(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株。
【請求項２】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられた医学的に使用されるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株。
【請求項３】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株を、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤とともに含む薬学的組成物。
【請求項４】
他の乳酸細菌をも含むことを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
１０４ｃｆｕ〜１０１１ｃｆｕのＬＢ９３１を含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
１０５ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕのＬＢ９３１を含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
懸濁液、スプレー剤、ゲル、クリーム、粉剤、カプセルまたは膣挿入剤である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株を含むことを特徴とする、吸収製品。
【請求項９】
女性用衛生製品、おむつ、生理用ナプキン、パンティガードまたは失禁ガードであることを特徴とする、請求項８に記載の吸収製品。
【請求項１０】
１０４ｃｆｕ〜１０１１ｃｆｕのＬＢ９３１を含む、請求項８に記載の吸収製品。
【請求項１１】
１０５ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕのＬＢ９３１を含む、請求項１０に記載の吸収製品。
【請求項１２】
前記の薬学的に受容可能なキャリアはスキムミルクあるいは粉末または他の形態の乳酸菌成長因子である、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株の使用であって、泌尿生殖管感染症の予防および／または治療を行うための薬学的組成物を調製するための使用。
【請求項１４】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＢ９３１株の使用であって、泌尿生殖管感染症の予防および／または治療に好適な吸収用品を製造するための使用。
【請求項１５】
泌尿生殖管感染症が腸内細菌のコロニー形成であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
吸収用品が、おむつ、生理用ナプキン、パンティガードまたは失禁ガードであることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、有用な薬学的特性を有する新規なラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌株に関する。本発明はまた、この細菌株を含む薬学的組成物および個人ケア製品ならびに泌尿生殖管感染症を防止するためのこの細菌株の使用に関する。
【０００２】
（技術的背景：下記の説明における引用はすべて参考として援用される）
泌尿生殖管領域における通常の細菌フローラは、５０を越える種々の細菌種を含む複雑な生態系によって形成されている（Ｈｉｌｌ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８４；８６（増刊）：２３〜２９）。正常なフローラは、妊娠可能な女性の膣環境に適合したグラム陽性の桿菌であるラクトバチルス（ＬＢ）属に属する細菌が優勢である。これらの細菌はまた、膣内における特定の環境および生態系バランスの維持にも寄与している。
【０００３】
膣およびそれ以外の泌尿生殖管領域の多数の細菌フローラの複雑な相互作用パターンに加えて、細菌の増殖特性および付着特性に影響し得る物理的条件の変化を検討する必要がある。ＬＶＳ細菌株のいくつかは、様々な機構で、潜在的な病原性細菌の増殖を阻害する。ＬＢの代謝によって、多くの他の細菌種には好ましくない膣分泌液の低いｐＨに寄与する有機酸（特に、乳酸および酢酸）が生成し得る。ＬＢはまた、潜在的に病原性の細菌および酵母の増殖を直接阻害する可溶性物質を産生する。ＬＢはまた、グラム陰性の嫌気性桿菌および腸内細菌科などのカタラーゼ酵素を有していない細菌にとって毒性の過酸化水素を産生し得る。このような阻害特性は、種々のＬＢ細菌株の間で大きく変化し得る（Ｈｏｏｔｏｎ他、ＪＡＭＡ、１９９０；２６５：６４〜６９）。
【０００４】
天然の防御システムが弱い場合、例えば、薬物療法、劣った個人ケア、あるいは皮膚または粘膜の微生物フローラの変化に関連して、潜在的な病原性微生物は臨床的な感染症を引き起こし得る。膣の正常なフローラはＬＢが優勢であり、周囲のｐＨは４．５未満である。酵母および腸内細菌はわずかであるか、または存在していない（Ｒｅｄｏｎｄｏ−Ｌｏｐｅｚ他、Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９８７；１２：８５６〜８７２）。膣の細菌フローラの変化が種々の病原的条件に関連して見出され得る。再燃した尿路感染症に罹っている女性は、膣および尿管口における腸内細菌の数が増大しており、そして泌尿生殖管の細菌フローラもまた乳酸菌が激減している（Ｍａｒｒｉｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７６、８、６７〜７２）。感染症の頻度が抗生物質による他の感染症の治療に関連して増大することもまた知られている（Ｓｔａｍｅｙ、Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９８７：９（増刊、２）：１９５〜２０８；Ｒｅｉｄ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９９１；４：３７〜４１）。さらに、度重なる抗生物質治療の病歴を有する子供は尿路感染症により罹りやすいことが明らかにされている（Ｍａｒｉｌｄ他、Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９９０；２２：４３〜４７）。
【０００５】
細菌性膣症においては、ＬＢの数が減少し、ｐＨが上昇する。バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）属の細菌種、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）およびモビルンクス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属もまた優勢である（Ｒｅｄｏｎｄｏ−Ｌｏｐｅｚ、上記）。腸内細菌の数の増大に伴う膣炎は、多くの場合、抗生物質治療に関連する明らかな問題である。ペニシリンの一般的な経口投与は、膣分泌液における物質の蓄積をもたらし（Ｓｊｏｂｅｒｇ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９０；７５：１８〜２１）、その後、腸内細菌および酵母のコロニー形成が生じる（Ｓｊｏｂｅｒｇ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２；３３：４２〜４６）。サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）での研究により、アモキシリンの膣投与によって、尿路病原性大腸菌のコロニー形成を阻害する正常な細菌フローラの能力が損なわれることが明らかにされている（Ｈｅｒｔｈｅｌｉｕｓ他、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、１９８８；１６：２６３〜２６６）。
【０００６】
妊娠期間中、膣フローラの組成は胎児および子供の罹患率に影響し得る。便および膣フローラにおけるＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）の存在は一般的である（妊娠した女性の３０％までである）。これらの細菌は、通常、女性の健康に対する脅威にはならない。しかし、ＧＢＳは重大な感染症を新生児に生じさせることがある。この場合、細菌は、出産前または出産に関連して母親から子供に垂直的に伝わる。他の細菌もまたこのように伝染して、感染症を子供に生じさせることがある。細菌性膣症と早産との間にも強い関係が存在する（Ｍａｒｔｉｕｓ他、Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１９９０；２４７：１〜１３）。この現象の背後にある機構は不明である。グラム陰性細菌種が優勢になる膣フローラの変化はホスホリパーゼＡ２の酵素量を増大させ、次いで、この酵素がアラキドン酸から始まるプロスタグランジン合成を開始させ得ることが明らかにされている（Ｂｅｊａｒ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８１；５７：４７９〜４８２）。膣症フローラはまた大量のエンドトキシンを産生する（Ｓｊｏｂｅｒｇ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９１；７７：２６５〜２６６）。これにより、おそらくはインターロイキン類によって媒介される内因性のプロスタグランジン合成が誘導され得る（Ｒｏｍｅｒｏ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８９；７３：３１〜３４）。
【０００７】
ＬＢの理論的に有望な特性により、その目的とする用途を有する市販の調製物においてＬＢを使用して、膣フローラを補い強化することが考えられる。これは成功しているが、多くの場合、入手できる調製物は、述べられているよりもかなり少ない数のＬＢを含有していることが多い。調製物の中には汚染されているものもある（Ｈｕｇｈｅｓ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９０；７５（２）：２４４〜２４８）。ＬＢを加えることによって泌尿生殖管領域における正常な細菌フローラを補い改善するためには、使用する細菌株を注意深く選択する必要である。この目的に好適なＬＢ細菌株は下記の基準を満たさなければならない：
１．そのようなＬＢ細菌株は、腸内細菌、Ｂ群連鎖球菌、ブドウ球菌および酵母に対する増殖阻害能を有する可溶性物質を大量に産生しなければならない。
２．そのようなＬＢ細菌株は皮膚および泌尿生殖管領域の粘膜に移動され得なければならない。
３．そのようなＬＢ細菌株は泌尿生殖管領域の上皮細胞表面に付着することができなければならない。
４．そのようなＬＢ細菌株は長期間にわたる貯蔵に耐えることができ、そして種々の種類の調製物においてそのような細菌株を誘導することができなければならない。
５．そのようなＬＢ細菌株は使用時に用品または調製物においてその生存性および特性を保持することができなければならない。
６．そのようなＬＢ細菌株はノノキシノール−９を含有する殺精子調製物に対して感受性であってはならない。
７．そのようなＬＢ細菌株はヒト女性の泌尿生殖管から単離されなければならない。
８．そのようなＬＢ細菌株はヒト泌尿生殖管のＬＢフローラの存在を可能にしなければならない。
従って、これらの条件を満たす細菌株が求められている。
【０００８】
（発明の要旨）
上記条件を満たすＬＢ９３１と呼ばれるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の新規な細菌株が単離された。この細菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に寄託され、ＤＳＭ１１９１８のアクセション番号が割り当てられている。従って、ＬＢ９３１は、泌尿生殖管感染症の治療および／または予防に使用することができる。ＬＢ９３１は、薬学的組成物および個人ケア用製品（おむつおよび生理用ナプキンなど）に都合よく含めることができる。
【０００９】
（定義）
本明細書中で開示されているように、用語「ＬＢ」は、ラクトバチルス属の細菌をいう。
【００１０】
本明細書中で開示されているように、用語「泌尿生殖管」は、会陰部、尿道および膣をいう。
【００１１】
本明細書中で開示されているように、用語「吸収用品」は、血液または尿などの体液を吸収するのに好適な製造物に関する。そのような用品の例は、女性用衛生製品、失禁ガードおよびおむつが挙げられる。
【００１２】
本明細書中で開示されているように、用語「ＧＢＳ」はＢ群連鎖球菌をいう。
【００１３】
本明細書中で開示されているように、用語「乳酸細菌」は、ラクトバチルス属およびラクトコッカス属に属する細菌などの乳酸を産生する細菌に関する。
【００１４】
用語「ｃｆｕ」は、コロニー形成単位を意味する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＬＢ９３１（ＤＭＳ１１９１８）として示されるラクトバチルス・プランタルムの新規な細菌株に関する。この細菌株は、非常に多数の病原性微生物の増殖を阻害するので、泌尿生殖器官感染症の予防および／または治療に有用である。この細菌株は耐久性であり、室温での長期間の保存において容易に生存する。従って、ＬＢ９３１を含有する製品は貯蔵寿命が長い。この細菌株は、ヒトの皮膚および膣上皮細胞に容易に移動し得る。ＬＢ９３１は、いくつかの抗生物質および殺精子化合物の治療的濃度に対して耐性である。
【００１６】
ＬＢ９３１の阻害特性は調べられている。十分に阻害された細菌種の例には、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびＢ群連鎖球菌である。従って、ＬＢ９３１は、これらの微生物によって引き起こされる感染症の予防および／または治療に有用である。
【００１７】
上記のように、本発明はまた、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤および／または希釈剤とともにＬＢ９３１を含む、好ましくは局所投与に好適な様々な薬学的組成物を提供する。一般に、そのようなキャリアは、用いられる投薬量および濃度で被投与者に対して非毒性でなければならない。通常、そのような組成物の調製には、治療薬剤を、緩衝剤、およびグリセリン、ポリエチレングリコールなどのゲル形成薬剤の増粘剤と組み合わせることが伴う。アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、炭水化物（グルコース、スクロースおよびデキストリン類を含む）、および他の安定化剤および賦形剤を含めることができる。可能な薬学的組成物は、軟膏、クリーム、液体溶液、坐薬またはカプセルである。
【００１８】
本発明はまた、ＬＢ９３１を含む吸収用品に関する。そのような用品は、着用者の皮膚と密着していることを目的とする浸透性の外側シート、使用時に着用者から遠位に置かれていることを目的とする好ましくは液体不浸透性の裏打ちシート、および前記の外側シートと裏打ちシートとの間に配置された吸収構造体を含むことができる。場合により、さらなるシートを、例えば詰め物または類似する材料の形態で、前記の外側シートと吸収構造体との間に置くことができる。拮抗作用性を示す微生物を、吸収用品の種々の部分に配置することができる。例えば、外側シート内に、吸収用品の吸収構造体内に、吸収用品の層の２つの間に、吸収用品における緩やかな挿入製造物に、あるいは特定の他の方法で配置することができる。
【００１９】
本発明は、添付した図面を参照して記載される。
図１は、凍結乾燥したＬＢ９３１の室温（＋２２℃）および＋６℃における安定性を示すグラフである。
図２は、吸収用品に含有されたＬＢ９３１の安定性を示すグラフである。
図３および図４は、ＬＢ９３１を含むパンティライナーを使用した後での少女の尿管口および会陰部皮膚に移動したＬＢ９３１の数を明らかにしている。
【００２０】
次に、本発明を、下記の実施例を参照して説明する。
実施例１：ラクトバチルス・プランタルムＬＢ９３１株の単離および分類
細菌サンプルを健康な女性から採取した。これらのサンプルから細菌株を単離し、それらの細菌株を腸内細菌のその増殖阻害能についてスクリーニングした（データは示さず）。健康な妊婦から単離された最も良い細菌株は、試験キットＡＰＩ５０ＣＨ（ＡＰＩシステムズ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）によりラクトバチルス・プランタルムと分類され、ＬＢ９３１と命名された。この細菌株は、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ（ベルギー）でのＳＤＳ−ｐａｇｅによるＤＮＡ分析によって、ラクトバチルス・プランタルム−ペントサス−パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ−ｐｅｎｔｏｓｕｓ−ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）であるとさらに型分類された。
【００２１】
実施例２：細菌株ＬＢ９３１の阻害能
この実験の目的は、他の細菌の増殖を阻害する細菌株ＬＢ９３１の能力をさらに明らかにすることであった。ＬＢ９３１を、ＭＲＳブロス（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）において３７℃の温度および５％ＣＯ２のもとで一晩増殖させた。１０８個の細菌を含有する１ｍｌを２５ｍｌの溶融した２％寒天ＭＲＳブロスに加えた。混合物をペトリ皿に注ぎ、固化させて、上記のように２４時間インキュベーションした。Ｍ１７寒天（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）の別の２５ｍｌを第１層の上部に注ぎ、平板を室温で４時間置いた。ＬＢ９３１を含まない同様の寒天平板もまた作製して、コントロール平板として使用した。
【００２２】
指標細菌を、別に、ＴＹ培地（Ｈｏｌｍ他、ＡＰＭＩＳ、１９６７、６９、２６４）において３７℃で空気中で培養した。培養物を２５区画のＢｅｒｔａｎｉトレーに移した。各区画には０．２５ｍｌ（１０６細菌／ｍｌ）が含まれた。この各トレーから、細菌を、Ｓｔｅｅｒのスチールピンレプリケーター（Ｓｔｅｅｒｓ他、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９７９、９、３０７）を使用して、ラクトバチルスを含有する寒天平板に移してスタンプした。平板を３７℃で一晩インキュベーションした。平板を観察して、ａ）指標細菌が増殖しているかどうか；ｂ）指標細菌の増殖が阻害されているかどうか；またはｃ）指標細菌の増殖が生じていないかどうかを明らかにした。
【００２３】
妨害試験の結果を表Ｉに示す。
【表１】
0004267822.tif 000002
【００２４】
これらの結果は、ラクトバチルス・プランタルムＬＢ９３１が非常に多数の細菌株の増殖を阻害しているか、または妨げていること、および他のラクトバチルスの細菌株はほとんど影響を受けていないことを示している。
【００２５】
実施例３：種々の調製物におけるＬＢ９３１の生存能
ａ）等量部のスキムミルクおよび０．９％ＮａＣｌの懸濁物に溶解したＬＢ９３１。
ＬＢ９３１を、０．９％ＮａＣｌを含有するスキムミルクに溶解した。次いで、溶解した細菌を種々の温度でインキュベーションした。細菌数を、細胞を計数することによって連続的に追跡した。結果を下記の表IIに示す。
【００２６】
【表２】
0004267822.tif 000003
【００２７】
これらの結果は、ＬＢ９３１が、＋４℃で、１ヶ月の期間にわたって、スキムミルクおよびＮａＣｌの混合物で安定であることを示している。
【００２８】
ｂ）ＬＢ９３１のスキムミルク調製物を標準的な方法に従って凍結乾燥した。得られた粉末を室温および＋６℃でペトリ皿において保存した。細菌数を７日後および２５日後にそれぞれ測定した。結果を下記の表IIIに示す。
【００２９】
【表３】
0004267822.tif 000004
【００３０】
凍結乾燥粉末中における細菌数もまた、４週間毎に６８週まで追跡した。これらの結果を図１に示す。ＬＢ９３１が室温および＋６℃の両方で２２週間にわたって安定であることが図から明らかである。１年後、＋６℃では、１０５ｃｆｕ／ｍｇを越えるＬＢ９３１が生存している。
【００３１】
ｃ）ｐＨ６．６の合成尿におけるＬＢ９３１の生存能を調べた。合成尿は、一価および二価のカチオンおよびアニオンならびに尿素を含有し、ＧｅｉｇｙのＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ（第２巻、第８版、１９８１、５３頁）における記載に従って調製した。滅菌した合成尿に微生物用の栄養培地を加えた。栄養培地は、Ｈｏｏｋ培地およびＦＳＡ培地の組成データに従って調製した。１ｍｌの合成尿に１０３個のＬＢ９３１細菌を加え、サンプルを３２℃で１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、サンプル中の細菌数は＞１０５／ｍｌであった。ＬＢ９３１は合成尿中で生存し、増殖することができる。
【００３２】
ｄ）吸収用品（パンティライナー）でのＬＢ９３１の生存能を調べた。ＬＢ９３１の懸濁液（１５０μｌ）を吸収用品に加えて、その後、この用品を密閉した包装で９ヶ月まで保存した。結果を図２に示す。非常に多くの細菌が７ヶ月間生存していた。
【００３３】
ｅ）最後に、ＬＢ９３１を増殖および保存の期間中のその特性について調べた。ＬＢ９３１をＭＲＳブロスで培養し、新しい継代物を３日毎に３ヶ月間にわたって作製した。その後、ＬＢ９３１の開始サンプルおよび最後の継代物を、ＡＰＩ試験、ＰＧＦＥ、および妨害試験で比較した。この２つのサンプルはすべての試験において同一であった。このことは、ＬＢ９３１は、増殖培地での貯蔵および数代の継代の後で非常に安定であることを示している。
【００３４】
実施例４：女性における会陰部皮膚および尿管口へのＬＢ９３１の移動
パンティライナーを使用したときに会陰部へのＬＢ９３１の移動を調べるために下記の試験を行った。すべての被験者は年齢が１２才〜６０才の女性であり、試験を必要に応じて月経期の間で行った。試験製品を、液体浸透性の外側シート、液体不浸透性の背面層、およびその間にある１００ｇ／ｍ２〜２００ｇ／ｍ２の化学セルロースパルプの吸収層を含む従来のパンティライナーから製造した。試験製品の吸収面に、ＬＢ９３１細菌の懸濁液を製品あたり１０９コロニー形成単位の量で噴霧した。
【００３５】
１３人の被験者の会陰部におけるＬＢ９３１の存在を明らかにするために、いわゆる綿棒試験を行った。細菌を、滅菌塩化ナトリウム溶液に浸漬した綿チップを含む滅菌スティックを所定の皮膚領域をこすることによって採取した。会陰部皮膚および尿管口におけるＬＢ９３１および他のＬＢの存在が明らかにされた。ブランクサンプルを求めるために、被験者をこのようにして調べた。この場合、被験者は、朝、５時間、パンティライナーを着用した。パンティライナーを脱ぎ、そして加えた乳酸細菌および天然の乳酸細菌の存在を、それぞれ、パンティライナーを脱いだ直後、再度測定した。このサンプルはサンプル１と呼ばれた。さらに４時間後〜５時間後、さらなるサンプルを採取し、サンプル２とした。乳酸細菌のタイプを、ＬＢ９３１についてはバンコマイシンを含むロゴサ寒天を使用し、他のＬＢについては嫌気的にインキュベーションしたロゴサ寒天平板を使用して同定した。さらなる同定をＡＰＩ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）およびＰＦＧＥ（パルスフィールド電気泳動）によって行った。これらの結果を表ＩＶに示す。ＬＢ９３１は、ＬＢ９３１を噴霧したパンティライナーを使用した後のすべての女性において会陰部皮膚または尿管口で見出すことができる。
【００３６】
【表４】
0004267822.tif 000005
【００３７】
実施例５：少女における会陰部皮膚および尿管口へのＬＢ９３１の移動
３才〜１２才の１３人の少女が試験に含まれた。会陰部皮膚および尿管口からの細菌サンプルを、綿棒を最初にＭＲＳブロスに浸し、次いでスティックで皮膚表面または上皮表面を穏やかにこすることによって得た。最後に、綿棒を、ＭＲＳブロスを含有するサンプル管に浸した。サンプルを下記の計画に従って得た：
サンプル０：ブランクサンプルを、ＬＢ９３１細菌を含む試験に入る前の夕方に得た。１日目の夕方、パンティライナーを着用した。
サンプル１：２日目の朝。新しいパンティライナーを１日中着用する。
サンプル２：サンプルを、任意に行われる入浴の前、および新しいパンティライナーを着用する前の夕方に採取した：２日目の夕方。
サンプル３：サンプル１の場合と同じ手順。３日目の朝。
サンプル４：サンプル２の場合と同じ手順。３日目の夕方。
サンプル５：サンプル１の場合と同じ手順。４日目の朝。
サンプル６：サンプルを、任意に行われる入浴の前の夕方に採取する。夜間はパンティライナーを着用しない：４日目の夕方。
サンプル７：サンプルを５日目の朝に採取する。日中はパンティライナーを着用しない。
サンプル８：最後のサンプルを５日目の夕方に採取する。
【００３８】
結果を図３（尿管口）および図４（会陰部皮膚）に示す。結果は、ＬＢ９３１は吸収剤用品から移動し得ることを示している。
【００３９】
実施例６：抗生物質および殺精子剤物質に対する感受性
ラクトバチルス・プランタルムＬＢ９３１のＭＩＣ値を、Ｅ試験（Ｂｒｏｗｎ他、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９９１；２７：１８５〜１９０）を使用して測定した。結果を下記の表Ｖに示す：
【００４０】
表Ｖ
抗生物質                    ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）
アンピシリン                ０．１９
セフォタキシム              ０．０９４
セフロキシム                ０．３８
ゲンタマイシン              ０．２５
イミペネム                  ０．０１６
メトロニダゾ−ル            ＞３２
エリスロマイシン            ０．２５
バンコマイシン              ＞２５６
ピペラシン／タゾバクタム    ２
テトラサイクリン            ２
トリメトプリム              ０．０１６
ベンジルペニシリン          ０．５
【００４１】
抗生物質に対する感受性もまた、ＳＩＲシステムを使用して測定した。下記の表VIにおいて、Ｓは感受性を意味し、Ｒは耐性を示す。
表VI
抗生物質                    ゾーン（ｍｍ）      判定
セファドロキシル            ２４                Ｓ
クリンダマイシン            ３５                Ｓ
トリ／スルファメトアゾール  ４３                Ｓ
セフタジジム                ３５                Ｓ
アミカシン                  ３０                Ｓ
アズトレオナム              ０                  Ｒ
メシリナム                  ０                  Ｒ
ナリジキシン酸              ０                  Ｒ
ネチリマイシン              ０                  Ｒ
ニトロフアンチン            ３６                Ｓ
ノルフロキサシン            ０                  Ｒ
トブラマイシン              ３２                Ｓ
メシリナム／アンピシリン    ４１                Ｓ
セフィピロム                ４７                Ｓ
オキサシリン                ０                  Ｒ
セファロチン                ２２                Ｓ
【００４２】
ＬＢ９３１は、尿管感染症について通常処方されるいくつかの抗生物質に対して感受性である。しかし、ＬＢ９３１はまた、例えば、ナリジキシン酸およびノルフロキサシンに対して耐性である。ＬＢ９３１はまたバンコマイシンに対して耐性である。
【００４３】
ＭＩＣ試験を殺精子剤のテルギトールについても行った。ＬＢ９３１を、ＭＲＳ寒天で、５％ＣＯ２のもと、３７℃で４８時間増殖させた。細菌を３ｍｌのＭＲＳブロスに接種し、前記と同じ条件で１０時間インキュベーションした。１．５％の培養物を３ｍｌのＭＲＳブロスに再接種し、同じ条件下で１８時間インキュベーションした。ＮＰ−９テルギトール（Ｓｉｇｍａ、米国）（ロット：４７Ｆ０００２）を３７℃（粘度を低下させた）の温度のＭＲＳブロスで希釈して、４０％の貯蔵溶液にした。この貯蔵溶液を使用して、下記濃度の３ｍｌの溶液を調製した：０％、５％、１０％、２０％、３０％および４０％。１０μｌの細菌培養物を各溶液に加えた。ブランク溶液を混合し、ＭＲＳ寒天平板に加えた。平板を、５％ＣＯ２のもと、３７℃で４８時間増殖させて、細胞密度を測定した。残りの溶液は、混合することなく、５％ＣＯ２のもと、３７℃で１８時間インキュベーションした。３０％および４０％のＮＰ−９を含有する溶液を３７℃のＭＲＳブロス（粘度を低下させた）で希釈した。すべての溶液を激しく混合し、滅菌０．９％ＮａＣｌで希釈して、ＭＲＳ寒天平板に加えた。平板を、５％ＣＯ２のもと、３７℃で４８時間インキュベーションして、ｃｆｕ／ｍｌを求めた。
【００４４】
結果を下記の表VIIに示す：
表VII
ＬＢ９３１の接種量は１．０×１０７ｃｆｕであった。
テルギトールＮＰ−９      ｃｆｕ／ｍｌ  ＬＢ９３１
０％                      ２．６×１０９
１％                      ２．５×１０９
５％                      ２．５×１０９
１０％                    １．６×１０９
２０％                    １．４×１０９
３０％                    １．０×１０９
４０％                    ６．９×１０７
【００４５】
これらの結果は、ＬＢ９３１が４０％までのテルギトールＮＰ−９において十分生存し得ることを示している。
【００４６】
実施例７：膣上皮細胞へのＬＢ９３１の付着
ａ）ＬＢ９３１懸濁物の調製
ＬＢ９３１をＭＲＳ寒天で増殖させた（５％ＣＯ２、３７℃、４８時間）。培養物を３ｍｌのブロスに接種した（５％ＣＯ２、３７℃、８時間）。得られた培養物の２％を１０ｍｌのＭＲＳブロスに再接種した（５％ＣＯ２、３７℃、１８時間）。得られた培養物を２０℃およびスィングアウト・ローターにおいて２０００ｒｐｍ（８２０ｘｇ）で８分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを５ｍｌの乳酸緩衝液（１０ｍＭ乳酸、ｐＨ４．５、０．１５ＭのＮａＣｌ）で洗浄した。細菌を乳酸緩衝液で希釈して、ＯＤ５００を約１．０（約１０８ｃｆｕ／ｍｌ）にする。
【００４７】
ｂ）膣上皮細胞の調製：
膣上皮細胞を、滅菌綿棒スティックを使用して集め、そして細菌を、４ｍｌの乳酸緩衝液またはＰＢＳを含む小さなチューブに移した。チューブを混合して、綿スティックを取り出した。チューブを、Ｊｏｕａｎ社のＣＲ−１２型スィングアウト・ローターにおいて、７００ｒｐｍおよび２０℃で８分間遠心分離した（約１００ｘｇ）。得られたペレットを３ｍｌの乳酸緩衝液またはＰＢＳで洗浄した。細胞を血球計で計数して、濃度を、乳酸緩衝液またはＰＢＳを使用して１０５〜１０６細胞／ｍｌに調節した。２５μｌの細胞を、洗浄手順を管理するために顕微鏡スライドに広げた（下記参照）。
【００４８】
ｃ）付着試験
０．５ｍｌのＬＢ９３１懸濁物および０．５ｍｌの細胞懸濁物を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブで軽く混合した。コントロールサンプルを、０．５ｍｌの細胞懸濁物および０．５ｍｌの緩衝液を混合することによって調製した。チューブを２０℃および２０００ｒｐｍ（約７２０ｘｇ）で遠心分離し、その後、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、チューブを２０℃および７００ｒｐｍ（約９０ｘｇ）で８分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの乳酸緩衝液またはＰＢＳで洗浄した。最後に、ペレットを４００μｌ〜５００μｌの乳酸緩衝液またはＰＢＳで懸濁した。
【００４９】
ｄ）分析
懸濁したペレットの２５μｌを顕微鏡スライド上で風乾し、その後、固定およびグラム染色を行った。各サンプルから、５０個の上皮細胞を分析する。細胞に付着したＬＢ９３１の数を計数して、結果を５群（０〜１０、１１〜３０、３１〜５０、５１〜１００、＞１００細菌／細胞）に分ける。
【００５０】
結果を下記の表VIIIに示す：
【表５】
0004267822.tif 000006
【００５１】
これらの結果により、ＬＢ９３１細菌は、細胞のサンプリング時期とは無関係に、膣上皮細胞に十分に付着することが明らかに示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  凍結乾燥したＬＢ９３１の室温（＋２２℃）および＋６℃における安定性を示すグラフである。
【図２】  吸収用品に含有されたＬＢ９３１の安定性を示すグラフである。
【図３】  ＬＢ９３１を含むパンティライナーを使用した後での少女の尿管口に移動したＬＢ９３１の数を示すグラフである。
【図４】  ＬＢ９３１を含むパンティライナーを使用した後での少女の会陰部皮膚に移動したＬＢ９３１の数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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