(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験細胞に発現する所望の抗原の発現量を測定する方法であって、
（ａ）該抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程；
（ｂ）該抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の蛍光標識された抗体を用いて、（ａ）の細胞群の蛍光強度をそれぞれ測定する工程；
（ｄ）予め定量されている該抗原の発現量と（ｃ）で測定された蛍光強度との相関関係を解析して相関式を用意する工程；
（ｅ）被験細胞と（ｂ）の蛍光標識された抗体を接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；及び
（ｆ）上記（ｅ）で測定された蛍光強度から、（ｄ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程が、該抗原の発現量が異なる複数の細胞群を用意し、該抗原に特異的に結合する、放射性同位体で標識された抗体を用いて該抗原の発現量を定量する工程を含む工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原の発現量が異なる複数の細胞群が、該抗原の発現量が少なくとも10倍以上異なる複数の細胞群である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）の相関式が、予め用意された相関式である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
所望の薬物療法と該薬物療法に対する患者の感受性の相関を公式化する方法であって、
（ａ）一群の被験患者を選択する工程；
（ｂ）前記薬物療法に対する患者の感受性に影響を与えると推定される抗原を選択する工程；
（ｃ）前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｄ）前記抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程；
（ｅ）上記（c）の蛍光標識された抗体を用いて、（ｄ）の細胞群の蛍光強度をそれぞれ測定する工程；
（ｆ）予め定量されている該抗原の発現量と（ｅ）で測定された蛍光強度との相関関係を解析して相関式を用意する工程；
（ｇ）被験患者由来の被験細胞と（ｃ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；
（ｈ）上記（ｇ）で測定された蛍光強度から、（ｆ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；及び
（ｉ）上記（ｈ）で算出された該抗原の発現量と患者の薬物療法に対する効果とを比較し、相関を解析する工程；
を含む方法。
【請求項６】
所望の薬物療法に対する患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）疾患において特異的に発現量が増加する抗原を選択する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｃ）前記抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程；
（ｄ）上記（ｂ）の蛍光標識された抗体を用いて、（ｃ）の細胞群の蛍光強度をそれぞれ測定する工程；
（ｅ）予め定量されている該抗原の発現量と（ｄ）で測定された蛍光強度との相関関係を解析して相関式を用意する工程；
（ｆ）患者由来の被験細胞と（ｂ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；
（ｇ）上記（ｆ）で測定された蛍光強度から、（ｅ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；及び
（ｈ）上記（ｇ）で算出された該抗原の発現量と該薬物療法に対する患者の感受性の相関とを比較する工程；
を含む方法。
【請求項７】
前記抗原が細胞表面上に発現する抗原である請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞表面上に発現する前記抗原が癌細胞の細胞表面上に特異的に発現する抗原である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌細胞の細胞表面上に特異的に発現する前記抗原が配列番号１に記載されたHM1.24抗原である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ADCC活性）または補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）を有する抗体を蛍光標識した抗体である請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体が、フルオレセイン（fluorescein）で蛍光標識された抗体である請求項１から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体が、抗HM1.24抗体を蛍光標識した抗体である請求項１から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗HM1.24抗体がヒト型化抗HM1.24抗体である請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光強度を測定する工程がフローサイトメトリーを用いて測定する工程である請求項１から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、蛍光強度と抗原数の相関式が、
抗原数＝2.53e2.15Log MEFL
で表される相関式である請求項１から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物療法が抗体療法である請求項５または６に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、所望の抗原が、前記抗体療法に用いる抗体が結合する抗原である請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体療法に用いる抗体が、ADCC活性および／またはCDC活性を有する抗体である請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記ADCC活性および／またはCDC活性を有する抗体が、抗HM1.24抗体である請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗HM1.24抗体が、ヒト型化抗HM1.24抗体である請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が造血器腫瘍を有する請求項５または６に記載の方法。
【請求項２２】
前記造血器腫瘍が骨髄腫および／またはリンパ球系腫瘍である請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項22に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、抗原の発現量を定量する方法、及びその応用に関する。
背景技術
Ｇｏｔｏ，Ｔらはヒト形質細胞を免役して得られた、Ｂ細胞系列に特異的に発現する分子量が２９〜３３ｋＤａの抗原を認識するマウスモノクローナル抗体（マウス抗ＨＭ１．２４抗体）を報告している（Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２−１９３０）。また、マウス抗ＨＭ１．２４抗体によって認識される抗原をＨＭ１．２４抗原と呼んでいる。ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗ＨＭ１．２４抗体を投与すると、この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこと（小阪昌明ら、日本臨床（１９９５）５３，６２７−６３５）から、抗ＨＭ１．２４抗体はラジオアイソトープ標識による腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。
また、上記Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２−１９３０には、抗ＨＭ１．２４抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ  ８２２６に対して細胞傷害活性を有することが述べられている。また、マウス抗ＨＭ１．２４抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域と置き換えたキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、およびマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）をヒト抗体に移植し、さらに幾つかのＦＲアミノ酸の置換を行ったヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（再構成ヒトＨＭ１．２４抗体）も作製されている（ＷＯ  ９８／１４５８０）。また、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体やヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体が、骨髄腫細胞に特異的に結合すること、さらには細胞傷害活性を有することが示されている（Ｂｌｏｏｄ（１９９９）９３，３９２２−３９３０）。
一方、リンパ球系腫瘍に関しても、抗ＨＭ１．２４抗体が認識する抗原タンパク質（ＨＭ１．２４抗原）がリンパ球系腫瘍に発現していること、および抗ＨＭ１．２４抗体がリンパ球系腫瘍に対し、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）や抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）による細胞傷害活性を有し、抗腫瘍効果を発現することが示されている（ＷＯ  ９８／３５６９８）。
この様に、ＨＭ１．２４抗原は、終末分化Ｂ細胞である骨髄腫細胞のみならず、リンパ球系腫瘍においても高発現しており、ＨＭ１．２４抗原を認識する抗ＨＭ１．２４抗体、特にヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は、多発性骨髄腫を含む骨髄腫やリンパ球系腫瘍の治療剤として有用であることが示されている。
抗ＨＭ１．２４抗体は、標的細胞表面上に発現しているＨＭ１．２４抗原に結合し、ＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性を介して殺細胞活性を発揮することから、当該活性は標的細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現量に依存する。従って、抗ＨＭ１．２４抗体、特に、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の多発性骨髄腫患者やリンパ球系腫瘍患者での効果を予測する際に、対象患者の腫瘍細胞上に発現するＨＭ１．２４抗原の発現量を定量することができれば、治療効果を精度よく予測することが可能となる。
発明の開示
一般に、細胞表面上に存在する抗原量を定性的に測定する方法としてフローサイトメトリーが広く用いられている。フローサイトメトリーは、細胞上の分子の発現量を、蛍光強度として簡便に測定することができる。しかし、その蛍光強度は相対値であり、異なる測定日、測定機器で得られた蛍光強度に関するデータを直接比較することはできない。従って、蛍光標識された抗ＨＭ１．２４抗体を用いてＨＭ１．２４抗原の発現量を定量するには、得られた蛍光強度を標準化する必要がある。
課題を解決するための手段
本発明者らは鋭意研究の結果、細胞に発現する抗原量を蛍光標識抗体を用いて定量する方法を見いだした。また、蛍光標識された抗体による蛍光強度と抗原の発現量との相関式を公式化する方法を見だした。これらの方法を用いることで、患者の診断、薬物療法に対する感受性の予測をおこなうことが可能になった。より具体的には、被験細胞を、フルオレセイン標識された、所望の抗原特異的抗体またはフルオレセイン標識された対照抗体と反応させ、その蛍光強度をフローサイトメーターにて測定し、ＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓを用いた検量線により、細胞の蛍光強度をＬｏｇ  ＭＥＦＬ値として標準化した。
さらに、一定量の抗原を結合させたビーズを作製し、このビーズを陽性対照とすることにより、アッセイ系および試薬の標準化、および品質管理を行うことが可能となった。実際に、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いて６つの血球系腫瘍細胞株（ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６Ｂｌ、ＡＲＨ−７７、ＫＰＭＭ２、ＩＭ−９、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ）、さらに健常人末梢血単核球および５例の骨髄腫患者由来腫瘍細胞を測定したところ、全ての細胞においてＨＭ１．２４抗原の発現が確認され、その発現量を定量化することが可能であった。さらに、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値とＨＭ１．２４抗原の発現量、およびＬｏｇ  ＭＥＦＬ値とヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体によるＡＤＣＣ活性の相関を検討した。
その結果、ＨＭ１．２４抗原発現量とＬｏｇ  ＭＥＦＬ値の相関係数は０．９９３６であり、高い相関のあることが明らかになった。また、これらの細胞を標的細胞として、ヒト末梢血単核球を介したヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を測定したところ、標的細胞上のＨＭ１．２４抗原発現量に応じたＡＤＣＣ活性が誘導され、患者のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体に対する応答性を予測することが可能であることを明らかにした。
従って、本発明は、所望の抗原の発現量と蛍光強度との相関式を公式化する方法であって、
（ａ）該抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程；
（ｂ）該抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｃ）（ｂ）の蛍光標識された抗体を用いて、（ａ）の細胞群の蛍光強度をそれぞれ測定する工程；及び
（ｄ）予め定量されている該抗原の発現量と（ｃ）で測定された蛍光強度との相関関係を解析する工程；
を含む方法を提供する。
上記の方法において、抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群を用意する工程は、好ましくは、該抗原の発現量が異なる複数の細胞群を用意し、該抗原に特異的に結合する、放射性同位体で標識された抗体を用いて該抗体の発現量を定量する工程を含む。前記抗原の発現量が異なる複数の細胞群は、好ましくは、該抗原の発現量が少なくとも１０倍以上異なる複数の細胞群である。
本発明はまた、被験細胞に発現する所望の抗原の発現量を測定する方法であって、
（ａ）該抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｂ）該抗原の発現量と（ａ）の蛍光標識された抗体による蛍光強度との相関式を用意する工程；
（ｃ）被験細胞と（ａ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；及び
（ｄ）上記（ｃ）で測定された蛍光強度から、（ｂ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；
を含む方法を提供する。
上記の方法において、前記抗原の発現量と（ａ）の蛍光標識された抗体による蛍光強度との相関式は、前記の公式化方法により得られる。
本発明はまた、所望の薬物療法と該薬物療法に対する患者の感受性の相関を公式化する方法であって、
（ａ）一群の被験患者を選択する工程；
（ｂ）前記薬物療法に対する患者の感受性に影響を与えると推定される抗原を選択する工程；
（ｃ）前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｄ）前記抗原の発現量と（ｃ）の蛍光標識された抗体による蛍光強度との相関式を用意する工程；
（ｅ）被験患者由来の被験細胞と（ｃ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；
（ｆ）上記（ｅ）で測定された蛍光強度から、（ｄ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；及び
（ｇ）上記（ｆ）で算出された該抗原の発現量と患者の薬物療法に対する効果とを比較し、相関を解析する工程；
を含む方法を提供する。
本発明はまた、所望の薬物療法に対する患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）疾患において特異的に発現量が増加する抗原を選択する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｃ）前記抗原の発現量と（ｂ）の蛍光標識された抗体による蛍光強度との相関式を用意する工程；
（ｄ）患者由来の被験細胞と（ｂ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；
（ｅ）上記（ｄ）で測定された蛍光強度から、（ｃ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；及び
（ｆ）上記（ｅ）で算出された該抗原の発現量と該薬物療法に対する患者の感受性の相関とを比較する工程；
を含む方法を提供する。
本発明はさらに、患者を診断する、および／または疾患を特定する方法であって、
（ａ）疾患において特異的に発現量が増加する抗原を選択する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合する、蛍光標識された抗体を用意する工程；
（ｃ）前記抗原の発現量と（ｂ）の蛍光標識された抗体による蛍光強度との相関式を用意する工程；
（ｄ）患者由来の被験細胞と（ｂ）の蛍光標識された抗体とを接触させ、該細胞の蛍光強度を測定する工程；
（ｅ）上記（ｄ）で測定された蛍光強度から、（ｃ）の相関式を用いて、被験細胞に発現する該抗原の発現量を算出する工程；及び
（ｆ）上記（ｅ）で算出された該抗原の発現量と健常人の該抗原の発現量とを比較する工程；
を含む方法を提供する。
本発明はさらに、抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および該抗体および／または該医薬組成物に対する患者の感受性の相関を記載した指示書、を含むキットを提供する。
このキットにおいて、抗体は、好ましくはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する抗体である。前記抗体を有効成分として含有する医薬組成物は、例えば、抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含有する造血器腫瘍治療用医薬組成物ある。前記造血器腫瘍は、例えば、骨髄腫および／またはリンパ球系腫瘍である。前記骨髄腫は、例えば、多発性骨髄腫である。前記該抗体および／または前記医薬組成物に対する患者の感受性の相関は、患者由来の被験細胞において細胞あたり一定量以上の抗原発現量がある場合に有効である。
本発明はさらに、抗体を有効成分として含有し、患者由来の被験細胞上に発現する抗原の発現量が細胞あたり一定量以上である場合に該患者に投与されることを特徴とする医薬組成物を提供する。前記抗体は、例えばＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有する抗体である。前記医薬組成物は例えば、抗体が抗ＨＭ１．２４抗体である造血器腫瘍治療用医薬組成物である。前記造血器腫瘍は、例えば骨髄腫および／またはリンパ球系腫瘍である。この骨髄腫は、例えば多発性骨髄腫である。
発明の実施の形態
本発明の方法は、抗原性を有するいかなる分子にも使用することができる。抗原性とは抗体によって認識される部位を有する特性、あるいは抗体と結合する部位を有する特性である。別の言い方をすれば、エピトープを有する分子である。本発明に使用される抗原は、免疫原性を有している必要はない。免疫原性とは、生体において特異抗体の産生を惹起する特性である。
従って、本発明に使用できる抗原は少なくとも抗原性を有する分子であって、免疫原性を有していてもよいし、免疫原性を有していなくてもよいが、抗原に対する抗体の作製が容易である点で、抗原が免疫原性を有することが好ましい。免疫原性を有さない抗原であっても、免疫原性を有する分子との複合体を作製し、当該複合体を用いて免役すれば、抗原に対する特異抗体を取得することが可能である。複合体の作製に使用される、免疫原性を有する分子としては、免疫される動物と異種の動物のタンパク質、例えばマウスに免疫する場合には、ヒトアルブミンやラットアルブミンを用いることができる。
本発明に使用される抗原は抗体によって認識される部位（エピトープ）を有する限り如何なる種類の分子であってもよく、タンパク質、糖鎖、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖タンパク質、プロテオグリカンあるいは有機化合物であってもよい。ポリヌクレオチドにはＤＮＡ、ＲＮＡが含まれる。有機化合物とは、炭素、水素、酸素を主要構成原子とし、アミノ酸や核酸をその構成単位としてない全ての分子であり、好ましくは分子量５００以上、より好ましくは分子量１０００以上、さらに好ましくは分子量２０００以上の分子である。
抗原は細胞内に存在してもよいし、細胞膜に存在していてもよいが、抗体による検出が容易である点で、細胞膜表面上に発現している、あるいは細胞外領域を有する分子であることが望ましい。細胞内に発現する抗原を抗体と接触させる方法としては、ホルムアルデヒド処理等、公知の方法を用いることができる。抗原として特に好ましくは、細胞外に露出した領域を有する巨大分子である。巨大分子には、タンパク質、糖蛋白質、プロテオグリカン等が含まれ、分子量が１０ｋＤ以上、好ましくは５０ｋＤ以上、さらに好ましくは１００ｋＤ以上の分子である。
細胞外領域を有する巨大分子には、細胞膜表面上に発現する生理活性物質の受容体が含まれる。例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、リンホカイン受容体ファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニン型受容体ファミリー、チロシンフォスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー等がある。
癌特異抗原あるいは癌関連抗原も細胞外領域を有する巨大分子に含まれる。癌特異抗原とは、腫瘍の発生母細胞とは質的、量的に異なる性質を腫瘍細胞に与える分子である。例えば、正常とは異なる糖鎖構造、正常とは異なる立体構造、正常とは異なる大量発現等である。より具体的には、癌特異抗原とは、正常細胞では全く発現していないか、あるいは発現量が低い抗原であるが、癌細胞においては発現が増大している抗原等、が癌特異抗原に含まれる。多くの場合、酵素、ホルモン、胎児タンパク質、ガングリオシドであり、プロテオグリカン、糖タンパク質、糖脂質または糖鎖を有さないタンパク質である。
本発明においては、特に、細胞が癌化した場合に、正常の母細胞における発現量よりも発現量が増大する、あるいは、正常細胞では発現していないが、癌化することによって発現が新たに誘導される抗原が好ましい。本発明における癌とは、正常の増殖分化の制御をのがれ、自律的に増殖する細胞であり、悪性の腫瘍でもよいし、良性の腫瘍であってもよい。
また、由来する組織、臓器は問わず、血球細胞由来の癌細胞であってもよいし、肝臓、腎臓、肺、前立腺、甲状腺等の各臓器に由来する癌細胞であってもよい。さらに、上皮細胞由来であるか、間質細胞由来であるか、あるいは、腺細胞由来であるかも問わない。例えば、ＨＭ１．２４抗原は、骨髄腫細胞において発現が増大していることが知られており、癌特異抗原に含まれる。また、大腸癌におけるＣＥＡ抗原とＺＣＥ−０２５抗体、卵巣癌におけるＣＡ１２５とＩＭＡＣＩＳ−２抗体、悪性黒色種におけるｐ９７抗原と９６．５抗体等を用いることができる。
本発明の方法に使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。
得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体、ヒト型化抗体の場合には、細胞傷害活性を有するヒト抗体Ｃ領域を適宜使用することができる。例えば、ヒト抗体Ｃ領域として、ヒトＣγ例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。これらのうち、特にＣγ１，Ｃγ３を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有することが知られている。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。
植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
例えば、ＨＭ１．２４抗原に対するモノクローナル抗体を取得するには、Ｇｏｔｏ，Ｔ．らの方法（Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２−１９３０）を用いることができる。また、ＨＭ１．２４抗原発現細胞として、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＫＰＭＭ２やＫＰＣ−３２（Ｇｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９１）３２，１４００）を用いて免疫することができる。ＫＰＭＭ２は、平成６年（１９９４年）２月２２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１９としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
また、ＨＭ１．２４抗原を免疫してもよい。ＨＭ１．２４抗原は配列番号１に示す塩基配列によってコードされ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ｃＤＮＡはｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩ切断部位の間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成５年（１９９３年）１０月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９）として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。
また、ＨＭ１．２４抗原に対するマウスモノクローナル抗体（マウス抗ＨＭ１．２４抗体）を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成７年（１９９５年）４月２７日にＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
また、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３として寄託されているＨＭ１．２４抗原に対するマウスモノクローナル抗体のヒト型化抗体を作製した。ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は、ＣＤＲの置換に加え、ＦＲ領域のアミノ酸置換を行うことで、幾つかのバージョンを作製し、その活性を確認した。最も好ましい活性を有するヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のバージョンは、軽鎖がバージョンａであり、重鎖はバージョンｓであった（国際公開番号ＷＯ  ９９／１８２１２を参照）。軽鎖バージョンａの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号３および４にそれぞれ記載した。また、重鎖バージョンｓの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号５および６にそれぞれ記載した。
尚、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の軽鎖バージョンａを含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇｋ）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成８年（１９９６年）８月２９日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の重鎖バージョンｓを含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成９年（１９９７年）９月２９日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。尚、本明細書においては、軽鎖バージョンａおよび重鎖バージョンｓを有するヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を特にＡＨＭと称する。
蛍光標識された抗体は市販の試薬によって適宜作製することができる。たとえば、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（いずれもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）等を使用することができる。フローサイトメトリー解析は周知の方法であり、特に説明を要するものではないが、例えば、以下の方法により測定することができる。被験細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＡＣＳ／ＰＢＳ（０．１％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））で所定の濃度に希釈した蛍光標識抗体あるいはコントロール抗体を加え、氷温化３０分インキュベートする。ＦＡＣＳ／ＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍｌから１ｍｌのＦＡＣＳ／ＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）または、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ製）で細胞の蛍光強度を測定すればよい。
本発明の態様のひとつは、所望の抗原の発現量と蛍光強度との相関式を公式化する方法に関する。すなわち、蛍光標識された抗体を用いて、該抗体が結合する抗原の発現量を算出するための相関式を導く方法に関する。所望の抗原に特異的に結合する抗体は、市販の抗体であってもよいし、上述した方法により作製したものであってもよい。また、蛍光標識された市販の抗体であってもよいし、蛍光標識試薬を用いて蛍光標識された抗体であってもよい。さらに、所望の抗原に結合する抗体（一次抗体）が蛍光標識されていてもよいし、所望の抗原に結合する抗体（一次抗体）に結合する二次抗体が蛍光標識されていてもよい。
蛍光標識された一次抗体を用いる場合には、被験細胞は一次抗体と反応させ、蛍光強度を測定すればよい。蛍光標識された二次抗体を用いる場合には、蛍光標識されていない一次抗体と被験細胞を反応させ、ついで、蛍光標識された二次抗体と反応させ、蛍光強度を測定すればよい。測定誤差が少なくなる点で、蛍光標識された一次抗体を用いることが好ましい。発現量が少ない抗原を測定する場合には、二次抗体として、蛍光標識されたポリクローナル抗体を使用することができる。
蛍光標識抗体の力価は、標準試薬を用いて一定に保つことができる。蛍光標識抗体の力価とは、抗体の抗原結合力（抗原親和性）と蛍光標識体の抗体への結合率に依存する。例えば、抗原結合活性が等しい抗体であっても、蛍光標識体の結合率が異なれば、蛍光標識抗体の力価は異なるし、蛍光標識体の結合率が同じであっても、抗原結合活性が異なれば、蛍光標識抗体の力価は異なる。
本発明においては、相関式の公式化に使用した蛍光標識抗体の力価と、抗原発現量の定量に使用する蛍光標識抗体の力価が同じである限り使用することができる。好ましくは、相関式の公式化に使用した蛍光標識抗体と、抗原発現量の定量に使用する蛍光標識抗体が同一の蛍光標識抗体である。通常の場合、精製された抗体を用いて、発売元の指示に従って蛍光標識体でラベルする限り、同じ力価を有する蛍光標識抗体を作製することができる。
新たに作製した蛍光標識抗体の力価が、それまでに使用していた蛍光標識抗体の力価と等しいことを確認するには、抗原を結合したビーズ（抗原ビーズ）を用いて、それぞれの蛍光標識抗体による抗原ビーズの蛍光強度を測定し、比較すればよい。また、抗原を発現することが明らかになっている細胞を抗原ビーズの代わりに使用することもできる。新旧の蛍光標識抗体による測定を同時並行で行う限り、抗原ビーズに結合している抗原量や細胞に発現している抗原量の経時的変化は無視することができる。
抗原ビーズは市販のビーズを用いて作製することができる。例えば、市販のＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）やＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することができる。抗原ビーズの作製に使用する抗原は全長であってもよし、部分断片であってもよく、抗体との結合活性が保持されている限り、アミノ酸配列の長さは制限はない。抗原の部分断片としては、細胞外領域を有し、細胞内領域及び膜貫通領域を有さない分泌型抗原を好適に使用することができる。
一組の抗原ビーズと蛍光標識抗体を作製できれば、どちらか一方を標準品として、新たに作製した抗原ビーズまたは蛍光標識抗体の力価を確認、調製することができる。抗原ビーズの力価は、ビーズひとつあたりに結合している抗原数に依存する。ビーズあたりの抗原結合数が等しければ、抗原ビーズの力価は等しい。通常は、使用する抗原のアミノ酸配列、ビーズとの結合反応に使用する抗原の濃度、反応液の組成、温度が等しければ、同じ力価の抗原ビーズを作製することができる。
所望の抗原の発現量が予め定量された複数の細胞群は遺伝的背景がことなる細胞群であってもよいし、遺伝的背景が同じである細胞群であってもよい。例えば、蛍光標識された抗体が、所望の抗原以外には結合する分子が存在しない限り、異なる遺伝的背景であってもよい。また、細胞群を構成する細胞は、細胞株であってもよいし、細胞株でなくてもよい。例えば、生体から分離した細胞でもよいし、プライマリー培養細胞であってもよい。遺伝的背景が異なる細胞群としては、例えば、所望の抗原の発現量が異なる細胞株Ａ、細胞株Ｂ、細胞株Ｃを使用してもよい。また、細胞株Ａを抗原の発現量に応じて細胞株Ａ−ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、細胞株Ａ−ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、細胞株Ａ−ｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎに分離して使用してもよい。これらの細胞は同一の遺伝的背景を有する細胞群である。
好ましくは、遺伝的背景が同じであり、当該抗原の発現量のみが異なる複数の細胞群を用意する。例えば、抗原をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに導入する。次いで、当該抗原が発現していない宿主細胞を選択し、当該細胞に上記発現ベクターを導入する。この様にして作製した形質転換細胞を、蛍光標識された抗体と反応させ、フローサイトメーターを用いて蛍光強度の異なる複数の細胞群に分取する。たとえは、強い蛍光強度を示す細胞群、中程度の蛍光強度を示す細胞群、弱い蛍光強度を示す細胞群に分けることができる。
分取した細胞は、限界希釈法等により単一の細胞株とし、拡大培養することで均質な細胞群とすることができる。拡大培養した形質転換細胞の蛍光強度を測定し、当該抗原の発現量が異なる複数の細胞群を適宜選択すればよい。選択された複数の細胞群は、抗原の発現量が異なる複数の細胞群として相関式を公式化する際の標準細胞として使用することができる。標準細胞とは、抗原の発現量と蛍光強度の相関式を公式化する際、相関解析を行うために使用する、予め抗原発現量が決定されている細胞群を意味する。
標準細胞として用いる複数の細胞群は、細胞群の数が多ければ多いほど正確な相関式を公式化することができる。通常は２から１０の細胞群を用いることができ、好ましくは２つの細胞群、より好ましくは３つの細胞群、さらに好ましくは４つの細胞群、最も好ましくは５つの細胞群を標準細胞として用いることができる。相関式の公式化に用いる標準細胞に発現する抗原量は、その差異が検出できる程度に異なることが好ましい。複数の標準細胞群において、最小の発現量を示す細胞群と最大の発現量を示す細胞群との抗原の発現量は、少なくとも５倍以上異なることが望ましく、より好ましくは１０倍以上、更に好ましくは１００以上、最も好ましくは１０００倍以上である。
抗原の発現量が異なる複数の細胞群に発現する抗原量を予め定量するには、放射性同位元素で標識された抗体を用いたスキャッチャードプロット法を用いることができる。放射性同位元素としては最も一般的にはヨウ素１２５が用いられる。本法は当業者には既に公知の方法であるが、例えば、「新生化学実験講座１２  分子免疫学Ｉ株式会社  東京化学同人」（ｐｐ１７０−１７６）を参考にすることができる。
予め定量されている抗原の発現量と蛍光強度との相関関係を解析する方法には特に制限はないが、蛍光強度をＬｏｇ  ＭＥＦＬ値に換算して抗原発現量との相関を解析することができる。ＭＥＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とは、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社が販売している、フローサイトメトリーのキャリブレーションに使用されるＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（８ｐｅａｋｓ）（ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓ）に使用されている蛍光強度の単位で、８つのビーズについて、それぞれ３３００００，１４００００，４００００，１５０００，４７００，１８００，６００，１００のＭＥＦＬ値が与えられている。従って、当該８つのＭＥＦＬ値とフローサイトメトリーから測定される蛍光強度パターンの平均値をプロットすることで検量線を作製することができ、当該検量線を用いれば、未知資料の蛍光強度パターンからＭＥＦＬ値を算出することができる。
蛍光強度パターンから得られる蛍光強度の平均値としては、ＭｅａｎあるいはＧｅｏ  Ｍｅａｎの２種類の平均値の求め方がある。Ｍｅａｎでは、蛍光強度をＬｏｇスケールで計算するのに対し、Ｇｅｏ  Ｍｅａｎでは目盛りの解像度で計算する。従って、より正確な蛍光強度の平均値はＭｅａｎで得られるが、細胞集団の平均的位置に近い値はＧｅｏ  Ｍｅａｎとして得られる。いずれの値も大きな違いは与えないが、本発明の方法においては、Ｇｅｏ  Ｍｅａｎを用いることが好ましい。Ｇｅｏ  ＭｅａｎやＭｅａｎの算出方法は、フローサイトメーター解析ソフトを用いて、簡単に求めることができる。
例えばＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓを用いて細胞の蛍光強度とＭＥＦＬ値との検量線を求めるには、一滴のＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓを１ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳに添加し、蛍光強度ヒストグラムを測定する。各ピークのＧｅｏ  Ｍｅａｎの対数（Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値）を計算する。一方、各ビーズに与えられたＭＥＦＬ値の対数（Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値）を計算し、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値をＬｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値に対してプロットすることにより、検量線を作成すればよい。Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値をｘ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値をｙとすると、その関係は一般にｙ＝Ａｘ＋Ｂで表すことができる（Ａ、Ｂは定数）。従って、被験細胞のフローサイトメトリー測定によって得られたＬｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値をｘに代入することにより、被験細胞のＬｏｇ  ＭＥＦＬ値を得ることができる。
Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値と抗原量との相関式を求めるには、予め抗原の発現量が定量されている複数の細胞群について、おのおの蛍光強度のＧｅｏ  Ｍｅａｎを求め、Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値を算出する。次に検量線から得られるＬｏｇ  ＭＥＦＬ値を求め、抗原発現量との相関式を求めればよい。具体的には、予め抗原の発現量が定量されている複数の細胞群を被験細胞として、フローサイトメトリーにより蛍光強度のＧｅｏ  Ｍｅａｎを求める。この際、抗原に特異的に反応する蛍光標識された抗体を用いて測定した値、および蛍光標識されたコントーロール抗体を用い値を求め、両Ｇｅｏ  Ｍｅａｎの差を抗原に特異的なＧｅｏ  Ｍｅａｎとする。
Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値を計算し、検量線からＬｏｇ  ＭＥＦＬ値を求める。次に、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値をＸ軸に、放射性同位元素等を用いて測定した抗原の発現量をＹ軸にプロットする。一般に、相関式として
ｙ＝ＡｅＢｘ
として公式化することができる（Ａ，Ｂはそれぞれ抗原と抗体の組み合わせによって決定される定数）。従って、未知の試料のＬｏｇ  ＭＥＦＬ値が得られれば、
ｙ＝ＡｅＢｘ
の相関式を用いて、抗原発現量を定量することができる。相関係数は好ましくは０．８以上であり、より好ましくは０．９以上、さらに好ましくは０．９５以上、最も好ましくは０．９８以上である。
一旦、蛍光標識された抗体が用意され、かつ、当該蛍光標識された抗体を用いた抗原の発現量と蛍光強度との上記相関式が明らかになれば、任意の細胞について蛍光標識された抗体を用いてフローサイトメトリーにより蛍光強度を測定し、得られたＬｏｇ  ＭＥＦＬ値から細胞に発現する抗原量を算出することができる。
被験細胞は、任意の細胞を使用することができる。例えば、細胞株であってもよいし、健常人や患者から採取した細胞であってもよい。健常人や患者から採取した細胞は、一旦培養した後に測定に使用しても良いし、培養せずに使用して用いてもよい。また、一旦凍結した細胞を解凍して使用することもできる。被験細胞として用いる細胞は、フローサイトメトリーで測定できるように細胞が分離されている限り特に制限はない。
例えば、健常人や患者から細胞や組織を採取し、所望の細胞を分離して被験細胞とすることができる。組織や細胞集団から所望の細胞を分離して調製する方法は周知の方法を用いることができる。例えば、肝臓、腎臓等の臓器から組織を採取し、得られた組織を酵素処理等により適宜単一の細胞に分離して被験細胞とすることができる。また、末梢血や骨髄から採取した血球細胞集団の場合には、比重分離法等により適宜血球細胞を分離して、所望の細胞を被験細胞として分離して使用することができる。
抗原の発現量を測定するためのキットとしては、少なくとも、蛍光標識された抗体、および、蛍光強度から抗原量を算出する指示書がふくまれていればよい。蛍光強度から抗原量を算出する指示書には、抗原の発現量と蛍光強度との相関式が記載されていることが好ましい。蛍光標識された抗体は、溶液状態で供給されてもよいし、凍結乾燥品であってもよい。
溶液状態で供給される場合には、抗体濃度としては、特に制限はないが、安定性の点から、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌである。凍結乾燥品の場合は、用時に溶解して使用することができる。従って、キットには溶解方法、好ましくは溶解する溶液の組成、及び量が記載された指示書が含まれていることが望ましい。より好ましくは、凍結乾燥された蛍光標識抗体と溶解液を含むキットである。また、蛍光標識された抗体と被験細胞を接触するために使用する反応液をキットに含めてもよい。
本発明の別の態様は、特定の疾患において発現が誘導される、あるいは、発現が増大する抗原を測定対象として、患者の薬物療法あるいは食事療法に対する感受性との相関式を作製する方法、および、患者の薬物療法あるいは食事療法に対する感受性を予測する方法、さらに、患者の疾患を特定する方法、または患者を診断する方法に関する。
薬物療法あるいは食事療法と当該治療法に対する患者の感受性の相関を公式化する方法においては、任意の抗原を選定することができる。例えば、患者の感受性に影響すると思われる抗原を複数選択し、薬物療法の感受性と相関のある抗原を決定してもよいし、予め相関が予想される抗原を選択し、当該抗原が患者も感受性に相関していることを確認してもよい。
薬物療法あるいは食事療法と当該治療法に対する患者の感受性の相関を公式化する方法においては、複数の患者からなる一群の被験患者（患者群）を選択する。患者群とは、特定の疾患に分類される患者が複数含まれる集団である。好ましくは、５人以上であり、より好ましくは１０人以上、さらに好ましくは３０人以上、最も好ましくは５０人以上の患者を含む集団である。蛍光標識された抗体を用いて、患者群に含まれる個々の患者から採取した細胞に発現する抗原量を測定する。
次いで、同じ患者に薬物療法を施し、当該患者における薬物療法の治療効果を定量化あるいは定性化すればよい。定性化は患者に対する薬物療法の効果の分類であってもよい。例えば、当該薬物療法に著効を示した患者群、効果のあった患者群、全く効果の無かった患者群の３つに分類してもよい。分類する患者群は、少なくとも２段階であり（効果あり、効果なし）、好ましくは３段階、さらに好ましくは４段階、最も好ましくは５段階の評価で分類する。
ついで、各分類に属する患者における抗原の発現量と当該薬物療法による治療効果を比較し、相関を解析する。相関解析においては、各分類に属する患者の抗原の発現量の平均を用いてもよいし、分散分布を用いてもよい。相関解析により得られた結果を相関として公式化することができる。薬物療法と当該薬物療法に対する患者の感受性の相関は、ある程度の幅をもった数値として示される。例えば、「抗原の発現量が１００００以上の患者の８０％は当該薬物療法に対して極めて良好な反応を示す」、「抗原の発現量が１０００から１００００である患者は、当該薬物療法で中程度の治療効果が期待できる」を例示することができる。
患者由来の細胞に発現する抗原量と任意の薬物療法に対する患者の感受性の相関が明らかになれば、当該相関を用いて、薬物療法に対する患者の感受性を予測することが可能になる。具体的には、被験患者から細胞を採取し、当該細胞と蛍光標識された抗体を反応させ、蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定する。得られた蛍光強度からＬｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ値を算出し、ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値を求め、抗原の発現量を算出する。得られた抗原の発現量を薬物療法と当該薬物療法に対する患者の感受性の相関にあてはめることで、被験患者の当該薬物療法に対する感受性を予測することができる。すなわち、当該薬物療法が当該患者に対してどの程度の効果があるかを予測することができる。
薬物療法に含まれる治療方法は、薬剤を用いる治療法である限り特に制限はないが、好ましくは薬剤として抗体を用いる抗体療法である。抗体療法に対する患者の感受性を予測する相関式を公式化する場合には、当該抗体療法に用いる抗体が結合する抗原の発現量と治療効果との相関を公式化することが好ましい。抗体療法に用いることができる抗体としては、抗体は完全な抗体であってもよいし、抗体断片であってもよい。抗原との結合活性を保持している限り、どの様な抗体断片であってもよいが、好ましくは抗原結合部位を含む断片である。
抗原結合部位を含む断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ２分子が結合して構成されたｄｉａｂｏｄｙであってもよい。抗体療法に用いられる抗体や抗体断片は、抗体自体が治療効果を有する薬剤である必要はなく、治療効果を有する薬剤を適切な部位に運ぶために使用されていてもよい。例えば、抗癌剤と抗体の複合体から構成される、いわゆるミサイル療法も本発明の抗体療法に含まれる。ミサイル療法では、抗体と各種抗癌剤を共有結合で結合した複合体であってもよいし、殺細胞作用を有する放射性同位体を結合させた抗体であってもよい。
また、抗癌剤や放射性同位体を含むマイクロカプセル、あるいはナノカプセルを作製し、当該カプセルの表面上に抗体を結合させてもよい。ミサイル療法に用いられる抗体は、標的細胞に特異的に発現する抗原に対する抗体であり、患者における抗原の発現量と抗体療法の治療効果、すなわち当該抗体療法に対する患者の感受性とはよい相関を示すことが期待される。従って、当該抗原の発現量を定量的に測定することができ、患者の感受性との相関が明らかになれば、当該抗体療法の効果を治療前に予測することが可能となる。
また、抗体療法には、抗体自体が細胞傷害活性を有する抗体を投与する治療方法が含まれる。細胞傷害活性にはＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、アポトーシス誘導活性等が含まれる。細胞傷害活性を有する抗体を用いる抗体療法は、主に癌治療に使用される。例えば、抗Ｈｅｒ２抗体を用いる癌の治療方法が挙げられる。さらに、中和活性を有する抗体を治療目的に用いる抗体療法も本発明に含まれる。例えば、生理活性物質に対する中和活性を有する抗体は、当該生理活性物質に起因する疾患の治療に用いることができる。
中和活性を有する抗体は生理活性物質の細胞内への取り込みや、生理活性物質の細胞上の受容体への結合を阻害することで治療効果が期待される。生理活性物質にはサイトカインやリンホカイン、ホルモン等、分泌タンパクが含まれ、例えば、ＴＮＦα受容体に対する中和抗体を使用したリウマチ治療が挙げられる。これらの抗体療法では、Ｈｅｒ２やＴＮＦα受容体は細胞表面上に発現した抗原であり、患者の細胞の表面上に発現しているＨｅｒ２分子やＴＮＦα受容体分子の発現量を測定することができれば、患者の抗体療法に対する感受性を予測することができる。
抗体療法と当該抗体療法に対する患者の感受性の相関を公式化する方法、および患者の感受性を予測する方法において使用される蛍光標識された抗体は、抗体療法に使用する抗体と同一の抗体であることが望ましいが、抗体の力価、あるいは抗原結合活性が等しい限り異なる抗体であっていてもよい。例えば、蛍光標識抗体としてマウス抗体を用いて相関を公式化し、患者由来の被験細胞に発現する抗原量を測定する。一方、抗体療法においては当該マウス抗体のキメラ抗体、あるいはヒト型化抗体を使用することができる。一般に、キメラ抗体においては同一の抗原結合を有していることが知られているし、ヒト型化抗体もマウス抗体とほぼ等しい抗原結合活性を有することが知られている。
抗体のＡＤＣＣ活性は、一般に次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血より比重遠心法で単核球を分離し、エフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ：Ｅ）として調製する。一方、標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ：Ｔ）を５１Ｃｒにより標識して調製する。次いで、標識した標的細胞にＡＤＣＣ活性を測定する抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、１％のＮＰ−４０を用いることができる。細胞傷害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）ｘ１００で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０により遊離された放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）である。
さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なＡＤＣＣ活性、あるいはＣＤＣ活性を誘導することができる。例えば、アミノ酸置換によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９４）１２，６８３−６８８）、アミノ酸付加によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１５４，２２２６−２２３６）、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２，７２４−７２７）、アミノ酸置換によるＩｇＧの二量体化（Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６，１１９１−１１９５，Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４８，２９１８−２９２２）、化学修飾によるＩｇＧの二量体化（Ｗｏｌｆｆ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，２５６０−２５６５）、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）２１，２３７９−２３８４）が挙げられる。これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
アポトーシス誘導活性は、プログラムされた細胞死を誘導する活性であり、ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖの結合、ＤＮＡの断片化、細胞萎縮（ｃｅｌｌ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）、アポトーシス体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｙ）を用いて検出することができる。
本発明の方法は、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）を用いる抗体療法に好適に使用することができる。抗ＨＭ１．２４抗体としては、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体が好ましい。ＨＭ１．２４抗原は骨髄腫細胞上に多量に発現している抗原であり、抗ＨＭ１．２４抗体の有するＡＤＣＣ活性を介した骨髄腫の治療が期待される。従って、本発明の好ましい態様のひとつは、ヒト定常領域としてＣγ１を有するヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いる抗体療法において、患者の骨髄腫細胞上に発現するＨＭ１．２４抗原の発現量を定量し、患者のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いる抗体療法に対する感受性を予測する方法である。
患者の骨髄腫細胞上に発現するＨＭ１．２４抗原の発現量の定量、およびＨＭ１．２４抗原の発現量と蛍光強度との相関式を公式化する際に使用される抗体は、抗体療法に使用するヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体、あるいは、ヒト型化の基本としたマウス抗ＨＭ１．２４抗体を使用することができるが、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いることが好ましい。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いて得られた蛍光強度（ｌｏｇ  ＭＥＦＬ）と抗原数の相関式は、抗原発現量をＹとすると、
Ｙ＝２．５３ｅ２．１５ｌｏｇ  ＭＥＦＬ
で表される。当該相関式を用いれば、蛍光標識されたヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による被験細胞の蛍光強度から、ＨＭ１．２４抗原の発現量を算出することができる。また、当該相関式が記載された指示書と蛍光標識されたヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を含むキットにより、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による抗体療法に対する感受性を予測することができる。また、ＨＭ１．２４抗原は、正常細胞に比べ、骨髄腫細胞で発現が増大することから、骨髄腫の診断にも利用することができる。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は造血器腫瘍全般に対して効果を有する可能性があるが、特に、リンパ球系腫瘍、形質細胞腫瘍、骨髄腫、特に多発性骨髄腫に対して効果を有することから、これらの患者のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いる抗体療法に対する感受性の予測、疾患の診断、あるいは、疾患の進行度の推定に利用することができる。リンパ球系腫瘍としては、急性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ｐｒｅ−Ｂリンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、びまん性リンパ腫、急性Ｔリンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性Ｔリンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、非ＡＴＬ末梢性Ｔリンパ腫（ＰＮＴＬ）等が挙げられる。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の抗腫瘍効果は、被験細胞あたり２０００個以上のＨＭ１．２４抗原の発現が確認できれば、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による抗体療法が効果を有すると予測され、より好ましくは細胞あたり１０００個以上発現している場合、さらに好ましくは５０００個以上、最も好ましくは１００００個以上ＨＭ１．２４抗原が発現している場合には、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による抗体療法が有効であると予測することができる。
患者の診断に使用する場合には、抗原の発現量が疾患に関連していることが明らかになっていることが必要である。抗原の発現量が疾患に関連しているとは、健常人においては発現されていないが、疾患に罹患した場合に特定の抗原が発現すること、または、健常人における発現量に比較して、疾患に罹患した患者では発現量が増大している場合を意味する。発現量の増大は、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、最も好ましくは１０００倍以上である。
本発明では、抗原の発現量と疾患との関連を明らかにすることも可能である。一群の患者を選択する工程、一群の健常人を選定する工程、任意の複数の抗原を選定を選定する工程を経て、患者および健常人から被験細胞を採取し、当該抗原の発現量を患者、および健常人の両群で測定し、患者と健常人で発現量の強弱に相関のある抗原を選定すればよい。抗原の発現量は、健常人で高く患者で低くてよく、あるいは、健常人で低く患者で高くてもよい。好ましくは、患者群と健常人群で発現量に有意差があることが望ましい。有意差の測定は、通常の統計解析により算出することができるが、好ましくは、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔでｐ  ｖａｌｕｅが０．２以下、更に好ましくは０．１以下、最も好ましくは０．０５以下である。
抗原の発現量と疾患の進行度が明らかになっていれば、患者から採取した細胞を被験細胞として、蛍光標識された抗体を用いて当該被験細胞に発現する抗原の発現量を測定し、ついで、当該抗原の発現量から疾患の進行度を推定することができる。例えば、癌細胞において特異的に発現する抗原（癌抗原）を標的分子として、当該抗原に対する蛍光標識された抗体を用いて当該癌抗原の発現量を測定することで、癌の進行度を推定することが可能である。
本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物は、非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、抗体については一回につき体重１Ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜３００ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇの投与量を選ぶことができる。また、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：ＨＭ１．２４抗原量のフローサイトメトリー解析
（１）実験材料
ヒト造血器腫瘍細胞株としてＫＰＭＭ２（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１９）、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）、Ｕ２６６Ｂｌ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１９６）（以上ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６２１）（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＩＭ−９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５９）（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４８４）（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）を使用した。
これらの細胞株の継代培養には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３、Ｌｏｔ  Ｎｏ．ＡＨＫ９０８１、ＨｙＣｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９８５−０２３、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、０．１ｍｇ力価／ｍＬ硫酸カナマイシン（硫酸カナマイシン注射液明治、明治製菓株式会社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８００、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）（以下、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地）を用いた。なお、ＫＰＭＭ２細胞の継代培養には、２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、終濃度４ｎｇ／ｍＬで組換えヒトＩＬ−６を添加した。
健常人由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は試験時に用時調製して用いた。すなわち、１０００単位／ｍＬのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注１０００、ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社）約５ｍＬをあらかじめ注入した注射器を用い、健常人ボランティアより末梢血約５０ｍＬを採取した。この末梢血を室温のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（−）（ＰＢＳ（−）、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．０５９１３、日水製薬株式会社）で２倍希釈した後、１２本に分注した。
末梢血と混合しないように、それぞれのチューブにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．１７−１４４０−０２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）約２．５ｍＬを注入した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取し、５％ＦＢＳ、０．１ｍｇ力価／ｍＬ硫酸カナマイシンを含むＭＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ２６４５、ＳＩＧＭＡ）で２回洗浄した。得られた細胞ペレットを同培地に懸濁しＰＢＭＣとした。
骨髄腫患者由来ヒト骨髄由来単核球（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＢＭＭＮＣ）は以下の様に調製した。すなわち、骨髄腫患者からヘパリン処理した骨髄穿刺サンプル３ｍＬを採取し、ここに７ｍＬの無血清Ｈａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を加え希釈した。これを３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳに重層し、遠心（１５００ｒｐｍ、３０分間、２０℃）した。単核球画分である中間層を分取し、７ｍＬの無血清ＨＢＳＳに懸濁後、遠心（１５００ｒｐｍ、５分間、２０℃）した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁しＢＭＭＮＣとした。
また、別法として以下の方法を用いた。すなわち、ヘパリン処理した骨髄穿刺サンプル１０ｍＬに、１０ｍＬの無血清ＨＢＳＳおよび２００μＬのＲｅｄ−Ｏｕｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０６９−００−０、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、室温にて５分間放置した。これをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８４０−０２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）に重層し、遠心（１６００〜１８００ｒｐｍ、２０分間）した。中間層を分取し、５％ＦＢＳを含むＨＢＳＳに懸濁後、遠心（１５００ｒｐｍ、５分間）した。得られた細胞ペレットを、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に懸濁しＢＭＭＮＣとした。
本実施例に使用したヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は、軽鎖がバージョンａであり、重鎖はバージョンｓであり（国際公開番号ＷＯ  ９９／１８２１２を参照）、軽鎖バージョンａの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号３、４にそれぞれ記載されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５）。また、重鎖バージョンｓの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号５、６にそれぞれ記載されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１２７）。なお、本明細書においては、当該アミノ酸配列を有するヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体をＡＨＭと称する。
対照抗体であるヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）抗体は、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１，Ｋａｐｐａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１３８８９、ロット番号：１０９Ｈ９１７９、供給元：ＳＩＧＭＡ）を用いた。供給元の指示に従いＰＢＳ（−）にて１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解しｈＩｇＧ１溶液とした。これを分注し、−２５℃にて保存し、用時解凍して用いた。尚、本対照抗体は、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体とアイソタイプの一致したヒト抗体でありかつ保存料を含まない。
可溶型ヒトＨＭ１．２４抗原は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２５８，５８３−５９１（１９９９）に記載の方法により作製した。アミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４９位のＡｓｎから１８０位のＧｌｎを有するアミノ酸配列を有する。
Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒは、０．２１０ｇのＮａＨＣＯ３（特級、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３１２−１３、ナカライテスク株式会社）および０．２６５ｇのＮａ２ＣＯ３（特級、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３１３−１１、ナカライテスク株式会社）を、それぞれ５０ｍＬのミリＱ水に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍＬとＮａ２ＣＯ３水溶液１ｍＬを混合し５０ｍｍｏｌ／ＬのＢｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒとして調製した。ｐＨは８．６１であった。調製した溶液は５℃で保存した。
ＮＨＳ−フルオレセイン溶液は、ＮＨＳ−フルオレセイン（Ｃａｔ．Ｎｏ．４６１００、ＰＩＥＲＣＥ）をＤＭＳＯ（特級、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５５３５−０３３０、純正化学株式会社）にて１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して調製した。
ＦＡＣＳ／ＰＢＳは、１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＲＩＡ  Ｇｒａｄｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ７８８８、ＳＩＧＭＡ）を１ＬのＣｅｌｌＷＡＳＨ（０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ（−）、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４９５２４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に溶解して調製した。保存は５℃で行った。
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒは、ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．５５９０８、ＩＣＮ）をＦＡＣＳ／ＰＢＳにて５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して調製した。保存は５℃で行った。
蛍光標識ビーズは、ＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（８ｐｅａｋｓ），３．０−３．４μｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＣＰ−３０−５Ａ，Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）（ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓ）をそのまま使用した。尚、ＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓは８つの異なる蛍光強度を示すビーズの混合物であり、フローサイトメーターのキャリブレーションに使用される。各ビーズの蛍光強度は、ＭＥＦＬ（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）単位で規定されており、その値は、３３０，０００、１４０，０００、４０，０００、１５，０００、４，７００、１，８００、６００、および１００である。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインは、通常の方法により作製した。すなわち、５５５．６μＬのヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体原液（１８．０ｍｇ／ｍＬ）を１４４４．４μＬのＢｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒにて希釈し、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。これに２００μＬのＮＨＳ−フルオレセイン溶液を加え、氷上にて２時間反応させることによりヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体をフルオレセイン標識した。
続いて、ＰＢＳ（−）にて平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５１−０１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を用いて、ゲルろ過による脱塩を行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６、ＢＩＯ−ＲＡＤ）にてタンパク濃度を測定後、ＦＡＣＳ／ＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＬに希釈し、設定温度５℃にて保存した。この溶液の一部をＦＡＣＳ／ＰＢＳにて２００μｇ／ｍＬに希釈しヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインとし、１ｍＬずつ、設定温度−８０℃にて分注保存した。使用時には解凍後、設定温度５℃にて保存した。
蛍光標識された対照抗体（ｈＩｇＧ１−フルオレセイン）は以下の方法により調製した。すなわち、４ｍｇのヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１，Ｋａｐｐａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３８８９、ＳＩＧＭＡ）を４ｍＬのＰＢＳ（−）にて溶解後、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  ０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＬＧＶ０２５ＬＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にてろ過した。これに４００μＬのＮＨＳ−フルオレセイン溶液を加え、氷上にて２時間反応させることによりｈＩｇＧ１をフルオレセイン標識した。続いて、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインと同様にして脱塩を行った。タンパク濃度を測定後、ＦＡＣＳ／ＰＢＳにて２００μｇ／ｍＬに希釈し、ＢＳＡを最終濃度０．１％となるように添加した。
これをｈＩｇＧ１−フルオレセインとし、１ｍＬずつ、−８０℃にて分注保存した。使用時には解凍後、５℃にて保存した。なお、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインおよびｈＩｇＧ１−フルオレセインについては、凍結融解回数が０回と１回のサンプルを、それぞれＫＰＭＭ２細胞と反応させ、細胞の蛍光強度に差がないことを確認し、凍結保存が可能であることを確認した。また、ｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応させたＫＰＭＭ２細胞と、反応させなかった細胞では、同様に蛍光強度に差がみられず、ｈＩｇＧ１−フルオレセインが細胞に結合しないことを確認した。
ＨＭ１．２４抗原結合ビーズ（ＨＭ−ｂｅａｄｓ）の調製は以下の方法により行った。すなわち、２ｍＬの可溶型ヒトＨＭ１．２４抗原溶液（ＨＭ１．２４抗原として０．７６４ｍｇ）を解凍後、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１３３５、ＰＩＥＲＣＥ）水溶液を１０９μＬ添加した。ＨＭ１．２４抗原とビオチンのモル比は１：２とした。氷上にて２時間反応させた後、２００μＬの１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｔ９０３、宝酒造株式会社）を添加することによりビオチン化反応を停止した。
続いて、脱塩カラム（ＳＭＡＲＴ（商標）ＳＹＳＴＥＭ、Ｆａｓｔ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＨＲ  １０／１０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．１７−０５９１−０１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、ビオチン化ＨＭ１．２４抗原を回収した。溶媒にはＰＢＳ（−）を用いた。回収したビオチン化ＨＭ１．２４抗原に１ｍＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，６．０  Ｍｉｃｒｏｎ（１．２５％  Ｓｏｌｉｄｓ−Ｌａｔｅｘ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２４１５８、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、室温にて１時間反応させた。ＦＡＣＳ／ＰＢＳにて２回洗浄後、２０ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳに懸濁した。これをＨＭ−ｂｅａｄｓとし、４０μＬずつ、−８０℃にて分注保存し、用時解凍した。
なお、凍結融解回数が０回と１回のＨＭ−ｂｅａｄｓを、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインおよびｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応させ、フローサイトメトリーにて解析し、二者は同等の蛍光強度を示すことを確認し、ＨＭ−ｂｅａｄｓの凍結保存が可能であることを確認した。また、ｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応させたビーズと、反応させなかったビーズは同じ蛍光強度を示し、抗体が非特異的に結合しないことを確認した。
（２）フローサイトメトリー測定・解析方法
約０．５〜１×１０６個の細胞を６０μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、氷上にて１５分間静置した。静置後、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセイン、ｈＩｇＧ１−フルオレセインまたはＦＡＣＳ／ＰＢＳを２０μＬ添加した。更に２０μＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳを加え全量を１００μＬとし、氷上にて３０分間反応させた。ＨＭ−ｂｅａｄｓの場合には、２０μＬのビーズを６０μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、氷上にて１５分間静置後、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインまたはｈＩｇＧ１−フルオレセインを２０μＬ添加し、氷上にて３０分間反応させた。
反応後、これらの細胞およびビーズをＦＡＣＳ／ＰＢＳにて２回洗浄し、１ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳに懸濁しフローサイトメトリーに供した。フローサイトメーターにはＥＰＩＣＳ  ＸＬ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）またはＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いた。サンプル中の死細胞の割合が高い場合、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ、ＦＳ）ｖｓ側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ、ＳＳ）ヒストグラムにて、生細胞集団にゲートを設定した。なお、死細胞はＰＩ染色により確認した。
ＰＢＭＣ中の単球を同定する場合、２０μＬのＰＥ標識抗ＣＤ１４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４７４９７、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加え、全量を１００μＬとした。また、ＢＭＭＮＣ中の骨髄腫細胞を同定する場合、２０μＬのＰＥ標識抗ＣＤ３８抗体（ＣＤ３８ＰＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４７６８７、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加え、全量を１００μＬとした（図１及び表１）。
0004297689.tif 000002
ＢＭＭＮＣを測定する場合、以下の様にフローサイトメーターの機器設定を調整した。まず、ＲＰＭＩ８２２６細胞をヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインのみ（１×１０６個、最終容量１ｍＬ、これをＡとした）、ＣＤ３８ＰＥのみ（１×１０６個、最終容量１ｍＬ、これをＢとした）、または抗体を加えずに（２×１０６個、最終容量２ｍＬ、これをＣとした）、調製した。Ａ、Ｂ、Ｃを混合し、フローサイトメーターにて測定した。
ＦＳ  ｖｓ  ＳＳヒストグラムで、細胞集団がややスケールアウトするようにＦＳを調整した。ＳＳは、細胞集団がヒストグラムの下半分に収まるように調整した。ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｖｓ  ＰＥヒストグラムで、Ｂの細胞集団がＰＥ軸の上方１／２に収まるようにＰＥを調整した。また、Ａの細胞集団がフルオレセイン軸の上方１／３に収まるようにフルオレセインを調整した。さらに、ＡとＣの細胞集団のＰＥ蛍光強度が等しくなるように、蛍光補正（ｃｏｌｏｒ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）（ＰＥ−％フルオレセイン）を行った。蛍光補正（フルオレセイン−％ＰＥ）は０％とした。
（３）蛍光標識ビーズ（ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓ）による蛍光強度の標準化
ＫＰＭＭ２細胞を用いて、細胞上のＨＭ１．２４抗原を測定した。まず、ＫＰＭＭ２細胞をヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインおよびｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応後、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定し、フルオレセインヒストグラムから平均の蛍光強度を求めた（図２のＢ）。細胞集団の蛍光強度の平均値を求める場合、ＭｅａｎおよびＧｅｏ  Ｍｅａｎの２種類の値が算出可能である。これらは、平均値を算出する際の、蛍光強度の目盛りの取り方が異なる。
Ｍｅａｎでは、蛍光強度をＬｏｇスケールで計算するのに対し、Ｇｅｏ  Ｍｅａｎでは目盛りの解像度（１０２４）にて計算する。従って、より正確な蛍光強度の平均値はＭｅａｎで得られるが、細胞集団の平均的位置に近い値はＧｅｏ  Ｍｅａｎとして得られる。そこでＫＰＭＭ２細胞の蛍光強度のＧｅｏ  Ｍｅａｎを求めたところ、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインと反応させた細胞では１１１４．９７、ｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応させた細胞では１７．２８であった。ＨＭ１．２４抗原に特異的な蛍光強度を求めるため、これらのＧｅｏ  Ｍｅａｎの差（１０９７．６９）を求め、さらにその対数値（Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ、３．０４）を計算し、ＫＰＭＭ２細胞の蛍光強度を表す値とした。
フローサイトメーターにより求められる蛍光強度は相対値である為、ＨＭ１．２４抗原発現量を定量する場合、既知の蛍光強度を有する物質を用いて、データを標準化する必要がある。そこで、ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓを標準物質とし、細胞の蛍光強度の標準化を行った。まず、一滴のＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓを１ｍＬのＦＡＣＳ／ＰＢＳに添加し、フルオレセインヒストグラムを測定した（図２のＣ）。各ピークのＧｅｏ  Ｍｅａｎの対数（Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ）を計算し、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬをＬｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎに対してプロットすることにより、検量線を作成した（図２のＤ）。
Ｌｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎをｘ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬをｙとすると、その関係はｙ＝０．９９９７ｘ＋１．９１７９で表され、ｘにＫＰＭＭ２細胞のＬｏｇ  Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ（３．０４）を代入することにより、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値として４．９６を得た。さらに、測定日時を変えて１４回測定したところ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬはそれぞれ、４．８５、４．９５、４．９２、４．９５、４．９６、４．９０、４．９４、４．９６、４．９５、４．９２、４．９４、４．８９、４．９１、４．９３であり非常にバラツキが少なかった。以上の結果から、ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓを標準物質として用いることにより、細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現量をＬｏｇ  ＭＥＦＬとして標準化することが可能となった。
ＳＰＨＥＲＯ−ｂｅａｄｓにて蛍光強度を標準化する場合、測定系および試薬の品質管理の為、陽性対照物質が必要である。そこで、一定量のＨＭ１．２４抗原が結合しているビーズ（ＨＭ−ｂｅａｄｓ）を作製し（上記試験方法参照）、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体−フルオレセインあるいはｈＩｇＧ１−フルオレセインと反応させ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬを測定した。その結果、異なる測定日、測定機器でも同じ結果が得られた（表２）。また、別ロットのＨＭ−ｂｅａｄｓについて測定日時を変えて４回測定したところ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬは５．０９（図２のＦ）、５．０７、５．１１、５．１３であり、非常にバラツキが少なかった。
0004297689.tif 000003
（４）結果
（４−１）健常人のＰＢＭＣ
上記方法により構築した測定系を用いて、単球およびリンパ球のＨＭ１．２４抗原を定量した（図３）。健常人ボランティア末梢血から調製したＰＢＭＣをサンプルに用い、単球とリンパ球はＦＳ  ｖｓ  ＳＳヒストグラムにて同定した。２名の健常人ボランティアについて、計４回の実験を行ったところ、単球のＬｏｇ  ＭＥＦＬは、４．００、３．９７、３．９６（以上ボランティアＡ）、３．９０（ボランティアＢ）、リンパ球のＬｏｇ  ＭＥＦＬは、３．２５、３．１６、３．２０（以上ボランティアＡ）、３．０４（ボランティアＢ）であった。ＨＭ１．２４抗原が少ない場合でも、バラツキの少ない測定値を得ることができた。
（４−２）造血器腫瘍細胞株
造血器腫瘍細胞株として、ヒト骨髄腫細胞株（ＫＰＭＭ２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６Ｂｌ）、ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株（ＡＲＨ−７７）、Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ細胞株（ＩＭ−９）、ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ細胞株（ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ）を用いた。これらの細胞のＨＭ１．２４抗原発現量を定量した（図４）。その結果、ＲＰＭＩ８２２６細胞が最も高い値を示し（Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ；５．２１）、以下、Ｕ２６６Ｂｌ（Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ；５．０８）、ＡＲＨ−７７（５．０２）、ＫＰＭＭ２（４．９０）、ＩＭ−９（４．８５）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（４．６３）であった。これらの造血器腫瘍細胞株ではＰＢＭＣに比べ、ＨＭ１．２４抗原が高発現していることが示された。
（４−３）患者由来骨髄腫細胞の測定
骨髄腫細胞はＣＤ３８を高発現しており、これをマーカーとして同定することができる。そこで、骨髄腫患者の骨髄穿刺サンプルから調製したＢＭＭＮＣをＣＤ３８ＰＥにて染色し、ＰＥ  ｖｓ  ＳＳヒストグラムにてＣＤ３８強陽性細胞を骨髄腫細胞とした（図５のＢ）。この細胞のＨＭ１．２４抗原発現量を測定したところ、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬは３．９８であった（図５のＣ）。
凍結細胞を用いても同様の結果が得られるか検討した。異なる２施設で得られた合計４サンプルの凍結ＢＭＭＮＣを同様に測定した結果、腫瘍細胞はいずれもＨＭ１．２４抗原を発現しており、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬは、４．６９、４．５１、４．２２、４．１１と算出された（図６及び図７）。凍結細胞においても、患者腫瘍細胞上のＨＭ１．２４抗原の定量が可能であることが確認された。
実施例２：ＨＭ１．２４抗原量の標識抗体による測定とＡＤＣＣ活性
実験材料
［１２５Ｉ］標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体）は、ＩＯＤＩＮＥ−１２５（ＳＯＤＩＵＭ  ＩＯＤＩＤＥ  ＩＮ  ｐＨ１０  ＳＯＤＩＵＭ  ＨＹＤＲＯＸＩＤＥ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＥＺＯ３３Ａ、（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）およびＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．０３２−０２１８２、和光純薬工業株式会社）を使用して、供給元の指示に従って作製した。
得られた１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（抗体濃度９．４７μｇ／ｍＬ、比放射能０．０９１２ＭＢｑ／μｇ、放射化学的純度９６．１％）は、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業株式会社）を含むＰＢＳ（−）を溶媒として含み、４℃で保存した。
ヒト腫瘍細胞株は、ＫＰＭＭ２（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１９）、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）、Ｕ２６６Ｂｌ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１９６）（以上ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６２１）（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＩＭ−９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５９）（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４８４）（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２０）（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ））、ＥＢ−３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８５）（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｔ  ｃｅｌｌ））、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１３）（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ））、ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８２）（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｔ  ｃｅｌｌ））を用いた。
ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＨＭ２１、ＣＨＯ／ＨＭ２５、ＣＨＯ／ＨＭ３１、ＣＨＯ／ＨＭ３２、ＣＨＯ／ＨＭ３４、ＣＨＯ／ＨＭ３６、ＣＨＯ／ＨＭ３７、ＣＨＯ／ＨＭ３９）は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２５８，５８３−５９１（１９９９）に記載の方法により作製した。すなわち、ＨＭ１．２４抗原をコードするベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ親細胞を得た。得られた細胞を単細胞にして培養し、単一の発現量を示す複数の細胞株を６０株樹立した。これらの樹立細胞株から、ＨＭ１．２４抗原の発現量の異なる複数の細胞株を選択した。
ＣＨＯ細胞株の培養には１０％  ＦＢＳ、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０１３１−０３５、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、０．１ｍｇ力価／ｍＬ硫酸カナマイシンを含むα−ＭＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９００．ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）（以下１０％ＦＢＳ／αＭＥＭ培地）を用いた。
ＡＤＣＣ活性の測定に用いる標的細胞浮遊液は、試験時に用時調製した。ＣＨＯ細胞の場合、細胞を６０ｍｍディッシュにて２〜３日間培養し、ディッシュ当たりの細胞数を約１×１０６個とした。細胞数は、実験に用いないディッシュにて確認した。上清を吸引除去後、５００μＬの１０％ＦＢＳ／αＭＥＭ培地および５．５５  ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＣＪＳ４、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃にて１時間培養した。この細胞を１０％ＦＢＳ／αＭＥＭ培地で２回、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、３００μＬのＥＤＴＡ（０．０２％ＥＤＴＡ溶液、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３８２−１４、ナカライテスク株式会社）を用いてディッシュから剥離し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地にて細胞密度を２×１０５／ｍＬに調整し、標的細胞浮遊液とした。
その他の細胞株の場合、１×１０６個を遠心し、細胞ペレットを約２００μＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地および５．５５ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＣＪＳ４、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に懸濁し、５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃にて１時間培養した。この細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地にて細胞密度を２×１０５／ｍＬに調整し、標的細胞浮遊液とした。
その他、健常人由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等、特に記載していない材料、方法は、実施例１に用いたものと同様のものを用いた。
（２）１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いたＨＭ１．２４抗原量の測定
１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地により１．３８ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に希釈し、１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体溶液とした。放射性同位体で標識されていないヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地により１．３８、４．１３、９．６３、２０．６、４２．６、１３７５ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に希釈し、非標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体溶液とした。ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地で洗浄後、ＣＨＯ／ＨＭ３６およびＣＨＯ／ＨＭ３９は１．１×１０６／ｍＬ、ＣＨＯ／ＨＭ２１は４．４×１０６／ｍＬ、ＣＨＯ／ＨＭ３１およびＣＨＯ／ＨＭ３２は５．５×１０６／ｍＬの細胞濃度に調整し、１．５ｍＬ容のマイクロチューブに２００μＬずつ分注した。これに１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体溶液および非標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体溶液を１０μＬずつ添加し氷上にて３時間反応させた。
この間３０分毎に攪拌した。各チューブから２００μＬを分取し、１５０μＬのＦＢＳをあらかじめ注入した０．４ｍＬ容のマイクロチューブ（アシストチューブ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７２．７０１、株式会社アシスト）に静かに重層した。これを遠心（１０，０００ｒｐｍ、３分間、４℃）後、設定温度−８０℃にて凍結した。細胞に結合した抗体は細胞ペレットに、遊離の抗体は上清に分画されるため、マイクロチューブを切断することにより細胞ペレットと上清とに分離した。それぞれの放射活性をガンマカウンター（ＣＯＢＲＡ  ＩＩ  ＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で測定し、細胞ペレットの放射活性をＢｏｕｎｄ（ｃｐｍ）と、上清の放射活性をＦｒｅｅ（ｃｐｍ）とした。
抗体は以下の様に添加した。
１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は終濃度０．０６２５ｎｍｏｌ／Ｌになるように加えた。１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体と非標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を合わせた総抗体濃度をＴｏｔａｌ（ｎｍｏｌ／Ｌ）とした。Ｔｏｔａｌ（ｎｍｏｌ／Ｌ）が（１）２ｎｍｏｌ／Ｌ、（２）１ｎｍｏｌ／Ｌ、（３）０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、（４）０．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、（５）０．１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、（６）０．０６２５ｎｍｏｌ／Ｌとなるように非標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を加えた。また、１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（終濃度０．０６２５ｎｍｏｌ／Ｌ）の１０００倍濃度の非標識ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を添加したものをｃｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（（７））とした。実験はｄｕｐｌｉｃａｔｅにて行った。なお抗体の分子量は１４８ｋＤａとして計算した。
ｃｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（（７））のＢｏｕｎｄ（ｃｐｍ）をＮｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｏｕｎｄ（ｃｐｍ）と定め、（１）〜（６）のＢｏｕｎｄ（ｃｐｍ）からＮｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｏｕｎｄ（ｃｐｍ）を減じた値をＳｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｏｕｎｄ（ｃｐｍ）とした。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体結合部位数はスキャッチャード分析により算出した。すなわち、抗原に特異的に結合した抗体濃度Ｂ（ｎｍｏｌ／Ｌ）は、Ｔｏｔａｌ（ｎｍｏｌ／Ｌ）×Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｏｕｎｄ／（Ｂｏｕｎｄ＋Ｆｒｅｅ）から求めた。遊離の抗体濃度Ｆ（ｎｍｏｌ／Ｌ）は、Ｔｏｔａｌ（ｎｍｏｌ／Ｌ）×Ｆｒｅｅ／（Ｂｏｕｎｄ＋Ｆｒｅｅ）から求めた。
全結合部位濃度をＢｍａｘ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の解離定数をＫｄ（ｎｍｏｌ／Ｌ）とすると、
Ｂ／Ｆ＝−（１／Ｋｄ）Ｂ＋（１／Ｋｄ）Ｂｍａｘ
の関係式が成り立つ。Ｂ／ＦをＹ軸、ＢをＸ軸にとり、勾配からＫｄを、Ｘ切片からＢｍａｘを求めた。細胞当たりのヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体結合部位数を、Ｂｍａｘから算出した。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体はモノクローナル抗体であることから、結合部位数＝抗原数として算出した。
（３）クロム遊離試験
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体およびｈＩｇＧ１溶液を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地にて希釈し、抗体溶液とした。９６ウェルＵ底プレートに、抗体溶液および標的細胞浮遊液を５０μＬずつ添加し、氷上にて１５分間静置した。続いて、各ウェルにエフェクター細胞としてＰＢＭＣを１００μＬずつ添加し５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で４時間静置した。最終的なエフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ）は５０／１、２０／１、８／１とした。遠心（１０００ｒｐｍ、５分間、４℃）後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡ  ＩＩ  ＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を２０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１３０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。
試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて行い、特異的クロム遊離率について平均値及び標準誤差を算出した。さらに、ＣＨＯ細胞を標的細胞とした場合、抗体存在下の特異的クロム遊離率から、非存在下の特異的クロム遊離率を減じ、ＡＤＣＣ活性（％）を求めた。
なお、エフェクター細胞を添加せず、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加したウェルにおける特異的クロム遊離率を測定し、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による直接的な傷害活性がないことを確認した。
結果
（４−１）Ｌｏｇ  ＭＥＦＬとＨＭ１．２４抗原発現量およびＡＤＣＣ活性との相関
Ｌｏｇ  ＭＥＦＬとＨＭ１．２４抗原発現量との相関を検討した。まず、ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現量を、１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いた試験により求めた。ＣＨＯ／ＨＭ２１、ＣＨＯ／ＨＭ３１、ＣＨＯ／ＨＭ３２、ＣＨＯ／ＨＭ３６、ＣＨＯ／ＨＭ３９の５つのＣＨＯ細胞株におけるＨＭ１．２４抗原量は、抗原数としてそれぞれ、２．５０×１０４、９．１４×１０３、５．５１×１０３、１．７２×１０５および１．３５×１０５と算出された（図８〜図１０）。次に、これらの細胞株について、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値を求めたところ、それぞれ、４．２０、３．８１、３．６４、５．１７および５．１２であった（図１１）。Ｌｏｇ  ＭＥＦＬをＸ軸、ＨＭ１．２４抗原数をＹ軸にプロットしたところ、その関係は
ｙ＝２．５３ｅ２．１５ｘ
で表された（図１２）。相関係数（Ｒ２）は０．９９４であり、高い相関が認められた。
次いで、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬとＡＤＣＣ活性の相関を検討した。まず、ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株である、ＣＨＯ／ＨＭ２１、ＣＨＯ／ＨＭ２５、ＣＨＯ／ＨＭ３１、ＣＨＯ／ＨＭ３４、ＣＨＯ／ＨＭ３６を標的細胞とし、クロム遊離試験によりヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を測定した。エフェクター細胞にはヒトＰＢＭＣを用い、Ｅ／Ｔ比は５０／１とした。実験は異なる健常人ボランティアＰＢＭＣをエフェクター細胞に用いて３回行い（Ｅｘｐ．１、Ｅｘｐ．２、Ｅｘｐ．３）、３回の実験の平均値および標準誤差を求めた（図１３及び図１４）。その結果、いずれのＣＨＯ細胞でも、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度に依存してＡＤＣＣ活性が誘導された。なお、ＨＭ１．２４抗原を発現しないＣＨＯ／ＨＭ３７では、ＡＤＣＣ活性はみられなかった。標的細胞に使用したこれらのＣＨＯ細胞について、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬを測定し、３回の実験の平均値および標準誤差を求めた（表３）。
0004297689.tif 000004
ＣＨＯ細胞のＨＭ１．２４抗原発現量は高い順に、ＣＨＯ／ＨＭ３６（Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ；５．２７）、ＣＨＯ／ＨＭ２１（４．３２）、ＣＨＯ／ＨＭ３１（３．８１）、ＣＨＯ／ＨＭ３４（３．６６）、ＣＨＯ／ＨＭ２５（３．３３）であった。また、図１２の式から、ＨＭ１．２４抗原数を算出した（表３）。各ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性をＬｏｇ  ＭＥＦＬに対してプロットしたところ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬのヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度で高い相関がみられた（図１５及び図１６）。次に、Ｅ／Ｔ比を５０／１、２０／１、８／１とし、ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性を比較した（図１７及び図１８）。
その結果、いずれのＥ／Ｔ比でも、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬに相関してＡＤＣＣ活性が誘導された。また、抗原発現量の低い細胞、例えば、ＣＨＯ／ＨＭ２５（ＨＭ１．２４抗原数が細胞あたり約３千個）においても、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度を高くすればＡＤＣＣが誘導されることが示された。一方、ＨＭ１．２４抗原を多く発現する細胞、例えば、ＣＨＯ／ＨＭ３６（ＨＭ１．２４抗原数が細胞あたり約２０万個）では、低いヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度（０．０１μｇ／ｍＬ）でもＡＤＣＣが誘導された。これらの結果は、抗原の発現量を測定することで、抗体療法に対する感受性を予測することができることを示す。
さらに、骨髄腫細胞を含む１１個の造血器腫瘍細胞株について、Ｌｏｇ  ＭＥＦＬとＡＤＣＣ活性を測定した（図１９〜図２１）。細胞株のＨＭ１．２４抗原発現量は高い順に、ＲＰＭＩ８２２６（Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ；５．１６）、Ｕ２６６Ｂｌ（５．１４）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（５．０４）、ＡＲＨ−７７（４．９３）、ＫＰＭＭ２（４．９１）、ＩＭ−９（４．８１）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（４．７５）、ＥＢ−３（４．７４）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（４．３８）、Ｄａｕｄｉ（３．８３）、ＭＯＬＴ−４（３．０８）であった。Ｌｏｇ  ＭＥＦＬ値をＨＭ１．２４抗原数に換算すると、それぞれ、１．６６×１０５、１．５９×１０５、１．２９×１０５、１．０１×１０５、９．７２×１０４、７．８４×１０４、６．８９×１０４、６．７５×１０４、３．１１×１０４、９．５３×１０３、１．９０×１０３であった。すべての細胞株でＡＤＣＣ活性が確認されたことから、少なくとも１．９０×１０３個以上のＨＭ１．２４抗原が発現していれば、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による造血器腫瘍の治療が可能であることが示された。
（５）考察
細胞上のＨＭ１．２４抗原発現量に関して、１２５Ｉ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を用いた試験にてＨＭ１．２４抗原数を測定し、フローサイトメトリーにて求めたＬｏｇ  ＭＥＦＬとの相関を検討した結果、両者に高い相関が確認された。Ｌｏｇ  ＭＥＦＬをｘとすると、ＨＭ１．２４抗原数は
２．５３ｅ２．１５ｘ
で表され相関式によって公式化された。本相関式をもちいれば、フローサイトメトリーにより簡便にＨＭ１．２４抗原の発現量を定量できる。骨髄腫患者由来腫瘍細胞のＬｏｇ  ＭＥＦＬは、４．６９、４．５１、４．２２、４．１１、３．９８であり、これをＨＭ１．２４抗原数に換算すると、６．０６×１０４、４．１１×１０４、２．２１×１０４、１．７４×１０４、１．３２×１０４となり、骨髄腫患者由来の腫瘍細胞には、少なくとも１万個のＨＭ１．２４抗原が存在すると考えられた。
ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞を標的細胞として、ヒトＰＢＭＣを介したヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬのヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度において、ＡＤＣＣ活性とＬｏｇ  ＭＥＦＬに高い相関がみられた。また、いずれのＣＨＯ細胞でも、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度、およびＥ／Ｔ比に応じたＡＤＣＣ活性が誘導された。ＨＭ１．２４抗原の発現量が細胞あたり約３千個のＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＨＭ２５）でも、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度およびＥ／Ｔ比が高い場合にはＡＤＣＣが観察された。
骨髄腫患者由来腫瘍細胞の場合、そのＬｏｇ  ＭＥＦＬはおおよそ４〜４．７であり、図１５から推測すると、０．１μｇ／ｍＬ以上のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の血中濃度を達成することができれば、ＡＤＣＣが誘導され、骨髄腫の治療が可能である。
【配列表】
0004297689.tif 000005
0004297689.tif 000006
0004297689.tif 000007
0004297689.tif 000008
0004297689.tif 000009
0004297689.tif 000010
0004297689.tif 000011
0004297689.tif 000012
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト骨髄由来単核球（ＢＭＭＮＣ）の染色方法を模式示した図である。
図２は、ＨＭ１．２４抗原の定量方法を確立する際に使用したフローサイトメトリーの蛍光測定の結果および蛍光強度との相関式を示した図である。
図３は、単球とリンパ球におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図４は、種々のヒト細胞株におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図５は、骨髄腫患者から得られたミエローマ細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図６は、骨髄腫患者から得られたミエローマ細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図７は、骨髄腫患者から得られたミエローマ細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図８は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるスキャッチャードプロットを示す図である。
図９は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるスキャッチャードプロットを示す図である。
図１０は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるスキャッチャードプロットを示す図である。
図１１は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるＨＭ１．２４抗原の発現を測定したフローサイトメトリーの図である。
図１２は、ＨＭ１．２４抗原数とｌｏｇ  ＭＥＦＬ値の相関を示した図である。
図１３は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）のＡＤＣＣ活性を示した図である。
図１４は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）のＡＤＣＣ活性を示した図である。
図１５は、ＨＭ１．２４抗原の発現量とヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性との相関を示した図である。
図１６は、ＨＭ１．２４抗原の発現量とヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性との相関を示した図である。
図１７は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるＥ／Ｔ比の変化に伴う、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性の変化を示した図である。
図１８は、種々のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株におけるＥ／Ｔ比の変化に伴う、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性の変化を示した図である。
図１９は、種々の細胞株におけるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性を示した図である。
図２０は、種々の細胞株におけるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性を示した図である。
図２１は、種々の細胞株におけるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（ＡＨＭ）によるＡＤＣＣ活性を示した図である。
【図１】
0004297689.tif 000013
【図２】
0004297689.tif 000014
【図３】
0004297689.tif 000015
【図４】
0004297689.tif 000016
【図５】
0004297689.tif 000017
【図６】
0004297689.tif 000018
【図７】
0004297689.tif 000019
【図８】
0004297689.tif 000020
【図９】
0004297689.tif 000021
【図１０】
0004297689.tif 000022
【図１１】
0004297689.tif 000023
【図１２】
0004297689.tif 000024
【図１３】
0004297689.tif 000025
【図１４】
0004297689.tif 000026
【図１５】
0004297689.tif 000027
【図１６】
0004297689.tif 000028
【図１７】
0004297689.tif 000029
【図１８】
0004297689.tif 000030
【図１９】
0004297689.tif 000031
【図２０】
0004297689.tif 000032
【図２１】
0004297689.tif 000033