(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化Ｔ細胞の調製方法であって、ヒト樹状細胞を前立腺抗原にin vitroで暴露すること、および前立腺抗原に暴露されたヒト樹状細胞にＴ細胞をin vitroで暴露することを含み、但し該活性化Ｔ細胞は、その有効量を癌増殖阻害応答を必要としている前立腺癌患者に投与することにより、癌増殖阻害応答を生じさせるために用いられるものであり、ここで、前記前立腺抗原が、LNCaP細胞の溶解物、LNCaP細胞の膜調製物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の溶解物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、精製された前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびモノクローナル抗体PD41によって認識される精製された前立腺ムチン抗原からなる群から選択されるものであるか、またはアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１ペプチド）およびアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２ペプチド）からなる群より選択される抗原性ペプチドである、前記方法。
【請求項２】
前立腺抗原がＰＳＭＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト樹状細胞が、上記前立腺癌患者の皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節または末梢血から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒト樹状細胞が末梢血から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヒト樹状細胞が寿命の延長された樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前立腺抗原に暴露されたヒト樹状細胞が、凍結保存され、融解され、そして回収されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞が上記前立腺癌患者から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞が、上記前立腺癌患者とＨＬＡが一致した健常人から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前立腺癌患者が転移性前立腺癌に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞が、精製されたCD8＋Ｔ細胞、またはCD4＋Ｔ細胞とCD8＋Ｔ細胞との混合集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト樹状細胞を前立腺抗原にin vitroで暴露することを含む、癌増殖阻害応答を生じさせるために用いられるヒト樹状細胞の調製方法であって、但し調製されるヒト樹状細胞は、その有効量を癌増殖阻害応答を必要としている前立腺癌患者に投与することにより、その投与後に前立腺癌に対する免疫応答を誘導するかまたは既存の免疫応答を増強するものであり、ここで、前記前立腺抗原が、LNCaP細胞の溶解物、LNCaP細胞の膜調製物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の溶解物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、精製された前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびモノクローナル抗体PD41によって認識される精製された前立腺ムチン抗原からなる群から選択されるものであるか、またはアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１ペプチド）およびアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２ペプチド）からなる群より選択される抗原性ペプチドである、前記方法。
【請求項１２】
前立腺抗原がＰＳＭＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト樹状細胞が、上記前立腺癌患者の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節または末梢血から得られたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト樹状細胞が末梢血から得られたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト樹状細胞が、上記前立腺癌患者とＨＬＡが一致した健常人から得られたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト樹状細胞が寿命が延長された樹状細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
調製されるヒト樹状細胞が、前立腺癌患者に投与される前に、凍結保存され、その後に融解される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前立腺癌患者が転移性前立腺癌に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前立腺抗原にin vitroで暴露されたヒト樹状細胞を有効量にて含む、前立腺癌患者において癌増殖阻害応答を生じさせるためにＴ細胞を活性化するための組成物であって、前記前立腺抗原が、LNCaP細胞の溶解物、LNCaP細胞の膜調製物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の溶解物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、精製された前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびモノクローナル抗体PD41によって認識される精製された前立腺ムチン抗原からなる群から選択されるものであるか、またはアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１ペプチド）およびアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２ペプチド）からなる群より選択される抗原性ペプチドである、前記組成物。
【請求項２０】
前立腺抗原にin vitroで暴露された後に凍結保存されている単離されたヒト樹状細胞を含む組成物であって、前記前立腺抗原が、LNCaP細胞の溶解物、LNCaP細胞の膜調製物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の溶解物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、精製された前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびモノクローナル抗体PD41によって認識される精製された前立腺ムチン抗原からなる群から選択されるものであるか、またはアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１ペプチド）およびアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）からなるペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２ペプチド）からなる群より選択される抗原性ペプチドである、前記組成物。
【請求項２１】
ヒト樹状細胞が寿命の延長された樹状細胞である、請求項１９または２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1995年７月31日に出願された特許出願第08/509,254号の一部継続出願であり、その全開示内容は引用文献として本明細書に組み込まれる。
１．発明の分野
本発明は、癌の免疫療法のための組成物ならびにヒト樹状細胞の単離および／または保存および使用の方法に関する。特に、本発明は、前立腺癌に対する養子細胞性免疫療法（adoptive cellular immunotherapy）で使用するための多数の前立腺抗原特異的Ｔ細胞の活性化と増殖のための樹状細胞の使用方法、ならびに原発性または転移性前立腺癌の増殖を遅らせるかまたは阻害するためのワクチンおよび／または免疫療法剤としての前立腺抗原パルス化樹状細胞の使用方法に関する。
２．発明の背景
２．１．前立腺癌
前立腺癌は男性における癌による死亡の第２位を占める。実際、高齢男性の人口の増加と前立腺癌に対する認識の広がり、および早期診断が可能になった結果として、アメリカ人の男性において最も普通に診断される（皮膚ではない）癌である。Wrightら、1995,Urol.Oncol.1:18-28を参照されたい。1995年には244,000人を超える男性が前立腺癌と診断されるものと予測されている。死亡者数は40,400人であろう。男性が一生のうち前立腺癌に罹るリスクは、白人が１／８であり、アフリカ系アメリカ人では１／７と概算されている。高リスク群は、陽性の家族の病歴を有するかまたはアフリカ系アメリカ人である。一生のうちで、前立腺癌と診断される男性の25％以上がこの疾患で死亡するであろう。Wingoら、1995,CA Cancer J.Clin.45（2）:8-30。さらに前立腺癌で死亡しない患者の多くは、疼痛、出血、および尿路閉塞などの症状の緩和のために治療を必要とする。すなわち、前立腺癌は、疾患および医療費支出額の大きな原因でもある。Catalona,W.J.,1994,New.Engl.J.Med.331:996-1004。
殺細胞性化学療法は、前立腺癌の治療にはほとんど効果がない。薬剤の組合せも単独薬剤の場合と同様に効果がなく、ホルモン療法に化学療法を加えても生存率は改善されない。Wittes,R.E.編、Consensus Development Conference on the Management of Clinically Localized Prostate Cancer,NCIモノグラフ第７号、ワシントンD.C.：政府印刷局（Government Printing Office）：151-153（NIH publication no.88-3005）中のEisenberger,M.A.,1988,Chemotherapy for prostate carcinoma。したがって、前立腺癌治療法の改善に対する大きなニーズがある。
２．２  癌免疫療法
免疫系が、原発性および転移性癌細胞を含めて、癌細胞を死滅させるように機能し得ることは、充分に確立されている。実際、免疫系が新生物性の癌細胞の存在を認識するという証拠は、癌組織中の浸潤性リンパ球の存在により支持される（Haskillら、1978,Contemp.Top.Immunobiol.8:107-170;VoseとMoore,1985,Semin.Hematol.22:27-40）。原因はまだ完全には明らかではないが、免疫細胞の存在にもかかわらず、しばしば癌が存在し、生き残るだけでなく離れた部位へ転移して無制限に増殖する。
Ｔ細胞の活性化と標的細胞の認識への理解についての最近の進歩により、Ｔ細胞仲介癌免疫療法の開発にかなりの進捗が始まった（Schwartz,1992,Cell 71:1065-1068;Pardoll,1992,Curr.Opin.Immunol.4:619-623）。
最も一般的な型では、免疫応答の発生は、抗原提示細胞（APC）との相互作用を介する、ヘルパーＴ細胞（TH、CD4+）および細胞毒性Ｔ細胞（CD8+）サブセットの感作で始まり、これらは抗原断片（すなわち、細胞表面への提示のためにMHC IおよびMHC IIに結合する抗原から得られる特異的アミノ酸配列）に関連した主要組織適合遺伝子複合体（MHC）−クラスＩまたはII分子を発現する。感作またはプライムされたCD4+Ｔ細胞は、Ｂ細胞ならびに種々のＴ細胞サブセットの活性化に参加するリンホカインを産生する。感作されたCD8+Ｔ細胞は、リンホカインに応答して数が増加し、一致するMHCがコードするクラスＩ分子に合致する特異的抗原断片を発現するすべての細胞を死滅させることができる。すなわち、悪性腫瘍の経過において、CTLは癌関連抗原または癌特異的抗原を根絶し、こうして腫瘍の拡散と疾患の進行とを制限する。
多くの特別な癌の免疫療法について、種々の方法が提案されている。しかし今日まで、原発性または転移性の前立腺癌に対して有効な免疫療法応答をうまく誘導する治療方法はまだ誰も開発していない。
２．３  抗原提示のための樹状細胞
抗原提示細胞（APC）は、有効な免疫応答の誘導に特に重要である。
定義によって、APCは抗原特異的受容体を有するＴ細胞に抗原を提示することができるだけでなく、Ｔ細胞の活性化に必要なすべてのシグナルを提供することができる。このようなシグナルの定義は不完全であるが、おそらく種々の細胞表面分子ならびにサイトカインまたは増殖因子も含まれる。さらに未変性のまたはプライムされていないＴ細胞の活性化に必要な因子は、すでにプライムされた記憶Ｔ細胞の再活性化に必要なものとは異なるかも知れない。Ｔ細胞活性化のために抗原を提示しシグナルを送達するAPCの能力を、一般にアクセサリー（accessory）細胞機能という。単球やＢ細胞はコンピテントなAPCであることが示されているが、そのin vitroにおける抗原提示能は、すでに感作されたＴ細胞の再活性化に限定されているようである。したがってこれらは、機能的に未変性のまたはプライムされていないＴ細胞集団を直接活性化することはできない。
「樹状細胞（decdritic cell,DC）」という用語は、リンパ組織および非リンパ組織中に見いだされる形態学的に類似した細胞型の多様な集団を意味する（Steinman,1991,Ann.Rev.Immunol.9:271-296）。これらの細胞には、脾臓のリンパDC、表皮のランゲルハンス細胞、および血流中のベール細胞（veiled cell）などがある。これらは、その形態、高レベルの表面MHCクラスIIの発現、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー細胞上で発現されるいくつかの他の表面マーカーの欠如に基づいて、群として集合的に分類されているが、共通の前駆体に由来するのかまたはすべてが同じ様式でAPCとして機能するのかは現在不明である。モノクローナル抗体CMRF-44により認識されるヒトDCの推定的な新規抗原性マーカーが報告されていることに注意されたい（Hockら、1994 Immunol.83（4）:573-581）。
最近の研究は、ヒト末梢血由来のものを含めて、ヒトDCの単離方法および増殖方法とを説明している［Macatoniaら、1991,Immunol.74:399-406;O’Dohertyら、1993,J.Exp.Med.178:1067-1078（単離）；およびMarkowiczら、1990,J.Clin.Invest.85:955-961;Romaniら、1994,J.Exp.Med.180:83-93;Sallustoら、1994,J.Exp.Med.179:1109-1118;Berhardら、1995,Cancer Res.55:1099-1104（増殖）］。PCT特許公報WO94/02156号は、抗原を提示して抗原特異的Ｔ細胞仲介応答を誘導するためのヒトDCの単離方法を記載している。感染症や癌に対する養子細胞性免疫療法およびDCの使用について記載している。
本出願の第２節（または他の任意の節）中の文献の引用または識別は、このような文献が本発明の先行技術として利用できることを認めているものと考えてはならない。
３．発明の要約
本発明は、原発性または転移性前立腺癌に対する免疫療法応答のためにＴ細胞を活性化するのに樹状細胞を使用する方法および組成物を提供する。ヒトドナーから得られるDCを、前立腺癌抗原または抗原性断片に暴露した後に、前立腺癌患者に投与し、関連するＴ細胞応答をin vivoで活性化する。あるいはin vitroでＤＣを前立腺癌抗原に暴露して、プライムしたＴ細胞またはプライムしていないＴ細胞とともにインキュベートして、関連するＴ細胞応答をin vitroで活性化する。次に活性化したＴ細胞を前立腺癌患者に投与する。いずれの場合も、ＤＣは原発性または転移性前立腺癌に対する免疫療法的増殖阻害応答を誘導するのに有利に使用できる。
ある実施態様においては、本発明は、癌の増殖阻害応答が必要な前立腺癌患者に有効量の活性化Ｔ細胞を投与することを含む癌増殖阻害応答を発生させる方法を提供する。ここでＴ細胞は、前立腺癌抗原に暴露されたヒト樹状細胞への暴露によりin vitroで活性化される。別の実施態様においては、本発明は、癌の増殖阻害応答が必要な前立腺癌患者に、in vitroで前立腺癌抗原に暴露した有効量のヒト樹状細胞を投与し、その結果投与後にヒト樹状細胞が前立腺癌に対する免疫応答を誘導するかまたは既存の免疫応答を増強させることを含む、癌増殖阻害応答を発生させる方法を提供する。
本発明の方法と組成物のために有用な前立腺癌抗原には、以下のものが含まれるがこれらに限定されるものではない：LNCaP細胞の溶解物、LNCaP細胞の膜調製物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の溶解物、前立腺癌患者の前立腺癌細胞の膜調製物、精製した特異的膜抗原（PSMA a/k/a PSM）、アミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）を有するペプチド、アミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）を有するペプチド、アミノ酸配列ＸＬ（またはＭ）ＸＸＸＸＸＸＶ（またはＬ）（配列番号３）を有するペプチド（ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す）、精製した前立腺特異的抗原（PSA）、およびモノクローナル抗体PD41によって認識される精製した前立腺ムチン抗原。
本発明はさらに、原発性および／または転移性前立腺癌に対する免疫療法応答を誘導するのに有用な、前立腺癌抗原に暴露した単離したヒト樹状細胞、ならびに低温保存単離ヒト樹状細胞および寿命の延長されたヒト樹状細胞を含んでなる組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
本発明は、以下の発明の詳細な説明、本発明の特別な実施態様の実施例、および添付図面を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。
図１は、発現された細胞表面抗原を例示する、培養樹状細胞のフローサイトメトリー解析結果のヒストグラムである。細胞は、GM-CSFとIL-4の存在下で培養した。（一番上の）上左のヒストグラムは、１次（１°）抗体の非存在下で２次（２°）抗体、すなわちヤギ抗マウスIgを使用したバックグラウンド蛍光染色である。ヒストグラムの残りは、２°抗体と各１°抗体（それぞれ、抗CD1a、抗CD3、抗CD4、抗CD11c、抗CD14、抗CD19、抗B7/BB1、および抗H-LA-DR抗体）の存在下での蛍光染色である。詳細については第６節を参照されたい。
図２は、自己のＤＣにより提示される破傷風毒素（TT）によるＴ細胞のin vitro活性化をグラフで示したものである。１サンプルを３つに分けて行ったアッセイの詳細については第６節を参照されたい。取り込まれた3HTdR（cpm）で示されるＴ細胞増殖の程度をｙ軸に示す。Ｔ細胞のための３つの異なる培養条件をｘ軸に示す：破傷風毒素単独（+TT）；樹状細胞単独（+DC）；および破傷風毒素と樹状細胞（+DC-TT）。個々の標準偏差を示す。
図３は、自己の樹状細胞による前立腺癌抗原の提示によって、４人の前立腺癌患者のＴ細胞のin vitroでの活性化をグラフで示したものである。各患者のデータを、示したように異なる棒グラフのパターンで示す。取り込まれた3H−チミジン（3HTdR）（cpm）で示されるＴ細胞増殖の程度をｙ軸に示す。Ｔ細胞のための３つの異なる培養条件をｘ軸に示す：前立腺癌抗原単独（＋LNCaP溶解物）；樹状細胞単独（+DC）；および前立腺癌抗原と樹状細胞（+DC+LNCaP溶解物）。詳細については第６．４．節を参照されたい。
図４は、抗原としてのLNCaP溶解物の自己のＤＣ提示に応答して増殖したＴ細胞集団の蛍光フローサイトメトリー解析を示すヒストグラムである。２°抗体（ヤギ抗マウスIg）単独による実験のバックグラウンド蛍光を点線のヒストグラムで示す。１°抗体（抗CD8）抗体とともに２°抗体を使用した実験で得られた蛍光を実線のヒストグラムで示す。詳細については第６節を参照されたい。
図５は、抗原としてのLNCaP溶解物の自己ＤＣ提示に応答して、in vitroで刺激されたＴ細胞の細胞溶解活性をグラフで示したものである。標的細胞の特異的溶解の平均パーセント（ｙ軸）は、エフェクター（活性化Ｔ細胞）：標的細胞（LNCaPを提示する自己ＤＣまたは自己ＤＣ単独）の関数（ｘ軸）として示す。実験は１サンプルを３つに分けて行い、記載した値は平均である。すべての実験の平均の標準誤差は＜10％であった。詳細については第６．４節を参照されたい。
図６は、あらかじめ凍結した自己の樹状細胞による前立腺癌抗原の提示によるＴ細胞（PBMC）のin vitro活性化を例示するものである。使用した前立腺癌抗原は、精製された前立腺特異的膜抗原（PSMA）である。取り込まれた3H-TdRで示すＴ細胞増殖の程度をｙ軸に示す。値は平均±標準偏差（S.D.）として示す。各実験は１サンプルを４つに分けて行なった。Ｔ細胞のための３つの異なる培養条件をｘ軸に示す：Ｔ細胞＋樹状細胞（PBMC+DC）；Ｔ細胞＋PSMA単独（PBMC+PSMA）；およびＴ細胞＋樹状細胞＋PSMA（PBMC+DC+PSMA）。詳細については第７．１節を参照されたい。
図７は、あらかじめ凍結した自己の寿命の延長された樹状細胞による抗原の提示によるＴ細胞のin vitro活性化を例示するものである。取り込まれた3H-TdRで示されるＴ細胞増殖の程度をｘ軸に示す。値は、平均バックグラウンド（PBMC＋培地のみ）を引いた後の平均値±S.D.として示す。Ｔ細胞の５つの異なる培養物をｙ軸に示す：Ｔ細胞＋寿命の延長された樹状細胞＋破傷風毒素（＋FBV細胞＋TT）；Ｔ細胞＋寿命延長樹状細胞＋前立腺抗原（＋EBV細胞＋LNCaP）；Ｔ細胞＋寿命延長樹状細胞＋抗原なし（＋EBV細胞）；Ｔ細胞＋破傷風毒素単独（＋TT）；およびＴ細胞＋前立腺抗原単独（＋LNCaP）。詳細については第８節を参照されたい。
図８は、アミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（PSMAのアミノ酸配列の一部を含む）を有するペプチドが、前立腺癌患者の末梢血から得たＴ細胞の混合集団（PBMC）の増殖を刺激することができることを示す。取り込まれた3H-TdRで示されるＴ細胞増殖の程度（cpm）をｙ軸に示す。詳細については第９節を参照されたい。
図９（Ａ−Ｃ）は、図８に示すペプチドＬＬＨＥＴＤＳＡＶに応答して増殖するＴ細胞集団の蛍光フローサイトメトリー解析を示すヒストグラムである。
図９Ａは、２°抗体のみを用いた実験で得られたバックグラウンド蛍光を示す。
図９Ｂは、２°抗体と１°抗体としての抗CD4とを用いて得られた結合蛍光を示す。図９Ｃは、２°抗体と１°抗体としての抗CD8とを用いて得られた結合蛍光を示す。詳細については第９節を参照されたい。
図10は、アミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶを有するペプチドが、前立腺癌患者の精製血液から得たＴ細胞（PBMC）を刺激することができることを示す。取り込まれた3HTdR（cpm）で示されるＴ細胞増殖の程度は、HLA-A2（+）細胞でより大きい。詳細については第９節を参照されたい。
図11は、アミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（PSM-P1）またはアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（PSM-P2）を有するペプチドに暴露した樹状細胞の投与が、ＤＣの投与前後におけるＴ細胞増殖の比で評価すると、後期前立腺癌患者の免疫応答増強を誘導したことを示す臨床試験の結果である。
この比を「刺激比」とした。図１１（Ａ）は、ペプチドPSM-P1単独（第１群）を注入した患者の結果を示す；図１１（Ｂ）は、ペプチドPSM-P2単独（第２群）を注入した患者の結果を示す；図１１（Ｃ）は、自己の樹状細胞単独（第３群）を注入した患者の結果を示す；図１１（Ｄ）は、樹状細胞とPSM-P1（第４群）を注入した患者の結果を示す；図１１（Ｅ）は、樹状細胞とPSM-P2（第５群）を注入した患者の結果を示す。詳細については第10節を参照されたい。
５．発明の詳細な説明
本発明は、原発性または転移性前立腺癌に対する免疫療法応答のためのＴ細胞を活性化するために樹状細胞を使用する方法および組成物を提供する。ヒトドナーから得られるＤＣは、いったん前立腺癌抗原または特異的抗原性ペプチドに暴露し、前立腺癌患者に投与して、関連するＴ細胞応答をin vivoで活性化する。あるいはin vitroでＤＣを前立腺癌抗原または特異的抗原性ペプチドに暴露して、プライムしたＴ細胞またはプライムしていないＴ細胞とともにインキュベートして、関連するＴ細胞応答をin vitroで活性化する。次に活性化したＴ細胞を前立腺癌患者に投与する。いずれの場合もＤＣは、原発性または転移性前立腺癌に対する免疫療法的増殖阻害応答を誘導するのに有利に使用できる。
単に説明を簡単にするために、本発明の説明は以下の節に分けて行う：（1）寿命の延長されたＤＣまたは低温保存ＤＣを含む樹状細胞を得るための方法または単離するための方法；（2）ＤＣによる提示のための前立腺特異的抗原；および（3）in vitroおよびin vivoで前立腺癌に対するＴ細胞を刺激するためのＤＣの適用または使用方法。
５．１．樹状細胞の単離
ヒトＤＣは、皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）のような非リンパ組織、および脾臓、骨髄、リンパ節や胸腺のようなリンパ組織、ならびに血液（血液ＤＣ）およびリンパ（ベール細胞）を含む循環系を含めて、それが存在する任意の組織から得られる。ヒト末梢血は、ヒトＤＣの容易に利用できる供給源であり、本発明の好適な実施態様の供給源として使用される。臍帯血はヒトＤＣの別の供給源であり、前立腺癌について高リスクであることがわかっている家族に男の子が産まれた場合、臍帯血をＤＣの供給源として使用して、これを必要であれば後に使用するために低温保存することができる。
ＤＣは、ヒト末梢血を含む存在する任意の組織で少数しか存在しないため、使用するにはＤＣを濃縮するかまたは単離しなければならない。反復的な、密度勾配分離、陽性選択、陰性選択、またはこれらの組合せを含む多くの方法のいずれかを使用して、濃縮された集団または単離ＤＣを得ることができる。ヒト末梢血からＤＣを単離する方法の例としては、O’Dohertyら、1993,J.Exp.Med.178:1067-1078;YoungとSteinman,1990,J.Exp.Med.,171:1315-1332;FreudenthalとSteinman,1990,PNAS USA 87:7698-7702;Macatoniaら、1989,Immunol.67:285-289;およびMarkowiczとEngleman,1990,J.Clin.Invest.85:955-961がある。ヒツジ赤血球および／またはウシ胎児血清への暴露を避けるヒト末梢血からＤＣを単離する方法は、PCT特許公報WO94/02156号に記載されている。リンパ組織からＤＣを単離する方法の例は、Macatoniaら、1989,J.Exp.Med.169:1255-1264に記載されている。
ＤＣが得られたら、これを適切な培地で培養して、細胞集団を増殖させるかおよび／またはＤＣを最適な抗原の取り込み、プロセシングおよび提示のための状態に維持する。in vitro培養でＤＣの「成熟」の正しい状態の維持のために特に有利なのは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とインターロイキン４（IL-4）の両方が存在することである。好適なのは、それぞれ約500ユニット／mlのGM-CSF：IL-4の組合せである。最近の研究は、「未成熟」対成熟ＤＣによる最適の抗原提示を明らかにしている（Kochら、J.Immunol.155:93-100）。本発明のいくつかの実施態様においては、未成熟なＤＣが好適である。
第６節の実施例（後述）で例示するように、ヒトＤＣを前立腺癌患者の末梢血から単離し、７日間培養すると、末梢血から直接単離されたものと比べて、約20〜50倍多い数がコンピテントとなり前立腺抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができるＤＣが回収された。
本発明の好適な実施態様において、ＤＣは治療すべき前立腺癌患者から得られた。ＤＣは、癌免疫療法および／または腫瘍増殖阻害のためにin vitroまたはin vivoで患者の自己のＴ細胞を活性化するのに使用される。
別の実施態様においては、前立腺癌に罹患していないことが明らかな健常人からＤＣが得られる。各人のPBMC上の関連するHLA抗原（クラスＩおよびIIの両方、例えばHLA-A、B、C、およびDR）が同定され、HLA抗原が前立腺癌患者と一致するＤＣが、前述のように単離され増殖される。例えば、ある例において、放射線および／または化学療法剤で治療されている後期前立腺癌患者は、充分なまたは効率的なＤＣを提供することができない。こうして、HLAの一致する健常人（例えば、兄弟姉妹）のＤＣを得て、上述した方法のいずれかを用いて増殖させ、前立腺癌抗原とin vitroでインキュベートして、HLAの一致する前立腺癌患者の免疫療法のためおよび／または腫瘍増殖阻害のための活性化Ｔ細胞を誘導することができる。
本発明の別の実施態様においては、「寿命の延長された樹状細胞」が使用される。ヒトの細胞はin vitroで有限の寿命を有し、通常アポトーシスを受けるまでに約50〜70回の細胞数の倍加に限定されている。本明細書において、「寿命の延長された樹状細胞」という用語は、遺伝的な修飾を受けて、より長い期間（少なくとも約100回の細胞数が倍加するが、これに限定されるものではない）in vitroの細胞培養培地中で増殖することができるＤＣを意味する。寿命の延長されたＤＣは、例えば、前立腺癌患者の末梢血から得られたＤＣのEBV形質転換によって、または当業者に公知の方法を使用して特異的細胞周期制御遺伝子（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、ＤもしくはＥまたは網膜芽腫をコードする遺伝子があるが、これらに限定されるものではない）のＤＣへの挿入によって得られる。
第８節の実施例（後述）に示すように、寿命の延長されたＤＣは、単離されたＤＣ集団のEBV形質転換によって得られている。関連するＤＣに特徴的な抗原を発現する多くのクローンが得られており、通常の単離されたＤＣが増殖および分裂できない期間以後も増殖し分裂し続けている。
本発明のさらに別の実施態様によれば、ＤＣは、前立腺癌抗原への暴露前または後に、例えば低温保存により保存することができる。
使用できる低温保存剤には、ジメチルスルホキシド（DSO）（LovelockとBishop,1050,Nature 183:1394-1395;Ashwood-Smith,1961,Nature 190:1204-1205）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Rinfret,1960,nn.N.Y.Actad.Sci.85:576）、ポリエチレングリコール（SloviterとRavdin,1962,Nature 196:548）、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、i-エリトリトール、D-リビトール、D-マンニトール（Roweら、1962,Fed.Proc.21:157）、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、塩化コリン（Benderら、1960,J.Appl.Physiol.15:520）、アミノ酸（Phan The TranとBender,1960,Exp.Cell Res.20:651）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Lovelock,1954,Biochem.J.56:265）、および無機塩（Phan The TranとBender,1960,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104:388;Phan The TranとBender,1961,Radiolbiology中、第３回オーストラリア放射線生物学会議事録（Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology）、Ilbery,P.L.T.編、Butterworth,London,p.59）などがあるが、これらに限定されない。
制御されたゆっくりした冷却速度が決定的に重要である。異なる低温保存剤（Rapatzら、1968,Cryobiology 5（1）:18-25）および異なる細胞型は、異なる最適の冷却速度を有する（例えば、骨髄幹細胞の生存率およびその移植可能性に及ぼす冷却速度の影響については、RoweとRinfret,1962,Blood 20:636;Rowe,1966,Cryobiolgy 3（1）:12-18;Lewisら、1967,Transfusion 7（1）:17-32;およびMazur,1970,Science 168:939-949を参照されたい）。水が氷になる融合期の熱は最小でなければならない。冷却操作は、例えば、プログラム可能な凍結装置またはメタノール浴法を使用して実施することができる。
プログラム可能な凍結装置は、最適冷却速度の測定を可能にし、標準的な再現性のある冷却を促進する。プログラム可能な制御速度フリーザー（例えば、CryomedまたはPlanar）は、所望の冷却速度曲線になるように凍結レジュメを調整することを可能にする。
完全な凍結後、細胞は迅速に長期低温保存容器に移すことができる。好適な実施態様においては、試料は液体窒素（-196℃）またはその蒸気（-165℃）中に低温保存することができる。このような保存は、非常に効率のよい液体窒素冷蔵庫（これは、非常に低い真空ときわめて高い内部の断熱性を有する大きな魔法瓶に似ており、熱のリークや窒素の喪失が最小限に押さえられている）の有用性によって大幅に促進される。
造血幹細胞（特に、骨髄または末梢血由来のもの）の操作、低温保存、および長期保存の考え方および方法は、本発明のＤＣにほぼ適用可能である。このような考察は、例えば、以下の文献（これらは引用文献として本明細書に組み込まれる）に見いだされる：Gorin,1986,Clinics in Haematology 15（1）:19-48;骨髄の保存、培養および移植（Bone-Marrow Conservation,Culture and Transplantation）、Proceedings of a Panel,モスクワ、19681年７月22〜26日、国際原子力機関（International Atomic Energy Agency）、ウイーン、pp.107-186。
生細胞の低温保存の他の方法、またはその修飾法が有用であり、利用することができる（例えば、cold metal-mirror technique;LiveseyとLinner,1987,Nature 327:255;Linnerら、1986,J.Histochem.Cytochem.34（9）;1123-1135;またSenkenらの米国特許第4,199,022号、Schawartzらの米国特許第3,753,357号、Fahyの米国特許第4,559,298号を参照されたい）。
凍結細胞は好ましくは迅速に融解し（例えば、37〜41℃に維持した水浴中）、融解後直ちに冷却する。
融解時に細胞が凝集しないように細胞を処理することが好ましい。凝集を防ぐためには、種々の方法が使用可能であり、凍結前および／または凍結後のDnase（Spitzerら、1980,Cancer 45:3075-3085）、低分子量デキストランおよびクエン酸塩、ヒドロキシエチルデンプン（Stiffら、1983,Cryobiology 20:17-24）などの添加があるが、これらに限定されない。
低温保護剤（もしヒトに対して毒性であれば）は、融解したＤＣの治療的使用の前に除去しなければならない。
低温保護剤を除去する１つの方法は、無視できる濃度まで希釈することである。
凍結ＤＣはいったん融解され回収されると、非凍結ＤＣについて記載したようにＴ細胞を活性化するために使用される。
第８節の実施例（後述）に示すように、寿命の延長されたＤＣは低温保存され、融解され、そしてin vitroでＴ細胞を活性化するために抗原を提示するのに使用される。
５．２  樹状細胞による提示のための前立腺特異的抗原
本発明において、多くの抗原または抗原性組成物が、ＤＣによる提示によってＴ細胞を活性化し、前立腺の免疫療法を行うのに有用である。
１つの実施態様において、LNCaPの溶解物（最初Horoszewiczら、1980,Prog.Clin.Biol.Res.37:115-132;1983,Cancer Res.43:1809-1818により記載された前立腺癌細胞株）が、ＤＣにより提示される抗原として使用される。単にLNCaP細胞の凍結融解のを繰り返すことにより得られた粗細胞溶解物を、抗原として使用することができる。この抗原の使用の例を、セクション６（後述）に示す。あるいは、Horoszewiczら、1987,Anticancer Res.7:927-936により記載されたLNCaP細胞の膜調製物が使用できる。
別の実施態様によれば、外科試料から回収した前立腺癌細胞溶解物を抗原として使用することができる。例えば生検または手術で得られた癌患者自身の腫瘍の試料を使用して、抗原用の細胞溶解物を提供することができる。あるいは前立腺癌患者の腫瘍細胞の膜調製物を抗原として使用することができる。
別の実施態様によれば、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ．５と特異的に反応する精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、ＣＹＰＰ抗原およびＰＳＭ抗原としても知られている）［（一般には、Horoszewiczら、1987，前述、米国特許第５，１６２，５０４号；Fengら、1991,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.32:（Abs.1418）:238を参照）］を、抗原として使用することができる。ＰＳＭＡ抗原をコードする遺伝子のクローニングは、Israeliら、1994,Cancer Res.54:1807-1811に記載されている。例えば酵母細胞、バキュロウイルス発現系または哺乳動物細胞培養発現系でのクローン化された遺伝子の発現は、本発明において使用されるＰＳＭＡ抗原の手近の供給源となる。
別の実施態様によれば、アミノ酸残基４〜１２のＰＳＭＡに対応するアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）を有する抗原性ペプチド（「ＰＳＭ−Ｐ１」と呼ぶ）が抗原として使用できる。別の実施態様によれば、ＰＳＭＡのアミノ酸残基７１１〜７１９に対応するアミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）を有する抗原性ペプチド（「ＰＳＭ−Ｐ２」と呼ぶ）が抗原として使用できる。
別の実施態様によれば、アミノ酸配列ＸＬ（またはＭ）ＸＸＸＸＸＸＶ（またはＬ）（配列番号３）を有する抗原ペプチド（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）（「ＰＳＭ−Ｘ」と呼ぶ）が抗原として使用できる。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフ（すなわち、「アンカー残基」（ロイシンとバリン）を有する９〜１０アミノ酸の結合モチーフ、ＨＬＡ−Ａ２＋患者に見いだされる）に似ている。Greyら、1995,Cancer Surveys 22:37-49。このペプチドは好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２＋患者に対する抗原として使用される。ＨＬＡ−Ａ２＋は、かなりの比率の患者によって発現される。［Central Data Analysis Committee「アレレ頻度」、セクション６．３、Tsuji,K.ら（編）、東京大学出版、pp.1066-1077を参照されたい］。
別の実施態様によれば、表１Ａ（下記）に記載のペプチドから選択される抗原性ペプチドが抗原として使用できる。表１Ａに記載のペプチドは、ＰＳＭの断片に対応するアミノ酸配列を有し、特異的ハプロタイプの結合モチーフに一致している。好適な実施態様によれば、ペプチドを、ＤＣによって提示し、表１Ａの各ペプチドについて記載したハプロタイプに一致する患者のＴ細胞を活性化するように選択する。
0004267692.tif 000002
さらに別の実施態様によれば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Papsideroら、1980,Cancer Res.40:2428-2432;McCormackら、1995,Urology 45（5）:729-744を参照）が抗原として使用できる。
別の実施態様によれば、表１Ｂ（下記）に記載のペプチドから選択される抗原性ペプチドが抗原として使用できる。表１Ｂに記載のペプチドは、ＰＳＡにより断片に対応するアミノ酸配列を有し、そして［要確認］表１Ｂに記載の特異的ハプロタイプの結合モチーフに一致している。好適な実施態様によれば、ペプチドはＤＣにより提示され、表１Ｂの各ペプチドに記載のハプロタイプに一致する患者のＴ細胞を活性化する。
0004267692.tif 000003
さらに別の実施態様によれば、Wright（米国特許第５，２２７，４７１号および第５，３１４，９９６号；Beckettら、1991,Cancer Res.51:1326-1333）により記載されたモノクローナル抗体PD41により認識される前立腺ムチン抗原が抗原として使用できる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１０９４）により産生される抗体に結合し、PD41ムチン抗原を発現する前立腺癌細胞の粗溶解物が抗原として使用できるであろう。
本発明によれば、ＤＣをin vitro培養培地中で抗原とインキュベートすることにより、所望の前立腺癌抗原または抗原性組成物に暴露することができる。ある方法では、水溶液または水性懸濁物型の抗原を、ＤＣと同時に細胞培養培地に加え、刺激すべきＴ細胞を加える。この方法の例についてはセクション６（後述）を参照されたい。セクション６に記載のようにＤＣは、Ｔ細胞へ首尾よく提示を行うために抗原を有利に取り込んだ。別の方法で抗原は、別の方法（飲作用胞の浸透圧的溶解およびｐＨ感受性リポソームの使用などがあるが、これらに限定されない）によりＤＣの細胞質中に導入される。一般的には、Okada et al,1982,「飲作用胞の浸透圧的溶解による培養哺乳動物細胞への巨大分子の導入」（″Introduction of Macromolecules Into Cultured mammalian Cells by Osmotic Lysis of Pinocytic Vesicles″）,Cell 29:33;Psteら、1976,「細胞へ生物活性物質を導入するための担体としての脂質液胞」（″Lipid Vesicles as Carriers for Introducing Biologically Active Materials Into Cells″）,Methods Cell Biol.14:33;Reddyら、1991,「ｐＨ感受性リポソームは可溶性タンパク質のクラスＩ限定ＣＴＬ認識に標的細胞を感作するための効率的な手段を提供する」（″pH Sensitive Liposomes Provide an Efficient Means of Sensitizing Target Cells to Class I Restiricted CTL Recognition of a Soluble Protein″）,J.Immunol.Methods 141:157を参照されたい。
５．３  使用の応用または方法
５．３．１  in vitroで前立腺抗原を提示するための樹状細胞の使用
前述のように本発明の１つの実施態様において、上記セクション５．２のいずれかの方法により前立腺特異的抗原に暴露された、単離されたヒトＤＣは、インビトロで前立腺癌に対してＴ細胞を活性化するために使用される。ＤＣは抗原に暴露後直ちに使用してＴ細胞を刺激できる。あるいはＤＣは、抗原とＴ細胞とに同時に暴露する前にＧＭ−ＣＳおよびＩＬ−４の組合せの存在下で維持することができる。
Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、キラー細胞（responder cell）として使用するための種々のリンパ組織から得ることができる。このような組織には、脾臓、リンパ節、および末梢血があるが、これらに限定されない。細胞は、混合Ｔ細胞集団または精製されたＴ細胞サブセットとして、抗原に暴露されたＤＣとともに同時培養できる。
例えば、精製されたCD8+Ｔ細胞を抗原を暴露したＤＣとともに培養して、前立腺特異的ＣＴＬを誘導することが好ましい。さらにCD4+Ｔ細胞を早期に除去することで、CD8+Ｔ細胞とCD4+Ｔ細胞の混合培養物中のCD4+Ｔ細胞の過剰増殖を防止できる。Ｔ細胞の精製は、ＣＤ２、ＣＤ３、CD4、ＣＤ５、およびCD8に対する抗体の使用など（ただし、これらに限定されない）の陽性選択または陰性選択により行われる。
一方、CD4+Ｔ細胞とCD8+Ｔ細胞との混合集団を使用して、細胞毒性およびＴH免疫応答を含む前立腺特異的応答を誘導することが好ましい。
好適な実施態様において、Ｔ細胞はＤＣが得られたのと同じ前立腺癌患者から得られる。in vitroで刺激または活性化後、自己Ｔ細胞を患者に投与して、前立腺腫瘍増殖を遅らせるかまたは阻害する免疫応答を、誘発するかまたは可能にする。
例えば、体表面積１ｍ2あたり約１０8〜１０9細胞の投与量で静脈内注入することによりＴ細胞が投与される（Ridellら、1992,Science 257:238-241を参照）。注入は、所望の間隔で（例えば、毎月）繰り返すことができる。Ｔ細胞注入中または注入後、受容者を副作用の有無について追跡する。
別の実施態様において、Ｔ細胞は前立腺癌患者から得られ、細胞を刺激するのに使用されるＤＣは、ＨＬＡの一致した健常ドナーから得られる。さらに別の実施態様において、Ｔ細胞とＤＣの両方は、ＨＬＡの一致した健常ドナー（例えば、前立腺癌患者の兄弟姉妹）から得られる。この実施態様は、例えば患者が放射線および／または化学療法剤により治療されてきた後期の前立腺癌患者であり、充分なまたは効率的なＤＣを提供することができない場合、特に有利である。刺激後のＴ細胞は、前述のように投与される。
５．３．２  in vivoで前立腺抗原を提示するための樹状細胞の使用
本発明の別の実施態様において、前立腺癌患者から単離されたＤＣは、培養され、in vitroで前立腺癌抗原に暴露され、増殖（expansion）および／または低温保存後、患者に戻して投与して、in vivoで患者の癌細胞に対する免疫応答（Ｔ細胞活性化を含む）を刺激する。患者自身の樹状細胞についてこのアプローチを用いると以下の利点が得られる：（１）外来ＤＮＡは使用しない；（２）種々のウイルスベクターを用いることによるｃＤＮＡ発現のための細胞の感染が排除される；（３）抗原は可溶性タンパク質の型で樹状細胞に提示され、樹状細胞に取り込まれ、細胞表面のＭＨＣ／ペプチド提示のために処理されるであろう；（４）樹状細胞はその表面にＢ７を発現し、このｃＤＮＡを樹状細胞中にトランスフェクションする必要性が減少する；（５）樹状細胞表面に対して内因性Ｂ７を使用することにより、サイトカイン自身の型でまたは特異的細胞へのｃＤＮＡのトランスフェクションの型でＩＬ−２または他のサイトカインを有するＴ細胞を提供する必要性がなくなる；（６）すべての操作は患者自身の細胞を使用して行われる。
実際には、セクション５．１に記載したように得られるＤＣは、in vitroで前立腺癌抗原に暴露され、洗浄され、投与されて、免疫応答を誘導するかまたは既存の（弱いが）応答を増強する。こうしてＤＣは、抗前立腺癌ワクチンおよび／または免疫療法剤となる。前立腺特異的抗原を提示するＤＣは、静脈内注入により、約１０6〜１０8細胞の投与量で投与される。患者の免疫応答は追跡することができる。注入は、患者の免疫応答に基づき所望の間隔で繰り返すことができる。
以下の実施例は例示のためであって、決して本発明の範囲を限定する意図ではない。
６．実施例：前立腺特異的Ｔ細胞を刺激するための樹状細胞の使用
以下の実施例は、前立腺癌患者から得られたヒト樹状細胞が、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方の増殖を誘導することができたことを証明する。
６．１．材料と方法
６．１．１．細胞系と試薬
前立腺癌細胞系であるLNCaP（Horoszewiczら、1983，ヒト前立腺癌のLNCaPモデル（LNCaP Model of Human Prostatic Carcinoma）、Cancer Research,43:1809-1818,（ＣＲＬ  １７４０、ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州））、をＲＰＭＩ１６４０中で培養して維持した。顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ２）およびインターロイキン４（ＩＬ４）は、Amgen（サウザンドオークス（Thousand Oaks）、カリホルニア州）から供与された。モノクローナル抗体Ｌｅｕ−６（抗ＣＤ１ａ）、Ｌｅｕ−４（抗ＣＤ３）、Ｌｅｕ−３ａ（抗CD4）、Ｌｅｕ−２ａ（抗CD8）、Ｌｅｕ−Ｍ３（抗ＣＤ１４）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスII）、およびＢＢ１（抗Ｂ７／ＢＢ１）は、ベクトン-ディッキンソン（Becton-Dickinson）（サンホセ、カリホルニア州）から購入した。モノクローナル抗体Ｓ１２５−Ｃ１（抗ＣＤ１９）と３．９（抗ＣＤ１１ｃ）は、シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。
６．１．２．前立腺癌患者
前立腺癌が組織学的に確認された患者をこの試験のために選択した（署名したインフォームドコンセント（signed infomed consent）を得た）。継続時観察期間中２週間に１回５０ccのヘパドナ化末梢血を採取した。臨床ステージ、血液学的状態、および他の関連する処置の詳細は、表２に記載されている。ステージ分けはThe American Urological Systemを使用した。すなわち、Ｂ2＝両葉で腫瘍は前立腺に限定されている、Ｃ2＝大きな局所的侵襲性腫瘍、Ｄ1＝陽性骨盤リンパ節、Ｄ2＝転移性疾患。
0004267692.tif 000004
これらの患者の大部分は、臨床ステージＤ1またはＤ2、ホルモン不応性前立腺腺癌であり、放射線治療を受けている。７人の患者は睾丸摘除を受けており、このうち３人（患者２、６、および９）はＳｒ89治療を受けている。表２は、これらの３人の患者からの末梢血単核細胞（PBMC）の収率（１〜３×１０5）は、Ｓｒ89治療を受けていない患者（１０6／ml）より有意に低いことを示す。
６．１．３．樹状細胞の単離
前立腺癌患者から末梢血を採取し、Lymphoprep（ギブコビーアールエル（GIBCO-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）密度勾配遠心分離を行なった。単離した末梢血単核細胞（PBMC）を、２４ウェルプレートに広げ（１０6〜１０7細胞／ウェル）、加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で９０分間インキュベートした。
非接着細胞を上清とともに除去し、ウェルを温かい（３７℃）ＯＰＴＩＭＥＭ培地（ギブコビーアールエル（GIBCO-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）と５％ＦＣＳとで静かに洗浄した。樹状細胞増殖培地（ＤＣＰＭ：５％ＦＣＳ、５００ユニット/ml ＧＭ−ＣＳＦおよび５００ユニット/ml ＩＬ−４を補足したＯＰＴＩＭＥＭ）を接着細胞に加えた（１ml／ウェル）。これらのＤＣ細胞を４〜６日間培養した後、ＤＣＰＭ中で１：３でサブ培養した。
単離したＤＣの純度と本体を、モノクローナル抗体、抗−ＣＤ１ａ、−ＣＤ３、−CD4、−CD8、−ＣＤ１１ｃ、−ＣＤ１４、−ＣＤ１９、−ＨＬＡ−ＤＲおよび−Ｂ７／ＢＢ１とともに氷上で３０分インキュベートし、次にフルオレセイン-イソチオシアネート標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体で氷上で３０分間インキュベートして確認した。蛍光結合は、ＦＡＣＳ  ＳＣＡＮフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ、カリホルニア州）を使用して解析した。すなわち、培養したＤＣ細胞をピペットで採取し（接着性の高い結合マクロファージを残す）、造血系起源の細胞に関する異なるタンパク質マーカーの表面発現についてフローサイトメーターで解析して、そのＤＣの本体を確認した。ＣＤ１４-、ＣＤ３-、およびＣＤ１９-以外の７／ＢＢ１+、ＣＤ１１ｃ+、およびＨＬＡ−ＤＲ+（ＭＨＣクラスII）によりＤＣ集団の本体を確認する。
６．１．４．Ｔ細胞増殖測定法
前立腺癌患者の１００万個のPBMCをマイクロタイタープレート中の、ＲＰＭＩ１６４０、ヘペス、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンからなり、１０％ヒトＡＢ血清（シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州））と１Ｕ/mlの組換えヒトＩｌ−２とを補足したＴ細胞培地（ＴＣＭ）中に入れた。１万個のマイトマイシン−Ｃ不活性化自己ＤＣと抗原とをウェルに入れてから培養した。
これらの測定法で使用した抗原は：（１）５００ng/mlの破傷風毒素（ＴＴ；シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州））；（２）等量の１０5LNCaP細胞／mlからのLNCaP細胞の溶解物；または（３）精製されたＰＳＭＡである。溶解物は既に記載されているように調製した。Topalianら、1994，「黒色腫特異的CD4＋Ｔリンパ球は、エプスタインバーウイルスで形質転換したＢ細胞により処理され提示されるヒト黒色腫抗原を認識する」、Int.J.Cancer 58:69-79。簡単に説明すると、１mlのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０7のLNCaPを、液体窒素での凍結と３７℃水浴での急速な融解との繰り返しサイクルにかけた。精製ＰＳＭＡを以下のように調製した。
プロテインＡ  ７Ｅ１１−Ｃ５カラムの調製
プロテインＡアガロースビーズを、１０×容量の３Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝９．０）で洗浄した。２mlの７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体溶液のｐＨを９．０に調整し、ＮａＣｌ濃度を３Ｍに調整した。抗体溶液とビーズとを室温で１時間混合した。インキュベート後、ビーズを１０×容量の３Ｍ  ＮａＣｌ、５０mMホウ酸ナトリウムで洗浄した。ビーズを１０×容量の３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ＝９．０）に再懸濁した。ジメチルピメラデート（dimethylpimeladate）を加えて、２０mMの濃度にした。混合物を室温で３０分混合した。ビーズを０．２Ｍメタノールアミン（ｐＨ８．０）で洗浄して反応を停止させた。次に０．２Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）を１０×容量で加え、２時間混合してインキュベートした。２×容量のＰＢＳ  ０．０１％メルチオレートで最後の洗浄を行った。
精液からのＰＳＭＡの免疫沈降
約７５mlのヒト精液を、受精能検査のためのＷＨＯガイドラインに従って有償でドナーから集めた。精液を１０，０００rpmで３０分間遠心分離した。次に上清を除去した。ペレットをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で２回洗浄し、次に１mlの溶解緩衝液［１％トリトンＸ−１００、５０mMヘペス、１０％グリセロール、１５mM  ＭｇＣｌ2、１mMフェニルメチルスルホニルフルオライドおよび１mMエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸］に１時間浸した。溶解物を１０，０００rpmで３０分遠心分離し、上清を集めた。
７Ｅ１１−Ｃ５結合プロテインＡビーズを、１５mlの結合緩衝液（２０mM,ヘペス、ｐＨ＝７．５）で洗浄した。洗浄後、ビーズを１mlの精液ペレット溶解物と２mlの結合緩衝液に加えた。混合物を一晩インキュベートした。
翌日ビーズを１５mlの結合緩衝液で洗浄し、次に１０ｍｌの洗浄緩衝液（１０mMリン酸ナトリウム）で洗浄した。溶出緩衝液（１００mMグリシン、ｐＨ＝１．８）を２mlの容量で加え、ＰＳＭＡを含有する画分を集めた。
次に細胞懸濁物を、Ｔ細胞増殖測定物に加えた。Ｔ細胞培養物を、５％ＣＯ2を補足した３７℃の加湿インキュベーター中で５日間インキュベートした後、１μCiの3Ｈ−チミジン／ウェルを加えた。２４時間インキュベート後、細胞を半自動細胞ハーベスター（スカトロン（Skatron）、ステビナ（Stevina）、バージニア州）で採取し、集めた細胞の放射能を測定した。細胞増殖は、平均3ＨＴｄＲ取り込みの測定により求めた。
６．２．前立腺癌患者からの樹状細胞の単離および性状解析
上記セクション６．１．３．に記載したように前立腺癌患者のPBMCからＤＣを得て、記載のようにＤＣＰＭ中で培養した。４〜７日間培養後、分裂する細胞の塊が形成し始め、組織培養フラスコにあまり接着しなくなった。これらの細胞はサイズが増大し、典型的な樹枝状の形態を示した（データは示していない）。わずかに接着性のこれらの細胞に加えて、強く接着するマクロファージも存在していた。７日間培養後の樹枝状形態を有する細胞の平均数は、５０mlの末梢血から２〜７×１０6であり、培養したPBMCの開始時の数の４〜１４％であった（表２）。
培養した細胞がＤＣであることを確認するために、細胞をピペットで採取し（強く結合したマクロファージを残して）、造血系起源の細胞に関する異なるタンパク質マーカーの表面発現についてフローサイトメトリー解析を行なった。結果を図１に示す。
図１に示すように、培養した細胞は、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、またはマクロファージ（ＣＤ１４）の系統特異的マーカーを発現しない。ランゲルハンス（Langerhans）細胞（例えば、皮膚から単離した樹状細胞）のマーカーであるＣＤ１ａは、培養物中で高レベルに発現されたが、細胞を１４日間を超えて維持した時レベルは低下した。ＣＤ１１ｃ（ベータ−２−インテグリン）およびＨＬＡ−ＤＲは高レベルで発現され、Ｂ７／ＢＢ１はこれらの細胞により中程度に発現され、培養された細胞がＤＣであることが確認された。
これらの培養物は２継代後に増殖が止まったが、新鮮な細胞増殖培地（ＤＣＰＭ）を毎週供給するとＤＣはその特徴的な形態と表面抗原発現を１ヶ月まで維持した。
６．３．樹状細胞による抗原特異的Ｔ細胞の刺激
同じ患者からの自己Ｔ細胞に抗原を提示しこれを刺激する培養樹状細胞の能力を評価するために、前記セクション６．１．４．に記載したようにＴ細胞増殖測定を三連で行なった。これらの実験で破傷風毒素（ＴＴ）を代表的抗原として選択して、患者の記憶Ｔ細胞がin vitroで活性化されるかどうか測定した。結果を図２に示す。
図２は、患者のＤＣとＴＴとともに培養した自己Ｔ細胞は、バックグランドレベル（ＤＣの非存在下）よりかなり高いレベルで増殖し、ＴＴ無しでＤＣとともに培養したＴ細胞よりかなり高いレベルで増殖し、自己混合リンパ球反応を示した。
すなわち、この結果は、ＤＣによるＴＴの提示はＴ細胞増殖に有用であることを証明している。さらに詳しくは、この結果は、前立腺癌患者から得られたＤＣは抗原特異的Ｔ細胞増殖を活性化するのに有用であることを証明している。
６．４．樹状細胞による前立腺特異的Ｔ細胞の刺激
前立腺癌特異的抗原を提示し前立腺癌患者の自己Ｔ細胞を刺激するＤＣの能力を測定した。ある試験において、LNCaP細胞（転移性前立腺癌細胞系）の粗細胞性溶解物を、一般的に前記セクション６．１．４．で記載したようにＴ細胞増殖測定で代表的前立腺癌抗原として使用した。結果を図３に示す。
図３は、ＤＣとLNCaP溶解物の両方をＴ細胞培養物中に含めると、４例のうち２例で3ＨＴｄＲ取り込みの大幅な上昇が観察されることを示す。すなわち、２／４例で、前立腺特異的抗原の提示は、in vitroで自己Ｔ細胞増殖を刺激した。抗原としてLNCaP溶解物を有する２つの陰性例は、可変濃度の前立腺抗原を有する粗細胞性溶解物を使用することの限界を反映していると、我々は考えている。精製した前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を使用する追加実験は、この見解を支持している（データは示していない）。
別の実験において、LNCaP溶解物のＤＣ提示の結果として増殖したＴ細胞を、２週間培養して増殖し、蛍光フローサイトメトリー解析を行って、誘導された２つのＴ細胞のサブタイプ（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とヘルパーＴ細胞（ＴH））の発現を測定した。特に、LNCaP溶解物のＤＣ提示の結果として増殖したＴ細胞を、マイトマイシンＣで不活性化した自己ＤＣとLNCaP溶解物の存在下でＴ細胞増殖培地中で培養して２週間増殖した（１０4LNCaP細胞／mlに相当）。１４日齢のＴ細胞を採取し、細胞傷害性Ｔ細胞特異的抗原（CD8）の発現を前述の蛍光フローサイトメトリーにより解析した。結果を図４に示す。
図４に示すように、ＣＴＬ（CD8＋）は、ＤＣによるLNCaP溶解物の提示によりLNCaPに対して誘導されるＴ細胞の約４０〜５０％を占めた。すなわち、自己ＤＣによる前立腺抗原の提示は、前立腺癌に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびヘルパーＴ細胞（ＴH）の両方を誘導するのに有用である。
さらに別に実験において、抗原としてLNCaP溶解物を提示するＤＣにより前述のように活性化したＴ細胞（CD4＋とCD8＋の両方）は、標的細胞としてLNCaP抗原を提示する自己ＤＣを使用して細胞溶解活性を示した。
簡単に説明すると、セクション６．２に記載したように前立腺癌患者からＤＣを単離し、前述のようにLNCaP溶解物に暴露した。自己Ｔ細胞をPBMCとして得て、LNCaPを提示するＤＣの存在下で培養した。ＤＣによる前立腺抗原提示の結果として増殖したＴ細胞は、前述のように全部で２１日間増殖された。
標的細胞を特異的に溶解する活性化Ｔ細胞の能力を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）アッセイ（プロメガ（Promega）；マジソン（Madison）、ウィスコンシン州）を使用して評価した。簡単に説明するとエフェクター細胞（CD4+とCD8+細胞の両方を含有する２１日目のＴ細胞）を、Ｔ細胞増殖培地中で２×１０4の標的細胞とともに、エフェクター：標的細胞比を２０：１、１０：１、および３：１で３７℃で５時間ＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。標的細胞は、自己ＤＣ単独、またはLNCaP溶解物に一晩暴露した自己ＤＣ［１０5細胞／mlに相当（ＤＣ＋LNCaP溶解物）］である。放出された乳酸脱水素酵素（細胞溶解により放出される安定なサイトリル酵素）を、培養上清から共役酵素測定法で４９０nmの吸光度を読みとって測定した。すべての実験は三連で行なった。結果を図５に示す。
図５に示すように、本発明のＤＣによる前立腺抗原の提示の結果として増殖したＴ細胞は、同じ前立腺抗原を提示する細胞に対して増強した特異的溶解活性を示した。すなわち、ＤＣによる前立腺抗原の提示は、前立腺抗原を発現する細胞に対して特異的細胞溶解活性を有するＴ細胞を誘導するのに有用である。
７．実施例：前立腺特異的Ｔ細胞を刺激するための低温保存樹状細胞の使用
７．１．前立腺癌患者からの低温保存樹状細胞
上記セクション６に記載したように前立腺癌患者のPBMCから樹状細胞を単離し、セクション６に記載したように、５００ユニット/mlのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養した。
７日目に、単離したＤＣを採取し、９０％ＦＣＳと１０％ジメチルスルホキシドを使用して低温保存した。低温保存したＤＣを一定時間凍結保存し、３７℃の水浴で融解し、１５mlのポリプロピレンチューブに移し、１２００rpmで５分間遠心分離した。次に融解したＤＣを、１０％熱不活性化ヒト血清を含有する培地に再懸濁して、計測した。
同じ前立腺癌患者の末梢血（PBMC）から得られた１０万個のあらかじめ凍結したＴ細胞を、１０4個のＤＣの存在下でまたは非存在下で５μl／ウェルの精製したＰＳＭＡ（上記セクション６．１．４を参照）とともに、１０％熱不活性化ヒト血清および１ユニット/mlのＩＬ−２を含有する総量２００μlの培地中で培養した。６日目に１μCi／ウェルの3Ｈ−チミジンを加え、１８時間後培養物を採取した。3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを液体シンチレーションカウンターで計測した。各実験は４連で行なった。結果を図６に示す。平均ｃｐｍと標準偏差をグラフに示す。
図６は、あらかじめ低温保存したＤＣと前立腺特異的抗原（すなわち、ＰＳＭＡ）をＴ細胞培養物に含めると、3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの極めて大きな上昇が観察されることを示す。すなわち、あらかじめ低温保存したＤＣによる前立腺特異的抗原の提示は、in vitroで自己Ｔ細胞増殖を刺激した。この作用は、抗原単独またはＤＣ単独で観察されたものよりはるかに大きいが、外来性前立腺抗原の場合はそうではなかった。
７．２．通常の患者の低温保存した樹状細胞
前立腺癌にかかっていないことが明らかな正常人または健常人からPBMCを得た。PBMCを交差タイピングし、発現されている関連するＨＬＡ抗原に注目した。関連するＨＬＡ抗原には、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲがある。セクション６に記載したようにPBMCからＤＣを単離した。次に上記セクション７．１に記載したようにＤＣを低温保存した。
低温保存したＤＣを本発明に従って使用して、癌患者で使用するためにＨＬＡの一致した個体または前立腺癌にかかっている患者からのＴ細胞を、in vitroで刺激した。
７．３．樹状細胞の低温保存および使用のための別のプロトコール
樹状細胞は以下のように本発明の方法に従って、前立腺癌患者または健常ドナーから単離し、低温保存し、そして使用することができる。
必要であれば、トリパンブルー排除（Kucher,1977,Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Dwoder,Hutchinsen & Ross,ストラスブルグ（Stroudsburg）、ペンシルバニア州、pp.18-19）および手動の細胞数計測により、生存活性ＤＣ計測を行うことができる。
前立腺癌患者からのＤＣは以下のプロトコールを使用して低温保存される：
１．冷（４℃）５０％自己血漿／ＲＰＭＩ−１６４０または５０％熱不活性化ＦＣＳ／ＲＰＭＩの混合物を使用して、細胞を４×１０6生存細胞／mlの濃度に静かに再懸濁し、懸濁液を氷上に置く。
２．２０％ＤＭＳＯＲＰＭＩ−１６４０の冷却した無菌低温保護性培地１mlを含有するクリオバイアル中で、低温保護性培地の上に上記細胞懸濁液１mlを注意深く重層する。
３．凍結の約１０分前に、１：１混合物を静かに反転させて混合し、次に氷上に置いて細胞と低温保護性培地との間を平衡化する。注意：「重層」したチューブは、長時間凍結せずに放置してはならず、従って細胞をＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ溶液に暴露した後２０〜３０分以内に凍結することが好ましい。
４．バイアルを凍結ラックに入れて、次にこれを４℃のメタノール浴に、細胞懸濁液を覆うのにちようど充分なだけ沈める。次にこれを−８０℃のフリーザーの底（正しい温度を確保するために）少なくとも２時間かつ２４時間未満置く。
５．細胞が凍結状態に達した後、これを注意深くかつ迅速に、長期液体窒素封入容器に移す。使用される低温保存容器は、ＬＲ１０００冷蔵庫（ユニオンカーバイド社（Union Carbide Corp.）、インディアナポリス、インディアナ州）であり、これは４０，０００のクリウレ（cryules）を収容できる。
所望の時間の低温保存後、以下のプロトコールを用いて、ＤＣ細胞を融解して、本発明の前立腺癌に特異的な自己Ｔ細胞を刺激するのに使用することができる。
１．液体窒素から凍結細胞のバイアルを取り出す。直ちに３７℃の水浴中でバイアルを静かに揺り動かして、細胞懸濁液を、わずかの氷のみが残るように融解する。
２．５０％自己血清／ＲＰＭＩ−１６４０培地または５０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地の冷却した混合物を、無菌的に一滴ずつ（各添加の間で軽く混合する）加え始め、懸濁液の容量が２倍になるまで加える。
３．この懸濁液を大きい遠心分離チューブ（１２〜１５ml）に移し、５０５血清／ＲＰＭＩ混合物を各添加の間に混合しながら滴下して、容量が６〜７mlに達するまで加える。各０．５mlの増加毎に混合しながら希釈液を滴下して、容量が９〜１０mlに達するまで加える。（注意：希釈液を滴下して加えるのは、細胞懸濁液中のＤＭＳＯが希釈される時に細胞が浸透圧ショックを受けるのを防ぐためである）。
４．４℃で２００×ｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットにする。上清を吸引する。
５．冷却した２０％自己血清／ＲＰＭＩ−１６４０混合物１mlを静かに滴下してペレットに加える。穏やかに動かしてペレットで再懸濁するペレットを再懸濁した後（凝集は残るかも知れない）、これを１mlのピペットで静かに上下に吸引してさらに再懸濁する。
６．さらに４mlの冷却した２０％自己血清／ＲＰＭＩを滴下して加え、各添加の間に混合する。次に前記したように０．５mlずつ加えて容量を増加させる。
７．４℃で２００×ｇで１０分間遠心分離して細胞をペレットにする。上清を吸引する。
８．２〜５mlの冷却した２０％自己血清／ＲＰＭＩ混合物で再懸濁する。
９．細胞数の計測（例えば、血球計算器を使用して）と生存率の試験（例えば、トリパンブルー排除により）を行う。
Ｄｎａｓｅ（２０Ｕ／２×１０6細胞）または低分子量デキストランおよびクエン酸塩（ｐＨを６．５に下げるため）を含めることにより、ＤＭＳＯの段階的除去の間の凝集による細胞の損失を減少させることができる。
８．実施例：前立腺特異的Ｔ細胞を刺激するための寿命の延長された樹状細胞の使用
寿命の延長された樹状細胞は、以下のように本発明に従って調製した。
前記セクション６．１．３．に記載したようにヒト末梢血からＤＣを単離し、４〜６日間培養した。４〜６日間の培養後、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２の存在下で、Walls & Crawford,「リンパ球：実際的アプローチ」（Lymphocytes:A Practical Approach）、GCB Klaus編、ＩＲＬプレス、オックスフォード、イングランド、pp.149-162中に記載のように一般的に、ＤＣをエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染させた。簡単に説明すると、ＤＣを採取（約３〜５×１０6細胞）し、５mlのＢ９５−８（ＥＢＶ産生マーモセット細胞系、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州）培養上清に再懸濁した。細胞懸濁液を２５cm2フラスコ（ヌンク（Nunc,Inc.）、ナパービル（Naperville）、イリノイ州）に移し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で２４時間インキュベートした。５mlの新鮮なＤＣＰＭを培養物に加えた。増殖している細胞の塊が、感染後２〜３週間観察された。寿命の延長されたＤＣ細胞を、感染後３〜５週間に毎週サブ培養した。
抗原を提示して前立腺癌患者の自己Ｔ細胞を刺激する寿命の延長されたＤＣの能力を測定した。この試験で、５００ng/mlの破傷風毒素（ＴＴ）または１０4細胞／ml当量のLNCaP細胞の溶解物を、代表的抗原として使用した。
増殖測定法で使用した自己Ｔ細胞は、末梢血から得て、すでに低温保存しておいた。１０万個の融解したＴ細胞（「PBMC」と呼ぶ）を、１０％熱不活性化ヒト血清および１ユニット/mlのＩＬ−２を含有する完全培地中で以下のように培養した：LNCaP抗原単独の存在下（＋LNCaP）；ＴＴ抗原単独の存在下（＋ＴＴ）；ＥＢＶで形質転換したＤＣの存在下（＋ＥＢＶ細胞）；ＥＢＶで形質転換した樹状細胞及びLNCaP抗原の存在下（＋ＥＢＶ細胞＋LNCaP）；またはＥＢＶで形質転換した樹状細胞及びＴＴの存在下（＋ＥＢＶ細胞＋ＴＴ）。培地単独の存在下でのＴ細胞（PBMC＋培地のみ）はバックグランド試料とした。
６日目に１μCi／ウェルの3Ｈ−チミジン（3Ｈ−ＴｄＲ）をすべてのウェルに加え、１８時間後に培養物を採取した。3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを、液体シンチレーションカウンターを使用して評価した。各実験は三連で行なった。平均バックグランドｃｐｍを引いて3Ｈ−ＴｄＲ取り込み（各培養物の平均ｃｐｍ）を測定した。結果を図７に示す。
図７は、ＴＴ抗原またはＰＳＭＡ抗原に暴露した寿命の延長されたヒト樹状細胞は、あらかじめ低温保存したＴ細胞培養物中の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを著しく上昇させることを示す。すなわち、寿命の延長されたＤＣは、前立腺特異的抗原を提示してin vitroで自己Ｔ細胞増殖を刺激することは明らかである。
９．実施例：Ｔ細胞を刺激するためのＰＳＭＡペプチドの使用
ｃＤＮＡ（ＰＳＭＡ遺伝子の）から推定されるＰＳＭＡ抗原のアミノ酸残基４〜１２に対応するアミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）を有するペプチド（「ＰＳＭ−Ｐ１」と呼ぶ）がＴ細胞を刺激する能力を評価して、本発明の方法を使用する上で、そのような抗原性ペプチドの提示が有用であるかどうかを調べた。以下のデータは、この抗原性ペプチドが本発明の方法で使用するのに適していることを示す。
アミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶを有するペプチド（「ＰＳＭ−Ｐ１」と呼ぶ）は、ゲネメドバイオテクノロジーズ（Genemed Biotechnologies）（サンフランシスコ、カリホルニア州）により合成され、精製された。
前立腺癌患者から得た１０万個のあらかじめ凍結したＴ細胞（「PBMC」と呼ぶ）を、２０μＭのＰＳＭＡペプチドの存在下でまたは非存在下で、１０％熱不活性化ヒト血清および１ユニット/mlのＩＬ２を含有する完全培地中で培養した。６日目に１μCi／ウェルの3Ｈ−チミジンを加え、１８時間後に培養物を採取した。3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを、液体シンチレーションカウンターで測定した。各実験は四連で行なった。平均ｃｐｍと標準偏差を図８に示す。
図８に示すように、ＰＳＭＡペプチドのアミノ酸残基４〜１２に対応する抗原性ペプチドは、このペプチドの非存在下でのＴ細胞と比較してＴ細胞増殖の大幅な増加を誘導した。
２μＭのＰＳＭＡペプチドと１ユニット／mlのＩＬ２を含有する完全培地中で、ＰＳＭＡペプチドの結果として増殖したＴ細胞を５日間培養して増殖した後、採取した。１００万個の細胞を抗CD4、抗CD8抗体または培地単独とともに氷上で３０分インキュベートし、次にフルオレセインイソチオシアネート標識２°抗体でさらに３０分インキュベートした。蛍光結合を前述したようにＦＡＣＳ  ＳＣＡＮフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ、カリホルニア州）を使用して解析した。CD4＋およびCD8＋細胞のパーセントを計算した。結果を図９に示す。
図９に示すように、ＣＴＬは、ＰＳＭＡペプチド抗原により刺激されるＴ細胞の約４１％を占めた。すなわちこのペプチドは、本発明の方法に従って、前立腺癌に対する前立腺特異的応答（細胞傷害性細胞（ＣＴＬ）およびヘルパー細胞（ＴH）の両方）を誘導するために、ＤＣによりＴ細胞に提示されるのに有用である。
別の一連の実験で、アミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）を有するペプチド（「ＰＳＭ−Ｐ２」と呼ぶ）のＴ細胞を刺激する能力を評価した。以下のデータは、この抗原性ペプチドが本発明の方法に有用であるであることを示す。
ペプチドＰＳＭ−Ｐ２を合成し精製した。
２０μｇのＰＳＭ−Ｐ２ペプチドの存在下または非存在下（すなわち「培地対照」）で、１０万個のＴ細胞（すなわち、ＨＬＡ−Ａ２（＋）またはＨＬＡ−Ａ２（−）前立腺癌患者から得たPBMC）を、３７℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で５日間培養した。６日目に１μCi／ウェルの3Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。さらに２４時間インキュベーション後、細胞を採取し、3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。各実験は三連で行なった。平均ｃｐｍと平均の標準誤差として結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ＰＳＭＡのアミノ酸残基７１１〜７１９に対応するペプチドは、このペプチドの非存在下でのＨＬＡ−Ａ２（＋）Ｔ細胞に比較してＨＬＡ−Ａ２（−）Ｔ細胞増殖の大幅な増加を誘導した。ＨＬＡ−Ａ２（−）Ｔ細胞をこのペプチドに暴露した時、観察されたＴ細胞増殖の増強はより小さかった。
１０．実施例：ヒト前立腺癌患者の免疫応答を発生させるための樹状細胞の使用
後期の前立腺癌患者の５つの処理群を使用して第１相臨床試験を設定した。この群は以下のように処理した：第１群、アミノ酸配列ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ（配列番号１）を有するペプチドＰＳＭ−Ｐ１のみを、０．２、２．０および２０．０μgで投与；第２群、アミノ酸配列ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ（配列番号２）を有するペプチドＰＳＭ−Ｐ２のみを、０．２、２．０および２０．０μgで投与；第３群、１×１０6（＃３〜４）または５×１０6（＃１、２）の自己樹状細胞のみ投与；第４群、ＰＳＭ−Ｐ１（配列番号１）を添加した２×１０7までの自己樹状細胞を投与；第５群、ＰＳＭ−Ｐ２（配列番号２）を添加した２×１０7までの自己樹状細胞を投与。すべての処理は、注入により行なった。患者は、注入後７日間追跡し、免疫機能は、上記セクション９に記載のように3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを使用して注入前および注入後のＴ細胞増殖を評価することにより解析した。第１〜５群の最初の注入後の結果を図１１（Ａ〜Ｅ）に示す。
図１１Ａに示すように、ＰＳＭ−Ｐ１のみを投与した患者は、ＨＬＡ型に関係なく、Ｔ細胞増殖を増加させなかった。図１１Ｂに示すように、ＰＳＭ−Ｐ２のみを投与した（８人のうち）１人の患者のみがＴ細胞増殖を示した。この唯一の陽性患者はＨＬＡ−Ａ２（＋）患者であった。
図１１Ｃに示すように、樹状細胞のみを投与した患者は、Ｔ細胞増殖を増加させなかった。図１１Ｃに示すように、４人の患者のうち３人はＨＬＡ−２（Ａ）（＋）であり、１人はＨＬＡ−２（Ａ）（−）であった。
図１１（Ａ〜Ｃ）に示した結果とは全く対照的に、図１１（Ｄ〜Ｅ）の結果は、ペプチドＰＳＭ−Ｐ１またはＰＳＭ−Ｐ２のいずれかに暴露されこれを提示するＤＣの投与は、Ｔ細胞増殖の増強を誘導することを示す。特に、ＰＳＭ−Ｐ１ペプチドを含有する樹状細胞を投与された患者は、図１１（Ｄ）に示すように５人のＨＬＡ−Ａ（２）（＋）のうち３人でＴ細胞増殖の増加を示した。さらに唯一のＨＬＡ−Ａ（２）（−）患者は、Ｔ細胞増殖の増加を示さなかった。これらの結果はまず、ＰＳＭ−Ｐ１ペプチドと組合せて樹状細胞を投与すると、後期の前立腺癌患者で免疫応答を有効に発生させることを示す。第２に、このペプチドを使用する時、免疫応答はＨＬＡ−Ａ（２）制限作用のようである。図１１（Ｅ）に示すように、ＰＳＭ−Ｐ２ペプチドを含有する樹状細胞を投与された２人の患者も、Ｔ細胞増殖の増加を示した。これらの患者はいずれもＨＬＡ−Ａ２（＋）であった。
得られた結果に基づき、我々は、ＰＳＭ−Ｐ１またはＰＳＭ−Ｐ２ペプチドに暴露された樹状細胞は、前立腺癌患者で免疫応答を発生させるのに有用であり、本発明の方法および組成物は、癌免疫療法に有用であると結論した。
本発明の範囲は、本発明の１つの側面を例示するために記載した実施態様に決して限定されるものではない。確かに、前述の説明および添付図面から、当業者は本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の修飾が明らかである。しかしこのような修飾は添付の請求項内に包含されると考えられる。
引用したすべての文献は、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：マーフィー，ジェラルド  ピー．
ボイトン，オルトン  エル．
ツジャ，ベンジャミン  エー．
（ii）発明の名称：前立腺癌の免疫療法のための樹状細胞の単離および／または保存
（iii）配列の数：３８
（iv）住所：
（Ａ）名宛人：ペニー  アンド  エドモンズ
（Ｂ）通り名：アメリカ通り、１１５５番地
（Ｃ）市名：ニューヨーク
（Ｄ）州名：ニューヨーク
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：１００３６
（ｖ）コンピューター読取り可能形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn  リリース#1.0，バージョン#1.30
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ
（Ｂ）出願日：１９９６年７月２９日
（Ｃ）分類：
（viii）代理人の情報：
（Ａ）代理人名：ボールドウィン，ジェラルディン  エフ．
（Ｂ）登録番号：３１，２３２
（Ｃ）参照／事件番号：８５１１−００７
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（２１２）７９０−９０９０
（Ｂ）テレファックス：（２１２）８６９−８８６４／９７４１
（Ｃ）テレックス：６６１４１  ＰＥＮＮＩＥ
（２）配列番号：１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000005
（２）配列番号：２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000006
（３）配列番号：３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｃ）他の情報：／ラベル＝Xaa
／ノート＝”Ｘ＝LeuまたはMet”
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｃ）他の情報：／ラベル＝Xaa
／ノート＝”Ｘ＝ValまたはLeu”
（xi）配列：
0004267692.tif 000007
（２）配列番号：４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000008
（２）配列番号：５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000009
（２）配列番号：６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000010
（２）配列番号：７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000011
（２）配列番号：８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000012
（２）配列番号：９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000013
（２）配列番号：１０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
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（２）配列番号：１１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
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（２）配列番号：１２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000016
（２）配列番号：１３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000017
（２）配列番号：１４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000018
（２）配列番号：１５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000019
（２）配列番号：１６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000020
（２）配列番号：１７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000021
（２）配列番号：１８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000022
（２）配列番号：１９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000023
（２）配列番号：２０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000024
（２）配列番号：２１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000025
（２）配列番号：２２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000026
（２）配列番号：２３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000027
（２）配列番号：２４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000028
（２）配列番号：２５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000029
（２）配列番号：２６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000030
（２）配列番号：２７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000031
（２）配列番号：２８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vii）直接の起源：
（xi）配列：
0004267692.tif 000032
（２）配列番号：２９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000033
（２）配列番号：３０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000034
（２）配列番号：３１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000035
（２）配列番号：３２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000036
（２）配列番号：３３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000037
（２）配列番号：３４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000038
（２）配列番号：３５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000039
（２）配列番号：３６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000040
（２）配列番号：３７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000041
（２）配列番号：３８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0004267692.tif 000042
【図１】
0004267692.tif 000043
【図２】
0004267692.tif 000044
【図３】
0004267692.tif 000045
【図４】
0004267692.tif 000046
【図５】
0004267692.tif 000047
【図６】
0004267692.tif 000048
【図７】
0004267692.tif 000049
【図８】
0004267692.tif 000050
【図９】
0004267692.tif 000051
【図１０】
0004267692.tif 000052
【図１１Ａ】
0004267692.tif 000053
【図１１Ｂ】
0004267692.tif 000054
【図１１Ｃ】
0004267692.tif 000055
【図１１Ｄ】
0004267692.tif 000056
【図１１Ｅ】
0004267692.tif 000057