(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属標識画像化剤を作成するための有用な組成物であって、
（１）固体支持体；
（２）固体支持体に結合した、ジヒドロピラン又はマレイミドである連結基；並びに
（３）配位子が、その中に金属により開裂しうる結合により連結基に結合している硫黄である金属配位性原子を含む、配位子及び標的分子よりなる結合体
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
配位子、標的分子及び結合体がペプチドである、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】
金属配位性原子が、配位子のシステイン残基中の硫黄原子である、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項４】
固体支持体が、調節多孔性ガラス、アクリル樹脂、シリカ及びアガロースより選択される、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項５】
金属標識画像化剤を作成するための方法であって、
（１）請求の範囲第１項記載の組成物を得る工程；
（２）組成物を金属に接触させ、金属と配位子の金属配位性原子の間に配位結合を形成させ、それにより支持体から金属標識結合体を放出させる工程；及び
（３）そのように放出された金属標識結合体を回収する工程
よりなる方法。
【請求項６】
金属標識画像化剤を作成するための有用な組成物であって、
固体支持体；
固体支持体に結合したマレイミド連結基；及び
金属により開裂しうる結合によりその連結基に結合している少なくとも１つの金属配位性硫黄原子を含む配位子
を含む組成物。
【請求項７】
配位子が、ペプチド又はその誘導体である、請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項８】
配位子が、標的分子に結合し、それにより結合体を形成する、請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項９】
金属標識画像化剤を作成するための方法であって、
（１）請求の範囲第６項記載の組成物を得る工程；
（２）組成物を金属に接触させて、金属と金属配位性硫黄原子の間に配位結合を形成させ、支持体から金属標識配位子を放出させる工程；及び
（３）そのように放出された金属標識配位子を回収する工程
よりなる方法。
【請求項１０】
金属標識配位子を標的分子と結合する工程を更に含む、請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
金属が、99mＴＣである、請求の範囲第１項又は第６項記載の組成物。
【請求項１２】
金属が、99mＴＣである、請求の範囲第５項又は第９項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、金属−配位子錯体を作成するための有用な組成物及び方法に関する。１つの明確な特徴として、本発明は、医学診断の分野における画像化剤として有用な金属−標識化合物に関する。
発明の背景
診断用画像化の技術は、体内の選択的な結合部位又は局在部位において診断的に重要な画像の分析を助ける試剤を利用する。例えば、クエン酸ガリウムは、腫瘍と体の感染組織に対する親和性を有し、走査型断層撮影法の助けにより、問題になっている体の領域を医師に示すことができる。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は物理化学的性質により組織の型を識別し、したがって、疾患により物理化学的に改変された組織を検出することができる。検出を増強するために、照射の際の磁場による体の水分子のプロトン緩和の速度に影響を及ぼす画像化剤が使用される。典型的なＭＲＩ剤は、常磁性金属で錯体化した、水溶性、かつ非毒性の有機キレート化剤、例えばガドリニウム−エチレンジアミン四酢酸（Ｇｄ−ＥＤＴＡ）よりなる。診断用画像化に使用される他の画像化剤は、ヒトの体の目的の領域に局在し、テクネチウムやレニウムのような放射性核種金属で標識されている、蛋白、ペプチド及び抗体のような標的分子に結合する。これらの画像化剤の局在は、ガンマカメラ解析により検出される。
金属原子による画像化剤の標識は、それらの化学構造のために困難である。従来の標識法は、典型的には非標識配位子が高レベルになっている、過剰な配位子溶液中での金属錯体の形成を含む。例えば、テクネチウム標識反応は、約１個の標識配位子に対して千以上の非標識配位子を生成する。多くの画像化剤について、限りある数の結合部位、即ち受容体があり、そのために、標識及び非標識の画像化剤の両者が競合する。このことが、画像を得るために画像化剤の大量投与を必要とさせる。現在、投与前に溶液中の標識画像化剤の濃度を高めるために高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用されている。この分離工程は、濃度を高めるが、追加の時間と費用を要するために、臨床での使用には非実用的なものとなっている。
本発明の目的は、標識画像化剤を作成するための有用な組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、実質的に非標識画像化剤を含まない標識画像化剤を作成するための有用な組成物を調製する方法を提供することでもある。
本発明の別の目的は、実質的に非標識画像化剤を含まない標識画像化剤、特に診断用画像化に有用な金属−標識化合物の調製物を作成するための組成物を使用する方法を提供することである。
発明の要約
本発明の１つの特徴により、固体支持体；固体支持体に結合した連結基；及び金属により開裂しうる結合によりその連結基に結合している少なくとも１つの金属配位性原子を含む配位子（ここで、該配位子は、更に金属結合部位を含まない標的分子に結合する）よりなる金属標識画像化剤を作成するのに有用な組成物が提供される。
本発明の別の特徴により、下記の、
（１）配位子の金属配位性原子が、固体支持体に結合した連結基に結合しており、更にこの配位子が標的分子に結合し、それにより配位子−標的分子結合体を形成している、組成物を得る工程；
（２）この組成物をその金属に接触させて、金属と金属配位性原子の間に配位結合を形成させ、それにより金属標識結合体を支持体から放出させる工程；及び
（３）こうして放出された金属標識結合体を回収する工程よりなる、金属−配位子錯体を作成するための方法が提供される。
本発明の更なる特徴において、金属標識画像化剤を作成するのに有用な組成物が提供され、この組成物は、固体支持体；固体支持体に結合したマレイミド連結基；及び金属により開裂しうる結合によりその連結基に結合している少なくとも１つの金属配位性硫黄原子を含む配位子よりなる。
本発明の更に別の特徴において、下記の、
（１）固体支持体；固体支持体に結合したマレイミド連結基；及び該金属により開裂しうる結合によりその連結基に結合している少なくとも１つの金属配位性硫黄原子を含む配位子よりなる組成物を得る工程；
（２）この組成物を該金属に接触させて、金属と金属配位性硫黄原子の間に配位結合を形成させ、それにより金属標識配位子を支持体から放出させる工程；及び
（３）こうして放出された金属標識配位子を回収する工程よりなる、金属標識画像化剤を作成するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、マレイミド官能基化固体支持体上の配位子の結合と標識化を示す概略図である。
発明の詳細な説明
本発明により、金属−配位子錯体を作成する方法は、金属で開裂しうる連結基を介して固体支持体に配位子を結合させる方策により単純化される。この方法において、固定化配位子への金属の導入の単一工程は、金属−配位子錯体を形成させるだけでなく、実質的に非錯体化配位子を含まない形での回収のために支持体からこれらの錯体を放出することになる。
本発明のある特徴により、固体支持体；固体支持体に結合した連結基；及び金属により開裂しうる結合によりその連結基に結合している少なくとも１つの金属配位性原子を含む配位子（ここで、該配位子は、更に金属結合部位を含まない標的分子に結合する）よりなる、実質的に非標識画像化剤を含まない金属標識画像化剤を作成するのに有用な組成物が提供される。
本発明の別の特徴により、実質的に非標識画像化剤を含まない金属標識画像化剤を作成するのに有用な組成物が提供される。本発明の組成物は、固体支持体；固体支持体に結合したマレイミド連結基；及び金属の存在下で開裂される結合によりその連結基に結合している金属配位性硫黄原子を含む配位子よりなる。マレイミド連結基と配位子の金属配位性原子との間の結合は、配位性原子と金属との間の配位結合の形成の際に開裂する。
「配位子」という用語は、特定の金属との配位結合を形成して安定な金属−配位子錯体を形成することができる少なくとも１つの金属配位性原子を結合する化合物のことをいう。配位子は、１つ以上の金属配位性原子を含有してよい；配位子が２つ以上の金属配位性原子を含有する場合にはこの配位子は「キレート化剤」と呼んでもよい。多座配位と呼ばれる２つ以上の配位性原子を含有する配位子は、典型的には単座配位配位子よりもより安定な金属−配位子錯体を形成し、このために好適である。放射性核種金属に結合する多くの配位子は、４つの窒素と金属配位性硫黄原子の組合せ、即ちＮ4、Ｎ3Ｓ及びＮ2Ｓ2を含有する四座配位であるが、これらは、酸素、リン及びセレンのような他の金属配位性原子を結合していてもよい。診断用画像化のためには、実質的な量で配位子から放出されて組織に集積しないようにこの金属錯体がインビボ（生体内）で高度に安定であることが特に望まれる。本発明は、同時係属中の１９９４年７月１８日出願のＰＣＴ  ＣＡ９４／００３９５号に記載されているＮ3Ｓキレート化剤や、同時係属中の１９９４年８月３１日出願のＰＣＴ  ＣＡ９４／００４７９号に記載されているＮ2Ｓ2キレート化剤のような、広い範囲の配位子に適用することができるが、好適な配位子は、金属に結合するためのペンダントスルフヒドリル基を結合するペプチド又はその誘導体である。適切なペプチド性キレート化剤は、ＷＯ９３１７７１９号に記載されている、標的分子、特にこれもペプチド性である標的分子に結合しやすいキレート化剤である。１つの実施態様において、本発明は、固有の標的特性を有する配位子を標識するために適用される。放射性診断用画像化に利用しうるこのような１つの配位子は、メルカプト−アセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）であり、これは腎組織に局在し、腎の画像化剤を調製するために本発明の方法により標識することができる。ＭＡＧ３は、３つの窒素配位性原子と１つの硫黄配位性原子を有するＮ3Ｓクラスの配位子である。
本発明の組成物での使用に適した標的分子は、特定の器官、組織又は細胞の型のような画像化部位にインビボで選択的に局在することができる化合物である。標的分子の例は、限定されないが、ステロイド、抗体、蛋白、ペプチド、ヌクレオチド及び糖類を含む。好適な標的分子は、蛋白とペプチドを含み、特に特定の疾患を特徴付ける細胞表面受容体に対して特異的に結合することができるものを含む。好適には、標的分子は、同時係属中のＣＡ９４／００３９５号（上記）に記載されるような細胞表面受容体に結合する３個以上のアミノ酸残基よりなるペプチド又はその誘導体である。好適には、標的分子は、約３〜５０個のアミノ酸、より好適には３〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドである。ある実施態様において、標的分子は、細胞表面受容体に結合する走化性ペプチドであり、特にアミノ酸配列ＴＫＰＰＲを結合する走化性ペプチドである。
連結基に結合した配位子が、更に標的分子に結合する本発明の特定の方法において、標的分子自体は、ペンダントスルフヒドリル基のような金属結合部位を含まないことが望ましい。標的分子が、システイン残基に見い出されるペンダントスルフヒドリル基のような金属結合部位を与えるこの特定の方法により標識された配位子−標的分子結合体は、１）その局在活性の一部又は全てを失うかもしれず、かつ２）インビボで金属を放出し、それによりバックグラウンドノイズを増加させ画像を不明瞭にするかもしれない。
ペプチド性である配位子及び／又は標的分子は、市販されているか、又は固相法により、又は組換えＤＮＡ法により新規に合成することができる。固相ペプチド合成は、一般に自動合成機と固相としての適切な支持体を使用し、この固相に目的ペプチドのＣ末端アミノ酸が結合される。次に合成が終了するまで、典型的にはＦＭＯＣ−又はＢＯＣ−に基づく化学的方法を使用して、適切に保護された形の次の目的アミノ酸を連続して結合することにより、Ｎ末端方向へペプチドが伸長される。次いで通常支持体からのペプチドの開裂と同時に、保護基がペプチドから開裂され、次にペプチドが単離される。一般的精製法は、溶媒としてアセトニトリルとイオン対生成剤としてトリフルオロ酢酸を使用する逆相ＨＰＬＣを含む。方法は多くの刊行物に記載されている。Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Eddition 1984,Pierce Chemical Company,Rockford,illinoisを参照されたい。あるいは、ペプチドは、溶液中か又は固相で小さなブロックを合成し、続いて連結して目的の配列を合成することができる。遺伝子でコードされないアミノ酸を結合するペプチドは、調製のための合成法を必要とする。
「固体支持体」という用語は、標識溶液に不溶性、かつ不活性であり、更に連結基で官能基化することができる任意の基質をいう。適切な固体支持体は、無機の硅酸塩ガラス（silicate glass）、シリカ又はアルミナビーズ、及び有機のポリスチレン、ポリアクリルアミド又はセファデックス（Sephadex）のような糖ポリマーを含む。本発明の好適な固体支持体は、市販のアルキルアミノ官能基化された調節多孔性ガラス（controlledpore glass）、アガロース、アクリル樹脂及びシリカである。このアミノ基は、支持体に連結基を結合するための反応部位として作用する。最も好適な支持体は、立体的な妨害が少ない連結基の結合を提供する長鎖アルキルアミノ調節多孔性ガラス支持体である。この支持体は、チューブに含有された粉末又はボールとして、又は容器の内側の被覆として提供されることができる。金属−配位子錯体を作成するためには、この支持体が、錯体溶液の容易な通過、回収及び濾過を可能にするカラム内にあることが好適である。
「連結基」という用語は、支持体又はその官能基化された基に共有結合して、配位子の配位性原子との結合を形成することができる化学物質のことをいう。適切な連結基は、錯体形成性金属の非存在下で支持体上に配位子を固定化することができ、更に金属と配位子の配位性原子との間の配位結合の形成時に配位子の放出を可能にするものである。連結基の必須の特徴は、錯体形成反応条件下で、その物質ごと支持体に結合したまま残ることにある。連結基は、配位子中の配位性原子の型により選択される。配位性原子が硫黄である時、金属で開裂しうるチオール保護基が連結基（linker）として作用することができる。金属により開裂しうるチオール保護基の幾つかの例は、Greene and Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley & Sons,New York,1991に記載されている。例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジルのような種々のパラ置換ベンジル基；トリフェニルメチル；ｔ−ブチル；アダマンチル；ジヒドロピラン；及びマレイミドを使用することができる。市販のアルキルアミンガラス支持体は、アミド基を介して支持体に連結基を結合させるジヒドロピランカルボン酸と、支持体を反応させることにより、ジヒドロピラン連結基のようなチオール保護基で官能基化することができる。次にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で支持体と配位子を反応させることにより、選択した配位子をジヒドロピラン官能基化支持体に結合することができる。
特別な特徴として、本発明の組成物は、配位子の金属配位性硫黄原子と金属で開裂しうる結合を形成するマレイミド連結基で官能基化される固体支持体よりなる。マレイミドは、例えばアルキルアミン官能基化した形の支持体を得て、ギ酸Ｎ−マレイミドエチル又はマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma）のような適切なマレイミドエステルと反応させるという、確立した化学的方法により種々の固体支持体に結合させることができる。次に重炭酸ナトリウムの存在下でこの支持体を配位子と反応させることにより、このマレイミド官能基化支持体に、ペンダントスルフヒドリル基を結合している選択した配位子を結合させることができる。
配位性原子がアミノ窒素である時、適切な連結基は、金属で開裂しうるアミノ保護基、例えばトリクロロエチルエステル、トリメチルシリルエチルエステル及びフェニル−エチルエステルのようなエチルエステル；並びにビニルエステル；及びアリルエステル基を含む。これらのアミノ保護基は、配位子に結合し、金属で開裂しうるカルバミン酸塩を形成する。配位性原子がアミド窒素である場合には、適切な連結基は、アリル基のような金属で開裂しうるアミド保護基を含む。酸素配位性原子を含有する配位子は、メチルチオメチル及びｔ−ブチルチオメチルのような金属で開裂しうるヒドロキシ保護基である連結基に結合することができる。金属で開裂しうる保護基の結合と開裂のための条件と試薬は、GreeneとWuts（上記）に記載されている。
「金属」又は「錯体形成性金属」という用語は、配位子の金属配位性原子と安定な配位結合を形成することができる状態にある任意の金属原子のことをいう。錯体を形成することができる金属は、遷移金属、ランタニド金属及びアクチニド金属を含む。ＭＲＩに使用するために、この金属は、二価及び三価クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、イッテルビウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム及びガドリニウムのような常磁性金属原子であってよい。ＭＲＩ用のより好適な金属は、ガドリニウムやマンガンのような強い磁気モーメントを示す金属である。これらの金属のハロゲン化塩、特にクロリド塩、又は酸化物は、目的の配位子と錯体形成することができる形であり、本発明に適している。放射性核種で標識した画像化剤は、レニウム−１８６及び−１８８のようなβ−放射体；及びテクネチウム−９９ｍのようなγ−放射体を含む金属同位元素を利用している。その６時間という有利な半減期、及びモリブデン−９９発生機から安価に調製できるために、放射性診断画像化に最も好適な金属はテクネチウム−９９ｍである。テクネチウム及びレニウム標識は、当該分野で確立している方法により達成される。どちらかの金属を、塩化第一スズのような適切な還元剤により、オキソ、ジオキソ又はニトリドの形、例えば過テクネチウム酸塩（99mＴｃＯ4-）又は過レニウム酸塩で水溶液中の配位子に導入することができる。あるいは、放射性診断剤は、テクネチウムのグルコン酸塩、ヘプタグルコン酸塩、酒石酸塩又はクエン酸塩のような弱い金属錯体の形で金属の使用を必須とするトランスキレート化（transchelation）反応により、目的の標識配位子を得ることにより調製することができる。トランスキレート化反応は、典型的には、この弱い錯体から配位子との錯体へのテクネチウムの変換を促進するために、例えば沸騰水浴中で加熱される。
本発明の方法により、配位子−標的分子結合体は、錯体形成性金属で標識されて、実質的に非標識結合体を含まない溶液を与える。一般に、この方法は、結合体の配位子が、金属で開裂しうる連結基を介して固体支持体に共有結合している組成物を得る工程；この支持体に錯体形成性金属を導入し；そしてこの支持体から放出された標識結合体を回収する工程よりなる。この方法で、この金属は、連結基に結合した配位子の金属配位性原子と配位結合を形成して、配位子原子と支持体との間の共有結合を開裂させる。その結果、標識結合体のみが支持体から放出される。
本発明の別の方法により、配位子は、錯体形成性金属で標識されて、実質的に非標識配位子を含まない溶液を与える。第１図に示されるように、この方法は、マレイミド連結基が、固体支持体と配位子の金属配位性硫黄原子に結合している組成物を得る工程よりなる。本発明の方法は配位性硫黄原子を結合している種々の金属錯体の製造に使用することができるが、特に有用な適用は、診断用画像化剤の製造である。特定の実施態様において、本発明の方法は、更にこの金属標識配位子を標的分子と結合して結合体を形成する工程よりなる。結合基を結合している配位子を、標的分子上の対応する反応基と反応させて、安定な共有結合を形成させることにより、結合体を形成させることができる。例えば、配位子のエステル基を標的分子のアミノ基と反応させるか、又は反対に配位子のアミノ基を標的分子のエステル基と反応させて、アミド結合を形成させることができる。配位子と標的分子の両方がペプチドである時、結合体は、最も好適にはペプチド結合を介して形成される。
本発明の方法の具体的な実施態様において、ペプチドのメルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）をテクネチウム−９９ｍで標識して、放射性診断用腎画像化剤を調製した。固相合成によりグリシル−グリシル−グリシンを合成して、続いてメルカプト酢酸で誘導体化してＭＡＧ３を得た。次に、マレイミド官能基化調節多孔性ガラス支持体に、pH６．８でこのペプチドの溶液をシリンジにより導入した。数時間後この溶液を濾過して、結合させた支持体をメタノールとジクロロメタンで洗浄し、次に乾燥した。この支持体は、市販の長鎖アルキルアミンガラス支持体への、トリエチルアミンとジメチルホルムアミド中のマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの添加により最初に調製した。この支持体を濾過し、メタノールで洗浄して、次に乾燥した。99mＴｃをヘプタグルコン酸第一スズとの過テクネチウム酸塩としてＭＡＧ３を結合させた支持体に添加して、次に錯体形成を促進するために加熱した。１０分後、事実上全てのテクネチウムがＭＡＧ３と錯体を形成して、もはやＭＡＧ３は支持体に固定されていなかった。
本発明の方法の別の具体的な実施態様において、ＭＡＧ３をジヒドロピラニル官能基化支持体上に結合させた。長鎖アルキルアミンガラス支持体に、真空下でジメチルホルムアミド中のジヒドロピランカルボン酸ナトリウム塩と、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ）を添加することにより、このジヒドロピラニル支持体を調製した。３時間後、支持体を濾過して、ジクロロメタン、水及びエーテルで洗浄して、次に乾燥した。ＤＭＦ中のペプチドの溶液をアルゴン下で添加することにより、ＭＡＧ３を支持体上に結合させた。数時間後、支持体を濾過して、ＤＭＦとジクロロメタンで洗浄して、次に乾燥した。
実施例１
Ｓ−保護メルカプトアセチル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの調製：
０℃でエタノール（１００ml）中のチオ安息香酸（５．７４ｇ、４１．６mmol）のパージした撹拌溶液に、水酸化カリウム（２７．８ml、３N、８３．２mmol）、続いてエタノール（３０ml）中のヨウド酢酸（７．７０ｇ、４１．６mmol）を添加した。この溶液を室温でアルゴン下で１０時間撹拌した。エタノールを減圧濃縮（rotavapped）し、橙色の固体生成物を水（４０ml）に溶解した。この溶液を、橙色の沈殿物が生成するpH２．０までの酸性とした。これを濾過し、水で洗浄し、真空下で乾燥して、橙−桃色の固体であるベンゾイルメルカプト酢酸（７．９８ｇ、収率９９％）を得た。
ジオキサン（１００ml）中のベンゾイルメルカプト酢酸（９．２０ｇ、４６．９mmol）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５．４１ｇ、４６．９mmol）の撹拌溶液に、ジオキサン（４０ml）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（９．７０ｇ、４７mmol）の溶液を添加した。この反応物を１２時間撹拌し、続いて４℃に冷却し、濾過し、ジオキサンを減圧濃縮して、白色固体を得た。これを冷イソプロパノールと一緒にこね、濾過し、真空下で乾燥した（１０．８ｇ、収率７８％）。ベンゾイルメルカプト酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２００mgを熱酢酸エチル５００mgから再結晶した。
水（２０ml）中の固相合成により調製したグリシル−グリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）（９４５mg、５mmol）と重炭酸ナトリウム（８５０mg）の撹拌溶液に、アセトン（２０ml）中のベンゾイルメルカプト酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．４７ｇ、５mmol）の溶液を滴下により添加した。この溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を１０mlまで減圧濃縮して、濃塩酸を滴下により添加して、白色沈殿物のＮ−（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｎ−Ｓ−ベンゾイル−ＭＡＧ３）を形成させた。これを濾過し、水で洗浄して、真空下で乾燥した（収量：１．７０ｇ、９２．４％）。
ジヒドロピラニル支持体の調製：
真空下で、長鎖アルキルアミンガラス支持体（孔径５００Å、粒径１２５〜１７７μ、（Sigma）（３．０ｇ、３００μmol）に、ジメチルホルムアミド（２０ml）中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ）（２．０ｇ、３．３mmol）とジヒドロピランカルボン酸ナトリウム塩（４８３mg、３．３mmol）の溶液を添加した。この橙色の溶液を３時間振盪した。この支持体を濾過し、ジクロロメタンで洗浄して、次に乾燥した。
支持体上のジヒドロピランの結合をチェックするために、以下の工程を行った：ジヒドロピランを結合させたガラス支持体（１００mg）に、ジクロロメタン（１．５ml）中のメルカプトエタノール（３５０μl）の溶液を添加した。２時間後、この支持体を濾過して、チオール臭が消失するまでジクロロメタンで洗浄した。支持体（６０mg）をＤＭＦ／ピリジン（２ml、３：１）中の塩化ジメトキシトリチル（８００mg）で一晩１６時間誘導体化した。このトリチル化支持体を濾過して、ジクロロメタンで数回洗浄した。支持体７mgから過塩素酸／エタノール（１０ml、３：２）中にジメトキシトリチル基が開裂して、５分後に暗橙色になった。上澄液の希釈とＵＶ解析により、ジヒドロピラン結合を間接的に測定して少なくとも７３．１μmol/gであることが分った。
ジヒドロピラニル支持体へのＭＡＧ３の結合：
硫黄保護ＭＡＧ３（Ｎ−Ｓ−ベンゾイル−ＭＡＧ３）を以下の工程により脱保護した。水（１０ml）中のベンゾイル−ＭＡＧ３（３７０mg、１mmol）の溶液に、アルゴン下で水酸化ナトリウム溶液（４４０μl、５N、２．２mmol）を添加した。この溶液を１０分間６０℃に加熱後、この溶液を塩酸（２N、２．２mmol）でpH２まで酸性にした。この溶液を減圧濃縮して、淡黄色の油状物を得た。
真空下で、ジヒドロピラン結合ガラス支持体（２００mg）に、ジメチルホルムアミド（５．０ml）中のＭＡＧ３（１mmol粗生成物）の溶液をアルゴン下で添加した。添加の際、発熱を検出した。この溶液を１６時間撹拌し、次に濾過し、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタンで洗浄し、次に真空下で乾燥した。
実施例２
マレイミド官能基化ＣＰＧ支持体の調製：
長鎖アルキルアミンを充填したガラス支持体（Sigma）（３００mg、３０μmol）に、真空下でジメチルホルムアミド（５ml）中のマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma）（１００mg、３７５μmol）とトリエチルアミン（１００μl）の溶液を添加した。この溶液を１６時間振盪し、濾過し、メタノールで洗浄して、真空下で乾燥した。アミンに関するニンヒドリン試験は、反応の終了を示す陰性であった。
マレイミド官能基化支持体の調製は、また、以下の工程により達成した。ガラス支持体（３．０ｇ）に、真空下でＤＭＦ（２０ml）中のマレイミドプロピオン酸（５５８mg、３．３mmol）、ＥＤＣｌ（２．０ｇ、９．９mmol）、及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１当量、３３０μmol）の溶液をシリンジにより添加した。この溶液を一晩回転させ、続いて濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥した。
マレイミド支持体を調製する最も好適な方法は、以下の工程により達成した。長鎖アルキルアミンを結合させたガラス支持体（Sigma）（５００mg、５０μmol）に、真空下で、水：アセトン（３ml、１：１）中のマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５０mg、１８５μmol）の溶液を添加し、重炭酸ナトリウム（１０mg）でpH７．５に緩衝化した。この溶液を、２時間振盪した。ニンヒドリン試験は、陰性であり反応の終了を示した。このマレイミドを結合した支持体を濾過し、水で洗浄し、真空下で乾燥した。
マレイミド支持体へのＭＡＧ３の結合：
方法１．  マレイミドを結合させたガラス支持体（２００mg）に、真空下で、ジメチルホルムアミド（５．０ml）中のメルカプトアセチル−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ（１mmol粗生成物）の溶液をアルゴン下で添加した。添加の際、発熱を検出した。この溶液を１６時間振盪し、次に濾過し、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタンで洗浄し、次いで真空下で乾燥した。
方法２．  あるいは、ＭＡＧ３を以下の工程によりマレイミド支持体上に結合した。ベンゾイルメルカプトアセチル−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ（３３５mg、０．９１mmol）の溶液に、アルゴン下で水酸化ナトリウム溶液（４００μl、５N、２．０mmol）を添加した。５０℃で３０分間この溶液を加熱後、塩酸（２N、２．２mmol）でこの溶液をpH６．５までの酸性とし、次に重炭酸ナトリウム溶液でpH６．８にした。この溶液を濾過し、真空排気したマレイミド結合ガラス支持体（１．５０ｇ）にシリンジにより添加した。この反応物を数時間回転させて、次にフィルターフリット（filter frit）上でメタノールで洗浄し、次いでジクロロメタンで洗浄し、濾過して、真空下で乾燥した。アミノ酸分析は、７．３μmol/gの結合を示した。
方法３．  好適には、以下の工程によりＭＡＧ３をマレイミド支持体上に結合させた。水（４ml）中のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（１１０mg）の溶液に、アルゴン下で水酸化ナトリウム溶液（５N）を添加した。この溶液を５０℃で１０分間加熱後、塩酸（２N）でこの溶液をpH６．５までの酸性とし、次に重炭酸ナトリウム溶液でpH７にした。この溶液を濾過し、真空排気したマレイミド結合ガラス支持体（５００mg）にシリンジにより添加した。この反応物を４時間振盪し、濾過し、水、次いでエーテルで洗浄して、真空下で乾燥した。
９９ｍ−ＭＡＧ３のクロマトグラフィーによる標準化：
テクネチウム標識ＭＡＧ３と、従来の溶液法により調製した弱い錯体99mＴｃ−グルコン酸を、固体支持体上のトランスキレート化反応の程度を測定するための３つのクロマトグラフィー系で標準化した。１．５mlのチューブに、Ｎ−Ｓ−ベンゾイル−ＭＡＧ３の０．５mg、生理食塩水２００μl、過テクネチウム酸塩１００μl及びグルコン酸第一スズ（塩化第一スズ５０μgとグルコン酸ナトリウム１mg）１００μlを導入することにより、99mＴｃ−ＭＡＧ３を調製した。このチューブにフタをして沸騰水浴に１０分間入れた。99mＴｃ−グルコン酸塩を、生理食塩水２００μl、過テクネチウム酸塩１００μl及びグルコン酸第一スズ１００μlから調製した。
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マレイミド支持体上のＭＡＧ３の標識：
方法２により調製し、水アスピレーターにより真空排気したＭＡＧ３を結合した調節多孔性ガラスマレイミド支持体２６０mgに、生理食塩水３００μl、過テクネチウム酸塩２００μl及びグルコン酸第一スズ１００μlの混合物を添加した。１０分後、室温で反応の進行をチェックするために真空を解除した。薄層クロマトグラフィー（ワットマン（Whatman）Ｎｏ．１紙細片／アセトニトリル：水）は、99mＴｃ−ＭＡＧ３の少量の形成を示したが、多くの99mＴｃ−グルコン酸は残っていた。
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この反応混合物を１０mlのチューブに移して、フタをして、真空排気し、１０分間沸騰水浴中に置き、錯体形成を促進させた。薄層クロマトグラフィーは、99mＴｃ−ＭＡＧ３への99mＴｃ−グルコン酸の完全なトランスキレート化を示した。
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実施例３
マレイミド官能基化アガロース支持体の調製：
膨潤したアルキルアミン官能基化架橋アガロース支持体（Biorad AffiGel 102）３ｇに、０℃で重炭酸塩水溶液６ml中のギ酸Ｎ−マレイミドエチル１００mgの溶液を添加した。時々振盪しながら３０分後、この支持体を室温で１時間機械的に振盪した。この支持体を濾過し、水で３回洗浄して、再度濾過した。
マレイミド官能基化アガロース支持体へのＭＡＧ３の結合：
マレイミド官能基化支持体１ｇに、重炭酸塩水溶液３ml中のＭＡＧ３  ５mgの溶液を添加した。この反応物を室温で１２時間振盪した。この支持体を濾過し、水で洗浄し、次に再度濾過して、この膨潤したビーズから過剰の水を除去した。アミノ酸分析は、６．１２μmol/g（乾燥）を示した。
マレイミド官能基化アガロース支持体への配位子−標的分子結合体の結合：
マレイミド官能基化支持体１ｇに、重炭酸塩水溶液３ml中の配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ（Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ配位子；Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ標的ペプチド）２５mgの溶液を添加した。この反応物を０℃で３０分間振盪した。この支持体を濾過し、水で洗浄し、次に再度濾過して、この膨潤したビーズから過剰の水を除去した。アミノ酸分析は、５．０μmol/g（膨潤）又は９９．５μmol/g（乾燥）を示した。
標識：
栓の付いたガラスシリンジ容器中の充填アガロース支持体（１００mg）に、過テクネチウム酸塩（１０mCi、１０μl）、生理食塩水（１００μl）、及びグルコン酸第一スズ溶液（１００μl）を添加した。混合するためこの容器を穏やかに振盪し、次に沸騰水浴中で１０分間加熱した。少量の生理食塩水又はエタノールを支持体の上から添加し、続いて溶出液を注射により真空バイアル瓶（vacutainer vials）中に引き込むことにより、溶出液画分を回収した。キャピンテク（Capintec）ガンマカウンターで各画分の活性を測定した。次に最初の画分を純度（標識配位子対標識過テクネチウム酸塩及び他の標識不純物）を評価するためＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
ＭＡＧ３標識生成物は、純度８０．５％であり、一方配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ標識生成物は、純度８６．３％であった。
実施例４
マレイミド官能基化シリカの調製：
真空排気した３−プロピルアミン官能基化シリカ支持体（Aldrich ３６，４２５−８）１．０ｇに、０℃で、重炭酸塩水溶液４ml中のギ酸Ｎ−マレイミドエチル５０mgの溶液を添加した。時々振盪しながら４５分後、水１６mlを添加した。この支持体を室温で１５分間機械的に振盪し、次に濾過して、水で洗浄した。
マレイミド官能基化シリカ支持体へのＭＡＧ３の結合：
マレイミド官能基化シリカ支持体１ｇに、重炭酸塩水溶液３ml中のＭＡＧ３の２０mgの溶液を添加した。この反応物を氷水浴中で１２時間振盪し、次に室温にした。この支持体を濾過し、水で洗浄し、次に再度濾過して、膨潤したビーズから過剰の水を除去した。アミノ酸分析は、７８．４μmol/g（乾燥）を示した。
マレイミド官能基化シリカ支持体上のＭＡＧ３の標識：
栓の付いたガラスシリンジ容器中の結合させた支持体（１００mg）に、過テクネチウム酸ナトリウム（１０mCi、１００μl）、生理食塩水（１００μl）、及びグルコン酸第一スズ溶液（１００μl）を添加した。混合するためこの容器を穏やかに振盪し、次に沸騰水浴中で１０分間加熱した。少量の生理食塩水又はエタノールをこの支持体の上から添加し、続いて溶出液を真空バイアル中に引き込むことにより、溶出液画分を回収した。キャピンテク（Capintec）ガンマカウンターで各画分の活性を測定した。次に最初の画分をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析は、純度９７．１％と評価した（標識ＭＡＧ３対標識過テクネチウム酸塩及び他の標識不純物）。
実施例５
マレイミド官能基化アクリル樹脂支持体の調製：
真空排気したアルキルアミン官能基化アクリル樹脂支持体（Sigma）１．５ｇに、０℃で重炭酸塩水溶液１０mlの溶液、続いて粉末化ギ酸Ｎ−マレイミドエチル１５５mgを添加した。時々振盪しながら２０分後、この支持体を室温で１．５時間機械的に振盪した。この支持体を濾過し、水、次いでメタノールで洗浄し、次に濾過して、真空下で乾燥した。
マレイミド官能基化アクリル樹脂支持体へのＭＡＧ３の結合：
マレイミド官能基化アクリル樹脂支持体１ｇに、重炭酸塩水溶液３ml中のＭＡＧ３の２０mgの溶液を添加して、この反応物を室温で３時間振盪した。この支持体を濾過し、水で洗浄し、次に再度濾過して、膨潤したビーズから過剰の水を除去した。アミノ酸分析は、１７．４μmol/g（乾燥）を示した。
マレイミド官能基化アクリル樹脂支持体への配位子−ペプチド結合体の結合：
マレイミド官能基化アクリル樹脂支持体１ｇに、重炭酸塩水溶液３ml中の配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ２５mgの溶液を添加した。この反応物を室温で４時間振盪した。この支持体を濾過し、水で洗浄し、次に再度濾過して、この膨潤したビーズから過剰の水を除去した。アミノ酸分析は、２９μmol/g（乾燥）を示した。
標識：
栓の付いたガラスシリンジ容器中の結合させたアガロース支持体（１００mg）に、過テクネチウム酸ナトリウム（１０mCi、１００μl）、生理食塩水（１００μl）、及びグルコン酸第一スズ溶液（１００μl）を添加した。混合するためこの容器を穏やかに振盪し、次に沸騰水浴中で１０分間加熱した。少量の生理食塩水又はエタノールをこの支持体の上から添加し、続いて注射により溶出液を真空バイアル中に引き込むことにより、溶出液画分を回収した。キャピンテク（Capintec）ガンマカウンターで各画分の活性を測定した。次に純度（標識配位子対標識過テクネチウム酸塩及び他の標識不純物）を評価するために、最初の画分をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
ＭＡＧ３標識生成物は、純度９７％であり、一方配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ標識生成物は、純度８５％であった。
実施例６
マレイミド官能基化調節多孔性ガラス支持体上の配位子の標識：
実施例２に記載された方法で調製したマレイミド官能基化調節多孔性ガラス支持体に、ＭＡＧ３と配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲを結合した。実施例３〜５に記載された方法により、この固定化配位子を標識した。キャピンテク（Capintec）ガンマカウンターで溶出液の最初の画分の活性を測定して、純度を評価するためＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ＭＡＧ３標識生成物は純度９３％であり、一方配位子−ペプチド結合体Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲは純度５９．７％であった。
【図１】
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