(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性であり、光学的に透明であり、合成かつ生体において安定なポリマー材料である、角膜内又は角膜表面上に配置される角膜アンレー又は角膜インプラントであって、
該材料が、組織細胞の付着及び成長を支持する表面を含み、
ここでその上に上皮組織が引き付けられそして付着するようになる角膜インプラントの外部表面、又は角膜アンレーの前部表面が、複数の表面のくぼみを含む解剖学的形状であって、前記解剖学的形状が、角膜アンレーまたは角膜インプラント上の角膜上皮組織の過剰成長を促進し、かつ前記複数のくぼみが、表面平面において、５００平方ナノメーターに等しいか又はそれを超え、そして０．７平方ミクロンに等しいか又はそれ未満である表面積を有する、角膜アンレー又は角膜インプラント。
【請求項２】
複数のくぼみが、表面平面において、一般に曲線又は円形の形状であり、０．０２５ミクロンに等しいか又はそれを超える最小直径を有し、そして０．９５ミクロンに等しいか又はそれ未満である最大直径を有することを特徴とする、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項３】
複数のくぼみが、表面平面における表面積の０．１０％に等しいか又はそれを超え、そして表面積の２０％に等しいか又はそれ未満である表面平面における同等面積を有することを特徴とする、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項４】
表面平面に対する表面のくぼみの深さの平均が、０．１ミクロンに等しいか又はそれを超えることを特徴とする、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項５】
複数のくぼみが、角膜上皮組織又は細胞又は細胞過程の、インプラント表面平面から２０ミクロンを超える深さへの成長に備えたものではないことを特徴とする、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項６】
複数のくぼみが、該複数の表面のくぼみ上又はくぼみ内に配置された、架橋されているかまたは架橋されていない天然由来または合成コラーゲンを含むコーティング又はゲルを有することを特徴とする、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項７】
インプラント又はアンレーを通り抜ける孔を有する、請求項１記載のアンレー又はインプラント。
【請求項８】
孔が、曲線又は円形状であり、孔の直径が、０．０２５ミクロンに等しいか又はそれを超える範囲、そして０．９５ミクロンに等しいか又はそれ未満である範囲にあることを特徴とする、請求項７記載のアンレー又はインプラント。
【請求項９】
複数のくぼみの表面積が、１０，０００平方ナノメーターに等しいか又はそれ未満であることを特徴とする、請求項７記載のアンレー又はインプラント。
【請求項１０】
複数のくぼみが、０．４ミクロンに等しいか又はそれ未満である最大直径を有することを特徴とする、請求項７記載のアンレー又はインプラント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
角膜アンレー
本発明は、改良された角膜アンレー（corneal onlay）に向けられる。より詳細には、本発明の角膜アンレーは、上皮の基底細胞層における半接着斑の発達を含む、角膜上皮の過剰成長と、過剰成長に続く重層上皮の形成を促進する前部表面の表面解剖学的形状（topography）及び構造を有する。
【０００２】
本発明は、詳細には、合成の上皮角膜形成物（epikeratoplasty）に使用するためのインプラント又は（上皮下の部位に配置される場合は）移植するコンタクトレンズとして使用するためのインプラントに向けられる。
【０００３】
本発明の目的は、更に表面改変又は生物学的コーティングを必要とせずに本質的に組織の過剰成長を支持するポリマー表面を提供することである。更なる目的は、この特性を、良好な生体における安定性、光学的特性及び機械的特性と併せ持つため、上角膜プロテーゼ（epikeratoprosthese）の製造に適したものとなっているポリマーを提供することである。
【０００４】
角膜アンレー自体は公知である。EP-A-729323に開示されているより最近の知見の一つは、栄養因子（trophic factor）及び栄養素が装置の前部及び後部の間を完全に通過することを可能とするには、角膜アンレーが、孔を有している必要があることを示唆している。該EP-A-729323は、多くの理由のため実例的なものであり、当該技術の背景水準を説明しており、そうでないと特に定義されていない限り、そこで使用されている定義は、本発明にも適用される。多数の合成ポリマーが角膜アンレー用、又は上皮形成が望まれているその他の角膜インプラント用に提案されている（疎水性材料、例えばペルフルオロポリエーテルに基く材料、又はコラーゲンハイドロゲルコポリマー性材料など）。
【０００５】
しかし、先行技術の例は、支持性である解剖学的形状が可能であることを示す以外には、
(i)角膜上皮組織がインプラントの表面を横切って移動する過程；
(ii)材料の表面を横切って組織が移動した後の重層角膜上皮の集合（assembly）の過程（この移動の過程を考慮すると、眼上皮とその他の上皮の間に細胞の移動の過程については相違がないことを確認する必要がある。角膜上皮の場合、角膜の中心領域に認められる上皮細胞は、辺縁領域（結膜と角膜の間の変わり目である領域）にある幹細胞から当初発生する。つまり、辺縁領域から中心角膜への上皮細胞の移動がある。これは、幹細胞が表皮の低レベルにあり、重層の前、重層の間、又は重層を可能とする細胞の移動が前部表面に向いている場合に、これはその他の上皮の状態と同等である）；
(iii)合成材料の表面、及び表面近くへの半接着斑（基底上皮細胞における）の形成の過程
のための合成ポリマーの表面の解剖学的形状に関する要件を教示も予測もしていない。
【０００６】
先行技術の角膜アンレーの欠点は、角膜上皮がアンレーを被覆するには、関連するのは孔ではなく、複数のくぼみ（a plurality of indentations）を有する解剖学的形状であるとの驚くべき知見に基づいた本発明の角膜アンレーによって克服される。
【０００７】
本明細書における開示による角膜内又は角膜表面上に配置される角膜アンレー又は角膜インプラントは、角膜上皮によるインプラント表面の過剰成長を可能とするための表面解剖学的形状を有している。角膜アンレー装置にかぶさる角膜上皮組織は、基底上皮細胞層内に半接着斑構造のタンパク様の成分が存在するなどの重層角膜上皮の特徴を示す。
【０００８】
本発明は、材料の多孔性とは別に、表面の解剖学的形状が、角膜上皮組織による角膜アンレーの過剰成長を促進することができるという認識から生まれた点で、先行技術とは異なる。
【０００９】
本発明は、角膜アンレーにおいて使用するためのポリマー表面であって、同じ合成ポリマーの滑らかで非多孔性の形状のものでみられるよりも優れたレベルで角膜上皮組織の過剰成長及び移動を支持する解剖学的形状を有する表面を提供する。
【００１０】
先行技術からは更に異なる特性は、本発明による表面は、この解剖学的形状を多孔性と組合わせていることである。
【００１１】
したがって本発明は、生体適合性であり、光学的に透明であり、合成かつ生体において安定なポリマー材料である、角膜内又は角膜表面上に配置される角膜アンレー又は角膜インプラントであって、該材料が、組織細胞の付着及び成長を支持する表面を有し、ここでその上に上皮組織が引き付けられ、そして付着するようになるインプラントの外部表面、又は角膜アンレーの場合はアンレーの前部表面が、複数の表面のくぼみを含む解剖学的形状を有する、角膜アンレー又は角膜インプラントに向けられる。
【００１２】
組織細胞の付着及び成長を支持する表面は、前記支持を直接もたらすか、または該表面は、組織細胞の付着及び成長を支持する表面被覆を付加的に有するかのいずれかである。
【００１３】
表面のくぼみは、孔を有していてもよいことは重要であるが、孔だけでは、表面のくぼみの意味には含まれない。言い換えると、「複数の表面のくぼみを含む解剖学的形状」という語は、孔プラスくぼみを有する表面を包含するが、更にくぼみを有さずに孔を有する表面は包含しない。EP-A-729323に開示されるような、孔を有するがくぼみを有しない角膜アンレーは、本発明の範囲内ではないという事実を別にすると、くぼみは任意の適当な形及び幾何学的構造を有していることができる。
【００１４】
複数のくぼみの好ましい特性は、これらが、表面平面において、５００平方ナノメーターに等しいか又はそれを超え、そして０．７平方ミクロンに等しいか又はそれ未満である表面積を有するか、又は
これらが一般的に表面平面において、曲線又は円形の形状を有し、０．０２５ミクロンに等しいか又はそれを超える最小直径を有し、そして０．９５ミクロンに等しいか又はそれ未満である最大直径を有するというものである。
【００１５】
より好ましい最小直径は、０．０５ミクロンに等しいか又はそれを超える。より好ましい最大直径は、０．８０ミクロンに等しいか又はそれ未満であり、更により好ましい最大直径は、０．５０ミクロンに等しいか又はそれ未満であり、最も好ましい最大直径は、０．３５ミクロンに等しいか又はそれ未満である。
【００１６】
複数の表面のくぼみの好ましい特性の別のセットは、これらが、表面平面における表面積の０．１０％に等しいか又はそれを超え、そして表面積の２０％に等しいか又はそれ未満である表面平面における同等面積を有することである。この点においてより好ましい値は、表面のくぼみが、表面平面における表面積の２％に等しいか又はそれを超え、そして表面平面における表面積の１５％に等しいか又はそれ未満である表面平面における面積を有するというものであり、最も好ましいのは、表面平面における表面積の３％に等しいか又はそれを超え、そして表面平面における表面積の１０％に等しいか又はそれ未満の範囲にある。
【００１７】
本明細書において使用する用語についてコメントするのが適当であろう。上述のくぼみのサイズのあるものは、それぞれのくぼみのサイズを意味し、これらのサイズの複数のくぼみがある。このようなくぼみは、すべて同一のサイズを有していなくてもよいが、全般的にこれらのサイズの範囲に適合する。この型のサイズは、例えば請求項２及び３に記載のものである。これとは反対に、上記で特定されているサイズのあるものは、くぼみの全体としての合計についてのものである。この型のサイズは、例えば請求項４に記載のものである。当業者であれば、開示されている絶対的な規模を考慮して、この相違を理解できると考えられる。
【００１８】
表面平面に対する表面のくぼみの深さの平均は、０．１ミクロンに等しいか、又はそれを超えるのが好ましい。
【００１９】
表面のくぼみは、角膜上皮組織もしくは細胞もしくは細胞の過程のインプラントの表面の平面から２０ミクロンを超える深さへの成長に備えるものではないのが好ましく、又は表面のくぼみが、角膜上皮組織若しくは細胞もしくは細胞の過程の、インプラントの視覚領域におけるインプラントの表面平面から２０ミクロンを超える深さへの成長に備えるものではないのがより好ましい。
【００２０】
上述したような表面のくぼみは、生物学的分子又はその合成類似化合物から形成されたコーティング又はゲルを、該複数の表面のくぼみ上又はくぼみ内に配置して有していてもよいし、有していなくてもよい。
【００２１】
上述したようなゲルは、例えば表面に化学的に架橋している、又はしていないコラーゲン（ここでゲル内のコラーゲン分子は架橋されているか、又は架橋されていない）から製造することができる。
【００２２】
更に上記で開示されたような複数の表面くぼみの一部又は全部は、表面平面以下の材料のバルク内で他のくぼみと連続性を有していてもよい。
【００２３】
また、表面のくぼみに加えて、インプラント又はアンレーを通過する孔が存在していることも可能である。このような場合、孔は、好ましくは曲線又は円形状であり、孔の直径は、０．０２５ミクロンに等しいか又はそれを超える範囲、そして０．９５ミクロンに等しいか又はそれ未満の範囲にある。この点においてより好ましい値は、直径０．０５ミクロンであり、そして直径０．３５ミクロンに等しいか、又はそれ未満である。
【００２４】
好ましい角膜アンレーは、以下の特徴を有する：これは、請求項１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、又は８及び１０及び１１の要素を結びつけたものである。本発明の好ましい特性のその他の組み合わせも可能であり、本発明の範囲内である。この記載は、上記で開示された本発明の側面及び以降に続くこのような側面を含む。
【００２５】
本発明の更に好ましい側面は、アンレーの前部表面の解剖学的形状が、上記で定義したようなくぼみと、上記で定義したような孔を含み、該解剖学的形状は、表面積が１０，０００平方ナノメーターに等しいか、又はそれ未満である複数の表面のくぼみからなるというものである。
【００２６】
本発明の別の好ましい側面は、アンレーの前部表面の解剖学的形状が、上記で定義したようなくぼみと、上記で定義したような孔を含み、該解剖学的形状は、最大直径が０．４ミクロンに等しいか、又はそれ未満である複数の表面のくぼみからなるというものである。より好ましくは、該最大直径は、０．２ミクロンに等しいか、又はそれ未満である。
【００２７】
上記の本発明の開示は、特に上皮内角膜アンレー及びその他の角膜インプラント材料に関してされたものである。しかし、この事実は、いかなる実質的な方法によっても制限するものと理解してはならない。上皮組織の過剰成長を支持する材料は、経皮アクセス装置などのその他の上皮内インプラントの成分としての用途も有するであろう。
【００２８】
以下の実施例は、説明を目的とするに過ぎず、いかなる方法によっても、請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００２９】
実施例１：本例は、複数の表面のくぼみを含む表面を有する材料が、同じ組成の材料であるが、表面のくぼみを含まない形状の材料と比較して、角膜上皮の増強された成長に備えるものであることを証明している。細胞培養アッセイにおいて証明を行い、材料表面の、角膜上皮組織の過剰成長に対する支持能を測定した。したがってこのアッセイのフォーマットは、角膜アンレーの表面が、角膜上皮が材料表面上を移動し、材料表面を被覆する能力を促進するという要件については、角膜アンレー装置の状況を複製するものである。
【００３０】
方法：ボイデンチェンバー（Boyden chamber）を用いたアッセーにおいて使用するための材料の組み立て：試験する材料を、上部及び下部チェンバーが試験する材料の直径２５mmのディスクで隔てられているような構造を有する改良「ボイデン」チェンバーにおいて組み立てた。これらの改良ボイデンチェンバーは、基体と上部のセクションからなり、これは一緒になって、培養アッセーに使用する材料を上下で留める。ポリカーボネート基体（５cm平方、高さ３．８cm）は、２ml容量の内部半球状下部チェンバーを含む。この下部チェンバーは、チェンバーの反対側に設置された２つのチャンネルによって外部と接続されており、これが下部ウエル内の培地が、細胞培養インキュベーター内で大気雰囲気中の５％ＣＯ2によって緩衝されるように空気の拡散を可能とする。下部セクションの頂上部において、下部チェンバー内に伸びて、試験する材料の直径２５mmの試料の末端の２mmを支持する２mmの幅の平坦な円形状のたな状部がある。基体は、ポリテトラフルオロエチレンから製造された糸を含み、これが上部セクションを留める。上部及び下部のセクションの間で、たな状部によって支持されて、１枚のシート、又は代わりに２枚の材料シートのいずれかであることができる試験する材料試料が配置される。２枚の材料シートがある場合には、これらのシートは、糸のメカニズムによって及ぼされる圧力により、非常にきつい並列で保持される。内径２３mm、外径２５mmのシリコーンガスケットが、材料試料と上部セクションの間に配置され、液体に対してもれのない密閉が得られるのを可能とし、培養培地を、下部及び上部チェンバーの両方に導入する。ボイデンチェンバーの下部セクションは、培地（約２ml）で完全に充填し、上部セクションに培地１．５mlを加えた。
【００３１】
試験材料の記載：軌跡腐食（track-etched）ポリカーボネート膜（湿潤剤を含まず、Poretic Corporation, USA製；名目上の孔径０．４ミクロン）。これらの膜材料は、柱状の孔を含んでおり、その測定直径は、０．３５ミクロンであった。本アッセイで使用した対照物質（つまり、試料Ａ）は、非多孔性ポリカーボネートであった。
【００３２】
角膜上皮組織過剰成長アッセイ：新たに摘出したウシ眼球から角膜を切除し、間質組織及び内皮層の大部分を除去した。皮膚生検パンチを用いて角膜組織の直径６mmのボタンを組織の末梢から採取した。このように採取された外植片は、無傷の上皮と、付着した少量の間質組織を含んでいたが、間質組織の９０％以上は、除去されていた。外植片を材料表面上に（間質側を下に）置き、インシュリン５μg/ml、トランスフェリン５μg/ml、亜セレン酸（Collaborative Research）５ng/ml、ペニシリン６０μg/ml、及びストレプトマイシン（ICN Flow）１００μg/mlを補給したダルベッコの改変イーグル培地／Ham's F12(ICN Flow)で被覆した。空気中に５％ＣＯ2(v/v)を含有する加湿大気中３７℃で、培地を３日目及び６日目に交換しながら９日間保持した。この期間の後、外植片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の１０％(v/v)ホルマリン中、室温で３０分間固定し、蒸留水で洗浄し、５分間空気乾燥した。外植片を、０．０２Mリン酸緩衝液（pH７）中の０．１％(w/v)クリスタルバイオレット（Edward Gurr Ltd）で室温で３０分間染色し、次に蒸留水で３回洗浄して、非結合染料を除去した。組織（上皮の成長＋外植片ボタンの当初の面積）の総面積を像解析（Quantimet 570, Leica Cambridge）により測定した。上皮組織成長の指標（組織成長指数）を、各外植片からの成長の最終表面積を、組織外植片の当初面積で除することによって計算した。したがって、組織成長指数の値が１．０であることは、角膜上皮組織の表面上での成長のなかった状態を意味する。各実験は、２回繰り返し、各処置ごとに４重に設定した。
【００３３】
結果：角膜上皮組織の過剰成長の程度を、３種類の異なるポリカーボネート材料で比較した。
試料Ａ：平滑で非多孔性ポリカーボネート表面
試料Ｂ：同じ材料からできているが、材料上の測定直径０．３５ミクロンの複数の表面くぼみを有する表面；複数の表面くぼみは、表面平面における表面積の９％に等しい表面平面における面積を含む。この試料は、名目上の直径０．４ミクロンの軌跡腐食孔ポリカーボネート膜によって提供された。試料Ｂでは、この材料は、下側上で、非多孔性材料に厳密に並列に組み立てたので、上部膜材料を介してタンパク質又は液体の流出は可能ではなかった。
試料Ｃ：材料上の複数の表面くぼみを有し、液体及びタンパク質及び栄養素の膜材料を介しての流出を可能とする孔を更に有する表面。
【００３４】
９日間の培養期間の間のこれらの試料における角膜上皮組織の過剰成長の程度は、以下のように測定された：
【００３５】
【表１】
0004282905.tif 000002
【００３６】
Student-Newman-Keuls多重比較統計試験に付したところ、以下の結論が得られた：試料Ｂ及びＣは、試料Ａよりも統計学的に有意に高い組織成長指数値を示した（両者ともＰ＜０．０５のレベル）が、試料Ｂと試料Ｃの間に統計学的な有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００３７】
この実験より、全般的に平滑な表面上への角膜上皮組織の過剰成長を支持する材料については（試料Ａについては、組織成長指数は１を超えていた）、この材料が、名目上の直径０．４ミクロン及び表面平面における表面積０．１２平方ミクロンの複数のくぼみを有する表面の形状の場合では、有意に優れた角膜上皮組織の成長の程度を支持していた（試料Ｂ及びＣ）。この優れたレベルの角膜上皮組織成長は、材料により材料の孔を介しての液体及びタンパク質及び栄養素の流出が可能である場合にも認められたが、この液体又は分子の動きに依存してはいなかった。材料の表面における孔が、液体及びタンパク質及び栄養素のこのような流出を支持することはできない場合にも見られたからである。
【００３８】
実施例２：この実験により、合成ポリマー表面の化学組成について同じ表面化学を有する一連の材料について、複数のくぼみを有する材料は、同じ平滑な表面よりも有意に優れた角膜上皮組織の成長の程度を支持していたことが示された。これは、合成ポリマー表面そして表面に共有結合したコラーゲンを有する材料の両方についてこれが見られた。これらの材料では、表面における複数のくぼみでは、名目上の直径は０．０７５ミクロンであり、表面平面における表面積は７８５０平方ナノメーターであった。複数の表面のくぼみ及び孔は、表面平面における表面積の２．５％と同じ表面平面における面積を有していた。
【００３９】
実施例３：この実施例では、基底膜及び半接着斑（共に、無傷な角膜中に存在する間質に対する層形成上皮の永続的癒着に対して責任があることが知られている）の集合におけるポリマー表面の解剖学的形状の、組織−材料インターフェースにおける上皮細胞による役割を試験した。各半接着斑は、基底上皮細胞の後部面上のケラチン中間体フィラメント及び半接着斑プラークに含まれており、これらは、基底膜を介して、前部間質を貫通するアンカーフィブリルに結合し、それによって上皮をその結合組織に固定していた。
【００４０】
方法及び材料：
試料Ａ：上記の実施例１に記載のとおりである。
試料Ｃ：同じポリカーボネート材料からできているが、材料上の測定直径０．３５ミクロンの複数の表面くぼみを有し（下記の表中の「Ａ値」）、加えて膜材料を介して液体及びタンパク質及び栄養素の流出を可能とする孔を有する表面。この試料は、０．４ミクロンの名目上の直径の軌跡腐食孔ポリカーボネート膜によって提供された（下記の表中の「Ｂ値」）。複数の表面くぼみ及び孔は、表面平面における表面積の９％に等しい表面平面における面積を有していた（下記の表中の「Ｃ値」）。
【００４１】
試料Ｄ、Ｅ及びＦは、Ａ値、Ｂ値及びＣ値が、以下の表から明らかなように変えられている以外は、試料Ｃと同様であった。
【００４２】
【表２】
0004282905.tif 000003
【００４３】
外植（explant）した角膜組織のボタンは、各表面の三重の試料上に配置し、２１日間培養して維持したが、その間、上皮組織は、基礎にあるポリマーと直接接触して成長した。表示組織−ポリマーインターフェースの超薄切片を、透過型電子顕微鏡を用いて調べ、基底膜及び半接着斑プラークのインターフェースに沿った形成（超顕微鏡的特性から確認）を記録した。
【００４４】
結果：試料Ａ材（平滑かつ非多孔性ポリカーボネート表面）上の上皮細胞の基底層を構成する細胞は、ポリマー表面に緊密に並列のままであり、この組織ポリマーインターフェースに沿った基底膜を示す証拠はほとんど若しくはまったくなく、そして半接着斑プラーク成分を示す証拠は全くなかった。
【００４５】
直径０．０７５ミクロンの複数のくぼみを含有する表面（試料Ｄ）と接触した細胞は、一致してこれらの孔開口部を架橋していた。このサイズの表面くぼみについては、連続した基底膜形成と、くぼみを横切っての半接着斑プラーク集合の規則的なパターンがあった。名目上の直径０．４、０．８又は１ミクロンの複数のくぼみを含有する表面（試料Ｃ、Ｅ及びＦ）と接触した細胞は、有効に孔を架橋していたが、細胞の細胞質は、ある種の表面くぼみの口内へわずかにはみ出ているのが観察された。しかし、ポリマーの固形部分（孔の間）が細胞とすぐに隣接している場合は、直径０．０７５ミクロンの複数のくぼみを含有する表面を有する膜とは反対に、これらの表面のそれぞれでは、基底膜及び半接着斑プラークの形成は、連続性を欠いており、これらの領域に限定されていた。つまり、表面のくぼみは、表面のくぼみのサイズが、直径０．４ミクロン又はそれを超える場合に、基底膜の連続性及び半接着斑プラークの組み立てを中断していた。
【００４６】
この研究により、永続的な上皮接着に責任のある構造の集合（無傷の角膜組織における上皮−間質インターフェースに見られるような、連続的な基底膜及び半接着斑プラークを含む）は、組織因子及び栄養素に向けた多孔性を含む材料について直径０．４ミクロン以下のくぼみを含有する表面に支持されていた。