(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳に特異的に発現するレセプタータンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質。
【請求項２】
脳に特異的に発現するレセプタータンパク質であって、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有する、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質。
【請求項３】
脳に特異的に発現するレセプタータンパク質であって、配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質であって、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質。
【請求項４】
脳に特異的に発現するレセプタータンパク質であって、配列番号：２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質であって、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号：２または２１に記載の塩基配列を有する請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質に被検化合物を接触させ、該タンパク質に結合する化合物を選択する工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質に結合するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質にリガンドを接触させ、該タンパク質とリガンドとの結合活性を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下での結合活性と比較し、該タンパク質とリガンドとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質を含有することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれかに記載のレセプタータンパク質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク質（以下、「Ｇタンパク質」と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なっている。このため、このレセプタータンパク質はＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と総称されている。あるいは７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、７回膜貫通型レセプタータンパク質とも総称されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。このため、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は医薬品開発の標的として非常に注目されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質としては、これまでにムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４（Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９２３−３９２９（１９８７））、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ５（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １，４０３−４１０（１９８８））、アデノシン・レセプターＡ１（Ｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，５６９−５７２（１９８９））、α１Ａアドレノレセプター（Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１４８５−１４９０（１９９１））、β１アドレノセプター（Ｆｒｉｅｌｌｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７９２０−７９２４（１９８７））、アンジオテンシン・レセプターＡＴ１（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３，９１０−９１６（１９９２））、エンドセリン・レセプターＥＴＡ（Ａｄａｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８０，１２６５−１２７２（１９９１））、ゴナドトロピン放出因子レセプター（Ｋａｋｅｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９，２８９−２９５（１９９２））、ヒスタミン・レセプターＨ２（Ｒｕａｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１６５８−１６７２（１９９２））、神経ペプチドＹレセプターＹ１（Ｌａｒｈａｍｍａｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３５−１０９３８（１９９２））、インターロイキン８・レセプターＩＬ８ＲＡ（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６３，１２７８−１２８０（１９９１））、ドーパミン・レセプターＤ１（Ｍａｈａｎ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２１９６−２２００（１９９０））、代謝型グルタミン酸レセプターｍＧｌｕＲ１（Ｍａｓｕ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，７６０−７６５（１９９１））、ソマトスタチン・レセプターＳＳ１（Ｙａｍａｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，２５１−２５５）などが報告されている（参考文献：Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。また、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を標的とした医薬品としては、塩酸テラゾシン（血圧降下剤、α１アドレノセプター・アンタゴニスト）、アテノロール（不整脈用剤、β１アドレノセプター・アンタゴニスト）、塩酸ジサイクロミン（鎮痙剤、アセチルコリン・レセプター・アンタゴニスト）、塩酸ラニチジン（消化性潰瘍治療剤、ヒスタミン・レセプターＨ２・アンタゴニスト）、塩酸トラゾドン（抗うつ剤、セロトニン・レセプター５−ＨＴ１Ｂ・アンタゴニスト）、塩酸ブプレノルフィン（鎮痛剤、オピオイド��レセプターκ・アゴニスト）などが開発されている（参考文献：Ｓｔａｄｅｌ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１８，４３０−４３７（１９９７）；医薬品要覧第５版、薬業時報社）。
ところで、脳の一部である視床下部は、自律神経系の中枢として特定の反応を引き起こす種々のプログラムを有しており、様々な出力系を介して内部環境の恒常性に寄与している。例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモンなどのホルモンを放出し、標的細胞に発現している特異的な受容体に対するこれらホルモンの作用を介して、全身の内分泌系を調節している。このような視床下部における出力系には、視床下部における受容体とそれに作用する物質が関与していると考えられている。このため、視床下部の出力系を調節している物質と視床下部におけるその特異的レセプターとの関係を明らかにすることは、内分泌異常などに起因する疾患の治療などための医薬品開発において非常に重要な手段であるといえる。
発明の開示
本発明は、脳（特に、視床や視床下部など）に発現する新規なＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該レセプタータンパク質を利用したリガンドおよび医薬品の候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、既知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質において高度に保存されている領域を独自に抽出し、これに対応するプライマーを設計してラット視床及び視床下部由来のｍＲＮＡに対し逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。次いで、これにより増幅された多くのクローンの中から無作為にクローンを選択し、その部分的な塩基配列の決定を行った。そして、塩基配列の決定を行ったクローンの中から公知のクローンを消去するために、類似性検索により公知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードすると判断されたクローンのｃＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、いずれのプローブにもハイブリダイズしない陰性クローンを選択した。そして、この陰性クローンの塩基配列に基づきプローブを調製し、ラット視床及び視床下部由来のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことにより、ラットＧタンパク質其役型レセプタータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを単離することに成功した。また、本発明者等は、得られたラットｃＤＮＡに対応するヒト全長ｃＤＮＡを単離することにも成功した。また、本発明者らは、これら遺伝子の発現の組織特異性をノーザンブロット解析した結果、これら遺伝子が脳に特異的に発現することを見出した。
これらＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、医薬品としての利用が期待されるレセプターからのシグナル伝達を調節する化合物やリガンドのスクリーニングにおいて非常に有用であると考えられる。
従って、本発明は、脳に発現する新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質、これらタンパク質をコードするＤＮＡ、およびこれらタンパク質を利用したリガンドおよび医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
より具体的には、
（１）  配列番号：１に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、
（２）  配列番号：２０に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、
（３）  配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、
（４）  配列番号：２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質の部分ペプチド、
（６）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または（５）に記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
（７）  配列番号：２または２１に記載の塩基配列を有する（６）に記載のＤＮＡ、
（８）  （５）乃至（７）のいずれかに記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター、
（９）  （８）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（１０）  （９）記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または（５）に記載の部分ペプチドの製造方法、
（１１）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または（５に記載の部分ペブチドに被検化合物を接触させ、該タンパク質または部分ペプチドに結合する化合物を選択する工程を含む、（１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質に結合するリガンドのスクリーニング方法、
（１２）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で（１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または（５）に記載の部分ペプチドにリガンドを接触させ、該タンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドとの結合活性を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下での結合活性と比較し、該タンパク質または部分ペプチドとリガンドとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
（１３）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または（５）に記載の部分ペプチドを含有することを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング用キット、
（１４）  （１）から（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質に結合する抗体、に関する。
なお、本発明において「Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質」とは、Ｇタンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なっているレセプタータンパク質を指す。また、本発明において「リガンド」とは、Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質に結合して、シグナル伝達を誘導する能力を有する天然の化合物を指す。また、本発明において「アゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質のリガンドと同様の生理活性を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明において「アンタゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質のリガンドの生理活性を抑制する能力を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明における「タンパク質」および「ペプチド」にはその塩も含まれる。
本発明は、新規なＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に関する。本発明等により単離されたラット由来のＧタンパク貿共役型レセプタータンパク質「ＢＧ２」のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に、「ＢＧ２」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。また、本発明等により単離されたヒト由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ２」のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２１に、「ＢＧ２」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。
ラット「ＢＧ２」タンパク質は、公知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であるウシ由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ３タンパク質（Ｌｅｅ，ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２３，１５１−１５４（１９９４））、ヒト由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ５タンパク質（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １，４０３−４１０（１９８８））、マウス由来α２Ａアドレノセプター（Ｌｉｎｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２，１６−２７（１９９２））とそれぞれ２６％、２５％、２９％のホモロジーを有する。また、疎水性プロット解析の結果、ラット「ＢＧ２」タンパク質は、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質に特徴的な疎水性ドメイン（７つの膜貫通領域）を保持していた。さらに、ラット「ＢＧ２」ｃＤＮＡのコード領域のサイズも、公知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と同程度の約１．２ｋｂを示した。
一方、ヒト「ＢＧ２」タンパク質は、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるヒト由来α−２Ｃ−１アドレノセプター（Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，６３０１−６３０５（１９８８））、マウス由来β−１アドレノセプター（Ｊａｓｐｅｒ  Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１７８，３０７−３０９（１９９３））、ヒト由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ３（Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９２３−３９２９（１９８７））とそれぞれ３２％、２８％、２７％のホモロジーを有する。
これらの事実は、これら「ＢＧ２」タンパク質が、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ファミリーに属することを示している。そして、「ＢＧ２」タンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であることは、そのリガンドの作用によりＧ蛋白質の活性化を通じてシグナル伝達を行っていることを示している。
また、ノーザンブロット解析により、これら「ＢＧ２」蛋白質をコードする遺伝子が脳特異的に発現することが示された。また、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、ラット「ＢＧ２」遺伝子は、海馬および脊髄で強い発現が認められ、視床下部、視床および小脳においても発現が検出された。
海馬は記憶や学習に重要な役割を担い、小脳は体性運動の制御を行い、視床下部は自律神経系の中枢である。「ＢＧ２」蛋白質はこれら機能の調節に関与していると考えられる。従って、「ＢＧ２」蛋白質やその遺伝子、「ＢＧ２」蛋白質の機能を調節し得るアゴニストやアンタゴニストは、記憶・学習障害の改善や、血圧、消化、体温、摂食等の自律神経系の調節への応用が考えられる。
「ＢＧ２」タンパク質は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、「ＢＧ２」タンパク質が発現していると考えられる視床または視床下部などの組織の抽出液に対し、後述する「ＢＧ２」抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように「ＢＧ２」タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
また、当業者であれば、公知の方法を用いて天然型のラットやヒト「ＢＧ２」タンパク質（それぞれ配列番号：１、配列番号：２０）中のアミノ酸の置換などの修飾を行い、天然型のタンパク質と同等の機能（グアノシン三リン酸結合タンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なう機能）を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加などにより天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３２９−３５０（１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４，３１５−２３（１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，４０４−４０７（１９９０））が挙げられる。機能的に同等なタンパク質におけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の１０％以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）である。
また、当業者にとってはハイブリダイゼーション技術（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，３３３−３４２（１９８３）、Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６，１８０−１８２（１９７７））などを用いて、ラットやヒト「ＢＧ２」ｃＤＮＡ配列（それぞれ配列番号：２、配列番号：２１）またはその一部を基に、種々の他の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡからこれら「ＢＧ２」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることも常套手段である。即ち、当業者であれば、ラットやヒト「ＢＧ２」ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、機能的に同等なタンパク質を調製することが可能であり、これらのタンパク質もまた本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。機能的に同等なタンパク質を単離する他の生物としては、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ブタなどが挙げられ、特に脳の組織（例えば、視床や視床下部など）が単離に適している。
ラットやヒト「ＢＧ２」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、通常、ラットやヒト「ＢＧ２」ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２、配列番号：２１）と高い相同性を有する。高い相同性とは、塩基レベルで少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を指す。配列の相同性は、ＦＡＳＴＡプログラムを利用して決定することができる。
ラットやヒト「ＢＧ２」ｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、通常、ハイブリダイゼーションを「６ｘＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃」、洗浄を「１ｘＳＳＣ、５５℃」で行う。好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ｘＳＳＣ、４０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．２ｘＳＳＣ、５５℃」で行う。さらに好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．１ｘＳＳＣ、６２℃」で行う。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のＮ末端領域の部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利用することができる。本発明の部分ポリペプチドは、少なくとも１５アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸の鎖長を有する。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、これらタンパク質やペプチドをコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：２や配列番号：２１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質が発現している組織（例えば、視床、視床下部）由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えば、視床、視床下部）由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：２や配列番号：２１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：２や配列番号：２１に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５−５７０（１９７６）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，１０６−１０（１９７９））。
これらＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：２や配列番号：２１に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のＧタンパク質其役型レセプタータンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。本発明のＧタンパク質其役型レセプタータンパク質はレセプタータンパク質であるため、細胞膜に発現させて調製することが可能である。
具体的には、宿主が大腸菌エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０（１９８８））などが用いられる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５（１９８８））などで行う。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００，１３５−１４４（１９９７））などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，Ｄ．ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，１４０（１９８１））、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，６４８５−６４８９（１９９０））などにより行なわれる。
一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、ヒトＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（クロンテク社）などのベクターが用いられる。ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））などで行われる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））などに記載の方法に従って行なうことができる。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。例えば、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的のタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、また、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。遺伝子治療に用いる場合には、ヒト細胞への遺伝子導入には、レトロウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，６４６０−６４６４（１９８８）；Ｄｒａｎｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，３５３９−３５４３（１９９３））、アデノウイルスベクター（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３，３０９−３１９（１９９３））などを用いる方法が用いられている。患者への投与法としては、骨髄移植、皮下注射、静脈注射などが用いられる（Ａｓａｎｏ，Ｓ．，蛋白質核酸酵素，４０，２４９１−２４９５（１９９５））。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体に関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の上記タンパク質またはペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現異常に起因する疾患の検査や抗体治療、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。
抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ  Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌに導入することにより調製できる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，２６８−２７０（１９８５））。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法においては、本発明のＧタンパク質其役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドに被検化合物を接触させ、これらタンパク質もしくはペプチドに結合する化合物を選択する工程を含む。被検化合物としては、例えば、アセチルコリン、アデノシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンジオテンシン、ボムベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、カルシトニン、カナビノイド、ケモカイン、コレシストキニン、ドーパミン、エンドセリン、フォルミルメチオニルペプチド、ＧＡＢＡ、ガラニン、グルカゴン、グルタミン酸、グリコペプチドホルモン、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプトファン、ロイコトリエン、メラノコルチン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オドラント、オピオイドペプチド、オプシン、パラサイロイドホルモン、血小板活性化因子、プロスタノイド、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、サイロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、オキシトシン（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））などの公知の化合物、その他の精製タンパク質、遺伝子（ライブラリーも含む）の発現産物、リガンドが存在していることが予想される組織もしくは細胞（例えば、脳、視床、視床下部）の抽出液、細胞培養上清などが用いられる。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに用いる被検化合物は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と被検化合物との結合は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、文献（Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ  ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。その他、ＴＷＯハイブリッドシステム（Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２，２２３−２３２（１９９４）、Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ��，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６，５３０−５３３（１９９５））を利用したレポーター遺伝子の活性の検出によっても結合を検出することができる。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質兵役型レセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドにリガンドを接触させ、該タンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドとの結合活性を検出する工程、および（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下での結合活性と比較し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程を含む。被検化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに利用するリガンドは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドとの結合活性は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドに結合したリガンドに付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、文献（Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ  ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。検出の結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、該被検化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）および該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。アゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを含有することを特徴とする、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング用キットに関する。本発明のキットにおける本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。本発明のキットの他の要素としては、上記レセプタータンパク質標品以外に、例えば、リガンド標品（標識されたもの、および標識されていないもの）、リガンドとレセプタータンパク質の反応のための緩衝液、洗浄液などが含まれていてもよい。リガンドに付される標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。本発明のキットの利用は、例えば、公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］  ラットＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離
Ｇタンパク質共役型受容体は、細胞膜を７回貫通するという構造上の特徴を有し、膜貫通領域およびその近傍のアミノ酸配列はしばしばよく保存されている。本発明者らは、まず、既知のＧタンパク質共役型受容体であるマウス神経ペプチドＹ受容体Ｙ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ１８２８０），ラットＹ１（同Ｚ１１５０４）、ヒトＹ１（同Ｍ８４７５５）、マウス神経ペプチドＹ受容体Ｙ４（同Ｕ４０１８９）、ラットＹ４（同Ｚ６８１８０）、ヒトＹ４（同Ｚ６６５２６）、マウス神経ペプチドＹ受容体Ｙ６（同Ｕ５８３６７）において高度に保存されている第２膜貫通領域および第７膜貫通領域のＤＮＡ配列の比較から、それぞれ配列番号：３で表される新規センスプライマー、配列番号：４で表される新規アンチセンスプライマーを合成した。
次いで、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）視床および視床下部由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ＲＮＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、これら２本のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をおこなった。具体的には、ラット視床および視床下部から、ファストトラック２．０キット（インビトロジェン社）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社）のプロトコルにしたがって、精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  ７５ｎｇから相補鎖ＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ全量を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅をおこなった。反応液の組成は、各０．１５ｍＭｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μｌ  ｒＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）、各０．５μＭ  ディジェネレートプライマーＦｇ（配列番号：３）およびＲｂ（配列番号：４）、１０×酵素付属ＰＣＲバッファーで、総反応液量１３０μｌとした後、２０μｌずつ６本に分注した。ペルティエサーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪリサーチ社）で、９４℃２分、「９４℃３０秒、４８℃１分、７２℃１分３０秒」を３５サイクル、７２℃８分の条件でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ反応後、６本の反応液を１本に集め、ウィザードＰＣＲ精製キット（プロメガ社）を用いて増幅産物を精製し、３０μｌのＴＥで溶出した。このうち２μｌを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。宿主にはＸＬ１−Ｂｌｕｅを用い、Ｅ．ｃｏｌｉパルサー（バイオラッド社）で形質転換した。得られた形質転換体のうち、白色または薄青色のコロニーを、遺伝子ライブラリー作製装置バイオピック（バイオロボティックス社）を用いて、５，７６０個を無作為に選択し、３８４ウェルプレート１５枚に分注した、１００μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬＢ培地に植菌した。クローンを３７℃で一晩培養し、遺伝子ライブラリー複製装置バイオグリッド（バイオロボティックス社）を用いて、グリセロールストック用に１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５％グリセロール入りＬＢ寒天培地に載せたフィルター上、およびコロニーハイブリダイゼーション用に１００μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬＢ寒天培地に載せたフィルター上に、それぞれ１枚ずつレプリカを作成した。
得られたＰＣＲクローンの中には、ＮＰＹ受容体ｃＤＮＡが多数重複して存在すると予想されたため、得られた５，７６０クローンから８０クローンを無作為に選び、部分塩基配列を決定した。塩基配列決定のための鋳型にはプラスミド自動単離装置ＰＩ１００Σ（倉敷紡績社）で精製したプラスミドＤＮＡを、酵素反応にはダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（パーキンエルマー社）を、反応産物の電気泳動にはＤＮＡシーケンサー３７７（パーキンエルマー社）を用いた。ウィスコンシン・パッケージ（ジェネティック・コンピュータ・グループ社）のｂｌａｓｔプログラムで、得られた配列を類似性検索にかけた結果、８０個のうち２９個はコイルドコイル様タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ７９０２４）の、１７個は神経ペプチドＹ受容体Ｙ１同Ｚ１１５０４）のｃＤＮＡであった。そこで、これら２種類のｃＤＮＡ断片をプローブに用いて、それぞれディジェネレートＰＣＲ増幅断片ライブラリーフィルターにハイブリダイズした。プローブは、それぞれのクローンの挿入断片をＰＣＲで増幅し、ウィザードＰＣＲ精製キット（プロメガ社）で精製し、プライム−イットＩＩランダムプライマーラベリングキット（ストラタジーン社）を用いて、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したものを用いた。コロニーハイブリダイゼーションは常法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，（１９８９））。コイルドコイル様タンパク質１に対しても神経ペプチドＹ受容体Ｙ１に対しても陰性のクローンについて部分塩基配列を決定した。塩基配列決定のための鋳型には、各クローンの培養液からＰＣＲで挿入断片を増幅し、ＰＣＲ産物精製用キット（アマシャム社）で精製したＤＮＡを用いた。酵素反応にはダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳを、反応産物の電気泳動にはＤＮＡシーケンサー３７７を用いた。ウィスコンシン・パッケージのｂｌａｓｔプログラムで、得られた配列を類似性検索にかけた結果、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ２２９２６）と有意の類似性を示すクローンが見出された。このクローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成９年１２月２５日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６５７５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７５）
次いで、この遺伝子の全長ｃＤＮＡを単離するために、まず、ラット視床および視床下部由来のｃＤＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社）のプロトコルに従い、ベクターにはｐＥＦ１ｘ、宿主にはＸＬ１−ｂｌｕｅＭＲＦ’（ストラタジーン社）を使用した。
なお、ｐＥＦ１ｘは、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）を以下のように改良したものである。
（１）ヒトＥＦ１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０４６１７）の調製
ヒトゲノミックＤＮＡから、プライマー（配列番号：６／ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣ、配列番号：７／ＣＧＧＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡ）を用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩ（宝酒造社）およびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社）で消化し、プラスミドベクターｐＵＣ１９（宝酒造社）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩで消化、クレノウ酵素（宝酒造社）で末端を平滑化した後、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）でセルフ・ライゲーションし、クローニングした。得られたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、インサート部分を回収した。
（２）ｐｃＤＮＡ３の改変
プラスミドｐｃＤＮＡ３ＤＮＡをＭｌｕＩ（宝酒造社）で消化、クレノウ酵素（宝酒造社）で末端を平滑化した後、ＤＮＡライゲーションキットでセルフ・ライゲーションし、クローニングした。得られたプラスミドＤＮＡをＡｆｌＩＩＩ（ニューイングランドバイオラボ社）およびＳｍａＩ（宝酒造社）で消化、クレノウ酵素（宝酒造社）で末端を平滑化した後、ＤＮＡライゲーションキットでセルフ・ライゲーションし、クローニングした。得られたプラスミドＤＮＡをＢｇｌＩＩ（宝酒造社）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＭＶプロモーター部分を除いた断片を回収し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて（１）で回収したインサート断片と連結し、クローニングした。これによりｐＥＦ１ｘを構築した。
次いで、ｃＤＮＡ断片の塩基配列からオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号：８／ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＧＴＡＣＧＴＡＣＣ）を合成し、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブセレクションシステム（ギブコＢＲＬ社）のプロトコルにしたがって、上記のように調製されたラット視床及び視床下部由来のｃＤＮＡライブラリーから、複数個のクローンを得た。次に、先に単離したクローン（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５７２）に挿入されたｃＤＮＡ断片をプローブにしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性のクローンを得た。このクローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成９年１２月２５日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６５７４号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７４）
このクローンの挿入断片長は２．７ｋｂｐであった。ギアプレップミディキット（キアゲン社）でプラスミドＤＮＡを調製し、ショットガン法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，（１９８９））で全塩基配列を決定した。ｃＤＮＡの断片化には、密閉式超音波生物材料処理装置バイオラプター（東湘電機社）を用い、断片化したＤＮＡを２％アガロース低融解ゲル電気泳動で分画し、０．６ｋｂｐ付近の断片を、ｇｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（ｂｉｏｌｏｌ社）で精製、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）で末端を平滑化して、ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ処理ｐＵＣ１１８ベクターにクローニングした。宿主にはＸＬ１−Ｂｌｕｅを用い、Ｅ．ｃｏｌｉパルサー（バイオラッド社）で形質転換した。得られたショットガンクローンを、ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（パーキンエルマー社）あるいはダイターミネーターサイクルシーケンシングキットＦＳ（パーキンエルマー社）でシーケンシングした。得られた配列を、ＤＮＡシーケンシングソフト・シーケンチャー（日立ソフト社）で結合・編集し、全塩基配列をした。全塩基配列は、２７００ｂｐで、４１３アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが明らかになった（配列番号：５）。オープン・リーディング・フレームの５’側に停止コドンが存在するため、このｃＤＮＡは、コード領域全長を含むと考えられる（配列番号：２）。この配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７膜貫通領域が疎水性プロット上で確認された（図１）。
また、オープン・リーディング・フレームのサイズも、公知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と比較して同程度の約１．２ｋｂであった。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質はそのアミノ酸配列にある程度の共通性を示し、一つのタンパク質ファミリーを形成している。そこで、単離したｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行なったところ、公知のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であるウシ由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ３タンパク質（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２３，１５１−１５４（１９９４））、ヒト由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ５タンパク質（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １，４０３−４１０（１９８８））、マウス由来α２Ａアドレノセプター（Ｌｉｎｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２，１６−２７（１９９２））とそれぞれ２６％、２５％、２９％のホモロジーを有する全く新規なレセプタータンパク質であることが判明した。
［実施例２］  ヒトＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離
得られたラットの配列をＥＳＴ検索にかけたところ、ヒトホモログの断片が見出された（ジーンバンクＮＩＤ：９４６０３０およびＮＩＤ：９０１７５６）。ヒト胎児脳ｃＤＮＡを特異的プライマーＩＦ０１（配列番号：９／ＣＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡ）およびＩＲ０２（配列番号：１０／ＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣ）（プローブ１）を用いてＰＣＲにより増幅した。プラークハイブリダイゼーションの標準的な方法により、プローブ１を用いて１．２ｘ１０６のサイズを有するｈｕｍａｎ  λ  ＥＭＢＬ３  ＳＰ６／Ｔ７  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社）をスクリーニングした。これにより２つの陽性クローンを単離した。得られたファージクローンをＳａｃＩで消化し、一つのクローンの３つのバンドをサブクローニングした。これをそれぞれＩ１（配列番号：１１）、１３（配列番号：１２）、およびＩ５（配列番号：１３）と命名した。これらの断片の配列を決定し、仮想的な配列をラットのホモログとの比較により検討した。Ｉ１およびＩ３は、それぞれ特異的プライマーＹＳ０３（配列番号：１４／ＴＧＡＡＣＧＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧ）およびＹＳ０５（配列番号：１５／ＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧ）、ＹＳ１２（配列番号：１６／ＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣ）およびＹＳ１４（配列番号：１７／ＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ）を用いてＰＣＲ増幅し、そのＰＣＲ産物をそれぞれプローブ２およびプローブ３と命名した。ヒト視床下部ｃＤＮＡ（１．３ｘ１０６ファージ）を１５０ｍｍプレート当たり５．６ｘ１０４の濃度でプレートに播いた。得られたサブプールをプライマーＹＳ０３およびＹＳ０５を用いたＰＣＲによりチェックした。プローブ２を用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングと同様の方法で、一つの陽性サブプールをスクリーニングした。これによりＴＭ５から５’ＵＴＲを含む一つのｃＤＮＡクローンを得て、ｃＤＮＡクローン１と命名した。
プライマーＹＳ０７（配列番号：１８／ＧＣＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣ）およびＹＳ１０（配列番号：１９／ＴＧＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＡＧ）を用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡクローン１からプローブ４を増幅した。プローブ３およびプローブ４を用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングと同様の方法で、ヒト海馬ライブラリー（３ｘ１０６ｐｆｕ）のスクリーニングを行った。いくつかのクローンを得て、その中で最も長いものをｃＤＮＡクローン２と命名して、その配列の決定を行った。このクローンはＴＭ２から３’ＵＴＲの領域を有していた。ｃＤＮＡクローン１をＳａｃＩＩで消化し、ベクターと５’端領域を含む３．３ｋｂバンドをシュリンプアルカリフォスファターゼで処理した。ｃＤＮＡクローン２もまたＳａｃＩＩで消化し、その１．７ｋｂの断片をｃＤＮＡクローン１由来の３．３ｋｂ断片に結合させた。この結合された断片が挿入されたクローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１０年１２月１７日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６６０９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６０９）
決定されたヒト「ＢＧ２」ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２１に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。
ヒト「ＢＧ２」タンパク質は、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるヒト由来α−２０−１アドレノセプター（Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，６３０１−６３０５（１９８８））、マウス由来β−１アドレノセプター（Ｊａｓｐｅｒ  Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１７８，３０７−３０９（１９９３））、ヒト由来ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ３（Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９２３−３９２９（１９８７））とそれぞれ３２％、２８％、２７％のホモロジーを有していた。
［実施例３］  ノーサンブロット解析
ヒト「ＢＧ２」の検出においては、プローブ４を３２Ｐγ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｎｍ，Ｐｒｉｍｅ  Ｉｔ  ＩＩ）で標識し、ｃＤＮＡプローブとして用いた。また、プロット膜としては、ＭＴＮ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロット（クロンテック社）を用いた。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社）中で６８℃で３０分のプレハイブリダイゼーション後、６８℃で１時間プローブを膜にハイブリダイズさせた（最終プローブ濃度は１．５ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌ）。０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣで４２℃で３０分、そのブロットを洗浄し、最終的な洗浄を０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで５０℃で３０分行った。次いで、そのブロットを−８０℃で２．５日間、コダックのオートラジオグラフィックフィルムに暴露した。
一方、マウスＢＧ２の検出においては、プローブの調製は、ラット「ＢＧ２」ｃＤＮＡを鋳型に、センスプライマーＭＦ２（配列番号：２２／ＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＧＴＡＣＧＴＮＣＣ）およびアンチセンスプライマーＭＲ１（配列番号：２４／ＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣ）を用いてＰＣＲで増幅後、増幅産物をアガロース電気泳動で精製し、上記ヒトと同様に標識することにより調製した。
また、ブロット膜としては、Ｒａｔ  ＭＴＮ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロット（クロンテック社）を用いた。ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド，４ｘＳＳＰＥ，１％ＳＤＳ，０．５％ＢＬＯＴＯ，１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、４２℃にて一晩のハイブリダイゼーションを行った。洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで６５℃で行った。次いで、そのブロットを−８０℃で一晩、コダックのオートラジオグラフィックフィルムに暴露した。
その結果、ヒトおよびラット由来の「ＢＧ２」遺伝子の発現は、特に脳において強く検出された（図２）。
［実施例４］  １ｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
１３から１８齢の成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ社）をエーテルの吸入により麻酔し、ロータリーポンプに接続し、左心室に挿入したカニューレを通じて、冷却した４％パラホルムアルデヒドーリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中を注入した。灌流後、脳、脳下垂体、および脊髄を取り出し、矢状方向にまたは冠状に切断した。組織標本を４℃で夜通し、同様の固定剤で固定した。次の過程はＲＮａｓｅの混入を避けるため、注意して行った。組織試料を常法にてパラフィンワックスで包埋し、回転ミクロトーム（Ｍｏｄｅｌ  ＨＭ  ３５５；ＭＩＣＲＯＭ  Ｌａｂｏｒｇｅｒａｔｅ  ＧｍｂＨ）を用いて６μｍの厚さのパラフィン切片を作製した。切片はＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するまで−２０℃で無湿状態で保存した。
ラットＢＧ２センスおよびアンチセンスＲＮＡプローブの調製のために、センスプライマーＭＦ２（配列番号：２２／ＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＧＴＡＣＧＴＮＣＣ）およびアンチセンスプライマーＭＲ３（配列番号：２３／ＡＴＣＡＴＴＡＧＧＡＧＣＧＴＧＴＡＮＧＧ）を用いてＭＰ２１プラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅したｃＤＮＡ断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。ＲＮＡプローブは、ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム社）を用いてジギトキシゲニンで標識した。パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的エタノール系列で洗浄し、蒸留水に移した。ジギトキシゲニンで標識したＲＮＡプローブを含まないＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試薬としては、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＩＳＨＲ，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３１６−０１９５１；ニッポンジーン社）を用いた。切片は緩衝液（ＰＢＳ；ＩＳＨＲ１）を用いて１分間と１０分間の２回インキュベートした。切片を３７℃で１０分間、プロディナーゼＫ（ＩＳＨＲ６）で処理した。氷酢酸（ＩＳＨＲ４）を含むアセチル化緩衝液（ＩＳＨＲ３）を用いてアセチル化を１５分行い、次いで、ＰＢＳ／グリシン緩衝液（ＩＳＨＲ２）を用いて室温で２０分のクエンチング後、４ｘＳＳＣ（ＩＳＨＲ５）で１０分間、２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ緩衝液で１０分間洗浄した。５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いて室温で３０分のプレハイブリダイゼーション後、ジギトキシゲニンで標識したＲＮＡプローブ（１μｇ／ｍｌ）を用いて４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ホルムルムアミド／２ｘＳＳＣを用いて４２℃で１０分間を２回行った。それから切片を３７℃で５分間、ＮＥＴ緩衝液（ＩＳＨＲ９）で洗浄後、ＲＮａｓｅＡ（ＩＳＨＲ１０）／ＮＥＴ緩衝液（ＩＳＨＲ９）を用いて３７℃で３０分間、ＲＮａｓｅ処理を行った。０．１ｘＳＳＣ緩衝液（ＩＳＨＲ１１）で２０分間、２回洗浄後、切片を移し、標識したジゴキシゲニンを、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム社）を用いて検出した。切片を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液（緩衝液１）で室温で１分間洗浄し、室温下、ブロッキング試薬（緩衝液２）で３０分間インキュベートした。切片は、アルカリフォスファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体を用いて室温で６０分間インキュベートした。緩衝液１を用いて１５分間、緩衝液３を用いて２分間、室温で洗浄後、切片を緩衝液３で希釈したＮＢＴ／Ｘリン酸溶液と室温で１２から１４時間インキュベートした。緩衝液４で洗浄後、切片はグリセロールまたはパーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）で封入した。
その結果、図３および図４に示すように、ＢＧ２  ｃＤＮＡプローブは、海馬および脊髄で強くハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはまた、視床下部、視床および小脳においても中程度のハイブリダイゼーションシグナルが検出された。
産業上の利用の可能性
本発明により、脳特異的に発現する新規なＧタンパク質共役型レセプタータンパク質およびその遺伝子が提供された。これにより該レセプタータンパク質を利用したリガンドや医薬品の候補化合物のスクリーニングが可能となった。これらリガンドや医薬品の候補化合物は、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の診断や治療などへの利用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウス「ＢＧ２」タンパク質の疎水性プロットを示す。図中の１乃至７の番号はＧタンパク質其役型レセプタータンパク質の特徴的な７つの疎水性領域（膜貫通領域）を示す。また、図下の番号は「ＢＧ２」タンパク質のアミノ酸の番号を示す。
図２は、ヒトおよびマウス「ＢＧ２」遺伝子の発現の組織特異性をノーザンブロット解析した結果を示す。
図３は、脳におけるマウス「ＢＧ２」遺伝子の発現の局在をＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す。
図４は、脊髄におけるマウス「ＢＧ２」遺伝子の発現の局在をＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す。「センス」はセンスＲＮＡプローブ（ｍＲＮＡとハイブリダイズしない；ネガティブコントロール）を用いてハイブリダイゼーションを行った結果、「アンチセンス」はアンチセンスＲＮＡプローブ（ｍＲＮＡとハイブリダイズする）を用いてハイブリダイゼーションを行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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