(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のｖＷＦプロペプチドを含む、フォンビルブラント疾患または血友病の処置用の医薬調製物。
【請求項２】
ｖＷＦプロペプチドからなる請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
ｖＷＦプロペプチドを含有するプロｖＷＦを含む請求項１に記載の調製物。
【請求項４】
プロｖＷＦが組換えプロｖＷＦである請求項３に記載の調製物。
【請求項５】
さらに止血タンパク質を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項６】
該止血タンパク質が血液因子である、請求項５に記載の調製物。
【請求項７】
該血液因子が、成熟ｖＷＦ、因子ＶＩＩＩ、活性化血液凝固因子、ＦＥＩＢ活性を有する血液因子およびＦＥＩＢＡからなる群から選択される請求項６に記載の調製物。
【請求項８】
プロｖＷＦが因子ＶＩＩＩと複合体形成している請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
さらに血小板成分を含む請求項１から８のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１０】
該血小板成分が、コラーゲン、血小板糖タンパク質、血小板、フィブリノーゲン、フィブリン、ヘパリンまたはその誘導体の少なくとも１つである、請求項９に記載の調製物。
【請求項１１】
さらにリン脂質を含む請求項１から１０のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１２】
ウイルスを不活化し、あるいはウイルスを除去するために処理された請求項１から１１のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１３】
さらに製薬的に許容される担体を含む請求項１から１２のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１４】
ｖＷＦプロペプチドが組換えｖＷＦプロペプチドである請求項１から１３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１５】
有効量のｖＷＦプロペプチドを含む、フォンビルブラント疾患または血友病の処置用の医薬調製物を製造する方法であって、ｖＷＦプロペプチドを含む供給源の物質を調製し、この供給源の物質からｖＷＦプロペプチドを分離し、ｖＷＦプロペプチドを医薬調製物に製剤化することを含む方法。
【請求項１６】
ウイルスを不活化し、あるいは除去するためにｖＷＦプロペプチドを処理する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
供給源の物質が血漿または血漿フラクションである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
供給源の物質を細胞培養物から得る請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
ｖＷＦプロペプチドを組換えＤＮＡ技術によって製造する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｖＷＦプロペプチドがプロｖＷＦに含まれる請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
プロｖＷＦがｖＷＦプロペプチドの開裂部位に突然変異を有する突然変異体プロｖＷＦである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｖＷＦプロペプチドのプロｖＷＦからの開裂を阻害する阻害剤の存在下で医薬調製物を製造する請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
クロマトグラフィーによって、供給源の物質からｖＷＦプロペプチドを分離する請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
該クロマトグラフィーがアフィニティークロマトグラフィーである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
アフィニティークロマトグラフィーが、ｖＷＦプロペプチドに対して特異的なリガンドを有する担体物質を用いる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
フォンビルブラント疾患または血友病の危険性がある患者の処置用の医薬組成物を調製するためのｖＷＦプロペプチドおよび／またはｖＷＦプロペプチドを含むプロｖＷＦの使用。
【請求項２７】
フォンビルブラント疾患または血友病の処置用のｖＷＦ医薬調製物の適合性を改良するためのｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦの使用。
【請求項２８】
血友病処置用の医薬組成物を調製するためのｖＷＦプロペプチドおよび／またはプロｖＷＦ組成物の使用。
【請求項２９】
表現型血友病または血友病Ａの処置用の、請求項２８に記載のｖＷＦプロペプチドおよび／またはプロｖＷＦ組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明はｖＷＦプロペプチド（ｐｐ−ｖＷＦ）を含む医薬調製物に関する。
フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）は、約５００から２０ ０００ｋＤの範囲のサイズを有する１シリーズの多量体として血漿中を循環している糖タンパク質である。ｖＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって互いに連結された２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットから構成されている。ｖＷＦは初期の、損傷血管壁の内皮下層（sub-endothelium）に対する血小板の接着を媒介し、また、より大きな多量体だけは止血活性をも示す。内皮細胞は大きな重合体形態のｖＷＦを分泌し、タンパク質分解性の開裂から低分子量のｖＷＦ（低分子量ｖＷＦ）が生じることが想定される。大きな分子量を有する多量体は内皮細胞内のWeibal-Pallade体に保存され、刺激に応じて放出される。
ｖＷＦは内皮細胞および巨大核細胞によって、大部分が繰り返しドメインからなるプレプロｖＷＦとして合成される。単一のペプチドの開裂時に、プロｖＷＦはそのＣ末端領域のジスルフィド結合を介して二量体を形成する。この二量体は遊離末端間のジスルフィド連結によって支配される多量体化のプロトマーとして働く。多量体の組み立て後、プロペプチドがタンパク質分解によって除去される（Leyte et al.，Biochem.J．274（1991），257-261）。
ｖＷＦの全長ｃＤＮＡがクローニングされた；プロポリペプチドは全長プレプロｖＷＦのアミノ酸残基２３から７６４に対応する（Eikenboom et al（1995）Haemophilia 1，77-90）。
ｖＷＦのプロペプチド（ｐｐ−ｖＷＦ）は、重篤なフォンビルブラント疾患（ｖＷＤ）の患者の血漿および血小板中に不足することが二番目に同定された抗原、フォンビルブラント抗原ＩＩと同一であることが示された。血漿は血液中の総プロペプチドｖＷＦの５％に満たない量しか含まないため、ｐｐ−ｖＷＦは特に血小板に局在し、これにより血小板カウントは３×１０8／ｍＬであることが想定される。すでに知られているように、ｐｐ−ｖＷＦは種々のアゴニストによる活性化時に血小板から放出される。ｐｐ−ｖＷＦは、過ヨウ素酸シッフの試薬と反応するばかりでなく、ヒラマネレクチンと結合するため、これは糖タンパク質である。ｐｐ−ｖＷＦは天然のタイプＩコラーゲンと特異的に結合するが、熱変性コラーゲンとは結合しない。ｐｐ−ｖＷＦとタイプＩコラーゲンの間のアフィニティーは高く、二価のカチオンを全く必要とせず、（多くの細胞の結合工程を阻害することが知られている）アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を含有するペプチドを加えても影響されずに結合が敏速に平衡に達することが示された。
ｐｐ−ｖＷＦの生理的役割は、プロｖＷＦ分子からの開裂前または後のｖＷＦ多量体の組み立てを支配することにあると仮定される。（Takagi et al.，JBC 264（18）（1989），10425-10430）。
また、ｐｐ−ｖＷＦは血小板コラーゲン相互作用を阻害することが示されている（Takagi et al.，JBC 264（11）（1989），6017-6020）。
Isobe et al.，JBC 272（13）（1997），6447-6453では、α４β１インテグリン発現白血病細胞に対する新規生理的リガンドおよび接着基質としてのｐｐ−ｖＷＦの役割が研究されている。ｐｐ−ｖＷＦが黒色腫転移ならびに血管炎症の基礎をなす機構において重要な役割を担っていることがわかった。
成熟ｖＷＦを含有する医薬調製物は既知である（例えば、ＵＳ５，５７１，７８４参照）が、ｐｐ−ｖＷＦまたはプロ形態ｖＷＦの医薬的使用法は先行技術において記載も提示もされていない。ＵＳ５，５７１，７８４によれば、ａＰＴＴによって測定したところ、ｖＷＦは抗凝固剤ヒルジンの浸透抗凝固作用を損なわず、むしろ抗凝固治療の出血副作用を減少させる。したがってｖＷＦは、抗血栓剤および／または繊維素溶解剤の投与によって引き起こされる出血に関する擬似解毒剤として提案される。
また、Blann et al．（Eur.J.Vasc.Surg.8（1994），10-15）によれば、アテローム性動脈硬化に関する危険性因子、ならびに全身細動脈疾患（diffuse arterial disesase）の患者内の危険性因子によってｖＷＦレベルが増加することが知られている。また、ｖＷＦレベルは、内皮の尺度であると考えられる。4＞インテグリン発現白血病細胞が研究された。ｐｐ−ｖＷＦが黒色腫転移ならびに血管炎症の基礎をなす機構において重要な役割を担っていることがわかった。
成熟ｖＷＦを含有する医薬調製物は既知である（例えば、ＵＳ５，５７１，７８４参照）が、ｐｐ−ｖＷＦまたはプロ形態ｖＷＦの医薬的使用法は先行技術において記載も提示もされていない。ＵＳ５，５７１，７８４によれば、ａＰＴＴによって測定したところ、ｖＷＦは抗凝固剤ヒルジンの浸透抗凝固作用を損なわず、むしろ抗凝固治療の出血副作用を減少させる。したがってｖＷＦは、抗血栓剤および／または繊維素溶解剤の投与によって引き起こされる出血に関する擬似解毒剤として提案される。
また、Blann et al．（Eur.J.Vasc.Surg.8（1994），10-15）によれば、アテローム性動脈硬化に関する危険性因子、ならびに全身細動脈疾患の患者内の危険性因子によってｖＷＦレベルが増加することが知られている。また、ｖＷＦレベルは、血管炎の内皮損傷の尺度であると考えられている。患者に低レベルのｖＷＦを提供することは、該疾患に対して保護的であることを示唆する。
改良された性質を有するｖＷＦ薬を提供することが本発明の課題である。本調製物は、各個体において内因性の血液凝固活性を高め、ｖＷＦ治療の動脈血栓危険性を減らすはずである。
本発明により、有効量のｖＷＦプロペプチドを含む、血液凝固障害を処置するための医薬調製物を提供することによってこの課題を解決する。ｐｐ−ｖＷＦが血液凝固において本質的役割を担うことがわかった。これは内因性の血液凝固を促進し、それにより、２次的止血に作用する。同時に、これは血小板接着を阻害し、コラーゲンと結合することによって成熟ｖＷＦの第一の止血活性を制御する。これらの発見に基づき、ｖＷＦ調製物中に別の有効タンパク質としてプロｖＷＦまたはｐｐ−ｖＷＦを加えることにより、このｖＷＦ調製物を改良することができる。ｐｐ−ｖＷＦは成熟ｖＷＦの第一の止血活性を制御し、これゆえ、例えば先行技術によって記載される動脈血栓症を誘導するようなｖＷＦの潜在的な血栓の危険性を減少させる。
驚くべきことに、実質量のｐｐ−ｖＷＦを含有する組換えｖＷＦ調製物（ｒｖＷＦ）がインビトロでトロンビン生成の増加を誘導することが発見された。このトロンビン生成は、ＦＥＩＢＡ（因子ＶＩＩＩ阻害物質バイパス活性；オーストリア特許第３５０ ７２６号、第３６８ ８８３号および第３９８ ０７９号）を加えてプロトロンビンの活性化を開始させ、ＦＶＩＩＩＣで置換されたｖＷＤ血漿中の洗浄されたｖＷＤ血小板を用いて行うインビトロアッセイによって測定された。ｒｖＷＦ調製物が優勢な量のプロｖＷＦおよびｐｐ−ｖＷＦを含んでいた場合、トロンビン生成は実質的に増加した。したがって、ｖＷＦの凝固促進作用に対するｐｐ−ｖＷＦの寄与は驚くほど重大である。
これらの結果から、血液凝固因子としてのｖＷＦの作用はｐｐ−ｖＷＦに関連していることが示唆されるため、これまでｖＷＦが提唱された領域、およびさらに凝固促進作用が望まれるより多くの領域においてｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦに基づく医薬調製物を適用することができる。
ｖＷＦの発現および性質に関するか、あるいは診断目的のたくさんの論文により、ｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦの調製物は当分野に周知である（例えば、Isobeら、Takagiら（両方とも１９８９年の論文）またはLeyteらの実験手法を参照。しかし、なんらかの個々の凝固促進活性がｖＷＦおよびｖＷＦのプロペプチド領域に関連するとの報告は未だまったく存在せず、したがって、それぞれの医薬調製物は未だ存在しない。ｐｐ−ｖＷＦはよく定義されているポリペプチドであり、組換えＤＮＡ技術によって容易に製造できるので、組換え法による製造は、本発明の医薬調製物を製造するのに好ましい態様である。また、このポリペプチドを精製し、あるいはクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはモノクローナル抗体、ヘパリン、コラーゲン、因子ＶＩＩＩタンパク質、またはその断片をアフィニティーリガンドとして用いるアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製することができる。また、ゲルろ過によって、混入タンパク質および／または成熟ｖＷＦからｐｐ−ｖＷＦを分離することができる。
本発明の好ましい態様は、本質的にｖＷＦプロペプチドからなる医薬調製物である。したがって、この調製物は精製されたｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦを少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上または約１００％純粋なｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦが含まれる程度にまで含有する。
本発明の別の態様は、本質的に、ｖＷＦプロペプチドを医薬調製物として含むプロｖＷＦからなる調製物である。
上記のように、組換え生産されたプロｖＷＦまたはｐｐ−ｖＷＦを本調製物用に用いるのが好ましい。（FEBS Letters 351（1994），345-348またはBlood 88（8）19996，2951-2958）。
本発明の調製物は少なくとも１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも３０ｎＭ、とりわけ５０ｎＭ以上のｐｐ−ｖＷＦ、および／または少なくとも１０ｎＭ、より好ましくは１００ｎＭ以上、とりわけ２５０ｎＭ以上のプロｖＷＦを含むのが好ましい。有効量はヒト血漿中の生理的量の少なくとも２倍のｐｐ−ｖＷＦ量を達成するように規定する。Blood 88（8）1996，2951-2958では、正常な血漿中のプロペプチドとｖＷＦ濃度のモル比が約０，１であることが報告されている。ｐｐ−ｖＷＦは、活性化状態の内皮において５から１００nmol／Ｌの濃度のやや豊富なタンパク質と考えられている。
プロｖＷＦに加えて、ｖＷＦが調製物中に含まれる場合、ｖＷＦ抗原に対するポリクローナル抗体調製物によって検出されるＵ−抗原（U-Antigen）として測定することができるプロｖＷＦとｖＷＦのモル比は少なくとも１０％である。本発明の好ましい調製物では、このモル比がより高く、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％である。本発明の最も有効な調製物は８０％以上のｖＷＦ抗原をプロｖＷＦとして含む。
本発明に記載の、プロｖＷＦに基づく医薬調製物はイソビボ投与時に迅速にプロセッシングされることがわかった。このように生成されたｐｐ−ｖＷＦはそのトロンビンポテンシャルおよび凝固促進活性において有効である。
別の好ましい態様では、本発明の医薬調製物はさらに、止血タンパク質、好ましくは血液因子を含む。好ましい態様のこれらの血液因子は成熟ｖＷＦ、因子ＶＩＩＩ、活性化血液凝固因子、ＦＥＩＢ活性を有する血液因子およびＦＥＩＢＡからなる群から選択される。正常な血漿のａＰＴＴまたはＰＴを減少させる止血タンパク質はいずれもｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦと適当に組み合わせたものである。
ｐｐ−ｖＷＦ調製物をＦＶＩＩＩＣと組み合わせたものは、改良された凝固活性を有する医薬調製物を提供する。プロペプチドが、ＦＶＩＩＩＣと複合体形成しているプロｖＷＦ形態である場合、本発明の医薬調製物はさらに、改良されたＦＶＩＩＩＣ安定性を示す。
本発明の医薬調製物におけるさらなる組み合わせは血小板成分を含む。ｖＷＦまたはプロｖＷＦまたはｐｐ−ｖＷＦに対する結合性または活性を有し、生理的活性に寄与するのに適当ないくつかの成分には、コラーゲン、血小板糖タンパク質、血小板、フィブリノーゲン、フィブリン、ヘパリン、またはその誘導体がある。
本発明の医薬調製物はさらにリン脂質を含んでいてもよい。
本発明の医薬調製物は、ウイルスの不活化または除去用の処理によって、ウイルスを含まないようにしておくのが好ましい。
ウイルスの不活化または除去処理は、有効であると許容される任意の処理によって行うことができる。本発明の好ましい態様では、テンシド（tensides）および／または熱、例えば固形状態での熱処理、とりわけＥＰ ０ １５９ ３１１またはＥＰ ０ ５１９ ９０１またはＥＰ ０ ６３７ ４５１に記載のスチーム処理、ＥＰ ０ ２４７ ９９８に記載の加水分解酵素処理、放射処理または化学的または化学／物理的方法、例えばＷＯ ９４／１３３２９に記載のカオトロピック試薬での処理、ＥＰ ０ １３１ ７４０に記載の有機溶媒および／またはテンシドでの処理または光学不活性化によって医薬組成物を処理する。また、ナノフィルトレーションは本発明の範囲内の好ましいウイルス涸渇方法である。
本発明の医薬調製物はさらに、製薬的に許容される担体および／または適当な緩衝液および／またはカルボヒドレートまたは塩のような補助的な保存/安定化物質、またはプロテアーゼ阻害剤または補因子それぞれを含む。最終的には、先行技術において記載される任意の既知のｖＷＦ調製物のように、とりわけ非経口的使用または局所的使用のために本調製物を製剤化する。投与に適当な形態で容器に充填し、好ましくは、場合により凍結乾燥状態または凍結状態で、安定に保存するためにパッケージングすることにより、これを行うことができる。
本発明の調製物は、血清または血漿から精製することによって、ならびにそれぞれの発現系によって製造することができる。トランスジェニック動物もまた同様にｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦの供給源である。
また、ｐｐ−ｖＷＦまたはｐｐ−ｖＷＦを含有するプロｖＷＦをイソビボまたはエクスビボで発現することによって本発明の調製物を調製することができる。この手法に特に適当なのは、培養することができ、あるいはヒト遺伝子治療に用いることができる哺乳類由来の細胞、特にヒト細胞である。また、ｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦを異種タンパク質として発現する形質転換細胞は、本発明の調製物を得るために適当な供給源である。
本発明のさらなる態様は、開裂部位に突然変異を有するプロｖＷＦ突然変異体を含む医薬調製物である。この突然変異体は、Borchielliniらによって、実験目的で記載されている（Blood 88（8），2951-2958（1996））。記載されるｖＷＦ−ＧＬｙ ７６３は、生理的酵素によって排除されないプロｖＷＦを提供する突然変異を有する。プロｖＷＦの開裂に対する抵抗性は、プロｖＷＦ形態に含まれるｐｐ−ｖＷＦの凝固促進活性の半減期を長くする。したがって、この延長作用を開裂部位の特定の突然変異により設計する。
この特定の突然変異は、Ａ２ドメインを欠く欠失突然変異体であって、分子への展開によって感受性にならない限り、タンパク質分解に耐性であるものを作成した、Lankhofら（Thrombin and Haemostasis 77（5），1008-13（1997））の技術によって行うことができる。
また、天然タンパク質の性質を示すｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦの他の突然変異体タンパク質を本発明調製物に用いることもできる。この場合、少なくとも８０％の相同性および修飾ｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦとして作用する機能を有する類似体または突然変異体を用いるのが好ましい。
本発明のさらに別の効果は、有効量のｐｐ−ｖＷＦを含む医薬調製物の製造方法であって、ｖＷＦプロペプチドを含む供給源の物質を調製し、この供給源の物質からｐｐ−ｖＷＦを分離し、このｐｐ−ｖＷＦを医薬調製物に製剤化することを含む方法である。
供給源の物質は、血液、血清、血液フラクション、トランスジェニックマウスの初乳または乳、または、特に組換えＤＮＡ技術によって作成された細胞由来の細胞培養溶液であるのが好ましい。ｐｐ−ｖＷＦを含む供給源の物質は、プロｖＷＦ中のｐｐ−ｖＷＦを含むのが好ましい。方法および技術は、FEBS Letters 351，345-348（1994）またはBorchiellini et al．上記文献に記載されている。
プロｖＷＦを得るため、ｖＷＦのプロセッシングおよび成熟を防止するように、発現を行うのが好ましい。これは、プロセッシング酵素を除去あるいは阻害することによって行うことができる。フリンまたはＰＡＣＥまたはＡ ７７０／９６および７６９／９６に記載の多量体化酵素（multimerase）のようなプロセッシング酵素の阻害により、時期尚早にプロｖＷＦがｖＷＦへプロセッシングされるのを防ぐ。一方では、ｐｐ−ｖＷＦを別個のタンパク質として発現させるか、あるいはインビトロでのプロｖＷＦの開裂およびプロセッシングによって得ることができる。
本発明のさらに別の態様は、ｐｐ−ｖＷＦの開裂部位に突然変異、例えばプロ−ｖＷＦ−Ｇｌｙ ７６３のような７６３位にアミノ酸の変異を有する突然変異体プロｖＷＦとしてプロｖＷＦを含む供給源の物質を提供することによって該方法を行うことである。
また、プロｖＷＦからのｐｐ−ｖＷＦの開裂を阻害する阻害剤の存在下でこの医薬調製物を製造することもできる。このような阻害剤の例には、開裂部位に対する抗体または開裂部位に対する結合ペプチドまたはプロセッシング酵素の阻害剤がある。
上記のように、ｐｐ−ｖＷＦを用いて行われた種々の実験の報告により、ｐｐ−ｖＷＦの調製および分離工程は当分野に周知である（Isobe et al.，Tagaki et al.，Leyte et al．参照）。
もちろん、ｐｐ−ｖＷＦは生物学的タンパク質であり、ヒトに投与される形態であるので、本発明の方法はウイルスを不活化あるいは除去するための処置を提示するのが好ましい。
本発明はさらに、薬物として使用するためのｐｐ−ｖＷＦおよび／またはプロｖＷＦを提供する。ｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦを一日一度あるいは数回に分けて投与して、インビボのｐｐ−ｖＷＦレベルを生理的な量の少なくとも２倍に高める有効な用量を提供する。インビボにおいてｐｐ−ｖＷＦの半減期がやや短いため、急性疾患の間には、タンパク質をしばしば投与する必要があるかもしれない。
本発明のさらに別の態様は、血液凝固障害、例えばｖＷＤ、血友病（例えば表現型血友病、血友病Ａおよび因子ＶＩＩＩ阻害物質）の危険性のある患者の処置用の医薬組成物を製造するために、ｐｐ−ｖＷＦおよび／またはｐｐ−ｖＷＦを含有するプロｖＷＦを使用することである。
本調製物を適用した場合の有効な用量は、それぞれの症状に応じて変化し、重要な血液因子の血中量または患者の血栓症に対する危険性を測定した後に選択されるべきである。また最適な用量は、非経口、好ましくは静脈内、皮下または筋肉内投与が巨丸剤（ボーラス）形態あるいは貯蔵物（デポット）として投与されるか否かにも依存する。適当な担体物質、例えばリポソームを用いることによって、経口投与することも可能である。また、これは全身的および／または血液凝固障害部位で局所的に適用するかどうかにも依存する。
したがって、本発明はまた、血液凝固障害の危険性のある患者の処置方法であって、該患者に有効量のｖＷＦプロペプチドまたはプロｖＷＦを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ｖＷＤ、表現型血友病、血友病Ａまたは因子ＶＩＩＩ阻害物質の患者を本発明にしたがって処置する。
動脈血栓症の危険性を有する調製物、例えばｖＷＦ調製物と混合された場合にｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦがポジティブな性質を提示することにより、ｖＷＦ調製物における血栓症の危険性を減らすために、ｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦを使用することは本発明の別の側面である。これにより、動脈血栓形成が強調される可能性は効率的にダウンモジュレートされ、一方、凝固欠陥の場合には内因性および外因性の血液凝固が促進される。
特に、ｖＷＦ調製物の適合性は、有効量のｐｐ−ｖＷＦまたはプロｖＷＦを添加するか、あるいはそれと混合することによって改善され、改良される。これはさらに、ｖＷＦプロペプチドを制御する機能のため、内因性および外因性のｖＷＦの有害な反応、特に血栓性血小板減少紫斑病、ヘノッホ シェンライン紫斑病、プレクランプシア（preclampsia）、新生児血小板減少症または溶血性尿毒性症候群、心筋梗塞または動脈手術後の血流量不足（poor outcome）の患者内におけるｖＷＦレベルの増加の処置および予防に貢献する。
以下の実施例および図面によって、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
図１は、血小板の存在下における血漿中のトロンビン生成に対するプロｖＷＦの効果を示す。
図２は、血小板の存在下における血漿中のトロンビン生成に対するプロｖＷＦの用量依存性の効果を示す。
図３ａおよび３ｂは、イヌにおけるプロｖＷＦおよび血漿由来ｖＷＦのインビボ効果の比較を示す。
実施例：
１．血小板の存在下における血漿中のトロンビン生成に対するプロｖＷＦおよびｐｐｖＷＦの効果
前もって１Ｕ／ｍＬ ＦＶＩＩＩＣ（Recombinate，Baxter，USA）（２００μＬ）と再組成しておいた深刻なｖＷＤ血漿（George King Bio-Medical Inc.，USA）を、０．１Ｕ／ｍＬ ＦＥＩＢＡ（Immuno，Austria）および１６ｍＭ ＣａＣｌ2の存在下、重篤なｖＷＤ患者由来の洗浄された血小板（タイプＩＩＩ）５０μＬとインキュベートした。また、アクチベーターとしてＦＶＩＩａを、好ましくは最終濃度０．２μｇ／ｍＬで用いてもよい。時間間隔でサブサンプル１０μＬを取り出し、以後の反応を停止するために３ｍＭ ＥＤＴＡを含むトロンビンに対する発色性基質（Ｄ−シクロヘキシル−ｇｌｙ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ；Immuno，Austria）３００μＬに加えた。７５％（ｖ／ｖ）酢酸１００μＬを加えてこの反応を停止し、トロンビン濃度の関数である４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（プロｖＷＦおよびプロペプチドをより少量およびより多量に含む）２つの異なるｖＷＦ調製物を、因子ＶＩＩＩを再組成した血漿サンプルに、最終濃度１ Risto Ｕ／ｍＬで加えると、次いでトロンビンが生成した。（1Risto Ｕ／ｍＬ＝正常な血漿中のｖＷＦのリストセチン補因子活性）。したがって、低プロｖＷＦおよび低プロペプチドを有する調製物の場合、血漿サンプルは０．２４ｎＭプロｖＷＦおよび０．１９ｎＭプロペプチドを含み、もう一方は３４ｎＭプロｖＷＦおよび４ｎＭプロペプチドをそれぞれ含んでいた。
この結果を図１に記載する。
両調製物ともトロンビン生成速度を増加させたが、高プロｖＷＦおよび高プロペプチドを含む産物はより強い効果を示し、高いトロンビン生成をもたらしたことがこの曲線から明らかである。
２．血小板の存在下における血漿中のトロンビン生成に対するプロｖＷＦの効果
実施例１に記載の系において、総ｖＷＦ抗原のうち９０％以上のプロｖＷＦを含む組換えｖＷＦ調製物のトロンビン生成に対する効果を研究した。他の重篤なｖＷＤ患者由来の洗浄された血小板（タイプＩＩＩ）および１Ｕ／ｍＬ ＦＶＩＩＩＣと再組成された、同患者の単離された血漿サンプルを実験に用いた。２および５ｖＷＦ−Ａｇ Ｕ／ｍＬ（１Ａｇ Ｕ＝正常な血漿１ｍＬ中のｖＷＦ抗原量）の組換えプロｖＷＦをそれぞれ血漿サンプルに加え、トロンビン生成をｖＷＦの不存在下のものと比較した。図２は、しきい値２ｖＷＦ−Ａｇ Ｕ／ｍＬを超えるとトロンビン生成の増加が観察されたことを示す。
実施例３．高プロｖＷＦ含有組換調製物および血漿由来ｖＷＦ調製物のインビボ効果の比較
ｖＷＦ欠陥を有するイヌ（検出限界以下のｖＷＦ抗原、および正常値の約５０％の因子ＶＩＩＩ活性）を麻酔し、９０％以上のプロｖＷＦを含む、実施例２で用いた３５Risto Ｕ／ｍＬの組換えｖＷＦを注入した。注入前および注入後１５、３０、４０分、１、２、３、６、２４、４８、７２、９５時間の血漿サンプルを取り出した。９５時間後、血漿由来のｖＷＦ調製物（Haemate HS-Behringwerke，Marburg，Germany）を加え、注入後、再び、前記と同間隔で血漿サンプルを取り出した。この血漿由来のｖＷＦ調製物はさらに因子ＶＩＩＩ：Ｃを含んでいたが、プロｖＷＦおよびｐｐｖＷＦを含んでいなかった。この血漿サンプルを実施例１に記載のように、総ｖＷＦ抗原（Asserachrom ELISA，Boehringer）、プロｖＷＦおよびプロペプチド（Borchiellini et al Blood 88，2951，1996にしたがって）、ならびにトロンビン生成能力（ポテンシャル）について分析した。トロンビンポテンシャルは、実施例１に記載のように測定された最大トロンビン濃度と規定した。
図３は、初期値を０とみなし、最大値のパーセントとして表した、種々のパラメータの相関を示す。
トロンビンポテンシャルは、組換えプロｖＷＦ調製物での処理後、プロペプチドの増加と平行して増加した。ＥＬＩＳＡの結果は、１５分後、数％のプロｖＷＦが循環中に残っていることを示し、これはもはや検出できなくなった（データは示していない）が、プロペプチドおよびｖＷＦの有意な増加は観察された。対照的に、血漿由来ｖＷＦの注入後のイヌでは、ｖＷＦ抗原レベルの増加にもかかわらず、プロペプチドおよび実質的トロンビンポテンシャルが観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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