(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）可逆的不活性化圧力の試料容器内で試料混合物を供給する工程を備え、前記試料混合物は、酵素と前記酵素の基質とを含有しており、さらに、
（ii）前記試料混合物を活性化圧力に晒す工程と、
（iii）前記活性化圧力が、期間ｔa,yだけ維持される工程と、
（iv）前記試料混合物を不活性化圧力に晒し、それによって酵素反応を調節する工程とを備え、前記酵素がラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩの内の少なくとも１つから選択されることを特徴とする酵素反応調節方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記不活性化圧力が前記工程（i）においてＰi,xであり、その圧力では、酵素反応工程が可逆的に阻害され、前記活性化圧力が前記工程（ii），（iii）においてＰa,yであり、その圧力では、前記酵素反応工程を実施可能であり、前記工程（ii）は、期間δｔa,yで、圧力をＰa,yまで変化させる工程を備え、前記不活性化圧力が前記工程（iv）においてＰi,zであり、その圧力では、追加される酵素反応工程が可逆的に阻害され、前記工程（ii）は、期間δｔi,zで、圧力をＰi,zまで変化させる工程を備え、ｘはゼロ以上の整数であり、ｙは１以上の整数であり、ｚは１以上の整数であり、それによって、前記酵素反応を調節することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記期間ｔa,yが、単一酵素事象の平均的長さに対応する期間であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記酵素が分布特性を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記酵素が進行的特性を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記基質が、前記試料容器内で固定化され、工程（iv）の後に、前記試料容器圧力を維持しながら、前記試料容器から前記試料混合物の成分を除去する工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記除去成分が、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ開裂生成物、エキソヌクレアーゼ、ヌクレオチドまたはその組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記除去成分が前記試料容器から除去される時、前記試料混合物を分離する半透性物質を通過することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、工程（iv）の後、前記試料混合物の成分の特性を検出する工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記特性が、放射能、蛍光、化学発光、分子イオンチャージ／質量比、電気化学電位、発光、表面プラスモン共振、および赤外吸収から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法において、前記基質が核酸であり、前記酵素が制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩであり、少なくとも１つの開裂フラグメントが前記核酸基質から開裂されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の方法において、前記基質が、前記試料容器内で固定化された核酸であり、前記酵素がラムダエキソヌクレアーゼであり、少なくとも１つのヌクレオチドが前記核酸基質から開裂されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖および一本鎖領域の両方を含むＤＮＡ、およびＲＮＡから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記基質が第１の基質であり、第２の基質をさらに備え、前記酵素が前記第１の基質を前記第２の基質に結合させることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記基質がキラルまたはプロキラル官能基を有する化合物であり、前記酵素が鏡像体特異的に前記基質上で作用することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、工程（ｉ）ないし（iv）における前記酵素が第１の酵素であり、工程（ｉ）ないし（iv）における前記試料混合物が第１の試料混合物であり、工程（iv）の後に以下の工程（v）ないし（vi）を含み、すなわち、
（v）試料容器内で第２の試料混合物を供給する工程をさらに備え、前記試料混合物が、可逆的不活性化圧力Ｐi,jで第２の酵素を備え、前記第２の酵素は、工程（ｉ）ないし（iv）における前記第１の酵素と同一かまたは異なり、前記試料容器は、工程（ｉ）ないし（iv）における前記試料容器を同一であるか、またはバルブによって前記第１の試料容器に連結した第２の試料容器であり、さらに
（vi）前記第２の試料混合物を可逆的不活性化圧力に晒し、それによって、前記第１および第２の酵素の酵素反応を調節する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記第１および第２の酵素が同一酵素であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記基質が前記試料容器内で固定化され、前記第２の酵素が前記第１の酵素とは異なり、工程（iv）と（v）との間に、溶離液で溶離することによって前記試料混合物圧力を維持しながら、前記試料容器から前記第１の酵素を除去する工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記基質が二本鎖核酸であり、前記第１の酵素が５’−３’エキソヌクレアーゼであり、前記第２の酵素が３’−５’エキソヌクレアーゼであり、それによって、前記第１の酵素で配列決定を行って１つ以上のヌクレオチドを同定し、また前記第２の酵素で配列決定を行って１つ以上のヌクレオチドを確認することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項２に記載の方法において、圧力Ｐi,xでの前記試料混合物が温度Ｔi,xであり、それによって前記酵素が阻害され、圧力Ｐa,yでの前記試料混合物が温度Ｔa,yであり、それによって前記酵素が活性であり、圧力Ｐi,zでの前記試料混合物が温度Ｔi,zであり、それによって前記酵素が阻害され、Ｔi,zおよびＴa,yの各々がＴi,xと独立して同じか、または異なることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２に記載の方法において、δｔa,yおよびδｔi,zの各々が１０ミリ秒から２５０ミリ秒までの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２に記載の方法において、合計（δｔa,y＋ｔa,y＋δｔi,z）が１０００ミリ秒以下であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、工程（ii）ないし（iv）が１サイクルであり、工程（ii）ないし（iv）のサイクルを少なくとも４９回繰り返す工程をさらに備え、サイクルにおける各々の値Ｐi,x、Ｐi,z、δｔa,y、Ｐa,yおよびδｔi,zが、他のどのサイクルのそれぞれの値からも独立していることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法において、工程（v）ないし（vi）が１サイクルであり、工程（v）ないし（vi）のサイクルを少なくとも４９回繰り返す工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、前記試料混合物の圧力を維持しながら、前記試料容器から、前記試料混合物の成分を除去する工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法において、前記酵素基質は、核酸であり、前記酵素は、前記核酸基質に作用可能な酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記核酸が二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法において、前記酵素が進行的特性を有することを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法において、反応生成物を検出する工程をさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の方法において、反応容器温度を調節する工程をさらに備え、前記不活性化圧力状態には、反応容器圧力を前記酵素活性化圧力まで低下させた場合に高レベルの酵素活性を許容する温度が含まれることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、前記反応容器を低い酵素不活性化温度および酵素活性化圧力に維持する工程と、前記圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、前記温度を酵素活性化温度まで下げる工程と、その後、前記圧力を酵素活性化圧力まで低下させる工程とをさらに備えることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、
前記工程（i）は、
ａ）前記酵素を５℃未満の不活性化温度に維持し、それによって、前記酵素を不活性状態にする工程と、
ｂ）前記核酸基質を前記不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と、
ｃ）前記試料容器の圧力を、平方インチあたり３０，０００ポンド（２０７ＭＰａ）よりも高い酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、を備え、
前記工程（ii），（iii）は、
ｄ）前記試料容器の前記反応混合物の温度を、１０℃よりも高く上げる工程と、
ｅ）調節した期間に、前記試料容器の前記圧力を平方インチあたり２０，０００ポンド（１３８ＭＰａ）未満の酵素活性化圧力まで下げることによって、前記酵素が前記核酸基質に作用するように前記酵素を活性状態にする工程と、を備え、
前記工程（iv）は、
ｆ）前記試料容器の前記圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記酵素活性化圧力が、平方インチあたり５，０００ポンド（３４．５ＭＰａ）から１５，０００ポンド（１０３Ｍｐａ）までの圧力であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法において、前記酵素活性化温度が、１５℃から２０℃であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の方法において、
ｇ）工程ｃ）ないしｆ）のサイクルを少なくとも１回繰り返す工程とを備えることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、工程ｅ）ないしｆ）の前記サイクルを少なくとも５回繰り返すことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項２６に記載の方法において、前記酵素不活性化圧力が前記酵素活性化圧力よりも高いことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項２６に記載の方法において、前記酵素が分布特性を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に、化学反応を行うための装置に関する。本発明は、この装置を用いて、一つ以上の化学反応を連続してコントロールするための方法も提供する。
本発明の背景
化学反応は、例えば、共有結合やイオン結合の形成および開裂；２個以上の化学化合物の会合または解離；ならびに一次、二次、三次または四次構造の変化のような分子相互作用をもたらす。化学反応は、非酵素反応および酵素反応を含む。酵素の存在に関わらず、化学反応は、通常、配座の変化、遷移状態形成、電子または陽子供与／受容、および電子転位を含む幾つかの機械論的工程または分子相互作用から成る。一般に、一連の化学反応は、有用な化学生成物を供給する。
例えば、分子生物学において、構造および調節遺伝子配列におけるＤＮＡセグメントの機能を探るために、部位突然変異導入により生成される一連の欠失体のセットが使用される。遺伝子内に一連の欠失体を生成することにより、エンハンサー、プロモータ、および調節機能に必要な終端部位のような領域、ならびに、タンパク質の特殊性を定めるドメインのように、構造上の機能を有する領域を細かくマッピングすることが可能となる。例えば、１０ないし２０塩基対程度の互いに僅かに離れた位置に欠失を生成するのが望ましい。一連の欠失体組を生成する既存の方法は、エンドヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１，パンクレアチンＤＮａｓｅＩ（ＤＮａｓｅＩ）およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）を含む種々の核酸分解酵素で二重鎖ＤＮＡを消化する。
エンドヌクレアーゼを用いて、所与のエンドヌクレアーゼのための多重部位を含有する鋳型ＤＮＡを部分的に消化する。この方法は、鋳型ＤＮＡの範囲内での制限部位に関する事前の知識を必要とする。鋳型ＤＮＡ上の制限部位は、ランダムに分散していないため、多くの鋳型ＤＮＡは、１組の有用な欠失変異体を生成するのに十分な、または適当に間隔を置いた制限酵素部位を含有しない。これは、変異体により調節ドメインの境界を解放するような場合、特に問題となる。
他のエンドヌクレアーゼによれば、Ｂａｌ３１が、５’および３’の終端から二重鎖直鎖状ＤＮＡを消化する。一連の一方向変異体を作るために、二重鎖鋳型ＤＮＡ（プラスミド、ファージまたはＭ１３のレプリカ形態）は、ターゲットシーケンスの一端部で開裂する制限酵素により線状にされる。線状になったＤＮＡは、Ｂａｌ３１とともに所定の温度下で保温される。反応時間および酵素の量は、それぞれ、消化の程度および消化速度をコントロールする。最もよく市販されているＢａｌ３１の製品は、２つの異なる酵素形態、速い形態と遅い形態であり、後者は、前者のタンパク質分解フラグメントである。消化の程度は、２つの形態の比に依存する。従って、Ｂａｌ３１の各バッチを分析して、好適な消化条件を決定する。
Ｂａｌ３１は、ターゲットＤＮＡとブランキングベクターＤＮＡの両方を同時に消化する進行的（プロセッシブ）加工酵素である。Ｂａｌ３１の活性は、鋳型ＤＮＡの一次構造に従って変化する。Ａ−Ｔリッチ領域は、Ｇ−Ｃリッチ領域よりも速く消化する。切断されたターゲットフラグメントの回収および適当なベクターへのサブクローニングを行う必要がある。進行特性により、種々異なる欠失体を生成することになる。Ｂａｌ３１は、ＲＮＡの存在によって抑制されるので消化前に鋳型を精製する必要がある。
第３の酵素、例えばパンクレアチックＤＮａｓｅＩが、Ｍｎ2+またはＣｏ2+のような遷移金属イオンが存在した状態で、両方の鎖のほぼ同じ位置で二重鎖鋳型ＤＮＡを切断する。ＤＮａｓｅＩで凝縮環状（クロズドサークル）ＤＮＡと反応することにより１組の直線分子が生成し、これらは、ターゲットＤＮＡをランダムに分散した場所で切断する。出発材料の一部分は、線状にされることはない。制限酵素がターゲットシーケンスの一端部で開裂すると、ＤＮＡポリメラーゼを用いてシーケンスが修復され、再度環状になる。この技術を用いて回復したクローンの画分をかなり小さくすることができる。ＤＮａｓｅＩは、例えば、プラスミド、ファージまたはＭ１３ベクターのレプリカ形態に含まれるターゲットＤＮＡに欠失を生成することが可能である「ジー・エフ・ホング（Ｇ．Ｆ．Ｈｏｎｇ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５３９（１９８２）およびメソッズ・エンザイモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５５：９３（１９８７）；エス・ラバイト（Ｓ．Ｌａｂｅｉｔ）他、メソッズ・エンザイモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５５：１６６（１９８７）」。
一連の欠失体の組を生成する方法の一つとして、ＥｘｏＩＩＩ「エル・エイチ・グオ（Ｌ．−Ｈ．Ｇｕｏ）およびアール・ウー（Ｒ．Ｗｕ）、メソッズ・エンザイモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）．１００：６０（１９８３）；エス・ヘニコフ（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）２３：３５１（１９８４）およびメソッズ・エンザイモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）．１５５：１５６（１９８７）」。ＥｘｏＩＩＩは、５’突出末端または平滑末端から３’ないし５’方向に二重鎖ＤＮＡ分子を消化する。ターゲットの一端部とベクター上のユニバーサルシーケンスプライマのための結合部位との間に開裂部位が存在する２種の制限酵素で二重鎖ＤＮＡを消化することにより、一連の欠失体を生成する。ターゲットＤＮＡの最も近くで切断する制限酵素は、平滑末端または５’突出末端のいずれかを生成しなければならない。他の酵素は、３’突出末端を生成しなければならない。ＥｘｏＩＩＩは、３’突出末端を有するＤＮＡを消化できないので、二重に制限した分子の消化が一方向に進む。時間の変化に伴うＥｘｏＩＩＩ消化に続いて、例えばマング・ビーン（Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ等の一本鎖ヌクレアーゼを用いて一本鎖領域を除去する。ＤＮＡは、その後、修復されて、再度環状になる。ＥｘｏＩＩＩ消化の程度は、反応時間の長さを変化することによってコントロールされる。さらに、温度を下げて、消化速度を遅めてもよい。「ジー・マーフィー（Ｇ．Ｍｕｒｐｈｙ）ＤＮＡシーケンスプロトコルにおいて（ｉｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、エイチ・ジー・グリフィン（Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ）およびエー・エム・グリフィン（Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ）、編集、フマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９３）ｐ．５８」。この方法は、上記条件を満たし、且つターゲットＤＮＡの範囲内で切断しない２個の制限酵素を必要とする。ターゲットＤＮＡが長い場合にこの必要条件を満たすのが困難である。
発明の要約
本発明は、タイミングを正確に調節して圧力を加えることにより、化学反応、特に酵素反応を好適に同期する方法および装置を特徴とする。開示した装置は、自動化して、一般に迅速に圧力を変化させることが可能である。同様に、これらの圧力変化は、化学反応を調節し、単一の感圧化学事象、例えば、単一アミノ酸またはヌクレオチドの開裂または添加を調節可能である。化学事象の調節および検出は、特に、核酸やポリペプチドのようなヘテロポリマの合成及び特徴づけに特に有用である。
本発明は、反応容器圧力のプログラマブル変動を生じる圧力サイクリング反応器を特徴とする。圧力サイクリング反応器は、数百ミリ秒以下で達成できるおよそ１０，０００ｐｓｉから３０，０００ｐｓｉ以上の容器圧力の最終的変化等の迅速なプログラマブル変動が可能であることが好ましい。１つの圧力と別の圧力との間の遷移時間は２５０ミリ秒、１５０ミリ秒、１００ミリ秒、５０ミリ秒、または３０ミリ秒以下であってもよい。
連続して変化する間、圧力を調節する。例えば、第１の圧力Ｐ１は、反応阻害圧力であり、これは、第２の圧力Ｐ2、すなわち反応許容または可能圧力に変化可能である。許容圧力は、調節した期間に、維持される。その後、圧力は、反応阻害圧力である第３の圧力Ｐ3に変化する。いくつかの実施形態では、反応混合物圧力をＰ1、Ｐ2またはＰ3のいずれかに維持しながら、反応混合物成分を添加し、除去する。
圧力パルスまたは圧力サイクルは、（ｉ）第１の圧力から第２の圧力への変化、（ii）期間中における第２の圧力の維持、（iii）第２の圧力から第３の圧力への変化を含む事象である。第１の圧力および第３の圧力は、実質的に異なってもよく、また実質的に同一であってもよい。第２の圧力は、反応容器の内容物に望ましい態様で影響を及ぼすのに充分な圧力であり、これによって、通常、反応または反応工程が生じる。
本発明によれば、圧力サイクリング反応器は、試料を入れるための反応容器と、反応容器に連結した容器加圧器と、加圧器へのシグナルにより反応容器内を反応不活性化圧力に維持し、加圧器へのシグナルにより所定の短くパルシングした期間に反応容器の圧力を反応活性化圧力に変化させた後、反応容器の反応不活性化圧力にリサイクルするためのコントローラとを備える。
本発明の特定の実施形態においては、加圧器が、およそ２５０ミリ秒未満で、２０，０００ｐｓｉよりも高く圧力を変化させる。容器加圧器は、コントローラに応答して反応容器と連通するように反応容器に連結した圧力室、例えば空気ポンプシリンダと、圧力源に連結した圧力伝送器、例えば空気シリンダとを備える。圧力室は、可変容積を有し、圧力室の位置は、圧力伝送器によって調節され、圧力室の容積を調節する。
リリーフバルブを用いて、圧力伝送器の圧力を急速に調整し、それによって反応容器内で圧力パルスを発生する。圧力室アウトレットバルブが、圧力室と反応容器との間に位置決めされる。反応容器と連通する流体源と、圧力室との間に、圧力室インレットバルブが位置決めされる。流体源は、貯蔵室圧力源に連結するための流体貯蔵室と、貯蔵室調節バルブとを備え、圧力室を介して、流体貯蔵室から反応容器に流体を移動し、その間、反応容器の圧力を調節する。貯蔵室の流体の温度は、流体貯蔵室に連結した温度センサと、貯蔵容器加熱および／または冷却源によって調節される。反応容器の温度は、反応容器に連結した温度センサと、反応容器加熱および／または冷却源によって調節される。コントローラは、圧力センサが反応容器に連結した状態で、反応容器の圧力をモニタする。圧力レギュレータは、圧力室の圧力を調整し、コントローラは、圧力センサからのフィードバックを利用して、圧力レギュレータを調節する。
第２の容器加圧器を反応容器に連結し、それによって、反応容器の圧力が調節される間、反応容器から流体を除去する。反応容器と第２の容器加圧器との間には、インレットバルブが配置されている。第２の容器加圧器と第２の流体貯蔵室との間には、アウトレットバルブが配置されている。第２の貯蔵室コントロールバルブは、第２の流体貯蔵室に連結されている。コントローラは、所定組の格納信号により、複数個のバルブを調節する。その信号はバルブを調節して、少なくとも１つの加圧した試薬流体を反応容器に添加し、また少なくとも１つの加圧した反応流体を反応容器から除去し、その間、反応容器には圧力をかけたままである。検出器、例えば、放射性同位元素検出器、赤外分光計、質量分析計、ガスクロマトグラフィー質量分析計、分光光度計、分光蛍光計、電気化学検出器、表面プラズモン共振検出器または光度計は、反応容器内の流体中に存在するか、または反応容器から除去した成分の特性を検出する。
反応容器は、抑制部、例えば、反応容器を２つの部分に分割する半透性バリアを備え、容器から流体を除去しながら、反応容器内で固定化試薬、例えば、非液体支持部に装着した有機化合物を保持する。
本発明は、さらに、試料の温度および圧力状態を調節することにより、試料の活性を断続的に阻害するための反応器を提供し、この反応器は、試料室と連通し、試料の活性を阻害するために選択した資料室に第１の所定圧力を加えるための第１の位置と、試料の活性を与えるために選択した第２の所定圧力に室圧力を変化させるための第２の位置との間で移動するために取り付けられた加圧器と、第１の状態と第２の状態とを有し、第１の位置と第２の位置との間で加圧器を移動させるためのスイッチと、第１および第２の状態間でスイッチを変化させるためのコントローラと、室内の温度を調整するための手段と、室と連通し、室から試料を除去するためのポートとを備える。
本発明は、さらに試料に加えた圧力を調節することにより、試料の活性を断続的に阻害するための反応器を提供し、この反応器は、室が加圧されている間、試験試薬のフローを流体貯蔵室から試料室内に供給するためのシステムを備える。このシステムは、流体貯蔵室と連通して、第１のコンジット内に配置した第１のバルブと、試料室と連通して、第２のコンジット内に配置した第２のバルブと、流体貯蔵室と室との間に置かれ、第１のコンジットおよび第２のコンジットと連通する第１の加圧器と、第１の加圧器に関連して、第１の加圧器にベントをつけるための第３のバルブとを備える。
第１のバルブが開位置にあり、第２のバルブが閉位置にある状態で、貯蔵室が第１の加圧器と連通して、第１の加圧器に流体フローを与える。第１のバルブが閉位置、第２のバルブが開位置、及び第３のバルブが閉位置にある状態で、加圧器が室と連通して、室を加圧し、第１のバルブが閉位置、第２のバルブが開位置、第３のバルブが開位置と閉位置との間でサイクリングされている状態で、室の圧力がパルシングされる。
本発明の特定の実施形態では、室から試験物質のフローを供給するために、システムが、室と連通して、第３のコンジット内に配置した第４のバルブと、第３のコンジットの下流で、第４のコンジット内に配置した第５のバルブと、室の下流に置かれ、第３のコンジットおよび第４のコンジットと連通する第２の加圧器と、第２の加圧器に関連して、第２の加圧器にベントをつけるための第６のバルブとを備える。
第１のバルブが閉位置、第２のバルブが開位置、第３のバルブが閉位置、及び第４のバルブが閉位置にある状態で、加圧器が室と連通して、室を加圧する。第１のバルブが閉位置、第２のバルブが開位置、第３のバルブが開位置と閉位置との間でサイクリングし、さらに第４のバルブが閉位置にある状態で、室の圧力がパルシングされる。第１のバルブが閉位置、第２のバルブが開位置、第３のバルブが閉位置、第４のバルブが開位置、第５のバルブが閉位置、及び第６のバルブが開位置にある状態で、第１の加圧器が第２の加圧器と連通して、第１の加圧器から、室を介して、第２の加圧器に至るフロースルーを可能にする。
本発明は、さらに、迅速な圧力サイクルまたは圧力パルスを有する酵素反応工程を調節する方法を特徴とする。この方法は、酵素反応工程が可逆的に阻害される圧力Ｐi,xで試料容器内に試料混合物を供給する工程を備える（ｘは０以上の整数である）。試料混合物は、酵素を含む。この方法はまた、期間δｔa,yにおける試料混合物の圧力を、酵素反応工程が実施可能である圧力Ｐa,yに変化させる工程を備える（ｙは１以上の整数である）。この方法はまた、期間δｔi,zにおける試料混合物の圧力を、追加酵素反応工程が可逆的に阻害される圧力Ｐi,zに変化させる工程を備え、ｚは１以上の整数であり、それによって酵素反応工程を調節する。
酵素に加えて、試料混合物は、以下の各々を１つ以上、様々に組み合わせて含むことも可能である：溶媒、酵素共同因子、酵素の基質、酵素阻害剤、擬態基質、および無機または有機イオン。大部分の実施形態においては、試料混合物が基質を含む。試料混合物は、試料混合物の成分は酵素反応後の第５工程の回復のために固定化する物質を含めることができる。それによって、試料混合物の成分が試料容器の空間内で保持されるか、または酵素反応の生成物または副生物が、除去され、吸着され、会合され、または共有もしくは非共有相互作用により結合される。
従って、一実施形態は、消化程度を微細に調節して、欠失体を生成することが可能である。酵素の変化量、反応の長さ、および外界圧力での温度は、圧力に加えて、圧力がおよそ外界圧力である方法よりも、消化の程度をより微細に調節できる。この実施形態は、広く、または接近したクラスター化した長さを有する欠失体を提供する。
本発明は、酵素反応を調節する方法を特徴とする。これらの方法は、可逆的不活性化圧力で試料容器内で試料混合物を供給する工程を備え、試料混合物は酵素を含有しており、さらに試料混合物を活性化圧力に晒す工程と、（iii）試料混合物を不活性化圧力に晒し、それによって酵素反応を調節する工程とを備える。試料混合物の成分（例えば、１つ以上の酵素基質、共同因子、遷移金属イオン、溶媒、塩および緩衝液）を、調節するべき特定の酵素反応または反応工程に適する順序で供給できる。酵素は、分布または進行的特性を有することが可能である。
不活性化圧力が工程（ｉ）においてＰi,xであり、その圧力では、酵素反応工程が可逆的に阻害され、活性化圧力が工程（ii）においてＰa,yであり、その圧力では、酵素反応工程を実施可能であり、露呈工程（ii）は、期間δｔa,yで、圧力をＰa,yまで変化させる工程を備え、不活性化圧力が工程（iii）においてＰi,zであり、その圧力では、追加酵素反応工程が可逆的に阻害され、露呈工程（iii）は、期間δｔi,zで、圧力をＰi,zまで変化させる工程を備え、ｘはゼロ以上の整数であり、ｙは１以上の整数であり、ｚは１以上の整数であり、それによって、酵素反応を調節する。
この方法は、以下の工程をさらに備えることが可能である。すなわち、工程（ii）と工程（iii）との間で、活性化圧力Ｐa,yが、単一酵素事象の平均的長さに対応する期間ｔa,yだけ維持されるか、または基質が、試料容器内で固定化され、工程（iii）の後に、試料容器圧力を維持しながら、試料容器から試料混合物の成分を除去する工程か、または試料容器圧力を維持しながら、試料混合物に液体を添加する工程をさらに備えることが可能である。
除去成分が、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ開裂生成物、エキソヌクレアーゼ、ヌクレオチドまたはその組み合わせを含む。除去成分を、試料容器から除去する時、半透性物質を通過させることが可能である。
この方法は、工程（iii）の後に試料混合物の成分の特性を検出する工程をさらに備えることが可能である。成分特性は、放射能、蛍光、化学発光、分子イオンチャージ／質量比、電気化学電位、発光、表面プラスモン共振、および赤外吸収を含む。
基質は、核酸であってもよい（例えば、二重鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二重鎖および一本鎖領域の両方を含むＤＮＡ、ならびにＲＮＡ、これらはいずれも試料容器内で固定化されるか、または固定化されない、ならびにその組み合わせ）。酵素は、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはターミナルトランスフェラーゼであってもよい。
従って、この方法は、核酸基質から開裂される少なくとも１つの開裂フラグメント（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、またはオリゴマ）を生成可能である。
１つの方法では、第１の基質と第２の基質とが存在し、酵素が第１の基質を第２の基質に装着する。一実施形態では、第１の基質はヌクレオチドであり、第２の基質はＲＡＮオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡヌクレオチドを含み、酵素は、第２の基質がＲＮＡオリゴヌクレオチドであるポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼであり、且つ第２の基質がＤＮＡヌクレオチドであるターミナルトランスフェラーゼである。
他の実施形態では、第１の基質はヌクレオチドであり、第２の基質はＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、酵素は、酵素クラス２．７．７から選択したトランスフェラーゼである。
一実施形態では、基質は、キラルまたはプロキラル官能基を有する化合物であり、酵素は、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、リパーゼ、または基質に鏡像体特異的に作用するエステラーゼである。
さらに、工程（ｉ）ないし（iii）における酵素が第１の酵素であり、工程（ｉ）ないし（iii）における試料混合物が第１の試料混合物である。この方法は、工程（iii）の後に、以下の工程（iv）ないし（vi）、すなわち、（iv）試料容器内で第２の試料混合物を供給する工程をさらに備え、試料混合物が、可逆的不活性化圧力Ｐi,jで第２の酵素を備え、第２の酵素は、工程（ｉ）ないし（iii）における第１の酵素と同一かまたは異なり、試料容器は、工程（ｉ）ないし（iii）における試料容器を同一であるか、またはバルブによって第１の試料容器に連結した第２の試料容器であり、さらに（ｖ）第２の試料混合物を可逆的不活性化圧力に晒す工程と、（vi）第２の試料混合物を可逆的活性化圧力に晒し、それによって、第１および第２の酵素の酵素反応工程を調節する工程をさらに備える。
圧力Ｐa,kまでの遷移時間は、第２の酵素の酵素反応工程が実施され得る圧力Ｐa,kまでの期間δｔa,kに生じる。第１および第２の酵素は、同一の酵素であってもよく、また異なる酵素であってもよい。期間δｔi,lの間、第２の試料混合物の圧力を、第２の酵素の追加酵素反応工程が可逆的に阻害される圧力Ｐi,lに変化させる。幾つかの実施形態では、工程（vi）における反応不活性化圧力Ｐi,zがＰi,lに実質的に等しい。
一実施形態によれば、圧力Ｐi,xでの試料混合物が温度Ｔi,x下にある場合、酵素が阻害される。また、圧力Ｐa,yでの試料混合物が温度Ｔa,y下にある場合、酵素が活性状態にある。さらに、圧力Ｐi,zでの試料混合物が温度Ｔi,z下にある場合、酵素が阻害される。Ｔi,zおよびＴa,yの各々は、Ｔi,xの値と同じか、または異なる。ｊ、ｋおよびｌの値は、ｘ、ｙおよびｚとそれぞれ等しい。これらの下付文字は、上記工程間で（例えば、工程（ｉ）と（ii）間で）圧力の追加工程を備えてもよく、必ずしも中間ではない異なる圧力を変化してもよいことを強調することを意図している。この方法における各工程は、望ましい特定の生成物により、反復サイクルとして、または圧力および時間の非反復変化として組み合わせることが可能である。さらに、遷移期間δ  ｔｓは短い、例えば１秒未満であるのが好ましく、５００、２５０、２００、１００または５０ミリ秒未満であるのが好ましく、δｔa,yおよびδｔi,zの各々は、１０ミリ秒から２５０ミリ秒までの間、または１０ミリ秒から５０ミリ秒までの間が好ましい。測定可能プラトーのないスパイク様の遷移変化から数百ミリ秒ないし数百秒までの範囲にわたる期間、例えばｔa,yまたはｔi,zにおいて圧力を維持することが可能である（図１１参照）。例えば、合計（δｔa,y＋ｔa,y＋δｔi,z）は、３００、７００または１０００ミリ秒以下である。
実施の形態は、以下の方法も備えており、この方法においては、基質が試料容器内で固定化され、第２の酵素が第１の酵素とは異なり、工程（iii）と（iv）との間に、溶出液で溶出させることによって試料混合物圧力を維持しながら、試料容器から第１の酵素を除去する工程をさらに備えている。また基質は、二重鎖核酸であり、第１の酵素が５’−３’エキソヌクレアーゼであり、第２の酵素が３’−５’エキソヌクレアーゼである。それによって、第１の酵素で配列決定を行って１つ以上のヌクレオチドを同定し、また第２の酵素で配列決定を行って１つ以上のヌクレオチドを確認することができる。
工程（ｉ）ないし（iii）が１サイクルである場合、方法が、工程（ｉ）ないし（iii）のサイクルを少なくとも４９回繰り返す工程をさらに備えることが可能であり、サイクルにおける各々の値Ｐi,x、Ｐi,z、δｔa,y、Ｐa,yおよびδｔi,zが、他のどのサイクルのそれぞれの値からも独立している。
工程（iv）ないし（vi）が１サイクルである場合、方法が、工程（iv）ないし（vi）のサイクルを少なくとも４９回繰り返す工程をさらに備えることが可能である。試料混合物の圧力を維持しながら、試料混合物（またはそれから除去した成分）に流体を添加することができる。
さらに、反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす方法は、（ｉ）試料容器内で試料混合物を供給する工程を備え、試料混合物は、圧力Ｐ0、温度Ｔ0であり、さらに（ii）試料混合物の温度をＴ1に変化させる工程と、（iii）反応混合物の圧力を、期間δｔ1の間、Ｐ1まで上昇させる工程とを備え、Ｐ1は、Ｐ0よりも少なくとも１０，０００ｐｓｉだけ大きく、さらに、（iv）反応混合物の圧力をＰ2まで低下させ、それによって、高圧で反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす工程を備える。
この実施形態では、圧力上昇工程（iii）の後に、試料混合物を反応させる工程をさらに備えるか、または試料混合物中に触媒を含め、圧力上昇工程（iii）の後に、生成物を触媒から解離させる工程をさらに備え、工程（iii）の後に、試料容器から試料混合物の成分を除去する工程をさらに備える。
本発明は、さらに、核酸を処理する方法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）試料容器と、ii）核酸基質と、iii）核酸基質に作用可能な酵素と、iv）容器の圧力を調節する加圧器とを、いずれかの順で設ける工程と、ｂ）酵素および核酸を試料容器に溶液で供給し、酵素を不活性化圧力状態で維持する工程と、ｃ）調節した期間に試料容器の圧力を酵素活性化圧力に変化させ、その結果、この期間中に酵素が活性状態になり、核酸基質に作用する工程とを備える。
酵素は、エキソヌクレアーゼ（例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ、進行的酵素、分布酵素であってもよい。酵素は、核酸基質を改変可能であり、その後、開裂したヌクレオチド、アミノ酸または改変した基質等の反応生成物を検出する。
この方法は、反応容器温度を調節する工程をさらに備えることができる。この場合、不活性化圧力状態には、反応容器圧力を酵素活性化圧力まで低下させると、高レベルの酵素活性を許容する温度が含まれる。この方法は、反応容器を低い酵素不活性化温度（例えば、およそ５℃未満）および酵素活性圧力（例えば、平方インチあたりおよそ５，０００ポントから１５，０００ポンド）に維持する工程と、圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、温度を酵素活性化温度（例えば、１５℃から２０℃までのインテグラル温度）まで下げる工程と、その後、圧力を酵素活性化圧力まで低下させる工程とをさらに備える。
例えば、この方法は、ａ）酵素をおよそ５℃未満の不活性化温度に維持し、それによって、酵素を実質的に不活性状態にする工程と、ｂ）核酸基質を不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と、ｃ）試料容器の圧力を、平方インチあたりおよそ３０，０００ポンドよりも高い酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、ｄ）試料容器の反応混合物の温度を、およそ１０℃よりも高く上げる工程と、ｅ）調節した期間に、試料容器の圧力を、平方インチあたりおよそ２０，０００ポンド未満の酵素活性化圧力まで下げ、それによって、酵素が核酸基質に作用するように、酵素を活性状態にする工程とを備える。この方法は、ｆ）試料容器の圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程を備えることも可能である。
この方法はまた、試料容器の圧力を、酵素不活性化圧力に変化させる工程と、工程ｃ）およびｄ）のサイクルを少なくとも１回および５回繰り返す工程とをさらに備えることが可能である。酵素不活性化圧力は、一般に酵素活性化圧力よりも高い。
本発明の他の特徴および利点は、以下の図面の説明、詳細な説明、実施例、および請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の反応器の概略図である。
図１Ａは、図１の反応器のスプリングシールおよびグランドワッシャを示す図である。
図２は、図１の反応器のハイドロリックシステムの概略図である。
図３は、図１の反応器のコントロールを示すブロック図である。
図４は、反応器の他の実施例を示す図である。
図５は、図４の反応器の構成部分の概略図である。
図５Ａは、図４の反応器のハイドロリックシステムの概略図である。
図６は、図４の反応器の機械的概略図である。
図６Ａは、ポンプ／バルブモジュールの詳細図である。
図６Ｂおよび図６Ｃは、反応容器の構造を示す図である。
図７は、ポンプ／バルブモジュール間の反応容器をシールするためのクランプを示す図である。
図８は、流体コントロールアルゴリズムのブロック図である。
図９は、流体コントロールアルゴリズムのステップの際のバルブ位置のリストである。
図１０は、図４の反応器のコントロールを示すブロック図である。
図１１は、圧力パルスの圧力ー時間プロファイルを示すグラフである。
図１２は、静水圧を加える手段によって核酸基体における酵素の作用をコントロールするための装置の概略図である。
図１３は、ラムダエキソヌクレアーゼによるＤＮＡの消化に加えられる静水圧の効果を示すグラフである。
図１４は、ラムダエキソヌクレアーゼによるＤＮＡの消化に加えられる種々の静水圧および温度の効果を示すグラフである。
定義
本発明を容易に理解するために、多くの用語が以下で、また開示の他の部分で定義されている。
試料混合物は流体である。流体は、液体または気体でもよい。液体は、水溶液および有機溶液を含む。応用次第で、試料混合物は、所与の工程で酵素を含んでもよいし、含まなくてもよい。
水性試料混合物は、（ａ）水（例えば、タップ、蒸留、濾過、脱イオン、脱気または重水素化）と、ならびに（ｂ）（ｉ）無機カチオンおよびアニオン、（ｉｉ）有機化合物および（ｉｉｉ）溶媒和ガスのうちの少なくとも一つとを成分として含む。試料混合物は、溶解または懸濁した（溶解していない）溶質の流体（溶媒）に関連して、一般に溶液である。試料混合物は、ポリマー、セラミックまたは複合ビーズもしくは表面上で固定化した酵素または酵素基体も含む。これらの固定化試料混合物成分は、試料混合物内で必ずしも溶解または懸濁していないが、試料混合物成分に晒し、流体の乱れによって混合することが可能である。
無機カチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、クロム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、銅およびアルミニウムを含む。無機アニオンは、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、炭酸塩および炭酸水素塩を含む。
有機成分は、天然および合成核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、αーアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチドミメチック、デプシペプチド、ペプチド、糖類、リポ糖類、およびこれらの混合物を含む。ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ等のデオキシヌクレオシド５’トリリン酸塩；ジデオキシヌクレオチド；ｃ７ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、ｃ７ｄＡＴＰ等のあいまいな配列（ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ）を決定するためのヌクレオチド；ｄＡＴＰαＳのような２’−デオキシヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリリン酸塩）；５−メチルデオキシシチジン５’−トリリン酸塩；リボヌクレオシド５’−トリリン酸塩；２’３’−ｄｄＮＴＰ；７−デアザ２’−ｄＮＴＰを含む。
アミノ酸の例として、２０個の共通αーアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＭｅｔおよびＰｒｏ）や他の天然または合成アミノ酸（例えば、ノルロイシン、エチルグリシン、オルニチン、メチルブテニルメチルートレオニン、フェニルグリシン、γ−カルボキシグルタル酸、β−ヒドロキシプロリン、γ−ヒドロキシプロリン、δ−ヒドロキシリジン、メチラートアミノ酸、ε−ヨード、ε１−ε２−ジヨード、ε−ニトロー、ε−アミノ−  およびＯ−アセチル−チロシン）が挙げられる。
糖類として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロースおよび他の自然発生置換糖類が挙げられる。有機化合物もまた、放射性同位元素化合物、および検出可能タグまたは信号を有する他の化合物を含む。
有機試料混合物は、化合物、例えば（ａ）有機溶媒またはその混合物（例としてメチレン塩化物、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド、エーテル、ベンゼン、トルエン、ヘキサンおよび酢酸エチル）、ならびに（ｂ）有機試薬を含む。
他の型式の流体では、気体は、希ガス（例えば、Ｈｅ、ＮｅおよびＡｒ）；ＨＣｌ、ＨＦ、二原子水素および二原子ハロゲンのような有機合成で試薬として使用されるガス；ならびに二酸化炭素、一酸化炭素および酸素のような生体システムにおいて試薬として使用される大気を含む。反応室を加圧ガス流体に晒すことにより、（ａ）反応容器の圧力を増加または減少させる、（ｂ）ｐＨを変化させる、（ｃ）化学または酵素反応のための試薬を提供する、ガス流体試薬が部分的に液体に溶解してもしなくても、もしあるならば、反応室もしくは気相、または反応容器に存在する、（ｄ）化学または酵素反応工程を抑制する、さらに（ｅ）反応容器内に、または反応容器から流体内容物を移動させることが可能となる。
ベクター（または媒介物）は、１個のセルから他のセルまで１個以上のＤＮＡセグメントを移動させる核酸分子である。発現ベクターは、望ましいコーディングシーケンスおよび特定のホスト生物体における動作可能に結合されたコーディングシーケンスの発現に必要な核酸シーケンスを含む組換えＤＮＡ分子である。原核生物における発現に必要な核酸シーケンスは、通常、プロモータ、任意にオペレータおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、エンハンサーならびに終結シグナルおよびポリアデニル化信号を利用することが知られている。
相補性は、幾つかの塩基のみが塩基対合規則に従って適合しているような部分的なものであってもよく、また完全であってもよい。核酸のストランド間の相補性の程度は、核酸のストランド間のハイブリダイゼーションの効率および強度にかなり影響を与える。従って、相補性は、核酸間の結合に依存する検出方法と同様に増幅反応の精度に影響を与える。
混成は、相補性核酸の対合である。混成および対合の強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、必要条件の厳重性（ストリンジェンシー）、形成された混成のＴmおよび核酸内のＧ：Ｃ比のような要因に影響される。Ｔmは、融解温度または、二重鎖核酸分子の占有数が一本鎖に半解離する温度である。核酸のＴmを計算する式は、従来技術においてよく知られている。標準引例で示すように、Ｔmの単一推定値は、以下の式で求めることができる：Ｔm＝８１．５＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）。この場合、核酸は、１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液に存在する（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、核酸混成（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（１９８５）における定量フィルタ混成（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ参照）。他の引例は、構造上の特性およびシーケンス特性をＴmの計算に対して考慮する、より複雑な計算を含む。
ストリンジェンシーは、核酸混成が行われる温度条件、イオン強度、有機溶媒のような他の化合物の存在に関連する。ストリンジェンシーが高い場合、相補性塩基シーケンスの高周波数を有する核酸フラグメント間のみで核酸塩基対合が生じる。ストリンジェンシーが弱いか、または低い場合、遺伝学上多様である生物体から得られる核酸は、たとえ相補性シーケンスの周波数が通常、よりいっそう低くても生じる。
”核酸”および”核酸基質”は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ（ペプチド核酸）を含み、一本鎖、二重鎖、もしくは断続する相補的セグメントを有する一本鎖またはその組み合わせのいずれかである。ＲＮＡおよびＤＮＡ残基の領域を有するキメラオリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴズ・イーティーシー、インク（Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ．，Ｉｎｃ（ウィルソンビル、オレゴン（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ））から商業上入手可能である。本発明は、原則として、核酸の長さを制限せず、核酸は、ゲノムであるか、もしくは定められた長さ（例えば、短いオリゴヌクレオチド）またはそのフラグメント（単一塩基を含む）であってもよい。核酸は、いかなる由来からも得られ、それ故に、自然発生する；自然発生して精製される；または合成して、組み換えて、もしくは増幅して生成される。核酸は、核酸基体からヌクレオチドを除去するか、または末端メチル基もしくは核酸を他の分子に結合する結合基のような化学成分を添加する酵素によって形成される改変された核酸を含む。他で説明したように、核酸は、ポリマーもしくは複合ビーズ、マトリックス、または他の支持面に固定可能である。
核酸は、いずれかの増幅方法によって増幅可能である。増幅可能な核酸は、通常、試料テンプレート、すなわち、試料から生じる核酸を含む。対照的には、バックグラウンドテンプレートは、試料に存在してもしなくてもよく、一般に、キャリオーバーの不本意な結果、または試料から精製除去すべき核酸汚染物の存在である。例えば、検出したもの以外の生物体からの核酸は、テスト試料におけるバックグラウンドとして存在してもよい。増幅方法の例は、ケー・ビー・ムリス（Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ）による米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号の方法のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これらはここで引用しており、クローニングまたは精製を行うことなく、ゲノムＤＮＡの混合物におけるターゲットシーケンスのセグメントの濃度を増すための方法について述べている。
”試料”は、最も広い意味で使用する。試料は、人間や動物の試料からの標本、培養、生物学的試料、環境試料等や、自然発生する合成物質を含む。”試料容器”という用語は、試料を包囲するか（例えば、バッチフォーマットで）、または包囲装置に入れた試料を用いるか（例えば、室、チャネルまたは流れにおける、またその間のチャネリング）のいずれかにより、試料を含有するための手段を示すために使用される。同様に、”反応容器”は、いかなるデザインであってもよく、一般に、反応が起きる試料容器である。
反応または試料混合物は、２個以上の成分の組み合わせに関連する。最適酵素温度は、所与の圧力および溶媒システム（溶媒および塩）で、酵素が最も活性状態にある時の温度である。最適条件は各酵素と共に変化するが、一般に、１０ないし８０℃、特に２５ないし３７℃の範囲である。最適温度は、例えば、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））によって提供されている生成物の文献において見い出せる。
実質上不活性の酵素は、最適酵素温度（＊＊および気圧？）（１００％活性）における活性の２０％未満であり、一般には、その１０％未満である。理想的には、抑制された、または実質上不活性の酵素は、完全に不活性の状態にあるが（０％活動度）、この決定は所与の活動度検定の感度および不確実さによって制限される。可逆的に抑制された酵素は、制限または抑制条件では活動度を示さないが、許容条件に晒した場合、活動度を回復する。許容条件に晒した後、また酵素活動度が回復する前に、休止または遷移状態にすることは、可能である。許容条件は、最適酵素活動度が生じる条件と、より遅いが、ある程度有用な活動度が生じる条件とを含む。
プライマはオリゴヌクレオチドであり、精製した制限消化物のように自然に発生するか、または合成的に生成されており、核酸線維に相補的なプライマ伸張生成物の合成が誘発される条件に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤が存在する状態で、また好適な温度およびｐＨで）、合成の開始点として作用することが可能である。プライマは、最大増幅効率のために一本鎖であるのが好ましいが、代わりに二重鎖であってもよい。二重鎖の場合、プライマを、伸張生成物を作るために使用する前に、まずその線維を分離処理する。プライマは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであるのが好ましい。プライマは、誘発剤の存在する状態で、伸張生成物の合成を行うのに十分に長くなくてはならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマの起源、および方法の利用を含む多くの要因に依存する。
プローブは、精製した制限消化物のように自然発生するか、または合成的に生成したオリゴヌクレオチドであり、これは、他のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することが可能である。プローブは、特定の遺伝子シーケンスの検出、識別および単離に有用である。プローブ、特定の遺伝子シーケンス、またはその両方は、”レポータ分子”で分類することができるので、プローブ、特定の遺伝子シーケンスまたはその両方は、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡおよび酵素ベースの組織化学分析）、蛍光放射性発光検出システムにおいて検出可能である。
ターゲットシーケンスは、検出および／または増幅に使用されるプライマにより（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により）結合した核酸領域である。このように、他のシーケンス間でターゲットを識別するのが望ましい。セグメントは、ターゲットシーケンス内の核酸領域である。
ＰＣＲ生成物または増幅生成物は、変性、アニーリングおよび伸張の各工程の２回以上のサイクルの後に結果的に生じる化合物の混合物である。これらの用語は、１つ以上のターゲットシーケンスの１つ以上のセグメントを増幅した場合を含む。
増幅試薬は、プライマ、核酸型および増幅酵素を除いた増幅に必要な試薬である。増幅試薬は、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸および緩衝液を含む。一般に、増幅試薬および他の反応成分を、反応（例えば試料）容器（試験管、マイクロウェル、任意のアウトレットを有する圧力変形可能ケーシング等）に入れる。
エンドヌクレアーゼおよび制限酵素は、酵素（例えば細菌性酵素）に関連し、その各々は、特定のヌクレオチドシーケンスにおいて、またはその近くで二重鎖ＤＮＡを切断する。
ＤＮＡ分子は、”５’端部”および”３’端部”を有すると言われる。その理由は、１個のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩を、フォスフォジエステル結合を介して一方向にその近隣の３’酸素に付与するように、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作るからである。従って、５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合されない場合、オリゴヌクレオチドの端部は”５’端部”と呼ばれ、その３’酸素が、後のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に結合されない場合は”３’端部”と呼ばれる。ここで使用するように、核酸配列は、たとえより大きいオリゴヌクレオチドの内部配列であっても、５’および３’端部を有するといえる。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の元素を、”下流”または３’元素の”上流”または５’として表現できる。この用語は、ＤＮＡストランドに沿って５’から３’方向に転写が進むという事実を反映する。結合遺伝子の転写を指示するプロモータおよびエンハンサーエレメントは、一般にコーディング領域の５’または上流に置かれる。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモータエレメントおよびコーディング領域の３’に置かれた場合でさえ、その効果を発揮することが可能である。転写終了およびポリアデニル化信号は、コーディング領域の３’または下流に置かれる。
ここで使用するように、用語”遺伝子をコードするヌクレオチドシーケンスを有するオリゴヌクレオチド”は、遺伝子のコーディング領域を備えるＤＮＡシーケンス、または換言すれば、遺伝子産物をコードするＤＮＡシーケンスを意味する。コーディング領域は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ形態のいずれかで存在可能である。エンハンサー／プロモータ、スプライス連結、ポリアデニル化信号等のような好適な調節因子は、転写の適当な開始および／または一次ＲＮＡ転写の正確な処理を可能にする必要がある場合、遺伝子のコーディング領域に最も近接して置くことができる。代わりに、本発明の発現ベクターで利用されるコーディング領域は、内因性エンハンサー／プロモータ、スプライス結合、介入シーケンス、ポリアデニル化信号等、または内在性および外来性調節因子の組み合わせを含んでもよい。
ポリマ基質を合成または消化する酵素は、各触媒事象の後、基質から解離させてもよい、すなわちそれらは非進行的（共核酸および分布）であってもよい。一方、それらは、多くの反応サイクルが完了するまで、ポリマーに結合したまま、すなわち”進行的（プロセッシブ）”であってもよい。酵素に関して、進行的、非進行的および分布という用語は、従来技術で用いられている（例として、エー・コーンバーグ（Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびティー・エー・ベーカー（Ｔ．Ａ．Ｂａｋｅｒ）ＤＮＡ複製（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、２ｎｄ  ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．１９９２）参照）。
発明の詳細な説明
Ａ．序論
本発明は、反応容器の圧力の迅速なプログラマブル変動を生じる圧力サイクリング反応器を特徴とする。圧力変動は、多くのプロファイルを用いてプログラミング可能である。２つの圧力ＰおよびＰ’間の変動が生じる場合、例えば、種々のプロファイルは以下の通りである。ａ）ＰおよびＰ’の各々における時間の長さがほぼ同じである、ｂ）Ｐにおける時間がＰ’における時間よりも長い、ｃ）ＰからＰ’までの遷移時間は、Ｐ’からＰまでの遷移時間とほぼ同じである、ｄ）ＰからＰ’までの遷移時間がＰ’からＰまでの遷移時間よりも長い、ｅ）ＰからＰ’までの遷移における中間圧力での休止が幾つかあるが、Ｐ’からＰまでのジャンプは非常に迅速である。さらに、圧力変動プロファイルは、ほとんど反復しない異なる圧力間の小さなステップまたは大きなジャンプの変動のような３つ以上の圧力ＰおよびＰ’を含んでもよい。
本発明はまた、反応容器の圧力を維持または増大しながら、反応容器内の成分を添加したり除去することが可能な圧力サイクリング反応器を提供する。成分は、圧力変動プロファイルを用いて多くの順列で添加または除去できる。各圧力パルスサイクルは同一である必要はない。
従って、圧力サイクリング反応器は、反応の少なくとも１つの工程が感圧的である応用において有用となる。これらの反応は、酵素、非酵素、化学的、物理的、動力学的、熱力学的相互作用を含む。換言すれば、感圧相互作用は、共有（結合破壊および結合形成）、疎水、イオン（溶媒和）、およびファンデルワールス力；疎水または親水相互作用；ならびに構造上の配座（二次、三次および四次、すなわちフォールディング、ならびにヘリックスおよびシートの形成）を含む。
可逆感圧反応工程の速度は、低下、停止、増大または開始することができ、後者は、可逆阻害圧力が許容圧力に迅速に変化する時に達成される。一般に、多数の酵素（同一か、または異なる酵素）の速度は、阻害圧力（例えば、高い圧力）でそれらを可逆的に阻害し、その後、圧力を許容圧力に迅速に変化させることにより、同期できる。
圧力反応器は、組み合わせまたは連続動作をそれぞれ行うために、多数の試料容器を並列または直列に含むことが可能であり、少なくとも１つの反応工程は感圧的である。多数の試料容器は（より大きい反応容器でさえ）、相互連結可能であるので、反応した試料混合物の部分を１個の試料容器から他の試料容器まで転送して、次の処理を受けることが可能である。オリゴヌクレオチド（構造物の製品を含む）、ペプチドおよび他の有機化合物の組み合わせ合成を、このように行うことができる。
Ｂ．  圧力サイクリング反応器
図１を参照すると、反応器１０は反応モジュール１２を備えており、反応モジュール１２は、例えばポリエチレンから作られた試料カプセル１７を入れるための室（チャンバ）１５を定める壁面１３を有する。反応モジュール１２におけるポート１２ａは、カプセル１７を室１５に配置できるようにする。ショートストローク圧力伝送空気シリンダ１４と、室１５に圧力を加えるための圧力伝送水圧シリンダ１６は、ベースプレート１８に実装されている。反応モジュール１２は、可変体積圧力室２３を定める、例えばステンレス鋼で形成したトラス２０によって支持される。例えば、青銅合金から形成されたベアリング２４によって支持され且つ案内され、室壁面２７を定める、例えば直径３／１６”のピストン２２は、反応室１２のボア２５とシリンダ１４および１６との間で連通する。ピストン２２は、シリンダ１４および１６と共に、室１５の圧力を調節する容器加圧器２１を形成する。反応モジュール１２は、例えばステンレス鋼から形成され、ボア２５は、直径がおよそ０．１８８”であり、長さがおよそ１”である。
図１Ａも参照すると、シール３６，例えばグランドワッシャ３８によって支持されたＢａｌ  Ｓｅａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）から入手可能であるばね３６ａならびにバックアップワッシャ３７、３７ａおよび３７ｂを含むばね付勢シールは、反応室１２内でピストン２２をシーリングする。グランドワッシャ３８は、バックアップワッシャ３７ｂの傾斜面３９ａと一致する傾斜面３９を含む。ばね３６ａは、低圧で確実にシーリングを行い、より高圧でシーリングを援助する。バックアップワッシャおよびグランドワッシャは、圧力をかけてシール３６の押し出しを防止する働きをする。グランドワッシャ３８は、トラス２０の棚４０によって支持される。
空気シリンダ１４は、例えば直径が２．５”のピストン１４ａを備えており、延長ロッド２６はスルーボア２８を有する。Ｏリング１４ｂは、ピストン１４ａと、空気シリンダ１４の内壁面１５との間にシールを形成する。空気シリンダを１４を付勢すると、ピストン２２の上向きの力を生じるロッド２６により、ピストン１４ａにかかる圧力をガイドベアリング２４に伝送する。この力は、インレット３０に装着したソース（図示せず）から空気シリンダまで圧力を変化させることにより、調整可能である。空気シリンダ１４によりピストン２２に加えられる力は、圧力パルシングの間、反応室１２内の低圧力レベルを決定する。空気シリンダ圧力は、およそ１００ｐｓｉ（反応室１２内でおよそ１７，０００ｐｓｉの圧力を生じる）まで調整可能である。
水圧シリンダ１６は、例えば直径が１”のピストン１６ａを備え、延長ロッド３２は、空気シリンダロッド２６のスルーボア２８を突き上げる。水圧ロッド３２の端部３４は、ガイドベアリング２４に支えられている。延長すると、水圧ロッド３２は、ピストン２２を上向きに駆動する。空気シリンダ１４によって発生する圧力に加えて、空気シリンダ１６によって発生する圧力は、反応室における高圧レベルを決定する。水圧シリンダ圧力は、上限をおよそ１，５００ｐｓｉに設定した状態で調整可能である。ピストン２２の断面積に対する水圧ピストン１６ａの断面積の比は、２８．４：１である。
反応モジュール１２は、熱硬化性ジャケット４２によって包囲され、反応室のの温度を調節する。ジャケット４２は、インレットおよびアウトレット取り付け部４４、４６をそれぞれ有し、それによって、流体が、温度調節加熱／冷凍浴（図示せず）から、壁面１３を包囲する室４８に循環する。反応室１２の上部および底部の周りには、熱硬化性ジャケット４２に対して流体シールを提供するＯリング５２、５４が設けられている。反応室１２には、その温度をモニタするためにサーモカップル（図示せず）が取り付けられている。反応室１２の温度は、およそ＋／−１℃の精度で、およそ−１５℃から＋４０℃までの範囲内で調節される。試料室１５に加える圧力に抵抗するのに十分な厚さでありながら、熱硬化室４８から試料室１５まで熱を伝達できるほど薄くなるように、壁面１３の厚さ、例えば、３／１６”の厚さを選択する。壁面１３の厚さおよびシール３６の性能により決定する反応モジュール１２の最大許容圧力は、およそ４０，０００ｐｓｉである。
アセンブリの上部には、圧力トランスジューサ５６、例えば、Ｓｅｎｓｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨの部品番号ＨＰ５６５１−０２−０２で入手可能な７５，０００ｐｓｉ、＋／−０．５％精度ストレーンゲージ型トランスジューサが取り付けられている。圧力トランスジューサ５６は、反応モジュール１２から取り外してポート１２ａに接近する。
図２を参照すると、水圧は、水圧ポンプ６２により、水圧シリンダ１６に送られる。水圧システム６０は、モータ６４によって駆動される水圧ポンプ６２と、流体貯蔵器６３と、リリーフバルブ６７と、チェックバルブ６５と、圧力調整バルブ６６と、圧力ゲージ６８と、アキュムレータ７０と、マニュアルバルブ７１と、４方向コントロールバルブ７２と、水圧シリンダ１６とを備える。
モータ６４は、例えば、最大３，０００ｐｓｉで０．８ＧＰＭの出力の２ＨＰ電気モータである。実際のシステム圧力は、圧力調整バルブ６６でコントロールされ、およそ１，５００ｐｓｉの設定上限まで変化可能である。
方向コントロールバルブ７２は、例えば、Ｐｅａｒｓｅ−Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）のＢｏｓｃｈ部品＃９８１０２３１０７２で入手可能なデュアル電気ソレノイドによって起動する３位置ばねセンタリングスプールバルブである。両方のソレノイドを減勢した状態で、水圧シリンダポート１９，１９ａは両方ともドレインライン７４に連結され、またシンリンダピストン１６ａは、移動自在である。使用する際、一方のソレノイドを付勢してポート１９を加圧し、他方のソレノイドを減勢してドレインライン７４に対してそれを開き、ピストン１６ａを強制的に延ばし、それによって試料室１５を加圧する。現在、試料室の圧力をパルスするために、両方のソレノイドが減勢されるので、ピストン１６ａは移動自在であり、試料室１５の圧力は、ピストン２２を強制的に下げて（空気シリンダ１４によって加える圧力のレベルまで）室内の圧力を低下させる。代わりに、他方のソレノイドを付勢してポート１９ａを加圧し、他方のソレノイドを減勢してドレインパイプ７４に対してそれを開き、ピストン１６ａを強制的に引っ込める。試料室１５からの圧力の受動低下が好ましい。その理由は、水圧応答時間がより速くなり、またピストン２２とロッド３２との継続的接触により、ピストン、ロッド間に衝撃荷重が生じるのを回避するからである。方向コントロールバルブ７２は、時々、２０ｍｓから２５ｍｓまで迅速にスイッチングして、水圧シリンダ１６に圧力を加えて、試料室１５の圧力を低下させる。
方向コントロールバルブ７２の近くには、水圧アキュムレータ７０が取り付けられており、応答性を向上させ、圧力変動を抑える。アキュムレータ７０は、例えば、１クォート容量を有し、ポンプ６２により、水圧システムライン圧力までチャージされる。チェックバルブ６５の存在により、ポンプ６２をオフにした後、アキュムレータ７０はチャージしたままとなる。マニュアルバルブ７１を用いて、アキュムレータをディスチャージし、水圧システムを減圧する。リリーブバルブ６７は、ポンプ６２から送られる最大圧力を制限する。
図３を参照すると、反応器１０は、調整可能パルス幅およびデューティサイクルを有するタイミングリレー８０によって調節される。タイミングリレー８０からの出力は、方向コントロールバルブ７２を調節する。圧力センサデータは、コンピュータまたはオシロスコープでモニタ可能である。空気シリンダ１４および水圧シリンダ１６によって加えられる反応室圧力は、およそ＋／−２００ｐｓｉの精度で調整可能である。圧力を高圧からパルシングした後、高圧にパルシングして戻す前に、低圧でのドエルが、およそ３０ｍｓｅｃから数分まで調整可能である・タイミング精度は、およそ＋／−１０ｍｓｅｃである。
使用する際、例えば酵素を用いて、およそ５０μｌの試料を入れたカプセル１７を、例えば、そのカプセル内の試料を凍結させて阻害温度に維持した状態で、試料室１５に配置する。その後、試料室１５には、例えばシリコン油が充填され、加えた圧力をカプセルに伝達可能とする。代わりに、酵素反応の開始を調節するために、反応カプセルは、圧力を加えるまでＤＮＡおよび酵素を偏析するバリアを備えることができる。その時、圧力トランスジューサ５６は反応モジュール１２に装着される。圧力を反応室１５に最初に加えると、カプセルバリアが破裂し、それによってＤＮＡと酵素が化合することになる。
空気シリンダ１４は、水圧シリンダ１６が室１２を加圧していない時、すなわち酵素が阻害されない時、室の圧力を調節する。酵素処理が、１０，０００ｐｓｉから２０，０００ｐｓｉまでの圧力で減速し始めるので、ＤＮＡ配列決定の間、単一ベースステッピングを最適化するために反応を減速するのが望ましい場合があり、空気シリンダ１４は、パルシングの間、圧力降下の大きさを制限する働きをする。このように、（空気シリンダ１４および水圧シリンダ１６によって加えられる）阻害圧力のレベルと、（空気シリンダ１４によって加えられる）活性化圧力との両方を個別に調節可能である。
図４を参照すると、好ましい別の実施例では、コンピュータコントロールフロースルー圧力サイクリング反応器１００は、圧力変調フロー環境における選択した物質の試料を反応することが可能な電空動作の流体処理装置である。流体ポンプおよびバルブの配置を利用して、試料を、静止した、または迅速に変化する圧力環境に維持すると同時に、様々な試薬に晒すことも可能である。流体圧力は、およそ４０，０００ｐｓｉのレベルまで調整可能であり、流体圧力は、かなり低いレベルまで迅速に低下し、その後、およそミリ秒で、より高いレベルに戻ることが可能である。空気システムについて述べているが、他のシステム、例えば水圧システムも採用可能であることが理解される。
圧力サイクリング反応器１００は、キャビネット１０１を備えており、このキャビネット１０１には、反応容器１０２と、第１の容器加圧器インジェクションポンプ／バルブモジュール１０４と、第２の容器加圧器ドレインポンプ／バルブモジュール１０６とが取り付けられている。モジュール１０４および１０６の役割は逆転できることが理解される。空気バルブモジュール１０８における一連の空気バルブ１０７は、さらに以下で述べるモジュール１０４、１０６において流体ポンプおよびバルブを調節する、キャビネット１０１に取り付けた圧力伝達空気シリンダ１２６、１２８、１３０、１５６、１５８および１６０に加圧ガスを向けてそれと切り換える。キャビネット１０１に取り付けた流体貯蔵室１１４、１１６は、ポンプ／バルブモジュール１０４、１０６にそれぞれ試薬を供給する。
圧力源１１８、例えばエアコンプレッサまたは圧縮ガスボトルは、流体貯蔵室１１４、１１６を加圧し、また空気バルブ１０７に圧力を供給する。流体貯蔵室は、例えば、ほぼ１０ｐｓｉまで加圧して、フローを助長して、フロー経路が真空状態にならないようにする。バルブモジュール、空気バルブおよび流体貯蔵室は、以下で述べるように、クランプ２６０に取り付ける。
コンピュータ１１０は、圧力パルシングおよび流体フローのタイミングを計ってコントロールし、システムの状態をモニタする。２個の信号条件付け装置１１２、１１３は、入力および出力信号の増幅およびスケーリングを提供する。
ディスプレイパネル３００は、圧力ゲージ３０２、３０４、３０６を備えており、これらは、流体貯蔵室１１４、１１６および空気バルブ１０７に加えた圧力をモニタする。ノブ３０８、３１０、３１２は連続する圧力レギュレータ１８０、１８２、１８４を調整し（図５Ａ参照）、この圧力レギュレータ１８０、１８２、１８４は、流体貯蔵室１１４、１１６および空気バルブ１０７に加える圧力を調節する。ノブ３１４は、バルブ１１８ｃの閉塞を調整する（図５Ａ参照）。ディジタルディスプレイ３１６は、圧力トランスジューサ１８８に示すように反応容器１０２内の圧力を表示する（図５参照）。パワースイッチ３１８、例えば照明ロッカースイッチは、マスターパワースイッチ、データ獲得パワースイッチおよび空気バルブパワースイッチである。インジケータライト３２０は、空気バルブの状態を示し、マニュアルオーバライドプッシュボタンスイッチとしても作用する。
図５を参照すると、インジェクションポンプ／バルブモジュール１０４（図４参照）は、水圧を発生して流体経路１９０に沿って流体を移動させるためのピストン型インジェクションポンプ１２０と、それぞれ流体の移動をコントロールして流体経路１９０内の圧力をシーリングするための高圧オンーオフインジェクションポンプインレットおよびアウトレットバルブ１２２、１２４とを備えている。インレットバルブ１２２は、バルブ１７４（以下で述べる）からインジェクションポンプ１２０まで延びるコンジット１２１内に配置され、アウトレットバルブ１２４は、インジェクションポンプ１２０から反応容器１０２まで延びるコンジット１２３内に配置される。ポンプ１２０は、コンジット１２１および１２３と連通する。空気シリンダ１２６は、機械的力を与えてポンプ１２０を駆動し、空気シリンダ１２８はポンプインレットバルブ１２２を作動し、空気シリンダ１３０はポンプアウトレットバルブ１２４を作動する。位置センサ１３１は、インジェクションポンプ１２０が底の手前にある時、すなわちポンプ１２０のピストン１２０ｂがほぼ最大限まで延びている時、信号を送る。
空気バルブモジュール１０８内に配置した４方向空気バルブ１３２、１３６および１３８は、圧力源１１８からシリンダ１２６、１２８および１３０まで、さらにシリンダ１２６、１２８および１３０からのガスのフローをそれぞれコントロールして、シリンダロッド１２６ｃ、１２８ｃおよび１３０ｃの運動をそれぞれコントロールする。例えば、バルブ１３６に関して、第１のフロー経路（矢印１３６ａ）が、シリンダ１２８の第１の室１２８ａを加圧してバルブ１２２を閉じ、第２のフロー経路（矢印１３６ｂ）が、シリンダ１２８の第２の室１２８ｂを加圧してバルブ１２２を開き、排出ポート１３６ｃが大気にベントを開く。
キャビネット１０１に配置した３方向空気リリーフバルブ１３４は、正または負の圧力パルスを発生するために、圧力を迅速に低下させ、シリンダ１２６の第１の室１２６ａをリチャージすることができる。キャビネット１０１に配置した３方向空気バルブ１４０により、室１２６ａの圧力をゆっくりと低下させる。バルブ１３２を貫通する第１のフロー経路１３２ａは、バルブ１３４および１４０を矢印１３４ａに沿ったガスフローを与えるように位置決めした状態で、シリンダ１２６の第１の室１２６ａを加圧してポンプ１２０のピストン１２０ｂを延ばし、第２のフロー経路１３２ｂは、シリンダ１２６の第２の室１２６ｂを加圧してピストン１２０ｂを引っ込める。ピストン１２０ｂは、圧力室シリンダ１２０ａの体積をコントロールする圧力室壁面１２０ｃを定める。
同様に、ドレインポンプ／バルブモジュール１０６は、ピストン型ドレインポンプ１５０と、高圧オン・オフドレインポンプインレットおよびアウトレットバルブ１５２、１５４とを備える。インレットバルブ１５２は、反応容器１０２からドレインポンプ１５０まで延びるコンジット１５１内に配置され、アウトレットバルブ１５４は、ドレインポンプ１５０からバルブ１７８（以下で述べる）まで延びるコンジット１５３内に配置される。ポンプ１５０は、コンジット１５１および１５３と連通する。空気シリンダ１５６は、機械的力を与えてポンプ１５０を駆動し、空気シリンダ１５８はポンプインレットバルブ１５２を作動し、空気シリンダ１６０はポンプアウトレットバルブ１５４を作動する。位置センサ１６１は、ドレインポンプ１５０が底の手前にある時、すなわちほぼ最小の容積である時、信号を送る。流量およびフロー速度は、ポンプ１２０および１５０によりコントロールされる。ポンプ１５０のピストン１５０ｂは圧力室壁面１５０ｃを定め、これによって、可変容積圧力室ポンプシリンダ１５０ａの容積をコントロールする。シリンダ１５０ａの最大容積は、反応容器１０２における流体の容積よりも実質的に大きい。
空気バルブモジュール１０８に配置した４方向空気バルブ１６２、１６６および１６８は、圧力源１１８から、シリンダ１５６、１５８および１６０までの、さらにシリンダ１５６、１５８および１６０からのガスのフローをそれぞれコントロールして、シリンダロッド１５６ｃ、１５８ｃおよび１６０ｃの運動をそれぞれコントロールする。３方向空気バルブ１７０により、シリンダ１５６の第１の室１５６ａから圧力をゆっくりと低下させる。
流体貯蔵室１１４は、多数のタンク１７２を備える。貯蔵室１１４に取り付けたマルチポジションバルブ１７４を用いて、望ましいタンク１７２を選択する。流体貯蔵室１１６は、多数のタンク１７６を備える。貯蔵室１１６に取り付けたマルチポジションバルブ１７８を用いて、望ましいタンク１７６を選択する。マルチポジションバルブ１７４および１７８、例えば８個のポジションフェースバルブまたはテーパードプラグバルブも、フロー経路１９０が大気に通じるように位置決め可能である。
圧力レギュレータ１８０、１８２および１８４は、さらに以下で述べるように、空気シリンダ１２６、１２８、１３０、１５６、１５８および１６０ならびに流体貯蔵室１１４および１１６への圧力を調整する。調整可能リリーフバルブ、例えばマニュアルスプリング負荷プランジャバルブ１８６または電子コンピュータコントロールバルブは、負の流体システム圧力パルスの下限を決定するシリンダ１２６からの排気圧力を調整する。
圧力トランスジューサ１８８は、例えば、反応容器１０２に連結した上記のストレインゲージ型トランスジューサ５６のような高速応答圧力トランスジューサは、試料圧力をモニタする。
図５Ａは、空気プランビングを示す。供給源１１８からのガスは、圧力をおよそ２００ｐｓｉまで低下させる圧力レギュレータ１１８ａと、ガスをフィルタリングしてガスから水分を除去するドレイン１１９を有するガスフィルタ／水分分離器１１８ｂと、マスターバルブ１１８ｃとを介してレギュレータ１８０、１８２および１８４に送られる。レギュレータ１８０を流れるガスはシリンダ１２６および１５６を加圧し、レギュレータ１８２を流れるガスはシリンダ１２８、１３０、１５８および１６０を加圧し、レギュレータ１８４を流れるガスは流体貯蔵室１１４および１１６を加圧する。バルブ１３２および１６２は、シリンダ１２６および１５６のどの室をそれぞれ加圧するかをコントロールする。バルブ１３６、１３８、１６６および１６８は、シリンダ１２８、１３０、１５８および１６０のうちのどの室をそれぞれ加圧するかをコントロールする。
ポンプ空気シリンダ１２６および１５６への圧力は、およそ５０ｐｓｉから１５０ｐｓｉまでの範囲で設定可能であり、それによって、反応室の阻害圧力をおよそ２０，０００ｐｓｉから６０，０００ｐｓｉまでの範囲に設定可能となる。圧力レギュレータ１８２は、およそ１５０ｐｓｉをバルブシリンダ１２８、１３０、１５８および１６０に送るように設定する。上記のように、貯蔵室圧力をおよそ１０ｐｓｉに設定する。圧力レギュレータは、手動調整可能であるか、またはコンピュータ制御も可能である。
図６を参照すると、ポンプ／バルブモジュール１０４および１０６ならびにシリンダ１２６、１２８、１３０、１５６、１５８および１６０の機械的構造を示している。反応容器１０２の一方側の構造は、反応容器の他方側の構造の鏡像であり、ポンプ／バルブモジュール１０４およびシリンダ１２６、１２８および１３０のみについて述べる。シリンダ１２６によって駆動されるポンプ１２０と、シリンダ１２８によって駆動されるバルブ１２２と、シリンダ１３０によって駆動されるバルブ１２４とが、ポンプ／バルブモジュール１０４のハウジング２５０内に取り付けられる。
図６Ａを参照すると、ハウジング２５０は、コンジット１２１および１２３（図５）によって定められた流体経路２５２と、コンジット１２１のアーム２５２ａにおける流体インレット２５４とを備える。バルブ１２２は、バルブプランジャ２５６を備え、このバルブプランジャ２５６は、流体インレット２５４をブロッキングする延長位置と、流体がインレット２５４を通過するのを可能にする引っ込み位置との間で移動する。バルブ１２４はプランジャ２５８を備え、このプランジャ２５８は、反応容器１０２に至るコンジット１２３におけるフローをブロッキングする延長位置と、反応室にフローを与える引っ込み位置との間で移動する。ポンプ１２０のピストン１２０ｂを用いて、流体経路２５２を加圧する。コンジット１２３の流体アウトレット２５１は、ハウジング２５０によって定められた反応室シート２５３に至る。
ハウジング２５０は、例えばステンレス鋼から形成されている。バルブ１２２および１２４のプランジャ２５６および２５８は、例えば熱処理したステンレス鋼から形成されている。バルブ１２２および１２４は、例えばステンレス鋼で形成したパッキング圧縮ナット２７０と、例えば青銅合金で形成したパッキングスペーサ２７２と、例えばテフロンで形成したバルブプランジャパッキングディスク２７４とを備える。ポンプ１２０のピストン１２０ｂは、例えば熱処理したステンレス鋼から形成されている。ポンプ１２０は、例えばステンレス鋼で形成した保持ナット２７６と、例えば青銅合金で形成したシールスペーサ２７８と、ピストンシール３６とを備える（図１Ａ参照）。ポンプシリンダ１２０は、ハウジング２５０内のボアによって定められている。
図６Ｂ及び図６Ｃを参照すると、試料の性質や反応に依り、様々な大きさや型式の反応室を利用できる。図６Ｂに示すように、反応容器１０２は、試料室３３０を定める第１の部分１０２ａと、第２の部分１０２ｂとを備える。試料室２２０は、数百マイクロリットルまでの試料容積を収容できる。２つの部分は、ねじ切りして係合され、Ｏリングシール３３２でシーリングされる。この２つの部分は、流路３３４を定める。図６Ｃは、通過するためではなく圧力パルシングのために設計した反応容器１０２の構造を示す。第１の部分４０２は試料室４３０を定め、第２の部分４０４は、試料室４３０と連通して流路４３４を定める。２つの部分は、ねじ切りして係合され、Ｏリング４３２でシーリングされる。
図６Ｂを再度参照すると、反応容器１０２は、周囲の流体ジャケット３３６によって温度調節される。代わりに、熱電加熱および冷却を採用することが可能であり、または温度を調節するために空気浴を利用することが可能である。外界温度で、またはそれより高いか、もしくは低い温度で、反応を行ってもよい。温度センサ３３８、例えば、熱電対、サーミスタまたはＲＴＤは、反応容器１０２の温度をモニタする。ポンプ／バルブモジュール１０４および１０６、ならびに貯蔵室１１４および１１６もまた、上記方法のうちの１つによる温度調節のための温度コントローラ４０２および温度センサ４０４を備えるのが好ましい（図６参照）。
図７を参照すると、クランプ２６０は、ポンプ／バルブモジュール１０４、シリンダ１２６、１２８および１３０、ならびに流体貯蔵室１１４を取り付けた固定端部２６２と、ポンプ／バルブモジュール１０６、シリンダ１５６、１５８および１６０ならびに流体貯蔵室１１６を取り付けた可動端部２６４とを備える。反応室シートにおけるポンプ／バルブモジュール間に反応容器１０２を配置し、クランプを締め付けて、モジュール間の反応室を保持し、シーリングする。クランプ２６０は、エアクランプマシンバイスであり、マシンスクリュ（ヘックスシャフト２６６）で手動で大きく調整し、マルチステージタンデムエアシリンダ２６８で最終クランピングを行う。レギュレータ１８２からの空気は、クランピングシリンダに圧力を加えるマニュアルバルブである空気オン・オフバルブ２６１を通過することにより、クランプエアシリンダをコントロールする。最大クランピング力は、およそ５，０００ポンドである。このクランピング機構は、反応容器１０２を迅速に交換し、様々な大きさの反応室を考慮することも可能である。
使用する際に、反応を行う試料を反応容器１０２を入れ、反応室を流路に取り付けた状態で、一般に流体が流体貯蔵室１１４から高圧バルブ１２２および１２４と、反応容器１０２と、高圧バルブ１５２および１５４とを介して流れ、バルブ１７８を介して排出される。しかし、システムシンメトリは、反対方向での同じフローにも備える。図８を参照すると、流路１９０（図５）を通過する流体のフローは、まず２００で流路に流体を充填し、２０２で流路を加圧し、反応容器１０２における２０４での圧力パルスの生成と２０６での反応室を通過する流体の移動とを交互に繰り返す。
図９を参照すると、流路１９０に流体を充填するために、貯蔵室１１４からの流体のアリコートを、バルブ１２４、１５２および１５４を閉じ、バルブ１２２を開き、シリンダ１２６を用いてポンプ１２０のピストン１２０ｂを引っ込めてポンプ１２０の可変容積圧力室ポンプシリンダ１２０ａに引き入れる（工程１）。このアリコートが反応室を通過して流れるためには、バルブ１２２を閉じ、バルブ１２４、１５２、１５４を開き、バルブ１７８をそのドレーン位置に配置する。ポンプ１２０のピストン１２０ｂは、その時、延在し、ポンプシリンダ１２０ａの内容物を反応室から排出する（工程２）。この動作により、バルブ１７４、１７８間の流路１９０を充填する。これは、反応容器１０２が加圧可能となる前に、必要である。
反応室の加圧は、以下のようにして行われる。バルブ１２４、１５２および１５４を閉じて、バルブ１２２を開く。その後、ポンプ１２０のピストン１２０ｂを引っ込めて、ポンプシリンダ１２０ａに貯蔵室１１４からの流体を充填する（工程３）。バルブ１２２を閉じ、シリンダ１２６を加圧してポンプ１２０のピストン１２０ｂを延ばし、バルブ１２４を開く（工程４）。ポンプ１２０のピストン１２０ｂは、流路１９０における流体の非圧縮性により、ほんの僅か内側に移動する。反応容器１０２を加圧する。圧力レベルは、レギュレータ１８０のガス圧設定の関数である。
ポンプ１２０を用いてブリーフ減圧パルスを生成することにより、反応室１０２内にブリーフ圧力パルスを生成することもできる。圧力パルシングのために、バルブ１２２および１５２を閉じ、バルブ１２４を開き、ピストン１２０ｂを延ばした状態で、バルブ１３４を瞬間的に駆動して（工程５）、流路１３４ｂを開いて、シリンダ１２６の加圧側（室１２６ａ）をリリーフバルブ１８６を介して空中に晒し、その後、そのフロー位置に戻って、経路１３４ａに沿ったフローを与えて、室１２６ａを再加圧する（工程６）。排出間隔において、ピストン１２０ｂの流体圧によって、ピストンが十分な量だけ引っ込み、反応容器１０２の流体圧を緩和する。しかし、リリーブバルブ１８６は、シリンダ１２６のガス圧の低下を順に制限し、反応容器１０２の流体圧の低下を順に制限する。このように、リリーフバルブ１８６の設定により、負に向かう圧力パルスのためのベースレベルを確立する。ガス圧がシリンダ１２６に再度加えられると、反応室はその前の圧力レベルに戻される。
圧力をかけて反応容器１０２を保持しながら、ポンプシリンダ１２０ａから反応容器１０２に、またそれを通過して流体を移動させるために、シリンダ１５６を加圧して、ポンプ１５０のピストン１５０ｂを内側に駆動する（工程７）。その後、バルブ１５２を開く（工程８）。シンメトリのため、ピストン１２０ｂにかかる力はピストン１５０ｂにかかる力によって相殺され、流体フローが生じない。バルブ１７０をそのベント位置に切り換えることにより、シリンダ１５６の加圧した端部１５６ａは、オリフィスを介して大気へとゆっくりベントを開くことになる。ガスを放出すると、ピストン１２０ｂは遅い速度で延び、ピストン１５０ｂは引っ込む。ポンプシリンダ１２０ａ内の流体は、反応室１２０を通過してポンプ１５０のポンプシリンダ１５０ａに送られる。ピストン１２０ｂが底に到達する直前に、位置センサ１３１が駆動され、電気信号を送る。この電気信号は、バルブ１５２を閉じ、バルブ１７０を切り換えてベントポートを閉じ、ポンプ１５０に圧力を再度加える（工程９）。反応室の圧力は、ポンプ１２０によって維持され続けることに注目されたい。
ポンプシリンダ１５０ａ内の流体は、バルブ１５４を開いて、バルブ１７８を介して流体を排出させることにより放出する（工程１０）。ピストン１５０ｂが底に到達する直前に、センサ１６１が信号を送って、バルブ１５４を閉じる。ピストン１５０ａが延び続けて、ポンプ１５４および１５２間でコンジット１５３および１５１において流体を加圧する。その後、バルブ１５２を開き、バルブ１２４を閉じて、次の流体伝送サイクルを開始する（工程１１）。反応室圧力をポンプ１５０によって維持する。ポンプ１２０は、今まさに、流体貯蔵室１１４からの試薬を再度充填されようとしている。別の圧力パルスを生じるために、バルブ１２２が開いて、ピストン１２０ｂが引っ込み、その後、バルブ１２２が閉じ、バルブ１２４が開き、バルブ１５２が閉じて、工程４から処理を繰り返すことが可能となる。
一定の反応に対しては、システムから過度に放出する前に、反応室を介して流体のアリコートを前後に数回移動させることが望ましい場合がある。これは、試料、試薬間の混合を改良することが望ましい場合に当てはまる。これを達成するために、ポンプ１２０から反応容器１０２を通過して試薬を搬送すると、ポンプ１５０には超過分が含まれた状態で、バルブ１２４および１５２を開き、バルブ１２２および１５４を閉じ、シリンダ１５６を加圧してピストン１５０ｂを延ばし、バルブ１４０を切り換えてシリンダ１２６からオリフィスを介してガスを流すことによって試薬を逆流させる。
一定の反応に対して、ある型式の試薬を一方向に流し、異なる試薬を反対方向に流すのが望ましい場合には、流体貯蔵室１１６を設けて、装置の通常の下流端部に流体源を備える。
図１０を参照すると、コンピュータ１１０をコントロールして流体システムの機能的構成部分を作動する。圧力と、温度と、位置センサ１３１および１６１で示すピストン１２０ｂおよび１５０ｂの位置とをコンピュータ１１０に入力する。空気バルブ１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１６２、１６６、１６８および１７０をコントロールするための電気信号をコンピュータ１１０によって出力する。流体の配列決定および時間圧力プロファイルは、オペレータプログラマブルである。レギュレータ１８０を自動的にコントロールして、圧力センサからのフィードバックを用いて反応室の望ましい圧力レベルを設定する。
Ｃ．使用
開示した反応器を用いて、核酸配列決定、核酸合成、タンパク質配列決定、酵素キラル合成およびラセミ混合物の鏡像異性体精製を含む化学反応を調節する。非酵素反応も、調節可能である。
反応容器の内容物に圧力を加えた場合の望ましい効果として、タンパク質アンフォールディング、タンパク質フォールディング、酵素の可逆阻害、酵素の活性化、反応速度の変動および非酵素反応の熱力学平衡が挙げられる。圧力誘導阻害とは、一つの酵素反応工程か、いくつかの配列決定酵素反応工程か、または完全酵素事象を阻害することである。さらに、阻害圧力は、個々の反応分子（例えば、酵素、共同因子、または第１もしくは第２の基質）の活性を同期することができる。圧力が許容圧力に変化すると、多数の酵素分子がほぼ同時に作用し始め、その結果、酵素の活性をより均一に、正確に、しかも再現可能に調節する。基質に対して酵素がモル過剰であるならば、通常、同期作用を増進する。酵素反応工程は、生成物（Ｐ）を形成するために酵素（Ｅ）と基質（Ｓ）との反応に必要な機械論的工程を含む。これらの工程は、完全酵素事象に依り、Ｅ、Ｓ、Ｐの配座変化およびその組み合わせ；Ｅ−ＳおよびＥ−Ｐの会合または解離；共同因子とＳまたはＥの相互作用；Ｓ、Ｅ、共同因子間の相互作用；Ｅ、Ｓまたは共同因子との溶媒相互作用；Ｅと、Ｓ、溶媒または共同因子等の試料混合物の成分とのプロトン交換；ＥとＳとの触媒相互作用を含む。酵素事象に依り、２つ以上の基質（Ｓ、Ｓ’、Ｓ”等）、２つ以上の生成物（Ｐ、Ｐ’、Ｐ”等）および２つ以上の共同因子が存在可能である。さらに、いくつかの実施形態では、２つ以上の溶媒または溶質（例えば、塩または金属イオン）および圧力と関連する温度を用いて、酵素反応工程を調節する阻害または許容状態を提供する。
同様に、試料混合物の圧力を、酵素反応工程を行うことが可能な圧力に変化させることで、次の酵素反応工程、一連の酵素反応工程、または１つ以上の完全酵素事象を行うことが可能となる。一般的な方法を用いて、望ましい一連の単一酵素事象をプログラミングすることにより、酵素の活性を調節することができる。高圧処理によって、多くの生体高分子、例えばタンパク質、酵素、抗体およびポリヌクレオチドが生じ、これらは１気圧で自然に作用してアンフォールドまたは変性する。このようなアンフォールディングによって、例えば酵素の活性を阻害する。逆に、いくつかの酵素またはタンパク質、特に高圧で自然に作用するもの（例えば、深海ベント生物体において）を、低圧で阻害することが可能である。
一般に、濃度、緩衝液、溶媒、酵素、基質および他の添加剤または促進分子が、従来技術において良く知られている。しかし、通常の酵素濃度よりも高くなると、より均一で再現可能な結果が得られることになる。従来技術においては、核酸、マーカー、リンカー、プライマ、緩衝液、アミノ酸、保護基、溶媒、酵素および関連の他の試薬に対する商業上の供給源に精通している（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。
１．検出
反応の過程および反応の生成物をモニタしたい場合、圧力サイクリング反応器は、流体に存在するか、または反応容器から除去される成分の特性を検出するために連結した検出器４００（図１０参照）を備える。検出器は、コンピュータ制御され、分析した成分に関する情報をコンピュータにリレーすることができる。このように、反応容器内での圧力パルスの前に、その間に、またはその後に、成分を分析することが可能である。成分はまた、反応容器から除去した後に分析することも可能である。検出器の例として、放射性同位体検出器、赤外分光計、質量分析計、ガスクロマトグラフィー質量分析計、分光光度計、分光蛍光計、電気化学検出器、表面プラスモン共振検出器および光度計が挙げられる。
２．試薬提示および生成物分離
圧力サイクリング反応器が、再使用可能または未使用の反応物を反応生成物から分離するための手段を備えている場合、反応物を効率的に使用することができる。圧力サイクリング反応器は、容器から流体を除去しながら反応容器内で試薬を保持するために抑制剤３３１（図６Ｂ参照）を有する反応容器を備えることも可能である。抑制剤の例として、大きさ、電荷、極性、キラリティーまたはその組み合わせによって試料混合物成分を分離する膜またはマトリックス等の半透性（すなわち分離）物質が挙げられる。
半透性物質は、フィルタまたはネット状に試料容器または反応容器の全断面積を占有することも可能である。抑制剤３３１、例えば半透性バリアは、反応容器を２つの部分に分割することができる。２つ以上の半透性バリアは、反応容器を３つ以上の部分に分割する。
例えば、反応容器または室は、少なくとも２つの異なる膜の間で、反応容器内に保持した固定化基質を入れることが可能である。１つの膜は、酵素および生成物または小さい分子が通過できる細孔を有する。他の膜は、生成物または小さい分子のみが通過する細孔を有する。
さらに、半透性物質は、反応容器または試料容器の壁面に装着したポーチまたはバッグ（固定しているか、可撓性であるかのいずれかである）であってもよい。例えば、反応容器は、固定化反応物もしくは試薬（酵素もしくは基質のいずれか）を有する多孔プラスチックもしくはガラスプラグ；または固定化反応物を含有する多孔膜を支持する反応容器の内面上の膜支持物を含むことが可能である。さらに、他の例として、固定化試薬を含有する堅い中空の多孔フリットが挙げられ、このフリットは、反応室または容器の内面に装着される。いくつかの実施形態では、抑制剤を移動して半透性バリアを提供し、その後、一連のプログラミングしたサイクルの間、一時的に除去して、反応容器または試料容器からすべての成分を自由に流し出すことが可能である。
分離物質は、一般に、試料混合物成分に関して化学的に不活性であり、また特定の応用において阻害圧力と同じほど高い流体圧力に構造上耐える。サイズ識別膜またはフィルムは、０．５ＫＤから３００ＫＤまでの分子量カットオフで入手可能なＤＩＡＦＬＯ（登録商標）  限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む。例えば、膜は、遊離ヌクレオチドまたはアミノ酸から酵素を、また遊離酵素および遊離ヌクレオチドまたは溶液中のアミノ酸から固定化基質を分離することが可能である。膜またはマトリックス等の分離物質は、試料混合物の成分と相互作用する物質または共有結合した配位子が含浸もしくはコーティングされ、またそうでない場合は、その配位子を用いて、より機能的となる。非対称表面特性または非対称細孔チャネル疎水性、親水性、サイズ等を有する物質を使用することも可能である。半透性物質は、カラムクロマトグラフィーの類似体を含むことも可能であり、少なくとも１つの試料混合物成分が溶離される充填物質を用いてキラル分離を達成する。
調節される反応と、選択した抑制剤の制限特性に依り、除去した流体は、ヌクレオチド、アミノ酸、酵素、非結合酵素基質、共同因子および種々の溶媒または塩を含むことが可能である。同様に、試料混合物の保持成分は、溶媒、塩、酵素、遊離基質または固定化試薬を含むことも可能である。固定化試薬は、非液体支持部に装着した有機化合物を含む。支持物の例として、ポリマー、複合体、プラスチックもしくはガラスビーズ、マトリックス、ボード、またはシリンダもしくはチューブを含む他の形状が挙げられる。
いくつかの実施の形態では、溶離した成分が、さらなる圧力処理のための次の試料容器に直接流れ込む。反応容器を通過して高圧で流体を流す能力は、酵素事象の調節に加えて分離を援助するための高圧液体クロマゴグラフィーに類似した方法で用いることが可能である。
高圧を含むいかなる圧力でも、また圧力パルスに関していかなる時にも（すなわち、１つ以上の酵素反応工程を行う前、その間、またはその後）、分離は発生し得る。各圧力パルスの後、または所定数の圧力パルスの後にも、分離は発生し得る。
３．  実施の形態
これらの反応に対して、第１および第３の圧力のみ、または外界温度以下との組み合わせでは、酵素の活性を阻害するのに十分であるが、第２の圧力のみ、または第１の温度よりも高い温度との組み合わせでは、阻害しないため、酵素は基質上で作用することになる。
本発明は、ＤＮＡ配列を決定するための開示した反応器を用いる方法を特徴とする。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩのような制限エンドヌクレアーゼは高圧状態によって可逆的に阻害可能な分布酵素である（実施例７参照）。ポリヌクレオチドの配列決定のためのエキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのエキソヌクレアーゼＩ−ＩＩＩ、ヌクレアーゼＢａｌ−３１、エキソリボヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの活性を含む。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、２５℃で３０，０００ｐｓｉおよび４０，０００ｐｓｉで阻害される分布酵素である。減圧した後に活性が検出されたことに基づいて、この圧力誘導阻害は可逆的である。
遺伝子ブラウジングの方法によれば、ある領域に制限エンドヌクレアーゼ処理を行い、その後、配列を決定する。エンドヌクレアーゼを繰り返し除去し、配列決定酵素を導入して、ポリヌクレオチド全体の配列決定を行うことなく長い核酸中の所定位置をスポット分析することができる。この配列マッピングまたは遺伝子ブラウジングの方法は、固定された大きな核酸基質を含有する試料混合物を与える工程と、制限酵素で基質を開裂する工程と、試料容器から制限酵素と開裂生成物とを除去する工程とを含む。この方法は、ラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力下でラムダエキソヌクレアーゼを添加する工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ作用圧力に変化させ、それによって固定化核酸から所定平均数のヌクレオチド（好ましくは１つのヌクレオチド）を脱離させる工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力に変化させる工程と、脱離したヌクレオチドを除去し分析する工程とをさらに含む。
配列決定の他の方法は、確証的配列決定である。この方法によれば、５’−３’活性の進行的ラムダエキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡに優先的に作用して、単一ヌクレオチドを除去する。その後、３’−５’活性の進行的エキソヌクレアーゼＩ（マグネシウム依存）は、現在露出している一本鎖ＤＮＡに作用して、単一ヌクレオチドを除去する。Ｅｘｏ  Ｉは、ラムダエキソヌクレアーゼが終結した場所、またはその近くの二重鎖領域で停止する。このように、一本鎖が配列決定され、相補的鎖もまた配列決定されて、第１の配列を確認する。
この方法は、固定化核酸基質を含有する試料混合物およびラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力でラムダエキソヌクレアーゼを供給する工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ作用圧力に変化させる工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力に変化させる工程と、脱離した１つ以上のヌクレオチドを除去して分析する工程とを備える。ヌクレオチド除去および分析が後に続く１つ以上の反復圧力パルスまたは圧力サイクルの後、０．２Ｍ−０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液等の溶離液、その後６７ｍＭ  グリシンＫＯＨ、ｐＨ９．５、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2等のＥｘｏ  Ｉ緩衝液を用いて、試料混合物からラムダエキソヌクレアーゼを除去する。試料容器には、エキソヌクレアーゼＩ−阻害圧力での３’−５’活性のエキソヌクレアーゼが含まれ、圧力がエキソヌクレアーゼ許容圧力に変化し、圧力がエキソヌクレアーゼ阻害圧力に変化し、放出したヌクレオチドが除去され、分析される。
さらに別の配列決定方法は、プローブ配列決定と、プライマ伸張プローブの配列決定との両方を含む。プローブ配列決定は、既知の突然変異部位（例えばシスチックフィブロシス）に対応するプライマの組として、一本鎖オリゴヌクレオチドを採用する。この方法によれば、患者のＤＮＡの１つ以上の一本鎖転写をＰＣＲ生成物から単離して固定化する。患者次第で、既知のＤＮＡ一本鎖プローブ基を用いた反応が一本鎖プローブのハイブリダイゼーションを全く生じないか、または１つ以上の一本鎖プローブのハブリダイゼーションを生じ、二重鎖領域を有する核酸生成物が生じる。二重鎖部分は、例えば３’−５’鎖上の５’−３’酵素を用いて選択的に配列決定される。
従って、この方法は、領域を表す固定化一本鎖ＰＣＲアンプリコンを含有する試料混合物を供給する工程と、既知の突然変異および野生型を含む１組のオリゴヌクレオチドプローブを試料混合物に添加する工程と、ハイブリッド形成していないオリゴヌクレオチドを除去する工程と、３’−５’エキソヌクレアーゼを任意に添加する工程と、ラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力で、ラムダエキソヌクレアーゼ（５’−３’）を含有する試料混合物を供給する工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ許容圧力に変化させる工程と、圧力をラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力に変化させる工程と、放出または脱離した１つ以上のヌクレオチドを除去し分析する工程とを備える。第１のプローブ配列が完了するまで、配列決定工程を繰り返す。次の組のプローブは、ハイブリッド形成され、洗浄される。一本鎖は、次の二重鎖領域に到達するまで、３’−５’エキソヌクレアーゼで消化される。その後、ラムダエキソヌクレアーゼ５’−３’を上記のように用いて、二重鎖領域を分析する。この方法は、オペレータ工程が少ないため、ＰＣＲおよび他の増幅技術よりも速い。
可変領域において既知の突然変異に対応する種々の一本鎖オリゴヌクレオチドに配列５’を用いて、プライマ伸張プローブを配列決定する方法に、圧力サイクリング反応器を使用することが可能である。通有プライマプローブは、ＰＣＲ生成物からの患者の一本鎖ＤＮＡと反応し、患者のＤＮＡは単離され、固定化される。低ストリンジェンシー状態で反応を行って、通有プローブの非適合を調節する。プローブは、その領域を介して伸張し、伸張したプライマは、エキソヌクレアーゼＩＩＩと３’−５’方向に配列決定される。この配列分析は、その領域における、既知および未知の突然変異を検出する。
上記実施例に基づいて、圧力サイクリングまたは圧力パルシングの基本原理は上で詳細に述べているので、この方法の他の実施の形態を以下のように要約することができる。上記各工程は、組み合わせてもよいし、さらに別の工程に分割してもよい。領域のＰＣＲアンプリコンを単離して固定化する。オリゴヌクレオチドプライマを固定化アンプリコンと反応させる。ハイブリッド形成されていないプローブを洗浄または溶離によって除去する。ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶｅｎｔR、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、阻害圧力をかけて試料混合物に供給する。圧力パルスを採用して所定数のヌクレオチドをプライマに添加する。遊離ポリメラーゼおよびヌクレオチドを洗浄によって除去する。阻害圧力をかけて、エキソヌクレアーゼＩＩＩを試料混合物に供給する。圧力パルスを採用して、伸張したプライマから単一ヌクレオチドを脱離する。放出したヌクレオチドを除去し、分析する。
部分的消化を行う方法を、以下で述べる。定型的な方法では、重要な試料の調製（一般に５００塩基対の読みとり長さ（ｒｅａｄ−ｌｅｎｇｔｈｓ）に対する切断、単離、精製およびマッピング）、配列決定、ならびにデータ分析（ギャップの解読、曖昧な配列の解読）を必要とする。本発明は、これら３つの工程の各々に、例えば長い読みとり長さのテンプレート（例えば、２，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００またはそれ以上の塩基）を与え、配列決定の際、酵素反応を調節し、単一のヌクレオチドを一度に放出し、検出して分析を簡素化することにより影響を与える。ゲル電気泳動は必要ない。５０００個の塩基を数時間以内で（例えば２時間未満または１時間未満）配列決定することが可能である。上記改良の結果、配列決定した１つ塩基についてのコストも削減される。
開示した反応器の他の実施の形態は、ＤＮＡの合成に用いる。Ｅｃｏ  ＩＩＩおよびＤＮＡジデオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ（ターミナルトランスフェラーゼ、例えばＥＣ２．７．７．３）等の分布酵素は、高圧で可逆的に阻害され、後者の酵素は、ＤＮＡ合成のための鋳型を必要とはしない。ＤＮＡを合成する方法は、（ａ）支持部（例えば、ビーズ、マトリックスまたは表面）上で固定化された開始因子（例えばプライマ）を含有する試料容器と、（ｂ）固定化開始因子の下流で、酵素を遊離ヌクレオチド（例えば、５、１０、１５、２０または２５ＫＤ）を分離するのに十分な分子量カットオフを有する半透性物質と供給する工程を備える。試料容器はまた、ターミナルトランスフェラーゼの超過量（例えば、開始因子の３’端部１モルあたり少なくとも２モル当量）も含有する。ヌクレオチドを含有する溶液を、ターミナルトランスフェラーゼ阻害圧力をかけて試料混合物に添加する。圧力をターミナルトランスフェラーゼ許容圧力に変化させ、この圧力は、１つのプライマにつき所定平均数のヌクレオチド（例えば、１つのプライマにつき１つのヌクレオチドまたは単一の完全酵素事象）を取り込むのに十分な時間だけ、保持される。試料容器圧力をターミナルトランスフェラーゼ阻害圧力に変化させた後、取り込まれていない、または遊離したヌクレオチドを（阻害圧力を保持した状態で）試料容器から洗浄、除去し、一方、酵素は半透性物質によって試料容器内に保持する。次に望ましいヌクレオチドを試料混合物に添加して、望ましいオリゴヌクレオチドを形成するまでサイクルを繰り返す。
いくつかの組み合わせた実施の形態では、試料容器は異なる複数の固定化開始因子を含めることができる。各開始因子に同時に一つのヌクレオチドが付加され、その結果これら開始因子には共通のオリゴヌクレオチド配列セグメントが形成される。半透性物質は、下流バリアとして表すことも可能であり、また試料容器は半透性物質から形成した複数の分子量カットオフポーチを含むことも可能であり、このポーチは、一定量のターミナルトランスフェラーゼおよび１つ以上のプライマを含む。ポリヌクレオチドを合成するのに有用なポリメラーゼは、ＳＰ６  ＲＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ、ｃｉｔｙ／ｓｔａｔｅから入手可能なシーケナーゼバージョン２．０）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（株９0  Ｎｍ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢーＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
クラスＥ．Ｃ．２．７．７の酵素は、ニコチンアミド−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ＦＭＮアデニリルトランスフェラーゼ、パンチテイン−フォスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、サルフェートアデニリルトランスフェラーゼ、サルフェートアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＤＰ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−ヘキソース−１−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−キシロース−１−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＴＰ−グルコース−ヘキソース−１−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、マンノース−１−フォスフェートグアニリル−トランスフェラーゼ、エタノールアミン−フォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、コリンフォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、ニコチネート−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡシチジリルトランスフェラーゼ、マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＤＰ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロフォスフォリラーゼ、グルコース−１−フォスフェートチミジリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡアデニリル−トランスフェラーゼ、グルコース−１−フォスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、ヌクレオシド−トリフォスフェートヘキソース−１−フォスフェートヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ヘキソース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、フコース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−フォスフェートチミジリルトランスフェラーゼ、グルコース−１−フォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、グルコース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、リボース−５−フォスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、アルドース−１−フォスフェートアデニリル−トランスフェラーゼ、アルドース−１−フォスフェートヌクレオチジルトランスフェラーゼ、３−デオキシマンノオクツロソネートシチジリルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−フォスフェートシチジリル−トランスフェラーゼ、Ｄ−リビトール−５−フォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、フォスファチデートシチジリルトランスフェラーゼ、グルタメート−アンモニア−リガーゼアデニリルトランスフェラーゼ、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ、グルクロネート−１−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、グアノシン−トリフォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ゲナタミシン２”−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシン３”−アデニリルトランスフェラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ、アデニリルサルフェート−アンモニアアデニリルトランスフェラーゼ、ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼ、ＡＴＰアデニリルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアデニルトランスフェラーゼ、アントラニレートアデニリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｎ−メチルフォスフォ−エタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ、（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−アデニレートシンターゼ、および［タンパク質ＰＩＩ］ウリジリルトランスフェラーゼを含む。
本発明は、ＲＮＡの合成と同様の方法を特徴とし、ここでは、例えば、酵素ポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼの分布特性をＤＮＡジヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼまたは上記の他のターミナルトランスフェラーゼの代わりに用いる。ポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼは鋳型も必要としない。多数の他のトランスフェラーゼおよびフォスフォリラーゼを上記方法で代用することができる。酵素が鋳型を必要とする場合、開始因子には鋳型が含まれる。
類似の方法で、ポリペプチドを合成し、配列決定することが可能である。タンパク分解酵素は、トリプシン（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞外プロテアーゼ）、キモトリプシン、ペプシン、アミノピプチダーゼＭ（ＥＣ３．４．１１．２）およびカルボキシペプチダーゼＡ、ＢおよびＣ（それぞれＥＣ３．４．１７．１；ＥＣ３．４．１７．２；およびＥＣ３．４．１６．１．）を含む。ポリペプチドは、サブチリシンおよびサーモリジンのような酵素を用いて合成できる。
４．合成化学
有機合成は、微生物と酵素の両方を採用してキラル化合物を合成する。このような酵素の例としては、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼおよびトランスフェラーゼが挙げられる。ラセミ混合物から鏡像異性体を分離するのに有用な酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼおよびトランスフェラーゼを含む。
原則として、感圧遷移状態を有するいかなる化学反応の反応速度も、開示した反応器によって供給される単なる圧力パルスで調節（増加、減少、または停止）可能である。化学反応の例としては、ポリペプチドの非酵素合成、グリコプロテイン、リポポリ糖類、および小さいキラル分子の酵素または非酵素合成が挙げられる。非酵素反応は、感圧熱力学平衡を受け、一定の圧力をかけて特定の立体異性体を生成する。平衡は、反応体のモル体積、遷移状態錯体、生成物、またはその組み合わせを基準にすることが可能である。触媒を採用する場合、圧力パルスを（温度と組み合わせて）用いて触媒からの生成物の解離を阻害または助長し、それによって未反応試薬を触媒生成錯体から分離し、生成物を単離し、精製を助長することが可能である。いくつかの実施形態では、聴音波が圧力パルスを発生することが可能である。
本発明は、反応平衡に影響を及ぼす方法を提供し、この方法は、圧力をかけて試料容器内に固定化試薬を供給し、望ましい温度および圧力状態（例えば、高圧）で１つ以上の反応物を取り込む工程とを備える。反応は、平衡選択状態で進行し、それによって特定の立体異性体を合成する。反応生成物は、高圧で、または試料容器を減圧した後に、除去される。
開示した反応器はまた、その二次、三次または四次構造配座をまず変えることにより化合物を改変する際に有用となる。例えば、高圧での処理は、タンパク質フォールディングの結果、通常埋め込まれる（タンパク質表面には露出していない）１つ以上のアミノ酸残留物を露出させる。露出したアミノ酸を改変した後、タンパク質を再フォールディングする。
５．阻害
酵素反応工程の阻害は、完全酵素事象を達成するために、酵素反応経路に影響を及ぼすか、またはそれに関連する機械論的工程、例えばここで述べるような工程を行わないことである。酵素反応工程の可逆阻害は、後の好都合な条件の下で、酵素反応工程を行うこと、すなわち酵素が回復不可能な変性、不可逆的な結合、改変または非活性化が行われていないことを意味する。可逆的阻害状態は、工程における酵素反応機構経路を一時的に阻止するか、または一時停止する。その阻害状態は、酵素事象に依り、機械的経路に沿って、２つ以上の酵素反応工程を効果的に阻止することが可能である。圧力、温度または溶媒内容物等の条件を変えると、さらなる酵素反応工程を阻害することが可能となる。試料混合物や、温度等の試料混合物条件に依り、圧力変化から起きるさらなる酵素工程の阻害として、後の単一酵素反応工程の阻害、幾つかの酵素工程の阻害、または完全な酵素事象（例えば、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の開裂もしくは添加、または官能基の合成有機変換）の阻害が可能である。阻害圧力が許容圧力に一旦変化すると、酵素反応経路に沿った進行が、試料混合物成分、時間、温度または溶媒条件によって制限される。
必要な試料混合物成分（例えば、基質、共同因子および金属イオン）がすべて存在し、且つ温度等の他の条件が好ましい場合、阻害圧力が完全酵素事象を阻害することが可能である。この場合、後に阻害圧力を許容圧力に変化させ、許容圧力を充分な時間だけ維持することにより、酵素事象が完了する。時間と試料混合物成分の量が充分存在すれば、複数回の酵素事象が生じる。
必要な試料混合物成分および条件の全てではなく、そのうちの幾つかが存在する場合、阻害圧力が、１つ以上の酵素反応工程を阻害できる。この第２の場合、阻害圧力を許容圧力に後に変化させて、許容圧力を充分な時間だけ維持することにより、必要な試料混合物成分および条件が利用可能である同数の酵素反応工程を生じることになる。必要な試料混合物成分のうちの幾つかが存在しない場合、または温度等の条件が好ましくない場合、完全酵素事象は起こり得ない。しかし、試料混合物成分および条件によって、１つまたはそれ以上の後の酵素反応工程が生じることになる。
一実施形態においては、本発明は、酵素を核酸合成酵素または分解酵素を同期的に作用させ、同一ＤＮＡフラグメントの複数のコピーを改変することを企図している。酵素が許容圧力にある期間を調節して、核酸に作用してそれを改変する酵素事象の数を決定する。
一実施形態は、核酸を処理する方法であって、この方法は、ａ）ｉ）核酸基質（例えば、二重鎖デオキシリボ核酸基質）と、ｉｉ）前記核酸基質に進行的に作用することができる酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）と、ｉｉｉ）圧力を加える手段とを供給する工程と、ｂ）前記核酸基質と前記酵素を混合して、（例えば温度を下げて）反応混合物を生成する工程と、ｃ）前記酵素の前記核酸基質に対する作用を調節する（例えば、可逆的に阻害する）ような条件で圧力（例えば、高圧）を加えるための前記手段を用いて、前記反応混合物を処理する工程とを備える。
他の実施形態では、ｄ）前記酵素が前記核酸基質に作用するような低圧条件で圧力を加えるための前記手段を用いて、前記反応混合物を処理する工程をさらに備え、ｅ）工程ｃおよびｄを少なくとも１回繰り返して、さらに改変された基質を生成する工程を任意に備える。この方法は、前記改変された基質（すなわち、酵素が作用できる各工程で発生した基質）を検出するか、または反応の他の生成物（基質から発生した１つ以上のフラグメント）を検出する工程を備えることも可能である。
Ｄ．圧力および温度を変化させる実施形態
温度を調節することによって、工程全体をさらに調節することができる。一実施形態では、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており、この方法は、ａ）ｉ）試料容器と、ｉｉ）核酸基質と、ｉｉｉ）前記核酸基質に作用可能な酵素と、ｉｖ）圧力を調節する手段と、ｖ）温度を調節する手段とをいずれかの順に供給する工程と、ｂ）水溶液内の前記酵素を前記試料容器に添加する工程と、ｃ）前記酵素が実質的に不活性となるように、前記温度調節素手段を用いて、前記試料容器内の前記水溶液の温度を下げる工程と、ｄ）前記核酸基質を前記不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と、ｅ）前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を高める工程と、ｆ）前記温度調節手段を用いて、前記試料容器の前記反応混合物の温度を上昇させる工程と、ｇ）前記酵素が活性状態であり、前記核酸基質に作用するように、前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を降下させる工程とを備える。工程（ｅ）の圧力増大は、最適酵素温度で前記核酸基質に対する前記酵素の作用を実質的に抑制できる圧力を達成することが企図されている。また、工程（ｇ）における酵素の前記作用により、前記核酸基質が改変されることも企図されている。この方法は、工程（ｇ）の後に、前記改変された核酸基質を検出する工程をさらに備えてもよい。また、工程（ｆ）における前記温度上昇は、前記酵素が活性状態である温度を達成することも意図されている。
他の実施形態では、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており、この方法は、ａ）ｉ）試料容器と、ｉｉ）核酸基質と、ｉｉｉ）前記核酸基質に作用可能な酵素と、ｉｖ）圧力を調節する手段と、ｖ）温度を調節する手段とをいずれかの順に供給する工程と、ｂ）水溶液内の前記酵素を前記試料容器に添加する工程と、ｃ）前記温度調節手段を用いて、前記試料容器内の前記水溶液の温度をおよそ５℃未満まで下げ、それによって、前記酵素を実質的に不活性にする工程と、ｄ）前記核酸基質を前記不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と、ｅ）前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を、平方インチあたりおよそ３０，０００ポンドよりも高くする工程と、ｆ）前記温度調節手段を用いて、前記試料容器の前記反応混合物の温度を、平方インチあたりおよそ３０，０００ポンドよりも高く上昇させる工程と、ｆ）前記温度調節手段を用いて、前記試料容器内の前記反応混合物の温度を、およそ１０℃よりも高くする工程と、ｇ）前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を平方インチあたりおよそ２０，０００ポンド未満まで下げ、それによって前記酵素が前記核酸基質に作用するように、前記酵素を活性状態にする工程とを備える。一実施形態においては、工程（ｇ）における前記圧力低下により、平方インチあたりおよそ５，０００から１５，０００ポンドの圧力を達成し、工程（ｆ）の前記温度上昇により、およそ１５℃から２０℃までの温度を達成する。
さらに他の実施形態において、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており、この方法は、ａ）溶液中の酵素を第１の試料容器に、溶液中の核酸基質を第２の試料容器に、いずれかの順で添加する工程と、ｂ）前記第１および第２の試料容器の温度をおよそ０℃からおよそ５℃までに下げる工程と、ｃ）前記核酸基質を反応容器中の前記酵素と化合して、０℃からおよそ５℃までの温度の反応混合物を生成する工程と、ｄ）圧力調節手段を用いて、前記反応容器の圧力を増大する工程と、ｅ）前記反応容器中の前記反応混合物の温度を、およそ１０℃からおよそ８０℃までに上昇させる工程と、ｆ）前記酵素が前記核酸基質に作用して、前記核酸基質が改変されるように、前記圧力調節手段を用いて、前記反応容器の圧力を低下させる工程とを備える。本発明は、工程ｄ）およびｆ）を少なくとも１回繰り返して、さらに改変された基質を生成する工程をさらに企図している。
核酸の改変は、処理の後、改変された核酸基質を検出することにより、測定できる。代わりに、核酸の改変の性質または程度を、酵素が添加または除去された塩基の検出および同定により決定することも可能である。
一実施形態においては、欠失体を生成するために、同期させた酵素作用を採用することが企図されている。圧力を使用することにより、消化速度を細かく調節し、一定の長さを有する欠失体の群の生成を定型化することが可能である。
本発明をうまく使用して、核酸配列決定を行うことも企図されている。さらに、本発明の他の実施形態は、タンパク質配列決定、多糖配列決定およびタンパク質合成にも有効に利用できる。一実施形態では、核酸配列決定方法を自動化する。一実施形態では、本発明は、二重鎖または一本鎖ポリヌクレオチドを配列決定するための方法を企図しており、この方法は、ａ）第１の端部を有するポリヌクレオチドを固定化する工程と、ｂ）前記第１の端部に結合可能な進行的酵素を添加し、この結合を生じさせる工程と、ｃ）前記酵素を阻害可能な静水圧を加える工程と、ｄ）前記酵素が前記ポリヌクレオチドに作用して生成物を産生させる時間間隔で、前記静水圧を非阻害レベルまで下げる工程と、ｅ）高圧フローストリームを与えて、前記生成物を検出器に輸送する工程と、ｆ）前記検出器を用いて前記生成物を検出する工程と、ｇ）工程（ｃ）から（ｆ）までを繰り返し、その結果、前記酵素が前記ポリヌクレオチドの全長を転位させる工程とを備える。一実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは一本鎖であり、工程（ｄ）から（ｇ）までは、複数の前記一本鎖ポリヌクレオチドに対して同期して行われることが企図されている。
この方法を実施する場合、固定化を反応室内で行うことも可能である。一実施形態では、上記固定化は、前記ポリヌクレオチドを前記反応室に共有結合された相補的フラグメントにハイブリッド形成させることを含む。酵素は、ＤＮＡポリメラーゼであってもよく、前記反応室内への（第１のデオキシヌクレオチドトリフォスフェートと共に）ポンピングにより供給してもよい。
本発明は、検出方法に限定されるものではない。例えば、検出器は、質量分析計または蛍光計であってもよい。
本発明は、酵素の活性を調節することに関し、特に、同期した酵素活性を用いて、核酸のような基質を処理することに関する。この新規なアプローチは、低圧のパルスによって阻害された反応システムに高い静水圧を加えることにより、ＤＮＡの合成または分解に必要な酵素の活性を正確に調節する能力に基づく。各々がＤＮＡ（例えば、固定化ＤＮＡ）の鎖に結合された、酵素の多数の転写体の活性を正確に調節する能力により、酵素触媒化反応の同期循環を生じる。各循環の際、生成物を緩衝液の流れで検出器に輸送する時に検出するのに充分な可溶性生成物を形成する。例えば、エキソヌクレアーゼが同期され、その結果、ＤＮＡの多数の転写体に作用する多数の酵素がすべて前方に移動し、同じ塩基を同時に放出する。逆に、ＤＮＡポリメラーゼはすべて前方に移動し、同じ塩基を添加する。電気化学的検出のような利用可能な技術、質量分析計および蛍光計を用いて、反応産物が容易に検出される。
Ｅ．酵素
本発明は、進行的特性を有する酵素と、非進行的（分布）特性を有する酵素とを使用することを企図している。塩またはイオン状態を変化させることにより、幾つかの酵素は、進行的または分布的特性を備えることが可能である（例えば、ある一定のフォスフォリラーゼ）。進行的酵素は、化学反応を繰り返し触媒化するものであり、一方で、特定の基質に結合されたままで、且つそれに沿って移動する。一実施形態では、本発明は、単一塩基を増加して、ＤＮＡテンプレートに沿った進行的酵素の移動を調節することを企図している。これは、反応システムに高い静水圧を加えて、酵素活性を阻止するか、または阻害することにより達成される。その後、静水圧を短期間だけ変化（例えば、低下）させて、酵素をＤＮＡテンプレートに沿って隣の塩基まで移動させる。この移動は、酵素に沿ったＤＮＡの転位としてここで定義されている。
一実施形態においては、本発明の方法に採用される酵素が、優れた進行性を示す。モノマー酵素が好ましいが、本発明の反応条件で解離しないオリゴマー酵素もまた適当である。温度、ｐＨ、塩の濃度および緩衝液成分等の二次反応パラメータの改変により、圧力によって誘導されるサブユニット解離を逆転させることが可能となる。
ＤＮＡ配列決定に有用な酵素は、ＤＮＡポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む。本発明に有用であるエキソヌクレアーゼの例は、ラムダエキソヌクレアーゼである。この酵素は、５’末端のモノヌクレオチドに対する進行的かつ階段的な加水分解および解離を触媒化して、二重鎖ＤＮＡの５’−リン酸末端を形成する。Ｊ．Ｗ．Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２：６７２（１９６７）参照。酵素は商業上入手可能である（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
適当な酵素を選択する際、一般的ではない物理化学的特性を示す酵素が有用となる。例示したものは、（１）２，０１０メーターのサブマリンサーマルベントから単離されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ等の“ベント”生物体の酵素（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および広い範囲の反応条件を許容する能力と配列決定生成物の産生量の向上との両方を備えた遺伝子学的に処理した酵素を含む。しかしこれらに限定されない。後者の例はシーケナーザであり、これは、２つのサブユニットを有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子学的に処理した（商業上入手可能な）バージョンである。他の例は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを含み、これは、検出可能３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないが、広い温度範囲を有する単量体酵素である。バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する単一ポリペプチドチェーンである。
本発明の方法により、使用可能なエキソリボヌクレアーゼがいくつかある。これらの酵素は、基質としてＲＮＡを利用する。Ｎ．Ｇ．Ｎｏｓｓａｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４３：９１３（１９６８）；Ｃ．Ｂ．Ｋｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：９２３（１９６８）参照。
適当な進行的酵素を選択するために、特定の条件の下での酵素の作用を調査することにより以下の疑問点を解決する必要がある：（１）ＤＮＡ基質が存在する状態で、また存在しない状態で酵素が安定したままである圧力範囲は？  （２）酵素が可逆的に阻害される圧力は？  またこの阻害は、酵素のＤＮＡ基質からの解離によるものか？  （３）加圧の際、反応パラメータの調整により、酵素の安定性および性能が改良されるか？  （４）同期性は、圧力パルス動作速度の関数としてどの程度維持されるか？  また許容圧力でのＤＮＡ基質に沿った酵素の推定移動速度は？
ここで実証されるように、テストした酵素のうちの幾つかは、同期ＤＮＡ配列決定に充分な安定性プロファイルを示す。ここで示す条件は、特定の酵素に適する圧力パルスの好適な作働圧力範囲および作働時間を提供する。
Ｆ．高圧の適用
本発明は、圧力装置の性質によって限定されることはない。４１１ＭＰａの圧力を発生可能な“手動”器具システムは、商業上入手可能であり、このシステムは加圧媒体としてシリコン油を使用し、２ｍＬ反応容器を有する（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｒｉｅ、ＰＡ）。このシステムは、図１に概略的に示す。
幾つかの実験を行う際（以下参照）、以下の成分を有する装置として、高圧装置を用いた：圧力発生器１つ（最大圧力６０，０００ｐｓｉ）ｃａｔ＃３７−５．７５−６０；圧力ゲージ１つ  ｃａｔ＃６ＰＧ７５；バルブ２つ  ｃａｔ＃６０−１１ＨＦ４；ティー２つ  ｃａｔ＃６０−２３ＨＦ４；１／４”ｘ６”ニップル４つ  ｃａｔ＃６０−８Ｍ４−２；１／４”ｘ２  ３／４”ニップル２つ  ｃａｔ＃６０−８Ｍ４−１および２ｍｌ反応室１つ。５ＭＰａ増量圧力ゲージも、このシステムに連結される。
加圧する溶液を、端部がクリンプシーリングされた小型の変形可能ポリエチレネカプセルに入れる。酵素／基質溶液を１０μｌから５０μｌ含有するカプセルを反応容器に配置して、その後、それをシステムに連結して加圧する。
本発明の圧力特性は、温度と組み合わせで利用可能であることが、意図されている。これは、特に、非反応時間（例えば、圧力処理の前に試料を混合してロードするための時間、および分析のために試料をアンロードして除去するための時間）の間、酵素を調節するために有用である。幾つかの実験では（以下参照）、別々の酵素および基質溶液を氷上で保持する。反応室は、冷蔵庫に保持した（およそ５℃）。ピペットの先端、カプセル、ピンセット、かみそりの刃、および作業面（共にテーピングしたガラスプレート３枚）をすべて、−２０℃に保持した。冷却前に、カプセルの一端部をクリンプシーリングした。すべての作業は、−２０℃のガラスプレード上で行った。ＤＮＡ基質および酵素溶液を、先端の冷たいカプセルに流し入れた。その後、カプセルの端部をクリンピングして、シーリングした。（これはおよそ５分かかる。）その後、反応室を圧力装置に連結して、酵素が活性状態にない圧力を加えた（例えば、５０，０００ｐｓｉ）。反応室を、望ましい温度に設定した。その後、望ましい時間、望ましい圧力まで上げ（例えば、酵素を活性化するための１５，０００ｐｓｉ）、酵素を停止する圧力（例えば、３０，０００ｐｓｉ）まで戻した。反応室を（圧力をかけて）取り外し、−７０℃の冷凍庫に配置した（４５分間）。カプセルの端部を切り離して、凍結した試料を回復し、その後、さらなる酵素反応を阻害する停止緩衝液を含むマイクロヒュージチューブ内でカプセルを遠心分離した。非反応時間調節は、許容圧力での反応と同期間、５０，０００ｐｓｉから３０，０００ｐｓｉまで圧力を高めて、実験試料と同じ処理を行った。
上記のように、圧力に関連して温度を使用し、酵素活性を調節することも可能である。例えば、実施例４は、酵素消化速度を調節するためにいかにして温度を変化させることができるかについて例示している。この実施例で述べた条件では、消化（すなわち、１秒あたりＤＮＡ配列から除去される塩基数として表す）は、温度が２０℃の時には、温度が１５℃の時の１０倍速く進み、その場合、その両温度での圧力は１０，０００ｐｓｉに設定される。温度降下が比較的小さいため（例えば、５℃）、消化速度をかなり落とすことができるという事実により、酵素活性の調節をさらに向上させて調査を行える。これは、非反応時間において特に重要となる可能性があり、その場合には、圧力をかけていない時に（酵素を害することなく可能な程度まで）消化が起きないようにすることが都合よい。
Ｇ．  自動化配列決定装置
本発明は、配列決定するための自動装置を企図しており、この装置は、静水圧での正確で迅速な自動変化を利用して、多数の酵素−基質錯体を同期する。この装置は、高圧反応室を高速ポンプおよび高速検出器に連結する。この装置は、１秒あたり数個の塩基を配列決定することができ、５，０００から１０，０００個の塩基の読みとり長さを有しており、同一の固定化された基質を再初期化して、配列決定を継続できる可能性がある。
この技術の基づく自動装置は、以下の工程を実施する：（１）フロー室内で配列決定するＤＮＡの一端部を固定化する；（２）触媒作用がわずか１つの塩基に限定される条件で、ＤＮＡ“端部”に酵素を結合させる；（３）高圧で、酵素活性を可逆的に阻害する；（４）酵素が１つの塩基だけ前方に同期的にステッピングするように、ある時間間隔で圧力のみを低下させることにより、酵素を活性化する；（５）阻害圧力で、高圧、高フローストリームで、検出器まで生成物を高速移動させる；（６）工程（３）、（４）および（５）を繰り返し循環させる。
３つの異なる組の工程は、自動装置に用いることが可能である。配列決定に用いられる酵素の特性により、いずれの組の工程を使用するかが決定される。酵素の特性は、以下のグループのうちの一つである。
Ａ．触媒活性を阻害するのに用いる圧力は、基質への酵素の結合を妨げない。
Ｂ．触媒活性を阻害する圧力はまた、基質への初期結合を阻害するが、基質結合酵素を解離しない。他の条件を変えて、触媒活性を調節する。これらの条件は、温度、ｐＨ、イオン強度、マグネシウムイオンの濃度および他の共同因子の濃度を含む。
Ｃ．触媒活性を阻害する圧力はまた、結合を抑制し、触媒活性を他の条件によって効果的に変えることができない。
グループＡの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う：
（１）フロー室内で配列決定するＤＮＡの一端部を固定化する；（２）高圧で、酵素溶液の活性を可逆的に阻害し、この溶液をフロー室に注入する；（３）酵素をＤＮＡに結合させ、その後、結合していない酵素を洗い出す；（４）酵素が１つの触媒作用により同期的に進むように、ある時間間隔で圧力のみを低下させて、酵素を活性化する；（５）、高圧、高フローストリームで検出器まで生成物を高速移動させる；（６）工程（４）および（５）を繰り返し循環させる。
グループＢの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う：
（１）フロー室内で配列決定するＤＮＡの一端部を固定化する；（２）その活性が圧力以外の条件、例えば遊離マグネシムイオンが存在しない状態で阻害される酵素溶液をフロー室に流し入れる；（３）酵素をＤＮＡに結合させ、その後、圧力を阻害レベルまで上げる；（４）阻害剤の条件を、圧力を低下させることにより酵素作用を許容するという条件に変える、例えば遊離マグネシウムイオンを添加する；（５）酵素が１つの触媒作用により同期的に進むように、ある時間間隔で圧力のみを低下させることにより、酵素を活性化する；（６）活性状態を維持する高圧、高フローストリームで、検出器まで生成物を高速移動させる；（７）工程（５）および（６）を繰り返し循環させる。
グループＣの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う：
（１）フロー室内で配列決定するＤＮＡの一端部を固定化する；（２）高圧で、酵素溶液の活性を可逆的に阻害し、この溶液をフロー室内に注入する；（３）酵素が１つの触媒事象を通過して同期的に結合して進むように、ある時間間隔で圧力を単に低下させることにより、酵素を活性化する；（４）高圧、高フローストリームで、検出器まで生成物を高速移動させる；（５）工程（３）および（４）を繰り返し循環させる。フローストリームは、生成物とともに、洗い出された酵素と置換するための酵素を含有させるか、または半透性物質のようなフローセルに酵素を保持する手段を使用する。
本発明で企図している装置は、ポンプおよび検出器に連結した反応室を備える。反応室は、固定化ＤＮＡを含み、試薬およびＤＮＡ結合酵素を取り入れるためのバルブが備わっている。ポンプは、システム内の緩衝液の流れを供給する。圧力パルスは、圧力パルスを発生する手段によって調節され、反応室における酵素触媒反応を同期化するためのものである。検出器は、反応室からの緩衝液により輸送される生成物を同定する。
本発明で企図するように、圧力瞬時昇降（ジャンプ）実験で使用されるパルシングシステムを適当に改変するべきである。このようなパルシングシステムは、６ミリ秒で圧力を変えることができる液圧駆動装置である。（Ｂｒｏｗｅｒ，Ｋ．Ｒ．，（１９６８）”Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  ｆａｓｔ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，９０：５４０１−５４０３）。圧電トランスジューサを使用して１００ミクロン秒で圧力を変えることができるパルシングシステムも、好適である（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｍａｘｆｉｅｌｄ，（１９７５）”Ａ  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｈａｎｇｅｓ，”Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１４：８８３−８８７）。
水の断熱圧縮に関連する温度急騰は、１ｘ１０-3  ｄｅｇ／ａｔｍである（Ｂｒｏｗｅｒ、Ｋ．Ｒ．，（１９６８）“Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｏｆ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０：５４０１−５４０３）。
ＤＮＡの固定化のための幾つかの化学的方法が、述べられている（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，（１９９０）  “Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｏｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｃｈｅｍ  １：１６５−１８７）。一本鎖ＤＮＡは、反応室に共有結合した相補的フラグメントに対するハイブリダイゼーションによって固定化できる。
種々の検出器を、このシステムと共に使用するのが好適である。配列決定のために使用する酵素の型式は、検出器の選択に影響を与える。
Ａ．ＤＮＡポリメラーゼをこの装置に用いる場合、蛍光計の質量分析計を、以下のフォーマットで検出器として使用可能である：
１．  ベータまたはガンマリン酸塩位置での改変を有するヌクレオシドトリリン酸塩の使用。各ヌクレオシドトリリン酸塩は、テンプレートに沿ったポリメラーゼ工程として生成される種々のピロリン酸生成物間を質量分析計により区別することを可能にする独特の改変を有する。例えば、ピロリン酸塩は、０、１または２チオ置換体を含有することが可能である。これにより、３つのヌクレオシドトリリン酸塩が独自に標識化される。第４のものは、18Ｏまたは34Ｓ等の安定同位体で標識付け可能である。フライト質量分析計の時間は、迅速に配列決定するのに必要な速度および感度を有する。
２．  質量分析計検出器を使用することにより、同時に反応室に存在する４つのｄＮＴＰのうちの２つのみを有することも可能となる。再度、チオ基をｄＮＴＰのうちの１つに取り込むことにより、ピロリン酸塩生成物の起源を同定することができる。このフォーマットは、２つの異なるｄＮＴＰ溶液を反応室内で洗浄するか、または反応室から洗い出す必要があるため、より時間を要する。このフォーマットを選択するには２つの理由がある；ａ）ポリメラーゼ活性をさらに調節する；およびｂ）各塩基が付加された生成物の生成量を向上させる方法を提供する（すなわち、工程効率を改善する）。以下の方策により、工程効率を上げることができる。現在のｄＮＴＰ溶液から塩基を添加した回数に等しい回数だけ、反応室をパルシングすることが可能である。これにより、ポリメラーゼが塩基添加の２つのチャンスが与えられるため、各付加体の生成量が改善されることになる。この効率改善により、１０，０００以上の塩基対を含有する核酸の配列決定が可能になる。
３．  さらに別のフォーマットは、検出器として蛍光計を使用する。４つの蛍光的に標識付けされたｄＮＴＰすべての溶液を、反応室内にポンピングする。この溶液内のｄＮＴＰの濃度は、ポリメラーゼのＫm未満である。これにより、１つの塩基を添加した後、ｄＮＴＰの濃度をさらに相対的に変化させ、どの塩基を添加したかを決定することがより容易になる。検出器は、発光スピクトルまたは蛍光寿命により、異なる標識を区別することができる。検出器が添加した塩基を同定すると、適当に標識付けされていないｄＮＴＰの高濃度溶液を反応室内にポンピングしてパルシングする。これは、その工程で付加される塩基数を高めることを保証するのに必要である。次に、標識付けされたｄＮＴＰ溶液を再度、反応室内にポンピングし、次の塩基を決定する。
Ｂ．  配列決定にエキソヌクレアーゼを使用する場合、基質は固定化ＤＮＡであり、生成物は、酵素によって放出したヌクレオシドモノリン酸塩である。反応室をパルシングする度に、次のヌクレオシドモノリン酸塩を放出する。その結果得られる生成物は、その後、検出器にポンピングされる。
例えば：
１．  再度、検出器として、どの塩基が放出したかを同定する質量分析計を使用することができる。このフォーマットは、鋳型作成を簡素化する標識付けされたＤＮＡを用いることを必要としない。
２．  他のアプローチとして、温度を下げて、ＨＣｌ等のエンハンサを添加することにより、ｄＮＭＰの固有蛍光性を向上する（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，（１９９３）”Ｓｕｐｅｒｆａｓｔ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ，  ”Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  ＪＰ０５，１２６，７３９［９３，１２６，７３９］Ｍａｙ  ２１）。この方法は、蛍光シグナルを発生させるために蛍光標識された基質を使用する必要はない。
３．  さらに他のアプローチとして、電気化学的検出を採用し、それによって、４つの異なるｄＮＭＰを区別できる。
配列決定装置の一実施形態として、以下のような操作を行う。反応室内に添加した既知の第１のｄＮＴＰと同時に酵素をポンピングすることにより、ポリメラーゼを固定化ＤＮＡに結合させる。添加する第１の塩基は、以下の理由から既知のものである。すなわちプライマ配列のいずれも既知であり、またはベクターを線状にする際に用いられる制限エンドヌクレアーゼの配列が知られているためである。圧力を抑止レベルまで上げ、結合していない酵素やｄＮＴＰを除去する。酵素のポリメラーゼ活性を用いる場合、ｄＮＴＰを含有する試験溶液を反応室内にポンピングし、圧力パルスを減少させる。代わりに、酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いる場合、ｄＮＴＰを洗い出した後、圧力パルシングを開始する。一本鎖ＤＮＡに対するエキソヌクレアーゼの結合が、選択した配列決定方法である場合、高い圧力をかけて、酵素を反応室内にポンピングして、パルシングを行い、酵素のうちの幾つかを結合させる。再度、結合していない酵素を配列決定開始前にポンピングする。本発明の一実施形態では、低温および非最適ｐＨを使用することを企図しており、それによって、結合パルス間で、２つ以上の塩基によって酵素がステッピングしないことが保証される。
配列決定装置の他の実施形態が、企図されている。一実施形態では、反応室および検出器に至る流路の体積を減少させることにより、パルス間の時間間隔をかなり短縮することになる。他の実施形態では、単一分子配列決定のために提案された技術を用いて、フローストリーム内で固定化ＤＮＡを懸濁する（Ｊｅｔｔ，Ｊ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｍａｒｒｏｎｅ，Ｂ．Ｌ．，Ｍｏｙｚｉｓ，Ｒ．Ｋ．Ｒａｔｌｉｆｆ，Ｒ．Ｌ．Ｓｅｉｔｚｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｈｅｒａ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｃ．，（１９８９）“Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ａｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｂａｓｅｄ  Ｕｐｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ，７：３０１−３０９）。さらに他の実施形態では、多数の検出器を使用し、反応室からのフローストリームを１つの検出器から次の検出器に迅速に移動させて、検出速度を増す。これらの改良を組み合わせる場合、単一圧力パルスを用いてまず基質上にエキソヌクレアーゼを結合させることが企図される。結合していない酵素を洗い出す。その後、圧力を降下することによって、酵素が通常の速度でＤＮＡを加水分解する。酵素がすべて同時点で始動し、すべて同一の基質を利用しているので、比較的長い時間、同期したままとなる。Ｅ．ｃｏｌｉのエキソヌクレアーゼＩによる加水分解の速度は、２７５塩基／秒であると報告されている（Ｂｒｏｄｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｇ．ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｄ．，（１９８６）“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：７１３６−７１４３）。２００塩基／秒の速度で、ＤＮＡの１０，０００塩基長を１分以内で配列決定できる。
Ｈ．  酵素の評価
一般に、特定の基質に結合したままで、それに沿って移動しながら化学反応を繰り返し触媒化する進行的酵素が、好ましい。酵素活性を調節する方法において用いるポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼの候補は、スクリーニングにより決定する。スクリーニングの手順は、以下で述べており、表１に要約している。
スクリーニング工程に必要な一時的工程は、以下の通りである：
Ｉ．    基質溶液に酵素を添加し、酵素が不活性状態になるまで圧力を加え（すなわち、阻害剤圧力）、その後減圧して、酵素が活性（すなわち、許容圧力）が維持されているかどうかを決定する。
ＩＩ．  活性が維持された酵素に対しては、酵素が可逆的に阻害可能であり、かつ許容できる活性を示す圧力範囲を（工程Ｉの手順を繰り返すことにより）決定する。
ＩＩＩ．酵素が可逆的に活性を保持し得る温度範囲を決定する。
ＩＶ．  酵素によって基質の同期処理を維持するための温度および圧力の最適条件を決定する。
0004308320.tif 000002
以下で例示するように、上記手順の思慮深い考察により、いかなる酵素（“Ｘ”）も本発明への適用のために評価することが可能である。
酵素（“Ｘ”）は、企図された圧力調節方法（すなわち、同期化させた酵素活性を用いて、核酸等の基質を処理する）において使用するために評価可能である。酵素Ｘは、最初に、適当な条件（例えば、低温）で、基質溶液にＸを添加することにより、工程Ｉに従って評価する。その後、Ｘが不活性状態になるまで圧力を加え、さらに減圧してＸが通常活性状態である圧力に復帰させる。これによって、Ｘが活性を維持できたかどうかを決定する。幾つかの酵素は、高圧処理の後、活性を回復するまでに、低圧での回復期間を必要とする可能性がある。Ｘが活性を回復しない場合は、Ｘはその二次および三次構造で不可逆変化により既に変性している。しかし、可逆阻害が可能な酵素に過剰な高さの圧力を与えた場合、不可逆阻害を生じる可能性があることを認識しておくことが重要である。従って、酵素が活性を回復しない時、より低い圧力では、酵素がうまく可逆阻害しないことを確信するべきである。
酵素Ｘの可逆阻害を実証できた場合には、次に、Ｘが可逆阻害可能であり且つ許容可能な活性レベルを示す圧力範囲を評価する（工程ＩＩ）。工程ＩＩは、望ましい範囲が確認されるまで、工程Ｉを進行的に繰り返すことにより、容易に実施できる。すなわち、不可逆阻害が達成されるまで工程Ｉの不活性圧力を進行的に高めることにより（幾つかの酵素は同一装置の圧力限界で安定する可能性がある）、またＸがこれ以上阻害されないようになるまで工程Ｉの不活性圧力を進行的に低下させることにより、不活性圧力範囲（例えば、２０，０００ｐｓｉから５０，０００ｐｓｉ）を容易に決定できる。Ｘが受容可能な活性レベルを示す圧力範囲は、一連の同じ工程を行って確認できる。不活性圧力範囲は、各圧力パルス間で、酵素を可逆的に阻害することができる圧力を示す。一方活性圧力範囲は、酵素により基質を調節的に処理することができる圧力を示す。
次に、工程ＩＩＩでは、工程ＩＩで予め決定された圧力下において、酵素Ｘが可逆的に活性状態を維持できる温度範囲を決定する。工程ＩＩＩは、工程ＩＩで述べたものと類似の態様で行うことが可能である。すなわち、温度範囲（例えば、５℃から６０℃）は、Ｘが不可逆的に不活性化されるまで徐々に温度を上げ、その後、同様に温度を下げることにより、決定する。
最終工程、工程ＩＶでは、Ｘにより基質の同期的処理を維持するための温度および圧力の最適条件を決定する。工程ＩＶでは、幾つかの異なる温度を決定することに注目すべきである。例えば、低温（例えば、５℃から１０℃）では、圧力の結合パルス間で、２つ以上のヌクレオチド塩基だけＸがステッピングしないことが確実となる。同様に、種々の温度対圧力比が、Ｘの活性速度の細かい調節を援助することができる。
以下の実施例は、本発明の、ある実施の形態および局面を例示しており、その範囲を限定するものではないと解釈するべきである。
実施例
下記の実験開示では、以下の省略形を適用する：℃（摂氏）；ＭＰａ（メガパスカル）；ｐｓｉ（平方インチあたりのポンド）；μｇ（マイクログラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；およびｍＭ（ミリモル）。圧力の単位は、以下のように変換できる：１気圧＝１０１．３ｋＰａ＝１４．５ｐｓｉ。
実施例１
ラムダエキソヌクレアーゼ
この実施例では、静水圧を用いたラムダエキソヌクレアーゼの活性調節を示す。これらの実験では、以下の検定緩衝液を用いた：６７ｍＭ  グリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．４）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５０μｇ／ｍｌ  アセチル化ＢＳＡ。これらの実験に用いる基質は、ラムダＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化物であった。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによるラムダＤＮＡの消化により、大きさが１２５から２３，１３０までの塩基対の範囲である８個のフラグメントが生成される。検定成分は、以下の割合で混合した：１．０μｌの１０ｘ検定緩衝液  ＋  ２．０μｌのＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化ラムダＤＮＡ（０．２４μｇ／μｌ）＋  ０．５μｌのアセチル化ＢＳＡ（１．０μｇ／μｌ）＋１．０μｌのエキソヌクレアーゼ（望ましい濃度）＋５．５μｌのＨ2Ｏ。ラムダエキソヌクレアーゼの保存液（２．０単位／μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、望ましい濃度まで検定緩衝液内で希釈した。一般的な高圧実験では、上記成分を、特定の割合で混合して、最終体積４０μｌを得た。冷却した試薬（０℃から５℃）を外界圧力下で混合し、最後に酵素を添加して、反応を開始した。次に、この溶液から１０μｌを、１．５ｍｌマイクロヒュージチューブに分注した。これを、非反応時間参照サンプルとして用いた。混合液の残りのものを、使い捨て全量ピペットの端部から引き出して作成した小型のポリエチレンカプセルに注入した。カプセルは、縮小端部を折り曲げてシーリングし、その折り曲げた縮小端部は、その上に小さなアルミニウムバンドをクリンピングして所定位置に保持される。その後、手動圧力装置の反応室に、カプセルを置く。この手動圧力装置は、圧力が望ましいレベルまで急速に上昇させることができる。カプセルに混合液を注入して圧力をかけるのに要する時間と、圧力を解除してカプセルから試料を回復するのに要する時間との合計を、非反応時間と呼ぶ。非反応時間は、８分から１０分であった。非反応時間調節用試料を用いて、圧力をかけない時に起きる反応の程度を決定する。ゲルローディング緩衝液４μｌ（２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％キシレンシアノール、０．２５％ブロモフェノルブルーおよび３０％グリセリン）を添加することにより、すべての反応を停止させる。望ましい時間だけ選択した圧力で、試料を反応させる。その後、圧力を解除し、回復した混合物のアリコート１０μｌにゲルローディング緩衝液４μｌに添加して反応を停止させる。回復後の試料の残りは、１５分間、外界圧力で反応させて、加圧後の酵素活性の回復の程度を決定することが可能である。
酵素反応後、ＤＮＡフラグメントをＴＢＥ緩衝液を用いて０．５％アガロースゲル上で分画した。ＤＮＡバンドは、エチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネータで撮影した。酵素活性により基質が、ほとんど染色されない極小さい一本鎖生成物に分解されると、基質バンド自身の強度減少することになる。
結果（図１３）は、ラムダエキソヌクレアーゼ活性が２０℃から２１℃の温度で、１０，０００ｐｓｉの圧力の下ではほとんど影響されないことを実証した。酵素活性の阻害は、１５，０００ｐｓｉで明白である。酵素活性の阻害は、１７，５００ｐｓｉおよび２０，０００ｐｓｉでさらに増大し、３０，０００ｐｓｉで完全に阻害されることが示唆された。反応混合物を１時間、阻害圧力で保持した後、１５分間、外界圧力に急速に戻すと、酵素活性は、完全に回復することが示された。この酵素は、高圧に対して非常に安定している。しかし、６０，０００ｐｓｉで基質存在下で１５分間の反応を行った結果は、回復活性を示さなかった。これらの結果は、ラムダエキソヌクレアーゼが、高い静水圧で可逆的に反応可能であること実証している。１つのサイクリング実験を行った。この実験では、１７．７秒３０，０００ｐｓｉ未満の、平均時間４３サイクルで２５０ｐｓｉ、３０，０００ｐｓｉ間で圧力を循環させた。その結果生じた基質バンディングパターンは、アガロースゲル電気泳動の後、進行的酵素のパターンになった。従って、酵素は、３０，０００ｐｓｉの圧力では基質から解離しなかった。
実施例２
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ
この実施例では、ＤＮＡサイズマーカを基質として使用し、サイズマーカをアガロースゲル電気泳動によって分離し、マーカをエチジウムブロマイド検出で視覚化することにより、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの二重鎖３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐ．６．３−６．１９）。エキソヌクレアーゼ活性により、バンドが、ゲル上のより小さいサイズに変わる。
製造業者によって供給される酵素緩衝液内で、室温で圧力をかけ、さらに本質的には実施例１の述べたように、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定した。０．５％アガロースゲル上のバンド変化によって明らかであるように、あよそ１００個の塩基対を２０分間、大気圧で消化した。基質が存在しない場合、３０，０００ｐｓｉ以上の圧力での１時間の反応により、酵素が完全に、しかも不可逆的に不活性化された。基質が存在する場合、１時間の反応の間、酵素を完全に、しかも不可逆的に不活性化するために、４０，０００ｐｓｉの圧力を必要とした。０．５％アガロースゲル上のバンド変化によって示すように、基質が存在する場合の３０，０００ｐｓｉでの１時間の反応によりラムダＤＮＡからのおよそ１００個の塩基対の欠失体を生じる。これらのデータは、カプセルに適当な圧力を加えることにより、酵素の活性を不可逆的に終結することができ、それによって、ＤＮＡの消化の程度を正確に調節する手段を提供することになる。
実施例３
ラムダエキソヌクレアーゼによる調節された消化
この実施例では、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化の程度を調節するために、静水圧を用いる。これらの実験のためのＤＡＮ基質は、プラスミドｐＢＲ３２２であり、この基質を線形にするためにＥｃｏ  ＲＶで消化した。これらの実験では、１０μｌの検定容積を用いた。これらの実験では、５μｌの基質混合物と５μｌの酵素混合物を生成して、氷上で冷却した。基質混合物は、４μｌの１．３３ｘ検定緩衝液＋１μｌの線状ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（およそ０．２５μｇ）を含有した。酵素混合物は、４μｌの１．３３ｘ検定緩衝液＋１μｌのラムダエキソヌクレアーゼ（３．３単位）を含有した。１．３３ｘ検定緩衝液は、１０μｌの１０ｘラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液＋４μｌのアセチル化ＢＳＡ（１．０μｇ／μｌ）＋６１μｌの蒸留水を含有した［１０ｘラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液は６７０ｍＭ  グリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．４）および２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有した］。実験を開始するために、酵素混合物を氷上の基質混合物に添加した。その後、この溶液を、上記のようにカプセルにローディングした（ｐ１８参照）。その後、カプセルを５℃の反応室に置き、圧力を５０，０００ｐｓｉまで急上昇させた。反応室に至るバルブを閉じ、さらに圧力をかけて、バルブと共に反応室を装置から取り外し、３０分間、２０℃の水浴に入れた。その後、バルブおよび反応室を装置に再連結して、圧力を１０，０００ｐｓｉまで急降下させ、望ましい期間だけ、そこで保持した。その後、圧力を３０，０００ｐｓｉまで上昇させた。それから、バルブおよび反応室を装置から取り外し、−７０℃の冷凍庫に入れた。その後、凍結した試料を上記のように回復させた（ｐ１８参照）。
上記のように、基質ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。これらの実験において用いられる酵素の濃度が高くなると、酵素消化が進むにつれて、基質バンドがより小さいサイズに変化する。
結果として、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化の程度を、許容圧力で浪費する時間を制限することにより調節できることが実証された。非反応時間対照サンプルレーンと実験レーンとの比較により、１０，０００ｐｓｉで浪費する時間が長くなると、消化の程度も増大することが実証された。
実施例４
ラムダエキソヌクレアーゼにより消化速度における圧力の効果
この実施例では、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化速度（すなわち、１秒あたりに除去される塩基の数）が、種々の圧力および２つの温度で決定された。この実施例では、基質は、ラムダＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化物を用いた。これらの実験では、最初の加圧の際、反応室の圧力を設定し、実験の間中、一定であり、反応室は、実験の期間中、水浴に入れたままであった。上記の例外としては、実施例３で述べたように実験を行った。
ヌクレオチドモノリン酸塩が基質バンドの端部から取り外される速度は、アガロースゲル電気泳動の後に見られる変化したバンドの塩基対のサイズを評価して決定された。酵素で処理されていないＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントのログ［塩基対］対移動距離を描くことにより、標準曲線を形成した。
２０℃の温度で、１０，０００ｐｓｉ以下の圧力は、ラムダエキソヌクレアーゼの速度にほとんど影響を与えない。２０，０００ｐｓｉ以上の圧力は、反応速度をかなり減速させる。１５℃の温度では、１０，０００ｐｓｉ以上の圧力により、反応速度がかなり減少する。データ（図１４）は、初期の実験から現れるが、３０，０００ｐｓｉで酵素が完全に阻害されたことを示しているが、事実は異なる。ここで示された阻害は、採用した検定法があまり感応的でないためであった。
実施例５
許容圧力での同等時間の１回の圧力サイクルと５分割の圧力サイクルとの比較
この実施例では、圧力を２分サイクルにより５回与えた場合に生じるバンド変化を１０分サイクルを１回で与えた場合と比較する。両方の場合、５０，０００ｐｓｉを阻害圧力として用い、５，０００ｐｓｉを許容（作用）圧力として用いた。実施例３で述べたように実験を行った。但し、以下の点で実施例と異なる。基質混合物として０．３４μｇのＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化ＤＮＡを含有させた。酵素化合物として０．８単位のラムダエキソヌクレアーゼを含有させた。圧力サイクルは上記の通りであり、５０，０００ｐｓｉで凍結停止を行った。
図６に示す結果は、両方のサイクリングプロトコルが同一パターンのバンドを生成することを実証しており、それによって、５分割サイクル実験におけるさらに４回の開始および停止によって、消化の程度に検出可能な効果が得られなかったことを示している。この結果はまた、元の長さの基質バンドもゲル上に見られるという事実に基づいて、酵素が５０，０００ｐｓｉで解離していないことも示唆している。
上記から、本発明が基質上の酵素活性を調節する改良した方法を提供することが明らかとなるはずである。核酸の場合、本発明は、核酸の処理や一連の欠失体の生成の実施を考慮し、消化の程度を調節することが可能である。消化の程度を調節する能力は、欠失変異体を最終的に使用するかどうかに依存して、広くまたは接近してクラスター化された長さを有する欠失群の生成を定型化することができる。
実施例６
シーケナーゼ２．０
進行的酵素Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）の合成形態であるシーケナーゼ２．０の活性を、基質としてラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて検定した。
ラムダフラグメントは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により、３’−５’方向で部分的に消化した。以下のものは、０．６５ｍｌの微小遠心チューブ中で混合した：５Ｘ（５倍濃度）シーケナーゼ緩衝液（１２μｌ）、ラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩ（０．３４μｇ／μｌ）および３６μｌの水。５Ｘ  シーケナーゼ緩衝液は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2および２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。チューブを、３分間６５℃の水浴に入れ、その後、氷浴に入れた。６μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３単位／μｌ）をチューブに加えた後、チューブを１時間、３７℃の水浴で反応させた。氷上で２分間から５分間、チューブを冷却させた後、チューブの内容物をカプセルに移し、カプセルをバージョン１の冷却反応室にローディングした。カプセルは特注のものであり、ポリエチレン分注ピペットの一端部を熱シーリングし、短く切断したものである。反応室の圧力を５０，０００ｐｓｉまで上昇させ、１時間維持してＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害した。反応室の圧力を２分間から４分間、大気圧に戻した後、カプセルから基質混合物を除去した。
３２μｌの溶液あたり２μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴを添加することにより、上記基質溶液をＤＴＴ  ５．９ｍＭにした。この希釈液を８．５マイクロリットルだけ、カプセルに入れて、１μｌの希釈したシーケナーゼ（３単位／μｌ）を添加した。その後、カプセルをバージョン２の開放した冷却（−５℃）反応室に置き、２分間反応させて、カプセルを冷却した。開放した反応室内で、１μｌの冷却（およそ０℃）ｄＮＴＰ溶液をカプセルにピペットで移した後、カプセル内の溶液を、およそ２０μｌの冷却シリコン油（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ｂａｔｈ  ｏｉｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で覆った。ｄＮＴＰ溶液は、４ｍＭ  ｄＡＴＰ、４ｍＭ  ｄＣＴＰ、４ｍＭ  ｄＧＴＰ、４ｍＭ  ｄＴＴＰ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。その後、反応室をシーリングして、望ましい圧力まで加圧した。
２０±１℃にサーモスタットで調温した溶液を反応室の周りで循環させ、反応室およびカプセルの温度を酵素作用温度まで上げた。選択した試験圧力での標準１０分反応を行い、カプセル温度を作用温度に到達させた。続いて、３つの異なる圧力プロファイル（１）から（３）までを行い、圧力に対する酵素活性の応答を決定した。これらの実験では、温度を用いたため、遷移時間が必要以上に長くなった。
（１）  あらゆる圧力で（２０，０００、３０，０００および４０，０００ｐｓｉ）、非反応時間実験を行った。この実験は、試料のローディングおよび回復の際、酵素活性が存在するかどうかを決定した。プロファイル：４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液２０℃、１０分間（上記参照）；４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液−１２±２℃、１２分間；圧力を大気圧まで降下させ、凍結試料を回復させる。
（２）  圧力で酵素活性を決定するために、以下のプロファイルを使用した：４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液２０℃、１０分間（大気から４０，０００ｐｓｉまでの遷移時間は５秒から１５秒までである）；４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液２０℃、さらに２０分間、４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温された溶液−１２±２℃、１２分間；圧力を大気圧まで降下させ（遷移時間は５秒から１５秒までであった）、凍結試料を回復させる。
（３）  圧力処理の後、酵素活性を決定するために、以下のプロファイルを使用した：４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液２０℃、１０分間；４０，０００ｐｓｉ、サーモスタットで調温した溶液２０℃、さらに２０分間；２５ｍｓｅｃの遷移時間で圧力を３００±１５０ｐｓｉまで降下、サーモスタットで調温した溶液２０℃、１０分間；圧力を大気圧まで降下する。サーモスタットで調温した溶液２０℃、試料を回復する。
カプセルのシーリング端部を切断して、４μｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．３５％硫酸ドデシルナトリウム、１７．５％グリセリンでカプセルの内容物を遠心分離して、各試料をカプセルから回復した。０．５％アガロースゲル上の電気泳動により、試料内のＤＮＡフラグメントのサイズを決定した。以下の実施例８のように、この検定では、シーケナーゼ活性により、拡散小型基質バンドが一定のサイズのより大きいサイズのバンドに変化した。電気泳動の後、エチジウムブロマイドで染色して、ゲルを撮影した。写真を目視検査して、シーケナーゼ活性を評価した（表２参照、結果は±１０％）。所定の圧力を加え酵素反応を行い得られたバンドパターンが非反応時間実験によるバンドパターンと同一である場合には、その圧力では検出可能な酵素活性を示さないものと判定された。後圧力試料（３）における一定サイズのバンドの存在は、圧力処理後の酵素活性の回復を示すものと解釈された。
0004308320.tif 000003
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩ
２つのＨｉｎｄ  ＩＩＩ開裂部位を有するビオチニル化ＰＣＲ生成物を基質として用いて、分布酵素である制限エンドヌクレーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．４）を３７℃で検定した。
ＰＣＲ生成物は、ビオチニル化Ｌａｃ  ＺフォワードプライマおよびＬａｃ  Ｚリバースプライマ（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）を用いて生成した。ｄＣＴＰは、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのものを使用した。対照テンプレートおよびＰＣＲ反応のための他のすべての成分は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤのＰＣＲ非放射性標識付けシステムからのものであった。このシステムのＰＣＲ生成物は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ開裂部位に対して含有する８９８塩基対フラグメントである。一つは、ビオチニル化端部からのおよそ１２６個の塩基対であり、もう一つは、ビオチニル化端部からのおよそ３４８個の塩基対である。ＤＮＡ混合物は、０．５μｌのＰＣＲ生成物（およそ２５ｎｇ）、０．５μｌの１０Ｘ緩衝液および４μｌの水を含有した。酵素混合物は、１μｌのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（１００単位／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、０．５μｌの１０Ｘ緩衝液、および３．５μｌの水を含有した。１０Ｘ緩衝液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含有した。
上記ＤＮＡおよび酵素混合物は、別々のチューブで氷上で冷却される。５マイクロリットルの酵素を５μｌのＤＮＡ溶液に添加し、氷上で混合し、冷却したカプセルに迅速に移し、冷却（およそ−１５℃）シリコン油で覆った。冷却した（−５℃）反応室（バージョン２）にカプセルをローディングした後、反応室を３０，０００ｐｓｉまで加圧した。サーモスタットで調温した３７℃の溶液が１０分間、反応室を循環する状態で、圧力を３０，０００ｐｓｉに維持した。４秒間の単一圧力パルスを加えた。パルスは、圧力を３００ｐｓｉ±２００ｐｓｉに変化させ、反応室をサーモスタットで３７℃に調温した。遷移時間は、およそ２５ミリ秒であった。圧力を３０，０００ｐｓｉに維持しながら、サーモスタットで−１２℃に調温した溶液を１２分間、反応室を循環させて、次の工程で酵素阻害を確実にした。次の工程では、圧力を大気圧まで下げ、冷却カプセルを取り外した。
単一サイクル時間が８秒、１２秒、１６秒および２０秒であることを除いて、上記のように、さらに他の試料を検定した。負の圧力をかけない非反応時間も、検定した。実施例６のように、試料を回復した。２％アガロースゲル上の電気泳動により試料を分析し、エチジウムブロマイドで染色した。非反応時間試料は、生成物由来のバンドは現れなかった、すなわち、３０，０００ｐｓｉでは検出可能活性が存在しなかった。４秒パルス試料が、わずかな生成物バンドを有しており、パルス時間が４秒から２０秒まで長くなると、生成物バンドの強度が増大した。２０秒パルス試料は、わずかな基質バンドを有し、これによって、２０秒の酵素活性の後、消化が完全でないこと示した。
酵素活性は、３０，０００ｐｓｉ（±６％）で阻害された。３００ｐｓｉ±２００ｐｓｉの外界圧力まで減圧することで、酵素活性を回復した。
実施例８
多数の短い圧力パルスを有するラムダエキソヌクレアーゼ
この実験では、ラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントのラムダエキソヌクレアーゼ消化を、多数の短い圧力パルスを用いて研究した。１回の検定につきＤＮＡ混合物は、２μｌのラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメント（０．３４μｇ／μｌ、ＩＢＩ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）および８μｌの１．３３Ｘ検定緩衝液を含有させた。酵素混合物は、１回の検定につき、１μｌのラムダエキソヌクレアーゼ（５単位／μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１μｌの水、および８μｌの１．３３Ｘ検定緩衝液を含有させた。［１．３３Ｘ検定緩衝液は、８９ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．４、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ＢＳＡ  ３４μｇ／ｍｌを含む］上記ＤＮＡおよび酵素混合物は、別々のチューブで氷上で冷却した。その後、１０μｌの酵素を１０μｌのＤＮＡ溶液に添加して、氷上で混合した。その直後に、この混合物を冷却ブロック（およそ−２０℃から−１０℃）内の冷却カプセル（およそ−１５℃から−５℃）に移して、冷却した（およそ−２０℃から−１５℃）のシリコン油で覆った。その後、カプセルをバージョン２の冷却（−５℃）反応室にローディングし、加圧した。それから、圧力は３０，０００±２，０００ｐｓｉに保持され、サーモスタットで２０℃に調温した溶液を１２分間、反応室を循環させた。その後、反応室の圧力を２．０２±０．０２秒のサイクル時間で、２１０±２０ｍ秒間、３００±１００ｐｓｉまでパルシングした。パルス時間は、３０，０００ｐｓｉ未満の合計時間のオシロスコープ測定による推定値であり、δｔa,y  ＋ｔa,y  ＋  ｔｉ,zに等しい。オシロスコープは、１７０±２０ｍ秒である１５，０００ｐｓｉ未満の合計時間を測定したのみであった。１つのパルスからパルス時間を含む次のパルスまでの時間は、２．０２秒であった。反応室および試料は、合計５９４±２回パルシングが加えられた。３０，０００ｐｓｉの圧力では、サーモスタットで−１２℃に調温した溶液を１２分間、反応室を循環させて、カプセル内の試料を凍結させた。その後、およそ３０ｍ秒で、圧力を大気圧まで降下させた。８μｌの停止緩衝液を用いたことを除いて、実施例６と同様に試料を回復させた。また、非反応時間に１７分を加えた時間、３０，０００ｐｓｉで、パルシングを行わないで試料を検定した。１．３μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドと、０．５Ｘ  ＴＢＥ＝（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）とを含有する０．５％アガロースゲル上で、上記試料を検定した。ゲルは、２３ボルトで１６時間、検定し、その後、撮影した。非反応時間に１７分を加えた時間による対照試料を用いて、パルシング実験中に３０，０００ｐｓｉで生じた酵素活性を評価した。３０，０００ｐｓｉおよび２０℃では、酵素はおよそ０．１塩基／秒の速度である。パルシングした試料でのバンド変化は、非反応時間に１７分を加えた時間による対照のバンドよりも大きかった。パルシングした試料において除去した塩基の合計から、非反応時間で１７分を加えた時間による対照実験で除去した塩基の数を引くことにより、パルス間で除去した塩基の数が得られる。パルシングの際に除去した塩基の平均数は、３５０±６０であり、これによって、���素は１パルスにつき、平均０．６個の塩基を加水分解したことになる。
実施例９
パルス長の異なる多数の短い圧力パルスを有するラムダエキソヌクレアーゼ
この実験では、ラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントに対するラムダエキソヌクレアーゼの作用を、様々な圧力パルス長で研究した。１回の検定あたりのＤＮＡ混合物は、２μｌのラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩフラグメント（０．３４μｇ／μｌ、ＩＢＩ）と、８μｌの１．３３Ｘ検定緩衝液とを含有する。酵素混合物は、１回の検定につき、１μｌのラムダエキソヌクレアーゼ（５単位／μｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１μｌの水、および８μｌの１．３３Ｘ検定緩衝液を含有する。［１．３３Ｘ検定緩衝液は、８９ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．４、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ2およびＢＳＡ  ３４μｇ／ｍｌを含有した］上記ＤＮＡおよび酵素混合物は、別々のチューブで氷上で冷却した。その後、１０μｌの酵素を１０μｌのＤＮＡ溶液に添加して、氷上で混合した。その直後に、この混合物を冷却ブロック（およそ−２０℃から−１０℃）内の冷却カプセル（およそ−１５℃から−５℃）に移して、冷却したシリコン油（およそ−２０℃から−１５℃）で覆った。その後、カプセルをバージョン２．０の冷却（−５℃）反応室にローディングし、加圧した。それから、圧力は４０，０００±２，０００ｐｓｉに保持され、サーモスタットで２０℃に調温した溶液を８分間、反応室を循環させた。その後、反応室の圧力を２．０２±０．０２秒のサイクル時間で、４３０±２０ｍ秒間、３００±１００ｐｓｉまでパルシングした。パルス時間は、４０，０００ｐｓｉ未満の合計時間の推定値であり、δｔa,y（４０，０００ｐｓｉから３００ｐｓｉまでの遷移時間）＋ｔa,y（３００ｐｓｉでの時間）＋δｔi,z（３００ｐｓｉから４０，０００ｐｓｉまでの遷移時間）に等しい。サイクル時間は、パルス時間にδｔｉ,z後でδｔa,y+1前に４０，０００ｐｓｉでの時間を加えたものに等しい。オシロスコープによれば、２０，０００ｐｓｉ未満のパルス時間は、３７０±２０ｍ秒であった。１つのパルスからパルス時間を含む次のパルスまでの時間は、２．０２秒であった。反応室および試料は、合計５００±２回パルシングした。４０，０００ｐｓｉの圧力では、サーモスタットで−１２℃に調温した溶液を１２分間、反応室を循環させて、カプセル内の試料を凍結させた。その後、およそ１５ｍ秒で、圧力を大気圧まで降下させた。８μｌの停止緩衝液を用いたことを除いては、実施例６のと同様に試料を回復させた。５９０±２０ミリ秒のパルス時間を用いて、上記のように、さらに他の試料を検定した。パルシングを行わず、非反応時間に４０，０００ｐｓｉで１２分２３秒を加えた時間を必要とする調節試料も検定した。上記試料は、実施例７で述べたように、０．５％アガロースゲル上で、検定した。非反応時間に１２分２３秒を加えた時間の試料は、検出可能な活性を示さなかった。バンドは、酵素調節を行わないバンドと同様であった。パルシングした試料に対して、変化したバンドのリーディングエッジを用いて、エキソヌクレアーゼによって消化した塩基の数を決定した。４３０ｍ秒のパルス時間で、酵素は、１つのパルスにつき平均０．６±０．２個の塩基を加水分解し、５９０ｍ秒のパルス時間で、酵素は、１つのパルスにつき平均１．１±０．２個の塩基を加水分解した��
実施例１０
迅速なパルスを用いたバージョン３．０フロースルー
既知の配列のターゲットＤＮＡを用いて、ＰＣＲ生成物を得る。１つは５’−ＮＨ2プライマであり、もう１つは５’−リン酸プライマである。このＰＣＲ生成物は、アミン反応性固体支持部上に固定化される（例えば、ＥＭＰＨＡＺＥ  ビーズ、３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）。ＰＣＲ生成物の固定化は、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化を遊離の５’−末端部（すなわち、リン酸化端部）のみに限定する。固定化ＤＮＡを有する固体支持部を反応室に置き、バージョン３．０にローディングする。反応室には、ビーズを保持するのに充分な細孔サイズの２つのフリットが取り付けられており、反応生成物を後に検出するのに充分なビーズ容積を含む。
反応室を、緩衝液Ａ（６７ｍＭ  グリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９．４）を用いて大気圧で洗浄する。反応室およびそれに流れ込む洗浄液を、２０℃の温度に平衡させる。その後、５０μｌ／ｍｌのＢＳＡおよび５単位／２０μｌのラムダエキソヌクレアーゼも含有する緩衝液Ａを用いて、反応室を洗浄する。Ｍｇ++が存在しない状態で、酵素はＤＮＡに結合するが、触媒として活性状態ではない。反応室の圧力を４０，０００ｐｓｉまで上げ、その後、反応室を２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（緩衝液Ｂ）を含有する緩衝液Ａを用いて洗浄する。その後、反応室の圧力を、５９０ｍ秒間、３００±２００ｐｓｉにパルシングする。圧力を、パルスの端部で４０，０００ｐｓｉに戻す。その後、反応室を１００μｌから３００μｌまでの緩衝液Ｂを用いて、４０，０００ｐｓｉで洗浄して、ラムダエキソヌクレアーゼの作用で放出した遊離ヌクレオチド５’−モノリン酸塩を除去する。洗浄液は、後の分析のために集める。後の５９０ｍ秒パルスおよび洗浄液は、上記のように繰り返し適用される。分析のために洗浄液を集める。
集めた洗浄液を質量分析計によって分析し、各洗浄液に存在するヌクレオチド５’−モノリン酸塩を同定する。この情報を用いて、ラムダエキソヌクレアーゼによって消化される鎖のヌクレオチド配列を決定する。
他の実施形態
上記から、当業者は、発明の精神および範囲を逸脱することなく、その本質的特徴を確認することが可能であり、また、発明の種々の変更および変形を行って、様々な利用および条件に適合させることが可能である。ここで述べた引例はすべて、参考文献として組み入れている。
例えば、開示した反応器は、殺菌、滅菌、タンパク質毒素の不活性化、食肉軟化、液体中のガスの可溶化、液体脱気、脱水または抽出、物質交代の変化および微生物の遺伝子発現、好圧微生物の研究、物質の結晶化および精製、ならびにコーティングの含浸等の工業用表面処理のような工程でも使用できる。
【図１】
0004308320.tif 000004
【図２】
0004308320.tif 000005
【図１Ａ】
0004308320.tif 000006
【図３】
0004308320.tif 000007
【図４】
0004308320.tif 000008
【図５】
0004308320.tif 000009
【図５Ａ】
0004308320.tif 000010
【図６】
0004308320.tif 000011
【図６Ａ】
0004308320.tif 000012
【図６Ｂ】
0004308320.tif 000013
【図６Ｃ】
0004308320.tif 000014
【図７】
0004308320.tif 000015
【図８】
0004308320.tif 000016
【図１０】
0004308320.tif 000017
【図９】
0004308320.tif 000018
【図１１】
0004308320.tif 000019
【図１２】
0004308320.tif 000020
【図１３】
0004308320.tif 000021
【図１４】
0004308320.tif 000022