(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）プラスミドがタンパク質に対する機能コード配列を含み、かつ菌類細胞がこの細胞に対する通常活性よりも低い水準のＵbc4pまたはＵbc5p活性を有し、かつこのプラスミドのコピー数が通常の数より増加されてなる、２μｍ系プラスミドを有する菌類細胞を準備し；
（ｉｉ）上記細胞を培養して菌類のタンパク質を生じさせ；
（ｉｉｉ）いずれかの用途のために上記タンパク質を精製する；
ことを包む、上記菌類細胞に異種なタンパク質の収率向上方法。
【請求項２】
この細胞が実質的に値零のＵbc4pまたはＵbc5p活性を示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｕbc4pまたはＵbc5pタンパク質が標的タンパク質に結合するのに障害になる化合物を、この細胞が生じ、該化合物が、標的タンパク質に結合するＵbc4pまたはＵbc5pタンパク質の非機能性変異体または断片である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
実質的に全くタンパク質が生じないように、または生じたタンパク質のいずれもが低減されたＵbc4pまたはＵbc5p活性を示すように、ＵＢＣ遺伝子が修飾されてなる、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子の少なくとも一部が欠失されてなる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子から生じたタンパク質のいずれの中にもユビキチン受容性システインが存在しないか、または存在しても低減されたユビキチン受容活性を示すように上記遺伝子が修飾されている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
上記ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子から生じたタンパク質のいずれもが、低減されたユビキチン供与活性を示すように修飾されている、請求項４記載の方法。
【請求項８】
上記遺伝子から生じたタンパク質のいずれもが、そのタンパク質のＮ末端における最初の２１アミノ酸の一つまたは二つ以上の突然変異の結果として低減された活性を示すように、ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子が修飾されてなる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記遺伝子から生じたタンパク質のいずれもが、そのタンパク質の最初のα−螺旋（残基３−１３）における突然変異の結果として低減された活性を示すように、ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子が修飾されてなる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
もとのＵＢＣ4またはＵＢＣ5が位置１０にグルタミン酸を有する主配列を有するタンパク質配列をコードし、かつ上記遺伝子から生じたタンパク質のいずれもが、その主配列中の位置１０におけるグルタミン酸に対する突然変異の結果として低減された活性を示すように、ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子が修飾されてなる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記遺伝子から生じたタンパク質のいずれもが、その主配列の位置１０におけるリシンまたはアルギニンアミノ酸置換の結果として低減された活性を示すように、ＵＢＣ4またはＵＢＣ5遺伝子が修飾されてなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
この細胞がＵＢＣ4またはＵＢＣ5アンチセンスｍＲＮＡを生ずる、請求項１または２記載の方法。
【請求項１３】
所望タンパク質が植物性または動物性タンパク質である、請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
所望タンパク質がヒトタンパク質である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
菌類細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項１から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
菌類細胞中の２μｍ系プラスミドのコピー数を増加するために菌類細胞のＵbc4pまたはＵbc5p活性を低減する手段の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は主として、親細胞菌株よりも実質的に高水準のタンパク質を発現する菌類の株の発生に関するものである。
背景および従来の技術
約２０年の間、所望の外来タンパク質は微生物中で生産されてきた。しかし必要なコード配列が導入され、発現が得られても、商業生産方法を最適化するためには、なお数多くの課題が残される。重要な分野の一つは、菌株の改良すなわち例えば一層高い収率および一層高い純度でタンパク質を作り得る宿主微生物の菌株を発見したり、または菌株を作ることに関する。
収率向上のためには、良好な発現システム（例えば転写プロモーター）が一度工夫されたら、そのコード配列のコピー数を増加したり（ＤＮＡ転写がその制約因子である場合にのみ所望の効果が得られるであろうが）、またはｍＲＮＡの安定性を向上させたり、またはタンパク質の劣化を低減させる試みを心に描くかもしれない。このように、後者の接近方法としては、ある種のプロテアーゼが欠失した酵親菌株（例えばpep 4-3）が所望の外来タンパク質の生産に使用されている。他の接近方法では、調節プロモーター例えばＧＡＬの制御下にＦＬＰ遺伝子をゲノム中に導入することにより、酵母Saccharomyces cerevisiae中の２μｍ系プラスミドの数が増加された。単一の炭素源としてのガラクトースを含む成長培地に切り替えると、プラスミドコピー数は増加するが（１１）、このＧＡＬプロモーターはＲＥＰ１／ＲＥＰ２により抑制されないので、このプラスミドコピー数の増加は制御されない。これが成長速度を低減させ、したがって元のcir+菌株（１１、２０）のcir0誘導体のクローン選択性を低減させる結果になる。
出願人らは、ランダムに突然変異体を生成させ、それにより一層好収率で異型タンパク質を生産する突然変異菌株を願わくば発見する目的で、突然変異源の適用により酵母菌株を突然変異させた（１６、２１）。出願人らは、所望のタンパク質を発現するプラスミドのコピー数を一層多く保有した、この種のランダム生産突然変異体を特徴付けし、ＵＢＣ4と呼称するユビキチン連結酵素をコードする遺伝子の一つ中に上記突然変異が生ずることを見いだした。このUBC4がコードした酵素（および密接に関連するUBC5がコードした酵素）は、異常タンパク質および短命タンパク質の劣化に関与しており、したがって、これらのいずれかの欠失が、取得された通常の所望のタンパク質の収率向上を可能にしたであろうと想定する、なんらの理由も存在しなかった。
ユビキチン連結酵素（ＵＢＣ）をコードする幾つかの遺伝子はバルクタンパク質劣化および酵母のストレス応答に連座している。ＵＢＣ1、ＵＢＣ4およびＵＢＣ5は細胞成長および細胞生存能力に対する重要な機能を仲介するように一緒に働く（２、３）。一本鎖遺伝子中に突然変異を有する酵母菌種は生存可能であり、かつ親細胞菌株に類似の成長速度を示すが、ＵＢＣ4／ＵＢＣ5二重突然変異体の成長速度は遅く、かつこれらはアミノ酸類似体に敏感であるが、一方、三重突然変異体は生存不能で、これらの活性が重複していることを示す。ＵＢＣ4およびＵＢＣ5遺伝子は密接に関連し、この２種のコードＤＮＡ配列は７７％同一性の残基を分け合うが、一方、この２種のタンパク質の予想アミノ酸配列は９２％同一性の残基を示す（３）。ＵＢＣ4およびＵＢＣ5タンパク質（以下、Ｕbc4pおよびＵbc5pと呼称）の接近した極度の類似性が原因で、ＵＢＣ4はＵＢＣ5突然変異体の機能損失を保管でき、逆も真であることが暗示されている（３）。この事実はＵＢＣ4／ＵＢＣ5二重突然変異体にだけ劇的な速度低下が観測された理由を説明する。パルスチエイス実験では、Ｕbc4pおよびＵbc5pは短命で異常なタンパク質の劣化に責任があり、これらのタンパク質の代謝回転はＵＢＣ4／ＵＢＣ5二重突然変異を有する菌株中でのみ低下することを示した。ＵＢＣ4またはＵＢＣ5単一突然変異体を有する菌株中では低減しなかった（３）。したがってこの文献は、単一のＩＢＣ4およびＵＢＣ5突然変異体体菌類菌株の使用は有利でないことを示唆した。
構造的に、全ての既知ＵＢＣ遺伝子は保存連結システインを含む約16kDaの保存領域（ＵＢＣ領域として知られる）をコードする（１、２２）。活性化されたユビキチンの転移は、ユビキチンのＣ末端がチオエステル結合を介しシステイン残基に共有結合で付加する結果になる。ＵＢＣ遺伝子は種々の部類に分類されている（２２中で論評）。部類ＩのＵＢＣ遺伝子は殆ど独占的に保存ＵＢＣ領域からなり、部類ＩＩおよび部類ＩＩＩはそれぞれＣ末端拡張部またはＮ末端拡張部を有するが、類ＩＶのＵＢＣ遺伝子はＣおよびＮ両末端に拡張部を有する（２２  菌類ゲノムは、染色体、染色体遺伝子の染色体外コピー例えばヌクレオソーム、および時には安定な染色体外要素を含む。これらの染色体外要素は、宿主の適応度を弱めることなく、それらの宿主と良性の寄生関係を発展させ、ここでは、要素の複製および分離のための細胞資源の盗みを成功裡に均衡させている。
菌類染色体外要素の一般的論評は、文献５および６で論ぜられ、一方、酵母Saccharomyces種のＤＮＡプラスミドは文献７および８で論ぜられ、Kluyveromyces種は文献９に含まれる。
Saccaromyces種の２μｍプラスミドは染色体外ＤＮＡ種であり、これらは、なんらの表現型なしに長期の自立的生存を確保する機構を進化させてきた。この２μｍプラスミドは核中に存在し、クロマチン中に包み込まれている。このプラスミド複製起点は自立複製配列として作用し、一方、他の配列は制御された高コピー数の維持を確実にし、有糸分裂に際してプラスミドが娘細胞中に均一に分配されることを可能にする。このプラスミドは通常の有糸分裂成長を必要とせず、かつ、宿主になんらの選択的利益をも提供することはない。その理由は、Saccaromyces菌種はcis0と命名される２μｍプラスミドが欠失しているために、２μｍプラスミドを含む親細胞、すなわちcir+よりも僅かに速く成長するだけであるからである。
この２μｍプラスミドは約６，３１８ｂｐの二本鎖環状プラスミドであり、各５９９ｂｐ長の正しく逆転した一対の繰り返し体により分離された、二つのユニーク領域２，７７４および２，３４６ｂｐを含んでいる。このモノマープラスミドは、In vivoでは、上記二つの繰り返し体（inverted repeats）間の位置特異性組換えに続いて形成される二つの逆転繰り返し異性体（ＡおよびＢ）の等量混合物として存在する。この２μｍプラスミドはＦＬＰ（Ａとしても知られる）、ＲＥＰ１（Ｂとしても知られる）、ＲＥＰ２（Ｃとしても知られる）およびＲＡＦ（Ｄとしても知られる）として知られる四つの読み取り枠をもつ。このプラスミドはＳＴＢまたはＲＥＰ3と呼称される複製起点とＲＡＦとの間に位置する一領域も含み、この領域は一連の不完全な６１ｂｐ繰り返し要素を含む。この要素は親細胞および娘細胞間の有効な分配を可能にするために、そのtrans型作用要素ＲＥＰ1およびＲＥＰ2と共に、cis型で必要とされる。
この２μｍプラスミドコピー数も染色体遺伝子の間接的制御下にあるが、これは２μｍプラスミドコピー数が異種saccharomyces cerevisiae菌株間で変わり、かつnib１として知られる染色体劣性突然変異が２μｍプラスミドコピー数の非制御的増幅に起因したクローン致死を生ずるためである（３９）。Nib１突然変異を有する酵母菌株は、ＦＬＰ遺伝子発現がガラクトース誘発である加工酵母菌株に類似している。菌類プラスミドコピー数の調節における、菌類ＡＴＰ依存性ユビキチンタンパク質劣化経路のタンパク質の関与は文献に記載がない。菌類ＡＴＰ依存性ユビキチンタンパク質分解経路は菌類プラスミドコピー数を制御するために操作できることも開示がない。
この２μｍプラスミドはsaccharomyces cerevisiaeの極めて普通の遺伝子成分であるが、他の酵母菌株はZygosaccharomyces rouxiiのｐＳＲ1およびｐＳＲ3プラスミド（６，２５１ｂｐおよび６，６１５ｂｐ）、Zygosaccharomyces bailiiのｐＳＢ１およびｐＳＢ2プラスミド（６，５５０ｂｐおよび５，４１５ｂｐ）、Zygosaccharomyces fermentatiのｐＳＭ1プラスミド（５，４１６ｂｐ）およびKluyverromyces drosophilarumのｐＫＤ１プラスミド（４，７５７ｂｐ）として知られる識別可能ＮＡプラスミドを含むことで知られている。これら全てのプラスミドの最も著しい特徴は、これらがsaccharomyces cerevisiae２μｍプラスミドにこれらが類似していることである。各プラスミドは環状であり、二重鎖ＤＮＡであり、逆転繰り返し配列により分離された、ほぼ等しい大きさの二等分体からなる。各プラスミドは逆転繰り返し配列の一つに近接して単一の自律複製配列（ＡＲＳ）および四つの読み取り枠を含み、その一つは逆転繰り返し体間の組換えを触媒するリコンビナーゼをコードする。
Saccharomyces cerevisiaeプラスミドは、少なくとも一つのプラスミド要素（ＡＲＳ、逆転繰り返し配列または２μｍ読み取り枠）特にＡＲＳを含む場合は、”２μｍ系”であると考えられる。
発明の要約
本発明の観点の一つは、（ｉ）タンパク質に対する機能コード配列をプラスミドが含み、かつ修飾された水準のＵbc4pまたはＵbc5p（以下、一般名Ｕbcp活性として知られる）を菌類細胞が有するような、プラスミドを有する菌類細胞を準備し；および（ｉｉ）上記細胞を培養して菌類細胞由来生成物を生じさせる；ことを含む、菌類細胞由来生成物の生産方法を提供する。
この菌類細胞由来生成物は上記コード配列によりコードされる所望タンパク質であり、かつＵbcp活性の上記修飾水準はこの細胞の場合の正規水準より低いことが好ましい。異常タンパク質代謝回転速度を測定することによりin vivoでこれを試験できる（３）。Ｕbcp（Ｕbpc4および／またはＵbc5p）活性の上記水準は大きくても野生型の５０％、３０％、２０％、１０％または１％へと低減できる。この細胞は最少限のＵbc4pまたはＵbc5p活性を有することが望ましい。しかし有用であるには、その成長速度が一般に余りにも遅くなるので、この細胞は低水準の両Ｕbcp4およびＵbc5p活性を有してはならない。
Ｕbcp活性の低減は各種方法のいずれかにより達成できる。第１に、この細胞はＵＢＣコード生成物がその受容体に結合するのを阻む化合物を生成し得る。したがって標的へのＵbc4pまたはＵbc5pの結合と競合するポリペプチドを発現させるために、細胞中に構成体を供給することが可能である。かくすると、有効なＵbpc4またはＵbc5p活性の低減が容易になる。これは、上記ＵＢＣ4またはＵＢＣ5によりコードされるＵＢＣ領域を過剰発現することにより実施できる。総体的Ｕbc4pまたはＵbc5p活性に実際に寄与し得る可能性があるので、ＵＢＣ4またはＵＢＣ5によりコードされる過剰発現ＵＢＣ領域は、それ自体の固有Ｕbc4p活性またはＵbc5p活性のいずれをも有しないことを確認することが重要である。このことは部位指向性変異誘発により、ＵＢＣ4（または5）のＵＢＣ領域以内のユビキチンに対する受容体部位またはＵＢＣ領域以内の他の保存アミノ酸に対する受容体部位として働くシステインを除去もしくは置換（例えばアラニンで）することにより達成できる。ＵＢＣ4（または5）の不活性ＵＢＣ領域の過剰発現は、それ自体の内因性プロモーターから、またはいずれか他の簡便なプロモーターから達成できる。この構成体は染色体またはエピソーム中に取り込みができる。
別法として、低減した水準のＵbcp活性を達成する目的で、実質的にタンパク質を生産しないように、または生産されたタンパク質のいずれもが低減された水準のＵbc4pまたはＵbc5p活性を有するように、この内因性ＵＢＣ遺伝子を修飾することができる。かくすると例えば、このＵＢＣ遺伝子は、ポリペプチドを全然生産しないか、または突然変異体（欠陥）ポリペプチド生成物が生成するように、このＵＢＣ遺伝子を削除（調節領域またはコード領域または両方のいずれか中で）できる。”調節領域”なる用語中には例えばＵＢＣ遺伝子活性化因子を生産する遺伝子等の、間接的にＵＢＣ遺伝子に作用するゲノム部分が包含される。ＵＢＣ読み取り枠（１４）の全てまたは一部の欠失は、Ｕbcp活性を低減または放棄させ、かつ非復帰突然変異菌類の菌株を生じさせるので好ましい。別法として、この活性は古典的突然変異誘発手法により低減または放棄でき、これによりＵＢＣ遺伝子のＤＮＡ配列が突然変異して、Ｕbcpの通常のアミノ酸配列が修飾および／または分断される点突然変異または欠失が生ずる。もし突然変異Ｕbcpポリペプチドが生産されると、これは不安定（すなわち天然タンパク質に比べて増進されたタンパク質代謝回転を受ける）になり；またはユビキチンを連結し得なくなり、または結合ユビキチンをこの基質へ配送できなくなる。
例えば、競合的（しかし不活性）ポリペプチド生産との関連で先に述べたように、例えば、システインを取り巻くアミノ酸残基における交替、または、さもなくてもシステンと相互作用するアミノ酸残基における交替により、それから生産されるいずれのタンパク質中にもユビキチン受容性システインが存在しないような態様、または存在してもユビキチン受容活性が低下しているような態様で、ＵＢＣ遺伝子を修飾できる。別法として、生産されるいずれの突然変異タンパク質の能力もＥ1ユビキチン供与体（ＵＢA1またはＵＢA2遺伝子の生成物）と相互反応しないような態様で、または上記供与体との親和性が低減されているような態様で、ＵＢＣを修飾できる。別法として、生産されるいずれの突然変異タンパク質も最終ユビキチン受容体および／またはユビキチンリガーゼ（Ｅ3）酵素と相互反応する能力が欠如または低減された態様で、ＵＢＣ遺伝子を修飾できる。具体的には、Ubc4pおよびUbc5pの主配列の最初の２１アミノ酸および最初のα螺旋（残基３−１３）以内（２９）の突然変異（欠失、挿入または置換）は、ユビキチンタンパク質リガーゼUbr1pへの関連タンパク質Ubc2pの結合に後者が連座している（３３）ので好ましくある。特に好ましいのは、Ｕbc4pおよＵbc5pの主配列以内の位置１０（Glu-10）のグルタミン酸に影響する突然変異であり、特にリシン（Glu10Ｌys）または（Ｇlu10Ａrg）による交替である。
これとは別に、ＵＢＣ遺伝子の発現を制御するために異なったプロモーターを使用できる；この種のプロモーターは調節可能である。例えば、これはガラクトース利用経路のプロモーターの様に誘発され得るし、または酸ホスフアターゼ基のプロモータの様に阻害剤除去により抑制解除ができる。
部位指向性突然変異誘発または他の既知技法は、文献２３記載のように、交替、挿入、欠失、および転位等の単一または多重突然変異の創造用に採用できる。好都合な突然変異の例中には、連鎖終結突然変異（３’末端近くに導入された停止コドンは、有益であるべき遺伝子生成物には十分な影響を与えないことは明瞭であり；当業者においては例えばコード配列の５’の３／４における突然変異を容易に創り得るはずである）、読み枠を変える点突然変異、大小に及ぶコード配列の欠失、遺伝子発現に影響するプロモーターまたはターミネーにおける突然変異、およびｍＲＮＡを不安定化する突然変異が包含される。遺伝子移転として知られる遺伝子分断技法の拡張により特定突然変異が導入できる（２４）。
一般的には、遺伝子配列を分断するために選択可能なマーカーを使用するが、もし表現型的に分断事象を検出できるならば、この限りではない。多くの場合、介在配列の挿入は、停止コドンがＵＢＣ配列と共に枠中に存在し、かつ挿入したコード配列が翻訳されないようになるはずである。これとは別に、挿入された配列はＵＢＣに対し異なった読み枠中にあってもよい。
Ｕbcp活性の低減を達成する第３の主たる方法は、ＵＢＣアンチセンスｍＲＮＡを生生じさせる細胞の場合である。これは、適切な配列のための発現構成体を細胞中に包含させる従来型方法で達成できる。ＵＢＣアンチセンスｍＲＮＡは構成プロモーターもしくは調節されたプロモーター系（例えばガラクトース異化経路のプロモーター）から生じさせてもよく、これにより翻訳可能なＵＢＣｍＲＮＡの低減が容易になる。調節されたＵＢＣアンチンスｍＲＮＡの使用もまた、活性化因子の添加または除去によりユビキチン依存性タンパク質分解経路の制御を可能にする。
本発明における方法で有用な菌類の細胞例中には、genera Pichia、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Hansenula（現在はPichiaとして再分類）、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces、Aspergillus、Metschunikowia、Rhodoporidum、Leucosporidum、Botryoascus、Endomycopis、Trichoderma、cephalosporium、Humicola、Mucor、Neurospora、その他が包含される。好ましい属はPichia、Saccharomyces、ZygosaccharomycesおよびKluyveromycesである。Saccharomyces sp.の例は、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces italicus、Saccharomyces diastaticus、およびZygosccharomyces rouxiiである。Kluyveromyces sp.の例はKluyveromyces fragilisおよびKluyveromyces lactisである。Hansenula sp.の例は、Hansenula polymorpha（現在はPichia angusta）、Hansenula anomala（現在はPichia anomala）、およびPichia capsulataである。Pichia sp.の例はPichia pastorisである。Aspergillus sp.の例はAspergillus nigerおよびAspergillus nidulansである。Yarrowia lipolyticaは好適なYarrowia種の例である。
好ましいのは酵母の菌株であり、この中でもSaccharomyces cerevisiaeは特に好ましい宿主である。使用される酵母菌株はSaccharomyces cerevisiaeの半数体または二倍体菌株のいずれでもよいが、二倍体菌株の場合はＵＢＣ遺伝子の両コピーからのＵbcp酵素活性が低減または放棄されていることが好ましい。
多数の種がSaccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4およびＵＢＣ5遺伝子の同族体を有することが判明している。ＵＢＣ4およびＵＢＣ5同族体はHomo sapiens（34）、Drosophila melanogaster（35）、Caenorhabditis elegans（36）、Arabidopsis thaliana（37）、Schizosaccharomyces pombeおよびCandida albicans（38）に記載されている。このDrosophila melanogasterおよびCaenorhabditis elegans同族体、Ｕbcc Ｄ1およびubc-2それぞれもＵbcp活性を有することが判っている。一つの同族体はＵＢＣ4またはＵＢＣ5と呼称される必要はなく、同様にＵＢＣ4またはＵＢＣ5と呼称される遺伝子は同族体である必要はない。
文献既知のＵＢＣ4／ＵＢＣ5同族体の中でも、各種タンパク質の類似性は主たるアミノ酸を配列させて計算できる。好適なプログラムはMegalign Program, Lasegene, DNASTAR Inc, 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, USAである。この種のプログラムを使用する場合に計算される百分率類似性は７５．７％から９７．３％の範囲である。これらの値は非常に高く、したがってＵbcタンパク質の高度に保存された性質を反映する。この活性サイトに高度に保存されたシステイン残基はコンセンサス配列中の位置１９３に見いだされる。他のＵbcタンパク質の中でも、それらの間の類似性およびSaccharomuces cerevisiae Ｕbc4pおよびＵbc5pに対して計算された百分率類似性は２４．２％から６３．５％の範囲である。したがって、Saccharomuces cerevisiae Ｕbc4pおよびＵbc5pに対するタンパク質類似性はClass I（Jentsch, 1992, 文献22により定義されたように）ユビキチン連結酵素として定義でき、この酵素はMegalignプログラムにより定義されるように、Saccharomyces cerevisiae Ｕbc4pまたはＵbc5pに対する主アミノ酸配列類似性６６．７％またはそれを超す類似性を保有している。ある遺伝子がこの種の酵素をコードするならば、その遺伝子はＳ．cerevisiae ＵＢＣ4またはＵＢＣ5に同族であると見做される。
多数の菌種がＵbcp活性を保有していることが判っている。先に述べたように、Saccharomyces cerevisiaeのubc4／ubc5二重突然変異体は倍加時間が長く、アミノ酸類似体に対する抵抗性が低く、かつ耐熱衝撃に劣っている。Saccharomyces cerevisiae Ｕbc4pまたはＵbc5pそれぞれに７９．６％および８０．３％類似で、ＵbcＤ1遺伝子によりコードされるDrosophila ＵＢＣ1タンパク質は、ＵＢＣ4プロモーターの下流に置かれるとＵbc4pまたはＵbc5p活性を有しない酵母の表現型を逆転し得ることが知られている（３５）。同様に、Saccharomyces cerevisiae Ｕbc4pまたはＵbc5pそれぞれに７８．２％および７８．９％類似で、ubc-2遺伝子によりコードされるCaenorhabditisタンパク質ubc-2が、同じ性質を示すことも知られている（３６）。したがって、このことは未知ソースからのタンパク質がＵbc4pまたはＵbc5p活性を有するかの機能試験になる。３８℃で２４時間後の倍加時間および生存率の例の場合、SeufertおよびJentsch（３，３６）が記載した単一ubc4もしくはubc5突然変異菌株は野生型菌種に類似の特性を示すことも判る。既に文献（３６）記載の手法により、未知もしくは突然変異Ｕbcタンパク質が、内因性ＵＢＣ4もしくはＵＢＣ5プロモーターの制御下に、好ましくは内因性ＵＢＣ4もしくはＵＢＣ5遺伝子座における単コピー組込みとしてSaccharomyces cerevisiaeゲノム中に、一度び組み込まれてしまうと、自然型Saccharomyces cerevisiae Ｕbc4pまたはＵbc5pに比べた、未知Ｕbcタンパク質のＵbcp活性、または既知Ｕbcタンパク質の突然変異型は、二重ubc4／ubc5突然変異菌株の３８℃で２４時間後の倍加時間もしくは生存率を野生型または単一ubc4もしくはubc5突然変異Saccharomyces cerevisiae菌株の場合の正規に引き戻す、その相対能力によって決定できる。
本発明の好ましい観点では、Ｕbc4pもしくはＵbc5p活性の水準は低減される。かくすると、細胞中の発現プラスミドのコピー数が増加し、かつそのプラスミドから発現される所望のタンパク質の発現水準が増加することが判った。逆に、Ｕbc4pもしはＵbc5p活性の水準が増加すると、そのタンパク質の発現水準が低減するが、これは例えばプラスミドコード化タンパク質が所望のタンパク質の生産を阻害する場合等のある種の環境では望ましい。
”所望のタンパク質”なる用語は通常の意味合いで、ヒトの介在なしに菌類の細胞が生産する水準よりも一層高い水準で所定プロセスにおいて望まれるタンパク質（または他のポリペプチド）のいずれかを意味する。この所望のタンパク質は問題の菌種に内在性であってよく、例えば通常宿主により生産される酵素であってもよい。しかし通常は上記タンパク質は宿主に対して異型である。このタンパク質は抽出されることなく宿主細胞または宿主細胞培地中で要求された仕事を遂行できる。しかし通常は、このタンパク質は細胞培地から抽出され、ある程度の精製後いずれかの使用に供される。このタンパク質はウイルス、微生物、菌類、植物または動物タンパク質例えば哺乳類タンパク質であってもよい。好ましくは、ヒトタンパク質例えばアルブミン、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメント（Ｆａｂフラグメントまたは単鎖抗体等の）、（ヘモ）グロビン、血液凝固因子（因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等）、インターフエロン、インターロイキン、α1−アンチトリプシン、インスリン、カルシトニン、細胞面受容体、フイブロネクイン、（プロ）−ウロキナーゼ、（プレ−プロ）−キモシン、ワクチンに対する抗原、ｔ−ＰＡ、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ成長ホルモン、血小板由来内皮細胞成長因子、およびグルコースオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ等の一般的酵素である。このタンパク質は当然乍らＵbc4pまたはＵbc5pそれ自体ではなく、またはＵbc4pもしくはＵbc5pがその生来の機能をその中で遂行するＵbc4pまたはＵbc5pいずれかの融合体でもない。
タンパク質が菌類培地から精製されるのであれば、所望のタンパク質は、そのタンパク質に適するいずれかの技法により取得できる。例えばアルブミンはＷＯ 96/37515号、ＥＰ−625 202号またはＥＰ-464 590号公報それぞれに記載の技法に従ってSaccharomuces、Kluyveromyces、またはPichia細胞培地から精製できる。
本発明は主としてヒトアルブミンに関するが、本発明はヒトヘモグロビンの発現にも有利であることが判明しているので、本発明の方法はこのタンパク質のみに適用され得る理由はない。
”ヒトアルブミン”なる用語は、ヒト血清アルブミンから区別不能な物質、またはその変異型もしくはそのフラグメントを指すように本発明では使われる。”変異型”なる用語中には、挿入、欠失、および同類置換もしくは非同類置換のいずかの置換型が包含され、この場合のこの種の変化は、アルブミンが示す腫張の、有用なリガンド結合性または免疫原性を実質的に変えない。例えば、ＥＰ−Ａ−322 094号公報に開示のヒトアルブミンもしくはヒトアルブミン類似体の天然型多形性変異型も包含される。一般的に、ヒトアルブミンの変異型もしくはフラグメントはヒト血清アルブミンのリガンド結合活性（例えばビリルビン結合）の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも８０％、９０％または９５％）およびヒト血清アルブミンの腫張活性の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも８０％、９０％または９５％）（ｗ／ｗ）を有するはずである。
所望のタンパク質コード領域は、プロモーター配列、このプロモーターの転写制御下にあるＤＮＡコード配列、タンパク質分泌を指令するリーダー配列、および真核転写終結シグナルを含むＤＮＡ配列を含むハイブリッドプラスミド以内に含まれるのが好ましく、次いでこのプラスミドは染色体外ＤＮＡ配列として維持されるか、または宿主生物の一種また二種以上の染色体中に統合される。
上記タンパク質の発現に適するプロモーターの例中には、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫＩ）遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）およびウリジンジホスホグルコース  ４−エピメラーゼ（ＧＡＬ１０）遺伝子、イソ−１−シトクロームｃ（ＣＹＣ１）、酸ホスフアターゼ（ＰＨＯ5）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１およびＡＤＨ２）ならびにＭＦα−１と結び付いたプロモーターが包含される。好ましいプロモーターは、ＥＰ第424 117号公報記載のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）およびＥＰ-431 880 B1公報記載のプロテアーゼＢ（ＰＲＢ１）プロモーターである。
好適な転写終結配列は、菌類宿主中で転写終結およびポリアデニル化に適するシグナルを含む、真核遺伝子の３’フランキング配列、または発現制御配列に生来結合する遺伝子配列、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）もしくはイソ−１−シトクロームｃ（ＣＹＣ１）遺伝子と結び付いた配列であってもよい。好ましい転写終結配列はアルコールデヒドロゲナーゼからの配列である。
好ましい分泌リーダー配列は、例えば、天然型ヒト血清アルブミンリーダー配列、Saccharomuces cerevisiae  ＭＦα−１リーダー配列からのリーダー配列、Kluyveromyces lactisキラー毒素リーダー、天然型ヒト血清アルブミンリーダーとSaccharomuces cerevisiae  ＭＦα−１リーダー配列との間の融合体、またはKluyveromyces lactisキラー毒素リーダーとSaccharomuces cerevisiae  ＭＦα−１リーダー配列との間の融合体、またはＷＯ 90/01063号公報記載のような配列の保守的修飾変異型である。
ハイブリッドプラスミドも使用でき、これらは発現制御配列とは別に、その異型遺伝子配列および転写終結配列はプロモーター機能すなわち所望のポリペプチドの発現に必須でないか、もしくは重要性が低い追加配列を含んでいるが、この配列は例えば上記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に重要な機能を果たす。この追加ＤＮＡ配列は原核おび／または真核細胞由来のものでよく、かつ染色体および／または染色体外ＤＮＡ配列を含んでもよい。例えば、この追加ＤＮＡ配列はバクテリア、酵母または一層高級な真核染色体ＤＮＡ等のプラスミドＤＮＡからなるか、またはこの種のプラスミドＤＮＡから由来できる。好ましいハイブリッドプラスミドはバクテリアプラスミド特にEscherichia coliプラスミドｐＢＲ３２２もしくは関連プラスミド、バクテリオフアージ、酵母２μｍプラスミド、および／または酵母染色体ＤＮＡに由来する追加ＤＮＡ配列を含む。
異型ポリペプチドの発現に好ましいハイブリッドプラスミドでは、この追加ＤＮＡ配列は酵母複製起点および酵母に対する選択的遺伝子マーカーを保有する。酵母複製起源例えば自律複製配列セッグメント（ＡＲＳ）を含むハイブリッドプラスミドは形質転換後に酵親細胞により染色体外で維持され、有糸分裂に際して自律的に複製される。酵母２μｍプラスミドＤＮＡに相同の配列を含むハイブリッドプラスミドも同様である。これらのハイブリッドプラスミドは、細胞内部に既に存在する酵母２μｍプラスミド中への組換えにより統合され得るし、または自律的に複製される。ＥＰ−Ａ−251 744号公報記載の組込みベクターまたはＥＰ−Ａ−286 424号公報記載の”壊変”ベクターも使用できる。
有利なことに、このハイブリッドプラスミド中に存在する上記追加ＤＮＡ配列も複製起点、およびバクテリア宿主特にEscherichia coliに対する選択可能マーカー、ならびに最終菌類宿主に対する選択可能マーカーを含んでいる。酵母ハイブリッドプラスミド中のEscherichia coli複製起点およびEscherichia coliマーカーの存在に結び付いた有用な特徴がある。第１に、Escherichia coli中での成長および増幅により大量のハイブリッドプラスミドＤＮＡが得られること、第２には、ハイブリッドプラスミドの構成が、クローン技術の全レパートリーを利用することによりEscherichia coliに基づいて都合よく実施できることである。ｐＢＲ３２２その他のEscherichia coliプラスミドは、Escherichia coli複製起点、および例えばテトラサイクリンおよびアンピシリン等の抗生物質に対する抵抗生を授けるEscherichia coli遺伝子マーカーの両方を含むので、酵母ハイブリッドベクターの一部として採用するのに好都合である。この選択性菌類マーカーは、マーカーの表現型発現に起因して形質転換細胞の選択を容易にする遺伝子のいずれかであってもよい。好適なマーカーは、特に抗生物質抵抗性を示すマーカー、または栄養要求性酵母突然変異体の場合におけるように、宿主障害を補足する遺伝子である。例えば抗生物質シクロヘキシミドに対する抵抗性を授ける対応遺伝子、または栄養要求性酵母突然変異体例えばＵＲＡ1、ＵＲＡ3、ＬＥＵ2、ＨＩＳ3、ＨＩＳ4、ＴＲＰ5、ＴＲＰ1およびＬＹＳ2遺伝子中にプロトトロフイーを提供する対応遺伝子である。
Pichia、Saccharomyces、Kluyveromycs、YarrowiaおよびHansenula属の菌類細胞は細胞壁の酵素消化により形質転換されてスフエロプラストを与える；次いでスフエロプラストを形質転換ＤＮＡと混合し、カルシウムイオンおよびポリエチレングリコールの存在下に保温すると、形質転換したスフエロプラストが再生培地中に再生する。この再生培地は、形質転換した細胞の再生および選択が同時にできる態様で調製する。
核酸またはアミノ酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺伝子は一般に選択マーカーとして使用されるので、上記再生は酵母最低培地中で遂行するのが好ましい。Saccharomyces cerevisiaeの形質転換方法は一般的にはＥＰ 251 744号、ＥＰ 258 067号、ＷＯ 90/01063号公報およびHinnenら（４）の教示があり、ここに文献として加入する。
したがって広い観点において本発明は、菌類細胞中のプラスミドコピー数を制御して菌類細胞中のＵＢＣ4もしくはＵＢＣ5機能を変化させる手法の使用を提供する。
本発明の範囲を制限をすることなく、実施例および付属図面を参照しながら本発明の好ましい実施態様を次に説明する：
図１は、ｐＤＢ2277のプラスミド地図であり；
図２は、ubc5分断酵母の、増加したｒＨＡ生産性を示すロケット免疫電気泳動ゲルの写真であり、菌株類は次のようである：試料１、ＤＳ569 ura 3［pＡＹＥ329/ＹＣ plac 33］；試料２−１７、ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329/ｐＤＢ2276］形質転換細胞1-16;試料１８−３３、ＤＳ1101 ura 3［pＡＹＥ329/ｐＤＢ2276］形質転換細胞1-16；試料３４−３８、ＨＳＡ標準100、75、50、30、および20μg／ｍＬＨＳＡ；
図３は、酵母Saccharomyces cerevisiae遺伝子ＵＢＣ4のゲノムＤＮＡ配列であり、この2.066kb配列はＵＢＣ4読み取り枠の開始の0.95kb上流ＰstIサイトから翻訳停止コドンの0.58kb下流ＰstIサイトへと拡張し；
図４は、ｐＡＹＥ399のプラスミド地図であり；
図５は、pＡＹＥ400のプラスミド地図であり；
図６は、pＵＢＴ1のプラスミド地図であり；
図７は、pＵＢＴ2のプラスミド地図であり；
図８は、pＨbＤ2-1のプラスミド地図であり；
図９は、pＡＹＥ792のプラスミド地図であり；
図１０は、pＢＳＴ＋のプラスミド地図であり；
図１１は、pＤＢ2258のプラスミド地図でであり；
図１２は、ＤＢ2259のプラスミド地図であり；
図１３は、ＤＢ2260のプラスミド地図であり；
図１４は、ＤＢ2261のプラスミド地図であり；
図１５は、Saccharomucys cerevisiae ＵＢＣ5遺伝子のゲノムＤＮＡ配列であり；この1.2kb配列はＵＢＣ5読み取り枠の開始の0.55kb上流BbIＩＩサイトから翻訳停止コドンの0.12kb下流Bc/Iサイトへと拡張し；
図１６は、pＤＢ2262のプラスミド地図であり；
図１７は、pＤＢ2264のプラスミド地図であり；
図１８は、pＤＢ2275のプラスミド地図であり；および
図１９は、pＤＢ2276のプラスミド地図である。
発明の詳細な説明
全ての標準組換えＤＮＡ手順は特に言及しなければ文献１３記載の通りである。
実施例１：  Saccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4遺伝子の分断（disruption）
Saccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4遺伝子は染色体ＩＩ上に位置する。このＵＢＣ4遺伝子のＤＮＡ配列を図３に示す。
遺伝子分断法（１４）により全ＵＢＣ4読み取り枠を欠失させてＵＢＣ4を突然変異させ、これにより活性ＵＢＣ4タンパク質の生産を妨げた。先ず、領域５’および３’と同一のＤＮＡ配列をＵＢＣ4読み取り枠に包含させるようにＵＲＡ3遺伝子の５’および３’末端を修飾した突然変異一本鎖標準ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法により適当なマーカー遺伝子（ＵＲＡ3）を増幅し、次いでura3栄養要求酵母菌の菌株をウラシルプロトトロフィー（prototrophy）に形質転換してこれを成就した。
両端にＵＢＣ4配列を組み込んだＵＲＡ3遺伝子の５’および３’末端のＰＣＲ増幅に好適な二つの一本鎖標準オリゴヌクレオチドプライマー（ＵＢＣ4ＵＲＡ1およびＵＢＣ4ＵＲＡ2）を「ＡＢＩ 380Ｂ  ＤＮＡ Synthesister」を用いて合成した。
0004282771.tif 000002
プラスミドＹＥp24からのＵＲＡ3遺伝子を増幅するためにＰＣＲ反応を行った（１５）。条件は次のようであった：１μｇ／ｍＬプラスミドＹＥp24ＤＮＡ、各プライマー２μＭ、９４℃で３０秒変性、４５℃で４０秒アニール、７２℃で２０サイクル１２０秒拡張、次いで７２℃で６００秒ソーク、次いで４℃でソーク、AmpilTaq Thermal Stable ＤＮＡ  ポリメラーゼ用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキット採用、全反応容量５０μＬ、メーカーの指示に従う。別途の条件は次のようであった：２ｎｇ／ｍＬプラスミドＹＥp24ＤＮＡ、各プライマー０．１μＭ、９４℃で３０秒変性、５５℃で４０秒アニール、７２℃で３０サイクル１２０秒拡張、次いで７２℃で６００秒間ソーク、次いで４℃でソーク、AmpilTaq Thermal Stable ＤＮＡポリメラーゼ用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキット採用、全反応容量５０μＬ、メーカーの指示に従う。生成物５’-ＵＢＣ4-ＵＲＡ3-ＵＢＣ4-３’をゲル電気泳動で分析きしたところ、約１．２ｋｂの予期した大きさであることが判った。この増幅ＰＣＲ生成物をPromega Wizard ＰＣＲ  ＤＮＡ  精製キットを用いてメーカーの指示に従って精製した。
Saccharomyces cerevisiae菌株ＤＳ569cir0（１６）を組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）分泌プラスミドｐＡＹＥ329を用いてロイシンプロトトロピーに形質転換した（１９）。このプラスミドのプロモーター配列は先に記載したようなＦＡＤ−結合グリセリン酸−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＵＴ2）遺伝子よりも寧ろ、Saccharomyces cerevisiae  ＮＡＤ−結合グリセリン酸−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ1）遺伝子の配列に一致する。
Saccharomyces cerevisiae菌株ＤＳ569［pＡＹＥ329］のura3栄養要求性誘導体はＵＲＡ3遺伝子のコード配列の一部が欠失した、遺伝子分断法（１４）によるＵＲＡ3遺伝子を突然変異させて創り、これにより活性Ｕｒａ3タンパク質の生産を妨げた。プラスミドＹＥp24（１５）はＨindIIIを用いて完全に消化させ、生成物をゲル電気泳動により分析した。1.17kb  Ｈind III ＵＲＡ3遺伝子フラグメントを単離し、pＡＣＹＣ184（１７）のユニークＨindIIIサイト中に配位子結合させ、プラスミドpＡＹＥ399を創った（図４）。プラスミドpＡＹＥ339をＰstIで完全消化し、ＮcoIで部分消化し、生成物を電気泳動で分析し、ＵＲＡ3遺伝子の中心部が欠如した5.41kb ＮcoI-ＰstI ＤＮＡフラフメントを単離し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて平滑末端を満たし、再配位子結合させた。生じたプラスミドpＡＹＥ400（図５）はＵＲＡ3読み取り枠以内に欠失を有し、かつ欠失部位にＮcoI部位を有している。ＵＲＡ3遺伝子（△ＵＲＡ3）の上記欠失誘導体を、プラスミドpＡＹＥ400から0.94KB  ＨindIIIフラグメントとして単離した。ＤＳ569［pＡＹＥ329］のura3栄養要求突然変異体は、△ＵＲＡ3 0.94kb  ＨindIIIフラグメントを用いてＤＳ569［pＡＹＥ329］を形質転換し、５−フルオロ−オロン酸に対する抵抗性によりＵra-酵母を選択して創った（１８）。この培地上で成育し得るコロニーを精製し、これらがウラシル補足なしには成育できず、かつこの欠陥は形質転換によるＵＲＡ3遺伝子の導入により補足され得たことを証明するために試験した。
この種の菌株の一つＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329］を５’−ＵＢＣ4-ＵＲＡ3-ＵＢＣ4-３’ＰＣＲ生成物を用いてウラシルプロトトロピーへと形質転換した。多数の形質転換細胞の消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを、2.07kb ＰstI  ＤＮＡフラグメントとしてのＵＢＣ4遺伝子を用いてプローブし、ＵＢＣ4遺伝子の分断を確認した。この新規の菌株をＵＢ05［pＡＹＥ329］と命名した。
いずれの半数体Saccharomyces cerevisiae菌株のＵＢＣ4の分断にもこれらの方法は等しく適用可能である。所望の宿主が既にura3栄養要求性突然変異を有している場合は、ＵＢＣ4の分断は上記５’-UBC4-URA3-UBC4-３’ＰＣＲ生成物を用いて遂行できる。所望の半数体宿主がura3栄養要求性突然変異を有さない場合は、ＵＢＣ4の分断は、一度菌株が、pＡＹＥ400からの△ＵＲＡ3 0.94kb  ＨindIIIフラグメントを用いた形質転換によりura3を作り、次いで上記５−フルオロ−オロン酸に対する抵抗性によりＵra-酵母を選択することにより達成してもよい。二倍体宿主の場合は両ＵＢＣ4遺伝子の分断が必要である。これは、二倍体化に先立ち先ず二つの親細胞半数体のそれぞれ中のＵＢＣ4遺伝子を分断して達成できる。
実施例２：  Saccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4遺伝子の分断が組換えヒトアルブミンの生産を増進した。
酵母菌株ＤＳ569［pＡＹＥ329］（このものはＵＢＣ4分断を有さない）のｒＨＡ生産性、およびＵＢ05-1［pＡＹＥ329］およびＵＢ05-6［pＡＹＥ329］（両方共にＵＢＣ4分断を有する）と呼称されるＵＢ05［pＡＹＥ329］の二つの独立単離体を、１０ｍＬ震盪フラスコ培養液中で評価した。酵母を２％ｗ／ｖグルコース含有リン酸ナトリウム／クエン酸ｐＨ６．０で緩衝したＹＮＢ（Difco）最少培地中に接種し、３０℃２００ｒｐｍ３日間保温した。このｒＨＡ生産性はＨＳＡ標準（２５−１５０μｇ／ｍＬ）に対するロケット免疫電気泳動により推定した。このｒＨＡ生産性はＨＳＡ標準（２５−１５０μｇ／ｍＬ）に対するロケット免疫電気泳動により推定した。これらの条件下のＤＳ569［pＳＹＥ329］のｒＨＡ生産性は４５ｍｇ／Ｌと計算されたが、一方、同一条件下に測定された二つのＵＢ05［pＡＹＥ329］単離体のｒＨＡ生産性はそれぞれ７７および７５ｍｇ／Ｌであると計算された。
実施例３：  Saccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4遺伝子の分断がハイブリッド２μｍプラスミドコピー数を増加させた。
酵母菌株ＤＳ569［pＡＹＥ329］、ならびにおよびＵＢ05-1［pＡＹＥ329］およびＵＢ05-6［pＡＹＥ329］と呼称する二つの独立単離体ＵＢ05［pＡＹＥ329］を、１００ｍＬ震盪フラスコ培地中で評価した。リン酸ナトリウム／クエン酸ｐＨ６．０で緩衝し、２％ｗ／ｖグルコースを含むＹＮＢ最少限培地中に酵母を接種し、充分の時間、通常は１から２日に亘り２００ｒｐｍ、３０℃で保温し、中間対数成長期に相当する５ＡＵ／ｍＬを超す培地密度になるように保温した。全ゲノムＤＮＡは酵親細胞のガラス分断、続く溶媒抽出、透析およびエタノール沈殿により抽出した。全ゲノムＤＮＡはＨindIIIで完全に消化し、生成物はゲル電気泳動により分析した。プラスミド特異性ＤＮＡバンドの臭化エチジウム染色はリボソマールＤＮＡ（ｒＤＮＡ）バンドの臭化エチジウム染色に比べて増加し、ハイブリッド２μｍプラスミドのプラスミドコピー数が増加したことを示す。ｒＤＮＡのコピー数と比較したハイブリッド２μｍプラスミドコピー数の定量は、同時ＤＮＡ／ＨＳＡ  cＤＮＡプローブを用いてサザンブロット分析により行った。これによれば、ハイブリッド２μｍプラスミドpＡＹＥ329のプラスミドコピー数は、ＤＳ569［pＡＹＥ329］の半数体ゲノム当たり４８．９±９．２コピーからＵＢ05-1［pＡＹＥ329］およびＵＢ05-6［pＡＹＥ329］における半数体当たりそれぞれ８３±１２．５および１１６．８±２９．０コピーへと増加したことを示した。
実施例４：  アンチセンスＵＢＣ4ｍＲＮＡ発現
ＵＢＣ4遺伝子の発現を分断する一つの方法は、アンチセンスポリヌクレオチドの発現条件を取り決めることである。
アンチセンス転写は、染色体（単または複）中に統合されたアンチセンス発現カセットのコピーまたはコピー類から発現でき、または、例えばＹＣp50（２５）もしくはＹＣplac 1111、ＹＣplac 33、ＹＣplac  22（２６）等の動原体ベクター、またはＧＡＬ1、ＧＡＬＬまたはＧＡＬＳプロモーター（２７）を含むp416に及ぶプラスミドp413等の低プラスミドコピー数ベクターから発現され得る。このアンチセンス転写も、ｐＪＤＢ207（１２）、ＹＥＰ13またはＹＥｐ２４（１５）等の高次プラスミドコピー数ベクターから発現され得る。これらの発現プラスミドまたは統合カセットの全ては、適切な栄養要求性突然変異マーカー（単または複）を含む酵母の形質転換中の選択を容易にするために、酵母選択性マーカー例えばＵＲＡ3、ＨＩＳ3、またはＴＲＰ１を要求する。アンチセンスＵＢＣ4もしくはアンチセンスＵＢＣ5の発現を推進するのに用いるプロモーターは天然型プロモーター、または関連のプロモーターであってよい。このことは、センス転写物の出現と同時にアンチセンス転写物の発現を促進する利点がある。特に好ましい実施態様では、センス転写物以上の過剰なアンチセンス転写物を確保するためにアンチセンス発現カセットが高プラスミドコピー数プラスミド上に提供される。これとは別のプロモーターの例中には、解糖プロモーター例えばＰＧＫ1、ＰＹＫ1、ＴＤＨ2/ＴＤＨ3およびＥＮＯ1/ＥＮＯ2等の強い構成モーターが包含される。強力に調節されるプロモーターの使用は、オペレーターの意思で調節できる。この種のプロモーターの例中には、ＧＡＬ1、ＧＡＬＬおよびＧＡＬＳプロモーターがある（Mumbergらの２７）。これらのガラクトース誘発プロモーターは多重クローニング部位によりＣＹＣ1ターミネーターから隔離された高および低プラスミドコピー数ベクター中に統合されている。次に記載の例示はp426ＧＡＬ1（Mumbergら、２７）と呼称するプラスミドを利用する。このアンチセンスＵＢＣ4転写物は、宿主菌類の菌株が熟達したＵＢＣ4遺伝子を含む場合にのみＵＢＣ4センス転写物を不活性化するのに有効であり得る。しかし、ubc4菌種の菌株中のＵＢＣ4アンチセンス転写物の発現は他のＵＢＣ4類似の転写物の片ずけに便利なので、このものは同様に選択可能な事項である。
ＵＢＣ4読み取り枠のＰＣＲ増幅に適する二つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー（ＵＢＣ43およびＵＢＣ44）はＡＢＩ380 Ｂ  ＤＮＡ Synthesiserを用いて合成した。
0004282771.tif 000003
酵母菌株Ｓ288Ｃから調製したゲノムＤＮＡからＵＢＣ4を増幅するためにＰＣＲ反応を行った。条件は次のようである：５μｇ／ｍＬＳ288ＣゲノムＤＮＡ、各プライマー２μＭ、９４℃３０秒の変性、４５℃４０秒のアニール、７２℃１２０秒、３５サイクルの拡張、次いで７２℃６００秒のソーク（soak）、続く４℃のソーク、AmpilTaq Thermal Stable ＤＮＡ  ポリメラーゼ用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキット採用、全反応容量５０μＬ、メーカーの指示に従う。生成物５’−（ＨindIII）-ＵＢＣ4-（ＨindIII）-３’をゲル電気泳動で分析し、約0.58kbの期待の大きさであることが判った。この増幅ＰＣＲ生成物はメーカーの指示に従ってPromega Wizard ＰＣＲ精製キッドを用いて精製した。これら二つのプライマーＵＢＣ43およびＵＢＣ44を用いてＨindIII部位５’および３’をＵＢＣ4読み取り枠に導入した。
精製したＰＣＲ生成物５’−（ＨindIII）−ＵＢＣ4-（ＨindIII）-３’をＨindIIIを用いて完全に消化し、二つのプラスミドpＵＢＴ1およびpＵＢＴ2（図６および７）を生ずるプラスミドp426ＧＡＬ1（Mumbergら、２７）のＣｙＣ1ターミナーターおよびＧＡＬ1プロモーターの間に位置するユニークＨindIII部位中に連結させた。プラスミドpＵＢＴ1はＧＡＬ1プロモーターからアンチセンスＵＢＣ4転写物を生ずるように配向したＵＢＣ4読み取り枠を含み、一方、プラスミドpＵＢＴ2はＧＡＬ1プロモーターからのセンスＵＢＣ4転写物を生ずるように配向したＵＢＣ4読み取り枠を含んでいた。
ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329］（実施例１）等の非機能性ura3遺伝子の存在に基づくウラシル生合成に不備な酵母菌株をプラスミドpＵＢＴ1を用いてウラシルプロトトロピーに形質転換した。ＵＢＣ4アンチセンス転写物生産は、単一炭素源としてのグルコースを含む酵母成長培地から単一炭素源としてのガラクトースを含む培地に切り替えることにより誘発された。逆に、ＵＢＣ4アンチセンス転写物生産は単一炭素源としてのガラクトースを含む酵母成長培地から単一炭素源としてのグルコースを含む培地へと切り替えることにより抑制された。
実施例５：ＧＡＬ1プロモーターからのセンスＵＢＣ4ｍＲＮＡ発現
プラスミドpＵＢＴ2（図７）はＵＢＣ4転写物の過剰生産を可能にする。プラスミドpＵＢＴ2で形質転換したubc4欠失菌類の菌株では、炭素源をグルコースからガラクトースへと交換すると、ＵＢＣ4  ｍＲＮＡ発現が増加し、従ってプラスミドコピー数が抑えられるはずである。これは、炭素源の抑制および活性化の間を取り替えることによりプラスミドコピー数の制御を容易にする他の一つの方法である。これはubc4またはＵＢＣ4バックグラウンドのいずれかで行える。
ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329］（１６）またはＵＢ05［pＡＹＥ329］（実施例１）のura3誘導体等の非官能ura3遺伝子の存在に起因するウラシル生合成欠失酵母菌類を、プラスミドpＵＢＴ2を用いてウラシルプロトトロピーへと形質転換した。ＵＢＣ4センス転写物生産は、単一炭素源としてのグルコースを含む酵母成長培地から単一炭素源としてのガラクトースを含む培地に交換することにより誘発された。逆に、pＵＢＴ2からのＵＢＣ4センス転写物生産は、単一炭素源としてのガラクートスを含む酵母成長培地から単一炭素源としてのグルコースを含む培地に交換することにより抑制された。
実施例６：  Saccharomyces cerevisiae  ＵＢＣ4遺伝子の分断は他の組換えヒトタンパク質の生産を増進する。
上記ubc4遺伝子を除去すると、他の異型タンパク質の発現が増進されるはずである。ＵＢＣ4読み取り枠以内に突然変異を有するＤＳ569およびＤＳ1101（実施例７に記載）中の組換えヒトヘモグロビンの発現水準を分析することにより、このことを例証した。ｐＨb Ｄ2-1（図８）と呼称するヒトヘモグロビン発現プラスミドは全２μｍ壊変ベクターpＳＡＣ35に基づいた（１６）。ヒトα−グロビン鎖の転写はＧＰＤ1プロモーター（１９）により指令され、ＰＧＫ1ターミネーターにより終結された。ヒトβ−グロビン鎖の転写はＰＲＢ1プロモーターから指令され、ＡＤＨ1タミネーターにより終結された（１６）。
ｐＨb Ｄ2-1を用いてロイシンプロトトロフィーへと形質転換された酵母菌株ＤＳ569およびＤＳ1101のｒＨb生産性を１０ｍＬ震盪フラスコ培養液中で評価した。リン酸ナトリウム／クエン酸ｐＨ６．０で緩衝し、かつ２％（ｗ／ｗ）グルコースを含むＹＮＢ最少培地中に酵母を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで３日間保温した。酵母溶解性細胞抽出物におけるｒＨｂ生産性を、既知濃度の標準ＨｂＡと比較して、第２微分スペクトル（derivative spectrum）のソーレー（Soret）ピーク高さから分光光度検定により定量化した。全可溶性タンパク質濃度はメーカー（Pierce）の指示に従ってクーマシータンパク質検定試薬により定量化した。ＤＳ569［ｐＨｂＤ2-1］中の可溶性ｒＨｂの発現水準は０．４％（ｗ／ｖ）全可溶性タンパク質に等しいと計算された。可溶性ｒＨｂの発現水準はubc4失欠を有するＤＳ1101［pＨb Ｄ2-1］菌株中で０．８％（ｗ／ｖ）に増加した。
実施例７：  Saccharomyces cerevisiae  ＵＢＣ4遺伝子の突然変異
上記のように、初期の突然変異は無作為化学的突然変異誘発により生じた。この方法の出発菌株はＤＳ569［pＡＹＥ329］（１６）であった。ＤＳ569［pＡＹＥ329］を、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）および特許ＥＰ第431880号記載のプレート選別手順により選択した潜在ｔＨＡ過剰発現突然変異体菌株による化学的突然変異誘発に処した。ＤＳ569［pＡＹＥ329］およびＤＳ1101［pＡＹＥ329］のｒＨＡ生産性の分析は、実施例２記載のような１０ｍＬ震盪フラスコ培養液中で遂行した。このｒＨＡ生産性はＨＳＡ標準（２５−１５０μｇ／ｍＬ）に対するロケット免疫電気泳動により推定した。これらの条件下でのＤＳ569［pＡＹＥ329］のｒＨＡ生産性は約４５ｍｇ／Ｌ計算され、一方、同一条件下に測定したＤＳ1101［pＡＹＥ329］のｒＨＡ生産性は７８／Ｌと計算された。
酵母菌株ＤＳ569［pＡＹＥ329］およびＤＳ1101［ｐＡＴＥ329］のハイブリッド２μｍプラスミドのプラスミドコピー数は実施例３記載のように、１００ｍＬ震盪フラスコ培養液中で評価した。ｒＤＮＡコピー数と比較したハイブリッド２μｍプラスミドコピー数の定量は同時ｒＤＮＡ／ＨＳＡ  ｃＤＮＡプローブを用いたサザンプロッテイング分析により遂行した。これによれば、ハイブリッド２μｍプラスミドｐＡＹＥ329のコピー数はＤＳ569［PＡＹＥ329］における半数体ゲノム当たり４８．９±９．２からＤＳ1101［pＡＹＥ329］における半数体ゲノム当たり７０．５±１５．９へと増加した。
プラスミドコピー数の増加およびＤＳ1101［pＡＹＥ329］において観察されたｒＨＡ生産性に責任があった初期突然変異の性質を確認し得るために、セントロメアベクターＹＣp50中のＤＳ569高分子量ゲノムＤＮＡから部分Ｓau3  ＡゲノムＤＮＡライブラリーを調製した（３０）。新規酵母菌株ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329］を実施例１記載の方法によりＤＳ1101［PＡＹＥ239］から調製した。ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329］をＤＳ569ＹＣp50ゲノムライブラリーからのＤＮＡを用いてウラシルプロトトロピーへと形質転換した。これらの形質転換細胞を、ＥＰ第431880号公報記載の抗ＨＳＡ抗体依存プレート選別手順により低減したｒＨＡ発現について検定した。一つの単離物ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/pＡＹＥ792］を識別したが、このものは１０ｍＬ震盪フラスコ中で検定したところ低減したｒＨＡ生産性を示した。リン酸ナトリウム／クエン酸ｐＨ６．０で緩衝し、かつ２％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＹＮＢ（Difco）最少限培地中に酵母を接種し、次いで３０℃、２００ｒｐｍで３日間保温した。このｒＨＡ生産性をＨＳＡ標準に対するロケット電気泳動により推定したところ、ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp50］対照に比べて減少したことが判明したが、ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp50］対照とは類似していた。酵母菌株ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp50］、ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp792］、ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp50］およびＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/ＹＣp792］のハイブリッド２μｍプラスミドのプラスミドコピー数は実施例３記載のように１００ｍＬ震盪フラスコ培養液中で評価した。ｒＤＮＡのコピー数と比較したハイブリッド２μｍプラスミドコピー数の定量は同時ｒＤＮＡ／ＨＳＡ  ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析により遂行した。これによれば、ハイブリッド２μｍプラスミドｐＡＴＥ329のプラスミドコピー数はＤＳ1101 ura3［p/ＡＹＥ329/ＹＣp50］中の半数体ゲノム当たり５９．４±６．０からＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/pＡＹＥ792］中の半数体当たり３８．３±１．３コピーへと減少したが、ＤＳ569 ura3［pＡＴＥ329/ＹＣp50］およびＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329/pＡＹＥ792］中では半数体ゲノム当たりそれぞれ３３．０±５．３および２７．５±４．５コピーで変化せずに残ることを示した。
上記pＡＹＥ792セントロメアプラスミドＤＮＡを菌株ＤＳ1101 ura3［pＡＹＥ329/pＡＹＥ792］（３１）からＥ．coli中に単離し、ＤＮＡ配列決定した（図９）。これによると、このプラスミドｐＡＹＥ792はＵＢＣ4、ＴＥＣ1およびＭ1 Ｓ1遺伝子を取り込んだ領域に広がる、Saccharomyces cerevisiae（３２）の染色体ＩＩからの近接９．０５ｋｂゲノム挿入断片を含むことが判った。上記三つの個々の遺伝子を引き続いてサブクローニングすることによりＵＢＣ4遺伝子は、低減されたｒＨＡ生産性に対して責任があり、かつ菌株ＳＤ1101 ura3［ｐＡＹＥ329／ｐＡＹＥ792］中のpＡＹＥ792と関連した、低減されたプラスミドコピー数に対して責任があることを示した。
ＤＳ569のＮＹＧ突然変異誘発によりＤＳ1101中に導入された突然変異の性質を確認するために、ＤＳ1101からのＵＢＣ4遺伝子をＰＣＲで単離した。２．１ｋｂ  ＵＢＣ4ゲノムＰstＩフラグメント（図３）のＰＣＲ増幅に適する二つの単一鎖オリゴヌクレオチドプライマー（ＵＢＣ4ＡおよびＵＢＣ4Ｂ）を、ＡＢＩ  380Ｂ  ＤＮＡ Synthesiserを用いて調製した。
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文献３０に従ってＤＳ1101から調製した高分子量ゲノムＤＮＡからのＵＢＣ4遺伝子を増幅するためにＰＣＲ反応を遂行した。条件は次のようである：５０ｎｇ／ｍＬから０．５ｎｇ／ｍＬのＤＳ110ゲノムＤＮＡ、各プライマーの２μＭ、９４℃で３０秒の変性、５０℃で４０秒のアニール、７２℃１２０秒、４０サイクルの拡張、続く７２℃６００秒のソーク、続く４℃ソーク、AmpliTaq Thermal Stable  ＤＮＡポリメラーゼを用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-CetusＰＣＲキット、全反応容量５０μｌ、メーカーの指示に従う。増幅した２．１ｋｂＤＮＡ生成物をBeneclean III  ＤＮＡ抽出キット（Bio 101 Inc., 1070 Joshua Way, Vista, Ca 92083, USA）によりＴＡＥアガロースゲル電気泳動により精製し、ＰstＩを用いて完全に消化した。このプラスミドpＢＳＴ＋（図１０）はpＢＳ＋をＥcoＲＩおよびＨind IIIで消化してフアージミド（phagemid）pＢＳ＋（Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA）から調製した。単離した直鎖ベクターを次の配列を有する二重鎖オリゴヌクレオチドリンカーを用いて連結させた：
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プラスミドpＢＳＴ＋をＰstＩで直鎖化し、ＰstＩで連結させ、ＰＣＲ増幅し２．１ｋｄ  ＵＢＣ4ＤＮＡ生成物を消化してｐＤＢ2258、pＤＢ2259、pＤＢ2260、およびPＤＢ2261と呼称する四つの別々のプラスミド単離体を生成させた（図１１−１４）。全ての四つのプラスミド（ＤＳ1101由来）のＰstＩ挿入断片およびpＡＴＥ792（ＤＳ569由来）から単離されたＵＢＣ4遺伝子をＤＮＡ配列決定に処した。このＤＮＡ配列分析によれば、ＤＳ1101 ＵＢＣ4遺伝子以内での突然変異が明瞭になった。ＧのＡ置換への上記突然変異は１０番目コドンに位置し、次のＤＮＡ配列を有していた：
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この突然変異は、１０番目のアミノ酸であるグルタミン酸がリシンへと変化したＧｌｕ１０Ｌｙｓと呼称される突然変異であった。
ＵＢＣ4遺伝子のこの突然変異形態は、または実際の所、Ｕbc4遺伝子のいずれの突然変異形態でも、実施例１に既に記載したように内因性Saccharomyces cerevisiae ＵＢＣ4遺伝子のCaenorhabditis elegans ubc-2遺伝子（３６）による置換の場合についての文献既知の類似法により、ＵＢＣ4遺伝子がＵＲＡ3により既に分断されている場合のいずれの菌株中へも導入できる。プラスミドｐＤＢ2258、pＤＢ2259、pＤＢ2260またはPＤＢ2261（図１１−１４）のいずれかからの２．１ｋｂ  ＰstＩフラグメントを用い、かつ５−フルオロ−オロン酸（１８）に対する抵抗性によるＵra-酵母の選択により、上記酵母菌株ＵＢ05（実施例１）をura3（Ura-）へと形質転換した。この培地上に成育し得るコロニーを精製し、ウラシル補給が無い場合には成育し得なかったことを証明するため、および上記欠失が形質転換によるＵＲＡ3の導入により補足され得たことを証明するために試験した。ＵＢ05中のＵＢＣ4遺伝子配座からのＵＲＡ3遺伝子の除去およびＵＢＣ4遺伝子のＧｌｕ10Ｌｙｓ突然変異形態によるその置換をサザンブロットにより確認した。
実施例８：  Saccharomyces cerevisiae  ＵＢＣ5遺伝子の分断
Saccharomyces cerevisiae  ＵＢＣ5遺伝子は染色体ＩＶ上に位置する。ＵＢＣ5遺伝子のＤＮＡ配列を図１５に示す。
ＵＢＣ5読み取り枠の全てが欠失したＩＢＣ5遺伝子を遺伝子分断法（１４）により突然変異させ、これにより、活性Ｉbc5タンパク質の生産を阻害した。これは、ＵＢＣ5読み取り枠中に領域５’および３’と同じＤＮＡ配列を含めるようにＵＲＡ3遺伝子の５’および３’末端が修飾された突然変異一本鎖ＤＮＡプライマーを用いて、適当なマーカー遺伝子（ＵＲＡ3）をＰＣＲ法により先ず増幅し、次いでｕｒａ3栄養要求性酵母菌株をウラシルプロトトロフイーへと形質転換することにより達成した。
その両末端にＵＢＣ5配列を取り込んだ、ＵＲＡ3遺伝子の５’および３’末端のＰＣＲ増幅に適する二つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー（ＵＢＣ5ＵＲＡ1およびＵＢＣ5ＵＲＡ2）は「ＡＢＩ380Ｂ  ＤＮＡ Synthesister」を用いて合成した。
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プラスミドＹＥp24（１５）からのＵＲＡ3遺伝子を増幅するためにＰＣＲ反応を行った。条件は次のようである：１μｍプラスミドＹＥp24ＤＮＡ、各プライマーの２μＭ、９４℃で３０秒の変性、４５℃で４０秒のアニール、７２℃、１２０秒、２０サイクルでの拡張、続く７２℃６００秒のソーク、続く４℃ソーク、ならびにAmpliTaq Thermal Stable  ＤＮＡポリメラーゼを用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus  ＰＣＲキット、全反応容量５０μｌ、メーカーの指示に従う。別途の条件は、２μｍ／ｍＬプラスミドＹＥp24ＤＮＡ、各プライマーの０．１μＭ、９４℃で３０秒の変性、５５℃で４０秒のアニール、７２℃で１２０秒３０サイクルの拡張、続く７２℃で６００秒のソーク、続く４℃ソーク、AmpliTaqThermal Stable ＤＮＡポリメラーゼを用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキット、全反応用量５０μｌ、メーカーの指示に従う。生成物５’−ＵＢＣ5−ＵＲＡ3−ＵＢＣ5−３’をゲル電気泳動により分析したところ、期待の大きさである約１．２ｋｂであることが判った。この増幅ＰＣＲ生成物をメーカーの指示に従ってPromega Wizard ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
ＤＳ 569 ura3［pＡＹＥ329］を、５’−ＵＢＣ5−ＵＲＡ3−ＩＢＣ5−３’ＰＣＲ生成物を用いてウラシルプロトトロピーへと形質転換した。多数の形質転換細胞の消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを０．５ｋｂＭluＩ−Ａsp 718 ＤＮＡフラグメントとしてのＵＢＣ5遺伝子を用いプローブし、ＵＢＣ5遺伝子の分断を確認した。この新規菌株をＵＢ1［ｐＡＹＥ329］と命名した。
ＵＢＣ5遺伝子を分断するための別法では、ＵＢＣ5の５’および３’末端に相当する部分をＰＣＲ法によりクローン化した。ＵＢＣ５遺伝子（ＤＳ101およびＤＳ102）の５’末端およびＵＢＣ5遺伝子（ＤＳ103およびＤＳ104）の３’末端のＰＣＲ増幅に適する一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーの二つの対は「ＡＢＩ 380Ｂ  Synthesister」を用いて合成した。
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ＵＢＣ5遺伝子の５’末端を増幅するためにＰＣＲ反応を遂行した。条件は次のようあった：１０００−１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ288 ＣゲノムＤＮＡ、２μＭ ＤＳ101プライマー、２μＭ  ＤＳ102プライマー、９４℃３０秒変性、３７℃３０秒アニール、７２℃６０秒３０サイクルの拡張、次いで７２℃６００秒間のソーク、次いで４℃でソーク、AmpliTaq Thermal Stable  ＤＮＡポリメラーゼを用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus  ＰＣＲキット、全反応用量５０μｌ、メーカーの指示に従う。生成物５’−ＵＢＣ5をゲル電気泳動で分析したところ、期待の大きさ２２９ｂｐであることが判った。増幅ＰＣＲ生成物はPromega Wizard  ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キットを用いてメーカーの指示に従って精製した。
ＵＢＣ5遺伝子の３’末端を増幅するためにＰＣＲ反応を遂行した。条件は次のようあった：１０００−１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ288 ＣゲノムＤＮＡ、２μＭ  ＤＳ103プライマー、２μＭ  ＤＳ104プライマー、９４℃３０秒変性、３７℃３０秒アニール、７２℃60秒３０サイクルの拡張、続く７２℃で６００秒間のソーク、次いで４℃でソーク、AmpliTaq Thermal Stable  ＤＮＡポリメラーゼを用いたPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus  ＰＣＲキット、全反応容量５０μｌ、メーカーの指示に従う。生成物３’−ＵＢＣ5をゲル電気泳動で分析したところ、期待の大きさ３２７ｂｐであることが判った。
この５’−ＵＢＣ5ＤＮＡフラグメントをＮotＩおよびＳalＩを用いて完全に消化し、フエノール／クロロホルムで抽出し、ＮotＩ／ＳalＩで直鎖化してホスフアターゼ化したpＢＳＴ＋中にクローン化してプラスミドｐＤＢ2262（図１６）を生じさせた。この３’−ＵＢＣ5ＤＮＡフラグメントをＮheＩおよびＨindＩＩＩを用いて完全消化し、フエノール／クロロホルム抽出し、ＮheＩ／ＨindＩＩＩで直鎖化してホスフアターゼ化したpＢＳＴ＋中にクローン化してプラスミドｐＤＢ2264（図１７）を生じさせた。このｐＤＢ2262およびpＤＢ2264のＤＮＡ挿入断片を配列決定して識別した。プラスミドpＤＢ2264をＨindＩＩＩ／ＮheＩを用いて完全消化し、次いでＵＢＣ5の３’末端に相当する327フラグメントを単離し、ＨindＩＩＩ／ＮheＩで直鎖化してホスフアターゼ化したｐＤＢ2262中にクローン化した。ｐＤＢ2275と呼称する生成プラスミドはユニークＨindＩＩＩ部位（図１８）により分離された、ＵＢＣ5遺伝子の５’および３’末端を含んでいた。１．２ｋｂＨindＩＩＩフラグメントとして単離された全ゲノムＵＲＡ3遺伝子を、ＨindＩＩＩで直鎖化てホスフアターゼ化したｐＤＢ2275中にクローン化し、プラスミドpＤＢ2276（図１９）およびpＤＢ2277（図１）生成させたが、これらはＵＲＡ3マーカー遺伝子の配向により互いに僅かに異なるだけであった。
ＤＳ569 ura3［pＡＹＥ329］を、１．７ｋｂ  ＭluＩ−ＸbaＩフラグメントとしてのｐＤＢ2276またはpＤＢ2277のいずれかから単離した５’−ＵＢＣ5-ＵＲＡ3−ＵＢＣ5−３’分断フラグメントを用いてウラシルプロトトロピーへと形質転換した。これらの酵母形質転換細胞のｒＨＡ生産性を１０ｍＬ震盪フラスコ培養液中で評価した。酵母を、リン酸ナトリウム／クエン酸ｐＨ６．０で緩衝し、かつ２％ｗ／ｖグルコースを含むＹＮＢ（Difco）最少限培地中に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで３日間保温した。このｒＨＡ生産性を、ＨＳＡ標準（２５−１５０μｇ／ｍＬ）に対するロケット免疫電気泳動を用いて推定した。これらの条件下でのＤＳ569［pＡＹＥ329］のｒＨＡ生産性は約４０ｍｇ／Ｌであると計算され、一方、同時に測定したｐＤＢ2276およびpＤＢ2277形質転換細胞の幾つかのｒＨＡ生産性はＤＳ569［pＡＹＥ329］の生産性よりも大きな水準まで増加し、約６０ｍｇ／Ｌであると計算された（図２）。
文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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