(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000033
（式中、ｍは１〜１０であり；
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は同一または異なり、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル基、ヒドロキシル化アルケニル基、ヒドロキシル化アルキニル基、エーテル含有アルキル基、エーテル含有アルケニル基、エーテル含有アルキニル基、トリフルオロメチル部分を含むアルキル基、またはトリフルオロメチル基であり（但し、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のうち二つがともに水素、ともにアルキル基、またはともにアルケニルである場合、他のものはトリフルオロメチル部分を含むアルキル基またはトリフルオロメチル基であり、またはＲ1、Ｒ2、およびＲ3のうち一つが水素であり、もう一つがアルキル基またはアルケニル基である場合、第三のものはトリフルオロメチル部分を含むアルキル基またはトリフルオロメチル基である）；
Ｒ4はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；
Ｒ5はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は対イオンである。）
【請求項２】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000034
（式中、ｎは１〜１０であり；
Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル基、ヒドロキシル化アルケニル基、またはヒドロキシル化アルキニル基であり；
Ｒ4およびＲ5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は陰イオンである。）
【請求項３】
ｎは１であり、Ｒ3はメチル基であり、かつＲ4およびＲ5が−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3または−（ＣＨ2）12ＣＨ3である請求項２記載の化合物。
【請求項４】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000035
（式中、ｎは１〜１０であり；
Ｒ3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル基、ヒドロキシル化アルケニル基もしくはヒドロキシル化アルキニル基であり；
Ｒ4およびＲ5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；
Ｒ6は１〜１０個の炭素のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり；
Ｒ7は１〜１０個の炭素のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり；かつＸ-は陰イオンである。）。
【請求項５】
ｎは１であり、かつＲ3、Ｒ6、およびＲ7はアルキル基である請求項４記載の化合物。
【請求項６】
ｎは１であり、Ｒ3、Ｒ6、およびＲ7はアルキル基であり、かつＲ4およびＲ5は各々がアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基である請求項４記載の化合物。
【請求項７】
ｎは１であり、Ｒ3、Ｒ6、およびＲ7はメチル基であり、かつＲ4およびＲ5は各々がアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基である請求項４記載の化合物。
【請求項８】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000036
（式中、ａ、ｂ、およびｄは同一または異なって、０〜１０であり；
Ｒ4およびＲ5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；
Ｒ8、Ｒ9、またはＲ10は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、トリフルオロメチル部分を含むアルキル基、またはトリフルオロメチル基であって、これらの３つのうちの少なくとも１つがトリフルオロメチル基であり；かつＸ-は陰イオンである。）。
【請求項９】
ａ、ｂ、およびｄは０〜１であり、かつＲ8はトリフルオロメチル基である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
ａ、ｂ、およびｄは０〜１であり、Ｒ8はトリフルオロメチル基であり、かつＲ9およびＲ10はメチル基である請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
ａは１であり、ｂおよびｄは０であり、Ｒ8はトリフルオロメチル基であり、かつＲ9およびＲ10はメチル基である請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000037
（式中、ａは０〜１０であり；
Ｒ4およびＲ5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；
Ｒ8はトリフルオロメチル基であり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、トリフルオロメチル部分を含むアルキル基、またはトリフルオロメチル基であり；かつＸ-は陰イオンである。）。
【請求項１３】
ａ＝１であり、Ｒ8はトリフルオロメチル基であり、Ｒ11およびＲ12はメチル基であり、かつＲ4およびＲ5は各々がアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基である請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000038
（式中、Ｒ基が−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3または−（ＣＨ2）12ＣＨ3である。）
【請求項１５】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000039
（式中、Ｒ基が−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3または−（ＣＨ2）12ＣＨ3である。）
【請求項１６】
下記構造式で表される化合物。
0004346111.tif 000040
（式中、Ｒ基が−ＣＨ2（ＣＨ2）6ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3または−（ＣＨ2）12ＣＨ3である。）
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物を含有する、トランスフェクション用組成物であって、ポリヌクレオチドをさらに含有すること、及び前記化合物における前記対イオンがオキシアニオンビスルフェート、トリフルオロメタンスルホネート、ヨウ化物または臭化物からなる群から選択されることを特徴とする、該組成物。
【請求項１８】
請求項１７記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）前記化合物を前記ポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｂ）前記化合物とポリヌクレオチドとの混合物を音波処理して前記組成物を製造する工程
を含む、該方法。
【請求項１９】
前記化合物が下記構造式で表される、請求項１８記載の製造方法。
0004346111.tif 000041
（式中、ａ、ｂ、およびｄは同一または異なって、０〜１０であり；
Ｒ4およびＲ5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；
Ｒ8、Ｒ9、またはＲ10は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、トリフルオロメチル部分を含むアルキル基、またはトリフルオロメチル基であって、これら３つのうち少なくとも１つがトリフルオロメチル基であり；かつＸ-はアニオンである。）
【請求項２０】
請求項１７記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）前記化合物を脂質と組合せる工程；
ｂ）前記化合物と脂質との組合せを前記ポリヌクレオチドと混合する工程；及び
ｃ）前記ポリヌクレオチドと化合物と脂質との混合物を音波処理する工程
を含む、該方法。
【請求項２１】
前記化合物と脂質との組合せにおける化合物：脂質の比率が９：１〜１：２である請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
前記脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
前記脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミンであり、かつ前記化合物：脂質の比率が１：１である請求項２１記載の製造方法。
【請求項２４】
前記音波処理が３０秒〜２分で行われる請求項２０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
サイトフェクチン（cytofectin）集団（サイトフェクチンは陽イオントランスフェクション両親和物である化学種と定義される）、またはポリヌクレオチド、ポリペプチド、医薬物質および他の生物活性種に結合して膜障壁を通過させて運ぶ陽イオン脂質集団を提供する。特に、選択された分子種と複合体を作り、これらの選択種の、膜およびそれに相応する境界構造物中への移送およびそれらを通過しての移送を促進する陽イオン脂質を開示する。
さらに、ポリヌクレオチドに結合し、膜障壁を経てそれらを運ぶサイトフェクチンまたは陽イオン脂質集団から、活性サイトフェクチン：ポリヌクレオチドトランスフェリン複合体を製造するための配合物および方法を開示する。特に、トランスフェクションを向上させるサイトフェクチンにおける構造的特徴を選択し、トランスフェクションを向上させるサイトフェクチンの対イオンを選択し、かつトランスフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を形成する加熱／音波処理条件を最大限にする。
２．背景技術の説明
遺伝子治療および類似する目標のための細胞トランスフェクション法が設計され実施されているが、これらの方法の多くは組換えウイルスベクターを伴い、かつ多様な問題がこれらのウイルス遺伝子伝達系に存在する。ほとんどの人がベクターとして選択されてきたものを含むアデノウイルス血清群の多くに対する抗体を有しているため、一般的に有利なアデノウイルス技術でさえも困難に直面している。アデノウイルスベクターで処置された患者の野生型アデノウイルス重複感染は、（稀な血清群を有するように選択された場合）意図しない多くの個体に感染する能力を有する欠陥ウイルス粒子として組換えベクターの増殖をもたらすこともある。アデノウイルス汚染の機会はかなり低いが、有り得ないわけではない。これらの遺伝材料をヒトに用いる安全性は依然として不明であり、よって危険である。
人の健康を向上させるための遺伝子伝達に基づく研究の潜在性は、その向上方法が細胞および組織に外来性遺伝材料をインビボ移送することについて開発されていない場合、不幸にも限定されよう。最近用いられているウイルスおよび非ウイルストランスフェクション剤は、１）伴う健康上の危険、２）免疫学的合併症、３）インビボトランスフェクションの不十分な効率、および４）直接の細胞毒性に関する一つ以上の問題により不十分とされてきた。安全で効果的なポリヌクレオチドに基づく医薬の開発はこれらの問題に取り組む改良溶液を必要とするだろう。したがって、トランスフェクションまたは遺伝子治療のための安全な非ウイルスベクター法が必須である。
現在、陽イオン両性親和物はインビボにおけるポリヌクレオチド移送のためのウイルスベクター技術に代わるものとみなされている。陽イオン脂質系試薬によりウイルスベクターに関連する多くの健康および免疫学的な懸念が避られる。実用的な意味で、陽イオン両性親和物系移送剤は、使用するのに比較的簡単であり、移送することのできる材料の性質において無類の柔軟性を提供する。典型的には、陽イオン脂質複合体は、ウイルス由来の移送剤を作るために典型的に必要とされる面倒な組換えDNAおよび細胞培養操作とは対照的に、活性粒子を作るために、陽イオン脂質（サイトフェクチン）を所望のDNA（1）、RNA（2）、アンチセンスオリゴマー（3）、またはタンパク質（4）と混合することにより調製される。
膜境界を経てDNA、タンパク質、およびその他の化学的材料を移送するそのような脂質移送システムがわずかに研究グループおよび企業により合成されている。合成スキームのほとんどが比較的複雑であり、制限されたトランスフェクション能のみを有する脂質系移送システムを作っている。生高分子輸送効率が高い陽イオン脂質種の必要性が遺伝子治療の分野に存在する。非常に制限された数のある種の第四アンモニウム誘導化（陽イオン）リポソームがDNAと自発的に会合し、細胞膜と融合し、そしてDNAを細胞質に移送することがここのところ知られている（既に注意したように、これらの種は「サイトフェクチン」と呼ばれている）。リポフェクチン（商標）は陽イオンリポソーム配合開発の第一の生成を表している。リポフェクチン（商標）は、化合物DOTMAを含む第四アンモニウムとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの、音波処理により水中で単層小球とした１：１配合物からなる。リポフェクチン（商標）に関連する問題としては非代謝性のエーテル結合、プロテインキナーゼＣ活性の阻害、および直接細胞毒性がある。これらの問題に対して、多くの他の関連化合物が開発されてきている。本発明のモノアンモニウム化合物は既存の陽イオンリポソームの能力に対して改善され、生物活性薬品のための非常に効率的な移送システムとして役立つ。
等量のサイトフェクチンDOTMA（N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩化物）と中性脂質DOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）とからなるリポソームはDNAと自発的に会合して効率的なトランスフェクチン複合体を形成するとの最初の報告（本開示で挙げられるすべての文献と同じように文献の援用により本明細書に含まれるFelgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M. and Danielsen, M. 1987.リポフェクチン：高く効率的な脂質仲介DNAトランスフェクション法。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84（21）: 7413-7）以来、その技術は徐々に向上している。原形剤DOTMAのインビボ活性に対して改善された開発サイトフェクチンはほとんど存在していない。この進歩の欠如は、サイトフェクチン仲介遺伝子移送を果たす原理に着目した研究よりも、むしろ陽イオン脂質技術の生物学的問題への適用に着目した基金が出された優先事項を反映するものだろう。具体的には、サイトフェクチン作用が伴う機構、サイトフェクチン仲介インビボ遺伝子移送に対する障壁、およびサイトフェクチン構造／活性の関係の明確化に着目した研究は、向上した陽イオン脂質系移送剤の発展を促進するだろう。陽イオン両性親和物仲介遺伝子移送に関与する機構の研究が多くの実験室で進行しているが（Sternberg, B., Sorgi, F. L. and Huang, L. 1994.凍結破砕電子顕微鏡により可視化されたDNAと陽イオンリポソームとの複合体形成における新しい構造。FEBS. Lett. 356（2-3）: 361-6, Wrobel, I. and Collins, D. 1995.陽イオンリポソームの哺乳類細胞との融合はエンドシトーシス後に生じる。Biochim. Biophys. Acta 1235（2）: 296-304,及びZabner, J., Fasbender, A. J., Moninger, T., Poellinger, K. A. and Welsh, M. J. 1995.陽イオン脂質による遺伝子移送に対する細胞および分子障壁。J. Biol. Chem. 270（32）: 18997-9007）、サイトフェクチン作用の機構の最も基本的な特徴（直接的な細胞質膜融合とエンドシトーシスの相対的寄与）でさえ未解決のままである。
最近、いくつかの陽イオン両性親和調製物が市販されており、新しい類似物が発表された。しかし、これらの薬剤は既存の化合物と比較されることなくしばしば報告されているために、ポリヌクレオチド翻訳に対する構造的部分の関連性に関する洞察を得ることは困難である。この困難性は、１）最初の報告で利用されたトランスフェクトされた細胞の種類、２）トランスフェクションを特性付けるために用いられたリポーター遺伝子、３）生物学的応答（典型的にはリポータータンパク質の発現）を報告する方法、および４）特定の発現ベクターの設計における多様性により悪化している。さらに、代用となる配合方法の効果を記載する報告はほとんど存在しない。逆説的に、そのような基本的情報が相対的に欠如しているのは、サイトフェクチン仲介遺伝子移送技術の著しい向上がさらに系統的な研究により達成されることを暗示している。
既に示されたように、様々な陽イオン脂質が以前の文献で合成されている。特許の範囲において、例えば、米国特許第4,812,449号は、影響を受けたくはない環境よりはむしろ標的領域における生物活性剤のin situ活性化合物の集合物を開示する。いくつかの荷電および非荷電アミン誘導体を記載している。
米国特許第5,171,678号にはリポポリアミンおよび真核細胞にトランスフェクトするためのそれらの使用が提示されている。ポリヌクレオチドを対象のリポポリアミンと混合し、処理すべき細胞と接触させる。
米国特許第5,186,923号および同第5,277,897号は、膜内電位の低減による親油性陽イオン有機金属化合物の細胞蓄積の促進に関する。テクネチウム含有化合物を開示している。
親油性陽イオン化合物が米国特許第5,208,036号で紹介されている。非対称アミン化合物を合成し、DNAトランスフェクション法に用いられている。アミン類は、本発明とは異なり、２つの水素またはアルキル、アリール、アラルキル、キヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリン基により四級化される。
米国特許第5,264,618号は生物活性分子の細胞内移送用の陽イオン脂質を開示する。陽イオン脂質を含む非対称アンモニウムが、分子を膜封入系に輸送するために紹介されている。アミン類は本発明とは異なり二つの水素またはアルキル基により四級化される。
中性脂質および陽イオン脂質による動物細胞への核酸のトランスフェクションが米国特許第5,279,833号で明らかにされている。核酸トランスフェクション活性を有するリポソームは中性脂質およびアンモニウム塩を含む陽イオン脂質から形成される。
米国特許第5,334,761号は、他のアミンを含む陽イオン脂質を記載する。陽イオン脂質を用いて、高分子および他の化合物の細胞への移送のための凝集体を形成する。これらのアミン類は、本発明とは異なり、二つの水素または非分鎖アルキル基により四級化される。
PCT/US94/13362のPCT公開公報に、ヘテロ環式ジアミンが開示されている。脂質尾部を有する対称第四ジアミンがリポソームを形成するために述べられている。
上記の特許と公開は出願人が気付いた最新技術を反映するものであり、本出願の審査に関して関連性のあると思われる情報を開示する際に出願人の認知した公正さの義務を果たす見解から述べられたものである。しかし、これらの特許のいずれも、単独または組み合わせて考慮した場合に出願人の請求する発明を教示または自明とするものではないと思われる。
発明の要約
本発明の目的は、膜構造物を経て生物活性化合物が移送されるのを大きく助けるアミン類の範疇から形成される脂質：ポリヌクレオチド複合体を製造する化合物、配合物、対イオンおよび条件を開示するものである。
本発明の他の目的は、選択された高分子およびその他の物質の膜障壁への輸送またはそれを通る輸送を助ける陽イオンアミン化合物群から形成された脂質：ポリヌクレオチド複合体を作る配合物、対イオン、および条件を提示するものである。
本発明のさらに別の目的は、構造式：
0004346111.tif 000002
（式中、ｍ＝１〜10；R1、R2、およびR3は同一または異なり、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニル基、エーテル含有アルキル、エーテル含有アルケニルもしくはエーテル含有アルキニル基、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；R4はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R5はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は選択された高分子および他の物質の膜障壁中またはそれを経る輸送を助ける陰イオンである。）または
0004346111.tif 000003
（式中、ａ、ｂ、またはｄは同一または異なり、０〜10であり、通常は０〜３であり、好ましくは０または１であり；R4およびR5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であるか、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8、R9、またはR10は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニル、アルキニル基であるか、または一つがハロゲンを含有する場合、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-は選択された高分子および他の物質の膜障壁中またはそれを経る移送を助ける陰イオンである。）を有する生物活性分子トランスポーター集団から形成されたサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を得る化合物、配合物、対イオン、および条件を述べることである。
本発明のさらにもう一つの目的は、トランスフェクション効率が、音波処理エネルギーの適用と周囲温度の関数となる複合体の有効サイズにより影響されるサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を得る化合物、配合物、対イオン、および条件を記載することである。
本発明のさらに別の目的はトランスフェクション効率に影響を与えるサイトフェクチンの構造的性質およびその対イオンを開示することである。
ポリヌクレオチドの膜障壁または境界中への移送およびそれを越える移送を助ける陽イオントランスポーター分子からのトランスフェクション活性のあるサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を作るための新規な配合物、対イオン、および加熱／音波処理条件を開示する。ポリヌクレオチド、ポリペプチド等の化合物の膜壁中またはそれを越える移送を助けるモノアミン陽イオントランスポーター分子（および一つのジアミン誘導体）を提示する。また、ポリヌクレオチド；少なくとも一つの第四アミンであって、それが結合した炭素鎖に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカノイル、アルケノイルもしくはアルキノイル基、及び少なくとも二つのアミンを結合したヒドロキシル化エーテル含有アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基、または少なくとも二つのアミンを結合したヒドロキシル化アシルオキシ含有アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基からなる群から選択される同一または異なる少なくとも一対のリポイル部分が結合しているか、又はハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基からなる群から選択される少なくとも一つのハロゲン含有部分と、少なくとも一つがヒドロキシル化したエーテルを含むアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基、または少なくとも一つがヒドロキシル化したアシルオキシを含むアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基との混合物からなる群から選択される少なくとも一つのアミンを結合したハロゲン含有部分が結合している少なくとも一つの第四アミン；および第四アミンの対イオンからなるサイトフェクチン：ポリヌクレオチドが述べられる。
特に、本化合物は次の構造を有する。
0004346111.tif 000004
式中、ｍ＝１〜10；R1、R2、およびR3は同一または異なり、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニル基、エーテル含有アルキル、エーテル含有アルケニルもしくはエーテル含有アルキニル基、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；R4はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R5はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は対イオンである。通常、ｍは１であり；R1、R2、およびR3はアルキル基であり、かつR4とR5はアルキル含有アシル基であり、さらに一般的にはｍ＝１であり；R1とR3はメチルまたはそれと同等な基であり；R2はエチルまたはそれと同等な基であり；R4とR5は−CO（CH2）12CH3またはそれと同等な基である。または
0004346111.tif 000005
式中、ａ、ｂ、またはｄは同一または異なり、０〜10であり、通常は０〜３であり、好ましくは０または１であり；R4およびR5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル基含有アシル基であり；R8、R9、またはR10は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニル、アルキニル基であるか、または一つがハロゲンを含有する場合、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-は対イオンである。
主題のサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体は、ポリヌクレオチド、四級化アミンを含むサイトフェクチン、および対イオンの混合物を所定の温度で選択された時間音波処理することにより製造する。通常、音波処理のために選択される時間は約30秒から約２分であり、所定の温度はサイトフェクチン内のリポイル部分の相転移温度以上であって約40℃〜約70℃であり、さらに一般的には約50℃〜約60℃であり、より好ましくは約56℃である。
トランスフェクションを向上させる対イオンはビスルフェート、トリフルオロメタンスルホネート、およびハロゲン化物であり、特にヨウ化物であり、それよりも低い程度では臭化物である。
トランスフェクション活性のあるサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を生成するのに好ましい反応条件は、高温および複合体の形成の際に音波処理を使用することが含まれる。
本発明の他の目的、利点、および新規な特徴は、添付図面と共に考慮すれば以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１はNIH 3T3細胞を用いるサイトフェクチン仲介DNAトランスフェクションの比較を示す。
図２はBalb-Cマウスにおけるサイトフェクチン仲介DNAトランスフェクションのインビボ比較を示す。
図３は多様なアミンサイトフェクチンに関するトランスフェクションのインビボデータを示す。
図４はサイトフェクチン構造領域の同定を示す。
図５は極性領域分析のための実験計画を示す。
図６はNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン極性領域構造の比較を示す。
図７はマウスへの二つの異なる疎水性側鎖の気管内注入に関してインビボでのトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン極性領域構造の比較を示す。
図８はNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチンの対イオンの比較を示す。
図９はBalb-Cの肺におけるインビボトランスフェクション活性に対するサイトフェクチンの対イオンの比較を示す。
図10はNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン疎水構造の比較を示す。
図11はヒト気管支上皮細胞（16HBE14o-）におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン疎水構造の比較を示す。
図12はネズミ肺におけるルシフェラーゼ発現に対する配合条件の効果を示す。
好適な実施態様の説明
陽イオン両性親和物（サイトフェクチン）は培養細胞のトランスフェクションに広く用いられており、遺伝子医薬の開発に有用となるだろう。生理化学的構造／生物学的機能の関連性の明確化に着目した基本研究は限定されているが、サイトフェクチン構造の最適化に関する一般原理が明らかとなり始めている。本明細書で開示する配合研究は高濃度のサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体の沈殿する傾向に焦点をあてるものである。これらの観察から、熱力学的に安定な生成物であると我々が考えていることが、サイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体の加熱とともに音波処理することによって形成することができることを示し、この方法が、現在多くのインビボ研究を困難にする反応速度的に起こる凝集と析出を減少させることを示す。
ここで、以下の開示と図１〜11に紹介されるデータを参照すると、アルキル鎖、アルケニル鎖、およびアルキルまたはアルケニルを含有するアシル鎖、例えば：
0004346111.tif 000006
（式中、ｍ＝１〜10；R1、R2、およびR3は同一または異なり、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニル基、エーテル含有アルキル、エーテル含有アルケニルもしくはエーテル含有アルキニル基、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基、またはアシル含有もしくはアシルオキシ含有アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であり；R4はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R5はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は陰イオンである）からなる群から選択される少なくとも一対のリポイル部分を有する陽イオンモノアミン（および一つのジアミン化合物）から形成されるサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体を生じる配合物と条件の好適な態様を記載する。１を超えるｍを有する余分な数のメチレンは、記載した本合成経路を補う標準的方法で導入される。
第一の構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000007
式中、化合物Ａに関して：ｎ＝１〜10、通常は１〜３であり、好ましくは１であり；R3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニル、ヒドロキシル化アルキニル基であり、しばしば１〜10個の炭素のアルキル基、好ましくはメチル基であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
0004346111.tif 000008
式中、合成スキームの略号Trは−C（Ph）3、ｎ＝１〜10、通常は１〜３であり、好ましくは１であり；R3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニル、ヒドロキシル化アルキニル基であり、しばしば１〜10個の炭素のアルキル基、好ましくはメチル基であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。他の方法が本発明の範囲内にあることが意図されるが、この化合物中および下記の化合物中の異なるアシル含有R4およびR5基を導入するための好適な方法は、ここで文献の援用により含まれるBennettらによる「ポリヌクレオチドトランスフェクションのための合成脂質アンモニウム塩への柔軟なアプローチ」に示された合成方法（Tetrahedron Letters, Vol. 36, No. 13, pp. 2207-2210）であることが強調される。この方法において、アシルの移動を用いて混合エステル生成物を作る。
化合物Ａ誘導体の一般的な合成スキームにおいて、最初の工程は、無水エタノール中、過塩素酸リチウムの存在下で、（ジヒドロキシエチル出発材料のCISiPh2tBuとの反応により作られた）tert-ブチルジフェニルシリルオキシ誘導化材料を（Bennett, M. J., Malone, R. W., and Nantz, M. H. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 2207に記載された方法により合成された）（トリフェニルメトキシ）メチルオキシランと反応させることを含む。ギ酸中のジエチルエーテルとの反応が第二の工程を構成した。第三の工程は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル、またはアルキル含有ハロゲン化アシル、アルケニル含有ハロゲン化アシルもしくはアルキニル含有ハロゲン化アシルとの反応である。第四の工程は、一般的な前駆体化合物を作るために、フッ化テトラブチルアンモニウムとTHFにより開始されるtert-ブチルジフェニルシリルオキシ保護基の除去である。次に、この一般的な前駆体化合物を選択されたハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニルまたはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニルと反応させる。
第二の好ましい構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000009
（式中、化合物Ｂについて：ｎ＝１〜10、通常は１〜３であり、好ましくは１であり；R3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニル基であり、しばしば１〜10個の炭素のアルキル基、好ましくはメチル基であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R6はすべてが１〜10個の炭素を有するアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基、またはアシル含有基であり、好ましくはメチル基であり；R7はすべてが１〜10個の炭素を有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアシル含有基であり、好ましくはメチル基であり；かつＸ-はアニオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
0004346111.tif 000010
式中、ｎ＝１〜10、通常は１〜３であり、好ましくは１であり；R3は水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニル、ヒドロキシル化アルキニル基であり、しばしば１〜10個の炭素のアルキル基、好ましくはメチル基であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R6は１〜10個の炭素のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、好ましくはメチル基であり；R7は１〜10個の炭素のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、好ましくはメチル基であり；かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
化合物Ｂの一般的な合成スキームにおいて、最初の工程は、無水エタノール中、過塩素酸リチウムの存在下で、アミン出発材料を（トリフェニルメトキシ）メチルオキシランと反応させる。ギ酸中のジエチルエーテルとの反応が第二の工程を構成した。第三の工程は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル、またはアルキル含有ハロゲン化アシル、アルケニル含有ハロゲン化アシルもしくはアルキニル含有ハロゲン化アシルとの反応である。次に、この一般的な前駆体化合物を、選択されたアルキル、アルケニル、アルキニル、またはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニルもしくはヒドロキシル化アルキニルと反応させる。
第三の好ましい構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000011
式中、化合物Ｃについて：ａ、ｂ、またはｄは同一または異なり、０〜10であり、通常は０〜３で、好ましくは０または１であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8、R9またはR10は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、または一つがハロゲンを含有している場合、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-はアニオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
より具体的には、化合物Ｃについて、好適な化合物は以下の通りである：
0004346111.tif 000012
式中、化合物Ｃについて：ａ＝０〜10、通常は０〜３であり、好ましくは１であり；R4およびR5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8はハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、またはハロゲン化アルキニル基であり、好ましくはトリフルオロメチル基であり；R11およびR12は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-はアニオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
0004346111.tif 000013
式中、ａ＝０〜10、通常は０〜３であり、好ましくは１であり；R4およびR5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8はアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり、好ましくはトリフルオロメチル基であり；R11およびR12は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
化合物Ｃ-1の一般的な合成スキームにおいて、最初の工程は、無水エタノール中、過塩素酸リチウムの存在下で、適当にハロゲン化された出発材料を（トリフェニルメトキシ）メチルオキシランと反応させる。ギ酸中のジエチルエーテルとの反応が第二の工程を構成した。第三の工程は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル、またはアルキル含有ハロゲン化アシル、アルケニル含有ハロゲン化アシルもしくはアルキニル含有ハロゲン化アシルとの反応である。次に、この一般的な前駆体化合物を、選択されたアルキル、アルケニル、アルキニルまたはヒドロキシル化アルキル、ヒドロキシル化アルケニル、ヒドロキシル化アルキニル、ハロゲン化R11およびハロゲン化R12（これらは同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基である）と反応させる。
上記のハロゲン化された化合物に関連した好ましいジアミンハロゲン化化合物は以下の通りである：
0004346111.tif 000014
式中、化合物Ｄについて：ａ、ｂ、またはｄは同一または異なり、０〜10であり、通常は０〜３であり、好ましくは０または１であり；R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8、R9またはR10は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、または一つがハロゲンを含有している場合、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
より具体的には、化合物Ｄについて、好適な構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000015
式中、化合物Ｄについて：ａ＝０〜10、通常は０〜３であり、好ましくは１であり；R4およびR5は同一または異なり、各々がアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり；R8はアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり、好ましくはトリフルオロメチル基であり；R11およびR12は同一または異なり、各々がアルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニル基であり；かつＸ-はアニオンであり、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。）
もう一つの好ましくかつさらに具体的な化合物Ｄの構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000016
式中、R4およびR5は同一または異なり、それぞれがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアルキル含有アシル基、アルケニル含有アシル基もしくはアルキニル含有アシル基であり、かつＸ-は陰イオン、通常はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
化合物Ｄ-1の一般的な合成スキームにおいて、最初の工程は、無水エタノール中、過塩素酸リチウムの存在下で、好ましくはハロゲン化された出発物質を1,3-ブタンジエポキシド（Aldrich Chemical社より入手可能）と反応させることである。第二の工程は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニルもしくはハロゲン化アルキニルまたはアルキル含有ハロゲン化アシル、アルケニル含有ハロゲン化アシルもしくはアルキニル含有ハロゲン化アシルとの反応である。次に、一般的な前駆体化合物Ｄ-1をハロゲン化メチルまたはそれと同等な物質と反応させる。
さらにより具体的には、３つの好ましい構造を具体的な合成スキームと共にここに提示する（下記実施例に詳細を示す）。
第一の具体的な好ましい構造は以下の通りである。
0004346111.tif 000017
0004346111.tif 000018
第二の具体的な好ましい構造は以下の通りである。
0004346111.tif 000019
第三の具体的な好ましい構造は以下の通りである：
0004346111.tif 000020
フッ化誘導体の代りの合成経路があり、そのうちの二つの経路を以下に提示するが、他の経路も上記合成スキームと同じように本開示の範囲内にある。
0004346111.tif 000021
すぐ上の化合物17はAldrich Chemical社より直接購入してもよく、通常はこの供給源に注文する。
0004346111.tif 000022
化合物19は、Wawzonek, S., McKillip, W., and Peterson, C. J. Organic Synthesis, Coll. Vol. V 1973, 758による文献の方法にしたがって2,2,2-トリフルオロエチルアミン（Aldrich Chemical社）から調製した。
合成の柔軟性のための一般的な示唆
本合成スキームは関連するアミン陽イオン輸送分子を合成する広く柔軟性のある一連のアプローチのための機会を提示する。本方法によって一置換アミントランスポーターが容易に合成されるだけでなく、類似または混合極性官能基を有する二置換または三置換誘導体も容易に製造される。一置換または二置換のいずれかのアミン出発材料を用いて最終化合物中に一つか二つの官能基を生成するか、または四級化中に官能基を含む残基を付加する（上記のフッ化例を参照のこと）。
具体例のためであって限定するものではないが、混合生成物は以下のように調製される：
0004346111.tif 000023
上記式中、R30、R40およびR50は同一または異なり、水素、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはヒドロキシ含有またはエーテル含有アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であるか、またはハロゲン含有アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基であり、R60およびR70はカルボニルを含有または含有しないアルキル、アルケニル、またはアルキニル基であり、かつＸ-はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである（最初の出発材料の単一または複数の基は、シレーション（silation）または他の適当な手段により保護する必要があるかもしれないことに注意されたい）。より具体的には、混合官能性生成物のための好ましい合成スキームは次の通りである。
0004346111.tif 000024
式中、R60およびR70はカルボニルを含有または含有しないアルキル、アルケニル、またはアルキニル基であり、かつＸ-はオキシアニオンまたはハロゲン化物対イオンである。
三置換誘導体を作る合成の具体例は以下の通りである：
0004346111.tif 000025
サイトフェクチン構造領域
サイトフェクチンは、陽イオンポリヌクレオチド結合領域（Ｉ）、負電荷対イオン（II）、および疎水性領域（III）の３種類の主要な部分により定めることができる（図４）。これらの領域の化学的性質はサイトフェクチンにより示された生物物理学的性質を示している。よって、各部分の構造的修飾によって、これらの両性親和物を含む医薬の挙動に著しい変化をもたらすことができる。この理由から、研究者らはポリヌクレオチドトランスフェクションの生物物理学的性質、化合物の構造、および機能的評価を関連付けようと試みてきた。
極性領域構造の考察
一般的に、多様な官能性がサイトフェクチン極性領域に導入されてきた。これらの官能性の多くはサイトフェクチン：ポリヌクレオチド複合体にポリヌクレオチドを結合させること及び縮合させるのを調節することが知られている。通常は窒素系の基を有してなるこれらのポリヌクレオチド結合領域は水溶液中のそれらの塩基性の結果として、または第四アミンを生じるN-アルキル化によりカチオン性である。研究者らは、テトラアルキルアンモニウム（Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M. and Danielsen, M. 1987.リポフェクチン：効率的な脂質仲介DNA-トランスフェクション法。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84（21）:7413-7, Leventis, R. and Silvius, J. R. 1990.新規な代謝可能な陽イオン両性親和物を含む脂質分散物との哺乳類細胞の相互作用。Biochim. Biophys. Acta 1023（1）: 124-32,及びFelgner, J. N., Kummar, R., Sridhar, C. N., Wheeler, C., Tsai, Y. J., Border, R., Ramsay, P., Martin, M. and Felgner, P. 1994.新規な一連の陽イオン脂質配合物による促進遺伝子移送および機構の研究）、ポリアンモニウム（Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P. and Perez-Mutul, J. 1989.リポポリアミン-被覆DNAによる哺乳類一次内分泌細胞中への効率的な遺伝子移送。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86（18）: 6982-6, Zhou, X. H., Klibanov, A. L. and Huang, L. 1991.親油性ポリリジンは哺乳類細胞において効率的なDNAトランスフェクションを仲介する。Biochim. Biophys. Acta 1065（1）: 8-14,及びPuyal, C., Mihaud, P., Bienvenue, A. and Philippot, J. R. 1995.遺伝子物質をカプセル化した新しい陽イオンリポソーム。ポリヌクレオチドのための潜在的な移送システム。Eur. J. Biochem. 228（3）: 697-703）、モノアルキルアンモニウム（Gao, X. A. and Huang, L. 1991.哺乳類細胞の効率的なトランスフェクションのための新規な陽イオンリポソーム剤。Biochem. Biophys. Res. Commn. 179（1）: 280-5）、およびアミジン系（Ruysschaert, J. M., et Ouahabi, A., Willeaume, V., Huez, G., Fuks, R., Vandenbranden, M. and Di Stefano, P. 1994.哺乳類細胞のトランスフェクションのための新規な陽イオン両性親和物。Biochem. Biophys. Res. Commun. 203（3）: 1622-8）等の多様な窒素系官能性を含む幾つかのサイトフェクチンを調製している。そのような官能性は、ポリヌクレオチドが陽イオン脂質粒子と相互作用する効率、脂質／DNA複合体と生物学的膜との相互作用、およびこれらの複合体がポリヌクレオチドを細胞に移送する機構に対して影響を持つかもしれない。したがって、極性領域の化学構造及び物理学的性質をトランスフェクション活性に相互関連付ける研究は、ポリヌクレオチド移送の際の極性領域の水和と分子間結合の役割を明らかにすると期待されよう。そのような研究を本明細書に提示する。
極性領域構造／活性の関連性の多くの調査が報告されてきた。以前の研究では脂質領域とポリヌクレオチド結合基を分離するアルキル鎖の長さの最適化（Ito, A., Miyazoe, R., Mitoma, J., Akao, T., Osaki, T. and Kunitake, T. 1990.リポソーム媒体DNAトランスフェクションのための合成陽イオン両性親和物。Biochem. Int. 22（2）: 235-41及びFarhood, H., Bottega, R., Epand, R. M. and Huang, L. 1992.遺伝子移送およびプロテインキナーゼＣ活性に対する陽イオンコレステロール誘導体の効果。Biochim. Biophys. Acta 1111（2）: 239-46）；陽イオン官能性（テトラアルキルアンモニウム対トリアルキルアンモニウム）と、プロテインキナーゼC活性と、トランスフェクション有効性との相互関連（Farhood, H., Bottega, R., Epand, R. M. and Huang, L. 1992.遺伝子移送およびプロテインキナーゼC活性に対する陽イオンコレステロール誘導体の効果。Biochim. Biophys. Acta 1111（2）: 239-46）；および頭部基の電荷密度とトランスフェクション活性との関連（Remy, J. S., Sirlin, C., Vierling, P. and Behr, J. P. 1994.一連の親油性DNA結合性分子による遺伝子移送。Bioconjug. Chem. 5（6）: 647-54）が注目されていた。次に、本研究は、トランスフェクション活性と、DNA、RNA、および関連ポリマーの陰イオン領域を結合させるのに用いられるテトラアルキルアンモニウム部分の機能的修飾との関連を調べるために行われた。この研究のためにテトラアルキルアンモニウム誘導化サイトフェクチンを用いる決定は、DOTMA関連化合物の三級アンモニウム類似体が活性なトランスフェクション剤ではないとの未発表の観察に基づくものであった。
サイトフェクチンの頭部基の構造（および関連物理学的性質）における修飾がトランスフェクション活性に影響を与えうるとの仮説を支持する証拠はFelgnerら（Felgner J. N., Kummar, R., Sridhar, C. N., Wheeler, C., Tsai, Y. J., Border, R., Ramsay, P., Martin, M. and Felgner, P. 1994.新規な一連の陽イオン脂質配合物による促進遺伝子移送と機構の研究。J. Biol. Chem. 269（4）: 2550-2561）および我々の実験室（Bennett, M. J., Malone, R. W. and Nantz, M. H. 1995.ポリヌクレオチドトランスフェクションのための合成脂質アンモニウム塩に対する柔軟性のあるアプローチ。Tetrahedron Lett. 36（1）: 2207-2210 and Balasubramaniam, R. P., Bennett, M. J., Aberle, A. M., Malone, J. G., Nantz, M. H. and Malone, R. W. 1996.陽イオントランスフェクション脂質の構造的および機能的分析：疎水性領域。Gene Ther. 3（2）: 163-172）により実施された研究に起因する。これらの研究により、それらの極性領域におけるヒドロキシエチル誘導化テトラアルキルアンモニウム基を取り込むサイトフェクチンが、そのような基を取り込まない類似体と比較した場合（例えば、DORI対DOTAP）、増強トランスフェクション活性を示すことが明らかにされた。
我々は、サイトフェクチンのテトラアルキルアンモニウム基の化学組成の変化が、１）配合の際の陽イオンリポソーム／ポリヌクレオチド相互作用に影響を与えること、２）陽イオンリポソーム／ポリヌクレオチド複合体と細胞膜との相互作用を変化させること、３）これらの複合体が細胞に入る経路を変化させること、４）脂質：ポリヌクレオチド複合体の細胞内交換を変化させること、および５）脂質：ポリヌクレオチド複合体の解離を変えることによりトランスフェクション活性に影響を与えるかもしれないと仮定する。アンモニウム部分へのヒドロキシエチル基のような選択官能基の共有結合は、脂質表面水和とアンモニウム基の有効荷電との両方に影響を与えうると我々は仮定する。これらの影響は、上記方法の一つ以上に影響を与えることによりサイトフェクチンのトランスフェクション活性を変えることができる。
表面水和は、極性領域の修飾がサイトフェクチントランスフェクション活性に影響を与える可能性のある一つの重要な性質であるかもしれない。脂質表面水和の程度は、ポリヌクレオチドの付加前および付加後の両方で細胞間脂質相互作用に影響を与えうる。そのような効果は多様な相互作用により起こりうる。増加する鎖長のアルキル基をアンモニウム基に付加することにより、頭部基の断面積を増加させることによる分子間の脂質相互作用を弱めるであろう（立体効果）。水素結合の形成にアクセプターまたはドナーのいずれかとして関与することのできる官能基が存在するかまたは存在しないことにより、水和、ポリヌクレオチドとの相互作用および隣接脂質（例えばサイトフェクチン、DOPEまたは細胞脂質）への結合に影響を与えるだろう。電子誘引機能を含ませることにより、誘導効果による結合領域の有効陽イオン電荷に影響を与えるだろう。しかし、これらの複合相互作用は、サイトフェクチントランスフェクション活性に影響を与える主要な因子を同定することを困難としている。一つの例として水素結合可能な官能基を含めることがある。この例において、１）分子間水素結合または２）増加した頭部基水和のそれぞれの結果として、強いかまたは弱い脂質―脂質相互作用が起こりうる。よって、我々はDNAトランスフェクション活性に対するそのような変更の効果を実験的に分析することを選択する。
脂質表面水和および有効陽イオン電荷に関する仮説を調べるために、陽イオン両性親和物集団（図５を参照のこと）を、Felgnerらにより用いられたもの（Felgner, J. N., Kummar, R., Sridhar, C. N., Wheeler, C., Tsai, Y. J., Border, R., Ramsay, P., Martin, M. and Felgner, P. 1994.新規な一連の陽イオン脂質配合物を用いる促進遺伝子移送と機構の研究。J. Biol. Chem. 269（4）: 2550-2561）と類似の方法を用いて、N,N-ジメチル-1,2-ジミリストイルオキシ-3-アミノプロパンを対応するハロゲン化アルキルで単純にN-アルキル化することにより調製した。これらの両性親和物および等モル量のDOPEを含む脂質薄フィルムを滅菌化脱イオン水を用いて水和し、プラスミドDNA pNDCLUXと混合し（Aberle, A. M., Bennett, M. J., Malone, R. W. and Nantz, M. H. 1996.プラスミドDNAの陽イオン脂質媒体トランスフェクションの対イオンの影響。Biochim. Biophys. Acta 1299（3）:281-283）（P. Pyralisルシフェラーゼをコードするもの）、得られた複合体を用いてNIH 3T3ネズミ繊維芽細胞にトランスフェクトした。実験計画を図５に要約する。この実験から得られたトランスフェクションデータに基づいて（図６を参照のこと）、以下の結論を為すことができる。1）脂質極性領域の断面積とトランスフェクション活性との相関性を調べるために選択された脂質のうち、DMEAP（このサイトフェクチンの正確な構造および以下に言及されるサイトフェクチンに関して下記実施例19および図５を参照のこと）が最大レベルのプラスミド活性を有した。２）水素結合の影響を検査するのに選択した脂質のうち、メチルエステルを含むDMMEPおよびヒドロキシエチルを含む脂質の双方が、水素結合能を持たないDMPAPよりも２倍の増強を示した。我々は、水素結合の数または態様（アクセプター対ドナー）の相互関連を観察しなかった。選択した化合物のトランスフェクション能力に対する極性領域の影響を以下に提示する（インビトロは図６、インビボは図７を参照のこと）。
対イオンの考察
モノアルキルアンモニウム、ポリアンモニウム、またはテトラアルキルアンモニウム系の官能基を導入した正電荷のサイトフェクチン極性領域はすべて、会合した負電荷の対イオンを有している。モノアルキルアンモニウムおよびポリアンモニウムを含む脂質は典型的には、水性媒体中の対応する第一、第二または第三アミンの塩基性に由来するアンモニウム塩形成の結果として一つ以上の水酸化物の対イオンを有している。テトラアルキルアンモニウム系サイトフェクチンは、アンモニウム塩がN-アルキル化の結果として形成された場合に負荷電対イオンを獲得する。
正電荷ポリヌクレオチド結合領域に対する負荷電対イオンの会合の結果、対イオンの化学的性質がサイトフェクチンの生理化学的性質に影響を与えると我々は考える。具体的には、対イオンは脂質表面水和、小胞流動性、および脂質多形性に影響を与えうる。したがって、対イオンはサイトフェクチンのトランスフェクション活性にも影響を与えうる。
サイトフェクチン仲介トランスフェクション活性に対して可能性のある対イオンの影響を研究するために、陰イオンである対イオンのみが異なるDOTAP（N-［1,2,3-ジオレオイルオキシ］プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム）類似物群をイオン交換クロマトグラフィーを用いて調製した（Aberle, A. M., Bennett, M. J., Malone, R. W. and Nantz, M. H. 1996.プラスミドDNAの陽イオン脂質仲介トランスフェクションの対イオンの影響。Biochem. Biophys. Acta 1299（3）:281-283）。陰イオン−水相互作用を直接比較できるように一連の対イオン（表１）を選択した。以前の研究は、多様な塩溶液中の膜挙動とホフマイヤー系列により分類された陰イオンの性質とに関連性が存在することを示し（Epand, R. M. and Bryszewska, M. 1988.二層から６角形までの相転移の調節および塩水溶液中のホスファチジルエタノールアミンの溶媒和。Biochemistry 27（24）: 8776-9, Koynova, R. D., Tenchov, B. G. and Quinn, P. J. 1989.水和ホスファチジルエタノールアミン中の単層液晶相の代価による６角（HII）相の糖香の形成。Biochim. Biophys. Acta 980: 377-380, and Collins, K. D. and Washabaugh, M. W. 1985.ホフマイスター効果と界面における水の挙動。Q. Rev. Biophys. 18（4）: 323-422）、これらはイオンをコスモトロープ（kosmotrope）（水構成）またはカオトロープ（chaotrope）（水脱安定）のいずれかに分類する（図１を参照のこと）。
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これらのサイトフェクチンを用いるトランスフェクション分析をインビトロ（NIH 3T3ネズミ繊維芽細胞）およびインビボ（マウスへの気管支注入）で行い、インビトロ（図８）とインビボ（図９）データとの間に優れた相関が得られた。これらのスクリーニングで観察された傾向は多様な細胞タイプに適用可能と推察されるだろう。さらに、このデータは、かなり非局在化した極性コスモトロピックオキシアニオン、ビスルフェートおよびトリフルオロメタンスルホネート（トリフレート）が最大レベルのルシフェラーゼ活性を促すことを示唆している。検査したハロゲンの中で、DOTAPヨウ化物類似体が最も活性であった。ヨウ化物が、静電相互作用のためにアルキルアンモニウム頭部基と最も密接に会合する一方、オキシアニオンは脂質表面から離れた水に競合的に結合すると考えられている。熱力学的議論は、脂質：溶媒相互作用が脂質多形性に直接的に影響を与えることを示唆した。よって、水の排除および密接な相互鎖充填が存在するかもしれない。結論として、これらの結果は、サイトフェクチン極性領域の脱水和を促進することのできるアニオンの導入がサイトフェクチントランスフェクション活性の増大を導くことを示している。
疎水性領域構造の考察
サイトフェクチンの設計に用いられてきた２種類の疎水性領域が存在する。ステロール系領域およびジアシル／アルキル系領域である。脂質二層構造が作られる足場として作用することのできる疎水性領域も、二層流動性と脂質多形性を調節する。二層流動性の増大により、脂質：DNA複合体がさらに効率的に形成され、サイトフェクチン：DNA複合体の細胞または体細胞膜への融合を増強し、これがトランスフェクションプロセスの鍵となる機構的工程と思える。ステロール疎水性領域の二層流動性への寄与が主に脂質粒子中のステロールの相対的濃度に依存する一方、膜流動性に寄与することを示しているのはジ-アシル／アルキル系脂質に含まれる脂肪族基の化学構造である。
サイトフェクチン活性とトランスフェクション脂質二層流動性とが直接的に関連性があることが既に述べられている。この仮説はAkaoらにより最初に提出され（Akao, T., Osaki, T., Mitoma, J., Ito, A. and Kunitake, T. 1991.合成陽イオン両性親和物の物理化学的特徴とそれらのDNAトランスフェクション能力との相関。Bull. Chem. Soc. Jpn. 64: 3677）、DNAトランスフェクションのための両性親和物の一つの主要な要件はTc（ゲル相と液晶相との相転移温度）が37℃よりも低く、そのためトランスフェクション脂質が細胞培養温度で液体の液晶状態を取ることを示唆している。この仮説を支持する研究（Felgner, J. N., Kummar, R., Sridhar, C. N., Wheeler, C., Tsai, Y. J., Border, R., Ramsay, P., Martin, M. and Felgner, P. 1994.新規な一連の陽イオン脂質配合物による促進遺伝子移送と機構の研究。J. Biol. Chem. 269（4）: 2550-2561及びAkao, T., Osaki, T., Mitoma, J., Ito, A. and Kunitake, T. 1991.合成陽イオン両性親和物の物理化学的特徴とそれらのDNAトランスフェクション能力との相関。Bull. Chem. Soc. Jpn. 64: 3677）は、限られた数のサイトフェクチン類似体と細胞系の分析に頼った。そのような研究を解釈する際に、我々は、疎水性領域構造、二層物理学的性質、およびトランスフェクション活性を関連付ける一般的結論を引き出す前に多細胞系または組織を用いて結果を得ることが重要であると考える（Balasubraminiam, R. P., Bennett, M. J., Aberle, A. M., Malone, J. G., Nantz, M. H. and Malone, R. W. 1996.陽イオントランスフェクション脂質の構造的および機能的分析：疎水性領域。Gene Ther. 3（2）:163-172）。適切なサイトフェクチン脂質の流動性により、ポリヌクレオチドに結合したときの脂質構造の流動性を予想するとの証拠は現在の時点で存在していないことに注意されたい。
ジ-アシル／アルキル系サイトフェクチンを含むリポソームの二層流動性は、これらの脂質に含まれる脂肪族基の対称性（表２を参照）、鎖長、および飽和度を操作することにより改良することができる。サイトフェクチン疎水性領域構造とトランスフェクション活性との関係を理解するために、我々は、疎水性領域に含まれる脂肪族基の組成のみが異なるサイトフェクチン群を調製した（Balasubramaniam, R. P., Bennett, M. J., Aberle, A. M., Malone, J. G., Nantz, M. H. and Malone, R. W. 1996.陽イオントランスフェクション脂質の構造的および機能的分析：疎水性領域。Gene Ther. 3（2）: 163-172）。この研究で調べたサイトフェクチンは、対称および非対称炭化水素側鎖がＣ18：１〜Ｃ８：０の長さで変わる化合物を包含した。以前の報告（Felgner, J. N., Kummar, R., Sridhar, C. N., Wheeler, C., Tsai, Y. J., Border, R., Ramsay, P., Martin, M. and Felgner, P. 1994.新規な一連の陽イオン脂質配合物による促進遺伝子移送と機構の研究。J. Biol. Chem. 269（4）: 2550-2561）も類似する一連のサイトフェクチンを調べた。しかし、単一の細胞系（COS-7）を用いてＣ18：１〜Ｃ14：０の長さで変わる対称炭化水素側鎖のみを調べた。この以前の研究から、ジミリスチル含有化合物DMRIEがCOS-7細胞のDNAトランスフェクションに最も有効であることがわかった。短い側鎖は調べなかったので、有効な最小アシル鎖長は定められなかった。これらのサイトフェクチンを含む陽イオンリポソームを、サイトフェクチンとDOPEのモル比１：１を用いて配合した。NIH 3T3ネズミ繊維芽細胞（図10を参照）、CHO細胞、および培養呼吸上皮細胞系（16HBE14o-）（図11を参照）を用いるトランスフェクション研究から、いくぶんか興味ある観察が明らかとなった。１）単一の対称または非対称類似体が、調べた細胞系のいずれのDNAトランスフェクションに対しても最も有効というわけではなく、２）非対称脂質は、最も有効な対称脂質類似体と同等またはそれ以上のルシフェラーゼ発現量をもたらし、３）短い側鎖を有する非対称サイトフェクチン（Ｃ12：０、Ｃ14：０）はスクリーニングされた細胞系において最も活性な脂質にあり、かつ４）ジオクタノイル（di  Ｃ８：０）化合物は一般的には最も活性がなく、脂肪アシル鎖長の有効下限がＣ（12）で定められることを示している。
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配合の考察
サイトフェクチンは水性溶媒中への混合の際に多様な生物学的高分子とのトランスフェクション複合体を自発的に形成する。活性トランスフェクション複合体を調製するために用いられる混合または配合プロトコールは、現在、１）陽イオン脂質：中性脂質の比率、２）溶媒の種類、および３）陽イオン電荷：ポリヌクレオチドリン酸電荷のモル比の最適化を伴う。
多くの最適化された配合物は、DNAとの混合前にサイトフェクチンとともにジオレオイルホスファチジル-エタノール-アミン（DOPE）を導入するが、適切なDOTAPでしばしば観察される高い活性はDOPEが必ずしも必要ではないことを示している。DOPEは脂質二重層の強い脱安定化剤であることが知られており（Litzinger, D and Huang, L. 1992.ホスファチジルエタノールアミンリポソーム：医薬移送、遺伝子転移および免疫診断の応用。Biochim. Biophys. Acta 1113, 201-227）、よって、多くのサイトフェクチンの固有の融合性（fusogeneic properties）を増強することができる。多様な細胞系、組織およびサイトフェクチンのためのサイトフェクチン：DOPEモル比の実験的な最適化により、選択された利用のためにトランスフェクション活性の著しい増加をもたらすことができる。我々の場合、最適化したモル比は９：１〜１：２（サイトフェクチン：DOPE）の範囲にあった。
細胞培養実験は典型的には、細胞系が培養されている培地、またはトランスフェリンおよび多様な成長因子等の因子に富んだ無血清培地であるOptiMem（Gibco／BRL）のいずれかからなる配合溶媒を用いる。OptiMemを用いて観察することのできる増強トランスフェクチン活性は、加えた生物活性剤が脂質：ポリヌクレオチド複合体に取込まれたことを反映するものだろう。そのような場合、細胞表面への結合は、特定のリガンド：レセプター相互作用により促進されよう。複合体は典型的には注射のための水または生理学的塩溶液等の等張溶媒のいずれかを用いるインビボ投与のために調製される。細胞培養の結果とは対照的に、溶媒に特異的な増強は報告されていない。
サイトフェクチン：ポリヌクレオチドリン酸の配合中に用いられるモルによる負荷比は報告されないことが多いが、培養細胞に対して典型的には１：１から４：１までの範囲にある。インビボ適用のためのプロトコール、および特に肺のトランスフェクションのためのプロトコールは顕著に異なるモル負荷比をしばしば用いる。Yoshimura（Yoshimura, K., Rosenfeld, M. A., Nakamura, H., Scherer, E. M., Pavirani, A., Lecocq, J. P. and Crystal, R. G. 1992.インビボ気管支プラスミド仲介遺伝子移送後のマウス肺におけるヒト嚢胞性繊維症経膜伝導調節遺伝子の発現。Nucleic Acids Res. 20（12）: 3233-40）は肺での移送のために非常に低いサイトフェクチン：DNA負荷比を使用したことを記載し、約１：2.5〜１：35の範囲のインビボ荷電タイトレーション（titration）を行った。最適な活性はサイトフェクチン：DNA荷電の１：35の比率を用いて得られた。このインビボプロトコールも、培養細胞のトランスフェクションに典型的に用いられるポリヌクレオチド濃度よりも1,000〜10,000倍も高いプラスミド1.4ミリグラム／注射液200ミリリットルまでを用いた。遊離のプラスミドDNAをネズミ肺に直接注射することにより、著しいレベルのリポーター遺伝子発現をもたらし得るので（Yoshimura, K., Rosenfeld, M. A., Nakamura, H., Scherer, E. M., Pavirani, A., Lecocq, J. P. and Crystal, R. G. 1992.インビボ気管支プラスミド仲介遺伝子移送後のマウス肺におけるヒト嚢胞性繊維症経膜伝導調節遺伝子の発現。Nucleic Acids Res. 20（12）: 3233-40, Meyer, K. B., Thompson, M. M., Levy, M. Y., Barron, L. G. and Szoka, F. C. 1995.マウス気道への気管支遺伝子移送：プラスミドDNA発現および薬物速度論の特性付け。Gene Ther. 2（7）: 450-60,及びBalasubramaniam, R. P., Bennett, M. J., Aberle, A. M., Malone, J. G., Nantz, M. H. and Malone, R. W. 1996.陽イオントランスフェクションの構造的および機能的分析：疎水性領域。Gene Ther. 3（2）:163-172）、サイトフェクチン：DNA比を非常に低くして配合した複合体は観察された肺トランスフェクションで活性素ではないと考えることができる。Yoshimuraらにより観察されたトランスフェクション活性が非結合または最小に結合されたポリヌクレオチドの活性を反映していると我々は仮定する。この場合、少量のリポフェクチンを高濃度のプラスミドDNAに加えた際に観察された増強トランスフェクション活性は、細胞培養で起こる脂質仲介トランスフェクションよりもむしろ、ヌクレアーゼからの部分的な保護を反映しているのかもしれない。我々は、プラスミドDNAを20マイクログラム／200マイクロリットルを用いる類似の荷電タイトレーション実験が、サイトフェクチンの種類とDOPE比率に依存しながら、２：１〜３：１の最適化サイトフェクチン：DNA負荷比をもたらすことを観察した。
高濃度の脂質：DNA複合体（２：１脂質：DNA荷電率、0.1mg／ml以上）は比較的不溶性であり、配合の際に析出する傾向がある（表３を参照）。我々はそのような析出物が細胞培養とインビボの双方においてトランスフェクション剤として比較的活性のないことを観察した。さらに、明らかに安定な脂質：ポリヌクレオチドエマルジョンでさえ室温で長期間保存されたときに析出しうる。攪拌混合および加熱は高濃度複合体の析出を容易にする傾向がある。サイトフェクチン：DNA複合体の析出は、サイトフェクチン医薬の開発に対して著しい障害である。これらの析出物は、低濃度で混合する際に形成する熱力学的に安定な生成物というよりも、脂質：DNA会合の速度論的生成物であると、我々は仮説を立てている。この仮説は以下のモデルから来るものである：1）最初の脂質：DNA結合の際、DNAは脂質の再組織化（ポリヌクレオチド被覆）を誘導し、DNA縮合および／または粒子の再構築（熱力学的生成物の複合物成熟／形成）をもたらす。脂質：脂質相互作用、ポリヌクレオチド結合の際の対イオンの置換、脂質：ポリヌクレオチド結合および縮合の際のポリヌクレオチド水和の変更を反映するそのような再構築に対するエネルギー的な障壁が存在する。したがって、そのような再組織化の速度は脂質構造、対イオンの種類、ポリヌクレオチドの構造、および温度の関数となるだろう。２）部分的に再組織化された複合体は溶液中で衝突の際に凝集を受ける。この凝集（例えば、架橋プロト-複合体-速度論的生成物）は、衝突粒子の表面上に存在する複合体化していないサイトフェクチンにより、非被覆ポリヌクレオチドの結合を介して仲介されるのだろう。したがって、凝集は濃度、系のエネルギー（温度、攪拌）、溶液粘度、および時間の関数であろうと我々は予想する。
表３に関して、音波処理対未音波処理のDNA-脂質複合体の動的光散乱（DLS）の推定値は、固定された２：１の脂質-DNA負荷比において、プラスミドDNA濃度を増加させている。サイジング実験はネズミ肺トランスフェクション条件に似るように設計した。複合体は、見えている凝集体が分散するまで（サイトフェクチン内のリポイル部分の相転移温度以上である）56℃でバスソニケーター（実験室用装置、Hicksville NYまたはそれと同等の装置）を用いて短時間（30”〜２分間）音波処理した。DLS実験はBrookhaven Instruments BI-90粒度計またはそれと同等の装置を25℃で用いて行い、連続的に５分毎にサンプリングし、累積率の方法により分析した。経時的な粒度分布に著しい変化は観察されなかった（データは示さず）。
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高濃度複合体の凝集と析出を克服する方法により、サイトフェクチン系の遺伝子医薬の調製がかなり容易になるだろう。不幸にも、熱エネルギーを加えることは「成熟」を促進しかつ系内で分散を高めると予想され、それによって衝突速度とエネルギーが増加するだろう。再構築と析出前に迅速に凝集体を分解するために、系の粘度の増加または音波処理の利用のいずれかと組合わせた加熱が熱力学生成物の形成を助けるというのが我々の仮説である。上記表３に示されているように、加熱と音波処理との組合せは、安定で小さい脂質粒子の形成をもたらす。さらに、この方法は、比較的活性のない化合物DOTAP等の脂質範囲（図12）の肺トランスフェクション活性を増強するように思われる。
実施例
実施例１：N,N-［ビス（2-tert-ブチルジフェニルシリルオキシエチル）］アミン、上記の特定の合成スキームにおける化合物２
ジエタノールアミン（4.78g、7.26mmol）、トリエチルアミン（2.5ml）、および4-ジメチルアミノピリジン（89mg、0.73mmol）の混合物の０℃ジクロロメタン溶液（73ml）にtert-ブチルクロロジフェニルシラン（5.46g、18.14mmol）を添加した。添加の完了後、反応混合物を室温まで放置した。12時間後、反応混合物を分液漏斗に移し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過し、ろ液の溶媒を減圧除去した。このようにして得られた粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ジクロロメタン中1%メタノール）、２をオイルとして2.53g（2.13mmol、29%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.70-7.34（m, 20H）, 3.79（t, J=5Hz, 4H）, 2.79（t, J=5Hz, 4H）, 2.09（s, 1H）, 1.05（s, 18H）;13C NMR（75MHz, CDCl3）d 135.5, 133.6, 129.6, 127.6, 63.5, 51.7, 26.9, 19.2; IR（KBr）3071, 2930, 1428cm-1.
実施例２：（±）-［（トリフェニルメトキシ）メチル］オキシラン、上記の特定の合成スキームにおける化合物３
（±）グリシドール（4.00g、33.5mmol）、トリエチルアミン（5.7ml）、および4-ジメチルアミノピリジン（420mg、3.4mmol）の混合物の０℃ジクロロメタン溶液（170ml）に塩化トリフェニルメチル（16.5g、51.2mmol）を添加した。添加完了後、反応混合物を室温まで放置した。12時間後、反応混合物を分液漏斗に移し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過し、ろ液の溶媒を減圧除去した。このようにして得られた粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（ヘキサン中3%ジエチルエーテル）、３をオイルとして8.70g（27.5mmol、82%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.47-7.20（m, 15H）, 3.33-3.30（m, 1H）, 3.16-3.09（m, 3H）, 2.76（m, 1H）, 2.61（dd, J=2, 5H, 1H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 143.8, 128.6, 127.9, 127.8, 127.1, 127.0, 86.7, 64.7, 51.0, 44.6; IR（KBr）3057, 2922, 1448cm-1.
実施例３：（±）-3-[N,N-ビス（2-tert-ブチルジフェニルシリルオキシエチル）アミノ］-1-（トリフェニルメトキシ）-2-プロパノール、上記の特定の合成スキームにおける化合物４
（±）-（トリフェニルメトキシ）メチルオキシラン（7.66g、24.2mmol）および過塩素酸リチウム（5.87g、55.2mmol）の混合物の無水エタノール溶液（110ml）にアミン２（11.7g、20.2mmol）を加えた。反応混合物を65℃まで温めて24時間攪拌した。この後、反応溶液を室温まで冷却し、次にジエチルエーテル（100ml）を含む分液漏斗に移した。得られた混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮して粗製精製物を黄色のオイルとして得た。精製はSiO2カラムカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中3%メタノール）により行い、４をオイルとして14.5g（16.1mmol、80%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.65-7.20（m, 25H）, 3.73-3.56（m, 5H）, 3.17（dd, J=5.9Hz, 1H）, 2.97（dd, J=5.9Hz, 1H）, 2.69（m, 5H）, 2.45（dd, J=10, 12Hz, 1H）, 1.02（s, 18H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 144.1, 135.5, 134.7, 133.5, 129.6, 128.7, 128.6, 127.7, 127.6, 126.8, 86.4, 67.2, 66.1, 62.1, 58.4, 56.6, 26.8, 26.5, 19.0; IR（KBr）3445, 3069, 2930, 1427cm-1.
実施例４：（±）-3-［N,N-ビス（2-tert-ブチルジフェニルシリルオキシエチル）アミノ］-1,2-プロパンジオール、上記の特定の合成スキームにおける化合物５
アミン４（8.43g, 9.40mmol）の混合物のジエチルエーテル溶液（12ml）に85%ギ酸（35ml）を加えた。得られた反応混合物を室温で20時間攪拌した。この後、固体NaHCO3を加えてこの酸溶液を中和した。得られた混合物をジエチルエーテル（100ml）で次に希釈して分液漏斗に移した。有機相を分離し、水、およびブラインで連続的に洗浄した。精製はSiO2カラムカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中3%メタノール）により行い、５をオイルとして3.75g（5.73mmol、61%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.65-7.31（m, 20H）, 3.68-3.60（m, 6H）, 3.40（dd, J=4, 9Hz, 1H）, 2.71（m, 4H）, 2.57（d, J=7Hz, 2H）, 1.03（s, 18H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 135.5, 133.4, 129.7, 127.7, 68.0, 64.4, 62.0, 57.2, 56.7, 26.8, 19.0; IR（KBr）3432, 3070, 2931, 1428cm-1.
実施例５：（±）-3-［N,N-ビス（2-tert-ブチルジフェニルシリルオキシエチル）アミノ］-1,2-ビス（9（z）-オクタデセノイルオキシ）プロパン、上記の特定の合成スキームにおける化合物６
ジオール５（4.78g、7.26mmol）、トリエチルアミン（2.5ml）および4-ジメチルアミノピリジン（89mg、0.73mmol）の混合物の０℃ジクロロメタン溶液（73ml）に塩化オレオイル（5.46g、18.14mmol）を滴下した。添加が完了したら、反応混合物を０℃で４時間攪拌し、ここでジクロロメタン（20ml）をさらに加えた。次に、反応溶液を分液漏斗に移し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機層を乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過し、ろ液溶媒を減圧除去した。このように得られた粗製精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ヘキサン中6% EtOAc）、６をオイルして2.53g（2.13mmol、29%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.67-7.34（m, 20H）, 5.37（m, 4H）, 5.03（m, 1H）, 4.29（dd, J=3, 12Hz, 1H）, 4.06（dd, J=6, 12Hz, 1H）, 3.65（t, J=6, 4H）, 2.67（m, 6H）, 2.23（m, 4H）, 2.02（m, 8H）, 1.51（m, 4H）, 1.29（m, 40）, 1.05（s, 18H）, 0.90（t, J=5Hz, 6H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 173.3, 172.9, 135.5, 133.6, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 127.6, 127.5, 70.0, 63.5, 62.5, 57.0, 55.4, 34.3, 34.05, 31.9, 30.0, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1（2）, 27.4, 27.2, 27.0, 26.8, 24.9（2）, 22.7, 19.1, 14.1; IR（KBr）3071, 2927, 1741cm-1.
実施例６：（±）-3-［N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ］-1,2-ビス（9（z）-オクタデセノイルオキシ）プロパン、上記の特定の合成スキームにおける化合物７
アミン６（2.50g、2.10mmol）の０℃THF溶液（11ml）にフッ化テトラブチルアンモニウム溶液（１M ＴＨＦ溶液６ml、６mmol）を滴下した。反応液を０℃で15時間攪拌し、この時点で薄層クロマトグラフィーでの分析により、出発材料が存在しないことを明らかにした。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、分液漏斗に移した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム、水、およびブラインで連続的に洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液を減圧除去した。粗製生成物を、塩化メチレン中の5%メタノールを用いる短いシリカゲルカラムに通して、７をオイルとして1.03g（1.45mmol、69%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 5.34（m, 4H）, 5.18（m, 1H）, 4.36（dd, J=3, 12Hz, 1H）, 4.10（dd, J=6, 12Hz, 1H）, 3.60（t, J=5Hz, 4H）, 2.71（m, 6H）, 2.32（dd, J=7, 14Hz, 4H）, 2.00（m=8H）, 1.61（m, 4H）, 1.37-1.15（m, 40H）, 0.87（t, J=6Hz, 6H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 173.7, 173.5, 129.9, 129.7, 129.6, 70.0, 63.5, 59.8, 57.2, 55.8, 34.3, 34.0, 31.9, 29.7（2）, 29.6（2）, 29.5, 29.4, 29.3, 29.1（2）, 27.2, 27.1, 24.8, 22.6, 14.1; IR（KBr）3416, 2925, 1740cm-1.
実施例７：（±）-N,N-[ビス（2-ヒドロキシエチル）］-N-メチル-N-[2,3-ビス（9（z）-オクタデセノイルオキシ）プロピル］アンモニウム塩化物（DODHP）、上記の特定の合成スキームにおける化合物１
アミン７（0.40mg、0.56mmol）を含む密封されたチューブにヨードメタン（３ml）を添加した。このチューブをアルゴンでフラッシュし、次に密封した。反応混合物を80℃まで15時間加熱した。この後、反応混合物をアルゴン下で濃縮した（注意：蒸発はヒュームフード中にて行うこと）。得られた黄色オイルを塩化メチレンに溶解し、丸底フラスコに移した。この混合物をロータリーエバポレーターで蒸発させて、確実に残留するヨードメタンをすべて除去した。粗製生成物を短いシリカゲルカラムに通し（ジクロロメタン中の5%〜10%メタノールのグラジエント）、１をワックスとして0.47g（0.55mmol、98%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 5.69（m, 1H）, 5.32（m, 4H）, 4.47（dd, J=3, 12Hz, 1H）, 4.25-4.12（m, 5H）, 3.95-3.76（m, 6H）, 3.36（s, 3H）, 2.57（s, 2H）, 2.37（m, 4）, 1.99（m, 8H）, 1.58（m, 4H）, 1.37-1.24（m, 40H）, 0.86（t, J=6Hz, 6H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 173.2, 172.7, 129.9, 129.5（2）, 65.5（2）, 63.9, 63.3, 55.6, 51.2, 34.2, 33.9, 31.8, 29.7, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0（2）, 27.1, 24.7, 24.6, 22.6, 14.0）; IR（KBr）.
実施例８：（±）-1-（トリフェニルメトキシ）-3-[N,N-ビス（2-メトキシエチル）アミノ］-2-プロパノール、上記の特定の合成スキームにおける化合物10
オキシラン３（5.00g、15.8mmol）および過塩素酸リチウム（3.36g、31.6mmol）の無水エタノール（80ml）中の混合物にアミン９（2.53g、19.0mmol）を加えた。反応混合物を65℃まで温めて24時間攪拌した。この後、反応混合物を室温まで冷却して、次にジエチルエーテル（20ml）を含む分液漏斗に移した。得られた混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、水、およびブラインで連続的に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮して粗製生成物を黄色オイルとして得た。精製はSiO2カラムカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中3%メタノール）により行って、10をオイルとして6.46g（14.18mmol、90%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 7.49-7.22（m, 15H）, 3.82（m, 1H）, 3.44（m, 4H）, 3.34（s, 6H）, 3.22（dd, J=6, 9Hz, 1H）, 3.06（dd, J=6, 9Hz, 1H）, 2.89-2.71（m, 5H）, 2.57（d, J=9, 13Hz, 1H）;13C NMR（75MHz, CDCl3）d 144.0, 128.7, 127.7, 126.9, 71.2, 67.8, 66.0, 58.7, 58.4, 54.7; IR（KBr）3437, 3058, 2874, 1449cm-1.
実施例９：（±）-3-[N,N-ビス（2-メトキシエチル）アミノ］-1,2-プロパンジオール、上記の特定の合成スキームにおける化合物11
アミン10（2.86g, 6.28mmol）のジエチルエーテル（13.4ml）中の混合物に85%ギ酸（16.7ml）を加えた。得られた反応混合物を室温で20時間攪拌した。この後、固体NaHCO3を加えてこの酸溶液を中和した。得られた混合物を次にジエチルエーテル（）で希釈して分液漏斗に移した。有機相を分離し、水、およびブラインで連続的に洗浄し、乾燥した（硫酸ナトリウム）。精製はSiO2カラムカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中3%メタノール）により行って、11をオイルとして0.99g（4.64mmol、74%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 3.68（m, 2H）, 3.53-3.39（m, 6H）, 3.33（s, 6H）, 2.86-2.70（m, 5H）, 2.64（d, J=6Hz, 2H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 71.1, 68.7, 64.7, 58.7, 57.7, 54.8; IR（KBr）3413, 2876cm-1.
実施例10：（±）-3-[N,N-ビス（2-メトキシエチル）アミノ］-1,2-ビス（9（z）-オクタデセノイルオキシ）プロパン、上記の特定の合成スキームにおける化合物12
ジオール11（0.30g、1.41mmol）、トリエチルアミン（0.5ml）および4-ジメチルアミノピリジン（17.2mg、0.14mmol）の混合物の０℃ジクロロメタン溶液（14ml）に塩化オレオイル（1.10g、3.66mmol）を滴下した。添加が完了したら、反応混合物を０℃で４時間攪拌し、ここでジクロロメタン（10ml）をさらに加えた。次に、反応溶液を分液漏斗に移し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過し、ろ液溶媒を減圧除去した。このように得られた粗製精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ジクロロメタン中１%メタノール）、12をオイルとして150mg（0.21mmol、15%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 5.31（m, 4H）, 5.08（m, 1H）, 4.35（dd, J=3, 12Hz, 1H）, 4.09（dd, J=6, 12Hz, 1H）, 3.40（t, J=6Hz, 4H）, 3.29（s, 6H）, 2.76-2.68（m, 6H）, 2.26（m, 4H）, 1.98（m, 8H）, 1.58（m, 4H）, 1.35-1.22（m, 40H）, 0.85（t, J=6Hz, 6H）;13C NMR（75MHz, CDCl3）d 173.3, 173.0, 129.9, 129.6, 71.4, 70.1, 63.7, 58.7, 55,2, 54.8, 34.3, 34.1, 31.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.2, 29.1, 29.0, 27.0（2）, 24.8, 22.6, 14.0; IR（KBr）2925, 2854, 1740cm-1.
実施例11：（±）-N,N-ビス（2-メトキシエチル）-N-メチル-N-[2,3-ビス（9（z）-オクタデセノイルオキシ）プロピル］アンモニウム塩化物（DODMP）、上記の特定の合成スキームにおける化合物８
アミン12（150mg、0.20mmol）を含む密封されたチューブにヨードメタン（３ml）を添加した。このチューブをアルゴンでフラッシュし、次に密封した。反応混合物を80℃まで15時間加熱した。この後、反応混合物をアルゴン下で濃縮した（注意：蒸発はヒュームフード中にて行うこと）。得られた黄色オイルを塩化メチレンに溶解し、丸底フラスコに移した。この混合物をロータリーエバポレーターで蒸発させて、確実に残留するヨードメタンをすべて除去した。粗製生成物を短いシリカゲルカラムに通して（ジクロロメタン中の5%〜10%メタノールのグラジエント）、８をワックスとして162mg（0.19mmol、95%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 5.59（m, 1H）, 5.24（m, 4H）, 4.40（dd, J=3, 12Hz, 1H）, 4.13-3.75（m, 11H）, 3.34（m, 9H）, 2.25（m, 4H）, 1.91（m, 8H）, 1.51（m, 4H）, 1.27-1.15（m, 40H）, 0.78（m, 6H）;13C NMR（75MHz, CDCl3）d 172.8, 172.6, 129.8, 129.4, 129.4, 65.9（2）, 63.5, 63.2, 63.0, 59.2, 50.4, 34.1, 33.8, 31.7, 29.5（2）, 29.3, 29.2（2）, 29.1, 29.0, 28.9（2）, 29.8, 27.0（2）, 24.5, 24.4, 22.5, 13.9; IR（KBr）3004, 2925, 1744cm-1.
実施例12：（±）-N-（2,2,2-トリフルオロエチル）-N,N-ジメチル-N-[2,3-ビス（9（z）-オクタデセニルオキシ）プロピル］アンモニウム塩化物（DOFEP）、上記の特定の合成スキームにおける化合物14
DMF（5ml）中にアミン15（0.50g、0.77mmol）を含む密封チューブに2-ヨード-1,1,1-トリフルオロエタン（1.1ml）を添加した。このチューブをアルゴンでフラッシュし、次に密封した。反応混合物を100℃まで15時間加熱した。この後、反応混合物を丸底フラスコに移し、揮発分（DMF、過剰のICH2CF3）を減圧下の蒸留により除去した。得られた黄色オイルを短いシリカゲルカラムに通して（ジクロロメタン中の5%〜10%メタノールのグラジエント）、14を固体として67mg（0.07mmol、10%）得た。1H NMR（300MHz, CDCl3）d 5.59（m, 1H）, 5.33（m, 4H）, 4.51（m, 2H）, 4.13（dd, J=6, 12Hz, 1H）, 3.87（dd, J=9, 14Hz, 1H）, 3.53（s, 6H）, 2.35（m, 4H）, 1.99（m, 8H）, 1.59（m, 4H）, 1.29-1.25（m, 40H）, 0.87（t, J=7Hz, 6H）; 13C NMR（75MHz, CDCl3）d 173.0, 172.5, 129.9, 129.8, 129.5, 129.4, 66.0, 65.6, 62.8, 54.6, 34.1, 33.8, 31.7, 39.7, 29.6, 29.4（2）, 29.3, 29.1（2）, 29.0（2）, 28.9, 27.1, 27.0, 24.6, 24.5, 22.5, 13.9; IR（KBr）.
実施例13：リポソーム配合物
適当な量のカチオン脂質および中性脂質（DOPE）をクロロホルム中の溶液として1.9mlの試料バイアルに加えて50：50モル比の陽イオン脂質：中性脂質を作った。クロロホルムをロータリーエバポレーターにより37℃で除去した。微量な溶媒をすべて確実に除去されるように、得られた薄い脂質フィルムを減圧下に一晩置いた。フィルムが水和するまで脂質混合物を１mlの滅菌水に70℃で再懸濁し、次に攪拌混合してエマルジョンを得た（未音波処理）。これらのエマルジョンは１mM陽イオン脂質濃度で作られた。本研究で用いられる音波処理調製物を作るために、脂質エマルジョンを、カップ容器および再循環水浴（35℃、２秒間の遅れを有する15分間の80%出力）を備えたBranson音波装置450ソニケーターを用いて音波処理した。比較トランスフェクション実験を行うことにより、相転移温度以上でのサイトフェクチンエマルジョンの音波処理はトランスフェクション効率を著しく変化させないことを測定した。さらに、70℃またはそれ以上での音波処理は薄層クロマトグラフィーにより測定された部分的な脂質分解をもたらした。
実施例14：細胞培養
NIH 3T3細胞をATCC（CRL 1658）から得て、10%ウシ血清を有するダルベッコ改良イーグル培地中で培養し、トランスフェクションの12〜24時間前にスタンダード24ウエル組織培養皿に塗布した。トランスフェクションのとき、細胞は約80%がコンフルーエントであった。CHO細胞（ATCC CCL 61）を、10%ウシ胎児血清を補充したHamのF12培地を用いて培養し、NIH 3T3について記載したように塗布した。
実施例15：培養細胞のトランスフェクション
NIH 3T3細胞を上記のように24ウエル組織培養プレートに塗布した。成長培地を吸引により除去し、細胞を0.5mlのPBS／ウェルで一回洗浄した。適当な量のDMEM（無血清）、プラスミドDNA（４マイクログラム）、リポソーム配合物を２mlのエッペンドルフチューブに800マイクロリットルの全体積になるまで連続的に加えることによりリポソーム／DNA複合体を形成した。典型的には、脂質エマルジョン24マイクロリットル（１mMサイトフェクチン、１mM DOPE）を用いてDNA ４マイクログラムを複合体化してサイトフェクチン：DNAモル電荷比を２：１とした。これらの物質の添加後、完全な攪拌混合および室温で15分間インキュベーションを行った。得られたトランスフェクション複合体のアリコート200マイクロリットルを各ウエルに加え（DNA １マイクログラム／ウエル、ｎ＝４）、細胞を37℃で４時間インキュベートした。このときに、500マイクロリットルの適当な成長培地＋10%ウシ血清／ウエルを加えて、溶解および分析前に約48時間培養した。次に、試料トランスフェクションは、再現性を確保するために、各細胞系に関して最低３回繰り返した。
実施例16：DNAまたは脂質／DNA複合体の気管支注入
体重が約20〜21グラムの（特定の病原菌を持たない）メスBalb／Cマウスをチャールズリバーラボラトリーズから得た。侵入法により麻酔を施し、動物をカリフォルニア大学、デービスのガイドラインにしたがってCO2吸入により殺した。DNAは点滴のために、滅菌水に希釈することにより調製した。脂質／DNA複合体は、モル電荷比（陽イオン脂質：DNA）４：１でプラスミドDNA 20マイクログラム（ルシフェラーゼ）を注射用滅菌水（全体積240ミリリットル）中に混合することにより調製した。混合物を調製し、室温で攪拌混合し、脂質：DNA複合体形成の５分以内に注射した。麻酔マウスに対して首の切開を前方首の皮膚を通した１cmの切り込みにて行い、唾液腺の切開と喉頭直下の前方気管周囲の筋肉組織の切開とを行い、咽喉下の１〜３気管環空間に挿入された１／２”30gの針を用いて、DNAまたは脂質／DNA複合体を240マイクロリットル注入した。注射後、唾液腺を気管欠損部に置き、表皮の首の傷を糸で閉じた。処理の48時間後にマウスを殺し、気管／肺ブロックを切開し、これを溶解緩衝液にホモゲナイズし、以下に記載のようにルシフェラーゼタンパク質をアッセイした。模擬物で処置したマウスの肺／気管をバックグランドルシフェラーゼ活性の評価のために用いた。コントロールの模擬物処置マウス組織には活性はまったく認められなかった。
実施例17：ルシフェラーゼのアッセイ
相対的なルシフェラーゼ活性はEnhanced Luciferase Assay Kitおよび単一光2010ルミノメーター（両方ともにカリフォルニア州、サンジエゴ所在のAnalytical Luminescence Laboratoriesから入手）を用いて行った。これは233.3mlの高濃度ルシフェラーゼ溶解緩衝液（最終濃度0.1Mリン酸カリウム、pH7.8、1% Triton X-100、1mM DTT、2mM EDTA）を各ウエルに直接適用し、細胞を氷に15分間置くことにより行った。成長培地の除去は溶解緩衝液の適用前に必要ではなかった。この技術は培地除去中に細胞損失の可能性を避けることにより再現性を高める。成長培地が除去された類似の実験は同様な結果を示した。溶解物31mlからのルシフェラーゼ発光を10秒間にわたって測定し、仮定された全溶解物体積933.3mlの関数として結果を表した。活性を、アッセイ条件、ルシフェラーゼ濃度、ルミノメーター光電子増倍管感度およびバックグラウンドの関数である相対光単位（relative light units）（RLU）として表されている。上記条件下で、相対光単位は等式［fgルシフェラーゼ＝（RLU／48.6）−824］によりルシフェラーゼタンパク質量に関連付けられる。
実施例18：対イオン種の生成
DOTAP類似体群を、イオン交換クロマトグラフィーを用いるアンモニウム頭部基に伴うアニオン性対イオンを変えることにより調製した。N-（1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウムヨウ化物（DOTAP）をSilivius法と類似の方法で調製した（Leventis, R. and Silvius, J. R.（1990）Fiochim. Biophys. Acta 1023, 124-132）。塩化物の置換は、Dowex強アニオン交換樹脂、8%架橋（200〜400メッシュ）、塩化物型を用いて行った。アセテートの置換はアニオン交換樹脂AG1−8×（200−４メッシュ）、アセテート型を用いて行い、残りの対イオンはこの樹脂の水酸化物型を用いて得た。塩化物またはアセテートイオンの交換は、対応する樹脂（1.0〜1.5g）を濾過高度純水（10〜20ml）に懸濁し、狭い内径のガラスカラムにかけることにより行った。カラムを水（５×、５ml）、メタノール（10×、５ml）で洗浄し、CH3OH／CH2Cl2（８：２）溶液で平衡化した。陽イオン脂質の溶液（CH3OH／CH2Cl2（８：２）約１ml中の脂質50〜70mg）を重力によりカラムから溶出させた。すべての他の対イオンの置換のために、水酸化物樹脂を、所望の対イオンの（そのナトリウム塩としての）１M溶液で洗浄することにより前処理した。次に、充填した樹脂を、溶出液のpHが約７で安定化するまで水で洗浄した。次に、イオン交換クロマトグラフィーを上記CH3OH／CH2Cl2平衡化手順を用いて行った。エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて得られた塩型の組成を確認した。
既に記載されたように調製され、トランスフェクトされ、そして次に分析された脂質フィルムおよび脂質-DNA複合体を用いることにより、トランスフェクションに対するこれらの対イオンの影響を調べた（Ruysschaert, J. M., el Quahabi, A., Willeaume, V., Huez, G., Fuks, R., Vandenbranden, M. and Di Stefano, P. 1994.哺乳類細胞のトランスフェクションのための新規な陽イオン両性親和物。Biochem. Biophys. Res. Commun. 203（3）: 1622-8）。P. pyralisルシフェラーゼをコードするプラスミドpNDCLux
実施例19：トランスフェクションのデータ
様々な文字の解釈は上記化合物および以下の略号、接頭語、または接尾語の一覧表、およびその関連する構造について参照することにより容易となる。
0004346111.tif 000029
0004346111.tif 000030
0004346111.tif 000031
0004346111.tif 000032
図１は、NIH 3T3細胞を用いるサイトフェクチン仲介DNAトランスフェクションの比較を示す。DNAトランスフェクションは、モル電荷比２：１（脂質電荷のDNAリン酸電荷に対する比）を用いて、実験方法に記載したように４同ずつ行った。これらのデータは脂質極性領域でのジヒドロキシエチル置換アンモニウム官能基の取込みがインビトロで著しく高いトランスフェクション効率をもたらすことを示している。DNA １マイクログラムのトランスフェクション後に可溶化した細胞から得られた全ルシフェラーゼ光単位（RLU）の平均（ｎ＝４）および標準偏差として棒グラフの形で、結果をまとめた。すべてのサイトフェクチンはDOPEで１：１のモル比で配合した。
図２において、サイトフェクチン仲介DNAトランスフェクションのインビボ比較を示す。Balb-Cマウスに、多様なトランスフェクションを用いてプラスミドDNAをトランスフェクトした。サイトフェクチン：DNA複合体の気管内注入は実験方法記載のように行った。これらのデータはジメトキシエチルとトリフルオロエチル置換アンモニウム官能基の脂質極性領域への導入は著しく高いトランスフェクション効能をインビボでもたらすことを示している。DNA 20マイクログラムによる処理の48時間後に溶解した気管／肺ブロックから得られた全ルシフェラーゼ光単位（RLU）の平均（ｎ＝４）および標準偏差として棒グラフの形で、結果をまとめた。
多様な化合物のトランスフェクション活性を図３に示す。図３からわかるように、本発明の-FEPおよびDMPのジオレオイル誘導体はトランスフェクションにおいて非常に有効である。一般的なトランスフェクション条件は上記の通りである。
図６に示すNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン極性領域の比較のために、サイトフェクチン：DOPEが１：１モル比のリポソーム配合物をpNDCLUXプラスミドDNA １mgと混合してモル電荷比２：１（脂質電荷のDNAリン酸電荷に対する比）を得る。得られた複合体は細胞表面上に直接置いた。トランスフェクションの48時間後に得られた細胞溶解物を、ルシフェラーゼ活性について分析した。各データ点は４つのトランスフェクションから得られた全光単位の平均値およびこの平均からの標準偏差を反映している。
図７はマウスへの気管内注入を示す。マウスへの気管内注入のために、ジオレイル疎水性領域が対応するジミリストイル類似体よりもさらに効果的である。また、誘導性官能基を導入するサイトフェクチンはマウス気管内トランスフェクションを増強する。
図８に示されたNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン対イオンの比較のために、サイトフェクチン：DOPEが１：１モル比のリポソーム配合物をpNDCLUXプラスミドDNA １mgと混合してモル電荷比２：１（脂質電荷のDNAリン酸電荷の比）を得る。得られた複合体は細胞表面上に直接置いた。トランスフェクションの48時間後に得られた細胞溶解物はルシフェラーゼ活性について分析した。各データ点は４つのトランスフェクションから得られた全光単位の平均値およびこの平均からの標準偏差を反映している。
図９に示すBalb-C肺におけるインビボトランスフェクションに対するサイトフェクチン対イオンの比較のために、pNDCLUXプラスミドDNAに多様なサイトフェクチン（２：１脂質／DNAリン酸電荷比）を混合して形成した脂質／DNA複合体をBalb-Cマウスにトランスフェクトした。サイトフェクチン：DNA複合体の気管内注入を他で記載されたように実施した（Balasubramaniam, R. P., Bennett, M. J., Aberle, A. M., Malone, J. G., Nantz, M. H. and Malone, R. W. 1996.陽イオントランスフェクション脂質の構造的および機能的分析：疎水性領域。Gene Ther. 3（2）:163-172）。DNA 20mgでの処置の48時間後に可溶化した気管／肺ブロックから得られた全ルシフェラーゼ光単位の平均（ｎ＝４）および標準偏差として棒グラフの形で、結果をまとめた。
図10に示したNIH 3T3細胞におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン疎水性構造の比較のために、サイトフェクチン：DOPEが１：１モル比のリポソーム配合物をpCMVLプラスミドDNA １mgと混合してモル電荷比２：１（脂質電荷のDNAリン酸電荷に対する比）を得た。得られた複合物を細胞表面に直接に置いた。トランスフェクションの48時間後に得られた細胞培養物はルシフェラーゼ活性について分析した。各データポイントは、４回のトランスフェクションから得られた全光単位の平均値およびこの平均からの標準偏差を反映する。
図11に紹介されたヒト気管支上皮細胞（16HBE14o-）におけるトランスフェクション活性に対するサイトフェクチン疎水性構造の比較のために、サイトフェクチン：DOPEが１：１モル比のリポソーム配合物をpCMVLプラスミドDNA １mgと混合してモル電荷比２：１（脂質電荷のDNAリン酸電荷に対する比）を得た。得られた複合物を細胞表面に直接に置いた。トランスフェクションの48時間後に得られた細胞培養物はルシフェラーゼ活性について分析した。各データポイントは、４回のトランスフェクションから得られた全光単位の平均値およびこの平均からの標準偏差を反映する。
図12に開示されるネズミ肺におけるルシフェラーゼ発現に対する配合条件の効果について、ルシフェラーゼ発現の全体的な増加が、固定された２：１電荷比において増加するDNA濃度とともに、音波処理（DOTAP-ビスルフェート）-DNA複合体について注意された。音波処理された複合体は既に記載されたように調製された（上記表３を参照のこと）。裸のDNAがコントロール比較のために設けられた。活性脂質DODMP-塩化物ならびにDOTAP-ビスルフェート（広く用いられているトランスフェクション脂質）の両方に対する加熱による音波処理の効果を示す実例を含む。
特定の態様によりこれまで本発明を説明してきた。他の態様は本明細書を鑑みれば当業者に示唆されるであろう。
理解し易くするために例示および実施例により本発明を詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲内である種の変更および改良を行ってもよいことは自明であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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