(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察光学系の観察下で、操作対象物に対して操作を行うマニピュレータ装置であって：
前記操作対象物に対して操作を行う処置具と；
前記処置具に含まれ、前記操作対象物に接触または最も接近する先端部と；
前記先端部の変位に伴って発生する、照明光によって照明された前記先端部からの散乱光を含む光の変化を検出する検出手段と；
を備えるマニピュレータ装置。
【請求項２】
請求項１に記載のマニピュレータ装置であって、
前記観察光学系によって観察される領域のうち、前記先端部が存在し得る領域に対して前記照明光を選択的に照射する照明光学系を更に備える。
【請求項３】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記照明光は、前記観察光学系を介して前記先端部が存在し得る領域に照射される。
【請求項４】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記照明光学系は、前記操作対象物を保持する面にエバネッセント光を生じさせる。
【請求項５】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記先端部の存在し得る位置と前記観察光学系の光軸とを合わせる第１の位置合わせ手段を更に備え、
前記照明光学系は、暗視野照明光学系である。
【請求項６】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記先端部の存在し得る位置と前記観察光学系の光軸とを合わせる第２の位置合わせ手段と、前記照明光が照射された領域と光学的に共役な位置に設けられた開口部を有する部材を更に備え、
前記検出手段は、前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出する。
【請求項７】
請求項６に記載のマニピュレータ装置であって、
前記観察光学系は、複数の前記開口部を持つディスクを備えるとともに、前記ディスクを回転させることにより当該開口部を通じて前記先端部の存在し得る領域を走査して照明し、
前記検出手段は、前記ディスクに設けられた前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出する。
【請求項８】
請求項６に記載のマニピュレータ装置であって、
前記照明光学系は、レーザ光を出射するとともに、前記レーザ光を前記先端部の存在し得る領域で収束させた状態で走査し、
前記検出手段は、前記レーザ光を収束させた領域と光学的に共役な位置に設けられた前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出する。
【請求項９】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記照明光学系は、少なくとも、前記先端部の存在しうる第１の領域に前記照明光を照射する第１の照明モードと、前記第１の領域とは異なる前記操作対象物の存在しうる第２の領域に前記照明光を照射する第２の照明モードとをそれぞれ切り換える。
【請求項１０】
請求項２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記照明光学系は、少なくとも、前記先端部に前記照明光を照射する第１の照明モードと、前記第１の領域とは異なる前記操作対象物に前記照明光を照射する第２の照明モードとをそれぞれ切り換える。
【請求項１１】
請求項１に記載のマニピュレータ装置であって、
前記先端部は、前記観察光学系の光学的分解能よりも小さい。
【請求項１２】
請求項１に記載のマニピュレータ装置であって、
前記検出手段が検出した前記先端部の位置を記憶する位置記憶手段を更に備える。
【請求項１３】
請求項１２に記載のマニピュレータ装置であって、
前記操作対象物が保持された面と前記処置具との相対的な距離を調節する駆動手段を更に備え、
前記駆動手段は、前記検出手段が検出した結果に基づいて前記処置具の移動を制御する。
【請求項１４】
請求項１に記載のマニピュレータ装置であって、
前記処置具による操作は、前記操作対象物への前記処置具の挿入、前記操作対象物への物質の注入、前記操作対象物の切断、前記操作対象物の保持、前記操作対象物の移動、および前記操作対象物への物理的または電気的な刺激を含む。
【請求項１５】
請求項１に記載のマニピュレータ装置であって、
前記操作対象物は生体試料を含む。
【請求項１６】
請求項１５に記載のマニピュレータ装置であって、
前記生体試料は生細胞である。
【請求項１７】
観察光学系の観察下で操作対象物に対して操作を行う、マニピュレータ装置を用いた処置具操作方法であって：
前記操作対象物に対して操作を行う処置具に含まれ、前記操作対象物に接触または最も接近する先端部を、照明光によって照明する工程と；
前記先端部の変位に伴って発生する、前記照明光によって照明された前記先端部からの散乱光を含む光の変化を検出する工程と；
を備えるマニピュレータ装置を用いた処置具操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マニピュレータ装置、マニピュレータ、およびマニピュレータ装置を用いた処置具の操作方法に関する。
本願は、２００４年３月３０日に出願された特願２００４−１００８２０号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、対象物としての細胞等の生体試料に遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させるための手段としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法等の物理的手法によるもの、リン酸カルシウム法やリポフェクション法等の細胞のエンドサイトーシスを利用する手法によるものが知られている。
これらの方法のうち、下記の特許文献１に記載されているようなマイクロインジェクション法では、個々の細胞に直接ＤＮＡ溶液を注入するので、任意の細胞に選択的に遺伝子を導入することができる。この方法では、マニピュレータ装置の処置具の先端が太いと、生体試料に与えるダメージが大きくなり、操作後の生存率が良好とはいえず、導入後の実験に支障を来すことがある。
そこで、例えば下記の特許文献２では、処置具として、細胞への挿入時にダメージを与えない極細径の針状部を使用し、遺伝子または遺伝子発現に関与する物質をこの針状部に固定化し、その状態で細胞への挿入及び保持を行うことで細胞への遺伝子導入を行っている。
【特許文献１】特開平０６−１０９９７９号公報
【特許文献２】特開２００３−３２５１６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一般に、上記のような遺伝子導入を行うためのマニピュレータ装置では、対象となる細胞の選択を光学顕微鏡下で行う。同様に、細胞に対して処置を行う処置具の先端もその光学顕微鏡で検出し、対象となる細胞との相対的な位置関係（面内位置および高さ）を制御する。
ここで、上記の特許文献２に記載されているように、細胞へのダメージを軽減するために処置具の先端の径を細くすると、処置具の先端を光学顕微鏡で検出することが困難になる。そこで、特許文献２では、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を付加し、処置具と細胞との距離の測定を、処置具であるカンチレバーと細胞との間に作用する原子間力を測定することで行っている。そのため、高価で構造や操作が複雑な原子間力顕微鏡が必要となる欠点がある。
また、このような構成であっても、細胞と処置具先端との位置合わせを正確に行うことができない。【０００４】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、安価でかつ簡単な構成で、マニピュレータの処置具の先端部の位置を正確に求め、同先端部の位置制御を良好に行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、観察光学系の観察下で、操作対象物に対して操作を行うマニピュレータ装置であって：前記操作対象物に対して操作を行う処置具と；前記処置具に含まれ、前記操作対象物に接触または最も接近する先端部と；前記先端部の変位に伴って発生する、照明光によって照明された前記先端部からの散乱光を含む光の変化を検出する検出手段と；を備えるマニピュレータ装置を提供する。【０００６】
上記のマニピュレータ装置によれば、非常に微細であるために観察の困難な処置具であっても、処置具の先端部からの散乱光を検出し、それを利用するだけで、処置具が物体に触れることがなく、処置具を破損する虞もなしにその先端部の位置を正確に求めることができる。【０００７】
上記のマニピュレータ装置は、前記観察光学系によって観察される領域のうち、前記先端部が存在し得る領域に対して前記照明光を選択的に照射する照明光学系を更に備えることが好ましい。【０００８】
上記のマニピュレータ装置によれば、位置決めを行いたい所定の領域に処置具先端部が達したときだけ、検出手段が散乱光の像の変化を検出できるので、処置具の先端部の位置を検出する精度を向上させることができる。【０００９】
上記のマニピュレータ装置において、前記照明光は、前記観察光学系を介して前記先端部が存在し得る領域に照射されることが好ましい。【００１０】
上記のマニピュレータ装置において、前記照明光学系は、前記操作対象物を保持する面にエバネッセント光を生じさせることが好ましい。【００１１】
上記のマニピュレータ装置によれば、操作対象物を保持した面に対し、５０〜１５０ｎｍという限りなく近接した位置まで処置具の先端部を近接させることができ、また、ほぼ処置具の先端部のみが検出されるので、処置具の先端部の位置を検出す精度を極めて向上させることができる。【００１２】
上記のマニピュレータ装置は、前記先端部の存在し得る位置と前記観察光学系の光軸とを合わせる第１の位置合わせ手段を更に備え、前記照明光学系は、暗視野照明光学系であることが好ましい。【００１３】
上記のマニピュレータ装置によれば、暗視野観察光学系を用い、処置具の先端部を移動させることにより、照明光学系からの照明光を直接検出することなく、対物レンズから離れた位置にある処置具でも、その先端部からの散乱光の像を簡単な顕微鏡の構成で選択的に検出することができる。【００１４】
上記のマニピュレータ装置は、前記先端部の存在し得る位置と前記観察光学系の光軸とを合わせる第２の位置合わせ手段と、前記照明光が照射された領域と光学的に共役な位置に設けられた開口部を有する部材を更に備え、前記検出手段は、前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出することが好ましい。
【００１５】
上記のマニピュレータ装置によれば、共焦点光学系を用いたうえで処置具の先端部を移動させることにより、照明光学系で照明された部分のうち、開口部と光学的に共役な位置に処置具の先端部が達したときのみ、散乱光の像を検出手段上で結像させることができるので、処置具の先端部からの散乱光を選択的に捉えることができ、処置具の先端部の位置を検出する精度を極めて向上させることができる。【００１６】
上記のマニピュレータ装置は、前記観察光学系は、複数の前記開口部を持つディスクを備えるとともに、前記ディスクを回転させることにより当該開口部を通じて前記先端部の存在し得る領域を走査して照明し、前記検出手段は、前記ディスクに設けられた前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出することが好ましい。【００１７】
上記のマニピュレータ装置によれば、ディスクを回転させることにより、照明光を観察視野内で走査させ、観察光学系の焦点が合った部分に達した処置具の先端部からの散乱光を、検出手段によって確実に検出することができる。【００１８】
上記のマニピュレータ装置は、前記照明光学系は、レーザ光を出射するとともに、前記レーザ光を前記先端部の存在し得る領域で収束させた状態で走査し、前記検出手段は、前記レーザ光を収束させた領域と光学的に共役な位置に設けられた前記開口部を通過した前記散乱光を含む光の変化を検出することが好ましい。【００１９】
上記のマニピュレータ装置によれば、レーザ光を観察視野内で走査させることにより、開口部と光学的に共役な位置に達した処置具の先端部からの散乱光を検出手段で確実に検出することができる。【００２０】
上記のマニピュレータ装置は、前記照明光学系が、少なくとも、前記先端部の存在しうる第１の領域に前記照明光を照射する第１の照明モードと、前記第１の領域とは異なる前記操作対象物の存在しうる第２の領域に前記照明光を照射する第２の照明モードとをそれぞれ切り換えることが好ましい。
【００２１】
上記のマニピュレータ装置によれば、処置具の先端部の粗い位置検出と精密な位置検出、処置具の先端部への照明と他の部分への照明等をそれぞれ切り替え、種々の操作を行うことができる。【００２２】
上記のマニピュレータ装置は、前記照明光学系が、少なくとも、前記先端部に前記照明光を照射する第１の照明モードと、前記操作対象物に前記照明光を照射する第２の照明モードとをそれぞれ切り換えることが好ましい。
【００２３】
上記のマニピュレータ装置によれば、処置具の先端部と操作対象物との正確な位置を検出することができる。【００２４】
上記のマニピュレータ装置は、前記先端部が、前記観察光学系の光学的分解能よりも小さいことが好ましい。【００２５】
上記のマニピュレータ装置によれば、極めて微細な処置具を用いれば、操作対象物へのダメージが最小限に抑制でき、このような処置具であっても、散乱光を検出する方法であれば確実にその先端部の位置を検出することができる。【００２６】
上記のマニピュレータ装置は、前記検出手段が検出した前記先端部の位置を記憶する位置記憶手段を更に備えることが好ましい。【００２７】
上記のマニピュレータ装置によれば、処置具の先端部の位置を、例えば基準位置として記憶すれば、一度の位置検出で確実に処置具の先端部の位置制御を行うことができる。【００２８】
上記のマニピュレータ装置は、前記操作対象物が保持された面と前記処置具との相対的な距離を調節する駆動手段を更に備え、前記駆動手段は、前記検出手段が検出した結果に基づいて前記処置具の移動を制御することが好ましい。【００２９】
上記のマニピュレータ装置によれば、検出手段が検出した処置具の先端部の位置を基準位置として用いるなどして、処置具を破損することなく、その位置調節や操作対象物への操作を行うことができる。【００３０】
上記のマニピュレータ装置は、前記処置具による操作が、前記操作対象物への前記処置具の挿入、前記操作対象物への物質の注入、前記操作対象物の切断、前記操作対象物の保持、および前記操作対象物への物理的または電気的な刺激を含むことが好ましい。【００３１】
上記のマニピュレータ装置において、操作とは、処置具の先端部分が対象物に触れる、触れない、のいずれの場合をも含め、種々のマニピュレーションを指す。【００３２】
上記のマニピュレータ装置において、前記操作対象物は生体試料を含むことが好ましい。また、前記生体試料は生細胞であることが好ましい。【００３４】
本発明は、観察光学系の観察下で操作対象物に対して操作を行う、マニピュレータ装置を用いた処置具操作方法であって：前記操作対象物に対して操作を行う処置具に含まれ、前記操作対象物に接触または最も接近する先端部を、照明光によって照明する工程と；前記先端部の変位に伴って発生する、前記照明光によって照明された前記先端部からの散乱光を含む光の変化を検出する工程と；を備えるマニピュレータ装置を用いた処置具操作方法を提供する。【００３５】
エバネッセント光を利用した微小領域の照明、暗視野照明光学系、共焦点光学系等の技術は従来から存在するが、これらの技術を使って非常に微細な針先を検出するという技術思想は、過去には存在しなかった。しかしながら、上記のマニピュレータ装置によれば、観察の困難な微細な処置具であっても、処置具先端からの散乱光を検出し、それを利用するだけで、処置具が物体に触れることなく、処置具を破損する虞なしにその先端の位置を正確に求められる。【００３６】
本発明の観察光学系によって観察することができる所定の領域に対し、照明光を選択的に照射する照明光学系としては、操作対象物を保持する面を含み、かつ観察に必要な光を透過する基板と操作対象物の媒質との界面において全反射する全反射照明光学系を適用することができる。【００３７】
この全反射照明光学系によれば、照明光は観察に必要な光を透過する基板と操作対象物の媒質の界面において全反射する。このとき、操作対象物の媒質中に、光軸方向に進行するエバネッセント波が発生する。このエバネッセント波は、基板と媒質の界面から５０〜１５０ｎｍ程度の領域にのみ存在するので、処置具を下降させてその先端部がこの領域に入ると、先端部で反射したエバネッセント波が、観察光学系を介して検出器上に結像し、検出される。エバネッセント波が存在する領域、すなわち全反射照明光学系によって照明される領域は５０〜１５０ｎｍ程度の領域であり、処置具の先端部以外は照明されないので、その先端部のみをコントラスト良く検出することができる。【００３８】
照明光学系としては、暗視野照明光学系を適用することもできる。暗視野照明光学系では、照明光は対物レンズの外側から対物レンズの開口数よりも大きな角度で照明されるので、水平面で反射した光は、対物レンズには直接は入射しない。しかしながら、処置具の先端部のように微小なものが照明領域に存在すれば、反射光の一部は対物レンズに入射するので、処置具の先端部を検出することができる。【００３９】
また、照明光学系および観察光学系として、試料の一点を照明し、結像位置での一点のみで反射光強度を検出する共焦点光学系を適用することもできる。これらを用いると、試料に焦点の合った領域だけが照明され、結像するので、この領域に処置具の先端部があるときのみ、その先端部を検出できる。共焦点光学系としては、ディスク走査型、レーザ走査型のいずれをも適用可能である。【００４０】
さらに、本発明のマニピュレータ装置においては、操作対象物あるいは操作対象物が保持された面と処置具との相対的な距離を調節する駆動手段を備え、この駆動手段が、前記観察光学系を通じて選択的に検出する検出手段によって検出された処置具の像に基づいて、操作対象物が保持された面と処置具との相対的な距離を調節するようにしてもよい。【００４１】
このような構成では、操作対象物が保持された面を照明するモードと、処置具を照明するモードが切り替え可能である。そして、操作対象物あるいは操作対象物が保持された面と処置具先端とを、それぞれ最適な照明方法で照明することによって容易に検出することができる。これにより、処置具と操作対象物の相対的な距離を調整することが可能となる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、処置具の先端部の像を良好に検出することが可能となる。そのため、処置具が通常の光学顕微鏡では捉えることができないほど微細なものであっても、処置具の先端部を基板に接触・破損させることなく、操作対象物に対して所定の操作を安全に行うことができる。したがって、操作対象物への挿入深さを正確に管理して、操作対象物に対する操作を非常に効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のマニピュレータ装置の第１の実施の形態を示す図であって、マニピュレータ装置の概略構成を示す図である。
【図２】倒立顕微鏡の全反射照明光学系の概略を示す側断面図である。
【図３】洗浄ユニットの構成を示す断面図である。
【図４】溶液台の構成を示す側面図である。
【図５】本発明の実施の形態におけるマニピュレータ装置の作業手順を示すフローチャートである。
【図６】倒立顕微鏡における全反射状態の生体試料と針との関係を示す断面図である。
【図７】本発明のマニピュレータ装置の第２の実施の形態を示す図であって、マニピュレータ装置に備わる倒立顕微鏡の暗視野照明光学系の概略を示す側断面図である。
【図８】本発明のマニピュレータ装置の第３の実施の形態を示す図であって、マニピュレータ装置に備わる倒立顕微鏡の共焦点光学系の概略を示す側断面図である。
【図９】共焦点光学系に用いるニポーディスクの模式図である。
【図１０】上記第３の実施の形態の変形例を示す図であって、正立顕微鏡におけるレーザ走査型の共焦点光学系の模式図である。
【符号の説明】
【００４４】
１，１ａ，１ｂ，１ｃ：マニピュレータ装置、２：倒立顕微鏡、２ａ：全反射照明光学系、３：ＸＹステージ、３ａ：駆動手段、４：試料容器、５：マニピュレータ本体、６：主架台、７：対物レンズ、８：接眼レンズ、９：光源、１０：撮像手段、１１：画像処理手段、１２：制御部、１３：保持装置、１４：針、１４ａ：先端部、１４ｂ：基部、１４ｃ：電源コード、１５：位置決め手段、１６：洗浄ユニット、１７：溶液台、１７ａ：導入物質溶液、２１：退避ステージ、２１ａ：保持部材、２２：Ｚステージ、２４，２５：駆動手段、２６：支持部材、２９：蛍光ランプ、３０：楔プリズム、３１：偏心スリット、３１ａ：調整手段、３２：励起フィルタ、３３：ミラー、３４：レンズ、３５：ダイクロイックミラー、４１：カバー、４１ａ：上面部、４２：開口部、４３：超音波洗浄槽、４４：超音波振動子、４５：配線コード、４６：電極、４７：配線コード、５０：ランプ、５１：穴あきミラー、５２：暗視野対物レンズ、５２ａ：照明光導光部、５３：結像レンズ、５４：ビームスプリッタ、５５：ニポーディスク、５６：回転モータ、６０：レーザ光源、６１：ビームスプリッタ、６２：２次元光走査機構、６３：瞳投影レンズ、６４：集光レンズ、６５：共焦点ピンホール、６６：光検出器、６７：駆動手段（第１の位置合わせ手段）、６８：駆動手段（第２の位置合わせ手段）
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明に係る第１の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
図１に、本発明に係るマニピュレータ装置の構成例を示す。このマニピュレータ装置１は、例えば、培地Ｃａ中に存在する操作対象物である細胞（生体試料）Ｃの核内に適当な遺伝子（導入物質）を導入し、遺伝子にコードされているタンパク質を発現させるものである（図６参照）。【００４６】
マニピュレータ装置１は、倒立顕微鏡（観察光学系）２と、マニピュレータ本体５とを主な構成要素としている。倒立顕微鏡２は、細胞Ｃ等を拡大して観察するために使用される。マニピュレータ本体５は、倒立顕微鏡２のＸＹステージ３上に載置される試料容器４に培地Ｃａを介して保持される細胞Ｃに対し、例えば針１４等の処置具を使って導入物質を導入する。ここで、試料容器４は、半透明材または透明材からなり、例えばガラスにより作られる。【００４７】
倒立顕微鏡２は、試料容器４等を設置して水平２軸方向（前後及び左右）に移動可能なＸＹステージ３と、このＸＹステージ３を支持する主架台６と、試料容器４内の生体試料を下方から観察するための対物レンズ７（図２参照）と、対物レンズ７で観察された画像を観察する接眼レンズ８と、主架台６の上部に設けられた光源９とを備えている。倒立顕微鏡２には、対物レンズ７で観察された生体試料の像を撮影するためのレンズ及びＣＣＤカメラからなる撮像手段１０が設けられている。この撮像手段１０は、画像処理手段（検出手段）１１を介して制御部１２に接続されている。また、ＸＹステージ３には、制御部１２に接続された駆動手段３ａが設けられている。この駆動手段３ａが制御部１２からの信号に従って駆動されると、ＸＹステージ３が前後または左右方向へ移動する。【００４８】
マニピュレータ本体５は、生体試料の細胞Ｃ等に導入する導入物質を保持する保持装置１３を備えている。保持装置１３は、生体試料の細胞Ｃ等に挿入される導入手段である針（処置具）１４と、針１４の位置を制御する位置決め手段１５と、針１４の先端部１４ａを洗浄して活性化させる洗浄ユニット１６と、針１４に吸着保持させる導入物質が収容される溶液台１７とを備えている。【００４９】
針１４は、鋭利な先端部１４ａと、先端部１４ａよりも大径な基部１４ｂとを有している。針１４の先端部１４ａは、倒立顕微鏡２の光学的分解能よりも小さい。また、針１４は、基部１４ｂを位置決め手段１５に保持されている。この実施の形態において、針１４は、少なくとも表面が白金等の導電性材料からなり、電源コード１４ｃを介して不図示の電源に接続されている。位置決め手段１５は、針１４の基部１４ｂを保持する退避ステージ２１と、退避ステージ２１をＺ方向（上下方向）に移動可能に支持するＺステージ２２と、前記ＸＹステージ３とを備えている。なお、ＸＹステージ３は、倒立顕微鏡２と兼用されている。【００５０】
退避ステージ２１は、針１４の基部１４ｂを保持する保持部材２１ａを有している。この保持部材２１ａは、駆動手段２４に接続されている。この駆動手段２４が制御部１２からの信号に従って駆動されると、保持部材２１ａが水平方向へ移動する。Ｚステージ２２には、駆動手段２５が設けられている。この駆動手段２５が制御部１２からの信号に従って駆動されると、Ｚステージ２２が上下方向へ移動する。つまり、Ｚステージ２２及び駆動手段２５は、保持手段２１ａ及び退避ステージ２１を介して針１４を昇降させる昇降手段を構成している。
なお、Ｚステージ２２は、支持部材２６を介して主架台６に取り付けられている。【００５１】
図２に示すように、倒立顕微鏡２の全反射照明光学系２ａは、蛍光観察を行う落射照明系に、楔プリズム３０と偏心スリット３１とが付加されたものである。全反射照明光学系２ａは、倒立顕微鏡２によって観察される領域のうち、針１４の先端部１４ａが存在し得る領域に対して照明光を選択的に照射し、細胞Ｃを保持する試料容器４の底面にエバネッセント光を生じさせる。この全反射照明光学系２ａにおいて、蛍光ランプ２９から出た光は、励起フィルタ３２、楔プリズム３０、偏心スリット３１を順に通過する。そして、ミラー３３で反射してレンズ３４を通過し、さらにダイクロイックミラー３５で反射し、専用の対物レンズ７内を経て試料容器４の裏面側（下面側）に入射する。【００５２】
ここで、偏心スリット３１の位置は、調整手段３１ａによって変更することが可能である。この偏心スリット３１の位置を変更することにより、少なくとも臨界角近傍における照明光の対物レンズ７への入射角、ひいては試料容器４の裏面への入射角を自由に設定することが可能である。なお、本実施の形態の照明光学系は、励起フィルタ３２、ダイクロイックミラー３５の各分光特性に依ることなく、照明を行うことが可能である。【００５３】
図３にも示すように、洗浄ユニット１６は、防塵のためのカバー４１を有している。カバー４１は、略方形状で内部に空間を有している。カバー４１の上面部４１ａの略中央には、針１４を挿入する開口部４２が設けられている。この開口部４２の径は、防塵のために、針１４を必要な量だけ挿入することができる最小限の大きさになっている。カバー４１内には、超音波洗浄槽４３と、超音波振動子４４とが配置されている。超音波洗浄槽４３には、針１４の先端部１４ａを十分に浸漬させられる程度の媒質（例えば、純水、中性洗剤、アルカリ性溶液）が保持されている。超音波振動子４４は、超音波洗浄槽４３の下部に取り付けられている。超音波振動子４４には、配線コード４５が接続され、配線コード４５は、カバー４１を貫通して不図示の電源に接続されている。
なお、洗浄液として洗剤や薬剤を使用する場合には、複数の超音波洗浄槽４３を用いて、中和及びすすぎを十分に行う。【００５４】
図４にも示すように、溶液台１７には、複数の凹部が、所定間隔をあけて設けられている。これら複数の凹部ごとに、例えば種類の異なる複数のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）溶液等の導入物質溶液１７ａが分注される。溶液台１７には、電極４６が埋め込まれている。この電極４６は配線コード４７を介して不図示の電源に接続されている。
なお、溶液１７ａを分注する凹部を、溶液台１７に設ける代わりに、溶液台１７の上面を撥水加工するとともに複数の親水領域を形成しておき、この親水領域に溶液１７ａを保持させるようにしてもよい。【００５５】
このようなマニピュレータ装置１を用いて、針１４の先端部１４ａに導入物質を保持させ、生体試料に導入物質を導入する手順を、図５に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、図１に示す位置決め手段１５を移動させて、針１４を洗浄ユニット１６の開口部４２に挿入し、図３に仮想線で示すように、針１４の先端部１４ａを超音波洗浄槽４３内の媒質に浸漬させる。この状態で、電源から駆動配線４５を介して超音波振動子４４に電力を供給し、超音波振動子４４を振動させる。超音波洗浄槽４３内の媒質には、超音波が印加され、針１４の先端部１４ａの表面が洗浄される。例えば、針１４の先端部１４ａの表面が有機物等で汚染されていた場合には、その有機物が除去される。これにより、針１４の先端部１４ａの表面が清浄化され、他の元素等の吸着を阻害する物質がない状態、つまり活性状態になる（Ｓ１）。【００５６】
超音波洗浄によって針１４の先端部１４ａに活性を付与したら、位置決め手段１５を作動させ、針１４の先端部１４ａを、容器台１７の所定の凹部に注入された導入物質溶液１７ａの液滴の所定箇所に内に挿入し、浸漬させる。このとき、針１４と電極４６との間に配線コード４７を介して所定の電圧を所定時間付与する。導入物質が一般的にマイナス電荷を帯びることが多いＤＮＡである場合には、針１４を陽極として針１４の先端部１４ａの表面にＤＮＡを吸着させる（Ｓ２）。
次に、照明モードを、操作対象物の観察・位置データの決定に適したものに設定する（Ｓ３）。【００５７】
操作対象物が生体試料である細胞Ｃの場合には、照明モードとして、光源９による透過明視野照明や位相差照明が良く用いられる。試料容器４内の生体試料を、光源９による明視野照明あるいは位相差照明を用いて顕微鏡観察し、導入対象となる細胞Ｃを選択する。必要に応じて、選択した細胞Ｃの位置データを制御部１２の記憶部（位置記憶手段）１２ａに記憶させる（Ｓ４）。【００５８】
次いで、顕微鏡視野内の導入対象となる細胞Ｃの近傍で、細胞Ｃが接着しておらず試料容器４の底面が露出している箇所に、駆動手段２５等を介して針１４の先端部１４ａを下降させ、安全に座標管理ができる範囲で十分に接近させる（Ｓ５）。安全に座標管理する手段としては、例えば、顕微鏡で十分観察可能な針１４の根元側の部位と試料容器４の底面とのフォーカス位置における対物レンズ７の座標に基づき、試料容器４の底面から１０〜数十μｍ程度の高さまで針１４の先端部１４ａを下降させる方法が挙げられる。【００５９】
次に照明モードを、蛍光ランプ２９を用いる試料容器４の底面への落射方向からの全反射照明に切り替える（Ｓ６）。全反射照明は、処置具の位置検出に適している。また、調整手段３１ａを使って偏心スリット３１の位置調整を行い、試料容器４の底面の上方に、エバネッセント光の他に若干の透過光が混入する、いわゆる疑似エバネッセント光を照射させる状態とする。これと同時に、顕微鏡のフォーカスが試料容器４の底面から上方５〜１０μｍに位置するように調整する。そして、例えば、１回の送りにつき２μｍ程度の微小送りで針１４を下降させ、針１４の先端部１４ａで反射した疑似エバネッセント光の散乱光が画像処理手段１１によって検出され始めた時点で、針１４の下降を停止させる。これで、粗動アプローチが完了する。【００６０】
次に、前述と同様、調整手段３１ａを使って偏心スリット３１の位置調整を行い、試料容器４の底面の上方に、エバネッセント光のみを照射させる状態とする。これと同時に、顕微鏡のフォーカスが試料容器４の底面に一致するかもしくは底面の上方約２００ｎｍ以内に位置するように調整する。そして、例えば、１回の送りにつき１００ｎｍ程度の極微小送りで針１４を下降させ、針１４の先端部１４ａで反射したエバネッセント光の散乱光が画像処理手段１１によって検出され始めた時点で（すなわち、散乱光が光っていない状態から光った状態に変化した時点で）、針１４の下降を停止させる。これで、微動アプローチが完了する。このときの針１４の高さを基準高さとする。すなわち、先端部１４ａが試料容器４の底面に接触する直前の極近接位置にあるときの針１４の位置を、基準高さとし、この値をデータの形で制御部１２内の記憶部１２ａに記憶させる（Ｓ７）。
なお、針１４の先端部１４ａで反射したエバネッセント光の散乱光が画像処理手段１１によって検出されるとき、針１４の先端部１４ａの高さ位置データの他に、針１４の先端部１４ａの水平面に沿ったＸＹ方向の位置データも検出することができる。そこで、検出されたＸＹ方向の位置データを、正確な針１４の先端部１４ａの位置として、制御部１２内の記憶部１２ａに記憶させる。【００６１】
このように、照明光学系を、針１４の先端部（第１の領域）１４ａを検出するための第1の照明モードに設定し、この状態で先端部１４ａに焦点を合わせて針１４の先端部１４ａを検出し、先端部１４ａを検出したら、照明光学系を、操作する対象物である細胞Ｃ（第２の領域）に照明光を照射するための第２の照明モードに設定し、細胞の位置を検出する。このように、照明モードを、処置具である針１４の先端部１４ａの検出に適したモード、または操作対象物である細胞Ｃの検出に適したモードに切り替えて、針１４の先端部１４ａの位置と細胞の位置とを検出する。
なお、図６において、Ｘは全反射照明光学系の光路、Ｙは対物レンズ７と試料容器の底面との間に介在されるイマージョンオイル、Ｚはエバネッセント照明領域を示す。【００６２】
次に、針１４を駆動手段２５によって上方へ一旦退避させた後、導入対象の細胞Ｃの核等の所定位置に針１４の先端部１４ａが位置するように、駆動手段３ａを介してＸＹステージ３を移動させる。そして、この状態で駆動手段２５を駆動させ、針１４を下降させる。この操作は、制御部１２に入力したデータに基づき、制御部１２から発せられる指令信号によって自動的に行っても良い。そして、針１４の先端部１４ａを導入対象の細胞Ｃの所定位置に挿入する。このとき、針１４の先端部１４ａの到達高さ、すなわち侵入限界高さを、Ｓ７において設定した基準高さから所定距離（例えば、１μｍ）上方に設定することにより、針１４の先端部１４ａが試料容器４の底面に衝突させることないので、針１４の先端部１４ａを細胞Ｃ内の目標位置まで確実に侵入させることができる（Ｓ８）。
なお、制御部１２に入力するデータは、前述の記憶した針１４の先端位置データであっても良く、このときの細胞Ｃの所定位置及び針１４の先端部１４ａとの相対位置を求め、両者を一致させる方法を用いて、針１４の先端部１４ａを導入対象の細胞Ｃの所定位置に挿入してもよい。【００６３】
上記針１４の先端部１４ａの細胞Ｃ内への挿入後、駆動手段２５を駆動させて針１４を上昇させ、細胞Ｃから退避させる。以上が、対象となる細胞Ｃへの物質を導入工程である。これにより、針１４に吸着させていたＤＮＡが細胞Ｃの核内で、針１４から脱落することにより、遺伝子導入が行われる。【００６４】
さらに、異なる細胞Ｃへの導入を行う際には、針１４を洗浄ユニット１６に挿入し、針１４に残留している導入物質及び細胞Ｃ内で付着した物質を洗浄除去する。以降は、細胞を選び終え、予定している全ての箇所への導入が終了するまで、洗浄ユニット１６で針１４を洗浄し、所定の導入物質を吸着させてから、針１４を生体試料の所定位置に挿入してその細胞Ｃに対する導入物質の導入工程を繰り返す（Ｓ９）。
なお、遺伝子を導入する手順は、以上で説明した順序に限定されるものでなく、遺伝子導入の目的に合致し、必要な精度を保つ範囲で適宜変更しても良い。例えば、導入針の位置検出（Ｓ６，Ｓ７）の後に細胞の位置検出（Ｓ３，Ｓ４）を行っても良いし、針先の洗浄（Ｓ１）やＤＮＡの吸着（Ｓ２）を、細胞や針先の検出（Ｓ３〜Ｓ７）の後、遺伝子導入（Ｓ８）の直前で行っても良い。また、１つの試料容器４内で複数回導入を行い、かつ導入毎に毎回針を交換せずに連続して使用する場合には、針先位置の検出（Ｓ６，Ｓ７）は最初に1回だけ行うようにしても良い。【００６５】
この実施の形態では、倒立顕微鏡２による落射方向の全反射照明を用いた観察下で、駆動手段２５及びＺステージ２２からなる昇降手段により針１４を漸次下降させる。その際、針１４の先端部１４ａがエバネッセント照明領域Ｚに至ると、エバネッセント光で照明される。このとき、針の先端部１４ａから発せられる散乱光が画像処理手段１１によって検出されるので、このときの針１４の高さ位置を基準高さとする。そして、この基準高さを基に、針１４を細胞Ｃ内に挿入するときの針１４の高さを設定するので、針１４の先端部１４ａが試料容器４の底面に接触することなく、針１４を細胞Ｃに安全に挿入させることができる。また、針１４の先端１４ａは光学顕微鏡では捉えることができないほど微細である場合であっても、試料容器４の底面に衝突して折損するのを未然に防止することができる。【００６６】
また、駆動手段２４を用いた針１４の退避・進出操作、駆動手段２５を用いた針１４の昇降操作、駆動手段３ａを用いたＸＹステージ３の移動操作、および倒立顕微鏡２の照明切替操作を、制御部１２からの指令信号に基づいて自動的に行っても良いし、手動で行っても良い。上記の操作を手動で行う場合には、基準高さを求めた後の針１４の下降位置が、設定された細胞Ｃの侵入限界高さに達した後は、制御部１２からの指令信号に基づき、それ以上の針１４の下降を規制するともに、制御部１２に接続された図示せぬ表示手段に、針１４の下降時の位置が所定高さに達したことを表示するようにしても良い。
なお、本発明は前記した実施の形態に限られることなく、必要に応じて適宜変更可能である。【００６７】
例えば、前述の実施の形態では、本発明のマニピュレータ装置１を及び該装置を用いた処置具の操作方法を、針１４による刺入・注入を利用した遺伝子導入の場合を例に挙げて説明したが、これに限られることなく、針１４の代わりに他の処置具を用い、移動、切断、保持、物理的または電気的な刺激等の操作を行っても良い。また、操作対象としては細胞Ｃに限られることなく、細菌等他の生体試料や、半導体やナノチューブ等の生体試料以外のワークを対象として前述の操作を行っても良い。【００６８】
また、前述の実施の形態では、針１４の外周面に電気を流して電気的に導入物質を吸着させているが、これに限られることなく、化学的に吸着させてもよい。また、十分に微細であれば、ノズル状として、その先端から導入物質溶液を直接細胞Ｃ等へ吐出するようにしてもよい。【００６９】
前述の実施の形態では、超音波を利用して針１４の洗浄を行っているが、これに限られることなく、目的や状況に応じて、プラズマや紫外線、あるいはオゾン等を利用したドライ洗浄を用いても良い。また、針１４を洗浄して再利用する代わりに、針１４を予め複数用意しておき、それら針を持ち替えて所定の操作を行っても良い。【００７０】
前述の実施の形態では、落射方向の全反射照明の光源として、蛍光ランプ２９を利用しているが、これに限られることなく、レーザを光源として用いてもよい。また、針１４の先端部１４ａの位置として予め設定し、制御部１２内の記憶部１２ａに記憶させた位置を、画像処理手段１１が検出したエバネッセント光による散乱光の位置をもとに修正しても良い。【００７１】
次に、本発明に係る第２の実施の形態について図７を用いて説明する。
図７に示すマニピュレータ装置１ａは、ランプ５０と、照明光学系５０ａと、穴あきミラー５１と、暗視野対物レンズ５２と、結像レンズ５３と、撮像手段１０と、画像処理手段（検出手段）１１とを備えている。暗視野対物レンズ５２の外周部には、照明光導光部５２ａが設けられている。針１４は、先端部１４ａの存在し得る位置と観察光学系の光軸とを合わせる駆動手段（第１の位置合わせ手段）６７に支持されている。このマニピュレータ装置１ａの照明光学系は、暗視野照明光学系である。【００７２】
ランプ５０から発せられた照明光束は、照明光学系５０ａを経て穴あきミラー５１に入射し、リング状の光束となって照明光導光部５２ａに入射する。照明光導光部５２ａに入射した光束は、図中破線で示すように、暗視野対物レンズ５２の先端部分で反射または屈折し、対物レンズ５２によって取り込むことができる光線の角度よりも大きな角度で試料容器４を照明する。【００７３】
ここで、試料容器４の底面等、比較的大きくて平坦な面で反射した光線は、対物レンズ５２には入射しないが、針１４の先端部１４ａのように微細な形状で反射して生じた散乱光には、一部、対物レンズ５２に入射する光がある。この光は対物レンズ５２で取り込まれ、穴あきミラー５１の開口部を通過し、結像レンズ５３で集光されて結像し、撮像手段１０によって画像化される。これにより、この散乱光が光っていない状態から光った状態に変化したことが、画像処理手段１１によって検出される。【００７４】
暗視野照明光は、試料容器４と培地Ｃａとの界面で一部が反射し、一部が屈折し、培地Ｃａ中を透過し、試料容器４の底面から離れた部分も照明する。これにより、針１４の先端部１４ａが試料容器４の底面から離れていても、画像処理手段１１によって同先端部１４ａを検出することができる。このため、エバネッセント光を照明する場合よりも更に、針１４の先端部１４ａの衝突・破損の可能性を低くすることができる。また、全反射状態を必要としないので、高価な油浸タイプの対物レンズを使う必要が無く、作業性も向上する。【００７５】
次に、本発明に係る第３の実施の形態について図８を用いて説明する。
図８に示すマニピュレータ装置１ｂは、ランプ５０と、照明光学系５０ａと、ビームスプリッタ５４と、ニポーディスク５５と、回転モータ５６と、結像レンズ５３と、撮像手段１０と、画像処理手段（検出手段）１１とを備えている。ニポーディスク５５には、図９に示すように、スパイラル状の微小開口５５ａが空いている。各微小開口５５ａ間の距離は、微小開口５５ａの直径の１０倍程度である。回転モータ５６は、ニポーディスク５５を一定速度で回転させる。針１４は、先端部１４ａの存在し得る位置と観察光学系の光軸とを合わせる駆動手段（第２の位置合わせ手段）６８に支持されている。このマニピュレータ装置１ｂにおいて、ニポーディスク５５は、結像レンズ５３の像位置に配置されるとともに、照明光学系および観察光学系と合わせてディスク走査型の共焦点顕微鏡を構成する。【００７６】
ランプ５０から発せられた照明光束は、照明光学系を経てビームスプリッタ５４で反射し、ニポーディスク５５に入射する。微小開口５５ａを通過した光束は結像レンズ５３、対物レンズ７を経て所定の点で収束し、その点に達した針１４の先端部１４ａを照明し、反射する。先端部１４ａで反射した光は、再び対物レンズ７、結像レンズ５３を経てニポーディスク５５に入射する。ここで、先端部１４ａが照明される位置と微小開口５５ａとが光学的に共役になっていれば、先端部１４ａに焦点が合っていると、反射光（散乱光）はニポーディスク５５上で集光し、微小開口５５ａを通過するが、針先端１４ａに焦点が合っていないと、反射光はニポーディスク５５上では集光せず、微小開口５５ａを収束した状態で通過することはできない。微小開口５５ａを収束した状態で通過した光は、ビームスプリッタ５４を透過し、撮像手段１０上で結像し、画像化される。これにより、この反射光が結像していない状態から結像した状態に変化したことが、画像処理手段１１によって検出される。【００７７】
ニポーディスク５５は定速度で回転するので、微小開口５５ａは焦点面全体を走査することができ、焦点面にある物体の像だけが検出され、焦点面にないものは画像化されない。したがって、針１４の先端部１４ａが焦点面に達したときのみ画像化されるので、針１４の高さを高精度で検出することができる。ここで、針１４の先端部１４ａの像は、ＣＣＤカメラのかわりに接眼レンズで目視観察しても良い。【００７８】
また、図１０に示すように、顕微鏡として正立型を用い、レーザ走査型の共焦点光学系を用いも良い。図１０に示すマニピュレータ装置１ｃは、レーザ光源６０と、ビームスプリッタ６１と、２次元光操作機構６２と、瞳投影レンズ６３と、結像レンズ５３と、対物レンズ７と、集光レンズ６４と、共焦点ピンホール６５と、光検出器６６とを備えている。２次元光走査機構６２は、２組のガルバノミラースキャナからなり、レーザ光を２方向に偏向（走査）させる。光検出器６６には、フォトダイオードやフォトマルチプライヤー（フォトマル）が採用される。【００７９】
レーザ光源６０から出射されたレーザ光は、ビームスプリッタ６１を透過して２次元光走査機構６２に入射する。２次元光走査機構６２に入射したレーザ光は、２次元光走査機構６２によって２方向に偏向され、瞳投影レンズ６３、結像レンズ５３、対物レンズ7を経て針１４等の処置具または細胞Ｃに照射され、反射する。針１４等の処置具または細胞Ｃで反射した光は、再び対物レンズ７、結像レンズ５３、瞳投影レンズ６３を経て２次元光走査機構６２に入射する。そして、２方向の偏向が解消し、ビームスプリッタ６１へと入射する。針１４等の処置具または細胞Ｃで反射した光は、ビームスプリッタ６１で反射し、集光レンズ６４で集光され、共焦点ピンホール６５へ導かれる。【００８０】
針１４等の処置具または細胞Ｃが対物レンズ７の合焦位置にある場合は、上記のようにレーザ光が照射された位置と共焦点ピンホール６５とが光学的に共役になっていれば、集光レンズ６４による収束光は、共焦点ピンホール６５上で一点に収束し、共焦点ピンホール６５を通過する。そして、光検出器６６によって検出され、電気信号に変換される。また、針１４等の処置具または細胞Ｃが対物レンズ７の合焦位置に無い場合は、集光レンズ６４による収束光は、共焦点ピンホール６５上では収束せずに広がっているので、その一部が共焦点ピンホール６５を通過しても、光検出器６６によっては検出されない。【００８１】
２次元光走査機構６２の光偏向に同期して光検出器６６の光検出を行うと、針１４等の処置具または細胞Ｃに対物レンズの焦点があった場合のみ、収束光が画像化される。さらに対物レンズの高さを順次変えながら画像を取り込むと、針１４等の処置具および細胞Ｃの像が得られる対物レンズ７の高さに応じて、細胞Ｃと処置具１４との高さの差を検出することができる。【００８２】
このようなディスク型あるいはレーザ走査型の共焦点光学系を採用したマニピュレータ装置では、処置具の先端部の像を良好に検出することができるのに加え、その高さも精度良く検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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