(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的に伸長反応させた後、サイバー（登録商標）グリーンIを作用させて、オリゴヌクレオチドに標識されている１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔとの蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより塩基多型を同定する方法。
【請求項２】
長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に蛍光共鳴エネルギー移動を測定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法において、以下の１〜３の行程を含むことを特徴とする方法。
１）長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的に伸張反応を行う。
２）伸張生成物を変性させ１本鎖にした後、伸張生成物に相補的なオリゴヌクレオチドを作用させ、伸張反応を行い２本鎖核酸を生成させる。
３）サイバー（登録商標）グリーンＩを作用させオリゴヌクレオチドに標識された１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔとの蛍光共鳴エネルギー移動およびサイバーグリーンＩの蛍光信号を測定する。
【請求項４】
請求項３記載の行程１及び２を繰り返して、増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定をすることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキットであって、次の（１）〜（３）の特徴を有するキット。
（１）長さが１６〜３０塩基である野生型オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドの両方を含み、かつ、該野生型オリゴヌクレオチド及び該変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔで標識され、前記オリゴヌクレオチドが野生型または変異型に多型特異的に作用する。
（２）ポリメラーゼを含む。
（３）サイバー（登録商標）グリーンIを含む。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸配列の変異または多型の同定方法に関する。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)法（特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００７】
また最近開発された検出方法は、プローブのハイブリッド形成の検出に蛍光強度を直接検出するのではなく、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FＲET)の方法を利用している。蛍光共鳴エネルギー移動は、ドナー蛍光体と消光剤色素(蛍光体でも、蛍光体でなくてもよい。)の間で発生し、一方(消光剤)の吸収スペクトルがもう一方(ドナー)の発光スペクトルとオーバーラップし、この2つの色素が近接したときに発生する。これらの特性を有する色素は、ドナー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれる。ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、共鳴双極子により引き起こされる双極子相互作用により、近くの消光剤に移動される。その結果、ドナー蛍光体の消光が起こる。場合によっては、消光剤も蛍光体の場合、その蛍光強度が増強されることもある。エネルギー移動効率は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、これらの関係を予測する式がForster(1948. Ann. Phys.2, 55-75)により開発されている。エネルギー移動効率が50％であるドナーと消光剤色素の距離はForster距離(Ro)と呼ばれる。蛍光消光の機序として他に、例えば、電荷移動消光および衝突消光等がある。
【０００８】
近接する2つの色素の相互作用により消光を引き起こすことに基づくエネルギー移動とその他の機序は、均一方式で実施できるため、ヌクレオチド配列を検出または同定する魅力的な手段である。均一分析方式は、1つの蛍光体標識の蛍光の検出に基づく従来のプローブハイブリッド形成分析法よりも簡単である。なぜならば、一般に、不均一分析はハイブリッド形成していない遊離標識からハイブリッド形成した標識を分離する更なるステップを必要とするからである。
【０００９】
典型的には、FＲETおよび関連方法は、2つの相補的オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成により結合された時に、一方または両方の色素標識の蛍光特性の変化を監視することに基づくものである。この方式において、蛍光特性の変化は、エネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光量の変化として測定され、典型的には、一方の色素の蛍光強度の増加として示される。この方法においては、ハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを分離せずに、目的のヌクレオチド配列を検出することが可能である。一方はドナー蛍光体で、もう一方は消光剤で標識された2つの別々の相補的オリゴヌクレオチドの間でハイブリッド形成を生じることができる。この時一方のオリゴヌクレオチドを塩基多型特異的配列を有する場合多型特異的にＦＲＥＴシグナルが得られることで塩基多型の同定が可能となる。
【００１０】
FＲETハイブリッド形成分析法に関する幾つかの方式が、Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992. Academic Press, Inc., pags. 311-352)に概説されている。あるいは、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成していない場合と、相補的配列とハイブリッド形成した場合とで、一方または両方の蛍光特性に検出可能な差が生じるように、ドナーと消光剤を1つのオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
【００１１】
この方式においては、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成するとドナー蛍光は増加し、エネルギー移動/消光は減少する。例えば、両端に標識された自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成すると、これによって2つの蛍光体(即ち、5'末端と3'末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。自己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの中の相補的配列がハイブリッド形成すると、ヘアピン構造は破壊され、2つの色素間距離が拡大するため消光は減少する。ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。
【００１２】
TyagiおよびKramer(1996.Nature Biotech.14, 303-308)は、ステムを形成するヘアピン構造の自己相補的アームの間のループ中に検出配列を含む上記の様に標識されたヘアピン構造を報告している。塩基対合したステムは、検出配列が標的とハイブリッド形成し、消光の減少を引き起こすためには融解しなくてはならない。「二重ヘアピン」プローブとそれを利用する方法が、B. Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国特許No.5,607,834)に報告されている。これらの構造はヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、従って、標的とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハイブリッド形成が関与している。Bagwellは、ミスマッチによりヘアピン構造を不安定化させることにより、不利なハイブリッド形成速度論の問題を解決している。
【００１３】
標的結合配列に塩基多型特異的配列を選択することでこの方法を用いて塩基多型の同定が可能であるが、一般的に１塩基の違いをオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション法により見分けるためには厳密なハイブリダイゼーション条件の設定が必要となる。
【００１４】
核酸増幅を検出するためにエネルギー移動またはその他の蛍光消光の機序を利用する均一方法も報告されている。L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res.21, 3761-3766)は、PCR中に標的増幅に特異的に二重標識検出プローブが切断されるリアルタイム検出方法を開示している。検出プローブが増幅プライマーの下流でハイブリッド形成されると、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が検出プローブを消化し、エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素を分離する。
この方法においても二重標識検出プローブを塩基多型特異的プローブとすることで塩基多型の同定が可能である。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、従来の方法では操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難であり、その為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
【００１６】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。
【００１７】
またＦＲＥＴを用いた方法は均一分析が可能であり過剰なプローブの除去等が不必要で検出が容易になっているが、各多型特異的に、異なる標識を付与した２本のオリゴヌクレオチドプローブが必要であったり、２重標識プローブが必要である。
【００１８】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、該標識と核酸特異標識との相互作用を測定することで、煩雑な検出操作や高価な標識プローブを多数必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］  試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、該標識と核酸特異標識との相互作用により塩基多型を同定する方法。
［２］  核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］  核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする［１］及び［２］に記載の方法。
［４］  オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする［１］〜［３］に記載の方法。
［５］  相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［１］〜［４］に記載の方法。
［６］  少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［１］〜［５］記載の方法。
［７］  試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、多型特異的に伸長反応を行った後、伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、該オリゴヌクレオチドの標識と該核酸特異的標識の相互作用により、塩基多型を同定する方法。
［８］  核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］  核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする［７］及び８に記載の方法。
［１０］  オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする［７］〜［９］に記載の方法。
［１１］相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［７］〜［１０］に記載の方法。
［１２］試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする［７］〜［１１］に記載の方法。
［１３］少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［７］〜［１２］記載の方法。
［１４］  試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法において、以下の工程、
１）少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして作用させ、伸長反応を行う。
２）伸長生成物を変性させ１本鎖にした後、伸長生成物に相補的なオリゴヌクレオチドを作用させ、伸長反応を行い２本鎖核酸を生成させる。
３）２本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、該蛍光色素とオリゴヌクレオチドの標識との相互作用及び核酸特異標識の蛍光信号を測定する。
を含むことを特徴とする方法。
［１５］  相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１６］  試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする［１４］〜［１５］に記載の方法。
［１７］  工程１及び２を繰り返して、増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［１４］〜［１６］記載の方法。
［１８］  少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、核酸特異標識を含む試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキット。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ(Angiotensin I
Converting Enzyme)遺伝子が挙げられる。
【００２２】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。
【００２３】
本発明において、野生型オリゴヌクレオチドと変異型オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。
【００２４】
本発明において、野生型用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、変異型用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本発明に用いられる上記オリゴヌクレオチドは、野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端から２番目のヌクレオチドが変異型配列のヌクレオチドと対応するように設計された。このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３' 末端もしくは３’末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
【００２６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基であり、上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在する。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
【００２７】
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
【００２８】
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
【００２９】
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００３０】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチドが伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。
【００３１】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００３２】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research  第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。
【００３３】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００３４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時にに用いて遺伝子増幅法を行う。
【００３５】
野生型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００３６】
本発明においては、標識オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション法にも利用できる。すなわち、標的核酸に対し、多型特異的及び野生型特異的オリゴヌクレオチドを用意して、各オリゴヌクレオチドを同時及びまたは別々に作用させて、各オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異的標識との相互作用を検出することで、塩基多型の同定が可能である。更には上記多型特異オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションを行う外側の配列をプライマーとして用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行いながらもしくはその後に上記多型特異プローブを作用させることで塩基多型の同定が可能である。
【００３７】
本発明において、オリゴヌクレオチドの標識は核酸特異標識と相互作用を起こす標識であれば何でもよく、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等があるがこの限りではない。
【００３８】
本発明において核酸特異標識物質は標識オリゴヌクレオチドが反応行った核酸に特異的に結合し、該オリゴヌクレオチドの標識と相互作用すれば何でもよく、好ましくは２本鎖核酸に特異的な標識が好ましい。２本鎖特異標識としては２本鎖にインターカーレートするサイバーグリーンＩ、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。
【００３９】
酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。  蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
放射性物質としては、32Ｐ、35Ｓなどが挙げられる。  発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００４０】
該標識は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５' 部位である。
野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、１回で検出が可能である。
【００４１】
キット
本発明において、キットとしては、野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットを含むものである。
増幅によって検出する場合には、更に、リバースオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  β3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)の検出
（１）β3 adrenergic receptor遺伝子の190番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜3に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜3と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア  バイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１は3'末端から2番目に野生型(T)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ2は3'末端から2番目に変異型(C)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ３がアンチセンス鎖であり、オリゴ１、2と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必要により標識して使用される。
【００４４】
（２）PCR法によるβ3 adrenergic receptor遺伝子多型の解析
▲１▼ PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトβ3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)を解析した。
【００４５】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１および／または２
(オリゴ1は5'をTexas  Redにより標識、オリゴ2は未標識)     5 pmol
オリゴ3 (未標識)                                         5 pmol
×10緩衝液                          2.5 μl
2mM dNTP                             2.5 μl
25 mM  MgCl2                         1.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ                  1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                           100 ng
【００４６】
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
▲２▼ FRETによる検出
▲１▼の増幅反応液5μlを Syber GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって、増幅されたヒトβ3 adrenergic receptor 遺伝子断片中にSyber Green Iが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。
所要時間は数分であった。
【００４７】
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
［式１］        FL１（試料の蛍光強度）＝FLb1-FLs1
FLｂ1：Negative Control （試料が未添加）の励起波長:355/蛍光波長612における蛍光強度
FLｓ1：各試料の励起波長:355/蛍光波長612における蛍光強度
［式２］        FL２（試料の蛍光強度）＝FLb2-FLs2
FLｂ2：Negative Control （試料が未添加）の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
FLｓ2：各試料の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
【００４８】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【００４９】
【配列表】
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【００５０】
0004310675.tif 000003
【００５１】
0004310675.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】β3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型の検出における各試料の蛍光強度
【図１】
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