(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0004353551.tif 000013
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、およびＲ３は、水素原子または
【化２】
0004353551.tif 000014
である。）
で表される物質を含有するアルドース還元酵素阻害剤（抽出エキスおよびフラクションを除く）。
【請求項２】
さらにフラボノイド配糖体も含有する請求項１記載のアルドース還元酵素阻害活性剤。
【請求項３】
前記フラボノイド配糖体がミリシトリン、メアンシトリン、ケルシトリン、デスマンチン-１およびグアヤベリンである請求項２記載のアルドース還元酵素阻害活性剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病に起因する合併症（網膜症、腎症、神経障害など）の予防や治療に有効なアルドース還元酵素阻害活性剤に関する。本発明は、特に、フトモモ科に属するMyrcia multiflora DC.の葉からのメタノール抽出エキスまたはそのフラクションから単離されたアルドース還元酵素阻害活性を有する新規フラバノングルコシドおよび／またはアセトフェノングルコシドを含有するアルドース還元酵素阻害活性剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我々は日常、多くの炭水化物（例えば、デンプン等）を摂食している。摂食される炭水化物に由来する糖分は、体内の酵素（α-グルコシダーゼ等）により代謝されて、単糖に分解された後、消化管から吸収される。
炭水化物の摂食量が増加すると、吸収される糖の量も増加して高血糖となり、肥満、強いては糖尿病や糖尿病由来の合併症等の重大な疾病をもたらすことがある。通常、網膜症、腎症および神経障害が三大合併症と呼ばれている。
【０００３】
高血糖が前記合併症をもたらすまでの糖の代謝経路は、徐々に解明されてきている。その一つに、吸収されたブドウ糖がソルビトールに転化し、さらにそれが果糖に転化するソルビトール代謝経路がある。
ソルビトール代謝経路は、炭水化物の摂食量が増加してブドウ糖濃度が高くなる（すなわち、血糖値が高くなる）と、アルドース還元酵素と呼ばれる酵素が活性化されてブドウ糖をソルビトールに転化し、次いで、生成したソルビトールがソルビトール脱水素酵素の作用により果糖に転化されるものである。
【０００４】
上記代謝経路において、アルドース還元酵素は、血糖値が低い間はほとんど活性を示さないが、血糖値が高くなると、急激に活性が亢進され、ソルビトールを大量に生成する。他方、ソルビトールを果糖に分解するソルビトール脱水素酵素は、血糖値の値に関係なく、常に一定の働きしかしないことが分かっている。したがって、血糖値が高くなり、大量のソルビトールが生成されたとしても、その後の果糖への転化率が変化しないため、細胞内に代謝されないソルビトールが蓄積されていく。
ソルビトールが細胞内に大量に蓄積されると浸透圧が高くなり、それを解消するために、細胞の周囲から水分を吸い込んで、結果として細胞が水ぶくれの状態となる。このような状態となると、酸素が細胞を通過するのを水が阻害するため、結果として細胞内で酸素が欠乏し、場合によっては細胞が死んでしまう。アルドース還元酵素が多く存在している腎臓、目の網膜または神経は、高血糖に起因する細胞の消滅の影響を、特に受け易い。そのため、上記合併症は、腎臓、目の網膜または神経において生じ得る。
糖尿病に由来する合併症が前記ソルビトール代謝経路によって引き起こされるとすると、その要因であるソルビトールの生成を抑制すればよいと考えられる。すなわち、ソルビトールを生成するアルドース還元酵素の活性を阻害することで、血糖値が高くなった場合でもソルビトールを大量に生成することなく、その結果、合併症の誘発を抑制することができる。
【０００５】
単糖の分解および消化管からの吸収を阻害するための糖尿病用剤として市販されているものは、例えば、α−グルコシダーゼ阻害活性を有するバイエル社製アカルボース（Acarbose、商品名「Glucobay（グルコバイ）」）や武田薬品製ボグリボース（Voglibose、商品名「Basen（ベイスン）」等）、並びにアルドース還元酵素阻害活性を有する小野薬品工業製エパルレスタット(Epalrestat、商品名「Kinedak（キネダック）」；糖尿病性末梢神経障害治療剤）等が挙げられるが、これらはいずれも合成薬剤である。上記薬剤には、その使用目的と薬効発現が患者によって異なることや副作用の問題等が存在する。
【０００６】
あるいは、合成薬剤でなく、生薬からの糖尿病用剤としては、フトモモ科に属するMyrcia multiflora DC.の葉および樹皮が「植物性インシュリン」として既知であるが、その有効成分の特定や詳細な薬理効序については未だ解明されていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生薬から得られた、アルドース還元酵素阻害活性を有する物質を提供することにある。さらに、本発明は、前記物質を含有する糖尿病用剤であって、高血糖の場合でも、アルドース還元酵素の作用を抑制するのに有効であり、かつ副作用が少ない薬剤の提供も目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明らは、上記目的を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、生薬であるMyrcia multiflora DC.の葉から未知の物質を新たに単離し、それが優れたアルドース還元酵素阻害活性を有することを見い出した。
すなわち、本発明は、Myrcia multiflora DC.の葉からの抽出エキス成分であって、かつ式：
【化３】
0004353551.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、およびＲ3は、水素原子または
【化４】
0004353551.tif 000003
である。）
で表されるアルドース還元酵素阻害活性を有する物質。本発明において、前記物質は、単離精製物であっても、あるいはメタノール抽出エキスまたはそのフラクションのいずれかの形態であってもよい。
また、本発明は、前記物質を含有するアルドース還元酵素阻害活性剤も提供する。
【０００９】
【発明の効果】
本発明のアルドース還元酵素阻害活性を有する物質である新規フラバノングルコシドおよび／またはアセトフェノングルコシドは、生薬として既知のMyrcia multiflora DC.の葉からのメタノール抽出エキスまたはそのフラクションから単離生成することができる。
本発明の物質を含有するアルドース還元酵素阻害活性剤は、従来公知の合成のアルドース還元阻害活性剤と同等またはそれ以上のアルドース還元酵素阻害活性を示す。
【００１０】
【発明の実施の形態】
Myrcia multiflora DC.は、フトモモ（Myrtaceae）科に属する４〜10mの高さの木で、主にブラジル、ガーナ、ペルー、パラグアイに広く分布している。Myrcia multifloraの葉や樹皮は、従来から糖尿病の特効薬として使用されているが、現在まで、その薬理的特性および活性作用が解明されていなかった。
本発明の第１の態様は、Myrcia multiflora DC.の葉からの抽出エキス成分であって、かつ式：
【化５】
0004353551.tif 000004
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、およびＲ3は、水素原子または
【化６】
0004353551.tif 000005
である。）
で表されるアルドース還元酵素阻害活性を有する物質である。本発明の物質は、新規のフラバノングルコシド（上記式(1)）およびアセトフェノングルコシド（上記式(2)）である。
【００１１】
式(1)において、Ｒ1およびＲ2がいずれも水素原子である場合、前記物質は、ミルシアシトリン（myrciacitrin）I（6,8-ジメチル-5,7,2',5'-テトラヒドロキシフラバノン7-Ｏ-β-D-グルコピラノシド）である。あるいは、Ｒ1が水素原子でかつＲ2がメチル基であれば、前記物質は、ミルシアシトリンII（6,8-ジメチル-5'-メトキシ-5,7,2'-トリヒドロキシフラバノン7-Ｏ-β-D-グルコピラノシド）である。
また、式(2)において、Ｒ3が水素原子であれば、前記物質は、ミルシアフェノン（myrciaphenone）Ａ（2-Ｏ-β-D-グルコピラノシル−2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン）である。あるいは、Ｒ3が
【化７】
0004353551.tif 000006
である場合、前記物質は、ミルシアフェノンＢ（2-Ｏ-β-D-グルコピラノシル−6'-ガロイルアセトフェノン）である。
【００１２】
本発明の物質は、いずれも優れたアルドース還元酵素阻害活性を有するが、中でも、ミルシアシトリンIが最も優れたアルドース還元酵素阻害活性を有する。
【００１３】
本発明の物質は、以下の手順で得ることができる。
先ず、Myrcia multiflora DC.の乾燥葉の粉砕物をメタノールで加熱抽出した後、溶媒を蒸発させてメタノール抽出エキスを得る。次に、このメタノール抽出エキスを酢酸エチル／水混合液を用いて酢酸エチル層および水層に分離し、さらにその酢酸エチル層から、シリカゲルカラムクロマトグラフ法により、フラクション（フラクション１〜５）を得る。各フラクションを、従来公知のシリカゲルカラムおよび高速液体クロマトグラフィーに供することで、本発明の新規フラバノングルコシドおよびアセトフェノングルコシドが単離・精製され得る。
【００１４】
上記手順において、メタノールによる加熱抽出は、好ましくは、60〜80℃の温度で60〜120分間の抽出操作を２〜３回行う。抽出エキスを分離するための酢酸エチル／水混合液は、比１：１（v/v）に調節する。得られた酢酸エチル層を順相カラムクロマトグラフィー法に付すと、５つのフラクションが得られる。ここで、上記順相カラムクロマトグラフィー法では、キャリアーとして、好ましくはクロロホルム／メタノール（１５／１〜２／１（v/v））混合溶媒を用いる。
前記フラクションのうち、５番目に得られるフラクションを、順相および逆相カラムクロマトグラフィー法に付し、その後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法に付すことによって、本発明の物質が得られる。
ここで、本発明の物質を得るのに適したキャリアーとしては、上記順相カラムクロマトグラフィー法では、クロロホルム／メタノール混合溶媒（８／１〜１／１（v/v））もしくはクロロホルム／メタノール／水（６／４／１（v/v/v））等、逆相カラムクロマトグラフィー法では、メタノール／水（３／７〜１０／０（v/v））混合溶媒を用いることができる。あるいは、ＨＰＬＣ法では、逆相法を、メタノール／水またはアセトニトリル／水などの混合溶媒を１／９〜１０／０まで等のように、キャリアーのグラジエント操作により選択することができる。ＨＰＬＣでは、好ましくはＹＭＣパックＯＤＳ−Ａカラム（ＹＭＣ社製）を用いる。
【００１５】
本発明の第２態様は、前記フラバノングルコシドおよびアセトフェノングルコシドを含有するアルドース還元酵素阻害活性剤である。本発明において、前記物質は、Myrcia multiflora DC.の葉からの抽出エキスまたはそのフラクション、あるいはそれらからの単離精製物のいずれの形態であってもよい。
【００１６】
本発明のアルドース還元酵素阻害活性剤は、さらにフラボノイド配糖体も含有し得る。フラボノイド配糖体は、本発明の物質を得る上記手順において、Myrcia multiflora DC.の葉からのメタノール抽出エキスあるいはそのフラクションからも単離できる。単離され得る主なフラボノイド配糖体は、ミリシトリン（myricitrin）、メアンシトリン（mearnsitorin）、ケルシトリン（quercitrin）、デスマンチン-１（desmanthin-１）およびグアヤベリン（guaijaverin）の５種であるが、ギンゴール酸、β-アミリン、(+)-カテキン、および没食子酸等も包含され得る。
主要なフラボノイド配糖体の各構造式を下記に示す。
【化８】
0004353551.tif 000007
（式中、
Ｒ4が水素原子であり、Ｒ5が水酸基であれば、ミリシトリン；
Ｒ4がメチル基であり、Ｒ5が水酸基であれば、メアンシトリン；および
Ｒ4およびＲ5がいずれも水素原子であれば、ケルシトリンである。）
デスマンチン-１：
【化９】
0004353551.tif 000008
グアヤベリン：
【化１０】
0004353551.tif 000009
ギンゴール酸：
【化１１】
0004353551.tif 000010
【００１７】
前記フラボノイド配糖体の中でも、デスマンチン-１が、特に高いアルドース還元酵素阻害活性能を発現する。したがって、本発明のアルドース還元酵素阻害活性剤は、前記フラバノングルコシドおよびアセトフェノングルコシドと共に、デスマンチン-１のみを含有するものであってもよい。
【００１８】
本発明において、前記フラバノングルコシドおよびアセトフェノングルコシドを、前記メタノール抽出エキスまたはそのフラクションの形態で使用する場合、抽出・溶離溶媒を、使用前に完全に蒸発させることが望ましい。
【００１９】
本発明のアルドース還元酵素阻害活性剤には、上述の物質以外に、糖尿病用剤に使用される既知の他の化合物、および経口投与に適した形態に成型するのに必要な化合物を包含し得る。そのような化合物としては、例えば、乳糖、デンプンヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどが挙げられ、それらは、合計で、薬剤全体に対して５〜99重量％含有させることができる。
【００２０】
本発明のアルドース還元酵素阻害活性剤は、経口投与に適した形状（例えば、粉末、固形剤、液剤）に成形され得る。
本発明のアルドース還元酵素阻害活性剤の投与量は、年齢、症状等によって変化し得るが、例えば、成人における有効量は、１回につき、10〜1,000ｍｇ、好ましくは50〜500ｍｇであって、これを食前30分位に１日３回服用するのが好ましい。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
以下の手順で、本発明の物質を調製・精製した。
サンパウロ（ブラジル）より輸入したMyrcia multiflora DC.の乾燥葉５kgを細かく刻んで、メタノールで３回加熱抽出した。減圧下で前記抽出物からメタノールを蒸発させて、メタノール抽出エキス528gを得た。この抽出エキス189gを酢酸エチル／水（＝１／１）混合液で分離し、酢酸エチル層および水層フラクションをそれぞれ得た。上記フラクションから溶媒を減圧下で除去することにより、酢酸エチル抽出エキス42gおよび水抽出エキス147gをそれぞれ回収した。
【００２２】
実施例２
実施例１の酢酸エチル抽出エキス42gを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：クロロホルム／メタノール（15／１〜２／１）、900g）でフラクション１〜５に分離した（フラクション１：13.5g；フラクション２：3.5g；フラクション３：3.1g；フラクション４：3.1g；フラクション５：16.0g）。フラクション１（13.5g）をさらに、順相（溶離溶媒：n-ヘキサン／酢酸エチル（50／１）、450g）および逆相（溶離溶媒：メタノール／水（１／９）、37g）シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した後、ＨＰＬＣ（ＹＭＣパックＯＤＳ−Ａカラム；キャリアー：メタノール／水＝90／10(v/v)）を用いて、ギンゴール酸17mgとβ-アミリン571mgを単離した。
また、フラクション５ 16.0gを、順相（溶離別溶媒：クロロホルム／メタノール（８／１）からクロロホルム／メタノール／水（６／４／１）、670g）および逆相（溶離溶媒：メタノール／水（３／７）、35g）シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した後、ＨＰＬＣ（ＹＭＣパックＯＤＳ−Ａカラム；メタノール／水およびアセトニトリル／水）を用いて、各成分に分離した。その結果、既知のフラボノール配糖体（ミリシトリン173mg、メアンシトリン78mg、ケルシトリン291mg、デスマンチン-1 31mgおよびグアヤベリン24mg、(+)-カテキン11mg、没食子酸638mg）と共に、ミルシアシトリンI 1164mmgおよびミルシアシトリンII 21mg並びにミルシアフェノンＡ 9mgおよびミルシアフェノンＢ 74mgが得られた。
【００２３】
上記で単離された(+)-カテキン11mgおよび没食子酸は、既知の化合物であり、薄層クロマトグラフィー特性、並びに1Ｈ-ＮＭＲおよび13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを用いて同定した。その他の既知のフラボノール配糖体、ギンゴール酸およびβ-アミリンについては物理特性（比旋光度、1Ｈ-ＮＭＲおよび13Ｃ-ＮＭＲスペクトル）を、報告されている値と比較することにより同定した。
本発明の物質であるミルシアシトリンIおよびII並びにミルシアフェノンＡおよびＢの構造はいずれも、比旋光度（［α］D）、高分解能陽イオンＦＡＢ−ＭＳ、円二色性スペクトル（［θ］）、メタノール中でのＵＶ最大吸収波長／吸光度、ＩＲスペクトル、並びに1Ｈ-ＮＭＲおよび13Ｃ-ＮＭＲを用いて確認した。13Ｃ-ＮＭＲの結果を表１に示し、それ以外の結果を以下に示す。
【００２４】
・ミルシアシトリンI（黄色粉末）：
［α］D27＝-51.0°（c＝1.7、メタノール）；
高分解能陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ23Ｈ26Ｏ11Ｎａ(Ｍ＋Ｎａ)+)：計算値501.1399、測定値501.1372；
円二色性（c＝0.0033、メタノール）［θ］25＝-28730(281nm)（負の最大値）；
ＵＶ最大吸収波長／吸光度（メタノール）：212nm/4.3、285nm/4.1、358nm/3.6；
ＩＲ（ＫＢｒ）：3375、2930、1655、1630、1458、1067(cm-1)；
1Ｈ-ＮＭＲ（270MHz、ＤＭＳＯ-ｄ6）δ：2.10（6H,s,6,8-CH3）,2.82(1H,dd,J=2.8,17.2Hz),3.09(1H,dd,J=12.9,17.2Hz)(3-H2),3.44(1H,dd,J=5.3,11.3Hz),3.63(1H,br d,J=11.3Hz)(6"-H2),4.61(1H,d,J=7.3Hz,1"-H),5.64(1H,dd,J=2.8,12.9Hz,2-H),6.60(1H,dd,J=2.6,8.7Hz,4'-H),6.70(1H,d,J=8.7Hz,3'-H),6.91(1H,d,J=2.6Hz,6'-H),8.87(1H,br s,5'-OH),9.11(1H,br s,2'-OH),12.11(1H,br s,5-OH)；
陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：501(Ｍ＋Ｎａ)+、479(Ｍ＋Ｈ)+。
【００２５】
・ミルシアシトリンII（黄色粉末）：
［α］D24＝-20.7°（c＝0.1、ピリジン）；
高分解能陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ24Ｈ28Ｏ11Ｎａ(Ｍ＋Ｎａ)+)：計算値515.1529、測定値515.1520；
円二色性（c＝0.0027、メタノール）［θ］25＝-3116(281nm)（負の最大値）；
ＵＶ最大吸収波長／吸光度（メタノール）：204nm/4.2、285nm/4.0、361nm/3.2；
ＩＲ（ＫＢｒ）：3422、2924、1655、1638、1458、1072(cm-1)；
1Ｈ-ＮＭＲ（500MHz、ＤＭＳＯ-ｄ6）δ：2.09（3H,s,8-CH3）,2.10(3H,s,6-CH3),2.83(1H,dd,J=2.7,16.8Hz),3.15(1H,dd-like)(3-H2),3.44(1H,dd,J=6.2,11.7Hz),3.62(1H,br d,J=11.7Hz)(6"-H2),3.70(3H,s,5'-OCH3),4.61(1H,d,J=7.6Hz,1"-H),5.68(1H,dd,J=2.7,12.8Hz,2-H),6.80(1H,dd,J=2.7,8.9Hz,4'-H),6.82(1H,d,J=8.9Hz,3'-H),7.04(1H,d,J=2.7Hz,6'-H),9.28(1H,br s,2'-OH),12.07(1H,brs,5-OH)；
陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：515(Ｍ＋Ｎａ)+、493(Ｍ＋Ｈ)+；
陰イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：491(Ｍ−Ｈ)-。
【００２６】
・ミルシアフェノンＡ（白色粉末）：
［α］D27＝-46.9°（c＝0.2、メタノール）；
高分解能陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ14Ｈ18Ｏ9Ｎａ(Ｍ＋Ｎａ)+)：計算値353.0849、測定値353.0866；
ＵＶ最大吸収波長／吸光度（メタノール）：203nm/4.5、284nm/4.0；
ＩＲ（ＫＢｒ）：3410、1630、1605、1459、1366、1076(cm-1)；
1Ｈ-ＮＭＲ（500MHz、ＣＤ3ＯＤ）δ：2.69（3H,s,8-H3）,3.72(1H,dd,J=5.5,12.2Hz),3.91(1H,dd,J=2.1,12.2Hz),(6'-H2),5.02(1H,d,J=7.6Hz,1'-H),5.94(1H,d,J=2.3Hz,5-H),6.18(1H,d,J=2.3Hz,3-H)；
陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：353(Ｍ＋Ｎａ)+；
陰イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：392(Ｍ−Ｈ)-。
【００２７】
・ミルシアフェノンＢ（白色粉末）：
［α］D24＝-64.6°（c＝0.1、メタノール）；
高分解能陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ21Ｈ22Ｏ13Ｎａ(Ｍ＋Ｎａ)+)：計算値505.0958、測定値505.0971；
ＵＶ最大吸収波長／吸光度（メタノール）：219nm/4.4、283nm/4.2；
ＩＲ（ＫＢｒ）：3403、1701、1628、1452、1367、1076(cm-1)；
1Ｈ-ＮＭＲ（500MHz、ＣＤ3ＯＤ）δ：2.63（3H,s,8-H3）,4.47(1H,dd,J=4.9,12.1Hz),4.57(1H,dd,J=1.8,12.1Hz),(6'-H2),5.07(1H,d,J=7.6Hz,1'-H),5.96(1H,d,J=2.0Hz,5-H),6.17(1H,d,J=2.0Hz,3-H)、7.09(2H,s,2",6"-H)；
陽イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：505(Ｍ＋Ｎａ)+、483(Ｍ＋Ｈ)+；
陰イオンＦＡＢ−ＭＳ（m/z）：481(Ｍ−Ｈ)-。
【００２８】
【表１】
0004353551.tif 000011
【００２９】
実施例３：本発明の物質のアルドース還元酵素阻害活性評価
実施例２で単離・精製した本発明の物質（ミルシアシトリンIおよびII並びにミルシアフェノンＡおよびＢ）およびフラボノール配糖体について、生成するＮＡＤＰの定量法をＵＶ吸収から蛍光強度の測定に変えたこと以外は、Dufrane S.P.ら著、Biochem.Med.,32巻,99〜105頁(1984年)に記載の方法と同様にして、アルドース還元酵素阻害活性評価を行った。
ウィスターラットの水晶体を、2-メルカプトエタノール10mＭを含有する135mＭ Ｎａ,Ｋ-リン酸緩衝液（pH7.0）を用いてホモナイズし、100,000×gで30分間遠心分離した後、上澄み液を酵素フラクションとして使用した。
【００３０】
180mＭ Ｎａ,Ｋ-リン酸緩衝液（pH7.0）225μＬに、1.0Ｍ Ｌｉ2ＳＯ4および10mＭ ＤＬ−グリセルアルデヒドをそれぞれ50μＬ、酵素フラクションを100μＬ、さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した試料（対照試料はＤＭＳＯ）25μＬを混合し、37℃で３分間プレインキュベートを行った。これに、基質として0.3mＭのＮＡＤＰＨを50μＬ添加し、反応を開始した。30分後に0.5Ｎ塩酸を150μＬ添加して反応を停止した。
その後、イミダゾール10mＭを含有する６Ｎ ＮａＯＨ 0.5mＬを添加し、溶液を60℃で10分間加熱することで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を蛍光生成物に変換した。この蛍光生成物について、蛍光光度計（日立製作所製650-10型）を用いて、室温で、励起波長360nmおよび発光波長460nmにおける蛍光強度を測定した。得られた測定値から、アルドース還元酵素による糖の還元を50％阻害するのに要する各種試料濃度（ＩＣ50）を算出した。
【００３１】
実施例４
試料として、実施例１の酢酸エチル抽出エキスおよび水抽出エキスを用いたこと以外は、実施例３と同様にして蛍光強度の測定を行った。測定値から、アルドース還元酵素による糖の還元を50％阻害するのに要する各種試料濃度（ＩＣ50）を算出した。
【００３２】
比較例１
アルドース還元酵素阻害活性を有する市販の糖尿病性末梢神経障害治療剤（小野薬品製、エパルレスタット(Epalrestat)）を用いたこと以外は、上記実施例３と同様にしてＩＣ50を算出した。
実施例３および４並びに比較例１の結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0004353551.tif 000012
表１中、
ａ）：アルドース還元酵素による糖の還元を50％阻害するのに要した試料濃度を示し、ＤＭＳＯ-ｄ6中で測定した。
ｂ）：小野薬品工業製、糖尿病性末梢神経障害治療剤；本試料は、ＣＤ3ＯＤ中で測定した。
【００３４】
上記の結果より、本発明の物質を含む、Myrcia multiflora DC.の葉から抽出した成分は全て、優れたアルドース還元酵素阻害活性を有することがわかる。また、この表からは、それら生薬から得られた物質は、合成薬剤である比較試料と同等の効果を発揮することもわかる。