(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の部：
（Ａ）（１）以下のアミノ酸領域：
ｉ）ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫ（１〜１０残基）；
ｉｉ）ＩＶＧＧＶＹＬＬ（３０〜３７残基）；
ｉｉｉ）ＲＬＧＶＲＡＴＲ（４３〜５０残基）；及び
ｉｖ）ＡＱＰＧＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧＣＧＷＡＧＷＬＬＳＰＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦ（７７〜１３０残基）、
の内の少なくとも２つにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が欠失されているか、又は１若しくは複数のアミノ酸が変更されている、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶコア・ペプチド；
（２）ＨＣＶ非コア・タンパク質；並びに
（３）ＨＣＶコア抗原に結合し、前記（Ａ）部（１）に記載のＨＣＶコア・ペプチドと結合しない、少なくとも１つの抗ＨＣＶコア・モノクローナル抗体、
によりコートされた固相、そして
（Ｂ）ＨＣＶコア抗原に結合し、前記（Ａ）部（１）に記載のＨＣＶコア・ペプチドと結合せず、及び前記（Ａ）部（３）に記載の抗ＨＣＶコア・モノクローナル抗体と同じエピトープに結合しない、標識された抗ＨＣＶコア・モノクローナル抗体、
を含む、ＨＣＶ抗体、及びＨＣＶ抗原の同時検出用キット。
【請求項２】
前記ＨＣＶ非コア・タンパク質がｃ２００及びＮＳ５から選ばれる、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記標識された抗ＨＣＶモノクローナル抗体が、酵素、フルオロフォア又は放射性標識により標識される、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記固相が、マイクロタイター・ウェル、ポリスチレン・ビーズ、磁性ビーズ又は膜である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
以下のアミノ酸領域：
ｉ）ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫ（１〜１０残基）；
ｉｉ）ＩＶＧＧＶＹＬＬ（３０〜３７残基）；
ｉｉｉ）ＲＬＧＶＲＡＴＲ（４３〜５０残基）；及び
ｉｖ）ＡＱＰＧＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧＣＧＷＡＧＷＬＬＳＰＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦ（７７〜１３０残基）、
の内の少なくとも２つにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が欠失されているか、又は１若しくは複数のアミノ酸が変更されており、かつ配列番号１９のアミノ酸配列の１１〜２９残基、３８〜４２残基、及び５１〜７６残基アミノ酸が欠失又は変更されない、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたＨＣＶコア・ペプチド。
【請求項６】
前記ｉ）部に記載のアミノ酸断片ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫ（１〜１０残基）からアミノ酸ＭＳＴＮＰＫＰＱが欠失され、かつ前記ｉｉ）部に記載のアミノ酸断片ＩＶＧＧＶＹＬＬ（３０〜３７残基）からアミノ酸ＶＧＧが欠失される、請求項５に記載の単離されたＨＣＶコア・ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
世界中でおよそ１億７千万人がＣ型肝炎（ＨＣＶ）に感染している。ここ数年のうちに、ＨＣＶを原因とする肝疾患及び肝癌による米国の死亡者の数が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を原因とする死亡者を上回る可能性がある。
【０００２】
ＨＣＶの伝染は血液と血液の接触を必要とするようである。１本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）を担持するＨＣＶは、後で少なくとも１０の機能性タンパク質に分裂するポリプロテインをコードするたった１つの遺伝子を含む。明らかに、ＨＣＶについて血液の供給源を試験する能力が非常に重要である。早期の段階で感染を検出しうる高感度アッセイは有益である。
【０００３】
ＨＣＶ検出アッセイはＨＣＶウイルスに対する抗体を典型的には検出する。これらの抗体をＨＣＶタンパク質配列を含む組み換えタンパク質及びペプチドを用いた免疫アッセイにより検出する。大部分の市販の抗ＨＣＶアッセイは以下の領域、コア・タンパク質、ＮＳ３，ＮＳ４、及びＮＳ５タンパク質配列からのタンパク質を使用する。
【０００４】
抗ＨＣＶコア抗体は慢性ＨＣＶ感染個体において検出される最も一般的な抗ＨＣＶ抗体の１つである。ＨＣＶコア・タンパク質は多重エピトープを含む。ＨＣＶコア領域に合成ペプチドを使用することで、これらのエピトープの大部分がこのタンパク質のアミノ末端に存在することが示された。例えば、それぞれ約１５アミノ酸の長さの重複ペプチドを使用し、慢性ＨＣＶ感染個体中の抗ＨＣＶ抗体についての選別のためのＥＬＩＳＡを開発した。以下の表１はこのペプチド配列を示す。以下の表２に示したとおり、ＨＣＶ感染個体はこれらのコア・ペプチドの２以上に対する抗体を持つ。よって、抗コア抗体を検出するために完全なコア・ペプチドを必要としないことが示された。
【０００５】
【表１】
0004283527.tif 000002
【０００６】
【表２】
0004283527.tif 000003
【０００７】
【表３】
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【０００８】
最近の報告は、ＨＣＶコア・タンパク質が抗ＨＣＶ抗体の出現前にＨＣＶ感染個体において検出されうることを指摘する（S. Lee et al., Vox Sanguinis, 2001; 80 : 19-23）。故に、我々は、ＨＣＶ感染の早期検出のより効果的な方法がＨＣＶコア・タンパク質及び抗コア抗体を含む抗ＨＣＶ抗体を検出しうる組み合わせアッセイであることを提案する。
【０００９】
本発明の概要
本発明は、特定の抗ＨＣＶマウス・モノクローナル抗体に結合するこのタンパク質の能力を排除するために１以上のアミノ酸を修飾又は欠失したＣ型肝炎ウイルス・コア・タンパク質配列を含むペプチド及び組み換えタンパク質を説明する。これらの修飾を以下の表３に示した下線部の領域で行った。ＨＣＶに感染した個体中の抗ＨＣＶ抗体の検出のために使用される免疫アッセイに使用されるこのタンパク質の能力を維持するように前記欠失及び修飾を設計する。これらの修飾コア・タンパク質は、ＨＣＶコア・タンパク質と抗ＨＣＶ抗体の同時検出のための組み合わせアッセイに使用されうる。前記組み合わせアッセイは、これまで使用されてきた抗体アッセイよりも早期にＨＣＶを検出しうる。
【００１０】
本発明の詳細な説明
本発明の１の目的は、ＨＣＶコア抗原を検出するための抗コア・モノクローナル抗体の存在下で抗ＨＣＶ抗体を検出しうるペプチド配列の開発である。故に、これらのコア抗原の１の使用は抗ＨＣＶ／ＨＣＶコア・アッセイ、又は「組み合わせアッセイ（combination assay)」へのそれらの使用である。
【００１１】
このために、表４からの２以上のモノクローナル抗体を１以上の修飾ＨＣＶコア・タンパク質と一緒に固相上に同時コートすることができ、これにより上記固相の抗ＨＣＶコア抗体とコア抗原の捕捉を可能にする。前記修飾は前記抗体によりＨＣＶコアの検出又は捕捉のために使用されるエピトープの除去により達成される。エピトープの除去は本技術分野で知られる手段、例えば前記コア配列の一部の欠失又は上記エピトープ配列中のアミノ酸の変更により達成されうる。これは、例えば市販のペプチド合成装置を用いた化学合成によるこれらのペプチドの合成によるか、あるいはＨＣＶコア・タンパク質を発現する組み換えクローンの修飾により達成されうる。前記組み換え配列を、プライマー依存性単独又は複合部位変異誘発又はプライマー依存性欠失により修飾しうる（B. Tao and K.C. Lee, PCR Technology Current Innovations, 1994 by CRC Press, Inc., Chapter 10, Mutagenesis by PCR）。
【００１２】
本発明の他の目的はＨＣＶコア・タンパク質の免疫優性領域の同定である。
【００１３】
本発明の他の目的は抗コア抗体を呈するＨＣＶ感染個体に共通したコア・ペプチドに対する応答パターンの測定である。
【００１４】
コア・タンパク質の高い応答性部分を維持し、かつ、そのペプチドがアッセイ中でコア・タンパク質を検出するために使用される抗体により検出されないように配列の残りの部分に対して修飾を実施することにより本発明のペプチドを製造した。
【００１５】
好ましい態様において、前記ペプチドは、表３に下線部で示された領域内のアミノ酸の置換又はアミノ酸の欠失のいずれかにより修飾される。表３に示される配列の残りの部分を変更してはならない。
【００１６】
他の好ましい態様において、前記ペプチドは組み合わせアッセイに使用される。それはＨＣＶ抗原と抗体の両方を同時に検出できるものである。
【００１７】
表３
ＨＣＶコア・タンパク質配列：
【００１８】
【化１】
0004283527.tif 000005
【００１９】
本発明の有効性及び利点を以下の実施例によりさらに説明する。
【００２０】
実施例１
合成ペプチド
ＨＣＶコア・タンパク質配列の全配列を覆う合成ペプチドを用いた。表１に示す１８の重複ペプチドをペプチド合成装置を用いた固相ペプチド合成により化学合成した。前記ペプチドの全てをＣ末端システイン・アミド残基により合成した。ペプチドを樹脂から分離し、そして逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。逆相ＨＰＬＣ分析に基づくこれらのペプチドそれぞれの純度は９５％超であった。各ペプチドの配列を上記ペプチドの酸加水分解物のアミノ酸分析により確認した。前記ペプチドの構造的同一性をマス・スペクトロメトリーにより確認した。前記ペプチドの全てが期待される分子量を有した。
【００２１】
実施例２
合成ペプチドを５０mMホウ酸バッファー中１μｇ／mlの濃度でＩｍｍｕｌｏｎ２マイクロウェル（Ｄｙａｎａｔｅｃｈ製）上にコートした。各マイクロウェルに２００μｌのペプチド溶液を添加し、そしてこのマイクロウェルを２５℃で１６〜２０時間インキュベートした。前記マイクロウェルを吸引し、そしてＴｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１度洗浄し全ての未結合ペプチドを除去した。次に、このマイクロウェルを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び３％ショ糖含有ＰＢＳ  ３００μｌを用いて再コートし、全ての利用可能なタンパク質結合部位をブロックした。２〜４時間後、このプレートを吸引し、ターボ乾燥させ（ｔｕｒｂｏ  ｄｒｉｅｄ）、そして２〜８℃で密封したパウチ中に保存した。
【００２２】
実施例３
合成ペプチドＥＬＩＳＡ
２００μｌの希釈剤中、１０μｌのＨＣＶに感染している疑いのあるサンプルを前記ペプチド・コート・マイクロウェル内に添加した。約１時間のインキュベーション後、このマイクロウェルを洗浄した。洗浄したマイクロウェルにホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼにより標識した抗ヒトＩｇＧを添加した。３０分間のインキュベーションの後、このマイクロウェルを洗浄し、そしてＯＲＴＨＯフェニレンジアミン・バッファー及び過酸化水素の溶液を各ウェルに添加した。約３０分後、各ウェルに硫酸を添加して前記反応を停止させた。オレンジ色又は黄色が前記サンプル中の抗ＨＣＶ抗体の存在を示した。
【００２３】
表４
モノクローナル抗体
以下の表は１５の抗体を同定する。この抗体を免疫原によりコートしたマイクロタイターウェル・プレートを用いて抗体開発の段階ごとに選別した。モノクローナル抗体のそれぞれの系統を産生したマウスの免疫感作に使用した免疫原を以下のもののうちの１つと同定する：ペプチドＯＤＳ  ２４３、実施例１においてさらに定義される巨大ペプチド；「ＦＬＣ」は実施例１において定義される完全長コア抗原を意味する；又はＫＬＨ結合コア・ペプチド番号８、本明細書中にさらに定義される短かいペプチド。番号付きペプチドに対するそれぞれの特異性を示し、そして各番号付きペプチドのアミノ酸配列を本明細書中で同定する。さらに、前記抗体が特異的に結合するエピトープを最後の列に収録し、このエピトープをコードするアミノ酸により定義する。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
実施例４
抗ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡにおける修飾コア・ペプチドの使用
ＨＣＶコア免疫優性領域アミノ酸１〜４３から成るペプチドを化学合成した。この領域に一部の欠失を持つ、すなわち、アミノ酸１〜８及び３１〜３３を欠失した他のペプチドをも合成した。これらのペプチドを、抗ＨＣＶ抗体の状態についての４０人の慢性ＨＣＶ患者の血清サンプルの試験に使用した。この結果は４０人中３９人の患者はこれらの配列の欠失により影響を受けなかったことを示した。前記欠失ペプチドは抗ＨＣＶモノクローナル抗体、例えば表４に示される１つと一緒に組み合わせアッセイに使用されうる。第３１〜３３アミノ酸の欠失を持つペプチドは表４に示されるモノクローナル抗体のいずれかと一緒に使用されうる。
【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
【配列表】
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