(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンへの曝露によって誘発されるアレルギーの予後を予測するためのデータを提供するための方法であって、
アレルゲンへの曝露によって誘発されるアレルギーを有する個体に由来するＩｇＥ抗体を含むサンプルを提供する工程；
該サンプルを、１以上の直鎖状ＩｇＥエピトープおよび１以上の高次構造ＩｇＥエピトープと接触させる工程であって、該直鎖状ＩｇＥエピトープおよび高次構造ＩｇＥエピトープが、天然から精製されたアレルゲン、組換えアレルゲン、還元およびアルキル化されたアレルゲン、還元およびアルキル化された該アレルゲンのフラグメント、該アレルゲンのフラグメント、該アレルゲンの４と４０との間のアミノ酸に対応するペプチド、またはそれらの組み合わせに由来する、工程；
該直鎖状ＩｇＥエピトープおよび高次構造ＩｇＥエピトープの反応性について、該サンプルをスクリーニングする工程；ならびに
直鎖状ＩｇＥエピトープよりも高次構造ＩｇＥエピトープとより反応性であるＩｇＥ抗体を有する該個体が、該アレルギーを増大する可能性を有することを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記直鎖状ＩｇＥエピトープおよび高次構造ＩｇＥエピトープが、スクリーニングのために固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させる工程の前に、前記個体がアレルギー性であるアレルゲンを同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質、花粉のタンパク質、塵のタンパク質、カビのタンパク質、昆虫のタンパク質、動物のタンパク質または植物のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質、木の堅果のタンパク質、乳のタンパク質、魚のタンパク質、あるいは貝および甲殻類動物のタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質または乳のタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
個体がアレルゲンへの曝露によって誘発されるアレルギーを増大する可能性を決定するためのキットであって、
アレルゲンの少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープを含む第１の組成物であって、ＩｇＥ抗体の該少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープとの反応性が、該アレルゲンに対するアレルギーが増大される可能性の減少と相関する、第１の組成物；および
ＩｇＥ抗体の検出用の試薬
を備える、キット。
【請求項９】
前記アレルゲンの少なくとも１つの高次構造ＩｇＥエピトープを含む第２の組成物をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記直鎖状ＩｇＥエピトープおよび高次構造ＩｇＥエピトープが固定化される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記第１の組成物が、前記アレルゲンの４と４０との間のアミノ酸に相当する１以上のペプチドを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記第１の組成物が、還元およびアルキル化されたアレルゲン、または還元およびアルキル化されたアレルゲンフラグメントを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記第２の組成物が、天然から精製されたアレルゲンを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
前記第２の組成物が、組換えアレルゲンを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
前記第２の組成物が、前記アレルゲンの１以上のフラグメントを含み、少なくとも１つのフラグメントが、少なくとも１つの高次構造ＩｇＥエピトープの保持に十分な三次元構造を保持する、請求項９に記載のキット。
【請求項１６】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質、花粉のタンパク質、塵のタンパク質、カビのタンパク質、昆虫のタンパク質、動物のタンパク質または植物のタンパク質である、請求項８に記載のキット。
【請求項１７】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質、木の堅果のタンパク質、乳のタンパク質、魚のタンパク質、あるいは貝および甲殻類動物のタンパク質である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質または乳のタンパク質である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第１の組成物および第２の組成物の一方または両方が、１より多くのアレルゲンのＩｇＥエピトープを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項２１】
アレルギー性の個体を、アレルギーを増大する可能性を有するか、または増大する可能性を有さないと分類するための方法であって、
アレルギーへの曝露によって誘発されるアレルギーを有する個体に由来するＩｇＥ抗体を含むサンプルを提供する工程；
該サンプル中に存在する場合に、エピトープ特異的ＩｇＥ抗体が少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープに結合するのを可能にする条件下で、該サンプルを、該アレルゲンの該少なくとも１つの直線状ＩｇＥエピトープと接触させる工程；および
該ＩｇＥ抗体の、該少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープとの十分に高い反応性の観察に基づいて、該アレルギー性の個体を、該アレルギーを増大する可能性を有さないと分類する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
アレルギー性の個体を、アレルギーを増大する可能性を有するか、または増大する可能性を有さないと分類するための方法であって、
アレルギーへの曝露によって誘発されるアレルギーを有する個体に由来するＩｇＥ抗体を含むサンプルを提供する工程；
該サンプル中に存在する場合に、エピトープ特異的ＩｇＥ抗体が少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープに結合するのを可能にする条件下で、該サンプルを、該アレルゲンの該少なくとも１つの直線状ＩｇＥエピトープと接触させる工程；および
該ＩｇＥ抗体の、該少なくとも１つの直鎖状ＩｇＥエピトープとの十分に低い反応性の観察に基づいて、該アレルギー性の個体を、該アレルギーを増大する可能性を有すると分類する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質、花粉のタンパク質、塵のタンパク質、カビのタンパク質、昆虫のタンパク質、動物のタンパク質または植物のタンパク質である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アレルゲンが、食物のタンパク質である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質、木の堅果のタンパク質、乳のタンパク質、魚のタンパク質、あるいは貝および甲殻類動物のタンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記食物のタンパク質が、ピーナッツのタンパク質、卵のタンパク質または乳のタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
アメリカ合衆国政府は、ＮＩＡＩＤからの助成金ＡＩ２４４３９およびＤＲＲ、国立衛生研究所からのＲＲ０００５２によって本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、１９９８年１月３０日に出願された米国特許出願第６０／０７３，１７１号に対する優先権を主張する。
【０００３】
食物に対する過敏性反応は、生涯の最初の数年間において６％までの小児に影響を与え（Ｂｏｃｋ，Ｓ．Ａ．１９８７．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ７９：６８３−６８８）、乳、卵、およびピーナッツが、証明されたアレルギー応答の大部分の原因である（Ｊａｍｅｓ  ＪＭおよびＳａｍｐｓｏｎ  ＨＡ．１９９２．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：６７−７８）。大部分の乳アレルギー小児は、生涯の最初の年において牛乳過敏症を発症させ、次いで、３歳までには約８０％がその反応性を「失う（ｏｕｔｇｒｏｗ）」（すなわち、臨床的に耐性になる）（Ｈｏｓｔ，Ａ．１９９４．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：５−３６）。鶏卵およびピーナッツに対する過敏症は、生涯の２年目においてさらに頻繁に認識される。卵アレルギーは、牛乳アレルギーよりも長く持続するようであり、一方、ピーナッツアレルギーは非常に稀にしか「失われる」ことがない（Ｂｏｃｋ，Ｓ．Ａ．１９８２．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６９：１７３−１７；Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｈ．Ａ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃａｎｌｏｎ．１９８９．Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １１５：２３−２７；Ｂｏｃｋ，Ｓ．Ａ．およびＦ．Ｍ．Ａｔｋｉｎｓ．１９８９．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８３：９００−９０４）。異なる食物アレルゲンに対する臨床的過敏症の持続性におけるこれらの相違の基礎は未知である。
【０００４】
卵アレルギーは、アトピー性皮膚炎を有する小児のほぼ３分の２に存在する（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｊ．１９９７  Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．９０（別冊３０）：３−９）。卵タンパク質が全くない食餌が卵アレルギー小児に与えられる場合、卵に対するＩｇＥ抗体（例えば、陽性有棘皮膚試験）が数年間持続する（Ｓａｍｐｓｏｎ  １９８９）とはいえ、約３分の１が、２年以内に卵に対する臨床的耐性を発達させる。オボムコイド（Ｇａｌ  ｄ  １）は、鶏卵における優勢なアレルゲンであり、そして持続性の卵アレルギーを有する小児は、反応性を「失う」小児よりも有意に高い濃度のＩｇＥ抗オボムコイド抗体を有する（Ｂｅｒｎｈｉｓｅｌ−Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ，Ｊ．ら，１９９４．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９３：１０４７−１０５９）。オボムコイドは、９つのドメイン内ジスルフィド結合および５つの炭化水素側鎖を含む３つのタンデムなドメインに配置された１８６アミノ酸から構成される糖タンパク質である。（Ｋａｔｏら，１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１９３−２０１）。
【０００５】
本発明の目的は、小児がアレルギー、特に食物アレルギーを失う可能性を予測するための方法および試薬を含むアッセイを提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、患者のサンプル中の高次構造エピトープに対する直鎖状エピトープに対する抗体の存在についてスクリーニングする方法および試薬を提供することである。
【０００７】
本発明のなお別の目的は、炎症性腸疾患を有する患者をスクリーニングして、この患者がより進行性の難治性の経過を有する可能性を決定する方法および試薬を提供することである。
【０００８】
（発明の要旨）
高次構造エピトープと比較した、直鎖状エピトープとのＩｇＥ抗体の免疫反応性についてスクリーニングすることにより、小児がアレルギー、特に食物アレルギーを失う可能性を予測する際に使用される方法および試薬が提供される。この小児は、最初に標準的な技術を用いてスクリーニングされて、どの抗原がこの小児にアレルギー性であるかを決定される。次いで、この患者由来のサンプル中の免疫グロブリンは、迅速かつ正確なスクリーニングのための固定化され得る、天然から精製した抗原、組換え抗原、還元およびアルキル化された抗原、この抗原のタンパク質分解フラグメント、または長さが４と４０との間のアミノ酸、好ましくは６〜１０アミノ酸の合成ペプチドのいずれかを用いて特徴付けられる。患者由来、代表的には血清サンプルまたは血漿サンプル中に存在する抗体は、このタンパク質またはペプチドと反応させられて、どのペプチドがこの抗体によって結合されるかが決定される。次いで、これらの抗体は、抗体が結合するエピトープが直鎖状であるかまたは高次構造をとっているかを決定するために特徴付けられる。高次構造エピトープと主に反応性の（すなわち、還元およびアルキル化されたタンパク質または合成直鎖状ペプチドと比較して、天然のタンパク質またはタンパク質分解フラグメントと反応性の）抗体を有する患者は、代表的に、アレルギーを失う。直鎖状エピトープと主に反応性である患者は、反応性を脱しないかもしれず、そして耐性を誘導するように処置される必要があり得る。
【０００９】
スクリーニング方法は、卵アレルギー患者由来のプールした血清およびオボムコイド配列由来の重複合成デカペプチドを利用する例において実証される。オボムコイドは、５つのアレルギー性ＩｇＥ結合エピトープを保有することが見出された。個々の患者血清を用いてアレルギー性エピトープを評価することにより、３パターンのエピトープ結合を明らかにした：３つ全てのオボムコイドドメインにおけるデカペプチドに対する広範なＩｇＥ結合、第１ドメインにおけるペプチドに対する優先的なＩｇＥ結合、およびいずれの合成ペプチドに対しても実質的にＩｇＥ結合が存在しない。このことは、後者のグループの大部分のＩｇＥ抗体が高次構造エピトープを認識したことを示す。全ての患者は、直鎖状合成ペプチドに対する広範なＩｇＧ抗体結合を有しており、一方、全ての非卵アレルギーコントロールは高次構造エピトープのみを認識した。直鎖状デカペプチドに対する広範なＩｇＥ結合を有するグループの患者は、より年長であって、かつ卵摂食後に、合成ペプチドに対するＩｇＥ抗体をほとんど有さない患者グループよりも重篤な、全身性のアレルギー症状を有する傾向があった。これらの知見は、示差的な抗原プロセシングおよび抗体−エピトープ構造認識が、アレルゲン感受性の臨床的経過に役割を果たすことを示す。
【００１０】
ＩｇＧ抗体またはＩｇＡ抗体の評価のための類似の方法を用いて、特定の炎症性障害、特に胃腸管を含む炎症性障害（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、およびセリアック病）の予後を予測し得る。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
ＩｇＥ特異的抗体の作製において、Ｂ細胞は、天然のタンパク質上で曝露されたオリゴペプチドへの表面ＩｇＭの結合に続いて活性化される。結果的に生成されたＩｇＥ抗体は、８〜２０の連続的な（一連の）アミノ酸を示す直鎖状のエピトープまたはアレルゲンの異なる領域由来のアミノ酸残基を包含する高次構造エピトープで指向され得る。直鎖状（例えば、Ｐｈｌ  ｐ  １；オオアワガエリ（Ｂａｌｌら、１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９：２８２３２−２８２４２））および高次構造的（Ｂｅｔ  ｖ  Ｉ；カバノキ花粉（Ｌａｆｆｅｒら、１９９６．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：４９５３−４９６２））の両方のＢ細胞エピトープは、吸入されるエアロアレルゲンとして定義されているが、後者が優性であると推定されている。食事性アレルゲンは、腸関連リンパ系組織の細胞への吸収および取り込みに先立って、広範な化学的およびタンパク分解性消化を受けるので、食事アレルゲン性のエピトープは、現実には優先的に直鎖状となることが推測される。しかし、卵アレルギー患者由来のプールされた血清を利用する以前の研究において、５  ＩｇＥ抗体および７ＩｇＧ抗体結合部位が、オボムコイドを含む１８６アミノ酸残基の間に同定された（Ｃｏｏｋｅ  およびＳａｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５９、２０２６−２０３２）。還元およびアルキル化（すなわち「直鎖化」）されたオボムコイドの評価は、全ての患者が、直鎖状エピトープを認識する抗オボムコイド抗体を有するわけではないこと、およびいくらかの患者が、主に高次構造エピトープ抗体を有することを示唆する。
【００１２】
以下の実施例において、重複する直鎖状デカペプチドおよび直鎖化された（還元およびアルキル化された）全てのオボムコイドを利用し、直鎖状オボムコイドエピトープを認識する個々の患者のＩｇＥ抗体を比較した。血清は、オボムコイドエピトープをスクリーニングするために、相対的に高レベルの卵特異的ＩｇＥ抗体（３５ｋＵA／Ｌ以上）を有する１７人の卵アレルギーの小児から選択された。合成されたデカペプチドへのＩｇＥの結合を比較した場合、３つの異なる抗体結合のパターンが存在することが明らかとなった。図３ａ〜３ｃに示したように、ある患者グループのＩｇＥ抗体は、以前に同定されていたほとんどのオボムコイドアレルゲン性エピトープ（ＣｏｏｋｅおよびＳａｍｐｓｏｎ  １９９７）を認識し、そしてあるグループのＩｇＥは、主に第１のオボムコイドドメインにおいてアレルゲン性エピトープを認識し、そして第３のグループは、合成されたデカペプチドのいずれに対しても実質的にＩｇＥ結合を有さなかった。研究された卵アレルギー患者において、合成デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ結合の３つのパターンが見られた。メジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  Ｉ  ＯＤスコアに反映されるように、患者のあるグループ（グループ１；図３ａ）は、３つ全てのオボムコイドドメインにおけるエピトープに対するＩｇＥ抗体を有し、あるグループは、主に第１のオボムコイドドメインにおけるエピトープに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を有し（グループ２；図３ｂ）、そしてあるグループは、いかなる合成デカペプチドに対しても極わずかなＩｇＥ抗体を有した（グループ３；図３ｃ）。
【００１３】
卵特異的ＩｇＥ抗体の量は、３つのグループで類似していたので、このことは、患者の第３のグループが、主に高次構造エピトープを認識するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を保有することを示唆した。この仮定は、「天然の」オボムコイドおよび「直鎖化された」（還元およびアルキル化された）オボムコイドに対する患者のオボムコイド特異的ＩｇＥ結合の比較の知見により支持された（図５ａ）。天然のオボムコイドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体の結合は、第３の患者グループと類似しているが、第３の患者グループのオボムコイド特異的ＩｇＥの約２２％のみが、天然の形態と比較して、直鎖化されたオボムコイドと結合した。一方、第１のグループの５０％より多くのオボムコイド特異的ＩｇＥが、オボムコイドの直鎖化形態と結合した。
【００１４】
これらの研究は、アレルギー（特に、食物アレルギー）が「増殖する（ｏｕｔｇｒｏｗ）」可能性のある任意の特定の個体を決定するための方法およびアッセイキットの開発を導いた。
【００１５】
（アレルギー増殖の可能性を決定するためのアッセイ）
（方法）
この方法は、小児が、直鎖状エピトープと比較して高次構造エピトープに対して、寛容なまたは「増殖する」アレルギーによりなりやすいようであるという発見に基づいている。従って、試験は、代表的に血液または血清サンプル、最も好ましくは小児からのサンプルを用いて行なわれるが、任意の年齢の個体が試験され得る。これらの個体は、まず標準的な試験（例えば、皮膚のプリックテストまたは個体が抗原に対してアレルギーである場合、および個体がアレルギーである範囲において、異なる力価で１つ以上の抗原を注入することにより決定する）を用いるアレルギーのスクリーニングにより同定される。抗体は、代表的には、患者の血液サンプルを取りだし、次いで赤血球を除き、そして残る血清または血漿を試験することにより得られる。サンプルは、抗原（ＣｏｏｋｅおよびＳａｍｐｓｏｎ  １９９７）によって示される定義されたエピトープを有するＩｇＥの反応性について直接的にスクリーニングされ得るか、または当業者に公知の方法を用いて他の抗体からＩｇＥ抗体を分離し、そして反応性についてスクリーニングされ得る。必要に応じて、サンプルはまた、エピトープとのＩｇＧ抗体の反応性についてもスクリーニングされ得る。
【００１６】
本実施例に記載した研究における１７人の卵アレルギー患者すべてが、生後２年のうちに自身の卵感受性を発現したが、第１の患者グループは、より年長であり、そして第３の患者グループよりも卵の摂取に続くアレルギー反応が、より著しかった。第１の患者グループの多数の直鎖状アレルゲン性エピトープに対する広範なオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体結合は、主なピーナッツ抗原であるＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２に対するピーナッツアレルギー患者において見られるものと類似している（Ｓｔａｎｌｅｙら、１９９７  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．３４２、２４４−２５３）。ピーナッツアレルギーを有する患者が、「遅延性の」（生涯にわたる）ピーナッツに対する反応性を有する傾向である（ＢｏｃｋおよびＡｔｋｉｎｓ  １９８９）ことは、「遅延性の」食事過敏性が、直鎖状エピトープに対するＩｇＥ抗体の有意な量の増加に関連する可能性を示唆する。卵に対するアナフィラキシー反応を繰り返し試験された３２歳の卵アレルギー個体（もともとの１７人の試験された個体の一部ではない）は、この研究の第１の患者のグループにおいて見られたように、直鎖状デカペプチドに対して広範に結合するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を有することに注目するべきである。
【００１７】
実施例は、エピトープ構造に対するＩｇＥ結合（すなわち、直鎖状対高次構造）と「遅延性の」食事過敏性の増大との間の関連を支持する。乳児は、消化過程の発達における二次的な成熟の遅延（例えば、胃の酸性度、タンパク質分解酵素の活性、ムチン組成物など、ならびに抗原取りこみの上昇）のためであると推定される、食事に続く血液循環における食物タンパク質のレベルの増加を示す（Ｈｙｍａｎら、１９８５．Ｊ  Ｐｅｄｉｔａｒ  １０６：４６７−４７１；Ｌｅｂｅｎｔｈａｌ，Ｅ．およびＰ．Ｃ．Ｌｅｅ．１９８０．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ６６：５５６−５６０；Ｓｈｕｂら、１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２１５：４０５−４１１；Ｂｒｅｓｓｏｎら、１９８４．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １８：９８４−９８７）。「漏出性の」乳児の腸は、有意な量の高次構造的に無傷の食物タンパク質が局部的なＢ細胞（活性化の際に、遺伝的に（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）前もって処理された宿主においてオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を生成する）と接近することを可能にする。胃腸管の成熟を伴う、高次構造的に無傷なより少ないタンパク質は、リンパ系組織およびＩｇＥ産生組織マスト細胞に関連した腸の活性化に接近可能であり、臨床的な反応性の低下およびアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体合成の最終的な損失を生じる。完全な卵タンパク質の食事性の排除は、さらに臨床的反応性の低下を促進するが、微量な卵タンパク質に対する連続した曝露は、直鎖状オボムコイドエピトープおよび遅延性の反応性に対するＩｇＥ抗体の増大を生じる。成熟した腸において、微量な免疫学的に無傷なタンパク質（おそらく、直鎖状エピトープ）は、胃腸バリアを透過する（Ｈｏｓｔ  １９９４；Ｂｒｕｎｎｅｒ、Ｍ．およびＷａｌｚｅｒ  Ｍ．１９２８．Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ４２：１７３−１７９；Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＪおよびＷａｌｚｅｒ  Ｍ．  １９３５．Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ５０：４９−５４；Ｈｕｓｂｙら、１９８５．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：８３−９２）。高次構造的に無傷なタンパク質は、おそらく排除される。これは、臨床的な応答性の低下の可能性が、診断の時点での患者の年齢、原因となるアレルゲンの除去の程度、および問題のアレルゲン（ピーナッツ、木の堅果および海産食物アレルギーは、まれに「増大」する）に関連しているという観察と一致する。より若年の小児は、高次構造ＩｇＥを産生する。食事過敏症となった時点でより若い患者は、診断され、そして／またはより厳密にアレルゲンが除去され、患者は、彼／彼女の食物アレルギーをより増大させるようである（Ｂｏｃｋ  １９８２；ＳａｍｐｓｏｎおよびＳｃａｎｌｏｎ  １９８９；Ｐａｓｔｏｒｅｌｌｏら、１９８９．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：４７５−４８３）。
【００１８】
（アレルゲン）
任意の抗原が、本明細書に記述のようにスクリーニングに用いられ得る。最も典型的な抗原は、卵、木の堅果、ピーナッツおよび牛乳のような食事アレルゲンである。他の一般的なアレルゲンは、花粉、カビ、およびチリダニならびに昆虫、家畜（イヌ、ネコ、トリ）および植物を含む。アレルゲンは、ＩｇＥ応答を提供する抗原である。
【００１９】
高次構造エピトープとの反応性を試験するために、アレルゲンは、無傷なタンパク質、組換えタンパク質、またはタンパク質分解性フラグメントとして利用され得る。アレルゲンの特性は、発現宿主の選択によって改変され得る（例えば、細菌発現系は、代表的にはタンパク質をグリコシル化しない、酵母およびバキュロウイルス／昆虫系は、改変されたグリコシル化を産生し、そしてさらに真核生物発現系においては、グリコシル化におよびリン酸化おいて改変され得、反応性変化し、そしてさらにエピトープを特徴づける）。
【００２０】
直鎖状エピトープは、短いタンパク質分解性フラグメントあるいは組換えＤＮＡの発現または標準的な技術を用いることにより合成的に作製されるペプチドであり得る。ペプチドは、代表的には４〜４０アミノ酸長であり、より好ましくは６〜２０、最も好ましくは８アミノ酸長である。これらは、公知のアミノ酸配列に基づいて設計され、通常はＧｅｎＢａｎｋのような公的な供給源から入手可能である。ペプチドは、好ましい実施態様において１〜９アミノ酸残基２〜１０アミノ酸残基などから始まってタンパク質に合成される。
【００２１】
結合について試験されるアレルゲンまたはそれらの一部は、好ましくは、固定され（例えば、９６ウェルプレート中に、またはクロマトグラフィーペーパーの切片上に）、次いで実施例に記載されたように結合について試験される。アレルゲンは、液層試験またはＥＬＩＳＡもしくは蛍光定量的な技術を用いる試験のために粒子または他の公知の手段に結合され得る。
【００２２】
（キット）
この方法は、好ましくは、患者の予後を特徴付けるのに十分な直線状エピトープおよび高次構造エピトープと反応性の患者のサンプルにおいてＩｇＥ抗体を同定するための試薬を含むキットを使用して、実施される。代表的なキットは、１以上のアレルゲンに対する直線状または高次構造のいずれかのエピトープをその中で固定化している多ウエルデバイスを含む。このキットもまた、ＩｇＧからのＩｇＥの検出または分離のための試薬（例えば、ＩｇＥに特異的な蛍光標識イムノグロブリンおよび非結合物質を洗浄除去するための緩衝液）を含む。このキットは、異なる力価で１以上の直線状エピトープおよび１以上の高次構造エピトープに対する反応性を評価し、次いでこれらの相対的な比率を決定することにより、高次構造抗体に対する直線状抗体へのＩｇＥの相対量を決定するために使用され得る。
【００２３】
この試験の結果は、代表的には、ネガティブコントロールまたはポジティブコントロールに対する対照のない、高次構造エピトープに対する直線状エピトープとの反応性のＩｇＥの比率であるが、この試験キット試薬およびアッセイ条件の整合性を保証するために、直線状エピトープまたは高次構造エピトープのいずれかと反応性のポジティブおよびネガティブなＩｇＥサンプルを含むことが望まれ得る。
【００２４】
（アレルギー、特に食物アレルギーの処置の方法）
高次構造エピトープと反応性の主要なＩｇＥを有するこれらの個体は、直線状エピトープとの反応性によって主に特徴付けられる個体よりアレルギーをより増加するようである。このことはさらに、実施例によって実証される。アトピーに対して素因化している乳児において、直線状エピトープに対する高次構造エピトープへのＩｇＥ抗体の発生は、胃腸管、腸の未成熟性およびアレルゲンの曝露による抗原プロセス化における成熟遅延および／または分子的な相違を一部、反映し得る。アトピーを発生させる「高い危険性」を有する乳児におけるアレルギーの予防に関する研究は、生後少なくとも初年の間の牛乳（主要な食物アレルゲン）の完全な回避によって、食物制限のない乳児と比較してミルクアレルギーの少ない結果を得ることを示している（Ｚｅｉｇｅｒら、１９８９．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：７２−８９；Ｈａｌｋｅｎら、１９９２．Ａｌｌｅｒｇｙ  ４７：５４５−５５３）。
【００２５】
上記の情報に基づいて、患者がアレルギー患者における耐性を誘導するために免疫療法様式を受けるべきか否かを決定する場合の補助のための一般化したスクリーニング方法およびスクリーニングのための処方物を開発し得る。このスクリーニングの結果に基づいて、処方され得る免疫療法様式は、このアレルゲン（例えば、患者のＩｇＥと反応性のエピトープを含む食物）の完全な回避、または脱感作療法を含む。
【００２６】
（炎症障害における予後を評価するための方法）
食物タンパク質に対するＩｇＧ抗体は、食物抗原に曝露した個体全てにおいて、実質的に検出され得るが（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５３：６６５−６７２；Ｓａｖｉｌｈａｔｉら、１９８７．Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ  ７６：１−６）、ＩｇＧ食物特異的抗体のレベルは、年齢と共に減少する傾向にある（Ｋｌｅｔｔｅｒら、１９７１  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：６５６−６６６）。食物アレルギーまたは炎症性腸疾患（例えば、セリアック病、炎症性腸疾患など）を有する患者は、顕著に上昇したレベルの食物特異的ＩｇＧを有する傾向である（Ｍａｙら、１９７７．Ｃｌｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ７：５８３−５９５）。同じことがＩｇＡ抗体の場合において予期され、これは、胃腸管の管壁において主に見出される。
【００２７】
この実施例は、遅延性の卵アレルギーを有する患者が直線状オボムコイドエピトープと結合する多量のＩｇＥ抗体を有するが、一方、より若い患者は、高次構造エピトープと結合する主要なＩｇＥ抗体を有することを実証する。さらに、卵アレルギーの患者は、直線状および高次構造エピトープに対する、有意な量のオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体を発生させるが、一方、非卵アレルギー個体は、高次構造エピトープに対してほぼ排他的にオボムコイド特異的ＩｇＧを発生させる。
【００２８】
上記のように、上昇したレベルの食物特異的ＩｇＧ抗体はまた、胃腸管の炎症により特徴付けられる障害、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病などにおいてみられる（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．Ａ．：１９９５  １１（６）、５４８〜５５３）。食物特異的抗体の上昇は二次的にこれらの障害において腸の浸透性を上昇させ、そして病原性でないと考えられている。合併症のない炎症性腸障害において、これらの食物特異的ＩｇＧ抗体は、高次構造エピトープで指向されるようである。しかし、進行性で難治性の腸疾患において、食物特異的ＩｇＧ抗体は、直鎖状エピトープで指向されると考えられており、これは、異常な免疫応答および好ましくない予後を示す。
【００２９】
実施例によって示されるように、直鎖状デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体結合が評価される場合、卵アレルギー患者群とコントロールとの間に有意差がみられた。直鎖状デカペプチドに対する最大量のオボムコイド特異的ＩｇＥを有する第１の患者群は、第２および第３の患者群よりもオボムコイドデカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体結合が有意に少ない（図４ａ〜４ｃ）。累積的ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアのメジアンにおいて反映されるように、卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）は、全ての３つのオボムコイドドメインにおけるエピトープに対する大量のＩｇＧ結合、および非卵アレルギーのコントロール（卵アレルギーのないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギーの正常コントロール（図４ｅ））よりも有意に多くのＳＰＯＴデカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体を有していた。卵アレルギー患者の第２群（図４ｂ）および第３群（図４ｃ）は、第１の群（図４ａ）よりも有意に多くの合成ペプチドに対するＩｇＧ抗体結合を有していた。しかし、天然型と比較して「直鎖化された」オボムコイドに対するオボムコイド特異的ＩｇＧ結合のパーセンテージには有意な差はなかった（図５ｂ）。卵に対してアレルギーでないアトピー性皮膚炎患者および非アレルギー性の正常コントロールからなるコントロール群は、天然のオボムコイドに対して有意なＩｇＧ抗体を有するが、直鎖状デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体は実質的には有さない（図４ｄ〜４ｅ）。これらの結果は、接食したアレルゲンに対する免疫応答における食物アレルギー個体と非アレルギー個体との間の抗原プロセシングのレベルでの質的な差を示唆する。
【００３０】
従って、合併症のない炎症性腸障害と比較した場合、進行性の難治性腸疾患により特徴付けらるようである炎症性障害を有する個体についてのスクリーニングが可能である。この方法および試薬は、高次構造エピトープと免疫反応性のＩｇＥに対する直鎖状エピトープに免疫反応性のＩｇＥの相対比率に基づき個体がアレルギーを失う可能性を決定するためのものと同様であるが、高次構造エピトープに対するＩｇＧの免疫応答性に対して、直鎖状エピトープに対するＩｇＧの免疫応答性を調べる。
【００３１】
本発明は、以下の非制限的な実施例に対する参考により、さらに理解される。
【００３２】
（実施例：抗卵ＩｇＥおよび抗卵ＩｇＧの免疫反応性を特徴付けるための患者サンプルのスクリーニング）
（方法および材料）
略号：
ＰＢＳ−リン酸緩衝化生理食塩水
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００３３】
（患者集団）
アトピー性皮膚炎の評価を示す小児１７名（年齢のメジアン：４歳、範囲１〜１５歳；男児１０名、女児１０名）を、Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．Ａ．およびＣ．Ｃ．ＭｃＣａｓｋｉｌｌ．１９８５．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ  １０７：６９９〜６７５；およびＳａｍｐｓｏｎ、Ｈ．Ａ．１９９２．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｏｒｏｌ（Ｓｔｏｃｋｈ）Ｓｕｐｐｌ．１７６：３４〜３７に記載のように、二重盲検プラシーボコントロールされた卵チャレンジによる卵過敏症について診断した。静脈穿刺により血液を得、そして血清を分離し、この研究で用いるまで−２０℃で凍結保存した。血清の卵特異的ＩｇＥ濃度は、ＣＡＰ−ＲＡＳＴ  ＦＥＩＡ  TM系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して決定した。
【００３４】
（還元およびアルキル化されたオボムコイドの調製）
オボムコイドを、ＣｏｏｋｅおよびＳａｍｐｓｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７に記載のように、全オボムコイドを５０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解して還元およびアルキル化した。
【００３５】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
タンパク質を以前に公開された（Ｂｅｒｎｈｉｓｅｌ−Ｂｒｏａｄｂｅｎｔら、１９８９．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：７０１〜７０９）ようなＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質サンプルの濃度を、アミドブラックにより染色し、そしてレーザーデンシトメトリーにより分析した場合、等価のシグナルを与えるように最適化した。引き続き、分離したタンパク質をニトロセルロースに転写し、次いでアミドブラックで染色して総タンパク質転写を見るか、または患者の血清を調査するために０．５％のブタのゼラチンを用いてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでブロックした。
【００３６】
（患者の血清でのイムノブロットの調査）
患者の血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ゼラチン添加）に１：１０で希釈し、室温で穏やかに撹拌しながら２時間イムノブロットとともにインキュベートし、そして以前に記載（ＣｏｏｋｅおよびＳａｍｐｓｏｎ  １９９７）のようにＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体について発色させた。イムノブロットは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＳｉｇｍａＦＡＳＴ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で発色させ、そしてレーザーデンシトメーター（Ｕｌｔｒａｓｃａｎ  ＳＬ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）でスキャンし、オボムコイド特異的抗体結合の量を決定した。
【００３７】
（ＩｇＥエピトープおよびＩｇＧエピトープについてのスクリーニング）
本研究において、誘導体化されたセルロース膜であるＳＰＯＴｓTM膜（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）を用いて、８×１２の行列の小さい円形のスポット状にデカペプチドを作製した。この方法を用いて、Ｇａｌ  ｄ  １の全配列をあらわす８９のデカペプチドを作製した；８アミノ酸が重複したペプチド、例えば、ペプチド＃１＝Ｇａｌ  ｄ  １アミノ酸１〜１０、ペプチド＃２＝Ｇａｌ  ｄ  １アミノ酸３〜１２、ペプチド＃３＝Ｇａｌ  ｄ  １アミノ酸５〜１４など。
【００３８】
患者血清を用いた重複Ｇａｌ  ｄ  １ペプチドのスクリーニングの前に、ＳＰＯＴ膜を０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．５％のブタのゼラチンおよび１％のヒト血清（卵タンパク質に対する検出可能ＩｇＥを有さないドナー由来）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）でブロックした。個々の患者血清を０．０１％のＴｗｅｅｎ２０および０．５％のブタのゼラチンを有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＋ゲル）で１：１２に希釈し、２時間、室温でロッキングプラットフォーム上でインキュベートし、そして以前に記載（ＣｏｏｋｅおよびＳａｍｐｓｏｎ  １９９７）のように、ＩｇＥ抗体について発色させた。患者のＩｇＧ抗体を検出するために、患者の血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＋ｇｅｌに１：１０に希釈した。インキュベーション時間および洗浄は、ＩｇＥ抗体に関してと同様であった。用いられた検出抗体は、ウサギの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）であった。この膜は、ＥＣＬの化学発光ＨＲＰ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて染色させた。
【００３９】
Ｘ線フィルムの現像後、それぞれの個々のペプチドスポットの光学密度（ＯＤ）を、反射デンシトメーター（Ｔｈｅ  Ａｎｓｗｅｒ  ＩＩ  ＭａｃＢｅｔｈ，Ｎｅｗｂｕｒｇｈ，ＮＹ）を用いて測定した。それぞれのペプチドスポットのＯＤを、実際のペプチドスポットのＯＤとバックグラウンドのフィルムのＯＤとの間の差として記録した。８９のデカペプチドのそれぞれに、「累積的なＳＰＯＴ」ＩｇＥおよびＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアを割り当てた。これは研究した１７例の患者についての８９のＧａｌ  ｄ  １  ＳＰＯＴペプチドのそれぞれについてのＯＤの合計を示す。それぞれの患者は、「累積的な患者」ＩｇＥおよびＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアを受け取った。これは、その患者についての８９のＧａｌ  ｄ  １  ＳＰＯＴペプチドのすべてのＯＤの合計を示す。
【００４０】
ＳＰＯＴ膜は、再生されそして８〜１０回、再調査され得る。この膜を脱イオン化蒸留水中で徹底的に洗浄した後、これを３５ＭｍのＳＤＳおよび０．１％のＢＭＥを含有する８Ｍ尿素中で、１０分間、３回洗浄し、それぞれの回にＩｇＥを剥離するかまたは３０分間でＩｇＧを剥離した。次いで、この膜を５０％エタノール中で３回（１０分洗浄）および、メタノール中の１０％酢酸で２回（１０分洗浄）し、次いで再調査のために再ブロックした。患者の血清の非存在下での剥離手順の後、二次抗体単独（抗ヒトＩｇＥまたは抗ヒトＩｇＧ）での膜のインキュベーションは、非特異的結合を示さなかった。これは剥離手順がＳＰＯＴ膜を成功裏に再生したことを示す。
【００４１】
（統計的な解析）
データの解析はすべて、非パラメトリック検定、−対２サンプル符号検定およびマン−ホイットニー検定で実行した。
【００４２】
（結果）
二重盲検プラシーボ制御の食物チャレンジにより確認した卵アレルギーを有する１７人の小児由来の血清を、この試験において用いた。すべて、血清の卵特異ＩｇＥが著明に上昇していた；メジアン＝８３Ｋｕa／Ｌ；範囲＝３５〜１００ｋＵA／Ｌを超えるまで。個々の患者の血清を、ＩｇＥペプチド特異的およびＩｇＧペプチド特異的抗体についてＳＰＯＴ膜を探査するために用いた。図１は、８９の合成ペプチドの各々について累積的ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  Ｏ．Ｄ．スコアを示す。ペプチド＃１、＃５、＃６、＃２４、＃２５および＃５７は、５０％より多くの患者からのＩｇＥ抗体により結合された。これは、これらのペプチドが「主要なアレルギー性エピトープ」を表すことを示す。これらの主要なアレルギー性エピトープは、Ｇａｌ  ｄ  １アミノ酸１〜１０（ペプチド１、ＡＥＶＤＣＳＲＦＰＮ）、９〜２０（ペプチド５および６、ＰＮＡＴＤＫＥＧＫＤＶＬ）、４７〜５８（ペプチド２４および２５、ＳＩＥＦＧＴＮＩＳＫＥＨ）および１１３〜１２２（ペプチド５７、ＶＥＱＧＡＳＶＤＫＲ）を示す。有意なＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＳＰＯＴ  ＯＤスコアを有する他の合成ペプチドとしては、ペプチド２（アミノ酸３〜１２、ＶＤＣＳＲＦＰＮＡＴ）、ペプチド４（アミノ酸７〜１６、ＲＦＰＮＡＴＤＫＥＧ）、ペプチド２１（アミノ酸４１〜５０、ＣＬＬＣＡＹＳＩＥＦ）、ペプチド３８および３９（アミノ酸７５〜８６、ＮＴＴＳＥＤＧＫＶＭＶＬ）、ペプチド５３（アミノ酸１０５〜１１４、ＥＣＬＬＣＡＨＫＶＥ）および８９（アミノ酸１７７〜１８６、ＴＬＴＬＳＨＦＧＫＣ）が挙げられた。これらのペプチドのほとんどは、６名以上の患者からのＩｇＥ抗体により結合された。図２は、８９の合成デカペプチドのそれぞれについて累積的ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＳＰＯＴ  Ｏ．Ｄ．スコアを示す。ＩｇＥ結合と比較してより大量のＧａｌ  ｄ  １合成ペプチドに対するＩｇＧ抗体の結合が存在した。
【００４３】
ＳＰＯＴ膜へのＩｇＥ抗体結合；それぞれの患者についてのデカペプチドを比較する場合、３つの異なるパターンのペプチド結合がみられた：１群−２つ以上のＧａｌ  ｄ  １ドメインにおけるＩｇＥ抗体結合エピトープ、２群−主に第１のＧａｌ  ｄ  １ドメインにおけるペプチドに対して特異的なＩｇＥ抗体、および３群−ＳＰＯＴ膜上の任意のデカペプチドに対する無視し得るＩｇＥ結合。３つの患者群（１群（ｎ＝５）−８０ｋＵA／Ｌ、群２（ｎ＝５）−９２ｋＵA／Ｌ、および３群（ｎ＝７）−７３ｋＵA／Ｌ）の間に血清の卵特異的ＩｇＥ濃度について有意差（ｐ＞０．４）は、存在しないが、３つの患者群についてのメジアン累積的ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアは、有意に異なっていた。１群の患者は、２群（メジアン累積  ＯＤ＝７．０；ｐ＜０．０５）または３群（メジアン累積ＯＤ＝２．７；ｐ＜０．０１）のいずれよりも有意に多い合成Ｇａｌ  ｄ  １デカペプチドに対するＩｇＥ結合（メジアン累積ＯＤ＝２７．９）を有し、そして２群は、３群よりも有意に多いＧａｌ  ｄ  １ペプチドに対するＩｇＥ結合を有する（ｐ＜０．０５）。それぞれの患者群についての個々のデカペプチドに対するＩｇＥ結合のメジアンを、図３に示す。興味深いことに、１群および２群の患者は、３群の患者と比べてより長く持続する卵アレルギーを有し、より高年齢である傾向があった；年齢のメジアンは、それぞれ１０および６歳であり、全ての患者は、生後２年のうちに診断されている。
【００４４】
図４ａ〜４ｅは、３つの患者群およびコントロールの２つのセットのそれぞれについての個々のデカペプチドに対するＩｇＧ結合のメジアンを示す。累積的患者ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １ＯＤスコアのメジアンにおける有意差が、３つの患者群およびコントロールの間でみられた：１群−５２．４、２群−７０．６、３群−６９．８、非食物アレルギーのアトピー性皮膚炎コントロール（ｎ＝５）−９．６、非アレルギー性コントロール（ｎ＝５）−１１．６。１群の患者は、２群および３群よりも有意に少ないＧａｌ  ｄ  １デカペプチドに対するＩｇＧ抗体結合２を有しており（ｐ＜０．０１）、一方、２群と３群との間には、有意差はなかった（ｐ＝０．４）。３つの卵アレルギー患者群は、２つの非卵アレルギーコントロール群よりも、有意に多い、オボムコイドデカペプチドに対するＩｇＧ結合を有していた（ｐ＜０．０１）。非卵アレルギーのアトピー性皮膚炎患者コントロールおよび非アトピー性のコントロールは、８９個のＳＰＯＴデカペプチドに対する、類似の（ｐ＝０．４）、最小のＩｇＧ抗体結合を示した。
【００４５】
３群の卵アレルギー患者による合成ペプチドに対するＩｇＥ結合の欠如は、それらのオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体の大部分が高次構造エピトープを認識したことを示唆した。これを試験するため、天然オボムコイドに対するＩｇＥ抗体結合ならびに還元およびアルキル化された（直鎖化）オボムコイドに対するＩｇＥ抗体結合を、３つの患者群で比較した。図５ａ〜ｂは、天然オボムコイドに対するＩｇＥ抗体結合と比較した還元およびアルキル化されたオボムコイドに対するＩｇＥ抗体結合（ＯＤ）の比を示す。天然オボムコイドおよび「直線化」（還元およびアルキル化）オボムコイドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ抗体の比を、それぞれの卵アレルギー患者群について比較した。天然のオボムコイドに対するＩｇＥ抗体の濃度は、すべての群について匹敵するが、１群の患者（長期の卵アレルギーを有し、より高年齢）は、３群（より若年）の患者よりも有意に多い直鎖化されたオボムコイドに対するＩｇＥ抗体を有した（図５ａ）。（図５ａ−メジアン：１群および３群について、それぞれ５２％対２２％、ｐ＜０．０５）。直鎖化された天然オボムコイドに対するＩｇＧ抗体の比における有意差は、卵アレルギー性患者群の間ではみられなかった（図５ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＳＰＯＴ膜上で作製した８９個の重複合成デカペプチドの各々についての累積ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。スコアは、研究した１７人の卵アレルギー患者の総結合を反映する。
【図２】  ＳＰＯＴ膜上で作製した８９個の重複合成デカペプチドの各々についての累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。スコアは、研究した１７人の卵アレルギー患者の総結合を反映する。
【図３Ａ】  メジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアとして示した、合成デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ結合のパターン：グループ１（図３ａ）は３つ全てのオボムコイドドメイン中のエピトープに対するＩｇＥ抗体を保有した、グループ２（図３ｂ）は主に第１のオボムコイドドメイン中のエピトープに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を有した、およびグループ３（図３ｃ）は全ての合成デカペプチドに対して無視してよいＩｇＥ抗体を有した。
【図３Ｂ】  メジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアとして示した、合成デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ結合のパターン：グループ１（図３ａ）は３つ全てのオボムコイドドメイン中のエピトープに対するＩｇＥ抗体を保有した、グループ２（図３ｂ）は主に第１のオボムコイドドメイン中のエピトープに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を有した、およびグループ３（図３ｃ）は全ての合成デカペプチドに対して無視してよいＩｇＥ抗体を有した。
【図３Ｃ】  メジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＥ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコアとして示した、合成デカペプチドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ結合のパターン：グループ１（図３ａ）は３つ全てのオボムコイドドメイン中のエピトープに対するＩｇＥ抗体を保有した、グループ２（図３ｂ）は主に第１のオボムコイドドメイン中のエピトープに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体を有した、およびグループ３（図３ｃ）は全ての合成デカペプチドに対して無視してよいＩｇＥ抗体を有した。
【図４Ａ】  卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）および非卵アレルギーコントロール：卵アレルギーを有さないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギー性正常コントロール（図４ｅ）についてのメジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。
【図４Ｂ】  卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）および非卵アレルギーコントロール：卵アレルギーを有さないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギー性正常コントロール（図４ｅ）についてのメジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。
【図４Ｃ】  卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）および非卵アレルギーコントロール：卵アレルギーを有さないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギー性正常コントロール（図４ｅ）についてのメジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。
【図４Ｄ】  卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）および非卵アレルギーコントロール：卵アレルギーを有さないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギー性正常コントロール（図４ｅ）についてのメジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。
【図４Ｅ】  卵アレルギー患者（図４ａ〜４ｃ）および非卵アレルギーコントロール：卵アレルギーを有さないアトピー性皮膚炎患者（図４ｄ）および非アレルギー性正常コントロール（図４ｅ）についてのメジアン累積ＳＰＯＴ  ＩｇＧ  Ｇａｌ  ｄ  １  ＯＤスコア。
【図５】  図５ａ〜ｂ。天然のオボムコイドおよび「直鎖化」（還元およびアルキル化された）オボムコイドに対するオボムコイド特異的ＩｇＥ抗体（図５ａ）およびオボムコイド特異的ＩｇＧ抗体（図５ｂ）の比を、各卵アレルギー患者群について比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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