(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビジエ由来のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列において、４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異、及び、３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異から選ばれる一方または両方の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素を保持し、野生型グルタチオン合成酵素を保持せず、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母。
【請求項２】
さらに、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する請求項１記載の酵母。
【請求項３】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異、及び、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する請求項２記載の酵母。
【請求項４】
変異型グルタチオン合成酵素が、３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異を有し、さらに、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する請求項２記載の酵母。
【請求項５】
サッカロマイセス・セレビジエ由来のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列である請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項６】
サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母を好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【請求項８】
飲食品がアルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母を好適な条件で培養し、得られた培養物から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性が弱化した変異型グルタチオン合成酵素を有する酵母、及び同酵母の菌体を利用した食品に関するものである。γ−グルタミルシステイン、及びそれから製造されるシステインは、食品分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
システインは、食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。システインを食品の風味改善に用いることを目的として、システイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そのような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。一方、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すれば、システインを高含有する食品素材を得ることが可能であると報告されている（WO 00/30474）。
【０００３】
γ−グルタミルシステインは、γ−グルタミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグルタミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオンはグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシステインとグリシンを基質にして合成される。そのため、γ−グルタミルシステインを高蓄積する酵母の育種方法としては、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を破壊することが考えられる。グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が破壊された酵母は、WO 00/30474; Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990; クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997; Inoue et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1395 (1998) 315-320）で報告されている。
【０００４】
しかしながら、上記酵母は、いずれも生育速度が大幅に低下するという欠点がある。さらに、Otakeらは、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が破壊された酵母は、グルタチオンを含まない培地で培養すると、グルタチオンを含む培地で培養したときよりも生育が悪いことを報告している（Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990）。しかしながら、一般にグルタチオンを豊富に含む培地は高価であり、またグルタチオン自身も高価である為、グルタチオンを十分量含まない安価な工業レベルの培地で前記酵母を高密度培養することは不適である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の技術背景の下に、活性が弱化した変異型グルタチオン合成酵素を保持し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母、及び、同酵母を利用したγ−グルタミルシステイン含有食品を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、特定の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素が、γ−グルタミルシステインの蓄積及び生育に好適な、適度のグルタチオン合成酵素活性を有すること、及び、同変異型酵素を保持する酵母はγ−グルタミルシステインを蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００７】
（１）４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異、及び、３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異から選ばれる一方または両方の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素を保持し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母。
（２）さらに、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する(1)の酵母。
（３）前記変異型グルタチオン合成酵素が、４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異、及び、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する(2)の酵母。
（４）変異型グルタチオン合成酵素が、３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異を有し、さらに、５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異を有する(2)の酵母。
（５）変異を有しないグルタチオン合成酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する(1)〜(4)のいずれかの酵母。
（６）サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する(1)〜(5)のいずれかの酵母。
（７）(1)〜(6)のいずれかの酵母を好適な条件で培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理によってシステインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
（８）飲食品がアルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料である(7)の飲食品。
（９）(1)〜(6)のいずれかの酵母を好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
（１０）(1)〜(6)のいずれかの酵母を好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵母は、以下の変異の一方、又は両方を有する変異型グルタチオン合成酵素を保持し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母である。
（１）４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異（以下、「T47I型」変異ともいう）。
（２）３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異（以下、「G387D型」変異ともいう）。
【０００９】
本発明において「変異型グルタチオン合成酵素を保持」するとは、野生型グルタチオン合成酵素を保持しないことを前提とする。
【００１０】
また、本発明において「γ−グルタミルシステインを産生する」とは、酵母野生株よりも多量のγ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積することをいう。好ましくは、本発明の酵母は、SD培地で培養したとき、その対数増殖期に、γ−グルタミルシステインを1.0重量％以上、好ましくは1.1重量％以上含有する。また、本発明の酵母は、SD培地で培養したとき、その対数増殖期に、グルタチオンを0.0001％〜0.1重量％の範囲、好ましくは0.001重量％〜0.006重量％の範囲で含有する。ここで「対数増殖期」とは、培養中における酵母の細胞数が培養時間に対して対数的に増加する時期をいう。
【００１１】
前記グルタチオン合成酵素の変異、及び後述する任意的な変異の位置は、報告されているサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子（GSH2）がコードするアミノ酸配列（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank accession Y13804）（配列表の配列番号２に示す）を基準とする。また、同遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
例えば、本発明の酵母が保持する変異型グルタチオン合成酵素が、基準となる配列と比べてＮ末端部分で１アミノ酸残基欠失している場合には、前記４７位及び３８７位は、変異型グルタチオン合成酵素のＮ末端から４６番目、及び３８６番目のアミノ酸残基に相当する。
【００１２】
本発明の酵母は、上記変異に加えて、さらに以下の変異の一方、又は両方を有していてもよい。
（３）５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異（以下、「P54L型」変異ともいう）。
【００１３】
本発明の酵母が保持する変異型グルタチオン合成酵素の好ましい態様は、以下のとおりである。
（ｉ）T47I型変異、及びP54L型変異を有するグルタチオン合成酵素。
（ii）G387D型変異、及びP54L型変異を有するグルタチオン合成酵素。
【００１４】
また、上記変異型グルタチオン合成酵素としては、変異を有しないグルタチオン合成酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００１５】
上記変異を有する変異型グルタチオン合成酵素は、野生型グルタチオン合成酵素に比べて活性が弱化しているため、これを保持する酵母は、γ−グルタミルシステインを産生する。また、前記変異型グルタチオン合成酵素を保持する酵母は、弱化したグルタチオン合成酵素活性を保持しているため、グルタチオンを含まない培地でも良好に生育することができる。
【００１６】
本発明の酵母としては、γ−グルタミルシステインを生産することができるものであれば特に制限されないが、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ等のシゾサッカロマイセス属等に属する酵母が挙げられる。また、本発明の酵母は、２倍性またはそれ以上の倍数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。２倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、上記変異型グルタチオン合成酵素を保持する酵母の育種に用いた１倍体酵母と、野生型グルタチオン合成酵素保持株の１倍体を接合させ、得られた２倍体酵母から、変異型グルタチオン合成酵素を保持し、γ−グルタミルシステインを産生する株を選択することによって、取得することができる。同様にして、３倍性又はそれ以上の倍数性を有する酵母を取得することができる。
【００１７】
本発明の酵母は、例えば、前記変異を有するグルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを用いた遺伝子置換により創製することができる。また、本発明の酵母は、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばUV照射、あるいはN−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。得られた変異株が目的の変異を有していることは、例えばＰＣＲ法等により確認することができる。
【００１８】
前記遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる。目的の変異を導入したグルタチオン合成酵素をコードする塩基配列を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換し、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子と染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にし、さらに、酵母で機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
【００１９】
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するグルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子と変異型グルタチオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が機能する。
【００２０】
次に、染色体ＤＮＡ上に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子のみを残すために、２個のグルタチオン合成酵素遺伝子の組換えにより１コピーのグルタチオン合成酵素遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、PCRによりグルタチオン合成酵素遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
【００２１】
尚、遺伝子置換に用いる変異型グルタチオン合成酵素遺伝子は、グルタチオン合成酵素全長をコードするものであってもよいが、変異部位を含む限り、酵素の一部をコードする遺伝子断片であってもよい。遺伝子断片を用いた場合も、上記と同様にして遺伝子置換を行うと、染色体ＤＮＡ上の野生型グルタチオン合成酵素遺伝子に目的の変異が導入される。
【００２２】
染色体ＤＮＡ上のグルタチオン合成酵素遺伝子と、導入しようとする変異型グルタチオン合成酵素遺伝子が、遺伝子置換法を適用できない程度に相同性が低い場合には、染色体ＤＮＡ上のグルタチオン合成酵素遺伝子を破壊した後に、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子をプラスミド上又は染色体ＤＮＡ上に保持させればよい。
【００２３】
目的の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素遺伝子は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって取得することができる。サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子は塩基配列が報告されており（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank accession Y13804、配列番号１）、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから取得することができる。
【００２４】
酵母の形質転換は、プロトプラスト法、ＫＵ法、ＫＵＲ法、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物  実験ライン31 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ10  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００２５】
本発明の酵母は、変異型グルタチオン合成酵素を保持することに加えて、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されていてもよい。
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステインを一定量以上産生し、かつ、グルタチオンが存在しないような工業的に用いられる培地における生育も良好であるので、単位時間あたりのγ−グルタミルシステインの生産能に優れている。
【００２６】
上記のようにして得られるγ−グルタミルシステインを産生する酵母を好適な条件で培養して得られた培養物は、γ−グルタミルシステインを含有する。このような培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
【００２７】
上記γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミルシステインからシステインを遊離させることができる。
培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されない。本発明の酵母は、グルタチオンを含まない培地でも良好に生育することができるので、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
【００２８】
培養条件及び酵母エキス等の調製は、通常の酵母の培養、及び酵母エキスの調製尚と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。
【００２９】
上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。
【００３０】
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例で使用した培地の組成は、以下のとおりである。尚、寒天培地は、精製寒天を２％含む。
【００３２】
〔YPD培地組成〕
グルコース     ２％
ペプトン       １％
酵母エキス     ０．５％
(pH5.0)
【００３３】
〔SD培地組成〕
グルコース     ２％
Nitrogen Base  １倍濃度
（10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
【００３４】
〔SDFOA培地組成〕
最終濃度で50mg/Lのウラシル及び1g/Lの５−フルオロオロチン酸−水和物を含むSD培地
【比較例１】
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が破壊された酵母の育種
食品用途に用いられる市販のサッカロマイセス・セレビシエを胞子形成させ、１倍体パン酵母S株(MATα)を取得した。さらに、S株から、ウラシルを含むSDFOA寒天培地を用いて、ウラシル要求性株S2株を取得した。S2株より、公開特許WO 00/30474記載の方法によりグルタチオン合成酵素遺伝子（GSH2）を破壊した酵母K1株を取得した。
【００３５】
【実施例１】
変異型グルタチオン合成酵素を有する酵母の育種
＜１＞弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセットの作製
（１）G387D型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセットの作製
プライマーF1（CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC（配列番号３））、及びR1（CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC（配列番号４））を用い、Pyrobest DNA Polymerase(宝酒造)を用い、製造者の指示する条件に従い、S2株のグルタチオン合成酵素遺伝子のORFの途中からORF下流約40塩基対をコードする領域をPCR法により増幅した。
【００３６】
上記のようにして増幅した遺伝子断片を精製し、以下の条件で72℃で10分間酵素反応を行うことにより、末端にＡを付加した。
【００３７】
（反応液組成）
遺伝子断片溶液                     5μｌ
10X PCR緩衝液(MgCl2フリー)        10μｌ
25mM MgCl2                         3μｌ
2.5mM dATP                         5μｌ
Taq DNA polymerase（宝酒造）       0.5μｌ
精製水                            31.5μｌ
合計                              50μｌ
【００３８】
この反応産物を、製造者の指示に従ってプラスミドpGEM-T Easy (Promega社)に連結し、プラスミドGSH2MS41/pGEMを得た。
【００３９】
次に、部位特異的変異法によって、GSH2MS41/pGEMに含まれるグルタチオン合成酵素遺伝子の387番目のアミノ酸Glyに対応するコドン（GGT）をAspのコドン（GAT）に置換した。この操作は、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーは、プライマーF2（CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG（配列番号５））、プライマーR2（CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG（配列番号６））を用いた。このようにしてプラスミドGSH2MS41dash/pGEMを作製した。
【００４０】
一方、プラスミドpYES2（Invitrogen社）から2μoriを除去したプラスミドを作製した。pYES2を制限酵素SspI、NheIで切断し、切断末端を平滑化した後、再環状化させ、プラスミドpYES2dashを得た。pYES2dash及びGSH2Mdash/pGEMを、いずれも制限酵素SacI及びSphIで切断し、pYES2dashからはURA3遺伝子を含む断片を、GSH2MS41dash/pGEMからは変異を有するグルタチオン合成酵素遺伝子断片を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドGSH2MS41dash/pYES2dashを作製した。GSH2MS41dash/pYES2dashを制限酵素MunIで切断し、カセット１を得た。
【００４１】
（２）T47I型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセットの作製
プライマーF3（CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG（配列番号７；グルタチオン合成酵素をコードするGSH2遺伝子のORFの約700塩基対上流の領域に相当する。）、プライマーR3（CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG（配列番号８））を用い、Pyrobest DNA Polymerase(宝酒造)を用い、製造者の指示する条件に従いS2株のグルタチオン合成酵素遺伝子を含む断片をPCR法により増幅した。
【００４２】
上記のようにして増幅した遺伝子断片を精製し、前記と同様の条件で72℃で10分間酵素反応を行うことにより、末端にＡを付加した。
この反応産物を、製造者の指示に従ってプラスミドpGEM-T Easy (Promega社)に連結し、プラスミドGSH2FD63/pGEMを得た。
【００４３】
次に、部位特異的変異法によって、GSH2FD63/pGEMに含まれるグルタチオン合成酵素遺伝子の47番目のアミノ酸Thrに対応するコドン（ACT）をIleのコドン（ATT）に置換した。この操作は、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーは、プライマーF4（CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC（配列番号９））、プライマーR4（GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG（配列番号１０））を用いた。このようにしてプラスミドGSH2FD63dash/pGEMを作製した。
【００４４】
pYES2dash及びGSH2FD63dash/pGEMを、いずれも制限酵素SacI及びSphIで切断し、pYES2dashからはURA3遺伝子を含む断片を、GSH2FD63dash/pGEMからは変異を有するグルタチオン合成酵素遺伝子断片を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドGSH2FD63dash/pYES2dashを作製した。GSH2FD63dash/pYES2dashを制限酵素で切断し、カセット２を得た。
【００４５】
＜２＞弱化型グルタチオン合成酵素を保持する酵母の育種
（１）G387D型グルタチオン合成酵素を保持する酵母の育種
上記のようにして作製したカセット１を用いて、S2株のグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。S2株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、カセット１を混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSD寒天培地で培養し、生育する株を選択した。カセット１が染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をK2中間体とした。K2中間体を培養し、SDFOA寒天培地にスプレッドし、生えてきた株の中からグルタチオン合成酵素がG387D型に置換された酵母K2株を取得した。
【００４６】
K2株の変異型グルタチオン合成酵素遺伝子は、報告されているサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子の塩基配列（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank accession Y13804）と比較した結果、上記G387D型変異の他に、５４位のプロリン残基のコドン（CCT）がロイシン残基のコドン（CTT）に置換していた。
【００４７】
（２）T47I型グルタチオン合成酵素を保持する酵母の育種
上記のようにして作製したカセット２を用いて、S2株のグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。S2株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、カセット２を混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSD寒天培地で培養し、生育する株を選択した。カセット２が染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をK3中間体とした。K3中間体を培養し、SDFOA寒天培地にスプレッドし、生えてきた形質転換体をSD寒天培地にスプレッドし、生えてきた株を選択し遺伝子置換カセット2が導入されているK3中間体株を取得した。K3中間体株を培養し、SDFOA寒天培地にスプレッドし、生えてきた株の中からグルタチオン合成酵素がT47I型に置換された酵母K3株を取得した。
【００４８】
K3株の変異型グルタチオン合成酵素遺伝子は、報告されているサッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子の塩基配列（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank accession Y13804）と比較した結果、上記T47I型変異の他に、５４位のプロリン残基のコドン（CCT）がロイシン残基のコドン（CTT）に置換していた。
【００４９】
（３）２倍体の酵母の作製
G387D型の変異型グルタチオン合成酵素を有する１倍体酵母（MATα）（K2株）を、常法に従い１倍体酵母（MATa）と接合させ、２倍体酵母を取得した。この２倍体酵母を常法に従い、胞子形成させ、G387D型の変異型グルタチオン合成酵素を有する１倍体酵母（MATa）を取得した。G387D型の変異型グルタチオン合成酵素を有する１倍体酵母（MATα）とG387D型の変異型グルタチオン合成酵素を有する１倍体酵母（MATa）を接合させ、ホモの形でG387D型の変異型グルタチオン合成酵素を有する２倍体酵母Z1株を取得した。T47I型の変異型グルタチオン合成酵素を有する２倍体酵母Z2株も同様の手法で取得した。Z1株、Z2株がγ−グルタミルシステインを乾燥酵母菌体あたり1％以上蓄積していることを確認した。
【００５０】
＜３＞変異型グルタチオン合成酵素を有する酵母の生育及びγ−グルタミルシステイン生産性の検討
（１）K2株、K3株の生育
K1株、K2株、K3株を、SD培地（必要量のウラシルを含む）又はグルタチオンを1mM含むSD培地（必要量のウラシルを含む）で培養した。酵母の増殖が対数増殖期になり、かつ660nmの吸光度が1.4以上になったときからの生育を測定した。結果を図１〜３に示す。
【００５１】
K2株のグルタチオンを含む培地における比増殖速度（１時間当たりの増殖度）は1.171であり、グルタチオンを含まない培地における比増殖速度は1.161であった。また、K3株は1.169、1.156であった。図１〜３からも、また比増殖速度からも明らかなように、K2株、K3株は、グルタチオンを含まない培地においても生育が良好であり、グルタチオン合成酵素遺伝子破壊株よりも工業レベルの培養に適している。よって、G387D型、T47I型のグルタチオン合成酵素を有する酵母は、工業レベルのグルタチオンを含まないか、又は少量しか含まない培地における培養においても好適に使用できる。
【００５２】
（２）K2株、K3株のγ−グルタミルシステイン生産性
K1株、K2株、K3株を、SD培地（必要量のウラシルを含む）で培養した。酵母の増殖が対数増殖期になり、かつ660nmの吸光度が1.4以上になったときからの生育及びγ−グルタミルシステインの蓄積量を測定した。各々の株の比増殖速度は1.104、1.161、1.156であった。また、K2株、K3株は、グルタチオンを乾燥酵母菌体あたり0.001%以上、かつ0.006%以下の量で蓄積していた。各々の株の対数増殖期における乾燥酵母菌体あたりのγ−グルタミルシステイン蓄積量は以下の通りであった。
【００５３】
【表１】
0004273689.tif 000002
【００５４】
次に、単位時間あたりのγ−グルタミルシステインの生産性を測定した。単位時間あたりのγ−グルタミルシステインの生産性は、一定時間にSD培地（必要量のウラシルを含む）50mlで各株を培養したときの坂口フラスコ中に含まれているγ−グルタミルシステインの量が、単位時間あたりにどれだけ増えたかによって、測定した。この値は、乾燥菌体あたりのγ−グルタミルシステイン蓄積量と酵母の増殖速度によって支配される値である。K1株は0.116mg/時間、K2株は0.130mg/時間、K3株は0.127mg/時間であった。
【００５５】
γ−グルタミルシステインを乾燥酵母菌体あたり1%以上含有する酵母及び酵母エキスは、食品の風味改善に使用可能であると報告されている（WO 00/30474）。したがって、K2株、K3株は、K1株よりも比増殖速度が速いので、γ−グルタミルシステインを乾燥酵母菌体あたり1%以上含有する酵母及び酵母エキスの製造に有利である。また、K2株、K3株は、K1株よりも単位時間あたりのγ−グルタミルシステインの生産性もよい。さらに、K2株、K3株は、0.001％以上のグルタチオンを含むので、グルタチオンを含まないような工業レベルの培養にも適している。以上の観点から、G387D型、T47I型の変異型グルタチオン合成酵素を有する酵母は、γ−グルタミルシステインを含有する酵母及び酵母エキスの製造に適しているといえる。
【００５６】
（３）K2株、K3株の植え継ぎ安定性に関する検討
K2株、K3株、Z1株、及びZ2株をYPD培地で培養した。K2株、K3株、Z1株、及びZ2株を１０回植え継ぎ培養し、復帰変異の有無を調べた。植え継ぎ培養は、次のようにして行った。4mlのYPD液体培地を含む試験管に各株を植菌し、30℃で振盪培養した。十分生育した後、培養産物の一部を4mlのYPD液体培地を含む試験管に植え継いだ。この操作を10回繰り返し行った。
【００５７】
復帰変異の確認の有無は次のように行った。培養液より酵母菌体を集菌し、染色体ＤＮＡを回収し、変異点の塩基配列を確認した。また、10mMのメチルグリオキサールを含むSD寒天培地（必要量のウラシルを含む）で30℃で培養したときの生育の有無を確認した。これらの結果から、K2株、K3株、Z1株、Z2株の植え継ぎ安定性が示された。
【００５８】
＜４＞P57L変異に関する検討
変異型グルタチオン合成酵素に対するP54L変異の影響について検討を行った。  T47I型変異又はG387D型変異のみを有するグルタチオン合成酵素遺伝子を含むプラスミドを作製した。グルタチオン合成酵素遺伝子を含むプラスミドとしては、pEGSH2を用いた。同プラスミドは、文献（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320）記載の方法により作製した。
【００５９】
まず、プラスミドpEGSH2のグルタチオン合成酵素遺伝子の47番目のアミノ酸Thrに対応するコドン（ACT）をIleのコドン（ATT）に置換した。この操作は、QuikChangeＴＭ Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーは、プライマーF4（CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC（配列番号９））、プライマーR4（GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG（配列番号１０））を用いた。このようにして、プラスミドpEGSH2-T47Iを構築した。
【００６０】
次に、プラスミドpEGSH2のグルタチオン合成酵素遺伝子の387番目のアミノ酸Glyに対応するコドン（GGT）をAspのコドン（GAT）に置換した。この操作は、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーは、プライマーF2（CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG（配列番号５））、プライマーR2（CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG（配列番号６））を用いた。このようにしてプラスミドpEGSH2-G387Dを構築した。一方、K1株より、ウラシル要求性を示す株K1dash株を、以下のようにして取得した。K1株をYPD培地で30℃で80時間培養し、培養産物をSDFOAプレートにスプレッドした。SDFOAプレートに生育してきた酵母の中から、ウラシル要求性を示し、グルタチオン合成酵素が破壊された酵母K1dash株を選択した。
【００６１】
上記のようにして得られたK1dash株を、上記プラスミドpEGSH2、pEGSH2-T47I、及びpEGSH2-G387Dで形質転換し、それぞれpEGSH2/K1dash株、pEGSH2-T47I/K1dash株、及びpEGSH2-G387D/K1dash株を取得した。K1dash株への各プラスミドの形質転換は以下のようにして行なった。K1dash株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、目的のプラスミドを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSD寒天培地で培養し、生育する株を選択した。
【００６２】
pEGSH2/K1dash株、pEGSH2-T47I/K1dash株、pEGSH2-G387D/K1dash株をSD培地で30℃で30時間しんとう培養し、培養産物をSD培地に2%植菌し、30℃でしんとう培養した。その対数増殖期（本培養開始10時間後）における菌体内グルタチオン蓄積量を測定した。pEGSH2/K1dash株は約0.80%、pEGSH2-T47I/K1dash株、pEGSH2-G387D/K1dash株は0.001%〜0.006%のグルタチオンを蓄積していた。
【００６３】
以上の結果から、P54Lという変異を有していなくても、T47I又はG387Dという変異を有するのみで、グルタチオン合成酵素活性が弱化し、微弱な量のグルタチオンを菌体内に含有することができ、γ−グルタミルシステインの高生産性に寄与することが示された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、活性が弱化した変異型グルタチオン合成酵素を保持し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母が提供される。本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン含有食品又はシステイン含有食品の製造に利用することができる。
【００６５】
【配列表】
0004273689.tif 000003
0004273689.tif 000004
0004273689.tif 000005
0004273689.tif 000006
0004273689.tif 000007
0004273689.tif 000008
0004273689.tif 000009
0004273689.tif 000010
0004273689.tif 000011
0004273689.tif 000012
0004273689.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】  SD培地又はグルタチオンを1mM含むSD培地（SDGSH）におけるK2株の生育を示す図。いずれの培地も必要量のウラシルを含む。
【図２】  SD培地又はグルタチオンを1mM含むSD培地（SDGSH）におけるK3株の生育を示す図。いずれの培地も必要量のウラシルを含む。
【図３】  SD培地（必要量のウラシルを含む）におけるK1株、K2株及びK3株の生育を示す図。
【図１】
0004273689.tif 000014
【図２】
0004273689.tif 000015
【図３】
0004273689.tif 000016