(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：６に記載された部分アミノ酸配列を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号：２に記載された塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号：２に記載された塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、付加、挿入、または置換された塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６いずれか記載のＤＮＡをプラスミドに挿入してなる発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを微生物に形質転換して得られる形質転換体。
【請求項９】
微生物が大腸菌である請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
一般式（１）
0004213771.tif 000041
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す）
に示されるケトン化合物をアミノ基受容体とし、アミノ基供与体である第一アミンの存在下に行うアミノ基転移反応における、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチド、または、請求項８記載の形質転換体もしくはその菌体処理物の使用方法。
【請求項１１】
置換アリール基が、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、水酸基、メトキシ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ケ所以上置換されたアリール基である、請求項１０記載の使用方法。
【請求項１２】
Ｒがメチル基、フェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、及び４−トリフルオロメチルフェニル基からなる群より選択される基である、請求項１０記載の使用方法。
【請求項１３】
ヘテロアリール基がピリジル基、ピラジニル基、チエニル基、フリル基、及びチアゾリル基からなる群より選択される基である、請求項１０記載の使用方法。
【請求項１４】
ｐが０、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子である、請求項１０〜１３いずれか記載の使用方法。
【請求項１５】
第一アミンが、一般式（３）
0004213771.tif 000042
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい）
に示される化合物である請求項１０〜１４いずれか記載の使用方法。
【請求項１６】
Ｒ1が炭素数１〜１０のアルキル基、フェニル基、又はナフチル基のいずれかであり、そしてＲ2がメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボキシル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、又はカルボキシメチル基のいずれかである、請求項１５記載の使用方法。
【請求項１７】
第一アミンが（Ｒ）体である、請求項１０〜１６いずれか記載の使用方法。
【請求項１８】
第一アミンが、Ｄ−アラニンまたはアルキル基の炭素数が１〜１０である、Ｄ−アラニンのアルキルエステルである、請求項１０〜１７いずれか記載の使用方法。
【請求項１９】
第一アミンが、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−１−ナフチルエチルアミン、（Ｒ）−１−メチルプロピルアミン、（Ｒ）−１−メチルヘキシルアミン、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノール、（Ｒ）−１−メチルブチルアミン、（Ｒ）−１−フェニルメチルアミン、（Ｒ）−１−アミノ−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエタノール、（Ｒ）−３−アミノヘプタン、（Ｒ）−１−アミノ−３−フェニルプロパン、（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロパノール、（Ｒ）−１−メチルヘプチルアミン、ベンジルアミン、（Ｓ）−２−フェニルグリシノール、（Ｒ）−３−アミノフェニルブタン、Ｌ−フェニルアラニノール、（Ｒ）−２−アミノ−１−メトキシプロパン、Ｄ−アラニンメチルエステル、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−１−フェニル−２−アミノプロパン、もしくはＤ−アラニンエチルエステルである、またはこれらのラセミ体である、請求項１０〜１８いずれか記載の使用方法。
【請求項２０】
一般式（５）
0004213771.tif 000043
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す）
に示されるラセミ体アミノ化合物に対して、一般式（４）
0004213771.tif 000044
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい）
に示されるケトン化合物の存在下に行うアミノ基転移反応における、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチド、または、請求項８記載の形質転換体もしくはその菌体処理物の使用方法。
【請求項２１】
一般式（１）
0004213771.tif 000045
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す。）
に示されるケトン化合物をアミノ基受容体とし、アミノ基供与体である第一アミンの存在下、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチド、または、請求項８記載の形質転換体もしくはその菌体処理物を作用させて対応する光学活性アミノ化合物を製造することを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項２２】
置換アリール基が、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、水酸基、メトキシ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ケ所以上置換されたアリール基である、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
Ｒがメチル基、フェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、及び４−トリフルオロメチルフェニル基からなる群より選択される基である請求項２１記載の製造方法。
【請求項２４】
ヘテロアリール基がピリジル基、ピラジニル基、チエニル基、フリル基、及びチアゾリル基からなる群より選択される基である請求項２１記載の製造方法。
【請求項２５】
ｐが０、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子である請求項２１〜２４いずれか記載の製造方法。
【請求項２６】
第一アミンが、一般式（３）
0004213771.tif 000046
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい。）
に示される化合物である請求項２１〜２５いずれか記載の製造方法。
【請求項２７】
Ｒ1が炭素数１〜１０のアルキル基、フェニル基、又はナフチル基のいずれかであり、そしてＲ2がメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボキシル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、又はカルボキシメチル基のいずれかである請求項２６記載の製造方法。
【請求項２８】
第一アミンが（Ｒ）体である請求項２１〜２７いずれか記載の製造方法。
【請求項２９】
第一アミンが、Ｄ−アラニンまたはアルキル基の炭素数が１〜１０である、Ｄ−アラニンのアルキルエステルである請求項２１〜２８いずれか記載の製造方法。
【請求項３０】
第一アミンが、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−１−ナフチルエチルアミン、（Ｒ）−１−メチルプロピルアミン、（Ｒ）−１−メチルヘキシルアミン、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノール、（Ｒ）−１−メチルブチルアミン、（Ｒ）−１−フェニルメチルアミン、（Ｒ）−１−アミノ−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエタノール、（Ｒ）−３−アミノヘプタン、（Ｒ）−１−アミノ−３−フェニルプロパン、（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロパノール、（Ｒ）−１−メチルヘプチルアミン、ベンジルアミン、（Ｓ）−２−フェニルグリシノール、（Ｒ）−３−アミノフェニルブタン、Ｌ−フェニルアラニノール、（Ｒ）−２−アミノ−１−メトキシプロパン、Ｄ−アラニンメチルエステル、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−１−フェニル−２−アミノプロパン、もしくはＤ−アラニンエチルエステルである、またはこれらのラセミ体である、請求項２１〜２９いずれか記載の製造方法。
【請求項３１】
一般式（５）
0004213771.tif 000047
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す）
に示されるラセミ体アミノ化合物に対して、一般式（４）
0004213771.tif 000048
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい）
に示されるケトン化合物の存在下、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチド、または、請求項８記載の形質転換体もしくはその菌体処理物を作用させて対応する光学活性アミノ化合物を製造することを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品や農薬等の中間体として用いられる１位にアリール基等を有する光学活性なアミノ化合物に関する。本発明の目的化合物の１つである１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンは、開発中の抗糖尿病薬、抗肥満薬として有望なＣＬ３１６、２４３（J.D.Bloomら、J.Med.Chem.,35,3081-3084（1992））やその類縁化合物の中間体として重要な化合物である。
また、別の目的化合物である（Ｓ）−２−アミノ−１−メトキシプロパンは除草剤中間体として用いることができる有用化合物である。
背景技術
酵素を用いて１位にアリール基等を有する光学活性なアミノ化合物を製造する方法としては、中道らの報告（Appl.Microbiol.Biotechnol.,33,634-640（1990））及び特公平４−１１１９４号公報が挙げられる。これらは１−（置換フェニル）−２−プロパノン類にアミノ基を酵素的に転移させることによって（Ｓ）体を効率的に合成できることを開示している。さらに、特公平４−１１１９４号公報には（Ｒ）体の合成についても記載があるが、（Ｒ）体については、本発明者らが特公平４−１１１９４号公報に記載のある微生物および基質について追試を行ったところ、非常に再現性に乏しく、実用化は困難であると考えられる。
更に、有機合成的に生産したラセミ体アミノ化合物にω−アミノ酸トランスアミナーゼを作用させて（Ｓ）体のみを分解し、残った（Ｒ）体を取得する方法がスターリングら（特開平３−１０３１９２号公報）によって開示されているが、この方法では、（Ｒ）体を取得するために（Ｓ）体を分解してしまう為、基質に対する収率が５０％以下に低下し、コスト的には有利な方法とは言えない。また、同じくスターリングらはω−アミノ酸トランスアミナーゼを用いて、ケトン体からアミノドナーの存在下に（Ｓ）−アミノ化合物のみを合成する方法をも開示しているが、この方法では光学活性な（Ｒ）−アミノ化合物を合成することはできない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、微生物酵素による（Ｒ）−アミノ化合物を主とする光学活性アミノ化合物の効率的かつ安価な製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、かかる製造方法に好適に用いることのできる立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
本発明者らは１位にアリール基を有するケトン化合物等に、例えば、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンに（Ｒ）体選択的にアミノ基を転移させることによって、収率良く（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンのような光学活性アミノ化合物を合成できる微生物を土壌より発見し、これを用いる反応の検討をすることによって、種々の光学活性アミノ化合物（一般式（２）のような立体配置であり、得られる多くの化合物は上記のような（Ｒ）体であるが、不斉炭素に結合する置換基の関係で、例えば、（Ｓ）−２−フェニルグリシノールのように（Ｓ）体の物もある。）を合成できる微生物を土壌より発見し、これを用いる反応を検討すると共に、該反応に関与する酵素（以下、トランスアミナーゼと呼ぶ。）の遺伝子を単離し、大腸菌等を宿主とした組換え微生物を用いて更に安価にトランスアミナーゼを製造する方法を検討することによって、本発明を完成させた。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕    一般式（１）
0004213771.tif 000002
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す。）に示されるケトン化合物をアミノ基受容体とし、アミノ基供与体である第一アミンの存在下、トランスアミナーゼを作用させて立体選択的にアミノ基転移を行わせることにより、
対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法、
〔２〕    （Ｒ）体選択的にアミノ基転移を行い、（Ｒ）体の光学活性アミノ化合物を得る前記〔１〕記載の製造方法、
〔３〕    置換アリール基が、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、水酸基、メトキシ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ケ所以上置換されたアリール基である、前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法、
〔４〕    Ｒがメチル基、フェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、及び４−トリフルオロメチルフェニル基からなる群より選択される基である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の製造方法、
〔５〕    ヘテロアリール基がピリジル基、ピラジニル基、チエニル基、フリル基、及びチアゾリル基からなる群より選択される基である前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法、
〔６〕    ｐが０、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子である前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の製造方法、
〔７〕    第一アミンが、一般式（３）
0004213771.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい。）に示される化合物である前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の製造方法、
〔８〕    Ｒ1が炭素数１〜１０のアルキル基、フェニル基、又はナフチル基のいずれかであり、そしてＲ2がメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボキシル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、又はカルボキシメチル基のいずれかである前記〔７〕記載の製造方法、
〔９〕    第一アミンが（Ｒ）体である前記〔１〕〜〔８〕いずれか記載の製造方法、
〔１０〕  第一アミンが、Ｄ−アラニンまたはアルキル基の炭素数が１〜１０である、Ｄ−アラニンのアルキルエステルである前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載の製造方法、
〔１１〕    第一アミンが、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−１−ナフチルエチルアミン、（Ｒ）−１−メチルプロピルアミン、（Ｒ）−１−メチルヘキシルアミン、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノール、（Ｒ）−１−メチルブチルアミン、（Ｒ）−１−フェニルメチルアミン、（Ｒ）−１−アミノ−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエタノール、（Ｒ）−３−アミノヘプタン、（Ｒ）−１−アミノ−３−フェニルプロパン、（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロパノール、（Ｒ）−１−メチルヘプチルアミン、ベンジルアミン、（Ｓ）−２−フェニルグリシノール、（Ｒ）−３−アミノフェニルブタン、Ｌ−フェニルアラニノール、（Ｒ）−２−アミノ−１−メトキシプロパン、Ｄ−アラニンメチルエステル、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−１−フェニル−２−アミノプロパン、もしくはＤ−アラニンエチルエステルである、またはこれらのラセミ体である、前記〔１〕〜〔１０〕いずれか記載の製造方法、
〔１２〕  立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物、または固定化菌体と、ケトン化合物及び第一アミンとを接触させる前記〔１〕〜〔１１）いずれか記載の製造方法、
〔１３〕  立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有するトランスアミナーゼを生産する微生物の無細胞抽出物、部分精製酵素、精製酵素、または固定化酵素と、ケトン化合物及び第一アミンとを接触させる前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の製造方法、
〔１４〕  トランスアミナーゼを生産する微生物がアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物である前記〔１２〕又は〔１３〕記載の製造方法、
〔１５〕  アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ１６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２８）である前記〔１４〕記載の製造方法、
〔１６〕  トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミン、（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミン、（ＲＳ）−１−メチルブチルアミン、（ＲＳ）−３−アミノ−２，２−ジメチルブタン、（ＲＳ）−２−アミノ−１−ブタノール、及び（Ｒ）または（ＲＳ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンからなる群より選択される一種以上のアミン類を培地に添加する前記〔１２〕〜〔１５〕いずれか記載の製造方法、
〔１７〕  ５〜１２の範囲のｐＨでトランスアミナーゼを作用させる前記〔１〕〜〔１６〕いずれか記載の製造方法、
〔１８〕  反応促進物質としての界面活性剤又は脂肪酸を添加して、トランスアミナーゼを作用させる前記〔１〕〜〔１７〕いずれか記載の製造方法、
〔１９〕  一般式（４）で示されるケトン化合物の存在下、一般式（５）で示されるラセミ体のアミノ化合物にトランスアミナーゼを作用させることにより、立体選択的にアミノ基転移反応を行い、対応する光学活性アミノ化合物
0004213771.tif 000004
（式中、Ｒ、ｐ、ｑ、ｒ、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2は一般式（１）、一般式（３）におけるＲ、ｐ、ｑ、ｒ、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2と同じである。）を得る、光学活性アミノ化合物の製造方法、
〔２０〕  立体選択的にアミノ基を転移させる活性（「立体選択的なトランスアミナーゼ活性」と略記する。）を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有してなるＤＮＡ、
〔２１〕  ポリペプチドがアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する菌株由来のものである前記〔２０〕記載のＤＮＡ、
〔２２〕  配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列の全部又はその一部をコードするＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
〔２３〕  配列表の配列番号：２に記載された塩基配列の全部又はその一部を含むＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
〔２４〕  配列表の配列番号：２に記載された塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、付加、挿入、または置換された塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
〔２５〕  配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
〔２６〕  アルスロバクター属に属する微生物の培養により得ることのできる、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、
〔２７〕  配列表の配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：６に記載された部分アミノ酸配列を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、
〔２８〕  配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、
〔２９〕  配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、
〔３０〕  前記〔２０〕〜〔２５〕いずれか記載のＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ、
〔３１〕  微生物、動物若しくは動物細胞、又は植物若しくは植物細胞において、コードされたポリペプチドを発現することができる前記〔３０〕記載の組換えＤＮＡ、
〔３２〕  前記〔３０〕又は〔３１〕記載の組換えＤＮＡを挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター、
〔３３〕  発現ベクターがプラスミドｐＡＴ２８、ｐＡＴ２９、またはｐＡＴ３０である前記〔３２〕記載の発現ベクター、
〔３４〕  前記〔３２〕又は〔３３〕記載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体、
〔３５〕  形質転換体が大腸菌である前記〔３４〕記載の形質転換体、
〔３６〕  大腸菌がＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２９）、又はＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ３０）である前記〔３５〕記載の形質転換体、
〔３７〕  前記〔３４〕〜〔３６〕いずれか記載の形質転換体を培養もしくは育種することによって、培養に用いた培養液又は該形質転換体より立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法、
〔３８〕  トランスアミナーゼとして、前記〔３７〕記載の製造方法により得られる立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを用いる前記〔１〕〜〔１９〕いずれか記載の製造方法、
〔３９〕  配列番号：２に記載した塩基配列を有するＤＮＡの全部あるいは一部分と、又は該ＤＮＡの相補鎖の全部あるいは一部分と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、並びに
〔４０〕  前記〔２０〕〜〔２５〕いずれか記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、プローブ又はプライマーとして用いることができるオリゴヌクレオチド、に関するものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本酵素の至適ｐＨを示す図である。
第２図は、本酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第３図は、本酵素遺伝子を持つプラスミドの作製方法と簡単な制限酵素地図を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、さらに詳しく本発明を説明する。まず、本発明における反応スキームを以下に示す。
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対応する光学活性アミノ化合物
本発明者らは、ケトン類を基質にして（Ｒ）体特異的に（Ｒ）−アミノ化合物を生成する能力を有する菌を国内土壌より分離すべく、スクリーニングを重ねたところ、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌に本反応を触媒する強い活性を認めた。その中で代表的なアルスロバクター・スピーシーズ〔Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＫＮＫ１６８と命名され、平成７年９月８日（原寄託日）より受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２８として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６））に寄託されている〕について、その菌学的な性質を以下に示す。
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本菌が生産するトランスアミナーゼは、後に詳述するように、例えばアミノ基供与体としては、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンのような（Ｒ）体のアミンを利用し、アミノ基受容体として１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンを用いた場合、生成物は光学活性な（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを生成する点で、アミノ基供与体として（Ｓ）体アミンを利用し、かつ生成物が光学活性な（Ｓ）−アミノ化合物である、中道ら（Appl.Microbiol.Biotechnol.,33,634-640（1990））が用いているブレビバクテリウム・リーネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）ＩＦＯ１２１４１の酵素や、スターリングら（特開平３−１０３１９２号公報）が利用したω−アミノ酸トランスアミナーゼとは明らかに異なる。
さらに、本発明に用いられるアルスロバクターのトランスアミナーゼは、他の多くの点で上記のブレビバクテリウムの酵素と異なっている。例えば、塩化アンモニウム等の無機のアンモニウム塩やグルタミン酸やアスパラギン酸等のＬ−アミノ酸（（Ｓ）アミンである。）をアミノ基供与体として用いることができない点等で違っている（表１）。
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また、本発明に用いられるアルスロバクターのトランスアミナーゼをスターリングら（特開平３−１０３１９２号公報）が用いているω−アミノ酸トランスアミナーゼと比較すると、上記の基質特異性についての明確な相違に加えて、アルスロバクターのトランスアミナーゼは、β−アラニンや４−アミノ酪酸等のω−アミノ酸、またｎ−ブチルアミン、プトレッシンのようなω−アミン又はＤＬ−３−アミノ酪酸等には作用しない点、そしてヒドロキシルアミンやフェニルヒドラジン等の反応阻害剤による影響が微弱である点等が違っている。
また、本発明者らの酵素と類似する他の酵素としては、ピルビン酸の存在下でベンジルアミンに強く作用してＬ−アラニンとベンズアルデヒドを生成するベンジルアミントランスアミナーゼが岡田ら（特開平６−１７８６８５号公報）によって開示されているが、この酵素によるトランスアミナーゼ反応の生成物の光学活性が、（Ｓ）体であるＬ−アラニンである点で上記のブレビバクテリウムの酵素やω−アミノ酸トランスアミナーゼと同種の光学選択性を示す酵素であり、本発明に使用されるアルスロバクターのトランスアミナーゼとは全く異なる酵素であるということができる。
さらに、これらの酵素を比較した場合、フェニルヒドラジン、Ｄ−ペニシラミン、そしてｐ−クロロメルクリ安息香酸等の反応阻害剤による影響に差があるように思われる。
以下にω−アミノ酸トランスアミナーゼとしてよく調べられているシュウドモナスｓｐ．Ｆ−１由来のω−アミノ酸トランスアミナーゼ（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）,42巻,2363-2367頁（1978年）、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）,43巻,1043-1048頁（1979年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,258巻,2260-2265頁（1983年））及び岡田らのベンジルアミントランスアミナーゼ（特開平６−１７８６８５号公報）との違いを表２にまとめて示す。本発明のトランスアミナーゼ反応は精製酵素で、他の二酵素についてはそれぞれの文献及び公開特許公報に記載されている精製酵素によるデータで示した。アミノ基受容体はいずれもピルビン酸を用いている。
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また、代表的なω−アミノトランスフェラーゼの基質に対する、本発明に用いられるトランスアミナーゼ（菌体内酵素）の活性を表３に示す。ω−アミノ酸、ω−アミンをアミノ基供与体とした場合は、ω−アミノトランスフェラーゼ活性は極めて小さく、またω−アミノ酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの代表的基質であるβ−アラニンには作用しない。（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンに対して特異的に高い活性を示す。従って、ω−アミノトランスアミナーゼとは、基質特異性が全く異なる。
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本発明に使用されるアミノ基転移反応を行う際には、菌の培養時に誘導物質を添加すれば酵素発現量が上昇する。かかる誘導物質としては（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミン、（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミン、（ＲＳ）−１−メチルブチルアミン、（ＲＳ）−３−アミノ−２，２−ジメチルブタン、（ＲＳ）−２−アミノ−１−ブタノール、及び（Ｒ）又は（ＲＳ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）アミノプロパン等のアミン類からなる群より選択される一種以上が用いられる。
本発明のＤＮＡは、立体選択的にアミノ基を転移させる活性（「立体選択的なトランスアミナーゼ活性」と略記する。）を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有してなる。かかるＤＮＡとしては、例えば、１）配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列の全部又はその一部をコードするＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、２）配列表の配列番号：２に記載された塩基配列の全部又はその一部を含むＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、３）配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び４）配列表の配列番号：２に記載された塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、付加、挿入、または置換された塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
本発明のＤＮＡは、以下に記載する方法でクローニングされ得る。
トランスアミナーゼ遺伝子のクローニング方法としては、当該活性を指標にする方法や当該酵素のアミノ酸配列を利用する方法等が利用できる。本発明ではアミノ酸配列を利用する方法について記述するが、同方法に限定されないことはいうまでもない。以下、まず、トランスアミナーゼの単離精製について説明し、次に、当該トランスアミナーゼ遺伝子をクローニングする方法について説明する。さらに、同遺伝子の発現（トランスアミナーゼの生産）についても説明する。
（トランスアミナーゼの単離精製）
用いる菌株としては、ケトン類を基質にして立体選択的に対応する光学活性アミノ化合物に変換する立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを生産する菌株であればどのような菌株であってもよい。例えば、アルスロバクター属に属する菌株由来のものが例示される。その中で代表的な菌株アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２８）の生産するトランスアミナーゼの単離精製について以下に示す。
ＫＮＫ１６８の培養には、同菌株が生育しかつトランスアミナーゼを生産する培養方法であればどのような方法でもよいが、好適には次に示す培養方法を用いうる。２リットル容ミニジャーを用い、１．５リットルのＪ培地（５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０００５ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（pH7.5）、４０ｇ／ｌ  グリセリン、３ｇ／ｌ  粉末酵母エキス、２０ｇ／ｌ  プロエキス（播州調味料製）、ｐＨ７．５に調整）に３０ｍｌの同培地で一晩培養した前培養液を植菌し、３０℃、０．５ｖｖｍ、４５０ｒｐｍで４３時間、ｐＨを７．５に調整しながら培養する。なお、培養開始後、１４時間後に最終濃度４ｇ／ｌとなるように除菌フィルターでろ過した（RS）−１−メチルプロピルアミンを添加して培養する。
培養液から遠心分離等の方法によって菌体を集め、好適な緩衝液、例えば２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、０．０ｌ％２−メルカプトエタノールに懸濁する。ダイノミル（Dynomill、スイス）等の処理によって菌体を破砕し、遠心分離によって上清を得る。これに、硫酸プロタミンを５０ｍｇ／ｍｌとなるように添加して核酸を除き、硫安等の塩析によってトランスアミナーゼを沈殿させる。好適な例として、硫安３０％から６０％飽和の間で塩析される画分が集められる。これを前記緩衝液に溶解させ、同緩衝液に対して透析した後、陰イオン交換樹脂によって更に精製される。好適な例として、透析サンプルを２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ピリドキサールリン酸となるように添加した同緩衝液組成に調整後、この液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース、ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ）カラムに供し、前記緩衝液で該カラムを洗浄後、０．３−０．５Ｍ  ＮａＣｌ直線濃度勾配によって溶出させる。活性画分を集め疎水クロマトグラフィーを行うことによって更に精製されうる。好適には、フェニル・セファロース（ファルマシアＬＫＢ）が用いられる。活性画分を透析後、０．２Ｍになるように硫安を添加し、０．３Ｍ  ＮａＣｌのかわりに０．２Ｍ  硫安を含む前記緩衝液で平衡化したフェニルセファロースカラムに供し、０．２から０Ｍの硫安の直線濃度勾配によって溶出する。この活性画分の硫安濃度を０．６Ｍに調整した後、０．２Ｍ  硫安のかわりに０．６Ｍ  硫安を含む緩衝液で平衡化したブチルセファロース（ファルマシアＬＫＢ）カラムに供する。この活性画分を集め、限外ろ過等の方法によって濃縮することにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一まで精製されたトランスアミナーゼ標品を得ることができる。
（アミノ酸配列分析）
次に、精製されたトランスアミナーゼについて、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定は、エドマン分解法によって行うことができ、気相プロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステム社、４７０Ａ型）等を利用することによってアミノ酸配列を決定できる。精製されたトランスアミナーゼを用いて直接アミノ酸配列決定を行うことによって、Ｎ末端アミノ酸配列を決定できる。あるいは、特異性の高いタンパク質加水分解酵素、例えば牛膵臓由来Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン、Staphyrococcus aureus V8 strain由来Ｖ８プロテアーゼ等、を作用させて限定加水分解を行い、得られるペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣ等を用いて分離精製した後、アミノ酸配列を決定し、内部アミノ酸配列を得ることができる。
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報をもとにトランスアミナーゼのクローニングを行い得る。
（トランスアミナーゼ遺伝子のクローニング）
トランスアミナーゼの部分アミノ酸配列をもとに同遺伝子のクローニングを行う方法としては、一般的に用いられるＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法、またそれらの組みあわせ等が用いられうる。
ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作成
染色体ＤＮＡライブラリーの作成はプラスミドベクター、やλファージベクターあるいはコスミドベクターを用いる方法がManiatis等によって示されている（Molecular Cloning,T.Maniatisら、Cold Spring Harbor Press）。ＫＮＫ１６８の染色体ＤＮＡはCurrent Protocol in Molecular Biology（F.Ausubel等Willy Interscience）に記載の方法等によって調製することができる。得られた染色体ＤＮＡを種々の制限酵素、たとえばSau3AIやTthHB8I、によって部分消化を行い、アガロースゲル電気泳動やショ糖密度勾配遠心等の方法によって、ベクターに組み込むために適切な大きさの染色体ＤＮＡ断片を精製する。ベクターの挿入部位は染色体ＤＮＡの調製に使用される制限酵素によって、適切に選ぶ必要がある。例えば、染色体ＤＮＡをSau3AIで切断して調製した場合には、BamHIが好適である。λファージベクターではおよそ８ｋｂから２０数ｋｂのＤＮＡ断片を挿入することが可能であり、コスミドベクターではさらに大きなＤＮＡ断片を挿入することができる。プラスミドを用いたライブラリーでは大きなＤＮＡ断片を挿入することが、後述するスクリーニングを行う上で有利であるが、どのようなサイズの染色体ＤＮＡ断片を挿入してもよい。プラスミドベクターとしてはpUC18,pUC19,pUC119,pTV118Nなどが好適に使用できるが、特に限定されない。
染色体ＤＮＡライブラリーとしては上記のいずれを用いてもよいが、以下、プラスミドを用いた場合について詳述する。
ｂ）形質転換
上記の方法で作製した組み換えプラスミドを宿主に導入して宿主を形質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場合、宿主大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生株、変異株のいずれも使用できる。形質転換方法は通常もちいられる方法、例えばT.Maniatis等の方法（Molecular Cloning,T.Maniatis等、Cold Spring Harbor Press）によって行うことができる。
形質転換株の選別は、例えばpUC19の場合、アンピシリンを含むプレート培地上で生育するコロニーとして選別される。さらに、染色体ＤＮＡを挿入された形質転換株は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色を呈するコロニーを選別することによって得られる。
このようにしてプラスミドベクターを用いた染色体ＤＮＡライブラリーが作製され得る。
ｃ）プローブの作製
ハイブリダイゼーションやＰＣＲに用いるためのプローブやプライマーとして使用されるＤＮＡは高い特異性が要求される。トランスアミナーゼの部分アミノ酸配列からプローブやプライマーを作製する場合、当該アミノ酸配列に対応する一本鎖ＤＮＡを作製することが一般的である。各アミノ酸に対応するコドンはメチオニンやトリプトファンのように１種類のものからロイシンのように６種類のものまである。プローブやプライマーの特異性を高めるためには、それらの鎖長を長くする必要があり、また当該アミノ酸配列に対応する塩基配列の種類が少ないことも必要である。好適な例としては、１５ヌクレオチド以上の鎖長からなり、１００〜２００種類以下の一本鎖ＤＮＡの混合物が望ましいが、特異性が得られればこれらに限るものではない。また、複数の塩基が対応する部位にイノシンを導入することによって、プローブやプライマーとして使用する場合もある。これらのＤＮＡはＤＮＡ合成機等を用いて合成することができる。
トランスアミナーゼのクローニングをコロニーハイブリダイゼーションによって行う場合には、合成したプローブの５’末端を放射能標識や蛍光標識等を行う。放射能標識の例としては〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰとＭＥＧＡＬＡＢＥＬTM（宝酒造（株））を用いることにより、高比活性のプローブを調製することができる。
部分アミノ酸配列を基にＮ末端側と内部の２本のプライマーを前述したように合成し、染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲ反応を行うことにより、トランスアミナーゼの遺伝子の一部を増幅することができる。こうして増幅した遺伝子を放射能標識や蛍光標識等をおこないプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションに供することもできる。放射能標識の例としては、〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰとＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（宝酒造（株））を用いることにより、高比活性のプローブを調製することができる。なお当該ＰＣＲ増幅ＤＮＡがトランスアミナーゼ遺伝子の一部であることは、当該ＤＮＡを後述するＤＮＡ塩基配列の決定法によって塩基配列を決定し、前記塩基配列から推定されるアミノ酸配列と先に得られている部分アミノ酸配列とを比較することによって確認できる。
ｄ）コロニーハイブリダイゼーションによるトランスアミナーゼ遺伝子のクローニング
プラスミドライブラリーとプローブをもちいてコロニーハイブリダイゼーションを行い、トランスアミナーゼ遺伝子のクローニングを行う。コロニーハイブリダイゼーションはT.Maniatis等の方法（Molecular Cloning,T.Maniatis等、Cold Spring Harbor Laboratry Press）が利用できる。
放射能標識や蛍光標識された部分アミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡプローブを利用する場合は、ハイブリダイゼーションの温度や洗浄の際の温度、塩濃度を当該ＤＮＡのＴｍ値を考慮してそれぞれのプローブに対して設定する必要がある。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をプローブとして利用する場合は、比較的鎖長が長いことから、ハイブリダイゼーションや洗浄の際の温度は６０〜６５℃が用いられる場合が多い。
このようにしてスクリーニングされた陽性クローンについてプラスミドＤＮＡを抽出し、塩基配列の決定を行い、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と内部アミノ酸配列とを比較することによって目的クローンであるかどうか決定することができる。
こうしてクローニングされたトランスアミナーゼ遺伝子からは１種類のポリペプチドが翻訳されるが、各アミノ酸に対応するコドンは１〜６種類あることから、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する遺伝子は多種類存在する。また、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に、アミノ酸置換や欠失、挿入または付加を導入した立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も多種類存在する。更に、当該遺伝子をクローニングした生物種以外の生物が有する立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、当該遺伝子とはアミノ酸配列が全く同一ではないが、アミノ酸配列や塩基配列においてホモロジーが存在する。
塩基配列のホモロジーを実験的に検出する方法としてハイブリダイゼーション法が利用できるが、当該トランスアミナーゼ遺伝子の全てまたは一部分とハイブリダイズする遺伝子として、上記トランスアミナーゼ遺伝子は含まれる。従って、当該トランスアミナーゼ遺伝子の全てまたは一部分とハイブリダイズする遺伝子は、本発明に包含されると言える。
具体的には、配列表の配列番号：２に示されるＤＮＡの全部あるいは一部分と、又はかかるＤＮＡの相補鎖の全部あるいは一部分と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、プローブ又はプライマーとして用いることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等が利用でき、その特異性はハイブリダイズする温度、洗浄温度、洗浄液の塩濃度等によって決定される、プローブとして用いる当該トランスアミナーゼ遺伝子の長さや、対象となるＤＮＡとの組合せによってハイブリダイゼーションの条件を適宜選べば良い。ハイブリダイズはストリンジェントな条件で行われ、具体的には、温度と洗浄温度は３０℃以上が用いられ、洗浄液の塩濃度は２×ＳＳＣまたは２×ＳＳＰＥ以下の塩濃度の洗浄液が用いられる。
ｅ）ＤＮＡ塩基配列の決定
ＤＮＡ塩基配列の決定は、Sanger法あるいはMaxam-Gilbert法（Molecular Cloning,T.Maniatis等、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて行われ得る。さらに、（株）パーキンエルマージャパンのDNA Sequencing kit（Dye Terminater Cycle Sequencing Ready Reaction）を用い、ABI373A DNAシーケンサーによって行うこともできる。
決定された塩基配列を解析し、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と先に得られている部分アミノ酸配列とを比較することによりトランスアミナーゼ遺伝子の構造を明らかにすることができる。
（トランスアミナーゼの遺伝子発現）
トランスアミナーゼの生産を行うためには宿主として微生物、動物および動物細胞、植物および植物細胞等が利用され得る。それぞれの宿主に対して好適な発現ベクターに、トランスアミナーゼ遺伝子を挿入し、当該宿主に形質転換を行う。得られる形質転換株を培養することにより、トランスアミナーゼを生産することができる。
好適な例として、大腸菌を宿主として用いることができる。発現ベクターとしてはラクトースオペロンのプロモーターを利用した発現ベクター、例えばｐＵＣＮＴ（WO 94/03613）、λファージのＰLプロモーターを利用した発現ベクター、例えばｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（ファルマシア  ＬＫＢ）、Ｔａｃプロモーターを利用した発現ベクター、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマシア  ＬＫＢ）を利用することができる。
挿入するトランスアミナーゼ遺伝子は、当該酵素の翻訳開始コドンから終止コドンまでを含む断片が用いられる。好適には当該遺伝子の上流、下流それぞれに余分のＤＮＡを含まないことが望ましいが、特にこれによって制限を受けない。また遺伝子によっては翻訳開始コドンがＡＴＧに代えてＧＴＧやＴＴＧ等が使用されている場合が在り、このような場合には大腸菌での発現のためには開始コドンをＡＴＧに変更することがより好適である。
以上をまとめると、本発明の立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えば上記のアルスロバクター属に属する微生物の培養により得ることができる。かかるポリペプチドとしては、例えば、１）配列表の配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：６に記載された部分アミノ酸配列を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、２）配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、及び、３）配列表の配列番号：１に記載されたアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、または置換されたアミノ酸からなるポリペプチドであって、かつ立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
本発明の組換えＤＮＡは、上記の本発明のＤＮＡを含んでなる。かかる組換えＤＮＡとしては、好ましくは、微生物、動物若しくは動物細胞、又は植物若しくは植物細胞において、コードされたポリペプチドを発現することができる発現ベクターである。例えば、一例としてｐＵＣＮＴに立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡを挿入した、上記発現ベクターがプラスミドｐＡＴ２８、ｐＡＴ２９、またはｐＡＴ３０である組換えＤＮＡが挙げられる。かかるプラスミドは、実施例に記載の方法で得ることができる。
本発明の形質転換体は上記の本発明の発現ベクターにより形質転換されてなる。かかる形質転換体としては、例えば、大腸菌〔Escherichia coli（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ）〕ＪＭ１０９やＨＢ１０１を形質転換した形質転換体が挙げられる。形質転換体として用いられる大腸菌としては、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２９）、又はＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ３０）が挙げられる。
上記の本発明の発現ベクダーで公知の方法により形質転換し、形質転換体を得ることができる。
本発明の立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法は、上記の本発明の形質転換体を培養もしくは育種することによって、培養に用いた培養液又は該形質転換体より立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする。培地組成、培地のｐＨ、培養温度、ＩＰＴＧの使用の有無と添加の時間、培養時間等について最適条件を決定することにより、効率良くトランスアミナーゼを生産し得る。本発明のポリペプチドの製造方法により得られるトランスアミナーゼは、本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法に好適に用いることができる。
形質転換体の培養物から立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドを精製するには、通常の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌の場合のようにポリペプチドが菌体内蓄積する場合では、培養終了後遠心分離等によって形質転換体を集め、これを超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを、塩析や、イオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニテイーなどの各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体外に分泌される場合があるが、この場合は培養上清から同様に精製すればよい。
また、宿主が大腸菌の場合、発現産物が不溶性の封入体として形成される場合がある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等を行うことにより封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素や塩酸グアニジン等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニテイーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリフォールデイング操作を行うことによって活性を有するトランスアミナーゼを得ることができる。
本発明に用いられるトランスアミナーゼは、各種の態様で使用することができる。すなわち、微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物をはじめ、無細胞抽出液、部分精製酵素、精製酵素等を用いることができ、更にはこれらの菌体の固定化物、菌体処理物の固定化物、酵素タンパク質の固定化用担体（例えば、陰イオン交換樹脂）への固定化物等が使用できる。なお、固定化は、常法（例えば特開昭６３−１８５３８２号公報）に従って行うことができる。
固定化に使用される支持体としては、デュオライト（Duolite）Ａ５６８又はＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）等のフェノール−ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、アンバーライト（Amberlite）ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、レワタイト（Lewatit）ＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、ダイアイオン（Diaion）ＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）等のポリスチレン樹脂のような各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他ＤＥＡＥ−セルロース等の支持体も使用することができる。
更に、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例として、グルタルアルデヒドを挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけではなく、部分精製酵素、菌体破砕液、無細胞抽出液等、種々の精製度のものが使用できる。
固定化酵素の調製は支持体に酵素を吸着後、架橋処理をする等の通常の調製法が使用できる。
本発明に使用されるアミノ基受容体としては、一般式（１）で示されるケトン化合物が挙げられる。
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式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換または無置換のアリール基、炭素数４〜１２のヘテロアリール基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子のいずれかを示し、Ｘは水酸基、カルボシキル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子のいずれかを示す。
置換アリール基としては、例えばハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、水酸基、メトキシ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基からなる群より選択される一種以上の置換基により一ケ所以上置換されたアリール基が挙げられる。具体的には、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、及び４−トリフルオロメチルフェニル基からなる群より選択される基が挙げられる。
ヘテロアリール基としては、例えばピリジル基、ピラジニル基、チエニル基、フリル基、及びチアゾリル基からなる群より選択される基が挙げられる。
前記一般式（１）で示されるケトン化合物の中では、特にｐが０、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子の１−アリール−２−プロパノンが好ましく、更に詳しくは、前記１−アリール−２−プロパノン中のアリール基がフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基である化合物が好ましい。
また、Ｒがメチル基、ｐが１、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子である、１−メトキシ−２−プロパノンが好ましい。更に、ｐが０、ｑが１、ｒが０、Ｒが水素原子でありＸがカルボキシル基のピルビン酸やそのアルキルエステル等も好ましい基質となる。
本発明に使用されるアミノ基供与体は第一アミンであり、例えば、一般式（３）で示される非キラルもしくはラセミ体又は光学活性体アミノ化合物類が挙げられる。
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式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１４の置換若しくは無置換のアリール基、炭素数１〜１４の置換若しくは無置換のアラルキル基、カルボキシル基、又は炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1とＲ2は分子内で結合して環を形成してもよい。
更に詳しくは、Ｒ1が炭素数１〜１０のアルキル基、フェニル基、ナフチル基のいずれかであり、Ｒ2がメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボキシル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、カルボキシメチル基のいずれかである第一アミン等が好ましい。
本発明で用いられる第一アミンの具体例としては、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−１−ナフチルエチルアミン、（Ｒ）−１−メチルプロピルアミン、（Ｒ）−１−メチルヘキシルアミン、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノール、（Ｒ）−１−メチルブチルアミン、（Ｒ）−１−フェニルメチルアミン、（Ｒ）−１−アミノ−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエタノール、（Ｒ）−３−アミノヘプタン、（Ｒ）−１−アミノ−３−フェニルプロパン、（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、（Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロパノール、（Ｒ）−１−メチルヘプチルアミン、ベンジルアミン、（Ｓ）−２−フェニルグリシノール、（Ｒ）−３−アミノフェニルブタン、Ｌ−フェニルアラニノール、（Ｒ）−２−アミノ−１−メトキシプロパン、Ｄ−アラニン、アルキル基の炭素数が１〜９の、Ｄ−アラニンのアルキルエステル（例えば、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｄ−アラニンエチルエステル等）、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、又は（Ｒ）−１−フェニル−２−アミノプロパン等が挙げられる。また、これら化合物のラセミ体も第一アミンとして挙げられる。
本発明の製造方法は、上記のケトン化合物に、上記第一アミンの存在下、立体選択的にアミノ基転移を行わせる活性を有する、上記のトランスアミナーゼを作用させることにより所望の光学活性アミノ化合物を得るというものである。
かかる酵素タンパク質をケトン化合物に作用させる方法としては、例えば、該酵素タンパク質を生産する微生物の培養物、分離した菌体、菌体処理物、又は固定化菌体と、ケトン化合物及び第一アミンとを接触させる方法や、該酵素タンパク質を生産する微生物の無細胞抽出物、部分精製酵素タンパク質、精製酵素タンパク質、又は固定化酵素タンパク質と、ケトン化合物及び第一アミンとを接触させる方法が挙げられる
反応に用いる基質の濃度は、アミノ基受容体が０．１〜１０％、好ましくは３〜５％であり、アミノ基供与体としては、キラールアミンの場合は主として（Ｒ）体を、アミノ基受容体に対して８０〜１５０モル％程度の濃度で用いることが好ましい。アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物を使用することもできる。ただし、使用濃度は光学活性の場合の２倍の濃度を要する。
トランスアミナーゼを作用させる際のｐＨは、ｐＨ５．０〜１２．０が好ましく、より好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。また、反応時の温度は、２５〜４０℃が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃である。
さらに、トランスアミナーゼを作用させる際に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）等の界面活性剤やリノール酸、オレイン酸等の脂肪酸を反応促進物質として添加することにより、反応生成物の収率が向上することがある。このときの界面活性剤や脂肪酸の添加量は、ケトン化合物、第一アミン、トランスアミナーゼ等が含有される反応液の０．１〜１０重量％となる量が好ましい。
本発明の製造方法によって製造されるアミノ化合物は、
具体的には、（Ｒ）−１−フェニル−２−アミノプロパン、（Ｒ）−１−フェニル−３−アミノブタン、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−３−（トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−３−（ｐ−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、（Ｒ）−４−（ｐ−メトキシフェニル）−２−アミノブタン、（Ｒ）−４−（３’，４’−メチレンジオキシフェニル）−２−アミノブタン、（Ｒ）−４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−アミノブタン、（Ｒ）−２−アミノ−１−メトキシプロパン等が挙げられる。
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法によれば、例えば、アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２８）を用い、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンをアミノ基受容体、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンをアミノ基供与体として、それぞれ３％濃度で２０時間程度の反応をさせた場合、アミノ基転移反応によって、７５％以上の１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンを９９％ｅｅ以上の光学純度の（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンに転換させることができる。
反応生成物として得られる光学活性アミノ化合物の定量は、高速液体クロマトグラフィーによって行うことが可能である。例えば、反応液を逆相カラム（コスモシル５Ｃ18−ＡＲ、ナカライテスク等）を用い、２５％アセトニトリル等を移動相として分離し、２１０ｎｍの吸収を、対照と比較することによって定量分析を行うことができる。また光学純度を測定する方法としては、いくつかの方法があるが、例えば、生成した光学活性アミノ化合物をＮ−カルボキシ−Ｌ−ロイシンアンヒドライド等と結合させてジアステレオマーを形成させ、これを上記の高速液体クロマトグラフィーの方法で分離、定量することによって、分析を行うことができる。
反応後に目的とする光学活性アミノ化合物を分離する方法としては、有機溶媒による抽出と蒸留を組み合わせた通常の方法によって行うことができる。例えば、抽出溶媒としては、酢酸エチルやトルエン等が使用可能で、反応液をまず酸性にして抽出を行うことにより、ケトン類を除き、その後アルカリ性にして抽出することにより目的化合物を含むアミン類を分離する。そしてこの抽出画分を更に蒸留することによって目的の光学活性アミノ化合物を単離することができる。
本発明に用いられるトランスアミナーゼは立体選択的にアミノ基転移反応を行う活性を有するため、一般式（４）で示されるケトン化合物（アミノ基受容体）の存在下に、一般式（５）で示されるラセミ体のアミノ化合物に該酵素タンパク質を作用させると、一方の立体のアミノ化合物のみが選択的にケトン化合物に変換され、その対掌体は変化を受けずにアミノ化合物として回収することができる。従って、本発明に用いられるトランスアミナーゼを用いて、ラセミ体のアミノ化合物から容易に対応する光学活性アミノ化合物を製造することが可能である。
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（式中、Ｒ、ｐ、ｑ、ｒ、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2は一般式（１）、一般式（３）におけるＲ、ｐ、ｑ、ｒ、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2と同じである。）
例えば、アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２８）を用い、ラセミ体の１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンや２−アミノ−１−メトキシプロパンをアミノ基供与体とし、ピルビン酸をアミノ基受容体として反応させた場合、アミノ基転移により（Ｒ）体のアミノ化合物がケトン体に転換し、（Ｓ）体のアミノ化合物が約５０％の収率で得られ、高い光学純度まで濃縮された状態で取得することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
国内各地より採取した土壌サンプル各２ｇを５ｍｌの生理食塩水に懸濁し、その上澄液０．２ｍｌを４ｍｌのＳ培地（２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｇ／Ｌ  グリセリン、３ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ  粉末酵母エキス、０．００４ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（ｐＨ７．５）、高圧蒸気殺菌後除菌フィルターで濾過した２−オキソグルタル酸又はピルビン酸、及び（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンをそれぞれ最終濃度１．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌとなるように添加）に加えて、３０℃で３〜７日間集積培養を行った。菌が生育した培養液を１．５％寒天を含むＳ培地プレートに０．２ｍｌずつ塗り付け、３０℃にて培養を行って生育したコロニーについて、それぞれＳ培地で振盪培養し、菌体を集菌後０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭピルビン酸、３０ｍＭ（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを含む０．２５ｍｌの反応液に懸濁し、３０℃で攪拌しながら２４時間反応させた。
この反応液を薄層クロマトグラフィー（Kieselgel 60F254（Merck））、展開液はジエチルエーテル：メタノール：アンモニア水（２７％）＝５０：５０：２）で分離し、基質の減少をニンヒドリンで、生成物１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンの生成を０．４％  ２，４−ジヒドロフェニルヒドラジンで検出した。目的生成物の生成が確認できた菌株については、その逆反応を行うことによって（Ｒ）選択的アミノ基転移反応活性の有無を調べた。即ち、０．６％  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、０．６％（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンを含む溶液中に培養した菌体を入れて３０℃で２４日間反応させた。その結果、（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンの生成が認められ、アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株に（Ｒ）選択的なアミノ基転移活性を認めた。
実施例２
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を実施例１に示す方法によって培養を行う際に、培地中に（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン（（Ｒ）−ＤＭＡ）の代わりに、（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミン、（ＲＳ）−１−メチルブチルアミン、（ＲＳ）−３−アミノ−２，２−ジメチルブタン、（ＲＳ）−２−アミノ−１−ブタノール、又は（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミンを添加した。その培養液から菌体を分離し、この菌体を用いて１％  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、１％（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミンを含む反応液中で３０℃、２０時間反応を行ったところ、表４に示すように反応性の向上がみられた。
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実施例３
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株をＲ培地（５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、３ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（ｐＨ７．５）、１５ｇ／Ｌ  グリセリン、２ｇ／Ｌ  粉末酵母エキス、８ｇ／Ｌ  プロエキス（播州調味料製）、高圧蒸気殺菌後除菌フィルターで濾過したピルビン酸、及び（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミンをそれぞれ最終濃度１．６ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌとなるように添加、ｐＨ７．２に調製）に接種して、３０℃で２４時間振盪培養した。その培養菌体を遠心分離により集菌し、１％  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、０．１％  トリトン  Ｘ−１００と表５に示すアミノ基供与体１％を含む反応液（ｐＨ８．５）中に懸濁して３５℃、２０時間反応させた。表５に示すように、（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミン、（ＲＳ）−１−メチルブチルアミン、（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミン及び（ＲＳ）−１−メチルブチルアミン等がアミノ基供与体として働くことがわかったが、（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミンが最も良好であった。
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実施例４
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株をＲ培地で培養して得た菌体を、２％  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、４％（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミンを含む反応液に懸濁し、表６に示す界面活性剤や脂肪酸を添加して、３０℃、ｐＨ８．５で２０時間反応させた。その結果、反応液にドデシル硫酸ナトリウムやリノール酸、オレイン酸等を添加することによって、反応生成物の収率が向上することが判った。
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実施例５
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株をＲ培地で培養した菌体を用い、２％  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、１．４％（ＲＳ）−１−フェニルエチルアミン、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウムを含む反応液のｐＨを７．５〜９．５まで変化させて３５℃で２０時間反応を行った。その結果、表７に示すように、ｐＨ８．５〜９．０での反応生成物の収率が良好であった。
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実施例６
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を２リットル容ミニジャーを用い、１．５リットルのＪ培地（５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（ｐＨ７．５）、４０ｇ／Ｌ  グリセリン、３ｇ／Ｌ  粉末酵母エキス、２０ｇ／Ｌ  プロエキス（播州調味料製）、ｐＨ７．５に調整）に３０ｍｌの一晩前培養液を植菌し、３０℃、０．５ｖｖｍ、４５０ｒｐｍで４３時間、１０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に調整しながら培養した。なお、培養開始後、１４時間後に最終濃度４ｇ／Ｌとなるように除菌フィルターで濾過した（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミンを添加して培養した。培養終了時の到達菌体濃度（ＯＤ610）は約２９で、その時のトランスアミナーゼ活性は培養液当たり０．３単位であった。なお、酵素活性単位は、３０℃で１μＭの基質１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンを１分間で（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンに転換する酵素活性量を示す。
培養液１．５リットルから集菌した菌体を用いて、４５ｇの１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、２８．３ｇの（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、６５．０ｇのオレイン酸を含む反応液（ｐＨ８．５）に懸濁し、３０℃で３９時間反応させたところ、基質の８１．６％が（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンに転換した。この反応液のｐＨを塩酸で２．０に調整した後、トルエンを用いて抽出し有機層にケトン類を移行させて分離した。水層のｐＨを水酸化ナトリウムで１２に調整した後、再びトルエンを用いて抽出したところ、有機層に３２．９ｇの（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンが含まれていた。この抽出物から蒸留によって目的化合物の分離を試みたところ、その主留画分に３０．３ｇの（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンが含まれていた。この一連の操作による総合収率は、約６８．７％であり、光学純度は９９．６％ｅｅ（Ｒ体）であった。
実施例７
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を４００ｍｌのＲ培地の入った坂口フラスコ中で３０℃、３０時間振盪培養した。集菌後、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、０．１％の２−メルカプトエタノールに懸濁し、超音波によって菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿物を除去して得られる上清として無細胞抽出液３４ｍｌを得た。
この無細胞抽出液１０ｍｌを用い、０．５ｇの１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、０．３４ｇの（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）よりなる１００ｍｌの反応液で、３０℃、２４時間反応させた。その結果、０．３６ｇの（Ｒ）−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンが生成した。
実施例８
実施例７と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を培養し、その１ｍｌから菌体を分離した。これを１ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ラセミ体の１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン４０ｍｇ、ピルビン酸２０ｍｇ、ドデシル硫酸ナトリウム２％を含む反応液に懸濁し、３０℃で４８時間、攪拌しながら反応させた。その反応後の溶液の分析を行ったところ、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンが２０．５ｍｇ残存しており、その光学純度は９６％ｅｅ（Ｓ体）であった。
実施例９
実施例６と同様に、アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を５リットル容ミニジャーを用い、３．５リットルのＪ培地で３０℃、４３時間培養した。菌体を遠心分離によって集め、１リットルの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、０．０１％の２−メルカプトエタノールに懸濁し、ダイノミル（Dynomill（登録商標）、スイス）で破砕後、遠心して上清８１０ｍｌを分離した。これに、硫酸プロタミンを５０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し核酸を除き、３０％飽和となるように硫安を添加して沈澱したタンパク質を除いた後、６０％飽和となるように硫安を添加して沈澱したタンパク質を分離した。これを上記緩衝液に溶解させ、同緩衝液に対して透析した後、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ピリドキサールリン酸となるように添加した同緩衝液組成に調整後、この液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース  ファストフロー（ファルマシア）カラム（φ４．４×２０ｃｍ）に供し、０．３〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ直線濃度勾配によって溶出させた。
この活性画分を集め透析後、０．２Ｍとなるように硫安を添加した後、０．３Ｍ  ＮａＣｌのかわりに０．２Ｍ  硫安を含む前記緩衝液で平衡化したフェニルセファロース（ファルマシア）カラム（φ２．２×１７ｃｍ）に供し、０．２〜０Ｍの硫安の直線濃度勾配により溶出した。この活性面分の硫安濃度を０．６Ｍに調整した後、０．２Ｍ  硫安のかわりに０．６Ｍ硫安を含む前期緩衝液で平衡化したブチルセファロース（ファルマシア）カラム（φ２．２×１７ｃｍ）に供し、０．６〜０．２Ｍ硫安の直線濃度勾配によって溶出した。この活性画分を集め、限外濾過で濃縮した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、分子量約３７，０００に相当するところに、ほぼ単一のバンドを形成していた。
実施例１０
実施例９で得られた精製酵素タンパク質を気相プロテインシークエンサー（４７０Ａ型、アプライド・バイオシステム社）にて分析することにより、アミノ末端のアミノ酸配列を調べた。その結果、当該酵素タンパク質は、アミノ末端付近に配列表の配列番号：３及び配列番号：４で示される２種類のアミノ酸配列を持つことが分かった。配列番号：４で示されるアミノ酸配列をアミノ末端に持つ酵素タンパク質に比べて配列番号：３で示されるアミノ酸配列をアミノ末端に持つ酵素タンパク質は微量であった。両配列の比較より、アミノ末端付近のプロセッシングにより、配列番号：３から配列番号：４で示されるアミノ酸配列をアミノ末端に持つトランスアミナーゼが生成したと推定された。
精製トランスアミナーゼ１００μｇ（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０％グリセリン、０．００５％メルカプトエタノール、１０μＭピリドキサールリン酸）に８μｇのＴＰＣＫトリプシンを加え、３７℃で２４時間処理した。得られた消化物を、ＨＰＬＣ（ＹＭＣ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．製、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム、流速１ｍＬ／分、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、８０％アセトニトリル、溶出条件：溶出液Ａが９０％、溶出液Ｂが１０％である混合溶液で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、９０分間で溶出液Ｂの割合を１００％にあげる。）で分離精製した。各ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を前述の方法で行った。その結果、配列番号：５、配列番号：６の部分アミノ酸配列を得た。
実施例１１
実施例９で得られた精製酵素タンパク質を用いて、ピルビン酸をアミノ基受容体として、種々のアミノ化合物に対する反応性を調べた。１５０μｌの基質溶液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、４０ｍＭピルビン酸、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、４０ｍＭ各種アミノ化合物）に１０倍希釈した精製酵素タンパク質溶液１５０μｌを添加し、３０℃で１時間チューブ内で反応させた。反応チューブを沸騰水中に移して反応停止後、反応液の一部を５倍希釈し、その１０μｌに０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０μｌ、８０ｍＭ  ４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）のエタノール溶液２０μｌを添加し、６０℃で１分間反応後氷冷し、５ｍＭ  ＨＣｌ  ４６０μｌを添加した。この反応液をファインパックＣ１８−５カラム（日本分光社製）Ｉ、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、ＣＨ3ＣＮ（９０：１０）を溶離液として高速液体クロマトグラフィーで分析し、励起波長を４７０ｎｍとし、５３０ｎｍでＮＢＤ化したアラニンの検出を行った。その結果を（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンを基質とした時の相対活性で表８に示す。
表８から明らかなように（Ｓ）−２−フェニルグリシノール、３−アミノフェニルブタン等が良好な反応性を示した。
0004213771.tif 000017
実施例１２
実施例９で得られた精製酵素タンパク質を用いて、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンをアミノ基供与体として、種々のカルボニル化合物に対する反応性について調べた。２００μｌの基質溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、２５ｍＭ（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、２５ｍＭ  各種カルボニル化合物）に精製酵素タンパク質溶液５０μｌを添加し、３０℃で１〜３時間チューブ内で反応させた。反応チューブを沸騰水中に移して反応停止後、反応液をメタノールで５倍希釈した。この希釈液をファインパックＣ18−５カラムで、メタノール−水（２０：８０）を溶離液として、高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応により生成したアセトフェノンの定量を行った。その時の結果をピルビン酸を基質とした時の相対活性で表９に示す。表９から明らかなように、オキザロ酢酸やフェノキシ−２−プロパノン等も良好な反応性を示した。
0004213771.tif 000018
実施例１３
実施例７と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を培養し、その培養液１ｍｌから菌体を分離した。これを１ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、１００ｍＭ  メトキシ−２−プロパノン、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む反応液に懸濁し、３０℃で２０時間攪拌しながら反応させた。この反応液の分析を行ったところ、基質であるメトキシ−２−プロパノンがほとんど消失して２−アミノ−１−メトキシプロパンに転換しており、その光学純度は９９．４％ｅｅ〔（Ｒ）体〕であった。
実施例１４
実施例１３と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を培養し、その培養液１ｍｌから菌体を分離した。これを１ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ラセミ体の２−アミノ−１−メトキシプロパン５０ｍｇ、ピルビン酸３７．５ｍｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．１％を含む反応液に懸濁し、３０℃で２４時間、攪拌しながら反応させた。この反応後の分析を行ったところ、２−アミノ−１−メトキシプロパンが２３．４ｍｇ残存しており、その光学純度は９５％ｅｅ〔（Ｓ）体〕であった。
実施例１５
実施例１４と同様の反応で、２００ｍＭのラセミ体の２−アミノ−１−メトキシプロパン、１５０ｍＭのｎ−ブチルアルデヒド又はプロピオンアルデヒドを用い、３０℃で２０時間反応させた。その分析の結果、（Ｓ）体の２−アミノ−１−メトキシプロパンが濃縮されており、（Ｓ）体の比率が、ｎ−ブチルアルデヒドを用いた場合で７６％、プロピオンアルデヒドを用いた場合で５８％となっていた。
実施例１６
実施例９で得られた精製酵素タンパク質を用いて、ｐＨが活性に及ぼす影響を調べた。２０μｍｏｌ  １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン、２０μｍｏｌ（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン及び１μｍｏｌピリドキサールリン酸を含み、以下に示す緩衝液によってｐＨを調整した０．９ｍｌの溶液に、適当に希釈した酵素タンパク質溶液０．１ｍｌを添加し、３０℃で１時間反応させた。使用した緩衝液はいずれも最終濃度０．１Ｍで酢酸緩衝液（ＣＨ3ＣＯＯＮａと省略、ｐＨ４〜６）リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ５〜８）及びトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７〜１０）である。反応後の反応液について生成した（Ｒ）−ＤＭＡを高速液体クロマトグラフィーで定量し、ｐＨ８．５の活性を１００％としてそれぞれのｐＨでの相対活性を第１図に示した。本酵素タンパク質は、ｐＨ８．５付近（ｐＨ７．５〜９．０）が至適ｐＨであることがわかった。
実施例１７
実施例９で得られた精製酵素タンパク質を用いて、ｐＨが酵素の安定性に及ぼす影響を調べた。酵素タンパク質溶液のｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨで各ｐＨに調整後、２０℃で２３時間保温した後、実施例１６と同様にしてｐＨ８．５で反応させ、生成した（Ｒ）−ＤＭＡを定量した。その結果を未処理の酵素タンパク質溶液の活性を１００％として各々のｐＨでの処理サンプルの活性を相対活性で第２図に示した。本酵素タンパク質は、ｐＨ７付近が最も安定であることがわかった。
実施例１８
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株より染色体ＤＮＡの調製を行った。下記に示す培地３０ｍｌの入った５００ｍｌ坂口フラスコにアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８を植菌した。３０℃にて２日間振とう培養した後、培養液を遠心分離し菌体を集めた。菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥと略す）に懸濁した後、Current Protocol in Molecular Biology（F Ausubel等、Willy Interscience）の方法に従って染色体ＤＮＡを調製した。ただし、この方法で使用するＳＤＳ処理濃度を０．５％から２％に変更した。１５ｍｌの培養液から約６．５ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
0004213771.tif 000019
実施例１９
プラスミドライブラリーの作製をT,Maniatisらの方法（Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Press）により作製した。染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIによって部分分解し、アガロースゲル電気泳動を行った。約６〜１２ｋｂのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＳＵＰＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）を用いて精製した。ｐＵＣ１９を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アルカリホスファターゼによって脱リン酸を行った。このように処理したｐＵＣ１９と部分分解した染色体ＤＮＡをDNA Ligation kit ver2（宝酒造（株）製）を用いて連結した。大腸菌JM109を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド），１００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬ培地にプレーティングした。染色体ＤＮＡを組み込まれたｐＵＣ１９は白色のコロニーを形成し、一方、染色体ＤＮＡを組み込まれていないｐＵＣ１９は青色のコロニーを形成するので容易に判別することができる。
実施例２０
実施例１０によって得られた配列表の配列番号：３、配列番号：４、及び配列番号：５に示されるアミノ酸配列から、配列番号：７（ＡＴ−１）及び配列番号：８（ＡＴ−３）に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡＴ−１とＡＴ−３をプライマーＤＮＡとして、アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株の染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造（株）製）を用い、反応組成は同プロトコールに準じた。反応温度条件は下記の条件で行った。
１）  ９４℃  ２分間
２）  ９４℃  １分間
３）  ４４℃  １分間
４）  ６８℃  ２分間
５）  ６８℃  ５分間
２）〜４）を３０サイクル
反応終了後、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて生成物を調べた結果、約４５０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が少ないながらも確認できた。
約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切りだし、ガラス棒にて粉砕後、ＴＥ緩衝液にて抽出し、精製した。このフラグメントをRegular pT7Blue T-vector kit（Novagen社製）を用いてpT7Blue Vectorにクローニングし、pAT1を得た。pAT1の挿入断片について（株）パーキンエルマージャパンのDNA sequencing kit（Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction）を用い、ABI373A DNAシーケンサー（パーキンエルマー（株）製）によって塩基配列を決定した。その結果、実施例１０で得た配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列が存在することが明らかになった。pAT1の挿入ＤＮＡ断片（約４５０ｂｐ）の塩基配列を配列表の配列番号：２１に示した。
実施例２１
pAT1をＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分離した約４５０ｂｐのＤＮＡ断片含むゲルを切りだし、ＳＵＰＵＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）を用いて同ＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片をRandom Primer DNA Labeling kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いて[α−32Ｐ]ｄCTPで放射能標識し、プローブとして用いた。実施例１９で作製したプラスミドライブラリーに対して同プローブでコロニーハイブリダイゼーションを行い、スクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーションはT.Maniatisらの方法（T.Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Press）に従って行った。約２０００株のクローンからなるプラスミドライブラリーをスクリーニングした結果、２株の陽性クローンJM109（pAT11）とJM109（pAT17）を得た。pAT11は約８kb、pAT17は約１０．５kbの染色体ＤＮＡ断片が挿入されていた。
pAT11を種々の制限酵素で切断し制限酵素地図を作製した（第３図）。pAT1の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号：２１）とpAT11の制限酵素地図を比較した結果と、トランスアミナーゼの分子量（ＭＷ３７，０００）から推定されるＯＲＦ（約１ｋｂ）の大きさより、pAT11のPstI切断によって得られる約1.6kbのＤＮＡ断片に当該遺伝子の全長が含まれていることが示唆された。
pAT11をPst Ｉで切断し、アガロース電気泳動し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、SUPRECTM−01（宝酒造（株）製）を用いて抽出精製した。
pUC19をPstIで切断し、１．６ｋｂのＤＮＡ断片と混合し、DNA Ligation kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションしたＤＮＡで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡをPst Ｉを含む種々の制限酵素で切断し解析を行った結果、挿入方向の異なるpAT22、pAT23が得られたことが分かった。簡単なpAT22、pAT23の制限酵素地図を第３図に示した。前記ｐＡＴ２２を保持する菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２２）と命名され、平成９年４月８日（原寄託日）より受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９０２として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）〕に寄託されている。
１．６ｋｂのPst Ｉ断片の塩基配列を決定するために、種々のプラスミドＤＮＡを作製した。pAT11をEcoRIとSmaIにてそれぞれ切断しDNA Ligation kit ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションしたＤＮＡで大腸菌JM109をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で切断した結果、それぞれ挿入ＤＮＡ断片内のStuI近傍のEcoRI、SmaI部位からベクターのEcoRI、SmaI部位まで欠失したプラスミドpAT20、pAT21をそれぞれ得たことが分かった。pAT22をSma ＩとStuIで切断し、DNA Ligation kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションをした。ライゲーションしたＤＮＡで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で切断し解析した結果、約３５０ｂｐのSmaI-StuI断片の欠失したプラスミドpAT26を得たことが分かった。pAT23をEcoRIで切断し同様にライゲーションを行い、大腸菌JM109を形質転換した。
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で解析した結果、ベクターのEcoRIから挿入ＤＮＡ断片内のEcoRI部位までの約９００ｂｐの欠失したプラスミドpAT24を得たことが分かった。pAT23をSmaIで切断し同様にライゲーションを行い大腸菌JM109を形質転換した。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し種々の制限酵素で解析した結果、ベクターのSmaIから挿入ＤＮＡ断片内のSmaI部位までの約1,100ｂｐを欠失したプラスミドpAT25を得たことが分かった。pAT22をSalIで切断し、同様にライゲーションを行い大腸菌JM109を形質転換した。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し種々の制限酵素で解析した結果ベクターのSalIから挿入ＤＮＡ断片内のSalI部位までの約２００ｂｐの欠失したプラスミドpAT27を得た。pAT20からpAT27までの各プラスミドの作製方法と簡単な制限酵素地図を第３図に示した。
これらのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、Ｍ１３−４７（宝酒造（株）製）、ＲＶ−Ｍ（宝酒造（株）製）をプライマーＤＮＡとして用い、実施例２０で示した方法によって塩基配列を決定した。また、この様にして順次決定された塩基配列に基づいて、配列番号：９〜１５のオリゴヌクレオチドを合成し、配列表の配列番号：９〜１５のオリゴヌクレオチド（ＡＴ−６〜９、１１、１２、１８）をプライマーとしてさらに塩基配列を決定した。こうして決定した１．６ｋｂのＰｓｔＩ断片の塩基配列を配列表の配列番号：１６に示した。
配列番号：１６の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、実施例１０で決定したアミノ末端付近のアミノ酸配列（配列番号：３および４）と比較した結果、トランスアミナーゼをコードする遺伝子の翻訳は、配列番号：１６の塩基配列の３８６番から３８８番のＧＴＧから開始されることが分かった。またアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８より調製されたトランスアミナーゼの大部分は、アミノ末端メチオニンより６アミノ酸が切断除去され、アミノ末端がスレオニンであることが判った。タンパク質をコードする領域に対応するアミノ酸配列と塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号：１と配列番号：２に示されている。
実施例２２
トランスアミナーゼを大腸菌において生産するために当該遺伝子の発現ベクターの構築を行った。発現ベクターとしてラクトースオペロンのプロモーターを有するpUCNT（WO/03613）を用いた。
トランスアミナーゼ遺伝子を発現ベクターに挿入するために必要な制限酵素部位を導入するためにＰＣＲ法を行った。アミノ末端プライマーＤＮＡとして配列番号：１７〜１９（ＡＴ−１３〜１５）、カルボキシル末端プライマーＤＮＡとして配列番号：２０（ＡＴ−１６）のオリゴヌクレオチドを合成した。ＡＴ−１３は翻訳開始コドンＧＴＧをＡＴＧに変更するためであり、ＡＴ−１４は翻訳開始コドンとして５番目のAspコドンＧＡＴをＡＴＧに変更するために合成した。またＡＴ−１５は翻訳開始コドンＧＴＧをそのまま用いるために作製した。
３種類のアミノ末端プライマーＤＮＡとカルボキシル末端プライマーＤＮＡを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲはTaKaRa Ex Taqを使用し、下記の温度条件にて実施した。
１）  ９４℃  ２分間
２）  ９４℃  １分間
３）  ５０℃  １分間
４）  ６８℃  ２分間
５）  ６８℃  ５分間
２）〜４）を３０サイクル
それぞれ約１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められた。ＡＴ−１３とＡＴ−１６をプライマーＤＮＡとして用いたＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片と、ＡＴ−１４とＡＴ−１６をプライマーＤＮＡとして用いたＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、ＤＮＡ断片をＳＵＰＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）にて抽出精製した。これらのＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断しアガロースゲル電気泳動し、切り出したゲルからＳＵＰＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）にて抽出精製したｐＵＣＮＴとＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションを行い、それぞれで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し解析した結果、それぞれトランスアミナーゼ遺伝子の挿入された発現プラスミドｐＡＴ２８、ｐＡＴ２９が得られた。
ＡＴ−１５とＡＴ−１６をプライマーＤＮＡとして用いたＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＰｍａＣＩとＢａｍＨＩで切断し０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、ＳＵＰＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）にて抽出精製を行った。ｐＵＣＮＴをＮｄｅＩで切断しＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（宝酒造（株）製）にて切断部位を平滑にした後、ＢａｍＨＩにて切断した。その後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、ＳＵＰＲＥＣTM−０１（宝酒造（株）製）にて抽出精製した。このようにして調製したＤＮＡ断片とベクターをライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し解析した結果、トランスアミナーゼ遺伝子の挿入されたプラスミドｐＡＴ３０を得たことが分かった。
実施例２３
実施例２２で作製したｐＡＴ２８を保持する大腸菌ＪＭ１０９、〔以下、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２８）のように略記する〕、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ２９）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＡＴ３０）を用いてトランスアミナーゼの発現（生産）を行った。対照としてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＵＣＮＴ）を用いた。また実施例９で示したアルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８のダイノミルによる粉砕後の遠心上清液も、対照として用いた。
それぞれの株を１００μｇ／ｍｌＩＰＴＧ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬ培地の入った試験管（直径２２ｍｍ、長さ２２０ｍｍ）に植菌した後、３７℃で一晩振とう培養した。こうして得た培養液１．５ｍｌを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分，４℃）して集菌した。４℃に冷却した２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８、２０μＭピリドキサールリン酸、０．０１％２−メルカプトエタノールから成る抽出バッファー１ｍｌを加え菌体を懸濁した。この懸濁液を氷上にて超音波破砕（トミー精工（株）Ｈａｎｄｙ  ｓｏｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ＵＲ−２０Ｐ、ｐｏｗｅｒ  ｍａｘにて９０秒  ２回）し、１５０００ｒｐｍ  ４℃，１０分の遠心分離を行い、細胞残渣を除き、上清を粗酵素タンパク質溶液とした。
トランスアミナーゼ活性は次のようにして測定した。２５ｍＭ（Ｒ）−フェニルエチルアミン、２５ｍＭピルビン酸、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５から成る基質溶液０．８ｍｌに酵素タンパク質溶液０．２ｍｌを加え、３０℃、１時間反応させた。沸騰水中にて３分間加熱し反応を停止した。
反応生成物であるアセトフェノンをＨＰＬＣにて分析することによって、酵素活性を求めた。分析条件を以下に示す。なお、トランスアミナーゼの量は、精製トランスアミナーゼの比活性より推定される値である。
ＨＰＬＣカラム：日本分光社製  Ｆｉｎｅｐａｃ  ＳＩＬ  Ｃ１８−５
展開溶媒：アセトニトリル／水＝２５／７５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２１０ｎｍ
アセトフェノンは約２４分に検出される。結果を以下に示す。
菌株    トランスアミナーゼ（ｍｇ／Ｌ）
E.coli JM109（pAT28）    ８１
E.coli JM109（pAT29）    ６６
E.coli JM109（pAT30）      ３．４
Arthrobactor sp.KNK168    １９
実施例２４
アルスロバクター・スピーシーズＫＮＫ１６８株を実施例６と同様に酵素誘導物質として（ＲＳ）−１−メチルプロピルアミンを用い振とう培養した。培養液１リットルから集菌した菌体を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液１リットルに懸濁し、３０ｇの１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−プロパノン、１８ｇの（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンを４４ｇのオレイン酸を加え（ｐＨ８．５）、３０℃で４０時間反応させた。反応後、実施例６と同様に抽出、蒸留し（Ｒ）−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパンが１９．５ｇ得られた。光学純度は１００％ｅｅ、収率は６５％であった。
産業上の利用可能性
本発明により、従来合成の困難であった１位にアリール基等を有する光学活性アミノ化合物等を高収率で容易に製造することが可能となる。また、本発明のポリペプチドは立体選択的なトランスアミナーゼ活性を有するものであり、本発明の製造方法に好適に用いることができる。また、本発明のＤＮＡは本発明のポリペプチドをコードするものである。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３２５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴：１（Xaaは-NH2、Met、Ala Phe Ser Ala Asp、又はMet Ala Phe Ser Ala Aspを示す。）
配列：
0004213771.tif 000020
配列番号：２
配列の長さ：９７６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴：１（NはGTGGCATTCA GCGCCGAT、ATGGCATTCA GCGCCGAT、又はATGを示す。）
配列：
0004213771.tif 000021
配列番号：３
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：１、２、１５（不明のアミノ酸）
配列：
0004213771.tif 000022
配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0004213771.tif 000023
配列番号：５
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0004213771.tif 000024
配列番号：６
配列の長さ：１８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0004213771.tif 000025
配列番号：７
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＨはＡ、ＣまたはＴ、およびＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴをそれぞれ示す。
配列：
0004213771.tif 000026
配列番号：８
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列の特徴：ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、およびＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴをそれぞれ示す。
配列：
0004213771.tif 000027
配列番号：９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000028
配列番号：１０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000029
配列番号：１１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000030
配列番号：１２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000031
配列番号：１３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000032
配列番号：１４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000033
配列番号：１５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000034
配列番号：１６
配列の長さ：１５７４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列：
0004213771.tif 000035
配列番号：１７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000036
配列番号：１８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000037
配列番号：１９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0004213771.tif 000038
配列番号：２０
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２１
配列の長さ：４６５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
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【図１】
0004213771.tif 000049
【図２】
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【図３】
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