(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列番号２、
配列番号２：
0004295358.tif 000003
に示されたアミノ酸配列からなる、繊毛虫類から得ることのできるカテプシンＬのプレプロ型。
【請求項２】
繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）である、請求項１に記載のプレプロ型タンパク質。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれか１項に記載されたプレプロ型タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
下記配列番号１、
配列番号１：
0004295358.tif 000004
に示されたＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
請求項４に記載されたＤＮＡの、第１番目から第８６番目の塩基に対応する前配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４に記載されたＤＮＡの、第２１番目から第８６番目の塩基に対応する、コーディング前配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】
すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてグルタミンをコードするコドンに置換された、請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
１番から２２番アミノ酸に対応する請求項５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１１】
第８７番目から第３４７番塩基に対応する、請求項４に記載のＤＮＡのプロ領域からなるＤＮＡ。
【請求項１２】
すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてグルタミンをコードするコドンに置換された、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
２３番から１０８番アミノ酸に対応する、請求項５に記載のアミノ酸配列のプロペプチド。
【請求項１５】
請求項５に記載の１１０番から３１４番アミノ酸を有する、繊毛虫類から得ることのできるカテプシンＬ。
【請求項１６】
繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）である、請求項１５に記載のカテプシンＬ。
【請求項１７】
請求項４に記載の、第３４８番から第１２７６番塩基に対応するＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項４に記載のＤＮＡの第３４８番から第９６５番塩基に対応するコーディングＤＮＡ。
【請求項１９】
すべてのＴＡＡコドンが、対応する発現系においてグルタミンをコードするコドンに置換された、請求項１７及び請求項１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
すべてのＴＡＡコドンが、ＣＡＡコドンに置換された、請求項１９に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
繊毛虫類を適当な培地で培養し、それに続いてカテプシンＬを単離することを特徴とする、請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載されたカテプシンＬを製造する方法。
【請求項２２】
カテプシンＬが繊毛虫類細胞から単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カテプシンＬが培養液から単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
繊毛虫がゾウリムシである、請求項２１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
繊毛虫がパラメシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
薬剤として用いるための、請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載されたカテプシンＬ。
【請求項２７】
傷を治療する薬剤を製造するための、請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載されたカテプシンＬの使用。
【請求項２８】
請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載されたカテプシンＬを含む、傷用軟膏。
【請求項２９】
カテプシンＬ阻害剤を同定するための、請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載されたカテプシンＬの使用。
【請求項３０】
薬剤として用いるための、請求項１４に記載されたカテプシンＬプロペプチド。
【請求項３１】
炎症性疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項１４に記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。
【請求項３２】
転移性腫瘍を治療する薬剤を製造するための、請求項１４に記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。
【請求項３３】
寄生性原生動物による感染を治療する薬剤を製造するための、請求項１４に記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。
【請求項３４】
骨粗しょう症を治療する薬剤を製造するための、請求項１４に記載されたカテプシンＬプロペプチドの使用。
【請求項３５】
請求項４に記載のＤＮＡを用い、異種発現系においてカテプシンＬを発現することを特徴とする、請求項１５及び請求項１６のいずれか１項に記載された、カテプシンＬを調製する方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載のＤＮＡを用い、異種発現系においてカテプシンＬプロペプチドを発現することを特徴とする、請求項１４に記載された、カテプシンＬを調製する方法。
【請求項３７】
発現系が大腸菌である、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項４または請求項１１に記載のＤＮＡが、熱誘導性ベクターを用いて大腸菌に導入される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
リーダー配列が、繊毛虫類の分泌される組換え発現型ペプチドまたはタンパク質のためのシグナルとして働く、請求項１０に記載のリーダー配列に翻訳するための、請求項６及び請求項７のいずれか１項に記載の前配列の使用。
【請求項４０】
カテプシンＬを阻害する薬剤を製造するための、請求項１４に記載のカテプシンＬプロペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明はカテプシンＬのプレプロ型（prepro form）、およびそのリーダー配列、およびカテプシンＬ、ならびに繊毛虫類、特にゾウリムシ由来のプロペプチドの単離、およびこれらのペプチドの利用、ならびに繊毛虫類からのカテプシンＬの調製法に関連するものである。
異なるプロテアーゼのプロペプチドがプロテアーゼであるチモーゲン（zymogens）の活性化によって自由になると、プロテアーゼ阻害剤として機能することができるという発見が知られている。たとえば、切断が起こると、緑膿菌エラスターゼのプロペプチドはエラスターゼに結合し、そのためこの酵素の不活性が起こる（ケスラー（kessler）とサフリン（Safrin）,1994,J.Biol.Chem.,269,22726）。パパインとパパイヤプロテイナーゼIVのプロペプチドは、成熟型パパイヤプロテアーゼ、およびラット肝の類似のB型ならびにL型カテプシンの阻害剤として選択的に働く（テイラー（Taylor）ら,1995,Biochem.Soc.Trans.,23,80）。他のカテプシンのプロペプチドもまた、プロテアーゼの阻害剤として働く。したがって、合成によって得られたヒトプロカテプシンＤのプロペプチドは、ウシのカテプシンＤを阻害する（ヴァクナー（Vagner）ら、1993,Collect.Czech.Chem.Commun.,58,435）。
プロテアーゼであるカテプシンＬは、さまざまな症候群とにおいて重要な役割を果たす。第一に、この酵素はおそらく腫瘍の侵潤および転移の形成に決定的な重要性をもつだろう（パイク（Pike）、1991、Sissertain Abstr.Intern.,53,4645）。このプロテアーゼはまた、宿主組織への病原性細菌または寄生性原生動物の侵入にも関与することができる。カテプシンＬまた、骨基質の分解にも関与している。したがってこの酵素は、骨粗しょう症の治療と関連して価値のある対象であることは明らかである（Pharma Japan,Sep.1995,1468,23）。
最後に、カテプシンＬはまた、関節炎などの炎症性疾患の発達にも関与することに言及することができる。
適当なカテプシンＬ阻害剤の同定は、前記諸疾病の治療に適した製剤の開発において、重要な段階を意味すると言ってよいだろう。さらに、比較的大量のカテプシンＬを単離するための適当な原料を持つことは、非常に有利であろう。これは、本酵素を適当なプロテアーゼ阻害剤を見つけるための、スクリーニング系に利用できる可能性があるからである。これに加えて、たとえば壊死性組織の分解を促進することが可能である、傷用の軟膏にも用いることが可能である。
したがって、本発明は繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）から得ることができるカテプシンＬプレプロ型に関連し、またそのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関連するものである。
本発明はさらに、繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシウム・テトラウレリア（Paramecium tetraurelia）由来のカテプシンＬ、およびそれに付随するＤＮＡ配列に関連し、また繊毛虫類からのその調製法、ならびに傷の治療薬を製造するためのその使用に関連するものである。
本発明によるカテプシンＬはさらに、たとえばいわゆる分子モデリングによって適当な阻害剤を同定するために用いることもできる。
さらに、本発明は繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシウム・テトラウレリア由来のカテプシンＬプロペプチドおよびそのＤＮＡ配列を提供する。
繊毛虫類由来のカテプシンＬプロペプチドは、このカテプシンＬの非常に特異的な阻害剤であり、そのため炎症性疾患、転移性腫瘍、細菌感染、寄生性原生動物による感染、または骨粗しょう症のための治療薬を製造するために適している。
本発明はさらに、繊毛虫類、好ましくはゾウリムシ、さらに好ましくはパラメシウム・テトラウレリア由来のカテプシンＬのリーダー配列、またはシグナル配列に対応した前配列（presequence）を提供し、その前配列は、組換え体ペプチドまたはタンパク質が発現される際に、対応するリーダー配列、またはシグナル配列に翻訳され、その結果、繊毛虫類細胞由来の組換え体発現ペプチドまたはタンパク質が分泌される。
本発明は次の部分と、実施例を助けとして明示されるものである。
本研究は、まず第一に繊毛虫類ゾウリムシ（原生生物）由来のカテプシンＬサブファミリーの、２種類のプロテアーゼの単離について述べるものである。クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列決定により、すでに報告されている哺乳動物と原生生物由来のカテプシンＬ型との類似性は高くても３０％であるが、特徴的なカテプシンＬモチーフは、プレプロ領域と実際の酵素内両方に存在することが証明されている。プロ領域は、典型的なＥＲＦＮＩＮモチーフを示す、８６アミノ酸からなる部分をコードする。プロ領域は大腸菌内で発現された。単離したプロペプチドは、ゾウリムシのカテプシンＬを効果的に（ナノモル領域で）阻害した。それとは対照的に、他のシステインプロテアーゼ、たとえばパパインや哺乳類のＢまたはＧまたはＨ型カテプシンは、プロペプチド濃度が１３μＭであっても阻害されなかった。その結果から、該プロペプチドはカテプシンＬの効果的かつ特異的な阻害剤である。このデータに基づき、上述の症候群の治療における化学的治療法のための、強力かつ高度に特異的な阻害剤を開発することが可能なはずである。
実施例
カテプシンＬアッセイ
32Ｐ-ホスホリラーゼａ（約5x104 cpm/min）を基質として用いた。テスト混合液（30μｌ）には、１０μＭの基質、12ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ7.0）、50μＭ ＥＤＴＡ、10ｍＭ ２−メルカプトエタノール、5ｍＭカフェイン、および6.7μｇのＢＳＡが含まれていた。反応は、３０℃で１０分間インキュベーションしたあと、200μｌのトリクロロ酢酸（２０％ ｗ／ｖ）を添加することによって停止した。沈殿しないペプチドの放射活性は、遠心した後の上清において測定した。１単位の酵素活性は、１分間に１μｍｏｌの32Ｐ-リン酸化ペプチド（phosphopeptide）を遊離する酵素量に対応する。
カテプシンＬの精製
大量培養したパラメシウム・テトラウレリアを原材料として用いた。カテプシンＬは、細胞が酵素を分泌もするため、細胞から得られ、また培養液からも大量に得られる。
すべての精製段階は４℃で行われた。細胞は、フレンチプレスを用いて、50ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ7.0），5ｍＭ ＥＤＴＡ中でホモジナイズされた。細胞残査は遠心で除いた（23,000xg、60分；100,000xg、60分）。上清を、20ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ7.0）で平衡化したＤＥＡＥセファロース▲Ｒ▼カラムにかけた。約半分のプロテアーゼ活性が、素通り画分に溶出された。カラムを250ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。残ったプロテアーゼ活性は450ｍＭのＫＣｌで溶出した。その後、活性画分はセファクリル▲Ｒ▼S-100ＨＲカラムによって精製した。プロテアーゼは約27kDaに溶出された。分取しておいた活性画分は、次にモノＱカラムにかけた。溶出は直線的勾配（100ｍＭ ＮａＣｌから350ｍＭ ＮａＣｌで60ｍｌ）を用いて行った。２種類の活性を持つプロテアーゼ（30kDaと33kDa）は、この段階で分離された。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて検定した。32Ｐホスホリラーゼを基質として用いる場合、２つのアイソザイムの至適ｐＨは6.5であり；至適温度は56℃であった。スルフヒドリルプロテアーゼ特異的阻害剤（たとえばシスタチン、ロイペプチンおよびＴＬＣＫ）は、活性を劇的に低下させた。一方、セリンプロテアーゼ類（アプロチニン）、メタロプロテアーゼ類（ＥＤＴＡ）およびＡｓｐプロテアーゼ類（ペプスタチン）に特異的な阻害剤は、まったく阻害効果を示さなかった。ホスホリラーゼおよびＢＳＡを用いて得られた分解様式から、２種類のプロテアーゼがエンドプロテイナーゼ・アイソザイムであることが示された。
アミノ酸配列決定
タンパク質はＳＤＳゲルからポリビニリドン・ジフルオライド膜に転写され、対応する30kDaおよび33kDaのバンドが切り出された。タンパク質断片の配列決定のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う前に、ＢｒＣＮ（350μｇ｛10μｇのタンパク質）でタンパク質を切断した。配列決定は、アプライドバイオシステムズ・シーケンサーによって行った。30kDaバンドのアミノ末端は：GAEVDWTDNKKVKYPAVKNQであり、一方33kDaバンドのアミノ末端は：
GAEVDXTXNK（Xは不明）であった。BrCN断片の配列決定はまた、同一の酵素タンパク質が、ただ異なったプロセッシングを受けたタンパク質とともに含まれることを示した。この場合、次の配列がいずれのタンパク質からも検出された：
DSAFEYVADNGLAEAKDYPYYASD。ＦＡＳＴＡプログラムを用いた、
ＥＭＢＬ遺伝子バンクの比較では、アミノ末端に関しては既知のタンパク質との対応は見られなかったが；一方で、内側にある24ｍｅｒのペプチドは１９種類の異なるシステインプロテアーゼと明らかな対応を見せた。
カテプシンＬの増幅とサブクローニング
アミノ酸配列決定の結果に基づき、また繊毛虫類のコドン使用率を考慮してオリゴヌクレオチドを調製した。用いたプライマーは：アミノ末端ペプチドGAEVDWDNKKVKから推定されたプライマー１（センス）5’-GCGGGGTACCGGWGCHGAAGTHGAYTGGACWGA-TAAYAARAARG-3’および内部にあるペプチド配列EAKDYPYYから推定されるプライマー２（アンチセンス）5’-TARTANGGRTARTCYTTNGCYTC-3’である。PCRはパーキンエルマー・サーマルサイクラー（30サイクル、94℃、55℃、および72℃、それぞれ１分間）を用いて行った。これらのプライマーを用いて、ゾウリムシｃＤＮＡライブラリーから275bpの断片が増幅された。このＤＮＡ断片の塩基配列決定により、それがカテプシンＬに似ているという明確な証拠が提供された。したがって、ＰＣＲ断片は２つの強く保存された領域GCNGGおよびCGCSWAを含んでいた。275bpの断片を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから1.3kbの挿入断片をもつ２つのクローンが同定された。これらのクローンの塩基配列決定により、それらが計算上の分子質量35,031Daを持つ、313アミノ酸のタンパク質をコードする、同一のオープンリーディングフレーム（open reading frames）を含むことが示された（第２図）。推定されるアミノ酸配列は、エドマン分解によって決定されたものと一致した。
プロペプチド（EX3RX2（V/I）FX2NX3IX3N）において保存されたERFNINモチーフは、この酵素をH型カテプシンまたはＬ型カテプシンと特徴づけるものである。カテプシンＨはエクソ型プロテアーゼとされるにもかかわらず、カテプシンＬは効率的なエンド型プロテアーゼとして分類される。本明細書で述べるプロテアーゼがエンド型プロテアーゼとして同定されたことは、それらが実際にカテプシンＬの一つの型であることを示唆する。異なる哺乳動物型に対するゾウリムシのカテプシンＬの相同性は、高くても３５％である（表１）。テトラヒメナ（Tetrahymena）のシステインプロテアーゼと比較した場合も、相同性はわずか３０％である。
0004295358.tif 000002
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
32Ｐ-標識PCR断片は、対応するクローンについてｃＤＮＡライブラリーをスクリーリングするために用いられた。この方法で同定された２種類のクローンをサザンブロッティング法で分析した。どちらのクローンも同一のプレプロカテプシンＬプロテアーゼをコードしていた。
細菌内でのカテプシンＬプロペプチドの発現
クローン化された遺伝子は、AA-1からAA-86の潜在的プロペプチド領域を含む。オープンリーディングフレームは５つの一般的なTAA終始コドンを含み、これはゾウリムシではＱをコードする。発現される前に、それらは部位特異的突然変異導入法によって、CAA（Ｑをコードする）に変更された。
プロペプチド領域を含むＤＮＡ断片はＰＣＲで増幅し、発現させるために熱誘導性に加えてhexa-Hisタグを含むベクターpEV41Cに導入した。ＰＣＲに用いたプライマーは、5’-AGGTCGTCATATGAATCTTTATGCAAATTGG（センス）、および5’-ATCCTCGAGTCACTTGTATTGGAAGTTAG（アンチセンス）であった。形質転換に続き、プロペプチドは大腸菌株２１３６で発現された。発現は、４２℃で予熱しておいたLBsmp培地を加えることによって誘導した。
集菌した後、細胞をホモジナイズし、細胞残査を遠心で除いた。上清をＮｉアフィニティーカラム（キアジェン（Qiagen）で精製した。タンパク質は、20ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、8.6％グリセロール、200ｍＭ ＮａＣｌおよび500ｍＭイミダゾールで溶出した。予想通り、この条件では13.6kDaのサイズをもつタンパク質が溶出された。
阻害実験では、このプロペプチドは、わずか60ｎＭの濃度で50％までゾウリムシ由来の30kDaカテプシンアイソザイムを阻害した（第１図）。他のプロテアーゼ（パパイン、ヒト肝カテプシンＨ、牛腎臓カテプシンBおよび白血球カテプシンＧ）は、プロペプチドが13μＭの濃度でも阻害されなかった。
【図１】
0004295358.tif 000005
【図２】
0004295358.tif 000006
0004295358.tif 000007