(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-グルクロン酸とN-アセチル-D-ガラクトサミンがβ1→3グリコシド結合した二糖を構成単位とし、下記物理化学的特性を有するナマコ類由来の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸を有効成分とする線溶活性亢進剤。
i)下記式（１）で表される二糖構成単位構造を有する。
【化１】
0004282267.tif 000009
ii)コンドロイチナーゼＡＢＣによる分解にて、不飽和二糖生成率が３５〜５５％である。
iii)構成二糖単位当たり、1.3〜1.8分子の硫酸基、及び、0.2〜0.4分子のフコビオシル基を含有する。
【請求項２】
硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸が平均分子量１１,０００〜１３,０００である請求項１記載の線溶活性亢進剤。
【請求項３】
硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸の分岐化度が２０〜５０％である請求項１又は２記載の線溶活性亢進剤。
【請求項４】
マナマコ由来である請求項１〜３の何れか１項に記載の線溶活性亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ-グルクロン酸とN-アセチル-D-ガラクトサミンがβ1→3グリコシド結合した二糖構造を主鎖の構成二糖単位とし、部分的に硫酸化フコビオシル基を側鎖として有する新規な硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸並びに該硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸を含有する医薬組成物及び線溶活性亢進剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸（以下、CSともいう）は、グリコサミノグリカン（以下、GAGともいう）の一種であり、Ｄ-グルクロン酸（以下、GlcAともいう）とN-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン（以下、GalNAcともいう）とがβ1→3グリコシド結合（GlcAβ1→3GalNAc）により結合した二糖を構成二糖単位とする多糖で、該構成二糖単位における硫酸基の結合位置や結合割合の違いにより数種の分子種に分類されている。例えば、GalNAcのＯ-４位またはＯ-６位に硫酸基が結合した構成二糖単位を多く含むコンドロイチン硫酸は各々コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Cと呼ばれ、GalNAcのＯ-４，６位が硫酸化されているコンドロイチン硫酸はコンドロイチン硫酸E（以下、ＣＳ-Ｅとも言う）とも呼ばれている。また、ＣＳは動物軟骨や結合組織中に存在することが広く知られており、様々な動物より単離された各種ＣＳ及びその構造や作用などの研究が報告されている。
【０００３】
例えば、マナマコからは、硫黄を9.5〜13％及びフコースを12〜28％含有したＣＳが単離され、分析の結果、このマナマコ由来のＣＳは、GlcAとGalNAcがβ1→3グリコシド結合により結合した二糖単位の繰り返し構造をコアポリマーとし、GalNAcのO-4位、O-6位及び／又はGlcAのO-3位に硫酸化フコース２残基から成る硫酸化フコビオシル基がグリコシド結合した構造を有している。マナマコＣＳは、直鎖構造のみから成る他のＣＳとは異なり、コンドロイチナーゼ類によって極めて消化されにくいことが報告されている（Kariya et al. (1997) Carbohydr. Res., 297, 273-279、特公平６-７００８５）。また、その生理活性に関しては、主に抗凝固活性が確認されている（Morao et al. (2001) Thromb. Res., 102, 167-176）。
【０００４】
同様に、他の各種ナマコ類からも硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸（以下、硫酸化フコビオシルＣＳという）の単離精製の例が報告されている（特公平６-７００８５）。他方、これらナマコ由来の硫酸化フコビオシル基側鎖を有する硫酸化フコビオシルＣＳは、ほとんど線溶活性を示さないことが報告されている（Sakai et al.(2000) Tromb Res.,100, 557-565）。一般に、棘皮動物に存在すると考えられる硫酸化フコビオシルＣＳを原料に、その構成を一部改変して製造した物質についての報告はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、線溶活性亢進作用を有する新規なコンドロイチン硫酸誘導体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、構成二糖単位毎ほぼ全てに硫酸化フコビオシル基の側鎖を有し、ほとんど線溶活性亢進作用を示さない硫酸化フコビオシルＣＳから硫酸化フコビオシル基側鎖を部分的に脱離させることにより、線溶活性亢進作用が適度に発現することを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）D-グルクロン酸（以下、GlcAともいう）とN-アセチル-D-ガラクトサミン（以下、GalNAcともいう）がβ1→3グリコシド結合した二糖を構成単位とし、下記物理化学的特性を有する硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸（以下、本発明物質ともいう）。
i)下記式（１）で表される二糖構成単位構造を有する。
【０００８】
【化２】
0004282267.tif 000002
【０００９】
ii）コンドロイチナーゼＡＢＣによる分解にて、不飽和二糖生成率が３５〜５５％である。
iii)構成二糖単位当たり、1.3〜1.8分子の硫酸基、及び、0.2〜0.4分子のフコビオシル基を含有する。
（２）平均分子量１１,０００〜１３,０００である上記（１）に記載の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸。
（３）ナマコ類由来の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸から、側鎖である硫酸化フコビオシル基を部分的に除去することにより得られる上記（１）又は（２）に記載の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸。
（４）分岐化度が２０〜５０％である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸を含有する組成物。
（６）医薬組成物である上記（５）記載の組成物。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸を有効成分とする線溶活性亢進剤（以下、本発明医薬ともいう）。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明物質は、GlcAのＯ-１位とGalNAcのＯ-３位とがβ-グリコシド結合した二糖単位の繰り返し構造を主鎖とし、側鎖として硫酸化フコース２残基から成る硫酸化フコビオシル基を部分的に有するＣＳの一種である。
【００１１】
本発明における硫酸化フコビオシル基とは、フコースのＯ-２位及びＯ-４位のヒドロキシル基（-ＯＨ）の硫酸（-ＯＳＯ３―）化の違いによりフコース１分子中に０〜２個硫酸基を有するフコース残基２残基がα-１,３結合しているフコビオース基であり、下記式（２）で表される。当該硫酸化フコビオシル基は、本発明物質の主鎖を構成するGalNAcのＯ-４位、Ｏ-６位、及び、GlcAのＯ-３位から選択される位置のヒドロキシル基と硫酸化フコビオシル基Ｏ-１位のヒドロキシル基とでグリコシド結合することにより、本発明物質の側鎖を形成している。
【００１２】
【化３】
0004282267.tif 000003
【００１３】
【表１】
0004282267.tif 000004
【００１４】
本発明物質をコンドロイチナーゼＡＢＣによって分解した際の不飽和二糖生成率は３５〜５５％である。不飽和二糖生成率は、後述の実施例に記載のコンドロイチナーゼABCによる分解とイオン交換高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとも言う）による分析を組み合わせた二糖組成分析により算出できる。本発明物質について、この方法で分析すると、下記式（３）で表される二糖構造が検出される。
【００１５】
【式４】
0004282267.tif 000005
【００１６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはＳＯ３―を示し、Ａｃはアセチル基を示す。
【００１７】
更に、化学組成分析の結果、主鎖の二糖単位１残基あたり、1.3〜1.8分子の硫酸基、好ましくは、1.5〜1.8分子の硫酸基を含有し、同様に主鎖の二糖単位１残基あたり、0.2〜0.4分子のフコビオシル基、好ましくは、0.2〜0.3分子のフコビオシル基を含有する。この化学組成分析の方法としては、本発明物質中のヘキソサミン含量、硫酸基含量及びフコビオシル含量又はフコース含量を測定可能な方法であれば、特に限定されないが、一例として、後述の実施例に記載の様に、MBTH法によりヘキソサミン含量を測定し、更にイオンクロマトグラフィー法及びアンスロン法（Dimler, R. Let al. (1952) Anal.Chem.,24, 1411-1414）にて、各々硫酸基含量及びフコース含量を測定する方法が挙げられる。
【００１８】
フコビオシル含量からみて、本発明物質は、硫酸化フコビオシル基側鎖を持たない構成二糖単位とGalNAcのＯ-４位、Ｏ-６位及びGlcAのＯ-３位より選択される位置に１つ以上の硫酸化フコビオシル基側鎖を有する構成二糖単位が混在した状態で構成されており、従って、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有するＣＳである。
【００１９】
本発明物質は、平均分子量１１,０００〜１３,０００であることが好ましく、平均分子量１１,０００〜１２,０００がより好ましい。尚、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、ＧＡＧの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明物質においても、上記平均分子量の範囲に厳密に限定されるべきものではない。
【００２０】
本発明物質は、その起源、由来、製法によっては特に限定されるものでは無く、本発明物質が有する物理化学的特性を満たすものであれば、天然資源から得られる部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有する硫酸化フコビオシルＣＳでも、天然資源（主として生物体）から得られる硫酸化フコビオシルＣＳを原料として後述の部分的に硫酸化フコビオシル基を除去する等の化学的手法等により改変したもの、若しくは、人工的に化学合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。
【００２１】
本発明物質自体が生物体から単離精製される場合や生物体から単離精製される硫酸化フコビオシルＣＳを原料として製造する場合に用いる生物体は、種、属など特に限定されない。生物体として、例えば、棘皮動物が挙げられ、好ましくはナマコ類が挙げられ、特に、マナマコ（Sea Cucumber Stichopus japonicus）、クロナマコ（Holthuria atra）、ニセクロナマコ（Holothuria leurospilota）などが挙げられる。尚、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
【００２２】
一例として、マナマコを原料とする本発明物質の製造方法を説明する。
先ず、ＧＡＧを生体組織から単離・精製する際に通常用いられる公知の方法（Carbohydr. Res., 297, 273-279 (1997), 特公平６−７００８５等参照）に準じてマナマコ体壁より硫酸化フコビオシルＣＳを単離精製し、次いで、側鎖である硫酸化フコビオシル基を部分的に脱離させ（部分的脱分岐化）、本発明物質を得る。
【００２３】
ここに於いて、側鎖である硫酸化フコビオシル基の部分的脱離方法は、本発明物質が有する物理化学的特性を満たすＣＳが生成する方法であれば、特に限定されないが、分岐化度２０〜５０％である硫酸化フコビオシルＣＳが得られる条件での緩和な酸加水分解、アルカリ加水分解反応や酵素消化反応などが挙げられる。上記のうち、特に0.05〜0.2Ｎ程度の硫酸、塩酸等の無機酸を用いて、７５〜８５℃程度の条件下で約２．５〜３．５時間、酸加水分解する方法が好ましい。尚、通常、反応後中和し、分離・精製工程に供する。かくして、より好ましくは、分岐化度３０〜４０％である反応終生成物（本発明物質）が得られる。上記部分的脱分岐化後、ＧＡＧの分離・精製の常套手段によって精製された本発明物質を得ることが出来る。
【００２４】
ここでいう、分岐化度とは、本発明物質１分子が有している側鎖である硫酸化フコビオシル基のモル量の、主鎖構成二糖単位のモル量に対する割合を示している。尚、上記の側鎖を部分的に脱離する方法によって本発明物質を製造する際の原料となりうるナマコ由来の硫酸化フコビオシルＣＳに関しては、主鎖を構成している二糖単位当たり、ほぼ１本の硫酸化フコビオシル基側鎖を有している（分岐化度＝１００％とする）事が既に報告されている。（Kariya et al. (1997) Carbohydrate Research 297, 273-279 ）
【００２５】
先に述べた様に、マナマコ由来ＣＳは、コンドロイチナーゼ類により極めて消化されにくい事が既に知られているが、マナマコ由来ＣＳから部分的に側鎖を除去する方法等により得られる本発明物質は、後述の実施例に記載の通り、コンドロイチナーゼABCにより３５〜５５％分解される。
【００２６】
また、上述の様にSakai.et.al (2000) Tromb Res.,100,557-565において、本発明物質の製造原料となるマナマコ由来ＣＳは極めて弱い線溶活性亢進作用しか示さないと報告されているが、本発明物質は、後述の実施例に記載の通り、プラスミノーゲン、一本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター及び合成基質を加えた線溶反応系において、マナマコ由来ＣＳに比べ、極めて高い線溶活性亢進作用を示した。
【００２７】
プラスミノーゲンアクチベーターを介した線溶活性亢進作用とは、プラスミノーゲンアクチベーター（以下、ＰＡとも言う）がプラスミノーゲンをプラスミンに限定分解し、活性化されたプラスミンがフィブリンを分解する一連の反応の総称である。
【００２８】
特に血管内線溶においては組織型ＰＡ（以下、ｔ-ＰＡという）が重要な調節因子となっており、ｔ-ＰＡの作用が低下すると血流中に生成した血栓を溶解しにくくなる為、脳梗塞や心筋梗塞など血栓症を発症しやすくなる。本発明物質は、優れた線溶活性亢進作用を有する為、本発明物質を有効成分とする医薬組成物（以下、本発明医薬組成物ともいう）は、ｔ-ＰＡ活性の促進が望まれるこれら上記の様な疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療を目的としてヒト、その他ほ乳動物に投与することが出来る。
【００２９】
本発明医薬組成物を生体に投与する際の剤型及び投与経路としては、対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択する事ができる。例えば、それらをそのまま、又は、他の薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、安定化剤等と共に適宜、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤などに製剤化し、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内、関節腔内、腹腔内等）、点眼、点滴、経皮、経口、吸入等の投与方法によって、経口又は非経口的に安全に投与することが出来る。
【００３０】
本発明医薬組成物における本発明物質の配合量や投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、経口的あるいは非経口的な投与経路において本発明物質として１日当たり概ね０．１mg/kg〜３００mg/kg程度を例示することが出来る。また、投与間隔は、１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、またはそれ以上の回数に分けて投与することも可能であるし、例えば点滴等により連続的に投与することも可能である。
【００３１】
更に、本発明物質を有効成分とする組成物は、上記医薬組成物としての用途以外に、凝固線溶系を研究するための研究用試薬としても有用である。
【００３２】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１  本発明物質の製造
▲１▼マナマコ体壁由来ＣＳの単離精製
マナマコ（Stichopus japonius）の体壁部をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１、v/v）で不要の脂溶性画分を抽出除去した。抽出残渣を乾燥後、オートクレーブ処理（１２０℃、３０分）に付し、５０ｍＭリン酸バッファー（p H 8.0）中に溶解し、懸濁液とした。この懸濁液に対し、蛋白質１gあたり５０mgのアクチナーゼ（科研製薬（株）製）を加え、５５℃にて８時間攪拌し、コラーゲンやコアプロテイン等を消化した。
【００３３】
アクチナーゼ消化物を０．４Ｍ水酸化ナトリウム、次いで１０％トリクロロ酢酸にて順次処理した後、遠心分離（5,000×g、１５分）に付し、上清を回収し、流水透析を行った。透析内液に２．５％酢酸ナトリウムを添加した冷エタノールを透析内液量の３倍量添加することにより目的物質を沈殿させ、遠心分離（5,000×g、１５分）により沈殿を回収した。更に、得られた沈殿を冷エタノールで洗浄し、得られたペレットを減圧乾燥することにより粗精製物を得た。
【００３４】
得られた粗精製物１．０gを少量の５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム緩衝液（p H 8.0）に溶解し、その半分量を同溶媒で平衡化したSephadex G-100（ファルマシア社製）を詰めたカラム（直径３．４ｃｍ×長さ１００ｃｍ）に付し、同溶媒にて溶出させ、溶出液を１０ml毎に回収した。得られた各フラクションにつき、ＵＶ２１０ｎｍにおける吸光度の測定、カルバゾール法（Bitter & Muir (1962) Anal. Biochem., 4, 330-334）によるウロン酸含量の測定及びアンスロン法（Dimler, R. L et al. (1952) Anal. Chem., 24, 1411-1414）による中性糖含量の測定を行った。
【００３５】
その結果、高分子画分にＧＡＧと推測されるカルバゾール反応陽性の画分を見出し、これを合一回収し、凍結乾燥により粉末を２２４ｍｇ得た。同様の操作を得られた粗精製物の溶液の残り半分量についても行い、合わせて５７４ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物のうち５００ｍｇを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH  5.0）で平衡化したＤＥＡＥ-セルロース（ＤＥ５２、Whatmann社製）を詰めたカラム（内径１．８ｃｍ×長さ１８ｃｍ）に付し、同緩衝液中０→１．２Ｍ 塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出した。
【００３６】
８ｍｌ毎に分画回収した各フラクションにつきカルバゾール法によるウロン酸含量の測定およびアンスロン法による中性糖含量の測定を行った。その結果、塩化ナトリウムの０．６Ｍ濃度付近に目的物質と目されるピークを見出したので、このピークに該当する画分を合一した後、流水透析にて透析後、凍結乾燥を行い、粉体を２１０ｍｇ得た。
【００３７】
▲２▼分析
上記▲１▼で得られた粉体について、化学組成分析を行った。
ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine (1981) Anal. Biochem., 115, 88-92）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を定量した。
【００３８】
分析結果から、この画分の構成成分の重量存在比を算出したところ、既に報告されていいるナマコＧＡＧの分析結果（Kariya et al.(1990) J.Biol.Chem.,265,5081-5085参照）とほぼ同等の組成を示した。
【００３９】
▲３▼本発明物質の製造
公知ナマコＧＡＧとほぼ同等の組成を有する上記▲１▼で得られた精製画分４０ｍｇを０.１N硫酸４ｍｌに溶解し、８０℃にて３時間あるいは６時間の加水分解反応にそれぞれ付した。反応は反応混液を室温までに冷却することによって停止させ、１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して中和した後、０.２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセルロファインＧＣＬ-９０ｍカラム（内径３.４×長さ１１０ｃｍ、生化学工業（株）製）に付し、溶出液を１０ｍｌ毎に分取した（以下、３時間の加水分解により得られたものを３時間水解物、６時間の加水分解により得られたものを６時間水解物という）。対照として４０ｍｇの未加水分解物（上記▲１▼で得られた精製画分、以下、未水解物ともいう）も同様にカラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を１０ｍｌづつ分取した。
【００４０】
未水解物、３時間水解物及び６時間水解物のカラム溶出液の各フラクションにつき、ウロン酸含量並びに中性糖含量を測定し、溶出液の挙動を比較した（図１）。得られた高分子画分域（３時間水解物（図１ｂ）はフラクションNo.４０〜５４、６時間水解物（図１ｃ）はフラクションNo.４０〜５８、未水解物（図１ａ）はフラクションNo.４０〜５０）は合一濃縮して、蒸留水で平衡化したセルロファインＧＣＬ-２５カラム（内径２.０×長さ２５ｃｍ、生化学工業（株）製）に付し脱塩した後、凍結乾燥処理によって乾燥・回収した。未水解物、３時間水解物及び６時間水解物の各高分子画分の収量は、各々３４.７ｍｇ、１８.１ｍｇおよび１５ｍｇであった。
【００４１】
実施例２  本発明物質の物理化学的性状の解析
▲１▼ゲル濾過溶出パターン
図１のゲル濾過溶出パターンを比較すると、未水解物（図１(ａ)）では高分子画分域にウロン酸及び中性糖のピークがほぼ完全に一致した位置に等しい形状でシングルピークとして観察された。しかし３時間水解物（図１(ｂ)）では、未水解物のパターンと比べ、対応する高分子画分域のウロン酸ピークはやや減少し、やや広がり、更に、同域の中性糖ピークの検出値は大幅に減少し、一方、低分子画分域に中性糖の新しいピークが出現した。このピークは加水分解処理により脱離した硫酸化フコビオシル基と考えられる。同様に６時間水解物（図１(ｃ)）においては、低分子画分域の新しい中性糖ピークがより顕著であり、更に、高分子画分域におけるウロン酸ピークの減少とより広い平坦化、更に中性糖ピークの顕著な減少が確認された。
【００４２】
これより、加水分解反応の進行に伴い、原料であるナマコ由来のＧＡＧ主鎖から硫酸化フコビオシル基が加水分解反応時間依存的に脱離している事が示唆される。
【００４３】
尚、３時間水解物の様に、硫酸化フコビオシル基が部分的に脱離した構造を有するＧＡＧは、これまでに報告がなく、新規な硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸である。
【００４４】
▲２▼化学組成分析
３時間水解物、６時間水解物、未水解物について、実施例１▲２▼に記載の化学組成分析を行い、結果として得られた各水解物の構成成分の重量存在比を算出した（表１）。更に、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出した上、ヘキソサミンのモル存在量を１として、各成分のモル比を算出した（表２）。
【００４５】
【表２】
0004282267.tif 000006
【００４６】
【表３】
表２      各水解物の構成成分のモル存在量
（各水解物毎にGalNAcのモル存在量を１とした場合の各成分のモル比）
0004282267.tif 000007
【００４７】
表１及び表２より、各水解物においては、ヘキソサミンとウロン酸のモル比はほぼ一定しており、加水分解後でも、主鎖部分の構造はＧＡＧ特有の二糖繰り返し構造が保持されていると考えられる。主鎖の二糖単位１残基あたりのフコビオシル基及び硫酸基含量は、未水解物が各々１．１９及び３．６９分子存在するのに対し、３時間水解物では各々０．２９及び１．７０分子であり、６時間水解物では各々０．１８及び１．０６分子と、加水分解反応時間依存的に減少していることが判明した。これは、上記実施例２▲１▼のゲル濾過溶出パターン（図１）の結果を支持しており、加水分解反応時間依存的に硫酸化フコビオシル基が脱離していると考えられる。
【００４８】
▲３▼脱分岐化度
加水分解反応による、硫酸化フコビオシル基の脱離割合を脱分岐化度として算出した。図１に於けるアンスロン法の吸光度を指標に、検出される高分子領域のピークと低分子領域のピークの面積から以下の式を用いて脱分岐化度の見積もりを行った。尚、グラフの描画にはMicrosoft Excel 2000を、面積の算出には、NIH Image 1.62を用いた。
【００４９】
脱分岐化度(％)＝低分子化領域ピーク面積(Ａ２)／全ピーク面積(Ａ１＋Ａ２)×１００
【００５０】
計算の結果、未水解物、３時間水解物および６時間水解物の脱分岐化度は、それぞれ０％、６７．６％及び９０．４％と算出された。この結果からも、加水分解による脱分岐化反応は、反応時間依存的に進行することが確認される。尚、分岐化度（％）＝１００−（脱分岐化度）である。
【００５１】
▲４▼コンドロイチナーゼＡＢＣ消化
コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製、以下、Ｃ-ＡＢＣという）による未水解物、３時間水解物、６時間水解物各々の消化の度合いをゲル濾過クロマトグラフィーを分離要因とする高速液体クロマトグラフィー（以下、ＧＰＣ-ＨＰＬＣという）により測定した。
【００５２】
各水解物を１０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、そのうち２０μｌを０．５ＵのＣ-ＡＢＣを含む酵素溶液１０μｌ（０．４Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％牛血清アルブミンを含む０．４Ｍトリス塩酸緩衝液(p H8.0)）に添加し、３７℃で１８時間、酵素消化反応を行った。反応混液に蒸留水５０μｌを添加し、沸騰水中で１分加熱後、遠心分離することにより上清を得た。
【００５３】
このＣ-ＡＢＣ酵素消化物を含む上清を、ＴＳＫ-Gel G4000PWXL、ＴＳＫ-Gel G3000PWXLおよびＴＳＫ-Gel G2500PWXLカラム（いずれも内径４.０×２５ｃｍ、Tosoh社製）を上流から順に連結して装着したＧＰＣ-ＨＰＬＣに付し、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液のアイソクラティック条件で溶出し、Refractive Indexを指標として検出した。同様に、Ｃ-ＡＢＣ消化前の各水解物に関しても、ＨＰＬＣチャートを得た。これらの結果を図２に示す。
【００５４】
得られたＨＰＬＣチャートのピーク面積から以下の式を用いて各水解物のＣ-ＡＢＣ消化度（不飽和二糖生成率）の見積もりを算出した。下記不飽和二糖生成率の計算式において、全ピーク面積とは、図２のＡ２、Ｂ２、Ｃ２（Ｃ-ＡＢＣ酵素消化後のチャート）における、△oligo、△Ｄｉ-diＳ、△Ｄｉ-monoＳ及び△Ｄi-zeroＳの合計ピーク面積を示し、不飽和二糖ピーク面積の和とは、各不飽和二糖ピークの面積の総和（△Ｄｉ-diＳ、△Ｄｉ-monoＳ及び△Ｄｉ-zeroＳの合計ピーク面積）である。尚、△oligoとは、Ｃ-ＡＢＣ消化にて二糖単位構造にまで分解されず、三糖以上の構造である不飽和オリゴ糖を示す。また、△Ｄｉ-diＳは、不飽和二糖単位構造中に硫酸基を二つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ-monoＳは、不飽和二糖単位構造中に硫酸基を一つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ-zeroＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を有さない不飽和二糖を示し、後述の不飽和二糖スタンダードに関して述べると、△Ｄｉ-diＳには△Ｄｉ-ｄｉ（２,６）Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓが、△Ｄｉ-monoＳには△Ｄｉ-６Ｓ、△Ｄｉ-４Ｓが、△Ｄｉ-zeroＳには△Ｄｉ-０Ｓが分類される。
【００５５】
不飽和二糖生成率（％）＝不飽和二糖ピーク面積の和／全ピーク面積×１００
【００５６】
酵素消化前のチャートにおいては、加水分解反応時間が長くなるに従ってメインピークの保持時間が長くなっており、若干の低分子化が起こっていることが観察された。これは硫酸化フコビオシル基側鎖の脱離が進行した結果であると推察される。
【００５７】
未水解物の酵素消化後のチャートを、酵素消化前と比較すると、メインピークの保持時間は僅かに長くなるが、ほとんど変化せず、不飽和二糖成分も検出されない。すなわち、消化された形跡が見られず、公知文献の記載と同様にＣ-ＡＢＣにより分解されないことが確認された。
一方、３時間水解物及び６時間水解物では、不飽和二糖及び不飽和オリゴ糖のピークが観察された。これらピークについて、上記式に従い二糖生成率を算出した。その結果、未水解物、３時間水解物及び６時間水解物の二糖生成率は各々０％、４６．５％及び６６．３％であった。
【００５８】
加水分解の反応時間に従い、Ｃ-ＡＢＣの消化性も高まり、不飽和二糖の生成も増えている。これより、硫酸化フコビオシル基側鎖を有するＣＳにおいて、Ｃ-ＡＢＣ酵素消化の障壁と成っているのは、硫酸化フコビオシル基側鎖の存在であると推測される。
【００５９】
更に、Ｃ-ＡＢＣ酵素消化物の不飽和二糖分析を行った。上記の各水解物のＣ-ＡＢＣ酵素消化物につき、上清をＹＭＣ-ＰＡ１２０Ｓ５カラム（内径４．０ｃｍ×２５ｃｍ、ＹＭＣ社製）を装着した強陰イオン交換ＨＰＬＣ（以下、ＳＡＸ-ＨＰＬＣともいう）に付し、MilliQ Water（商標名：ミリポア社製）と０．８Ｍリン酸二水素ナトリウム溶液の直線的濃度勾配システム（１６ｍＭ→５２０ｍＭ／３８分）で溶出し、２３０ｎｍの吸光度で検出した。結果を図３に示す。
【００６０】
不飽和二糖スタンダードとしてコンドロイチン硫酸タイプの△Ｄｉ-０Ｓ、△Ｄｉ-６Ｓ、△Ｄｉ-４Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（２,６）Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓおよび△Ｄｉ-ｔｒｉＳを用いた。
【００６１】
尚、これら△Ｄｉ-０Ｓ、△Ｄｉ-６Ｓ、△Ｄｉ-４Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（２,６）Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓおよび△Ｄｉ-ｔｒｉＳとは、前述式３で示される二糖組成中の各置換基が下表の通りであるものを示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
図３より、△Ｄｉ-０Ｓ、△Ｄｉ-６Ｓ、△Ｄｉ-４Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（２,６）Ｓ、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓおよび△Ｄｉ-ｔｒｉＳの各ピークの合計に対し、３時間水解物では、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓが５２.２％、△Ｄｉ-６Ｓが３０．４％であったのに対し、６時間水解物では△Ｄｉ-６Ｓが４９．８％、△Ｄｉ-ｄｉ（４,６）Ｓが２５．３％であった。また、両者とも△Ｄｉ-ｄｉ（２，６）Ｓ及び△Ｄｉ-ｔｒｉＳは観察されず、いくつかの不飽和オリゴ糖由来と目されるピークが見られた。以上の結果は一見したところ、６時間水解物で観察された△Ｄｉ-６Ｓの一部は、３時間水解物に存在した△Ｄｉ-ｄｉ（４，６）Ｓの４-Ｏ-硫酸基の加水分解によって生じたものと推定される。
【００６４】
しかしながら一方では、△Ｄｉ-６ＳのGalNAcのＯ-４位から伸展していた硫酸化フコビオシル基の加水分解による脱離速度は遅く、△Ｄｉ-ｄｉ（４，６）ＳのGlcAのＯ-３位から伸展していた硫酸化フコビオシル基の加水分解による脱離速度が速かった為に、見かけ上、上記のように△Ｄｉ-ｄｉ（４，６）Ｓの４-Ｏ-硫酸の脱離が発生した様に見えた可能性が高い。尚、図２のＣ-ＡＢＣ消化後のチャートにおいて、全ピーク面積に対する△Ｄｉ-ｄｉＳ成分である△Ｄｉ-ｄｉ（４，６）Ｓの割合が、３時間水解物で２８．８％、６時間水解物で２９．７％とほぼ同等だったことからも、後者の可能性が高いことが支持される。
【００６５】
この不飽和二糖組成は硫酸化フコビオシル基側鎖が脱離し、酵素消化可能となった直鎖構造を有する部分の組成であり、側鎖が保持されている部分の二糖組成についてはこの方法では分析出来ない。
【００６６】
以上のことより、本発明物質の一例である３時間水解物は、ＣＳ-Ｅタイプの二糖単位を有し、Ｄ-グルクロン酸のO-３位に結合している硫酸化フコビオシル基が優先的に脱離した、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有する新規な硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸と言える。
【００６７】
実施例３  本発明物質の組織プラスミノーゲンアクチベーターを介した線溶活性亢進作用
実施例１にて製造した未水解物、３時間水解物、６時間水解物及び、公知ナマコＧＡＧ（Stichopus japonicus由来、1997年に単離精製）について種々の濃度の溶液を作成し、当該溶液３０μｌと０．４８μＭのプラスミノーゲン５０μｌ、７．５ｎＭの一本鎖ｔ−ＰＡ（以下、ｓｃｔ―ＰＡという）及び１．８ｍＭの合成基質S-2251（Ｈ-Ｄ-Ｖａｌ―Ｌ-Ｌｅｕ―Ｌ-Ｌｙｓ―p-ニトロアニリド・二塩酸塩）４０μｌをウェルで混和後、自動マイクロタイタープレート読み取り機にセットし、３７℃に加温して反応を進行させながら、１５秒毎に４０５ｎｍ（対照４９２ｎｍ）の吸光度を測定した。なお、反応はＴｗｅｅｎ80を０．００５％含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。
【００６８】
プラスミノーゲンの活性化の初速度は、時間ｔの時の４０５ｎｍ（対照４９２nm）の吸収値Ａ405-492と時間の自乗のプロットの傾き（Ａ405-492／t2）より得た。促進率はＧＡＧのない場合の初速度を１とし、それに対する相対比をポテンシエーションファクターとして示した。以上の活性測定を種々のＧＡＧ濃度で実施し、最も高い活性を示したＧＡＧ濃度（１．５６μｇ／ｍｌ）における結果を図４に示した。
【００６９】
活性の高い順に列挙すると３時間水解物が飛び抜けて高い活性を示し、次いでずっと低いレベルに６時間水解物、公知ナマコＧＡＧそして未水解物の順であり、本発明物質である３時間水解物は、非常に高い線溶活性亢進作用を有する事が明らかとなった。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、線溶活性亢進作用を有する新規な部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有する硫酸化フコビオシルコンドロイチン硫酸が提供される。
【００７１】
【図面の簡単な説明】
【図１】  未水解物、３時間水解物及び６時間水解物のセルロファインＧＣＬ-９０ｍカラム溶出液の各フラクションにおけるウロン酸含量並びに中性糖含量を測定したグラフであり、縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。(a)、(b)及び(c)は、各々、未水解物、３時間水解物、６時間水解物の結果である。
【図２】  未水解物、３時間水解物及び６時間水解物における、Ｃ-ＡＢＣ消化前後のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、縦軸は示差屈折率、横軸は保持時間（分）を示す。Ａ１は、未水解物のＣ-ＡＢＣ消化前のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、Ａ２は、未水解物のＣ-ＡＢＣ消化後のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、二糖生成率は０％である。Ｂ１は、３時間水解物のＣ-ＡＢＣ消化前のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、Ｂ２は、３時間水解物のＣ-ＡＢＣ消化後のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、二糖生成率は４６．５％である。Ｃ１は、６時間水解物のＣ-ＡＢＣ消化前のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、Ｃ２は、６時間水解物のＣ-ＡＢＣ消化後のＧＣＰ-ＨＰＬＣチャートであり、二糖生成率は６６．３％である。
【図３】  Ｃ-ＡＢＣ消化後の未水解物、３時間水解物及び６時間水解物におけるＳＡＸ-ＨＰＬＣチャートであり、縦軸は吸光度、横軸は保持時間(分)を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは各々、未水解物、３時間水解物、６時間水解物及び不飽和二糖スタンダードの結果である。
【図４】  sct-PAを介したglu-plg（Ｎ末端のアミノ酸がグルタミン酸(Glu）から始まるるタイプのプラスミノーゲン）の活性化測定による、未水解物、３時間水解物、６時間水解物及び公知ナマコＧＡＧの１．５６μｇ／ｍｌ濃度に於ける組織プラスミノーゲンアクチベーターを介した線溶活性促進率を示す。縦軸は、Potentiation Factorである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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