(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡと、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとが細胞内に導入されて形質転換されたことにより、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強されたＬ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌をメタノールを含む培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【請求項２】
前記メチロフィラス属細菌が、さらにアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種、２種又は３種の酵素の活性が増強されたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法、及び同製造法に用いる微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニン等のアミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物としては、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりアミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特公昭45-25273号公報）、プロタミノバクター属（特開昭49-125590号公報）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特開昭50-25790号公報）、ミクロサイクラス属（特開昭52-18886号公報）、メチロバチルス属（特開平4-91793号公報）、バチルス属（特開平3-505284号公報）などに属する微生物を用いる方法が知られている。
【０００５】
しかし、これまでメチロフィラス属細菌を用いてＬ−アミノ酸を製造することは知られていない。また、組換えＤＮＡを用いたメチロフィラス属細菌の形質転換方法として、EP
0 035 831 A、EP 0 037 273 A、EP 0 066 994 Aに記載の方法が知られているが、メチロフィラス属細菌のアミノ酸の生産性の改善に組換えＤＮＡ技術が適用された例は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なＬ−アミノ酸生産菌及び同生産菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メチロフィラス属細菌がＬ−アミノ酸の製造に適していることを見出した。さらに、従来、メチロフィラス属細菌の栄養要求性変異株を得ることは困難であるとされてきた（FEMS Microbiology Rev.
39, 235-258 (1986)、Antonie van Leeuwenhoek 53, 47-53 (1987)）が、本発明者らは同細菌の栄養要求性変異株を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌。
（２）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンである（１）のメチロフィラス属細菌。
（３）Ｌ−アミノ酸アナログ耐性又はＬ−アミノ酸要求性を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（４）Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された（１）のメチロフィラス属細菌。
（５）ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（６）ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（７）アスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（８）さらにアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種、２種又は３種の酵素の活性が増強された（５）〜（７）のいずれかのメチロフィラス属細菌。
（９）Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡと、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとが細胞内に導入されて形質転換されたことにより、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強された（５）のメチロフィラス属細菌。
（１０）アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性が増強され、Ｌ−スレオニン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（１１）メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである（１）〜（１０）のいずれかの細菌。
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１３）前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（１２）の方法。（１４）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該細菌の菌体中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させることを特徴とする、Ｌ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体の製造法。
（１５）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンである（１４）記載のメチロフィラス属細菌菌体の製造法。
（１６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパルトキナーゼ活
性を有するタンパク質。
（１７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１６）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１８）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（１９）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（１８）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２０）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
（２１）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（２０）のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２２）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質。
（２３）下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである（２２）のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２４）下記（Ｉ）又は（Ｊ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｉ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｊ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
（２５）下記（ｉ）又は（ｊ）に示すＤＮＡである（２４）のＤＮＡ。
（ｉ）配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｊ）配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
尚、本明細書において「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−アミノ酸を蓄積する能力、又は菌体中のアミノ酸含量を増加させる能力をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌である。本発明のメチロフィラス属細菌としては、例えばメチロフィラス・メチロトロファス（Methylophilus methylotrophus）AS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。
【００１０】
本発明により生産されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等が挙げられる。生産されるアミノ酸は１種類でもよく、２種又は３種以上であってもよい。
【００１１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、その活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００１２】
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。
【００１３】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌はオレイン酸要求変異株等として、Ｌ−スレオニン生産菌はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性変異株として、Ｌ−ホモセリン生産菌はＬ−スレオニン要求変異株又はＬ−フェニルアラニンアナログ耐性変異株として、Ｌ−フェニルアラニン生産菌は、Ｌ−チロシン要求変異株として、Ｌ−イソロイシン生産菌はＬ−ロイシン要求変異株として、Ｌ−プロリン生産菌は、Ｌ−イソロイシン要求変異株として、育種することができる。
【００１４】
さらに、後記実施例に示すように、分岐鎖アミノ酸（Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン）の１種又は２種以上を生産する菌株は、カザミノ酸要求株として取得され得る。
【００１５】
本発明者は、メチロフィラス属細菌から変異株を取得するために、まずストレプトマイシン耐性株の出現頻度を指標に最適な変異処理条件を詳細に検討した。その結果、変異処理後の生存率が約０．５％となる条件のとき、ストレプトマイシン耐性株の出現頻度が最高となり、この条件により栄養要求株を取得することに成功した。また、変異株のスクリーニングもこれまでE. coli等で行われているよりも大幅にスケールアップして行うことにより、困難とされてきた栄養要求株の取得に成功した。
【００１６】
上記のように、変異株取得に好適な条件でメチロフィラス属細菌を変異処理することにより変異株の取得が可能であることが判明したので、変異処理方法に応じて変異処理後の生存率が約０．５％となるような条件を適宜設定することにより、所望の変異株を取得することが容易となる。
【００１７】
メチロフィラス属細菌から変異株を得るための変異処理としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、メチロフィラス属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を得ることできる。
【００１８】
Ｌ−アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したメチロフィラス属細菌を種々の濃度のＬ−アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。
【００１９】
また、栄養要求性変異株は、メチロフィラス属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ−アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
【００２０】
次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００２１】
〔Ｌ−リジン〕
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
【００２２】
メチロフィラス属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メチロフィラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをメチロフィラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
【００２３】
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、メチロフィラス属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、E. coli由来のdapA及びlysCを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。E. coli由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、E. coli由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メチロフィラス属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPSを「変異型DDPS」、変異型DDPSをコードするＤＮＡを「変異型dapA」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するE. coli由来のAKIIIを「変異型AKIII」、変異型AKIIIをコードするＤＮＡを「変異型lysC」と呼ぶことがある。
【００２５】
尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００２６】
E. coli由来の野生型dapAの塩基配列を配列番号１に、同塩基配列によってコードされる野生型DDPSのアミノ酸配列を配列番号２に例示する。また、E. coli由来の野生型lysCの塩基配列を配列番号３に、同塩基配列によってコードされる野生型AKIIIのアミノ酸配列を配列番号４に例示する。
【００２７】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型DDPSをコードするＤＮＡとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するDDPSをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型AKIIIをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２８】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００２９】
また、メチロフィラス属細菌で機能するベクターとは、例えばメチロフィラス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396, (1980)）等が挙げられる。
【００３０】
dapA及びlysCとメチロフィラス属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００３１】
変異型DDPSをコードする変異型dapA及び変異型AKIIIをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-13936として寄託され、そして1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号が付与されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００３２】
RSFD80に含まれている変異型dapAは、配列番号１に示す野生型dapAの塩基配列において塩基番号623のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型DDPSは、配列番号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、RSFD80に含まれている変異型lysCは、配列番号３に示す野生型lysCの塩基配列において塩基番号1638のＣがＴ変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型AKIIIは、配列番号４に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する。
【００３３】
上記のように調製した組換えＤＮＡをメチロフィラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
【００３４】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをメチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
【００３５】
DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３６】
遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,  (1989)等に記載されている。
【００３７】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、WO96/40934号参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭60-87788号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平6-102028号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。好ましくは、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素の少なくとも１種以上の酵素の活性が増強される。
【００３８】
メチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素については後述する。
【００３９】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864参照）。
【００４０】
上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、以下に示す他のアミノ酸についても同様に適用することができる。
【００４１】
〔Ｌ−グルタミン酸〕
メチロフィラス属細菌へのＬ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンターゼ（特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＷＯ９９／０７８５３）等の酵素をコードするＤＮＡを導入することによって、付与することができる。
【００４２】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。
【００４３】
〔Ｌ−スレオニン〕
Ｌ−スレオニン生産能は、例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性を増強することにより、付与又は増強することができる。これらの酵素の活性は、例えば、スレオニンオペロンを含有した組換えプラスミド（特開昭５５−１３１３９７号公報、特開昭５９−３１６９１号公報、特開昭５６−１５６９６号公報、および特表平３−５０１６８２号公報参照）でメチロフィラス属細菌を形質転換することにより、増強することができる。
【００４４】
また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロン（特公平１−２９５５９号公報）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６０−０１２９９５号）、又はホモセリンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６１−１９５６９５号）を増幅又は導入することによっても、生産性を付与又は増強することができる。
【００４５】
さらに、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡを導入することによって、Ｌ−スレオニン生産能を向上させることができる。
〔Ｌ−バリン〕
Ｌ−バリンの生産能の付与は、例えば、制御機構が実質的に解除されたＬ−バリン生合成系遺伝子をメチロフィラス属細菌に導入することによって行うことができる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するＬ−バリン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。
【００４６】
Ｌ−バリン生合成系遺伝子としては、例えばE. coliのｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙げられる。尚、ｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する。したがって、Ｌ−バリン合成系の反応を効率よく進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないオペロンを用いることが好ましい。このようなスレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を失うような変異がｉｌｖＡに導入された、又はｉｌｖＡが破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、あるいはｉｌｖＡが欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンが挙げられる。
【００４７】
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい。
【００４８】
上記のような、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得られる（以上、ＷＯ９６／０６９２６参照）。
【００４９】
〔Ｌ−ロイシン〕
Ｌ−ロイシンの生産能の付与または増強は、例えば、上記Ｌ−バリン生産に必要な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたＬ−ロイシン生合成系遺伝子をメチロフィラス属に属する微生物に導入することによって行われる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するＬ−ロイシン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。このような遺伝子として、例えば、Ｌ−ロイシンによる阻害が実質的に解除されたｌｅｕＡ遺伝子が挙げられる。
【００５０】
〔Ｌ−イソロイシン〕
Ｌ−イソロイシンは、例えば、E. coli由来のＬ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを導入することにより、Ｌ−イソロイシン生産性を付与することができる（特開平８−４７３９７参照）。
【００５１】
〔その他のアミノ酸〕
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンは、メチロフィラス属細菌のホスホエノールピルビン酸の生産能を上昇させることによって、生合成が強化され得る（ＷＯ９７／０８３３３）。
【００５２】
Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンは、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱感作型３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（ＤＳ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。
【００５３】
また、Ｌ−トリプトファンは、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロン（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第4,371,614）を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。
【００５４】
なお、本明細書において、酵素の「活性が増強されている」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が増強された菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味する。また、酵素の「活性が低下している」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。
【００５５】
上記にようにして得られるＬ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００５６】
また、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該細菌の菌体中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させることにより、メチロフィラス属細菌の野生株に比べてＬ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体を製造することができる。
【００５７】
本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００５８】
メタノールを主たる炭素源として用いると、Ｌ−アミノ酸を安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に通常0.001〜30%添加する。窒素源としては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。
【００５９】
培養は、通常には、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、pH5〜9、温度20〜45℃に保持して行われ、通常24〜120時間で終了する。
培養物からのＬ−アミノ酸の採取は、通常、イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６０】
また、メチロフィラス属細菌菌体の培地からの分離は、通常の微生物菌体の分離法によって分離することができる。
【００６１】
＜２＞本発明の遺伝子
本発明のＤＮＡは、メチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ（以下「AK」ともいう）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（以下「ASD」ともいう）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下「DDPS」ともいう）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（以下「DDPR」ともいう）、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（以下「DPDC」ともいう）の各々の酵素をコードする遺伝子である。
【００６２】
本発明のＤＮＡは、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリーを用いて、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを欠損した微生物の変異株を形質転換し、栄養要求性が回復したクローンを選択することによって取得することができる。
【００６３】
メチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリーは、例えば以下のように作製することができる。まず、メチロフィラス・メチロトロファス野生株、例えばメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）から全染色体ＤＮＡを、Saitoらの方法（Saito, H.and Miura, K. (1963) Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629）等により調製し、適当な制限酵素、例えばSau3AI又はAluI等で部分分解して、種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。
【００６４】
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、大腸菌（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素と同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素をベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００６５】
得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌、例えば大腸菌JM109株等を形質転換し、形質転換体の培養液から組換えＤＮＡを調製することによって、遺伝子ライブラリー液が得られる。この形質転換は D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。後記実施例では、エレクトロポレーション法を採用した。
【００６６】
前記ベクターとしては、pUC19、pUC18、pUC118、pUC119、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV29等が挙げられ、その他ファージベクターも使用することができる。例えば、pUC118、pUC119にはアンピシリン耐性遺伝子が、pSTV28及びpSTV29にはクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれているので、培地中にアンピシリン又はクロラムフェニコールを含有させることにより、ベクターあるいは組換えＤＮＡを保持する形質転換体のみを生育させることができる。
【００６７】
形質転換体を培養し、菌体から組換えＤＮＡを回収する方法としては、アルカリSDS法等が挙げられる。
上記のようにして得られたメチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリー液を用いて、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを欠損した微生物の変異株を形質転換し、栄養要求性が回復したクローンを選択する。
【００６８】
AKを欠損した微生物の変異株としては、３種類のAKをコードする遺伝子（thrA, metLM,
lysC）を欠損したE. coli GT3が挙げられる。ASDを欠損した微生物の変異株としては、E. coli Hfr3000 U482 (CGSC 5081株)が挙げられる。DDPSを欠損した微生物の変異株とし
ては、E. coli AT997(CGSC 4547株)が挙げられる。DDPRを欠損した微生物の変異株としては、E. coli AT999 (CGSC 4549株)が挙げられる。DPDCを欠損した微生物の変異株としては、E. coli AT2453(CGSC 4505株)が挙げられる。これらの変異株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州ニューヘブン(New Haven)06511-7444、エール大学生物学 部オズボーン記念研究所（Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs.）、P.O. Box 6666）から入手できる。
【００６９】
上記変異株は、いずれもM9最少培地では生育できないが、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、これらの遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。したがって、最少培地で生育可能な形質転換株を選択し、同株から組換えＤＮＡを回収すれば、各々の酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。また、E. coli AT999 (CGSC 4549株)は、Ｌ培地等の完全培地であっても、ジアミノピメリン酸を添加しない場合には生育が非常に遅いが、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子を保持する形質転換株は当該遺伝子が機能することにより、正常な生育が観察される。したがって、Ｌ培地で正常に生育する形質転換株を選択することによっても、DDPRをコードする遺伝子を保持する形質転換株が得られる。
【００７０】
得られた組換えＤＮＡから挿入ＤＮＡ断片を取り出し、塩基配列を決定すると、各々の酵素のアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列が決定される。
【００７１】
本発明のAKをコードする遺伝子（以下「ask」ともいう）は、配列表配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するAKをコードする。ask遺伝子として具体的には、配列番号５の塩基番号からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のask遺伝子は、配列番号６に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。
【００７２】
本発明のASDをコードする遺伝子（以下「asd」ともいう）は、配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するASDをコードする。asd遺伝子として具体的には、配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のasd遺伝子は、配列番号８に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。
【００７３】
本発明のDDPSをコードする遺伝子（以下「dapA」ともいう）は、配列表配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するDDPSをコードする。dapA遺伝子として具体的には、配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５から塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のdapA遺伝子は、配列番号１０に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。
【００７４】
本発明のDDPRをコードする遺伝子（以下「dapB」ともいう）は、配列表配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するDDPRをコードする。dapB遺伝子として具体的には、配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のdapB遺伝子は、配列番号１２に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。
【００７５】
本発明のDPDCをコードする遺伝子（以下「lysA」ともいう）は、配列表配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するDPDCをコードする。lysA遺伝子として具体的には、配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また
、本発明のlysA遺伝子は、配列番号１４に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。
【００７６】
また、本発明の各酵素遺伝子は、各々配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであって、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで「１若しくは複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００７７】
上記のようなAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００７８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを保持する微生物の種や菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００７９】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を調べることにより、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列、配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列、配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列、配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列、配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。なお、本明細書で、「塩基配列又はその一部を有する」とは、その塩基配列もしくはその一部又はそれに相補的な塩基配列を有することを意味する。
【００８０】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、プローブの塩基配列や長さによって異なるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば４０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００８１】
プローブとして、各遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）反応によって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合
には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００８２】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を測定することによって容易に取り除くことができる。
【００８３】
本発明により、メチロフィラス・メチロトロファス由来のAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列が明らかにされたので、これらの配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、メチロフィラス・メチロトロファス遺伝子ライブラリーから、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。また、これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、上記ヌクレオチド配列を基に作製したオリグヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ法によりメチロフィラス・メチロトロファス染色体ＤＮＡから増幅することによっても得られる。
【００８４】
上記遺伝子は、メチロフィラス属細菌のＬ−リジン生産性を増強するのに好適に利用することができる。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は特に指定しない限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHあるいはHClで調整した。
【００８６】
（Ｌ培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）10g/L
酵母エキス（ディフコ社製）       5g/L
NaCl                             5g/L
［120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。］
【００８７】
（Ｌ寒天培地）
Ｌ培地
バクトアガー（ディフコ社製） 15g/L
［120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。］
【００８８】
（SOC培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）20g/L
酵母エキス（ディフコ社製）       5g/L
10mM NaCl
2.5mM KCl
10mM MgSO4
10mM MgCl2
20mMグルコース
［マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸気滅菌した(120℃、20分間)後、予め0.22μmのフィルターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO4、1M MgCl2）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフィルターを通した。］
【００８９】
（121M1培地）
K2HPO4         1.2g/L
KH2PO4         0.62g/L
NaCl           0.1g/L
(NH4)2SO4      0.5g/L
MgSO4・7H2O    0.2g/L
CaCl2・6H2O    0.05g/L
FeCl3・6H2O    1.0mg/L
H3BO3         10μg/L
CuSO4・5H2O    5μg/L
MnSO4・5H2O   10μg/L
ZnSO4・7H2O   70μg/L
NaMoO4・2H2O  10μg/L
CoCl2・6H2O    5μg/L
メタノール 1%(vol/vol) pH 7.0
[メタノール以外は121℃、15分間の蒸気滅菌を行った。良く冷めてからメタノールを添加した。］
【００９０】
（121生産培地の組成）
メタノール                     2%
リン酸二カリウム               0.12%
リン酸一カリウム               0.062%
塩化カルシウム六水塩           0.005%
硫酸マグネシウム七水塩         0.02%
塩化ナトリウム                 0.01%
塩化第二鉄六水塩               1.0mg/L
硫酸アンモニウム               0.3%
硫酸第二銅五水塩               5μg/L
硫酸第一マンガン五水塩        10μg/L
モリブデン酸ナトリウム二水塩  10μg/L
ホウ酸                        10μg/L
硫酸亜鉛七水塩                70μg/L
塩化第一コバルト六水塩         5μg/L
炭酸カルシウム（関東化学製）   3%
（pH7.0）
【００９１】
（121M1寒天培地）
121M1培地
バクトアガー（ディフコ社製）15g/L
［メタノール以外は121℃、15分間の蒸気滅菌を行った。良く冷めてからメタノールを添加した。］
【００９２】
（Ｍ９最少培地）
Na2HPO4・12H2O   16g/L
KH2PO4            3g/L
NaCl              0.5g/L
NH4Cl             1g/L
MgSO4・7H2O     246.48mg/L
グルコース        2g/L
pH7.0
［MgSO4、およびグルコースは別に殺菌(120℃、20分間)して加えた。また、必要に応じて
適量のアミノ酸およびビタミンを添加した。］
【００９３】
（Ｍ９最少寒天培地）
Ｍ９最少培地
バクトアガー（ディフコ社製）15g/L
【００９４】
実施例１  Ｌ−リジン生産菌の創製（１）
（１）メチロフィラス属細菌への変異型lysC及び変異型dapAの導入
変異型lysC及び変異型dapAは、これらを含む公知のプラスミドRSFD80（WO95/16042号参照）を用いてメチロフィラス属細菌に導入した。RSFD80は、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）に由来するプラスミドpVIC40（WO90/04636国際公開パンプレット、特表平3-501682号公報）のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター（tetP）の下流に、tetPに対して転写方向が正方向となるようにE. coli由来の変異型dapA及び変異型lysCがこの順序で配置されている。この変異型dapAは、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型DDPSをコードしている。また、前記変異型lysCは、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型AKIIIをコードしている。
【００９５】
RSFD80は、以下に示すようにして構築された。プラスミドpdapAS24上にある変異型dapAをpVIC40のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結し、図１に示す様にしてRSF24Pを得た。次に、このRSF24Pと、変異型lysCを含むpLLC*80から、変異型dapA及び変異型lysCを有するプラスミドRSFD80を図２に示す様にして作製した。すなわち、pVIC40はスレオニンオペロンを含んでいるが、RSFD80ではこのスレオニンオペロンが変異型dapAを含むＤＮＡ断片及び変異型lysCを含むＤＮＡ断片と置換されている。
【００９６】
RSFD80プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は、1993年10月28日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-13936として寄託され、そして1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号が付与されている。
【００９７】
E. coli AJ1239株を、ストレプトマイシンを20mg/L含む30mlのLB培地で30℃で12時間培養して得た菌体から、WizardR Plus Midipreps DNA Purification System(プロメガ社より市販)を用いてRSFD80プラスミドを精製した。
【００９８】
上記のようにして得られたRSFD80プラスミドを、エレクトロポレーション法（Canadian
Journal of Microbiology, 43, 197(1997)）によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）に導入した。なお、対照として、RSFD80プラスミドを作製する際に用いたpVIC40プラスミドよりスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つpRSプラスミド（特表平3-501682号公報参照）を、RSFD80と同様にしてAS1株に導入した。
【００９９】
（２）E. coli由来の変異型lysC及び変異型dapAを保持するメチロフィラス属細菌のAKIII活性
RSFD80プラスミドを保持するメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（以下、「AS1/RSFD80」と略すことがある）と、pRSプラスミドを保持するメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（以下、「AS1/pRS」と略すことがある）より、無細胞抽出液を調製し、AK活性を測定した。無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにして調製した。AS1/RSFD80およびAS1/pRS株を、ストレプトマイシン20mg/Lを含む上記組成の121生産培地に植菌し、37℃で34時間振とう培養し、炭酸カルシウムを除いた後、集菌した。
【０１００】
上記のようにして得られた菌体を、０℃の条件下で0.2% KClで洗浄し、10mM MgSO4, 0.8M (NH4)2SO4および0.03M β−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に懸濁し、超音波処理（０℃、２００Ｗ、１０分）で菌体を破砕した。菌体破砕液を0℃の条件下で、33,000rpmで３０分間遠心し、上清をとってこれに80%飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、0℃で１時間放置した後遠心し、ペレットを10mM MgSO4, 0.8M (NH4)2SO4および0.03Ｍ β−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に溶解した。
【０１０１】
AK活性の測定はスタットマンらの方法（Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G.,
and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033(1961)）に従った。すなわち、下記組成の反応液を30℃で45分インキュベートし、FeCl3溶液（2.8N HCl: 0.4ml, 12%TCA: 0.4ml, 5% FeCl3・6H2O/0.1N HCl: 0.7ml）を加えて発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量で表示（1U=1mmol/分）した。モル吸光係数は600とした。なお、反応液からアスパラギン酸カリウムをのぞいたものをブランクとした。酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の度合いを調べた。結果を表１に示した。
【０１０２】
（反応液組成）
reaction mixture *1                     0.3ml
ヒドロキシルアミン溶液 *2               0.2ml
0.1Mアスパラギン酸カリウム(pH7.0)       0.2ml
酵素液                                  0.1ml
水（バランス）                      計  1ml
*1：1M Tris-HCl(pH8.1) 9ml, 0.3M MgSO4 0.5ml, 0.2M ATP(pH7.0) 5ml
*2：8Mヒドロキシルアミン溶液を直前にKOHで中和したもの
【０１０３】
【表１】
0004273661.tif 000002
【０１０４】
表１に示すように、RSFD80プラスミドの導入によりAK活性が約1.7倍に上昇した。また、RSFD80プラスミドにコードされるE. coli由来のAKはＬ−リジンにより阻害が完全に解除されていることが確認された。また、AS1株が元来保持するAKは、Ｌ−リジン単独では阻害を受けないことがわかった。尚、本発明者らは、AS1株由来のAKは、Ｌ−リジンとＬ−スレオニンが反応液中に各2mMずつ存在するときに、100%阻害されることを発見している（協奏阻害）。
【０１０５】
（３）E. coli由来の変異型lysC及び変異型dapAを保持するメチロフィラス属細菌によるＬ−リジンの製造
次に、AS1/RSFD80およびAS1/pRS株をストレプトマイシン20mg/Lを含む121生産培地に植菌し、37℃で34時間振とう培養した。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
0004273661.tif 000003
【０１０７】
実施例２  Ｌ−リジン生産菌の創製（２）
（１）広宿主域ベクターへのtacプロモーター領域の組込み
Ｌ−リジン(Lys)の生合成に関与する酵素をメチロフィラス・メチロトロファス内で高生産させる為に、E.coliで多用されるtacプロモーターを、目的酵素の遺伝子発現用に用いた。
【０１０８】
tacプロモーター領域は、pKK233-3(ファルマシア社製)のDNAをPCRの鋳型に用い、配列番号１５及び１６の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとして、耐熱性DNAポリメラーゼによるPCRにて増幅し取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-60秒のサイクルを30回という条件で行った。その後、その増幅DNA断片を回収し、制限酵素EcoRI及びPstIにて処理した。一方、広宿主域ベクターpRS（特表平3-501682号公報参照）も同じ制限酵素にて切断し、それぞれの制限酵素切断端に、上記のtacプロモーター領域を含むDNA断片を組み入れ、pRS-tacを作成した。
【０１０９】
（２）dapA遺伝子（ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子）発現プラスミドpRS-dapA24およびlysC遺伝子(アスパルトキナーゼ遺伝子)発現プラスミドpRS-lysC80の作成
Lysによる酵素活性のフィードバック阻害が幾分解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異型遺伝子(dapA*24)を（１）に記載した方法にて作成したプラスミドpRS-tacに組み入れた。
【０１１０】
まずdapA*24遺伝子領域はRSFD80(実施例１参照)のDNAを鋳型に、配列番号１７及び１８の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとしてPCRにて増幅して取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-90秒のサイクルを30回という条件で行った。その断片を制限酵素Sse8387I及びXbaIにて処理し、それぞれの切断端をもつdapA*24遺伝子断片を調製した。一方、pRS-tacも、同様にSse8387Iで処理し、XbaIにて部分消化した。そこへ上記のdapA*24遺伝子断片をT4-DNAリガーゼにて連結することでpRS-dapA24を得た。
【０１１１】
また同様に、Lysによる酵素活性のフィードバック阻害が幾分解除されたアスパルトキナーゼの遺伝子（lysC*80）も、RSFD80のDNAを鋳型にし、配列番号１９及び２０の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとしたPCRにて取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-90秒のサイクルを30回という条件で行った。得られたDNA断片は制限酵素Sse8387I及びSapIにて処理した。一方、ベクターであるpRS-tacも制限酵素Sse8387I及びSapIにて処理し、これに、上記のlysC*80遺伝子断片をT4 DNAリガーゼにて連結することで、pRS-lysC80を作成した。
【０１１２】
（３）pRS-dapA24またはpRS-lysC80のメチロフィラス・メチロトロファスへの導入と培養評価
上記のようにして得られたpRS-dapA24及びpRS-lysC80を、それぞれ、エレクトロポレーション法によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)に導入し、AS1/pRS-dapA24及びAS1/pRS-lysC80を得た。それぞれストレプトマイシン20mg/Lを含む121生産培地に植菌し、37℃で48時間振とう培養した。同様に対照株としてpRSを有するAS1株も培養した。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表３に示す。
【０１１３】
【表３】
0004273661.tif 000004
【０１１４】
実施例３  Ｌ−リジン生産菌の創製（３）
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を、121M1培地に植菌し37℃で15時間培養した。得られた菌体を常法によりNTG処理（NTG濃度100mg/L、37℃、５分）し、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（AEC）7g/L、及びＬ−スレオニン3g/Lを含有する121M1寒天培地に塗布した。これを、37℃で２〜８日間培養し、生じたコロニーを釣菌分離して、AEC耐性株を取得した。
【０１１５】
上記のAEC耐性株を、121生産培地に植菌し、好気的に37℃で38時間培養した。培養終了後、培地から菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。親株よりＬ−リジン生産能が向上した株を選択し、メチロフィラス・メチロトロファスAR-166株と命名した。親株（AS1株）及びAR-166株のＬ−リジン生産量を表４に示す。
【０１１６】
【表４】
0004273661.tif 000005
【０１１７】
メチロフィラス・メチロトロファスAR-166株は、プライベートナンバーAJ13608が付与され、1999年6月10日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-17416として寄託され、そして2000年3月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-711
2が付与されている。
【０１１８】
実施例４  Ｌ−スレオニン生産菌の創製
（１）メチロフィラス属細菌へのスレオニンオペロンプラスミドの導入
E.coli由来のスレオニンオペロンを搭載したプラスミドpVIC40 (WO90/04636国際公開パンフレット、特表平3-501682号公報)をエレクトロポレーション法 (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197(1997))によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株 (NCIMB10515) に導入し、AS1/pVIC40株を得た。対照として、pVIC40プラスミドよりスレオニンオペロンをコードするDNA領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドpRSプラスミド(特表平3-501682号公報)をpVIC40と同様にしてAS1株に導入し、AS1/pRS株を得た。
【０１１９】
（２）E.coli由来のスレオニンオペロンを保持するメチロフィラス属細菌によるＬ−スレオニンの製造
AS1/pVIC40及びAS1/pRS株を、ストレプトマイシン20mg/L、Ｌ−バリン1g/l及びＬ−ロイシン1g/lを含む121生産培地に植菌し、37℃で50時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表５に示す。
【０１２０】
【表５】
0004273661.tif 000006
【０１２１】
実施例５  分岐鎖アミノ酸生産菌の創製
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を、121M1培地に植菌し、37℃で15時間培養した。得られた菌体を常法によりNTG処理（NTG濃度100mg/L、37℃、５分）し、カザミノ酸（DIFCO社製）0.5%を含有する121M1寒天培地に塗布した。これを37℃で２〜８日間培養し、コロニーを形成させた。これらのコロニーを釣菌分離して、121M1寒天培地及びカザミノ酸0.5%を含有する121M1寒天培地に植菌し、前者に比べて後者で生育がよい株を選択し、これをカザミノ酸要求株とした。こうして、５００株のNTG処理株から９株のリーキーなカザミノ酸要求株を得た。これらのカザミノ酸要求株から、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを親株よりも多く培地中に蓄積する株を１株得た。これをメチロフィラス・メチロトロファスC138株と命名した。
【０１２２】
メチロフィラス・メチロトロファスC138株は、プライベートナンバーAJ13609が付与され、1999年6月10日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-17417として寄託され、そして2000年3月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7113が付与されている。
【０１２３】
親株（AS1株）及びC138株を、121生産培地に植菌し、好気的に37℃で34時間培養した。培養終了後、培地から菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−バリン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンの濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表６に示す。
【０１２４】
【表６】
0004273661.tif 000007
【０１２５】
実施例６  メチロフィラス・メチロトロファスAS1株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
（１）メチロフィラス・メチロトロファスAS1株からの染色体DNAの調製
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を試験管内5mlの121M1培地に一白金耳植菌し、37℃一晩振盪培養した。得られた培養液を500ml容坂口フラスコ内の50mlの121M1培地に1%となるように接種し、37℃にて一晩振盪培養した後、遠心分離にて集菌した。50mlのTEN溶液（50mM Tris-HCl (pH8.0), 10mM EDTA及び20mM NaClからなる溶液 (pH8.0)）に懸濁し、遠心分離して集菌後、5mg/mlのリゾチームおよび10μg/mlのリボヌクレアーゼＡを含む5mlのTEN溶液に再懸濁した。37℃で30分間保温後、プロテイナーゼＫ及びラウリル硫酸ナトリウムを終濃度が各々10μg/ml及び0.5 %(wt/vol)となるように添加した。
【０１２６】
70℃で２時間保温後、等量の飽和フェノール溶液（10mM Tris-HCl (pH 8.0) で飽和したフェノール溶液）を加えて混合した後、遠心分離して上清を回収し、等量のフェノール・クロロホルム溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25：24：1）を加えて混合し、遠心分離した。上清を回収後、等量のクロロホルム溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝24：1）を加えて同様の抽出操作を繰り返した。上清に1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)と2.5容のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 8.0)）適量に溶解した。
【０１２７】
（２）遺伝子ライブラリーの調製
（１）で得られた染色体DNA（1μg/μl）50μl、H緩衝液（500mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 10mM ジチオスレイトール, 1000mM NaCl (pH7.5)）20μl、制限酵素Sau3AI（宝酒造製）8単位を、全容200μl中で37℃において10分間反応させた後、200μlのフェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、0.8%アガロースゲルにて分離し、2〜5キロベースペア（以下「kbp」と記載）に相当するDNAを、ConcertTM Rapid Gel Extraction System（DNA回収キット、GIBCO BRL社製）を用いて回収した。このようにして分画したサイズをもつDNAの溶液を50μl得た。
【０１２８】
一方、プラスミドpUC118（宝酒造製）2.5μg、K緩衝液（200mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 10mM ジチオスレイトール, 1000mM KCl (pH8.5)）2μl、制限酵素BamHI（宝酒造製）10単位を、全容20μl中で37℃において２時間反応させた後、子牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）20単位を添加して、さらに30分間反応させた。等量のフェノール・クロロホルム溶液を加えて混合、遠心分離し、上清を回収後、等量のクロロホルム溶液を加えて同様の抽出操作を繰り返した。上清に1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)と2.5容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。このDNAを遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液に溶解した。
【０１２９】
以上のように調製した染色体DNAのSau3AI消化物と、pUC118のBamHI消化物を、Ligation
Kit ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウム (pH4.8)と2.5容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。これを遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液に溶解した（リガーゼ液Ａ）。
【０１３０】
上記の操作と同様にして、染色体DNAを制限酵素AluI(宝酒造製)にて部分消化した断片とプラスミドpSTV29(宝酒造製)をSmaIにて消化した断片を連結したものも調製した（リガーゼ液Ｂ）。
【０１３１】
E. coli JM109を試験管内5mlのＬ培地に一白金耳植菌し、37℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を500ml容坂口フラスコ内の50mlのＬ培地に1%となるように接種し、37℃にて、OD660が0.5〜0.6となるまで培養した後、15分間氷冷した。4℃で遠心分離して集菌した。菌体を50mlの氷冷した水に懸濁し、遠心分離して菌を洗浄した。この操作をもう一度繰り返した後、50mlの氷冷した10%グリセロール溶液に懸濁し、遠心分離して菌を洗浄した。菌体と同じ容量の10%グリセロール溶液に懸濁して50μlずつ分注した。各50μl容量分の細胞に対して、上記で調製したリガーゼ液Ａあるいはリガーゼ液Ｂをそれぞれ１μl加え、BioRad社製のエレクトロポレーション装置専用（0.1cm幅)のキュベット（予め氷冷）に混合液を移した。
【０１３２】
装置の設定を1.8kV、25μF、パルスコントローラーの設定を200Ωにした。キュベットを装置にセットし、パルスを印加した。印加後、直ちに氷冷したSOC培地1mlを加え、滅菌した試験管に移し、37℃で１時間振盪培養した。抗生物質を含むＬ寒天培地（リガーゼ液Ａを用いた場合は100μg/mlのアンピシリン、リガーゼ液Ｂを用いた場合は20μg/mlクロラムフェニコール）にそれぞれの菌体培養液を塗布し、37℃で一晩保温した。各寒天培地上に出現したコロニーを各々掻き集め、500ml容坂口フラスコ内の、各々の抗生物質を含むＬ培地50mlに各々接種し、37℃で２時間振盪培養した。アルカリSDS法にて各々の培養液からプラスミドDNAを抽出し、それぞれ遺伝子ライブラリー液Ａおよび遺伝子ライブラリー液Ｂとした。
【０１３３】
実施例７  メチロフィラス・メチロトロファスAS1株のリジン生合成遺伝子のクローニング
（１）アスパルトキナーゼ（AK）をコードする遺伝子のクローニング
３つのAKをコードする遺伝子(thrA, metLM, lysC)を欠損したE. coli GT3を、上記と同じエレクトロポレーション法で、遺伝子ライブラリー液Ｂを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、培養液を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地に塗布しコロニーを出現させた。これをマスタープレートとして、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9寒天培地へのレプリカを行い、37℃にて２〜３日間保温した。宿主はAK活性を有さないためにジアミノピメリン酸を含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のAKをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。
【０１３４】
約3000個の形質転換体から２個がM9培地にコロニーを形成した。M9培地で出現したコロニーよりプラスミドを抽出し、解析を行ったところ、プラスミド上に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMASK-1、pMMASK-2と命名した。これらのプラスミドを用いて、再度E. coli GT3を形質転換したところ、形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらにこれらのプラスミドを各々含む形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離して集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Miyajimaらの方法（Journal of Biochemistry (Tokyo), vol.63, 139-148 (1968)）に従いAK活性を測定した（図３、pMMASK-1、pMMASK-2）。なお、ベクターpSTV29を保持す
るGT3株を、20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養し、AK活性を測定した（図３、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体に比べて、挿入断片を有する２つのクローンには有意にAK活性の増加が認められたので、pSTV29上にクローニングできた遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のAKをコードする遺伝子であることが判明した。この遺伝子をaskと命名した。
【０１３５】
ask遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。pMMASK-1とpMMASK-2は共通の断片を含んでいることがわかった。このようにして得られたメチロフィラス・メチロトロファス由来ask遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号５に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号５及び６に示す。
【０１３６】
（２）アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ASD）をコードする遺伝子のクローニング
asd遺伝子を欠損したE. coli Hfr3000 U482 (CGSC 5081株)を、上記と同様にして、エレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ｂを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離にて集菌した。菌体をL培地に懸濁後、遠心分離にて洗浄を行った。同様の洗浄操作をもう一度繰り返し、菌体をL培地に懸濁後、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。宿主はasd遺伝子を欠損しているために、ジアミノピメリン酸を含んでいないＬ培地では生育が非常に遅い。これに対してメチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりＬ培地においても正常な生育が観察されると予想される。さらにM9最少培地において、宿主E. coliは生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。そこでＬ培地で正常に生育してきた形質転換体のコロニーを釣上げ、これをM9寒天培地に画線培養したところ生育が認められ、予想どおりこれら形質転換株においてASDをコードする遺伝子が機能していることを確認した。
【０１３７】
M9培地で出現した形質転換体３株よりプラスミドを抽出し、それらプラスミドの中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMASD-1、pMMASD-2、pMMASD-3と命名した。これらのプラスミドを用いて再度E. coli Hfr3000 U482を形質転換したところ、各形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに各形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一晩培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて粗酵素液を調製し、Boyらの方法（Journal of Bacteriology, vol.112(1), 84-92(1972)）に準じてASD活性を測定した（図４、pMMASD-1、pMMASD-2、pMMASD-3）。なお、コントロール実験についてはベクターを保持する宿主を、20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養しASD活性を測定した（図４、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性を検出できなかったのに対して、挿入断片を有する３つのクローンにはASD活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子（asdと命名）であることが判明した。
【０１３８】
asd遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。そして得られた３つのクローンは全て共通の断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来asd遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号７に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。
【０１３９】
（３）ジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS)をコードする遺伝子のクローニング
dapA遺伝子を欠損したE. coli AT997(CGSC 4547株)を、上記と同じエレクトロポレーシ
ョン法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、培養液を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地に塗布しコロニーを出現させた。これをマスタープレートとして100μg/mlのアンピシリンを含むM9最少寒天培地へのレプリカを行い37℃にて2〜3日間保温した。宿主はdapA遺伝子を欠損しているために、ジアミノピメリン酸を含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPSをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。
【０１４０】
M9培地で出現したコロニー２株よりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMDAPA-1、pMMDAPA-2と命名した。これらのプラスミドを用いてE. coli AT997をあらためて形質転換したところ、各形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらにこれらのプラスミドを含む形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Yugariらの方法（Journal of Biological Chemistry, vol.240, p.4710(1965)）に従いDDPS活性を測定した（図５、pMMDAPA-1、pMMDAPA-2）。なお、コントロール実験についてはベクターを保持する宿主を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて同様に培養し、DDPS活性を測定した（図５、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性を検出できなかったのに対して、挿入断片を有するプラスミドをもつ各形質転換体にはDDPS活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPSをコードする遺伝子（dapAと命名）であることが判明した。
【０１４１】
dapA遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。２つの挿入断片中には共通するDNA断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来dapA遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号９に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号９及び１０に示す。
【０１４２】
（４）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（DDPR）をコードする遺伝子のクローニング  dapB遺伝子を欠損したE. coli AT999 (CGSC 4549株)を、上記と同じエレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離にて集菌した。菌体をL培地に懸濁後、遠心分離にて洗浄を行った。同様の洗浄操作をもう一度繰り返しL培地に懸濁後、100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地に培養液を塗布し、37℃一晩保温した。宿主はdapB遺伝子を欠損しているためにジアミノピメリン酸を含んでいないＬ培地では生育が非常に遅い。メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子をもつプラスミドを保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりＬ培地においても正常な生育が観察される。さらにM9最少培地において宿主E. coliは生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPR遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。
【０１４３】
Ｌ培地で正常に生育してきた形質転換体をＭ９寒天培地に画線培養したところ、M9培地上でも生育してきた。こうしてこのDDPRをコードする遺伝子が機能していることを確認した。M9培地で出現したコロニーよりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。当該プラスミド（pMMDAPB）を用いて、再度E. coli AT999を形質転換したところ、当該形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに当該プラスミドを含む形質転換体をL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Tamirらの方法（Journal of Biological Chemistry, vol.249, p.3034(1974)）に従いDDPR活性を測定した（図６、pMMDAPB）。なお、コントロール実験については、ベクターを保持する宿主を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて同様に培養し、DDPR活性を測定した（図６、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性は検出できなかったのに対して、pMMDAPBを有する形質転換体にはDDPR活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子（dapBと命名）であることが判明した。
【０１４４】
dapB遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。メチロフィラス・メチロトロファス由来dapB遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１１に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１１及び１２に示す。
【０１４５】
（５）ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(DPDC)をコードする遺伝子のクローニング
lysA遺伝子を欠損したE. coli AT2453(CGSC 4505株)を、上記と同じエレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液にSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離し、菌体を5mlの滅菌水に懸濁しさらに遠心分離し洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、菌体を500μlの滅菌水に懸濁し、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9最少寒天培地に培養液を塗布し、37℃にて2〜3日間保温した。宿主はlysA遺伝子を欠損しているためにリジンを含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDPDCをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。
【０１４６】
M9培地で出現した形質転換体３株よりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3と命名した。これらのプラスミドを用いてE. coli AT2453をあらためて形質転換したところ、各プラスミドの形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに各当該プラスミドを含む形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Cremerらの方法（Journal of General Microbiology, vol.134, 3221-3229(1988)）に従いDPDC活性を測定した（図７、pMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3）。なお、コントロール実験については、ベクターを保持する宿主を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養しDPDC活性を測定した（図７、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性は検出できなかったのに対して、挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転換体3株からはいずれもDPDC活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDPDCをコードする遺伝子（lysAと命名）であることが判明した。
【０１４７】
lysA遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。３つの挿入断片は全て共通のDNA断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来lysA遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１３に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１３及び１４に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明により、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌、同細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法、及びＬ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体が提供される。本発明の方法によれば、メタノールを原料としてＬ−アミノ酸を製造することが可能となる。また、本発明により、メチロフィラス属細菌の新規なＬ−リジン生合成酵素遺伝子が提供される。
【０１４９】
【配列表】
配列表(SEQUENCE LISTING)
<110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> Ｌ−アミノ酸生産菌及びＬ−アミノ酸の製造法
<130> B-591MSOP975
<150> JP 11-103143
<151> 1999-04-09
<150> JP 11-169447
<151> 1999-06-16
<150> JP 11-368097
<151> 1999-12-24
<160> 20
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 1197
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (272)..(1147)
<400> 1
ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca 60
caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag 120
tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca 180
tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca 240
ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc    292
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val
1               5
gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct agc   340
Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser
10                  15                  20
ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc agc ggt act tcg gcg atc   388
Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile
25                  30                  35
gtt tct gtt ggc acc act ggc gag tcc gct acc tta aat cat gac gaa   436
Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu
40                  45                  50                  55
cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg gat ctg gct gat ggg cgc att   484
His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile
60                  65                  70
ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac gct act gcg gaa gcc att agc   532
Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser
75                  80                  85
ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt atc gtc ggc tgc ctg acg gta   580
Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val
90                  95                 100
acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa gaa ggt ttg tat cag cat ttc   628
Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe
105                 110                 115
aaa gcc atc gct gag cat act gac ctg ccg caa att ctg tat aat gtg   676
Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val
120                 125                 130                 135
ccg tcc cgt act ggc tgc gat ctg ctc ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg   724
Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu
140                 145                 150
gcg aaa gta aaa aat att atc gga atc aaa gag gca aca ggg aac tta   772
Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu
155                 160                 165
acg cgt gta aac cag atc aaa gag ctg gtt tca gat gat ttt gtt ctg   820
Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu
170                 175                 180
ctg agc ggc gat gat gcg agc gcg ctg gac ttc atg caa ttg ggc ggt   868
Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly
185                 190                 195
cat ggg gtt att tcc gtt acg act aac gtc gca gcg cgt gat atg gcc   916
His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala
200                 205                 210                 215
cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa gaa cat ttt gcc gag gca cgc gtt   964
Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val
220                 225                 230
att aat cag cgt ctg atg cca tta cac aac aaa cta ttt gtc gaa ccc   1012
Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro
235                 240                 245
aat cca atc ccg gtg aaa tgg gca tgt aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg   1060
Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala
250                 255                 260
acc gat acg ctg cgc ctg cca atg aca cca atc acc gac agt ggt cgt   1108
Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg
265                 270                 275
gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat gcc ggt ttg ctg taaagtttag    1157
Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu
280                 285                 290
ggagatttga tggcttactc tgttcaaaag tcgcgcctgg                       1197
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1               5                  10                  15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
20                  25                  30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35                  40                  45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn
65                  70                  75                  80
Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85                  90                  95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln
100                 105                 110
Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu
115                 120                 125
Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130                 135                 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile
145                 150                 155                 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu
165                 170                 175
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
180                 185                 190
Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn
195                 200                 205
Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu
210                 215                 220
His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys
245                 250                 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260                 265                 270
Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275                 280                 285
Ala Gly Leu Leu
290
<210> 3
<211> 2147
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (584)..(1930)
<400> 3
tcgaagtgtt tctgtagtgc ctgccaggca gcggtctgcg ttggattgat gtttttcatt 60
agcaatactc ttctgatttt gagaattgtg actttggaag attgtagcgc cagtcacaga 120
aaaatgtgat ggttttagtg ccgttagcgt aatgttgagt gtaaaccctt agcgcagtga 180
agcatttatt agctgaacta ctgaccgcca ggagtggatg aaaaatccgc atgaccccat 240
cgttgacaac cgccccgctc accctttatt tataaatgta ctacctgcgc tagcgcaggc 300
cagaagaggc gcgttgccca agtaacggtg ttggaggagc cagtcctgtg ataacacctg 360
agggggtgca tcgccgaggt gattgaacgg ctggccacgt tcatcatcgg ctaagggggc 420
tgaatcccct gggttgtcac cagaagcgtt cgcagtcggg cgtttcgcaa gtggtggagc 480
acttctgggt gaaaatagta gcgaagtatc gctctgcgcc cacccgtctt ccgctcttcc 540
cttgtgccaa ggctgaaaat ggatcccctg acacgaggta gtt atg tct gaa att   595
Met Ser Glu Ile
1
gtt gtc tcc aaa ttt ggc ggt acc agc gta gct gat ttt gac gcc atg   643
Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met
5                  10                  15                  20
aac cgc agc gct gat att gtg ctt tct gat gcc aac gtg cgt tta gtt   691
Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
25                  30                  35
gtc ctc tcg gct tct gct ggt atc act aat ctg ctg gtc gct tta gct   739
Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala
40                  45                  50
gaa gga ctg gaa cct ggc gag cga ttc gaa aaa ctc gac gct atc cgc   787
Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg
55                  60                  65
aac atc cag ttt gcc att ctg gaa cgt ctg cgt tac ccg aac gtt atc   835
Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile
70                  75                  80
cgt gaa gag att gaa cgt ctg ctg gag aac att act gtt ctg gca gaa   883
Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu
85                  90                  95                 100
gcg gcg gcg ctg gca acg tct ccg gcg ctg aca gat gag ctg gtc agc   931
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser
105                 110                 115
cac ggc gag ctg atg tcg acc ctg ctg ttt gtt gag atc ctg cgc gaa   979
His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu
120                 125                 130
cgc gat gtt cag gca cag tgg ttt gat gta cgt aaa gtg atg cgt acc   1027
Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr
135                 140                 145
aac gac cga ttt ggt cgt gca gag cca gat ata gcc gcg ctg gcg gaa   1075
Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu
150                 155                 160
ctg gcc gcg ctg cag ctg ctc cca cgt ctc aat gaa ggc tta gtg atc   1123
Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile
165                 170                 175                 180
acc cag gga ttt atc ggt agc gaa aat aaa ggt cgt aca acg acg ctt   1171
Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu
185                 190                 195
ggc cgt gga ggc agc gat tat acg gca gcc ttg ctg gcg gag gct tta   1219
Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu
200                 205                 210
cac gca tct cgt gtt gat atc tgg acc gac gtc ccg ggc atc tac acc   1267
His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr
215                 220                 225
acc gat cca cgc gta gtt tcc gca gca aaa cgc att gat gaa atc gcg   1315
Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala
230                 235                 240
ttt gcc gaa gcg gca gag atg gca act ttt ggt gca aaa gta ctg cat   1363
Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His
245                 250                 255                 260
ccg gca acg ttg cta ccc gca gta cgc agc gat atc ccg gtc ttt gtc   1411
Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val
265                 270                 275
ggc tcc agc aaa gac cca cgc gca ggt ggt acg ctg gtg tgc aat aaa   1459
Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys
280                 285                 290
act gaa aat ccg ccg ctg ttc cgc gct ctg gcg ctt cgt cgc aat cag   1507
Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln
295                 300                 305
act ctg ctc act ttg cac agc ctg aat atg ctg cat tct cgc ggt ttc   1555
Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe
310                 315                 320
ctc gcg gaa gtt ttc ggc atc ctc gcg cgg cat aat att tcg gta gac   1603
Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp
325                 330                 335                 340
tta atc acc acg tca gaa gtg agc gtg gca tta acc ctt gat acc acc   1651
Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr
345                 350                 355
ggt tca acc tcc act ggc gat acg ttg ctg acg caa tct ctg ctg atg   1699
Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met
360                 365                 370
gag ctt tcc gca ctg tgt cgg gtg gag gtg gaa gaa ggt ctg gcg ctg   1747
Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu
375                 380                 385
gtc gcg ttg att ggc aat gac ctg tca aaa gcc tgc ggc gtt ggc aaa   1795
Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys
390                 395                 400
gag gta ttc ggc gta ctg gaa ccg ttc aac att cgc atg att tgt tat   1843
Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr
405                 410                 415                 420
ggc gca tcc agc cat aac ctg tgc ttc ctg gtg ccc ggc gaa gat gcc   1891
Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala
425                 430                 435
gag cag gtg gtg caa aaa ctg cat agt aat ttg ttt gag taaatactgt    1940
Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu
440                 445
atggcctgga agctatattt cgggccgtat tgattttctt gtcactatgc tcatcaataa 2000
acgagcctgt actctgttaa ccagcgtctt tatcggagaa taattgcctt taattttttt 2060
atctgcatct ctaattaatt atcgaaagag ataaatagtt aagagaaggc aaaatgaata 2120
ttatcagttc tgctcgcaaa ggaattc                                     2147
<210> 4
<211> 449
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1               5                  10                  15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
20                  25                  30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35                  40                  45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50                  55                  60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85                  90                  95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100                 105                 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115                 120                 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130                 135                 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165                 170                 175
Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180                 185                 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195                 200                 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210                 215                 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225                 230                 235                 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245                 250                 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260                 265                 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275                 280                 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290                 295                 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His
305                 310                 315                 320
Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325                 330                 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340                 345                 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355                 360                 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370                 375                 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385                 390                 395                 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405                 410                 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420                 425                 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435                 440                 445
Glu
<210> 5
<211> 1981
<212> DNA
<213> Methylophilus methylotrophus
<220>
<221> CDS
<222> (510)..(1736)
<400> 5
gtttaacgcg gccagtgaat ttgactcggt cccctgcctg gcaaaatcgc acaggtgatg 60
gacaacgtga aatcgcttga aaaagaattg gcacgcctca agtccaagct ggcctcctca 120
cagggggatg acctcgcgac gcaagcgcag gacgtcaacg gcgccaaagt actggcagcc 180
accctcgacg gggcggatgc caatgccttg cgtgaaacca tggataagct caaagataaa 240
ctcaaatctg cagtcattgt gctggcgagc gtggctgacg gtaaagtcag cctggctgcg 300
ggtgtcacta ctgacttgac tggcaaggtc aaagcaggcg aagttggtca atcatgtggc 360
tggtcaggtc ggtggcaaag gtggtggtaa accggatatg gcgatggcag gtggtactga 420
gcccgctaat ttgccgcagg ctttggcaag tgtgaaggct tgggtagaaa caaaactaaa 480
ttaatttaat tgattaacag agcgaaata atg gca tta atc gta caa aaa tat   533
Met Ala Leu Ile Val Gln Lys Tyr
1               5
ggt ggt acc tcg gtg gct aat ccc gag cgt atc cgt aat gtg gcg cgt   581
Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Pro Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Arg
10                  15                  20
cgc gtg gcg cgt tac aag gca ttg ggc cac cag gtg gtg gtt gtg gta   629
Arg Val Ala Arg Tyr Lys Ala Leu Gly His Gln Val Val Val Val Val
25                  30                  35                  40
tcc gca atg tct ggt gaa acc aac cgg ttg atc tca ctg gcc aag gaa   677
Ser Ala Met Ser Gly Glu Thr Asn Arg Leu Ile Ser Leu Ala Lys Glu
45                  50                  55
atc atg caa gac cct gat cca cgt gag ctg gat gtg atg gta tca acc   725
Ile Met Gln Asp Pro Asp Pro Arg Glu Leu Asp Val Met Val Ser Thr
60                  65                  70
ggt gag cag gtc acc atc ggc atg acg gcc ctg gca ctg atg gag ctt   773
Gly Glu Gln Val Thr Ile Gly Met Thr Ala Leu Ala Leu Met Glu Leu
75                  80                  85
ggc att aag gca aaa agc tat acc ggt acc cag gtt aag atc ttg act   821
Gly Ile Lys Ala Lys Ser Tyr Thr Gly Thr Gln Val Lys Ile Leu Thr
90                  95                 100
gac gat gct ttt acc aag gca cgt att ctg gat atc gac gaa cat aac   869
Asp Asp Ala Phe Thr Lys Ala Arg Ile Leu Asp Ile Asp Glu His Asn
105                 110                 115                 120
ctg aaa aaa gac ctg gat gat ggc tat gtc tgc gtg gtg gct ggg ttc   917
Leu Lys Lys Asp Leu Asp Asp Gly Tyr Val Cys Val Val Ala Gly Phe
125                 130                 135
cag ggc gtg gat gcc aat ggc aat att acg acc ttg ggc cgt ggc ggc   965
Gln Gly Val Asp Ala Asn Gly Asn Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly
140                 145                 150
tca gat act act ggt gta gca ctg gct gcg gcg tta aag gcg gat gaa   1013
Ser Asp Thr Thr Gly Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Lys Ala Asp Glu
155                 160                 165
tgt cag att tat acc gat gtc gat ggc gtt tac acc acc gat ccg cgt   1061
Cys Gln Ile Tyr Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Thr Asp Pro Arg
170                 175                 180
gtg gtg cct gag gca cgc cgc ttg gat aaa att acc ttt gaa gaa atg   1109
Val Val Pro Glu Ala Arg Arg Leu Asp Lys Ile Thr Phe Glu Glu Met
185                 190                 195                 200
ttg gaa ctg gct tca cag ggc tcc aaa gta ttg caa att cgc tcg gtt   1157
Leu Glu Leu Ala Ser Gln Gly Ser Lys Val Leu Gln Ile Arg Ser Val
205                 210                 215
gag ttt gcc ggt aaa tac aaa gtc aaa tta cgt gtg ctg tcc agc ttc   1205
Glu Phe Ala Gly Lys Tyr Lys Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Ser Phe
220                 225                 230
gaa gag gag ggc gac ggt aca ctg atc aca ttc gaa gaa aat gag gaa   1253
Glu Glu Glu Gly Asp Gly Thr Leu Ile Thr Phe Glu Glu Asn Glu Glu
235                 240                 245
aac atg gaa gaa cca att atc tcc ggc atc gcc ttt aac cgc gat gag   1301
Asn Met Glu Glu Pro Ile Ile Ser Gly Ile Ala Phe Asn Arg Asp Glu
250                 255                 260
gcg aaa att acc gtg acg ggc gtg ccc gac aaa cca gga att gcc tat   1349
Ala Lys Ile Thr Val Thr Gly Val Pro Asp Lys Pro Gly Ile Ala Tyr
265                 270                 275                 280
cag att ttg ggc ccg gtg gca gac gcc aat att gat gtg gat atg att   1397
Gln Ile Leu Gly Pro Val Ala Asp Ala Asn Ile Asp Val Asp Met Ile
285                 290                 295
atc cag aac gtc ggt gcg gat ggt acg act gac ttc acc ttt acc gta   1445
Ile Gln Asn Val Gly Ala Asp Gly Thr Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val
300                 305                 310
cat aaa aat gag atg aac aaa gcc ctg agc att ctt aga gat aaa gtg   1493
His Lys Asn Glu Met Asn Lys Ala Leu Ser Ile Leu Arg Asp Lys Val
315                 320                 325
cag ggc cat atc cag gca cgt gaa atc agc ggc gac gac aag att gcc   1541
Gln Gly His Ile Gln Ala Arg Glu Ile Ser Gly Asp Asp Lys Ile Ala
330                 335                 340
aaa gtc tct gtg gtt ggg gtg ggt atg cgc tca cat gta ggg atc gcc   1589
Lys Val Ser Val Val Gly Val Gly Met Arg Ser His Val Gly Ile Ala
345                 350                 355                 360
agc cag atg ttc cgt acg ctg gcc gaa gaa ggg atc aat att caa atg   1637
Ser Gln Met Phe Arg Thr Leu Ala Glu Glu Gly Ile Asn Ile Gln Met
365                 370                 375
atc tca acc agc gaa att aaa att gca gtc gtg atc gaa gag aag tac   1685
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Lys Ile Ala Val Val Ile Glu Glu Lys Tyr
380                 385                 390
atg gaa ctg gct gta cgc gtg ttg cat aaa gca ttc ggc ctc gaa aac   1733
Met Glu Leu Ala Val Arg Val Leu His Lys Ala Phe Gly Leu Glu Asn
395                 400                 405
gca taatcgccaa cggacgaata aagaaataaa acattcttct tttttgcgtt        1786
Ala
gatttttgaa gggttttcac gtagtatggc agcccttcga tgcagtagca atgctgcaaa 1846
gagaacagca tgccgctgtg ttggtactat taaaacttca ttgttttaat aaggtgaggg 1906
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggcc gtaatccatg gtcatagctg 1966
tttcctggtg tgaaa                                                  1981
<210> 6
<211> 409
<212> PRT
<213> Methylophilus methylotrophus
<400> 6
Met Ala Leu Ile Val Gln Lys Tyr Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Pro
1               5                  10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Arg Arg Val Ala Arg Tyr Lys Ala Leu
20                  25                  30
Gly His Gln Val Val Val Val Val Ser Ala Met Ser Gly Glu Thr Asn
35                  40                  45
Arg Leu Ile Ser Leu Ala Lys Glu Ile Met Gln Asp Pro Asp Pro Arg
50                  55                  60
Glu Leu Asp Val Met Val Ser Thr Gly Glu Gln Val Thr Ile Gly Met
65                  70                  75                  80
Thr Ala Leu Ala Leu Met Glu Leu Gly Ile Lys Ala Lys Ser Tyr Thr
85                  90                  95
Gly Thr Gln Val Lys Ile Leu Thr Asp Asp Ala Phe Thr Lys Ala Arg
100                 105                 110
Ile Leu Asp Ile Asp Glu His Asn Leu Lys Lys Asp Leu Asp Asp Gly
115                 120                 125
Tyr Val Cys Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asp Ala Asn Gly Asn
130                 135                 140
Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Gly Val Ala Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ala Leu Lys Ala Asp Glu Cys Gln Ile Tyr Thr Asp Val Asp
165                 170                 175
Gly Val Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Pro Glu Ala Arg Arg Leu
180                 185                 190
Asp Lys Ile Thr Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ser Gln Gly Ser
195                 200                 205
Lys Val Leu Gln Ile Arg Ser Val Glu Phe Ala Gly Lys Tyr Lys Val
210                 215                 220
Lys Leu Arg Val Leu Ser Ser Phe Glu Glu Glu Gly Asp Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Thr Phe Glu Glu Asn Glu Glu Asn Met Glu Glu Pro Ile Ile Ser
245                 250                 255
Gly Ile Ala Phe Asn Arg Asp Glu Ala Lys Ile Thr Val Thr Gly Val
260                 265                 270
Pro Asp Lys Pro Gly Ile Ala Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Val Ala Asp
275                 280                 285
Ala Asn Ile Asp Val Asp Met Ile Ile Gln Asn Val Gly Ala Asp Gly
290                 295                 300
Thr Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val His Lys Asn Glu Met Asn Lys Ala
305                 310                 315                 320
Leu Ser Ile Leu Arg Asp Lys Val Gln Gly His Ile Gln Ala Arg Glu
325                 330                 335
Ile Ser Gly Asp Asp Lys Ile Ala Lys Val Ser Val Val Gly Val Gly
340                 345                 350
Met Arg Ser His Val Gly Ile Ala Ser Gln Met Phe Arg Thr Leu Ala
355                 360                 365
Glu Glu Gly Ile Asn Ile Gln Met Ile Ser Thr Ser Glu Ile Lys Ile
370                 375                 380
Ala Val Val Ile Glu Glu Lys Tyr Met Glu Leu Ala Val Arg Val Leu
385                 390                 395                 400
His Lys Ala Phe Gly Leu Glu Asn Ala
405
<210> 7
<211> 1452
<212> DNA
<213> Methylophilus methylotrophus
<220>
<221> CDS
<222> (98)..(1207)
<400> 7
gcatgcccgc aggtcgactc tagaggatcc ccctgttcaa aaatcttcca aataatcact 60
gtaatgccgg gttgtccggc tgaaatatcg agtcact atg tta aaa gta ggg ttt  115
Met Leu Lys Val Gly Phe
1               5
gta ggc tgg cgt ggc atg gtt gga tcc gtg cta atg cag cgc atg atg   163
Val Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val Leu Met Gln Arg Met Met
10                  15                  20
cag gaa aac gat ttt gcg gat att gaa ccg caa ttc ttt acg acc tca   211
Gln Glu Asn Asp Phe Ala Asp Ile Glu Pro Gln Phe Phe Thr Thr Ser
25                  30                  35
caa acg gga ggg gct gcg cct aaa gtt gga aaa gat act cct gcg ctg   259
Gln Thr Gly Gly Ala Ala Pro Lys Val Gly Lys Asp Thr Pro Ala Leu
40                  45                  50
aaa gat gcc aag gat att gat gct ttg cgc cag atg gat gtg att gtg   307
Lys Asp Ala Lys Asp Ile Asp Ala Leu Arg Gln Met Asp Val Ile Val
55                  60                  65                  70
acc tgc cag ggt ggc gat tac acg agt gac gtc ttc cca caa ttg cgc   355
Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Ser Asp Val Phe Pro Gln Leu Arg
75                  80                  85
gca acc ggc tgg agc ggc cac tgg att gac gcg gcc tct acc tta cgc   403
Ala Thr Gly Trp Ser Gly His Trp Ile Asp Ala Ala Ser Thr Leu Arg
90                  95                 100
atg gaa aaa gac tcc gtg atc att tta gac ccg gtg aac atg cat gtg   451
Met Glu Lys Asp Ser Val Ile Ile Leu Asp Pro Val Asn Met His Val
105                 110                 115
att aaa gat gca ttg tcc aat ggc ggc aaa aac tgg atc ggc ggc aac   499
Ile Lys Asp Ala Leu Ser Asn Gly Gly Lys Asn Trp Ile Gly Gly Asn
120                 125                 130
tgt acc gtc tca ctt atg ttg atg gcg ctg aat ggc ctg ttt aag gct   547
Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ala Leu Asn Gly Leu Phe Lys Ala
135                 140                 145                 150
gac ctg gtc gag tgg gcc act tcc atg acc tac cag gcg gct tca ggc   595
Asp Leu Val Glu Trp Ala Thr Ser Met Thr Tyr Gln Ala Ala Ser Gly
155                 160                 165
gca ggc gcg cag aat atg cgt gaa ctg att agc cag atg ggc gta gtg   643
Ala Gly Ala Gln Asn Met Arg Glu Leu Ile Ser Gln Met Gly Val Val
170                 175                 180
aat gcc tcc gtg gct gat ttg ctg gcg gat cca gct tct gcc att ttg   691
Asn Ala Ser Val Ala Asp Leu Leu Ala Asp Pro Ala Ser Ala Ile Leu
185                 190                 195
cag atc gat aaa aca gtg gcg gat acc atc cgt agc gaa gag ttg cct   739
Gln Ile Asp Lys Thr Val Ala Asp Thr Ile Arg Ser Glu Glu Leu Pro
200                 205                 210
aaa tct aac ttt ggt gtg cca ttg gcg ggc agt ctg atc cca tgg atc   787
Lys Ser Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly Ser Leu Ile Pro Trp Ile
215                 220                 225                 230
gac aag gac tta ggg aat ggt caa agt aaa gaa gaa tgg aag ggc ggc   835
Asp Lys Asp Leu Gly Asn Gly Gln Ser Lys Glu Glu Trp Lys Gly Gly
235                 240                 245
gta nag acc aat aag att tta ggt cgt gaa gcg aac ccg att gtg att   883
Val Xaa Thr Asn Lys Ile Leu Gly Arg Glu Ala Asn Pro Ile Val Ile
250                 255                 260
gac ggt ttg tgt gta cgt atc ggc gcc atg cgt tgc cat tca caa gcg   931
Asp Gly Leu Cys Val Arg Ile Gly Ala Met Arg Cys His Ser Gln Ala
265                 270                 275
ttg act atc aag ctg cgc aag gat gtg ccg ctg gat gaa atc aat cag   979
Leu Thr Ile Lys Leu Arg Lys Asp Val Pro Leu Asp Glu Ile Asn Gln
280                 285                 290
atg ctg gct gaa gcg aac gac tgg gct aaa gtc att ccc aat gag cgt   1027
Met Leu Ala Glu Ala Asn Asp Trp Ala Lys Val Ile Pro Asn Glu Arg
295                 300                 305                 310
gag gtc agt atg cgg gaa ctc acc ccg gca gcg att acc ggc agt ctg   1075
Glu Val Ser Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala Ile Thr Gly Ser Leu
315                 320                 325
gcg acg cca gta ggg cgt ttg cgc aaa ctg gcg atg ggt ggt gaa tac   1123
Ala Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Ala Met Gly Gly Glu Tyr
330                 335                 340
ttg tcg gca ttt acc gta ggt gac cag ttg tta tgg ggc gct gcc gaa   1171
Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln Leu Leu Trp Gly Ala Ala Glu
345                 350                 355
cct ttg cgc aga atg ttg agg att ctg gtc gaa tct taagtaattg        1217
Pro Leu Arg Arg Met Leu Arg Ile Leu Val Glu Ser
360                 365                 370
tttaagtagc agcccgtaaa gctatgattt atcaataaaa tcatggtctt ttcgggcttt 1277
tgcttttggt gcaatcctgt ttaatggtta ttgtagcctc aaatcctgta tttattgctc 1337
tcaagccgcc tgggtgcgct tgcgtggctg ggtgaatgat gctattttga caaacgccat 1397
gaattactaa gggttaatcg gtgagtaaat ttcaattaaa aaaaatagcc tttgc      1452
<210> 8
<211> 370
<212> PRT
<213> Methylophilus methylotrophus
<400> 8
Met Leu Lys Val Gly Phe Val Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1               5                  10                  15
Leu Met Gln Arg Met Met Gln Glu Asn Asp Phe Ala Asp Ile Glu Pro
20                  25                  30
Gln Phe Phe Thr Thr Ser Gln Thr Gly Gly Ala Ala Pro Lys Val Gly
35                  40                  45
Lys Asp Thr Pro Ala Leu Lys Asp Ala Lys Asp Ile Asp Ala Leu Arg
50                  55                  60
Gln Met Asp Val Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Val Phe Pro Gln Leu Arg Ala Thr Gly Trp Ser Gly His Trp Ile Asp
85                  90                  95
Ala Ala Ser Thr Leu Arg Met Glu Lys Asp Ser Val Ile Ile Leu Asp
100                 105                 110
Pro Val Asn Met His Val Ile Lys Asp Ala Leu Ser Asn Gly Gly Lys
115                 120                 125
Asn Trp Ile Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ala Leu
130                 135                 140
Asn Gly Leu Phe Lys Ala Asp Leu Val Glu Trp Ala Thr Ser Met Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gln Asn Met Arg Glu Leu Ile
165                 170                 175
Ser Gln Met Gly Val Val Asn Ala Ser Val Ala Asp Leu Leu Ala Asp
180                 185                 190
Pro Ala Ser Ala Ile Leu Gln Ile Asp Lys Thr Val Ala Asp Thr Ile
195                 200                 205
Arg Ser Glu Glu Leu Pro Lys Ser Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210                 215                 220
Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Asp Leu Gly Asn Gly Gln Ser Lys
225                 230                 235                 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gly Val Xaa Thr Asn Lys Ile Leu Gly Arg Glu
245                 250                 255
Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Gly Leu Cys Val Arg Ile Gly Ala Met
260                 265                 270
Arg Cys His Ser Gln Ala Leu Thr Ile Lys Leu Arg Lys Asp Val Pro
275                 280                 285
Leu Asp Glu Ile Asn Gln Met Leu Ala Glu Ala Asn Asp Trp Ala Lys
290                 295                 300
Val Ile Pro Asn Glu Arg Glu Val Ser Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala
305                 310                 315                 320
Ala Ile Thr Gly Ser Leu Ala Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu
325                 330                 335
Ala Met Gly Gly Glu Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln Leu
340                 345                 350
Leu Trp Gly Ala Ala Glu Pro Leu Arg Arg Met Leu Arg Ile Leu Val
355                 360                 365
Glu Ser
370
<210> 9
<211> 3098
<212> DNA
<213> Methylophilus methylotrophus
<220>
<221> CDS
<222> (1268)..(2155)
<400> 9
cgtgccaact tgcatgcctg ccggtcgctc tagaggatca attgctggca acatttgagt 60
acattattcg cctttgcatg gtaaaggcct atggtcttga tgtaactttc aagacctgcc 120
agccccaaat ccaggatagc ctgcggtgtg ttggccacct tgaacaattt gcgggtggca 180
atattgacac ctttgtctgt cgcctgtgca gacaagatga cggcaatcag taattcgaac 240
gtggagctat gctccagctc agtggttgga ttggggatgg cttgggccag ccgctcaaat 300
atcgccagtc ttttttgtgc attcataaaa cggtttcaat cataggtcac agggtcaacc 360
tgtcttttgc gctttgacgc gcgccatggc tgcggcaatg gcatttttct tgagcacctc 420
agttgagggt gtctcggtcg tagcaagcgt ctggttgcgt ttgctgtagg tttgggcggt 480
ctcccgtttt tcaagggcga ggcgagaaag gcgttgctgg tggcgttgtc tcgctaccgc 540
ggcttcagct tcattcatgg cggtagcccg accgggaatc gtttgcatct gtatgcagtc 600
caccgggcag ggcggtaaac atagctcaca gccagtgcat tcctgggaaa tcaccgtatg 660
catcagtttg gatgcgccca aaatggcatc aacgggacag gcctgtatac acagggtgca 720
gccgatgcat gtttcctcat caatcaaggc caccgctttg ggtttggtga tgccgtgggc 780
cggatttaat gcctggaaag gacgttgcag taatttggca agcgcatgaa tgcccgcttc 840
tcctccaggc ggacattggt tgatattggc ctctccgcgg gcgatcgctt cagcataagg 900
tttgcatccc tcgtaaccgc attggcggca ttgagtttgc ggtaataccg cgtcgatctt 960
tgcaatgagg tcgacaaagc gttctggcag ctcaggcgca gtcccttcga cttcaatcat 1020
gtgatggcag gtgagtctgc attcggtcct ggctaaatag ccgtttaaga tgggttgcta 1080
agagttttat tataaccgaa accttgcttt tcctttggcc gggagctagg cggaaaaagc 1140
ttgccgcagt tgggtgccag tgattttgcc gccgtcttgc gcttgtatcc gtccagatac 1200
agcaagtagg cgcgttcttt ggcgttagac cggataatca gttaaaatat tcgctttatt 1260
cttaaag atg gcg cta ggt atg tta acg ggc agt ttg gtc gca atc gtg   1309
Met Ala Leu Gly Met Leu Thr Gly Ser Leu Val Ala Ile Val
1               5                  10
acc ccc atg ttt gaa gat gga cgt ttg gat ctg gac gcc ctc aaa aag   1357
Thr Pro Met Phe Glu Asp Gly Arg Leu Asp Leu Asp Ala Leu Lys Lys
15                  20                  25                  30
ctg gtc gac ttt cat gta gag gca ggg aca gat ggt att gtc atc gtt   1405
Leu Val Asp Phe His Val Glu Ala Gly Thr Asp Gly Ile Val Ile Val
35                  40                  45
ggc acg act ggc gag tcg ccc acg gtg gat gta gat gag cat tgt ctg   1453
Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Val Asp Val Asp Glu His Cys Leu
50                  55                  60
ctg atc aaa acc acg atc gag cat gtc gcc aag cgc gtg cca gtc att   1501
Leu Ile Lys Thr Thr Ile Glu His Val Ala Lys Arg Val Pro Val Ile
65                  70                  75
gcc ggt act ggc gca aat tcc act gct gaa gcc att gaa ctg act gcc   1549
Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ser Thr Ala Glu Ala Ile Glu Leu Thr Ala
80                  85                  90
aag gcc aag gcg ctt ggc gca gac gcc tgc ctg ctg gtg gca ccg tat   1597
Lys Ala Lys Ala Leu Gly Ala Asp Ala Cys Leu Leu Val Ala Pro Tyr
95                 100                 105                 110
tac aac aag ccc tcg caa gag ggt ttg tac cag cac ttt aaa gcc gtg   1645
Tyr Asn Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Val
115                 120                 125
gct gag gcg gtc gat att ccg caa att ctc tat aat gtg cca ggc cgc   1693
Ala Glu Ala Val Asp Ile Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Gly Arg
130                 135                 140
acc ggt tgc gac ttg tct aac gac acc gta ttg cgc ctg gcg cag att   1741
Thr Gly Cys Asp Leu Ser Asn Asp Thr Val Leu Arg Leu Ala Gln Ile
145                 150                 155
cgc aac att gtc ggg att aag gat gcg act gga ggg att gag cgc ggt   1789
Arg Asn Ile Val Gly Ile Lys Asp Ala Thr Gly Gly Ile Glu Arg Gly
160                 165                 170
acc gat ttg ttg ttg cgt gca cca gct gat ttc gcc att tac agc ggg   1837
Thr Asp Leu Leu Leu Arg Ala Pro Ala Asp Phe Ala Ile Tyr Ser Gly
175                 180                 185                 190
gat gat gcc act gcg ctg gcc ctg atg tta tta ggg ggg aaa ggc gtg   1885
Asp Asp Ala Thr Ala Leu Ala Leu Met Leu Leu Gly Gly Lys Gly Val
195                 200                 205
att tcg gtc acg gcc aat gtc gcg ccc aaa tta atg cat gaa atg tgc   1933
Ile Ser Val Thr Ala Asn Val Ala Pro Lys Leu Met His Glu Met Cys
210                 215                 220
gag cat gct ttg aat ggc aac ctg gcc gca gcc aaa gcg gcc aat gcc   1981
Glu His Ala Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Asn Ala
225                 230                 235
aaa ctg ttt gca ttg cac cag aag ttg ttt gta gaa gcg aac ccg att   2029
Lys Leu Phe Ala Leu His Gln Lys Leu Phe Val Glu Ala Asn Pro Ile
240                 245                 250
cca gtg aaa tgg gta tta caa caa atg gga atg att gcc act ggc atc   2077
Pro Val Lys Trp Val Leu Gln Gln Met Gly Met Ile Ala Thr Gly Ile
255                 260                 265                 270
cgt ttg ccg ctg gtc aat tta tcc agc caa tat cat gaa gta ttg cgc   2125
Arg Leu Pro Leu Val Asn Leu Ser Ser Gln Tyr His Glu Val Leu Arg
275                 280                 285
aac gcc atg aag cag gca gaa att gcc gct tgatcggcta aaactaattt     2175
Asn Ala Met Lys Gln Ala Glu Ile Ala Ala
290                 295
agggtgaaac aagtgaaata catgagtcat gtttggttac aacgtttggt gctggccagt 2235
ctggtcacag cgctttcagc gtgcgattcc atcccgttta ttgataatag ttctgactac 2295
aagggcgcag gtcgctccag gccacttgaa gtgccgccag acctgaccgc ggtgcgtacc 2355
agcagtactt acaatgtgcc tggtagcacc agttactctg cctatagcca gaaccaggaa 2415
gtgcaagagc agaatggtcc acagcctgtg ctcgcagata tgaaaaacgt gcgcatggtg 2475
aaagcaggcc agcagcgttg gctggtggtc aatgcgcctc cggaaaaaat ctggccgatt 2535
gtgcgtgatt tctggctgga tcaaggcttt gctgtcaggg tagagaatcc tgagcttggc 2595
gtgattgaaa ccgagtggtt gcaatctgat gccatcaagc ctaaggaaga taaccgtggc 2655
tatggtgaaa agtttgatgc ctggctggat aaactttctg gttttgccga caggcgtaaa 2715
ttccgtacgc gtctggaacg tggggagaaa gacggcacca ccgaaatcta tatgacgcac 2775
cgtactgtcg ccggtgcacc ggatgatggc aaaaattatg tgcagaccca attgggtgtc 2835
attgataccg gttatcgccc caacgcggct gaaaacaaga acaatgccgg taaagagttt 2895
gatgctgact tggatgcaga attactccgt cgaatgatgg tgaaattagg tctggatgag 2955
cagaaagcag accaggtgat ggcacaatct gcttcagaca agcgtgcaga tgtggtcaag 3015
gagtctgacc agagcgtcac cttgaagttg aatgagccgt ttgaccgtgc ctggcgccgt 3075
gtggcctggc ctggatcccc ggg                                         3098
<210> 10
<211> 296
<212> PRT
<213> Methylophilus methylotrophus
<400> 10
Met Ala Leu Gly Met Leu Thr Gly Ser Leu Val Ala Ile Val Thr Pro
1               5                  10                  15
Met Phe Glu Asp Gly Arg Leu Asp Leu Asp Ala Leu Lys Lys Leu Val
20                  25                  30
Asp Phe His Val Glu Ala Gly Thr Asp Gly Ile Val Ile Val Gly Thr
35                  40                  45
Thr Gly Glu Ser Pro Thr Val Asp Val Asp Glu His Cys Leu Leu Ile
50                  55                  60
Lys Thr Thr Ile Glu His Val Ala Lys Arg Val Pro Val Ile Ala Gly
65                  70                  75                  80
Thr Gly Ala Asn Ser Thr Ala Glu Ala Ile Glu Leu Thr Ala Lys Ala
85                  90                  95
Lys Ala Leu Gly Ala Asp Ala Cys Leu Leu Val Ala Pro Tyr Tyr Asn
100                 105                 110
Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Val Ala Glu
115                 120                 125
Ala Val Asp Ile Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Gly Arg Thr Gly
130                 135                 140
Cys Asp Leu Ser Asn Asp Thr Val Leu Arg Leu Ala Gln Ile Arg Asn
145                 150                 155                 160
Ile Val Gly Ile Lys Asp Ala Thr Gly Gly Ile Glu Arg Gly Thr Asp
165                 170                 175
Leu Leu Leu Arg Ala Pro Ala Asp Phe Ala Ile Tyr Ser Gly Asp Asp
180                 185                 190
Ala Thr Ala Leu Ala Leu Met Leu Leu Gly Gly Lys Gly Val Ile Ser
195                 200                 205
Val Thr Ala Asn Val Ala Pro Lys Leu Met His Glu Met Cys Glu His
210                 215                 220
Ala Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Asn Ala Lys Leu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Leu His Gln Lys Leu Phe Val Glu Ala Asn Pro Ile Pro Val
245                 250                 255
Lys Trp Val Leu Gln Gln Met Gly Met Ile Ala Thr Gly Ile Arg Leu
260                 265                 270
Pro Leu Val Asn Leu Ser Ser Gln Tyr His Glu Val Leu Arg Asn Ala
275                 280                 285
Met Lys Gln Ala Glu Ile Ala Ala
290                 295
<210> 11
<211> 3390
<212> DNA
<213> Methylophilus methylotrophus
<220>
<221> CDS
<222> (2080)..(2883)
<400> 11
ccgcaggtcg ctctagagga tcagagttgg acggacaagc tgaagttttg ggagtctgaa 60
gaagctgcgg gcgaagtgat aaagcagctg aatcaactgt agccactgca agcgacgaat 120
gaaagcaaag gcgctgcact cgctaaggat gaggcagccg aatctcagaa aaccacgtca 180
gagcctgtca aggccgagca agaggtattg ccctcggcca ctgcaacaaa taattcagct 240
gctgcagcga cattggctga agaagaagtg gttccctaca ttccggaggg ggagtatcag 300
gctgcaccca ctccagaaga gatggccaag ggtaatctgg atgtcagtga aaaccaggtt 360
actgaggcta aggcacatcc agtgaatgaa aaggaaatgg ctgcccaaat tgcagatacg 420
gttgagccac cacccgtttt tcagcaggaa ccgatggcag aacctattgt agcggctgaa 480
cccgaacccg tattgccacc gcccgtaaaa gccgaaccag ctgtgaagaa tatcacagcg 540
ccagttgttg ccgcagccac tgttgcagcg gcggcaacca agactgctga atctgagtca 600
gttaaatcca aacctgttga tcctaagcct gtggaagcaa aaaccgctgt atcaaaaact 660
gaagtacaaa cacccgcggc acaggcacct gctgcggcag cggccgttga agatgacgag 720
gtcattccat atattcccga aggtgaatat gtggctcctg tcattcctag tgaggccgaa 780
atggttaaag gcaatatggc ggaggcaaat gcacctgcga ctgatgctca agcgcgccag 840
gtaactgaaa aaggggtggc acccacatcg gatgcggcag cagagccatc accgacattt 900
gtcgctgagc aattgccaga accagagcca gaacctgaat tgccaccgcc gcctccgcca 960
tccgtcagca agcctgttgt gagagaggta gcgccagtgg ctgcgctggc agcagaagaa 1020
gagaaaccag tcgctgcgca gcctgagact gagcagccgg ctgccaaggt tgttgagcct 1080
gcatcggtcg cctcccctgt ggcgacgcca gaagcgccag ctggtgatgc tgaaatcaac 1140
caggctgtgg cggcatgggc acaagcttgg cgcagcaagg acattaaaaa ctacctcgct 1200
gcatatgccc ctgacttcat gccagaaggg ttgccttcca gaaaggcatg ggagtcgcaa 1260
cgcaaacagc gtttatctgc aggccagggt gcgattacac tcgtactaaa taatgtgcag 1320
attcagcgtg acggtaccac tgtcgccgtg cagtttgagc aaaaatatgc tgctaaagtt 1380
tataaagatg aattggtcaa aacactggaa atgcgttacg agccaacgca gaaacgttgg 1440
ttgatcacac gtgaacgtgt tgccccttta accggtttgc cagtagcgag tgtgccaacg 1500
acccgtctgc cagcagtcgc tgcagcgtca tccaatacgg atgtggtcga gtcagctgtg 1560
ccaccgacac aatcgacatc atctgcgcct gtagcggaag tgagtgttga atcagcgatt 1620
gacgcctggg cacaggcttg gcgcagtaaa aacatcaatg cttactttgc ggcgtattct 1680
ccagaatttg tgccggaggg attgccaaac agaggtgtct gggaagcgca acgtaaaaag 1740
cgcttgtccc cacagcaggg caagatcagc ctggatgtca cgaatgtaag cgtgagccgc 1800
gaaggagaaa cagccgtggc cacctttagg cagaaatatg cgtctaaggc ctatcgtgat 1860
gaagtagtga agcgtctaca gttaaaactg gatgctgcaa gcaatcgctg gctgattgtg 1920
cgtgaaagta ccggtagtga ggcagaagtg ccaatgggca agcagtcagt gagtgcgcca 1980
gaagagagct cggaacatca ggatggtgct ctggagccga tcggatttta atggtctgct 2040
gatgtcgtgg tttaagtatt aaaaataatt gagtgagtt atg ttg aaa gta gtg    2094
Met Leu Lys Val Val
1               5
att gct ggc gtg tct ggt cgt atg gga cat gcc tta ctg gat gga gtt   2142
Ile Ala Gly Val Ser Gly Arg Met Gly His Ala Leu Leu Asp Gly Val
10                  15                  20
ttt tct gat aac ggc ttg cag ttg cac gcg gca ctc gat cgt gct gaa   2190
Phe Ser Asp Asn Gly Leu Gln Leu His Ala Ala Leu Asp Arg Ala Glu
25                  30                  35
agc gcc atg ata ggg cgg gat gca ggc gag cag ttt ggc aag gtc agt   2238
Ser Ala Met Ile Gly Arg Asp Ala Gly Glu Gln Phe Gly Lys Val Ser
40                  45                  50
ggc gtg aaa atc acg gct gac atc cat gcc gca ttg gtc ggt gcc gat   2286
Gly Val Lys Ile Thr Ala Asp Ile His Ala Ala Leu Val Gly Ala Asp
55                  60                  65
gtg ctg gtg gat ttc acg cgg ccg gaa gcc agt atg caa tat tta caa   2334
Val Leu Val Asp Phe Thr Arg Pro Glu Ala Ser Met Gln Tyr Leu Gln
70                  75                  80                  85
gcc tgc cag caa gcc aac gtt aaa tta gtg att ggt act acc ggg ttt   2382
Ala Cys Gln Gln Ala Asn Val Lys Leu Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe
90                  95                 100
agt gag gca gaa aag gcc agt att gag gct gcg tcc aaa aat atc ggt   2430
Ser Glu Ala Glu Lys Ala Ser Ile Glu Ala Ala Ser Lys Asn Ile Gly
105                 110                 115
atc gta ttt gct cca aac atg agc gta ggg gtc acc ctc ttg att aac   2478
Ile Val Phe Ala Pro Asn Met Ser Val Gly Val Thr Leu Leu Ile Asn
120                 125                 130
ctg gtt gag caa gcc gca cgg gtg ctc aat gaa ggc tat gat att gag   2526
Leu Val Glu Gln Ala Ala Arg Val Leu Asn Glu Gly Tyr Asp Ile Glu
135                 140                 145
gtg gtt gaa atg cat cac cgc cat aag gtg gat gcg cct tca ggc acg   2574
Val Val Glu Met His His Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr
150                 155                 160                 165
gct tta cgg ttg ggt gag gct gcg gca aaa ggg att gat aaa gcg ctt   2622
Ala Leu Arg Leu Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Asp Lys Ala Leu
170                 175                 180
aaa gat tgt gct gtg tat gcg cgc gaa ggc gtg act ggt gaa cgc gaa   2670
Lys Asp Cys Ala Val Tyr Ala Arg Glu Gly Val Thr Gly Glu Arg Glu
185                 190                 195
gcg ggc acg att ggt ttt gca acc tta cgt ggt ggg gat gtg gtc ggt   2718
Ala Gly Thr Ile Gly Phe Ala Thr Leu Arg Gly Gly Asp Val Val Gly
200                 205                 210
gac cat acg gtg gtt ctg gct ggt gtg ggt gag cga gta gag tta acg   2766
Asp His Thr Val Val Leu Ala Gly Val Gly Glu Arg Val Glu Leu Thr
215                 220                 225
cat aaa gca tca agc cgt gcc aca ttt gca caa ggt gcg tta cgt gcg   2814
His Lys Ala Ser Ser Arg Ala Thr Phe Ala Gln Gly Ala Leu Arg Ala
230                 235                 240                 245
gct aaa ttt ctg gct gat aaa ccc aag gga ttg ttt gat atg cgt gat   2862
Ala Lys Phe Leu Ala Asp Lys Pro Lys Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp
250                 255                 260
gtg ttg gga ttt gaa aag aac tgatctttag taggcgatcc cgtctggcta      2913
Val Leu Gly Phe Glu Lys Asn
265
aggtctggca ggaatcgtct gatgcttctg agttgccctt gagtgggctg tcaatgtacg 2973
ctataatgct gtaattctga aacgggaaga gtcgaacaag cttttcccgt tttgcacatc 3033
tattcactgc agcttgaatt tcacttccag ccatggtgaa ccctctaaaa gatgtgtttc 3093
gtgtcaaact taaggagcta aaggtgtcaa aaacaattcc agcgattctc gtgttagcag 3153
atggaactgt ttttaagggc attagcattg gcgcttccgg tcatacggta ggtgaggtgg 3213
tgtttaatac ctccatcacc ggttatcagg agattcttac cgatccttcc tataccgaac 3273
aaatcgtgac actgacctat ccgcacattg gtaactacgg gaccaatcgt gaagatggga 3333
gtcaggtaaa gtctatgctg cgggtctgat ccccgggacc gagccgggtt cgtaaag    3390
<210> 12
<211> 268
<212> PRT
<213> Methylophilus methylotrophus
<400> 12
Met Leu Lys Val Val Ile Ala Gly Val Ser Gly Arg Met Gly His Ala
1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Gly Val Phe Ser Asp Asn Gly Leu Gln Leu His Ala Ala
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ala Glu Ser Ala Met Ile Gly Arg Asp Ala Gly Glu Gln
35                  40                  45
Phe Gly Lys Val Ser Gly Val Lys Ile Thr Ala Asp Ile His Ala Ala
50                  55                  60
Leu Val Gly Ala Asp Val Leu Val Asp Phe Thr Arg Pro Glu Ala Ser
65                  70                  75                  80
Met Gln Tyr Leu Gln Ala Cys Gln Gln Ala Asn Val Lys Leu Val Ile
85                  90                  95
Gly Thr Thr Gly Phe Ser Glu Ala Glu Lys Ala Ser Ile Glu Ala Ala
100                 105                 110
Ser Lys Asn Ile Gly Ile Val Phe Ala Pro Asn Met Ser Val Gly Val
115                 120                 125
Thr Leu Leu Ile Asn Leu Val Glu Gln Ala Ala Arg Val Leu Asn Glu
130                 135                 140
Gly Tyr Asp Ile Glu Val Val Glu Met His His Arg His Lys Val Asp
145                 150                 155                 160
Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Arg Leu Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly
165                 170                 175
Ile Asp Lys Ala Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr Ala Arg Glu Gly Val
180                 185                 190
Thr Gly Glu Arg Glu Ala Gly Thr Ile Gly Phe Ala Thr Leu Arg Gly
195                 200                 205
Gly Asp Val Val Gly Asp His Thr Val Val Leu Ala Gly Val Gly Glu
210                 215                 220
Arg Val Glu Leu Thr His Lys Ala Ser Ser Arg Ala Thr Phe Ala Gln
225                 230                 235                 240
Gly Ala Leu Arg Ala Ala Lys Phe Leu Ala Asp Lys Pro Lys Gly Leu
245                 250                 255
Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Gly Phe Glu Lys Asn
260                 265
<210> 13
<211> 2566
<212> DNA
<213> Methylophilus methylotrophus
<220>
<221> CDS
<222> (751)..(1995)
<400> 13
tgctttaggg ggaacctaga ggatccccct acccgaggaa gaagtgagcc aacatgtact 60
tccagtcgta ccatcaaaag tagaagtttt cggcgttatc ctgattcaca gtaaacgaaa 120
aattgcccat attctgaccg gatttaccgg tggcttttaa ggtataagtg gtcgctgact 180
ggttctcaat gctgtaatca aaaaatttgg catcactggg gacacaggca aatcccacat 240
atgtgaagtt gtcctgataa aactgttcgg cctgcacacg gcaattggca agattggcag 300
gcgcttccgc ggcattaccg cttttgatgt aatcctgata gcctggtatg gcgatgctgg 360
ccaagatacc cataatggcc accacgacca tgacttctat caggctgaat ccgtactgat 420
ttgaggactt cattatcaaa ccccttttta gatagcctta tcatgcaaac aggcagctgt 480
catgtccagc atcagccgac caatggtcag gattacccga cgaacggtca aaccactaaa 540
acgcccagtc actggtgcca tgagcaactg caggtttaat gataaaatgg cactcaattt 600
acattggact gtgaacatgt tttccttcta tacgagatta ttggcggttg ccctgctatt 660
ggcacaattg agtgcctgtg gtctcaaagg ggacctgtat attcctgagc gccaataccc 720
tcaaacgcct caacaagata agtcttcatc gtg acc gct ttt tca atc caa caa  774
Val Thr Ala Phe Ser Ile Gln Gln
1               5
ggc cta cta cat gcc gag aat gta gcc ctg cgt gac att gca caa acg   822
Gly Leu Leu His Ala Glu Asn Val Ala Leu Arg Asp Ile Ala Gln Thr
10                  15                  20
cat caa acg ccc act tac gtc tat tca cgt gcc gcc ttg acg act gct   870
His Gln Thr Pro Thr Tyr Val Tyr Ser Arg Ala Ala Leu Thr Thr Ala
25                  30                  35                  40
ttc gag cgt ttt cag gca ggc ctg act gga cat gac cat ttg atc tgc   918
Phe Glu Arg Phe Gln Ala Gly Leu Thr Gly His Asp His Leu Ile Cys
45                  50                  55
ttt gct gtc aaa gcc aac cca agc ctg gcc att ctc aac ctg ttt gcg   966
Phe Ala Val Lys Ala Asn Pro Ser Leu Ala Ile Leu Asn Leu Phe Ala
60                  65                  70
cga atg gga gcg ggc ttt gat att gtg tcc ggt ggt gag ctg gca cgc   1014
Arg Met Gly Ala Gly Phe Asp Ile Val Ser Gly Gly Glu Leu Ala Arg
75                  80                  85
gtc ttg gcc gca ggt ggc gac ccg aaa aaa gtg gtg ttt tct ggt gtg   1062
Val Leu Ala Ala Gly Gly Asp Pro Lys Lys Val Val Phe Ser Gly Val
90                  95                 100
ggc aaa tcc cat gcg gaa atc aaa gcc gcg ctt gaa gcg ggc att ctt   1110
Gly Lys Ser His Ala Glu Ile Lys Ala Ala Leu Glu Ala Gly Ile Leu
105                 110                 115                 120
tgc ttc aac gtg gaa tca gtg aat gag cta gac cgc atc cag cag gtg   1158
Cys Phe Asn Val Glu Ser Val Asn Glu Leu Asp Arg Ile Gln Gln Val
125                 130                 135
gcg gcc agc ctg ggc aaa aaa gcg cct att tcc ctg cgc gtg aac ccc   1206
Ala Ala Ser Leu Gly Lys Lys Ala Pro Ile Ser Leu Arg Val Asn Pro
140                 145                 150
aat gtg gat gcc aaa aca cat ccc tat att tcc cac ccg gct ctc aaa   1254
Asn Val Asp Ala Lys Thr His Pro Tyr Ile Ser His Pro Ala Leu Lys
155                 160                 165
aac aat aaa ttt ggt gtg gca ttt gaa gat gcc ttg ggc ctc tat gaa   1302
Asn Asn Lys Phe Gly Val Ala Phe Glu Asp Ala Leu Gly Leu Tyr Glu
170                 175                 180
aaa gcg gcg caa ctg cca aac atc gag gta cac ggc gta gat tgc cat   1350
Lys Ala Ala Gln Leu Pro Asn Ile Glu Val His Gly Val Asp Cys His
185                 190                 195                 200
atc ggc tcg caa atc act gag ctg tca cct ttc ctc gat gcc ttg gat   1398
Ile Gly Ser Gln Ile Thr Glu Leu Ser Pro Phe Leu Asp Ala Leu Asp
205                 210                 215
aaa gta ttg ggc ctg gta gat gca ttg gcc gcc aaa ggc att cat atc   1446
Lys Val Leu Gly Leu Val Asp Ala Leu Ala Ala Lys Gly Ile His Ile
220                 225                 230
cag cat ata gac gtt ggc ggc ggt gtc ggt att act tac agc gac gaa   1494
Gln His Ile Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ile Thr Tyr Ser Asp Glu
235                 240                 245
acg cca cca gac ttt gca gcc tac act gca gcg att ctt aaa aag ctg   1542
Thr Pro Pro Asp Phe Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Ile Leu Lys Lys Leu
250                 255                 260
gca ggc agg aat gta aaa gtg ttg ttt gag ccc ggc cgt gcc ctg gtg   1590
Ala Gly Arg Asn Val Lys Val Leu Phe Glu Pro Gly Arg Ala Leu Val
265                 270                 275                 280
ggt aac gcc ggt gtg ctg ctg acc aag gtc gaa tac ctg aaa cct ggc   1638
Gly Asn Ala Gly Val Leu Leu Thr Lys Val Glu Tyr Leu Lys Pro Gly
285                 290                 295
gaa acc aaa aac ttt gcg att gtc gat gcc gcc atg aac gac ctc atg   1686
Glu Thr Lys Asn Phe Ala Ile Val Asp Ala Ala Met Asn Asp Leu Met
300                 305                 310
cgc ccg gct ttg tat gat gct ttc cac aac att acg acc att gcc act   1734
Arg Pro Ala Leu Tyr Asp Ala Phe His Asn Ile Thr Thr Ile Ala Thr
315                 320                 325
tct gca gcc ccc gca caa atc tat gag atc gtt ggc ccg gtt tgc gag   1782
Ser Ala Ala Pro Ala Gln Ile Tyr Glu Ile Val Gly Pro Val Cys Glu
330                 335                 340
agt ggt gac ttt tta ggc cat gac cgt aca ctt gcg atc gaa gaa ggt   1830
Ser Gly Asp Phe Leu Gly His Asp Arg Thr Leu Ala Ile Glu Glu Gly
345                 350                 355                 360
gat tac ctg gcg att cac tcc gca ggc gct tat ggc atg agc atg gcc   1878
Asp Tyr Leu Ala Ile His Ser Ala Gly Ala Tyr Gly Met Ser Met Ala
365                 370                 375
agc aac tac aac acg cgc gcc cgt gcc gca gag gta ttg gtt gat ggt   1926
Ser Asn Tyr Asn Thr Arg Ala Arg Ala Ala Glu Val Leu Val Asp Gly
380                 385                 390
gac cag gtg cat gtg atc cgt gaa cgt gaa caa att gcc gac ctg ttt   1974
Asp Gln Val His Val Ile Arg Glu Arg Glu Gln Ile Ala Asp Leu Phe
395                 400                 405
aaa ctg gag cgt acg ctg cca taacattgac ggcaacccct aataaaaaaa      2025
Lys Leu Glu Arg Thr Leu Pro
410                 415
ccgaagccgc caagcttcgg ttttttatta atagcgcatc ctttaatcaa agatcacggt 2085
cttgttcgcg tagagcaaga ttctatgctc aatatgccag cgcacggctt tggaaagcac 2145
aacacgctcc aggtcacggc ctttctggat caggtcttcc acctgatcgc ggtgtgaaat 2205
gcgcgccaag tcctgctcaa taatcggccc ctcatccaac acctctgtca cataatgact 2265
ggtcgcaccg atcagtttca cgccacgctc aaacgcacgg tggtaaggac gtgcgccgat 2325
aaatgctggc aggaatgagt ggtggtgaat gttgataatc cgctgaggat accgtgcgac 2385
aaaatctggt gacagaatct gcatgtagcg tgccagcaca atcaggtcaa tcttgtgttg 2445
atcaaacagg gcaaactgct gngcctctac ctctgccttg gtttaccttg gtcatcggta 2505
aatagtgaaa cgggatgcca taaaactgcg ccagggggat cctctgggtc cccctaaagc 2565
a                                                                 2566
<210> 14
<211> 415
<212> PRT
<213> Methylophilus methylotrophus
<400> 14
Val Thr Ala Phe Ser Ile Gln Gln Gly Leu Leu His Ala Glu Asn Val
1               5                  10                  15
Ala Leu Arg Asp Ile Ala Gln Thr His Gln Thr Pro Thr Tyr Val Tyr
20                  25                  30
Ser Arg Ala Ala Leu Thr Thr Ala Phe Glu Arg Phe Gln Ala Gly Leu
35                  40                  45
Thr Gly His Asp His Leu Ile Cys Phe Ala Val Lys Ala Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Ala Ile Leu Asn Leu Phe Ala Arg Met Gly Ala Gly Phe Asp Ile
65                  70                  75                  80
Val Ser Gly Gly Glu Leu Ala Arg Val Leu Ala Ala Gly Gly Asp Pro
85                  90                  95
Lys Lys Val Val Phe Ser Gly Val Gly Lys Ser His Ala Glu Ile Lys
100                 105                 110
Ala Ala Leu Glu Ala Gly Ile Leu Cys Phe Asn Val Glu Ser Val Asn
115                 120                 125
Glu Leu Asp Arg Ile Gln Gln Val Ala Ala Ser Leu Gly Lys Lys Ala
130                 135                 140
Pro Ile Ser Leu Arg Val Asn Pro Asn Val Asp Ala Lys Thr His Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Ser His Pro Ala Leu Lys Asn Asn Lys Phe Gly Val Ala Phe
165                 170                 175
Glu Asp Ala Leu Gly Leu Tyr Glu Lys Ala Ala Gln Leu Pro Asn Ile
180                 185                 190
Glu Val His Gly Val Asp Cys His Ile Gly Ser Gln Ile Thr Glu Leu
195                 200                 205
Ser Pro Phe Leu Asp Ala Leu Asp Lys Val Leu Gly Leu Val Asp Ala
210                 215                 220
Leu Ala Ala Lys Gly Ile His Ile Gln His Ile Asp Val Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Val Gly Ile Thr Tyr Ser Asp Glu Thr Pro Pro Asp Phe Ala Ala Tyr
245                 250                 255
Thr Ala Ala Ile Leu Lys Lys Leu Ala Gly Arg Asn Val Lys Val Leu
260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Arg Ala Leu Val Gly Asn Ala Gly Val Leu Leu Thr
275                 280                 285
Lys Val Glu Tyr Leu Lys Pro Gly Glu Thr Lys Asn Phe Ala Ile Val
290                 295                 300
Asp Ala Ala Met Asn Asp Leu Met Arg Pro Ala Leu Tyr Asp Ala Phe
305                 310                 315                 320
His Asn Ile Thr Thr Ile Ala Thr Ser Ala Ala Pro Ala Gln Ile Tyr
325                 330                 335
Glu Ile Val Gly Pro Val Cys Glu Ser Gly Asp Phe Leu Gly His Asp
340                 345                 350
Arg Thr Leu Ala Ile Glu Glu Gly Asp Tyr Leu Ala Ile His Ser Ala
355                 360                 365
Gly Ala Tyr Gly Met Ser Met Ala Ser Asn Tyr Asn Thr Arg Ala Arg
370                 375                 380
Ala Ala Glu Val Leu Val Asp Gly Asp Gln Val His Val Ile Arg Glu
385                 390                 395                 400
Arg Glu Gln Ile Ala Asp Leu Phe Lys Leu Glu Arg Thr Leu Pro
405                 410                 415
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of tac promoter
<400> 15
agggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgac                        39
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of tac promoter
<400> 16
cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac   58
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of dapA*24 gene
<400> 17
tgacctgcag gtttgcacag aggatggccc atgtt                            35
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of dapA*24 gene
<400> 18
cattctagat ccctaaactt tacagcaaac cggcat                           36
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of lysC*80 gene
<400> 19
gaacctgcag gccctgacac gaggtagatt atgtc                            35
<210> 20
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amilification of lysC*80 gene
<400> 20
ctttcggcta gaagagcgag atgcagataa aaaaattaaa ggcaattatt ctccg      55
【図面の簡単な説明】
図１は、変異型ｄａｐＡを有するプラスミドＲＳＦ２４Ｐの製造工程を示す図。「ｄａｐＡ＊２４」は、１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型ＤＤＰＳをコード変異型ｄａｐＡを表す。
図２は、変異型ｄａｐＡ及び変異型ｌｙｓＣを有するプラスミドＲＳＦＤ８０の製造工程を示す図。「ｌｙｓＣ＊８０」は、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＡＫＩＩＩをコード変異型ｌｙｓＣを表す。
図３は、ａｓｋ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のアスパルトキナーゼ活性を示す図。
図４は、ａｓｄ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を示す図。
図５は、ｄａｐＡ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を示す図。
図６は、ｄａｐＢ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を示す図。
図７は、ｌｙｓＡ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を示す図。
【図１】
0004273661.tif 000008
【図２】
0004273661.tif 000009
【図３】
0004273661.tif 000010
【図４】
0004273661.tif 000011
【図５】
0004273661.tif 000012
【図６】
0004273661.tif 000013
【図７】
0004273661.tif 000014