(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物であって、以下の構造：
【化６】
0004295431.tif 000021
【化７】
0004295431.tif 000022
【化９】
0004295431.tif 000023
および
【化１０】
0004295431.tif 000024
からなる群より選択される構造を有し、ここで、 ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そしてＲ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化１１】
0004295431.tif 000025
である、分子模倣物。
【請求項２】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組合せて含む、哺乳動物被験体においてナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ疾患を、予防するための組成物であって、以下の構造：
【化１７】
0004295431.tif 000026
【化１８】
0004295431.tif 000027
【化２０】
0004295431.tif 000028
および
【化２１】
0004295431.tif 000029
からなる群より選択される構造を有し、ここで、 ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そしてＲ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化２２】
0004295431.tif 000030
である、組成物。
【請求項３】
前記分子模倣物がキャリア分子に共有結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記分子模倣物がキャリア分子に非共有結合的に会合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
さらに、免疫学的アジュバントを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物被験体においてナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ疾患を、予防するための組成物の製造における、請求項１に記載の分子模倣物の使用。
【請求項７】
前記組成物が免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
請求項１に記載のナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法であって、該方法が：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程；
（ｂ）該集団を、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ莢膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性ではない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、該接触させる工程を、該抗体と存在する場合該分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、該結合していない分子から分離する工程、を包含する、方法。
【請求項９】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ抗体を、生物学的サンプル中で検出するための方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルと、請求項１に記載の分子模倣物とを、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ抗体が、該生物学的サンプル中に存在するときに、該分子模倣物に
結合して、抗体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；ならびに
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出し、それにより、該サンプル中でのナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する、
方法。
【請求項１０】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ感染を検出するための免疫診断試験キットであって、該試験キットが、請求項１に記載の分子模倣物および該免疫診断試験を行うための指示書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して細菌病原体に関する。特に、本発明は、自己免疫活性を欠く抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）エピトープの分子模倣物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性髄膜炎および敗血症の原因因子である。髄膜炎菌は、莢膜および細胞壁の抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学的群に分けられる。現在認識されている血清型には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および２９Ｅが含まれる。血清型特異性を担うポリサッカライドは、いくつかのこれらの群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、およびＹを含む）から精製されている。
【０００３】
Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）は、合衆国およびヨーロッパに居住する乳児および小児における細菌性髄膜炎の約５０パーセントを占める。この生物はまた、若年成人に致死的な敗血症を引き起こす。青年において、外膜タンパク質（ＯＭＰ）粒子からなる実験的ＭｅｎＢワクチンが、約５０％防御的であることが見出されている。しかし、防御は、ワクチン接種された幼児および小児（疾患の最も大きな危険にある年齢群）において観察されていない。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型特異的かつサブタイプ特異的であり、そして優勢なＭｅｎＢ株は、地理的および時間的変化の両方を受け、このようなワクチンの有用性を制限する。
【０００４】
莢膜ポリサッカライドに基づく有効なワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５によって引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、ＭｅｎＢポリサッカライドワクチンを開発する類似の試みは、莢膜ＭｅｎＢポリサッカライド（本明細書中で、「ＭｅｎＢ  ＰＳ」と呼ばれる）の乏しい免疫原性に起因して失敗している。ＭｅｎＢ  ＰＳは、（Ｎ−アセチル（α２→８）ノイラミン酸のホモポリマーである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１は、同一の莢膜ポリサッカライドを有する。ＭｅｎＢ  ＰＳによって惹起される抗体は、宿主のポリシアル酸（ＰＳＡ）と交叉反応する。ＰＳＡは、胎児および新生児組織において豊富に、特に脳組織中に見出される神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ」）上で発現される。ＰＳＡはまた、腎臓、心臓、および嗅神経を含む成人組織においてより低い程度にまで見出される。従って、ほとんどの抗ＭｅｎＢ  ＰＳ抗体もまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎児発達に有害に影響を与えるか、または自己免疫疾患を導く能力を有する。
【０００５】
ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ  ＰＳの不良な免疫原性を回避するための試みにおいて調製されている。例えば、Ｃ3〜Ｃ8  Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体が記載されている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対するＥＰ公開第５０４，２０２Ｂを参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する米国特許第４，７２７，１３６号は、Ｎ−プロピオン化ＭｅｎＢ  ＰＳ分子（本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ」と呼ばれる）を記載する。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ複合糖質で免疫したマウスは、ＩｇＧ抗体の高力価を誘発すると報告された。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（１９８６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８。ウサギにおいて、抗体の２つの異なる集団（２つの異なるエピトープに結合し、１つは天然のＭｅｎＢ  ＰＳにより共有されていて、１つは共有されていないと報告されている）が、誘導体を用いて産生された。殺菌活性が、ＭｅｎＢ  ＰＳと交叉反応しなかった抗体集団において見出された。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（１９８７）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６５：１２０７。この結合体によって惹起された防御的抗体と反応する細菌表面のエピトープの同一性は、未知なるままである。
【０００６】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体、および他のポリサッカライド結合タンパク質に結合することによってポリサッカライドの模倣物として作用し得る。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（これは、末端α連結マンノースまたはグルコース残基を有するオリゴサッカライドに結合する）は、ｐＩＩＩコートタンパク質のアミノ末端に短いペプチド配列を有する細菌性ファージのランダムライブラリー由来のペプチド模倣物を選択するために使用されている。Ｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５３９３；  Ｓｃｏｔｔら（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５３９８。同様に、モノクローナル抗体は、ファージライブラリー由来の腺ガン細胞の表面上に存在する炭水化物のペプチド模倣物を同定した。Ｈｏｅｓｓら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：４３。
【０００７】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体もまた惹起し得る。例えば、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ５６：１１２０は、Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ（「ＭｅｎＣ」）莢膜ポリサッカライドに対するモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用した。抗イディオタイプ抗体で免疫したマウスは、致死的用量のＭｅｎＣ細菌での感染から防御された。これらの実験者らは、引き続き、ＭｅｎＣ抗イディオタイプ抗体のペプチドフラグメントが血清抗ＭｅｎＣ抗体を誘発し、そして動物をＭｅｎＣ細菌での致死的抗原投与後の菌血症および死から防御することを示した。Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：４０２１。
【０００８】
しかし、現在までに、このようなアプローチはＭｅｎＢワクチンの開発に関して採用されていない。ＭｅｎＢに対する安全でかつ効果的なワクチンの産生が特に望ましいことは、容易に明白である。
【０００９】
（発明の要旨）
共有に係る米国特許出願第０８／９２５，００２（１９９７年８月２７日出願）において、ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体に対して指向される、多数の機能的に活性な抗体が記載されている。これらの抗体は、宿主組織とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、従って、自己免疫疾患を惹起するリスクを最小限に提起し、そして本明細書において「非自己反応性」と称する。これらの非自己反応性抗体を本明細書において使用して、ワクチン組成物において使用され得る独特なＭｅｎＢ  ＰＳエピトープの分子模倣物を同定する。
【００１０】
従って、１つの実施態様において、本発明は、ＭｅｎＢ  ＰＳの独特なエピトープの分子模倣物に関する。これらの分子模倣物は、宿主組織に対して、交叉反応しないかまたは最小限に交叉反応性であるＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体に対して指向された、機能的に活性な抗体を用いて同定された、新規の化合物からなる。このような新規の分子模倣物は、以下の構造１に代表される：
【００１１】
【化２３】
0004295431.tif 000002
【００１２】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下からなるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であり；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式またはアリール環を形成し、上記環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまでのヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【００１３】
【化２４】
0004295431.tif 000003
【００１４】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、アミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明の分子模倣物は、以下の構造に代表される：
【００１６】
【化２５】
0004295431.tif 000004
【００１７】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜３である；
【００１８】
【化２６】
0004295431.tif 000005
【００１９】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜３である；
【００２０】
【化２７】
0004295431.tif 000006
【００２１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜３である；
【００２２】
【化２８】
0004295431.tif 000007
【００２３】
および
【００２４】
【化２９】
0004295431.tif 000008
【００２５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００２６】
【化３０】
0004295431.tif 000009
【００２７】
である；
【００２８】
【化３１】
0004295431.tif 000010
【００２９】
および
【００３０】
【化３２】
0004295431.tif 000011
【００３１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００３２】
【化３３】
0004295431.tif 000012
【００３３】
である。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載のような、ＭｅｎＢの独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物被験体において、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１疾患を、予防するための方法であって、上記組成物の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する、方法に関する。
【００３６】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法に関し、上記方法は：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程；
（ｂ）上記集団を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ莢膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ  ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性ではない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、上記接触させる工程を、上記抗体と、存在する場合上記分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、上記結合していない分子から分離する工程、
を包含する。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１抗体を、生物学的サンプル中で検出するための方法であって、上記方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）上記生物学的サンプルと、本発明の分子模倣物とを、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１抗体が、上記生物学的サンプル中に存在するときに、上記分子模倣物に結合して、抗体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；ならびに
（ｃ）上記複合体の存在または非存在を検出し、それにより、上記サンプル中でのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する方法に関する。
【００３８】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書における開示を参照すれば、当業者は容易に実施する。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術内の免疫学、微生物学、および分子生物学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９７３）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版、１９８５）；Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｂ．、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｓｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他にその内容が明確にそうではないことを意味するものでないときは、複数の言及を含む。
【００４１】
（定義）
本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合「ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体」とは、ＭｅｎＢの天然の莢膜ポリサッカライドの化学的改変によって得られた分子をいう。このようなＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、適切なアシル基（例えば、Ｃ3〜Ｃ8およびより高級なアシル基（ここで用語「アシル基」は任意のアシル化された直鎖状分子、分枝状分子、脂肪族分子、または芳香族分子を含む））との、天然の分子のシアル酸残基Ｎ−アセチル基の置換によって改変されているＭｅｎＢ  ＰＳ分子を含むが、これらに限定されない。本明細書中での使用に対して特に好ましいＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、天然のＭｅｎＢ  ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ−プロピオニル基での置換を含む（本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ」と称する）。Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳを含む）を合成するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらの米国特許第４，７２７，１３６号およびさらにＪｅｎｎｉｎｇｓらのＥＰ公開番号第５０４，２０２  Ｂ号に記載される。
【００４３】
ＭｅｎＢ  ＰＳまたはＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体の「分子模倣物」とは、ＭｅｎＢ細菌上に発現される少なくとも１つの「独特の」エピトープを機能的に模倣する分子である。「独特のエピトープ」は、宿主組織のポリシアル酸と交叉反応しない（それゆえ自己免疫活性を欠く）か、または最少に交叉反応するかのいずれかである機能的に活性な（例えば、オプソニン媒介性殺菌および／または補体媒介性殺菌）抗ＭｅｎＢ抗体の形成を惹起し得るエピトープである。このような分子模倣物は、ワクチン組成物において有用であり、そして以下でさらに記載される診断的な適用または治療的適用のための抗体の惹起において有用である。分子模倣物には、小有機化合物；核酸および核酸誘導体；サッカライドまたはオリゴサッカライド；ペプチド、タンパク質、およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣物（例えば、非ペプチド有機部分を含むペプチド、アミノ酸および／またはペプチド結合を含んでもよいし、含まなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド）；ピロリジン；Ｎ−置換グリシンを含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド（例えば、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９３６７に記載されるペプトイドおよびオリゴペプトイド））；ならびに抗体（これは、抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。分子模倣物の同定および生成のための方法は、以下により十分に記載される。
【００４４】
用語「アルキル」とは、本明細書において使用される場合、１〜２４炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）、ならびに環式アルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）をいう。本明細書において、好ましいアルキル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして最も好ましいアルキル基は、１〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、１以上のアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている。
【００４５】
用語「アルケニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの二重結合を含む炭化水素基（例えば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、ｔ−ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニル）、ならびに３〜８、好ましくは５または６の炭素原子の環式アルケニル基などをいう。本明細書において、好ましいアルケニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして最も好ましいアルケニル基は、１〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、１以上のアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている。
【００４６】
用語「アルキニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの三重結合を含む炭化水素基（例えば、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニル）などをいう。本明細書において、好ましいアルキニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして好ましくは、１〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【００４７】
用語「アリール」とは、本明細書において使用される場合、必要に応じて１以上のへテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳ）を含む、５員環、６員環または７員環を含む、モノ、ビ、トリおよびテトラ環式芳香族種をいう。例は、以下を含むがこれらに限定されない：フェニル、ベンジル、ナフチル、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン、カルバゾール、フェナントレン、アントラセン、ベンゾピレン、アズレン、インドール、インダンなど。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【００４８】
用語「アルキルアリール」とは、本明細書において使用される場合、アルキルに結合したアリール環をいい、ここで用語アルキルおよびアリールは上記のとおりである。
【００４９】
用語「炭素環式環」とは、本明細書において使用される場合、上記に記載のようにシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルをいい、必要に応じて、１以上のへテロ原子（例えば、Ｎ、ＯおよびＳ）を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、上記のように置換されている。
【００５０】
用語「アルコキシ」とは、本明細書において使用される場合、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する。すなわち、「アルコキシ」基は、ＯＲとして規定され、ここでＲは上記に規定のようなアルキルである。好ましい実施態様において、アルコキシ基は、１〜６の、より好ましくは１〜４の炭素原子を含有する。
【００５１】
用語「アシル」とは、分子置換基ＲＣＯ−をいうためにその従来の意味で用いられ、ここでＲは上記に規定されるようなアルキルである。好ましい実施態様において、アシル基は、１〜６、より好ましくは１〜４の炭素原子を含むアルキルを含む。
【００５２】
用語「ペプトイド」とは、本明細書において使用される場合、Ｎ置換されたグリシンのオリゴマーを含み、そして用語オリゴマーＮ置換グリシン（ＮＳＧ）と交換可能に使用される。
【００５３】
用語「多価リンカー部分」とは、任意の適切なまたは結合可能な部分に結合され得る、任意の適切なリンカーを表し、これは、セラミドまたはタンパク質もしくはペプチド（多重抗原ペプチドを含む）を含み、そして好ましくは、その上に反応基を有する、他の分子（例えば、分子模倣物など）と共有結合を可能にする基である。
【００５４】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物ならびにハイブリッド抗体、変化された抗体、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆ（ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可変物（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、およびもとの抗体分子の免疫学的結合特性を示すそれらの機能的なフラグメントを含む調製物を含む。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、免疫グロブリン分子全体ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可変物（ｓｃＦｖ）、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして下記により十分に記載される。
【００５６】
「抗原」は、本明細書において、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の物質を含むと規定される。「免疫原」は、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原である。
【００５７】
「エピトープ」とは、特定のＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。タンパク質、ポリサッカリドもしくは他の生体高分子上のＢ細胞エピトープ部位は、その高分子の異なる部分からの部分から構成され得、これらは折り畳みによって一緒にされている。この種のエピトープは、立体配座的または不連続エピトープといわれる。なぜなら、この部位は、線形な順序で不連続であるが、折り畳まれた立体配座において連続であるポリマーのセグメントから構成されるからである。生体高分子もしくは他の分子の単一のセグメントから構成されるエピトープは、連続もしくは線形的エピトープといわれる。Ｔ細胞エピトープは一般的に線形ペプチドに限定される。ペプチドエピトープは、そのエピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、より通常には少なくとも８〜１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は当該分野で公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体が、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。この単純な免疫アッセイは、ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする能力を示す。
【００５８】
「独特のＭｅｎＢエピトープ」は、本明細書において、ＭｅｎＢ細菌上に存在するエピトープと規定される。ここで、このエピトープを指向する抗体はＭｅｎＢに特異的に結合し得、そして宿主組織の表面上に存在するシアル酸残基と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。従って、１つ以上の「独特のＭｅｎＢエピトープ」を含むか、または模倣する免疫原は、ＭｅｎＢ疾患の予防のためのワクチンにおいて有用であり、そして自己免疫応答を惹起しないか、または自己免疫応答を惹起する最少の危険を与える。
【００５９】
本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定される、ＭｅｎＢに対する補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を抗体分子が示す場合、その抗体はＭｅｎＢ生物に対する「機能的な活性」を示す。
【００６０】
本明細書中に記載される結合アッセイを使用して決定される、宿主組織中のポリシアル酸との交叉反応性免疫学的結合特性をその抗体が示さない場合、「独特の」ＭｅｎＢエピトープに対して特異的な抗体は、「自己免疫活性を欠き」、そして／または「自己反応性ではない」。
【００６１】
本明細書中で記載される結合アッセイにおいてポジティブであるとみなされる公知の交叉反応性自己抗体と比較して、宿主組織のポリシアル酸への結合を示すのに約１０倍高い抗体濃度を、その抗体が必要とする場合、「独特の」ＭｅｎＢエピトープに対して特異的な抗体は「最小限に自己反応性」を示し、そして／または「最小限に自己反応性」である。
【００６２】
本明細書中で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有結合的な相互作用の型をいう。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織または液体のサンプルをいい、これらには、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖管の外分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検を含むがこれらに限定されず、そしてまた、インビトロ細胞培養成分のサンプルは、培養培地中の細胞および組織（例えば、組換え細胞）の増殖／成長から得られた馴化培地および細胞成分を含む。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子をいい、これは、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、色素原、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンもしくはハプテン）などを含むがこれらに限定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲内で蛍光を示し得る物質もしくはその一部をいう。本発明のもとで使用され得る標識の特定の例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダーゼを含む。
【００６５】
（発明を実施する形態）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物の発見（これは、ＭｅｎＢに対して指向された機能的抗体を用いて同定された）に基づく。抗体は、宿主組織中のポリシアル酸と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、それゆえ、この抗体は、宿主組織と高度に交叉反応性である抗体よりも自己免疫活性を惹起する危険性が低い。この模倣物を診断試薬として使用し、そして／または、ＭｅｎＢおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１疾患を予防するための組成物に使用し得る。
【００６６】
上記で説明されるように、ＭｅｎＢの天然の莢膜ポリサッカライド（本明細書中で「ＭｅｎＢ  ＰＳ」という）は、ヒトおよび他の哺乳動物被験体において不免疫原性に乏しい。さらに、天然のＭｅｎＢ  ＰＳは、自己抗体の産生を惹起し得、それゆえ、ワクチン組成物における使用には不適切であり得る。従って、本発明は、ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体に対して調製された抗体を使用する。これらの抗体は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能活性（ここで、この機能活性はＭｅｎＢ疾患に対する防御を付与することにおいて重要である）を示すそれらの能力に基づいて選択される。この抗体はまた、最小限または検出不可能な自己免疫活性を示すことに基づいて選択された。
【００６７】
より詳細には、ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、本発明の分子模倣物を同定するために使用される抗体分子を得るために調製された。この誘導体は、一般に、天然の分子のシアル酸残基Ｎ−アセチル基のＣ3〜Ｃ8アシル置換体を含む。特に好ましいＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、天然ＭｅｎＢ  ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ−プロピオニル基の置換を含み、これは、本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ」という。Ｍｅｎ  ＰＳ誘導体を合成するためのこのような誘導体および方法は、例えば、米国特許第４，７２７，１３６号およびＥＰ公報第５０４，２０２  Ｂ号（両者ともＪｅｎｎｉｎｇｓら）に記載される。
【００６８】
Ｃ3〜Ｃ8アシル誘導体は、まず天然のＭｅｎＢ（例えば、Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養物から得られる）を強塩基の存在下で処置して定量的にＮ−アセチル基を除去し、そしてこの分子のシアル酸残基部分内の反応性アミン基を提供することにより作製され得る。次いで、脱アシル化ＭｅｎＢ  ＰＳフラグメントはＮ−アセチル化される。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳの場合、脱アシル化分子は、米国特許第４，７２７，１３６号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら）に記載されるように、無水プロピオン酸または塩化プロピオニルのようなプロピオニル基の供給源を用いてＮ−プロピオニル化される。Ｎ−アセチル化の程度は、例えば、ＮＭＲ分光学を用いて決定され得る。一般に、反応条件は、Ｎ−アセチル化の程度が少なくとも約８０％であるように選択される。
【００６９】
ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体の免疫原性を増大させるために、誘導体を適切なキャリア分子に結合させて複合糖質を提供し得る。詳細には、十分に規定されそして制御された構造的立体配置を有するＮ−アセチル化ＭｅｎＢ  ＰＳ複合糖質調製物は、以下に記載のように、中間サイズのＮ−アセチル化ＭｅｎＢオリゴサッカライドから形成され得る。
【００７０】
従って、Ｎ−アセチル化ＭｅｎＢ  ＰＳ複合糖質の一群（その一例は、本明細書中で「ＣＯＮＪ−２」といわれる）は、以下のように調製され得る。例えば、ＮＭＲ分析により決定される場合、実質的に１００％のＮ−アシル化シアル酸残基を有するＮ−アシル化ＭｅｎＢ  ＰＳ調製物は、緩和な酸性条件下で断片化され、種々の大きさのオリゴサッカライド分子の集団を提供し得る。断片化産物は、例えば、標準的なイオン交換クロマトグラフィー技術を、例えば段階的塩濃度勾配と組合せて使用してサイズ分画され、同質のサイズのＮ−アシル化ＭｅｎＢ分子の画分を提供する。中間サイズのオリゴサッカライドを含む画分（例えば、約５〜約２２、好ましくは１０〜約２０、そしてより好ましくは約１２〜約１８の平均Ｄｐを有する）は、非還元末端において化学的に末端活性化され、そして還元的アミノ化技術によりタンパク質キャリアに結合され、ＣＯＮＪ−２複合糖質を提供する。首尾良い複合体化は、例えば、ゲル濾過により決定され得、そして最終のサッカライドのタンパク質に対する比率（ｗ／ｗ）は、呈色アッセイにより評価され得る。
【００７１】
次いで、ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体（例えば、ＣＯＮＪ−２）から形成される複合糖質を、本明細書中で使用して免疫化宿主における抗サッカライド抗体の形成を惹起する。このような抗体のサブセットは、本明細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、ＭｅｎＢ細菌に結合するはずであるか、宿主組織シアル酸残基と交叉反応しないはずであるか、または最小限に交叉反応性であるはずである。抗体は、アイソタイプ、精緻な抗原特異性、機能活性、および宿主組織との交叉反応性に関して十分に特徴づけられ得る。
【００７２】
例えば、哺乳動物被験体（簡便には、齧歯類およびウサギのような標準的な実験動物）は、複合糖質を含む組成物を、適切なアジュバントと共に免疫してポリクローナル血清の産生を惹起し得る。動物の群は、一般に、その組成物で免疫化され、そして何回か追加免疫される。免疫化された動物由来の抗血清が得られ得、そして宿主組織と交叉反応しないポリクローナル血清は、インサイチュ吸着または従来のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて得られ得る。首尾良い複合糖質抗原は、Ｔ細胞依存性抗原の特徴である、実質的なＩｇＧ抗ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体−抗体応答を惹起するそれらの能力により同定され得る。高度に免疫原性であり、そして主にＩｇＧ抗体を産生することが見い出されている複合体は、本発明の方法における使用について特に好ましい。
【００７３】
細菌性抗血清の形成を惹起し得るＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、モノクローナル抗体の産生における使用に適している。より詳細には、種々のＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体結合体を提供するために使用されるプロセスは、ＭｅｎＢ生物の表面に見い出されるエピトープを模倣し、そして宿主において最小限に発現される独特のサッカライド関連エピトープを提示する優れた免疫原を産生するために設計される。従って、本明細書中に記載されるＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体は、抗ＭｅｎＢワクチンについての独特のエピトープを提供するＭｅｎＢポリサッカライド抗原の模倣物について検索するのに使用されるＭｅｎＢ特異的な抗体の産生を惹起し得る。
【００７４】
従って、本発明の実施において、選択されたＭｅｎＢ誘導体を使用して、モノクローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。本明細書中において使用される、特定のモノクローナル抗体に関する用語「機能的等価物」は、以下である分子を意味する：（ａ）例示的なモノクローナル抗体を交叉ブロックする；（ｂ）問題のＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体または複合糖質に選択的に結合する；（ｃ）本明細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、宿主ＰＳＡ（および、必要に応じて、以下に記載される標準的なアッセイにより決定される場合、ＭｅｎＢ細菌性細胞に対する活性（例えば、補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性））とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。さらに、本発明の特定のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細書中において使用される場合、用語「子孫」は、世代または核型の同一性に係わらず、親により産生されるモノクローナル抗体を産生する、親のハイブリドーマのすべての誘導体、子孫（ｉｓｓｕｅ）、子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を含むことが意図される。
【００７５】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）の方法によって、またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：３７７により記載される））を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合しているＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体で免疫し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞に解離する。所望であれば、脾臓細胞は、細胞懸濁液を抗原でコートされたプレートまたはウェルに適用することにより、スクリーニングされ得る（非特異的接着細胞の除去後）。抗原に特異的な膜結合型イムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣とともにはリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞、またはすべての剥離した脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合を誘発させる。ハイブリドーマ形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）における使用のための代表的なマウスミエローマ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能なミエローマ株を含む。
【００７６】
より詳細には、体細胞ハイブリッドは、Ｂｕｃｋら（前出）の方法により、アザグアニン耐性非分泌マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣから入手可能）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に限界希釈法によりクローン化され、そして免疫抗原に特異的に結合し、そして無関係の抗原に結合しない抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空繊維反応器中）、またはインビボ（例えば、マウスの腹水）のいずれでも培養される。
【００７７】
ハイブリドーマ上清は、例えば、免疫化ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体または天然のＭｅｎＢ  ＰＳ（ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳ）を用いる固相ＥＬＩＳＡまたは間接免疫蛍光アッセイのいずれかを用いて、抗ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合的特異的結合アッセイ（例えば、阻害ＥＬＩＳＡなど）を用いて評価され得る。例えば、緩衝液か、または可溶性ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体もしくはＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳを含む緩衝液のいずれか中に希釈されている抗体分子は、結合したＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体の存在下でＥＬＩＳＡ容器中で反応される。洗浄後、結合抗体は、二次抗体としての標識抗Ｉｇ（抗ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ）により検出される。可溶性ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体により阻害される抗体は、特異的であると考慮され得、従ってさらなる研究（アイソタイプ決定および交叉反応性、機能活性および自己反応性についてのさらなるスクリーニングを含む）のために選択され得る。
【００７８】
特に、部分精製したモノクローナル抗体分子は、その細胞表面上にポリシアル酸残基を発現する宿主細胞に結合するその能力について個々に評価され得る。このような細胞は、自己免疫活性を示す抗体の検出についての代理標的を代表する。１つの標的は、ヒト神経芽腫細胞株ＣＨＰ−１３４（これは、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４４３に記載されるように、長鎖α２−８ポリシアル酸（ＮＣＡＭ）をその細胞表面上に発現する）を含む。また、Ｇｒａｎｏｆｆ、Ｄ．Ｍ．ら（１９８８）Ｔｈｅ  Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：５０２８−５０３６は、ヒトポリシアル酸とは交叉反応しない独特のＭｅｎＢ  ＰＳエピトープを規定する殺菌性モノクローナル抗体を記載する。他の適切な標的は、以下を含むがそれらに限定されない：新生児脳細胞、例えば腎臓、心臓および嗅覚神経由来の組織、培養伏在静脈内皮細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。例えば、Ｂｒａｎｄｏｎら（１９９３）、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６：７７を参照のこと。ハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体分子は、培養物中の適切な試験細胞集団に添加され得、そしてそのモノクローナル抗体の細胞標的に対する潜在的結合が、標識モノクローナルを用いて直接、または各々のモノクローナル抗体と特異的に反応する適切な標識二次試薬（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡおよびＧならびに抗マウス抗体分子）を用いて間接的に、検出および定量され得る。試験宿主組織ＰＳＡと交叉反応しないか、または最小限の反応性を示す抗体は、本発明の目的について自己反応性とはみなされない。従って、これらの抗体は、さらなる使用に適切である。さらに、試験組織との結合（この結合は試験細胞のノイラミニダーゼでの前処理によっては影響されない）を示すいくつかの抗体もまた、さらなる使用に適切であり得る。このような抗体の自己反応性は、本明細書中で「不定な」と呼ぶ。
【００７９】
機能活性は、補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を評価することにより測定され得る。詳細には、抗体の補体媒介性殺菌活性は、Ｇｏｌｄら（１９７０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  １：４７９、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ５６：１１２０、Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７９、およびＧｒａｎｏｆｆら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：５７４により記載されるような標準的なアッセイを使用して評価され得る。これらのアッセイにおいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを、補体供給源とともに、および試験される抗体とともに反応させる。細菌計数を、種々の試料採取時間で行う。補体媒介性殺菌活性を実証するこれらの抗体は、０時間でのコロニー数と比較した場合、抗体および補体との６０分間のインキュベーションの後に測定される生存細菌細胞数において最小５０％の減少が実証される場合、本発明の目的上、細菌活性を示すとみなされ、そしてさらなる使用に適切である。
【００８０】
補体媒介性溶菌は、浸潤性の髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機構であると考えられる。しかし、証拠は、オプソニン作用の重要な保護役割もまた支持する（例えば、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６３：１６０を参照のこと）。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能活性を評価するための第二の手段として、または別の手段として、評価され得る。オプソニンアッセイからの結果は、殺菌性データを補充するために、および保護を与え得る抗体の選択を助けるために、使用され得る。オプソニン活性の評価はまた、本明細書中で、ＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明のマウスモノクローナル抗体の評価のために特に有用である。マウスＩｇＧ１は（ヒトＩｇＧ１と比較して）、補体の活性化に有効ではない。従って、マウスＩｇＧ１抗体は、上記のアッセイにおいて、ＭｅｎＢの補体媒介性溶菌を活性化しない。しかし、ＩｇＧ１抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳモノクローナル抗体の機能活性は、補体の非存在下でのオプソニン作用により評価され得る。
【００８１】
種々のオプソニンアッセイ方法が、当該分野で公知であり、そして本発明のモノクローナル抗体の機能活性を評価するために使用され得る。このような標準的なアッセイには、Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．，Ｃ節  ９５：２８３、Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２１：２６７、Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ  ９９：７６９、Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ  Ａｎｎａｌｓ  １４：１５７、Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ  １００：４４９、Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６０：２７７７、Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃ．  Ｄｉｓ．  １６７：１３１４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６３：１６０、Ｈａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７１：１４８１、ｄｅ  Ｖｅｌａｓｃｏら（１９９５）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７２：２６２、およびＶｅｒｈｅｕｌ，  Ａ．Ｆ．Ｍ．（１９９１）「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ＬＰＳ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ」，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  １１２−１３５頁、によって記載されるものが含まれる。
【００８２】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用の組織培養方法を用いてインビトロで、または哺乳動物被験体を用いてインビボで拡大され得る。例えば、プリスタン初回刺激マウスは、腹水生成のためにＰＢＳ中の対数期ハイブリドーマ細胞を、接種され得る。腹水液は、さらなる精製の前に、−７０℃で貯蔵され得る。
【００８３】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗体分子フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ分子）は、公知の技術を使用して生成され得る。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６；Ｅｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９；ならびにＨｕｓｔｏｎら、米国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒら、第４，９４６，７７８号。
【００８４】
あるいは、インビトロでモノクローナル抗体分子集団を拡大するために、ファージ表示系が使用され得る。Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓｃｈａｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１０７６；米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｙａｎｇら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５４：３９２；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ．  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ８：９４；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８。
【００８５】
一旦生成すると、ファージ表示ライブラリーは、公知の技術を使用して、Ｆａｂ分子の免疫学的結合親和性を改良するために使用され得る。例えば、Ｆｉｇｉｎｉら（１９９４）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３９：６８を参照のこと。
【００８６】
ファージ表示ライブラリーから選択されたＦａｂ分子の重鎖および軽鎖部分のコード配列は、単離または合成され得、そして発現のために任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類、および哺乳動物系を含む任意の適切な発現系が使用され得る。細菌における発現系は、Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７、欧州出願第ＥＰ  ３６，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２１−２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９に記載されるものを含む。
【００８７】
酵母における発現系は、以下に記載されるものを含む：
【００８８】
【数１】
0004295431.tif 000013
【００８９】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米国特許第４，７４５，０５１号、欧州出願ＥＰ１２７，８３９およびＥＰ１５５，４７６、Ｖｌａｋら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７７６、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：４０９、Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９、Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３およびＭａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ  ７：９９。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびに宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞は、以下に記載される：Ｌｕｃｋｏｗら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５，Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）ＧＥＮＥＲＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｓｅｔｌｏｗ、Ｊ．Ｋ．ら（編），第８巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２７７−２７９頁、およびＭａｅｄａら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５：５９２−５９４。
【００９０】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１、および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る：Ｈａｍら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号および米国再発行特許第ＲＥ３０，９８５号および国際公開ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５。
【００９１】
上記の本発明の抗ＭｅｎＢ抗体は、ＭｅｎＢからの独特のエピトープの分子模倣物を同定するために、多様な分子ライブラリーをスクリーニングするためのレセプターとして簡便に使用される。分子ライブラリーにおいて模倣物を同定するための方法は、一般に１つ以上の以下の手順の使用を含む：（１）固定化標的レセプターでのアフィニティー精製；（２）可溶性レセプターの繋留リガンドへの結合；および（３）溶解性化合物を、抗原競合アッセイにおいて直接的に試験する工程、または生物学的活性について試験する工程。分子模倣物についてスクリーニングされた分子には、小さな有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルライブラリー、核酸、核酸誘導体、糖類またはオリゴ糖、ペプトイド、溶解性ペプチド、固相上に繋留されたペプチド、細菌性ファージ表面タンパク質上に提示されるペプチド、細菌性表面タンパク質または抗体、および／または非ペプチド有機部分を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
例えば、多様な分子種のライブラリーは、コンビナトリアル有機合成を用いて作製され得る。例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：１３３５を参照のこと。例えば、ピロリジン、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３）；Ｎ−置換グリシンポリマーのようなペプトイド（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９３６７）；およびビニル性のポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４：６５６８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
当該分野で公知の種々のアプローチが、合成の間にビルディングブロックが加えられる際に、ビルディングブロックを探知するために使用され得、その結果個々のライブラリーメンバーの動作記録が測定され得る。これらのアプローチには、写真平板チップ上のアドレス可能な部位（オリゴカルバメート）、逆重畳積分ストラテジー（ここで、「ヒット」は、部分的な合成ライブラリー（ペプトイド、ペプチド）へのモノマーの再帰性付加を介して同定される）、およびヌクレオチド（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５：９８１２）または他の有機部分（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１０９２２）（「タグ」）の別々の合成によりコンビナトリアルライブラリーをコードすることが含まれる。次いで、各ライブラリーメンバーと結合したコード化タグは、模倣物が選択された後に解読（デコード）され得る。例えば、核酸タグは、ＤＮＡ配列決定により解読され得る。
【００９４】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、独特なＭｅｎＢエピトープの分子模倣物を同定するために特に有用である。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーであり（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９３６７）、そして新規の分子の化学的に多様なライブラリーを作製するために使用され得る。モノマーは、ｔ−ブチル−ベース側鎖および９−フルオレニル−メトキシ−カルボニルα−アミン保護を組み込み得る。ペプトイドオリゴマーへのモノマーの集合は、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４：１０６４６の「サブモノマー法」を用いて、固相上で行われ得る。この方法において、合成は、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂を用いて行われる（Ｒｉｎｋら（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２８：３７８７）。樹脂結合アミンは、ジイソプロピルカルボジイミドでのブロモ酢酸のインサイチュ活性化によってブロモアセチル化される。続いて、樹脂結合ブロモアセトアミドはアミンの付加により置換される。このアミンは、さらなる反応基のｔ−ブチルベース保護を組み込み得る。この２工程サイクルは、所望の数のモノマーが付加されるまで、繰り返される。次いで、オリゴペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸／５％水での処理により樹脂から遊離される。好ましくは、合成は、ロボットの合成機を用いて行われる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４０：４９８およびＺｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６７：４３７を参照のこと。代替において、ペプトイドモノマーのオリゴマー化は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスフェートまたはブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのいずれかにより、インサイチュ活性化によって行われ得る。この代替方法において、他の工程は、α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を用いる従来のペプチド合成と同一である（例えば、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）前出、を参照のこと）。
【００９５】
一旦ペプトイドライブラリーが作製されると、それらは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を、コンビナトリアルペプトイドの種々のプールとともに、ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体またはＭｅｎＢ細菌（単独または複合糖質としてのいずれか）でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに添加することによってスクリーニングされ得る。インキュベーション期間および非結合抗体を除去するための洗浄の後に、結合抗体の存在は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ５５３を参照のこと。結合抗体を含まないウェルは、その抗体に結合するペプトイド模倣物の存在を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定の詳細な正体は、モノマーユニットを部分的に合成されたライブラリーのメンバーに再帰的に添加することによって決定される。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、（１９９４）  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８。低分子のプールにおける活性化合物を同定するための他の方法は、逆相ＨＰＬＣまたはアフィニティー選択／質量分析によるプールの分画を含む（Ｎｅｄｖｅｄ  Ｍ．Ｌ．ら、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：４２２８）。
【００９６】
一旦、推定される分子模倣物が同定され、これらは、上記のように自己反応性を欠落しているかまたは最小限の自己反応性を有する機能的に活性（例えば、細菌性および／またはオポソニンの）である抗体を誘発するそれらの能力について試験される。これらの特性を有する分子模倣物は、さらなる使用（例えばワクチン組成物）において適している。
【００９７】
本発明の機能的に活性な抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された分子模倣物は、診断アッセイにおける使用のための抗体試薬を産生するために使用され得る。例えば、分子模倣物と反応性である抗体は、免疫診断技術（例えば、競合、直接反応、またはサンドイッチタイプのアッセイ）を用いて、生物学的サンプル中の細菌抗原を検出するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジンタイプアッセイ；ラジオイムノアッセイ；イムノ電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。この反応は、一般には標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射活性標識、酵素標識）または色素分子の暴露、または模倣物と抗体またはこの模倣物と反応する抗体との複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００９８】
上述のアッセイは、一般に、模倣物−抗体複合体が結合している固相支持体からの液相中の結合していない抗体の分離を含む。本発明の実施において使用され得る固相支持体は以下のものを含む、ニトロセルロースのような基材（例えば、メンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁力応答性ビーズなど。
【００９９】
代表的には、固体支持体は、適切な結合条件下で固相成分（例えば、１つ以上のＭｅｎＢ分子模倣物）と最初に反応し、その結果、この成分はこの支持体に十分に固定される。時々、支持体への模倣物の固定は、良好な結合特性を有するタンパク質へ、まずこの模倣物が結合されることにより増強され得る。適切な共役タンパク質は以下を含むがこれらに限定されない、ウシ血清アルブミンを含む（ＢＳＡ）を含む血清アルブミンのような高分子、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリイン、オボアルブミン、および当業者に周知である他のタンパク質。模倣物を支持体に結合させるために使用され得るたの分子は、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどを含む。これらの分子を抗原と共役させるこのような分子および方法は当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、Ｍ．Ａ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；およびＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ（１９８７）３０：１１７−１２４を参照のこと。
【０１００】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の固定された固相化合物が支持体から洗浄により除去され、次いでこの支持体結合成分を、適切な結合条件下でリガンド部分（例えば、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１抗体）を含むと思われる生物学的試料と接触させる。いくらかの結合していないリガンドを除去するための洗浄後、二次結合物部分を適切な結合条件下で添加し、ここで、この二次結合物は結合リガンドと選択的に結合し得る。次いで、この二次結合物の存在は、当該分野で周知の技術を使用して検出され得る。
【０１０１】
より詳細には、ＥＬＩＳＡ法が使用され得、ここで、マイクロタイタープレートのウェルは、本発明に従う模倣物でコートされる。次いで、抗ＭｅｎＢまたはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと思われる生物学的試料がコートされたウェルに添加される。抗体を固定された模倣物に結合させるために十分なインキュベーション時間の後に、このプレートは洗浄されて結合していない部分を除去し、そして検出可能に標識された二次抗体が添加される。この二次結合分子を任意の捕捉試料抗体と反応させ、このプレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【０１０２】
従って、１つの特定の実施態様において、生物学的試料由来の結合したＭｅｎＢ／Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１抗原リガンドは、抗体リガンドに対して指向される抗体を含む二次結合物を使用して容易に検出し得る。多くの数の抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が当該分野で公知であり、これらは検出可能な酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼ）に対して当業者に公知の方法を使用して容易に結合し得る。次いで、適切な酵素基質を使用して検出可能なシグナルを生成する。他の関連する実施態様では、競合型ＥＬＩＳＡ技術は、当業者に公知の方法を使用して実施され得る。
【０１０３】
アッセイはまた溶液中で行われ得、この結果、模倣物およびこれらの模倣物に特異的な抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。１つの特定の実施態様において、この模倣物は、固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に対して当該分野で公知の結合技術（例えば、化学的に直接の結合、または間接的な結合）を使用して付着され得る。次いで、この模倣物コート粒子を、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１に対する抗体を含むことが予測される生物学的試料と適切な結合条件下で接触させる。結合抗体間の架橋は沈降され得、そして洗浄および／または遠心分離を使用してこの試料から分離され得る粒子−模倣物−抗体複合体凝集体の形成を生じる。この反応混合物を、抗体−模倣物複合体の存在または非存在を決定するために多数の標準的な方法のいずれか（例えば、上記のそれらの免疫診断方法）を使用して分析し得る。
【０１０４】
なおさらなる実施態様では、免疫親和性マトリクスが提供され得、ここで、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１の抗体を含むことが予測される生物学的試料由来の抗体のポリクローナル集団が基材に固定される。これに関しては、試料の最初のアフィニティー精製は、固定された抗体を使用して実施され得る。従って、得られた試料調製物は、抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１部分のみを含み、そのアフィニティー支持体における潜在的な非特異的結合特性を避ける。高収量および抗原結合活性の良好な保持における多くの数の運動抑制免疫グロブリン（インタクトであるかまたは特異的フラグメントのいずれかである）は当該分野で公知である。任意の特定の方法により制限されないが、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧが免疫グロブリンを固定するために使用され得る。
【０１０５】
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリクスを提供するために固定されると、標識分子は、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の非特異的結合模倣物が免疫親和性支持体から洗浄された後、結合抗体の存在が、当該分野で公知の方法を使用する標識のためのアッセイにより決定され得る。
【０１０６】
本発明を使用するＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１感染を診断するために特に好ましい方法は、ストリップイムノブロットアッセイ（ＳＩＡ）技術（例えば、当業者に公知である、伝統的なウェスタンブロッティング技術とドットブロッティングを組み合わせる当業者に公知の方法（例えば、ＲＩＢＡ（商標）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）試験）の使用を含む。これらのアッセイにおいて、１つ以上の本発明に従う模倣物が、メンブレン支持体試験ストリップ上の個々の分離したバンドとして固定される。生物学的試料における抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１反応の可視化は，比色分析酵素基質とともに抗ヒトＩｇＧ酵素結合物を使用して達成される。内部コントロール（例えば、抗ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧもまた、このストリップ上に存在し得る。このアッセイは手動で実施され得るかまたは自動化フォーマットにおいて使用され得る。
【０１０７】
上記に記載のアッセイ試薬（本発明の模倣物またはそれらに対する抗体を含む）は、上記のイムノアッセイを行うための、適切な説明書および他に必要とされる試薬と共にキット中で提供され得る。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、適切な標識および他のパッケージ試薬および物質（すなわち、洗浄緩衝液など）を含む。上記のような標準的なイムノアッセイは、これらのキットを使用して実施され得る。
【０１０８】
さらに、分子模倣物組成物、分子模倣物を用いて同定された独特な（例えば、非自己反応性）ＭｅｎＢエピトープは、哺乳動物被験体におけるＭｅｎＢ疾患の診断および予防のために本明細書中で使用され得る。特に、分子模倣体のワクチン組成物は、ワクチン接種した被験者のＭｅｎＢ疾患の予防のために使用され得る。
【０１０９】
このワクチン組成物は、ＭｅｎＢの分子模倣物、または非自己免疫エピトープの１つ以上を含み得る。ワクチンはまた、他の抗原および免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン：（これらは、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むがこれらに限定されない））と共に投与され得る。
【０１１０】
このワクチンは、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１１１】
アジュバントもまた、ワクチンの有効性を増強するために用いられ得る。アジュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別々に（ワクチン投与と同時または直後のいずれかで）投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下述）または細菌細胞壁成分）を有するまたは有さない）：例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ  ９０／１４８３７号）：５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５を含む（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下述）を含むが、必要とされるわけではない）、微小流動機（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に処方された、（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下述）を含む、サブミクロンエマルジョンに微小流動されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成するようにボルテックスされるかのいずれかである、（ｃ）ＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）：２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群に由来、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含む；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）が用いられ得るか、またはそれから生成された粒子であり得る（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンは部位６３での野生型アミノ酸と置換される）ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンは部位７２での野生型アミノ酸と置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンは部位１０９の野生型アミノ酸と置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンは部位９の野生型アミノ酸と置換され、そしてグリシンが部位１２９で置換される）（例えば、国際公開ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）のような細菌のＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体、；ならびに（７）免疫刺激剤として作用して組成物の効果を増強する他の物質。
【０１１２】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
分子模倣物から形成されたワクチン組成物の有効性を増強するために、模倣物をキャリア分子に結合体化させることが必要であり得る。このようなキャリア分子は、それ自身、有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的には、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）、不活性ウイルス粒子、ＣＲＭ197（無毒変異ジフテリア毒素）など）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。模倣物結合体は、ＭｅｎＢ細菌細胞の表面に見られるものに密接に類似するエピトープを発現するそれらの能力について選択される。従って、適切な結合体は、細菌に対して機能活性を有する抗体の形成を惹起し、かつ本明細書中に記載の結合アッセイを用いて決定されるように宿主組織においてポリシアル酸と交差反応しないか、または最小限で交差反応性である。
【０１１４】
代表的には、ワクチン組成物は、注射用（液体溶液または懸濁液のいずれか）として調製される；注射前に液体ビヒクルに入れて溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、上述のように、アジュバント効果の増強のために、リポソーム中に乳化またはカプセル化され得るか、あるいは粒子に吸着され得る。
【０１１５】
このワクチンは、有効量のタンパク質の分子模倣物、および必要に応じて任意の他の上述の成分を含む。「有効量」とは、投与される個体において免疫応答を誘導し、かつ個体において自己免疫応答を刺激する危険性を最小限にとどめる分子の量を意味する。一般に、このような応答は、被験体において、このワクチンに対して分泌性、細胞性、および／または抗体媒介性免疫応答の発達を生じる。通常、このような応答は、以下の効果の１つ以上を含むがこれらに限定されない：免疫クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）のいずれかからの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増殖、および分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはγδＴ細胞集団の拡大。
【０１１６】
一旦処方されると、ワクチンは、非経口（例えば、注射により、皮下、または筋内のいずれか）に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる。投与処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【０１１７】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。本実施例は、例示の目的にのみ提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。
【０１１８】
用いた数字（例えば、量、温度など）に関して正確に記載するよう試みたが、幾分かの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【０１１９】
（実施例１）
（「サイズ化」複合糖質の調製）
例示のＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライド破傷風トキソイド結合体ワクチン（本明細書中、以後ＣＯＮＪ−２と称する）を以下のように調製した。ＭｅｎＢ  ＢポリサッカライドのＮ−アセチル基を、ポリサッカライドをＮａＢＨ4の存在下で２Ｍ  ＮａＯＨ中で６時間、１１０℃に加熱することにより除去した。脱アセチル化ポリサッカライドを飽和炭酸水素ナトリウム緩衝液中で十分に透析し、次いで過剰のプロピオン酸無水物と共に、室温で１２時間、撹拌した。溶液を水中で十分に透析し、Ｎ−プロピオニル化髄膜炎菌Ｂ（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ）ポリサッカライドを凍結乾燥により回収した。
【０１２０】
結合体ワクチンの調製のために、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ポリサッカライドを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中でｐＨ５．５で５０℃で２時間、部分的に加水分解した。得られたオリゴサッカライド混合物をＱ−セファロース上で分画した。２〜６の平均重合度（Ｄｐ）を有するオリゴサッカライドを、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてまず溶出し、そして廃棄した。中間サイズのオリゴサッカライドを５００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて溶出した。続いて、Ｍｏｎｏ  Ｑカラムを用いる分析用イオン交換クロマトグラフィーにより、中間サイズのオリゴサッカライドがＤｐ  １３〜２０の大きさの範囲であることを決定した（平均＝Ｄｐ  １３）。
【０１２１】
末端アルデヒド基を、暗所において室温で１５〜３０分間、これらを１００ｍＭ  過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、中間サイズのオリゴサッカライドの非還元末端で生成した。過剰のエチレングリコールを用いて酸化反応を停止させ、そしてその生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上で脱塩した。オリゴサッカライド−タンパク質結合体を、４０ｍｇ／ｍｌのシアノホウ素化水素ナトリウムを有する０．７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ９．０）中で末端アルデヒド含有ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  オリゴサッカライドと破傷風トキソイドとの混合物（それぞれモル比２００：１）を、４０℃で１日および室温で２日撹拌することにより調製した。得られたＮＰｒ−ＭｅｎＢ  オリゴサッカライド−破傷風トキソイド結合体（ＣＯＮＪ−２）を、溶出緩衝液として５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００におけるゲル濾過クロマトグラフィーにより最終的に精製した。結合体ワクチンのシアル酸組成およびタンパク質組成をそれぞれ、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍレゾルシノール反応（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，  Ｌ．  （１９５７）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ２４：６０４）およびＬｏｗｒｙアッセイにより測定した。重量基準で、ＣＯＮＪ−２結合体の最終的な糖対タンパク質比は、０．１０〜０．２５の範囲であった。
【０１２２】
（実施例２）
（複合糖質の特徴付け）
ＣＯＮＪ−２複合糖質を以下のように特徴付けた。共有結合性（例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳとタンパク質キャリアとの間の共有結合を確立する）を示すために、以下を含む多くの物理化学的技術を使用し得る：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ウェスタンブロット；Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００ゲル濾過；など。本研究の目的のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、キャリアタンパク質バンド自体と比較した場合、結合体バンドについてより高い分子量へのシフトを示すことによって、ＮＰＲ−ＭｅｎＢ  ＯＳ／ＴＴ  ＣＯＮＪ−２複合糖質の共有結合を確立した。ＣＯＮＪ−２複合糖質のウェスタンブロット分析は、ＴＴおよびＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳについてのポジティブ免疫反応性シグナルの、特異的な抗ＴＴおよび抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ抗血清との一致によって共有結合性を示した。
【０１２３】
立体因子に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質の調製における大きな分子量のポリサッカライドの代わりのオリゴサッカライドの使用は、タンパク質キャリア分子上へのサッカライド抗原のより高いカップリング効率を可能にする。これらのＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライドに基づく複合体の最終的なサッカライド対タンパク質比は、タンパク質キャリア１個当たり共有結合する約３〜５のＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライド鎖に対応する、約０．１０〜０．２５に及ぶ。毎重量に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質は、以前に報告されたＮＰｒ−ＭｅｎＢポリサッカライドに基づく結合体（米国特許第４，７２７，１３６号）（ここで、ＣＯＮＪ−２は平均して約７．５〜１８．８倍多いサッカライドを含む）より高いサッカライドローディングを有するようである（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳの分子量として１０，０００ダルトンを用いる）。
【０１２４】
さらに、十分に規定された中間体の鎖長（例えば、平均１０〜２０  Ｄｐ）の実質的に均一なサイズのサッカライド部分を有するＣＯＮＪ−２複合糖質を構築することは、より一貫した免疫学的挙動を呈する複合糖質を生じることが予期される。さらに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製ＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライドの選択的末端活性化（例えば、非還元性末端でのアルデヒド基の選択的導入）は、両方の末端で誘導される「活性な」アルデヒド基を有するＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ分子の使用から生じ得る架橋不均一構造の可能性を回避する。この点において、両末端活性化ＰＳ（両方の末端にアルデヒド基を有する）は、Ｎ−脱アセチル化手順の間に、予めＮａＢＨ4に曝露されたＮ−アセチル化ＭｅｎＢ  ＰＳの過ヨウ素酸酸化から誘導され得るようである。
【０１２５】
（実施例３）
（モノクローナル抗体の調製）
４〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳ／ＴＴ  （ＣＯＮＪ−２）複合糖質抗原および（最後の追加免疫注射を除いて）ＦＣＡを含む組成物を用いて、腹腔内注射によってワクチン接種した。ワクチン接種を、１ヶ月間隔で合計２または３投薬量で投与した（追加免疫を含む）。融合の３日前、初回刺激した動物を、アジュバントの非存在下でＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳ／ＴＴ  （ＣＯＮＪ−２）複合糖質抗原で追加免疫した。各用量の最終容量は０．１ｍｌであり、これは２．５μｇのシアル酸を含んだ。追加免疫注射後、動物を脾臓摘出し、そして脾臓細胞をミエローマ細胞との融合用に調製した。
【０１２６】
融合の約１週間前、非分泌マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ受託番号第ＡＴＣＣ−１５８０−ＣＲＬ号から入手可能）を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液およびＬ−グルタミンを有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ０４１−０２４００）で拡大した。細胞培養物を、細胞増殖、細胞数をモニターするため、およびコンタミネーションをスクリーニングするために定期的に評価した。
【０１２７】
融合の１日目、脾臓細胞、およびパートナーのＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞（Ａｇ８細胞）を洗浄し、収集し、そして５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）の比で混合した。細胞融合を、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で３７℃にて実施した。生じた細胞ペレットを収集し、そして９６ウェル平底細胞培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ  ３５９６）中に置き、そして適切な条件下で（例えば、５％ＣＯ2中３７℃にて）インキュベートした。インキュベーションの１日後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）を含む選択培地を、各ウェルに添加した。
【０１２８】
増殖し、そして約１０〜２５％のコンフルエンスを示す細胞を含むウェルからのハイブリドーマを、ＨＡＴ選択培地中でのインキュベーションの約２週間後にスクリーニングのために選択した。選択したハイブリドーマ上清を、固相アビジン−ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳに基づくＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。上清における抗体結合の特異性を、インヒビターとして可溶性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳを用いて決定した。ネガティブコントロールは、ＲＰＭＩ培地、Ａｇ８ミエローマ上清、および無関連のモノクローナル抗体調製物を含んだ。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳ／ＴＴ  （ＣＯＮＪ−２）複合糖質で免疫したマウス由来のプールしたポリクローナル血清を、ポジティブコントロールとして使用した。上清との一晩のインキュベーション後、反応ウェルを洗浄し、そして結合した免疫グロブリンを、アルカリホスファターゼ標識多価抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）を用いて検出した。
【０１２９】
候補ハイブリドーマを、上記のＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳについてのそれらの示された結合親和性に基づいて同定した。高度に反応性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを、限界希釈によってクローニングした。詳細には、候補ハイブリドーマ細胞株を、２０μｌのクローニング／拡大培地（ＩＬ６を有する完全  ＲＰＭＩ−１６４０）中に、Ｔｅｒａｓａｋｉプレート（ＮＵＮＣ）中０．３、１．０、および３．０細胞／ウェルでプレートした。２週間後、培養物を増殖について視覚的に検査した。頻度分析を、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓら（１９８４）  Ｉｍｍｕｎ．  Ｔｏｄａｙ  ５  （９）：  ２６５によって記載される最小二乗法を用いて実施した。マスターウェル中の反応性上清を同定するために使用されるＥＬＩＳＡアッセイを繰り返し、７および１４日目の抗体活性を評価した。次いで、選択したクローンを、組織培養および腹水生成におけるその後の使用のために拡大および凍結した。このようにして、３９のハイブリドーマのパネルを生成し、そしてそれから得た分泌したモノクローナル抗体分子（「ＳＥＡＭモノクローナル抗体」、詳細にはモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−１〜ＳＥＡＭ−２４、ＳＥＡＭ−２６、ＳＥＡＭ−２８〜ＳＥＡＭ−３１、ＳＥＡＭ−３３〜ＳＥＡＭ−３６、ＳＥＡＭ−３８〜ＳＥＡＭ−４２、およびＳＥＡＭ−４８と命名した）を、さらなる評価のために調製した。
【０１３０】
より詳細には、選択したモノクローナル抗体を、組織培養においてか、または腹水液においてのいずれかで、Ｐｒｉｓｔａｎｅで初回刺激した７〜８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて生成した。各動物被験体を、ハイブリドーマ細胞での接種の１週間前に、０．５ｍｌのＰｒｉｓｔａｎｅでの腹腔内注射によって初回刺激した。接種前、ハイブリドーマ細胞濃度を、滅菌したＰＢＳを用いて、２．５×１０6〜３×１０6細胞／ｍｌに調整した。初回刺激した動物に、１ｍｌのハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した。ここで、各クローン細胞株を３匹の異なるマウス中に接種した。接種の１〜２週間後、腹水液の回収を開始し、約１週間継続した。回収した液体を、２７００ｒｐｍ（１５００×ｇ）にて室温で１０分間遠心分離した。上清を収集し、そしてペレットを廃棄した。単離した腹水液を、回収の過程にわたって４℃にて貯蔵し、そして異なる日に回収した液体をプールし、一定分量に分け、そして−７０℃にて凍結した。
【０１３１】
（実施例４）
（モノクローナル抗体の特徴付け）
精製していないモノクローナル抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイおよび放射状免疫拡散アッセイを用いて決定した。詳細には、捕捉ＥＬＩＳＡ手順を用いて、各抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳモノクローナル抗体の濃度を決定した。１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において１μｇ／ｍｌに希釈した１００μＬ／ウェルのアフィニティー精製ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ（ＨおよびＬ、Ｚｙｍｅｄ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から入手可能）を、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄後、２５０μＬのブロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で満たし、そして室温にて３０〜６０分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。そのプレートを、洗浄緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。試験するべき抗体を、希釈緩衝液（１％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）に希釈し、次いで各ウェル当たり１００μｌで添加した。プレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ免疫グロブリン標準（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手可能）を、５００ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度で使用して、抗体濃度を定量するための標準曲線を構築した。
【０１３２】
一晩のインキュベーション後、ウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、そして希釈緩衝液において１：２０００希釈した１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡポリクローナル抗体（ＨおよびＬ、Ｚｙｍｅｄ）とともに、４℃で３時間インキュベートした。次いで、プレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液  （１．０Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。約３０分後に４０５ｎｍでの吸光度値を測定した。モノクローナル抗体調製物の免疫グロブリン濃度を、標準曲線から算出した。
【０１３３】
放射状免疫拡散アッセイを以下のように実施した。放射状免疫拡散プレートおよび試薬を、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。次いで、アッセイプロトコルは、ＲＩＤキットとともに供給された製造業者の具体的な説明書に基づいた。簡単には、キットに供給されたキャリブレーター抗体を、適切な量の蒸留水を用いて再構成した。１：２および１：１０希釈のキャリブレーター抗体を調製した。必要ならば、試験サンプルを１％  ＢＳＡに希釈し得る。キャリブレーター抗体（適切な、１：２および１：１０希釈）について１０μｌのアリコート（ＩｇＡおよびＩｇＧ２ａサブクラス抗体について２０μｌ）および試験サンプルを、プレート上の分離したウェルに適用し、そして室温にて１２０時間インキュベートした。抗体の濃度を、沈殿物の環の直径を測定し、そしてこれらの値をＲＩＤキットに含まれる参考の表と比較することによって決定した。
【０１３４】
次いで、組織培養物または腹水液由来のモノクローナル抗体を、以下のように部分的に精製した。モノクローナルを含む組織培養上清または腹水（２００ｍｌまたは指示された容量）を、溶液を穏やかに撹拌しながら、等量の冷１００％飽和硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）にゆっくりと添加した。このモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を、４℃で一晩インキュベートした。翌朝に、混合物を、均質化のために穏やかに撹拌し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃にて３０分間遠心分離した。上清をデカントした後、等容量の５０％硫酸アンモニウム溶液（すなわち、１００％飽和硫酸アンモニウムと同じ容量）を使用して、ペレットを洗浄し、そして再懸濁した。得られた混合物を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃にて３０分間遠心分離した。次いで、上清をデカントし、そして排出した。
【０１３５】
腹水について、ペレットをＰＢＳ  緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）において、０．３〜０．５容量の開始容量に再構成した。組織培養上清について、このペレットを、ＰＢＳ  緩衝液の０．１容量の開始容量に再構成した。再構成したモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を透析チューブ（分子量カットオフ１０，０００〜１２，０００）に入れ、そして４ＬのＰＢＳ中で一晩透析させた。ＰＢＳ溶液を、後の２日間にわたって３〜４回交換した。透析チューブからのモノクローナル抗体分子をシリンジ中に移し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌し、次いで−２０℃にて貯蔵した。
【０１３６】
次いで、部分精製したモノクローナル抗体調製物を（ａ）免疫グロブリンアイソタイプ、（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの濃度依存性結合、（ｃ）種々のＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴマーの、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの結合を阻害する能力、（ｄ）天然のＭｅｎＢ  ＰＳとの交差反応性、（ｅ）ＭｅｎＢの病原性株との交差反応性、（ｆ）補体媒介性殺菌活性、（ｇ）オプソニン活性、および（ｈ）細胞表面にて長鎖α２−８連結ポリシアル酸を発現する神経芽細胞腫細胞株への結合によって示されるような自己反応性について特徴付けした。これらの実験において、モノクローナル抗体の濃度を、捕捉ＥＬＩＳＡおよび上記のＲＩＤアッセイによって測定した。
【０１３７】
（ａ）抗体のアイソタイプ分類：
モノクローナル抗体（重鎖および軽鎖）のアイソタイプを、二次アルカリホスファターゼ結合抗体がＩｇＧサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ならびにκ軽鎖およびλ軽鎖に特異的であるという唯一の差異を有する、上記の抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ  ＥＬＩＳＡについてのプロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡによって決定した。また、キットを使用して、この抗体分子をアイソタイプ分類した。このキットは、異なる型の免疫グロブリンペプチド鎖について特異的なヤギ抗体でコートした分類固着基質からなった。キットは、その基質に対するヤギ抗体に結合するマウスモノクローナル抗体を検出するための、抗マウス免疫グロブリンに特異的なペルオキシダーゼ標識種を提供する。
【０１３８】
以下で表１に記載するように、３９のモノクローナル抗体中のアイソタイプの分布が、１つのＩｇＭ、および３８のＩｇＧ（８つのＩｇＧ１、５つのＩｇＧ２ａ、１６のＩｇＧ２ｂ、および９つのＩｇＧ３）からなることを見出した。さらに、すべての抗体分子は、κ軽鎖を有した。
【０１３９】
【表１】
0004295431.tif 000014
【０１４０】
【表２】
0004295431.tif 000015
【０１４１】
【表３】
0004295431.tif 000016
【０１４２】
（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの濃度依存性結合：
固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、緩衝液のみまたは２５μｇ／ｍｌの可溶性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳインヒビターの存在下での抗体分子のＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの濃度依存的結合を評価した。ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ−ＡＤＨを、Ｓｕｔｔｏｎら（１９８５）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８２：２１５の方法を用いて調製した。１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中の１００μｌ／ウェルのアビジン（４μｇ／ｍｌ  Ｅｘｔｒ  Ａｖｉｄｉｎ，  Ｓｉｇｍａ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．より入手可能）を、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄後、ＰＢＳ中の１００μｌのビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、そしてこのウェルを２５０μｌのブロッキング緩衝液で満たし、そして室温で３０〜６０分間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。
【０１４３】
ブロッキング後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。モノクローナルの種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液、または１ｍｌあたり５０μｇの可溶性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳを含む（２５μｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかで含む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸，  Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの吸光値を約３０分後に測定した。
【０１４４】
表１は、３９のＳＥＡＭモノクローナル抗体の各々に対ついてＥＬＩＳＡにおいて０．５のＯＤをもたらすに必要な抗体のそれぞれの濃度範囲を要約する。示される値における大きな不均一性に対する最も可能性の高い説明は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの抗体の結合活性の相違である。
【０１４５】
（ｃ）オリゴマーによるＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの抗体結合の阻害：
競合固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳに対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するためのＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴマーインヒビターの能力を評価した。アッセイを、モノクローナル抗体を、０．５〜１のＯＤをもたらす濃度まで予め希釈したことを除いては、抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ  ＥＬＩＳＡについて上記のように実施した。モノクローナル抗体を、複製プレートのウェル（各々は、２５μｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度をもたらす以下の可溶性インヒビターの１つを含む：高分子量（ＨＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ；または低分子量（ＬＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳ（３．８の平均Ｄｐを有する））へ添加した。
【０１４６】
このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸，  Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの吸光値を約３０分後に測定した。阻害パーセントを、インヒビターの非存在下での結合と比較して計算した。
【０１４７】
ＨＭＷ  ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳインヒビターは、試験された全てのモノクローナル抗体において、約７５％〜９５％の阻害を与えた。モノクローナル抗体における微細な抗原特異性の差異は、試験されたＬＭＷインヒビターとの異なるそれぞれの阻害パターンから明白である。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへのＳＥＡＭ−３およびＳＥＡＭ−１８の結合は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳの可溶性ＬＭＷインヒビターによって完全に阻害される。対照的に、ＳＥＡＭ−２およびＳＥＡＭ−１６は、オリゴマーによって顕著には阻害されない（２０％未満）。全てのモノクローナル抗体についてのＬＭＷ  ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＯＳ阻害の結果を表１に示す。さらに、以下に記載のように、モノクローナルの微細な抗原特異性における他の差異は、ＥＬＩＳＡにおけるＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの交差反応性において観察された差異、および宿主のポリシアル酸への結合における差異によって明白である。
【０１４８】
（ｄ）ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳとの交差反応性：
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ形式において、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳの直接的結合によって示されたように、ＮＡｃ−ＭｅｎＢポリサッカライドへとの交差反応するそれらの能力について評価した。使用された方法は、固相抗原としてビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳの代わりに、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳ−ＡＤＨを使用したこと以外は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ  ＥＬＩＳＡについての上記の方法と類似した。
【０１４９】
モノクローナルの種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液、または１ｍｌあたり５０μｇの可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳを含む（２５μｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかを含む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて、４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸，  Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの吸光値を、約３０分後に測定した。
【０１５０】
４６のモノクローナル抗体のそれぞれのＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳとの交差反応性を、高い交差反応性（＋＋＋）から交差反応性でない（０）範囲にわたって得点づけした。この結果を表１に示す。見られ得るように、１６のモノクローナル抗体が、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳと交差反応し、そして４つが最小で交差反応した（±）。これらの２０のポジティブまたは弱いポジティブなモノクローナル調製物の交差反応性の特異性を、可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳを用いた結合の阻害によって確認した。２６の非交差反応性モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍｌまでの抗体濃度で試験した場合、固相ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの顕著な結合は示さなかった。
【０１５１】
（ｅ）細菌結合アッセイ：
抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体の、病原性細胞株Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群の表面に結合する能力を、間接的免疫蛍光アッセイのフローサイトメトリー検出を用いて決定した。２つの完全に莢膜された髄膜炎菌Ｂ試験生物（８０４７株（殺菌活性の測定のために使用した株、以下を参照のこと）およびＮｍＢ株）を使用した。ＮｍＢのトランスポゾン含有変異体である第３の非莢膜化株、Ｍ７（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら  （１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．  ５９：４０９７−４１０２）を、莢膜ポリサッカライドへの抗体結合の特異性についてのネガティブコントロールとして使用した。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地および０．２５％グルコース中において対数増殖中期へ増殖された細菌細胞を回収し、そして１ｍｌあたり約１０8細胞の密度でブロッキング緩衝液において再懸濁した。次いで、モノクローナル抗体（１０または１００μｇ／ｍｌの濃度）を添加し、そして氷上で２時間細胞へ結合させた。ブロッキング緩衝液での２回の洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）とインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中の０．２５％ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１５２】
ポジティブコントロール抗体は、髄膜炎菌特異的血清型決定およびサブタイプ決定モノクローナル抗体（ＭＮ２Ｃ３Ｂ、ＭＮ１６Ｃ１３Ｆ４、ＲＩＶＭ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含んだ。ネガティブコントロールは、関連しない特異性を有するマウスＩｇＧモノクローナル抗体からなった。
【０１５３】
表１に要約されるように、２４の抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験した場合、細菌結合の証拠を示した。２つのさらなる抗体は、莢膜化株および非莢膜化変異株の両方に最小の結合の証拠を示した。これらの抗体の細菌結合を、不定（ｉ）として得点づけした。
【０１５４】
（ｆ）補体媒介性殺菌活性：
殺菌アッセイを、Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃ．  Ｄｉｓ．  １７２：１２７９に記載される方法を使用して、以下の改変を用いて行った：生物を０．２５％グルコース；およびバルビトール緩衝液の代わりにＧｅｙ緩衝液からなる血清希釈緩衝液を含有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で増殖させた。いくつかの実験では、補体の異なる供給源を使用した：これらは２つの異なるウサギの乳仔の血清プール（Ｒａｂ  Ｃ  ＩおよびＲａｂ  Ｃ  ＩＩと呼ばれる）ならびにヒト無ガンマグロブリン血症血清（Ｈｕ  Ｃと呼ばれる）を含んだ。
【０１５５】
補体媒介性細菌溶解を活性化する各モノクローナル抗体の能力を、表１に報告する。ＥＬＩＳＡによるＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳと交差反応性である殺菌性抗体の例（例えば、ＳＥＡＭ−１８、ＳＥＡＭ−３０、およびＳＥＡＭ−３５）がある。ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳとの交差反応性を示さない殺菌性抗体の例（例えば、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、およびＳＥＡＭ−８）もまたある。
【０１５６】
（ｇ）オプソニン活性：
モノクローナル抗体のオプソニン活性を、種々の確立された方法によって測定し得る。Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．，  Ｓｅｃ．  Ｃ  ９５：２８３，  Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２１：２６７，  Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ  ９９：７６９，  Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ  Ａｎｎａｌｓ  １４：１５７，  Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ  １００：４４９，  Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６０：２７７７、Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃ．  Ｄｉｓ．  １６７：１３１４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６３：１６０、およびＨａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７１：１４８１。
【０１５７】
１つのオプソニン作用アッセイにおいて、ＧＮ寒天プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｅｋ，  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢＶ，  Ａｌｐｈｅｎ  ａ／ｄ  Ｒｉｊｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で３７℃で新たに増殖させたＮ．  ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓを使用して、０．１の初期ＯＤを得るように８ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地  （Ｄｉｆｃｏ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）に接種した。細菌を、激しく振盪しながら対数期（０．７５〜０．８５の６６０ｎｍでの吸光度）まで増殖させた。細胞を、蓋付きの滅菌のプラスチックチューブに移し、そして１０分間３５００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１５８】
細胞を、４ｍｌの７０％エタノールを添加し、そして４℃で少なくとも１時間インキュベートすることによって固定した。固定した細胞を、３５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって再度ペレット化し、そして滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１．０のＯＤになるように再懸濁した。細胞懸濁物（１．３５ｍｌ）をエッペンドルフチューブに添加し、そして５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、そして別の１．３５ｍｌを同じチューブに添加し、続いて遠心分離して１チューブあたり１×１０9細胞を得た。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の１．０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そして５分間超音波処理し、次いで５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＦＩＴＣ−ＰＢＳ溶液（５０μｌ）を各チューブの細菌に添加し、次いで軽度に攪拌しながら３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ（９５０μｌ）を各チューブに添加し、そして２分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１ｍｌのＰＢＳで１回、そして１ｍｌのＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ）で１回洗浄した。ＦＩＴＣ標識した髄膜炎菌を１％のＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で再構成し、そして１００μｌのアリコートに分けた。これを、アッセイでの使用まで−２０℃で保存した。
【０１５９】
ヒト多型性核細胞（ＰＭＮ）をヘパリン含有チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）中の健常な成体の末梢血から単離した。１０ｍｌの容量の血液を、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；  ｐＨ  ７．４）で希釈し、そして１２ｍｌのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度１．１１９、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の上部に１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ  ＰａｑｕｅTM  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｉｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）からなるＦｉｃｏｌｌ  ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配に載せた。室温で４００×ｇで２０分間の遠心分離後、ＰＭＮをｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの上部から回収し、そして１％のゼラチンを含有する氷冷ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＮＹ）を添加した。細胞を２５０×ｇで遠心分離し、そして残りの赤血球を９ｍｌの氷冷した蒸留水中に細胞を再懸濁することによって溶解させた。１分後、濃縮したＰＢＳおよびＲＰＭＩ−ゼラチンを添加して細胞懸濁物を等張化した。ＰＭＮを遠心分離し、そしてＲＰＭＩ培地に１×１０7／ｍｌの密度に再懸濁した。ＰＭＮの純度および生存性は９５％以上であった。
【０１６０】
マイクロタイタープレートに、試験されるべきモノクローナル抗体の適切な希釈物（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で希釈した）、５μｌの１０％ヒト補体（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ中）、および２５μｌのＦＩＴＣ標識した細菌懸濁物を添加して、５０μｌの全容量にした。選択した抗体を、補体を含まずに、そして３つまでの異なる補体供給源：正常なプールしたヒト血清；無ガンマグロブリン血症血清；およびウサギ乳仔血清を用いて、１〜１０％までで補体濃度を変化させて試験した。各アッセイはポジティブおよびネガティブ抗体コントロール、ならびに補体、非オプソニン作用、および細胞のみのコントロールを含んだ。オプソニン作用反応を、３０分間３７℃にて振盪機上で進行させ、その後、氷上にマイクロタイタープレートに置くことによって反応を停止した。
【０１６１】
食細胞懸濁物（５０μｌ）を５×１０6細胞／ｍｌの最終濃度で添加した。これによって１０：１の細菌：食細胞の比が得られる。食細胞活動を、振盪機上で３７℃で３０分間進行させ、その後、それを氷上に置いた。冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ（１００μｌ）を各ウェルに添加した。プレートを１０分間１１００ｒｐｍで遠心分離した。上清をウェルから吸引し、そして細胞をさらに２回１５０μｌの冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳで洗浄した。次いで、冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ（１５０μｌ）を添加し、そして得られた細胞懸濁物を滅菌チューブに移した。２％のパラホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）を含有するＰＢＳの溶液を添加して細胞を固定した。次いでサンプルを、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６２】
１６の代表的なＳＥＡＭモノクローナル抗体についてのオプソニン作用実験の結果を、表１に報告する。オプソニンであることが見出されている全ての抗体はまた、この補体供給源の少なくとも１つを使用する上記のアッセイにおいて殺菌性であった。しかし、表１に見られ得るように、殺菌性であるがオプソニン性ではない抗体の例（例えば、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、ＳＥＡＭ−１６、およびＳＥＡＭ−４１を参照のこと）がある。
【０１６３】
（ｈ）自己反応性の評価：
３９  ＳＥＡＭモノクローナル抗体を含有する部分精製された組織培養上清を、宿主のポリシアル酸に対する自己反応性について評価した。１つのアッセイにおいて、モノクローナル抗体を、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＣＨＰ−１３４（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、（１９８８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：９４４３）と交差反応するその能力について、間接的免疫蛍光のフローサイトメトリー検出を用いて評価した。このアッセイにおいて、その表面の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）に結合した長鎖ポリシアル酸（ＰＳＡ）を発現するＣＨＰ−１３４細胞は、ヒトＰＳＡ抗原についての細胞性マーカーとして作用する。コントロール実験において、ほぼコンフルエントな細胞培養物を５０ｍｌの遠心管に回収し、そして１０００×ｇで遠心分離した。上清をデカントした後、５ｍｌのブロッキング緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。次いで、細胞を血球計で計数し、そして２つの等しいアリコートに分けた。１方のアリコートを、エキソノイラミニダーゼ（１０ユニット／１０8細胞、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）とともに室温で２時間インキュベートした；他方のアリコートを、同様に、しかし酵素なしで処理した。インキュベーションの後、各アリコートからの細胞を、個々の反応管間で、各管が１０6個の細胞を含むよう分配した。細胞を洗浄するために、２ｍｌのブロッキング緩衝液を各反応管に添加し、その管をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、１０００ｒｐｍで、６分間遠心分離し、そして上清を吸引除去した。洗浄した細胞を、総容量２００μｌで、抗体を含まずに、または示された濃度（通常１０または１００μｇ／ｍｌ）の試験抗体（すなわち、ＳＥＡＭ  ＭＡｂ）とともにのいずれかで、氷上で２時間インキュベートした。
【０１６４】
アッセイにおけるコントロール抗体は、以下を含んでいた：（１）関連しない特異性のＩｇＧモノクローナル抗体（ネガティブコントロールとしての、ＶＩＩＧ１０）；（２）ＩｇＭ抗ポリシアル酸モノクローナル抗体（ポジティブコントロールとしての、２−１Ｂ）；および（３）ＮＣＡＭのタンパク質骨格に特異的な抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）。ブロッキング緩衝液（２ｍｌ）を各反応管に添加し、そして管をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、１０００ｒｐｍで、６分間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を吸引除去し、そして細胞を室温で１時間、１５０μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合体化Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４μｇ／ｍｌに希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）とともにインキュベートした。ブロッキング緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中の４００μｌの０．２５％ホルムアミドを細胞に添加し、そして細胞をＦＡＣＳＣＡＮTM細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６５】
全ての抗体を、複製において最終濃度１０および１００μｇ／ｍｌの抗体で、未処理細胞、およびノイラミニダーゼで前処理した細胞を使用して試験した。この処理によって、表面ポリシアル酸が切断され、そしてポリシアル酸への抗体結合の特異性についてのアッセイにおけるコントロールを提供する。代表的な実験において、一次抗体なしで、または関連しない抗原特異性を有するコントロールモノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は、非常に小さい蛍光を示す（約９８％の細胞が＜１０ユニットの蛍光を有する）。対照的に、抗ＮＡｃ  ＭｅｎＢ  ＰＳモノクローナル抗体である２−１Ｂで処理された実質的に全ての細胞が、強く蛍光を発する。この蛍光は、抗体がノイラミニダーゼで前処理された細胞とともにインキュベートされる場合、コントロールレベルまで減少する。同様に、抗ＣＤ５６で処理した細胞は、強く蛍光を発する。この抗体を用いて、蛍光は、細胞をノイラミニダーゼで前処理することによって影響を受けない。なぜなら、ＣＤ５６決定基は、ＮＣＡＭのタンパク質骨格に位置し、そしてノイラミニダーゼによるポリシアル酸の除去によって影響を受けないからである。
【０１６６】
ＳＥＡＭ−５抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験される場合、検出可能な結合を与えず、このアッセイではネガティブであると考えられる。ＳＥＡＭ−３５抗体は、１０または１００μｇ／ｍｌで試験した場合、強力なポリシアル酸特異的結合を示し、ポジティブであると考えられる。少数個の抗ＮＰｒ  ＭｅｎＢ  ＰＳモノクローナル抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験された場合、結合を示すが、１０μｇ／ｍｌで試験された場合、ネガティブであるようである（例えば、ＳＥＡＭ−１２）。このような抗体は、本出願の目的で、最小限に自己反応性であると考えられる。稀少抗体は、細胞のノイラミニダーゼによる前処理によって影響を受けなかった神経芽細胞株との弱い反応性を有するようであった（例えば、ＳＥＡＭ−７）。このような抗体のポリシアル酸との自己反応性は、アッセイにおいて不定として得点され、そしてこれらの抗体もまた、本出願の目的で、宿主ＰＳＡに対して最小の自己反応性を有すると考えられる。
【０１６７】
表１は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて決定した場合の、各抗体の自己抗体活性を要約する。ＣＨＰ−１３４細胞において発現したポリシアル酸抗原との交差反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体のＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳとの交差反応性と密接に相関した。表１に示すように、ＥＬＩＳＡにおいてＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳと交差反応しなかったモノクローナル抗体は、ＣＨＰ−１３４細胞にも結合しなかったが、ＥＬＩＳＡにおいてＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳと交差反応した抗体の全てが、ＰＳＡともまた交差反応した。２つのアッセイ間のこの相関は、予想されなかった。なぜなら、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ  ＰＳおよび宿主ＰＳＡのポリサッカライド共有結合構造は、同一であると報告されているからである。
【０１６８】
（実施例５  ＳＥＡＭモノクローナル抗体を用いたＭｅｎＢ抗原の分子模倣物の同定）
以下の手順を、本発明のＳＥＡＭモノクローナル抗体と相互作用する分子模倣物を同定するために実施した。コンビナトリアル合成分子を、上記のＺｕｃｋｅｒｍａｎらの手順に従って合成した（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７：４３７およびＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１４：１０６４６を参照のこと）。分子模倣物を、逆相ＨＰＬＣによってプールを分画することにより同定した。このプール（約２００μｌまたはＤＭＳＯ中１０μＭ／分子溶液）を、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８逆相カラム（Ｖａｒｉａｎ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に注入し、そして０．１％トリフルオロ酢酸中０％〜８０％（ｖ／ｖ）にアセトニトリルの６０分間にわたる直線勾配を用いて溶出した。この画分を凍結乾燥し、そして４０μｌのＤＭＳＯまたはアセトニトリル／水（１：１）に再懸濁した。次いで、各画分のアリコート（５μｌ）を、ＥＬＩＳＡにおいて特定のＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮｐｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳの結合を阻害することによって試験した。次いで、阻害活性を有する画分中の分子を、ＬＣ／ＭＳ（ＨＰ１１００  ＬＣ／ＭＳＤ，  Ｈｅｗｌｗｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって同定した。
【０１６９】
上記の標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３０分でＯＤ405を与えるのに必要な濃度とほぼ等しい濃度までＰＢＳ中に希釈したＳＥＡＭモノクローナル抗体（１００μｌ）を、Ｎｐｒ−Ｍｅｎ  ＰＳ被膜したプレートのウェルに添加した。ＤＭＳＯ中のコンビナトリアル合成分子の溶液（１〜２μｌ）を、モノクローナル抗体溶液に添加し（プール中１分子あたり１μＭの最終濃度）、そして４℃にて一晩インキュベートした。コントロールを、（１）抗体のみ、（２）緩衝液のみ、ならびに（３）抗体および緩衝液とともに、各々１〜２μｌのＤＭＳＯとインキュベートした。このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、そして以前に記載したように発色させた。プールを、ＳＥＡＭモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−３、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−１２、ＳＥＡＭ−１６、ＳＥＡＭ−１８、およびＳＥＡＭ−２８を用いてスクリーニングし、そしてＤＭＳＯを用いて抗体と比較した阻害が、インヒビターの非存在下で観察された結合の８０％以上である場合、ポジティブであると判断した。
【０１７０】
上記の構造１の分子模倣物を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて特定のＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの結合を阻害するとして同定した。ＩＣ50値（ＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの結合を５０％阻害するのに十分な個々の化合物の推定濃度）を、上記のＥＬＩＳＡにおけるプールの連続希釈によって決定した。本発明の分子模倣物のＩＣ50濃度は、このプール中で単一の活性分子と仮定して、約３ｎＭ〜７００ｎＭの範囲である。
【０１７１】
（実施例６）
（分子模倣物ワクチン組成物の調製）
上記の模倣物に対応する低分子を含有するワクチン組成物を、その模倣物とキャリアタンパク質との、非共有結合、または共有結合によって調製する。疎水基または反応性基を模倣物に付加して、この模倣物のＥＬＩＳＡにおいてＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳに対するＳＥＡＭモノクローナル抗体の結合を阻害する能力を保持する様式において、低分子模倣物とキャリアタンパク質との会合を促進する。
【０１７２】
（ＯＭＰビヒクルの調製）ＯＭＰビヒクルを、Ｌｏｗｅｌｌら（１９８８）（Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１６７：６５８〜６６３）およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９７９）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：８３６〜８４８）に記載の技術を組み合わせて用いて、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ群の莢膜欠損変異株（Ｍ７株）から調製する。手短には、細菌をＭＨブロス中で増殖し、遠心分離によってペレット化して、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む１５ｍｌの緩衝液中に再懸濁して、次に３０分間、５６℃まで暖める。室温まで冷却した後、懸濁液をＰｏｌｙｔｒｏｎ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＧｍｂＨ．、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、全速で３分間せん断し、次に１６０００×ｇで１５分間遠心分離する。生じるペレットを、１０ｍｌの緩衝液（５００ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム）に再懸濁し、５ｍｌの界面活性剤溶液（１０％  デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、０．１５Ｍ  グリシン（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、および３０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を用いて処理する。この懸濁液を１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。次に、上清を収集して、１００，０００×ｇで２時間遠心分離する。外膜タンパク質調製物を含むペレットを、１０ｍｌの水に再懸濁し、４℃で保存する。
【０１７３】
外膜タンパク質の１０ｍｌの懸濁液を、５ｍｌの界面活性剤溶液で再処理し、次に３０分間、５６℃まで暖める。冷却後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を、第２の界面活性剤溶液（１％  ＤＯＣ、０．０５Ｍ  グリシン、および０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．８）中の、２ｃｍ×２０ｃｍ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用するクロマトグラフィーによって（１度に２ｍｌ）、外膜タンパク質から除去する。ピーク画分を収集し、３０℃まで暖め、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して、４容量の冷濾過滅菌エタノール中に直接、滅菌濾過する。この混合液を4℃でオーバーナイトインキュベートする。生じる沈殿を１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、１ｍｌの滅菌蒸留水中に再懸濁する。生じるＯＭＰ調製物を−６０℃で保存する。
【０１７４】
ラウロイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ基を含有する分子模倣物を、等重量のラウロイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ誘導体と界面活性剤溶液（１％  ＤＯＣ、０．０５Ｍグリシン、および０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ）中に可溶化したＯＭＰビヒクルとを合わせることによる疎水的相互作用を介して、ＯＭＰビヒクルと複合体化する。この溶液を、１０，０００ダルトンの分子量化カットオフを有する透析チューブ中に配置し、３Ｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して、各１Ｌの２４時間にわたる３回の緩衝液交換において透析する。
【０１７５】
（分子模倣物−キャリアタンパク質結合体の調製）キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、例えば、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を２ｍｌの蒸留水に再懸濁し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、１．５ｍｌの微量遠心管に添加する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルおよびＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のようなマレイミド基を含むヘテロ二官能性架橋剤（２ｍｇ）を１ｍｌの結合緩衝液（０．０８３Ｍ  リン酸ナトリウム、０．９Ｍ  塩化ナトリウム、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に溶解する。１００μｌのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を、直ちにＫＬＨ溶液と合わせ、周囲温度において、１時間反応させる。この溶液を、結合緩衝液で平衡化した１．５ｃｍ×１０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにアプライする。ボイドボリュームに溶出するマレイミド活性化ＫＬＨを収集し、保持する。システインアミノ酸を含む上記の分子模倣物を、１００μｌのＤＭＳＯ中に再懸濁し、マレイミド活性化ＫＬＨの溶液に添加する。混合液を、周囲温度で１８時間反応させる。この反応を、最終濃度５ｍＭのβメルカプトエタノールの添加により停止する。最後に、ハプテンキャリア結合体を、ＰＢＳで平衡化した２ｃｍ×２５ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムでの浸透ゲルクロマトグラフィーによって、精製する。カラムを２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターする。
【０１７６】
（実施例７）
（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳエピトープの低分子模倣物による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの抗体の結合の阻害）
ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳエピトープの低分子模倣物（構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２））を上記のように合成した。これらの分子模倣物は、以下の構造を有する：
【０１７７】
【化３４】
0004295431.tif 000017
【０１７８】
【化３５】
0004295431.tif 000018
【０１７９】
【化３６】
0004295431.tif 000019
【０１８０】
【化３７】
0004295431.tif 000020
【０１８１】
競合的固相ファージＥＬＩＳＡ手順を使用して、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳに対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳエピトープの低分子模倣物の能力について評価した。モノクローナル抗体を０．５〜１のＯＤを生じるような濃度にまで、ＰＢＳ中で予め希釈したことを除いて、オリゴマーＥＬＩＳＡによって、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳに対する抗体の阻害のアッセイを上記のように行った。次に、モノクローナル抗体を、レプリカプレートのウェル（各々は７０μｌのＰＢＳおよびアセトニトリル／水（１：１）中に希釈された５μｌのインヒビターを含み、これを５０μｌの抗体溶液の添加前に添加した）に添加した。インヒビターおよび抗体を、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ  ＥＬＩＳＡプレートとともに、周囲温度で、１時間インキュベートした。４つのＳＥＡＭ抗体の４つの分子模倣物による阻害の結果を、図１Ａ〜Ｄのグラフに示す。特に、図１は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）による、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、および（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度依存性阻害を示す。
【０１８２】
（（ａ）ＥＬＩＳＡプレート上に直接コートした分子模倣物との交差反応性）
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ型式における分子模倣物に対する直接的結合によって示される分子模倣物との交差反応するその能力について評価した。使用した方法は、以下の例外を除き、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ  ＥＬＩＳＡについての上記の方法と類似の方法であった。抗体をＰＢＳ中に希釈し、そしてプレートを周囲温度で１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳで５回洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）をＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡプレート上で周囲温度でインキュベートした。図２は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【０１８３】
（実施例８）
（構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のウシ血清アルブミン結合体の調製）
ジメチルスルホキシド中の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、または６Ｂ（２）の溶液（１５０μｌ、約５０ｍＭ）を、ジメチルスルホキシド中の５０μｌの０．１７Ｍ  ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と合わせた。約２０μｌの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ８．０を、反応から放出される酸を中和するために添加した。周囲温度での１時間のインキュベーションの後、０．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。周囲温度での１８時間のインキュベーションの後、混合液を、ＰＢＳで平衡化した１０−ＤＧゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に通すことにより精製した。画分（０．５ｍｌ）を収集し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質の存在について試験した。タンパク質を含有する、カラムから溶出する最初の３画分を合わせた。
【０１８４】
（（ａ）構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢＳＡ結合体と、ＳＥＡＭ抗体との、交差反応性）
構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢＳＡ結合体を、ＰＢＳ中に１：１０００で希釈し、各１００μｌを、マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃより入手可能）のウェルに添加した。このプレートを４℃で、オーバーナイトインキュベーションした。このウェルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、２５０μｌのブロッキング緩衝液で満たし、非特異的結合部位をブロックするために周囲温度で３０〜６０分間インキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。試験する抗体を、ＰＢＳ中に希釈して、次に、各ウェルあたり１００μｌ添加した。このプレートをカバーし、そして４℃でオーバーナイトインキュベートした。
【０１８５】
オーバーナイトのインキュベーションの後、このウェルをＰＢＳで５回洗浄し、そして、１ウェルあたり１００μｌの（ＰＢＳ中で１：２０００に希釈した）アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）とともに、周囲温度で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳで洗浄し、そして基質緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌに希釈した新鮮に調製した基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｓｉｇｍａ）１００μｌを、各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度の値を約３０分後に測定した。図３は、上記の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【０１８６】
従って、ＭｅｎＢの独特なエピトープの新規分子模倣物、ならびにこれの取得方法、および使用方法を開示する。本発明の好ましい実施態様は、ある程度詳細に記載されているが、明白なバリエーションが、添付の請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解される。
【０１８７】
（本発明の実施において有用な株の寄託）
以下のハイブリドーマ細胞株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に対して行った。示される受託番号が、生存率試験に成功し、そして必要な手数料の支払い後に、割り当てられた。寄託は、特許手続上の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の条項およびその規則のもとになされた（プタペスト条約）。これは、寄託の日より３０年間の期間生存可能な培養物の維持を保証する。その寄託された生物は、ブタペスト条約の条文よって、そしてＣｈｉｒｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとＡＴＣＣとの間の合意に従ってＡＴＣＣより利用可能となる。このことは、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２およびそれに従う米国特許庁長官の規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１２を含む、特に８８６ＯＧ６３８を参照）に従い、米国特許庁長官によってその生物に対する権利を与えられると決定される者に対し、その子孫についての永久的かつ無制限の利用可能性を保証する。特許の付与に際して、寄託された培養物に対する公衆の利用可能性についての全ての制限は、取り消し不能に除去される。
【０１８８】
この寄託は、単に当業者の利便性のために提供され、そして３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２のもとで要求される寄託の承認ではない。これらのハイブリドーマの核酸配列、ならびにそれによってコードされる抗体分子のアミノ酸配列は、本明細書において参考として援用され、そして本明細書における記載でのいかなる矛盾の事象においても、支配的である。寄託された物質の製造、使用、または売却のためには、ライセンスが必要とされ得、そして本明細書においては、そのようなライセンスは、全く付与されない。
ハイブリドーマ      寄託日                    ＡＴＣＣ番号
ＳＥＡＭ−３        １９９６年８月１６日      ＨＢ−１２１７０
ＳＥＡＭ−１８      １９９６年８月１６日      ＨＢ−１２１６９
ＳＥＡＭ−２        １９９７年７月３０日      ＣＲＬ−１２３８０
ＳＥＡＭ−１２      １９９７年７月３０日      ＣＲＬ−１２３８１
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｄ】  図１Ｄは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳへの、（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図２】  図２は、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【図３】  図３は、構造５Ａ（１）、構造５Ｂ（１）、構造６Ａ（１）、および構造６Ｂ（１）のＢＳＡ結合体とＳＥＡＭ抗体との交叉反応性を示す。特に、図３は、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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