(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド耐性乳癌の治療のための医薬の製造のための、11β−(4−アセチルフェニル)−17β−ヒドロキシ−17α−(1,1,2,2,2−ペンタフルオロエチル）エストラ−4,9−ジエン−３−オンの使用。
【請求項２】
前記乳癌細胞への増殖因子EGFの結合が、癌細胞において阻害される請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の増殖因子依存性を阻害するためへのプロゲステロン受容体インヒビターの使用に関する。
エストラジオール及びプロゲステロンは、乳癌の成長に関与している。しかしながら、診断の時点で、腫瘍のわずか約1/3が、ステロイドホルモン依存性を示す。大部分のステロイドホルモン−耐性腫瘍においては、局部−作用性オートクライン又は傍分泌ペプチド増殖因子についての増殖制御が引き継がれることが仮定される。この場合、増殖因子−受容体−陽性及びステロイドホルモン−耐性である、非常に不良な予後を伴なう侵襲性腫瘍が生じる（Elledge など., Semin. Onkol. 19 (1992), 244-253）。
【０００２】
増殖因子は、細胞表面上の高い親和性のチロシンキナーゼ受容体に結合した後、細胞内シグナルトランスダクション経路の活性化により細胞増殖を調節する。つい最近の発見は、乳癌細胞EGFのミトゲン作用のためにプロゲスチンにより感作され得ることを示している（Groshongなど., Mol. Endocrinol. 11 (1997), 1593-1607）。従って、例えばヒト乳癌細胞系T47Dにおけるプロゲステロンが、サイクリン１D及びサイクリン−依存性キナーゼ４の活性の一時的な上昇により付随される、S期における細胞の攻撃を誘発することは可能である。
【０００３】
しかしながら増殖刺激は、１回の周期に制限され、そして続いて、２回目の周期のG1/S−遷移での増殖阻止が伴う（Groshongなど., (1997), 前記；Musgroveなど., Mol. Cell Biol. 13 (1993), 3577-3587）。プロゲステロンにより停止されるその条件下で、細胞は、EGFの増殖作用に対して敏感である。さらに、プロゲステロンが、EGFR、Erb2及びErb3を高めることによって、T47D細胞に対するEGFの作用を増強し、そしてシグナル分子のチロシンリン酸化を高めることが示されている（Langeなど., J. Biol. Chem. 273 (1998), 31308-31316; Richerなど., J. Biol. Chem. 273 (1998), 31317-31326）。対照的にプロゲステロン受容体に影響を及ぼすことによって、腫瘍細胞に対するEGFの作用の阻害性を示すことはまだ不可能である。
【０００４】
本発明を導く試験の範囲内で、プロゲステロン受容体、例えば17α−フルオロアルキルステロイドのインヒビターが、腫瘍細胞、特に、プロゲステロン受容体の高い及び/又は構造的発現を有する腫瘍細胞経の増殖因子の結合を少なくとも部分的に阻害することができることが、驚くべきことには十分に見出された。
【０００５】
従って、本発明の目的は、腫瘍細への増殖因子の結合を阻害し、そして特に、増殖因子により生成される腫瘍細胞又は腫瘍の増殖を阻害するための剤の生成のためへのプロゲステロン受容体のインヒビターの使用である。本発明に関するプロゲステロン受容体のインヒビターは好ましくは、プロゲステロンのその受容体への結合を競争的に阻害する物質である。この場合、プロゲステロン受容体のインヒビターは好ましくは、例えばWO98/34947号に開示されるように、17α−フルオロアルキルステロイド類から選択される。それらの17α−フルオロアルキルステロイド類は、下記一般式I：
下記一般式I：
【０００６】
【化３】
0004335525.tif 000002
【０００７】
［式中、R1は、メチル又はエチル基を表し、
R2は、式CnFmHoで表される基を表し、ここでｎは２，３，４，５又は６であり、ｍ＞１であり、そしてｍ＋o＝2n＋1であり、
R3は、遊離、エーテル化された又はエステル化されたヒドロキシ基を表し、
R4及びR5は、追加の結合又はメチレン基と共に、水素原子をそれぞれ表し、
Stは、下記部分式A, B又はC：
【０００８】
【化４】
0004335525.tif 000003
【０００９】
で表されるステロイド性ABC−環システムを表し、
前記式中、R6は、水素原子、直鎖C1-C1アルキル基もしくは枝分かれ鎖C3-C4アルキル基、又はハロゲン原子を意味し、
R7は、水素原子、直鎖C1-C4アルキル基もしくは枝分かれ鎖C3-C4アルキル基、又はStがステロイド性ABC−環システムA又はBを表す場合、さらにR6及びR7は一緒に、追加の結合を意味し、
Xは、酸素原子、ヒドロキシアミノ基＝N−OH又は２個の水素原子を意味し、
【００１０】
R8は、基Y、又はいくつかの位置で基Yにより任意に置換されるアリール基を意味し、ここでYは水素原子、ハロゲン原子、-HO, -NO2, -N3, -CN, -NR9aR9b, -NHSO2R9, -CO2R9, C1-C10アルコキシ、C1-C10アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ−C1-C10アルカノイル、C1-C10ヒドロキシアルキル又はベンゾイル基であり、そしてR9a及びR9bは同じか又は異なり、そしてR9のように、水素原子又はC1-C10アルキル基を表す］で表される17α−フルオロアルキルステロイド類、及び基−NR9aR9bに関しては、酸とのそれらの生理学的に適合できる塩、及び基−CO2R9（R9は水素である）に関しては、塩基とのそれらの生理学的に適合できる塩を示す。
【００１１】
そのようなプロゲステロン受容体のインヒビターの特に好ましい例は、化合物11β−（４−アセチルフェニル）−17β−ヒドロキシ−17α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン（下記化合物A）である。さらに、他の抗黄体ホルモン、例えばオナプリストン（11β−［p−（ジメチルアミノ）フェニル］−17α−ヒドロキシ−17−（３−ヒドロキシプロピル）−13α−エストラ−４，９−ジエン−３−オン）がまた、適切である。
【００１２】
プロゲステロン受容体インヒビターの作用が、高い及び/又は構成的プロゲステロン受容体発現を有する腫瘍細胞、例えばプロゲステロン受容体−陽性乳癌細胞系T47Dの場合に特に見出されている（Sartoriusなど., Cancer Res. 54 (1994), 3668-3877）。
プロゲステロン受容体インヒビターは、増殖因子、特にEGF受容体ファミリー、例えばEGF受容体の増殖因子に結合するそれらの因子の発現のプロゲステロン−誘発された増強を阻害する。前記インヒビターは特に好ましくは、ヒト乳癌細胞へのEGFの結合を阻害する。
【００１３】
従って本発明によれば、プロゲステロン受容体インヒビターは、哺乳類及び好ましくはヒトにおける腫瘍治療のために、特にステロイド−依存性増殖の増殖因子−依存性増殖への腫瘍、特に乳癌の進行を阻止するために使用され得る。この場合、腫瘍の効果的処理は、患者についての予後の相当な悪化に関連する増殖因子−依存性増殖の段階において進行できる腫瘍を伴なわないで、例えば抗エストロゲンによるステロイド−依存性増殖の段階において生じることができる。プロゲステロン受容体インヒビターの投与はまた、増殖因子−依存性増殖の段階における腫瘍増殖を遅延することができる。
【００１４】
このためには、非ステロイド性抗エストロゲン、例えばタモキシフェン及びナフォキシジン、及びラロキシフェン及びEM800が使用され得る。前記言及された最後の２種の抗エストロゲンは、前記言及されたSERM（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）の代表であり；また、SERMの作用のプロフィールを有する他の化合物、例えばPCT/EP99/05093号に言及される化合物が本発明に従って使用され得、そして後者の化合物は、特に化合物５−（４−{５−［（RS−４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチル）スルフィニル］−ペンチルオキシ}フェニル）−６−フェニル−８，９−ジヒドロ−7H−ベンゾシクロヘプテン−２−オールである。
【００１５】
ステロイド性抗エストロゲンの例は、EP0348341A号に開示されるそれら、特にファスロデック（Faslodex）、及びWO98/07740号に開示されるそれら、特に11β−フルオロ−７α−{５−［N−メチル−N−３−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルチオ−プロピル）アミノ］ペンチル}−エストラ−１，３，５（10）トリエン−３，17β−ジオール、又はWO99/33855号に記載されるそれら、特に11β−フルオロ−7α−{５−［メチル−（７，７，８，８，９，９，10，10，10−ノナフルオロ−デシル）−アミノ］ペンチル}−エストラ−１，３，５（10）トリエン−３，17β−ジオール、又は医薬的に適合できるそれらの誘導体又は類似体である。抗エストロゲン効果を有するアロマターゼインヒビター、例えばEP0495825B1のページ７〜８から知られているそれらが、抗エストロゲンとして、同様に使用され得る。
【００１６】
プロゲステロン受容体インヒビターの投与は、通常使用される方法に従って、例えば局部的に、皮下的に、経腸的に又は非経口的に行われ得る。経腸投与に関しては、特に錠剤、被覆された錠剤、カプセル、ピル、懸濁液又は溶液（生薬において知られている添加剤及びビークルにより、通常の手段で生成され得る）が適切である。局部的使用に関しては、膣用坐剤又は経皮用システム、例えば皮膚パッチが適切である。皮下投与は、油溶液と共に注射することにより行われ得る。
用量単位は、例えば0.1〜100mgの活性化合物（プロゲステロン受容体のインヒビター）を含むことができる。ヒトへの投与に関しては、活性化合物の毎日の用量は、約0.1〜400mg、好ましくは約10〜100mg及び特に約50mgである。
【００１７】
さらに、本発明は次の例により説明される。
実施例
１．材料及び方法：
材料：
125I−EGF（100mCi/mモル）を、Amersham Bucklerにより得た。化合物A、ヒドロタモキシフェン（４−OH−Tam）、ZM1B2780及びエストラジオールを、既知方法に従って、Institute for Pharmaceatical Agent Chemistryにおいて合成した。
【００１８】
細胞系：
ヒトエストロゲン受容体（ER）−及びプロゲステロン受容体（PR）−陽性乳癌細胞系T47D（Freakなど., BBRC101 (1981), 1131-1138）を使用した。
増殖研究：
腫瘍細胞を、個々の場合に示される化合物の存在下で、10%ウシ血清、200nMのインスリン及び0.1nMのエストラジオールを含むRPMI培地を含む96−ウェルプレートにおいて、5000個の細胞/ウェルで６日間、培養し、そして増殖を、結晶バイオレットによる染色により決定した。
【００１９】
PR及びERタンパク質の量：
細胞溶解物におけるPR及びERの量を、Fuhrmannなど., (Contraception54 (1996), 243-251) に記載される方法に従って、放射性ラベルされたプロゲステロン又はエストラジオールによるステロイド結合アッセイの使用により決定する。
腫瘍細胞への125I−EGFの結合：
R5020−前処理されたT47D細胞を、125I−EGFと共に4℃で２時間インキュベートした。非特異的結合は常に、合計結合の10％以下であった。
【００２０】
トランス活性化アッセイ：
T47D細胞を、MTV−LUC（Catoなど., EMBO J., 9: 2237-40）により、一時的にトランス固定化し、そして1nMのR5020の不在又は存在下で培養した。PR−介在性拮抗作用に対する試験においては、その一時的にトランス固定化されたT47D細胞を、R5020により、及びさらに、上昇する濃度の化合物A又はRU486により処理した。24時間後、ルシフェラーゼ試験を行った。
【００２１】
２．結果：
図１は、種々の試験物質の抗増殖作用を示す。T47D細胞を、0.1nMのE2及び上昇する濃度の化合物A（黒三角）、オナプリストン（黒正方形）、ZK191703（●）又は４−OH−Tam（◆）の存在（上方の陰影部）又は不在（下方の陰影部）下で培養した。T47D細胞の場合、化合物Aはまた、非常に低い濃度で有意な抗増殖作用を示す。
図２は、T47D細胞におけるPR−及びER−タンパク質の量を示す。
図３は、T47D細胞におけるPRの転写活性を示し、それにより、それぞれの細胞はMTV−LUCにより一時的にトランス固定化され、そして（Co）の不在下又は1nMのR5020の存在下で培養された（a）。PR−介在性拮抗性についての試験においては、その一時的にトランス固定化されたT47D細胞は、0.1nMのR5020、及び上昇する濃度の化合物A又はRU4681により処理された（ｂ）。
【００２２】
図４においては、T47D細胞への125I−EGF結合のScatchard分析が示されている。細胞は、20nMの化合物Aを伴なって又はそれを伴なわないで、20nMのR5020の存在下で48時間、培養され、そして次に、洗浄された。次に、EGFの0.25〜150ng/mlの濃度範囲にわたってのEGF−結合が、4℃での２時間のインキュベーションに決定された。挿入は、遊離リガンド濃度の対数に対する結合されたリガンドの量を示す。化合物A（下方の図）が添加される場合、モニターリング（上方の図）に関して、R5020（中間の図）により引き起こされるEGF結合の上昇を阻止することが可能であったことは明確である。
【００２３】
図５においては、損なわれていないT47D細胞への125I−EGFの結合が示される。このためには、細胞は、２又は20nMのR5020＋化合物A又はオナプリストン、又は化合物Aのみにより48時間、処理された。化合物AはR5020により引き起こされるT47D細胞へのEGF−結合の上昇を阻止することがまた見出され得る。相当に弱い効果であるが、同様のことがまた、オナプリストンに関しても見出される。
【００２４】
議論：
上記結果は、高い及び構成的なPR接触を伴なって、T47D細胞のエストラジオール−刺激された増殖が化合物Aにより効果的に阻止されたことを示す。
トランス活性化アッセイにより、PRはT47D細胞において転写的に活性的であり、そして化合物１により阻止され得ることを示すことが可能であった。
【００２５】
R5020によるT47D細胞の刺激は、化合物Aにより阻止される、２〜３倍に高められたEGF−受容体発現をもたらした。同時に、細胞へのEGFの結合が２〜３倍に高められ、そして化合物Aにより妨げられ、そしてオナプリストンによっては、低いが、効果的に妨げられ得た。R5020処理された細胞への高められたEGF−結合が、増強されたEGF−受容体発現、又はEGF受容体とerbB2との間で高められたヘテロダイマー形成により生成され得た。
【００２６】
それらの結果は、ヒト乳癌細胞におけるPR−シグナルシステムと増殖因子−シグナルシステムとの間の相互作用を示す。抗黄体ホルモンの使用により、ステロイド−依存性増殖からの腫瘍細胞の増殖因子―依存性増殖への進行が阻害されるか又は妨げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、乳癌細胞系T47Dに対する試験物質の抗増殖作用を示す。
【図２】  図２は、乳癌細胞系T47Dにおけるプロゲステロン受容体（PR）及びエストロゲン受容体（ER）のタンパク質の量を示す。
【図３】  図３は、T47D細胞におけるプロゲステロン受容体の転写活性を示す。
【図４】  図４は、試験物質の存在の関数としてのT47D細胞へのEGFの結合のScatchard分析を示す。
【図５】  図５は、試験物質の存在に対するT47D細胞へのEGFの結合の存在性を示す。
【図１】
0004335525.tif 000004
【図２】
0004335525.tif 000005
【図３】
0004335525.tif 000006
【図４】
0004335525.tif 000007
【図５】
0004335525.tif 000008