(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＥＣＡＣＣ９４１１３０２６で寄託されたハイブリドーマによって生産されるＮグリコリル含有ガングリオシドに対するネズミの抗体に対し生じた、ガンマ型抗イディオタイプ（Ａｂ２γ）モノクローナル抗体であって、該Ａｂ２γは、寄託番号ＥＣＡＣＣ９７１１２９０１で寄託されたハイブリドーマ細胞株から得られる、上記モノクローナル抗体。
【請求項２】
寄託番号ＥＣＡＣＣ９７１１２９０１で寄託された、請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３】
稀釈剤、アジュバントまたは輸送分子と共に、請求項１記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項４】
悪性腫瘍の治療用の医薬の製造のための請求項１記載のモノクローナル抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、抗イディオタイプモノクローナル抗体、および免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。更に詳しくは、本発明は、Ｎ−グリコリル含有ガングリオシドおよびガン細胞において発現される抗原に反応性のあるネズミモノクローナル抗体に対して開発されたネズミモノクローナル抗体；および腫瘍増殖に対する阻害効果に関する。
【０００２】
（背景）
ガンの治療に対する戦略の一つは、能動的な免疫療法の使用、即ち、ガンに対する宿主の免疫系の自然の力を活性化する目的を有する治療様式であった。
【０００３】
Ｎｉｅｌｓ  Ｊｅｒｎｅが、１９７４年に（Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．１９７４、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５Ｃ，３７３−３８９）、彼のイディオタイプネットワーク理論を提案して以来、ガンに対する効果的な治療法の研究において、新しい可能性が開かれた。Ｊｅｒｎｅの理論は、初めて、抗体の可変部位またはイディオタイプ（Ｉｄ）を通して、抗体間、および多数の自然のエピトープと相互作用することができる抗体のネットワークとしての免疫系を提唱したのであった。このイディオタイプ−抗イディオタイプ相互作用の複雑なセットは、抗原に対する免疫応答を調節する作用をする。元の抗原に応答してつくられるこれら抗体は、Ａｂ１と命名されており、それ自体抗原となり、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体またはＡｂ２、と称される第２の抗体のセットの産生を誘発するが、それは、また、抗−抗イディオタイプ（Ａｂ１′またはＡｂ３）と称される、別の抗体により調節され得る。
【０００４】
最初のＪｅｒｎｅの理論は、再検討されて、Ａｂ１を有するリンパ球とＡｂ２の相互作用の結果は、免疫応答を必ずしも抑制しないで、むしろこの応答を促進することが報告された。更に、Ｊｅｒｎｅは彼の理論をＢリンパ球と抗体に限定したが、しかし、今や、Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターのイディオタイプを通じた制御に重要な役割を演じていることが明らかになっている［Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２，１２８２−１２８５；Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，３１４０−３１４６；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）１４０，３２６６−３２７２；Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，２０２−２０８；Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２，２７−３２；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１，２７１−２７８；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，３９０２−３９１０；Ｄｕｒｒａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，４８３７−４８４０］。
【０００５】
イディオタイプは、与えられたイディオタイプ中のイディオタイプ決定基またはイディオトープを認識する１つ以上の抗Ｉｄとの反応性により免疫学的に決定される。それで、特定のＡｂ１は多数のイディオトープを発現するので、このＡｂ１を同系の動物に投与すると、抗Ｉｄ抗体の不均一集団が得られる。
【０００６】
抗Ｉｄ抗体の分類は、抗原結合部位内におけるそれらの結合、またはイディオタイプの、他の領域に焦点を合わせている。もしＡｂ２のＡｂ１との結合が、相当する抗原により阻害されるなら、そして、もし、Ａｂ２がまた、Ａｂ１と同じ抗原特異性を含むことができるなら、自然抗原を模倣することであり、Ａｂ２βに分類される；この型のＡｂ２は内部イメージ抗Ｉｄと称され、サロゲート抗原として作用することができる。抗原によって阻害されない抗ＩｄはＡｂ２αと命名され、これらＡｂ２は、抗原結合部位と構造的に関連しないＡｂ１イディオタイプと反応する。
【０００７】
１９８４年に、ＢｏｎａおよびＫｏｅｈｌｅｒは、立体構造妨害のために抗原によって阻害される第３の型の抗Ｉｄ抗体（Ａｂ２γ）を提案した、この型の抗Ｉｄは抗原結合部位に構造的に関連するイディオトープと反応するが、Ａｂ１によって認識される抗原エピトープを模倣しない［Ｂｏｎａ  ａｎｄ  Ｋｏｅｈｌｅｒ（１９８４）、抗イディオタイプ抗体および内部イメージ。モノクローナルおよび抗イディオタイプ抗体：レセプター構造および機能に対するプローブ。Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒａｓｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．（編）ＮＹ，Ａｌａｎ  Ｒ，Ｌｉｓｓ，ｐｐ１４１−１４９，１９８４］。
【０００８】
Ｊｅｒｎｅの理論を基にして、腫瘍関連抗原を含む多数の抗原に対するワクチンの検索において２つの主な方法が開発された。第１の方法は、Ａｂ２βを使用した、異なった分子環境におけるエピトープの提示を基にしたものである。この型の抗Ｉｄ抗体を含有するワクチンは、ウイルス、細菌、および寄生虫に対する防御反応を誘導することができる［Ｋｅｎｎｅｄｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）２３２，２２０−２２３；ＭｃＮａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，１３２５−１３２６］。また、Ａｂ２βは、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用され、肯定的な結果が動物モデルおよび臨床治験において得られている［Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，１７４３−１７４９；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，３９０２−３９１０；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，１３５４−１３６０；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，１３９８−１４０３；Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ．４，３４７−３５７；Ｃｈｅｎ，Ｚ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０）３５１−３５９；Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ５、６１５−６２４；Ｆｕｒｕｙａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２、２７−３２；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，４６６−４７０；Ｄｕｒｒａｎｔ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，４８３７−４８４０；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，４１５−４２１；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３，３８９−３９６；Ｃｈａｋｒｏｂａｒｔｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１８，９５−１０３；Ｃｈａｋｒｏｂａｒｔｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，１５２５−１５３０；Ｆｏｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１，１２８５−１２９４；Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １４，１５９−１６６；Ｓｃｌｅｂｕｓｃｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １４，１６７−１７４；Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３，６５−７６］。それにもかかわらず、Ａｂ２のβ性質は、Ａｂ２を誘導することができる生物学的効果を予測するには充分でないことが明らかにされた［Ｒａｙｃｈａｕｈｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，１７４３−１７４９；Ｒａｙｃｈａｕｈｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３１−２７８；Ｍａｒｕｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５，５４７−５５３］。
【０００９】
第２の方法は、抗原結合には関係しないが、他の抗体またはＴ細胞を共有しているイディオタイプに関与している調節性イディオトープを通じたネットワーク操作を基にしたものである。これら抗イディオタイプ抗体は、また、免疫応答および防御効果を産生することができるという証拠が蓄積されてきた（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｏｎａ，Ｃ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ３，２３０−２３４；ＭｃＮａｍａｒａ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６，１３２５−１３２６；Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｓ（１９９２）Ｐｒｏｃ．８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒ．  Ｃｏｎｇ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｂｕｄａｐｅｓｔ，ｐｐ．６１９）。
【００１０】
ガングリオシドはシアリン酸を含有するスフィンゴ糖脂質であり、大多数の哺乳類細胞膜に発現される。これらの抗原は、正常組織中に存在しているが、ガン細胞の表面の異なった構成およびコンフォーメーションに大量に発現されて見出される［Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（１９８５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５，２４０５−２４１５；Ｍｉｒａｌｄｉ，Ｆ．（１９８９）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＸＩＸ，２８２−２９４；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｆ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３，１−８１］。
【００１１】
ガングリオシドは、免疫応答の有用な標的ではあるが、それらの炭水化物性および自己抗原状態のゆえに、それらの免疫原性は極端に貧弱である［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３５７−３６６］。
【００１２】
シアリン酸のＮ−グリコリル変異体は、ほとんどの哺乳動物の正常組織で発現されている；しかしヒトの正常組織においては検出するのは非常に困難である［Ｗａｔａｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７，１０６２−１０６９］。一方、これら抗原の存在は、大腸ガン、メラノーマ、網膜芽細胞腫および肺ガン、その他で報告されている［Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７５，１０２５−１０２９；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５，３７９６−３８０２；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７８，１６１４−１６２０；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７９，９５２−９５６；Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  ６５，４９９−５０５；Ｄｅｖｉｎｅ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，５８２６−５３８６；Ｖａｚｑｕｅｚ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４，５５１−５５６；Ｍａｒｑｕｉｎａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，５１６５−５１７１］。
【００１３】
ガングリオシド含有ワクチンでの免疫は、抗ガングリオシド抗体を発現したメラノーマ患者の生存を延長した［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，２９１１−２９１５；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，７０４５−７０５０；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１４５，１４７−１６６］。それにもかかわらず、抗原のその問題は、それらの貧弱な免疫原性と共に、抗Ｉｄ抗体の使用を、この抗原モデルにおける能動免疫療法に対する魅力的な代替品にしている。ネズミ抗Ｉｄ・ｍＡｂ（４Ｃ１０）は、ヒトメラノーマでＧＭ３を認識する、ヒトＩｇＭ・ｍＡｂ（Ｌ６１２）に対して生成された。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合した、この抗Ｉｄ・ｍＡｂで免疫したマウスの血清は、抗原陽性メラノーマ細胞株および生成ＧＭ３と強力に反応し、このことは、ＧＭ３の内部イメージ（Ａｂ２β）を輸送する抗Ｉｄ・ｍＡｂは、メラノーマ患者において能動特異的免疫療法に有効な手段である、ことを示唆している［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８２，１７５７−１７６０；Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．米国特許第５，２０８，１４６号］。この抗Ｉｄ・ｍＡｂからのＶＬおよびＶＨは、クローン化され、配列決定され、キメラマウス／ヒトＩｇＧ１抗体として発現された［Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，１６８１−１６８６］。
【００１４】
また、アルファ型抗イディオタイプｍＡｂは、免疫診断手順において有用なヒトｍＡｂ１６１２に対して生成された（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．米国特許第５，２０８，１４６号）。
【００１５】
ＧＤ３ガングリオシドを認識するマウスｍＡｂ（ｍＡｂＲ２４）に対し生じたネズミ抗Ｉｄ・ｍＡｂである、ｍＡｂ・ＢＥＣ−２はＧＤ３を模倣することができ、正常ウサギ組織におけるＧＤ３の発現にもかかわらず、このガングリオシドに対して抗体を誘導することができる［Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ａｎｄ  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．（１９９１）８８，１８６−１９２］試験的研究の結果は、ＢＥＣ−２プラスＢＣＧアジュバントは、小細胞肺ガン患者の生存を有意に増加した［Ｓｃｒｉｐ  Ｍａｇａｚｉｎｅ（１９９６）ｐｐ５６−５９；３３ｒｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ（１９９７）］
【００１６】
ＧＤ２に対し特異的なネズミｍＡｂで免疫したラット（３Ｆ８）は、抗Ｉｄ・ｍＡｂｓを生成し、マウスにおいて免疫原として試験したときに、ガングリオシドＧＤ３と反応する抗体を刺激することができた。これら抗Ｉｄ・ｍＡｂはワクチン構造として有用であることを示唆している［Ｃｈｕｎｇ，Ｎ−Ｋ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４，４９９−５０５］。
【００１７】
また、ヒト抗Ｉｄ・ｍＡｂが、ＧＤ２に対し特異的なネズミｍＡｂ１４Ｇ２で処理した、患者からの末梢血単核細胞を用いて生成された。このヒト抗Ｉｄ・ｍＡｂでウサギを免疫すると、抗ＧＤ２抗体および抗原陽性腫瘍細胞に対するＤＴＨ応答を誘導した。この抗体は、悪性メラノーマ患者において、ヒト抗Ｉｄワクチンとして強力に使用できることが示唆された［Ｓａｌｅｈ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，３３９０−３３９８］。
論文「ガングリオシドワクチン」において：抗原サロゲートとして抗イディオタイプモノクローナル抗体（Ｉｇｌｅｓｉａｓ、Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１，１９９７，ｐａｇｅ５０，ＸＰ−００２０９１４６６）が、Ｐ３Ｍａｂと強力に反応し、他の試験した抗ガングリオシドＩｇＭ・ＭＡｂｓとは反応性が見られなかった７つのＩｇＧ１抗イディオタイプモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が記載されている。７つの抗イディオタイプＭＡｂｓは、１ないし１０μｇ／ｍｌの濃度範囲においてＮＧｃＧＭ３に結合するＰ３をブロックする能力を有していた。これら抗イディオタイプの内の５つはＮＧｃＧＭ３に対し体液性応答を誘発する能力を有しており、Ａｂ２βおよびＡｂ２α抗イディオタイプモノクローナル抗体として分類された。
一方、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（「イディオタイプネットワークについて、ガングリオシドは我々に何を示すか」。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１，１９９７，ｐａｇｅ４２，ＸＰ−００２０９１４６７）はまた、抗ガングリオシド抗体Ｐ３は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、強力なＩｇＧ抗イディオタイプ応答を高める（Ａｂ２、力価１／１００００ないし１／５００００）、ことを記載している。得られた、これら特異的Ａｂ２クローンの大部分はＰ３ＭＡｂのＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）への結合をブロックすることができた。これらの抗体は、上記の例におけるように、ガングリオシドに対し自然の自家抗体応答を誘導することができ、Ａｂ２β抗イディオタイプ抗体としても分類された。
【００１８】
上記背景から明らかなように、同時に、動物モデルにおいて抗腫瘍効果を発揮することができる、Ｎ−グリコシル含有ガングリオシドを認識するモノクローナル抗体に対し、ガンマ型抗イディオタイプモノクローナル抗体は、今まで生成したことはなかったのである。
【００１９】
（発明の開示）
本発明は、一般的に、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびガン治療のための免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。更に詳しくは、本発明は、Ｎ−グリコリル含有ガングリオシドおよびガン細胞中で発現される抗原と反応するネズミｍＡｂに対して開発された、ネズミガンマ型抗Ｉｄ・ｍＡｂに関する。
【００２０】
本発明によると、本発明の目的は、異種移植モデルにおいて、優勢的に抗イディオタイプ反応を誘発し、そして悪性腫瘍を有するマウスまたはその他の動物種において防御効果を発揮することができる新規な抗Ｉｄ・ｍＡｂを提供する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
抗ガングリオシドｍＡｂｓ（モノクローナル抗体）に応答する抗イディオタイプ（Ａｂ２）抗体を得るための免疫手順
マウスおよびその他の哺乳動物種は、アジュバントの存在または不存在下に、所望により輸送タンパク質と結合させた精製抗ガングリオシドｍＡｂの投与量２５−２００μｇで免疫する。動物は、投与間隔１４ないし３０日で抗ガングリオシド抗体の２−６回投与を受ける。可能な免疫経路は、腹腔内、皮下、静脈内またはこれらの組合せである。
【００２２】
免疫期間前または間で、動物血清は、何れかの公知のイムノアッセイ法で測定される。動物血清稀釈物を免疫原として使用される抗ガングリオシドｍＡｂと、または免疫プロトコルにおいて使用されない、その他の抗ガングリオシドｍＡｂと共にインキュベートされる。
【００２３】
実験は、また、免疫した動物の血清が、免疫原として使用した抗ガングリオシドｍＡｂのその抗原との結合を阻止する能力を定義するために行われた。
【００２４】
抗ガングリオシドｍＡｂｓに対する抗イディオタイプｍＡｂ産生
高Ａｂ２抗体力価を有するマウスは、免疫原として使用したｍＡｂで抗体産生細胞を得る前３日間、再免疫を受ける。脾細胞が優先的に使用されるが、他の抗体産生細胞も選択され得る。
【００２５】
これらの細胞は、ミエローマ細胞と融合され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで再生能を有するハイブリッド細胞またはバイブリドーマを与える。細胞融合はいずれの公知の方法によっても行い得る。
【００２６】
ハイブリドーマによって産生された抗体は、イムノアッセイ法により、好ましくは、ハイブリドーマ上清が免疫原として使用されるｍＡｂと共に、および免疫において使用されないその他の抗ガングリオシドｍＡｂと共に、インキュベートされる、イムノエンザイムアッセイによって試験される。
【００２７】
抗原に対する免疫原として使用される抗ガングリオシドｍＡｂの結合を阻止するハイブリドーマ上清の能力は、抗ガングリオシドｍＡｂの適当に稀釈した上清をインキュベートすることにより、次いで、該抗体をその抗原とインキュベートすることにより定量される。
【００２８】
選択されたハイブリドーマは少なくとも２回クローニングされ、そして得られたｍＡｂは、上記したようにしてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。
【００２９】
得られた抗イディオタイプｍＡｂｓは、抗ガングリオシドｍＡｂｓを認識し、そして抗原に対し抗ガングリオシドｍＡｂの結合を阻止する能力を有することができる。
【００３０】
異種移植モデルにおいてＡｂ２・ｍＡｂｓに対し応答する抗−抗イディオタイプ（Ａｂ３）抗体を得るための免疫手順
サルまたはその他の異種移植動物種を抗イディオタイプｍＡｂｓで免疫する。これらｍＡｂｓは、アジュバントを添加し、あるいは添加せずに投与することができ、所望により、免疫原として使用される前に輸送タンパク質と結合することができる。
【００３１】
各動物は、投与間隔７ないし３０日間隔で、抗イディオタイプｍＡｂ２５０μｇないし２ｍｇの、２から８回投与を受ける。
【００３２】
免疫経路は、皮内、皮下、静脈内、腹腔内またはこれらの組合せとすることができる。動物血液試料は、免疫計画前および間に得られ、Ａｂ３抗体応答の存在は公知のイムノアッセイを用いてモニターされる。
【００３３】
抗ガングリオシドｍＡｂｓで免疫することによって産生された、抗イディオタイプｍＡｂｓの動物への投与は、抗原特異的抗体応答の誘導なしに、免疫原として使用される抗イディオタイプｍＡｂのイディオタイプに対する優勢な抗体応答を誘導することができる。
【００３４】
抗イディオタイプｍＡｂｓ処理の抗腫瘍効果
抗イディオタイプｍＡｂは、アジュバントの存在または不存在の有効量および所望により使用前に輸送タンパク質に結合させて、投与される。有効量なる用語は、抗腫瘍効果を達成するために必要とされる抗イディオタイプｍＡｂの量を意味するものと理解されるべきである。抗イディオタイプｍＡｂでの治療は、動物におけるガンへの実験的投与の前または後に行われる。
【００３５】
動物は、投与の間７−３０日間隔で、抗イディオタイプｍＡｂｓの１０−２００μｇの１−５回投与を受ける。
【００３６】
免疫化経路は、皮内、腹腔内、皮下、静脈内、またはこれらの組み合わせをとることができる。抗イディオタイプｍＡｂｓでの治療後、抗イディオタイプｍＡｂｓで治療した群におけるガン発生率および生存率を、対照群あるいは同様に処置し保持したものと比較することができる。
【００３７】
抗イディオタイプｍＡｂ治療は担腫瘍動物の生存率を有意に増加させ、肺転移を減少させた。
【００３８】
実施例１：同系モデルにおけるＰ３・ｍＡｂに対する抗イディオタイプ抗体の生成
雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、６−８週令、をＫＬＨと結合した精製Ｐ３・ｍＡｂ［抗Ｎ−グリコリル含有ガングリオシド（ＥＡＣＣ寄託番号９４１１３０２６、ヨーロッパ特許出願ＥＰ６５７４７１Ａ１；Ｖａｚｑｉｅ．ＡＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９５）１４，５５１−５５６）５０μｇを、投与間隔１４日で、２回投与して免疫した。
【００３９】
最終免疫３日後、Ｐ３・ｍＡｂに対するＡｂ２抗体の高血清レベルのマウスの脾を採取し、ステンレススチール製ふるいを通して圧縮することによりまたは脾を灌流することにより、細胞懸濁液を調製した。
【００４０】
融合は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎにより記載された方法［１９７５，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）２５６，４９５−４９７］を少し修正して、行った。
【００４１】
ネズミ脾細胞を、ＥＣＡＣＣ、Ｎｏ．８５０１１４２０、から得られる非分泌ネズミミエローマＰ３／Ｘ６３・Ａｇ８・６．５．３．の細胞と、ＰＲＭ１−１６４０培地中４２％ポリエチレングリコール含有融合媒体０．５ｍｌで、１０：１の比率中で、融合した。
【００４２】
融合後、細胞はＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中で、３７℃、５％ＣＯ2加熱雰囲気中で培養した。
【００４３】
融合後１０ないし１５日に、バイブリドーマ上清中の抗体の存在をＥＬＩＳＡにより評価決定した。ＥＬＩＳＡプレート（高結合型ＣＯＳＴＡＲ）を４℃、Ｐ３・ｍＡｂ１０μｇ／ｍｌおよび他のＩｇＭ抗ガングリオシドｍＡｂと共に、炭酸・重炭酸バッファー、ｐＨ９．８、中で一夜インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄後、プレートを、１％ＢＳＡを含有する同じバッファーで、３７℃、１時間、ブロックした。
【００４４】
洗浄ステップを繰り返し、上清５０μｌ／ウエルを加えた。２時間インキュベートの後、プレートを再洗浄し、アルカリ性ホスファターゼヤギ抗ネズミＩｇＧ・Ｆｃ領域結合抗血清を加えた。洗浄後、基質溶液（ジエタノールアミン・バッファー、ｐＨ９．８、に稀釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ／ウエルを加えた。吸光度４０５ｎｍをＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【００４５】
また、ＮｅｕＧｃＧＭ３に対するＰ３・ｍＡｂの結合をブロックする上清の能力を、以下の方法に従って、固定化ＮｅｕＧｃＧＭ３と共に塩化ポリビニール活性化したプレート（ＩＣＮ−ＦＬＯＷ）上で間接ＥＬＩＳＡにより決定した：メタノール中ガングリオシドの１５μｌ（４μｌ／ｍｌ）を各ウエルに加えた。メタノールをプレートを３７℃、１時間おいて蒸発させた。後に、１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８、１５０μｌ／ウエルを加え、プレートを３７℃、３０分間インキュベートした。
【００４６】
ハイブリドーマ上清を、Ｐ３・ｍＡｂ、４μｇ／ｍｌと共に３時間、３７℃インキュベートし、混合物の５０μｌを各ウエルに加え（５０μｌ／ウエル）、３７℃、９０分間インキュベートした。
【００４７】
ウエルを２００μｌＰＢＳで４回洗浄し、適切に稀釈した、アルカリ性ホスファターゼ抗マウス免疫グロブリン結合抗血清５０μｌを加えた。ＰＢＳで洗浄後、前に記載したようにして、基質溶液と共にインキュベートした。
【００４８】
ＩｇＧ１サブクラスの抗イディオタイプｍＡｂ、１Ｅ１０と称する、を得た。この１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂは、免疫原として使用されるＰ３・ｍＡｂに非常に特異的である。それは、Ｅ１、Ａ３およびＦ６のような他の抗ガングリオシド抗体と反応しない（図１）。この抗イディオタイプｍＡｂはＰ３・ｍＡｂのＮｅｕＧｃＧＭ３およびＰ３陽性肺腫瘍細胞株に対する結合を阻害することができる（図２）。
【００４９】
実施例２：異種移植モデルにおける１Ｅ１０抗Ｉｄ・ｍＡｂに対する抗−抗イディオタイプ（Ａｂ３）抗体応答の生成
水酸化アルミニウム沈殿１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂを、一注射当りｍＡｂ２ｍｇの投与で１４日間隔でカニクイザルに皮内で免疫するのに、使用した。動物はｍＡｂを数回投与された。
【００５０】
血清試料を免疫前、後に採取した。サル血清中のＡｂ３抗体応答の存在はＥＬＩＳＡによって決定された。ＥＬＩＳＡプレート（高結合型Ｃｏｓｔａｒ）は、１Ｅ１０・ｍＡｂまたはそのＦ（ａｂ′）２フラグメントの炭酸・重炭酸バッファー、ｐＨ９．８、中１０μｇ／ｍｌで４℃にて、一夜インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄後プレートを、１％ＢＳＡ含有同バッファーで、１時間、３７℃にてブロックした。
【００５１】
洗浄ステップを繰り返し、別の血清稀釈液を１ウエル当り５０μｌ（５０μｌ／ウエル）加えた。３７℃、２時間、インキュベートの後、プレートを再洗浄し、アルカリ性ホスファターゼヤギ抗ヒト免疫グロブリン、抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＧ結合抗血清を加えた。洗浄後、基質溶液を前に記載したように加えた。
【００５２】
阻止実験は、抗イソタイプと抗イディオタイプ抗体応答の間の区別をするために実施された。サル血清を、１Ｅ１０・ｍＡｂと同じイソタイプを有し、異なった特異性を有する、ｍＡｂ５００μｇ／ｍｌを４℃にて一夜インキュベートした。そして、１Ｅ１０・ｍＡｂに対する、レムナント血清反応性を、上記したようにして、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００５３】
上に記載したＥＬＩＳＡ法を使用して、ＥＬＩＳＡプレート中にコートした、１Ｅ１０・ｍＡｂ・Ｆ（ａｂ′）２フラグメントに対するビオチン化Ｐ３・ｍＡｂの結合を阻害する、サル血清の能力をしらべた、但し、血清稀釈でコートしたプレートをインキュベートした後、ビオチン化Ｐ３・ｍＡｂ、５０μｌ／ウエル、を加えた。３７℃にて１時間インキュベーションの後、プレートを洗浄し、アビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体、５０μｌ／ウエル、を１時間、３７℃にて加えた。洗浄後、基質バッファー（リン酸・クエン酸バッファー、ｐＨ５．０、１２ｍｌ中ｏ−フェニレンジアミン、８ｍｇ）を加えた。吸光度を４９２ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダーにて測定した。
【００５４】
１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂで免疫したサルから得た血清は１Ｅ１０・Ｆ（ａｂ′）２フラグメントと強く反応した（図３）。免疫したサルの血清は免疫１Ｅ１０・ｍＡｂに特異的に結合し、関係のないｍＡｂ（ｉｏｒ・Ｃ５）とは弱い反応性を示した。１Ｅ１０イディオタイプに対する抗体の存在は、関連性のないｍＡｂと動物血清とインキュベートした後に、１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂと吸着血清の強い反応性から、確認された；驚くべきことに、誘導された抗イディオタイプ抗体応答は、生成した抗イソタイプ抗体応答に比較して優れていた（図４）。サルＡｂ３血清は、また、ビオチン化Ｐ２・ｍＡｂの１Ｅ１０抗Ｉｄ・ｍＡｂに対する結合を阻害した、このことは、サルＡｂ３血清はＰ３・ｍＡｂとイディオトープを共有していることを示している（図５）。優勢なＩｇＧ抗体応答が１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂに対して生成された（図６）。サルの血清は、動物が最終免疫を受けてから後４ヶ月間でも、１Ｅ１０・Ｆ（ａｂ′）２フラグメントと反応し（図7）、１Ｅ１０に結合するＰ３・ｍＡｂの阻害能力を有するＡｂ３抗体が、また、同時に検出された。ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗体は動物血清中に検出されなかった。
【００５５】
１Ｅ１０抗イディオタイプｍＡｂはガンマ型であることが、１Ｅ１０抗イディオタイプｍＡｂが、Ｐ３・ｍＡｂとその抗原との結合を阻害し得ること、および動物にＰ３様抗体の産生を誘導することができないこと、から明らかにされた。
【００５６】
実施例３：１Ｅ１０抗Ｉｄ・ｍＡｂによるマウスの治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、水酸化アルミニウム沈殿１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂ、５０μｇ、を１４日間隔で投与することで免疫した。１週間後、マウスに５×１０3Ｂ１６メラノーマ細胞を皮下注射した。動物を同様に処置したもの、但し、ｍＡｂを投与しなかったものを対照とした。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を図８に示す；生存は、対照群よりも１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂで免疫下群で有意によかった。
【００５７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬｅｗｉｓ肺ガン細胞、５０×１０3個を静脈注射した。１４日後、１Ｅ１０、１０μｇ、を静脈投与し、６日後、マウスを屠殺し、肺転移数を計数した。無関連のＩｇＧ・ｍＡｂで処置した動物またはＰＢＳのみを投与した動物を対照とした。１Ｅ１０抗Ｐ３・ｍＡｂで治療した動物１０頭中７頭は肺転移をおこしていなかった。残り３頭は最大総転移数は３であった。これに対し、未関連ＩｇＧまたはＰＢＳのみで処置された動物の全ては肺転移をおこしていた。これらの結果は、このガンマ型抗Ｉｄ・ｍＡｂでの治療は、腫瘍に対し防御効果を有していることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂのＰ３、Ｅ１、Ａ３およびＦ６抗ガングリオシドｍＡｂｓに対する反応性を示す。
【図２】  図２は、Ｐ３・ｍＡｂを１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂとインキュベートし、後にＰ３・ｍＡｂのＮｅｕＧｃＧＭ３に対する反応性をＥＬＩＳＡで測定した、阻害アッセイの結果を示す。
【図３】  図３は、動物に水酸化アルミニウム沈殿１Ｅ１０抗Ｉｄ・ｍＡｂの異なった投与量を与えた後に、ＥＬＩＳＡによって測定した、サル血清抗体と１Ｅ１０・Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの反応性を示す。
【図４】  図４は、ＥＬＩＳＡで測定した反応性の阻害アッセイの結果を示す。１Ｅ１０・ｍＡｂとサル非前吸着血清（−■−）、イソタイプ不適合ｉｏｒ・Ｃ５・ｍＡｂとサル非前吸着血清（−●−）、１Ｅ１０・ｍＡｂに対する血清抗体の結合（−□−）、および無関係なｉｏｒ・Ｃ５・ｍＡｂと血清抗体の結合（−○−）。矢印は免疫時、および連続線は採血時を示す。
【図５】  図５は、ＥＬＩＳＡにより測定した、１Ｅ１０・ｍＡｂで免疫したサルの血清による、Ｐ３・ｍＡｂの１Ｅ１０抗Ｉｄ・ｍＡｂに対する結合の阻害を示す。矢印は免疫時を示し、連続線は採血時を示す。
【図６】  図６は、ＥＬＩＳＡにより測定した、抗イディオタイプｍＡｂで免疫したサルの血清中の１Ｅ１０・ｍＡｂに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体応答の反応速度論を示す。矢印は免疫時を示し、連続線は採血時を示す。
【図７】  図７は、サル前免疫血清による；水酸化アルミニウム沈殿１Ｅ１０抗イディオタイプｍＡｂ（矢印で示す）の最終投与後のサルから得た血清による；および、最終免疫を受けた動物の４ヶ月後に得た血清による、１Ｅ１０・Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの認識を示す。
【図８】  図８は、１Ｅ１０抗Ｉｄ・Ｐ３・ｍＡｂで処置した、およびＢ１６メラノーマ細胞を接種した、マウスにおけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【図８】
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