(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（１１）の特性を有し、且つ油水分離能を有する高分子物質（以下、ＡＰＲ−３という。）の生産能（以下、ＡＰＲ−３生産能という。）を有するブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３３）、コマモナス・テストステロニーＫＹＭ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３６）、サルモネラｓｐ．ＫＹＭ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３７）、セルロモナス・セルランスＫＹＭ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５８）又はアグロバクテリウム・ツメファシエンスＫＹＭ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８０６）をサイアミン含有培地に培養して、得られる培養物を主成分とすることを特徴とする油水分離剤。
（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）重量％
（２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されない。
（３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されない。
（４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。
（５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝（６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。
（６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラクトース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸（０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。
（７）分子量：２×１０6以上。
（８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ローター、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±１，０００）ｃＰ。
（９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノール、エタノール及びアセトンに不溶。
（１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５°
（１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ-1）：２，７００〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、１，１６０。
【請求項２】
以下の（１）〜（１１）の特性を有し、且つ油水分離能を有する高分子物質（以下、ＡＰＲ−３という。）の生産能（以下、ＡＰＲ−３生産能という。）を有するセルロモナス・セルランスＫＹＭ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５８）とアグロバクテリウム・ツメファシエンスＫＹＭ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８０６）との少なくとも２株を含む複合微生物をサイアミン含有培地に培養して、得られる培養物を主成分とすることを特徴とする油水分離剤。
（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）重量％
（２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されない。
（３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されない。
（４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。
（５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝（６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。
（６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラクトース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸（０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。
（７）分子量：２×１０6以上。
（８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ローター、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±１，０００）ｃＰ。
（９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノール、エタノール及びアセトンに不溶。
（１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５°
（１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ-1）：２，７００〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、１，１６０。
【請求項３】
培養物が、２〜２０００μｇ／ｌのサイアミン濃度を有するサイアミン含有培地で培養して得られる培養物である請求項１又は２に記載の油水分離剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の油水分離剤を油懸濁水と接触させることを特徴とする油水分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、油水分離剤及び油水分離方法に関し、更に詳しくは、油環境汚染における油除去処理に用いる油水分離剤及び油水分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の油水分離剤は各種の合成高分子からなっており、タンカー事故等で実際の使用例もあるが、細胞毒性、特にＤＮＡ（遺伝子）毒性が高く環境生態系並びに人の安全性に懸念が持たれているものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記の問題に鑑み、人と環境生態系に優しく安全である油水分離能を有する油水分離剤及びそれを用いる油水分離方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題達成のために鋭意努力した結果、特定の微生物群が、従来知られていない高分子物質を生産すること、又、それらの特定微生物群を混合して複合的培養若しくは複合培養すると、その高分子物質が培地中に著量生産・蓄積されること、そして、より優れた油水分離能活性を有すること等の知見を得た。本発明はこの知見に基づいて完成された。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）の特性を有し、且つ油水分離能を有する高分子物質（以下、ＡＰＲ−３という。）の生産能（以下、ＡＰＲ−３生産能という。）を有するブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３３）、コマモナス・テストステロニーＫＹＭ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３６）、サルモネラｓｐ．ＫＹＭ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３７）、セルロモナス・セルランスＫＹＭ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５８）又はアグロバクテリウム・ツメファシエンスＫＹＭ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８０６）をサイアミン含有培地に培養して、得られる培養物を主成分とすることを特徴とする油水分離剤を提供する。
（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）重量％
（２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されない。
（３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されない。
（４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。
（５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝（６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。
（６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラクトース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸（０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。
（７）分子量：２×１０6以上。
（８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ローター、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±１，０００）ｃＰ。
（９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノール、エタノール及びアセトンに不溶。
（１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５°
（１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ-1）：２，７００〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、１，１６０。
【０００６】
又、本発明は、２）以下の（１）〜（１１）の特性を有し、且つ油水分離能を有する高分子物質（以下、ＡＰＲ−３という。）の生産能（以下、ＡＰＲ−３生産能という。）を有するセルロモナス・セルランスＫＹＭ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５８）とアグロバクテリウム・ツメファシエンスＫＹＭ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８０６）との少なくとも２株を含む複合微生物をサイアミン含有培地に培養して、得られる培養物を主成分とすることを特徴とする油水分離剤を提供する。
（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）重量％
（２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されない。
（３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されない。
（４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。
（５）元素分析：炭素Ｃ＝（４０±２）％、水素Ｈ＝（６±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。
（６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラクトース１、グルコース（５．６±０．１）、コハク酸（０．６±０．１）、ピルビン酸（２．５±０．１）。
（７）分子量：２×１０6以上。
（８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ローター、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型ＡＰＲ−３の０．５重量％濃度溶液）：（９，０００±１，０００）ｃＰ。
（９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノール、エタノール及びアセトンに不溶。
（１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５°
（１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ-1）：２，７００〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、１，１６０。
【０００７】
又、本発明は、３）培養物が、２〜２０００μｇ／ｌのサイアミン濃度を有するサイアミン含有培地で培養して得られる培養物である前記１）又は２）に記載の油水分離剤を提供する。
【００１３】
又、本発明は、４）前記１）〜３）の何れかに記載の油水分離剤を油懸濁水と接触させることを特徴とする油水分離方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
次に実施形態を挙げて本発明を更に詳しく説明する。しかし、本発明はこの実施形態により何ら限定されるものではない。
本発明でいうＡＰＲ−３とは、次ぎのの特質を有する高分子物質である。
【００１５】
（１）糖含有量（フェノール・硫酸法）：（６４±２）重量％
（２）アミノ糖（エルソン・モーガン法）：検出されない。
（３）ウロン酸（カルバゾール・硫酸法）：検出されない。
（４）蛋白質（ニンヒドリン法）：検出されない。
（５）元素分析：炭素Ｃ＝４０（±２）％、水素Ｈ＝６（±１）％、窒素Ｎ、リンＰ及び硫黄Ｓは痕跡。
（６）構成する糖及び有機酸の組成（モル比）：ガラクトース１、グルコース５．６（±０．１）、コハク酸０．６（±０．１）、ピルビン酸２．５（±０．１）。
（７）分子量：２×１０6以上。
（８）粘度（ビスメトロン回転粘度計、ＳＳ−２ローター、２５℃、回転数３〜６０ｒｐｍ、溶媒は純水、Ｈ型ＡＰＲ−３の０５重量％濃度溶液）：９，０００（±１，０００）ｃＰ。
（９）溶媒溶解性：水に可溶、アルカリに易溶、メタノール、エタノール及びアセトンに不溶。
（１０）比旋光度（２０℃）：−１７〜−１５°
（１１）ＩＲスペクトル吸収帯（ｃｍ-1）：２，７００〜３，７００、１，７３０、１，６００、１，４００、１，１６０。
以上の特性を有する高分子物質は現在まで知られていないので、当該物質は新規物質である。
【００１６】
本発明において、油水分離能とは、油懸濁水（海水も含む。）を油相と水相とに分離する能力のことをいう。該油水分離能は次のようにして測定される。
Ａ）油水分離能の活性測定法
サラダ油１０ｇとノニオン系界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬社製：ソルビタンモノオレアートのエチレンオキシド縮合物）０．５ｇをビーカー中で２〜３分間超音波処理してサラダ油を乳化させる。この中に撹拌しながら海水を加えて全量を２リットルとし、これを油懸濁水の原水とする。
【００１７】
２リットルのビーカーに原水１リットルを移し、ｐＨを１０に調整する。この原水０．８リットルを加圧浮上装置（宮本製作所製ＭＳ９０００）に供給する。更にサンプル液２０ｍｌを添加して、室温で内容物を十分に撹拌した後、加圧水を０．３リットル添加する。１０〜２０分間静置後、水相のＣＯＤを重クロム酸カリウム法で測定する。活性はそのＣＯＤ値で示される。そして、油水分離能は次式により計算される。
油水分離能＝（（Ａ−Ｂ）／Ａ）×１００（％）、但し、Ａ：処理前の    ＣＯＤ値、Ｂ：処理後のＣＯＤ値。
【００１８】
本発明の第一の特徴は、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を、サイアミン含有の固体若しくは液体の栄養培地に培養して得られる培養物を主成分として使用する油水分離剤である。  そして、サイアミン含有培地とは、培養開始から、即ち種培養若しくは前培養から、目的の油水分離能を得るまで、固体若しくは液体の栄養培地中にサイアミンが含有していることを意味する。サイアミン濃度は、２〜２０００μｇ／ｌの濃度、好ましくは５〜１０００μｇ／ｌの濃度、より好ましくは２〜５００μｇ／ｌ濃度で培地中に含有していればよい。２μｇ／ｌ以下の場合は油水分離活性が極端に低下する。２０００μｇ／ｌ以上の場合は油水分離剤活性がそれ以上増加しないので、培地にそれ以上含有させることの意味がなくなる。
本発明のサイアミンとは、サイアミン自体、サイアミン塩酸塩等のサイアミンの各種塩類、サイアミンの各種誘導体、サイアミン含有物などをいう。
【００１９】
ＡＰＲ−３生産能を有する微生物はＡＰＲ−３生産能を有するものであれば、細菌、放線菌、酵母、カビ等のどのような微生物でも使用できる。本発明においては、特にフタル酸を資化できる特性とスライム形成性を目安にスクリーニングして得られたが、スクリーニング方法等に何ら限定されるものではない。
ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の特徴は、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の少なくとも１種を含む複数の微生物の混合物（以下、複合微生物という。）からなるものである。複合微生物は、その中の各微生物を少なくとも１種を単離できるものでもよく、単離できないものでもよい。複合微生物自体がＡＰＲ−３生産能を有するものであればよい。又、当該複合微生物の中に本発明の微生物以外のものが混入していても、ＡＰＲ−３の生産を阻害しない限り、一向に差し支えない。このような複合微生物を用いて、有用物質を生産するという発想は本発明者らが初めて為したものである。
【００２０】
ＡＰＲ−３生産能を有する微生物の中でも、好ましいものとして細菌類を挙げることができる。より具体的には、ブルセラ属、ステノトロフォモナス属、ザントモナス属、アシネトバクター属、コマモナス属、サルモネラ属、大腸菌属、オーレオバクテリウム属、セルロモナス属及びアグロバクテリウム属に属する微生物である。
【００２１】
上記の属に属する微生物の中でも、特に好ましい菌株として、ブルセラ属に属する微生物としてブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株を、ステノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属する微生物としてＫＹＭ−２株を、アシネトバクター属に属する微生物とそてアシネトバクターｓｐ．ＫＹＭ−３株を、コマモナス属に属する微生物としてコマモナス・テストステロニーと同種かそれに極めて近い種に属するＫＹＭ−４株を、サルモネラ属に属する微生物としてサルモネアｓｐ．ＫＹＭ−５株を、オーレオバクテリウム属に属する微生物としてオーレオバクテリウムｓｐ．ＫＹＭ−６株を、セルロモナス属に属する微生物としてセルロモナス・セルランスＫＹＭ−７株を、そしてアグロバクテリウム属に属する微生物としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはそれに極めて近い種に属するＫＹＭ−８株等を挙げることができる。
【００２２】
上記の微生物の中でも、ＫＹＭ−１、ＫＹＭ−２、ＫＹＭ−３、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−６、ＫＹＭ−７及びＫＹＭ−８の菌株番号が付されたものは、フタル酸資化性及びスライム形成性を指標として、活性汚泥及び土壌からのスクリーニングより、ＡＰＲ−３生産能を有する複合微生物として得られたものである。各々、単離してその性質を調べた結果を下記の表１〜４に示してある。各菌株は、生命工学研究所に寄託され、ＫＹＭ−１はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３３、ＫＹＭ−２はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３４、ＫＹＭ−３はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３５、ＫＹＭ−４はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３６、ＫＹＭ−５はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３３７、ＫＹＭ−６はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５７、ＫＹＭ−７はＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５８、ＫＹＭ−８はＦＥＲＭ  Ｐ−１６８０６の番号が付されている。
【００２３】
表１
0004304244.tif 000002
【００２４】
表２
0004304244.tif 000003
【００２５】
表３
0004304244.tif 000004
【００２６】
表４
0004304244.tif 000005
【００２７】
上記のＫＹＭ菌株を、表１〜４に記載の形態学的及び生理学的性質に基づいて、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology（第１巻、第２巻、第３巻、第４巻）に記載の分類基準に従って、同定すると、
ＫＹＭ−１は、シュドモナス・ファギー（Pseudomonas faagi）、
ＫＹＭ−２は、ザントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）、
ＫＹＭ−３は、アセネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobactor calcoaceticus）、
ＫＹＭ−４は、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、
ＫＹＭ−５は、ハフニア・アルベイア（Hafnia alveia）、
ＫＹＭ−６は、コリネバクテリウム・アクアチクム（Corynebacterium aquaticum）、
ＫＹＭ−７は、セルロモナス・カルタエ（Cellulomonas cartae）、
ＫＹＭ−８は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）
に属する菌株である。尚、ブルクホルデリア・セパシアは、旧名称シュドモナス・セパシアとされ、ハフニア・アルベイアは、旧名称サルモネラｓｐ．とされ、そしてセルロモナス・カルタエは、旧名称オエルスコビア属とされていた（再分類され現名称となっている）。
【００２８】
しかしながら、最近、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の相同性から、微生物を発生系統的に同定・分類する方法が行なわれている（日本微生物生態学会報（Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology）、１０巻、１１９〜１３６ページ、１９９５年、同報、１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。上記の菌株をこの方法で解析しその結果を表５に記載した。表５より同定・分類すると：
【００２９】
表５
0004304244.tif 000006
に属する菌株である。
尚、上記の１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析法によると、サルモネラ属と大腸菌属に属する微生物は、同一属の微生物と見做されている。その故に本発明で使用する微生物は、サルモネラ属又は大腸菌属のどちらの属に属する微生物でもよい。
【００３０】
以上の結果より、本発明で使用する菌株は、
ＫＹＭ−１は、ブルセラｓｐ．又はシュドモナス・ファギー、
ＫＹＭ−２は、ステノトロホモナスｓｐ．又はザントモナス・マルトフィリア、
ＫＹＭ−３は、アセネトバクター・カルコアセティカス、
ＫＹＭ−４は、コマモナス・テストステロニー又はブルクホルデリア・セパシア、
ＫＹＭ−５は、サルモネラｓｐ．又はハフニア・アルベイア、
ＫＹＭ−６は、オーレオバクテリウムｓｐ．又はコリネバクテリウム・アクアチクム、
ＫＹＭ−７は、セルロモナス・セルランス又はセルロモナス・カルタエ、
ＫＹＭ−８は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス
に属する菌株である。
【００３１】
本発明において、総合的に検討した結果、
ＫＹＭ−１株は、ブルセラｓｐ．に属する菌株、
ＫＹＭ−２株は、ステノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属する菌株、
ＫＹＭ−３株は、アシネトバクターｓｐ．属に属する菌株、
ＫＹＭ−４株は、コマモナス・テストステロニーと同種かそれに極めて近い種に属する菌株、
ＫＹＭ−５株は、サルモネラ又は大腸菌のグループに属する菌株（本発明においては簡便化のためサルモネラ属という。）、
ＫＹＭ−６株は、オーレオバクテリウムｓｐ．に属する菌株、
ＫＹＭ−７株は、セルロモナス・セルランス若しくはそれに極めて近い種に属する菌株、
ＫＹＭ−８株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはそれに極めて近い種に属する菌株
であると判断した。
【００３２】
ＫＹＭ−１〜ＫＹＭ−７菌株は公知菌株であるが、ＫＹＭ−８菌株は新規微生物菌株である。以上のことから、本発明の油水分離剤に使用する微生物は、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物であればよく、上記のような具体的な菌名をもって制限されるものではない。
【００３３】
本発明において、好ましい実施形態として、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を培養するにあたり、ＡＰＲ−３生産能を有する微生物を、少なくとも１種を含む複合微生物を複合的培養若しくは複合培養することである。それ故、複合微生物とは、少なくとも上記の属に属する微生物の中の１種を含む。その中でも特に好ましい実施形態は、少なくともアグロバクテリウム属に属する微生物及び／又はセルロモナス属に属する微生物を含むものである。
【００３４】
本発明における複合微生物は、ブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株、ステノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属するＫＹＭ−２株、アシネトバクターｓｐ．ＫＹＭ−３、コマモナス・テストステロニーと同種か極めて近いＫＹＭ−４、サルモネラ属に属するいずれかの微生物、オーレオバクテリウム属に属するいずれかの微生物及びセルロモナス属に属するいずれかの微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはそれに極めて近いＫＹＭ−８との組合せを含む。
【００３５】
若しくは、ブルセラｓｐ．ＫＹＭ−１株、ステノトロフォモナス又はザントモナスのグループに属するＫＹＭ−２株、アシネトバクターｓｐ．ＫＹＭ−３、コマモナス・テストステロニーと同種か極めて近いＫＹＭ−４、サルモネラ属に属するいずれかの微生物及びオーレオバクテリウム属に属するいずれかの微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物と、セルロモナス属に属するＫＹＭ−７株との組合せを含む。
【００３６】
更に特に好ましい実施形態は、上記の組合せの中でも、サルモネラ属に属するいずれかの微生物がＫＹＭ−５株、オーレオバクテリウム属に属するいずれかの微生物がＫＹＭ−６株、セルロモナス属に属するいずれかの微生物がＫＹＭ−７株である。
【００３７】
上記の組合せの詳しい具体例として一例を挙げるならば次の如くである。
（ａ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７
（ｂ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−１
（ｃ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５
（ｄ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４
（ｅ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−１
（ｆ）ＫＹＭ−８、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−６、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、
ＫＹＭ−３、ＫＹＭ−２、ＫＹＭ−１
（ｇ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−４
（ｈ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−１
（ｉ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、
（ｊ）ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−１
【００３８】
本発明で使用する微生物の中でも、ＫＹＭ−１株〜ＫＹＭ−８株の微生物は、単独の状態又は上記のいずれの組合せの複合状態で、寒天培地上でスライムを形成するフロック状態になる。そして、フロック状態のまま、植えつぐことも、保存することもできる。又、便利に種培養菌として用いることもできる。
それで、上記の組合せの微生物の中でも、（ｆ）、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）は各々、Ｒ−３菌、Ｒ−４菌、Ｒ−５菌、Ｒ−６菌、Ｒ−７菌、Ｒ−８菌、Ｒ−９菌、Ｒ−１０菌、Ｒ−１１菌及びＲ−１２菌と略称される。
【００３９】
これらの菌は、寒天培地上でスライムを形成する。しかし、このスライム形成は本発明を何ら限定するものではない。尚、これらの組合せの菌株を用いて培養を行なう場合は、寒天培地上でスライムを形成させ、スライム形成微生物を種菌として用いると便利である。
【００４０】
本発明では、上記の本発明の微生物の植えつぎ、連続植えつぎ、又は保存にあたり、使用する培地として、寒天培地などの固体培地、又液体培地のどちらも採用出来る。そして十分な生育量を得ることが出来る。
しかしながら、本培養におけるＡＰＲ−３の生産活性を良好に得るには、上記の培地にもサイアミンを含有させるのが好適である。そのサイアミンの濃度は、２〜２０００μｇ／ｌ、好ましくは５〜１０００μｇ／ｌ、より好ましくは５〜５００μｇ／ｌである。２μｇ／ｌ以下の場合は、ＡＰＲ−３生産活性が極端に低下する。２０００μｇ／ｌ以上の場合はＡＰＲ−３生産活性がそれ以上増加しない。それでそれ以上の含有は意味がないものとなる。
更に良好なＡＰＲ−３生産活性を得るには、サイアミン含有培地で培養した菌体を、グリセロール、グルコース、マルトース、トレハロース等の糖類、又ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）等、好ましくは１０重量％マルトースを含む液体培地中ないし溶液中又は緩衝液中に保存することが好適である。そしてそれらの糖類の濃度は５〜１５重量％である。
保存温度は−１００℃〜−２０℃、好ましくは−８０℃〜−６０℃である。
【００４１】
本発明において微生物を培養するにあたり、使用する培地は、本発明の微生物の液体又は固体の栄養培地で、且つサイアミンを含有するものであればどのようなものでもよく、特に制限されない。そして、通常の公知の方法に従って調製することができる。例えば、その組成は、炭素源として、デンプン、廃糖蜜、デキストリン、サッカロース、マルトース、マンニット、グルコース及びフラクトース等、窒素源として、硫安、塩安、尿素、肉エキス、ペプトン及び酵母エキス等、無機塩類として、リン酸塩、マグネシウム塩、食塩、鉄塩及びマンガン塩等、ビタミン類としてサイアミン、その他のビタミン類、酵母エキス、コーンステープリカー及び廃糖蜜等が適当量含有していればよい。
【００４２】
上記の炭素原の中でもデンプン、マンニットは好ましいものとして挙げることができ、培地中に占める量として０．０１〜３０重量％、好ましくは、０．１〜２０重量％で使用する。ｐＨは５〜９位の範囲に調整すればよい。固体培地又は液体培地の種類は問われない。尚、農産物廃棄物、食品産業廃棄物、発酵廃液及び残渣類、都市ゴミ類等も炭素源、有機窒素源及びビタミン類等として使用することができる。培養は、振盪、通気撹拌等の操作で、２０〜４０℃で２〜１５日間行なえばよい。そして回分或いは連続等の培養方法が採用できる。前培養なしの方法或いは前培養ありの方法等どちらも採用できる。
【００４３】
上記のようにして本発明の培養物が得られる。
そして、本発明において、得られた培養物とは培養液自体の他に培養液の各種処理物をも含むものとする。例えば、培養液の濃縮物並びにその乾燥物、培養液から菌体を除いた上澄液並びにその濃縮物並びにその乾燥物、培養液から得られる菌体自体及びその懸濁物若しくはその乾燥物等である。そして、本発明において得られた培養物をそのまま油水分離剤とすることが出来る。又、適当な付加剤又は添加剤等を添加して、油水分離剤とすることもできる。そして、本発明の油水分離剤を油懸濁水に接触させると、効率よく油と水を分離することが出来る。
【００４４】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。尚、文中「％」とあるのは特に断りの無い限り重量基準である。
実施例１：本発明で使用する混合菌であるＲ−３菌の培養
本発明で使用する菌の種培養及び本培養に用いる培地の組成（％）：
デンプン＝１％
Ｋ2ＨＰＯ4＝０．５％
ＫＨ2ＰＯ4＝０．２％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＝０．０２％
（ＮＨ４）2ＳＯ4＝０．０５％
ポリペプトン（商標名）（大五栄養化学ＫＫ製）＝０．２％
サイアミン塩酸塩＝２００μｇ／ｌ
水道水＝残り
ｐＨ＝７．０（３Ｎ  ＫＯＨで調整）
殺菌条件：１２１℃（達温）及び１５〜２０分間
【００４５】
Ｒ−３菌を肉汁寒天平板培地に３０℃で５日間培養した。当該菌の１白金耳を液体培地８０ｍｌ（５００ｍｌ容振盪フラスコ）に添加し、３０℃で２日間培養し種培養を調製した。尚、ロータリーシェイカーを用いて当該フラスコを振盪した。当該培養液（６０ｍｌ）を５リットル容ジャーファメンター（培地３リットル）に添加し、３０℃で３リットル／ｍｉｎの通気量で、７日間撹拌（２００〜４００ｒｐｍ）しながら培養した。生育度（ＯＤ３１０ｎｍにおける濁度にて測定）、油水分離能及びカオリン凝集活性ともに３日間で最高値に達した。培養液の粘度は最後まで増加した。生育度１６．５（３１０ｎｍにおける濁度測定）、カオリン凝集活性２７７、粘度１，２００（ｃＰ）なる培養液を得た。尚、粘度はビスメトロン回転粘度計を用い、ＳＳ−２ローター使用し、２５℃及び回転数３〜６０ｒｐｍの条件で測定した。
【００４６】
実施例２：ＡＰＲ−３の分離精製
実施例１のようにしてＲ−３菌を培養して得た培養液３リットルを純水１２リットルで希釈し、菌体を遠心分離（２８，０００Ｇ及び３０ｍｉｎ）で除去し、その後、膜濃縮機を使用して２リットルまで濃縮した。当該濃縮液に２倍容のエタノールを添加し、繊維状の沈殿物（ＡＰＲ−３）を析出させた。当該沈殿物を遠心分離で採取し、シリカゲル入りのデシケーターの中で、一晩減圧乾燥した。９．２ｇの粗ＡＰＲ−３を得た（対デンプン収率＝３０．５％）。
【００４７】
５００ｍｇの当該粗ＡＰＲ−３を蒸溜水１００ｍｌに溶解した。次、これに２％cetylpyridium chloride（ＣＰＣ）溶液５０ｍｌを撹拌しながら添加し、数時間静置し、ＡＰＲ−３とＣＰＣの複合体の沈殿物を形成させた。当該複合体の沈殿物を遠心分離により集め、０．５モルの食塩水に溶解した。これに２倍容のエタノールを添加し、繊維状の沈殿物を得た。当該沈殿物をエタノール及びアセトンで各々５回洗浄した後、上記のようにして減圧乾燥した。純度検定で９８％以上のＡＰＲ−３（３８０ｍｇ）のを得た（対デンプン収率＝２１．０％）。このことから、Ｒ−３菌の培養液には約２ｍｇ／ｍｌのＡＰＲ−３が生産されていることが分かる。
【００４８】
上記の純度検定は次のようにして行なった。
上記の如くして精製されたＡＰＲ−３を、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液で加水分解し、脱アセチル化した。得られた脱アセチル化ＡＰＲ−３について、酢酸セルロース膜を支持体として電気泳動を行った。その結果、当該ＡＰＲ−３は陽極側に移動し、単一のスポットを与えた（図１参照）。よって当該ＡＰＲ−３は純粋なものと判断した。
【００４９】
実施例３：ＡＰＲ−３の特質
上記の精製ＡＰＲ−３について分析した。
１．全糖
フェノール・硫酸法により測定した。その結果６４（±２）％であった。
２．アミノ糖
エルソン・モーガン法により定性分析を行った。アミノ糖は検出されなかった。
３．ウロン酸
カルバゾル・硫酸法により検出を試みたが、検出されなかった。
【００５０】
４．蛋白質
ニンヒドリン法により検出を試みたが、検出されなかった。
５．元素分析
炭素Ｃ＝４０（±２）％、水素Ｈ＝６（±１）％、窒素Ｎ＝痕跡、リンＰ＝痕跡、硫黄＝痕跡。
【００５１】
６．構成糖
上記の精製ＡＰＲ−３を２Ｍのトリフルオロ酢酸で４時間加水分解した。
定性分析：
当該加水分解物について、次の条件で薄層クロマトグラフィーを行った。その結果、グルコース及びガラクトースのみが検出された。条件：プレート＝シリカゲル６０（０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４）、展開相＝イソプロピルアルコール：アセトン：０．１Ｍ乳酸（２：２：１  重量比）。
【００５２】
定量分析：
上記加水分解物について、ＴＭＳ誘導体を調製して、次の条件でガスクロマトグフィーによる分析を行った。その結果、ＡＰＲ−３は、ガラクトース１モルに対してグルコース５．６（±０．１）モルの割合で構成されていることが判明した。条件：装置＝島津（Shimadzu）ＧＣ−１５Ａ、検出器＝ＦＩＤ、カラム＝Hicap-CBPI（OV-1 chemical bonding）キャピラリーカラム。
【００５３】
７．構成有機酸
ＡＰＲ−３を、２Ｎの硫酸溶液で１００℃で２時間加水分解した。この加水分解物について、薄層クロマトグラフィーによる定性及び同定分析を次の条件で行なった。その結果コハク酸とピルビン酸が検出された。
【００５４】
定性分析：
プレート＝セルロースＦ２５４Ｓ又はシリカゲルＦ２５４、展開相＝ブタノール：ギ酸：水（４：１．５：１  重量比）又はアミルアルコール：０．２５Ｍアンモニア（２：１  重量比）。
【００５５】
定量分析：
ＡＰＲ−３を２Ｍトリフルオロ酢酸溶液で１００℃で４時間加水分解し、その加水分解物をメチル化した。それをガスクロマトグラフィーで定量した。その結果、コハク酸とピルビン酸が、構成糖であるガラクトース１モルに対して各々０．６（±０．１）モル及び２．５（±０．１）モル含まれていることが分かった。
【００５６】
８．分子量
脱アセチル化したＡＰＲ−３について、トヨパールＨＷ７５Ｆゲルカラムを使用するゲルクロマトグラフィーでＡＰＲ−３の分子量を求めた（図２参照）。ブルーデキストランよりも先にＡＰＲ−３のピークが出現するので、分子量は２×１０6以上であると判断された。
【００５７】
９．比旋光度
比旋光度は−１７〜−１５°であった。
１０．ＩＲスペクトル
図３に当該スペクトルを示した。２，７００〜３，７００ｃｍ-1に水酸基の吸収、１７００ｃｍ-1及び１，１６０ｃｍ-1にカルボキシルエステル結合の吸収、そして１，６００ｃｍ-1及び１，４００ｃｍ-1にイオン化カルボキシル基の吸収を示した。
【００５８】
１１．溶媒に対する溶解性
水に可溶、アルカリに易溶、メタノール及びアセトンに不溶であった。
１２．粘度特性
ビスメトロン回転粘度計で、ＳＳ−２  ローターを使用し、２５℃及び回転数３〜６０ｒｐｍの条件で測定した。対照物質としてザンサンガムを用いた。ＡＰＲ−３はＮａ型（塩）、Ｃａ型（塩）及びＨ型（フリー型）にして測定した。ザンサンガム及びＡＰＲ−３の濃度は０．５重量％溶液とした。その結果を図４に示した。いずれの型のＡＰＲ−３もザンサンガムと同様に、シュードプラスチック流動特性を示した。又、ザンサンガムよりも高粘度であった。
以上の特性を有する高分子物質は、現在まで発見されていないので、新規物質と認定した。
【００５９】
実施例４
実施例１で得たＡＰＲ−３の粉末について、ＡＰＲ−３溶液（５０ｍｇ／１ｍｌ蒸留水）を調製し、その内の２０ｍｌを使用して、上記の油水分離能測定法により測定し、下記表６の通りの結果を得た。
【００６０】
表６
0004304244.tif 000007
表６から分かるように、本発明のＡＰＲ−３は油水分離能を有することは明らかである。又、下記の比較例実験の表７から分かるように、公知のロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９２３）のものより高活性を有する。
【００６１】
比較例１
ロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９２３）を、実施例１と同様な条件で培養して得た培養液の上澄液について、膜濃縮により２５倍の濃縮を行い、ＡＰＲ−３溶液（５０ｍｇ／１ｍｌ蒸留水）の調製条件と同様なものにした。実施例４と同様の条件で油水分離能を測定し、下記表７の結果を得た。
【００６２】
表７
0004304244.tif 000008
【００６３】
実施例５
Ｒ−３菌をＲ−４菌に代えること、及び培地にサイアミンを添加すること（以下、サイアミン含有系という。）並びに添加しないこと（以下、サイアミン非含有系という。）以外は、実施例１と同様に培養し、その培養の経時変化を調べた。その結果を図５及び６に示した。尚、図５はサイアミン含有系のものであり、図６はサイアミン非含有系のものである。図５及び６から分かるように、サイアミン非含有系では培養３日目でカオリン凝集活性は最高値に達し、その後減少傾向を示した。又、粘度（ｃＰ）は培養４日目で最高値に達し、その後減少傾向を示した。しかし、サイアミン含有系では、培養３日頃からカオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）の増加率が減少するものの、カオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）の値が減少することはなかった。尚、活性は培養液の上澄液について測定した。ＡＰＲ−３生産能を有しないが、微生物産生凝集剤を生産することが知られているロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９２３）を対照菌株として採用し、Ｒ−４菌のサイアミン含有系と同様の条件で培養した。その結果を図７に示した（比較例１参照）。図５、６及び７から分かるように、Ｒ−４菌は、カオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）が格段に高い培養液を生産すること、又、サイアミン含有系は、非含有系のものより培養液のカオリン凝集活性及び粘度（ｃＰ）が高く、且つ培養の安定性が優れているが分かる。尚、生育度は３１０ｎｍにおける濁度測定によった。
【００６４】
実施例６
実施例５において、回分培養を連続的回分培養（回分培養の培養終了時の培養液を種培養液として利用する形式の培養方法）に変えること以外は実施例５と同様に培養した。なお、本実施例では、連続的回分培養方法を採用しているので、種培養は第一回目の培養においては実施例１と同様に行い、接種も実施例１と同様に行ったが、第二回目からは前回培養終了時の培養液を種培養として利用した。そして接種量は１０容量％とした。そして、５回、そして各回１０日間培養し、得た各回の培養液について油水分離能を測定した。その結果を表７に示した。
【００６５】
表８
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＊ＣＯＤ（ｍｇ／ｌ）：原水＝１０．０００；無添加＝４．０２０
【００６６】
実施例７
Ｒ−３菌をＲ−４菌に代えること、及びサイアミンの濃度を表９に記載のように変えること以外は、実施例１と同様に培養を行って、表９のような結果を得た。サイアミン含有培地のサイアミン濃度が  ２〜２０００μｇ／ｌの範囲の場合に、粘度の高い培養液が得られることが表９から分かる。そして２０００μｇ／ｌ以上になると粘度はそれ以上は増加しない。本発明においては油水分離能の増加と粘度の増加は相関する。よってサイアミン含有培地のサイアミン濃度が  ２〜２０００μｇ／ｌの範囲の場合に油水分離能の高い培養液が得られることが分かる。
【００６７】
表９
0004304244.tif 000010
【００６８】
実施例７
Ｒ−３菌の代わりに、ＫＹＭ−１、ＫＹＭ−４、ＫＹＭ−５、ＫＹＭ−７、ＫＹＭ−８及びそれらを図７に示したような組み合わせた混合菌及び混合菌であるＲ−３〜Ｒ−１２を用いて、実施例１と同条件で培養した。そして、図８のような結果を得た。本実施例においては、油水分離能が粘度と相関する故、油水分離能を粘度測定で行った。粘度測定条件は実施例１と同様である。これから、本発明の複合微生物は、ＡＰＲ−３の生産により効果的であることが分かる。そして、ＫＹＭ−７又は／及びＫＹＭ−８を含む複合微生物が特に効果的であることが分かる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明の微生物菌を、サイアミン含有培地で培養することにより得られる培養液は、サイアミン非含有培地で培養したものより油水分離能が高い。よってその培養液を主成分としてなる油水分離剤は、安価で高活性の油水分離剤として使用できる。それ故に、環境汚染の油水分離処理において、それらの処理を効率よく達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡＰＲ−３の電気泳動パターン。
【図２】  ＡＰＲ−３のゲルクマトグラフィーパターン。
【図３】  ＡＰＲ−３のＩＲスペクトル。
【図４】  ＡＰＲ−３の粘度特性。
【図５】  Ｒ−４菌における、サイアミン含有系の培養の経時変化。
【図６】  Ｒ−４菌における、サイアミン非含有系の培養の経時変化。
【図７】  ロードコッカス・エリスロポレスＫＲ−２５６−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９２３）菌株における、サイアミン含有系の培養の経時変化。
【図８】  本発明のＫＹＭ−８菌、ＡＰＲ−３生産能を有するＫＹＭ各菌及びそれらの混合菌であるＲ−３〜Ｒ−１２菌の活性比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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