(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分を、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル又は１〜４の炭素原子を有する低級アルカノールからなる群より選択された水に混和性の有機溶媒又は有機溶媒と水との混合物によって抽出することにより得られる、パルテニウム・インテグリフォリウムのエキス及び医薬的に許容できる担体を含有する、痛みの緩和、片頭痛又は頭痛の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分と、γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸と、医薬的に許容できる担体とを含有する、痛みの緩和、片頭痛又は頭痛の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項３】
パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分と、ジンギベル・オッフィキナレ又はその部分若しくはそのエキス又はその成分と、医薬的に許容できる担体とを含有する、痛みの緩和、片頭痛又は頭痛の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項４】
痛みの緩和のための医薬を製造するための、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用。
【請求項５】
偏頭痛又は頭痛の治療又は予防のための医薬を製造するための、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、植物であるパルテニウム・インテグリフォリウム(Parthenium integrifolium)、より具体的には、それに由来する医薬組成物、及び痛みの緩和のための医薬若しくは炎症性の又は自己免疫性の疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用に関する。
発明の背景
パルテニウム・インテグリフォリウム（Ｌ．）（キク科、Asteraceae）は一般にミズーリ・スネーク・ルート(Missouri snake root)としても知られているが、北米の森林地帯や草原地帯に野生に生育する。この草は、３０〜１３０ｃｍの高さで、２５ｃｍまでの幅の平たい花部を形成する無数の白い頭状花を持つ。その根は、４ｃｍまでの直径を有する短い円錐形又は球根形の頭茎(headstem)と、その頭茎から突き出た、長く伸び2次的でねじれた枝とを備えている。
多くの化学物質が、パルテニウム・インテグリフォリウム・エキスの主成分として同定されてきた。１つのグループは、テトラノイリンＥ(tetraneurin E)及びテトラノイリンＣ(tetraneurin C)に代表されるセスキテルペンラクトン類である。他のグループは、エキナジオールシンナメート、エポキシエキナジオールシンナメート、エキナキサントールシンナメート及びジヒドロキシナルドールシンナメートに代表されるセスキテルペンエステル類である。更にもう１つのグループは、クェルセタゲチンメチルエーテル類及びそのＯ−グリコシドに代表されるフラボノイド類である。パルテニウム・インテグリフォリウムのその他の特徴的な成分は、ピロメコン酸である。この植物中に存在する他の化学物質は、クマリン酸及び種々のフェノール系グリコシド類である。
ドイツ特許出願公開第３６３８７１５−Ａ１号明細書には、パルテニウム・インテグリフォリウム由来の上記セスキテルペンエステル類が記載されている。該出願の実験部分によれば、それらセスキテルペンエステル類の免疫学的活性試験から、それらがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける顆粒球食細胞活動を３０％まで促進することがわかったとのことである。この効果は、免疫系の非特異的部分（細網内皮食細胞活動系）に関連するプロ炎症作用と考えるべきである。
現在のところ、非ステロイド系抗炎症剤(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)は、炎症及び痛みに伴う症状の治療に最も普通に適用される治療剤である。ＮＳＡＩＤｓは、プロスタグランジン生成酵素シクロオキシゲナーゼ(COX)を阻害することによりその作用を発揮する。ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２と呼ばれるシクロオキシゲナーゼの２種類の生化学的特殊型がある。ＣＯＸ−１は、ほとんどの細胞において構造的に発現し、重要な基礎的生理学的作用（例えば、室に無傷の粘膜を与える）に介在するプロスタグランジンの生成の原因となる。ＣＯＸ−２は普通は存在しないが、或る種の血漿因子、サイトカイン及び成長因子によって誘導されることがあり、多くの炎症の症状に介在する炎症性プロスタグランジン生成の原因となる。ＮＳＡＩＤｓは一般に非選択的であり、そのことは、ＮＳＡＩＤｓがＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の両方を阻害し、ＣＯＸ−２の阻害による抗炎作用及び鎮痛作用並びにＣＯＸ−１の阻害による多くの副作用（そのうち胃潰瘍化は最重要の一つである）を結果することを意味する。
多発性硬化症、クローン病、リューマチ様関節炎、糖尿病のような自己免疫性疾患は、よく知られた症状及び重大な組織破壊に導く免疫系の炎症腕（ＴH１経路）の過活性化を伴う。これらの疾患に対する最も良く確立された治療法は、コルチコステロイド類の管理であり、コルチコステロイド類の効果は異なるタイプの免疫細胞の作用及び増殖を非選択的に阻害することにより発揮される。残念ながら、コルチコステロイド類は多くの重大な副作用（例えば、免疫抑制及びオステオポローシス）を伴う。
発明の要約
私は、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分が以下のような薬理学的作用を発揮することを見出した。すなわち、免疫系のＴH２経路の促進、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０の水準の向上、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の抑制、慢性又は急性の痛みの軽減、及び炎症の軽減である。パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分には、ＮＳＡＩＤｓに比べて、胃腸及び腎臓に対する副作用を伴わないという利点がある。それらは更に、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０の生成を促進することによって、コルチコステロイド類に特徴的な重大な副作用を起こすことなく、免疫系のＴH２経路に対して下方に調節する効果を有する。これらの効果ゆえ、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分は次のような治療用途に利用することができる。
・痛みの緩和
・炎症性又は自己免疫性疾患の治療又は予防
したがって、本願発明は、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分と、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供するものである。
より具体的には、本発明は、免疫系のＴH２経路の促進のための、インターロイキン−４又はインターロイキン−１０の水準の向上のための、およびＣＯＸ−２の選択的な抑制のための医薬を製造するためのパルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用を提供するものである。
このように、本発明によれば、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分を、そのような植物材料又はそのような植物材料を含む医薬組成物を個体に投与することを含む、当該個体の痛みを緩和する方法において使用することができ、そして、本発明は、痛みを緩和するための医薬を製造するためのパルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用を含む。
また、本発明によれば、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分は、そのような植物材料又はそのような植物材料を含む医薬組成物を個体に投与することを含む、当該個体の炎症性又は自己免疫性の疾患の治療又は予防の方法において使用することができ、そして、本発明は、炎症性又は自己免疫性の疾患の治療又は予防のための医薬の調製のためのパルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の使用を含む。
さらに、本発明は、パルテニウム・インテグリフォリウムのエキスを製造する方法であって、この植物又はその部分（好ましくはその根）を有機溶媒又は有機溶媒と水との混合物を含む抽出剤を用いて抽出し、引き続き必要により該抽出剤を除去して利用に適したエキスを得ることを含む、上記方法を提供する。
発明の詳細な説明
驚くべきことに、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分は痛み、炎症及び自己免疫を伴う症状の治療法に関連して薬理学的な作用を発揮することが見出された。
より具体的には、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分は、生命体への投与により以下の薬理効果を提供する。
・免疫系のＴH２経路の促進
・インターロイキン−４及びインターロイキン−１０の水準の向上
・ＣＯＸ−１に影響を与えることなく、ＣＯＸ−２を抑制
・苦痛の軽減
・炎症の軽減
これらの作用は、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の下記の治療上の適用にあたっての理論的根拠の一部を提供する。
・パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分の投与を特徴とする、痛みまたは炎症を伴うあらゆる症状を治療するための方法。出願人は、この抗炎作用及び痛みを緩和する作用は、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０の水準の向上によって、一方で免疫系の炎症を起こす部分（ＴH１経路）が下方に調節され、他方で、ＣＯＸ−２の発現が抑制され、炎症性のプロスタグランジンが低い水準に導かれるためであるとの仮説をたてている。この作用のメカニズムは、通常の非ステロイドの抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）と比べて、ＣＯＸ−１が妨害されず、それにより胃潰瘍形成及び腎臓への副作用が避けられるという利点を有している。予備的臨床観察において、背部低部の変形性関節症による痛み及び炎症に悩む患者を、実施例１に記載のパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスを１日あたり２５０ｍｇ用いて治療したところ、顕著な改善が見られた。当該患者は、１日２回当該エキスを堅いゼラチンカプセルにいれて経口投与量１２５ｍｇで投与された。痛み全体の除去及び痛めた関節の可能性の増加を含む症状の改善は、治療第２日に明らかになり、３週間の治療の期間中ずっと持続した。治療を止めたところ、２日後に痛みが再発した。この臨床的改善は、上記したパルテニウム・インテグリフォリウムの効果によるものである。実施例４に記載した臨床的なパイロットスタディでは、偏頭痛を患う患者（ｎ＝１６）にパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスを毎日投与した。スタディスケジュールは４週間の４つの期間からなっていた。最初の期間はベースラインの役割をするものであり、治療は施されなかった。第２の期間では、一日の投与量２００ｍｇのパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスが投与された。第３の期間では、一日の投与量１００ｍｇのパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスが投与された。第４の期間では、一日の投与量２００ｍｇのパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスが投与された。これらの４つの期間の間、偏頭痛の発生率をすべて記録した。ベースラインの期間と比べて、全ての治療期間において偏頭痛の発生率は低減した。最後の治療期間において、偏頭痛の発生率は５７％減少し、これは統計的に有意である（ｐ＜０．０５；  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）。観察された臨床上の改善は、上記したパルテニウム・インテグリフォリウムの効果に帰するものである。
・パルテニウム・インテグリフォリム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分を投与することを特徴とする炎症性疾患や自己免疫性疾患の治療法。出願人は次のような仮説を立てている。すなわち、この治療作用は、炎症性疾患や自己免疫性疾患の発現に重要な役割を演じている免疫系のTH1経路を下方に調節するインターロイキン−４及びインターロイキン−１０の水準が増大することによる。さらに、インターロイキン−４とインターロイキン−１０は、炎症性プロスタグランヂンの生成を減少させ、急性の炎症の症状を軽減するＣＯＸ−２の発現を下方に調節する。この治療作用は全ての知られている自己免疫性疾患又は炎症性疾患に関連する可能性もあり、以下の例はこの治療作用に関して限定的なものではない。すなわち、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、一次硬化性胆管炎、自己免疫溶血性貧血、グレーブス病、重症筋無力症、１型真性糖尿病、炎症性筋障害、多発硬化症、橋本病、自己免疫副腎炎、クローン病、潰瘍性大腸病、糸球体炎、進行性全身性硬化症(強皮症)、シューグレン病、紅斑性エリテマトーデス、一次脈管炎、リューマチ性関節炎、若年性関節炎、混合結合織疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、天痘瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎等。
本発明の好ましい態様は、パルテニウム・インテグリフォリウムのエキスである。本発明のエキスは、例えば、新鮮なまたは乾燥したパルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分（好ましくは根）を抽出、若しくは水蒸気蒸留又は真空蒸留を行うことにより得ることができる。抽出は、多くの異なる有機溶媒（好ましくは水に混和性の溶媒）及び有機溶媒と水との混合物を使って行ってもよい。その抽出は、任意の抽出技術、例えば細断、パーコレーションあるいは超臨界抽出を利用して熱時または冷時に行うことができる。
好ましい抽出溶媒は、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、１〜４の炭素原子を有する低級アルカノール及びそれらの水との混合物である。好ましい抽出温度は、抽出効率ゆえ使用する溶媒の沸点近辺であるが、更に低い温度でもよく、その分長時間の抽出が必要になる。
適用する溶媒の組成を変えることによって、パルテニウム・インテグリフォリウムのある種の成分についての抽出を一層選択的にすることができ、最終エキス中のそれらの含量を増減することができる。例えば、フェノール性グリコシドの含量はより親水性の溶媒を使うことによって増すことが出来、一方セスキテルペン類の含量はより親油性溶媒を使うことによって向上することができる。
主たる抽出工程の後、液―液抽出、カラムクロマトグラフィ、水蒸気蒸留又は真空蒸留のような第二の加工工程を使って、任意の抽出成分を除去又は濃縮し、できれば単離することもできる。これにより、パルテニウム・インテグリフォリウムの任意の成分、例えばピロメコン酸、テトラノイリンＥおよびテトラノイリンＣのようなセスキテルペンラクトン類、エキナジオールシンナメート、エポキシエキナジオールシンナメート、エキナキサントールシンナメート及びジヒドロキシナルドールシンナメートのようなセスキテルペンエステル類、クェルセタゲチンメチルエーテルおよびそのO-グリコシドのようなフラボノイド様、クマリン又は各種フェノール性グリコシドを最終抽出物中において除去又は濃縮することが出来る。このように、パルテニウム・インテグリフォリウムの任意の成分の含量を、医薬組成物を製造することを目的とする最終エキス中において標準化することができる。
本発明によれば、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分は、他の活性成分あるいは植物エキスと併用して治療作用を強化することができる。したがって、我々は、炎症性疾患あるいは自己免疫性疾患を治療するために、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分を、魚油由来のエイコサペンタエン酸あるいはγ―リノレン酸と併用することを提案するものである。我々は、これと平行して、痛みや炎症の治療のために、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分をジンゲベル・オッフィキナレ(Zingeber officinale)又はその部分若しくはそのエキス又はその成分と併用することを提案するものである。
更に、本発明の医薬を製造するための使用において、パルテニウム・インテグリフォリウム又はその部分若しくはそのエキス又はその成分を、界面活性剤、溶媒、増粘剤、安定剤、保存料、抗酸化剤、フレーバ等の添加剤と混合して、所望の製剤を得ることもできる。同様に、本発明に係る医薬組成物は、上記のような添加剤を更に含有してもよい。製剤の投与形態に制限はないが、錠剤、ゼラチンカプセル、液剤又は顆粒剤が考えられる。所望により、消化液中における組成物の分散性を改善して生物利用性を向上させたり、最終剤型の組成物を得るため、界面活性剤（例えば、胆汁塩又はポリオキシエチレン−ソルビタン脂肪酸エステル）を含めてもよい。
例
例１
本発明のパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスを次のように調製した。
パルテニウム・インテグリフォリウムの乾燥根１００ｇを、煮沸９０％エタノール１５００ｍｌで４時間抽出した。次いで、その抽出物を濾過し、真空下で蒸発させ乾燥した。このようにして、錠剤又は硬質ゼラチンカプセルの製造に適したこはく色の結晶抽出物２２ｇを得た。
例２
本発明のパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスを次のように調製した。
パルテニウム・インテグリフォリウムの乾燥根１００ｇを、沸騰した９６％エタノール１５００ｍｌで５時間抽出した。次いで、その抽出物を濾過し、真空下で蒸発させ乾燥した。このようにして、こはく色の結晶抽出物１５ｇを得た。このパルテニウム・インテグリフォリウム抽出物は、８０％エタノール３０ｍｌで希釈し、次いで、これに１５ｇのアセチル化モノグリセリド及び５ｇのポリオキシエチレン−ソルビタンモノオレエート（トウィーン(Tween)８０）を添加した。このようにして、軟質ゼラチンカプセルの製造に適した液体抽出物を得た。
例３
材料と方法
マウス
５〜６週齢のＢＡＬＧ／ｃマウスを複数、デンマークのＧｌ．ボンホルトガード(Bomholtgaad)，Ｒｙから入手した。特にことわらないかぎり、これらのマウスに、標準固形飼料及び水を随時与えた。
試験化合物（パルテニウム・インテグリフォリウム・エキス）
本発明のパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスを次のように調製した。
パルテニウム・インテグリフォリウムの乾燥根１００ｇを、沸騰した８０％エタノール１５００ｍｌで３時間抽出した。次いで、その抽出物を濾過し、真空下で蒸発させ乾燥した。このようにして、こはく色の結晶抽出物２４ｇを得た。このパルテニウム・インテグリフォリウム・エキスは、この例では以後、「ＰＩ」と省略する。
給餌方式
通常の粉砕済みマウス用固形飼料及び水を随時マウスに与えた。粉砕済みマウス用固形飼料は、ＰＩ又はプラセボに曝した。即ち、ＰＩのエタノール溶液を調製し、粉砕済み標準マウス用固形飼料と混合した。乾燥後のＰＩ含有量はマウス用固形飼料１ｋｇあたり６ｍｇであった。一匹のマウスは、一日あたり５ｇの標準マウス用固形飼料を消費すると試算され、その結果、一日あたりのＰＩ摂取量は０．３０ｍｇとなり、これは一匹あたり平均体重３０ｇのマウスに対しては一日あたりの投与量１０ｍｇ／ｋｇに相当する。対照食餌は、上述の手順において、ＰＩのエタノール溶液を純エタノールに置き換えることによって調製した。
試薬
ヒツジ赤血球(sheep red blood cells，SRBC)は、デンマーク、コペンハーゲンのスタテンス・セルムインスチチュート(Statens Seruminstitut)から入手した。エリザ・アッセイ(Elisa assay)用抗体は、米国、カルフォルニア、サンジエゴのファーミンゲン(Pharmingen)から入手した（下記参照）。ＳＲＢＣは、使用前に生理的食塩水で３回洗浄した。
ＳＲＢＣペスト形成細胞(SRBC plague forming cells，SRBC-PFC)
生理的食塩水中の１０％ＳＲＢＣを０．２ｍｌ静脈注射した後４日目に、マウスを犠牲にし、それらの脾臓を取り出し、その器官を金属網に穏やかに押し付けて通過させることによって均質化した。当該細胞を計数し、ＳＲＢＣ及びウサギ補体と混合し、次いで、その細胞混合物を、ＳＲＢＣ−ＰＦＣを定量すべく反応室（カニンガム(Cunningham)及びシュツェンベルグ(Stzenberg)）に移した。４つの各々のアッセイ室は、スプレノサイト(splenocyte)の調製を通して計数した。ＰＦＣの数は、スプレノサイト１０6個当りの数として計数した。
抗−ＳＲＢＣ抗体力価
マウスの腹膜組織内に、生理的食塩水中の１０％ＳＲＢＣの容積０．５ｍｌを注射した。１００ｍｌの血液を、免疫後第３日、第６日及び第９日に眼窩静脈叢(retroorbital venous plexus)から収集し、ヘパリン２単位を含有する食塩水２００ｍｌの入ったバイアル(vial)へ移した。血漿（５０％希釈物）を遠心分離によって回収し、一連の希釈を丸底マイクロ力価プレート（ヌンク(Nunc)、ロスキルデ(Roskilde)、デンマーク）中で行った。ＳＲＢＣ０．１％及び新たに希釈したばかりのウサギ補体（グラプコ(Glapco)、ジランド(Jylland)、デンマーク）を添加したプレートを３７℃で２時間インキュベートした。各々血漿試料の溶血素力価は、添加したＳＲＢＣの全溶解(total lysis)を与える最高血漿希釈として目測で読んだ。
混合リンパ球培養（ＭＬＣ）
５個の脾臓のプールから得た脾臓細胞を、２５ｍｌのＴフラスコ中で１０ｍｌ（２×１０6）／ｍｌの容積で培養し、照射されたＣ５７ＢＬ６スプレノサイト（１０6／ｍｌ）で刺激した。１ｍｌの培養上澄み液を、サイトカイン(cytokine)測定のため、培養第３日及び第４日で除去した。
ＭＬＣ応答細胞により分泌されたサイトカイン
ファーミンゲンからの試薬：ＩＬ−２スタンダード１９２１ＩＵ、ＩＬ−４スタンダード１９２３ＩＷ及びＩＬ−１０スタンダード１２２８ＩＶを使用して、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のエリザ・アッセイを準備した。抗体：anti-ＩＬ−２  １８１６１Ｄ、anti-ＩＬ４  １８０３１Ｄ及びanti-ＩＬ−１０  １８１４ＩＤ（捕集Abs）、anti-ＩＬ−２  １８１７２Ｄ、anti-ＩＬ−４  １８０４２Ｄ及びanti-ＩＬ−１０  １８１５２Ｄ（ビオチル化検出Abs）。投与量−反応サイトカイン標準曲線ができた。ＭＬＣ応答細胞により培養第３日及び第４日に分泌された３種の異なるサイトカインを、ＭＬＣ培養上澄み液を反復して希釈することにより測定した。標準サイトカイン曲線の直線部分を、個々のサイトカインの量を測定するのに使用した。
統計量
ＰＩ及びプラシーボを与えたマウスにおけるanti-ＳＲＢＣ抗体力価及びＳＲＢＣ−ＰＦＣ数をそれぞれ比較するために、対相違のウィルコクソン順位和検定(Wilcoxon rank sum test)及びフィシャー正確性試験(Fischers exact test)を使用した。
結果
ＰＩ及びプラシーボを与えた動物は、いずれも破砕済みマウス用固形飼料によくなじみ、どの実験用マウス又はプラシーボ処理したマウスについても何らの重量減少も記録されなかった。
ＳＲＢＣ−ＰＦＣ
２１匹のマウスの２つのグループの１０6スプレノサイト当たりの個々のＳＲＢＣ−ＰＦＣ数を、別々の３実験から誘導した。マウスに連続して１０日間ＰＩまたはプラシーボを与え、第６日にＳＲＢＣで免疫し、給餌第１０日目に殺した。２つのグループの１０6スプレノサイト当たりの平均のＳＲＢＣ−ＰＦＣ数は、それぞれ、４００及び２２０であった。しかし、これらの値は統計的に差異があるものではなかった（ｐ＞０．０５、ウィルコクソン）。しかし、マウスの２つのグループ間に若干の差異を見出した。すなわち、ＰＩを与えたグループの２１匹のマウスのうちの６匹とプラシーボグループの２１匹のうちのただ１匹とが、１０6スプレノサイト当たり５００より大きいＰＦＣを生じ、この２つのグループ間での相違は有意であった（ｐ＜０．０２、フィッシャー正確性試験）。その上、各２つのグループにおいて最も高いＳＲＢＣ−ＰＦＣ数を生じた１０匹のマウスを比較すると、これらの２つの高い反応「サブグループ」間での相違は有意であった（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン）。
anti-ＳＲＢＣヘモリシン(hemolysins)
上記のＳＲＢＣ−ＰＦＣ研究の結果から、我々は、それぞれＰＩ又はプラシーボを１４日間与えた個々のマウスからanti-ＳＲＢＣ抗体力価の水準を調べることを促された。表１はその結果を示す。ＰＩを与えたマウスのグループは、免疫後第６日において、プラシーボを与えたマウスのグループより有意に高い（ｐ＜０．００５）anti-ＳＲＢＣ力価の値を示した。
0004346685.tif 000002
サイトカイン
上述のＭＬＣ培養からの上澄み液を、培養第３日及び第4日におけるサイトカイン濃度について分析した。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のそれぞれの量は、ＭＬＣ上澄み液中において敏感なエリザ(ELISA)技術により測定した。表２に示すように、培養第３日において、ＰＩを与えたマウスからのＭＬＣ上澄み液は、ＩＬ−２及びＩＬ−１０を２倍、ＩＬ−４を７倍含有していた。培養第４日においては、ＰＩを与えたマウスからの培養上澄み液は、プラシーボを与えた動物のＭＬＣ上澄み液に比べて、ＩＬ−１０を３倍、ＩＬ−４を２倍含有していた。
0004346685.tif 000003
５つの脾臓のプールからのＭＬＣ応答固体細胞によって産出された培養上澄み液１ｍｌあたりのサイトカインの量、数値は２回繰り返したサイトカイン測定の平均を示す。
例４
研究目的
本発明に従い、パルテニウム・インテグリフォリウムのエキスを以下の様に調製した。
１０００ｇのパルテニウム・インテグリフォリウム乾燥根を１００００ｍｌの煮沸９０％エタノールで４時間抽出した。その後、抽出物を濾過し、真空下で蒸発、乾燥させ、２１６ｇのこはく色の結晶抽出物を得た。この抽出物５０ｇを含む錠剤を調製した。
研究概略
背景
本研究の目的は、開放(open)臨床試験における偏頭痛に対するパルテニウム・インテグリフォリウムのエキスの予防効果を評価することであった。
方法
ここ最近６か月間に毎月少なくとも４回偏頭痛が発生したという病歴を有する１６人の偏頭痛患者を、この研究に含めた。
研究スケジュールは、４週間の４つの期間から構成された。最初の期間はベースラインの役割をするものであり、何の治療も行わなかった。第２の期間においては毎日４錠の投薬を行った。第３の期間においては毎月２錠の投薬を行った。第４の期間においては毎日４錠の投薬を行った。４つの期間中、偏頭痛の発生をすべて記録した。
統計量
３つの治療期間それぞれにおける偏頭痛の発生をベースライン期間の偏頭痛発生と比較するために、対相違のためのウィルコクソン順位和検定(Wilcoxon rank sum test)を用いた。
結果
第１期間（ベースライン）における偏頭痛の平均発生は５．７５であった。このベースラインと比較して、第２期間における偏頭痛の平均発生は３０％低く、第３期間では４３％低く、第４期間では５７％低かった。第４期間ではベースラインと有意に相違していた（ｐ＜０．０５；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）。
考察
この研究において、検定を行ったパルテニウム・インテグリフォリウムの抽出物は、偏頭痛の予防において効能の高い薬であると結論付けられた。