(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される単離されたDNA：
配列番号：1の4329位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入されたDNA；
配列番号：1の2178位のヌクレオチドがTであるDNA；
配列番号：1の4404位のヌクレオチドがTであり、配列番号：1の4405位のヌクレオチドが欠失しており、且つ配列番号：1の4409位のヌクレオチドがAであるDNA；
配列番号：1の4570位のヌクレオチドが欠失しているDNA；
配列番号：1の5244位のヌクレオチドがTであるDNA；および
配列番号：1の2190位のヌクレオチドの後にAが挿入されたDNA。
【請求項２】
請求項1に記載のDNAを組み入れたベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４】
核酸分子によってコードされるポリペプチドを生産する方法であって、請求項３記載の組換え宿主細胞を該核酸分子の発現に適した条件下で培養する段階を含む方法。
【請求項５】
請求項1に記載のDNAによってコードされるアミノ酸配列から選択される蛋白質。
【請求項６】
アルストレーム症候群の保因者をスクリーニングする方法であって、ALMS1における変異の保因者であると推定される者から得た遺伝物質を検査する段階を含み、遺伝子における変異の存在がアルストレーム症候群を示し、該変異が、
配列番号：1の4329位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入されたDNA；
配列番号：1の2178位のヌクレオチドがTであるDNA；
配列番号：1の4404位のヌクレオチドがTであり、配列番号：1の4405位のヌクレオチドが欠失しており、且つ配列番号：1の4409位のヌクレオチドがAであるDNA；
配列番号：1の4570位のヌクレオチドが欠失しているDNA；
配列番号：1の5244位のヌクレオチドがTであるDNA；および
配列番号：1の2190位のヌクレオチドの後にAが挿入されたDNA
からなる群より選択される方法。
【請求項７】
アルストレーム症候群の保因者をスクリーニングする方法であって、ALMS1における変異の保因者であると推定される者の組織試料において、配列番号：2に記載のALMS1における変異の保因者であると推定される者から得た遺伝物質を検査する段階を含む方法。
【請求項８】
a）以下に示される変異を含む、ALMS1のヌクレオチド配列の一部に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする連続したヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の標識核酸、および
b）該標識を検出するための試薬
を別々の容器に含む、ALMS1核酸の変異の存在に関して試料をアッセイするための試薬キットであって、
ALMS1の変異が、以下の変異、欠失、および挿入からなる群より選択される試薬キット：
配列番号：1の4329位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入される；
配列番号：1の2178位のヌクレオチドがTである；
配列番号：1の4404位のヌクレオチドがTであり、配列番号：1の4405位のヌクレオチドが欠失しており、且つ配列番号：1の4409位のヌクレオチドがAである；
配列番号：1の4570位のヌクレオチドが欠失する；
配列番号：1の5244位のヌクレオチドがTである；ならびに
配列番号：1の2190位のヌクレオチドの後にAが挿入される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルストレーム症候群に関連するDNA（ALMS1）、そのDNAの変異体（variant）、そのDNAによってコードされる蛋白質、およびアルストレーム症候群の保因者であるか否かを判定するために個体を検査するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルストレーム症候群は、高インスリン血症、慢性高血糖症、および神経感覚障害を伴う小児期肥満を特徴とする常染色体上の劣性ホモによる遺伝病である（非特許文献１および２を参照）。アルストレーム症候群の遺伝子座は遺伝的変更因子と相互作用する可能性が高いと思われるが、これは患者の複数の亜集団が、拡張型心筋症（非特許文献３）、肝機能障害（非特許文献４）、甲状腺機能低下症（非特許文献５）、類宦官症、低身長、軽度から中等度の発達遅延、ならびに2型糖尿病に通常伴う高脂血症およびアテローム性動脈硬化症などの二次性合併症などの別の特徴も呈するためである。アルストレーム症候群の遺伝子座は最初、フランス系アカディア人の大家系で染色体2p13の14.9cMの領域内にマッピングされ（非特許文献６）、その後、精度が高められて6.1cM区域にマッピングされた（非特許文献７および８）。
【０００３】
【非特許文献１】
Alstrom, C.H.、Haligren, B.、Nilsson, L.B.およびAsander, H.、肥満、糖尿病および神経性難聴を合併する網膜変性症・ローレンス-ムーン-ビードル症候群とは異なる(これまで記載されていない)特有の症候群・大規模家系に基づく臨床内分泌学的および遺伝学的な検討（Retinal degeneration combined with obesity, diabetes mellitus and neurogenous deafness. A specific syndrome (not hitherto described) distinct from Laurence-Moon-Biedl syndrome. A clinical endocrinological and genetic examination based on a large pedigree）、「Acta Phychiatr Neurol Scand」、1959年、第34巻（補遺129）、p.1〜35
【非特許文献２】
Goldstein, J.L.およびFialkow, P.J.、「Medicine Baltimore」、1973年、第52巻、p.53〜71
【非特許文献３】
Michaud, J.L.ら、「J Ped」、1996年、第128巻、p.225〜229
【非特許文献４】
Connolly, M.B.ら、「Am J Med Genet」、1991年、第40巻、p.421〜424
【非特許文献５】
Charles, S.J.、Moore, A.T.、Yates, J.R.、Green, T.およびClark, P.、アルストレーム症候群：常染色体劣性遺伝および内分泌機能障害に関するさらなる証拠（Alstrom's syndrome: further evidence of autosomal recessive inheritance and endocrinological dysfunction）、「J Med Genet」、1990年、第27巻、p.590〜592
【非特許文献６】
Collin, G.B.、Marshall, J.D.、Cardon, L.R.およびNishina, P.M.、「Hum-Mol-Genet」、1997年、第6巻、p.213〜219
【非特許文献７】
Collin, G.B.ら、「Hum Genet」、1999年、第105巻、p.474〜479
【非特許文献８】
Macari, F.ら、「Hum Genet」、1998年、第103巻、p.658〜661
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルストレーム症候群に関連するDNA、そのDNAの変異体、そのDNAによって産生される蛋白質を提供することを課題とする。さらに、アルストレーム症候群の保因者であるか否かを判定するために個体を検査するためのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ポジショナルクローニングの手法を用いて、それまで特徴が明らかでなかった転写物KIAA0328を同定し、アルストレーム症候群に関して分離された6つの血縁関係のない家族に属する罹患個体では、それに4つのフレームシフト変異および2つのナンセンス変異を含む配列変異があることを変異解析によって明らかにした。ALMS1は、低レベルで普遍的に発現され、これまで報告された他の遺伝子とは明らかな配列相同性のない新規遺伝子である。ALMS1遺伝子の同定により、アルストレーム症候群、ならびにその表現型の上での特徴である肥満、高インスリン血症、および高血糖などの一般的疾患の双方の解明につながる新たな道への入り口が開かれた。ALMS1遺伝子は、遺伝子の変異に関して遺伝子検査を行うことにより、または患者組織において遺伝子によってコードされる蛋白質の産生レベルが十分であるかを検査することにより、アルストレーム症候群の診断に用いることができる。また、ALMS1の同定により、個体がアルストレーム症候群の保因者であるか否かを遺伝子検査によって判定するためのスクリーニングも可能となる。
【０００６】
本発明に係るDNAにおいては、（１）ALMS1を含むDNAであることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明に係るALMS1のDNAにおいては、（２）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列を含むALMS1のDNAであることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明に係るDNAにおいては、（３）ALMS1またはALMS1の相補配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするDNA、およびALMS1と同一のアミノ酸配列をコードするDNAからなる群より選択されるDNAであることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係るDNAにおいては、（４）配列番号：2に記載のALMS1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係るDNAにおいては、（５）アルストレーム症候群と関連のある変異を有するALMS1を含むDNAであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係るDNAにおいては、（６）ALMS1の3737位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入されたALMS1を含むDNA；ALMS1の1582位のヌクレオチドがTであるALMS1を含むDNA；ALMS1の3808位のヌクレオチドがTであり、ALMS1の3809位のヌクレオチドが欠失しており、且つALMS1の3813位のヌクレオチドがAであるALMS1を含むDNA；ALMS1の3974位のヌクレオチドが欠失しているALMS1を含むDNA；ALMS1の4648位のヌクレオチドがTであるALMS1を含むDNA；およびALMS1の1594位のヌクレオチドの後にAが挿入されたALMS1を含むDNAからなる群より選択される、上記(1)〜(5)のいずれか一項に記載のDNAであることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る核酸構築物においては、（７）ベクターと、上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載のDNAからなる群より選択されるDNAを含む核酸分子とを含む、核酸構築物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る組換え宿主細胞においては、（８）上記(7)記載のベクターを含む組換え宿主細胞であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（９）上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載のDNAを含むトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１０）ALMS1核酸分子またはその部分を含み、該核酸分子またはその部分の転写および/または発現がALMS1ポリペプチドの合成低下を引き起こす、トランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係るトランスジェニック真核細胞においては、（１１）ALMS1核酸分子またはその部分を含み、該核酸分子またはその部分の転写および/または発現がALMS1ポリペプチドの合成低下を引き起こす、トランスジェニック真核細胞であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る方法においては、（１２）核酸分子によってコードされるポリペプチドを生産する方法であって、上記(8)記載の組換え宿主細胞を該核酸分子の発現に適した条件下で培養する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１３）上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載のDNAおよびmALMSによってコードされるアミノ酸配列から選択される蛋白質であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（１４）配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係るポリペプチド変異体においては、（１５）ALMS1ポリペプチド変異体であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る抗体またはその抗原結合性断片においては、（１６）上記(13)〜(15)のいずれか一項に記載のポリペプチドと選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る方法においては、（１７）アルストレーム症候群の診断方法またはアルストレーム症候群の保因者をスクリーニングする方法であって、ALMS1における変異の保因者であると推定される者から得た遺伝物質を検査する段階を含み、遺伝子における変異の存在によってアルストレーム症候群であることが示される方法であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る方法においては、（１８）患者におけるアルストレーム症候群を診断する方法であって、患者の組織試料における、ALMS1によってコードされる蛋白質の有無を決定する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（１９）ALMS1によってコードされる蛋白質の有無を決定する段階が、ALMS1によってコードされる蛋白質に対して特異的な抗体を組織試料由来の蛋白質に添加する段階、および組織試料由来の蛋白質と結合する抗体の量を決定する段階によって行われる、上記(18)記載の方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る試薬においては、（２０）ALMS1核酸の存在に関して試料をアッセイするための試薬であって、該ALMS1遺伝子のヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む核酸を含む試薬であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る試薬キットにおいては、（２１）ALMS1核酸の変異の存在に関して試料をアッセイするための試薬キットであって、
a）ALMS1のヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の標識核酸、および
b）該標識を検出するための試薬
を別々の容器に含む試薬キットであることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る試薬キットにおいては、（２２）ALMS1の変異が、以下の変異、欠失、および挿入からなる群より選択される、上記(21)記載の試薬キットであることを特徴とする：ALMS1の3737位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入される；ALMS1の1582位のヌクレオチドがTである；ALMS1の3808位のヌクレオチドがTであり、ALMS1の3809位のヌクレオチドが欠失しており、且つALMS1の3813位のヌクレオチドがAである；ALMS1の3974位のヌクレオチドが欠失する；ALMS1の4648位のヌクレオチドがTである；ならびにALMS1の1594位のヌクレオチドの後にAが挿入される。
【００２８】
また、本発明に係る試薬キットにおいては、（２３）ALMS1蛋白質の存在に関して試料をアッセイするための試薬キットであって、ALMS1蛋白質またはALMS1蛋白質の変異体と選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片と、結合した抗体またはその抗原結合性断片を検出するための手段とを含む試薬キットであることを特徴とする。
【００２９】
【発明の実施の形態】
したがって、本発明は、ALMS1を含むDNAを提供する。本明細書で用いる「ALMS1」という用語は、アルストレーム症候群と関連のある遺伝子を含む染色体2p13上の核酸分子のことを指し、ALMS1ポリペプチドをコードする単離された核酸分子の一部または断片、好ましくは配列番号：2のALMS1ポリペプチドをコードする配列を含む核酸のことも指す。さらにもう1つの態様において、核酸分子には配列番号：1またはその相補配列が含まれる。さらにもう1つの態様において、本発明は、ALMS1またはALMS1の相補配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、サムブルック （Sambrook）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、USAに記載された標準的なハイブリダイゼーション条件下で、2つの核酸断片が互いにハイブリダイズ可能であることを意味する。より具体的には、本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」とは、250mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)、7％（w/v）SDS、1％（w/v）BSA、1mmol/l EDTA、および0.1mg/ml一本鎖サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で行う65℃でのハイブリダイゼーションのことを指す。最終的な洗浄は、125mmol/l リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)、1mmol/l EDTA、および1％（w/v）SDS中にて65℃で行う。
【００３０】
本発明の核酸分子は、RNA、例えばmRNAでもよく、cDNAおよびゲノムDNAなどのDNAでもよい。DNA分子は二本鎖または一本鎖でもよい；一本鎖のRNAまたはDNAは、コード鎖もしくはセンス鎖でもよく、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖でもよい。核酸分子は遺伝子のコード配列の全体または一部を含むことができ、さらにイントロンならびに調節配列を含む非コード3'側および5'側配列などの他の非コード配列を含むこともできる。さらに、核酸分子をマーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製に役立つポリペプチドをコードする配列と融合させることもできる。このような配列は当技術分野で周知である。本発明の核酸分子は、単離された核酸分子であることが好ましい。
【００３１】
本発明のさらにもう1つの局面において、核酸は、アルストレーム症候群と関連のある変異を有するALMS1を含む。1つの好ましい態様において、核酸には、ALMS1またはALMS1の相補配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするDNA、ALMS1と同一のアミノ酸配列をコードするDNA、ならびに、配列番号：2に記載のALMS1ポリペプチドをコードする配列を含む核酸からなる群より選択されるDNAが含まれ、但し、変異が、ALMS1の3737位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入されたALMS1を含むDNA；ALMS1の1582位のヌクレオチドがTであるALMS1を含むDNA；ALMS1の3808位のヌクレオチドがTであり、ALMS1の3809位のヌクレオチドが欠失しており、ALMS1の3813位のヌクレオチドがAであるALMS1を含むDNA；ALMS1の3974位のヌクレオチドが欠失しているALMS1を含むDNA；ALMS1の4648位のヌクレオチドがTであるALMS1を含むDNA；およびALMS1の1594位のヌクレオチドの後にAが挿入されたALMS1を含むDNAからなる群より選択される。
【００３２】
本発明のもう1つの局面は、本発明の核酸分子のいずれか1つを含む核酸構築物に関する。本構築物には、本発明の配列がセンス方向またはアンチセンス方向に挿入されたベクター（例えば、発現ベクター）が含まれる。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、それと結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子のことを指す。
【００３３】
組換えALMS1核酸分子、アンチセンス分子、このような核酸分子またはアンチセンス分子を組み入れたベクターは、分子生物学の当業者に知られた方法によって作製することができる。例えば、ベクターの選択は所望の機能に依存すると考えられ、これにはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子工学に通常用いられる他のベクターが含まれる。種々のプラスミドおよびベクターの構築に用いうる当業者に周知の方法については、例えば、サムブルック（Sambrook）、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory（1989）N.Y.、およびアウスユーベル（Ausubel）、分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.（1989）、（1994）に記載された技法を参照のこと。または、標的細胞への送達のために核酸分子およびベクターをリポソーム中に再構成することもできる。特定のポリペプチドの発現が必要な場合には関連配列を発現ベクターに導入することができる。代表的なクローニングベクターには、pBscpt sk、pGEM、pUC9、pBR322、およびpGBT9が含まれる。代表的な発現ベクターには、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、pET、pGEX、pMALC、pPIC9、pBacが含まれる。本発明の組換え核酸構築物は、原核細胞または真核細胞、例えば細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞における本発明のポリペプチドの発現のために設計することができる。その他の適した宿主細胞は当業者に知られている。
【００３４】
本発明のもう1つの局面は、本発明の組換え核酸構築物が導入された組換え宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。これらの用語が特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または将来の子孫も指すことは理解されている。
【００３５】
本核酸構築物は、当業者に周知の通常の形質転換法またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。
【００３６】
培養下にある原核宿主細胞または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドの生産に用いうる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを生産するための方法も提供する。1つの態様において、本方法は、本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸構築物が導入されたもの）を、前記核酸分子の発現に適した条件下で培養することを含む。もう1つの態様において、本方法はさらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離することを含む。
【００３７】
本発明の宿主細胞を、非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いることもできる。例えば、1つの態様において、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。続いて、このような宿主細胞を用いて、外因性ヌクレオチド配列がゲノム中に導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ヌクレオチド配列が改変された相同組換え動物を作製することができる。このような動物は、ヌクレオチド配列およびその配列によってコードされるポリペプチドの機能および/または活性を検討するため、ならびにそれらの活性の変更因子を同定および/または評価するために有用である。本明細書で用いる「トランスジェニック動物」は、動物の1つまたは複数の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどの齧歯動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、成熟動物のゲノム中に維持されることにより、トランスジェニック動物の1つまたは複数の細胞種または組織においてコード遺伝子産物の発現を誘導する外因性DNAである。胚操作および微量注入を介したトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製するための方法は当技術分野で一般的なものとなっている。トランスジェニック胚の作製およびそれらのスクリーニングは、例えば、ジョイナー（A.L. Joyner）編、遺伝子ターゲティング、実践的アプローチ（Gene Targeting, Practical Approach）（1993）、Oxford University Pressに記載された通りに行うことができる。
【００３８】
このため、本発明は、本発明の核酸を含むトランスジェニック動物にも関する。本発明は、前記トランスジェニック動物に由来するトランスジェニック細胞および組織も提供する。本発明の1つの好ましい態様において、前記トランスジェニック細胞、組織または非ヒト動物は、対応する野生型の細胞、組織または非ヒト動物と比べてALMS1発現レベルの実質的な低下または上昇を示す。好ましくは、前記のALMS1発現レベルの実質的な低下または上昇は、トランスジェニック細胞、組織または非ヒト動物の変化した典型的な反応をもたらす。通常、ALMS1発現レベルの低下を示す前記トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも1つのALMS1変異型対立遺伝子、または異なる遺伝子の対応するトランス優性対立遺伝子を含む。好ましくは、前記トランスジェニック非ヒト動物はALMS1ノックアウト動物である。特に好ましい態様において、前記トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。
【００３９】
また、トランスジェニック動物の発生および/または生存期間の何らかの時期に、ALMS1ポリペプチドの発現または機能を不活性化することも望ましいと考えられる。これは例えば、ALMS1をコードするRNAをコードするRNA転写物を標的とするアンチセンスまたはリボザイムの発現を誘導する、組織特異的な、発生および/または細胞によって調節および/または誘導されるプロモーターを用いて行うことができる。適した誘導系は、例えば、ゴッセン（Gossen）およびブヤード（Bujard）、Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA（1992）、5547〜5551、ならびにゴッセン（Gossen）ら、Trends Biotech. 12（1994）、58〜62に記載されたような、テトラサイクリンによって誘導される遺伝子発現である。同様に、（変異型）ALMS1ポリペプチドの発現をこのような調節要素によって制御することもできる。
【００４０】
さらに、本発明は、ALMS1核酸分子またはその部分を（好ましくはゲノム中に安定的に組み込まれた形で）含み、核酸分子またはその部分の転写および/または発現がALMS1ポリペプチドの合成低下を引き起こすような、トランスジェニック非ヒト動物および真核細胞にも関する。1つの好ましい態様において、この低下はアンチセンス、センス、リボザイム、コサプレッションおよび/または優性変異の作用によって達成される。「アンチセンス」および「アンチセンスヌクレオチド」とは、天然に生じる遺伝子産物の発現を阻止するDNA構築物またはRNA構築物のことを意味する。
【００４１】
これを達成するための技法は当業者に周知である。これらには例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、アンチセンスおよびリボザイムの機能を兼ね備えた分子、ならびに/またはコサプレッション作用をもたらす分子の発現が含まれる。細胞内のALMS1ポリペプチドの量を減少させるためにアンチセンスの手法を用いる場合には、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は、形質転換に用いる動物種と相同な起源であることが好ましい。しかし、ALMS1ポリペプチドをコードする内因性核酸分子に対して高度の相同性を示す核酸分子を用いることも可能である。この場合には、相同性は好ましくは80％よりも高く、特に90％よりも高く、さらにより好ましくは95％よりも高い。トランスジェニック真核細胞におけるALMS1ポリペプチドの合成低下は、例えばアルストレーム症候群で認められるような変化を引き起こす可能性がある。このような細胞を含むトランスジェニック動物では、これによってさまざまな生理的、発生的、および/または形態的な変化が引き起こされる可能性がある。
【００４２】
本発明は、ALMS1によってコードされる蛋白質およびポリペプチド、ならびにその断片および変異体、さらには本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドにも関する。本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体のことを指し、特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質は、ポリペプチドの定義に含まれる。本発明のポリペプチドは単離されたポリペプチドであることが好ましい。本発明のポリペプチドは均一になるまで精製することができる。ポリペプチドが均一になるまで精製されていない調製物も有用であることは理解されている。特に重要な特徴は、他の成分がかなりの量存在していても、調製物がポリペプチドの必要な機能およびその同定を許容することである。したがって、本発明は、さまざまな程度の純度の本発明のポリペプチドを含む。
【００４３】
1つの態様において、本発明は、以下の群より選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドを提供する：ALMS1を含むDNA、ALMS1またはALMS1の相補配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするDNA、mALMS1、アルストレーム症候群と関連のある変異を含む前記の核酸配列、ならびに以下のものからなる群より選択される変異、欠失、および挿入を有するALMS1を含むDNA：ALMS1の3737位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入される；ALMS1の1582位のヌクレオチドがTである；ALMS1の3808位のヌクレオチドがTであり、ALMS1の3809位のヌクレオチドが欠失しており、且つALMS1の3813位のヌクレオチドがAである；ALMS1の3974位のヌクレオチドが欠失する；ALMS1の4648位のヌクレオチドがTである；ならびにALMS1の1594位のヌクレオチドの後にAが挿入される。
【００４４】
1つの好ましい態様において、本発明は、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４５】
本発明のポリペプチドには、断片および配列変異体も含まれる。変異体には、ある生物体の同一の遺伝子座によってコードされる実質的に相同なポリペプチド、例えば対立遺伝子変異体ならびに他のスプライス変異体が含まれる。変異体には、ある生物体の別の遺伝子座によってコードされるが同一の蛋白質ファミリーに属する実質的に相同なポリペプチド、さらには別の生物体に由来する実質的に相同または同一なポリペプチド、例えばオルソログも含まれる。また、変異体には、化学合成または組換え法によって生産される実質的に相同または同一なポリペプチドも含まれる。
【００４６】
したがって、本発明は、ALMS1ポリペプチドの実質的に相同な変異体を含む。このような変異体は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当技術分野で知られた一般的な規則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復および置換を含む。例えば、表現型に影響しない（phenotypically silent）アミノ酸置換を行うための手引きは、ボウイ（Bowie）、Science 247（1990）、1306〜1310に示されており、そこで著者らはアミノ酸配列の変化に対する耐性を検討するためには主に2つの手法があることを示している。1つの好ましい態様において、ALMS1ポリペプチドの変異体は、本発明のALMS1アミノ酸配列との同一性が90％を上回るアミノ酸配列を含む。
【００４７】
ALMS1の変異体は、保存的アミノ酸置換のほかに、以下のものを含む：（i）1つもしくは複数の非保存的なアミノ酸残基による置換、この際、置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでもそうでなくともよい、または（ii）置換基を有する1つもしくは複数のアミノ酸残基による置換、または（iii）成熟ポリペプチドと別の化合物、例えばポリペプチドの安定性および/もしくは溶解性を高める化合物（例えば、ポリエチレングリコール）との融合、または（iv）ポリペプチドと他のアミノ酸、例えばIgG Fc融合領域ペプチドもしくはリーダー配列もしくは分泌配列もしくは精製を容易にする配列との融合。このような変異体ポリペプチドは、本明細書の開示により、当業者の扱う範囲内に含まれるものと考えられる。
【００４８】
例えば、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸による荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含むALMS1ポリペプチドの変異体は、凝集性が低いというように改善された特徴を備えた蛋白質を産生する可能性がある。医薬製剤の凝集は、活性を低下させるとともに、凝集物の免疫原活性のために排出も増加させる。例えば、ピンカード（Pinckard）、Clin. Exp. Immunol. 2（1967）、331〜340；ロビンス（Robbins）、Diabetes 36（1987）、838〜845；クリーランド（Cleland）、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10（1993）、307〜377を参照のこと。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、それを自然に発現する細胞から精製すること、それを発現するように組換え操作によって改変された細胞から精製すること、または既知の蛋白質合成法を用いて合成することが可能である。1つの態様において、ポリペプチドは組換えDNA技術によって生産される。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、抗体の産生または免疫応答の誘発に用いることができる。本ポリペプチドを、それと結合する分子の生体液中のレベルを定量的に決定するためのアッセイ法において試薬、例えば標識試薬として用いることもできる。さらに、本ポリペプチドを、対応する結合性物質を単離するため、および結合相互作用に対するペプチド性もしくは低分子性のアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングを行うためのマーカーとして用いることもできる。
【００５１】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドと選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。本発明の抗ALMS1（または抗ALMS1変異体）抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒトまたはヒト化抗体、霊長類化抗体、異種抗体、キメラ抗体、またはALMS1ポリペプチドと特異的に結合するその断片のいずれでもよく、さらに二重特異性抗体、合成抗体、Fab、FvもしくはscFv断片などの抗体断片、またはこれらのいずれかの化学修飾誘導体も含まれる。抗体を作製するための一般的な方法は周知であり、例えば、ケーラー（Kohler）およびミルシュタイン（Milstein）、Nature 256（1975）、494に記載があり、ハレル（J.G.R. Hurrel）編、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技法および応用（Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications）」、CRC Press Inc.、Boco Raron、FL（1982）に総説がなされているほか、ミムス（L.T. Mimms）ら、Virology 176（1990）、604〜619にも開示されている。さらに、前記のポリペプチドに対する抗体またはその断片を、例えば、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体、実験マニュアル（Antibodies、Laboratory Manual）」、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988に記載された方法を用いて入手することもできる。
【００５２】
一般的に、本発明の抗体は、標準的な技術、例えばアフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降により本発明のポリペプチドを単離するために用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体を用いて、ポリペプチド発現の量およびパターンを評価するためにポリペプチドを検出することができる（例えば、細胞溶解液、細胞上清、または組織試料において）。抗体を診断的に用いて、臨床試験技法の一部として組織中の蛋白質レベルをモニターすることができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させることによって容易に実施することができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。
【００５３】
本発明はまた、個体におけるALMS1遺伝子または遺伝子産物の存在に関連したアルストレーム症候群を診断する方法にも関する。診断アッセイ法は、ALMS遺伝子発現を評価するため、またはALMS1ポリペプチドの存在もしくは活性を評価するために設計することができる。このアッセイ法は、生体試料の場合に用いることができ、それによって個体がアルストレーム症候群に罹患しているか、またはアルストレーム症候群を発症するリスクがあるか否かを判定することができる。本発明はまた、個体がアルストレーム症候群の保因者であるか否か、およびアルストレーム症候群を発症しやすいか否かを決定するための予後的アッセイ法を提供する。
【００５４】
本明細書に記載の核酸、ポリペプチド、および抗体は、アルストレーム症候群またはアルストレーム症候群に対する感受性を診断する方法に用いることができるのみならず、アルストレーム症候群の診断またはアルストレーム症候群に対する感受性を調べるキットに用いることができる。
【００５５】
本発明の1つの態様において、遺伝子に変異が存在すればアルストレーム症候群であることが示される、推定の保因者からの遺伝物質をALMS1における変異に関して試験することを含む、アルストレーム症候群を診断する方法またはアルストレーム症候群の保因者をスクリーニングする方法が提供される。
【００５６】
上記の診断方法の多くにおいて、核酸プローブが重要な要素として組み入れられる。プローブを用いて標的配列の存在を検出する場合、血液または血清のような分析すべき生体試料を処理して核酸を抽出してもよい。試料核酸は、標的配列の検出を促進するために様々な方法、例えば変性、制限酵素消化、電気泳動、またはドットブロットにより調製してもよい。検体である核酸の標的領域は通常、プローブの標的化配列とのハイブリッドを形成するために、少なくとも部分的に一本鎖でなければならない。配列が本来一本鎖であれば、変性は必要ないと思われる。しかし、配列が二本鎖の場合、配列は変性させる必要があると思われる。変性は、当技術分野で既知の様々な技術によって行うことができる。
【００５７】
標的核酸、プローブ、および検体は、プローブ中の標的配列と分析物中の推定の標的配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件でインキュベートすることができる。検体を結合するために用いられるプローブの領域は、ヒト2番染色体の標的化領域と完全に相補的であるように作製しなければならない。したがって、擬陽性を防ぐために高ストリンジェントな条件が望ましい。しかし、高ストリンジェントな条件は、プローブがゲノムにおいて独自である染色体領域に対して相補的である場合に限って用いられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーションおよび洗浄技法の際の多くの因子によって決定される。これらの因子は、例えば、マニアティスら（Maniatis）「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratry Manual）」、Cold Springs Harbor Laboratory、1982年、およびサムブルック（Sambrook）ら、1989年において概要されている。特定の状況では、標的配列を検出する手段を提供するために、三本鎖、四本鎖等のような高次ハイブリッドの形成が望ましい可能性がある。
【００５８】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチ数の他に、塩濃度、温度、または有機溶媒のような条件によって影響を受けると思われる。ストリンジェントな温度条件は一般的に、30℃を超える温度、典型的に37℃を超える温度、および好ましくは45℃を超える温度が含まれる。ストリンジェントな塩条件は、通常、1000 mM未満、典型的に500 mM未満、および好ましくは200 mM未満であると考えられる。しかし、パラメータを組み合わせることは、如何なる単一のパラメータの測定よりはるかに重要である。プローブの配列はまた、三重鎖または他の高次DNA複合体を形成するために特定の条件下で二本鎖DNAに対して特異的にハイブリダイズしてもよい。そのようなプローブの調製および適したハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知である。
【００５９】
得られたハイブリッドの検出は、必要な場合には、通常、標識プローブを用いることによって行う。または、プローブは標識しなくてもよく、直接的または間接的に標識されたリガンドとの特異的結合によって検出可能となってもよい。適した標的、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は、当技術分野で既知であり、例えば既知の方法（例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、またはカイネーシング）によって組み入れてもよい放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えばジオキセタン、特に誘発ジオキセタン）、酵素、抗体等が含まれる。この基本スキームの変法は当技術分野で既知であり、これらには、外因性物質より検出されるハイブリッドの分離を促進する、および／または標識部分からのシグナルを増幅するそれらの変法が含まれる。これらの変法の多くは例えば、マシューズ＆クリッカ（Matthews and Kricka、Anal. Biochem. 169：1、1988）；およびランドグレンら（Landegren、Science 242：229、1988）；ミットリン（Mittlin、1989）において論評されている。
【００６０】
上記のように、PCRに基づかない多くのスクリーニングアッセイ法が本発明において考慮される。1つの技法は、核酸プローブ（または正常なホスホジエステルを置換するメチルホスホネート骨格のような類似体）を、低濃度で存在するDNA標的とハイブリダイズさせる。このプローブは、共有結合によってハイブリダイゼーションの特異性が妨害されないように、プローブに酵素を共有結合させてもよい。次に、この酵素-プローブ-結合体と標的核酸との複合体を、遊離のプローブ酵素結合体から単離することができ、酵素を検出するために基質を加える。酵素活性は、その結果感受性が増加する発色または発光量の変化として認められる。オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリホスファターゼ結合体の調製およびハイブリダイゼーションプローブとしてそれらを用いることに関する例については、ヤブロンスキーら（Jablonski、N.A.R. 14：6115〜6128、1986）を参照のこと。二段階標識増幅方法論は、当技術分野で既知である。これらのアッセイ法は、小型のリガンド（ジゴキシゲニン、ビオチン等のような）が、本発明のALMS1配列に特異的に結合することができる核酸プローブに結合するという原理に基づいて行う。対立遺伝子特異的プローブも同様に本発明の範囲内であると考慮され、例示的な対立遺伝子特異的プローブには、素因となる本発明の変異を含むプローブが含まれる。
【００６１】
1つの態様において、核酸プローブに結合した小型のリガンドは、抗体-酵素結合体によって特異的に認識される。もう1つの態様において、ジゴキシゲニンは、核酸プローブに結合する。ハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ結合体に結合した抗ジゴキシゲニン抗体によって検出する。アルカリホスファターゼは、化学発光基質を改変して、その後これを検出することができる。この態様に従って核酸プローブを標識する方法に関しては、マーチンら（Martin、BioTechniques 9：762〜768、1990）を参照のこと。第二の例において、小型のリガンドは、第一のリガンドと特異的に複合体を形成することができる第二のリガンド-酵素結合体によって認識される。本実施例の周知の態様は、ビオチン-アビジン型相互作用である。核酸プローブを標識する方法、およびそれらをビオチン-アビジンに基づくアッセイ法において用いる方法に関しては、ヌグエンら（Nguyen、BioTechniques 13：116〜123、1992）を参照のこと。同様に、本発明の核酸プローブアッセイ法が、ALMS1変異を検出することができる核酸プローブの組み合わせを利用することも、本発明の範囲内であると考慮される。このように、細胞試料における変異の有無を検出するための1つの例において、遺伝子に対して相補的な1つ以上のプローブを用い、特に、異なるプローブの数は、または2、3、または5個の異なる核酸プローブ配列である。もう1つの例において、患者におけるALMS1配列の多型の有無を検出するために、遺伝子と相補的な1つ以上のプローブを用いる。
【００６２】
先に考察した技術の1つによって何らかの配列の差異が認められる場合には、その個体は、アルストレーム症候群に関連する可能性があるALMS1の分子変異体を有すると同定されると思われる。これらの変異体は多くの形態をとることができ、コード領域と非コード領域の双方で起こりうる。発現された遺伝子に関連した特定の変異は、異常な蛋白質を産生するか、または蛋白質の発現を有意に変化させうるであろう。さらなる破壊的変異には、小規模のフレーム内欠失；およびシステインへの変化もしくはシステイン残基からの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への変化もしくはその逆、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化もしくはその逆のような、産生される蛋白質に対して有意な影響を及ぼしうる非保存的塩基対置換；または二次もしくは三次蛋白質構造に影響を及ぼすその他の多型が含まれる。サイレント多型または保存的アミノ酸置換が起こる多型は一般的に、蛋白質機能を破壊しないと予想される。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、患者の組織試料においてALMS1によってコードされる蛋白質の有無を決定することを含む、患者におけるアルストレーム症候群を診断する方法が提供される。ALMS1ポリペプチドの存在は、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む様々な方法によって調べることができる。この方法の好ましい態様において、ALMS1によってコードされる蛋白質の有無を決定することは、ALMS1によってコードされる蛋白質に対して特異的な抗体を、組織試料由来の蛋白質に添加する段階、および組織試料由来の蛋白質に結合する抗体量を決定する段階によって行われる。
【００６４】
診断方法において有用なキット（例えば、試薬キット）は、例えばハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマー、標識分子を検出するための試薬、制限酵素、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変異型もしくは天然型のALMS1ポリペプチドに結合する抗体、ALMS1を含む核酸を増幅するための手段、またはALMS1の核酸配列を分析するための手段、もしくはALMS1ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段等を含む、本明細書に記載の任意の方法において有用な成分を含む。
【００６５】
したがって、本発明は、ALMS1核酸の存在に関して試料をアッセイするための試薬であって、上記のALMS1の核酸配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む核酸を含む試薬を提供する。
【００６６】
さらに、本発明は、a）ALMS1ヌクレオチド配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の標識核酸、およびb）上記の標識を検出するための試薬を別々の容器に含む、ALMS1核酸変異の存在に関して試料をアッセイするための試薬キットを提供する。
【００６７】
好ましい態様において、ALMS1変異は以下の変異、欠失、および挿入からなる群より選択される：ALMS1の3737位のヌクレオチドの後に19ヌクレオチドが挿入される；ALMS1の1582位のヌクレオチドがTである；ALMS1の3808位のヌクレオチドがTであり、ALMS1の3809位のヌクレオチドが欠失しており、且つALMS1の3813位のヌクレオチドがAである；ALMS1の3974位のヌクレオチドが欠失する；ALMS1の4648位のヌクレオチドがTである；およびALMS1の1594位のヌクレオチドの後にAが挿入される。
【００６８】
その上、さらなる態様において、ALMS1蛋白質またはALMS1蛋白質変異体に選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片、および結合した抗体またはその抗原結合性断片を検出するための手段を含む、ALMS1蛋白質の有無に関して試料をアッセイするための試薬キットが提供される。
【００６９】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これにより本発明が制限されることはない。
【００７０】
【実施例】
実施例1．
家系
アルストレーム家系のメンバーおよび対照被験者からのDNAを、標準的なプロトコール（クンケル（Kunkel, L.M.）ら、「染色体変異体におけるヒトY染色体特異的反復DNAの解析（Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants）」、Proc Natl Acad Sci USA 74：1245〜1249（1977））を用いて末梢全血から単離した。参加基準は、臨床診断と共にALMSの主要な特徴の評価に基づいた。書面でのインフォームドコンセントを全ての被験者から得た。プロトコールは全て、ジャクソン研究所(Jackson Laboratory)の内部審査委員会によって予め承認された。
【００７１】
遺伝子タイピング
短い縦列反復配列多型（STRP）を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、リサーチジェネティクス社(Research Genetics)から得たか、または設計して（マックベクター6.0）（ラストギ（Rastogi, P.A.）「マックベクター・マッキントッシュ用の組み込み配列解析（MacVector. Integrated sequence analysis for the Macintosh）」、Methods Mol. Biol. 132：47〜69（2000））注文した（One Trick Pony）。STRPのPCR増幅は、既に記述されているように（コリン（Collin, G.B.）ら、「ヒト19番染色体上の新規マイクロサテライト多型の物理的および遺伝子マッピング（Physical and genetic mapping of novel microsatellite polymorphism on human chromosome 19）」、Genomics 37：125〜130（1996））、33P-標識オリゴヌクレオチドによって行った。PCR産物は、6％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【００７２】
変異解析
ALMS1の16個のエキソンを標準的なPCRプロトコールに従ってPCR増幅した（表2および配列番号：3〜34を参照のこと）。増幅産物を1〜1.2％ゲル上で分離して、切除し、ヌクレオスピンカラム（CLONTECH）を用いて精製してシークエンシングした（ABIプリズム3700）。シークエンシング結果を非罹患対照、BAC配列（AC069346およびAC074008）およびcDNA（KIAA0328）と比較した。
【００７３】
マウスcDNA配列
総RNAは、雄性C57BL/6Jマウスの全脳から調製した。組織をホモジナイズして、製造元のプロトコールに従ってトリゾール（Life Technologies）による処理によってRNAを単離した。cDNAは、スーパースクリプトワンステップRT-PCRキット(Superscript One-Step-PCR kit)(Life Technologies)を用いて作製した。Alms1のPCR増幅のためのプライマーは、セレラ社(Celera)のデータベースよりアライメントしたESTの配列より設計した。cDNAのPCR増幅は、エクスパンドテンプレートシステム(Expand Templatesystem)(Roche)を用いて行った。
【００７４】
発現解析：
マウスノーザン：ノーザン解析のためのプローブを作製するために、マウスC57BL/6J網膜cDNAを、エクスパンドテンプレートシステム（Roche）を用いて、エキソン1-特異的プライマー
0004255052.tif 000002
によってPCR増幅した。394 bp産物を精製して放射標識した（レディプライムII標識システム(Rediprime II labelling system)(Amersham Pharmacia）。マウスの多数の組織ブロット（ニシナ、ノース、イケダ、ヤン＆ナガート（Nishina, P.M., North, M.A.,Ikeda, A., Yan, Y. and Naggert, J.K.）、「マウスおよびヒトにおける新しいタビー遺伝子ファミリーメンバー、TULP3の分子特徴付け（Molcular characterization of a novel tubby gene family member, TULP3, in mouse and humans.）」、Genomics 54：215〜220（1998））をRapid Hyb緩衝液（Amersham Pharmacia）によって1時間プレハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションを一晩行った。膜を洗浄して、ハイブリダイズした産物を8日間感光させた後、オートラジオグラフィーによって可視化した。対照としてβアクチンによってブロットをプロービングした（ニシナ、ノース、イケダ、ヤン＆ナガート（Nishina, P.M., North, M.A.,Ikeda, A., Yan, Y. and Naggert, J.K.）、「マウスおよびヒトにおける新しいタビー遺伝子ファミリーメンバー、TULP3の分子特徴付け（Molcular characterization of a novel tubby gene family member, TULP3, in mouse and humans.）」、Genomics 54：215〜220（1998））。
【００７５】
ヒトノーザン：ヒトの多数の組織ブロット（ファーストチョイスブロット1、Ambion）を、ゲノムDNAのPCR増幅によって作製した490 bpのプローブとハイブリダイズさせた
0004255052.tif 000003
ハイブリダイゼーションは上記のように行った。
【００７６】
RT-PCR：ヒトの多数の組織のcDNAパネルI（CLONTECH）を
0004255052.tif 000004
を用いて、アニーリング温度56℃で35サイクルのPCR増幅を行った。
【００７７】
GenBankアクセッション番号：
ヒト転写物KIAA0328、AB002326、マウスC57BL6/J cDNA、AF425257、およびヒトBAC、AC069346、およびAC074008。
【００７８】
アルストレーム症候群の染色体2p13の6.1 cM領域への先行技術のマッピングに基づき、さらなる組換えおよび物理的マッピングを行うことによって、1.2 Mb領域を含む重要区域＜2cMを決定した（図1）。物理的コンティグは、重複するBACクローンを並置して、転写単位の内容によって断片をつなぎ合わせることによって、公共の利用可能な配列データ（GenBank）から構築した。変異解析のための候補となる遺伝子は、NIXアノテーション-パイプライン（ウィリアムス、ウーランド＆ヒンガンプ（Williams, G.W.、Wooland, P.M., and Hingamp, P.）、Nix：「HGMP-RC」URL、http://www.hgmp.mrc.ac.uk/NIX/でのヌクレオチド同定システム（1998））および個々のデータベース検索（Incyte Genomics＆GenBank）を用いて、コンティグの配列を、同定された遺伝子および発現された配列タグ（EST）クラスタの配列と比較することによって同定した。16個の遺伝子および最小区域内のESTクラスタを同定した。候補遺伝子は、その発現パターンおよび機能に基づいてまず優先順位をつけた。その後、その領域の全ての遺伝子の系統的なスクリーニングを行った。
【００７９】
新規cDNA配列KIAA0328（AB002326）を含む1つのESTクラスタは、アルストレーム患者において多くの罹患組織で発現されるcDNA断片で構成され、従って、これに変異解析を行った。対応するcDNAの完全長のコード配列を得るために、KIAA0328および重複する転写物（Incyte Genomics、NCBIおよびTIGR）の間でアラインメントを行った。1902個のアミノ酸に及ぶオープンリーディングフレームを持つ、6,612 bpのヒトcDNA全配列が推定された（配列番号：1；配列番号：2）。翻訳開始部位は、597位のヌクレオチドにおいて同定され、2つの推定ポリアデニル部位（AATAAA）はそれぞれ、6389位および6591位に認められた。cDNA配列とゲノム配列とのアラインメントによって、様々な長さ（45〜1865 bp）の16個のエキソンが同定された。
【００８０】
ALMS1と呼ばれるKIAA0328遺伝子のエキソン-イントロン構造を図2aに示す。2つの重複するヒトBACクローン、ctd2005P16およびRPCI-582H21（AC069346およびAC074008）は、〜160 kb（コードエキソン）の完全なゲノム配列を含む。ALMS1のいくつかのスプライス変異体が公共およびインサイトゲノミクス(Incyte Genomics)cDNAライブラリーデータベースから同定されている（図2b）。変異体の相対的な量は、異なる配列を表すGenBankクローンの数、およびインサイトデータベースにおいて報告される組織分布解析から推定されている。最も豊富に存在する変異体は、16個のエキソンを含むβ型（TIGR、THC530050）である。カルボキシル末端のエキソンである、14〜16位は、当初同定されたα転写物（GenBank、AB002326）では示されておらず、これはイントロン14におけるもう1つのポリアデニル部位を利用している。α型の予想されるオープンリーディングフレームは、エキソン14の直後で終了する。配列解析によって、β蛋白質産物（1902個のアミノ酸）は、α蛋白質産物（1855個のアミノ酸）とC末端で47個のアミノ酸の伸長部のみが異なるに過ぎないと予想される。データベース検索によっても同様に、おそらくエキソン3内に内部スプライスドナー部位を用いたことによる短縮型第3エキソンを有するδ型（GenBank、W11846；Incyte、1453614.1）；5'伸長エキソン13と3'伸長エキソン14とを有するε変異型配列（インサイト、1453614.3）；および3'非コード領域におけるイントロンのプロセシングの結果であって、β変異型ではそれの867 bp下流でポリアデニルシグナルを利用する（示していない）φ変異型（GenBank、AW082244）を含む、他のまれな変異型配列が同定された。これらの変異型は、脳、副腎、肺、および精巣を含む多様な組織において発現されている。
【００８１】
イントロンプライマーを設計して、アルストレーム症候群に罹患した無関係な患者6名に由来するDNA内の完全なコード領域を増幅してシークエンシングした。血縁関係にあるアカディア人の大家系（マーシャル（Marshall, J.D.）ら、Am. J Med Genet 73：150〜161（1997））（K1）において、19 bpの挿入がエキソン9において同定され（図3a）、これはフレームシフトを引き起こしてコドン1263位での早期終結を引き起こす。挿入は家系における罹患患者5名全員においてホモ接合状態で存在した。非罹患保因者における挿入対立遺伝子の伝達は、以前に報告されたハプロタイプと一致した（コリン、マーシャル、カードン＆ニシナ（Collin, G.B., Marshall, J.D., Cardon, L.R, and Nishina, P.M.）、Hum-Mol-Genet. 6：213〜219（1997））。挿入対立遺伝子は、一般集団からの無関係な100名の個体では認められなかった。さらなる5個の変異が多様な民族の無関係な5つの家系において同定された（図3b〜e、表3）。全ての変異がALMS1と共に分離した。血縁関係にあるイタリア人家系（K57）において、ホモ接合変異1582C>Tが同定され、TAA終結シグナルを生じたが、血縁関係にあるフランス人家系（K22）では、コドン1279位での早期終結シグナルが形成されるフレームシフト変異3808GA>T；3813G>Aが罹患兄弟3名に認められた。血縁関係にあるポルトガル人家系（K59）では、TAAナンセンス変異4648C>Tが又従兄弟2名において同定された。従兄弟1名は、ホモ接合状態で変異を有し、もう1名の保因者は変異1コピーを有する。コドン535位の下流の2個のアミノ酸に終結シグナルが形成される第二の変異1594insAは、後者の個体で同定され、それによって複合ヘテロ接合状態が起こる。
【００８２】
3974delC変異は、無関係な若い成人2名、すなわちイギリス人の血を引く19歳の男性（K42、被験者A5）と、その祖先が2世紀前のイギリス人までたどることができる21歳男性（K3、被験者A6）において認められた。いずれも生後2ヶ月以内に乳児心筋症を示し、その後、低身長、脊柱側彎、II型真性糖尿病、および腎不全を発症した。しかし、これらの被験者はその疾患の発現が異なった。被験者K42 A5は18歳の時に拡張型心筋症を突然再発したが、肝機能障害の証拠は認められない。しかし、被験者K3 A6は20歳の時に重度の肝不全を示したが、心筋症の再発は認められなかった。同一変異を有する個体において疾患の進行が異なることに関するこの知見は、多くのアルストレーム患者において認められる表現型の多様性が、遺伝的または環境的変更因子とALMS1座が相互作用した結果である可能性を示唆する。
【００８３】
発現解析は、マウスRNAおよびヒトRNAについて行った。ALMS1 cDNA断片をプローブとしてヒトの多数の組織ブロットを調べたところ、7日間曝露してもALMS1の発現を検出できず、転写物の量が少ないことが示唆された。しかし、ヒトcDNAパネル1（CLONTECH）のRT-PCRは、ALMS1が普遍的に発現されていることを示した（図4a）。マウスポリA+ RNA（5μg）のノーザン解析によって、肺、心臓、腎臓、大腸、脾臓、眼、および卵巣において普遍的であるが発現が低いことが確認された（図4b）。公共およびインサイトゲノミクスデータベースにおいて示される精巣cDNAライブラリーにおけるALMS1の量と一致して、高レベルの発現がマウス精巣において認められた。インサイトゲノミクスデータベースに由来するヒトcDNAライブラリーで発現を示したが、RT-PCRまたはノーザン解析によって調べていないさらなる組織には、副腎、甲状腺、下垂体、および乳腺、胸腺、子宮、尿道、結腸、および結合組織が含まれた。
【００８４】
NCBIデータベースにおいて、他のヒト遺伝子との有意な相同性は認められなかったが、マウスAlms1 cDNA配列（5.6 kb）は、いくつかのEST配列のアラインメンを、ヒトcDNA配列をマウスゲノム追跡データ（GenBank）およびマウスゲノム断片（Celera）と共に並置することによって構築することができる。マウスcDNA配列は、C57BL6/JマウスにおいてPCR-増幅したマウスAlms1 cDNA（GenBank、AF425257）をシークエンシングすることによって確認した。推定アミノ酸配列は、ヒトALMS1蛋白質配列と67.3％の同一性を有する。
【００８５】
ALMS1の機能を推定する試みにおいて、プロサイト(Prosit)およびPfamデータベースを用いてモチーフおよび相同性検索を行った。シグナル配列または膜貫通領域は検出されず、このことは蛋白質が全体的な疎水性特性を有し、従って細胞内に存在することを示唆している。予想されるヒト蛋白質（配列番号：2）において、ロイシンジッパーモチーフ（PS00029、アミノ酸213〜234位）およびセリンリッチ領域（アミノ酸1590〜1606位）が認められた。さらに、潜在的な核移行シグナル（PS50079、アミノ酸1538〜1563位、および1670〜1687位）、ならびにヒスチジンリッチ領域（アミノ酸1219〜1256位）がマウス配列において同定された。これらの特徴は全て、ヒトとマウスALMS1の間で保存されている；しかし様々な蛋白質においてこれらのモチーフが頻繁に現れることから、これらのマッチが機能的に重要であるかについては、実験により調べる必要がある。上記のドメインの他に、マカクザル（AB055273）およびマウス（AK016590）に由来する2つの予想蛋白質の領域と配列類似性を示す、ALMS1のC末端での120個のアミノ酸の領域が同定された。相同性領域が比較的小さいことから、これらの配列がさらに別のファミリーメンバーを示す可能性はないと思われる。このよく保存されたALMSモチーフは、構造的または機能的に重要でありうる蛋白質ドメインを定義する可能性がより高い（図5）。
【００８６】
普及した公衆衛生問題である肥満と2型糖尿病は、罹患率と死亡率のリスクの増加に関係しており、集団において高い割合で罹患する（コペルマン（Kopelman, P.G.）、「医学的問題としての肥満（Obesity as a medical problem）」、Nature 404：635〜643（2000））。いずれの疾患も環境条件によって影響を受けるが、強い遺伝的要素によっても影響を受ける（フロゲル＆ベロ（Froguel, P. and Velho, G.）、「2型糖尿病の遺伝的決定因子（Genetic determinants of type 2 diabetes）」、Recent Prog Horm Res 56：91〜105（2001）；ナガート、ハリス＆ノース（Naggert, J., Harris, T. and North, M.）、「肥満の遺伝学（The genetics of obesity）」、Curr Opin Genet Dev. 7：398〜404（1997））。興味深いことに、今日までに同定された肥満および2型糖尿病を引き起こす遺伝子のほとんどが、バルデー-ビードル症候群のような症候性疾患の場合に認められている（スラボチネク（Slavotinek, A.M.）ら、「MKKSにおける変異はバルデー-ビードル症候群を引き起こす（Mutations in MKKS causes Bardet-Biedl syndrome）」、Nat Genet 26：15〜16（2000）；ミキチン（Mykytyn, K.）ら、Nat Genet 28：188〜191（2001）；ニシムラ（Nishimura, D.Y.）ら、Hum Mol Genet 10：865〜874（2001））。アルストレーム患者において認められる乳児肥満は、罹患した子供全員に認められる初期の（生後6ヶ月）表現型となるため、アルストレーム遺伝子の変化の第一義的な結果である可能性が最も高い。アルストレーム症候群において認められる、高脂血症およびアテローム性動脈硬化症のような二次的な合併症を伴うインスリン抵抗性および慢性高血糖症の続発症は、成人発症型2型糖尿病の一般型において認められる疾患であり、その違いは、アルストレーム患者では急速に起こる点である。このことは、ALMS1が肥満関連NIDDMと同じまたは平行した経路に存在する可能性があることを示唆している。ALMS1遺伝子の機能を決定すれば、おそらく、この遺伝子がどのようにして他の遺伝子と相互作用してその病的作用を生じるかについて洞察を与えると思われる。ALMS1内の変異が一般集団における一般的な疾患において主要な役割を有する可能性は低いが、この遺伝子を調べる真の価値は、それが肥満、2型糖尿病、神経感覚疾患、および関連障害の病因に関係する新規代謝および調節経路を提供する可能性があることである。生物学的経路において上流および下流の分子を同定することができる一遺伝子変異の同定に関するこのパラダイムの多くの例は、文献から得ることができる（すなわち、肥満におけるレプチンおよびJak/Statキナーゼ経路（イヌイ（Inui, A.）、「視床下部神経ペプチドによる節食および体重調節−レプチンの作用の媒介（Feeding and body weight regulation by hypothalamic neuropeptides - mediation of the actions of leptin）」、Trends Neurosci. 22：62〜67（1999））。
【００８７】
【表１】
ALMS1スプライス接合部
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【００８８】
【表２】
ALMS1変異解析のためのプライマー対
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【００８９】
【表３】
アルストレーム症候群の6つの家系において認められた変異の要約
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一般対照集団からの試料では変異は認められなかった。
【００９０】
本発明は、その好ましい態様を参照して特に示し、記述してきたが、その形態および詳細に対して様々な変更を行ってもよく、それらも添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内に含まれることは、当業者によって理解されると思われる。
【００９１】
【発明の効果】
ALMS1の発見、およびアルストレーム症候群とのその連鎖によって、アルストレーム症候群の診断が改善される。この情報を用いて多くの新しい方法で、患者をアルストレーム症候群に関して調べることができる。遺伝物質（特にゲノムDNAまたはmRNA）を既知の方法によって患者から単離およびシークエンシングして、アルストレーム症候群を示すであろうALMS1遺伝子のコード配列の任意の変異の存在を決定することができる。さらに、ALMS1のDNA、その相補鎖、またはALMS1のDNAもしくはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列を、遺伝子の転写レベルを調べるためにノーザンブロット解析において用いることができる。転写が存在しなければ、組織に存在する機能的ALMS1遺伝子産物が不十分であることが示されるため、遺伝子の正常な転写レベルより低い場合には、アルストレーム症候群であると診断することができる。最後に、ALMS1によってコードされる蛋白質を発現させて、単離し、その蛋白質に対して特異的な抗体をバイオテクノロジーの標準的な方法によって得ることができる。次に、抗体は、患者からの組織試料中のALMS1蛋白質の有無を検出するために有用となると思われる。ALMS1蛋白質が不十分であれば、アルストレーム症候群であることが示されると考えられる。上記の方法は全て、当業者がALMS1の配列およびALMS1とアルストレーム症候群との連鎖を知れば、当業者によって実践することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ALMS1領域の高分解能マップおよび物理地図を示す図である。フランス系アカディア人の家系の罹患小児（I）および小規模の核家族の小児（II）における組換えにより、ALMS1の重要区域の位置は＜2cMの領域に特定される。8つの重複BACによって1.2Mbコンティグの全体がカバーされる。ESTクラスターに由来する16種の既知の予想される遺伝子の位置を黒いバーとして示している。変異解析に関して検討した遺伝子を星印で示している。1〜16：SEC15（AB023136）、SPR（セピアプテリンレダクターゼ）、EMX1（エンプティスパイラクル(empty spiracle)、ショウジョウバエホモログ1）、THC529835（C.エレガンス(C.elegans)sre2のホモログ）、PP75（KIAA0857）、EST（THC551446）、EMXホメオボックス蛋白質に関連する新規遺伝子、NN8-4AG（レチノイン酸反応性）、CCT7（TCP1を含むシャペロニン、サブユニット7）、EST（THC530316）、EST（AI014261）、EGR4（初期成長応答遺伝子4(early growth response 4)）、EST（KIAA0328）、DUSP11（二重特異性ホスファターゼ11(dual-specificity phosphatase 11)）、AMSH（STAM関連分子）およびACTG2（アクチン、γ-2、平滑筋、腸性）。
【図２】  ALMS1遺伝子のゲノム構造および選択的スプライシングを示す図である。ａは、同一縮尺で示したKIAA0328（ALMS1）のエキソン-イントロン構造（表1も参照）を示す。本遺伝子はゲノムDNAの＞164kbにわたる16エキソンを含む。5'UTRおよび3'UTRならびにエキソン領域をそれぞれ白抜き枠および黒枠で示した。配列情報が完全でないイントロンは斜線入りのバーで示した。ｂは、ヒトALMS1の主な選択的転写物を示す。
【図３】  ALMS1に関して分離された5つの血縁関係のない家族における変異を示す図である。変異は罹患被験者A1〜A8のすべてに認められた。ａ〜ｄは、罹患個体において疾患とホモ接合状態で共分離されたすべての変異を示す。ａは、血縁関係にあるアカディア人の大家系（K1）におけるKIAA0328のエキソン9内の19bp挿入物の検出（Marshall, J.D.ら、アカディア人大家系および3つの別の家系におけるアルストレーム症候群の家系学、自然史および表現型（Genealogy, natural history, and phenotype of Alstrom syndrome in a large Acadian kindred and three additional families）、Am J Med Genet 73、150〜161（1997））を示す。クロマトグラムにより、正常対照と罹患個体との間の配列の差異が示されている。アカディア人家系に属する1つの核家族からの19bp挿入物に対するPCR増幅の結果を右側に示す。親（1,2）はこの変異に関してヘテロ接合性であり（保因者）、非罹患小児（3）は正常対立遺伝子のホモ接合型であり（439bp、非保因者）、罹患小児（4）は挿入に関してホモ接合型であった（458bp）。この挿入が伝達されることは、以前に報告されたハプロタイプ（提示せず）によって十分な合意が得られている。ｂは、イタリア人家系の罹患個体のエキソン3における1582C＞Tナンセンス変異を示す。ｃは、フランス人家系の3人の罹患兄弟姉妹のすべてにフレームシフトをもたらしているエキソン9内の3808GA＞T；3813G＞A変異を示す。NS＝サンプルなし。ｄは、2つの家系におけるエキソン9内の3974delCフレームシフト変異を示す。この2つの間の家系学的関係は同定されていない。早期終結シグナルがコドン1330に生じている。ｅは、又従兄弟A7（ホモ接合性）およびA8（ヘテロ接合性）における4648C＞Tナンセンス変異を示す。A8にはフレームシフトを生じる第2の変異（1594insA）も同定された。
【図４】  種々の成人組織およびマウス組織におけるALMS1の発現を示す図である。ａは、ヒトcDNA多組織パネル（CLONTECH）のRT-PCRを示す。ｂは、5μgのポリA+ RNAをエキソン1〜3にまたがる490bpのcDNA断片および対照としてβ-アクチンとハイブリダイズさせたマウスでのノーザンブロット解析を示す。脳および筋肉におけるALMS1の発現はヒトでのノーザン解析によっては検出されなかったが、RT-PCRによってわずかな発現が観察された。
【図５】  ヒトおよびマウスのALMS1の、マウス（AK016590）およびマカクザル（AB055273）のドメインとの間のアミノ酸類似性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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