 000009
１６Ｓ ｒＤＮＡの部分的配列は、アグロバクテリウム亜属およびリゾビウム亜属の代表的なものに対する、比較的高い類似度約９６％を示した。これらの亜属の範囲内で、不明瞭でない種の決定をすることは不可能であった。
バチルス・シンプレックスBacillus simplex Ｋ２の分類学的記述
0004335314.tif 000010
0004335314.tif 000011
細胞の脂肪酸を分析した結果、バチルス属への帰属が確認された。１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列は、バチルス・シンプレックスへの１００％の類似を示した。
シュードモナス・プチダPseudomonas putida Ｋ３２の分類学的記述
0004335314.tif 000012
0004335314.tif 000013
細胞の脂肪酸のプロフィールは、シュードモナス・プチダに典型的なものであった。
１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列は、シュードモナス・メンドキナおよびシュードモナス・アルカリゲネスへの約９８％の類似度を示した。シュードモナス・プチダへの類似度は、９７．４％であった。
ロドコッカスｓｐ．ＦＢ  ３８７（ＤＳＭ１１２９１）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：  短く分岐した線状で、成長すると桿状および球状に分裂する。コロニーはつやが無く、薄い赤〜オレンジ色である。ＲＡＬ２００８
２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：  メソジアミノピメリン酸
３．菌類酸：  ロドコッカス菌酸；  菌酸の鎖長（Ｃ32−Ｃ44）およびＤＳＭＺ菌酸データバンクに入っているデータとの比較により、ロドコッカス・ルーバー株のパターンと、ごく小さな（類似度０．０１９）類似性が見出されただけであった。この相関因子はあまりに低く、種の同定には使用できない。
４．脂肪酸パターン：  非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステアリン酸。この脂肪酸パターンは、ロドコッカス属のすべての代表的な菌およびその近縁の菌、たとえばミコバクテリウム、ノカルディアおよびゴルドナに関して決定可能なものであった。脂肪酸パターンの定性的および定量的な差異を含めることにより、種のレベルにおける異同を決定しようとの企てがなされた。ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７の脂肪酸パターンを、データバンクに入っているデータと比較するため、多くの方法が使用された。それらの方法によっても、類似度が小さい（０．０６３）ため、ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７を、すでに記述されているロドコッカスの種に分類することは不可能であった。
５．菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分的な配列に関して、９６−８１８は、ロドコッカス・オパクスに、相関度９７．９％をもって分類された。この配列の一致は、この分類法が、不明瞭でない種の決定するためには必要であるとしている、９９．５％の相関度よりは低い。
入手できた結果に基づけば、菌株ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７は、ロドコッカスの、新規であってこれまで記述されたことのない種であると推測される。
本発明の酵素、すなわち前記の式VIIのシクロペンテン誘導体を加水分解することのできるＮ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼは、たとえば、本発明の微生物の細胞を、当業者にとっては常用の手法で破壊することによって得ることができる。このためには、たとえば、超音波やフレンチプレス法を使用することができる。これらの酵素は、たとえば、微生物ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得ることができる。本発明の微生物、とくにロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得ることができる酵素は、次の特性を有することが好ましい。
ａ）最適ｐＨが、ｐＨ７．０±１．０であること；
ｂ）最適温度が、ｐＨ７．０において２５℃から３０℃の間にあること、および
ｃ）基質１−アセチルアミノ−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンに対するＫMの値が２２．５ｍＭ±７．５ｍＭ（３０℃、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）であること。
ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭｌ０６８６）から得られる酵素の塩基配列を分析して、次のことがわかった。
ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asnであること、
また、分子量の測定から、次のことがわかった。
ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は５０ｋＤであること。
本発明の微生物、たとえばロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得られるそのような酵素は、次のような物質を加水分解する。たとえば、とりわけ、１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、１−プロピオニルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンおよび１−イソブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンである。
本発明の、下記の式の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン
0004335314.tif 000014
および（または）下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミノアルコール誘導体
0004335314.tif 000015
（式中、Ｒ1は前記した意味を有する）
の製造方法は、たとえば第一工程で、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン
0004335314.tif 000016
をアシル化して、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体とすることによって行なわれる。
0004335314.tif 000017
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
前駆体の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンは、ＥＰ−Ｂ０５０８３５２に記載されているようにして、製造することができる。
アシル化は、下記の一般式のハロゲン化カルボニルを使用するか、
0004335314.tif 000018
（式中、Ｘはハロゲン原子をあらわし、Ｒ1は上記した意味を有する）
または、下記の一般式のカルボン酸無水物を使用して実施することができる。
0004335314.tif 000019
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する）
ハロゲン原子Ｘとしては、Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩが使用できる。ＣｌまたはＦが、好ましく使用される。
ハロゲン化カルボニルの例は、アセチルクロライド、クロロアセチルクロライド、ブチリルクロライド、イソブチリルクロライド、フェニルアセチルクロライド、ベンジルクロルホルメート（Ｃｂｚ−Ｃｌ）、プロピオニルクロライド、ベンゾイルクロライド、アリルクロロホルメートまたはtert−ブチルフルオロホルメートである。カルボン酸無水物の例は、ジ−tert−ブチルジカーボネート、ブチリックアンハイドライド、アセチックアンハイドライドまたはプロピオニックアンハイドライドである。
アシル化は、溶媒なしでも実施できるし、またアプロティックな溶媒を用いても実施できる。
アシル化は、アプロティックな溶媒の中で、好都合に実施できる。適切なアプロティック溶媒の例は、ピリジン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トルエン、メチレンクロライド、Ｎ−メチルピロリドンまたはこれらの混合物である。好ましく使用される溶媒は、ピリジンまたはアセトニトリル、とくにピリジンとアセトニトリルとの混合物である。
アシル化は、−８０から５０℃の温度で好都合に実施でき、好ましくは、０から２５℃において実施される。
本発明の方法の第二工程では、式VIの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体を還元して、下記の一般式のシクロペンテン誘導体とする。
0004335314.tif 000020
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する。）
還元は、アルカリ金属ボロハイドライドまたはアルカリ土類金属ボロハイドライドを用いて、またはアルカリ金属アルミニウムハイドライドまたはアルカリ土類金属アルミニウムハイドライドまたはビトライドVitride、すなわちナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムハイドライドを用いて、好都合に実施することができる。ナトリウムまたはカリウムのアルミニウムハイドライドが、アルカリ金属アルミニウムハイドライドとして使用できる。ナトリウムまたはカリウムのボロハイドライドが、アルカリ金属ボロハイドライドとして使用できる。カルシウムボロハイドライドが、アルカリ土類金属ボロハイドライドとして使用できる。
この還元は、プロティックな溶媒の中で好都合に実施することができる。使用できるプロティックな溶媒は、低級脂肪族アルコール、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、sec−ブタノール、tert−ブタノールもしくは水、またはこれらの混合物である。
還元は、−４０から４０℃の温度で好都合に実施でき、好ましくは、０から２０℃において実施される。
本発明の従う、一般式VIIのシクロペンテン誘導体の、下記の式の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン
0004335314.tif 000021
への転化は、微生物またはそれから抽出した酵素を手段としてもよいし、ペニシリンＧアシラーゼを手段としてもよいし、また、Ｎ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ活性を有する酵素を手段としてもよい。このバイオ変換は、上記の式ＩおよびIIの（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンをもたらす（適切であればそれを単離する）だけでなく、下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミノアルコール誘導体
0004335314.tif 000022
（式中、Ｒ1は上記した意味を有する）
をも与える。後者の物質も、適切であれば同様に単離する。
一般式VIIのシクロペンテン誘導体を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる、すべての微生物が、本発明に適する。バイオ変換は、シクロペンテン誘導体の（１Ｒ，４Ｓ）−異性体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる微生物を用いて、好都合に実施することができる。
このバイオ変換は、好ましくは、アルカリゲネス／ボルデテラ、ロドコッカス、アースロバクター、アルカリゲネス、アグロバクテリウム／リゾビウム、バチルス、シュードモナスまたはゴルドナ属から選んだ微生物、とりわけ、アルカリゲネス／ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、アースロバクター ｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカス ｓｐ．ＦＰ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンス ｓｓｐ．デニトリフィカンス ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウム ＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２、シュードモナス・プチダＫ３２、またはゴルドナ ｓｐ．（ＤＳＭ１９６８７）、またはこれらの機能的に等価な変異種または突然変異種を使用して行なう。これらの微生物は、すでに述べたように、ブダペスト条約に従って寄託済みである。
本発明の方法にとってきわめて適当な微生物の種は、アルカリゲネス／ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）およびゴルドナ ｓｐ．（ＤＳＭ１０６８７）である。
バイオ変換は、これらの微生物の常法に従った当初の培養の後、静止状態の細胞（もはや炭素源もエネルギー源も要求しない、非成長細胞）を用いて、または成長している細胞を用いて、行なうことができる。バイオ変換は、好ましくは静止状態の細胞を用いて行なう。
本発明の方法にとって好適な酵素であるＮ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼは、上述した方法により得ることができ、かつすでに上述した特性を有する。
適切なペニシリンＧアシラーゼは、多種類の微生物たとえば、バクテリアまたはアクチノミセテスactinomycetesから得ることができる。とくに、下記の微生物から得ることができる：エシェリチア・コリEscherichia coli ＡＴＣＣ９６３７、バチルス・メガテリウムBacillus megaterium、ストレプトミセス・ラベンデュリStreptomyces lavendulae ＡＴＣＣ１３６６４、ノカルディア ｓｐ．ＡＴＣＣ１３６３５、プロビデンシア・レットゲリProvidencia rettgeri ＡＴＣＣ９９１８、アースロバクター・ビスコススArthrobacter viscosus ＡＴＣＣ１５２９４、ロドコッカス・ファシアンスRhodococcus fascians ＡＴＣＣ１２９７５、ストレプトミセス・フェオクロモゲネスStreptomyces phaeochromogenes ＡＴＣＣ２１２８９、アクロモバクターAchromobacter ＡＴＣＣ２３５８４およびミクロコッカス・ロゼウスMicrococcusu roseus ＡＴＣＣ４１６である。市場で入手できるペニシリンＧアシラーゼ、とくにエシェリチア・コリから得たペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリンガー・マンハイム）、またはバチルス・メガテリウムから得たものが使用できる。
固定化したペニシリンＧアシラーゼは、好ましい態様において使用される。
バイオ変換は、当業技術において通常の媒体、たとえば、低モル濃度のリン酸塩、クエン酸塩またはヘペスHepes緩衝溶液の中で、水の中で、完全培地たとえば栄養イーストブロスNutrient Yeast Broth（ＮＹＢ）または表に示したそれの中で行なうことができる。このバイオ変換は、好ましくは表１に示した培地または低モル濃度のリン酸緩衝液を使用して実施する。
本発明のバイオ変換は、シクロペンテン誘導体（式VII）を、１回で添加しても実施できるし、連続的に添加して濃度が重量で１０％、好ましくは２％を超えないようにして、好都合に実施することができる。
バイオ変換の間、ｐＨは、５ないし９の範囲、好ましくは６ないし８の範囲とすることができる。このバイオ変換は、温度２０ないし４０℃、好ましくは２５ないし３０℃で、好都合に実施できる。
（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンがバイオ変換の間に生成するときは、これを、酸たとえば塩酸を用いた酸加水分解により、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンに転化させることができる。
［実施例１］
（±）−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１００ｇを、アセトニトリル（８００ml）およびピリジン（１６１．２６ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、アセチルクロライド１０４．５ｇを、２時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で４．５時間攪拌した。混合物に水８００mlを添加し、アセトニトリルを、真空下に蒸発させた。水性相を３回、酢酸エチル４００mlで抽出した。一体にした有機相を１Ｎ−ＨＣｌ（４００ml）、水（４００ml）、飽和ＮａＣｌ（４００ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残渣をメチレンクロライドに取り、シリカゲルで濾過した。濾液を濃縮し、生成物を蒸留により精製した。製品１０７．７６ｇが、透明な液体として得られた。収率は７１％であった。
沸点（０．０７Torr）：  ５１℃
0004335314.tif 000023
［実施例２］
（±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１００．３ｇを、アセトニトリル（７２０ml）およびピリジン（１４２ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、ブチリルクロライド１４１．８ｇを、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で３時間攪拌した。混合物に、水７２０mlを添加した。アセトニトリルを真空下に蒸発させ、水性相を３回、酢酸エチル（３００ml）で抽出した。一体にした有機相を１Ｎ−ＨＣｌ（３５０ml）、飽和ＮａＣｌ（４００ml）および水（５００ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。生成物を蒸留により精製した。製品１０７．７６ｇが、透明な液体として得られた。収率は８５％であった。
沸点（０．０５Torr）：  ７０℃
0004335314.tif 000024
［実施例３］
（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの３３．４ｇを、アセトニトリル（２４０ml）およびピリジン（４８．３ml）中に窒素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、フェニルアセチルクロライド６８．６ｇを、３０分間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で３．５時間攪拌した。混合物に水２４０mlを添加した。アセトニトリルを真空下に蒸発させ、水性相を３回、酢酸エチル（１５０ml）で抽出した。一体にした有機相を、１Ｎ−ＨＣｌ（１５０ml）、飽和ＮａＣｌ（１５０ml）および水（１５０ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。粗生成物をシリカゲルで濾過した（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）。粗製品６８．３４ｇが、黄色い液体として得られた。
［実施例４］
（±）−２−プロピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの４７ｇを、アセトニトリル（３２５ml）およびピリジン（４１ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、プロピオニルクロライド４３．９ｇを、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を、室温で５時間攪拌した。混合物に水１４５mlを添加し、アセトニトリルを真空下に蒸発させた。水性相を３回、酢酸エチル１１５mlで抽出した。一体にした有機相を、１Ｎ−ＨＣｌ（１４０ml）、飽和ＮａＨＣＯ3（４０ml）溶液およびＮａＣｌ（４０ml）溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残留物を蒸留により生成した。表題化合物５５．８ｇが得られ、放置したところ固化した。収率は８１．６％であった。
２．８mbarにおける沸点：  ７５−８０℃
融点：５４−５６℃
0004335314.tif 000025
［実施例５］
（±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの４５．１ｇを、アセトニトリル（３１０ml）およびピリジン（３９ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解した。１０℃において、イソブチリルクロライド５４．１ｇを、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で５時間攪拌した。混合物に水１４０mlを添加し、アセトニトリルを真空下に蒸発させた。水性相を、４×１２０mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を、１Ｎ−ＨＣｌ（５０ml）、飽和ＮａＨＣＯ3（５０ml）溶液およびＮａＣｌ（５０ml）溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残留物を、活性炭とともに、ｎ−ヘキサン（２４０ml）中で還流下に沸騰させた。活性炭を濾過して分離したのち、濾液を０℃に冷却し、表題化合物を濾過して取得した。５４．５ｇの製品がえられた。収率は７６％であった。
融点：４１−４２℃
0004335314.tif 000026
［実施例６］
（±）−２−クロロアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１０．１ｇを、ジクロロメタン（１０ml）、ピリジン（８．４ml）および４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの０．２２ｇの混合物中に、窒素ガス雰囲気下に溶解した。クロロアセチルクロライド１３．５ｇを、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。温度は４４℃に上昇した。ついで混合物を、室温でさらに２時間攪拌した。混合物に水１００mlを添加した。相分離ののち、水性相を１００mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残留物を、活性炭１ｇとともに、ジイソプロピルエーテル１００ml中で還流下に１０分間沸騰させた。熱時濾過して得た濾液を室温に冷却し、固体を濾過して分離したのち、乾燥した。表題化合物１０．３５ｇが得られた。収率は６０％であった。
融点：  ８６−８８℃
0004335314.tif 000027
［実施例７］
（±）−２−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの７９．５６ｇを、エタノール（４５０ml）中に、窒素ガス下に溶解し、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１９．８ｇを分割して、４５分間を費やして、この溶液に滴下した。
混合物を０℃で３時間攪拌し、ついで濃硫酸を用いて、ｐＨを１．８に調整した。酢酸エチル（２００ml）をこの混合物に添加し、固体分を濾過分離した。ついで、完全に蒸発させた。残渣を水に取り、メチレンクロライドで洗浄し、完全に蒸発させた。粗生成物を、酢酸エチル／メタノール５：１を溶媒として用いたシリカゲル濾過により精製した。濾液を濃縮した。５１．８３ｇの生成物が、白色固体として得られた。収率は、使用した２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、６４％であった。
融点：９１−９３℃
0004335314.tif 000028
［実施例８］
（±）−１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの７３．８７ｇを、エタノール（４００ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１５．６８ｇを、分割して、４５分間を費やしてこの溶液に滴下した。混合物を０℃で３時間攪拌し、ついで濃硫酸を用いてｐＨを１．５に調整した。酢酸エチル（２００ml）をこの混合物に添加し、固体分を濾過分離した。ついで完全に蒸発させた。残渣を水に取り、メチレンクロライドで洗浄し、完全に蒸発させ他のち、高真空下に乾燥した。６０．５５ｇの生成物が得られた。収率は、使用した（±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、８０％であった。
融点：７１−７２℃
0004335314.tif 000029
［実施例９］
（±）−１−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの６７ｇを、エタノール（４５０ml）中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１３．２ｇを、分割して、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。混合物を室温で３．５時間攪拌したのち、濃硫酸を用いて、ｐＨを３．８に調整した。ついで完全に蒸発させた。残渣を乾燥したのち、シリカゲル濾過（ヘキサン：酢酸エチル＝１：９）により精製した。酢酸エチルからの再結晶の後、５４．６ｇの白色固体が得られた。収率は、使用した（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、８０％であった。
0004335314.tif 000030
［実施例１０］
（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンハイドロクロライドの１５ｇを、水１５０mlとジオキサン１５０mlとの混合溶媒中に、室温で窒素ガス雰囲気下に溶解した。溶液のｐＨを１Ｎ−ＮａＯＨで１４に調整し、tert−ブチロキシカルボニルフルオライド（ＢＯＣ−Ｆ，２０％過剰）のジエチルエーテル溶液を加え、混合物をさらに３時間室温で攪拌した。（ＢＯＣ−Ｆは、Synthesis 1975, 599に従って用意した。）ｐＨを、濃ＨＣｌで２に調節した。有機溶媒を蒸留除去し、残渣に水５０mlを加えてから、混合物を３×１００mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させた。残渣を、ジイソプロピルエーテル１１０mlとｎ−ヘキサン８０mlとの混合物から再結晶させた。表題化合物１１．９５ｇが得られた。収率は５６％であった。
融点：６８−７０℃
0004335314.tif 000031
［実施例１１］
（±）−１−プロピオニルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−２−プオピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１６．６ｇを、水（１４０ml）と２−ブタノール（６６ml）との混合溶媒中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、−５℃に冷却した。３ｇのナトリウムボロハイドライドを、分割して２時間にわたって添加した。混合物を１０℃で２．５時間で攪拌し、ついで、濃塩酸と水との混合物（１：１）で、ｐＨを２．２に調節した。溶液を４０ｇになるまで蒸発させ、２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを６．２に調節した。混合物を５×５０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させ、残渣を、トルエン（１５０ml）から再結晶させた。表題化合物１１．１ｇが得られた。収率は６５％であった。
融点：６７−６８℃
0004335314.tif 000032
［実施例１２］
（±）−１−イソブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製造
（±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの９ｇを、水（３２ml）と２−ブタノール（８４ml）との混合溶媒中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１．３７ｇを、分割して３．５時間にわたって添加した。混合物を３時間、２０℃で攪拌し、ついで濃塩酸と水との混合物（１：１）でｐＨを２．５に調節したのち、２Ｎ−ＮａＯＨで中和した。溶液を４０ｇになるまで蒸発させた。濃縮液を、３×８０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させた。その結果生じた固体を、トルエン２５mlから再結晶させた。表題化合物６．８ｇが得られた。収率は７３．６％であった。
融点：８０−８１℃
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［実施例１３］
ペニシリンＧアシラーゼを使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
Ｅ．ｃｏｌｉから得たペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリンガー・マンハイム）１６５Ｕ（単位）／ｇまたはバチルス・メガテリウムから得たペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１を、バイオ変換に使用した。
この目的で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５−９，４ml）に１−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの非ラセミ体を１重量％、適切なペニシリンＧアシラーゼ４００mgを、３７℃で接種した。
所定の時間間隔でサンプルを採取し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０、ブタノール：水：氷酢酸＝３：１：１、ニンヒドリンで検出）、ガスクロマトグラフィー（キャピラリーカラム、ＨＰ−５、５％フェニルメチルシロキサン）またはＨＰＬＣにより分析した。酵素が、フェニルアセチル基を高い活性をもって除去し、それによって４０％までの対応するアミノアルコールを放出した。遊離のアミノアルコールが、８０％のｅｅをもって得られた。
［実施例１４］
微生物を使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
１４．１
ヴィスプにあるARA水処理プラントから得た下水汚泥（２０％）を、１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリル−、または１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを０．５重量％含有するA+N培地（表１を参照）に接種して、３７℃において、振とうしながら培養した。（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの生成を、薄層クロマトグラフィーにより確認した。
１−３転移は、これら成分の１％の富化によって実施され、単離は固体（表１の培地中における板状計数寒天；２０ｇ／ｌ）媒体上で行なった。微生物アルカリゲネス／ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、ゴルドナ ｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）およびロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）を、このようにして単離した。
１４．２
上記のようにして単離した微生物を、１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリル−、または１−ブチリル−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを０．５％含有する培地（表１）で培養した。微生物は、２４ないし３６時間後に、光学密度（ＯＤ）２ないし３に成長した。このようにして得た細胞を、成長の遅い指数関数相において収穫し、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液中で洗浄した。
これに続くバイオ変換を、１−アセチル−、１−イソブチリル−、または１−ブチリル−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを１重量％含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液中（ｐH４．５−９）で実施した。薄層クロマトグラフィーにより、基質の５０％が加水分解されて（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンになったことが見出された。ＨＰＬＣ分析により、ｅｅ値は８０ないし９３％であることが判明した。
基質として１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを使用したとき、バイオ変換の速度は、ＤＳＭ１０６８６株をA＋N培地上で培養した場合は０．１４（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）、１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを含有するＮＹＢ（栄養イーストブロス）培地上で培養した場合は０．０３（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。
同じ変換を、ＤＳＭ１０６８７株を用い、基質（１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン）濃度２００ｍＭで実施した場合、バイオ変換速度は０．１６１（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。
0004335314.tif 000034
１４．３
ロドコッカス・エリスロポリスＤＳＭ１０６８６を、唯一の炭素および窒素源として酢酸アンモニウム（３ｇ／ｌ）を加えた最小培地（表２参照）中、６リットルの発酵器を用いて、３０℃において、細胞密度がＯＤ６５０＞２５となるまで培養した。細胞の成長の間、追加の炭素源として、５０％酢酸を連続的に添加した。ついで、酵素活性を誘起するため、６０ｇの（＋／−）−１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを添加し、培養をさらに数時間続けた。最後に、さらに４０ｇの（＋／−）−１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを添加し、さらに１０時間、培養を続けた。バイオ変換の進行は、オンラインでＨＰＬＣにより追跡した。使用した基質ラセミ体基準での分析値が４０％、ｅｅ値が８５％に到達したとき、酸を加えることにより発酵を停止した。
0004335314.tif 000035
１４．４
実施例１４．３と同様にして、微生物アースロバクター ｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンス ｓｓｐ．デニトリフィカンス ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウム ＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２およびシュードモナス・プチダＫ３２を、酢酸ナトリウム上、前記培地（表１）上で、１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリル−、または１−ブチリル−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（以下「アミノアルコール」と略称）の存在下または不存在下に培養した。
アミノアルコールの存在下に培養した指数関数細胞に関して、下記の結果が得られた。（ＨＰＬＣ分析）
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菌株Ｋ２およびＫ１７を培養し、収穫して、６０時間のバイオ変換にかけた。
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すべてのバッチから指数関数成長細胞および定常状態細胞を収穫し、バイオ変換の静止細胞として使用した。ＴＬＣ分析の結果からは、アミノアルコールで誘導した細胞と、誘導しなかった細胞との間に、差異は認められなかった。
［実施例１５］
ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノ−アルコールハイドロラーゼの精製
酵素を、下記のようにして、分子量５０ｋＤにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ファルマシア・ファストゲル、１０−１５％勾配）蛋白質バンドが単一になるまで精製した。
ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）の細胞を、５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ6.2）の中で洗い、光学密度ＯＤ650nmが１９０になるまで濃縮した。最終濃縮物１ｍＭおよびＤＮＡｓｅにフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を添加した後、粗生成物を得るため、細胞をフレンチプレスで処理した。遠心分離を行なって、２００mlの細胞を含まないエキストラクトを、蛋白質濃度４．８mg/mlで得た。
細胞を含まないエキストラクト９６０mgを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡にしておいた、ハイロードHiLoad２６／１０Ｑ−セファロースSepharoseイオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に載せた。
カラムを同じ緩衝溶液で洗浄したのち、蛋白質を直線的な緩衝溶液勾配（１５００ｍｌ；勾配は、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）−ＤＴＴの１ｍＭおよび１Ｍ−ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．０）である）で溶離した。酵素は、３７０および４３０ｍＭ−ＮａＣｌの間、ｐＨ７．６において、カラムから溶出した。活性な画分を集め、９mlに濃縮した。蛋白質の含有量は４１mgであった。
さらに精製するため、この蛋白質溶液を、５０ｍＭのＮａＣｌおよびＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液であらかじめ平衡にしてある、ハイロード２６／６０スーパーデックスSuperdex ７５ゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に載せた。活性な成分を一体にしたところ、全蛋白質含有量は１０．９mgであった。
この蛋白質溶液を、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．５）であらかじめ平衡にしてある、モノMonoＱＨＲ５／５カラム（ファルマシア）に載せた。蛋白質を、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．５）−ＤＴＴの１ｍＭおよび１Ｍ−ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．５）という、直線的な勾配（４０ml）で溶離した。酵素は、３９０および４４０ｍＭ−ＮａＣｌの間で溶出した。活性な画分は、蛋白質１．４mgを含んでいた。
最後の精製段階では、上記と同じ緩衝溶液で平衡にした、同じカラムを使用した。使用した溶離の勾配は、同じ緩衝溶液で、０−５００ｍＭ−ＮａＣｌおよびｐＨ７．０−８．５とした。このようにして、４３０μｇの純粋な酵素を得ることができた。
この酵素のＮ−末端配列が、プロテイン・ブロットから直接決定された。下記の２０個のアミノ酸配列が得られた：Thr−Glu−Gln−Asn−Leu−His−Trp−Leu−Ser−Ala−Thr−Glu−Met−Ala−Ala−Ser−Val−Ala−Ser−Asn
この配列は、既知の蛋白質のいずれに対しても、同族関係を示さなかった。
［実施例１６］
酵素の特性の決定
酵素の特性の決定を、精製した酵素と、細胞を含まないエキストラクトであって、セファデックスSephadex Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０，ファルマシア）を使用して脱塩したものとの、両方について行なった。
細胞を含まないエキストラクト中の蛋白質濃度は７．３mg/mlであり、精製した酵素の中の蛋白質濃度は１３５μg/mlであった。この細胞を含まないエキストラクトに、ＰＭＳＦは加えなかった。
１６．１  Ｋｍ測定
細胞を含まないエキストラクトについて、Ｋｍ測定を行なった。ｐＨ７．０および温度３０℃における反応のＫｍは、基質１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンに関し、２２．５ｍＭであった。
１６．２  最適ｐＨ
１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（２５ｍＭ）の加水分解に最適なｐＨを、精製した酵素および細胞を含まないエキストラクトについて、ｐＨ６．２−９．０のｐＨ範囲において、下記の緩衝溶液中で決定した。
トリス緩衝溶液１００ｍＭ  ｐＨ９．０；８．５；８．０；７．５；７．０
クエン酸／リン酸緩衝溶液１００ｍＭ  ｐＨ７．０；６．５５；６．２
活性は、２４時間測定した。
反応の最適ｐＨは、１Ｒ，４Ｓおよび１Ｓ，４Ｒエナンチオマーを製造する反応に関して、ｐＨ７．０からｐＨ７．５の間にあった。
細胞を含まないエキストラクトの活性に対し最適なｐＨは、ｐＨ７．０であった。選択性は、しかし、ｐＨ６．０からｐＨ７．０の間で、より高かった。
第１図は、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ（細胞を含まないエキストラクト）の活性を、ｐＨの関数として示す。
１６．３  最適温度
実施例１６．２に示した反応にとって最適な温度は、２５ないし３０℃であった。
第２図は、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノ−アルコールハイドロラーゼ（細胞を含まないエキストラクト）の活性を、温度の関数として示す。
塩基配列のリスト
（１）一般的情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：  ロンザＡＧ
（Ｂ）町名：  ミュンヒェンシュタイナーシュトラーセ  ３８
（Ｃ）市名：  バーゼル
（Ｅ）国名：  スイス
（Ｆ）郵便番号：  ４００２
（ii）発明の名称：  アミノアルコールの製造方法
（iii）配列の数：  １
（iv）コンピューター読み取り可能なフォーム
（Ａ）媒体のタイプ：  フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：  ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：  パテントイン
リリース＃１．０、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（２）配列情報のＩＤ番号：  １
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：  ２０アミノ酸
（Ｂ）タイプ：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  未知
（ii）分子のタイプ：  たんぱく質
（iii）ハイポセチカル：  なし
（iv）アンチセンス：  なし
（ｖ）断片のタイプ：  Ｎ−末端
（vi）最初の起源：
（Ｂ）菌株：  ロドコッカス・エリスロポリス
（Ｃ）個別／単離体：  ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１
（xi）配列の記述：配列ＩＤ番号：  １
0004335314.tif 000038
【図１】
0004335314.tif 000050
【図２】
0004335314.tif 000051