(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子。
【請求項２】
アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基酸配列を有するものである請求項１記載のアルカリセルラーゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、衣料用洗剤等に配合可能なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源である。１９７３年の石油ショック以来、石油代替資源開発の一貫として、バイオマスを利用した再生可能な生物資源を燃料用エタノール等のエネルギーや工業用素材、医療素材等への付加価値産物への変換利用技術研究が、世界中の研究機関において多岐にわたり行われている。セルラーゼ利用の中で、環境負荷を小さくするセルラーゼの衣料用洗剤への応用が考えられていたが、従来のセルラーゼは中酸性領域のみで作用する酵素であり、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用できるものは知られていなかった。しかし、掘越（特公昭５０−２８５１５号公報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、これまでに困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、実際に好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−０３０５７８号公報、ＵＳ４９４５０５３等）が開発され、衣料用洗剤へ配合されるに至った。衣料用洗剤へのアルカリセルラーゼの配合は、洗浄力を向上させるばかりでなく、洗剤のコンパクト化にも貢献して広く定着してきた。
【０００３】
一般に、洗剤用酵素として優れた効果を発揮するプロテアーゼ、アミラーゼ又は、リパーゼの共通した特徴として、何れも高い等電点を有していることが経験上認められ、等電点の高い酵素は洗浄力も高いと考えられている。従って、洗剤用酵素としてのセルラーゼについても等電点の高い物が求められるが、これまでに高い等電点を有するアルカリセルラーゼは一部のカビ(Fusariumu oxysporum)由来のものが見出されているだけで（ＷＯ９５／２４４７１号公報）、その等電点も９であり、洗浄力も十分ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、自然界から高等電点を有するアルカリセルラーゼを得るべく種々のセルラーゼ生産菌をスクリーニングし、等電点約９．３を有する新規な洗剤用アルカリセルラーゼを見出し、特許出願を行った（特願２０００−５０１１６）。
本発明の目的は、この洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子を取得し、遺伝子組換えにより大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製造し得る形質転換体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ２５７株と命名され、ＦＥＲＭＰ−１７４７３として寄託されているアルカリセルラーゼ生産菌からアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をクローニングし、また遺伝子組換えによりアルカリセルラーゼの生産性の優れた形質転換体が得られることを見出した。
【０００６】
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する。アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特に制限されない。また、配列番号１に示した成熟酵素のアミノ酸配列（アミノ酸番号１番〜４０７番）におけるアミノ末端には１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換していても構わない。
【０００８】
本発明の配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｎ２５７セルラーゼと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列とその相同性を比較するとBacillus circulansの生産するセルラーゼ(Bueno ら、Nucleic Acids Research 18, 4248, 1990)との相同性が最も高く、７５．９％であり、Bacillus sp.ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ（Ozakiら、J. Gen. Microbiol., 137, 41-48, 1991）と４４．４％、Clostridium josui由来のセルラーゼ(EMBL D16670, G391654)とは、２７．８％であった。最も高い相同性を示したBacillus circulans の生産するセルラーゼ（相同性７５．９％）はエンドβ−１，３−１，４  グルカナーゼ(EC3.2.1.73)に属するリケナーゼであり、本発明の遺伝子からコードされるＮ２５７セルラーゼ(EC 3.2.1.4)とは分類上異なる酵素である。また、Bacillus sp.ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ(EC 3.2.1.4)は所謂、酸性セルラーゼである。従って、本発明の遺伝子からコードされるアルカリセルラーゼは新規な酵素である。
なお、相同性の検索はＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフトウェア開発（株）製、ｖｅｒ．３６］を用いたアミノ酸配列ホモロジー検索法にて行った。
【０００９】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその変異体をコードするものであればよい。
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、例えばBacillus sp.（バチルス  エスピー）  ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７３）等から既知のショットガン法、ＰＣＲ法等を用いてクローン化することにより得られる。
【００１０】
また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４(Sumitomoら、Biosci. Biotechnol, Biocem., 59, 2172-2175, 1995)あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００１１】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがBacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００１２】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００１３】
【実施例】
実施例１  アルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した［２．０重量％（以下単に％と記載する）カルボキシメチルセルロース（Ａ１０ＭＣ）、１．０％肉エキス（オキソイド社）、１．０％バクトペプトン（ディフコ）、１．０％塩化ナトリウム、０．１％リン酸２水素カリウム、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）］。３０℃の培養器で３日間静置培養し、菌の生育後、０．１％（ｗ／ｖ）コンゴーレッド溶液を注ぎ染色した。その後、１Ｍの塩化ナトリウム溶液で脱色し、生育した菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これらの菌株を２．０％ポリペプトンＳ（日本製薬）、１．０％魚肉エキス（和光純薬）、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．１％酵母エキス（ディフコ）、０．０７％硫酸マグネシウム７水塩、０．１％カルボキシメチルセルロース、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る液体培地を用いて３０℃、３日間振盪培養を行った。培養上清液を採り、Phast-system（ファルマシア；IEFゲル、pH３．０−９．０）を用いて等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（pH７．０）に浸した後、カルボキシメチルセルロースを含む寒天プレート［１．０％カルボキシメチルセルロース、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０）、１．５％寒天］上に置いた。３０℃、３時間放置後、ゲルを取り去り、０．１％コンゴーレッド溶液を注いだ。約１０分後に１Ｍの塩化ナトリウム溶液で脱色し、等電点の高い部分にカルボシキメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株を取得した。
【００１４】
Bacillus sp. KSM-N257株は、次の菌学的性質を有していた。
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×３．２〜６．８μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．８〜１．０×１．０〜１．６μｍ、準端位、膨潤有り。
（ｅ）グラム染色：不定、但しクリスタルバイオレット（ＣＶＴ）寒天培地には生育しない。
（ｆ）抗酸性：陰性
【００１５】
Ｂ．生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：陽性
（ｂ）脱窒反応：陰性
（ｃ）ＭＲテスト：陽性（ｐＨ５−５．５）
（ｄ）ＶＰテスト：陰性
（ｅ）インドールの生成：陰性
（ｆ）硫化水素の生成：陰性
（ｇ）デンプンの加水分解：陽性
（ｈ）カゼインの加水分解：陰性
（ｉ）ゼラチンの液化：陰性
（ｊ）クエン酸の利用：陰性
（ｋ）カタラーゼ：陽性
（ｌ）オキシダーゼ：陽性
（ｍ）ウレアーゼ：陰性
（ｎ）生育の温度範囲：１３−１４℃
（ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ６−１０
（ｐ）生育における酸素の影響：嫌気条件下で生育する。
（ｑ）塩化ナトリウム耐性：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。
（ｒ）グルコースからのガス産生：陰性
（ｓ）糖からの酸産生：グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン、グリセロール、ラムノース等から酸産生が認められ、ソルビトール、イノシトールから酸産生は認められない。
【００１６】
実施例２  Bacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２５７株のゲノムＤＮＡの調製
Bacillus sp. Ｎ２５７株の培養は、２％ポリペプトンＳ（大日本製薬）、０．１％カルボキシセルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１％酵母エキス（ディフコ）、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．０７％硫酸マグネシウム７水塩、０．５％グルタミン酸ナトリウム（別滅菌）及び０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２５rpm）して行った。得られた培養液約３００mLから遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収した。この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００１７】
実施例３  Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子断片のクローニング
（ａ）ゲノムＤＮＡの制限酵素処理
Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子の取得は、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｋｉｔ（タカラ製）を用いて行った。まず、Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株ゲノムＤＮＡを以下の手順によりＥｃｏＲｌ処理による部分分解処理を行った。即ち、ゲノムＤＮＡ１．５μL（１μg）、１０倍濃度緩衝液１０μL、脱イオン水８６．５μL、及びＥｃｏＲｌを２μL（２０units）混合し、３７℃で３時間処理し、反応終了後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製（２５μL）した。
【００１８】
（ｂ）ライゲーション反応
精製したゲノムＤＮＡのＥｃｏＲｌ分解フラグメント溶液５μLに、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｇ  ＫｉｔのＥｃｏＲｌカセット２．５μL（５０ngＤＮＡ）、ライゲーション溶液Ｉ  １５μL及びライゲーション溶液II７．５μLを加え、１６℃で３０分間反応した後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔによりＤＮＡを精製回収した。
【００１９】
（ｃ）ＰＣＲによるＮ２５７セルラーゼ遺伝子の増幅
ライゲーション精製溶液２０μLに脱イオン水１４．５μLを加え、９４℃で１０分間加熱処理した後、次の通り１回目のＰＣＲを行った。加熱処理溶液３４．５μLにＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｋｉｔ中の１０倍濃度緩衝液５μL、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ０．５μL、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ８μL、プライマーＣ１  １μL（１０ｐｍｏｌ）及びBacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株の培養上清より精製したアルカリセルラーゼのＮ末配列より推定した複合プライマー１（配列番号３）１μL（１０ｐｍｏｌ）を混合した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃、１分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５５℃、２分間、７２℃、１分間（３０サイクル）で行った。得られたＰＣＲ反応溶液を脱イオン水で１００倍希釈し、１μLを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。１００倍希釈溶液１μLにＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｋｉｔ中の１０倍濃度緩衝液５μL、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ０．５μL、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ８μL、プライマーＣ２  １μL（１０ｐｍｏｌ）及びBacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２５７株からの精製酵素のＮ末配列より推定した複合プライマー２（配列番号４）１μL（１０ｐｍｏｌ）を混合し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー製）でＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５５℃、２分間、７２℃、１分間（３０サイクル）で行った。かくして得られたＮ２５７セルラーゼ遺伝子の部分増幅断片（約０．７ｋｂ）を用いて塩基配列決定を行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマーバイオシステム）を用いて決定した。
【００２０】
実施例４  全塩基配列決定
（ａ）インバースＰＣＲ（ＥｃｏＲｌ）
Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子の部分増幅断片（約０．７ｋｂ）の塩基配列をシークエンスプライマーとして、プライマーＣ２（３．２ｐｍｏｌ）及びプライマー２（配列番号４、３．２ｐｍｏｌ）を用いて解析した。決定した約０．５ｋｂの塩基配列を基にインバースＰＣＲを行った。Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株のゲノムＤＮＡ溶液１．５μL（１μg）、１０倍濃度緩衝液１０μL、脱イオン水８６．５μL及びＥｃｏＲｌ  ２μＬ（２０units）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理した。得られたゲノムＤＮＡ分解産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製後（２０μL）、５μLを使用してＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラ製）を用いて自己閉環した（１６℃、１時間）。得られたライゲーションミクスチャー１μLを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。アンチセンスプライマー３（配列番号５）及びセンスプライマー４（配列番号６）を用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μL、各プライマー２０μL（１μM）、１０倍濃度緩衝液１０μL、ｄＮＴＰミックス８μL（２．５mM）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ製）０．５μL（２．５units）、及び脱イオン水４０μLを混合した後、サーマルサイクラーでＤＮＡを増幅した。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５７℃、１分間、７２℃、２分間（３０サイクル）及び７２℃、２分間で行った。得られたＰＣＲ産物（約０．７ｋｂ）をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）を用いて精製した後、アンチセンスプライマー５（配列番号７）及びセンスプライマー６（配列番号８）を用いてシークエンスを行い、Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子のプロモータ領域中のＥｃｏＲｌ部位（塩基番号１）から下流の構造遺伝子内のＥｃｏＲｌ部位（塩基番号１０９０）間約１．１ｋｂの塩基配列を決定した。
【００２１】
（ii）インバースＰＣＲ（ＰｖｕII）
構造遺伝子内のＥｃｏＲｌ部位下流の未決定の塩基配列を決定する目的で、再度インバースＰＣＲをＰｖｕIIを用いて行った。Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株のゲノムＤＮＡ溶液１．５μL（１μg）、１０倍濃度緩衝液１０μL、脱イオン水８６．５μL及びＰｖｕII  ２μL（２０units）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理した。得られたゲノムＤＮＡ分解産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製後（２０μL）、５μLを使用してＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラ製）にて自己閉環した（１６℃、１時間）。得られたライゲーションミクスチャー１μLを鋳型ＤＮＡとして、アンチセンスプライマー７（配列番号９）及びセンスプライマー４（配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μL、各プライマー２０μL（１μM）、１０倍濃度緩衝液１０μL、ｄＮＴＰミッスク８μL（２．５mM）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ製）０．５μL（２．５units）、及び脱イオン水４０μLを混合した後、サーマルサイクラーでＤＮＡを増幅した。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５７℃、１分間、７２℃、２分間（３０サイクル）及び７２℃、２分間で行った。得られたＰＣＲ産物（約１．５ｋｂ）をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）を用いて精製した後、センスプライマー６（配列番号８）及びセンスプライマー８（配列番号１０）を用いてシークエンスを行い、構造遺伝子内ＥｃｏＲｌ部位下流の未決定の塩基配列を決定した。以上、プロモーター領域及びターミネーター領域を含めたＮ２５７セルラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。
【００２２】
実施例５  形質転換枯草菌によるＮ２５７セルラーゼの生産
Ｎ２５７セルラーゼのアミノ末端側からターミネーター下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳａｌｌ／ＢａｍＨｌ部位に連結し、構築した組換えプラスミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換した。形質転換株を３．０％ポリペプトンＳ、３．０％マルトース、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸２水素カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μg／mL）から成る培地（ＰＭ培地、pH６．８）にて３０℃、４８時間振盪培養を行った、遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約１００００Ｕ／Ｌであった。
【００２３】
実施例６  組換えＮ２５７アルカリセルラーゼの精製
組換えＮ２５７培養上清液を８５％飽和の硫安塩析処理した後、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、５℃）を行い沈殿物を回収した。この沈殿物を２mM塩化カルシウムを含んだ適当量の１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に懸濁した後、充分量の同緩衝液に対して５℃で１５時間透析した。透析内液を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、５℃）し、得られた上清を予め２mM塩化カルシウムを含んだ１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したＳＰトヨパール（東ソー）カラム（２．５cm×１５cm）に添着した後、同緩衝液でカラムを洗浄した後、同緩衝液中０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。目的のＮ２５７アルカリセルラーゼは、塩化ナトリウム濃度０．０２Ｍ付近で、電気泳動的にほぼ単一な成分として溶出された。比活性は１４．８Ｕ／mgであった。
【００２４】
実施例７  組換えＮ２５７アルカリセルラーゼの最適反応pH
実施例６の如く調製して得られた組換えＮ２５７アルカリセルラーゼ精製標品を用いて、最適反応pHを調べた。酢酸緩衝液（pH５．１−６．６）、リン酸緩衝液（pH６．２−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（pH７．６−９．１）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５−１０．７）、炭酸緩衝液（pH１０．８−１１．５）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５−１１．４）の各緩衝液（５０mM）を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH８．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、pH７から９の間で最大活性の７０％以上の活性を示すとともにpH５から１０の広範囲でも最大活性の１０％以上の活性を有していた（図１）。組換えＮ２５７アルカリセルラーゼは分子量、約４２ｋＤａ、pH７．５で陽イオン交換体に吸着し、野生株の酵素と同様に塩化ナトリウムにより溶出されることから等電点が高く、最適反応pHがpH８．５、２０個のＮ末端アミノ酸配列Ala-Asn-Lys-Pro-Phe-Pro-Gln-His-Thr-Ser-Tyr-Thr-Ser-Gly-Ser-Ile-Lys-Pro-Asn-AsnがBacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素のＮ末端アミノ酸と完全に一致することから、野生株由来のＮ２５７アルカリセルラーゼと同じ性質を持つ酵素である。
【００２５】
［酵素活性測定法］
０．２mLの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０）、０．４mLの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３mLの脱イオン水から成る反応液に０．１mLの適当に希釈した酵素液を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いて洗剤用アルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産することができる。
【００２７】
【配列表】
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【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組換えアルカリセルラーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図１】
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