(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスまたはアデノウイルス性タンパク質を除いたウイルスおよび／またはウイルス性タンパク質を、ワクチンとしての使用のために生産する方法であって、
アデノウイルスのＥ１遺伝子の少なくとも１種の遺伝子生成物をコード化する少なくとも１種の配列を、前記ウイルスをコード化する核酸と共に備えている細胞を提供する工程、
前記細胞を適切な培地において培養する工程および前記ウイルスを発現させる工程、および
前記ウイルスおよび／またはウイルス性タンパク質を前記培地および／または前記細胞から収集する工程を具え、
前記細胞は培地において増殖させるために不死化されており、および前記細胞はヒトの胚性網膜芽細胞から導かれている、方法。
【請求項２】
Ｅ１遺伝子の少なくとも１種の遺伝子生成物をコード化する前記配列は前記ヒト細胞のゲノムにおいて存在する、請求項１記載の方法
【請求項３】
前記細胞はアデノウイルス構造タンパク質を生産しない、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞はさらに、Ｅ２Ａをコード化する配列を備える、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
Ｅ２Ａをコード化する前記配列は前記ヒト細胞のゲノムにおいて存在する、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記Ｅ２Ａコード化配列は温度感受性突然変異Ｅ２Ａをコード化する、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト細胞は他にアデノウイルス配列を含まない、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト細胞は懸濁物において増殖し得る、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト細胞は血清の不存在下に培養される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト細胞はＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号の下に受託されたような細胞またはその誘導体である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスは、翻訳後および／または翻訳周辺の修飾を受けるタンパク質を備える、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾はグリコシル化である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス性タンパク質はインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼおよび／または血球凝集素を備える、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスは、ライノウイルス、口蹄疫ウイルス（aphtovirus）または灰白髄炎ウイルスのような腸内ウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルスまたはウシヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスのようなオルソミクソウイルス、または、ニューカッスル病ウイルス、呼吸シンティチオウイルス（respiratory syncitio virus）、流行性耳下腺炎ウイルス、または麻疹ウイルスのようなパラミクソウイルスである請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスはヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルスであり、または前記ウイルスはパルボウイルスまたはパポーバウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスは、ロタウイルス、または伝染性胃腸炎ウイルスのようなコロナウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、または黄熱ウイルスのようなフラビウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスは、風疹ウイルス、または東洋、西洋もしくはベネズエラのウマ脳脊髄炎ウイルスのようなトガウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスはＡ型肝炎もしくはＢ型肝炎ウイルスのような肝炎誘起ウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスは豚コレラウイルスのようなペスチウイルス、または、狂犬病ウイルスのようなラブドウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスはハンタウイルスのようなブニヤウイルス科ウイルスである、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
不死化したヒト細胞で、アデノウイルスの少なくとも１種のＥ１タンパク質をコード化する配列をそのゲノムにおいて持ち、構造上のアデノウイルスタンパク質を生成しない細胞の、ワクチンにおいて用いるためのアデノウイルスではないウイルスの生産についての使用であって、前記ヒト細胞はヒトの胚性網膜芽細胞から導かれる、使用。
【請求項２４】
前記ヒト細胞は、ＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号の下に受託されたような細胞またはその誘導体である、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記ヒト細胞はさらに、そのゲノムにおいて、Ｅ２Ａをコード化する配列を備える、請求項２３又は２４記載の使用。
【請求項２６】
前記Ｅ２Ａは温度感受性である、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ヒト細胞であって、アデノウイルスの少なくとも１種のＥ１タンパク質をコード化する配列をそのゲノムにおいて持ち、細胞は、構造上のアデノウイルスタンパク質を生産せず、およびアデノウイルスではないウイルスをコード化する核酸を持ち、前記ヒト細胞はヒトの胚性網膜芽細胞から導かれる、ヒト細胞。
【請求項２８】
ＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号の下に受託されたような細胞から導かれる、請求項２７記載のヒト細胞。
【請求項２９】
さらに、Ｅ２Ａをコード化する配列をそのゲノムにおいて備える、請求項２７又は２８記載のヒト細胞。
【請求項３０】
前記Ｅ２Ａは温度感受性である、請求項２９記載のヒト細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ワクチンの開発および製造に関する。特に、本発明は、ウィルスタンパク質および／またはウィルスの生産分野、より詳細には、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞の、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞内で増殖するウィルスを生産するための使用に関する。本発明は、特に、脊椎動物、特に哺乳動物、特にヒトのウィルス病原体からの防御を支援するためのワクチン生産に有用である。
【０００２】
（ヒト）細胞におけるウィルスおよび／ウィルスタンパク質の、好ましくは規定された合成培地を使用した生産手段および方法ならびに細胞および／または培養培地からのウィルスおよび／またはその成分の精製手段および方法を本明細書中に記載している。ウィルスまたはその成分を含む薬学的組成物およびその製造および回収ならびに／または精製法を提供する。
【０００３】
（背景）
ワクチン接種は、最も重要なウィルス感染の処置経路である。多数の抗ウィルス薬が利用可能であるにもかかわらず、典型的には、これらの薬剤の有効性は限定されている。ウィルスへの抗体の投与は、一旦個体が感染すると（受動免疫化）ウィルス感染を処置するためには良好な方法であり、典型的には、ヒトまたはヒト化抗体は多数のウィルス感染を処置する見込みがあると思われるが、ほとんどの有効且つ安全なウィルス感染処置法は能動免疫化による予防法であるか、おそらくそうであろう。能動免疫化は、一般にワクチン接種と呼ばれ、ワクチンは典型的にはワクチンの少なくとも１つの抗原決定基、好ましくは、例えば少なくとも１つのウィルス由来の（ウィルス）ポリペプチドまたはタンパク質のワクチンへの組み込みによる少なくとも１つのウィルスまたは他の病原体の多数の異なる抗原決定基を含む。典型的には、これまでに挙げられている形態には、免疫応答を高めるためのアジュバントが含まれる。これはまた、例えば不活性形態の全ウィルス（病原体）を基本としたワクチンについても可能である。さらなる可能性は生きているものを使用することであるが、これは弱毒化形態の病原性ウィルスである。成体の個体に感染の危険性がない場合は野生型ウィルスの使用もさらに可能であるが、幼児には母親の抗体などによって保護するか保護することができる。ワクチン生産は、常に容易な手順ではない。ウィルス物質が卵で生産される場合があり、これは物質の精製が困難であるので、汚染などに対してさらに安全な手段が必要である。常にではなく時々ではあるが卵の代わりとしての細菌および／または酵母における生産もまた、多数の精製および安全工程が必要であり得る。哺乳動物細胞での生産も選択されるが、哺乳動物細胞の使用には今までのところ全て、例えば血清の存在および／または成長のための固体支持体への接着が必要である。最初の場合では、さらなる精製および安全性ならびに例えばいくつかのウィルスの複製を支持するためにプロテアーゼが必要であることが問題となる。第２の場合、高収量および生産の容易さがさらに問題となる。本発明は、先行技術の系のワクチン用ウィルスおよび／またはウィルスタンパク質生産用の生産系で遭遇する少なくとも１つの問題を克服する。
【０００４】
（詳細な説明）
本発明は、ウィルス生産用のウィルスの増殖および回収のための新規のヒト不死化細胞株を開示する。ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの調節下でのＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１Ａ−およびＥ１Ｂコード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０）を含むプラスミドを使用して、初代ヒト胚網膜細胞のトランスフェクションによってＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ９７／００３２６）を作製した。
【０００５】
以下の特徴によりＰＥＲ．Ｃ６または誘導体はウィルス生産の宿主として特に有用である：十分に特徴づけられたヒト細胞株であること、ＧＬＰに適合するように開発されていること、規定された無血清培地（全てのヒトまたは動物血清タンパク質を欠く）中で浮遊培養物として増殖することができること、約３５時間の倍加時間で、その増殖が回転ボトル、震盪フラスコ、回転フラスコ、および生物反応器と適合していること。
【０００６】
インフルエンザの疫学
Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーであるインフルエンザウィルスは、例年の急性感染性呼吸器疾患の原因物質である。米国だけでも５０００万人のアメリカ人が毎年インフルエンザを罹患している。全世界の推定死亡者数（１９７２〜１９９２）は、６０，０００人である（ＣＤＣ統計）。３つの主要なインフルエンザ伝染病発生例が存在し、すなわち、１９１８年（スペイン型インフルエンザ、推定死亡者数４０００万人）、１９５７年（アジア型インフルエンザ、推定死亡者数１００万人）、および１９６８年（香港型インフルエンザ、推定死亡者数７万人））の発生例である。インフルエンザウィルスの感染は、広範な疾患および合併症に関連し、全世界で特に高齢者および慢性疾患患者が相当数罹患および死亡する。インフルエンザに対するワクチン接種がこの感染に関連するしばしば致死的な合併症の予防に最も有効である（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ、１９９６）。二倍体ヒト細胞株ＭＲＣ−５におけるインフルエンザウィルスの生産が報告されている（Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｅｕｒｉｂｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３）。しかし、インフルエンザウィルスの力価は非常に低い。
【０００７】
インフルエンザウィルス株
現在のインフルエンザワクチンは、インフルエンザＡおよびＢの精製血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む。疫学的に重要な株である３種のウィルスは、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ型（Ｈ３Ｎ２）、およびインフルエンザＢ型である。Ａ型とＢ型との分類は、その核タンパク質（ＮＰ）と基質（Ｍ）タンパク質抗原との間の抗原の相違に基づく。インフルエンザＡ型は、血球凝集素（Ｈ１〜Ｈ５）とノイラミニダーゼ（Ｎ１〜Ｎ９）分子の抗原組成（配列）に基づいてさらに亜群に分類される。これらの代表的な各亜類型が水鳥から単離されており、水鳥は鳥類および哺乳動物種全てのインフルエンザウィルスの根本的な貯蔵者であろう。ブタ−ヒト間、最近では（Ｈ５Ｎ１）トリ−ヒト間での伝染が認められている。
【０００８】
インフルエンザワクチン
世界で以下の３つの型のインフルエンザワクチンが使用されており、全ウィルス、分割した産物、および表面抗原またはサブユニットワクチンである。これらのワクチンは全て来るシーズンにヒト集団において蔓延すると予想されるインフルエンザウィルス株の表面糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む。ワクチンに組み込んだこれらの株を発育中の鶏卵内で増殖させ、その後さらなる処理前にウィルス粒子を精製する。「抗原連続変異（Antigenic drift）」および「抗原不連続変異（Antigenic shift）」として公知の過程によって引き起こされる抗原の変異により、毎年インフルエンザワクチンを調整する必要がある。
【０００９】
「抗原連続変異（Antigenic drift）」は、ウィルスのＨまたはＮタンパク質のいずれかにおける一連の点変異の蓄積によって起こり、アミノ酸置換を引き起こす。これらの置換により、以前の感染によって誘導された中和抗体が妨害され、新規の変異体が宿主に感染することができる。
【００１０】
「抗原不連続変異（Antigenic shift）」は、動物とヒトのインフルエンザＡ型ウィルス間の遺伝子の再組み合わせ（reassortment）による新規の亜類型の出現である。１９５７年（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年（Ｈ３Ｎ２）に流行した株は、トリＨおよび/またはＮ遺伝子が蔓延しているヒトウィルスに組み込まれた再組み合わせウィルスの例であり、後にヒト集団に蔓延し得る。
【００１１】
１００を超える世界中の国立インフルエンザセンターによる疫学的調査に基づいて、世界保健機構（ＷＨＯ）は毎年、通常北半球では毎年２月に、南半球では９月にインフルエンザワクチン組成物を推奨している。この実施は、ワクチンの生産および基準化の時間窓を最大９ヶ月に制限する。大量のワクチンの需要が差し迫っている場合、例えば、インフルエンザＡ型ウィルスの新規の亜類型が惹起された場合、卵の利用可能性は限られているので迅速なワクチン生産の妨げとなり得る。この生産システムのさらなる不都合は、柔軟性の欠如、毒素の存在の危険性および外来ウィルス、特にレトロウィルスの危険性、および不妊に関する問題である。これは、今日の発育途中の鶏卵内でのインフルエンザワクチン生産業務における重大な問題である。
【００１２】
したがって、インフルエンザワクチン生産用の細胞培養系の使用は魅力的な代替法である。インフルエンザウィルスを、サルの腎臓、ウシの腎臓、ハムスターの腎臓、およびニワトリの腎臓を含む、多数の初代細胞上で増殖させることができる。しかし、各ワクチン調製のためにこれらの初代細胞から培養系を再確立する必要があるので、ワクチン生産でのそれを使用することは実用的ではない。したがって、インフルエンザワクチン生産用の継続的な不死化細胞株の使用が魅力的な代替法である。
【００１３】
ＨＡが2つのサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）にタンパク質分解性切断されることがインフルエンザウィルスの感染力に必要とされると認識されることにより、培養系の使用は容易になったが、トリプシンの添加によってこれを得ることができる。トリプシンを含むことにより、マディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（Mardin-Darby canine cell）の複製およびプラーク形成が可能になる（Ｔｏｂｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、１９７５）。
【００１４】
最近、ＭＤＣＫ細胞株は、ワクチン生産用のインフルエンザウィルスの増殖を支持することが示されている（Ｂｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６  ａｎｄ  １９９７、Ｐａｌａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。無血清組織培養培地（ＭＤＣＫ−ＳＦ１）でのＭＤＣＫ細胞の増殖にはトリプシンの使用が必要である。しかし、ＭＤＣＫ細胞は、現在インフルエンザウィルス生産用の基質として承認されていない。
【００１５】
重要なことには、どの非ヒトインフルエンザ生産系も「順応（adaptation）」として公知の固有の欠点を有する。ヒトインフルエンザＡ型およびＢ型ウィルスは共に発育途中の鶏卵内で順応するためにＨＡが変異している。これらの変異により、抗原性が変化する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９３、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｇｕｂａｒｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｒｏｂｅｒｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。ヒトでは、卵順応変異を有するＨＡを含んでいるワクチンで免疫化することにより、非卵順応性ＨＡを含むウィルスに対する中和抗体が減少する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。
【００１６】
ＭＤＣＫ細胞等のイヌ細胞中で増殖するヒトインフルエンザウィルスもまた順応を示すにもかかわらず、範囲が狭い。このようなウィルスは、卵由来ウィルスよりも密接に元のヒト単離物と類似している（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。
【００１７】
さらに、ＮＡの宿主特異的変化およびＮＡの宿主特異的リン酸化パターンは、インフルエンザウィルスの複製に影響を与えることが証明されている（Ｓｃｈｕｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｓｅ、１９９７；Ｓｕｇｉａｒａ  ａｎｄ  Ｕｅｄａ、１９８０；Ｋｉｓｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９７６）。
【００１８】
したがって、インフルエンザウィルスの順応または他の宿主誘導変化を回避することが明らかに有利である。これにより、ウィルス集団がより均一になり、最終的なワクチンがより有効になり得る。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、ワクチン開発に適し、高力価のインフルエンザウィルスの産生の基質としてのヒト細胞を提供することにある。
【００２０】
ロタウィルスおよびロタワクチン
ロタウィルスは、世界中の幼児の重篤な脱水性胃腸炎のもっとも重要な原因である。開発途上国では、ロタウィルスの感染により、年間８０万人以上が死亡している。合衆国では、ロタウィルス感染による推定医療費は、年間１０億米ドルを超えている。
【００２１】
レオウィルス（Reoviridae）ファミリーのメンバーであるロタウィルスは、それぞれ構造または非構造ウィルスタンパク質（ＶＰ）をコードする、１１個のＲＮＡセグメントからなる二本鎖ＲＮＡウィルスである。このウィルスの内部コアは以下の４つのＶＰを含む：ＶＰ１、２、３、および６。ＶＰは、ＨＲＶ群、亜群、および血清型の３つの主要な抗原性を決定する。ＶＰ６によってコードされる、異なる７つの群（Ａ〜Ｇ）の抗原が同定されている。ヒトロタウィルス（ＨＲＶ）の感染は、主に血清型１〜４を有するＡ群のロタウィルスに原因するが、Ａ群のロタウィルスは臨床疾患の９５％を占める。天然の疾患の予防は血清型特異性である。Ａ群は、さらに亜群ＩおよびＩＩに分類される。
【００２２】
ウィルスキャプシドを形成する二重膜外殻は、感染防御免疫に関連する中和化抗原であり且つ血清型を決定する２つのウィルスタンパク質ＶＰ４およびＶＰ７からなるが、血清型決定におけるＶＰ４の役割は小さい。異なる血清型による同時感染の間に、断片化したゲノムは容易に遺伝子の再組み合わせを受けるが、それはワクチンの作製に使用されている特性である（Marsha et al 1999）。
【００２３】
ロタウィルスの世界的蔓延が幼児の罹患率および死亡率に関連することを考えると、ロタウィルスに対する大規模なワクチン接種がこのウィルスに対処する最も有効な方法と考えられる。ワクチン接種の目的は、疾患の予防だけでなく、特に出生から数年間の疾患の重症度および合併症を低減させることである。
【００２４】
現在利用可能な唯一の有効なワクチンは、ヒトロタウィルスのＲＮＡセグメントの再組み合わせに基づく弱毒化経口用生ワクチンであり、そのロタウィルスはアカゲザルロタウィルスの血清型１、２、および４のＶ７をコードし、血清型３のＶＰ７と共にバックグラウンドを供給している。このヒトアカゲザル再組み合わせ４価ワクチン（ＲＲＶ−ＴＶ）によるワクチン接種は重篤な胃腸炎を予防するにおいてとても有効であるが、腸重積症（腸閉塞症）に関連する。この理由で、このワクチンはもはや利用されていない。
【００２５】
（発明の説明）
本発明は、アデノウィルスまたはアデノウィルス性蛋白質以外のウィルスおよび／またはウィルス性蛋白質をワクチンとして使用すべく生成する方法であって、アデノウィルスのＥ１遺伝子もしくはその機能的誘導体の少なくともひとつの遺伝子生成物をコード化する少なくともひとつの配列を備えた細胞を配備する段階と、上記ウィルスおよび／または上記ウィルス性蛋白質をコード化する核酸を上記細胞に提供する段階と、上記細胞を適切な培地内で培養し、上記ウィルスおよび／または上記ウィルス性蛋白質を発現させる段階と、上記培地および／または上記細胞から上記ウィルスおよび／または上記ウィルス性蛋白質を収穫する段階と、を備えた方法を提供する。
【００２６】
本発明まで、再生可能で拡大可能な様式であり、そして／または十分に高収量であり、そして／または精製が容易なワクチン用のウィルスおよび／またはウィルスタンパク質の生産に適切であることが見出されている（ヒト）細胞はほとんどない。本発明者らは、今回、好ましくはゲノムにアデノウィルスＥ１配列を有する細胞が相当量のウィルスの増殖を維持することができることを見出した。
【００２７】
本発明の好ましい細胞は、ヒト初代細胞、好ましくはＥ１遺伝子の遺伝子産物によって不死化された細胞由来である。初代細胞を増殖可能にするために、不死化することが勿論必要である。このような細胞の好適な例は、ヒト胚網膜芽細胞（human embryonic retinoblast）由来のものである。
【００２８】
本発明の細胞では、細胞周期の間にＥ１遺伝子配列が喪失していないことが重要である。したがって、Ｅ１遺伝子の少なくとも１つの遺伝子産物をコードする配列が（ヒト）細胞のゲノムに存在することが好ましい。安全のために、本発明の細胞中に不必要なアデノウィルスを回避するように最善を尽くす。したがって、アデノウィルスの構造タンパク質を産生しない細胞を得ることが本発明の別の実施態様である。しかし、細胞培養による大規模（連続）ウィルス生産を達成するために、細胞が足場を必要とせずに増殖できる様にすることが好ましい。本発明の細胞はこの能力を有する。ウィルスの回収および所望するならば精製が容易な清潔且つ安全な生産系を得るために、本発明の方法を利用することが好ましく、前記ヒト細胞は他のアデノウィルス配列を含まない。本発明の方法および使用のための最も好ましい細胞はＦＣＡＣＣ番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲ．Ｃ６またはその誘導体である。
【００２９】
したがって、本発明は本発明の細胞を使用する方法を提供するものであり、前記細胞はＥ２Ａまたはその機能的誘導体もしくは相似物もしくは断片をコード化する配列を更に備える細胞であり、好ましくはＥ２Ａまたはその機能的誘導体もしくは相似物もしくは断片をコード化する前記配列が前記ヒト細胞のゲノム内に存在する細胞であり、最も好ましくは前記Ｅ２Ａコード化配列が温度感受性突然変異Ｅ２Ａをコード化する細胞である。
【００３０】
さらに、記載のように、本発明はまた、前記（ヒト）細胞が懸濁液中で増殖することができる本発明の方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、前記ヒト細胞を血清の非存在下で培養することができる方法を提供する。本発明の細胞、特に、ＰＥＲ．Ｃ６は、血清または血清成分の非存在下で培養することができるというさらなる利点を有する。したがって、単離が容易であり、安全性が増し、系の信頼度は良好である（合成培地は再現性が最も高い）。本発明のヒト細胞、特に初代細胞に基づいたもの、特にＨＥＲ細胞に基づいたものは、正常な翻訳後および翻訳周辺（peritranslational）の修飾および構築が可能である。これは、この細胞がワクチン用のウィルスタンパク質およびウィルス調製に非常に適切であることを意味している。
【００３２】
したがって、本発明は、ウィルスおよび／またはウィルスタンパク質が翻訳後および／または翻訳周辺修飾を受け、前記翻訳は特にグリコシル化である方法を提供する。任意の信頼できる様式での生産が厄介なウィルスワクチンの好個の例はインフルエンザワクチンである。本発明は、ウィルスタンパク質がインフルエンザウィルスノイラミニダーゼおよび／または血球凝集素の少なくとも１つである方法を提供する。本発明の方法で生産することができる、その他のウィルスタンパク質（サブユニット）およびウィルス（不活化されるべき野生型）または弱毒化ウィルスには、エンテロウィルス（ライノウィルス、アフターウィルス、またはポリオウィルスなど）、ヘルペスウィルス（単純ヘルペスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、またはウシヘルペスウィルスなど）、オルソミクソウィルス（インフルエンザウィルスなど）、パラミクソウィルス（ニューカッスル病ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、または麻疹ウィルスなど）、レトロウィルス（ヒト免疫不全ウィルスまたはパルボウィルスなど）、パポーバウィルス、ロタウィルス、またはコロナウィルス（伝染性胃腸炎ウィルス）、フラビウィルス（ダニ保有脳炎ウィルスまたは黄熱病ウィルスなど）、トガウィルス（風疹ウィルスまたは東洋、西洋、もしくはベネズエラのウマ脳脊髄炎ウィルスなど）、肝炎ウィルス（Ａ型肝炎またはＢ型肝炎ウィルスなど）、ペスチウィルス（豚コレラウィルスなど）、ラブドウィルス（狂犬病ウィルスなど）、ブンヤウィルス科（ハンタウィルスなど）が含まれる。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明の細胞は胚性卵（embryonal egg）であまり有効に増殖しないインフルエンザウィルス株の作製に有用である。
【００３４】
本発明はまた、アデノウィルスの少なくとも一種類のＥ１蛋白質、または、その機能的誘導体、相同体もしくは断片をコード化する配列を当該ヒト細胞のゲノム内に有するヒト細胞の使用方法であって、アデノウィルス構造蛋白質を生成しない該細胞を、ワクチン中で使用するためにウィルスまたは少なくとも一種類のウィルス性蛋白質を生成するための使用方法である、ヒト細胞の使用方法を提供する。勿論、このような用途のためでも、本発明の方法で好ましい細胞もまた好ましい。本発明はまた、本発明の方法および使用により生じる産物もまた提供するものであり、特に適切な賦形剤およびいくつかの形態（不活化ウィルス、サブユニット）のアジュバントからなる薬学的組成物に含まれた場合の、本発明の方法および／または方法で得ることができるウィルスタンパク質およびウィルスを特に提供する。既に登録されているワクチンで得られない場合に限り、通常の臨床試験によって投薬量および投与経路を解明することができる。
【００３５】
したがって本発明は、本発明の方法または使用によって得ることができる、ワクチンに用いるためのウィルスまたはウィルスタンパク質もまた提供するものであり、前記ウィルスまたはウィルスタンパク質はいかなる非ヒト哺乳動物プロテイナーゼ物質も含まず、かつその様なウィルスおよび／またはタンパク質からなる。
【００３６】
本発明は更に、アデノウィルスの少なくとも一種類のＥ１蛋白質、または、その機能的誘導体、相同体もしくは断片をコード化する配列を当該ヒト細胞のゲノム内に有するヒト細胞であって、該細胞はアデノウィルス構造蛋白質を生成せず、且つ、ウィルスまたは少なくとも一種類の非アデノウィルス性蛋白質をコード化する核酸を有する、ヒト細胞を提供する。この細胞を、本発明の方法で使用することができる。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法または本発明の使用によって得ることができるインフルエンザウィルスを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の方法および本発明の使用によって得ることができるインフルエンザワクチンを提供する。
【００３８】
別の観点では、本発明は、本発明の方法または使用によって得ることができる、少なくとも１つのウィルスタンパク質またはウィルスを含むサンプル中のプロテアーゼ活性の同定用キットを提供するものであり、前記ウィルスまたは前記ウィルスタンパク質はいかなる非ヒト哺乳動物プロテアーゼ物質も含まない。本発明のこの態様は、培養培地中のプロテアーゼ活性の同定に特に有用である。培養培地は、プロテアーゼ活性の同定が困難であることが知られている。しかし、本発明のウィルスタンパク質またはウィルスをプロテアーゼの標的として使用することにより、培養培地中の前記プロテアーゼ活性も正確に同定することができる。したがって、好ましい実施形態では、培養培地を含むサンプル中の前記プロテアーゼ活性を同定する。好ましい実施形態では、前記プロテアーゼにはトリプシンが含まれる。好ましい実施形態では、前記ウィルスタンパク質には、ＨＡ０が含まれる。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも部分的にウィルス感染力を保持し得る条件下でインフルエンザウィルスを濃縮する方法であって、細胞培養物から上記ウィルスを含む細胞除去上清を獲得する段階と、低剪断条件下で上記上清を限外濾過する段階とを備える、濃縮方法を提供する。胚性卵（embryonal egg）から回収したインフルエンザウィルス調製物は、典型的にはワクチン調製のために精製する必要がある。典型的には、精製は、少なくとも１つのウィルス濃縮工程が必要である。インフルエンザウィルスのこのような比較的粗製の調製物からのインフルエンザウィルスの現在の濃縮技術は面倒である。本発明の濃縮法を使用すれば、少なくとも一部のウィルス感染力を維持する条件下でインフルエンザウィルス調製物の濃縮が可能である。好ましくは、感染性または感染性にすることができるウィルスを濃縮する。感染性にすることができるとは、ＨＡ０の切断を介した感染性ウィルスの作製を意味する。好ましい実施形態では、中空ファイバを使用して濃縮を行う。中空ファイバは、特に、低剪断条件下でのチオ濃縮物（tio concentrate）に適切である。好ましい実施形態では、細胞培養物にはインビトロ培養細胞が含まれる。本発明の方法を使用した濃縮に特に適切であるのは、インビトロで培養された細胞由来の上清である。上清が無血清培養培地を含む場合、特に適切である。好ましい実施形態では、１つのタンパク質を通過させるがウィルスを保持するフィルターを用いて限外濾過を行う。好ましくは、前記フィルターは５００ＫＤのカットオフである。より詳細には、前記フィルターは７５０ＫＤのカットオフである。特に好ましい実施形態では、さらに、濃縮により少なくとも５００ＫＤ未満分子量からなる蛋白質の一部分、より好ましくは５００ＫＤ未満分子量からなる蛋白質の一部分が取り除かれる。好ましくは、記載のフィルターを使用して濃縮を行う。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法で濃縮した感染性インフルエンザウィルスまたはその誘導体を提供する。本発明の感染性インフルエンザウィルスの誘導体は、典型的には、免疫化に使用することが可能な、ウィルス、ウィルス粒子、またはウィルスタンパク質またはその一部である。典型的には、この免疫化には感染力の不活化工程が必要である。
【００４１】
（実施例）
本発明を例示するために、以下の実施例を提供するが、これらは本発明の範囲の制限を意図しない。
【００４２】
実施例１
材料と方法
ＰＥＲ．Ｃ６およびＭＤＣＫ細胞培養
マディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清および１×Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂｒｅｄａ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で, ３７℃と１０％ＣＯ２で培養した。ＰＥＲ．Ｃ６の浮遊培養物を、１×Ｌ−グルタミンを補足したＥｘＣｅｌｌ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、３７℃と１０％ＣＯ２で、６ウェルディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）での静置培養または４９０ｃｍ２組織培養回転ボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１ｒｐｍで継続的に回転しながら培養した。
【００４３】
免疫蛍光試験
製造者の標準的なプロトコールに従ってＩＭＡＧＥＮＴＭインフルエンザウィルスＡおよびＢキット（Ｄａｋｏ）を使用して、インフルエンザウィルス感染を検出するために、直接免疫蛍光検定法を行った。落射蛍光照明を使用して、サンプルを顕微鏡で観察した。感染細胞を、明るいアップルグリーンの蛍光によって特徴づけた。
【００４４】
ヨウ化プロピジウム染色
細胞ペレットを、当該分野で公知の、３００μｌの冷ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ＋５μｌのヨウ化プロピジウム（濃度５０μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ／ＦＣＳ／アジド溶液中に再懸濁した。次いで、フローサイトメトリー分析によって生細胞および死細胞を検出した。
【００４５】
血球凝集検定法
一般に、インフルエンザウィルス力価についての血球凝集検定法を、当業者に公知の方法に従って行った。ここでは、５０μｌの２倍希釈ウィルスＰＢＳ溶液を、２５μｌのＰＢＳおよび２５μｌの１％シチメンチョウ赤血球懸濁物（Ｂｉｏｔｒａｄｉｎｇ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  Ｂ．Ｖ．）のＰＢＳ溶液に添加し、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、４℃で１時間インキュベートした。血球凝集パターンを試験して記録し、血球凝集単位（ＨＡＵ）として示した。ＨＡＵ数は、完全な血球凝集を示した最も高いウィルス希釈物の逆数に対応する。
【００４６】
インフルエンザＨＡタンパク質のウェスタンブロット分析
一般に、得られたインフルエンザウィルスを、当業者に公知の方法によってラエムリ緩衝液中で破壊し、得られた体積が異なるタンパク質混合物を、１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥを使用して分離した。簡単に述べれば、ブロック溶液（１％ウサギ血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を補足した５％脱脂粉乳（Ｂｉｏｒａｄ）のＴＢＳＴ溶液）によって室温で３０分間ブロットをブロックした後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、ブロットを、５％ウサギ血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで１／５００に希釈した抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７  ＨＡ抗血清（９８／７６８  ＮＩＢＳＣ）と、室温で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。ブロットを、再度ＴＢＳＴで８回洗浄した。最後に、ブロットを、ブロック溶液で１／６０００に希釈したウサギ抗ヒツジ抗血清（ＨＲＰ標識、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）と、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで８回洗浄後、タンパク質−コンジュゲート複合体を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で視覚化し、フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を感光した。ＮＩＢＳＣ（ＵＫ）から抗血清を購入し、ＮＩＢＳＣが推奨する希釈に適用した。
【００４７】
一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）検定法
インフルエンザウィルス感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞由来の上清中の血球凝集素濃度を、以前に記載の（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９７７）一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）試験で同定した。標準的なＮＩＢＳＣ（ＵＫ）抗原および抗血清試薬を使用して検定法を行った。
【００４８】
プラーク検定法
全部で１ｍｌの１０倍連続希釈ウィルス上清を、６ウェルプレート中で密集度９５％まで増殖させたＭＤＣＫ細胞に接種した。３５℃で１時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３ｍｌのアガロース混合物（１．２ｍｌの２．５％アガロース、１．５ｍｌの２×ＭＥＭ、３０μｌの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２４μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ、２５０μｌのＰＢＳ）で過負荷を行った。次いで、細胞を、湿気のある１０％ＣＯ２雰囲気下、３５℃で約３日間インキュベートし、ウィルスプラークを目視によって記録した。
【００４９】
ウィルス感染検定法（ＴＣＩＤ５０）
感染性ウィルスの滴定をＭＤＣＫ細胞に対して行った。簡単に述べれば、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ中、４×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に細胞を播種した。２４時間後、４μｇ／ｍｌの濃度のトリプシン−ＥＤＴＡを含む培地中で、１０倍に連続希釈した１００μｌの培養上清を用いて、細胞を４連で感染させた。感染の２時間後、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシンを含む培地中、３５℃で７日間インキュベートした。次いで、これらの培地由来の上清をＨＡ検定法で試験した。Ｋａｒｂｅｒ（１９３１）の方法に従って、ＴＣＩＤ５０力価を計算した。
【００５０】
βプロピオラクトンでのインフルエンザウィルス不活化
ＰＥＲ．Ｃ６由来のワクチン作製のために、完全に不活化したウィルスを得る目的でウィルスを不活化するため、βプロピオラクトンを使用した当業者に公知の変異プロトコールを行った。βプロピオラクトンは、ウィルス不活化に広く使用されており且つその変異効果が当該分野で周知の非常に有効な薬剤である。この薬剤は、ウィルスゲノムおよび宿主細胞ゲノムの核酸塩基を改変し、その後の複製を妨害する。胚性卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ  ｅｇｇ）で調製した全不活化インフルエンザワクチンの調製に使用した確立したプロコールの後、株あたり約４００μｇのＨＡに対応する量のウィルスを不活化し、最後のワクチン形成に使用した。簡単に述べれば、１体積の０．３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を、９体積のインフルエンザウィルス調製物に添加した。１００体積のリン酸緩衝化ウィルス調製物に１体積の１０％βプロピオラクトン（Ｎｅｗａｌｌ  Ｄｅｓｉｇｎ、ＵＫ）を添加し、２０℃で２４時間インキュベートしてウィルスの不活化を行った。ウィルスの不活化をプラーク検定法でチェックしたが、いかなる不活化バッチについてもプラークは検出されなかった（データ示さず）。
【００５１】
実施例２Ａ
ＰＥＲ．Ｃ６細胞保存および継代培養
細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（応用微生物学研究センターの欧州動物細胞培養物コレクションにＮｏ９６０２２９４０として寄託）またはその誘導体を使用した（ＷＯ９７／００３２６に記載）。細胞株を２力価細胞保存系で保存した。選択した細胞株を異なる場所で保存された研究細胞バンク（ｒＭＣＢ）で保存した。以下のようにこのｒＭＣＢから研究作業細胞バンク（ｒＷＣＢ）を調製した：ｒＭＣＢのアンプルを解凍し、ドライアイスを使用した細胞の凍結に十分な細胞が得られるまで細胞を増殖させた。１ｍｌ（１〜２×１０６細胞／ｍｌ）のｒＷＣＢを含む５００本までのアンプルを、液体Ｎ２フリーザーの気相で保存した。ＷＣＢの５×１０６ＰＥＲ．Ｃ６細胞を含む１本のアンプルを３７℃の水浴中で解凍した。細胞を直ちに５０ｍｌのチューブに移し、１×Ｌグルタミンを補足した９ｍｌの浮遊培地ＥｘＣｅｌｌ  ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって再懸濁した。固定型遠心分離機中、１０００ｒｐｍで３分間の遠心分離後、細胞を３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁し、Ｔ８０組織培養フラスコ中で３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。２〜３日後、細胞を４９０ｃｍ２の組織培養回転ボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に３×１０５／ｍｌの密度で播種し、１ｒｐｍで継続的に回転させた。
【００５２】
実施例２Ｂ
インフルエンザＡウィルス許容細胞株としてのＰＥＲ．Ｃ６細胞
ヒト細胞としてのＰＥＲ．Ｃ６が、インフルエンザウィルス感染および複製に耐える能力については知られていなかった。したがって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞がポジティブコントロールとして使用したイヌ細胞株マディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）と比較してインフルエンザウィルス感染に許容性を示すかどうかを評価した。
【００５３】
感染前日に、２×１０５ＭＤＫ細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、ウェルあたり４×１０５播種したＰＥＲ．Ｃ６およびＭＤＣＫ細胞を、Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（力価３．６×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）（Ｅ．Ｃｌａａｓ、ライデン大学医療センター、オランダから得た）で感染させた。０．１〜１０ｐｆｕ／細胞の範囲の、種々の感染多重度（ｍｏｉ）で感染を行った。３７℃で約２時間のインキュベーション後、種菌を除去し、新鮮な培養培地と交感した。感染から２４時間および４８時間後にインフルエンザウィルスの感染を検出するための直接免疫蛍光検定法を行った。この実験により、ＰＥＲ．Ｃ６のインフルエンザ感染の許容が認められ、陽性細胞の割合はｍｏｉ依存性であり且つＭＤＣＫに匹敵した（図１）。
【００５４】
実施例３
インフルエンザＡウィルス増殖に使用したＰＥＲ．Ｃ６
インフルエンザウィルスの複製および増殖をＰＥＲ．Ｃ６によって支持することができるかどうかを評価した。感染当日、５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下、２×１０６細胞／ｍｌの密度、最終体積４０ｍｌで４９０ｃｍ２組織培養回転ボトルにＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種した。細胞を偽インキュベーションを行うか、Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｓｈｅｎｚｈｅｎ／２２７／９５（力価１．５×１０６ｐｆｕ／ｍｌ）（Ｅ．Ｃｌａａｓ、ライデン大学医療センター、オランダから得た）で感染させた。１０−４および１０−３ｐｆｕ／細胞で感染させた。３７℃で１時間の接種後、１５００ｒｐｍでの細胞の遠心沈降によって種菌を除去し、新鮮な培養培地＋５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ中で細胞を再懸濁した。感染から１〜６日後１．３ｍｌの細胞懸濁物を毎日回収した。上清を−８０℃で保存し、血球凝集検定法に使用した。直接免疫蛍光試験およびヨウ化プロピジウム染色に細胞ペレットを使用した。
【００５５】
異なるインフルエンザ株についてのＰＥＲ．Ｃ６の許容
種々のインフルエンザウィルス株の増殖についてのＰＥＲ．Ｃ６の許容をさらに調査するために、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、ＵＫ）から得たＨ１Ｎ１ワクチン株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびその再組み合わせ物Ｘ−１２７の使用による感染を行った。感染日にＰＥＲ．Ｃ６細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの密度、最終体積５０ｍｌで４９０ｃｍ２の組織培養回転ボトルに播種した。５μｇ／ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡの存在下で、５μｌ（１０−４希釈）および５０μｌ（１０−３希釈）のウィルスを細胞に接種した。トリプシンが実際に必要であるかどうかを証明するために、プロテアーゼの非存在下で、株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５を５μｌ接種することによって、もう１回感染を行った。３７℃で約１時間のインキュベーション後、種菌を１５００ｒｐｍでの細胞の遠心沈降によって除去し、これを５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ有り無し（±）の新鮮な培養培地に再懸濁した。感染から２日後および４日後に、サンプルにさらにトリプシンを添加した。感染から１日目〜６日目に１．３ｍｌの細胞懸濁液を回収した。上清を−８０℃で保存し、血球凝集検定法およびさらなる感染に使用し；細胞ペレットを直接免疫蛍光試験に使用した。上記の免疫蛍光検定法および血球凝集検定法で得られた結果をそれぞれ図４および図５に示し、これはウィルスの有効な複製および放出を示している。
【００５６】
実施例５
ＰＥＲ．Ｃ６で増殖させたウィルスの感染力
ＰＥＲ．Ｃ６で増殖したウィルスは感染性であり、細胞株への順応によりウィルスの収容を増加させることができるかどうかを評価した。株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびその再組み合わせＸ−１２７（ｄｉｌ．１０−３）を感染させ、感染６日後に回収したＰＥＲ．Ｃ６由来のウィルス上清を使用した。感染日にＰＥＲ．Ｃ６細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの密度、最終体積５０ｍｌで４９０ｃｍ２の組織培養回転ボトルに播種した。５μｇ／ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡの存在下で、１００μｌおよび１ｍｌのウィルス上清を細胞に接種した。トリプシンが依然として必要であるかどうかを証明するために、プロテアーゼの非存在下で、１００μｌの株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５を接種することにより、もう１回感染を行った。３７℃で約１時間のインキュベーション後、種菌を１５００ｒｐｍでの細胞の遠心沈降によって除去し、これを５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ有り無し（±）の新鮮な培養培地に再懸濁した。感染から２日後および４日後に、サンプルにさらにトリプシンを添加した。感染から１日目〜６日目に１．３ｍｌの細胞懸濁液を回収した。上清を−８０℃で保存し、血球凝集検定法およびさらなる感染に使用し；細胞ペレットを直接免疫蛍光試験に使用した。上記の免疫蛍光検定法および血球凝集検定法で得られた結果をそれぞれ図６および図７に示す。本実験で得られたデータにより、ＰＥＲ．Ｃ６で増殖したウィルスの感染力ならびにウィルス収量の増加が認められた。
【００５７】
実施例６
ＰＥＲ．Ｃ６でのインフルエンザウィルスの細胞表面レセプターの存在
発育途中の鶏卵内でのヒトインフルエンザＡ型およびＢ型株の増殖により、分子の露出した機能的に重要な領域中のＨＡ球状ヘッドの遠位部分でアミノ酸置換されたレセプター結合変異型が必ず選択される。これらの変異により、卵順応株は、その抗原性および免疫原性活性ならびにその病原性が元のヒトウィルスと異なり得る。ＭＤＣＫ細胞から単離したヒトインフルエンザウィルスは、通常、元の臨床サンプルのウィルスに存在するＨＡタンパク質と同一のＨＡタンパク質を呈する。最近の研究（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａ、１９９９）により、ニワトリ卵での変異型の選択およびＭＤＣＫ細胞におけるこの変異型選択事象の不存在下に基づく細胞を明らかにした。ＭＤＣＫ細胞から単離された全てのヒトインフルエンザＡ型およびＢ型株が、細胞表面レセプター中のオリゴ糖に存在するα２，６シアル酸−ガラクトース結合に高親和性および特異性で結合することが見出されたのに対して、その卵増殖対応物は、オリゴ糖を有する細胞表面レセプター中のα２，３−シアン酸−ガラクトース結合（Ｓｉａ−３Ｇａｌ）の親和性の増加を示した。特定のレクチンを使用して、Ｓｉａ２−３Ｇｌａ含有レセプターが発育途中の鶏卵内細胞の表面上に存在するのに対し、ＭＤＣＫ細胞はＳｉａ２−６ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌの両方を発現することを証明した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞表面上のＳｉａ２−３ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌ部分の発現を、以下の２つの異なるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用したＦＡＣＳ分析によって研究した：Ｓｉａ２−６Ｇａｌ結合を特異的に認識するＳａｍｂｕｃａ  ｎｉｇａ凝集素（ＳＮＡ）およびＳｉａ２−３Ｇａｌ結合を特異的に認識するＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）。図８Ａは、ＳＮＡおよびＭＡＡレクチンの認識およびグリコシル化部位への結合を示す。さらに、図８Ａは、細胞表面上に存在するレセプターのグリコシル化骨格中の特異的シアリル結合を認識するＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体とＤＩＧ標識レクチンとの間の概略的相互作用を示す。両レクチンを、グリカン識別キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）から選択した。
【００５８】
懸濁液および接着性ＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞におけるＰＥＲ．Ｃ６細胞に対する実験を行った。ＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して固体支持体から放出させた。次いで、細胞懸濁液をＭｅｍ−５％ＰＢＳで１回洗浄し、この培地中、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）での洗浄後、細胞を結合培地中（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）、０．５％ＢＳＡ、および１ｍＭの各ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＣａＣｌ２）約１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞アリコートをＤＩＧ標識レクチンＳＮＡおよびＭＡＡと室温で１時間インキュベートした。１時間後、レクチン処理細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に室温でさらに１時間インキュベートした。最後に、細胞ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣ選別装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した蛍光標示式細胞分取器によって分析した。図８Ｂに示した結果は、Ｓｉａ２−６ＧａｌおよびＳｉａ２−３Ｇａｌレセプターの存在を示す両レクチンによって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞が染色されたことを示す。
【００５９】
同様の実験において、両シアリル化レセプターのポジティブコントロールとしてＭＤＣＫ細胞を使用するのに対して、これらのハムスター細胞中にα２−６シアリルトランスフェラーゼグリコシル化酵素が存在しないためにＣＨＯ細胞はＳｉａ２−６Ｇａｌ部分のネガティブコントロールであった。上のパネルはＳＮＡを使用した結果を示し、下のパネルはＭＡＡレクチンを使用した結果を示す。これらの結果から、ＰＥＲ．Ｃ６はそのオリゴ糖鎖中にＳｉａ２−３ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌ結合の両方を有する細胞表面タンパク質を発現すると結論付けることができる。
【００６０】
実施例７
ＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存度、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるインフルエンザウィルス生産、およびそれから誘導されたＨＡタンパク質に対する異なる濃度のトリプシン−ＥＤＴＡの効果。細胞培養物中でのインフルエンザウィルスの増殖にトリプシンが必ず必要であるために、いくつかのインフルエンザ株を使用した感染後のＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＰＥＲ．Ｃ６細胞生存度およびウィルス複製に対する異なる濃度のトリプシン−ＥＤＴＡの効果を調査した。
【００６１】
低濃度のトリプシンの存在下でのインフルエンザウィルス株Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７での感染
感染当日、０．５、１、２、３、および５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡの存在下、１×１０６細胞／ｍｌの密度で４９０ｃｍ２組織培養回転ボトルにＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種した。これらのトリプシン濃度は細胞の成長特性およびその生存度を阻害しなかった（データ示さず）。細胞を偽感染するか、１０−４ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでＰＥＲ．Ｃ６増殖インフルエンザウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７を感染させた。ウィルス生産を直接免疫蛍光（データ示さず）、血球凝集検定法、上記の単一放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）、およびプラーク検定法（全て上記）でモニターした。この実験結果を図９に示し、これは、ＳＲＩＤによって測定したＨＡ含有量およびウイルスの生物活性（ＨＡＵで示す）は１μｇ／ｍｌのトリプシン濃度を使用した場合に最も高いことを示す。図９はまた、プラーク検定法の使用によって、サンプル中でｍｌあたり最も多数のプラーク形成単位（ｐｆｕ）が認められ、これは２μｇ／ｍｌのトリプシンを含む培地で増殖した細胞に対応することを示す。
【００６２】
インフルエンザウィルス株Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４での感染
感染当日、１〜５μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度のトリプシン−ＥＤＴＡの存在下、１×１０６細胞／ｍｌの密度で４９０ｃｍ２組織培養回転ボトルにＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種した。細胞に１０−３ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでＰＥＲ．Ｃ６増殖ウィルスＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４を感染させた。ウィルス生産を、図１０に記載のように直接免疫蛍光、血球凝集検定法、およびプラーク検定法でモニターした。トリプシンの濃縮に伴って２日目のＰＥＲ．Ｃ６の感染力が増加した。しかし、３日目には、１、２．５、または５μｇ／ｍｌのトリプシンが存在する場合、感染細胞の割合に有意差は認められなかった。トリプシンの不存在下では、インフルエンザの感染は検出されなかった。最後の回収日（感染から４日後）に、血球凝集検定法で測定したウィルスの生物活性は顕著には異ならなかった。興味深いことに、感染３日目および４日目で回収したサンプルで行った感染力検定法では、ウィルス生産の相違が認められた。２．５〜５（３日目）および１μｇ／ｍｌ（４日目）のトリプシン濃度を使用した場合に最も高い力価が得られた。
【００６３】
インフルエンザウィルスリアソータントＸ−１２７での感染
感染日に、０〜７．５μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度のトリプシン−ＥＤＴＡの存在下、１×１０６細胞／ｍｌの密度でＴ２５組織培養フラスコにＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種した。細胞に１０−４および１０−３ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでＰＥＲ．Ｃ６増殖ウィルスＸ−１２７（株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５の卵リアソータント）を感染させた。ウィルス増殖を、直接免疫蛍光、血球凝集検定法、およびプラーク検定法でモニターした。図１１および図１２に示すように、ＨＡＵ力価は使用したトリプシン濃度および初期ｍｏｉに関係なくサンプル間で同一であった。さらに、プラーク検定法で測定したところ、感染力価に有意差は認められなかった。
【００６４】
高濃度のトリプシンの存在下でのインフルエンザウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７でのＰＥＲ．Ｃ６の感染
細胞生存度に対する高濃度のトリプシンの効果を試験するために、０〜１２．５μｇ／ｍｌの種々の濃度範囲のトリプシン−ＥＤＴＡの存在下、１×１０６細胞／ｍｌの密度で４９０ｃｍ２組織培養回転ボトルにＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種した。細胞を偽感染するか、１０−５ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでＰＥＲ．Ｃ６増殖ウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７を感染させた。得られたバッチに存在するＨＡＵを、上記のように同定した。重要なことには、図１３に示すデータは、１０μｇ／ｍｌまでのトリプシン濃度では細胞の生存度を阻害しないことを明白に示している。さらに、ＨＡＵで測定したところ、感染から４日後に得たウィルスの生物活性は、使用トリプシン濃度が２．５〜５μｇ／ｍｌである場合により高かった。さらに、ＴＣＩＤ５０を測定し（図１４Ａ）、プラーク検定法を行った（データ示さず）。このプラーク検定法、感染力価（ＴＣＩＤ５０）、ＨＡ切断、およびウェスタンブロット分析で同定した量（約１０μｇ／ｍｌ）（図１４Ｂ）において関連する相違は見出されなかった。
【００６５】
実施例８
中空糸灌流バイオリアクターシステムにおけるＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるインフルエンザウィルス生産
ＰＥＲ．Ｃ６細胞が増殖した懸濁液中でのインフルエンザウィルス生産の拡大性を、２リットルの細胞懸濁体積の血清培地（動物またはヒト由来のタンパク質も含まない）（ＥｘＣｅｌｌ  ５２５、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む３リットル（全体積）のバイオリアクターを使用して研究した。
【００６６】
約３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でインフルエンザ感染を行った。細胞を、１０−４ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでＰＥＲ．Ｃ６増殖Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ウィルスとインキュベートした。５〜１０ｍｌの細胞懸濁液のサンプルを毎日回収して総細胞数を計数し、グルコース濃度測定、直接免疫蛍光、血球凝集、および感染力検定法のために細胞の生存度を同定した。これらの実験結果を図１５に示す。
【００６７】
ＨＡタンパク質の存在および状態を調査するために、ＮＩＢＳＣから入手した２つの異なる抗ＨＡ抗体を使用したウェスタンブロットを使用した。上記のＳＲＩＤ検定法も行った。図１６の２つのウェスタンブロットに示した結果は、このバイオリアクターで生産されたインフルエンザウィルスは、ＳＲＩＤ検定法で確認したところ１５μｇ／ｍｌの推定濃度のＨＡ含有量が得られたことを示す。生産されたＨＡは、サブユニット組成および基準亜類型特異的抗血清との免疫反応性に関して類似する。
【００６８】
実施例９
１５リットルのバイオリアクターにおけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７でのＰＥＲ．Ｃ６の感染後の特異的下流処理工程（ＤＳＰ）
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を増殖させた懸濁液を、１０リットルの細胞懸濁液体積の無血清ＥｘＣｅｌｌ  ５２５培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１５リットルのバイオリアクター中空糸灌流システムにおいて３７℃でインキュベートした。５μｇ／ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３５℃の培地中、約３．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でインフルエンザを感染させた。細胞を１０−４ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで細胞にＰＥＲ．Ｃ６増殖Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ウィルス（第３継代）を接種した。トリプシン−ＥＤＴＡを含む無血清ＥｘＣｅｌｌ  ５２５培地での灌流を感染まで２４時間継続した。感染から２日後、細胞に、以下のグルコース、必須アミノ酸、および追加のグルタミンを含む流加培養液を与えた：５０ｍ／Ｖ％グルコース（ＮＰＢＩ−Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｇｌｎを含まない５０×必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および２００ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む８２ｍｌ／リットル懸濁液。１０ｍｌの細胞懸濁サンプルを毎日回収して、標準的な細胞計数（図１７の右のグラフに結果を示す）、グルコース濃度測定（図１７の右のグラフに結果を示す）、直接免疫蛍光（図１８）、血球凝集（図１９）、および感染力検定法（データ示さず）を行った。さらに、ＨＡタンパク質をウェスタンブロット分析で調査し、ＮＩＢＳＣ標準ＨＡコントロールと比較した（図２０）。全細胞懸濁液の最終回収日（感染から９２時間後）に、製造者が提供するプロトコールにしたがってＰｏｗｅｒｆｕｇｅＴＭ分離システム（Ｃａｒｒ、ＪＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を使用して２０，０００ｇの連続流れ方式で細胞破片の明澄化を行った。次いで、明澄化した上清を５００ｋＤカットオフの中空糸膜カートリッジ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＪＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用して２０倍に濃縮した。図２１に示した結果は、血球凝集および感染力検定法で測定した中空糸による濃縮後の生きたインフルエンザウィルスの定量的回収率非常に有意であることを示す。
【００６９】
実施例１０
ＰＥＲ．Ｃ６増殖インフルエンザウィルスおよびそのワクチンの免疫原性
ＰＥＲ．Ｃ６増殖インフルエンザウィルスの免疫原性を同定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究およびケナガイタチの攻撃モデルを設計した。３株それぞれの１５μｇのＨＡを含む２バッチの３価の全不活化インフルエンザウィルスワクチン（Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４から構成される）を使用した。第１のバッチをニワトリ受精卵から獲得し、第２のバッチをＰＥＲ．Ｃ６細胞から獲得した。３価の全不活化ＰＥＲ．Ｃ６誘導インフルエンザワクチンの生産、精製、不活化、および処方を、下記のように行った。
【００７０】
ＰＥＲ．Ｃ６でのＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４の増殖
２リットルの細胞懸濁液体積の３つの異なる３リットルの中空糸流加バイオリアクターシステムで３つ全てのインフルエンザウィルスバッチの生産を行った。以下の溶液を流加した：５０ｍ／Ｖ％グルコース（ＮＰＢＩ）、５０×Ｇｌｎ以外の必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および７．５ｍ／Ｖ％  ＮａＨＣＯ３（Ｍｅｒｃｋ）を含む９６ｍｌの全量を１回で添加した。５μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを含むＥｘＣｅｌｌ  ５２５無血清培地中、１．８×１０６〜２．６×１０６の生細胞／ｍｌの範囲の細胞密度でインフルエンザ感染を行った。異なるｍｏｉ（１０−４（Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７）または１０−３（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４））でＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４ウィルスバッチをＰＥＲ．Ｃ６細胞に接種した。ウィルス生産期間中、１０ｍｌのサンプルを毎日回収して、標準的細胞および生細胞計数、グルコース濃度測定、直接免疫蛍光、および血球凝集検定法を行った。図２２（Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞からの結果）は、ウィルス感染後の総細胞数および生存細胞数（上の左のパネル）、グルコース消費量（上の右のパネル）、直接免疫蛍光検出中の陽性細胞の割合（下の左のパネル）、およびＨＡＵ（下の右のパネル）を示す。図２３（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞からの結果）は、ウィルス感染後の総細胞数および生存細胞数（上の左のパネル）、グルコース消費量（上の右のパネル）、直接免疫蛍光検出中の陽性細胞の割合（下の左のパネル）、およびＨＡＵ（下の右のパネル）を示す。図２４（Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞からの結果）は、ウィルス感染後の総細胞数および生存細胞数（上の左のパネル）、グルコース消費量（上の右のパネル）、直接免疫蛍光検出中の陽性細胞の割合（下の左のパネル）、およびＨＡＵ（下の右のパネル）を示す。濃縮物を含むウィルスを、ＤＳＰまで−８０℃で保存した。
【００７１】
３つ全ての場合では、グルコース消費およびＰＥＲ．Ｃ６細胞の生細胞および総細胞数は類似していた。直接免疫蛍光で測定した３つのウィルスの生産レベルもまた類似していた。各株でＨＡＵおよび感染力価が異なっていたにもかかわらず、ＰＥＲ．Ｃ６は、ここで試験した全インフルエンザウィルスの複製が維持されていた。
【００７２】
全バッチの回収日（感染後３日または４日）に、ウィルス上清を固定式遠心分離機における２０００ｒｐｍでの遠心分離によって明澄化し、製造者のプロトコールに従って、７５０ｋＤカットオフの中空糸膜（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＪＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用した限外濾過によって１０倍に濃縮した。その後２つの密度遠心分離工程（２５〜７０％のブロックスクロース勾配（２７Ｋで１．５時間）およびその後の２５〜７０％の連続的スクロース勾配（２３Ｋで４時間））によって濃縮上清からインフルエンザウィルスを精製した。ウィルスバンドを約５０ｍｌのリン酸緩衝液で希釈し、超遠心機において２４，０００ｒｐｍで最終的にペレット化した。ウィルスペレットを、１．５〜２．３ｍｌのリン酸緩衝液に溶解し、等分して−８０℃で保存した。不活性化インフルエンザワクチンの処方は、ＳＲＩＤ検定法で測定した「免疫学的に活性な」ＨＡタンパク質の量（μｇ）に基づく（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９７７）。試験を行ってバッチのＨＡ含有量を特徴づけた。それと同時に、製造者が提案する手順に従ったローリーベースのＤＣタンパク質検定法キット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、総タンパク質量を測定した。ＨＡはウィルス調製物の総タンパク質含有量の約２０〜３０％を構成することが見出された。
【００７３】
実施例１１
卵子内およびＰＥＲ．Ｃ６上において生成された不活化ワクチンの生体内免疫原性
白イタチおよびマウスは、インフルエンザ感染症を研究する２つの安定した動物モデルを代表すると共に、インフルエンザワクチンの有効性および免疫原性を決定すべく使用されてきた。マウスモデル検定システムを用いると、ＰＥＲ．Ｃ６および卵子から誘導されてＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４を含む三価ワクチンにより生成される免疫原性は、ワクチン接種された動物の血清を血液凝集抑制検定により分析することで比較される。白イタチの感染症モデルを用いると、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７による攻撃に対しては免疫形成が追随する。２つのワクチンの免疫原性および有効性を比較すべく、ＭＤＣＫ細胞に関するウィルス回収率および血清上で実施された血液凝集抑制検定が使用される。
【００７４】
マウスにおける生体内研究
９０匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスが１０匹ずつの９グループに分けられた。第０日目には、１００μｌの血液が収集された。血清が分離されて−２０℃で保存された。次に各マウスは、表Ｉにおける一覧内容に従い適切なワクチンでワクチン接種された。第２８日目に、更に１００μｌの血液が採取された。血清は−２０℃で保存された。各マウスは再び表Ｉの一覧内容に従いワクチン接種された。第４２日目には、１００μｌの血液サンプルが採取され、全てのマウスは処分された。血清が分離されて−２０℃で凍結された。第０日、第２８日および第４２日からの血清サンプルに対し、血液凝集抑制（ＨＩ）検定が行われた。これらの検定は、卵子および細胞から成長したウィルスの両方に対して各日に関して並行して行われた。
【表１】
0004331432.tif 000002
【００７５】
白イタチにおける生体内研究
１８匹の成熟した雌白イタチ（白子またはケナガイタチ）が以下の如く６匹ずつの３グループに分割された：グループ１は、卵子から誘導された試験用ワクチンＩｎｔｒａ  Ｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ（ＩＭ）を受け、各動物はＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７による攻撃を受けた。グループ２は、ＰＥＲ．Ｃ６から誘導された試験用ワクチンＩＭを受け、各動物はＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７による攻撃を受けた。グループ３は、試験用ワクチンの希釈液のみを受けるとともにＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７による攻撃を受けた。また、第０日目および第２８日目には試験用ワクチンが投与された。第５６日目には全ての白イタチが、ＴＣＩＤ５０１０３における０．５ｍｌのＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７攻撃ウィルスにより鼻腔内的に感染された。鼻腔洗浄が実施されると共に、第５７日目から第６３日目までは一日一回、各白イタチの炎症細胞個数、体温および体重が監視された。第６３日目には、全ての動物が処分された。血清が分離され、−２０℃で保存された。鼻腔洗浄サンプルは氷上に保存され、鼻腔洗浄による回収細胞の計数がトリパンブルー除外検定を用いて実施された。
【００７６】
鼻腔洗浄サンプルから獲得されたウィルスの力価（ｔｉｔｅｒ）は、ＭＤＣＫ細胞上でのウィルス回収率を測定することで決定された。ＴＣＩＤ５０値を計算する上では、ＳｐｅａｒｍａｎおよびＫａｒｂｅｒ（１９３１年）の計算が使用された。また第０日、第２８日、第５６日および第６３日に採取された血清サンプルに対しては、血液凝集抑制検定が行われた。この実験からは、ＰＥＲ．Ｃ６から誘導された試験用ワクチンが有効と結論付けられた。
【００７７】
実施例１２
ＰＥＲ．Ｃ６上で生成されたインフルエンザウィルスから誘導されたＨＡ蛋白質の特性解析
ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＨＡのグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を研究すべく、非開裂ＨＡ（ＨＡ０）が生成された。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、５μｇ／ｍｌの最終濃度にてトリプシンＥＤＴＡを含有するＥｘＣｅｌｌ５２５培地内で１、０．１および０．０１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉにてウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（ＰＥＲ．Ｃ６上の継代数６）により感染された。３５℃における１時間の温置の後、各細胞はＰＢＳにより２度洗浄されてトリプシンが除去され、トリプシンなしで３５℃かつ１０％ＣＯ２にて一晩（Ｏ／Ｎ）温置された。その一日後、細胞懸濁液が収穫かつ遠心分離（５００Ｇ）されると共に、細胞ペレットが媒質により２回洗浄された。ウィルス性の上清が−８０℃で凍結されると共に、そのサンプルは前述のウエスタンブロット検定において用いられ、非開裂ＨＡ蛋白質の有無が吟味された。
【００７８】
非開裂ＨＡ蛋白質（ＨＡ０）は、ジスルフィド結合を介して接続された２つのサブユニット：ＨＡ１およびＨＡ２から成る。このジスルフィド結合はＤＴＴによる還元により分断され得ることから、ＨＡ１およびＨＡ２は還元ゲル上で分離して視認化された後、サブユニットを認識する抗血清を用いてウエスタンブロットが行われる。上記ＨＡ蛋白質がＨＡ０のみから成れば、ＨＡ１サブユニットおよび最速移動ＨＡ２サブユニットと比較してＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを通り更に低速で移動する１つのバンドが視認可能である。図２５に示された結果は、ＮＩＢＳＣ（英国）から得られた卵子誘導の陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較し、主としてＰＥＲ．Ｃ６感染からの非開裂ＨＡ０の存在を示唆した。検出されたバンドが実際に非開裂ヘムアグルチニンであることを確認すべく、３７℃にて一晩、培地において２．５〜１０μｇ／ｍｌの種々のトリプシン濃度でＨＡ０サンプルが温浸（ｄｉｇｅｓｔ）された。温浸された蛋白質は次に、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に還元条件で装荷されてから、図１４に対して記述されたのと同一の抗血清を用いたウエスタンブロット検定が行われた。図２６Ａに示された如くＨＡ０の開裂が行われ、ＰＥＲ．Ｃ６上での非開裂ＨＡ蛋白質の生成が確認された。これらの結果に基づき、基質としてインフルエンザＨＡ０を用いて培養培地内でトリプシン活性を決定する検定法が開発された。
【００７９】
トリプシン活性検定法
インフルエンザ生成処理進行を行う培養培地内に存在するトリプシンが依然として有効であるか否かを決定すべく、トリプシン活性検定法が開発された。この検定法は、インフルエンザワクチン生成に対して最も適切な基質：ＨＡ０を開裂するトリプシンの酵素活性の測定値に基づいている。
【００８０】
インフルエンザＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４（ｍｏｉ  １０−３／１０−４  ｐｆｕ／細胞）が植え付けられたＰＥＲ．Ｃ６の培養株内において、生成処理進行の全体に亙りトリプシンが有効なままであるか否かが決定された。この目的の為に、感染後の第１日目、第２日目および第３日目に採取された１０μｌの上清が、インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７のＨＡ０から成る６８ｎｇの基質を３７℃で一晩開裂すべく使用された。温浸に続き、１５０ｍＭのＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ）による３ｘのＬａｅｍｌｉ緩衝液内で１ｘの最終濃度（完全プロテアーゼ抑制因子混合物、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）までプロテアーゼ抑制因子が添加された。上記サンプルは１０％のＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上に装荷され、処理進行された。前述の如くウエスタンブロットが行われた。結果は図２６Ｂに示され、インフルエンザＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４が植え付けられたＰＥＲ．Ｃ６の培養株においてトリプシンは生成処理進行の全体に亙り有効のままであることが例証された、と言うのも、培養株の上清はＨＡ０を完全に開裂し得たからである。
【００８１】
実施例１３
Ｎ−グリコシダーゼＦによるＨＡ０の消化
インフルエンザウィルスＨＡ蛋白質は、３〜９個のＮ結合グリコシル化オリゴ糖部位を含む糖タンパク質である。部位の個数は、ウィルス系統に依存する。これらの部位の箇所はＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列により決定され、また、インフルエンザのウィルスゲノムは修復ミスの多いＲＮＡポリメラーゼにより複製されることから、グリコシル化部位の追加または除去を生成する突然変異が高頻度で発生する。次に、ＨＡ上に存在する少糖鎖の成分および構造が、宿主細胞により提供される生合成およびトリムを行うグリコシル化酵素の配列により決定される。ＨＡのグリコシル化は毒力とワクチンの有効性において重要な役割を演ずることから、インフルエンザ感染ＰＥＲ．Ｃ６上で生成されたＨＡの特性が吟味された。製造者により示された手順を用いＮ−グリコシダーゼＦ酵素によりＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７の非開裂ＨＡ０蛋白質の消化が行われて、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７  ＨＡポリペプチド上に存在すると予測される７個のオリゴ糖が除去された。インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｍｅｒｃｋ）に溶解された。６８ｎｇのＨＡに対応するこの溶解ウィルスの一定分量に対しては、１×の最終濃度（完全プロテアーゼ抑制因子混合物、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）までプロテアーゼ抑制因子が添加された。このサンプルは、１００ｍＭのＮａＰＯ４  ｐＨ７、１０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）、１％のＳＤＳ（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）および１％のＢ−メルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ）の存在下で温置された。これは室温で１０分間温置された。サンプルはｍＭのＮａＰＯ４  ｐＨ７、１０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）、０．６２５％のＮＰ−４０および１％のＢ−メルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ）において５回希釈された。この内、４０μｌがグリコ−Ｆ消化に使用された。これに対し、２μｌ  １Ｕ／μｌのグリコ−Ｆ（Ｎ−グリコシダーゼＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が添加され、３７℃で１６時間の最短期間に亙り温置された。１５０ｍＭのＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ）による３ｘのＬａｅｍｌｉ緩衝液が１ｘの最終濃度まで添加された。上記サンプルは、７．５％のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で処理進行された。ＳＤＳ／Ｐａｇｅおよびウエスタンブロットは、以下の如く実施された。要約すると、上記ブロットは遮断溶液（ｂｌｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１％のウサギ血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）が補足されたＴＢＳＴにおける５％脱脂ドライミルク粉末）により室温で３０分間遮断された。次に上記ブロットは、５％ウサギ血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）により１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ内で１／５００に希釈された抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡ抗血清（９８／７６８  ＮＩＢＳＣ）により室温で一晩に亙り温置された。上記ブロットは再び、ＴＢＳＴにより８回洗浄された。最後に上記ブロットは、（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）１／６０００とラベル表示されて遮断溶液内でに希釈されたウサギ抗羊抗血清−ＨＲと共に室温で１時間温置された。ＴＢＳＴによる８回の洗浄の後、蛋白質共役錯体がＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により視覚化され、フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、Ａｍ��ｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）が露光された。図２７に示された如くグリコシダーゼ−Ｆ酵素による処理は、オリゴ糖当たり約４ｋＤの予測損失である略々２８〜３０ｋＤにより蛋白質のサイズを減少した。アスタリスク（＊）により示された蛋白質バンドは脱グリコシル化されたＨＡ０であり、これは、ＨＡ０をＨＡ１およびＨＡ２サブユニット（右側の列）に開裂した後で獲得されるＨＡ１サブユニット生成物と同様に移動する。
【００８２】
実施例１４
ＡｃｃｕｔａｓｅによるＨＡ０の開裂
哺乳類から誘導されたトリプシン−ＥＤＴＡを哺乳類以外の蛋白質または組換え蛋白質で置き換える可能性が検討された。最近、無脊椎動物種からの蛋白質分解およびコラーゲン分解酵素（Ａｃｃｕｔａｓｅ［登録商標］、ＰＡＡ）が通常の細胞培養に対して利用可能となった。供給源が哺乳類以外であることからＡｃｃｕｔａｓｅは、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を可能的に汚染し得るプリオン、パルボウィルスおよび他の成分を含まない。今日まで、Ａｃｃｕｔａｓｅ内に存在する蛋白質分解酵素のタイプに関する情報は得られていない。ＨＡ０の開裂が、ウエスタンブロット検定を用いて研究された。トリプシンなしで１ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）にてＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７に感染したＰＥＲ．Ｃ６により獲得された一定量のＨＡ０蛋白質が、３７℃で一晩、Ａｃｃｕｔａｓｅの順次的希釈物により消化された。陽性対照として、１００ｎｇのトリプシン−ＥＤＴＡにより消化された同一量のＨＡ０が使用された。消化された蛋白質は次に還元条件下で、ウエスタンブロット検定に対して１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に装荷された。図２８に示された如く２μｌのＡｃｃｕｔａｓｅ処理による消化は完全なＨＡ０の開裂に帰着し；０．２μｌを用いると部分的な開裂が観察された。
【００８３】
これらの結果によれば、インフルエンザの再現および生成の間におけるＡｃｃｕｔａｓｅによる処理は、ＰＥＲ．Ｃ６上でのインフルエンザの感染の間においてトリプシン−ＥＤＴＡを置き換え得ることが示唆される。
【００８４】
実施例１５
ＰＥＲ．Ｃ６細胞上でのインフルエンザウィルスの電子顕微鏡検査分析
インフルエンザ株Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７が感染したＰＥＲ．Ｃ６細胞上、ならびに、ウィルス含有上清およびショ糖精製材料上で透過電子顕微鏡検査が行われ、ＰＥＲ．Ｃ６上で生成されたこのインフルエンザウィルスの発現型が決定された。用いられた全ての方法は、当業者に公知である。図２９は、ウィルスのライフサイクルの最終段階は細胞質膜からの被膜ビリオンの発芽および放出により表されることを示している。ＨＡおよびＮＡウィルス性蛋白質に対応するスパイクが検出され、ビリオン粒子の周縁部を縁取っている。この図はまた、インフルエンザウィルスの固有多形態性も示している。
【００８５】
実施例１６
多様なインフルエンザＡおよびＢウィルス系統によるＰＥＲ．Ｃ６の感染
インフルエンザワクチンの生成の基本技術としてＰＥＲ．Ｃ６を用いるためには、広範囲な種々のインフルエンザ亜型の系統の成長をサポートする必要がある。
【００８６】
ＥｘＣｅｌｌ５２５培地におけるＴ２５フラスコ内および／または６ウェル（ｗｅｌｌ）プレート内で成長したＰＥＲ．Ｃ６細胞の静的懸濁培養株が、図３０Ａに示された１６種の異なるインフルエンザウィルスの系統により１０６細胞／ｍｌの細胞密度で感染された。これらの系統は、数種のＨ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｂ型および鳥類の系統から成っていた。感染は、５μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下で実施された。各ウィルスは卵子継代された野生型または再配列株としてＮＩＢＳＣ（英国）から入手され、記録された。感染は、種々の系統と共に配送された製品説明書においてＮＩＢＳＣにより推奨されたウィルス希釈により実施された。試験されたウィルスは全て、ｐｆｕ検定における上清流体の免疫蛍光検査（データは不図示）および滴定（図３０Ｂ）により視覚化される如く、ＰＥＲ．Ｃ６上で伝播可能であった。
【００８７】
これらの結果によれば、通常は有胚卵子上で生成するのが極めて困難なＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／９４、Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３およびＡ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−Ｑ／Ｆ１１９−３／９７などの（アスタリスクにより示された）インフルエンザ系統が、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞上で再現され得ると共に生成され得ることが示される。
【００８８】
実施例１７
ＰＥＲ．Ｃ６上におけるタイプ１単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ−１）、タイプ２単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ−２）および麻疹ウィルスの生成
タイプ１およびタイプ２単純疱疹ウィルスならびに麻疹ウィルスなどの、インフルエンザウィルス以外の他のウィルスもＰＥＲ．Ｃ６上で再現され得るか否かが試験された。ＰＥＲ．Ｃ６成長ウィルス・バッチからは、これらのＰＥＲ．Ｃ６成長ウィルスから誘導されたワクチンであってヒトにおける野生型感染に対する防御のための中和効果を誘起するワクチンが生成される。表ＩＩには、ＡＴＣＣから入手されてＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染に使用された系統が示される。
【表２】
0004331432.tif 000003
【００８９】
ＡＴＣＣから入手したＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ならびに麻疹ウィルスがＰＥＲ．Ｃ６上で再現されて生成され得るか否かを試験すべく、当業者に公知の方法を用いてポリ−Ｌ−リシンが被覆されたＬａｂｔｅｋｃｈａｍｂｅｒ内に、継代数４６の細胞が１０５細胞／ウェルで播種された。サルから誘導されたＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣから入手）が、継代数１３７で培養されると共に陽性対照として使用され、且つ、２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種された。第０日目にて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞によるウェルが６０％でＶｅｒｏ細胞が８０％の融合の時点で、各細胞は種々のｍｏｉ（１０−３、１０−２、１０−１および１のＴＣＩＤ５０／細胞）で感染された。感染したなら一日間隔で、キット（タイプ１および２単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）用ＩＭＡＧＥＮ（Ｄａｋｏ））と、麻疹ウィルスのＨＡおよび基質蛋白質に対するＦＩＴＣ共役抗体（麻疹ＩＦＡキット、Ｌｉｇｈｔ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とを用いてＦＩＴＣ共役タイプの特定モノクローナル抗体を使用して、各細胞が固定されて免疫蛍光検査により検定され、次に製造者により示唆された処置が行われた。抗血清は、ＨＳＶ−１および−２ならびに麻疹ウィルス抗原に対して企図された。
【００９０】
図３１に要約された結果は、ＰＥＲ．Ｃ６がＨＳＶ−１（図３１Ｄ）、ＨＳＶ−２（図３１Ｅ）および麻疹ウィルス（図３１Ａ）感染に対して容認され得ることを示している。更に上記動態は、これらのウィルスはｍｏｉ依存様式でＰＥＲ．Ｃ６上に再現されることを示唆している。
【００９１】
次に、ＨＳＶ−１、−２および麻疹ウィルスがＰＥＲ．Ｃ６上で伝播され得るか否かが吟味された。この目的の為に、ＨＳＶ−１（図３２Ｃ）およびＨＳＶ−２（図３２Ａ）に対しては０．０１、０．１および１のＴＣＩＤ５０／細胞のｍｏｉで、且つ、麻疹ウィルス（図３２Ｂ）（継代数１）に対しては０．００１のＴＣＩＤ５０／細胞のｍｏｉで、各細胞が感染された。殆ど完全なｃｐｅが発生した時点で、細胞および上清が収穫され、液体Ｎ２で迅速に凍結され、かつ解凍された。この後、清澄した上清が約１００μｌを用いて（継代数２の）ＰＥＲ．Ｃ６へと盲検的に継代された。再び殆ど完全なｃｐｅに到達した後、第３継代（継代数３）が同様の様式で実施された。継代数２および３のｍｏｉは、ＴＣＩＤ５０検定による振り返りで決定された。
【００９２】
これらの実験の結果によれば、タイプ１およびタイプ２単純疱疹ウィルスおよび麻疹ウィルスはＰＥＲ．Ｃ６上で再現され得ると共に、１０−７もの低いｍｏｉが使用された場合でも伝播が生じ得ることが示された。
【００９３】
実施例１８
ＰＥＲ．Ｃ６上での再現に対するロタウィルスのスクリーニング
ＰＥＲ．Ｃ６がロタウィルスの再現もサポートし得るか否かを試験すべく、アカゲザルのロタウィルス（ＭＭＵ  １８００６Ａ；ＡＴＣＣ＃ＶＲ−９５４；系統Ｓ：ＵＳＡ：７９：２；ロット＃２１８１１５３）によりＰＥＲ．Ｃ６細胞が感染された。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（継代数４１）が１×１０５／ｍｌの密度で培養されると共にサルから誘導されたＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣから入手、継代数１３９）が２．５×１０４／ｍｌの密度で培養され、引き続き、当業者に公知の方法を用いてポリ−Ｌ−リシンが被覆されたＬａｂｔｅｋｃｈａｍｂｅｒ内に播種された。各細胞は、２μｇ／ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡの存在および不存在下でアカゲザルのロタウィルスの１ＴＣＩＤ５０／細胞のｍｏｉにより感染された。９０分の感染の後、各細胞はＥｘＣｅｌｌ５２５培地により洗浄され、加湿雰囲気で１０％のＣＯ２で３７℃にて更に温置された。感染に続き連続して５日間、上清のサンプルが収穫され、卓上遠心分離器による２０００ｒｐｍでの遠心分離により細胞および細胞破片から清澄され、ロタウィルス（ＩＤＥＩＡロタウィルス、Ｄａｋｏ）に対して特有のＥＬＩＳＡにより分析された。図３３に示された結果は、ＰＥＲ．Ｃ６上でアカゲザルのロタウィルスが再現されることを明瞭に示している。
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【図面の簡単な説明】
【図１】  １０−３および１０−４のｍｏｉにてヨウ化プロピジウムによる染色の後でＦＡＣＳを介して測定された死滅細胞の百分率に対する、免疫蛍光測定検査後に見られる感染細胞（陽性細胞）の百分率。１０−３のｍｏｉにおける感染から誘導されたサンプルの細胞の生存能力は乏しいので、信頼性の高いデータは得られなかった。
【図２】  免疫蛍光測定検査の後で顕微鏡で見た感染細胞の百分率。感染後４８時間に１０および１のｍｏｉにおける感染から誘導されたサンプルは、完全なＣＰＥの故に図示されない。
【図３】  感染後１〜６日における血球凝集単位（ＨＡＵ）で測定されたウィルス増殖の動態。
【図４】  免疫蛍光測定検査後に顕微鏡で見た感染細胞（陽性細胞）の百分率。
【図５】  感染後１〜６日における血球凝集単位（ＨＡＵ）で測定されたウィルス増殖の動態。
【図６】  免疫蛍光測定検査後に顕微鏡で見た感染細胞（陽性細胞）の百分率。
【図７】  感染後２〜６日における血球凝集単位（ＨＡＵ）で測定されたウィルス増殖の動態。
【図８】  中国産ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびＭＤＣＫ細胞上に存在する細胞表面受容体上でのＳｉａ２−３ＧａｌおよびＳｉａ２−６Ｇａｌの結合の発現。（Ａ）は、Ｓｉａ２−６Ｇａｌ結合を特異的に認識するサンブカ黒質凝集素（ＳＮＡ）レクチンとＳｉａ２−３Ｇａｌ結合を特異的に認識するＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）との相互作用の概略図である。細胞表面蛋白質上のオリゴ糖鎖に結合したＤＩＧ標識化レクチンを認識するＦＩＴＣ標識化抗ＤＩＧ抗体に対する概略的相互作用も示される。（Ｂ）は、ＤＩＧ標識化レクチンと共に温置された細胞のＦＡＣＳ分析である。細胞に付着したレクチンは、当業者に公知の手順を用いてＦＩＴＣ標識化抗ＤＩＧ抗体により検出された。細胞の個数は、ＦＩＴＣ抗ＤＩＧ抗体（白抜き）のみと共に温置された細胞と比較して、レクチン染色細胞（灰色）の蛍光強度に対してプロットされている。上側の各図はＳＮＡレクチンを用いて獲得されたＦＡＣＳ分析におけるシフトを示し、下側の各図はＭＡＡレクチンを用いて獲得されたＦＡＣＳ分析におけるシフトを示している。
【図９】  ＰＥＲ．Ｃ６上でのＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７による感染。（Ａ）は、ＨＡＵ力価に関するトリプシン−ＥＤＴＡの効果。（Ｂ）および（Ｃ）は夫々、感染後９６時間にて未処理ウィルス上清内で測定されたμｇ／ｍｌ単位のＨＡ濃度およびｐｆｕ／ｍｌ単位のウィルス感染価である。
【図１０】  ＰＥＲ．Ｃ６上でのＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４による感染。（Ａ）は、発育動態に関してウィルス感染の間およびその後に存在するトリプシン−ＥＤＴＡの種々の濃度の影響である。（Ｂ）は５０μｌ当たりのＨＡＵ力価、および、（Ｃ）はｐｆｕ／ｍｌ単位のウィルス感染価である。
【図１１】  ＰＥＲ．Ｃ６上で１０−３のｍｏｉを用いたＸ−１２７による感染。（Ａ）はＨＡＵ／５０μｌで与えられるＨＡＵに関するトリプシン−ＥＤＴＡの影響であり、（Ｂ）は感染後５日の間におけるｐｆｕ／ｍｌ単位のウィルス感染価である。
【図１２】  ＰＥＲ．Ｃ６上で１０−４のｍｏｉを用いたＸ−１２７による感染。（Ａ）はＨＡＵ／５０μｌで与えられるＨＡＵに関するトリプシン−ＥＤＴＡの影響であり、（Ｂ）は感染後５日の間におけるｐｆｕ／ｍｌ単位のウィルス感染価である。
【図１３】（Ａ）ＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存能力および（Ｂ）ウィルスの生物活性に関するトリプシン−ＥＤＴＡの影響。細胞生存能力はトリパンブルー染色の後で測定された。ＨＡＵ力価は上述の如く測定され、５０μｌ当たりで与えられた。
【図１４】  ウィルス感染価に関するトリプシン−ＥＤＴＡの影響、および、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６細胞のインフルエンザ感染後のＨＡ蛋白質含有量。（Ａ）感染力検定は、トリプシン−ＥＤＴＡ（４μｇ／ｍｌ）を備えた無血清培地内で、１０倍ずつ順次に希釈された合計で１００μｌのウィルス含有上清にＭＤＣＫ細胞を４通りに植え付けることで実施された。７日後、これらの培養株の上清がＨＡ活性に対して試験された。インフルエンザウィルス力価はＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ（１９３１）の方法に従い計算された。（Ｂ）Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡ蛋白質のウエスタンブロット分析。ウィルス性蛋白質の収穫は、溶菌緩衝液を含むＳＤＳを用いて蛋白質の分断および変性による実施された。電気泳動処理は、還元条件下で１０％のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で実施された。分離された蛋白質は、特異抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ−ＨＡ抗血清により精査された。増加量の陽性対照Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ  ＨＡ抗原（左側４列）と、示されたトリプシン温置サンプルの１０μｌのＰＥＲ．Ｃ６細胞上清（右側５列）が装荷された。
【図１５】  中空ファイバ灌流システムにおけるＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存能力、グルコース濃度およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７の発育動態。
【図１６】  中空ファイバ灌流システムにおいてＰＥＲ．Ｃ６上で増殖させたインフルエンザウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７の特性解析および定量。抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ−羊ＨＡ抗体に対して図１４の説明で記述された如くＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットが行われた。１：１０００希釈においては抗ＨＡタグ（ＨＡプローブ（Ｆ７））モノクローナル抗体すなわちマウス・モノクローナル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）が使用された。１：７５００希釈においては第２の抗体として、抗マウス−ＨＲＰ共役ヤギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ）が使用された。
【図１７】  Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ウィルスを用いたウィルス感染の後、９２時間までの１２リットルの生物反応炉内でのＰＥＲ．Ｃ６細胞生存能力（左側の図）およびグルコース濃度（右側の図）。
【図１８】  １２リットルの生物反応炉内で１０リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６の感染。免疫蛍光測定検査により測定されたウィルス複製の動態は、明確に染色された細胞の百分率で与えられる。
【図１９】  １２リットルの生物反応炉内で１０リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染。血液凝集検定により測定されたウィルス複製の動態は、ウィルス感染後数日間のＨＡＵで与えられる。アスタリスクにより示された柱状部は、本文中で記述されたＰｏｗｅｒｆｕｇｅ（登録商標）清澄の後で獲得されたＨＡＵの数値である。
【図２０】  １２リットルの生物反応炉内で１０リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６の感染に続くウエスタンブロット。インフルエンザウィルスＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡポリペプチドの特性解析および定量が示される。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットは図１４の説明に記述された如く行われた。異なるサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）および非開裂ＨＡ０蛋白質は矢印で示される。ＮＩＢＳＣから入手されたＨＡは陽性対照との役割を果たした。
【図２１】  １２リットルの生物反応炉内で１０リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６の感染の後におけるＨＡＵおよびｐｆｕ／ｍｌの測定値。感染はダウンストリーム処理（ＤＳＰ）に追随した。中空ファイバ限外濾過（２０倍の濃度）後のウィルス収量の回収量も示される。
【図２２】  ３リットルの生物反応炉内で２リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７によるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存能力（左上）、グルコース濃度（右上）、明確に染色された細胞の百分率におけるウィルスの発育動態（左下）およびＨＡＵ（右下）が与えられる。
【図２３】  ３リットルの生物反応炉内で２リットルの細胞懸濁液におけるＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５によるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存能力（左上）、グルコース濃度（右上）、明確に染色された細胞の百分率におけるウィルスの発育動態（左下）およびＨＡＵ（右下）が与えられる。
【図２４】  ３リットルの生物反応炉内で２リットルの細胞懸濁液におけるＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４によるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の生存能力（左上）、グルコース濃度（右上）、明確に染色された細胞の百分率におけるウィルスの発育動態（左下）およびＨＡＵ（右下）が与えられる。
【図２５】  非開裂Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡ０蛋白質のウエスタンブロット分析。ＮＩＢＳＣから入手した特異抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ抗血清と共に且つ図１４の説明および本文中で記述された様に温置した後、明確に染色された蛋白質が検出された。
【図２６Ａ】２６（Ａ）トリプシンにより消化されたＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７誘導ＨＡ０蛋白質のウエスタンブロット分析。蛋白質は特異抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ抗血清と共に温置した後で検出された。左側は標準開裂Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ  ＨＡであり、右側は増加量のトリプシンにより処理されたＨＡ０である。
【図２６Ｂ】２６（Ｂ）基質としてインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７のＨＡ０を用いたインフルエンザＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４生成処理の培養株上清におけるトリプシン活性の決定。ＨＡ０開裂生成物であるＨＡ１およびＨＡ２のウエスタンブロット分析は、図１４の説明で言及された抗インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡ特異抗血清により視認化された。
【図２７】  Ｎ−グリコシダーゼＦにより消化されたＡ／Ｓｙｄｎｅｙ  ＨＡ０のウエスタンブロット分析。蛋白質は、特異抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７抗血清による温置の後で決定された。アスタリスクと共に示された蛋白質バンドは脱グリコシル化生成物である。
【図２８】  Ａｃｃｕｔａｓｅ消化後のＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７ＨＡのウエスタンブロット分析。蛋白質は、特異ポリクローナル抗Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ  ＨＡ抗血清による温置の後で決定された。左側はトリプシン処理の前後のＨＡ０であり、右側は減少量のＡｃｃｕｔａｓｅにより消化されたＨＡ０である。
【図２９】  インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７の電子顕微鏡写真。（Ａ）感染後７２時間のＰＥＲ．Ｃ６細胞。（ＢおよびＣ）感染ＰＥＲ．Ｃ６から誘導されたウィルスの陰性染色。（ＤおよびＥ）ショ糖精製材料の陰性染色。
【図３０Ａ】ＰＥＲ．Ｃ６細胞上で試験された全て異なるインフルエンザＡおよびＢの系統。
【図３０Ｂ】感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞から誘導された図示の３種のＡおよびＢ型インフルエンザウィルスの感染価。
【図３１】  インフルエンザ以外のウィルスに感染したＰＥＲ．Ｃ６およびＶｅｒｏ細胞の免疫蛍光検査。（Ａ）麻疹ウィルスによる感染時において明確に染色された細胞。（Ｂ）ＨＳＶ−１ウィルスによるＶｅｒｏ細胞の感染時において明確に染色された細胞。（Ｃ）ＨＳＶ−２ウィルスによるＶｅｒｏ細胞の感染時において明確に染色された細胞。（Ｄ）ＨＳＶ−１ウィルスによるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染時において明確に染色された細胞。（Ｅ）ＨＳＶ−２ウィルスによるＰＥＲ．Ｃ６細胞の感染時において明確に染色された細胞。
【図３２】  ＰＥＲ．Ｃ６細胞上において麻疹ウィルス（中央の図）、ＨＳＶ−１ウィルス（下側の図）およびＨＳＶ−２ウィルス（頂部の図）の伝播後に決定された感染価。
【図３３】  種々のｍｏｉによるＰＥＲ．Ｃ６細胞（上側の図）およびＶｅｒｏ細胞（下側の図）の感染後に未処理上清においてＥＬＩＳＡにより測定されたロタウィルスの再現。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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