(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表わされる水溶性の蛍光インターカレータ：
【化１】
0004267208.tif 000016
［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結基であって、Ｘが、ナフタレンジイミド基、アントラセン基、アントラキノン基、フルオレン基、ビフェニレン基、フェナントレン基、およびピレン基からなる群より選ばれる環状基であるか、あるいは、Ｌａが、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基または１，４−ジ（ｎ−プロピレニル）−ピペラジニル基である］。
【請求項２】
Ｘに、−Ｌｂ−Ｚ［但し、Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基である］で表わされる置換基が結合している請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項３】
Ｘが、窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基、２位、６位、１位もしくは５位に結合手を有するアントラセン基、２位、６位、１位もしくは５位に結合手を有するアントラキノン基、２位もしくは６位に結合手を有するフルオレン基、２位もしくは６位に結合手を有するビフェニレン基、２位もしくは７位に結合手を有するフェナントレン基、および２位もしくは７位に結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項４】
Ｘが、窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基、２位、６位、１位もしくは５位に結合手を有するアントラキノン基、もしくは２位、６位、１位もしくは５位に結合手を有するアントラセン基である請求項３に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項５】
Ｆが、芳香族基を含む蛍光性基である請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項６】
Ｆが、アクリジン基、インドシアニン基、もしくはアザインドレニンシアニン基である請求項５に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項７】
Ｚが、芳香族基を含まない非蛍光性基である請求項２に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項８】
Ｚが、酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を含む非蛍光性基である請求項７に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項９】
Ｚが、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ基、もしくはメルカプト基である請求項８に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項１０】
Ｌａが、芳香族基を含まない連結基である請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項１１】
Ｌａが、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基である請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項１２】
ＬａのＦからＸまでの最も近い連結路に沿って数えた主鎖の原子の数が２〜５０の範囲にある請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項１３】
Ｌａ−Ｘ−Ｌｂの、ＦからＺまでの最も近い連結路に沿って数えた主鎖の原子の数が１０〜１００の範囲にある請求項２に記載の蛍光インターカレータ。
【請求項１４】
基板に固定されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる方法：
上記プローブ分子に、請求項１に記載の蛍光インターカレータそして水の存在下にて、相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を接触させることにより、プローブ分子と相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハイブリダイズさせて、上記蛍光インターカレータの少なくとも一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工程、そして
基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工程。
【請求項１５】
基板に固定されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる方法：
上記プローブ分子に、水の存在下で、相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を接触させることにより、プローブ分子と相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハイブリダイズさせて、基板上にハイブリッド構造体を形成させる工程、
請求項１に記載の蛍光インターカレータを水の存在下にて上記ハイブリッド構造体と接触させて、該蛍光インターカレータの少なくとも一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工程、そして
基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の核酸断片などのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをＤＮＡチップと蛍光インターカレータとを用いて蛍光法により検出する方法に関する。本発明はまた、該蛍光法を用いる検出方法に有利に使用できる蛍光インターカレータにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学、医学分野での遺伝子解析においては、特定の配列を有する核酸断片を検出する方法として、ハイブリダイゼーション法が用いられている。
この中でも特に、目的とする遺伝子を特異的に検出することができる方法として、サザンハイブリダイゼーション法（サザンブロッティング法）が、一般的に有用されている。サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料ＤＮＡを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに分離する。次に、分離した試料ＤＮＡ断片を一本鎖に変性した後、ナイロン・フィルターもしくはニトロセルロース・ペーパーに固定化する。そして、その試料ＤＮＡ断片と、この試料ＤＮＡ断片に相補性を有する放射性同位元素で標識された一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせた後、洗浄後のフィルターをオートラジオグラフィーにかけ現像することによって、相補性ＤＮＡとハイブリダイズする特定の塩基配列を有する試料ＤＮＡ断片を検出することができる。
【０００３】
しかし、上記のサザンハイブリダイゼーション法を含めた放射性同位元素を用いる方法は、標識として放射性同位元素を用いるため、検出に長時間を要し、明確なバンドを得難いばかりでなく、放射性物質取り扱いやコストの点において実用上の問題がある。
【０００４】
サザンハイブリダイゼーション法では、放射性同位元素による標識の代わりに蛍光による標識法も知られている。蛍光を用いる検出方法は、安全性、迅速さ、及び感度の点で現在のところ最も優れた方法である。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されているＤＮＡ断片と、蛍光物質で標識した試料ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせて、試料ＤＮＡ断片を検出するＤＮＡマイクロアレイ技術は既に有用されている（蛋白質・核酸・酵素,Vol.,43,No.13,2004-2011(1998)）。蛍光物質としては、シアニン色素であるＣｙ３（登録商標）やＣｙ５（登録商標）を使用することができるが、これらは高価であるばかりでなく、試料ＤＮＡ断片への取り込み率が１％程度と低いため、試料ＤＮＡ断片の充分な標識ができないという問題点を有する。
【０００５】
一方、特開平９−２８８０８０号公報には、出力端子を備えた電極に、試料ＤＮＡ断片および電気化学活性縫い込み型インターカレータを接触させ、電極上に固定されているＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡに結合（「結合」とは、一定の速度で、当該インターカレータのハイブリッドＤＮＡの塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている状態をいう。）した当該インターカレータと電極との間を流れる電流量を測定することによって、試料ＤＮＡ断片を検出する方法が開示されている。この方法では、標識した試料ＤＮＡ断片を調製する必要がない。特開平９−２８８０８０号公報に開示された電気化学活性縫い込み型インターカレータは、ナフタレンジイミド基の両端部に、酸化還元活性を持つフェロセン分子が結合した構造を有し、二つの塩基対間に一個の割合で、ナフタレンジイミド部分が二本鎖ＤＮＡ断片に結合するため、非塩基対部分の認識も可能である。上記の電気化学的検出法は、電極表面の処理やハイブリダイゼーションの条件を改良することによって、現在では蛍光法とほぼ同程度の感度を達成できるようになっている。
【０００６】
前述したように、蛍光法は高い感度を有する点で非常に有用な方法である。そこで、上記の縫い込み型インターカレータによる検出方法と同様の原理で、蛍光性の縫い込み型インターカレータが利用できれば、その有用性は非常に高いと考えられ、開発が行なわれている。
【０００７】
これまで、蛍光インターカレータとしては、アクリジン色素が知られている。しかし、このアクリジン色素は二本鎖ＤＮＡ断片からの脱離反応が速いという問題点を有する。一方、蛍光インターカレータとして、両端部にアクリジン色素が結合した下記式で表される、Ｎ，Ｎ−ビス｛３−［４−（３−（６−クロロ−９−イミノ−２−メトキシアクリジニル）プロピル）−１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝ナフタレンジイミドも知られている（Bull.Chem.Soc.Jpn.,72,327-337 (1999)）。
【０００８】
【化２】
0004267208.tif 000002
【０００９】
上記記載のインターカレータを用いると、ナフタレンジイミド部分がハイブリッド複合体の塩基対間に結合し、さらに、両端部の二つのアクリジン分子もそれぞれ塩基対間に結合する様式で二本鎖ＤＮＡ断片との複合体を形成するため、高い感度での二本鎖ＤＮＡ断片の検出が可能であると考えられる。
【００１０】
しかしながら、本発明者の検討によると、水溶液中でのハイブリッド複合体への挿入と脱離とは平衡関係にあるため、上記の蛍光インターカレータもまた、蛍光法による測定対象の水溶液中において相当割合にて脱離状態で存在し、この脱離状態の蛍光インターカレータもまた強い蛍光を示すため、充分なＳ／Ｎ比が達成できないこと（即ち、溶液中の蛍光インターカレータから発せられる蛍光の強度に体する蛍光インターカレータが挿入されたハイブリッド複合体部分から発せられる蛍光の強度の相違が充分高くないこと）が判明した。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、相補性を有する二本鎖核酸断片あるいは部分相補性を有する二本鎖核酸断片等の検出において、特に有効に用いることが可能な新規な水溶性型蛍光インターカレータ、および相補性を有する核酸断片の検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で表わされる水溶性の蛍光インターカレータにある：
【化３】
0004267208.tif 000003
［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結基であって、Ｘが、ナフタレンジイミド基、アントラセン基、アントラキノン基、フルオレン基、ビフェニレン基、フェナントレン基、およびピレン基からなる群より選ばれる環状基であるか、あるいは、Ｌａが、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基または１，４−ジ（ｎ−プロピレニル）−ピペラジニル基である］。
本発明の蛍光インターカレータは、その水溶性塩の状態にあってもよい。
【００１３】
一般式（Ｉ）において、Ｘには、−Ｌｂ−Ｚ［但し、Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基である］で表わされる置換基が結合していることが好ましい。すなわち、下記の一般式（Ｉａ）で現われる蛍光インターカレータが好ましい。
Ｆ−Ｌａ−Ｘ−Ｌｂ−Ｚ      −−−（Ｉａ）
【００１４】
本発明はまた、基板に固定されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる方法：
上記プローブ分子に、請求項１に記載の蛍光インターカレータそして水の存在下にて、相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を接触させることにより、プローブ分子と相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハイブリダイズさせて、上記蛍光インターカレータの少なくとも一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工程、そして
基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工程にもある。
【００１５】
さらに、本発明は、基板に固定されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる方法：
上記プローブ分子に、水の存在下で、相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を接触させることにより、プローブ分子と相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハイブリダイズさせて、基板上にハイブリッド構造体を形成させる工程、
請求項１に記載の蛍光インターカレータを水の存在下にて上記ハイブリッド構造体と接触させて、該蛍光インターカレータの少なくとも一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工程、そして
基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工程にもある。
【００１６】
本発明の水溶性蛍光インターカレータの好ましい態様は以下の通りである。
（１）Ｘが、縮合環を有する芳香族基である。
（２）Ｘが、ナフタレンジイミド基、アントラキノン基、もしくはアントラセン基である。
（３）Ｆが、芳香族基を含む蛍光性基である。
（４）Ｆが、アクリジン基、インドシアニン基、もしくはアザインドレニンシアニン基である。
（５）Ｚが、芳香族基を含まない非蛍光性基である。
（６）Ｚが、酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を含む非蛍光性基である。
（７）Ｚが、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ基、もしくはメルカプト基である。
【００１７】
（８）Ｌａ及び／又はＬｂが、芳香族基を含まない連結基である。
（９）Ｌａ及び／またはＬｂが、イミノ基、１，４−ピペラジニル基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−、及び／又は−ＳＯ2−を含む連結基である。
（１０）ＬａのＦからＸまでの最も近い連結路に沿って数えた主鎖の原子の数が２〜５０の範囲にある。
（１１）Ｌａ−Ｘ−Ｌｂの、ＦからＺまでの最も近い連結路に沿って数えた主鎖の原子の数が１０〜１００の範囲にある。
【００１８】
本発明のＤＮＡ断片などのオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための方法は、基板表面に一本鎖核酸断片を固定してなる核酸分析素子の該表面に、試料一本鎖核酸断片を、液相かつ本発明の水溶性型蛍光インターカレータの存在下で接触させる工程を含むことを特徴とする、該一本鎖核酸断片に対して該相補性を有する核酸断片の検出方法である。この方法で用いる核酸分析素子は、一般にＤＮＡチップと呼ばれる分析素子に代表されるものであって、「固定」とは、核酸断片の一方の末端部が基板表面に化学結合している状態のみならず、結合はしていないが末端部付近が静電気的な相互作用によって仮固定状態であるものも含む(Schena,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,10614-10619(1996)) 。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規な水溶性蛍光インターカレータ（以下、単に、蛍光インターカレータという）は、下記一般式（Ｉ）あるいは（Ｉａ）で示す化合物である。本発明の蛍光インターカレータは、下記式に示すように蛍光性基を一方の端部側にのみ有することを特徴とする。
【００２０】
【化４】
Ｆ  −  Ｌａ  −  Ｘ        −−−（Ｉ）
Ｆ−Ｌａ−Ｘ−Ｌｂ−Ｚ      −−−（Ｉａ）
【００２１】
［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結基であって、少なくともＸとＬａのいずれかは、該インターカレータに、水溶性を付与できるか、あるいは水溶性を付与できる基に変換し得る部位を有する。なお、Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基である］。
【００２２】
上記式中、Ｘは、本発明の蛍光インターカレータのコア部分であり、置換基を有していてもよい一価もしくは二価の環状基を表す。環状基としては、平面性を有する環状基であることが好ましく、窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基、２位、６位、１位もしくは５位（好ましくは、２位もしくは６位）に結合手を有するアントラセン基、アントラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノン基、２位もしくは６位に結合手を有するフルオレン基、２位ともしくは６位に結合手を有するビフェニレン基、２位もしくは７位に結合手を有するフェナントレン基、および２位もしくは７位に結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基であることが特に好ましい。置換基としては、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが好ましいが、水素原子であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが好ましい。
【００２３】
Ｘの具体例を下記に示す。＊印は、結合手の位置を示す。
【００２４】
【化５】
0004267208.tif 000004
【００２５】
Ｆは、蛍光性基（一つの結合手を有する蛍光発生基）を表す。蛍光発生基は、特定の波長、例えば、波長が４００乃至７００ｎｍの範囲（好ましくは、４００乃至５５０ｎｍの範囲）にある励起光の照射によって蛍光を発する基であることが好ましい。このような蛍光発生基となる化合物としては、インドシアニン系化合物、アザインドレニンシアニン系化合物、アクリジン系化合物、および溝結合型化合物（groove binder）を挙げることができる。ここで、溝結合型化合物とは、一般的に、その分子内に四級カチオン性基を有し、そのカチオン性基の存在によって、二本鎖核酸断片のリン酸エステル基のアニオンと強く相互作用する化合物をいう。溝結合型化合物は、そのコア部分（Ｘ）と蛍光性基（Ｆ）とが塩基対を介して積層した状態で二本鎖核酸断片に結合する。なお、「結合」とは、一定の速度で、蛍光インターカレータの二本鎖核酸断片の塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている状態をいう。
【００２６】
下記に、インドシアニン系化合物（ＩＩ）、アザインドレニンシアニン系化合物（ＩＩＩ）、アクリジン系化合物（ＩＶ）、および溝結合型化合物（Ｖ）の具体例をこの順に、一つの結合手を有する構造として示す。結合手の位置を＊印で示す。
【００２７】
【化６】
（ＩＩ）
0004267208.tif 000005
【００２８】
【化７】
（ＩＩＩ）
0004267208.tif 000006
【００２９】
【化８】
（ＩＩＩ）
0004267208.tif 000007
【００３０】
【化９】
（ＩＩＩ）
0004267208.tif 000008
【００３１】
【化１０】
（ＩＶ）
0004267208.tif 000009
【００３２】
【化１１】
（Ｖ）
0004267208.tif 000010
【００３３】
【化１２】
（Ｖ）
0004267208.tif 000011
【００３４】
【化１３】
（Ｖ）
0004267208.tif 000012
【００３５】
上記式中、Ａは、酸素原子あるいはイオウ原子を示す。
【００３６】
【化１４】
（Ｖ）
0004267208.tif 000013
【００３７】
ＬａおよびＬｂは、互いに独立に、蛍光インターカレータに可溶性を付与する基を含む二価の連結基であることが好ましく、その直鎖部分が炭素原子数が３乃至１０の炭化水素基に相当する長さを有する基を持つことが好ましい。ここで、直鎖部分とは、Ｌａに関しては、その一方の端部がコア部分（Ｘ）と縮合し、かつ他方の端部がＦと縮合する部分、Ｌｂに関しては、その一方の端部がコア部分（Ｘ）と縮合し、かつ他方の端部がＺと縮合する部分をいう。ＬａとＬｂは、蛍光インターカレータの調製の都合上、互いに同一の基であることが好ましい。なお、Ｌａは、二価の連結基中に、アルキレン基と、窒素原子を有する二価の基とを含む連結基であることがさらに好ましい。窒素原子を有する二価の基は、Ｌａの直鎖部分に含むことが好ましい。窒素原子を有する二価の基としては、イミノ基、１，４−ピペラジニル基、１，３−イミダゾリジニル基、ピロリジニル基、二価のピラゾリジニル基、あるいは二価のピペリジニル基であることが好ましく、イミノ基、あるいは１，４−ピペラジニル基であることが特に好ましい。
【００３８】
窒素原子は、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基であることが好ましい。イミノ基の置換基としては、メチル基であることが特に好ましい。従って、Ｌａ（もしくはＬｂ）は、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基であることが特に好ましい。
【００３９】
ＬａおよびＬｂは、イミノ基、チオエーテル基、カルボニルオキシ基、チオカルボニルオキシ基もしくはカルボニル基を含むことがより好ましく、イミノ基、チオエーテル基もしくはカルボニル基を含むことがさらに好ましく、イミノ基を含むことが特に好ましい。
【００４０】
Ｚは、非蛍光性基を表し、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ基およびメルカプト基からなる群より選ばれる基であることが好ましく、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基あるいはメルカプト基であることがより好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。
【００４１】
本発明の蛍光インターカレータは、一般的に、水性溶媒条件下で用いられるため、水溶性であることが必要とされる。インターカレータに水溶性を付与するために、前記記載のように、Ｘ、ＬａあるいはＬｂに可溶性を付与する基を含めることも好ましいが、インターカレータの塩として用いてもよい。塩としては、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等の無機塩との酸付加塩、あるいは酢酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸との付加塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の無機塩類、あるいはピリジン塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩等の有機塩類を挙げることができる。
【００４２】
本発明の蛍光インターカレータは、公知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）を利用して簡便に製造することができる。この方法では、蛍光性基が二つ導入されたものも得られるが、反応条件を変えて、あるいは反応生成物の分離精製を行って本発明の蛍光インターカレータのみを得ることができる。
【００４３】
本発明の蛍光インターカレータの核酸断片への結合と蛍光の発生との関係について説明する。
図１の（ａ）に、蛍光インターカレータの液相での積層状態を示す。蛍光インターカレータは、一定のイオン強度下では、二本鎖核酸断片もしくは一本鎖核酸断片が存在しない場合には、通常、蛍光物質（Ｆ）とコア部分（Ｘ）とが積層した状態をとる。しかし、本発明に係るすべての蛍光インターカレータがこの積層状態をとるか否かは明らかではなく、ＦとＸとの組み合わせに依存するものと推定される。図では、蛍光物質（Ｆ）およびコア部分（Ｘ）以外の基を省略して示す。蛍光物質（Ｆ）とコア部分（Ｘ）とが積層している場合には、液相に励起光を照射しても消光する現象が認められる。
【００４４】
一方、二本鎖核酸断片の存在下では、蛍光インターカレータは、図１の（ｂ）に示すように、蛍光性基（Ｆ）およびコア部分（Ｘ）が何れも塩基対間に結合する態様で、二本鎖核酸断片との複合体を形成する。このとき、蛍光性基（Ｆ）およびコア部分（Ｘ）は、それぞれ、塩基対間二つに一個の割合で結合する。形成された複合体に励起光を照射すると、蛍光インターカレータは蛍光を発する。また、（ｃ）に示すように、（Ｘ）のみが二本鎖核酸断片に結合する場合にも蛍光の発生が認められる。前記記載の蛍光インターカレータの一つである溝結合型化合物は、蛍光性基（Ｆ）の平面性が高いため、主に、図１の（ｂ）に示す態様で結合していると推定される。
【００４５】
核酸断片が存在する場合に発せられる蛍光量は、核酸断片がまったく存在しない場合（消光状態）に発せられる蛍光量（バックグランド値）に対して、蛍光強度の値で１５乃至５０倍の範囲にある。この蛍光強度の増強現象は、エンハンス効果と呼ばれる。
【００４６】
一本鎖核酸断片に対しても、蛍光インターカレータは複合体を形成し得る。しかし、一本鎖核酸断片の場合には、二本鎖核酸断片の場合と比べて、核酸断片からの解離速度が非常に速いために、複合体が形成されても即座に解離が起こる。
従って、一本鎖核酸断片は、蛍光インターカレータの存在下では、実質的にほとんど検出されないものと考える。実際に、一本鎖核酸断片と蛍光インターカレータとの複合体の解離速度は、二本鎖核酸断片との複合体のそれと比較して６０乃至１２０倍の範囲にある。二本鎖核酸断片と一本鎖核酸断片では、そのエンハンス効果に大きな差が認められるため、容易に二本鎖核酸断片の検出が可能である。
【００４７】
二本鎖核酸断片は、液相でかつ基板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片が固定（好ましくは、核酸断片がその一端で固定）されてなる核酸分析素子上でハイブリダイゼーションによって作製された二本鎖核酸断片であっても、ハイブリダイゼーション以外の方法によって入手した二本鎖核酸断片であってもよい。後者の場合には、真核生物の細胞や組織サンプルから単離されたものを用いることが好ましい。
【００４８】
上記記載のように、本発明の蛍光インターカレータは二本鎖核酸断片を特異的に認識するものである。従って、特定の核酸断片（Ａ）に対して相補性を有する核酸断片（Ｂ）を含む試料を付与すると、（Ａ）と（Ｂ）とのハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖核酸断片を簡便に検出することができる。すなわち、試料中の（Ｂ）の検出が可能となる。検出は、二本鎖核酸断片に結合した蛍光インターカレータの蛍光性基から発生する蛍光量を測定することによって行う。
【００４９】
ハイブリダイゼーションによって得られる二本鎖核酸断片は、非塩基対を部分的に有する二本鎖核酸断片であってもよい。すなわち、本発明の蛍光インターカレータによって、部分相補性核酸断片をも検出することができる。部分相補性核酸断片とは、核酸断片（Ｃ）に対して相補性を有する核酸断片を（Ｄ）としたときに、核酸断片（Ｄ）と塩基配列が部分的に同一性（即ち、部分的に非同一性）を示す核酸断片をいう。このような核酸断片としては、核酸断片（Ｄ）に関して塩基欠損、塩基挿入などの塩基配列の変化を有する核酸断片を挙げることができる。部分相補性核酸断片の検出方法は、特に遺伝子診断分野での未知の異常遺伝子の探索・同定に重要な手法である。詳細が特願平１１−１５９３３９号の明細書に記載されている。
【００５０】
以下、本発明の核酸断片の検出方法を、基板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片が固定（好ましくは、核酸断片がその一端で固定）されてなる分析素子を用いて、分析素子上の核酸断片と試料中の一本鎖の核酸断片とのハイブリダイゼーションによって得られる二本鎖核酸断片の検出を対象として説明する。
【００５１】
基板は、疎水性の板状の基板、あるいは親水性の低い板状の基板であることが好ましい。また、その表面に凹凸を有した平面性の低いものも好ましく用いることができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができ、上記記載の各種のプラスチック、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板が板状である場合には、その厚さは、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００５２】
核酸断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。
核酸断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。核酸断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００５３】
核酸断片の基板への固定方法は、核酸断片の種類および基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素,Vol.,43,No.13,2004-2011(1998)）。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いることができる。表面処理がされた基板上に、さらに、電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性の高分子等を含ませることも可能であり、このような処理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処理を行うことによって、疎水性、あるいは親水性に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進することができる。基板としては、表面処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを用いることが好ましい。
【００５４】
合成ヌクレオチドを固定する場合には、基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した基板に共有結合させる方法を用いることができる。官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。基板としては、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラスやシリコンの表面処理には、公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。
【００５５】
基板上に固定される核酸断片は、後述する検出対象の試料核酸断片であってもよい。以下、基板に固定される核酸断片を塩基配列が既知の核酸断片とし、核酸分析素子に接触させる核酸断片を試料核酸断片とする。
【００５６】
核酸断片の固定は、核酸断片の水性液を基板上の領域に点着して行うことが好ましい。点着後、所定の温度（好ましくは、室温）でそのまま数時間放置すると核酸断片の一端が基板上の領域に固定される。点着の条件は、使用する基板の種類、大きさ等によって異なる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、ＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッター装置を用いて行うことも好ましい。即ち、基板表面に区画された一つまたは複数の領域に、スポッター装置を用いて核酸断片の水性液をスポットすることも好ましい。スポッター装置を用いる場合には、点着される核酸断片は、基板表面に対して、１乃至１０-15モルの範囲にあることが好ましく、そして、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。
【００５７】
点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００５８】
上記の工程によって作製された分析素子の寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ分析素子で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ分析素子ではさらに長期間である。これらの分析素子は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する、試料核酸断片とのハイブリダーゼーションである。
【００５９】
核酸断片試料としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によりｃＤＮＡとすることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量としては、測定条件によって異なるが、数μｇ以下を用いることが好ましい。分析素子上の核酸断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。
【００６０】
ハイブリダイゼーションは、前記記載の本発明の蛍光インターカレータの存在下にて行うことが好ましい。蛍光インターカレータは、１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲にて用いることが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００６１】
蛍光量の測定は、ハイブリダイゼーション後の基板を乾燥させるか、あるいは水性溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよく、あるいは該基板を乾燥させないように基板をカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）法によって行ってもよい。
【００６２】
【実施例】
［製造例］
Ｎ−｛３−［４−（３−（６−クロロ−９−イミノ−２−メトキシアクリジニル）プロピル）−１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝−Ｎ’−｛３−［４−（３−アミノプロピル）−１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝ナフタレンジイミドの製造
【００６３】
【化１５】
0004267208.tif 000014
【００６４】
冷却還流管を付けた２００ｍＬのナス型フラスコに、ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸二水和物（１ｇ、３．７ミリモル）と、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２０ｍＬ、９．２ミリモル）とを入れ、ここに、ＴＨＦ（１５ｍＬ）を加えて溶解させた。８時間還流した後、室温まで冷却し、反応混合物をエーテル（１Ｌ）に注ぎ込んだ。生じた沈殿物をガラスフィルター（Ｇ４）で濾別した。過剰のＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンを除去するため、濾別した沈殿物をクロロホルムとメタノールとの混合溶媒に溶解させ、再度、エーテルに注ぎ込んだ。生成した結晶をガラスフィルターにて濾別し、減圧下で乾燥させた。
【００６５】
次いで、乾燥した上記結晶（０．５２ｇ、０．８ミリモル）および６，９−ジクロロ−２−メトキシアクリジン（０．５３ｇ、１．９ミリモル）を２００ｍＬのナス型フラスコに入れ、さらに、フェノール（１５ｍＬ）を加えてこれらの化合物を溶解させた。１００乃至１３０℃の温度範囲で８時間加熱し、その後室温まで冷却し、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残留物に、最小量のクロロホルムを加え、エーテル（１Ｌ）に注ぎ込んだ。生じた結晶をガラスフィルターで濾別し、減圧下で乾燥させた。得られた結晶をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物を得た（収率：３７％）。
【００６６】
［実施例］
（１）蛍光インターカレータの二本鎖ＤＮＡへの結合の検出
仔牛胸腺ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ、１００μＭ）および硫酸ナトリウム（５ｍＭ）を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、製造例１で得られた縫い込み型蛍光インターカレータ（２μＭ）を添加し、仔牛胸腺ＤＮＡと蛍光インターカレータとの複合体をリン酸緩衝液中で形成させ、この複合体を含むリン酸緩衝液の蛍光スペクトル（励起光の照射波長は、４３４ｎｍ）を４４０乃至６００ｎｍの波長の範囲にて測定した。また、仔牛胸腺ＤＮＡを入れない場合についても、上記と同様にしてその蛍光スペクトルを測定した。その結果、仔牛胸腺ＤＮＡを存在させた場合には、存在させない場合に比較して蛍光強度が大きくなることが分かる。即ち、波長４７５ｎｍにおいて、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合の蛍光強度は、仔牛胸腺ＤＮＡを含まない場合の蛍光強度に対して約３０倍の値を示した。
【００６７】
（２）蛍光インターカレータの仔牛胸腺ＤＮＡからの解離速度の測定
上記（１）で用いた仔牛胸腺ＤＮＡと蛍光インターカレータとの複合体を含むリン酸緩衝液に、最終濃度が０．５容量％となるようにＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液を添加した。添加後の該複合体を含むリン酸緩衝液について、吸光度の経時変化を測定した。この結果より、仔牛胸腺ＤＮＡからの蛍光インターカレータの解離速度を求めたところ、０．０２／秒であった。
【００６８】
［比較例１］
二本鎖の仔牛胸腺ＤＮＡの代わりに、仔牛胸腺ＤＮＡを９０℃にて２０分間加熱処理して得られた一本鎖ＤＮＡを用いる以外は実施例１と同様にして、蛍光インターカレータの一本鎖ＤＮＡへの結合の検出、および蛍光インターカレータの一本鎖ＤＮＡからの解離速度の測定を行った。その結果、一本鎖ＤＮＡを含む場合の蛍光強度は、含まない場合の蛍光強度の約１６倍であり、また、一本鎖ＤＮＡからの蛍光インターカレータの解離速度は、１．２／秒であった。
【００６９】
実施例１および比較例１より、一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡと比べて、蛍光インターカレータとの複合体を形成しにくく、また、一本鎖ＤＮＡとインターカレータとで形成された複合体から、インターカレータがより速く解離することが分かる。従って、本発明の蛍光インターカレータは、二本鎖ＤＮＡを特異的に検出することができる。
【００７０】
（２）蛍光物質の仔牛胸腺ＤＮＡからの解離速度の測定
仔牛胸腺ＤＮＡと蛍光物質との複合体を含むリン酸緩衝液を用いる以外は実施例１の（２）と同様にして蛍光強度の経時変化を測定した。この結果より、蛍光物質の仔牛胸腺ＤＮＡからの解離速度を求めたところ、１９．０／秒であった。
【００７１】
［比較例２］
製造例１で得られた型蛍光インターカレータの代わりに、下記式で表される９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（Molecular Probe,Inc.社製）を用いる以外は実施例１と同様にして、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合と含まない場合についてそれぞれ蛍光強度を求めたところ、前者は後者の約６倍の蛍光強度を示した。
【００７２】
【化１６】
0004267208.tif 000015
【００７３】
［比較例３］
製造例１で得られた型蛍光インターカレータの代わりに、前述のＮ，Ｎ−ビス｛３−［４−（３−（６−クロロ−９−イミノ−２−メトキシアクリジニル）プロピル）−１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝ナフタレンジイミド）を用いる以外は実施例１と同様にして、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合と含まない場合についてそれぞれ蛍光強度を求めたところ、前者は後者に対して高いＳ／Ｎ比をもたらすような充分相違する蛍光強度を示さなかった。
【００７４】
実施例および比較例より、本発明の蛍光インターカレータは、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジンに比較して、仔牛胸腺ＤＮＡと安定な複合体を形成することが分かる。このことは、本発明の蛍光インターカレータが、二本鎖ＤＮＡ断片を高感度に検出できるものであることを示す。
【００７５】
【発明の効果】
一本鎖核酸断片に対して一時的に複合体を形成したとしてもその複合体からの解離速度が大きく、一本鎖核酸断片とは安定な複合体を形成しにくいことから、二本鎖核酸断片のみを簡便に検出することができるものである。また、本発明の水溶性縫い込み型蛍光インターカレータは、二本鎖核酸断片に結合する性質を有する蛍光物質として公知の９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジンと比較して、二本鎖核酸断片に特異的に結合するばかりでなく、その結合安定性が大きいため、従来のインターカレータでは達成できなかった検出感度を有する。
【００７６】
さらに、蛍光物質で標識された核酸断片を使用するこれまでの蛍光法は、核酸断片に充分な量の蛍光物質を取り込むことが困難であるが（取り込み率が１％程度）、本発明の蛍光インターカレータは、二本鎖核酸断片の二つの塩基対間に一つの割合で結合するため、充分な量の蛍光物質を二本鎖核酸断片に導入することができる。従って、本発明の蛍光インターカレータを用いる検出方法では、相補性を有する試料核酸断片のみならず、部分的に相補性を有する試料核酸断片をも高感度で簡便に検出することができる。
【００７７】
本発明の蛍光インターカレータは、二つの蛍光物質を有する公知の蛍光インターカレータ（Bull.Chem.Soc.Jpn., 72,327-337 (1999)）と比較して、高い感度（Ｓ／Ｎ比）を有することが確認されており、相補性試料核酸断片および部分相補性試料核酸断片の検出に有効に用いることができる。また、本発明の蛍光インターカレータは二つの蛍光物質を有する蛍光インターカレータの製造時に同時に得られるものであるため、有効利用という観点からもメリットを有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の水溶性縫い込み型蛍光インターカレータの液相における積層状態を示す模式図である。
【図２】本発明の水溶性縫い込み型蛍光インターカレータと二本鎖核酸断片とで形成される複合体を示す模式図である。
【図１】
0004267208.tif 000017
【図２】
0004267208.tif 000018