(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドがε−ポリリジンであるヘパリン吸着体。
【請求項２】
ε−ポリリジンを水不溶性担体に結合してなるヘパリン吸着体。
【請求項３】
ε−ポリリジンがストレプトマイセス属細菌により生産されたものである請求項１または２記載のヘパリン吸着体。
【請求項４】
ε−ポリリジンの平均分子量が５００〜１，０００，０００の範囲である請求項１〜３の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【請求項５】
ε−ポリリジンの平均分子量が１，０００〜１０，０００の範囲である請求項１〜３の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【請求項６】
水不溶性担体が水不溶性球状粒子である請求項２記載のヘパリン吸着体。
【請求項７】
水不溶性球状粒子の真球度が0.9以上である請求項６記載のヘパリン吸着体。
【請求項８】
水不溶性球状粒子が球状セルロース粒子である請求項６または７記載のヘパリン吸着体。
【請求項９】
球状セルロース粒子が、平均粒径50〜2000μｍを有するものである請求項８記載のヘパリン吸着体。
【請求項１０】
球状セルロース粒子が、排除限界分子量50万〜500万を有するものである請求項８または９記載のヘパリン吸着体。
【請求項１１】
球状セルロース粒子が、排除限界分子量80万〜300万を有するものである請求項８または９記載のヘパリン吸着体。
【請求項１２】
水不溶性担体が水不溶性中空糸である請求項２記載のヘパリン吸着体。
【請求項１３】
水不溶性担体が水不溶性膜である請求項２記載のヘパリン吸着体。
【請求項１４】
ε−ポリリジンと水不溶性担体とが、反応性の官能基を介して結合している請求項２〜１３の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘパリン吸着体、及びそれを用いたヘパリンの除去方法に関する。更に詳しくは、リガンドがε−ポリリジンであるヘパリン吸着体、およびそれを用いたヘパリンの除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは平均分子量5,000〜30,000のムコ多糖の１種であり、強力で安定した抗凝固作用を持ち、投与法も簡便で経済的にも安価であることから、抗血液凝固剤として人工透析などの体外循環治療法に使用されている。
しかしながら、ヘパリンは、長期にわたる、または大量の投与により出血助長作用を促し、また、血小板の活性化、骨多孔症、および動脈硬化などを進行させるといった問題を発生させる場合があった。
【０００３】
前述のような、血液中に投与した際のヘパリンの問題点を回避する方法としては、へパリンに親和性を持つ陽性タンパクである硫酸プロタミンを投与し中和する方法が従来行われてきた。この他にもへパリン代替物質となる抗凝固剤も開発検討されているが、安全な投与量や投与法が確立されていないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヘパリンの除去方法としては、架橋アガロース担体にフィブロネクチンの還元およびそのアルキル化誘導体をリガンドとして結合させたへパリン吸着体を用いたヘパリンの除去方法などを挙げることができるが、医療用として用いる際にはヘパリン吸着体としての能力が十分ではなく、架橋アガロース担体を用いたヘパリンの除去方法は、へパリン吸着体として効率が高いとはいえない場合があった。
【０００５】
本発明者らは、前述の従来の問題点に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、リガンドがε−ポリリジンである吸着体、または、ε−ポリリジンを水不溶性担体に結合してなるヘパリン吸着体であれば、ヘパリンの吸着能力が高く、この吸着体を用いれば、ヘパリンを含有する液体から、高い効率でヘパリンを除去することが可能であることを知見し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記の構成からなる。
（１）リガンドがε−ポリリジンであるヘパリン吸着体。
【０００７】
（２）ε−ポリリジンを水不溶性担体に結合してなるヘパリン吸着体。
【０００８】
（３）ε−ポリリジンがストレプトマイセス属細菌により生産されたものである前記第１項または第２項記載のヘパリン吸着体。
【０００９】
（４）ε−ポリリジンの平均分子量が５００〜１，０００，０００の範囲である前記第１項〜第３項の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【００１０】
（５）ε−ポリリジンの平均分子量が１，０００〜１０，０００の範囲である前記第１項〜第３項の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【００１１】
（６）水不溶性担体が水不溶性球状粒子である前記第２項記載のヘパリン吸着体。
【００１２】
（７）水不溶性球状粒子の真球度が0.9以上である前記第６項記載のヘパリン吸着体。
【００１３】
（８）水不溶性球状粒子が球状セルロース粒子である前記第６項または第７項記載のヘパリン吸着体。
【００１４】
（９）球状セルロース粒子が、平均粒径50〜2000μｍを有するものである前記第８項記載のヘパリン吸着体。
【００１５】
（１０）球状セルロース粒子が、排除限界分子量50万〜500万を有するものである前記第８項または第９項記載のヘパリン吸着体。
【００１６】
（１１）球状セルロース粒子が、排除限界分子量80万〜300万を有するものである前記第８項または第９項記載のヘパリン吸着体。
【００１７】
（１２）水不溶性担体が水不溶性中空糸である前記第２項記載のヘパリン吸着体。
【００１８】
（１３）水不溶性担体が水不溶性膜である前記第２項記載のヘパリン吸着体。
【００１９】
（１４）ε−ポリリジンと水不溶性担体とが、反応性の官能基を介して結合している前記第２項〜第１３項の何れか１項記載のヘパリン吸着体。
【００２０】
（１５）前記第１項〜第１５項の何れか１項記載のヘパリン吸着体を用いることを特徴とす
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本願第１の発明は、ε−ポリリジンをリガンドとして用いたヘパリン吸着体である。本発明においてはリガンドがε−ポリリジンであれば、該リガンドが固体の担体に結合していても、固体の担体に結合していなくても構わない。つまり、本発明のヘパリン吸着体は、リガンドであるε−ポリリジン自身がヘパリン吸着体であってもよく、また、水不溶性の担体などに結合した状態であってもよい。
【００２２】
また、本願第２の発明は、ε−ポリリジンを水不溶性担体に結合してなるヘパリン吸着体である。
【００２３】
本発明に用いるε−ポリリジンは、ストレプトマイセス属細菌により生産された微生物由来のものであっても、化学合成によって得られたものであっても構わない。
【００２４】
その中でもストレプトマイセス属細菌により生産された微生物由来のε−ポリリジンは、生分解性があることから生体適合性が高く、さらに、安価で大量入手が可能であることから、本発明に好ましく使用することができる。
【００２５】
本発明に用いるポリリジンの分子量は、取り扱いの容易さの面から、５００〜１，０００，０００の範囲のものであることが好ましく、特に好ましくは、１，０００〜１０，０００の範囲である。
【００２６】
本願第２の発明に使用することができる水不溶性担体とは、担体を構成する成分が非水溶性、あるいは水溶性の物質を架橋反応などの処理を行うことにより水不溶性とした物質からなる担体で、具体的には、架橋アガロース、セルロース、およびポリアクリルアミドなどを挙げることができる。
また、本発明に使用する水不溶性担体の形状は、球状粒子、中空糸、膜など、特に限定されるものではないが、その中でも球状粒子である場合には、製造、取り扱いが容易であり、担体あたりに結合するリガンド量も多く、本発明に好ましく使用することができる。
【００２７】
中空糸状の担体とは内部に連続または不連続の空洞を持つ繊維状の担体を示すもので、紡糸液に発泡剤を添加、または特殊な口金などを用いて内部に空洞を形成させたものである。
【００２８】
膜状の担体とは市販のメンブランフィルターのように平板状で多孔を有し、一定の範囲の排除限界分子量を持つもののことである。
【００２９】
本発明に使用する水不溶性球状粒子は、真球度が高いものであることが好ましい。真球度が高いとカラム等に充填した場合、均一に充填することが容易である。
本発明で云うところの真球度とは、粒子の最短径（短径）と最長径（長径）との比（短径／長径）であり、この値が１．０に近づくほど真球度が高いことを示す。
本発明に使用する水不溶性球状粒子の真球度は、０．９以上であることが好ましく、より好ましくは０．９５以上である。
【００３０】
水不溶性球状粒子の中でも、球状セルロース粒子は、安価で生体適合性が高く、また、従来ヘパリン除去用吸着体の担体として用いられてきた架橋アガロース担体と比べ強度、カラム耐圧性が高く、オートクレーブによる加圧高温滅菌にかけるも可能なことから、本発明に好ましく使用することができる。
【００３１】
本発明に使用する球状セルロース粒子の平均粒子径は、カラム充填時の取り扱いやすさの点から５０〜２０００μｍであることが好ましい。より好ましくは１００〜３００μｍである。該球状セルロース粒子の平均粒子径がこの範囲であればカラム内の液の流れをより安定化できる。
【００３２】
発明に使用する球状セルロース粒子は、多孔性であることが好ましい。その場合の孔の大きさや数は、ヘパリン除去の際の条件等によっても異なり一概に限定できるものではないが、ポリエチレンオキサイドを標準物質として測定した排除限界分子量で示すと５０万〜５００万であることが好ましく、より好ましくは８０万〜３００万である。ポリエチレンオキサイドによる排除限界分子量がこの範囲であればカラム内における血液成分の物理的な付着などの問題を抑制できる。
【００３３】
多孔性の水不溶性担体の製造方法は特に限定されるものではないが、球状セルロース粒子の場合を例に説明する。
例えば、特開昭５３−８６７４９号記載のように、セルロース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解し、この溶液を水性媒体中に懸濁させることによってセルロース酢酸エステルを球状化し、次いで有機溶媒を蒸発させてセルロースエステル粒子を得、これをケン化後セルロース粒子とすることによって、本発明に好ましい、多孔性球状セルロース粒子を得ることができる。
【００３４】
ε−ポリリジンと水不溶性担体との結合は、反応性の官能基を介して行えばよく、公知の方法をもちいて行えばよい。
その中でも、ε−ポリリジンと水不溶性担体との結合に、該反応性の官能基としてエポキシ化合物を用いたヘパリン吸着体であれば、水不溶性担体とリガンドであるε−ポリリジンとが強固に結合することから、該ヘパリン吸着体をヘパリンの除去に使用した場合であっても、リガンドの離脱が起こりにくく好ましい。
【００３５】
該反応性の官能基としてエポキシ化合物を用いて、ε−ポリリジンと水不溶性担体とを結合させる方法として、具体的に、水不溶性担体を、ビスオキシランと反応させてエポキシ基を導入し、このエポキシ基とε−ポリリジンを反応させる方法や、水不溶性担体をエピクロルヒドリンでエポキシ化し、これをアミノ化して無水コハク酸と反応させてカルボキシル基を導入し、この末端カルボキシル基とε−ポリリジンのアミノ基を縮合させる方法や、前記▲２▼の方法で得られた、カルボキシル基を導入した水不溶性担体とＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性タイプ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化物）としてε−ポリリジンと結合させる方法を挙げることができる。
【００３６】
本願第３の発明は、第１または第２の発明のヘパリン吸着体を用いて、ヘパリンを含む液体からヘパリンを除去する方法である。本発明の用途は特に限定されるものではないが、本発明は、人工透析時に血液凝固防止を目的として血液に添加されたヘパリンを除去する際に有効である。
その際の具体的な形態は、特に限定されるものではないが、本発明のヘパリン吸着体をカラムに充填し、体外循環治療装置のオンライン回路中に組み込まれて行う形態であることが好ましい。
【００３７】
より具体的には、患者の体内から取り出され、抗凝固剤としてヘパリンを加えられた血液、或いは血球と分離された血漿成分が、最初に体外循環装置の有害成分を取り除くカラムを通し、有害成分が除去された状態で患者の体内に戻る直前に、該血液若しくは該血漿成分を、本発明のヘパリン吸着体を充填したカラムに通し、過剰に加えられたヘパリンが取り除かれた状態の血液を患者の体内に戻す形態であることが好ましい。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．ヘパリン吸着体の調製
実施例１（本発明のヘパリン吸着体の調製）
平均粒径が８０μｍ、真球度が０．９５、ポリエチレンオキサイドを標準物質として測定した排除限界分子量が２００万のセルロース粒子100g（湿重量）を、200mlの純水に懸濁させ、撹拌しながら３０℃に昇温させた後、該懸濁液に２０％ＮａＯＨ溶液６０mlを加え、１時間撹拌した。次いでエピクロロヒドリン６０ｇを加え、２時間撹拌し反応させた。反応終了後、ろ過し、中性まで水洗した。このようにして得られたエポキシ活性化セルロース粒子100g（湿重量）に純水９０ｍｌ、ε−ポリリジン２５％溶液（チッソ株式会社製、分子量4、700）３０ｍｌを加え、４５℃で２時間撹拌し反応させた。反応終了後水洗し、球状セルロース粒子（本発明のヘパリン吸着体、以下「粒子A」）を得た。
【００３９】
比較例１
ε−ポリリジン２５％溶液（チッソ株式会社製、分子量4、700）を加える操作以降を省いた以外は、実施例１に準拠して操作を行い、球状セルロース粒子（エポキシ活性化セルロース粒子、以下「粒子Ｂ」）を得た。
【００４０】
２．ヘパリン吸着用カラムの作成
実施例１により得られた粒子Ａ、及び比較例１の粒子Ｂをリン酸バッファー（ｐＨ7.4，NaHPO4,3.3mM；Na2HPO4,6.7mM；NaCl,126.7mM;NaN3,25mM）で洗浄してゲルの平衡化を行った。ゲルの脱気を行った後、沈降体積で1mlの前記粒子Ａ，Ｂ２種をそれぞれポリプロピレン製カラム（内径9mm、高さ16mm：テルモ社製）に充填した。カラム入り口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径1mm、外径13mm、長さ1m）を装着し、血液回路付きカラムを作成した。粒子Ａ（実施例１）を用いたカラムをカラムＡとし、粒子Ｂ（比較例１）を用いたカラムをカラムＢとした。
【００４１】
３．ヘパリン除去
健常人から採決した血液に10mg/L血中(2.0 units/ml血中)の濃度となるようにヘパリンナトリウム溶液（シグマ社製）を添加し、この血液をテフロン製三角フラスコ（内容量100ml、サンワ（株）製）内に入れ、37℃の恒温槽にてスターラーチップを用いて低速で撹拌し、該血液を流速0.5ml/minでカラム内に通血した。血液がカラムの出口側から流出してきた時点を通液開始時とし、以降５分ごとにカラム出口側の血液を所定量採取した。血中ヘパリン濃度の測定はヘパリン濃度測定キットであるACCUCLOT/HEPTEST-HI（シグマ社製）を用いた。
【００４２】
測定の結果、カラムＡ（実施例１）においてはヘパリン濃度が通液開始10分後に初期濃度の約70%まで低下し、30分後には約20%まで低下し平衡となった。一方比較例として用いたカラムＢ（比較例１）の場合、通液開始後10分後に初期濃度の約80%まで低下が見られたが、その後ヘパリン濃度の低下は見られなかった。
【００４３】
【発明の効果】
リガンドがε−ポリリジンである本発明の吸着体、またはε−ポリリジンを水不溶性担体に結合してなるヘパリン吸着体であれば、ヘパリンの吸着能力が高く、この吸着体を用いれば、ヘパリンを含有する液体から、高い効率でヘパリンを除去することが可能である。