(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド８６８からヌクレオチド
２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ ＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸１１３からアミノ酸６５４までのアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性（ａ）および（ｂ）を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、
（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡがコードする蛋白。
【請求項５】
配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド５３２からヌクレオチド
２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ−Ｐ ＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ−Ｐ。
【請求項７】
請求項５記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ細胞表面においてＡβに結合する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡがコードする蛋白。
【請求項９】
配列表の配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号１４１〜１４６または５８９〜５９７において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失もしくは置換されている請求項８記載の蛋白。
【請求項１０】
請求項１または３に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を、請求項１０記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。
【請求項１３】
請求項５または７に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４記載の形質転換体を、請求項１３記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。
【請求項１６】
経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３８として寄託されている形質転換体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換体中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の形質転換体を、その中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を含有するベクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。
【請求項１９】
請求項２または４に記載の蛋白に特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２である請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
請求項２または４に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ＣＬＡＣの活性阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１９記載の抗体を用いることを特徴とするＣＬＡＣの検出方法。
【請求項２３】
該抗体が経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２を用いるＣＬＡＣの精製方法。
【請求項２５】
請求項６、８または９に記載の蛋白に特異的に結合する抗体。
【請求項２６】
経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２である請求項２５記載の抗体。
【請求項２７】
請求項６、８または９に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ＣＬＡＣ−Ｐの活性阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項２５記載の抗体を用いることを特徴とするＣＬＡＣ−Ｐの検出方法。
【請求項２９】
該抗体が経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２を用いるＣＬＡＣ−Ｐの精製方法。
【請求項３１】
検知可能に標識された経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体９Ｄ２を構成成分とするアルツハイマー病診断用キット。
【請求項３２】
請求項１、３、５または７のいずれかに記載ＤＮＡを人為的に染色体中に導入するか、あるいは染色体から欠損させたヒトを除くトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アルツハイマー病患者の脳に老人斑を形成して蓄積するアミロイド物質中に存在するヒト型のコラーゲン様新規蛋白（以下、ＣＬＡＣと称する）およびＣＬＡＣ前駆体（以下、ＣＬＡＣ−Ｐと称する）、ならびにそれらをコードする遺伝子に関する。さらに本発明は、マウス型ＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列にも関する。また本発明は、これらを応用して、アミロイド蛋白の蓄積促進機序を阻害することによる治療法および細胞障害を抑制することによる治療法、ならびにアルツハイマー病の診断法の開発にも関する。
背景技術
アルツハイマー病は、神経細胞変性・脱落とともに、老人斑の形成および神経原線維変化の出現を特徴とする痴呆性神経変性疾患である。最も特徴的な老人斑はβアミロイド前駆体蛋白質（β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、βＡＰＰと略すこともある）に由来するアミロイドβペプチド（以下、Ａβと略すこともある）を主成分として（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２２，１１３１（１９８４））、アポリポ蛋白Ｅ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ５４１，１６３（１９８４））や補体成分Ｃｌｑ（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ５７，２３９（１９８２））などの生体成分が沈着したものである。Ａβはそれ自体が凝集性を有するが、前記の非Ａβアミロイド成分、すなわちアポリポ蛋白Ｅ（Ｎａｔｕｒｅ  ３７２，９２（１９９４））やＣｌｑ（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ４６，５８（１９９６））の作用によりアミロイド線維の形成が促進される。アミノ酸４０〜４２個からなるＡβは、神経細胞を含め種々の細胞から分泌されており、通常の濃度では顕著な毒性を細胞に与えることはない。しかし、高濃度になるとＡβは凝集し、神経細胞に対して毒性を示すようになる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，２７９（１９９０））。この際に細胞表面に存在し、凝集したＡβの受容体として作用する分子としてはＲＡＧＥ（Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，６８５（１９９６））やスカベンジャー受容体Ａ（Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，７１６（１９９６））などが知られている。アルツハイマー病の神経細胞障害過程には、アミロイドの凝集と蓄積、細胞に対する毒性が極めて重要視されており、両過程の阻害はアルツハイマー病の治療法として有効と考えられる。
Ａβのアミロイドとしての蓄積はアルツハイマー病にきわめて特徴的ではあるが、Ａβの蓄積のみでは神経細胞に対する毒性の発揮、アルツハイマー病の発症には不十分であることが明らかになりつつある（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，７０５３（１９９７））。一方でアポリポ蛋白Ｅのように、Ａβと結合し、老人斑アミロイド蓄積過程を促進する蛋白質の遺伝的多型性が、アルツハイマー病発症の危険因子として作用する例（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，９２１（１９９３））からも推察されるように、老人斑アミロイド中の未知蛋白成分がアミロイドの蓄積性および神経細胞障害性に重大な影響を与えている可能性が注目されてきたが、その成分の同定は未だなされてこなかった。
発明の開示
かかる状況に鑑みて、本発明者らは、アルツハイマー病患者脳から抽出したアミロイド画分に対するマウスモノクローナル抗体を作成した結果、意外なことに、これらのモノクローナル抗体の中から、老人斑アミロイドを選択的に染色し、生化学的に５０ないし１００キロダルトンの新規蛋白を認識する抗体を見いだした。
さらに本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに鋭意研究を進めた結果、アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に存在する、新規なヒト・コラーゲン様アルツハイマーアミロイド構成蛋白ＣＬＡＣ（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を見いだし、その全構造ならびにその前駆体ＣＬＡＣ−Ｐ（ＣＬＡＣ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする新規遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。さらに本発明者らは、マウス型のＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。
すなわち、本発明は、
（１）配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド８６８からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ  ＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸１１３からアミノ酸６５４までのアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ、
（３）上記（２）に記載の蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特性（ａ）および（ｂ）を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、
（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する、
（４）上記（１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ以下の特性（ａ）および（ｂ）を有する蛋白をコードするＤＮＡ：
（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、
（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する、
（５）上記（３）または（４）のいずれかに記載のＤＮＡがコードする蛋白、
（６）配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド５３２からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ−Ｐ  ＤＮＡ、
（７）配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ−Ｐ、
（８）上記（７）に記載のＣＬＡＣ−Ｐにおいて１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白をコードするＤＮＡ、
（９）上記（６）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白をコードするＤＮＡ、
（１０）上記（８）または（９）のいずれかに記載のＤＮＡがコードする蛋白、
（１１）配列表の配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号１４１〜１４６または５８９〜５９７において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失もしくは置換されている上記（１０）記載の蛋白、
（１２）上記（１）、（３）または（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、
（１３）上記（１２）に記載のベクターによって形質転換された形質転換体、
（１４）上記（１３）記載の形質転換体を、上記（１２）記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、
（１５）上記（６）、（８）または（９）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、
（１６）上記（１５）に記載のベクターによって形質転換された形質転換体、
（１７）上記（１６）記載の形質転換体を、上記（１５）記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、
（１８）経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３８として寄託されている形質転換体、
（１９）上記（１８）に記載の形質転換体中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子、
（２０）上記（１８）に記載の形質転換体を、その中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を含有するベクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、
（２１）上記（２）または（５）に記載の蛋白に特異的に結合する抗体、
（２２）モノクローナル抗体９Ｄ２である上記（２１）記載の抗体、
（２３）上記（２）または（５）に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ＣＬＡＣの活性阻害剤のスクリーニング方法、
（２４）上記（２３）のスクリーニング方法により得られる、ＣＬＡＣの活性阻害剤、
（２５）上記（２１）記載の抗体を用いることを特徴とするＣＬＡＣの検出方法、
（２６）上記（２１）記載の抗体または上記（２４）記載のＣＬＡＣの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法、
（２７）該抗体がモノクローナル抗体９Ｄ２である上記（２５）記載の方法、
（２８）該抗体がモノクローナル抗体９Ｄ２である上記（２６）記載の方法、
（２９）モノクローナル抗体９Ｄ２を用いるＣＬＡＣの精製方法、
（３０）上記（７）、（１０）または（１１）に記載の蛋白に特異的に結合する抗体、
（３１）モノクローナル抗体９Ｄ２である上記（３０）記載の抗体、
（３２）上記（７）、（１０）または（１１）に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ＣＬＡＣ−Ｐの活性阻害剤のスクリーニング方法、
（３３）上記（３２）のスクリーニング方法により得られる、ＣＬＡＣ−Ｐの活性阻害剤、
（３４）上記（３０）記載の抗体を用いることを特徴とするＣＬＡＣ−Ｐの検出方法、
（３５）上記（３０）記載の抗体または上記（３３）記載のＣＬＡＣ−Ｐの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法、
（３６）該抗体がモノクローナル抗体９Ｄ２である上記（３４）記載の方法、
（３７）該抗体がモノクローナル抗体９Ｄ２である上記（３５）記載の方法、
（３８）モノクローナル抗体９Ｄ２を用いるＣＬＡＣ−Ｐの精製方法、
（３９）検知可能に標識されたモノクローナル抗体９Ｄ２を構成成分とするアルツハイマー病診断用キット、ならびに
（４０）上記（１）、（３）、（４）、（６）、（８）または（９）のいずれかに記載のＤＮＡを人為的に染色体中に導入するか、あるいはいずれかを染色体から欠損させたトランスジェニック動物、に関する。
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド８６８からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＤＮＡであって、ＣＬＡＣをコードするＤＮＡである。
本発明の第２の態様は、配列番号：２に記載のアミノ酸１１３からアミノ酸６５４までのアミノ酸配列を有するＣＬＡＣである。
本発明の新規アミロイド分子ＣＬＡＣおよびＣＬＡＣ−Ｐは、実施例２に詳述するように、抗体との特異的相互作用を利用して検出することができ、その部分アミノ酸配列、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を決定することができる。以下に、これらの手順につき簡単に説明する。
ＣＬＡＣおよびＣＬＡＣ−Ｐは、例えば、以下の方法により検出することができる。
アルツハイマー病患者脳よりショ糖密度勾配遠心法、尿素抽出法等の公知の方法により不溶性画分として粗精製した老人斑アミロイド成分を、例えば、ＢＡＬＢ−Ｃマウスに免疫して抗体、好ましくはモノクローナル抗体を得る。得られた抗体を用いて、下記（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの方法により検出することができる。
（ｉ）アルツハイマー病患者大脳皮質を２４時間１０％ホルマリンにて固定後作成した組織切片の免疫学的化学染色によりアミロイド斑として検出、あるいは  （ｉｉ）アルツハイマー病患者大脳皮質をトリス緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウム溶液で抽出後の沈殿物を７０％ギ酸で溶解したアミロイド画分のＳＤＳ電気泳動・ウェスタンブロット解析により、５０ないし１００キロダルトンのポリペプチドとして検出。
使用する抗体としては、実施例１にて詳述するモノクローナル抗体９Ｄ２が好ましい。
本発明のＣＬＡＣの部分アミノ酸配列は、例えば、以下の工程（イ）〜（ホ）を含む方法により決定することができる。
（イ）アルツハイマー病患者大脳皮質をトリス緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳという）溶液で抽出後の沈殿物を７０％ギ酸で溶解したアミロイド成分を逆相高性能液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）にて分画、Ａβペプチドと分離し、
（ロ）ゲル濾過カラムにて５０および１００キロダルトンのポリペプチドをそれぞれ単離し、
（ハ）蛋白分解酵素、例えば、リシルエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎ、トリプシン等により限定分解を加え、
（ニ）逆相ＨＰＬＣによりペプチド断片を分離し、
（ホ）アミノ酸配列分析装置によりペプチドのアミノ酸配列を決定する。
ＣＬＡＣ蛋白質の前駆体、すなわちＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡ核酸配列は、例えば、以下工程（イ）、（ロ）を含む方法にて得ることができる。
（イ）上述のごとく得られたＣＬＡＣの部分アミノ酸配列、例えばＧｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  配列番号：１１）の一部分をコードする核酸配列に対応しうる合成オリゴヌクレオチド混和物（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ）をプライマーとして、ヒト脳由来の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーからポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法を用いて、ＣＬＡＣ蛋白の一部分をコードするｃＤＮＡをクローニングし、
（ロ）（イ）で得られた核酸配列を鋳型として、ＰＣＲ法を用いた「ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ」法（当業者に公知）を反復して施行する。
またＣＬＡＣ−Ｐの全予想アミノ酸配列は、上記核酸配列を常法に従ってアミノ酸に翻訳することにより得ることができる。
かくして得られたヒトＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号：１に示す。この配列は６５４個のアミノ酸からなるＣＬＡＣ−ＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を有し（ヌクレオチド５３２〜２４９３）、その６５４個のアミノ酸からなるＣＬＡＣ−Ｐ蛋白の全予想アミノ酸配列を配列表の配列番号：２に示す。
また、マウスもしくはラット脳由来ｃＤＮＡライブラリーを用いて、上記ヒトＣＬＡＣ−Ｐの核酸配列から適切に選択した核酸配列に相当するオリゴヌクレオチドを化学合成し、それをプライマーとしてＰＣＲ法を施行することにより、マウスもしくはラットのＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡおよびそれらのアミノ酸配列を得ることもできる。
本発明のＣＬＡＣは、（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する。
本発明のＣＬＡＣのＡβ凝集を促進する機能を種々の方法により評価することができるが、例えば、次の方法（イ）または（ロ）により評価することができる。
（イ）合成Ａβ（１−４２）ペプチド［アミロイドβペプチドのＮ末端から１番目〜４２番目のアミノ酸からなることを意味する］１１５μＭと適量の精製ＣＬＡＣを混和し、室温で０〜５日インキュベーションする。反応液を１５，０００ｘｇ、１５分遠心し、沈殿物を１０μｌのＰＢＳ液に懸濁する。チオフラビンＴを適量加え、蛍光光度計で分析する。λｅｘは４４０ｎｍ、λｅｍは４８２ｎｍで行う。得られた測定値を、精製ＣＬＡＣを加えないＡβ（１−４２）ペプチドのみを同様にインキュベーションした場合の値と比較する。あるいは、
（ロ）ヒトＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスとアルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスを交配して生まれたマウスの脳のβアミロイド斑がアルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子のみを過剰発現したトランスジェニックマウス脳のそれよりも増加していることを免疫組織化学もしくは生化学的に確認することにより、あるいはマウスＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子をノックアウトしたマウスにアルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスの脳のβアミロイド斑が、アルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスのそれよりも減少していることを免疫組織化学もしくは生化学的に確認する。
本発明の第３の態様は、ＣＬＡＣのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された、いわゆるＣＬＡＣ変種蛋白であって、（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有するＣＬＡＣ変種蛋白をコードするＤＮＡである。
ここで、１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、人為的に生じたものであってもよく、自然発生的に生じたものであってもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８（１９８３））あるいはＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｈ．１５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の公知の方法により遺伝子工学的に行うことができる。また、かかるアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は生体内で生じるものであってもよく、スプライスバリアント、対立遺伝子による変種等も本発明のＣＬＡＣ変種蛋白に包含される。さらに、上記機能（ａ）および（ｂ）を有するＣＬＡＣの部分ペプチドも本発明のＣＬＡＣ変種蛋白に包含される。また、１または複数のアミノ酸において、化学的修飾（人為的であっても自然発生的であってもよい）がなされたものも、本発明のＣＬＡＣ変種蛋白に包含される。かかる化学修飾としては、例えば、アセチル化、アミド化、アシル化、糖鎖付加、リン酸化、硫酸化、脂質付加、ハロゲン化、塩の形成等がある。さらに、天然のＬ−型の２０種以外のアミノ酸（Ｄ−型、人工アミノ酸等）がＣＬＡＣ変種蛋白中に存在していてもよい。かかるＣＬＡＣ変種蛋白をコードするＤＮＡ配列の、元のＣＬＡＣをコードするＤＮＡ配列（本発明の第１の態様）に対する相同性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
ここに、相同性とは、２つのＤＮＡまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致の度合いをパーセントで表現したものをいう。今日では、相同性の検索にはコンピュータープログラムが使用されており、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｎｍａｎアルゴリズム、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴプログラム等が使用されている。
また、本発明の第４の態様は、配列番号：１に記載のヌクレオチド８６８からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ  ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する蛋白をコードするＤＮＡである。ここに、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩基配列間に少なくとも９０％以上の相同性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こるような条件を意味し、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、ついで、０．１ｘＳＳＣ中６５℃で洗浄を行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄については周知の手法で行うことができ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｈ．１１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に示されている。
本発明の第５の態様は、
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸１１３からアミノ酸６５４までのアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ蛋白において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された、いわゆるＣＬＡＣ変種蛋白であって、（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有するＣＬＡＣ変種蛋白をコードするＤＮＡ；あるいは
（ｉｉ）配列番号：１に記載のヌクレオチド８６８からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ  ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有する蛋白をコードするＤＮＡ
のいずれかによりコードされる蛋白である。かかる蛋白としては、ＣＬＡＣ変種蛋白またはＣＬＡＣに対して高いアミノ酸配列相同性を有する蛋白であって、上記（ａ）、（ｂ）の機能を有するものが挙げられる。例えば、上記のＣＬＡＣ変種蛋白や、ＣＬＡＣの部分ペプチド、ラットやマウスのＣＬＡＣ等が具体例として挙げられる。
本明細書において、第２の態様のＣＬＡＣならびに第５の態様のＣＬＡＣ変種蛋白をまとめて、「ＣＬＡＣ」と称することがある。
本発明の第６の態様は、配列表の配列番号：１に記載のヌクレオチド５３２からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ−Ｐ  ＤＮＡである。
本発明の第７の態様は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＬＡＣ−Ｐである。
本発明のＣＬＡＣ−Ｐは細胞表面においてＡβ受容体として機能する。
本発明のＣＬＡＣ−Ｐの細胞表面におけるβアミロイド受容体としての機能を種々の方法により評価することができるが、例えば、次の方法により評価することができる。
ＣＬＡＣ−Ｐを恒常的に発現したＨＥＫ２９３細胞およびコントロール細胞をコンフルエントな状態まで培養し、予め６０分間試験管内でインキュベーションした１０ｍＭ  Ａβ（１−４２）を加え、６０分間インキュベーションする。回収した細胞を、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて超音波破砕により可溶化し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により蛋白を分解し、抗Ａβ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、細胞に結合したＡβ量を検出することができる。
ＣＬＡＣ−Ｐを介して細胞に結合したＡβの細胞毒性については、次の方法により評価することができる。例えば、ＮＧＦにより神経細胞に分化誘導したＰＣ１２細胞に、リポフェクション法によりＣＬＡＣ−Ｐを一過性に発現させ、予め１時間インキュベーションしたＡβ（１−４２）を加え、１時間インキュベーションする。その後、細胞を１０％ホルマリンで固定し、ＴＵＮＥＬ染色性により、アポトーシスによる細胞死過程を示す細胞核を染色し、陽性細胞の比率をＣＬＡＣ−Ｐを発現しないＰＣ１２細胞と比較する。あるいは、各ウェルに臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェノルテトラゾリウム（ＭＴＴ）試薬を加え、生存細胞に取り込まれたＭＴＴ試薬の量を吸光光度計により測定し、比較してもよい。
本発明の第８の態様は、ＣＬＡＣ−Ｐの１個もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白、いわゆるＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白をコードするＤＮＡである。
ここで、１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、人為的に生じたものであってもよく、自然発生的に生じたものであってもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８（１９８３））あるいはＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｈ．１５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の公知の方法により遺伝子工学的に行うことができる。また、かかるアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は生体内で生じるものであってもよく、スプライスバリアント、対立遺伝子による変種等も本発明のＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白に包含される。さらに、細胞表面においてＡβ受容体として機能するＣＬＡＣ−Ｐの部分ペプチドも本発明のＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白に包含される。また、１または複数のアミノ酸において、化学的修飾（人為的であっても自然発生的であってもよい）がなされたものも、本発明のＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白に包含される。かかる化学修飾としては、例えば、アセチル化、アミド化、アシル化、糖鎖付加、リン酸化、硫酸化、脂質付加、ハロゲン化、塩の形成等がある。さらに、天然のＬ−型の２０種以外のアミノ酸（Ｄ−型、人工アミノ酸等）がＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白中に存在していてもよい。かかるＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白をコードするＤＮＡ配列の、元のＣＬＡＣ−ＰをコードするＤＮＡ配列（本発明の第６の態様）に対する相同性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
また、本発明の第９の態様は、配列番号：１に記載のヌクレオチド５３２からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ  Ｐ  ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白をコードするＤＮＡである。
本発明の第１０の態様は、
（ｉ）ＣＬＡＣ−Ｐの１個もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白、いわゆるＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白をコードするＤＮＡ；あるいは
（ｉｉ）配列番号：１に記載のヌクレオチド５３２からヌクレオチド２４９３までの塩基配列からなるＣＬＡＣ  Ｐ  ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、細胞表面においてＡβ受容体として機能する蛋白をコードするＤＮＡのいずれかによりコードされる蛋白である。かかる蛋白は、ＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白またはＣＬＡＣ−Ｐに対して高いアミノ酸配列相同性を有する蛋白であって、細胞表面においてＡβ受容体として機能するものである。例えば、上記のＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白や、ＣＬＡＣ−Ｐの部分ペプチド、ラットやマウスのＣＬＡＣ−Ｐ等が具体例として挙げられる。
さらに本発明の第１１の態様は本発明のＣＬＡＣ−Ｐのスプライスバリアントである。本発明のＣＬＡＣ−Ｐのスプライスバリアントとしては、例えば、配列番号：２のアミノ酸番号１４１〜１４６において１個もしくは６個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたもの、あるいは配列番号：２のアミノ酸番号５８９〜５９７において１個もしくは９個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたもの、上記のアミノ酸の欠失または置換が同時に起っているものが挙げられる。かかる多様性は選択的スプライシングによる複数種のメッセンジャーＲＮＡ形成によるものと考えられる。
本明細書において、第７の態様のＣＬＡＣ−Ｐ、第１０の態様のＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白ならびに第１１の態様のＣＬＡＣ−Ｐのスプライスバリアントをまとめて、「ＣＬＡＣ−Ｐ」と称することがある。
本発明の第１２の態様は、本発明の第１、第３または第４のいずれかの態様のＤＮＡを含有する発現ベクターである。本発明の第１３の態様は、該発現ベクターにより形質転換された形質転換体である。本発明の第１４の態様は、該形質転換体を、該発現ベクターの発現可能条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法である。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。かかる組み換え蛋白は、本発明のＣＬＡＣであるか、あるいは（ａ）アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（ｂ）Ａβ凝集を促進する機能を有するＣＬＡＣ変種蛋白である。
本発明の第１５の態様は、本発明の第６、第８または第９のいずれかの態様のＤＮＡを含有する発現ベクターである。本発明の第１６の態様は、該発現ベクターにより形質転換された形質転換体である。本発明の第１７の態様は、該形質転換体を、該発現ベクターの発現可能条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法である。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。かかる組み換え蛋白は、本発明のＣＬＡＣ−Ｐであるか、あるいは細胞表面においてＡβ受容体として機能するＣＬＡＣ−Ｐ変種蛋白である。これらの態様に関連した態様において、本発明は、ＣＬＡＣ−Ｐをコードする遺伝子を含むベクターを入れたＨＥＫ２９３細胞形質転換体（経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３８として寄託されている）に関する。したがって本発明は、上記寄託株中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子にも関する。さらなる態様において、該寄託形質転換株を、その中に含まれるＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を含有するベクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする組み換え蛋白の製造方法にも関する。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。
かかる組み換え法による蛋白の製造は当業者に公知の方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載された方法により行うことができるが、以下に典型例を示す。
上記ＤＮＡを組み込むのに適したベクターとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７７））、ｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，４，１２１（１９７８））、ｐＵＣ１２（Ｇｅｎｅ，１９，２５９（１９８２））、ｐＵＣ１３（Ｇｅｎｅ，１９，２５９（１９８２））、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３（１９８７））、枯草菌由来のｐＵＢ１１０（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１１２，６７８（１９８３））等が挙げられる。その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用いることができる。
プラスミドに上記ＤＮＡを組み込む方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｐ．２３９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）等に記載の方法がある。
このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主、例えばエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌等に導入する。
上記エシェリシア属菌の例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１６０（１９８６））、Ｍ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９（１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０，５１７（１９７８））、ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４５９（１９６９））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４））等が挙げられる。
形質転換する方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｐ．２４９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）に記載の塩化カルシウム法あるいは塩化カルシウム／塩化ルビジウム法等が挙げられる。
このようにして得られた形質転換体の中から自体公知の方法、例えばコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｅｎｅ，１０，６３（１９８０））およびＤＮＡ塩基配列決定法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，５６０（１９７７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９（１９８１））等を用い、所望クローンを選出する。
このようにして、クローン化された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を含むＤＮＡを有するベクターを保持する微生物が得られる。
次に、該微生物からプラスミドを単離する。
該単離法としては、アルカリ法（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｍｂｉｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，１５１３（１９７９））等が挙げられる。
上記のごとくクローン化された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を含む組み換えＤＮＡを有するプラスミドは、そのまま、あるいは所望により制限酵素で切り出して利用することができる。
クローン化された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。発現型ベクターにて形質転換される宿主としては動物細胞が好ましく、好ましいベクターとしては、動物細胞発現用プラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒ等）が挙げられる。また、本発明の組み換え蛋白の生成に適したものであれば、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞ならびにそれらに適したベクターでも使用可能であり、これらは当業者によく知られている。
該遺伝子はその５’末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ（所望により適当なシグナルペプチドをコードする塩基配列）を有し、また３’末端には翻訳開始コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＡＴＡＧ（好ましくはＴＧＡ）を有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター等が挙げられ、とりわけＳＶ４０のプロモーターが好ましい。
動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、諸種動物の神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、線維芽細胞等が挙げられるが、本発明の組み換え蛋白の発現ならびに分泌量が多い細胞が好ましく、中でもヒト胎児性腎線維芽細胞２９３が好ましく用いられる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行われる。
このようにして本発明の組み換え蛋白をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリシア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機質その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、コンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
エシェリシア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２））が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリシア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えばＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３１（１９５０））などが挙げられる。これらに約５〜２０％の胎児牛血清を添加してもよい。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃、必要に応じて通気や撹拌を加える。
上述のような本発明のＣＬＡＣ−ＰまたはＣＬＡＣの遺伝子を組み込んだ誘導発現ベクターは、大腸菌などの細菌に導入してベクターの大量調製、あるいは種々の細胞における本発明の組み換え蛋白の調製に使用できるほか、後述するトランスジェニック動物の作成にも利用することができる。
上述のごとく、ＣＬＡＣ−Ｐは、その断片型であるＣＬＡＣの前駆体であり、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有する。
ＣＬＡＣ−Ｐの、その断片型ＣＬＡＣへのプロセッシングは、配列番号：２のアミノ酸配列の１１２番目のアミノ酸Ａｒｇと１１３番目のアミノ酸Ｇｌｕとの間で起こる開裂による。したがって、配列番号：２の１１３番目のアミノ酸Ｇｌｕから６５４番目のアミノ酸ＬｙｓまでがＣＬＡＣのアミノ酸配列である。また、通常は、ＣＬＡＣの第１番目のアミノ酸Ｇｌｕは環化してピログルタミン酸残基となっている。
ＣＬＡＣ−ＰからＣＬＡＣへの転換は生体内に存在するプロセッシング酵素の作用による。かかるプロセッシング酵素は本発明に包含される。かかるプロセッシング酵素は、例えば以下の（イ）〜（ホ）のいずれかのようにして同定することができる。
（イ）ＣＬＡＣ−Ｐを発現する培養細胞が分泌あるいは産生するＣＬＡＣにつき、細胞培養液もしくは細胞周囲に産生された細胞外マトリックスを回収し、アミノ酸配列解析に供し、ＣＬＡＣ−Ｐと比較して切断部位を決定すること、あるいは
（ロ）ＣＬＡＣ−Ｐを発現する細胞に既知の蛋白分解酵素阻害剤を添加し、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現するＣＬＡＣ蛋白の量の減少を指標とする、
（ハ）ＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子に公知の蛋白分解酵素による切断に必須とされるアミノ酸に変異をもたらす核酸配列変異を導入し、培養細胞に発現させ、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現するＣＬＡＣ蛋白の量の減少を指標とする、
（ニ）ＣＬＡＣ−Ｐを発現する培養細胞に公知の蛋白分解酵素をコードするｃＤＮＡをさらに導入し、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現するＣＬＡＣ蛋白の量の増加を指標とする、
（ホ）公知の蛋白分解酵素を欠損する培養細胞にＣＬＡＣ−ＰをコードするｃＤＮＡを発現させ、培養細胞に発現させ、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現するＣＬＡＣ蛋白の量の減少を指標とする。
上記の方法により同定されるプロセッシング酵素としては、ｆｕｒｉｎ変換酵素等があるが、これ以外のプロセッシング酵素を同定することも可能である。
上記の蛋白分解酵素阻害剤としては、フリン（ｆｕｒｉｎ）の競合阻害剤であるデカノイル−ＲＶＫＲ−クロロメチルケトンおよび類似の化合物が挙げられるが、ＣＬＡＣ−Ｐを発現する培養細胞は、ＣＬＡＣを多量に産生・分泌するため、ＣＬＡＣの産生ないし分泌を阻害する物質を効率よく高感度にスクリーニングすることができる。かかる阻害剤のスクリーニング法としては、例えば、被検物質を含有する培地中で、本発明の形質転換細胞を培養し、ＣＬＡＣの産生ないし分泌の阻害を検出または定量することにより行うことができる。該スクリーニング法においては、ＣＬＡＣに特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング法などの方法を適宜利用して、被検物質による細胞からのＣＬＡＣの産生ないし分泌の変化を検出し、定量することができる。
具体的には、例えば、本発明の形質転換細胞をマルチプレートに蒔き、血清を含むＤＭＥＭ培地で細胞がコンフルエントになるまで培養する。その細胞を無血清培地（０．５％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ）で洗浄後、同培地に被検物質を添加し、一定時間（例えば２４時間）培養する。その培養上清もしくはマルチプレート上に付着した細胞外マトリックスに含まれるＣＬＡＣ量をウェスタンブロッティング法により定量し、被検物質非添加群に対するＣＬＡＣ量の割合およびＣＬＡＣの産生・分泌促進低下作用を惹起する濃度で被検物質のＣＬＡＣ産生・分泌阻害作用を評価する。
本発明の形質転換細胞は継代培養でき、大量のＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣを産生ないし分泌できるので、再現良く、かつ高感度にスクリーニングに用いることができる。したがって、本発明の形質転換細胞を用いると、ＣＬＡＣの産生ないし分泌を阻害する物質のスクリーニングを有利に行うことができる。また、常にクローン化された安定な細胞を多量に得ることができるので、スクリーニングの安定性と効率の点で有用である。このようなスクリーニングにより同定されるＣＬＡＣの産生ないし分泌を阻害する物質は本発明に包含される。
ＣＬＡＣは、培養細胞を用いて、例えば、次の（イ）、（ロ）または（ハ）に記載したような方法で大量発現し、精製することができるが、これら以外の方法を用いてもよい。
（イ）ＣＬＡＣ−Ｐを恒常発現するＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で３日間培養し、細胞がセミコンフルエントの状態になったら、ＦＢＳを除いたＤＭＥＭ培地中で４８時間培養し、培養液を回収する。培養液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）に対し一晩、４℃で透析し、その後２５，００００ｘｇ、３０分遠心分離する。沈殿物を０．１Ｍ酢酸に溶解させ、ＤＥＡＥカラムにアプライする。溶出は０Ｍから０．１Ｍおきに１Ｍまで順に濃度を変えたＮａＣｌで行う。全画分を０．１Ｍ酢酸に対し透析し、例えば、特異抗体９Ｄ２を用いたイムノブロッティングで確認し、陽性画分を精製ＣＬＡＣ画分として用いる（一般的操作についてはＦｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３００８３（１９９７）参照）。
（ロ）ＣＬＡＣ−Ｐを恒常発現するＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ倍地中で３日間培養し、細胞がセミコンフルエントの状態になったら、ＦＢＳを抜いたＤＭＥＭ倍地中で４８時間培養し、培養液を回収する。培養液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）に対して一晩、４℃で透析し、その後２５０，０００ｘｇで３０分遠心分離する。沈殿物を０．１５Ｍ酢酸に溶解させる。さらに２Ｍ尿素を含んだ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）（ＰＢ／Ｕ液）に対して一晩透析後、２５０，０００ｘｇで３０分遠心分離し、上清をヘパリンカラムにアプライする。溶出は０Ｍから０．１おきに１Ｍまで順に濃度を変えたＮａＣｌで行う。全画分をＰＢ／Ｕに対し透析し、特異抗体９Ｄ２を用いたイムノブロッティングで確認し、陽性画分を精製ＣＬＡＣ画分として用いる（一般的操作についてはＭｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２０，９３４（１９９６）参照）。
あるいは（ハ）あらかじめＣＬＡＣ特異抗体（例えば、９Ｄ２）（１ｍｇ／ｍｌ）をアフィゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）などのＮＨＳ活性型担体に結合させ、抗体カラムを作製する。ＣＬＡＣ−Ｐを恒常発現するＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ倍地中で３日間培養する。細胞がセミコンフルエントの状態になったら、ＦＢＳを抜いたＤＭＥＭ培地中で４８時間培養し、培養液を回収する。培養液に対し、５０％飽和硫安で蛋白を沈殿させる。ＩＰバッファー（０．５％  ＳＤＳ、０．５％  ＮＰ−４０を含んだＴＳＩ液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（関東化学），０．５ｍＭ  ＤＩＦＰ（和光純薬），０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１ｍＭ  ＥＧＴＡ（和光純薬），１μｇ／ｍｌ  アンチパイン（Ｓｉｇｍａ），１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（和光純薬），１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン（Ｓｉｇｍａ），１μｇ／ｍｌ  ＴＬＣＫ（Ｓｉｇｍａ）］）に溶解させ、０．４５μｍフィルターに通し、上記抗体カラムにアプライする。溶出は０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で行う。溶出画分を精製ＣＬＡＣとして用いる（一般的操作についてはＨｉｒａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，９７１１（１９９８）参照）。
したがって、本発明のさらなる態様は、モノクローナル抗体９Ｄ２を用いるＣＬＡＣの精製方法である。
なお、モノクローナル抗体９Ｄ２を産生するハイブリドーマは、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７として寄託されている。
本発明のさらなる態様は、本発明のＣＬＡＣ−ＰまたはＣＬＡＣに特異的に結合する抗体である。
ＣＬＡＣ−ＰならびにＣＬＡＣに対する特異的抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。
ＣＬＡＣならびにＣＬＡＣ−Ｐのアミノ酸配列に基づき、
0004249927.tif 000002
0004249927.tif 000003
等のペプチドを合成し、ついで、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と結合させたこれらのペプチドを抗原としてウサギに免疫し、得られた血清の抗原ペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡ法により評価しつつ抗血清を得る。抗血清は抗原ペプチドを結合したアフィゲルに結合させ、特異抗体のみをアフィニティ精製することもできる。
本発明の第１１態様のＣＬＡＣ−Ｐのスプライスバリアントに関しても、上記のように利用することができる。
本発明のＣＬＡＣ−ＰまたはＣＬＡＣに特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル、モノクローナルいずれであってもいが、モノクローナル抗体が好ましく、上記９Ｄ２モノクローナル抗体が特に好ましい。
かかる抗体の中にははＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐに特異的に結合する。また、それらの作用機能を阻害するものも存在する。したがって、本発明のさらなる態様は、かかる抗体を用いたＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐの検出方法である。この検出方法をアルツハイマー病の診断に使用してもよく、これらの抗体を当業者公知の標識、例えば、放射性標識（例えば、９９Ｔｃ）または蛍光標識、酵素標識等で標識することができ、生きた動物に注入してイメージをスキャンすることにより、あるいは生検または剖検試料中のＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐ蛋白との結合を検知し定量することができる。
よって、本発明のさらにもう１つの態様は、検知可能に標識したＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐに対する特異的抗体を構成成分とするアルツハイマー病診断用キットである。生きたヒトに直接キット成分を注入し、イメージをスキャンするものであってもよく、生検試料または剖検試料にキット成分を作用させるものであってもよい。抗体としてはモノクローナル抗体９Ｄ２が好ましい。標識としては、放射性標識（例えば、９９Ｔｃ等）、蛍光標識、酵素標識等があり使用方法、用途、部位等に応じて選択される。かかる標識は当業者によく知られている。本発明の診断キットは、各成分を別個の容器に入れたものであってもよく、いくつかの成分をまとめて数個の容器に入れたものであってもよい。一般的には、適切な説明書をキットに添付する。
また、本発明のもう１つの態様は、ＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐの作用機能を阻害する活性阻害剤のスクリーニング法である。かかる活性阻害剤は、結果としてＡβの蓄積を阻害する等の効果を有するので、アルツハイマー病の治療薬として使用することができる。
かかる活性阻害剤は、例えば、次の（イ）（ロ）または（ハ）に記載したような方法を用いてスクリーニングすることができる。
（イ）ＣＬＡＣとβアミロイドの結合或いはそれに起因するアミロイド凝集促進に影響を与える物質については、合成Ａβ（１−４２）ペプチドと適量の精製ＣＬＡＣに加えて被検物質を混和し、室温で０〜５日インキュベートし、チオフラビンＴによる蛍光を発するアミロイド線維の形成の抑制を評価する。或いは、ヒトＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスとアルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスを交配して産まれたマウス、もしくはアルツハイマー変異型βＡＰＰ遺伝子を過剰発現したトランスジェニックマウスに被検物質を経口的、もしくは経静脈的、もしくは経脳室的に投与し、脳のβアミロイド斑が被検物質を投与しないマウスに比して減少することを免疫組織化学的もしくは生化学的に評価する。
（ロ）ＣＬＡＣ−Ｐを介したβアミロイドの細胞への結合を抑制する物質については、ＣＬＡＣ−Ｐを恒常的に発現したＨＥＫ２９３細胞及びコントロール細胞を培養し、予め６０分間試験管内でインキュベートした１０μＭのＡβ（１−４２）と被検物質を加え、さらに６０分間インキュベートし、回収した細胞に結合したＡβ量を検出することにより評価する。
（ハ）ＣＬＡＣ−Ｐを介して細胞に結合したＡβの細胞毒性を抑制する物質については、例えば、ＮＧＦにより神経細胞に分化誘導したＰＣ１２細胞に、リポフェクション法によりＣＬＡＣ−Ｐを一過性に発現させ、予め１時間インキュベートしたＡβ（１−４２）ならびに被検物質を加え、その後細胞をＴＵＮＥＬ染色してアポトーシスの抑制を評価する、或いはＭＴＴ試薬により生存細胞の増加を評価する。
したがって、本発明のさらなる態様は、ＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐを用いることを特徴とする、かかる活性阻害剤のスクリーニング方法である。
かかる活性阻害剤としては、ＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐに対するアンタゴニスト、ＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐに類似した構造を有するポリペプチド、あるいは他の低分子化合物等がある。
また、本発明のＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐに特異的に結合する抗体にはＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐの作用効果を阻害するものもあり、これらの抗体は結果として脳中のＡβ蓄積を抑制し、アルツハイマー病を治療、進行遅延または予防することができる。
したがって、本発明のさらにもう１つの態様は、かかる活性阻害剤またはかかる抗体を投与することを特徴とするアルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法である。かかる活性阻害剤またはかかる抗体をそのまま、あるいは精製水もしくは生理食塩水のごとき適当な担体とともに投与することができ、その投与経路としては、経静脈的、経脳脊髄腔経路等があるが、経静脈的経路が好ましい。または、その投与量は通常１μｇ〜１００ｍｇ／キログラム体重であるが、投与経路、処置すべき疾病の重さ、患者の状態等により適宜増減される。
上記方法に適した抗体はモノクローナル抗体９Ｄ２である。
さらにＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐ自体の産生を抑制することによりアルツハイマー病の治療効果を発揮する物質も本発明に包含される。かかる物質のスクリーニング方法としては、例えば、次の方法がある。
ＣＬＡＣもしくはＣＬＡＣ−Ｐの産生の低下を介して治療効果を発揮する物質については、被検物質を含有する培地中で、本発明の形質転換細胞を培養し、ＣＬＡＣの産生ないし分泌の阻害を検出又は定量することにより行いうる。該スクリーニング法においては、ＣＬＡＣに特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング法などの方法を適宜利用して、被検物質による細胞からのＣＬＡＣの産生ないし分泌の変化を検出し、定量することができる。
具体的には、例えば、本発明の形質転換細胞をマルチプレートに蒔き、血清を含むＤＭＥＭ培地で細胞がコンフルエントになるまで培養する。その細胞を無血清培地（０．５％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ）で洗浄後、同培地に被検物質を添加し、一定時間（例えば２４時間）培養する。その培養上清もしくはマルチプレート上に付着した細胞外マトリックスに含まれるＣＬＡＣ量をウェスタンブロッテイング法による定量し、被検物質非添加群に対するＣＬＡＣ量の割合およびＣＬＡＣの産生・分泌低下作用を惹起する濃度で被検物質のＣＬＡＣ産生・分泌阻害作用を評価する。このようなスクリーニング方法も本発明に包含される。
さらに、上記のような、ＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣと相互作用し、生理学的に有用なペプチド性分子については、例えば、以下の工程（イ）、（ロ）または（ハ）のいずれかを含む方法により取得・同定することができる。
（イ）ヒトＣＬＡＣ−ＰとＤＮＡ結合蛋白の融合遺伝子、ならびにヒト脳由来ｃＤＮＡに転写活性化蛋白を融合させた遺伝子ライブラリーを、ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ法を利用して酵母細胞に発現し、陽性反応を示す遺伝子を取得する。
（ロ）ヒトＣＬＡＣ−ＰあるいはＣＬＡＣリコンビナント蛋白を結合したカラムにヒト脳抽出物を通し、結合した蛋白を溶出してアミノ酸配列解析を行う。
（ハ）ヒトＣＬＡＣ−Ｐ抗体を固定したカラムにヒト脳抽出物を通し、ヒトＣＬＡＣ−ＰあるいはＣＬＡＣとともにカラムに結合する蛋白を溶出してアミノ酸配列解析を行う。
かかるペプチド性分子もまた、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防に有用である。したがって、かかるペプチド性分子ならびにその取得・同定方法も、本発明に包含される。
ＣＬＡＣ−Ｐ及びＣＬＡＣの分泌、産生に影響を与える蛋白も、本発明の治療、進行遅延または予防方法において有用である。かかる蛋白は、例えば、ＣＬＡＣ−Ｐを発現する培養細胞にヒトｃＤＮＡライブラリーを発現し、限界希釈法によって単一ｃＤＮＡを発現したクローンを選択し、その細胞クローンから分泌されるＣＬＡＣ量の変化をウェスタンブロット法により評価した後、導入された遺伝子を同定することにより同定することができる。したがって、かかる蛋白ならびにその同定方法も本発明に包含される。
本発明のさらにもう１つの態様は、本発明のＣＬＡＣ  ＤＮＡまたはＣＬＡＣ−Ｐ  ＤＮＡのいずれかを人為的に染色体中に導入するか、あるいはいずれかを染色体から欠損させたトランスジェニック動物である。トランスジェニック動物とは、遺伝子組み換えにより外来遺伝子を導入された動物であって、通常の交雑育種では不可能な形質を持った動物をいう。トランスジェニック動物の製造方法は、当業者によく知られており、一般的には、導入したいＤＮＡを含む遺伝子をクローン化し、発現を所望する時期に所望臓器で特異的に発現するプロモーターを該遺伝子に連結し、これを受精卵に導入し、ついで、借腹に移植する工程を含む方法により製造される。発現調節配列を適宜選択あるいは変異させることにより、本発明のＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐの発現を人為的に調節されたトランスジェニック動物を得ることができる。また、正常な遺伝子の機能を破壊したノックアウト動物もトランスジェニック動物に含まれる。かかるトランスジェニック動物は、本発明のＣＬＡＣまたはＣＬＡＣ−Ｐの機能または発現調節、それらが関与する疾病の発症機構の解明、医薬品の開発・スクリーニング等に利用価値がある。好ましくは、かかるトランスジェニック動物はヒト以外のものである。
ヒト以外のＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣをクローニングすることもできる。例えば、所望の動物のｃＤＮＡライブラリーを用いて、本質的には上記の方法と同様にして遺伝子増幅を行うことにより、所望の動物のＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣ遺伝子をクローニングし、そのアミノ酸配列を推定することができる（マウスのＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子のクローニングについては本明細書の実施例７参照）。
実施例
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：モノクローナル抗体９Ｄ２の作製
（１）老人斑アミロイドの部分精製
アルツハイマー脳大脳皮質より灰白質を切り出し、１Ｍしょ糖（関東化学）を含んだＴＳＩ液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（関東化学），０．５ｍｌ  ＤＩＦＰ（和光純薬），０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１ｍＭ  ＥＧＴＡ（和光純薬），１μｇ／ｍｌ  アンチパイン（Ｓｉｇｍａ），１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（和光純薬），１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン（Ｓｉｇｍａ），１μｇ／ｍｌ  ＴＬＣＫ（Ｓｉｇｍａ）］中でポッターエルベジェム型ホモジナイザー（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ）でホモジナイズし、遠心機（日立工機）で４℃、３０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。
得られた沈殿物を１Ｍしょ糖を加えたＴＳＩ液に懸濁し、しょ糖密度勾配法［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４８  １５１７（１９９６）］により分画して１．５Ｍしょ糖／２．２Ｍしょ糖界面を集めた。
得られた界面をＤＮａｓｅ  Ｉ（和光純薬）で３７℃、３時間処理し１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００及び、５Ｍ尿素（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を含んだＴＳＩ液中に懸濁させ、毛細血管を除去し［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５８  １９５３（１９９２）］、遠心機で４℃、３０分、１００，０００ｘｇで遠心分離した。
得られた沈殿物を老人斑アミロイド画分とする。
（２）抗体の作製
老人斑アミロイド画分を１％  ＳＤＳを含んだ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ液中に懸濁し、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）でエマルジョン化し、マウス（ＢＡＬＢ−Ｃ、７週齢、オス）足底に免疫した［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９  １６９３（１９８９）］。
免疫後２５日目に下肢リンパ節を摘出しＲＰＭＩ培地中でリンパ球を取り出し、電気融合法により、マウス骨髄腫由来のミエローマ細胞ＰＡＩ株と融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマをＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に分注し１０日間培養した。
（３）モノクローナル抗体のスクリーニング
ハイブリドーマを培養したウエルから培養上清を回収し、老人斑アミロイド画分を塗沫したスメア標本上で、アミロイドを陽性に染色する抗体をを選択した［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４８  １５１７（１９９６）］。
２８８個のハイブリドーマクローンから、最も陽性の結果を示したモノクローナル抗体９Ｄ２を選択した。モノクローナル抗体のアイソタイプはＭｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｋｉｔ（アマシャム）によりＩｇＧ１と確認した。９Ｄ２抗体を最も多く産生するハイブリドーマをハイブリドーマ９Ｄ２と命名して、茨城県つくば市東１丁目１番３号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託し、２００１年１月３０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３７を付与された。
偶然にも、かかる抗体は、性質等が明らかにされていない、アルツハイマー病脳由来の未知蛋白（本発明において、ＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣと命名）に特異的に強く結合することがわかった。特に、モノクローナル抗体９Ｄ２は、ＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣへの特異的結合が強力である。さらにモノクローナル抗体９Ｄ２は、ＣＬＡＣ−Ｐのアミノ酸番号１１３のＧｌｕがピログルタミン酸化されたペプチド断片Ｘａａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ（配列番号：２９）と強く反応するという特徴を有する。
これらの未知蛋白遺伝子（ＣＬＡＣ−ＰおよびＣＬＡＣ）のクローニング、配列決定等について実施例２で説明する。
実施例２：ヒトＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子のクローニング
アルツハイマー脳大脳皮質より２０ｇの灰白質を切り出し、ＴＳＩ液中でポッターエルベジェム型ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた沈殿物を１Ｍしょ糖を含んだＴＳＩ液中でホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた沈殿物を０．３２Ｍのしょ糖を含んだＴＳＩ液中に懸濁し、毛細血管を除去し、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた沈殿物を２％のＳＤＳ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）を含んだＴＳＩ液中でホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた沈殿物を７０％ギ酸（和光純薬社）中で超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）により破砕し、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた上清を凍結乾燥機（Ｔｏｍｙ社）で乾固後６Ｍグアニジン塩酸（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）水溶液に懸濁し、遠心機で４℃、２０分、２６０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた上清に対し１００分の１倍容の７０％ギ酸を加え逆相ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｈａｒｄ社）で、Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ３００カラム（２．１×３０ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて分画した［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７  １７０４７（１９９２）］。
モノクローナル抗体９Ｄ２に対し陽性を示す画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いたイムノブロッテイング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４  ２０２５（１９９７）］により選んだところ、アセトニトリル（和光純薬）濃度約３０％の画分であった。９Ｄ２陽性画分を凍結乾燥機で乾固後６Ｍグアニジン塩酸水溶液に懸濁して還元カルボキシメチル化法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３８  ６２２（１９６３）］で還元し、ゲル濾過ＨＰＬＣでＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６×６００ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）を用いて分画した。イムノブロッテイング法で９Ｄ２抗体が強く反応した分子量約３５ｋＤａの画分をリシルエンドペプチダーゼであるＡＰＩ（ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ）または、Ａｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で消化［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７  １７０４７（１９９２）］した。消化物を逆相ＨＰＬＣでＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂカラム（２．１×１２５ｍｍ，Ｍｅｒｃｋ社）を用いて分画しペプチドマップを得た。
ペプチドマップで得られた画分をＴＯＦ（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）型質量分析機（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｆｒａｎｚｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｋ社）及びアミノ酸配列解析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析し［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４  ７３６８（１９９９）］、質量分析機による分子量と一致する部分アミノ酸配列を選び出した。
以下に得られた配列をアミノ末端側から示す。
消化酵素ＡＰＩにより
0004249927.tif 000004
が得られた（Ｈｙｐはヒドロキシプロリンを意味する）。
消化酵素Ａｓｐ−Ｎにより
0004249927.tif 000005
が得られた。
結果、９Ｄ２抗原の部分アミノ酸として、次の２８アミノ酸が得られた。
0004249927.tif 000006
この配列をもとに縮重プライマーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による９Ｄ２抗原部分ｃＤＮＡクローニングを行った。用いたプライマーは次のように設計した。
0004249927.tif 000007
0004249927.tif 000008
ただしｉはイノシン、ｒはａもしくはｇを、ｙはｃもしくはｔを、ｄはａ，ｇもしくはｔを、ｖはａ，ｇもしくはｃを表す。
Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型としてＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）によりＰＣＲ機（宝酒造）で９５℃、３０秒間熱変性、５８℃、３０秒間アニーリング、７２℃、１分間ＤＮＡ合成を４０回繰り返し、８０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを増幅させた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にこのフラグメントをサブクローニングし、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャム社）により自動シーケンサー（Ｌｉ−ＣＯＲ社）で塩基配列を確認した。
その配列を元にＰＣＲを用いたＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法を繰り返すことによりＣＬＡＣ−ＰのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含むＣＬＡＣ−Ｐ  ＤＮＡのクローニングに成功した。用いた特異プライマーを以下に示す。
0004249927.tif 000009
Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型としてＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）によりＰＣＲ機（宝酒造）で９５℃、３０秒間熱変性、５８℃、１分間アニーリング、７２℃、５分間ＤＮＡ合成を３５回繰り返し、その後反応液にさらにｎｅｓｔｅｄプライマーを加え９５℃、３０秒間熱変性６０℃、１分間アニーリング、７２℃、５分間ＤＮＡ合成を３０回繰り返してフラグメントを増幅させた。得られたフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングし、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔにより自動シーケンサーで塩基配列を確認した。
その結果新規蛋白ＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡを得ることに成功した（配列番号：１）。これよりＯＲＦのアミノ酸配列を推定した（配列番号：２）。これらのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図１に示す。
ＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡは全長６５４アミノ酸をコードするＯＲＦを含む（図１、配列番号：１および配列番号：２参照）。ＣＬＡＣ−Ｐはアミノ末端を細胞質側、カルボキシ末端を細胞外側に持つタイプＩＩ型の新規な１回膜貫通蛋白であり、細胞外領域に３回のコラーゲン様Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（Ｇはグリシンを意味し、Ｘａａ１、Ｘａａ２は任意のアミノ酸を意味する）繰り返し配列を有している。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて各種ヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を調べたところ、脳と精巣に特異的な発現が認められた。予想されるアミノ酸配列をもとに作製したペプチド抗体は、アルツハイマー病の脳において老人斑を染色し、得られたｃＤＮＡに由来する蛋白断片が老人斑アミロイドに蓄積していることが確認された。
実施例３：ヒトＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現形質転換細胞を用いたＣＬＡＣ−Ｐのアミロイドβペプチド受容体機能の検定
ＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡを以下のようにして調製した。すなわち、ＣＬＡＣ−Ｐの５’ＵＴＲ領域の−４０位にＨｉｎｄＩＩＩで切断され、３’ＵＴＲ領域の最初の停止コドンより＋１００位の所にＢａｍＨＩで切断されうる配列になるようにＣＬＡＣ−Ｐ遺伝子を改良し、ＣＭＶプロモーターを持つｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ領域に組み込んだ。
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に３．０〜５．０ｘ１０５個／ウェルの密度で蒔き、２４時間培養した。次に、１ウェルあたり溶液Ａ：１μｇプラスミドＤＮＡ／１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、溶液Ｂ：１０μｌ  ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）／１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを作製し、溶液Ａと溶液Ｂを混合し、室温で３０分間インキュベーションした後に、この混合物に８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えて１ｍｌとした（ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体）。細胞からＤＭＥＭを取り除き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗浄後、各ウェルに１ｍｌのＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を加え６時間培養した。続いて１ｍｌの２０％  ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを加え、さらに２４時間培養し、ＤＭＥＭに培地を交換後さらに２４時間培養した。次に各ウェルの細胞を１０ｃｍディッシュに蒔き直し、ヒグロマイシン（和光純薬）１３３μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ中で選択培養した。１０〜１４日間選択培養を行った後、増殖してきた細胞を、目的のプラスミドを導入したポリクローン細胞株として取得した。ポリクローン細胞株はさらに限界希釈法によりクローニングし、モノクローン細胞株を１５株取得した。取得したモノクローン細胞株はＣＬＡＣ−Ｐ蛋白特異抗体を用いたイムノブロッティングにより発現を解析し、最も発現の高い３株を選んで、９Ｄ２−１、９Ｄ２−２、９Ｄ２−１１と命名し、以後の実験に使用した。なお、ＨＥＫ２９３細胞ヒトＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現形質転換細胞９Ｄ２−１株は茨城県つくば市東１丁目１番３号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託され、２００１年１月３０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４３８を与えられた。
予めポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ／ｍｌ）をコートしたカバーグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）を１０ｃｍディッシュ上に並べ、その上に細胞を蒔き、培養、遺伝子導入後、カバーグラスを回収した。カバーグラスをＰＢＳ液で２回洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ）を含んだＰＢＳ液で室温、３０分間固定した。さらにＰＢＳ液で２回洗浄後、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ）を含んだＰＢＳ液で室温、３０分間パーメアビリゼーション（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）とブロッキングを行った。溶液を取り除き、０．３％  ＢＳＡを含んだＰＢＳ液で抗体を１０００倍に希釈して加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ液で３回洗浄、さらに０．３％  ＢＳＡを含んだＰＢＳ液で二次抗体としてＦＩＴＣ結合抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を希釈して加え、遮光し室温で１時間反応させた。ＰＢＳ液で３回洗浄後、封入剤を用いて封入し、蛍光顕微鏡（ＡＸ−８０、オリンパス製）で観察した。図２左パネル（Ａ）に示すように、ＣＬＡＣ−Ｐ細胞膜系、ことに小胞体、ゴルジ装置ならびに細胞表面膜に分布していた。
１０ｃｍディッシュで培養したモノクローンＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現ＨＥＫ２９３株をＴＳ液で洗浄後、ＴＳＩ液中でセルスクレイパーを用いて回収した。細胞をポリトロンホモジナイザー（日立工機）で破砕後、遠心機で４℃、１，０００ｘｇ、７分間遠心分離した。その上清を回収し、遠心機で４℃、２，０００ｘｇ、３０分間遠心分離した。この沈殿物を膜性画分とした。上清をさらに超遠心機で４℃、１０，００００ｘｇ、６０分間遠心分離した。この沈殿物をマイクロソーム画分として、上清を細胞質画分として回収し、解析に用いた。図２右パネル（Ｂ）に示すように、ＣＬＡＣ−Ｐ発現細胞の膜性画分に特異的に８０キロダルトンの全長ＣＬＡＣ−Ｐ蛋白の発現が検出された。
ヒトＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現ＨＥＫ２９３細胞とｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみを恒常発現した対照細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈで培養し、コンフルエントになったところで予め３７℃で６０分インキュベートした１０μＭ  Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ）を加え、インキュベートした。一定時間後、Ａβを含む培養上清を除き、ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をスクレイパーで回収し、微量遠心機（ＴＯＭＹ）で７，０００ｒｐｍ、５分遠心して細胞を沈降させ、サンプルバッファーを加えて超音波処理して可溶化し、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅａｒｃｅ）を用いて蛋白量を定量した。
上記の細胞抽出液を各サンプルが一定蛋白量となるように調整し、最終濃度１％となるよう２−メルカプトエタノール（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を加え、１０分間熱処理した。１５％のＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白を分離し、３時間１５０ｍＡの条件で、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。転写したメンブレンはＰＢＳ中で１０分間熱処理を加えた後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ）−ＰＢＳで室温で３０分間ブロッキングし、同様のブッロッキング液で希釈した各種抗体と室温２時間又は４℃一晩反応させた。ＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含むＰＢＳ）で１０分間３回の洗浄を行い、続いて同様のブロッキング液で希釈した二次抗体（抗−マウスまたは抗−ウサギＩｇ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合全抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ））と室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回の洗浄後、ＥＣＬｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に感光させ、Ａβの結合を検出した。ヒトＣＬＡＣ−Ｐを発現した細胞は、細胞由来蛋白１ｍｇ当たり３０ｎｇのＡβ（１−４２）を結合したが、ベクターのみを発現した細胞では６ｎｇであった。即ちＡβ（１−４２）の結合は５倍に増加しており、細胞表面に発現したヒトＣＬＡＣ−ＰがＡβを結合する受容体として働くことが示された。
実施例４：ヒトアルツハイマー脳アミロイド由来ＣＬＡＣのアミノ酸配列解析ならびに９Ｄ２抗体との反応性
実施例２の（１）の方法により精製したヒトアルツハイマー脳由来のＣＬＡＣをアミノ酸配列解析に供すると、アミノ末端がブロックされており、解読不能であった。そこでＣＬＡＣ−Ｐのアミノ酸番号１１３〜１１８に相当し、第１１３アミノ酸のＧｌｕをピログルタミン酸（Ｘａａ）に置換したペプチドＸａａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ（配列番号：２９）を合成し、Ｃｙｓを介してＫＬＨと結合した後、これを抗原として抗体を作製した（以下、該抗体をＰｙｒｏＧと称する）。ＰｙｒｏＧ抗体は、文献の記載（Ｎｅｕｒｏｎ，１４  ４５７（１９９５））から推定できるように、合成ペプチドのＫＬＨ結合側と反対側のアミノ末端切断端構造を特異的に認識した。すなわち、ＰｙｒｏＧ抗体は実施例３の方法で培養細胞に発現させて取得した全長リコンビナントＣＬＡＣ−Ｐ蛋白とはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたイムノブロッティング法にて反応しなかったが、Ｘａａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓペプチドをマイクロウェルプレートに固着させ（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，２８９５（１９９２）の方法に準じて行った）、ＰｙｒｏＧ抗体を１次抗体として間接ペルオキシダーゼ法で酵素抗体反応法（ＥＬＩＳＡ）を施行すると陽性反応を呈し、また上記方法でヒトアルツハイマー脳より得たＣＬＡＣとイムノブロッティング法で陽性に反応した。さらに９Ｄ２抗体とアルツハイマー脳由来ＣＬＡＣのイムノブロッティング法による陽性反応、およびアルツハイマー脳組織標本の老人斑との免疫組織化学による染色性は、上記ペプチドＸａａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓを予め９Ｄ２抗体に混和し、抗体活性を吸収することにより（Ｎｅｕｒｏｎ，１３，４５（１９９４）の方法に準じて行った）消失した。これらの事実から、アルツハイマー脳アミロイド由来ＣＬＡＣはＣＬＡＣ−Ｐの第１１３アミノ酸より始まり、当該第１１３アミノ酸はピログルタミン酸化されていること、９Ｄ２抗体はかかる修飾を受けたＣＬＡＣ蛋白を認識することが示された。
実施例５：ＣＬＡＣとβアミロイド（Ａβ）の試験管内結合実験
ＣＬＡＣとＡβの試験管内結合実験についてはＷｅｂｓｔｅｒらの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５０，１５３１（１９９７））に従った。
実施例３で得られたヒトＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現形質転換細胞（９Ｄ２−１株）を１０％  ＦＢＳ、ヒグロマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で４日間選択培養し、その培養上清を回収した。予め３７℃で１日放置しておいた０．１ｍｇ／ｍｌの合成Ａβ１−４２（Ｂａｃｈｅｍ）を５０μｌずつ９６穴マイクロウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に固着させ、デシケーターで乾固させた。続いてブロッキング液として１％ゼラチン（和光純薬）を含んだＰＢＳ−Ｔで１時間ブロッキング後、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回の洗浄を行い、回収した培養上清をアプライした。同様に実施例３で用いた対照ＨＥＫ２９３細胞の培養上清もアプライした。１時間室温で反応後ＰＢＳ−Ｔで１０分間５回洗浄し、同様のブロッキング液で５０００倍に希釈した抗ＣＬＡＣ抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで１０分間５回洗浄後、同様のブロッキング液で５０００倍に希釈した二次抗体（抗−ウサギＩｇ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合全抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ））と室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで１０分間５回洗浄後、ＴＭＢ発色試薬（Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させた。
１０回の試行の結果、ＣＬＡＣを分泌しているＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現形質転換細胞の培養上清は分泌していない対照ＨＥＫ２９３細胞の培養上清よりも約５００倍強く発色し、有意に（ｐ＜０．０００１）ＣＬＡＣはＡβと試験管内で結合していることが示された。
実施例６：ＣＬＡＣがＡβの凝集に及ぼす影響の検討
実施例３で得られたヒトＣＬＡＣ−Ｐ恒常発現形質転換細胞（９Ｄ２−１株）をヒグロマイシン、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で３日間選択培養し、セミコンフルエントな状態からＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地中で４日間培養し、その培養上清を回収した。培養上清を２０００ｘｇで遠心後上清をＤＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ）にアプライし、素通り画分をさらにヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にアプライする。２Ｍ尿素（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を含んだＰＢＳ液（ＰＢ−Ｕ液）でカラムを十分に洗浄後、１ＭＮａＣｌを含んだＰＢ−Ｕ液で溶出し、溶出液をＰＢＳ液に対し透析する。このようにして得られた溶液を粗精製ＣＬＡＣとし、比較として対照ＨＥＫ２９３細胞からも同様にして得ておく。
Ａβの凝集実験についてはＬｅＶｉｎｅの定法に従う（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３０９，２７４）。
上記で得られた粗精製ＣＬＡＣあるいは、ＨＥＫ２９３細胞から得られた溶液を３．６μＭ合成Ａβ１−４２（Ｂａｃｈｅｍ）にそれぞれ１００μｌずつ加え、０．２２μｍのフィルターを通した後３７℃で１日反応させる。反応液に３μＭチオフラビンＴを含んだ１０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ溶液（ｐＨ＝８．５）を４００μｌ加え、蛍光光度計（ＨｉｔａｃｈｉＦ−２０００）で測定する。蛍光は４４２ｎｍで励起し、４９６ｎｍの蛍光を測定した。
１８回の試行の結果、粗精製ＣＬＡＣは、対照ＨＥＫ２９３細胞から得られた溶液よりも約６０倍Ａβを凝集させるという結果が得られ、これは有意（ｐ＜０．０００１）であった。
実施例７：マウスＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡのクローニング
ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりマウスＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡのクローニングを行った。ヒトＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡ配列をもとに以下にあげるプライマーを作製した。
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プライマー１、２を用い、ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（宝酒造）によりＰＣＲ機（宝酒造）で９５℃、４５秒間熱変性、４２℃、４５秒間アニーリング、７２℃、３分間ＤＮＡ合成を４０サイクル繰り返し、約３３０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを増幅させた。次にこの反応液を鋳型として１：５０となるようにＰｒｅｍｉｘＴａｑに加え、プライマー２、３を用いて９５℃、４５秒間熱変性、５１℃、４５秒間アニーリング、７２℃、３分間ＤＮＡ合成を３５サイクル繰り返すｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。その結果約３００ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを精製し、ＴＡクローニング法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、自動シーケンサー（Ｌｉ−ＣＯＲ）により塩基配列を確認した（配列番号：５０）。
また、ヒトＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡをもとに検索した結果、ＧｅｎＢａｎｋより約７０ｂｐのａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ由来のヒトＣＬＡＣ−Ｐに相同性の高い配列を見出した（ＡＶ２６４７５２、配列番号：５１）。この配列と、先に得られた配列をもとに新たに次のプライマーを合成した。
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まずプライマー５、６を用いて９５℃、４５秒間熱変性、５５℃、４５秒間アニーリング、７２℃、３分間ＤＮＡ合成を３８サイクル繰り返し、この反応液を鋳型とし、プライマー７、８を用いて同条件にてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲをい、約１２００ｂｐのフラグメントを増幅させた。フラグメントを精製し、ダイプライマーとして合成したプライマー４を用いて自動シーケンサーにより塩基配列を得た。この塩基配列をもとに次のプライマーを作製した。
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プライマー５、６によりＰＣＲを行った反応液を鋳型としてプライマー９、１１を用いて９５℃、４５秒間熱変性、５６℃、４５秒間アニーリング、７２℃、３分間ＤＮＡ合成を３８サイクル繰り返した。約５６０ｂｐのフラグメントを増幅させ、Ｘｈｏ  Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化した断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングし、塩基配列を確認した（配列番号：５２）。また、プライマー５、６によりＰＣＲを行った反応液を鋳型としてプライマー１０、１２を用いて９５℃、４５秒間熱変性、５６℃、４５秒間アニーリング、７２℃、３分間ＤＮＡ合成を３８サイクル繰り返した。約５５０ｂｐのフラグメントを増幅させ、ＴＡクローニング法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングし、塩基配列を確認した（配列番号：５３）。
次にこれらの配列をもとにＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法を行った。用いたプライマーを以下に示す。
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ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、９５℃、４５秒間熱変性、５９℃、４５秒間アニーリング、７２℃、５分間ＤＮＡ合成を繰り返し、その反応液を鋳型に９５℃、４５秒間熱変性、６０℃、４５秒間アニーリング、７２℃、５分間ＤＮＡ合成を繰り返し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、フラグメントを増幅させた。これをＴＡクローニング法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングし、塩基配列を確認した（配列番号：５４、５５、５６）。
これらのＤＮＡ断片の配列からマウスＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡ配列を決定した（図３および配列番号：４８）。このｃＤＮＡ配列よりＯＲＦのアミノ酸配列を推定した（図４および配列番号：４９）。マウスＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡは全長６６６アミノ酸をコードしており、ヒトＣＬＡＣ−Ｐ  ｃＤＮＡとの相同性は約８３％、アミノ酸では約９０％であった。分子構造は基本的にヒトＣＬＡＣ−Ｐと同様で、ＩＩ型の一回膜貫通蛋白であり、細胞外領域に３カ所のコラーゲン様繰り返し配列を有していた。また、コラーゲン様配列内にａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇを受ける配列も見出した（図４、配列番号：４９中の下線部）。
産業上の利用の可能性
本発明において得られた新規コラーゲン様蛋白ＣＬＡＣは、アルツハイマー病患者脳老人斑アミロイドに蓄積し、その主成分であるβアミロイドの凝集を促進し、ＣＬＡＣの前駆体であるＣＬＡＣ−Ｐは膜貫通蛋白として細胞膜表面に分布し、βアミロイドを細胞表面に結合する受容体として作用するため、アルツハイマー病の進行に関与しており、その予防、進行遅延、治療に用いることができる。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａおよび図１Ｂ  ＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡの塩基配列および対応推定アミノ酸配列を示す図である。
図２  ＣＬＡＣ−Ｐを発現したＨＥＫ２９３細胞の９Ｄ２免疫染色像（左パネルＡ）ならびにＣＬＡＣ−Ｐを発現したＨＥＫ２９３細胞膜画分のウェスタンブロット（右パネルＢ）である。
図３  マウスＣＬＡＣ−ＰのｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
図４  マウスＣＬＡＣ−Ｐの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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