(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）標的ＲＮＡに対する第一のＤＮＡプライマーの付着と伸長、
（２）該伸長によって生じるＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、
（３）該分解後に残るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの付着と伸長、
（４）該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づく標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、
の各反応からなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの増幅方法（ここで前記第一又は第二のＤＮＡプライマーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモーター部位を有する）であって、
前記（１）から（３）の反応で使用するトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素は、その成分の８０％以上が、分子量６８０００のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダイマーであることを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、トリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素組成物等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（以下「ＡＭＶＲＴ」という）は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）に感染した個体から精製し得る酵素であり、分子生物学的研究や遺伝子の増幅反応に広く用いられている。ＡＭＶに感染した固体から精製されたＡＭＶＲＴは、分子量６８０００のαサブユニット１分子からなるαモノマー（αサブニットはβサブユニットが断片化して生じる）、αサブユニットと分子量９２０００のβサブユニットの各１分子からなるヘテロダイマー（αβヘテロダイマー）及びβサブユニット２分子からなるホモダイマー（ββホモダイマー）の三成分を含むことが知られている。
【０００３】
ＡＭＶＲＴの主要な酵素活性は逆転写活性、即ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性であるため、従来からＡＭＶＲＴの活性は、ｐｏｌｙ（Ａ）・Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をテンプレート・プライマーとして用い、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのデオキシリボヌクレオチドを酸沈殿画分に取り込ませる酵素量を１ユニットとする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を用いて表現されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
近年では、被検試料中の微量核酸を定性・定量し得る遺伝子診断が、特に感染症等の疾病の早期発見と治療効果のモニタリング、輸血用血液のスクリーニング、食品や環境のモニタリング等のために広く使用されるようになっているが、ＡＭＶＲＴはかかる遺伝子診断の前提となる遺伝子の増幅反応にも用いられている。
【０００５】
ＡＭＶＲＴを用いる遺伝子の増幅反応には、一例を示せば、例えば、特許第２６５０１５９号公報に記載されたいわゆるＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法や特表平４−５００７５９号公報に記載されたいわゆるＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、更には本出願人らが報告した特開２０００−１４４００号公報記載のＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。
【０００６】
上記した増幅方法は、比較的低温かつ一定温度という条件下で、いずれも転写反応を介在させて検出しようとする核酸（標的ＲＮＡ）と相同又は相補的なＲＮＡコピーを生成するものである。具体的には、例えば、標的ＲＮＡに対して第一のＤＮＡプライマー（プロモーター部位を含む）を付着、伸長させてＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸を生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡを分解し、該分解後に残ったＤＮＡに対して第二のＤＮＡプライマーを付着、伸長させてプロモーター部位を含む二重鎖ＤＮＡを生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡコピーを生成する方法である（ここで生成したＲＮＡコピーに対して前記第二のＤＮＡプライマーが付着、伸長してＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸が生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡが分解された後に残ったＤＮＡに対して前記第一のＤＮＡプライマーが付着、伸長してプロモーター部位を含む二重鎖ＤＮＡが生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡコピーが生成される、という増幅サイクルが成立する）。また具体的に例えば、標的ＲＮＡに対して第一のＤＮＡプライマーを付着、伸長させてＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸を生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡを分解し、該分解後に残ったＤＮＡに対して第二のＤＮＡプライマー（プロモーター部位を含む）を付着、伸長させてプロモーター部位を含む二重鎖ＤＮＡを生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡと相同なＲＮＡコピーを生成する方法である（ここで生成したＲＮＡコピーに対して前記第一のＤＮＡプライマーが付着、伸長してＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸が生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡが分解された後に残ったＤＮＡに対して前記第二のＤＮＡプライマーが付着、伸長してプロモーター部位を含む二重鎖ＤＮＡが生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡと相同なＲＮＡコピーが生成される、という増幅サイクルが成立する）。なおこれら増幅方法における標的ＲＮＡは、上記のような転写が介在する反応系によって生成されたＲＮＡであっても制限はない。
【０００７】
ＡＭＶＲＴは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性だけでなく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性及びリボヌクレアーゼＨ活性を有している。上記の増幅方法においては、ＡＭＶＲＴの主要活性であるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性だけでなく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性及びリボヌクレアーゼＨ活性もまた重要となる。とりわけリボヌクレアーゼＨ活性は、前記増幅方法から、温度上昇によるヘテロ二重鎖の分離とその後の反応のための温度下降という操作を省くために重要であり、ＲＮａｓｅＨ等を追加的に使用しない増幅方法においては、特に重要である。
【０００８】
ところが、ＡＭＶＲＴの酵素活性が従来から逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性）で表現されていたことからも明らかなように、ＡＭＶＲＴに含まれる各成分については、逆転写活性のみが注目され、その他の活性の観点からは何ら検討はされていない。即ち、ＡＭＶＲＴの逆転写活性はαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモダイマーのいずれでも発現することは知られているが、それ以外の活性については何ら検討はされていないのである。
【０００９】
かかる状況に鑑みて本願発明者らは、ＡＭＶＲＴの各成分について鋭意検討を行ったところ、逆転写活性は確かにはαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモダイマーのいずれもが発現するが、かかる成分を単独で前記したような増幅方法用試薬として使用すると、驚くべきことに、αβヘテロダイマーのみが有効で、αモノマー成分又はββヘテロダイマーでは増幅反応が進行しないことが明らかになった。
【００１０】
そこで本願発明の第１の目的は、前記したようなＲＮＡ増幅方法に有効なＡＭＶＲＴを提供することにある。また本願発明の第２の目的は、かかるＡＭＶＲＴの製造方法を提供することにある。そして本願発明の第３の目的は、かかるＡＭＶＲＴを含む、前記のような核酸増幅方法用試薬を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記第１の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、その成分の８０％以上が分子量６８０００のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダイマーである、ＡＭＶＲＴ組成物である。本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、実質的に分子量６８０００のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダイマーのみからなることを特徴とするＡＭＶＲＴ組成物である。
【００１２】
前記第２の目的を達成するためになされた本願請求項３の発明は、分子量６８０００のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダイマーと、前記αサブユニットのモノマー（αモノマー）及び／又は前記βサブユニットのホモダイマー（ββホモダイマー）とを含むＡＭＶＲＴ溶液から前記αβヘテロダイマーを製造する方法であり、該溶液をイオン交換クロマトグラフィーに供することからなる方法である。本願請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係り、前記イオン交換クロマトグラフィーがイオン交換基としてＤＥＡＥ基を有するイオン交換体を用いるイオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする。
【００１３】
前記第３の目的を達成するためになされた本願請求項５の発明は、標的ＲＮＡに対する第一のＤＮＡプライマーの付着と伸長、該伸長によって生じるＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、該分解後に残るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの付着と伸長、該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づく標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、の各反応からなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの増幅反応（ここで前記第一又は第二のＤＮＡプライマーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモーター部位又は該部位の相補部位を有する）に用いる試薬であって、前記請求項１のＡＭＶＲＴ組成物を含むことを特徴とする試薬である。
【００１４】
以下、本願発明を詳細に説明する。本願発明のＡＭＶＲＴ組成物は、ＡＭＶに感染した個体から得たＡＭＶＲＴや市販されている天然由来のＡＭＶＲＴ試薬（例えばＣＨＩＭＥＲｘ社、商品名；ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、４０Ｕ／μｌ）から製造することができる。遺伝子組換えで製造した現状のＡＭＶＲＴは、αモノマーのみからなるため、本願発明のＡＭＶＲＴ組成物を製造するための原料としては不適当である。
【００１５】
本願発明のＡＭＶＲＴ組成物は、上記の市販ＡＭＶＲＴ試薬等を原料として、液体クロマトグラフィーを実施することで製造できる。液体クロマトグラフィーは、使用するカラム（充填剤）の機械的強度等が十分に確保できるのであれば、いわゆる高速液体クロマトグラフィーを採用することが特に好ましい。
【００１６】
液体クロマトグラフィーは、具体的にはエーテルカラムを用いるものが例示できるが、充填剤として例えばＤＥＡＥ基を有するイオン交換体を用いるイオン交換クロマトグラフィーが特に好ましい。充填剤の基材等には特に制限はなく、シリカ系、ポリマー系等のものが使用できるが、中でもペプチド等の吸着容量が大きいものが好ましい。一方、充填剤を充填するカラムには特に制限はなく、通常のステンレス、ポリエーテルエーテルケトン又はガラス等を使用することができる。かかる好適な市販充填剤充填済カラムとして、例えばＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（商品名、東ソー（株）製）を例示することができる。
【００１７】
本願発明のＡＭＶＲＴ組成物を製造するための原料は、市販のＡＭＶＲＴを適当な緩衝液等に溶解したＡＭＶＲＴ溶液である。溶解に使用する緩衝液等にも特に制限はなく、例えば２０ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ７．２）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）、ジチオスレイトール（以下ＤＴＴとする）（２ｍＭ）及びグリセロール（１０％）を含む緩衝液が例示できる。なおＤＴＴは、ＡＭＶＲＴの保護のために添加するものである。本願発明者らの知見によれば、ＡＭＶＲＴのαβヘテロダイマーは、２ｍＭ程度のＤＴＴではモノマー化されない。またＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００はＡＭＶＲＴのカラムへの吸着を防止するために添加するものである。本願発明者らの知見によれば、ＡＭＶＲＴのαβヘテロダイマーは、０．２％程度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ではモノマー化されない。
【００１８】
上記のような緩衝液に溶解したＡＭＶＲＴをカラムに供した後、充填剤に保持されたＡＭＶＲＴを溶出させる。ＡＭＶＲＴの溶出は、例えばカラムに供する緩衝液の塩濃度を段階的に又は連続的に上昇させることにより行うことができる。例えば前記したような緩衝液（以下緩衝液Ａとする）をＡＭＶＲＴの溶解及び充填剤への保持のために供した場合には、例えば２０ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ７．２）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、グリセロール（１０％）及びＮａＣｌ（１Ｍ）を含む緩衝液（以下緩衝液Ｂとする）を一定割合で混合して供することが例示できる。より具体的には、１ｍｌ／分程度の流速で、まず緩衝液Ａを１５分程度供して充填剤に保持されない成分を溶出させた後、２０分間に渡って緩衝液Ｂの割合を５０％にまで徐々に増やし、その後１０分間に渡って緩衝液Ｂの割合を１００％にまで徐々に増やし、そしてその後１５分に渡って緩衝液Ｂのみを供してカラムを洗浄することが例示できる。ここで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００はＡＭＶＲＴのカラムへの吸着を防止するために添加するものである。
【００１９】
以上のようなグラディエント溶出を行うことにより、ＡＭＶＲＴの各成分は、αモノマー、αβヘテロダイマーそしてββホモダイマーの順に溶出する。これらは全てＡＭＶＲＴの主要な酵素活性である逆転写活性を有するが、各成分を用いて遺伝子の増幅反応に使用するとαβヘテロダイマーのみが該反応を進行させることができ、αモノマー及びββホモダイマーでは増幅反応は進行しない。従って溶出液を一定量ずつフラクションとして分取し、各フラクション中のαサブユニットとβサブユニットの量比を確認して目的とするαβヘテロダイマーの画分、即ち両者がほぼ１対１で存在する画分を取得すれば良い。各フラクション中の各サブユニットの量比の確認のためには、例えば各サブユニットを特異的に認識し得る抗体を用いる酵素免疫測定（ＥＩＡ）や、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施すれば良い。ここでいう還元条件下とは、各フラクションから被検液を取得し、例えばメルカプトエタノール等の強力な還元剤を５％程度となるように添加したり、例えば９５℃で５分間加熱する等してダイマーを強制的にモノマー化できる程度のものであれば良い。なおＳＤＳ−ＰＡＧＥによるαサブユニットとβサブユニットの量比確認においては、泳動後のゲルを銀染色試薬等で染色した後にデンシトメーター等を用いて各バンドの濃さを数値化することが例示できる。
【００２０】
本願発明の他のＡＭＶＲＴ組成物、即ち、実質的にαβヘテロダイマーのみからなるＡＭＶＲＴ組成物は、例えば上記のように製造されたＡＭＶＲＴ組成物を、αサブユニットに対する抗体を固定化したアフィニティー充填剤を充填したカラムとβサブユニットに対する抗体を固定化したアフィニティー充填剤を充填したカラムとに供することにより、製造することができる。
【００２１】
以上の操作により、その成分の８０％以上がαβヘテロダイマーであるＡＭＶＲＴ組成物や実質的にαβヘテロダイマーのみからなるＡＭＶＲＴ組成物を製造することができる。このようにして製造される本願発明のＡＭＶＲＴ組成物は、例えば透析等の通常の方法により濃縮することが可能であり、また一般的な酵素の保存方法に従って保存することが可能である。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下本願発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  ＡＭＶＲＴ組成物の製造
市販のＡＭＶＲＴ試薬（ＣＨＩＭＥＲｘ社製、商品名；ｎａｔｉｖｅ、４０Ｕ／μｌ）５００μｌを下記緩衝液Ａ（４．５ｍｌ）で希釈した。
【００２４】
緩衝液Ａ（濃度はすべて終濃度）
２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．２）
２ｍＭ  ジチオスレイトール
０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０％  グリセロール
市販のイオン交換クロマトグラフィー用カラム（東ソー（株）製、商品名；ＤＥＡＥ−５ＰＷ、７．５ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ）に前記希釈したＡＭＶＲＴ溶液を供した後、４℃にて下記緩衝液Ｂを供し、溶出時間に従って１分毎に１ｍｌづつ、６０のフラクションを取得した。なおグラディエントの条件は以下の通りであり、緩衝液の流速は１ｍｌ／分である。
【００２５】
緩衝液Ｂ（濃度はすべて終濃度）
２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．２）
２ｍＭ  ジチオスレイトール
０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０％  グリセロール
１Ｍ  ＮａＣｌ
グラジエント条件
０〜１５分まで：緩衝液Ａ  １００％
１５〜３５分まで：緩衝液Ａ  １００％から、緩衝液Ａ  ５０％＋緩衝液Ｂ５０％のグラディエント
３５〜４５分まで：緩衝液Ａ  ５０％＋緩衝液Ｂ  ５０％から、緩衝液Ｂ  １００％のグラディエント
４５〜６０分まで：緩衝液Ｂ  １００％
次に、各フラクション中のαサブユニットとβサブユニットの量比を確認するために、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
【００２６】
まず、各フラクションから被検液を５μｌずつ取得し、下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液５μｌを加え、９５℃で５分加熱した後、市販の１０％泳動ゲル（アトー（社）製、商品名；ｅ・パジェル、型式；Ｅ−Ｒ１０Ｌ、９０ｍｍ（Ｗ）×７３ｍｍ（Ｈ）×１ｍｍ（ｔ））に７μｌずつ供して３０ｍＡで泳動した。なお泳動用緩衝液は以下の通りである。
【００２７】
サンプル緩衝液
０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）
２０％  ＳＤＳ
５０％  グリセロール
０．０５％  ブロムフェノールブルー
泳動用緩衝液（以下を蒸留水で１リットルに調整したもの）
３．０ｇ  Ｔｒｉｓ−塩酸
１４．４ｇ  グリシン
１．０ｇ    ＳＤＳ
泳動後のゲルを、市販の銀染色試薬（第一化学薬品（株）製、商品名；第一）により染色した。染色後のゲルの様子を図１に示す。また染色後のゲルをデンシトメーター（アトー（株）製、商品名；Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ  Ｌａｎｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）に供し、αサブユニットとβサブユニットの量比を確認した。その結果、フラクション４〜１６及び２６〜２８にはαモノマーが、フラクション３０〜３４にαβヘテロダイマーが、そしてフラクション３６〜５８にはββホモダイマーが溶出した。各フラクションのデンシトメーターでの測定結果（αサブユニットのバンドの濃さ：βサブユニットのバンドの濃さ）は、フラクション４〜１６では１：０、フラクション２６〜２８では１：０、フラクション３０〜３４では５５：４５、フラクション３６〜５８では１６：８４であった。以上の通り、本実施例によりαモノマー、αβヘテロダイマー、ββホモダイマーをそれぞれ製造することができた。フラクション３０〜３４（αβヘテロダイマーのフラクション）はデンシトメーターでの測定結果が５５：４５であった。デンシトメーターでの解析結果は、このフラクションはその成分の８０％以上がαβヘテロダイマーであり、αモノマーとββホモダイマーの合計が２０％以下であることを示す。
実施例２  ＲＴ活性の測定
実施例１で用いたＡＭＶＲＴ試薬を水で希釈して、各種濃度（３０Ｕ／μｌ、１０Ｕ／μｌ、３Ｕ／μｌ、１Ｕ／μｌ、０．１Ｕ／μｌ）のＡＭＶＲＴ溶液を調製した。前記各濃度のＡＭＶＲＴ溶液（それぞれ５μｌ）を下記組成の反応溶液（２０μｌ）を３７℃で１０分間インキュベーションした。
【００２８】
反応溶液（濃度はすべて終濃度）
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
４０ｍＭ  ＫＣｌ
８．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
１０ｍＭ  ジチオスレイトール
０．１％牛血清アルブミン
２５０ｍＭ  Ｐｏｌｙ（Ａ）（ファルマシア社製）
５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）３０
１ｍＭ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＴＰ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］（第一化学薬品（株）製）
次に混合液（ＴＥ  ８０μｌ、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ３μｌ、７．５Ｍ  アンモニウムアセテート  ５０μｌの混合液）１３３μｌを加え、１００％エタノール３７５μｌを添加し、−２０℃で３０分静置した。４℃、１５０００ｒｐｍ（回転半径７ｃｍ）で１０分間遠心後、上清を注意深く除去し、７０％エタノールを５００μｌ添加し、再び４℃、１５０００ｒｐｍ（回転半径７ｃｍ）で１０分間遠心後、上清を注意深く除去した。これをＴＥ  １００μｌに懸濁し、全量をシンチレーションカウンターで測定し、検量線を作成した。なお、ＴＥとは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡである。
【００２９】
続いて、ＡＭＶＲＴ溶液として実施例１で製造した各フラクション５μｌを、上記と同じ処理を行った後、その全量についてシンチレーションカウンターで測定し、上記のようにして作成した検量線から各フラクションの逆転写活性を求めた。結果を図２に示す。図２から明らかなように、フラクション２６〜４４の全て、即ちαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモダイマーの何れのフラクションにおいても逆転写活性が認められた。
【００３０】
実施例３  ＲＮＡ増幅活性の測定
特開２００１−３５３０００号公報に記載した方法に従い、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｉｔａｎｔ  Ｓｔｅｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ、以下ＭＲＳＡとする）のｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡ（以下ｍｅｃＡ−ＲＮＡとする）を標的とした増幅反応を行った。なお本実施例でいうｍｅｃＡ−ＲＮＡとは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
（１）ＭＲＳＡが産生する細胞壁合成蛋白質ＰＢＰ−２’をコードするｍｅｃＡ−ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松橋ら「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２１、１６７〜１７１（１９８７）」に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い１．０×１０3コピー／２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。なお初期ＲＮＡ量は１０3コピー／試験である。
（２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料２．５μｌを添加した。
【００３１】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．６）
１３．０ｍＭ  塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ  ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各１．０μＭの第一のプライマー（配列番号１）と第二のプライマー（配列番号２）
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３、標的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末端はアミノ化してある）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号４、なおインターカレーター性蛍光色素は、配列番号４のオリゴヌクレオチドにおける５’端６番目の「Ｇ」と７番目の「Ａ」の間に標識されており、またその３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。特許第３１８９０００号公報参照。）
３９Ｕ  リボヌクレエース  インヒビター（宝酒造（株）製）
１５．０％  ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
（３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、液量３０μｌあたり実施例１で製造した各フラクションのＡＭＶＲＴ溶液５μｌを含む、以下の組成の予め４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを添加した。
【００３２】
酵素液の組成（反応時の再終濃度）
１．７％  ソルビトール
１４２ユニット  Ｔ７  ＲＮＡポリメレース  （ＧＩＢＣＯ社製）
３μｇ  牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
ＰＣＲチューブを、温調を行いつつチューブ内の反応液について蛍光強度を測定可能に構成した装置（特開２０００−２１４０９０号公報参照）を用いて、反応液を４１℃で保温しつつ、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍでの蛍光測定を酵素液添加時の時刻を０分として、反応液からの蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を測定した。結果を図３に示す。
【００３３】
図３より、フラクション３０〜３４に蛍光強度の増加が観測され、当該フラクションに含まれるαβヘテロダイマーのみが、上記のＲＮＡ増幅反応を有効に進め得ること、即ち逆転写活性のみならず、少なくともリボヌクレアーゼＨ活性を有することが確認された。一方その他のフラクションではＲＮＡ増幅反応は進行しなかった。
【００３４】
実施例４  濃縮とＲＮＡ増幅活性の測定
実施例１で製造したαβヘテロダイマーを含むフラクション（フラクション３０〜３４）を以下の２種類の方法で濃縮した。
【００３５】
まず第１の方法として、フラクション３０〜３４を混合液１．３ｍｌを透析チューブ（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ、スペクトラムメディカルインダストリーズ社製）に入れ、４℃で外液（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）５００ｍｌに対し３時間透析した。外液を新液と交換後、更に１０時間透析した。透析後で残ったフラクション混合液は濃縮器（商品名；セントリコン３０、ミリポア社製）で２５μｌまで濃縮した。濃縮後、保存のためにグリセロールを終濃度５０％となるように添加した。以下、このようにして製造したαβヘテロダイマーを含む溶液を濃縮液１とする。
【００３６】
次に、第２の方法として、前記混合液の１．３ｍｌを透析チューブ（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ、スペクトラムメディカルインダストリーズ社製）に入れ、４℃で外液（２ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭジチオスレイトール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１Ｍトレハロース）５００ｍｌに対し３時間透析した。外液を新液と交換後、更に１０時間透析した。透析後で残ったフラクション混合液は濃縮器（商品名；セントリコン３０、ミリポア社製）で１３０μｌまで濃縮した。濃縮後、保存のためにグリセロールを終濃度５０％となるように添加した。以下、このようにして製造したαβヘテロダイマーを含む溶液を濃縮液２とする。
【００３７】
上記のようにして製造した濃縮液１及び濃縮液２を実施例３と同様のｍｅｃＡ−ＲＮＡの増幅に使用した。ただし実施例３において使用したＡＭＶＲＴに代えて濃縮液１又は濃縮液２を反応液３０μｌあたり０．２５μｌ使用した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、濃縮液１又は濃縮液２のいずれを用いてもＲＮＡを増幅することができた。
【００３８】
【発明の効果】
従来のＡＭＶＲＴは、その主要活性である逆転写活性、即ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性に基づいて酵素量（ユニット）が表現されている。従って、従来のようにαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモダイマーの三成分を含むＡＭＶＲＴを前記ユニットに基づいて所定量使用したとしても、先に説明したような遺伝子の増幅反応に真に寄与するＡＭＶＲＴの量を一定にすることは不可能である。またＡＭＶＲＴの製造ロットや購入先によってαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモダイマーの三成分の含有比率が変動する可能性が大きいが、これらの含有比率の変動に従ってＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性又はリボヌクレアーゼＨ活性の比が変動するとなれば、たとえ同一ユニットの酵素量を使用したとしても増幅反応の効率が異なり、かかる増幅反応を利用する遺伝子の定性・定量も影響を受けることが容易に予想される。
【００３９】
従って本願発明で提供されるＡＭＶＲＴ組成物を用いることにより、添加するＡＭＶＲＴ組成物当たりの増幅効率を向上して、より少量のＡＭＶＲＴを使用することで従来と比較して同等の遺伝子増幅を達成することが可能となり、また同時に、より厳密な意味で、遺伝子の増幅反応条件を均一化して異なるロットのＡＭＶＲＴを使用した場合の定性・定量結果の比較を容易ならしめることが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の電気泳動の結果を示す図であり、電気泳動用ゲルを銀染色した様子を示すものである。フラクション２〜６０の偶数フラクションを泳動した。レーンＭは分子量マーカーであり、ＡＭＶ  ８Ｕは精製前のＡＭＶＲＴである。
【図２】図２は、実施例２のＲＴ活性測定結果である。フラクション１０〜５０の偶数フラクションの活性を測定した。
【図３】図３は、実施例３のＴＲＣ反応の結果である。フラクション２０〜４８の偶数フラクションの活性を測定した。
【図４】図４は、実施例４に示す方法で得られたαβヘテロダイマー濃縮物のＴＲＣ反応の結果である。図中、αβ体濃縮物１は濃縮物液１を、αβ体濃縮物２は濃縮液２をそれぞれ示す。陰性対照はＲＮＡを添加せずにＴＲＣ反応を行ったものである。なお初期ＲＮＡ量１０3コピー／試験である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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