(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
稲植物体、籾、玄米、精米、米飯、餅あるいはこれらの粉砕物から抽出したＤＮＡを鋳型とし、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）及びＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）、Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）及びＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１１）及びＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２）、Ｅ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３１）及びＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号３２）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号３５）及びＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号３６）、Ｇ４Ｆ１８（配列表の配列番号３９）及びＧ４Ｒ２４（配列表の配列番号４０）、Ｇ２２Ｆ２７（配列表の配列番号４３）及びＧ２２Ｒ２３（配列表の配列番号４４）、Ｇ２８Ｆ１７（配列表の配列番号４７）及びＧ２８Ｒ２８（配列表の配列番号４８）、Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号５１）及びＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号５２）、Ｍ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号５５）及びＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５６）、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号５９）及びＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号６０）、Ｐ５Ｆ２０（配列表の配列番号６７）及びＰ５Ｒ２５（配列表の配列番号６８）、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号７５）及びＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号７６）、Ｔ１６Ｆ２４（配列表の配列番号８３）及びＴ１６Ｒ２６（配列表の配列番号８４）、ＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号８７）及びＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号８８）からなるプライマー対の群より選ばれた５種以上のＳＴＳ化プライマー対を用いたＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無に基づいて良食味米を選抜することを特徴とする米のＤＮＡ食味判定方法。
【請求項２】
籾又は玄米を半裁し、胚を含まない籾半粒又は玄米半粒から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無に基づいて良食味米を選抜した後に、胚を含む残りの籾半粒又は玄米半粒を発芽させて植物体を得ることによって良食味米系統を選抜する請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法において、ＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無を数値化して説明変数とし、官能検査及び／あるいは物理化学的測定方法による米の食味評価結果を目的変数とする多変量解析を行って得られる食味推定式に基づいて良食味米を選抜することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法において、官能検査による米の食味評価が、米飯の「総合評価」、「外観」、「香り」、「味」、「硬さ」及び「粘り」から選ばれた１種以上であり、かつ、物理化学的測定方法による米の食味評価が、タンパク質含量、アミロース含量、米飯の硬さ及び米飯の粘りから選ばれた１種以上である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
米飯の物理特性を判定する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ判別法による米の食味判別技術及び良食味米選抜技術に関し、詳しくは稲植物体、籾、玄米、精米、米飯、餅あるいはこれらの粉砕物から抽出したＤＮＡを適正化プライマー（ＳＴＳ化プライマー）共存下でＰＣＲ法により増幅して得られるＤＮＡバンドのうち、食味評価結果と相関の高いＤＮＡバンドを識別用ＤＮＡマーカーとして用いて良食味米を選抜することを特徴とする米のＤＮＡ食味判定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
世界各国あるいはわが国において、米は小麦やトウモロコシと並んで三大穀物と言われ、世界の人口の過半数の主食として重視されている。最近では、食料としての米の量の確保とならんで質の確保、すなわち、米飯とした場合の食味も重要視され、世界的にはインドやパキスタンの「バスマティ３７０」、タイにおける「ジャスミンライス」、日本における「コシヒカリ」のような極良食味米が高価格で取り引きされており、需要が高まっている。
【０００３】
米の食味の判定方法としては、炊飯米を試食して評点をつける官能検査（試食試験）と、米あるいは米飯の化学成分や物理特性などを測定して食味を推定する物理化学的評価とがあるが、それぞれに利点と問題点がある。このため、現在においては、片方あるいは両者の併用によって米の食味評価が行われている。
しかしながら、官能検査、物理化学的評価ともに、少なくとも５０から５００グラムの米試料を必要とするため、少量、特に一粒の試料米によって対象ロットあるいは対象品種・系統の食味を推定することは不可能であった。
【０００４】
本発明者らは、これまでに米の食味評価に関する研究を行い、例えば食品工業４２巻１７号（ｐ．５５−６１）等の文献発表を行ってきた。しかしながら、本発明者らの従来の技術についても、一定量の米試料を用いる官能検査や物理化学的評価であり、少量、特に一粒の試料米によって非破壊的に食味を推定することは不可能であった。
【０００５】
また、本発明者らは、これまでにＲＡＰＤ法やＳＴＳ化プライマー法等のＤＮＡによって米の品種判別を行う技術に関する研究を行い、日本食品科学工学会誌４６巻３号（ｐ．１１７−１２２）等の文献発表や特許出願（特開２００１−９５５８９号公報等）を行ってきた。しかしながら、これらの従来技術は、すでに種苗として登録された米の品種を対象にし、食味とは無関係に品種判別用ＤＮＡマーカーを組み合わせて判別するものであり、世界各地の未知の米、新しく育成中の米、あるいは市場に登場したけれども食味評価の定まっていない米等を含む広範な米を対象としたＤＮＡ食味判別技術については、判別対象としていない。
【０００６】
また、これまでに、稲の幼苗や多量の米試料を用いて、ＲＦＬＰ（制限酵素断片多型性）による遺伝子マーカーを用いた病虫害抵抗性遺伝子の探索等の研究が行われてきている。しかし、ＲＦＬＰ法では試料ＤＮＡを各種の制限酵素によって切断して得られるＤＮＡ多型に基づいて探索を行うため、本発明のように少量の試料、特に一粒の米試料による非破壊的な食味評価及び良食味米選抜は不可能である。
したがって、従来の公知技術では、少量の試料、特に一粒の米試料を用いて、ＤＮＡ識別マーカーによって食味評価を行うことは不可能であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微量試料、特に半粒あるいは１粒の米試料を用いてＤＮＡ食味判別を行う方法を提供することにあり、次世代の稲体のもとになる胚芽を破壊することなく食味を判別し、良食味米を選抜する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、各種の米試料から抽出したＤＮＡを、適正なプライマー存在下のＰＣＲ法によって増幅して得られるＤＮＡバンドのうち、食味評価結果と相関の高い識別用ＤＮＡマーカーによって良食味米を選抜できることを見出し、本発明に到達したものである。
【０００９】
すなわち、請求項１記載の本発明は、稲植物体、籾、玄米、精米、米飯、餅あるいはこれらの粉砕物から抽出したＤＮＡを鋳型とし、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）及びＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）、Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）及びＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１１）及びＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２）、Ｅ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３１）及びＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号３２）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号３５）及びＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号３６）、Ｇ４Ｆ１８（配列表の配列番号３９）及びＧ４Ｒ２４（配列表の配列番号４０）、Ｇ２２Ｆ２７（配列表の配列番号４３）及びＧ２２Ｒ２３（配列表の配列番号４４）、Ｇ２８Ｆ１７（配列表の配列番号４７）及びＧ２８Ｒ２８（配列表の配列番号４８）、Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号５１）及びＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号５２）、Ｍ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号５５）及びＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５６）、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号５９）及びＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号６０）、Ｐ５Ｆ２０（配列表の配列番号６７）及びＰ５Ｒ２５（配列表の配列番号６８）、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号７５）及びＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号７６）、Ｔ１６Ｆ２４（配列表の配列番号８３）及びＴ１６Ｒ２６（配列表の配列番号８４）、ＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号８７）及びＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号８８）からなるプライマー対の群より選ばれた５種以上のＳＴＳ化プライマー対を用いたＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無に基づいて良食味米を選抜することを特徴とする米のＤＮＡ食味判定方法である。
【００１０】
請求項２記載の本発明は、籾又は玄米を半裁し、胚を含まない籾半粒又は玄米半粒から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無に基づいて良食味米を選抜した後に、胚を含む残りの籾半粒又は玄米半粒を発芽させて植物体を得ることによって良食味米系統を選抜する請求項１記載の方法である。
【００１１】
請求項３記載の本発明は、請求項１又は２記載の方法において、ＰＣＲによるＤＮＡバンドの出現の有無を数値化して説明変数とし、官能検査及び／あるいは物理化学的測定方法による米の食味評価結果を目的変数とする多変量解析を行って得られる食味推定式に基づいて良食味米を選抜することを特徴とする請求項１又は２記載の方法である。
【００１２】
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の方法において、官能検査による米の食味評価が、米飯の「総合評価」、「外観」、「香り」、「味」、「硬さ」及び「粘り」から選ばれた１種以上であり、かつ、物理化学的測定方法による米の食味評価が、タンパク質含量、アミロース含量、米飯の硬さ及び米飯の粘りから選ばれた１種以上である請求項１〜３のいずれかに記載の方法である。
【００１３】
請求項５記載の本発明は、米飯の物理特性を判定する請求項１〜４のいずれかに記載の方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明における米の食味とは、精米を炊飯した場合の米飯の美味しさを指す。米飯の美味しさは、国や地域、時代、食事の環境、試食者の空腹度合い等によって変動することが知られている。
しかし、一定条件下で炊飯した白飯を多数の試食者で試食試験を行った場合には嗜好性の傾向が現れる。例えば、日本では「軟らかくて粘りが強くつやのある米飯」が好まれるが、逆にインドでは「硬くてしっかりした歯ごたえのある粘りの少ない米飯」が好まれる。
本発明で述べる米の食味とはこの嗜好性の傾向を指し、例えば、旧農林水産省食糧研究所で開発された官能検査方法に基づいて毎年実施され結果が公表されている日本穀物検定協会の米の食味ランキングや各地の農業試験場の稲育種研究室で行われている食味試験結果や後述する食味の物理化学的測定結果などが相当する。
【００１５】
本発明における米の食味の官能検査とは、米飯を試料とし、４名から５０名（通常は２４名）の試食者が、「総合評価」、「硬さ」、「粘り」、「外観」、「味」や「香り」等の項目ごとに、試料米飯と同時に供試される基準米と比較しながら、「劣る」、「同等」、「優れている」等の評価を行い、これらの評価値を、平均値との差の検定や２元配置分散分析等の統計処理によって食味評価を行うことである。例としては、前述の日本穀物検定協会の方法や全国の国公立の稲育種研究室で実施されている食味試験がこれに相当する。
【００１６】
本発明における米の食味の物理化学的測定結果とは、米の食味の官能検査結果を推定するために、米のタンパク質含量やアミロース含量等の化学成分測定や米粒あるいは米粉の可視光から近赤外光領域の分光スペクトル測定、炊飯特性試験、米飯物性測定等を行った個別の測定結果あるいはこれらの測定値を説明変数として重回帰分析、ニューラルネットワーク解析等の多変量解析によって推定した食味推定値を指す。
【００１７】
本発明における米飯物性測定とは、米飯の食味に関係が深いとされる硬さや粘りを、テクスチュロメーター、レオメーター、レオログラフ、テンシプレッサー等の引張り圧縮試験機やレオログラフマイクロ等の粘弾性測定装置によって測定する方法を指す。米飯の物性測定は、米飯であれば１〜３粒程度から米飯塊等にいたる各種の試料を用いて行うことができる。
【００１８】
本発明における稲植物体、籾、玄米、精米、米飯、餅あるいはこれらの粉砕物からのＤＮＡ抽出は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドを用いる方法（以下、ＣＴＡＢ法と略記することがある。）、アルカリＳＤＳ法、フェノール法、酵素法、塩化ベンジル法等の常法あるいは市販のＤＮＡ抽出用キットを用いることができる。本発明においては、後記の実施例で示すように、ＣＴＡＢ法あるいは酵素法を用いるのが好ましい。
たとえば、試料にＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍトリス／塩酸、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて攪拌し、恒温槽に入れた後、再びＣＴＡＢ溶液を加え、所定時間静置して抽出することにより、ゲノムＤＮＡを得ることができる。
また、試料が米飯や餅等の場合には、特許第３０４８１４９号明細書に記載されているように、粉末試料を耐熱性アミラーゼによって処理した後にゲノム遺伝子を抽出する酵素法によって抽出することもできる。
【００１９】
試料として、特に籾又は玄米を用いる場合、籾又は玄米をカッターやナイフ等を用いて半裁し、胚（胚芽）を含まない半粒からＤＮＡを抽出して食味判定を行うことにより、後述するように、残りの胚（胚芽）を含む半粒を発芽させて、食味評価の高い良食味米の植物体を得ることができる。
【００２０】
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈殿等の精製工程を加えてもよい。これらの工程の中では、クロロホルム／イソアミルアルコール処理が好ましい。この処理は、たとえばＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌、遠心分離して得られる上清に、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ溶液、２０ｍＭトリス／塩酸、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えてさらにＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離を行って得られたＤＮＡ沈殿物を１Ｍ  ＮａＣｌで抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解するもので、これによりＤＮＡ試料液を得ることができる。
【００２１】
続いて、ランダムプライマーの共存下に、上記の操作により得られるゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行う。これは、ゲノムＤＮＡのうち、次のＰＣＲ用のＳＴＳ化プライマー設計の基となる品種間の識別性を有する塩基配列を増幅させるために行うものである。
ここで、本発明におけるＰＣＲ法とは、上記により抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、各種の遺伝子断片（プライマー）共存下で、変性（９０〜９６℃の高温による鋳型ＤＮＡの2 本鎖から１本鎖への分離）、結合（３０〜７５℃における各ＤＮＡへのプライマーの結合）、伸長（７０〜７５℃における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー結合部分からのＤＮＡ分子の伸長）の３過程を２０〜５０サイクル繰り返すことによって鋳型ＤＮＡを１００万倍〜１００億倍に増幅する方法を指す。
【００２２】
本発明におけるＲＡＰＤ法とは、ＰＣＲ法において、無作為に合成された８〜５０量体のランダムプライマーを用い、増幅されたＤＮＡの多型（多様な変化）を検出する方法を指す。
本発明におけるランダムプライマーとは、試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増幅する際に、変性して一本鎖に分かれたゲノムＤＮＡに相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型ＤＮＡ複製の開始点となるプライマーを指す。通常は８〜５０量体のヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーのことであり、たとえば市販されている１０量体ランダムプライマー（オペロン社製）やＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）（和光純薬社製）等が挙げられる。すなわち、ＰＣＲに用いるランダムプライマーがＯＰＡ６、ＯＰＢ１、ＯＰＢ１８、ＯＰＥ２２、ＯＰＦ６、ＯＰＧ４、ＯＰＧ２８、ＯＰＭ１１、ＯＰＰ３、ＯＰＰ５、ＯＰＱ１６、ＯＰＴ１６からなるプライマー群の中から選ばれた１あるいは２種類以上のランダムプライマーを用いてＰＣＲを行い、識別バンドの有無を有の場合に１、無の場合に０と数値化して食味推定の説明変数とする。
【００２３】
ＳＴＳ（Sequence Tagged Site）化プライマーとは、品種間の識別性の現れる塩基配列を増幅させることができる１対のプライマーであり、前記したように、ＲＡＰＤ法に基づき、上記試料より得られるＤＮＡからＰＣＲ法を行って得られる品種間に識別性のあるバンド部分の塩基配列を基に設計されるものである。すなわち、対象とする試料のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマー存在下で行うＰＣＲ法によって識別バンドとして得られたＤＮＡの塩基配列を決定し、そのうちランダムプライマー部分のフォワード側及びリバース側の８〜５０残基を１対のプライマーとして、対象穀類の鋳型ＤＮＡと共に品種識別のために行うＰＣＲ法に使用するものを指す。
ＳＴＳ化プライマーを選定することにより、ランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、食味判定のために行うＰＣＲ法においては、識別に有用な判定バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。
【００２４】
ＰＣＲで得られる増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これは、増幅産物のうち、目的とするＳＴＳ化プライマーを設計するための基となる、食味の相違の現れる塩基配列であることを示すバンドを検出するためである。
【００２５】
このようにして検出された食味の識別性の現れたバンドから、次のようにして１対のプライマーを作製する。
すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出、回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲ法で増幅し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
【００２６】
決定された塩基配列から、ＳＴＳ化プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型ＤＮＡである試料由来のＤＮＡのうちランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有しているはずである。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した食味判定性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲ法におけるＳＴＳ化プライマーの母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。
したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側及びリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さを有する良食味米の選抜に有用なＳＴＳ化プライマーを設計することができる。
【００２７】
すなわち、本発明におけるＳＴＳ化プライマーは、前記したように、識別用ＤＮＡバンドからＤＮＡを抽出してその塩基配列を決定し、ＰＣＲにおいて当該識別バンドＤＮＡのみが増幅されるように５’側及び３’側の両側から識別バンドＤＮＡを挟み込むように塩基配列を設計したフォワード・リバースの対をなすプライマー（対合プライマー）を指し、互いに同一配列あるいは相同配列を有していることが望ましい。
【００２８】
また、ＳＴＳ化プライマーのサイズ（構成塩基の残基数）は、好ましくは８〜５０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基の範囲内であることが必要である。プライマーがこの範囲を超える場合は、鋳型ＤＮＡとの結合性及び結合後の解離が悪くなり、ＰＣＲ後にも識別バンドが検出されず、品種識別が困難になるため好ましくない。また、この範囲を下回る場合は、非特異的な結合によるミスマッチ等が起こり、識別バンド以外のバンドの発現頻度が高くなるため、食味判定が困難になる他、複数のプライマーの併用によるＰＣＲの簡易迅速化が困難になるため好ましくない。
【００２９】
本発明者らは、上記のＰＣＲを行った結果、各種品種間に識別性の現れる数種のバンドを得た。米における識別バンドと品種識別性の関係を第１表に示す。
本発明における識別用ＤＮＡバンドとは、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動等によって検出することにおいて、試料米品種の間の相違を示すＤＮＡを指す。
【００３０】
【表１】
第１表（その１）
0004255630.tif 000002
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３１】
【表２】
第１表（その２）
0004255630.tif 000003
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３２】
【表３】
第１表（その３）
0004255630.tif 000004
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３３】
【表４】
第１表（その４）
0004255630.tif 000005
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３４】
各バンドに由来して、種々のＳＴＳ化プライマーを得た。
（１）識別バンドＡ７（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「あきたこまち」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＡ７から、１対のプライマーＡ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）及びＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３' 側から所定数の塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＡ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）及びＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）を得た。
【００３５】
（２）識別バンドＢ４３（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」や「ササニシキ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「きらら３９７」や「朝の光」では見られない。このＢ４３から、１対のプライマーＢ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２１）及びＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２２）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３' 側から所定数の塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＢ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２３）及びＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２４）を得た。
【００３６】
（３）識別バンドＥ３０（０．８５ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「むつほまれ」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「あきたこまち」では見られない。このＥ３０から、１対のプライマーＥ３０Ｆ３０（配列表の配列番号２９）及びＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３０）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＥ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３１）及びＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号３２）を得た。
【００３７】
（４）識別バンドＪ６（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「きらら３９７」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「ササニシキ」では見られない。このＪ６から、１対のプライマーＪ６Ｆ３０（配列表の配列番号４９）及びＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５０）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＪ６Ｆ１８（配列表の配列番号５１）及びＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号５２）を得た。
【００３８】
（５）識別バンドＭ２ＣＧ（１．２ｋｂｐ）
このバンドは、１０量体ランダムプライマーに２残基添加したもので、「ひとめぼれ」や「日本晴」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「キヌヒカリ」では見られない。このＭ２ＣＧから、１対のプライマーＭ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号５３）及びＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号５４）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＭ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号５５）及びＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５６）を得た。
【００３９】
（６）識別バンドＳ１３（１．８ｋｂｐ）
このバンドは、「きらら３９７」や「ほしのゆめ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＳ１３から、１対のプライマーＳ１３Ｆ３０（配列表の配列番号７３）及びＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号７４）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＳ１３Ｆ２５（配列表の配列番号７５）及びＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号７６）を得た。
なお、Ｓ１３からはＳ１３Ｆ４０（配列表の配列番号８９）及びＳ１３Ｒ４０（配列表の配列番号９０）を設計することもできるが、このプライマーから塩基を切除したＳ１３Ｆ１２（配列表の配列番号９１）及びＳ１３Ｒ１２（配列表の配列番号９２）については、ＰＣＲを行う際に、非特異的な結合によるミスマッチ等が起こり、識別バンド以外のバンドの発現頻度が高くなるため、品種識別が困難になる等の問題が生じた。
【００４０】
（７）識別バンドＷＫ９（１．６ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「あきたこまち」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「こしひかり」や「ササニシキ」では見られない。このＷＫ９から、１対のプライマーＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号８５）及びＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号８６）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明のＳＴＳ化プライマーであるＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号８７）及びＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号８８）を得た。
【００４１】
本発明のＳＴＳ化プライマーを得るために行う塩基の切除とは、試料より抽出した鋳型ＤＮＡを増幅し、これを基に設計された１対のプライマーの不要な塩基を切除し、１５〜３０個の塩基とすることをいう。
塩基を切除する方法としては、好適な制限酵素を用いて行う常法によって実施すればよい。
【００４２】
具体的には、１対のプライマーであるＡ６Ｆ３０（配列表の配列番号１）及びＡ６Ｒ３０（配列表の配列番号２）、Ａ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）及びＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）、Ｂ１Ｆ３０（配列表の配列番号９）及びＢ１Ｒ３０（配列表の配列番号１０）、Ｂ７Ｆ３０（配列表の配列番号１３）及びＢ７Ｒ３０（配列表の配列番号１４）、Ｂ１８Ｆ３０（配列表の配列番号１７）及びＢ１８Ｒ３０（配列表の配列番号１８）、Ｂ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２１）及びＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２２）、Ｅ２２Ｆ３０（配列表の配列番号２５）及びＥ２２Ｒ３０（配列表の配列番号２６）、Ｅ３０Ｆ３０（配列表の配列番号２９）及びＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３０）、Ｆ６Ｆ３０（配列表の配列番号３３）及びＦ６Ｒ３０（配列表の配列番号３４）、Ｇ４Ｆ３０（配列表の配列番号３７）及びＧ４Ｒ３０（配列表の配列番号３８）、Ｇ２２Ｆ３０（配列表の配列番号４１）及びＧ２２Ｒ３０（配列表の配列番号４２）、Ｇ２８Ｆ３０（配列表の配列番号４５）及びＧ２８Ｒ３０（配列表の配列番号４６）、Ｊ６Ｆ３０（配列表の配列番号４９）及びＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５０）、Ｍ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号５３）及びＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号５４）、Ｍ１１Ｆ３０（配列表の配列番号５７）及びＭ１１Ｒ３０（配列表の配列番号５８）、Ｐ３Ｆ３０（配列表の配列番号６１）及びＰ３Ｒ３０（配列表の配列番号６２）、Ｐ５Ｆ３０（配列表の配列番号６５）及びＰ５Ｒ３０（配列表の配列番号６６）、Ｑ１６Ｆ３０（配列表の配列番号６９）及びＱ１６Ｒ３０（配列表の配列番号７０）、Ｓ１３Ｆ３０（配列表の配列番号７３）及びＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号７４）、Ｔ８Ｆ３０（配列表の配列番号７７）及びＴ８Ｒ３０（配列表の配列番号７８）、Ｔ１６Ｆ３０（配列表の配列番号８１）及びＴ１６Ｒ３０（配列表の配列番号８２）、ＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号８５）及びＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号８６）から、上記の方法によって、不要な塩基を切除した１５〜３０個の塩基からなるＳＴＳ化プライマーからなる群より選ばれた２種以上の対合プライマーを用いることができる。
【００４３】
すなわち、ＳＴＳ化プライマーとしては、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）及びＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）、Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）及びＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１１）及びＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２）、Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号１５）及びＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号１６）、Ｂ１８Ｆ１５（配列表の配列番号１９）及びＢ１８Ｒ２１（配列表の配列番号２０）、Ｂ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２３）及びＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２４）、Ｅ２２Ｆ２０（配列表の配列番号２７）及びＥ２２Ｒ２１（配列表の配列番号２８）、Ｅ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３１）及びＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号３２）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号３５）及びＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号３６）、Ｇ４Ｆ１８（配列表の配列番号３９）及びＧ４Ｒ２４（配列表の配列番号４０）、Ｇ２２Ｆ２７（配列表の配列番号４３）及びＧ２２Ｒ２３（配列表の配列番号４４）、Ｇ２８Ｆ１７（配列表の配列番号４７）及びＧ２８Ｒ２８（配列表の配列番号４８）、Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号５１）及びＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号５２）、Ｍ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号５５）及びＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５６）、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号５９）及びＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号６０）、Ｐ３Ｆ２０（配列表の配列番号６３）及びＰ３Ｒ１５（配列表の配列番号６４）、Ｐ５Ｆ２０（配列表の配列番号６７）及びＰ５Ｒ２５（配列表の配列番号６８）、Ｑ１６Ｆ２５（配列表の配列番号７１）及びＱ１６Ｒ２０（配列表の配列番号７２）、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号７５）及びＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号７６）、Ｔ８Ｆ２２（配列表の配列番号７９）及びＴ８Ｒ２５（配列表の配列番号８０）、Ｔ１６Ｆ２４（配列表の配列番号８３）及びＴ１６Ｒ２６（配列表の配列番号８４）、ＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号８７）及びＷＫ９Ｒ２0 （配列表の配列番号８８）からなる群より選ばれた２種あるいはそれ以上の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００４４】
本発明で用いるＳＴＳ化プライマーについては、上記したＳＴＳ化プライマーのみに限定されるものではなく、識別性や融解温度（Ｔｍ）等の点で使用可能なＳＴＳ化プライマーを新たに設計して使用することもできる。
ここで、Ｔｍとは、ＤＮＡの２本鎖がそれぞれの１本鎖に分離する温度のことであり、ＰＣＲのアニーリング温度は、通常、使用するプライマーのＴｍ付近が適している。本発明においては、ＳＴＳ化プライマーの併用に際し、Ｔｍの類似したＳＴＳ化プライマー同士を選択して使用し、Ｔｍに近い適正なアニーリング温度を選定することによって、各ＳＴＳ化プライマーを単独で使用した場合に得られる識別バンドを１回あるいは数回のＰＣＲで得ることができる。
【００４５】
具体的には、使用するＳＴＳ化プライマーのＴｍの平均値と、各ＳＴＳ化プライマーのＴｍとの差が１５℃（±１５℃）以内で、かつＰＣＲのアニーリング温度もその範囲内とすることが好ましい。
アニーリング温度をＳＴＳ化プライマーのＴｍの平均値よりも１５℃以上低い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来識別バンドが現れない品種にも識別バンドが現れる恐れがあるため、好ましくない。一方、Ｔｍの平均値よりも１５℃以上高い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来発現していた識別バンドが消えてしまうことがあり、好ましくない。
【００４６】
ＳＴＳ化プライマーを適切に選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。
本発明において、ＳＴＳ化プライマーのうちの１種類あるいは２種類以上の組み合わせを混合使用することが可能である。
本発明におけるＳＴＳ化プライマーの混合使用とは、選択した複数のＳＴＳ化プライマーを、品種の識別を行うためのＰＣＲにおいて、同一反応に併用することを意味する。本発明では、適切なＳＴＳ化プライマーの組み合わせ（プライマーセット）を用いることにより、それぞれのプライマーに対応する識別バンドのみが電気泳動で発現することになるため、混合使用が可能である。
【００４７】
調製したＳＴＳ化プライマーは、全てが混合使用できるものではなく、各プライマー間で相互のプライマーダイマー生成が起こらないこと、識別バンドが重ならないこと等に注意しながら好適な組み合わせ及び配合割合を選定することが必要である。各種の好適なＳＴＳ化プライマーを混合使用することにより、プライマー毎にＰＣＲを行う必要がなくなり、１回のＰＣＲで多くの品種を正確、かつ簡便に識別することができるため、品種判別に要する労力、時間や費用を大幅に減少させることができる。
【００４８】
次に、本発明である稲植物体、籾、玄米、精米、米飯、餅あるいはこれらの粉砕物から抽出したＤＮＡをＳＴＳ化プライマー共存下でＰＣＲ法により増幅して得られるＤＮＡバンドのうち、食味評価結果と相関の高いＤＮＡバンドを識別用ＤＮＡマーカーとして用い、良食味米を選抜する米のＤＮＡ食味判定方法について説明する。
【００４９】
食味を判定するに際しては、第１表におけるＰＣＲによる識別バンドの出現の有無を数値化し、識別バンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０とする２値化を行う。また、食味の数値化を図るために食味官能検査結果や物理化学測定値を直接用いる方法、あるいはこれ以外に、例えば「米の食味ランキング」（日本穀物検定協会発行、２００１年）における評価特Ａを５点、評価Ａを４点、評価Ａ’を３点、評価Ｂを２点、評価Ｂ’を１点として各品種の食味の数値化を行う方法、また「米品種大全２」（米穀データバンク社発行、１９９９年）における各品種米の食味評価の星印５個を５点、星印４個を４点、星印３個を３点、星印２個を２点、星印１個を１点として、上記の食味ランキングの数値に加え、合計数値を各品種米の食味評価値とする方法等が挙げられる。
【００５０】
次に、上記によって数値化したＳＴＳ化プライマーあるいはランダムプライマー共存下でのＰＣＲによる識別バンドの出現の有無を説明変数とし、前記した食味評価値、官能検査結果、物理化学測定値のいずれかを目的変数として用い、重回帰分析等の多変量解析を行って、食味推定式を得る。この食味推定式より重相関係数を算出し、良食味米であるかを判定する。
食味推定式は、重回帰分析を用いて求めることが多いが、これ以外の一般的な多変量解析の手法、例えば主成分分析、クラスター分析、ＰＬＳ解析、ニューラルネットワーク解析等の手法を用いることができる。
【００５１】
例えば、重回帰分析は以下の方法によって行うことができる。まず、食味評価値のような目的変数をｙとし、１からｐ個の各プライマーの識別バンドの出現の有無に相当する説明変数をｘ１、ｘ２、ｘ３、・・・ｘｐとし、個体１からｐまでの目的変数ｙ１、ｙ２、ｙ３、・・・ｙｐに対する説明変数をｘ１１、ｘ２１、ｘ３１、・・・ｘｐ１とするとき、下記の式ような線形重回帰モデルを作成する。
【００５２】
【数１】
0004255630.tif 000006
【００５３】
ここで、未知の定数項ｋとａ１、ａ２、ａ３、・・ａｐの回帰係数が決まれば、得られた各説明変数であるｘ１、ｘ２、ｘ３、・・・ｘｐの任意の値に対してそれに対応する目的変数の予測値を計算することができる。
この予測値と実測値との差である予測誤差の２乗和を最小にするように、ａ１、ａ２、ａ３、・・ａｐの回帰係数を定めればよい。すなわち、下記の式を最小にするように（ｐ＋１）元の連立方程式を立てることにより、その解としてａ１、ａ２、ａ３、・・ａｐの回帰係数が求められ、定数項ｋも回帰係数を回帰モデル式に代入することで求めることができる。
【００５４】
【数２】
0004255630.tif 000007
（iは１〜ｐまで）
【００５５】
次に、本発明の方法において良食味米を選抜する方法について説明する。良食味米を選抜する際、ＤＮＡを抽出するための試料としては胚（胚芽）を含まない籾又は玄米半粒を用いる。すなわち、玄米あるいは籾をカミソリやカッター等によって半裁し、胚（胚芽）を含まない籾又は玄米半粒から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、ＳＴＳ化プライマー等の各種プライマーの共存下でＰＣＲを行う。
続いて、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動等によって検出し、試料の中から良食味米に特有の識別用ＤＮＡマーカーの出現は多いが、低食味米に特有の識別用ＤＮＡマーカーの出現は少ない籾又は玄米を選抜する。このような識別用ＤＮＡマーカーとしては、食味評価の高い品種に特有に出現するＤＮＡバンド、あるいは食味評価の低い品種に特有に出現するＤＮＡバンドが用いられることが多いが、それ以外のＤＮＡバンドも用いることができる。
【００５６】
上記のように、識別用ＤＮＡマーカーによって良食味米を選抜した後に、胚（胚芽）を含む残りの籾又は玄米半粒を発芽させ、植物体に生育させることによって良食味米系統を選抜することができる。
胚（胚芽）を含む玄米又は籾の半粒を発芽させて植物体を生育させ、次世代の穀粒を得るには、例えば以下のようにする。すなわち、胚（胚芽）を含む半粒を１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した後、例えば下記の組成の培地に置床し、３０℃で発芽させ、発芽半粒種子を得る。
【００５７】
培地組成（１Ｌ中、ｐＨ５．８）
アガロース                ８．０００ｇ
硫酸アンモニウム          ０．４６３ｇ
硝酸カリウム              ２．８３０ｇ
塩化カルシウム            ０．１６６ｇ
硫酸マグネシウム          ０．１８５ｇ
リン酸２水素カリウム      ０．４００ｇ
硫酸第二鉄                ０．２７８ｇ
ＥＤＴＡ２ナトリウム      ０．３７３ｇ
ニコチン酸                ０．２５０ｍｇ
ビタミンＢ６              ０．２５０ｍｇ
ビタミンＢ１              ０．５００ｍｇ
グリシン                  １．０００ｍｇ
【００５８】
発芽半粒種子を人工気象器に移し、２８℃（光照射）１０時間、２８℃（暗）１４時間のサイクルで培養し、幼苗を緑化させる。次いで幼苗を、前記の培地を含むアグリポットに移植し、生育させた後、育苗培土に移植し、人工気象室で２週間程度生育させる。これらの苗を埴土をいれたワグナムポットに移植し、前記の人工気象室で約４ヶ月間栽培し、出穂させる。さらに、穂が完熟するまで約４０日間生育を続けた後に穂を刈り取り、脱穀、籾摺りを行う。
こうして得られた各玄米から精米粉末を調製し、上記と同様に、ＣＴＡＢ法等によるＤＮＡの抽出を行い、該ＤＮＡを鋳型として各種のＳＴＳ化プライマー等の共存下でＰＣＲを行い、電気泳動することによって検出する識別用ＤＮＡバンドの有無に基づいて得られる食味推定式によって食味選抜を行う。
得られた各玄米試料は試験用精米機で精米し、官能検査や物性測定等の食味試験に供することもできる。
【００５９】
また、玄米あるいは籾の半粒を用いて良食味米の育種・選抜は、例えば以下の方法によって行うことができる。すなわち、常法に従って約４０℃の温湯に浸漬して除雄した母本に花粉親の花粉を受粉させた後、ポット栽培等で雑種第一代の種子を得る。当該種子の籾又は玄米の胚（胚芽）を含む部分と含まない部分とに半裁し、胚芽を含まない部分の玄米／籾の半粒を乳鉢ですりつぶし、ＣＴＡＢ法等によりＤＮＡを抽出してＰＣＲの鋳型ＤＮＡとする。
【００６０】
この鋳型ＤＮＡを各種のＳＴＳ化プライマー等の共存下でＰＣＲに供し、増幅されたＤＮＡを電気泳動することによって検出する識別用ＤＮＡバンドの有無を１又は０に数値化し、識別バンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０とする２値化を行う。
また、前記した「米の食味ランキング」（日本穀物検定協会発行、２００１年）及び「米品種大全２」（米穀データバンク社発行、１９９９年）による食味の数値化の他に、物理化学的測定結果や物性測定結果として得たものを数値化したものについても、食味評価値と同様に用いることができる。
【００６１】
次に、前記したように、上記によって数値化したＰＣＲによる識別バンドの出現の有無を説明変数とし、食味評価値や物理化学測定値等を目的変数として、重回帰分析等の多変量解析を行って作成した食味推定式より重相関係数を算出し、良食味米であるかを判定する。すなわち、識別用ＤＮＡバンドの有無を２値化したものを得られた食味推定式に導入し、食味推定値を算出する。この食味推定値が高い種子あるいは米飯物性予想値の適正な鋳型ＤＮＡを有する種子を選抜する。米飯物性予想値の適正な鋳型ＤＮＡを有する種子としては、例えば日本人向けには米飯の粘り／硬さの推定値の大きいものを、インド人向けには硬さの推定値の大きいものを選抜する。
このようにして選抜された種子の胚（胚芽）を含む半粒を、前記した方法に従って播種、発芽、移植、生育させた後、成熟種子を得る。このようにして得られた雑種第二代の良食味系統を常法に従って自殖を重ねて固定化することによって、籾又は玄米半粒から良食味米を選抜育成することができる。
【００６２】
以下に、実施例により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（食味評価値を目的変数とする米飯ＰＣＲ食味推定式の未知試料への適用性）
わが国の平成１１年度における作付け上位２０品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試料とし、試験用精米機ライスパルＶＰ３１Ｔ（山本製作所製）を用いて歩留まり９０％に精白し、精米試料を得た。
【００６３】
精米試料を、１粒ずつ１．５ｍＬ容プラスチックチューブ（アシスト社製）に取り、脱イオン水３５μＬを加え、スタンドに立てて1 時間浸漬した。浸漬後、プラスチックチューブを開封状態で電気炊飯器ＲＣ−１８３（東芝社製、外釜に脱イオン水７５ｍＬ添加）にて１５分間炊飯した後、１５分間蒸らしたものを米飯試料とした。
ＤＮＡの抽出は、次のように行った。米飯試料各１粒をマイクロチューブに取り、１００ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有）３００μＬを加え、ペレットミキサー（コンテス社製）で粉砕した。粉砕後の米飯試料に、耐熱性アミラーゼであるα−アミラーゼ（シグマ社製、７９０Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いで、トリチラチウム・アルバム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー社製、２０ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。
【００６４】
酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍＬを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）し、沈殿を得た。この沈殿を３００μＬのＴＥ（１０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μＬを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
次いで、遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１  ）を加え、３０分間抽出し、遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して得た上清に５Ｍ  ＮａＣｌを６ｍＬ添加し、冷却したエタノール４００μＬを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μＬの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料液とした。
【００６５】
ＰＣＲは以下のように行った。
上記の方法で米飯試料から調製したＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼとしてTaq polymerase（宝酒造社製、５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス／塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、Ａ６Ｆ２１及びＡ６Ｒ２２（配列番号３及び４）各０．４μＬ、Ａ７Ｆ２２及びＡ７Ｒ１７（配列番号１５及び１６）各０．５μＬ、Ｍ１１Ｆ２０及びＭ１１Ｒ２０（配列番号５９及び６０）各０．６μＬ、Ｓ１３Ｆ２５及びＳ１３Ｒ２４（配列番号７５及び７６）各０．５μＬ、Ｔ１６Ｆ２４及びＴ１６Ｒ２６（配列番号８３及び８４）各０．４μＬ、Ｊ６Ｆ１８及びＪ６Ｒ２０（配列番号５１及び５２）各０．４μＬ、ＷＫ９Ｆ２０及びＷＫ９Ｒ２０（配列番号８７及び８８）各０．４μＬを使用し、滅菌水を加えて合計２０．０μＬとした。
反応装置はＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社製）を使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で３５サイクル反応させた。
【００６６】
増幅ＤＮＡはミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
また、食味の数値化を図るために、「米の食味ランキング」（日本穀物検定協会発行、２００１年）における評価特Ａを５点、評価Ａを４点、評価Ａ’を３点、評価Ｂを２点、評価Ｂ’を１点として、各品種の食味の数値化を行った。さらに、「米品種大全２」（米穀データバンク社発行、１９９９年）における各品種米の食味評価の星印５個を５点、星印４個を４点、星印３個を３点、星印２個を２点、星印１個を１点として食味ランキングの数値に加え、合計数値を各品種米の食味評価値とした。電気泳動によるバンドパターンの検出結果及び食味評価の結果を、第２表及び図１に示す。
【００６７】
なお、第２表におけるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、７種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、食味評価値を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式が得られた。
【００６８】
【数３】
0004255630.tif 000008
【００６９】
この食味推定式（式１）の未知試料に対する適用性を検定するために、平成９年産米１１点、平成１０年産米１１点及び平成１１年産米１０点について、食味の官能検査結果である食味実測値と食味推定式（式１）による食味推定結果である食味予想値とを比較した。図２〜図４は、食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
この結果、食味推定式（式１）による食味推定値は、平成９年産米で０．８５、平成１０年産米で０．９１、平成１１年産米で０．９３という高い重相関係数を示した。したがって、食味推定式の作成に用いなかった未知試料に対しても、年次を越えて適用性のあることが明らかとなった。
【００７０】
【表５】
第２表  作付け上位品種とその食味評価値及びプライマー特性表
0004255630.tif 000009
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
＊：官能検査を実施しなかったもの
【００７１】
実施例２（食味官能検査結果を目的変数として作成した精米ＰＣＲ食味推定式の適用性）
精米粉末を試料とした以外は、実施例１と同様に行った。すなわち、実施例１と同じ２０品種の玄米を試料とし、精米粉末を調製し、そのうちの６ｇからＣＴＡＢ法によって、ゲノムＤＮＡを次の方法で抽出した。すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍトリス／塩酸、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍＬを加えて撹拌し、５５℃の恒温槽に入れ、上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍＬを加え、３０分間ＤＮＡを抽出した。
【００７２】
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、遠心分離して上清をとり、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ溶液、２０ｍＭトリス／塩酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて４℃で一晩静置してＤＮＡを沈殿させた。次に、遠心分離して得られたＤＮＡ沈殿物に１Ｍ  ＮａＣｌによって抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μＬに溶解してＤＮＡ試料液とした。
【００７３】
抽出したＤＮＡを鋳型とし、Ｂ１、Ｆ６、Ｇ２８、Ｐ５及びＴ１６の５種類のＳＴＳ化プライマーを用いた。ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼとしてTaq polymerase（宝酒造社製、５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス／塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１５）及びＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１６）各０．２μＬ、Ｆ６Ｆ２５及びＦ６Ｒ２２（配列番号３５及び３６）各０．４μＬ、Ｇ２８Ｆ１７及びＧ２８Ｒ２８（配列番号４７及び４８）各０．２μＬ、Ｐ５Ｆ２０及びＰ５Ｒ２５（配列番号６７及び６８）各０．３μＬ、Ｔ１６Ｆ２４及びＴ１６Ｒ２６（配列番号８３及び８４）各０．３μＬを使用し、滅菌水を加えて合計２０．０μＬとした。ＰＣＲの条件は、実施例１と同様である。
【００７４】
増幅されたＤＮＡは、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
また、食味の数値化を図るために、官能検査を以下の方法で行った。精米試料各６００グラムを洗米し、１．３倍（重量）の純水を加えて１時間吸水させた後、電気炊飯器ＲＣ１８３(東芝社製)により炊飯し、スイッチが切れた後、１５分間蒸らした。その後、ふたを取らずに１時間静置した。次いで、ふたを取って米飯を良く切り返した後、プリンカップにとってさらに盛りつけ、これを食味官能試験の試料とした。
【００７５】
食味試験のパネラーは、２４名とした。官能検査結果は、「日本晴」を基準米（０点）とし、基準米と比べて食味の総合評価を１口目の試食でかなり明確に美味しいと感じる場合を＋３、１口目の試食で明確な確信はないが少し美味しいと感じる場合を＋２、１口目の試食ではっきりしないが２口目の試食で僅かに美味しいと感じる場合を＋１、１口目の試食でかなり明確に美味しくないと感じる場合を−３、１口目の試食で明確な確信はないが少し美味しくないと感じる場合を−２、口目の試食ではっきりしないが２口目の試食で僅かに美味しくないと感じる場合を−１という尺度で採点を行い、各試料の平均値を求めることにより評価した。電気泳動によるバンドパターンの検出結果及び食味評価の結果を、第３表に示す。
【００７６】
なお、第３表におけるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、５種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、平成１０年産の１１種類の試料米の食味官能検査結果食味評価値を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式（式２）が得られた。この食味推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．８７であった。
【００７７】
【数４】
0004255630.tif 000010
【００７８】
この食味推定式を、平成１１年産の「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「ササニシキ」、「ほしのゆめ」、「きらら３９７」、「むつほまれ」、「朝の光」、「ハツシモ」、「キヌヒカリ」、「日本晴」及び「月の光」の１２品種の食味官能検査結果に対して適用性の検定を行った。平成１１年産米１２点について、食味の官能検査結果である食味実測値と式２による食味推定結果である食味予想値とを比較した。図５は、食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
以上のことから明らかなように、重相関係数０．８５が得られ、本発明におけるＰＣＲ結果に基づく食味推定式は、次年度産の未知試料米に対しても有効であることが明らかになった。
【００７９】
さらに、数値化したＰＣＲ結果を変数とする主成分分析を行った。図６は、主成分分析の結果をプロットしたものである。なお、図中の個体プロット番号は、実施例１に示した平成１１年度における作付け上位２０品種に対応し、１：「コシヒカリ」、２：「ひとめぼれ」、・・・、２０：「アキホ」を表す。
この結果、図６に示すような個体プロットが得られ、本発明のＰＣＲ結果は多変量解析を行うことにより、食味評価に基づく米のグループ分けにも有用であることが明らかとなった。
【００８０】
【表６】
第３表  １２種類の品種の官能検査及びＰＣＲの結果
0004255630.tif 000011
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
＊：官能検査を実施しなかったもの
【００８１】
実施例３（官能検査結果を目的変数として作成した米飯ＰＣＲ食味推定式の適用性）
平成９年産及び平成１０年産の「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「ササニシキ」、「ほしのゆめ」、「きらら３９７」、「むつほまれ」、「朝の光」、「ハツシモ」、「キヌヒカリ」、「日本晴」の合計１１品種、２２点の米を試料とし、実施例１と同様に、食味評価及び米飯抽出ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。
【００８２】
抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、Ｂ１、Ｆ６、Ｇ２８、Ｍ１１及びＰ５の５種のＳＴＳ化プライマーを用いた。ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼとしてTaq polymerase（宝酒造社製、５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス／塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１５）及びＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１６）各０．２μＬ、Ｆ６Ｆ２５及びＦ６Ｒ２２（配列番号３５及び３６）各０．４μＬ、Ｇ２８Ｆ１７及びＧ２８Ｒ２８（配列番号４７及び４８）各０．２μＬ、Ｍ１１Ｆ２０及びＭ１１Ｒ２０（配列番号５９及び６０）各０．２μＬ、Ｐ５Ｆ２０及びＰ５Ｒ２５（配列番号６７及び６８）各０．２μＬを使用し、滅菌水を加えて合計２０．０μＬとした。ＰＣＲの条件は、実施例１と同様である。
【００８３】
増幅されたＤＮＡは、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
また、食味の数値化を図るために、実施例２と同様に、官能検査を行った。電気泳動によるバンドパターンの検出結果及び食味評価の結果を、第４表に示す。
【００８４】
なお、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、５種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、平成１０年産の１１種類の試料米の食味官能検査結果である食味評価値を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式（式３）が得られた。この食味推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．８０であった。
【００８５】
【数５】
0004255630.tif 000012
【００８６】
この食味推定式を、未知試料である平成９年産米に対して適用した結果、重相関係数０．８０が得られた（図７）。この結果から、本発明によって得られる食味推定式は、未知試料に対しても良好に適用されることが示された。
【００８７】
【表７】
第４表  官能検査及びＰＣＲの結果
0004255630.tif 000013
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
＊：官能検査を実施しなかったもの
【００８８】
実施例４（米飯物性値を目的変数として作成した精米ＰＣＲ推定式の適用性）
本実施例においては、米飯食味の基礎をなす、米飯の物理特性の評価と推定に対する本発明の適用について検討した。
すなわち、平成１０年度産の「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「ハツシモ」、「朝の光」及び「月の光」の１２品種、平成１１年度産の「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「ハツシモ」、「朝の光」及び「月の光」の１０品種を試料とし、実施例２と同様に精米粉末試料からＤＮＡを抽出・精製し、各種のＳＴＳ化プライマー共存下でＰＣＲを行い、電気泳動によって各識別バンドの増幅の有無を調べた。
【００８９】
使用したＳＴＳ化プライマーとしてＢ４３Ｆ１７及びＢ４３Ｒ１８（配列番号２３及び２４）各０．１μＬ、Ｇ２２Ｆ２７及びＧ２２Ｒ２３（配列番号４３及び４４）各０．３μＬ、Ｐ５Ｆ２０及びＰ５Ｒ２５（配列番号６７及び６８）各０．３μＬ、Ｇ４Ｆ１８及びＧ４Ｒ２４（配列番号３９及び４０）各０．２μＬ、Ｍ２ＣＧＦ１６及びＭ２ＣＧＲ１５（配列番号５５及び５６）各０．２μＬの５種類を用いた以外は、実施例２と同様に行った。
増幅されたＤＮＡは、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
【００９０】
また、米飯の物性測定を、以下の方法で行った。各精米試料１０ｇをプリンカップにとり、純水１６ｍＬを加えて１時間吸水させた。次いで、当該試料入りプリンカップ５個を電気釜ＲＣ−１８３（東芝社製）に入れ、純水７５ｍＬをカップ外部に加えて炊飯した。スイッチ停止後１５分間蒸らしを行い、２５℃で２時間静置した。
静置後、試料ごとに米飯試料各２０粒を引っ張り圧縮試験機テンシオプレッサー・マイボーイ（タケトモ電機社製）によって、米飯試料の厚みの２５％を圧縮する低圧縮試験を行い、米飯粒表層の付着量（Ｌ３）を測定した。結果を第５表に示す。
【００９１】
なお、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、５種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、平成１０年産米の物性測定値（Ｌ３）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の物性推定式（食味推定式）（式４）が得られた。この物性推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．９９であった。
【００９２】
【数６】
0004255630.tif 000014
【００９３】
【表８】
第５表  米飯物性測定及びＰＣＲの結果
0004255630.tif 000015
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
物性測定値：テンシオプレッサーの低圧縮試験の付着量Ｌ３（ｍｍ）で表示
【００９４】
重回帰式である式４を平成１１年産の未知試料に適用した結果、未知試料に対する重相関係数は０．９９であり、ＤＮＡ判別に基づく物性推定式は有用であることが示された。
【００９５】
実施例５（各国産米の米飯物性値を目的変数とする精米ＰＣＲ推定式の作成）
本実施例においては、米飯食味の基礎をなす、米飯の物理特性の評価と推定に対する本発明の適用について、世界各国の米試料として検討した。
すなわち、日本の「コシヒカリ」、韓国の「一品」、中国の「富士光」、イタリアの「エリオ」、インドの「バスマティ」及び「バンガナ」、ベトナムの「タムソアン」及び「Ｃ７０」、ナイジェリアの「オリザグラベリマ（ＣＧ−１４）」及び「ＷＡＢ４５０１０６」、オーストラリアの「アマルー」及び「ペルデ」、タイの「カオドクマリ」、米国の「錦」及び「ベンガル」の１５品種の米を試料とし、実施例２と同様にして精米粉末試料からＤＮＡを抽出・精製し、各種のＳＴＳ化プライマー共存下でＰＣＲを行い、電気泳動によって各識別バンドの増幅の有無を調べた。
【００９６】
使用したＳＴＳ化プライマーは、Ａ６Ｆ２１及びＡ６Ｒ２２（配列番号３及び４）各０．４μＬ、Ｅ３０Ｆ２８及びＥ３０Ｒ２４（配列番号３１及び３２）各０．６μＬ、Ｆ６Ｆ２５及びＦ６Ｒ２２（配列番号３５及び３６）各０．４μＬ、Ｇ４Ｆ１８及びＧ４Ｒ２４（配列番号３９及び４０）各０．５μＬ、Ｊ６Ｆ１８及びＪ６Ｒ２０（配列番号５１及び５２）各０．５μＬ、Ｍ２ＣＧＦ１６及びＭ２ＣＧＲ１５（配列番号５５及び５６）各０．５μＬ、Ｓ１３Ｆ２５及びＳ１３Ｒ２４（配列番号７５及び７６）各０．５μＬ、ＷＫ９Ｆ２０及びＷＫ９Ｒ２０（配列番号８７及び８８）各０．４μＬの８種類である。ＰＣＲの条件は、実施例２と同じである。
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
【００９７】
また、米飯試料の物性測定を、次の方法で行った。各精米試料１０ｇをプリンカップにとり、純水１６ｍＬを加えて１時間吸水させた。次いで、当該試料入りプリンカップ５個を電気釜ＲＣ−１８３（東芝社製）に入れ、純水７５ｍＬをカップ外部に加えて炊飯した。スイッチ停止後１５分間蒸らしを行い、２５℃で２時間静置した。
静置後、試料ごとに、米飯試料各３粒について引張り圧縮試験機テクスチュロメーター（全研社製）（５反復）によって、米飯試料の硬さ（Ｈ１）を測定した。
【００９８】
なお、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、８種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、物性測定値（Ｈ１）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の物性推定式（食味推定式）（式５）が得られた。図９は、物性測定結果である物性実測値と式５による物性推定結果である物性予想値とを比較した。図９は、物性実測値と物性予想値の関係を表したものである。この物性推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．９３であった。
【００９９】
【数７】
0004255630.tif 000016
【０１００】
【表９】
第６表  米飯物性測定及びＰＣＲの結果
0004255630.tif 000017
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
物性測定値：テクスチュロメーターによる硬さ（Ｈ１、単位ｋｇｆ）で表示
【０１０１】
この結果、世界の幅広い品質特性の米においても、本発明のＳＴＳ化プライマーを用いたＰＣＲによって出現する識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を説明変数として多変量解析することによって、米飯物性値を推定できることが明らかとなった。
【０１０２】
実施例６（各国産米の米飯物性を目的変数とするＰＣＲ推定式の作成）
本実施例においては、米飯食味の基礎をなす、米飯の物理特性の評価と推定における本発明の適用について、世界各国の米試料を用いて検討した。
すなわち、日本の「コシヒカリ」、中国の「富士光」、イタリアの「エリオ」、「セレミオ」、「タイボンネット」及び「アルボリオ」、ナイジェリアの「オリザグラベリマ（ＣＧ−１４）」、「ＷＡＢ４５０１０６」、「ＷＡＢ９６１１」、「ＷＩＴＡ７」及び「シスダネ」の１１品種の米を試料とし、実施例２と同様に、精米粉末試料からＤＮＡを抽出・精製し、各種のＳＴＳ化プライマー共存下でＰＣＲを行い、電気泳動によって各識別バンドの増幅の有無を調べた。
【０１０３】
使用したＳＴＳ化プライマーは、Ａ６Ｆ２１及びＡ６Ｒ２２（配列番号３及び４）各０．４μＬ、Ｂ１Ｆ２５及びＢ１Ｒ２０（配列番号１１及び１２）各０．４μＬ、Ｅ３０Ｆ２８及びＥ３０Ｒ２４（配列番号３１及び３２）各０．６μＬ、Ｆ６Ｆ２５及びＦ６Ｒ２２（配列番号３５及び３６）各０．４μＬ、Ｊ６Ｆ１８及びＪ６Ｒ２０（配列番号５１及び５２）各０．５μＬ、Ｓ１３Ｆ２５及びＳ１３Ｒ２４（配列番号７５及び７６）各０．５μＬ、ＷＫ９Ｆ２０及びＷＫ９Ｒ２０（配列番号８７及び８８）各０．４μＬの７種類である。
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することによりバンドパターンを検出した。
【０１０４】
各精米試料１０ｇをプリンカップにとり、純水１６ｍＬを加えて１時間吸水させた。次いで当該試料入りプリンカップ５個を電気釜ＲＣ−１８３（東芝社製）に入れ、純水７５ｍＬをカップ外部に加えて炊飯した。スイッチ停止後１５分間蒸らしを行い、２５℃で２時間静置した。
静置後、試料ごとに、米飯試料各２０粒を引っ張り圧縮試験機テンシオプレッサー・マイボーイ（タケトモ電機社製）を用いて、米飯試料の厚みの２５％を圧縮する低圧縮試験を行い、米飯粒表層の付着量（Ｌ３）を測定した。
【０１０５】
なお、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、７種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、物性測定値（Ｌ３）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の物性推定式（食味推定式）（式６）が得られた。図１０は、物性測定結果である物性実測値と式６による物性推定結果である物性予想値とを比較した。図１０は、物性実測値と物性予想値の関係を表したものである。この物性推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．９８であった。
【０１０６】
【数８】
0004255630.tif 000018
【０１０７】
【表１０】
第７表  米飯物性測定及びＰＣＲの結果
0004255630.tif 000019
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
物性測定値：テンシオプレッサーによる付着量（Ｌ３，単位ｍｍ）で表示
【０１０８】
この結果、本発明のＳＴＳ化プライマーを用いたＰＣＲによって出現する識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を説明変数として多変量解析することによって、世界の幅広い品質特性の米においても米飯物性値を推定できることが明らかとなった。
【０１０９】
実施例７（ＲＡＰＤ法による精米の食味判定例）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「むつほまれ」、「キヌヒカリ」、「朝の光」、「はえぬき」を試料とし、実施例１と同様に精米粉末を調製した。そのうち６ｇから、実施例１と同様に、ＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。
すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍトリス／塩酸、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍＬを加えて撹拌し、５５℃の恒温槽に入れ、ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍＬを加え、３０分間ＤＮＡを抽出した。
【０１１０】
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、遠心分離して上清を得た。こうして得た上清に、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ溶液、２０ｍＭトリス／塩酸、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて、４℃で一晩静置し、さらにＤＮＡを沈殿させた。その後、遠心分離し、得られたＤＮＡ沈殿物に１Ｍ  ＮａＣｌを加え、ＤＮＡを抽出した後、イソプロピルアルコール、エタノールによるＤＮＡの洗浄、沈殿を常法に従って行った。
こうして得たＤＮＡ沈殿物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  、ｐＨ８．０）２００μＬに溶解し、これをＤＮＡ試料液とした。
【０１１１】
上記により抽出したＤＮＡを鋳型としランダムプライマーＯＰＢ１、ＯＰＢ１８、ＯＰＭ１１、ＯＰＴ１６（オペロン社）の４種類を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼとしてTaq polymerase（宝酒造社製、５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス／塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、ＰＣＲに用いるランダムプライマー各２．０μＬを使用し、滅菌水を加えて合計２０．７μＬとした。
反応装置はＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社製）を使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３６℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で３５サイクル反応させた。
【０１１２】
なお、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を数値化するために、識別用ＤＮＡバンドが出現したもの（＋）を１、出現しない場合（−）を０として２値化した。
さらに、４種類のプライマーの場合の識別バンド出現の有無（１あるいは０）を説明変数とし、食味評価（第２表）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の物性推定式（食味推定式）（式７）が得られた。この物性推定式の既知試料に対する重相関係数は、０．８９であった。
【０１１３】
【数９】
0004255630.tif 000020
【０１１４】
実施例８（玄米半粒による良食味米の選抜例）
良食味米である「コシヒカリ」及び病害抵抗性で食味の劣る「月の光」の玄米を５粒ずつ１０粒を混合し、各玄米粒を胚芽を含む部分と胚芽を含まない部分とにカッターで半裁した。
半裁した胚芽を含まない部分を半粒ずつ乳鉢で粉砕し、実施例２と同様にＣＴＡＢ法でＤＮＡを抽出した。但し、実験規模を全て五百分の一に縮小して行った。こうして得た１０種類のＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。
【０１１５】
ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼとしてTaq polymerase（宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μＬ  、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス／塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ  、ｐＨ８．３）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、Ａ６Ｆ２１及びＡ６Ｒ２２（配列番号３及び４）各０．４μＬ、Ａ７Ｆ２２及びＡ７Ｒ１７（配列番号１５及び１６）各０．５μＬ、Ｍ１１Ｆ２０及びＭ１１Ｒ２０（配列番号５９及び６０）各０．６μＬ、Ｓ１３Ｆ２５及びＳ１３Ｒ２４（配列番号７５及び７６）各０．５μＬ、Ｔ１６Ｆ２４及びＴ１６Ｒ２６（配列番号８３及び８４）各０．４μＬ、Ｊ６Ｆ１８及びＪ６Ｒ２０（配列番号５１及び５２）各０．４μＬ、ＷＫ９Ｆ２０及びＷＫ９Ｒ２０（配列番号８７及び８８）各０．４μＬを使用し、滅菌水を加えて合計２０．７μＬとした。
【０１１６】
反応装置は、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社製）を使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅されたＤＮＡの電気泳動は、ミューピッドII（コスモバイオ社製）を使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後に紫外線照射することにより識別用ＤＮＡバンドの出現パターンを検出した。電気泳動によるバンドパターンの検出結果を、第８表に示す。
【０１１７】
また、食味の数値化を図るために、実施例１と同様に、「米の食味ランキング」（日本穀物検定協会発行、２００１年）における評価と「米品種大全２」（米穀データバンク社発行、１９９９年）における各品種米の食味評価の合計数値を各品種米の食味評価値とした。なお、第８表におけるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡについて、実施例１と同様に、識別用ＤＮＡバンドの出現の有無を２値化した。
第８表に示した結果に基づいて、実施例１の食味推定式（式１）に適用し、食味推定値を算出した。算出した食味推定値を用いて、試料を食味推定値の高いＡ群と低いＢ群の２群にグループ分けを行った。
【０１１８】
これら２群に分けた各試料の胚（胚芽）を含む半粒各５粒ずつを１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した後、下記の組成の培地に置床し、３０℃で７日間発芽させた。発芽半粒種子を人工気象器バイオトロンＮＣ３５０（日本医科器械製作所製）に移し、２８℃（光照射）１０時間、２８℃（暗）１４時間のサイクルで培養し、幼苗を緑化させた。
次いで、幼苗を前記の培地を含むアグリポットに移植し、７日間生育させた後、育苗培土に移植し、人工気象室ＴＧＨ−６（タバイエスペック社製）で２週間生育させた。さらに、これらの苗を埴土をいれたワグナムポットに移植し、前記の人工気象室で４ヶ月間栽培し、出穂させた。
【０１１９】
培地組成（１Ｌ中、ｐＨ５．８）
アガロース                ８．０００ｇ
硫酸アンモニウム          ０．４６３ｇ
硝酸カリウム              ２．８３０ｇ
塩化カルシウム            ０．１６６ｇ
硫酸マグネシウム          ０．１８５ｇ
リン酸２水素カリウム      ０．４００ｇ
硫酸第二鉄                ０．２７８ｇ
ＥＤＴＡ２ナトリウム      ０．３７３ｇ
ニコチン酸                ０．２５０ｍｇ
ビタミンＢ６              ０．２５０ｍｇ
ビタミンＢ１              ０．５００ｍｇ
グリシン                  １．０００ｍｇ
【０１２０】
さらに４０日間成熟させた後に穂を刈り取り、脱穀、籾摺りを行い、各玄米から実施例２と同様にして精米粉末の調製した後、ＣＴＡＢ法によるＤＮＡの抽出を行った。さらに、上記と同様にＰＣＲを行った。
これらの結果、Ａ群は「コシヒカリ」、Ｂ群は「月の光」と同じ識別用ＤＮＡバンドパターンを示した。また、「コシヒカリ」と判定された米は炊飯後に良好な食味を示し、「月の光」と判定された米は食味が劣っていた。
以上のことから、胚（胚芽）を含まない玄米半粒からＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＳＴＳ化プライマーを用いたＰＣＲによる食味推定を行った後、残りの胚（胚芽）を含む半粒を発芽させて良食味米を選抜することが可能であることが明らかとなった。
【０１２１】
【表１１】
第８表  コシヒカリ及び月の光のＰＣＲによる識別例
0004255630.tif 000021
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【０１２２】
実施例９（育種における玄米半粒のＰＣＲによる良食味米の選抜例）
良食味米である「コシヒカリ」を母本とし、病害抵抗性で食味の劣る「月の光」を花粉親とし、「コシヒカリ」を常法によって温湯除雄して「月の光」を交配し、次世代稲から籾を得た。この雑種第一代の籾を育苗培土を入れたワグナムポットに播種し、人工気象室ＴＧＨ−６（タバイエスペック社製）において自殖栽培し、雑種第二代の種子を得た。
これらの種子の籾摺りした玄米粒を、胚（胚芽）を含む部分と胚（胚芽）を含まない部分とにカッターで半裁した。このうち、胚芽を含まない部分を半粒ずつ乳鉢で粉砕し、実施例２と同様にＣＴＡＢ法でＤＮＡを抽出した。但し、実験規模を全て五百分の一に縮小して行った。これらのＤＮＡを鋳型とし、ＳＴＳ化プライマーを用いたＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲについては、実施例７と同様に行った。
【０１２３】
ＰＣＲによって得た識別用ＤＮＡバンドのバンドパターンについて、実施例１の食味推定式（式１）に適用し、食味推定値を算出した。算出した食味推定値が５以下の群と食味推定値が８以上の群の２群にグループ分けした。これら２群の胚芽を含む半粒について、実施例７と同様に発芽させて幼苗を得て、出穂させた後、成熟した穂を刈り取り、脱穀、籾摺りを行い、各玄米を試験用精米機で精米し、電気釜ＲＣ−１８３（東芝社製）で炊飯し、実施例２と同様の方法で官能検査を行った。
【０１２４】
この結果、食味推定値が５以下の群では食味が劣っており、食味推定値が８以上の群では食味が優れていた。
以上のことから、交配種子を半裁し、胚芽を含まない玄米あるいは籾の半粒からＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしＳＴＳ化プライマーを用いたＰＣＲによる食味推定を行った後に、残りの胚芽を含む半粒を発芽させて良食味米を選抜することが可能であることが示された。
【０１２５】
【発明の効果】
本発明の方法により、稲植物体、稲種子、米あるいは米加工品等について、食味と高い相関を有する物理化学的測定値や米飯物性測定値を推定することができる。また、食味判定に用いる試料は、例えば米粒半粒や１粒といった微量の試料でも可能である。このため、籾又は玄米の半粒を試料として食味を推定して良食味米を選抜し、残りの玄米又は籾の半粒を発芽させて植物体を得ることによって良食味米を選抜することが可能となる。
さらに、本発明の方法は、日本型米のみならず、世界各国の幅広い品種・特性の米についても適用できる。
【０１２６】
【配列表】
SEQUENCE  LISTING
<110> 独立行政法人  食品総合研究所
<120> 米のＤＮＡ食味判定技術及び籾／玄米半粒による良食味米選抜方法
<130> P131218K
<160> 92
<210> 1
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<213> Artificial Sequence
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gtttcgctcc tacagtaatt aaggg      25
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tggccggcat gactcac       17
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actggccggc atcaagac      18
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ggaatggaac cgaagtggag ctattccctg      30
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ggaatggaac cgccgtaaac ttgaatgcta      30
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ggaatggaac cgaagtggag      20
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ggaatggaac cgccgtaaac t      21
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tacctggttg atgtatacag atctggttat      30
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atccctcgat ccctctagca ttatatcctc      30
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tacctggttg atgtatacag atctggtt      28
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atccctcgat ccctctagca ttat      24
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accactccat atcaccacaa ggcgtttagg      30
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accactccat atatatcatc caaag      25
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accactccat atcaccacaa gg      22
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gtggtgttta gatccagaga ctta      24
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agggccatga tacaagactc tgttctgtag      30
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ctcactcaaa tttacagtgc attttct      27
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agggccatga tacaagactc tgt      23
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ggccgtcgtt ctgcgatggt ctccaagaat      30
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ggagaatccc acagtaagtt tttctttgtt      30
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ggcggtcgtt ctgcgat      17
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ggagaatccc acagtaagtt tttctttg      28
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gtccactgtg accacaacat ttcttccagc      30
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gtccactgtg gggattgttc cataaaagat      30
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aacgggccaa cgcag      15
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acaacggtcc gtccttgctt aggaaaaggc      30
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acaacggtcc gtccttgctt      20
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acaacggtcc aacagatact tttga      25
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agtgcagcca ttatatagga ctaac      25
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agtgcagcca aaccagaaga      20
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gtcgttcctg tggttaggac agggtcgcaa      30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 74
gtcgttcctg ctggtgtctc agatcgttcg      30
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
gtcgttcctg tggttaggac agggt      25
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<211> 24
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<400> 76
gtcgttcctg ctggtgtctc agat      24
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<400> 77
aacggcgaca taaaataagt tgttacatgt      30
<210> 78
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aacggcgaca gtggcatgct cgatgacgac      30
<210> 79
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<212> DNA
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<400> 79
aacggcgaca taaaataagt tg      22
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
<400> 80
aacggcgaca gtggcatgct cgatg      25
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<400> 81
ggtgaacgct gtagttggaa tataagtata      30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
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<400> 82
ggtgaacgct cagatttaaa tataattagt      30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 83
ggtgaacgct gtagttggaa tata      24
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
ggtgaacgct cagatttaaa tataat      26
<210> 85
<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<400> 85
ccgcagttag atgcaccatt agaattgctt      30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 86
ccgcagttag atcaagtggc aaggttccat      30
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 87
ccgcagttag atgcaccatt      20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 88
ccgcagttag atcaagtggc      20
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<211> 40
<212> DNA
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<400> 89
gtcgttcctg tggttaggac agggtcgcaa attcagtctt      40
<210> 90
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgttcctg ctggtgtctc agatcgttcg ggggcttgcg      40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 92
gtcgttcctg ct      12
【図面の簡単な説明】
【図１】電気泳動によるＤＮＡバンドパターンの検出結果である。図中、Ｍはマーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つるがロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「あきほ」を表している。
【図２】平成９年度米における食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
【図３】平成１０年度米における食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
【図４】平成１１年度米における食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
【図５】実施例２における食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
【図６】実施例２における主成分分析の結果をプロットしたものである。
【図７】実施例３における食味実測値と食味予想値の関係を表したものである。
【図８】実施例４における物性実測値と物性予測値の関係を表したものである。
【図９】実施例５における物性実測値と物性予測値の関係を表したものである。
【図１０】実施例６における物性実測値と物性予測値の関係を表したものである。
【図１】
0004255630.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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