(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示す配列からなる、アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １ａをコードする組替えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が配列番号１のヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の組替えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が、遺伝子コードの縮重により、配列番号２のアミノ酸配列から誘導したヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の組替えＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号４または配列番号６に示すアミノ酸配列からなるアイソタイプ（ｉｓｏｆｏｒｍ）Ａｒｔ  ｖ  １ｂまたはＡｒｔ  ｖ  １ｃをコードする組替えＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列からなる請求項４の組替えＤＮＡ分子。
【請求項６】
１ＭのＮａＣｌ  ６０℃そして２回洗浄５ｘＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ５０℃であるストリンジェントな条件で配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズされ、ストリンジェントな洗浄条件下で該ハイブリダイゼーションによる結合が維持されている請求項１または４に記載の組替えＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記アイソタイプ（ｉｓｏｆｏｒｍ）Ａｒｔ  ｖ  １ｂまたはＡｒｔ  ｖ  １ｃのＤＮＡ分子が配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列を有し、１ＭのＮａＣｌ  ６０℃そして２回洗浄５ｘＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ５０℃であるストリンジェントな条件で配列番号１に示すＡｒｔ  ｖ  １ａとハイブリダイズされる請求項６に記載の組替えＤＮＡ分子。
【請求項８】
下記の手順よりなる組替えアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １の作製方法、
（ａ）アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を宿主細胞に発現させることにより、請求項２または６に記載のＡｒｔ  ｖ  １をコードするＤＮＡを含む原核性または真核性の宿主細胞を培養し、
（ｂ）アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を分離する。
【請求項９】
前記宿主細胞が真核性で、組替えアレルゲンがグリコシル化される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
挿入因子として請求項２または６に記載のＤＮＡ分子を含む原核性または真核性の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０の発現ベクターを含む原核性または真核性の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が植物起源である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞がタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の培養細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項８の作製方法で得られた組替えアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を有効成分とするアレルギー患者の診断用薬剤。
【請求項１７】
請求項８の作製方法で得られた組替えアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を有効成分とするアレルギー患者の治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １をコードする組替えＤＮＡ分子、アレルゲン分子の調製方法、ベクターおよび形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
（従来技術の説明）
よもぎの花粉は、晩夏の欧州におけるアレルギーの主要原因の一つである（１, ２）。花粉による全アレルギー患者のうち、よもぎの花粉によるアレルギー症例は１０〜１４％である（２，３）。よもぎ花粉から抽出した全蛋白質の免疫ブロットは、患者のＩｇＥがＡｒｔ  ｖと呼ばれる２７〜２９ｋＤａの主要なアレルゲンを認識することを示している。よもぎ花粉に対するアレルギー患者の９５％以上のＩｇＥが免疫ブロットにおいて、Ａｒｔ  ｖ  １を認識している。そのようなブロットを、以下本明細書では、患者ブロットと呼ぶ。よもぎ花粉から抽出された他の蛋白質も、２７〜２９ｋＤａの見かけ上同一のＭｒに移動している。そのため、ｃＤＮＡの分離およびｃＤＮＡがＡｒｔ  ｖ  １をコードすることの証明は困難である。
【０００３】
（発明の開示）
本発明の目的は、尋常よもぎからの花粉のアレルゲンをコードする組替えＤＮＡ分子の提供である。
【０００４】
本発明によれば、上記目的は、配列番号２に示す配列を有し、アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １ａをコードする組替えＤＮＡ分子を作製することにより達成される。これは、尋常よもぎの主要アレルゲンが発見され、尋常よもぎによるアレルギーの診断・治療のために利用可能になったことを意味する。これらのＤＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列により特徴付けられる。これらの分子は遺伝子コードの縮重を介して配列番号２のアミノ酸配列から誘導することもできる。好ましくは、本発明の分子は、その配列が配列番号１の配列と６０％以上の同一性を有する。さらに、本発明の組替えＤＮＡ分子は、配列番号４および６の配列を有するアイソタイプＡｒｔ  ｖ  １ｂおよびＡｒｔ  ｖ  １ｃのアミノ酸配列をコードすることができる。これらの組替えＤＮＡ分子は、配列番号３および５の配列を有していてもよい。本発明の組替えＤＮＡ分子は、配列番号１に示す配列とハイブリダイズすることができ、かつストリンジェント洗浄条件下でも該ハイブリダイゼーションによる結合が維持されている。これは配列番号３および配列番号５に示す配列にも該当する。ストリンジェントハイブリゼーション条件は、 例えば６０℃で１ｍＭ（水中）であり、ストリンジェント洗浄条件は、例えば５倍のＳＳＰＥ（ＳＳＰＥは、０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを指す。）および０．１％  ＳＤＳ中、５０℃での２回の洗浄である。
【０００５】
本発明のアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １の調製方法は、以下の手順により特徴付けられる。
（ａ）アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を宿主細胞に発現させることにより、Ａｒｔ  ｖ  １をコードするＤＮＡ（配列番号１）または該ＤＮＡの配列と６０％以上の同一性を有するＤＮＡを含む原核性または真核性の宿主細胞を培養し、
（ｂ）アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を分離する。
【０００６】
この組替えアレルゲンは、グルコシル化させることもできる。本発明の方法では、本発明の方法の上記手順（ａ）に記載のＤＮＡ分子を含む複製可能な原核性または真核性の発現ベクターを提供することができる。そのような発現ベクターは、有名な宿主細胞、好ましくは大腸菌またはＰｉｃｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓに含まれる。
【０００７】
Ａｒｔ  ｖ  １ａ（図１）をコードする真正かつ完全なｃＤＮＡクローンを分離することにより、よもぎの花粉の主要アレルゲンが示される。Ａｒｔ  ｖ  １ａのａは、アイソタイプａを表す。さらに、Ａｒｔ  ｖ  １ｂおよびＡｒｔ  ｖ  １ｃと呼ばれるＡｒｔ  ｖ  １の真正かつ完全なアイソタイプをコードする２つのさらなるクローンが分離された。後者２つのアイソタイプの配列を図２および図３に示す。クローンは、典型的な真核性のコンテクスト中に開始ＡＵＧコドンを含むため、５’末端で完了する。クローンは停止コドンの後、ポリＡ+ 末端へと続く１７７〜２００のヌクレオチドを含むため、３’領域で完了する。オープンリーディングフレームの外側の配列は、図には示されていない。Ａｒｔ  ｖ  １ａ、１ｂおよび１ｃのヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列を各々図４および図５に示す。両図の比較からＡｒｔ  ｖ  １が、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルのいずれにおいても、互いに比較的大きな配列のずれを有する異なるアイソタイプの混合物であることが示される。これらの相違は、翻訳されない配列の上流部分および下流部分（図示していない）を考慮に入れた場合、より顕著となる。異なるアイソタイプおよびヌクレオチド置換の数は、本発明者等が遺伝子ファミリーを扱っているため、非常に確かである。遺伝子ファミリーは相同配列がひまわりで見つかったことから（４）、明らかに種固有のものでもなく、属固有のものでもない。ひまわり蛋白質（ＳＦ１８）は、おそらく花粉固有の機能を示す表皮葯細胞中に発現し、ｇａｍｍａ−ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ  ｆａｍｉｌｙといくらか類似性を示す。
【０００８】
（実施例）
Ａｒｔ  ｖ  １ａをコードするｃＤＮＡクローンの分離は以下の方法で実施した。
ファージｌａｍｂｄａ−ＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州、カタログ  Ｎｏ．２３７６１２）中にｃＤＮＡ発現ライブラリを調製した。開始物質はよもぎ花粉のｍＲＮＡであった。ｃＤＮＡライブラリは、患者ブロットでＡｒｔ  １を認識した２０人の患者の血清プールで免疫学的にスクリーンした。クローンは血清プールと正反応したものを分離し、繰り返しスクリーンを行うことにより、１００％免疫的に正であるプラークを与えた。このクローンとの免疫反応は、比較的弱いが、明らかに正である。このクローンがＡｒｔ  ｖ  １をコードすることの証明は、以下の手順で実施した。
主要アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を非常に穏やかな条件、すなわち室温で、光振とう（ｌｉｇｈｔ  ｓｈａｋｉｎｇ）の下で水を用いてよもぎ花粉から、１５〜３０分間抽出した。この抽出物を予備的なゲル電気泳動で分離し、画分を免疫ブロットで試験した。図６ａに、クーマシーで染色可能な蛋白質不純物が存在せず、見かけ上２２ｋＤａと２９ｋＤａの間のＭｒを移動する蛋白質バンドを含む３つの画分（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３）を示す。時折、約５０ｋＤａに相当する二つのバンドも見られた。図６ｂに、これらの画分の患者ブロットを示す。最も高いＭｒの画分は、試験した３人の患者全てのＩｇＥと結合しており、一方最も低いＭｒの画分は、患者の血清によってのみ弱く認識されていることは明らかである。図６ｃは、同じブロットをベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）糖蛋白質検出キット（ＤＩＧ  グリカン／蛋白質  二重標識キット、カタログ番号１５００７８３）で染色した後に得たものである。３つの画分全てが糖蛋白質からなることは明らかである。３つの画分は全てＮ末端エドマン分解法で分析し、図１〜図３で下線で示したものと同一のＮ末端配列が得られた。Ｎｉｅｌｓｅｎ等による図１の推定される蛋白質配列のコンピュータ解析（５）は、Ａｒｔ  ｖ  １が小胞体およびゴルジ体を標的にした場合に生じる典型的な疎水性のＮ末端信号配列を有することを予測している。このコンピュータアルゴリズムにより予測された蛋白質の成熟体の開始後の配列は、天然蛋白質中に見つかったＮ末端配列（図１〜図３において下線で表したもの）と同一である。非常に類似したＮ末端部分配列がＭａｔｔｈｉｅｓｅｎ等によって既に発見されている（６）。Ａｒｔ  ｖ  １は、そのＮ末端が典型的なＥＲ信号配列を除去することで形成される分泌蛋白質と結論することができる。天然蛋白質はグリコシル化の度合いの相違によりヘテロであり、完全なグリコシル化体（図６のＦ３）が最も良くＩｇＥと結合する。
【０００９】
Ａｒｔ  ｖ  １ａの一次クローンは、ランダムプライミング法により32Ｐで標識した後、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。上記のライブラリをこのプローブを用いてスクリーンし、さらに２つのクローンを得て、Ａｒｔ  ｖ  １ｂおよびＡｒｔ  ｖ  １ｃと名づけた。これらクローンについてＤＮＡ塩基配列決定を行った。配列を図２および図３に示す。
【００１０】
大腸菌は、発現系ｐＭＷ１７２でｃＤＮＡの適当な部分を再クローンした後、Ａｒｔ  ｖ  １ａ蛋白質の成熟体（短体）を非融合の組替え蛋白質として発現するのに使用した。大腸菌に発現した組替え蛋白質が、合成後の修飾（Ｎ末端メチオニン開裂の可能性を除いて）を示さず、特に糖類を含まないことは良く知られている。発現プラスミドの構築を図７に示す。組替えＡｒｔ  ｖ  １蛋白質は大腸菌蛋白質の可溶性画分中に濃縮されている。図８に１５人の別々の患者を用いた可溶性画分の免疫ブロットを示す。天然蛋白質の見かけ上のＭｒは約２７ｋＤａであり（図８のよもぎ花粉）、一方、組替え蛋白質の見かけ上のＭｒは、グルコシル化がないため、約１８ｋＤａである。理論上のＭｒは１０．８ｋＤａであることから、組替え蛋白質がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で、非常に例外的な電気泳動を行っていることを示している。１５人の患者のうち１０人のＩｇＥが、グルコシル化されていない蛋白質を認識している一方で、この形態の蛋白質を認識しない患者が存在することが明確に確認できる（図８のｒＡｒｔ  ｖ  １ａ）。非常に驚くべきことに、患者３、４および１０は、天然のグルコシル化されたたんぱく質よりもグルコシル化されていない蛋白質をはるかに良く認識している。図８のコントロール群は、患者および二次的な抗体によって認識されないか、または弱くのみ認識されていることを示している。これら弱いバンドは図８に示した３人全ての患者で確認されうる。
【００１１】
最後に実験結果を説明するため、以下の仮定を提起する。Ａｒｔ  ｖ  １の糖部分は、その天然構造に蛋白質骨格をもたらすために必要であり、何人かの患者のＩｇＥはそのようにして形成されたエピトープと結合し得ると推定できる。他方、何人かの他のエピトープは糖類なしで、患者の血清によって容易に検出され得る。上記観察についての、さらに別のより可能性の低い説明では、グルコシル化体を検出しない患者の血清は、糖類からなるエピトープを検出する。
【００１２】
よもぎ花粉の天然の主要アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １の予備的特性評価
よもぎ花粉の天然の主要アレルゲンを以下の手順で、均一な状態まで精製した。
１．ｐＨ５．２で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）によるアニオン交換クロマトグラフィーを行い、
２．ＴＳＫ−ゲルＧ２０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈａａｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）によるＨＰＬＣ−ゲルロ過を行う。
物質はＮ末端蛋白質配列およびアミノ酸解析により均一であると判断したが、異なるグルコシル化パターンにより、異種の分子量を有していた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルメータで決定した分子量は、１３ｋＤａおよび１５．５ｋＤａの平均分子量を有する２つのブロードのピークを示した。他方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した見かけ上の分子量は、２４〜２８ｋＤａであった。これは非常に例外的な蛋白質構造または糖部分の非常に例外的な構造の目安としてとらえることが出来る。加水分解によりポリペプチド鎖に共有結合する糖の予備的分析およびＨＰＬＣは、アレルゲンＡｒｔ  ｖ  １でＮグリコシル化が起こらず、また、典型的なＯグリコシル化も起こらないことを示していた。むしろ、上記のヒドロキシプロリン残基でのＯグリコシル化の方が真相と思われる。Ａｒｔ  ｖ  １はプロリンリッチの蛋白質で（プロリン２０％）、成熟体の蛋白質プロリンとヒドロキシプロリン残留物が４：６の比で存在するように合成後に修飾する。既知のＮグリカンおよびＯグリカンに固有の５つの異なるレクチン（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｐｅａｎｕｔ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）についての包括的な研究はこれらの糖構造物がアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １に存在しないことを示している。この主要アレルゲンのＢ細胞エピトープの組成上の例外的な蛋白質構造および例外的な糖部分について、現在調査を行っている。図８は、ＩｇＥがアレルゲンＡｒｔ  ｖ  １を識別する上で糖部分が重要な役割を果たしている可能性に関する最初の手がかりを与えた。
【００１３】
文  献
１．Charpin, J., Surinyach, R., and Frankland, A. W. (1974) ：Atlas of European Allergenic pollens，Sandoz, Paris.
２．Spieksma, F. T. M., Charpin, H., Nolard, N., and Stix, E.(1980), Clin. Allergy 10 : 319-329.
３．Cornillon, J., Bernard, J-P., Gueho, E., and Touraine, R. (1972), Rev. Franc. Allergol. 12 : 131-135.
４．Domon, C., Evrard, J. L., Herdenberger, F., Pillay, D. T. N., and Steinmetz, A. (1990), Plant Mol. Biol. 15 : 643-646.
５．Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., and von Heijne, G. (1997), Prot. Eng. 10 : 1-6.
６．Matthiesen, F., Ipsen, H., and Lowenstein, H. (1990), In : Allergenic pollen and pollinosis in Europe. pp 36-44. D'Amato, G., Spieksma, F. T. M., and Bonini, S. eds., Blackwell Scientific Publications, Cambridg
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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