(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラスキャピラリーカラムに酸又はアルカリ溶液を導入した後、純水を導入して前記キャピラリーカラム内から前記酸又は前記アルカリ溶液を除去する工程、
前記キャピラリーカラムに、先に酸を導入した場合はアルカリ溶液を導入し、又は先にアルカリ溶液を導入した場合は酸を導入し、その後、純水を導入して前記キャピラリーカラム内から前記アルカリ溶液又は前記酸を除去する工程、
不活性ガスを導入して前記キャピラリーカラム内を乾燥させる工程、及び
その後、前記キャピラリーカラム内にゲル又は高分子ポリマーからなる分離媒体を充填する工程
を含むことを特徴とするキャピラリー電気泳動用ガラスキャピラリーカラムの調製方法。
【請求項２】
先にアルカリ溶液を導入し、その後に酸を導入する請求項１に記載のキャピラリー電気泳動用ガラスキャピラリーカラムの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸や蛋白などの分離・分析を行なうキャピラリー電気泳動に用いるガラスキャピラリーカラムの調製方法に関するものである。ガラスキャピラリーカラムを用いたキャピラリー電気泳動装置は、基礎生化学や医学、農学、薬学などの研究分野に用いられ、特にＤＮＡシーケンスの解析に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配列したマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサが提案されている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少なく高感度検出ができるのである。
【０００３】
内径が１０〜２００μｍのガラスキャピラリーカラム内に分子ふるい効果を有する支持体（分離媒体）を導入するキャピラリーゲル電気泳動では、分離媒体の分子ふるい効果により核酸や蛋白質などの分離を行なう。分離媒体としては、架橋されたポリアクリルアミドなど、キャピラリーカラム内でcross-linkゲルを重合させたものや、リニアポリアクリルアミドやハイドロキシエチルセルロースなど、予め重合させた高分子ポリマーをキャピラリーカラムに充填するものがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリーカラム内でゲルを重合させる種類の分離媒体では、キャピラリーカラムの内壁面の状態がゲルの重合状態に影響する。内壁面の状態が悪いとゲルの重合状態が悪くなり、電気泳動中にキャピラリーカラム内に気泡が発生する頻度が増加する。さらに、キャピラリーカラムの内壁面の状態が悪いと、cross-linkゲル、高分子ポリマーにかかわらず、キャピラリーカラムの試料注入側の端部からゲルがずり出す頻度が増加する。そのため、泳動結果の再現性が悪くなるという問題があった。
そこで、本発明は、ガラスキャピラリーカラムを用いたキャピラリー電気泳動において、泳動結果の再現性を向上させることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ガラスキャピラリーカラムに酸又はアルカリ溶液を導入した後、純水を導入してキャピラリーカラム内から酸又はアルカリ溶液を除去し、さらにキャピラリーカラムに、先に酸を導入した場合はアルカリ溶液を導入し、又は先にアルカリ溶液を導入した場合は酸を導入し、その後、純水を導入してキャピラリーカラム内からアルカリ溶液又は酸を除去し、さらに不活性ガスを導入してキャピラリーカラム内を乾燥し、その後、キャピラリーカラム内にゲル又は高分子ポリマーからなる分離媒体を充填するするキャピラリー電気泳動用ガラスキャピラリーカラムの調製方法である。
酸はｐＨ４以下のものが好ましい。不活性ガスとしては、窒素ガスのほか、ヘリウムガス、アルゴンガスなどの希ガスを用いることができる。
【０００６】
ガラスキャピラリーカラムの内壁面にはシラノール基（−ＳｉＯＨ）が多数存在する。それらのシラノール基の状態はキャピラリーカラムごとに異なる。シラノール基の状態はゲルの重合状態に大きく影響するので、キャピラリーカラムごとのシラノール基の状態の差は、ゲルの重合状態に差を生ずる。
そこで、本発明では、ゲルやポリマーを充填する前に、キャピラリーカラムに酸を導入して、キャピラリーカラムの内壁面のシラノール基の状態を整える（以下、酸処理という）とともに、シラノール基の状態をゲルの重合に対して最適な状態にする。その結果、キャピラリーカラム内でのゲルの重合状態を安定させることができる。一方、酸はゲルの重合を阻害するので、キャピラリーカラムに酸処理を施した後、純水によりキャピラリーカラム内の洗浄を行なう。
【０００８】
ガラスキャピラリーカラムを繰返し使用していると、キャピラリーカラムの内壁面に、前の測定におけるゲルの残留物などの汚れが付着している場合がある。かかる場合、そのままキャピラリーカラム内でゲルの重合を行なうと、ゲルの重合状態が悪くなる。
そこで、cross-linkゲルや高分子ポリマーを充填する前に、キャピラリーカラムにアルカリ溶液を導入して、キャピラリーカラムの内壁面に付着している汚れを除去する（以下、アルカリ処理という）。その結果、キャピラリーカラム内でのゲルの重合状態を安定させることができる。一方、アルカリ溶液もゲルの重合を阻害するので、キャピラリーカラムにアルカリ処理を施した後、純水によりキャピラリーカラム内の洗浄を行なう。
アルカリ溶液はｐＨ９以上のものが好ましい。
キャピラリーカラム内に水分が残留するとゲルの重合が阻害されたり、ゲル濃度が低下したりするので、不活性ガスによりキャピラリーカラム内の乾燥を行なう。
【００１０】
ガラスキャピラリーカラムに酸処理及びアルカリ処理の両方を施すことにより、酸処理のみ又はアルカリ処理のみよりもゲルの重合状態を安定させることができる。
ガラスキャピラリーカラムに酸処理及びアルカリ処理を施す順序は、アルカリ処理後に酸処理を施すことが好ましい。その結果、より高い洗浄効果及びシラノール基の安定を得ることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
【実施例】
図１は、一実施例の操作手順を表すフロー図である。この実施例では、酸として１Ｎ−ＨＣｌ、アルカリ溶液として１Ｎ−ＮａＯＨ、不活性ガスとして窒素ガス、純水としてイオン交換水以上の純度のものを用いた。図１に沿ってこの実施例の操作を説明する。
（１）ガラスキャピラリーカラムの一端側から１Ｎ−ＮａＯＨを１０分間導入し、他端側から排出した。キャピラリーカラムの内壁面に付着している汚れは他端側からキャピラリーカラム外にＮａＯＨとともに排出される。ここではアルカリ溶液として１Ｎ−ＮａＯＨを用いたが、本発明に用いることができるアルカリ溶液はこれに限定されるものではない。他のアルカリ溶液を用いる場合もｐＨ９以上のものが好ましい。
【００１２】
（２）ガラスキャピラリーカラムの一端側から純水を２分間導入し、キャピラリーカラム内のＮａＯＨを排出した。
（３）キャピラリーカラムの他端側を純水により洗浄して、他端側のキャピラリーカラム外壁に付着しているＮａＯＨを除去した。
（４）ガラスキャピラリーカラムの一端側から純水を１０分間導入してキャピラリーカラム内を洗浄し、残留するＮａＯＨを除去した。
（５）ガラスキャピラリーカラムの一端側から窒素ガスを１０分間導入してキャピラリーカラム内を乾燥させた。
【００１３】
（６）キャピラリーカラム内が乾燥した後、ガラスキャピラリーカラムの一端側から１Ｎ−ＨＣｌを１０分間導入した。その結果、キャピラリーカラムの内壁面のシラノール基の状態が安定する。ここでは酸として１Ｎ−ＨＣｌを用いたが、本発明に用いることができる酸はこれに限定されるものではない。他の酸を用いる場合もｐＨ４以下のものが好ましい。
（７）ガラスキャピラリーカラムの一端側から純水を２分間導入し、キャピラリーカラム内からＨＣｌを排出した。
【００１４】
（８）キャピラリーカラムの他端側を純水により洗浄して、他端側のキャピラリーカラム外壁に付着しているＨＣｌを除去した。
（９）ガラスキャピラリーカラムの一端側から純水を１０分間導入してキャピラリーカラム内を洗浄し、残留するＨＣｌを除去した。
（１０）ガラスキャピラリーカラムの一端側から窒素ガスを３０分間導入してキャピラリーカラム内を十分乾燥させた。
【００１５】
次に、この実施例の前処理を施したキャピラリーカラム及び前処理を施さなかったキャピラリーカラムについてゲルの充填を行なった。ゲルは、ポリアクリルアミド（Ｔ５％，Ｃ５％）、７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ緩衝液の組成のものを用いた。
図２，３は、これらのキャピラリーカラムを用いてそれぞれ電気泳動を行なったときの分離結果を表す波形図であり、図２は実施例に述べた前処理を施したキャピラリーカラム、図３は前処理を施さなかったキャピラリーカラムのものである。これらのデータは、複数本のキャピラリーカラムを検出側で平面上に一列に配列し、その検出側で検出器をスキャンすることにより複数本のキャピラリーカラムについて分離成分の検出を同時に行なうことができるマルチキャピラリー電気泳動装置を用いて電気泳動を行なった際のデータであり、それぞれ１本のキャピラリーカラムについてのデータである。縦軸は検出信号強度を表し、横軸はスキャン回数（１回／秒）を表す。
【００１６】
図２及び図３からわかるように、前処理を施さなかったキャピラリーカラムの波形図ではスキャン回数２６００付近から急に検出ピークが広がり始めているが（図３）、前処理を実施したキャピラリーカラムではスキャン回数６０００付近でも安定した検出ピークが見られる（図２）。このように、ゲルを充填する前に本発明にかかる前処理を施すことにより、試料の分離を安定させることができる。
【００１７】
また、電気泳動中のキャピラリーカラム内の気泡発生率は、キャピラリーカラムに前処理を施さなかったものでは２０％であったのに対し、本発明にかかる前処理を実施したものでは０％となり、気泡発生率を低減させることができた。
さらに、本発明にかかる前処理を実施したキャピラリーカラムでは、前処理を施さなかったキャピラリーカラムに比べ、キャピラリーカラムの両端に電気泳動電圧を印加したときに生じるゲルのずり出しを軽減させることができた。
このように、本発明にかかる前処理を施すことにより、試料の分離状態の安定、気泡発生率の低減及びゲルのずり出しの軽減を達成でき、泳動結果の再現性を向上させることができる。
【００１８】
本発明にかかる前処理方法は上記の実施例の操作に限定されるものではなく、例えばステップ（５）を省略するなど、キャピラリーカラムへの酸処理の効果及びアルカリ処理の効果を得られるものであればどのような操作でもよい。酸処理及びアルカリ処理の両方を施す場合にはどちらを先に施してもよい。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のキャピラリー電気泳動用ガラスキャピラリーカラムの調製方法では、アルカリ溶液によりキャピラリーカラム内の汚れを除去し、酸によりキャピラリーカラムの内壁面のシラノール基の状態を整えるようにしたので、ゲルの充填及びゲルの重合に関し、キャピラリーカラムの内壁面の状態を最適なものにすることができる。その結果、ゲル重合時の重合状態が向上し、泳動電圧印加時の気泡発生率やゲルのずり出しが減少するので、泳動結果の再現性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  一実施例の操作手順を表すフロー図である。
【図２】  同実施例の前処理を施したキャピラリーカラムにゲルを充填して電気泳動を行なったときの分離結果を表す波形図である。
【図３】  キャピラリーカラム内壁面に前処理を施さなかったキャピラリーカラムにゲルを充填して電気泳動を行なったときの分離結果を表す波形図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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