(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化グルクロノフカン又はその塩：
（１）構成糖：フコースとグルクロン酸を含有し、そのモル比が３５〜４４：１０である、
（２）下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。：
【化１】
0004331912.tif 000063
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈ又はＣＨ３ＣＯである）
【請求項２】
ｎが１〜５０００の範囲であることを特徴とする請求項１記載の硫酸化グルクロノフカン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は褐藻類に含まれる多種類の硫酸化多糖を分解する酵素を生産するのに有用な新規な細菌、糖鎖工学分野において有用な硫酸化グルクロノフカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、該酵素を活性化させる様々な因子、並びに糖鎖工学用試薬として有用な脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖、それらの製造方法に関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。例えば、▲１▼フコースと硫酸基のみからなる硫酸化フカン、▲２▼グルクロン酸、マンノース、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロノマンナン、例えばＷＯ９７／２６８９６公報に記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ（構成糖及びそのモル比がフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基＝約１０：７：４：５：２０、以下、Ｕ−フコイダンと称す）、▲３▼フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコガラクタン、例えば、ＰＣＴ／ＪＰ００／００９６５号明細書に記載の硫酸化フコガラクタン（構成糖及びそのモル比がフコース：ガラクトース＝１：１〜６、以下、Ｇ−フコイダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られている。
これらの多糖はフコイダンあるいはフコイジンと総称され、その構造は由来となる海藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコンブ、オキナワモズク、モズクあるいはワカメメカブのそれぞれから抽出される硫酸化多糖は、異なる構造を持つことが知られていた。さらに、これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程において理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そのため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離されることなく、そのまま生物活性が調べられることが多い。例えば、硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性、硫酸化フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性が報告されている。しかしながら、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコース含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
このような生理活性を有する硫酸化多糖を医薬品として開発する場合、その化学構造を決定する必要がある。そのためには、生理活性を有する硫酸化多糖を分解する酵素が必要になってくる。また、上記硫酸化多糖からオリゴ糖を得る場合でも、上記硫酸化多糖のそれぞれを分解する酵素を採取する必要がある。
しかしながら、褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によって異なることが多いため、１種類の硫酸化多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する分解酵素が必要となる。例えば、特定の硫酸化多糖を分解する酵素を得るために、その硫酸化多糖を資化する微生物のスクリーニングを行うことが多い。この場合、特定の硫酸化多糖を資化する微生物を単離し、同定し、培養条件を検討して硫酸化多糖分解酵素を効率良く生産することができるが、単離、同定に長時間を要する。また、１種の微生物が１種以上の硫酸化多糖を資化する例は少なく、まして、いくつもの目や科に渡る褐藻類の硫酸化多糖を資化する微生物はほとんど知られていない。
従って、既同定の単離菌を使用して硫酸化多糖分解酵素を生産すること、あるいは一種類の菌株により何種類もの硫酸化多糖分解酵素を生産することが望まれていた。
また、最近オキナワモズクの硫酸化多糖に関する研究において、該多糖が胃潰瘍原因微生物のヘリコバクター  ピロリの胃粘膜への定着を阻害すること、該多糖と繊維芽細胞増殖因子の複合体を繊維芽細胞増殖促進剤として使用できること、該多糖を経口で与えることにより細菌及びウイルス等による感染症を防げること等が報告されている。そのためオキナワモズクに関する生理活性とオキナワモズク由来の硫酸化多糖の化学構造の関係について研究されている。例えば、該多糖について２つの報告があり、一つはグライココンジュゲート  ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第１６巻，１９−２６頁（１９９９）に記載のフコース：グルクロン酸：硫酸基：アセチル基のモル比が６．１：１．０：２．９：１で分子量は約５６，０００である硫酸化グルクロノフカンであり、もう一つは、応用糖質科学、第４３巻、１４３−１４８頁（１９９６）に記載のフコース：グルクロン酸：キシロース：硫酸基：アセチル基のモル比が３〜４：０．８−１．２：０．１〜０．３：０．８〜１．２：０．５〜１で分子量は約５０万〜６０万である硫酸化グルクロノフカンである。しかしながら、現在のところ物理化学的な分析によりその平均的な構造が判明しているに過ぎない。
また、医薬品等の開発のために構造が均一に保持されたオリゴ糖を得る必要があるが、例えば、オキナワモズク由来の硫酸化多糖から構造が均一に保持されたオリゴ糖を得ることは困難であった。
以上のことから、多種類の褐藻類由来の硫酸化多糖を分解する微生物、オキナワモズク由来の硫酸化多糖、すなわち硫酸化グルクロノフカンを特異的に分解する酵素、及び酵素的に製造した構造が均一な硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖が求められていた。
発明の目的
本発明の目的は、多種類の褐藻類由来の硫酸化多糖を分解する新規な微生物、糖鎖工学的に有用な硫酸化グルクロノフカンを分解する３種類の酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化グルクロノフカンに該酵素を作用させて得られる低分子化物及びその製造方法、さらに硫酸化グルクロノフカン分解酵素の活性化因子を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、多種類の褐藻類由来の複数の硫酸化多糖を資化する能力を持つ細菌を単離することに成功し、フコフィラス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ）属と命名した。また、フコフィラス属に属する細菌の１菌株、フコフィラス  フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株が、３種類の硫酸化グルクロノフカン分解酵素、すなわち、フコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを生産することも見出した。また、それらの酵素の製造方法についても見出した。さらに、それらの酵素の効率的利用には、塩化ナトリウム、カルシウム塩、及び蛋白質が有用なことについても見出した。また、糖鎖工学用試薬として利用できる、酵素的に製造した脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン、構造の均一な硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖及びそれらの製造方法を見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とするフコイダンデアセチラーゼに関する。該酵素は、硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に作用して、アセチル基を加水分解し、酢酸を遊離させることができ、至適ｐＨは約６〜９．１の範囲であり、至適温度は約２３〜４５℃の範囲である。
本発明の第２の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とするα−Ｄ−グルクロニダーゼに関する。該酵素は、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に作用して、α−Ｄ−グルクロニル結合を加水分解し、Ｄ−グルクロン酸を遊離させることができ、至適ｐＨは約５．８〜７．８の範囲、至適温度は約１４〜２９℃の範囲である。
本発明の第３の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド−α−Ｌ−フコシダーゼに関する。該酵素は、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に作用してα−Ｌ−フコシル結合をエンド的に加水分解し、還元性末端にＬ−フコースを持つオリゴ糖を生成させることができ、至適ｐＨは約４．５〜７．５の範囲、至適温度は約２３〜４２℃の範囲である。
本発明の第１〜第３の発明において、フコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼあるいはエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、該酵素の生産能を有する微生物を培養し、その培養物から該酵素を採取することによって製造することができる。
本発明の第４の発明は、硫酸化グルクロノフカンに本発明の第１の発明のフコイダンデアセチラーゼを作用させて少なくとも１分子以上のアセチル基を除去した脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンを採取することを特徴とする脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの製造方法に関する。
本発明の第５の発明は、本発明の第４の発明の方法により得られる脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン又はその塩に関する。
本発明の第６の発明は、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンに本発明の第２の発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを作用させて少なくとも１分子以上のグルクロン酸残基を除去した脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを採取することを特徴とする脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンの製造方法に関する。
本発明の第６の発明において、脱グルクロン酸化は、塩化ナトリウム、カルシウム塩及び／又は蛋白質の共存下で行うことができる。
本発明の第７の発明は、本発明の第６の発明の方法により得られる脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン又はその塩に関する。
本発明の第８の発明は、硫酸化グルクロノフカンにフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて採取することを特徴とする硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の製造方法に関する。この場合、フコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを同時に作用させてもよいし、フコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ、エンド−α−Ｌ−フコシダーゼの順に作用させてもよい。
本発明の第９の発明は、アルカリ処理により脱アセチル化した硫酸化グルクロノフカンにα−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて採取することを特徴とする硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の製造方法に関する。この場合、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを同時に作用させてもよいし、まずα−Ｄ−グルクロニダーゼを作用させた後にエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させてもよい。
本発明の第８及び第９の発明においては、塩化ナトリウム、カルシウム塩及び／又は蛋白質の共存下で行うことができる。
本発明の第１０の発明は、本発明の第８〜第９の発明の方法により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖又はその塩に関する。
本発明の第１１の発明は、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）から選択される化学構造を有する糖化合物又はその塩に関する。
0004331912.tif 000002
0004331912.tif 000003
0004331912.tif 000004
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３ＨまたはＣＨ３ＣＯである。また、ｎは０又は１以上の整数である）。
本発明の第１２の発明は、下記理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化グルクロノフカン又はその塩に関する。該硫酸化多糖は、構成糖としてフコースとグルクロン酸を含有し、そのモル比が３５〜４４：１０であり、下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とするものが例示される。
0004331912.tif 000005
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３ＨまたはＣＨ３ＣＯである）。
本発明の第１２の発明において、上記一般式（ＶＩＩＩ）中のｎは１〜５０００の範囲であることが好ましい。
本発明の第１３の発明は、褐藻類由来の複数の硫酸化多糖を資化する能力を持つフコフィラス属細菌に関する。
本発明の第１３の発明において、当該フコフィラス属細菌には電子伝達鎖にメナキノンを有し、ＧＣ含量が約５０％である細菌が含まれる。また、配列表の配列番号３記載の１６Ｓ  リボソーマルＤＮＡの塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する１６Ｓ  リボソーマルＤＮＡを持つ細菌が含まれる。特に限定はされないが、例えば、フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１７）が挙げられる。
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本明細書においてフコフィラス属に属する細菌とは、褐藻類由来の複数の硫酸化多糖を資化することができる細菌であればよく、例えば、ガゴメコンブ、マコンブ、ワカメ、モズク、オキナワモズク、レッソニア  ニグレッセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、フカス  ベシクロサス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）、アスコフィラム  ノドスム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）等の褐藻類由来の硫酸化多糖をそれぞれ１種類以上ずつ資化できる細菌が好適に使用できる。本発明において資化とは、生物が培地に添加された物質をそのままあるいは低分子化して生体内に取り入れること、あるいは代謝的に別物質に変換することをいう。本明細書において上記褐藻類由来の硫酸化多糖を低分子化する酵素を生産することができる微生物は、褐藻類由来の硫酸化多糖を資化することができる微生物に含まれる。本発明のフコフィラス属細菌は、従来の菌学的分類法のみによって同定することが不可能な細菌であり、分子遺伝子学的に分類する方法、例えば、１６Ｓ  リボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ；リボソーマルＲＮＡをコードするＤＮＡ）の塩基配列の相同性に基づく分類法を、従来の方法と組み合わせて使用する必要がある。即ち、本発明のフコフィラス属細菌には、菌学的にフコフィラス属に分類される細菌、及びその１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列が本明細書に開示するフコフィラス属細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列と約９０％以上の相同性を有する細菌が含まれる。１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の相同性解析は、例えば、インターネットのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のホームページで利用可能なＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈを利用することができる。
上記フコフィラス属細菌としては、特に限定はないが例えば、本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株が好適に使用できる。該フコフィラス  フコイダノリティカスＳＩ−１２３４株は、ナマコの消化管内容物より本発明者らが新たに検索して得た細菌で、その菌学的性質は次のとおりである。
ａ．  形態的性質
本菌は直径１．２〜１．６μｍの球菌である。
胞子の有無    なし
グラム染色性    陰性
ｂ．  生理的性質
（１）生育温度    ２５℃で生育する。
（２）酸素に対する態度    好気性
（３）カタラーゼ    陽性
（４）オキシダーゼ    陰性
（５）塩類要求性：
０％食塩培地での生育    陰性
１％食塩培地での生育    陰性
海水培地での生育        陽性
（６）キノン系    メナキノン７
（７）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量    ５２％
（８）ＯＦ−テスト    酸を生成しない
（９）集落の色調    特徴的な集落色素を生成せず
（１０）運動性    陰性
（１１）滑走性    陰性
（１２）鞭毛    なし
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネィティブ  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第９巻（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、ＧＣ含量が５２％という点でグループ４に属する菌と異なる。そこで、本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定するために、配列表の配列番号１及び２記載の塩基配列を有するプライマー及びタカラＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域を増幅し、該増幅断片の塩基配列を常法にて解析した。該１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。配列表の配列番号３の塩基配列について既知の細菌との相同性を比較したところ１６Ｓ  ｒＤＮＡの全域（約１５００塩基）にわたって約９０％以上の相同性を示す既知菌株は存在しなかった。従って、本発明者らは、本菌株は、既知の属に属さない新属の細菌であると断定し、本菌株をフコフィラス  フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株と命名した。なお、上記フコフィラス  フコイダノリティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株は、ブダペスト条約のもと、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成１１年８月１８日（原寄託日）より受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９５のもとに寄託されている。
実際に、特に限定はされないが、例えば、ガゴメコンブ、マコンブ、ワカメ、レッソニア  ニグレッセンス、エクロニア、マキシマ等のコンブ目に属する褐藻類やモズク、オキナワモズク等のナガマツモ目に属する褐藻類やフカス、ベシクロサス、アスコフィラム  ノドスム等のヒバマタ目に属する褐藻類由来のそれぞれの硫酸化多糖を基質に上記フコフィラス  フコイダノリティカスＳＩ−１２３４株を培養すると培地中の各硫酸化多糖は資化され、さらに該菌体抽出液をそれぞれの硫酸化多糖と混合すると、明らかに硫酸化多糖の低分子化が見られる。
本発明のフコフィラス  フコイダノリティカス１２３４株は、上記褐藻類由来の複数の硫酸化多糖を資化する能力、硫酸化グルクロノフカンを分解する能力及び本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを生産する能力を有する微生物である。
本明細書において硫酸化グルクロノフカンは、構成糖として主にフコースとグルクロン酸を３５〜４４：１０のモル比で含有する硫酸化多糖であり、アセチル基を持つことが知られている。硫酸化グルクロノフカンとしては、例えば、フコースとグルクロン酸とアセチル基のモル比が４：１：０．５の硫酸化グルクロノフカンが例示される。また、平均分子量は、例えば、ＨＰＬＣゲルろ過法で約１００万（分子量分布は、約１０万〜２００万）である。
本明細書において硫酸化グルクロノフカンの構造は、下記一般式（ＶＩＩＩ）に表わされる。下記一般式においてｎは、１以上の整数であり、例えば１〜５０００の範囲、さらに好ましくは１〜１０００の範囲のものが上記硫酸化グルクロノフカンに含まれる。また、上記硫酸化グルクロノフカンには、上記範囲であれば、下記一般式（ＶＩＩＩ）が連続的に繰り返した構造をもつもの及び他の構造が介在して非連続的に下記一般式（ＶＩＩＩ）が含有される構造をもつもののいずれもが含まれる。
0004331912.tif 000006
（式中ＲはＨ又はＳＯ３Ｈ又はＣＨ３ＣＯである。）
なお、上記硫酸化グルクロノフカンの分子量、糖組成、及び硫酸基含量は、該硫酸化グルクロノフカンの原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法、硫酸化グルクロノフカンの抽出時の加熱条件、あるいはｐＨ条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸化グルクロノフカンは加水分解される場合がある。従って、本明細書に記載した硫酸化グルクロノフカンの分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその１例にすぎず、該硫酸化グルクロノフカンの抽出処理条件により、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量は容易に変化させ得る。例えば、オキナワモズクからｐＨ６．０、９５℃、２時間の抽出方法で抽出すると、上記の糖組成と分子量を示す硫酸化グルクロノフカンが得られる。すなわち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸化グルクロノフカンを調製することができる。例えば、上記硫酸化グルクロノフカンの主要な構成糖は、フコース４糖あたりおよそ２残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量あるいはアセチル基含量は減少するものである。すなわち、硫酸化グルクロノフカンから意図的に脱硫酸や脱アセチル化を行うことが可能である。また、脱硫酸や脱アセチル化の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熟処理時の温度や時間を調整すれば、切断する硫酸基やアセチル基の量も調整することができる。特に限定はされないが、例えば約０．５〜１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で２５℃  ２４時間処理によって得られる脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンは、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼやエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの基質として好適に使用できる。
従って、本明細書の硫酸化グルクロノフカンは、前述の特徴を備えた硫酸化グルクロノフカンもしくは、本発明の硫酸化グルクロノフカン分解酵素で低分子化される硫酸化グルクロノフカンであればすべての褐藻類由来のものを包含する。その由来は特に限定されるものではないが、例えば、オキナワモズク、イシモズク、ニセフトモズク、フトモズク等ナガマツモ科の褐藻類は硫酸化グルクロノフカンの含有量が多く原料として好適である。
例えば、オキナワモズク由来の硫酸化多糖の主鎖は一般の糖よりも酸に対して弱いＬ−フコースからなるため、ｐＨ３．０や０．２Ｎ塩酸による抽出では、硫酸化多糖の低分子化が起こると考えられる。すなわち、オキナワモズク由来の硫酸化多糖も他の硫酸化Ｌ−フコースを主要構成糖とする多糖と同様に加熟や酸処理により容易に低分子化される。
本発明の硫酸化グルクロノフカンは、硫酸基及び／又はカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化グルクロノフカンは、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化グルクロノフカンに導くことが可能である。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。
本発明の硫酸化グルクロノフカンの塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウムマグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の塩が挙げられる。
本発明で使用する硫酸化グルクロノフカンを製造する際にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際、硫酸化グルクロノフカンの低分子化を防ぐためには、ｐＨ４〜９、温度１００℃以下で水溶性画分抽出液を得ることが好ましい。また、上記抽出液中のアミノ酸や低分子性の色素等は、限外ろ過により効率良く除去することができる。さらに、疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。このようにして褐藻類由来の硫酸化多糖画分を得ることができる。また、該画分を陰イオン交換カラムにより分離すればより純度の高い硫酸化グルクロノフカンを得ることができる。
上記方法で得られた硫酸化グルクロノフカンは、育毛効果を示す。従って、例えば、育毛剤の構成成分として有用である。
さらに上記の方法で得られた硫酸化多糖画分あるいは陰イオン交換カラムで精製した硫酸化グルクロノフカンのいずれもが本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの基質として使用できる。また、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを精製する際の活性測定用の基質として、あるいは本発明の脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を製造する際の原料としても使用することができる。
本明細書において硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖とは、硫酸化グルクロノフカンから生成したオリゴ糖を言う。基本的には硫酸基、グルクロニル基、フコシル基、アセチル基を含むが、例えば硫酸基とフコシル基のみからなる場合も、由来が硫酸化グルクロノフカンの場合は硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖と言う。
本明細書においてフコイダンデアセチラーゼとは、硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用してアセチル基を加水分解し、酢酸を遊離させる酵素のことをいう。本発明のフコイダンデアセチラーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用して、アセチル基を加水分解し、酢酸を遊離させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約６〜９．１の範囲である（図１）。
すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２３〜４５℃の範囲である（図２）。
すなわち、図２は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ）分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約３万〜５万である。
本発明のフコイダンデアセチラーゼの確認は、アセチル基を持つ硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖及びその還元性末端を蛍光標識した化合物の分解活性を測定することによって行うことができる。これらの蛍光標識オリゴ糖を用いることにより微量、高感度の活性測定系を構築することができる。また、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖にフコイダンデアセチラーゼを作用させた後、反応生成物に含まれる酢酸と脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を分離し、それぞれの酢酸量及びアセチル基の量を測定することによって、また反応生成物の質量分析を行うことによって、フコイダンデアセチラーゼ活性を確認することもできる。本発明のフコイダンデアセチラーゼの活性は、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも測定可能である。
１つの実施態様において、本発明のデアセチラーゼは、塩化ナトリウム及び／又は蛋白質の存在下で活性化される。これらの因子は単独であるいは両方の組み合わせによっても効果がある。まず、塩化ナトリウムに関して述べると、試薬の塩化ナトリウム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明のデアセチラーゼの反応液に添加する塩化ナトリウム濃度は、好ましくは、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲、さらに好ましくは１ｍＭ〜６００ｍＭの範囲である。
次に、蛋白質について述べると、本発明のフコイダンデアセチラーゼを活性化させる目的で反応液中に添加する蛋白質は本発明のフコイダンデアセチラーゼを分解したり、その反応を阻害しない限りいかなる蛋白質でもよい。好適には牛血清アルブミン等を使用できる。また、例えば、本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株の菌体から抽出された蛋白質等も使用することができる。本発明のフコイダンデアセチラーゼの反応液に加える蛋白質の濃度は、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、さらに好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
本明細書においてα−Ｄ−グルクロニダーゼとは、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用してグルクロン酸とフコースの間のα−Ｄ−グルクロニル結合を加水分解し、Ｄ−グルクロン酸を遊離させる酵素のことをいう。本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用して、α−Ｄ−グルクロニル結合を加水分解し、Ｄ−グルクロン酸を遊離させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約５．８〜７．８の範囲である（図３）。
すなわち図３は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約１４〜２９℃の範囲である（図４）。
すなわち、図４は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ）分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約１２〜１８万である。
本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの確認は、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの分解活性を測定することによって行うことができる。また、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖及びそれらの還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識した化合物も本酵素の基質となり、これらの蛍光標識オリゴ糖を用いることにより微量、高感度の活性測定系を構築することができる。硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖にα−Ｄ−グルクロニダーゼを作用させた後、反応生成物に含まれるグルクロン酸と硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を分離し、それぞれの総糖量および総ウロン酸量を測定することによって、また反応生成物の質量分析を行うことによって、α−Ｄ−グルクロニダーゼ活性を確認することもできる。本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの活性は、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも測定可能である。
１つの実施態様において、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼは、塩化ナトリウム、カルシウムイオン、及び／又は蛋白質の存在下で活性化される。これらの因子は単独であるいは２種類あるいは３種類の組み合わせによっても効果がある。まず、塩化ナトリウムに関して述べると、試薬の塩化ナトリウム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、α−Ｄ−グルクロニダーゼの反応液に添加する塩化ナトリウム濃度は、好ましくは、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲、さらに好ましくは１ｍＭ〜６００ｍＭの範囲である。
次に、カルシウムイオンに関して述べると、カルシウムイオンを発生させるものならいかなる物質でもよい。好適には可溶性のカルシウム塩、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を使用できる。また、難溶性のカルシウム塩、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、硫酸カルシウム等でも硫酸化グルクロノフカン等の硫酸化多糖が溶存している状態では徐々にカルシウムイオンを発生させるので本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの活性化に使用することができる。また、硫酸化グルクロノフカンの硫酸基やカルボキシル基のカウンターイオンにカルシウム塩を含む場合は基質そのものがカルシウムイオンの発生源となるため、活性化のために加えるカルシウムイオン源はその分減らすことができる。場合によってはカルシウム塩を添加しなくても本酵素が作用する。本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの反応液に加えるカルシウムイオンの濃度は、好ましくは０．１〜２００ｍＭの範囲、さらに好ましくは、１〜１００ｍＭの範囲である。
次に、蛋白質について述べると、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを活性化させる目的で反応液中に添加する蛋白質は本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを分解したり、その反応を阻害しない限りいかなる蛋白質でもよい。好適には牛血清アルブミン等を使用できる。また、例えば、本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４の菌体から抽出された蛋白質等も使用することができる。本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの反応液に加える蛋白質の濃度は、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、さらに好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
本明細書においてエンド−α−Ｌ−フコシダーゼとは、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用してα−Ｌ−フコシル結合をエンド的に加水分解し、還元性末端にＬ−フコースを持つオリゴ糖を生成させる酵素のことをいう。本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、天然の硫酸化グルクロノフカンに対してはあまり作用しないが、あらかじめフコイダンデアセチラーゼ及びα−Ｄ−グルクロニダーゼで処理した硫酸化グルクロノフカンに対して、あるいはフコイダンデアセチラーゼ及びα−Ｄ−グルクロニダーゼ共存下での硫酸化グルクロノフカンに対しては、よく作用する。しかしながら天然の硫酸化グルクロノフカンの場合であっても、例えば他の海洋細菌由来の酵素あるいは物理・化学的な要因等の何らかの理由でアセチル基及びグルクロン酸が除去されていれば、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの基質として好適に使用できる。
本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用して、α−Ｌ−フコシル結合をエンド的に加水分解し、還元性末端にＬ−フコースを持つオリゴ糖を生成させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約４．５〜７．４の範囲である（図５）。
すなわち図５は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２３〜４２℃の範囲である（図６）。
すなわち、図６は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ）分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約１５万〜２０万である。
本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの確認は、脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンの分解活性を測定することによって行うことができる。また、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼで処理して得られるオリゴ糖及びそれらの還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識した化合物も本酵素の基質となり、本蛍光標識オリゴ糖を用いることにより微量、高感度の活性測定系を構築することができる。例えば、８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡ（下記）を基質に用いて反応させ、反応生成物をＨＰＬＣで分析すれば、エンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性を測定できる。本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性は、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも測定可能である。
１つの実施態様において、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、塩化ナトリウム、カルシウムイオン、及び／又は蛋白質の存在下で活性化される。これらの因子は単独であるいは２種類あるいは３種類の組み合わせによっても活性化の作用がある。まず、塩化ナトリウムに関して述べると、試薬の塩化ナトリウム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、エンド−α−Ｌ−フコシダーゼの反応液に添加する塩化ナトリウム濃度は、好ましくは、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲、さらに好ましくは１ｍＭ〜６００ｍＭの範囲である。
次に、カルシウムイオンに関して述べると、カルシウムイオンを発生させるものならいかなる物質でもよい。好適には可溶性のカルシウム塩、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を使用できる。また、難溶性のカルシウム塩、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、硫酸カルシウム等でも硫酸化グルクロノフカン等の硫酸化多糖が溶存している状態では徐々にカルシウムイオンを発生させるので本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性化に使用することができる。また、硫酸化グルクロノフカンの硫酸基やカルボキシル基のカウンターイオンにカルシウム塩を含む場合は基質そのものがカルシウムイオンの発生源となるため、活性化のために加えるカルシウムイオン源はその分減らすことができる。場合によってはカルシウム塩を添加しなくても本酵素が作用する。本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの反応液に加えるカルシウムイオンの濃度は、好ましくは、０．１〜２００ｍＭの範囲、さらに好ましくは、１〜１００ｍＭの範囲である。
次に、蛋白質について述べると、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを活性化させる目的で反応液中に添加する蛋白質は本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを分解したり、その反応を阻害しない限りいかなる蛋白質でもよい。好適には牛血清アルブミン等を使用できる。また、例えば、本発明のフコフィラスフコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株の菌体から抽出された蛋白質等も使用することができる。本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの反応液に加える蛋白質の濃度は、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、さらに好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの製造に使用される微生物としては、上記硫酸化多糖画分あるいは硫酸化グルクロノフカンを低分子化する酵素を生産する微生物であれば特に限定はないが、例えば、フコフィラス属細菌が好適に使用できる。上記フコフィラス属細菌は、菌学的性質から同属と分類されたもの、あるいは１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の相同性に基づいて同属と分類されたものの全てが含まれるが、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼあるいはエンド−α−Ｌ−フコシダーゼと同様に硫酸化グルクロノフカンを分解する酵素を生産する微生物であれば、すべての微生物が含まれる。
本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを生産する微生物を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、その存在下で該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化グルクロノフカン、オキナワモズク等の海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、該微生物の培地は、海水あるいは市販の人工海水の培地であってもよい。
また、培養条件及び培地組成等は使用する微生物に応じ、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。例えば、培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９、５〜７２時間の通気攪拌培養が好ましく、前述の条件で本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの生産量は、最大に達し得る。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを得ることができる。
特に限定はされないが、例えば、本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次に、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素を含まない純化された本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを得ることができる。また、硫酸化グルクロノフカンを固定化した樹脂を用いれば本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼと本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを容易に分離することもできる。
さらに、上述の培養上清中にも本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
上記のフコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株は、硫酸化グルクロノフカンを資化する微生物であり、硫酸化グルクロノフカンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを生産する。これらの３種類の酵素は、カラム精製操作により分離することができる。
本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、本発明のフコイダンデアセチラーゼ及びα−Ｄ−グルクロニダーゼと共存すると、硫酸化グルクロノフカンを硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に分解するが、単独ではほとんど分解することができない。また、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを、単独で分解することができる。従って、硫酸化グルクロノフカンの硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖への分解のためには、本発明のフコイダンデアセチラーゼ及びα−Ｄ−グルクロニダーゼとの共存は必ずしも必要ではなく、硫酸化グルクロノフカンの脱アセチル化及び脱グルクロン酸が必要であることが分かる。
本明細書において脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンとは、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンに本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを作用させて、少なくとも１分子以上のα−Ｄ−グルクロニル結合を加水分解したものである。該脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンからＤ−グルクロン酸を除去すると最終的にグルクロン酸含量がゼロになる（すなわち、脱アセチル化された硫酸化フカンである）が、酵素反応の条件を調整することにより、フコースとグルクロン酸のモル比が４：１から４：０までの様々なグルクロン酸含量の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを製造することができる。
本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを得るには、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンにα−Ｄ−グルクロニダーゼを作用させて、遊離したＤ−グルクロン酸を例えば限外ろ過、ゲルろ過、陰イオン交換カラム処理などにより除去すればよい。必要に応じて脱塩、凍結乾燥などの処理を行ってもよい。脱グルクロン酸化処理を行う際に、あらかじめ硫酸化グルクロノフカンをフコイダンデアセチラーゼ処理やアルカリ処理などにより脱アセチル化しておけば脱グルクロン酸化を効率よく行うことができる。
例えば、オキナワモズク由来の硫酸化グルクロノフカンを脱アセチル化して得た脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンにはフコース４分子あたり１分子程度のＤ−グルクロン酸が含まれているが、α−Ｄ−グルクロニダーゼによりＤ−グルクロン酸を除去し、様々なグルクロン酸含量の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを調製することができる。脱グルクロン酸反応に用いる酵素量や基質量、反応時間、反応温度、ｐＨ等の条件を調整することにより、特に限定はされないが、例えば、１ｇの脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンに適量の塩化ナトリウム、牛血清アルブミン及び５００ｍＵの本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを混合し、２０℃、ｐＨ７付近で様々な時間反応させることによりフコースとグルクロン酸のモル比が４：１から４：０までの様々なグルクロン酸含量の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを製造することができる。
脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンはそのまま、糖鎖工学用試薬として使用することも可能であるが、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの基質として活性測定に使用できる他、その反応生成物は本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖として、糖鎖工学用試薬として有用である。
本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンを調製するにあたり、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、若しくは脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、若しくは該脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン含有物の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して選定すればよい。脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常２０℃付近で行う。酵素量、反応液の組成、反応時間等を調整することによって、脱グルクロン酸の程度を調整することもできる。脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンは、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、限外ろ過等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。
本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンは、硫酸基及び／又はカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンは、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンに導くことが可能である。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。
本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンの塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウムマグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の塩が挙げられる。
本明細書において硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖とは、上記の硫酸化グルクロノフカンに本発明のフコイダンデアセチラーゼを作用させるかあるいはアルカリ処理等により脱アセチル化した後、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がＬ−フコースであるものをいう。特に限定はされないが、例えば下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）から選択される化学構造を有する糖化合物が挙げられる。
0004331912.tif 000007
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈ又はＣＨ３ＣＯである。）
0004331912.tif 000008
0004331912.tif 000009
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈ又はＣＨ３ＣＯである。またｎは０又は１以上の整数である。）
本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖は、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを硫酸化グルクロノフカン、若しくは硫酸化グルクロノフカン含有物に作用させることによって効率よく調製することができ、あらかじめアルカリ処理等の化学的処理により脱アセチル化した硫酸化グルクロノフカンに本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させることによっても調製することができる。硫酸化グルクロノフカン含有物としては、例えば硫酸化グルクロノフカンの部分精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。また、当然のことであるが、本発明の脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンに本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させても本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を得ることができる。特に限定はされないが例えば、オキナワモズク由来の硫酸化グルクロノフカンを脱アセチル化し、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させることにより、上記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）から選択される化学構造を有する糖化合物あるいはその塩を得ることができる。
本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を調製するにあたり、硫酸化グルクロノフカン、若しくは硫酸化グルクロノフカン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化グルクロノフカン、若しくは該硫酸化グルクロノフカン含有物の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの量を考慮して選定すればよい。硫酸化グルクロノフカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択することができる。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常２５℃付近で行う。反応に使用する本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの配合比率や使用量、反応液の組成、反応時間等を調整することによって、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の分子量やグルクロン酸及びアセチル基の含量を調整することもできる。硫酸化グルクロノフカンは３種類の酵素、すなわち本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼにより分解されるのであるが、これら３種類の酵素反応は同時に行っても良く、別々に行うこともできる。すなわち、あらかじめ硫酸化グルクロノフカンを本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼにより脱アセチル化及び脱グルクロン酸化し、その後本発明のフコイダンデアセチラーゼ及びα−Ｄ−グルクロニダーゼを熱処理や酸、アルカリ処理などにより失活させた後、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを作用させれば、生成する本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の分子量分布やグルクロン酸及びアセチル基含量の調整が容易である。
上記の様にして得られた本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムにより分画することによって、更に均一な分子量あるいは均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。この方法により、ＮＭＲ分析により構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を得ることができる。
本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖は、硫酸基及びカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩は、ダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に導くことが可能である。また、これらは、必要に応じ既知の塩交換方法を行いて、所望の種々の塩に交換することができる。
本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウムマグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の塩が挙げられる。
また、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖は、糖鎖工学用試薬として使用することができる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、該オリゴ糖のＰＡ−化物を調製すれば、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性測定用基質として使用できる。このように本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖は、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質である。
本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、硫酸化グルクロノフカンを低分子化するため硫酸化グルクロノフカンの構造解析に使用することができる。さらに、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは、反応液中に塩化ナトリウム、蛋白質及び／又はカルシウムイオンを共存させることにより安定性及び反応速度が高まるため、これらの硫酸化グルクロノフカン分解酵素活性化因子を共存させることにより上記低分子化を効率よく行うことができる。また、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン及び脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンは、糖鎖工学用試薬として使用することができ、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性測定用の基質としても使用できる。
実施例
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１
（１）粗硫酸化グルクロノフカン画分の調製
市販の塩蔵オキナワモズク６２５ｇを４３７５ｍｌの３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ホモジナイザーにより８０００回転／分、５分間処理後、９５℃、１時間処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に１０ｇの活性炭を添加後３０分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶媒置換し、凍結乾燥して１０．９ｇの粗硫酸化グルクロノフカン画分の乾燥物を得た。
（２）硫酸化グルクロノフカン分解活性測定方法
本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは単独では硫酸化グルクロノフカンに作用してオリゴ糖を効率良く生成することができないが、組み合わせることにより硫酸化グルクロノフカンを分解し、効率よく低分子化させることができる。前記３種の酵素が共存した状態での硫酸化グルクロノフカンを分解する活性を、「硫酸化グルクロノフカン分解活性」と称し、下記の活性測定方法により数値化した。
すなわち、１０μｌの１％の粗硫酸化グルクロノフカン画分溶液と、５２．５μｌの５０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）と、５．５μｌの４Ｍの塩化ナトリウムと、２μｌの１Ｍの塩化カルシウムと、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンと、２０μｌの本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが共存する酵素液とを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後９０μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが共存する酵素液の代わりに、その酵素液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び粗硫酸化グルクロノフカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。１単位の硫酸化グルクロノフカン分解活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化グルクロノフカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断されたフコシル結合の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000010
１０×１０００×１／１００：反応系中に添加した粗硫酸化グルクロノフカン画分（μｇ）
ＭＧ：基質硫酸化グルクロノフカンの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化グルクロノフカンが酵素により切断された部位の数
１８０：反応時間（分）
０．０２：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。また、蛋白質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌの蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例１
フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４株を参考例１（１）の方法で調製したオキナワモズク由来粗硫酸化グルクロノフカン画分０．２％とペプトン１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地５０ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２４℃で７２時間培養して種培養液とした。参考例１（１）の方法で調製したオキナワモズク由来の粗硫酸化グルクロノフカン画分０．２％、ペプトン１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ８．０からなる培地６００ｍｌを２リットルの三角フラスコに入れ、１１５℃、１０分間オートクレーブ処理した培地を７本用意し、上記の種培養液を各三角フラスコに５ｍｌずつ接種し、毎分９０回転の回転速度で、２４℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
得られた菌体は、２５０ｍｌの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を粗酵素液とした。
得られた粗酵素液は、同じ緩衝液で平衡化した３００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから４００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。この様にして部分精製酵素液を得た。なお、上記の培養上清と粗酵素液に含まれる、「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を測定した結果、いずれにおいても活性が確認され、菌体抽出液中には培地１ｍｌあたり０．４ｍＵの活性が検出された。
実施例２
（１）参考例１（１）記載の粗硫酸化グルクロノフカン画分に実施例１記載の粗酵素液を作用させ本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を調製した。すなわち、５ｇの粗硫酸化グルクロノフカン画分を１リットルの２５０ｍＭの塩化ナトリウム及び２０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解後、３５ｍＵの実施例１記載の粗酵素液を加え、３０℃で６日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用いて、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分１とした。
（２）実施例２（１）で得られた硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分１を脱塩装置（マイクロアシライザーＧ３、旭化成工業製）により脱塩した。脱塩した硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分１に５ｍＭとなるようにイミダゾールを、２０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、２０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションの中には少なくとも８個の明瞭なピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖１−（１）〜（８）とし、それぞれをエバポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％のエタノールで溶出して脱塩した。こうして本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）〜（８）、すなわち、オリゴ糖１−（１）〜（８）を得た。
（３）実施例２（２）で得られたオリゴ糖１−（１）〜（８）について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法による還元末端糖及び糖組成の分析、さらにＵＦＣ測定試薬Ｔａｋａｒａ（宝酒造）を用いてフコースの絶対配置の決定を行ったところ、オリゴ糖１−（１）〜（８）の還元性末端糖は総てＬ−フコースであった。また、糖組成は、オリゴ糖１−（１）はフコースのみでオリゴ糖１−（２）〜（８）はフコースとグルクロン酸からなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）により質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いてＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。以下にオリゴ糖１−（１）〜（８）の物性を示す。
（ａ）オリゴ糖１−（１）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図８に、マススペクトルを図９にそれぞれ示した。図７、図８において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図９において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；７６２
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８０．２［Ｍ−２Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１に示す。
0004331912.tif 000011
糖組成  Ｌ−フコースのみ（４分子）
硫酸基  ２分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＶ）の通りである。
0004331912.tif 000012
（ｂ）オリゴ糖１−（２）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（２）のマススペクトルを図１０に示した。図１０において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１４５６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８４．６［Ｍ−３Ｈ＋］３−
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝７：１
硫酸基  ３分子
（ｃ）オリゴ糖１−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１１に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１２に、マススペクトルを図１３にそれぞれ示した。図１１、図１２において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１３において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１６８２
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８７３．４［Ｍ＋３Ｎａ＋−５Ｈ＋］２−、８６２．４［Ｍ＋２Ｎａ＋−４Ｈ＋］２−、５７４．４［Ｍ＋２Ｎａ＋−５Ｈ＋］３−、５６７．２［Ｍ＋Ｎａ＋−４Ｈ＋］３−、４２５．２［Ｍ＋Ｎａ＋−５Ｈ＋］４−、４１９．８［Ｍ−４Ｈ＋］４−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表２に示す。
0004331912.tif 000013
0004331912.tif 000014
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝８：１
硫酸基  ４分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。
0004331912.tif 000015
（ｄ）オリゴ糖１−（４）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（４）のマススペクトルを図１４に示した。図１４において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２３７６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９８．８［Ｍ＋Ｎａ＋−５Ｈ＋］４−、４７４．６［Ｍ−５Ｈ＋］５−
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１１：２
硫酸基  ５分子
（ｅ）オリゴ糖１−（５）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（５）のの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１５に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１６に、マススペクトルを図１７にそれぞれ示した。図１５、図１６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１７において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２６０２
ＭＳ  ｍ／ｚ  ６６６．４［Ｍ＋３Ｎａ＋−７Ｈ＋］４−、６６１．０［Ｍ＋２Ｎａ＋−６Ｈ＋］４−、５２４．０［Ｍ＋Ｎａ＋−６Ｈ＋］５−、４３３．０［Ｍ−６Ｈ＋］６−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表３に示す。
0004331912.tif 000016
0004331912.tif 000017
0004331912.tif 000018
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１２：２
硫酸基  ６分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＸＩ）の通りである。
0004331912.tif 000019
0004331912.tif 000020
なお、以下、本物質を１２Ｆｕｃ−６Ｓ−２ＧｌｃＵＡと称す。
（ｆ）オリゴ糖１−（６）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（６）のマススペクトルを図１８にそれぞれ示した。図１８において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；３２９６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８４０．０［Ｍ＋３Ｎａ＋−７Ｈ＋］４−、６７２．０［Ｍ＋３Ｎａ＋−８Ｈ＋］５−、５５６．０［Ｍ＋２Ｎａ＋−８Ｈ＋］６−、４７３．２［Ｍ＋Ｎａ＋−８Ｈ＋］７−
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１５：３
硫酸基  ７分子
（ｇ）オリゴ糖１−（７）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（７）のの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１９に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２０に、マススペクトルを図２１にそれぞれ示した。図１９、図２０において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２１において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；３５２２
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８９６．６［Ｍ＋３Ｎａ＋−７Ｈ＋］４−、７１２．６［Ｍ＋２Ｎａ＋−７Ｈ＋］５−、５９７．２［Ｍ＋３Ｎａ＋−９Ｈ＋］６−、５０５．４［Ｍ＋Ｎａ＋−８Ｈ＋］７−、４３９．６［Ｍ−８Ｈ＋］８−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表４に示す。
0004331912.tif 000021
0004331912.tif 000022
0004331912.tif 000023
0004331912.tif 000024
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１６：３
硫酸基  ８分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＸＩＩ）の通りである。
0004331912.tif 000025
0004331912.tif 000026
なお、以下、１６Ｆｕｃ−８Ｓ−３ＧｌｃＵＡと称す。
（ｈ）オリゴ糖１−（８）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（８）のマススペクトルを図２２にそれぞれ示した。図２２において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；４２１６
ＭＳ  ｍ／ｚ  １０９２．０［Ｍ＋７Ｎａ＋−１１Ｈ＋］４−、８６９．０［Ｍ＋６Ｎａ＋−１１Ｈ＋］５−、７１３．０［Ｍ＋３Ｎａ＋−９Ｈ＋］６−、６１１．０［Ｍ＋３Ｎａ＋−１０Ｈ＋］７−、５２９．２［Ｍ＋Ｎａ＋−９Ｈ＋］８−、４７０．２［Ｍ＋Ｎａ＋−１０Ｈ＋］９−
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１９：４
硫酸基  ９分子
実施例３
（１）参考例１（１）記載の粗硫酸化グルクロノフカン画分に実施例１記載の部分精製酵素液を作用させ本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を調製した。すなわち、３ｇの粗硫酸化グルクロノフカン画分を１リットルの２５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭの塩化カルシウム、及び１ｇの牛血清アルブミンを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解後、２９ｍＵの実施例１記載の部分精製酵素を加え、３０℃で３日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用いて、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分２とした。
（２）実施例３（１）で得られた硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分２を脱塩装置（マイクロアシライザーＧ３、旭化成工業製）により脱塩した。脱塩した硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分２に５ｍＭとなるようにイミダゾールを、１０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、１０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションの中には少なくとも５個の明瞭なピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集め、オリゴ糖２−（１）〜（５）とし、それぞれをエバポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％のエタノールで溶出して脱塩した。こうしてオリゴ糖２−（１）〜（５）を得た。
（３）オリゴ糖の構造解析
実施例３（２）で得られたオリゴ糖２−（１）〜（５）の脱塩物について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法により還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、総てのオリゴ糖の還元性末端糖はＬ−フコースであった。また、糖組成は、オリゴ糖２−（１）はフコースのみでオリゴ糖２−（２）〜（５）はフコースとグルクロン酸からなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）により質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いてＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
以下にオリゴ糖２−（１）〜（５）の物性を示す。
（ａ）オリゴ糖２−（１）の物性
上記分析の結果、本物質はオリゴ糖１−（１）と同じ物質であることが判明した。
（ｂ）オリゴ糖２−（２）の物性
上記分析の結果本物質はオリゴ糖１−（３）と同じ物質であることが判明した。
（ｃ）オリゴ糖２−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２３に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２４に、マススペクトルを図２５にそれぞれ示した。図２３、図２４において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２５において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１５３６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８００．２［Ｍ＋３Ｎａ＋−５Ｈ＋］２−、７８９．２［Ｍ＋２Ｎａ＋−４Ｈ＋］２−、５２６．０［Ｍ＋２Ｎａ＋−５Ｈ＋］３−、５１８．６［Ｍ＋Ｎａ＋−４Ｈ＋］３−、３８８．８［Ｍ＋Ｎａ＋−５Ｈ＋］４−、３８３．２［Ｍ−４Ｈ＋］４−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表５に示す。
0004331912.tif 000027
0004331912.tif 000028
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝７：１
硫酸基  ４分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＶＩ）の通りである。
0004331912.tif 000029
（ｄ）オリゴ糖２−（４）の物性
上記分析の結果本物質はオリゴ糖１−（５）と同じ物質であることが判明した。
（ｅ）オリゴ糖２−（５）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２６に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２７に、マススペクトルを図２８にそれぞれ示した。図２６、図２７において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２８において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２４５６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５４．８［Ｍ＋５Ｎａ＋−８Ｈ＋］３−、８４７．２［Ｍ＋４Ｎａ＋−７Ｈ＋］３−、８４０．４［Ｍ＋３Ｎａ＋−６Ｈ＋］３−、６３５．４［Ｍ＋４Ｎａ＋−８Ｈ＋］４−、６３０．０［Ｍ＋３Ｎａ＋−７Ｈ＋］４−、６２４．４［Ｍ＋２Ｎａ＋−６Ｈ＋］４−、５０３．６［Ｍ＋３Ｎａ＋−８Ｈ＋］５−、４９９．４［Ｍ＋２Ｎａ＋−７Ｈ＋］５−、４９５．０［Ｍ＋Ｎａ＋−６Ｈ＋］５−、４１６．０［Ｍ＋２Ｎａ＋−８Ｈ＋］６−、４１２．４［Ｍ＋Ｎａ＋−７Ｈ＋］６−、４０８．８［Ｍ−６Ｈ＋］６−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表６に示す。
0004331912.tif 000030
0004331912.tif 000031
0004331912.tif 000032
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１１：２
硫酸基  ６分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＸＩＩＩ）の通りである。
0004331912.tif 000033
0004331912.tif 000034
なお、以下、本物質を１１Ｆｕｃ−６Ｓ−２ＧｌｃＵＡと称す。
上記実施例２及び実施例３で得られた酵素反応生成物をみると、例えば、オリゴ糖１−（１）、１−（３）、１−（５）、１−（７）の間の質量の差は、フコース４分子と硫酸基２分子とグルクロン酸１分子の質量に相当する。オリゴ糖１−（２）、１−（４）、１−（６）、１−（８）の間の質量の差、オリゴ糖２−（１）、２−（２）、２−（４）の間の質量の差、オリゴ糖２−（３）と２−（５）の間の質量の差も同様である。このことから、実施例１で得られた粗酵素液及び部分精製酵素液には硫酸化グルクロノフカンの繰り返し単位、すなわち、フコース４分子と硫酸基２分子とグルクロン酸１分子単位（（−３Ｆ−３（４Ｓ）Ｆ１−３（４Ｓ）Ｆ１−３（ＧＵ１−２）Ｆ１−）、但しα−Ｌ−フコースをＦ、硫酸基をＳ、α−Ｄ−グルクロン酸をＧＵと略する。）で切断する酵素が含まれていると考えられる。しかしながら、反応生成物の中にはフコース４分子と硫酸基２分子とグルクロン酸１分子からなるオリゴ糖はなく、その構造に近いものとして、フコース４分子と硫酸基２分子からなるオリゴ糖が生成している。すなわち、実施例１（１）で得られた粗酵素液及び部分精製酵素液は、少なくともグルクロニダーゼとフコシダーゼの混合物であることが示唆された。
実施例４
（１）硫酸化グルクロノフカン  セルロファインの調製
実施例１（１）で得られた部分精製酵素液中に含まれる酵素を分離するアフィニティー樹脂を調製するために、参考例１（１）に記載の粗硫酸化グルクロノフカン画分をアミノセルロファイン（生化学工業製）に固定化した。固定化の方法は、生化学工業の指示書に準じた。すなわち、１．５ｇの粗硫酸化グルクロノフカン画分を８０ｍｌの水に溶解後、塩酸でｐＨを４．５とし、５０ｍｌのアミノセルロファインと３ｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加え、４℃で２０時間攪拌し、ろ過後、水で充分洗浄して、硫酸化グルクロノフカン  セルロファインを得た。
（２）硫酸化グルクロノフカン  セルロファインによるα−Ｄグルクロニダーゼとエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの分離
実施例１（１）で得られた部分精製酵素液を５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析後、同じ緩衝液で平衡化した５０ｍｌの硫酸化グルクロノフカンセルロファインにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出したフラクションの「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を測定したところ活性の回収率は約２％であったが、「硫酸化グルクロノフカン分解活性」が僅かに残った溶出画分と、硫酸化グルクロノフカンセルロファイン非吸着画分を混合すると「硫酸化グルクロノフカン分解活性」はほぼカラムにかけた活性と等しくなった。
上記非吸着画分は、単独では硫酸化グルクロノフカンを全く低分子化できないこと、及び僅かに「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を持つ溶出画分も単独では硫酸化グルクロノフカンを完全に低分子化できないことから非吸着画分と溶出画分はそれぞれ異なる作用により硫酸化グルクロノフカンを分解していること、そして、非吸着画分は、溶出画分があらかじめ硫酸化グルクロノフカンに作用してからでないと作用できないことも判明した。このことから、溶出画分は硫酸化グルクロノフカンの側鎖、すなわち、α−Ｄグルクロニル結合あるいは硫酸エステル結合などの硫酸化グルクロノフカンの分子量をあまり大きく変化させない部分を切断すること、非吸着画分は主鎖、すなわちα−Ｌ−フコシル結合を切断することが示唆された。
実施例５
（１）２−アミノピリジンによる蛍光標識（ＰＡ化）法によるオリゴ糖の標識
実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分の作用機作を確認するために以下の実験を行った。
硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）〜（８）及び２−（３）及び２−（５）の乾燥物を各５０ｎｍｏｌｅとり、グライコタッグ及びグライコタッグリージェント  キット（共に宝酒造社製）を用いて還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識（ＰＡ化）し、該オリゴ糖のＰＡ化物を調製した。
（２）実施例５（１）記載の１０種のオリゴ糖のＰＡ化物に対する実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分の作用を下記の反応系により調べた。
反応系
５０μｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）
２３μｌ  水
５μｌ  ４Ｍ  塩化ナトリウム
２μｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
５μｌ  ５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１０μｌ  ２ｐｍｏｌｅ／μｌ  オリゴ糖のＰＡ化物
５μｌ  水あるいは実施例４（２）記載の非吸着画分あるいは
実施例４（２）記載の溶出画分
上記全成分を混合後３０℃で３時間反応させ、１００℃で１０分処理後遠心分離し、上清を下記の条件でＨＰＬＣにより分析し、各オリゴ糖のＰＡ化物に対する作用を確認した。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０％のジメチルスルホキシドを含む０．２Ｍの塩化ナトリウム
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
上記分析の結果から判明した、各種硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖のＰＡ化物に対する実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分の作用の有無及び作用前後のＳＢ８０３カラムにおける保持時間を表７に示す。
0004331912.tif 000035
表７に示したように実施例４（２）の非吸着画分は、上記総てのオリゴ糖のＰＡ化物に対して作用できなかった。一方、実施例４（２）の溶出画分は硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）には作用できなかったが、その他の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖に作用した。この結果より実施例４（２）の溶出画分は硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖のグルクロン酸を切断する酵素であることが強く示唆された。例えば、オリゴ糖１−（３）からフコースが１分子切断されるとオリゴ糖２−（３）が生成される。その際の保持時間の変化は８．９４分から８．９２分になると考えられる。オリゴ糖１−（３）に対する実施例４（２）の溶出画分の反応において、保持時間は８．９４分から９．０６分に変化した。従って、この反応はフコースを切断する反応ではないと考えられる。同様にオリゴ糖２−（５）と１−（４）及び２−（３）と１−（２）を比較することにより実施例４（２）の溶出画分の反応は硫酸エステルを切断する反応ではないことが考えられる。さらに、オリゴ糖１−（５）と１−（４）、１−（７）と１−（６）、及び１−（３）と１−（２）を比較することにより実施例４（２）の溶出画分の反応は、硫酸化フコースを切断する反応ではないことが示唆された。
（３）実施例４（２）記載の溶出画分がα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性を持つことを確認するため、実施例２記載の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）に実施例４（２）記載の溶出画分を作用させ、その質量変化を分析した。まず、下記の反応系を構築した。
反応系
３２．１ｍｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）
２．０ｍｌ  ４Ｍ  塩化ナトリウム
０．８ｍｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
４．０ｍｌ  ５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１０ｍｇ    実施例２記載の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）
１．０ｍｌ  実施例４（２）記載の溶出画分
上記全成分を混合後３０℃で５日間反応させ、脱塩のために、１０％のエタノールで平衡化したセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（４×９０ｃｍ）にかけ、１フラクションあたり９．１ｍｌで分取し、分取したフラクションに対して総糖量（フェノール−硫酸法）及び総ウロン酸量（カルバゾール−硫酸法）を測定した。この結果フェノール−硫酸法による発色が強い陽性の画分はカルバゾール−硫酸法による発色が陰性であった。すなわち、グルクロン酸を含む硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）からグルクロン酸が切断されたことが強く示唆された。さらに、グルクロン酸が切断されたことを確認するため、フェノール−硫酸法による発色が強い陽性の画分の質量分析を行った。その結果、これらのフラクションには質量１５０６、すなわち硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）からグルクロン酸が切断された質量（１５０６）に一致する物質が存在した。なお、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）と一致する質量（１６８２）の物質は検出できなかったことより、脱グルクロン酸化反応は完全に進んだことが分かった。
以上の結果より、実施例４（２）記載の溶出画分にはα−Ｄ−グルクロニダーゼが存在することが判明した。硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）からグルクロン酸が切断された質量（１５０６）に一致する物質は、下記式（ＶＩＩ）の構造を持つと考えられた。
0004331912.tif 000036
なお、以下、本物質を８Ｆｕｃ−４Ｓと称する。
そこで、実施例５（１）で得られた、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物に対する本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの至適反応条件を検討した。また、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの活性を求めるときは下記の反応系により活性を測定した。
反応系
５０μｌ  １００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
２１μｌ  水
４μｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
１０μｌ  ３ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１０μｌ  ４ｐｍｏｌｅ／μｌ  実施例５（１）で得られた、硫酸化グルクロノ
フカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物
５μｌ  α−Ｄ−グルクロニダーゼ溶液
上記全成分を混合後２２℃で３時間反応させ、１００℃で１０分間処理後遠心分離し、上清を下記の条件でＨＰＬＣにより分析した。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：Ｌ−カラム（４．６×２５０ｍｍ、（財）化学品検査協会製）
溶離液：０．３％のブタノールを含む５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ５．０）
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
１単位の本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼは上記反応系において１分間に１μｍｏｌｅの実施例５（１）で得られた、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物のグルクロニル結合を切断する酵素量とした。切断されたグルクロニル結合の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000037
ＤＧＡ：切断された実施例５（１）で得られた、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物の量（μｍｏｌｅ）
１８０：反応時間（分）
０．００５：酵素液量（ｍｌ）
（４）実施例５（３）記載の８Ｆｕｃ−４Ｓの２−アミノピリジンによる蛍光標識（ＰＡ化）
実施例５（３）記載の８Ｆｕｃ−４Ｓを５０ｎｍｏｌｅとり、グライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キット（共に宝酒造社製）を用いて還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識（ＰＡ化）し、該オリゴ糖のＰＡ化物を調製した。以下本物質を８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡと称する。
（５）８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡを用いた実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分の作用検討
実施例５（４）記載の８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡに対する実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分の作用を下記の反応系により調べた。
反応系
５０μｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）
２３μｌ  水
５μｌ  ４Ｍ  塩化ナトリウム
２μｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
５μｌ  ５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１０μｌ  ２ｐｍｏｌｅ／μｌ  ８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡ
５μｌ  水あるいは実施例４（２）記載の非吸着画分  あるいは
実施例４（２）記載の溶出画分
上記全成分を混合後３０℃で３時間反応させ、１００℃で１０分間処理後遠心分離し、上清を実施例５（３）記載の条件でＨＰＬＣにより分析した。
上記分析の結果、実施例４（２）記載の非吸着画分は８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡを分解したが、実施例４（２）記載の溶出画分は８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡを分解しなかった。また、実施例４（２）記載の非吸着画分により、８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡを分解して得られた分解物は実施例５（１）で得られた、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）のＰＡ化物と同じ溶出位置に溶出してきた。このことは、実施例２及び実施例３で硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）と同じ物質が大量に得られたことと矛盾しないものである。すなわち、実施例４（２）記載の非吸着画分は脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカンや硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖などに作用するエンド−α−Ｌ−フコシダーゼであることが判明した。
この結果より、実施例４で調製した硫酸化グルクロノフカン  セルロファインは本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼと本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを分離するのに有用な樹脂であることが判明した。
（６）なお、８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡに対する本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの至適反応条件を検討した。また、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性を求めるときは下記の反応系により活性を測定した。
反応系
５０μｌ  ４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
２３μｌ  水
２μｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
１０μｌ  ３ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１０μｌ  ４ｐｍｏｌｅ／μｌ  ８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡ
５μｌ  エンド−α−Ｌ−フコシダーゼ溶液
反応は３０℃で３時間行い、反応液の分析は上記と同様に行った。
１単位の本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは上記反応系において１分間に１μｍｏｌの８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡのフコシル結合をエンド的に切断する酵素量とした。切断されたフコシル結合の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000038
ＤＰＡ：切断された８Ｆｕｃ−４Ｓ−ＰＡの量（μｍｏｌｅ）
１８０：反応時間（分）
０．００５：酵素液量（ｍｌ）
実施例６
実施例４（２）記載の非吸着画分及び溶出画分をそれぞれ、あらかじめ１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カルシウム、及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）でゲルろ過し、溶出液を１３．５ｍｌずつ分取した。溶出フラクションに対して、実施例４（２）記載の非吸着画分は実施例５（２）記載の方法で、基質には硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物を用いて、実施例４（２）記載の溶出画分は実施例５（５）記載の方法でそれぞれ、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性を測定した。上記ゲルろ過法にて測定した本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの分子量は約１２万〜１８万、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの分子量は約１５万〜２０万であった。
実施例７
参考例１（１）記載の粗硫酸化グルクロノフカン画分をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００により精製した。すなわち、あらかじめ、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムに同じ緩衝液に溶解させた５ｇの参考例１（１）記載の粗硫酸化グルクロノフカン画分をかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、１００ｍＭから２Ｍまでの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出画分は５００ｍｌずつ分画し、総糖量をフェノール−硫酸法により測定した。溶出塩濃度５００ｍＭ付近に溶出してくる硫酸化グルクロノフカンの主成分と考えられる画分を集め、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置により脱塩し、凍結乾燥させて、精製硫酸化グルクロノフカン画分０．９ｇを得た。上記の精製硫酸化グルクロノフカン画分のグルクロン酸含量の調整を検討した。まず、下記の反応系を構築した。
反応系
５ｍｌ  ５０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）
０．５ｍｌ  ４Ｍ  塩化ナトリウム
０．５ｍｌ  １Ｍ  塩化カルシウム
０．２５ｍｌ  ５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
３．３５ｍｌ  実施例４（２）記載の溶出画分
２．４ｍｌ  １．２５％の精製硫酸化グルクロノフカン画分水溶液
上記全成分を混合後２５℃で反応させ、経時的にサンプリングし、そのサンプルを充分透析して切断されたグルクロン酸を除去した。表８に透析後の各サンプル中に含まれるフコース量、グルクロン酸量、及びそれらの比率を記す。
0004331912.tif 000039
上記結果より、実施例４（２）記載の溶出画分を用いれば硫酸化グルクロノフカンのグルクロン酸を切断除去することによりフコースとグルクロン酸の比率を調整できることが判明した。
実施例８
（１）酵素反応におけるカルシウム塩濃度の影響
本発明の「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を測定する際に、反応系に含まれる塩化カルシウムの濃度を低下させると、活性の低下が認められた。そこで、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼについても反応系に含まれる塩化カルシウムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、両酵素とも塩化カルシウムにより活性化されることが判明した。なお、酢酸カルシウムによっても同様の活性化がみられた。
（２）酵素反応におけるたん白質の影響
本発明の「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を測定する際に、反応系から牛血清アルブミンを除去すると、活性の低下が認められた。そこで、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼについても反応系に含まれる牛血清アルブミンの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、両酵素とも牛血清アルブミンにより活性化されることが判明した。なお、本発明のフコフィラス  フコイダノリティカスＳＩ−１２３４が生産する蛋白質によっても同様の活性化がみられた。
（３）酵素反応における塩化ナトリウムの影響
本発明の「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を測定する際に、反応系から塩化ナトリウムを除去すると活性の低下が認められた。そこで本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼについても反応系に含まれる塩化ナトリウムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、両酵素とも低分子のオリゴ糖を基質にした時は、塩化ナトリウムにより活性化されないことが判明した。このことから、塩化ナトリウムは、酵素の基質が高分子の硫酸化グルクロノフカンの時に両酵素を活性化することが確認できた。
実施例９
フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４を参考例１（１）の方法で調製したオキナワモズク由来の粗硫酸化グルクロノフカン画分０．２％とペプトン１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２４℃で７２時間培養して種培養液とした。ペプトン２００ｇ、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメンターで、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に、参考例１（１）の方法で調製したオキナワモズク由来の粗硫酸化グルクロノフカン画分４０ｇを２リットルの人工海水に溶解し、９５℃、１時間処理したものを混合し、上記の種培養液を接種し、毎分１２５回転の回転速度で、２４℃で７２時間培養した。なお、培養中は培地のｐＨが７以上になるように自動制御した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
上記方法のように、本培養の培地に添加する硫酸化グルクロノフカンに対する加熱温度が９５℃程度である場合、１２０℃付近で加熱殺菌した場合と比べて、フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４株による硫酸化グルクロノフカンの資化率が高く、単位培地量あたりの本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼとエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの生産量が多いことが確認できた。
上記の培養で得られた菌体を１リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離し、得られた抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼとエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが共存する上清を得た。
得られた上清に含まれる、「硫酸化グルクロノフカン分解活性」を参考例１（２）記載の方法で、本発明のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの活性をそれぞれ実施例１４、実施例５（３）及び実施例５（６）に記載の方法でそれぞれ測定した。その結果、「硫酸化グルクロノフカン分解活性」は培養液１ｍｌあたり６ｍＵ、本発明のフコイダンデアセチラーゼは培養液１ｍｌあたり１ｍＵ、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼは培養液１ｍｌあたり１３０μＵ、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼは培養液１ｍｌあたり６μＵ生産されていることが確認できた。
実施例１０
（１）硫酸化グルクロノフカン画分について育毛効果を検討した。
生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、５日齢で実験に用いた。マウスを脱血致死させ、ハサミとピンセットを用いてヒゲを、皮下組織ごと採取した。さらに、Ｏｇａｗａらの方法（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０３：３０６−３０９，１９９４）に従い、顕微鏡下、シャーレの中でヒゲを毛包ごと分離した。一匹の左右より１４〜１６本のヒゲを採取した。次に、参考例１（１）記載のオキナワモズク由来の粗硫酸化グルクロノフカン画分をＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解し、所定濃度の２０倍濃度液を調製し、培養系には２０分の１量を加えた。対照群には同量の培地を加えた。ヒゲの培養は、組織培養用ディッシュ  Ｆａｌｃｏｎ  ３０３７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社製）を用い、中央のウエルに０．７ｍｌの２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地を入れ、その上に滅菌したステンレスメッシュ（池田理化株式会社製）とレンズペーパー（ティーシーケース株式会社製）を敷いた。ヒゲはその上に載せて培養した。オキナワモズク由来の粗硫酸化グルクロノフカン画分は、予め培地の中に添加した。培養は３５℃、５％ＣＯ２存在下で６日間行った。ヒゲの長さは、培養開始前と終了後に、顕微鏡下でカリパーを用いて０．１ｍｍの位まで測定した。各サンプル濃度の一群について３〜５本のヒゲを用いて測定し、伸長した長さを平均±標準誤差で表示した。また、有意差検定はステューデントのｔ検定を行い、対照群に対してＰ値を求めた。その結果を表９に示す。
0004331912.tif 000040
表９に示したように、オキナワモズク由来の硫酸化グルクロノフカン画分は、対照に比べて、マウスのヒゲを伸長させる効果があることを確認した。
実施例１１
（１）酵素の調製
実施例９の方法により調製したフコフィラス  フコイダノリティカス  ＳＩ−１２３４株の菌体抽出液を１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼとエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが共存する粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから４００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、一本あたり６７ｍｌで分取し、硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を集めた。得られた硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を分画分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮し、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝液を置換した。得られた酵素液を同じ緩衝液で平衡化した実施例４（１）に記載の５０ｍｌの硫酸化グルクロノフカン  セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり１０ｍｌで行い、各画分の硫酸化グルクロノフカン分解活性を測定した。その結果、溶出画分には僅かに活性が検出されたが、非吸着画分には活性が見出されなかった。しかし、非吸着画分と溶出画分を混合すると硫酸化グルクロノフカン分解活性は、カラムにかけた活性とほぼ等しくなった。
非吸着画分を集め、限外ろ過機により１００ｍｌに濃縮し、非吸着画分濃縮液を得た。一方、溶出画分は、濃縮した非吸着画分を用いて硫酸化グルクロノフカン分解活性を測定し、その活性画分を限外ろ過機により２００ｍｌに濃縮して、溶出画分濃縮液を得た。これらの酵素を更に精製して硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の調製を試みた。まず、それぞれの画分の活性を測定するための反応系を構築した。
上記の非吸着画分及び溶出画分は単独では硫酸化グルクロノフカンに作用してオリゴ糖を効率良く生成することができないが、共存すると硫酸化グルクロノフカンを分解し、効率良く低分子化させることができる。両酵素が共存した状態での硫酸化グルクロノフカンを分解する活性を、下記の活性測定方法により数値化した。
非吸着画分の活性測定方法は、以下のようにして行った。すなわち、１０μｌの１％の粗硫酸化グルクロノフカン画分溶液と、５３μｌの５０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）と、５μｌの４Ｍの塩化ナトリウムと、２μｌの１Ｍの塩化カルシウムと、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンと、１μｌの溶出画分濃縮液及び１９μｌの活性を測定する非吸着分由来酵素液とを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後９０μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、非吸着画分由来酵素液の代わりに、その酵素液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び粗硫酸化グルクロノフカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。
１単位の硫酸化グルクロノフカン分解活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化グルクロノフカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断されたフコシル結合の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000041
１０×１０００×１／１００：反応系中に添加した粗硫酸化グルクロノフカン画分（μｇ）
ＭＧ：対照反応液の硫酸化グルクロノフカンの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化グルクロノフカンが酵素により切断された部位の数
１８０：反応時間（分）
０．０１９：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６ＨＱ（８ｘ３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
他方、溶出画分の活性測定は下記の様に行った。すなわち、１０μｌの１％の粗硫酸化グルクロノフカン画分溶液と、５３μｌの５０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）と、５μｌの４Ｍの塩化ナトリウムと、２μｌの１Ｍの塩化カルシウムと、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンと、１９μｌの非吸着画分濃縮液及び１μｌの活性を測定する溶出画分由来酵素液とを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後９０μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、溶出画分由来酵素液の代わりに、その酵素液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び粗硫酸化グルクロノフカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。
１単位の硫酸化グルクロノフカン分解活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化グルクロノフカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断されたフコシル結合の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000042
１０×１０００×１／１００：反応系中に添加した粗硫酸化グルクロノフカン画分（μｇ）
ＭＧ：対照反応液の硫酸化グルクロノフカンの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化グルクロノフカンが酵素により切断された部位の数
１８０：反応時間（分）
０．００１：酵素液量（ｍｌ）
非吸着画分濃縮液の精製は、以下のようにして行った。すなわち、上記の非吸着画分濃縮液に４Ｍの塩化ナトリウムを加えて、２５０ｍＭとし、同じ緩衝液で平衡化した３０ｍｌのフェニル−セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、２５０ｍＭから０ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、その後、１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で、次に、１０％のエタノールと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出させ、一本あたり１０ｍｌで分取し、上記の方法により測定した硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を集めた。
得られた硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウム及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を溶離液とした、セファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）で分画した。１本あたり、１３．５ｍｌで分取し、上記の方法により測定した硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を、精製非吸着画分とした。
さらに、溶出画分濃縮液の精製は、以下のようにして行った。すなわち、上記の溶出画分濃縮液を分画分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置により、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で置換し、同じ緩衝液で平衡化した４５ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから４００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、一本あたり１０ｍｌで分取し、上記の方法により測定した硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を集めた。
得られた硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウム及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を溶離液とした、セファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）で分画した。１本あたり、１３．５ｍｌで分取し、上記の方法により測定した硫酸化グルクロノフカン分解活性画分を、精製溶出画分とした。
（２）硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の調製
上記の精製非吸着画分と精製溶出画分を用いて硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の調製を行った。
すなわち、１０ｇの粗硫酸化グルクロノフカン画分を１リットルの２５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭの塩化カルシウム、５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１ｇの牛血清アルブミンを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解後、１００ｍＵの精製溶出画分及び６００ｍＵの精製非吸着画分を加え、３０℃で１０日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用いて、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分３とした。
（３）硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖の精製
上記の硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分３を脱塩装置（マイクロアシライザー  Ｇ３、旭化成工業製）により脱塩した。脱塩した硫酸化グルクロノフカン酵素消化物画分３に５ｍＭとなるようにイミダゾールを、１０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、１０ｍＭから４００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションの中には少なくとも５個の明瞭なピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集め、オリゴ糖３−（１）〜（５）とし、それぞれをエバポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％のエタノールで溶出して脱塩した。こうして本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（１）〜（５）、すなわち、オリゴ糖３−（１）〜（５）を得た。
（４）オリゴ糖の構造解析
得られた上記オリゴ糖３−（１）〜（５）の脱塩物について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法により還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、総てのオリゴ糖の還元性末端糖はフコースであった。また、糖組成は、オリゴ糖３−（２）はフコースのみでオリゴ糖３−（１）及び３−（３）〜（５）はフコースとグルクロン酸からなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）により質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いてＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。以下にオリゴ糖３−（２）〜（５）の物性を示す。
（ａ）オリゴ糖３−（２）の物性
上記分析の結果、本物質は前記オリゴ糖１−（１）と同じ物質であることが判明した。
（ｂ）オリゴ糖３−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２９に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３０に、マススペクトルを図３１にそれぞれ示した。図２９、図３０において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図３１において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１２３０
ＭＳ  ｍ／ｚ  １２７３．４［Ｍ＋２Ｎａ＋−３Ｈ＋］−、６２５．２［Ｍ＋Ｎａ＋−３Ｈ＋］２−、４０９．２［Ｍ−３Ｈ＋］３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１０に示す。
0004331912.tif 000043
0004331912.tif 000044
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝６：１
硫酸基  ２分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＸＩＶ）の通りである。
0004331912.tif 000045
なお、以下、本物質を６Ｆｕｃ−２Ｓ−１ＧｌｃＵＡと称す。
（ｃ）オリゴ糖３−（４）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３３に、マススペクトルを図３４にそれぞれ示す。図３２及び図３３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図３４において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１７２４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ８９４．１［Ｍ＋３Ｎａ＋−５Ｈ＋］２−、５８８．７［Ｍ＋２Ｎａ＋−５Ｈ＋］３−、４３５．６［Ｍ＋Ｎａ＋−５Ｈ＋］４−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１１に示す。
0004331912.tif 000046
0004331912.tif 000047
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝８：１
硫酸基  ４分子
アセチル基  １分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＸ）の通りである。
0004331912.tif 000048
なお、以下、本物質を８Ｆｕｃ−４Ｓ−１ＧｌｃＵＡ−１アセチルと称す。
（ｄ）オリゴ糖３−（５）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３５に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３６に、マススペクトルを図３７にそれぞれ示した。図３５及び図３６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図３７において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２６８９
ＭＳ  ｍ／ｚ  ９２４．０［Ｍ＋４Ｎａ＋−７Ｈ＋］３−、６８７．３［Ｍ＋３Ｎａ＋−７Ｈ＋］４−、５４５．３［Ｍ＋２Ｎａ＋−７Ｈ＋］５−、４５０．５［Ｍ＋Ｎａ＋−７Ｈ＋］６−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１２に示す。
0004331912.tif 000049
0004331912.tif 000050
0004331912.tif 000051
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−グルクロン酸＝１２：２
硫酸基  ６分子
アセチル基  ２分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｘ）の通りである。
0004331912.tif 000052
0004331912.tif 000053
なお、以下、本物質を１２Ｆｕｃ−６Ｓ−２ＧｌｃＵＡ−２アセチルと称す。
実施例１２
（１）α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの精製
実施例９の方法によりフコフィラス  フコイダノリティカス  ＳＩ−１２３４株を３回培養し、それぞれの培養で得られた菌体から、実施例９の方法により菌体抽出液を調製し１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼとエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが共存する粗酵素液を得た。以下、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性を実施例５（３）記載の方法により、本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性を実施例５（６）記載の方法により測定することによりそれぞれの酵素を精製した。
得られた粗酵素液を同じ緩衝液で平衡化した３ＬのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから４００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、一本あたり２００ｍｌで分取し、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を集めた。この時点では本発明の両酵素はほとんど同じ挙動を示し分離されなかった。
上記の両酵素活性画分を分画分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝液を置換した。
得られた酵素液を同じ緩衝液で平衡化した２４０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり２５ｍｌで行い、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を集めた。この時点では本発明の両酵素はほとんど同じ挙動を示し分離されなかった。
上記の両酵素活性画分を分画分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮し、５０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝液を置換した。
得られた酵素液を同じ緩衝液で平衡化した５０ｍｌの硫酸化−セルロファイン（生化学工業製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから１Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり５０ｍｌで行い、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分及び本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を集めた。ここで、両酵素が完全に分離したので、以下それぞれの酵素を別々に精製した。
（２）エンド−α−Ｌ−フコシダーゼの精製
上記（１）で得られたエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を分画分子量１万の限外ろ過膜を用いて濃縮し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で溶出させた。分取は１本あたり１３．３ｍｌで行い、エンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を集めた。
得られたエンド−α−Ｌ−フコシダーゼ活性画分を、１０ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）とエタノールの混合比が８５：１５の緩衝液で平衡化したフェニル−セルロファインのカラム（２．４×４４ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で溶出させた。分取は１本あたり３０ｍｌで行った。得られた活性画分はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一であった。このようにして本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの精製物を得た。
（３）α−Ｄ−グルクロニダーゼの精製
上記（１）で得られた本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分を分画分子量１万の限外ろ過膜を用いて濃縮し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと１０ｍＭの塩化カルシウムと５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で溶出させた。分取は１本あたり１３．３ｍｌで行い、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分を集めた。
得られた本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ画分を３００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した２０ｍｌの硫酸化−セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、３００ｍＭから９００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり１０ｍｌで行い、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分を集めた。
得られた本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ画分を２００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した２０ｍｌの硫酸化−セルロファインのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、２００ｍＭから８００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は１本あたり７ｍｌで行い、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼ活性画分を集めた。得られた活性画分はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一であった。このようにして本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの精製物を得た。
実施例１３
実施例１２（２）で得られた本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの精製物及び実施例１２（３）で得られた本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼの精製物を用いて硫酸化グルクロノフカンの低分子化を試みた。まず、硫酸化グルクロノフカンの分解に及ぼすアセチル基の影響を調べるために脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの調製を行った。
（１）脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの調製
参考例１（１）の方法により調製した硫酸化グルクロノフカン２００ｍｇを２０ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し２５℃で２０時間処理し、次に２００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭのイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．６）で充分透析し脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンを得た。
（２）各基質の分解
参考例１（１）の方法により調製した硫酸化グルクロノフカン及び上記（１）の方法により調製した脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンに対し、２００ｍｇあたり本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼを１５０μＵと本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼを１ｍＵ添加し２５℃で分解反応を行った。なお、これらの反応液の各成分の最終濃度は、硫酸化グルクロノフカン６．７ｍｇ／ｍｌ、牛血清アルブミン０．１ｍｇ／ｍｌ、塩化ナトリウム２００ｍＭ、塩化カルシウム５０ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭで、ｐＨは６．６に調整した。この結果、反応開始時は硫酸化グルクロノフカンと脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンの分子量はほぼ同じであったが、２日反応後の平均分子量は硫酸化グルクロノフカンでは、約１９５万、脱アセチル化硫酸化グルクロノフカンでは、約２７，０００であった。
すなわち、本発明のα−Ｄ−グルクロニダーゼと本発明のエンド−α−Ｌ−フコシダーゼにより、硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖を効率良く得るには、脱アセチル化が必要であることが確認できた。また、実施例１に記載の粗酵素及び部分精製酵素を硫酸化グルクロノフカンに作用させると、得られたオリゴ糖にはほとんどアセチル基がついていないこと、実施例１１（１）記載の精製非吸着画分と精製溶出画分を硫酸化グルクロノフカンに作用させると、アセチル基がついたオリゴ糖が生成することから、本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株は硫酸化グルクロノフカンのアセチル基を遊離させるフコイダンデアセチラーゼを生産することが推定された。
実施例１４
フコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株が生産する硫酸化グルクロノフカンのアセチル基を遊離させるフコイダンデアセチラーゼについて検討した。
（１）フコイダンデアセチラーゼの精製
まず、実施例１１（１）の方法により調製した本発明のフコフィラス  フコイダノリィティカスＳＩ−１２３４株の粗酵素溶液に存在するフコイダンデアセチラーゼの活性を測定する反応系を確立した。
すなわち、１００μｌの５０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と１０μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと１μｌの１Ｍ塩化カルシウムと４０μｌの１％硫酸化グルクロノフカンと２９μｌの水に、２０μｌのフコイダンデアセチラーゼ溶液を加え、３０℃で３時間反応させ、遊離してくるアセチル基の量を市販の酢酸定量用キット（Ｆ−キット酢酸、ロシュ・ダイアグノスティックス製）により測定した。その結果、培養液１ｍｌあたりの本発明のフコイダンデアセチラーゼの活性は約２ｍＵであった。
また別法として、オリゴ糖３−（４）の還元性末端を２−アミノピリジンで蛍光標識したものを基質に用いて以下の反応系でフコイダンデアセチラーゼの活性を測定した。
反応系
７５μｌ      ５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
２８．５μｌ  水
９μｌ      ４Ｍ  塩化ナトリウム
１５μｌ      ３ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１５μｌ      ４ｐｍｏｌｅ／μｌ  オリゴ糖３−（４）の蛍光標識物
７．５μｌ  フコイダンデアセチラーゼ溶液
上記全成分を混合後３０℃で１時間反応させ、１００℃で１０分処理後遠心分離し、上清を下記の条件でＨＰＬＣにより分析し脱アセチル化量を測定した。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：Ｌ−カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ、（財）化学品検査協会製）
溶離液：０．５％のブタノールを含む５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ５．０）
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
１単位の本発明のフコイダンデアセチラーゼは上記反応系において１分間に１μｍｏｌｅのアセチル基を切断する酵素量とした。なお、上記の反応系において基質のアセチル基が切断されると実施例５（１）で得られた硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）のＰＡ化物と同じ構造になるので、アセチル基が切断された基質のカラム保持時間を確認するために該ＰＡ化物を使用した。切断されたアセチル基の量は下記式により求めた。
0004331912.tif 000054
0004331912.tif 000055
ＤＡ：切断されたアセチル基の量（μｍｏｌｅ）
６０：反応時間（分）
０．０１５：酵素液量（ｍｌ）
上記の方法により測定した場合、培養液１ｍｌあたりの本発明のフコイダンデアセチラーゼの活性は０．８ｍＵ／ｍｌであった。
上記の粗酵素溶液５０ｍｌを、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、及び５ｍＭアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させたセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で溶出させた。一本あたり１３ｍｌで分取し、各フラクションに含まれる本発明のフコイダンデアセチラーゼの活性を上記の方法により測定した。溶出液量から算出した本発明のフコイダンデアセチラーゼの分子量は約３万〜５万であった。
上記の活性画分を集め、本発明のフコイダンデアセチラーゼの性質を調べた。その結果を図１〜図２に示す。即ち、図１は至適ｐＨ、図２は至適温度を示す。
図１に示したように、本発明のフコイダンデアセチラーゼの至適ｐＨは、約６〜９．１の範囲、至適温度は２３〜４５℃の範囲であった。
（２）フコイダンデアセチラーゼを用いた各種フコイダンからの脱アセチル反応
下記の反応系を構築し、種々のフコイダンに含まれるアセチル基の量を測定した。
反応には下記表１３に示す海藻由来のフコイダンを用いた。
反応系
６０μｌ    １％フコイダン
５０μｌ    １００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５
１０μｌ    ４Ｍ塩化ナトリウム
２０μｌ    ３ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
３０μｌ    水
３０μｌ    フコイダンデアセチラーゼ
上記全成分を混合後３０℃で２１時間反応させ、生成した酢酸の量を上記の酢酸定量キットにより測定した。また、各フコイダンを１Ｎの水酸化ナトリウム中で２５℃、１８時間処理して、生成した酢酸の量を上記の酢酸定量キットにより測定した。その結果を表１３に示す。
0004331912.tif 000056
表１３に示したように、本発明のフコイダンデアセチラーゼは種々の海藻由来のフコイダンに作用してアセチル基を加水分解する酵素であることが確認できた。また、水酸化ナトリウムを用いて非特異的に脱アセチル化した場合と比較することにより本発明のフコイダンデアセチラーゼが、オキナワモズク由来のフコイダンすなわち硫酸化グルクロノフカンのアセチル基に対する特異性が高いことが確認できた。
実施例１５
（１）本発明の硫酸化グルクロノフカンの主要構造の解析
実施例７で調製した精製硫酸化グルクロノフカン画分の全構造及び硫酸化グルクロノフカン分解酵素の切断部位を決定するために、ＮＭＲ分析を行なった。ＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化グルクロノフカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３８に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３９にそれぞれ示す。図３８及び図３９において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。さらに、赤外吸収スペクトルを図４０に示す。図４０において、縦軸は透過率（％）を、横軸は波数（ｃｍ−１）を示す。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１４に示す。
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表１４に示した帰属より、本発明の硫酸化グルクロノフカンは、下記式（仮ＸＶ）に示すようにＦ１のフコースがα結合で別の繰り返し５糖のＦ４のフコースの３位に結合したものであった。また、アセチル基は、繰り返し５糖あたり１残基が主にＦ１のフコースの４位に結合していることが確認できた。すなわち硫酸化グルクロノフカンは、下記に示す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。
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産業上の利用の可能性
本発明により硫酸化グルクロノフカンの構造解析や硫酸化グルクロノフカンの低分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規のフコイダンデアセチラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ及びエンド−α−Ｌ−フコシダーゼが提供される。また、該酵素の製造方法も提供される。また、該酵素を使用することにより糖鎖工学用試薬として有用な様々な割合で脱アセチル化された脱アセチル化硫酸化グルクロノフカン、様々な割合で脱グルクロン酸化された脱アセチル化脱グルクロン酸化硫酸化グルクロノフカン及び硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖が提供される。また、該酵素を効率良く使用するための添加物が提供される。また、様々な褐藻類由来の硫酸化多糖分解酵素を生産する微生物も提供される。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１  本発明により得られるフコイダンデアセチラーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図２  本発明により得られるフコイダンデアセチラーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図３  本発明により得られるα−Ｄ−グルクロニダーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図４  本発明により得られるα−Ｄ−グルクロニダーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図５  本発明により得られるエンド−α−Ｌ−フコシダーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図６  本発明により得られるエンド−α−Ｌ−フコシダーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図７  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図８  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図９  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１０  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１１  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１２  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１３  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１４  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンフカンオリゴ糖１−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１５  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１６  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（５）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１７  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンフカンオリゴ糖１−（５）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１８  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（６）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１９  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（７）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２０  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（７）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２１  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（７）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図２２  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖１−（８）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図２３  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２４  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２５  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図２６  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２７  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖２−（５）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図２８  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカン低分子化物であるオリゴ糖２−（５）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図２９  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３０  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３１  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカン低分子化物であるオリゴ糖３−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図３２  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３３  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（４）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３４  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカン低分子化物であるオリゴ糖３−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図３５  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３６  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカンオリゴ糖３−（５）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図３７  本発明により得られる硫酸化グルクロノフカン低分子化物であるオリゴ糖３−（５）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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