(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）に対応することおよびｃｄｃ２／サイクリンＢに対して１μＭ以下のＩＣ50を呈することを特徴とするプリン誘導体：
【化１】
0004340796.tif 000006
式中
−  Ｒ２は、
プロパン−２−オール−１−イル−アミノ、
（２Ｒ，Ｓ）−ブタノール−２−イル−アミノ、
エタンアミン−２−イル−アミノ、
（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル、
（２Ｒ）−２−フェニル−エタノール−２−イル−アミノ、
（２Ｒ，Ｓ）−ペンタノール−２−イル−アミノ、
（２Ｒ）−プロパノール−２−イル−アミノ、および
（２Ｓ）−プロパノール−２−イル−アミノ
を含む群において選ばれ；
−  Ｒ６は、場合によりハロゲンによって置換されるベンジルアミノ基であり；
−  Ｒ９は、イソプロピルまたはシクロペンチル基である。
【請求項２】
Ｒ２が（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル基であり、Ｒ６がベンジルアミノ基である場合に、Ｒ９はシクロペンチル基である、請求項１の誘導体。
【請求項３】
請求項１または２の誘導体の光学異性体、ラセミ混合物または幾何異性体。
【請求項４】
２−（Ｒ，Ｓ）−（６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）−ブタン−１−オール。
【請求項５】
２−（Ｒ）−（６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）−ブタン−１−オール。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の少なくとも１種のプリン誘導体を活性成分として、不活性医薬担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項７】
経口または注射経路で投与可能である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
錠剤、カプセル剤または丸剤であり、服用単位当たり１〜１００ｍｇの活性成分を含有する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
服用単位当たり１０〜４０ｍｇの活性成分を含有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
注射可能な液剤であり、これらの液剤が投与単位当たり１〜５０ｍｇの活性成分を含有する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記液剤は、投与当たり１０〜３０ｍｇの活性成分を含有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
抗有糸分裂薬として用いられる、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌の化学療法のために用いられる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
乾癬の治療のために用いられる、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アルツハイマー病の治療のために用いられる、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗神経退行薬として用いられる、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗神経退行薬は、神経細胞の抗アポトーシス薬である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗増殖性を有する新規プリン誘導体およびそれらの生物学的用途を対象とする。
それは、特にサイクリン依存性キナ−ゼ蛋白質、略してｃｄｋに対して阻害作用を有するプリン誘導体を対象とする。
細胞周期（cell cycle）を制御する分子機構の研究により、ｃｄｋの調節機能を明らかにすることが可能になった。これらの蛋白質は、触媒サブユニット（ｃｄｃ２がそのプロトタイプである）と調節サブユニット（サイクリン）との少なくとも２つのサブユニットからなる。これまでに８種のｃｄｋが記載されている。すなわち、ｃｄｋ１（＝ｃｄｃ２）、ｃｄｋ２〜ｃｄｋ８である。
結合するサイクリンが知られていないｃｄｋ３を除いて、これらのｃｄｋは、次のサイクリン族の一員との一時的結合により調節が確実なものとされる：サイクリンＡ（ｃｄｃ２、ｃｄｋ２）、サイクリンＢ１〜Ｂ３（ｃｄｃ２）、サイクリンＣ（ｃｄｋ８）、サイクリンＤ１〜Ｄ３（ｃｄｋ２−ｃｄｋ４−ｃｄｋ５−ｃｄｋ６）、サイクリンＥ（ｃｄｋ２）、サイクリンＨ（ｃｄｋ７）。
これらの複合体の各々は、細胞周期の一つの相に関連する。ｃｄｋの活性は、翻訳後修飾により、他の蛋白質との一時的結合により、およびそれらの細胞内局在の修飾により、調節される。ｃｄｋ調節因子は、活性化因子（サイクリン、ｃｄｋ７／サイクリンＨ、ホスファタ−ゼｃｄｃ２５）、サブユニットｐ９CKSおよびｐ１５cdk-BPならびにインヒビタ−蛋白質（ｐ１６INK4A、ｐ１５INK4B、ｐ２１Cip1、ｐ１８、ｐ２７Kip1）を包含する。
細胞分裂調節機構に関する純粋に基本的な研究と並行して、ヒトでの腫瘍の発生におけるサイクリン依存性キナ−ゼの調節解除の重要性が、多くの研究によって証明されてきている。例えば、多くの腫瘍におけるサイクリンＤおよびＥの過剰発現、ｃｄｃ２の過剰発現、サイクリンＤおよびＡの腫瘍原性、サイクリン依存性キナ−ゼの一時的な異常発現、蛋白質阻害剤（プロテインインヒビタ−）の重大な調節解除（変異、欠失）が観察されてきた。
細胞分裂周期調節因子は、多くの臨床的研究の対象となっている（処置のための指示マ−カ−としての利用）。
これらの結果は、細胞周期調節機構を詳細に理解しようとする努力を非常に勇気付けるものである。それらはまた、サイクリン依存性キナ−ゼインヒビタ−分子をスクリ−ニングにより探究することへと導くものでもある。
ブチロラクトン、フラボピリド−ル、オロモウシン（olomoucine）と呼ばれる２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリンなどの多くのキナ−ゼインヒビタ−が既に記載されている。オロモウシンに関する研究は、本明細書の最後に示した参照文献リスト中の参照番号（１）の論文においてヴェゼリ（Vesely）らが報告している。
このｃｄｃ２インヒビターは、効果が大であり（そのＩＣ50は７μＭである）、きわめて選択的であり（３５種より多くのキナ−ゼが試験されている）、次の式に対応する：
0004340796.tif 000002
この領域における発明者らの研究は、オロモウシンの酵素特異性を保持しながら低用量でｃｄｃ２を阻害する、特に興味ある新規分子の合成へと導いた。
それゆえ、本発明は、とりわけ抗増殖性を有する新規プリン誘導体を提供することを目的とする。
本発明はまた、工業的規模でこれらの誘導体を製造することを可能ならしめる合成法によるそれらの取得方法をも対象とする。
それはまた、それらの治療における応用および除草剤としての用途を対象とするものでもある。
本発明のプリン誘導体は、それらが式Ｉに対応することを特徴とする：
0004340796.tif 000003
式中
−  Ｒ２、Ｒ６およびＲ９は互いに同一または異なって、ハロゲン原子、Ｒ−ＮＨ−基、Ｒ−ＮＨ−ＮＨ−基、ＮＨ2−Ｒ’−ＮＨ−基またはＲ−ＮＨ−Ｒ’−ＮＨ−基を表わし、Ｒは直鎖状または分枝鎖状の飽和または不飽和アルキル基、アリ−ル基またはシクロアルキル基もしくは複素環を表わし、Ｒ’は直鎖状または分枝鎖状の飽和または不飽和アルキレン基、アリ−レン基またはシクロアルキレン基を表わし、ＲおよびＲ’は各々１〜８個の炭素原子を含有し、場合により１個以上の−ＯＨ基、ハロゲン、アミノ基またはアルキル基で置換されていてもよく、
−  Ｒ２はさらに、場合により各々に１個以上の−ＯＨ基、ハロゲン、アミノ基またはアルキル基で置換されていてもよい直鎖状または分枝鎖状の飽和または不飽和アルキル基、アリ−ル基またはシクロアルキル基もしくは複素環を有していてもよい複素環を表わすことができ、
−  Ｒ９はさらに、直鎖状または分枝鎖状の飽和または不飽和アルキル基、アリ−ル基またはシクロアルキル基を表わすことができ、
−  Ｒ２およびＲ９はさらに、水素原子を表わすことができる。ただし、前記置換基がそれぞれに次のものを表わす誘導体を除く：
Ｒ６およびＲ９がベンジルアミノおよびメチル基、
Ｒ２およびＲ６が２−ヒドロキシエチルアミノおよびベンジルアミノ基、
Ｒ２、Ｒ６およびＲ９がアミノ、ベンジルアミノおよびメチル、あるいはクロロ、アミノおよびメチル、あるいはクロロ、ベンジルアミノおよびメチル、あるいはクロロ、３−ヒドロキシベンジルアミノおよびメチル、あるいはクロロ、５−ヒドロキシペンチルアミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、ベンジルアミノおよびイソプロピル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、アミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、イソペンテニルおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、イソペンテニルアミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、ベンジルアミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、ベンジルアミノおよび２−ヒドロキシエチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、ベンジルアミノおよびイソプロピル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、（３−ヒドロキシベンジル）アミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、（３−ヒドロキシベンジル）アミノおよびイソプロピル、あるいは２−ヒドロキシイソブチルアミノ、６−ベンジルアミノおよびメチル、あるいは２−ヒドロキシエチルアミノ、イソペンテニルアミノおよびイソプロピル、あるいは（２−ヒドロキシエチル）アミノ、（４−メトキシベンジル）アミノおよびイソプロピルアミノ基を表わす誘導体。
本発明のプリン誘導体はさらに、ｃｄｃ２／サイクリンＢに対して約５μＭ以下のＩＣ50を呈することによっても特徴付けられる。
上記の本発明から除外される誘導体は、引用文献（１）に記載されている。
一般的に言って、本発明の誘導体はきわめて興味のもたれるプロテインキナ−ゼインヒビタ−となる。
好ましいのは、ハロゲン原子が塩素、臭素または弗素のうちから選ばれ、アルキル基がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルおよびヘプチル基のうちから選ばれ、アルキレン基がメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンテンまたはイソペンテン基のうちから選ばれ、アリ−ル基がベンジル基であり、シクロアルキル基がシクロヘキシル基であり、アリ−レン基がベンジレン基であり、シクロアルキレン基がシクロヘキシレン基であり、複素環が窒素および／または酸素含有複素環、例えばイミダゾ−ル、オキサジアゾ−ル、ピリジン、ピリダジンまたはピリミジンあるいはピロリジンである場合である。
本発明の一態様に従えば、Ｒ２は、ｃｄｋ２／ＡＴＰ複合体中のリボ−スが占めるＡＴＰ結合ドメインの一領域に結合しうる基のうちから選択される。塩素原子ならびにアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−ヘプチルアミノ、アミノエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、ジメチルアミノエチルアミノ、ヒドロキシエチルアミノ、ヒドロキシプロピルアミノ、ヒドロキシイソブチルアミノ、ヒドロキシペンチルアミノ、ジメチルヒドラジノ、ヒドロキシメチルプロピルアミノ、〔（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル〕、Ｎ−ベンジルアミノエタノ−ル、（Ｒ，Ｓ）−アミノヘキサノ−ル、（Ｓ）−アミノ−２−フェニルエタノ−ル、（Ｒ）−アミノ−２−フェニルエタノ−ル、（Ｒ）−アミノ−３−フェニルプロパノ−ル、（Ｒ，Ｓ）−アミノペンタノ−ル、（Ｒ）−アミノプロパノ−ル、（Ｓ）−アミノプロパノ−ルおよび（Ｒ）−Ｎ−ピロリジンメタノ−ルの各基のうちから選ばれた基が有利である。
特に好ましい誘導体は、基Ｒ２としてヒドロキシプロピルアミノ基を含むものである。
本発明の他の一態様に従えば、Ｒ６は、アミノ、イソペンテニルアミノ、ヒドロキシペンチルアミノ、４−ヒドロキシ−３−メチル−トランス−２−ブテニルアミノ、ベンジルアミノ、ヒドロキシベンジルアミノ、ヒドロキシエチルベンジルアミノ、シクロヘキシルメチルアミノ、イソペンテン、ベンジルアミノまたは（３−ヨ−ド）ベンジルアミノ基のうちから選ばれる。
好ましいのは、Ｒ６が、ベンジル、ヒドロキシベンジル、イソペンテニルなどの疎水性の基を含む場合である。
Ｒ２が〔１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ〕、〔（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル〕および〔（Ｒ）−Ｎ−ピロリジンメタノ−ル〕から成る群から選ばれ、Ｒ６がベンジルアミノであるのが好ましい。
また、本発明の別の一態様に従えば、置換基Ｒ９は、水素原子、メチル、イソプロピルまたはヒドロキシエチルの各基のうちから選ばれる。
Ｒ９が疎水性の基、特にイソプロピル基であるのが有利である。
本発明の好ましいプリン誘導体は、Ｒ２、Ｒ６およびＲ９が下記の表１に示したごときものである化合物のうちから選ばれる。
0004340796.tif 000004
次の誘導体が特に好ましい：すなわち、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン、非結晶性６−ベンジルアミノ−２−〔（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル〕−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン、２−（Ｒ）−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノ−２−フェニルエタノ−ル、２−（Ｒ，Ｓ）−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノペンタノ−ル、２−（Ｒ）−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノプロパノ−ル、２−（Ｓ）−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノプロパノ−ル、２−（Ｒ）−（−）−〔６−（３−ヨ−ド）ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕−Ｎ−ピロリジンメタノ−ルおよび２−（Ｒ）−（−）−〔６−ベンジルアミノ−９−シクロペンチル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕−Ｎ−ピロリジンメタノ−ル。
本発明は、上に定義した誘導体の光学異性体およびラセミの混合物、場合によっては幾何異性体、特に（２−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノ−２−フェニルエタノ−ルおよび２−〔６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕アミノプロパノ−ルのＲ異性体をも対象とするものである。
上に定義した誘導体は、有機合成の標準的方法によって得られる。出発プリン誘導体を使用し、それの置換により所望の各基を導入することが可能である。
例えばプリンの２−クロロ−６−ベンジルアミノ誘導体を用いることによって、例えば対応するハロゲン化アルキルとの反応により９位にアルキル基を導入することができる。
次にアミノアルコ−ルとの反応により、２位に、塩素の代わりに、アルキルヒドロキシアルキルアミノ基を導入できる。
大きい関心の持たれる側面に従えば、本発明の誘導体は、選択性の大きいキナ−ゼ阻害性を有する。これらの阻害作用は可逆性である。
ｃｄｋは細胞周期諸事象の開始、進行および完了において中心的役割を演じるが、ｃｄｋインヒビタ−分子は、癌、乾癬、真菌類の生育、寄生虫（動物、原生生物）の生育、さらに植物（除草剤）の生育などの望ましくない細胞増殖を抑制でき、神経細胞アポト−シスやアルツハイマ−病などの神経退行性（antineurod egenerative properites）疾患の制御に介入することができる。
これらの誘導体の阻害作用に対して特により感受性であるキナ−ゼは、ｃｄｃ２、ｃｄｋ２およびｃｄｋ５である。
それらの阻害が、きわめてわずかな用量のプリン誘導体によって得られる。
すなわち、最も一般的に、ｃｄｃ２に対して５０μＭ未満のＩＣ50、さらには強力なインヒビタ−であると考えられているオロモウシンのそれ（７μＭ）よりも低いＩＣ50が認められる。
本発明は、とりわけ、５μＭを越えないＩＣ50を有するプリン誘導体、特にＩＣ50が０．６５μＭである２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン（以下ロスコビチン（roscovitine）とも呼ぶ）、非結晶性の６−ベンジルアミノ−２−〔（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル〕−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリンおよび２−（Ｒ）−（−）−〔６−（３−ヨ−ド）ベンジルアミノ−９−イソプロピル−（９Ｈ）−プリン−２−イル〕−Ｎ−ピロリジンメタノ−ルを対象とする。
ｃｄｋ、ｃｄｃ２、ｃｄｋ２およびｃｄｋ５に対して効果が大きく、選択性の高いインヒビタ−であるこの誘導体は、反面、予想外のことに、キナ−ゼｅｒｋ１およびｅｒｋ２に対してオロモウシンのそれらと同様の作用を呈する。それゆえ、サイクリン依存性キナ−ゼに対する選択性が明らかにすぐれている。本発明の他のプリン誘導体で見られるこの利点は、キナ−ゼｅｒｋ１およびｅｒｋ２を細胞分裂以外の多くの細胞応答に関与させるよりも上流においてのシグナルトランスダクション経路への干渉を排除することを可能ならしめる。
本発明はまた、該プリン誘導体とｃｄｋとの複合体、特にｃｄｋ２とロスコビチン（roscovitine）との複合体の結晶化した形態をも対象とする。
本発明の誘導体に関して実施された研究により、それらのキナ−ゼ特異性阻害作用のほかに、細胞作用およびきわめて関心の持たれるアポト−シスに対する作用が示された。
例えば、きわめて低い濃度（ロスコビチンおよび誘導体の多くでマイクロモル濃度）で、それらは、実施例で示すが、ヒトデの卵母細胞およびウニの胚に関する実験により示されたように、前期／中期遷移を阻害することができる。
ツメガエルの非細胞性抽出物に対して、それらは、Ｍ期のプロモ−タ−因子およびＤＮＡ合成を同時に阻害することができる。
これらの細胞作用は、有利にはきわめて低い誘導体濃度で得られる。
既知の通り、種々の研究が細胞周期とアポト−シスとの間に存在する関連を対象としている。種々のル−トが細胞のアポト−シスに至るが、それらには、キナ−ゼ依存性のものもあれば、逆にこれらの酵素を必要とするとは思われないものもある。アポト−シスはＧ１またはＧ２の段階で惹起されうること、ＤＮＡ損傷の結果、ある種の細胞がＧ１期にとどまり、そのときｐ５３依存性のアポト−シスル−トが誘発されることが示されている。
異なる状況のもとでは、ＤＮＡに引き起こされた損傷に対応して、細胞がＧ２／Ｍ期にとどまり、ｐ５３非依存性アポト−シスル−トの活性化が認められるようである。
このル−トは、活性ｐ５３の喪失が認められる腫瘍の治療において特に重要であることが明らかにされている。
それゆえ、本発明の誘導体によって、ミトキサントロン（mitoxantrone）またはシスプラチン（cis-platin）などの薬剤によるＤＮＡの損傷によってＧ２期にとどめられた細胞におけるｐ５３非依存性アポト−シスを刺激する手段を準備することの利益が予測される。
本発明のｃｄｃ２インヒビタ−は、例えば、現在使用されている抗腫瘍剤の治療効果を増強することができる。
本発明の誘導体は、ｃｄｋ５インヒビタ−として、アルツハイマ−病の間に観察されるタウ（tau）の異常な過燐酸化を減じるための役割を演じることもできる。
これらの多様な有利な性質に加えて、本発明の誘導体には細胞毒性がないという利点がある。
それゆえ、本発明は、医薬組成物の作成のために、これらの誘導体の諸性質、特にそれらの抗有糸分裂性（antimitotic properites）および抗神経退行性を有効利用することを対象とする。
本発明の医薬組成物は、上に定義したプリン誘導体の少なくとも１種の有効量を不活性医薬担体と組み合わせて含有することを特徴とする。
本発明の組成物は、抗有糸分裂薬として、特に癌の化学療法のための医薬として、さらには乾癬治療、原生生物または真菌によるものなどの寄生虫症、またはアルツハイマ−病もしくは神経細胞アポト−シスの治療のための医薬として、特に好適である。
これらの組成物は、必要に応じ、他の医薬の有効成分を含有する。とりわけ、タキソ−ル（taxol）、シスプラチン、ＤＮＡインタ−カレ−ション（挿入）剤などをベ−スとしたものなどの抗有糸分裂薬とそれらとの組み合わせが挙げられよう。
販売のための諸条件、特にラベル付けおよび使用説明、ならびに有利には包装は、予定された治療上の適用に応じて処方される。
本発明の医薬組成物は、種々の形態で、特に経口または注射経路で投与され得る。
経口投与のためには、特に圧縮錠、丸剤、錠剤、カプセル剤、滴剤が用いられる。これらの組成物は、服用単位当たり１〜１００ｍｇ、好ましくは１０〜４０ｍｇの活性成分を含有していることが有利である。
他の投与形態として、無菌または滅菌可能な溶液から出発して作成される静脈内、皮下または筋肉内経路で注射可能な液剤が挙げられる。懸濁剤または乳剤も挙げることができる。
これらの注射可能な形態は、投与単位当たり、１〜５０ｍｇ、好ましくは１０〜３０ｍｇの活性成分を含有する。
参考までに述べれば、ヒトで採用しうる用法、用量は次の通りである：例えば、腫瘍の治療もしくは乾癬または寄生虫症の治療のためには、１０〜５０ｍｇ／日を１回または数回患者に投与する。
本発明はまた、上に定義したプリン誘導体の少なくとも１種を、場合により他の植物治療薬と組み合わせて含有する除草剤組成物を対象とする。
本発明はさらに、活性成分が上に定義したプリン誘導体からなる生物学的試薬を対象とする。
これらの試薬は、細胞分裂の研究において、参照物質または標準物質として利用できる。
本発明の他の特徴および長所は、以下の実施例において、また図１〜８を参照して、述べる。
図１は、種々のロスコビチン濃度でのｐ３４cdc2／サイクリンＢの活性に関する試験からの線型条件下での速度論的結果を示す。
図２は、ロスコビチン濃度の関数としてのヒトデ卵母細胞の卵核胞の崩壊（ＧＶＢＤ）百分率を示す。
図３および４は、それぞれ、ヒトデ卵母細胞の成熟およびイン・ビボでのｐ３４cdc2のチロシンの脱燐酸に及ぼすロスコビチンの影響を示す。
図４は、ウニの胚の分裂周期に及ぼすロスコビチンの影響を示す。
図５は、遅れた前期にとどめられたこれらの胚を示す。
図６は、イン・ビトロにおけるＤＮＡ合成およびＭＰＦ活性に及ぼすロスコビチンの影響を示す。
図７は、Ｌ１２１０細胞の生育阻害およびそれらの細胞周期のＧ２／Ｍでの停止に及ぼすロスコビチンの影響を示し、図７Ａには、種々濃度のロスコビチンに暴露してから２日後のＬ１２１０細胞の生育（無処置対照細胞の生育に対する平均±標準偏差）が示されており、図７Ｂには、６０μＭのロスコビチンの存在下または不存在下にまず４８時間培養した細胞の周期の分布の平均（±標準偏差）が示されている。
図８は、ｃｄｃ２特異性部位におけるビメンチン（vimentine）のイン・ビボ燐酸化に対するロスコビチンの阻害作用を示す。
材料および方法
化学製品
オルトバナジン酸ナトリウム、１−メチルアデニン（１ＭｅＡｄｅ）、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＭＯＰＳ、β−グリセロホスフェート、ジチオトレイト−ル（ＤＴＴ）、弗化ナトリウム、ニトロフェニルホスフェート、ロイペプチン、アプロチニン、ダイズトリプシンインヒビタ−、ベンズアミジン、ヒストンＨ１（タイプIII−Ｓ）、ミエリン塩基性蛋白質、カゼイン、硫酸プロタミン、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＣＮＢｒで活性化したセファロ−ス４Ｂ、ＬＢ培地、グルタチオンおよびグルタチオン−セファロ−スビ−ズ；これらの製品はすべてシグマ・ケミカルズにより市販されているままのものである。
プリンアナログは通常ＤＭＳＯに溶解させて、１００ｍＭ原液を準備する。反応混合物中のＤＭＳＯ中の最終濃度は１％（ｖ／ｖ）未満である。
〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰはアマ−シャムの製品である。
ＧＳＴ−網膜芽腫蛋白質は細菌中で発現させ、以前に（１）および（２）において記載されているようにしてグルタチオン−セファロ−スビ−ズにより精製する。
緩衝液
均質化緩衝液：
６０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、２５ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭのＥＧＴＡ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのフェニルホスフェート、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビタ−および１００μＭのべンズアミジン。
緩衝液Ｃ：
均質化緩衝液の組成、ただし、ＥＧＴＡ濃度は５ｍＭ、ＮａＦを含まず、プロテア−ゼインヒビタ−をも含まない。
Ｍ期ヒトデ卵母細胞抽出物の調製
大規模に卵母細胞抽出物標本を得るため、成熟Mart hasterias glacialisの生殖腺を摘出し、ミリポア（millipore）で濾過した天然海水中で１０μＭの１−ＭｅＡｄｅとともに放卵までインキュベ−トする。そのとき、卵母細胞はすべてＭ期に入っている。遠心分離によりインキュベ−ション培地を分離し、卵母細胞を直接液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存する（（１）および（３）参照）。
Ｍ期の卵母細胞を、卵母細胞１ｇ当たり２ｍｌの割合の均質化緩衝液中でホモジナイズする。
１０００００ｇで４５分間遠心分離後、上澄みを回収し、直接、ｐ９CKShs1−セファロ−スビ−ズを用いてのキナ−ゼｐ３４cdc2／サイクリンＢのアフィニティ−クロマトグラフィ−による精製に用いる（（１）および（４）参照）。
酵素
キナ−ゼの活性は、特に断らないかぎり、緩衝液Ｃ中、３０℃で定量する。デ−タからブランクの値を差し引き、１０分間のインキュベ−ションについて蛋白質受容体に取り込まれた燐酸塩のピコモル量として、活性を計算する。
対照を、ＤＭＳＯの適当な希釈液とともに用いる。
必要な場合には、基質の燐酸化度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のオ−トラジオグラフィ−によって求める。
・ヒトデのＭ期の卵母細胞から、上記の通り、ｐ９CKShs1を用いて溶出するｐ９CKShs1−セファロ−スビ−ズを用いてのアフィニティ−クロマトグラフィ−により、ｐ３４cdc2／サイクリンＢを精製する（（２）、（３）および（５）参照）。
定量のために、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ミリモル、１ｍＣｉ／ｍｌ）の存在下に、１ｍｇ／ｍｌのヒストンＨ１（シグマ、タイプIII−Ｓ）を用いる（（１）および（６）参照）。
３０℃で１０分間のインキュベ−ションののち、ホスホセルロ−ス製ワットマンＰ８１濾紙上に上澄みのアリコ−ト２５μｌを置き、２０秒後、水１リットル当たり燐酸１０ｇの溶液で濾紙を５回洗う（１回当たり少なくとも５分間）。
濡れた濾紙を６ｍｌのプラスチックシンチレ−ションアンプルに移し、つぎにＡＣＳシンチレ−ション液（アマ−シャム）５ｍｌを加え、パッカ−ドカウンタ−で放射能を計測する。
キナ−ゼ活性は、１０分間のインキュベ−ションについてヒストンＨ１中に取り込まれた燐酸塩のピコモル量または最大活性に対する百分率として表現する。
線型条件下で速度論的実験を実施するために、上記の通り、キナ−ゼｐ３４cdc2についての最終点検定系を用いるが、予備試験に基づいて、飽和に至らない適当な基質濃度を用いる。
キナ−ゼｐ３４cdc2／サイクリンＢは、酵素濃度および時間に対して直線状の活性が得られるように添加する。
多くの場合に、このために、緩衝液Ｃで３〜１０倍酵素を希釈することが必要となる。
速度デ−タを、添加した酵素量ごとに基質中に取り込まれた１秒間当たりのピコモル量により表現する。見掛けの阻害定数をグラフの解析によって求める。
・ｐ３３cdk2／サイクリンＡおよびｐ３３cdk2／サイクリンＥを、種々のバクロウイルスに感染させた昆虫ｓｆ９の細胞の抽出液から再構成する。
サイクリンＡおよびＥは、ＧＳＴ−サイクリンの融合蛋白質であり、それらの複合体をグルタチオン−セファロ−スビ−ズにより精製する。
キナ−ゼ活性は、キナ−ゼｐ３４cdc2／サイクリンＢについて記載したのと同様に、１ｍｇ／ｍｌのヒストンＨ１（シグマ、タイプIIIＳ）を用い、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、１０分間にわたり定量する。
・ｐ３３cdk5／ｐ２５を、ウシ脳から精製する（７）が、モノＳクロマトグラフィ−の工程は用いない。
ス−パ−ロ−ス１２のカラムから回収した活性画分を合わせ、濃縮して、最終濃度を約２５μｇ酵素／ｍｌとする。
キナ−ゼの定量は、ｐ３４cdc2／サイクリンＢについて記載したのと同様に、１ｍｇ／ｍｌのヒストンＨ１（シグマ、タイプIIIＳ）を用い、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、１０分間にわたり実施する。
・ｐ３３cdk4／サイクリンＤ１を、昆虫細胞溶解産物から取得する。ｃｄｋ４は、構成産物ＧＳＴ−ｃｄｋ４であり、活性複合体をグルタチオン−セファロ−スビ−ズにより精製する。
そのキナ−ゼ活性は、精製ＧＳＴ−網膜芽腫蛋白質を用い、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下で定量する。
１５分間のインキュベ−ションののち、ラエムリ（Laemmli）の緩衝液（２×３０μｌ）を加える。
燐酸化した基質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＭＰハイパ−フイルムを約１４時間暴露させることによるオ−トラジオグラフィ−およびデンシトメトリ−により分析する。
・ｐ３３cdk6／サイクリンＤ２）を、昆虫細胞溶解産物から取得する（８）。試験のためには、ｐ３３cdk4／サイクリンＤ１蛋白質について上に示した通りに操作する。
・ＭＡＰキナ−ゼ：ヒトバンクＨｅｐＧ２からクロ−ン化されたＧＳＴ−ｅｒｋ１（９）を細菌中で発現させ、グルタチオン−セファロ−スビ−ズで精製し、１ｍｇ／ｍｌのミエリン塩基性蛋白質を用い、キナ−ゼｐ３４cdc2／サイクリンＢについて上に記載したのと同様に、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下で試験する。
ヒストンにより標識した蛋白質ｅｒｋ１およびｅｒｋ２をＭＡＰＫＫによりイン・ビトロで活性化し、精製し（アフィニティ−ＮｉおよびモノＱ）、上記の通り、最終体積３０μｌ中で１０分間試験する。
・ウシ心臓から精製したｃＡＭＰ依存性キナ−ゼの触媒サブユニットを、ｐ３４cdc2／サイクリンＢについて上に記載したのと同様に、１５μＭの［γ−32Ｐ］−ＡＴＰの存在下に、１ｍｇ／ｍｌのヒストンＨ１を用いて試験する。
ウシ起源の気管の平滑筋から均質にまで精製したｃＧＭＰ依存性キナ−ゼ（１０）を、ｐ３４cdc2／サイクリンＢについて上に記載したのと同様に、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、１ｍｇ／ｍｌのヒストンＨ１を用いて試験する。
・カゼインキナ−ゼ２を、ラット肝臓のサイトゾルから単離し（１１）、１ｍｇ／ｍ１のカゼインおよび１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰを用いて試験する。基質をワットマン３ＭＭフィルターに載せ、１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで洗う。
・メンドリの砂嚢から精製した（１２）ミオシン軽鎖キナ−ゼを、１００ｎＭのカルモジュリン、１００μＭのＣａＣｌ2、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、７．５のｐＨで、平滑筋ミオシン軽鎖燐酸化部位に基づく合成ペプチド（ＫＫＲＰＱＲＡＴＳＮＶＦＡＭ、５０μＭ）を用い、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、最終体積５０μｌ中で試験する。
放射性燐酸塩の取り込みを、上記のように、ホスホセルロ−スフィルター上でチェックする。
・ＧＳＫ−３の植物における同族体であるＡＳＫ−γを、大腸菌中でＧＳＴ融合蛋白質として発現させ（１３）、グルタチオン−セファロ−スで精製する。キナ−ゼＡＳＫ−γの活性は、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、５μｇｍのミエリン塩基性蛋白質を用いて、３０℃で１０分間定量する。燐酸化されたミエリン塩基性蛋白質を、ｐ３４cdc2／サイクリンＢについて上に記載したのと同様にして、ホスホセルロ−ス製ワットマンＰ８１濾紙上に回収する。
・インスリン受容体のチロシンキナ−ゼドメイン（１４）を、バクロウイルス系で過剰発現させ、均質になるまで精製する。そのキナ−ゼ活性は、最終体積３０μｌ中、１５μＭの〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰの存在下に、５μｇのレイタイド（オンコジ−ン・サイエンシズ）を用い、３０℃で１０分間定量する。燐酸化された製品レイタイドを、ｐ３４cdc2／サイクリンＢについて上に記載したのと同様にして、ホスホセルロ−ス製ワットマンＰ８１濾紙上に回収する。
実施例１：ロスコビチンの合成
合成は、３段階で実施するが、それは、１）まず、６−ベンジルアミノ−２−クロロプリンを、２）つぎに６−ベンジルアミノ−２−クロロ−９−イソプロピルプリンを、そして３）６−ベンジルアミノ−２−Ｒ−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−９−イソプロピルプリンを調製することを含む。
１）６−ベンジルアミノ−２−クロロプリンの合成：
ホカ−ト（Hocart）がPhytochemistry、１９９１年、第３０巻第２４７７−２４８６頁に記載している通りに操作する。
２）６−ベンジルアミノ−２−クロロ−９−イソプロピルプリン（Ｉ）の合成：
６−ベンジルアミノ−２−クロロプリン（３．７ｇ；１４．２ミリモル）、炭酸カリウム（１１ｇ；８０ミリモル）および臭化イソプロピル（８．２ｍｌ；８７ミリモル）の無水ＤＭＳＯ（１００ｍｌ）中混合物を室温で３日間攪拌する。薄層クロマトグラフィ−〔ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（９８：２）〕により、６−ベンジルアミノ−２−クロロプリンの不存在を確認する。５０℃以下での真空蒸留によりＤＭＳＯおよび過剰の臭化イソプロピルを除去する。残留物を水と酢酸エチルとに分配する。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、真空下で蒸発させる。
ＭｅＯＨで結晶化させて、生成物３．５１ｇ（８２％）を得る；融点１８１−１８２℃；ＵＶ（ＭｅＯＨ）：λｍａｘ  ２７３．５；ＩＲ（ニコレット２０５、ＫＢｒ、ＤＲＩＦＴ、ｃｍ-1）１７１３、１６２６、１５７２、１５３７、１４９７、１４７１、１４５６、１４２５、１３９８、１３５５、１３１４、１２９２、１２５５、１２２８、１２０２。
３）６−ベンジルアミノ−２−Ｒ−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−９−イソプロピルプリン（II）ラセミ誘導体の合成
２．７ｇ（８．９５ミリモル）のＩおよび１７ｍｌ（０．１８モル）のＲ（−）−２−アミノ−１−ブタノ−ル（フルカ社品、９０％、Ｒ：Ｓ＞９：１）を入れ、真空にした密封容器（アンプル）を、１６０−１６５℃のオ−ブン中で３時間３０分加熱する。５０℃以下の温度で過剰のアミンを蒸発させ、生成物IIを、ＣＨＣｌ3中のＭｅＯＨの量を０、次に２、および３％と増加させるカラムクロマトグラフィ−により精製する。
酢酸エチルで結晶化させて、２．２ｇのII（６９％）を得る；融点１３２−１３４℃、〔α〕＝＋３５．１（ｃ＝０．２９、ＣＨＣｌ3）、質量分析〔フィニガムＭＡＴ９０、ＢＥジオメトリ−７０ｅＶ、線源温度２５０℃、放出電流１ｍＡ、加速電圧５ｋｅＶ、直接導入、ＤＩＰ温度１９０−２２０℃、標準としてウルトラマ−ク１６００Ｆ（ＰＣＲ社；アメリカ合衆国フロリダ州）を用い、ピ−ク重複法によりＨＲＭＳを実施〕３５４．２１６７（Ｍ+、Ｃ19Ｈ26Ｎ6Ｏとして計算値３５４．２１６８、２７％）、３２５（７％）、３２４（２９％）、２３２（１００％）、２９５（３％）、２８２（７％）、２８１（３％）、２１７（６％）、１８５（５％）、１３４（３％）、９１（３４％）。ＦＴＩＲ（ニコレット２０５、ＫＢｒ、ＤＲＩＦＴ、ｃｍ-1）：１６２２、１６１０、１５４７、１５４０、１４５２、１３８９、１３７０、１２６１、１０６８。
実施例２：ロスコビチンのキナ−ゼ阻害性および細胞周期に対するそれの影響の検討
ａ）キナ−ゼ阻害性の検討
次の表に報告されている酵素の活性は、ロスコビチンまたはオロモウシンを濃度を上げながら添加したのちに測定したものである。これらの活性は、適当な基質（ヒストンＨ１、ミエリン塩基性蛋白質、カゼインなど）を、１５μＭのＡＴＰとともに用いて、測定された。
ＩＣ50は、得られた用量反応曲線から算出した。（−）の表示は、何らの阻害作用も認められなかったことを示している。最大試験濃度は括弧内に示されている。
0004340796.tif 000005
・ｃｄｃ２、ｃｄｋ２およびｃｄｋ５の阻害
これらの結果を検討すると、ロスコビチンが標的のｃｄｃ２およびｃｄｋ２に対してはオロモウシンより１０倍高い活性を、ｃｄｋ５に対しては２０倍高い活性を呈することが示される。
これに比較して、それの作用は、キナ−ゼｃｄｋ４／サイクリンＤ１およびｃｄｋ６／サイクリンＤ２に対しては、オロモウシンで観察されたと同様、限定されているようである（ＩＣ50が１００μＭを越える）。この効果の不存在は、種々の起源に由来するｃｄｋ４を用いて確認された。同一条件下で操作するとき、ＧＳＴ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａはｃｄｋ４／サイクリンＤ１を阻害する。
・阻害作用の特異性
確認できる通り、多くのキナ−ゼが弱く阻害されるか、または全く阻害されない。
ロスコビチンはその標的のｃｄｋに対してはオロモウシンのそれの少なくとも１０倍高い効果を示すが、その阻害作用は、ｅｒｋ１およびｅｒｋ２に対しては、オロモウシンのそれときわめて類似している。例えば、ｃｄｃ２の阻害と同様にｅｒｋ１を阻害するには、４０倍（ｅｒｋ２の場合には２０倍）高いロスコビチン濃度が必要であることが分かる。
・ｂ）ＡＴＰに対する影響
ロスコビチンの作用機構を調べるために、ＡＴＰレベルを変える（０．１ｍＭから０．５ｍＭまで）とともに、濃度を高めていったロスコビチンの存在下で速度論的実験を実施した。ヒストンＨ１の濃度は０．７ｍｇ／ｍｌに一定に保つ。結果を図１に示す。
これらの結果は、ロスコビチンがＡＴＰに対して競合インヒビタ−として作用することを示している。ロスコビチン濃度の関数としての勾配の直線性を考慮に入れて、それを直線インヒビタ−と形容する。見かけの阻害定数Ｋｉは１．２μＭである。
ロスコビチンとｃｄｋ２との共結晶の構造の分析により、オロモウシンと同様に、ロスコビチンがＡＴＰへの結合ドメインにおいて結合していることおよびそのプリン環がオロモウシンのそれと同じように、すなわちＡＴＰのプリン環と全く異なって、配向していることが確認される。
・ｃ）ＤＮＡ合成およびＭＰＦ活性に対する影響の検討
多くのタイプの細胞について実施した実験の結果を報告する。
・ヒトデ卵母細胞の成熟に対する影響およびイン・ビボでのｐ３４cdc2のチロシンの脱燐酸に及ぼす影響
前期にとどめられているヒトデ卵母細胞を、ホルモン１−ＭｅＡｄｅ（１μＭ）の添加に先立ち、濃度を増していくロスコビチンで１５分間処理する。３０分後、卵核胞崩壊％（ＧＶＢＤ）を記録する。これらの値を、ロスコビチン濃度（μＭ）の関数として図２に示す。ロスコビチンは５μＭのＩＣ50で核膜の破裂を阻害する（同じ条件下で操作するとき、オロモウシンのＩＣ50は３０μＭである）。これらの結果を図２に示す。
オロモウシンを用いて既に観察されているのと同様に、ロスコビチンは、イン・ビボでのｐ３４cdc2のチロシンの脱燐酸を減少させるが、阻害はしない。卵母細胞を、１μＭの１−ＭｅＡｄｅ添加に先立ち、時刻０において、１０μＭのロスコビチンで１５分間処理する。種々の時刻において抽出物を調製し、ｐ９ｃｋｓｈｓ１−セファロ−スビ−ズのカラムにかける。
ビ−ズに結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗ＰＳＴＡＩＲＥ抗体を用いてウェスタンブロットを行なう。ウェスタンブロットの写真を図３に示す。燐酸化されている形のｐ３４cdc2は上部に、脱燐酸された形は下部に現われる。
それゆえ、ロスコビチンはｃｄｃ２の活性化を阻害しないが、その活性を阻害する。ｐ３４cdc2のチロシンの脱燐酸はｃｄｃ２５によって触媒され、通常ならば、Ｇ２／Ｍ遷移に際してｃｄｃ２キナ−ゼの活性化に先行する。さらに、ｃｄｃ２キナ−ゼがｃｄｃ２５ホスファタ−ゼを燐酸化し、過活性化する。したがって、ロスコビチンは、ｃｄｃ２キナーゼのレベルで中断を惹起でき、脱燐酸の減少をもたらすことができたのである。
・ウニの胚の分裂周期に及ぼす影響
受精６０分後に、ロスコビチンを加える。受精１２０分後に、分裂した胚の百分率を記録する。結果を図４に示す。
それは遅れた前期での休止を惹起し、これが用量依存的であることが確認される。
ＩＣ50は１０μＭである。（オロモウシンは、１００μＭでも、前期／中期遷移の減速しか惹起せず、細胞を前期で休止させることはしない）。
図５に示すように、ロスコビチンによってこのように休止させられた卵中に大きい核が観察される。
この休止が完全に可逆性であることが明らかになる。事実、海水で何回も洗った後、卵は改めて分裂周期に入り、成長して、正常なプルテウス幼生となる。これらの結果は、１００μＭという高いロスコビチン濃度においても得られる。
・ツメガエルの卵の抽出物におけるイン・ビトロでのＤＮＡ合成およびＭＰＦ活性に及ぼす影響
試験は、（１５）に従い、オロモウシンについて（１）に記載されている通りに操作して、実施する。
中期にとどめられたツメガエルの抽出物をロスコビチンおよび精子クロマチンとともにインキュベ−トする。
０から５μＭまでのロスコビチン濃度の場合、染色体は強度に凝縮されたままであり、核膜は全く見られない。１０μＭおよびそれより高い濃度で、クロマチンが部分的に凝縮解除された間期の核および完全な核膜が現われ、ＭＰＦ活性が阻害されたことを示す（ＩＣ50は５μＭである）。
オロモウシンについて（１）に記載の通りに操作して、ＤＮＡ合成の阻害も検討した。
すなわち、中期にとどめられている卵の抽出物にロスコビチンおよび精子クロマチンを添加した。
次に、ＣａＣｌ2の添加により抽出物を間期に放置した（１５）および（１６）。３時間後に、ＴＣＡで沈殿させうる物質に〔γ−32Ｐ〕−ｄＡＴＰを取り込ませ、総ＤＮＡ合成を測定した。
図６に示すように、複製がロスコビチンにより１５μＭのＩＣ50で阻害される。
このように、本発明は、特異性の高い、ｃｄｃ２／サイクリンＢ阻害性を持つ新規プリンを提供する。
実施例３：ロスコビチンの生化学的性質および哺乳動物細胞に対する影響
方法
ヒト腫瘍細胞のイン・ビトロでのスクリ−ニング
９つのタイプの腫瘍を含む６０株のヒト腫瘍細胞系統を２４時間培養したのち、０．０１〜１００μＭのロスコビチンに４８時間連続暴露させた。細胞毒性を推定するために、スルホロ−ダミン（sulphorhodamime）Ｂ蛋白質試験を用いた。
Ｌ１２１０細胞の培養
１０％のウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地上の指数増殖の培養から採取したＬ１２１０細胞を、血球計数器で計数し、５×１０4細胞／ｍｌの割合で、種々濃度のロスコビチンまたはオロモウシンの存在下または不存在下に、９６ウエルの組織培養プレ−トに載せ、次いで５％のＣＯ2のもとに３７℃でインキュベ−トした。ロスコビチンの作用を逆転させるために、ロスコビチンの存在下または不存在下に２日間培養したＬ１２１０細胞をＰＢＳで洗って、活性生成物の痕跡を完全に除去し、計数し、再び、いかなる活性製品（ロスコビチンまたはオロモウシン）をも含有しない新鮮な培地に入れた。細胞の増殖を、微小培養に対するテトラゾリウム試験を用いて、毎日測定した。エタノ−ルで固定し、１００μｇ／ｍｌのＲＮア−ゼで処理し、沃化プロピジウムで発色させた細胞について、細胞周期の解析を実施した。デ−タの取得は、コ−ルタ−（アメリカ合衆国フロリダ州ハイアリ−）ＥＰＩＣＳエリ−ト（登録商標）フロ−サイトメトリ−によって行ない、これらのデ−タの解析は、ロジカルマルチサイクル（フェニックス・フロ−・システムズ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）（登録商標）を用いて実施した。これらの試験はすべて３回反復して実施し、すべての実験は少なくとも２回反復した。
イン・ビボでのビメンチンの燐酸化
イン・ビボでのキナ−ゼｃｄｃ２によるビメンチンの燐酸化を検討するため、６０μＭのロスコビチンで４８時間細胞を処理するかまたは処理せず、１０ｎｇ／ｍｌのコルセミドにさらに２時間暴露させた。次に、細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せて、泳動させ、ウェスタンブロットにより移し、４Ａ４抗体とともにインキュベ−トした。これらの抗体はｃｄｃ２により燐酸化されたビメンチンと交差的に反応するが、他のキナ−ゼ（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナ−ゼ、プロテインキナ−ゼＣ、Ｃａ2+−カルモジュリン依存性プロテインキナ−ゼ）により燐酸化されたビメンチンとも、燐酸化されていないビメンチンとも反応しない；抗体４Ａ４は、細胞が有糸分裂に入ったときにキナ−ゼｃｄｃ２によりそのＳｅｒ−５５残基において燐酸化されたビメンチンを特異的に認識する。
結果
９つのタイプの腫瘍を含む６０株のヒト腫瘍細胞系統（白血病、非小細胞性肺癌（cancer of larger cells of the lungs）、結腸癌、中枢神経系の癌、黒色腫、卵巣癌、腎癌、前立腺癌および乳癌)に対して、ロスコビチン（０．０１〜１００μＭ；４８時間暴露）を試験した。すべての細胞系統がロスコビチンに対して同等の感受性を示した。ＩＣ50の平均値は１６μＭである（オロモウシンの場合には６０．３μＭ）。ロスコビチンに対する細胞系統の感受性と野性または変異ｐ５３の存在との間には、なんらの相関関係も認められなかった。比較解析法により、ロスコビチンの作用とフラボピリド−ル（flavopiridol）の作用とが似通っていることが示された。
Ｌ１２１０細胞系統の増殖に対するロスコビチンの作用に関して、図７Ａが示しているように、きわめて明瞭な用量依存性の増殖阻害が観察された。図７Ａにおいては、細胞の増殖が、ロスコビチンまたはオロモウシンの濃度の関数として示されている。上記の腫瘍細胞で観察されたのと同様に、２日および３日培養後には、曲線は実質的に同一である。細胞増殖を阻害するのに、ロスコビチンはオロモウシンよりほぼ４倍効果的である（ロスコビチンのＩＣ50は４０μＭ、オロモウシンのそれは１６０μＭ）。多くの細胞が、６０μＭのロスコビチンで４８時間処理後に生存可能である（トリパンブル−排除により９６±２％）が、それらは、十分な洗浄後にも、不可逆的に停止させられたままである。１２０μＭのロスコビチンに暴露された細胞は、速やかに死滅する。次に、細胞周期の分布に対するロスコビチンの影響を、フロ−サイトメトリ−により検討した。ロスコビチン６０μＭで、図７Ｂが示しているように、細胞はＧ１で停止したままであり、Ｇ２で蓄積される。図７Ｂには、ロスコビチンの存在下または不存在下で観察された細胞周期の各期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）の割合（％）が示されている。
ロスコビチンのイン・ビボでの分子標的を同定、確認する目的で、抗体４Ａ４を使用した。結果を図８に示したが、そこには、ロスコビチン処置（＋）または無処置（−）細胞から抽出され、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、抗体４Ａ４を用いてウェスタンブロットされた総蛋白質が示されている。無処置細胞は、中期にとどめられ、ｃｄｃ２により燐酸化されたビメンチンを蓄積する。これに対し、ロスコビチン処置細胞はｃｄｃ２により燐酸化されたビメンチンを示さず、このことは、ｃｄｃ２がイン・ビボで実際に阻害されたことおよびそれらの細胞が中期の前で停止させられたことを示している。
ロスコビチンは、アルツハイマ−病の間に観察されるタウの過燐酸化を低減させるのにも寄与する；タウのいくつかの部位を燐酸化する脳特異性ｃｄｋ（ｃｄｋ５／ｐ３５）はロスコビチンに対して特に感受性である。
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【図１】
0004340796.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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