(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SETドメインに対応するヒトクロマチン調節タンパク質またはその部分配列をコードするＤＮＡ分子であって、そのヌクレオチド配列が、図６に示されたEZH2なる名称の配列であるか、又は図７に示されたSUV39Hなる名称の配列であるか、或いはEZH2又はSUV39HのSETドメインに対応する部分配列であることを特徴とする前記ＤＮＡ分子。
【請求項２】
ＤＮＡ分子が、機能性クロマチンレギュレーターをコードするＤＮＡ分子、その縮重変異体又はその遺伝子重複にトレースバックし得る変異体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子が、EZH2をコードするｃＤＮＡ分子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
ＤＮＡ分子が、EZH2のSETドメインをコードするｃＤＮＡ分子である請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
ＤＮＡ分子がSUV39HをコードするｃＤＮＡ分子である請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡ分子がSUV39HのSETドメインをコードするｃＤＮＡ分子である請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
部分配列として以下の配列を含む、EZH1なる名称の請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子の突然変異体。
0004295824.tif 000036
【請求項８】
原核宿主生物または真核宿主生物中の発現のために、発現調節配列に機能的に連結された、請求の範囲第３項又は第５項に記載のｃＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された原核宿主生物または真核宿主生物。
【請求項１０】
請求の範囲第３項又は第４項に記載のｃＤＮＡ分子の発現により得られる、組換えヒトクロマチン調節タンパク質EZH2またはSETドメイン。
【請求項１１】
請求の範囲第５項に記載のｃＤＮＡ分子の発現により得られる、組換えヒトクロマチン調節タンパク質SUV39HまたはSETドメイン。
【請求項１２】
以下のアミノ酸配列からなる、EZH2に対する抗体。
0004295824.tif 000037
0004295824.tif 000038
【請求項１３】
以下のアミノ酸配列からなる、SUV39Hに対する抗体。
0004295824.tif 000039
0004295824.tif 000040
【請求項１４】
SETドメインを含有するクロマチン調節遺伝子の脱調節に起因するヒトの疾患の治療及び診断のための請求の範囲第４項または第６項に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項１５】
ＳＥＴドメインを含有するクロマチン調節遺伝子の脱調節に起因するヒトの疾患の治療及び診断のための請求の範囲第12項または第13項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
本発明はクロマチンの構造及び機能の調節に役割を果たす遺伝子、並びに治療及び診断におけるそれらの使用に関する。
動原体、テロメア中並びに真正染色質性領域及び異質染色質性領域中の真核染色体の機能的組織化は、夫々の細胞分裂に関する遺伝情報の正確な複製及び分布を確実にするのに重要なメカニズムである。対照的に、腫瘍細胞は染色体の再配列、トランスロケーション及び異数性をしばしば特徴としている（Solomonら，1991; Pardue, 1991）。腫瘍細胞中の増大された染色体不安定性をもたらすメカニズムは未だ明瞭にされていなかったが、ごく最近、酵母中のテロメアの位置効果（Renauldら，1993; Buck及びShore, 1995; Allshireら，1994）で始まって、ショウジョウバエ属中の斑入り型位置効果（PEV）（Reuter及びSpierer, 1992）を経由して、ヒト白血病におけるトランスロケーション破損点の分析（Solomonら，1991; Cleary, 1991）に至る幾つかの実験系が、脱調節された（deregulated）増殖に関与する幾つかの染色体タンパク質を同定することを可能にしていた。
第一に、SIR4-タンパク質の短縮バージョンの過剰発現（overexpression）が酵母の長い寿命をもたらすことがわかった（Kennedyら，1995）。SIRタンパク質は定常交配型遺伝子座及びテロメアにおける多量体複合体の生成に寄与するので、過剰発現されたSIR4はこれらの異質クロマチン様複合体と干渉し、最終的に調節されない増殖をもたらし得るであろう。この仮定はヒトの癌の殆どの型における脱調節されたテロメア長さの発生の頻度と一致する（Counterら，1992）。
第二に、ショウジョウバエ属中のPEVの遺伝子分析が、異質染色質性位置で、またホメオティック遺伝子クラスター内でクロマチンの構造を変化する幾つかの遺伝子産物を同定した（Reuter及びSpierer, 1992）。これらの遺伝子の幾つか、例えば、モジュロ（modulo）（Garzinoら，1992）及びポリホメオティック（Smouse及びPerrimon, 1990）の突然変異がショウジョウバエ属の脱調節された細胞増殖または細胞死滅を生じ得る。第三に、ホメオティックショウジョウバエ属セレクター遺伝子のクロマチン構造のアクチベーター（トリソラックス（Trithorax）またはtrx-グループ）そしてまたリプレッサー（例えば、ポリコームまたはPc-グループ）の両方の哺乳類同族体が記載されていた。これらの中で、ヒトHRX/ALL-1（trx-グループ）がトランスロケーションにより誘発された白血病発生に関与することが示され（Tkachukら，1992; Guら，1992）、またマウスbmi（Pc-グループ）の過剰発現がリンパ腫の形成をもたらすことが示されていた（Hauptら，1991;Brunkら，1991; Alkemaら，1995）。染色体タンパク質の機能に関するモデルは、それらが複合体中のアクチベーターとリプレッサーの間のバランスに応じて周囲のクロマチン領域の縮合度を決定する多量体複合体を生成することを結論させる（Lockeら，1988）。複合体の成分の一つの過剰発現により生じたこの平衡のシフトは真正染色質性領域及び異質染色質性領域の新しい分布を示した（Buck及びShore, 1995; Reuter及びSpierer, 1992; Eissenbergら，1992）。この用量効果は所定の遺伝子座におけるクロマチン構造を不安定にすることができ、これが最後の分析において正常状態から形質転換状態への転移をもたらす。
クロマチン構造を変化することができるプロトオンコジーンとしてのHRX/ALL-1及びbmiの特性決定にもかかわらず、クロマチンと相互作用する哺乳類遺伝子産物に関する本発明者らの知識は依然として非常に制限される。対照的に、ショウジョウバエ属中のPEVの遺伝子分析により、クロマチンレギュレーターに関する約120の対立遺伝子が記載されていた（Reuter及びSpierer, 1992）。最近、カルボキシ末端領域が、陽性（ｔｒｘ、trx-グループ）及び陰性（Ｅ（z）、Pc-グループ）ショウジョウバエ属クロマチンレギュレーターに共通である配列の類似性により同定された（Jones及びGelbart, 1993）。更に、このカルボキシ末端はまたショウジョウバエ属中のクロマチン分布の優性サプレッサーであるＳｕ（var）3-9に保存される（Tschierschら，1994）。
本発明は、“SET”と称されるこのタンパク質ドメイン（Tschierschら，1994）がそれらの進化的保存及び拮抗遺伝子産物中のそれらの存在のためにそれらの発育ヒストリーに関して重要である哺乳類クロマチンレギュレーターの新しい遺伝子ファミリーを形成するという前提から開始した。更に、HRX/ALL-1は別にして、SETドメイン遺伝子のグループのその他の員の特性決定は、悪性形質転換をおそらくもたらすクロマチンの構造変化の原因であるメカニズムを説明することを助ける。
それ故、本発明の目的はヒトクロマチン調節遺伝子を同定し、それらの機能を明らかにし、それらを診断及び治療に使用することであった。
この目的を達成するために、最初にSETドメインの配列情報がヒトｃＤＮＡバンクからショウジョウバエ属のSETドメイン遺伝子に相同のヒトｃＤＮＡを得るのに使用された。E（z）及びSu（var）3-9のヒト同族体を構成する２種のｃＤＮＡが得られた。相当するヒト遺伝子がEZH2及びSUV39H（下記を参照のこと）と称された。加えて、EZH2の変異体形態が同定され、これがEZH1と称された。
こうして、本発明は、ＤＮＡ分子が図６または図７に示されたヌクレオチド配列を有することを特徴とする、SETドメインを有するクロマチン調節タンパク質をコードする配列、またはその部分配列を含むＤＮＡ分子に関する。本発明のＤＮＡ分子は以下“本発明の遺伝子”とも称される。
本発明の遺伝子はEZH2及びSUV39Hと称される。それらは最初に“HEZ-2”及び“H3-9”として知られていた。
別の局面によれば、本発明はこれらの遺伝子に由来するｃＤＮＡ（その縮重変異体；機能性クロマチンレギュレーターをコードする突然変異体及び遺伝子重複にトレースバックし得る変異体を含む）に関する．この例がEZH1であり、その部分配列が図８中にEZH2と比較して示される。
本発明の範囲に示された目的を達成するために、以下の特別な操作に従った。保存されたSETドメインの配列情報から開始して、ヒトＢ細胞特異性ｃＤＮＡライブラリーが、低下されたストリンジェンシーのもとに、E（z）及びSu（var）3-9のSETドメインをコードする混合ショウジョウバエ属ＤＮＡプローブでスクリーニングされた。500,000のプラークから、40の一次ファージが選択された。スクリーニングの別の２ラウンド後に、31種のファージが真正E（z）配列をコードし、５種のファージがE（z）変異体を構成することが明らかになった。対照的に、２種のファージのみがSu（var）3-9単独のSETドメインを含むプローブとハイブリッドを形成した。
ファージインサートがポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅され、制限マッピング及び部分配列決定により分析された。代表的なｃＤＮＡインサートがサブクローン化され、それらの全長にわたって配列決定された。5’末端が陽性ファージを5’-DNAプローブでもう一度スクリーニングすることにより単離され、その後に、サブクローニング後に、完全ｃＤＮＡが得られた。
E（z）のヒト同族体をコードする完全ｃＤＮＡがEZH2と称され、Su（var）3-9のヒト同族体をコードするＤＮＡがSUV39Hと称された。全体で、ショウジョウバエ属タンパク質とヒトタンパク質の間のアミノ酸の同一性はEZH2について61％の量であり、SUV39Hについて43％の量であり、一方、Ｃ末端SETドメインが非常に高度に保存される（EZH2について88％そしてSUV39Hについて53％）。配列比較は相同性のその他の明らかな領域、例えば、EZH2中のシステインに富むドメイン及びSUV39H中のクロモ−ボックス（Chromo-Box）を示した（ポリコーム中で、クロモ−ボックスはＤＮＡとクロマチンの間の相互作用に必須のドメインであることが示された；Messmerら，1992）。対照的に、ショウジョウバエ属タンパク質のアミノ末端GTP結合モチーフを含む207アミノ酸はヒト同族体SUV39Hから不在である。
ショウジョウバエ属遺伝子とヒト遺伝子の間のアミノ酸配列の比較が図１及び２に示される。
図１はEZH2とゼスト（zeste）のショウジョウバエ属エンハンサー（E（z））の間のアミノ酸配列の比較を示す。保存されたカルボキシ末端SETドメイン（陰影付きのボックス）及びCysに富む領域（Cys基が強調されている）の同一アミノ酸が示される。推定の核配置シグナルが下線を施される。
図２はヒト同族体SUV39Hとショウジョウバエ属Su（var）3-9の間のアミノ酸配列の比較を示す。保存されたカルボキシ末端SETドメイン（陰影付きのボックス）及びクロモ−ドメイン（更に暗い陰影付きのボックス）の同一アミノ酸が示される。推定の核配置シグナルが下線を施される。図面の上部に２種のタンパク質構造の図式要約があり、これはヒト同族体中で207アミノ酸がＮ末端で欠いていることを示す。
翻訳コンセンサス配列がまたヒトSUV39H-cDNAの開始ATGの環境中、更にはSu（var）3-9中の相当する内部位置に存在するので、ショウジョウバエ属タンパク質は付加的なエクソンを含むべきであり、これらは進化のその後の段階で機能に必要ではなくなった。
この仮説の正確なことはショウジョウバエ属中で5’末端で完全であり、または短縮されたヒトSUV39H-cDNA及びSu（var）3-9のｃＤＮＡを発現することにより確認し得る。更に、MG-44として知られている別のｃＤＮＡが記載され（以下を参照のこと）、これはまたショウジョウバエ属遺伝子の5’末端を欠いている。SUV39HのヒトｃＤＮＡの他に、相同遺伝子座がまたマウスで単離され（Suv39h;以下を参照のこと）、その配列分析及びプロモーター構造がショウジョウバエ属Su（var）3-9と較べて哺乳類相同遺伝子のアミノ末端短縮を明らかに確認する。
本発明の範囲内で行われたＤＮＡブロット分析は、Su（var）3-9の哺乳類相同遺伝子が個々の遺伝子座によりマウス及びヒト中で提示され、一方、E（z）の哺乳類相同遺伝子がマウス及びヒト中で二つの別個の遺伝子座によりコードされることを示す。また、第二のヒト遺伝子座（EZH1として知られている）がヒトｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンの大半とはそれらの3’隣接配列を異にする少数のｃＤＮＡ変異体を特性決定することにより確認された。配列決定された領域中のEZH2とEZH1の相違が図８に示される。このEZH1のSETドメインはEZH2と較べて突然変異を示す。更に、本発明者らが単離したEZH1変異体（おそらく、異常にスプライシングされたｃＤＮＡ）は47Ｃ末端アミノ酸だけタンパク質を短縮する読み取り枠中に配置された終止コドンを有する。図８は上部ライン中の位置1844〜2330からのEZH2 cDNAのヌクレオチド配列、5’スプライシング部位及び下線を施されている潜在的な終止コドンを示す。EZH1変異体のｃＤＮＡの部分配列をEZH2配列に起因するために、本発明者らはウィスコンシンGCGネットワークサービスのギャッププログラムを使用した。EZH1中の早期終止コドン（位置353）が下線を施されている。保存されたSETドメインをコードする配列が目立つようにされる。更に、異常な転写産物B52（以下を参照のこと）の3’末端（EZH1中の位置151）が示される。利用可能な配列にわたって、B52はEZH1に97％同一であり、かつEZH2に72％同一であることがわかった。EZH1とEZH2との配列比較並びにヒト及びマウス中に二つの別個のE（z）相同遺伝子座があるという知見は、遺伝子重複が哺乳類中で起こったことを結論させる。
ジーンバンクデータバンク中のｃＤＮＡ配列と比較して、腫瘍組織中の異常な転写産物に由来するデータバンクに記録された或るｃＤＮＡ部分配列は本発明のｃＤＮＡの突然変異バージョンを構成することが驚くことにわかった。
一方、乳癌及び卵巣癌にかかりやすくする遺伝子であるBRCA1に関する研究において、271ヌクレオチドを有する部分ｃＤＮＡ配列が単離され、B52として知られ、これはSETドメインの突然変異体をコードし、それがヒト染色体17q21にマッピングされた（Friedmanら，1994）。本発明の範囲内で、B52は本発明のEZH1-cDNA変異体（上記を参照のこと）と97％の同一性を示すことが驚くことにわかった。EZH1はおそらく再活性化が脱調節された増殖に役割を果たす遺伝子であるかもしれない。
一方、ｃＤＮＡ（2,800ヌクレオチド; MG-44）がヒト染色体Xpl1（Geraghtyら，1993）から単離され、その領域は網膜及び滑膜の肉腫の変性疾患にかかりやすくする。このｃＤＮＡは本発明のSUV39H-cDNAと98％の同一性を有することが驚くことにわかった。
こうして、本発明の範囲内で調製された新規遺伝子は、或る種の癌とクロマチンレギュレーター中の突然変異の間の相関関係を推定することを可能にする。MG-44-cDNAの場合、それがクロモ−ドメイン及びSETドメインを中断する多数の点突然変異及びフレームシフト突然変異を有するので、本発明のSUV39H-cDNAを使用してSu（var）3-9とMG-44の相関関係を明らかにすることが初めて可能になった。
既に記載された配列は別にして、ジーンバング配列データバングはまた、SETタンパク質ファミリーの別のヒト員としてショウジョウバエ属trxの良く報告されたヒト同族体、HRX/ALL-1（Tkachukら，1992; Guら，1992）を記録し、そしてまたヒト主要組織適合性複合体中に存在するG9aとして知られている未知の機能の遺伝子（Milner及びCampbell, 1993）を記録し、第三に未熟ミエロイド腫瘍細胞から単離された未公表のｃＤＮＡ（KG-1）（Nomuraら，1994）を記録する。G9aは突然変異バージョンが従来知られていないSETドメインを有する現在唯一のヒト遺伝子であるが、KG-1はSETドメインをアミノ末端ハーフ及びカルボキシ末端ハーフに開裂する342アミノ酸の挿入を有する。おそらく、このKG-1-cDNAは異常にスプライシングされた変異体を構成する。何となれば、その挿入の両末端に5’及び3’コンセンサススプライシング部位があるからである。
合計で、SETタンパク質ファミリーの５種の現在知られているヒト員のうちの４種が変化を受けており、その全ての変化がSETドメインを突然変異する（HRX/ALL-1、EZH1/B52、SUV39H/MG-44及びKG-1）。更に、三つの場合に、トランスロケーション破損点または不安定な染色体領域の付近の相当するヒト遺伝子座がマッピングされた（HRX/ALL-1、EZH1/B52及びSUV39H/MG-44）。図３はヒトSETドメイン遺伝子の異常な転写産物を示す。図の左に、適当な染色体に関する５種の現在知られているSETドメイン遺伝子の位置がある。図は、とりわけ、異常なｃＤＮＡがトランスロケーション破損点または不安定なクロマチン領域にマッピングされた３種の遺伝子（HRX/ALL-1、EZH1/B52及びSUV39H/MG-44）を示す。示された５種のSETドメイン遺伝子のうちの４種が突然変異を有し、その全てが図中に暗いボックスにより示されているカルボキシ末端SETドメインを中断する。トランスロケーションはHRXのアミノ末端ハーフを無関係の遺伝子配列（これはENLと称される点付きのボックスとして示される）に連結する。突然変異及び早期終止コドンはEZH1/B52のSETドメインを変化する。点突然変異及びフレームシフト突然変異はMG44中のクロモ−ドメイン及びSETドメインを中断する。大きい挿入はKG-1のSETドメインを二つのハーフに開裂する。現在、G9aについて異常な転写産物は知られていない。B52中のシステインに富むクラスターが点付きのボックスとして示される。HRX/ALL-1では、メチルトランスフェラーゼとの相同性の領域が陰影付きのボックスとして示され、A/Tフックが垂直の線として示される。夫々の場合の真正遺伝子の名称が図の右手側に示される。
SETタンパク質ファミリーの哺乳類遺伝子であるHRX/ALL-1がトランスロケーション誘導白血病発生と関連していたという事実（Tkachukら，1992; Guら，1992）は、SETドメインを含むタンパク質が遺伝子発現のクロマチン依存性変化を同時決定する発育の重要なレギュレーターであるだけでなく、突然変異後に、それらがまた正常な細胞増殖を中断するという強力な指示である。
従来記載された突然変異の全てがSETドメインの一次構造を中断するので、正常な状態から形質転換された状態への転移に重要な役割を果たすのはSETドメインそのものであることを仮定することは正当である。更に、SETドメインは酵母からヒトに至るまで生じる遺伝子産物中のその進化的保存に鑑みて重要な役割を有するものと考えられる。
図４はSETドメインタンパク質の進化的保存を示す。ウィスコンシンGCGネットワークサービスのtfastaプログラムを使用して、SETドメインに対する相同性を有するタンパク質及び読み取り枠が同定された。図は酵母からヒトに至るまでの代表的な選択を示す。番号はアミノ酸を示す。カルボキシ末端SETドメインが黒色のボックスにより表され、Cysに富む領域が暗い点付きのボックスにより示され、Su（var）3-9中のGTP結合モチーフが明るい点付きのボックスにより示され、またSu（var）3-9及びH3-9のクロモ−ドメインが明るい点付きのオープンボックスにより示される。メチルトランスフェラーゼに相同である領域（trx及びHRX）が陰影付きのボックスとして示される。A/Tフックが垂直の線により示される。また、別のSerに富む領域（C26E6.10中のS）及びGluに富む領域（G9a中のE）またはアンキリンリピート（G9a中のANK）が強調される。YHR119（ジーンバンク受理番号U00059）及びC26E.10（ジーンバンク受理番号U13875）は機能上の特性決定をしないでデータバンクに最近入れられたコスミドの読み取り枠である。％はヒト及びショウジョウバエ属のタンパク質間の合計のアミノ酸同一性を示す。
図５はSETドメイン中のアミノ酸の間の一致を示す。図４に示された遺伝子のSETドメインは、ウィスコンシンGCGネットワークサービスのパイルアップ・プログラムを使用して配置された。KG-1 SETドメインを比較するために、SETドメインを二つのハーフに分ける大きいアミノ酸インサートがパイルアップの前に除去された。10の一致のうちの８を有するアミノ酸位置が強調される。
本発明の範囲内で定められた基準に基いて、SETドメインを有する遺伝子は脱調節された増殖のクロマチン依存性発生に関与することが明らかになる。こうして、これらの遺伝子またはそれらに由来するｃＤＮＡ並びに部分配列及び突然変異配列がこのような増殖に起因し得る疾患の治療及び診断に使用し得る。
正常細胞及び形質転換細胞の間のSETドメインＲＮＡの転写レベルの差異は、SETドメイン遺伝子の発現が脱調節される疾患の診断パラメーターとして使用し得る。
こうして、SETドメインそのものまたはその部分をコードするオリゴヌクレオチドは、SETドメインが突然変異される癌の或る型を診断するために診断マーカーとして使用し得る。本発明の範囲内のSETドメイン遺伝子配列の診断上の使用に関する本発明のｃＤＮＡまたはその部分の機能の詳細な分析について、相同のマウスｃＤＮＡがEZH1（Ezh1）及びSUV39H（Suv39h）から単離された。正常なマウス発育中のEzh1遺伝子活性を研究するために“RNAse保護”分析においてSETドメインをコードするマウス特異性ＤＮＡプローブを使用する場合、bmiの発現プロフィール（Hauptら，1991）に似ている若干広い発現プロフィールが明らかになった。そのマウス配列を用いて行われた分析は、種々のヒト細胞培養系における未熟前駆細胞、腫瘍細胞及び分化細胞の間のＲＮＡの量を比較するためにヒト配列で拡大された。それ故、SETドメインが特別な癌の診断腫瘍マーカーまたは一般の診断パラメーターとして適しているかを見出すために、関連実験マニュアル（Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及びManiatis,T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されたようにＲＮＡ濃度を測定するための現行の方法、例えば、ノーザンブロット、S1-ヌクレアーゼ保護分析またはRNAse保護分析を使用することが可能である。
SETドメインが特別な突然変異を受ける頻度を調べるために、SET特異性ＤＮＡプローブを使用して一本鎖コンホメーション多形性を分析することが可能である（SSCP; Gibbonsら，1995）。
SET特異性ＤＮＡプローブが診断マーカーとして使用し得る癌の型は乳癌（EZH1; Friedmanら，1994）、滑膜癌（SUV39H; Geraghtyら，1993）及び白血病である。
SETドメイン遺伝子のヌクレオチド配列の知識に鑑みて、ｃＤＮＡ配列に由来する相当するタンパク質（これらはまた本発明の目的である）を、それらをコードするｃＤＮＡを好適なベクターに挿入し、それらを宿主生物中で発現することにより、組換え形態で生成することが可能である。組換えタンパク質を生成するのに使用される技術は当業者に公知であり、また関連マニュアル（Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及びManiatis,T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）から採用されてもよい。
こうして、本発明は、別の局面において、EZH2、SUV39HまたはEZH1をコードするＤＮＡ及びそれらに機能的に連結する発現調節配列を含む組換えＤＮＡ分子、並びにそれにより形質転換された宿主生物に関する。
本発明の組換えタンパク質はクロマチンまたは異質クロマチン複合体のその他の員とのSETドメインタンパク質の相互作用を分析するのに使用し得る。これらの複合体の活性の様式に関してこうして得られた知見から開始して、それに関与するメカニズムにおける標的された介入に関する詳細な可能性が特定され、治療用途に使用し得る。
SETドメインの機能を更に分析するのに利用できる研究が、例えば、ヒトEZH2またはSUV39Hをコードし、かつエピトープ（それに対する抗体が利用できる）を備えているｃＤＮＡをin vitro及び組織培養で発現することにより行われる。適当なエピトープ特異性抗体による免疫沈殿後に、EZH2及びSUV39Hがin vitroで互いに相互作用することができること、また複合体形成がEZH2及び／またはSUV39Hとその他のクロマチンレギュレーターの間でin vivoで起こることを証明することが可能である。
異質クロマチンタンパク質の種々の員の間の複合体形成がそれらの機能に必須であることがその他の著者ら（DeCamillisら，1992; Rastelliら，1993; Orland及びParo, 1993）により既に推定されていた。本発明のSETドメイン遺伝子の利用可能性に鑑みて、SET領域が相互作用のために機能するドメインを構成すること、またはそれが多量体の異質染色質性複合体の形成に寄与することを測定することが可能である。同様に、SETドメインがGAGA因子（Adamsら，1992）を含む種々のクロマチンレギュレーターのアミノ末端BTBドメインと同様の抑制機能を有することを測定することが可能である。全部で、エピトープを備えたEZH2及びSUV39Hタンパク質との相互作用の分析はSETドメインの機能の更なる特性決定を可能にする。これは、例えば、遺伝子治療方法を使用してSETドメインｃＤＮＡ配列の優性−陰性変異体を細胞に導入することにより、脱調節された活性に対して作用することの可能性を広げる。このような変異体は、例えば、最初にSETタンパク質の機能性ドメイン、例えば、ＤＮＡ／クロマチン相互作用またはタンパク質間の相互作用の原因の配列部分を特定し、次いで無傷の機能性タンパク質により生じる脱調節された増殖と競合するために、一種以上の関連ドメインまたはその部分により短縮されたＤＮＡ配列を当該細胞中で発現することにより得られる。
また、本発明のｃＤＮＡの利用可能性は、トランスジェニック動物、例えば、マウスを生産することを可能にし、これらの動物中で、SETドメイン遺伝子が過剰発現でき（“機能の獲得”）、またはこれらの遺伝子がスイッチオフし得る（“機能の損失”）。本発明の遺伝子の相当する動物配列、特にマウス配列が最終分析に使用される。また、これらのマウスは本発明の目的である。
特に、本発明の遺伝子の対立遺伝子がマウスに導入される“機能の獲得”分析は、腫瘍形成のクロマチン依存性要件におけるEZH2及びSUV39Hの原因となる関与について最終の結論を与える。“機能の獲得”分析について、ヒトEZH2及びSUV39Hの完全ｃＤＮＡ配列並びにこれらの突然変異バージョン、例えば、EZH1/B52及びMG-44が高い発現率を可能にするベクター、例えば、ヒトβ−アクチンプロモーターを有するプラスミド、及び免疫グロブリン（Eμ）のＨ鎖のエンハンサーそしてまたモロニーウイルスエンハンサー（Mo-LTR）により誘導し得る。最近、bmi遺伝子（これはEZH2と共通に陰性クロマチンレギュレーターのPcグループに属する）のEμ/Mo-LTR依存性過剰発現がトランスジェニックマウス中にリンパ腫を生じるのに充分であることが示されていた（Alkemaら，1995）。
“機能の損失”分析において、Ezh1及びSuv39hの内在性マウス遺伝子座が胚幹細胞中で相同組換えにより中断されるものと仮定すると、in vivo遺伝子機能の損失がマウスの異常な発育をもたらすことを測定することが可能である。
これらのin vivo系の結果として、EZH2及びSUV39Hの活性が確認し得る。これらの系はまたヒト遺伝子治療と関連する動物モデルの基礎を形成する。
本発明のＤＮＡ配列またはそれから誘導された配列（例えば、相補アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、機能性遺伝子配列を導入することにより、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子発現を抑制することにより、または優性−陰性突然変異体をコードする配列を導入することにより、治療すべき疾患が機能性遺伝子配列の不在の結果として、または相当する遺伝子の過剰発現の結果としてクロマチンの脱調節に起因し得ることに応じて、遺伝子治療に使用し得る。当該ＤＮＡ配列は高等真核生物細胞のトランスフェクションのための通常の方法（これはウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス）を使用する遺伝子移入を含んでもよい）を使用して、またはレセプター介在性エンドサイトーシスに基く非ウイルス系を使用して細胞に挿入し得る。普通の方法の概説が、例えば、Mitani及びCaskey, 1993; Jolly, 1994; Vile及びRussel, 1994; Tepper及びMule, 1994; Zatloukalら，1993; WO 93/07283により与えられる。
本発明の遺伝子の発現を抑制するために、転写の機構に干渉する低分子物質を使用することがまた可能である。遺伝子の5’調節領域を分析した後に、例えば、WO 92/13092に記載された方法を使用して、この領域との関連転写因子の相互作用を完全または部分的に阻止する物質についてスクリーニングすることが可能である。
脱調節された増殖の抑制はまたEZH2タンパク質またはSUV39Hタンパク質の相当する抗体、例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体を治療上使用することにより遺伝子産物に作用し得る。このような抗体は既知の方法により、例えば、Malavsi及びAlbertini, 1992またはRhein, 1993により記載されたようにして産生される。
また、本発明は治療上または診断上使用し得るEZH2またはSUV39Hの抗体に関する。
図面の要約
図１：EZH2とE（z）の間のアミノ酸配列の比較
図２：SUV39HとSu（var）3-9の間のアミノ酸配列の比較
図３：ヒトSETドメイン遺伝子の異常な転写産物
図４：SETドメインタンパク質の進化的保存
図５：SETドメイン中のアミノ酸の一致
図６：EZH2のＤＮＡ及びアミノ酸配列
図７：SUV39HのＤＮＡ及びアミノ酸配列
図８：ヒトEZH2及びEZH1のｃＤＮＡの間の部分配列の比較
実施例
a）ｃＤＮＡライブラリーの調製
Bardwell及びTreisman, 1994により記載されたようなヒトＢ細胞特異性ｃＤＮＡライブラリーを、ポリ（A）+-RNAをヒトBJA-B細胞から単離し、それをポリ（dT）15プライミングにより逆転写酵し、それを二本鎖ｃＤＮＡに変換することにより調製した。配列5’ AATTCTCGAGCTCGTCGACAのEcoRIアダプターの添加後に、ｃＤＮＡをバクテリオファージgt10のEcoRI部位につないだ。ライブラリーの増殖及び増幅をE.coli C600中で行った。
b）ＤＮＡプローブの調製
E（z）及びSu（var）3-9の保存SETドメインをコードするショウジョウバエ属ＤＮＡプローブをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により公表されたショウジョウバエ属配列（Jones及びGelbart, 1993; Tschierschら，1994）に基いて調製した。ショウジョウバエ属メラノガスター（Drosophila melanogaster）ＤＮＡ（クロンテク）１μgを２種のプライマーE（z）1910（5’ ACTGAATTCGGCTGGGGCATCTTTCTTAAGG）及びE（z）2280（5’ ACTCTAGACAATTTCCATTTCACGCTCTATG）とともにPCR増幅（94℃で30秒、55℃30秒及び72℃で30秒の35サイクル）にかけた。Su（var）3-9に関する相当するSETドメインプローブを、同サイクル条件を使用して、プライマーsuvar.up（5’ ATATAGTACTTCAAGTCCATTCAAAAGAGG）及びsuvar.dn（5’ CCAGGTACCGTTGGTGCTGTTTAAGACCG）の対を用いてプラスミドＤＮＡ（Tschierschら，1994;クローンM4）10ngから増幅した。得られたSETドメインＤＮＡフラグメントをゲル精製し、増幅された配列の正確さを確かめるために部分配列決定した。
c）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
5 x 105プラーク形成単位（pfu）をE.coli C600のバクテリア宿主株の培養液（10mMのMgSO4中0.5の光学密度OD600で懸濁した）5mlとともに37℃で15分間インキュベートし、ついで大きい（200mm x 200mm）予熱されたLB皿に注入した。37℃で一夜増殖した後、ファージをナイロン膜（ジーンスクリーン）に吸収させた。吸収されたファージを含む面を上向きにして、膜を変性溶液（1.5MのNacl、0.5MのNaOH）中で30秒間浮遊させ、次いで変性溶液に60秒間浸漬し、最後に3MのNacl、0.5MのトリスpH8中で５分間中和した。次いで膜を3xSSC中で素早くすすぎ、ファージＤＮＡをUV架橋によりナイロンフィルターに固定した。フィルターをチャーチ緩衝液（１％のBSA、1mMのEDTA及び0.5MのNaHPO4、pH7.2）30ml中で30分間にわたって50℃でプレハイブリダイゼーションし、次いで（E（z）-SET及びSu（var）3-9-SET）の放射能標識したＤＮＡプローブ混合物2 x 106cpmを添加した。そのＤＮＡプローブをレジプライム（RediPrime）キット（アメーシャム）を使用してランダムプライミングにより調製した。ハイブリダイゼーションを50℃で一夜行った。ハイブリダイゼーション溶液を除去した後、フィルターを周囲温度で2xSSC、１％のSDS中で10秒間洗浄し、次いで50℃で10秒間洗浄した。フィルターをサランラップで包み、増感フィルムを使用してオートラジオグラフィーにかけた。
オートラジオグラムを整合することにより、陽性ファージコロニーを最初のプレートで同定し、パスツールピペットの大きな端部を使用して、相当する寒天フラグメントを除去した。ファージプールを、二三滴のCHCl3を含む、SM緩衝液（H2O １リットル中、Nacl 5.8g、MgSO4-H2O 2g、50mlのトリスpH7.5、５mlの２％のゼラチン）１ml中で４℃で一夜溶離した。個々の良く単離された陽性プラーク（第三ラウンドでプレート当たり20〜100のプラークを）得るために、ファージ溶解産物をスクリーニングの第二ラウンド及び第三ラウンドのために塗布した。
d）配列分析
組換えファージからのｃＤＮＡをｐブルースクリプトKS（ストラタゲン）のポリリンカーにサブクローン化し、ジデオキシ方法を使用して自動配列決定装置（アプライド・バイオシステムズ）中で配列決定した。得られた遺伝子当たり少なくとも２種の独立の単離物の完全配列をプライマーウォーキングにより決定した。配列をGCGソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン大学）で分析し、“ブラスト・アンド・ファスタ”または“tfasta”ネットワークサービスを使用して相同性に関する研究を行った。EZH2及びSUV39Hの完全配列を図６及び７に示す。
0004295824.tif 000002
0004295824.tif 000003
［配列表］
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2600塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）起源：
（A）生物名：ヒト
（G）細胞の種類：B-cell
（ix）特徴：
（A）名称／キー：5’UTR
（B）存在位置:1..89
（ix）特徴：
（A）名称／キー：CDS
（B）存在位置:90..2330
（ix）特徴：
（A）名称／キー：3’UTR
（B）存在位置:2331..2600
（xi）配列：配列番号：１：
0004295824.tif 000004
0004295824.tif 000005
0004295824.tif 000006
0004295824.tif 000007
0004295824.tif 000008
0004295824.tif 000009
0004295824.tif 000010
0004295824.tif 000011
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：747アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：２：
0004295824.tif 000012
0004295824.tif 000013
0004295824.tif 000014
0004295824.tif 000015
0004295824.tif 000016
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2732塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）起源：
（A）生物名：ヒト
（G）細胞の種類：B-cell
（ix）特徴：
（A）名称／キー：5’UTR
（B）存在位置:1..44
（ix）特徴：
（A）名称／キー：CDS
（B）存在位置:45..1283
（ix）特徴：
（A）名称／キー：3’UTR
（B）存在位置:1284..2732
（xi）配列：配列番号：３：
0004295824.tif 000017
0004295824.tif 000018
0004295824.tif 000019
0004295824.tif 000020
0004295824.tif 000021
0004295824.tif 000022
0004295824.tif 000023
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：413アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：４：
0004295824.tif 000024
0004295824.tif 000025
0004295824.tif 000026
0004295824.tif 000027
（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：489塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）起源：
（A）生物名：ヒト
（G）細胞の種類：B-cell
（ix）特徴：
（A）名称／キー：CDS
（B）存在位置:1..341
（C）他の特徴：部分配列、配列番号１の配列に相同
（ix）特徴：
（A）名称／キー：ハイポセティカル非コード領域
（B）存在位置:342..489
（xi）配列：配列番号：５：
0004295824.tif 000028
0004295824.tif 000029
（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：113アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（E）WEITERES MERKMAL: Teilsequenz, Homologie zu SEQ ID NO. 2
（ii）分子の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：６：
0004295824.tif 000030
（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：20塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ix）特徴
合成アダプター分子
（xi）配列：配列番号：７：
0004295824.tif 000031
（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：31塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ix）特徴：
合成プライマー分子
（xi）配列：配列番号：８：
0004295824.tif 000032
（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：31塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ix）特徴：
合成プライマー分子
（xi）配列：配列番号：９：
0004295824.tif 000033
（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ix）特徴：
合成プライマー分子
（xi）配列：配列番号：１０：
0004295824.tif 000034
（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：ヌクレオチド
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：DNA
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ix）特徴：
合成プライマー分子
（xi）配列：配列番号：１１：
0004295824.tif 000035
【図１】
0004295824.tif 000041
【図２】
0004295824.tif 000042
【図３】
0004295824.tif 000043
【図４】
0004295824.tif 000044
【図５】
0004295824.tif 000045
【図６】
0004295824.tif 000046
0004295824.tif 000047
0004295824.tif 000048
【図７】
0004295824.tif 000049
0004295824.tif 000050
【図８】
0004295824.tif 000051