(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物。
【請求項２】
バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物。
【請求項３】
有機物質の分解方法であって、前記有機物質を、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の有効な分解量で処理し、それにより該物質を分解することを具備する方法。
【請求項４】
有機物質の分解方法であって、前記有機物質を、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の有効な分解量で処理し、それにより該物質を分解することを具備する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、該有機物質が可塑性物質である方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、該可塑性物質がポリエチレンである方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、該ポリエチレンが、該微生物で処理する前に照射される方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、該照射が、該ポリエチレンを紫外光に晒すことを具備する方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、該有機物質がダイオキシンまたはポリクロロビフェニルである方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、該ダイオキシンがジベンゾフラン（Ｄｉｂｅｎｚｏ  Ｆｒａｎ）である方法。
【請求項１１】
請求項３または４に記載の方法であって、該有機物質がタンパク質を含む方法。
【請求項１２】
請求項３または４に記載の方法であって、該有機物質が糖を含む方法。
【請求項１３】
請求項３または４に記載の方法であって、該有機物質がアミノ酸を含む方法。
【請求項１４】
請求項３または４に記載の方法であって、該有機物質が核酸分子を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、該核酸分子がデオキシリボ核酸分子を含む方法。
【請求項１６】
請求項３に記載の方法であって、該有機物質がマグロ頭部を含む方法。
【請求項１７】
請求項３に記載の方法であって、該有機物質がイカを含む方法。
【請求項１８】
請求項３に記載の方法であって、該有機物質が有機汚泥である方法。
【請求項１９】
請求項３または４に記載の方法であって、前記処理が５．０から８．０のｐＨで達成される方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ｐＨが７．４である方法。
【請求項２１】
請求項３または４に記載の方法であって、前記処理が好気性環境で達成される方法。
【請求項２２】
汚泥処理方法であって、前記汚泥に、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、またはそれらの組み合わせを投入することを含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、該汚泥が有機物である方法。
【請求項２４】
バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号５５９２６として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で該微生物を培養することを具備する方法。
【請求項２５】
バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号２０２０５０として寄託されている微生物、または６２℃から１００℃の温度でその分解活性が維持されているそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で該微生物を培養することを具備する方法。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の方法であって、前記ｐＨが５．０から８．０である方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記ｐＨが７．４である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
廃棄物を生分解する細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景
人間の産業活動は、必ず産業廃棄物を生じる。これらの産業廃棄物は、主として、工場、農業、水産業および食品加工業から排出された無機廃棄物および有機廃棄物からなる。これらの廃棄物を分解し、または取り扱うための高い費用は、これらの産業が負担している。これらの費用は、これらの産業および他の産業が関連するビジネスの市場拡大を妨げている。
【０００３】
現在、廃棄物を利用するために有機廃棄物発酵および処置システムが開発されている。これらのシステムを使用すると、一般に、土壌改良剤および堆肥などの生物活性物質を生産することが可能である。
【０００４】
バイオマス発酵の製造および販売や、水産業並びに植物および動物性のバイオプロセス産業から生じた廃棄物を、生物反応調整剤、飼料、化学肥料または発酵剤へ変換し得る処理方法は有用である。そのような方法には、廃棄物分解に有用な、廃棄物を処理するシステムおよび新規発酵剤が含まれる。そのようなシステムを使用した場合、以下のことが可能である。１）廃棄物処理費用を減じること、２）環境の汚染を防ぐこと、３）例えば、農地などの土壌を改良すること、および４）生物学的に活性な再使用可能な物質を産出すること。
【０００５】
したがって、出願人は、脂質、タンパク質、炭水化物および木材繊維を分解し得る新規の細菌を探索した。そのような細菌は、廃棄物の生分解での多数の異なった目的に対して有用である。この生分解の新システムは、異なった種類の廃棄物を処理し、更に、廃棄物分解方法の適用性を広げることができるであろう。
【０００６】
好熱性細菌は急速に増殖するので、出願者らはそれらの細菌に的を絞った。また、この分野では、多数の点から、好熱性細菌が、バイオプロセス法での利用にあたって最も安全で且つ最も効果的な細菌であると考えられる。
【０００７】
好熱性細菌は次のような理由から理想的な選択である。すなわち、好熱性細菌は、
１）よく研究されている上、特性が決定されており、
２）好気性であり、
３）組換えＤＮＡを目的とした操作が可能であり、
４）特定の至適高温で生育可能であり、
５）導入された外来遺伝子を安定して維持することが可能であり、および
６）外因性のタンパク質を生産する導入された外因性遺伝子を効率的且つ予測可能に発現するからである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
発明の概要
本発明は、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物を提供する。さらに、本発明は、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物を提供する。
【０００９】
本発明は、有機物質を分解する方法であって、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、またはその分解活性を保持しているそれに由来する突然変異株の有効な分解量で、該有機物質を処理し、それによって該物質を分解することを具備する方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、分有機物質を分解する方法であって、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、または解活性を保持しているそれに由来する突然変異株の有効な分解量で、該有機物質を処理し、それによって該物質を分解することを具備する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物またはそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で該微生物を培養することを具備する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、またはそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で該微生物を培養することを具備する方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、またはそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本出願は、１９９７年１１月２６日に出願された米国出願番号第０８／９７９，５８６号の一部継続出願であり、その内容は引用によって本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本発明全体にわたって、多数の刊行物を引用する。それにより、これらの刊行物の開示を引用によって本明細書に組み込み、本発明が関係する技術分野についてより十分に記載する。
【００１６】
発明の詳細な説明
この出願の全体にわたって、特定ヌクレオチドの表示は、核酸のコード鎖上に存在するヌクレオチドについてのものである。特定のヌクレオチドを示すために、次の標準略語を明細書全体にわたって用いる。Ｃ＝シトシン、Ａ＝アデノシン、Ｔ＝チミジン、Ｇ＝グアノシン。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「好気性」とは、酸素に適応する、または酸素を要求することを意味する。
【００１８】
本発明は、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、またはそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物を提供する。
【００１９】
バクテリウム属菌株、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ａ(Bacillus midousuji SH2A)は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ＡＴＣＣ、米国、２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ１２３０１）へ１９９７年１月２１日に寄託した。バクテリウム属の菌株ＳＨ２Ａには、ＡＴＣＣ受託番号５５９２６が付与された。
【００２０】
更に、本発明は、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、またはそれに由来する突然変異株の生物学的純粋培養物を提供する。
【００２１】
バクテリウム属菌株、バシルス・ミドウスジ・ＳＨ２Ｂ(Bacillus midousuji SH2B)は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ＡＴＣＣ、米国、２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ１２３０１）へ１９９７年１０月２４日に寄託した。バクテリウム属の菌株ＳＨ２Ｂには、ＡＴＣＣ受託番号２０２０５０が付与された。
【００２２】
また、本発明は、有機物質の分解方法であって、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第５５９２６号として寄託されている微生物、またはその分解活性を保持しているそれに由来する突然変異株の有効な分解量を用いて、該有機物質を処理し、それによって該物質を分解することを具備する方法を提供する。
【００２３】
特許請求の範囲の発明に記載された微生物の有効な分解量の決定は、当業者の知識の範囲内である。目的の廃棄物を効果的に分解するのに必要な細菌の量を決定することができるものには様々な方法がある。
【００２４】
さらに、本発明は、有機物質の分解方法であって、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ受託番号第２０２０５０号として寄託されている微生物、またはその分解活性を保持しているそれに由来する突然変異株の有効な分解量を用いて、該有機物質を処理し、それによって該物質を分解することを具備する方法を提供する。
【００２５】
上述の細菌株によって分解される有機物質には可塑性物質、特にポリエチレンが含まれるが、これに限定されるものではない。ある具体的な実施形態においては、その細菌株を用いて処理する前にポリエチレンに照射して分解工程を促進してもよい。特に、そのような実施形態では、紫外線でポリエチレンを照射することができる。
【００２６】
また、上述の細菌株によって分解される有機物質には、タンパク質、特に家庭や、食品加工、農業、酪農または水産業などの産業からの廃産物を含んでいてもよい。具体的な実施例として、木材パルプ、紙製品、甲殻類、コーヒー豆滓、マグロ頭部、イカおよびこれらの産業の他の副産物が含まれるが、これに限定されるものではない。さらにまた、これらの細菌は厨房廃棄物を分解することができる。厨房廃棄物には、紙製品、甲殻類、コーヒー豆滓、マグロ頭部、イカ、並びに厨房貯蔵所、ごみ置き場および他の消費者が使った廃棄物中に見つけ出される他の副産物が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
また、本発明は、糖を含有する有機物質を上述の方法によって分解することを提供する。特に、そのような糖類にはマンノース、マルトース、トレハロース、フラクトースおよびラフィノースが含まれるが、これに限定されるものではない。これらの糖の多くは、厨房廃棄物で確認されるであろう。また、例えば、果物などの食品加工および農業の産業における副産物でもある。
【００２８】
また、該有機物質にはアミノ酸を基礎とする化合物が含まれる。これらの化合物は、天然で生じた、または合成のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドであってもよい。
【００２９】
また、該有機物質には、核酸分子、特にデオキシリボ核酸分子が含まれていてもよい。ＤＮＡｓｅ活性がこれらの細菌株中で検出されている。
【００３０】
上記の同定方法は、約６２℃から約１００℃の温度で行うことができる。特に、その細菌株の至適増殖温度は約６２℃であった。しかしながら、そのバイオプロセスはより高温で生じるかもしれない。当業者は、これらの細菌株を用いて物質を分解するための至適温度を決定することができるであろう。
【００３１】
上述の同定方法は、約５．０から約８．０のｐＨ、特に約７．４のｐＨで行うことができる。
【００３２】
さらに、これらの細菌株は、好気性環境下の上述の同定方法で用いることができる。本発明は、また、ＳＨ２Ａと称する微生物、ＳＨ２Ｂと称する微生物、またはそれらの組み合わせを汚泥に加えることを具備する汚泥の処理方法を提供する。ある実施形態では、その汚泥は有機汚泥である。
【００３３】
また、本発明は、ＳＨ２Ａと称し、且つＡＴＣＣ寄託番号第５５９２６で寄託された微生物またはそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で微生物を培養することを具備する方法を提供する。
【００３４】
その上、また、本発明は、ＳＨ２Ｂと称し、且つＡＴＣＣ寄託番号第２０２０５０号で寄託された微生物またはそれに由来する突然変異株の増殖方法であって、該微生物の増殖を促進するのに効果的な温度および培地で微生物を培養することを具備する方法を提供する。
【００３５】
その細菌株は、約６２℃から約１００℃の温度で、特に約６２℃の温度で増殖可能である。
【００３６】
ｐＨに関しては、約５．０から約８．０、特に約７．４のｐＨでその細菌株は増殖可能である。
【００３７】
上述のように、これらの微生物の増殖を促進するのに有効な培地は広く知られている。これらの微生物の増殖を促進するのに有効な培地は当業者には公知であろう。具体的な実施形態において、出願者はトリプチカーゼ大豆培地(trypticase soy medium)を用いた。
【００３８】
本発明を以下の実験詳細の項で説明する。これらの項は、本発明を理解しやすくする目的で記述したものであり、特許請求の範囲に記載した本発明をいかなる方法において制限することを意図するものではなく、またそのように解釈すべきものではない。
【００３９】
（実施例１）
試料および方法
細菌株：単離物の起源
菌株ＳＨ２Ａおよび菌株ＳＨ２Ｂは、日本の大阪にて収集した堆肥の試料から単離した。
【００４０】
培養方法および培地
一般的な好気性技術をすべての実験で用いた。菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂは、６４℃でトリプチカーゼ大豆培地（ＢＢＬ）上で培養した。
【００４１】
胞子形成試験
栄養寒天培地(Oxoid、ＵＫ)を胞子形成のための試験に用いた。平板に一晩培養物を接種し、次に、６４℃で５日間までインキュベーションして胞子の存在を検出した。
【００４２】
培養細胞の耐熱性はトリプチカーゼ大豆液体培地中で決定した。６０℃、７０℃、８０℃および９０℃でそれぞれ一晩インキュベーションした後、その細胞の生存度を６４℃でトリプチカーゼ大豆寒天平板上に継代培養することにより測定した。
【００４３】
形態学的特性
形態学的特性は、位相差顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法により決定した。
【００４４】
分析技術
好気性生活は、スタフィオグラム・アイデンティフィケーション・キット（Staphyogram Identification kit、テルモ、日本）で培養物を増殖させることにより達成した。酸産生は、マンノース、ラクトース、マルトース、グリセロール、サリシン、トレハロース、スクロース、マンニトール、フラクトースおよびラフィノースの存在状態下で試験した。インドール生成はコバックス試薬(Kovacs reagent)で試験した。硝酸還元はグリース試薬(Griess’s ragent)で試験した。また、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルギニンデヒドラーゼおよびウレアーゼ活性は、スタフィオグラム・アイデンティファイ・キット(Staphyogram Identification kit)で検出した。デオキシリボヌクレアーゼ(DNAase)の生成は、サケ精子ＤＮＡを用い、１．５ＮのＨＣｌとのＤＮＡ沈殿反応の後、ハロー（ｈａｌｏ）形成を評価する寒天平板方法によって検出した。該細胞による高耐塩性は、７．５％ＮａＣｌ含有トリプチカーゼ大豆寒天平板でその細菌培養物を一晩６４℃で増殖させることによって決定した。カナマイシンおよびアンピシリン耐性は、これらの抗生物質をそれぞれ５０μｇ含有するＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天平板で細胞を一晩６４℃で増殖させることによって測定した。溶血反応は、５％の羊血液含有トリプチカーゼ大豆寒天平板で一晩６４℃で測定した。グラム染色は、標準的な方法を用いて行った。
【００４５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の研究
購入可能なキット(Gene Amp kit,Geneclean spin)を使用して、ゲノムＤＮＡの精製、並びに単離ＳＨ２Ａの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子セグメントの増幅および精製を行った。精製ＰＣＲ産物を直接に塩基配列決定した。シーケンシングは、製造者(Applied Biosystems, LTD)によって推奨されるプリズム・ジオキシ・ターミネーティング・サイクル・シーケンス・キット(Prism dideoxy terminating cycle sequence kit)を使用して、ＡＢＩ自動ＤＮＡシークエンサーで行った。増幅およびシーケンシングのために用いたプライマーは、１６ＳＲＲ  Ｉ：ｃａｇ  ｃａｇ  ｃｃｇ  ｃｇｇ  ｔａａ  ｔａｃ  （配列番号１）、および１６ＳＲＲ  ＶＩＩＩ：ｇａｔ  ｔａｇ  ａｔａ  ｃｃｃ  ｔｇｇ  ｔａ  （配列番号第２）である。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子セグメント(DNA Strider)に対して得られたＤＮＡ配列は、リボソーム・データベース・プロジェクト(Ribosomal Database Project)およびゲンバンク(Genbank)から入手した１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列とともに並べ、比較した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して得られたＤＮＡ配列は、公知の細菌（図１）と比較してユニークであった（配列番号３）。
【００４６】
マグロ頭部の生分解およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の抽出
冷凍のマグロ頭部(DHA27%)の１００キログラムを１×１０１１細胞の菌株ＳＨ２Ａの懸濁液とビタミンＥの１０ｇと混合し、４時間または８時間、７５℃でインキュベートした。生分解された試料をＤＨＡついて分析した。各試料からの鹸化したマグロ油について、６０℃で４ＮのＮａＯＨ−エチルアルコールで処理することによって分析した。遊離脂肪酸をｎ−ヘキサン抽出によって得た。脂肪試料中のＤＨＡの分析は、ガス‐液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を使用して行った。
【００４７】
ポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）の生分解
２０ｐｐｍの各異性体ＰＣＢを含むトリプチカーゼ醤油ブロスに１×１０７細胞／ｍｌの菌株ＳＨ２Ｂを接種し、５日まで６４℃でインキュベートした。インキュベーション後、該試料をｎ−ヘキサンで抽出し、ＧＬＣを用いて分析した。
【００４８】
重金属（カドミウム）の細菌蓄積
トリプチカーゼ大豆液体培地中のＣｄ（ＮＯ３）４Ｈ２Ｏ６μｇ（2.2ppmのカドミウム）に１×１０７細胞／ｍｌの菌株ＳＨ２Ｂを混合し、３日間、６４℃でインキュベーションした。インキュベーション後、その試料を細菌細胞がペレットになるまで遠心分離し、その上清をカドミウム原子赤外線吸光度によって測定した。
【００４９】
可塑性物質の分解
１ｃｍ２のポリエチレンビニルシートに１４０ｎｍの紫外線照射を１時間行い、トリプチカーゼ大豆液体培地の中で菌株ＳＨ２Ｂと共に６４℃で２日間インキュベーションした。処理した試料のビニル表面について、走査電子顕微鏡分析を行った。
【００５０】
結果
堆肥化された葉および枝の中で発見された細菌株を見つけた場所から、菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂをバシルス・ミドウスジ(Bacillus midousuji)と名付けた。
【００５１】
１．異なる培地での活性
結果から、本菌株は、自発的に胞子を形成し得るグラム陽性桿菌であることがわかった。ＳＨ２Ａは、マンノース、マルトース、サリシン、トレハロース、スクロース、マンニトール、フラクトースおよびラフィノースから酸を生成した。また、ＳＨ２Ａは、インドール産生、硝酸還元、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ウレアーゼ、およびＤＮＡａｓｅ活性について陽性であった（表Ｉ）。
【００５２】
【表１】
0004361210.tif 000002
【００５３】
ＳＨ２Ａは、５０μｇ／ｍｌ濃度のカナマイシン、および５０μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンに対してともに感受性である（表ＩＩ）。
【００５４】
【表２】
0004361210.tif 000003
【００５５】
菌株ＳＨ２Ａは、トリプチカーゼ大豆寒天培地上に平滑なコロニー表面を示し、トリプチカーゼ大豆液体培地での増殖中に均質な懸濁を生じた。
【００５６】
別の菌株、ＳＨ２Ｂは、マンノース、マルトース、サリシン、トレハロース、スクロース、マンニトール、フラクトースからの酸産生に対し陽性であり、また、インドール産生、硝酸還元、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ウレアーゼおよびＤＮＡａｓｅ活性に対しても陽性であった（表Ｉ）。
【００５７】
本菌株は、５０μｇ／ｍｌ濃度のカナマイシンに耐性があるが、５０μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンには感受性であった（表ＩＩ）。
【００５８】
菌株ＳＨ２Ｂは、トリプチカーゼ大豆寒天培地上で粘着性コロニーを形成し、トリプチカーゼ大豆液体培地中では糸状性の増殖を示した。
【００５９】
ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂ菌株の両方は好熱性超高温細菌(thermophilic extremophiles)であり、増殖ためには少なくとも６２℃が必要である。
【００６０】
菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂは、７．５％のＮａＣｌ含有培地で増殖した。これらの菌株には、羊血液寒天培地平板における溶血活性は認められなかった（表ＩＩ）。
【００６１】
他の細菌のｒＲＮＡ遺伝子を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対する配列を比較したところ、両菌株ともにバチルス属の新規種であることがわかった（図１）。
【００６２】
２．マグロ頭部の生分解およびＤＨＡの抽出
２７％のＤＨＡを含むマグロ頭部を菌株ＳＨ２Ａによって生分解した。４時間および８時間のインキュベーション時間の後、遊離ＤＨＡ濃度は６０％まで増加した。
【００６３】
３．ＰＣＢの生分解
２０ｐｐｍのＰＣＢは、５日間の培養の後に、菌株ＳＨ２Ｂにより完全に分解された。
【００６４】
４．重金属（カドミウム）の細菌蓄積
１×１０７細胞／ｍｌの菌株ＳＨ２Ｂを含むトリプチカーゼ大豆液体培地中のＣｄ（ＮＯ３）４Ｈ２Ｏの６μｇ（カドミウム２．２ｐｐｍ）を、３日間、６４℃でインキュベーションした。インキュベーション時間の後、その試料を遠心分離し、その上清を分析した。３日間のインキュベーションの後、その上清には０．０３６ｐｐｍのカドミウム濃度が含まれていた（０．０１６倍希釈）。
【００６５】
５．可塑性物質分解
１ｃｍ２のポリエチレンビニルシートの試料に１４０ｎｍの紫外線照射を１時間行い、トリプチカーゼ大豆液体培地中で菌株ＳＨ２Ｂを加えて６４℃で２日間インキュベーションした。走査電子顕微鏡分析により、生分解を示す証拠が確認された。すなわち、可塑性物質表面に孔が生じていた。対照の可塑性物質表面（ＵＶ非照射）は、細菌細胞の存在または不在において無損傷のままであった。出願人は、無損傷の可塑性物質がポリ含水炭素フイルムであり、またＵＶ照射がフイルムを、細菌細胞が付着し、増殖し、可塑性物質の分解を引き起こし得るカルボキシル化フイルムに変換するのではないかと推測している。
【００６６】
（実施例２）
細菌株：単離物の起源
菌株ＳＨ２Ａおよび菌株ＳＨ２Ｂは、日本の大阪にて収集した堆肥の試料から単離した。
【００６７】
培養方法および培地
一般的な好気性技術をすべての実験で用いた。菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂは、６４℃でトリプチカーゼ大豆培地（ＢＢＬ）上で培養した。
【００６８】
イカの生分解
イカ１００キログラムを菌株ＳＨ２Ａの細胞懸濁液と混合し、６時間、６２℃でインキュベーションした。生分解された試料をＤＨＡ、ＥＰＡおよびＰＣＢ、並びに脂肪酸などの他の特徴について分析した。遊離脂肪酸はｎ−ヘキサン抽出によって得た。脂肪試料中のＤＨＡの分析は、ガス液体クロマトグラフィー(GLC)を用いて行った。また、ＰＣＢの分析もＧＬＣを用いて行った。
【００６９】
結果
６５℃で６時間インキュベーションした後の菌株ＳＨ２Ａを用いたイカの分解の結果を表ＩＩＩに示した。
【００７０】
【表３】
0004361210.tif 000004
【００７１】
結論
マグロ頭部の生分解およびＤＨＡの抽出
イカを菌株ＳＨ２Ａによって生分解した。６５℃で６時間インキュベーションした後、イカの分解の証拠が確認された。
【００７２】
（実施例３）
分子および細胞生物学の研究から生じた商業活動の展開は、発酵バイオテクノロジーの明るい前途を保証する。長期的には、再生可能な原料の発酵が、バルク化学物質の原料としての枯渇の再生不可能な化石燃料に取ってかわるかもしれない。
【００７３】
遺伝工学における最近の重要な発展は、産業発酵工学の範囲および可能性を広げた。遺伝工学を使用し、細菌および他の好適な生物に外来遺伝子を挿入することによって、遺伝可能な物質の新しい組合せを構築することができる。発酵工学の主要な担い手のうちの１つであるバチルス属は、そのような遺伝子工学実験用の好適な細菌宿主として用いることができる。
【００７４】
サッカロマイセス属(Saccharomyces)およびアスペルギルス属(Aspergillus)などの真核生物の微生物は、特に、酵素等の組換え非医薬品を生産するにあたって、バチルス属(Bacillus)などの原核生物よりもタンパク質合成および分泌系が著しく複雑である。
【００７５】
構造遺伝子の翻訳産物であるタンパク質およびペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いる第１の明白な標的である。今後、鍵酵素(key enzymes)の遺伝工学によって、代謝産物産生を改善する第１代謝系および第２代謝系を操作できる可能性がある。
【００７６】
１００℃まで基質を分解する能力を有する、高温安定性酵素を産生する好熱性のバチルス属は、基質加水分解工程を効率化するだけでなく、非常に安定した特性で他の酵素を単離または構築する起動力を生じる。
【００７７】
細菌はタンパク質を高水準で発現することができる。一般に、グラム陰性細菌は、細胞外タンパク質分泌細胞として優れてはいないが、グラム陽性細菌は、細胞外タンパク質の分泌に著しく優れている。したがって、ＳＨ２ＡとＳＨ２Ｂなどの好熱性バチルス属は工業用酵素の好適な産生細胞であろう。
【００７８】
出願人は、可能な限りＤＮＡ組換えによって、細菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂの改良を開発し、複数の目的に使用可能な、急速に増殖するが、安全で有効な組換え細菌を提供する。例えば、出願人は、さらに、脂質、タンパク質、炭水化物、または繊維分解を増強する遺伝子を導入することを計画している。材料が廃棄物から容易に回収され、また、ほんのわずかな操作工程を必要とするだけであるので、脂質は理想標的である。その後、処理した脂質を細菌によって廃棄物中で分解することができる。
【００７９】
（実施例４）
脱水による有機汚泥脱水およびバシルス・ミドウスジ菌株を用いた凍結解凍処理の方法
１．汚泥の一般的な概念
排水からの除去懸濁物質中には、分離段階で沈殿し濃縮する部分と、汚泥と称する部分がある。汚泥は遊離物質、懸濁物質、中和生成物などからなり、その濃度は数千ｐｐｍから数万ｐｐｍｓの範囲にあり、また、分散粒子の大きさはコロイドから粗いものまで多様である。
【００８０】
水処理工程から生じた汚泥は、廃棄物として処理しなければならない。そのためには、まず脱水し、その濃縮状態でさえ高水分含量であるので、その質量を低減しなければならない。
【００８１】
汚泥の特性は、含まれている微粒子、縮合剤などの添加剤および製品、並びに粒度分布によって変わる。一般に、汚泥の脱水工程は、実行が困難であり、汚泥処理の大きな問題となっている。
【００８２】
２．脱水方法
現在的に実施可能な汚泥脱水方法には以下のものがある。乾燥床方法（実施が容易、しかし広い用地が必要）、遠心分離法（ほとんどの生汚泥および消化汚泥に適用）、加圧濾過法、真空濾過方法（本実験での真空濾過として使用）。
【００８３】
３．凍結／解凍方法
汚泥に縮合剤を添加することによって水分を除去し、次に、上記方法によって汚泥を脱水することによる１つの主要な欠点は、縮合剤が汚泥の全体量を増加するということである。また、これは、質量を低減するという脱水の所期の目的に反するものであり、そのような方法は不適当である。
【００８４】
この問題を解決するために開発された方法の１つが凍結／解凍方法である。イギリスで最初に使用されたこの方法は、理想的条件で凍結した汚泥を解凍し、次いでそれを濾過した場合、脱水率が縮合剤添加法で達成されるのと等しいか、または優れているという結果を示した。
【００８５】
４．凍結／解凍処理の原理
凍結解凍処理による材料処理の目的は粒子を拡大させることであり、それは粒子表面積を縮小し、その結果、粒子表面に付着する水分を低減するとともに、粒子内の水分を除去する。この脱水効果を指示する理論が検討されている公表報告書はほとんどない。G.S.ロングスドン(G.S.Longsdon)ら（米国）が図２のような理論を記載している。
（１）図２では、該容器底部が冷却表面として明示されており、まず、純水がその冷却表面から凍結する。氷を形成するための十分な水移動で、汚泥固形物は成形する氷と混合することなく、層中の凍結表面の表面で圧縮される。
（２）汚泥粒子並びに凍結境界に接する表面に付着している水の間の水は、毛管力によってこの凍結法を実施している間に氷になる。脱水された固形物層からの抵抗により、水移動はスローダウンし、集められた固形物層は氷に取り込まれる。
（３）凍結境界の成長は、水が自由に移動している領域まで続き、上述の工程は継続する。
【００８６】
５．凍結／解凍処理の特性
凍結／解凍処理の特性については、以下のように述べることができる。
ａ．化学薬品を使用することなく脱水処理を行うことができる。従って、
ｉ．最終段階で処分され得る汚泥の量が増加しない；
ｉｉ．添加剤による二次汚染の危険がない。（濾過助剤として用いられる石灰を土地に入れた場合、土壌はアルカリ性になり、いかなる植物の成長も妨げる。）
ｂ．水を再び加えても、最終産物はそのオリジナルの状態に戻ることはない。（これは埋めたて処分の間重要となる）。
ｃ．濾過流体は使用後さらに清澄を維持する。（水処理施設では、環境によって、それを供給源水として再使用してもよい）。
ｄ．焼却および乾燥との比較
Ｉ．汚泥を標準温度以下で処理することができ、煙および臭気などの二次汚染の危険はない；
ｉｉ．材料および腐食の問題を最小限にすることができる；
ｉｉｉ．脱水工程に必要なエネルギー使用量が小さくてすむ；
ｉｖ．メンテナンス方法が簡単なので、人件費が削減できる。その工程は完全に自動化することができる。
【００８７】
６．凍結／解凍融合処理の制限
汚泥は主として、有機汚泥（家庭廃棄物水からの排水）、無機汚泥（クロム、酸性洗浄剤排水および水処理施設から汚泥）、前記２つの混合、の３つに分類することができる。有機汚泥では、処理可能な水負荷濃度に関し、その脱水効果は無機汚泥ほど広範ではない。現在、無機汚泥に対する凍結／解凍処理の実施に労力を注いできているが、この処理方法では、処理可能な有機含有量濃度の限界が５０％であり、排水処理に不適当である。これは、排水中の有機含有量濃度が無機含有量濃度よりも高く、結合した水除去が困難となっているためである。
【００８８】
７．微生物の分解
本実験の目的は、有機汚泥に対する凍結／解凍処理の効果を改良することであり、高温での微生物分解によって、我々は汚泥から結合水を除去することを試みている。さらに、我々は、混合物へ添加することにより、界面活性剤および培養物溶解酵素の効果を検討した。
【００８９】
Ｉ．材料および機器
１．好熱菌
バシルス・ミドウスジ ＡＴＣＣ５９２６  ＳＨ２Ａ、ＳＨ２Ｂ。
【００９０】
２．サポニン
洗浄剤はアマゾン植物(amazone plant)から調製した。
【００９１】
３．酵素
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｙｃｕｓ(Pure Chemical Inc.)由来。
【００９２】
４．汚泥
水処理施設、有機汚泥排水処理施設から得た濃縮無機汚泥、および標準活性汚泥（グルコース、ペプトン、リン酸カリウムを含むｐＨ７の培地でインキュベートされたもの）。実験で用いる汚泥は、沈殿して濃縮した。
【００９３】
５．汚泥凍結システム
２×２５×２５ｃｍのステンレス容器を汚泥凍結容器として使用した。汚泥の凍結は、不凍液冷却によって摂氏−４０℃に調節することができる低温一定温度深皿(low constant temperature basin、ADVANTEC INC.)に直接汚泥を入れることにより行った。
【００９４】
６．Ｎｕｔｃｈ装置
汚泥の脱水は、排水試験方法におけるＮｕｔｃｈ装置により実施した。
【００９５】
７．赤外線水分測定
この装置は、赤外線で試料を乾燥し、その工程で得られた水分蒸発から質量の変化を測定することによって水分含有量および固形含有量を測定する(Kett Inc.FD-240)。乾燥質量低減法(dry mass reduction method)と呼ばれるこの工程は、最も基本的な測定の１つであり、多くの組織で公式標準測定法として採用されている。
【００９６】
ＩＩ．実験方法
１．凍結／解凍方法
水処理施設からの汚泥（無機汚泥）、微生物分解が行われた排水処理施設からの汚泥（有機汚泥）、および標準汚泥を汚泥凍結容器に入れた。その後、低温一定温度深皿にその凍結容器を置き、そこで、汚泥試料を−１０℃で３時間凍結した。その後、熱水で汚泥試料を解凍した。
【００９７】
２．微生物分解方法
有機汚泥試料を５０ｍｌの蓋付き容器中に入れた。汚泥試料にＢ．ｍｉｄｏｒｉｓｕｊｉを接種し、次に、６２℃で１６〜１８時間培養した。その後、微生物分解を行った。
【００９８】
３．サポニン処理
有機汚泥に対し、サポニン０．２ｍｌを汚泥２０ｍｌごとに添加した。
【００９９】
４．酵素処理
有機汚泥に対し、酵素０．０１ｇを汚泥４０ｍｌごとに添加し、３７℃で１８時間保持した。上述の１〜４の方法および処理組み合わせることによって、水分量および濾過速度を測定した。水分および濾過速度の測定は、以下のように行った。
【０１００】
（１）濾過速度の測定
Ｎｕｔｃｈ装置に汚泥試料を入れた。減圧工程の間、時間経過に従って濾過流体の量を測定した。得られたグラフ上に示された角度から、濾過速度を計算した。
【０１０１】
（２）汚泥水分の測定
汚泥試料を上述の処理方法で濾過した後、水分量を赤外線水分測定によって測定した。
【０１０２】
５．燃焼完了（ｂｕｒｎｔ  ｏｕｔ）の測定
各汚泥の有機物含有量レベルを検出するために、燃焼完了工程を実施した。
【０１０３】
ａ．無機汚泥の水分および濾過の測定
無機汚泥に関する速度
１．変質していない試料を赤外線水分測定の試料プレート上に置き、原料の水分を測定した。
２．（減圧濾過）図のように試料１５ｍｌを該装置のブフナー濾過器に置き、濾過器を減圧し、ストップウォッチをスタートした。（濾過速度計算の目的で）濾液が吸光度ビン内部の試験管中に蓄積するまでの時間を記録した。加圧濾過の場合には、試料の上に更なる濾過紙を置き、その後、２００ｍｌが入ったビーカーを重しとして試料上に置き、吸収を開始した。
３．濾過紙の上の汚泥水分は赤外線水分測定によって測定した。
４．（凍結／解凍）試料を凍結容器に入れ、その容器を低温一定温度深皿に置いた。その試料は、−３℃の冷却（凍結）温度で３時間までそこで凍結し、その後、熱水で解凍した。
５．その凍結し解凍した試料を吸収濾過に通した後、水分含有量を測定した。
【０１０４】
ｂ．有機汚泥に関する水分量および濾過速度の測定
１．無機汚泥と同様に、原料汚泥の水分量を測定した。
２．有機汚泥に関し、水分量は以下のそれぞれについて測定した。真空減圧濾過前に処理を行わない凍結／解凍、微生物分解のみ、凍結／解凍後に微生物分解、微生物分解後に凍結／解凍、サポニン処理、および、サポニン処理後に凍結／解凍。サポニン処理は以下のように実施した；
１）微生物分解：汚泥試料を試験管に入れ、微生物をそれらに接種した。微生物は、６２℃で１６〜１８時間、恒温器中で培養した：
２）サポニン処理：２０ｍｌの試料ごとにサポニン０．２ｍｌを添加した：
３）標準の活性汚泥試料は、酵素０．０１ｇを添加し、３７℃で保持して、有機汚泥と同じ工程を行い、凍結／解凍および吸着または吸着床濾過の後に、水分含有量を測定した：
４）燃焼完了（Ｂｕｒｎｔ  ｏｕｔ）による質量換算。
【０１０５】
約１５ｍｌの試料を濾過し、濾過紙上の脱水ケーキを乾燥機中で乾燥した。これらは蒸発残留物（ｇ）になった。これらをプラチナポットで燃焼完了し、燃焼残留物の質量と燃焼による蒸発残留物の質量低減の比（％）を算出した。
【０１０６】
図３は、汚泥の微生物分解を記述している。汚泥を凍結容器に入れる。その凍結容器を冷水浴に入れる。その汚泥を−１０℃で３時間凍結する。その後、それを熱水で解凍し、ビーカーへ注いだ。
【０１０７】
図４は、真空濾過の工程について記述している。汚泥２０ｍｌをブフナー濾紙Ｎｏ．１へ注ぐ。真空ポンプを作動し、ストップウォッチをスタートする。試験管中へ滴下する濾過液体の量、およびそれに要した時間を記録する（濾過速度計算）。加圧濾過については、濾紙の新たな層を汚泥上に置き、水２００ｍｌを満たした２００ｍｌ容ビーカーを重しとして上部に置いた。水分量の測定は図５に記載したとおりである。濾過した汚泥を水分測定の試料プレート上に置く。水分測定器の蓋を閉め、スタートボタンを押す。
【０１０８】
ＩＩＩ．実験結果
１．水処理汚泥からの汚泥（無機汚泥）
原料汚泥の水分量は、すべての水処理施設において約９５％であった。対照的に、真空濾過を通した汚泥試料の水分量は、平均がわずかに７９％であり、凍結／解凍および真空濾過を通した汚泥の水分量は、平均６３％であった。さらに、真空濾過と比較した場合、加圧濾過では７％だけ水分量が低くなった（水処理施設Ｋ）。
【０１０９】
凍結／解凍を実施した場合、真空濾過のみと比較すると、その濾過速度は、水処理施設Ｙでは６．８倍、水処理施設では２．８倍、水処理施設Ｋでは８．８倍高まった。
【０１１０】
２．排水処理施設からの汚泥（天然有機汚泥）
原料汚泥の水分は９８％であった。これは真空濾過の後に８３．７％まで低下した。原料汚泥に微生物分解を行った後、水分量はＳＨ２Ａ菌株では７７．４％、ＳＨ２Ｂ菌株では７４．３％まで低下した。凍結／解凍（ＳＨ２Ａのみ）の後に微生物分解を行った汚泥では、水分量は７３．５％まで低下した。一方、微生物分解の後に凍結／解凍を行った汚泥試料では、ＳＨ２Ａの水分量は７４．３％、ＳＨ２Ｂの水分量は７６．３％であった。
【０１１１】
凍結／解凍を行った汚泥の濾過速度は、未処理のものより１．７倍速く、一方、微生物分解を実施した汚泥試料は、未処理ものと比べると、ＳＨ２Ａでは１．５倍、ＳＨ２Ｂでは１．３倍速くなった。凍結／解凍後に微生物分解を行った汚泥については、濾過速度は未処理ものと同じであった。しかし、微生物分解後に凍結／解凍を行った汚泥試料については、未処理のものに比べて、ＳＨ２Ａの濾過速度は３．３倍速く、ＳＨ２Ｂの濾過速度は３．０倍速くなった。
【０１１２】
サポニンが添加された汚泥については、サポニン処理のみ実施したものの水分は８４．１％であり、また、その濾過は未処理の汚泥と同じままだった。このスラッジで凍結／解凍処理を実施した場合、水分は８０．３％まで減少し、濾過速度は２０％だけ増した。なおそのうえに微生物処理（ＳＨ２Ａ）を実施した場合、水分は７４．６％まで低下し、濾過速度は１０％だけ増した。
【０１１３】
酵素を添加した場合、水分量は７８．４％まで減少し、濾過速度は１０％高まった。
【０１１４】
３．標準活性汚泥
原料汚泥の水分は９９．４％であった。真空濾過の後に、水分は８４．８％まで低下し、また、凍結／解凍の後には８０．６％まで低下した。微生物分解が単独で実施された汚泥試料は、ＳＨ２Ａでの水分量は９０．１％であり、ＳＨ２Ｂでの水分量は８８．２％であった。凍結／解凍後に微生物分解を実施した汚泥については、ＳＨ２Ｂでの水分は７３．８％であった。微生物分解後に凍結／解凍を行った汚泥試料については、ＳＨ２Ａでの水分量が７７．３％であり、ＳＨ２Ｂでの水分は７８．１％であった。
【０１１５】
凍結／解凍を単独で実施した汚泥については、濾過速度は未処理のものより１．５倍速くなった。微生物分解を単独で実施した汚泥試料については、ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂの双方の濾過速度は、未処理のものより０．５倍速くなった。凍結／解凍（ＳＨ２Ｂ）後に微生物分解を実施した汚泥については、濾過速度が、未処理のものより２．８倍速くなった。微生物分解後に凍結／解凍を実施した汚泥試料については、未処理のものに比べて、ＳＨ２Ａでの濾過速度は２．４倍速く、ＳＨ２Ｂでの濾過速度は２．６倍速くなった。
【０１１６】
サポニンを添加した汚泥では、添加したサポニンのみを含む汚泥の水分は７９．０％であり、濾過速度は１．５倍速くなった。凍結／解凍をサポニン添加後に行った場合、水分は７８．３％まで低下し、濾過速度は２．４倍速くなった。
【０１１７】
酵素を添加した汚泥については、添加された酵素を単独で含む汚泥の水分は８４．２％であり、濾過速度は０．９倍速くなった。凍結／解凍をを酵素添加の後に行った場合、水分は８１％まで低下し、濾過速度は２．７倍速くなった。
【０１１８】
４．燃焼完了による質量低減
水処理施設汚泥について、懸濁物質に対する質量減少の割合は、処理施設Ｙでは２９．８％、処理施設Ｍでは２３．０％、処理施設Ｋでは４１．６％であった。天然有機汚泥のその割合は７６．６％であった。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
ＩＶ．論考
序文で述べているように、無機汚泥のために、凍結／解凍は、脱水の実用的且つ実施可能な方法となっている。実験結果から、我々は適当量以上の再生産データを得ることができた。
【０１２７】
燃焼終了による質量減少の実績から、我々は、無機汚泥および天然有機汚泥の有機含有量が大きく変動することを確認でき、また、すでに述べられているように、凍結／解凍は有機汚泥より無機汚泥の脱水においてより効果的であった。
【０１２８】
天然有機汚泥の場合については、我々は、微生物分解のみを行うことで凍結／解凍を実施した汚泥と同じレベルを得ることができた。濾過速度は未処理の汚泥よりもわずかに増し、したがって、微生物分解が天然有機汚泥に有効であることが証明された。一方、微生物分解と凍結／解凍の組み合わせは、より多量の水分量の低下をもたらさず、したがって、我々は、この場合には微生物分解のメリットは見出せなかった。
【０１２９】
しかし、興味ある特徴は濾過速度であった。２種の組み合わせの中で、最初に微生物分解を実施し、次に凍結／解凍を行った組み合わせの場合、未処理の汚泥と比較すると３倍までに濾過速度が増した。この事実は微生物分解に対する新たな可能性を開くかもしれない。
【０１３０】
標準の活性汚泥に対する微生物分解単独では、水分または濾過速度における顕著な効果はもたらされなかった。分解を行った汚泥が分解処理前の汚泥よりも品質においてより濃さを増したという事実は肉眼でも明らかであり、また、濾過速度の低下を示したデータによってこの観察は裏づけされた。
【０１３１】
しかし、それと凍結／解凍と組み合わせることにより、凍結／解凍単独を実施した汚泥と比較すると、水分量は低下し、また、濾過速度は増した。組み合わせた２つの処理方法に対するデータが正確であり、また、これらの優れたデータ結果が別々の測定日によるものでなく、また、実験の実効エラーによるものでない場合、２つの処理方法の組み合わせによる効果は多くの新たな可能性を開きうるであろう。
【０１３２】
実験結果から、いずれの方法を先に実施すべきかという疑問が生じる。天然有機汚泥については、水分量に関してその程度は重要ではなかったが、他のほとんどすべてのデータは微生物分解を最初に行うべきことを示した。我々は微視的なデータを持たないので、汚泥で微生物分解がどのように行われているのかというメカニズムについては不確かであるが、しかし、汚泥が微生物によって分解されるか破壊され、それによって凍結／解凍の有効性が増加するのではないかと思われる。最初に凍結／解凍を実施する場合、後で実施された微生物分解が汚泥内の微生物を増加するので、凍結／解凍処理の効果が無くなると考えられる。
【０１３３】
サポニン処理および酵素処理に関しては、サポニン処理が標準活性汚泥に有効であるのに対して酵素処理は天然有機汚泥に有効である。凍結／解凍とこれらの２種の方法との組み合わせによって、汚泥処理の新しい方法が得られると思われる。しかし、実験のこの部分は補足として実施されたものであるので、さらなるコメントをするためには、得られたデータでは不完全すぎる。
【０１３４】
（実施例５）
バシルス・ミドウスジＡＴＣＣ  ２０２０５０  ＳＨ２Ｂ(Bacillus midousuji ATCC 202050 SH2B)によるジベンゾフランの生分解
１．試料および方法
１）ｎ−ヘキサンにジベンゾフラン（関東化学株式会社、東京）を１０，０００ｐｐｍとなるように溶解した；
２）１００ｐｐｍのトリプチカーゼ大豆液体培地(BBL)でＤＦを１ｍｌまで希釈し、さらに、培地を蒸留水で１倍、１／４倍、１／６倍に希釈した；
３）ＤＦ溶液(0.5mL)へＳＨ２Ｂ菌株を１０５細胞で接種した。；
４）ＤＰ  ｗ／  ＳＨ２Ｂを振盪浴を用いて６４℃で４２時間インキュベートした。
【０１３５】
２．溶液中に残存するＤＦの検出
１）各試料試験管に内部コントロール（３７Ｃ１テトラＣ１−ＤＦ  １０ｎｇ）を添加した；
２）溶液に２ＮまでＨＣｌを加えた；
３）試験管を１時間静置し、３．５５ｍＬまで３ｍＬのＰＷを添加した。
４）トルエンによってＤＦを、３回、抽出した；
５）１００ｎＬまでのＮ２ガスで抽出した；
６）ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィ−質量分析）によってＤＰを検出し、ＳＩＭ（単イオンモニター）システムによってＤＰを定量した；
７）さらに、代謝産物をＴＩＭシステムを備えたＧＣ−ＭＳによって検出した。
【０１３６】
３．図６の結果
ブランク；９０μｇのＤＰ
完全培地：１０μｇのＤＰ
１／４培地：３０μｇのＤＰ
１／６培地：４５μｇのＤＰ
代謝物質は検出されず、Ｈ２Ｏまで分解されたものと思われる。
【０１３７】
４．所見
好熱性のバシルス・ミドウスジ(Bacillus midousuji)ＡＴＣＣ２０２０５０  ＳＨ２Ｂ菌株は、ダイオキシンの一種、ジベンゾフラン非塩化物を二酸化炭素および水まで分解した。
【０１３８】
（実施例６）
ＰＣＢ異性体の生分解
１）テフロンスクリューキャップ付きの３つのガラスフラスコをエタノールで３回洗浄し、乾燥した。
【０１３９】
２）フラスコに４０ｍｌの液体培地（トリプチカーゼ大豆液体培地−ＢＢＬ）を注いだ。
【０１４０】
３）ハミルトンマイクロシリンジによってエタノール中にＰＣＢ３０μｌを添加した。
【０１４１】
４）負性対照として、単離ＳＨ２Ａ、ＳＨ２Ｂ（１０６ｃｆｕ）および液体培地をそれぞれフラスコへ分け、６２℃で６０時間隔離した。
【０１４２】
５）各内容物をそれぞれガラス輸送びんへ注ぎ移した。生理食塩水で残余を洗浄し、デッドスペースなく輸送びんへ移した。
【０１４３】
６）輸送びん中の全ＰＣＢをトルエンによって抽出し、ガス質量分析によって定量化した。
【０１４４】
結果
１）高温細菌バシルス・ミドウスジＡＴＣＣ  ５５９２６  ＳＨ２Ｂ菌株は、塩素化ビフェニル（１）２，（２）４，（３）２．６，（４）４．４’，（５）３．４．４’，（６）２．２’，６．６，（７）２．２’，４．６．６’などのＰＣＢ異性体を分解した。
【０１４５】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  細菌株ＳＨ２ＡおよびＳＨ２Ｂの１６Ｓ ｒＲＮＡの核酸配列を示す。
【図２】  ロングスドン(Ｌｏｎｇｓｄｏｎ)らによって記載された脱水効果の理論を示す。
【図３】  汚泥中の微生物分解を示す。
【図４】  真空濾過を示す。
【図５】  水分含量の測定を示す。
【図６】  Ｂ．ミドウスジ ＳＨ２Ｂ(B.midousuji SH2B)によるジベンゾフラン（ダイオキシン非塩化物）分解を示す。
【図７】  Ｂ．ミドウスジ生分解のＰＣＢ異性体基質特異性を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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