(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニス再建に用いられる移植可能なプロステーゼ海綿体状構造体であって、前記構造体は、延長形状を有しかつ海綿体平滑筋細胞が接種された生物学的適合性ポリマ・マトリックスを包含し、前記構造体が移植されると、平滑筋細胞の成長を誘発して人工海綿体部材が形成される、プロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項２】
前記ポリマ・マトリックスが、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、弗化ポリエチレン、フェノールポリマ、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリサルファイド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリ弗化ビニリデン、再生セルロース、シリコン、ユリア−ホルムアルデヒド、およびこれらのコポリマ又は物理的混合物を包含する、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項３】
前記ポリマ・マトリックスが生分解性材料を包含する、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項４】
前記生分解性材料がポリグリコール酸ポリマである、請求項３に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項５】
前記ポリマ・マトリックスが、尿道を受容するように適合されている手段を更に包含する長尺の筒である、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項６】
尿道を受容するように適合されている前記手段が、その長さ方向に沿った長手方向の溝である、請求項５に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項７】
前記ポリマ・マトリックスが、壁面厚さとその長さ方向に沿った孔とを有する中空の筒状バルーンである、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項８】
前記中空の筒状バルーンチューブが、その長さ方向に沿って尿道を受容するように適合されている、請求項７に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項９】
前記移植片を下行骨盤に取りつけるために、少なくとも一つの一端を更に包含する、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項１０】
前記構造体が、プロスタグランジンＥ１(ＰＧＥ１) の生産を増大させる平滑筋細胞を更に包含する、請求項１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項１１】
前記ポリマ・マトリックスに接種された内皮細胞を更に包含する、請求項１〜１０のいずれかに記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【請求項１２】
前記内皮細胞が、ＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞である、請求項１１に記載のプロステーゼ海綿体状構造体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、支持体上で成長した海綿体組織を包含する移植片を利用することによりペニスの欠陥を治療するための方法及び材料、特に勃起性ペニスの再建に有用な方法及び材料に関する
【０００２】
背景の説明
ペニス又は陰茎は、性交及び尿排泄に関する男性器官であり、根元、本体および末端即ち陰茎亀頭を包含する。ペニスの構造は、二つの並行な筒状の本体、即ち海綿体と、それらの下にある尿道海綿体とからなり、この中を尿道が貫通する。ペニスの根元は、陰茎脚により恥骨の下降部分に付いており、この陰茎脚が海綿体の末端である。尿道はペニスの下側に沿って走った後、上に向かって走り、ペニスの先端で蓋のようになった、拡張した円錐型の先端である陰茎亀頭で開放する。空洞体又は海綿体（原語：cavernosorum）ペニスは、ペニスの海綿体の空洞又はペニスの海綿体内の膨張可能な隙間のことを指しており、そこに血液が充満し、勃起と共に膨張してくる。緩い皮膚がペニスを覆って収縮可能な包皮又は陰茎包皮を形成する。体の（原語：corporal）、腺の（原語：corporeal）及び小体の（原語：corporic）、という用語は、海綿体から誘導される組織、又は、自然又は人工的な手段により海綿体組織へと発生、分化又は変性させうる組織を説明するのに用いる。
【０００３】
種々の先天性及び後天性の尿生殖器系異常には、陰茎の外科的な再建及び/又は増大が必要である。性器形成不全症、先天性奇形及び尿道上裂症候群、小陰茎症、無陰茎症、重度尿道下裂症、湾曲陰茎症、隠伏陰茎症、重陰茎症、有帆陰茎症（原語：penis palmatus）、形成性陰茎異常、インポテンツ、女性性器から男性性器への性器の変更、腹側尿道下裂症及び退縮陰茎症（脊髄損傷および外傷性又は手術による後天性の陰茎欠陥のある患者に見られる）のような多様な症状に取り組んでいる外科医達は、満足のいく、機能する陰茎形成術のための正常な体組織が十分にないことによって惹起される共通の困難に遭遇する（Woodhouse,C.R.J.: J.Urol., 152:645, 1994;Atala, A et al. J. Urol., 150:745, 1993 ）。
【０００４】
ペニスの再建および延長のために設計された最近の手術様式は、尿道上裂に関連する短小陰茎の治療用に開発された技術に依存している。ペニスの提靭帯のリーシス又は座骨恥骨の羽枝からの海綿体の分離等、これらの靭帯状付着物から海綿体を遊離させるように設計されたこのような技術は、ペニスの長さを明らかに増大させる結果をもたらしてきたが、これらの技術は、十分な自生の体が存在することに本質的に依存することで限界を有する。こうした患者は、たとえ性的能力があっても、ペニスの長さに限度があるために満足することはない。
【０００５】
完全な又は完全に近い陰茎形成術のために設計された、遊離皮弁技術を用いる手術は、外観上は容認できる程の結果をもたらし得るが、性的貫入が可能な程に十分な固さを獲得するには期待はずれであった。自己移植片組織は、単独でも又は人工ペニスプロテーゼとの組み合わせでも、ペニスの高度に分化した勃起機能を満足させる程に代替することはできなかった。更に、自己由来の移植組織であってもまた人工的な移植片であっても、びらん、突出、吸収、湾曲および脱落などの数多くの合併症をもたらした。現在の手法には、正常で、機能的な勃起性組織の良質な代替物がないことで限界があることは明らかである（Horton, C.E. and Dean, J.A.: World J. Surg., 14: 757, 1990; Hage, J. J., and De Graaf, F. H., 14: 592, 1993）。
【０００６】
外科技術も同様にインポテンツの症状に対処するには不適切であった。インポテンツには数多くの原因がある。器質的なインポテンツは、特定の生理学的過程の干渉を原因とする機能的勃起を起させる又は維持する能力の喪失である。器質的インポテンツの原因には、脊髄損傷又は骨盤骨折などの外傷、前立腺切除、膀胱切除、外部括約筋切開及び腹部会陰切開などの術後合併症、動脈硬化又は持続勃起症などの血管疾患、末梢ニューロパシ及び多発性硬化症などの神経疾患、糖尿病、性腺機能低下症及び腎不全などの内分泌及び代謝疾患、及び、エストロゲン、副交感神経遮断剤、モルヒネ、及びヘロインなどの投薬が含まれる。勃起のメカニズムに必然的に伴う複合反射作用も同様に生理学的な要因によって影響される。
【０００７】
陰茎再建術が最初に試みられたのは自己組織を用いた３０年代後期のものである（例えばGoodwin, W.E. et al., Phalloplasty. J. Urol., 68: 903, 1952を参照されたい）。外傷によりペニスを失った患者には肋骨軟骨が硬質化材料として用いられてきている。この方法には複数の段階を経る外科術が含まれ、美容的に満足のいく結果を出していない（Frumpkin, A.P.: Am. Rev. Sov. Med., 2: 14, 1944）１９７０年代にはシリコン製のプロテーゼが人気を博した（Bretan, P.N.Jr.: In: Genitourinary Prostheses. Montague, D. K. (ed), Philadelphia, W. B. Saunders Co., 1 989; Small, M. P. et al., Urology, 5 : 479, 1975）のペニス用プロテーゼは成人向けの治療様式としては受け容れられているが、びらん及び感染といった合併症が依然問題として残っている（Nukui, F. et al., Int. J. Urol., 4: 52, 1997; Kardar. A. et al., Scan. J. Urol. & Nephrol., 29: 355 , 1995）。人工プロテーゼに関して報告された問題には、他にも、尿道を貫通した突出、又は背側陰茎骨幹の沈み込み、リンパ水腫、亀頭冠の刺激、プロテーゼ上の亀頭の滑り、海綿体の感染、脚部の穿孔、中央骨幹中隔の穿孔、及びペニス痛、がある（Small, M. P. et al., Urology, 5: 479, 1975）。
【０００８】
シリコン製のペニス用プロテーゼは、ペニス再建術の必要な成人向けの治療様式として受け容れられてはいるが、小児集団にはあまり適用されておらず、その大きな理由はこれらの人工装置に伴う長期的問題である。このように、性器の再建術を必要とする小児で用いることができるかも知れない生物学的適合性がありかつ弾性のペニス用移植片が求められている。
【０００９】
現在の方法における欠点によって、陰茎再建術には深刻な制限が課されている。例えば、生まれつきの重度の偽半陰陽及び/又は小陰茎症をもつ遺伝子型の男の幼児は、医師が、十分な大きさの、機能する新生陰茎を提供する能力がないために性の再割り当てを余儀なくされるおそれがある。同様に、移植によって機能する勃起組織を受ける選択肢がないために、重度の体繊維症及び筋疾患を患うインポテンツ患者は、血管作動性の治療薬剤又は血管のバイパスに無反応なために、ペニスプロテーゼによる置き換えという最終的な選択しか残されておらず、また正常な勃起機能を回復する将来の見込みが否定されている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、構造支持部材を再形成するための組織及び臓器の再建術に於ける現在の戦略及びデザインに伴った問題及び短所を克服するものである。
【００１１】
本発明の一実施例は、解剖学的欠陥又は勃起の欠陥を有する患者を治療するのに用いる移植可能なプロテーゼ構造に関する。この構造は、ポリマ・マトリックスを移植したときに海綿体状の構造部材が形成されるよう、解離性海綿体細胞をマトリックス上及びマトリックス内部に沈着させた所望の支持部材の形状に成形されたポリマ・マトリックスから形成される。このプロテーゼ海綿体状の構造部材は、欠陥部位に必要な勃起機能をもつ構造支持が提供されるような制御された生体力学的特性を有する。
【００１２】
本発明のさらなる実施例は、このような治療を必要とする患者のペニスを再建する方法に関する。構造部材を形成するよう成形されると共に、海綿体に合う又は海綿体に代わるよう採用された、生物学的適合性の合成又は天然ポリマ・マトリックスが提供される。海綿体細胞をポリマ・マトリックス上及びポリマ・マトリックス内部に沈着させて、マトリックス／細胞コンストラクトを形成する。このマトリックス／細胞コンストラクトを、プロテーゼ海綿体状構造が生体内に、その性質が生体力学的に制御された状態で形成されるよう、患者の海綿体に移植することで、機能的臓器として働くに充分な勃起時の固さ及び曲げ強さを持った再建されたペニスを提供する。
【００１３】
ポリマ上に接種された培養海綿体細胞が、生体内に移植される際に海綿体筋肉を形成するようになる一方、好適に再形成された体組織には、内皮及び筋肉細胞が含まれる。従って、本発明は、平滑筋を内皮細胞と組み合わせることで（図１）、生体内に体組織を発生させるための方法を提供する。本発明のその他の実施例及び利点は、以下の記載に部分的に述べたものであり、また同記載は、部分的には、本明細書から明白であると共に本発明の実施から学ばれるところであろう。
【００１４】
発明の説明
最も広い態様では、本発明は陰茎の解剖学的欠陥を有する患者を治療するための、また、勃起性の構造支持部材を提供することにより少なくとも部分的に治療され得る患者を治療するための方法及び材料に関するものである。この方法は同様に必要な膨張性支持体を提供してクリトリスの類似の欠陥を治療するのに用いてもよい。必要となる構造支持は、所定形状であると共に制御された膨張性及び生体力学的性質を有する組織操作され、かつ海綿体細胞を移植された構造部材により、本発明に基づき提供することができる。
【００１５】
本発明による方法の一つの利点は、この方法によって、再建したペニスが解剖学的及び生理学的双方の機能に関して自生の体組織と実質的に同様な態様で機能することが可能になることである。この方法で海綿体の実質組織の本体が形成されるので、海綿体再建術の最も自然な方法は、海綿体平滑筋自体を用いることである。
【００１６】
海綿体組織は、外来患者ベースの経皮手術手法に於いて局部麻酔のもとで安全にかつ容易に入手することができる（Wespes, E. et al., Eur. Urol., 18:81, 1990）。一旦採取したら、この組織は、自己由来のヒト海綿体平滑筋細胞、繊維芽細胞及び内皮細胞の外植組織培養を確立するために用いてもよい。試験管内で展開後、これらの細胞は、付着及び増殖場所である生分解性ポリグリコール酸ポリマ足場上に接種すればよい。再建手法に於ける自己移植片として一旦生体内環境に移されると、これらの細胞は、それらに高度に分化された生理学的機能を再構成し、かつこうした機能を取り戻すことができる。自己由来の細胞移植で使用する採取した海綿体平滑筋細胞の有用性は、本発明によるインポテンツの治療に用いことができる。
【００１７】
本発明の別の実施例は、インポテンツ患者から採取した病変のある海綿体平滑筋細胞の治療に関する。治療は、発生学的変性療法の様式でよい。発生学的変性療法は、化学物質ベースの又はウイルスベースのトランスフェクションのような一般的に公知の技術を用いて実施してもよい。例えば、ヒトの海綿体平滑筋細胞のなかには、シトキン変質変換成長因子１（ＴＧＦ−１）の細胞過剰生産のよる欠陥細胞がある。ＴＧＦ−１の増加が次には、動脈性機能不全症患者の体内での過剰コラーゲンの合成及び蓄積に至り、体繊維症となる（Moreland, R.B. et al., J. Trol., 153:826, 1995）。プロスタグランジンＥ１(ＰＧＥ１)の投与によって、この効果が試験管内で抑制される一方、症状の除去は一時的に過ぎない。本発明の一実施例では、海綿体平滑筋細胞は、インポテンツ患者から採取され、発生学的に変質されてＴＧＦ−１の生産を減少又は中断させたり、又は代わりにＰＧＥ１の生産を増大させる。これらの細胞は、ペニス再建術に使用される。一旦これらの細胞が病変した海綿体を増殖させるのに用いられると、患者は勃起機能性を取り戻すことができる。
【００１８】
本発明の別の実施例は、超微細構造的正常度を基準にして特定の細胞集団を事前に選択することで勃起機能障害を治療する方法に関する。正常（勃起性）細胞と異常（非勃起性）細胞を選別するために超音波を用いることに対する実行可能性が証明されている（Jevtich, M. et al., J. Utrol., 143: 289, 1990; Persson, C. et al. J. Urol., 142: 1462, 1989）。勃起機能障害患者からの体外移植組織培養物に超微細構造分析を行えば、超微細構造的に正常な細胞の一集団を選択的に展開することができよう。これらの数多くの機能細胞をこのような患者の体に再導入する方法を、勃起性機能の回復に用いてもよい。この方法の利点の一つは、この治療には発生学的変質療法が関係しないことである。こうした治療様式は、ある患者集団及び規制機関にとってはより受け入れ易いと言えよう。
【００１９】
本発明の別の実施例は、性器再建術で又はインポテンツの治療として使用するための細胞/ポリマ移植片を外科的に送出することで勃起障害を治療する方法に関する。この方法に於いては、経皮治療法を用いてもよく、ここでは注入可能なポリマが海綿体平滑筋細胞の送出媒体として働く。例えば、海綿体組織を、分離し、展開し、そして注入可能なマトリックスゲルと混合してもよい。細胞混合物は、低パーセンテージの機能している海綿体平滑筋細胞が自生組織内にある場合に、勃起障害の経皮的治療のために注入される。
【００２０】
別の実施例は、脈管形成因子で体細胞を再移植することで、ペニスの障害を治療する方法に関する。この脈管形成因子は、外生でも又は内生であってもよい。外生的脈管形成因子は、細胞又はポリマ・マトリックスと混合してもよい。経皮的脈管形成因子は、脈管形成因子又はこれらの因子の先駆物質を発現させるための、体細胞の発生学的変質によって獲得できる。脈管形成因子を送出する別の方法は、脈管形成因子を発現する細胞を含む細胞集団を混入することである。
【００２１】
この治療方法の一つの利点は、体細胞の表現型の転形を逆転できることである。機能的表現型を維持する体細胞の能力は、十分な血液供給が前提となる（Moreland, R.B. et al., J. Urol., 153: 826, 1995; Jevtich, M. et al., J. Urol., 143: 289, 1990; Persson, C. et al. J.Urol., 142: 1462, 1989）。移植された細胞集団は、慢性的なペニス動脈機能不全症を有するインポテンツ患者の海綿体平滑筋細胞と全く同様に、合成表現型への退行及び/又は転形を被るおそれがあり、沈着したコラーゲン筋原繊維の形で細胞間マトリックスが漸進的に蓄積されていく。本発明による方法の一つの利点として、脈管形成因子はより高度な酸素引張力をもたらすことができ、収縮性表現型に向かって大規模な分化を促進することになろう。
【００２２】
本発明の別の実施例は、海綿体平滑筋細胞のための生分解性ポリマ足場を解剖学的な、予備形成構造を介して用いることで、ペニス障害を治療する方法に関する。このような構造体上に海綿体平滑筋細胞を送出すると、ポリマが生分解した後で、機能的な新生海綿体の可能性が生まれよう。合成ポリマも同様に、使用に先立って試験管内の転形を受ける可能性を有し、細胞の成長及び生体内での分化を促進することが期待できる必須成長因子/又は他の薬剤を運ぶことができよう（Langer, P. and Moses, M.: J Cell. Biochem., 45: 340, 1991）。
【００２３】
細胞
細胞は、平滑筋細胞を包含していれば任意の組織から分離してもよい。細胞分離のための一つの好適な組織タイプは、ペニスの海綿体組織である。平滑筋細胞の供給源として役立つ可能性のある他の組織には、患者の任意の筋グループからの平滑筋細胞がある。一つの好適な筋グループは、患者の体からの大無紋不随意筋である。開示された方法によって、筋細胞の小さな最初の集団が展開することができるので、ごく小さな組織試料で十分である。試験管内での展開能力の一つの利点は、たとえ患者に正常な海綿体組織が限られた量しかなくても、本発明の治療方法は、自己移植片に又患者の治療に使用可能なことである。
【００２４】
海綿体細胞のような平滑筋細胞は、また好適には自己海綿体細胞は、所望であれば、ポリマ・マトリックス「足場」上での接種用に利用可能な、このような細胞の数を増やすために試験管内で培養することができる。培養条件は、本出願の実例部分で説明する。同種異型の細胞、より好適には自己の海綿体細胞を用いることは、組織拒否反応を抑制するのに好ましい。しかしながら、ペニス再建構造体の移植後、免疫反応が実際に患者に生じることがあれば、例えばサイクロスポリン又はＦＫ５０６のような免疫抑制剤で治療し、ＰＣＣＳの拒絶症状の可能性を抑えるようにしてもよい。ある実施例では、キメラ細胞、又は遺伝子導入動物からの細胞が、ポリマ・マトリック上に接種することができる。これらのキメラ細胞又は形質転換動物の細胞は、移植片拒絶を抑制するために遺伝子操作してもよい。
【００２５】
免疫拒否に対処するための方法は、当業者には公知である。免疫拒否を抑制する公知の方法の実例には、主要及び副組織適合遺伝子のアブレーション又は抑圧（即ち、アンチセンスＤＮＡ等の技術の使用）がある。例えば、クラスＩ及びクラスＩＩ組織適合遺伝子等の細胞表面抗原の発現は、抑圧可能である。これによって移植細胞はホストからの拒絶確率を低く抑えることができるようになった。トランスフェクションも同様に遺伝子送出に使用可能になった。海綿体細胞等の平滑筋細胞は、ＴＧＦ−１の発現を抑制するために、又は脈管形成因子の発現を増大させるためにトランクフェクションによって促してもよい。脈管形成は、新生陰茎の勃起機能のためばかりでなく細胞が非勃起陰茎へと分化するのを防止するためにも重要である。
【００２６】
本発明の別の実施例では、海綿体細胞は、ポリマ接種前に特定の遺伝子でトランスフェクションを行うことができる。細胞ポリマ構造体は、ホスト又は組織操作した新生器官の長期生存に必要な遺伝子情報を運ぶことができよう。例えば、細胞は糖尿病治療にインシュリンを発現するようにトランスフェクションを行ってもよい。
【００２７】
細胞培養は、細胞分別段階の有無に関係なく作成できる。分別段階は、ドナ細胞が高いパセンテージで欠陥がある場合は、有用である。例えば、ペニスの癌の治療に於いて、一試料の海綿体組織を培養して、新生細胞を除去するために分類してもよい。残余の非新生細胞は、ペニスの再建用にしてもよい。
【００２８】
細胞分別及び分類は、細胞の副次集団に対して特定的な抗体で蛍光活性した細胞分類のような技術を用いて実行することができる。沈殿法、細胞体積、電気的及び無線波透過、ＥＧＦ−１発現等の他の判定基準を、細胞分類又は予備分類のために利用してもよい。細胞分別が使用されてもよいが、それは本発明の実施には必要がない。
【００２９】
本方法の別のオプション手法は、低温保存である。例えば、低温保存は、複数の侵入性外科手法の必要性を低減させるのに有用であろう。細胞集団を増幅しても、増幅した細胞集団の任意部分を用いても、また別の部分を超温保存してもよい。細胞を増幅及び保存する能力は、ドナ細胞の選択の幅をかなり広げる。例えば、組織適合ドナからの細胞は、増幅してもよく、一つ以上の宿主に用いることができる。
【００３０】
低温保存法の有用性の別の実例は、細胞バンクにある。ドナ細胞は組織適合性データと共に低温保存可能である。例えば、ドナ細胞はドナ組織バンクに貯蔵可能である。ＰＣＣＳ用に組織が必要の際には、患者にとって最も組織適合性がある細胞を選択すればよい。病気があったり又は従来の陰茎形成術を受けていたりする患者は、低温保存された海面体の一部を有している場合もある。後日、従来の治療が万一不成功と判明した場合には、保存細胞をペニス再建術用に解凍すればよい。もしもその患者が非常に若かったり、又は陰茎形成術を遅延させねばならないような医学的な緊急時には、細胞低温保存法は同様に有用である。例えば、火傷犠牲者及び免疫系の不全症を有する幼児は、患者の状態が改善した際に、引き続いて再建術が受けられるように組織を低温保存してもよい。
【００３１】
ポリマ・マトリックス材料
生物学的適合性材料、特に生分解性材料がポリマ・マトリックスの構造には好適な材料である。生物学的適合性のある、とは、生物学的機能に有毒又は有害な作用のない材料を言う。生分解性のある、とは、患者の体内で吸収又は分解の可能な材料を言う。生分解性のある材料の例には、例えば吸収性縫合糸がある。生分解性の構造を形成するための代表的な材料には、制御された速度で加水分解されると共に再吸収されるような、例えばコラーゲンや、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル及びポリ無水物などのポリ（アルファエステル）などの、天然又は合成のポリマ、及びそれらのコポリマが含まれる。これらの材料では、分解能力、操作性、大きさ及び形状を最大限に制御できる。好適な生分解性ポリマ材料には、吸収性の合成縫合糸材料として開発されたポリグリコール酸及びポリグラクチンが含まれる。ポリグリコール酸及びポリグラクチンファイバはメーカが提供したまま用いてもよい。その他の生分解性材料には、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、弗化ポリエチレン、フェノールポリマ、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリサルファイド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリ弗化ビニリデン、再生セルロース、シリコン、ユリア−ホルムアルデヒド、又はこれらの材料のコポリマ又は物理的混合物が含まれる。当該材料を適した抗菌剤と一緒に含浸させてもよく、また可視性を高め、外科的手法の助けとなるよう着色剤で着色してもよい。
【００３２】
いくつかの実施例では、基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、これらの混合物や、細胞培養における当業者に公知の生物学的マトリックス分子に類似の性質を有するその他の材料などの化合物でポリマをコーティングすることにより、ポリマに対する細胞の付着を高める。全てのポリマは、引き続く成長及び増殖共に細胞に適切な支持体を提供するのに必要な機構的かつ生化学的なパラメータを満足させねばならない。栄養素、成長因子、分化又は脱分化の誘導物質、分泌生成物、免疫修飾物質、炎症抑制物質、退行因子、リンパ網又は神経繊維の内方成長を助長又は許容する生物学的に活性のある複合物及び薬品を含む諸因子が、マトリックスと一体化したり、又はマトリックスと共に提供されるうる。同様に、付着ペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のようにペプチドを包含するポリマは、マトリックスを形成時に用いるために合成することができる。
【００３３】
現在、好適な生物学的適合性のあるポリマはポリグラクチン及びポリグリコール酸である。ポリグラクチンはビクリルが撚り合わされた吸収性縫合糸（ニュージャージー州サマービル、エシコン社製）（Craig P. H., Williams J. A.. Davis K. W., et al.: A Biological Comparison of Polyglactin 910 and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures. Surg. 1 4 1 ; 101O, (1975)）として製造された、グリコリド及びラクチドが９０：１０のコポリマである、吸収性の合成縫合材料として開発された。ポリグラクチン及びポリグリコール酸ファイバはメーカが提供したままの状態で利用することができる。生物学的適合性のあるポリマは、例えば溶媒鋳造、圧縮成形、フィラメント引き、メッシング、リーチング、ウィービング及びコーティングなどの方法を用いて成形してもよい。溶媒鋳造では、一つ又はそれ以上のポリマを例えば塩化メチレンなどの適した溶媒に溶かした溶液をブランチング・パターンのレリーフ構造として鋳造する。溶媒を蒸発させた後で薄膜を得る。圧縮成形では、ポリマを適したパターンに１平方インチ当り最大３０，０００ポンドの圧力で圧縮する。フィラメント引きは、溶融ポリマから引き出すステップを含み、メッシングはファイバをフェルト様の物質に圧縮することによりメッシュを形成するステップを含む。リーチングでは、二つの材料を含有する溶液を、マトリックスの最終形に近い形に広げる。次に、溶媒を用いて構成要素の一方を溶解させて細孔を形成する（例えばここに参考文献として編入することとするMikosの米国特許第5，514，378号を参照されたい）。核生成法では、マトリックスの形状の薄膜を放射性核分裂生成物に曝露することで、材料が放射線で損傷することによって軌跡を生じさせる。次に、ポリカーボネートのシートを酸又は塩基で食刻し、放射線で材料が損傷したことで生じた軌跡を細孔に変化させる。最終的に、レーザを用いて、数多くの材料を貫通している個々の孔を成形及び焼成して、均一な大きさの細孔を持つマトリックス構造を形成してもよい。
【００３４】
コーティングとは、ポリマ構造に、例えば液化コポリマ（ポリ−DL−ラクチド、コグリコリド50：50、80ｍｇ／ｍｌの塩化メチレン）などの材料をコーティング又は浸透させてその力学的特性を変化させることを言う。コーティングは、所望の力学的特性が達成されるまで、一層又は複数の層で行なってもよい。これらの成形技術を組み合わせて利用してもよく、例えばポリマ・マトリックスを編み、圧縮成形し、相互に接着してもよい。さらに、異なるプロセスで成形される異なるポリマ材料を相互に接合して複合形状を形成してもよい。この複合形状は層状構造でもよい。例えば、ポリマ・マトリックスを一つ又はそれ以上の同じか又は異なる組成のポリマ・マトリックスに付着させて複数層のプロテーゼ海綿体構造を形成してもよい。この付着は、例えば液体ポリマを用いた接着、ステープリング、縫合、又はこれらの方法の組合せなど、いかなる適した手段で行なってもよい。加えて、ポリマ・マトリックスを固形の塊として形成し、レーザ又はその他の標準的機械加工技術で、所望の最終形状に成形してもよい。レーザ成形とは、レーザを用いた材料の除去加工を言う。
【００３５】
ポリマは、力学的特性に付いては例えばインストロン・テスタを用いた引張り強度、ポリマ分子量についてはゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）、示差走査熱量計（ＤＳＣ）によるガラス遷移温度、及び赤外（ＩＲ）分光による接着構造、毒性学的にはエームス・アッセイ及び試験管内奇形発生性アッセイを含む初期スキャンニング試験、免疫抗原性、炎症、放出及び分解実験のための動物における移植実験、で特徴付けることができる。試験管内での細胞接着及び生存率は、放射性同位体を用いた走査電子顕微鏡法、組織学、及び定量評価により評価することができる。
【００３６】
ポリマ・マトリックスを移植前に（ポリマ・マトリックスに細胞を接種する前又は後に）添加剤又は薬剤で処置して、例えば移植後の新組織の形成を促進することもできる。このように、例えば成長因子、脈管形成因子、サイトカイン、細胞間マトリックス成分、及びその他の生活性物質をポリマ・マトリックスに加えて、移植片の治癒及び新組織の形成を促進してもよい。成長因子及び他の添加剤（例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合した上皮細胞増殖因子様成長因子（ＨＢＧＦ）繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ），シトキン、遺伝子、タンパク質）、添加された細胞が利用される場合は、ポリマ・マトリックス上に接種した細胞によって作製可能なこのような因子（もしあれば）の任意量を超える量が付加されうる。このような付加的添加剤は、新しい海綿体組織の形成等のように、新生陰茎の形成を促進するのに十分な量が提供されることが好ましい。その他の有用な添加剤には、感染を抑制することにより治癒を促進する抗菌及び抗真菌性薬剤がある。
【００３７】
一つの好適な支持マトリックスは、一旦細胞支持マトリックスが移植されると短い距離を越えて栄養物質が拡散することにより細胞の生存を許容することができる交差糸状体からなる。
【００３８】
プロテーゼ海綿体構造（ＰＣＣＳ）
ＰＣＣＳは、上述のように制御された細孔構造で作製されてもよい。これらの細孔の寸法を用いて細胞分布が測定される。例えば、ポリマ・マトリックス状の細孔は、細胞が当該構造の内部に移動できるほどに大きくてよい。
【００３９】
ポリマ・マトリックスは、任意の数の所望の構造に成型されて、再建された海綿体又は新生陰茎構造を形成することができる。例えば、ペニスの自然な構造を再建することが所望の場合は、二つの海綿体構造を再建して、ペニスに移植すればよい。又は、一つの大きな構造を、両海綿体に代えてもよい。好適な構造は、所望の合成海綿体、即ちペニスの形に大体似たものである。ＰＣＣＳが移植されて海綿体に支持体を提供したり、又はそれと置き代える場合は、当該ＰＣＣＳは、海綿体に似せて成形することができる。すなわち、ＰＣＣＳは、二つの細長い筒又は二つの細長いバルーンを形成するように成形することができる。さらに、精密なペニスの再建には、ＰＣＣＳは細長いロッドに似せて成型することができる。両海綿体を置き代えるように設計された場合は、ＰＣＣＳに、腎臓を象った断面積を有する細長い筒の形状を持たせてもよい。ＰＣＣＳは、中空でも、又は中実のロッド形状をしていてもよい。ＰＣＣＳが中空の場合は、この中空のロッドには尿道の配設用の隙間を有することができる。尿道は自然な、合成され又は巧みに設計された新生尿道でよい。
【００４０】
ペニスプロテーゼの重要な特徴は、その構造を保持するのに必要な十分な硬度を獲得できることである。大人では、プロテーゼは、性交可能にする程の一定の圧力に耐えることができねばならない。したがって、勃起機能を獲得するのに十分な強さを有する細胞層のペニスプロテーゼを備えることが望ましい。再建した構造体の強さは、多層細胞又は細胞間マトリックスの十分に強力な層の誘導によって達成してもよい。ポリマ・マトリックスの形状は、調整することで、合成プロテーゼ海綿体の最終的な強さを変えることができる。例えば、厚くかつ更に多孔性のポリマ・マトリックス層を用いることで一段と強固さを得ることができる。厚い層によって、多層細胞が形成されかつ互いに接着し合うであろう。
【００４１】
ポリマ・マトリックスは、使用前に任意公知の方法を用いて滅菌できる。その方法は、ポリマ・マトリックスで用いた材料による。滅菌方法には、蒸気、乾熱、放射線、酸化エチレンのようなガス及び煮沸がある。
【００４２】
接種
ポリマ・マトリックスを接種する手法は、実例で説明されており、また本明細書に参考文献として特に編入されている発行済み米国特許第５，０４１，１３８号で説明されているような数多くの方法で実施されてよい。
【００４３】
ペニス再建術
移植及び再建術は数多くの技術を用いて行なうことができる。典型的には、患者を背側切開位置に配置し、識別目的のためにカテーテルを尿道内に配する。縦に正中線切開を陰嚢の基部から肛門に向かって行い、この切開を下に向かって球海綿体筋まで行なう。海綿体筋及び尿道を一方の側に引き込ませ、坐骨海綿体筋及び陰茎脚を識別する。同脚を識別したら、約２センチメートルの長さに亘り、これを開放する。ヘーガル頚膨張器を用いて坐骨結節に対して近位、そして陰茎海綿体の全長にわたって遠位にある陰茎脚を膨張させる。ＰＣＣＳを海綿体内部に挿入する。プロテーゼは海綿体の壁面に対してしっかりと密着させるべきである。理想的には、大きさの異なる２、３個のＰＣＣＳを提供するべきである。あるいは、外科医が患者に合うようにＰＣＣＳをトリミングしてもよい。一方のプロテーゼを挿入したら、同じ手法を反対側についても行なってよい。次に、各海綿体の切り込みを３−０の腸線縫合糸で閉じる。傷の残りは通常の方法で閉じる。この手法の間、ＰＣＣＳを例えばポリミキシン−ネオマイシンなどの抗生物質溶液で浸漬する。挿入後、傷を同じ溶液で潅注する。幅広い抗生物質を与えるが、術後も継続する。 ＰＣＣＳの代替外科手法は、当業者には即座に理解されよう。
【００４４】
さらにＰＣＣＳは全ペニス再建術にも用いることもできる。ペニス再建術のための顕微的技術が公知である（例えばJordan et al., J. Urol. 152:410-414, 1994を参照されたい）。このような技術には、まず組織片の神経を陰部大腿又は腸骨鼠径神経へ接合し、筋膜皮膚組織片の局部神経を陰茎背神経に接合し、感覚皮膚を覆うために補助的な自由組織片を用いて薄筋筋皮組織片及び副直筋筋皮組織片を用いて再建し、顔面皮前腕自由組織片を再建するという、感覚上の新形成陰茎の創出が含まれる。完全な再建術では新形成尿道を新形成陰茎と一緒に作製してもよい。また新形成尿道を別に作製し、移植前に新形成陰茎に取りつけてもよい。あるいは、新形成尿道を、二つの異なる細胞種を群集させた基のＰＣＣＳ構造の一部としてもよい。このように、陰茎構築全体を達成することが可能である。小型の生検標本は患者の耳及び膀胱から得ることができる。軟骨細胞及び尿路上皮細胞を別々に成長及び展開させてもよい。細胞は別々の予め形成された生分解性ポリマの足場に接種して、その後一回のステップの操作により、充分な新形成尿道を持つ陰茎を構築することもできる。
【００４５】
ＰＣＣＳを体内の移植物に取りかえることで、びらん及び感染などの合併症の可能性をなくすこともできる。同様のアプローチを、鎌状赤血球貧血症に続発する再発性持続勃起症を呈する患者に応用してもよい。現在可能な処置には再発性持続勃起症を防ぐという証拠がない。自己由来の海綿体細胞から成る操作された天然プロテーゼの移植により、海綿体内のうっ血という問題を恒久的になくすことができるであろう。
【００４６】
ＰＣＣＳに対して考えられる別の有用性は、ペーロニ病のような苦痛を伴う性器の状態に適用されよう。これらの例に対して考えられる治療方法は、発生学的な材料でトランスフェクションを実施した細胞を用いることで達成できよう。トランスフェクションを実施した細胞ポリマ足場によって、送出した遺伝子の機能発現を有する器官様の構造が形成される。炎症及び繊維症を制御する遺伝子が、自己海綿体細胞からなる操作されたペニスプロテーゼへと送出される。この変質プロテーゼが、病気の再発を防止するために機能発現に必要な全ての遺伝子情報を伝達することになろう。
【００４７】
ヒトの海綿体平滑筋細胞は、生体内の環境に首尾良く送出され、生分解性ポリマ足場上で生存し、かつ分化したままに留まる。しかしながら、ヒトの内皮細胞も体組織内に存在する。したがって、ヒトの海面体平滑筋細胞をヒトの内皮細胞と共に用いることで生体内に体組織を創出することが可能かどうか研究がなされた。一つの好適実施例では、ヒトの海綿体平滑筋及び内皮細胞が、生分解性ポリマ足場上に接種された。この足場は、ポリグリコール酸エステルでもよく、典型的には、それぞれ、１０ｘ１０６細胞／ｃｍ３及び１０ｘ１０６細胞／ｃｍ３の濃度である。
【００４８】
内皮の使用は、血栓症の発生率を抑制するために血管代替用にコーティングした移植片に対する生体内実験で試みられた（Heering, et al., 1798, Surgery, 84: 498; Machluf, et al., 1998, Graft 1: 31）。内皮細胞も血管狭窄を防ぐために成長因子及びシトキニンの送出用に用いられてきた（Thompson, et al., 1988, Science, 241: 1349）。しかしながら、知る限りは、複合組織内の毛細管内部成長の促進物質として内皮細胞を用いることは今まで試みられることはなかった。海綿体平滑筋細胞単独の移植は、血管形成を誘導することができるが、新生血管質は正常な体状構造の創出には十分でない。内皮細胞の追加移植は、通常のヒト体組織内で普通に存在する濃度（内皮：３分の１）、海綿体状構造の形成には必須条件であった。
【００４９】
泌尿器細胞を採取し、育てる方法の発展について既に述べた（Atala, et al., 1993, J.Urol. 150:608-612; Cilent, et al., 1994, J. Urol., 152: 665-670）。尿道を含め種々の泌尿器学的臓器を創出するために、生分解性ポリマを用いて細胞が使用された（Atala, Atala A, 及びMooney D: 組織操作において。Boston, Birkhauser Press, Boston, 1997, pp 149-164; Yoo, et al., 1987, Urology, 51: 221; Yoo, et al., 1998, J. Urol., 160: 1164）。本発明は完全な陰茎再建術を提供するものであり、この再建術は組織操作技術を駆使して達成し得るものである。ペニスの小さな組織生検材料を獲得し、尿路上皮、筋肉及び内皮細胞を成長させ、別々に展開させることができる。細胞は、予め構成した勃起性組織及び新生尿道からなる生分解ポリマ足場の上に接種することができ、次いで男性器の再建術が実施される。さらに、繊維症及び炎症を規制する遺伝子が、既に確立されている遺伝子送出法（Yoo, et al., 1997, J. Urol., 158: 1066）を用いて、新たに形成した海綿体組織へ送出することができる。
【００５０】
本発明の他の実施例及び利点は、一部は、以下に続く説明に記載されており、一部は、この説明から明かになろうし、また本発明の実施例から知ることができる。
【００５１】
実例
実例１ヒトの海綿体平滑筋細胞の培養
ヒトの海綿体の外埴片培養物は、ペニスプロテーゼの移植時に入手した海綿体組織の機能性を有する生検材料から得られ、既刊の方法（Moreland, R.B. et al. J. Urol., 153: 826, 1995）に従って処置された。全ての試薬は、別途指定がなければ、ギブコ社（メリーランド州ゲイザーズバーグ）又はシグマ社（ミズーリ州セントルイス）のような学術関係の会社から市販されている標準的な試薬である。簡単に説明すると、外科用検体を約１ｍｍの小さな断片に切り刻み、カルシウム及びマグネシウムを除去したハンクス液内で洗浄し、そして１ｇ/ｌのブドウ糖を含むダルベッコの緩和されたイーグル培地内の３５ｍｍ細胞培養ウエル内に置き、１０％のウシの胎児血清、１ｍｌ当たり１００ユニットのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０，２５μｇ／ｍｌのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（メリーランド州ギブコ社）及び２ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ／Ｓｕｐｐ．）を追加した。細胞は、３７℃、９５％の空気および５％二酸化炭素の加湿雰囲気内で培養した。培養して７日経過後、平滑筋細胞が外埴片から外に移動しているのを観察した。次に移植片を除去し、これらの細胞が成長して合体できるようにした。細胞が集合すると、細胞培養フラスコで二次培養した。細胞培養媒体は、３日毎に規則的に交換した。細胞は、直径２５ｃｍのプラスチックの組織培養プレートへ入れて第三パッセージ（原語：third passage  ）へと二次培養し、３４日間連続培養を続けた。
【００５２】
位相差顕微鏡検法によってヒトの海綿体平滑筋細胞の外埴培養物を形態的に分析することで、紡錘体形状をした細胞の同質集団のなかに平滑筋の原型が明かになった。合体は、二次培養後４日から６日で正常に達成でき、続いて、重なった層の中で細胞が対数的に成長した。ヒト海綿体平滑筋（ＨＣＰＣＣＳ）細胞の合体集合した培養物の位相差顕微鏡検法で、「丘と谷」のような外観が明らかになった。（Chamely-Campbell, J., G. and Ross, R.: Physiol. Rev., 59: 1, 1979）
【００５３】
３４日の細胞培養期間中に、細胞は多層の「組織状の」合胞体へと増殖した。ポリマのロッド接種の当日に、トリンパンブルー除外法を用いる血球計によって細胞を計算すると、２５ｃｍプレート当たり平均細胞密度が１１６Ｘ１０６ の生存可能な細胞が存在した。ポリマ繊維への細胞付着は、接種後２４時間以内に観察された。アルファ平滑筋アクチンを求めて培養されたＨＣＰＣＣＳ細胞を間接免疫蛍光検査で着色することで、平滑筋であることを確認した。
【００５４】
実例２  ポリマ構造の作製
生分解性シート、つまり有孔９５％以上の編まれていないポリグリコール酸ポリマのメッシュを切断し、１ｃｍｘ１ｃｍの寸法で管状ロッドを作製した。８フレンチの寸法の尿管ステントを、管腔の開通性を保持する助けとなるように各ロッド内に配設した。各ロッドの対向する両端を２−０ポリプロピレンの縫合糸で印をつけた。平均的なポリマ繊維の直径は、１μｍであった。繊維間の距離は、０μｍから２００μｍまで種々であった。ポリマは、低温の酸化エチレンガスで滅菌され、細胞接種まで無菌真空条件下で貯蔵された。
【００５５】
実例３  宿主の選定
若い成熟した雄の無胸腺症のニュー／ニュー（毛を剃った）ハツカネズミが、全ての実験で細胞宿主として用いられた。これらの動物たちは、一緒に入れ物に入れて、餌や水は自由に摂取できるようにしておき、約１２時間づつの昼夜の周期を維持した。全ての動物は、コーン投与（原語:cone administration）によってメトキシフルランで麻酔をかけた。１ｍｇのセファゾリンの筋肉注射が、手術前の抗生物質による予防法として役立った。ハツカネズミは、検体片を摘出する前に安楽死させた。
【００５６】
実例４  ヒトの海綿体平滑筋細胞の摂取、体内移植及び摘出
１８個のポリマロッドの生分解性足場に２５ｃｍプレートのヒトの海綿体平滑筋細胞を接種した。細胞の多重層が、一つの連続したシートとしてコスタ細胞リフタを使って慎重に持ち上げられ、各ポリマロッドの周囲に円周に沿って接種した。培養媒体は１５分間除去され、ポリマ足場と細胞を適切に接着させた。各細胞／ポリマ足場はその後それぞれの細胞培養ウエルに移され、新たに補充されたＤＭＥＭ媒体のなかに浸した。この媒体は培養中３日間にわたって毎日交換した。位相差顕微鏡検法によって、培養されたＨＣＰＣＣＳ細胞が、試験管内で生分解性ポリマ足場に付着したことが明らかになった。
【００５７】
合計１８個の細胞及びポリマ足場を、無胸腺症のハツカネズミの脇腹の中へと皮下移植した。宿主動物当たり３つの接種済みの足場が体内移植された。更に４匹のハツカネズミに接種していないポリマ足場が体内移植され、対照標準とした。宿主動物は、体内移植後７日、１４日及び２４日で安楽死に処された。細胞及びポリマ移植片を摘出して総合的、組織学的、免疫細胞化学的に及びウェスタンブロット分析で検査された。
【００５８】
実例５  移植片の組織学的検査
移植片は無胸腺症ハツカネズミの脇腹から摘出され、１０％の中性緩衝ホルマリン内で６時間固定し、次いでパラフィン内に包埋された。５μｍの連続切片が、各パラフィンブロックから切り取られた。これらの検体片は、従来の組織学及びマッソン三色染色法で、平滑筋とコラーゲンとの識別を助けるようにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。 α平滑筋アクチンに関する免疫組織化学染色を行い、平滑筋表現型を確認した。
【００５９】
移植後一週間して、摘出した標本を組織学的に分析したところ、ポリマ足場の表面に沿って空間的に配向された生育可能な平滑筋細胞多層が観察された。この多層細胞群は、本研究期間中はポリマ線維との関連性を保った。血管の内方成長は、全ての足場中に存在し、且つ移植時間と共に増加した。７日目までには急性期炎症性反応が現れ、その後は軽い慢性異物反応に代わった。ポリマ線維生分解は２４日目までに現れた。確認可能な海綿体平滑筋細胞を含む移植片の割合は、７日（１００％）及び１４日（１００％）時点で最高となり、２４日（８３％）時点で最低となった。対照ポリマ移植片の何れかでヒト海綿体平滑筋の存在を示す証拠はなかった。マッソンの三重染色法によって、無胸腺マウス内への移植の２週間後に、生育可能なＨＣＰＣＣＳ細胞多層がポリマ足場の表面に沿って生育しているのが発見された。顕著な血管内方成長を伴うよく発達した平滑筋細胞層が、移植後２４日時点で可視できるようになった。
【００６０】
マイクロフィラメントα−平滑筋アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（ダコ社、カリフォルニア州カーペンタリア）を使った間接蛍光抗体分析が、Ｋｘａｌｌ等の方法に従ってチェンバースライドに生育させた細胞に対して行われた。（７）簡単に述べると、細胞はマイナス２０度Ｃで５分間メタノールで固定され、５分間氷温のアセトンに移され、その後乾燥させた。２０分間リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再水和させた後、スライドを、α−平滑筋アクチンに対する１次モノクローナル抗体で１時間ほど培養した。ＰＢＳ中で１０分間ほど３回連続で洗浄して結合していない抗体を除去した後、スライドをフルオレセインイソチオシアネート接合抗マウス免疫グロブリンで１時間に亘り培養した。洗浄をもう一度繰り返し、スライドを蛍光顕微鏡で検査した。最初の培養の際に、１次抗体を省略することで陰性対照を提供した。
【００６１】
摘出して脱パラフィン化した標本の免疫細胞化学染色をビオチン−ストレプタビジン（原語：streptavidin）法を用いて行った。内的ペルオキシダーゼ活性を水中で３％のＨ２Ｏ２で５分間消光し且つ、３０分間ＰＢＳ中で希釈したウマ精子で非特異性結合を遮断した後、スライドを希釈した１次抗体で１時間に亘り培養した。その後、スライドを５分間ＰＢＳ中で３回洗浄し、希釈したバイオチニレートした（原語：biotynilated）抗マウス免疫グロブリンで３０分間培養した。繰り返し洗浄した後、ＡＢＣ試薬（ベクターラボラトリーズ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）で３０分間培養した。ＰＢＳ中での５分間の３回の最終洗浄後、３分間に亘り３，３ジアミノベンゼンテトラヒドロ塩化物を備えた切片が形成され、ギルのヘマトキシリンで後染色し、更に、光学顕微鏡で検査した。移植ＨＣＰＣＣＳ細胞のα−平滑筋アクチンに関する免疫細胞化学染色で、平滑筋プロトタイプが確認される。
【００６２】
実例６ ウェスタンブロット分析
全ての培地を吸引除去した後、直径２５ｃｍの組織培養皿中で成長させたヒト海綿体平滑筋細胞の融合性細胞多層培養を氷温のＰＣＢで２回洗浄した。残留ＰＢＣを除去して、２００マイクロリットルの１Ｘドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）標本緩衝剤を培養皿に加えた。溶解した細胞を溶液中に掻き取って、１．５ミリリットルマクロ遠心管に移した。１００度Ｃにおける可溶化の後で、破片をマイクロ遠心分離で除去して、上澄を新しい管に移し替えた。（８）
【００６３】
ポリマ／細胞移植片及び接種されていない対照体を７日目および２４日目に回収し、使用するまで液体窒素で冷凍し且つ保存した。冷凍標本を乳鉢および乳棒で破片に砕いた。組織破片を氷温のＰＣＢで念入りに洗浄し、その後５分間にわたり４度Ｃで３，０００ｇでペレットにした。上澄みは吸引して、０．１Ｍの塩化ナトリウムと、０．０１Ｍのトリス塩化物（ｐＨ７．６）と、０．００１Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、１ミリリットル当たり１グラムのアプロチニンと、１ミリリットル当たり１００グラムのフェニルメチルスルホニルフッ化物とを含む氷温の懸濁緩衝剤を三倍量加えた。同量の２ＸＳＤＳ標本緩衝剤を加えた後、タンパク質を１００度Ｃで可溶化した。
【００６４】
全てのタンパク質溶解産物（バイオ−ラッドＤＣタンパク質アッセイで測定した、標本１つ当たり９５０マイクログラム）のポリアクリルアミドゲル電気泳動を１０％分離ゲルに対して行い、その後、分離タンパク質をイモビロンＰ吸取り薄膜上に電気移行させた。
【００６５】
免疫検出を、ＥＣＬ検出システムの製造者であるアマーシャムインターナショナル（英国バッキンガムシャー）が提供した方法に従って実行した。非特異性結合部位を、１０％（体積当たり重量）の無脂肪乾燥牛乳と、０．１％（体積当たり体積）のトウィーン２０と、１３７ｍＭの塩化ナトリウムと、２０ｍＭのトリスベースとで遮断した。遮断緩衝剤で１：５００に希釈したα−平滑筋アクチンのモノクローナルの抗体を、室温で４５分間に亘り薄膜で培養した。ＴＢＳ−０．１％トウィーンで繰り返し洗浄した後、薄膜は、遮断緩衝剤で１：２５０００に希釈されたカラシペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧで、室温で４５分間培養した。薄膜はＴＢＳ−０．１％トウィーンで繰り返し洗浄し、その後、ＴＢＳのみで一度洗浄した。ＥＣＬシステム（アマーシャムインターナショナル、英国バッキンガムシャー）を用いてオートラジオグラフィフィルムの暴露によって、化学発光により検出が行われた。
【００６６】
融合性細胞培養から得られたタンパク質分留物のウェスタンブロット分析によって、４２ｋＤａの存在が実証され、培養細胞がα−平滑筋アクチンの一形式であることを示した。この結果は、免疫細胞化学的な結果を確証するものである。ＨＣＰＣＣＳ細胞−ポリマ移植片から得られたタンパク質分留物のウェスタンブロット分析によっても、４２ｋＤａタンパク質の存在が実証された。よって、ＨＣＰＣＣＳ細胞−ポリマ移植片も、平滑筋アクチンからなるものである。これらのウェスタンブロット分析実験において、ラット陰茎全体から分離されたタンパク質が陽性対照として使用される一方、外陰類表皮腫の培養細胞株Ａ４３１から分離されたタンパク質が陰性対照として使用された。
【００６７】
ａ−平滑筋アクチンに対して特異性があるモノクローナルの抗体で、チャンバスライド内で生育される細胞を蛍光抗体染色したところ、海綿体平滑筋を同定できた。
【００６８】
実例７ 合成ポリマにおけるヒト海綿体平滑筋細胞の生体内維持
マッソンの三重染色法による組織化学的染色により、移植時間と共にコラーゲン沈着量が累進的に質的増加することが実証された。ａ−平滑筋アクチンに関する免疫細胞化学染色により、移植片内の平滑筋表現型の存在を確証された。ａ−平滑筋アクチンに対するモノクローナル抗体で行われた、７日および２４日目の海綿体平滑筋細胞／ポリマ移植片から得られたタンパク質分留物のウェスタンブロット分析によって、４２ｋＤａの存在が実証された。このタンパク質は、細胞無しで移植された対照ポリマ中には有意には存在せず、また陰性対照として使用された外陰類表皮腫の培養細胞株（Ａ４３１）の細胞中にも有意には存在しなかった。
【００６９】
実例８  内皮および筋肉細胞を用いた再建
ＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞は、正常な臍帯静脈から得られる（Takahashi, et al., 1990, In Vitro Cell-Dev. Biol., 26:265）。これらの細胞は、その独特な特性のためこの研究用に選ばれた。殆どの内皮細胞タイプと異なり、ＥＣＶ３０４内皮細胞は抗ｖＷＦ抗体には反応しないが、抗サイトケラチン抗体を用いて同定できる(Hughes, et al., 1996, Experiment. Cell Res., 225:171)。我々は、移植に先立って培養でこれらの特性を確認した。これらの差によって、我々は、宿主内皮細胞から移植したＥＣＶ３０４細胞を区別することができた。試験管内では、ＥＣＶ３０４細胞は、発達した毛細管状の内皮ネットワークを形成した(Riehmann, et al., 1993, J. Urol., 149:1309)。
【００７０】
ポリマ。１．０ｘ１．０ｘ０．３ｃｍの寸法の不織シートのポリグリコール酸ポリマ（５８ｍｇ／ｃｃの密度）を細胞送出手段として使用した。不織ポリマメッシュは、接種以前の段階で、９５％を超える多孔度を備えた直径１５マイクロメートルの線維から成っていた。生分解性ポリマ足場は、６乃至８週間で加水分解によって分解するように設計された。これらポリマは、エチレンオキシドで殺菌し、細胞送出まで殺菌状態で保存された。
【００７１】
細胞培養。１次正常海綿体平滑筋細胞およびＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞（ＡＴＣＣ社、メリーランド州ロックビル）を、この研究で用いた。ヒトの海綿体平滑筋組織生検は、告知に基づく同意の後、通常のペニス手術において得た。筋肉細胞を確立された外植技術を用いて分離した(Moreland, et al., 1995, J. Urol., 153:826)。手短に説明すると、外科標本を、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、直径約１ｍｍの小断片に細かに切り刻んだ。これらの筋肉片は、カルシウムおよびマグネシウムが入っていないハンクス液で洗浄して、１０％のウシ胎仔血清を補足したデルベコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ；シグマ、ミズーリ州セントルイス）が入った３５ｍｍ組織培養プレート中に入れた。これら細胞は、９５％の空気および５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３７度Ｃに保たれた。ＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞は、１０％のウシ胎仔血清を補足した培地１９９（シグマ、ミズーリ州セントルイス）が入った１００ｍｍ組織培養皿中に置いた。融合性単層を、０．０５％のトリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ ４Ｎａ（ギブコＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含むカルシウムの無いＰＢＳ中で処理して、副次培養した。ヒト海綿体平滑筋および内皮細胞は、十分な細胞量が得られるまで増大させた。細胞はトリプシン処理し、収集し、洗浄し、接種のために計数した。海綿体平滑筋および内皮細胞は、それぞれ２０ｘ１０６細胞／ｃｍ３および１０ｘ１０６細胞／ｃｍ３の濃度でポリグリコール酸ポリマに接種された。
【００７２】
移植。２０頭の無胸腺マウスをこの研究のために細胞被移植者として用いた。これらの動物は一緒に収容され、食料および水を自由にとることができ、それぞれ１２時間の昼／闇のサイクルで飼育された。全ての動物は、コーン投薬によってイソフルランで麻酔をかけた。合計８０のポリマ足場（６０が細胞で接種され、２０が細胞無し）が、２０頭の無胸腺マウスの皮下空間に移植された。それぞれのマウスは、筋肉および内皮細胞で接種した３つのポリマ足場と一つの対照（ポリマのみ）とから成る４カ所の移植部位を備えるようにした。マウスは、移植から１、３、５および７日目（各２頭ずつ）に犠牲にし、１４、２１、２８および４２日目（各３頭ずつ）に犠牲にした。回収した構造体は、肉眼および組織学的に分析した。
【００７３】
免疫細胞化学的および組織学的分析。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織の連続切片（５マイクロメーター）を、切断して、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫細胞化学的分析を、複数の特異性抗体を用いて、ラブテックチャンバスライド（ナンク社、イリノイ州ナパービル）上で生育させた培養細胞および回収した標本に実施した。多クローン性の抗ｖＷＦ（ダコ社、カリフォルニア州カーペンタリア）を用いて、浸潤性宿主血管を同定した。広く反応するモノクローナル抗パンシトケラチン（原語：pancytokeratin）ＡＥ１／ＡＥ３（ボウリンガーマンハイム、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、ＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞を同定した。海綿体平滑筋線維はモノクローナル抗アルファ平滑筋アクチン（ダコ社、カリフォルニア州カーペンタリア）で標識された。免疫標識を、アビジン−ビオチン検出システム（ベクターラボラトリーズ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて行った。切片はヘマトキシリンで後染色された。
【００７４】
結果
培養されたヒト海綿体平滑筋細胞は、位相差顕微鏡により紡錘形状細胞が均質に構成されているのが観察された。ＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞が、最初は丸石状単層で観察されたが、漸進的に凝集して、培養の２７日目までには発達した毛管状のネットワークを形成した（図２Ａ）。試験管内でのこれら細胞の免疫細胞化学的分析によって、抗パンシトケラチンを用いてＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞の同定が可能となり（図２Ｂ）、また、アルファ平滑筋アクチンを用いて平滑筋細胞の同定が可能となった（図２Ｃ）。多クローン性の抗ｖＷＦ抗体はＥＣＶ３０４細胞を染色しなかった（図２Ｄ）。
【００７５】
全ての実験動物は、なんの有害反応も見せず犠牲にするまでは生き延びた。摘出に際して、細胞接種したポリマ足場は、独特な組織構造を形成しており、更にその移植以前の大きさを維持していた。細胞のない対照の足場は時間と共に大きさが減少した。
【００７６】
組織学的には、海綿体平滑筋および内皮細胞で接種した摘出ポリマには、移植後７日目で内皮に隣接して平滑筋の多層細片が形成されているのが見られた（図３）。貫通性自生脈管構造の存在が観察された。移植から１４日目には、平滑筋構成の増加および管腔構造の内側をおおう内皮が蓄積しているのが明白となった。筋肉および内皮細胞からなる良く構築されたコンストラクトが、移植から２８乃至４２日で観察された。ポリマ線維の目立った分解が２８日までに観察された。対照（細胞のないポリマ）には組織形成の兆候は見られなかった。
【００７７】
抗ｖＷＦ（自生脈管の同定）および抗パンシトケラチン（ＥＣＶ３０４内皮細胞の同定）を用いた免疫細胞化学分析で、各コンストラクト内の血管構造の起始が判別された。抗ｖＷＦ抗体は、自生血管を陽性染色したが、移植内皮細胞および再構成血管構造は染色しなかった（図４Ａ）。対照的に、抗パンシトケラチン抗体は、移植内皮細胞および再構成血管は同定したが、自生血管構造は染色しなかった（図４ＢおよびＣ）。抗アルファアクチン抗体は、平滑筋表現型の存在を確認した。平滑筋線維は時間と共に組織化が進行した（図５）。
【００７８】
この研究によって、ポリマ足場に接種されたヒト海綿体平滑筋および内皮細胞が生体内で再構成され得ることが示された。足場は、海綿体平滑筋および宿主および移植内皮細胞による血管新生からなる良く組織化されたコンストラクトであることが観察された。移植された内皮細胞は、通常のヒト組織に見られるものと類似した海綿体的構築の形成を促進した。これらの発見は、海綿体平滑筋のみが移植されていた以前の実例からの結果を補足するものである。これら研究では、平滑筋は存在し且つ血管化されていたが、内皮が不十分であった。よって、この構築は自生の勃起組織とは幾分異なっていた。
【００７９】
この研究では、生分解性ポリマ足場に接種されたヒト海綿体平滑筋および内皮細胞が、生体内に移植されると、血管化した海綿組織を形成できることが示されている。これは、複合組織形成を目的として内皮細胞を付加することによって毛管形成が容易になることを示す、組織工学における初の実証となるものである。内皮細胞は自生血管系と協力して作用できる。平滑筋および内皮細胞からなる良く血管化した自己勃起海綿体組織の生成が、こうして立証された。
【００８０】
本発明のその他の実施例および使用は、本明細書およびここに開示された本発明の実施を考慮すれば明らかとなろう。何らかの理由でここに参照された全ての米国特許およびその他の引例は、言及して編入する。本明細書と実例は、添付のクレームによって示された本発明の範囲と精神に基づいてのみ例として考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実例の手法の概略図を示す。ヒトの海綿体平滑筋細胞及びＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞が成長させ、展開させ、そして生分解性のポリマ足場の上に接種する。これらの足場は、無胸腺症ハツカネズミに移植され、また分析のために種々の時点で取り出される。
【図２】  本発明の方法によって作製した細胞構造の顕微鏡図を示す。（Ａ）はＥＣＶ３０４ヒト内皮細胞が培養２７日目で凝集し、毛細管状の管のネットワークを形成した。位相差顕微鏡法で、１００倍から縮小。（Ｂ）は抗パンシトケラチンが、ＥＣＶ３０４細胞を着色した。（Ｃ）は第一期ヒト海綿体平滑筋細胞が、アルファ平滑筋アクチンで着色した。１００倍から縮小。（Ｄ）はＥＣＶ３０４内皮細胞は、多クローン性抗ｖＷＦ抗体では着色しなかった。１００倍から縮小。
【図３】  本発明の方法によって作製した細胞構造の顕微鏡図を示す。移植後７日目で取り出された細胞ポリマ足場が、内皮に隣接する平滑筋の多層ストリップの形成を示す。Ｈ＆Ｅ、２５０倍から縮小。
【図４】  本発明の方法によって作製した細胞構造の顕微鏡図を示す。（Ａ）は抗ｖＷＦを用いる免疫細胞化学的分析で、移植後４週間で自生血管が着色した。ＥＣＶ３０４細胞からなる新生血管は着色しなかった。４００倍から縮小。筋肉及び内皮細胞の継続的組成が、移植後４週間（Ｂ）及び６週間（Ｃ）で観察された。ホスト血管が抗パンシトケラチンで着色しなかったが、ＥＣＶ３０４内皮及び新生血管が確実に着色した。４００倍から縮小（Ｂ、４週間）、２００倍から縮小（Ｃ、６週間）、４００倍から縮小（Ｃ、４週間）。
【図５】  本発明の方法によって作製した細胞構造の顕微鏡写真を示す。アルファアクチン抗体が、移植後６週間で良好に組成された平滑筋組織を識別した。４００倍から縮小。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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