(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）：
【化１】
0004267123.tif 000039
［式（１）中、
Ｘは、ＮＨであり；
Ｚは、ＮＨ又はＯであり；
ｋは０又は１であり；
ｍは０ないし２の整数であり；そして
ｎは１ないし２０の整数である］
で表される構造を有する化合物。
【請求項２】
式（１）において、ＸがＮＨであり、ＺがＯであり、ｋが０であり、ｍが２であり、そしてｎが５である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）：
【化２】
0004267123.tif 000040
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントの製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の結合体を抗原として用いることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を示し、マラオクソンに対する交差反応率が１．６％以下である、抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項７】
モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３又はそのフラグメントである、請求項５若しくは６に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメント。
【請求項８】
請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１５７で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメントを用いることを特徴とする、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【請求項１１】
さらに、請求項１若しくは２に記載の化合物又は請求項３に記載の結合体を用いることを含む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ−１，２−ビス（エトキシカルボニル）エチル  Ｏ，Ｏ−ジメチルホスホロジチオアート（以下、本明細書中「マラチオン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
マラチオンは、以下の式（２）：
【０００４】
【化３】
0004267123.tif 000002
【０００５】
で表される構造を有する、ジチオ型の低毒性有機リン系殺虫剤である。ウンカ・ヨコバイ類、アブラムシ、スリップス、アザミウマなどの吸汁性害虫に効力を示す。本剤の殺虫機構の主体はパラチオン剤、ＥＰＮ剤などと同様にコリンエステラーゼの阻害にある。殺虫力はそれらよりも一般に弱いが、虫の種類によっては強く、選択的であり、速効的である。浸透移行性はかなりあるが、植物体組織中で分解されやすく、また、植物体表面からの揮散や分解によっても失われるので残効期間は短いと考えられる。そのため果樹や野菜に対して収穫の数日前まで使用できるが、発生期間の長い害虫や世代の短い害虫には反覆して使用しないと効果が少ない。土壌害虫や潜食性害虫にも効果は少ない。薬害としては、特にウリ類、トマト類の苗はマラチオン剤に対して感受性が高いので注意する必要がある（農薬ハンドブック  第２８頁−第３２頁及び第５１４頁、１９９４年版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」  第３８４頁−第３８６頁、農薬残留分析法研究班編集  中央法規出版）。
【０００６】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。マラチオンについては、食品衛生法に基づき残留基準値が、米（０．１ｐｐｍ）、穀類（２−８ｐｐｍ）、豆類、果実、野菜（０．５−８ｐｐｍ）、小麦粉（１．２ｐｐｍ）、オイルシード（０．１−８ｐｐｍ）、ナッツ類（８ｐｐｍ）、ホップ（１ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  同上）。さらに、水質に関しても、水質汚濁に係る登録保留基準値が０．１ｍｇ／ｌと定められている（改訂３版  農薬登録保留基準ハンドブック  第８７４頁−第８７６頁  １９９８年９月２５日  化学工業日報社）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、マラチオンの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【０００７】
従来、例えば農作物中のマラチオンは、穀類、豆類、種実類、ホップ、果実、野菜等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、例えば試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶し、必要によりヘキサン−アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法等が採用されている。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。マラチオンの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００８】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【０００９】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＳＢＮ  ０−７２０４−４２００−１  （１９９０）  に記載されている。
【００１０】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、マラチオンのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【００１１】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１２】
このように、マラチオンについては、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明前には得られていなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マラチオンに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００１４】
本発明はその一態様において、マラチオンに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００１５】
本発明は、また、マラチオンに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、さらに、マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１８】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を使用することを含む、マラチオンの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、マラチオン又はその部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入したマラチオンハプテンを使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００２０】
本発明の対象となるマラチオンは、以下の式（２）：
【００２１】
【化４】
0004267123.tif 000003
【００２２】
で表される化合物である。
本発明において、化合物の立体異性体は特に限定されず、全ての立体異性体を含む。
【００２３】
本発明の抗体は、例えば、マラチオンにスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した化合物をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【００２４】
【化５】
0004267123.tif 000004
【００２５】
［式（１）中、
Ｘは、ＮＨ又はＳであり；
Ｚは、ＮＨ又はＯであり；
ｋは０又は１であり；
ｍは０ないし２の整数であり；そして
ｎは１ないし２０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。
【００２６】
好ましくは、ｋは０である。好ましくは、ｍが２である。好ましくは、ｎが５ないし１０の整数である。
【００２７】
より好ましくは、ＸがＮＨであり、ｋが０であり、ｍが２であり、そしてｎが５である。
【００２８】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、マラチオンに反応する抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるマラチオンの免疫学的測定方法に関する。
マラチオンハプテンの作製
式（１）で表されるマラチオンハプテンは、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
Ｉ．Ｘ＝Ｓの場合
ｉ）ｋ＝０かつＺ＝ＮＨの場合
先ず、五硫化二リンに有機溶媒中、メタノールを反応させる。反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは４０℃から７０℃で、１時間から２４時間、好ましくは２時間から５時間、撹拌しながら行う。
【００２９】
有機溶媒としては、例えば、トルエン、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、ペンタン、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いることができる。
【００３０】
次いで、塩基を加え、さらに、以下の式（Ｙ１）：
【００３１】
【化６】
0004267123.tif 000005
【００３２】
［式（Ｙ１）中、ＬはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子である］
で表される構造を有するエステル化合物を反応させて、以下の式（Ｙ２）：
【００３３】
【化７】
0004267123.tif 000006
【００３４】
で表される構造を有する化合物を得る。
塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、リチウムジイソプロピルアミド等を用いることができる。
【００３５】
反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは４０℃から７０℃で、１時間から２４時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【００３６】
次いで、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジイソプロピルアミド等の存在下、有機溶媒中、式（Ｙ２）の化合物を以下の式（Ｙ３）：
【００３７】
【化８】
0004267123.tif 000007
【００３８】
［式（Ｙ３）中、
Ｐはカルボキシル基の保護基であり；そして
Ｌ及びｍは、先に定義した通りである］
で表される構造を有するエステル化合物を反応させて、以下の式（Ｙ４）：
【００３９】
【化９】
0004267123.tif 000008
【００４０】
［式（Ｙ４）中、Ｐ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造式を有する化合物を得る。
【００４１】
有機溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。
【００４２】
Ｐで表されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエトキシメチル基等が挙げられる。但し、後述する加水分解による除去工程においてエチル基よりもカルボキシル基から遊離しやすいものがよく、例えば、ｔ−ブチル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基等が好ましい。
【００４３】
反応は、マイナス１００℃から溶媒の沸点、好ましくはマイナス８０℃から３０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【００４４】
次いで、式（Ｙ４）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｙ５）：
【００４５】
【化１０】
0004267123.tif 000009
【００４６】
［式（Ｙ５）中、ｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００４７】
保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。
【００４８】
すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｙ４）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させることにより式（Ｙ５）の化合物を得ることができる。
【００４９】
また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｙ４）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、ＴＨＦ、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から室温で、５分から１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させることにより式（Ｙ５）の化合物を得ることができる。
【００５０】
更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によっても行うことができる。
【００５１】
更にまた、Ｐがシリル基の場合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても行うことができる。
【００５２】
次に、好ましくはＴＨＦ、メタノール、エタノール、エチレングリコール等の有機溶媒中、式（Ｙ５）の化合物を以下の式（Ｙ６）：
【００５３】
【化１１】
0004267123.tif 000010
【００５４】
［式（Ｙ６）中、Ｐ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させることにより、以下の式（Ｙ７）：
【００５５】
【化１２】
0004267123.tif 000011
【００５６】
［式（Ｙ７）中、Ｐ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００５７】
反応は、マイナス２０℃から溶媒の沸点、好ましくはマイナス１５℃から３０℃で、３０分から２０時間、好ましくは１時間から２時間行う。
【００５８】
反応溶液中には、Ｎ−メチルモルホリン等の塩基、及びイソブチルクロロ蟻酸等のハロ蟻酸エステルを存在させることが望ましい。
【００５９】
さらに、（Ｙ７）の化合物よりＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物（Ｘ＝Ｓ、Ｚ＝ＮＨかつｋ＝０）を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、式（Ｙ５）の化合物の合成において上述したのと同様の方法によって行うことができる。
【００６０】
ｉｉ）ｋ＝０かつＺ＝Ｏの場合
ｉ）において上述した式（Ｙ２）の化合物に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジイソプロピルアミド等の存在下、有機溶媒中、以下の式（Ｙ８）：
【００６１】
【化１３】
0004267123.tif 000012
【００６２】
［式（Ｙ８）において、Ｌ、Ｐ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｙ９）：
【００６３】
【化１４】
0004267123.tif 000013
【００６４】
［式（Ｙ９）において、Ｐ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００６５】
有機溶媒は、式（Ｙ４）の化合物の合成に使用したものと同様のものを使用できる。反応は、マイナス１００℃から溶媒の沸点、好ましくはマイナス８０℃から３０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【００６６】
式（Ｙ９）の化合物から、Ｐのカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物（Ｘ＝Ｓ、Ｚ＝Ｏかつｋ＝０）を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、上述したのと同様の方法によって行うことができる。
【００６７】
ｉｉｉ）ｋ＝１かつＺ＝ＮＨの場合
先ず、式（Ｙ２）の化合物の合成と同様に、五硫化二リンに有機溶媒中、メタノールを反応させる。次いで、塩基を加え、さらに、以下の式（Ｙ１０）：
【００６８】
【化１５】
0004267123.tif 000014
【００６９】
［式（Ｙ１０）中、Ｌ、Ｐ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有するエステル化合物を反応させて、以下の式（Ｙ１１）：
【００７０】
【化１６】
0004267123.tif 000015
【００７１】
［式（Ｙ１１）中、Ｐ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。式（Ｙ１１）の化合物の合成は、式（Ｙ２）の化合物の合成と同様に行うことができる。
【００７２】
次いで、式（Ｙ１１）の化合物を以下の式（Ｙ１２）：
【００７３】
【化１７】
0004267123.tif 000016
【００７４】
［式（Ｙ１２）中、Ｌは先に定義した通りである］
で表される構造を有するエステル化合物を反応させて、以下の式（Ｙ１３）：
【００７５】
【化１８】
0004267123.tif 000017
【００７６】
［式（Ｙ１３）中、Ｐ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造式を有する化合物を得る。式（Ｙ１３）の化合物の合成は、式（Ｙ４）の化合物の合成と同様に行うことができる。
【００７７】
次いで、式（Ｙ１３）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｙ１４）：
【００７８】
【化１９】
0004267123.tif 000018
【００７９】
［式（Ｙ１４）中、ｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。カルボキシル基の保護基の除去は上述したのと同様の方法によって行うことができる。
【００８０】
次いで、式（Ｙ１４）の化合物に、上述した式（Ｙ６）の化合物を反応させて、以下の式（Ｙ１５）：
【００８１】
【化２０】
0004267123.tif 000019
【００８２】
［式（Ｙ１５）中、Ｐ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。式（Ｙ１５）の化合物の合成は、式（Ｙ７）の化合物の合成と同様に行うことができる。
【００８３】
さらに、（Ｙ１５）の化合物よりＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物（Ｘ＝Ｓ、Ｚ＝ＮＨかつｋ＝１）を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、上述したのと同様の方法によって行うことができる。
ＩＩ．Ｘ＝ＮＨの場合
Ｚ＝Ｏかつｋ＜ｍの場合
先ず、以下の式（Ｙ１６）：
【００８４】
【化２１】
0004267123.tif 000020
【００８５】
［式（Ｙ１６）中、ｋ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物の−（ＣＨ2）m側に近いカルボキシル基に保護基を導入し、以下の式（Ｙ１７）：
【００８６】
【化２２】
0004267123.tif 000021
【００８７】
［式（Ｙ１７）中、
Ｐはカルボキシル基の保護基であり；そして
ｋ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を合成する。
【００８８】
Ｐで表されるカルボキシル基の保護基は公知のものを使用でき、保護基の導入も既知の方法を用いて行うことができる。例えば、保護基としてベンジル基を導入する場合、ジエチルエーテル等の有機溶媒あるいは水中、硫酸等の縮合剤の存在下、ベンジルアルコールを反応させて、縮合反応によりベンジル基を（Ｙ１６）の化合物に導入する。
【００８９】
反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは２０℃から３０℃で、１時間から４０時間、好ましくは２０時間から３０時間行う。
【００９０】
次に、式（Ｙ１７）の化合物のアミノ基に保護基を導入して、以下の式（Ｙ１８）：
【００９１】
【化２３】
0004267123.tif 000022
【００９２】
［式（Ｙ１８）中、
Ｐ’はアミノ基の保護基であり；そして
Ｐ、ｋ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を合成する。
【００９３】
Ｐ’で表されるアミノ基の保護基は公知のものを使用でき、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等を用いることができる。保護基の導入も既知の方法を用いて行うことができる。
【００９４】
例えば、保護基としてベンジルオキシカルボニル基を導入する場合、水中、塩基の存在下、ベンジルオキシカルボニルクロリドを反応させて、保護基を（Ｙ１７）の化合物に導入する。塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等を用いることができる。反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から８０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【００９５】
次に、式（Ｙ１８）の化合物に塩化水素のジエチルエーテル溶液を反応させて、以下の式（Ｙ１９）：
【００９６】
【化２４】
0004267123.tif 000023
【００９７】
［式（Ｙ１９）中、Ｐ、Ｐ’、ｋ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を合成する。
【００９８】
反応は、エタノール中、０℃から溶媒の沸点、好ましくは４０℃から６０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【００９９】
次に、式（Ｙ１９）の化合物から、Ｐで表されるカルボキシル基の保護基及びＰ’で表されるアミノ基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｙ２０）：
【０１００】
【化２５】
0004267123.tif 000024
【０１０１】
［式（Ｙ２０）中、ｋ及びｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。保護基の除去は、カルボキシル基の保護基の除去に関して上述したような公知の方法によって行うことができる。
【０１０２】
例えば、Ｐ及び／又はＰ’がベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によって行うことができる。
【０１０３】
次に、式（Ｙ２０）の化合物にアミノ基の保護基を再び導入し、以下の式（Ｙ２１）：
【０１０４】
【化２６】
0004267123.tif 000025
【０１０５】
［式（Ｙ２１）中、Ｐ’、ｋおよびｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【０１０６】
次に、式（Ｙ２１）の化合物に、有機溶媒中、以下の式（Ｙ２２）：
【０１０７】
【化２７】
0004267123.tif 000026
【０１０８】
［式（Ｙ２２）中、Ｐ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させることにより、以下の式（Ｙ２３）：
【０１０９】
【化２８】
0004267123.tif 000027
【０１１０】
［式（Ｙ２３）中、Ｐ、Ｐ’、ｋ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【０１１１】
反応は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒中、０℃から溶媒の沸点、好ましくは２０℃から３０℃で、１時間から４０時間、好ましくは２０時間から３０時間行う。
【０１１２】
反応は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の塩基触媒、カンファースルホン酸等の酸触媒、並びに、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド等の縮合剤の存在下において行う。
【０１１３】
次に、式（Ｙ２３）の化合物よりＰ’で表されるアミノ基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｙ２４）：
【０１１４】
【化２９】
0004267123.tif 000028
【０１１５】
［式（Ｙ２４）中、Ｐ、ｋ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。アミノ基の保護基の除去は、式（Ｙ２０）の化合物の合成について上述したのと同様の方法によって行うことができる。
【０１１６】
次に、式（Ｙ２４）の化合物に、以下の式（Ｙ２５）：
【０１１７】
【化３０】
0004267123.tif 000029
【０１１８】
［式（Ｙ２５）中、Ｌは先に定義した通りである］
で表される構造を有するハロゲン化チオリン酸ジメチルを、有機溶媒中、塩基の存在下で反応させて、以下の式（Ｙ２６）：
【０１１９】
【化３１】
0004267123.tif 000030
【０１２０】
［式（Ｙ２６）中、Ｐ、ｋ、ｍ及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【０１２１】
式（Ｙ２６）の化合物の合成のための有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等、あるいはこれらの混合溶液を用いることができる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、リチウムジイソプロピルアミド等を用いることができる。
【０１２２】
反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは４０℃から６０℃で、１時間から１０時間、好ましくは１時間から２時間行う。
【０１２３】
次に、式（Ｙ２６）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基の除去を行うことにより、式（１）の化合物（Ｘ＝ＮＨかつＺ＝Ｏの場合）を得ることができる。
【０１２４】
カルボキシル基の保護基の除去は前述したような公知の方法によって行うことができる。
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【０１２５】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたマラチオンハプテンを適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原もしくは固相化用抗原として使用する。
【０１２６】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ及びＢＳＡが好ましい。
【０１２７】
マラチオンハプテンと高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４２３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４  １０９０‐１０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うことができる。
【０１２８】
活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。
【０１２９】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは１時間から２時間である。
【０１３０】
カップリング反応後、反応液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができる。
【０１３１】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応において慣用されている化合物を使用することができる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【０１３２】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をマラチオンハプテンに結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32Ｐ、125Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
ポリクローナル抗体の作製
マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、マラチオンハプテン−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したもので、動物を免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【０１３３】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【０１３４】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、マラチオンと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
モノクローナル抗体の作製
マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【０１３５】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
（ａ）免疫用抗原として使用するマラチオンハプテンと高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ  テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載されている。
【０１３６】
以下、本発明のマラチオンに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
【０１３７】
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【０１３８】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【０１３９】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，  １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ  ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ，  ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，  １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ  １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ，  ２７７，１３１−１３３，（１９７９））等を使用できる。
【０１４０】
上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約３×１０3以上の細胞数を確保する。
【０１４１】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学  ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【０１４２】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【０１４３】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、マラチオンに対する抗体活性を測定する。
【０１４４】
さらに、測定によりマラチオンに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【０１４５】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗マラチオンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【０１４６】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【０１４７】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗マラチオンモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗マラチオンモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【０１４８】
以上のようにして得られた抗マラチオンモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
抗体によるマラチオンの測定
本発明で使用する抗体によるマラチオンの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【０１４９】
マラチオンの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
【０１５０】
（ａ）まず、固相化用抗原であるマラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【０１５１】
（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。
【０１５２】
（ｃ）これに各種濃度のマラチオンを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びマラチオンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、マラチオン−抗体複合体を生成させる。
【０１５３】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のマラチオンの量を決定することができる。
【０１５４】
（ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【０１５５】
固相化用抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【０１５６】
なお、担体に固相化させる固相化用抗原としては、抗体を作製したマラチオンハプテンと高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として使用することも可能である。例えば、式（１）においてＸ、Ｚ、ｋ、ｍ又はｎが抗体作製用抗原と相違する化合物を、固相化抗原として使用することもできる。さらに、式（１）に含まれない他のマラチオン類似化合物も、固相化抗原として使用可能である。
【０１５７】
（ｂ）工程のブロッキングは、固相化用抗原（マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、マラチオンハプテン部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば固相化用抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いることができる。
【０１５８】
次いで（ｃ）工程において、マラチオンを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びマラチオンと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びマラチオン−抗体複合体が生成する。
【０１５９】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のマラチオンに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【０１６０】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３７℃で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いることができる。
【０１６１】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から約１００００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【０１６２】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からマラチオンの量を算出することができる。
【０１６３】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【０１６４】
マラチオンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のマラチオンを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のマラチオンの濃度を算出できる。
【０１６５】
あるいはマラチオンの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
【０１６６】
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
【０１６７】
（ｃ）各種濃度のマラチオンを含む試料及び、マラチオンハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させる。
【０１６８】
（ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のマラチオンの量を決定する。
【０１６９】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【０１７０】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のマラチオン並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【０１７１】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製は、マラチオンハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、マラチオンを含む試料と混合する。
【０１７２】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したマラチオンハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原として使用することも可能である。例えば、式（１）においてＸ、Ｚ、ｋ、ｍ又はｎが抗体作製用抗原と相違する化合物を、標識競合用抗原として使用することもできる。さらに、式（１）に含まれない他のマラチオン類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能である。
【０１７３】
（ｃ）工程においてマラチオンを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、マラチオンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。マラチオンを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えば６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を使用することができる。
【０１７４】
さらに、（ｄ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からマラチオンの量を算出することができる。
【０１７５】
例えば、本発明のモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法では５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌの範囲で、ＭＬＴ４５−３では、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において５０ｎｇ／ｍｌから５０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲でマラチオンを測定できる（実施例１３、図１）。
【０１７６】
さらに、前述したように直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競合用ハプテンとして使用できる。例えば、本発明のモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３はマラチオンハプテン−５を用いて得られた抗体であるが、標識競合用ハプテンとしてマラチオンハプテン−６を用いた場合、４ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、マラチオンハプテン−４を用いた場合１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でマラチオンと反応する。また、モノクローナル抗体ＭＬＴ４０−４もマラチオンハプテン−５を用いて得られた抗体であるが、標識競合用ハプテンとしてマラチオンハプテン−６を用いた場合４０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、マラチオンハプテン−４を用いた場合１０ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でマラチオンと反応する（実施例１４、図２）。
【０１７７】
このように本発明のモノクローナル抗体は、標識競合用ハプテンとの組み合わせによって直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において固有の反応性を示す。特にモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３とマラチオンハプテン−６／ＨＲＰを組み合わせた場合、マラチオンと最も高い反応性となる。
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【０１７８】
例えば、ＭＬＴ２−２３はマラチオンの代謝物であるマラオクソンと１．６％の交差反応性を示すものの、他の化合物に対してはすべて１％以下しか交差反応をせず、マラチオンに対する高い特異性を有する（実施例１５、表２８）。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１７９】
【実施例】
実施例１  マラチオンハプテン−１の合成
【０１８０】
【化３２】
0004267123.tif 000031
【０１８１】
（２）の合成
２２．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）の五硫化二リンをトルエン溶液１００ｍｌに溶解し、メタノール１６ｇ（５００ｍｍｏｌ）を５０℃で滴下して３．５時間撹拌した。この溶液を氷冷しながら２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６に調整した。３４ｇ（２００ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸エチルを室温で滴下し、６０℃で３０分、そして７０℃で３０分撹拌した。トルエン層を集めて、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１→１９：１→９：１→２：１）で精製すると、黄色の透明油状物として２２．４ｇ（収率４６％）の（２）を得た。
【０１８２】
【表１】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．３４（３Ｈ，ｔ）、３．５３−３．６５（２Ｈ，ｄ）
４．１３−４．２６（２Ｈ，ｑ）
（３）の合成
１．０Ｍのリチウムビス（トリメチルシリル）アミド  （ＬｉＨＭＤＳ：ヘキサメチルジシラザン・リチウム）３１ｍｌをドライアイス−アセトンでマイナス７０℃以下に冷却し、窒素気流下で７．５ｇ（３０ｍｍｏｌ）の（２）を滴下した。１時間撹拌後、６．０ｇ（３０ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。滴下終了後にデュアーバスをはずして１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１→９：１）で精製すると、透明油状物として７．１ｇ（収率６６％）の（３）を得た。
【０１８３】
【表２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．３３（３Ｈ，ｔ）、１．３７−１．４９（９Ｈ，ｓ）
２．７５−３．００（２Ｈ，ｍ）、３．７０−３．８７（６Ｈ，ｍ）
３．９９−４．２７（３Ｈ，ｍ）
（４）の合成
７．０ｇ（１９ｍｍｏｌ）の（３）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌを加えて室温で１時間撹拌し、更にＴＦＡ５ｍｌを添加して１．５時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→２：１→１：１）で精製すると、透明油状物として５．０６ｇ（収率８６％）の（４）を得た。
【０１８４】
［表３］
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２３−１．３５（３Ｈ，ｔ）、２．９０−３．１８（２Ｈ，ｍ）
３．７６−３．８７（６Ｈ，ｄ）、４．０６−４．２９（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
２．４６ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．８２ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌ、次いでクロロ蟻酸イソブチル１．１ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。１０分間撹拌後に、１．５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。５分間氷冷下で撹拌後、４℃で２０分、更に室温で１０分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）で粗精製した。
（６）の合成
（５）を含む粗精製物を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ＴＦＡ１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１→酢酸エチル）で精製すると、透明油状物として１．９４ｇ（（４）からの通算収率５７％）の（６）を得た。
【０１８５】
【表４】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１４−１．７１（９Ｈ，重複）、２．２５−２．４１（２Ｈ，ｔ）
２．６１−２．９４（２Ｈ，  ｍ）、３．１２−３．３１（２Ｈ，ｍ）
３．６７−３．８６（６Ｈ，  ｍ）、４．０３−４．２７（３Ｈ，重複）
５．５９−５．６５（１Ｈ，ｂｒ）
実施例２  マラチオンハプテン−２の合成
【０１８６】
【化３３】
0004267123.tif 000032
【０１８７】
（２）の合成
２２．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）の五硫化二リンをトルエン溶液１００ｍｌに溶解し、メタノール１６ｇ（５００ｍｍｏｌ）を５０℃で滴下して３．５時間撹拌した。この溶液を氷冷しながら２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６に調整した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル３５ｇ（１７９ｍｍｏｌ）を室温で滴下し、６０℃で１時間撹拌した。トルエン層を集めて、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１→９：１）で精製すると、黄色の透明油状物として１８．７ｇ（収率３４％）の（２）を得た。
【０１８８】
【表５】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．４８（９Ｈ，ｓ）、３．４１−３．５７（２Ｈ，ｄ）
３．６８−３．８７（６Ｈ，ｄ）
（３）の合成
１．０Ｍのリチウムビス（トリメチルシリル）アミド１９ｍｌをドライアイス−アセトンでマイナス７０℃以下に冷却し、窒素気流下で５．０ｇ（１８ｍｍｏｌ）の（２）を滴下した。１時間撹拌後、３．１ｇ（１８ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸エチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。滴下終了後にデュアーバスをはずして１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後、酢酸エチルに溶解して水洗した。その濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１→９：１）で精製すると、透明油状物として３．５ｇ（収率５３％）の（３）を得た。
【０１８９】
【表６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２０−１．３０（３Ｈ，ｔ）、１．４８（９Ｈ，ｓ）
２．７９−３．０５（２Ｈ，ｍ）、３．７３−３．８７（６Ｈ，ｍ）
３．９７−４．２３（３Ｈ，ｍ）
（４）の合成
３．４ｇ（９．５ｍｍｏｌ）の（３）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌを加えて室温で３時間撹拌し、更にＴＦＡ５ｍｌを添加して４０分間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→２：１）で精製すると、透明油状物として２．２ｇ（収率７６％）の（４）を得た。
【０１９０】
［表７］
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２０−１．３１（３Ｈ，ｔ）、２．８４−３．１１（２Ｈ，ｍ）
３．７２−３．８８（６Ｈ，ｍ）、４．０６−４．２７（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
１．５ｇ（５ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．６７ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液５ｍｌ、次いで０．９ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のクロロ蟻酸イソブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。２０分間撹拌後に、１．１ｇ（５．９ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。３０分間氷冷下で撹拌後、更に室温で１５分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製すると、透明油状物として３９０ｍｇ（収率１６％）の（５）を得た。
【０１９１】
【表８】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２０−１．６７（１８Ｈ，ｍ）、２．１６−２．２７（２Ｈ，ｔ）
２．８１−３．１５（  ２Ｈ，ｍ）、３．２０−３．３１（２Ｈ，ｍ）
３．７１−３．８３（  ６Ｈ，ｍ）、３．９９−４．１９（３Ｈ，ｍ）
６．４９−６．５８（  １Ｈ，ｍ）
（６）の合成
３９０ｍｇ（８３０μｍｏｌ）の（５）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ＴＦＡ５ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１→酢酸エチル）で精製すると、透明油状物として２６０ｍｇ（収率７６％）の（６）を得た。
【０１９２】
【表９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２２−１．７４（９Ｈ，ｍ）、２．３２−２．４３（２Ｈ，ｔ）
２．８２−３．１４（２Ｈ，ｍ）、３．２２−３．３３（２Ｈ，ｍ）
３．７３−３．８４（６Ｈ，ｍ）、３．９９−４．２０（３Ｈ，ｍ）
６．５６−６．７７（１Ｈ，ｍ）、８．６９−９．２５（１Ｈ，ｂｒ）
実施例３  マラチオンハプテン−３の合成
【０１９３】
【化３４】
0004267123.tif 000033
【０１９４】
（２）の合成
２２．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）の五硫化二リンをトルエン溶液１００ｍｌに溶解し、メタノール１６ｇ（５００ｍｍｏｌ）を５０℃で滴下して３．５時間撹拌した。この溶液を氷冷しながら２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６に調整した。３４ｇ（２００ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸エチルを室温で滴下し、６０℃で３０分、そして７０℃で３０分撹拌した。トルエン層を集めて、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１→１９：１→９：１→２：１）で精製すると、黄色の透明油状物として２２．４ｇ（収率４６％）の（２）を得た。
【０１９５】
【表１０】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．３４（３Ｈ，ｔ）、３．５３−３．６５（２Ｈ，ｄ）
４．１３−４．２６（２Ｈ，ｑ）
（３）の合成
１．０Ｍのリチウムビス（トリメチルシリル）アミド５．３ｍｌをドライアイス−アセトンでマイナス７０℃以下に冷却し、窒素気流下で１．３ｇ（５．３ｍｍｏｌ）の（２）を滴下した。１時間撹拌後、２．０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）の１１−（ブロモアセトキシ）ウンデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液２ｍｌを滴下した。滴下終了後にデュアーバスをはずして１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後、酢酸エチルに溶解して水洗した。その濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１→９：１）で精製すると、黄色の透明油状物として１．３ｇ（収率４５％）の（３）を得た。
【０１９６】
【表１１】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１７−１．４７（２８Ｈ，ｍ）、２．１１−２．２３（２Ｈ，ｔ）
２．８２−３．１１（  ２Ｈ，ｍ）、３．７１−３．８６（６Ｈ，ｍ）
４．００−４．２７（  ５Ｈ，ｍ）
（４）の合成
１．３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）の（３）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製すると、黄色の透明油状物として１．０ｇ（収率８８％）の（４）を得た。
【０１９７】
【表１２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１７−１．４０（１５Ｈ，ｍ）、１．５０−１．７０（４Ｈ，ｍ）
２．２４−２．４０（  ２Ｈ，ｔ）、２．７９−３．１０（２Ｈ，ｍ）
３．６８−３．８６（  ６Ｈ，ｍ）、３．９９−４．２６（５Ｈ，ｍ）
実施例４  マラチオンハプテン−４の合成
【０１９８】
【化３５】
0004267123.tif 000034
【０１９９】
（２）の合成
２２．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）の五硫化二リンをトルエン溶液１００ｍｌに溶解し、メタノール１６ｇ（５００ｍｍｏｌ）を５０℃で滴下して３．５時間撹拌した。この溶液を氷冷しながら２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６に調整した。３４ｇ（２００ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸エチルを室温で滴下し、６０℃で３０分、そして７０℃で３０分撹拌した。トルエン層を集めて、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１→１９：１→９：１→２：１）で精製すると、黄色の透明油状物として２２．４ｇ（収率４６％）の（２）を得た。
【０２００】
【表１３】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．３４（３Ｈ，ｔ）、３．５３−３．６５（２Ｈ，ｄ）
４．１３−４．２６（２Ｈ，ｑ）
（３）の合成
１．０Ｍのリチウムビス（トリメチルシリル）アミド８ｍｌをドライアイス−アセトンで−７０℃以下に冷却し、窒素気流下で１．９６ｇ（８ｍｍｏｌ）の（２）を滴下した。１時間撹拌後、２．３５ｇ（８ｍｍｏｌ）の６−（ブロモアセトキシ）ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。滴下終了後にデュアーバスをはずして１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後、酢酸エチルに溶解して水洗した。その濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１→９：１）で粗精製した。
（４）の合成
（３）を含んだ粗精製物を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製すると、透明油状物として０．５４ｇ（（２）からの通算収率２０％）の（４）を得た。
【０２０１】
【表１４】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２０−１．５０（５Ｈ，重複）、１．５８−１．７６（４Ｈ，ｍ）
２．３１−２．４３（２Ｈ，  ｔ）、２．８２−３．１１（２Ｈ，ｍ）
３．７１−３．８８（６Ｈ，  ｍ）、４．０３−４．２７（５Ｈ，重複）
実施例５  マラチオンハプテン−５の合成
【０２０２】
【化３６】
0004267123.tif 000035
【０２０３】
（２）の合成
硫酸１０ｍｌをジエチルエーテル１００ｍｌに加えた後、撹拌しながらベンジルアルコール１００ｍｌを加えた。ジエチルエーテルを留去後に１３．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸を少しずつ加えた。室温で１日撹拌後に、エタノール２００ｍｌとピリジン５０ｍｌを加えて、一晩冷蔵庫に放置した。析出した結晶をろ別し、エーテルと水で洗浄した後に乾燥させると、１１ｇ（収率４９％）の（２）を得た。
（３）の合成
１１ｇ（４９ｍｍｏｌ）の（２）を６００ｍｌの水に加えて、８０℃で溶解させた。加熱を停止して６０℃まで冷却した時に、１０．５ｇ（１２５ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムと１２ｇ（７０ｍｍｏｌ）のベンジルオキシカルボニルクロリド（Ｚ−Ｃｌ）を加えて３時間撹拌した。ジエチルエーテルで洗浄後に、氷冷しながら濃塩酸でｐＨを１にして酢酸エチルで抽出した。脱水（無水硫酸ナトリウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→１：２）で精製すると、白色結晶として４．５ｇ（収率２５％）の（３）を得た。
【０２０４】
【表１５】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
２．８０−３．１７（２Ｈ，ｍ）、４．５４−４．７６（１Ｈ，ｍ）
５．１１（４Ｈ，ｓ）、          ５．７４−５．８９（１Ｈ，ｄ）
７．３１（１０Ｈ，ｓ）、        ９．３８−１０．０２（１Ｈ，ｂｒ）
（４）の合成
４．５ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）の（３）をエタノール１５０ｍｌに溶解し、１．０Ｍの塩化水素ジエチルエーテル溶液１５ｍｌを加えて３０分間環流させた。更に該溶液１５ｍｌを加えて３０分環流させた後、三度１５ｍｌの該溶液を加えて３０分間環流させた。反応液をろ過して濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→２：１）で精製すると、透明油状物として１．８ｇ（収率３７％）の（４）を得た。
【０２０５】
【表１６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１３−１．２７（３Ｈ，ｔ）、２．８３−３．１４（２Ｈ，ｍ）
４．０８−４．２２（２Ｈ，ｍ）、４．５８−４．６９（１Ｈ，ｍ）
５．１１（４Ｈ，ｓ）、          ５．６９−５．８１（１Ｈ，  ｄ）
７．３４（１０Ｈ，ｓ）
（５）の合成
８．６ｇ（２２ｍｍｏｌ）の（４）をエタノール２００ｍｌに溶解して、５％パラジウムカーボン２．０ｇを加えて水素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。反応液をろ過、濃縮して（５）を得た。
（６）の合成
４．２ｇの粗カルボン酸（５）を３００ｍｌの水に加えて、８０℃で溶解させた。加熱を停止して６０℃まで冷却した時に、炭酸水素ナトリウム０．８８ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）を加えた後に３．０ｇ（１７．６ｍｍｏｌ）のＺ−Ｃｌを加えた。更に１．３ｇ（１５．５ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムを加えて３時間撹拌した。ジエチルエーテルで洗浄後に、氷冷しながら濃塩酸でｐＨを２に調整して酢酸エチルで抽出した。脱水（無水硫酸ナトリウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：２）で精製すると、白色結晶として１．６３ｇ（（４）からの通算収率５０％）の（６）を得た。
【０２０６】
【表１７】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１１−１．３０（３Ｈ，ｔ）、２．７４−３．１２（２Ｈ，ｍ）
４．０６−４．２５（２Ｈ，ｍ）、４．５５−４．７０（１Ｈ，ｍ）
５．１０（２Ｈ，ｓ）、          ５．８４−５．９９（１Ｈ，ｄ）
７．３３（５Ｈ，ｓ）、          ８．４９−９．２６（１Ｈ，ｂｒ）
（７）の合成
１．６３ｇ（５．５ｍｍｏｌ）の（６）、２２４ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４２６ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）のカンファースルホン酸（ＣＳＡ）、１．４ｇ（７．４ｍｍｏｌ）の６−ヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍｌに加えた。１．７ｇ（８．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。室温で１日撹拌後、反応液をろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→２：１）で精製すると、透明油状物として２．１６ｇ（収率８４％）の（７）を得た。
【０２０７】
【表１８】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２０−１．４６（１４Ｈ，重複）、１．５１−１．６９（４Ｈ，ｍ）
２．１５−２．２６（  ２Ｈ，  ｔ）、２．７７−３．０７（２Ｈ，ｍ）
４．０２−４．２６（  ４Ｈ，  ｍ）、４．５７−４．６７（１Ｈ，ｍ）
５．１２（２Ｈ，ｓ）、              ５．７３−５．８２（１Ｈ，ｄ）
７．３７（５Ｈ，ｓ）
（８）の合成
２．１６ｇ（４．６ｍｍｏｌ）の（７）をエタノール２００ｍｌに溶解し、５％パラジウムカーボン３００ｍｇを加えて水素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。反応液をろ過、濃縮して（８）を得た。これを精製せずに次の反応に用いた。（９）の合成
粗アミン（８）と０．８ｇ（５ｍｍｏｌ）のクロロチオリン酸ジメチル、０．７ｇ（５ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムをアセトニトリル８０ｍｌに加えて５０℃で１時間撹拌した。ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製すると、１．７１ｇ（（７）からの通算収率１００％）の（９）を得た。
【０２０８】
【表１９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２３−１．４９（１４Ｈ，重複）、１．５４−１．７１（４Ｈ，ｍ）
２．１５−２．２７（  ２Ｈ，  ｔ）、２．７１−３．００（２Ｈ，ｍ）
３．６３−３．７５（  ６Ｈ，  ｍ）、４．００−４．１１（５Ｈ，ｔ）
４．１７−４．３４（  ３Ｈ，重複）
（１０）の合成
１．７１ｇ（４．６ｍｍｏｌ）の（９）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した。更にＴＦＡ５ｍｌを添加して１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製すると、透明油状物として１．４４ｇ（収率９９％）の（１０）を得た。
【０２０９】
【表２０】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２２−１．３３（３Ｈ，  ｔ）、１．３５−１．４９（２Ｈ，ｍ）
１．５９−１．７５（４Ｈ，  ｍ）、２．３１−２．４２（２Ｈ，ｔ）
２．７１−３．００（２Ｈ，  ｍ）、３．６２−３．７６（６Ｈ，ｍ）
４．０１−４．３４（５Ｈ，重複）
実施例６  マラチオンハプテン−６の合成
【０２１０】
【化３７】
0004267123.tif 000036
【０２１１】
（２）の合成
５８．８ｇ（４００ｍｍｏｌ）のＬ−グルタミン酸と４８ｇ（４４０ｍｍｏｌ）のベンジルアルコールを６０％硫酸（濃硫酸３９．２ｇ＋水２６ｍｌ）に加えて、７０℃で４５分間撹拌した。７０℃で３時間濃縮後、６７．２ｇ（８００ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムを含む冷水２００ｍｌ中に撹拌しながら注ぎ、冷水１５０ｍｌを加えた後放置した。析出した結晶をろ別し、水で洗浄した。その結晶を水で再結晶すると、白色結晶として３５ｇ（収率３７％）の（２）を得た。
（３）の合成
４．７４ｇ（２０ｍｍｏｌ）の（２）を３００ｍｌの水に加えて、８０℃で溶解させた。加熱を停止して６０℃まで冷却した時に、４．２ｇ（５０ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムと４．１ｇ（２４ｍｍｏｌ）のベンジルオキシカルボニルクロリド（Ｚ−Ｃｌ）を加えて３時間撹拌した。ジエチルエーテルで洗浄後に、氷冷しながら濃塩酸でｐＨを１にして酢酸エチルで抽出した。脱水（無水硫酸ナトリウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製すると、白色結晶として６．４ｇ（収率８６％）の（３）を得た。
【０２１２】
【表２１】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．９３−２．３７（２Ｈ，ｍ）、２．３７−２．６１（２Ｈ，ｍ）
４．３０−４．５０（１Ｈ，ｍ）、５．１０（４Ｈ，ｓ）
５．４０−５．５３（１Ｈ，ｄ）、７．３３（１０Ｈ，ｓ）
（４）の合成
６．０ｇ（１６ｍｍｏｌ）の（３）をエタノール１５０ｍｌに溶解し、１．０Ｍの塩化水素ジエチルエーテル溶液１ｍｌを加えて３０分間環流させた。更に該溶液３ｍｌを加えて３０分環流させた後、三度３ｍｌの該溶液を加えて１時間環流させた。反応液をろ過して濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→４：１→２：１）で精製すると、透明油状物として４．２ｇ（収率６５％）の（４）を得た。
【０２１３】
【表２２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１５−１．３３（３Ｈ，ｑ）、１．８７−２．３２（２Ｈ，ｍ）
２．３３−２．５８（２Ｈ，ｍ）、４．０７−４．２５（２Ｈ，ｍ）
４．３２−４．４８（１Ｈ，ｍ）、５．１０（４Ｈ，ｓ）
５．３２−５．４５（１Ｈ，ｄ）、７．３４（１０Ｈ，ｓ）
（５）の合成
１６ｇ（４０ｍｍｏｌ）の（４）をエタノール２５０ｍｌに溶解して、５％パラジウムカーボン２．５ｇを加えて水素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。反応液をろ過、濃縮して（５）を得た。粗収量８．６ｇ（粗収率１２２％）。
（６）の合成
８．６ｇの粗カルボン酸（５）を３００ｍｌの水に加えて、８０℃で溶解させた。加熱を停止して６０℃まで冷却した時に、８．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムと８．２ｇ（４８ｍｍｏｌ）のＺ−Ｃｌを加えて３時間撹拌した。ジエチルエーテルで洗浄後に、氷冷しながら濃塩酸でｐＨを１にして酢酸エチルで抽出した。脱水（無水硫酸ナトリウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：２）で精製すると、白色結晶として５．４ｇ（（４）からの通算収率４３％）の（６）を得た。
【０２１４】
【表２３】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．１７−１．３５（３Ｈ，ｑ）、１．８８−２．３０（２Ｈ，ｍ）
２．３３−２．５７（２Ｈ，ｍ）、４．０６−４．２６（２Ｈ，ｍ）
４．３４−４．４９（１Ｈ，ｍ）、５．１１（２Ｈ，ｓ）
５．３８−５．５１（１Ｈ，ｄ）、７．３４（５Ｈ，ｓ）
（７）の合成
１．０ｇ（３．２ｍｍｏｌ）の（６）、１３０ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２５０ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）のカンファースルホン酸（ＣＳＡ）、６００ｍｇ（３．２ｍｍｏｌ）の６−ヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５ｍｌに加えた。１．０ｇ（４．９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のＴＨＦ溶液１５ｍｌを滴下した。室温で２０時間撹拌後、反応液をろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→２：１）で精製すると、透明油状物として９４０ｍｇ（収率６０％）の（７）を得た。
【０２１５】
【表２４】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．４７（１４Ｈ，重複）、１．５２−１．７０（４Ｈ，ｍ）
１．９０−２．０６（  １Ｈ，  ｍ）、２．１６−２．２７（３Ｈ，ｍ）
２．３４−２．４７（  ２Ｈ，  ｍ）、４．００−４．１０（２Ｈ，ｔ）
４．１４−４．２６（  ２Ｈ，  ｑ）、４．３３−４．４４（１Ｈ，ｍ）
５．１１（２Ｈ，ｓ）、              ５．３７−５．４６（１Ｈ，ｄ）
７．３６（５Ｈ，ｓ）
（８）の合成
５．９ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）の（７）をエタノール１５０ｍｌに溶解し、５％パラジウムカーボン６００ｍｇを加えて水素雰囲気下、室温で３０分間撹拌した。反応液をろ過、濃縮して（８）を得た。これを精製せずに次の反応に用いた。
（９）の合成
粗アミン（８）と２．０ｇ（１２、４ｍｍｏｌ）のクロロチオリン酸ジメチル、１．７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムをアセトニトリル１００ｍｌに加えて６０℃で１時間撹拌した。ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製すると、４．７ｇ（（７）からの通算収率１００％）の（９）を得た。
【０２１６】
【表２５】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２１−１．４７（１４Ｈ，重複）、１．５４−１．７０（４Ｈ，ｍ）
１．８３−２．１５（  ２Ｈ，  ｍ）、２．１８−２．２６（２Ｈ，ｔ）
２．３７−２．４８（  ２Ｈ，  ｍ）、３．６０−３．７３（６Ｈ，ｍ）
３．９３−４．１１（  ３Ｈ，重複）、４．１５−４．２７（２Ｈ，ｑ）
（１０）の合成
４．７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）の（９）を８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した。ＴＦＡ５ｍｌを追加して、更に１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製すると、透明油状物として３．５ｇ（収率８７％）の（１０）を得た。
【０２１７】
【表２６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
１．２４−１．３６（３Ｈ，  ｔ）、１．３６−１．５０（２Ｈ，ｍ）
１．６０−１．７４（４Ｈ，  ｍ）、１．８３−２．２０（２Ｈ，ｍ）
２．３４−２．５０（４Ｈ，重複）、３．６１−３．７６（６Ｈ，ｍ）
３．９４−４．２８（５Ｈ，  ｍ）
実施例７  免疫用抗原及びスクリーニング用抗原の作製
実施例１ないし６で作製したマラチオンハプテン−１ないし６をハプテンとして、各々３．６μｍｏｌをＤＭＳＯ  １００μｌに溶解させた。これらの溶液に、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（１６μｍｏｌ）を１０μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を添加した。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（５．６μｍｏｌ）を２０μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を加え、室温にて１．５時間反応させた。これらの反応溶液に、ＢＳＡ又はＫＬＨ各々１０ｍｇを８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解したものを加え、再び室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、ダルベッコのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」と言う）で透析し、マラチオンハプテン−１ないし６とＫＬＨとの結合体（以下、「マラチオンハプテン−１ないし６／ＫＬＨ」と言う）、マラチオンハプテン−１ないし６とＢＳＡとの結合体（以下、「マラチオンハプテン−１ないし６／ＢＳＡ」と言う）を各々調製した。
実施例８  免疫感作
免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週令、メス）を用いた。実施例７で調製したマラチオンハプテン−１ないし６／ＫＬＨ１００μｇを各々ＰＢＳ（−）５０μｌに溶解した。これを等量のフロイント完全アジュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に接種した。１カ月後、初回免疫量の１／４量を追加免疫し、さらにその５週間後、追加免疫と同量を最終免疫した。
実施例９  ハイブリドーマの作製
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るための細胞融合は、実施例８の最終免疫後３日目のマウスの脾臓細胞を用いて行った。
【０２１８】
摘出した脾臓から、ＤＭＥＭ中に脾臓細胞を取り出し、ＤＭＥＭにて３回洗浄した。洗浄後、マウスのミエロ−マ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）となるように混合し、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈渣を集めた。この細胞沈渣に予め３７℃に加温しておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）１ｍｌを加え、細胞を融合した。ＤＭＥＭ  １０ｍｌを徐々に添加し、牛胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と言う）１ｍｌを更に添加することにより、細胞融合を停止した。融合した細胞は、ＤＭＥＭに１０％  ＦＢＳ、ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、及びチミジン（１６μＭ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁後、９６ウェルのマイクロプレートの各ウェルに２×１０5細胞／ウェルで分注した。３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０ないし１４日間培養した後、各ウェルにハイブリドーマのコロニーが形成された。
実施例１０  モノクローナル抗体の作製
実施例９でコロニーが形成された各ウェルの内、それらの培養上清中にマラチオンに反応するモノクローナル抗体を産生しているものを、以下のように間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした。
【０２１９】
まずＰＢＳ（−）に溶解したマラチオンハプテン−１ないし６／ＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１晩静置することにより固相化した。次に３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％  ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で置き換え、室温で１時間ブロッキングした。これらに希釈液Ａ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で適当な濃度に段階的に希釈したマラチオン溶液を５０μｌ／ウェルで添加した。次いで、直ちに培養上清を同じ希釈液で適当な濃度に希釈したものを５０μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応させた。適当な濃度とは、マラチオン未添加条件での本ＥＬＩＳＡ法の吸光度が抗体飽和時の１／２を示し得る抗体濃度である。
【０２２０】
洗浄液（６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で３回洗浄した後、２次抗体用の希釈液Ｂ（０．３％  ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で１０００倍希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。再び３回洗浄後、ＨＲＰ基質溶液（１００μｇ／ｍｌの３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン及び０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））で１０分間発色させ、１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２２１】
各ウェルの反応性を定性的にスクリーニングした後、マラチオンとの反応性を示したウェルのハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。このようにして、マラチオンに反応性を有する抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を３株（ＭＬＴ２−２３、ＭＬＴ４０−４、ＭＬＴ４５−３）分離した。これらの３株はいずれもマラチオンハプテン−５／ＫＬＨを抗原として得られたハイブリドーマである。
【０２２２】
さらにＦＢＳを１０％添加したＤＭＥＭ中でこれらのモノクローナル抗体産生細胞を培養し、得られた培養上清を各々モノクローナル抗体とした。以後、各モノクローナル抗体は、これらを産生するモノクローナル抗体産生細胞と同一の名称を用いる。
【０２２３】
作製したモノクローナル抗体のサブクラスを、以下の表２７に示した。
【０２２４】
【表２７】
表２７  作製したモノクローナル抗体のサブクラス
モノクローナル抗体      サブクラス
ＭＬＴ２−２３        ＩｇＧ２ａ
ＭＬＴ４０−４        ＩｇＧ１
ＭＬＴ４５−３        ＩｇＧ１
得られたモノクローナル抗体のうちＭＬＴ２−２３を平成１１年１月２２日に、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１５７で工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５−００４６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
実施例１１  モノクローナル抗体の精製
実施例１０で得られた各モノクローナル抗体の精製を行った。まず、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に各モノクローナル抗体産生細胞を接種し、腹水を得た。ＭＬＴ２−２３産生細胞由来の腹水には、３５％飽和となるように、また  ＭＬＴ４０−４産生細胞及びＭＬＴ４５−３産生細胞由来の腹水には、３３％飽和となるように硫安を加え、各々４℃で撹拌したのち遠心し、沈殿物を得た。これらの沈殿物はＰＢＳ（−）で可溶化した後、さらにＰＢＳ（−）で２晩透析し、精製抗体とした。これらの抗体の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した結果、少なくとも９０％以上であった。
実施例１２  マラチオンハプテンとＨＲＰとの結合体の調製
マラチオンハプテン−４ないし６の各々１．２５μｍｏｌをＤＭＳＯ５０μｌに溶解した。これらの溶液へ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μｍｏｌ）を３．４μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（１．９μｍｏｌ）を６．８μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を加え、室温にて１時間反応させた。これらの反応液に１Ｍ  炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、さらにＨＲＰ（５ｍｇ）を蒸留水２５０μｌに溶解した溶液を加えて、室温で３時間反応させた。得られた反応液から、ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−２５）を用いて低分子化合物を除去し、マラチオンハプテン−４ないし６とＨＲＰとの結合体（以下、「マラチオンハプテン−４ないし６／ＨＲＰ」と言う）とした。
実施例１３  直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるマラチオンに対するモノクローナル抗体の反応性
得られたモノクローナル抗体のマラチオンに対する反応性を、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。
【０２２５】
実施例１１で精製したＭＬＴ２−２３、ＭＬＴ４０−４は３μｇ／ｍｌの濃度で、ＭＬＴ４５−３は５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解した。これらを９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１晩静置することにより固相化した。つぎに３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液で置き換え、室温で１時間ブロッキングした。一方、希釈液Ｃ（０．３％  ＢＳＡと１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で適当な濃度に段階的に希釈したマラチオンと、同じく適当な濃度に希釈したマラチオンハプテン−５／ＨＲＰの混合液を調製した。適当な濃度とは、マラチオン未添加の条件での本ＥＬＩＳＡ法の吸光度がＨＲＰ結合ハプテン飽和時の１／２を示し得るＨＲＰ結合ハプテンの濃度である。これらを先のブロッキング済みの各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、実施例１０に示した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２２６】
結果を図１に示す。ここで阻害率は以下の式で計算した。
【０２２７】
【化３８】
0004267123.tif 000037
【０２２８】
図１に示されるように、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４は１０ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌ、モノクローナル抗体ＭＬＴ４５−３は１００ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でマラチオンと反応した。よって、特にモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４がマラチオンに対して高い反応性を示すことが明らかとなった。
実施例１４  ヘテロロガスなハプテンを用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４のマラチオンに対する反応性
実施例１３でマラチオンに対して高い反応性を示したモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４について、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に用いるＨＲＰ結合ハプテンを変えてマラチオンに対する反応性の変化を調べた。具体的にはＨＲＰ結合ハプテンとして、マラチオンハプテン−５／ＨＲＰの代わりにマラチオンハプテン−６／ＨＲＰ又はマラチオンハプテン−４／ＨＲＰを用いた他は、実施例１３と同様にして行った。
【０２２９】
その結果を図２に示す。図２に示されるように、用いるＨＲＰ結合ハプテンの種類により各抗体ともマラチオンに対する反応性が変化した。すなわち、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３は、実施例１３の結果と異なり、マラチオンハプテン−６／ＨＲＰを用いた場合４ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、マラチオンハプテン−４／ＨＲＰを用いた場合１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でマラチオンと反応した。一方、モノクローナル抗体ＭＬＴ４０−４は、マラチオンハプテン−６／ＨＲＰを用いた場合４０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、マラチオンハプテン−４／ＨＲＰを用いた場合１０ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でマラチオンと反応した。
【０２３０】
このようにモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４は、いずれも標識競合用ハプテンとの組み合わせによって固有の反応性を示した。特にモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３とマラチオンハプテン−６／ＨＲＰを組み合わせた場合、マラチオンと最も高い反応性となることが明らかとなった。
実施例１５  モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３の交差反応性
実施例１４の結果より、マラチオンへ最も高い反応性を示したモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３とマラチオンハプテン−６／ＨＲＰの組み合わせを用い、マラチオンの代謝物及び類縁化合物に対する交差反応性を調べた。
【０２３１】
結果を以下の表２８に示す。
【０２３２】
【表２８】
0004267123.tif 000038
【０２３３】
表２８において、ＩＣ５０は、反応を５０％阻害する化合物の濃度であり、交差反応率はマラチオンのＩＣ５０値／各化合物のＩＣ５０値×１００である。表２８より、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３は、マラチオンの代謝物であるマラオクソンと１．６％の交差反応性を示したものの、他の化合物に対してはすべて１％以下しか交差反応をせず、マラチオンに対する高い特異性を持つことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による本発明のモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３、ＭＬＴ４０−４及びＭＬＴ４５−３のマラチオンに対する反応性を示す。
【図２】図２は、ヘテロロガスな直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による本発明のモノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３及びＭＬＴ４０−４のマラチオンに対する反応性を示す。
【図１】
0004267123.tif 000041
【図２】
0004267123.tif 000042