(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化プロテインＣ；増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖、およびそれらの混合物で構成される群から選択されたもの；および再構成した際に得られる製剤が５．５〜６．３との間のｐＨを有するような緩衝剤系、を含む安定な凍結乾燥製剤。
【請求項２】
緩衝剤系がクエン酸ナトリウムを含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
活性化プロテインＣと、増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖で構成される群から選択されたものを含有する凍結乾燥製剤であって、該活性化プロテインＣと該増量剤との重量比が１：５〜１：７である、凍結乾燥製剤。
【請求項４】
増量剤がショ糖、トレハロース、またはラフィノースである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
増量剤がショ糖である請求項４の製剤。
【請求項６】
さらに医薬的に許容される塩を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
重量比が活性化プロテインＣ１部、塩７部と８部との間、および増量剤５部と７部との間、である請求項６の製剤。
【請求項８】
重量比が活性化プロテインＣ１部、塩７．６部、および増量剤６部、である請求項６の製剤。
【請求項９】
塩がＮａＣｌであり、増量剤がショ糖である請求項８の製剤。
【請求項１０】
活性化プロテインＣ５ｍｇ、ショ糖３０ｍｇおよびＮａＣｌ３８ｍｇを含む安定な凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
活性化プロテインＣ２０ｍｇ、ショ糖１２０ｍｇおよびＮａＣｌ１５２ｍｇを含む安定な凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
活性化プロテインＣと、増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含有する溶液を凍結乾燥することを含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製剤を製造する方法。
【請求項１３】
溶液のｐＨが５．５〜６．３の間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製剤を含む単位用量レセプタクルを含む単位用量剤型。
【請求項１５】
脈管内血液凝固を伴う病状の処置における薬剤として使用するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
血栓症発作の処置における薬剤として使用するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の安定な凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
この出願には１９９７年４月２８日に出願された米国予備出願第６０／０４５２５５の利益享受を請求する。
本発明の技術分野
この発明はヒト用医薬品の分野、殊に活性化プロテインＣによる脈管性疾患の処置の分野、に属する。さらに特定的には、本発明は活性化ヒトプロテインＣの製剤に関する。
本発明の背景
プロテインＣはセリンプロテアーゼの一種であって、血液凝固経路でＶａ因子およびＶＩＩＩａ因子を不活性化することによって恒常性を調節する役割を担っている天然起源の抗血液凝固剤である。ヒトのプロテインＣは生体内では主として肝臓でアミノ酸４６１個の単鎖ポリペプチドとして製造される。この単鎖前駆体分子は次のものを含む、多重の転写後修飾を受ける：すなわち、１）アミノ酸４２個のシグナル配列を切断する；２）単鎖チモーゲンから２鎖のチモーゲン型分子を与えるための１５６位リジン残基および１５７位アルギニン残基における蛋白質分解的な切断を受ける（すなわち、セリンプロテアーゼを含有するアミノ酸残基２６２個の重鎖とジスルフィド橋を経て結合するアミノ酸残基１５５個の軽鎖とになる）；３）ガンマカルボキシグルタミン酸残基９個を与える軽鎖の最初のアミノ酸４２個に集結しているグルタミン酸残基９個がビタミンＫ依存性のカルボキシル化を受ける；および４）４個所（軽鎖にある１個所および重鎖にある３個所）に炭水化物が付着する。重鎖はよく確認されているＡｓｐ２７５、Ｈｉｓ２１１およびＳｅｒ３６０からなるセリンプロテアーゼ三個組を含有する。最後に、循環している２鎖チモーゲンはカルシウムイオンの存在下にホスホリピド表面にあるトロンビンによって生体内活性化される。この活性化は重鎖のＮ−末端にあるドデカペプチドの除去に起因するものであって、酵素作用を有する活性化プロテインＣ（ａＰＣ）が産生される。
ａＰＣの酵素活性に加えて、ａＰＣは血液凝固経路の中で自己分解して、抗血液凝固剤としての機能が低下することがある。本発明者はこの一つの重要な分解経路を発見した。軽鎖Ｎ末端の自己分解で１０位ヒスチジン残基のどちらかの側に切断を起こすことがある。そこで、この分解経路は不活性産物２種を与える：すなわち、１）デス（１〜９）活性化プロテインＣであって、軽鎖Ｎ−末端の最初の残基９個が失われたもの；および２）デス（１〜１０）活性化プロテインＣであって、軽鎖Ｎ−末端の最初の残基１０個が失われたものである。今迄に報告されたことがないこの分解経路で６位および７位にある必須なＧＬＡ残基が除去される結果として抗血液凝固作用が失われる。それ故、デス（１〜９）活性化プロテインＣおよびデス（１〜１０）活性化プロテインＣの自己分解産物レベルを削減することは強力で高純度な活性化プロテインＣ医薬製剤に到達するには重要である。これらの変化体はこれまで知られていない分解産物であって、通常の精製技術で除去することは、不可能でないとしても非常に困難である。本発明者はさらに特定の増量剤が存在すると、固体状態の溶解性が顕著に改善されることを発見した。
溶液および凍結乾燥固体の両方において活性化プロテインＣの分解を削減することは明らかに望ましいことである。従って、これらの発見で医薬品製造業者にとって製薬学的に見事な、強力で高純度な活性化プロテインＣ製剤の製造が可能になる。
本発明はこのような自己分解産物、特にデス（１〜９）型活性化プロテインＣ型軽鎖およびデス（１〜１０）型活性化プロテインＣ型軽鎖を持つ活性化プロテインＣを実質的に含有しない改良された活性化プロテインＣの製剤を提供する。それ故、本製剤はそれを必要とする患者にとって適切である。
発明の要約
本発明は活性化プロテインＣおよび増量剤であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖、およびその混合物で構成される群から選択されたもの、を含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。
本発明はまた活性化プロテインＣ約２．５ｍｇ／ｍＬ、ショ糖約１５ｍｇ／ｍＬおよびＮａＣｌ約２０ｍｇ／ｍＬを含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。さらに、本発明は活性化プロテインＣ約５ｍｇ／ｍＬ、ショ糖約３０ｍｇ／ｍＬおよびＮａＣｌ約３８ｍｇ／ｍＬを含有する安定な凍結乾燥製剤を提供する。
本発明はまた活性化プロテインＣおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む製剤の製法を提供する。
本発明はまた重量比で活性化プロテインＣ約１部、塩約７．６部および増量剤約６部である製剤を含む単位用量レセプタクル（receptacle）を含む単位用量剤型を提供する。
本発明はさらに本明細書に記載する活性化プロテインＣの製剤を投与することを包む脈管内血液凝固を伴う病状を処置する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本明細書に開示し、特許請求する本発明の目的では、下記の用語を次の通りに定義する。
ａＰＣまたは活性化プロテインＣは活性化型のプロテインＣを示すが、これは組換え体であっても血漿由来であってもよいものとする。ａＰＣにはヒトの活性化プロテインＣを包含するが、これは好ましいものである。ａＰＣはまた、他種由来のものまたはプロテインＣの分解性、アミド分解性、エステル分解性および生物学的（抗血液凝固性またはプロ−フィブリン分解性）な活性を有する誘導体であってもよいものを包含する。プロテインＣの誘導体の例は、ここに全教示を参考のために引用するＧｅｒｌｉｔｚほかの米国特許第５４５３３７３号およびＦｏｓｔｅｒほかの米国特許第５５１６６５０号に記載されている。
ＡＰＴＴ−活性化部分トロンボプラスチン時間。
ｒ−ｈＰＣ−組換えヒトプロテインＣチモーゲン。
ｒ−ａＰＣ−試験管内または生体内でプロテインＣチモーゲンを活性化することによって、または原核生物細胞、真核生物細胞またはトランスジェニック動物からの活性型プロテインＣの直接的な分泌であって、例えばヒト腎臓２９３細胞からチモーゲンとして分泌させ、次に当業者によく知られている技術およびここに全教示を参考のために引用するＹａｎの米国特許第４９８１９５２号およびＣｏｔｔｉｎｇｈａｍのＷＯ第９７／２００４３号で証明されている技術によって精製および活性化されたもの含むものによって産生された組換え活性化プロテインＣ。
連続点滴−実質的に中断なく、血管への溶液の導入を所定の時間継続すること。
一時注射−所定量の薬剤（ボーラスと称する）を一時に注射すること。
投与に適する−治療剤として投与するのに適切な凍結乾燥剤または液剤。
チモーゲン−本明細書で使用されるプロテインＣチモーゲンは単鎖型であっても二鎖型であってもよい分泌された不活性型プロテインＣを示す。
医薬的に許容される緩衝剤−医薬的に許容される緩衝剤はこの技術分野で知られている。医薬的に許容される緩衝剤には燐酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはＴＲＩＳが含有されている。
活性化プロテインＣは、たとえばヘパリンおよび経口投与用のヒドロキシクマリン型抗凝固剤のような入手可能な抗凝固剤と比較して広い治療係数を持つ抗血栓剤である。抗血栓剤としては、ａＰＣは血栓性発作、深部脈管血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈に由来する塞栓症、急性心筋梗塞、播種性静脈内血液凝固、および移植または網膜血栓症を含む急性の前毛細血管閉塞または後毛細血管閉塞、を包含する脈管内血液凝固を伴う広範囲な後天的病状の処置に素晴らしい効果を示す。
本発明は活性化プロテインＣの製剤に関する。所望の製剤は活性化プロテインＣおよび増量剤（bulking agent）であって、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびショ糖で構成される群から選択されたものを含有する高純度で安定な凍結乾燥製品であるものの一つであろう。この凍結乾燥製品はたとえば無菌水または無菌食塩水のような適当な希釈剤を用いて再構成される。製造された液はｐＨが約５．５から約６．５までであるのが好ましい。
製剤内で活性化プロテインＣ、緩衝剤、塩濃度、ｐＨ、温度および増量剤の間の分子的相互作用は複雑であって、各因子が製剤の安定化に寄与する役割は予測不能である。本発明の凍結乾燥製剤を再懸濁化すると、自己分解の低下のために安定で酵素的に活性な活性化プロテインＣを提供する。本発明の製品では、殊にデス（１〜９）ａＰＣおよびデス（１〜１０）ａＰＣのレベルが低下している。一般にデス（１〜９）ａＰＣおよびデス（１〜１０）ａＰＣの量は自己分解産物中の１０％またはそれ以下である。好ましくはデス（１〜９）ａＰＣおよびデス（１〜１０）ａＰＣの量は自己分解産物中の８％またはそれ以下である。さらに好ましくはデス（１〜９）ａＰＣおよびデス（１〜１０）ａＰＣの量は自己分解産物の中の５％またはそれ以下であり、最も好ましくは自己分解産物の中で３％またはそれ以下である。この安定性は注意深い製造条件の調節によって、また、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、またはマンニトールの添加によって得られる。興味深いことに、たとえばヒドロキシエチル澱粉およびグリシンのようなその他の増量剤は必要とする安定性または医薬としての見事さを提供することはない。
本発明の増量剤は均一な外観を有し、また、適切な溶剤を用いて再懸濁すると容易に溶解する医薬的に見事な製剤を提供する。再構成すると、この製剤は室温で２４時間から４８時間までにわたって安定である。安定性についてのこの結果は以前には到達不能であった。
この活性化プロテインＣ製剤における増量剤の好適なものは、ショ糖、トレハロースおよびラフィノースである。さらに好適な増量剤はショ糖およびラフィノースであり、最も好適な増量剤はショ糖である。この製剤中の増量剤の量は重量比でａＰＣ１部に対して増量剤１部から１０部までである。さらにその上、この製剤の増量剤濃度は凍結乾燥工程での重要な製剤化用変動値である。増量剤の最適濃度はａＰＣの量および選択した増量剤の種類に依存する。凍結溶液中のショ糖の好適な濃度は１０ｍｇ／ｍＬから４０ｍｇ／ｍＬまでである。さらに好適なショ糖濃度は１５ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬまでである。ａＰＣ２．５ｍｇ／ｍＬの製剤では凍結溶液中の最も好適なショ糖濃度は１５ｍｇ／ｍＬである。ａＰＣ５．０ｍｇ／ｍＬの製剤では凍結乾燥用溶液中の最も好適なショ糖濃度は３０ｍｇ／ｍＬである。活性化プロテインＣの製剤におけるここに特許請求する増量剤の存在は化学的および物理的安定性を増大する。
溶液状態における自己分解を削減するためには、凍結乾燥の前および再構成の後にｐＨを５．５から６．５までの範囲に維持することは好ましい。この製剤の好適なｐＨは約５．６と約６．４との間のｐＨである。さらに好適なのは約５．７と約６．３間との間のｐＨである。さらに一層好適なのは約５．８と約６．２との間のｐＨである。さらに好適なものは約５．９と約５．１との間のｐＨである。最も好適なｐＨは約６．０である。
有効なｐＨ調節を維持するために、ａＰＣ溶液は医薬的に許容される緩衝剤を含有すべきである。従って、凍結乾燥時にこの製剤は所望ならばまた好ましくは医薬的に許容される緩衝剤を含有する。代表的な緩衝剤系にはトリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、および燐酸ナトリウムを包含する。さらに好適な緩衝剤系にはクエン酸ナトリウムおよび燐酸ナトリウムを包含する。最も好適な緩衝剤はクエン酸ナトリウムである。この緩衝剤系の好適なモル濃度は１０ｍＭから５０ｍＭまでである。緩衝剤系のさらに好適なモル濃度は１０ｍＭから２０ｍＭまでである。最も好適なモル濃度は４０ｍＭである。熟練した専門家はそのほかにも多くの緩衝剤系が入手できること本発明の製剤に使用できるを認識することとなろう。
同様にして、凍結乾燥の間および再構築後のイオン強度は溶液状態での安定性を保証するために重要な変数である。このイオン強度は一般にその溶液の塩濃度によって決定される。イオン強度を作製するために典型的に使用される医薬的に許容される塩は、これらに限定するものではないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を包含する。本発明における好適な塩は塩化ナトリウムである。この塩の濃度は凍結乾燥の間の凍結乾燥周期の凍結段階でこの塩が結晶化を起こすに十分な高濃度としなければならない。塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭよりも濃いのが好ましい。凍結させる溶液中の塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭと１０００ｍＭとの間がさらに好ましい。ａＰＣ２．５ｍｇ／ｍＬを含有する製剤については、凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭと６５０ｍＭとの間である。凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は２５０ｍＭと４５０ｍＭとの間である。凍結する溶液中の塩化ナトリウム濃度は３００ｍＭと４００ｍＭとの間がなおさらに好ましい。凍結する溶液中の最も好ましい塩化ナトリウム濃度は、ａＰＣ２．５ｍｇ／ｍＬを含有する製剤については３２５ｍＭである。
同様にして、ａＰＣ５．０ｍｇ／ｍＬを含有する製剤については凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭと１０００ｍＭとの間である。凍結する溶液中のさらに好ましい塩化ナトリウム濃度は２５０ｍＭと７５０ｍＭとの間である。凍結する溶液中のそれ以上に好ましい塩化ナトリウム濃度は４００ｍＭと７００ｍＭとの間である。凍結する溶液中の最も好ましい塩化ナトリウム濃度はａＰＣ５．０ｍｇ／ｍＬを含有する製剤については６５０ｍＭである。
ａＰＣ：塩：増量剤の比率（ｗ：ｗ：ｗ）は凍結乾燥工程のために適切な製剤における重要な因子である。この比率はａＰＣ濃度、塩の選択およびその濃度、および増量剤の選択およびその濃度に依存して変動する。当技術分野の熟練者は当技術分野で認められている技術、例えば実施例１に記載されている技術などによってａＰＣ：塩：増量剤の好適な比率を容易に確認できよう。殊に重量比で活性化プロテインＣ１部に対する約７部と約８部との間の塩、約５部と約７部との間の増量剤が好適である。より好適なものでは活性化プロテインＣ１部に対する重量比で約７．５部と約８部との間の塩、および約５．５部と約６．５部との間の増量剤である。最も好適なものは活性化プロテインＣ約１部に対する約７．６部の塩、および約６部の増量剤、の比率である。
好適な塩は３２５ｍＭ濃度（ａＰＣ２．５ｍｇ／ｍＬを含有する製剤で）および３２５ｍＭ濃度（ａＰＣ５．０ｍｇ／ｍＬを含有する製剤で）の塩化ナトリウムおよび約１．３：１の比率のショ糖（ｗ：ｗ）である。この濃度は、凍結工程の間に塩が結晶化を起こして、凍結乾燥することができるａＰＣ、ショ糖およびクエン酸塩の無晶形混合物を与えることが予期されるためには十分に高濃度である。このようにして、好適な濃度である３２５ｍＭおよび６５０ｍＭのＮａＣｌのイオン強度はこの製剤に凍結乾燥工程の間の安定性を与える。
本発明はさらに活性化プロテインＣおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤の製造法を提供する。本発明はまた活性化プロテインＣ約２．５ｍｇ／ｍＬ、ショ糖約１５ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ約１９ｍｇ／ｍＬおよびクエン酸ナトリウム緩衝剤を含有し、ｐＨ５．５またはそれ以上であるがｐＨ６．５またはそれ以下である溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤の製法を提供する。さらにその上、本発明は活性化プロテインＣ約５ｍｇ／ｍＬ、ショ糖約３０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ約３８ｍｇ／ｍＬおよびクエン酸ナトリウム緩衝剤を含有し、ｐＨ５．５またはそれ以上であるがｐＨ６．５またはそれ以下である溶液を凍結乾燥することを含む安定な凍結乾燥製剤を製造する方法を提供する。
本発明は、活性化プロテインＣおよび増量剤であってマンニトール、トレハロース、ラフィノース、ショ糖およびその混合物で構成される群から選択されたものを含む安定な凍結乾燥製剤を含有する単位用量レセプタクル（receptacle）を含む単位用量剤型を提供する。さらに本発明は前記の製剤を投与することを含む脈管内血液凝固を伴う病状の処置法を提供する。
ａＰＣは好ましくは有効な型で血流に送達されることを確実にするために適切な用量を約１時間から約４８時間にわたって連続的な点滴剤として注射することによって非経口的に投与する。投与するａＰＣの量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／時から約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時までである。これとは別にａＰＣは約５分間から約３０分間にわたってボーラス注射として時間当り用量の適切な一部を注射し、それに続いて約２３時間から約４７時間にわたって適切な用量を連続的に点滴することによって投与して２４時間から４８時間にわたる適切な用量の投与とするものでもよい。
以下の実施例に本発明を実施する方法を記載し、本発明を例示することとしたい。本発明の範囲を以下の実施例のみから構成されると理解すべきではない。
製造例１ ヒトプロテインＣの製造
組換えヒトプロテインＣ（ｒ−ｈＰＣ）は、たとえばここに全教示を参考のために引用するＹａｎの米国特許第４９８１９５２号に記載されているような熟練した専門家によく知られた技術によってヒトの腎２９３細胞中で産生させた。ヒトのプロテインＣをコードする遺伝子はここに全教示を参考のために引用するＢａｎｇほかの米国特許第４７７５６２４号に開示され、特許されている。ヒトのプロテインＣを２９３細胞中で発現するプラスミドはプラスミドｐＬＰＣで、ここに全教示を参考のために引用するＢａｎｇほかの米国特許第４９９２３７３号に開示されている。プラスミドｐＬＰＣの構築はここに全教示を参考のために引用する欧州特許公開番号０４４５９３９号およびＧｒｉｎｎｅｌｌほか著、１９８７年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５巻：１１８９〜１１９２頁にも記載されている。略述すれば、このプラスミドを２９３細胞に遺伝子移入し、次に安定な形質転換体を確認し、副次培養して血清不含培地中で増殖させた。発酵後、マイクロ濾過によって細胞不含培地を得た。
ヒトのプロテインＣをＹａｎの米国特許第４９８１９５２号に記載の技術を適用することによって培養液から分離した。清澄化した培地を４ｍＭ−ＥＤＴＡとした後、アニオン交換樹脂に吸着（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ・Ｑ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）させた。４カラム容の２０ｍＭ−トリス、２００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．４および２カラム容の２０ｍＭ−トリス、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて洗浄した後、結合した組換えヒトのプロテインＣチモーゲンを２０ｍＭ−トリス、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４を用いて溶離した。溶離した蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって判断すると純度９５％またはそれ以上であった。
この蛋白質のその後の精製は、この蛋白質をＮａＣｌで３Ｍとし、続いて２０ｍＭ−トリス、３Ｍ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４と平衡させた疎水性相互作用樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ・Ｐｈｅｎｙｌ、６５０Ｍ、ＴｏｓｏＨａａｓ社製）に吸着させることによって達成した。２カラム容のＣａＣｌ2不含の平衡緩衝剤で洗浄した後、組換えヒトプロテインＣを２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４で溶離した。
溶離した蛋白質から残留カルシウムを除去して活性化する準備をした。組換えヒトプロテインＣを金属親和性カラム（Ｃｈｅｌｅｘ−１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）上を通過させてカルシウムを除去し、再度アニオン交換剤（Ｆａｓｔ・Ｆｌｏｗ・Ｑ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に結合させた。両カラムを直列に並べ、２０ｍＭ−トリス、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４と平衡させた。蛋白質を負荷した後、Ｃｈｅｌｅｘ−１００カラムを１カラム容の同じ緩衝液で洗浄後、連結した装置から外した。アニオン交換カラムを３容の平衡緩衝液で洗浄後、０．４Ｍ−ＮａＣｌ、２０ｍＭ−トリス−アセテート、ｐＨ６．５を用いて蛋白質を溶離した。組換えヒトプロテインＣ溶液および組換え活性化プロテインＣ溶液の蛋白質濃度はＵＶ２８０ｎｍの吸光度によって測定して、各々Ｅ0.1%＝１．８１または１．８５の値を得た。
製造例２ 組換えヒトプロテインＣの活性化
ウシのトロンビンを活性化したＣＨ−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に４℃でｐＨ７．５の５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳの存在下に結合させた。この結合反応はトロンビン約５０００単位／樹脂ｍＬを用いてカラムに予め充填しておいた樹脂上で行った。カラムにトロンビン溶液を約３時間循環させた後、２−アミノエタノール（ＭＥＡ）を０．６ｍＬ／循環溶液Ｌの濃度で添加した。このＭＥＡ含有溶液をさらに１０〜１２時間循環させて樹脂上にある未反応アミンの完全な遮断を確保した。遮断に続いてトロンビン結合樹脂を１０カラム容の１Ｍ−ＮａＣｌ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ６．５を用いて洗浄し、非特異的に結合した蛋白質を全て除去し、これを活性化緩衝液と平衡させた後に活性化反応に使用した。
精製したｒ−ｈＰＣをＥＤＴＡ（残留カルシウムがあればキレート化するために）で５ｍＭとし、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４または２０ｍＭ−トリス−アセテート、ｐＨ６．５を用いて２ｍｇ／ｍＬ濃度まで希釈した。この物質を３７℃で５０ｍＭ−ＮａＣｌおよび２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４か２０ｍＭ−トリス−アセテート、ｐＨ６．５かのどちらかと平衡させたトロンビンカラム上を通過させた。流速はｒ−ｈＰＣとトロンビン樹脂との間の接触時間が約２０分間になるように調節した。溶出液を集めて直ちにアミド分解活性について検定した。この物質が樹立されたａＰＣ標準と比較して特異的（アミド分解的）活性を持たなければ、それをトロンビンカラムに再循環させてｒ−ｈＰＣを完全に活性化させた。それに続いてこの物質を前記と同じｐＨ７．４または６．５の２０ｍＭ−緩衝液を用いて１：１希釈してａＰＣを低濃度に保持して次のプロセッシング工程まで待機させた。
このａＰＣ物質から浸出したトロンビンの除去はａＰＣを１５０ｍＭ−ＮａＣｌを用いて活性化緩衝液（２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４または２０ｍＭ−トリス−アセテート、ｐＨ６．５）と平衡させたアニオン交換樹脂（Ｆａｓｔ・Ｆｌｏｗ・Ｑ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に結合させることによって達成した。トロンビンはこれらの条件下にはアニオン交換樹脂とは相互作用せずにカラムを通過して試料用溶出液に入る。カラムにａＰＣを負荷した後、２〜６カラム容の２０ｍＭ−平衡緩衝液による洗浄を行った後、５ｍＭ−トリス−アセテート、ｐＨ６．５または２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４中の０．４Ｍ−ＮａＣｌを用いる段階的溶離によって結合したａＰＣを溶離した。カラムの大容積洗浄はドデカペプチドの完全性の高い除去を促進した。このカラムから溶離した物質を凍結溶液中で（−２０℃）、または凍結乾燥粉末として保存した。
活性化プロテインＣの抗血液凝固作用は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）血液凝固検定法での血液凝固時間の延長を測定することによって決定した。標準曲線は希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ放射免疫検定級ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ3）中、プロテインＣ濃度１２５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で作製し、一方、試料はこの濃度範囲内で数段階希釈して調製した。各試料キュベットに冷ウマ血漿５０μＬおよび再構成した活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、Ｓｉｇｍａ社製）５０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、適当な試料または標準５０μＬを各キュベットに添加した。試料または標準品の代わりに希釈緩衝液を用いて基礎血液凝固時間を決定した。各試料または標準品に３７℃で３０ｍＭ−ＣａＣｌ2５０μＬを添加した直後にフィブロメーター（ＣｏＡ・Ｓｃｒｅｅｎｅｒ・Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ・Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ｌａｂｏｒ社製）のタイマーを起動させた。試料の活性化プロテインＣ濃度は標準曲線の線形回帰式から算出した。標準曲線試料の分を含めて、本明細書で報告する血液凝固時間は最低３回反復の平均値である。
実施例１ 活性化プロテインＣの製剤
ヒトの活性化プロテインＣは製造例１および製造例２に記載したようにして製造した。活性化プロテインＣ製剤は通常の凍結乾燥機による処理法について分析した。凍結乾燥顕微鏡術および示差走査型熱量測定術（ＤＳＣ）を用いてパラメータ２種を測定して製剤が通常の凍結乾燥機で処理できるかどうかを検討した。凍結乾燥顕微鏡術は凍結乾燥をするために凍結した溶液の崩壊（collapse）温度を決定するためには有用な技術である。ＤＳＣは凍結した溶液のガラス転移温度（Ｔｇ’）を決定するために有用な技術である。崩壊温度およびガラス転移温度は凍結乾燥工程の間に安全に使用できる温度の上限を予測するために特に有用である。凍結乾燥顕微鏡術の結果はＤＳＣによって得られるＴｇ’値のガラス転移温度と符合する。−４０℃またはそれより上の崩壊温度は、通常の凍結乾燥機で処理すべき試料について最適である。
0004383547.tif 000002
ａＰＣ対ショ糖対塩化ナトリウムの比率（１０ｍＭまたは２０ｍＭ−クエン酸塩緩衝液中）は崩壊温度およびガラス転移温度に影響を与える重要な製剤用変数である。通常の凍結乾燥機で処理するためには、塩化ナトリウム濃度は凍乾剤製法の凍結工程の間に塩化ナトリウムが晶出を起こすために十分に高い濃度（好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬのａＰＣ製剤については３２５ｍＭおよび５ｍｇ／ｍＬのａＰＣ製剤については６５０ｍＭ）でなければならない。ａＰＣの製剤は通常の凍結乾燥機で処理すれば重量比で１部のａＰＣ、６部のショ糖および７．６部の塩化ナトリウムから構成される凍結乾燥製品を製造できる。
実施例２ 種々の増量剤を含有する製剤製品におけるａＰＣの安定性
分子安定性に対する様々な増量剤の効果を検討するため、ａＰＣの製剤を調製した。塩を含有しない燐酸緩衝液中のａＰＣに合計６種の添加剤を加えた。これらの増量剤はグリシン、マンニトール、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、およびヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）である。燐酸塩中、無塩、無増量剤製剤（「対照」）でのａＰＣの安定性を増量剤添加製剤での安定性と比較した。試料は５０℃、４０℃、および２５℃で様々な長さの時間貯蔵した。これらの試料の分析データを初期値（時間＝０）と比較した。ＡＰＴＴ力価、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛋白質含量検定法を使用して製剤の物理学的および化学的安定性を評価した。
ａＰＣの製剤はａＰＣを燐酸緩衝液にａＰＣ５ｍｇ／ｍＬまで溶解することによって調製した。増量剤は６：１の比率（増量剤対ａＰＣ）または３０ｍｇ／ｍＬでａＰＣ溶液の一部に添加した。これらの試料を凍結乾燥してａＰＣ５ｍｇ／バイアルとした。
これらの製剤は５０℃で１４日間および２８日間；４０℃で２８日間、４８日間および６ケ月間；および２５℃で６ケ月間および１２ケ月間；にわたる安定性試験を行った。各時点において、各製剤のバイアル２個を別個の試料として独立に分析し、これらの試料から得たデータを初期値（時間＝０）と比較した。分析には、ａＰＣ力価（ＡＰＴＴ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＰＣモノマーの百分率、および蛋白質含量を含めた。
0004383547.tif 000003
0004383547.tif 000004
0004383547.tif 000005
0004383547.tif 000006
ｐＨ、色、包装特性および物理的外観にはどの試料にも１年の安定性試験期間内に顕著な変化は認められなかった。ＡＴＰＰおよびＳＥ−ＨＰＬＣ操作で分析すると、ＨＥＳ製剤およびグリシン製剤は対照と比較して物理学的安定性（凝集による）および化学的安定性（力価）が低かった。マンニトール製剤は対照と比較すると僅かに良好な物理学的および化学的安定性を示したが、その他の製剤、すなわちショ糖、トレハロースおよびラフィノースの製剤は全て対照と比較してはるかに優れた物理学的および化学的な安定性を示した。それ故、ａＰＣ製剤における増量剤としてのマンニトール、ショ糖、トレハロースおよびラフィノースは増量剤不含またはグリシンまたはＨＥＳを有するａＰＣ製剤と比較して化学的および物理学的に優れた安定性を示す。
実施例３ 組換えヒト活性化プロテインＣの安定性
組換えヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）の凍結乾燥製剤２ロットを４０℃／相対湿度７５％で１ケ月貯蔵後、分解の可能性について分析した。ａＰＣの安定性は無菌水で再構成し、常温で７２時間まで貯蔵したものについても観察した。バイアル中の凍結乾燥ａＰＣ製品はａＰＣ１０ｍｇ、ショ糖６０ｍｇ、塩化ナトリウム７６ｍｇ、およびクエン酸塩１５．１ｍｇを含有していた。この製剤中のａＰＣは乾燥状態では４０℃／相対湿度７５％で短くとも１ケ月間は安定であって、溶液中では常温で貯蔵した時には２４時間安定である。
両ロットはバイアル当りａＰＣ１０ｍｇ、ショ糖６０ｍｇ、塩化ナトリウム７６ｍｇおよびクエン酸塩１５．１ｍｇを含有する同一の単位処方を使用して製造した。ａＰＣの両凍結乾燥ロットは４０℃／相対湿度７５％で１ケ月間貯蔵後にＡＰＴＴ検定、ａＰＣペプチドを定量するためのイオン対形成ＨＰＬＣ、および蛋白質変化体を定量するための質量分析を使用してａＰＣの安定性を観察した。ロットの一つは無菌水を使用してａＰＣ１ｍｇ／ｍＬに再構成し、常温に保持した。溶液中におけるａＰＣの安定性は０時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点でＡＰＴＴおよび質量スペクトル術を使用して観察した。
乾燥状態では４０℃／相対湿度７５％で１ケ月間の貯蔵後にａＰＣ活性の低下は認められず、また分子構造の分解量は有意でなかった。この製剤中のａＰＣは１ｍｇ／ｍＬに再構成後、２４時間まで安定である。