(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｚｔ−１プロモーターの制御下に、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有してなる人工オペロンであって、前記各遺伝子は、ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子、ＧｒｏＥＬをコードする遺伝子、トリガーファクターをコードする遺伝子の順番で配置され、前記トリガーファクターをコードする遺伝子が、配列番号：２に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：２に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子であり、前記ＧｒｏＥＬをコードする遺伝子が、配列番号：５に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：５に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子であり、前記ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子が、配列番号：６に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：６に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子である、人工オペロン。
【請求項２】
配列番号：７に示される塩基配列からなる、請求項１記載の人工オペロン。
【請求項３】
請求項１又は２記載の人工オペロンを保持する、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれを発現しうるプラスミド。
【請求項４】
さらに、ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及びｔｅｔＲリプレッサーを有する請求項３記載のプラスミド。
【請求項５】
請求項３又は４記載のプラスミドと外来タンパク質用の発現プラスミドとを保持する共形質転換体。
【請求項６】
大腸菌のプロテアーゼ変異株を用いて得られる請求項５記載の共形質転換体。
【請求項７】
プロテアーゼ変異株がｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株、またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株である、請求項６記載の共形質転換体。
【請求項８】
大腸菌のｐｌｓＸ変異株を用いて得られる、請求項５記載の共形質転換体。
【請求項９】
大腸菌のｒｐｏＨ変異株を用いて得られる、請求項５記載の共形質転換体。
【請求項１０】
ｒｐｏＨ変異株がｒｐｏＨ欠失変異株である、請求項９記載の共形質転換体。
【請求項１１】
外来タンパク質が、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因子、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調節因子およびウイルス構成タンパク質からなる群より選択された、請求項５〜１０いずれか記載の共形質転換体。
【請求項１２】
請求項５〜１１いずれか記載の共形質転換体を用いることを特徴とする、外来タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
トリガーファクターの発現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量が外来タンパク質の可溶化に適した量となる誘導条件下に共形質転換体の培養を行なう、請求項１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる、人工オペロン、該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミドと外来タンパク質発現ベクターとを含有した共形質転換体および該共形質転換体を用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリガーファクターは、イン・ビトロでの大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐＡの前駆体であるｐｒｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な細胞質因子として発見された因子である〔Crooke, E. and Wickner, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5216-5220 (1987)〕。また、分子量４８ｋＤａのトリガーファクターをコードする遺伝子としてｔｉｇ遺伝子がクローニングされている〔Guthrie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-5562 (1990) 〕。アミノ酸配列の解析により、トリガーファクターはＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを有し、ＦＫ５０６との結合活性とペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性の発現に必要なすべてのアミノ酸が保存されていることが明らかにされている〔Callebaut, I. and Mornon, J. -P., FEBS Lett., 374, 211-21 (1995)〕。
【０００３】
トリガーファクターは、大腸菌リボソームの５０Ｓサブユニットに結合したＰＰＩａｓｅとしても同定され、該トリガーファクターは、変異型ＲＮａｓｅＴ１のイン・ビトロでのリフォールディングにおけるプロリル異性化反応を著しく促進することが報告されている〔Stoller, G. et al. (1995) EMBO J. 14, 4939-4948 〕。さらに、クロスリンク試薬を用いた実験により、トリガーファクターは大腸菌リボソーム上の新生ポリペプチド鎖と結合することが見出されている〔Valent, Q. A. et al., EMBO J., 14, 5494-5505 (1995); Hesterkamp, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4437-4441(1996)〕。また、トリガーファクターはＧｒｏＥＬのアンフォールドタンパク質への結合を促進することも知られている〔Kandror, O. et al., EMBO J., 14, 6021-6027 (1995) ;Kandror, O. et al., J. Biol. Chem., 272, 1730-1734 (1997)〕。
【０００４】
ＰＰＩａｓｅはペプチド鎖中のプロリン残基に作用し、ペプチド結合に関する配置のシス−トランス異性化を触媒する。この反応はタンパク質の折畳み過程の律速段階とされており、ＰＰＩａｓｅファミリータンパク質の役割として、細胞内でのタンパク質折畳み、リフォールディング、会合と解離、輸送などへの関与が考えられている。
【０００５】
また、イン・ビトロにおいては、トリガーファクターがいくつかのタンパク質の折り畳みを助けることが示されている〔Scholz, C. et al., EMBO J. 16, 54-58, (1997)〕。しかしながら、トリガーファクターの機能の実態は不明であった。
【０００６】
大腸菌による外来タンパク質の発現において、シャペロンを共発現させて目的の外来タンパク質の不溶化抑制および安定化の試みは、これまで種々行なわれている。しかしながら、どのタンパク質にどのシャペロンの共発現が有効かを予測することは困難であり、試行錯誤が繰り返されている。また、既知のシャペロンの共発現では十分な効果が得られない場合もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有した人工オペロンを提供することを目的とする。また、本発明は、該オペロンを含有したプラスミドおよびトリガーファクター発現プラスミドを提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記プラスミドと外来タンパク質発現ベクターとを含有した共形質転換体を提供することにある。さらに、本発明は、前記共形質転換体を用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  Ｐｚｔ−１プロモーターの制御下に、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有してなる人工オペロンであって、前記各遺伝子は、ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子、ＧｒｏＥＬをコードする遺伝子、トリガーファクターをコードする遺伝子の順番で配置され、前記トリガーファクターをコードする遺伝子が、配列番号：２に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：２に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子であり、前記ＧｒｏＥＬをコードする遺伝子が、配列番号：５に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：５に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子であり、前記ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子が、配列番号：６に示される塩基配列からなる遺伝子、または配列番号：６に示される塩基配列において、１乃至数個の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入の変異が導入された塩基配列からなる遺伝子である、人工オペロン、
〔２〕  前記〔１〕記載の人工オペロンを保持する、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれを発現しうるプラスミド、
〔３〕  前記〔２〕記載のプラスミドと外来タンパク質用の発現プラスミドとを保持する共形質転換体、ならびに
〔４〕  前記〔３〕記載の共形質転換体を用いることを特徴とする、外来タンパク質の製造方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の人工オペロンは、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子（それぞれｔｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子、ｇｒｏＥＳ遺伝子という）を含有することを１つの大きな特徴とする。本発明の人工オペロンは前記ｔｉｇ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの各遺伝子を含有するため、該人工オペロンを外来タンパク質をコードする遺伝子と共発現させた場合に、可溶性の発現産物を効率よく得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１０】
本発明において、「トリガーファクター」とは、イン・ビトロでの大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐＡの前駆体であるｐｒｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な細胞質因子として発見された因子をいう。
【００１１】
前記トリガーファクターは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する因子である〔Guthrie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-5562 (1990) 〕。本発明において、トリガーファクターは、外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる因子であれば、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基に、置換、欠失、付加または挿入の変異が導入された配列を有する因子をも包含する。
【００１２】
本発明の人工オペロンには、前記トリガーファクターのアミノ酸配列に対応するｔｉｇ遺伝子が用いられる。かかるｔｉｇ遺伝子としては、配列番号：２に示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる〔Guthrie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-5562 (1990) 〕。前記配列番号：２に示される塩基配列からなる遺伝子は、例えば、小原クローンＮｏ．１４８〔Kohara, Y et al., Cell, 50, 495-508 (1987)〕から得ることができる。
【００１３】
また、本発明において、ｔｉｇ遺伝子は、外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された配列からなる遺伝子をも包含する。
【００１４】
さらに、本発明において、ｔｉｇ遺伝子は、外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前記配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子をも包含する。
【００１５】
なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル第２版〔Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989) 〕に記載の条件などが挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および４に示す〔Hemmingsen, S. M. et al., Nature, 333, 330-334 (1988) 〕。本発明において、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳは、前記配列番号：３および４のそれぞれに示される配列を有する野性型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳと同等の機能を有する因子であれば、前記配列番号：３および４のそれぞれに示されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基に、置換、欠失、付加または挿入の変異が導入された配列を有する因子をも包含する。
【００１７】
本発明に用いられるｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、それぞれ配列番号：５および６に示される塩基配列〔Hemmingsen, S. M. et al., Nature, 333, 330-334 (1988) 〕からなる遺伝子が挙げられる。前記ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、例えば、ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (1998) 〕から得ることができる。
【００１８】
本発明においては、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳと同等の機能を有する因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号：５および６に示されるそれぞれの塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠失、付加または挿入の変異が導入された配列を有する遺伝子をも包含する。
【００１９】
さらに、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳと同等の機能を有する因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番号：５および６に示されるそれぞれの配列または前記配列番号：５および６に示されるそれぞれの塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子をも包含する。
【００２０】
本発明の人工オペロンにおいて、前記ｔｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子の配置は、特に限定されるものではないが、例えば、ｇｒｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ−ｔｉｇの順番で配置されたオペロンなどが挙げられる。
【００２１】
本発明の人工オペロンにおいては、前記ｔｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、プロモーターの制御下に配置することができる。
【００２２】
プロモーターの制御下に存在する前記オペロンの転写を制御するプロモーターは、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量を調節する観点から、誘導可能なプロモーターであることが好ましい。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａ、Ｐｚｔ−１、ＰL およびＴ７が挙げられる。前記ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃは、いずれもイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導することができ、前記ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１は、それぞれ、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、Ｌ−アラビノース、テトラサイクリンを用いて誘導することができる。また前記ＰL は高温（４２℃）で誘導することができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって特異的にかつ強力に転写されるＴ７プロモーターも使用できる。この場合、ｌａｃプロモーター下流に連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化した大腸菌を用いることにより、ＩＰＴＧで誘導が可能である。前記プロモーターの中では、誘導操作性の容易さの観点から、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１が好ましい。前記プロモーターは、公知のベクターなどに含まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜切り出して用いることができる。
【００２３】
また、本発明の人工オペロンにおいては、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２などに代表されるターミネーターを有することにより、より安定に人工オペロン上の因子を発現させることが可能になる。これらのターミネーターは、公知のベクターなどに含まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜切り出して用いることができる。
【００２４】
本発明の人工オペロンの具体例としては、例えば、配列番号：７に示される塩基配列を有するオペロンなどが挙げられる。
【００２５】
本発明のプラスミドは、トリガーファクターをコードする遺伝子または前記人工オペロンを保持することを１つの大きな特徴とする。
【００２６】
本発明のプラスミドにおいては、誘導可能なプロモーターにより、トリガーファクターをコードする遺伝子または人工オペロン上にコードされる因子（トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ）を発現できることが好ましい。
【００２７】
また、本発明のプラスミドを宿主に導入するに際して、同一のプラスミド上に、トリガーファクターをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする外来タンパク質とをコードする遺伝子を有しているプラスミドを用いてもよく、トリガーファクターをコードする遺伝子またはオペロンを保持するプラスミドと外来タンパク質をコードする遺伝子を保持するプラスミド（以下、共発現型プラスミドという）とを同時に用いてもよい。なかでも、外来タンパク質ごとにトリガーファクターをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする外来タンパク質とをコードする遺伝子を含有するプラスミドを作製する必要性がないこと、宿主内でのプラスミドの安定性などの観点から、共発現型プラスミドが好ましい。
【００２８】
外来蛋白質の発現レベルを低下させず、トリガーファクターまたは前記人工オペロン上にコードされる因子の発現量や発現時期を最適化するために、トリガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因子の発現と目的蛋白質の発現は独立して制御できる方が有利である。前記したような観点から、トリガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因子の発現に用いる誘導可能なプロモーターとしては、目的蛋白質の発現に用いられるプロモーターと異なるものが好ましい。
【００２９】
前記プラスミドとして共発現型プラスミドを用いる場合、使用する宿主内、例えば、大腸菌内で目的蛋白質の発現ベクターと不和合性を示さないレプリコンを有するものであれば使用可能である。例えば、目的蛋白質の発現ベクターとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１レプリコンをもつベクターを用いる場合、トリガーファクターまたは前記人工オペロン上にコードされる因子の発現に用いるプラスミドには、ｐＡＣＹＣ系プラスミドに存在するｐ１５Ａレプリコンを使用することができる。
【００３０】
本発明の発現プラスミドの具体例としては、共発現型プラスミドである、ｐＴｆ１３およびｐＧ−Ｔｆ１が挙げられる。それぞれの概略構成図を図１および図２に示す。
【００３１】
前記ｐＴｆ１３およびｐＧ−Ｔｆ１は、それぞれ、例えば、下記実施例１および下記実施例２のようにして得ることができる。
【００３２】
本発明の共形質転換体は、本発明のプラスミド（共発現型プラスミド）と外来タンパク質発現ベクターとを導入することによって得ることができる。
【００３３】
前記共形質転換体に用いる外来タンパク質発現ベクターとしては、特に限定されないが、所望の外来タンパク質を菌体の細胞質内で発現または菌体のペリプラズムに分泌させうるベクターであり、かつ前記発現プラスミドと和合性を示すベクターなどが挙げられ、特に誘導可能なプロモーターにより、目的の外来タンパク質の発現が誘導されるベクターが好ましい。誘導可能なプロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが挙げられるが、トリガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因子の誘導発現に用いるプロモーター以外のプロモーターを選ぶことにより、トリガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因子と目的外来タンパク質とを別々に発現誘導することができる。
【００３４】
また、外来タンパク質発現ベクターは、必要に応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げられるが、本発明のプラスミド（共発現型プラスミド）に含まれる選択マーカー遺伝子以外のものを用いることにより、共形質転換体の二重選別が可能となる。
【００３５】
前記外来タンパク質発現ベクターとしては、得られた外来タンパク質のジスルフィド結合の正しい形成を行なう観点から、菌体のペリプラズムに分泌させるベクターであることが好ましく、かかるベクターとしては、例えば、目的とする外来タンパク質にＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＭａｌＥ、β−ラクタマーゼなどのシグナルペプチドが付加されたポリペプチドをコードする遺伝子を有するベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、例えば、前記シグナルペプチドをコードする遺伝子を遺伝子工学的に目的外来タンパク質をコードする遺伝子上のＮ末端に対応する箇所に付加し、得られた遺伝子を公知のベクターに組み込むことにより得ることができる。
【００３６】
また、本発明の外来タンパク質発現ベクターにおいては、本発明の目的を妨げないものであれば、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などのタンパク質との融合タンパク質としての発現；ヒスチジンタグなどを付加したタンパク質としての発現などに代表される目的外来タンパク質の精製を容易に行なうための手法を可能にする配列を含んでもよい。
【００３７】
本発明に用いられる宿主としては、例えば、大腸菌が挙げられ、具体的には、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０等の一般的に用いられる株、ならびにｄｅｇＰ変異株、ｏｍｐＴ変異株、ｔｓｐ変異株、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株等のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒｐｏＨ変異株（例えば、ｒｐｏＨ欠失変異株、ｒｐｏＨミスセンス変異株など）等の変異株が挙げられる。
【００３８】
本発明においては、外来タンパク質をより安定に発現させる観点から、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒｐｏＨ変異株が好ましい。前記ｒｐｏＨ変異株のなかでは、外来タンパク質をより安定に発現させる観点から、ｒｐｏＨ欠失変異株が好ましい。
【００３９】
ここで、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来のＫＹ２７８３株が好ましい。なお、前記ＫＹ２７８３株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＹ２７８３と命名・表示され、平成１０年２月３日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２４４として寄託されている。
【００４０】
また、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株において、さらにＨｓｌＶ／ＵプロテアーゼをコードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株であり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来のＫＹ２８９３株が好ましい。なお、前記ＫＹ２８９３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＹ２８９３と命名・表示され、平成１０年２月３日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２４３として寄託されている。
【００４１】
本発明により、発現させる外来タンパク質としては、宿主内、特に大腸菌内で不安定化および／または不溶化する外来タンパク質であれば、いかなるタンパク質でもよい。かかる外来タンパク質の具体例としては、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因子、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調節因子およびウイルス構成タンパク質が挙げられる。
【００４２】
本発明のプラスミドを外来タンパク質発現ベクターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法が用いられる。共形質転換体のスクリーニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬剤により行なうことができる。外来タンパク質の発現は、例えば、ウエスタンブロット解析等により確認することができる。
【００４３】
本発明の外来タンパク質の製造方法は、前記共形質転換体を用いることを１つの大きな特徴とする。前記製造方法は、例えば、トリガーファクターの発現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量が、発現対象の外来タンパク質の安定化および／または可溶化に適した量となる誘導条件下に共形質転換体を培養し、菌体を集め、集めた菌体を破砕し、外来タンパク質に応じた精製方法に従って、該外来タンパク質を単離・精製することにより行なうことができる。
【００４４】
前記誘導条件は、本発明のプラスミドおよび外来タンパク質発現ベクターに用いられた誘導可能なプロモーターにより異なるが、トリガーファクターの発現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量が外来タンパク質の可溶化に適した量となる条件であればよい。例えば、前記誘導条件は、以下のようにして決定することができる。
【００４５】
まず、前記プロモーターの誘導物質を、種々の添加濃度、添加時期を変化させて添加する。外来タンパク質を発現させた菌体を集め、集めたそれぞれの菌体を破砕し抽出物を得る。得られたそれぞれの抽出物を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、クマシーブリリアントブルー染色や銀染色などによりゲル中のタンパク質に由来するバンドを可視化する。可視化されたバンドのなかで、外来タンパク質に由来するバンドについて、デンシトメトリーなどでその濃度を測定することにより適切な誘導条件を調べることができる。
【００４６】
共形質転換体の培養は、宿主として用いた細胞により異なるため、特に限定されないが、種々の培養時間、培養温度などを設定し、それぞれの培養条件下に発現した外来タンパク質の量を前記誘導条件の決定と同様に調べることにより決定することができる。
【００４７】
外来タンパク質の分離精製方法は、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーに代表されるタンパク質の精製方法により行なうことができる。
【００４８】
【実施例】
実施例１  ｐＴｆ１３の構築
トリガーファクターを含む小原クローンＮｏ．１４８〔Kohara, Y. et al. (1987) Cell 50, 495-50〕から、ｔｉｇ遺伝子を含む約２．６ｋｂの断片をＸｍｎＩおよびＮｒｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＸｍｎＩ−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化し、ｔｉｇ遺伝子断片を得る。ｐＡＲ３プラスミド〔Perez-Perez, J. & Guitierrez, J.，Gene 158, 141-142 (1995)〕をＰｓｔＩで切断し、ついで得られた直鎖状のプラスミド断片を平滑末端化して、ｐＡＲ３断片を得る。前記のようにして得られたｔｉｇ遺伝子断片をｐＡＲ３断片に連結し、ｐＴｆ１３を構築した。
【００４９】
実施例２  ｐＧ−Ｔｆ１の構築
前記小原クローンＮｏ．１４８から、ｔｉｇ遺伝子を含む約２．５ｋｂの断片をＢｓｐ１２８６１ＩおよびＮｒｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＢｓｐ１２８６１Ｉ−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化して、ｔｉｇ遺伝子断片を得る。ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (1998) 〕のｇｒｏＥＬ遺伝子の下流をＳｍａＩで切断したのち、前記平滑末端化されたｔｉｇ遺伝子断片を連結し、ｐＧ−Ｔｆ１を得た。
【００５０】
調製例１
マウスエンドスタチン発現のための共形質転換体の調製
ｐＴｆ１３またはｐＧ−Ｔｆ１のそれぞれ（各５０ｎｇ）とマウスエンドスタチンをコードするｐＴＢ０１＃８〔O'Reilly, M. S. et al., Cell, 88, 277-285 (1997); ハーバード大学子供病院Thomas Boehm博士、Judah Folkman 博士より入手〕（５０ｎｇ）とを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行なった。
【００５１】
ｐＴｆ１３とｐＴＢ０１＃８を保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られたトリガーファクターとマウスエンドスタチンとを共発現するクローンをＮＫ３６５と命名した。
【００５２】
ｐＧ−Ｔｆ１とｐＴＢ０１＃８を保持する共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られた得られたトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共発現するクローンをＮＫ３６４と命名した。
【００５３】
比較例として、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥとマウスエンドスタチン、ならびにＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共発現する共形質転換体をそれぞれ調製した。
【００５４】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共発現するクローンは、ｐＧ−ＫＪＥ８とｐＴＢ０１＃８とを共形質転換し、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いて、スクリーニングすることにより得た。得られたクローンをＮＫ３６３と命名した。
【００５５】
前記ｐＧ−ＫＪＥ８はｐＧ−ＫＪＥ６〔Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 1694-1699 (1998)〕のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺伝子の下流にｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター配列を入れることにより、シャペロン発現調節をより厳密に行えるようにしたプラスミドで、下記のように調製した。まず、ｐＫＪＥ７のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺伝子の下流にあるＫｐｎＩ部位を平滑末端化した後、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）からＸｍｎＩ部位で切り出したｒｒｎＢＴ１Ｔ２配列を挿入し、プラスミドｐＫＪＥ９を得た。次いで、ｐＫＪＥ９をＸｍｎＩ部位で切断して、ｐＧ−ＫＪＥ６を調製した場合と同様にＴｅｔＲ−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ断片を平滑末端で挿入した。ＴｅｔＲ−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ断片がｐＧ−ＫＪＥ６と同じ向きに入っているプラスミドを選択し、該プラスミドをｐＧ−ＫＪＥ８とした。
【００５６】
試験例１  マウスエンドスタチンの発現
調製例１で得られた各共形質転換体を用いて、マウスエンドスタチンの発現を調べた。培養には、Ｌ培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いた。
【００５７】
各共形質転換体は３７℃で培養した。培養開始する際に、ＮＫ３６５の培地にはＬ−アラビノース（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、またＮＫ３６４の培地にはテトラサイクリン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加してシャペロンを発現誘導した。Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔ約６０の時に培養液に１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4 とλファージＣＥ６（Ｎｏｖａｇｅｎ社）３×１０9 ｐｆｕ／ｍｌを加えてエンドスタチンの発現を誘導した。
【００５８】
ＮＫ３６３の培養開始時に培地にテトラサイクリン（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔ約６０の時に前記と同様に１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4 とλファージＣＥ６を加えて、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンの発現を誘導した。
【００５９】
また、培養開始時にＬ−アラビノース（１０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔ約６０の時にＭｇＣｌ2 とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥとマウスエンドスタチンの発現を誘導した。
【００６０】
さらに、培養開始時にＬ−アラビノース（１０ｍｇ／ｍｌ）とテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍｌ）を、Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔ約６０の時にＭｇＣｌ2 とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンの発現を誘導した。
【００６１】
エンドスタチンの発現誘導を２時間行なったのち、菌体を回収した。得られた菌体を超音波破砕し、ついで８２００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、菌体タンパク質８μｇに由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。なお、対照として、トリガーファクターを発現誘導しないＮＫ３６５から得られた画分を用いた。結果を図３に示す。
【００６２】
図３の左パネルに示すように、通常大腸菌内では不溶化しインクルージョンボディーとして発現するマウスエンドスタチンとＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのみとの共発現した場合には、エンドスタチンは大部分が可溶性画分に検出されたが、不溶性画分にもマウスエンドスタチンが検出された。さらに、マウスエンドスタチンとＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥまたはＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとを共発現した場合にも、不溶性画分にマウスエンドスタチンが検出された。
【００６３】
一方、図３の右パネルの結果より、マウスエンドスタチンとトリガーファクターまたはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとを共発現したどちらの場合も、発現したエンドスタチンは可溶性画分においてのみ検出され、不溶性画分には検出されなかった。また、トリガーファクターまたはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを共発現していない対照に比べ、可溶性画分が増加していることが観察された。
【００６４】
以上のように、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ、ならびにＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれのシャペロンの共発現に比べ、トリガーファクターまたはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの共発現により、一層外来タンパク質の可溶化の効果が得られることが示された。
【００６５】
調製例２
ヒトＯＲＰ１５０発現のための共形質転換体の調製
実施例１もしくは２で得られたｐＴｆ１３もしくはｐＧ−Ｔｆ１、またはｇｒｏＥＬおよびｇｒｏＥＳを保持するプラスミドであるｐＧｒｏ１１〔Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (1998) 〕のそれぞれ（各５０ｎｇ）とヒトＯＲＰ１５０をコードするプラスミドｐＯＲＰ４（５０ｎｇ）とを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。なお、形質転換は塩化カルシウム法により行なった。
【００６６】
ｐＴｆ１３とｐＯＲＰ４の共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られたクローンをＮＫ３６０と命名した。
【００６７】
ｐＧ−Ｔｆ１とｐＯＲＰ４の共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られたクローンをＮＫ３４０と命名した。
【００６８】
ｐＧｒｏ１１とｐＯＲＰ４の共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。得られたクローンをＮＫ３４１と命名した。
【００６９】
試験例２  ヒトＯＲＰ１５０発現
調製例２で得られたＮＫ３６０、ＮＫ３４０およびＮＫ３４１を用いて、ヒトＯＲＰ１５０の発現を調べた。培養には、Ｌ培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いた。
【００７０】
各共形質転換体は３７℃で培養した。ＮＫ３４０およびＮＫ３４１は、Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔが約４０に達した時に、それぞれの培養液にテトラサイクリン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加してシャペロンおよびＯＲＰ１５０の発現を誘導した。ＮＫ３６０は、Ｋｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔが約２０に達した時にＬ−アラビノース（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加してトリガーファクターを発現誘導し、続いてＫｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔが約４０に達した時にＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加してＯＲＰ１５０の発現を誘導した。
【００７１】
ＩＰＴＧ添加２時間後にそれぞれの菌体を回収した。得られた菌体を超音波破砕し、ついで８２００×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、菌体タンパク質８μｇに由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。なお、対照として、シャペロン（ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ）を発現誘導しないＮＫ３４１から得られた画分を用いた。結果を図４に示す。
【００７２】
図４の結果より、通常大腸菌内では不溶化しインクルージョンボディーとして発現するＯＲＰ１５０は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとの共発現あるいはトリガーファクターとの共発現により、発現したＯＲＰ１５０の半分程度が可溶性タンパク質となり、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳおよびトリガーファクターとの共発現によりほぼすべてのＯＲＰ１５０が可溶性タンパク質となることが示された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明の人工オペロンおよびプラスミドは、目的の外来遺伝子との共発現により、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ可溶化した状態で発現することができるという優れた性質を発揮する。また、本発明の共形質転換体は、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ可溶化した状態で発現することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の外来蛋白質の製造方法によれば、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ可溶化した状態で発現することができるという優れた効果を奏する。本発明によれば、大腸菌における外来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
【００７４】
【配列表】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＴｆ１３（約５．９ｋｂ）の概略構成図を示す。図中、ａｒａＢ  ｐ／ｏはａｒａＢプロモーター／オペレーター、ｔｉｇはトリガーファクターの構造遺伝子、ｐＡＣＹＣ  ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製開始起点、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｒａＣはａｒａＣアクチベーター／リプレッサーをそれぞれ示す。
【図２】図２は、ｐＧ−Ｔｆ１（約８．４ｋｂ）の概略構成図を示す。図中、Ｐｚｔ−１ｐはＰｚｔ−１プロモーター、ｇｒｏＥＳおよびｇｒｏＥＬはＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬをコードする遺伝子、ｔｉｇはトリガーファクターの構造遺伝子、ｔｅｔＲはｔｅｔＲリプレッサー、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＡＣＹＣ  ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製開始起点をそれぞれ示す。
【図３】図３は、共発現によるマウスエンドスタチンの可溶化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、Ｉは不溶性画分を示す。
【図４】図４は、共発現によるヒトＯＲＰ１５０の可溶化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、Ｉは不溶性画分を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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