(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（a）及び（b）を含む、哺乳動物の消化管の潰瘍を処置するための治療用組成物：
（a）モルフォゲン；
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、かつ、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定される：
（b）生体適合性組織表面被覆組成物；
さらに、ここで、前記モルフォゲンは、哺乳動物の消化管障壁組織における潰瘍形成又は潰瘍付随組織損傷を実質的に抑制するために十分な濃度で当該被覆組成物と混合される。
【請求項２】
次の（a）及び（b）を含む、哺乳動物の口腔粘膜炎を処置するための口腔洗浄組成物：
（a）モルフォゲン；
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、かつ、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定される：
（b）生体適合性組織表面被覆組成物；
さらに、ここで、前記モルフォゲンは、哺乳動物の消化管障壁組織における潰瘍形成又は潰瘍付随組織損傷を実質的に抑制するために十分な濃度で当該被覆組成物と混合される。
【請求項３】
次の（a）及び（b）を含む、哺乳動物の消化管の潰瘍を処置するための治療用組成物：
（a）モルフォゲン；
ここで、当該モルフォゲンは、錠剤、トローチ、薬用ドロップ及びチューインガムから選択される摂取可能な放出を制御する送達賦形剤（delivery vehicle）の中に分散され、当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、かつ、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定される：
（b）生体適合性組織表面被覆組成物；
さらに、ここで、前記モルフォゲンは、哺乳動物の消化管障壁組織における潰瘍形成又は潰瘍付随組織損傷を実質的に抑制するために十分な濃度で当該被覆組成物と混合される。
【請求項４】
次の（a）及び（b）を含む、薬剤の上皮細胞を破壊する細胞毒性作用から哺乳動物の再生上皮細胞集団を保護するための治療用組成物：
（a）モルフォゲン；
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、かつ、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定される：
（b）生体適合性組織表面被覆組成物；
さらに、ここで、前記モルフォゲンは、薬剤の上皮細胞を破壊する細胞毒性作用から再生上皮細胞集団を実質的に保護するために十分な濃度で当該被覆組成物と混合される。
【請求項５】
次の（a）及び（b）を含む、哺乳動物において上皮細胞集団の増殖を抑制するための治療用組成物：
（a）モルフォゲン；
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、かつ、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定される：
（b）生体適合性組織表面被覆組成物；
さらに、ここで、前記モルフォゲンは、哺乳動物において上皮細胞集団の増殖を抑制するために十分な濃度で当該被覆組成物と混合される。
【請求項６】
被覆組成物が組織接着剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ペクチン、グリセロール、スクラルファート懸濁液、又はフィブリノーゲン及びトロンビンの組合せを含む、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
モルフォゲンが、当該モルフォゲンファミリーのメンバーのプロドメインのアミノ酸配列からなる1種または複数種のポリペプチドとの会合（association）によって可溶化された請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
さらに、塩基性アミノ酸、洗浄剤または担体蛋白質を含む請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
モルフォゲンがOP-1、BMP-5、BMP6、COP-5、COP-7、及びCOP-16からなる群から選択される請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
モルフォゲンがOP-1である請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
消化管障壁組織が口腔粘膜である請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
上皮細胞が口腔粘膜細胞である請求項4または5に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物の消化管管腔内壁の正常な状態を維持するための医薬の製造においてモルフォゲンを使用する方法：
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定され、かつ、当該医薬の当該モルフォゲンの濃度は哺乳動物の消化管障壁組織における潰瘍形成又は潰瘍付随組織損傷を実質的に抑制するために十分な濃度である。
【請求項１４】
消化管の潰瘍性疾患に罹患した哺乳動物の失われた、または損傷された消化管障壁組織を再生させるための医薬の製造においてモルフォゲンを使用する方法：
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定され、かつ、当該医薬の当該モルフォゲンの濃度は当該哺乳動物の消化管の潰瘍形成部位において消化管障壁組織の再生を誘導するのに十分な濃度である。
【請求項１５】
上皮細胞を破壊する薬剤の細胞毒性作用から、哺乳動物の消化管障壁組織を保護するための医薬の製造においてモルフォゲンを使用する方法：
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定され、かつ、当該医薬の当該モルフォゲンの濃度は消化管内壁上皮の増殖を抑制するために十分な、消化管障壁組織を含む細胞の老化を抑制するために十分な、又は当該薬剤で処理された哺乳動物の消化管管腔内壁の炎症を抑制するために十分な濃度である。
【請求項１６】
上皮細胞を破壊する薬剤の細胞毒性作用から、哺乳動物の再生上皮細胞集団を保護するための医薬の製造においてモルフォゲンを使用する方法：
当該モルフォゲンは哺乳動物の消化管障壁組織の形態発生を誘導する、一対の折り畳まれたポリペプチドを含む二量体蛋白質を含み、当該ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列はC-末端の7システインドメインと60%以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み、当該ドメインの配列は配列番号5の残基38-139で規定され、かつ、当該医薬の当該モルフォゲンの濃度は当該再生細胞集団の増殖を抑制するために十分な、又は当該薬剤で処理された哺乳動物の当該再生細胞集団の老化又は炎症を抑制するために十分な濃度である。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項１８】
モルフォゲンが組織接着剤組成物に分散される、請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項１９】
医薬中のモルフォゲン濃度が、哺乳動物での投与あたり100μgモルフォゲン／kg体重未満となる濃度である、請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２０】
医薬中のモルフォゲン濃度が、投与あたり30μgモルフォゲン／kg体重未満となる濃度である、請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２１】
医薬中のモルフォゲン濃度が、投与あたり10μgモルフォゲン／kg体重未満となる濃度である、請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２２】
医薬が口腔乾燥症、口腔粘膜炎、胃もしくは十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、直腸炎、限局性腸炎、壊死性腸炎又は炎症性腸疾患の恐れがあるか、または当該疾病に罹患している哺乳動物において、潰瘍のできた消化管障壁組織の再生を誘導する請求項14に記載の使用する方法。
【請求項２３】
哺乳動物の上皮細胞を破壊する薬剤が、化学療法剤又は放射線療法剤である請求項15又は16に記載の使用する方法。
【請求項２４】
哺乳動物の上皮細胞を破壊する薬剤が、癌を治療する薬剤である請求項15又は16に記載の使用する方法。
【請求項２５】
医薬が、全身投与用、局所投与用又は局部投与用に製剤化される請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２６】
医薬が、経口投与、直腸投与又は非経口（parenteral）投与用に製剤化される請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２７】
医薬が、放出を制御する摂取可能な送達賦形剤（delivery vehicle）中で製剤化される請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２８】
消化管障壁組織が口腔粘膜である請求項13から15のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項２９】
細胞集団が、表皮細胞、基底上皮細胞、又は毛髪形成細胞を含む、請求項16に記載の使用する方法。
【請求項３０】
基底上皮細胞が口腔粘膜細胞である請求項29に記載の使用する方法。
【請求項３１】
モルフォゲンが、OP-1、BMP-5、BMP6、COP-5、COP-7、及びCOP-16からなる群から選択される請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【請求項３２】
モルフォゲンがOP-1である請求項13から16のいずれかに記載の使用する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に消化管（ＧＩ）疾患とそれに付随する組織の損傷の治療に関する。特に、本発明は、哺乳動物の消化管内の潰瘍性疾患の治療に関する。
発明の背景
哺乳動物の消化管（ＧＩ管）の内層（これは口腔から直腸に広がる）は、粘膜層の上に広がる持続的に増殖する基底上皮細胞である保護層を含む。この基底上皮と粘膜は一緒になって“消化管障壁”を創出する。この障壁の破壊は、下層組織の感染を引起し、および／または胃液の腐食作用に曝される病巣を生じる。消化管の潰瘍形成は、口腔粘膜炎、胃潰瘍、壊死性腸炎、限局性回腸炎、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎（クローン病）、直腸炎およびその他の型の腸管炎症疾患（ＩＢＤ）をもたらす。
潰瘍性口腔粘膜炎は、化学療法および放射線療法を含む種々の種類の癌治療の投与量の制限を必要とする重篤な毒性副作用である。口腔粘膜炎は、これらの患者に顕著な痛みと不快感を与えるが、その症状は発赤と腫脹から明瞭な潰瘍病巣までいろいろである。化学療法剤および放射線照射は、口腔を覆う上皮細胞を損傷する。そのような損傷には、口腔基底上皮を急速に増殖させる有糸分裂に対して化学療法剤が有する抑制作用が含まれる。損傷の程度は、化学療法剤の種類と投与量および同時に行われる治療（例えば放射線療法）に関係がある。さらに、慢性刺激の原因、例えば不完全な歯科修復、欠けた歯または咬合不良義歯が存在する場合、潰瘍は促進される。口腔粘膜炎は、癌治療のほぼ１−２週間後に、しばしば、頬、口唇、軟口蓋、舌下表面および口腔底の非角質化粘膜を冒す。この病巣は、しばしば二次感染を生じ、一層治癒が困難になる。口腔粘膜の破壊は、口腔に見出される多数の微生物の全身への浸入門戸となる。結果的に、口腔は、顆粒球減少性癌患者の敗血症の最も同定可能な原因である。最も懸念されるものは以下のような治療を受けている患者である：白血病、乳癌のような癌に対する化学療法、または腫瘍摘出に対するアジュバントとしての化学療法；頭部および頸部の癌に対する放射線療法；および骨髄移植に対する化学療法と放射線療法の併用。
口腔粘膜炎の原因の１つは口内乾燥症または慢性の口腔乾燥によるが、後者は典型的には唾液分泌減少もしくは停止または無唾液症に起因する。唾液腺の機能不全または萎縮は、高齢者の組織の老化または器質的な異常に起因するかもしれない。口内乾燥症は、最もよく見られる入院治療または薬剤治療の望ましくない副作用である。通常、唾液は口腔粘膜を潤し、口腔内に導入された外来物質の溶解と限定的吸収を可能にする。口内乾燥症患者では、食物や医薬を含む刺激性外来物質は粘膜に曝されたままで、炎症および潰瘍を生じる。口内乾燥症を惹起する医薬については、ギャラガーらの論文（Gallagerら、（1991）Current Opinion in Dentistry 1：777-782）に記載されている。
現在行われている粘膜炎治療は、単なる局部的もしくは全身的症状緩和または局所的抗菌治療のいずれかに限られている。現在のところ、粘膜炎の有効な治療は存在しない。治療は、典型的には痛みの治療と二次感染に対する治療に限られている。特に、推奨されるものには、局所麻酔薬（例えばキシロカイン、ベンゾカインおよびコカイン）による治療、多糖類ゲルによって潰瘍病巣を被覆する溶液による治療、およびクロルヘキサジンのような防腐剤溶液の使用が含まれる。これらの治療は全てある程度の緩和を提供するものの、これらはいずれも、粘膜上皮細胞の直接的治癒を必要とする、口腔粘膜炎の本当の治癒をもたらさない。
最近、ある種の局所作用性の増殖因子（例えばＴＧＦ−α）は、低濃度で潰瘍性粘膜病巣に対してある程度の効果を有する（高濃度ではしかし効果は少ない）ことが示された（米国特許第5102870号（Florineら）、1992年４月７日発行参照）。そのような因子によって示された二相性作用は、それらの臨床的利用を制限するかもしれない。したがって、潰瘍性粘膜炎病巣形成を抑制し、粘膜炎が形成された後は病巣の治癒を顕著に強化する治療に対する要望は依然として残っている。
消化管潰瘍疾患、特に消化性潰瘍は、合衆国人口の５−１５％が罹患している。消化性潰瘍は、胃潰瘍（胃壁内の病巣として発生する）、十二指腸潰瘍（十二指腸、すなわち小腸上部の壁に発生する深部病巣である）を含む。小児科医を悩ませる他の潰瘍は未熟児に発生する。壊死性腸炎として知られるこの症状は、誕生時体重が１．５ｋｇ以下の新生児の１０−１５％に見られ、小腸にしばしば手術を必要とする重篤な潰瘍形成をもたらす。胃潰瘍は、自然の消化管障壁を維持する因子の不均衡に起因する可能性がある。これらの因子には、腐食性胃液を中和する因子（例えば粘液性重炭酸塩）および管腔損傷物質から身体を保護するその他の因子が含まれる。抗分泌性物質、例えばシメチジンやラニチジンを含む現在の抗潰瘍治療薬は十二指腸潰瘍の治療に有効であるように見えるが、それらは正常な胃酸分泌を抑制するために有効であると一般に考えられている。酸性度の減少は潰瘍の閉鎖を助けるが、一方、それは正常な消化も妨害する。したがって、現在の治療薬で治癒した潰瘍の多くは治療後１年以内に再発する。潰瘍の高率な再発は、部分的には瘢痕組織内の粘液産生細胞の数の減少に起因すると考えられる。この瘢痕組織は、治癒潰瘍部位に生じるもので、消化管の酸性度が正常に復帰したとき、その部位を裂けやすくする。
ＰＣＴ出願PCT/US89/03467号は、酸耐性局所作用性線維芽細胞増殖因子をＧＩ潰瘍の治療に用いることを開示する。米国特許第5043329号は、消化管潰瘍の治療にホスホリピドを使用することを開示する。ＰＣＴ公告ＷＯ８９／１０４０９号はウシおよびヒトＢＭＰ３をコードするｃＤＮＡを開示し、骨形態発生蛋白は“軟骨様結節”の形成を誘発することが示され、また骨および／または軟骨の形成を誘発するために有用であると提唱された。ＷＯ８９／１０４０９号では、ＢＭＰ３はまた他の組織の損傷（例えば、“切開、熱傷および潰瘍”のような創傷を含む）の修復に有用であろうと推定する。
消化管粘膜の重度の潰瘍はまた、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と呼ばれる一連の臨床症状において腸の下方（回腸遠位部および結腸）にも偶発的に発生する。この分類による重要な２つの症状は潰瘍性大腸炎および限局性腸炎（クローン病）であるが、これらは重度の粘膜潰瘍（しばしば腸壁を貫通し狭窄とフィステルを形成する）、重度の粘膜と粘膜下層の炎症および浮腫並びに線維症を伴う。ＩＢＤの他の形態には、限局性回腸炎および直腸炎が含まれる。臨床的には、急性ＩＢＤの患者は、大量の下痢、血液損失、脱水、体重減少および発熱を示し重症となる。この疾患の予後は悪く、しばしば冒された組織の切除が必要となる。
本発明の目的は、哺乳動物の消化管管腔内層の完全性を維持するための方法および組成物を提供することである。別の目的は、潰瘍を生じた消化管の障壁組織（口腔粘膜を含む）の基底上皮および粘膜を再生するための方法および組成物を提供することである。本発明の別の目的は、化学療法や放射線療法の継続または強化を可能にする、組織を保護する方法および組成物を提供することである。別の目的は、上皮細胞、特に消化管の基底上皮細胞の増殖を制限することができる方法および組成物を提供することである。また別の目的は、潰瘍性疾患に通常付随する炎症を実質的に抑制する方法および組成物を提供することである。別の目的は、口内乾燥症に付随する組織破壊作用から粘膜組織を保護するための方法および組成物を提供することである。また別の目的は、口腔粘膜炎、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、壊死性腸炎、直腸炎および消化管の他の潰瘍性疾患の治療のための方法および組成物を提供することである。
本発明のこれらの目的およびその他の目的並びに特徴は、詳細な説明、図面および請求の範囲から明らかとなろう。
発明の要旨
本明細書で定義される形態発生蛋白（“モルフォゲン”）が、特に潰瘍形成の危険性がある患者において消化管管腔の内層を潰瘍形成から保護するために有用であることが見出された。特に本明細書に開示するモルフォゲンは上皮細胞の増殖を制限し、潰瘍性疾患に通常付随する炎症を抑制し、瘢痕組織の形成を抑え、および／または潰瘍を形成した組織の修復と再生を誘発する。
本発明の特徴の１つは、哺乳動物に治療的に有効な量の形態発生蛋白（モルフォゲン）（本明細書で定義される）をＧＩ管腔内層の全体または一部の損傷に際して、またはそのような損傷が予想される場合に、ＧＩ管腔内層の完全性を維持（潰瘍発生組織の修復および／またはそれらの損傷の抑制を含む）するために十分な時間および濃度で投与するという工程を含む治療方法および組成物である。
本発明の別の特徴は、哺乳動物のＧＩ管腔内層の完全性を維持するための組成物および治療方法であって、これは、ＧＩ管腔内層の全体または一部の損傷に際して、またはそのような損傷が予想される場合に、管腔内層の完全性維持（潰瘍発生組織の修復および／またはそれらの損傷の抑制を含む）に十分である、治療的に有効な濃度の内因性モルフォゲンを哺乳動物の体内にインビボで誘発できる化合物を哺乳動物に投与することを含む。これらの化合物は本明細書ではモルフォゲン−刺激薬と呼ばれるが、哺乳動物に投与したとき、通常それに反応する（またはモルフォゲンを産生および／またはモルフォゲンを分泌できる）組織または器官内の細胞に作用し、さらに、内因性モルフォゲンのレベルを変化させる物質を含むと考える。この物質は、例えば内因性モルフォゲンの発現および／または分泌を刺激することによって作用するかもしれない。
本明細書で用いたように、“消化管”は、哺乳動物の完全な消化管（口腔、食道、胃、腸の上部および下部、並びに大腸を含む包括的な口から直腸まで）を指す。本明細書で用いたように、“潰瘍”とは、消化管の開放病巣または消化管の上皮性内層の完全性の崩壊を指し、その下の粘膜の浸食を生じる。“管腔内層の完全性の維持”とは、消化管の管腔内層細胞にモルフォゲンの有効濃度を提供することを意味し、この濃度は消化管障壁の基底上皮における病巣形成を実質的に抑制（損傷組織の再生刺激、および／または損傷組織のさらなる損傷の抑制を含む）するために十分な濃度である。粘膜組織を“保護する”とは、消化管の管腔内層細胞に、組織の潰瘍に伴う組織損傷を抑制（損傷組織の再生刺激、および／または損傷組織のさらなる損傷の抑制を含む）するために十分な治療的に有効な濃度のモルフォゲンを提供することを意味する。“症状緩和補助因子”とは、本発明の治療剤とともに投与することができ、十二指腸組織の欠損に典型的に付随する症状の１つまたは２つを緩和する１種またはそれ以上の医薬を指す。典型的な補助因子は、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルスおよび抗黴剤、非ステロイド性抗炎症剤、麻酔剤、鎮痛剤並びに抗分泌剤を含む。
本発明の好ましい具体例では、哺乳動物はヒトであり、本発明にしたがって治療できる潰瘍は、限局性回腸炎を引き起こす回腸で認められるもの、潰瘍性大腸炎を引き起こす大腸で認められるもの、限局性腸炎（クローン病）、直腸炎および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のその他の形態、胃潰瘍（例えば胃、小腸、十二指腸および食道で認められるようなもの）、並びに口内で認められる潰瘍を含む。本明細書に記載した組成物および方法は化学療法または放射線療法によって生じた粘膜炎の治療に特に有用である。
本明細書に記載したモルフォゲンは、癌の治療に専ら起因する口腔粘膜の潰瘍形成を抑制するので、本発明の別の特徴では、患者における口腔粘膜炎の開始を顕著に減少または抑制する癌治療方法および組成物が提供される。さらに、本明細書に記載したモルフォゲンは現存する化学療法および放射線療法と併用して使用し、それら療法の効果を強化することができる。現在使用されている癌の化学療法および放射線療法は、重篤な口腔粘膜炎および／または敗血症（しばしば病巣形成後に生じる）の開始によって、しばしば投与量および期間が制限される。本明細書に記載したモルフォゲンは、病巣形成を抑制することができるので、癌療法の一部分として患者にそれらを投与することは、現在の治療投薬量および／または治療期間の顕著な増強を可能にするかもしれない。
本明細書に記載したモルフォゲンは、上皮細胞増殖集団の細胞増殖を制限し、それによって化学療法および放射線療法の毒性作用からこれらの細胞を保護することができる。したがって、本発明の別の特徴では、上皮細胞の分裂活性を制限する方法および組成物が提供される。モルフォゲンのこの活性はまた、上皮細胞増殖を伴う他の疾患（乾癬およびそのような他の皮膚組織疾患を含む）にも応用される。さらに、モルフォゲンのこの作用は、癌の治療に典型的に付随する毛髪の損失を制限するためにも有用であるかもしれない。
本明細書に記載したモルフォゲンはまた炎症を抑制する。したがって、本発明の別の特徴では、潰瘍性疾患に付随する炎症を抑制する方法および組成物が提供される。
本明細書に記載したモルフォゲンはまた、組織の損傷部位において組織の形態発生を刺激し、病巣部位における疲痕組織の形成を抑制する。したがって、本発明の別の特徴には、病巣部位における瘢痕組織形成を抑制する方法および組成物が含まれる。
本発明の別の特徴では、ここに記載したモルフォゲンは、口内乾燥症に付随する組織破壊作用から粘膜を保護するために有用である。口内乾燥症の症状は、癌治療を含む臨床的措置、投薬、治療食によって誘発されるか、または唾液腺組織の老化もしくは器質的疾患から生じるであろう。
好ましい実施例では、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬は、局所的投与、例えば処置するべき所望の表面をモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬で被覆することによって、個々の患者に直接投与される。例えば、治療剤は、被覆または吸着能力を有する化合物と一緒に治療物質を含む製剤を管腔内層表面で消費させることによって、所望の部位に提供できる。そのような化合物は、ペクチン含有溶液またはスクラルファート溶液（例えばマグネシアミルク（Milk of Magnesia）およびカオーペクテート（Kaopectate）で用いられているもの）を含む。口腔粘膜炎の治療には、冒された組織を被覆するために、口腔内をさっと洗浄する口内洗浄液と同様な口腔嗽薬として提供するか、または徐々に溶解するロゼンジもしくはトローチとして与えることができる。また別に、治療剤は、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬を含む製剤を当該部位に物理的に適用するか、または塗布することによって当該部位に提供してもよい。局所適用のための構成物はまた、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬を組織表面に付着させるために液体接着剤を含んでいてもよい。有用な接着剤には、オーラベース（Orabase）で用いられているようなジラクチン（Zilactin）、ヒドロキシプロピルセルロースおよびフィブリノーゲン／トロンビン溶液が含まれる。他の潜在的な有用性をもつ接着剤は、米国特許第5197973号に記載された生体接着剤である。液体接着剤は組織表面に塗布してもよいし、また患部組織に噴霧するエアロゾル中に製剤化されていてもよい。腸下部の治療には、治療薬はまた、特に回腸および結腸の治療には、直腸的に、例えば座薬、泡沫、液体軟膏またはクリームによって提供してもよい。本発明のまた別の実施例では、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬は全身的、例えば非経口的投与によって提供される。
本発明のいずれの治療方法においても、“モルフォゲンの投与”とは、モルフォゲンを単独または他の分子と組み合わせて投与することを意味する。例えば、モルフォゲンの成熟形が、その前駆体“プロ”ドメイン（これは生理学的溶液中で該蛋白の溶解度を高めることが知られている）と結合されて提供される。蛋白の溶解度を高めることが知られている他の有用な分子には、カゼインおよび他のミルク成分の他、種々の血清蛋白が含まれる。モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬と結合させることができるその他の有用な分子は、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬を上皮性粘膜組織に誘導することができる組織照準用分子を含む。本発明の治療プロトコルで有用と思われる組織照準用分子には、抗体、抗体フラグメント、またはＧＩ障壁組織細胞上の表面分子と特異的に反応するその他の結合蛋白が含まれる。炎症組織を典型的な標的とする非ステロイド性抗炎症剤もまた用いることができる。
また別の有用な組織照準用分子は、モルフォゲン前駆体“プロ”ドメインの一部または全部を含んでいてもよい。自然に発生する状態の下では、本明細書に記載した内在性モルフォゲンは他の組織で合成され、この合成組織から分泌された後標的組織に輸送されるであろう。例えば、この蛋白は骨組織で作用することが知られているが、一方ＯＰ−１の主要な合成源は尿産生系組織（例えば腎および膀胱組織）であるらしい。さらに、この蛋白は、血清、唾液およびミルクの種々の形態において認められた。さらにまた、この蛋白の分泌形は、無傷のモルフォゲン配列のプロドメインと結合した状態の成熟二量体を含む。この結合モルフォゲンプロドメインは、インビボで特異的モルフォゲンを異なる組織に誘導するために作用するのかもしれない。
組織照準用または可溶性増強結合分子はまた、標準的な化学的方法を用いてモルフォゲンに共有結合させてもよい。このような化学的方法には、ＧＩ管のような酸性環境で優先的に切断されると思われる酸感受性結合が含まれる。
最後に、本明細書で提供されるモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬はまた、潰瘍治療の助けになることが分かっている他の分子（“補助因子”）（特に潰瘍化組織の損傷および／または破壊に典型的に付随する症状を緩和できる補助因子）と組み合わせて投与してもよい。そのような補助因子の例には、キシロカインおよびベンゾカインのような鎮痛剤／麻酔剤；クロロヘキシジンのような防腐剤；抗菌、抗ウイルスおよび抗黴剤（アミノグリコシド、マクロライド、ペニシリンおよびセファロスポリンを含む）；シメチジンまたはラニチジンのような制酸剤または抗分泌剤が含まれる。
本発明でとりわけ有用なモルフォゲンは、本来骨形成蛋白として同定された蛋白（例えばOP-1、OP-2およびCBMP2蛋白）の他、アミノ酸配列類縁蛋白（例えばDPP（ショウジョウバエ由来）、Vg1（アフリカツメガエル由来）、Vgr-1（マウス由来、オッパーマン（Oppermann）らの米国特許第5011691号参照）GDF-1（マウス由来、Lee（1991）PNAS 88：4250-4254参照）（これらは全て表ＩＩおよび配列番号５−１４に示す）および最近同定された６０Ａ蛋白（ショウジョウバエ由来、配列番号２４、Whartonら、（1991）PNAS 88：9214-9218参照）である。この種類の蛋白（ＴＧＦ−β上科の蛋白を含む）は、そのＣ−末端領域において実質的なアミノ酸相同性を共有する。これらの蛋白は前駆体として翻訳され、Ｎ−末端シグナルペプチド（典型的には薬３０残基未満）を有し、その後に“プロ”ドメインが続くが、これは切断されて成熟配列が得られる。この蛋白の“プロ”形はプロドメインと成熟ドメインを含み、培養哺乳類細胞から分泌される主要な形態と思われる可溶性物質種を形成する。シグナルペプチドは、翻訳に際して迅速に切断されるが、この切断部位は、フォンハイジンの方法（Von Heijine（1986）Nucleic Acids Research 14：4683-4691）を用いて与えられた配列中において予測することが可能である。下記の表Ｉは今日までに同定された種々のモルフォゲンを示すが、これには本明細書で用いた命名、その配列番号、配列リストには記載されていない蛋白の全長のアミノ酸配列のための文献が含まれている。これらの文献は参照により本明細書に含まれる。
表Ｉ
“ＯＰ−１”
ＯＰ−１蛋白をコードするＤＮＡ配列の一部または全体から発現される形態発生的活性を有する蛋白群を総称的に指し、その対立形質や種の変異体、例えばヒトＯＰ−１（“hOP-1”、配列番号５、成熟蛋白のアミノ酸配列）、またはマウスＯＰ−１（”mOP-1”、配列番号６、成熟蛋白のアミノ酸配列）を含む。保存された７個のシステイン骨格は、配列番号５および６の残基３８から１３９によって示される。蛋白の全長をコードするｃＤＮＡ配列およびアミノ酸は、配列番号１６および１７（hOP1）および配列番号１８および１９（mOP1）で提供される。成熟蛋白は、残基２９３−４３１（hOP1）および２９２−４３０（mOP1）で示される。当該蛋白の“プロ”領域は、切断されて形態発生的活性を示す成熟蛋白を生じる。本質的には残基３０−２９２（hOP1）および残基３０−２９１（mOP1）によって示されている。
“ＯＰ−２”
ＯＰ−２蛋白をコードするＤＮＡ配列の一部または全体から発現される活性な蛋白群を総称的に指し、その対立形質や種の変異体、例えばヒトＯＰ−２（”hOP-2”、配列番号７、成熟蛋白のアミノ酸配列）、またはマウスＯＰ−２（“mOP-2”、配列番号８、成熟蛋白のアミノ酸配列）を含む。保存された７個のシステイン骨格は、配列番号７および８の残基３８から１３９によって示される。蛋白の全長をコードするｃＤＮＡ配列およびアミノ酸は、配列番号２０および２１（hOP2）および配列番号２２および２３（mOP2）で提供される。成熟蛋白は、本質的には残基２６４−４０２（hOP2）および２６１−３９９（mOP2）で示される。当該蛋白の“プロ”領域は、切断されて形態発生的活性を示す成熟蛋白を生じる。おそらくは、本質的には残基１８−２６３（hOP2）および残基１８−２６０（mOP2）によって示される。（別の切断部位はｈＯＰ−２については２１残基上流にも生じる。）
“ＣＢＭＰ２”
ＣＢＭＰ２蛋白をコードするＤＮＡ配列から発現される活性な蛋白を総称的に指し、その対立形質や種の変異体、例えばヒトＣＢＭＰ２Ａ（”CBMP2A（fx）”、配列番号９）、またはヒトＣＢＭＰ２ＢＤＮＡ（”CBMP2B（fx）”、配列番号１０）を含む。完全な長さのアミノ酸配列（文献ではBMP2AおよびBMP2B、またはBMP2およびBMP4と呼ばれる）は、ウォズニーらの文献（Wozneyら、（1988）Science：242 1528-1534）に記載されている。ＢＭＰ２（ＢＭＰ２Ａ）のプロドメインはおそらく、残基２５−２４８または２５−２８２を含み、成熟蛋白は残基２４９−３９６または２８３−３９６を含む。ＢＭＰ４（ＢＭＰ２Ｂ）のプロドメインはおそらく、残基２５−２５６または２５−２９２を含み、成熟蛋白は残基２５７−４０８または２９３−４０８を含む。
“ＤＰＰ（ｆｘ）”
ショウジョウバエＤＰＰ遺伝子によってコードされる、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白の配列（配列番号１１）を指す。蛋白の全長のアミノ酸配列は、パジェットらの文献（Padgettら、（1987）Nature 325：81-84）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基４５６に至り、成熟蛋白はおそらく残基４５７−５８８によって示される。
“Ｖｇ１（ｆｘ）”
アフリカツメガエルＶｇ１遺伝子によってコードされる、７個のシステインの保存骨格を特定する蛋白の配列（配列番号１２）を指す。蛋白の全長についてのアミノ酸配列は、ウィークスの文献（Weeks、（1987）Cell 51：861-867）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基２４６に至り、成熟蛋白はおそらく残基２４７−３６０によって示される。
“Ｖｇｒ−１（ｆｘ）”
マウスＶｇｒ−１遺伝子によってコードされる、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白配列（配列番号１３）を指す。蛋白の全長のアミノ酸配列は、リオンらの文献（Lyons、（1989）PNAS 86：4554-4558）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基２９９に至り、成熟蛋白はおそらく残基３００−４３８によって示される。
“ＧＤＦ−１（ｆｘ）”
ヒトＧＤＦ−１遺伝子によってコードされ、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白配列（配列番号１４）を指す。蛋白の全長についてのｃＤＮＡおよびコードされるアミノ酸配列は配列番号３２で与えられる。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基２１４に至り、成熟蛋白はおそらく残基２１５−３７２によって示される。
“６０Ａ”
６０Ａ蛋白をコードするＤＮＡ配列（ショウジョウバエ６０Ａ遺伝子由来）の一部または全体から発現される形態発生的活性を有する蛋白を総称的に指す（配列番号２４を参照。蛋白の全長のためのｃＤＮＡとコードされるアミノ酸配列が提供される）。“６０Ａ（ｆｘ）”は、保存された７個のシステイン骨格（配列番号２４の残基３５４から４５５）を示す蛋白配列を指す。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基３２４に至り、成熟蛋白はおそらく残基３２５−４５５によって特定される。
“ＢＭＰ３（ｆｘ）”
ヒトＢＭＰ３遺伝子によってコードされ、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白配列を指す（配列番号２６）。蛋白の全長のアミノ酸配列は、ウォズニーらの文献（Wozneyら、（1988）Science：242 1528-1534）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基２９０に至り、成熟蛋白はおそらく残基２９１−４７２によって特定される
“ＢＭＰ５（ｆｘ）”
ヒトＢＭＰ５遺伝子によってコードされ、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白配列を指す（配列番号２７）。蛋白の全長のアミノ酸配列は、セレステらの文献（Celesteら、（1991）PNAS 87：9843-9847）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基３１６に至り、成熟蛋白はおそらく残基３１７−４５４によって特定される。
“ＢＭＰ６（ｆｘ）”
ヒトＢＭＰ６遺伝子によってコードされ、保存された７個のシステイン骨格を特定する蛋白配列を指す（配列番号２８）。蛋白の全長のアミノ酸配列は、セレステらの文献（Celesteら、（1991）PNAS 87：9843-9847）に記載されている。プロドメインはおそらくシグナルペプチド切断部位から残基３７４に至り、成熟蛋白はおそらく残基３７５−５１３で特定される。
ＯＰ−２蛋白は、この種類の蛋白に共通な保存されたシステイン骨格に加えて、この領域にさらにシステイン残基を有する（例えば配列番号７および８の残基４１を参照）。ＧＤＦ−１蛋白は、保存された骨格内に４つの挿入アミノ酸（配列番号１４の残基４４−４７）を有するが、この挿入は折り畳まれた構造内のシステインの関係を妨害しない。さらに、ＣＢＭＰ２蛋白ではシステイン骨格内で１つのアミノ酸が失われている。
モルフォゲンは還元されたとき活性を失うが、酸化された同種二量体の場合、さらに本発明の他のモルフォゲンと組み合わせて酸化されたとき活性を有する。したがって、本明細書で定義したように、モルフォゲンは一対のポリペプチド鎖を含む二量体蛋白で、各ポリペプチド鎖は、配列番号５の残基４３−１３９で示されるＣ−末端のシステイン６個の骨格を少なくとも含むが、これには、これらシステインの機能的に同等な配置（例えば該配列の直線的なシステインの配置を変更するアミノ酸の挿入または欠失であるが、その折り畳み構造におけるシステインの関係には変化を与えないもの）も含まれるが、それは、例えば、ポリペプチド鎖が折り畳まれたとき、一対のポリペプチド鎖を含むこの二量体蛋白種が、本明細書で定義したようなモルフォゲンとして作用することができるように、適切な鎖内ジスルフィド結合または鎖間ジスルフィド結合を含む適切な三次元構造を有するような場合である。特に、モルフォゲンは一般的には、形態発生が可能な環境下で下記の全ての生物学的機能が可能である：前駆細胞の増殖刺激；前駆細胞の分化刺激；分化細胞の増殖刺激；および分化細胞の増殖および維持の支援。さらにまた、これらモルフォゲンは適切な環境条件下で該当細胞の再分化を誘発することができるということが予測される。
本発明のモルフォゲンの好ましい特徴では、２種の一般アミノ酸配列のうちの１種を含む：一般配列１（配列番号１）または一般配列２（配列番号２）であるが、ここで各Ｘａａは、２０個の天然に存在するＬ型異性体、α−アミノ酸またはその誘導体の１つを指す。一般配列１は、保存された６個のシステイン骨格を含み、一般配列２は、保存された６個のシステイン骨格とＯＰ−２で認められたさらに付加されたシステインを含む（配列番号２、残基３６参照）。別の好ましい特徴では、これらの配列はさらに、そのＮ−末端に以下の配列が付加されている：
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前述の一般配列内の好ましいアミノ酸は以下を含む：一般配列３（配列番号３）、一般配列４（配列番号４）、一般配列５（配列番号３０）および一般配列６（配列番号３１）。これらは下記に挙げる。これらの一般配列は、表ＩＩに示したモルフォゲン類の好ましい種々の配列間で共通な相同性とともに、これらの間で変動する類型アミノ酸配列も含んでいる。特に一般配列３および４は、表ＩＩに掲げられ、配列番号５−１４で示した下記の蛋白の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１（hOP-1、配列番号５および１６−１７）、マウスＯＰ−１（mOP-1、配列番号６および１８−１９）、ヒトおよびマウスＯＰ−２（配列番号７、８および２０−２２）、ＣＢＭＰ２Ａ（配列番号９）、ＣＢＭＰ２Ｂ（配列番号１０）、ＤＰＰ（ショウジョウバエ由来、配列番号１１）、Ｖｇ１（アフリカツメガエル由来、配列番号１２）、Ｖｇｒ−１（マウス由来、配列番号１３）およびＧＤＦ−１（マウス由来、配列番号１４）。この一般配列は、表ＩＩの配列に共通の両方のアミノ酸同一性とともに、該配列内の種々の部位についてまた別の残基を含んでいる。これらの一般配列は、一般配列３または４のそれぞれ４１位または４６位にさらにシステインの付加させて、分子間または分子内ジスルフィド結合の形成を可能にする適切なシステイン骨格を提供しているということ、およびこの蛋白の三次構造に影響を与えるある種の重要なアミノ酸を含んでいるということは留意すべきであろう。
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ここで、各Ｘａａは以下のように規定される１つまたは２つ以上のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＨｉｓまたはＡｓｎ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＡｓｎ）；残基１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＧｌｎ）；残基２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＧｌｎ）；残基２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｎ）；残基３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＧｌｎ）；残基３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３３のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；残基３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｅｕまたはＡｌａ）；残基３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基３８のＸａａ−（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；残基４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基４５のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５０のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｓｎ）；残基５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基５４のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）；残基５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＡｌａ）；残基５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基５９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＬｅｕ）；残基６０のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（ＴｈｒまたはＡｌａ）；残基６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｓｐ）；残基６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＶａｌ）；残基７１のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｌａ）；残基７２のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＬｅｕ）；残基７６のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＡｓｎ）；残基７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＴｙｒ）；残基７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；残基８２のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；残基８６のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；残基８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；残基８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）；残基９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＧｌｙまたはＧｌｕ）；残基９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）。
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ここで各Ｘａａは以下によって規定される１つまたは２つ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基４のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）；残基５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｒｏ）；残基９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基１１のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基１２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基１３のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基１６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＨｉｓまたはＡｓｎ）；残基１７のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＡｓｎ）；残基１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基２０のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基２３のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基２５のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＧｌｎ）；残基２８のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基３１のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＧｌｎ）；残基３３のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｎ）；残基３５のＸａａ＝（Ａｌａ、ＳｅｒまたはＰｒｏ）；残基３６のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；残基４０のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｅｕまたはＡｌａ）；残基４１のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基４２のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基４４のＸａａ＝（Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；残基４５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基５１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基５２のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基５４のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５５のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｓｎ）；残基５６のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５７のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基５９のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；残基６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＡｌａ）；残基６２のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基６３のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基６４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＬｅｕ）；残基６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基６８のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基７０のＸａａ＝（ＴｈｒまたはＡｌａ）；残基７１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基７２のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基７３のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｓｐ）；残基７４のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７５のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＶａｌ）；残基７６のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｌａ）；残基７７のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基７９のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基８０のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＬｅｕ）；残基８１のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＡｓｎ）；残基８２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基８３のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＴｙｒ）；残基８４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基８５のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；残基８７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基９０のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；残基９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）；残基９５のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；残基９７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基９８のＸａａ＝（Ａｌａ、ＧｌｙまたはＧｌｕ）；および残基１０２のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）。
同様に、一般配列５（配列番号３０）および一般配列６（配列番号３１）は、表ＩＩで明らかにした全てのモルフォゲン蛋白類の各々に共通の相同性を含んでいる。特に、一般配列５および６は、ヒトＯＰ−１（hOP-1、配列番号５および１６−１７）、マウスＯＰ−１（mOP-1、配列番号６および１８−１９）、ヒトおよびマウスＯＰ−２（配列番号７、８および２０−２２）、ＣＢＭＰ２Ａ（配列番号９）、ＣＢＭＰ２Ｂ（配列番号１０）、ＤＰＰ（ショウジョウバエ由来、配列番号１１）、Ｖｇ１（アフリカツメガエル由来、配列番号１２）、Ｖｇｒ−１（マウス由来、配列番号１３）およびＧＤＦ−１（マウス由来、配列番号１４）、ヒトＢＭＰ３（配列番号２６）、ヒトＢＭＰ５（配列番号２７）、ヒトＢＭＰ６（配列番号２８）および６０（Ａ）（ショウジョウバエ由来、配列番号２４−２５）の複合アミノ酸配列である。この一般配列は、Ｃ−末端ドメインにおいてこれらの配列に共通で、システイン６個および７個の骨格（それぞれ一般配列５および６）によって特定される両方のアミノ酸同一性とともに、該配列内の種々の部位について別の残基を含む。一般配列３および４のように、一般配列５および６は、４１位（一般配列５）または４６位（一般配列６）にシステインの付加させて、分子間または分子内ジスルフィド結合を形成することができる適切なシステイン骨格を提供し、さらに該蛋白の三次構造に影響を与えるある種の重要なアミノ酸を含む。
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ここで、各Ｘａａは以下のように規定される１つまたは２つ以上のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；残基３のＸａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；残基７のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；残基１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；残基２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；残基２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒ）；残基２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；残基３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｓｎ）；残基３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；残基３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；残基３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；残基４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；残基４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；残基５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）；残基５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；残基５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＶａｌまたはＬｙｓ）；残基５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）；残基５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；残基６０のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；残基６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；残基７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；残基７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；残基７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）；残基７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；残基７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；残基８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；残基８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＶａｌ）；残基８６のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；残基８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；残基８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）；残基９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩＩｅ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；残基９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）および残基９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）。
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ここで、各Ｘａａは、下記によって定義される１つまたは２つ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；残基３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）；残基４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）；残基５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）；残基７のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；残基８のＸａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基１１のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基１３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基１６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基１７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；残基１９のＸａａ＝（ＩＩｅまたはＶａｌ）；残基２０のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基２１のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基２３のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基２４のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；残基２５のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；残基２８のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基３１のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒ）；残基３３のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；残基３５のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｓｎ）；残基３６のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；残基４０のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；残基４１のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基４２のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基４３のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基４４のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；残基４５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４９のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；残基５０のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基５１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基５２のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基５３のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基５４のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５５のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；残基５６のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５７のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基５８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）；残基５９のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；残基６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＶａｌまたはＬｙｓ）；残基６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）；残基６２のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基６３のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基６４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；残基６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基６８のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基７０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基７１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基７２のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基７３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；残基７４のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７５のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基７６のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；残基７７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；残基７９のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基８０のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；残基８１のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）；残基８２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基８３のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；残基８４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基８５のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；残基８７のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；残基８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基９０のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＶａｌ）；残基９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）；残基９５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基９７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基９８のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；残基１００のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）；残基１０２のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）。
本発明のモルフォゲンとして使用するために特に有用な配列は、Ｃ−末端ドメイン、例えばＶｇ１、Ｖｇｒ−１、ＤＰＰ、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＧＤＦ−１のＣ−末端９６−１０２のアミノ酸残基（下記の表ＩＩおよび配列番号５−１４参照）の他、６０Ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５およびＢＭＰ６のＣ−末端ドメインを含む蛋白（配列番号２４−２８参照）を含むが、これらは全て、少なくとも保存された６個または７個のシステインの骨格を含む。さらに、一般配列からデザインされた生合成構築物、例えば米国特許第５０１１６９１号に開示されたＣＯＰ−１、３−５、７、１６もまた有用である。その他の配列はインヒビン／アクチビン蛋白（例えば米国特許第4968590号および第5011691号参照）を含む。
したがって、他の有用な配列は、上記の配列のいずれかと、少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性または“類似性”、好ましくは８０％の相同性または類似性を共有するようなものである。これらは、対立形質変異体および他の配列変異体（例えば“ミューテイン”または突然変異蛋白”を含む）（天然に存在するか、生合成によって産生されるかに拘わらない）の他、このモルフォゲン蛋白類の新規な種も同様に含むと考えられる。本明細書で用いたように、“アミノ酸配列相同性”とは、アミノ酸配列の類似性を意味すると解され、相同な配列は同一または同様なアミノ酸を共有している。ここで、同様なアミノ酸とは、デイオフらに定義されたように（蛋白配列と構造図（Atlas of Protein Sequence and Structure）；５巻、付録1.3、345-362ページ（M. O. Dayoff編、Nat’l BioMed. Research Fdn.刊、ワシントンD.C. 1978）保存されたアミノ酸である。したがって、対照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補配列は、候補配列の配置を対照配列でたどった場合、候補配列のアミノ酸の７０％が対照配列の対応するアミノ酸と同一であるか、またはそれに対して保存されたアミノ酸変化を構成していることが要求される。“アミノ酸配列同一性”とは、２つの関連配列間で同一のアミノ酸が要求されると理解できる。したがって、対照配列と６０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、候補配列の配置を対照配列でたどった場合、候補配列のアミノ酸の６０％が、対照配列の対応するアミノ酸と同一であることが必要である。
本明細書で用いたように、全ての相同性および同一性は、対照配列としてＯＰ−１を用いて計算した。さらに本明細書で用いたように、相同性と同一性の算定には、ニードルマンらの方法（Needlemanら、（1970）J. Mol. Biol. 48：443-453）を用いて配列を並べ、同一性はドゥナスター社（DNAstar, Inc.）のアラインプログラムを用いて計算した。全ての事例で、配列を並べたときの候補配列における内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、相同性／同一性計算を実施するときは無視した。
本発明のモルフォゲンとして有用な現時点で最も好ましい蛋白は、ｈＯＰ−１の保存された６個のシステイン骨格を特定するアミノ酸配列（例えば配列番号５の残基４３−１３９）と６０％以上、好ましくは６５％以上の同一性を有するものを含む。これら最も好ましい配列は、ＯＰ−１およびＯＰ−２蛋白の対立形質変異体および種変異体（ショウジョウバエ６０Ａ蛋白を含む）を含む。したがって、本発明の別の好ましい特徴では、有用なモルフォゲンは、本明細書で“ＯＰＸ”と呼ばれる一般アミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む活性蛋白を含むが、これは、明らかとなった種々のＯＰ−１およびＯＰ−２種間の相同性を有する（配列番号２９）。
本発明のまた別の好ましい特徴では、有用なモルフォゲンは、ＯＰ−１またはＯＰ−２の保存された７個のシステインドメインを特定するＣ−末端配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば配列番号１６および配列番号２０のそれぞれヌクレオチド１０３６−１３４１およびヌクレオチド１３９０−１６９５）と、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含有する二量体蛋白を含む。本明細書で用いたように、厳密なハイブリダイゼーションの条件とは、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルトの溶液（Denhardt’s solution）および０．１％ＳＤＳ（３７℃、一晩）でハイブリダイゼーション、さらに５０℃で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄すると規定される。
本発明の方法、組成物および装置で有用なモルフォゲンは、天然に存在するものから分離されたか、または組換え体（リコンビナント）ＤＮＡまたは他の合成技術で産生されたかに拘わらず、上記のポリペプチド鎖のいずれかを含有する蛋白を含むが、さらに、これら蛋白の対立形質変異体および種変異体、天然に存在する変異体もしくはその生合成変異体の他、種々の短縮形および融合構築物をも含む。欠失または付加変異体もまた活性を有すると考えられるが、これらには、保存されたＣ−末端システイン保存骨格を変更するようなものも、その変更が、折り畳まれた構造におけるこれらシステインの関係を機能的に破壊しない限り含まれる。したがって、そのような活性形は、本明細書で開示する特定の構築物と同等のものと考えられる。
この蛋白は、様々な糖化パターン、様々なＮ−末端、アミノ酸配列の相同性を有する領域をもつ関連蛋白類、および宿主細胞中でのリコンビナントＤＮＡの発現によって産生される天然もしくは生合成蛋白の活性な短縮形もしくは変異形を有する形態も含むことができる。
この形態発生蛋白は、無傷もしくは短縮ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡから原核もしくは真核宿主細胞中で発現させ、さらに精製、切断、再折り畳みを行い、さらに二量体を形成させ形態発生作用を有する組成物を作ることができる。現在のところ好ましい宿主細胞は、大腸菌または哺乳類細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢＳＣ細胞）を含む。本発明の方法、組成物および装置で有用なモルフォゲンについての詳細な記載は、国際出願ＵＳ９２／０１９０８号（WO92/15323）で開示されている。それらのリコンビナント産生方法はサンパスらの論文（Sampathら、（1992）J. Biol. Chem. 267：20352-20362）で提供される。
したがって、本明細書を概読することによって、遺伝子工学分野の技術を有する者は、適切なアミノ酸配列をコードする様々な種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから遺伝子を分離し、またはオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築し、続いてそれらを原核細胞および真核細胞の両方を含む様々な型の宿主細胞で発現させ、潰瘍形成の危険性をもつ患者の消化管管腔内層の完全性を維持する能力を有する活性蛋白を大量に製造することが可能である。
本発明の前述およびその他の目的並びに特徴、以下の詳細な説明によって一層明白となろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の前述およびその他の目的、特徴並びに利点は、本発明それ自体同様、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明によってより完全に理解されるであろう。
図１は、粘膜炎病巣形成におけるモルフォゲン（例えばＯＰ−１）と偽薬コントロールとの効果を表すグラフである。
図２（ＡおよびＢ）は、口腔粘膜炎の動物モデルでの病巣形成抑制のためのモルフォゲンの能力を示す顕微鏡写真であるが、ここで（２Ａ）は未処置のハムスターの頬袋における病巣形成を示し、（２Ｂ）はモルフォゲン処置頬袋における顕著な減少効果を示す。
図３（ＡおよびＢ）は、ミンク肺細胞におけるモルフォゲンの抗増殖作用を示すグラフである。
図４（Ａ−Ｄ）は、霊長類の繊維芽細胞培養でのコラーゲン産生（４Ａおよび４Ｂ）およびヒアルロン酸産生（４Ｃおよび４Ｄ）におけるモルフォゲン（例えばＯＰ−１、図４Ａおよび４Ｃ）並びにＴＧＦ−β（図４Ｂおよび４Ｄ）の効果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本明細書に開示した蛋白は、哺乳動物の消化管管腔内層の完全性を維持するために有効な物質であることを見出した。本明細書に記載したように、これらの蛋白（“モルフォゲン”）は、実質的に、基底上皮における病巣形成または付随する組織損傷を抑制し、および／または潰瘍の後、障壁組織の修復と再生を刺激する能力がある。この蛋白は、上皮細胞増殖を抑制し、および／または障壁組織を損傷から保護する能力を有する。この蛋白はまた、哺乳動物の病巣形成後に典型的に現れる瘢痕組織形成を抑制する能力を有する。さらに、モルフォゲンはまた、潰瘍性疾患に通常付随する炎症を抑制することができる。この蛋白は、口内粘膜炎、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、直腸炎および限局性腸炎を含む消化管の潰瘍性疾患の治療に用いることができる。この蛋白はまた、口内乾燥症の患者の損傷に対して、ＧＩ組織を保護および／または治療するために用いてもよい。最後に、モルフォゲンは化学療法または放射線療法の一部として投与し、癌療法を受けている患者の病巣形成を抑制し、それによって癌治療の効果を高めることができる。
本発明の方法および組成物として有用な適切なモルフォゲンの他、その投与と適用方法の詳細な説明する。さらに、（１）消化管管腔内層の完全性を維持するための治療薬として本明細書で開示するモルフォゲンが適切であることおよび（２）その有用性について候補モルフォゲンおよびモルフォゲン刺激薬を検査するアッセーを示す多数の非限定的な実施例をあげる。特に、これらの実施例は、口腔粘膜炎、十二指腸潰瘍、消化性潰瘍および消化性大腸炎（実施例３−６）におけるモルフォゲンの有用性を明らかにするためのモデルを提供し、さらに、上皮細胞増殖抑制（実施例７）、炎症抑制（実施例８）および瘢痕組織形成抑制（実施例９）のためのモルフォゲンの効果を明らかにする。これらの実施例はまた、モルフォゲン発現組織を明らかにし、モルフォゲン刺激候補薬をスクリーニングする方法もまた説明する（実施例１、２および１０）。
Ｉ．有用なモルフォゲン
本明細書で定義したように、新規で器官特異的組織の形成を完結させる細胞的、分子的発生過程を誘発する能力をもち、少なくとも、保存された６個のシステインのＣ−末端骨格もしくはその機能的同等物を含む場合は、その蛋白は形態発生的である（上掲書参照）。特に、モルフォゲンは一般的に、形態発生を許容する環境下で下記の生物学的機能のすべてを備えている：前駆細胞の増殖刺激、前駆細胞の分化刺激、分化細胞の増殖刺激および分化細胞の増殖と維持の支援。本発明の方法で有用なモルフォゲンが最初どのように識別されたかは、その製造方法、使用方法およびモルフォゲン活性の検査方法と同様に、詳細に国際出願ＵＳ９２／０１９６８号（WO92/15323）に開示されている。そこにに開示されているように、モルフォゲンは天然に存在する物質または該国際出願で開示された遺伝子配列を用いて、原核もしくは真核宿主細胞からリコンビナントによって産生された物質から精製することができる。また別に、新規なモルフォゲン配列はそこでで開示された方法にしたがって同定することができる。
特に有用な蛋白は、表ＩＩに示す天然物質に由来する配列を含む。他の有用な配列は、６０Ａ、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３、および米国特許第５０１１６９１号（この文献は参照により本明細書に含まれる）で開示されたような生合成構築物（例えば、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７およびＣＯＰ−１６）を含む。
したがって、本発明の方法および組成物で有用なモルフォゲンはまた、上記の配列のいずれかと７０％、好ましくは８０％の相同性（類似性）を共有するアミノ酸配列を有する形態発生的に活性な蛋白によって説明できる。ここで“相同性”は、本明細書ですでに定義した通りである。
本発明の方法で有用なモルフォゲンはまた、本明細書で述べる６個の一般配列（一般配列１、２、３、４、５および６）によって説明することができる。一般配列１および２はまた、そのＮ−末端に次の配列を含むことができる：
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下記で説明する表ＩＩは、モルフォゲンと同定された天然の蛋白の活性領域のアミノ酸配列を比較する。これらには、ヒトＯＰ−１（hOP-1、配列番号５および１６−１７）、マウスＯＰ−１（mOP-1、配列番号６および１８−１９）、ヒトおよびマウスＯＰ−２（配列番号７、８および２０−２３）、ＣＢＭＰ２Ａ（配列番号９）、ＣＢＭＰ２Ｂ（配列番号１０）、ＤＰＰ（ショウジョウバエ由来、配列番号１１）、Ｖｇｌ（アフリカツメガエル由来、配列番号１２）、Ｖｇｒ−１（マウス由来、配列番号１３）およびＧＤＦ−１（マウス由来、配列番号１４）が含まれる。これらの配列は、本質的にはニードルマンらの方法（Needlemanら、（1970）J.Mol.Biol. 48：443-453）にしたがって並べ、アラインプログラム（DNAstar, Inc.製）を用いて計算した。この表で、３個の点は、その位置のアミノ酸がｈＯＰ−１のアミノ酸と同じであることを示している。３本の棒線はそに位置にはアミノ酸が存在しないことを示し、相同性を表すために含まれている。例えば、ＣＢＭＰ−２ＡおよびＣＢＭＰ−２Ｂのアミノ酸残基６０は“欠落”している。もちろん、この領域においてこれらのアミノ酸は両方ともＡｓｎ−Ｓｅｒ（残基５８、５９）を含みＣＢＭＰ−２Ａについてはその後ＬｙｓおよびＩｌｅを含み、一方ＣＢＭＰ−２ＢはＳｅｒおよびＩｌｅを含む。
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前述のアミノ酸配列の比較から明らかなように、形態発生活性は保持されているかぎり、顕著なアミノ酸の変化が一般配列内に生じることができる。例えば、表ＩＩに示したＧＤＦ−１蛋白配列は、そこに記載したｈＯＰ−１配列と約５０％のアミノ酸同一性を共有するだけであるが、ＧＤＦ−１配列は、ｈＯＰ−１配列と７０％以上のアミノ酸配列相同性（または類似性）を共有している。この場合、デイオフら（Atlas of Protein Sequence and Structure ５巻、付録３、345-362ページ、M. O. Dayoff編、Nat’l Res. Fd’n刊、ワシントンD.C.）が定義したように、“相同性”または“類似性”には、配列内の許容される保存的アミノ酸の変化が含まれる。
本発明のモルフォゲンとして現在のところ最も好ましい蛋白は、ｈＯＰ−１の保存された６個のシステイン骨格を表すアミノ酸配列（例えば配列番号５の残基４３−１３９）と６０％以上、好ましくは６５％以上の同一性を有するものを含む。これらの最も好ましい配列には、ＯＰ−１およびＯＰ−２蛋白の対立形質変異体および種変異体（ショウジョウバエ６０Ａ蛋白を含む）が含まれる。したがって、本発明のまた別の好ましい特徴では、本明細書で“ＯＰＸ”と呼ばれる一般アミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含有するモルフォゲンを含む。ＯＰＸは７個のシステイン骨格を示し、種々の明らかにされたマウスおよびヒトのＯＰ１およびＯＰ２蛋白間の同一性を有する。OPXは配列番号２９に提示されている。そこに示したように、与えられた位置の各Ｘａａは、マウスまたはヒトのＯＰ１またはＯＰ２のＣ−末端配列（配列番号５−８および／または１６−２３参照）の対応する位置に出現する残基からそれぞれ別個に選ばれる。
ＩＩ．製剤および治療薬の投与方法
モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬は、適切ないずれの方法によっても、好ましくは口内、直腸または他の直接的な投与によって、またそれに代えて全身的投与によって患者に提供することができる。
全身的投与の適切性は、例えば、国際特許出願ＵＳ９２／０７４３２号（WO93/05751）および下記の実施例２で示された乳汁またはヒト血清中の内因性モルフォゲンの検出によって明らかにされる。モルフォゲンが非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、心室内、関節包内、脊椎内、クモ膜下槽内、腹腔内または膣内投与によって提供される場合、このモルフォゲンは好ましくは水溶液部分を含む。この溶液は、所望のモルフォゲンの患者への薬剤送達に加え、また別に患者の電解質と容積バランスに悪影響を与えないように、生理学的に許容できるものである。したがって、モルフォゲンのための水性媒体は、通常の生理学的食塩水（０．８５％ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７−７．４）を含んでいてもよい。モルフォゲン含有水溶液は、例えば０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または０．１％ＨＣｌまたはアセトニトリルを含む５０％エタノールまた同等な溶液にこの蛋白を溶解させて製造することができる。続いて得られた溶液１溶を、例えば燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０容に加えるが、これはさらに、０．１−０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むことができる。得られた溶液は好ましくは十分にボルテックスで攪拌する。所望の場合は、与えられたモルフォゲンに適切な分子を結合させて可溶性を高めることができる。例えば、モルフォゲン蛋白のプロ形は、生理学的溶液に可溶性の蛋白種を含む。実際、内因性蛋白はこの形態で輸送（例えば分泌および循環）されると考えられる。蛋白のこの可溶形は、モルフォゲン分泌細胞の培養液から得ることができる。また別に、可溶種は、成熟二量体（またはその活性フラグメント）と下記（ＩＩ．Ａ．参照）に述べるようにプロドメインの一部または全体とで複合体をつくることによって製剤化してもよい。種々の血清蛋白を含む他の成分もまた有用であろう。
非経口投与用の有用な溶液は、例えば、レミントンの薬学（Remington ’s Pharmaceutical Science）（A. Gennaro編、Mack Pub.刊、1990）に記載されたような製薬分野で周知のいずれかの方法で調製することができる。製剤は、例えばポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）、植物油、水素添加ナフタレンなどを含むことができる。これらモルフォゲンのための潜在的に有用な他の非経口薬剤送達系は、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能輸液系およびリポゾームを含む。非経口的投与用製剤はまた、膣投与用にクトリックアシッド（cutric acid）を含むことができる。
好ましくは、本明細書に記載したモルフォゲンは、直接、例えば局所的に、例えば経口または直腸投与によって、または所望の組織にこの治療製剤を直接適用することによって投与される。治療薬としての蛋白を経口投与することは、殆どの蛋白が哺乳動物の消化系において、血流中にそれらが吸収される前に消化酵素および酸によって分解されやすいので実施されない。しかしながら、本明細書に記載したモルフォゲンは酸耐性およびプロテアーゼ耐性である（例えば米国特許第4968590号参照）。さらに、少なくとも１つのモルフォゲン（ＯＰ−１）は、乳腺抽出物、初乳および５７日令乳汁で明らかにされた。さらに、乳腺抽出物から精製されたＯＰ−１は形態発生的に活性である。特に、この蛋白は、適切なマトリックス材と一緒に標準的なインビボ骨アッセー（例えば米国特許第4968590号に記載）を用いて皮下に埋め込んだとき、哺乳類で軟骨内の骨形成を誘発する。さらに、上記に記載したように、モルフォゲンはまた血流中でも検出される。これらの発見は、経口投与は、患者にモルフォゲンを投与するための実用的な手段であることを示唆している。さらに、本明細書に記載したある種のモルフォゲンの成熟形は溶解度が低いが、一方、乳汁中（および乳腺抽出物、初乳）に見出されるモルフォゲン形は容易に溶解するが、おそらくは無傷の配列のプロドメインの一部または全体と形態発生的に活性な成熟形が結合することによるか、および／または１つまたは２つ以上の乳汁成分との結合によるものであろう。したがって、本明細書で提供される化合物は、インビトロまたはインビボでその溶解度を高めることができる分子と結合させることができる。
口腔粘膜炎の治療には、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬（以下では包括的に“治療薬”という）は、嗽薬と同様な口腔洗浄液として製剤化してもよい。この場合、液体で口内をさっと洗って治療薬が口腔粘膜と接触するようにし、最大限の病巣の治療を得る。または別に、治療薬は、徐々に溶解するトローチまたはロゼンジの一部として製剤化するか、または該治療薬が咀嚼とともに遊離されるように、チューインガムとして適切なガム基材中に拡散させて製剤化してもよい。
粘膜を被覆することができる適切な賦形剤を用いて直接局所に投与することによって、口腔またはＧＩ管の粘膜表面により長時間接触させることが可能である。典型的な例はペクチン含有製剤またはスクラルファート懸濁剤（例えば、カオーペクラートおよびマグネシアミルクで見出されるもの）である。直接投与用製剤はまた、グリセロールまたは粘稠性の高いその他の組成物を含んでいてもよい。粘膜組織表面に粘着し、組織部位に治療薬を保持することができる組織接着薬もまた用いることができる。有用な粘着性組成物には、ヒドロキシプロピル−セルロース含有溶液（例えばオーラベース▲Ｒ▼（Colgate-Hoyt Laboratories製、ノーウッド、マサチューセッツ）に見出されるもの）、またはフィブリノーゲン／トロンビン含有溶液が含まれる。別の有用な接着薬は、米国特許第５１９７９７３号に記載された生体接着剤である。好ましくは、これらの製剤は組織表面に塗布するか、またはエアロゾルとして製剤化し組織表面に噴霧する。非経口投与については、この治療薬は溶解度を高める分子と結合させてもよい。例えば、０．２％のカゼインの添加はＯＰ−１の成熟活性形の溶解度を８０％まで増加させる。別の有用な分子はモルフォゲンプロドメインである。
全ての消化管治療用に、この治療薬はまた摂取のために固形または液体製剤とするか、または吸入剤として製剤化してもよい。腸下部の治療のためには直腸投与用製剤好ましく、座薬、クリーム、ゲル、ローションなども含むことができる。
いずれの適用においても、生体適合性（好ましくは生体再吸収性）ポリマー（例えばヒアルロン酸、コラーゲン、ポリブチレート、燐酸三カルシウム、グリコリド、ラクチドおよびラクチド／グリコリドコポリマーを含む）もまた、インビボでモルフォゲンの遊離を制御するための有用な賦形剤であろう。錠剤またはカプセルは、添加剤、例えば医薬的に許容できる担体（例えばラクトース、コーンスターチ、軽無水珪酸、微晶質セルロース、蔗糖）、結合剤（例えばα型澱粉、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉、低置換ヒドロキシプロピルセルロース）、界面活性剤（例えばトゥイーン８０（Kao-Atlas）、プルロニック（Pluronic）Ｆ６８（アサヒデンカ、日本）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー）、抗酸化剤（例えばＬ−システイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク）などを用いて調製してもよい。
吸入投与用製剤は、賦形剤として、例えばラクトースを含んでいてもよいが、また、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液でもよい。点鼻薬としての投与のためには油状溶液、または経鼻的に適用できるゲルでもよい。直腸投与用製剤はまた、メトキシサリシレートを含むことができる。直腸投与用製剤はまた、医薬的に許容できる非毒性担体または賦形剤を含有する塗布用クリーム、ゲル、座薬、泡沫、ローションまたは軟膏が可能である。生体適合性（好ましくは生体再吸収性）ポリマー（例えばヒアルロン酸、コラーゲン、ポリブチレート、燐酸三カルシウム、ラクチドおよびラクチド／グリコリドコポリマーを含む）もまた、インビボでモルフォゲンの遊離を制御するための有用な賦形剤である。
本明細書で提供される化合物はまた、モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬を消化管障壁組織に誘導することができる分子と結合させてもよい。例えば、抗体、抗体フラグメント、または基底上皮細胞の表面分子と特異的に作用するその他の結合蛋白を用いることができる。有用な誘導分子は、例えば米国特許第５０９１５１３号で開示された単一鎖結合部位技術を用いてデザインすることができる。
上記に記載したように、本明細書で提供されるモルフォゲンは、Ｃ−末端の活性ドメインにおいて顕著な配列相同性を共有する。反対に、プロドメインを特定する配列においては、配列は顕著に異なっていく。したがって、プロドメインはモルフォゲン特異的であると考えられる。上記で述べたように、今日までに明らかにされた種々のモルフォゲンは、異なる組織で異なる発現をする。したがって、どのような理論にも制限されることなく、生体内の自然な状態の下では、おそらく、選ばれたモルフォゲンが一定の組織に典型的に作用するであろう。したがって、溶液中で活性なモルフォゲン形と結合することが明らかにされているプロドメインの一部または全体は、本明細書に記載するモルフォゲンの誘導分子として機能することができる。例えば、プロドメインは、標的組織の１つまたは２つ以上の分子と特異的に作用し、そのプロドメインと結合したモルフォゲンをその組織に誘導することができる。したがって、モルフォゲンを消化管障壁組織に誘導する別の有用な誘導分子は、モルフォゲンプロドメインの一部または全体、特にＧＩ管組織で作用することが分かっている内因性モルフォゲンと通常結合しているプロドメインの一部または全体を含むことができる。上記で述べたように、プロドメインを含むモルフォゲンは、モルフォゲン分泌哺乳類細胞の培養液から得ることができる。また別に、組織標的化モルフォゲンは成熟二量体（またはその活性フラグメント）をプロドメインの一部または全体と複合させることによって製剤化することができる。実施例１では、モルフォゲン発現組織および／またはモルフォゲンの標的組織を明らかにするためのプロトコルを詳述する。
最後に、本明細書で提供されるモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激薬は、単独または消化管潰瘍の治療に有益であることが分かっている他の分子、特に症状緩和補助因子と併用して投与することができる。有用な医薬的補助因子には、鎮痛および麻酔剤（例えばキシロカイン、ベンゾカインなど）：防腐剤（例えばクロロヘキシジン）；抗ウイルスおよび抗黴剤；並びに抗生物質（アミノグリコシド、マクロライド、ペニシリンおよびセファロスポリンを含む）が含まれる。他の潜在的に有用な補助因子には、抗分泌薬（例えばＨ２−レセプター拮抗剤（例えばシメチジン、ラニチジン、ファモチジン、酢酸ロキサチジン））、ムスカリンレセプター拮抗剤（例えばピレンゼピン）および制酸剤（例えば水酸化アルミニウムゲル、水酸化マグネシウムおよび重炭酸ナトリウム）が含まれる。そのような薬剤は、別々にまたはモルフォゲンもしくはモルフォゲン刺激薬を含む治療用組成物の成分として投与できる。
この組成物は、治療的に有効な量でヒトまたは他の哺乳動物に非経口投与または直接投与するために製剤化することができる。この治療的に有効な量は、例えば、患者の消化管管腔内層を病巣形成から保護するために適切な濃度を十分な時間提供するもので、上皮細胞、特にＧＩ管の基底上皮細胞の増殖を制限する量、上記の潰瘍性疾患に付随する炎症を制限する量、さらに、病巣の修復および組織の再生を刺激するために十分な量を含む。
当業者には理解されるように、治療用組成物で詳述する化合物の濃度は、投与されるべき薬剤の用量、用いる薬剤の化学的性状（例えば疎水性の程度）および投与経路を含む、多くの要素によって変動するであろう。投与される薬剤の好ましい用量はまた、潰瘍性疾患の種類や進行の程度、特定の患者の全体的な健康の状態、選択される化合物の相対的な生物学的有効性、合成賦形剤の製剤化、投与経路のような変動要素によっても左右されるであろう。概説すれば、本発明の化合物は、非経口投与には、約０．００１から１０％（ｗ／ｖ）の化合物を含む生理学的な水性緩衝液として提供される。典型的な投与量範囲は、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ体重から約１ｇ／ｋｇ体重、好ましい投与量の範囲は１日当たり約０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重である。最適には、与えられるモルフォゲン用量は、０．１−１００μｇ蛋白／ｋｇ患者体重の間である。投与は１日１回投与か、または複数回投与、例えば口内嗽薬で複数回洗浄する（例えば１日３から４回１分間洗浄）。成熟モルフォゲン（例えばＯＰ−１、２０μｇ）を２１日間連続して正常な成長ラットに毎日投与しても、明瞭な病巣は誘発されない。さらに、正常な新生児マウスに１０日間毎日１０μｇのモルフォゲンを全身的に注射しても、全体的な異常は全く出現しない。
本発明の方法でモルフォゲンを全身的に投与する場合、好ましくは、処置の開始に大容量の負荷投与量が用いられる。その後維持投与量で治療が継続される。その後さらに投与するかは、例えばモルフォゲン特異抗体と標準的免疫アッセー方法を用いて、血中のモルフォゲンレベルをモニターすることによって決定できる。
粘膜の損傷が、例えば化学療法または放射線療法の一部として故意または偶発的に誘発される場合は、モルフォゲンは好ましくは治療の導入前または治療と同時に与えられる。好ましくは、モルフォゲンは治療の一環として予防的に投与される。最適には、与えられるモルフォゲン投与量は、０．１−１００μｇ／ｋｇ患者体重の間である。同様に、モルフォゲンは口内乾燥症または病因に拘わらず免疫不調患者を含む、潰瘍形成の可能性がある者に予防的に投与してもよい。
上記のルートのいずれかによって、内因性モルフォゲンレベルを刺激することができる薬剤の有効量を投与することができる。例えば、ＧＩ管組織細胞におけるモルフォゲン産生および／または該細胞へのモルフォゲン分泌を刺激することができる薬剤を哺乳動物に与えることができる。ある組織における内因性モルフォゲンレベルを調節することができる薬剤を明らかにし、さらにテストする方法を、実施例１０に一般的に記載するが、詳細は国際出願ＵＳ９２／０７３５８号（WO93/04692）に記載されている。さらに、実施例１には、モルフォゲン発現組織を決定するためのプロトコルが記載されている。簡単に記せば、候補化合物を明らかにし、さらに、該化合物を被験組織またはその細胞とインビトロで、該化合物が該組織の細胞によってつくられるモルフォゲンの産生（すなわち発現および／または分泌）に影響を与えることを可能にするために十分な時間培養することによって検査することができる。ここで、適切な組織または該組織の培養細胞はＧＩ管障壁の細胞を含むであろう。例えば、検査用の適切な組織は基底上皮および粘膜から分離された培養細胞などを含む。
現在のところ、候補化合物に曝したときの培養中のモルフォゲンレベルを検定するための好ましい検出手段は、抗体または、モルフォゲンと特異的に反応してモルフォゲンとの複合体の一部分として検出することができる他の適切な結合蛋白を利用する免疫アッセーを含む。免疫アッセーは、当該技術分野で既知の標準的な技術とモルフォゲンに対して産生され該モルフォゲンに特異的な抗体を用いて実施できる。本明細書で記載したように、モルフォゲンは天然に存在する物質から分離するか、またはリコンビナントを用いて産生してもよい。続いて内因性モルフォゲンを刺激することができる薬剤を医薬調製物として製剤化し、本明細書で述べたように投与することができる。
ＩＩ．Ａ．可溶性モルフォゲン複合体
水溶液中で改善された溶解性をもち、本質的にアミノ酸から成る治療薬として有用なモルフォゲンの現在のところ好ましい形態は、モルフォゲン類のプロ領域の一部または全体を含むペプチド複合体を形成していて、モルフォゲン類に特徴的な７個またはそれ以上のシステイン残基のパターンを有する、少なくとも１００個のアミノ酸のペプチド配列を含む二量体の形態発生蛋白、またはその対立形質変異体もしくは種変異体、または他の配列変異体である。好ましくは、二量体の形態発生蛋白は、２つのペプチドと複合している。また、この二量体の形態発生蛋白は、好ましくは、プロ領域ペプチドまたはペプチドと非共有結合的に複合体を形成している。このプロ領域ペプチドはまた、好ましくは、与えられたモルフォゲンのプロ領域を特定するＮ−末端の少なくとも１８個のアミノ酸を含む。最も好ましい具体例では、実質的に全長のプロ領域を特定するペプチドが用いられる。
モルフォゲンの他の可溶形は、これらの蛋白の非切断プロ形の二量体の他、二量体の１つのサブユニットがその蛋白の非切断プロ形で他方のサブユニットがその蛋白の成熟形（その短縮形を含み、好ましくは切断プロドメインペプチドと非共有結合している）を有する“ヘミ−二量体”を含む。
上記で述べたように、有用なプロドメインは全長のプロ領域の他、種々のその短縮形、特に蛋白分解性Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ切断部位で切断された短縮形を含む。例えば、ＯＰ−１では、可能なプロ配列は、残基３０−２９２（全長の形）；４８−２９２；および１５８−２９２により特定される配列を含む。可溶性ＯＰ−１複合体の安定性は、プロ領域が、短縮形（例えば４８−２９２短縮形）よりむしろ全長を有する形を含むとき強化される。この場合、残基３０−４７は、他のモルフォゲンのＮ−末端部分と配列相同性を示し、全てのモルフォゲンについて複合体の安定性を強化する上で特別な有用性をもつと考えられている。したがって、現在のところ、好ましいプロ配列は、与えられたモルフォゲンのためのプロ領域で完全な形をコードするものである。有用であると考えられる他のプロ配列は、生合成プロ配列、特に１つまたは２つ以上のモルフォゲンのプロ配列のＮ−末端部分に由来する配列を取り込んだものを含む。
当業者には理解されるところであるが、プロ領域をコードする有用な配列は、既知のモルフォゲンをコードする遺伝子配列から得られる。また別に、キメラプロ領域は、１つまたは２つ以上の既知のモルフォゲンから構築できる。また別の選択肢は、１つまたは２つ以上の既知のプロ領域配列の合成配列変種を作製することである。
別の好ましい特徴では、有用なプロ領域ペプチドは、ＯＰ−１またはＯＰ−２のためのプロ領域配列のＮ−末端の少なくとも１８個のアミノ酸をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば配列番号１６および２０のそれぞれヌクレオチド１３６−１９２および１５２−２１１）と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸を含有するポリペプチド鎖を含む。
ＩＩ．Ａ１．馴化培地または体液からの
可溶性モルフォゲン複合体の分離
モルフォゲンは、可溶性複合体として哺乳類細胞から発現される。典型的にはしかしながら、この複合体は、精製の間に、一般的には精製溶液にしばしば添加される変性剤（例えば洗剤、アルコール、有機溶媒、カオトロピック剤）および溶液のｐＨを低下させるためにしばしば添加される化合物に曝されることによって解離する。この可溶性たんぱくを馴化培地（または場合によって、血清、脳脊髄液または腹水のような体液）から非変性条件下で精製する、現在のところ好ましいプロトコルが下記に提供される。この方法は、迅速で再現性があり、これによって実質的に純粋な形で分離された可溶性モルフォゲン複合体が得られる。
可溶性モルフォゲン複合体は、変性剤の非存在下で実施される簡単な、３工程のクロマトグラフィープロトコルを用いて馴化培地から分離できる。このプロトコルは、培養液（または体液）をアフィニティーカラムに流し、その後イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを実施する工程を含む。下記に記載するアフィニティーカラムはＺｎ−ＩＭＡＣカラムである。このプロトコルは、種々のモルフォゲンの精製に一般的に応用することができ、全ての場合において、下記に述べるマイナーなプロトコルの修飾によって分離できると期待される。利用性があると考えられるまた別のプロトコルは免疫親和性カラムで、これは、標準的な工程と、例えば与えられたモルフォゲンプロドメイン（これは例えば蛋白Ａ共役セファロースカラムに結合されている）に特異的な抗体を用いて作製された。免疫親和性カラムの開発のためのプロトコルは、当技術分野で周知である（例えば、蛋白精製指針（Guide to Protein Purification M.Deutscher編、アカデミックプレス、サンディエゴ、1990、特にVII章およびXI章参照）。
この実験では、ＯＰ−１は、当技術分野で知られているように（例えば国際出願US90/05903号（WO91/05082）参照）、哺乳類ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、chinese hamster ovary）細胞で発現された。０．５％のＦＢＳを含むＣＨＯ細胞の馴化培地を、初めに固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製した。馴化培地の可溶性ＯＰ−１複合体は、極めて選択的にＺｎ−ＩＭＡＣ樹脂に結合し、結合複合体を効果的に溶出させるためには高濃度のイミダゾル（５０ｍＭイミダゾル、ｐＨ８．０）が必要である。このＺｎ−ＩＭＡＣ工程は、通過流および３５ｍＭイミダゾル洗浄分画で溶出する大量の夾雑血清蛋白から可溶性ＯＰ−１を分離する。次に、Ｚｎ−ＩＭＡＣ精製の可溶性ＯＰ−１を、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）で平衡化したＳ−セファロース陽イオン交換カラムにかけた。このＳ−セファロース工程は、精製をさらにすすめ、その後のゲル濾過工程のための調製物における可溶性ＯＰ−１複合体を濃縮する。この蛋白を、ＴＢＳで平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲカラムにかけた。実質的に同じプロトコルを用いて、可溶性モルフォゲンもまた、血清、脳脊髄液または腹水を含む１つまたは２つ以上の体液から分離できる。
ＩＭＡＣは、カラム容量の３倍量の０．２ＭＺｎＳＯ4でチャージしたキレートセファロース（chelating-Sepharose）（ファルマシア）を用いて行った。馴化培地は、ｐＨ７．０にし、５００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で平衡化したＺｎ−ＩＭＡＣ樹脂に直接適用した。このＺｎ−ＩＭＡＣ樹脂に、樹脂１ｍｌ当たり８０ｍｌの出発馴化培地をロードした。ロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、夾雑蛋白の殆どを平衡化緩衝液中の３５ｍＭイミダゾル（ｐＨ７．０）で溶出させた。続いて、可溶性ＯＰ−１複合体を２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび５００ｍＭＮａＣｌ中の５０ｍＭイミダゾル（ｐＨ８．０）で溶出させる。
可溶性ＯＰ−１複合体を含む５０ｍＭイミダゾル溶出液を９倍量の２０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）で希釈し、５０ｍＭＮａＣｌ含有２０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）で平衡化したＳ−セファロース（ファルマシア）カラムにかけた。樹脂１ｍｌ当たり８００ｍｌ相当の出発馴化培地とともにＳ−セファロース樹脂をロードした。ロードした後、Ｓ−セファロースカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、２０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）中の１００ｍＭＮａＣｌで、続いて３００ｍＭＮａＣｌおよび５００ｍＭＮａＣｌで溶出させた。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、この３００ｍＭＮａＣｌプールをさらに精製した。３００ｍｌＮａＣｌ溶出液の５０ｍｌを、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化した５．０×９０ｃｍセファクリルＳ−２００ＨＲ（ファルマシア）に適用した。このカラムを５ｍｌ／分の流速で溶出させ、１０ｍｌずつ分画採取した。可溶性ＯＰ−１の見かけの分子量は蛋白分子量標準（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ，１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，６９ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ，３０ｋＤａ）、およびチトクロームＣ（ｃｙｔＣ，１２．５ｋＤａ））との比較によって決定した。Ｓ−２００カラム分画の純度は、クーマシーブルーで染色した標準的な１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上での分離によって決定した。成熟ＯＰ−１とそのプロドメインは、標準的な逆相Ｃ１８ＨＰＬＣを用いて成熟ＯＰ−１をそのプロドメインから分離した後、Ｎ−末端配列分析によって決定した。
可溶性ＯＰ−１複合体は、１１０ｋＤａの見かけの分子量で溶出する。このことは、２つのプロドメイン（各々３９ｋＤａ）と結合した１つの成熟ＯＰ−１二量体（３５−３６ｋＤａ）をもつ可溶性ＯＰ−１複合体の予測組成と符合する。最終的な複合体の純度は、適切な分画を１５％ポリアクリルアミド還元ゲルに流すことによって確認することができる。
この複合体成分は、Ｓ−２００またはＳ−２００ＨＲカラムからの複合体含有分画を逆相Ｃ１８ＨＰＬＣカラムに流し、標準的方法を用いてアセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ中）で溶出させることによって確認できる。複合体はこの工程で分離し、プロドメインと成熟種は別々の種として溶出する。続いてこれら分離種は、標準的方法（例えば、蛋白精製指針（Guide to Protein Purification M. Deutscher編、アカデミックプレス、サンディエゴ、1990、特に602-613ページ参照）を用いてＮ−末端配列決定を行い、分離された３６ｋＤ、３９ｋＤａ蛋白の正体は、それぞれ成熟モルフォゲンと分離された切断プロドメインであることを確認することができる。哺乳類細胞産生ＯＰ−１から分離されたプロドメインのＮ−末端配列決定によって、プロ領域の２つの形態、無傷の形（配列番号１６の残基３０で始まる）および短縮形（配列番号１６の残基４８で始まる）を明らかにした。分離された成熟種のポリペプチドサブユニットのＮ−末端配列決定によって、成熟配列のためのＮ−末端の範囲が明らかにされたが、これらは配列番号１６の残基２９３、３００、３１３、３１５、３１６および３１８で始まり、標準的な骨誘発アッセーによって明らかにされたように、それらは全て活性を有していた。
ＩＩ．Ａ２．可溶性モルフォゲン複合体のインビトロ形成
培養培地または体液から可溶性複合体を精製する別の方法として、可溶性複合体は精製プロドメインと成熟二量体種から作ることができる。複合体形成が上手く行われるためには、ジスルフィド結合に影響を与えることなく、これらの分子の折り畳み構造を弛緩させるために十分な変性条件下でこれらの成分を結合させることが必要である。好ましくは、この変性条件は、細胞内小胞の環境を十分に模倣するものであって、これは、折り畳み構造が弛緩した条件の下で、切断プロドメインが成熟二量体種と結合する機会をもつというものである。続いて溶液中の変性剤の濃度を制御しながら、好ましくは段階的減少させ、それによって二量体とプロ領域の適切な再折り畳みを可能にし、一方プロドメインと二量体の結合を維持する。有用な変性剤は、ｐＨ４−１０、好ましくはｐＨ６−８の好ましい溶液中の４−６Ｍ尿素または塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を含む。続いて可溶性複合体は、制御しながら透析を行うことによって、または、変性剤の最終濃度が０．１−２Ｍ未満の尿素またはＧｕＨＣｌ、好ましくは１−２Ｍ尿素またはＧｕＨＣｌを有する溶液に希釈することによって形成される。続いて、これは好ましくは生理学的緩衝液で希釈される。蛋白の精製／再生方法および考察は当技術分野でよく開示されており、適切な再生プロトコル開発の詳細は、当業者によって容易に決定される。この問題の有用な参考書は、蛋白精製指針（Guide to Protein Purification M. Deutscher編、アカデミックプレス、サンディエゴ、1990）の特にV章である。複合体形成は、１つまたは２つ以上のチャペロン蛋白の添加によって促進できる。
ＩＩ．Ａ３．可溶性モルフォゲン複合体の安定性
高度に精製された可溶性モルフォゲン複合体の生理学的緩衝液、例えばトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）および燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）での安定性は、多数の手段のいずれによっても高めることができる。現在のところ好ましいものは、プロ配列の少なくとも最初の１８個のアミノ酸（例えばＯＰ−１のための配列番号１６の残基３０−４７）を含むプロ領域、さらに好ましくは全長のプロ領域を用いるものである。残基３０−４７は、地のモルフォゲンのＮ−末端部分と配列相同性を示し、すべてのモルフォゲンについて複合体の安定性を高めるという特別な有用性をもつと考えられている。可溶性モルフォゲン複合体の安定性を高める他の有用な手段は、３種類の添加剤を含む。これらの添加剤は、塩基性アミノ酸（例えばＬ−アルギニン、リシン、ベタイン）；非イオン性洗剤（例えばトィーン８０またはノニデットＰ−１２０）；および担体蛋白（例えば血清アルブミンおよびカゼイン）を含む。これらの添加剤の有用な濃度は、塩基性アミノ酸については、１−１００ｍＭ、好ましくは１０−７０ｍＭ（５０ｍＭを含む）；非イオン性洗剤については、０．０１−１．０％、好ましくは０．０５−０．２％（０．１％（ｖ／ｖ）を含む）；担体蛋白については０．０１−１．０％、好ましくは０．０５−０．２％（０．１％を含む）を含む。
ＩＩＩ．実施例
実施例１．モルフォゲン発現組織の同定
モルフォゲンの組織分布の決定は、与えられた組織で発現される種々のモルフォゲンを明らかにし、また新規な関連モルフォゲンを明らかにするために用いられる。組織分布はまた、候補モルフォゲン刺激薬をスクリーニングし、同定するために使用する有用なモルフォゲン産生組織を明らかにするために用いることができる。モルフォゲン（またはそのｍＲＮＡ転写物）は、標準的な方法と、モルフォゲンの発現が低い組織ではそれを少し修飾したものを用いて、種々の組織で容易に同定される。例えば、蛋白分布は、標準的なウェスタンブロット分析または免疫蛍光技術、さらにモルフォゲン、問題のモルフォゲンに対する特異抗体を用いて決定することができる。同様に、モルフォゲン転写物の分布は、標準的なノザンハイブリダイゼーションプロトコルおよび転写物特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて決定できる。
転写物と特異的にハイブリダイズし、問題の転写物を他の関連転写物と区別することができるいずれのプローブも用いることができる。本明細書に記載するモルフォゲンは、その活性なＣ−末端ドメインにおいて高い相同性を共有するので、特異的なモルフォゲン転写物の組織分布は、未成熟蛋白のプロ領域に特異的なプローブおよび／または成熟蛋白のＮ−末端領域に特異的なプローブを用いて決定するのが一番よい。別の有用な配列は、終止コドンの直後に隣接する３’非コード領域である。配列のこの部分は、本発明のモルフォゲン間で実質的に変化しており、したがって、各蛋白に特異的である。例えば、特に有用なＶｇｒ−１特異的プローブ配列は、ＰｖｕＩＩ−ＳａｃＩフラグメント（成熟配列の非翻訳プロ領域およびＮ−末端の両方の部分をコードする２６５ｂｐのフラグメント）である（ｃＤＮＡ配列についてはLyonsら、（1989）PNAS 86：4554-4558を参照）。同様に、特に有用なｍＯＰ−１特異的プローブ配列は、ＢｓｔＸ１−ＢｇｌＩフラグメント（ｍＯＰ−１プロ領域の約２／３をカバーする０．６８Ｋｂの配列）；ＳｔｕＩ−ＳｔｕＩフラグメント（７−システインのドメインの直ぐ上流の０．２Ｋｂ配列）：およびＥａｒ１−Ｐｓｔ１フラグメント（３’非翻訳配列の一部分を含む０．３Ｋｂフラグメント）である（配列番号１８を参照。ここではプロ領域は本質的に残基３０−２９１で表されている）。同様な方法が、例えばｈＯＰ−１（配列番号１６）またはヒトもしくはマウスＯＰ−２（配列番号２０および２２）を用いて実施できる。
これらのモルフォゲン特異的プローブ（これらは、合成によって、またはクローニングした配列から得ることができる）を用いて、当業者に既知の標準的方法によって、モルフォゲン転写物を哺乳類組織で同定することができる。簡単に記せば、全ＲＮＡを成獣マウスの種々の組織（例えば肝臓、腎臓、精巣、心臓、脳、胸腺おおび胃）から、例えばコムチャスキーらの方法（Chomczyaskiら、（1987）Ana. Biochem. 162：156-159）および下記に述べたような標準的な方法を用いて調製する。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（例えばタイプ７、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）を用いて調製する。各組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（通常１５μｇ）を１％アガロース／ホルムアミドゲルで分画し、ナイトラン膜（Nytran membrane, Schleicher & Schuell）に移す。移し終わった膜を８０℃で加熱し、ＲＮＡをＵＶ光の下で架橋させる（通常１ｍｗ／ｃｍ2で３０秒）。ハイブリダイゼーション前に、適切なプローブを加熱によって変性させる。ハイブリダイゼーションは、ローラーボトル装置で約１回転／分で回転するルサイト円筒管で、４０％ホルムアミド、５×デンハルツ、５×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション混合物を用いて３７℃で１５時間実施する。ハイブリダイゼーションの後、非特異的カウントをフィルターから０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで５０℃で洗い流す。
発育組織および成獣組織における種々のモルフォゲン（Ｖｇｒ−１、ＯＰ−１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＧＤＦ−１、ＯＰ−２を含む）の組織分布を示す実施例は、国際出願ＵＳ９２／０１９６８号（WO92/15323）および幾つかの文献に開示されている（Ozkaynakら、（1991）Biochem. Biophys. Res. Commn. 179：116-123、Ozkaynakら、（1992）J. Biol. Chem. 267：25220-25227、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。本明細書に記載したこの一般的なプローブによる方法を用いて、脳、脾臓、肺臓、心臓、肝臓および腎臓組織を調べるために、これらモルフォゲンに特異的なプローブによってノザンブロットを実施したところ、腎関連組織がＯＰ−１の主要な発現元で、脳、心および肺組織は第二の発生場所らしいということが示唆された。このプローブ法によってまた、ＯＰ−１ｍＲＮＡは唾液腺、特にラットの耳下腺で同定された。肺組織は、Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ５、ＢＭＰ４およびＢＭＰ３の主要な発現場所で、一方、肝臓はＢＭＰ５の第二の発現場所で、さらに脾臓はＢＭＰ４の第二の発現場所のようである。ＧＤＦ−１は主に脳組織で発現されるようである。今のところ、ＯＰ−２は初期の胎児組織で主に発現されようである。特に、マウス胎児および出生後６日の動物のノザンブロットによって、豊富なＯＰ−２発現は８日令胎児で示される。発現は１７日令胎児で顕著に減少し、出生後の動物では検出されない。
ＯＰ−１特異抗体を用いた免疫局在実験によって、モルフォゲンは、初期の胎児発育の間（妊娠５−１３週）、消化系管状器官の平滑筋の内部環状および外部縦走被覆の両方に局在することが示されたが、このことは、内因性モルフォゲンもまた消化管の組織形態発生における役割を果たしていることを示唆する。
さらに、ラットの組織でのノザンブロット分析（上記のようにｍＯＰ−１特異的標識ヌクレオチドフラグメントで調べた）によって、発育ラットの消化管組織（胃、十二指腸、および腸組織を含む）でＯＰ−１ｍＲＮＡが同定された。これらのデータは、モルフォゲンはＧＩ管の組織で発現され、作用することを示している。
実施例２．体液中の活性モルフォゲン
ＯＰ−１発現は唾液中（特にラット耳下腺、実施例１参照）、ヒト血清および種々の乳汁形（乳腺抽出物、初乳および５７日令ウシ乳汁）で明らかにされた。さらに、また国際出願ＵＳ９２／０７４３２号（WO93/05751）にも記載されたように、体液抽出蛋白は形態発生的な活性を有する。モルフォゲンは天然には乳汁および唾液に存在するという発見は、活性な成熟ＯＰ−１は酸耐性でプロテアーゼ耐性であるという知見とともに、口腔投与は、哺乳動物に対して治療のためのモルフォゲン投与経路として有用であることを示唆している。典型的には、口腔投与は、広範囲で予防的な治療のための好ましい送達態様である。さらに、初乳を含む全ての乳汁形態でモルフォゲンが認められたことは、この蛋白は組織の発育（幼年期の骨格の発育を含む）に重要な役割を果たしている可能性を示唆する。
２．１乳汁中のモルフォゲン検出
ＯＰ−１は、ラットの乳腺抽出物、ウシ初乳、および５７日令乳汁から、これらの液を一連のクロマトグラフィーカラム（例えば、陽イオン交換、アフィニティーおよび逆相）を通すことによって部分的に精製した。各工程で、溶出液を分画採取し、これらを標準的な免疫ブロットによってＯＰ−１の存在について調べた。続いて、免疫反応を示す分画を一緒にし、さらに精製した。その後最終的な部分精製産物を、ＯＰ−１特異抗血清を用いてウェスタンブロット分析によってＯＰ−１の存在を調べ、さらにインビボおよびインビトロ活性について検査した。
種々の乳汁源から精製したＯＰ−１の性状を、ＯＰ−１およびＢＭＰ２に対して産生させた抗体を用いてウェスタンブロットで調べた。抗体は、当技術分野で周知の標準的な免疫プロトコルと、下記の実施例１５で一般的に記載するように免疫原として全長の大腸菌産生ＯＰ−１およびＢＭＰ２を用いて調製した。全ての事例において、精製ＯＰ−１は抗ＯＰ−１抗体とのみ反応し、抗ＢＭＰ２抗体とは反応しなかった。
乳腺抽出物から精製したＯＰ−１の形態発生的活性は、本質的には米国特許第４９６８５９０号（これは参照により本明細書に含まれる）に記載されたラットのモデルアッセーにしたがって、インビボで検定した。簡単に記せば、サンプルは、乳腺抽出物由来ＯＰ−１の最終産物の各ＯＰ−１免疫反応性分画から分画の一部分（３３％）を凍結乾燥し、２２０μｌの５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ中にこの蛋白を再懸濁して調製された。ボルテックスで攪拌後、２５ｍｇのコラーゲンマトリックスを添加した。サンプルを一晩凍結乾燥し、ロングエバンス（Long Evans）ラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ、２８−３５日令）に埋め込んだ。各分画は２つを１組として埋め込んだ。コラーゲンマトリックスの移植の詳細については、例えば、米国特許第４９６８５９０号（これは参照により本明細書に含まれる）を参照されたい。１２日後、移植物を除去し、米国特許第４９６８５９０号に記載されたように組織学的検査によって新規な骨の形成を調べた。全ての事例で、免疫反応性分画は骨発生的な活性を有していた。
２．２血清でのモルフォゲン検出
モルフォゲンは、モルフォゲン特異的抗体を用いて血清中で検出できるであろう。このアッセーは、いずれの標準的な免疫アッセー、例えばウェスタンブロット（免疫ブロット）などを用いても実施できる。好ましくは、アッセーはアフィニティーカラムを用いて実施される。このカラムにモルフォゲン特異的抗体を結合させ、続いて血清を注入し、問題のモルフォゲンを選択的に抽出する。このモルフォゲンはその後溶出される。適切な溶出緩衝液は、まず初めにコントロール（例えば組換え体によって産生された精製モルフォゲン）で適切な結合と溶出条件を決定することによって経験的に定めることができる。続いて標準的な免疫ブロットによってモルフォゲンの存在について分画を調べ、その結果をＮ−末端配列決定によって確認する。好ましくは、アフィニティーカラムは単クローン抗体を用いて調製される。続いて、血清または他の液体サンプル中のモルフォゲン濃度を、標準的な蛋白定量技術（分光光度計吸収または結合抗体の定量を含む）を用いて決定できる。
下記に提示したものは、血清中のＯＰ−１を同定するための見本のプロトコルである。この一般的な方法にしたがって、他のモルフォゲンも血清を含む体液において検出できる。血清中のモルフォゲンの同定によって、さらに、全身的投与は、治療濃度のモルフォゲンを患者に提供するために適切な手段であり、モルフォゲンは内分泌様因子として全身的に作用するようであることが示唆される。最後に、このプロトコルを用いて、内因性モルフォゲンレベルの変動を検出することができ、これらのレベル変動は、組織の機能不全のインジケーターとして用いることができる。また別に、モルフォゲンレベルの変動は、実施例１で述べた標準的なノザンブロット分析または、モルフォゲンｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる標識プローブと当技術分野で周知でありさらに実施例１で一般的に述べた標準的なＲＮＡハイブリダイゼーションプロトコルを用いたインサイチュウハイブリダイゼーションのいずれかによって、モルフォゲンの転写レベルをモニターすることによって算定できる。
ＯＰ−１は、以下のアッセーを用いてヒト血清中で検出された。組換え体によって産生された哺乳類ＯＰ−１に対して、当技術分野で周知であり、さらに実施例１５で一般的に述べる標準的免疫技術によって作製した単クローン抗体を、アガロース活性化ゲル（例えばＡｆｆｉ−ＧｅｌTM、バイオラッドラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア、製造元の指示にしたがって調製）にこの抗体を通すことによって固定し、血清からのＯＰ−１を精製するために用いた。続いて、ヒト血清をこのカラムに通し、３ＭのＫ−チオシアネートで溶出させた。その後、Ｋ−チオシアネート分画を、６Ｍ尿素、２０ｍＭＰＯ4、ｐＨ７．０中で透析し、Ｃ８ＨＰＬＣカラムにかけ、さらに、２５−５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配、２０分で溶出させた。組換え体によって産生された成熟ＯＰ−１同種二量体は２０−２２分の間に溶出するので、その後これらの分画を採取し、ＯＰ−１特異的抗体を実施例２．Ａ．のように用いて標準的免疫ブロットによってＯＰ−１の存在について検査した。
例えば治療プロトコルなどの有効性を調べるために、投与されたモルフォゲンまたは内因性モルフォゲンのレベルを、体液サンプル中に存在するモルフォゲン量と予め決定しておいたレファレンス値と比較することによって本明細書に記載した治療においてモニターすることができる。さらに、抗体または内因性モルフォゲン抗体と特異的に反応することができる他の結合蛋白を用いて、（おそらくは血清中の）内因性モルフォゲン抗体レベルにおける変動もこの方法によって検出できるであろう。モルフォゲンまたは内因性モルフォゲン抗体レベルにおいて検出される変動は、例えば組織の状態の変化のためのインジケーターとして用いることができる。例えば、損傷組織が再生し、その組織または器官の機能が“正常”な状態に回復するにつれ、さらに組織の損傷が加わらなければ、少量のモルフォゲン投与量が必要とされ、より高レベルの循環モルフォゲン抗体が測定されるかもしれない。
実施例３．口腔粘膜炎のモルフォゲン治療
口腔粘膜膜炎は、例えば放射線療法または化学療法の結果として口腔の潰瘍形成を伴う。潰瘍性粘膜炎の過程は、破壊相と治癒相に分けられる。口腔上皮の基底層細胞は急速に分裂するので、それらは、化学療法の抗有糸分裂的な毒性作用に感受性を有する。結果として、萎縮性の変化が生じ、その後潰瘍が形成される。これは破壊相を構成する。潰瘍形成の後、病巣は治癒相の間にゆっくりと消散する。
下記の実施例は、ハムスターモデルにおいて、口腔粘膜炎から口腔粘膜を保護する（潰瘍形成の抑制および潰瘍組織の再生強化の両方を含む）モルフォゲンの有効性を明らかにする。詳細なプロトコルはソニスらの文献に記載されている（Sonisら、（1990）Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol 69：437-443、この文献は参照により本明細書に含まれる）。簡単に記せば、ゴールデンシリアンハムスター（６−８週令、チャールズリバーラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ）を３つのテスト群に分けた：群１、偽薬（例えば食塩水）コントロール；群２、モルフォゲン低投与量（１００ｎｇ）；群３、モルフォゲン高投与量（１μｇ）。モルフォゲン投薬は３０％エタノールで実施した。各群は１２匹の動物を含む。
０日に開始し５日まで続けた。群２および３は１日に２回モルフォゲン投与を実施した。３日目に全群に粘膜炎誘発工程を開始した。５−フルオロウラシルを３日目（６０ｍｇ／ｋｇ）および５日目（４０ｍｇ／ｋｇ）に腹腔内注射した。７日目に、右の頬袋の粘膜に口径測定１８ゲージ針で表面に浅く炎症を起こさせた。未処置動物では、１０日目までに重篤な潰瘍性粘膜炎が少なくとも８０％の動物で誘発された。
賦形剤コントロール（偽薬）またはモルフォゲンの投与では、まず最初に、頬袋の粘膜を穏やかに乾燥させ、続いて粘膜表面上に賦形剤またはモルフォゲン物質を平均して適用することによって実施した。ヒドロキシプロピルセルロースを基剤とした被覆を用いて、粘膜とモルフォゲンとの接触を維持した。
１２日目に、各群２匹の動物を組織学的検査のために殺処分した。標準的な解剖組織学の方法を用いて、右の頬袋の粘膜とその下の結合組織を切開し、１０％ホルマリンで固定した。標本をパラフィンに封入し、組織学的検査用に調製した。続いて切片をヘマトキシリンとエオジンで染色し、ハムスターの組織学に専門知識をもつ３人の口腔病理検査技師が盲検的に検査し、標準的な粘膜炎パネルに思考に頼らないでスコアーを記録した。萎縮の範囲、細胞性炎症、結合組織の崩壊、潰瘍形成の程度および上皮化の程度が調べられた。
２１日間、各群の平均的粘膜炎スコアーを、各実験群について右頬袋の写真撮影と肉眼検査によって毎日求めた。群間の違いは、スチューデンツ“ｔ”検定を用いて決定した。さらに、データは、カイ平方統計分析を用いて重篤な粘膜炎をもつ動物の数を比較することによって群間で調べた。また毎日の体重平均の違いの有意性ももとめた。
実験結果は図１および図２に示す。図１のグラフは、モルフォゲンの効果（高投与量、四角；低投与量、ダイヤモンド形）および偽薬の効果（丸）を粘膜炎の平均スコアーで示している。低および高モルフォゲン投与量の両方とも、用量依存的態様で病巣形成を顕著に抑制する。図２（ＡおよびＢ）は、１４日目の頬袋の顕微鏡写真であるが、（Ｂ）は高投与量モルフォゲンで前処置されたもの、（Ａ）は食塩水単独処理である。顕著な組織の壊死（組織内の暗いエリアで示される）と潰瘍形成（組織内の明るい円形エリアで示される）が図２Ａの未処置頬で明瞭である。対照的に、図２Ｂのモルフォゲン処置組織は、壊死がなく潰瘍形成も殆どないか、または全く認められない健常な組織を示している。さらに、組織学的結果は、組織の萎縮、細胞残屑および免疫エフェクター細胞（活性化マクロファージおよび好中球を含む）が、未処置のコントロール動物と比較してモルフォゲン処置動物では、常に、顕著に減少することを示している。
このプロトコルの類型を用いて、モルフォゲンはまた、粘膜炎誘発の前に数日間毎日、および／または５−フルオロウラシル治療の後より長期にわたって投与できる。
実施例４．十二指腸の潰瘍形成のモルフォゲン治療
以下の実施例は、十二指腸の潰瘍形成治療におけるモルフォゲンの有効性を示すラットモデルを提供する。このプロトコルの詳細な記載はピランらの文献によって提供される（Pilanら、（1985）Digestive Diseases and Sciences 30：240-246、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
簡単に記せば、雌のスプラーグドーリーラット（例えば、チャールズリバーラボラトリーズ産、１５０−２００グラム）に十二指腸潰瘍原システアミン−塩酸を２５−２８ｍｇ／１００ｇ体重で胃内カニューレにより同一日に３回与えた。さらに、システアミン−塩酸の投与によって生じる死亡率を低下させるために５ｍｇ／ｋｇ体重のコーチゾルを一回各ラットの皮下に投与する。
システアミン−塩酸の投与後３日に、貫入性および穿孔性十二指腸潰瘍をもつラットを標準的な開腹術によって認定し、コントロールとモルフォゲン処置群に任意抽出した。
群１のラット（全て潰瘍を有する）にはモルフォゲンを与えず、食塩水のみで処置する。群２のラット（全て潰瘍を有する）には、５０−１００ｎｇ／１００ｇｍ体重のモルフォゲンを与える。群３のラット（全て潰瘍を有する）には、２００−５００ｎｇ／１００ｇｍ体重のモルフォゲンを与える。全ての処置は、２１日目の剖検まで毎日２回胃内カニューレによって実施される。剖検時に潰瘍を測定し組織切片を作製する。
モルフォゲン処置動物の十二指腸切片の組織所見は、十二指腸潰瘍および／または治癒潰瘍に付随する組織損傷の減少を示すことが確信される。さらにまた、潰瘍形成前または形成と同時にモルフォゲンで処置することによって、潰瘍形成の抑制および／または付随する組織損傷の減少がもたらされるであろうと期待される。
実施例５．モルフォゲン処置ラットの胃酸およびペプシン分泌
以下の実施例は、胃酸およびペプシン分泌によって決定されるモルフォゲンの有効性を明らかにする。このプロトコルの詳細な記載は上記のピランらの文献に開示されている。簡単に記せば、１８−２０匹のラットを２群、コントロール群（群１）およびモルフォゲン処置群（群２）に分ける。
全ラットは２４時間給餌を断ち、食塩水賦形剤単独（群１）またはモルフォゲン（５００ｎｇ／ｍｌ、群２）の何れかを与える。続いて１時間、幽門結紮によってラットの胃を収縮させる。
群１および２の各ラットから胃液を採取し、遠心して一部分酸定量のために処理し、胃酸放出とペプシン測定を算定する。胃酸は胃液の酸性度によって測定され、ペプシンレベルは当技術分野で周知の標準的プロテアーゼアッセーにしたがって決定される。ペプシンは胃内で最も豊富なプロテアーゼであるので、総合的なプロテアーゼレベルはペプシンレベルの良好な測定法である。胃液の部分標本を、基質としてアルブミンを用いて分光光度計によって分析する（S. Szaboら、（1977）Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 16：311-323、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
コントロールとモルフォゲン処置ラットの両方において、正常レベルの胃ペプシン放出と胃液容積が測定される。ＧＩ管潰瘍のモルフォゲン処置は、ＧＩ管内の胃酸またはペプシンの正常レベルに影響を与えないであろうと期待される。
実施例６．潰瘍性大腸炎のモルフォゲン治療
潰瘍性大腸炎は大腸の潰瘍を伴う。下記の実施例は、モルモットモデルを用いた潰瘍性大腸炎の治療におけるモルフォゲンの有効性を明らかにする。このプロトコルの詳細な記載はオンデルロンクらの論文で提供される（Onderdonkら、（1979）Amer. J. Clin. Nutr. 32：258-265、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
簡単に記せば、モルモット（例えば５００−５５０ｇ、チャールズリバーラボラトリーズ）を３つの実験群に分ける。各群は複数の動物を含む：群１はコントロール、これは飲み水として蒸留水が与えられる；群２は１％の分解カラゲニンを含む蒸留水が与えられる；群３は飲み水として５％分解カラゲニン含有蒸留水が与えられる。分解カラゲニンはレッドシーウィード由来の多糖類で（グラクソラボラトリーズ、パリ、フランス）、モルモットで潰瘍性大腸炎の誘発物質であることが知られている。
大腸炎の発達は幾つかの基準を用いて決定される：１）ゆるい、および／または肉眼検査で血液を含む便、２）ヘモカルトデベロッパー（Helena Labs、ブモント、テキサス）でのカラスクリーン（Coloscreen）IIIを用いた便の潜出血の検出、３）体重減少。
２５日目に各動物を、ケタミン（３−５ｍｇ／ｋｇ）の筋注で麻酔し、小さな鼻孔鏡を用いて３ｍｍの結腸直腸粘膜の生検を得る。全ての標本を１５％ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンとエオジンを用いて組織学的に調べた。潰瘍性大腸炎の病理診断は、膿瘍嚢、リンパ球浸潤、固有層の毛細管鬱血、大腸粘膜の潰瘍形成の存在によって決定される（Onderdonk（1985）Digestive Disease Science 30：40（s）、この文献は参照により本明細書に含まれる）。潰瘍性大腸炎の重篤度は、０から３の規模で等級付けされ、標準的な得点系（Onderdonkら、（1979）Amer. J. Clin. Nutr. 32：258）にしたがって病理学指標として示される。
３０日目に、組織学的に潰瘍性大腸炎が明確なモルモットの２５％をモルフォゲンで処置し、残りの２５％にはコントロールとして蒸留水を与えた。モルフォゲンは、半分のモルモットには低用量（例えば１００ｎｇ／１００ｇ）で、半分には高用量（例えば５００−１０００ｎｇ／１００ｇ）で、３ｍｍの球根状注射針で１０日間（２８日目−３７日目）１日２回経口的に投与された。
処置の間、動物を臨床的に調べ、体重の改善、一定の排便および便の血液の減少および消失を記録した。３７日目に全ての動物を過剰量のベントバルビタール（＞２００ｍｇ／ｋｇ）で殺処分し、組織学的検査のために結腸全体を摘出した。モルフォゲン処置動物の大腸潰瘍に付随する組織損傷は減少し、および／または未処置潰瘍と比べ、潰瘍は顕著に修復され治癒されるであろうと確信される。
実施例７．モルフォゲンの上皮細胞増殖の抑制
本実施例は、上皮細胞の増殖をインビトロで抑制するモルフォゲンの能力を示す。これはミンクの肺上皮細胞株（ATCC No. CCl 64、ロックビル、メリーランド）の培養細胞および、標準的な哺乳類細胞培養方法を用いて3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定された。簡単に記せば、細胞を互いに合流し合うまで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２００単位／ｍｌのペニシリンおよび２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖させ、さらに細胞濃度を２０００００細胞／穴で４８穴（ウェル）の培養プレートに播種するために用いる。この培養が互いに合流し合うようになったとき、培養液を１％ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンを含む０．５ｍｌのＥＭＥＭに交換し、さらに培養を２４時間３７℃で保温した。５％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中のモルフォゲン被験サンプルをウェルに添加し、さらに１８時間細胞を保温した。保温後、１０μｌ中の3Ｈ−チミジンの１０μＣｉを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で４時間保温した。続いて、培養液を除去し、細胞を氷冷燐酸緩衝食塩水で１回洗浄し、さらに、０．５ｍｌの１０％ＴＣＡを各ウェルに添加して室温で１５分保温することによってＤＮＡを沈澱させた。続いて、細胞を氷冷蒸留水で３回洗浄、０．５ｍｌの０．４ＭＮａＯＨで溶解させ、各ウェルの溶解物を続いてシンチレーションバイヤルに移して、シンチレーションカウンター（スミス−クラインベックマン）で放射能活性を記録した。
結果は、図３Ａおよび３Ｂに示す。調べた種々のモルフォゲンの抗増殖作用は、ＤＮＡに組み込まれた3Ｈ−チミジンのカウント（×１０００）として表した。この実施例では、生合成構築物ＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７を２列１組としてテストした：ＣＯＰ−７−１（１０ｎｇ）およびＣＯＰ−７−２（３ｎｇ、図３Ａ）、およびＣＯＰ−５−１（６６ｎｇ）およびＣＯＰ−５−２（１６４ｎｇ、図３Ｂ）。モルフォゲンは、未処置細胞（陰性コントロール）およびＴＧＦ−β（１ｎｇ）（局所作用性因子で、また上皮細胞増殖を抑制することが知られている）で比較された。ＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７は、以前に骨発生活性を有することが示され、標準的なラット骨アッセー（米国特許第5011691号参照）で軟骨形成をもたらす完全な一連の生理的過程を誘発することができる。図で明らかなように、モルフォゲンは、顕著に上皮性細胞の増殖を抑制する。ＣＯＰ−１６およびｈＯＰ（骨を用いて精製した骨形態発生蛋白、ＣＢＭＰ２およびＯＰ−１を含む二量体蛋白）およびリコンビナントＯＰ−１を用いて実施した同様な実験でも、細胞増殖は抑制された。ｈＯＰ−１およびＣＯＰ１６はまた軟骨形成を誘発する（米国特許第4968590号参照）。
実施例８．モルフォゲンの細胞性および液性炎症反応の抑制
本明細書で述べるように、モルフォゲンは、単核食細胞が正常に活性化される条件（例えば組織の損傷または外来物質の存在に対して反応する）下で、これら細胞の多核形成を抑制する。例えば、そして国際出願ＵＳ９２／０７３５８号（WO93/04692）にも記載されたように、例えば石化骨、酸化チタンのようなセラミック、または多核巨細胞形成を惹起する他のいずれかの基質から成る移植（例えば皮下移植）基質材は、モルフォゲンの非存在下では急速に多核巨細胞（例えば外来物質に反応しこれを破壊するために刺激された活性化食細胞）に囲まれる。しかしながら、モルフォゲンの存在下では、補充されたこれらの細胞はその単核前駆細胞形のままであり、マトリックス材は妨害されない。したがって、ＧＩ管管腔内層の完全性を維持するというモルフォゲンの作用は、これら免疫エフェクター細胞の活性抑制を含む。
さらに、本明細書に記載するモルフォゲンはまた、哺乳類での外来抗原に対する反応で刺激される抗体産生も抑制する。特に、ウシの骨コラーゲンマトリックスをラットの骨部位に単独で移植したとき、標準的な抗ウシコラーゲンＥＬＩＳＡ試験で測定（移植後４週間隔で（例えば１２および２０週）採血した血液サンプルで実施）すると、コラーゲンに対する標準的な抗体反応が刺激された。血清の抗コラーゲン抗体価（ナグラー−アンダーソンら（Nagler-Andersonら、（1986）PNAS 83：7443-7446、この文献は参照により本明細書に含まれる）の記載した方法に基本的にしたがってＥＬＩＳＡで測定）は、実験の間ずっと持続的に増加した。しかしながら、マトリックスをモルフォゲン（例えば、ＯＰ−１、基本的に米国特許第4968590号に記載されたようにマトリックス上に分散させそれに吸着させた）とともに移植したとき、抗ウシコラーゲン抗体の産生は顕著に抑制された。液性反応を抑制するというこのモルフォゲンの活性は、ＧＩ管潰瘍形成に付随する組織の損傷を緩和するうえで、モルフォゲンの有用性をさらに立証するものである。
実施例９．線維化と瘢痕組織形成におけるモルフォゲンの影響
本明細書に記載するモルフォゲンは、損傷または消失組織の組織形態発生を誘発する。モルフォゲンのこれらの蛋白の新しい組織を再生させる能力は、これら蛋白の抗炎症作用を高める。以下に、モルフォゲンの間葉性細胞の遊走と蓄積を誘発する能力を明らかにする一連のインビトロ実験を示す。さらに、この実験は、ＴＧＦ−βと異なり、モルフォゲンは線維化または瘢痕組織形成を刺激しないことを示す。特に、モルフォゲンは、コラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはメタロプロテイナーゼ（このすべては線維化または瘢痕組織形成に付随する）の主要な繊維芽細胞における産生を刺激しない。対照的に、ＴＧＦ−β（繊維症の誘発物質として知られるが、本明細書で定義したように組織の形態発生は誘発しない））は、線維症のこれらのマーカーの産生を刺激する。
間葉性原始細胞の走化性および遊走は、基本的にファーバらの記載（R. A. Favaら、（1991）J. Exp. Med. 173：1121-1132、この文献は参照により本明細書に含まれる）にしたがって、原始好中球、単球および線維芽細胞の遊走を測定するために、２、３および８ミクロンの出入口をもつポリカーボネートフィルターを用いて改造ボイデンチャンバーで測定した。走化性は、ある範囲のモルフォゲン濃度、例えば１０-20Ｍから１０-12ＭのＯＰ−１で測定した。原始好中球および単球については、１０-18−１０-17ＭのＯＰ−１は常に最大の遊走を誘発し、さらに原始線維芽細胞については、１０-14−１０-13ＭのＯＰ−１は最大の遊走を誘発した。全ての場合で、走化性活性は抗ＯＰ−１抗体で抑制できた。同様な遊走活性は、ＴＧＦ−βでも測定され認められた。
線維化におけるモルフォゲンの作用は、ＨＡ、コラーゲン、コラゲナーゼおよびメタロプロテイナーゼの組織抑制物質（ＴＩＭＰ）の線維芽細胞産生を調べることによって決定した。
ヒトの線維芽細胞は、幼児の包皮の体外移植片から確立され、標準的な培養方法（例えば（1976）J. Exp. Med. 144：1188-1203参照）を用いて単層培養として維持された。簡単に記せば、線維芽細胞を、非必須アミノ酸、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、ＮａＨＣＯ3およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（１μｇ／ｍｌ）および９％熱不活化ＦＣＳを補充したイーグルＭＥＭから成る維持培養液で増殖させた。走化性を測定するために標的細胞として用いる線維芽細胞は、直径１５０ｍｍのガラス製ペトリ皿で維持した。コラーゲン、ヒアルロン酸、コラゲナーゼおよびＴＩＭＰの合成を測定するためのアッセーで用いる線維芽細胞は、直径１００ｍｍのプラスチック製培養用ペトリ皿で増殖させた。
ヒアルロン酸、コラーゲン、コラゲナーゼおよびＴＩＭＰの線維芽細胞産生におけるモルフォゲンの影響は、標準アッセーで決定した（例えば、Posttewaiteら、（1989）J. Clin. Invest. 83：629-636、Posttewaiteら、（1988）J. Cell Biol. 106：311-318およびClarkら、（1985）Arch. Bio-chem Biophys. 241：36-44参照、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。これらのアッセーのために、線維芽細胞は２４穴組織培養プレートに８×１０4細胞／ウェルの濃度で移した。線維芽細胞は９％ＦＣＳを含む維持培養液で７２時間細胞が合流するまで増殖させ、続いて血清無添加維持培養液で２４時間培養した。その後、培養液を各ウェルから除去し、５０μｌＰＢＳ中の種々の濃度のＯＰ−１（リコンビナントによって産生された成熟または可溶形）またはＴＧＦ−β−１（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス）を３列１組として、互いに合流した単層の線維芽細胞を含むウェルに加えた。コラゲナーゼとＴＩＭＰの産生を測定する実験については、５％ＦＣＳを含む維持培養液（４５０μｌ）を加え、培養上清を各ウェルから４８時間後に採取し、アッセーまで−７０℃で保存した。ＨＡ産生を測定する実験のためには、２．５％ＦＣＳを含む維持培養液（４５０μｌ）を各ウェルに添加し、４８時間増殖させた。線維芽細胞のコラーゲン産生を測定する実験のためには、非必須アミノ酸を含まない血清無添加維持培養液（４５０μｌ）を各ウェルに加え、７２時間培養した。線維芽細胞のＨＡ産生は、新規に合成されるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を〔3Ｈ〕−アセテートで最後の２４時間の培養して標識し、特異的にヒアルロン酸を分解するストレプトマイセス・ヒアルロリチクス（Streptomyces hyalurolyticus）由来ヒアルロニダーゼ（ICNバイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ）で保温したあと遊離する放射能活性を定量することによって測定した。線維芽細胞による全コラーゲン産生は、最後の２４時間の培養で新たに合成されるコラーゲンへの〔3Ｈ〕−プロリン取り込みを反映するコラゲナーゼ感受性蛋白アッセーを用いて測定した。繊維芽細胞培養上清のコラゲナーゼおよびＴＩＭＰ蛋白レベルは特異的なＥＬＩＳＡによって測定した。
図４に示したように、ＯＰ−１は、ＴＧＦ−βと比較してコラーゲンまたはＨＡ産生を刺激しない。図では、パネルＡはコラーゲン産生におけるＯＰ−１の影響を示し、パネルＢはコラーゲン産生におけるＴＧＦ−βの影響を示し、パネルＣおよびＤはＨＡ産生におけるＯＰ−１（パネルＣ）およびＴＧＦ−β（パネルＤ）の影響をそれぞれ示している。モルフォゲンの結果は用いたＯＰ−１が可溶形であるか成熟形であるかに拘わらず同じであった。対照的に、ＴＧＦ−β潜在形（例えばＴＧＦ−βのプロドメイン付随形）は活性を示さなかった。
実施例１０．内因性モルフォゲンレベルを変化させる候補化合物のスクリーニングアッセー
与えられたモルフォゲンのレベルに影響を与えるために投与できる候補化合物は、以下のスクリーニングアッセーを用いて見出すことができる。このアッセーでは、測定可能なレベルのモルフォゲンを産生する細胞タイプによるモルフォゲン産生レベルを測定するが、この細胞に対する化合物の影響を算定するために化合物の非存在下または存在下でこの培養細胞を保温する。これは、蛋白レベルまたはＲＮＡレベルのいずれかでモルフォゲンを検出することによって達成できる。より詳細な記載はまた国際出願ＵＳ９２／０７３５９号（WO93/05172）で見出すことができる。
１０．１培養細胞の増殖
腎臓、副腎、膀胱、脳または他の器官の細胞培養は、広く文献に記載されているように調製できる。例えば、腎臓は、新生児、若年または成獣のゲッ歯類（マウスまたはラット）から体外移植片として取り出し、全体または切片として器官培養に用いることができる。腎臓、副腎、膀胱、脳、乳腺または他の組織に由来する初代組織培養および確立細胞株はまた、通常の細胞培養技術にしたがってマルチウェルプレート（６穴または２４穴）で得ることができ、さらに、一定期間（１−７日間）血清の非存在下または存在下で培養される。細胞は、例えば、血清（例えば１−１０％のウシ胎児血清（ギブコ製））を含むダルベッコーの修飾イーグル培地（ギブコ製、ロングアイランド、ニューヨーク）、または所望の場合は血清由来培養液、または限定培養液（例えば、インシュリン、トランスフェリン、グルコース、アルブミンまたは他の成長因子を含む）中で培養できる。
モルフォゲン産生レベルをテストするサンプルは、周期的に採取した培養上清または細胞溶解物を含み、免疫ブロット分析（分子クローニング：実験室マニュアル、第2版、サンブルック(Sambrook)ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版部、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)）によってＯＰ−１の産生を調べるか、または細胞培養自体の一部を周期的に採取し、ＲＮＡ分析のためにポリＡ+ＲＮＡを調製するために用いてもよい。ＯＰ−１の新規合成をモニターするために、いくつかの培養を35Ｓ−メチオニン／35Ｓ−システイン混合物で６−２４時間通常の方法で標識し、続いて、通常の免疫沈澱方法によってＯＰ−１合成を評価する。
１０．２形態発生蛋白レベルの測定
細胞タイプによる形態発生蛋白の産生を定量するために、該蛋白に特異的な多クローン性抗体または単クローン性抗体を用いて免疫アッセーを実施し、モルフォゲンを検出することができる。例えば、ＯＰ−１は、ＯＰ−１特異的多クローン性抗体を用いて以下のようにＥＬＩＳＡで検出することができる。
ＯＰ−１に特異的なアフィニティー精製多クローン性ウサギＩｇＧの１μｇ／１００μｌを９６穴プレートの各ウェルに加え、３７℃で１時間保温する。ウェルを、０．１％トゥイーン２０を含む０．１５ＭＮａＣｌ＋０．１６７Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（ＢＳＢ）、ｐＨ８．２で４回洗浄する。非特異的結合を最小にするために、ＢＳＢ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で完全にウェルを満たし、３７℃で１時間保温することによってウェルを遮断する。続いて、ウェルを０．１％トゥイーン２０を含むＢＳＢで４回洗浄する。細胞培養上清の各被験サンプルの適切な希釈の部分標本１００μｌを各ウェルに３列１組で添加し、３７℃で３０分保温する。保温後、１００μｌのビオチン化ウサギ抗ＯＰ−１血清（保存溶液は約１ｍｇ／ｍｌで、１％ＢＳＡ含有ＢＳＢで使用前に１：４００に希釈する）を各ウェルに添加し、３７℃３０分保温する。続いてこのウェルを０．１％トゥイーン２０含有ＢＳＢで４回洗浄する。１００μｌのストレプアビジン−アルカリホスファターゼ（サザンバイオテクノロジーアソシエーツ社製、バーミンガム、アラバマ、使用前に０．１％トゥイーン２０含有ＢＳＢで１：２０００に希釈）を各ウェルに添加し、３７℃３０分保温する。プレートを０．５Ｍトリス緩衝液食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．２で４回洗浄する。５０μｌの基質（ＥＬＩＳＡアンプリケーションシステムキット、ライフテクノロジーズ社製、ベセスダ、メリーランド）を各ウェルに添加し、室温で１５分保温する。続いて５０μｌの増幅物質（同じ増幅システムキット）を添加してさらに１５分室温で保温する。反応は５０μｌの０．３Ｍ硫酸を添加して停止させる。各ウェルの溶液の４９０ｎｍでのＯＤを記録する。培養液のＯＰ−１を定量するために、被験サンプルとともにＯＰ−１標準曲線を平行して実施する。
多クローン性抗体は以下のように調製できる。各ウサギに、０．１％ＳＤＳ中の１００μｇ／５００μｌの大腸菌産生ＯＰ−１単量体（配列番号５のアミノ酸３２８−４３１）と５００μｌのフロイントの完全アジュバントとの混合物で一次免疫を施す。抗原は、動物体の背中および横腹の多数の部位に皮下注射する。フロイントの不完全アジュバントを用いながら同じ態様で１ヶ月後にウサギに追加免疫を施す。７日後に試験採血を耳静脈から行う。ＯＰ−１に対する抗体がＥＬＩＳＡアッセーを用いて血清中で検出されるまで、さらに１ヶ月ごとに追加免疫と試験採血を行う。その後、ウサギを１００μｇの抗原で追加免疫し、追加免疫後７日目と１０日目に採血する（各採血当たり１５ｍｌ）。
与えられたモルフォゲンに特異的な単クローン抗体は以下のように調製できる。マウスに二度大腸菌産生ＯＰ−１単量体を注射する。第一回の注射は１００μｇのＯＰ−１をフロイントの完全アジュバント中に含み、皮下に投与された。第二の注射は、５０μｇのＯＰ−１を不完全アジュバント中に含み、腹腔内に注射される。続いて８ヶ月の間種々の時期に、総計２３０μｇのＯＰ−１を４度でマウスの腹腔内に注射する。融合の１週間前に、マウスの腹腔内に１００μｇのＯＰ−１（３０７−４３１）と３０μｇのＳＭＣＣ架橋剤を用いてウシ血清アルブミンに付加システインを介して複合させたＮ−末端ペプチド（Ｓｅｒ293−Ａｓｎ309−Ｃｙｓ）で追加免疫を施す。この追加免疫は、融合前５日（腹腔内）、４日（腹腔内）、３日（腹腔内）および１日（静脈内）に繰り返した。その後マウスの脾臓細胞をミエローマ（例えば６５３）細胞と１：１の此でＰＥＧ１５００（べーリンガーマンハイム）を用いて融合させ、この融合細胞をプレートに播き、さらに抗原としてＯＰ−１を用いてＯＰ−１特異抗体についてスクリーニングする。細胞融合と単クローン抗体スクリーニングは、当技術分野で広く利用可能な標準的テキストに記載された標準的方法による。
本発明は、その神髄または本質的な特徴から外れることなく他の特定の形態で実施できる。本実施例は、したがっていずれの局面からも説明のためのものであって、制限的なものと考えられるべきではない。発明の範囲は、前述の記載よりはむしろ添付の請求の範囲によって示され、したがって、請求の範囲と同等性の範囲内にある全ての変更は、その中に包含されると解される。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：クリエイティブ  バイオモレキュルズ，インコーポレイテッド（Creative Biomolecules,Inc.）
（Ｂ）街：45  サウス  ストリート（South Street）
（Ｃ）市：ホプキントン（Hopkinton）
（Ｄ）州：マサチューセッツ州（MA）
（Ｅ）国：アメリカ合衆国（USA）
（Ｆ）郵便コード（ZIP）：01748
（Ｇ）電話：1-508-435-9001
（Ｈ）テレファックス：1-508-435-0454
（Ｉ）テレックス：
（ｉｉ）発明の名称：消化管潰瘍のモルホーゲン治療
（ｉｉｉ）配列の総数：３３
（ｉｖ）郵便物の宛先：
（Ａ）あて先：クリエイティブ  バイオモレキュルズ，インコーポレイテッド（Creative Biomolecules Inc.）
（Ｂ）街：45  サウス  ストリート（South Street）
（Ｃ）市：ホプキントン（Hopkinton）
（Ｄ）州：マサチューセッツ州（MA）
（Ｅ）国：アメリカ合衆国（USA）
（Ｆ）郵便コード（ZIP）：01748
（ｖ）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒体型：フロッピー ディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PCコンパチブル
（Ｃ）演算システム：PC-DOS/HS-DOS
（Ｄ）ソフト：PatentIn Release #1.0,バージョン#1.25
（ｖｉ）現在の出願状況：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）これまでの出願状況
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（ｖｉｉｉ）代理人情報：
（Ａ）氏名：キリー エスク，ロビン ディ．(Kelley Esq,Robin D.)
（Ｂ）登録番号：34,637
（Ｃ）リファレンス／ドケット番号：CRP-074
（ｉｘ）通信に関する情報：
（Ａ）電話：617/248-7477
（Ｂ）テレファックス：617/248-7100
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．９７
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列１
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に２０個の天然に存在するＬ型異性体、α−アミノ酸、またはその誘導体の１つを指す
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１：
0004255986.tif 000013
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．９７
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列２
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に２０個の天然に存在するＬ型異性体、α−アミノ酸、またはその誘導体の１つを指す
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２：
0004255986.tif 000014
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．９７
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列３
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に、明細書に規定された、１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選ばれる
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：
0004255986.tif 000015
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列４
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に、明細書に規定された、１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選ばれる
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４：
0004255986.tif 000016
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１３９
（Ｄ）他の情報：／標識＝ｈＯＰ１−成熟型
（ｘｉ）配列の記載：配列番号５：
0004255986.tif 000017
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１３９
（Ｄ）他の情報：／標識＝ｍＯＰ１−成熟型
（ｘｉ）配列の記載：配列番号６：
0004255986.tif 000018
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１３９
（Ｄ）他の情報：／標識＝ｈＯＰ１−成熟型
（ｘｉ）配列の記載：配列番号７：
0004255986.tif 000019
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１３９
（Ｄ）他の情報：／標識＝ｍＯＰ１−成熟型
（ｘｉ）配列の記載：配列番号８：
0004255986.tif 000020
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ウシ科
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０１
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＣＢＭＰ−２Ａ−ＦＸ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号９：
0004255986.tif 000021
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０１
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＣＢＭＰ−２Ｂ−ＦＸ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１０：
0004255986.tif 000022
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：キイロショウジョウバエ
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０１
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＤＰＰ−ＦＸ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１１：
0004255986.tif 000023
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：アフリカツメガエル
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＶＧＬ−ＦＸ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２：
0004255986.tif 000024
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ネズミ科
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＶＧＲ−１−ＦＸ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３：
0004255986.tif 000025
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｉｉ）ハイポセチィカル：無し
（ｉｖ）アンチセンス：無し
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：脳
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０６
（Ｄ）他の情報：／付記＝“ＧＤＦ−１（ｆｘ）”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４：
0004255986.tif 000026
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１５：
0004255986.tif 000027
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１８２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセチィカル：無し
（ｉｖ）アンチセンス：無し
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：４９．．１３４１
（Ｃ）同定方法：実験による
（Ｄ）他の情報：／機能＝“骨発生蛋白
／産物＝“ＯＰ１”
／証明＝実験による
／標準＿名称＝“ＯＰ１”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６：
0004255986.tif 000028
0004255986.tif 000029
0004255986.tif 000030
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４３１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１７：
0004255986.tif 000031
0004255986.tif 000032
0004255986.tif 000033
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１８７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセチィカル：無し
（ｉｖ）アンチセンス：無し
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：１０４．．１３９３
（Ｄ）他の情報：／機能＝“骨発生蛋白
／産物＝“ＭＯＰ１”
／付記＝ＭＯＰ１（ＣＤＮＡ）”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１８：
0004255986.tif 000034
0004255986.tif 000035
0004255986.tif 000036
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４３０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１９：
0004255986.tif 000037
0004255986.tif 000038
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１７２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：４９０．．１６９６
（Ｄ）他の情報：／機能＝“骨発生蛋白
／産物＝“ｈＯＰ２−ＰＰ”
／付記＝ｈＯＰ２（ｃＤＮＡ）”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２０：
0004255986.tif 000039
0004255986.tif 000040
0004255986.tif 000041
（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２１：
0004255986.tif 000042
0004255986.tif 000043
（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１９２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎮の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｖｉ）由来
（Ａ）名称：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：９３．．１２８９
（Ｄ）他の情報：／機能＝“骨発生蛋白
／産物＝“ｍＯＰ２−ＰＰ”
／付記＝“ｍＯＰ２  ｃＤＮＡ”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２２：
0004255986.tif 000044
0004255986.tif 000045
0004255986.tif 000046
（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：３９９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２３：
0004255986.tif 000047
0004255986.tif 000048
（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１３６８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：１．．１３６８
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２４：
0004255986.tif 000049
0004255986.tif 000050
0004255986.tif 000051
（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４５５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２５：
0004255986.tif 000052
0004255986.tif 000053
（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０４
（Ｄ）他の情報：／付記＝“ＢＭＰ３”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２６：
0004255986.tif 000054
（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来：
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／付記＝“ＢＭＰ５”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２７：
0004255986.tif 000055
（２）配列番号２８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｖｉ）由来：
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／付記＝“ＢＭＰ６”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２８：
0004255986.tif 000056
（２）配列番号２９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／標識＝ＯＰＸ
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に、明細書に規定された、１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選ばれる
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２９：
0004255986.tif 000057
（２）配列番号３０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．９７
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列５
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に、明細書に規定された、１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選ばれる
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３０：
0004255986.tif 000058
（２）配列番号３１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１０２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位：１．．１０２
（Ｄ）他の情報：／標識＝一般配列６
／付記＝各Ｘａａはそれぞれ別個に、明細書に規定された、１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選ばれる
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３１：
0004255986.tif 000059
（２）配列番号３２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１２４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｖｉ）由来：
（Ａ）名称：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：脳
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：８４．．１１９９
（Ｄ）他の情報：／産物＝“ＧＤＦ−１”
／付記＝“ＧＤＦ−１  ＣＤＮＡ”
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３２：
0004255986.tif 000060
0004255986.tif 000061
0004255986.tif 000062
（２）配列番号３３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：３７２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３３：
0004255986.tif 000063
0004255986.tif 000064
【図１】
0004255986.tif 000065
【図２Ａ】
0004255986.tif 000066
【図２Ｂ】
0004255986.tif 000067
【図３Ａ】
0004255986.tif 000068
【図３Ｂ】
0004255986.tif 000069
【図４Ａ】
0004255986.tif 000070
【図４Ｂ】
0004255986.tif 000071
【図４Ｃ】
0004255986.tif 000072
【図４Ｄ】
0004255986.tif 000073