(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリミキシンＢおよび／またはコリスチンによる生育阻害に対する耐性を有し、かつ親株よりも高いプリンヌクレオシド生産能を有するバチルス属細菌であって、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）またはバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amiloliquefaciens）に属するバチルス属細菌。
【請求項２】
前記プリンヌクレオシドはイノシンである請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記プリンヌクレオシドはキサントシンである請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記プリンヌクレオシドはグアノシンである請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、同培地からプリンヌクレオシドを採取することを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項７】
前記プリンヌクレオチドは５'−イノシン酸、５'−キサンチル酸または５'−グアニル酸である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項３に記載の細菌を培地で培養し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５'−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成蓄積した５'−グアニル酸を採取することを特徴とする５'−グアニル酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イノシン、キサントシン、グアノシンのようなプリンヌクレオシドを製造するための発酵方法、ならびに同方法に使用する新規微生物に関する。プリンヌクレオシドは、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸のような相当するヌクレオチドの合成のための原料として使用される。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヌクレオシドは、アデニン栄養要求株、またはこれらの株にプリンアナログ、サルファ剤、メチオニンアナログおよび抗葉酸剤のような種々の薬剤に対する耐性が付与した株を用いた発酵法により工業的に生産されてきた。ヌクレオシド生産株として、バチルス属に属する菌株（特許文献１〜９）、またはブレビバクテリア属に属する菌株（特許文献１０〜１２、非特許文献１）、またはエシェリヒア属に属する菌株（特許文献１３）等が利用され得る。
【０００３】
従来、これらの変異株の取得は、微生物を、変異を誘発する線量の電離放射線（紫外線、Ｘ線、γ線）の照射、または化学薬剤（硝酸ナトリウム、硫酸ジエチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）に曝し、その後、適切な選択培地を用いることで所望の菌株を選択することによってなされてきた。
【０００４】
ストレス（温度、放射線照射、飢餓、阻害剤および抗生物質）の下に微生物細胞を曝すような種々の処理、あるいは定常期への移行により、ＲＮＡおよびＤＮＡの崩壊を誘発し、その後核酸誘導体が排出され得ることはよく知られている（非特許文献２〜４）。今日では、細胞膜を介した代謝産物の透過は、通常は、多かれ少なかれ特定の排出輸送タンパク質により媒介されることが一般に知られている（非特許文献５〜７）。ＵＶまたはＸ線照射したエシェリヒア・コリ細胞は、遊離塩基、リボース配糖体、モノヌクレオシドおよびＡＴＰを排出することがかなり以前に示されていた（非特許文献８）。これらの排出は、ＤＮＡ断片またはペプチドは検出されなかったことから、細胞溶解の結果として生じたものではない。
【０００５】
【特許文献１】
特公昭３８−２３０３９号公報
【特許文献２】
特公昭５４−１７０３３号公報
【特許文献３】
特公昭５５−２９５６号公報
【特許文献４】
特公昭５５−４５１９９号公報
【特許文献５】
特開昭５６−１６２９９８号公報
【特許文献６】
特公昭５７−１４１６０号公報
【特許文献７】
特公昭５７−４１９１５
【特許文献８】
特開昭５９−４２８９５号公報
【特許文献９】
特開平０６−１１３８７６号（１９９２年）
【特許文献１０】
特公昭５１−５０７５号公報
【特許文献１１】
特公昭５８−１７５９２号公報
【特許文献１２】
特公昭０２−１７４６８９号
【特許文献１３】
国際公開第９９０３９８８号パンフレット
【非特許文献１】
Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)
【非特許文献２】
A. Demain (1968)、Production of purine nucleotides by fermentation. In: Progress in Industrial Microbiology, Vol. 18. Ed. D.J.D. Hockenhull. J.&A. Churchill Ltd. London
【非特許文献３】
Cohen and Kaplan. J. Bacteriol., 129, 651-657, (1977)
【非特許文献４】
Rinas et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 4147-4151, (1995)
【非特許文献５】
Pao et al., 1988. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34
【非特許文献６】
Paulsen et al., 1988. J. Mol. Biol., 277, 573-592
【非特許文献７】
Saier et al., 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (1999) 1, 257-279
【非特許文献８】
Billen, D. (1957), Arch. Biochem. Biophys., 67, 333-340
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオシド生産株によるヌクレオシド生産能を高めること、及びその株を用いたイノシン、キサントシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシドの製造方法、ならびに５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、細胞膜の構造および／または機能に影響を及ぼす幾つかの変異が、ストレス状態を模倣して、特定の輸送体の活性増大を誘導し、その結果、培地中のプリンヌクレオシド、好ましくはイノシンおよびキサントシンのような核酸誘導体の蓄積を増大させ得ると推測した。そのために、本発明者は、バチルス属に属し、ポリミキシンＢおよびコリスチン等のペプチド抗生物質に対する耐性を付与する新規な変異を有する微生物が、かなり多い量のプリンヌクレオシドを生成し、培地中に蓄積し得ることを見出した。これまで、プリンヌクレオシドの生産能が、プリンヌクレオシド生産菌にこのような性質を付与することで向上するということは知られていなかった。そして、この知見に基づいて研究を続け、本発明を達成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、バチルス属に属し、プリンヌクレオシド生産能を有する細菌を提供する。特に、本発明は、ポリミキシンＢおよびコリスチン等のペプチド抗生物質に対する耐性を付与する変異によりプリンヌクレオシド生産能が向上した細菌を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、前記細菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地に蓄積させ、同培地からプリンヌクレオシドを採取することとを特徴とする発酵によりプリンヌクレオシドを製造する方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取ことを特徴とする５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、前記細菌を培地で培養し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル酸の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は、以下のとおりである。
（１）ポリミキシンＢおよび／またはコリスチンによる生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌクレオシド生産能を有するバチルス属細菌。
（２）バチルス・ズブチリスに属する（１）に記載の細菌。
（３）バチルス・アミロリケファシエンスに属する（１）に記載の細菌。
（４）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。
（５）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。
（６）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、同培地からプリンヌクレオシドを採取することを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。
（８）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（７）に記載の方法。
（９）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである（７）に記載の方法。
（１０）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである（７）に記載の方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。
（１２）前記プリンヌクレオチドは５’−イノシン酸である（１１）に記載の方法。
（１３）前記プリンヌクレオチドは５’−キサンチル酸である（１１）に記載の方法。
（１４）前記プリンヌクレオチドは５’−グアニル酸である請求項（１１）に記載の方法。
（１５）（５）に記載の細菌を培地で培養し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成蓄積した５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル酸の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を元々有する細菌に、特定の耐性を付与することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、特定の耐性を有する細菌に、プリンヌクレオシド生産能を付与することによっても得ることができる。
【００１４】
「ポリミキシンＢおよび／またはコリスチンによる生育阻害に対する耐性を有する微生物」という用語は、親株としての細菌株に由来し、ポリミキシンＢおよび／またはコリスチン等のペプチド抗生物質を含有する培地中で生育できるように、遺伝的に改変された微生物を意味する。
【００１５】
例えば、５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上の濃度のポリミキシンＢ、または、５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上のコリスチンを含有する寒天培地上で、３４℃で培養したときに、３〜５日以内にコロニーを形成することができる細菌は、これらのペプチド抗生物質に耐性である。前記寒天培地としては、Ｌブロス寒天培地が挙げられる。
すでに述べた性質に加えて、本発明の細菌は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、および薬剤依存性のような他の特定の性質を有してもよい。
【００１６】
グラミシジン、ナイジェリシン等と合わせてポリミキシンＢおよびコリスチン（ポリミキシンＦ）は、いわゆる「ペプチド抗生物質」と呼ばれる化合物の部類に属する。それらは、細胞膜の構造および機能に影響を及ぼし、ストレス状態を模倣する。ペプチド抗生物質は、グラム陰性菌に対して有効な化合物である（Vaara, Microbiol. Rev., 56, 395-411, 1992）。本発明者は、ポリミキシンは、バチルス属に属するグラム陽性菌の生育をも阻害し得ることを見出した。バチルス属細菌で見出された、ポリミキシン耐性を付与するような変異は、細胞膜に影響を及ぼしてストレス状態を模倣することにより、プリンヌクレオシド排出輸送体を誘導する可能性がある。
【００１７】
本発明の細菌は、ペプチド抗生物質に対していわゆる「交差耐性」を有してもよい。これは、ペプチド抗生物質の１つに対して耐性を有する細菌が、別のペプチド抗生物質に対しても耐性を示し得ることを意味する（実施例参照）。複数のペプチド抗生物質は、同一の作用メカニズムを持つことが示唆されている。例えば、ポリミキシンＢおよびグラミシジンＳは、いずれもこれらの抗生物質により高分子合成が阻害される条件下で、緊縮応答を調節するヌクレオチドであるグアノシン四リン酸（ppGpp）の蓄積を誘導することが示されている（Cortay J.C. and Cozzone A.J., Biochim. Biophys. Acta, 1983, 755(3), 467-473）。
【００１８】
本明細書で使用する「プリンヌクレオシド生産能」という用語は、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積する能力を意味する。「細菌がプリンヌクレオシド生産能を有する」という用語は、液体培地で培養中に、有意な量のプリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させる能力を細菌が有することを意味する。通常、これは、実施例に記載する条件下で、５０ｍｇ／ｌ以上のプリンヌクレオシドを、より好ましくは０．５ｇ／ｌ以上のプリンヌクレオシドを蓄積する能力を意味する（以下参照）。
【００１９】
本明細書中で使用する「プリンヌクレオシド」という用語は、イノシン、キサントシン、グアノシン及びこれらの混合物を含む。
【００２０】
本発明の実施に用いられる変異細菌は、紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、および変異誘発化学物質による処理のような従来の変異誘発法により変異誘発を行い、続いてレプリカ法のような従来法による選択をすることによって得ることができる。好ましい変異誘発物質は、Ｎ−ニトロ−Ｎ’−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴＧと称する）である。
【００２１】
例えば、プリンヌクレオシド生産能を元々有するバチルス属に属する既知の菌株を、変異株を得るために上記のいずれかの処理をし、続いて、その変異がペプチド抗生物質に対する耐性に関して本発明の要件を満たし、そして本発明に適切に使用できるかどうかについて、試験を行う。さらに、得られた菌株を栄養培地中で培養し、親株よりも高い収率でプリンヌクレオシドを生産する能力を有する株を選択して、本発明に使用する。
【００２２】
本発明の要件を満たす菌株は、当業者によく知られている遺伝子組換え技術によっても得ることができる。
【００２３】
上記のような耐性に関する性質は、連続的な選択または遺伝子組換え技術により、１つの菌株中で組み合わせてもよい。
【００２４】
本発明で使用されるバチルス属細菌の例として、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amiloliquefaciens）等が挙げられる。本発明の実施に使用される菌株の代表例として、バチルス・ズブチリスＫMBS16polR1-1（VKPM B-8245）、バチルス・アミロリケファシエンスColR7-105（VKPM B-8246）がある。本発明によりプリンヌクレオシドを生産する際に使用される細菌は、ペプチド抗生物質に対する耐性、および高収率でプリンヌクレオシドを生産する能力以外は、親株と同じ細菌学的性質を有していてもよい。バチルス・ズブチリスKMBS16polR1-1およびバチルス・アミロリケファシエンスColR7-105は、、２００２年１月２９日に、the Russian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に、それぞれ受託番号VKPM B-8245、VKPM B-8246のもとで寄託され、２００３年１月６日に原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
【００２５】
本発明の細菌を得るために改良されるべき親株として、バチルス・ズブチリスAJ12707（FERM P-12951）（特開昭61-13876号）、バチルス・ズブチリスAJ3772（FERM P-2555）（特開昭62-014794号）、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus）NA-1102（FERM BP-289）、バチルス・ズブチリスNA-6011（FERM BP-291）およびバチルス・ズブチリスNA-6012（FERM BP-292）（米国特許第４，７０１，４１３号）、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）、バチルス・アミロリケファシエンスAS115-7（VKPM B-6134）（ロシア特許第2003678号）等のバチルス属に属するイノシン生産株が使用できる。また、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用してもよい。この株は、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子（purR::spc）、スクシニルＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（deoD::kan）に変異が導入された、既知のバチルス・ズブチリス168trpC2株の誘導体である。
【００２６】
＜２＞プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、該プリンヌクレオシドを培地から採取する、プリンヌクレオシドの製造方法を包含する。
【００２７】
本発明の方法においては、バチルス細菌の培養、液体培地からのプリンヌクレオシドの採取および精製は、細菌を用いた発酵によりプリンヌクレオシドを製造する従来法と同様にして行うことができる。
【００２８】
プリンヌクレオシド生産用培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、および必要に応じて他の有機成分を含有する限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、およびデンプンの加水分解産物等の糖類、グリセロール、マンニトールおよびソルビトール等のアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸等の有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、ダイズ加水分解産物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水溶液等を使用することができる。また、ビタミンＢ1等のビタミン、アデニンおよびＲＮＡ等の核酸、または酵母抽出物等の必須物質を、極微量有機栄養分として適切な量で含有することが望ましい。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を添加してもよい。
【００２９】
培養は、好ましくは、好気性条件下にて１６〜７２時間実施され、培養温度は、３０〜４５℃の範囲に、ｐＨは、５〜８の範囲に制御される。ｐＨは、無機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、及びアンモニアガスにより調節され得る。
【００３０】
プリンヌクレオシドの発酵液からの採取は、イオン交換樹脂法および沈殿法のような従来の技法のいずれか、またはそれらの任意の組合せにより、行うことができる。
【００３１】
＜３＞プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取する、プリンヌクレオチドの製造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したイノシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−イノシン酸を採取する、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸を採取する、５’−キサンチル酸の製造方法を包含する。
【００３２】
本発明においては、培養、培地からのプリンヌクレオシドの採取および精製等は、プリンヌクレオシドを微生物を用いて生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。さらに、本発明においては、生成、蓄積したプリンヌクレオシドのリン酸化、および生成、蓄積したプリンヌクレオチドの採取は、プリンヌクレオシドからプリンヌクレオチドを生産する従来の発酵法に類似した様式で実施されてもよい。
【００３３】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々のホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを用いて酵素的に、あるいはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を用いて化学的に行うことができる。ヌクレオシドへのピロリン酸塩のリン酸基のＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能なホスファターゼ（Mihara et al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii, Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816)、またはポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）もしくはカルバミルリン酸（塩）をリン酸ドナーとして利用する酸性ホスファターゼ（WO 96/37603A1）等を使用してもよい。また、ホスファターゼの一例として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600）、無機リン酸塩（特開昭４２−１１８６号）またはアセルリン酸塩（特開昭６１−４１５５５号）を利用してヌクレオシドのＣ−２’、３’または５’位へのリン酸基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等を使用してもよい。ヌクレオチドキナーゼの例としては、エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナーゼ(Mori et al., Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926；WO 91/08286）等を使用してもよい。ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p203-258. In  A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）により記載されているヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用してもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3のようなリン酸化剤（Yoshikawa et al, Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508)等を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明の方法は、前記細菌のような細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取する、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。本発明においては、前記細菌のような細菌の培地での培養、生成、蓄積したキサントシンのリン酸化、生成、蓄積した５’−キサンチル酸のアミノ化、および生成、蓄積した５’−グアニル酸の採取は、５’−キサンチル酸から５’−グアニル酸を生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。
【００３５】
５’−キサンチル酸のアミノ化は、例えば、エシェリヒア・コリ由来のＧＭＰシンテターゼを用いて酵素的に行うことができる（Fujio et al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845、欧州特許第０２５１４８９Ｂ１号）。
【００３６】
本発明の方法においては、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子発現が高められるように改変してもよい。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【参考例１】
バチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株の構築ｐｕｒＲ、ｐｕｒＡ、およびｄｅｏＤ遺伝子中に挿入−欠失変異を有する変異株であるバチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株を、バチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ株から得た。
【００３８】
１）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＲ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．１（配列番号１）およびＮｏ．２（配列番号２）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．１（２８mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＲ遺伝子（M. Weng, P.L. Nagy, and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-7459）の開始コドン上流の２４６番目〜２２８番目のヌクレオチド由来の配列、および、５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．２（２８mer）は、ＰｓｔＩ部位を含む９mer配列を５’末端に融合したｐｕｒＲ遺伝子の終止コドンの下流の５７〜７５のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．９ｋｂ）を、ｐＨＳＧ３８９(TaKaRa, Japan)の両方の制限酵素部位の間に挿入して、ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲを創製した。増幅されたｐｕｒＲ遺伝子の内部配列であるＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．３ｋｂをｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲから除去し、続いて、ｐＤＧ１７２６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のスペクチノマイシン耐性遺伝子（１．２ｋｂ）で置き換えた。
【００３９】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＲ：：ｓｐｃを、Dubunau and Davidoff-Abelsonの方法（Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 1971, 56:209-221）により調製したバチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇのコンピテントセルの形質転換に使用した。スペクチノマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＲ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ４と命名した。
２）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＡ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．３（配列番号３）およびＮｏ．４（配列番号４）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．３（２９mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＡ遺伝子の開始コドンの上流の１３７番目〜１１８番目のヌクレオチド由来の配列（P. Mantsala and H, Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and gua A, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J, Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890）、および５’末端に付加したＳａｌＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．４（２９mer）は、５’末端でＳｐｈＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｐｕｒＡ遺伝子の終止コドンの下流の５１〜７０のヌクレオチド由来の配列である。ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ＢＳＰＡをＭｌｕＩおよびＢｇｌIIで消化し、増幅ｐｕｒＡ遺伝子の内部配列０．４ｋｂを除去して、クレノウ酵素で平滑末端化し、続いて、ｐＤＧ６４６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子（１．６ｋｂ）の平滑末端化した断片に連結した。
【００４０】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＡ：：ｅｒｍを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製された、ＫＭＢＳ４のコンピテントセルの形質転換に使用した。エリスロマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＡ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ  ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１３と命名した。予想通り、ＫＭＢＳ１３の細胞は、アデニン栄養要求株であった。
【００４１】
３）バチルス・ズブチリスのｄｅｏＤ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス由来のｄｅｏＤ遺伝子の５’末端およびその上流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．５（配列番号５）およびＮｏ．６（配列番号６）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．５（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの上流の３１０番目〜２９１番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＥｃｏＲＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．６（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの下流の３９〜５７のヌクレオチド由来の配列である。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮを創製した。
【００４２】
ｄｅｏＤ遺伝子の３’末端およびその下流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．７（配列番号７）およびＮｏ．８（配列番号８）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．７（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの下流の３２１番目〜３０２番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．８（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの上流の２４番目〜４２番目のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮの両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣを創出した。
【００４３】
ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）のカナマイシン耐性遺伝子を増幅するために、鋳型としてｐＤＧ７８３のプラスミドＤＮＡ(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)を、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．９（配列番号９）およびＮｏ．１０（配列番号１０）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．９（３３mer）は、カナマイシン耐性遺伝子の開始コドンの上流の５１３番目〜４９０番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．１０（３３mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したカナマイシン耐性遺伝子の終止コドンの下流の１１７〜１４０のヌクレオチド由来の配列である。ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ｄｅｏＤ：：ｋａｎを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製した、ＫＭＢＳ１３のコンピテントセルの形質転換に使用した。カナマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いてプライマーＮｏ．５およびＮｏ．７を用いた上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｄｅｏＤ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ：：ｅｒｍ  ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１６と命名した。
【００４４】
【実施例１】
バチルス・ズブチリス イノシン生産株のポリミキシン耐性変異株の選択および評価
バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株の細胞（〜１０8）を、１５、２０、３０または４０ｍｇ／ｌのポリミキシンＢ硫酸塩（Sigma, USA）を含有するＬブロス寒天培地（トリプトン−１０ｇ／ｌ、酵母抽出物−５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ−０．５ｇ／ｌ、グルコース−２ｇ／ｌ、ｐＨ７、寒天２０ｇ／ｌ）に植菌した。これらのプレートを３４℃にて５日間インキュベートした。出現した自然変異株のコロニーから、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株（ＶＫＰＭ  Ｂ−８２４５）を選択した。
【００４５】
変異株および親株のポリミキシンおよびコリスチンに対する耐性（相対生育度）を、以下の手法により評価した。段階的な濃度のポリミキシンまたはコリスチンを添加することにより調製したＬブロス５ｍｌを入れた試験管に、あらかじめＬブロス中で１８時間振とうしながら生育させた試験株を約１０6細胞／ｍｌとなるように接種し、３７℃で２４時間振とう培養を行った。得られた培地を水で適当に希釈して、希釈物の５４０ｎｍでの吸光度を測定して、生育度（ポリミキシンの場合にはＰＯＤ540、またコリスチンの場合にはＣＯＤ540）を調べた。抗生物質を含まないＬブロスでの同一株の生育度（ＯＤ540）を１００とした。ポリミキシン含有培地またはコリスチン含有培地における相対生育度は、それぞれ（ＰＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００、または（ＣＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００として算出することができる。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0004385611.tif 000002
【００４７】
表１から、ポリミキシンＢ耐性として取得されたバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株は、コリスチンにも耐性であることがわかる。
【００４８】
バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株および親株であるバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を、それぞれＬブロス中で３４℃で１８時間、通気しながら培養した。次に、得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３４℃で７２時間培養した。
【００４９】
発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース              ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4                １．０
ＭｇＳＯ4                 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ        ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ−ＴＮ        １．３５
ＤＬ−メチオニン          ０．３
ＮＨ4Ｃｌ               ３２．０
アデニン                  ０．１
トリプトファン            ０．０２
ＣａＣＯ3               ５０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは、別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０度で２時間、乾熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。
【００５０】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨＰＬＣにより測定した。培地試料（５００μｌ）を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで１００倍希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。
【００５１】
分析条件：
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）  ２５０×３ｍｍ、５ｕ(Phenomenex, USA)。
緩衝液：２％ Ｃ2Ｈ5ＯＨ；０．８％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン；０．５５％（ｖ／ｖ）酢酸（氷酢酸）；ｐＨ４．５。
温度：３０℃。
流速：０．３ｍｌ／分。
検出：ＵＶ２５０ｎｍ。
保持時間（分）：
キサントシン        １３．７
イノシン              ９．６
ヒポキサンチン        ５．２
グアノシン          １１．４
アデノシン          ２８．２
【００５２】
結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
0004385611.tif 000003
【００５４】
表２に示すように、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株は、親株よりも多くイノシンを蓄積した。
【００５５】
【実施例２】
バチルス・アミロリケファシエンス イノシン生産株のコリスチン耐性変異株の選択および評価
バチルス・アミロリケファシエンスＡＳ１１５−７株の細胞（〜１０8）を、１０、１５、２０、３０または４０ｍｇ／ｌのコリスチン硫酸塩（Sigma, USA）を含有する実施例１と同様のＬブロス寒天培地に植菌した。これらのプレートを、３４℃で５日間インキュベートした。出現した自然変異株のコロニーから、バチルス・アミロリケファシエンスＣｏｌR７−１０５株（ＶＫＰＭ  Ｂ−８２４６）を選択した。
【００５６】
この株及び親株のポリミキシンに対する耐性（相対生育度）を、実施例１に記載の方法により評価した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
0004385611.tif 000004
【００５８】
表３からわかるように、コリスチン耐性株として得られたバチルス・アミロリケファシエンスＣｏｌR７−１０５株は、ポリミキシンＢに対してより耐性である。
【００５９】
バチルス・アミロリケファシエンスＣｏｌＲ７−１０５株および親株であるバチルス・アミロリケファシエンスＡＳ１１５−７株を、それぞれＬブロス中で、３４℃で１８時間培養した。次に、得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管に入れた、Ｌ−トリプトファンの代わりに４０μｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジンおよび４０μｇ／ｍｌのＬ−チロシンを含有する実施例１の発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３４℃で７２時間培養した。培養後、培地中に蓄積したイノシン量を、上記のようにしてＨＰＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
0004385611.tif 000005
【００６１】
表４に示すように、コリスチンに耐性のＢ．アミロリケファシエンスＣｏｌR７−１０５株は、親株よりも多くイノシンを蓄積した。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、バチルス属に属する細菌によるイノシンおよびキサントシン等のプリンヌクレオシドの生産性を向上させることができる。また、本発明によれば、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを効率よく製造することができる。
【００６３】
【配列表】
0004385611.tif 000006
0004385611.tif 000007
0004385611.tif 000008
0004385611.tif 000009
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