(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリオスペルマム由来の（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は同酵素組成物であって、
シアン化合物およびカルボニル化合物から(S)-シアノヒドリンへの合成反応を触媒するものであり、かつ、バリオスペルマムの植物体の懸濁液を、30-70％硫酸アンモニウム画分を用いる硫安分画及び交換基にジエチルアミノエチルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製して得られるものである、前記（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は酵素組成物。
【請求項２】
前記（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼが2.9付近の比活性を示すものである、請求項１記載の（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は酵素組成物。
【請求項３】
バリオスペルマム由来の（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は同酵素組成物を用いてカルボニル化合物及びシアン化合物を処理することを特徴とする、シアノヒドリンの製造方法であって、
ここで、前記（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は酵素組成物が、シアン化合物およびカルボニル化合物から(S)-シアノヒドリンへの合成反応を触媒するものであり、かつ、バリオスペルマムの植物体の懸濁液を、30-70％硫酸アンモニウム画分を用いる硫安分画及び交換基にジエチルアミノエチルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製して得られるものである、前記方法。
【請求項４】
前記（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼが2.9付近の比活性を示すものである、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性シアノヒドリンは、光学活性有機合成中間体として有用であり、例えば医薬品等を得るために使用される。
【０００３】
光学活性(S)-シアノヒドリンをシアン化合物とカルボニル化合物とから合成する手段の一つとして、(S)-ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素を使う合成方法が知られている（特開平2-223546号公報：特許文献１、特開平7-51076号公報：特許文献２、特開平9-227488号公報：特許文献３、特開平11-243984号公報：特許文献４、特表2001-513625号公報：特許文献５）。例えば、ベンズアルデヒドとシアン化カリウムとを、(S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ触媒により反応させると、（S)-マンデロニトリルが生成する（図１）。
【０００４】
(S)-ヒドロキシニトリルリアーゼには、例えばトウダイグサ科に属する植物であるキャッサバ（Manihot esculenta)由来のもの（EC 4.1.2.37）、パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）由来のもの(EC 4.1.2.39)、あるいはイネ科に属する植物であるモロコシ（Sorghum bicolor）由来のもの（EC 4.1.2.11）などが知られており、これらの酵素をコードする遺伝子配列も知られている。
【０００５】
通常、上記酵素を使用する光学活性シアノヒドリンの合成は、当該酵素並びに基質であるシアン化合物及びカルボニル化合物を必須要素として、水系、水-有機溶媒二相系、有機溶媒-微水系、有機溶媒系等で実施されるが、その際に、非対称のシアノヒドリンのエナンチオマー混合物が生じる。一般に、生物活性エナンチオマー混合物においては、二種類のエナンチオマーのうちの一方だけが生物活性を示すため、光学活性シアノヒドリンの(S)-エナンチオマーをできるだけ高純度で製造する必要がある。
しかし、得られた(S)-シアノヒドリンの光学純度は、必ずしも満足のいくものではない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平2-223546号公報
【特許文献２】
特開平7-51076号公報
【特許文献３】
特開平9-227488号公報
【特許文献４】
特開平11-243984号公報
【特許文献５】
特表2001-513625号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼを提供することを目的とする。また、本発明は、該酵素を用いた(S)-シアノヒドリンの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、バリオスペルマムの植物体の懸濁液から（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ組成物を得、これにより光学活性なシアノヒドリンを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけたときの酵素の比活性は2.9付近である、バリオスペルマム由来の（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（２）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて得ることができる、（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物。
（３）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけることを特徴とする、（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物の製造方法。
（４）前記（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ又は酵素組成物を用いてカルボニル化合物及びシアン化合物を処理することを特徴とするシアノヒドリンの製造方法。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の(S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、「(S)-hnl」という。）は、シアン化合物とカルボニル化合物とから(S)-シアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味し、バリオスペルマム(Baliospermum)から得ることができる。
【００１２】
１．酵素の調製
本発明の酵素組成物の供給源としては、バリオスペルマムの植物体が挙げられる。バリオスペルマムとは、中国（雲南省）等に産するトウダイグサ科植物でる。バリオスペルマムの植物体は、直接採木したものでも市販のものでもよく、茎、葉、種子等が用いられる。本発明においては、採取しやすい点で葉（若葉）が好ましい。
【００１３】
本発明の酵素組成物は、以下の調製方法により得ることができる。すなわち、上記バリオスペルマムの葉、茎を液体窒素等により凍結してすりつぶした後、リン酸バッファー等の緩衝液に懸濁する。
この懸濁液について、酵素の精製に常用される(1)沈澱による分画、(2)各種クロマトグラフィー、(3)透析、限外濾過等による低分子物質の除去方法などを、単独で、又は適宜組み合わせて使用することにより得ることができる。
【００１４】
(1)の沈澱による分画に使用される物質は、水に対する溶解度が高く、溶解度の温度変化が少ない点で硫酸アンモニウム（硫安）が好ましい。添加する濃度は特に制限はないが、(S)-hnlを収率良く回収でき、しかも他の蛋白質成分と分離できる条件が好ましい。例えば、30-70%硫酸アンモニウムを用いることにより、(S)-hnl成分を効率よく分画することができる。
【００１５】
(2)のクロマトグラフィーとしては、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、コンカナバリンＡ(Con-A)クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１６】
▲１▼ ゲルろ過法は、タンパク質を分子量の大きさで分ける手法であり、ゲル粒子が持つ網目構造により、目的とするタンパク質の分子量に応じて選択することができる。ゲルろ過に使用されるカラムとしては、例えばSephadex G25、Sephadex G50、 Sephadex G100又はSephadex G200（いずれもPharmacia)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
▲２▼イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質が両性電解質であることを利用した分離法であり、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーがある。陽イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはカルボキシメチル(CM)が用いられ、例えばCM-Toyopearl（東ソー）、CM-Cellulofine（生化学工業）、CM-Sephadex（Pharmacia）カラム等が挙げられる。また、陰イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはジエチルアミノエチル（DEAE）が用いられ、例えばDEAE-Toyopearl（東ソー）、DEAE-Cellulofine（生化学工業）、DEAE-Sephadex（Pharmacia）カラム等が挙げられる。但し、これらのカラムに限定されるものではない。
【００１８】
▲３▼ 疎水性クロマトグラフィーは、タンパク質とゲルに結合したリガンド間の疎水的相互作用に基づく分離手法である。また、移動相を極性有機溶媒、固定相を長鎖の無極性リガンドとし、両相間で溶質の分配を行う逆相クロマトグラフィーを利用することもできる。
【００１９】
▲４▼ コンカナバリンＡ(Con-A)クロマトグラフィーは、糖鎖を持つタンパク質とレクチンであるコンカナバリンＡの相互作用に基づく分離手法である。例えばCon-A-Sepharose（Pharmacia）カラム等が挙げられる。
【００２０】
(3)透析、限外濾過等
透析は、セロハン製の透析チューブに試料液を入れ、大量の純水又は低濃度の緩衝液に浸すことにより低分子化合物をセロハンチューブの外側に透過させる手法である。
限外ろ過法は、限外ろ過膜（平板膜、中空繊維ホロファイバー）を用いて、目的のタンパク質を濃縮する手法である。カットオフ分子量は500〜500,000程度の範囲である。手法としては加圧撹拌法、強制循環式濃縮法（ホロファイバー）、遠心法がある。
【００２１】
本発明においては、上記精製手法のうち硫安分画及び陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて用いることが好ましい。
【００２２】
２．酵素の性質
本発明の酵素組成物は、複数の酵素活性物質を含む混合物であってもよく、それらの活性物質が単離された個別の活性物質からなる酵素組成物（又は酵素自体）をも包含する。
葉の懸濁液を硫安分画した後の酵素組成物の比活性は1.2(U/mg)であり、その後さらにDEAE-Toyopearl陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた後の比活性は2.9(U/mg)付近である。
ここで、「比活性」とは、標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから、酵素1mg中、1分あたり1 μmolの光学活性マンデロニトリルを生成する酵素の量（U/mg)をいう。
【００２３】
３．シアノヒドリンの製造
本発明においては、光学活性シアノヒドリンの製造原料としてカルボニル化合物及びシアン化合物を用い、本発明の(S)-hnlを作用させてシアノヒドリンを製造する。
ここで、カルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
Ｒ1−ＣＯ−Ｒ2    （Ｉ）
で示される化合物をいう。
【００２４】
式Iにおいて、Ｒ1及びＲ2は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）の炭化水素基、置換基を有していてもよい炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜20（Ｃ6〜Ｃ20）のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数７〜20（Ｃ7〜Ｃ20）のアルキルアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数２〜20（Ｃ2〜Ｃ20）のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいシリル基又は水酸基である。但し、Ｒ1及びＲ2が同時に水素原子となることはない。また、置換基を有していてもよいアルキルチオ基、置換基を有していてもよいアリールチオ基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基であってもよい。
【００２５】
前記炭化水素基中、−ＣＨ2−及び−ＣＨ3のＣＨ2はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ2は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ2−のＣ−Ｈ、−ＣＨ3のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ及び＝ＣＨ2のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ1及びＲ2は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２６】
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基、Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基、Ｃ6〜Ｃ18アリール基、Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基、Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基、（Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル）Ｃ1〜Ｃ10アルキル基などが含まれる。
【００２７】
Ｃ1〜Ｃ20アルキル基は、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基であることが好ましい。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
【００２８】
Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル基であることが好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、2-メチル-1-プロペニル基、2-メチルアリル基、2-ブテニル基等が挙げられる。
【００２９】
Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルキニル基であることが好ましい。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基は、Ｃ4〜Ｃ10アルキルジエニル基であることが好ましい。アルキルジエニル基としては、例えば1,3-ブタジエニル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｃ6〜Ｃ18アリール基は、Ｃ6〜Ｃ10アリール基であることが好ましい。アリール基としては、例えばフェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基は、Ｃ6〜Ｃ12アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基としては、例えばo-トリル基、m-トリル基、p-トリル基、2,3-キシリル基、2,4-キシリル基、2,5-キシリル基、o-クメニル基、m-クメニル基、p-クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
【００３１】
Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基は、Ｃ6〜Ｃ12アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、1-ナフチルメチル基、2-ナフチルメチル基、1-フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
【００３２】
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｃ1〜Ｃ20アルコキシ基は、Ｃ1〜Ｃ10アルコキシ基であることが好ましい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ20アリールオキシ基は、Ｃ6〜Ｃ10アリールオキシ基であることが好ましい。アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ7〜Ｃ20アルキルアリールオキシ基は、Ｃ7〜Ｃ12アルキルアリールオキシ基であることが好ましい。アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
【００３４】
Ｃ2〜Ｃ20アルコキシカルボニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルコキシカルボニル基であることが好ましい。アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、2-メトキシエトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
【００３５】
置換基を有していてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、メチルフェニルアミノ基、フェニルアミノ基等が挙げられる。
【００３６】
置換基を有していてもよいシリル基としては、例えばジメチルシリル基、ジエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリフェニルシリル基、トリフェノキシシリル基、ジメチルメトキシシリル基、ジメチルフェノキシシリル基、メチルメトキシフェニル基等が挙げられる。
【００３７】
前記式Iで示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００３８】
本発明においては、反応原料の濃度を高めて生産性を良くするために、反応溶媒として有機溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば芳香族炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）；ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）；アルコール系溶媒（例えばｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど）；エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）；エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。
【００３９】
前記有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和されていてもよく、更に過剰の水又は水性緩衝液を加えて、有機溶媒相と水相との二相系を形成する溶液状態としたものでもよい。前記の有機溶媒を水又は水性緩衝液で飽和する方法としては、例えば前記の有機溶媒と水又は水性緩衝液を二相を形成する割合で混合及び撹拌し、静置した後、その有機層を用いる方法が挙げられる。
【００４０】
本発明において使用されるシアン化合物としては、例えばシアン化水素又はその塩（シアン化カリウム、シアン化ナトリウム）などが挙げられる。
【００４１】
本発明の(S)-hnlは、粉末状、液状、又は適当な担体に固定化してなる固定化酵素などの状態のものを使用することができる。固定化担体としては、例えば多孔性の無機担体、セルロースなどの繊維状の担体、高分子化合物からなる担体などが挙げられ、具体的には、多孔性のセラミック粒子、多孔性のシリカゲル粒子、ゼオライト系粒子、寒天、アルギン酸カルシウム、キトサンなどの天然高分子ゲル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成高分子ゲルなどが挙げられる。酵素を固定化するには、例えば担体に酵素液を吸収させる方法、酵素液と担体とを混合し、酵素を吸着固定する方法、酵素を包括固定化する方法、酵素を架橋剤で架橋する方法等の任意の手法を採用することができる。
【００４２】
固定化酵素及び基質の使用量又は反応条件は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、固定化酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物1mmolに対して0.1〜500単位、好ましくは1〜100単位である。基質の濃度は、カルボニル化合物の場合は通常1〜500g/Lの範囲に設定し、シアン化合物は用いるカルボニル化合物に対して0.1〜10倍モル、好ましくは0.5〜5倍モルの濃度で添加する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が60％以上、好ましくは80％以上に達するまでの時間が適当である。但し、反応時間はこれらに限定されるものではない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であれば特に限定されるものではなく、通常0〜50℃、好ましくは10〜40℃である。
【００４３】
本発明の方法によって生成された(S)-シアノヒドリンは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などによって、測定又は定量することができ、必要に応じて、抽出、減圧蒸留、カラム分離などの通常の手段によって分離精製することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例1〕バリオスペルマム酵素液の調製及び酵素活性の測定
(1) 粗酵素液の調製
バリオスペルマムの若葉(35 g)を液体窒素中で凍結し、乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした。得られた粉末を120 mlの50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 6.0)に約3-4時間懸濁し、次に数層のガーゼを通して濾した。濾液を28,000 xgで25分間2回遠心した。得られた溶液を10 mMバッファーに対して4時間透析し（バッファーは３回交換）、100 mlの酵素溶液を得た。この酵素溶液をAmiconセル（PM 10フィルター）により1.0 mlに濃縮した。マンデロニトリルリアーゼ活性の検出には、この濃縮溶液を使用した。
【００４６】
タンパク質（酵素）濃度は、ウシ血清アルブミンを標準品とするBio-Rad protein assay Kit (Bio-Rad, USA)を用いて、あるいは595 nmにおける吸光度を測定することによって求めた。
その結果、酵素濃度は7.19 mg/mlであった。
【００４７】
(2)ベンズアルデヒドを基質とした活性測定
次に、ベンズアルデヒドからの(S)-マンデロニトリルの生成を測定することによって酵素活性をアッセイした。
100 μlの酵素溶液を添加することによって反応を直ちに開始し、25℃で120分間インキュベートした。種々の反応時間に対して、100 μlの反応混合物を分取した。
900 μlの有機溶媒（ヘキサン：イソプロパノール= 9:1）を添加して反応を停止させ、遠心（15,000 x g、10 分）により得た上清をHPLCによりアッセイした。
各成分の量はCHIRALCEL OJ-Hカラムを用いてヘキサン：イソプロパノール= 90:10 を移動相として流量1.0 ml/分で流し254 nmで測定し、それらの標準曲線を用いて算出した。
標準アッセイ溶液は、最終容量0.9 ml中に300 mMリン酸カリウムバッファー(pH 6.0)、50 mMベンズアルデヒド及び100 mMシアン化物溶液を含有する。
なお、上記分析条件で図２に示すように活性測定が可能となる。
標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから1分あたり1 μmolの光学活性マンデロニトリルを生成する酵素の量を酵素活性の1単位(U/mg)を定義したところ、比活性は0.63 U/mgであった（図３）。
【００４８】
(3) 硫安沈殿
バリオスペルマムの若葉（48 g）を液体窒素中で凍結し、乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした。得られた粉末を120 mlの50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 6.0)に約3-4時間懸濁し、次に数層のガーゼを通して濾した。濾液を28,000 xgで25分間2回遠心した。得られた溶液を10 mMバッファーに対して4時間透析し（バッファーは３回交換）、120 mlの酵素溶液を得た。
この酵素溶液をAmiconセル（PM 10フィルター）により52 mlに濃縮した。
上記の酵素液(52 ml)に、氷上で撹拌しながら固形硫安を30%飽和になるまで添加した。30分撹拌後、生成した沈殿物を4℃で30分間遠心することにより分離し、廃棄した。その後、上清の硫安濃度を70%飽和まで上げた。生成した沈殿物を4℃で30分間遠心することにより回収し、10 mM バッファーに溶解した。この溶液を10 mMバッファーに対して12時間透析した（バッファーは３回交換）。
前記(2)と同様にして酵素活性を測定したところ、30-70%飽和固形硫安画分に活性が認められた。
【００４９】
(4) DEAE-トヨパールを用いたカラムクロマトグラフィー
酵素溶液を10 mMリン酸カリウムバッファーで平衡化したDEAE-トヨパールカラム(0.7 x 3 cm)に供した。20 mlのバッファーでカラムを洗浄した後、200 mM NaClを含有するバッファーで溶出を行った。溶出後、YM-10メンブレンを備えたAmiconフィルター装置（米国Amicon社製）を用いて濃縮を行い、2.0 mlの酵素溶液を得た。
タンパク質濃度は1.68 mg/mlであった。比活性は2.91 U/mgであった。この活性はホモジネートの活性よりも約4.6倍高かった（図４）。
【００５０】
(5) まとめ
各精製段階における酵素組成物の収量、活性を表１の通り示す。
【表１】
0004361742.tif 000002
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、（S)-ヒドロキシニトリルリアーゼが提供される。（S)-ヒドロキシニトリルヒアーゼは、その触媒作用によりアルデヒドをニトリルに生成する触媒活性を有するため、工業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベンズアルデヒドとシアン化カリウムから(S)-ヒドロキシニトリルリアーゼ触媒により（S)-マンデロニトリルを生成する反応を示す図である。
【図２】本発明の(S)-hnlのHPLCクロマトグラムである。
【図３】本発明の(S)-hnlによる（S)-マンデロニトリル生成活性を示す図である。
【図４】    DEAE-トヨパールを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行ったときの溶出画分による(S)-hnl活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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