(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン２及びエクソン３を欠失した第１の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマーとして用い、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン４を欠失した第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をリバース側プライマーとして用いてヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含み、前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数が、それぞれ１５塩基以上である、ヒトチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡの測定方法。
【請求項２】
前記フォワード側プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの206nt〜454ntの領域内に少なくともその１部がハイブリダイズする核酸であり、前記リバース側プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの455nt〜556ntの領域内に少なくともその１部がハイブリダイズする核酸である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フォワード側プライマーは、少なくともその３’末端が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの206nt〜454ntの領域内の塩基に対合し、前記リバース側プライマーは、少なくともその３’末端が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの455nt〜556ntの領域内の塩基に対合する請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記フォワード側プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの206nt〜454ntの領域内にハイブリダイズする核酸であり、前記リバース側プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡの455nt〜556ntの領域内にハイブリダイズする核酸である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーは、それぞれ配列表の配列番号１に示す塩基配列の対応部分の塩基配列と同一の塩基配列又は該塩基配列と１０％以下の塩基が置換した塩基配列を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーは、それぞれ配列表の配列番号１に示す塩基配列の対応部分の塩基配列と同一の塩基配列を有する請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記フォワード側プライマーは、配列表の配列番号１で示される塩基配列中の210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt及び450ntから成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記フォワード側プライマーは、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超える請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記フォワード側プライマーは、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有する請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記リバース側プライマーは、配列表の配列番号１で示される塩基配列中の464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntから成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リバース側プライマーは、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超える請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記リバース側プライマーは、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有する請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数が、それぞれ１５〜３０である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン２及びエクソン３を欠失した第１の変異型ｃＤＮＡ及びヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン４を欠失した第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマー又はリバース側プライマーとして用いてヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含む、ヒトチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡの測定方法。
【請求項１５】
前記フォワード側プライマー又はリバース側プライマーは、配列表の配列番号１で示される塩基配列中の210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt、450nt、464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntから成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
増幅をRT-PCR法により行う請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトチミジル酸合成酵素ｃＤＮＡの測定方法並びにそれに用いられるプライマー、プローブ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
チミジル酸合成酵素(thymidylate synthase; EC2.1.1.45、以下、「TS」と言うことがある）は、デオキシウリジル酸からチミジル酸を生成する反応を触媒する酵素で、チミンの供給に不可欠なものであり、また、ＤＮＡ前駆体供給経路の律速酵素の１つである。従って、細胞増殖の盛んな癌細胞中でその生産量が多くなることが知られている。
【０００３】
一方、5-フルオロウラシル（以下、「5-FU」と言うことがある）や5-フルオロデオキシウリジン等のフルオロピリミジン系の抗癌剤は、TSを標的とするものである。例えば、5-FUは、生体内でリボシル化及びリン酸化を受け、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン5'-リン酸となり、これがデオキシウリジル酸をチミジル酸に転換するTSを阻害することによりＤＮＡ合成を抑制する。
【０００４】
5-FU等のフルオロピリミジン系の抗癌剤は、TS量の少ない癌細胞に対してはよく効き、TS量の多い癌細胞に対してはあまりよく効かないことがわかっている。従って、癌細胞中のTSの生産量を測定することは、抗癌剤の治療効果を予測し、抗癌剤を選定することに有用である。また、これらの抗癌剤により治療効果が得られる場合には、治療期間中に癌細胞中のTSの生産が減少し又は阻止されることも知られており、癌細胞中のTSの生産量を測定することは、抗癌剤による治療効果の判定にも有用である。
【０００５】
従来、細胞中のTSの生産量の測定は、多くの場合、免疫測定により行われている。また、癌細胞中のTSのｍＲＮＡ量を測定することにより、TSの生産量を測定し、それによって抗癌剤治療の予後を予測することも行われている。ｍＲＮＡ量は、リアルタイム検出RT-PCR法やRT-PCRサザン法等の、核酸増幅過程を含む方法により測定されている。
【０００６】
しかしながら、癌細胞中のTSのｍＲＮＡの測定量が減少しないのに予後が良好であるケースがしばしば認められ、従来法によるｍＲＮＡの測定により予後を測定する方法の信頼性は必ずしも満足できなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、活性を有するTSのみを的確に測定することができる、TSのｍＲＮＡの測定方法並びにそのためのプライマー、プローブ及びキットを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、ヒト胃癌組織由来セルライン及びヒト大腸癌組織由来セルライン中に、オルタナティブスプライシング(alternative splicing)により、ヒトTS遺伝子のエクソン２及びエクソン３が欠失した変異型のｍＲＮＡ並びに／又はエクソン４が欠失した変異型のｍＲＮＡが生産されていることを見出した。１個又は２個のエクソンが全部欠失した酵素は、酵素活性を有していないと考えられる。従って、これらのオルタナティブスプライシングを考慮し、これらのエクソンの欠失がない、正常なTS mRNAのみを測定することにより、活性のあるTSの生産量を測定することが可能になる。本発明は、これらのエクソンの欠失がない、正常なTS mRNAのみを測定する方法並びにそのためのプライマー、プローブ及びキットを提供するものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン２及びエクソン３を欠失した第１の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマーとして用い、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン４を欠失した第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をリバース側プライマーとして用いてヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含み、前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数が、それぞれ１５塩基以上である、ヒトチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡの測定方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ヒトTSのｃＤＮＡは既にクローニングされており、その塩基配列も報告されている。ヒトTSのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列中、第１番目の塩基（本明細書において、例えば、第１番目の塩基は「1nt」のように表記する）〜205ntがエクソン１、206nt〜279ntがエクソン２、280nt〜454ntがエクソン３、455nt〜556ntがエクソン４、557nt〜732ntがエクソン５、733nt〜804ntがエクソン６、805nt以降がエクソン７に対応する領域である。
【００１１】
下記実施例において詳述するように、本願発明者は、ヒト胃癌組織由来セルラインであるKATO III細胞及びMKN45細胞中で、エクソン２及びエクソン３の全領域が欠失し、他の領域は正常である変異型のｍＲＮＡ（エクソン２及びエクソン３が欠失した変異型を本明細書において「第１の変異型」と呼ぶ）、並びにエクソン４の全領域が欠失し、他の領域は正常である変異型のｍＲＮＡ（エクソン４が欠失した変異型を本明細書において「第２の変異型」と呼ぶ）が生じていることを見出した。さらに、ヒト大腸癌組織由来セルラインであるHCT15細胞でもこれらの変異型ｍＲＮＡが生じていることを確認した。これらの変異では、１個又は２個のエクソンの全領域がすっぽりと欠失し、その他の領域には欠失が生じていないことから、これらの変異は、オルタナティブスプライシングによるものであると考えられる。ヒトTS遺伝子について、これらのオルタナティブスプライシングが起きることは、本願発明者が世界で初めて見出したものであり、本発明は、この新知見に基づくものである。
【００１２】
上記した第１及び第２の変異型では、１個又は２個のエクソンの全領域がすっぽりと欠失しているのであるから、これらの変異型ｍＲＮＡが翻訳されて生成されるTSは、酵素活性を有しないものと考えられる。本発明の方法は、これらのオルタナティブスプライシングによる欠失を有さないｍＲＮＡ又はそれを鋳型として形成されたｃＤＮＡ（本明細書において、これらのオルタナティブスプライシングを有さないTS ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡをそれぞれ「正常型」ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと呼ぶ）のみを測定するものである。
【００１３】
本願発明者は、ヒトTSのｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として形成されたｃＤＮＡを測定するにあたり、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないフォワード側プライマーと、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないリバース側プライマーとを用いてヒトｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅することにより、正常型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのみを増幅することができることに想到した。なぜなら、第１の変異型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡには、フォワード側プライマーがハイブリダイズできないので増幅が起きず、第２の変異型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡには、リバース側プライマーがハイブリダイズできないので増幅が起きず、正常型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのみを増幅することができるからである。
【００１４】
このような増幅の方法として、先ず、RT-PCR法を挙げることができる。なお、RT-PCR法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、このような市販のキットを用いて容易に実施することができる。RT-PCR法では、先ず、検体からｍＲＮＡを抽出し、抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡは、目的とするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて形成してもよいが、ランダムプライマーのような全ｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて全ｍＲＮＡのｃＤＮＡを形成してもよい。ｃＤＮＡの形成は、プライマー及び逆転写酵素の存在下でｍＲＮＡを鋳型としてＤＮＡの相補鎖を形成し、次いで、形成された相補鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡを形成することにより行うことができる。このようにして二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
次に、形成された二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。この際、フォワード側プライマーとして、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプライマーを用い、リバース側プライマーとして、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプライマーを用いる。フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの両者が鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズしないと増幅が起きないので、これらのフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いて増幅を行うことにより第１の異常型及び第２の異常型ｃＤＮＡはいずれも増幅されず、正常型ｃＤＮＡのみが増幅される。
【００１６】
正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないフォワード側プライマーとしては、エクソン２及びエクソン３の領域内、すなわち、配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡの206nt〜454ntの領域内に少なくともその一部がハイブリダイズするものを用いることができる。なお、フォワード側プライマーは、センスプライマーであり、実際には、配列番号１に現実に記載されている塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするものである。配列表には、ルールにより、二本鎖のうちのセンス鎖の塩基配列を記載することになっているので、一本鎖の塩基配列のみが記載されているが、実際には、二本鎖を表示している場合もある。従って、本明細書において、配列表に示される塩基配列中の特定の領域にハイブリダイズするとは、その領域の二本鎖のいずれかの鎖にハイブリダイズするということを意味する。ただし、上記の通り、フォワード側プライマーは、アンチセンス鎖（配列表に実際に記載されている配列の相補鎖）にハイブリダイズするものである。フォワード側プライマーは、その全体が、エクソン２及びエクソン３の領域内（配列番号１の206nt〜454ntの領域内）にハイブリダイズすることが好ましいが、エクソン１又はエクソン４の領域に跨るものであってもよい。この場合、少なくともプライマーの３’末端がエクソン２又はエクソン３の領域内の塩基に対合するものであることが好ましく、及び／又は、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン２又はエクソン３の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このようなプライマーを採用することにより、たとえ、エクソン１又はエクソン４の領域に跨る領域にハイブリダイズするものであっても、プライマーの３’末端にミスマッチがある場合にはプライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくく、また、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン２又はエクソン３の領域にハイブリダイズするものである場合には、第１の変異型ｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保することができる。また、フォワード側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の対応領域（プライマーがハイブリダイズする領域）と完全に同一の塩基配列を有していることが好ましいが、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない又は増幅が起きないという要件が満たされる限り、少数の塩基が置換した配列を有していてもよい。この場合、相補鎖の塩基に対して非相補的な、置換した塩基の数は、プライマーの全塩基数の１０％以下であることが好ましい。また、プライマーの３’末端は、このような置換塩基ではないことが好ましい。なお、ヒトTS遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列の一部が点突然変異した遺伝子も知られているが、このような点突然変異型遺伝子と同一の塩基配列を有するフォワード側プライマーも、上記要件を満足する限り、本発明の方法に用いることができる。
【００１７】
正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないリバース側プライマーとしては、エクソン４の領域内、すなわち、配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡの455nt〜556ntの領域内に少なくともその一部がハイブリダイズするものを用いることができる。なお、リバース側プライマーは、アンチセンスプライマーであり、配列番号１に現実に記載されている塩基配列にハイブリダイズするものである。リバース側プライマーは、その全体が、エクソン４の領域内（配列番号１の455nt〜556ntの領域内）にハイブリダイズすることが好ましいが、エクソン３又はエクソン５の領域に跨るものであってもよい。この場合、少なくともプライマーの３’末端がエクソン４の領域内の塩基に対合するものであることが好ましく、及び／又は、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このようなプライマーを採用することにより、たとえ、エクソン３又はエクソン５の領域に跨る領域にハイブリダイズするものであっても、プライマーの３’末端にミスマッチがある場合にはプライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくく、また、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン４の領域にハイブリダイズするものである場合には、第２の変異型ｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保することができる。また、リバース側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の対応領域（プライマーがハイブリダイズする領域）と完全に同一の塩基配列を有していることが好ましい（なお、リバース側プライマーは、アンチセンスプライマーであり、実際には、配列番号１に現実に記載されている塩基配列にハイブリダイズするものであるが、上記の通り、配列表に記載された配列は、二本鎖を示している場合も包含されるので、本明細書において、配列表に示される塩基配列中の特定の領域と同一の塩基配列を有するとは、その領域の二本鎖のいずれかの鎖に同一の塩基配列を有するということを意味する。ただし、この場合、上記の通り、リバース側プライマーは、アンチセンス鎖（配列表に実際に記載された配列の相補鎖）と同一の塩基配列を有する）。もっとも、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない又は増幅が起きないという要件が満たされる限り、少数の塩基が置換した配列を有していてもよい。この場合、相補鎖の塩基に対して非相補的な、置換した塩基の数は、プライマーの全塩基数の１０％以下であることが好ましい。また、プライマーの３’末端は、このような置換塩基ではないことが好ましい。なお、ヒトTS遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列の一部が点突然変異した遺伝子も知られているが、このような点突然変異型遺伝子と同一の塩基配列を有するリバース側プライマーも、上記要件を満足する限り、本発明の方法に用いることができる。
【００１８】
上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数は、特に限定されないが、それぞれ好ましくは１５〜３０である。また、上記説明において、「ハイブリダイズする」とは、例えば下記実施例に具体的に記載するような、ＰＣＲにおける通常の反応溶液中で、そのアニーリング工程に採用される温度（必ずしも限定されないが通常、５０〜６５℃程度）でハイブリダイズすることを意味する。
【００１９】
本願発明者は、配列番号１に示す塩基配列と相同性を有する偽遺伝子が存在するか否か、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースからTS 遺伝子の偽遺伝子を検索した。検索の結果、ACCESSION No. D16517に2454bpからなるTS 遺伝子の偽遺伝子が存在した。TS 遺伝子とTS 偽遺伝子の相同性は図１及び図２に示すように79.29 %と高かった。本発明の方法では、細胞からｍＲＮＡを抽出し、上記した増幅方法を行うことが好ましいが、その場合でも、偽遺伝子ＤＮＡが混入する恐れを完全に排除することは困難である。従って、この偽遺伝子ＤＮＡが増幅されて偽陽性を生じることがないようにフォワード側プライマー又はリバース側プライマーを設定することが好ましい。
【００２０】
この偽遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す配列と整列させたものを図１及び図２に示す。図１及び図２に示されるように、エクソン２及びエクソン３領域では、両者の塩基は、配列番号１に示すTSのｃＤＮＡの210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt及び450ntにおいて不一致となっている。従って、フォワード側プライマーは、これらの不一致の部位を少なくとも１つ含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。すなわち、フォワード側プライマーは、上記した種々の部位の塩基から成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。この場合、フォワード側プライマーは、これらの群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超えるものであることが好ましく、及び／又は、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有するものが好ましい。これらの場合には、フォワード側プライマーが偽遺伝子にハイブリダイズしないか、又は、プライマー３’末端にミスマッチがある場合には、プライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくい。
【００２１】
同様に、エクソン４領域では、両者の塩基は、配列番号１に示すTSのｃＤＮＡの464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntにおいて不一致となっている。従って、リバース側プライマーは、これらの不一致の部位を少なくとも１つ含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。すなわち、リバース側プライマーは、上記した種々の部位の塩基から成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。この場合、リバース側プライマーは、これらの群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超えるものであることが好ましく、及び／又は、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有するものが好ましい。これらの場合には、リバース側プライマーが偽遺伝子にハイブリダイズしないか、又は、プライマー３’末端にミスマッチがある場合には、プライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくい。
【００２２】
フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのいずれか一方が、上記偽遺伝子とハイブリダイズしない又は増幅が起きないものであれば、偽遺伝子が増幅されないので、偽遺伝子に起因する偽陽性を防止することができる。もっとも、念のために、フォワード側プライマーとリバース側プライマーの両者共が、上記偽遺伝子とハイブリダイズしない又は増幅が起きないものであることが好ましい。
【００２３】
ＰＣＲ自体は、周知の方法で行うことができ、下記実施例にも詳細な条件の例が記載されている。また、必要な試薬類や装置は全て市販されているので、これらの市販品を用いて容易に行うことができる。
【００２４】
ｍＲＮＡを正確に定量する場合には、ＰＣＲを、リアルタイム検出ＰＣＲで行うこともできる。リアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平６−５０００２１号公報）は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなレポーター蛍光色素と、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなクエンチャー蛍光色素とを１つのプローブに結合したプローブ(TaqMan（登録商標）プローブ）の存在下でＰＣＲを行うことにより、増幅産物が生成されるに従って、反応液中の蛍光強度が増加し、ＰＣＲの各サイクル後の蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を測定する方法である。蛍光強度は、あるサイクル数の後に急に増加するが、この蛍光が急に増加するサイクル数が試料中の被検核酸の量と直線的な相関を有するため、蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を正確に測定することができる。リアルタイム検出RT-PCRは、上記したRT-PCRのＰＣＲ工程を、TaqMan（登録商標）プローブの存在下で行うことにより容易に行うことができる。この場合のプローブは、ＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズする（但し、プライマーがハイブリダイズする領域とは重複しない領域にハイブリダイズする）配列を有する核酸であれば何ら限定されない。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ法自体は周知であり、このためのキットも市販されているので、市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００２５】
ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を測定する方法として、リアルタイム検出ＰＣＲ法以外に、インターカレーションモニタリングPCR法、モレキュラービーコンプローブ法、ハイブリダイゼーションプローブ法、サンライズプライマー法などが挙げられるが、これらのいずれも本発明の方法に適用することができる。本発明の方法は、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの配列に特徴があるが、それ以外は、常法に従ってこれらの各種方法を容易に実施することができる。
【００２６】
本願発明の方法をRT-PCR法により行う場合について説明したが、本願発明の方法は、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いてヒトTSのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの増幅を行う方法であればRT-PCR法に限定されるものではなく、他のいずれの核酸増幅法を採用することができる。例えば、NASBA法（3SR法、TMA法）によりｍＲＮＡを増幅することもできる。NASBA法では、リバース側プライマーの5'末端にT7プロモーター配列を付加したものをリバース側プライマーとして、AMT-RT等の逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を形成する。得られたRNA/DNA二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖をRNase Hにより分解して一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）とする。次に、この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、フォワード側プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としてAMT-RTを用いる場合には、AMT-RTがＤＮＡポリメラーゼ活性を有するのでこれで兼用する）の存在下で相補鎖を形成して、二本鎖ｃＤＮＡとする。この二本鎖ｃＤＮＡは、T7プロモーター配列を含んでいるので、これにT7 RNAポリメラーゼを作用させると、転写によりＲＮＡ（アンチセンス鎖）が次々に形成される。さらに、形成された二本鎖ｃＤＮＡについて、変性工程、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程を繰り返すことにより、二本鎖ｃＤＮＡが増幅され、これを鋳型とした転写によりさらにＲＮＡ（アンチセンス鎖）が形成される。このようなNASBA法においても、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとして、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いることにより、正常型TSのｍＲＮＡのみを増幅することができる（ただし、生成物は上記の通りアンチセンス鎖であるが、この場合にも本明細書では、「ｍＲＮＡを増幅する」と呼ぶ）。なお、NASBA法自体は周知であり、このためのキットも市販されているので、市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００２７】
以上のようにして正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのみを増幅することができる。
【００２８】
次に、増幅産物を測定する。本明細書において、「測定」には、検出と定量の両者が包含される。さらに、増幅産物の電気泳動バンドの蛍光強度測定や、太さの目視判定のような、簡易定量又は半定量も「測定」に包含される。増幅産物の測定は、上記の通り、正確な定量を行う場合には、リアルタイム検出RT-PCR法等のように、ＰＣＲを行いながらリアルタイムで蛍光を測定することにより行うことができる。また、増幅産物を電気泳動にかけ、増幅バンドを検出することにより行うことができる。また、増幅バンドの蛍光強度を測定することによっても行うことができる。さらに、電気泳動パターンをナイロンやニトロセルロースのメンブレンに転写し、増幅産物にハイブリダイズする標識プローブをハイブリダイズさせて、標識を検出又は定量する(PCR-Southern法）によっても行うことができる。さらには、増幅産物にハイブリダイズするプローブを固相化し、上記増幅工程を標識ヌクレオチドトリフォスフェートの存在下に行い、固相化プローブに増幅産物を結合させ、固相に結合された増幅産物を測定することによっても行うことができる。これらはいずれも常法であり、周知の方法により行うことができる。
【００２９】
本発明の第２の方法では、ヒトTS遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型ｃＤＮＡ及び第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマー又はリバース側プライマーとして用いてヒトTS遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定する。正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型及び第２の変異型ｃＤＮＡのいずれともハイブリダイズしない核酸は、エクソン３とエクソン４の領域に跨る領域にハイブリダイズする核酸である。この場合、プライマーの全長の２０％以上８０％以下、さらに好ましくは４０％以上６０％以下がエクソン３の領域にハイブリダイズし、残りがエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このプローブは、第１の変異型ｃＤＮＡではエクソン３が欠失しているので、ハイブリダイズすることができず、第２の変異型ｃＤＮＡではエクソン４が欠失しているのでやはりハイブリダイズすることができず、正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとのみハイブリダイズする。上記領域にハイブリダイズするプライマーは、フォワード側プライマーであってもリバース側プライマーであってもよく、増幅に用いるもう一方のプライマーは、正常型ｃＤＮＡの任意の領域にハイブリダイズするものであってよい。もっとも、フォワード側プライマーは、リバース側プライマーよりも上流の領域にハイブリダイズするものである。
【００３０】
第２の方法に用いられるプライマーも、偽遺伝子による偽陽性を排除するために、配列番号１で示される塩基配列中の210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt、450nt、464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntから成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものが好ましい。
【００３１】
第２の方法に用いられるプライマーについての他の説明、すなわち、種々の好ましい又は許容できる態様等については、上記したフォワード側プライマー又はリバース側プライマーについての説明を適用できる。また、増幅方法や増幅産物の測定方法は、プライマーの種類とは関係がないので、上記した本願発明の方法についての説明を適用できる。
【００３２】
本発明は、また、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーを少なくとも含むヒトTS ｍＲＮＡの測定用キットをも提供する。また、本発明は、上記第２の方法に用いられるフォワード側プライマー又はリバース側プライマーを少なくとも含むヒトTS ｍＲＮＡの測定用キットをも提供する。キットに含まれる試薬類は、本発明のプライマー以外は周知のものであり、例えば、下記実施例に記載されているように、M-MLV逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ、dNTP、ランダムプライマー、RNase阻害剤、緩衝液等を含めてキットにすることができる。あるいは、キットは、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのみを含むものとし、他の試薬類は、市販のRT-PCR用キット等を利用するようにしても良い。
【００３３】
本発明は、さらに、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとはハイブリダイズするが、上記第１の変異型ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又は上記第２の変異型ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない核酸から成るヒトTSのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの測定用プローブをも提供する。このようなプローブとしては、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーとして用いることができる核酸を本発明のプローブとして用いることができる。プローブは、上記本発明の方法により増幅される増幅産物にハイブリダイズするものが好ましい。なお、プローブの好ましい塩基数は、１０〜増幅産物の全長、さらには１５〜増幅産物の全長である。
【００３４】
さらに、本発明は、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型ｃＤＮＡ及び第２の変異型ｃＤＮＡのいずれにもハイブリダイズしない核酸から成るプローブをも提供する。このようなプローブは、エクソン３及びエクソン４に跨る領域にハイブリダイズするものである。この場合、プローブの全長の２０％以上８０％以下、さらに好ましくは４０％以上６０％以下がエクソン３の領域にハイブリダイズし、残りがエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このプローブは、第１の変異型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡではエクソン３が欠失しているので、ハイブリダイズすることができず、第２の変異型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡではエクソン４が欠失しているのでやはりハイブリダイズすることができず、正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとのみハイブリダイズする。このプローブの場合、プローブのサイズは、特に限定されないが、１０〜１００程度が好ましく、さらに好ましくは１５〜５０程度である。また、プライマーの場合と同様、プローブがハイブリダイズする領域と完全に同一の塩基配列を有することが最も好ましいが、プローブ全長の１０％以下の塩基が置換していてもよい。なお、本明細書において、プローブが「ハイブリダイズする」とは、サザンブロット等の、核酸プローブをハイブリダイズさせて被検核酸を検出する方法において採用される一般的な条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００３５】
プローブは、上記核酸に蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識等の周知の標識を結合して標識プローブとすることもでき、このような標識プローブも言うまでもなく本発明のプローブに包含される。また、プローブは、例えば固相化プローブとして用いる場合に、固相に結合させる領域や、分枝プローブにおける標識を結合させるための分枝のような、被検核酸とは無関係な任意の核酸が結合されたものであってもよい。
【００３６】
本発明のプローブは、上記した本発明の方法により増幅された増幅核酸の測定に用いることができる。上記した、本発明の方法をリアルタイム検出RT-PCRにより行う場合のTaqMan（登録商標）プローブ等も本発明のプローブである。また、本発明のプローブは、本発明の方法による増幅を経ていない（すなわち、全く増幅されていないか、本発明の方法以外の方法で増幅された）、ヒトTSのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの測定にも用いることができる。とりわけ、上記した、正常型とはハイブリダイズするが第１及び第２の変異型のいずれともハイブリダイズしないプローブを用いると、正常型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのみを測定することができる。また、第１及び第２の変異型のいずれか一方とはハイブリダイズするプローブであっても、エクソン２及び３から成る領域にハイブリダイズする第１の変異型用プローブと、エクソン４領域にハイブリダイズする第２の変異型用プローブを用い、いずれのプローブでも測定されるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡが正常型という判定を行うことは可能である。増幅せずにプローブで正常型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを測定する場合には、プローブとしては、１つのプローブに多数の分枝を形成し、各分枝に標識を結合させることにより多数の標識を結合させた、いわゆる分枝型プローブを用いることにより測定感度を向上させることができる。
【００３７】
なお、本発明により、第１及び第２の変異型が発見されたので、正常型ヒトTSのみと反応する抗体を提供することも可能になった。すなわち、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチド領域をエピトープとする抗体は、第１及び第２の変異型のいずれとも免疫反応せず、正常型ヒトTSとのみ免疫反応する。このような抗体は、常法により、ヒトTSを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、ELISA等の免疫測定により、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチドと免疫反応するものをスクリーニングすることによって得ることができる。あるいは、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチドを、単独で、あるいはキーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミンのような担体に結合した該ペプチドを免疫原とした常法により抗体（モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい）を得ることもできる。
【００３８】
本発明の方法を適用する試料は、特に限定されず、いかなる組織由来の細胞中のｍＲＮＡであってよい。胃癌、大腸癌等の各種固形癌細胞や血液癌細胞由来のｍＲＮＡが好ましい。細胞からｍＲＮＡを抽出して本発明の方法を適用することが好ましいが、ｍＲＮＡの抽出は必須的ではない。なお、細胞からのｍＲＮＡの抽出は、市販のｍＲＮＡ抽出用試薬を用いる常法により容易に行うことができる。
【００３９】
本発明の方法により、正常型のヒトTSｍＲＮＡのみを測定することにより、従来のｍＲＮＡの測定方法を用いる場合と比較して、より正確に、抗癌剤治療による予後を予測することができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
(I)TS mRNA スプライシング変異体（バリアント）の発見
(1)プライマーの合成
TS遺伝子のエクソン１領域に設定したプライマー5'-gtc ggt att cgg cat gca gg-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン５領域に設定したプライマー5'-aga act ggc aga ggg cat gg-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００４２】
(2)核酸抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：American Type Culture Collection (ATCC))および健常人末梢血細胞 106個からDNAをGENOMIX(TALENT社製)を用いて抽出した。106個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００４３】
また、106個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００４４】
0004249407.tif 000002
*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００４５】
(3)PCR反応
(1)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。
0004249407.tif 000003
* rTaq DNAポリメラーゼ に付属
【００４６】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(437bp)をした。
【００４７】
上記(1)、(2)、(3)の操作により、胃癌セルラインにおいて、目的増幅産物(437bp)の他に、335bp付近、188bp付近に増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、目的増幅産物(437bp)のみが確認された。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００４８】
胃癌セルラインから検出された335bp付近および188bp付近の増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ゲルから核酸を抽出するためにSUPREC-01(宝酒造製)にセットした。セット後、5000×gで５分間遠心し、SUPREC-01の下層に溶出した溶液を回収した。
【００４９】
(4)PCR反応
(1)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。
0004249407.tif 000004
* rTaq DNAポリメラーゼ に付属
【００５０】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(335bpおよび188bp)をした。
【００５１】
(5)塩基配列の決定
上記操作により、増幅した335bp付近および188bp付近のPCR産物をシーブカラムにセットし、2500×gで１分間遠心し、増幅産物を精製した。精製した２種類の増幅産物をダイレクトシークエンス法によって、塩基配列を決定した。
【００５２】
(1)で合成したプライマーを用いてサイクルシークエンス反応を実施した。
0004249407.tif 000005
【００５３】
ダイレクトシークエンス反応は96℃/10秒、50℃/5秒、60℃/4分を１サイクルとし、25サイクル実施した。
0004249407.tif 000006
*ABI PRIZM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(Applied Biosystems社製)。
【００５４】
ダイレクトシークエンス反応は96℃/10秒、50℃/5秒、60℃/4分を１サイクルとし、25サイクル実施した。
【００５５】
反応終了後、ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems、HITACHI社製)にて塩基配列を得た。得られたフォワードプライマー側からの塩基配列(センス鎖)とリバースプライマー側からの塩基配列(アンチセンス鎖)を比較し、最終的に塩基配列を決定した。
【００５６】
上記(5)の操作により、２種類の増幅産物の塩基配列を決定した。決定された塩基配列はTS 遺伝子(Full length isoform)に対し、エクソン２およびエクソン３が欠失し、他はTS遺伝子と同じもの(バリアント 1（第１の変異型）)、エクソン４が欠失し、他はTS遺伝子と同じもの（バリアント 2)（第２の変異型））の２種類であった。バリアント１及びバリアント２の塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２及び３にそれぞれ示す。
【００５７】
(II)  TS バリアント1およびバリアント2の特異的検出
(6)プライマーの合成
バリアント1を検出するために、TS遺伝子のエクソン１およびエクソン４領域にオーバーラップしたプライマー5'-cgc gct aca gcc tga gag att att ca-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン７領域に設定したプライマー5'-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００５８】
バリアント2を検出するために、TS遺伝子のエクソン３およびエクソン５領域にオーバーラップしたプライマー5'-aga ata cag aga tat gga atc aga tct tcc-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン７領域に設定したプライマー5'-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００５９】
(7)RNA抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：ATCC)、大腸癌組織由来セルラインHCT15(入手先：ATCC)および健常人末梢血細胞 106個からDNAをGENOMIX (TALENT社製)を用いて抽出した。106個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００６０】
また、106個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００６１】
0004249407.tif 000007
*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００６２】
(8)PCR反応
(6)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。
0004249407.tif 000008
* rTaq DNAポリメラーゼ に付属
【００６３】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(393bp)をした。
【００６４】
0004249407.tif 000009
* rTaq DNAポリメラーゼ に付属
【００６５】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(296bp)をした。
【００６６】
上記(6)、(7)、(8)の操作により、胃癌および大腸癌セルラインにおいて、TS バリアント1 mRNA由来増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、増幅産物は確認されなかった。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００６７】
上記(6)、(7)、(8)の操作により、胃癌および大腸癌セルラインにおいて、TS バリアント2 mRNA由来増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、増幅産物は確認されなかった。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００６８】
(III) TS full length isoform mRNAの特異的検出
(9)偽遺伝子の検索
TS 遺伝子のfull length isoform mRNAを特異的に検出するために、抽出したRNAに混入したDNA由来の増幅を排除する必要がある。このため、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースからTS 遺伝子の偽遺伝子を検索した。検索の結果、ACCESSION No. D16517に2454bpからなるTS 遺伝子の偽遺伝子が存在した。TS 遺伝子とTS 偽遺伝子の相同性は図１及び図２に示すように79.29 %と高かった。
【００６９】
(10)プライマーの合成
バリアント1およびバリアント2を検出しないために、エクソン２あるいは３にフォワードプライマーを、エクソン４にリバースプライマーを設定し、一方、偽遺伝子を検出しないプライマーを設定した。すなわち、TS遺伝子のエクソン３領域に設定したプライマー5'-cag cct ggg att ctc cac ca-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン４領域に設定したプライマー5'-atg atg att ctt ctg tcg tca ggg-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００７０】
(11)RNA抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：ATCC)、大腸癌組織由来セルラインHCT15(入手先：ATCC)および健常人末梢血細胞 106個からDNAをGENOMIX (TALENT社製)を用いて抽出した。106個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００７１】
また、106個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００７２】
0004249407.tif 000010
*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００７３】
(12)PCR反応
(10)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。
0004249407.tif 000011
* rTaq DNAポリメラーゼ に付属
【００７４】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(170bp)をした。
【００７５】
上記(10)、(11)、(12)の操作により、胃癌、大腸癌セルラインおよび末梢血において、目的増幅産物(170bp)が確認された。DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明により、ヒトTS遺伝子の新たなオルタナティブスプライシングが見出され、これらのスプライシングバリアント以外の正常型のヒトTS mRNAのみを測定する方法が提供された。本発明の方法により癌細胞中のヒトTS ｍＲＮＡを測定することにより、従来の方法を用いる場合に比較して、抗癌剤治療による予後をより正確に判定することが可能になる。
【００７７】
【配列表】
0004249407.tif 000012
【００７８】
0004249407.tif 000013
0004249407.tif 000014
0004249407.tif 000015
【００７９】
0004249407.tif 000016
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【００８０】
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0004249407.tif 000019
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【００８１】
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【００８２】
0004249407.tif 000022
【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
0004249407.tif 000025
【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】正常型ヒトTSｃＤＮＡと偽遺伝子の塩基配列を整列させて示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図１】
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【図２】
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