(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２：
0004282761.tif 000013
又は配列番号４：
0004282761.tif 000014
のアミノ酸配列からなるポリペプチドのコード情報を含む核酸分子。
【請求項２】
配列番号１：
0004282761.tif 000015
のヌクレオチド配列を含む請求項１記載の核酸分子又は前記核酸分子の縮重変異体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２：
0004282761.tif 000016
又は配列番号４：
0004282761.tif 000017
のアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２記載の核酸分子のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項６】
発現ベクターである請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項５又は６記載のベクターをもつ宿主細胞。
【請求項８】
a)請求項７記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドが前記宿主細胞によって発現される条件下で培養する工程、及び
b)前記ポリペプチドを単離する工程を含む請求項３又は４記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項９】
前記宿主細胞がE．coli細胞又は哺乳動物細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項３又は４記載のポリペプチドに特異的な抗体分子。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、完全免疫グロブリン、免疫グロブリンのFab′又はF(ab)2フラグメント、組換え抗体、組換え単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、二重特異性抗体又は人化抗体である請求項１０記載の抗体分子。
【請求項１２】
下記のアミノ酸配列のいずれか一つに特異的である請求項１０又は１１記載の抗体分子。
0004282761.tif 000018
【請求項１３】
請求項２記載の核酸分子の配列の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号８：5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT-3′の核酸配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
IL-2依存性細胞増殖を阻止するための医薬組成物を調製するための請求項１３記載のアンチセンスヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
請求項１３記載のアンチセンスヌクレオチドを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ポリペプチドp43、NAD+、インターロイキン２受容体（IL-2R）β鎖又はIL-2Rγ鎖の少なくとも２種の結合部位を含むポリペプチド、前述のポリペプチドのコード情報を含む核酸分子、前述のポリペプチドに特異的な抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、前述のポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物、及び前述のポリペプチドの生産方法に関する。
発明の背景
インターロイキン2（IL-2）は、造血細胞の増殖及び分化の調節に重要な役割を果たしている（27，29）。IL-2は、タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）活性化、及び細胞増殖に重要である核プロトオンコジーン発現（16，29）を含む特定の細胞表面受容体（IL-2R）（30）に結合することによって多数の生物活性を与える。IL-2Rは、少なくとも３種類の異なるサブユニット；α鎖、β鎖及びγ鎖を有する（5，9，28）。それらのサブユニットの中でIL-2Rβ鎖とγ鎖は共に細胞外ドメインにおいて４つの保存システインとTrp-Ser-X-Trp-Serの配列（“WSモチーフ”）を特徴とするサイトカイン受容体の新たに同定されたスーパーファミリーに属する（1，2）。特に、IL-2RサブユニットはいずれもPTK活性のような既知の触媒活性をもたない。
IL-2Rサブユニットの異なる組合わせの発現は、種々の形のIL-2Rを生じ、各々がIL-2に対して異なる結合親和性を示す（28）。“高親和性”IL-2R（Kd; 10-11M）は、ヘテロ三量体α鎖、β鎖及びγ鎖からなり、“中間親和性”IL-2R（Kd; 10-9）は、ヘテロ二量体β鎖及びγ鎖から生じ、“低親和性”IL-2R（Kd; 10-8）は、α鎖のみの発現によってつくられる。IL-2Rβ鎖は、２８８個のアミノ酸（a.a.）からなる最大の細胞質ドメインを有し、IL-2シグナル導入に重要な役割を果たすことがわかった（8）。本来は内在IL-2Rα鎖及びγ鎖を発現するがβ鎖を発現しないマウスIL-3依存性プロＢ細胞系BAF-B03にヒトIL-2Rβ鎖cDNAを導入すると、それらの細胞はIL-2Rに応答して増殖することができた（3，8）。IL-2Rβ鎖の欠失変異cDNAによる発現実験から、“セリンを多く含んだ”領域（S領域）と呼ばれるIL-2Rβ鎖の限定細胞質領域がBAF-B03細胞のIL-2R刺激によるc-myc遺伝子誘導及びマイトジェン形成に不可欠であることがわかった（26）。“酸性”領域（A領域）と呼ばれる酸性アミノ酸に多く含んだIL-2Rβ鎖の他の細胞質領域は、S領域のほかにBAF-B03細胞のIL-2R刺激によるsrcファミリーPTK活性化及びp21ras活性化並びにc-fos/c-jun遺伝子導入に必要である（6，7，17，24，26）。いくつかの証拠から、IL-2Rγ鎖がIL-2R誘導シグナル導入に重要であることも示されている（29）。更に、IL-2Rγ鎖は、IL-2、IL-4及びIL-7受容体及びおそらく他のサイトカイン受容体の間で共有された共通の成分であることが示されている（14，15，21，23）。IL-2Rγ鎖の突然変異は、T細胞発生の欠陥を示す重篤なＸ連鎖性複合型免疫不全患者に見られ、サイトカインシグナリングにおけるIL-2Rγ鎖の重要な役割が証明された。更に、最近の研究により、IL-2Rβ鎖とγ鎖の細胞質ドメイン間の機能協力がIL-2シグナリングに重要であることが示された（11，19，20）。
正常な身体機能及び疾患にIL-2R仲介過程が重要であることから、それらの過程をより理解することが求められていると共にそれらに影響する新規な手段が求められている。
発明の開示
本発明は、新規なIL-2R結合タンパク質、p43、及びp43のコード情報を有する核酸分子を提供する。好ましくは、該p43ポリペプチドは、配列番号２（図1A参照）:
0004282761.tif 000002
又は配列番号４（図1B、マウスp43参照）:
0004282761.tif 000003
のアミノ酸配列を有する。
本発明は、更に、p43様活性をもつポリペプチド又はp43の機能誘導体に関し、特に、少なくともNAD+とIL-2Rβ鎖、NAD+とIL-2Rγ鎖、又はIL-2Rβ鎖とIL-2Rγ鎖の結合部位を含むポリペプチドに関する。機能誘導体は、p43の変異体、断片、化学誘導体、又は融合タンパク質とすることができる。
他の態様においては、本発明は、p43、p43様活性をもつポリペプチド、又は機能誘導体のコード情報を有する核酸分子に関する。好ましくは、本発明の核酸は、配列番号１（図1A参照）:
0004282761.tif 000004
0004282761.tif 000005
のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１のヌクレオチド配列を有する前記核酸分子の縮重変異体、又は配列番号１を有する核酸分子に対してハイブリッド形成することができる核酸分子、又は前述の核酸分子のいずれかのヌクレオチド配列の一部を含む核酸分子、又は前述の核酸分子のいずれかの断片である。好ましくは、配列番号１の一部を含むかかる核酸分子は、配列番号９：
0004282761.tif 000006
のヌクレオチド配列、又は配列番号９の縮重変異体を含む。
本発明の核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子に対して、好ましくは50％を超える、更に好ましくは70％を超える、更に好ましくは80％を超える、更に好ましくは90％を超える相同性、又は配列同一性を選ぶ条件下でハイブリッド形成することができる。ハイブリッド形成することができるかかる核酸分子は、好ましくはp43様生物活性及び／又は免疫活性をもつポリペプチド、更に好ましくはNAD+、IL-2Rβ鎖、又はIL-2Rγ鎖のp43結合部位の少なくとも１種、更に好ましくは前記結合部位の少なくとも２種を有する前記ポリペプチドのコード情報を含む。
本発明の他の態様は、前述の核酸のいずれかのヌクレオチド配列を含むベクター、特に前記ヌクレオチド配列が発現ベクターのように発現調節配列に作用上結合される場合に含むベクターである。
本発明の別の態様は、記載されたベクター、特に発現ベクターをもつ宿主細胞である。かかる宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞とすることができる。かかる宿主細胞は、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞である。前記宿主細胞は、更に好ましくはE．coli細胞又はCOS細胞である。
従って、本発明の別の態様は、組換え発現によるp43、p43の機能誘導体、又はp43様活性をもつポリペプチドの生産方法である。かかる方法は、p43、p43の機能誘導体、又はp43様生物活性をもつポリペプチドのコード情報を含む発現ベクターをもつ記載された宿主細胞を、前記コード情報が前記宿主細胞によって発現される条件下で培養し、発現したポリペプチドを単離することを特徴とする。
本発明の別の態様は、p43、p43の機能誘導体、又はp43様活性をもつポリペプチドに特異的な抗体分子である。かかる抗体分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、完全免疫グロブリン又はその断片、特にFab′又はF（ab）2フラグメント、組換え抗体又は抗体断片、例えば、組換え単鎖抗体（scFv）、キメラ抗体、二重特異性抗体、又は人化抗体とすることができる。
好ましくは、かかる抗体分子は、下記のアミノ酸配列:
0004282761.tif 000007
の１種に特異的であり、配列番号11が好ましい。
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドの好適実施態様は、配列番号8の配列:  5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT-3′を有する。
本発明の別の態様は、p43、p43の機能誘導体、又はp43様活性をもつポリペプチド、前述のポリペプチドのいずれかのコード情報を含む核酸、又は前記核酸分子のヌクレオチド配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物である。かかる医薬組成物は、IL-2R関連疾患の治療及び診断に用いられる。
本明細書に用いられる“p43様活性をもつポリペプチド”は、p43に実質的に類似している生物活性を示すポリペプチドである。これは、例えば、NAD+、IL-2Rβ鎖、及び／又はIL-2Rγ鎖へのp43の結合特性についてp43と共通の構造又は触媒特性を１つ以上、好ましくは少なくとも２つもつことを意味する。本明細書に用いられるp43の“機能誘導体”は、p43の生物活性に実質的に類似している生物活性（機能或いは構造）をもつ化合物である。生物活性の例としては、p43の天然リガンドへの結合能、好ましくはNAD+、IL-2Rβ鎖、又はIL-2Rγ鎖の少なくとも２種を結合する能力が含まれる。両者の分子が実質的に類似の構造をもつ場合又は両者の分子が類似の生物活性をもつ場合には一つの分子はもう１つの分子に“実質的に類似”していると言われる。p43の“機能誘導体”としては、p43の断片、変異体、化学誘導体又は融合タンパク質が含まれる。“p43の断片”という語は、その分子のポリペプチドサブセットを表すことを意味する。“p43の変異体”という語は、全分子、又はその断片に構造が実質的に類似した分子を表すことを意味する。但し、その変異体はp43の活性に類似しているか或いはp43の活性に阻止する少なくとも１種の生物活性をもっている。p43の変異体は、１個以上のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によりp43と異なることができる。好ましくは、変異体はNAD+、IL-2Rβ鎖、又はIL-2Rγ鎖の少なくとも２種を結合する能力を有する。“p43の化学誘導体”は、p43から化学反応、例えば、ヨウ素化、アセチル化、又は放射性同位元素又は毒素への結合により誘導された分子である。“p43の融合タンパク質”は、p43遺伝子の全部又は一部を他の遺伝子又は核酸の全部又は一部に融合した枠内コード情報を含むものの組換え発現によりつくられたポリペプチドである。核酸分子の“縮重変異体”は、遺伝コードの縮重により、第１核酸分子と比べて異なるヌクレオチド配列を有しかつ第１核酸分子と同じアミノ酸配列をコードする第２核酸分子である。核酸分子の“断片”は、第１核酸分子の核酸配列の一部を表すヌクレオチド配列を有する第２核酸分子を意味する。
本発明を実施する１つの方法は、タンパク質産物がIL-2Rγ鎖と相互作用することができるcDNAを単離する方法である。IL-2Rγ鎖と相互作用することができるタンパク質をコード化するヒトcDNAを選別するために、（37）及び（4）に記載された二ハイブリッドスクリーニング法が用いられる。概要としては、IL-2Rγ鎖をコードするDNA（28）、又はその一部がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）GAL4タンパク質の、特定のDNA配列に結合することができる（UASG）Ｎ末端ドメインをコードするDNAに融合される。次に、その構築物が発現ベクターに組込まれ、GAL4が欠失した酵母株に形質転換される。選別されるべきcDNA収集物は発現ベクターに組込まれ、個々のcDNA分子がGAL4の転写活性化ドメインをコードするDNAに融合される。得られた構築物はIL-2Rγ鎖構築物で前形質転換された同じ酵母株に形質転換される。問題のcDNA、即ち、IL-2Rγ鎖に結合することができるポリペプチドをコードするcDNAをもつ酵母細胞において、それらの分子は同じ細胞内で発現されるIL-2Rγ鎖ポリペプチドに結合し、２つのGAL4ドメイン（IL-2Rγ鎖に融合したDNA結合ドメインと問題のcDNAに融合した転写活性化ドメイン）を共に架橋する。その相互作用の結果として、GAL4/UASGによって調節された遺伝子の転写が起こる。それは、例えば、周知のβ−ガラクトシダーゼ／ガラクトース系を用いる適切な選択系に用いられる。例えば、LexAタンパク質とIL-2Rγ鎖の融合遺伝子が構築され、適切な酵母細胞に形質転換される。得られた形質転換細胞はpACTヒトcDNAライブラリー（4）で連続して形質転換され、形質転換細胞はスクリーニング法に供される。形質転換細胞は選択のもとに置かれ、生存コロニーについてβ−ガラクトシダーゼを生産する能力が選別される。GAL4転写活性化ドメインに融合した部分的オープンリーディングフレームからなる正のクローンが同定される。かかる正のクローンのcDNA挿入断片を用いてオーバーラップcDNAが得られる。オーバーラップ断片から標準の手順によって全長cDNAクローンが得られるか又は構築される。次に、このようにして得られたcDNAを用いて関連ポリペプチドを同定するためにマウスのような他の種からの他のcDNAライブラリーを選別することができる。それは、同様に標準の手順で行われる。
本発明の情報、特に図1A及び図1Bの配列情報があれば、本発明のポリペプチド及び核酸分子は標準の手順で生成される。例えば、図1Aのヌクレオチド配列を有する核酸分子は、化学合成によって生成される。代替的方法は、図1Aに示されたヌクレオチド配列の一部に対応するオリゴヌクレオチド又はDNA断片を化学的に合成する方法及びハイブリッド形成によって適切なcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーを選別する方法である。そのようなオリゴヌクレオチド又はDNA断片をどのように設計するか、ライブラリーをどのように作成するか、及びそのようなライブラリーをオリゴヌクレオチド又はDNA断片とハイブリッド形成することによりどのように選別するかの詳細なプロトコールは、標準実験マニュアル、例えば（32）、特にchap.7，8，9，11 & 12に見られ、その内容を参考として本明細書に引用する。その中で、あるプローブに適切なハイブリッド形成条件、例えば、完全な適合（100％の相同性）、又は50％、70％、80％又は90％の相同性を選択する条件をどのように調整するかも教示されている（32、p.11.45-11.57）。例として、ヒトp43 cDNAをプローブとして用いて、3×SSC中65℃でハイブリッド形成するとアミノ酸レベルで約90％の相同性を有するマウスp43 cDNAが選択される。また、p43、又はその断片のコード情報を含む核酸は、標準実験プロトコールのポリメラーゼ連鎖反応によってcDNAライブラリーから生成される（32，chap.24）。
検討中のp43又はその機能誘導体をコードする核酸、特に図1Aのコード配列（図1Aのヌクレオチド配列の位置246のＡから始まり位置1433のＴで終わる）を用いて、当業者は原核細胞或いは真核細胞において標準プロトコールに従って組換え発現によりポリペプチドを生産することができる（例えば、32、特にchap.16 & 17参照）。その目的のために、問題のコード配列を含む核酸分子は、発現調節配列に作用上結合される発現ベクターに組込まれる。その発現ベクターは、選ばれた宿主細胞の特別な要求に適応する。発現は、調節可能である。次に、発現ベクターは、選ばれた宿主細胞に導入される。適切な条件下で培養する際に、宿主細胞はp43ポリペプチド又はその機能誘導体を合成する。発現系は、発現したポリペプチドを培養液に分泌させることができる。次に、ポリペプチドは、宿主細胞或いは発現したポリペプチドが培養液に分泌される場合には培養液から単離される。p43又はその機能誘導体の発現の個々の例は下記に記載される。
本発明の情報、特に図1A又は図1Bの配列情報があれば、当業者はp43の機能誘導体を構築することができる。それは、機能誘導体のコード情報を含むDNA分子を構築し、そのDNA分子を発現ベクターに組込み、その発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記機能誘導体をコードする前記DNA分子を発現することにより達成される。例えば、当業者はp43をコードするDNA分子の断片を作製することができ、前記DNA断片は完全配列の一部のみ含み、その断片を発現する。得られたポリペプチド断片の機能分析については、当業者はp43、NAD+、IL-2Rβ鎖又はIL-2Rγ鎖の天然リガンドとの結合実験を下記に記載されるように或いは類似の方法で行うことができる。p43の断片は、NAD+、IL-2Rβ鎖、又はIL-2Rγ鎖の結合部位を好ましくは少なくとも１種、更に好ましくは少なくとも２種保持する。変異体の生成については、当業者は、p43の完全コード情報の全部又は一部を含むDNA分子を標準の手順、例えば、部位特定変異誘発により修飾することができ（32、特にchap.15; 33，chap.11，p.279-295）、このように修飾したDNA分子を記載されたように発現する。例として、変異体は、記載されたp43と比べて１、２、３個以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって確認される。発現後、このように生成された変異体ポリペプチドは、記載された機能であるかが試験される。あるポリペプチドの化学誘導体の生成については、標準の手順が同様に用いられる（例えば、33，chap.9，p.225-245、及びchap.10，p.247-277参照）。融合タンパク質の生成は、下記の実施例に記載される。
本発明の情報、特に図1A又は図1Bの配列情報があれば、当業者は、標準の手順に従ってp43、又はその機能誘導体に特異的な抗体を生産することができる（34、特にvol.1、chap.2，3，4）。抗原として使用する場合には、例えば、配列番号２又は４、又は図1A及び1Bのアミノ酸配列の一部を示す合成ペプチドが合成され、担体に作用上結合された免疫化プロトコールで用いられる。抗原を生成する他の例は、例えばE．coli中でのp43又はその機能誘導体、場合によっては融合タンパク質としての組換え発現である。次に、発現したポリペプチド又は融合タンパク質−精製されていてもよい−は、免疫化計画において用いられる。次に、個々の抗体又は−モノクローナル抗体の場合−個々の抗体を生産するハイブリドーマが適切な方法で選択される（35）。抗体は、モノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体とすることができる。そのままの免疫グロブリンの代わりに、免疫グロブリンの断片、例えば、Fab′又はF（ab）2フラグメントが用いられる。ある抗原に対する組換え抗体又は抗体断片、キメラ抗体、人化抗体、二重特異性抗体又は単鎖抗体の生産は、当該技術の状態である。抗体は、他の物質、例えば、放射性同位元素又は毒素に結合される。p43、又はその機能誘導体に特異的な抗体は、IL-2誘導細胞因子の機構を研究する有用な手段であり、IL-2誘導シグナルの伝達を遮断又は減弱するためにも用いられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準の手順に従って化学的に合成される。
p43、その機能誘導体、p43又はその機能誘導体のコード情報を含む核酸、p43又はその機能誘導体に特異的な抗体、又はp43又はその機能誘導体をコードするヌクレオチド配列の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-2関連疾患の治療又は診断用医薬組成物を製造するための薬剤として用いられる。本発明の分子は、既知の方法に従って処方され、それらの物質は薬学的に許容しうる担体賦形剤と共に混合される。適切な賦形剤、及び場合によってはヒト血清アルブミンのような他のヒトタンパク質との製剤は、例えば（36）に記載される。医薬組成物は、患者に静脈内、筋肉内、皮下、経腸、又は非経口投与される。投与は、持続注入又は一回又は多回用量によることができる。用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身状態、疾病等の要因によって異なる。通常は約1pg/kg〜10mg/kg患者の体重の範囲内にある。
組換えで生産されたp43又はその機能誘導体は、また、IL-2誘導シグナル導入の機構を研究するために用いられる。
図面の説明
図１．  p43のヌクレオチド配列と予想アミノ酸完全配列。（A）ヒトp43のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列。アミノ酸配列は、一文字コードで示される。予想NAD+結合ドメインの保存残基は、下線で示される。ヌクレオチド数は左側に、アミノ酸数は右側にある。（B）ヒトとマウスのp43アミノ酸配列のアラインメント。予想NAD+結合ドメインの領域は枠に囲まれている。
図２．  p43と各デヒドロゲナーゼ間の相同性。アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリン酸グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼがヒト又はマウスp43に対して配列される；番号はヒトp43に対するものである。ヒト又はマウスp43との同一は枠で示される。
図３．  ヒト組織におけるp43 mRNA発現。ヒト組織ブロット（Clontech,カリフォルニア州パロアルト）。分子量サイズは左側に示されている（キロベースで）。
図４．  COS細胞におけるp43とIL-2Rとの会合。（A）p43とIL-2Rγ鎖との会合。COS細胞から細胞溶解物を調製した。COS細胞をCD4γ+LCK標識、CD4γ+LCK-p43、CD4γM1+LCK標識又はCD4γM1+LCK-p43でトランスフェクトした。各細胞溶解物の分割量を抗CD4抗体（OKT4）で免疫沈降させた後、抗Lckをブロットして免疫反応で検出した。（B）p43とIL-2Rβ鎖との会合。COS細胞から細胞溶解物を調製した。COS細胞をLCK-p43+CD4γ、CD4γM1、CD4β、CD4βA又はCD4βSでトランスフェクトした。
図５．  IL-2誘導DNA合成に関するp43アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの影響。FWT-2細胞についてIL-2刺激後にアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの存在下で[3H]チミジンを取込む能力を分析した。データは、３回分析の平均として示されている。
図６．  NAD+はp43に結合する。[32P]NAD+をフィルターとインキュベートし、結合バッファー中のオボアルブミン、組換えp43及びアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質を導入した（材料及び方法参照）。次に、フィルターを洗浄し曝露した。
実施例
実施例１：二ハイブリッドスクリーニング及びcDNA単離
特にことわらない限り、（4）のプロトコールを適応させた。酵母二ハイブリッドスクリーニングについては、ヒトIL-2Rγ鎖細胞質領域（28）のオープンリーディングフレームを次の手順によりベクターpBTM116（4）中のLexA DNA結合ドメインに融合した；SmaI又はSalI部位を各々含む合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス:  5′-ATTTCCCGGGGGAACGGACGATGCCCCGAA-3′，アンチセンス:  5′-CTTCTGTCGACGGATTGGGGTTCAGGTTTC-3′）をIL-2Rγ鎖細胞質領域をコード化するcDNAのPCR増幅に用いた。断片をSmaI及びSalIで切断し、pBTM116と結合した。得られたプラスミドをPstIで切断し、結合してγ鎖のＣ末端半領域を除去した。得られたプラスミドを餌としてのCTYLD酵母株に形質転換した。引き続きこの形質転換細胞株をDr．S．Elledgenから恵与されたＢ細胞由来pACTヒトcDNAライブラリー（4）で形質転換し、1×106形質転換細胞を（4）に記載された標準法で分析した。希有生存コロニーについてβ−ガラクトシダーゼの生産能を選別した。正の１クローンを同定した。クローン36と呼ばれるクローンの配列分析により、GAL4転写活性化ドメインに融合した〜1.4kbの部分的オープンリーディングフレームがコード化される。プローブとしてこの挿入断片を用いて、ジャーカット細胞のmRNAから作成されたヒトcDNAライブラリーを選別してp43コード配列の全長cDNAを得た。ヒト全長cDNAの単離については、λgt11 cDNAライブラリーをポリ（A）+TPA誘導ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞白血病系）からのRNAで標準の手順（32）に従って調製した。スクリーニングについては、二ハイブリッドスクリーニングで得られたp43 cDNAのXhoI酵素処理（切断）によりプローブDNAを調製した。５オーバーラップクローンを確認し、0.5〜２kbの挿入断片を有することがわかった。ジデオキシヌクレオチド鎖末端法を用いてDNA配列決定を行った。最も長い挿入断片コード配列を表すクローンを配列決定した。クローンは、クローン36と約1.4kbが重なり、5′端に更に約0.6kb伸び、AUG開始コドンを含む2.0kbのcDNAセグメントを有した。これにより、予想分子サイズ43kdを有する396アミノ酸ポリペプチド（図1A）の潜在的オープンリーディングフレームがわかった。我々は、この遺伝子産物をp43と呼ぶ。遺伝子バンクデータベースによるコンピュータ配列検索により、p43の配列はNAD+結合ドメイン内の部分的類似性を除いて既知のタンパク質に対してほとんど相同性がない。
更に、マウスp43 cDNAを得るために、マウス脾細胞mRNAから作成されたcDNAライブラリーを用い、プローブとしてp43 cDNA断片を用いて選別した。マウスp43 cDNAクローンの単離については、プローブとして全長ヒトp43 cDNAクローンからのEcoRI切断挿入断片を用いると共に（38）に記載されたマウスcDNAライブラリーを用いてハイブリッド形成を行い、フィルターを3 x SSC中65℃で洗浄した（SSCバッファーをref．32，p．B.12に従って調製した）。マウス脾臓からのcDNAライブラリーをヒトp43 cDNAで選別すると極めて関連した配列のクローンが得られた。予想したヒトとマウスのp43アミノ酸配列は極めて関連し、タンパク質レベルで〜90％同一である（図1B）。NAD+結合ドメインのアミノ酸配列はヒトとマウスp43の双方で保存される（図1B及び2）。
ノーザンブロット分析により検出されたp43 mRNAの発現は、試験したヒト組織全てに偏在した。p43 mRNAは長さが約2.0kbであり、骨格筋に最も存在した（図3）。
実施例２：哺乳動物細胞におけるp43とIL-2Rγ鎖との会合
上述の通り、我々は酵母二ハイブリッド系を用いてIL-2Rγ鎖結合分子、p43を単離した。しかしながら、我々はp43が哺乳動物細胞においてIL-2Rγ鎖と会合することができるかわからなかった。哺乳動物細胞においてp43とIL-2Rγ鎖の結合を確認するために、我々はp43をp56lck（LCK-p43）のＮ末端領域を認識した特定の抗体に結合しIL-2Rγ鎖をCD4（CD4γ）の細胞外ドメインに結合する２つのキメラタンパク質を構築した。発現プラスミド、CD4γ及びLCK-p43をサルCOS7細胞に一時的にコトランスフェクトした後、分子内結合をOKT4との免疫沈降により分析し、続いて抗Lck抗血清でウェスタンブロット分析した（詳細については実施例６参照; ref.（7）も参照）。LCK-p43及びLCK標識を、全細胞溶解物の抗Lck抗血清イムノブロッティングにより評価されるようにトランスフェクトしたCOS細胞中で発現させた（データは示されていない）。図４から、LCK-p43に結合したが対照のLCK標識に結合しなかったIL-2Rγ鎖又は端を切り取ったIL-2Rγ鎖が経膜領域のみ含むことがわかり、哺乳動物細胞における２つのタンパク質の直接結合を意味する。
実施例３：IL-2Rβ鎖はp43と会合する
IL-2Rγ鎖とβ鎖が会合しIL-2シグナル導入の重要な機能を共有することから、我々はIL-2Rβ鎖がp43と会合するかを求めた。これらの分子の結合を確認するために、我々はIL-2Rβ鎖、又は変異体β鎖をCD4に融合するキメラ遺伝子を構築した（CD4-IL-2Rβ，CD4-βS，CD4-βA）。これらのプラスミド及びLck-p43をサルCOS7細胞にコトランスフェクトし、分子内結合を測定した（cf.実施例2，6）。図4Bから、p43がIL-2Rγ鎖のみと会合せずIL-2Rβ鎖と会合することがわかる。おもしろいことに、p43は、IL-2仲介シグナル導入に重要な領域であるＳ領域を介してIL-2Rβ鎖としっかりと会合した。
実施例４：オリゴデオキシヌクレオチドの合成及び[3H]チミジン取込みの測定
S-オリゴデオキシヌクレオチドを自動DNAシンセサイザー（Applied Biosystems）で合成した。センス及びアンチセンスのオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、各々5′-CAGGATGGGCGTTTTGAAGA-3′及び
5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT-3′である。野生型ヒトIL-2Rβ鎖とγ鎖を発現するBAF-B03由来細胞系であるFWT-2細胞を本実験に用いた。連続して増殖した後、細胞をPBSで洗浄し、細胞を1×104/ウェルの開始濃度で96ウェルプレートに分配した。オリゴマー（5μM又は10μM）をIL-2R（2nM）と共に又はなしで加えた。20時間インキュベートした後、細胞を1μCiの[3H]チミジン（20μCi／ミリモル）（NEN Research Products）で４時間パルスラベルした後に収集した。
増殖のパラメーターとしてIL-2R刺激後の[3H]チミジン取込みにおけるp43センス及びアンチセンスオリゴマーの影響を図５に示されるように評価した。実験を少なくとも３回繰り返した。p43アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが[3H]チミジン取込みを部分的に阻害する（〜30％）ことは明らかである。一方、センスオリゴデオキシヌクレオチドを用いた影響は認められなかった。これらの結果は、p43分子がIL-2シグナルを部分的に変えるが、全スケールのシグナルを阻害しないことを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在するときp43のないことを補償することができる重複結合分子の存在を評価することは残っている。
実施例５：NAD+結合分析
前述の通り、p43はアルコールデヒドロゲナーゼのようなNAD+結合タンパク質に部分的相同性を有する。p43がNAD+を結合することができるかを確認するために、我々はNAD+結合分析を行った。我々は、まず、細菌内で産生された組換えp43へのNAD+の結合を試験した。p43の完全オープンリーディングフレームを6×His標識配列に融合し、得られたキメラタンパク質をNiカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで過剰発現細菌株から精製した。組換えE.coli発現p43については、6×Hisアフィニティー標識に融合したp43キメラタンパク質を、Mr.Hashimoto（ロックフェラー大学）から恵与されたベクター、6HisT-pET11dを用いて構築した。プラスミドをE．coli株BL21/pLysSに形質転換し、組換えp43をNiカラム（Invitrogen）を用いて精製した。精製したp43及び対照タンパク質（オボアルブミン及びアルコールデヒドロゲナーゼ）をSDS-PAGE（10〜20%勾配ゲル）に加え、PVDF膜フィルターに電気泳動的に移した。結合バッファー[50mMトリス-HCl pH7.5、1mM EDTA、5mM MgCl2、0.3%（v/v）トゥイーン20]に室温で１時間浸漬した後、その膜フィルターを結合バッファー中[32P]NADと20℃で18時間インキュベートした。次に、そのフィルターを結合バッファーで３回洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。図６に示されるように、p43のNAD+結合能が検出された。一方、その結合能は削除した過剰非放射能NADの存在下に完全に消失した。
実施例６：免疫沈降及び免疫ブロット分析
IL-2R及びp43の免疫沈降及び免疫ブロット法については、CD4細胞外及び経膜ドメインをもつキメラ遺伝子:  CD4β、CD4βA、CD4βS、CD4γ及びCD4γM1キメラレセプター発現プラスミドを次の通り構築し、IL-2Rβ鎖、内部“S領域”及び“A領域”を欠くIL-2Rβ鎖、IL-2Rγ鎖の細胞質ドメイン、及びIL-2Rγ鎖の細胞質ドメインの膜方向の７アミノ酸を（18）のように構築した。概要としては、CD4β及びCD4γキメラレセプターは、２組の合成オリゴヌクレオチドを用いてIL-2Rβ鎖及びIL-2Rγ鎖と枠内で各々融合したヒトCD4細胞外／経膜ドメインを含む。CD4β及びCD4γcDNAをEcoRI/XbaI切断pEFベクター（25）（pEF-CD4β及びpEF-CD4γ）に各々挿入した。キメラ分子、CD4βA及びCD4βSの発現ベクター（pEF-CD4βA及びCD4βS）を構築するために、pdKCRA及びpdKCRSベクター（8）を各々NcoI及びBamHIで消化した。消化後、各NcoI-BamHI断片（〜0.9Kb）をNcoI/BamHI切断pEF-CD4βベクターに挿入した。LCK-p43キメラ分子は、LCKのPCR断片を用いてp43と枠内で融合したGlyからAlaまでミリスチル化部位で変異したp56lckＮ末端領域（〜100アミノ酸）を含む。LCK-p43 cDNAをpEFベクター（25）に挿入した。構築物を制限酵素消化及びDNA配列決定で確認した。
COS細胞における一時的cDNA発現の実験を（7）のように行った。抗CD4抗体（OKT4）を用いる免疫沈降及び抗p56lck抗血清を用いる免疫ブロット分析を（18）のように行った。
実施例７：抗体の生産
ポリクローナル抗体を、p43の異なる配列モチーフに対応する下記の合成ペプチドに対して高めた。
0004282761.tif 000008
抗原複合体調製、免疫化及び抗体力価測定のプロトコールは次の通りである。
担体タンパク質へのスルフヒドリル含有ペプチドの複合のプロトコールを用いた。概要としては、５００μlのPBS中１mgのペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（KLH，cf．34，vol．I，p．26）を５００μlの完全フロインドアジュバントとリュアロックコネクト型注射器を用いて混合した。複合成分の適切な混合を試験した後、ウサギの首の後ろに皮下注射した。ウサギに５００μgの抗原（不完全フロインドアジュバントと混合した複合体）を２週間の間隔で３ヵ月間追加注射した。
抗血清を酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）を用いて定期的に試験し、１μg/μlのペプチドKLH結合体をコーティングバッファー（0.1M NaHCO3 pH9.0）中で96ウェルマイクロプレートに被覆した。そのマイクロプレートをリンスバッファー（PBS，0.1％トゥイーン20）で洗浄した後、免疫血清又は対照血清の種々の希釈液を５０〜１００μlの容量でウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。
プレートをリンスバッファーで洗浄し、PBS及び１％BSA及び0.1％トゥイーン20中アルカリホスファターゼと結合した５０μlのヤギ抗ウサギIgGをウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。そのマイクロプレートをリンスバッファーで洗浄し、基質バッファー中１００μlの基質、p-フェニルリン酸二ナトリウムをウェルに加えた。マイクロプレートを室温で１〜２時間インキュベートし、光学濃度（OD）を405nmで測定した（ref．620nm）。
３種類の異なる抗ペプチド抗体は、希釈度1/104のペプチド結合体を認識することができた。配列番号11のペプチドに対する抗体は、E．coli発現組換えヒトp43を認識することができた。
文献
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0004282761.tif 000010
0004282761.tif 000011
0004282761.tif 000012
【図１Ａ】
0004282761.tif 000019
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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