(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドに対する親和性が上昇し、かつKm値が100以下である変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む組換えDNAによって形質転換された微生物をpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシドならびに燐酸供与体に作用させてヌクレオチド−５’ −燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド-５’-燐酸エステルの製造法であって、配列表の配列番号７のアミノ酸配列において、６３番目のロイシン残基がグルタミン残基に、６５番目のアラニン残基がグルタミン残基に、６６番目のグルタミン酸残基がアラニン残基に置換した酵素であることを特徴とする、ヌクレオシド−５’ −燐酸エステルの製造法。
【請求項２】
前記変異型酸性フォスファターゼがさらに７４番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に、１５３番目のイソロイシン残基がスレオニン残基に置換した酵素である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記変異型酸性フォスファターゼが、さらに１３５番目のスレオニンがリジン残基に、１３６番目のグルタミン酸がアスパラギン酸残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項２に記載の製造法。
【請求項４】
前記変異型酸性フォスファターゼが、さらに６９番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に、７１番目のセリン残基がアラニン残基に、72番目のセリン残基がアラニン残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項３に記載の製造法。
【請求項５】
前記変異型酸性フォスファターゼが、さらに１１６番目のアスパラギン酸残基がグルタミン残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項４に記載の製造法。
【請求項６】
前記変異型酸性フォスファターゼがさらに１３０番目のセリン残基がグルタミン酸残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項５に記載の製造法。
【請求項７】
前記変異型酸性フォスファターゼがさらに９２番目のアラニン残基がセリン残基に、９４番目のアラニン残基がグルタミン酸残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項６に記載の製造法。
【請求項８】
前記変異型酸性フォスファターゼが、さらに104番目のグルタミン残基がグリシン残基に、及び/または１５１番目のスレオニン残基がアラニン残基に置換した酵素であり、かつ温度安定性を向上するように改変した酵素であることを特徴とする、請求項７に記載の製造法。
【請求項９】
ヌクレオシドに対する親和性が上昇し、かつKm値が100以下である変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む組換えDNAによって形質転換された微生物をpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシドならびに燐酸供与体に作用させてヌクレオチド-５’-燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド-５’-燐酸エステルの製造法であって、配列表の配列番号２４のアミノ酸配列において、８１番目のロイシン残基がグルタミン残基に、８３番目のアラニン残基がグルタミン残基に、８４番目のグルタミン酸残基がアラニン残基に置換した酵素であることを特徴とする、ヌクレオシド-５’-燐酸エステルの製造法。
【請求項１０】
前記変異型酸性フォスファターゼがさらに９２番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に、１７１番目のイソロイシン残基がスレオニン残基に置換した酵素である、請求項９に記載の製造法。
【請求項１１】
前記変異型酸性フォスファターゼが、さらに１５３番目のスレオニンがリジン残基に、１５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸残基に置換した酵素であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造法。
【請求項１２】
燐酸供与体がポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチルリン酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択されるものである請求項１から１１のいずれか1項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造法に関する。また、本発明は、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造において有用な新規な酸性フォスファターゼ、該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有する微生物に関する。ヌクレオシド−５′−燐酸エステルは、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドを生化学的に燐酸化してヌクレオシド−５′−燐酸エステルを製造する方法としては、燐酸供与体として、パラニトロフェニル燐酸を用いる方法（特公昭39-29858号）、無機燐酸を用いる方法（特公昭42−1186号）、ポリ燐酸を用いる方法（特開昭53-56390号）、アセチル燐酸を用いる方法（特開昭56−82098号）、アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）を用いる方法（特開昭63−230094号）が知られている。しかしながら、これらの方法にあっては使用する基質が高価であったり、反応副生物が生じたりするために、安価かつ効率的にヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生産を行うには満足のいくものではなかった。
【０００３】
そこで、本発明者らは、特定の微生物菌体を、酸性条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択される燐酸供与体に作用させることにより、２′−、３′−ヌクレオチド異性体の副生を伴うことなく、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを効率よく生成する方法を開発した（特開平7−231793号）。
【０００４】
しかしながら、この方法においても、使用する微生物菌体にわずかながら存在するヌクレオシド分解活性のために反応中に基質が一部分解され、また、反応を継続すると生成蓄積したヌクレオシド−５′−燐酸エステルが分解するため、反応液中に副生物が生成するとともに、十分な収率が得られなかった。さらに、菌体あたりの燐酸転移活性が低いため、高濃度の基質を添加して反応を行えない等の欠点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安価かつ効率的なヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造方法において有用な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡを保有する微生物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来の方法よりも効率の良いヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造方法を開発するために種々の検討を加えた結果、微生物の無細胞抽出液より精製した酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させることにより、高収率で効率良くヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生産することができることを発見した。さらに、種々の細菌より酸性フォスファターゼをコードする野生型遺伝子を取得し、エシェリヒア属細菌に由来する酸性フォスファターゼに変異を導入することにより、ヌクレオシドへの燐酸転移反応においてヌクレオシドへの親和性が野生型酵素よりも上昇した変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を取得することに成功し、遺伝子工学的手法により該遺伝子を大量発現させることによりヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生産性が飛躍的に向上することを見いだした。
また、本発明者らは、本酸性フォスファターゼによる燐酸転移反応をより高温で行えれば反応速度が向上し、かつ反応液中のリン酸受容体のヌクレオシド濃度を上げて反応を行えるため、さらに効率的にヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造が可能になると考え、温度安定性が向上した変異型酸性フォスファターゼの作製を試みた。そして実施例１９に記載の変異型酸性フォスファターゼよりも温度安定性が向上し、高温条件で反応が可能な変異型酸性フォスファターゼを作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヌクレオシドへの親和性が上昇し及び／又は温度安定性が向上した酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びに燐酸供与体、好ましくはポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチルリン酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造法を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し及び／又は温度安定性が向上した酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡによって形質転換された微生物をpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシドならびに燐酸供与体、好ましくはポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチルリン酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させてヌクレオチド−5’−燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、ヌクレオシドへの親和性が上昇し及び／又は温度安定性が向上した変異型酸性フォスファターゼ、該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを保有する微生物を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
＜１＞酸性フォスファターゼの取得
本発明において使用される酸性フォスファターゼは、pH3.0〜5.5の条件下で、ヌクレオシドへの、燐酸供与体、例えば、ポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチルリン酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択される燐酸供与体からの、燐酸基の転移によりヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成する反応を触媒するものであれば制限はない。このような酸性ホスファターゼとしては、微生物に由来するものが好ましく、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェリヒア属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属又はセラチア属に属する細菌が、当該酵素活性を有しており、これら細菌に由来する酵素がある。そのような細菌の代表例として以下のような菌株を挙げることができる。
モルガネラ・モルガニ（Morganella  morganii） NCIMB 10466
モルガネラ・モルガニ（Morganella  morganii） IFO 3168
モルガネラ・モルガニ（Morganella  morganii） IFO 3848
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） JCM 1650
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33429
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33430
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 29851
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 33672
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 12010
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 13534
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IFO 14939
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IAM 1133
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） IAM 13540
セラチア・ マルセセンス（Serratia marcescens） IAM 12143
【００１１】
なお、酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）は、本来、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触媒する酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレオシド−５′−燐酸エステルを分解するヌクレオチダーゼ活性（以下、「燐酸エステル加水分解活性」という）を有している。本発明のヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造法においては、高い収率でヌクレオシド−５′−燐酸エステルを得るために、ヌクレオシドへの燐酸転移反応においてヌクレオシドへの親和性が野生型酵素よりも上昇した変異型酸性フォスファターゼ（以下、単に「変異型酸性フォスファターゼ」ともいう）を使用する。好ましくはヌクレオシドに対するＫｍ値が１００以下の変異型酸性フォスファターゼを使用する。
【００１２】
変異型酸性フォスファターゼは、後述するように、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を直接変異させることによって得られる変異型遺伝子を発現させることによって得られるが、ヌクレオシドへの親和性が上昇した酸性フォスファターゼを産生する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤により処理し、ヌクレオシドへの親和性が上昇した変異型酸性フォスファターゼを産生するようになった微生物を培養することによっても、変異型酸性フォスファターゼを得ることができる。
【００１３】
上記のような微生物から酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質を得るには、該活性を有する菌株を適当な培地で培養し、増殖した菌体を回収し、当該菌体を破砕して無細胞抽出液を調製して、これより必要に応じ精製すればよい。
【００１４】
微生物を培養する培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン及び必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、シュクロース等の糖類、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等、又はこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、大豆加水分解物等が適宜用いられる。
【００１５】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてpH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよい。
【００１６】
増殖した菌体は、遠心分離等により培養液から回収することができる。回収した菌体から無細胞抽出液を調製するには、通常の方法が用いられる。すなわち、菌体を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により菌体残渣を除去することにより無細胞抽出液が得られる。
【００１７】
無細胞抽出液から酸性フォスファターゼを精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラまフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿等、酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用いられる。精製は、完全精製である必要は必ずしもなく、基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が除去できればよい。
【００１８】
＜２＞酸性フォスファターゼ遺伝子の取得
酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片は、当該酵素活性を有する微生物等の細胞からクローニングすることができる。クローニング方法としては、例えば、酵素活性を指標として染色体遺伝子発現ライブラリーを探索する方法、当該蛋白質に対する抗体を作成して染色体遺伝子発現ライブラリーを探索する方法、精製された蛋白質のＮ末端等のアミノ酸配列を解析し、これを基にプローブを作製し遺伝子ライブラリーを探索する方法等がある。
【００１９】
具体的には、上記のモルガネラ・モルガニ、エシェリヒア・ブラッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ、セラチア・フィカリア、又はセラチア・ マルセセンスの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子は、それぞれの微生物の染色体遺伝子発現ライブラリーを作成し、フォスファターゼ活性を指標として該ライブラリーを探索することによりクローニングできる。
【００２０】
すなわち、まず、上記細菌より染色体ＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で部分分解した後、エシェリヒア・コリで自律複製できるベクターに連結し、得られた組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリを形質転換することにより染色体遺伝子発現ライブラリーが作成できる。染色体ＤＮＡを切断する際に、切断反応時間等を調節して切断の程度を調整すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。また、遺伝子のクローニングに使用するベクターとしては、エシェリヒア・コリで自律複製できるベクターであればいかなるものでも構わない。例えば、pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322、pBluescriptII等が用いられる。
【００２１】
ベクターと、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結して組換え体ＤＮＡを調製するには、染色体ＤＮＡを切断するときに用いる制限酵素と同じもの、又は染色体ＤＮＡ断片の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いてあらかじめベクターを切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いてＤＮＡ断片との連結を行えばよい。作成した組換えＤＮＡの受容菌としては、ベクターの複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例えばHB101、JM109、DH5等のエシェリヒア・コリ菌株が用いられる。
【００２２】
かくして得られる形質転換体を寒天培地上に生育させコロニーを形成させた後、培地表面にｐ−ニトロフェニル燐酸を含む反応液を注ぎ反応を行うと、フォスファターゼ活性を発現した株は、ｐ−ニトロフェノールを遊離して黄色を示す。前記反応を酸性条件下で行い、呈色を指標として形質転換体を選択することにより、目的の酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有する形質転換体を選択することができる。
【００２３】
次いで、選択された形質転換体より組換えＤＮＡを回収し、ベクターに連結されている酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の構造を解析する。酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の塩基配列は、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２に、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650由来の遺伝子の場合、配列表配列番号６に、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２１に、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２３に、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２５に、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２７にそれぞれ示される。
【００２４】
上記遺伝子によりコードされると推定される酸性ホスファターゼのアミノ酸配列を、配列表配列番号４、８、２２、２４、２６又は２８に示す。上記の遺伝子によってコードされる酸性ホスファターゼは、本発明に好適に使用することができる。さらに、上記遺伝子によってコードされる酸性ホスファターゼのアミノ酸配列のいずれかと実質的に相同であるアミノ酸配列を有する酸性ホスファターゼも、本発明に好適に使用することができる。「実質的に相同」とは、酸性ホスファターゼのアミノ酸配列が、ヌクレオシド−５′−燐酸エステル生成活性（以下、「燐酸転移活性」という）を失わないような１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を含んでいてもよいことを意味する。
【００２５】
＜３＞変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の取得
上記で得られる野生型酸性フォスファターゼは、燐酸エステル加水分解活性を有するため、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造においては、反応時間の経過とともに生産物の分解を伴い、反応収率を低下させる要因となることがある。これを避けるためには、ヌクレオシドに対する親和性が上昇するように酸性フォスファターゼをコードする遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。
また、本酸性フォスファターゼによる燐酸転移反応をより高温で行えれば反応速度が向上し、かつ反応液中のリン酸受容体のヌクレオシド濃度を上げて反応を行えるため、さらに効率的にヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造が可能となる。このためには、温度安定性が向上するように酸性フォスファターゼをコードする遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。
【００２６】
ＤＮＡの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)）；Carter, P., Meth. in Enzymol.,  154, 382 (1987)）、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）などがある。
【００２７】
ヌクレオシドに対する親和性が上昇した変異型酸性フォスファターゼの例としては、配列表配列番号４、８、２２、２４、２６又は２８に示されるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、かつ、野生型酸性フォスファターゼのヌクレオシドに対する親和性を上昇させる変異を有する変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。具体的には、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650由来の酵素の場合、配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列において７４番目のグリシン残基及び／又は１５３番目のイソロイシン残基が他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。後述の実施例では、７４番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に、１５３番目のイソロイシン残基をスレオニン残基に置換した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子取得の例を示した。
【００２８】
配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列において６３番目のロイシン残基、６５番目のアラニン残基、６６番目のグルタミン酸残基、６９番目のアスパラギン残基、７１番目のセリン残基、７２番目のセリン残基、８５番目のセリン残基、９２番目のアラニン残基、９４番目のアラニン残基、１１６番目のアスパラギン酸残基、１３０番目のセリン残基、１３５番目のスレオニン残基、及び／又は１３６番目のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換が生じると、さらに酸性フォスファターゼのヌクレオシドに対する親和性が上昇する。
温度安定性が向上した変異型酸性フォスファターゼの例としては、配列表配列番号４、８、２２、２４、２６又は２８に示されるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、かつ、野生型酸性フォスファターゼの温度安定性を向上させる変異を有する変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。具体的には、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650由来の酵素の場合、配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列において１０４番目のグルタミン酸残基及び／又は１５１番目のスレオニン残基が他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。後述の実施例では、１０４番目のグルタミン酸残基をグリシン残基に置換したものおよび、１５１番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子取得の例を示した。
【００２９】
従って、これらの変異型酸性フォスファターゼをコードするように、上記の部位特異的変異法により、野生型遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えばよい。なお、ヌクレオシドに対する親和性を上昇させる変異は、野生型酸性フォスファターゼと比較してヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生成活性の実質的な低下を伴わない変異であることが望ましく、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生成活性が低下する場合であっても、燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結果、燐酸エステル加水分解活性／ヌクレオシド−５′−燐酸生成活性の比が野生型酸性フォスファターゼより低くなるような変異であればよい。ヌクレオシドに対する親和性上昇の程度としては、ヌクレオシドへの燐酸転移反応においてヌクレオシドに対するＫｍ値が１００以下となることが好ましい。また、温度安定性の向上した変異とは、同一の条件での温度で処理した後に残存する活性が、野生型酸性フォスファターゼよりも高くなっているものをいう。温度安定性の向上の程度としてはｐＨ7.0、50℃で30分処理しても活性の低下が起こらない程度に安定性が向上したものが望ましい。
【００３０】
後述の実施例のように、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の酸性フォスファターゼのアミノ酸配列は、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の酸性フォスファターゼと高い相同性を有しており、配列番号４に示されるアミノ酸配列において７２番目のグリシン残基、１０２番目のグルタミン酸残基、１４９番目のスレオニン残基及び１５１番目のイソロイシン残基は、それぞれ配列番号８に示されるアミノ酸配列における７４番目のグリシン残基、１０４番目のグルタミン酸残基、１５１番目のスレオニン残基及び１５３番目のイソロイシン残基に相当する。また、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650以外にも、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939及びセラチア・フィカリア IAM 13540等の微生物に由来する酸性フォスファターゼのアミノ酸配列も、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の酸性フォスファターゼと相同性が高く、それぞれ配列番号４に示されるアミノ酸配列において７２番目のグリシン残基、１０２番目のグルタミン酸残基、１４９番目のスレオニン残基及び１５１番目のイソロイシン残基に相当するアミノ酸残基を有しており、同様にして変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を得ることができる。配列番号４に示されるアミノ酸配列における７２番目のグリシン残基、１０２番目のグルタミン酸残基、１４９番目のスレオニン残基及び１５１番目のイソロイシン残基に相当するアミノ酸残基は、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010及びクレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の酸性ホスファターゼでは、配列表配列番号２２、２４及び２６に示すアミノ酸配列において、９２番目のグリシン残基、１２２番目のグルタミン酸残基、１６９番目のスレオニン残基及び１７１番目のイソロイシン残基であり、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の酸性ホスファターゼでは、配列表配列番号２８に示すアミノ酸配列において、８８番目のグリシン残基、１１８番目のグルタミン酸残基、１６５番目のスレオニン残基及び１６７番目のイソロイシン残基である。
【００３１】
上記各酸性フォスファターゼのアミノ酸配列を比較した結果は図１２に示されている。図１２に基づいて、一つの酸性フォスファターゼのある位置のアミノ酸残基が、別の酸性フォスファターゼではどの位置のアミノ酸残基に相当するのかを判断することができる。
【００３２】
＜４＞酸性フォスファターゼ遺伝子の宿主への導入
上記のようにして得られる酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、酸性フォスファターゼ活性を高レベルに発現した組換え菌を得ることができる。その際、野生型酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を用いれば、野生型酸性ホスファターゼが、変異型酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を用いれば、変異型酸性ホスファターゼが発現される。
【００３３】
宿主としては、上記したHB101、JM109、DH5等のエシェリヒア・コリ菌株が挙げられるが、これ以外にも、構築した組換えＤＮＡの複製起点と酸性フォスファターゼ遺伝子が機能し、組換えＤＮＡが複製可能でかつ酸性フォスファターゼ遺伝子の発現が可能な細菌ならば、すべて宿主として利用できる。最も好ましい宿主の１つはエシェリヒア・コリ JM109である。
【００３４】
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主において複製可能なものであれば特に制限はない。宿主としてエシェリヒア・コリを用いる場合には当該細菌で自律複製できるプラスミドを挙げることができる。例えば、ColE1系プラスミド、p15A系プラスミド、Ｒ因子系プラスミド、ファージ系プラスミド等を用いることができる。具体的に例示すれば、pBR322（Gene, 2, 95 （1977））、pUC19（Gene, 33, 103（1985））、pUC119（Methods in Enzymology, 153, 3（1987））、pACYC184（Ｊ. Bacteriol, 134, 1141（1978））、pSC101（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240（1973））等が挙げられる。
【００３５】
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、宿主で機能可能なプロモーターを含んでいる場合には、そのままベクターに連結すればよい。前記ＤＮＡ断片がプロモーターを含まない場合には、前記遺伝子の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の宿主微生物内で働く他のプロモーターを連結すればよい。前記ＤＮＡ断片がプロモーターを含んでいる場合であっても、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を効率的に発現させるために、他のプロモーターと置換してもよい。
【００３６】
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとを連結させてなる組換えＤＮＡを宿主に導入する方法としては特に制限はなく、通常の方法により行うことができる。宿主としてエシェリヒア・コリを用いる場合には、塩化カルシウム法（J. Mol. Biol., 53, 159（1970）） 、Hanahan法（J. Mol. Biol.,166,557（1983））、ＳＥＭ法（Gene,96,23（1990））、Chungらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86,2172（1989））、電気穿孔法（Nucleic Acids Res., 16, 6127（1988））などの方法を用いることができる。
【００３７】
また、上記のように、酸性フォスファターゼ遺伝子を自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、酸性フォスファターゼ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Biotechnol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平2-109985）または相同組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００３８】
＜５＞組換え菌による酸性フォスファターゼ遺伝子の発現
上記のようにして得られる酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質転換体は、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要ならば有機栄養源を含む適当な培地で培養することにより酸性フォスファターゼ活性を高レベルで菌体内に発現することができる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、大豆加水分解物、その他が適宜用いられる。また、培地にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）等の、プロモーターに応じた発現誘導剤を添加することにより、酸性フォスファターゼ活性の発現量が上昇する場合がある。
【００３９】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてpH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行なえばよい。
【００４０】
次いで、培養物から菌体を回収し、破砕により無細胞抽出液を取得し、これから酸性フォスファターゼを精製することができる。精製には上記＜１＞に述べたような酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わせて用いられる。精製は完全精製である必要は必ずしもなく、基質のヌクレオシドの分解に関与する酵素等の夾雑物が除去できればよい。
【００４１】
＜６＞ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造
上記＜１＞で取得した酸性フォスファターゼ又は上記＜５＞に示したような遺伝子工学的手法により遺伝子を大量発現させて得られる酸性フォスファターゼをヌクレオシド並びに燐酸供与体、好ましくはポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチルリン酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に接触反応させることにより、反応液中にヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成することができる。この際、高い生産性を得るには、反応液のpHを3.0〜5.5の範囲の弱酸性に調製することが重要である。
【００４２】
また、遺伝子工学的手法により酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を大量発現させた場合、特に、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を大量発現させた場合には、精製した酸性フォスファターゼに替えて、形質転換体の菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾燥処理等した菌体処理物を使用することによっても、安価かつ効率的にヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成することができる。
【００４３】
使用するヌクレオシドとしては、プリンヌクレオシド類として、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、プリンリボシド、６−メトキシプリンリボシド、２，６−ジアミノプリンリボシド、６−フルオロプリンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−アミノ−６−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシン等、ピリミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シチジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ブロモウリジン、６−アザウリジン等が挙げられる。反応によりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオシドの５′位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応するヌクレオシド−５′−燐酸エステルが生成する。
【００４４】
反応液に添加するヌクレオシドの濃度は１〜20g/dlが望ましい。水に難溶性のヌクレオシドを使用する場合には、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を添加すると反応収率が向上する場合がある。
ヌクレオシドが発酵法により製造される場合には、発酵終了後の発酵液をそのまま燐酸化反応液に添加することができる。発酵液にヌクレオシド−５′−燐酸エステルを分解する成分が含まれる場合には、これら成分を除去する程度の精製操作を行うことが好ましい。
【００４５】
燐酸供与体として用いられるポリ燐酸（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、又はそれらのナトリウム塩、カリウム塩もしくはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムもしくはそれらの混合物などが、アセチル燐酸（塩）としては、アセチル燐酸リチウムカリウムなどが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃度によって決定される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍量が望ましい。
【００４６】
反応は通常、温度20〜60℃、好ましくは30〜40℃で、pH3.5〜6.5、好ましくはpH4.0〜5.0の弱酸性側が好結果を与える。温度安定性が向上した変異型酸性フォスファターゼで反応を行う場合には、反応温度は20〜70℃、好ましくは30〜60℃である。反応には静置又は攪はんのいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１〜100時間である。
【００４７】
このようにして生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法が採用できる。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４９】
燐酸転移活性の測定は、イノシンを基質として次の条件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH5.0、30℃で10分反応を行った。2Ｎ塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により生成した５′−イノシン酸を定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolの５′−イノシン酸を生成する酵素量を１unitと定めた。
【００５０】
また、燐酸エステル加水分解活性の測定は、５′−イノシン酸を基質として次の条件で行った。５′−イノシン酸10μmol/ml、メス／NaOH緩衝液（pH6.0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（１ml）で30℃で10分反応を行った。２Ｎ塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、加水分解反応により生成したイノシンを定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolのイノシンを生成する酵素量を１unitと定めた。
【００５１】
なお、イノシン及び５′−イノシン酸は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
カラム：Cosmosil 5Ｃ18-AR （4.6×150mm）〔ナカライテスク社製品〕
移動相：5mM 燐酸カリウムバッファー（pH 2.8）／メタノール ＝ 95／5
流速：1.0ml/min
温度：室温
検出：ＵＶ245nm
【００５２】
また、イノシン以外のヌクレオシドを原料とするヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生成反応においても、原料のヌクレオシド及び生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルは、上記と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５３】
実施例１  モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼの精製と性質
ペプトン１g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩１g/dlを含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培養したモルガネラ・モルガニ NCIMB 10466を一白金耳接種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離により回収した菌体約3,000gを１Ｌの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【００５４】
この無細胞抽出液に30％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離で集め、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
【００５５】
この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）５Ｌに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したDEAE-トヨパール 650Mカラム（φ4.1×22cm）にチャージし、800mlの20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性は、素通り画分にあったので、当該画分を回収した。
【００５６】
この活性画分に、35％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、35％硫安飽和の20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したブチルトヨパールカラム（φ3.1×26cm）に吸着させた。35％飽和から20％飽和燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。
【００５７】
活性画分を集め、50mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）１Ｌに対し透析した後、50mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（φ5×6.5cm）に吸着させた。50mMから300mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。
【００５８】
活性画分を集め、限外ろ過により濃縮した。この酵素液をHiLoadＴＭ 16/60 Superdex200カラム（ファルマシア社製品）に注入し、100mM食塩を含む50mM燐酸カリウムバッファー(pH7.0)、流速1.0ml/分にて溶出した。
【００５９】
以上の操作によって、燐酸転移活性を示す酵素を無細胞抽出液より最終的に約10％の回収率で約550倍に精製した。この精製過程における比活性及び回収率を表１に示す。この酵素標品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において均一であった。
【００６０】
【表１】
0004304727.tif 000002
【００６１】
精製された酵素は次の性質を有していた。
（１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシドに燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示す。
（２）基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが燐酸供与体となる。また、燐酸受容体としてはプリンリボシド、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一方、燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、さらに、５′−プリンリボチド、５′−イノシン酸、５′−グアニル酸、５′−アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用を受ける。
（３）至適pH：5.2（燐酸転移反応）、6.5（燐酸エステル加水分解反応）
（４）pH安定性：pH3.0〜12.0（30℃、60分処理）
（５）至適温度：35℃付近
（６）温度安定性：30℃まで安定（pH7.0、30分処理）
（７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属イオン添加による活性化現象は見られず、Ag2+、Pb2+、Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード酢酸によって阻害される。
（８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G-3000SW、東ソー社製品)により約190,000と算出される。
（９）サブユニット分子量：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約25,000と算出される。
【００６２】
本酵素はヌクレオシドへの燐酸転移活性だけでなく、逆に燐酸エステルを加水分解する活性も示し、しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べて20倍以上高い活性を示した。また、その他の性質もモルガネラ属の菌が産生する既知の酸性フォスファターゼとよく一致することから（Microbiology, 140, 1341-1350 (1994)）、本酵素は酸性フォスファターゼであることが明らかとなった。
【００６３】
ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及びイノシン２g/dlをpH5.5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッファーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとなるように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は、５′−イノシン酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結果を図１に示す。５′−イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い方が高くなった。５′−イノシン酸の生産にはpH4.0の反応条件が最も効率がよく、３時間の反応で2.60g/dlの５′−イノシン酸が生成蓄積した。
【００６４】
実施例２  モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応
ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及び燐酸受容体としてイノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンを２g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例１の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、30℃で３時間反応させた。反応により生成したヌクレオシド−５′−エステルの量を表２に示す。
【００６５】
なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシド−５′−エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌクレオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかった。
【００６６】
【表２】
0004304727.tif 000003
【００６７】
実施例３  モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする５′−イノシン酸の生産
イノシン２g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例１で調製した酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら30℃で３時間反応させた。反応により生成した５′−イノシン酸の量を表３に示す。
【００６８】
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。
【００６９】
【表３】
0004304727.tif 000004
【００７０】
実施例４  エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼの精製と性質
ペプトン１g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩１g/dlを含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培養したエシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650を一白金耳接種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離により菌体を回収した。この菌体約3,300gを１Ｌの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【００７１】
この無細胞抽出液に30％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離により生成した沈澱を除去した後、上清液に60％飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離により回収し、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。
【００７２】
この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）５Ｌに対し４回透析した後、20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したDEAE-トヨパール650Mカラム（φ6.2×35cm）にチャージし、20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活性は素通り画分にあったので、当該画分を回収した。
【００７３】
この活性画分に35％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを35％飽和硫酸アンモニウムを含む20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したブチルトヨパールカラム（φ5.0×22.5cm）に吸着させた。これを35％飽和から20％飽和燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。
【００７４】
活性画分を集め、100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）１Ｌに対し透析した後、100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（φ3.0×7.0cm）に吸着させた。これを50mMから100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。
【００７５】
この酵素液を10mM燐酸カリウムバッファー（pH6.0）１Ｌに対し透析した後、10mM燐酸カリウムバッファー（pH6.0）で平衡化したCM-Toyopearlカラム（φ2.0×14.0cm）に吸着させた。これを0mMから300mM 塩化カリウムを含む燐酸カリウムバッファー（pH6.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。この活性画分を集めた。
【００７６】
以上の操作によって、燐酸転移活性を示す酵素を無細胞抽出液より最終的に約16％の回収率で約600倍に精製した。この精製過程における比活性及び回収率を表４に示す。この酵素標品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において均一であった。
【００７７】
【表４】
0004304727.tif 000005
【００７８】
精製された酵素は次の性質を有していた。
（１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシドに燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示す。
（２）基質特異性：燐酸転移反応においてはピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムなどが燐酸供与体となる。また燐酸受容体としてはプリンリボシド、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容体となる。一方、燐酸エステル加水分解反応においては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、そして５′−プリンリボチド、５′−イノシン酸、５′−グアニル酸、５′−アデニル酸、５′−キサンチル酸、５′−ウリジル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌクレオチドが作用を受ける。
（３）至適pH：5.2（燐酸転移反応）、6.5（燐酸エステル加水分解反応）
（４）pH安定性：pH3.5〜12.0（30℃、60分処理）
（５）至適温度：35℃付近
（６）温度安定性：40℃まで安定（pH7.0、30分処理）
（７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属イオン添加による活性化現象は見られず、Fe2+、Ag2+、Pb2+、Hg2+及びCu2+によって阻害される。また、ヨード酢酸によって阻害される。
（８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G-3000SW、東ソー社製品)により約188,000と算出される。
（９）サブユニット分子量：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約24,500と算出される。
【００７９】
本酵素もモルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の無細胞抽出液より精製した酵素と同様にヌクレオシドへの燐酸転移活性だけでなく、逆に燐酸エステルを加水分解する活性も示した。しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性に比べて30倍以上高い活性を示すことから、酸性フォスファターゼであることが明らかとなった。
【００８０】
ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン３g/dlをpH5.5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリウムバッファーに溶解し、これに上記の酵素標品を50units/dlとなるように添加した。各pHを維持しながら30℃で６時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は５′−イノシン酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結果を図２に示す。５′−イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大となったが、５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低い範囲の方が高く、５′−イノシン酸の生産はpH4.0の反応条件が最も効率的であった。30℃、pH4.0の反応では３時間で1.56g/dlの５′−イノシン酸が生成蓄積した。
【００８１】
実施例５  エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応
ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジンを３g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で３時間反応させた。生成したヌクレオシド−５′−エステルの量を表５に示す。
【００８２】
なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシド−５′−エステルのみでヌクレオシド−２′−エステル及びヌクレオシド−３′−エステルの副生は全く認められなかった。
【００８３】
【表５】
0004304727.tif 000006
【００８４】
実施例６  エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体とする５′−イノシン酸の生産
イノシン２g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、千代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに実施例４で調製した酵素標品を上記の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で３時間反応させた。生成した５′−イノシン酸の量を表６に示す。
【００８５】
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナトリウムを燐酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。
【００８６】
【表６】
0004304727.tif 000007
【００８７】
実施例７  モルガネラ・モルガニ染色体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の無細胞抽出液から実施例１記載の方法に従い精製した酸性フォスファターゼをＤＩＴＣメンブレン（Milligen/Biosearch社製）に吸着させ、Prosequencer 6625（Milligen/Biosearch社製）を用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番号１に示した20残基のＮ末端アミノ酸配列が決定された。
【００８８】
（２）酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離
モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の培養菌体からMurray and Thomsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。これを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離により３〜６kbpのＤＮＡ断片を分画した。プラスミドベクターpUC118（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、部分分解した染色体ＤＮＡ断片と連結させた。ＤＮＡの連結はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行った。次いで、得られたＤＮＡ混合物を用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換体をアンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーティングして生育させ、遺伝子ライブラリーを作成した。
【００８９】
形質転換体の生育した寒天培地の表面に４mM ｐ−ニトロフェニル燐酸及び100mM メス／ＮａＯＨバッファー（pH6.5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォスファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノールを遊離して黄色を示すため、これを指標として形質転換体を選択した。約20,000株の形質転換体の遺伝子発現ライブラリーを探索した結果、フォスファターゼ活性を発現した形質転換体30株が得られた。
【００９０】
フォスファターゼ活性を発現した30株の形質転換体を単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液より集菌した菌体にイノシン２g/dl及びピロ燐酸ナトリウム10g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）50μlを添加し、30℃で16時間反応を行った。ＨＰＬＣ分析にて５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、目的の酸性フォスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有すると予想される形質転換体５株を得ることができた。
【００９１】
実施例８  モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定
実施例７で得られたモルガネラ・モルガニ NCIMB10466由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有すると予想される形質転換体の１株より、アルカリ溶菌法（Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratoty Press, p1.25（1989））によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。なお、このプラスミドをpMPI501と命名した。決定した挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図３に示す。
【００９２】
さらにサブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＨｉｎｄIIIと制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出される1.2Kbpの大きさの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のために、この1.2kbpの断片をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで切断したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。pMPI505と命名したこのプラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造（社）製）を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。
【００９３】
pMPI505を保有するエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)）に従って行った。決定したオープン・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号２に示した。また、この塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号３に示した。このアミノ酸配列中に精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する配列が存在した。精製酵素のＮ末端は配列番号３に示される配列の21番目のアラニン残基から開始していたため、配列番号３に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、１番目のメチオニン残基から20番目のアラニン残基までのペプチドは翻訳後に除去されるものと考えられた。これより推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号４に示した。アミノ酸配列から予想される成熟蛋白質の分子量は24.9キロダルトンと算出され、精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。以上の結果及び本断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示すことから本オープン・リーデイング・フレームは目的の酸性フォスファターゼをコードする領域であると同定した。
【００９４】
塩基配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号２に示される塩基配列は、既知のモルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子（Thaller, M. C. et. al. Microbiology , 140, 1341 (1994)）では、54番目のＧがＡ、72番目のＧがＡ、276番目のＴがＧ、378番目のＴがＣ、420番目のＧがＴ、525番目のＣがＧ、529番目のＣがＴ、531番目のＧがＡである以外は配列が一致し、また、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列は、モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼと同一であることが判明した。すなわち、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の酸性フォスファターゼ遺伝子である。
【００９５】
なお、前駆体蛋白質は249個のアミノ酸から成り、その配列から予想される蛋白質の分子量は27.0キロダルトンであった。
【００９６】
また、pMPI505をエシェリヒア・コリ JM 109に保持させた株は、AJ13143と命名され、平成８年２月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号FERM BP-5422が付与されている。
【００９７】
実施例９  モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅
実施例８にて構築したエシェリヒア・コリ JM109／pMPI505をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【００９８】
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プラスミドpUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリ JM109及びモルガネラ・モルガニ野生株より調製した無細胞抽出液の活性を対照として測定した結果を表７に示した。エシェリヒア・コリ JM109／pUC118では燐酸転移活性は検出されず、モルガネラ・モルガニ野生株でも燐酸転移活性は低かった。一方、エシェリヒア・コリ JM109／pMPI505はモルガネラ・モルガニ野生株に比べて比活性で150倍と高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入したＤＮＡ断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを高発現していることが示された。
【００９９】
【表７】
0004304727.tif 000008
【０１００】
実施例１１  エシェリヒア・ブラッタエ染色体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離
（1）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の無細胞抽出液から精製した酸性フォスファターゼをＤＩＴＣメンブレン（ミリジェン／バイオサーチ社製）に吸着させ、Prosequencer 6625（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番号５に示す15残基のＮ末端アミノ酸配列が決定された。
【０１０１】
（2）酸性フォスファターゼをコードする遺伝子断片の単離
エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の培養菌体からMurray and Thomsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。これをＳａｕ３ＡＩで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離により３〜６KbpのＤＮＡ断片を分画した。プラスミドベクターpUC118（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで切断し、部分分解した染色体ＤＮＡ断片と連結させた。ＤＮＡの連結はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行った。次いで、得られたＤＮＡ混合物を用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換体をアンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーティングして生育させ、遺伝子ライブラリーを作成した。
【０１０２】
形質転換体の生育した寒天培地の表面に４mM ｐ−ニトロフェニル燐酸及び100mM メス／ＮａＯＨバッファー（pH6.5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分間保温した。フォスファターゼ活性を発現した菌は、ｐ−ニトロフェノールを遊離して黄色を示すため、これを指標として、形質転換体を選択した。約8,000株の形質転換体の染色体遺伝子発現ライブラリーを探索した結果、フォスファターゼ活性を発現した形質転換体14株が得られた。
【０１０３】
フォスファターゼ活性を発現した14株の形質転換体を単コロニー分離し、アンピシリン100μg/mlを含むＬ培地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。培養液から集菌した菌体にイノシン２g/dl及びピロ燐酸ナトリウム10g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）50μlを添加し、30℃ 16時間反応を行った。ＨＰＬＣ分析にて ５′−イノシン酸の生成を検出し、燐酸転移活性を持つ菌株を選択した。その結果、燐酸転移活性を示し、目的の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると予想される形質転換体３株を得ることができた。
【０１０４】
実施例１２  エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650由来酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定
実施例１１で得られたエシェリヒア・ブラッタエ  JCM 1650由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有すると予想される形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドをpEPI301と命名した。決定した挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を図５に示す。
【０１０５】
さらにサブクローニングにより酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＣｌａＩとＢａｍＨＩで切り出される2.4kbpの大きさの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のために該断片をＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで切断したpBluescript KS（+）（ストラテジーン社製）に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。pEPI305と命名したこのプラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造製）を形質転換し、これをアンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。
【０１０６】
pEPI305を保有するエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行った。決定したオープン・リーデイング・フレームの塩基配列を配列表配列番号６に示した。この塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号７に示した。このアミノ酸配列中に精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する配列が存在した。精製酵素のＮ末端は配列表配列番号７の配列の19番目のロイシン残基から開始していたため、配列番号７に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、１番目のメチオニン残基から18番目のアラニン残基までのペプチドは翻訳後に除去されるものと考えられた。これより推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号８に示した。これより予想される成熟蛋白質の分子量は25.1キロダルトンと算出され、精製酵素ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。以上の結果及び本断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示すことから本オープン・リーデイング・フレームは目的の酸性フォスファターゼをコードする領域であると同定した。
【０１０７】
すなわち、配列表番号８に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の酸性フォスファターゼ遺伝子である。
【０１０８】
塩基配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表番号５に示される蛋白質及びそれをコードするＤＮＡは新規であることが判明した。本遺伝子のコードする前駆体蛋白質は249個のアミノ酸から成り、その配列から予想される蛋白質の分子量は27.0キロダルトンであった。
【０１０９】
アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った結果、本蛋白質はプロビデンシア・スチュアルテイ（Providencia stuartii）の酸性フォスファターゼと77.4％、実施例８のモルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）の酸性フォスファターゼと77.1％、サルモネラ・チヒムリウム（Salmonella typhimurium）の酸性フォスファターゼと44.3％の相同性を示した。
【０１１０】
なお、pEPI305をエシェリヒア・コリ JM 109に保持させた株は、AJ13144と命名され、平成８年２月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号FERM BP-5423が付与されている。
【０１１１】
実施例１３  エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650 由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅
実施例１２で作成したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【０１１２】
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プラスミドpBluescript KS（+）で同様に形質転換したエシェリヒア・コリ JM109及びエシェリヒア・ブラッタエ野生株より調製した無細胞抽出液を対照として測定した結果を表８に示した。エシェリヒア・コリ JM109／pBluescript KS（+）では燐酸転移活性は検出されず、エシェリヒア・ブラッタエ野生株でも燐酸転移活性は低かった。一方、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI305はエシェリヒア・ブラッタエ野生株に比べて比活性で120倍と高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入したＤＮＡ断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを高発現していることが示された。
【０１１３】
【表８】
0004304727.tif 000009
【０１１４】
実施例１４  エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650 由来の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸の生産
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン６ｇ/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記のエシェリヒア・コリ JM109／pEPI305の菌体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で10時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸及び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結果を図６に示す。本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積した。
【０１１５】
実施例１５  燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子の作成
実施例１３及び１４に示したようにエシェリヒア・ブラッタエ由来酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積する。しかし、生成した５′−イノシン酸が酸性フォスファターゼ自体が有する燐酸エステル加水分解活性によって分解を受けるために５′−イノシン酸の蓄積量がある程度以上上がらないことが判明した。そこで実施例１１にてクローニングしたエシェリヒア・ブラッタエ由来酸性フォスファターゼ遺伝子にＰＣＲを用いる部位特異的変異法により変異を導入し酵素の性質の改良を行うこととした。
【０１１６】
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列表配列番号９、１０及び１１に示すオリゴヌクレオチドMUT300、MUT310及びMUT320をそれぞれ合成した。
【０１１７】
鋳型として実施例１２で調製したプラスミドpEPI305 １ng、プライマーとしてＭ13プライマーＲＶ（宝酒造社製）及びMUT310オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム  50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリスー塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドpEPI305 １ng、プライマーとしてＭ13プライマーＭ3（宝酒造社製）及びMUT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【０１１８】
それぞれのＰＣＲ反応液１μlをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mMトリスー塩酸緩衝液（pH8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックＤＮＡポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にＭ13プライマーＲＶ及びＭ13プライマーＭ3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【０１１９】
２回目のＰＣＲ反応の生成物をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このＤＮＡ断片をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断したpBluescript KS（＋）に結合し、得られたプラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。
【０１２０】
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。このようにして成熟蛋白質の74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（G*A*T）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI310と命名した。
【０１２１】
鋳型としてpEPI305、プライマーとしてMUT300とMUT320オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟蛋白質の153番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニン残基（A*CC）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI320と命名した。さらに鋳型としてpEPI310、プライマーとしてMUT300とMUT320オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟蛋白質の74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（G*A*T）に、153番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニン残基（A*CC）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI330と命名した。
【０１２２】
それぞれの変異型遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI310、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI320、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性をpH4.0にて測定し、野生株のものと比較した。
【０１２３】
野生型および燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した結果を表９に示す。燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼは、野生型酸性フォスファターゼと比較して、燐酸エステル加水分解活性と燐酸転移活性がいずれも低下していたが、燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大きく、その結果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォスファターゼに比べて低くなっていた。
【０１２４】
【表９】
0004304727.tif 000010
【０１２５】
実施例１６  燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸の生産
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI310、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI320、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。
【０１２６】
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン６g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記培養で得たエシェリヒア・コリ各菌株の菌体を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図７に示す。
【０１２７】
図７中、縦軸は５′−イノシン酸の濃度（mg/dl）を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI305、黒埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI310、白抜き円形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI320、白抜き四角形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI330の各菌体を使用した場合の反応の推移を示す。
【０１２８】
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−イノシン酸の生産反応においては生成した５′−イノシン酸の分解速度が低下しており、その結果として ５′−イノシン酸の収率及び蓄積量が向上した。７４番目のグリシン残基及び１５３番目のイソロイシン残基がそれぞれアスパラギン酸残基及びスレオニン残基へと置換された燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア・コリ JM109／pEPI330が最も高い５′−イノシン酸の蓄積を示した。
【０１２９】
実施例１７  燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生産
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI330をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及び燐酸受容体としてイノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン６g/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で200ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させた。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エステルの量を表１０に示した。なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシド−５′−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２′−燐酸エステル及びヌクレオシド−３′−燐酸エステルの副生は全く認められなかった。
【０１３０】
【表１０】
0004304727.tif 000011
【０１３１】
実施例１８  燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いる各種燐酸化合物を燐酸供与体とする５′−イノシン酸の生産
燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI330をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。
イノシン６g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナトリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、千代田化学（株）製品）、フェニル酢酸ジナトリウム又はカルバミル燐酸ジナトリウム12g/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で200ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させた。生成した５′−イノシン酸の量を表１１に示した。いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。
【０１３２】
【表１１】
0004304727.tif 000012
【０１３３】
実施例１９  エシェリヒア・ブラッタエＪＣＭ1650 由来新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の作製および変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の酵素学的性質の検討
実施例１９〜２２においては、ヌクレオシドへの燐酸転移活性の測定は次の条件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100μmol/mlおよび酵素を含む反応液（1ml）でpH4.0、30℃で10分反応を行った。2Ｎ塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により生成した5’−イノシン酸を上記の条件で定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolのイノシン酸を生成する酵素量を1unitと定めた。
【０１３４】
また、上記の組成の反応条件においてイノシン濃度を10から100μmol/mlまで変化させて燐酸転移活性を測定し、Hanes-Woolfプロット（Biochem.J., 26,1406 (1932)）により燐酸転移反応におけるイノシンの速度定数を求めた。
【０１３５】
後述するように実施例１５に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が向上した変異型酵素について、詳細な分析を行った結果、変異型酵素は野生型酵素に比べてヌクレオシドに対する親和性が２倍程度に向上していることが明らかになった。そこで本発明者らは、さらに該酵素のヌクレオシドに対する親和性を上げればヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が向上するであろうと考え、遺伝子工学的手法を用いてさらなる酵素の改変を行った。
【０１３６】
実施例１５に記載のエシェリヒア・ブラッタエＪＣＭ1650 由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpEPI305を用い、このプラスミドＤＮＡに遺伝子工学的手法により部位特異的変異を導入し、変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した。pEPI305はエシェリヒア・ブラッタエＪＣＭ1650 に由来する野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素ＣｌａＩと制限酵素ＢａｍＨＩで切り出される2.4Kbpの大きさのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで切断したpBluescript KS(+)（ストラテジーン社製）に結合したプラスミドＤＮＡであり、該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の塩基配列は配列表配列番号６に示される配列である。また、この塩基配列より予想される前駆体蛋白質のアミノ酸配列は配列表配列番号７に示される配列である。そして精製酵素の分析結果（実施例４に記載）から成熟蛋白質のアミノ酸配列は配列表配列番号８に示される配列であると推定される。
【０１３７】
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列表に示す配列のオリゴヌクレオチドMUT300（配列表配列番号９）、MUT310（配列表配列番号１０）、MUT320（配列表配列番号１１）、MUT330（配列表配列番号１２）、MUT340（配列表配列番号１３）、MUT350（配列表配列番号１４）、MUT360（配列表配列番号１５）、MUT370（配列表配列番号１６）、MUT380（配列表配列番号１７）およびMUT390（配列表配列番号１８）を合成した。
【０１３８】
鋳型としてpEPI305  1ng、プライマーとしてＭ13プライマーＲＶ（宝酒造社製）およびMUT310オリゴヌクレオチド各2.5μmolおよびタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム
【０１３９】
50mMおよび塩化マグネシウム  1.5mMを含む100mM  トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドＤＮＡpEPI305  1ng、プライマーとしてＭ13プライマーＭ3（宝酒造社製）およびMUT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【０１４０】
それぞれのＰＣＲ反応液1μlをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウム  1.5mMを含む100mM  トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックＤＮＡポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にＭ13プライマーＲＶおよびＭ13プライマーＭ3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【０１４１】
2回目のＰＣＲ反応の生成物をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このＤＮＡ断片をＣｌａＩとＢａｍＨＩで切断したｐBluescript KS（＋）に結合し、得られたプラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア・コリＪＭ109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。  形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列の決定は  Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit （アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。このようにして成熟蛋白質の74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（G*A*T）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI310と命名した（実施例１５）。
【０１４２】
変異を導入したプラスミドを鋳型として同様の操作を繰り返し、累加的に部位特異的変異を導入した。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。作製した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子と変異部位を表１２に示した。変異部位のアミノ酸残基は配列表配列番号８に示した成熟蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を示している。
【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ109／pEPI330、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI340、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI350、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI360、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI370、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI390、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI400および野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI305をアンピシリン100μg/mlおよびＩＰＴＧ1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。それぞれの菌の培養液2Ｌから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。菌体を50ｍｌの100ｍＭ燐酸バッファー（pH7.0）に懸濁し、4℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。それぞれの無細胞抽出液より実施例４に記載の方法にてそれぞれの酸性フォスファターゼの精製を行った。各酵素標品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において均一であった。
【０１４５】
精製した各変異型酸性フォスファターゼおよび野生型酸性フォスファターゼの燐酸転移反応におけるイノシンの速度定数を求めた結果を表１３に示した。実施例１５に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が向上したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI330で発現している変異型酵素は、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI305で発現している野生型酵素に比べてＶmaxは低下しているものの、イノシンに対するＫｍ値が大きく低下し、イノシンに対する親和性が２倍以上に向上していることが明らかになった。これより本変異型酵素のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が飛躍的に向上したのは、ヌクレオチダーゼ活性が低下したためだけでなく、ヌクレオシドに対する親和性が向上したことも重要なファクターとなっていることが示唆された。そこで、さらにヌクレオシドに対する親和性を上昇させれば生産性が向上することが予想された。
【０１４６】
本実施例にて作製した新規変異型酵素遺伝子を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109で発現している新規変異型酵素はいずれも実施例１５に記載のエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI330のものよりもさらにイノシンに対する親和性が向上しており、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が向上していることが期待された。また、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380で発現している変異型酵素は、イノシンに対する親和性が向上しているだけでなく、Ｖmaxも野生型酵素よりも高くなっており、さらにヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産性が向上していることが期待された。
【０１４７】
【表１３】
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【０１４８】
実施例２０  新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−イノシン酸の生産
変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入した、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI330、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI340、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI360、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI370、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380をアンピシリン100μg/mlおよびＩＰＴＧ1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸15g/dl、およびイノシン8g/dlを酢酸バッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記の変異型および野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109の菌体を乾燥菌体重量で200ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応を行い、経時的に生成した５’−イノシン酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は５’−イノシン酸のみで２’−イノシン酸および３’−イノシン酸の副生は全く認められなかった。結果を図８に示す。
【０１４９】
実施例１５に記載のエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI330は高い５’−イノシン酸の蓄積を示すが、基質がまだ残存するにもかかわらず、５’−イノシン酸の蓄積が7.5g/dl程度に達した時点で５’−イノシン酸の生成が停止し、それ以上は蓄積が上がらなかった。それに比べて、新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株はいずれも高い蓄積を示した。なかでもエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI370およびエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380を用いた反応においては、さらに高い５’−イノシン酸の蓄積を示した。また、反応速度も速く、５’−イノシン酸の生産性がさらに飛躍的に向上していることが示された。特にエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380は反応速度が速く、非常に高い生産性を示した。
【０１５０】
実施例２１  新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産
新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380をアンピシリン100μg/mlおよびＩＰＴＧ1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸15g/dl、および燐酸受容体としてイノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンを8g/dlを100ｍＭ酢酸バッファー（pH4.5）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で12時間反応させた。生成したヌクレオシド−5’−燐酸エステルの量を表１４に示した。いずれのヌクレオシドを用いた場合にも良好に燐酸化反応が進行し、それぞれ対応するヌクレオシド−５’−燐酸エステルが生成蓄積した。なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシド−５’−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２’−燐酸エステルおよびヌクレオシド−３’−燐酸エステルの副生は全く認められなかった。
【０１５１】
【表１４】
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【０１５２】
実施例２２  新規酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いる各種燐酸化合物を燐酸供与体とする５’−イノシン酸の生産
新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380をアンピシリン100μg/mlおよびＩＰＴＧ1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。
イノシン6g/dl、および燐酸供与体としてトリポリ燐酸、ポリ燐酸（千代田化学（株）製品、商品名「ポリゴンＰ」）、フェニル酢酸ジナトリウム、またはカルバミル燐酸ジナトリウム15g/dlを100ｍＭ酢酸バッファー（pH4.0）に溶解し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で12時間反応させた。生成した５’−イノシン酸の量を表１５に示した。いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５’−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体として用いた場合に最も５’−イノシン酸の蓄積量が高かった。
【０１５３】
【表１５】
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【０１５４】
実施例２３  プロビデンシア・スチュアルティ染色体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離と塩基配列の確認
既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列（EMBL Accession number X64820）を基に、該酸性フォスファターゼ遺伝子を増幅するようにデザインした配列表配列番号１９及び２０に示す配列を有するＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーPRP1及びPRP2を合成した。
【０１５５】
プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851の培養菌体から、Murry and Thompsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8, (1980)）に従い染色体ＤＮＡを調製した。鋳型としてこの染色体ＤＮＡ 0.1ng、プライマーとしてPRP1及びPRP2オリゴヌクレオチド各2.5μmol並びにタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mM及び塩化マグネシウム1.5mMを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを30回繰り返すＰＣＲ反応を行った。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅された約１kbpのＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて回収した。この遺伝子断片をＢａｍＨＩで切断後、ＢａｍＨＩで切断したpUC118に結合した。このプラスミドをpPRP100と命名した。
pPRP100を導入したエシェリヒア・コリ JM109/pPRP100の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定した。その結果、本菌は燐酸エステル加水分解活性だけでなく、ヌクレオシドへの燐酸転移活性も示した。
【０１５６】
エシェリヒア・コリ JM109/pPRP100よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行った。決定したオープン・リーデイング・フレームの塩基配列及びこの塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号２１及び配列番号２２に示した。本オープン・リーデイング・フレームの塩基配列は既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列と完全に一致した。
【０１５７】
実施例２４  エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ及びセラチア・フィカリアの染色体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離と塩基配列の決定
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシエラ・プランティコラIFO 14939及びセラチア・フィカリア IAM 13540の培養菌体からMurry and Thompsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8, (1980)）に従い、それぞれの染色体ＤＮＡを調製した。ついで、実施例７（２）と同様の方法により、約20,000株のエシェリヒア・コリ JM109の形質転換体よりなる染色体遺伝子発現ライブラリーをそれぞれ作成し、探索した結果、燐酸転移活性を示す形質転換体を得ることができた。これらの形質転換体はそれぞれの菌株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を保有すると考えられた。
【０１５８】
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を保有すると考えられるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドをpENP100と命名した。決定したエンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図９に示す。
【０１５９】
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＳａｌＩと制限酵素ＫｐｎＩで切り出される1.6kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のためにこのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片をＳａｌＩ及びＫｐｎＩで切断したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。このプラスミドをpENP110と命名した。
【０１６０】
同様に、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると考えられるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドをpKLP100と命名した。決定したクレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１０に示す。
【０１６１】
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出される2.2kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のためにこのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。このプラスミドをpKLP110と命名した
【０１６２】
また、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有すると考えられるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体の１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドをpSEP100と命名した。決定したセラチア・フィカリア IAM 13540由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１１に示す。
【０１６３】
サブクローニングにより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＨｉｎdIIIで切り出される1.4kbpの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列の決定のためにこのＨｉｎdIII断片をＨｉｎdIIIで切断したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。このプラスミドをpSEP110と命名した。
【０１６４】
pENP110、pKLP110及びpSEP110をそれぞれ導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP110、エシェリヒア・コリ JM109/pKLP110及びエシェリヒア・コリ JM109/pSEP110の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりそれぞれのプラスミドを調製し、実施例８の方法に従い、挿入断片の塩基配列の決定を行った。決定したそれぞれの挿入断片のオープン・リーデイング・フレームの塩基配列のうちエンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来のものを配列表配列番号２３に、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来のものを配列表配列番号２５に、そしてセラチア・フィカリア IAM 13540由来のものを配列表配列番号２７に示した。また、各々の推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２４、２６、２８に示した。各ＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸転移活性を示したことから、これらのオープン・リーデイング・フレームは目的の酸性フォスファターゼ遺伝子であると同定した。
【０１６５】
塩基配列、アミノ酸配列各々について既知の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号２３、２５及び２７に示される遺伝子はいずれも新規な遺伝子であることが判明した。また、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の遺伝子がコードする蛋白質は248個、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の遺伝子がコードする蛋白質は248個、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の遺伝子がコードする蛋白質は244個のアミノ酸からそれぞれなるものと推定された。なお、これらの蛋白質は、モルガネラ・モルガニ及びエシェリヒア・ブラッタエの酸性フォスファターゼの場合と同様、前駆体蛋白質である可能性がある。
【０１６６】
また、これらの塩基配列より予想される蛋白質のアミノ酸配列を実施例８で推定したモルガネラ・モルガニ NCIMB 10466、実施例１２で推定したエシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650及び既知のプロビデンシア・スチュアルティ（EMBL Accession number X64820）の酸性フォスファターゼの前駆体蛋白質のアミノ酸配列と共にアミノ酸の一文字表記で図１２に示した。図中ですべてのアミノ酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示した。
【０１６７】
図１２に示したように６種類の菌株由来の酸性フォスファターゼのアミノ酸配列は非常に相同性が高く、130個のアミノ酸残基がすべてのアミノ酸配列において共通していた。これより、これらの酸性フォスファターゼは非常に類似する機能を持つことが予想される。
【０１６８】
実施例２５  プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ 及びセラチア・フィカリア由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅
実施例２３にて構築したエシェリヒア・コリ JM109/pPRP100、実施例２４にて構築したエシェリヒア・コリ JM109/pENP110、エシェリヒア・コリ JM109/pKLP110及びエシェリヒア・コリ JM109/pSEP110をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【０１６９】
得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシエラ・プランティコラ IFO 14939、セラチア・フィカリア IAM 13540及びプラスミドpUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・コリ JM109より調製した無細胞抽出液の活性を対照として測定した結果を表１６に示した。いずれの菌も野生株の燐酸転移活性は低かった。また、エシェリヒア・コリ JM109/pUC118では燐酸転移活性は検出されなかった。一方、酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ JM109の形質転換体はいずれも野生株に比べて高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入した遺伝子断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォスファターゼを高発現していることが示された。
【０１７０】
【表１６】
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【０１７１】
実施例２６  温度安定性の向上した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の作製
実施例２０、２１および２２に記載したように実施例１９にて作製したエシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、高い変換収率で５′−イノシン酸が生成蓄積した。本酸性フォスファターゼの反応至適温度は35℃であったが、この反応をより高温で行えれば反応速度が上昇し、かつ反応液中のリン酸受容体のヌクレオシド濃度を上げて反応を行えるため、さらに短時間で効率的にヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造が可能になると予想された。そこで実施例１９にてクローニングしたエシェリヒア・ブラッタエ由来酸性フォスファターゼ遺伝子にＰＣＲを用いる部位特異的変異法により変異を導入し酵素の温度安定性を向上させることとした。
【０１７２】
実施例１９記載のエシェリヒア・ブラッタエＪＣＭ1650 由来変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpEPI380を用い、このプラスミドＤＮＡに遺伝子工学的手法により部位特異的変異を導入し、温度安定性の向上した変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した。pEPI380はエシェリヒア・ブラッタエＪＣＭ1650 に由来する変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む制限酵素ＣｌａＩと制限酵素ＢａｍＨＩで切り出される2.4Kbpの大きさのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで切断したpBluescript KS(+)（ストラテジーン社製）に結合したプラスミドＤＮＡである。該酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の塩基配列より予想される成熟蛋白質のアミノ酸配列は配列表配列番号８に示される配列のうち、実施例１９中の表１２に示した１１個のアミノ酸残基がそれぞれ置換された配列であると推定される。
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列表に示す配列のオリゴヌクレオチドMUT300（配列表配列番号９）、MUT400（配列表配列番号２９）、MUT410（配列表配列番号３０）を合成した。
【０１７３】
鋳型として実施例１９記載のpEPI380、変異導入用プライマーとしてMUT300およびMUT410を用いて、実施例１５と同様にしてＰＣＲを用いる方法によって、成熟蛋白質の１０４番目のグルタミン酸残基（ＧＡＧ）がグリシン残基（ＧＧ*Ｔ*）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI410と命名した。また、同様に鋳型としてpEPI380、変異導入用プライマーとしてMUT300およびMUT310オリゴヌクレオチドMUT420を用いて１５１番目のスレオニン残基（ＡＣＣ）がアラニン残基（Ｇ*ＣＣ）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI420と命名した。
【０１７４】
変異型フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドpEPI410およびpEPI420を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109の 形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製して塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。
【０１７５】
本実施例にて作製した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ ＪＭ109／pEPI410、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI420、および実施例１９記載のエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380をアンピシリン100μg/mlおよびIPTG 1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。それぞれの菌の培養液50mlから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。菌体を5mlの100ｍＭ燐酸バッファー（pH7.0）に懸濁し、4℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【０１７６】
各菌体より調整した無細胞抽出液を0℃から80℃までの各温度にてpH7.0で30分保温した。保温後、各温度で処理した無細胞抽出液を用いて標準反応条件のpH4.0、30℃にて燐酸転移反応を行い、残存活性を測定した。その結果を図１３に示した。実施例１９記載のエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380で発現している変異型酵素は、40℃、30分処理では安定であったが、それ以上の温度では活性の低下が見られた。それに比べ本実施例にて作製した新規変異型酵素遺伝子を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI410およびエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI420で発現している新規変異型酵素はいずれも温度安定性が向上しており、50℃、30分処理でも活性の低下が見られなかった。これらの菌を用いてヌクレオシド−５’−燐酸エステル生産反応を高温で行えば、さらに生産性が向上することが期待された。
【０１７７】
実施例２７  温度安定性の向上した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−イノシン酸および５’−グアニル酸の生産
変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI410、エシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI420および実施例１９記載のエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380をアンピシリン100μg/mlおよびＩＰＴＧ1ｍＭを含むＬ培地50ｍｌに接種し、37℃で16時間培養した。
ピロ燐酸15g/dl、およびイノシン8g/dlまたはグアノシン8g/dlを酢酸バッファー（pH4.0）に溶解し、これに各変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しながら、50℃で9時間反応を行い、生成した５’−イノシン酸または５’−グアニル酸の量を測定した。その結果を表１７に示した。なお、生成したヌクレオシド燐酸エステルはヌクレオシド−５’−燐酸エステルのみでヌクレオシド−２’−燐酸エステルおよびヌクレオシド−３’−燐酸エステルの副生は全く認められなかった。対照としてエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380の菌体を用いて同様に35℃で12時間反応を行った結果を示した。
【０１７８】
実施例２１に記載したようにエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI380は効率的にヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成蓄積した。これと比較すると、実施例２６で作製したエシェリヒア・ブラッタエ由来の新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI410およびエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI420は50℃で反応を行った場合に、同等の５’−イノシン酸または５’−グアニル酸をより短い反応時間で生成蓄積し、さらに効率的なヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産が可能であった。特にエシェリヒア・コリＪＭ109／pEPI420を用いた反応においては、反応時間が短縮されるだけでなく、５’−イノシン酸および５’−グアニル酸の蓄積も向上し、非常に高い生産性を示した。
【０１７９】
【表１７】
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【０１８０】
【配列表】
【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０５】
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【０２０６】
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【０２０７】
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【０２０８】
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【０２０９】
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【０２１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、モルガネラ・モルガニ由来の酵素を用いた反応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関係を示す図である。
【図２】  図２は、エシェリヒア・ブラッタエ由来の酵素を用いた反応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関係を示す図である。
【図３】  図３は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むモルガネラ・モルガニの染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図４】  図４は、モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシン酸の生産量を示す図である。
【図５】  図５は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むエシェリヒア・ブラッタエの染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図６】  図６は、エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシン酸の生産量を示す図である。
【図７】  図７は、エシェリヒア・ブラッタエ由来の野生型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５−′イノシン酸の生産量を示す図である。
【図８】  図８は、エシェリヒア・ブラッタエ 由来の新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における5’−イノシン酸の生産量を示す線図である。
【図９】  図９は、  酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むエンテロバクター・アエロゲネスの染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図１０】  図１０は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むクレブシエラ・プランティコラの染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図１１】  図１１は、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むセラチア・フィカリアの染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図１２】  図１２は、モルガネラ・モルガニ、エシェリヒア・ブラッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコラ及びセラチア・フィカリアの酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列より予想される蛋白質のアミノ酸配列をアミノ酸の一文字表記で示した図である。これらのアミノ酸配列は、各々配列表配列番号４、８、２２、２４、２６及び２８に３文字表記で示されている。図中ですべてのアミノ酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の下に＊で示した。
【図１３】  図１３はエシェリヒア・ブラッタエ由来の新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株より調製した無細胞抽出液中の酸性フォスファターゼ活性の温度安定性を示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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