(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用生細胞、および
細胞接着に有用な少なくとも1個の分子に共有結合している、少なくとも1個のアルギネート鎖部分を含むポリマーを含有する修飾アルギネート
を含む、細胞移植マトリックス形成用の注射可能な液またはゲルであって、細胞接着に有用な分子がペプチド、プロテオグリカンまたは細胞接着リガンドを含有する他の多糖である、注射可能な液またはゲル。
【請求項２】
細胞接着に有用な分子が、アルギネート鎖部分にウロン酸残基を介して結合している、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項３】
細胞接着に有用な分子が成長因子ペプチドまたは酵素である、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項４】
細胞接着に有用な分子が、アミノ酸配列：アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）、ＧＲＥＤＶＹ、ＹＩＧＳＲまたはＲＥＤＶを含む、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項５】
細胞接着に有用な分子が、アミノ酸配列：アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含む、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項６】
細胞接着に有用な分子が、フィブロネクチン、ビトロネクチオン、ラミニンＡ、ラミニンＢ１、ラミニンＢ２、コラーゲン１またはスロンボスポンジンである、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項７】
アルギネート鎖部分が、Ｄ−マヌロネートのブロック・ユニット、Ｌ−グルロネートのブロック・ユニット、Ｄ−マヌロネートおよびＬ−グルロネートのブロック・ユニットまたは当該ブロック・ユニットの混合物を含む、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項８】
アルギネート鎖部分が５０，０００未満の分子量を有する、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項９】
アルギネート鎖部分が３０，０００未満の分子量を有する、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項１０】
アルギネート鎖部分が１００，０００またはそれを超える分子量を有する、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項１１】
アルギネート鎖部分が天然物アルギネートである、請求項１の注射可能な液またはゲル。
【請求項１２】
移植用生細胞、および
細胞接着に有用な少なくとも1個の分子に共有結合している、少なくとも1個のアルギネート鎖部分を含むポリマーを含有する修飾アルギネートのハイドロジェル
を含む、移植マトリックスであって、細胞接着に有用な分子がペプチド、プロテオグリカンまたは細胞接着リガンドを含有する他の多糖である、移植マトリックス。
【請求項１３】
細胞接着に有用な分子が、アルギネート鎖部分にウロン酸残基を介して結合している、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１４】
細胞接着に有用な分子が成長因子ペプチドまたは酵素である、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１５】
細胞接着に有用な分子が、アミノ酸配列：アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）、ＧＲＥＤＶＹ、ＹＩＧＳＲまたはＲＥＤＶを含む、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１６】
細胞接着に有用な分子が、アミノ酸配列：アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含む、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１７】
細胞接着に有用な分子が、フィブロネクチン、ビトロネクチオン、ラミニンＡ、ラミニンＢ１、ラミニンＢ２、コラーゲン１またはスロンボスポンジンである、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１８】
アルギネート鎖部分が、Ｄ−マヌロネートのブロック・ユニット、Ｌ−グルロネートのブロック・ユニット、Ｄ−マヌロネートおよびＬ−グルロネートのブロック・ユニットまたは当該ブロック・ユニットの混合物を含む、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項１９】
アルギネート鎖部分が５０，０００未満の分子量を有する、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項２０】
アルギネート鎖部分が３０，０００未満の分子量を有する、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項２１】
アルギネート鎖部分が１００，０００またはそれを超える分子量を有する、請求項１２の移植マトリックス。
【請求項２２】
アルギネート鎖部分が天然物アルギネートである、請求項１２の移植マトリックス。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリサッカライド鎖、特にアルギネートまたは修飾アルギネートを含む物質に関する。ポリサッカライド、特にアルギネートまたは修飾アルギネート鎖は、ポリサッカライドでもあり得る主鎖ポリマー鎖からの側鎖または補助鎖として含まれる。更に、ポリサッカライド鎖は、側鎖、補助鎖および／または主鎖の間を架橋し得る。これらの物質は、有利には、細胞接着または他の細胞性相互作用のための生理学的分子のそれへの共有結合により修飾される。物質は特に、骨または軟組織置換の組織工学適用のような多くの適用のためのポリマー物質を提供するのに特に有用である。例えば、骨組織の損失は臨床的歯科学（例えば、歯周病、虫歯、外傷の治療の骨切り）の多くの態様における中心的特性であり、本明細書に記載の物質由来のマトリックスは、損失骨性組織の治療または代替に有用である。物質はまた、生理学的活性分子が分解可能結合により結合している時、ドラッグデリバリー適用にも有用である。
非修飾アルギネート、ポリサッカライドは、先に、組織工学マトリックスとして、細胞封入または移植研究において利用されている。細胞が、アルギネート内でほとんど細胞外傷なく固定化され、アルギネート／細胞マトリックスが最小の浸入法で移植できるため、有用なマトリックスである。本発明の一つの態様は、細胞接着とマトリックスの相互作用により、細胞−マトリックス相互作用を高度にコントロールできるように特異的細胞接着リガンドをマトリックスに結合させるマトリックスの提供である。
本発明の一つの態様は、ポリサッカライド基、特にアルギネートまたは、好ましくは重合化Ｄ−マヌロネートおよび／またはＬ−グルロネートモノマーである修飾アルギネートが結合したポリマー主鎖を含むポリマーに関する。ポリサッカライド、特にアルギネート基は、主鎖の末端に側鎖を含むことが意図されたポリマー主鎖の側鎖として存在し、従って、主鎖の続きである。合成修飾ポリサッカライドおよびアルギネートを備えたポリマーは、その最終的な使用に依存して、制御可能な特性を示す。更に、本発明はこのようなポリマーの製造法およびこのようなポリマーの、例えば、細胞移植マトリックス、細胞移植のための予備的形成ヒドロゲル、免疫単離細胞移植のための非分解マトリックス、ドラッグデリバリーのための媒体、傷外傷用医薬材料および産業的適用アルギネートの代替としての使用に関する。
本発明の他の態様は、架橋していることで修飾されたポリサッカライド、特にアルギネートに関する。アルギネートは、更に、細胞接着または他の細胞性相互作用のための生理学的活性分子が共有結合していることにより修飾され得る。アルギネートの架橋は、特に制御された機械的特性および形状記憶特性をアルギネート物質に提供し、これはその使用範囲を、例えば、マトリックスのサイズおよび形が重要な組織工学適用まで広げる。架橋アルギネートの生理学的活性分子での修飾は、更に三次元環境を提供し、これは細胞性接着に特に有利であり、従ってこのようなアルギネートを更に細胞移植マトリックスとして有用とする。更に、本発明はこのような架橋アルギネートの製造法および、例えば、細胞工学のための物質の形成のためのおよび／または特に注射可能細胞移植溶液および細胞移植のための予備形成物質のような細胞移植物質のための細胞接着特性を有する使用に関する。
本発明の他の態様は、アルギネート主鎖（即ち、非修飾アルギネート）または上記側鎖アルギネートまたは架橋アルギネートまたは、それに遺伝子発現の所望のパターンの持続、生存力および指向的発現に特に有効な、細胞接着または他の細胞性相互作用のような生理学的活性分子の共有結合的結合により修飾された修飾アルギネートのような修飾アルギネートに関する。修飾アルギネートポリマーは、三次元環境を提供し、それは特に細胞接着に有効である。更に、本発明はこのようなポリマーの製造法およびこのようなポリマーの、例えば、ゲル、または細胞移植溶液および細胞移植のための予備形成ヒドロゲルのような特に細胞移植マトリックスのための細胞接着特性を有する非常に粘性の液体の形成のための使用に関する。
本発明の更なる態様は、以下の記載から当業者は容易に決定し得る。
発明の背景
臓器または組織不全は、医療技術における進歩にもかかわらず、健康問題における頻繁で、経済的でそして重大な問題のままである。現在、利用可能な処置は、一つの個体から他への臓器移植、外科的再構成、機械的装置（例えば、腎臓透析器）および投薬治療を含む。しかしながら、これらの処置は完全な解決ではない。臓器移植は臓器ドナーの不足、可能性のある拒絶および他の合併症により限界がある。機械的装置は臓器の全ての機能を行うことができず、例えば、腎臓透析器は、ある代謝性老廃物の体外への排出のみを補助できる。同様に、体のコントロールシステムと同等な医薬レベルは達成が困難である。これは、特にインビボでの医薬レベルの制御の困難性のためである。経済的に、手術の費用は非常に高い。医学、生理学および物理科学的進歩は、組織工学の分野の緊急性を可能にしている。“組織工学”は、機能回復、持続または改善のための、工学および生命科学の、製造および病理的哺乳類組織の構造／機能関係の基本的理解および生理学的代替物の開発への原則および方法の適用である。従って、これは全臓器または組織の置換体または代替物としての生理学的置換体の構築の方法の開発を含む。生存細胞および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の移植可能部分または装置の開発への使用は、機能の回復または置換に魅力的な試みである。この試みの、全臓器／組織移植を超える利点は、問題の細胞のみが移植され、それらがインビトロで増殖できる可能性があるということである。従って、小生検が大組織塊に生育でき、多くの患者の処置に使用できる可能性がある。増加した組織供給は、疾病の間の初期の介入が可能であり、これは組織不全の経過としてもたらされる長期入院を防止し得るため、治療費の減少を提供し得る。免疫抑制剤の使用も、患者自身の細胞を使用することにより、ある適用で避けられ得る。
アルギネートは、例えば、ブラウン・シー・アルガエから単離されたポリサッカライドであり、二価カチオン（例えば、Ｂａ++、Ｃａ++）存在下で安定なヒドロゲルを形成する（Smidsrod et al（1990）;Alginate as immobilization matrix for cells. TIBTECH, 8:71-78）。アルギネートは現在、ある細胞型のインビトロ培養において、注射可能細胞送達マトリックスとして、免疫単離基本治療のために、そして酵素固定化基質として使用されている（Atala et al., 1993:Injectable alginate seeded with chondrocytes as a potential treatment for vesicureteral reflux. J. Urology, 150:745:747;Levesque et al., 1992:Maintenance of long-term secretory function by microencapsulated islets of Langerhans. Endocrinology, 130:644-650:Dominguez et al., 1988:Carbodiimide coupling of β-galactosidase from Aspergillus oryzae to alginate. Enzyme Microb. Technol., 10:606-610;およびLee et al. 1993:Covalent Immobilization of Aminoacylase to Alginate for L-biphenylalanine produciton. J. Chem. Tech. Biotechnol, 58:65-70．）。アルギネートヒドロゲルは、そのインビボで緩和なゲル化条件、細胞栄養素への低分散バリアーおよび低炎症性および非毒性のために細胞での使用に非常に魅力的である（Smidsrod前掲）。
アルギネートはＤ−マヌロネート（Ｍ）およびＬ−グルロネート（Ｇ）のコポリマーとして自然に存在し、異なる天然源から単離した場合、異なるモノマー組成を有する。モノマーユニットのブロック長、全組成およびアルギネートの分子量がその特性に影響する。例えば、Ｇにおいてアルギン酸カルシウムに富むことは硬い物質である（例えば、Sutherland, IW（1991）;Alginates. In Biomaterials.: Novel materials from biological sources参照）。ゲル形成は主にＧ−ブロックによるものであり、Ｍ−ブロックは本質的に非選択性であることが理論付けられている。このような配置において、カルシウムイオンはポリグルロネート残基の配列の間の選択的結合であり、1Ｃ4鎖構造であるＬ−グルロネート残基に二軸的に結合して担持される。カルシウムイオンは、従って、二つ一組になって関連したポリグルロネート鎖の間の隙間にパックされ、この構造は“鶏卵箱”配列の名前で呼ばれる。結合領域を形成する能力は、異なるアルギネートのＧ−ブロックの長さに依存する（Sutherland前掲）。アルギネートの他の利点は、その広い利用性、全栄養素への低い分散バリアーおよび相対的生体適合性を含む（Smidsrod et al., Trends in Biotech, 8:71-78, 1990）。
細胞性成分でのアルギネートヒドロゲル使用の限界は、固有の細胞接着の欠失である。これは、細胞結合およびほとんどの哺乳類細胞システムの長期生存に必須である。軟骨細胞およびランゲルハンス島はアルギネートを使用した移植が成功しているが、アルギネートによる適当な細胞接着の欠失は、その使用を軟骨および島細胞適用に限定する。ほとんどの他の細胞型は、生存するために細胞外基質への結合を必要とする。
先の試みは、細胞結合および生存のための細胞接着リガンドを包含する三次元ヒドロゲル環境の製造である。一つのシステムは、ポリマー主鎖上に移植されたＲＧＤペプチドを有するヒドロゲルを基本にした光重合可能ポリアクリルアミドである。このポリマーはＵＶ光存在下で光ゲル化し、ポリマー／細胞ハイブリッドとして重合化し得る（Moghaddam et al., 1993:Molecular design of three-dimensional artificial extracellular matrix:photosensitive polymers containing cell adhesive peputide. J. Polymer Science:Part A;Polymer Chem. 31:1589-1597）。他は、またＲＧＤリガンドが共有結合的に結合したポリサッカライドシステムであり、これは生理学的相互作用前に触媒的に重合化する（Woerly et al., 1995:Intracerebral implantation of hydrogel-coupled adhesion peptides:tissue reaction. J. Neural Transplant. Plasticity, 5:245:255）。このようなシステムの欠点は、ポリマーの液体から固体への変換であり、ゲルまたは非常に粘性なシステムは、細胞生存性に有害な、例えば、有機溶媒の使用および／または上昇した温度の条件を必要とする。
生物工学適用への使用のアルギネートヒドロゲルの他の主な限界は、その安定性がカルシウム（または他の２価カチオン）結合にのみ依存し、これがこれらの物質の使用における限界を提示し得る（例えば、ゲルからのカルシウムの損失はゲル溶解を導く）。加えて、アルギネートヒドロゲルは、現在操作できる可変性のものの数の限界により、限られた範囲の物理特性を有する（即ち、アルギネート濃度、ゲル化に使用する特異的２価カチオンおよび２価カチオンの濃度）。この限界は、アルギネートを組織工学における注射可能細胞送達媒体として使用する時、特に明白である。注射後のマトリックスの予め定義された望ましい形を得ることが不可能であり、従って特異的で望ましい形およびサイズの新規組織を製造することが不可能である。これは、新規組織のサイズおよび形が組織の機能に重要であるとき、例えば、鼻または耳のような顔の再構成または関節の再構成において、特に重要である。
発明の要約
本発明の目的は、アルギネートの改善された合成アナログの設計、このようなポリマーの製造法および、特に組織工学適用におけるこのようなポリマーを使用する組成物および方法であった。本発明により、ゲル安定性が２価カチオンに結合したカチオン以外の可変性に関連する、アルギネート含有物質の提供である。従って、例えば、先のシステムの欠点は、緩和な条件下で、即ち、水性系中のＣａ++またはＢａ++の存在下で、例えば、有機溶媒の使用および／または上昇した温度の必要性なく、ゲル化できまたは非常に粘性にできるアルギネートの提供により避けることができる。
一つの態様において、一般に、アルギネートのゲル化行動を示さないが、分解のような制御可能特性を有するポリサッカライドを提供する、ポリサッカライドの側鎖を有するポリマーを提供する。これらのポリマーは、ポリサッカライド側鎖が共有結合的に結合した重合主鎖部分を含み得る。他の態様は、重合した、所望により修飾したＤ−マヌロネート（Ｍユニット）および／またはＬ−グルロネート（Ｇユニット）モノマーの側鎖、好ましくは複数の側鎖が結合した重合主鎖セクションを提供する。修飾アルギネートは、好ましくは慣用のアルギネートの緩和なゲル化行動を維持するが、上記の欠点は有しない。重合主鎖セクションと側鎖の結合は、二官能性または多官能性リンカー化合物により、ポリサッカライドユニットと反応性の重合主鎖セクションに含まれる基によりおよび／または重合主鎖セクション上の基と反応的なポリサッカライドユニットまたはその誘導体上の基により提供され得る。ポリマーは、有利には、更にそれに結合した、特に好ましくは、Ｍおよび／またはＧユニットのカルボン酸基を介して結合した生理学的活性分子を含む。特に好ましい態様において、側鎖はアルギネートであり、生理学的活性分子は細胞接着特性を示し、ポリマーは細胞移植に有用である。
これらの物質の有利な態様は、アルギネートに類似であるが、特に細胞移植目的で使用した時、非常に制御可能な特性を有するポリマーを提供する能力である。ポリマーの異なる部分、即ち、主鎖、リンカー、側鎖および所望により生理学的活性物質の化学構造、官能性およびサイズは、生理学的システムにおけるポリマーの多くの特性、例えば、分解性、生体適合性、臓器または組織特性および親和性、細胞接着、細胞生育および細胞分化、システムからの除去の方法および速度、溶解性および粘性を制御できるように提供する。
重合主鎖セクションとして、最終的な使用に適合性であり、直接またはリンカーを介して、ポリサッカライド、特に重合化Ｍおよび／またはＧユニットに共有結合できるような適当な官能基を有するホモ−またはコ−ポリマーまたはその誘導体が使用できる。上記の要求を満たす他のポリマーが本明細書で有用であり、具体的ポリマーの選択およびこのようなポリマーの獲得および製造は、当分野では慣用的である。The Biomedical Engineering Handbook, ed. Bronzino, Section 4, ed. Park参照。このような重合主鎖セクションに好ましいのは、例えば、グラフトポリマーを含む、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキサイド）、特にポリ（エチレンオキサイド）、ポリペプチド、ポリ（リジン）のようなポリ（アミノ酸）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４−アミノメチルスチレン）のような修飾スチレンポリマー、ポリエステル、ポリホスファゼン、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）およびコポリマーである。
重合主鎖セクションは、広範囲の分子量を有するもの、一般に１００から１０，０００，０００までで選択され得る。しかしながら、重合主鎖セクションの分子量および構造の選択、ポリマーの分解性の出現および速度およびポリマーの生理学的システムからの放出の速度が影響を受け得る。例えば、分子量約１００，０００以上を有する、例えば、高分子量非分解可能重合主鎖セクションは、一般に、免疫単離細胞移植のための非分解可能マトリックスに有用であり得るより安定なポリマーを提供する。あるいは、約３０，０００から５０，０００より小さい分使用を有する重合主鎖セクション、または主鎖自体が分解性であるものは、腎臓を介して、および他の通常の代謝経路で排泄される。主鎖にエステル基を含むポリマーのような分解可能重合主鎖セクションを有するポリマーは、加水分解可能基をその中に含むもの、例えば、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸）を含むポリ（α−ヒドロキシ酸）の脂肪族ポリエステルを含む。主鎖がそれ自体分解可能である時、このような分解能を提供するために、低分子量である必要はない。主鎖が分解可能であるポリマーの具体的例は、下記の式で示すＰＥＯ（ポリエチレンオキサイド）およびアセチル−アスパルテートのグラフトポリマーであり、最初の式は分解可能主鎖の式を示し、２番目の式は、それへの側鎖の結合を示す：
0004335316.tif 000002
コポリマー含量はＰＥＯのブロック長さにより制御でき、Ａｃ−アスパルテート中で混合。
0004335316.tif 000003
重合主鎖セクションの溶解性、粘性、生体適合性等はまた最終ポリマー生産物の所望の特性に作用するものとして考慮する。
一つの態様において、重合主鎖セクションは、別のリンカー基が必要でないように、ポリサッカライド側鎖の結合部位を含むものであり得る。例えば、遊離アミノ基を有するポリ（アミノ酸）をこの目的で使用し得る。
リンカー基を使用する時、このようなリンカー基は、ポリマーの最終的使用と適合性であり、重合主鎖セクションとポリサッカライド側鎖の間に共有結合を提供する２価部分から選択し得る。このようなリンカー基は、このような目的で当分野で慣用的なものであり、慣用法で主鎖と結合し得る。ポリマーのリンカーまたは結合部位のポリサッカライドへの結合のために、ポリサッカライドが通常カルボン酸基を介して結合するため、カルボン酸基と反応するのに有用な化学反応がポリマーのリンカーまたは結合部位の提供に特に有用である；例えば、
BronizoおよびHermanson下記参照。リンカー基は、リンカー鎖における基の加水分解性の程度に依存して、ポリマーの生物分解性に有意に影響するように選択し得る。アミノ酸リンカーおよびその誘導体は、その分解特性の制御可能のために好ましい。例えば、グリシンのようなアミノ酸リンカー基は、エステル結合を提供し、これは容易に加水分解され、従って水性環境でポリマーの分解を促進し、一方アミノアルコールはエーテル結合を提供し、これは明らかにほとんど分解されない。アミノアルデヒドはまた有用なリンカー基である。アミノ酸の置換基はまた結合の分解性の速度に作用する。例えば、主鎖と側鎖の間で１から１０原子で提供された結合が好ましいが、それより長い鎖も可能である。更に、結合は分枝し得、側鎖の複数結合部位を提供し、例えば、実施例５に示すような樹枝状構造を提供する。リンカーは、結合の間に除去される基は無い結合結合の残基の形である。
側鎖はポリサッカライド、好ましくは所望により修飾されたアルギネートユニットであり、これは２価金属、例えばＣａ++またはＢａ++存在下でゲルまたは高粘性液体の製造を可能にする。好ましくは、重合化Ｍ−マヌロネート（Ｍ）および／またはＬ−グルロネート（Ｇ）モノマーのを含むが、また修飾されたこのようなモノマーも含む。側鎖は特に好ましくはＭユニット、ＧユニットまたはＭとＧユニットのオリゴマーブロックを含む。各側鎖の分子量またはユニットの数およびこのような側鎖の数はまた所望のポリマーの最終特性に影響し、この態様の選択性は本発明の有利な特性である。特別の限定はないが、側鎖の分子量は、２００から１，０００，０００までであり、好ましくは２から５，０００個のＭおよび／またはＧユニットを含み得る。重合主鎖セクションに関して、例えば、約１００，０００までの高分子量側鎖が、より安定なポリマーが望まれる場合、一般に有用であり、低分子量側鎖、例えば、３０，０００から５０，０００以下が、腎臓、または他の正常機能を介した排泄が可能な生物分解可能種が望ましい場合、一般に有用である。
ＭとＧユニットの分散はまた、Ｇユニットの高い割合は一般にその形を良好に保つ硬いポリマーを提供するというような、本発明の制御可能な性質も提供する。Ｇユニットの割合が、全Ｍ＆Ｇユニットを基本にして１０から１００％である側鎖が特に好ましい。側鎖のＧユニットの数の増加または減少がまたポリマーのゲル化の速度の増加または減少を可能とする。これは、ポリマーを注射溶液として使用するとき興味深いことがあり、この速度は溶液が注射後適当な時間にゲル化するように制御する。ポリマー主鎖セクションに備えられる側鎖の数は、ゲル化の程度および速度に影響し、従って、最終的使用に依存して変化する。一般に、側鎖が多いほどより硬く、小さいポリマーとなり、存在する場合、結合した生理学的活性分子のより濃い濃度を提供する。側鎖の数は、好ましくは、ポリマー分子当たり、主鎖で利用可能な反応性モノマーユニットの１から１００％である。全てのリンカー基または結合部位に側鎖がついている必要はない。例えば、遊離リンカーまたは結合部位は、その意図されるシステム内にポリマーの溶解性および／またはコンパーチビリティーをを促進するために残し得る。更に、遊離リンカーまたは結合部位はまた異なる構造または割合のアルギネート側鎖または他の側鎖の後の付加の可能性を提供し得る。
更に、全側鎖または個々のＭおよび／またはＧユニットは、天然に存在するユニットから修飾し得る。天然に存在するＭおよびＧアルギン酸ユニットは、その源に関係無く同じ一般的な化学構造を示すが、ＭとＧユニットの分散および比率が源に依存して変化する。天然源アルギネート、例えば、海草または細菌由来のものは、従って、ポリマーの最終的使用のために適当なＭとＧユニットを有する側鎖を提供するために選択できる。側鎖として本明細書で使用するための天然源からのアルギネート鎖の単離は、慣用法で行うことができる。Biomaterials:Novel Materials ferom Biological Sources, ed. Byrum, Alginates chapter（ed. Sutherland），p. 309-331（1991）参照。あるいは、当分野で既知のものと類似の合成経路で製造した選択したＭとＧ他に比率および分酸を有する合成アルギネートを、側鎖として使用できる。更に、天然または合成源ポリマーを、修飾側鎖を有するポリマーがゲルまたは高粘性液体を、アルギネートユニットと２価金属との相互作用により提供する限り、修飾構造を有するＭとＧユニットを提供するために修飾し得る。Ｔおよび／またはＧユニットは、例えば、Spaltro（米国特許５，４９０，９７８）のポリサッカライドの修飾に示されるような、グリコールのような他のアルコールと、種々の分子量のポリアルキレン酸化ユニットで修飾され得る。側鎖のこのような基での修飾は、一般に、ポリマーをより安定とし、これは一般に少ない粘性のゲルをもたらす。このような修飾基は、側鎖でアルカリ耐性をもたらすように、例えば、米国特許２，５３６，８９３に示すように修飾できる。
アルギネート以外の有用なポリサッカライドは、表１に記載のようなアガロースおよび微生物性ポリサッカライドを含む：
0004335316.tif 000004
ポリマー主鎖セクション、結合および側鎖は、多くの配置で提供され得、その配置はポリマー特性の制御可能な因子である。ポリマー主鎖セクション、結合部位の数および位置および側鎖のタイプおよび数が配置を決める。有用な配置の例は図１に示すが、本発明はこのような配置に限定されず、３つの基本構造ユニットを使用して更なる配置が本発明により提供され得る。直鎖ポリマーの“側鎖”は、主鎖の末端であるが、本明細書ではまだ側鎖と見なすことは注意する。更に、側鎖は、別のブロックタイプの配置のポリマー主鎖のセクションの間に存在し得る。
一つの好ましい態様は、主鎖自体がアルギネートである物質である。側鎖は、例えば、アルギン酸ナトリウム由来のポリグルクロネート誘導体であり得る。具体的例は、それ自体に、架橋ポリマーを形成するための加水分解的分解可能結合を介して、二官能性架橋分子を使用した結合ポリグルクロネートである。下記のようなデンドリックポリマーおよび櫛型ポリマーまはたこのような物質として提供される。これらの構造は、高度に交差架橋したポリマーを提供でき、これは低分子量成分に急速に分解可能であり、容易に体内から排泄される。この目的を達成するために、例えば、ポリアルデヒドグルロネートをヒドラジンおよび水素化ホウ素ナトリウムと反応させ、ポリヒドラジノグルロネートとする。本アルギネート由来ポリマーのヒドラジン基は、そのヘミアセタール末端を介してＧ−ブロック鎖を取りこむのに使用する。これは、天然源由来の物質に加水分解可能ヒドラゾン結合を提供し、従って、生体適合性および生体分解可能である。これらの物質のヒドラゾン結合の加水分解は、腎臓から排泄される短鎖ポリサッカライドを導く。更に、ヒドラゾン結合のボロハイドライドによる還元は、非分解可能物質を提供する化学的に安定なヒドラジン結合を形成できる。従って、生体分解可能および非分解可能生物物質が、天然源ポリサッカライドから由来し得る。ポリマー内の細胞は、架橋反応により傷害を受けず、これらの物質が、例えば、細胞移植に有用であることを示す。
デンドリマーは、分子形および構造の差異により、対応する直鎖ポリマーと異なる特性を示すため、特に興味深い主鎖構造を提供する。樹枝状分子は、狭い領域で多くの官能基を枝分かれさせるハンドルを有する主鎖として提供できる。ポリペプチドが生物分解可能であり、その分解産物（即ち、アミノ酸）が非毒性であるため、あるポリペプチド（例えばポリリジン）は樹枝状ハンドルとして使用できる。それと関連して、固相および液層合成の両方を合わせた可溶性ポリマーサポートは、本物質の製造に使用できる。最も典型的な可溶性ポリマーサポートは、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）を含む。その理由は、ＰＥＯの親水性性質および精製目的で望ましい種々の有機溶媒への不溶性である。
更に有用な主鎖構造は、ポリマー主鎖から伸びる多くのポリマーを含む櫛状ポリマーである。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）は櫛状ポリマーの特に有用な主鎖を提供する。ＰＶＡのアルコール基はエステル化でき、上記の側鎖結合を提供するためのカルボジイミド結合化学に付す。
ポリマー主鎖を含む物質は、当分野で既知の合成法を使用して製造し得、そのいくつかは上記であり、例えばBiomedical Engineering Handbook, Section 4である；Odian, Principles of Polymerization, Capter 9, 2nd ed.，（1970）もまた参照。例えば、既に適当な結合部位、例えば、あるポリ（アミノ酸）のような遊離アミノ基を既に含む重合主鎖出発物質を使用でき、またはポリマーはリンカー化合物と反応して、特に重合主鎖の適当な部位とアミノ酸誘導体（所望により、アミノ基は保護されていてもよい）の反応により、適当な結合部位を形成する。更に、主鎖のある反応部位はこのような部位を遊離にしておくか、またはこのような部位に続いて異なるリンカー基を提供することが望ましい場合、リンカー基の結合を防止するために保護し得る。この化学はリンカー／ポリマー形成の分野で慣用的であり、特にエステル、アミド、エーテルまたは他の共有結合を含む；例えば、BronzinoおよびHermanson，上記参照。保護基に関しては、例えば、Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry, 5th ed. p. 550+および784+参照。リンカー上の所望の保護の除去後、Ｍおよび／またはＧユニットの側鎖の反応を、好ましくは、リンカーのアミノ基を有する側鎖の還元末端の還元的アミノ化によるグラフティングを介して行う。側鎖を天然源からまたは合成的に上記のように提供し、所望により、上記のように、または他の慣用法で結合し得る記載の修飾をし得る。
他のアルギネート物質の合成アナログは、アルギネートの共有結合により提供される。この共有結合的架橋は一般的にこれらの物質を有用とする状況の範囲を拡張する。この修飾の一つの具体的適用は、形状記憶であるアルギネートのマトリックスの開発である。架橋アルギネートは、細胞移植マトリックスの形成への使用を特に有用とする、有利な形状記憶特性および圧縮耐性特性を提供する。形状記憶マトリックスはその本来の次元を“記憶”するように設計され、体内に（例えば、シリンジを介して）小型化して注射されたかまたは体内またはそれを使用し得る他の位置への他の配置の他の手段での配置後、その本来のサイズおよび形を再生する。アルギネートの形状記憶特性は、その架橋により提供される。架橋はまた圧縮耐性および／またはアルギネートの他の機械的特性も改善できる。更に、架橋アルギネートは、生理学的活性細胞接着リガンドの使用無しでさえ、ある程度の細胞接着を提供できる。二価カチオンによるゲル化は、架橋に加えて、アルギネートの粘性および構造の程度の増加の他の手段を提供する。更に、架橋アルギネートは、細胞接着および細胞生存性の維持をするために提供された少なくとも一つの細胞接着リガンドと共有結合的結合をし得る。
本発明の架橋に使用するアルギネートは、重合化Ｄ−マヌロネート（Ｍ）および／またはＬ−グルロネート（Ｇ）モノマーを含むアルギネート鎖であるが、本明細書で使用する用語“アルギネート”または“アルギネート鎖”はまた、それらが最終的使用と適合性であり、共有結合的に結合できる場合、このようなモノマーが下記のように修飾されている側鎖を含むことを意図する。アルギネート鎖は、特に好ましくはＭユニット、Ｇユニット、ＭとＧユニットのオリゴマーブロック、またはこのようなブロックの混合物を含む。ＭとＧユニットのアルギネート直鎖コポリマーの一般的構造は、下記一般式で証明される：
0004335316.tif 000005
アルギネート鎖の分子量、即ち、ユニットの数および鎖の長さは、ポリマーの所望の特性に依存して選択し得る。一般に、各鎖の分子量は、例えば、約１，０００から１，０００，０００の範囲であり得る。高分子量鎖、例えば、約１００，０００を超えるものは、より安定なアルギネートポリマーが望ましい場合一般的に有用であり、低分子量鎖、例えば、約３０，０００から５０，０００以下のものは、腎臓を介した、または他の通常の代謝機能を介した排泄ができる生体分解可能種が望ましい場合、一般に有用である。
ＭとＧユニットの分散はまた、Ｇユニットの比率が高いと一般的にその形を良好に保つ硬いアルギネート物質を提供する、本発明の制御可能特性も提供する。全ＭとＧユニットを基本にしてＧユニットが１０から１００％であるアルギネートが特に好ましい。鎖のＧユニットの数の増加または減少は、アルギネートのゲル化速度のそれぞれ増加または減少を可能にする。これは、アルギネートを注射用溶液に使用し、溶液が注射後適当な時間でゲルとなるように速度を制御する場合、特に興味深いことがある。
アルギネート鎖または個々のＭおよび／またはＧユニットは、また天然に存在するユニットから修飾し得る。天然に存在するアルギネートおよび修飾アルギネートの源は、上記の重合主鎖態様においてアルギネート側鎖に関連して上に記載している。
更に、アルギネート出発物質として有用なのは、上記のようにアルギネート側鎖が結合した重合主鎖を有する物質である。架橋は、同じ主鎖の側鎖間および／または他の主鎖の側鎖間で起こり得る。アルギネート部分またはその鎖の間に架橋を有するアルギネート含有物質の異なるタイプも有することも可能である。
アルギネートの架橋は、アルギネートユニットのウロン酸のカルボン酸と他のアルギネートユニットのウロン酸のカルボン酸基の共有結合を提供するための、架橋剤を介した、架橋剤の作用によるものである。このような架橋は、好ましくは異なるアルギネート鎖のアルギネートユニット間である。しかしながら、架橋は、同じ鎖のアルギネートユニット間でも起こり得、またはアルギネートが上記のようにポリマー主鎖の側鎖である場合、架橋は同じまたは異なるポリマー主鎖の間で起こり得る。
架橋剤は、アルギネートのカルボン酸基および／またはアルコール基またはその修飾基に共有結合できる少なくとも二つの官能基を有する適当な試薬であり得る。高価官能性の架橋剤も使用し得る。例えば、２官能性、３官能性スターポリマーまたはデンドリックアミンのようなポリアミンが有用であり、これらは、例えば、対応するポリオールから慣用法で製造できる。好ましい架橋剤は、例えば、ジアミンまたはヒドラジン化合物のような少なくとも二つの窒素ベース官能基を有するものである；その非限定的例は、ジアミノアルカン、ジェフアミンシリーズ化合物、アジピン酸ジヒドラジドおよびプトレッシンである。特に架橋剤として好ましいのはリジン、特にそのエステル、特にメチルまたはエチルエステルである。
架橋剤は、得られる架橋アルギネート物質の例えば、インビボ環境での生存時間が、意図される使用により修飾できるように、大きなまたは小さな生体分解性または非生体分解性結合を提供するように選択し得る。
アミンとの架橋の時に形成されたアミド結合は、アルギネートの架橋剤が、アルギネートの連続的ウロン酸ユニットの間のアセタール結合と比較して、加水分解的開裂に感受性が低い。従って、通常のジアミンと結合した生産物は、ポリサッカライド（アルギネート）が架橋分子が分解する前に分解するため、この一連の物質では相対的に低い生物分解性である。生物分解の速度を改善するために、より不安定な官能基を架橋剤内に挿入し得る。二官能性生物分解可能架橋剤は、確立された化学経路により合成し得る。生物分解可能エステル結合を有するか教材の模式的製造参考：
0004335316.tif 000006
生物分解可能２官能性架橋剤を形成するためのエチレングリコールの修飾。
例えば、エチレングリコールは２つのＮ−（ｔ−Ｂｏｃ）グリシンと、カルボジイミド化学を経由して結合し、１，２−エチレン−（Ｎ’，Ｎ’−ジ−ｔ−Ｂｏｃ）グリシン中間体を産生する。この中間体は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸を使用して種々の温度で脱保護し、１，２−エチレングリコールジグリシネート中間体を産生する。この中間体は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸を使用して種々の温度で脱保護し、１，２−エチレングリコールジグリシネート中間体を産生する。エチレングリコールに加えて、二つの末端アルコール官能基を有する他の分子を使用し得る。更に、たとえば、（星型またはデンドリック）を含むポリオールを同様のタイプの架橋剤に、平衡化学経路を使用して包含された生物分解可能エステル官能基で変換できる。
好ましくは、必須では無いが、架橋剤はアルギネートユニットのカルボン酸基と反応する活性化化合物により促進され、架橋剤とより反応的になる。カルボン酸基を架橋剤、特に架橋剤のアミン官能基とより反応性にする有用な活性剤は、当分野で既知である。この例は、カルボジイミド、特に、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）およびＣＤＩ（カルボジイミダゾール）のような水溶性カルボジイミドを含むが、これらに限定されない。
また好ましくは、活性化化合物を使用する場合、得られる活性化基を安定化する安定化剤を使用する。また、活性化基のための安定化剤も当分野で既知である。カルボジイミド、特にＥＤＣのために、有用な安定化剤は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）であり、これは加水分解に対して活性化基を安定化する。他の有用な安定化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシスルヒルスクシンイミド（sulfo-NHS）を含む。
リジンエチルエステル架橋剤とＥＤＣ活性化剤およびＨＯＢＴ安定家財を使用した反応の流れを以下に模式的に示す：
0004335316.tif 000007
アルギネート架橋の反応経路。ＥＤＣはＯ−アシルソルエン中間体形成のためにカルボン酸を活性化する。中間体はＨＯＢＴと反応し、ＨＯＢＴ活性化中間体を形成する。リジンエチルエステル中の一級アミノ基は、次いで隣接アルギネート分子の活性化カルボキシル基と結合し、架橋アルギネートを形成する。
架橋は一般に室温および中性ｐＨで構成されるが、しかしながら、その条件を変え、特に使用する適用および架橋化学を最適化し得る。ＨＯＢＴまたはスルホ-ＮＨＳ中間体ステップがある、ＥＤＣ化学を使用する架橋にとって、ｐＨ4.0〜8.0および温度0℃〜室温（25℃）が最適であり好ましい。高温度は、ＥＤＣが分解するためこの化学には好ましくないことが知られている。同様に、塩基性ｐＨ（例えば８−１４）もまた、この化学を用いるときこの理由により好ましくない。
他の架橋化学もまた使用し得る。例えば、架橋剤のスペーサーとしてポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）をＮ-保護アミノ酸（実施例１２参照）したアミノ酸とともに用いる。酸化したアルギネートの架橋は、アジピン酸ジヒドラジドで構成し得る。酸化により、架橋用のポリアルデヒドアルギネート（酸化されたアルギネートを制限する）が生ずる（実施例１７参照）。加えて、架橋は光反応物質を用い光活性により効果をなし得る（実施例２６参照）。
別の架橋システムの機構である他の方法は、ポリマーネットワークの架橋、Ｍｃ間の分子量を変え得る（Peppas and Bar-Howell, Hydrogels in Medicine and Pharmacy. Vol I, CRC, Boca Raton, pp28-55, 1986;and, Anseth et al.,Biomaterials 17:1647-1657, 1996）。Ｍｃは架橋の程度を制御することにより、または架橋分子の分子量を変化させることにより修飾され得る（Simon et al., Polymer 32:2577-2587, 1991）。これら両ストラテジは別のアルギネートゲルの機構性質を利用し得る。共有性架橋は幾つかの異なるアプローチにより行われている。リシンで架橋することにより、アミド結合が形成され、それは安定となり、たいへんゆっくりと分解される。ＰＥＧ−架橋体にはエステル結合を含み、加水分解に対し不安定である。最終的に、アジピン酸ジヒドラジドで酸化したアルギネートの架橋により、ヒドラゾン結合が生ずる。重要なことに、これら物質は共有性およびイオン性（例えばカルシウム）の、両方の架橋をし得る。これは、２-段階のゲル化が好ましい適用において利点となる。例えば、下記ポリアルデヒドアルギネートは、とても速く（例えば数分）イオン性架橋し、一方で共有性架橋反応は、とてもゆっくりと（例えば数時間）起き形成され得る。外科医は、それゆえこれらポリマーをイオン性架橋し、シリンジまたはエンドスコープで注入しやすい溶液となるが、設置（placed）後、遊出しないほどの粘性となる（この段階における粘性は、酸化程度が増加するにともない減少する）。その共有架橋は、その後、より硬い、流動可能な塊体に移し得る物質を硬くする。
アルギネートの架橋により、より構築された物質、少なくとも部分の架橋の程度に依存する構築の程度を生ずる。アルギネート物質の構築の程度は、他の因子のなかで、上記２価金属カチオンのイオン性結合の作用によるゲル化程度、および開始アルギネート物質の性質（それは上記のように変化し得、例えば物質の硬さに影響する）に依存する。架橋の程度およびこれら他の因子により、架橋アルギネート物質は、以下の構造を通してスペクトル分析をし得る：例えば、粘性の液体、膨張性ゲル、非膨張性ゲル、膨張したポリマーネットワークまたは固体マトリックス。
架橋の程度は、架橋剤の量および使用する架橋方法、すなわち架橋し得るアルギネートカルボン酸基に対する架橋剤のモノ％に相関する。アルギネートは、架橋すると粘性が増加する。架橋の程度は、最終的な使用に依存する。例えば過吸収性のあるゲル物質を得るため、低い架橋程度、例えば架橋架橋可能な基の約１〜２０％、好ましくは１−１０％に有用である。組織マトリクス物質のためには、例えば架橋の程度は好ましくは約５％〜７５％となる。特に下記実施例の態様において、アルギネートは、架橋剤量が約２５モル％またはそれ未満のとき粘性液体となり、その量が約５０％のとき膨張可能なゲルとなり、その量が約７５％またはそれ以上のとき大きさや形状を固定した固体構造となる。しかしながら、架橋化学は、選択され最適化されて低い架橋程度において粘性を制御する。他の実施態様では、架橋剤は、架橋可能なアルギネートカルボン酸（ウロン酸）の数と同じくらいのモル量（すなわち、１００モル％）で使用される。
加えて、架橋は、２価金属カチオンの作用によるゲル化前、ゲル化後またはゲル化と同時の何れかで構成され得る。ゲル化した物質の内部に架橋剤が拡散する問題を防止するため、架橋が２価カチオンのゲル化前、またはゲル化と同時に何れかで構成される応用が好ましい。
この物質は理想的な２-段階ゲル化マトリクスを造り得る。合成の最初のステップにおけるアルギネートの酸化の程度により、イオン性ゲル化に利用可能な結合部位を制御し、それゆえカルシウム架橋ゲルの粘性を制御する。アジピン酸ジヒドラジドを用いる共有架橋反応は数時間かかり、それゆえゲルをゆっくりと固めるのに使用し得る。マトリクスの最終的機構性質は、共有架橋の程度を変化することにより制御され得、これはアジピン酸濃度に相関する。例えば、広く、イオン性架橋時間の時間に反応せず、共有架橋よりも僅かに短いイオン性架橋の時間枠である物質がデザインされ得る。
更なる実施態様では、架橋アルギネートは２価金属カチオンの作用によるゲル化を全くしないか、体などの生物学システムに架橋アルギネートの到達後のみ、インビボに存在するカチオンによりゲル化する。
上記理由のため、膨張の程度および架橋アルギネート物質のマトリクス構造は、ゲル化により２価カチオンにより、および架橋の程度および性質により何れにも影響される。これらおよび他の因子の変化の可能性は、最終の適用に特に適当なデザイン物質においてかなりの可動性を提供する。
下記細胞接着のタイプに加えて、架橋アルギネートにより供されるマトリクス構造は、例えばマトリクスの細胞のトラッピングまたはリシンなどの架橋剤の作用のため、細胞接着タイプの性質を促進し得る。例えば、マトリクスのような架橋アルギネートは組織工学に導入され得、細胞はインビボでマトリクスの孔に移動し得る。しかしながら、それは、架橋アルギネートに、下記のように細胞接着または他の生物学的相互作用を促進する生物学的作用分子を提供することに利点となる。そのリガンドは、２価カチオンによるアルギネートおよび／またはゲル化の架橋前、架橋中、または架橋の後に添加され得る。
上記、合成的な修飾ポリサッカライドまたはアルギネート物質の相対生物学的不活性物扱うため、ポリマーは、生物学的活性分子で修飾され得る。本発明の他の様相は、上記合成アルギネート類似体の修飾ばかりでなく、ここに記載の修飾または類似アルギネート物質を生ずることにある。たとえアルギネートまたは修飾アルギネート物質がポリマー性バックボーンに提供されず、および／または架橋しないとしても、アルギネートを生物学的作用分子の結合により、それが組織工学および他の適用に有用となる。
ポリマー性のバックボーンを含みおよび／または架橋アルギネートおよび天然に生じ修飾塩基性アルギネート物質は、細胞接着活性分子で、例えば生物学的分子のアミン基と、アルギネートまたは他のポリサッカライドのウロン酸残基（ＭおよびＧ単位）の遊離カルボン酸との間でアミド化学を用いる共有結合により修飾され得る。物質がポリマー性バックボーンおよび／または他の修飾ものに架橋し結合するならば、遊離酸基は細胞接着基に追加されたままでなければならない。もし細胞接着基が最初に添加されるならば、その後の架橋、ポリマー結合または他の修飾に作用する基を残存させなければならない。他の化学は、生物学的作用分子への結合などに効果をなすために使用され得る。例えば、アルギネートまたは類似体物質は修飾され得、そのアルデヒド基を共し、それはペプチドのアミノ末端で結合し安定なアミンを少なくするイミン結合を共する。この化学の例は、実施例２４に記載している。
適当な細胞接着分子の例には、既知の細胞アタッチメント性質、プロテオグリカン・アタッチメント・ペプチド配列（表２参照）、生物学的作用プロテオグリカン（例えばラミニンおよびフィブロネクチン）および他のポリサッカライド（例えばヒアルロン酸およびコンドロイチン-６-サルフェート）を含む。他の適当な生物学的分子の例には、ペプチド成長因子（ＥＧＦ，ＶＥＧＦ，ｂ-ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ等、血小板誘導性成長因子、ＴＧＦまたはＴＧＦ-β）、および酵素（Dominguez et al., 1988:Carbodiimide coupling of β-galactosidase from Aspergillus oryzae to alginate. Enzyme Microb. Technol., 10:606-610;and Lee et al., 1993:Covalent Immobilization of Aminoacylase to Alginate for L-h\phenylalanine production. J. Chem. Tech. Biotechnol. 58:65-70）。これら分子およびその機能の例を以下の表１に示す。
0004335316.tif 000008
0004335316.tif 000009
アルギネート鎖に接着した細胞接着分子として特に好ましいものは、細胞付着リガンドとして知られ、各種の天然細胞外マトリックス分子中に見出される、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）アミノ酸配列を含んでいる合成ペプチド類である。特に重要なものは、ＧＲＥＤＶＹ（血管内皮細胞特異的）ペプチドである。そのような修飾をしたアルギネート類は、殊に細胞移植マトリックスとして使用する場合に、アルギネート類似体、天然アルギネートあるいは修飾アルギネートに細胞接着性を付与し、哺乳動物細胞系の長期生存を維持するとともに、細胞の生育と分化をも制御する。
アルギネートへの細胞接着分子の結合は、当業者に一般的に知られている合成的手法を用いて実施することができる。特に有用な方法は、アルギネート鎖上のカルボキシル酸基群と細胞接着分子上のアミノ基群との間にアミド結合を形成させることによるものである。その他の有用な接着化学には、Hermansonにより、Bioconjugate Techniques, p. 152-183（1996）中で論じられているもの、殊にDCC及びDIC（Woodward’s Reagent K）中で論じられているカルボジイミドカップラー類を使用するものが含まれる。細胞接着分子の多くがペプチド類であることから、それらは末端にその接着のためのアミノ基を含んでいる。このアミド結合形成は、ペプチド合成に一般的に使われている水溶性酵素である、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）により好適に触媒される。上記化学の一例は、次式に示すものである。
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上式中、ＥＤＣはアルギネート骨格上のカルボキシレート部分と反応し、アミン類と反応性である活性エステル類を生成する。Ｒ−ＮＨ2は、遊離アミン（例えばリジンやペプチド配列Ｎ−末端）を有する分子を表す。不都合な副反応を減少させるためには、ＥＤＣを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルフィルスクシンイミドあるいはＨＯＢＴとともに使用し、競合諸反応中でアミド結合を促進させてもよい。
このカップリング化学の反応条件は、例えば反応緩衝液、ｐＨ、ＥＤＣ：ウロン酸比を変化させ、ペプチド導入効率、例えば６５ないし７５％を達成させることにより、最適化できる。好ましいｐＨは、約６．５ないし７．５である。緩衝性を与えるイオン濃度（例えばＮａＣｌからの）は、好ましくは約０．１ないし０．６モルである。ＥＤＣ：ウロン酸グループのモル比は、好ましくは１：５０ないし２０：５０である。ＨＯＢＴを用いる場合、ＥＤＣ：ＨＯＢＴ：ウロン酸の好ましいモル比は、約４：１：４である。細胞接着リガンドの密度は、生物学的材料への接着に続く細胞の表現型の臨界的レギュレーターであるが、（Massia and Hubbell, J. Cell Biol. 114:1089-1100; Mooney et al., J. Cell Phys. 151:497-505, 1992; and Hansen et al., Mol. Biol. Cell 5:967-975, 1994）、５等級のマグニチュード密度範囲にわたって容易に変化させ得る。その例は第２図に示してある。
アルギネートの表面カップリングも、バルクカップリングと同様に、いずれも、このカップリング化学により容易に行われ得る。従って、表面およびバルクカップリング操作により、例えば、マトリックス内部で結合したある型の分子と、表面上で結合した他の型の分子とを有する材料を調製することができる。
接着リガンド類の接合あるいは固定化方法として従来知られているその他の方法、たとえば前記Bronzino p. 1583-1596中で論じられている方法を用いることもできる。
しかしながら、上述のアルギネート物質に付着させるのに有用な生物学的分子は、細胞接着機能を付与するものに限定されない。例えば、この高分子物質は、傷を包帯したとき殺菌性機能を示す分子、あるいは遺伝子発現に特異的な接着組織、環境中での細胞の増殖を増強する生育因子あるいは組織の血管新生あるいは坑炎症活性を提供する分子、に結合させ得る。
アルギネート及びアルギネート類似物質と、それらと結合している細胞接着リガンド類との組合わせは、その中で細胞がアルギネートとの接着に働く各種の影響力により相互に作用し合う独特の三次元的環境を与え、多様な用途、殊に組織工学への応用をもたらす。この細胞接着リガンド類は、所望の細胞に特異的な細胞膜レセプター部位を提供する。アルギネートあるいはアルギネート類似物質上における細胞接着リガンド類の数、型及び位置は、細胞接着、細胞発育力維持性質に影響しするものであり、それらの因子は個々の応用に適するように変化させ得る。それらの応用には、ヒト及び動物に適用される組織工学的方法が含まれる。好ましくは、水和アルギネートのミリリットル当たり接着分子１０-12ないし１０-4モルを使用する。Massia et al., J. Cell Biol; Vol. 114, p. 1089-1100（1991）参照。本発明によれば、また、細胞接着リガンドあるいは他の生物学的活性分子を変化させた細胞接着リガンド類を組合わせて利用することもできる。それらの付加グループは、アルギネート上の他の部位で、あるいは、アルギネートまたはアルギネート類似物質上に既に存在するリガンドの適切な部位に接着できる。
重合体骨格を有するか、さらに／または架橋結合しているアルギネート、あるいは天然のもしくは修飾したアルギネートあるいはその他の多糖類は、場合により生物学的に活性な分子とともに、天然の細胞外マトリックスの機能を倍増し得る哺乳動物細胞の合成的細胞外環境（ＥＣＭ）を創製することができる。従って、ここに記述した物質は、組織工学、生物材料，および基礎細部科学の分野で、三次元的な細胞相互作用や組織形態発生学の研究に応用されるであろう。ここに記載した物質は、インビボまたはインビトロでの組織形成における細胞遺伝子発現を誘導し得る合成ＥＣＭ創製のためのモデル系として有利である。
天然ＥＣＭは、細胞の生育および分化を制御するとともに、細胞周辺の機械的ならびに化学的環境のコントロールも行う性質もある。D. E. Ingber. Mechanochemical Switching between growth and Differentiation by Extracellular Matrix, in Principles of Tissue Engineering（Ed, Lanz, Langer and Chick）p. 89-100（1997））。アルギネートおよび類似物質は、広範囲の機械的特性を発揮し得るとともに、記述したとおり、生物学的に活性な分子による共有修飾を施して，例えば、従前の細胞カプセル化マトリックスがなし得なかったような、哺乳動物細胞と細胞外環境との結合などの広範囲の生物化学的特性を発揮し得る。生物学的に活性な配列による共有修飾は、金属イオン封鎖性生育因子、ホルモン類またはこれらの特殊化学物質中の活性配列、の形成における生物化学的信号を提供し得る二次元的または三次元的な合成細胞外環境を創製するものであり、さらにはより重要な、当該物質へ直接共有結合している細胞接着ペプチド類（例えば、ＲＧＤ，ＹＩＧＳＲ，ＲＥＤＶ）を介して、アルギネート物質を経由する、哺乳動物細胞と他の細胞との直接交信を行わせるものである。これまでは、アルギネート物質の機械的特性を制御すること−例えば、上述したような重合体骨格の性質により、および／または架橋により、および／またはアルギネート鎖の修飾により−細胞同志のまたは細胞群落間の細胞間信号伝達を制御することが可能である。（D. E. Ingber. Mechanochemical Switching between growth and Differentiation by Extracellular Matrix, in Principles of Tissue Engineering（Ed, Lanz, Langer and Chick）p. 89-100（1997）and GF Oster,JD Murray, and AK Harris, Mechnical aspects of Mesenchymal;Morphogenesis, Journal of Embryology and Experimantal Morphology, Vol. 78, p. 83-125（1983）参照）
非修飾アルギネートは、緩和なゲル化条件で安定なヒドロゲルを形成することから、長年、細胞固定化マトリックスとして用いられてきた。しかしながら、アルギネートは、三次元的に細胞または細胞凝集物を分散する中性試薬としてのみ作用するものである。この多糖類を上述のような方法で構造的に修飾することにより、また所望により、細胞接着ペプチド類、生育因子、ホルモン類または例えばＥＣＭ結合配列とともに、このアルギネートは、空間的ならびに時間的な細胞遺伝子発現を誘導し得る、活性で相互作用し得るマトリックスに形質転換させることができる。このアルギネートの粘弾力性を制御できる能力は、細胞遺伝子発現を誘導する際に肝要となる面であり、（M. Opas, Substrautum Mechnics and Cell Differentiation. International Review of Cytology, Vol.150, p. 119-137（1994）；and GF Oster, JD Murry, and AK Harris, Mechnical aspects of Mesenchymal Morphogenesis, Journal of Embryology and Experimental Morphorogy, Vol. 78, p.83-125（1983）参照）、インビトロの細胞培養系モデルや組織工学的応用において使用できる。
このマトリックスは、組織工学において中心的役割を果たすものである。マトリックスは、体内の所望の部位に細胞を到達させること、処理する組織の空間的位置を定めること、および組織発達の過程を誘導することに利用される。幾つかの場合に、マトリックス抜きで細胞分散液を直接注射することが行われてきたが、移植細胞の位置付けをコントロールすることは困難であった。加えて、哺乳動物の細胞の大部分の型は、固定依存性（anchorage dependent）であり、接着基質を給与しなければ死んでしまう。
重合した、および／または架橋した、および／または生物学的に活性な分子で修飾した状態のアルギネート物質は、上述のとおり、細胞を高負荷下にかつ特定部位へ効果的に到達させ得るマトリックスとして好適に使用できる。本発明のこの物質は、圧縮および張力に対する機械的支持をも提供し、体外の攻撃的環境から体形および骨格を保持する。これはアルギネートを高度に架橋した場合に顕著である。これらの物質により提供される骨格は、宿主の免疫系成分への物理的障壁としても働き、あるいは骨格のデザインによっては組織再生を誘導するマトリックスとしても働く。
第１の骨格型、免疫保護デバイスは、デバイスと宿主の細胞間交流を制限するために半浸透性膜を利用する。これらのデバイスの小孔、例えば（ｄ＜10mμ）は、低分子量の蛋白質および分子の移植組織と宿主組織間の移送は可能とするが、大分子の蛋白（例えば、イムノグロブリン類）や免疫系の宿主組織（例えば、リンホサイト類）がデバイス中に入り移植細胞の拒絶を媒介するのを阻止する。反対に、大サイズ孔、例えば（ｄ＞10mμ）の開放構造は、新しい組織が宿主組織と結合することを期待する場合に典型的に利用する。マトリックスの形態学は、その組織のサイズ、形状および血管新生を含む、処理組織の構造を誘導することができる。
上述のとおり、本発明のアルギネート、アルギネート類似体および修飾アルギネート物質は、細胞移植マトリックスに有用である。これらの物質は、それらのマトリックスを各種の方法で提供することに用い得る。例えば、マトリックスが天然組織の一時的な代用マトリックスであることが望まれる場合、その物質は生物学的分解性能とシステム開放をねらって、例えば、比較的低分子量のアルギネート鎖、生物学的に分解し得る架橋剤、生物学的に分解し得る重合体骨格および／または低分子量の重合体骨格断片を使用して、加水分解し得る結合を提供することにより、デザインする。あるいは、分解性の少ないマトリックスを望む場合、非−加水分解性結合、より高分子量のアルギネート鎖、非−分解性架橋剤および／または高分子量の重合体骨格断片が使用できる。この物質の性質を変え得る多くの方法が、特定応用に適合する要件の物質提供を制御する際に高度な制卸性能を与える。
より分解性能の小さい形態では、マトリックスは細胞抜きで体内に導入できるが、細胞はインビボでマトリックス中に浸透し、そこで再生する。このアルギネートまたは類似物質は、所望により、生理学的系中の内生２価金属カチオンが注射後にその物質のアルギネート部分のゲル化を起こす場合には注射後に、適当な生育できる細胞に結合させて、注射し得る形態で提供できる。あるいは、２価金属カチオンを、注射の直前に、例えば硫酸カルシウム溶液のような溶液中に加える。上述のように、この物質は、最終目的に進むためにそのゼラチン化速度を制御するようにデザインすることができる。そのような注射液は、泌尿器系組織の再生、再形成術、皮膚移植、その他の矯正学的適用、またはその他の組織移植や修復適用のための細胞送達に利用できる。このアルギネート−含有物質は、その中で細胞が適合性であり、それらが意図する機能、例えば最終的にマトリックスと置き換わって組織置換を達成するように生育する、高度に構造性の、ゲル化したまたは高度に粘性なマトリックスを提供する。
この物質、殊に重合体型のものは、そのまま体内で、細胞外マトリックスの天然グリコサミン−グリカン類およびプロテオグリカン類の類似体として作用する。さらに、それらは、細胞に結合した、予め形成させたゲル化したもしくは高度に粘性のマトリックスを提供するためにも使用でき、それらは体内へ外科的に移植できる。この物質が細胞を含まないマトリックスを移植に使用でき、その後で細胞をインビボでマトリックス中に植え付けることができるということは、特に驚くべき利点である。この物質は、所望により、例えば、ゲルとして、粘凋溶液として、比較的固形物として、予めヒドロゲル化して、半−浸透性膜内に入れて、マイクロカプセル内に入れて、提供することができ、その重合体性質は上述のようにそれらの適用を可能とするようにコントロールされる。この重合体の細胞移植および組織工学への有用性は、殊に従来は、合成的物質でそのような結果を達成することは、実現されないかあるいは不可能と思われていたことから、当該技術の重要な進歩である。C. Ezzell, The Journal of NIH Reseach, July 1995, Vol.7, p. 49-53参照。
この物質はまた、薬剤送達用媒体、特に徐放性媒体として有利に役立つ。薬剤輸送施用の場合、分解性結合によりアルギネートポリマーおよび/または類似物質に結合する生物活性分子、即ち薬剤をこのシステムでの制御放出用に選択することは有用である。この物質は、結合した生物学的分子を必要に応じて採用でき、その他の有用性には、例えば、創傷手当て材、創傷治癒マトリックス材、インビトロ細胞培養研究用マトリックス、工業用に常用されているアルギネートの代用、例えば、食品濃化剤、および印刷添加剤、例えば、濃縮インキ、および上記の特性が望まれる類似の用途がある。この架橋物質は、必ずしも生物活性成分を含有するわけではないが、その特に有利な用途の１つは、高吸収性物質としてである。特に、架橋度の低い、例えば、約１−２０％架橋の物質は、この有用性を持つ。この吸収性特性により、例えば、使い捨てダイヤパー使用においてこれらは有用なものになる。本発明の合成ポリサッカライドの特性制御性およびこのように選択した合成ポリサッカライドの一貫した再現性により、多くの応用に対して特に有利なものになる。
上記および下記に引用した各種出願、特許および刊行物全ての全開示内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
実施例
温度は全て未訂正のセ氏温度であり、特記しない限り、部およびパーセンテージは全て重量によるものである。
実施例１：
下記の図式は、細胞接着分子ＲＧＤで修飾した本発明のアルギネートの実施態様の一製法を示す。
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このアルギネート/ペプチドコンジュゲーションの反応図式では、カルボジイミド酵素（ＥＤＣ）を０．５％アルギネート溶液に加える。アルギネート主鎖上でカルボン酸基を１５分活性化させる。ＲＧＤ含有ペプチドをこの反応に加え、室温で２４時間反応させる。ＥＤＣを不活性化する１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を止める。１Ｍ ＮａＯＨを加えて溶液のｐＨを７に戻し、３ないし５日間十分に透析して、未反応化学品を除去する。次いで、ポリマーを水に再度溶解し、滅菌濾過する。
実施例２：
ペンタペプチド（ＧＲＧＤＹ）をモデル細胞接着ペプチドとして使用した。Ｎ−末端遊離アミンは、アルギネートへ結合するための部位を提供し、Ｃ−末端チロシンは、結合反応を定量的に分析可能にする、ヨウ素化部位（125Ｉ−標識ペプチド）を提供する。
ペプチドは全て、Michigan Peptide Core Facility大学で合成し、出発物質アルギネート（非修飾）はProNovaから購入した。アルギネートポリマー主鎖上での共有ペプチドグラフト形成は、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液中１％（ｗ/v）アルギネート溶液にて行う。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を、ＨＯＢｔと同様にして、ＥＤＣ効率を大きく高める共反応体として使用する。スルホ−ＮＨＳを反応溶液に加え、次いで、ペプチドおよびＥＤＣを加える。ウロン酸：ＥＤＣ：スルホ−ＮＨＳの比率は一定であるが、反応に利用するペプチドだけは変える。この化学は、図２に示したように、利用ペプチドと比べ、一貫して、６５−７５％結合効率を与える。この溶液を１４−１８時間反応させ、その時点でヒドロキシルアミンを加えて、未反応活性化スルホ−ＮＨＳ−エステルと再度生じたカルボキシレートを消滅させる。この溶液を３５００MWCO透析管にて再度十分に水で透析する。125Ｉ−標識ＧＲＧＤＹを利用する予備実験から、＜０．５％の未反応ペプチドが透析後に残っていることが示され、これは、相対的に純粋なアルギネート−ペプチド生成物であるといえる。透析した溶液を滅菌濾過し、凍結乾燥し、使用時まで乾燥貯蔵する。最近報告された技術（Klock et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 638-643, 1994）を使用して、アルギネート中のポリフェノール混入を検出できる。
アルギネートヒドロゲルの表面修飾のみは、試薬節約のため、２次元細胞培養実験用に行われるであろう。このプロセスは、滅菌濾過水溶液中で全ての反応体を用い、滅菌条件下で実施される。この反応は、上記ＭＥＳ緩衝液またはｄｉＨ2Ｏ中で実施してもよいが、結果、反応効率は１０倍下がる。125Ｉ実験は、バルク修飾アルギネートの場合と同様の反応効率を示す。架橋アルギネートゲルを平行ガラスプレートの間に２mm間隔で鋳込み、ディスクに円形パンチで穴をあける。１０または１２枚のディスクを上記と同じ比率の反応体を入れた反応溶液４０mlと共に５０ml遠心管に入れる。ディスクを水、次いでＤＭＥＭで入念に洗浄し、その後、細胞実験用の２４ウェルプレートに入れる。
反応条件は、反応緩衝液、ｐＨ、ＥＤＣ：ウロン酸比率を変えることにより最適化すると、典型的には６５および７５％の間のペプチド組込み効率が得られる。細胞表現型の重要なレギュレーターであり、後に生体物質に接着する細胞接着リガンドの密度は、５桁の密度範囲にわたって容易に変えることができる。アルギネートの表面結合並びにバルク結合はいずれもこのアプローチで容易に得ることができる。
実施例３：
アルギネートマトリックスへの３Ｔ３繊維芽細胞および骨格筋原細胞の接着は、培養で確認されている。図３を参照すると、接着リガンドのない対照のアルギネート表面では細胞接着は見られないが、血清含有培地でえも見られない。更に、骨格筋原細胞は、これらのマトリックス上で分化した表現型を示す。非修飾アルギネートヒドロゲル表面は細胞接着を支持しないため、このデータは、細胞分化に対する不溶性ＥＣＭシグナル形成が細胞接着リガンドの結合中に部分的に提供され得ることを示している。
実施例４：
下記の図式は、本発明のポリマー主鎖物質の一製法を示す：
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この図式は、グラフト共重合体の合成に使用され得る合成経路の例を示す。オリゴ−グルロネートは、グルロネート含量７０％のアルギネートの部分的加水分解により製造した。加水分解は、交互領域（Ｍ/Ｇ領域）で優先的に起こったため、オリゴ−マヌロネートとオリゴ−グルロネートの混合物ができた。後者を高度に酸性の条件での溶解度の差により他のオリゴマーから分離した。Penman A., Sanderson GR（1972）: A method for the determination of uronic acid sequence in alginates. Carbohydr. Res. 25: 273-282 and Haug A, Larson B., Smisrod O(1966): A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis. Acta Chem Scand 20: 183-190参照。ＰＶＡ（ポリ（ビニル）アルコール）は、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でＢＯＣ−グリシンに結合させた。反応混合物中のＢＯＣ−グリシン量により、後の工程で得られるグラフト共重合体の分枝比率を調節する。ＢＯＣ保護基を酸性条件下で除去すると、結果、ＰＶＡ上のグリシンのアミノ基によるカルボヒドレート還元末端の還元アミノ化によるオリゴ−グルロネートのグラフト形成により所望の共重合体が得られた。
実施例５：
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側鎖の組込みは、ＰＡＭに対するＧulの比率により、側鎖を持つ主鎖の１００％、５０％および１０％の部位でポリマーを提供するよう調節した。
実施例６：
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実施例７：
ポリサッカライド側鎖を付加する場合に樹枝状ポリマーを与えるための分枝状リンカー基を持つポリエチレングリコール（ＰＥＯ）主鎖（実施例８の図式参照）
樹枝状ポリマーは、２つ以上の異なる樹枝状ポリマーの側鎖間にカルシウムイオンが配位することにより網状組織を形成し得る。このリンカー基は加水分解可能であるため、分解可能である。
実施例８：
Ｇ−ブロックアルギネート鎖組込み用のポリマー主鎖としての樹枝状ポリリジンは、下記の図式に示すようにして製造した。リジンのアミノ基はＢoc基で保護するが、カルボキシル末端はペプチド結合をＤＣＣ/ＨＯＢt化学により実施するために非保護であった。まず、ＰＥＯ（８０００Ｍｗ）をジクロロメタン中di−Ｂoc保護リジンのヒドロキシスクシンアミドエステルに結合させた。エーテル洗浄ポリマーを、ＣＨ2Ｃｌ2中、２５％ＴＦＡに溶解して、Ｂoc基を除去する。、エーテル中に沈殿させて脱保護ペプチドを得、次の結合サイクルに備えた。過剰のＤＣＣ/ＨＯＢt活性化di−Ｂoc−リジンを用いて対応する遊離ポリアミンをポリマー支持体へ結合させ、エーテルから結晶化した後、ＰＥＯ−結合Ｇ１、Ｇ２およびＧ３デンドリマーがそれぞれ得られた。メタノール中ＰＥＯ−ペプチドコンジュゲートをヒドラジンで１時間処理して、ヒドラゾンペプチドデンドリマーを良好な収率で生成することにより、ポリマー支持体からペプチドを切断した。更に、遊離のヒドロキシル末端を持つＧ−２デンドリマーも、メタノール中水酸化ナトリウム水溶液で１時間処理することにより製造した。ＰＥＯ−Ｇｎ（ｎ＝０−３）は、申し分のないプロトンおよびカーボンＮＭＲスペクトルを示した。Ｇ−２およびＧ−３デンドリマーの純度および構造は、ＴＬＣ、元素分析および13Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析で確認した。
要約すると、分子量３０９６のＧ−３樹枝状ポリリジン（１５Ｌ−リジン単位）は、７工程で迅速に合成した。我々は、これらのデンドリマーがそのヘミアセタール末端を介してＧ−ブロック鎖に結合するよう設計した。このことは、シアン化ホウ化水素ナトリウムを用いる還元アミノ化により達成された。
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ＰＥＯ−リジンデンドリマーの合成。ａ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2。ｂ）Ｌ−リジン、ＤＣＣ、ＨＯＢＴ、ＣＨ2Ｃｌ2。
実施例９：
くし型ポリマーは、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を用いて製造した。ＰＶＡは、その特性が広範囲に変化し得る水溶性ポリマーの分類に属する。ＰＶＡは、その単量体が不安定であるため直接的には合成できない。アルコール分解、加水分解またはアミノリシスによるポリ（ビニルアセテート）の脱アセチル化によりＰＶＡが導かれる。親水性および水溶性は、加水分解の度合いと使用したポリ（ビニルアセテート）の分子量により容易に調節できる。ＰＶＡは、不安定な結合を持たないため、正確には生体内分解性ではないが、分子量＜２０ＫのＰＶＡは腎臓により浄化されるので、薬剤送達マトリックスおよび外科用人工器具として使用されてきた。
ＰＶＡ（ＭＷ＝９０００−１００００、８０％加水分解）は、ＤＭＦ中、下記の図式に示したＤＣＣ結合法を用いてＢoc−グリシンによりエステル化できる。Ｂoc−グリシン中のカルボン酸量に対するＰＶＡ中のヒドロキシル基の比率を変えることにより、程度の異なるグラフト形成（即ち、０．８、０．２５および０．１６）を達成できる。アミノ保護基（Ｂoc）は、ＣＨ2Ｃｌ2中トリフルオロ酢酸の利用により除去できる。ポリマーは、ＴＬＣ、ＦＴ−ＩＲ、1Ｈ−ＮＭＲおよび水性ＳＥＣなどの標準的な実験法により特性化する。第２の反応工程では、アミノ官能性ＰＶＡを還元アミノ化によりオリゴグルロネートに共有結合させることができる。
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ＤＭＦ中、ＰＶＡ１のＢoc−グリシン２によるエステル化、およびその後のＣＨ2Ｃｌ2中トリフルオロ酢酸により脱保護。
実施例１０：
製法１−水性アルギン酸ナトリウム（２％）のストック溶液５つをエルレンマイヤーフラスコ中で製造した。リジンエチルエステルを各溶液に加えて、次の比率：０、２５、５０、１００、１５０％リジン：ウロン酸モル比率を得た。リジンのモル量の２倍のＥＤＣおよびＨＯＢＴそれぞれを各溶液に加えた。混合物を入念に混合し、ペトリ皿に注いだ。次いで硫酸カルシウム粉末を加えて、溶液を２４−４８時間ゲル化した。各バッチから円形ディスクを作り、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させた。各ディスクの寸法および重量は、凍結乾燥の前後で測定した。
製法２−水性アルギン酸ナトリウム（２％）のストック溶液幾つかをエルレンマイヤーフラスコ中で製造した。選択した量のリジンエチルエステル（０、２５、５０、１００、１５０％リジン：ウロン酸モル比率）を各溶液に加え、２４時間撹拌した。各溶液をペトリ皿に注ぎ、直径３mmの層を作った。次いで、硫酸カルシウム粉末を層表面に加えて、ゲル化を誘導した。ゲルが硬化した後（２４−４８時間）、ゲル全体から円形ディスクを切り取った。各ディスク組を試験管に移した。次いで、ＥＤＣおよびＨＯＢＴを各試験管に加えた（リジン：ＥＤＣ：ＨＯＢＴ １：２：２モル比率）。ディスクを２４時間振盪させ、蒸留水で濯いだ。各ディスクの寸法および湿式重量を記録した。次いで、それぞれのディスクを凍らせ、凍結乾燥し、その後各ディスクの寸法および乾燥重量を記録した。
研究１：製法２を用いて様々な試薬の組合わせ（表Ａ参照）により製造したアルギネートゲルを、クエン酸ナトリウム溶液に曝してカルシウムのキレートを形成した後、その構造維持能力について試験する。対照アルギネートゲル（非架橋）は予想どおり溶解した。リジン中のアミノ基は保護されていてアルギネートのカルボン酸基と結合できないので、保護ｔ−bocリジンをこの研究の対照として使用した。ＥＤＣ単独を用いてリジンに架橋させたアルギネートゲルは溶解しなかったが、カルシウムキレート形成後のサイズは拡大した。これらの結果は、その構造が二価カチオン架橋とは独立して維持できるマトリックスをアルギネートゲルの架橋が導くことを確認するものであり、また、ＨＯＢＴ安定剤の存在により架橋が向上することも示している。
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研究２：アルギネートゲルは、リジンに対して様々な比率のアルギネートを用い、方法２により架橋させて、リジン含量に対してゲル安定性の用量依存性があるかどうかを測定した。ＥＤＣ単独（ＨＯＢＴなし）およびＥＤＣ＋ＨＯＢＴと架橋したゲルをクエン酸ナトリウムにさらし、膨張するか溶解するかについて試験した。ゲル溶解および安定性は、表Ｂに示したように、リジン含量と架橋条件の関数であった。
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研究３：リジンと架橋したアルギネートゲル（リジン含量１００％、ＥＤＣおよびＨＯＢＴと架橋）をスラブ状（初期容量５７６mm3）に切断し、凍結乾燥し、次いで、その形状記憶を試験した（図４参照）。乾燥マトリックス（図の右側）を圧縮し、内径１．５６mmの管（図の真中）（およそ４．５フレンチ−内視鏡的操作に典型的に利用される管径）に入れ、管の５cm長部分まで押し込んだ。次いで、マトリックスを水を含むペトリ皿に入れ、経時観測した。１時間後、これらのマトリックスはスラブ形状に戻り（図の左側）、この時点までにおよそ４００mm3（初期容量のおよそ７０％）の容量になった。強力に圧縮した後にこれらのマトリックスが元のおよその寸法および形状に戻る能力は、これらが顕著な形状記憶を持つことを示している。
研究４：架橋マトリックスの重要な特徴は、製造後に細胞と共に接種される能力である。架橋アルギネートゲル（リジン含量１００％、ＥＤＣ＋ＨＯＢＴと架橋）を凍結乾燥させ、滅菌した。マトリックスの走査性電子顕微鏡試験により、大きい孔を持つ高度に多孔性の物質であることが明らかになった（図５）。このマトリックスを組織培養培地（１０％ウシ血清を補足したＤＭＥＭ）中の平滑筋細胞の懸濁液に入れ、細胞浸潤について試験した。顕微鏡によるマトリックスの観察から、細胞懸濁液は架橋アルギネートマトリックスに吸収され、その結果、マトリックス全体に細胞が分布していることが示された（図示せず）。
研究５：２％アルギネートゲルを方法１を用いてリジン（リジン１００％）と架橋させたが、最大限に架橋させるために１０倍のＥＤＣおよび５倍のＨＯＢＴ濃度を使用した。２％アルギネート溶液２０g（およそ２０ml）を円錐ビーカー５０mlに加え、選択したリジン（リジン０％、１％、１０％、２５％、５０％および１００％、アルギネート単量体単位と比較）およびＨＯＢＴ量を加えた。溶液を十分に混合し、次いで、適量のＥＤＣを加えた。ＥＤＣ添加後直ちに、硫酸カルシウム０．１６８gを加え、円錐ビーカーを勢いよく１０ないし２０秒間振ってから溶液を注いだ。ゲルを約２．５mm間隔の平行プレートの間で３時間硬化させた。次いで、ディスクを打ち抜き、クエン酸ナトリウム（カルシウム除去のため）または０．１Ｍ塩化カルシウムのいずれかを１０秒間加えてから、蒸留水中で貯蔵した。カルシウム除去した場合のゲル安定性および機械的試験を全ての条件で行った。
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リジン含量の用量依存性は研究２から再確認したが、カルシウム除去の際に２５％以上の架橋ゲルが完全な安定性を示したとおり、架橋の度合いは増大した。ゲルディスクの圧縮率は、恐らくアルギネート中のカルシウム結合部位のリジン分解により、リジン含量の増大につれて減少した。興味深いことに、クエン酸ナトリウムでカルシウム除去すると、ゲルディスクの率は、リジン含量の増大につれて増大した。
実施例１１：
ジアミンとのアルギネート架橋は、０．３Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ７の０．１ＭＭＥＳ緩衝液中で実施する。様々なｐＨ、［ＮａＣｌ］およびＥＤＣ：ＨＯＢＴ：ウロン酸比率を用いてこの化学を最適化し、最大限の架橋が達成されるようにした。ＥＤＣは、ウロン酸のカルボキシル基と反応させて、アミンと反応性の活性化エステル中間体を作る。アミド結合形成との主たる競合反応は、水によるＥＤＣ中間体の加水分解であり、ＥＤＣ中間体の半減期は秒単位である（Hermanson, 1996，上記引用）。しかしながら、ＨＯＢｔまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドなどの共反応体を添加すると、ＥＤＣ活性化エステルと反応し、より長期間持続する中間体が作られ、より大きい反応効率が導かれる（Hermanson, 1996，上記引用）。
実施例１２：
ＰＥＧ架橋分子の反応図式は、下記に示すように、ポリ（エチレングリコール）（１）およびＮ−保護アミノ酸（２）のアルコール基と等モル量を加えること、およびＣＨ2Ｃｌ2中のＤＣＣおよびＤＭＡＰによる直接結合を介するエステル化を含む。化合物（３）におけるＢＯＣ保護基の脱保護は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の利用により実施する。アルギネートのカルボキシル基と修飾ＰＥＧ分子の１級アミノ基との架橋反応は、インシツでのヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステルの形成、その後の結合剤ＥＤＣの添加により、実施する。官能性を与えたＰＥＧは、液体カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＴＬＣ、ＦＴ−ＩＲ、1Ｈ−ＮＭＲおよび元素分析などの標準的な実験法を利用して特性化する。ポリマーの分子量分布、並びに構造情報は、水溶液中でのＧＰＣ測定により測定する。我々は、絶対分子量を得るために、ＳＥＣ3（ＲＩ、Viscometer, RALLS）として知られている比較的新しい技術を利用しているため、標準とサンプルが同じ分子構造を持つという仮定は排除している。
分子量ＭＷ２００、４００、６００および１０００のポリ（エチレングリコール）は、Lancaster Synthesis Inc.から入手した。ＭＷ３４００のＰＥＧと１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）は、Aldrich Chemical Company社のものである。Ｎ−ｔ−boc−グリシン（９８％）、トリフルオロ酢酸および１−エチル−３−［３−ジメチルアミノ−プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）は、Sigma, St. Louis, MOから得た。
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反応溶液を平行ガラスの間に１２−１６時間鋳込み、規定の形状をこれらのヒドロゲルシートから切り抜くことができる。規定の形状は、反応溶液を所望の形状の型に鋳込み、架橋反応を起こさせることによっても形成できる。得られたヒドロゲルの機械特性（弾性率、剪断率、最大真正応力、最大伸張力）および膨張特性の特徴を記録する。リジンと分子量２００、４００、６００、１０００および３４００の修飾アミノ末端ＰＥＧのメチルエステルを用いて、アミノ：カルボキシル基の比率３−５０％でアルギネートを架橋した。
実施例１３：
リジン架橋アルギネート。アルギネートヒドロゲルをリジンのメチルエステルと架橋させた。ｐＨ、反応緩衝液のイオン強度およびＥＤＣ：ＨＯＢＴ：ウロン酸比率を変えて、カルボジイミド化学を最適化し、最大効率の架橋が達成されるようにした。ヒドロゲル網状組織の機械的仕組みは、架橋のために利用できるリジンの量を変えることにより調節できる（図６）。ヒドロゲルの弾性率は、リジン含量が３５％に増大するのにつれて増大するが、その後、更にリジンを加えると低下する。この弾性率の低下は、網状組織の機械的特性に寄与せず、この場合は、実際に剪断数の欠損による機械的仕組みを損なう、多くのダングリング半反応リジンや弾力的に効果のないループを含む網状組織欠損の増大に起因する。
弾性率により示される硬さ、並びに強度および弾性を含む機械的特性は、反応に利用するリジンの量を変えることにより調節できる。
リジン架橋ヒドロゲルの膨張能力は、既知量の架橋アルギネートが吸収する水の容量を測ることにより、測定した。膨張したヒドロゲルディスクを直径１５．７mmに切り抜き、タオル乾燥させ、水およびポリマーの重量を測定した。次いで、ディスクを凍らせ、凍結乾燥して、ヒドロゲルから全ての水を除去し、凍結乾燥後、非常に多孔性の綿毛状ディスクを残した。ヒドロゲルの初期湿式重量を乾燥ディスクの乾燥重量で割って、膨張率を定めた（図７）。リジン架橋アルギネートヒドロゲルの膨張能は、架橋の増大と共に低下する。架橋アルギネートはいとも簡単に、その質量の２０００倍以上の水を吸収し、これは、超吸収物質（例えば、使い捨てダイヤパー）として有用であることを示している。より高度に架橋したゲルは、その重量のおよそ７０倍の水を吸収し、中間体架橋密度範囲はこれら２つの極値の間であった。次いで、乾燥ディスクをdiＨ2Ｏで４８時間かけて再度湿らせて、重量を測り、凍結乾燥ディスクが最初に収容した量に匹敵する量の水を吸収できるかどうかを測定した。凍結乾燥ディスクは、最初に収容した量に対し＋/−約１０％のほぼ同量の水を吸収できた。より高度に架橋したゲル（リジン７５％）は、およそ１０％以下の水を吸収し、軽度に架橋したゲル（リジン１−２０％）は、初期測定値よりも１０％多く吸収した。乾燥させると、アルギネート網状組織層は分離して、高度に多孔性のスポンジとなる。再水和後、最初の数時間以内にスポンジをタオル上に置くと、スポンジに吸収されたかなりの水が除去され得るので、水和した網状組織微細構造は、再水和すると直ちに再形成するのではないらしい。しかしながら、吸収後４８時間後、乾燥タオルにさらした場合に構造から除去できた水は全くなく、これは、水和した網状組織構造が戻ることを示している。
実施例１４：
高度に架橋したアルギネートマトリックスは、特定の応用に有利な形状記憶特性を示す。凍結乾燥アルギネートマトリックスは、水にさらすと、親水性スポンジとして働き、殆ど即座に水和する。形状記憶特性を示すために、５０％リジン架橋スポンジを圧縮し、細い筒状に巻き上げ、３mmＩＤシリコン管に入れて、実験台上で内視鏡送達の真似をした。巻き上げたマトリックスを可撓性のテフロン糸（１．３mmＯＤ）で管中に押し込み、再水和するとそれらは数秒間以内にその最初の形状および寸法に戻った。圧縮ディスクの水吸収特性は、（上記膨張研究での）非圧縮ディスクと同様であり、２４時間後、最初の水含量の９０％程度を吸収する。
実施例１５：
アルギネート網状組織中の架橋間の分子量は、剪断率と膨張測定値から直接算出し（Peppas and Merrill, J. Appl. Polym. Sci. 21: 1763-17701, 1977）、機能的架橋（間鎖）の密度を評価した。その後、この数を化学的に測定した架橋（内部および間鎖）の総数と比較できる。Ｍcの計算は、関係式：
Ｇ＝ＲＴＣr/Ｍc（１−２Ｍc/Ｍn）Ｑ-1/3      等式１
式中、Ｇは剪断率であり、ＲおよびＴは、それぞれ気体定数およびケルビン温度であり、Ｃrは架橋溶液中のポリマー濃度であり、Ｍcは架橋間の分子量であり、Ｍnは天然ポリマーの数平均分子量である、
を用いて行った。Ｑは
Ｑ＝ｖr/ｖs      等式２
式中、ｖrは非膨張架橋ゲルにおけるポリマーの容量フラクションであり、ｖsは膨張ゲルの容量フラクションである、
と定義される膨張比率である。Ｇは、応力対−（λ−１/λ2）、ここで、
λ＝Ｌ/Ｌo      等式３
ＬoおよびＬは、それぞれ圧縮前および圧縮中のゲルの厚さである、をプロットすることにより、圧縮試験の応力−ひずみデータを操作して得られる。
これらの計算値は、Ｍｃが、最も高いリジン架橋アルギネートの場合の１５００から、最も低い架橋（リジン１％）アルギネートの場合のおよそ２５，０００までの範囲であることを示す。
実施例１６：
ポリエチレングリコール架橋アルギネート中の架橋分子の分子量を変えることにより、Ｍｃを変える研究も行った。これらの研究では、我々の実験室で架橋分子として合成したＰＥＧジアミンを利用した。アルギネートゲルの圧縮率は、分子量１０００までの架橋分子中の繰返し単位の数と共に増大した。図８参照。圧縮における弾性率［ＫＰａ］対架橋分子中の繰返し単位数を示す。等モル量の各単量体を各反応に使用した。これは、直接、架橋ＰＥＧの分子量、または高い反応度をもたらす架橋分子の可撓性増大と相関し得る（Allen et al, Macromolecules, 22: 809-816, 1989）。架橋分子の分子量の更なる低下と共に率も低下した。架橋密度を変える（分子量１０００のＰＥＧを用いる）と、再び、ゲルの硬さに強い影響が出た。リジンの場合の結果と同様、率の増大は、ある程度の架橋までは注目されたが、その後、更に架橋すると低下した。図９は、分子量１０００のＰＥＧを架橋分子として利用する弾性率対架橋密度［％］を示す。この率の低下もまた、機械的仕組みから損なう多くのダングリング半反応ＰＥＧを含む、より高いＰＥＧジアミン濃度の網状組織欠損における増大に起因するようである。
実施例１７：
架橋ポリアルデヒドアルギネート（ＰＡＡ）。共有架橋アルギネートに対する新たなアプローチは、アルギネートを酸化し、これを二官能性クロスリンカーと架橋させて、ヒドロゲルを形成することである。この場合、アルギネート１を下記のように過ヨウ素酸ナトリウム酸化により周辺温度で誘導体化して、限定酸化生成物２を得た。反応は、ＦＴＩＲによるアルデヒドの対称振動バンド（カルボニル）現象により追跡した。次いで、限定酸化アルギネートをアルデヒド基を介してアジピン酸二水和物と架橋させ、ヒドロゲル３を形成した。この操作後は、１７３５cm-1の対称振動バンドは消滅した。
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さらに、制限的酸化アルギネートをアジピン酸ジヒドラジドと種々の％w/wのアルギネートで架橋させた。得たゲルの圧縮率を測定し、評価した（図１０）。ゲル化は３％w/wアルギネートでは２００ｋＰａの架橋で生じ、アルギネートの％を増すと１０％w/wアルギネートで９００ｋＰａに達した。この架橋方法はアルギネートに基づくバイオ物質の機械的強度を広範にコントロール（７００ｋＰａ）することを提供する。
架橋制限的酸化アルギネートの機械的強度は架橋剤の濃度および最終ゲルのカルシウムイオン濃度にも依存する。圧縮率はゲル中のアジピン酸ジヒドラジドの濃度と共に増加する。例えば２５mMのアジピン酸ジヒドラジドでは、圧縮率は２００ｋＰａであり、１５０mMでは１００ｋＰａに増加する。また、カルシウムイオン濃度が１０mMから３０mMに増すにつれて、圧縮率が２５０ｋＰａの顕著な増加が認められた（図１２）。
実施例１８
アルギネートのゲル化を行なうポリグルロネートを単離し、誘導し、架橋すると、ヒドロゲルを形成し、これは実施例１７に示す図と同様であるが、非架橋物質についてである。１で示すポリグルロネートナトリウムを改良法（Haug,A.；Larsen,B.：Smidsrod,O.Acta Chem.Scand．１９６６，２０，１８３-１９０；and Haug,A.；Larsen,B.：Smidsrod,O.Acta Chem.Scand．１９６７，２１，６９１-７０４）に従って酸加水分解によりアルギネートから単離した。この産物をＦＴＩＲ、Ｈ−ＮＭＲで特性を測定したところ、すでに報告されている特性（Penman,A.；Sanderson,G.R.Carbohyd.Res．１９７２，２５，２７３-２８２）とよく相関した。ポリグルロネートナトリウムを室温で過ヨウ素酸ナトリウム酸化で誘導し、ポリアルデヒドグルロネート塩を（ＰＡＧ，２と示す）得た。酸化の程度は各反応に用いたモル当量過ヨウ素酸塩により調節した。反応はＦＴＩＲでのアルデヒド対称振動バンド（カルボニル）の状態で監視した。ＰＡＧをアジピン酸ジヒドラジドと架橋すると、ヒドロゲル（３と示す）を形成した。この工程は対称振動バンドが１７３５cm-1で消失した後に行なった。
分子プローブおよびタンパク質のプロテオグリカン上への固定化についての共通の方法は、シップの形成を経る結合すなわちヒドラゾン架橋化に続くプロテログリカンのポリサッカライド部分の部分的過ヨウ素酸酸化である。この架橋はヒドロゲルの機械的安定性および強度について、イオン性架橋に併せて、コントロールの追加的レベルを提供する。
実施例１９
ある物質のゲル性質についての要因を理解するためには、得たゲルにおけるポリアルデヒドグルロネート、アジピン酸ジヒドラジドおよびカルシウムイオンの濃度を変えて効果を調べることが欠かせない。従ってここでは、種々の濃度のポリアルデヒドグルロネートでゲルを架橋し、圧縮率を測定して、それを最終％w/wＰＡＧに対してプロットした（参照、図１３）。４％w/w以下のＰＡＧでは、４８時間の間隙をおいても、ヒドロゲルが形成しなかったが、架橋したポリアルデヒドグルロネートは５％w/wＰＡＧでゲル化が始まり、圧縮率は８２ｋＰａであった。圧縮率は最終ゲルのＰＡＧ量と共に増加し、１０％w/wＰＡＧでは８８０ｋＰａに達した。このことは、アルデヒド官能基の数がゲル中のＰＡＧ量と共に増加することから予測された。結果として、最終ゲルの％w/wＰＡＧを変えることによって、対応するゲルの弾性および強度のコントロールを提供できる。
ゲルの機械的強度を架橋の程度が増すことで増加できる。ここでは、種々の濃度のアジピン酸ジヒドラジドで６％w/wＰＡＧを架橋し、圧縮率を調べた。その結果、アジピン酸ジヒドラジドの濃度を増加すると６％w/wＰＡＧの圧縮率が増加することが分かった。最適値５６０ｋＰａは１５０mMアジピン酸ジヒドラジドの濃度で得られた。アジピン酸ジヒドラジドの濃度をさらに増すと圧縮率は３５０ｋＰａに低下した（参照、図１４）。理論的に、ヒドラジド官能基の量がポリマー中のアルデヒド数を越えると、架橋の効率が低下するはずである。換言すると、高アジピン酸ジヒドラジド高濃度では、架橋剤は１つのアルデヒド基とのみ反応し、他の末端基は反応しない。結果として、官能架橋の程度は、アジピン酸ジヒドラジドの取りこみ量が増加しても、低下する。
非修飾アルギネートに比して、架橋ポリアルデヒドグルロネートは、これらの物質中に存在するカルシウムイオン量によってもコントロールされ得る。ＰＡＧ（６％w/w）を種々の濃度の塩化カルシウムおよび塩化ナトリウム（例えば、１０、２０、４０、８０および１００mM）でアジピン酸ジヒドラジド（１５０mM）と架橋させた。得たゲルの圧縮率はカルシウム濃度が増加すると共に増加し、最適値６００ｋＰａは１０mM塩化カルシウムで得られた（参照、図１５、図中、白四角□は塩化ナトリウム、黒四角■は塩化カルシウムを示す）。これ以上の濃度では、圧縮率に統計的差異がなかった。このことは、イオン架橋がアルギネートの場合と同様にこれら物質の機械的性質をコントロールし得ることを示している。圧縮率におけるイオン強度の寄与をなくするために、上記と同じ濃度で塩化ナトリウムの存在でＰＡＧを架橋した。ナトリウムイオンを増すと圧縮率に小さい増加が最初に認められたが、圧縮率は３９０ｋＰａに止まっていた。カルシウムとナトリウムイオンとの間で２１０ｋＰａの有意の差異があった。圧縮率についてこの差異（１５０ｋＰａ）は、カルシウムの存在がこれらの物質の機械的強度に寄与していることを明らかにしている。
これらの物質の考えられる利用は、上記したように細胞移植のための３次元的マトリックスとしての使用である。これらの物質における細胞の生存および増殖を確かめるために、生理的条件（ｐＨ７．４）におけるゲル化の挙動を調べる必要があった。これらの物質をｐＨ７．４に調節すると圧縮率にわずかな低下がみられた。例えば、ｐＨ７．４では５％w/wＰＡＧでゲルは形成せず、より低いｐＨでは５％w/wＰＡＧでゲル形成が始まる（図１６、図中、白四角□はｐＨ７．４、黒四角■はｐＨ<７を示す。）さらに元の条件で８８０ｋｐａであるに対し、１０％w/wＰＡＧでは６００ｋＰａであった。このことは、ヒドラジド基とアルデヒドの反応性がより低いｐＨで適していることがよく知られているので、予測された。酸性条件では、アルデヒドはプロトン化され、ヒドラジン基による求核攻撃を受けやすい。しかし、塩基性から中性の条件では、反応速度は遅く、長い時間を反応完結に要する。これは、架橋が低程度であると圧縮率を低下せしめることとなる。
これらの物質の架橋の程度はポリグルロネート鎖の酸化程度を変えることで調節できる（参照、Painter，Ｔ．；Larsen、B. Carbohyd. Res. 1969,10,186-187；Painter,T.Larsen,B.Acta Chem.Scand.1970,24,813-833；and,Ishak,M.F.；Painter,T.Acta Chem.Scand.1971,25,3875-3877）。これは、架橋に利用できるポリグルロネート鎖上のアルデヒド・ユニットの数について今一つのコントロールを提供する。結果として、２４ウエルプレートにおいて種々の量の過ヨウ素酸ナトリウムを用いてポリグルロネートを酸化し、１０％w/wＰＡＧで最適濃度１５０mMのアジピン酸ジヒドラジドと架橋した。すべてのゲル化物質は２０％理論上酸化で出発し、圧縮率は５００ｋＰａであった（参照、図１７）。ポリグルロネートの酸化％を増すと圧縮率は、１００％理論酸化で最大値１０００ｋＰａに達した。この結果から明らかなように、広範な機械的安定性がポリグルロネートの酸化程度を変えることで達成された。架橋２０％酸化ＰＡＧはアルギネートに匹敵する弱いゲルであり、８０％以上の酸化ＰＡＧは高い圧縮率を有し、堅くそしてもろい。これらの特性は、細胞固定のためのバイオ物質をつくるのに大変望ましい。ポリマーの酸化の程度に従って、特別の小孔サイズおよび機械的強度を有する物が、移植部位への細胞および薬剤を運ぶがために提供される。
実施例２０
細胞移植における重要な問題は、非架橋モノマー中に存在する細胞が架橋反応によって損傷を受けないかと言うことである。平滑筋（ラット大動脈より）をＰＡＧ液に入れ、アジピン酸ジヒドラジドを加えて架橋した。ゲル中への平滑筋の組みこみはほぼ１００％であり、細胞数および細胞の代謝活性は試験の７日間保持された。この結果から、この化学的性質で架橋された物質（ＰＡＡポリマーも同じ架橋を用いる）中に細胞を移植できることが分かった。細胞が接着リガンドを含有していないので、これらのマトリックス中で細胞が増殖するのは期待しなかった。また何らの増殖も認めなかった。ＰＧＤ含有および他の細胞接着ポリペプチドは、上記したようにこれらのポリマーと容易に結合でき、細胞間作用を高める。約７０％の結合効率がアルギネートについて最適の結合のための化学条件を用いて達成されている。
実施例２１
これらのポリマーについて、脈管形成因子のための運搬担体としての適合性も調べた。ＶＥＧＦをＰＡＧと混合し、ＰＡＧを架橋した。ＶＥＧＦの放出を125Ｉ−ＶＥＧＦの痕跡量を加えることで監視した。塩化カルシウムの存在下に125Ｉ−ＶＥＧＦを含むアジピン酸ジヒドラジドでＰＡＧ（２０％w/w）を架橋し、混合物を１時間置いてゲルとし、次いでＤＭＥＭ培地で３７℃でインキュベートした。この培地を新しい培地に移し、その放射活性を計数した。すべての実験条件でＶＥＧＦの放出は、僅かまたはほとんどなかった（参照、図１８、図中、白四角□はヘパリンと共に、黒四角■はヘパリンなしである）ヘパリンの存在で、ＶＥＧＦの放出は５日間で組みこみ生長因子の計７％／日であり、次の１４日間は２％／日の遅い放出であった。ヘパリンの不存在で、最初の５日間は９％／日の高い放出であり、次の１４日間はまた２％／日の低い放出であった。
実施例２２
ポリアルデヒドグルロネートを１０％w/wＰＡＧで塩化カルシウムの存在でアジピン酸ジヒドラジドと架橋した。これらの物質からの125Ｉ−ＶＥＧＦの放出は、ヘパリンの存在および不存在の両方で低かった。ヘパリンの存在で、ＶＥＧＦは最初５日間は４％／日で放出され、次の１４日間は０．２％／日と放出は遅かった（参照、図１９、図中、白四角□はヘパリンと共に、黒四角■はヘパリンなしである）ヘパリンの不存在で、ＶＥＧＦは最初５日間は６％／日で放出され、次の１４日間は０．８％／日で放出された。これらの実験から、カルシウムおよびヘパリンの存在を調節することにより、これらの物質からのＶＥＧＦの放出速度をコントロールすることができるのが分かる。放出はＰＡＧの濃度および架橋の密度に大きく依存し、これらを変えることでヒドロゲル中の小孔サイズを調節し得ると思われる。これらの値を変えることで、非常に広範な放出速度を得ることができる。
実施例２３
細胞接着リガンドＧＲＧＤＹをアルギネートの結合に用いたのと同じ型のＥＤＣ化学条件でポリグルロネートナトリウムおよびＰＡＧに結合した。結合の程度の監視をするために、接着ペプチドに痕跡量の125Ｉ−ＧＲＧＤＹを混合し、混合物２回蒸留水で透析した。透析液を液体シンティレーション計数器で測定し、存在する放射活性物質の量を決めた。ＥＤＣの不存在では、ポリグルロネートナトリウム中に僅か１．５％ＧＲＧＤＹが存在したが、ＥＤＣが存在すると、６１％のペプチドが取りこまれた（図２０）。ＰＡＧ物質において、５５％のＧＲＧＤＹがＥＤＣにとりこまれたのに対し、ＥＤＣの不存在では２４％であった。
このリガンドをＰＡＧに結合さすのに異なる化学条件を用いた。ここではＰＡＧ物質に豊富なアルデヒド基およびペプチド末端上のアミノ官能基の還元的アミン結合を用いた。基本的に、アミンをアルデヒドと反応さすと、不安定なイミノ結合を形成し、シアノボロヒドリドナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を用いて還元すると安定なアミノ結合を形成した。ペプチドのＰＡＧ物質への取りこみ率は６５％である。ペプチドのアミノ末端とのイミン結合はペプチドを結合するのに用いられる。この反応はペプチドのいくつかと関連して、活性化したカルボキシル酸基との反応を防ぎ、低程度のペプチド取りこみをもたらす。同じ反応は基本的にいかなる添加物もなしにペプチド取りこみ（２４％）についての理由を説明している。
この新しい結合化学条件は、他のペプチド、タンパク質（例えば生長因子）または薬剤をＰＡＧおよび制限的酸化アルギネート化学的に結合せしめるのに用いられる。この反応が結合分子を分解し、放出する不安定な結合を形成することが重要である。このことにより、薬剤がマトリックスからゆるやかに放出され、分散が両工程によってコントロールされる。この結合はシアノボロヒドリドナトリウムにより容易に還元されて、もし結合分子を結合のままで留めようとするなら（例えば、細胞接着リガンド）、非常に安定な結合を生じる。アミノ基を有するすべての生長因子はこの反応で結合できる。強力に使用できる薬剤は、例えば下記の図式によるイミノ結合形成で利用されるアミノ基を有する。アミノ基に加えて、生長ホルモンおよぴ薬剤は修飾されて遊離のヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバヂドと結合し、夫々ヒドラゾンまたはセミカルバゾンを形成する。これによって薬剤またはホルモンの種々の放出が可能となり、従って放出速度についての他のレベルでのコントロールを提供する。
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制限的酸化アルギネートにおけるＶＥＧＦ取りこみと物質マトリックス
実施例２４
ＰＥＧヒドラジド架橋剤、ＰＡＧはアジピン酸ジヒドラジドと架橋できる。ヒドラジド架橋剤はポリエチレングリコールコアから出発して種々の長さで合成できる。分子量２００、４００、１０００および３４００のポリエチレングリコール、ＰＥＧを無水コハク酸とＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下に反応せしめると、ポリ（エチレングリコールジサクシネート）が形成する。
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ＰＥＧコアとコハク酸基との間に形成されたエステル結合はバイオ分解性である。ヒドラジンはＤＣＣ化学条件を用いてこれらのポリマーの末端を結合して、ポリエチレングリコールヒドラジドが得られる。種々の分子量のＰＥＧから出発して、種々の長さのジヒドラジト架橋剤が合成され得る。これらのポリマーは架橋ポリエチレングリコール、ＰＡＧに用いられる。
実施例２５
ＰＡＧ物質の分解性をよりコントロールするために非分解性コアで架橋剤で合成する方法が提供される。種々の分子量のＰＥＧとメチルクロロアセテートとの反応はジカルボキシメチルＰＥＧを形成し、これは両末端でヒドラジンと結合し、ＰＥＧジヒドラジドが得られる。これらのヒドラジドはエーテル結合がある非分解性コアを有する。上記のように、出発ＰＥＧポリマーの分子量を調節すると、種々の鎖長を有するＰＥＧジヒドラジドが得られる。
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これらのジヒドラジドは架橋ＰＡＧに用いられ、ヒドラゾン結合である１つのみの分解性結合を有する物質をつくる。この結合はポロハイドリド還元でさらに安定化され、非分解性の物質が得られる。ここでは、ＰＡＧポリマーをジヒドラジドと架橋すると非分解性物質、ヒドラゾン分解性結合を有する物質、またはヒドラゾンとエステル結合の両方が分解性である物質が形成する。この方法は種々の速度の分解性を有する物質を提供する。さらに、ＰＥＧポリマーの適当な長さを選ぶことで、得る架橋バイオ物質の機械的性質をコントロールすることができる。
実施例２６
光線重合性ポリグルロネートは、ヒドラジドアクリル酸モノマーをアルデヒド末端を経由したＧブロックポリグルロネートに結合さすことから合成される。これらの物質は望む部位に注入されて光線化学的に重合されて、ヒドロゲルを形成する。ヒドラジドアクリル酸塩はアクリロイルクロライドおよびｔ−ブチルカルバゼートから出発して、保護されたヒドラジドアクリル酸を形成する。
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トリフルオロ酢酸ＴＦＡを用いて脱保護すると望むモノマーが得られる。この方法はＧ−ブロックを望む部位に運び、光線による遊離ラジカル重合を経て重合化する手段を提供する。ＰＡＧにおけるようにヒドラジドはアルデヒドと反応する。本例において、ヒドラジドはＧブロッグのヘミアセタル末端と反応してＧブロック鎖上状にアクリルヒドラゾン末端を形成する。ヒドラジドアクリル酸塩は、Ｇブロック中にそれらの官能基を取りこみやすいことから、選択された。
これらの物質はあらかじめ望む形に重合化でき、細胞移植のための３次元マトリックスとして用いるか、あるいは細胞と混合して、溶液として移植部位に注入される。アクリル酸基の光線誘発遊離基重合は非分解性のバックボーンを提供する。
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これらのモノマーは、アクリル酸、アクリルアミド、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ＨＰＭＡ、アリルアミン、ジメチルアリルアミンまたは同じ官能性を有する他のモノマーと共重合することができる。Ｇブロックの取りこみの程度は、用いる共ポリマーの％を変えることによりコントロールできる。
実施例２７
開始剤として過硫酸アンモニウムを用いて水溶液中でジアリルジメチルアンモニウムクロライドモノマーおよびアリルジメチルアンモニウムクライドとＧ−ブロックヒドラジドアクリル酸との共重合は、種々の剛性バックボーン構造を有するＧブロック取りこみポリマーを提供する。
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重合後に形成したピロリジンユニットは、その環状構造によりポリマーの運動性を制限し、バックボーンにさらに剛性を付与する。バックボーンの堅さは、取りこまれるジアリルジメチルアンモニウムクロライドの％によってコントロールされる。
これらのポリマーの他の合成方法は、ヒドラジドアクリル酸塩をジアリルジメチルアンモニウムクロライドおよびアリルジメチルアンモニウムクロライドモノマーと予め重合せしめることである。
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重合は水溶液中で過硫酸アンモニウムを用いて行なわれる。その後、Ｇブロックをヒドラジド基に結合すると分解性ヒドラゾン結合が形成する。ヒドラゾン結合をシアノボロヒドリドナトリウムで還元すると、より安定なヒドラジド結合が形成する。
実施例２８
ポリアクリル酸塩および誘導体の機械的強度をコントロールする一般的方法は、これらのポリマーをアクリル酸に基づく架橋剤で架橋することである。
（Naghash et al.,Polymer，１１８７−１１９６，１９９７；Dietz and Peppas,Polymer，３７６７−３７８１，１９９７）。エチレングリコールジメタアクリレート、ヘキサエチレングリコールジメタアクリレートおよび他の２価の官能性または多官能性架橋剤がＧブロックヒドラジドアクリル酸モノマーを架橋する。
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さらに、最終産物における架橋剤の％をコントロールすることにより、得るポリマーの機械的性質をコントロールできる。
実施例２９
樹枝状ポリマーはＧブロックをＰＥＧ−リジン樹枝状ポリマーに結合することにより提供される。モノサッカライドおよびポリサッカライドのヘミアセタール末端がオープンアルデヒド型に均衡していることはよく知られている。
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さらに、アミンのアルデヒドとの反応も均衡している。シアノボロヒドリドナトリウムの存在下で、アミンとアルデヒドから形成したイミノ結合は、よりアルデヒドを形成する均衡に変わり、反応を完結に導く。しかし、この工程は緩やかであり、Gブロックを種々のポリマーに結合するには、より速いかつ効率的な方法を要する。それで、ヒドラジド官能基を用いて、この結合を行なう。ヒドラジン、ヒドラジトおよびセミカルバシドをアルデヒドと反応さすと、イミノ様結合が形成する。この方法はボロヒドリドの存在に依存しない。ヒドラジド部分はアミンよりも求核的であり、カルボニル基のような電子吸引核をより速く攻撃できる。さらに、シアノボロハイドリドナトリウムは後に用いられて、ヒドラゾンまたはセミカルバゾン架橋に安定性をもたらす。
実施例３０
Ｇブロック結合のための末端に活性官能基を有するデントリマーを、リジンデントリマーで用いたのと同じ方法およびセミカルバジド末端に修飾した末端基を使用して、合成した。
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上記のように、ポリエチレングリコール、ＰＥＧから出発し、ＤＣＣ化学条件を経て（Ｂｏｃ）2−リジンに結合し、トリフルオロ酢酸、ＴＦＡで脱保護し、ＰＥＧジリジネートを形成せしめた。ＰＥＧジリジネートを過剰のアルキルジイソシアネートに反応さすと、末端にイソシアネート基を有するポリマーが得られる。イソシアネート基をヒドラジンと反応さすと、Ｇブロックを結合するのに利用できるセミカルバジド基を有する修飾デントリマーが最終的に得られる。同じ方法が基本的に用いられ、ＰＥＧヘキサリジネート、ＰＥＧオクタリジネート等が合成される。
実施例３１
櫛状ポリマー：モノサッカライドおよびオリゴサッカライドが適切にポリアクリルアミドのバックボーン中に取りこまれる（Callstrom and Bednarski, MRS Bullerin：５４−５９，１９９２）。同様の方法がＧブロックをいくつかの合成ポリマーのバックボーン中に取りこむのに用いられる。３種の方法が新しいバイオ物質を合成するのに行なわれる。第１は、Ｇブロック鎖が結合されたヒドラジド基で官能化されたポリ（ビニルアルコール）バックボーン結合のために活性ヒドラジド基を取りこむように修飾されたポリ（アリルアミン）バックボーンを用いる。これらのバックボーンは、バイオ適合性であり、分子量１０，０００以下であって腎臓から容易に排出されることから、選ばれる。第３の方法は、ポリグルロネートをポリアルデヒドグルロネートに結合することに関する。これはアルギネート誘導分子を完全に含有するポリマーの形成をもたらす。
ＰＶＡに基づく物質
低分子のポリ（ビニルアルコール）、ＰＶＡは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＡＰの存在下でコハク酸無水物と反応させて修飾すると、ポリ（ビニルサクシネート）中間体が得られる。
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ＰＶＡとサクシネート基との間に形成したエステル結合は、生体系において酵素的分解をおこしやすいバイオ分解性結合である。次いで、ヒドラジンをＤＤＣ結合を経てこの中間体に結合すると、ポリ（ビニルヒドラジドサクシネート）を形成する。従って、ヒドラジド取りこみの程度は最終産物において、前の反応で用いたコハク酸無水物の数量をコントロールすることにより、コントロールできる。ヒドラジド取りこみの程度をコントロールすることは、次の工程におけるＧブロックの程度を読みとることになるので、重要である。
ＰＶＡバックボーン中に取りこまれ得る他のヒドラジド基は、オキサリルジヒドラジド（ｎ＝０）、マロン酸ジヒドラジド（ｎ＝１）、コハク酸ジヒドラシド（ｎ＝２）、アジピン酸ジヒドラジド（ｎ＝４）、スベリン酸ジヒドラジド（ｎ＝６）などである。これらのジヒドラジドは、ＰＶＡバックボーンとＧブロック鎖との間に取りこまれるスペーサー・アームについて種々の長さを提供する。
アルデヒド基に対するヒドラジドの反応性からして、ヘミアセタール末端を経るこのポリマーへＧブロック鎖を接着するのに同じ方法が用いられる。これは、分解性結合を経てＧブロックが架橋する合成バックボーンポリマーを提供する。
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この架橋は、シアノポロヒドリドナトリウムによる還元でさらに安定となる。最終産物におけるＧブロック取りこみの程度は、形成したヒドロゲルのゲル性質および強度との直接的関係を表す。
ポリ（アリルアミン）に基づく物質
同様の方法を用いて、ポリ（アリルアミン）をコハク酸無水物と反応せしめ、次いでカルボジイミドを用いるヒドラジド取りこみを行ない、ポリ（Ｎ−アリルサクシンアミドヒドラジド）が形成される。
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上述の例における様に、反応性ヒドラジド基はヘミアセタール末端を経てＧブロックをポリマーバックボーンに接着せしめる手段を提供する。ＰＶＡに基づく物質と異なり、ポリ（アリルアミン）とサクシネート基の間に形成したアミド結合は非分解性結合である。
Ｇブロックの両ポリマーバックボーンへの結合はヒドラゾンの形でバイオ分解性の架橋を形成する。
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これらの架橋はシアノボロヒドリドナトリウムでさらに還元されて、非分解性の安定なヒドラジン架橋を形成する。従って、合成法による種々の程度の分解性を有するバイオ物質を得ることができる。
ＰＡＧに基づく櫛型ポリマー
ポリアルデヒドグルロネート、ＰＡＧをヒドラジンおよびボロヒドリドナトリウムと反応せしめると、ポリヒドラジノグルロネート誘導体が得られる。このアルギネート誘導ポリマー上のヒドラジン基は、ヘミアセタール末端を経てＧブロック鎖を取りこむのに用いられる。
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これは、加水分解性ヒドラゾン架橋を有する天然由来のポリサッカライドからバイオ適合性およびバイオ分解性の物質を提供する。この物質中のヒドラゾンの加水分解は、腎臓から排出され得る短鎖のポリサッカライドをもたらす。さらに、ボロヒドリドでヒドラゾンを還元すると、非分解性物質を提供する化学的に安定なヒドラジン結合が形成される。これはさらに、天然ポリサッカライド由来のバイオ分解性および非分解性の両方の物質を提供する。
上記の実施例で用いた本発明に関する一般的または特殊的な反応物質および操作条件を変えることによって、同様の適切さで、上記実施例を再現することができる。
上述のことから、当業者は、本発明の基本的特性を容易に確認することができ、その精神および範囲を逸脱することなく、種々の利用法および条件に適合するように本発明を様々に変更あるいは修飾することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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