(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン、修飾されていてもよいアレルゲンおよび３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡを含んでなるアレルギー予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
アレルゲンがチロシンで被覆および／またはチロシンに吸着されている請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アレルギーの予防または治療において使用するための医薬の製造における、チロシン、修飾されていてもよいアレルゲンおよび３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの使用。
【請求項４】
請求項１または２に記載の医薬組成物の製法であって、（ａ）架橋剤との反応によりアレルゲンを修飾してもよく；（ｂ）修飾されていてもよいアレルゲンの水溶液をチロシンの水性強酸溶液と混合し；（ｃ）混合溶液を中和し、それによりチロシンおよび修飾アレルゲンを共同沈降させ；（ｄ）その生成物を３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと混合し；および（ｅ）生理学上許容される担体を加えてもよいことからなる方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はアレルギー患者の脱感作治療において使用する新規処方に関する。
脱感作治療は、投与されるアレルゲンに特異的な免疫学的応答に変化をもたらすことが知られている。かかる変化はアレルギーの症状を治療および改善する有益な効果に関与していると考えられる。
有益性に関与する免疫学的変化は完全には理解されていない。アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体応答の亢進が望ましい治療結果であると考えられているが、現在ではアレルゲン特異的Ｔ細胞（Ｔリンパ球）応答におけるある種の変化がより重要であると考えられている。
Ｔ細胞の２種のサブクラス、ＴＨ１様およびＴＨ２様は種々のメッセンジャー分子を介して互いに相互作用する。アレルギー患者においては、アレルゲン特異的ＴＨ１活性よりもＴＨ２活性の方が大きいと思われる。このことはアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を高レベルにまで引き上げ、好酸球活性をより大きくしうる。これらのことはアレルギー症候群の二つの重要な構成要素である。
上記した状況にてアレルゲン特異的ＴＨ２活性よりもむしろＴＨ１活性に変えることが、臨床的効果をもたらす免疫療法の重要な構成要素であると考えられる。
ＧＢ-Ａ-１３７７０７４は、その中にアレルゲンを分散させたチロシンの共同沈降物の製法を開示している。
ＧＢ-Ａ-１４９２９７３は、その中に修飾したアレルゲンを分散させたチロシンの共同沈降物の製法を記載している。そのアレルゲンは、分子内架橋を誘起し、未修飾アレルゲンと比べて生成物のアレルゲン性を減少させる、グルタルアルデヒドなどの試薬と反応させることにより修飾されている。
３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（以下、３-ＤＭＰＬまたは「ＭＰＬ」と称する）はＧＢ２２２０２１１（Ribi）より知られている。化学的には、この物質は、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５または６アシル化鎖の混合物であり、Ribi Immunochem Montanaにより製造されている。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態がＰＣＴ出願番号第９２／１１６５５６号に開示されている。３-ＤＭＰＬは投与されるアレルゲンのＴＨ２よりもＴＨ１指向特性を亢進しうる物質の一つである。
本発明によれば、チロシン、修飾されていてもよいアレルゲンおよび３-ＤＭＰＬを含んでなる医薬組成物が提供される。典型的には、アレルゲンを、例えば共同沈降または混合操作によりチロシンで被覆および／またはチロシンに吸着させる。
投与前に３-ＤＭＰＬを組成物の別の成分と混合できる。別法として、生成物の製造中に別の成分と一緒に処方することもできる。また別法として、それを別の成分と異なる部位でまたは異なる時間に投与することができる。非経口および腸管内投与などの多くの経路により投与を行うことができる。
本発明のさらなる態様は、このように、アレルギーに罹患している患者の治療法であって、その患者に有効量のチロシン、修飾されていてもよいアレルゲンおよび３−ＤＭＰＬを投与してなる方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、アレルギーの予防または治療にて用いるための医薬の製造における、チロシン、修飾されていてもよいアレルゲンおよび３−ＤＭＰＬの使用を提供する。
アレルゲンは、花粉（例えば、ブタクサまたはカバの花粉）、食物、昆虫の毒液、カビ、動物の毛皮、またはチリダニ類（D. farinaeまたはD. pteronyssinus）などのアレルギー誘起物質より誘導させることができる。本明細書にて用いる「アレルゲン」は、単一の供給源または１以上の供給源より由来してもよいアレルゲンの混合物を包含する。「アレルゲン」なる語はまた、アレルゲンの酵素分解または他の手段により、合成によってすべて調製されたアレルゲンフラグメントなどの、アレルゲンの１またはそれ以上のエピトープを含有するペプチドを包含する。
アレルゲンはジアルデヒド、とりわけグルタルアルデヒドなどの架橋剤との反応により修飾されていてもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明に係る医薬組成物の製法であって、（ａ）架橋剤との反応によりアレルゲンを修飾する（してもよい）こと；（ｂ）修飾されていてもよいアレルゲンの水溶液を、チロシンの水性強酸中溶液と混合すること；（ｃ）溶液の混合物を中和し、それによりチロシンおよび修飾アレルゲンを共同沈降させること；（ｄ）生成物を３-ＤＭＰＬと混合すること；および（ｅ）所望により生理学上許容される担体を添加してもよいことからなる方法を提供する。
適当な生理学上許容される担体は、フェノール−セイラインおよび滅菌水を包含する。
典型的には、アレルゲンを、水溶液中、ｐＨ５から１０、典型的には約７で、温度は０から１００℃で、より一般的には４から３７℃で、１０時間まで、例えば室温で約２時間、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドと反応させることにより修飾する。アレルゲンのグルタルアルデヒドに対する比率は、典型的には、５０：１から２：１の範囲、例えば約１０：１である。
中間体を凍結乾燥させ、あるいは次の段階で使用することができる。
ついで、典型的にはｐＨ７±１の、架橋操作または固体の溶媒和のいずれかから反応混合物として得られた修飾アレルゲンの溶液を、チロシンの水性強酸中溶液と混合する。強酸は、通常、無機酸、好ましくは塩酸である。この工程で使用したアレルゲン溶液は、典型的には、０．１μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌ、例えば約４００μｇ／ｍｌのアレルゲンタンパク質を含有する。混合物中のアレルゲン：チロシンの比率は、典型的には１：４ｘ１０5から１：１ｘ１０2重量／重量の範囲である。
得られたアレルゲンおよびチロシン溶液の混合物を中和する。中和とはｐＨを４．０から７．５の範囲内にその値に調整することを意味する。中和の間、溶液のｐＨが、決して、または少なくとも長時間、明らかに７．５を超えないことが重要である。この条件は、溶液を激しく攪拌し、所望により必要な量の塩基のみを使用することで合致させることができる。種々の緩衝剤をアレルゲンの溶液に添加し、混合および中和段階でｐＨ調節を補助することができる。
中和を行うのに特に有用な方法は、チロシンの酸中溶液と中和塩基を別々の流れでアレルゲンの溶液と混ぜることである。添加する溶液の流速は、ｐＨスタット、すなわち、反応混合物のｐＨが実質的に所定のレベルで一定であるように、溶液の一方または両方の流速を制御する装置で調節する。本発明者らは、正確なｐＨはアレルゲンの特性により変化するが、最適な結果は、通常、ｐＨを６．５ないし７．５の範囲内に調整することで得られることを見出した。
中和した結果、アレルゲンの溶液が吸蔵および／または吸着されている範囲内および／または上で、チロシンが迅速に沈降する。沈降した後、混合物を直ちに洗浄するか、または洗浄までに２、３時間ないし１日もしくは２日放置する。
得られた沈降物を遠心分離または濾過により溶液から取りだし、例えばフェノール−セイラインで洗浄した後、フェノール−セイラインまたは滅菌水などの生理学上許容される担体に懸濁させ、３-ＤＭＰＬと組みあわせた脱感作治療における使用に適した注射用組成物を生成することができる。
以下の調製３に記載する方法により、または音波処理により溶解したＭＰＬをアレルゲンまたは修飾アレルゲンのチロシン吸着物に加える前に種々の方法により希釈できる。ＭＰＬの調製物を、最初、典型的には０．５ｍｇ／ｍｌと４ｍｇ／ｍｌの間、例えば１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。ついで、それを５００μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間、好ましくは約１００μｇ／ｍｌに希釈できる。この希釈物は、精製水または１％と４％の間、好ましくは２％のグリセロールを含有するグリセロール水溶液中で行うことができる。ついで、かかる希釈物を前記のように製造したチロシン吸着体の懸濁液に加えることができる。都合よくは、ＭＰＬ溶液およびチロシン吸着物の懸濁液の濃度は、各々、略等しい容量を混合して注射用の最終生成物が得られるように選択する。典型的な最終生成物は約１００μｇ／ｍｌのアレルゲンと約２５０μｇ／ｍｌのＭＰＬを含有する。
以下の実施例は本発明を説明するものである。
調製１
透析または分画化により一部精製した略０．５ｍｇ／ｍｌの芝草花粉（grass pollen）抽出物の中性溶液を、０．２５重量／容量％のグルタルアルデヒドを等容量添加することで化学的に修飾し、混合物を室温で約２時間攪拌した。前記の混合物にｐＨ７±１のリン酸緩衝液を加えた。１容量のＨＣｌ中のＬ-チロシン（２４ｇのＬ-チロシンを３．８Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）に溶解して調製）および１容量の３．２Ｍ ＮａＯＨを４容量のアレルゲン溶液に同時に加えて激しく攪拌して、アレルゲン溶液をチロシンで共同沈降させた。そのようにして形成した懸濁液を遠心分離に付し、緩衝セイラインで繰り返し洗浄して夾雑物を除去し、緩衝セイライン（ｐＨ６±１）で元の容量に再懸濁させた。
前記の製剤と共同投与するのに適した３-ＤＭＰＬを以下の調製３に記載のとおり調製した。
調製２
卵白アルブミン（ＸＯＡ）８ｍｇをＥＶＡＮＳ溶液２０ｍｌに混合することにより溶解した。次いでリン酸塩緩衝液（６．９ｍｌ）を混合しながら加えた。磁気攪拌棒の入った１００ｍｌビーカーに溶液を入れた。磁気攪拌機を使用して混合しながら、３．２Ｎ ＮａＯＨ（６．９ｍｌ）および２４重量／容量％−チロシンを含有する３．８Ｎ ＨＣｌ（６．９ｍｌ）を５分間にわたって同時に滴加し、沈降物を形成させた。混合物をさらに５分間攪拌し、次いで５０ｍｌの遠心管に移して２５００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心分離に付した後、上澄をデカンテーションし、ペレット状の沈降物をリン酸緩衝液（４０ｍｌ）に再び懸濁させた。混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離に付した。遠心分離に付した後、上澄をデカンテーションし、沈降物をリン酸塩緩衝液（４０ｍｌ）に再び懸濁させた。混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離に付した。遠心分離に付した後、上澄をデカンテーションし、ペレット状の沈降物を０．４容量／容量％グリセロールおよび保存剤として０．０１重量／容量％のチメロサールを含有するリン酸塩緩セイライン（４０ｍｌ）に再に懸濁させた。最終生成物は略４０ｍｇ／ｍｌのチロシン吸着物を含有する。チロシン吸収物に対してＸＯＡの１００％が結合すると仮定すると、最終生成物中ＸＡＯは２００μｇ／ｍｌであった。ＸＯＡ-チロシン吸着物は必要時まで４℃で保存した。
調製３
１，２-ジパルミトイル-ＳＮ-グリセロ-３-ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の無水エタノール中溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を調製した。各１．０ｍｇのＭＰＬ▲Ｒ▼-ＴＥＡ塩を溶解させるために、ＤＰＰＣ（２７μｌ）を加えてＭＰＬ▲Ｒ▼を溶かした。窒素流をバイアルに穏やかに吹き込みエタノールを除去した。ついで、乾燥ＭＰＬ▲Ｒ▼／ＤＰＰＣ混合物に、ＭＰＬ▲Ｒ▼各１ｍｇについて、発熱物質不含の注射用水（１．０ｍｌ）を加えた。溶液を透明になるまで６０−７０℃の音波処理浴にて超音波処理に付した。次いで、ＳＦＣＡ ２９０-４５２０ Nalgene ０．２μｍフィルターを通して濾過することにより、ＭＰＬ▲Ｒ▼／ＤＰＰＣ溶液を濾過滅菌した。ＭＰＬ▲Ｒ▼／ＤＰＰＣ溶液を１．０ｍｇ／ｍｌで発熱物質を除去したバイアルに無菌状態にて分配し、ＭＰＬ▲Ｒ▼-ＡＦのラベルを貼り、４℃で保存した。
生物学的活性
マウスにおけるＴＨ１誘発活性はＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の産生と等しく、ＴＨ２誘発活性はＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体の産生と同等であるとすることができる。
従って、一例として、マウスにおいて実験を行い、鶏卵より由来する周知の食物アレルゲンである標本アレルゲン卵白アルブミン（ＸＯＡ）に対するアレルゲン特異的抗体のプロファイルを測定した。これにより、ＭＰＬ＋ＸＯＡ＋チロシンからなる処方がＭＰＬ＋ＸＯＡ、ＸＯＡ＋チロシンまたはＸＯＡ単独よりも優れた抗体プロファイルを刺激することが確認された。
一群８匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６-８週齢）に、以下のワクチンの一つを０．２ｍｌにて鼠蹊部に皮下注射した。
ＸＯＡ＋チロシン：注射する３０分以内に、前記の調製２で調製したＸＯＡチロシン吸着物を同容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。
ＸＯＡ＋チロシン＋ＭＰＬ：注射する３０分以内に、前記の調製２で調製したＸＯＡチロシン吸着物を、同容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ▲Ｒ▼-ＡＦで希釈した。
ＸＯＡ＋ＭＰＬ：ＸＯＡをリン酸緩衝セイラインに２００μｇ／ｍｌで溶解し、注射する３０分以内に、同容量のリン酸緩衝セイライン中５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ▲Ｒ▼-ＡＦで希釈した。
ＸＯＡ単独：ＸＯＡをリン酸緩衝セイラインに２００μｇ／ｍｌで溶解し、同容量のリン酸緩衝セイラインで希釈した。
２１日後、４群のマウスに新たに調製したワクチン０．２ｍｌをブースター投与した。ブースター投与した１４日後に、マウスを放血させて、血清を分離して−７０℃で検定時まで保存した。
その血清を、Southern Biotechnology, Inc.（Birmingham, ＡＬ）から購入し、製造業者の指示に従って用いられる、西洋ワサビ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ1、ＩｇＧ2aおよびＩｇＧ2b抗体を用いる、慣用的なＥＬＩＳＡ技術により検定した。ＩｇＧ1、ＩｇＧ2aおよびＩｇＧ2b力価はＡ490でが＞０．１ ＯＤユニットの読取りを付与する相互の血清希釈を示す。抗ＩｇＥ捕捉ＥＬＩＳＡを用い、つづいてビオチニル化卵白アルブミンプローブを用いて血清中ＩｇＥレベルを測定した。西洋ワサビ接合ストレパビジン調製物を加えた後に、結合を測定した。その結果をＡ490でのＯＤユニットとして報告する。
結果
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特に重要なことは、アレルゲン＋チロシン＋ＭＰＬを組み合わせが、他の組み合わせほどアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を誘発しないことである。さらには、ＩｇＧ2aおよびＩｇＧ2bのＩｇＧ1抗体に対する比率が大きく、初めの２つの抗体のイソタイプで最高レベルが、他のいずれの群のマウスよりもアレルゲン＋チロシン＋ＭＰＬを投与したマウスの実験で観察されることとも一致する。これはこの群では他の群のマウスで誘発される割合と比較して、ＴＨ１細胞誘発のＴＨ２細胞誘発に対する割合が大きいことを示すものである。