(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式Ｉで示される化合物：
【化１】
0004361617.tif 000007
上式中、
Ｘは下式：
【化２】
0004361617.tif 000008
で示されるフェノール部分であり、
Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、炭素原子数２〜８個のアシル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、
Ｒ3 が水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれ、
Ｒ4 がニトロであり、そして
Ｒ5 が水素であるが、但し、
式Ｉの化合物は、カルシウムイオンと錯体を形成した際に５８０ｎｍよりも長波長側に吸収ピークを示し、かつ、カプラー溶剤に可溶性である。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物において、
Ｒ3 が（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル基であるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の一方がトリフルオロメチルであり且つその他方が水素である場合には、Ｒ3 が水素であってもよい化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物において、
Ｒ1 がトリフルオロメチルであり、Ｒ2 及びＲ3 が水素である化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を含有し、ｐＨを６〜９の範囲に緩衝化させた水性組成物。
【請求項５】
カルシウムイオンと錯体を形成した場合に５８０ｎｍよりも長波長側に吸収ピークを示す請求項１に記載の化合物を含有する水性組成物。
【請求項６】
下式Ｉで示される化合物を含有する吸収剤担体を含む、カルシウムイオンを定量するための分析要素：
【化３】
0004361617.tif 000009
上式中、
Ｘは下式：
【化４】
0004361617.tif 000010
で示されるフェノール部分であり、
Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、炭素原子数２〜８個のアシル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、
Ｒ3 が水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれ、
Ｒ4 がニトロであり、そして
Ｒ5 が水素であるが、但し、
式Ｉの化合物は、カルシウムイオンと錯体を形成した際に５８０ｎｍよりも長波長側に吸収ピークを示し、かつ、カプラー溶剤に可溶性である。
【請求項７】
試薬帯域と多孔質展開帯域とを担持する非多孔質支持体を含み、前記帯域の少なくとも一つに下式Ｉで示される化合物が含まれている、カルシウムイオンを定量するための分析要素：
【化５】
0004361617.tif 000011
上式中、
Ｘは下式：
【化６】
0004361617.tif 000012
で示されるフェノール部分であり、
Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、炭素原子数２〜８個のアシル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、
Ｒ3 が水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれ、
Ｒ4 がニトロであり、そして
Ｒ5 が水素であるが、但し、
式Ｉの化合物は、カルシウムイオンと錯体を形成した際に５８０ｎｍよりも長波長側に吸収ピークを示し、かつ、カプラー溶剤に可溶性である。
【請求項８】
前記帯域が上下に重ねられた層をなしている、請求項７に記載の分析要素。
【請求項９】
前記式Ｉで示される化合物が前記試薬帯域に含まれている、請求項７に記載の分析要素。
【請求項１０】
さらに１〜２００ｍＭのシトレート又はクエン酸を含有する、請求項７に記載の分析要素。
【請求項１１】
前記シトレート又はクエン酸が、前記展開帯域において、０．１〜２０ミリモル／ｍ2 の濃度で含まれている、請求項１０に記載の分析要素。
【請求項１２】
下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、カルシウムイオンを定量するための方法：
（ａ）カルシウムイオンが含まれていると思われる液体試料と、下式Ｉで示されるクロモイオノフォア化合物とを接触させる工程；及び
（ｂ）カルシウムイオンと下式Ｉで示される化合物との錯体化により生じる光学濃度変化を測定することによって、前記試料中に存在するカルシウムを比色定量する工程。
【化７】
0004361617.tif 000013
上式中、
Ｘは下式：
【化８】
0004361617.tif 000014
で示されるフェノール部分であり、
Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、炭素原子数２〜８個のアシル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、
Ｒ3 が水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれ、
Ｒ4 がニトロであり、そして
Ｒ5 が水素であるが、但し、
式Ｉの化合物は、カルシウムイオンと錯体を形成した際に５８０ｎｍよりも長波長側に吸収ピークを示し、かつ、カプラー溶剤に可溶性である。
【請求項１３】
前記クロモイオノフォア化合物が、試薬帯域と多孔質展開帯域とを担持する非多孔質支持体を含む、カルシウムイオンを定量するための乾式分析要素に含まれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記展開帯域が０．１〜２０ミリモル／ｍ2 のシトレート又はクエン酸を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該化合物の被覆量が０．１０〜１．５ｇ／ｍ2 の範囲内にある、請求項７に記載の分析要素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床化学分野に、特にカルシウム分析用の新規化合物と、これを用いた分析用の組成物、分析要素及び分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウム含有量を測定するための分析測定は、各種分野において応用されている。重要な用途の一つに臨床化学分野があるが、血清等の生物学的流体中のカルシウム濃度測定値を、診断目的で、ある種の異常状態を示すものとして利用することができる。例えば、血清中カルシウム濃度の上昇は、サルコイドーシスやいくつかの転移性癌において、上皮小体及び甲状腺の疾患を示すものとすることができる。高カルシウム血も、骨粗しょう症、骨形成性癌、急性膵炎及びアシドーシスとの関連がある。
【０００３】
カルシウム濃度はいくつかの分析方法により定量測定することができる。一般に、色素とカルシウムイオンとの錯体化を含む直接比色法が、他のより複雑な方法よりも好まれている。比色測定法では、カルシウムイオンとクロモイオノフォア(chromoionophore) との接触により、その発色団の吸収スペクトルがシフトするので、これを定量測定することができる。このような目的で一般に用いられている色素の一種が、Arsenazo III（２，２’−（１，８−ジヒドロキシ−３，６−ジスルホナフチレン−２，７−ビスアゾ）ビスベンゼンアルソン酸（Anal. Chim. Acta, 71, 375 (1974)を参照のこと）として知られているものである。この色素は非常に有用であるが、これを大規模に使用することは、環境上の問題から制限される。
【０００４】
米国特許第３，９９２，１５８号（Przybylowicsら）及び米国特許第４，２５８，００１号（Pierceら）に記載されているもののような乾式薄フィルム多層分析要素が、臨床化学分野におけるアッセイを行うために一般に用いられている。一般にこれらの要素は非孔質支持体の上に多孔質展開層と試薬層を有している。このような要素の一種にカルシウムイオン測定用のものがあり、VITROS臨床化学スライドとして Johnson & Johnson Clinical Diagnostics 社(Rochester, N.Y.) より市販されている。この要素は、カルシウムと選択的に錯体を形成して検出可能な色変化を提供する上記Arsenazo色素を利用するものである。しかしながら、上述のように、環境上の問題から、このような乾式分析要素に導入することができる新規なカルシウム錯体形成性化合物が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ジアザ−１８−クラウン−６をはじめとするクラウンエーテル系化合物は、カチオンと錯体を形成することが知られている。クラウンエーテルに発色団を導入し、該クラウンエーテルとカチオンが錯体を形成した際に変色するものが報告されている。例えば、Anal. Letters, 10(13), 1115-1122 (1977) を参照されたい。M. Shigaらは、分析化学, 32(9), E293-E300 (1983) に、カルシウムの溶液測定においてクロモイオノフォアとして２−ヒドロキシ−５−（ニトロフェニルアゾ）−ベンジル系発色団置換基を有する特定のＮ，Ｎ−二置換−ジアザ−１８−クラウン−６系化合物を記載している。しかしながら、これらの化合物は、薄フィルムクロモイオノフォアコーティングとして適用するためのコーティング液又は分散液に導入することが難しいため、発色測定用の乾式スライド要素において有効に使用することができない。その上、市販の分析装置の光度計は、ビリルビン、その他６００ｎｍ未満に吸収を示す試料や測定成分による妨害を避けるため、一般に６００ｎｍ又はより長波長側へフィルターがかけられている。Shiga らのジニトロフェニルアゾ系化合物は、所望の読取り領域よりも短い吸収ピークを有する。すなわち、そのλmax は約５７５ｎｍである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下式Ｉで示される新規ジアザ−１８−クラウン−６化合物を提供する。
【０００７】
【化９】
0004361617.tif 000002
【０００８】
上式中、
Ｘは下式：
【０００９】
【化１０】
0004361617.tif 000003
【００１０】
で示されるものの中から選ばれたフェノール部分、ナフトール部分又はキノリノール部分であり、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は、各々独立に、水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト、アルキルスルホニル、アリールスルホニル及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれるが、但し、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ5 が水素であり且つＸがフェノールである場合には、Ｒ4 はニトロではなく、さらに、
Ｘがフェノールであり且つＲ5 が水素である場合には、Ｒ1 （又はＲ2 ）とＲ4 が共にニトロであることはない。
【００１１】
上式で示される化合物は、溶液アッセイ又は乾式アッセイにおいてカルシウムイオンを検出するためのクロモイオノフォアとして有用であるが、とりわけ、乾式の薄フィルム多層型分析要素において使用した場合、該化合物はカプラー溶剤に容易に分散して薄フィルムとして均一に塗布されることができ、カルシウム用の乾式スライド分析要素が得られるので、非常に有用である。上式で示される化合物のうちＲ1 、Ｒ2 又はＲ4 に電子求引性置換基を有するものは、６００ｎｍ又はより長波長側の吸収スペクトルで読取りが可能であるため、より短波長側に妨害があるようなアッセイ系では特に有利である。好ましくは、薄フィルムアッセイ系、特に上記VITROS乾式アッセイ系で使用する場合には、カルシウムイオンと錯体を形成した際に５６０ｎｍよりも長波長側、好ましくは５８０ｎｍよりも長波長側に吸収を示す本発明の化合物が好適である。
【００１２】
従って、本発明はまた、上記クロモイオノフォア化合物を含有する吸収剤担体を含む、カルシウムイオンを定量するための分析要素をも提供する。
さらに、
（ａ）カルシウムイオンが含まれていると思われる液体試料と、上式で示されるクロモイオノフォア化合物とを接触させる工程；及び
（ｂ）カルシウムイオンと該化合物との錯体化により生じる光学濃度変化を測定することによって、該試料中に存在するカルシウムを比色定量する工程
を含む、カルシウムイオンを定量するための方法が提供される。
【００１３】
上記に関連して、５８０ｎｍ又はそれ以上の波長で運転する分析装置に使用する薄フィルム多層乾式スライド分析要素として好適な化合物は、式Ｉにおいて、Ｘがフェノールであり、Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、ニトロ、炭素原子数２〜８個のアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、Ｒ3 が水素、ハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、アセトアミド、メルカプト、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、トリフルオロメチル、アリール及び置換アリール〔該アリール部分はフェニル及びナフチルの中から選ばれ、且つ該アリール置換基はハロ、シアノ、ニトロ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ2 〜Ｃ8 ）アシル、フェニル、アセトアミド、メルカプト、アルキルスルホニル、アリールスルホニル及びトリフルオロメチルの中から選ばれる〕の中から選ばれ、Ｒ4 がニトロであり、そしてＲ5 が水素である化合物である。
【００１４】
このような目的にとって特に好適な化合物は、式Ｉにおいて、Ｘがフェノールであり、Ｒ1 及びＲ2 が、各々独立に、水素並びにハロ、シアノ、ニトロ、炭素原子数２〜８個のアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル及びトリフルオロメチルの中から選ばれた電子求引性基から選ばれるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の少なくとも一方は電子求引性基であり、Ｒ3 が（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル基であり、Ｒ4 がニトロであり、そしてＲ5 が水素であるが、但し、Ｒ1 及びＲ2 の一方がトリフルオロメチルであり且つその他方が水素である場合には、Ｒ3 が水素であってもよい化合物である。
【００１５】
このような目的にとって最も好適な化合物は、式Ｉにおいて、Ｘがフェノールであり、Ｒ1 がトリフルオロメチルであり、Ｒ2 及びＲ3 が水素であり、そしてＲ4 がニトロである化合物である。このような化合物では、そのトリフルオロメチル基が、カプラー溶剤における分散を促進する疎水性基として作用すると同時に、５８０ｎｍ以上において高い（ピーク）吸収を提供する電子求引性基としても作用する。
本発明の主題である式Ｉの化合物は、下記合成経路１及び２により、入手容易な出発原料から合成することができる。
合成経路１
【００１６】
【化１１】
0004361617.tif 000004
【００１７】
合成経路１によると、式１の４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６と２−アセトキシベンジルブロミドとをＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミンの存在下で反応させて式３のベンジルアセテート化合物を得る。これを酢酸水溶液等の弱酸で処理して式４の２−ヒドロキシベンジル中間体を得る。Ｘがナフトール部分又はキノリン部分である化合物を合成する場合には、上記式２のフェニル化合物の代わりに、適当に置換されたナフチル系化合物又はキノリン系化合物を使用すればよい。
合成経路２
【００１８】
【化１２】
0004361617.tif 000005
【００１９】
合成経路２によると、まず式５の置換アニリン化合物を塩酸中で亜硝酸ナトリウムと反応させた後、ヘキサフルオロリン酸で処理してフェニルジアゾニウムヘキサフルオロホスフェート中間体６を得る。次いで、２当量の中間体６と、合成経路Ｉで得られた１当量のヒドロキシベンジル−ジアザ−１８−クラウン−６中間体４とを適当な溶剤中で反応させて、式Ｉの最終化合物を得る。勿論、ヒドロキシベンジル中間体４の代わりに、適当に置換されたナフチル系化合物又はキノリノール系化合物を使用してもよい。
【００２０】
上記反応は、使用する試薬や材料に適し且つ変換に適した溶剤の中で行われる。有機合成分野の当業者であれば、分子上の各種官能基が上記化学変換と矛盾してはいけないことを理解している。これには、合成の工程順序、反応性基の保護及び反応条件の選択に関する判断が必要な場合も多い。当業者であれば、用いた置換基に適合する反応条件、必要な場合の保護基の選択、等は明白である。
【００２１】
本発明によると、水性液体中のカルシウムイオンの定性又は定量測定に使用することができる新規なクロモイオノフォア組成物が提供される。この組成物は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、唾液、汗、排泄物、等の生物学的流体におけるカルシウム濃度を測定するための分析方法に使用することができ、有利である。骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚、等のヒトや動物の組織の流体調製物についても、本発明によりカルシウム濃度を測定することができる。
【００２２】
上記目的で使用する場合、本発明の化合物は、従来技術の組成物よりも優れている点がいくつかある。具体的には、カルシウムイオンとの錯体形成時に本発明のクロモイオノフォア化合物により得られる色素は、最高性能のピークで測定することができる。さらに、広範囲にわたるカルシウム濃度を希釈なしで測定することができ、また、上述のように、該化合物はカプラー溶剤に容易に分散し、そして薄フィルムとして均一塗布することにより乾式スライド分析要素を提供することができる。最後に、該化合物は合成が容易であると共に、毒性のある重金属を一切必要としない。
【００２３】
本発明の化合物は溶液アッセイでも乾式分析要素においても使用可能である。溶液アッセイに用いる場合、該化合物を適当な緩衝液に溶かしてｐＨを約６〜９とする。溶液アッセイ用の水性組成物は、本発明のカルシウム錯体形成性化合物を通常約５０マイクロモル〜、好ましくは約１００〜約３００マイクロモル含有する。アッセイは、本発明のクロモイオノフォア化合物とカルシウムイオンを含むと思われる流体試料とを短時間混合することにより行われる。次いで、カルシウムイオン濃度を、該化合物とカルシウムイオンとの錯体化により生じた光学濃度変化（すなわち、分光吸収のシフト）を、適当な比色検出装置で適当な波長において測定することにより決定する。特に薄フィルム態様で用いる場合、該化合物を錯体化時に約６００ｎｍ付近に吸収を示すように選定することができるので有利である。
【００２４】
本発明のクロモイオノフォア化合物は、乾式分析要素において利用することもできる。最も簡易な要素は、本発明の錯形成性化合物を含有する吸収剤担体(absorbent carrier material)、例えば、濾紙やフィルター片のような薄いシート状の自立性吸収材料からなるものとすることができる。該要素は、離散した二以上の帯域に分割し、担体の別の帯域には異なる試薬を導入したものとすることができる。このような要素は、当該技術分野では、テスト片、診断要素、ディップスティック、診断薬、等として知られている。
【００２５】
本発明のクロモイオノフォア化合物は、乾式分析要素に用いた場合に特に有用となる。このような要素では、該化合物は、一般に、適当な担体材料の内部に導入されるか、又は担体材料の表面に塗布される。別法として、該化合物を測定中に要素に添加することも可能である。乾式分析要素は、多層化することができ、また乾式分析要素技術分野において周知の技法で製造することができる。例えば、このような要素及びその製造方法が米国特許第４，３５７，３６３号明細書に記載されている。一実施態様として、展開層と、下塗層と、ゼラチン緩衝層と、該化合物及び緩衝剤を含有する試薬層とを含む要素が挙げられる。上記の層はいずれも支持体の上に塗布される。
【００２６】
その他の実施態様も知られており、例えば、異なる少なくとも二つの帯域を有する下塗層と共に複合試薬／展開層を含む一態様が挙げられる。この要素では、展開層への緩衝剤の導入を、完成した要素上に塗布する方法によるか、又は塗布前に展開層中に緩衝剤をボールミルで導入するかによって行う。
【００２７】
いずれの実施態様でも、一般に層は相互に流体接触状態にある、すなわち、隣接する帯域の重なり合った領域間では流体が移動することができる。換言すると、要素が水性流体と接触した場合に、本発明の分析組成物のすべての拡散性試薬と水性流体の拡散性成分とが混合して均質配合物を形成する。
【００２８】
有用な展開層は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書（Kitajimaら）に記載されているような、適当なバインダー材料を混合したか又は織物状にした繊維状材料、米国特許第３，９９２，１５８号明細書に記載されているようなブラッシュポリマー(blush polymer) 等のポリマー組成物又は粒状材料、米国特許第４，２５８，００１号明細書(Pierce)に記載されているような結合性接着剤を含むか又は含まずに互いに結合させたビーズ、を使用して調製することができる。特に有用な展開層は硫酸バリウム又は二酸化チタンを含むものである。試料は一般に展開層に直接アプライされるので、展開層は等方性多孔質であること、すなわち、粒子間、繊維間又はポリマー鎖間の連続空間又は連続孔による多孔性が、層のいずれの方向においても同等であること、が望ましい。
【００２９】
本発明の要素は、製造上及び運転上の様々な利点のために通常用いられるその他の添加剤を一種又は二種以上含有することができる。このような添加剤として、界面活性剤、緩衝剤、静菌剤、溶剤、硬化剤、その他当該技術分野で周知の剤が挙げられる。
層は、ポリ（エチレンテレフタレート）のような透明な（すなわち、輻射線透過性の）支持体の上に塗布することができる。その他の支持体は当該技術分野では周知である。
【００３０】
要素中、本発明のクロモイオノフォア化合物は、一又は二以上の帯域において、一般に約０．１０ｇ／ｍ2 以上、好ましくは約０．１０〜約１．５ｇ／ｍ2 の被覆量で存在する。その他の試薬及び材料は、当業者の周知範囲の被覆量で存在する。
本発明の要素は、任意の幅の細長いテープ状、シート状、スライド状又はチップ状をはじめとする各種形状をとることができる。
【００３１】
本発明の要素はマニュアル式アッセイ法又は自動化アッセイ法のいずれでも使用することができる。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロール、チップパケット又はその他の出所から取り出し、それを被検流体試料（例えば、１μＬ〜２００ｍＬ）と物理的に接触させて試料と試薬とが該要素内部で混合されるようにする。このような接触は適当ないずれの方法でも行うことができるが、例えば、要素を試料中に浸漬する方法や、好ましくは要素に手又は機械で適当な分配手段により試料を点着する方法がある。
【００３２】
試料を適用した後、その要素を１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、最も好ましくは２５〜３７℃の温度で約５分以内のインキュベーションを行うことにより発色を促進させる。インキュベーションとは、測色前又は測色中に試薬同士の接触を所望の温度で所定の時間維持することを意味する。
【００３３】
好ましい実施態様では、上記アッセイ用組成物又は被検試料にシトレート（又はクエン酸）を添加することによって、ランダムなバイアスを回避することができる。いずれの場合も、シトレート（又はクエン酸）を１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの量で存在させる。好ましい実施態様は、アッセイを上記の薄フィルム要素で行う場合であって、該要素がシトレート又はクエン酸を塗布量として０．１〜２０ミリモル／ｍ2 の範囲でアッセイ要素の一又は二以上の層に含有する場合である。このより好適な範囲は１〜１０ミリモル／ｍ2 である。好ましくは、シトレート又はクエン酸を塗布工程の際に展開層中に導入する。本発明のクロモイオノフォア化合物を使用するアッセイにシトレート又はクエン酸を導入することにより、ランダムなバイアスが改善される。また、クロモイオノフォアのダイナミックレンジが拡張し、さらに比色測定値を６００ｎｍ付近以上の波長で得られる点で有利である。
【００３４】
【実施例】
下記の実施例は、本発明の代表的化合物の化学合成法を詳細に記載したものである。これらの手順は例示であり、本発明をその化学反応や条件によって限定されるものと解釈すべきではない。これらの反応において得られる収量（収率）の最適化は行っていないが、当業者であれば反応時間、温度、溶剤及び／又は試薬の変更により収量が増加しうることは自明であろう。
【００３５】
実施例１
７，１６−ビス〔２−ヒドロキシ−５−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニルアゾ）ベンジル〕−７，１６−ジアゾ−１，４，１０，１３−テトラオキサシクロオクタデカン
第１部：７，１６−ビス（２−ヒドロキシベンジル）−７，１６−ジアゾ−１，４，１０，１３−テトラオキサシクロオクタデカンの合成
７，１６−ジアゾ−１，４，１０，１３−テトラオキサシクロオクタデカン（１３ｇ，０．０５モル）を、２−アセトキシベンジルブロミド（０．１２モル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（０．２５モル）と共にアセトニトリル（１５０ｍＬ）へ添加した。この混合物を室温で２４時間維持し、その後溶剤を除去してペースト状とした。このペーストを水に溶かし、その溶液を二塩化メチレンで２回抽出した。抽出物を乾燥すると２５ｇの粘性油状物が得られた。この油状物をメタノール（１００ｍＬ）、水（１０ｍＬ）及び酢酸（１ｍＬ）の混合物に溶かし、その混合物を室温で２時間維持した。この混合物を冷却し、そして攪拌ロッドで容器を引っ掻いた際に白色結晶が形成した。ジエチルエーテルを添加し、濾過して生成物を分離し、これを乾燥した。
【００３６】
第２部：４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニルジアゾニウムヘキサフルオロホスフェートの合成
亜硝酸ナトリウム（１０ｇ）を２０ｍＬの水に溶かした溶液を、氷浴中の４−ニトロ−トリフルオロメチルアニリン（２０．６ｇ）及び濃塩酸の懸濁液に添加した。添加完了後、混合物を１時間攪拌し、その後１５ｍＬの６０％ヘキサフルオロリン酸で処理して固体析出物を得た。水を添加し、生成物を濾過して集め、析出物を水で洗浄し、そして風乾すると２７ｇ（７５％）が得られた。
【００３７】
第３部：表題の化合物の合成
第２部で合成したジアゾニウム化合物（１．５ｇ）を３０ｍＬの酢酸エチルに溶かした溶液を、第１部で合成したビスフェノール（９００ｍｇ）を７５ｍＬの酢酸エチルに溶かした溶液へ、攪拌しながら１０分間かけて添加した。色素が即座に形成し、そしてその混合物をさらに１０分間攪拌した後、１時間冷却し、その生成物を濾過して集め、ジエチルエーテルで洗浄し、そして乾燥した。収量は１．０ｇであった。元素分析の結果は下記の通り。
理論値（含２ＨＰＦ6 ）：Ｃ＝４０．０；Ｈ＝３．７；Ｎ＝９．３；Ｆ＝２８．５；Ｐ＝５．２
測定値：Ｃ＝３６．８３；Ｈ＝３．７５；Ｎ＝８．４７
【００３８】
実施例２
７，１６−ビス〔２−ヒドロキシ−５−（２−メチルスルホニル−４−ニトロフェニルアゾ）ベンジル〕−７，１６−ジアゾ−１，４，１０，１３−テトラオキサシクロオクタデカン
４−ニトロ−２−トリフルオロメチルアニリンの代わりに２−メチルスルホニル−４−ニトロアニリン（１．７ｇ，４．５ミリモル）を用いて実施例１、第２部の手順により合成した２−メチルスルホニル−４−ニトロフェニルジアゾニウムヘキサフルオロホスフェートをアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶かした溶液を、実施例１、第１部に記載したように合成した７，１６−ビス（２−ヒドロキシベンジル）−７，１６−ジアゾ−１，４，１０，１３−テトラオキサシクロオクタデカンを１００ｍＬのアセトニトリルに溶かした溶液に、１５分間かけてゆっくりと添加し、０℃で３時間維持した後、溶剤を蒸発させた。その残留物を水で洗浄し、そしてメタノールと希水酸化ナトリウム水溶液との混合物中で温めながら溶解させた。その混合物を冷却し、そして生成物を酢酸添加により析出させ、濾過して集め、イソプロピルアルコールで洗浄し、その後エーテルで洗浄した。一部をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かし、エタノール添加により析出させ、風乾し、その後９０℃で１０分間さらに乾燥し、そして試験した。
【００３９】
実施例３
カルシウムイオンの乾式アッセイ
本発明の分析要素を下記フォーマットで製作し、そしてカルシウム測定用のスライドとして切り出して搭載した。
0004361617.tif 000006
【００４０】
上記フォーマットの分析要素を製作するため、実施例１のクロモイオノフォア（１％）と、トリクレジルホスフェート系カプラー溶剤（５％）と、Alkanol XC（商標）アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム系界面活性剤（０．６％）と、ゼラチン（６％）とを含む色素分散液を、色素、溶剤及び界面活性剤をミル粉砕して所望の粒径を有する均一で安定な分散液を製造する標準的な写真カプラー分散法により調製した。
【００４１】
次いで、この色素分散液をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に塗布し、下記の層組成を得た。
試薬層１：分散液としての色素（０．２５ｇ／ｍ2 ）、ゼラチン（１０．０ｇ／ｍ2 ）及びＴＲＩＳ緩衝剤〔２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール緩衝剤、３７℃のｐＨを７．７に設定〕（０．０２５モル／ｍ2 ）
ゼラチン／緩衝剤層２：ＴＲＩＳ（３７℃のｐＨを７．７に設定）（０．０３５モル／ｍ2 ）、ゼラチン（１０．０ｇ／ｍ2 ）中、０．５ｇ／ｍ2 のビス（ビニルスルホニルメチル）エーテルで架橋
下層３：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（０．３９ｇ／ｍ2 ）
展開層４：下記組成を有するＴｉＯ2 展開層：
６７．２ｇ／ｍ2 二酸化チタン
９．８ｇ／ｍ2 酢酸セルロース
１．８ｇ／ｍ2 Triton X-405（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール非イオン界面活性剤）
０．９ｇ／ｍ2 Brij 78 （ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテル、非イオン界面活性剤）
１．８ｇ／ｍ2 Estane 5715 、ポリウレタンエラストマー（B.F.Goodrich製）
【００４２】
この要素を用いて、カルシウム濃度範囲１．５７〜１６．５ｍｇ／ｄＬの５０種の患者血清のカルシウム濃度を、一血清試料当たり３回繰り返して測定した。本発明のクロモイオノフォア化合物とカルシウムイオンとの錯体化により得られる反射濃度を、市販のスライド分析装置（Johnson & Johnson VITROS）を用いて６００ｎｍで読み取った。上記分析要素で実験的に求められたカルシウム濃度は、市販のカルシウム分析要素を用いて同一血清試料について測定したカルシウム濃度と相関した。
【００４３】
実施例４
カルシウムイオンの乾式アッセイ
本発明の分析要素を実施例３のフォーマットで製作したが、ＴｉＯ2 展開層に２．０ミリモル／ｍ2 のクエン酸を添加したものとしないものとを製作した。これらのコーティングを用いて５０種の患者血清試料をカルシウム濃度について分析し、その発色の反射濃度を６００ｎｍの波長で測定した。血清の（原子吸光分光分析法で測定した）基準値を用いて各コーティングを校正し、次いで、対応する検量線から各血清のカルシウム濃度を予測した。コーティングにより予測される値と基準値との差を算出し、これをバイアスとした。下記式による残差平方和（residual sum of squares)を算出した。
残差平方和＝Σ（予測濃度−基準濃度）2 
シトレートを含まない場合の残差平方和は４．０７となり、シトレートを含む場合の残差平方和は１．６９となった。個別の試料バイアスについて図１（シトレート無し）及び図２（シトレート含む）にプロット図を示す。明らかに、展開層にクエン酸を含有する要素は、対応するクエン酸を含まない要素と比べ、バイアスが有意に減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】シトレートを添加していない本発明の分析要素により測定した血清試料中のカルシウム濃度を、基準値との差としてプロットしたグラフである。
【図２】シトレートを添加した本発明の分析要素により測定した血清試料中のカルシウム濃度を、基準値との差としてプロットしたグラフである。
【図１】
0004361617.tif 000015
【図２】
0004361617.tif 000016