(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新脈管形成活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
真骨魚類に対して該薬剤を投与する工程、および
新脈管形成活性を示す該真骨魚類における応答を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記新脈管形成活性が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記新脈管形成活性が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記応答が、正常な血管形成における減少である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記応答が、正常な血管形成における増加である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記応答が、既存の血管の損失である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記真骨魚類が、胚、幼生、または成体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオ、またはフグである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ胚である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真骨魚類が、野生型系統である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記真骨魚類が、選択された遺伝子において変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記真骨魚類が、トランスジェニックである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、前記真骨魚類を含む培地中に該薬剤を溶解することにより、該真骨魚類に投与される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、前記真骨魚類に該薬剤を注射することにより、該真骨魚類に投与される、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、キャリアと組み合わせて、前記真骨魚類に投与される、方法。
【請求項１６】
前記キャリアが、溶媒、脂質またはペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、化合物であり、そして化合物のライブラリーは、新脈管形成活性についてスクリーニングされる、方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、脂質、または糖脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項５に記載の方法であって、ここで、血管が、前記真骨魚類のアルカリホスファターゼ染色の後に光学顕微鏡によって可視化される、方法。
【請求項２１】
前記真骨魚類が、マイクロタイターウェルに含まれる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記応答が、マイクロプレートリーダーを使用して検出される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本特許出願は、１９９８年２月２３日に出願の、米国特許仮出願番号６０／０７５，７８３号、および１９９８年９月１８日に出願の、米国特許仮出願番号６０／１００，９５０号に対する優先権を主張する。これらの出願の各々は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
１９９８年１２月１日出願の、同一人の同時係属米国特許出願番号６０／１１０，４６４は、関連する主題に指向され、そして全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００３】
（連邦政府委託研究および開発下で成された発明に対する権利に関する声明）  本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金により援助された（助成金番号１Ｒ４３ＣＡ７９３８−０１）。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００４】
（発明の背景）
現在、新脈管形成活性を増強または阻害する能力、細胞死活性を増強または阻害する能力、および／または低い毒性を示す能力を有する、標的特異的な治療的化合物および予防的化合物の探索は、薬物の発見および開発の３つの主要な焦点を含む。新脈管形成は、胚の血管系のさらなる発達にのみならず、多くの出生後のプロセス（例えば、創傷治癒ならびに組織および器官の再生）においても重要な役割を果たす。新脈管形成はまた、固形腫瘍増殖に関する重要なプロセスとして同定されている。さらに、制御されない血液細胞増殖および過剰な新脈管形成は、多くの疾患（慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、網膜症、乾癬、および水晶体後線維増殖症を含む）において、有意な病原性成分を構成することが示されている。
【０００５】
新脈管形成活性を阻害または増殖する能力についての薬剤をスクリーニングする方法は、新脈管形成プロセスに関わる種々の疾患の治療的処置または予防的処置において有効であるこれらの薬剤を同定する際に有用である。例えば、新脈管形成の阻害は、癌の寛解（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１７５７−１７６３（１９９５）；Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：３５５（１９９７））および組織虚血（例えば、糖尿病性網膜症）に関連する血管損失の回復（Ｂｏｎｎ，Ｌａｎｃｅｔ  ３４８：６０４（１９９６）；Ｂｒｅｉｅｒら、Ｈａｅｍｉｓｔ．７８（１）６７８−６８３（１９９７））のための強力な潜在的アプローチである。抗新脈管形成治療は、後天性の薬物耐性（現在の癌治療に伴う主要な問題）を誘導しない（Ｂｏｅｈｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：４０４−４０７（１９９７））ことが明らかである。しかし、治療的候補分子はほとんど存在しない。従って、新脈管形成を阻害し、そして癌および糖尿病のような、新脈管形成阻害から助けられる疾患に対する治療的活性を有する化合物を同定する方法を提供することが望ましい。同様に、血管形成を刺激することにより新脈管形成を増強する化合物についてスクリーニングする方法は、種々の疾患（例えば、冠状動脈疾患、うっ血性心不全、末梢動脈疾患、および末梢静脈疾患）において、循環性機能を改善するための最小の侵襲性アプローチにおける使用に有利である。不幸にも、新脈管形成についての多くの現在のアッセイは、動物モデル全体、あるいは動物モデルの複数の組織または器官において同時にかつ経時的に、化合物またはその副作用のインビボでの評価を可能にしない。さらに、新脈管形成活性についての現在の多くのアッセイは、それらの複雑性のために、迅速な、自動化された、または広範な化合物のスクリーニング（特に、多くの化合物を含む化合物ライブラリーのスクリーニング）に適切ではない。
【０００６】
細胞死を調節促進または阻害し得る化合物の探索もまた、極めて重要である。壊死およびアポトーシスは、細胞死の２つの公知の型である。壊死は、組織細胞に対する非生理学的損傷に起因する、被験体における生組織の病理学的な死を含む。アポトーシス（プログラムされた細胞死を含む）は、多細胞生物のほとんどの自己再生組織における細胞増殖と細胞分化との間で、平衡状態が維持されることを確証する生理学的プロセスである。細胞死活性の調節（特に、アポトーシス）は、多くに疾患（例えば、癌および器官移植を含む）に対する治療的および予防的アプローチにおける重要な機構を構成する。アポトーシス活性を評価するための現存するモデルとしては、線虫蠕虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが挙げられる。線虫は、モデル系として多くの利点を有するが、脊椎動物の細胞死活性の評価または脊椎動物における強力な治療的活性についての化合物のスクリーニングの際の使用に最適なモデルではない。
【０００７】
脊椎動物宿主における細胞死活性を検出するために、現在２つのアプローチが存在する。第１のアプローチは、標準的な細胞培養技術を使用し、そして代表的には標準的なマイクロプレートリーダーに活用して、生物から培養された細胞の死を検出する。細胞培養アッセイ形式の主な弱点は、それが、培養されなかった細胞型（すなわち、他の細胞型）に対する化合物に対する効果の分析が可能でないことである。それはまた、インビボで特定の組織または器官に対する、あるいはインタクトな宿主全体における化合物の効果の評価を可能にしない。さらに、このようなアッセイ形式は、生存宿主の複数の組織、器官、または系における細胞死活性の同時のモニタリング、あるいはこのような活性の経時的な継続したモニタリングを可能にしない。さらに、その細胞培養アッセイアプローチは、多くの化合物の迅速な、または自動化された高処理能スクリーニングを可能にしない。
【０００８】
細胞死活性を検出するための第２のアプローチは、組織化学的染色技術（末端デオキシウリジンヌクレオチド末端標識（ＴＵＮＥＬ）と命名される）を利用して、脊椎動物胚の切片化された組織における死細胞または瀕死細胞を検出する。不幸にも、このアプローチを用いると、宿主の生活環におけるただ単一の時点のみが試験され得；長期間にわたる被験体の種々の組織または器官における細胞の死は、モニターされ得ない。多くの変性疾患が段階で生じるために、化合物により引き起こされる細胞死活性のパターンにおける変化、ならびに複数の組織および器官に対するその化合物の直接の効果および副作用の持続時間を試験する能力は、このような方法に全体にわたる有意な改善を意味する。さらに、ＴＵＮＥＬアプローチは、細胞が可視化のために固定されることが必要とされるために、生存動物における効果はモニターされ得ない。
【０００９】
低毒性および／または低副作用を示す標的特異的な治療的化合物および予防的化合物の同定はまた、薬物の発見および開発の焦点である。ヒトおよび動物の健康状態に対する異なる化合物の潜在的影響の評価は、リスク評価の主要な構成要素である。現在の毒性試験手順は不適切であるという懸念が増加している。細胞ベースのインビトロでの多くの毒性スクリーニングが、開発されてきた。しかし、有意に、これらのスクリーニングは、インタクトな動物に対する化合物の毒性効果のインビボでの評価を可能にしない。特に、これらの細胞ベースのアッセイは、分子レベルおよび細胞レベルで設計され；結果として、より高いレベルの細胞性の組織化（例えば、循環系および神経発生）に対する目的の化合物の影響を決定することが依然として、引き続く動物全体の試験を必要とする。さらに、現在のスクリーニングは、動物の全ての潜在的な標的細胞、組織、または器官に対する薬物効果の評価を可能にしない。複数の標的組織および器官に対する化合物の効果は、現在のアッセイを使用して同時にまたは経時的に研究され得ない。より予測的でかつ包括的な毒性スクリーニング方法の開発についての必要性が強調されるため、予備的な細胞ベースの試験を通過した多くの化合物は、最終的なＦＤＡの承認に必要となる最後の大型動物の毒性試験で失敗に終わっている。さらに、即時型の致死を生成しない、いくつかの潜在的な治療化合物は、特定の器官および組織における毒性効果を誘導する。動物全体における毒性活性、ならびに１以上の指定された標的組織および器官における毒性活性について、インビボおよびインビトロでの細胞において、かつ経時的に、化合物をスクリーニングする費用効果的、包括的方法の必要性が存在する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、一般に真骨魚類において、活性についての薬剤をスクリーニングする方法に関する。１つの局面において、インビボまたはインビトロで新脈管形成活性について、薬剤をスクリーニングする方法が提供される。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、およびその真骨魚類における応答、または新脈管形成活性を示す真骨魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性を示すそのような細胞における応答を検出する工程を含む。いくつかのそのような方法において、その応答は、未処置の真骨魚類と比較した血管形成における減少である。他のそのような方法において、その応答は、未処置の真骨魚類と比較した血管形成における増加である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、およびその真骨魚類における応答、あるいは真骨魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官またはそれらの細胞死活性に対する効果を示す細胞における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示すそのような細胞における応答を検出する工程を含む。いくつかのそのような方法において、その応答は、細胞死活性における増加である。他のそのような方法において、その応答は、細胞死活性における減少である。その細胞死活性は、アポトーシス活性および壊死活性を含み得る。いくつかのそのような方法において、死細胞または瀕死細胞を標識する蛍光色素が投与され、細胞死活性の検出を容易にする。いくつかのそのような方法において、蛍光色素が、薬剤の投与前にその真骨魚類に投与される。いくつかのそのような方法において、その蛍光色素は、非対称的なシアニン色素（例えば、キノリウム（ｑｕｉｎｏｌｉｕｍ）色素）である。
【００１２】
インビボまたはインビトロで毒性活性についての薬剤をスクリーニングする方法もまた提供される。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、およびその真骨魚類における応答、または毒性を示す真骨魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および毒性を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。いくつかのそのような方法において、その応答は、真骨魚類の２以上の器官において同時に検出される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで新脈管形成活性および毒性についての薬剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性および／または毒性を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性および／または毒性を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで新脈管形成活性および細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を含む。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類に薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性および／または細胞死活性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性および／または細胞死活性に対する効果を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。
【００１５】
本発明はまた、インビボまたはインビトロで細胞死活性および毒性活性に対する効果ついて薬剤をスクリーニングする方法を含む。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、および細胞死活性および／または毒性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および細胞死活性および／または毒性に対する効果を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。
【００１６】
本明細書中の本発明の本質および利点のさらなる理解は、発明の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかにされ得る。
【００１７】
（定義）
他に規定しない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者により、通常、理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考は、本発明において用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年、第２版）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において用いる場合、以下の用語および句は、他に特定されない限り、これらに基づいた意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語および句は、それらが本明細書において用いられる場合、以下の一般的な意味を有することが意図される：
本明細書において用いる場合、用語「被験体」は、動物を含む。本明細書において用いる用語「動物」は、脊椎魚（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｆｉｓｈ）のような脊椎動物を含む。脊椎魚としては、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント  レリオ（Ｇｉａｎｔ  ｒｅｒｉｏ）およびフグのような真骨魚類（ｔｅｌｅｏｓｔｓ）が挙げられる。
【００１８】
本明細書において用いる場合、用語「真骨魚類（ｔｅｌｅｏｓｔ）」は、ＴｅｌｏｓｔｅｉまたはＴｅｌｅｏｓｔｏｍｉ（骨の骨格および放射状のひれを有する多くの魚からなる群）を意味するかまたはそれに属する。真骨魚類としては、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント  レリオおよびフグが挙げられる。
【００１９】
本明細書において用いられる用語「幼生」または「幼生の」は、脊椎魚（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント  レリオおよびフグのような真骨魚類を含む）のような脊椎動物を含む任意の種々の動物の、胚形成と成体との間の段階を意味する。
【００２０】
薬剤に関連する「新脈管形成活性（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「脈管形成活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、本明細書において、血管またはリンパ管の形成または成長を増強、阻害または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関する新脈管形成活性または脈管形成活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における新脈管形成、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する新脈管形成と関連する活性をいう。
【００２１】
薬剤に関連する「抗新脈管形成活性」または「抗脈管形成活性」は、本明細書において、血管またはリンパ管の形成または成長を阻害、防止、または大きく減弱するか、あるいは出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）または成長の間のこのような血管を破壊する薬剤の能力として定義される。被験体に関する抗新脈管形成活性または抗脈管形成活性は、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における抗脈管形成、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する新抗脈管形成と関連する活性をいう。
【００２２】
薬剤に関する用語「アポトーシス性活性」または「アポトーシス活性」は、本明細書において、アポトーシスを増強、阻害、または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関するアポトーシス性活性またはアポトーシス活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における細胞の死、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する細胞の死と関連する活性をいう。
【００２３】
薬剤に関する「細胞死活性」は、本明細書において、被験体または被験体の器官もしくは組織中における、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する１つ以上の細胞の死を増強、阻害または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関する細胞死活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における細胞の死、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する細胞の死と関連する活性をいう。
【００２４】
薬剤に関する用語「壊死性活性」または「壊死活性」は、本明細書において、壊死を増強、阻害、または防止する薬剤の能力として定義される。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「細胞死活性に対する効果」は、薬剤が被験体において細胞死活性に作用するまたは影響する様式をいう。このような効果は、被験体において細胞死活性を増強または阻害する能力（例えば、被験体における細胞死において生じるか、観察されるか、関連するか、または特有の、臨床兆候、特徴、症状または事象により示されるかあるいは表されるような）を含む。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「アポトーシス性活性に対する効果」は、薬剤が被験体においてアポトーシス性活性に作用するまたは影響する様式をいう。このような効果は、被験体においてアポトーシス性活性を増強または阻害する能力を（例えば、被験体における細胞のアポトーシスにおいて生じるか、観察されるか、関連するか、またはそれに特有の、臨床兆候、特徴、症状または事象により示されるかまたは表されるような）を含む。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「内因性に発生する」とは、内部から発生が生じることを意味する。
【００２８】
用語「遺伝子」は、生物学的な機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを呼ぶために広く用いられる。従って、遺伝子は、その発現に必要なコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子はまた、発現されないＤＮＡセグメント（例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する）も含む。用語「核酸」または「核酸セグメント」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいい、これらは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである。特に限定されない限り、この用語は、ヌクレオチドの公知のアナログ（合成的におよび天然に生じる）を含む核酸を包含する。この核酸は、参照の核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、明白に示されるその配列と同様にその保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または、すべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと相互交換可能に用いられる。
【００２９】
用語「単離された核酸」または「単離された核酸セグメント」は、一本鎖または二本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）を意味する。これらは、天然の配列を自然に伴う他のゲノムＤＮＡ配列ならびにタンパク質または複合体（例えば、リボソームおよびポリメラーゼ）から実質的に分離されている。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、そして組換えＤＮＡ単離体またはクローン化ＤＮＡ単離体および化学的に合成されたアナログまたは異種の系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含む。「単離されたポリペプチド」またはタンパク質は、あらゆる細胞混雑物およびインビボでそのタンパク質と自然に会合する成分から実質的に分離されているポリペプチドまたはタンパク質という類似の意味を有する。
【００３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために本明細書において互換可能に用いられる。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸の対応物の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーにあてはまる。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書において、その通常公知の３文字略号かまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字略号のいずれかで呼ばれ得る。ヌクレオチドは同様に、その通常受容される１文字コードで呼ばれ得る。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「キメラ分子」とは、２つ以上の異なる型の分子（例えば、脂質、糖脂質、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、核酸、天然物質、合成化合物、有機分子、無機分子など）の結合後に得られる連結分子をいう。
【００３３】
本明細書において用いる場合、用語「正常な血管形成」とは、被験体における血管の形成または生成の代表的な、通常の、または天然のプロセスをいう。
【００３４】
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子発現プロフィール」または「遺伝子発現パターン」は、そのプロフィールまたはパターンに含まれるそれぞれの遺伝子についてのｍＲＮＡの検出に基づくプロフィールまたはパターンを意味する。ｍＲＮＡは、特定の時間で、または特定の状況下で検出され得る。ｍＲＮＡは、細胞、組織、器官または目的の生物体全体から抽出されそして検出される。特定の遺伝子についてのｍＲＮＡの量またはレベルは、定量的に決定され得る。
【００３５】
本明細書において用いる場合、用語「タンパク質発現プロフィール」または「タンパク質発現パターン」は、タンパク質の検出に基づくプロフィールまたはパターンを意味する。タンパク質は、特定の時間で、または特定の状況下で検出され得る。タンパク質は、細胞、組織、器官または目的の生物体全体から抽出されそして検出される。タンパク質の量またはレベルは、定量的に決定され得る。
【００３６】
用語「薬剤」は、例えば、薬学的な、治療的な、薬理学的な、環境的な、もしくは農業的な汚染物質もしくは化合物、水中の汚染物質、化粧品、薬物、毒素、天然の産物、合成化合物または化学的化合物を含むがこれに限定されない任意のエレメント、化合物または実体を含む。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「天然の化合物」は、植物、動物、酵母、細菌または他の微生物から単離、抽出または精製された分子を含む。天然の化合物としては、例えば、とりわけ、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、脂肪、糖脂質の広い生化学的な分類に属する有機分子、ならびに例えば、より多いこれらの基礎的な生化学的な分類のエレメントを含む、より複雑な分子が挙げられる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、用語「合成化合物」は、新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成されたか、または天然の化合物を改変もしくは誘導体化することにより作製される分子を含む。
【００３９】
本明細書において用いられる場合「発生欠陥」は、正常な発生に比較して動物の組織、器官または他の身体的成分の発生における欠損、不完全または差異を意味する。このような欠陥は、成分の正常な発生と比較して、その動物の組織、器官または他の身体的成分の発生における完了または適切な操作のために必要かまたは所望されるものの、変化、差異または欠失として定義される。発生欠陥としては、例えば、適切に発生するための器官の不全、正常な細胞増殖に比べて過剰なまたは減少した細胞増殖、および器官または組織の機能不全が挙げられる。
【００４０】
一般に、本明細書において以降用いられる命名法ならびに以下で記載される細胞培養、分子遺伝学および核酸化学における実験手順は、周知であり、そして当該分野において通常用いられるものである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２版、１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１〜３巻（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｅｎｓｏｎ  Ｃｈａｎｄａ編、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９４〜１９９８）（これらのそれぞれは、その全体がすべての目的のために参考として本明細書に援用されている）に記載されるような標準的技術は、組換え核酸方法、核酸合成、細胞培養、およびトランスジーンの組み込みのために用いられる（例えば、エレクトロポレーション、注入、摂取、およびリポフェクション）。エレクトロポレーション技術は、目的の分子を細胞、組織または生物体へ導入するために高い電流のパルスを利用する。リポフェクションは、細胞膜と強力に相互作用する脂質様陽イオン性分子を用いる。これは細胞膜を局所的に不安定にし、これにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの細胞内への侵入を可能にする。一般的に、オリゴヌクレオチド合成および精製工程は、本明細書に従って実行される。この技術および手順は、一般に当該分野の従来方法および本明細書を通じて提供される種々の一般的参考文献に従って実施される。それらにおける手順は、当該分野で周知と考えられており、そして読者の便利のために提供される。
【００４１】
生物体または動物に関する用語「トランスジェニック」は、染色体に外来遺伝子が挿入された、受精卵から発生した生物体または動物を含む。このようなトランスジェニック生物および動物は、全ての細胞に外来遺伝子挿入物を保有する。トランスジェニック生物および動物は、公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｄｅｖｌｉｎ編、第３版、１９９２）を参照のこと）（これは、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されている）を用いることにより作製される。トランスジェニック生物および動物は、外来の遺伝子の異なる局面を研究するために用いられ得る。これには、ＤＮＡ調節エレメント、分化の間のタンパク質の発現、組織特異性、ならびに成長、分化および腫瘍形成の誘導における癌遺伝子産物の潜在的な役割の分析を含む。「トランスジーン」は、元々の形態のまたは改変形態の遺伝子であり、これはこのような遺伝子を天然には有さない生物または動物に導入される。「モザイク的に発現するトランスジーン」は、トランスジェニック生物または動物の細胞のサブセットにおいて無作為に発現されるトランスジーンである。「外因性の遺伝子」は、遺伝子が導入された種に属さない生物または動物由来の遺伝子である。「一過性のトランスジェニック動物」は、染色体に挿入されていない導入された遺伝子を保有するトランスジェニック動物である。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「創始魚（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｆｉｓｈ）」とは、魚の系統が発生される魚をいう。通常、創始魚は、特有の変異を保有し、そして子孫（これもまた変異を保有する）を発生するために用いられる個体の魚である。
【００４３】
生物に関する「生理的な活性」は、本明細書において、生存する生物の任意の正常なプロセス、機能または活性として定義される。
【００４４】
「予防的な活性」は、疾患の兆候もしくは症状を示さないかまたは疾患の早期の兆候もしくは症状のみを示す被験体に投与された場合、被験体における症状の発生の危険性を減弱、低下または予防する、例えば、薬剤、遺伝子、核酸セグメント、医薬品、物質、化合物または組成物の活性である。
【００４５】
「治療的活性」は、病態を示している被験体に投与された場合、病理的な兆候または症状を減弱、または排除する、例えば、薬剤、遺伝子、核酸セグメント、医薬品、治療薬、物質、化合物または組成物の任意の活性として本明細書において定義される。薬剤に関する用語「治療上有用な」は、その薬剤が、病態または疾患の病理的兆候または症状を減弱すること、減少すること、処置することまたは排除することにおいて有用であることを意味する。
【００４６】
（特定の実施態様の説明）
（Ｉ．全般）
本発明は、活性についての薬剤のスクリーニングの方法に関する。本願の第ＩＩ節で、新脈管形成活性を増強、阻害またはブロックする薬剤の性能または能力についてのスクリーニング方法を議論する。第ＩＩＩ節において、細胞死活性を増強する、阻害するまたは起こす能力についての薬剤のスクリーニング方法を記載する。第ＩＶ節において、毒性活性についての薬剤のスクリーニングの方法を示す。
【００４７】
（Ａ．動物モデル）
活性（例えば、新脈管形成活性、細胞死活性および毒性活性）についての薬剤スクリーニングに関する本発明の方法は、一般に、魚のような脊椎動物を含む種々の動物における使用のために適用可能である。種々の種の魚が適切であり、これには真骨魚類を含む。適切な真骨魚類としては、例えば、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、メダカ、ジャイアント  レリオ（Ｇｉａｎｔ  ｒｅｒｉｏ）およびフグが挙げられる。代表的には、本発明の動物モデルは、以下の段階の少なくとも１つにある透明または半透明（すなわち、光学的に透明）である魚である：胚性段階、幼生段階または成体段階。
【００４８】
特定の真骨魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント  レリオおよびフグを含む）は、本発明のスクリーニング方法での使用のために他の動物モデル系よりも重要な利点を提供する。第１に、これらの真骨魚類は、遺伝子構造が他のモデル（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび線虫）よりもヒトの遺伝子構造により近縁関係にある脊椎動物である。ヒトの形態および器官の発生の全ての必須の成分は、これらの真骨魚類で模倣されており、そして組織および器官の発生の形態的および分子的基礎は、他の脊椎動物（ヒトを含む）と同一かまたは類似しているかのいずれかである。ＣｈｅｎおよびＦｉｓｈｍａｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：２９３〜３０２（１９９６）；ＧｒａｎｔｏおよびＮｕｓｓｅｌｉｅｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．６：４６１〜４６８（Ｗｙｌｉｅ編、１９９６）。結果として、これらの真骨魚類は、脊椎動物の発生およびヒト疾患状態の研究のための優れたモデルとして働く。
【００４９】
第２に、これらの真骨魚類は、それらの胚が、非常に透明であることにより有利な動物モデルを提供する。胚の透明性を考えると、投与された薬剤により生成される新脈管形成活性、細胞死活性（例えば、アポトーシスおよび壊死）および毒性活性は、不透明な動物においてよりもさらにより迅速に検出および診断され得る。これらの活性はまた、ゼブラフィッシュのより成熟した幼生および成魚形態において検出され得る。ただし、このような形態では次第に光学的に明瞭度が低下するのでいくらか容易性が低下する。これらの活性はまた、３つすべての形態でインビボで検出され得るか、またはインビトロでそれらの細胞内で検出され得る。対照的に、動物モデル系として通常用いられるマウスは、不透明な動物であり、そして表現型の変化または発生的な変化の同様の迅速な評価またはインビボ評価を可能にしない。これらの変化は、動物全体または器官もしくは組織の全体において、細胞死、新脈管形成または毒性と関連する変化を含む。重大なことに、これらの真骨魚類の脳、眼、心臓ならびに筋肉組織の前駆組織および成分は、他の系においてよりも透明な真骨魚類においてより容易に、そして迅速に検出および可視化される。この他の系には、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、比色定量、化学発光（ケミルミネセンス）、デジタル画像、マイクロプレートリーダー技術、ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションなどを含む種々の検出技術による他の脊椎動物系（例えば、マウス）を含む。
【００５０】
他の動物モデルより優れた真骨魚類の別の重要な利点は、真骨魚類は他の動物モデルが発生するよりも迅速に発生することである。一般に、真骨魚類の体制プラン、器官、組織および他の系は、他の脊椎動物モデル系（例えば、マウス）におけるそのような成分が発生するよりもより迅速に発生する。例えば、ゼブラフィッシュの脊椎動物体制プラン全体は、代表的には、２４時間内に樹立される。機能する心血管系は、発生の２４時間内にゼブラフィッシュ中で明らかになる。ＳｔａｉｎｉｅｒおよびＦｉｓｈｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．４：２０７〜２１２（１９９４）。ゼブラフィッシュの残りの器官（腸、肝臓、腎臓および血管系を含む）は、４８時間内に樹立される。孵化したゼブラフィッシュの胚は、１２０時間内に形態形成をほぼ完成する。これにより、操作および観察に非常にアクセス可能になり、そして高処理能力の自動観察および検出手順に受け入れられる。
【００５１】
薬剤の細胞死活性、新脈管形成活性および毒性活性およびこれらの活性を示す応答は、真骨魚類全身においておよび／またはインビボであるいはインビトロでのその細胞中で、経時的にモニターされ得る−（子宮内で発生する他の動物の胚（例えばマウス）を用いては、不可能かまたは容易に実施できない手順）。さらに、真骨魚類胚全体または複数の系（例えば、心血管系、腸管系および筋系）、器官もしくは組織に対する薬剤の効果は、透明な真骨魚類を用いて同時に検出され得る。このような効果の持続性は、単純な可視化方法を用いることにより、そして選択した時間間隔にわたってモニターされ得る。対照的に、子宮内で発生する動物において、経時的に、器官、組織および系における発生的変化および表現型変化（例えば、薬剤による新脈管形成、細胞死、または毒性活性の阻害または増強）を検出および評価することは非常に困難である。例えば、マウス胚は、アッセイが実施され得る前には、母体から取り出さねばならない−（分娩集中的な手順）。
【００５２】
真骨魚類はまた、毒性効果について評価される薬剤が発生中の真骨魚類に直接投与され得るという利点を提供する。候補化合物の直接導入は、マウス胚のような子宮内で発生する動物においては邪魔される。さらに、真骨魚類の胚は、インタクトな自己維持性の生物体である。例えば、それは、その母体の子宮から物理的に離れているために自己維持性またはインタクトではないマウス胚とは異なる；マウス胚は、「器官」培養などとしてより機能する。
【００５３】
別の重大な利点はコストである。マウスアッセイは高価であり、これは主に、育種および維持のコストならびに手技的な注射および引き続く分析の必要性に起因する。商業的なマウス腫瘍アッセイの平均コストは、約２，９００ドル（１機関あたり１，６００ドル）である。対照的に、ゼブラフィッシュのような真骨魚類は、作製および維持のために比較的高価でない。例えば、ゼブラフィッシュ分析の推定コストは、１００ドル未満である。ゼブラフィッシュの単回交配により、１００〜２００の卵が産生される。近交系が利用可能であり、そして数千のゼブラフィッシュが水槽の小部屋で安価に増やされ得る。さらに、真骨魚類卵（ゼブラフィッシュの卵を含む）は、外部で受精される。真骨魚類胚（例えば、ゼブラフィッシュ）水からの酸素および卵黄からの栄養の拡散により生存し得、従って完全な循環システムがなくても早期発生の間は十分耐えられる。Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１１４３〜１１４７（１９９５）。
【００５４】
さらに、１つの真骨魚類胚の全体は、発生の最初の６日間、１００マイクロリットル程度の液量で、インビボで維持され得る。インタクトな生存胚は、個々のマイクロタイターウェルまたはマルチウェルプレートの培養物中で維持され得る。試験化合物は、魚が浸けられている溶液に直接添加され得る。化合物は、インタクトな胚に直接浸透し、これは、このマルチウェル形式を、高処理能力および自動化化合物スクリーニングに特に魅力的にさせる。薬物の治療的活性および副作用（例えば毒性）の両方は、インビボで同時に魚においてアッセイされ得る。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法を用いる真骨魚類は、代表的には、早期段階の真骨魚類の胚である；しかし透明な幼生または成体真骨魚類もまた、用いられ得る。真骨魚類の野生型系統が通常、用いられる。野生型系統は、代表的には、受精能低下後も約１年間維持される。真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）の変異系統は、例えば、治療剤と特異的遺伝子欠損との間の相互作用を評価するために用いられ得る。この真骨魚類は、選択された遺伝子における変異を含み得る。この変異は、例えば、発生欠損に関係する遺伝的変異を含む遺伝的な変異であり得る。この真骨魚類はまた、トランスジェニックであり得る。
【００５６】
（Ｂ．スクリーニングされる薬剤）
種々の供給源由来の多様な薬剤が、本発明の方法を用いることによる新脈管形成活性、細胞死活性および／または毒性活性を増強または阻害することについてスクリーニングされ得る。スクリーニングされる薬剤は、天然に存在するかまたは合成分子であり得る。スクリーニングされる薬剤はまた、天然の供給源（例えば、海洋の微生物、藻類、植物、真菌など）から得られ得る。あるいは、スクリーニングされる薬剤は、薬剤のコンビナトリアルライブラリー（ペプチドもしくは低分子を含む）に、または産業（例えば、化学工業、製薬工業、環境産業、農業、海洋工業、化粧品産業、製薬業および生物工学産業）で合成された化学化合物の現存のレパートリーに由来し得る。薬剤としては例えば、医薬品、治療剤、環境的薬剤、農業的薬剤または工業的薬剤、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、キメラ分子などが挙げられ得る。
【００５７】
コンビナトリアルライブラリーは、１段階ごとの様式で合成され得る多数の型の化合物について作製され得る。このような化合物としては、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ置換型グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大きいコンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ，ＷＯ  ９５／１２６０８，Ａｆｆｙｍａｘ  ＷＯ  ９３／０６１２１，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＷＯ  ９４／０８０５１，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＷＯ  ９５／３５５０３およびＳｃｒｉｐｐｓ，ＷＯ  ９５／３０６４２（このそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されている）に記載のコードされた合成的ライブラリー（ＥＳＬ）法により構築され得る。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ方法により作製され得る。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ，ＷＯ  ９１／１８９８０を参照のこと。スクリーニングされる化合物はまた、政府からまたは私的な供給源から入手され得る。これには、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ（ＮＣＩ）Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＮＣＩ’ｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍなどが挙げられる。
【００５８】
（Ｃ．薬剤の投与）
新脈管形成活性、細胞死活性および／または毒性活性への効果についてスクリーニングされる薬剤は、生きた真骨魚類を含む培地へ直接薬剤を添加することにより真骨魚類に対して投与され得る。あるいは、この薬剤は、最初、培地に溶解され、そして生きた真骨魚類は引き続き培地に浸され得る。このようなアプローチは、麻酔薬および他の化学物質を魚の胚に導入するために用いられている。例えば、Ｍ．Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（第３版、１９９５）（すべての目的のためにその全体が本明細書に援用されている）を参照のこと。薬剤はまた、その薬剤が生きた真骨魚類に直接注射されるマイクロインジェクション技術を用いることにより真骨魚類に投与され得る。例えば、薬剤は、真骨魚類の胚の卵黄もしくは体またはその両方のいずれかに注射され得る。
【００５９】
薬剤はまた、エレクトロポレーション、リポフェクションもしくは経口摂取により、または微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）の細胞ローディング技術（生物学的分子でコートされた微粒子が高圧銃を用いて目的の細胞または組織に「微粒子銃的に（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）」打ち込まれる）により真骨魚類に投与され得る。このような技術は、当業者にとって周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ｃｈｏｗら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）：１６６７〜１６７９（１９９８）を参照のこと。
【００６０】
薬剤は、単独で、種々の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）またはキャリア（例えば、ペプチド、脂質または溶媒キャリアを含む）と組み合わせて、あるいは他の化合物と組み合わせて投与され得る。
【００６１】
薬剤は、特定の活性（例えば、細胞活性、血管形成活性、毒性活性）を示す動物における反応の検出のために用いられる色素の投与前、投与と同時に、または投与後に真骨魚類に投与され得る。
【００６２】
（Ｄ．色素の投与）
活性（例えば、細胞死活性、新脈管形成活性、毒性活性）についての薬剤スクリーニングの方法に用いられる色素は、この薬剤を生きた真骨魚類を含む培地に直接添加することにより真骨魚類に投与され得る。あるいは、色素は、最初、培地に溶解され、そして生きた真骨魚類が引き続き培地に浸され得る。例えば、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，前出、を参照のこと。色素はまた、その色素が生きた真骨魚類に直接注射されるマイクロインジェクション技術を用いることにより真骨魚類に投与され得る。色素は、真骨魚類の胚の卵黄もしくは体またはその両方のいずれかに注射され得る。
【００６３】
色素は、単独で、種々の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）、または他の色素と組み合わせて投与され得る。色素は、特定の活性（例えば、細胞死活性、新脈管形成活性、毒性活性）を示す真骨魚類における反応の検出のために用いられる色素の投与前、投与と同時に、または投与後に真骨魚類に投与され得る。蛍光色素（例えば、キノリウム色素のような非対称性シアニン色素）が活性（例えば、細胞死活性）の検出のために用いられる場合、この色素は、好ましくは、薬剤の投与の前に投与される。
【００６４】
（Ｅ．真骨魚類における薬剤の活性および反応の検出）
種々の技術が一緒にまたは別々に用いられ、シグナルを産生し得、そして薬剤の細胞死活性または真脈管形成活性または毒性活性に対する薬剤の効果を検出および評価し得る。シグナルは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、特定のタンパク質の抗体染色（例えば、ＶＥＧＦならびにＡｎｇ１および２を含む、真骨魚類における脈管形成的脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖｅｓｓｅｌ）と関連したシグナル伝達タンパク質を標識する抗体マーカー；死細胞または瀕死細胞などを検出するための末端のデオキシウリジンヌクレオチド末端標識）によって生成され得る。毒性活性もしくは脈管形成活性、または細胞死活性への効果を示す反応は、例えば、視覚検査、比色定量、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、ケミルミネセンス（化学発光）、デジタル画像分析、標準的マイクロプレートリーダー技術、蛍光定量法（時間分解蛍光定量法を含む）、視覚検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、もしくは現在の装置（例えば、レーザー走査デバイス、蛍光測定器、フォトダイオード、量子計測器、プレートリーダー、エピ蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリ、キャピラリー電気泳動検出器）の使用によってまたはシグナル増幅のための手段（例えば光電子増倍管など）によって検出され得る。反応は、パターン認識のソフトウェアを用いることにより識別および／または分析され得る。試薬は、それが生成する活性または反応に従うスクリーニング方法を用いて同定および選択される。
【００６５】
タンパク質の分布における空間的かつ時的的、両方の変化（タンパク質の完全な欠如を含む）は、検出され得、そしてタンパク質発現プロフィールが作製され得る。インタクトな真骨魚類における酵素または酵素活性のレベルの変化はまた、動物の肝臓、腸および消化管における天然にビオチン化されたカルボキシラーゼ酵素を検出するための種々の手段（例えば、アルカリホスファターゼ染色およびストレプトアビジン（アビジン）結合体化レポーター酵素の使用を含む）により検出される。
【００６６】
（Ｆ．自動化方法）
手動のスクリーニング方法に加えて、本発明はまた、自動手順を用いて、新脈管形成活性、細胞死活性および毒性活性のような活性についての薬剤の迅速なスクリーニングのための方法を提供する。この自動化方法は、市販の自動装置およびソフトウェアならびに公知の自動観察および検出手順を用いることにより容易に実施され得る。マルチウェル形式は、高処理能力スクリーニングおよび自動化合物スクリーニングのために特に魅力的である。スクリーニング方法は、例えば、標準的マイクロプレートウェル形式を用いて、マイクロプレートのそれぞれのウェルにゼブラフィッシュの胚全体を用いて、実行され得る。この形式により、スクリーニングアッセイが標準的マイクロプレート手順およびマイクロプレートリーダーを用いて自動化され、ウェルにおけるゼブラフィッシュの胚において新脈管形成活性の増強または阻害を検出することが可能になる。マイクロプレートリーダーは、マイクロプレート（例えば、９６ウェルプレート）からのシグナルを読み取り得る任意のデバイスを備え、これには、エンドポイントアッセイまたは動的アッセイのいずれかによる蛍光測定法（標準または時間分解）、照度測定法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｏｒｙ）、または測光法を含む。このような技術を用いて、インビボまたはインビトロにおける多数の真骨魚類（例えば、真骨魚類の胚）に対する特定の薬剤の効果が、迅速に確認され得る。さらに、このような配置とともに、広範な種類の薬剤が、ウェルに含まれた真骨魚類の細胞への薬剤のそれぞれの効果について迅速かつ効率的にスクリーニングされ得る。
【００６７】
サンプルの取り扱いおよび検出手順は、色素および薬剤の迅速な再現可能な適用、液体交換ならびに標的化合物の自動化スクリーニングのための市販の装置およびソフトウェアシステムを用いて自動化され得る。化合物投与の処理能力を向上するために、現在利用可能な自動システム（例えば、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６００、ＺｙｍａｒｋのＺｙｍａｔｅ、またはＢｅｃｋｍａｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＢｉｏｍｅｋ）（そのほとんどはマルチウェル培養プレート形式を用いる）が用いられ得る。プロセシングの手順は、所定の時点で実施されるべき多数の液体交換を含む。自動化されていない処理能力は、代表的には、１ウェルあたり１つの胚を有する９６ウェルプレートを用いること、および１つの濃度あたり１０の胚を有する２つの濃度をスクリーニングすることに基づいて、１週あたり、１研究者あたり５マイクロタイタープレート（４００の真骨魚類の胚および２０の化合物）である。現在利用可能な液体操作ハードウェア（例えば、Ｂｏｄｈａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｚｙｍａｒｋ）および本発明者らの標準的サンプル操作手順を用いて、１日あたり５０〜１００プレート（４８００〜９６００の真骨魚類胚および２００〜４００化合物）が処理され得る。市販の液体操作装置の組み込みは、手動スクリーニング手順の時間枠を有意に短縮し、そして多数の薬剤（薬剤のライブラリーを含む）の効率的な分析を可能にする。
【００６８】
（ＩＩ．新脈管形成活性に対する効果についての薬剤のスクリーニングの方法）
（Ａ．新脈管形成）
脈管供給の形成および樹立は、栄養物の細胞内流入、老廃物質の流出ならびにほとんどの組織および器官におけるガス交換に本質的に必要である。このような血管発生および分化のために２つのプロセスが、同定されている。「血管新生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と名付けられる血管新生の１つのプロセスは、胚で生じ、そして間葉細胞の血管芽細胞へのインサイチュの分化からなる。血管芽細胞は、内皮細胞および血液細胞の両方の前駆体である。「新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と名付けられた第２のプロセスは、既に存在している内皮細胞に由来する新しい血液およびリンパ管の形成を含む。このプロセスにおいて、組織および器官は、より小さい血管がより大きい血管から伸長し、そして特定の組織に侵入する出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）により血管新生化される。Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。新脈管形成はまた、内皮細胞の移動および増殖、内皮細胞の管様構造への分化、ならびに血管周囲の基底膜マトリックスの産生を含む。Ｈｅｒｂｅｒｔら、Ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１３６５〜１３７３（１９８８）。
【００６９】
新脈管形成活性の阻害または増強についての薬剤スクリーニングのための方法は、脈管形成のプロセスを含む種々の疾患の治療的処置または予防的処置において有効である薬剤の同定において有用である。
【００７０】
（Ｂ．血管の形成）
新しい血管は、一連の連続工程における正常な組織増殖および修復の間に形成する：存在する小血管（毛細血管）の壁を形成する内皮細胞は、活性型になり、細胞外マトリックス（その周辺）組織を分解する酵素を分泌し、マトリックスに侵入し、そして分裂を開始する。結局のところ、新しい内皮細胞のストリングは、中空の管に組織化し、組織を作製しそして修復し得る血管の新しいネットワークを生み出す。通常は、内皮細胞は、休眠中である。しかし、必要時には、血管成長の短時間爆発（ｂｕｒｓｔ）が組織の局所化された部分に生じる。新しい毛細血管成長は、内皮細胞成長を活性化または阻害する因子の間できちんと調整された平衡により厳重に制御される。約１５のタンパク質が、内皮細胞の成長および運動を活性化することが公知である。これには、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、上皮増殖因子、エストロゲン、繊維芽細胞増殖因子、プロスタグランジン、腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および顆粒球刺激因子を含む（Ｚｅｔｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４９：４０７〜４２４（１９９８））。ＶＥＧＦは、内皮細胞上でチロシンキナーゼレセプターｆｌｔ−１およびｆｌｋ−１／ＫＤＲに結合する（Ｈａｎａｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：４８〜５０（１９９７））。ＶＥＧＦの下流の効果としては、マトリックスプロテアーゼおよびグルカロノイダーゼ（ｇｌｕｃａｒｏｎｉｄａｓｅ）の活性化、内皮細胞接合の弛緩、ならびに内皮細胞の増殖および移動が挙げられる。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の下流の効果としては、内皮細胞のマイトジェンの刺激が挙げられる（Ｒｅｌｏｕら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ  ５：５２５〜５３０（１９８８））。いくつかの新脈管形成の公知のインヒビターとしては、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ１および２の組織インヒビター（Ｚｅｔｔｅｒ、前出）が挙げられる。
【００７１】
（Ｃ．脈管形成阻害）
新脈管形成は、固形腫瘍の増殖に必須であるので、新脈管形成の阻害は、腫瘍増殖を防ぐための１つのストラテジーである。新しい血管の発生をブロックすることにより、酸素および栄養物の腫瘍供給は、断たれ得、それにより腫瘍の持続的な増殖および転移は、阻止され得る。いくつかのストラテジーは、以下を含む、抗新脈管形成剤を設計することであり得る：１）血管形成を刺激する因子のブロック；２）新脈管形成の天然のインヒビターの使用；３）周囲の組織へ侵入する血管の新しい形成を可能にするブロック分子；および４）内皮細胞の新しい分裂の無能力化。一般に、より高密度の血管を有する腫瘍は、より転移するようであり、そして不幸な臨床的結果に関連する。また、原発性腫瘍からの細胞の剥落は、腫瘍が血管の完全なネットワークを有した後にのみ始まる。さらに、新脈管形成および転移の両方は、マトリックスメタロプロテイナーゼを必要とし、この酵素は、血管および腫瘍浸潤中に周辺組織および細胞外マトリックスを破壊する酵素である。腫瘍侵入を必要とする。標準的化学療法と抗新脈管形成治療との間のいくつかの差異は、脈管形成インヒビターが腫瘍細胞よりも分裂中の内皮細胞を標的するという事実から生じる。抗新脈管形成薬は、標準的な化学療法処置の特徴である骨髄抑制、胃腸の症状または毛髪の損失を生じないようである。また、抗新脈管形成薬は、腫瘍を必ずしも殺傷する必要はないがむしろ腫瘍を停止状態に不定的に抑えるので、初期臨床試験の指標は、標準的な治療のためとは異なり得る。腫瘍応答についてのみ探すよりも、生存の増加およびまたは疾患進行の時間を評価することが適切であり得る。
【００７２】
薬物耐性は、化学療法の薬剤での主要な問題である。なぜなら、ほとんどの癌細胞は、遺伝子的に安定でなく、従って変異しがちであるからである。脈管形成薬物は、遺伝子的に不安定ではない正常な内皮細胞を標的するので、薬物耐性は、発生し得ない。これまで、耐性は、可能性のある治療剤候補の長期の動物研究または臨床試験において主要な問題ではなかった。抗脈管形成治療は、腫瘍細胞で直接目的とされる治療と組み合わせて有用性を証明し得る。それぞれの治療は異なる細胞標的において目的とされるので、このような組み合わせ療法は、より有効であるはずである。癌が慢性疾患になり得るという認識が大きくなっている。処置が長期である場合、薬物の毒性プロフィール（透明な真骨魚類（例えばゼブラフィッシュ）の胚において容易に試験され得る）は、薬物のスクリーニングおよび発展のためにますます重要なパラメーターとなる。
【００７３】
（Ｄ．新脈管形成刺激）
心臓または四肢における虚血組織はＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ（側副血管の局所成長を刺激する）を分泌するが、虚血組織へ供給される側副血管の天然の形成は、心血管疾患の患者における血流の完全な復旧のためにはほとんど十分ではない。外因性の脈管形成薬剤により誘導される新しい血管の成長は、種々の心血管疾患を有する患者における虚血組織への血流を回復し得る。刺激的な脈管形成治療はまた、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、鬱血性心不全、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）および末梢静脈疾患（ＰＡＤ）における循環機能の改善のための最小限の侵襲性アプローチを提供する。刺激的な脈管形成治療はまた、移植の受け入れまたは生存を容易にし得る。脈管形成刺激因子の不利な点としては、潜伏腫瘍の増殖の増悪、および糖尿病性網膜症の進行が挙げられる。アテローム性動脈硬化症のプラークの周囲の側副動脈の成長を誘導するための理想的な脈管形成薬剤は、虚血組織の局所でのみ機能すべきであるか、または局所的に送達されるべきである。
【００７４】
新脈管形成遺伝子治療は、新しい血管を成長させることにより心臓をそれ自身のバイパス手術を行うよう策略するために用いられる実験的技術である。ＶＥＧＦのようなタンパク質（存在する血管から出芽するように新しい血管を助成する）をコードする遺伝子は、患者の心臓に注射され、そして身体は自身の冠状動脈バイパスを行う。これらの新しい血管は、再度閉塞される傾向はより少ない。ウサギでの予備的な実験において、ウサギの脚の動脈を、結塞し、そしてＶＥＧＦ遺伝子を、カテーテルおよび小さいバルーンを用いて動脈を並べる平滑筋細胞上に直接適用した。３〜１０日のうちに、新しい血管が出芽し、そして妨害物周囲にそれら血管の道を見出ことが観察された。Ｒｉｖａｒｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９（１）：１１１〜１２０（１９９９）。ヒトでの予備的実験において、遺伝子を、左室（心臓のポンプ室）内に直接注射した。これらの研究から今までの結果は有望である。副作用は存在せず、そして今日まで最悪の結果は生じていない。新しい血管の出芽は、それが生じる場合、４〜６週間後に停止するようである。Ｌｏｓｏｒｄｏら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８（２５）：２８００〜２８０４（１９９８）。
【００７５】
（Ｅ．ゼブラフィッシュにおける新脈管形成）
ゼブラフィッシュにおいて、他の脊椎動物と同様に、血管は、胚の中胚葉を通じて広範に分布している前駆細胞（血管芽細胞）から形成する。いくつかの血管芽細胞は、長い距離を移動し、一方、他のものは、局所的に残存し、血管を形成する（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。主要血管（大動脈、大静脈、およびいくつかの器官に指向される血管を含む）は、血管芽細胞の管への局所集合により形成すると考えられる（脈管形成：ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ）。図１を参照のこと。脈管形成に加えて、より小さい脈管は、特定の組織を貫入するように、より大きな脈管から伸長する（新脈管形成：ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。実験は、血管形成の両経路（新脈管形成および脈管形成）が、局所シグナルにより駆動されることを示唆する。発生３日目までに、ゼブラフィッシュは、主要血管および新芽を含む、インタクトな機能化血管系を発達した。このことは、血管位置の一貫したパターンを有する。図２Ａおよび３Ａを参照のこと。ゼブラフィッシュ胚は、循環系を有することなく少なくとも４〜５日間生存および発達し得るので、透明なゼブラフィッシュを用いて、インタクトな生存動物において血管形成の全ての局面に対する種々の薬剤の効果を研究することが可能である。
【００７６】
（Ｆ．新脈管形成についてのスクリーニングアッセイにおいてゼブラフィッシュを用いる利点）
最近、種々のアッセイは、種々の動物モデルにおける新脈管形成の過程を研究するために使用される。これらのアッセイは、ウサギまたはマウスの皮膚において透明な窓を調製する工程、腫瘍細胞もしくはキャリアマトリックスを無血管領域（例えば、角膜）に注入する工程、および既存の血管を構築することにより虚血を誘導する工程を包含する（Ｊａｉｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１２０３−１２０８（１９９７））。これらおよび他のアプローチは、新脈管形成の過程について大量の情報を生成する一方、各アッセイについて要求される組織操作は、スクリーニングツールとして使用するために不適切とする。（比較アッセイを、さらに以下に詳述する。）真骨魚類およびゼブラフィッシュは、特に、新脈管形成についてのインビボでのスクリーニングアッセイに関する有意な利点を提供する。上述のように、ゼブラフィッシュは、生成および維持するために比較的高価でなく、かつ胚は、個々のマイクロタイターウェル中に配置され得、これは、標準的な液体取り扱い装置を用いる自動化分析を可能にする。
【００７７】
さらに、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）を用いて、薬剤の副作用は、薬剤の主要な効果と共に同時にモニタリングおよび評価され得る。これは、新脈管形成活性について化合物をスクリーニングするための方法において有意な利点を提供する。顕著には、抗新脈管形成剤（例えば、抗癌治療薬）として使用され得る化合物の同定と関連するのが困難なのは、癌細胞の増殖を阻害するために使用される化合物の多くがまた、非癌細胞における増殖において有害な効果を有することである。これは、小児に罹患する癌を処置するときに特に問題である。なぜなら、それらの器官および組織の多くが、未だ成長中および発達中であるからである。透明な真骨魚類の胚を用いて、新脈管形成活性に対する薬剤の効果ならびに任意の毒性効果もしくは副効果が同時にアッセイされ得る。ゼブラフィッシュ細胞および／または胚形成に対する薬剤の副効果または毒性効果は、薬剤の投与後に、時間間隔でモニタリングされ得る。代表的には、測定は、投与された薬剤の活性を評価するための測定と同時に実施される。
【００７８】
（Ｇ．新脈管形成スクリーニング方法）
本発明は、一用量の薬剤の真骨魚類への投与に応じて、真骨魚類において薬剤が新脈管形成活性を増強するか、阻害するか、またはブロックする能力（ａｂｉｌｉｔｙ）もしくは潜在能（ｃａｐａｃｉｔｙ）について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。新脈管形成活性は、薬剤が投与されなかった同時期のおよび／または歴史的なコントロール真骨魚類（またはそれらの組織、器官、もしくは細胞）に比較して評価される。新脈管形成活性は、真骨魚類の血管系の変化で反映される。血管の形成および発達は、薬剤が投与された真骨魚類およびコントロールの真骨魚類において経時的にモニタリングされ得る。正常血管形成の増大を示す応答は、化合物が新脈管形成を増強または増大することを示唆する。正常血管形成の減少もしくは低下または以前に確立された既存の血管の死もしくは損失を示す応答は、化合物が、新脈管形成活性を減少させるか、妨害するか、または阻害する（すなわち、抗新脈管形成活性を増強または刺激する）か、あるいは既存の血管を破壊することを示唆する。新脈管形成活性を示す応答は、真骨魚類全体または真骨魚類の１つ以上の器官もしくは組織で、同時にまたは別個に検出され得る。応答は、経時的におよび所定の時間間隔で検出され得る。これらの応答はまた、真骨魚類の細胞においてインビトロで検出され得る。
【００７９】
本発明の方法は、新脈管形成過程を包含する種々の疾患（癌、冠動脈疾患、鬱血性心不全、末梢動脈疾患、末梢静脈疾患、神経疾患、心肺疾患、虚血、発達疾患、自己免疫疾患、ならびに骨および軟骨の疾患を包含する）の治療的処置または予防的処置で有効である薬剤を同定することにおいて有用である。一般に、これらの方法は、新脈管形成活性の増大（例えば、血管の形成の増大）または新脈管形成活性の減少（すなわち、抗新脈管形成活性、血管の形成の減少）から恩恵を受ける疾患に対する治療的活性について、化合物をスクリーニングすることにおいて有用である。
【００８０】
１つの局面では、本方法は、脈管形成または新脈管形成の始まる前に化合物が溶解された培養培地に胚を浸すことにより、真骨魚類の胚に、スクリーニングされるべき化合物を投与する工程を包含する。適切な期間（例えば、２４時間もしくは４８時間）後に、胚は、固定化され、そして内因性血管マーカー（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ））について染色される。血管の形成の減少または増大、および血管の正常パターンの摂動は、例えば、アルカリホスファターゼ染色、タンパク質の抗体染色、インサイチュハイブリダイゼーション後に光学顕微鏡によって視覚的に決定され得る。器官または組織機能はまた、酵素活性を測定することにより決定され得る。
【００８１】
小分子を含む化合物は、代表的には、単なる拡散によって真骨魚類胚を貫入する。胎児表皮（外部外胚葉）を貫入しない化合物について、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または他の溶媒もしくは浸透圧ショックが、胎児表皮を一過的に貫入するために使用され得る。化合物はまた、他の周知の投与方法（摂取または胚嚢もしくは真骨魚類胚の心臓のいずれかへの直接的注射を含む）によっても投与され得る。いったん胚の中に入ると、化合物は、胚内を自由に拡散する。
【００８２】
例えば、新脈管形成活性に対する化合物の効果についてスクリーニングするために、腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）または体節間（ｉｎｔｅｒｓｏｍｉｔｉｃ）の管が代表的には試験される。脈間形成活性に対する化合物の効果をスクリーニングするために、背側の動脈および腹側の血管が試験される。これらの血管全ては影響されなかった真骨魚類胚においてとても優勢であり、従って、血管パターンの変化の理想的な指標として役立つ。特に、これらの血管は、以下について試験される：１）血管の存在もしくは不在（新脈管形成の阻害を示す）；２）過剰な分枝（新脈管形成の増強を示す）；および３）血管の形成の構造の変化（局所的なシグナル伝達事象の変化を示す）。本発明者らの方法において、ゼブラフィッシュ胚が、使用される。なぜなら、それは、循環系を有さずに、約４〜５日間生存および発達し得、したがって、インタクトな胚における血管形成の全ての局面に対する薬剤の効果は、容易に評価され得るからである。
【００８３】
血管パターンの変化は、血管芽細胞および血管成長因子を試験するためにＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション分析、ならびに循環機能および心臓機能（その全ては、血管形成において役割を有する）を試験するために細血管造影を実施することにより研究され得る。一例として、スクリーニングされる化合物は、培養中の胚を含有する培養培地中に化合物を溶解する（脈管形成または新脈管形成の開始の前に）ことにより、２４時間真骨魚類胚に投与される。さらなる２４時間後（発生４８時間で）、胚は、形態学的欠陥について事実上検査される。胚の５０％は、血管芽細胞を同定するために、ｆｌｋ−１プローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションのために固定化される。残りの胚は、発生７２時間で固定化され、ＡＰで染色される。内因性ＡＰの発現に影響し、それによってＡＰ染色を用いることによる血管パターンをアッセイすることを困難にする化合物が、細血管造影を用いることによりアッセイされ得る。次いで、胚は、血管の正常パターンにおいて任意の摂動について試験される。
【００８４】
新脈管形成活性はまた、以前に示した標準的な技術（例えば、比色定量、蛍光顕微鏡（例えば、時間解像フルオロメトリーを含む）、化学発光、デジタル化画像分析、標準マイクロプレート読み取り技術、応答識別についてのパターン認識ソフトウェアおよび分析などを含む）によって検出され得る。特定のエピトープの抗体染色はまた、真骨魚類組織におけるエピトープの分布および発現における空間または時間的変化ならびに分子改変を検出するために使用され得る。
【００８５】
（Ｈ．新脈管形成活性および／または毒性活性および／または細胞死活性についての薬剤の同時スクリーニング）
新脈管形成活性または抗新脈管形成活性についての薬剤をスクリーニングするための方法は、以下に記載の本発明の他の方法（細胞死活性（セクションＩＩＩ）または毒性活性（セクションＩＶ）に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を含む）と組み合わせられ得る。これらの方法と共に使用される真骨魚類は、透明であるので、他の活性と合わせて、新脈管形成活性または抗新脈管形成活性を評価することが可能である。種々の活性を示す応答もまた、互いと合わせて検出され得る（別々にまたは同時にのいずれかで）。
【００８６】
このような組み合わせ方法は、真骨魚類における薬剤の複数の影響を評価することにおいて有用である。薬剤は、所望の応答（例えば、新脈管形成の増強）および毒性（所望されない）応答の両方を引き起こし得る。薬剤の投与に起因して、真骨魚類において複数の活性および応答を評価する能力は、可能な治療的化合物を同定すること、およびそれらの副作用を評価することにおいて特に恩恵を受ける。例えば、標的化癌細胞に対する抗癌治療薬として使用され得る化合物を同定することの関連することが困難であることは、つまり、いくつかの化合物もまた、非癌細胞に対する有害な効果を有し得るということである。例えば、抗新脈管形成癌療法は、代表的には、このような細胞の血液供給を遮断することにより、癌細胞においてアポトーシスを誘導しようとする。このタイプの処置レジメは、腫瘍の血管新生を予防するかまたは減少させる手段として血管芽細胞においてアポトーシスを誘導するように設計され得る。処置の間、平衡は、無視し得る程度のレベルの細胞死が体内の他の組織または位置で（例えば、心臓）誘導されるように達成されなければならない。このような望ましくない異所性細胞死は毒性活性であるとみなされ得る。薬剤の新脈管形成、細胞死、および毒性活性を評価するための組み合わせスクリーニングが、他の場所でアポトーシスを誘導する薬剤から心臓を防御する薬剤を同定することにおいて有用である。他を促進することなく１つの活性を促進するのに有効な薬剤の用量レベルもまた確かめられ得る。このような組み合わせスクリーンもまた、代表的には、損傷組織または移植組織において細胞死を予防する治療目標を有する前新脈管形成療法について薬剤を同定し、そして評価することにおいて有用である。
【００８７】
複数の活性／応答は、真骨魚類全体において、または真骨魚類の１つ以上の組織もしくは器官においてモニタリングされ得る。このような活性および応答は、経時的に、および所定の時間間隔でモニタリングされ得る。種々の技術は、一緒にまたは別個に用いられて、複数の活性および応答を分析し得る。このような技術としては、例えば、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、デジタル化画像解析、標準マイクロプレート読み取り技術（比色定量、蛍光光度法（例えば、時間解像蛍光光度法を含む）、および化学発光）、インサイチュハイブリダイゼーション、特異的タンパク質の抗体染色、動物内で時間的および空間的に分布されたタンパク質の変化、真骨魚類全体において、または真骨魚類の組織、器官もしくは細胞における酵素活性のレベルの変化などが挙げられる。さらに、応答は、パターン認識ソフトウェアを用いることにより識別され、かつ／または分析され得る。
【００８８】
１つの局面では、本発明は、上記のように新脈管形成活性の増大または減少について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法には、毒性活性の増大または減少を示す、真骨魚類における応答を検出することにより毒性の増大または減少について薬剤をスクリーニングする工程をさらに包含する。このような方法は、例えば、化合物の治療価に対する反対指標を同定することにおいて、有用である。
【００８９】
別の局面では、本発明は、上記のように、新脈管形成活性の増大または減少について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、細胞死活性の増強または阻害を示す、真骨魚類における応答を検出することにより細胞死活性を増強または阻害する能力について薬剤をスクリーニングする工程をさらに包含する。このような方法は、例えば、化合物の治療価に対する反対指標を同定することにおいて、有用である。このような組み合わせのスクリーニングはまた、他にアポトーシスを誘導する循環剤から心臓を防御する薬剤の同定を可能にする。
【００９０】
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュにおける新脈管形成活性についての化合物のスクリーニング）
（Ａ．材料および方法）
１）胚収集
ゼブラフィッシュ胚を、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出（これは、全ての目的のために、その全体を本明細書中に参考として援用される）に記載のように、天然対交配によって生成した。４〜５のゼブラフィッシュ対を、各交配のために設定した；１つの対あたり平均して１００〜１５０の胚が生成された。胚を収集し、生存度について分別される前に、基準として形態学的および発生的の両方の期を用いて、５ｇのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  Ｓａｌｔと、３ｇの硫酸カルシウムとを２５リットルの蒸留水中で２７℃でおよそ２０時間（２１体節期）組み合わせることによって調製した卵培養培地に置く。次いで、健常胚を、室温で５分間、１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏ．）を用いる酵素消化によって脱絨毛膜処理した。次いで、この胚を胚水（ｅｍｂｒｙｏ  ｗａｔｅｒ）中で５回洗浄した。魚胚は、付随の卵黄嚢から栄養を受容するので、さらなる維持は必要ではなかった。
【００９１】
２）スクリーニングされた化合物
以下の２つの供給源由来の化合物を、新脈管形成活性を増強するかまたは阻害する能力または潜在能についてスクリーニングした：ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭａｒｙｌａｎｄおよびＴｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＩＴ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ。
【００９２】
ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙは、１００，０００より多くの独特の化合物構造からなる；現在、１２，０００のみがスクリーニングのために利用可能である。
【００９３】
ＭＩＴから得られる化合物は、１１のフマギリン誘導体からなった。これは、ＴＮＰ４７０（Ｔｕｒｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１６３−１１６９（１９９８））およびＡＧＭ−１４７０を含む。フマギリンは、強力な抗新脈管形成効果および毒性効果を伴う真菌から単離された天然産物である。ＡＧＭ−１４７０および他のフマギリン誘導体は、新脈管形成インヒビターである。これは、正常であるが形質転換されていない内皮細胞の細胞周期のＧ１期への進入を、２型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ２）を結合させることにより防ぐ。この誘導体を、２０ｍＭの開始濃度で供給した。サンプルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で１０ｍＭのストック濃度に希釈した。
【００９４】
ＮＣＩからの化合物を、ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙから無作為に選択した。化合物は、９６マイクロプレートアレイ中にＮＣＩから供給された。この各々には、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの開始濃度であった。化合物供給源、活性、化学構造、または作用機構に関する具体的な情報は得られなかった。
【００９５】
３）化合物の投与
魚における血管形成に対する化合物の効果を決定するために、化合物を魚胚を含む培養培地溶液に直接的に（例えば、魚胚を含む個々のマイクロウェルに）添加した。化合物を、魚胚の発生１２時間または２４時間の時に培地溶液に添加した。これは、新脈管形成血管がｆｌｋ−１インサイチュハイブリダイゼーションプローブを用いてまず同定され得る時点以前である。Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。６ウェル、２４ウェル、または９６ウェルのプレート中でアッセイを実施した。このようなプレートは、化学的適用および続く分析（用量応答を含む）および続く分析の自動化を容易にした。
【００９６】
４）可視スクリーニング
魚胚に化合物を投与した後、この胚を個々のマイクロウェル中に２８℃で発生３日目まで維持した。化合物を魚胚が培養された培地に添加した２４時間および４８時間後に、胚を、生存度、巨視的な形態学的欠陥、心拍数、および循環について可視検査した（表１を参照のこと）。循環を、各胚を通じて血管細胞の動きに従うことによりアッセイした。
【００９７】
５）血管染色
発生３日目に、胚をアルカリホスファターゼ染色について収集した。詳細には、胚を４％パラホルムアルデヒド中に固定化し、そして内因性アルカリホスファターゼ活性について染色した。胚を、２時間、室温で固定化した。次いで、胚を、２回、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＴ）を有するリン酸緩衝化生理食塩水中２５％、５０％、７５％、および１００％メタノール中に浸漬して脱水し、胚を透過処理した。次いで、この胚を、再水和し、１００％ＰＢＴ中で洗浄した。染色のために、胚を、ＮＴＭＴ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５；５０ｍＭ  ＭｇＣｌ；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温で平衡化した。胚が平衡に達した後、１ｍｌ当たり、４．５μｌの７５ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および３．５μｌの５０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加することにより胚を染色した。１０分間染色した後、魚胚中の全ての血管を標識化した（例えば、図２Ａ−２Ｃ、３Ａ〜３Ｂ、４、７を参照のこと）。染色反応を、ＰＢＳＴを添加することにより停止した。次いで、胚を立体解剖顕微鏡で試験した。このタイプのアッセイについてゼブラフィッシュを使用する１つの利点は、胚嚢の上に位置する腸管下血管は、血管形成に影響する因子に対して感受性であり、かつこの方法により容易にアッセイされる（例えば、図７を参照のこと）ことである。腸管下血管は、発生４８時間までゼブラフィッシュ胚の胚嚢の背外側表面に通常存在する。それらは、胚嚢上の体節の腹側縁から５０〜１００μｍ伸長する明確なバスケット形状を形成する。発生７２時間（腸管下血管が正常に出現した２４時間後）の腸管下血管をアッセイすることにより、血管形成の時期における通常の変化は避けられた。染色手順は、市販の装置を用いて容易に自動化される。
【００９８】
６）真骨魚類の漂白
所望であれば、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ胚）は、アルカリホスファターゼ染色の前または後に漂白され得る。漂白は、真骨魚類からメラニン色素を除去し、１−フェニル−２−チオ尿素（ＰＴＵ）処理の有害な効果を生じさせることなく真骨魚類のスクリーニングを可能にする。染色後漂白はまた、バックグラウンド染色と関連した細胞外染色を除去する。漂白は、いくつかの細胞の色素除去によって、処置された真骨魚類の化合物に対する応答の可視化および分析を有効に増強する。漂白は、毒性、新脈管形成、および細胞死活性を示す応答の可視検出を増強する。
【００９９】
ゼブラフィッシュを漂白するために、室温で１０分間、５％ホルムアミド、１×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、および１０％過酸化水素中に魚を浸漬した。
【０１００】
７）インサイチュハイブリダイゼーション
可視スクリーニングの実施に加えて、真骨魚類組織における特定の分子変化は、ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションまたは特定のタンパク質の抗体染色により検出され得る。ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションは、ゼブラフィッシュにおける慣用的な分子アプローチである（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出）。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからのジゴキシゲニン標識化キットは、ＲＮＡプローブを標識化するために使用され得る。ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションは、以下のように実施され得る：胚をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化し、プロテイナーゼＫでわずかに消化し、そしてインサイチュハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、５００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、９２μｌの１Ｍクエン酸、ｐＨ６．０、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中１μｇのプローブと６５℃でハイブリダイズさせた。アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いてシグナルを検出する。内因性アルカリホスファターゼからのバックグラウンド染色は、問題を提起しない。なぜなら、内因性アルカリホスファターゼは、インサイチュハイブリダイゼーション手順で残存しないからである。ＮＢＴ／Ｘ−ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で染色した後、胚を１００％メタノール中で漂白し、４％パラホルムアルデヒド中で固定化し、そしてＰＢＳ中に保存した。マルチプルインサイチュハイブリダイゼーションは、マルチウェルディッシュ中で異なる真骨魚類において同時に実施され得る。
【０１０１】
８）新脈管形成についてのさらなるアッセイ
血管パターンの任意の変化が血管芽細胞の阻害または刺激に起因するか否かを決定するために、公知の血管芽細胞マーカーｆｌｋ−１、ｔｉｅ、ｔｅｋ、およびｆｌｉにおけるＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション分析（Ｄｕｍｏｎｔら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０３：８０−９２（１９９５）；Ｌｉａｏら、Ｄｅｖ．（補遺）１２４：３８１−３８９（１９９６）；Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）は、上記で概要を述べた手順を使用して実施され得る。Ｆｌｋ−１（図８）、ｔｉｅ、およびｔｅｋは、レセプターチロシンキナーゼであり、これは、発生初期で血管芽細胞を標識する。ｆｌｉは、それらを後期段階で標識する転写因子である。ｆｌｋ−１、ｔｉｅ、ｔｅｋ、およびｆｌｉは、脊椎動物における血管芽細胞発生の間に連続して出現する（Ｄｕｍｏｎｔら、前出）ので、これらの分子の存在または不在についてアッセイすることは、血管芽細胞が影響しているかどうかだけでなく、それらが影響された発生期もまた決定することを可能にする。
【０１０２】
インタクトな真骨魚類内で空間的および時間的両方のタンパク質の分布の変化（タンパク質の完全な不在を含む）が検出され得る。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のパターンの変化は、標準的な抗体染色手順（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出）または上記のインサイチュハイブリダイゼーション技術（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出もまた参照のこと）を使用して試験され得る。ＶＥＧＦは、血管発達において２つの法則を有すると考えられる：１）化学誘引性または誘導の法則；および２）維持の法則（Ｄｕｍｏｎｔら、前出）。従って、ＶＥＧＦ発現に影響する化学物質は、特に興味深い。上記は、周知の分子マーカーの例である；他の分子マーカーもまた利用され得る。
【０１０３】
９）機能アッセイ
血管構築の変化に加えて、血管機能（循環および心拍数）は、化合物によって影響され得る。ゼブラフィッシュに投与された化合物が血管機能（例えば、心拍数および循環）に影響するか否かを決定するために、ゼブラフィッシュ胚の心拍数および循環を研究する。この場合、心拍は、心拍数／分を計数することにより評価した。循環を、心臓および主要血管を通じた血液細胞の動きについて解剖顕微鏡下でゼブラフィッシュ胚を試験することにより評価した。ゼブラフィッシュ胚をまた、胚嚢（心臓を通る血流の乏しい指標）および胚の体内（漏洩血管の指標）における血液プール化について試験した。化合物が血液細胞発生に影響することが観察されたいくつかの胚において、微小血管造影を、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１１４３−１１４７（１９９５）に概要を述べた手順を使用して実施し、血管漏洩および閉塞（これらは、血管の形成および維持の変化を引き起こし得る）について血管系の完全性を試験した。胚をトリカインで麻酔して心臓を停止させ、マイクロピペットを心臓に挿入し、そして蛍光ビーズを注入した。次いで、トリカインを洗い流し、心臓の鼓動を再開させた。次いで、蛍光ビーズの流れを、表面蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡を用いて観察し、そしてコンピューターに取り付けた微光レベルカメラを用いて記録した（図９）。このアプローチは、血管系の完全性の試験および心臓の状態に対する化学物質の効果の評価を可能にする。
【０１０４】
（Ｂ．結果）
（（１）標的組織および器官への化合物の送達のためのパラメーターの決定）
（（ａ）胚発生期）
本発明者らの最初の研究おいて、本発明者らは、アッセイのためにゼブラフィッシュの１２時間の胚（６体節期）を使用し、そして発生の１２時間目でアッセイを始めた。この時点は、血管芽細胞形成の開始の直前であるため（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）好都合であるが、いくつかの不都合が存在する。これらの最も有意な点は、１２時間の発生で、ゼブラフィッシュ胚の多くの構造（脊索、体節、および心臓を含む）が、形成を開始する点である。これらの構造は、脈管形成および新脈管形成の両方に直接影響するので、血管形成において観察された化合物の効果が一次（血管に対する直接効果）または二次（他の組織に対する損傷に起因する関節効果）であるか否かを決定することは困難である。
【０１０５】
この問題を回避するために、本発明者らは、２２時間の発生（２６体節期）でアッセイを開始した。この発生の期にて、背面大動脈および腹側静脈は前方に存在するが、ゼブラフィッシュ胚の後方領域には存在しない。このことは、同じ胚において独立して、脈管形成および新脈管形成の両方の実験を可能にする。脈管形成について、本発明者らは、尾のほとんどの後方領域における背面大動脈および腹側静脈の存在について、胚を実験した。新脈管形成について、本発明者らは、新芽血管（腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）および体節内血管を含む）の存在について、胚を実験した。腸管下血管は、３６時間の発生で形成を開始する；それゆえ、２２時間の時点の使用は、化合物投与と脈管形成性の血管形成との間の時間を減少する。このことは、培養条件下で不安定な化合物についての重要な考察である。
【０１０６】
（（ｂ）胚の維持）
最初の実験を、６ウェル培養ディッシュ中の３５ｍｍウェルで、１ウェルあたり５０のゼブラフィッシュ胚を用いて、５ｍｌの胚水中で行った。このアプローチを行う間、多数の欠点が存在した。この欠点としては以下が挙げられる：１）比較的多量の化合物を使用して胚に投薬しなければならない；２）同時にスクリーニングし得る化合物の数は制限される；および３）ディッシュ中には複数の胚が存在するので、死胚が生胚を汚染し得る。
【０１０７】
これらの欠点を回避するために、本発明者らは、２つの別の形式（９６ウェルプレートおよび２４ウェルプレート）を実験した。予備観察は、単一のゼブラフィッシュ胚は、５日までに、５０〜１００μｌの胚水中で生存し得、そして正常に発生し得ることを示した。それゆえ、本発明者らは、２２時間の胚を回収し、脱絨毛膜化（ｄｅｃｈｏｒｉｎａｔｅ）し、そして以下のいずれかに選別した：１）１００μｌにつき１ウェルあたり１つの胚を含む９６ウェルプレート；または２）５００μｌ胚水中につき５つの胚を含む２４ウェルプレート。この胚を、実験の前に７２時間発生させた。この胚を、大きさ、形態、および運動によって評価した。マイクロウェルプレートで増加する胚と、大きな容器で増加するコントロール胚との間に自明な差異は観察されなかった。この胚を固定し、そして内在のアルカリホスファターゼについて染色して、血管形成を実験した。実験胚における染色パターンは、コントロールで観察されたパターンと同一であった。手動スクリーニングのために、本発明者らは、２４ウェル型を選択し、そして以下に記載する全ての実験のためにそれを使用した。
【０１０８】
（（ｃ）化合物送達）
化合物をスクリーニングするためのパラメーターを最適化するために、本発明者らは、ＭＩＴから得た１１のフマギリン誘導体およびＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎライブラリーから得た１０のランダムな化合物を使用して一連の実験を行った。本発明者らは、本発明者らの予備調査から、フマギリンがゼブラフィッシュにおける脈管形成を阻害することを知っていた；従って、本発明者らは、これらの化合物を、アッセイを検証するためのポジティブコントロールとして使用することを決定した。本発明者らはまた、ＮＣＩからの１０の化合物を使用して、確立したパラメーターが他の型の化合物に適切であることを検証した。一般的には、本発明者らは、低分子が、胚の中へ、および発生の最初の２〜３日の胚を囲む絨毛膜を介して、自由に拡散することを予測した。しかし、潜在的な問題を回避するために、本発明者らは、酵素消化によって絨毛膜を取り除いた。このアプローチは十分確立されており、そして適切に行われる場合、この手順は、胚に有害な影響を与えなかった。
【０１０９】
【表１】
0004383533.tif 000002
（（ｄ）化合物濃度）
化合物の効果についての一次スクリーニングの場合、本発明者らは、３つの異なる濃度で各化合物を試験して、どの濃度がほとんどの情報を提供するかを決定した。試験した濃度は、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭであった。結果を表１に要約する。これらの実験のために、本発明者らは、５０μＭの１０ｍＭストック溶液を５ｍｌの胚水に添加して、１％ＤＭＳＯ中１００μＭ溶液を生成した。後の濃度を、胚水中１：１０および１：１００希釈で生成した；各濃度について、ＤＭＳＯを合計溶液の１％まで添加した。コントロール溶液は、胚水中１％ＤＭＳＯからなる。１０胚／化合物／濃度を試験した。試験した２１の化合物のうちの１５（１１／１１  ＭＩＴ、４／１０  ＮＣＩ）は、１００μＭ濃度で致死であった。１０μＭ濃度では、フマギリン誘導体の７／１１は、新脈管形成阻害効果を有した。しかし、１０μＭで致死であるフマギリン誘導体は存在しなかったが、その全てが胚の増殖において有害な効果を有した（図２Ａ）。このことは、フマギリン誘導体の標的がメチオニンアミノペプターゼ（２型）（これは、真核生物細胞において細胞周期制御に、ある役割を果たす）であることを示す、以前に公開された結果（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．６：３９０−３９６（１９９６）；Ｋｒｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１０：９８６−９９３（１９９８））と一致する。
【０１１０】
フマギリン誘導体とは対照的に、１０μＭで、ＮＣＩ化合物は、血管形成において観察可能な効果を有さなかった。しかし、１０のＮＣＩ化合物のうちの１つは、この濃度で致死であり、そして１０の化合物のうち２つは、胚において色の変化を生じた。色の変化は、化合物の色を利用することに単に制限されなかった；１つのＮＣＩ化合物は、メラノサイトを紫色に変える原因となった。フマギリン誘導体を用いた場合、９の全ての非致死性ＮＣＩ化合物はわずかに発生遅延を生じる。なぜなら、約１２時間までに形態学的判断基準によって明らかな胚は、発生において遅延するからである。１μＭでは、２０／２１の化合物が発生遅延を生じ、そして１／２１の化合物が致死であった。これらの結果は、培地に添加した化合物が、ゼブラフィッシュ胚に入って効果を誘導し得ることを、きわめて明確に示す。
【０１１１】
（（ｅ）ＤＭＳＯの使用）
上記の実験条件に伴う１つの問題は、胚水中１％ＤＭＳＯに維持されるコントロール胚もまたわずかな発生遅延を示し、これは全ての濃度のＮＣＩ化合物および１μＭ濃度のフマギリン誘導体について観察されたことと類似することであった。本発明者らは、０．１％ＤＭＳＯ中それぞれ１０μＭおよび１μＭ濃度の化合物を使用する実験を繰り返した。この結果は表１と同一であったが、１０μＭ濃度のフマギリン誘導体を除く全ての化合物についての発生遅延が排除されたことは除く。これらの実験を行った後、本発明者らは、０．１％ＤＭＳＯを含む１０μＭ濃度を使用することを決定した。この結果は、比較的高濃度で、ＤＭＳＯが、発生中のゼブラフィッシュに何らかの効果を有することを示した。ＤＭＳＯは低濃度では発生中のゼブラフィッシュに全く効果が無いようであるが、本発明者らは、相乗効果が生じ得ることを承知している。不運なことに、スクリーニングに利用可能な多くの化合物は、ＤＭＳＯまたは類似の溶媒にのみ可溶性であった。任意の一次スクリーニングを用いる場合、ポジティブな結果は、さらなる検証および精査を必要とする。
【０１１２】
（（２）血管形成における化合物の効果の評価）
基本的なアッセイパラメーターを確立した後に、本発明者らは、ＭＩＴ（１１の化合物）およびＮＣＩ（１９０の化合物）から受け取った化合物を、血管形成（新脈管形成および脈管形成）における効果についてスクリーニングした。胚を、２０時間の発生で収集し、そして脱絨毛膜化した。２２時間の発生で、この胚を、５００μｌの胚水につき１ウェルあたり５つの胚を含むように、２４ウェルプレートに選別した。ＭＩＴおよびＮＣＩからの化合物を、１０μＭの濃度で添加した。各化合物について、３セットの胚（合計１５）をスクリーニングした。便宜上、各セットを、別々のマルチウェルプレートに維持した。このことは、１プレートあたり１セットのコントロールを含む２３の化合物／プレートの試験を可能にした。７２時間の発生で、胚を、総形態学的欠損および心機能について、解剖顕微鏡を用いて視覚的にスクリーニングした。視覚的スクリーニング後、血管構築を分析するために、胚を固定し、そして内在のアルカリホスファターゼ活性について染色した。実験結果を表２に示し、そして以下に記載する。
【０１１３】
【表２】
0004383533.tif 000003
（（ａ）血管変化）
血管形成をアッセイするために、胚を固定し、そして染色し、そしてその血管を上記のように計数した。腸管下血管は、胚の両側の卵黄の背側表面で、卵黄を越えて体節の腹側縁から５０〜１００μｍ伸長するバスケットの形状で形成する。このスクリーニングについて、抗脈管形成効果を、これらの血管の完全な不在かまたはバスケットの外側もしくは背側腹面血管のいずれかの欠失かのいずれかとして規定した（図２Ｂ〜２Ｃ、３Ｂ、４）。脈管形成効果を、このスクリーニングのために、体節から１５０μｍを超えるバスケットの拡張として規定した。このことは、バスケット全体の大きさの増加および／またはバスケットからの投影の両方を含む（図６Ａ、６Ｃ、６Ｄ）。全体のバスケットの大きさＳに加えて、本発明者らはまた、血管血管の直径の増加も探索した。通常血管は直径で１０μｍ未満である。胚もまた、大きな血管（背側肺動脈および腹側静脈を含む）における総変化についてスクリーニングした。
【０１１４】
試験した２４１の化合物のうちの２５は（ＭＩＴからの７／１１およびＮＣＩからの１８／１９０）は、何らかの抗脈管形成効果を生じた（表３）。これらのうちの２３／２５は、種々の程度の発生遅延と関連した；より重篤でより劇的な遅延は、血管形成における減少であった（図２Ａ〜２Ｂ）。血管形成における減少または欠失を生じた２つの他の化合物のうちの１つは、胚軸の切断と関連した（図４）。身体中心部の欠損は一般的に、腸管下血管の欠失を生じず、このことは、血管効果を軸線効果から区別し得ることを示唆する。試験された化合物の１つだけが、血管形成において特定の効果を示した。この化合物を用いると、胚において観察可能な効果を伴わない、腸管下血管の欠失が存在した（図２Ｂ）。
【０１１５】
【表３】
0004383533.tif 000004
脈管形成効果を生じた８／２５の化合物を用いて、本発明者らは、大きな血管が尾に適切に局在し損なうようであることを観察した。本発明者らは、重篤な発生遅延を誘導する化合物を用いて、この効果のみを観察した。大動脈および腹側静脈が適切に局在し損なうことは二次効果であり得るようである。変わったところでは、スクリーニングした化合物で、腸管下血管のサイズまたはこの血管の直径のいずれかの増加によってアッセイしたような血管形成の増加を生じる化合物はなかった。
【０１１６】
腸管下血管の欠失が血管芽細胞の欠失に起因するか否かを決定するために、本発明者らは、血管形成の減少を生じることが以前に示されている化合物で処理した胚で、インサイチュ分析を行った。本発明者らは、ｆｌｋ−１に対するプローブを使用した。これは、脈管形成性の血管形成において中心的な役割を果たすことが示されているレセプターチロシンキナーゼである（Ｈａｎａｈａｎ、前出）。Ｆｌｋ−１は、ゼブラフィッシュ胚の血管芽細胞のための最初期のマーカーであることが示されている（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。通常は、ｆｌｋ−１は、新規に形成される血管における発生を通じて高度に発現され、そしてその形成後に大きな血管において低レベルで発現される。脈管形成性血管の非存在下では、本発明者らは、体節および腸管下領域においてｆｌｋ−１の発現が見られることを期待しない；それゆえ、本発明者らは、大きな血管におけるｆｌｋ−１発現に焦点を合わせた。
【０１１７】
胚を、４８時間の発生で収集した（化合物の添加後２４時間）。なぜなら、Ｆｌｋ−１は、この段階にて大きな血管でさらに高度に発現されるからである。腸管下血管において減少を生じた１８のＮＣＩ化合物の内の１７について、ｆｌｋ−１染色のパターンは、４８時間の発生で正常であることを明らかにした。詳細には、ｆｌｋ−１染色は、背側大動脈および腹側静脈ならびに心臓の血管に存在した。しかし、体節間空間または卵黄の背側表面のいずれかでは染色されなかった；このことは、これらの血管が形成しなかったことから予測されていた。ある化合物は、尾の大きな血管でｆｌｋ−１染色の欠失を生じたが、頭部では生じなかった。この化合物はまた、胚の切断、尾の菲薄化および心臓形成異常を生じた（図５）。おそらく、ｆｌｋ−１染色の欠失は、特定の抗脈管形成効果よりもむしろ、より全体的な欠陥の一部である。
【０１１８】
（（ｂ）発生遅延）
多数の欠陥は胚の大きさおよび形状の変化を含んだので、形態学的欠陥と発生遅延との間を区別するために、本発明者らは３つの別個のパラメーターを使用した。通常は、ゼブラフィッシュ胚を、卵黄球上の頭部、胚の長さ、および形成中のメラノサイトの位置によって段階付ける。本発明者らの第４の判定基準の場合、本発明者らは、ひれの大きさおよび形状を使用して、胚の段階付けを補助する。このスクリーニングのために、発生遅延を、同じマルチウェルプレート上のコントロール胚よりも、少なくとも１２時間遅いとして規定した。以前に注記したように、全てのフマギリン誘導体は、少なくとも２４時間の実質的な発生遅延を生じた（図２Ａ〜２Ｃ）。このことは、おそらく、これらの化合物の標的が細胞周期調節タンパク質であるからである（Ｔｕｒｋら、前出）。発生遅延はまた、ＮＣＩからの１９０の低分子化合物のうちの１６（８．５％）で観察された。発生遅延が観察された全ての場合において、血管構築における変化は、発生遅延と一致した（図２Ａ〜２Ｃ）。増殖および成長に影響する化合物はまた、脈管形成性の血管形成（これは、新たな血管を形成するために細胞増殖を必要とする）に影響するようである。これらの１６の化合物のうち８つはまた、尾の大きな血管の組織崩壊であるようであるものを生じた。
【０１１９】
（（ｃ）身体中心部の欠損）
３つの代表的な型の身体中心部の欠損が存在した：１）上方または下方のいずれかの軸線の屈曲（ＮＣＩ３／６、ＭＩＴ３／３）；２）軸線の短縮（ＮＣＩ２／６）；および３）脊索の小気泡化（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）（図５）（ＮＣＩ２／６）。腸管下血管の減少は、身体中心部の欠損を生じる化合物の１つのみで観察された（図４）。
【０１２０】
（（ｄ）頭側欠損）
頭側欠損を、中枢神経系（ＣＮＳ）形態学の破壊（通常は、中脳／菱脳境界で）またはＣＮＳの脳室における細胞片の存在のいずれかとして規定された。１９０のＮＣＩ化合物のうちの７つは、頭側欠損を生じた；しかし、腸管下血管または尾の大きな血管に影響したものはなかった。
【０１２１】
（（ｅ）毒性）
この特異的実験のために、本発明者らは、７２時間の発生による全体の胚死亡率として毒性を規定した。以前に確立したアッセイパラメータを使用して、本発明者らは、１０μＭ濃度の化合物が毒性を誘導しないようであることを予測した。それゆえ、本発明者らは、試験した化合物のわずか５％（ＮＣＩの６．８％、１３／１９０）が致死であったことには驚かなかった。１３の致死化合物のうちの８つは、適用の２４時間以内に胚を殺傷した。残りの５つの化合物は、２４時間以内に局在した細胞死を生じ（尾で４つおよび頭部で１つ）、そして７２時間の発生までに全体の胚の致死を生じた。より低濃度で、これらの化合物は、毒性を生じずに新脈管形成に影響し得る；しかし、このことは、毒性効果がきわめて全体的なので、見込みがありそうにない。
【０１２２】
（（３）血管機能における効果のアッセイ）
（（ａ）循環／心臓速度欠損）
発生遅延および身体中心部の欠損を生じる多数の化合物が存在し、これはまた、心臓において構造変化を引き起こした。一般的には、これらの効果は、心臓の未発生（ｕｎｄｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）と一致した。機能を評価するために、本発明者らは、本発明者らの分析を胚に制限した。ここで、心房および心室の存在ならびに心拍によって規定されるように、心臓は比較的正常であるようである。６／１９０のＮＣＩ化合物は、心臓の心拍速度の減少を生じた。このスクリーニングについて、減少した心拍速度を、コントロールの速度の５０％以下として規定した。生物学的要因および環境要因は、心拍速度において自然な変化を引き起こすので、正常な心拍速度は、各プレートについて、コントロールウェル中の１０の胚の平均心拍速度として得た。これを、実験ウェル中の胚の平均心拍速度と比較した。３／６の化合物において、卵黄にわたる心膜浮腫および血液のプール化は、減少した速度を達成した。心膜浮腫が明らかであるにも関わらず、血球が主要な血管を通じて移動した。これらの化合物のうちの３つ全ての化合物が、脈管形成性血管における減少と関連して発生遅延を生じた；詳細には、腸管下血管が非存在であった。残りの３つの化合物は、減少した心拍速度以外の観察可能な効果は有さなかった。
【０１２３】
試験した非致死性化合物のうちで、血球の数の観察可能な減少を生じたものはなかった；従って、血球の血管を通じる移動を観察することによって循環をアッセイすることが可能である。心拍速度の評価を用いる場合、構造的に正常な心臓を有する胚のみを分析した。なぜなら、奇形の心臓または未発達の心臓は、通常は血液をくみ上げ得ない。化合物のうちで、血流の不足、血液プール化、または漏出性血管によって評価されるような循環に影響するようである化合物はない。
【０１２４】
循環を、血球の胚を通じる流れを観察することによって評価した。この研究において試験した２１２の化合物のうちで、血球の形成に影響したものはなかった；それゆえ、任意の細血管造影を行って循環をアッセイすることは必要なかった。しかし、これは全ての化合物についての場合でなないようなので、細血管造影技術は、代表的には、スクリーニング方法の一部として包含される。細血管造影を、３日の発生でのゼブラフィッシュ胚における本発明者らの最初の研究の一部として行った。細血管造影は、ゼブラフィッシュ胚の正常な血管パターン（頭側血管、体節間血管、および腸管下血管を含む）を示す。図９を参照のこと。
【０１２５】
（Ｃ．考察）
上記の結果は、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）は、血管形成における効果について低分子（例えば、化学化合物）をスクリーニングするための生モデルであることを実証する。このような低分子は、胚に拡散するだけでなく、血管形成において特異的で観察可能な効果も誘導し得る。
【０１２６】
（（１）真骨魚類胚への小化合物の拡散）
実験の前の１つの主要な関心は、異なる型の低分子が、媒体への添加後にゼブラフィッシュ胚に拡散するか否かであった。本発明者らの最初の研究は、フマギリンおよびオビシリン（ｏｖｉｃｉｌｌｉｎ）が、ゼブラフィッシュ胚に拡散し得ることを実証した。しかし、これらの化合物は、培養中の細胞に拡散する能力のために同定された天然の産物である。スクリーニングした２０１の低分子化合物のうちの８１は、ゼブラフィッシュ胚において何らかの観察可能な効果を有した。（ＮＣＩからの７０／１９０の化合物（色変化を生じた２３の化合物を含む（データは示さず））および１１／１１のフマギリン誘導体）。これらの結果は、低分子が拡散によって胚に侵入するという本発明者らの初めの仮説が正しいことを示唆する。
【０１２７】
（（２）全胚スクリーニングの利点）
アッセイのために全真骨魚類胚を使用する１つの有意な利点は、複数の標的における効果を同時に同定する能力である。本発明者らの最初のセットの実験において、本発明者らは、さらなる標的を、さらなる染色を用いずに可視化し得る事象に制限した。発生遅延は、これらのパラメーターのうちの最も有用なものであった。細胞培養アッセイとは異なり、全胚アッセイを用いると、本発明者らは、１１のＭＩＴ化合物が、細胞増殖効果（これは、抗脈管形成性効果と同じであっても同じでなくてもよい）を生成するようであるものを生じることを観察し得た。このことは、２型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ２）（Ｔｕｒｋら、前出）または関連する細胞周期タンパク質の結合に起因し得る。
【０１２８】
本発明者らはまた、他の化合物を用いて多数の他の効果を観察した。６つの化合物を用いて、本発明者らは、目視検査による生胚の心拍速度における効果を観察した。心臓は初期の胚において非常に顕著であるので、目視検査によって遅い心拍速度対正常な心拍速度を観察することが可能であった。この観察された効果についての２つの可能な機構は以下である：１）化合物が、正常な心拍に必要な伝導機構が存在しない方法で心臓の発生に影響し得る；または２）化合物が、βブロッカーと類似の様式で伝導機構を直接拮抗する（ＲｅｉｔｅｒおよびＲｅｉｆｆｅｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８２（４Ａ）：９−１９（１９９８））。本発明者らはまた、７／２０１の化合物において頭側欠損、および９／２０１の化合物において身体中心部の欠損を記録し得た。続く研究（以下に記載する）において、本発明者らは、特異的抗体および染色技術を使用して、他の器官（肝臓および腎臓を含む）における化合物の効果を分析して、脈管形成性化合物の有害効果を決定した。肝臓および腎臓は、高度に血管化される；結果として、これらの器官は、血管形成における有害効果について化合物をスクリーニングするための潜在的な標的を提示する。
【０１２９】
（（３）抗脈管形成性効果についてのスクリーニング）
抗脈管形成性効果についての本発明者らの最初のセットのスクリーニング実験において、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚における血管形成の際のフマギリン（天然の抗新脈管形成化学物質）の効果を実験した。この化合物を、魚培養媒体に添加することによって投与した。この化合物は、新脈管形成において減少を生じ、このことは、腸管下および体節間血管の減少によって示された（例えば、図７を参照のこと）。しかし、各化合物はまた、胚において深刻な合併症（心膜浮腫、発生遅延、および身体中心の欠損を含む）を生じた。これらの実験は、薬物スクリーニングについてのアプローチの可能性を実証したが、これらはまた、選択的に新脈管形成に影響する化合物を同定する重要性を強調する。上記のスクリーニングパラメーターを使用して、本発明者らは、明白に特異的な抗脈管形成性効果を生じる２つの化合物を同定した。さらに、本発明者らは、他の効果に加えて脈管形成性の血管形成の減少を生じる１６の他の化合物を同定した。これらの結果は、ゼブラフィッシュ胚モデルを使用して、新脈管形成および抗脈管形成活性に特異的に影響する化合物についてスクリーニングし得ることを示す。
【０１３０】
（４）Ｆｌｋ−１染色を使用する血管芽細胞形成についてのスクリーニング）
腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｖｅｓｓｅｌ）形成における減少を引き起こした１８のＮＣＩ化合物のうちの１つは、ｆｌｋ−１染色パターンに対して効果を有した。ｆｌｋ−１は、血管芽細胞についての初期マーカーであるので、この結果は、１８のうちの１７の化合物について、新脈管形成のブロックは血管芽細胞の欠損に起因するのではないが、むしろ脈管形成経路のいくつかの他の要素の干渉に起因することを示唆する。ｆｌｋ−１染色に実際に作用した１つの化合物について、この染色の欠損が血管芽細胞の欠損に起因するのかまたはｆｌｋ−１チロシンキナーゼの発現の欠損に起因するのか否かは明らかでなかった。このことは、血管芽細胞および新脈管形成経路の両方についてマーカーを確立することの重要性を示す（下記を参照のこと）。
【０１３１】
（５）脈管形成効果）
試験された化合物は全て、脈管の形成において観察可能な増加を生じなかった。この観察の２つの可能な説明は以下の通りである：１）試験された化合物は全て脈管形成特性を有していなかった；および２）正常なゼブラフィッシュの胚は、外因性脈管形成刺激に対して無反応性である。これらの２つの可能性の間を識別するために、本発明者らは、以下に記載される実験を実施した。ここでＶＥＧＦを２４時間目の胚に注射した。これらの実験は、新脈管形成の増大が、正常なゼブラフィッシュ胚において誘導され得ることを示唆した（図５Ａ〜５Ｃ）。新脈管形成を刺激する化合物を同定する可能性を増加させるために、本発明者らは、変異ゼブラフィッシュ系統（例えば、グリッドロック（ｇｒｉｄｌｏｃｋ）変異（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、前出）、これは新脈管形成をブロックする欠損を有する）の使用を探索した。
【０１３２】
（６）脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ））
ヒトと同じくゼブラフィッシュにおいて、脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ）は、大脈管（大動脈、大静脈、およびいくつかの器官への脈管を含む）を、胚の中胚葉全体に分布する局所的な前駆体細胞（血管芽細胞）から形成するプロセスである（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。本発明者らは、スクリーニングされた２４１の化合物のうちの８つを用いて、血管欠損を観察した。観察されたこの効果は、重篤な発生遅延を伴う胚における背部大動脈および腹部脈管の解体に限定された。血管形成が広範な細胞増殖を必要とすることは明らかでなく、そして大脈管において観察されたこれらの効果は、血管芽細胞に対する直接的な効果というよりもむしろ、周辺組織の破壊に起因し得る。
【０１３３】
（７）新脈管形成活性についての薬剤スクリーニングの迅速かつ自動化された方法）
本発明者らの実験は、インビボおよびインビトロで新脈管形成を阻害または増強する化合物の検出、同定および分析における使用についてのモデルとして、真骨魚類の汎用性および価値を実証した。本発明の方法とともに、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ胚）を使用して、新脈管形成に対する効果について迅速に多数の化合物をスクリーニングし得る。例えば、液体交換について、２４ウェル形式および手動の技術を使用して、本発明者らは複数の時点での種々の効果について２４１の化合物をスクリーニングした。これらの効果としては、形態学的欠損、機能的欠損、および致死率が挙げられる。これらの標的効果は、非常に多量の情報を提供するが、他の標的（例えば、心拍数、血行、および他の器官）の分析は、新脈管形成効果についてのあらかじめスクリーニングされた化合物においてのみ実施されるべき二次レベルのスクリーニングを構成する。新脈管形成に作用する化合物についての一次スクリーニングは、７２時間目の胚における染色された腸管下に集中するべきである。
【０１３４】
本発明はまた、動物モデルにおいてインビボでおよびそれらの細胞においてインビトロで、新脈管形成活性を増強または阻害する化合物を迅速にスクリーニングするための自動化された方法を含む。好ましい動物モデルとしては、透明な真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）が挙げられる。本明細書中に記載される任意の化合物（例えば、以下に記載される小さな化合物または大きな生物学的分子を含む）は、先に記載された自動化された手順を用いてスクリーニングされ得る。
【０１３５】
上記の本発明者らの分析において、本発明者らは、ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙから１９０の化合物をスクリーニングした。このライブラリーは、１００，０００を超える独特の化合物構造からなるが、現在では１２，０００のみがスクリーニングについて利用可能である。本発明の手動のスクリーニング方法を使用して、２年間で化合物ライブラリー全体をスクリーニングし得る。市販の液体を操作する器具の使用を組み入れることは、この期間を３ヶ月未満まで有意に減少する。
【０１３６】
（２．新脈管形成活性についての生物学的分子のスクリーニング）
本発明はまた、新脈管形成活性を増強または阻害する能力について、より大きな分子（生物学的分子を含む）のスクリーニング方法を含む。これらの方法は、真骨魚類に化合物を投与する工程、および新脈管形成活性における増強または阻害を示す応答を検出する工程を包含する。新脈管形成活性について、大きな生物学的分子をスクリーニングするための正確な方法は、現在存在しない。従って、本発明の方法は、ヒトにおいて新脈管形成のプロセスに関与する種々の疾患（神経学的疾患、心肺疾患、虚血、発生疾患、自己免疫疾患、骨および軟骨の疾患、ならびに癌を含む）を処置するための治療剤および／または予防剤としての生物学的化合物の使用を評価する際に、特定の価値および用途がある。
【０１３７】
広範な生物学的化合物（ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、脂質、糖脂質など（そのような化合物の誘導体、アナログ、およびキメラを含むが、それらに限定されない）を含む）が、これらの方法によってスクリーニングされ得る。上記で議論したように、化合物のライブラリー（コンビナトリアルライブラリーを含む）由来の化合物がスクリーニングされ得る。
【０１３８】
近年、多くの生物学的分子が、抗脈管形成効果または脈管形成効果のいずれかを有することが同定された（Ｈａｎａｈａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：４８−５０（１９９７）；Ｚｅｔｔｅｒ、前出）。いくつかの生物学的化合物は特徴付けられ、そして細胞培養物およびマウスにおける新脈管形成活性について分析されており；少数のそのような化合物をヒトにおける治療的および／または予防的処置プログラムにおいて試験している。これらの化合物および真骨魚類のモデル、ならびに本発明のスクリーニング方法を使用した結果の比較は、真骨魚類のモデルおよび本明細書中に記載のスクリーニング方法が、ヒトにおける治療的効果について予測的であるか否かに関して、決定することを可能にし；このような比較は、試験された化合物が、ヒトにおける新脈管形成関連障害の治療的処置および／または予防的処置についてのプログラムにおいて有用であるか否かを決定する際に有用である。
【０１３９】
（Ａ．タンパク質）
真骨魚類の胚での新脈管形成におけるタンパク質およびタンパク質フラグメント（ならびに、ペプチドおよびペプチドフラグメント）の効果を試験するために、タンパク質（ならびに、タンパク質フラグメントおよびペプチドフラグメント）を２４時間目のゼブラフィッシュ胚の循環中に直接的に注射した。胚を収集し、そして上記のように絨毛膜除去（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅ）した。次いで、この胚を、胚の水（ｅｍｂｒｙｏ  ｗａｔｅｒ）中に１％アガロースでできたホールディングランプ（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｒａｍｐ）中で選別し、そして卵黄球の突出を上に向ける。マイクロインジェクションの注入を以下のように実施する：タンパク質をＰＢＳ中に懸濁し、そして吸引されたガラスのマイクロピペット中に充填する。次いで、マイクロピぺットをマイクロマニピュレーターおよび窒素タンクに取り付けたｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｕｅ）に取り付けた。このマイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットのチップを胚中に挿入し、そして少量のタンパク質溶液を陽圧を使用してチップから押し出した。本発明者らの動物モデルがこれらの化合物のスクリーニングに効果的に使用され得るか否かを決定するために、本発明者らは、脈管形成において対立する効果を有する２つの異なるタンパク質のうちの１つ、ヒトエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ８８（２）：２７７−２８５（１９９７）およびヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））を胚に注射する一連の実験を実施した。エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）は、強力な抗脈管形成活性を有する内因性タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞決定ならびに脈管形成の両方において重要な役割を果たすことが示されている。予備実験において、本発明者らは、卵黄球内または卵黄と胎児表皮との間の卵黄周囲腔内のいずれかにＶＥＧＦタンパク質を注射した。第２の位置は静脈還流の経路にあるので、タンパク質は胚の循環中に達する。注射ピペットを充填するために、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌ溶液のＶＥＧＦを使用した。ＶＥＧＦを卵黄内に注射した場合、本発明者らは２つの脈管形成表現型を観察した：１）腸管下バスケット（ｂａｓｋｅｔ）から突き出た長いスパイク（ｓｐｉｋｅ）の出現（図６Ａ）；および２）腸管下バスケットにおける脈管直径の増加（図６Ｃ）。対照的に、卵黄周囲腔内へのＶＥＧＦの注射は、脈管形成および心臓発生の破壊（図６Ｄ）を導いた。このことは、他の脊椎動物における観察と一致する。Ｄｒａｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１７）：７６５７−７６６１（１９９５）；Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。エンドスタチンをＶＥＧＦと同様にゼブラフィッシュに注射した。ＶＥＧＦとは対照的に、エンドスタチンの結果は一致せず、従って解釈不可能である。これらの実験は、脈管パターンにおける変化が、本発明者らの動物モデルにおいて誘導され得ることを実証した。さらに、ヒトタンパク質はこれらの効果を生成したので、これらの実験は、新脈管形成についての機構がゼブラフィッシュおよびヒトにおいておそらく類似していることを示唆する。
【０１４０】
（Ｂ．核酸）
真骨魚類に核酸を送達するために、本発明者らはマイクロインジェクション系を確立した。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のマイクロインジェクションは、単一細胞、カエル胚、マウス胚、およびゼブラフィッシュを含む、種々の生物学的系において使用される十分に確立された手順である。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出。ゼブラフィッシュにおいて、１〜１６細胞ステージの胚の卵黄に目的の分子を注射することによって、胚の全ての細胞を負荷することが可能である。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出を参照のこと。これらの標準的なアプローチを使用して、数百の胚を２時間で負荷し得る。
【０１４１】
（３．微粒子銃細胞ローディング技術の評価）
微粒子銃細胞ローディング技術は、コーティングした微粒子を使用して、動物の組織および器官に目的の分子を導入する。この技術において、生物学的分子でコーティングされた微粒子は、高圧銃を使用して動物の目的の細胞または組織内に「微粒子銃で」打ち込まれる。この技術は、大きなＤＮＡプラスミド構築物を用いて、一次培養細胞ならびにマウスの全胚を首尾よく負荷するために使用されてきた。Ｃｈｏｗら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）：１６６７-１６７９（１９９８）。
【０１４２】
本発明の方法とともに、微粒子銃細胞ローディングをマイクロインジェクション技術の代替として使用して、動物内（例えば、成体、幼生、および真骨魚類の胚のような）に化合物を注射し得る。ＤＮＡを、真骨魚類に局所的（例えば、新脈管形成の開始前、開始後または同時に、尾または卵黄の背部表面）に投与し得る（例えば、真骨魚類の胚の中の特異的な位置に導入される）。
【０１４３】
（４．新脈管形成活性および内皮細胞毒性に対する化合物の効果を、定量化および特徴付けするためのパラメーターの確立）
特定の化合物が治療的または予防的使用の可能性があるか否かを決定するために、多くのさらなるパラメーター（治療的ウインドウおよび有効性ウインドウを含む）が決定され得る。
【０１４４】
（Ａ．治療的ウインドウ）
治療的ウインドウ（ＴＷ）は、致死濃度のメジアン（ＬＣ５０）に対する有効濃度のメジアン（ＥＣ５０）の割合である（すなわち、ＬＣ５０／ＥＣ５０）。ＬＣ５０は、薬剤の段階希釈物を投与し、そして各希釈段階で真骨魚類の何割が致死するかを決定することによって決定される。ＬＣ５０は、真骨魚類の５０％の致死率を引き起こすのに必要とされる濃度である。高い治療的ウインドウ（ＬＣ５０／ＥＣ５０）を示す薬剤（例えば、１００または１，０００）は、良好な潜在的薬物の候補である。なぜなら、治療的濃度において毒性が低いからである。薬剤の濃度は代表的にピコモル濃度〜ミリモル濃度の範囲である。
【０１４５】
（Ｂ．有効性ウインドウ）
有効性ウインドウ（ＥＷ）は、新脈管形成の間で、化合物が有効である時点を同定する。これは、血管芽細胞が最初に検出可能である１２体節ステージで開始して、胚における血管新生が完了する７２時間目のステージを通して、新脈管形成の種々のステージで化合物のＥＣ５０に胚を曝露することによって決定される。
【０１４６】
本発明者らの予備的研究において、本発明者らは種々の濃度で毒性である多くの化合物を同定した。このような化合物は非常に強力であること、そしてわずか低濃度（ピコモル濃度）のこのような化合物で新脈管形成に作用することが可能である。この問題は、毒性を誘導する濃度を十分下回る濃度で脈管形成効果について化合物をスクリーニングすることによって、検討され得る。
【０１４７】
（Ｃ．脈管増殖の定量化）
目的の化合物で処理された胚の、未処理の胚（コントロール）との可視的な比較は、新脈管形成に関連する脈管構築における変化を同定するための手段として有効であるが、これは定量的評価が可能でない。可視的比較の代替として、または可視的比較に加えて、画像解析を使用して、分析を定量化しそして標準化し得る。多くの市販のソフトウェアパッケージが存在し（例えば、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ＰｌｕｓTM、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ；ＷＳＲ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＷｉｎｄＳｗｏｒｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、これらは可視的分析について使用されるパラメーターである脈管寸法および分布の距離ならびに面積の両方の測定を可能にする。
【０１４８】
（Ｄ．脈管形成活性を特徴づけるためのさらなるマーカーの評価）
ゼブラフィッシュにおける脈管形成に関与するシグナリングタンパク質を標識する抗体マーカー（ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１および２（Ｈａｎａｈａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：４８−５０（１９９７）を含む）は、脈管の発生およびパターン化を導くシグナリング分子のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである化合物を同定する際に補助をする。多くの抗体マーカーがマウスにおいて同定されており、そして市販されている（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）。これらのマーカーを、標準的な抗体染色プロトコールを使用して、真骨魚類において試験し得る。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出。ＲＮＡプローブの代わりに抗体を使用して、アッセイ手順を単純化し得る。
【０１４９】
簡潔には、胚を室温で２時間固定した。次いでこの胚をＴｗｅｅｎを有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＴ）中で２度洗浄し、そして−２０℃で７分間のアセトン処理によって透過化した。胚を再水和し、次いでブロッキング溶液（ＰＢＴ中の２％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で室温で３０分間処理する。次いで、胚を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中に４℃で一晩浸漬する。次いで、胚を１％ＢＳＡを有するＰＢＴ中で５回洗浄する。胚を、二次ＨＲＰ−結合抗体を含有するブロッキング溶液中に室温で４時間浸漬する。次いで、胚を洗浄し、そしてＤＡＢ溶液（１ｍｇのジアミノベンジジン、１ｍｌの０．１Ｍ  ＰＯ4緩衝液、１ｍｌのｄＨ2Ｏおよび２０μｌのＤＭＳＯ）中に１５分間浸漬することによって染色する。次いで、発色のために、Ｈ2Ｏ2をこの溶液に添加する。この反応をＰＢＴを添加することによって停止する。
【０１５０】
（Ｅ．内皮細胞毒性を誘導する化合物のアッセイ）
新たな脈管形成をブロックするストラテジーは、抗癌治療のために重要な可能性を有するが、代替のストラテジーは、腫瘍において既に存在する脈管を破壊することである。そのようなストラテジーでは、真骨魚類に対し、脈管形成の前でなく脈管形成後に化合物を投与する。真骨魚類の胚を含有する培地にどのくらいの期間、化合物が持続するかは公知でない；本発明者らは、血管形成に対する効果が、化合物の投与後に比較的すぐに生じることを仮定する。形成後の血管に対して毒性効果を有する化合物を同定するために、本発明者らは、腸管下脈管が十分に確立されている発生の６０時間目のゼブラフィッシュ胚に対して、化合物を投与した。次いで、本発明者らは、発生の７２時間目および８４時間目に胚をアッセイした。上記のように、化合物を、腸管下脈管染色の欠損を生じた化合物についてスクリーニングした。
【０１５１】
（Ｆ．変異魚系統の使用の評価）
研究は、正常な動物系において、さらなる脈管増殖を誘導することが困難であり得ることを示唆する。例えば、虚血についてのマウスモデルにおいてこの証拠が存在する（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）：１６６７−１６７９（１９９８））。この問題は、脈管の発生を損なわれた動物においてスクリーニングを実施することによって回避され得る。脈管形成を破壊するゼブラフィッシュにおいて、少数の遺伝的変異が存在する。このような変異の例は：１）グリッドロック、ゼブラフィッシュにおける局在化され遺伝可能な脈管パターン欠損（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＭＡ（１９９８））、ここで脈管形成は、発生の最初の３〜４日目については頭部領域で正常および尾部で欠損し、そして４日後から尾部において側副血管が出現し始める；２）クローシュ（ｃｌｏｃｈｅ）（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９７（２）：２４８−４９（１９９８））、ここで血管芽細胞の発生は損なわれている；および３）尾部なしかつ固定していない（ｆｌｏａｔｉｎｇ）頭部（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）、脊索（ｎｏｔｏｃｏｒｄ）変異、ここで大脈管の形成はブロックされている。これらおよび他の変異株の有用性は、本明細書中に記載される脈管形成活性について化合物をスクリーニングする方法を使用することによって、容易に評価される。現在、ゼブラフィッシュにおいて、脈管増殖の増加を生じる公知の変異は存在しない。
【０１５２】
（Ｇ．器官系に対する脈管形成／抗脈管形成化合物の効果のアッセイ）
脈管系以外の器官系（例えば、腎臓、心臓など）に対する化合物の効果を、本明細書中に記載のスクリーニング方法を使用することによって決定し得る。そのような決定をする能力は重要である。なぜなら、新脈管形成活性について化合物をスクリーニングする方法を用いて同定された任意の化合物の潜在的な治療的価値を評価する際に、不利な効果（他の器官系に対する不利な効果を含む）を同定することはまた重要であるからである。真骨魚類モデルはこの目的のために理想的である。なぜなら、その器官の多くが、透明な真骨魚類の胚において、光学顕微鏡によって可視化され得るからである（例えば、心臓およびＣＮＳ）；あるいは、真骨魚類胚の多くの器官は、単純な染色技術によって同定され得る（例えば、肝臓、腸、心臓、および腎臓）。例えば、心臓の機能および肝臓の生存力をアッセイし得る。心臓は血管系と直接的に連結されること、および心臓と脈管はいくつかの同じ細胞型を共有することの両方の理由により、心臓は新脈管形成活性に作用する化合物の第二の標的であるように思われる。肝臓は多くの化合物（特に、毒素）の蓄積および代謝の部位であるので、化合物および分解産物の両方の毒性の指標である。
【０１５３】
上記のように、本発明者らの最初の研究において、本発明者らは少数の化合物がゼブラフィッシュ胚の心拍数に作用することを観察した。６つの化合物を用いて、本発明者らは、正常の１秒あたり４〜５拍に代わって、ゼブラフィッシュが１秒あたり約１〜２拍で心拍することを観察した。特定の化合物が真骨魚類の心臓の発生に作用するか否か、または伝導機構に対してアンタゴニストとして作用するか否かを決定するために、本発明者らは、機能的な心臓および脈管系が存在する発生の７２時間目のゼブラフィッシュ胚に、目的の化合物を投与した。次いで、胚を、化合物の添加後２時間、心拍数および収縮力に対する直接的な効果について評価し、そして２４時間目に新規の遺伝子またはタンパク質の発現に必要とされ得る効果について評価した。化合物が、ゼブラフィッシュの心臓の伝導または収縮装置のいずれかに対して直接アンタゴニストとして作用する場合、ゼブラフィッシュへの任意のステージでの投与が効果を示すようである。しかし、化合物がゼブラフィッシュの心臓の発生に作用する場合、その存在は発生の後期ステージで全く効果を示さないはずである。
【０１５４】
心拍数および収縮力を試験することに加えて、本発明者らはまた視覚的な検査（Ｓｔａｉｎｉｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：２８５−９２（１９９６））およびトロポミオシンおよび心臓ミオシン重鎖に対する抗体での心臓の染色（ＳｔａｉｎｉｅｒおよびＦｉｓｈｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．４：２０７−２１２（１９９４）、これは、魚類心臓の２つの室である心房および心室の同定を可能にする）の両方によって心臓の構造を試験した。簡潔には、胚を室温で２時間固定した。次いで、胚をＴｗｅｅｎを有するＰＢＴ中で２回洗浄し、そして−２０℃での７分間のアセトン処理によって透過化した。この胚を再水和し、次いでブロッキング溶液（ＰＢＴ中の２％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中で、室温で３０分間処理した。次いで、この胚を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中に４℃で一晩浸漬した。次に、この胚を１％ＢＳＡを含有するＰＢＴ中で５回洗浄した。引き続いて、この胚を検出について適切な蛍光結合二次抗体に曝露した。この胚をエピ蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）を用いて分析する。この方法は、検出の特定の手段を使用する；例えば、色素形成、放射線写真または他の方法を含む、代替二次抗体または可視化（すなわち、検出）方法を使用し得る。
【０１５５】
（ＩＩＩ．細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法）
（Ａ．細胞死）
多細胞生物体の細胞の死は、天然のプロセスまたは外因的な非生理学的原因から生じ得る。２つの細胞死の型が公知である：壊死およびアポトーシスである。壊死は、細胞への急性の非生理学的損傷から生じる、生細胞の病理的な死である。Ｈｅｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９（４）：３００−０７（１９９８）。壊死は、多くの異なる条件（毒素、重篤な低酸素症、大量の傷害もしくは物理的損傷、またはアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）枯渇の状態を含む）に、細胞を曝露することから生じ得る。同上。壊死は、例えば、虚血発作での梗塞組織の中心、または毒素作用の中心で生じる。同上。壊死細胞は膨張および溶解し、それによってそれらの核内容物を細胞間領域周囲に放出して、そして炎症性応答を生じる。同上。しかし、重要なことに壊死は単に細胞がそれによって死ぬだけの機構ではない。
【０１５６】
アポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）は、発生の間に組織を形作る際に重要な役割を果たす、天然に生じる生理学的なプロセスである。Ｋｅｒｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６：２３９−２５７（１９７２）；Ｃｌａｒｋｅ、Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．１８１：１９５−２１３（１９９０）。アポトーシスは、多細胞生物の自己再生組織のほぼ全てにおいて、細胞増殖と細胞分化との間でバランスを維持することを保証する。アポトーシスは、例えば、もはや必要でない細胞、過剰に産生された細胞、損傷を受けた細胞、または不適切に発生した細胞の排除を可能にする。多くの細胞型が、アポトーシスプロセスを通した細胞死を受ける。Ｈｅｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９（４）：３００−３０７（１９９８）。アポトーシスの細胞は、多くの特徴的な変化（クロマチン縮合、核のフラグメント化、および細胞質の小疱形成を含む）を受ける。ＬｉｅｐｉｎｓおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ、Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．８：６３１−６４１（１９９４）。このプログラムされた細胞死機構は正確かつ予測可能であり、そして細胞死を支配するステージおよび遺伝子は、多細胞動物の間で高度に保存されている。
【０１５７】
アポトーシスは、自身の細胞を死滅させることにより方向付けられるように思われ、そして発生の間、所定の器官または組織における適切な細胞数および細胞型を維持することに関与する。いくつかのアポトーシスの事象は、増殖因子または生存因子の量を制限することによって調節されると考えられる。これはまた、外因性刺激（例えば、照射、高体温、ホルモン離脱、免疫応答、照射、化学毒素、極度な温度、増殖因子の誘導、およびいくつかのウイルスによる感染を含む）に対する応答でもまた誘発され得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２（１９９５）。
【０１５８】
異常なアポトーシスの調節は、不適切な細胞死または細胞死の阻害から生じる広範な疾患の発症および進行に関与している。アポトーシスの調節不全は、例えば、対応する正常な細胞の生存よりも長い期間生存するいくつかの型の癌細胞に関与する。アポトーシス機構の抑制または不全は、形質転換された状態または癌性状態へと導くさらなる変異を、特定の癌細胞が受けることを可能にする。Ｈｅｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９（４）：３００−３０７（１９９８）。制御不能のアポトーシスはまた、神経変性性障害、リンパ球増殖、自己免疫疾患、ならびに心臓疾患および腎疾患を含む他の障害に関与する。同上。
【０１５９】
さらに、疾患（例えば、癌、心臓疾患、および神経変性性疾患）についての多くの治療的アプローチ（種々の化学療法、および臓器移植を含む）が、正常な細胞においてアポトーシスを誘導することが示されている。同上。
【０１６０】
アポトーシスの無差別的な阻害は、広範な過形成を導き得、そしてアポトーシスの不適切な促進は、所望されない組織の変性を導き得、細胞死の研究に対してより正確なアッセイについての必要性を強調する。アポトーシスに対する複数の経路は、異常なアポトーシス調節を処置するために異なる治療的アプローチが可能であることを意味し、このことは細胞死を生じるかまたは抑制するそれらの能力について化合物をスクリーニングするためのアッセイについての必要性を実証する。
【０１６１】
アポトーシスを含む細胞死活性の機構の理解は、細胞死を刺激するか、誘発するか、または開始するか、あるいは択一的には、細胞死を抑制するか、阻害するか、またはブロックするのいずれかの、治療的化合物の開発を容易にする。例えば、シグナル伝達タンパク質およびそれらの対応するレセプターの発見は、アポトーシスの細胞機械が間違った場合、または細胞の殺傷のためのその潜在能力を活用する場合に、アポトーシスの細胞機械を修正するための道具の開発のための機会を提供する。アポトーシスの異常な調節は、広範な疾患の発症および進行に関与しているので、現在、それらが多すぎるアポトーシスまたは少なすぎるアポトーシスと関連があるかどうかに基づいて、多数の障害が分類され得る。特に、多くのガン治療に向けたアプローチが現在研究中である。なぜなら、アポトーシスエンジンが操作し損なう場合に、腫瘍細胞が増殖することが公知であるからである。潜在的な修復方法としては、腫瘍細胞におけるアポトーシス機能を回復するためのレセプターを標的とする化学物質を見い出す工程、および腫瘍を発症した血管においてアポトーシスを誘導する工程が挙げられる。
【０１６２】
分子的なアポトーシス経路の理解の改善はまた、新規な非薬学的治療の開発を刺激し得る。例えば、１つのアデノウイルス（ｐ５３欠損細胞中でのみ複製可能であり、そしてその細胞を殺すアデノウイルス）は、ｐ５３欠損腫瘍細胞のみを殺し、影響されていない正常細胞を残存させる可能性のある抗腫瘍剤として、フェーズ１の臨床試験中である。心臓発作後に注射した場合に冠状動脈の損傷を制限する化合物もまた、現在研究中である。これは、アポトーシスの選択的な阻害および誘導の両方を行う低分子を使用する分子的アプローチの開発の可能性を強調する。分子レベルでのアポトーシスの生理学的プロセス理解の改善は、疾患の病因論についての洞察を提供し、そして診断の、予後の、および治療の道具を開発するための新しい道を開く。
【０１６３】
アポトーシスの遺伝的および分子的機構は、１９８０年代後期および１９９０年代初期に線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを用いる研究において特徴付けられた。線虫は、モデル系として多くの利点（アポトーシスに関与するシグナル伝達経路の多くの進化的な保存を含む）を持つけれども（例えば、Ｓｔｅｌｌｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４４５〜４９（１９９５）を参照のこと）、脊椎動物の細胞死活性および疾患状態の理解のための最適なモデルではない。脊椎動物は、非常により複雑であり、そしてより多くのシグナル伝達分子からなる多数のアポトーシス経路を有する。現在、脊椎動物の系においてインビボで、細胞死活性（例えば、アポトーシス）に対する影響について化合物をスクリーニングする迅速なインビボアッセイは存在しない。それゆえに、脊椎動物の系において、細胞死活性（アポトーシスおよびネクローシスを含む）に対する影響について化合物をスクリーニングする迅速なインビボ方法を提供することが望まれる。
【０１６４】
現在、脊椎動物宿主において細胞死活性を検出するための２つの主要なアプローチが存在する。第１のアプローチは、標準的な細胞培養技術を使用し、そして代表的には生物から培養された細胞の死を検出するための標準的なマイクロプレートリーダーによる。細胞培養アッセイ様式の主な欠点は、培養されていない細胞型（すなわち、他の細胞型）、またはインビボで１つ以上の組織または器官、またはインタクトな宿主全体に対する化合物の効果の分析が不可能であることである。さらに、このようなアッセイ様式は、生きている宿主の複数の組織、器官、または系における細胞死活性の同時モニタリング、あるいは経時的モニタリングが不可能である。
【０１６５】
細胞死活性を検出するための第２のアプローチは、脊椎動物胚の切片組織中の死んでいる（ｄｅａｄ）か、または瀕死の（ｄｙｉｎｇ）細胞（例えば、アポトーシス性の細胞）を検出するために、末端デオキシウリジンヌクレオチドエンド標識（ＴＵＮＥＬ）と呼ばれる、組織学的染色技術を利用する。Ｇａｖｒｉｅｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：４９３〜５０１（１９９２）。不運にも、このアプローチでは、宿主の生活環における、ただ１つの時点のみが試験され得る；種々の組織または器官の細胞の死は、経時的にはモニターされ得ない。投与された化合物に起因する副作用も、同時または経時的にモニターされ得ない。多くの疾患が複数の段階において起こるので、化合物、複数の組織の化合物の直接的作用および副作用の持続によって起こる細胞死活性のパターンの変化を試験する能力は、現在の方法よりも有意な改善を示す。
【０１６６】
細胞死活性（アポトーシスを含む）を調節する遺伝子産物は、多くの疾患プロセスを緩和するうえでの治療的介入のための優秀な標的である。このような治療的遺伝子産物は現在ほとんど存在しない。細胞死活性に対する強力な治療的効果について化合物をスクリーニングする方法を提供することもまた、望まれる。このような方法は、異常な細胞死プロセス（不適切な細胞死または細胞死の阻害（例えば、アポトーシスの調節不全）から生じたものを含む）から生じた疾患を緩和する上で利点を有する。
【０１６７】
（Ｂ．細胞死活性について薬剤をスクリーニングする方法）
本発明は、動物の細胞において、インビボまたはインビトロで、脊椎動物（例えば、真骨魚類）における細胞死活性に対する効果のための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。細胞死活性は、薬剤の投与に応答して、動物、組織、器官、または細胞における細胞死を増強、刺激、阻害、またはブロックする薬剤の能力（ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ）である。細胞死活性は、薬剤が投与されていない、同時発生的および／または履歴されたコントロール真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）と比較して評価される。このような方法は、アポトーシスまたはネクローシスのプロセスを誘発するか、増強するか、抑制するか、または除去する能力について、薬剤をスクリーニングするために有用である。同定された薬剤は、異常な細胞死プロセスから生じる疾患、あるいは標的化された細胞もしくは組織の除去または制御された死から利益を得る疾患の治療的または予防的処置において強力に使用され得る。
【０１６８】
いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類の全身に薬剤を投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。他のこのような方法は、真骨魚類の細胞の培養物にインビトロで薬剤を投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示す細胞における応答を検出する工程を含む。このようないくつかの方法において、検出される応答は、細胞死活性の増加または開始である。他の方法において、検出される応答は、細胞死活性の減少または抑制である。いくつかの方法において、応答は、アポトーシス活性の増加または減少である。アポトーシス活性における効果は、このような効果を示す応答を検出することによって測定され得る；その応答は、例えば、アポトーシスの増大もしくは誘発すること、またはアポトーシスの減少もしくは抑制であり得る。アポトーシス活性の増大は、一般的に、動物の組織または器官の細胞の死の増大を含む。
【０１６９】
代表的には、その動物は真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）である。通常、その真骨魚類は透明である。その真骨魚類は、胚性、幼生、または成体の形態であり得る。
【０１７０】
あるいは、薬剤は、インビボで真骨魚類にその薬剤を投与すること、および真骨魚類におけるネクローシス活性に対する効果を示す応答を検出することによって、インビボでのネクローシス活性に対する効果についてスクリーニングされ得る。薬剤はまた、インビトロで真骨魚類の培養細胞にその薬剤を投与すること、およびネクローシス活性に対する効果を示す細胞において検出することによって、インビトロでのネクローシス活性に対する効果についてスクリーニングされ得る。このような両方の方法において、応答はネクローシス活性の増大または減少であり得る。
【０１７１】
全身の、インタクトな真骨魚類および／または真骨魚類の１つ以上の器官、組織、もしくは系（例えば、心血管系、内臓系、および筋系）への特定の薬剤の効果は、真骨魚類の細胞において（そして所望の場合、経時的におよび／または選択された時間間隔で）、インビボまたはインビトロで測定され得る。器官および／または組織の組み合わせにおける応答は、同時に、または別々に検出され得る；そのような分析は、あらかじめ決定された時間間隔で、経時的に行われ得る。これらの方法はまた、単離された細胞または細胞溶解物とともに使用され得る。
【０１７２】
細胞死活性は、種々の技術のうちの少なくとも１つの（例えば、蛍光顕微鏡技術、光学顕微鏡技術、デジタル画像分析技術、または標準的なマイクロプレートリーダー技術（比色定量、時間分解フルオロメトリーを含むフルオロメトリー、および化学発光）、タンパク質の抗体染色、真骨魚類の全身または真骨魚類の組織、器官、もしくは細胞における酵素レベルあるいは酵素活性の変化、ならびに動物中の時間的および空間的なタンパク質分布の変化を含む）を使用することにより、インビボまたはインビトロで検出され得る。応答はまた、パターン認識ソフトウェアを使用することによって、識別および／または分析され得る。従って、例えば、アポトーシスまたはネクローシス組織の増加は、このような技術を使用することによって、ゼブラフィッシュにおいて分析され得る。
【０１７３】
蛍光に基づく検出技術および蛍光顕微鏡検査はまた、動物（例えば、真骨魚類）における細胞死活性に対する薬剤の効果を検出するために使用され得る。例えば、真骨魚類は、細胞死活性（例えば、アポトーシスまたはネクローシス）の検出を可能にする、膜不浸透性の核染色蛍光色素を用いて染色され得る。種々の蛍光色素が使用され得る。好ましい色素は、非対称的なシアニン色素ファミリー（例えば、キノリウム色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）））の色素（その誘導体、アナログ、および置換形態または非置換形態を含む）を含む。このような色素は、一般的に米国特許第５，６５８，７５１号において議論され、これは、すべての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。多くのこれらの色素は市販されている。
【０１７４】
モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム）を含むこれらの色素は、生きている胚の細胞のインタクトな膜を通過し得ない。しかし、これらの色素は、膜が不連続になっているか、または破壊された（細胞死を受けている細胞に特徴的、ＬｉｅｐｉｎｓおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ、Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．８：６３１〜４１（１９９４））、死んでいる細胞あるいは瀕死の細胞には入り得る。顕著には、死んでいる細胞、瀕死の細胞、またはアポトーシス細胞に特徴的な膜の細胞質の小疱形成および他の特性は、このような色素を細胞に入れることを可能にする。
【０１７５】
細胞膜の通過に際して、モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム）は、死んでいる細胞または瀕死の細胞のＤＮＡに挿入される。高密度のクロマチンおよび核のフラグメント化は、色素挿入およびシグナル増幅のための理想的な環境を提供する。Ｓｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｔｌ．１：２６７〜２７６（１９９７）。ＤＮＡへの挿入に際して、色素は、強い蛍光性となり、単純な蛍光顕微鏡検査を使用して標識された細胞の迅速な検出を可能にする。顕著には、ＤＮＡ中で濃縮された場合、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素の蛍光シグナルは、４００倍まで増幅される。Ｓｅｒｂｅｄｚｉｊａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３１（３）：２７５〜２８２（１９９６）。シグナルの強度は、アポトーシス細胞数またはネクローシス細胞数の測定手段として使用する。
【０１７６】
顕著には、本発明の細胞死活性のための薬剤をスクリーニングするインビボの方法は、既存のアプローチによって可能にされたものよりも、インビボでの胚全体における細胞死の、より感度が高くかつ正確な検出および測定を提供する。細胞死の他の蛍光マーカー（例えば、アクリジンオレンジ）は、種々の条件下で、モノマー性のシアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素）よりもずっとより容易に生きている胚の細胞の膜を通過し、そして蛍光を発する。例えば、アクリジンオレンジは、核酸と結合した場合、およびリソソーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）のような細胞下区画に局在された場合に蛍光を発する。アクリジンオレンジは、時としてアポトーシスと関連するクロマチンの密集化を含む、いくつかの状況下ではＤＮＡと効果的には結合しないこともまた、報告されている。従って、アクリジンオレンジおよび類似のこのような色素は、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素と同程度の細胞死の特異的なマーカーを提供しない。
【０１７７】
モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素）はまた、核酸に結合した場合、細胞死の他の蛍光マーカー（例えば、アクリジンオレンジ）よりも、より高いシグナル対バックグラウンド比を提供する。さらに、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素の蛍光放射スペクトルは、他の蛍光標識の放射スペクトル（例えば、非常に広い蛍光放射スペクトルを有するアクリジンオレンジ）よりも、代表的にはより狭い（すなわち、狭い波長の放射バンドにわたって放射が起こる）。モノマー性のシアニン色素の特徴的な放射スペクトルは、キノリウム色素と組み合わせて、同時に２つ以上のさらなる蛍光標識の使用を可能にし、それによって同じもしくは異なる器官または組織中の生理学的事象の多数の型の特徴付けを可能にする。広い放射スペクトル（例えば、アクリジンオレンジ）は、標識の蛍光放射スペクトル放射の間の重複に起因して、本明細書中に記載されるスクリーニング方法のための複数の蛍光標識を使用する能力を厳しく制限する。従って、本明細書中に記載される本発明の方法を用いて、１より多い蛍光色素が、同時に経時的にインビボで動物に投与された薬剤に対して応答する、複数の細胞的現象および／または分子的現象をモニタリングするために、ともに用いられ得る。市販のフィルターセット（例えば、フルオレセインのためのフィルター、またはいくつかの励起バンドおよび放射バンドを有する複数の発蛍光団を検出するためのフィルターセット）と一致する放射バンドを有するように色素が選択され得る。
【０１７８】
さらに、細胞死の他の蛍光マーカーとは対照的に、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素は毒性ではない；従って、色素が投与された生きている真骨魚類におけるアポトーシス性およびネクローシス性効果は、その真骨魚類が色素による副作用に影響される危険性なしに、かなりの期間にわたってモニターされ得る。対照的に、細胞死の他の型のマーカーを使用するアッセイは、宿主が屠殺され、そして固定されることが必要とされる（例えば、ＴＵＮＥＬ標識）。
【０１７９】
蛍光色素は、代表的には、真骨魚類を含む培地に色素を添加することによって真骨魚類に投与される。あるいは、色素は真骨魚類へ直接的に注入され得る。色素は、代表的には、細胞死活性についてスクリーニングされるべき薬剤の投与に先立って投与される。この手順は、既存のアプローチを超える優れた結果を提供する。なぜなら、本発明者らは、色素がアポトーシスが誘導された後に添加された場合、その色素は、標識された死んでいる細胞または標識された瀕死の細胞においてより効果が少ないことを見い出したからである。アポトーシス機構の１つ（例えば、細胞内膜および原形質膜の成分の重合）は、色素が細胞に入ることを困難にまたは不可能にし得る。結果として、アポトーシスを起こしている細胞は標識されないかもしれない。薬剤の適用に先立つ色素の適用によって、この問題は避けられる。色素の蛍光放射は、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルムを含む標準的な蛍光測定技術を使用すること、または現在の機器（例えば、レーザースキャニング装置、蛍光メーター、フォトダイオード、量子カウンター、光子カウンター、プレートリーダー、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはシグナルを増幅するための手段（例えば、光電子増倍管）によって）の使用によってモニターされる。
【０１８０】
困難な標識手順（例えば、ＴＵＮＥＬ標識）を含む他の公知の色素とは違って、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素は、高処理能力の、自動化されたスクリーニング方法のために特に適切である。これらの色素において固有なより高いシグナル対ノイズ比、そしてアポトーシスについてスクリーニングされる薬剤の投与に先立つ本発明者らの優れた色素の投与方法は、自動化されたデータの獲得、収集されたデータ（例えば、デジタル画像）のより正確な定量、および獲得されたデータの特徴の抽出／画像セグメント化の可能性を可能にする。これらの特徴は、特異的な真骨魚類の運命のマップと同調する運命マップと相関し得る空間的／時間的次元におけるアポトーシスシグナルのマッピングを可能にする。このような情報は、スクリーニングされた薬剤のさらなる特徴付けを可能にする。
【０１８１】
上記のように、細胞死活性（例えば、アポトーシスおよびネクローシス）はまた、デジタル画像化によって検出され得る。デジタル画像化は、人の目と比較した場合に、いくつかの利点のため、生物学的調査のための欠くことのできない道具である。デジタル画像化は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を使用する画像の収集を含む。より高い感度の画像化検出器は、補助されない人の目によっては検出不可能な非常に低い光の対象物を可視化することを可能にする。人の目の感受性のスペクトルは、４００〜７００ｎｍに限られている。対照的に、画像化検出器の感度範囲スペクトルはより広く、ｘ線からまでの赤外線の範囲からシグナルが検出され得る。デジタルマッピングおよびパターン認識ソフトウェアの組み合わせは、複数のデータセットの定量および比較を可能にし、そして実験的な真骨魚類動物を用いる同時発生的および履歴されたコントロールの比較を容易にする。
【０１８２】
本発明はまた、真骨魚類におけるインビボの細胞死活性、または経時的に真骨魚類の細胞におけるインビトロの細胞死活性に対する効果について化合物をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、インビボで真骨魚類に、またはその細胞にインビトロで化合物を投与する工程、細胞死活性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程、およびさらに、あらかじめ決められた期間、または時間間隔の後に、真骨魚類における細胞死活性の応答を検出する工程を含む。実施者によって選択される期間は、代表的には、化合物の存在下で検出可能な細胞死が生じるのに十分な時間である。さらに、複数の時点が、任意の適切な生理学的活性を検出するために試験され得る。いくつかのこのような方法は、本明細書中で記載される検出技術を使用して、第２のあらかじめ決定された時間間隔後に、細胞死活性（例えば、アポトーシス）における応答を検出する工程をさらに含む。このような方法は、インタクトな、生きている真骨魚類において経時的に組織および器官に対する薬剤（例えば、化学化合物、薬物、環境的薬剤、農業的化合物、毒素、医薬、化粧品など）の効果を評価するうえで有用である。
【０１８３】
なお別の局面において、本発明は、上記のように、インビボまたはインビトロで細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法はさらに、真骨魚類の１つ以上の組織または器官における細胞死活性の増加または減少を同時に検出する工程を含む。このようないくつかの方法において、細胞死活性の増加または減少は、あらかじめ決められた時間間隔において１つ以上の組織または器官中で同時に検出される。種々の細胞、組織、および胚の器官に対する特定の化合物の効果は、経時的にモニターされ、そして評価され得る。複数の組織または器官の細胞死活性は、本明細書を通して記載される検出技術を使用することによって検出され得る。
【０１８４】
本発明はまた、インビトロまたはインビボでの細胞死活性に対する効果について化合物をスクリーニングする自動化方法を提供する。本発明の方法は、マイクロプレートのウェルあたり１つ以上の真骨魚類の全身を用いる標準的なマイクロプレートウェル様式を使用して行われ得る。この様式は、標準的なマイクロプレート手順およびウェル中のゼブラフィッシュの細胞死を検出するためのプレートリーダーを使用して、自動化されるスクリーニングアッセイを可能にする。この設定を用いて、多数の真骨魚類に対する特定の化合物の効果が、迅速に確認され得る。さらに、このような様式を用いて、広範な種々の化合物が、ウェル中に含まれる真骨魚類（例えば、真骨魚類の胚）の細胞に対するそれぞれの効果について、迅速かつ効率的にスクリーニングされ得る。サンプルの取り扱いおよび検出手順の両方は、色素および化合物の迅速な再現可能な適用、ならびに標的化合物の自動化スクリーニングのために、市販の機器およびソフトウェアシステムを使用して、自動化され得る。
【０１８５】
これらの方法とともに使用される同時発生的および／または履歴されたコントロール真骨魚類（真骨魚類の組織、器官または細胞を含む）は、アポトーシスの分子機構の少なくとも１つのインヒビター（例えば、公知のまたは特定のアポトーシスの分子機構のインヒビターを含む）が、発生の特定の段階において真骨魚類（または、その組織、器官、もしくは細胞）に投与されたものを含み得、それによって、組織の奇形（例えば、中枢神経系の増大；排泄腔／肛門腔領域の奇形；任意の組織における細胞の過剰増殖）のような特定の表現型を生成する。次いで、薬剤は、同一のまたは同様の表現型を誘導する能力（すなわち、表現系応答）についてスクリーニングされ得る。このような方法を用いて、薬剤は、上記のように真骨魚類に投与される；真骨魚類における表現型応答は、光学顕微鏡によって、上記で議論したように非対称的なシアニン色素を用いる蛍光標識によって、または選択された細胞型についてのインサイチュハイブリダイゼーションもしくは抗体染色を用いる標識化によって、視覚的に検出され得る。これらの型のコントロールを使用して、薬剤は、アポトーシスインヒビターによって誘導される分子機能または分子機構の損失の効果を「表現型複写」する能力についてスクリーニングされ得る。実験的な真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）における表現型複写は、コントロールにおいて観察される同一のもしくは類似の表現型の複製または模倣に関する。
【０１８６】
本発明は、アポトーシスと関連する酵素活性を検出することに依存するスクリーニング方法を含む。１つの局面において、本発明は、薬剤を真骨魚類に投与する工程、および酵素の活性（例えば、カスパーゼ基質の切断）を検出することによってアポトーシス活性を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む、アポトーシス活性についての薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１８７】
例えば、カスパーゼ酵素は、多数のアポトーシスの経路においてトリガー、エフェクター、またはメディエーターとして機能する、十分に特徴付けられているプロテアーゼである。蛍光原性のカスパーゼ基質は、種々の方法（例えば、真骨魚類への注入による方法、真骨魚類を含む培地への基質の溶解による方法を含む）によって真骨魚類に導入され得る。基質の導入の様式は、レポーター基質の設計の特定の型および性質（例えば、低分子、プラスミド）に依存する。蛍光原性のカスパーゼ基質は、薬剤の投与の時点で、または投与後に、または通常、投与に先立って導入され得る。カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ基質の切断）は、例えば、市販の比色定量もしくは蛍光定量の酵素アッセイを使用することによって、または切断された基質を検出する抗体（例えば、Ｍ３０  ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用することによって、測定され得る。胚の発育不全の特定のパターンは、発生の間に自然に起こるアポトーシス事象の阻害から生じる。カスパーゼ活性の阻害は、組織の奇形を含む特定の形態学的効果を引き起こし得る。このような方法は、インビボで真骨魚類の全身を使用して、またはインビトロで真骨魚類の細胞を使用して行われ得る。このような方法は、種々の疾患（例えば、ガン）を処置するために潜在的な治療的または予防的用途を有し得る、アポトーシス活性を有する薬剤を同定するために有用である。
【０１８８】
（Ｃ．細胞死活性および／または新脈管形成活性および／または毒性活性について薬剤を同時にスクリーニングする工程）
細胞死活性について薬剤をスクリーニングするための方法は、本発明の他の方法（新脈管形成活性（セクションＩＩ）または毒性活性（セクションＩＶ）について薬剤をスクリーニングする方法を含む）と組み合わせられ得る。真骨魚類は透明であるので、薬剤に応答して真骨魚類中で細胞死活性、新脈管形成活性、および／または毒性効果の効果を同時に評価することが可能である。応答は、１つ以上の組織または器官中で、そしてあらかじめ決められた時間間隔でモニターされ得る。
【０１８９】
以前に記したように、これらの組み合わせた方法は、所望の応答および所望でない応答（例えば、有害な副作用）、ならびに他方を促進することなく、一方の活性を促進するのに有効な薬剤の用量レベルを含む、薬剤の複数の効果を評価するうえで有用である。薬剤の投与に起因する、動物における複数の活性および応答を評価する能力は、潜在的な治療化合物を同定すること、およびそれらの副作用を評価することにおいて、特に有用である。例えば、アポトーシスの病理学的な調節は、広範な種々のヒトの疾患（ガン、心臓疾患、神経変性性障害、ならびに免疫疾患、腎臓疾患、およびウイルス誘導性の疾患を含む）と関連する。本質的には、すべての細胞は発生の最も初期の段階から自殺するように保たれている。従って、薬物が厳しく標的化されることは避けられない。標的化されていない組織または器官における細胞死および毒性効果が無視できるレベルのみであるようなバランスがまた、薬物を用いる処理の間に、達成されなくてはならない。本発明の組み合わせた方法は、特定の器官および組織、または動物全体中での、潜在的な薬物の細胞死ならびに有害な効果および毒性の効果の特異性ならびに程度を評価するうえで有用である。
【０１９０】
種々の技術が、複数の活性／応答を分析するために、ともにまたは別個に使用され得る。これらの技術は、例えば、蛍光顕微鏡技術、光学顕微鏡技術、デジタル画像分析技術、標準的マイクロプレートリーダー技術（比色定量、フルオロメトリー（時間分解フルオロメトリーを含む）、および化学発光）、放射測定分析、インサイチュハイブリダイゼーション、真骨魚類の全身または真骨魚類の組織、器官もしくは細胞における酵素の活性およびレベルの変化、特定のタンパク質の抗体染色、動物内での時間的および空間的なタンパク質分布の変化などを含む。
【０１９１】
１つの局面において、本発明は、上記のようなインビボまたはインビトロでの細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法はさらに、毒性活性の増加または減少を示す真骨魚類における応答を検出することによって、毒性活性の増加または減少について薬剤をスクリーニングする工程を含む。別の局面において、本発明は、上記のようなインビボまたはインビトロでの細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法はさらに、新脈管形成活性の増加または減少を示す真骨魚類における応答を検出することによって新脈管形成活性の増加または減少について薬剤をスクリーニングする工程を含む。
【０１９２】
このような組み合わせ方法を用いて、細胞死活性スクリーニングのための同時発生的および／または履歴されたコントロール真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）は、少なくとも１つのアポトーシス分子機構のインヒビターが、発生の特定の段階での真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）に投与され、従って特定の表現型を生成する上記のものを含み得る。次いで、薬剤は、同一のまたは類似の表現型を誘導する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１９３】
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュ胚への細胞死の導入）
レチノイン酸（ＲＡ、ビタミンＡ酸）でのゼブラフィッシュの処理は、多数の発生中の組織（神経管を含む）におけるアポトーシスの増加を導く。Ｅｌｌｉｅｓら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６１：２３−３６（１９９７）。レチノイン酸は、Ｈｏｘ遺伝子ファミリーの発現を調節することが公知である。この遺伝子ファミリーのメンバーは、発生の間に細胞に対して位置の同定を付与することが示されている。Ｈｕｎｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８６１−８６４（１９９１）。レチノイン酸誘導性アポトーシスは、細胞の独自性の変化の結果であり得るか、またはアポトーシス経路に対する直接的効果の結果であり得る。いずれの場合でも、異なる段階の発生へのレチノイン酸の適用は、細胞死に独特のパターンをもたらす（例えば、図１０Ａ〜１０Ｂを参照のこと）。
【０１９４】
正常なアポトーシスは、７２時間の完全な形態発生期間を通してゼブラフィッシュ胚において生じる；しかし、高レベルのアポトーシスは、２４時間胚へのレチノイン酸の投与によりその胚において誘導され得る。本発明の方法では、レチノイン酸を用いて、アッセイの最適化のために細胞死の再現性のあるパターンを生じる。細胞死活性がアポトーシスを含む場合、本発明のアッセイは、ゼブラフィッシュ胚においてインビボでレチノイン酸により誘導されるアポトーシスの効果（すなわち、コントロール）と、ゼブラフィッシュ胚に対するインビボでの試験化合物の効果の比較を含み得る。このようなアッセイの精度は、ＴＵＮＥＬアッセイ（上記）を同じゼブラフィッシュ胚について実施することにより確認され得る。
【０１９５】
脊椎動物胚におけるインビボでの細胞死活性（例えば、アポトーシスまたは壊死）に対する効果について試験化合物をスクリーニングする方法を以下に示す：
【０１９６】
【数１】
0004383533.tif 000005
本方法は、公知の自動化ソフトウェアおよび計器システムを用いて容易に自動化され得る。
【０１９７】
本方法を用いて、ゼブラフィッシュ胚を、天然の交配により最初に生成し、次いで収集し、そして５グラム（ｇ）の即席海水塩（Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  Ｓａｌｔ）と３ｇの硫酸カルシウムとを２５リットルの蒸留水中で合わせることにより調製した卵用水（ｅｇｇ  ｗａｔｅｒ）中に置いた。次いで、胚を２ｍｇ／ｍｌプロナーゼ溶液で２８℃にて１分間処理し、そして卵水中で３回洗浄して卵殻（ｃｈｏｒｉｏｎ）を除去する。この胚を、実験を通じて卵用培地中で保持する。なぜなら、ゼブラフィッシュ胚は、結合している卵黄球（ｙｏｌｋ  ｂａｌｌ）から食物を受け取り、さらなる維持管理は必要とされないからである。発生の１２〜１４時間後、胚を、０．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の０．１  μＭ〜１μＭレチノイン酸で２時間処理して、ゼブラフィッシュの前脳および菱脳において細胞死を誘導する。前脳および菱脳における細胞死を、発生約２４時間で検出し得る（図１０Ａ〜１０Ｂを参照のこと）。次いで、胚を、卵用水中で２回洗浄し、そして染色のために適切な発生段階に到達するまで、２８℃にて維持する。
【０１９８】
（２．生きたゼブラフィッシュ胚における細胞死の蛍光検出）
細胞死を受けている細胞を同定するために、胚を、膜不透性の核染色蛍光色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素ファミリーの色素）で染色する。ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素は、ＤＭＳＯ中に可溶性であり、そして色素を直接その培地（この培地は通常ＤＭＳＯを含む）に添加することにより、ゼブラフィッシュに投与され得る。ゼブラフィッシュは、高レベルのＤＭＳＯに十分耐性である。
【０１９９】
ゼブラフィッシュ胚を生成し、そして卵殻を上記の通りに除去する。この胚を以下の４つの群に分ける：
１）未処理の非染色胚（自己蛍光＋細胞死）
２）処理した非染色胚（自己蛍光ｗ／誘導性細胞死）
３）未処理の染色した胚（蛍光色素＋正常細胞死）
４）処理し、染色した胚。
【０２００】
２群および４群からの胚を、上記の通りに発生１２時間でレチノイン酸で処理する。発生２０時間で、各群からの個々の胚を、卵用水１００マイクロリットル（μｌ）中でマルチウェル培養プレート（例えば、９６ウェル培養プレート）の単一のウェルに置く。ゼブラフィッシュ胚は１００μｌの水中で正常に発生するので、この魚を維持する培地に試験化合物および色素を容易に直接添加し得る。この手順では、蛍光色素を、３群および４群からの胚の培地に、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、および１／２００の希釈で添加する。各色素濃度について、胚を、３０分間の間隔で４時間収集する。次いで、この胚をタンク水中で５分間、２回洗浄する。この胚を、低い光レベルの検出のためにＣＣＤカメラを備えた上方蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて調べる。画像を、標準的なソフトウェア（例えば、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ，Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて収集し、そして比較する。１群の胚は、正常レベルの自己蛍光を反映する。２群の胚は、アポトーシス細胞またはレチノイン酸により引き起こされた自己蛍光を反映する。３群の胚は、正常に生じる細胞死を示す。４群の胚は、アッセイの開発のための一次ベースラインを提供する。
【０２０１】
細胞死（例えば、アポトーシス）の蛍光検出の精度を確認するために、従来のＴｄＴ媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識アッセイ（末端デオキシウリジンヌクレオチド末端標識または「ＴＵＮＥＬ」と称される）を同じ胚について行う（１群〜４群、上記）。このＴＵＮＥＬアッセイは、Ｇａｖｒｉｅｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：４９３−５０１（１９９２）に記載される。このアッセイは、標準的な組織病理学的手順を通じて処理された組織切片における核におけるＤＮＡ切断のインサイチュでの標識方法である。この方法は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、アポトーシス細胞の核内でＤＮＡフラグメントを末端標識する。ＴｄＴは、３’−ＯＨ末端のＤＮＡに特異的に結合し、ポリデオキシヌクレオチドポリマーの合成を確実にする。組織学的切片上の核ＤＮＡをタンパク質分解処理に曝露した後、ＴｄＴを用いて、ＤＮＡ切断部位でビオチン化デオキシウリジンを取り込む。得られるシグナルを、アビジン−ペルオキシダーゼにより増幅し、光学顕微鏡法による従来の組織化学的同定を可能にする。
【０２０２】
ゼブラフィッシュ胚は透明であるので、全体を取り付ける形式でＴＵＮＥＬ染色を行い得る。胚全体を、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、そしてＧａｖｒｉｅｌｉ（前出）により記載されたＴＵＮＥＬ手順を用いて染色する。胚を、ｄｄＨ2０（二回蒸留水）および１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中でリンスする。次いで、胚を、ＴｄＴ緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ塩基、１４０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１Ｍ  塩化コバルト（ＣｏＣｌ2））を用いて３７℃にて３時間前処理する。次いで、胚を、ｐＨ７．２にて、０．１％  Ｔｗｅｅｎを有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）中で３０分間３回洗浄する。次いで、ＰＢＳＴを、４０μＭビオ−１６−ｄＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および０．３単位／μｌのＴｄＴ酵素（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ）を含有するＴｄＴ緩衝液の反応混合物で３７℃にて一晩置換する。この反応を、胚を２×生理食塩水−クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）中で洗浄することにより終結させる。次いで、胚を、ＰＢＳ中でリンスする。ビオチン化ヌクレオチドを、製造業者のプロトコル（Ａ＋Ｂ試薬、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプトアビジン複合体を用いて検出する。ＨＲＰを、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の５００μｇ／ｍｌ  ＤＡＢ、０．２％  ＣｏＣｌ2、０．２％  ＮｉＳＯ4（ＮＨ4）2ＳＯ4−６Ｈ2Ｏおよび１０％  Ｈ2Ｏ2を含有する３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液中でこの切片をインキュベートすることにより検出する。染色した胚を、複合光学顕微鏡で可視化する。
【０２０３】
本発明者らの細胞死検出方法のさらなる試験として、本発明者らはまた、シクロオキシゲナーゼインヒビターであって細胞死の特有のパターンを生じる、イブプロフェンで処理した胚中の細胞を色素が標識する能力を試験した。このパターンは、この胚の細胞における不透明性の変化の進行により示されるような細胞の死の後ろから前への進行からなる。
【０２０４】
発生２４時間の胚を、胚用培地中で１００ナノモル濃度の蛍光色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素）で１時間前処理した。次いで、この胚を、この培地への添加により１００μＭのイブプロフェンに曝露し、そして光学顕微鏡法および上方蛍光顕微鏡法により１５分間毎に２時間調べた。コントロールの胚を、同じ濃度の色素で前処理したが、イブプロフェンには曝露しなかった。１時間以内に、蛍光標識細胞は、実験胚の尾の後部端で検出されたが、コントロール胚では検出されなかった。１時間および３０分間では、標識された細胞は、尾の先端から肛門のレベルまで広がる大きな斑状に検出された。２時間では、蛍光標識された細胞は、胚全体を通して見られ得た。対照的に、標識細胞のこのようなパターンは、コントロール胚では観察されなかった。蛍光標識された細胞のこのパターンは、胚において不透過性変化が観察されたパターンと同一であった。
【０２０５】
（３．誘導された細胞死活性のレスキュー）
真骨魚類モデルを用いて細胞死活性をブロックまたは低減する化合物についてスクリーニングし得るか否かを決定するために、イブプロフェンへの曝露の前に胚に、カスパーゼ３インヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃２６４１５５）をマイクロインジェクションした。
【０２０６】
具体的には、発生２４時間の胚を、卵殻除去（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅ）し、そして２５μＭカスパーゼ３インヒビターまたはＰＢＳのいずれかを卵黄にマイクロインジェクションした。発生２６時間で、胚を、培地への添加により１００μＭイブプロフェンに曝露した。１時間で、不透明な細胞が、ＰＢＳを注射した胚において観察されたが、カスパーゼインヒビターを注射した胚においては観察されなかた。イブプロフェンの添加の２時間後、ＰＢＳを注射した胚は完全に不透明であった。対照的に、カスパーゼインヒビターを注射した胚は、依然として透明であったが、これらの胚における尾の最後部の領域において不透明な細胞が出現し始めた。イブプロフェンの導入の２４時間後、実験胚の全てが死滅した。
【０２０７】
（４．細胞死活性に対する効果についての化合物のスクリーニング）
広範な種々の化合物を、細胞死活性（例えば、アポトーシス活性または壊死活性）に対するそれらの潜在的な効果について、本発明の方法を用いることにより分析し得る。治療的または予防的な薬物、化学物質、毒素、および医薬は、なかでも、細胞死活性に対するそれらの効果（アポトーシスを阻害または誘発する能力を含む）について試験し得るものである。
【０２０８】
スクリーニングされ得る化合物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを含む種々の供給源から入手され得る。
【０２０９】
試験され得る化合物は、その化合物を、真骨魚類を含む溶液または培地中に溶解することにより、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）にインビボで投与され得る。この化合物は、真骨魚類により吸収される。あるいは、この化合物は、真骨魚類に直接注射され得る。
【０２１０】
アポトーシス活性に対するその効果について化合物をスクリーニングする場合、その試験化合物が投与された真骨魚類胚を利用するアッセイを、レチノイン酸が投与されている胚と比較することは有用である。このような比較アッセイのために、真骨魚類胚を以下の４つの群に分ける：
１）レチノイン酸なし、試験化合物なし（正常コントロール）
２）レチノイン酸、試験化合物なし（誘導された細胞死のコントロール）
３）レチノイン酸なし、試験化合物
４）レチノイン酸、試験化合物
スクリーニング方法は、上記の通りに実施される。具体的には、２群および４群に属するゼブラフィッシュ胚を、上記と同じ条件下でレチノイン酸で処理して、同じ程度のアポトーシスを誘導する。次いで、３群および４群に属するゼブラフィッシュ胚を、この試験化合物に曝露する。次いで、全ての胚を、色素で染色し、そして低い光レベルの検出のためにＣＣＤカメラを備えた上方蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ  Ｅ６００）を用いて画像を収集する。次いで、各群からのゼブラフィッシュ胚を、画像および分析ソフトウェアを用いて比較する。１群胚を、（正常）コントロール胚として役立てる。２群の胚は、レチノイン酸によって誘導されるアポトーシスのレベルについてのコントロールを提供する。３群の胚は、この試験化合物がアポトーシスを誘導する能力を実証する。４群の胚は、レチノイン酸と比較した、この試験化合物がアポトーシスを誘導または抑制する能力を表す。アポトーシスのシグナル面積およびアポトーシス細胞数の絶対変化を用いて、この試験化合物がアポトーシス活性に対する効果を有したかを決定する。
【０２１１】
特に、本発明の方法は、生きた透明な真骨魚類胚において実施される。細胞死活性（例えば、アポトーシス活性または壊死活性）に対する試験化合物のインビボでの効果を、上記のゼブラフィッシュ胚群を４日間までの期間にわたって２４時間間隔で調べることにより、経時的に決定し得る。真骨魚類の特定の器官（例えば、脳）または組織の細胞の死に対する化合物の効果は経時的に調べられ得る。細胞死の器官特異的パターンおよび組織特異的パターンを同定し得る。さらに、この化合物の効果の持続性および持続時間を、本発明の方法により決定し得る。さらに、胚全体または特定の器官および組織系（例えば、心血管系、腸系、および筋系）のいずれかまたは両方に対する化合物の効果を、インビボで同時にまたは独立して決定し得る。真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）は作製することが容易であり、そしてこのアッセイは容易に再現可能であるので、多数の試験化合物は、アポトーシスおよび／または壊死を含む細胞死活性に対する、および細胞死活性の調節のそれらのそれぞれの効果について容易にかつ迅速にスクリーニングされ得る。
【０２１２】
ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素を利用する方法を用いて、特定の化合物がアポトーシスのプロセスおよび壊死プロセスに対して有し得る潜在的効果を区別し得ない。発生中の胚では、壊死細胞死は、例えば、物理的操作によって引き起こされる非生理学的損傷によって胚が損傷を受けない限り、稀にしか生じない。胚への非生理的損傷を除去するため（従って、壊死から生じる任意の細胞死を除去するために）、卵殻除去した胚を、寒天でコーティングしたウェルにおいて維持する。寒天でのコーティングは、胚の外胚葉への表皮剥奪を防止する。このような表皮剥奪は、胚がプラスチックの表面と接触した場合に生じ得る。胚へのさらなる非生理学的損傷を予防するために、一旦各胚をマルチウェル培養プレートのウェル中に置いたら、各胚に触らない。胚に対する染色、化合物曝露、および観察は、胚を操作することなく、マルチウェル培養プレートにおいて全て行われ得、それゆえ、その胚への壊死的損傷の可能性を低減する。酵素活性（例えば、カスパーゼ酵素活性）が報告された特異的蛍光原基質を、透明な真骨魚類胚において用い得、そしてアポトーシス活性と壊死活性との間を区別することを補助し得る。
【０２１３】
真骨魚類胚（例えば、ゼブラフィッシュ）は、発生の最初の４〜５日間は少ない流体容量（例えば、１００μｌ）において維持され得るので、単一の胚を、マルチウェル（例えば、９６ウェル）培養プレートの個々のウェルにおいて保持し得る。あるいは、複数の胚（例えば、１０個の胚）を、２４ウェル培養プレートまたは４８ウェル培養プレートなどの各ウェルにおいて保持し得る。このことは、例えば、蛍光シグナル、比色シグナル、放射性シグナル、および化学発光シグナルを含むシグナルを、標準的なマイクロタイタープレートリーダーを用いて検出すること、ならびに細胞死活性に対するそれらの効果についての種々の化合物のＡＰ染色および検出の方法を自動化することを可能にする。
【０２１４】
検出を自動化することに加えて、サンプル操作を、色素および化合物の真骨魚類への迅速な再現性のある適用のために、本明細書中に記載される方法を用いて自動的に行い得る。化合物適用の処理能力を増加させるために、現在利用可能なロボットシステム（例えば、ＱｉａｇｅｎからのＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６００、ＺｙｍａｒｋからのＺｙｍａｔｅ、またはＢｅｃｋｍａｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＢｉｏｍｅｋ）（これらの大部分はマルチウェル培養プレート形式を用いる）を本発明の方法について用い得る。周知でかつ市販の機器システムを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションおよびデータ記録、ならびに本発明のスクリーニング方法の修正システムおよび他の局面を自動化し得る。
【０２１５】
本発明はまた、細胞死活性に対するインビボでの効果について化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、この化合物を真骨魚類にインビボで投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示す、真骨魚類における応答を検出する工程を含む。ここで、化合物のライブラリーは、アポトーシス活性および壊死活性を含む細胞死活性に対する効果についてスクリーニングされる。いくつかのこのような方法において、化合物のライブラリーは、天然の化合物を含む。本発明の他のこのような方法では、化合物のライブラリーは、合成化合物を含む。本発明のさらに他の方法では、このライブラリーはコンビナトリアルライブラリーである。本発明の方法は、化合物および化学ライブラリーを、細胞死を抑制または誘発する（アポトーシスまたは壊死を抑制または誘発することを含む）分子についてスクリーニングするために有用である。
【０２１６】
（ＩＶ．毒性活性についての薬剤のスクリーニング方法）
（Ａ．動物全体での毒性試験）
毒性試験のための優れた方法は、ヒトおよび動物の健康に対する種々の化合物の潜在的影響を評価するために細胞ベースのアッセイを用いる。哺乳動物細胞に対する化学物質の細胞傷害性効果を、細胞生存率および予定外のＤＮＡ合成によって主に測定する。これらの毒性スクリーニングは、細胞標的に対する化合物のインビトロでの効果を評価するために設計されているので、これらは、死亡率を含む、生物レベルでの効果を予測する能力が制限される。対照的に、毒性試験のための動物全体の使用は、細胞ベースのアッセイの限界に取り組み、そして分子レベルおよび細胞レベルでの同時評価を可能にする。
【０２１７】
胚全体での試験は、無脊椎動物（ショウジョウバエおよび線虫を含む）について以前に行われた（Ｅｉｓｓｅｓ，Ｔｅｒａｔｏｇ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．Ｍｕｔａｇｅｎ  ９：３１５−３２５（１９８９）；Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋら，Ａｒｃｈ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：２５２−２６０（１９９７））。しかし、無脊椎動物はヒトには密接に関連しておらず、多くの同じ器官および酵素を欠いているので、ヒトにおける毒性効果の予測物としてのこのような結果の使用は、制限される。哺乳動物における胚毒性試験は、以下の２つのカテゴリーに分類される：１）ラット胚またはマウス胚のいずれかを用いる培養アッセイ、および２）化合物が妊娠したマウスまたはラットの腹膜中へ注射される、子宮内アッセイ。胚全体でのマウスおよびラット培養技術は、脊椎動物における毒性試験についての確認方法である（Ｃｈａｔｏｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０７：１４７１−１４７３（１９８０）；ＣｉｒｃｕｒｅｌおよびＳｃｈｍｉｄ，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  １８：６１７−６２４（１９８８））が、この方法を用いる毒性試験は、複雑であり、そして制限された数の高価なアッセイしか行われ得ない。胚は、発生８．５日目に、内臓卵黄嚢および栄養膜錐体（ｅｃｔｏｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｃｏｎｅ）を用いてインタクトで、慎重に外植されなければならない。胚の培養時間はまた、４８時間までに制限される（Ｂｅｃｈｔｅｒら，Ｔｅｒａｔｏｌ．４４：２９Ａ（１９９１））。さらに、培養条件の複雑さに起因して、偽陽性および偽陰性の両方の発生率は高い（Ｇｕｅｓｔら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２（１）：５７−６２（１９９４））。子宮内アプローチは、これらの問題を回避する；しかし、このアプローチは、母体の肝臓において試験されるべき化合物が代謝され得るという事実によって複雑になる。さらに、子宮内アプローチは出生前効果を調べるのに有用であるが、このアプローチは、生後の発達に対する化合物の毒性効果を評価する際には役立たない。カエル胚系は、インビトロでの毒性試験のために通常用いられる別のモデルである；しかし、カエル胚は透明ではないので、特定の組織および器官に対する毒性活性を経時的に、または同時に調べることが非常に困難である。動物の複数の異なる器官および組織における毒性活性について、同時におよび／または動物全体においてインビボで薬剤をスクリーニングするのを可能にする方法が必要である。
【０２１８】
（Ｂ．毒性活性スクリーニング方法）
本発明は、インタクトな動物全体において、ならびに動物全体の組織および器官においてインビボで、または動物の細胞をインビトロで使用して細胞において、毒性活性について薬物をスクリーニングする方法を提供する。このような活性は、この薬剤が投与されていない同時および／または歴史的なコントロールの真骨魚類（または真骨魚類の組織、器官、または細胞）に対して評価され得る。このような方法は、薬剤を真骨魚類に投与する工程、および活性を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。このような方法は、特定の薬剤に起因する、真骨魚類全体における発生中の器官および組織に対する有害な効果および致死的な効果を含む毒性応答について迅速に、包括的に、そして再現可能にスクリーニングし、そしてこの毒性応答を予測するために有用である。
【０２１９】
ゼブラフィッシュは、なかでも、これらの方法のために好ましい真骨魚類である。上記で詳細に概説したように、ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュが透明であること（従って、複数の組織および器官の観察および分析を同時に容易にすること）を含む毒性試験についての多数の利点を提供し、迅速に発生し、生成し、そして維持するのが容易でかつ安価であり、そして高処理量毒性スクリーニングに敏感に反応する。さらに、この組織および器官の発生の形態学的および分子的な基礎は、一般に、ヒトを含む他の脊椎動物に同一であるかまたは類似するかのいずれかであり、従って、ゼブラフィッシュにおける化合物の毒性スクリーニングは、ヒトにおける化合物の効果についての関連する情報を提供する。さらに、本発明者らは、真骨魚類が毒性に対して用量依存性を示し、従って、ゼブラフィッシュおよび本明細書中に記載の毒性スクリーニング方法が特定の器官および組織系に対する薬物の特定の用量の効果、ならびにこのような用量に対する特定の器官および組織の感受性を決定する際に有用であることを決定した。
【０２２０】
上記のように、スクリーニングされるべき化合物は、この化合物を、真骨魚類を含む培地に単に添加することにより拡散によって、またはマイクロインジェクションもしくは当業者に公知の類似の技術によって、真骨魚類に投与され得る。
【０２２１】
本発明は、１以上の器官（例えば、腎臓、膵臓、心血管系、中枢神経系、肝臓など）または組織に対する毒性効果または活性について薬剤をインビボで同時にまたは独立してスクリーニングするための方法を含む。薬剤が動物細胞の培養物に投与され、そして活性を示す応答がその細胞中で検出される、インビボでの方法もまた含まれる。全てのこのような方法を用いて、とりわけ、化学的化合物、医薬、治療剤、環境的薬剤および農業的薬剤、工業的薬剤、汚染物質、化粧品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、合成または天然の化合物、薬物、有機化合物、脂質、糖質コルチコイド、ペプチド、抗生物質、キメラ分子、糖、炭水化物などを含む、広範囲の薬剤および化合物をスクリーニングし得る。これらの薬剤および化合物を単独でまたは複合体混合物を含む混合物としてスクリーニングし得る。
【０２２２】
本発明の方法は、器官毒性についての生体マーカーとしての重要な肝臓および腎臓の酵素を評価するための分子的方法の調査を可能にする。差し引きライブラリー技術および複数の酵素的アッセイは、公知の毒性の薬物と組み合わせて用いられて、薬物応答および代謝活性化現象に関与する新規な遺伝子を同定し得、従って、新規な生体マーカーを確立および確認することに寄与する。
【０２２３】
動物（例えば、真骨魚類）への化合物の投与により生じる毒性効果および活性は、その動物における種々の応答（例えば、分子的変化、遺伝子変異、発生の欠損、発生の遅延、遺伝子毒性、生殖毒性、器官毒性、または発育不全、行動毒性、奇形遺伝性、その動物の死などを含むがこれらに限定されない）により示され得る。毒性活性を示す応答は、真骨魚類全体において、または真骨魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官において検出され得る。この応答は、複数の組織および器官において同時にまたは所定の時間間隔を空けて経時的に別々に検出され得る。例えば、この応答は、少なくとも２つの異なる組織、少なくとも２つの異なる器官、または少なくとも１つの器官および少なくとも１つの組織において検出され得る。インビトロでの方法では、この応答は、真骨魚類の１以上の細胞において検出される。
【０２２４】
さらに、毒性活性を示す応答を、薬剤投与後の特定の時間におよび／または特定のセットの条件下で細胞、組織、器官、または動物全体において発現された１以上のｍＲＮＡのレベルを抽出および測定することにより、動物のこのような１以上の細胞、組織、もしくは器官についての、または動物全体についての遺伝子発現（ｍＲＮＡ）プロフィールの変化として検出し得る。このことを行うために、差し引きライブラリー実験を実施し得る。コントロール（未処理）胚および実験（処理）胚からのｍＲＮＡを、初期および後期の応答期間に抽出する。差し引きライブラリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて構築する。化合物への曝露の結果として示差的に発現される、この胚からの遺伝子を、標準的な手順を用いて選択的に単離し、クローニングし、そして特徴付ける。このｃＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡマイクロアレイを構築する。
【０２２５】
毒性活性を示す応答をまた、薬剤投与後の特定の時間におよび／または特定のセットの条件下で細胞、組織、器官、または真骨魚類全体において発現された１以上の異なるタンパク質のレベルを抽出および測定することにより、動物の１以上の細胞、組織、器官についての、または動物全体についての、タンパク質発現プロフィールの変化として検出し得る。このタンパク質ベースのアプローチでは、翻訳後修飾または翻訳後プロセシング（例えば、切断）の差異を、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて調べ得る。コントロール胚および化合物に曝露した胚からの抽出物を、電気泳動での分離の前に各抽出物を異なる発蛍光団でタグ化することにより、同じゲルにおいて直接比較し得る。このタグは、電気泳動の間に標識されたタンパク質の相対移動度に対して効果を有さない。両方のサンプルにおいて改変されないで出現するタンパク質は、両方の蛍光色素から構成される点として出現する。切断、リン酸化などの結果として２つのサンプル間で異なるタンパク質は、元の抽出されたサンプルにおいてタグ化されたように蛍光を発する。
【０２２６】
当業者は、種々の技術を一緒にまたは別々に用いてシグナル（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、特定のタンパク質の抗体染色など）を生成し得、そして応答を（例えば、比色定量、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、デジタル画像解析、標準的なマイクロプレートリーダー技術、蛍光比色法（時間分解型蛍光比色法を含む）、および化学発光、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、または最新の機器の使用（例えば、レーザー走査デバイス、蛍光測定器、フォトダイオード、量子計数管、プレートリーダー、上方蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメーター、キャピラリー電気泳動検出器、またはシグナルを増幅するための手段（例えば、光電子倍増管）によって）検出および評価し得ることを認識する。
【０２２７】
（Ｃ．毒性活性および／または新脈管形成活性および／または細胞死活性についての薬剤の同時スクリーニング）
本明細書に記載される毒性活性についての薬剤のスクリーニングのための方法は、新脈管形成活性（第ＩＩ節）および細胞死活性（第ＩＩＩ節）について薬剤をスクリーニングする方法を含む本発明の他の方法と組み合わせられ得る。透明な真骨魚類について以前に記載したように、真骨魚類まるごとまたは１つ以上の組織または器官におけるそのような複数活性およびそのような活性から生じる応答を、同時にかつ予め設定された時間間隔で評価することは可能である。毒性スクリーニングを細胞死活性についてのスクリーニングと組み合わせるアッセイは、以前に議論したように、薬剤の投与から生じる有害かつ致死的な応答、適切な投薬量を同定するために、ならびに有効な治療薬および処置プログラムの開発において有用である。
【０２２８】
種々の技術（蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、デジタル画像解析、標準的マイクロプレートリーダー技術（比色定量、蛍光定量（時間分解型蛍光定量を含む）、および化学発光）、インサイチュハイブリダイゼーション、特異的なタンパク質の抗体染色、酵素変化、真骨魚類における時間的および空間的なタンパク質分布に於ける変化などを含む）が、複数の活性および応答を一緒にまたは別々に分析するために使用され得る。
【０２２９】
１つの局面において、本発明は、細胞死活性に対する効果（上記の通り）を示す真骨魚類における応答を検出することにより、細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする工程をさらに含む、上記のような毒性活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。細胞死の組織および器官特異的パターンは、器官に対する毒性を分析するために種々のマーカーを検査することに加えて、評価され得る。細胞死を経る細胞は、上記で議論したような手段を含む種々の手段（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素ファミリーからの膜不透過性の核染色色素、ＴＵＮＥＬアッセイ、またはカスパーゼ活性の比色定量もしくは蛍光定量酵素アッセイを使用して）によって同定され得る。
【０２３０】
別の局面において、本発明は、新脈管形成活性における増加または減少を示す真骨魚類における応答を検出することによって、新脈管形成における増加または減少について薬剤をスクリーニングする工程をさらに含む、上記のように毒性活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０２３１】
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュにおける肝臓および腎臓に対する毒性活性についての化合物のスクリーニング）
（Ａ．方法）
１）胚収集
野生型ゼブラフィッシュ胚を天然の対となる交配によって生成し、生存性について選別し、そしてセクションＩＩに記載のように、新脈管形成活性についてのスクリーニング方法のために収集した。生存性について選別される前の胚。この魚の胚は、付着している卵黄嚢から食物を受けるので、さらなる維持管理は必要とされなかった。
【０２３２】
２）化合物スクリーニング
上記のように、動物まるごと（例えば、真骨魚類）ならびに特定の器官および組織に対する、毒性活性について記載の方法を使用して種々の化合物がスクリーニングされ得る。治療的／薬理学的化合物の発生性の毒性効果がまた研究され得；真骨魚類を使用したときのそのような化合物での結果は、哺乳動物モデルを使用してＮＣＩによって得られる結果と比較され得る。このような比較によって、潜在的な治療化合物の発生性の毒性効果についての予言的アッセイのための本発明の方法および動物モデルの使用が評価され得る。
【０２３３】
３）胚の維持および化合物の投与
受精したゼブラフィッシュ胚を、我々の水産養殖設備における天然の放卵から入手した。バッチ間の変動を減少させるために、３または４個の独立した交配からの胚の無作為化したサンプルを使用した。試験培地を、前出のＷｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄに従って、蒸留水２５リットル中、５ｇのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  Ｓａｌｔを３ｇのＣａＳＯ4と混合することにより調製した。実験を通して、試験培地において胚を維持した。発生２４時間での胚（卵殻を有する）を、化学的化合物およびコントロールの異なる濃度の化学的化合物に５日間連続的に曝露した。一般に、濃度は、１００ナノモル濃度（ｎＭ）から１００マイクロモル濃度（μＭ）までの範囲であった。試験を各シリーズの希釈について４回繰り返し、そして標準偏差を、各処理について計算した（「統計学的方法」の節を参照）。濃度あたり１０個の胚を、２４マルチウェルプレートを使用して総容量１ｍｌ（１００μｌ／胚の一定比）に曝露した。（９６ウェルプレートのような他のサイズのマルチウェルプレートもまた、スクリーニングを容易にするために使用され得る）。その化合物を毎日更新した。全ての場合において、０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、処理の間のキャリア溶媒として使用した。０．１％ＤＭＳＯを含むコントロールおよび含まないコントロールを、全ての実験において行った。このアプローチは、麻酔薬および他の化学物質を、魚の胚に導入するために使用されてきた（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出）。
【０２３４】
光への曝露に起因する化合物の分解を防止するために、暗黒下で一定の温度（２８〜２８．５℃）で実験を行った。死滅した胚を毎日除去し、計数し、そして中央致死濃度（ＬＣ５０、本明細書の「統計的方法」の節を参照のこと）を計算するために用いた。毎日、生存している胚を、解剖用双眼顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、倍率３０〜５０×）下で視覚的に分析した。巨視的な奇形（例えば、軸方向の欠陥、胚の死亡率、成長阻害、一般的な奇形（小頭症、大頭症、尾の切断、尾の奇形、体節の軸の構造の欠失などを含む））を、動物まるごとに対する毒性を評価するために、観察し、分類分けし、そして計数した。致死的な化合物、または発生の間（例えば、発生の最初の５日間）にこれらもしくは任意の記録された奇形もしくは破壊を誘導した化合物、器官に対する毒性効果についてさらに試験した。この毒性化合物によって影響を受ける胚発生段階が決定され得る。器官毒性は、インサイチュハイブリダイゼーション、酵素アッセイ、および免疫化学手順を使用して生存している胚において評価され得る。
【０２３５】
毒性効果についてスクリーニングされた治療薬物について、Ｍｅｄｉａｎ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＥＣ５０）（標的に対して所望の効果を生じるために必要とされる濃度の中央値）が決定され得る。治療的ウインドウ（ＴＷ）（例えば、ＬＣ５０／ＥＣ５０）もまた、決定され得る；高Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｗｉｎｄｏｗ（例えば、１００または１０００）を示す化合物は、良好な潜在的薬物候補である。なぜなら、治療濃度において毒性が低いからである。
【０２３６】
４）組織および器官に対する毒性試験
ａ）インサイチュハイブリダイゼーション
特定の組織および器官の変性をアッセイするために、ジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識したＲＮＡプローブでの全マウントインサイチュハイブリダイゼーションを使用し得る。初期胚組織を染色するプローブには、体節形成の間の沿軸中胚葉についてＭｙｏＤ；脊索について短尾奇形が含まれる。器官を特異的に染色するプローブには、尾側の中脳および前側の菱脳の異常発生の検出のためのｋｒｘ２０およびｐａｘ２；予定脳（ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ  ｂｒａｉｎ）、脊髄、および排泄系についてのｃ−ｒｅｔ（発生中の腎臓；前腎管（ｎｅｐｈｒｉｃ  ｄｕｅｔ）および前腎）；ならびに眼蓋（ｏｐｔｉｃ  ｔｅｃｔｕｍ）、肝臓原基、および胃についてのｐｅｓが含まれる。インサイチュハイブリダイゼーションは、以下のように実施される：胚をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして６５℃でハイブリダイズする。顕微鏡下での視覚的検査のために、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を使用して、ＮＢＴ／Ｘホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）での染色後にシグナルを検出する。組織および器官の発生および機能（例えば、肝臓および腎臓）に対する毒性効果、異なる器官および組織における免疫組織化学的位置決定によるシトクローム（Ｃｙｔ．）Ｐ−４５０の構成性アイソザイムＬＭＣ２およびダイオキシン誘導性アイソザイムＬＭ４Ｂの発現および誘導性は、Ｂｕｃｈｍａｎｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：１６０−１６９（１９９３）に記載される方法を用いて分析され得る。
【０２３７】
自動化インサイチュハイブリダイゼーション画像化分析は、ＮＢＴ／Ｘホスファターゼでの染色後にシグナルを検出するために、アルカリホスファターゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を使用して容易に行われる。
【０２３８】
ｂ）染色による肝臓における毒性活性の評価
処理された動物まるごとの肝臓における毒性活性を、迅速比色定量染色手順を使用して視覚的に評価し得る。この手順は、動物まるごと（例えば、ゼブラフィッシュ胚）の肝臓、胃、および消化管における天然にビオチン化したカルボキシラーゼ酵素を検出するために、ストレプトアビジン（アビジン）結合体化レポーター酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）の使用に基づいている。これらのビオチニルリジン含有酵素（例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよび他のカルボキシラーゼ）は、主に、肝臓および消化管に存在する。結果として、染色は、器官特異的である（図１１）。肝臓の定量的なビオチン化評価がなされ得る。ビオチン化の視覚的な検出により、肝臓のサイズおよび位置が決定され得る。
【０２３９】
ゼブラフィッシュ胚（４、５、または６日齢）を、４％パラホルムアルデヒドで１時間、室温で固定し、そして１００％メタノールで一晩、−２０℃で処理した。胚を、再水和し、そしてＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳＴで洗浄後、胚をブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中、３％  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で、１時間インキュベートし、そして漂白溶液（５％ホルムアミド、０．５×ＳＳＣ、Ｈ2Ｏ2  １０％）で２０分間、自然光照射下で処理した。漂白後、胚を同じブロッキング溶液で再び（２回目）１時間インキュベートし、そしてストレプトアビジン結合体化ペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）（同じブロッキング溶液中で１：１００希釈）とともに振盪させながら室温で２時間インキュベートした。次いで、胚を２０分間３回ＰＢＳＴで洗浄し、そしてペルオキシダーゼについて２つの異なる色素：肝臓染色を評価するためのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ）（不溶性）、および比色定量方法を使用して定量的可視的シグナルを測定するための２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ）（可溶性）で染色した。使用したＤＡＢ染色溶液は、以下を含んでいた：１ｍｌ  ＤＡＢストック溶液（ＰＢＳ中５ｍｇのジアミノベンジジン／ｍｌ、ｐＨ７．４）、９ｍｌのＰＢＳ、１０μｌのＨ2Ｏ2（３０％）。通常、特異的肝臓染色は１〜５分で可視化された。ＤＡＢ溶液についての染色は、水での何回かの洗浄によって終結させた。ＡＢＴＳ比色定量法は、１０ｍｌのＡＢＴＳ溶液（３３ｍｌの０．１Ｍ  クエン酸／ＯＨ、ｐＨ４．３５中１０ｍｇ）および１０μｌの過酸化水素（３０％ストック）を使用し、そして室温で１つの条件あたり少なくとも５個の胚（１ｍｌのＡＢＴＳ溶液／５個の胚）で３０分間行った。ＡＢＴＳ染色を、２０％ＳＤＳ／５０％Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミドで終結させた。ＡＢＴＳシグナルを、４０５ナノメータ（ｎｍ）で分光光度計を使用して、その溶液の吸光度を測定することによって検出した。各条件について、４回繰り返し、そして下記の「統計的方法」のセクションに示すように標準偏差「Ｓ」を計算した。
【０２４０】
ｃ）染色による腎臓における毒性活性の評価
腎臓（前腎）での毒性活性は、処理された動物まるごと（例えば、ゼブラフィッシュ）の腎臓の比色定量染色によって視覚的に評価され得る。ゼブラフィッシュ前腎は、色素生産性色素を使用して容易にアッセイし得る高レベルの酵素アルカリホスファターゼを発現する。ゼブラフィッシュ胚において腎臓を染色するために、胚を２％パラホルムアルデヒドで一晩４℃で固定し、次いで、１００％メタノールで３０分間室温で処理した。胚を再び水和し、そしてＮＴＭＴ緩衝液（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温で平衡化し、次いで染色溶液（同じ緩衝液中に平衡化した７５ｍｇ／ｍｌ  ＮＢＴおよび５０ｍｇ／ｍｌ  Ｘホスフェート）で染色した。通常、特異的な腎臓染色を、１０〜２０分間可視化した（図１４）。この染色法を用いて、アスピリンおよびデキサメタゾンの腎臓に対する毒性活性を評価した（以下を参照のこと）。
【０２４１】
ｄ）酵素活性の評価
酵素活性の評価についての方法論は、異なる時点（数時間から数日）での異なる化合物への真骨魚類胚の曝露、および引き続く異なる酵素活性のインビトロ分析に関与する。胚を、異なる化合物の存在下または非存在下（すなわち、コントロール）でマルチウェルプレートにおいてインキュベートする。曝露後、それらを使用して細胞溶解産物調製物を得る。酵素を、終点または速度論実験において、比色定量色素または蛍光定量色素の使用によりアッセイする。このプレートを適切なマイクロプレートリーダーにおいて読みとる。多酵素マイクロアレイが構築され得る。
【０２４２】
５）アスピリンおよびデキサメタゾンの器官毒性活性の評価
実行可能性研究において、アスピリンおよびデキサメタゾンをゼブラフィッシュ胚に対する毒性活性について、本明細書に記載の本発明の方法を用いてスクリーニングした。アスピリン（シクロオキシゲナーゼの一般的なインヒビターである）（Ｂｏｓｍａｎ，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：３２４−３３４（１９９４））は、哺乳動物胚における種々の器官（腎臓を含む）において毒性を生じることが以前に示された（Ｕｎｇｖａｒｙら、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ  ２７（２）：２６１−６９（１９８３）。デキサメタゾン（免疫抑制剤（Ｉｉｄａら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９：１１９１−１２０２（１９９８）））は、肝臓毒性および胃腸毒性を産生すること、および癌治療を受けている子供において肝毒性であることが以前に示された（Ｗｏｌｆｆら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １８（４Ｂ）：２８９５−９９（１９９８））。
【０２４３】
結果を表４に表す。アスピリンにおいてと同様に、デキサメタゾンについては、ゼブラフィッシュ胚で得られたＬＣ５０は、マウスおよびラットについて以前に記載された値と類似していた（表４）。肝臓毒性および胃腸毒性ならびに用量応答性効果がまた、観察された（図１２Ａ〜１２Ｂ）。上記で議論した定量的な比色定量終点法を、肝臓に対する薬物処理の効果を測定するために使用した（図１３）。１００μＭのデキサメタゾンでの処理は、未処理の胚と比較して、比色定量シグナルを約７０％低減させた（コントロール、０％デキサメタゾン、図１３）。サイズの減少と十分に相関する色における変化は、色素生産性色素を使用して肝臓において以前に観察された（図１２Ｂ、下）。これは、このアッセイの再現性および精度を示唆する。この方法は、定量的であり（良好な信頼限界で）、迅速であり、そして実施するのが容易であった。
【０２４４】
この方法は、自動化毒性スクリーニングの公知の装置および技術を使用して自動化され得る。
【０２４５】
【表４】
0004383533.tif 000006
６）統計学的方法
ａ）ＬＣ５０の推定
これらの研究においてアスピリンおよびデキサメタゾンで試験した濃度について、部分的致死性はなく、そして効果濃度のパラメータ「死亡なし」（０％）および「死亡」（１００％）の幾何平均はＬＣ５０とされ、そして二項式信頼限界をＳｔｅｐｈａｎ、「ＬＤ５０を計算する方法」、Ａｑｕａｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈａｚａｒｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｆ．Ｌ．ＭａｙｃｅおよびＪ．Ｌ．Ｈａｍｅｌｉｎｋ編）ＡＳＴＭ  ＳＴＰ  ６３４、６５〜８４頁、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９７７）に従って計算した。
【０２４６】
ｂ）標準偏差
上記の比色定量肝臓染色法を、定性的データ（すなわち、器官のサイズ、存在、または位置の変化）を得るために使用し、そして各処理に見出される変化の有意性を研究するために使用した。各条件について、４回繰り返し、そして統計値を標準偏差とともに使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ９７または類似の公知の、標準的ソフトウェア／グラフィックスプログラムを使用してグラフィックスを作製した。
【０２４７】
７）催奇効果
例えば、成長阻害および奇形発生（小頭症、大頭症、尾の切断、尾の奇形を含む）のような、化合物の毒性活性を示すさらなる毒性応答／効果についての情報を、解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、倍率３０〜５０×）を使用して視覚的検査によって評価し得る。多数の毒性応答および効果は、透明な真骨魚類胚において迅速かつ同時に評価され得る。
【０２４８】
８）さらなる生体マーカーの評価
市販されている抗体は、腎臓および肝臓の異なる酵素の発現および誘導性を免疫組織化学により検出するために使用され得る。これらの生体マーカーを用いて、薬物および化合物（公知の毒性を有するものを含む）の毒性が、調査され得る。差引きライブラリースクリーニングにおいて使用されるべき新たな薬物の毒性効果もまた、本明細書に記載の方法に従って容易に評価され得る。このような抗体の例には、例えば、抗プロトンポンプＨ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（腎臓、Ｐａｎｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；以前に記載されたようにシトクロームＰ−４５０の抗ＬＭＣ２および抗ダイオキシン誘導性アイソザイムＬＭ４Ｂ（腎臓および肝臓）（Ｂｕｃｈｍａｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：１６０−６９（１９９３））；抗グルタチオンＳトランスフェラーゼ（腎臓、肝臓、Ｐａｎｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。
【０２４９】
（２．差引きライブラリー技術を使用する化合物毒性応答に関与する器官特異的遺伝子の同定）
薬物毒性についての予想法として、多数パラメータ毒性試験が、非常に価値がありかつ有用である。差引きライブラリー実験は、このようなアプローチを開発するのに有用である。このような方法論は、化学物質／薬物への曝露の結果として標的器官において差引きに発現する遺伝子の同定を可能にする。現在、薬物／化学物質毒性応答および薬物／化学物質代謝活性化に関与する遺伝子／経路は、主に利用可能なプローブおよび基質がないために、アッセイするのが困難である。器官薬物毒性に関するさらなる情報は、差引きライブラリー法を使用して、動物（例えば、真骨魚類）において新たな遺伝子を単離することによって得られ得る。遺伝子がクローニングされ、その遺伝子の発現プロフィールが評価され、そして毒性についてのマーカーとしてのそれらの有意性が、哺乳動物において以前に得られたデータと比較される。
【０２５０】
（Ａ．差引きライブラリー技術）
薬物／化学物質への曝露の結果として標的器官において差引きに発現される遺伝子は、以下のように、差引きライブラリー技術を使用することによって、同定され得る。本発明者らのＬＣ５０および器官毒性法および上記の分析からの選択された化合物を使用して、ゼブラフィッシュ胚を器官毒性を誘導するように処理する。薬物処理の間の異なる時点において、肝臓および／または腎臓（処理およびコントロール）を解剖する。この材料は、処理された胚およびコントロール胚において差引きに発現される新たな遺伝子を単離するための差引きライブラリーを調製するために使用される。差引きライブラリー技術（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、選択的に遺伝子を単離する。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔシステムは、抑制ＰＣＲを使用し、そしてｃＤＮＡを差し引きしそして均等化するのに、わずか１回の差引きハイブリダイゼーションを必要とするのみである。さらに、この技術は、比較している２つの型の組織から調製される非常に低い量のポリＡ＋ＲＮＡ（通常、０．５〜２．０μｇ）を必要とする。最近、この技術を使用して、カフェインでアップレギュレートされるいくつかの遺伝子（ＩＧＦ−１Ｂを含む）を、前Ｂ細胞株１〜８から、そしてナチュラルキラー細胞抗原ＮＫＲ−Ｐ１（ＨｕｂａｎｋおよびＳｃｈａｔｚ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５６４０−５６４８（１９９４））の推定ホモログを単離した。
【０２５１】
差引きライブラリー技術によって同定された遺伝子を選択し、そして化合物／薬物への曝露の間の胚におけるこれらの遺伝子の発現パターンを評価し得る。この発現パターンを、類似の条件下で哺乳動物ホモログにおいて見出されるパターンと比較し得る。毒性（例えば、器官毒性）の「良好な」インジケータまたはマーカーとして作用する遺伝子が、同定および選択され得る。
【０２５２】
（Ｂ．トランスジェニック真骨魚類）
標的遺伝子から上流の、推定の毒性値応答を有する適切な調節領域を使用して、レポーター遺伝子を有するトランスジェニック真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）を構築し得る。トランスジェニックゼブラフィッシュにおけるレポーター遺伝子の発現をコントロールする調節領域を使用するために、これらの遺伝子の５’上流領域を分析する。このアプローチにおいて、差引きライブラリー技術を使用して単離された遺伝子を使用して、５’調節領域を分析する。レポーター遺伝子（例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をこれらの調節領域の制御下で保有するプラスミドを構築するために、サイズ（１または２キロベース）および発現プロフィールにおいて適切な上流の調節領域を用いる。これらのプラスミドを使用して、Ｌｏｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：４１０５−４１１１（１９９７）に記載されるようにトランスジェニック魚を産生する。例えば、ゼブラフィッシュは透明なので、ＧＦＰ（特定の器官および組織におけるレポーター遺伝子）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの細胞は、標準的な蛍光に基づく検出技術を使用して、インビボで検出され得る。特に、ＧＦＰを発現する細胞が青色光または紫外線（ＵＶ）光で照射される場合、明るい緑の蛍光が観察される。光刺激ＧＦＰ蛍光技術は、コファクター、基質、またはさらなる遺伝子産物を必要としない。従って、スクリーニングがインビボで行われ得、そして同じ胚を使用して、毒性効果が、例えば、蛍光プレートリーダーを使用して経時的にモニターされ得る。このスクリーニング法を使用して、他の方法ではアッセイするのが困難である薬物応答に関与する多くの遺伝子が容易に評価され得る。
【０２５３】
（Ｃ．ゼブラフィッシュｃＤＮＡマイクロアレイ）
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術は、薬物毒性応答における遺伝子発現の複雑な組み合わせおよび代謝活性化現象のプロフィールを作るのに使用され得る。特定の器官毒性の遺伝子発現を、上記の差引きライブラリー技術によって単離された選択されたゼブラフィッシュ遺伝子および他の遺伝子供給源のマイクロアレイを使用してモニターし得る。ｃＤＮＡアレイは、単純であり、そしてハイブリダイゼーション結果の直接読み取りを可能にする；従って、これらは、異なる時点で薬物処理を経験した組織における遺伝子発現パターンを研究するための理想的な技術を構築する（Ｈｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５（１９９７））。
【０２５４】
（Ｄ．スクリーニングの自動化）
上記の多数パラメータ方法論は、標準的な装置およびコンピューターソフトウェアプログラムを使用して自動化され得、そして１週間あたり数百の化合物のスクリーニングを可能にする。真骨魚類胚のスクリーニングを、受精胚を含む９６マルチウェル培養プレートにおいて行い得る。上記の他のスクリーニング法に関しては、真骨魚類胚が通常１００μｌの水において発生するので、化合物および色素は、容易に培地に添加され得る。さらに、透明な真骨魚類胚は、それらが死んだ場合には不透明になるので、胚の死亡率は、標準的なマイクロタイタープレートリーダーを使用してＬＣ５０を計算するのは比較的簡単である。器官の毒性について、ｃＤＮＡマイクロアレイアッセイは、良好な信頼限界を伴って定量的（色または蛍光）であり、そしてＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュは、経時的にモニターされ得るので、マルチウェルプレートリーダー形式（例えば、９６ウェルまたは任意の他の数のマルチウェル）が使用され得る。
【０２５５】
上記の発明は、明確性および理解のために、いくらか詳細に記載されているが、本開示を読めば、形態および詳細の種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者には明らかである。上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の他の改変が、当業者には容易に明らかであり、本発明の特許請求の範囲に包含される。従って、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、その代わりに、添付の特許請求の範囲をその等価物の全範囲とともに参照して決定されるべきである。本出願において引用された全ての刊行物、参考文献、および特許文献は、本明細書において、各々の刊行物または特許文献がそのように個々に示されているのと同程度まで、全ての目的のためにその全体が参考として援用される
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ）および新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のプロセスを示す概略図である。
【図２】  図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、発生７２時間（ｈｒ）でのゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。この胚は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で染色されている。血管は、アルカリフォスファターゼ染色後、光学顕微鏡で可視化されている。０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理したコントロールの胚（図２Ａ）は、正常な形態および血管形成を有する。腸管下の血管（ＳＩＶ）（矢印）は、特徴的なパターンである。１０マイクロモル（μＭ）の濃度でフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）誘導体で処理した胚（図２Ｂ）は、発生の遅延（ひれの大きさおよび体幹（ａｘｉａｌ）の長さの減少）およびＳＩＶ（矢印）の損失の両方を示す。原腎管は、ＡＰ染色についての陽性コントロールを提供する（三角印）。１００μＭの濃度でフマギリン誘導体で処理した胚（図２Ｃ）は、死んでいる。フマギリン誘導体は、胚において発育の遅延および毒性応答を誘導する。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。
【図３】  図３Ａおよび３Ｂは、発生７２時間でのゼブラフィッシュの胚の２つの側面を示す解剖顕微鏡による写真である。それぞれの胚は、アルカリフォスファターゼで染色されている。図３Ａは、コントロールを示す；図３Ｂは、ＮＣＩライブラリー由来の化合物で処理した処理胚を示す。両方の胚は、形態学的に正常であるが、処理胚は、ＳＩＶ（矢印）を全く形成することができず、そして腸管下血管の特異的な損失を示す。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。
【図４】  図４は、発生７２時間でのアルカリホスファターゼ染色したゼブラフィッシュの胚の側面の解剖顕微鏡による写真である。この胚は、切断、心嚢浮腫（矢印）およびＳＩＶ形成（三角印）の減弱を誘導する化合物で処置している。ＳＩＶバスケットにおける外側血管の損失が示される。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。
【図５】  図５は、脊索（ｎｏｔｏｃｏｒｄ）の小疱形成（矢印）を誘導するが、ＳＩＶ形成（三角印）には影響しない化合物で処理したゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。この胚は、ＡＰで染色されている。体幹の欠損は、通常、脈管形成に影響しない。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。
【図６】  図６Ａ〜Ｄは、発生７２時間でのゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。胚は、ＡＰで染色されている。ＶＥＧＦを、胚の卵黄に注入した場合（図６Ａおよび６Ｃ）、２つの脈管形成の表現型が観察された：１）腸管下の血管バスケットから突出する長いスパイクの出現（長い矢印）；および２）腸管下のバスケット中の血管直径の増加（三角印）。ＶＥＧＦを胚の囲卵の空隙（図６）に注入した場合、本発明者らは、大きい血管の融合、不適切な血管形成（矢印）、ならびに心臓の欠陥（長い矢印）および発生の欠陥を観察した。緩衝液が囲卵の空隙のいずれかの卵黄に注入されたコントロール胚（図６Ｂ）は正常であった。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。
【図７】  図７は、発生３日でのゼブラフィッシュの胚のアルカリホスファターゼ染色の複合顕微鏡（対物１０×）による写真である。未処理胚（上側）および処理胚（下側）のこれらの背面は、腸管下の静脈（矢印）に対する抗新脈管形成薬オビシリン（Ｏｖｉｃｉｌｌｉｎ）の効果を示す。腸管下の血管において減少を生じることに加えて、この薬剤は、心嚢浮腫（三角印）を生じることを含む、他の効果を有した。この図において、文字「Ｅ」は眼を示し、そして文字「Ｙ」は、卵黄球を示す。
【図８】  図８は、ゼブラフィッシュの胚の１日目での実施したｆｌｋ−１での全ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示す複合顕微鏡（対物２０×）による写真である。体幹のこの側面において、体節内血管（矢印）（背面の大動脈から出芽している）（Ａ）は、プローブで標識されている。前方が左側で、そして背面が上部である。
【図９】  図９は、ゼブラフィッシュの胚の発生３日目で側面プロフィールを示すマイクロアンギオグラフ（ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｇｒａｐｈ）であり、正常な血管パターンを示し、これには、頭部血管（Ｃ）、体節間血管（Ｉ）および腸管下血管（Ｓ）を含む。文字「Ｈ」は、心臓を示し、そして文字「Ｅ」は、眼を示す。マイクロアンギオグラフを作製するためのデータは、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡から得、そしてデジタル画像処理のソフトウェアを用いて処理した。
【図１０】  図１０Ａおよび１０Ｂは、複合顕微鏡下の複合顕微鏡写真（対物×１０）であり、それぞれ、正常なゼブラフィッシュ胚の位相画像（図１０Ａ）、およびレチノイン酸処理したゼブラフィッシュの胚の位相画像（図１０Ｂ）を示す。レチノイン酸（ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で処理した胚を、１２〜１４時間、１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）に曝露した。アポトーシスが、ＲＡ処理した胚の菱脳に生じた。これは、正常な胚と比較した場合のレチノイン酸処理した胚における菱脳の組織崩壊および耳胞と眼との間の間隔の有意な減少により証明される（図１０Ａおよび１０Ｂの矢印を比較のこと）。文字「Ｅ」は眼を示し、そして文字「ＹＢ」は、卵黄球を示し、そして文字「ＯＴ」は、耳胞を示す。
【図１１】  図１１は、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼで染色した５日目のゼブラフィッシュの胚の側面示す解剖顕微鏡による写真である。肝臓（矢印）および腸（Ｇ）の両方が染色されている。胚の眼（Ｅ）および耳胞（ＯＶ）を位置付けのために印している。拡大率は、図１２Ａおよび１２Ｂに匹敵する。
【図１２】  図１２Ａおよび１２Ｂは、特定の用量のデキサメサゾンを投与されたゼブラフィッシュ胚の用量反応を示す解剖顕微鏡による写真である。ゼブラフィッシュの胚をデキサメサゾンで５日間処理し、肝臓の発生および機能に対するデキサメサゾンの効果を決定した。胚をパラホルムアルデヒドで固定し、そしてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとともにインキュベートし、発色色素とのインキュベート後、肝臓を検出した。矢印は、肝臓の位置を示す。図１２Ａ（上側）、６日齢の非処理の胚（コントロール胚）；図１２Ｂ（下側）、５日間１００μＭのデキサメサゾンで処理した６日齢の胚。デキサメサゾンで処理した胚は、コントロールの胚に比べて、肝臓のサイズの劇的な減少を示した。スケール棒＝１ミリメートル（ｍｍ）；眼（Ｅ）；腸（Ｇ）；尾（Ｔ）。
【図１３】  図１３は、種々の用量のデキサメサゾンに対するゼブラフィッシュの胚の用量反応を示すグラフの図である。ゼブラフィッシュの胚を、図１２Ａおよび１２Ｂについて記載したように、種々の濃度のデキサメサゾン（すなわち、１μＭ〜１００μＭの範囲にわたる濃度）に５日間、曝露した。処理後、この胚を可溶性の色素で染色し、特異的に肝臓の欠陥を検出した。染色後、ペルオキシダーゼにより形成される産物を４０５ナノメートル（ｎｍ）での吸光度により検出した。この値は、コントロール（すなわち非処理の胚）を１００％とした場合の、コントロールのパーセンテージ（％コントロール）として表した。標準偏差も計算し、そしてデータに加えた。デキサメサゾンにより生じる肝臓毒性は、肝臓のサイズの減少により示唆される。
【図１４】  図１４は、パラホルムアルデヒドで固定し、そしてアルカリホスファターゼで染色した６日齢のゼブラフィッシュの胚の写真である。矢印は、染色した胚の腎臓の位置を示す。スケール棒＝１ｍｍ；眼（Ｅ）；腸（Ｇ）；尾（Ｔ）。
【図１】
0004383533.tif 000007
【図２】
0004383533.tif 000008
【図３】
0004383533.tif 000009
【図４】
0004383533.tif 000010
【図５】
0004383533.tif 000011
【図６】
0004383533.tif 000012
【図７】
0004383533.tif 000013
【図８】
0004383533.tif 000014
【図９】
0004383533.tif 000015
【図１０】
0004383533.tif 000016
【図１１】
0004383533.tif 000017
【図１２】
0004383533.tif 000018
【図１３】
0004383533.tif 000019
【図１４】
0004383533.tif 000020