(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸の分子間架橋物を得るヒアルロン酸架橋工程と、
（２）該ヒアルロン酸架橋工程で得られた分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、
（３）該スポンジ化工程で得られたヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面にアテロコラーゲン水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより細胞接着部としてコラーゲンスポンジを形成する積層工程と、
（４）該積層工程によって形成されたコラーゲンスポンジに分子間架橋を施すコラーゲン架橋工程とを含むことを特徴とする組織再生用基材の製法。
【請求項２】
（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸水溶液を織布、不織布又は編物と接触させた状態で濃縮することによりヒアルロン酸の分子間架橋物を得るヒアルロン酸架橋工程と、
（２）該ヒアルロン酸架橋工程で得られた分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、
（３）該スポンジ工程で得られたヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面からアテロコラーゲン水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより細胞接着部としてのコラーゲンスポンジを形成する積層工程と、
（４）該積層工程によって形成されたコラーゲンスポンジに分子間架橋を施すコラーゲン架橋工程とを含むことを特徴とする組織再生用基材の製法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸架橋工程において、ヒアルロン酸の濃縮は、その濃度が１〜１０重量％となるまで継続されることを特徴とする請求項１又は２記載の組織再生用基材の製法。
【請求項４】
前記積層工程において、前記ヒアルロン酸スポンジの片面に複数の穴を開け、その穴を開けた片面からアテロコラーゲン水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の組織再生用基材の製法。
【請求項５】
前記スポンジ化工程及び前記積層工程は、
前記第１の架橋工程によって得られた分子間架橋物を生体由来の高分子材料の水溶液と接触させたあと真空凍結乾燥することにより、前記ヒアルロン酸スポンジと該高分子材料からなる前記細胞接着部とを同時に形成するスポンジ化・積層工程であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の組織再生用基材の製法。
【請求項６】
前記スポンジ化・積層工程において、前記架橋工程後の分子間架橋物の上下方向に複数の有底の穴を設ける工程と、生体由来の高分子材料の水溶液と接触させてこの水溶液を前記穴に浸透させる工程と、真空凍結乾燥することにより前記ヒアルロン酸スポンジと該高分子材料からなる前記細胞接着部とを形成する工程とを有することを特徴とする請求項５記載の組織再生用基材の製法。
【請求項７】
請求項１〜６の製法によって製造されたことを特徴とする組織再生用基材。
【請求項８】
請求項７記載の組織再生用基材と、
前記組織再生用基材の細胞接着部に保持された細胞と
を備えたことを特徴とする移植用材料。
【請求項９】
前記細胞は、線維芽細胞、角化細胞、色素産生細胞、血管内皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞又はランゲルハンス島細胞であることを特徴とする請求項８記載の移植用材料。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の組織再生用基材の製法によって組織再生用基材を作製したあと、この組織再生用基材の細胞接着部に細胞を組み込むことを特徴とする移植用材料の製法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料及びそれらの製法に関する。
背景技術
近年、細胞を培養し、組織を再構築する再生組織工学が注目されている。この再生組織工学では、生体親和性の高い種々の材料で形成された組織再生用基材に各種細胞を保持させ、培養することで移植用材料を得ている。
例えば、線維芽細胞等を組み込んだ培養皮膚ではコラーゲンスポンジが組織再生用基材として利用できることが知られており（特開平４−３３２５６１号公報）、最近では、コラーゲンに代えてヒアルロン酸が利用可能であることも示唆されている（特開平１１−３１９０６８号公報）。
ヒアルロン酸は、二糖繰り返し構造を持つムコ多糖の一種であり、主として動物の関節液や眼球硝子体、臍帯や真皮層などの結合組織などに存在する物質である。また、分子量のオーダーは数十万〜数百万であり、非常に多量の水と結合する性質があり、これが例えば関節の低摩擦性や皮膚真皮組織の保水性に関連している。また、損傷を受けた結合組織が修復するとき、ヒアルロン酸の産生が一時的に活発になり、組織再構築における細胞移動を促進する。このようなことから、ヒアルロン酸は創傷被覆材として優れた能力を発揮するものといえる。
しかしながら、ヒアルロン酸は創傷被覆材としては優れた能力を発揮するものの、含水性が非常に高いため、組織再生用基材として利用するには、細胞の接着性が低く、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での細胞培養が困難であるという問題があった。
本発明は上記問題点を解決することを課題とするものであり、ヒアルロン酸を主体とする組織再生用基材であって生体外での細胞培養と、移植後の組織再生に適したものを提供することを目的とする。また、この組織再生用基材の製法を提供することを別の目的とする。更に、この組織再生用基材を利用した移植用材料及びその製法を提供することを別の目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するため、本発明者は鋭意研究の結果、下記の第１〜第４の発明を完成するに至った。
本発明の第１は、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体を主体としたヒアルロン酸スポンジと、前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面に生体由来の高分子材料からなるスポンジを積層させた細胞接着部とを備えたことを特徴とする。この組織再生用基材の細胞接着部は、生体由来の高分子材料からなるスポンジを積層したものであるため、組織再生用基材に組み込まれる細胞が良好に接着する。また、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体を主体としたヒアルロン酸スポンジを備えているため、細胞増殖の促進等の創傷治癒能力にも優れている。したがって、この組織再生用基材によれば、生体外での細胞培養と、移植後の組織再生を良好に行うことができる。また、細胞を高密度で播種した場合、従来のコラーゲンスポンジでは大きな収縮がみられるのに対して、本発明の組織再生用基材ではそのような収縮はほとんどみられない。この組織再生用基材は、細胞を組み込んで移植用材料として使用してもよいが、それ以外に創傷面を被覆する創傷被覆材として使用してもよい。
ここで、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えばヒアルロン酸ナトリウムやヒアルロン酸カリウム等のヒアルロン酸金属塩のほか、ヒアルロン酸のヒドロキシル基やカルボキシル基等がエーテル化、エステル化、アミド化、アセタール化、ケタール化されたもの等が挙げられ、中でも、ヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。また、ヒアルロン酸スポンジとしては、分子間架橋されたもの（架橋ヒアルロン酸スポンジ）が好ましい。また、生体由来の高分子材料としては、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸等が挙げられるが、このうちコラーゲン特に抗原性の少ないアテロコラーゲンが好ましく、また、コラーゲン、ゼラチンは分子間架橋されたものが好ましい。
この組織再生用基材は、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との境界付近において、ヒアルロン酸スポンジに生体由来の高分子材料が入り込んだ状態になっていることが好ましい。この場合、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との膨潤率に差があったとしても、含水時に両者が剥がれたりするおそれがない。
この組織再生用基材は、ヒアルロン酸スポンジが支持体としての織布、不織布又は編物に支持されていることが好ましい。この場合、支持体によって組織再生用基材の強度が増し、ピンセットで摘んで持ち上げたりする際にも欠損するおそれがなく、ハンドリングが良好になる。ここで、支持体の材質としては、ヒアルロン酸スポンジを補強する役割を果たすものであれば特に限定されないが、例えばナイロン、ポリエステル、シリコーンなどの合成高分子材や、絹、木綿、麻などの天然高分子材等が挙げられる。
本発明の第２は、このような組織再生用基材の製法であって、（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を得る架橋工程と、（２）前記分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、（３）前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成する積層工程とを含むことを特徴とする。この製法では、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジとした上で、その少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと再度真空凍結乾燥を行う。この製法によれば、本発明の第１の組織再生用基材を比較的容易に作製できる。
ここで、架橋工程において、架橋剤としては、例えば水溶性エポキシ化合物やグルタールアルデヒド等が挙げられるが、そのうち水溶性エポキシ化合物が好ましい。この水溶性エポキシ化合物としては、例えばエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル等が挙げられる。架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合、その使用量はヒアルロン酸及び／又はその誘導体に対して、重量比で概ね１／２〜１／１０の割合であることが好ましく、特に１／５〜１／１０程度が好ましい。
この架橋工程においては、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を用いるが、この水溶液におけるヒアルロン酸及び／又はその誘導体の濃度は、用いるヒアルロン酸及び／又はその誘導体の種類や分子量等にもよるが、概ね０．５〜１．５重量％である。また、溶媒として用いる水としては、ｐＨ５〜６のイオン交換水が好ましい。
この架橋工程においては、架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋反応を行うが、加温して行うのが好ましい。濃縮時の温度は、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、約３０〜６０℃が好ましく、約４０〜６０℃がより好ましく、約５０℃が特に好ましい。６０℃を越えるような高い温度で加熱すると混合液に気泡が生じて、得られるヒアルロン酸スポンジのスポンジ構造の均一性が十分でない場合がある。一方、３０℃より低い温度では、分子間架橋反応速度が小さくなり、所望の濃度の分子間架橋物を得るのに長時間を要することがある。また、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋反応は、中性領域（ｐＨ５〜８）又は酸性領域（ｐＨ３〜５）で行うことが好ましい。また、酸性領域で行うと、中性領域で行う場合に比べて濃縮時間が短くなる傾向にあるため、好ましい。
この架橋工程において、例えばヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液の濃度が１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％、特に好ましくは約５重量％になった時点で濃縮を終えることが好ましい。濃縮を十分行わなかった場合には、次のスポンジ化工程後に得られるヒアルロン酸スポンジの膨潤性を十分抑制できないことがあるため、好ましくない。即ち、ヒアルロン酸スポンジが高い膨潤性を有していると、例えば細胞培養時に液体培地等に浸した場合に必要以上に膨潤してしまい、その結果脆弱になると共に形状も大きくなるので、ハンドリングが困難になる。これに対して、上述のように濃縮の終点を制御すれば、ヒアルロン酸スポンジの膨潤性が十分抑制されるため、液体培地等に浸した場合に必要以上に膨潤することがなく、その結果脆弱になったり形状が大きく成りすぎることもないので、ハンドリングが容易になる。なお、濃縮液が完全にフィルム状になるまで架橋工程を行うと、真空凍結乾燥によるスポンジ化工程を行ったとしても、ヒアルロン酸スポンジは形成されないため、濃縮液がフィルム状になる前に濃縮の終点を設定する必要がある。
次に、スポンジ化工程においては、架橋工程後の分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るが、真空凍結乾燥時の温度条件は、大きな氷の結晶を形成させないために、約−８５℃〜−３０℃、好ましくは約−８５℃〜−５０℃、より好ましくは約−８５℃であり、真空条件は、３０×１０−３〜１００×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜１０Ｐａ）程度が好ましく、より好ましくは３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）である。
このスポンジ化工程においては、架橋工程で十分な濃縮を行えずに得られた分子間架橋物に対しては、凍結し解凍する操作を少なくとも１回以上行ったあと真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得ることが好ましい。真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作を行わなかった場合には、含水時に形状を保持しにくいスポンジになることがあるのに対して、真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作を行った場合には、おそらく水素結合のような分子間相互作用が促進された結果と思われるが、含水時に形状を保持しやすいスポンジが得られる。このように真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作は複数回行ってもよいが、製造工程の簡素化を考慮すれば１回行うことが好ましい。また、真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作における凍結の温度条件は、約−８５℃〜−３０℃、好ましくは約−８５℃〜−５０℃、より好ましくは約−８５℃であり、また、解凍の温度条件は約２０℃〜３０℃、好ましくは約３０℃付近である。但し、解凍時に温度を多段階に分けて加温して解凍してもよい。この場合には、分子間架橋物が割れたりしないように注意する。なお、架橋工程において適切な濃縮条件で、十分な濃縮を行って得られた分子間架橋物に対しては、十分な強度を有しているので、真空凍結乾燥前の凍結／解凍操作を必ずしも行う必要はない。
次の積層工程に移る前に、スポンジ化工程で作製したヒアルロン酸スポンジを洗浄する水洗工程を設けることが好ましい。この水洗工程においては、未反応の架橋剤を不活性化させる不活性化剤を洗浄水中に添加しておいてもよい。例えば、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、不活性化剤としては、エポキシ基を開環させる機能を持ったもので生体に害を与えないものが好ましく、例えばグリシンが用いられる。
次に、積層工程においては、ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより細胞接着部を形成するが、生体由来の高分子材料としては既述の通り、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸等が挙げられ、このうちコラーゲン特に抗原性の少ないアテロコラーゲンが好ましい。また、生体由来の高分子材料の水溶液としては、０．２〜１．０重量％の水溶液、好ましくは０．２〜０．５重量％の水溶液、より好ましくは０．５重量％程度の水溶液を用いればよく、また、生体由来の高分子材料とヒアルロン酸との重量比は、１：２〜１０、好ましくは１：２〜４、特に好ましくは１：４程度とすればよい。また、真空凍結乾燥の条件は、スポンジ化工程における真空凍結乾燥の条件と同様である。
また、この積層工程では、ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させているため、得られた組織再生用基材のヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との境界付近において、ヒアルロン酸スポンジに生体由来の高分子材料が入り込んだ状態になっている。このため、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との膨潤率に差があったとしても、組織再生用基材を含水させた時に両者が剥がれたりするおそれがない。
この積層工程において、ヒアルロン酸スポンジの片面に複数の穴を開け、その穴を開けた片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成してもよい。この場合、生体由来の高分子材料の水溶液は、ヒアルロン酸スポンジの有する多孔に浸透するのに加えて複数の穴にも入り込むため、ヒアルロン酸スポンジとの間にアンカーリングの効果も得られる。このようにして各穴や多孔に生体高分子材料の水溶液を浸透させた後真空凍結乾燥することにより、組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性を一層向上させることができる。なお、ここでいう「穴」には、例えば丸穴や角穴などのような一般的な穴のほか、例えば切れ目や凹凸などのように平面に比べて接触面積が大きくなるようなものも含まれる。
この積層工程において生体由来の高分子材料としてコラーゲン又はゼラチンを用いた場合には、積層工程後に紫外線ランプを照射してコラーゲン又はゼラチンを部分的に分子間架橋することにより含水時にコラーゲン又はゼラチンが流出することを防止するのが好ましく、更にその後にエチレンオキサイドガス等により滅菌するのが好ましい。また、前述の水洗工程を行わなかった場合は、未反応の架橋剤を不活性化させるために、不活性化剤を生体由来の高分子材料の水溶液に添加しておくのが好ましい。不活性化剤としては前述と同様に、例えば、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、グリシン等のエポキシ基を開環させる機能を持ったもので生体に害を与えないものが好ましい。
ところで、前述のスポンジ化工程及び積層工程の代わりに、以下のスポンジ化・積層工程を採用してもよい。即ち、架橋工程後の分子間架橋物を生体由来の高分子材料の水溶液と接触させたあと真空凍結乾燥することにより前記ヒアルロン酸スポンジと共に細胞接着部を形成する工程を採用してもよい。この場合、真空凍結乾燥を一度だけで済ませることができるので、製造プロセスが簡略化される。
このスポンジ化・積層工程では、スポンジ化前の分子間架橋物に生体由来の高分子材料の水溶液を接触させるため、生体由来の高分子材料の水溶液がスポンジ化前の分子間架橋物に浸透しにくく、最終的に得られる組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性が十分でないおそれがある。そこで、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物の上下方向に複数の穴を設け、生体由来の高分子材料の水溶液との接触面積を大きくしてアンカーリングの効果を得ることが好ましい。このようにして各穴に生体高分子材料の水溶液を浸透させたあと真空凍結乾燥することにより、組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性を向上させることが好ましい。なお、ここでいう「穴」には、例えば丸穴や角穴などのような一般的な穴のほか、例えば切れ目や凹凸などのように平面に比べて接触面積が大きくなるようなものも含まれる。
このスポンジ化・積層工程を採用してヒアルロン酸スポンジが支持体に支持された組織再生用基材を作製するには、例えば以下のような手順で行う。即ち、予め容器の底面に支持体を敷いておき、架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液をこの容器内に入れる。その後、この水溶液を加温して濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を作製する。その後、この容器内で分子間架橋物の上下方向に複数の穴を設け、生体由来の高分子材料の水溶液を加えて分子間架橋物と接触させ、真空凍結乾燥する。なお、必要に応じて、真空凍結乾燥前（例えば穴を設ける前あるいは穴を設けた後）に、分子間架橋物を凍結し解凍する操作を行ってもよい。このような操作を行うことにより、強度が向上し、含水時に形状を保持しやすいスポンジが得られる。
本発明の第３は、移植用材料であって、上述の組織再生用基材と、この組織再生用基材の細胞接着部に保持された細胞とを備えたことを特徴とする。この移植用材料は、細胞が細胞接着部に密着性よく保持されているため生体外で容易に細胞培養が可能であり、しかもヒアルロン酸の細胞移動の促進や保湿効果による創傷治癒能力により組織が適切に再生される。ここで、細胞接着部に保持される細胞はどのような細胞であってもよいが、線維芽細胞、角化細胞、色素産生細胞、血管内皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、ランゲルハンス島細胞等が挙げられる。例えば他人由来の線維芽細胞を保持させた移植用材料を使用するには、皮膚創傷部にこの移植用材料を移植し、抗菌剤を含有する膜（例えばポリウレタン膜）で被覆し、更に包帯で被覆する。そのようにすると、他人由来の線維芽細胞から産生される各種サイトカインにより治癒が促進される。
本発明の第４は、このような移植用材料の製法であって、上述の組織再生用基材を作製したあと、この組織再生用基材の細胞接着部に細胞を組み込むことを特徴とする。この製法によれば、本発明の第３の移植用材料を比較的容易に作製できる。ここで、細胞接着部に細胞を組み込む方法としては、例えば、組織再生用基材を培養液に浸漬させると共に細胞を孔内へ取り込ませることにより保持する方法がある。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の好適な実施例について説明する。本発明は、下記実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下において「％」は特に断りのない限り重量％を表す。
（実施例１）
［１］組織再生用基材の作製（図１参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）１０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで攪拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ３１３（グリセロールジグリシジルエーテル；ナガセ化成工業）１ｇを蒸留水２０ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ３１３溶液（以下、ＥＸ３１３溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ３１３溶液２０ｍｌを、攪拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに攪拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を底面積が１８０ｃｍ２（１０ｃｍ×１８ｃｍ）のトレーに１８０ｍｌ注入した。このときのヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の深さは、およそ１ｃｍとなった。トレーに注入されたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を室温で２時間静置し、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液内の気泡を抜いた後、予めトレーの大きさに応じて切断したベンリーゼ（不織布；旭化成工業）をヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液に上載した。
不織布を上載した状態のヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を空気循環型乾熱器に入れ、５０℃で１０時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ３１３のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約２／５（つまりヒアルロン酸濃度として約２．５重量％）になるまで濃縮した。このときの濃縮液の深さは、およそ４ｍｍであった。
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。この凍結後、室温に１〜１．５時間放置して一度解凍し、解凍後、再び５〜６時間程度、−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
アテロコラーゲン１ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４に調整し、０．２％アテロコラーゲン水溶液を作製した。作製したアテロコラーゲン水溶液を底面積１８０ｃｍ２のトレーに９０ｍｌ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（１８０ｍｌ）の半分の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は１：１０となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジをアテロコラーゲン水溶液の入ったトレーにベンリーゼが上方に位置するように浸漬し、１時間放置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、このコラーゲン水溶液に浸漬させたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で凍結後、真空乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものを、コラーゲンスポンジ側に１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２５ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ（エチレン・オキサイド・ガス）滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであってベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
組織再生用基材のベンリーゼとは反対側の面に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ギブコ社製）中に浮遊した培養ウサギ線維芽細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種したのち、ＣＯ２５％、３７℃のインキュベータ中で７日間培養し、移植用材料としての培養真皮を作製した。培地を除去し、これを凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）に入れ、−１５２℃の冷凍庫内で保存した。
［３］移植試験
冷凍庫内に保存した培養真皮（移植用材料）を使用時に解凍して凍結保存液を除去し、ハンクス液３０ｍｌで２回洗浄して動物実験に使用した。ウサギの背部に直径７ｃｍの円を描き、全層皮膚を切除し、皮膚欠損創とした。この皮膚欠損創に先の培養真皮を適用し、創傷面の周辺を縫合し、その上にポリウレタンフィルム製創傷被覆材を適用し、更に滅菌パットを載せて、創傷の周辺を縫合し、伸縮性包帯で圧迫固定した。その結果、良好な肉芽組織形成と創面積の顕著な減小が観察された。
（実施例２）
［１］組織再生用基材の作製（図２参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
実施例１と同様にして、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を作製し、得られたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を底面積が１８０ｃｍ２（１０ｃｍ×１８ｃｍ）のトレーに１８０ｍｌ注入した。トレーにはその大きさに合わせて切断したベンリーゼ（前出）が予め載置されており、少量の蒸留水を加えて含水させてトレー底面に接着させておいた。トレーに注入したヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の深さは、およそ１ｃｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を空気循環型乾熱器に入れ、５０℃で１５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ３１３のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／５（つまりヒアルロン酸濃度として約５重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった。
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１５Ｌのイオン交換水を入れた容器内に架橋ヒアルロン酸スポンジを一日浸漬させ、水洗した。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
アテロコラーゲン２．５ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３．２に調整し、０．５％アテロコラーゲン水溶液を作製した。水洗した架橋ヒアルロン酸スポンジを、不織布を下側にして底面積１８０ｃｍ２のトレーに置き、この上に作製したアテロコラーゲン水溶液を９０ｍｌ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（１８０ｍｌ）の半分の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は１：４となる。
架橋ヒアルロン酸スポンジは周囲が若干収縮しており、トレーの側面との間に隙間が生じた。この隙間にアテロコラーゲン水溶液が浸入することにより、ヒアルロン酸スポンジの周囲を包み込むようにコラーゲンが配置され、膨潤時に架橋ヒアルロン酸スポンジとコラーゲンスポンジとが分離するのを抑制した。
アテロコラーゲン水溶液を注入して一昼夜経過後、アテロコラーゲン水溶液を含んだヒアルロン酸スポンジを−８５℃で真空凍結乾燥した。真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジが積層化したものを、コラーゲンスポンジ側に１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２５ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであってベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
上記方法により作製した１８０ｃｍ２の組織再生用基材を切断し、９０ｃｍ２の大きさにした。切断した組織再生用基材を１８０ｃｍ２のトレーに入れ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを１００ｍｌ注入し、ｐＨを調整した。ｐＨを調整後（ｐＨ７．４）、培養液を一度廃棄し、ヒト線維芽細胞懸濁液５ｍｌを組織再生用基材に５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種後、３７℃で一晩静置し、ヒト線維芽細胞を組織再生用基材に定着させた。その後、上記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を１００ｍｌ加え、３７℃，５％ＣＯ２下で１週間培養を行った。このように作製した培養真皮（移植用材料）は、十分な強度を有しているばかりでなく、周囲が２〜３ｍｍ程度収縮しているのみであるので、ハンドリングが良好であり、欠損するおそれもないものだった。
（実施例３）
［１］組織再生用基材の作製（図３参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）２０ｇを蒸留水２Ｌに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した後、１Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ３．５に調整した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで撹拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ８１０（グリセロールジグリシジルエーテル；ナガセ化成工業）４ｇを蒸留水４０ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ８１０溶液（以下、ＥＸ８１０溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ８１０溶液（４０ｍｌ）を、撹拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに撹拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を底面積が１１０ｃｍ２（１０ｃｍ×１１ｃｍ）のトレーに５０ｇ注入した。トレーにはその大きさに合わせて切断したベンリーゼ（前出）が予め載置されており、少量の蒸留水を加えて含水させてトレー底面に接着させておいた。トレーに注入したヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液の深さは、およそ５ｍｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を空気循環型加熱器に入れ、５０℃で５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ８１０のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／２（つまりヒアルロン酸濃度として約２重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった、
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行った。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１Ｌの蒸留水を入れた容器内に架橋ヒアルロン酸スポンジを一晩浸漬させ、水洗した。
水洗後、再び−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
コラーゲンスポンジによる積層化に先立ち、剣山を使用して架橋ヒアルロン酸スポンジを穿孔した。このときの孔の間隔は、ほぼ４ｍｍであった。
アテロコラーゲン８ｇを蒸留水１．６Ｌに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３．５に調整し、０．５％アテロコラーゲン水溶液を作製した。作製したアテロコラーゲン水溶液を底面積１１０ｃｍ２のトレーに４０ｇ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（５０ｇ）の約４／５の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は２：５となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジをアテロコラーゲン水溶液の注入したトレーにベンリーゼが上方に位置するように浮かべ、１晩静置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、コラーゲン水溶液をしみ込ませたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で完全に凍結した後、真空凍結乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものの両側に、各々１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２０ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ（エチレン・オキサイド・ガス）滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであって、ベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
上記方法により作製した組織再生用基材をトレーに入れ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを５０ｍｌ注入し、ｐＨを調整した。ｐＨを調整後（ｐＨ７．４）、培養液を一度廃棄し、ヒト線維芽細胞懸濁液５ｍｌを組織再生用基材に１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種後、３７℃で一晩静置し、ヒト線維芽細胞を組織再生用基材に定着させた。その後、上記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を５０ｍｌ加え、３７℃，５％ＣＯ２下で１週間培養を行った。このように作製した培養真皮（移植用材料）は、培地を除去し、これを凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）に入れ、−１５２℃の冷凍庫内で保存した。
［３］移植試験
冷凍庫内に保存した培養真皮（移植用材料）を使用時に解凍して凍結保存液を除去し、乳酸リンゲル液３０〜５０ｍｌで３回洗浄してヒト臨床適用した。創傷面は残存壊死組織を除去した後、消毒を行い、生理食塩水で十分に洗浄した。この皮膚欠損創に先の培養真皮を適用し、培養真皮の周囲を縫合固定した。その上に抗生剤含有軟膏を染み込ませたガーゼを適用し、さらに滅菌ガーゼを載せて、創傷の周辺を縫合し、伸縮性包帯で圧迫固定した。その結果、良好な肉芽組織形成と創面積の顕著な減少、創周囲からの上皮化が観察された。
（実施例４）
［１］組織再生用基材の作製（図４参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）２ｇを蒸留水２００ｍＬに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した後、１Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ３．５に調整した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで撹拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ８１０  ０．２ｇを蒸留水２ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ８１０溶液（以下、ＥＸ８１０溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ８１０溶液（２ｍｌ）を、撹拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに撹拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を底面積がφ３５ｍｍディッシュに４．８ｇ注入した。ディッシュに注入したヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液の深さは、およそ５ｍｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を空気循環型加熱器に入れ、５０℃で５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ８１０のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／２（つまりヒアルロン酸濃度として約２重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった、
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行った。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１Ｌの蒸留水を入れた容器内に一晩浸漬させ、水洗した。水洗後、再び−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
コラーゲンスポンジによる積層化に先立ち、剣山を使用して架橋ヒアルロン酸スポンジを穿孔した。このときの孔の間隔は、ほぼ４ｍｍであった。
一方、０．５％コラーゲン水溶液（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ  Ｉ−ＰＣ：株式会社高研製）をφ３５ｍｍディッシュに３．８ｇ注入した。コラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（４．８ｇ）の約４／５の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比はおよそ２：５となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジのうち穿孔した面が下になるようにコラーゲン水溶液の注入したディッシュに浮かべ、一晩静置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、コラーゲン水溶液をしみ込ませたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で完全に凍結した後、真空凍結乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものの両側に、各々１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２０ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。この組織再生用基材には、ベンリーゼによる強度付加はなされていないが、ピンセット等による取扱いは容易に行うことができた。
本実施例の組織再生用基材は、実施例１〜３と同様、培養真皮として利用することができるほか、創傷被覆材として用いることもできる。創傷被覆材として用いる場合には、生体吸収性を有しているため除去が不要であるし、コラーゲン側を創傷面に当てることによりコラーゲンの細胞保持効果が得られ、創傷適用後にヒアルロン酸が創傷面に溶出して細胞遊走性を発揮し治癒促進効果が得られることが期待される。
なお、実施例２の別例として、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の分子間架橋反応後、真空凍結乾燥することなく架橋反応物の上下方向に穴を開け、その穴を開けた面とアテロコラーゲン水溶液とを接触させたあと真空凍結乾燥することにより、ヒアルロン酸スポンジにすると同時にコラーゲンスポンジにすることもできる。この場合、製造プロセスが簡略化されるし、両スポンジは穴の存在によりアンカーリングの効果が得られるので良好に密着する。
産業上の利用の可能性
本発明は、ヒアルロン酸を主体とする組織再生用基材であって生体外での細胞培養と移植後の組織再生に適しているため、医療分野に広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図２は実施例２の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図３は実施例３の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図４は実施例４の組織再生用基材の作製手順を表す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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