(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイゼイン含有物と、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス及びストレプトコッカス・コンステラータスからなる群から選ばれる少なくとも１種のダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物とを必須成分として含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５号として寄託されたバクテロイデス Ｅ−２３−１５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６号として寄託されたストレプトコッカス Ｅ−２３−１７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７号として寄託されたストレプトコッカス Ａ６Ｇ−２２５からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール及びフラクトオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種を更に含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ダイゼイン含有物が、更にゲニステイン、ダイジン及びゲニスチンを含むものである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ダイゼイン含有物が大豆イソフラボンである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置を行なうための、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
食品形態である請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
食品形態が飲料、乳製品、発酵乳、バー、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
医薬品形態である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬品形態が水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置に有効な組成物の製造のための、ダイゼイン含有物及びバクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス及びストレプトコッカス・コンステラータスからなる群から選ばれる少なくとも１種のダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物の使用。
【請求項１２】
バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス及びストレプトコッカス・コンステラータスからなる群から選ばれる少なくとも１種のダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物をダイゼイン含有物に作用させて製造されることを特徴とする、エクオール含有組成物。
【請求項１３】
ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５号として寄託されたバクテロイデス Ｅ−２３−１５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６号として寄託されたストレプトコッカス Ｅ−２３−１７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７号として寄託されたストレプトコッカス Ａ６Ｇ−２２５からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール及びフラクトオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種を更に含有する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ダイゼイン含有物が、更にゲニステイン、ダイジン及びゲニスチンを含むものである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
ダイゼイン含有物が大豆イソフラボンである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置を行なうための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
食品形態である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
食品形態が飲料、乳製品、発酵乳、バー、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬品形態である請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
医薬品形態が水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ダイゼインに、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス及びストレプトコッカス・コンステラータスからなる群から選ばれる少なくとも１種のダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物を作用させることを特徴とするエクオールの製造方法。
【請求項２３】
ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５号として寄託されたバクテロイデス Ｅ−２３−１５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６号として寄託されたストレプトコッカス Ｅ−２３−１７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７号として寄託されたストレプトコッカス Ａ６Ｇ−２２５からなる群から選ばれるものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５号として寄託されたバクテロイデス Ｅ−２３−１５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６号として寄託されたストレプトコッカス Ｅ−２３−１７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７号として寄託されたストレプトコッカス Ａ６Ｇ−２２５から選択される微生物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、イソフラボン含有組成物、より詳しくは、ダイゼイン含有物と、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物とを配合してなるか又は上記ダイゼイン含有物に該微生物を作用させて得られるエクオールを配合してなり、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる各種症状の予防乃至緩和に有用な新しい組成物に関する。
背景技術
男性の前立腺癌や女性の乳癌、卵巣癌等の性別に特有の癌が、欧米人と比べて日本人に少ないのは、日本人がイソフラボン誘導体を含む大豆製品等をより多く摂取し、これによってホルモンのバランスがよく保たれているためであるという報告が、国立がんセンターとヘルシンキ大学（フィンランド）との共同研究によりまとめられている（Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ，３３９，１２３３；  Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ，３４２，１２０９−１２１０）。
最近では、イソフラボン誘導体がエストロゲン（女性ホルモン）様作用（Ａ．Ｍｏｌｔｅｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２５，７５１Ｓ−７５６Ｓ）を有することが注目されており、これがエストロゲンの分泌が低下或いは消失する閉経後の骨粗鬆症（Ｄ．Ａｇｎｕｓｄｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ，１９（Ｓｕｐｐｌｅ），Ｓ４３−Ｓ４８）や更年期障害（Ｄ．Ｄ．Ｂａｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８０，１６８５−１６９０；  Ａ．Ｌ．Ｍｕｒｋｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，，２１，１９５−１９８）に対して有効であると報告されている。
また、マーガレット  ロック（Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｌｏｃｋ）の調査（Ｍ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍａｔｕｒｉｔａｓ．，１０，３１７−３３２）では、日本人女性の更年期症状の出現率は、カナダ女性に較べて非常に低いことが示されている。これを受けて、アドラークロイツ（Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ）らは、日本人女性は豆腐、味噌、醤油等の大豆加工食品を多く摂取しており、之等に含まれている植物エストロゲン（イソフラボン誘導体）が、更年期症状の出現を低くしていると考えている。また彼らは、実際に摂取されたイソフラボン誘導体の吸収量を反映するといわれている尿中排泄量（２４時間）を比較した結果、日本人女性は欧米人女性に比べて該尿中排泄量が数十倍高いことを報告している（Ｃ．Ｈｅｒｎｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２５，７５７Ｓ−７７０Ｓ）。
以上のように、閉経後の骨粗鬆症や更年期障害等の緩和や予防には、ダイゼイン、ゲニステイン、ダイジン、ゲニスチン等のイソフラボン誘導体の摂取が、有効であると考えられている。特に、昨今の女性の寿命延長に伴われる閉経後の人生は３０年以上になるといわれ、この時期に現われる各種疾患乃至症状の緩和や予防は、ＱＯＬ（クオリティーオブライフ）の向上につながる点より、重要な課題となっている。
しかしながら、上記報告、即ち、我が国での中高年女性のイソフラボン誘導体の摂取量及び尿中イソフラボン誘導体排泄量の調査報告は、農村部の限られた地域を対称とした報告であり、その実体についての詳細は不明であり、また、更年期障害の出現とイソフラボン誘導体摂取量との関連も殆ど検討はなされておらず、明らかにはされていない。
従って、本発明の目的は、従来有効な予防法や緩和手段の確立されていなかった更年期障害を含む中高年女性の不定愁訴の予防乃至緩和に有効な新しい組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記目的より、更年期前後の女性を対象として都市部を含む広範囲で食事調査、尿中イソフラボン誘導体排泄量の測定、及び更年期症状（不定愁訴）のアンケート調査をまず行なった。
福岡県栄養士会に所属する４０〜６０歳の女性１１６名を対象に行なった上記調査結果によると、イソフラボン誘導体摂取量は、ダイゼインが平均９ｍｇ／日、ゲニステインが平均１３ｍｇ／日であった。尿中イソフラボン誘導体排泄量は、ダイゼインが平均１９．６μｍｏｌ／日、ゲニステインが平均１０．０μｍｏｌ／日であり、またダイゼインの代謝物であるエクオールが平均１１．９μｍｏｌ／日（検出者の平均値）であった。尚、上記ダイゼインとゲニステインについては全ての対象者で検出されたが、エクオールは９５名中４６名（５１．６％）にのみ検出された。
また、月経不順と閉経後５年以内のものを更年期者として、更年期障害の診断で使用されてきている１７項目［クッパーマンらの閉経指数（Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９５３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，１３，６８８−７０３）を改変した１７項目、即ち、１．顔がほてる、２．汗をかきやすい、３．腰や手足がひえる、４．息切れがする、５．手足がしびれる、６．手足の感覚がにぶい、７．夜なかなか寝つかれない、８．夜眠ってもすぐ目を覚ましやすい、９．興奮しやすい、１０．神経質である、１１．つまらないことにくよくよする、１２．めまいや吐き気がある、１３．疲れやすい、１４．肩こり、腰痛、手足の節々の痛みがある、１５．頭が痛い、１６．心臓の動悸がある、１７．皮膚をアリがはう様な感じがする］について、アンケート調査を行ない、簡易更年期指数（ＳＭＩ）を算出した。該ＳＭＩが２０以上の者を不定愁訴高値群とし、１９以下の者を不定愁訴低値群として、各群に属する更年期者について、イソフラボン誘導体摂取量と尿中イソフラボン誘導体排泄量とを比較した。
その結果、ダイゼイン摂取量については、両群間に差を認めなかったが、ゲニステイン摂取量は、不定愁訴高値群がｐ＝０．０６４３で低い傾向にあった。尿中イソフラボン誘導体排泄量では、ダイゼイン及びゲニステイン共に両群間に差を認めなかったが、エクオールの排泄量が不定愁訴高値群で有意に低かった（ｐ＜０．０１）。
以上の結果より、本発明者らは、更年期女性の不定愁訴がイソフラボン誘導体の中でも特にゲニステインの摂取量及び尿中エクオール排泄量と密接に関連することを見出した。
これまでの知見では、ダイゼインやゲニステイン等のイソフラボン誘導体の種類に関係なく、イソフラボン誘導体全体の摂取量及び尿中排泄量についてのみ、その生理作用との関係が論じられてきたが、本発明者らの日本人中高年女性の調査研究の結果から、単にイソフラボン誘導体の摂取量及び尿中排泄量だけではなく、ゲニステイン摂取量及び尿中エクオール排泄量、特に更年期女性におけるダイゼインからエクオールへの代謝能が、不定愁訴と密接に関係していることを認めた。
また、本発明者らが別途に行なった健常成人（２５〜３３歳）を対象とした試験では、イソフラボン誘導体含有食品の代表例である豆乳を単回摂取させた後の尿中イソフラボン誘導体（ダイゼイン及びゲニステイン）排泄量は、用量依存的に増加するが、エクオールが尿中に排泄されない人では、豆乳摂取量を２倍にしてもエクオールは検出されず、ダイゼインからエクオールへの代謝系には個人差のあることが判った。
尚、上記ダイゼインの代謝物であるエクオールは、大豆加工食品等のイソフラボン誘導体を含有する食品中には検出されず、また日常の食生活では食品からは殆ど摂取されないことが知られている（Ｋ．Ｒｅｉｎｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎｕｔｒ，Ｃａｎｃｅｒ，２６，１２３−１４８）。
これらの知見をもとに、本発明者らは更に鋭意研究を重ねた結果、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力（代謝活性）を有する微生物と、ダイゼイン又はこれを含む適当な素材とを組合せた新しい組成物、及び上記微生物にてダイゼインを資化させて得られるエクオールを含む新しい組成物の開発に成功すると共に、それらの摂取が中高年女性の不定愁訴の予防及び緩和に有効であるという事実を発見した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
発明の開示
本発明によれば、まず、ダイゼイン含有物と、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物とを必須成分として含有する、食品形態又は医薬品形態の組成物（以下「イソフラボン含有組成物」という）が提供される。
本発明によれば、次に、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物を、ダイゼイン含有物に作用させて得られるエクオールを含有する、食品形態又は医薬品形態の組成物（以下「エクオール含有組成物」という）が提供される。
本発明によれば、また、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物が、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス及びストレプトコッカス・コンステラータスからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物、特に該微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５として寄託されたバクテロイデス  Ｅ−２３−１５（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｅ−２３−１５）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６として寄託されたストレプトコッカス  Ｅ−２３−１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅ−２３−１７）及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７として寄託されたストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ６Ｇ−２２５）からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、また、上記微生物の維持、増殖成分、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール及びフラクトオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種、を更に含有する上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、上記ダイゼイン含有物が、更にゲニステイン、ダイジン及びゲニスチンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むもの、より好ましくは大豆イソフラボンである上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、また、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置を行なうための、上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、また、食品形態が飲料、乳製品、発酵乳、バー、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、また、医薬品形態が水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル及び錠剤形態から選択されるものである上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物が提供される。
本発明によれば、更に、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置を行なう方法であって、該予防及び処置を要求される中高年女性に、上記イソフラボン含有組成物又はエクオール含有組成物の有効量を投与する方法が提供される。
本発明によれば、更に、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる症状の予防及び処置に有効な上記イソフラボン含有組成物及びエクオール含有組成物の製造のための、ダイゼイン含有物及びダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物の使用が提供される。
本発明によれば、更に、ダイゼインに、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物を作用させる、エクオールの製造方法も提供される。
本発明によれば、更に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５として寄託されたバクテロイデス  Ｅ−２３−１５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６として寄託されたストレプトコッカス  Ｅ−２３−１７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７として寄託されたストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５から選択される微生物も提供される。
以下、本発明イソフラボン含有組成物につき詳述する。
本発明イソフラボン含有組成物においては、一方の必須成分としてダイゼイン含有物を使用する。ここでダイゼイン含有物には、ダイゼイン自体の他、その配糖体であるダイジン及びこれらを含む各種の素材が包含される。上記ダイゼインは、主に大豆、葛等の食素材、その加工品、例えば豆腐、油揚げ、豆乳等、及びその発酵調製物、例えば納豆、醤油、味噌、テンペ等に含まれており、本発明では、之等食素材、その加工品及び発酵調製物を上記ダイゼイン含有物として利用することができる。特に、之等は、ダイゼインの他に、エストロゲン様作用を有する各種のイソフラボン誘導体、例えばゲニステイン、ダイジン、ゲニスチン等や、これらの一部がメチル化された前駆体であるバイオチェインＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ａ）、フォルモネチン（Ｆｏｒｍｏｎｅｔｉｎ）等を含有しており、本発明に好適に利用できる。
本発明に好適なダイゼイン含有物には、また大豆由来の大豆イソフラボン、例えばフジッコ社製「フジフラボンＰ１０」（登録商標）等の市販品や、レッドクローブやアルファルファ等の植物に由来するイソフラボン誘導体が包含される。
本発明イソフラボン含有組成物においては、他方の必須成分として、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力（代謝活性）を有する微生物を用いる。該微生物には、より詳しくはバクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・インターメディアス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）及びストレプトコッカス・コンステラータス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）に属するものが包含される。之等に属する特に好ましいものとしては、本発明者らがヒト糞便中より新たに単離同定した寄託菌、即ち、バクテロイデス  Ｅ−２３−１５（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｅ−２３−１５，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５）、ストレプトコッカス  Ｅ−２３−１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅ−２３−１７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６）及びストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ６Ｇ−２２５，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）を例示することができる。
以下、之等の微生物の菌学的性質につき詳述する。
（１）バクテロイデス  Ｅ−２３−１５（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｅ−２３−１５，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５）
Ｉ．培地上での発育状態
本菌株は、ＥＧ（Ｅｇｇｅｒｔｈ−Ｇａｇｎｏｎ）寒天培地、ＢＬ（Ｂｌｏｏｄ  Ｌｉｖｅｒ）寒天培地もしくはＣＡＭ培地（Ｇｉｆｕ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いてスチールウール加嫌気ジャーにより、３７℃、４８時間、嫌気培養した際に、良好もしくは普通の生育を示す。その集落性状は、正円、凸内状に隆起し、表面、周縁とも平滑〜やや粗ぞうで、ＥＧ寒天培地上では灰白色、ＢＬ寒天培地上では灰褐色を呈する。菌形態は、ダラム陰性の桿菌で、球桿菌、単桿菌、長桿菌等の多形性を示すが、単在性で連鎖は見られない。本菌株は芽胞を形成しない。
ＩＩ．生理学的性質
（１）至適発育温度：３７℃
（２）至適発育ｐＨ：７．０
（３）ゼラチンの液化：＋
（４）可溶性澱粉の加水分解：＋
（５）エスクリンの加水分解：＋
（６）インドール産生：−
（７）ウレアーゼ：−
（８）カタラーゼ：−
（９）各炭素源の同化性：
Ｌ−アラビノース        ＋
Ｄ−キシロース          ＋
Ｄ−グルコース          ＋
シュクロース            ＋
Ｌ−ラムノース          ＋
Ｄ−ラフィノース        ＋
Ｄ−マンニット          ＋
インドール              ＋
ラクトース              ＋
マルトース              ＋
サリシン                ＋
ゼラチン                ＋
グリセリン              ＋
Ｄ−セロビオース        ＋
Ｄ−マンノース          ＋
Ｄ−メレチトース        ＋
Ｄ−ソルビトール        ＋
Ｄ−トレハロース        ＋
（１０）ペプトン又はグルコース資化後の有機酸組成：
糖資化性用培地であるＰＹＦ（ペプトン・イーストエクストラクトフィールド）培養液（約５％ペプトン含有）及びＰＹＦ培養液にグルコースを終濃度０．５％となるように添加したものを用いて、本菌株を嫌気的条件下で、３７℃、７２時間培養することによって得られた培養物中の有機酸をＨＰＬＣ法によって測定した。結果（単位：ｍＭ）を次に示す。
0004310601.tif 000002
以上、菌の形状、生化学的性質、糖資化性及び有機酸産生の各点から、本菌株は、グラム陰性桿菌であるバクテロイデス  オバタスあるいはバクテロイデス  ユニフォルミスに分類されるが、ラムノースに対する資化性を有することから、バクテロイデス  オバタスに属すると判断された。従って、本発明者は本菌株をバクテロイデス  Ｅ−２３−１５（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｅ−２３−１５）と命名し、平成９年７月７日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、微工研菌寄第Ｐ−１６３１２号として寄託した。尚、このものは、平成１０年７月２２日に、原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託に移管されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３５である。
（２）ストレプトコッカス  Ｅ−２３−１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅ−２３−１７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６）
Ｉ．培地上での発育状態
本菌株は、ＥＧ寒天培地、ＢＬ寒天培地もしくはＣＡＭ培地を用いてスチールウール加嫌気ジャーにより、３７℃、４８時間、嫌気培養した際に、良好もしくは普通の生育を示す。その集落性状は、正円、円錐〜中心凸状も隆起し、すりガラス状〜顆粒状構造で、周縁平滑〜やや粗を示す。ＥＧ寒天培地上では透明〜灰褐色を呈する。菌形態は、グラム陽性の球菌で、楕円形又は両端がやや尖った形をとる。単在もしくは双球状で不規則にかたまった集団を形成する。連鎖は見られない。芽胞は形成しない。
ＩＩ．生理学的性質
（１）至適発育温度：３７℃
（２）至適発育ｐＨ：７．０
（３）ゼラチンの液化：−
（４）可溶性澱粉の加水分解：−
（５）エスクリンの加水分解：＋
（６）インドール産生：−
（７）ウレアーゼ：−
（８）カタラーゼ：−
（９）各炭素源の同化性：
Ｌ−アラビノース        ＋
Ｄ−キシロース          −
Ｄ−グルコース          ＋
シュクロース            −
Ｌ−ラムノース          ＋
Ｄ−ラフィノース        −
Ｄ−マンニット          ＋
インドール              −
ラクトース              ＋
マルトース              ＋
サリシン                ＋
ゼラチン                −
グリセリン              −
Ｄ−セロビオース        ＋
Ｄ−マンノース          ＋
Ｄ−メレチトース        −
Ｄ−ソルビトール        ＋
Ｄ−トレハロース        ＋
（１０）ペプトン又はグルコース資化後の有機酸組成：
糖資化性用培地であるＰＹＦ（ペプトン・イーストエクストラクトフィールド）培養液（約５％ペプトン含有）及びＰＹＦ培養液にグルコースを終濃度０．５％となるように添加したものを用いて、本菌株を嫌気的条件下で、３７℃、７２時間培養を行なうことによって得られた培養物中の有機酸をＨＰＬＣ法によって測定した。結果（単位：ｍＭ）を次に示す。
0004310601.tif 000003
以上、菌の形状、生化学的性質、糖質化性及び有機酸産生の各点から、本菌株は、ダラム陽性球菌であるルミノコッカス  プロダクタスあるいはストレプトコッカス  コンステラタスに分類されるが、ルミノコッカス  プロダクタスの基準株とは、シュクロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ラフィノースの同化性の点で異なっている。従って、本発明者は本菌株をストレプトコッカス  Ｅ−２３−１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅ−２３−１７）と命名し、平成９年７月７日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、微工研菌寄第Ｐ−１６３１３号として寄託した。尚、このものは、平成１０年７月２２日に、原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託に移管されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６である。
（３）ストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ６Ｇ−２２５，ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）
Ｉ．培地上での発育状態
本菌株は、ＥＧ寒天培地、ＢＬ寒天培地もしくは
ＣＡＭ培地を用いてスチールウール加嫌気ジャーにより、３７℃、４８時間、嫌気培養した際に、良好もしくは普通の生育を示す。その集落性状は、正円、円錐〜中心凸状も隆起し、すりガラス状〜顆粒状構造で、周縁平滑〜やや粗を示す。ＥＧ寒天培地上では透明〜灰白色を呈する。菌形態は、ダラム陽性の球菌で、楕円形又は両端がやや尖った形をとる。単在もしくは双球状で不規則にかたまった集団を形成する。連鎖は見られない。芽胞は形成しない。
ＩＩ．生理学的性質
（１）至適発育温度：３７℃
（２）至適発育ｐＨ：７．０
（３）ゼラチンの液化：−
（４）可溶性澱粉の加水分解：−
（５）エスクリンの加水分解：＋
（６）インドール産生：−
（７）ウレアーゼ：−
（８）カタラーゼ：−
（９）各炭素源の同化性：
Ｌ−アラビノース      −
Ｄ−キシロース        −
Ｄ−グルコース        ＋
シュクロース          ＋
Ｌ−ラムノース        −
Ｄ−ラフィノース      ＋
Ｄ−マンニット        −
インドール            −
ラクトース            ＋
マルトース            ＋
サリシン              ＋
ゼラチン              −
グリセリン            −
Ｄ−セロビオース      ＋
Ｄ−マンノース        ＋
Ｄ−メレチトース      −
Ｄ−ソルビトール      −
Ｄ−トレハロース      −
（１０）ペプトン又はグルコース資化後の有機酸組成：
糖資化性用培地であるＰＹＦ（ペプトン・イーストエクストラクトフィールド）培養液（約５％ペプトン含有）及びＰＹＦ培養液にグルコースを終濃度０．５％となるように添加したものを用いて、本菌株を嫌気的条件下で、３７℃、７２時間培養を行なうことによって得られた培養物中の有機酸をＨＰＬＣ法によって測定した。結果（単位：ｍＭ）を次に示す。
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以上、菌の形状、生化学的性質、糖資化性及び有機酸産生の各点から、本菌株は、ダラム陽性球菌であるストレプトコッカス  インターメディアスに分類されるが、その基準株とは、Ｌ−ラムノース、Ｄ−トレハロースの同化性の点で異なっている。従って、本発明省は本菌株をストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ６Ｇ−２２５）と命名し、平成９年７月７日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、微工研菌寄第Ｐ−１６３１４号として寄託した。尚、このものは、平成１０年７月２２日に、原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託に移管されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７である。
本発明者が独自に単離した上記３種の微生物は、いずれも、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有することをその最大の特徴としている。ここで、ダイゼインには、例えばダイジン等のイソフラボン配糖体のアグリコンとしてのダイゼインも包含される。該ダイジンは上記微生物により資化されて、ダイゼインが産生され、更に該ダイゼインからエクオールが産生される。
従来、かかるエクオール産生能を有する微生物は報告された例がない。従って、本発明はかかるエクオール産生能を有する新しい微生物をも提供するものである。
本発明イソフラボン含有組成物の必須成分とする上記微生物は、各微生物の生菌そのものであるのが一般的であるが、特にこれに限定されず、例えばその培養液、培養物の粗精製品乃至精製品、それらの凍結乾燥品等であってもよい。その配合量は微生物の種類等に応じて適宜決定でき、特に限定されるものではない。例えば牛乳を発酵させた場合のストレプトコッカス・インターメディアス菌の場合は、菌数が１０８〜１０９個／ｍｌ前後となる量に調整されるのが好適である。該菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して３７℃下、嫌気培養を行ない、生育したコロニー数を計測することにより算出したものである。他の菌株の場合も上記菌数を目安として適宜決定できる。
本発明イソフラボン含有組成物中には、更に好ましくは、上記微生物の維持、増殖に特に適した栄養成分を含有させることができる。該栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖を例示できる。これらの配合量は、特に限定されるものではないが、通常本発明組成物中に１〜３重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。
本発明組成物は、一般には上記必須成分及びその他の成分の所定量を混合して、摂取乃至投与に適した適当な食品乃至医薬品形態、例えば食品形態の場合は、飲料、乳製品、発酵乳、バー、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等の形態、医薬品の場合は、水溶液、乳化液、類粒、粉末、カプセル、錠剤等の形態にそれぞれ調製される。これら各形態への調製は、常法に従うことができる。またこれら各形態への調製に当たって用いられる担体は、可食性担体乃至製剤学的に許容される賦形剤や希釈剤等の担体のいずれでもよい。特に食品形態の場合は、口当たりのよい味覚改善効果のある担体が好ましい。
特に使用の好ましい担体としては、例えばマスキング剤であるトレハロース（林原社製）、サイクロデキストリン、ベネコートＢＭＩ（花王社製）等を例示できる。
また、本発明組成物における上記ダイゼイン含有物、特定微生物及び必要に応じて添加配合される微生物の維持、増殖成分の混合比率は、特に限定的ではないが、一般に、本発明組成物１００ｇに対して、ダイゼイン含有物ではダイゼインが約１０〜５０ｍｇの範囲内とするのが好ましい。また、微生物は、同組成物に対して１０９〜１０１０個（生菌数として）、オリゴ糖は同組成物に対して約１〜５ｇの範囲内であるのが望ましい。
尚、上記の通り、本発明イソフラボン含有組成物は、微生物（主に生菌）を含有させるものであるため、該組成物の製品化に当たっては、加熱、加圧等の条件の採用はあまり好ましくない。従って、本発明組成物を例えばバー、顆粒、粉末、錠剤等の製品形態に調整するに当たっては、微生物を凍結乾燥菌体として直接処方するか、凍結乾燥菌体を適当なコーティング剤で加工して用いるのが好ましい。
本発明組成物には、必要に応じて、更に各種の栄養補給効果を奏し得る他の食素材や医薬品の調製に当たって慣用される各種の添加剤等を適宜添加配合することができる。該食素材としては、例えばカルシウム、ビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ（特に納豆菌由来のＭＫ−７（ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ−７））等を例示できる。他の添加できる素材の例としては、例えば亜鉛、セレン等を例示できる。
かくして得られる本発明イソフラボン含有組成物は、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる、例えば骨粗鬆症、更年期障害等の症状の予防及び処置に有用である。かかる、予防及び処置は、これを要求される中高年女性に、上記本発明組成物の有効量を投与するか又は摂取させることにより実施される。該有効量は、本発明組成物の投与によって、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる、例えば骨粗鬆症、更年期障害等の症状の予防及び処置が可能である限り、特に限定されるものではないが、一般には、ダイゼインが約１０〜５０ｍｇ／日、ゲニステインが約１０ｍｇ／日以上摂取される量とするのが好ましい。
次いで、本発明エクオール含有組成物につき以下に詳述する。
本発明エクオール含有組成物は、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られるエクオールを有効成分として含有することを必須とする。
ここで微生物としては、前述した本発明イソフラボン含有組成物において必須成分とするそれと同一のものを挙げることができる。また、該微生物を作用させるダイゼイン含有物も、前述した本発明イソフラボン含有組成物における場合と同様に、単離精製されたダイゼイン及びこれを含む食素材、その加工品もしくは発酵調製物、例えば大豆イソフラボン、葛、レッドクローブ、アルファルファ等に由来するイソフラボンやこれらを含む製品、例えば豆腐、豆乳、煮大豆、納豆、大豆胚軸抽出物等であることができる。
本発明エクオール含有組成物は、その有効成分とするエクオールが上記の通り天然物であることから、安全性に優れており、また微生物を用いて調製されたものであることに基づいて、その製造工程に由来する化学薬品等の混入のおそれもなく、更に高収率で且つ低生産コストである利点がある。
本発明エクオール含有組成物は、上記ダイゼイン含有物、好ましくは大豆イソフラボン又はこれを含有する食素材を基質として利用して、一般的な発酵方法に従い、上記微生物を培養することによって調製できる。
この方法は、より詳しくは、例えば基質を溶液状態にして滅菌した後、これに所定の微生物を添加して、３７℃下に、嫌気状態あるいは好気的静置状態で、４８〜９６時間程度発酵（必要に応じてｐＨ調節剤、還元物質（例えば酵母エキス、ビタミンＫ１等）を添加できる）させることにより実施できる。
上記培養は、例えばストレプトコッカス  インターメディアス菌の場合は、より好ましくは次の如くして実施できる。即ち、嫌気性菌増殖用の変法ＣＡＭ培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｉｆｕ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ）に、基質としてダイゼインを０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲で溶解する。予め、変法ＣＡＭ培地で１４時間程度前培養して増殖させた微生物の培養液を、ダイゼインを溶解させた変法ＣＡＭ培地に接種する。接種量は培地の１／１００容量とする。好気的条件下に、３７℃で、４８〜９６時間静置培養する。
本発明は、かかる微生物を利用したエクオールの製造方法をも提供するものである。
上記発酵系内には、更に好ましくは上記微生物の維持、増殖に特に適した栄養成分を含有させることができる。該栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等のオリゴ糖を例示できる。これらの配合量は、特に限定されるものではないが、通常本発明組成物中に１〜３重量％程度配合される量範囲から選ばれるのが好ましい。
かくして、所望のエクオール含有培養物が得られる。
該培養物からのエクオールの単離精製は、常法に従うことができる。例えば得られた発酵培養物をイオン交換樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０，三菱化成社製）に吸着させた後、メタノールで溶出させ、乾固して、エクオール粗精製物とすることができる。
本発明のエクオール含有組成物は、上記の如くして得られるエクオール含有培養物又は単離されたエクオールを利用して、これを更に必要に応じて適当な他の食素材等を適宜配合して、適当な食品形態乃至医薬品形態に調製することができる。
上記食品形態としては、例えば飲料、乳製品、発酵乳、バー、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等を例示できる。また、医薬品形態としては、例えば水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等の形態を例示できる。これら各形態への調製は、常法に従うことができる。またこれら各形態への調製に当たって用いられる担体は、可食性担体乃至製剤学的に許容される賦形剤や希釈剤等の担体のいずれでもよい。特に食品形態の場合は、口当たりのよい味覚改善効果のある坦体が好ましい。
かくして得られる本発明組成物中のエクオール量は、調製される食品形態及び医薬品形態に応じて決定され、特に限定されるものではないが、通常組成物全１００ｇ中にエクオールが１０〜５０ｍｇ程度含有される量の範囲とするのが好ましい。
本発明組成物の摂取量は、特に限定されるものではないが、摂取した場合に尿中のエクオール排泄量が５μＭ／日以上となる量を目安とすることができる。
本発明エクオール含有組成物は、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる、例えば鬆症、更年期障害等の症状の予防及び処置に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明イソフラボン含有組成物の調製例、エクオール含有組成物の調製例、エクオールの製造例を実施例として挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１  飲料の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、飲料形態の本発明組成物を調製した。
水溶性大豆蛋白の発酵培養物      １０ｍｌ
乳果オリゴ糖（５５％含量）    １０．０ｇ
ビタミン・ミネラル                適量
香料                              適量
水                                適量
全量                          １５０ｍｌ
上記水溶性大豆蛋白の発酵培養物は、水溶性大豆蛋白２．２ｇを水１０ｍｌに溶解したものに、ストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）を１０８個加えて、３７℃で４８時間発酵させたものである。
実施例２  発酵乳の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、発酵乳形態の本発明イソフラボン含有組成物を調製した。
水溶性大豆蛋白                            ２．２ｇ
乳果オリゴ糖（５５％含量）              １０．０ｇ
ストレプトコッカスＡ６Ｇ−２２５発酵乳  １００ｍｌ
ビタミン・ミネラル                          適量
香料                                        適量
水                                          適量
全量                                    ５０ｍｌ
尚、水溶性大豆蛋白中には、ダイゼインが３〜４％程度（高速液体クロマトグラフィー分析による、以下同じ）含まれる。また、ストレプトコッカスＡ６Ｇ−２２５発酵乳は、牛乳１リットルにストレプトコッカスＡ６Ｇ−２２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）を１０８個を加え、３７℃で２４時間発酵させたものである。
実施例３  発酵豆乳凍結乾燥粉末の調製
ストレプトコッカスＡ６Ｇ−２２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）約１０７個／ｍｌの１ｍｌを用いて、豆乳１００ｇを３７℃で２４時間乳酸発酵させて、エクオールを生成させた。これを凍結乾燥して粉末とした。粉末中のエクオール含量は、０．１〜０．３重量％であった。
上記粉末を用いて、下記処方の各成分を秤量混合して、発酵豆乳凍結乾燥粉末形態の本発明組成物を調製した。
発酵豆乳凍結乾燥粉末                    ２．２ｇ
賦形剤                                  適量
ビタミン・ミネラル                      適量
香料                                    適量
全量                                  ２０ｇ
尚、賦形剤としては、コーンスターチ１７ｇを用いた。
実施例４  粉末の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、粉末形態の本発明
組成物を調製した。
粗精製大豆イソフラボン末                  ４．１ｇ
乳果オリゴ糖（５５％含量）              １０．０ｇ
ストレプトコッカスＥ−２３−１７凍結乾燥粉末
１．０ｇ
ビタミン・ミネラル                        適量
香料                                      適量
全量                                    ２０ｇ
尚、ストレプトコッカスＥ−２３−１７凍結乾燥粉末は、ストレプトコッカスＥ−２３−１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３６）を増殖可能な適当な液体培地（ＣＡＭブロス）で培養（３７℃、２４〜４８時間）した後、集菌したものを凍結乾燥することによって得られたものであり、その菌体含量は１０９〜１０１０個／ｇである。
実施例５  顆粒の調製
下記処方の各成分を秤量混合して、顆粒形態の本発明組成物を調製した。
粗精製大豆イソフラボン末                  ４．１ｇ
乳果オリゴ糖（５５％含量）              １０．０ｇ
ストレプトコッカスＥ−２３−１７凍結乾燥粉末
１．０ｇ
ソルビトール                              適量
ビタミン・ミネラル                        適量
香料                                      適量
全量                                      ２０ｇ
尚、ストレプトコッカスＥ−２３−１７凍結乾燥粉末としては、実施例４と同一のものを用いた。
実施例６（微生物によるエクオールの製造）
基質として水溶性大豆イソフラボン素材（フジッコ社製「フジフラボンＰ１０」）を用いて、その２．２％濃度水溶液中に、ストレプトコッカスＡ６Ｇ−２２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）の  １０７〜１０９菌数を嫌気性菌培養用のＧＡＭ培地に懸濁させた液１ｍｌを加え、好気的、３７℃、静置条件下で９６時間、培養し、培養液中に産生するエクオール量をＨＰＬＣ法により測定した。尚、上記水溶液のダイジン濃度は１．０８３ｍｇ／ｍｌであり、ダイゼイン濃度は０．０１４ｍｇ／ｍｌであった。
その結果、水溶性大豆イソフラボン素材中には、エクオールは検出されなかったのに対して、９６時間培養後の培養液中のエクオール含量は、６１３．０±８．７μｇ／ｍｌ（５回の平均値±標準偏差）であり、ダイジン及びダイゼインは検出されなかった。
尚、上記において水溶性大豆イソフラボンに代えてダイゼイン（フナコシ社製、純度９９％以上）０．０１ｍｇ／ｍｌを含む基質液（ダイゼイン５ｍｇを特級メタノール２ｍｌに懸濁させ、これをＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地で５０ｍｌに希釈したもの）を用いて、同様にしてエクオールを製造した結果、９６時間後の培養液中のエクオール含量は、１７．９±１．４μｇ／ｍｌ（５回の平均値±標準偏差）であった。
このことから、本発明微生物の利用によれば、ダイゼインからエクオールを効率よく製造できることが明らかである。
実施例７  飲料の調製
エクオール含有発酵培養物        １．５５ｇ
ブドウ糖                        ５．００ｇ
クエン酸                        ０．５ｇ
ビタミン・ミネラル                適量
香料                              適量
水                                適量
全量                            ２００ｍｌ
実施例６と同様にして、水溶性大豆イソフラボン素材（フジフラボンＰ１０，フジッコ社製）の２．２％濃度水溶液に、ストレプトコッカス  Ａ６Ｇ−２２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４３７）の１０７〜１０９菌数を嫌気性菌培養用のＣＡＭ培地に懸濁させた液１ｍｌを加え、好気的、３７℃、静置条件下で９６時間培養して得られたエクオール含有発酵培養物を用いて、上記処方に従い、飲料形態本発明組成物を調製した。
実施例８  バーの調製
エクオール含有発酵培養物      １．５５ｇ
バター                        ２０．０ｇ
砂糖                          ２０．０ｇ
塩                                少々
卵                              １／２個
小麦粉                        ８０．０ｇ
ビタミン・ミネラル                適量
香料                              適量
牛乳                          ３０．０ｇ
実施例７に記載のエクオール含有発酵培養物を用いて、上記処方に従い、生地を調製し、これを適当なバー状形態に賦形後、１７０℃のオーブンで１５分間焼いて、菓子バーを調製した。
実施例９  ゼリーの調製
エクオール含有発酵培養物      １．５５ｇ
果汁                        ５０．０ｇ
砂糖                        ５０．０ｇ
寒天                          ２．５ｇ
ビタミン・ミネラル              適量
香料                            適量
実施例７に記載のエクオール含有発酵培養物を用いて、上記処方に従い、各成分を混合しながら、９０℃まで加熱して、寒天を溶かし、全体を適当な容器に流し込んだ後、５〜１０℃に冷却して凝固させて、ゼリー状形態の本発明組成物を調製した。
産業上の利用可能性
本発明組成物は、食品形態乃至医薬品形態でこれを摂取乃至投与することによって、中高年女性における不定愁訴乃至閉経に伴われる各種症状の予防乃至緩和に有用である。