(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質担体に含水率が３０〜４０重量％となるように液体培地を含有させた後、培養槽内において該多孔質担体を密閉状態で滅菌し、次に、外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地を該培養槽内に添加して該多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整し、無菌状態で、多孔質担体を攪拌した後に静置状態とすることにより、外生菌根菌を培養することを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該多孔質担体が無機質材料を含むことを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項３】
請求項２に記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該無機質材料は、バーミキュライトとパーライトとを単独又は混合して用いることを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該滅菌方法が、オートクレーブ滅菌であることを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該無菌状態で外生菌根菌を培養する温度が、２４〜２８℃であることを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌は、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムのうち少なくとも１種類以上を含有することを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地は、菌体が１ｍｍ以下に砕片化されていることを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外生菌根菌の固体培養方法に関し、特に、数十リットル以上の培養槽を用いて、外生菌根菌を安定的に固体培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外生菌根菌は、マツ科、ブナ科、カバノキ科などの木本植物の根に共生する担子菌類や子嚢菌類などであり、現在、世界中において65属5000種以上存在することが知られている。
宿主植物の根に共生した外生菌根菌は、宿主植物から供給されるグルコースなどの光合成産物をエネルギー源として、菌自身が増殖する一方で、広範囲の土壌中に張り巡らせた菌糸を通じて、可給態リン酸やカリウム、窒素などの無機養分または水分を宿主植物に供給する。
そのため、外生菌根菌が感染した植物は、感染していない植物よりも、宿主植物の生存率を向上させたり、成長を促進させたりすることが知られている。
また、これ以外にも、宿主植物の根に共生した外生菌根菌は、宿主植物根への病原菌の侵入を軽減したり、乾燥耐性、凍害耐性、重金属耐性を宿主植物に付与したりするなど宿主植物の生育環境を改善する効果が報告されている。
【０００３】
上述したような外生菌根性木本植物の生育しているところでは、通常、土着の外生菌根菌が既に存在しているため、ほとんどの根は、これら土着菌が高い割合で感染している。
しかし、道路建設などによって表層土が取り除かれ、下層土が剥き出しとなった裸地、火災や焼畑などの跡地、火山活動に伴う火砕流や自然災害による土石流などの堆積地、土壌浸食や沙漠化によって生じた裸地、地下資源を得るために掘削した鉱山跡地などには、土着菌が存在しないか、またはたとえ存在したとしても非常に少ない場合が多い。また、このような場所では、植物や菌類の種多様性も長期に亘って低い場合が多い。
【０００４】
ところで、今日、世界中では地球温暖化などの地球環境問題についての関心の高まりから、人類がこれまで開発した場所や自然災害によって裸地化した場所を、人為的に元の植生へ復元するための緑化や樹林化が行われている。
その際、導入する外生菌根性の木本植物の定着率を向上させたり、生育を促進させたりするために、播種および苗移植の前後に外生菌根菌を接種したり、外生菌根菌感染苗を移植したりする方法が行われてきた。
この場合の使用する接種源としては、（１）外生菌根性の木本植物の生育地土壌（土壌接種源）、（２）外生菌根菌の子実体から採取した胞子（胞子接種源）、（３）室内で人工的に培養、増殖させた栄養菌糸（栄養菌糸接種源）の主に3つの形態がある。
【０００５】
他方、我が国においては、国土の約70％が森林であり、外生菌根性樹種を主体とするほとんどの森林土壌には既に土着の外生菌根菌が存在し、これらの土壌を接種源とすることで、容易に外生菌根菌感染苗を作製することができる。
しかし、近年、我が国においては、道路や土地開発に伴う森林伐採、活発な火山活動などにより、広域の裸地面積が増加している。そのため、今後、国内においてもこれらの裸地化した場所を緑化または樹林化する機会が増加し、外生菌根菌の接種源を接種したり、外生菌根菌の感染苗を移植したりする場面が増加することが予測される。
このため、従来の土壌接種源だけではなく、胞子や栄養菌糸など多様な形態の接種源を安定的に確保する技術の開発が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上述した問題を解決し、外生菌根菌の接種源のなかで、特に栄養菌糸を用いた外生菌根菌を、数十リットル以上の培養槽を用いて、短期間で安定かつ大量に培養することが可能であり、しかも、均質な菌体を培養することが可能な固体培養方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、請求項１に係る発明は、多孔質担体に含水率が３０〜４０重量％となるように液体培地を含有させた後、培養槽内において該多孔質担体を密閉状態で滅菌し、次に、外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地を該培養槽内に添加して該多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整し、無菌状態で、多孔質担体を攪拌した後に静置状態とすることにより、外生菌根菌を培養することを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法である。
なお、本発明における「静置状態」には、発育速度の異なる外生菌根菌の種類により、静置と撹拌を繰り返すことを含むものである。
【０００８】
好ましくは、請求項２に係る発明のように、請求項１に記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該多孔質担体が主に無機質材料であることを特徴とする。
より好ましくは、請求項３に係る発明のように、該無機質材料は、バーミキュライトとパーライトとを単独又は混合して用いることを特徴とする。
【０００９】
また、請求項４に係る発明では、請求項１乃至３のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該滅菌方法が、オートクレーブ滅菌であることを特徴とする。
【００１０】
さらに、請求項５に係る発明では、請求項１乃至４のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該無菌状態で外生菌根菌を培養する温度が、２４〜２８℃であることを特徴とする。
【００１１】
また、請求項６に係る発明では、請求項１乃至５のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌は、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムのうち少なくとも１種類以上を含有することを特徴とする。
さらに、請求項７に係る発明では、請求項１乃至６のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地は、菌体が１ｍｍ以下に砕片化されていることを特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明における好適例を用いて詳細に説明する。
本発明に係る外生菌根菌としては、ハラタケ目テングタケ科のテングタケ属である、Amanita murina、Amanita pantherina（テングタケ）、Amanita muscaria（ベニテングタケ）、Amanita porphyria、Amanita rubescens、Amanita aspera、Amanita citrina、Amanita spreta、Amanita xanthocephla、Amanita umbrenella、Amanita flavoconia、Amanita spissa（ヘビキノコ）や、イグチ科のイグチ属である、Boletus edulis（ヤマドリタケ）、Boletus aereus（ススケヤマドリタケ）、Boletus erythropus（オオウラベニイロガワリ）、Boletus calopus（アシベニイグチ）、Boletus pulverulentus（イロガワリ）、Boletus ornatipes（キアミアシイグチ）、ヌメリイグチ属である、Suillus collinitus、Suillus granulatus（チチアワタケ）、Suillus luteus（ヌメリイグチ）、Suillus brevipes、Suillus bovinus（アミタケ）、Suillus laricinus（シロヌメリイグチ）、Suillus subluteus（ヌメリツバイグチ）、Suillus plorans、Suillus variegatus、Suillus lakei、Suillus grevillei（ハナイグチ）、Suillus intermedius、Suillus bellinii、Suillus mediterraneensis、Suillus americanus（キヌメリイグチ）、Suillus neoalbidipes、Suillus ochraceoroseus、Suillus sinuspaulianus、Suillus spectabilis（キノボリイグチ）、Suillus tomentosus（ワタゲヌメリイグチ）、Suillus placidus（ゴヨウイグチ）、Suillus sibiricus、コショウイグチ属である、Chalciporus pierrhuguesii、Chalciporus piperatus（コショウイグチ）、アワタケ属である、Xerocomus subtomentosus（アワタケ）、Xerocomus chrysenteron（キッコウアワタケ）、 Xerocomus badius（ニセイロガワリ）、Xerocomus ferrugineus、ヤマイグチ属である、Leccinum aurantiacum、Leccinum arenicola、Leccinum holopus（シロヤマイグチ）、ニガイグチ属である、Tilopilus felleus（ニガイグチ）、アミハナイグチ属である、Boletinus cavipes（アミハナイグチ）、またフウセンタケ科のフウセンタケ属である、Cortinarius favrei、Cortinarius russus、Cortinarius purpurascens（カワムラフウセンタケ）、Cortinarius vibratilis（キアブラシメジ）、Cortinarius allutus（ニセマンジュウガサ）、Cortinarius amoenolens、Cortinarius anomalus（マルミノフウセンタケ）、Cortinarius brunneus、Cortinarius glaucopus、Cortinarius mucosus（アブラシメジモドキ）、Cortinarius subpurpurascens、Cortinarius caerulescens（ムラサキシメジモドキ）、ワカフサタケ属である、Hebeloma edurum、Hebeloma repandum、Hebeloma mesophaeum（ワカフサタケ）、Hebeloma hiemale、Hebeloma crustuliniforme（オオワカフサタケ）、Hebeloma cylindrosporum、Hebeloma sinapizans、Hebeloma marginatulum、Hebeloma polare、Hebeloma longicaudum（ナガエノワカフサタケ）、Hebeloma westraliense、Hebeloma eburneum、Hebeloma sinapizans、Hebeloma mesophacus、Hebeloma velutipes、Hebeloma vinosophyllum（アカヒダワカフサタケ）、またオキナタケ科のキショウゲンジ属である、Descolea maculata、ヌメリガサ科のヌメリガサ属である、Hygrophorus latitabundus、Hygrophorus russula（サクラシメジ）、ヒダハタケ科のヒダハタケ属である、Paxillus involutus（ヒダハタケ）、ベニタケ科のチチタケ属である、Lactarius deliciosus（アカモミタケ）、Lactarius sanguifluus、Lactarius rufus（アカチチタケ）、Lactarius hatsudake（ハツタケ）、Lactarius akahatsu（アカハツ）、Lactarius insulsus（カラハツモドキ）、Lactarius chrysorrheus（キチチタケ）、Lactarius deterrimus、Lactarius porninsis（カラマツチチタケ）、Lactarius scrobiculatus（キカラハツタケ）、Lactarius affinis、Lactarius hygrophoroides（ヒロハチチタケ）、Lactarius chelidonius、Lactarius indigo（ルリハツタケ）、Lactarius mucidus、Lactarius pubescens（シロ��ラハツタケ）、Lactarius subpurpureus、Lactarius thejogalus、Lactarius thyinos、Lactarius torminosus（カラハツタケ）、Lactarius vinaceorufescens、Lactarius acerrimus（カラハツタケ）、ベニタケ属である、Russula norvegica、Russula foetens（クサハツ）、Russula subfoetens、Russula velenovskyi、またキシメジ科のキツネタケ属である、Laccaria laccata（キツネタケ）、Laccaria fraterna、Laccaria amethystea（ウラムラサキ）、Laccaria deliciosus、Laccaria montana、Laccaria bicolor（オオキツネタケ）、Laccaria proxima、Laccaria ochropurpurea、Laccaria farinacea、キシメジ属である、Tricholoma matsutake（マツタケ）、Tricholoma focale、Tricholoma striatum（マツシメジ）、Tricholoma flavovirens（キシメジ）、Tricholoma portentosum（シモフリシメジ）、Tricholoma saponaceum（ミネシメジ）、Tricholoma vaccinum（クダアカゲシメジ）、Tricholoma tridentinum var. cedretorum、Tricholoma caligatum（オウシュウマツタケ）、Tricholoma cedrorum、Tricholoma terreum（クマシメジ）、Tricholoma aurantium、Tricholoma cingulatum、Tricholoma fulvum（キヒダマツシメジ）、Tricholoma myomyces、Tricholoma populinum（ムレワシメジ）、Tricholoma resplendens、Tricholoma virgatum（ネズミシメジ）、Tricholoma columbetta（シロケシメジ）、Tricholoma portentosum（シモフリシメジ）、Tricholoma sulphureum（ニオイキシメジ）、シメジ属である、Lyophyllum semitale（スミゾメシメジ）、Lyophyllum shimeji（ホンシメジ）、Lyophyllum fumosum（シャカシメジ）、Lyophyllum decastes（ハタケシメジ）、またオニイグチ科のキクバナイグチ属である、Boletellus russellii（セイタカイグチ）、オニイグチ属である、Strobilomyces floccopus（オニイグチ）、さらに、ニセショウロ目コツブタケ科のコツブタケ属である、Pisolithus tinctorius（コツブタケ）、Pisolithus albus、Pisolithus marmoratus、またニセショウロ科のニセショウロ属である、Scleroderma verrucosum（ザラツキカワタケ）、Scleroderma cepa（タマネギモドキ）、Scleroderma flavidum（ウスキニセショウロ）、Scleroderma dictyosporum、Scleroderma meridionale、Scleroderma polyrhizum（ツチグリカタワタケ）、Scleroderma areolatum（ヒメカタショウロ）、Scleroderma citrinum（ニセショウロ）、Scleroderma paradoxum、Scleroderma bovista（ハマニセショウロ）、さらに、スッポンタケ目ヒステランギウム科のヒステランギウム属である、Hysterangium incarceratum、Hysterangium clathroides、またヒメノガステル目ショウロ科のショウロ属である、Rhizopogon roseolus、Rhizopogon rubescens（ショウロ）、Rhizopogon vinicolor、Rhizopogon semireticulatus、Rhizopogon ochraceorubens、Rhizopogon luteolus（ホンショウロ）、Rhizopogon subaerolatus、Rhizopogon ventricisporus、Rhizopogon vulgaris、Rhizopogon bacteri、Rhizopogon fuscorubens、Rhizopogon ponderosus、Rhizopogon truncates、Rhizopogon abietis、Rhizopogon cusickensis、Rhizopogon liui、Rhizopogon occidentalis、Rhizopogon smithii、Rhizopogon vulgaris、Rhizopogon superiorensis、Rhizopogon colossus、Rhizopogon hawkerae、Rhizopogon parkii、Rhizopogon subareolatus、Rhizopogon villosulus、Rhizopogon clavitisporus、Rhizopogon subcinnamomeus、Rhizopogon arctostaphyli、Rhizopogon atroviolaceus、Rhizopogon ellenae、Rhizopogon subcaerulescens、Rhizopogon subgelatinosus、またヒメノガステル科のヒメノガステル属である、Hymenogaster albus、Hymenogaster viscidus、Hymenogaster zeylanicus、またヒドナンギウム科のヒドナンギウム属である、Hydnangium carneum（コイシタケ）、Hydnangium sublamellatum、Hydnangium archeri、さらに、塊菌目セイヨウショウロタケ科のセイヨウショウロタケ属である、Tuber borchii、Tuber brumale、Tuber albidum、Tuber melanosporum、さらに、ツチダンゴ目ツチダンゴ科のツチダンゴ属である、Elaphomyces granulatus（ツチダンゴ）などがある。また、最近になって遺伝子解析から小房子嚢菌類に分類するのが妥当とされるCenococcum geophilum（シノコッカム ジオフィラム）がある。
これらは、純粋培養が可能な外生菌根菌であり、これらを単独または複数種類を組み合わせて用いることが可能である。本発明の実施例では、上述の中からヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムの３種類を例示するが、これに限定されるものではない。
【００１３】
シイタケやマイタケなど難分解性木質資材を利用できる菌類を増殖するには、おがくずや米糠など１００％有機質材料を使用するが、外生菌根菌は主に低分子量の糖類を利用するため、上記のような有機質材料を分解して利用できない。また、製品化後、外生菌根菌の利用できない有機質材料が土壌に混入される場合、土着の腐生菌侵入の要因となる。本発明に係る方法は、無機質の鉱物資材、特に表面積の大きな多孔質担体で構成され、それらに低分子量の糖類や無機元素から構成された栄養液体培地を含有させた後、十分に撹拌することで、少量の種菌を該多孔質担体中に短期間に増殖させることを特徴とする。しかも、菌体を砕片化して添加するため、多孔質担体内での外生菌根菌を均質に増殖させることが可能となる。
外生菌根菌を固体培養する際に利用する担体の種類としては、外生菌根菌の栄養菌糸が侵入可能な孔隙を有する多孔質担体が好ましく、無機質材料としては、例えばバーミキュライト、パーライトなどを単独、または複数のものを混合して使用することが可能である。
バーミキュライトとパーライトとを混合する場合の混合割合は、バーミキュライトの総容量に対してパーライトを４０〜７０容量％用いる。また、菌種によって、有機質材料、例えばヤシ殻、ピートモスや草炭などの泥炭を、無機質材料に混合して用いることも可能である。
バーミキュライトとパーライトを主とし、ヤシ殻を混合するには、総容量の内、ヤシ殻を２０〜３０容量％用いることが好ましい。
【００１４】
さらに、外生菌根菌の生育促進剤として、無機質材料の焼成珪藻土、ベントナイト、ゼオライト、イソライト、炭、木炭、活性炭、竹炭、有機質材料のミズゴケ、あら粉（ダイズ、トウモロコシなど）、森林のリター、おがくず、のこくず、穀粒または籾殻（コムギ、オオムギ、ホワイトミレット、イネなど）、ミミズ糞、貝殻粉末、貝化石、カニ殻、シャコ殻などを適宜少量添加して使用することも可能である。
【００１５】
栄養液体培地としては、ＭＭＮ培地（麦芽エキス３．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４０．２５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１５ｇ、ＣａＣｌ２０．０５ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１２ｇ、ＮａＣｌ０．０２５ｇ、チアミンＨＣｌ０．１ｇ、純水１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、ＭＰ培地（麦芽エキス１０．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、酵母エキス培地（酵母エキス２．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、ＰＤＡ培地（ディフコ社製ＰＤＡ培地３９ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）などが利用可能である。
【００１６】
次に、外生菌根菌の固体培養方法を説明する。
バーミキュライトやパーライトなどを混合した多孔質担体に、含水率が３０〜４０重量％となるように栄養液体培地を含有させる。多孔質担体の含水率を３０〜４０重量％に調整することにより、オートクレーブ滅菌効果を高めると共に、オートクレーブ滅菌後の撹拌効率を上げ、さらには、菌の繁殖効率を向上させることができる。水分が３０重量％未満では、オートクレーブ滅菌が部分的に不完全になるという不具合が生じ、４０重量％を超えると、後に行う外生菌根菌の栄養菌糸を含む栄養液体培地の添加処理によって担体が過湿になるため、攪拌効率が低下し、さらには、菌の繁殖効率も低下するという問題を生じる。
【００１７】
水分及び栄養液体培地を添加して含水率を調整した多孔質担体は、培養槽に入れられ、密閉状態にて滅菌処理を行う。これは、外生菌根菌を純粋培養するためには、可能な限り雑菌の繁殖を抑え、無菌状態に近い状態で培養するのが好ましいためである。
滅菌処理には、オートクレーブ滅菌を利用することができる。特に、多孔質担体に、無機質材料のみ利用する場合には、オートクレーブ滅菌が好ましい。オートクレーブの処理条件としては、担体が固体であること、容量が大きいことから１２１℃、２時間以上が望ましい。
多孔質担体に、ヤシ殻などの有機質材料を利用する場合には、オートクレーブ処理において、有機酸などの毒性物質を発生させる可能性がある。このような場合は、予め水に浸水させるなどして毒性物質を水抽出させた後、オートクレーブ滅菌する。
【００１８】
次に、培養槽内の滅菌処理した多孔質担体に、外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地を添加して、該多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整する。栄養液体培地を添加して多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整するのは、効率的に栄養菌糸を増殖させるためである。含水率が６５重量％未満では、外生菌根菌の栄養菌糸を生育させるには若干乾燥しており、８０重量％を超えると過湿によって増殖が抑制されるという問題を生じる。
そして、添加された外生菌根菌以外の菌が培養槽内に入らないように、培養槽内を無菌状態に保持すると共に、多孔質担体を攪拌した後に静置状態とすることにより、外生菌根菌の培養を行う。
培養槽内の環境は、外生菌根菌の種類に対応して、培養に適した環境に設定する必要があり、例えば、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムなどを培養する場合には、培養温度２４〜２８℃、培養初期のｐＨ５〜７が好ましい。外生菌根菌の最適生育温度は菌の種類によって数値範囲を多少とも異にするが、活性低下を生じない範囲として、この範囲が望ましい。また、ｐＨについては、菌の密度や生育期間によって変化するが、培養途中で酸やアルカリによってｐＨ調整を行わない場合、培養の最終段階では、ｐＨは３〜８程度に変化する。
菌の生育環境を最適に維持するため、必要に応じて、培養途中で酸やアルカリを添加し、ｐＨを一定の範囲に維持することも可能である。
【００１９】
培養槽内の多孔質担体の攪拌は、添加した外生菌根菌の栄養菌糸片が多孔質担体と完全に混合して均一となるように行う。例えば、固定された攪拌棒と培養槽の鉛直軸まわりの回転による攪拌や、培養槽自体の水平軸まわりの回転のみにより行う方法を利用することが可能である。また、攪拌回数や攪拌速度も適宜調整可能であり、１回の攪拌で、培養槽を１〜５回程度回転させ、鉛直軸周りの回転の場合には１回転当たり数分間を要する場合もある。
攪拌後の静置期間は、通常数週間であり、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムなどでは、１７〜２７日間程度で培養が可能である。静置培養期間は、菌の増殖速度によって異なる。ヌメリイグチは扇状に速く伸長し、ウラムラサキは斑状に遅く伸長する。また、シノコッカム ジオフィラムは、伸長速度は遅いが、砕片化した菌糸からよく伸長し、担体に侵入後、さらに細かく分岐して増殖するため、担体への定着能力が高い。本発明に係る方法では例示としてこれらの生育型の異なった種類の菌を用いて試験を行っている。砕片化した栄養菌糸を培養槽内で均質に撹拌して分散させ、栄養菌糸の担体への接触機会を高めて定着を確保した後、担体内での増殖を促進し、短期間の製品化を主要な技術とする。
【００２０】
外生菌根菌の栄養菌糸を含む多孔質資材は、培養後、吸引装置を用いて、無菌採取および包装される。従来、外生菌根菌の製品化に関しては、液体培養菌体をゲルに封入する方法が知られているが、固体培養したものを無菌で封入し、包装され供給された例は少ない。本発明では、培養槽内の担体の袋詰めあるいはカプセル化が可能である。また、培養期間を短期間に設定しているため、宿主植物への感染に至るまでに、担体に含まれる糖類や菌体の二次代謝物質の影響はほとんどないと考えられ、担体の滅菌水での洗浄や絞りとりなどの処理は行わない。
【００２１】
培養槽に添加される外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地に関し、その製造方法について説明する。
まず、予備培養として、保存菌株を寒天培地へ置床し、静置培養を行う。
次に、液体培地への馴化を行うため、寒天培地上で増殖した栄養菌体を、液体培地へ添加し、静置培養を行うと共に、栄養菌体の砕片化をブレンダーによって１分間に１６８００回転、１０〜３０秒行う。この方法では、菌体は、１ｍｍ以下に砕片化する。そして、栄養菌体を増殖させるため、砕片化した栄養菌体を新たな液体培地へ添加し、静置培養し、再度、栄養菌体の砕片化することにより、種菌として使用可能な栄養菌糸を含む液体培地を得ることができる。この方法で、少量の種菌から早期に固体担体への供給を可能とした。
固体培地への供給には、液体培地で増殖した菌体を濃縮して高密度の接種源液とする必要がある。各液体培地を遠心分離機に一分間に３０００回転、２０分行い、これを集めて菌体を高密度とした接種源を作製する。この接種源は、菌によっては塊状となるものがあり、この場合には軽くブレンダーをかける。この接種源は、時間を経過すると互いに結合してしまうため、培養装置へ接種する数日前に調整する。菌の種類による生育速度の相違や、菌体が栄養液体培地に浮上あるいは浮遊しやすい性質をもつものなど取扱いに注意を要するが、総じて２〜４日前の調整が望ましい。ただし、これらは、全て無菌操作で行う。
【００２２】
次に、培養した外生菌根菌の試験方法を説明する。
（生存率の測定方法）
培養後の乾燥した多孔質担体、約０．３ｇ乾物を、栄養寒天培地の入ったシャーレに置床し、２５℃に保ったインキュベーターで、３０〜６０日間、静置培養し、全シャーレの数に対して、外生菌根菌の栄養菌糸の育成が確認されたシャーレ数を、生存率（％）として算出した。
（接種試験方法）
培養後の多孔質担体、約１．５ｇ乾物を、生育１年のコナラ、アラカシのポット上部に接種し、屋外で栽培した。１か月毎に２本ずつ採取し、実体顕微鏡により観察し、視覚的に外生菌根の形成過程を５段階（１：無し、２：非常に少ない、３：少ない、４：多い、５：非常に多い）で評価した。また、培養後の多孔質担体、約１８．８ｇ、５．７ｇ、１．４ｇ乾物を、ペーパーポットに充填した土壌表面より深さ約５〜１０ｃｍの層に接種し、クロマツ種子を播種し、５か月目に各接種量に対し、６本、３本、５本ずつの合計１４本および無接種苗５本を採取し、上記と同様に外生菌根の形成過程を評価した。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
多孔質担体として、バーミキュライト（旭工業株式会社製，商品名バーミキュライト）とパーライト（宇部興産株式会社製，商品名グリーンサム・グレイン）とを利用し、混合割合が容量比で３対２となるように混合した。ＭＰ液体培地（麦芽エキス１０．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、純水１０００ｃｃ）を多孔質担体の総重量の１０重量％吸収させ含水率を３０重量％に調整した。
培養槽としては、株式会社フジワラテクノアート製、（商品名）回転式通気無菌固体培養装置（型式ＡＦ−３５０、培養槽容量３０リットル、攪拌方法は固定攪拌棒と培養槽の鉛直軸まわりの回転による攪拌、温度制御方法は無菌空気の送風による制御）を利用した。
栄養液体培地を含む多孔質担体を、培養槽内に１５リットル入れ、培養槽を密閉した状態で、１２１℃、２時間のオートクレーブ滅菌を行い、培養槽内の担体温度が培養適用温度の２５℃に低下した後、外生菌根菌であるヌメリイグチの栄養菌糸を含む栄養液体培地を培養槽内へ担体重量あたり約１０％を培養槽内に添加した。
添加直後に、培養槽を５回回転させることにより培養槽内の担体を攪拌し、その後１週間毎に培養槽を２〜５回回転させる攪拌を行い、１７日間の静置培養を行った。培養温度は２４〜２８℃であり、多孔質担体の含水率はチョウ計量機（ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＢＡＬＡＮＣＥ  ＰＤ２−３００ＷＭＢ）で測定し、平均７７．７％であり、ｐＨは、ガラス電極式水素イオン濃度計（ＨＯＲＩＢＡ  ｐＨ  ＭＥＴＥＲ  Ｆ−１１）で測定し、静置培養の最終段階における平均ｐＨは４．８であった。
【００２４】
（実施例２）
バーミキュライトとパーライトとの混合割合が容量比で７対３となるように混合し、１週間目と２週間目に再度攪拌を行い、培養期間を２７日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は７１．１％、平均ｐＨは５．１であった。
【００２５】
（実施例３）
培養槽としては、株式会社フジワラテクノアート製、（商品名）回転式加圧蒸煮缶（型式ＮＫ−６０、培養槽容量１２０リットル、攪拌方法は手動による培養槽自体の水平軸まわりの回転による攪拌、温度制御方法は培養槽周囲のジャケットの温度調節により制御）を利用した。
また、栄養液体培地を含む多孔質担体の容量を７０リットル、培養期間を２１日間とした以外は、実施例２と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６５．４％、平均ｐＨは５．０であった。
【００２６】
（実施例４）
多孔質担体として、ヤシ殻（フマキラー株式会社製，商品名簡単培養土）とパーライト（宇部興産株式会社製，商品名グリーンサム・グレイン）とを利用し、混合割合が容量比で３対２となるように混合した。培養期間を２５日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は７７．７％、平均ｐＨは５．０であった。
【００２７】
（実施例５）
外生菌根菌をウラムラサキとし、培養期間を２１日間とした以外は、実施例２と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６９．５％、平均ｐＨは５．９であった。
【００２８】
（実施例６）
外生菌根菌をシノコッカム ジオフィラムとし、培養後２週間目に再度攪拌を行い、培養期間を２３日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６９．５％、平均ｐＨは７．１であった。
【００２９】
上記実施例１〜６の生存率を測定した結果を、表１に示す。
【００３０】
【表１】
0004238317.tif 000002
【００３１】
実施例１と２とを比較すると、バーミキュライトとパーライトとの混合割合が３対２（バーミキュライトに対するパーライトの容量比は約６６％）の方が、７対３（同容量比は約４３％）より、ヌメリイグチの培養能力が高いことが理解される。
【００３２】
また、実施例２と３とを見ると、培養期間の差により単純に比較はできないが、栄養液体培地を含む多孔質担体の容量が１５リットルから７０リットルに増加しても、ヌメリイグチを培養することが可能であるが、該容量が増加するに従い、培養能力の低下が見られる。これは、３０リットルの培養装置は細部まで撹拌できるのに対し、１２０リットルの培養装置は培養槽自体を反転させて攪拌するため、細部まで攪拌できていなかった可能性がある。したがって、後者の培養装置は、前者のものよりも、種菌接種後の撹拌に注意を払う必要があると考えられる。
【００３３】
実施例１と４とを比較すると、ヌメリイグチの培養には、多孔質担体として、無機質材料であるバーミキュライトとパーライトを用いる方が、有機質材料であるヤシ殻を混合するより、培養能力が高いことが理解される。
【００３４】
実施例５と６とを見ると、ウラムラサキについては、生存率が低いものの、ウラムラサキ、シノコッカム ジオフィラムに関しても、本発明に係る固体培養方法により、外生菌根菌の培養が可能であることが理解される。
【００３５】
次に、実施例２とほとんど培養条件を同じくするが、本実験では培養期間は１９日間、培養後1週間目に再度攪拌を行った。本例で得られた培養後の多孔質担体（ヌメリイグチの資材）をクロマツに、また、実施例６で得られた培養後の多孔質担体（シノコッカム  ジオフィラムの資材）をコナラ及びアラカシに接種した場合の試験結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
0004238317.tif 000003
【００３７】
表２より、本発明に係る固体培養方法で得られたヌメリイグチ、シノコッカムジオフィラムは、接種後５ヶ月も経過すると樹木幼苗への感染が目視でも確認できる程度まで成長している。
このため、本発明に係る固体培養方法で培養された外生菌根菌は、苗木への外生菌根菌の接種源として利用可能であり、しかも、上記実施例のように１５〜７０リットル単位での固体培養も可能である。この培養量は、苗畑などの野外において、数百から数千本の苗木への接種源を提供する能力を意味し、本発明は、外生菌根菌の生産能力向上に極めて有用であることが理解される。
【００３８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、外生菌根菌の接種源のなかで、特に栄養菌糸を用いた外生菌根菌を、数十リットル以上の培養槽を用いて、短期間で安定かつ大量に固体培養することが可能であり、しかも、均質な菌体を固体培養することが可能となる。