(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分である２５ＭＵ／ｍｌ以下のヒトインターフェロン−βと、
ｐＨを５〜８に調節する緩衝剤と、
メチオニンと、を含み、
ヒト血清アルブミンを含まず、
組成中に０．３〜５重量％の酸性アミノ酸、アルギニンまたはグリシンを含まないという条件で、３ヶ月間２５℃に保存した後のＣＰＥ法によるインビトロでの生物活性が、初期活性の少なくとも８０％であるという長期安定性を示す液状組成物。
【請求項２】
ｐＨを６〜７．２に調節する緩衝剤を含むことを特徴とする、請求項１記載の液状組成物。
【請求項３】
グルコシル化インターフェロン−βを含むことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
上記インターフェロン−βが、ＣＨＯ細胞由来であることを特徴とする、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
上記緩衝剤を、１０ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの濃度で含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤およびこれらの混合物のうちから選ばれた緩衝剤を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
リン酸塩／クエン酸塩緩衝剤を含むことを特徴とする、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ｐＨが６から７．２の間であることを特徴とする、請求項１および３〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
活性成分を除いて、ヒトまたは動物のポリペプチドを含まないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
界面活性剤を含まないことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
６か月間２５℃で保存後も化学的に不変であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
６か月間２５℃で保存後も物理的に不変であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
１種または複数種のアミノ酸をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
上記メチオニンが０．１〜４ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
等張度を調整するための添加剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
粘度を増すための増粘剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
生理学的に許容可能な保存剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかの液状組成物を含むことを特徴とする製剤。
【請求項１９】
経口用、非経口用または眼科用の請求項１８記載の製剤。
【請求項２０】
単位用量が１〜２５ＭＵの剤形である請求項１８または１９記載の製剤。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれかの組成物と、医薬品添加剤と、を配合し、適切な剤形に製剤することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれかに記載の製剤の調製方法。
【請求項２２】
組成中に０．３〜５重量％の酸性アミノ酸、アルギニンまたはグリシンを含まないという条件で、
ヒト血清アルブミンを含まず、および、１種または複数のアミノ酸を含むことを特徴とする、
活性成分であるヒトインターフェロン−βと、ｐＨを５〜８に調整する緩衝剤と、メチオニンと、を含む液状組成物の保存期間を改良する方法。
【請求項２３】
改良された保存期間が、ＣＰＥ法によるインビトロでの生物活性、化学的不変性または／および物理的不変性という改良された長期安定性を包含することを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトインターフェロン−βの液状組成物に関する。この組成の特徴は、組成が弱酸性から中性であるｐＨ５から８の範囲にあることと、溶液中でインターフェロン−βが極めて安定で分子的に変化を受けないことである。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在するインターフェロンは種に特異なタンパク質または場合によっては糖タンパク質であり、ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、その他のポリヌクレオチドおよび抗原などの刺激を受けて体内の各種の細胞で産生される。インターフェロンは多くの生物活性を示し、例をあげれば、抗ウイルス性、抗増殖性、および免疫調節性などの性質を示す。ヒトインターフェロンでは少なくとも３種類の異なったタイプのものが見出されており、これらは白血球、リンパ球、線維芽細胞、免疫系の細胞で産生され、α−、β−およびγ−インターフェロンと名付けられている。個々のタイプのインターフェロンはさらに細かく分類でき、多くの亜種がある。
【０００３】
天然型のヒトインターフェロン−βは、ポリ−ＩＣによるヒト線維芽細胞の培養物を超誘導し、次いでクロマトグラフィーや電気泳動のテクニックを使用してインターフェロン−βを単離、精製するすることにより、商業的に生産することができる。天然のインターフェロン−βと類似の性質を示すタンパク質やポリペプチドも、組換えＤＮＡ技術により生産できる（欧州特許出願第０  ０２８  ０３３号、欧州特許出願第０ ０４１ ３１３号、欧州特許出願第０  ０７０  ９０６号、欧州特許出願第０ ２８７ ０７５号、Chernajovsky et al, (1984) DNA 3, 297-308、 McCormick et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 166-172などを参照）。組換えヒトインターフェロン−βは真核生物細胞（たとえばＣＨＯ細胞）および原核細胞（たとえば大腸菌）において生産可能である。問題にしているインターフェロンは、それぞれインターフェロン−β−１ａおよびインターフェロン−β−１ｂと名付けられているものである。インターフェロン−β−１ｂとは対照的に、インターフェロン−β−１ａはグリコシル化されている（Goodkin, (1994) Lancet 344, 1057-1060参照）。
【０００４】
インターフェロン−βを治療に用いる場合、そのタンパク質が長期間にわたって保存安定性を持ち、分子的に変化を受けないように製剤することが必須となる。インターフェロン−βは不安定で、各種の分解反応を受けやすい。これらの反応としては、特に、ペプチド結合の切断、脱アミド反応、メチオニンの酸化によるメチオニンスルフィドの生成、ジスルフィド交換反応、糖側鎖の変化で脱グリコシル化までも含むものがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
インターフェロンが治療面で効果があるため、近年各種の組成物が開発されてきた。しかし、そのいずれもがなにがしかの欠点を持っている。米国特許第４，６４７，４５４号（Inter-Yeda Ltd.社）には、線維芽細胞インターフェロン−βの製剤が記載されており、高い酸性領域（ｐＨ  ３．５）でポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することにより安定化できるとされている。その他の好ましい添加剤としては、マンニトール、ヒト血清アルブミン、酢酸塩緩衝剤などがある。この組成物は凍結乾燥し、４℃で保存する。
【０００６】
特開昭５９−１８１２２４号公報（住友化学工業（株））には、インターフェロンを安定化させるために、ヒト血清アルブミンに加えて、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、トレオニン、およびこれらのナトリウム塩といった極性アミノ酸を用いる、インターフェロンの水溶液が記載されている。
【０００７】
国際特許出願第９５／３１２１３号（Applied Research Systems ARS Holding社）には、ポリオール（好ましくはマンニトール）と、非還元性糖またはアミノ酸との添加により安定化させたインターフェロン−βの液状組成物が記載されている。この組成物にはさらに、緩衝剤（酢酸塩緩衝剤ｐＨ３．０〜４．０）とヒト血清アルブミンとが含まれている。ｐＨ５〜６の組成物では生物活性が急速に低下するため、特許明細書において好ましいとしている組成物では、ｐＨの値が３．０〜４．０の時に十分安定となっている。さらに、安定性に関する記述は組成物の生物活性に触れられているだけで、活性成分に対する分子的な変化については述べられていない。
【０００８】
欧州特許出願第０ ２１５ ６５８号（Cetus Corp.社）には、組換えインターフェロン−βの組成物が記載されており、そこではヒト血清アルブミンまたはヒト血漿タンパク質画分、さらに適当ならばデキストロースのような安定化剤を添加し、ｐＨを２から４の間にした水性媒体中にこの生理活性化合物を溶解している。Cetus Corp.社の別の特許出願（国際特許出願第８９／０５１５８号）にもインターフェロン−βの組成物が記載されており、そこではグリセリンまたはポリエチレングリコポリマーで平均分子量が１９０から［原文通り］１６００ダルトンのものを安定化剤として用い、ｐＨを２〜４にしており、緩衝剤成分としてグリシン、リン酸、クエン酸が適しているとされている。
【０００９】
欧州特許出願第０ ２１７ ６４５号（Cetus Corp.社）には、ＩＬ−２またはインターフェロン−βの製剤について述べられており、ｐＨ７〜８でこれらを添加物媒体に溶解し、ラウリン酸ナトリウムを界面活性剤として添加して安定化させている。さらに、これらの製剤を安定化させるために、イオン性界面活性剤としてＳＤＳも必要である。
【００１０】
欧州特許第０ ２７０ ７９９号（Cetus Oncology Corp.社）には、安定化剤として非イオン性のポリマー系洗浄剤を含む不活性な水系添加物媒体中における、非グリコシル化組換えインターフェロン−βのための組成物が記載されている。
【００１１】
欧州特許出願第０ ５２９ ３００号（Rentschler Biotechnologie GmbH社）には、液状インターフェロン−β組成物が記載されており、３０または７０ＭＵ／ｍｌの濃度の組換えＩＦＮ−β、塩化ナトリウム、およびイミダゾール緩衝剤またはリン酸ナトリウム緩衝剤からなり、ｐＨが７．５（実施例３）のものである。これらの組成物では、その生物活性に関しては、保存温度２５℃で４週間は安定である。しかしながら、これらの組成物の欠点は、使用されたインターフェロン−βの濃度（３０ＭＵ／ｍｌ以上）が実用には高すぎることである。さらに、この欧州特許出願第０  ５２９  ３００号では、ヒト血清アルブミンを添加すると液状インターフェロン−β組成物の安定性が低下することには、触れられていない。その反対に、ヒト血清アルブミンの添加が、好ましいとしている。
【００１２】
インターフェロン−βの組成物に加えて、インターフェロン−αの医薬用投与形態についての記載もある。欧州特許明細書第０ ０８２ ４８１号（Schering Corp.社）には、凍結乾燥のための水性組成物が開示されており、リン酸塩緩衝剤とグリシンに加えてヒト血清アルブミンが含まれている。さらに成分として加えてよいものとして、アラニンが記されている。これを再溶解（reconstitution）すると、溶液のｐＨは７．０と７．４の間になる。Schering Corp.社の別の特許出願（国際特許出願第９６／１１０１８号）には、インターフェロン−αの安定な水溶液が開示されており、これには、キレート化剤（ＥＤＴＡナトリウムまたはクエン酸）、界面活性剤（ポリソルバット（Polysorbat）８０）、等張化剤（塩化ナトリウム）およびメチルパラベン、プロピルパラベン、ｍ−クレゾール、フェノールなどの適切な保存剤が含まれ、ｐＨは４．５〜７．１である。生物活性（W.P. Protzman, J. Clinical Microbiology, 1985, 22, pp. 596-599に記載されているような、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）を抑制する標準的な方法）に関しては、この開示された水性組成物は２５℃で６か月の間安定であることが示された（生物活性が、初期活性の９０％以上）。しかしながら、それと並行して行われたＨＰＬＣによるタンパク質含量の測定では、２５℃で６か月後には、その含量が２０．２％（表３）から３２．５％（表４）減少していることがわかっている。
【００１３】
欧州特許出願第０ ７３６ ３０３号（Hoffman-LaRoche AG社）では、インターフェロン−αに加えて、非イオン性洗浄剤、ｐＨを４．５から５．５の範囲にするための緩衝剤、ベンジルアルコール、それに、必要に応じて等張化剤を含む水性インターフェロン−α組成物が開示されている。インターフェロン−α２ａの初期濃度を１８ＭＵとし２５℃で３か月保存後に、ＨＰＬＣによる測定で残存含量が８４．５％であることがわかった。しかし、安定化剤のベンジルアルコールを入れないと、この数値は６２．８％まで低下する。
【００１４】
欧州特許出願第０ ６４１ ５６７号（Ciba Geigy AG社）には、ハイブリッドインターフェロン−αと、安定化剤としてのｐＨが３．０から５．０の間の緩衝剤からなる医薬用組成物が記載されている。
【００１５】
米国特許第５，３５８，７０８号（Schering Corp.社）にはインターフェロン−αの水性組成物が記載されていて、安定化剤として、メチオニン、ヒスチジン、あるいはこれらの混合物を含んでいる。インターフェロン溶液を４０℃で２週間保存すると、活性成分含量は２０％低下していることがわかった。
【００１６】
上述のインターフェロンのための組成物は、たとえば、血液提供者からのウイルスによる汚染に対する安全性が一段と必要とされてきているので、タンパク質を安定化させるためにヒト血清アルブミンを添加することは、避けるべきであるため、現時点で見れば欠陥がある。さらに、上記組成物の多くで、アミノ酸の添加および／または凍結乾燥を必要としている。しかし、凍結乾燥製品はその製造工程が複雑で、そのため高価になり、また再溶解の必要があるので余分な手間がかかり、特に運動能力が限られた患者の場合にはこの余分な手間が負担になることが多い。一連の組成物では生理学的には問題のある５．０以下のｐＨ値となっている。このような値が全く異常であるというわけではないが（S. Sweetana and N.J. Aders, Journal of Pharamaceutical Sciences and Technology, 1996, 50: 330-342を参照）、筋肉内注射や皮下注射の場合には、間違いなく疼痛刺激をもたらすであろう。Sweetana および Akers によれば、ポリソルバット８０のような界面活性剤を使うことが可能であるとしているが、特に新生児あるいは乳幼児で一連の副作用が報告されているので、そのような添加剤使用には疑問がある。界面活性剤の毒性は Attwood および Florence によりまとめられている（Surfactant Systems, their Chemisty, Pharmacy and Biology, Chapman and Hall; London, 1983）。ポリソルバット８０の薬理学については R.K. Varma らの総説がある（Arzneim.-Forsch./ Drug Res. 35, 1985, 804-808）。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上述のような欠点を配慮して、インターフェロン−βの最適な組成物は、以下の性質を合わせ持つものでなければならない。
−保存期間中、生物活性を維持すること、
−保存期間中、活性成分分子に分子的な変化がないこと、
−液状組成物であって、コストのかかる凍結乾燥や、余分な再溶解の手間を必要としないこと、
−ヒト血清アルブミンまたは界面活性剤（洗浄剤）といった危険な添加剤を使用しないこと、
−ｐＨは中性から弱酸性の範囲にすること。
【００１８】
本発明ではこれらの要件をすべて満たしている。これについて、以下により詳細に述べる。
【００１９】
驚くべきことに、好ましくないと知られている先行技術の添加剤類に頼ることなく、生理学的に妥当な５〜８、好ましくは５．５以上から８の間のｐＨで、長期間液状のインターフェロン−βの分子に変化をもたらさないような製剤組成が見出された。
【００２０】
したがって本発明の第一の態様は、活性成分として最高２５ＭＵ／ｍｌの濃度のヒトインターフェロン−βと、ｐＨを５〜８、好ましくは５．５以上から８の間にする緩衝剤とを含み、ヒト血清アルブミンを含まず、２５℃で３か月の保存後でも初期活性の少なくとも８０％の生物活性（インビトロ（in vitro））を持つような長期間安定性の液状医薬用組成物である。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、活性成分としてのヒトインターフェロン−βと、ｐＨを６と７．２の間にする緩衝剤とを含み、ヒト血清アルブミンを含まず、２５℃で３か月の保存後でも初期活性の少なくとも８０％の生物活性（インビトロ）を持つような長期間安定性の液状医薬用組成物である。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、活性成分としてのヒトＩＦＮ−βと、ｐＨを５と８の間、好ましくは５．５以上から８の間にする緩衝剤と、１種または複数のアミノ酸を含み、２５℃で３か月の保存後でも初期活性の少なくとも８０％の生物活性（インビトロ）を持つような長期間安定性の液状医薬用組成物である。
【００２３】
液状医薬用組成物の長期安定性は２５℃で測定した。２５℃の温度を選んだのは、一つの理由としては、分解反応を加速するためであり、別の理由としては、温度が不当に高い時におきる人工的変異をさけるためである。インターフェロン−βの安定性の測定に用いる適切な分析手段はつぎの総説に記されている。J. Geigert (J. Parent. Sci. Technol. 43 (1989), 220-224) または  M.C. Manning, K. Patel and R.T. Borchardt (Pharm. Res. 6 (1989), 903-918)。
【００２４】
それぞれの場合において、定められた保存期間後における生物活性は、ウイルスの細胞変性効果の抑制についての標準的な方法で測定した。この試験方法の詳細については、Stewart, W.E. II (1981): The Interferon System (Second, enlarged Edition), Springer-Verlag: Vienna, New YorkおよびGrossberg, S.E. et al. (1984), Assay of Interferons In: Came, P.E., Cartger W.A. (eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp.23-43に述べられている。２５℃で３か月間保存した後でも、本発明の組成物は、初期活性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の生物活性を維持している。
【００２５】
２５℃で６か月間保存した後でも、本発明の組成物は、初期活性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の生物活性を維持している。
【００２６】
さらに温度を上げて、たとえば３７℃で保存しても、本発明の組成物はその生物活性が驚くほど高い長期安定性を示す。たとえば、３７℃で１か月保存しても、その初期活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の生物活性を維持している。
【００２７】
本発明による液状医薬製剤は、好ましくはヒト血清アルブミンを含まず、特に好ましくは（活性成分は別として）ヒトまたは動物のポリペプチド、特に血清タンパク質を含まないものである。さらに、本発明による液状医薬用組成物は界面活性剤を含まないことが好ましく、特にイオン性の洗浄剤および／または非イオン性界面活性剤を含まないことがさらに好ましい。
【００２８】
本発明による組成物は、活性成分としてインターフェロン−βを含んでいるが、これは、天然のヒトインターフェロン−βと同じ生物学的および／または免疫学的性質を示すポリペプチドを意味し、天然に存在するか、あるいは組換えのインターフェロン−βであってもよい。組成物にはグリコシル化インターフェロン−β、特にＣＨＯ細胞からの組換えインターフェロン−βが含まれていることが好ましい。使用するのに最も好ましいインターフェロン−β種は、ＢＩＣ８６２２（ＥＣＡＣＣ ８７ ０４ ０３ ０１）培養細胞株から得られるもので、それについては、欧州特許公報第０ ２８７ ０７５号および欧州特許出願第０ ５２９ ３００号に述べられている。
【００２９】
本発明の組成物では、活性成分は最高２５ＭＵ／ｍｌまでの濃度であることが好ましい。しかし用量は、１〜２５ＭＵ／ｍｌが好ましく、特に好ましいのは３〜２０ＭＵ／ｍｌの範囲であり、最も好ましいのは３〜１０ＭＵ／ｍｌの範囲である。高温で特に良好な安定性を示すことと共に、上記の用量範囲は、さらに希釈する必要もなく直ちに投与できる範囲である。
【００３０】
本発明の液状医薬品組成物のさらに好ましい態様は、２５℃で３か月、好ましくは６か月の保存後に、化学的変化性を示す、すなわち、ペプチドの切断、酸化、脱グリコシル化に対して安定なことである。化学的な不変性は、ペプチドマップ、ウェスタンブロット、グリコシル化分析で測定できる。本発明の目的上、化学的に安定というのは、製剤後のインターフェロン−βが、所定の保存期間後に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％の化学的不変性を持っている組成であるということである。
【００３１】
本発明の液状医薬用組成物のさらに好ましい態様は、２５℃で３か月、好ましくは６か月の保存の後で、物理的に変化を受けないことである。この場合の物理的不変性は、４２０ｎｍでの透過率測定と溶液の目視で測定する。物理的に安定であるとは、これらの溶液が、定められた保存期間後に９０％以上、好ましくは９３％以上の透過率を示し、目視で濁りが認められないことを言う。
【００３２】
驚くべきことに本発明により、生物学的、化学的、物理的に長期間安定で、しかも、好ましからざる成分、たとえば、ヒト血清アルブミンや界面活性剤などを使用しない、液状インターフェロン−β組成物が得られることになった。活性成分に加えて、本発明の組成物には緩衝剤が含まれており、その濃度は、好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ〜２００ｍｍｏｌ／ｌで、たとえば、約５０ｍｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌであり、それにより、組成物のｐＨを５〜８の範囲、好ましくは５．５以上から８まで、さらに好ましくは６〜７．４に保つ。ｐＨの範囲が６〜７．２であるのが、特に好ましく、さらに６．２〜６．８の間であれば、特に高い安定度となり分子的な変化を受けないので、最も好ましい。緩衝剤は医薬用に許容された緩衝剤から選ぶことができ、たとえば、ホウ酸塩、コハク酸塩、Ｌ−リンゴ酸塩、ＴＲＩＳ、サリチル酸塩、グリシル−グリシン、トリエタノールアミン、イソクエン酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩やこれらの混合物などの緩衝剤がある。リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩緩衝剤やこれらの混合物が好ましいが、特に好ましいのはリン酸塩／クエン酸塩緩衝剤である。
【００３３】
活性成分と緩衝剤に加えて、本発明の組成物は他の生理学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。たとえば、血液や組織に等張度を合わせるための添加剤や非還元性糖類、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはグリセリンのような糖アルコールなどである。化学的安定性をさらに増すために、本発明の組成物に、アラニン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンまたは／およびメチオニンのようなアミノ酸を１種または複数加えてもよい。この点では、メチオニンが好ましい。メチオニンの濃度は０．１〜４ｍｍｏｌ／ｌの範囲が好ましく、２ｍｍｏｌ／ｌの濃度が特に好ましい。さらに、たとえば眼科用途の場合には、粘度を上げるために組成に増粘剤を含んでいてもよい。好ましい増粘剤の例としては、眼科用途に適したもので、たとえば、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどがある。
【００３４】
さらに、本発明による組成には、保存剤が含まれていてもよい。たとえば、眼科用途では、チオメルサレートを０．００１〜０．００４％（ｗ／ｖ）の量で使用する。
【００３５】
本発明はさらに、上記のような液状インターフェロン−β含有組成物を含む製剤に関する。これらの製剤は特に、経口用、非経口的用途、あるいは眼科用途に適している。組成物は１から２５ＭＵのＩＦＮ−βを単位用量とすることが好ましい。本発明はさらに、そのような製剤の調製方法にも関しており、本発明による組成物および、適切なら、必要な他の医薬用添加剤を調合し、適切な剤形に製剤する。
【００３６】
本発明の組成物は適当な、洗浄・滅菌済みのガラスバイアル（加水分解クラス１）に、医薬用に許容されたゴム栓をして保存する。
【００３７】
さらに、本発明の組成物は、自己注射システム用にプレフィルド注射器（ready-to-use syringe）あるいはその他の容器に無菌的に充填し、利用されることもある。あまり好ましいとは言えないが、この水溶液に、当業者ではよく知られている添加剤を添加して、凍結乾燥し、それを再溶解してから液状で使用することもできる。
【００３８】
適切な保存剤を使用することで、多数回投与形式の液剤や、点眼液、経口用滴下溶液などにすることも可能である。
【００３９】
適切な剤形にするためにさらに必要な補助薬品は、当業者にはよく知られている。
【００４０】
最後に、本発明は活性成分としてのヒトインターフェロン−βとｐＨを５〜８、好ましくは５．５以上から８にする緩衝剤からなる液状組成物の有効期限を改良する方法に関するものであり、ヒト血清アルブミンを使用せず、または／および、１種または複数のアミノ酸を使用する組成物であることが特徴である。有効期限の改良とは、上に記してきたように、生物活性（インビトロ）、化学的不変性、または／および、物理的不変性などの長期間にわたる安定性の改良を包含している。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに、以下の実施例で説明する。
実施例
すべての実施例において、ＣＨＯ細胞から得たインターフェロン−βを用いた。
＜１．液状インターフェロン−β組成物の２５℃における長期安定性＞
以下の組成物について試験した。
組成物１：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムｐＨ５．０
組成物２：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌグリセリン
組成物３：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５０ｍｇ／ｍｌグリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物４：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物５：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０
組成物１７：  ７０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニンｐＨ６．５
組成物を希釈して約１０〜１５ＭＵ／ｍｌ（すなわち、１０〜１５×１０6ＩＵ／ｍｌ）の濃度にした。
【００４２】
組成物１７を除いて（下記参照）、各組成物は、加水分解クラス１のガラスバイアル（ＤＩＮ  ２Ｒバイアル）に入れ、市販のクロロブチルゴム製の栓をして、記載されている期間の間２５℃で保存された。生物活性（インビトロ）は以下の文献にしたがって行った。Stewart, W.E. II(1981), The Interferon System (Second, enlarged edition), Springer-Verlag, Vienna, New York および  Grossberg, S.E. ら (1984), Assay of Interferons, In: Came, P.E., Carter W.A. (eds.) Interferons and their Applications, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 23-43。
【００４３】
結果を表１〜５に示す。「％（ref.）」は、表記の期間中−２０℃で保存されていた参考試料の生物活性を基準にした生物活性を示している。「％（０mo.）」は０か月での初期値を基準にした生物活性パーセントである。
0004293497.tif 000002
【００４４】
0004293497.tif 000003
【００４５】
0004293497.tif 000004
【００４６】
0004293497.tif 000005
【００４７】
0004293497.tif 000006
【００４８】
上記の表から明らかなのは、驚いたことに、ヒト血清アルブミンを含まない組成物（組成物１、３、４、５）は、ヒト血清アルブミンを含む組成物（組成物２）よりも優れた安定性を示していることである。
【００４９】
組成物１７では（上記参照）、ヒト血清アルブミンを含まないインターフェロン溶液を無菌状態下で、６ＭＵ／０．５ｍｌの活性に調製した。次いで無色透明な溶液を濾過滅菌し、定量０．５ｍｌをあらかじめ滅菌済みの使い捨て注射器に充填しシールした。このプレフィルド注射器を２５℃で保存し、透明度、ｐＨおよび生物活性を調べた。以下のような結果が得られた。
0004293497.tif 000007
【００５０】
＜２．液状ＩＦＮ−β組成物の３７℃における長期安定性＞
以下の組成物をプレフィルド注射器に入れて試験した。
組成物６：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物７：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、１８ｍｇ／ｍｌグリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物８：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、１８ｍｇ／ｍｌ  グリセリン、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物９：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムｐＨ６．０、１８ｍｇ／ｍｌ  グリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
組成物１０：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、１８ｍｇ／ｍｌグリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニン
これらの組成物を、３ＭＵ／０．５ｍｌ（用量力価３）、６ＭＵ／０．５ｍｌ（用量力価６）、および１２ＭＵ／ｍｌ（用量力価１２）の力価で試験した。
【００５１】
結果をつぎの表６に示す。
0004293497.tif 000008
【００５２】
表６の結果では、驚くべきことに、ヒト血清アルブミンを含まない本発明による組成物は３７℃での安定性が改良されている。
＜３．２５℃における化学的安定性＞
ＩＦＮ−βの液状組成物の化学的安定性を調べるために、７バッチの組成物を作り、２５℃で保存した。３か月および６か月後に、タンパク質をＬｙｓ−Ｃマッピングと完全炭水化物分析で分析した。メチオニンスルホキシドの生成と脱シアリル化は特に注意して調べた。
【００５３】
組成物１０（前記）に加えて、以下の組成物について試験した。
組成物１１：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニンｐＨ７．０〜７．２
組成物１２：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．０〜７．２
組成物１３：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、１８ｍｇ／ｍｌグリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニンｐＨ５．０〜５．２
組成物１４：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、１８ｍｇ／ｍｌグリセリンｐＨ５．０〜５．２
組成物１５：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（医薬品グレード）、１８ｍｇ／ｍｌグリセリン、２ｍｍｏｌ／ｌメチオニンｐＨ５．０〜５．２
組成物１６：  ５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（医薬品グレード）、１８ｍｇ／ｍｌグリセリン、ｐＨ５．０〜５．２  （比較例）
すべてのバッチにおいて、ＩＦＮ−βの含量は１０〜１１ＭＵ／ｍｌであった。
＜試験方法＞
分析のために、試料を濃縮する必要があった。さらに、バッチ１５および１６の場合にはヒト血清アルブミンの除去も必要であった。これが各バッチを抗βクロマトグラフィーカラムに通した理由である。各バッチ当たりの初期容積は３２ｍｌであった。バッチ１３から１６までは、抗βクロマトグラフィーにかける前に、０．４ｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4を２．１ｍｌ、０．４ｍｏｌ／ｌのＮａ3ＰＯ4を２．１ｍｌ添加することによって中和した。
【００５４】
インターフェロン−βのモノクローナル抗体へのインターフェロン−βの免疫吸着（ＢＯ２セファローズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）により架橋）のために、Ｃ１０クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に５ｍｌのＢＯ２セファローズを充填し、３回、それぞれゲル容積の５〜１０倍のＰＢＳ、０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）、およびＰＢＳおよび１ｍｏｌ／ｌのＫＣｌを一定速度１．０ｃｍ／分で流して洗浄した。
【００５５】
インターフェロン／ＨＳＡ含有溶液約３２ｍｌを０．５ｃｍ／分の一定速度で流した。
【００５６】
洗浄にはゲル容積の１０倍のＰＢＳと１ｍｏｌ／ｌのＫＣｌを使用し、１ｃｍ／分の一定速度で流して、ＯＤがベースラインに戻るまで続けた。溶出は、０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）の１〜２ゲル容積分を１ｃｍ／分の一定速度で流しておこなった。インターフェロン−βが単一ピークとして高純度で得られた。この溶出物は、その後のタンパク質のキャラクタリゼーションに適したものであった。
＜分析方法＞
１．Ｌｙｓ−Ｃマッピング
アクロモバクター（ＡＰ）酵素エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを用いて、還元条件下でインターフェロン−βをリシン残基のＣ末端で切断して１２のペプチドとする。
【００５７】
抗βクロマトグラフィーの溶出液５０μｌ（インターフェロン−β、１２．５〜５０μｇ）をエッペンドルフ反応容器に入れ、２ｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳを５μｌ添加した。和光エンドプロテイナーゼを酵素／基質の比が１／１０になるように添加した（５０ｍｍｏｌ／ｌのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−ＣのＴＲＩＳ／ＨＣｌ溶液、ｐＨ９．０）。この溶液を混合して、２時間３０℃で温置した。次いで、０．１ｍｏｌ／ｌのＤＴＴを５μｌ、そのバッチに添加した。
【００５８】
ペプチドは、２１４ｍｍのダイオドアレー検出器つきＨＰ１０９０ＭシリーズのＨＰＬＣで、逆相カラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３００オングストローム、５μｍ、２．１ｍｍ）を用いて分離した。その際、Ａ液：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、Ｂ液：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用いてグラジエントをかけた。ペプチドは保持時間の順に番号をふり、以下の配列が割り当てられた。
0004293497.tif 000009
【００５９】
参考文献：
Utsumi et al. (1989), Characterization of four different mammalian-cell-derived recombinant human interferon-β1. Eur. J. Biochem. 181, 545-553.
Utsumi et al. (1988), Structural characterization of fibroblast human interferon-β1. J. Interferon Res. 8, 375-384.
Allen, G. (1981), Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology.  Sequencing of proteins and peptides. Elsevier Verlag.
Castagnola et al. (1988): HPLC in Protein sequence determinations. J. Chromatography 440, 213-251.
（ox）の印をつけたペプチドは、アミノ酸のメチオニンがメチオニンスルホキシドの形になったものである。その定量は、変化していないペプチドと酸化されたペプチドとの全面積に対する、酸化したペプチドのピーク面積の割合を計算することによりおこなった。新鮮なインターフェロン−β製剤中には、酸化されたメチオニンの割合はほんのわずかしかない。しかし、保存条件（緩衝剤、ｐＨ、温度など）にもよるが、保存をしている間にその割合が多かれ少なかれ劇的に増加する。インターフェロン−β分子を不安定にしたり、インビボ（in vivo）での性質に顕著な影響をもたらしたりするので、この変化は望ましいものではない。
【００６０】
したがって、酸化を受けたペプチド、ＡＰ４（ox）、ＡＰ６（ox）、ＡＰ８（ox）およびＡＰ１０（ox）は、液状組成物の中でインターフェロン−βの化学的な不変性を評価するには、重要な基準となる。
２．炭水化物定量
まず最初のステップとして、オリゴ糖をポリペプチドから分離し、脱塩した。
抗βクロマトグラフィーの流出物の約０．７ｍｌを透析にかけた。透析は、緩やかに撹拌している透析緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、０．１０ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．２５）５００ｍｌ中で透析チューブ（直径６ｍｍ、Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｄ−９２７７）を用いて、室温で１６〜２０時間かけておこなった。次いで、チューブの一端を切り開き、内容物をエッペンドルフ反応容器に絞り出した。透析後の試料容積は１ｍｌであった。
【００６１】
透析後の試料に、２０μｌのＴｗｅｅｎ２０（力価１０％）と１５μｌのＮ−グリコシダーゼＦ溶液（Boehringer Mannheim社）をピペットで添加した。この混合物を２４時間３７℃で培養した。培養終了後、混合物を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、次いでクロマトグラフにかけて分画した。クロマトグラフには、脱塩カラム（ＨＲ１０／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社  Ｎｏ．１７−０５９１−０１）を使用し、流速１．０ｍｌ／分の均一組成溶離液でおこなった（溶離液Ａ：蒸留水）。遊離のオリゴ糖は２０６ｎｍで検出した。
【００６２】
第２のステップでは、単離したオリゴ糖を、シアル酸残基の数を基準にイオン交換樹脂で分離した。
【００６３】
脱塩カラムの流出液に含まれるオリゴ糖約２ｍｌを、アニオン交換樹脂（Mono Q HR 5/5、 Pharmacia No.17-0546-01）に通す。流出液中にあるのはアシアロ形である。ＮａＣｌで軽くグラジエントをかけることで、モノシアロ、ジシアロ、トリシアロ形がそれぞれはっきり別れて、この順で次々と流出してくる。
溶離液Ａ：  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
溶離液Ｂ：  ０．１０ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ
0004293497.tif 000010
【００６４】
流速：  ０．７５ｍｌ／分
クロマト時間：  ２６分（再生  ３６分）
検出：  ＵＶ  ２０６ｎｍ
オリゴ糖の個々の画分はＵＶ検出器（２０６ｎｍ）を使用して検出した。定量計算は、個々のピーク面積を積分することでおこなった。
【００６５】
オリゴ糖の画分であるモノシアロ、ジシアロおよびトリシアロを次いで、前記の脱塩カラムに通した。
【００６６】
第３のステップでは、酸性のｐＨ条件下で末端のシアル酸残基を加水分解的に除くことで、荷電オリゴ糖を中性オリゴ糖に変化させる。
【００６７】
このために、それぞれのオリゴ糖画分約１５μｌにＭｉｌｌｉ Ｑ水を１５μｌ加えてミクロ試験管に入れ、１０ｍｍｏｌ／ｌの硫酸３０μｌを添加した。この混合物を８０℃で９０分間加熱した。
【００６８】
次いでこの反応液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけ、ミニバイアルにピペットで移した。炭水化物はここでは中性になっているが、アルカリ性ｐＨで弱アニオン性として、アニオン交換カラム（ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（４×２５０ｍｍ）、Ｐ／Ｎ３５３９１，Ｄｉｏｎｅｘ）にかけた。溶離にはつぎのようなグラジエントをかけた。
溶離液Ａ：  ＮａＯＨ０．１６ｍｏｌ／ｌ
溶離液Ｂ：  ＮａＯＨ０．１６ｍｏｌ／ｌ、酢酸ナトリウム０．１０ｍｏｌ／ｌ
溶離液Ｃ：  ＮａＯＨ０．１６ｍｏｌ／ｌ、酢酸ナトリウム０．７５ｍｏｌ／ｌ
0004293497.tif 000011
【００６９】
流速：  １．０ｍｌ／分
クロマトグラフィー時間：  ５０分
検出器：  ＰＡＤ
ＰＡＤ（pulsed amperometric detection、パルス電流滴定検出器）をオリゴ糖の決定に用いた。オリゴ糖分子が電気化学的に酸化され、そこで生成する電流を測定する。ＰＡＤは感度の高さでは抜きんでており、ｎｇの桁のものでも難なく検出可能である。検出器の出力信号（ｍＶ）は炭水化物の量に直接比例する。ピーク面積を積分することで定量がおこなわれる。
【００７０】
脱グリコシル化と分析の間は、試料を一時的に−２０℃で保存した。
＜参考文献：＞
Townsend (1988): High-performance anion-exchange chromatography of oligosaccharides. Analytical Biochemistry 174, 459-470.
＜結果＞
１．Ｌｙｓ−Ｃマッピング
バッチ１１から１６までのＬｙｓ−Ｃマッピングでは、保持時間およびペプチドの定性分析に関しては初期値と変化はなかった。
【００７１】
液状で保存している間の、メチオニンスルホキシド含量の測定値を表７（３か月保存）および表８（６か月保存）に示した。
0004293497.tif 000012
【００７２】
0004293497.tif 000013
【００７３】
表７から、メチオニンを含むバッチ１３および１５では、メチオニンを含まないバッチに比較して、３か月保存ではメチオニンスルホキシド含量が低いことがわかる。６か月の保存後では、バッチ１１、１３、１５における添加メチオニンの効果は一層明らかになっている。これらのバッチでは、メチオニンスルホキシド含量の増加がごくわずかしか認められない。メチオニンを含まないバッチでは、メチオニンスルホキシド含量の増加はやや高いが、酸化されたメチオニン含量を合計しても、全メチオニン含量の１０％未満であった。
２．炭水化物の定量
３か月または６か月保存後の炭水化物の定量結果を、表９ａ、９ｂ、１０ａ、１０ｂ、１１ａ、１１ｂに示した。
【００７４】
インターフェロン−β−１ａはアミノ酸鎖に、単糖類の特定の配列を持つ炭水化物構造を持っている。枝分かれのタイプによって、これらの構造をバイアンテナリー（２本腕）、トリアンテナリー（３本腕）、テトラアンテナリー（４本腕）と名付ける。
【００７５】
炭水化物の構造には、単糖類のマンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸が含まれる。
【００７６】
この状況においては、シアル酸はいくつかの点で特別なものである。
−これは電荷を持つ基（カルボキシル基）を持つ唯一の単糖である。
−必ず炭化水素鎖の末端に存在する。
−他の単糖類に比較して、酵素的あるいは加水分解的にかなり容易に切断される。
−中性の炭水化物鎖の構造はかなり一定であるのに、シアル酸分子構造は、とりわけ、インターフェロンの細胞培養や精製法の影響を受けて大きく変わる。
＜参考文献：＞
Kagawa et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 17508-17515;
欧州特許出願第０  ５２９  ３００号。
【００７７】
シアロ状態（個々のシアロ構造の割合）を３か月保存後（表９ａ）、６か月保存後（表９ｂ）で調べた。末端シアル酸を持たない炭水化物はアシアロと名付けた。末端シアル酸を一つ持つ炭水化物はモノシアロと名付けた。末端シアル酸を二つ持つ炭水化物はジシアロと名付けた。末端シアル酸を三つ持つ炭水化物はトリシアロと名付けた。
【００７８】
さらに、アンテナリティ（個々の分岐のタイプの割合）を３か月保存後（表１０ａ）、６か月保存後（表１０ｂ）で調べた。分岐が一つ、したがって末端ガラクトースが二つあるものは、バイアンテナリーと呼ばれる。これはゼロから二つまでの末端シアル酸を持つことができる。分岐が二つ、したがって末端ガラクトースが三つあるものは、トリアンテナリーと呼ばれる。末端シアル酸をゼロから三つまでを持つことができる。
【００７９】
シアリル化の程度（末端ガラクトース残基がシアル酸で占められている割合）についても、３か月保存後（表１１ａ）、６か月保存後（表１１ｂ）に調べた。
【００８０】
これらの結果から、ｐＨ５で保存すると、わずかではあるが再現性よく脱シアリル化がおきていることがわかる。ｐＨ７での保存では、シアリル化の程度に変化はない。
【００８１】
バッチ１５および１６に特有なアフコ（afuco）含量は、おそらく添加されたヒト血清アルブミンによる外部タンパク質によるものと思われ、これは抗βクロマトグラフィーでは定量的に除去できなかった。
【００８２】
アンテナリティに関しては、液状保存では検出できるほどの影響はなかった。
0004293497.tif 000014
【００８３】
0004293497.tif 000015
【００８４】
0004293497.tif 000016
【００８５】
表 １０b
0004293497.tif 000017
【００８６】
表  １１ａ
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【００８７】
表  １１a
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【００８８】
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