(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質がアミン結合を介して多糖に結合しており、かつ、出発原料の遊離抗生物質より毒性が低下している、多糖と未酸化の生物学的活性なポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体。
【請求項２】
前記抗生物質がナイスタチンである請求項１記載の複合体。
【請求項３】
ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖複合体の製造方法であって、
ａ）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、
ｂ）前記ジアルデヒドを、アニオン交換樹脂を充填したカラムに通塔することにより妨害アニオンおよび副生成物から精製し、
ｃ）反応混合物のｐＨを８．８〜９．０に維持しながら、前記抗生物質をシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合して前記複合体を生成させ、そして
ｄ）前記複合体を精製すること、
を含んでなる上記製造方法。
【請求項４】
工程（ｃ）に続いて、前記複合体を還元剤によってアミン複合体に還元する工程をさらに含んでなる、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記抗生物質がナイスタチンである請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
前記抗生物質がアンホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ）である請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
前記多糖がデキストランである請求項３記載の製造方法。
【請求項８】
前記デキストランが９０００〜７５，０００ドルトン（ｄａｌｔｏｎ）の間の分子量を有する請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記多糖がアラビノガラクタンである請求項３記載の製造方法。
【請求項１０】
前記還元剤がＮａＢＨ4、ＮａＨＳＯ3、およびＨＯ−ＮＨ2：ＨＣｌを含んでなる群から選ばれる、請求項４記載の製造方法。
【請求項１１】
前記還元剤がＮａＢＨ4である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ジアルデヒドが、強塩基性アニオン交換樹脂に通塔することによって精製される、請求項３記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項３記載の製造方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖イミン複合体。
【請求項１４】
請求項３記載の製造方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖アミン複合体。
【請求項１５】
ナイスタチン−デキストランである請求項１３記載の複合体。
【請求項１６】
ナイスタチン−デキストランである請求項１４記載の複合体。
【請求項１７】
請求項１３記載の複合体を含んでなる、真菌感染症の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１８】
静脈内投与用の請求項１７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、ポリエン抗生物質の水溶性多糖複合体の製造方法、さらに詳しくは、抗真菌性ポリエン・ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）およびアンホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）の複合体に関する。本発明はまた、本方法によって製造された複合体およびそれらを含んでなる製薬学的組成物に関する。
発明の背景
真菌感染症の治療は、ポリエンのような効果的な抗真菌薬が使用できるにも拘わらず、重要な問題として残されている。これらの市販の薬物を臨床的に使用することが、生命を脅かす真菌感染症、特に癌患者、移植後の患者およびＡＩＤＳ患者のような免疫無防衛宿主中での発生が増加している結果として連続的に増加している。しかし、利用できるポリエン抗生物質の大多数は毒性があり、そしてそれらの応用を制限する副作用を引き起こす。最も広範に使用されるポリエン抗生物質は、アンホテリシンＢ（Ａｍｐｈ  Ｂ）およびナイスタチン（Ｎｙｓ）−広範囲の真菌によって引き起こされる真菌感染症の治療のための良好な薬物−である。最初のものは、可溶化形態の非経口薬剤、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（商標）として、そしてさらに最近に開発された毒性の低いリポソーム形態の薬剤、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）として存在する。しかし、抗真菌剤のリポソーム状の製剤的静脈内注射形態をさらに実際的に開発するためには、リポソームの物理的安定性およびリポソームのバッチ間の再現性に関連する重要な技術的難点をなを克服する必要がある(1、2)。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（商標）はリポソームを含有していないが、その治療用量はその最大耐量（ＭＴＤ）に極めて近く、それ故通常は生命を脅かす症状の場合にのみ処方される。Ｎｙｓに関しては、新規で効果的な非経口的抗真菌剤形態の開発の問題がまだ残されている。Ｎｙｓのリポソーム形態は文献に記載されているが(3)、これらは、Ａｍｐｈ  Ｂに関連して上記された問題点の外に、リポソームからの薬物の漏洩および薬物の化学的保全性の維持の問題に悩まされている。それ故、Ｎｙｓの使用は、現在は経口または局所形態に限定され、そして非経口製剤は未だこの強力な薬物について開発されていない(4)。例えば、デキストランのような水溶性の酸化多糖は、最も興味をそそる薬物担体の候補の一つであると考えられる(5)。ジアルデヒドデキストラン（ＤＡＤ）、デキストランと過ヨウ素酸塩との酸化反応の主要生成物は、酵素（例えば、米国特許第４，４４６，３１６号明細書）および抗生物質(6-10)を含む薬物のための安定剤として提案された。しかし、非経口投与に適用できるポリエン抗生物質の複合体は全く報告されていない。
英国特許第９７８，１７０号明細書には、多糖をポリジアルデヒドに酸化させた後、ポリエンと反応させるポリエン抗生物質の水溶性イミン誘導体の製造法が記載されている。上記の特許に記載の複合体の中には、ピマリシン−デキストランおよびＮｙｓ−トウモロコシ澱粉がある。この英国特許には、アミン複合体の記載はない。本出願の出願人によって行われそして実施例８に記載された実験では、上記の特許に記載の方法に従って製造されたＮｙｓ−デキストラン複合体は水溶性であるが、それは安定性および活性が極めて低くそしてポリマーの劇的な分解および複合された薬物の不活性化に感受性であることが見出された。このことは、酸化ポリマーが複合前に過剰の酸化剤から精製されないので、ポリエンが酸化を受けるためであると考えられる。この精製は、以下にさらに記載するように、複合薬物の安定性、効能および毒性の欠如のために必須である。
要するに、上記の研究は、全身性真菌感染症に対する、水溶性形態でのＮｙｓ投与の有利な効果を記録するのに成功したものは全くなかった。それ故、一般的にはポリエンおよび特定的にはＮｙｓのための、ＩＶ注射可能で無毒性のシステムを形成することは、重篤な真菌性疾患の全身的治療のためにそれらを使用することを制限する問題点として残されている。
発明の要旨
静脈内投与に適する水溶性ポリエン抗生物質の製造方法を提供することが本発明の目的である。
遊離ポリエンよりも高い溶解度、大きい効能および低い毒性を有するポリエン抗生物質の水溶性複合体を提供することが本発明のさらなる目的である。
追加的には、静脈内投与並びに局所適用に適する水溶性ポリエン抗生物質を含んでなる医薬組成物を提供することが本発明の目的である。
本発明の一つの態様によれば、
（１）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、
（２）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、
（３）前記ポリエンをシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合させて前記複合体を生成させ、そして
（４）前記複合体を精製すること、
を含んでなる、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性多糖複合体を製造する方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、
（１）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、
（２）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、
（３）前記ポリエンをシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合させて前記複合体を生成させ、そして
（４）前記複合体を還元剤によってアミン複合体に還元し、そして
（５）前記複合体を精製すること、
を含んでなる、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性多糖複合体を製造する方法が提供される。
本発明の好適な態様では、ポリエンはＮｙｓおよびＡｍｐｈ  Ｂであり、そして多糖はデキストランまたはアラビノガラクタンである。
本発明のもう一つの態様によれば、多糖とポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体を製造する方法が提供される。
好適な態様では、ポリエンはアミン結合を介して多糖に複合される。
本発明のさらにもう一つの態様によれば、本発明の複合体を含んでなる、真菌性感染症の治療で使用するための医薬組成物が提供される。
多糖に過ヨウ素酸塩を反応させて（構造式Ａ、図１）酸化多糖（ＯＰ−構造式Ｂ）を生成させることは良く研究され、そして反応混合物の妨害アニオン（過ヨウ素酸塩、ヨウ素酸塩およびギ酸塩）から活性化ポリマーを高度に効果的に分離する技術的条件が提案される。このことは、酢酸塩型の強塩基性アニオン交換樹脂を充填したカラムに反応混合物を通塔することによって達成される。この精製方法は、迅速であり、そして初期濃度で高い収率の精製ＯＰを提供し、その後アニオン交換樹脂は容易に再生される。同様の方法が多くのタンパク質のＤＡＤへの結合に成功裡に使用されたが(13-15)、抗生物質または他の低分子量の薬物の複合のためのかかる担体を製造する試みは行われなかった。
次いで、ＯＰをポリエン抗生物質のアミノ基と反応させて、シュッフ塩基（構造式Ｃ）を生成させる。好適には、次いで、シュッフ塩基結合を、還元剤、好適には水素化ホウ素ナトリウムまたはカリウムによって安定なアミン結合（構造式Ｄ）に転化する。かかる結合は体内で容易には加水分解されそうにない。ＮａＨＳＯ3またはＨＯ−ＮＨ2：ＨＣｌのような他の還元剤も使用することができることが理解されるべきである。
次いで、複合体を、塩、低分子量ポリマーフラクションおよび微量の未結合水溶性薬物から、透析によって分離し、次いで遠心分離および凍結乾燥を行う。
複合体は、予想されるように、浸透圧の増加に顕著には貢献しない。それ故、静脈用液剤の製造の場合、凍結乾燥された複合体を単に食塩水に溶解させ、濾過またはオートクレーブによって滅菌する。
点眼剤または点耳剤を製造することが望まれる場合、パラヒドロキシ安息香酸エステル誘導体（メチル、プロピル、ブチル）のような適切な保存剤を食塩液に添加するべきである。
【図面の簡単な説明】
本発明は、以下の図面と合同して、好適な態様の以下の詳細な説明から、一層よく理解される。図面中、
図１は、本発明の方法の好適な態様の反応スキームを示し；
図２は、本発明の方法の好適な態様の複合体生成物のＨＰＬＣ分析を示し；
図３は、時間の関数として測定された安定性実験の結果を示し；
図４は、温度および時間の関数として測定された安定性実験の結果を示し；
図５は、ｐＨの関数として測定された安定性実験の結果を示し；
図６ａおよび図６ｂは、生体内検定法で真菌接種後２４時間（図６ａ）および４８時間（図６ｂ）に測定した、本発明の複合体の効能を示し；
図７は、本発明の複合体の生体外毒性研究を示し；
図８は、生体内検定法で低濃度のマウスのカンジジアシス（ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）細胞の接種後に測定した、本発明の複合体の効能を示し；
図９は、生体内検定法で高濃度のマウスのカンジジアシス細胞の接種後に測定した、本発明の複合体の効能を示し；そして
図１０ａおよび図１０ｂは、生体内検定法で低濃度のマウスのクリプトコッコシス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）細胞の単回接種（図１０ａ）または多回接種（図１０ｂ）後に測定した、本発明の複合体の効能を示す。
好適な態様の詳細な説明
方法
１．クロマトグラフィー法
ＨＰＬＣ−ＧＰＣは、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  Ｒ  ＳＥＣ−１２５  ＨＰＬＣゲル濾過カラム３００×７．５ｍｍ（日本）上で、移動相としてＤＤＷを使用して、行った。
ＧＰＣは、全量５５ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５および１９ｍｌの空隙容量を含有するカラム上で、溶離液としてＤＤＷを使用して行った。
２．分光分析法
ＵＶスペクトルは、ＵＶＩＫＯＮ分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して記録した。
ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ２００ＦＴ−ＩＲを使用して記録した。
３．複合体の滅菌法および凍結乾燥法
動物研究のための無菌抗真菌性複合体は、無菌の発熱物質を含まないフィルター（０．２ミクロン、２０ｍｍ、４５ｍｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を通す濾過によって製造した。凍結乾燥は、Ｃｈｒｉｓｔ  Ａｌｐｈａ−Ｉｓ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ中で行った。無菌性は、Ｂａｃｔｅｃ４６装置（Ｊｏｈｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｗｓｏｎ，Ｍｄ，ＵＳＡ）を使用する無菌試験法によって確認した。この機器は、試験試料を接種したＢａｃｔｅｃ培養バイアル中の放射性二酸化炭素を定量的に測定するように設計されている。好気性または嫌気性バイアルを培養して一定の基線水準以上の14ＣＯ2が検出されると、原接種中に生存可能な微生物が存在することを示す。
４．毒性研究
ａ．生体内研究
ヒト赤血球に対する毒性の検定は、７０時間までの期間に亙って、所定の時間間隔で、（１，３）に記載の溶血反応の過程中の５５０ｎｍでのヘモグロビンの放出を追跡することによって行った。
ｂ．生体内研究
体重２０ｇの健康な雄性の白のＢＡＬＢ／ｃマウスに、尾部静脈を通して、Ｎｙｓ形態の各用量（０．５および１．０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。各剤形を、滅菌水を使用して製造した０．１０または０．２０ｍｌの液剤の単回大量注射によって、１０匹のマウスの群に静脈内投与した。生残率を４５日までの間追跡した。多回用量処理の場合、Ｎｙｓ複合体液剤の５日連続用量（０．１ｍｌ）を、マウス（１０匹の群）の尾部静脈中に注射した。
５．効能研究
ａ．カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に対する生物活性の生体外研究
酵母感受性試験（ＭＩＣ決定法）を使用した(12)。ＮｙｓおよびそのＤＡＤとの複合体のＭＩＣ（最小阻止濃度）値は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＣＢＳ５６２（基準代表菌株）に対して、酵母窒素塩基培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄｉｆｃｏ）および４段階系統希釈を使用する寒天希釈法に従って決定した。
ｂ．カンジダ属およびクリプトコッコシス属に対する生物活性の生体内研究
すべての実験において、Ｃ．アルビカンスＣＢＳ５６２を、０．１ｍｌの液剤の単回大量によって、雄性の白のＢＡＬＢ／ｃマウス（２０±３ｇ）の尾部静脈中に注射した。接種量は、サブロー・デキストロース寒天上で３７℃の２４時間培養物からのマウス当たり５×１０4〜１０5酵母細胞の範囲内であった。これらの接種量を用いて、１０−１５日以内に全数死滅をもたらす全身性感染症をマウス中に定期的に作成した。各実験に適切な接種量は実験的に決定した。酵母の濃度は血球計の計数によって決定した。生菌数は、接種の２日後３７℃のサブロー・デキストロース寒天上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定した。幾つかの実験では、死亡率の外に、腎臓中での増殖を、均質化された器官のＣＦＵによって測定して、監視した。
上記のように感染させたマウスを、無傷のマウスについての最大耐量−２％ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｋｇ（かかる濃度の溶媒は無毒であることが分っていた）のＮｙｓ液剤またはＮｙｓ−複合体で処理した。１０匹のマウスを各処理で使用し、そして個別のケージ中に保持した。処理は、感染開始の２４時間後、多回処理実験では、２５ｍｇ  Ｎｙｓ／ｋｇに等しい用量で、ＮｙｓまたはＮｙｓ複合体の５日連続用量の注射によってか、或いは単回処理実験では、８０ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍｌ）に等しい濃度で、複合体の単回大量の注射によって始めた。比較のために、複合体の延長効果を考慮して、他の群のマウスが、上記の用量のＮｙｓまたは複合体で、多回週２回ＩＶ処理（注射の間に２−３日の間隔をおいて５回注射）を受けた。複合体の代わりに食塩水で処理された１０匹の感染マウスの対照群が含まれた。各群中の生残動物数を４５日までの期間に亙って毎日記録した。
効能研究は、クリプトコッカス標準型について、同様の実験条件下で行った。
実施例
実施例１−シッフ塩基複合体の形成
１．０ｇのＤｅｘｔｒａｎ−４０（平均Ｍ．Ｗ．４０．０００、Ｓｉｇｍａ）を、２０．０ｍｌの蒸留水中に、室温で５分間撹拌した後溶解させた。１．２７５ｇの過ヨウ素酸カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を添加し、そして混合物を、塩が完全に溶解するまで、同一温度で２時間効果的に撹拌した。生成したジアルデヒドデキストラン（ＤＡＤ）を、市販のアニオン交換樹脂（Ｓｉｇｍａ）を１Ｍ酢酸溶液で前処理して得た酢酸塩型のＤｏｗｅｘ−１を充填したカラム（６ｍｍ×８０ｍｍ、Ｖｏ＝２．０ｍｌ）に通塔することによって、反応混合物の妨害アニオンおよび副生成物から分離した。精製されたＤＡＤは５０．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度であり、ヨウ素還元滴定法によって測定して５０％酸化された(12)。
２０．０ｍｌの精製ＤＡＤ溶液を等量の０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９．１と混合し、４００．０ｍｇのＮｙｓをこのポリマー溶液（ポリマーおよび薬物の初期濃度はそれぞれ２５ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌであった）に添加した。混合物のｐＨ値を３７℃で８．９±０．１に１６時間維持した。その時間の終期に、すべてのＮｙｓは溶解した。この事実は、反応混合物のＨＰＬＣ分析（図２）での単一ピークの存在と一緒になって、水溶性複合体が９５％以上の収率で生成することを示した。
複合体を、１２−１４ＫｄのＭ．Ｗ．カットオフを持つＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ分子多孔性膜チュービングを使用して、ＤＤＷに対して４℃で３０時間透析し、次いで２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、凍結乾燥した。
アンスロン法によって決定して６５％のポリマーおよび４１９−４２０ｎｍでのＵＶ吸収によって評価して３５％のＮｙｓを含んでなる、９２５ｍｇの凍結乾燥した最終生成物を得た。複合体中のＮｙｓの収率は８７％であり、ポリマーの計算収率は６７％であった。
凍結乾燥した複合体は、水中に１００ｍｇ／ｍｌもの濃度に容易に溶解し、一方遊離Ｎｙｓは、ＤＭＳＯ中にのみ３０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度に容易に溶解し、メタノール中にはより少なく（１ｍｇ／ｍｌ）、水中には極少量で（０．２−０．４ｍｇ／ｍｌ）溶解する。反対に、Ｎｙｓ−デキストラン複合体はＤＭＳＯまたはメタノール中に不溶である。
複合体のＵＶスペクトルは遊離Ｎｙｓと同様であるが、ＤＡＤと結合すると、以下のようにピーク波長がある一定の移動を示す（波長（ｎｍ））：
ＤＭＳＯ中のＮｙｓ：４１５−１４６、３９１−３９６、３２０−３２４、３０５−３０９、２９２、２９５；
ＤＭＳＯ−水混合物中のＮｙｓの溶液：４１６−４１８、３９２−３９５、３２１−３２３、３０６−３０８、２８９−２９１；
水溶液中の複合体：
未還元型：
４１７−４１９、３９２−３９３、３２１、３０６−３０７、２８９−２９３、２７０−２７３、２３１；
還元型：１４９−４２０、３９４、３２２、３０７、２８５−２８９、２７１−２７５、２３２−２３３。
結合方法を、デキストランの分子量および酸化度、薬物−ポリマー比、ｐＨ、温度および反応時間の関数として研究した。９，３００−７４，０００の範囲内の分子量および５−５０％の酸化度を持つデキストランを、Ｎｙｓと、７．５−１０の範囲内のｐＨの水性緩衝液中で４−３７℃で２−２０時間反応させた。反応混合物中の薬物およびポリマー濃度は、それぞれ５−１５ｍｇ／ｍｌおよび５−５０ｍｇ／ｍｌの範囲内であった。結果を表１に示す。
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反応混合物のｐＨを低下させると、生成物の収率が低下し、他方ｐＨ値を９．０以上にすると、劇的にポリマーが分解しそしてＮｙｓが不活性化する。さらに、ポリマー酸化の程度が減少すると、ポリマーの分解能が低下するが、同時にＮｙｓ結合が低下する。
水溶液中の複合体の安定性を、遊離ＮｙｓおよびＮｙｓとデキストランとの混合物の安定性と３７℃で比較した。図３に示すように、複合体は、急速に分解した他の調製物とは反対に、１００時間を超える間ＵＶ吸光度を殆ど完全に保持した。
図５は、ＤＭＳＯ中の遊離Ｎｙｓとは反対に、水溶液中の未還元複合体のｐＨ安定性が増加することを示している。調製物を、室温で、各種ｐＨのリン酸緩衝液中で、２０時間インキュベートした。
上記の結果は、本発明の方法によるポリエン抗生物質の多糖への結合が、ポリエン薬物の水溶性および安定性を顕著に向上させるという結論を支持する。
未還元複合体（＃３）の抗真菌性能を、ＭＩＣ試験で、各種真菌に関して、遊離Ｎｙｓ（＃１）と比較して試験した。複合体は、遊離薬物の２倍を超える効果（ＭＩＣ値は低くなる）を示すことが分かった。同様の結果が、ＮｙｓとＡｍｐｈ  Ｂ（示されていない）とのアラビノガラクタン複合体について得られた。
無菌未還元（イミン）複合体調製物は、生体外検定法で測定して、遊離薬物よりずっと毒性が低かった（図７）。生体内毒性試験法でＮｙｓおよび未還元複合体についての急性毒性値を比較評価した結果は、薬物の単回独注射の場合の最大耐量（ＭＴＤ）は、Ｎｙｓについては３−４ｍｇ／ｋｇであり、複合体については７００ｍｇ／ｋｇ以上であることを示した。
実施例２−アミン複合体の形成
Ｎｙｓ−デキストラン複合体は実施例１に記載の通りに得た。しかし、複合の後、反応混合物を、二倍モル過剰の水素化ホウ素ナトリウムで、４℃で３０分間処理した。次いで、その後のすべての操作は上記の実施例１に記載の通りに行った。得られた複合体（９４５ｍｇ）は、アンスロン法によって決定して６６％ポリマーおよび４１９−４２０ｎｍでのＵＶ吸収法によって評価して３４％結合Ｎｙｓを含んでなった。複合体中のＮｙｓの収率は８６％であり、そしてポリマーの計算収率は６９％であった。
還元複合体は未還元対応品より色が淡く、水溶解度が高かった（２００ｍｇ／ｍｌまで）。還元（アミン）複合体の１ｍｇ／ｍｌ水溶液は、４℃、３７℃および５０℃で５００時間を超える期間に亙って測定して、未還元（イミン）型の等量溶液より有意的に安定であることが見出だされた（図４）。還元複合体のｐＨ安定性もまた、未還元複合体より少し優れていることが見出された（図５）。
還元調製物（＃２）は、ＭＩＣ試験で、未還元複合体（＃３）と同様の活性を有した（図６ａおよび図６ｂ）。生体外毒性研究（図７）は、アミン誘導体が遊離薬物より毒性がずっと低く、そしてイミン誘導体より有意的に毒性が低いことを示した。実施例１に記載の生体内毒性研究では、還元複合体についてのＭＴＤは８８０ｍｇ／ｍｌであった。マウスに５日連日注射した第二実験では、複合体についてのＭＴＤは、遊離Ｎｙｓについての１ｍｇＮｙｓ／ｋｇ／日と比較して、１５０ｍｇＮｙｓ／ｋｇ／日であった。
図８−１０に示されるように、還元複合体と遊離Ｎｙｓとを比較するために、生体内効能試験も行った。
図８は、図に示されるように、薬物または薬物複合体で処理する前に、マウス中に３×１０3Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞／０．２ｍｌを注射した実験の結果を示す。図１０ａおよび図１０ｂは、マウスのクリプト・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の２×１０3細胞を用いた同様の実験を示す。図９は、１０5Ｃ．アルビカンス細胞／０．２ｍｌをマウスに注射した実験の結果を示す。すべての生体内実験は、遊離薬物と比較して、複合体の抗真菌効能が増強したことを明らかに示す。
実施例３
複合体を、９，３００ＭＷデキストランを使用したことを除いて、実施例２に記載の通りに製造し、そして反応混合物中の最終デキストラン濃度は２０ｍｇ／ｍｌであった。複合体が透析チュービングを通過するのを防止するために、６，０００のＭ．Ｗ．カットオフを持つＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ分子多孔性膜チュービングを使用した。得られた９４０ｍｇの複合体は３６％の結合Ｎｙｓを含有し、最終収率はＮｙｓについては９１％であり、ポリマーについては６７％であった。複合体のＭＩＣおよび毒性結果は、実施例２の複合体と同様であった（示されていない）。
実施例４
複合体を、７４，０００ＭＷデキストランを使用したことを除いて、実施例２に記載の通りに製造し、そしてＮｙｓの最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラムに通塔した場合、各分子量を有する複合体に対応する２つのピークが観察された。
実施例５
複合体を、可溶性多糖アラビノガラクタン（Ｌａｒｅｘ  ＵＦ）−アラビノースとガラクトースとのポリマー（１：６）−をデキストランの代わりに使用したことを除いて、実施例２に記載の通りに製造した。酸化ポリマーおよびＮｙｓの初期濃度はそれぞれ２５ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複合体中の薬物の収率は８０％であった。
実施例６
Ａｍｐｈ  Ｂおよびアラビノガラクタンとの複合体を、実施例２に記載の条件下で製造した。酸化ポリマーおよび薬物の初期濃度はそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複合体中の薬物の収率は７５％であった。
実施例７
フンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（可溶性Ａｍｐｈ  Ｂ）を、アラビノガラクタンに、実施例２の条件下で複合させた。酸化ポリマーおよびＡｍｐｈ  Ｂの初期濃度はそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌであった。ポリマー複合体中の薬物の収率は９５％であった。
実施例８
本発明の複合方法を英国特許第９７８，１７０号明細書の方法と比較するために、３種のＮｙｓ−デキストラン複合体を製造した。即ち、
（１）Ｎｙｓ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、未精製ＤＡＤ（２０ｍｇ／ｍｌ）に、１Ｍ  ＮａＯＨの強アルカリ性媒体中で、５０℃で、２０分間複合させ（反応混合物のｐＨは反応の過程に亙って１３．５から１２．５に低下した）；（２）Ｎｙｓを未精製ＤＡＤに、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８−９．０）中で、３７℃で、１０時間複合させ；（３）注意深く精製したＤＡＤ（酸化アニオン含量２．５％以下）を本発明の方法に従って使用した以外は、（２）と同じ。
複合体＃１および＃２は水中に急速に溶解したが、溶液並びにそれらの極めて吸湿性の凍結乾燥物は、ＧＰＣ−ポリマー複合体に対応する副ピークおよびクロマトグラフカラムの全容量で溶出する低分子量の生成物に対応する主ピーク−によって測定される２つの主要フラクションの混合物を含有した。両フラクションにおいて、４１９ｎｍおよび３９３ｎｍでのＵＶピークの完全な消失によって証明されるように、Ｎｙｓは有意的に不活性化され、そして残余の抗真菌活性は８％を超えないことが見出された。このことは、上記の２つのＵＶピークが遊離薬物中と同一の大きさであり、そしてＨＰＬＣ溶出液中には高分子量フラクションのみが存在する複合体＃３とは著しく対照的である。
上記の結果は、安定で活性なＮｙｓ−複合体調製物を得るためには、ＤＡＤの予備精製並びに反応混合物のｐＨの９．０以下への維持の両方が必要であることを明らかに示す。
本発明を数項の好適な態様の見地から記載したが、この開示を考察したとき、当業者の頭に種々の改変および改良が浮かぶことが予想される。
本発明の範囲は、本明細書で説明された説明的態様によって限定されるものと解釈されるべきではなく、添付の請求の範囲に従って決定されるべきである。
文献
引例
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本発明の主要な態様または特徴は次のとおりである。
１．抗生物質がイミン結合を介して多糖に結合している、多糖と未酸化の生物学的活性なポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体。
２．前記抗生物質がナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）である上記項目１記載の複合体。
３．抗生物質がアミン結合を介して多糖に結合している、多糖と未酸化の生物学的活性なポリエン抗生物質との実質的に安定な水溶性複合体。
４．前記抗生物質がナイスタチンである上記項目３に記載の複合体。
５．ａ）前記多糖を過ヨウ素酸酸化によってジアルデヒドに活性化し、
ｂ）前記ジアルデヒドを妨害アニオンおよび副生成物から精製し、
ｃ）前記抗生物質をシッフ塩基形成によって前記精製ジアルデヒドに結合して前記複合体を生成させ、そして
ｄ）前記複合体を精製すること、
を含んでなるポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖複合体の製造方法。
６．工程（ｃ）に続いて、前記複合体を還元剤によってアミン複合体に還元する工程をさらに含んでなる上記項目５に記載の方法。
７．前記抗生物質がナイスタチンである上記項目５に記載の複合体。
８．前記抗生物質がアンホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）である上記項目５に記載の複合体。
９．前記多糖がデキストランである上記項目５に記載の方法。
１０．前記デキストランが９０００〜７５，０００ドルトン（ｄａｌｔｏｎ）の間の分子量を有する上記項目９に記載の方法。
１１．前記多糖がアラビノガラクタンである上記項目５に記載の方法。
１２．前記還元剤がＮａＢＨ4、ＮａＨＳＯ3、およびＨＯ−ＮＨ2：ＨＣｌを含んでなる群から選ばれる上記項目５に記載の方法。
１３．前記還元剤がＮａＢＨ4である上記項目１２に記載の方法。
１４．前記ジアルデヒドが、強塩基性アニオン交換樹脂に通塔することによって、精製される上記項目５に記載の方法。
１５．上記項目５に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖イミン複合体。
１６．上記項目６に記載の方法に従って製造された、ポリエン抗生物質の実質的に安定な水溶性の多糖アミン複合体。
１７．ナイスタチン−デキストランである上記項目１５に記載の複合体。
１８．ナイスタチン−デキストランである上記項目１６に記載の複合体。
１９．上記項目１５に記載の複合体を含んでなる、真菌感染症の治療に使用するための医薬組成物。
２０．静脈内投与に適した上記項目１９に記載の医薬組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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