(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾クロストリジウム神経毒素と結合した標的成分（TM）を包含し、一次感覚求心の細胞質に該修飾クロストリジウム神経毒素のL鎖又はその断片を導入させ、それによって、一次感覚求心からの少なくとも１つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を制御することにより、一次感覚求心と投射ニューロンの間の信号伝達を阻害する末梢感覚求心に対する特異性を示す非細胞毒性薬剤であって、
前記修飾クロストリジウム、及び前記TMが以下の特徴を有する前記薬剤：
（ｉ）TMは、一次感覚求心の細胞表面結合部位に対するリガンドを包含し、かつ、結合部位と機能的に反応して薬剤と一次感覚求心の表面との間での物理的会合を起こさせる能力を有し、
（ｉｉ）修飾クロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素の重鎖（H鎖）が化学誘導、突然変異または蛋白質加水分解により除去または修飾されることにより、運動ニューロンに対するその本来の結合親和性が低減または除去されたものであり、かつ、クロストリジウム神経毒素の軽鎖（L鎖）又はその断片を有することによって、神経分泌効果器の成分に対して特異的なプロテアーゼ活性を保持している。
【請求項２】
クロストリジウム神経毒素のＨ鎖のＨｃ部分が除去または修飾されている修飾クロストリジウム神経毒素と結合した標的成分（ＴＭ）を包含する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
クロストリジウム神経毒素のＨ鎖がクロストリジウム神経毒素のＨNフラグメントである、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
クロストリジウム神経毒素成分がボツリヌス神経毒素から得られたものである、請求項１〜３いずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
クロストリジウム神経毒素成分がボツリヌス神経毒素タイプＡ、タイプＢ、またはタイプＣ１から得られたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
ＴＭをボツリヌス神経毒素タイプＡ、タイプＢ、またはタイプＣ１のＬＨNフラグメントに結合させることにより形成させたものである、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
Ｈ鎖が、Ｌ鎖とは異なるクロストリジウム神経毒素成分から得られたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
Ｈ鎖がボツリヌス神経毒素タイプＡから得られ、Ｌ鎖がボツリヌス神経毒素タイプＢから得られたものである、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
ボツリヌス神経毒素タイプＡのＨNフラグメント、及びボツリヌス神経毒素タイプＢのＬ鎖と結合したＴＭで構成されている、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
Ｌ鎖またはＬ鎖断片が直接共有結合によってＨ鎖と結合していることを特徴とする、請求項１−９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
Ｌ鎖またはＬ鎖断片が１つまたはそれ以上のスペーサー領域を含む共有結合によってＨ鎖と結合している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１２】
ＴＭが、補助なしにＬ鎖またはＬ鎖断片を一次感覚求心の細胞質中に入れる能力を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１３】
Ｌ鎖またはＬ鎖断片を一次感覚求心の細胞質中に供給する能力がもっぱらＴＭのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１４】
ＴＭが一次感覚求心の結合部位に結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１５】
ＴＭが一次痛覚求心の結合部位に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１６】
ＴＭが一次感覚求心の中で逆行輸送がおこる結合部位に結合するものである、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１７】
ＴＭが一次痛覚求心の中で逆行輸送がおこる結合部位に結合するものである、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１８】
ＴＭが一次感覚求心の細胞表面受容体に対するリガンドを包含するものである、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１９】
ＴＭが一次感覚求心の成長因子受容体、神経ペプチド受容体、サイトカイン受容体、またはホルモン受容体に対するリガンドを包含するものである、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項２０】
ＴＭが、一次感覚求心の表面抗原に対するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体から誘導されたものを包含するものである、請求項１〜１３いずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２１】
ＴＭが、神経成長因子受容体に対するリガンドを包含するものである、請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２２】
ＴＭが、神経成長因子を包含するものである、請求項２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
ボツリヌス神経毒素タイプＡのＬＨNフラグメントと結合した神経成長因子を包含する、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
ＴＭがクロストリジウム神経毒素から誘導された成分に直接共有結合によって結合されたものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２５】
ＴＭがクロストリジウム神経毒素から誘導された成分に、１つまたはそれ以上のスペーサー領域を含む共有結合によって結合されたものである、請求項１〜２３に記載の薬剤。
【請求項２６】
一次感覚求心から神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を防止する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２７】
一次痛覚求心からの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制する、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
TMを修飾クロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素の断片に共有結合させることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤を調製する方法。
【請求項２９】
TMを１つまたはそれ以上のスペーサー領域を介在させることによって、修飾クロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素の断片と共有結合させることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤を調製する方法。
【請求項３０】
修飾クロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素の断片をコードする遺伝子構築物を構築すること、該遺伝子構築物を宿主細胞へ組み入れること、修飾クロストリジウム神経毒素又はクロストリジウム神経毒素の断片を生産するために前記遺伝子構築物を発現させること、及び、修飾クロストリジウム神経毒素又はクロストリジウム神経毒素の断片を共有結合によってTMと結合させることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤を調製する方法。
【請求項３１】
修飾クロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素の断片をコードする遺伝子構築物を構築すること、該遺伝子構築物を宿主細胞へ組み入れること、修飾クロストリジウム神経毒素又はクロストリジウム神経毒素の断片を生産するために前記遺伝子構築物を発現させること、及び、修飾クロストリジウム神経毒素又はクロストリジウム神経毒素の断片を、一つまたはそれ以上のスペーサー領域を介在させて共有結合によってTMと結合させることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤を調製する方法。
【請求項３２】
薬剤をコードする遺伝子構築物を構築すること、該遺伝子構築物を宿主生体中に取り込ませることを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤を調製する方法。
【請求項３３】
前記薬剤が、請求項３２に記載の方法によって調製される融合蛋白質である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は末梢求心性機能を修正させることができる新規薬剤に関する。本薬剤は特定のニューロン群からの神経伝達性物質の放出を抑制し、それによって末梢神経から中枢痛覚神経繊維求心性痛覚信号の伝達を減少、または好ましくは防止することができる。本薬剤は痛みの治療、特に慢性的な痛みの治療のための薬剤として、またはそれらの薬剤に組み入れて使用できる。
背景技術
触覚は伝統的に古典的な五感の1つと捉えられているが、実際にはこれは極めて複雑で、多くのさまざまな感覚を変換するものである。これらの感覚は特化されたさまざまな神経終末および関連組織によって末梢で検知される。それらのいくつかは、接触、圧力、振動、および髪または髭の変形などの各種の機械的刺激に対して特異性のものである。もう1つ別の種類の神経群は、熱および寒さにより活性化される種々の神経繊維により温度を検知することができる。さらにその他の神経終末群は通常は弱い刺激では興奮せず、強い刺激によってのみ興奮させられる。このカテゴリーの感覚神経は1つ以上の刺激に応答することが多く、多モード性神経繊維として知られている。それらは潜在的に損傷を起こす状況または物体を感知するのに使用される。多モード性神経繊維はまた、酸により引き起こされる“焼けるような”感覚といった化学信号類も変換する。このように、触覚は対象物の非常に詳細な内容を伝達することができ、事象の詳細な内容の伝達と警告の両方の働きをする。
末梢から感覚そのものへの感覚信号の変換は、マルチ神経経路および脳の情報処理センターにより行われる。感覚刺激の伝達にかかわる神経経路の最初の神経細胞群は一次感覚求心と呼ばれる。頭およびその他いくつかの体内器官からの一次感覚求心のための細胞体は、中枢神経に関連する神経節、特に三叉神経核ならびに単生経路の核に関連するさまざまな神経節中に存在する。身体のその他の部分のための一次感覚求心の細胞体は脊柱の背根神経節の中にある。一次感覚求心およびそれらのプロセスは組織学的に分類されているが、細胞体は2つのクラスに分類される：すなわちAタイプは大きく（直径60-120μm）、一方Bタイプは小さく（14-30μm）、かつ数が多い。同様にプロセスも2つのカテゴリーに分類される：すなわち、C繊維はA繊維が有する髄鞘が欠落している。A繊維はさらに、よく発達したミエリンを有する大径のAβ繊維と、あまり発達していないミエリンを有する薄いAδ繊維に細分される。Aβ繊維はAタイプ細胞体から派生し、AδおよびC繊維はBタイプ細胞体から派生すると一般的に考えられている。これらの分類はさらに、一定範囲の分子量マーカーの選択的発現を調べることによって細分することができる。
機能分析では正常な条件下においてはAβ繊維は触感ならびに中程度の温度区分を伝達するのに対し、C繊維は主として前述の多モード性高閾値神経繊維と同等であることが示されている。Aδ繊維の役割は、高低両閾値のさまざまな応答モードを持つようであり、あまり明確にはなっていない。
一次感覚求心の活性化の次にくる感覚信号の変換ステップは、視床核など中枢神経系の上位部分へ信号を運ぶ投射ニューロンの活性化である。これらニューロンの細胞体（脳神経に関わるもの以外）は脊髄の後角に存在する。この部位はまた一次求心と投射ニューロンの間のシナプス（神経細胞接合部）が存在する場所でもある。この後角は一連のラミナ（層）に組織化されており、ラミナIが最も背側、次にラミナ□といったように積み重なっている。異なる一次求心は異なるラミナにシナプスを作る。皮膚一次求心については、C繊維がラミナIと6にシナプスを作り、Aδ繊維がラミナI、6、およびVにシナプスを作り、またAβ繊維はラミナ7、8、および9に作る。より深部のラミナ（V-VII、X）は筋肉および体腔内諸器官（内臓）などの深い組織から到達する感覚経路に関与すると考えられている。
一次求心と投射ニューロンの間のシナプスにおける支配的な神経伝達物質はグルタメートであるが、C繊維がサブスタンスPおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）などいくつかの神経ペプチド類を含むことも重要なことである。A繊維はまた特定の条件下では、神経ペプチドYなどの神経ペプチド類も発現することがある。
これらシナプスの伝達効率は下降経路および脊髄に局在する介在ニューロンにより変えることができる。これらの調節ニューロンは、感覚の程度を増強または低減させるメカニズムを与えるための抑止性（たとえばオピオイドペプチド、グリシン）または興奮性（たとえば酸化窒素、コレシストキニン）のいずれかの多くのメディエーター（媒介物）を放出する。
そうした生理学的変調を必要とする感覚のカテゴリーは痛みである。痛みは怪我または病気を警告することができる感覚であり、これは日常生活に欠くべからざるものである。しかしながら、痛みを無視できることが必要な場合があり、これが生理学的には、たとえばオピオイドペプチド（アヘン様作用ペプチド）類の機能である。不都合なことは、これらの生理学的メカニズムがあるにもかかわらず、痛みは病気の間または怪我をした後、その有用性がすでになくなっても継続することがあり得ることである。こうした状況下では痛みは疾患の症状ということになるが、これはできるだけ軽減されるべきものである。
臨床的には、痛みは3つのカテゴリーに分類される。すなわち、（1）急性の痛み；これは通常怪我または手術で発生するもので、怪我が治れば消滅すると考えられる。（2）悪性疾患から発生する慢性的痛み；転移ガンを持つ人の多くが中程度ないし激しい痛みを持ち、これは疾病の治療成功または患者の死亡のいずれかで解決される。（3）悪性疾病によらない慢性的痛み；これは雑多な苦痛であり、関節炎や末梢神経症などさまざまな疾病により引き起こされるもので、通常生命を脅かすほどではないが、痛みのレベルが何十年にもわたり増加することがあるものである。
組識損傷からくる痛みの生理は、中枢神経系統の欠陥によるものよりは理解が進んでいる。正常な条件下において痛みにつながる感覚は先ず、高閾値信号を運ぶAδおよびC繊維によって変換される。したがってラミナIおよびIIが痛み信号の伝達に関与し、C繊維により放出されるグルタメートおよびペプチドが使用されて適切な投射ニューロンを活性化させる。しかしながら、いくつかの慢性的痛みにおいては別のA繊維（Aβ繊維を含む）が痛みの信号を運ぶという証拠があるとされており、これがたとえば神経痛に関与する痛覚過敏症および異痛症における一次痛覚求心として働くことになる。これらの変化は、A繊維中の神経ペプチドYなどのペプチド類の発現と関係する。種々の慢性的痛みの条件においてはさまざまな感覚求心のシナプスは投射ニューロンとともにいくつかの方法により修正される。すなわち、シナプス数の増加につながる動態学的な変化があり、種々のペプチドのレベルと比率が変化し、また投射ニューロンの感度も変化することがある。
痛みによる臨床的問題の多さに鑑みて、痛みを解消する方法を見つけるために多大の努力が払われてきた。痛みを解消するために最も広く使用されている薬剤は2つのカテゴリーに分類される。すなわち、（1）アスピリンおよびイブプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症剤類（NSAIDs）、（2）モルヒネなどのオピオイド（アヘン様作用剤）類。
NSAIDsは、損傷組識によるプロスタグランジン類の産生を防止することによって主として末梢に働く鎮痛作用を有する。プロスタグランジン類は痛みと炎症の末梢メディエーターであり、それらの濃度の減少が患者に救いをもたらすことが判っている。これは特に、炎症が痛みの主因となるマイルドな関節疾患の場合がそうである。プロスタグランジン類は脊髄および脳の中の痛みの媒介に関与することが示唆されており；これはNSAIDsがなぜ炎症または末梢組織損傷を伴わないある種の痛みの状態で鎮痛作用を持つかということを説明するものとなろう。しかしながら、プロスタグランジン類は痛みのいくつかのメディエーターのただ1つに過ぎず、NSAIDsはある種のマイルドな痛みを受容できるレベルに低減させることにのみ有効なものである。それらは作用限界を有するものとされており、ある量以上に用量を増やしても鎮痛作用を増強させることがない。さらにそれらは慢性的な痛みでの有用性に限界をもたらす副作用も有する。NSAIDsの使用は胃腸系統に悪作用を及ぼし、長期間の使用は胃の広範な腫瘍化をもたらすことになる。これは特に、たとえば関節炎などの同齢患者集団を形成する老齢患者の場合に当てはまる。
オピオイド類は脊髄レベルで作用し、一次痛覚繊維（主としてC繊維）と投射ニューロンの間の神経伝達の効果を抑制する。オピオイド類はこれらシナプスの両要素を長期的に過極させることによってその効果をもたらす。オピオイド類の使用は、急性の痛みおよび慢性的な悪性痛みのほとんどのタイプを軽減するのに効果がある。しかしながらオピオイド鎮痛薬でも部分的または全く手におえない多くの慢性的な悪性の痛みの状態もある。特に、たとえば腫瘍形成による神経圧迫をもたらしている場合がそうである。不都合なことにオピオイド類はまた以下のような望ましくない全身的副作用も有する：すなわち、（1）脳幹中の呼吸センターレベルでの呼吸系の抑圧、（2）胃腸系の平滑筋に対するさまざまな作用による便秘の誘発、ならびに（3）沈静および陶酔感の誘発を含む精神活性化作用である。これらの副作用は鎮痛作用をもたらす用量と同程度で起きるため、患者に与える用量を制限しなければならないことになる。
脊髄レベルへのオピオイド類の供給は副作用を全体的に減らすことができるが、頻繁な脊椎注入の反復またはカテーテルの挿入のいずれかを必要とし、これらはいずれも患者に対する負担を増やすものとなる。カテーテルの装着は患者を基本的にベッドに縛り付けることになり、これはさらに患者の生命の質（Quality of Life）に制限をもたらすことになる。
その他いくつかの慢性的痛みの治療のためのオピオイド類の使用は一般的に効果的でないか、または望ましくない。その例としては、リウマチ関節炎および神経損傷後に現れる神経腫に関連した痛みの場合がある。これらの患者に対するオピオイド治療が望ましくないのは、単に前述の副作用や疾病の長期化に関連するということだけでなく、オピオイドの4番目の重要な副作用、すなわち依存性が関係するからである。モルヒネやヘロインなどのオピオイド類は身体的依存性をもたらす濫用性のある周知の薬剤であり、この副作用が耐性（torelance）を発現させることになる：つまり、同じ鎮痛効果をもたらすのに必要とされる薬剤の用量が時間とともに増加する。これは痛みを解消するのに必要な用量が、先の3つの副作用のために生命に危険を及ぼす状態になりかねないことになる。
NSAIDsおよびオピオイド類は痛みの治療に有用なものではあるが、そこでは特に慢性的な激しい痛みの完全な治療には不十分であるという共通の認識がある。
その他の治療法もまた使用され、特に背根切断や脊髄切断によるものから下垂体破壊に至る末梢神経のいくつかのレベルにおける痛みの経路の外科的病変を含む慢性的な激しい痛みの治療に用いられている。しかしながら、これらのほとんどは患者に対して著しい危険性をもたらす深刻な手術である。
したがって多くのタイプの痛みの治療のための新しいクラスの薬剤の開発に対する強い要請がある。それら新しい治療の望ましい特性は要約すれば次のようになる：（1）激しい痛みを含め、痛みに対して著しい救いとなる能力を有する；（2）患者の生命の質を著しく損なうような全身的副作用がないこと；（3）頻繁な注入または患者に対する長期間のカテーテル使用を必要としない長期持続作用；（4）耐性およびそれに付随する依存性をもたらさない薬剤を提供することである。
発明の開示
本発明は末梢から中枢神経系統への痛み信号の伝達を低減し、好ましくは防止することができ、それによって痛みの感覚を軽減する薬剤に関する。具体的には、本発明は痛覚求心から投射ニューロンへの痛み信号の伝達を減らし、好ましくは防止することができる薬剤を提供する。さらに詳細には、本発明は痛覚求心の少なくとも1つのカテゴリーから少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーター物質のエキソサイトーシス（細胞の外への開口分泌）を抑制することができる薬剤を提供するものである。
本発明の第1の視点では、全身的に投与でき、かつ規定された痛覚求心集団を標的とし、神経のシナプス末端からの少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制する薬剤を提供する。
本発明の第2の視点では、末梢で局所的に投与することができる薬剤で、かつ末梢から痛み信号を伝達する痛覚求心のシナプス末端からの少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制できる薬剤を提供する。
本発明の第3の視点では、脊髄に投与することができる薬剤で、かつ脊髄のその領域で終る痛覚求心のシナプス末端からの少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制できる薬剤を提供する。
本発明の第4の視点では、規定した求心ニューロン集団を標的とする薬剤を提供し、それにより薬剤の作用をその細胞種に限定する薬剤を提供する。
本発明の第5の視点では、本発明に基づく薬剤の有効量を投与することを包含する痛みの治療法を提供する。
本発明の第6の視点では、本薬剤に必要とされる成分を含む融合蛋白質として、本薬剤を再結合的に発現させることができる。
定義
以下に示す定義によって限定されることを望むものではないが、本明細書では下記の用語は以下の意味を持つものとする：
軽鎖とは、クロストリジウム神経毒素を形成する2つのポリペプチド鎖の小さい方を意味し、約50kDaの分子量を有し、通常L鎖または単にLと呼ばれる。
重鎖とは、クロストリジウム神経毒素を形成する2つのポリペプチド鎖の大きい方を意味し、約100kDaの分子量を有し、通常H鎖または単にHと呼ばれる。
HCフラグメントとは、クロストリジウム神経毒素のH鎖から誘導されるフラグメントで、H鎖のカルボキシ末端側とほぼ同じか、または完全なH鎖中のフラグメントに相当するドメインを意味する。これは運動ニューロンへの結合に関与する天然毒素のドメインを含む。
HNフラグメントとは、クロストリジウム神経毒素のH鎖から誘導されるフラグメントで、H鎖のアミノ末端側とほぼ同じか、または完全なH鎖中のフラグメントに相当するドメインを意味する。これはエンドソーム膜を通過するL鎖の転移（トランスロケーション）に関与するドメインを含む。
LHNとは、クロストリジウム神経毒素のH鎖から誘導されるフラグメントで、L鎖またはL鎖の機能フラグメントがHNフラグメントに結合したものを含むものを意味する。これは通常完全な神経毒素から蛋白質加水分解により取り出される。
標的成分（TM）とは、結合部位に機能的に作用して薬剤と一次感覚求心表面との物理的会合を起こす薬剤の化学的構造すべてを意味する。
結合部位（BS）とは、細胞の表面構造の1つで、その構造により外性分子が細胞と物理的会合をもたらすような反応ができる構造を意味する。
一次感覚求心とは、末梢から中枢神経系へ向かって感覚情報を運ぶことができる神経細胞である。
一次痛覚求心とは、感覚情報を末梢から中枢神経系へ向かって運ぶことができる神経細胞で、そこでその情報は痛みの感覚となる。
【図面の簡単な説明】
図1は、誘導した神経成長因子（NGF）とBoNT/Aから誘導したLHNの結合反応産物のゲル濾過クロマトグラフィ画分のSDS-PAGE分析のクーマシー染色［Coomassie stain］を示す。
図2は、還元および非還元条件下におけるNGFとLHN接合物のSDS-PAGE分析のクーマシー染色を示す。
図3は、PC12細胞の抽出物をNGFとLHNの接合物で処理し、BoNT/AのL鎖によりSNAP-25の蛋白質分解産物を認識する抗体で証明したウエスタン・ブロットを示す。
図4は、ラット背根神経節ニューロンの抽出物をNGFとLHNの接合物で処理し、BoNT/AのL鎖によりSNAP-25の蛋白質分解産物を認識する抗体で証明したウエスタン・ブロットを示す。
発明の詳細な説明
末梢の痛覚求心ニューロンから投射ニューロンへの痛み信号の伝達を減少または防止する薬剤は、痛みの感覚、特に激しい慢性的痛みの感覚を低減させるのに多くの潜在的な用途を有することが考えられる。
本発明では、痛覚求心のシナプス終末から少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターあるいはその両方の放出を抑制することができる薬剤を提供する。
この薬剤は数多くの際立った機能を有する。
1）この薬剤は痛覚求心ニューロンに特徴的、かつある程度の特異性を有する表面構造（結合部位［BS］）に結合する。
2）この薬剤はニューロン中に入り込む。細胞への分子の入り込みはエンドサイトーシスのプロセスによって起きる。細胞表面のある種のBSだけがエンドサイトーシスを起こし、本薬剤が結合するBSはそれらの1つであることが好ましい。本発明の1つの視点では、このBSは痛覚求心ニューロンの末梢の感覚性繊維に存在し、取り込み後に細胞体およびニューロンの中枢プロセスへ逆行輸送されるが、本薬剤もニューロンのこれらの領域に送られることとなる。本発明の別の視点では、薬剤が結合するBSは痛覚求心ニューロンの中枢プロセスまたは細胞体に存在する。
3）本薬剤は細胞質に入り込む。
4）本薬剤はそれらニューロンの中枢プロセスのシナプス終末に存在するエキソサイトーシス効果器の成分を変化させ、シナプス終末からの少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を減少または好ましくは防止する。
驚くべきことに、本発明の薬剤はクロストリジウム神経毒素またはそれらのフラグメントを修飾することにより産生させることができる。
クロストリジウム神経毒素は150kDaクラスの分子量を有する蛋白質である。それらはクロストリジウム属のさまざまな種から産生され、最も重要なのはC.tetaniおよびC.botulinumのいくつかの株である。現在のところ8つの異なる神経毒素のクラスが判明している：すなわち、破傷風毒、およびボツリヌス神経毒素の血清型A、B、C1、D、E、FおよびGであり、それらはすべて類似した構造と作用形態を有する。クロストリジウム神経毒素はバクテリアにより単一ポリペプチドとして合成され、これがジスルフィド結合により2つのポリペプチド鎖が結合されるように翻訳後に修飾される。これら2つの鎖は、約100kDaの分子量を有する重鎖（H）と、約50kDaの分子量を持つ軽鎖（L）である。クロストリジウム神経毒素は運動ニューロンの細胞膜上の受容体部位に神経筋接合部で結合し、エンドサイトーシス機序により取り込まれる。取り込まれたクロストリジウム神経毒素は、シナプトブレビン［synaptobrevin］、シンタキシン［syntaxin］またはSNAP-25の3つの蛋白質の少なくとも1つの特異的なペプチド結合を加水分解する高度に特異的な亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を有する。これらの蛋白質は神経分泌効果器の不可欠の成分であり、クロストリジウム毒素のこの活性が筋肉痙攣を長引かせる。クロストリジウム神経毒素の亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性はL鎖中にあることが判明している。クロストリジウム神経毒素は運動ニューロン上の受入れ部位の特異的な性質のために運動ニューロンに対して高度に選択的である。クロストリジウム神経毒素の特異的な神経筋接合部の結合活性は、2本鎖神経毒素分子の重鎖成分のカルボキシ末端部分、すなわちHC領域に存在することが判っている。
驚くべきことに、H鎖のHC領域を除去または修飾した1つのクロストリジウム神経毒素、または2つのクロストリジウム神経毒素をハイブリッド化したものを、新しい分子または成分、すなわち感覚性ニューロンの表面上のBSに結合する標的成分（TM）に共有結合させることにより、痛覚求心からの少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制することができる新規な薬剤が産生される。本発明のさらに驚くべき視点は、もしクロストリジウム神経毒素のL鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含むL鎖のフラグメントをTMに共有結合させると、これもまたL鎖またはそれらのフラグメントを感覚性ニューロンの細胞質へ取り込ませることができ、これもまた少なくとも1つの神経伝達物質または神経モジュレーターの放出を抑制する能力のある新規な薬剤を産生させることになる。本薬剤の構成部分を結合させるために使用される共有結合には適当なスペーサー領域が含まれていてもよい。
TMは痛覚求心ニューロンのBSに特異性を与える。本薬剤のTM成分には、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（Fab、F（ab）’2、Fv、ScFvなど）、レクチン、ならびにホルモン、サイトカイン、成長因子または神経ペプチドの受容体に対するリガンドなど、これらに限定はされないが多くの細胞結合分子の1つを包含させることができる。可能性のあるTM類のリストを表1に示すが、このリストは説明のためのものであって本発明の要求を満たすことができるTM類の範囲を制限するものではない。本発明の実施態様の1つにおいてTMは逆行輸送をするBSに結合させる。
当分野においては神経毒素分子のHC部分はHNとして知られる重鎖のその他の部分から除去できることが知られており、HNフラグメントは神経毒素分子の軽鎖（L鎖）にジスルフィド結合したまま、LHNとして知られるフラグメントとして残る。したがって本発明の1つの実施態様においては、クロストリジウム神経毒素のLHNフラグメントを、1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むリンケージを使用してTMに共有結合させる。
本発明の別の実施態様においては、クロストリジウム神経毒素のHCドメインを突然変異または化学修飾などにより修飾し、神経毒素が神経筋接合部で受容体に結合する能力を減少または好ましくは不活化させる。この修飾クロストリジウム神経毒素を次に1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むリンケージを使用してTMに共有結合させる。
本発明のさらに別の実施態様においては、クロストリジウム神経毒素の重鎖、ただしHCドメインは突然変異または化学修飾などにより修飾して神経筋接合部での神経毒素の受容体への結合能力を減少または好ましくは不活化させたものを、別のクロストリジウム神経毒素のL鎖と混成する。このハイブリッド化した修飾クロストリジウム神経毒素を次に、1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むリンケージを使用してTMに共有結合させる。
本発明のさらに別の実施態様においては、クロストリジウム神経毒素のHN部分を別のクロストリジウム神経毒素のL鎖と混成する。このハイブリッド化したLHNを次に、1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むリンケージを使用してTMに共有結合させる。
本発明のさらに別の実施態様においては、クロストリジウム神経毒素の軽鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含む軽鎖のフラグメントを、1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むリンケージを使用してTMに共有結合させるが、これもまた軽鎖またはエンドペプチダーゼ活性を含むそれらのフラグメントを細胞の細胞質へ取り込ませることになる。
本発明のさらに別の実施態様においては、本薬剤を融合蛋白質としてリコンビナント的に発現させるが、これは望ましいスペーサー・ドメインの他に標的成分の適当なフラグメントも含むものである。再結合的に発現される薬剤は、神経毒素の1つの血清型をコードする遺伝子から全体的に誘導するか、または2つの異なる血清型をコードする遺伝子からキメラ体を派生させてもよい。
本発明のさらに別の実施態様においては、異なるクロストリジウム毒素タイプからのLおよびHNのハイブリッドといった必要とされるLHNを、TMおよび1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含む融合蛋白質として再結合的に発現させる。
本発明のさらに別の実施態様においては、クロストリジウム神経毒素の軽鎖またはエンドペプチダーゼ活性を含む軽鎖のフラグメントを、TMを含む融合蛋白質として再結合的に発現させるが、これもまた軽鎖またはエンドペプチダーゼ活性を含むそれらのフラグメントを細胞の細胞質へ取り込ませることになる。発現される蛋白質はまた1つまたはそれ以上のスペーサー領域を含むものでもよい。
本開示の根幹は、限定かつ規定されたクラスのニューロン（一次感覚求心）に対して非常に特異的かつ規定された活性を有する新規薬剤を作り出したことにあり、そしてそれら薬剤が神経毒素の形態をなしていることである。天然のボツリヌス神経毒素を治療に使用することは先行技術で公知となっている。しかしながら、ボツリヌス神経毒素の作用形態は先行技術に説明されているように、アセチルコリン分泌抑制のメカニズムによるものであり、かつ標的ニューロン、求心運動ニューロンのカテゴリーが本開示に説明する薬剤と明らかに異なるものである。先行技術は、開示した薬剤の活性または化学構造のいずれについても教示していない。したがって本明細書で議論してきたように、先行技術は天然のクロストリジウム神経毒素について多くを教示しているが、天然の非修飾クロストリジウム神経毒素は本開示では対象事項とはしない。本発明の薬剤はクロストリジウム神経毒素を、先行技術で教示されている標的特性を除去するように修飾することを必要とする。修飾された神経毒素は次に新しい標的機能（TM）に結合させ、天然クロストリジウム神経毒素の特性とは異なる、また先行技術では教示されていない新しい生物学的特性を有する新規な薬剤とするものである。この新しい特性を有する新規な薬剤が本開示の主題事項である。
産業上の利用可能性
本発明で説明した薬剤は痛みの治療用に、直接的または薬学的に許容される塩としてのいずれかで、生体内で使用することができる。
たとえば、本発明による薬剤は激しい慢性的痛みの治療のために全身的に使用することができる。この具体的な例は多数の関節を患っているリウマチ関節炎に関連する臨床的な痛みの治療での使用である。
別の例では、本発明による薬剤を痛みの治療用に局所的に適用することができる。この具体的な例は炎症的痛みに冒されている関節への局所注入による治療である。
本発明による薬剤のさらなる利用の例は、冒された器官の神経支配に関係する脊椎部分のレベルで脊髄注入（硬膜外または髄腔内）して、痛みの治療のために投与することができる。これはたとえば、慢性的な悪性の痛みなどの深部組織痛の治療に適用可能である。
次に本発明を以下の非限定的な実施例を参照しながら説明する：
［実施例1］NGFとBoNT/AのLHNフラグメントの接合体の合成
凍結乾燥したラット2.5 S NGFに水を加えて溶解させ、MES緩衝液（0.1M MES、0.1M塩化ナトリウム、pH5.0）中に透析した。この溶液（濃度約0.3mg/ml）にPDPH（DMF中に100mg/ml）を加えて最終濃度を1mg/mlとした。混合した後、固形EDACを加え、最終濃度を約0.2mg/mlとした。反応を室温で少なくとも30分間進行させた。次いで過剰のPDPHを、事前にMES緩衝液で平衡させたPD-10カラム（ファルマシア製）で脱塩して除去した。
BoNT/AのLHNフラグメントを、基本的にショーン［Shone］C.C.、ハンブルトン［Hambleton］，P.、およびメリング［Melling］，J．1987、Eur．J．Biochem．167、175-180の方法に基づいて調製した。トリエタノールアミン緩衝液（0.02Mトリエタノールアミン/HCl、0.1M塩化ナトリウム、pH7.8）に溶解させるのに使用したNGFの半量に相当するNHLを濃度約1mg/mlで、最終濃度2mMのトラウト［Traut］試薬（1Mトリエタノールアミン/HCl中に100mM溶解させた保存液、pH8.0）と反応させた。1時間後にLHNを、PD-10カラム（ファルマシア）を使用してPBSE（1mM EDTAを含む燐酸緩衝生理食塩水）で塩析した。カラム溶離液からの蛋白質ピークをマイクロコン50（アミコン）を使用して濃縮し、最終濃度を約2mg/mlとした。
誘導したNGFを最終濃縮ステップに供し、出発容量の10％以下の容量に減らし、次いで室温で一晩誘導したLHNと混合した。この反応生成物をドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析した。
上記の反応で生成された接合体を部分的にバイオ-ゲルのP-100（バイオ-ラッド）のゲル濾過クロマトグラフィにより精製した。この溶離液を280nmの光学濃度で測定し、またこの画分をSDS-PAGE分析した。これにより接合体は遊離NGFと反応副生成物から分離された。
図1は上記バイオ-ゲルP-100カラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。遊離LHNおよび接合体（M、100kDaおよびそれ以上）は大部分の遊離NGF（M、13kDa）から明確に分離されている。2.5 S NGFは非共有結合反応で形成されたホモダイマーであるため、SDSによる処理で解離された。したがって1つのサブユニットだけを通してLHNに共有架橋結合により形成された分子はSDS-PAGE分析中に解離され、画分4-6に見られる遊離NGFバンドとなった。この結果はNGFのホモダイマー性構造が誘導後も完全に維持されていることを示している。これらの画分に見られる遊離LHNはNGFに結合しなかった少量の成分である。画分4-6をさらなる分析の前に集めて一緒にした。
図2は還元および非還元条件下でのSDS-PAGEによる接合物の分析を示す。レーン1は非還元条件下での遊離LHNであり、レーン2は50mMジチオスレイトールで還元した同量のLHNである。レーン3と4はジチオスレイトールによる還元をせず（レーン3）または還元（レーン4）してゲル濾過クロマトグラフィをした後の接合体を示す。同様にレーン5と6はそれぞれ還元をしなかった、または還元をしたNGFを示す。この結果は明らかに、100kDa以上の見掛けの分子量を有するレーン5の物質は還元するとLHNとNGFだけの構成バンドを作る。さらに還元後のバンドの強度は、非還元サンプルに見られる少量の遊離LHNとNGF以外の物質を除去しなければならないことを示している。余剰となる唯一のものは、見掛けの分子量が＞100kDa以上の物質である。ゲル濾過クロマトグラフィ後に得られた画分中の接合体は還元可能なジスルフィド結合によって共有結合されたNGFとLHNである。
接合体を含む画分は必要になるまで4℃で保存した。
［実施例2］PC12細胞中のNGFとLHN接合体の活性
PC12細胞は神経機能の研究用のモデルシステムとして広く使用されている神経外胚葉発生の細胞系である。NGFとLHNの接合体の機能をテストするためのモデルシステムとしては2つの特性が必要である：第1にそれらが低濃度のNGFに応答して分化プロセスに関与することが明らかな細胞表面受容体を有していること。第2に、神経伝達物質の放出のためにエキソサイトーシス効果器、特にこの実施例では重要なSNAP-25を含むことである。
PC12細胞を、予めMATRIGEL基底膜マトリックス（コラボレイティブ・バイオメディカル・プロダクツ）を一穴当たり約5×105細胞個の密度で被覆した24穴プレート上に塗布した。数日間の培養後の培地（2mMグルタミン、10%ウマ血清および5%ウシ胎児血清を加えたRPMI 1640、37℃、5% CO2）を、接合体（実施例1記載のように調製したもの）またはLHNを添加あるいは添加しない新しい培地と取り替えた。一晩培養物中で保持した後培地を取り除き、細胞を新しい培地で1回洗浄した。その後細胞に0.45mlの水酸化ナトリウム（0.2M）を加えて30分間溶離した。その後溶液に0.45mlの塩酸（0.2M）を加え、さらに0.1mlのHEPES/NaOH（1M、pH7.4）を加えて中和した。これら混合物から膜蛋白質を抽出するためにトライトン-X-114（10％、v/v）を添加し、4℃で60分間インキュベートし、不溶性物質を遠心分離により除去し、そして上澄み液を37℃で30分間温めた。得られた2つの相を遠心分離で分離し、上相を破棄した。下相中の蛋白質をウエスタン・ブロットによる分析用にクロロホルム／メタノールを用いて沈降させた。
サンプルをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移した。神経分泌プロセスの重要な成分であり、またBoNT/Aの亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性の基質であるSNAP-25の蛋白質加水分解物を、開裂SNAP-25の新しくできたカルボキシ末端を認識する抗体を用いて証明することによって検知した（抗体については特許出願PCT/GB95/01279に記述されている）。図3はそうしたウエスタン・ブロットの例を示す。対照細胞（レーン1および2）からのサンプルでは顕著な免疫反応性は観察されなかったのに対し、10mg/mlのLHNとともにインキュベートしたサンプル（レーン5および6）では29kDaの分子量に相当する弱いバンドが観察され、またNGFとLHNの接合体（レーン3および4）10mg/mlとともにインキュベートしたサンプル中では強く観察された。このようにPC12細胞を接合体とともにインキュベートした場合、SNAP-25の著しい蛋白質加水分解が認められ、この接合体がBoNT/AのL鎖の亜鉛依存性蛋白質加水分解活性をこの細胞の細胞質ゾルに導入したことを示している。接合体の構成成分の場合にはそのような活性は殆どまたはまったく見られない。
過剰の遊離NGFの存在下での接合体との細胞のインキュベーションでは接合体単独とのインキュベーションの場合よりもSNAP-25の蛋白質加水分解産物の産生は少なくなった。このことは接合体の作用がNGF標的成分が細胞表面のNGFに対する受容体と作用することによって起きることを示している。
［実施例3］背根接合部ニューロンの一次培養物中のNGFおよびLHN接合体の活性
背根接合部は一次痛覚求心の細胞体を含む。この組織の一次生体内培養においては、ニューロンが痛覚求心の多くの特性を保持することが十分に解明されている。これらの特性には、生体内において痛みを引き起こすものとして知られている化学刺激に対応してサブスタンスPなどの神経ペプチド類を放出する能力がある（たとえばキャプサイシン［capsaicin］）。さらにこれらニューロンはNGFに対する受容体を有することが知られている。背根接合部ニューロンの一次培養をラット胎児（胎児令12-15日）から切除した接合部を解離させて作った。細胞をNGF（100mg/ml）を含む培地に入れ、12穴プレートに当初密度3x105細胞個/穴の密度で塗布した。培養1日後にシトシンアラビノシド（10mM）を含む新しい培地を加え、非ニューロン性細胞を殺した。このシトシンアラビノシドを2-4日後に取り除いた。さらに数日後培養物の培地を、NGFを含まず接合体またはLHNを含む新しい培地と取り替えた。37℃で一晩インキュベートした後、培地を取り除き、細胞を溶離し、実施例2で説明したようにトライトン-X-114を使用して疎水性蛋白質を抽出した。
これらのサンプルを実施例2で説明したようにウエスタン・ブロットにより、SNAP-25のBoNT/A蛋白質加水分解産物を認識する抗体により分析した。対照細胞（レーン4）からのサンプルについては免疫反応性は観察されなかったのに対し、10mg/ml LHNとともにインキュベートしたサンプル（レーン3）では弱く、また10mg/mlのNGFとLHNの接合体とともにインキュベートしたサンプル（レーン1および2）では強く認められた。
この結果は、接合体がBoNT/Aの蛋白質加水分解活性L鎖を、生体内で一次痛覚求心を形成するニューロン細胞の細胞質中に入れることができることを示している。
［実施例4］BoNT/Bから派生させたL鎖とBoNT/Aから派生させたHNフラグメントのキメラLHNの産生
BoNT/AのHNフラグメントは、ショーン［Shone］C.C.、ハンブルトン［Hambleton］，P.、およびメリング［Melling］，J．1987、Eur．J．Biochem．167、175-180の方法に基づいて調製し、またBoNT/BのL鎖はサチャモーシー［Sathyamoorthy］，V.とラスグプタ［DasGupta］，B．R．（1985、J．Biol．Chem．260、10461-10466）に基づいて調製した。BoNT/AのHNフラグメント上の遊離システインを次に、10倍モル過剰のジピリジルジスルフィドを加えて誘導し、その後4℃で一晩インキュベートした。過剰のジピリジルジスルフィドと副産物チオピリドンを、PD10カラム（ファルマシア）でPBS中に蛋白質を塩析することにより除去した。
誘導したHNを次に、等モル量のBoNT/BからのL鎖（PBS中に＞1mg/ml）と混合する前に、蛋白質濃度が1mg/ml過剰となるように濃縮した。室温で一晩インキュベートした後、この混合物をスーパーローズ［Superrose］6（ファルマシア）でゲル濾過クロマトグラフィにより分離し、それらの画分をSDS-PAGEで分析した。実施例1に説明したように標的接合体を産生させるためのキメラLHNが誘導された。
上述の実施例は純粋に本発明の説明のためのものである。本薬剤の合成においては、修正クロストリジウム神経毒素またはそれらのフラグメントへのTMの結合は、当分野で周知の薬剤と技法を用いた化学結合により行なった。したがって、提示した実施例では専らPDPH/EDACとトラウト試薬法を使用したが、薬剤のTM成分をクロストリジウム神経毒素誘導成分に共有結合させることができる他の結合方法ならびに当分野の熟練技術者に公知の方法はいかなるものも本出願の範囲に含まれる。同様に薬剤全体または薬剤のフラグメントのいずれかのDNAコーディングは容易に組み立てることができ、適当な生体中に発現した場合、本薬剤または薬剤のフラグメントを再結合的に産生させるために使用できることは、当分野の熟練技術者は周知のとおりである。当分野の熟練技術者周知の技法により得るそのような本発明薬剤の遺伝子的構築物もまた本発明の範囲に入る。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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