(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋で、ウィルスを含まない免疫グロブリン製剤を製造する方法であって、
（ａ）ヒト血漿から単離された免疫グロブリン画分を、非イオン性界面活性剤を含む150 mM±20％の高イオン強度緩衝液と混合し；
（ｂ）混合物に対して30 nm未満のカットオフ等級を有するナノフィルターを用いてナノフィルトレーションを行い；そして
（ｃ）ナノフィルトレーションのパーミエートを回収し、当該パーミエートは実質的に純粋で、ウィルスを含まない免疫グロブリンであり、当該免疫グロブリンが180キロダルトンまたはそれ以下の分子量を有する；
工程を含む上記方法。
【請求項２】
高イオン強度緩衝液が150 mM NaCl-グリシン緩衝液である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤が非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤がポリソルベート-80である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
カットオフ等級が12 nmである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ナノフィルトレーションが、10,000 K〜60,000 Kのカットオフ等級を有する第二ナノフィルターの使用を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
カットオフ等級が50,000 Kである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
免疫グロブリンが抗D免疫グロブリンである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
実質的に純粋で、ウィルスを含まない、抗D抗体を含む免疫グロブリンの製造方法であって、
（ａ）ヒト血漿から単離された抗D抗体を含む免疫グロブリン画分を非イオン性界面活性剤を含む150 mM±20％の高イオン強度緩衝液と混合し；
（ｂ）免疫グロブリンに対して30 nm未満のカットオフ等級を有するナノフィルターを用いてナノフィルトレーションを行い；そして
（ｃ）ナノフィルトレーションのパーミエートを回収し、当該パーミエートは実質的に純粋で、ウィルスを含まない、抗D抗体を含む免疫グロブリンである；
工程を含む上記方法。
【請求項１０】
高イオン強度緩衝液が150 mM NaCl-グリシン緩衝液を含み、非イオン性界面活性剤がポリソルベート-80を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
カットオフ等級が12 nmである、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
ナノフィルトレーションが、10,000 K〜60,000 Kのカットオフ等級を有する第二ナノフィルターの使用を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
カットオフ等級が50,000 Kである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
50,000 Kのカットオフ等級を有するナノフィルターを用いて免疫グロブリン濃度を濃縮し且つ非イオン性界面活性剤を含む高イオン強度緩衝液を50 mMまたはそれ未満の低イオン強度緩衝液と交換する工程（ｄ）を更に含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
低イオン強度緩衝液が50 mM NaCl-グリシン緩衝液である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
実質的に純粋なタンパク質の製造方法であって、
（ａ）血漿からタンパク質を単離し；
（ｂ）該単離されたタンパク質を非イオン性界面活性剤を含む150 mM±20％の高イオン強度緩衝液と混合し；
（ｃ）混合物に対して30 nm未満のカットオフ等級を有するナノフィルターを用いてナノフィルトレーションを行い；そして
（ｄ）ナノフィルトレーションからパーミエートを回収し、当該パーミエートは実質的に純粋なタンパク質であり、当該タンパク質が180キロダルトンまたはそれ以下の分子量を有する；
工程を含む上記方法。
【請求項１７】
実質的に純粋なタンパク質が免疫グロブリンである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
単離工程（ａ）が、バッチ若しくはイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはCohn法から成る群より選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
免疫グロブリンが0.1〜1％の濃度で混合されて存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
非イオン性界面活性剤が0.015 g/L〜0.024 g/Lの濃度である、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
非イオン性界面活性剤が80〜200 ppmの濃度である、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
バッチクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーにより、免疫グロブリン画分をヒト血漿から単離する、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
アルコール分別法により免疫グロブリン画分をヒト血漿から単離する、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
アルコールがメタノールであるアルコール分別法により、免疫グロブリン画分をヒト血漿から単離する、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の属する分野は、精製、ウイルス減少またはウイルスクリアランス処理中の小細孔排除フィルター（a small pore exclusion filter）を介する大型タンパク質性物質の回収である。γグロブリンのような大型生体分子からのサイズ排除によるウイルスの除去は、概して、医薬品および診断用の用途に必要な望ましい細孔サイズを有するサイズ排除フィルターを介して大型球状タンパク質を効率よく通過させる難しさによって妨げられている。本発明の処理方法を用いるタンパク質性分子からのウイルスの除去により、ウイルスを実質的に含まない製品がもたらされる。
【０００２】
【従来の技術】
精製、ウイルス減少またはウイルスクリアランス処理中の小細孔排除フィルターを介する大型タンパク質性物質の回収は、医薬および診断の産業に重要な問題を提起している（Roberts,P., Vox Sang, 1995;69:82-83 を参照されたい）。γグロブリン（単クローン性または多クローン性）のような大型生体分子からのサイズ排除によるウイルスの除去は、１２−１５ｎｍ細孔サイズを有するサイズ排除フィルターを介して大型球状タンパク質を効率よく通過させる難しさによって妨げられている。その問題は、小型の非エンベロープウイルスを高分子量の製品から除去しようとする場合に特に明らかである。その処理を更に複雑にしているのは、回収される免疫グロブリンなどのタンパク質性物質が、それらフィルターを介して通過することが難しいまたは全く通過しない二量体および三量体を形成していることである。
【０００３】
膜細孔サイズが小さいほど、ウイルス粒子を保持する場合にその膜は有効である。しかしながら、細孔サイズがより小さくなると、ウイルス除去された製品を自由に通過させる膜の能力は低下する。いずれのウイルス減少法を用いるとしても、それぞれの製品およびそれぞれのウイルスに関してそれぞれの用途の利点について評価される必要がある。小型の非エンベロープウイルスの除去を必要とする場合、最小の細孔度（３５ｎｍ未満、好ましくは、１２−３０ｎｍ）を有するウイルスフィルターの使用が不可欠であると考えられるが、これは、高分子量の製品にも、二量体および三量体を形成する製品にも使用できないことがありうる。
【０００４】
その問題は、上に引用された Roberts の公報に概説されており、そこでは、小型のウイルスおよびプリオンを除去するためには、７０、１６０ｋＤおよび１５、３５、４０、５０および７０ｎｍの名目分画値を有するフィルターが有用でありうるが、免疫グロブリン（ＩｇＧ，１５０ｋＤ）およびVIII因子（３５０ｋＤ）のようなより大きい分子量を有する製品は、より大きい細孔度のフィルターしか通過できないということが考察されている。
【０００５】
本発明の方法は、免疫グロブリンの医薬製剤の濾過処理およびウイルスクリアランスを含む。
【０００６】
新生児溶血性疾患の予防の場合、ヒト由来のＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリンを母親に注射する。このような製品は、本発明の譲受人から入手可能なＲｈｏＧＡＭ（登録商標）であり、それは、免疫感作されていないＲｈｏ（Ｄ）陰性の母親が、赤血球上に存在し且つＲｈｏ（Ｄ）陽性の胎児から“受容する” Ｒｈｏ（Ｄ）抗原に応答するのを妨げることによって機能する。したがって、その母親による抗Ｒｈｏ（Ｄ）生産を妨げることにより、この母親からの次のＲｈｏ（Ｄ）陽性の胎児は、新生児溶血性疾患から防護される。この成功した製品は、現在、Cohn アルコール分別型処理によって製造されるが、幾人かの研究者は、広範囲の血漿必要条件を減少させるために、別の方法を用いて同様の物質を製造し、それによって、経済的により好都合な製品を製造することを試みている。このような研究努力は、Hoppe らにより、“Prevention of Rh Immunization Modified Production of IgG Anti-Rh For Intravenous Application By Ion Exchanged Chromatography”，Vox Sang, 25:308-316(1973) および Friesen ら，“Column Ion-Exchange Preparation and Characterization of an Rh Immune Globulin for Intravenous Use”, Journal of Applied Biochemistry, 3,164-175(1981) に報告されている。
【０００７】
ドイツの Hoppe も、カナダの Friesen も、ＤＥＡＥ−Sephadex クロマトグラフィーカラムをリン酸緩衝液溶離剤と一緒に用いた。Hoppe の抗Ｄ含有血漿源は、ＨＢ  Ａｇ実験室検査に少なくとも６ヶ月間合格したボランティアからであり、その血漿はその期間中貯蔵された。したがって、Hoppe は、まず始めに、比較的安全な非感染性血漿を用いた。しかしながら、ＤＥＡＥ−Sephadex Ｂ型肝炎表面抗原の有効性を確認するための追加の試験は行わなれなかった。Hoppe の関心はむしろ、凝集した物質の除去、および比較的高い抗体濃度を有する免疫電気泳動によって純粋なフラグメント化されていないＩｇＧの単離に向けられていた。Friesen の公報は、カナダで用いるための静脈内Ｒｈ  ＩｇＧの開発のためにHoppe 法に為された変更について報告している。Hoppe が行ったように、Friesen は、ＨＢ  ＡＧに関してＲｈ血漿の単位毎に試験して、陽性を示すドナーを全て排除した。Friesen は、Abbott Laboratories, ノース・シカゴ，ＩＬＬからの放射性免疫検定キット（Ausria I Kit）を用いた。この試験は、今のところ最も感受性のものの一つと考えられ、後で記載される発明の開発でも用いられた。Friesen は、臨床試験により、ＤＥＡＥ Sephadex 樹脂／リン酸緩衝液組合せを用いて製造される物質が、Ｒｈ免疫感作の予防に有効且つ安全であったことが示されたことを報告した。Friesen は、しかしながら、血漿試料からＢ型肝炎表面抗原を除去するＤＥＡＥ−Sephadex／リン酸緩衝液組合せの有効性を確認するための別の試験については報告しなかった。ドナー血漿試料をスクリーニングする場合に用いられる放射性免疫検定試験は、なお感染性でありうる２桁または３桁小さいＨＢ  ＡＧ粒子の濃度を検出することができないので、少なくとも米国政府の視点から、これは特に重要である。このような方法によって製造される試薬の潜在的な感染性に関するこの問題は、試薬中で注射可能な免疫グロブリンの製造を固相法によって可能にする場合に、米国政府がかなりなお制限的であったということである。
【０００８】
ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）Ｒｈｏ（Ｄ）Immune Globulin（ヒト）は、抗体に媒介される免疫抑制を達成するための最初に成功した特異的抗体の予防的使用であった。ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）は、用量当たり３００マイクログラムの抗Ｄ活性の用量で抗Ｒｈｏ（Ｄ）を含有するＩｇＧ免疫グロブリン溶液である。ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）は、免疫感作されていないＲｈｏ（Ｄ）陰性の妊婦に、そのＲｈｏ（Ｄ）陽性の子の将来の疾患を予防する適当な時期に与えることができる。その疾患は、新生児溶血性疾患または、より詳しくは、Ｒｈ−胎児赤芽球症と称される。
【０００９】
より少ない用量の抗Ｒｈｏ（Ｄ）であるＭＩＣＲｈｏＧＡＭ（登録商標）Immune Globulin（ヒト）Micro-Dose（５０マイクログラムの抗Ｒｈｏ（Ｄ））も、流産し且つ妊娠１２週目またはそれ以前に妊娠中絶する女性の処置のために本発明の譲受人によって販売されている。充分な用量は、最大１５ｍｌまでのＲｈｏ（Ｄ）陽性赤血球として受容者を保護し、最大２．５ｍｌまでのＲｈｏ（Ｄ）陽性赤血球のより少ない用量も保護を与える。ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）は、出生前予防法として妊娠２６−２８週目に用いられる。他の適応症には、妊娠の継続を伴う全ての妊娠段階での切迫流産、妊娠１３週目またはそれ以降の流産または妊娠中絶、腹部外傷または遺伝学的羊水穿刺、絨毛膜ウイルス採取（ＣＶＳ）および経皮臍帯血採取（ＰＵＢＳ）が含まれる。
【００１０】
ＦＤＡおよび Bureau of Biologics によって使用が認められた大部分の免疫グロブリン注射用物質は、１９４０年代中に Harvard の Dr.E,Cohn によって開発されたアルコール分別法によって製造されており、本明細書中に援用される Cohn ら，J.Am.Chem.Soc. 68,459(1946) に記載されている。肝炎感染性、ＨＩＶ、および利用可能な最も感受性の試験によって確認される他の血液由来病原体に陰性の血漿の慎重な選択と関連づけられるこの方法は、米国政府が、この方法から得られた製剤だけを安全と認める見解を採用していたこのような長い期間用いられてきた。この方法によって製造される製品が実際に安全であるということは、何百万人もの非感染製品受容者によって容易に実証されうる。
【００１１】
ヒト血清からγグロブリンを分離するいくつかの慣用法は、特に、Baumstark ら，“A Preparative Method For The Separation of 7S Gamma Globulin From Human Serum”，Archives of Biochemistry and Biophysics, 108,514-522(1964) および A.Webb による“A 30-Minute Preparative Method For Isolation Of IgG From Human Serum”，Vox Sang, 23:279-290(1972) に記載されており、それらは両方とも本明細書中に援用される。これら論文は両方とも、多数の他の混入タンパク質を含有する血清からの種々のγグロブリンクラスの分離および選択により大きく関係しているが、それらは、元の血清試料からの混入タンパク質および物質の除去に取り組んでいる。両者とも、ＤＥＡＥ−Sephadex カラムをリン酸緩衝液溶離剤と一緒に用いている。双方の研究者らは、混入タンパク質の除去に関する限り、ある程度成功したが、しかしながら、両者とも、混入する肝炎ウイルス粒子を安全な注射用試薬を提供するために除去する問題と取り組んではいなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、注射用のウイルス除去された純粋な免疫グロブリンを提供することである。このような実質的に純粋な製品は、本発明の処理方法を用いて製造される。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、時間的、平方フィートおよびタンパク質収率の必要条件の点から適当である免疫グロブリンを精製するための製造方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明で用いられる濾過は、ウイルス対フィルター平均細孔サイズのサイズ関係に依存したシーブ保持機序によって行われる。その効率は、温度、イオン強度、ウイルス力価試験投与、圧力、ｐＨ、表面張力および他の変数の濾過条件によって影響されない。本発明の界面活性剤およびイオン強度条件は、フィルターを通過するＩｇＧ粒子の能力に影響するが、ウイルスクリアランスに影響することはない。本発明の譲受人のために行われた研究により、用いられる緩衝液組成は、ウイルス失活およびウイルスエンベロープ除去の点から、ウイルス粒子への最小限の作用を有することが示されている。
【００１５】
発明の要旨
本発明の方法は、実質的に純粋な免疫グロブリンを生じる。その免疫グロブリンは、単クローン性または多クローン性免疫グロブリン、例えば、単クローン性または多クローン性抗Ｄ免疫グロブリン、より詳しくは、ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）またはＭＩＣＲｈｏＧＡＭ（登録商標）であってよい。
【００１６】
本発明の免疫グロブリン製剤は、約４．０重量％〜６．０重量％の免疫グロブリン、約２４〜３６ｐｐｍのチメロソール（Thimerosol）および約８０〜２００ｐｐｍのポリソルベート８０を含む。より詳しくは、本発明の免疫グロブリン製剤は、約５．０重量％の免疫グロブリン、約３３ｐｐｍのチメロソールおよび約１００ｐｐｍのポリソルベート８０を含む。
【００１７】
本発明は、大型球状タンパク質の実質的に純粋な製剤を製造する方法であって、（ａ）ヒト血漿をアルコール中で分別し；（ｂ）得られた沈殿IIを再懸濁させ；（ｃ）その再懸濁された沈殿IIを、賦形剤を含有する高イオン強度緩衝液と混合し；そして（ｄ）その免疫グロブリンについてナノフィルトレーションを行なう；工程を含む方法を企図する。そのアルコールはメタノールであってよい。その高イオン強度緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液でありうる。その賦形剤は非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤、例えば、ポリソルベート−８０である。
【００１８】
そのナノフィルトレーションは、約３０ｎｍ未満、好ましくは、約１２ｎｍのカットオフ等級を有する第一ナノフィルターの使用を含む。そのフィルトレーションは、約１０，０００Ｋ〜約６０，０００Ｋ、好ましくは、約５０，０００Ｋのカットオフ等級を有する第二ナノフィルターの使用を更に含むことができ、これは、メタノールを除去し、タンパク質を濃縮し、そして緩衝液を製品安定性について最もよいものに交換する。このような緩衝液は、例えば、低イオン強度緩衝液、例えば、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液である。
【００１９】
実質的に純粋な抗Ｄ抗原の製造方法であって、
（ａ）分別されたヒト血漿からの沈殿IIを再懸濁させ；
（ｂ）その再懸濁された沈殿IIを処理用助剤と混合し；そして
（ｃ）その免疫グロブリンについてナノフィルトレーションを行なう；
工程を含む方法も企図される。その処理用助剤は、高イオン強度緩衝液および非イオン性賦形剤を含み、その高イオン強度緩衝液は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液を含み、その非イオン性賦形剤はポリソルベート−８０を含む。
【００２０】
本発明の方法は、工程（ｄ）約５０，０００Ｋのカットオフ等級を有するナノフィルターを用いて免疫グロブリン濃縮に集中することを更に含む。この工程はまた、高イオン強度緩衝液を低イオン強度緩衝液、例えば、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液に交換もする。
【００２１】
発明の詳細な記述
本発明は、大型生体分子からのウイルス減少またはウイルスクリアランス中に処理用助剤として高（ほぼ生理学的範囲）イオン強度緩衝液および非イオン性賦形剤の組合せを用いる。本発明は、小細孔サイズ排除ナノフィルターを、免疫グロブリンのような球状タンパク質分子について、顕著な収量損失および免疫グロブリンサブクラス、凝集体レベルまたは安定性の有意の変化を伴うことなく用いることを可能にする。その高イオン強度緩衝液および賦形剤は、処理用助剤としてのみ用いられ、処理後にナノフィルトレーションによって減少させることができる。本発明の方法は、ウイルスを実質的に含まない製品を生じる。本発明の方法（サイズ排除）によって除去されるウイルスは、可能性のある全てのウイルス種類を確実にし、エンベロープ（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス）も非エンベロープ（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９）も、その製品から除去される。
【００２２】
本発明の処理用助剤の利点には、次が含まれる：（１）それら処理用助剤が、タンパク質二量体、三量体および凝集体形成からその平衡を離れるように移動させ、それが、増加したタンパク質濃度で製品を処理することを可能にするので、処理時間は大きく減少し、付随して、収量はより多い；（２）より小さい非エンベロープウイルスのウイルスクリアランスをより確実にすることを考慮して、より小さい細孔サイズ膜を用いる能力；（３）その膜によって処理される免疫グロブリンは、ＩｇＧサブクラスまたは安定性が変化しない；そして（４）処理用装置、したがって製造用床面積は、フィルター面積当たりの最高製品収量に最適化することができる。
【００２３】
本発明の方法によって処理される大型分子には、アルブミン、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）およびそれらのフラグメント、VIII因子、IX因子およびXI因子などの血液凝固因子、成長ホルモン、アポリポタンパク質、酵素（例えば、ストレプトキナーゼ）、天然に存在するにせよ遺伝子操作されているにせよ、上の全てのような大型球状タンパク質が含まれる。
【００２４】
本発明の実質的に純粋なウイルス不含免疫グロブリン製品の製造で用いられるナノフィルトレーション装置の細孔サイズは、約３０ｎｍ未満、最も好ましくは、約１５ｎｍである。しかしながら、タンパク質性溶液から非エンベロープウイルスを減少させるまたは排除するのに充分なフィルターカットオフ等級を有する膜はいずれも、本発明の処理方法で用いることができる。例えば、約１８０ＫＤ分子量または約１２ｎｍ未満の分子量細孔サイズ等級を有するような装置、Viresolve−１８０（Millipore Corporation, ベッドフォード，ＭＡ）装置を用いてよい。本発明の方法は、小型の組換えタンパク質、サイトカインおよびリンホカイン製品、更には血液分別製品の濾過において現在用いられている７０ＫＤナノフィルター細孔サイズ装置の使用も企図する。
【００２５】
ナノフィルトレーション処理用助剤としての非イオン性賦形剤の本使用は新規である。本発明の非イオン性賦形剤には、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーまたはコポリマー（PluronicsTM）、多糖、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）、およびアクリルアミドポリマーおよびそれらの誘導体または塩が含まれる。ポリ（エチレンオキシド）には、ポリエチレングリコールが含まれることは理解される。本発明において有用なビニルポリマーは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールから成る群より選択されうる。本発明において有用な多糖は、セルロースまたはセルロース誘導体、グリコサミノグリカン、寒天、ペクチン、アルギン酸、デキストラン、デンプンおよびキトサンから成る群より選択されうる。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチンおよび関連分子から成る群より選択されうる。本発明において有用なタンパク質は、ゼラチンおよびフィブロネクチンから成る群より選択されうる。本明細書中上記の物質のいくつかは、ナノフィルターを通過しないかもしれないが、それらが保持物質側に存在することは、本発明の目的を達成するのに充分でありうる。
【００２６】
セルロース誘導体には、アルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースが含まれうる。
【００２７】
本発明において企図されている球状タンパク質のナノフィルトレーションに最も好ましいのは、イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンまたは糖先端基を有する非イオン性界面活性剤、リゾリン脂質および胆汁酸塩およびそれらの組合せである。特に好ましいのは、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤、例えば、ポリソルベート、Pluronics、Brij、Sterox−ＡＪ、Tritons および Tween類である。最も好ましいのは、ポリソルベート８０である。
【００２８】
本発明の非イオン性賦形剤は、処理方法において最初にタンパク質溶液中に約０．０１５ｇ／Ｌ〜約０．０２４ｇ／Ｌの範囲で、最も好ましくは、約０．０２ｇ／Ｌまたは２０ｐｐｍで存在してよい。処理中のこのような賦形剤濃度は、ウイルスクリアランスに影響しないことが確認された。非イオン性賦形剤の内、特に好ましいのはポリソルベート８０であるが、これは、最も好ましくは処理中に、処理について０．００２％または２０ｐｐｍの濃度で用いられる。この範囲は、ポリソルベート８０の臨界ミセル濃度またはその範囲内である。本発明において他の賦形剤の濃度を決定する場合、その賦形剤の臨界ミセル濃度の情報から指標を得ることができる。この段落で引用される賦形剤の量は、抗Ｄ免疫グロブリンに特異的であるが、しかしながら、上記量は、ＩｇＧの他の製剤、例えば、免疫血清グロブリン（ヒトおよびウマ）およびＢ型肝炎免疫グロブリンに適応できると企図される。製品中の最終賦形剤濃度は、最大約０．１〜０．２％ｗ／ｖまで、より好ましくは、約８０〜２００ｐｐｍ、最も好ましくは、ポリソルベート８０の場合約１００ｐｐｍであってよい。概して、最終製品中に存在する賦形剤の量は、ほぼ同様の用量で投与される全てのＩｇＧ分子についてほぼ同様であると考えられる。賦形剤の使用のもう一つの利点は、濾過処理中の脱泡助剤としてである。
【００２９】
本発明で用いられるヒト血漿は、本明細書中上記の Cohn らの方法（“Cohn 法”）によって、バッチまたはカラム交換クロマトグラフィーによって、またはアフィニティークロマトグラフィーによって得ることができる。
【００３０】
沈殿II（Cohn らの方法による）物質を約４．６〜５．０ｍｇ／ｍｌ（約０．５％）まで希釈し、後に限外濾過によって１０Ｘに濃縮する必要がある本発明の方法においては、低い初期濃度の賦形剤を用いることが重要であり、本明細書中上記の範囲の賦形剤濃度、好ましくは、約０．００２％が、その方法に悪影響を与えない。このような悪影響は、例えば、エンベロープウイルス、そのウイルスのエンベロープからの分離、およびウイルス粒子の濾液中への通過に関係していると考えられる。弾丸形のエンベロープ型ＲＮＡ含有ウイルスである水疱性口内炎ウイルス（Vesicular Stomatitis Virus）を用いる本発明の譲受人のために行われた研究により、本発明において用いられる賦形剤の濃度（処理について５Ｘで１００ｐｐｍまたは０．０１％）では、顕著なウイルス活性化は起こらないことが示された。
【００３１】
本発明の処理において用いられるタンパク質濃度は、約０．１重量％〜約１重量％の範囲内であろう。そのタンパク質物質がモノマーまたは単クローン性である場合、最大約１％まで用いることができる。本発明において用いられる沈殿II免疫グロブリンについては、処理のために用いられる初期タンパク質濃度は約４．６〜５．０ｍｇ／ｍｌ（約０．４６〜０．５％）である。
【００３２】
本明細書中にその内容が援用される Cohn の米国特許第２，３９０，０７４号は、γグロブリンを製造する血液分別法を開示している。その Cohn 法によって製造されるγグロブリンは、１９Ｓグロブリン、プラスミノーゲンおよび脂質を含有する。このγグロブリンは、麻疹および破傷風などの疾患に対する予防法にきわめて適しているが、それら１９Ｓグロブリン、プラスミノーゲンおよび脂質の存在は、不必要な混入物であり、そして胎児赤血球上のＲｈ因子への免疫感作を予防する場合のその有効性を低下させることがありうる。
【００３３】
本発明の有効な方法によって製造される実質的に純粋な抗Ｒｈグロブリンは、アルブミン、プラスミノーゲン、α、βおよびγグロブリン、および種々の脂質を含有するヒト血漿から製造される。具体的には、本発明の抗Ｒｈグロブリンはγグロブリンである。
【００３４】
抗Ｒｈグロブリンを得るためのヒト血漿の分別は、同一人に譲渡されたPollack らの米国特許第３，４４９，３１４号の方法にしたがって行われ、その特許の内容は本明細書中に援用される。添付の図１のフローシートに関して、ヒト血漿を分別する能力は、その血漿の各種成分の溶解性に依存する。分別の各段階において、抗Ｒｈグロブリン中の望ましくないそれら成分の画分の分離および最終的な除去は、ｐＨ、温度、沈殿剤の濃度およびその系のイオン強度の臨界的制御によって決定される。
【００３５】
アセトンおよびアルコールなどの低誘電率の各種有機溶媒は、タンパク質を沈殿させるので、血漿の分別に用いられてきた。本発明の方法で用いられるそれら有機溶媒には、各種アルコールおよびアセトン、好ましくは、メタノールが含まれる。メタノールは、他の有機溶媒よりもその比較的低い毒性およびより安全な取扱（例えば、爆発の危険）ゆえに好適である。
【００３６】
分別中のタンパク質の変性を妨げるために、沈殿は低温で行われる。タンパク質の溶解性は温度依存性であるので、それぞれの分別工程について選択される温度は、変性を妨げるのに望ましい分離を可能にする使用できる最低温度でなければならない。
【００３７】
図１のフローシートに関して、その分別は、全ヒト血漿から行われる。その血漿を約１℃に冷却した後、遠心分離して、冷不溶性沈殿をその上澄みから分離する。その上澄みを更に分別して、沈殿Ｉおよび上澄みＩを生じる。主としてフィブリノーゲンから成る沈殿Ｉを捨てる。上澄みＩを更に分別して、上澄みII＋IIIおよび沈殿II＋IIIを生じる。上澄みII＋IIIは捨てられるが、αおよびβグロブリンおよび脂質を含有する。沈殿II＋IIIは、主として、βおよびγグロブリンおよび同種凝集素から成るが、プロトロンビン、プラスミノーゲン、コレステロールおよび他の脂質も含有する。沈殿II＋IIIは、更に分別すると、上澄みII＋IIIＷおよび沈殿II＋IIIＷを生じる。βグロブリン、コレステロールおよび他の脂質は、大部分が上澄みII＋IIIＷ中で除去され、これを捨てる。沈殿II＋IIIＷは、主として、γグロブリン、同種凝集素、プラスミノーゲンおよびプロトロンビンおよびいくつかのβグロブリン、コレステロールおよび他の脂質から成る。更に分別すると、沈殿II＋IIIＷは、上澄みIII＋沈殿IIIを生じる。沈殿IIIは捨てられるが、同種凝集素、プラスミノーゲンおよびプロトロンビンを含有する。上澄みIIIは、主として、γグロブリンおよび微量のフィブリノーゲンおよび脂質から成る。最終の分別工程により、１９Ｓグロブリン、プラスミノーゲンおよび脂質をほぼ完全に含まない本質的に純粋なγＧグロブリンである沈殿IIを生じる。本発明の方法によって製造される沈殿IIは、抗Ｒｈγグロブリンである。
【００３８】
本発明の好ましい方法において、再懸濁のための免疫グロブリン出発物質は、改良された Cohn 法からの沈殿IIペーストである。そのタンパク質が、本発明によって企図されているような賦形剤の存在下で凍結乾燥されるならば、凍結乾燥された沈殿IIペーストを用いてよい。
【００３９】
本発明において沈殿IIペーストを再懸濁させるのに用いられる液体希釈剤には、注射用水（Water For Injection）（“Ｗ．Ｆ．Ｉ．”），米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、規定食塩水，米国薬局方、または一定範囲の適当な緩衝液のいずれかであって、適当なｐＨを与えるのに好都合なものより選択される薬学的に許容しうる希釈剤が含まれる。適当な緩衝液は、約６．４のｐＨの、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグリシン緩衝液から成る群より選択されるものである。好ましくは、最初の希釈剤は、ペーストの３重量倍のＷ．Ｆ．Ｉ．であり、後にこれを、最初のナノフィルトレーションの前に高イオン強度緩衝液で希釈する。本明細書中で企図されている高イオン強度緩衝液も、最初の希釈剤として適している。好ましくは、１５０ｍＭ＋／−２０％のイオン強度、好ましくは、１５０ｍＭ＋／−２０％ＮａＣｌ  グリシン緩衝液；ｐＨ６．４を用いる。
【００４０】
本発明の免疫グロブリンの処理および濾過の際、高イオン強度緩衝液は、好ましくは、その免疫グロブリンの二量体および三量体の形成を減少させる処理用助剤として用いられ、フィルターを介するより完全な通過を可能にする。適切な高イオン強度希釈液は、再懸濁用希釈剤に関して本明細書中上記に引用されたものであるが、しかしながら、比較的高いイオン強度および約６．４のｐＨである。好ましくは、このような処理用助剤は、最も好適である約１５０ｍＭ＋／−２０％濃度のイオン強度で存在し、これは、ほぼ生理学的イオン強度である。本発明の最も好ましい実施態様において、高イオン強度処理用助剤は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液，ｐＨ６．４である。
【００４１】
本発明の免疫グロブリンの処理において、非イオン性賦形剤は、その方法の濾過工程の最初に、高イオン強度緩衝液と一緒に好都合に混合することができる。これについては、ポリソルベート８０を含有する高イオン強度緩衝液の調製に関する実施例２Ａおよび３Ａを参照する。本発明のそれら処理用助剤は、ポリソルベート８０濃度を増加させるばあい、そのイオン強度含有物を減少させることができるように互いに相対して調整することができる。
【００４２】
保存剤は、本発明の処理法から得られる医薬製品中で用いることができる。好ましい保存剤は、チメロソールおよびアジ化ナトリウムなどの薬学的に許容しうる保存剤であり、前者は、２６〜３６ｐｐｍで、本発明においては３３ｐｐｍ（０．００３％）で用いることができる。しかしながら、本発明の免疫グロブリン製剤、特に、単回使用非経口剤として計画されるＲｈｏＧＡＭ（登録商標）およびＭＩＣＲｈｏＧＡＭ（登録商標）製剤の場合、保存剤を用いる必要はない。
【００４３】
本発明の、例えば、二番目に小さい細孔サイズのナノフィルトレーションフィルター、例えば、約１０，０００Ｋ〜約６０，０００Ｋカットオフまでのフィルター、例えば、Biomax−５０（５０，０００Ｋカットオフ）フィルター（Millipore Corporation, ベッドフォード，ＭＡ）フィルターを用いるタンパク質濃縮および有機溶媒除去工程の場合、その高イオン強度緩衝液は、場合により、比較的低いイオン強度、例えば、５０ｍＭ緩衝液に交換してもよい。このタンパク質濃縮工程は、ナノフィルトレーションされるタンパク質製品を濃縮し、同時に、若干の賦形剤および有機溶媒を除去するのに役立つ。
【００４４】
Viresolve−１８０膜システムを用いる濾過の際、その膜貫通圧力は、好ましくは、ほぼ＞０〜約３．０ｐｓｉの範囲内、最も好ましくは、約１．５ｐｓｉ未満である。篩分け係数（sieving coefficient）は、好ましくは、約６０％より大きいであろう。
【００４５】
本発明の処理は、周囲温度で行うことができる。冷却温度での処理は、このような温度（例えば、１６〜１７℃）が、概して粘度を増加させるので、概して、濾過時間を延長させるであろう。処理中の製品温度は、ほぼ０℃または僅かにそれ以上〜約４５℃、より好ましくは、約１５℃〜３０℃、最も好ましくは、約２０℃〜２５℃でありうる。
【００４６】
本明細書中で用いられる次の用語は、次のようなそれらの意味を有する。
【００４７】
クロス流量（Cross Flow Rate）：  膜表面を越える供給溶液のｍＬ／分での流量
パーミエート（Permeate）：  膜を通過する精製された製品
保持物質（Retentate）：  膜によって保持される物質
フラックス（Flux）：  パーミエート流量／面積
変換率（Conversion）：  パーミエート流量／クロス流量
篩分け係数：  パーミエートのタンパク質含量／保持物質のタンパク質含量
本発明の一つの実施態様において、および図２に関して、実質的に純粋な（ウイルス除去された）免疫グロブリン、例えば、ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）をナノフィルトレーションによって生じる製造規模処理は、次のように行われる。
【００４８】
Ｒｈｏ（Ｄ）免疫グロブリンを、メタノールがエタノールに置き換えられている Chon 精製法（Chon ら，J.Am.Chem.Soc.,Vol.68, 459-475頁）を用いて精製して“沈殿II”にし、注射用水（ＷＦＩ），米国薬局方中に再懸濁させ、２〜８℃に冷却する。Ｗ．Ｆ．Ｉ．の容量は、次の式を用いて計算される：
【００４９】
【数１】
0004255210.tif 000002
【００５０】
沈殿IIペースト１ｋｇにつき、３ＬのＷ．Ｆ．Ｉ．中に再懸濁させる。
【００５１】
その混合物を、保持タンク−製品（１）中で３〜８時間ボルテックスし（無発泡）、次に使用するまで４℃で貯蔵する。スチーム・イン・プレース（Steam in place）（ＳＩＰ）法をウイルスクリアランスシステムで行うが、このシステムには、ウイルスクリアランスフィルターホルダー（２）中に Viresolve ＣＩＰ／ＳＩＰモジュール（Millipore Corporation, ベッドフォード，ＭＡ）および限外濾過フィルターホルダー（３）上に Pellicon ＣＩＰ／ＳＩＰモジュール（Millipore Corporation, ベッドフォード，ＭＡ）の装置が含まれる。そのＣＩＰ／ＳＩＰ法は、そのシステムおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液貯蔵タンク（４）でも行われる。
【００５２】
クリーン・イン・プレース（Clean in Place）（ＣＩＰ）法は、装置部品の分解を伴わない清浄処理装置の方法である。その装置での必要条件には、全てのパイプがステンレス鋼製であり、適当なピッチおよび並列度であり、最小限数のガスケットを有することが含まれる。ＣＩＰの目的は、手動清浄およびロットの相互汚染を排除することである。その方法は有効でありうる。清浄要素には、時間、温度、化学的および機械的パラメーターが含まれる。処理後に残る残留物の種類により、そのＣＩＰ法で用いられるべきクリーナーが決定されるであろう。当医薬処理業者は、ＣＩＰの方法および必要条件に精通している。
【００５３】
ＳＩＰ法後、約４０Ｌ容量の再懸濁された沈殿II容量につき Viresolve−１８０Ｒモジュール，２０スタック（２）を、Viresolve ＣＩＰ／ＳＩＰモジュール（２）の適所に取り付ける。（１０スタック Viresolve−１８０フィルターを１０〜１６Ｌに用い、２０スタックを＞１６〜４０Ｌの最終製品容量に用いる。）４個の Biomax−５０カセット（Millipore Corporation, ベッドフォード，ＭＡ）を、Pellicon ＣＩＰ／ＳＩＰモジュール（３）に代えて取り付ける。２個の Biomax−５０カセットを１０〜１６Ｌの再懸濁された沈殿II容量に用い、４個のカセットを＞１６〜４０Ｌの容量に用いる。その Viresolve−１８０モジュールを塩素で衛生的にし、ジエチルフェニレンジアミン（ＤＰＤ）法によって塩素がｄ０．３ｐｐｍを示すことが確認されるまで洗浄する。
【００５４】
圧力保持試験は、衛生化後にモジュール（２）で行われる。そのモジュールは、必要な５分の試験時間にわたって、最低１０ｐｓｉに耐え、ｄ１ｐｓｉの圧力低下を示さなければならない。
【００５５】
Biomax−５０膜（３）を、ＷＦＩ，米国薬局方を用いてフラッシュする。塩化ベンザルコニウム測定（Determination of Benzalkonium Chloride）（Roccal）は、最終透過フラッシュ試料で行われ、その塩化ベンザルコニウム含量は≦１０ｐｐｍでなければならない。拡散試験は、Biomax−５０カセットで行われ、放出速度は次のように計算される：
【００５６】
【数２】
0004255210.tif 000003
【００５７】
その放出速度は、≦１８ｃｃ／分／カセットでなければならない。
【００５８】
Viresolve−１８０（２）を用いるウイルスクリアランス限外濾過は、５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液で行われる。そのウイルスクリアランス再循環タンク（Ｔ−１）（５）に、５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液を入れる。最大２５０Ｌを、最低１３０Ｌで充満させる。
【００５９】
その緩衝液をＴ−１（５）中で再循環させ、同時に、その緩衝液パーミエートをタンクオフライン中に集める。
【００６０】
そのウイルスクリアランス再循環タンク（Ｔ−１）（５）に、最低６０Ｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液を入れて、そのタンクおよび膜をフラッシュする。
【００６１】
沈殿II再懸濁液は、次のように処理される。沈殿IIを、発泡することなく渦を生じる速度で、完全に懸濁するまで１５〜３０分間混合する。屈折率によるタンパク質％（Percent Protein by Refractive Index）（タンパク質ｍｇ／ｍｌ）は、手動プロトメーターを用いて沈殿II再懸濁液に対して行われる。５．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得るのに希釈された沈殿IIの必要な最終容量は、次の式を用いて計算される：
【００６２】
【数３】
0004255210.tif 000004
【００６３】
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液の必要量は、次の式を用いて計算される：
【００６４】
【数４】
0004255210.tif 000005
【００６５】
緩衝液を希釈された沈殿IIに加え、発泡することなく渦を生じる充分な速度で最低３０分間混合する。その混合物を、更に処理するまで１５〜３０℃で最大２．５時間貯蔵する。
【００６６】
希釈された沈殿IIのバッチを、限外濾過のためのウイルスクリアランス再循環タンク（Ｔ−１）（５）中に入れる。ＴＭＰ整定値は、約３．０に設定される。しかしながら、その値はより高くなるかもしれないが、しかしながら、それが約１２に達する場合、その膜を分極させてよく、その保持物質は、（パーミエートを減少させることによって）その膜を洗浄するようことを可能にするはずである。Viresolve レベル整定値は次のように計算される：
【００６７】
【数５】
0004255210.tif 000006
【００６８】
上の結果が＜５０である場合、５０を Viresolve レベル整定値として設定して入れた。その１／３全容量は、最も近い全Ｌに四捨五入される。
【００６９】
限外濾過濃縮終点は、次のように計算される：
【００７０】
【数６】
0004255210.tif 000007
【００７１】
上の結果が＜２０である場合、２０を濃縮終点として入れた。限外濾過ダイアフィルトレーション終点は、次のように計算される：
【００７２】
【数７】
0004255210.tif 000008
【００７３】
ダイアフィルター全整定値は、次のように計算される：
【００７４】
【数８】
0004255210.tif 000009
【００７５】
限外濾過／濃縮法を開始するために、Viresolve−１８０供給ポンプ（Ｐ１）（７）速度を、２０スタックフィルターサイズについて７５％〜８３％まで、または１０スタックフィルターについて３７％〜４２％まで傾斜させる。ＴＭＰ制御を行い、そのＴＭＰは、パーミエートポンプ（Ｐ２）の速度によって制御され；膜貫通圧力が３．０になる場合、そのポンプを減速させる。Viresolve パーミエートポンプ（Ｐ２）（８）速度を最大１８％まで、または１０スタックフィルターについて９％まで徐々に傾斜させる。Ｐ２がいったん傾斜したら、≧５．０ｐｓｉの保持物質圧力（ＰＴ３）を維持する。ＴＭＰが平衡化したら、そのポンプ速度範囲を、１０スタックフィルターについて９％〜１１％に、２０スタックフィルターについて１８％〜２３％に設定する。ＴＭＰ圧力は制御されない；しかしながら、それは、好ましくは、比較的低い、例えば、約３．０ｐｓｉ未満であり、またはその膜は、分極した状態になってよい。ＴＭＰがより高く、例えば、約１２ｐｓｉになった場合には、そのパーミエートは、保持物質が膜を洗浄できるように停止することができる。ＵＶメーター（ＵＶ１）（９）は、４．０Ａ．Ｕ．の下限と７．７Ａ．Ｕ．の上限との間であるべきである。パーミエートフロー（ＦＴ１）は、０．８１リットル／分（ＬＰＭ）の下限と０．９８ＬＰＭの上限との間であり；１０スタックフィルターについては０．４０ＬＰＭ〜０．４９ＬＰＭ間である。処理温度は、約１５〜３０℃で維持される。これら条件は、ウイルスクリアランス／限外濾過法の間中監視される。ＵＶメーター（ＵＶ１）（９）は、６．４Ａ．Ｕ．の下限と７．７Ａ．Ｕ．の上限との間である。篩分け係数は、約≧７５％であるべきである。
【００７６】
Ｔ−２（６）容量が約７５〜１００Ｌに達した時点で、Pellicon システム（３）を調整し、混合を始める。ＵＦ供給ポンプ（Ｐ５）（１０）を始動／傾斜させ、ＵＦパーミエート流量をそのポンプ速度によって制御する。ＵＦ供給圧力（ＰＴ４）およびＵＦ保持物質圧力（ＰＴ５）は、次のように維持される：
ＵＦ供給圧力：≦３０ｐｓｉ
ＵＦ保持物質圧力：≦１０ｐｓｉ
示差を供給圧力と保持物質圧力との間で≦２０ｐｓｉに維持する：
【００７７】
【数９】
0004255210.tif 000010
【００７８】
希釈された沈殿II供給タンクＴ−１（５）中の容量レベルを監視し（重量による）、Ｔ−１上のロードセルによって応答させる。
【００７９】
定容量ダイアフィルトレーションをＴ−１（５）中で行う。このダイアフィルトレーションを用いて、残留するタンパク質をそのシステムおよび Viresolve−１８０膜によって洗浄し、それによって収量を増加させる。３×１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液ダイアフィルトレーションを行い；設定量の緩衝液を、それが Viresolve−１８０パーミエートによって除去されるのと同様の速度で加える。ダイアフィルトレーション工程がいったん完了したら、Ｔ−１（５）および Viresolve−１８０モジュール（２）を、本明細書中上記のように塩素処理を用いて衛生化して、維持されたウイルスを全て不活化することを確実にする。Ｔ−２（６）のバルクを、Ｔ−２（６）中の定容量ダイアフィルトレーションにより、ウイルス除去された５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液を用いて濃縮する。この工程は、バルク製品を濃縮し、より高いイオン強度緩衝液濃度をより低いイオン強度濃度に交換し、Cohn 法からのメタノールおよび約半分のポリソルベート８０を除去する。ダイアフィルトレーション処理を完了後、Ｔ−２（６）中のレベルをリットルで記録する。Ｔ−２（６）から試料を抜き取り、ＵＦパーミエート試料についてディジタル導電率測定を行う。その結果は、４．９５〜５．６７×１０-3ｍｈｏｓ／ｃｍでなければならない。その必要条件が最初の試験で満たされない場合、その試験結果がこの必要な範囲内になるまで定容量ダイアフィルトレーションを続けなければならない。
【００８０】
５．５Ｘダイアフィルトレーション後のＴ−２レベルは、再懸濁された沈殿II容量の≦９５％であるべきである。Ｔ−２レベルが再懸濁された沈殿II容量の＞９５％である場合、そのＴ−２容量がより高い容量レベル必要条件を満たすまで、そのバルクを濃縮し続ける。その容量レベルが満たされたら、そのＵＦパーミエートを停止させ（１１）、そのバルクを再循環によって混合し、１０．５ｍｌ試料を無菌的に取り出す（１２）。タンパク質％測定は、その試料の０．５ｍｌアリコートについて、手動プロトメーターを用いて屈折率によって行われる。タンパク質濃度が最低で約５．５％でない場合、その試料は、このような最低％になるまで更に濃縮されなければならない。そのバルクを仮の容器に移し、その正味重量を、次の式を用いて重量法によって計算する：
【００８１】
【数１０】
0004255210.tif 000011
【００８２】
バルク調整は、最終バルク容量に達するように加える５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液の容量を、次の式を用いることによって決定することによって行うことができる：
【００８３】
【数１１】
0004255210.tif 000012
【００８４】
加えるのに必要な５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液の容量は、次のように計算される：
【００８５】
【数１２】
0004255210.tif 000013
【００８６】
初期ｐＨ測定は、残りの試料アリコートについて、最初にそのアリコートを０．９％  ＮａＣｌで１：１０に希釈することによって行われ、０．５Ｎ  ＨＣｌまたは０．５Ｎ  ＮａＯＨの１：１００希釈を用いて６．３〜６．４のｐＨに滴定する。
【００８７】
調整が必要ならば、そのバルクのｐＨを調整するのに必要な未希釈０．５Ｎ試薬の量を、次のように計算する：
【００８８】
【数１３】
0004255210.tif 000014
【００８９】
完全性試験は、認可された方法にしたがって、Viresolve−１８０フィルターモジュールで行われる。その完全性試験値は、≧０．２でなければならないし、そのモジュールは、上のように塩素を用いて衛生化され且つ洗浄されなければならない。
【００９０】
本明細書中上記の式を用いて計算される０．５Ｎ未希釈試薬および、所望ならば１００Ｘチメロソール溶液をそのバルクに加える。所望ならば加えるチメロソール溶液の必要量は、次のように計算される：
【００９１】
【数１４】
0004255210.tif 000015
【００９２】
５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液を、次の式によって計算されるようにバルクに加える：
【００９３】
【数１５】
0004255210.tif 000016
【００９４】
そのバルクを、ポンプ作用でＴ−２中に戻し、必要な最終容量に達した後、Ｔ−２中で１０〜６０分間混合し続けた後、バルク製品の１０．５ｍｌアリコートを、ｐＨの測定用に無菌的に取り出す。ｐＨは６．３〜６．４でなければならない。ｐＨが規定範囲外である場合、前と同様にアリコートを希釈し、許容しうるｐＨまで滴定し、そして本明細書中上記のように、未希釈０．５Ｎ試薬の必要量を計算し、そのバルク中に混合しながら加え戻さなければならない。
【００９５】
タンパク質％は、上記のように手動プロトメーターを用いて屈折率によって決定される。そのタンパク質濃度が許容しうるｅ５．０％である場合、そのバルクは次の工程に通過してよい。そのタンパク質濃度が許容しうる百分率未満である場合、そのバルク製品は棄却される。
【００９６】
そのバルクは、場合により、濾過処理中に１５ｐｓｉ以下の圧力を用い、０．２ｕ  Optiseal フィルター（１３）を介して濾過された後、そのバルクは、微生物学的におよび血清学的に検査される。
【００９７】
ＷＦＩおよびスチームを用いる洗浄から成るクリーン・イン・プレース法は、ウイルスクリアランスシステム（本明細書中上記のＣＩＰ法）で行われる。
【００９８】
その製品の許容しうる判定基準を表１に挙げる。
【００９９】
【表１】
0004255210.tif 000017
【０１００】
本発明の製剤の投与方式は、その１種類または複数の化合物が供給されるであろう生物の部位および／または器官中の細胞を決定しうる。本発明のそれら化合物は、単独で投与されうるが、概して、予定の投与経路および標準的な医薬慣例に関して選択される医薬担体または希釈剤との混合物で投与されるであろう。それら製剤は、非経口で、例えば、動脈内または静脈内に注射されうる。それら製剤は、経口、皮下または筋肉内経路によって供給されてもよい。非経口投与に関して、それらは、例えば、他の溶質、例えば、その溶液を等張にさせるのに充分な塩類またはグルコースを含有しうる滅菌水溶液の形で用いることができる。
【０１０１】
経口投与方式に関して、本発明のＥＰＯ組成物は、錠剤、カプセル剤、口中錠、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水性液剤および懸濁剤等の形で用いることができる。錠剤の場合、用いることができる担体には、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩類が含まれる。デンプンのような種々の崩壊剤、およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤は、錠剤中で一般的に用いられる。カプセル形での投与に関して、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。経口使用に水性液剤が必要とされる場合、ある種の甘味剤および／または着香剤を加えることができる。
【０１０２】
本発明の実質的に純粋な免疫グロブリンは、ヒトを含めた哺乳動物などの対象に投与することができる。苦痛の処置における投与に関して、処方する医師または獣医師は、最終的には、一定のヒトまたは動物対象に適当な用量を決定するであろうが、これは、その個体の体重、年齢および応答、更には、その個体の症状の性状および重症度によって異なると考えられうる。
【０１０３】
本発明の実質的に純粋な抗Ｄ免疫グロブリンの場合、その用量当たり投薬量は、ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）については約３００ｕｇおよびＭＩＣＲｈｏＧＡＭ（登録商標）について約５０ｕｇであろうが、それらはそれぞれ、本明細書中上記およびそれぞれの製品文献で考察されたようなガイドラインにしたがっておよび目的で投与される。上述の製品はそれぞれ、処置する医師によって決定される全供給量について複数回用量でもありうる。
【０１０４】
次の実施例は、単に例示の目的で与えられ、本発明の範囲の制限と考えるべきではない。
【０１０５】
【実施例】
実施例１
限外濾過によるウイルス除去（ｖｉｒａｌｌｙ−ｃｌｅａｒｅｄ）ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）の製造は、以下のように進んだ。
【０１０６】
修飾Ｃｏｈｎ精製法（上記に参考文献を記載）を用い、段階「沈澱ＩＩペースト」まで精製したＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン３．２５０ｋｇを、インジェクション用水（ＷＦＩ）、Ｕ．Ｓ．Ｐ．  ９．７５０Ｌに再懸濁し、５℃に冷却した。混合物を（泡を作らず）４時間ボルテックスし、そしてさらに使用するまで４℃で貯蔵した。再懸濁沈澱ＩＩの重量は３．２５０ｋｇだった。
【０１０７】
ＳＩＰ法にしたがい、体積およそ１３．０Ｌの再懸濁沈澱ＩＩ体積に対し、Viresolve-180Ｒモジュール（Millipore Corporation）（１０スタック）を取り付けた。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＣＩＰ／ＳＩＰモジュールの代わりに２つのＢｉｏｍａｘ−５０カセットを取り付けた。Viresolve-180モジュールを塩素で殺菌し（ｓａｎｉｔｉｚｅｄ）、そしてリンスした。ＷＦＩ、Ｕ．Ｓ．Ｐ．でＢｉｏｍａｘ−５０膜を洗い流した。最終浸透洗い流し試料に対し塩化ベンザルコニウム測定（Ｒｏｃｃａｌ）を行い；塩化ベンザルコニウム含量は６ｐｐｍであった。Ｂｉｏｍａｘ−５０カセットに対し、拡散試験を行った；放出速度は、上述のように計算した；放出された総体積は、５分間で２ｍＬであり、そして実際の放出速度は０．４ｃｃ／分だった。
【０１０８】
５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液１９０．０Ｌに対し、Viresolve-180を用いたウイルス除去限外濾過を行った。ウイルス除去再循環タンク（Ｔ−１）に５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液１００Ｌを装填した。先に殺菌してある５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液貯蔵タンクに緩衝液浸透物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を集める間、緩衝液を再循環させた。集めた浸透緩衝液の体積は、２１．７℃で１２３．３Ｌであり、収集は５０分間で完了した。ウイルス除去緩衝液は、約２５℃の室温で貯蔵した。
【０１０９】
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液（実施例２Ａを参照されたい）の洗い流しは、ウイルス除去再循環タンク（Ｔ−１）に緩衝液供給タンクを結びつけることにより、行った。Ｔ−１は、洗い流しのため、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液６０Ｌを装填した。
【０１１０】
沈澱ＩＩ再懸濁は、以下のように処理した。沈澱ＩＩ（３２５０ｇ）を泡立てず、渦（ｖｏｒｔｅｘ）を生成する速度で、完全に懸濁されるまで２０分間混合した。屈折率によるパーセントタンパク質（ｍｇ／ｍＬタンパク質）測定を、沈澱ＩＩ再懸濁物に対し、手で持ったプロトメーター（ｐｒｏｔｏｍｅｔｅｒ）で行い、そして４９ｍｇ／ｍＬ（およそ５．０％タンパク質）であった。
【０１１１】
５．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を達成するための希釈沈澱ＩＩの必要体積を計算した：
【０１１２】
【数１６】
0004255210.tif 000018
【０１１３】
または
【０１１４】
【数１７】
0004255210.tif 000019
【０１１５】
２０ｐｐｍ  ポリソルベート８０を含む１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液（実施例１Ａを参照されたい）の必要体積を、以下の式を用い、計算した：
【０１１６】
【数１８】
0004255210.tif 000020
【０１１７】
または
【０１１８】
【数１９】
0004255210.tif 000021
【０１１９】
希釈沈澱ＩＩ  １３Ｌに緩衝液１１４．４Ｌを添加し、そして泡立てず、渦を生成するのに十分な速度で、４５分間混合した。
【０１２０】
ウイルス除去再循環タンクに希釈沈澱ＩＩ  １００．０Ｌを装填した。使用される１０スタックのViresolve-180モジュールに対し、４０％の供給ポンプ速度で、ウイルス除去再循環タンク（ポンプ第１番）を始動した。ウイルス除去浸透ポンプ流速（ポンプ第２番）は、＜１．６ｐｓｉの最初の膜貫通圧（ＴＭＰ）を維持するため、１０スタックモジュールに対し、０．４５０ＬＰＭ（１０．０％）に傾斜させた（ｒａｍｐｅｄ）。維持された実際の圧は、１．６ｐｓｉだった。産物ポンプ速度（ポンプ第３番）は、コントロールと同じになるように調整した。ウイルス除去再循環タンクの貯留（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）側のタンパク質濃度をモニターすることにより、過程を通じ、ＴＭＰを３．０ｐｓｉ以下に維持した。直列（ｉｎ−ｌｉｎｅ）ＵＶモニターを観察し、そしてタンパク質含量４．５−５．５ｍｇ／ｍＬに対応するように、６．４−７．７吸光度単位の範囲に維持した。
【０１２１】
ウイルス除去タンクからおよそ７５Ｌの浸透物を限外濾過タンク（ＵＦ）に装填した後、限外濾過供給ポンプ（ポンプ第５番）を１０％で始動した。ＵＦ浸透物流速がウイルス除去浸透物の流速と等しくなるまでポンプ速度を（３０％に）増加させ、その後体積を維持するため、２５％にセットした。ＵＦ浸透物流速は０．４  ＬＰＭであり、そしてＶＣ浸透物流速は０．４６０  ＬＰＭだった。維持されたＵＦタンク定体積は、７５．３Ｌだった。ＵＦ供給圧は５．４ｐｓｉであり、ＵＦ浸透圧は０．２ｐｓｉであり、そしてＵＦ貯留圧は０．３ｐｓｉだった。
【０１２２】
タンクが約１５−２０Ｌ含むと直ちに、定体積分離濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をＴ−１で行った。分離濾過は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液の最小限の３回の緩衝液交換で維持された（約６０Ｌの総体積）。分離濾過が完了したとき、ウイルス除去タンクポンプおよびミキサーを止めた。維持されたＶＣ再循環タンク定体積は１６．２Ｌだった。交換された総体積は４９Ｌだった。ウイルス除去分離濾過は、ＵＦ供給ポンプが始動された時間から約４時間で完了した。
【０１２３】
Ｔ−２のバルク（ｂｕｌｋ）を再循環させ、そしてそれにより、ウイルス除去ロットの５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液（ポリソルベート８０を含まない）で、Ｔ−２における定体積分離濾過により濃縮した。バルクをそれによりだいたい再懸濁沈澱ＩＩの元来の出発体積に濃縮した。浸透バルブは完全に開いており、そしてＵＦ供給ポンプ速度は６５％だった；供給圧は３０ｐｓｉ未満に維持され、そして圧差は貯留ループに背圧（ｂａｃｋ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を適用することにより、１４−１７ｐｓｉに維持した。維持されたＵＦ定カラムは２０Ｌであり、そして交換された総緩衝液体積は、１１０Ｌだった。ＵＦ浸透試料に対し、デジタル特定コンダクタンス測定を行うため、Ｔ−２から試料を抜き出した。結果は５．２９×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍであった。体積レベルが一致すると直ちに、ＵＦ浸透を止め、そしてバルクを再循環により混合し、そして１０．５ｍＬの試料を無菌的に除いた。屈折率によるパーセントタンパク質測定を、試料の０．５ｍＬアリコットに対し、手で持ったプロトメーターを用い行った。タンパク質濃度は４．８％だった。
【０１２４】
５％タンパク質含量を達成するためのバルクの必要最終体積を以下のように計算した：
【０１２５】
【数２０】
0004255210.tif 000022
【０１２６】
または
【０１２７】
【数２１】
0004255210.tif 000023
【０１２８】
必要とされる５％タンパク質濃度に一致するように、バルクをさらに最終体積１１．４２４に濃縮した。
【０１２９】
最初のｐＨ測定は、残存試料アリコットに対して行い、まずアリコットを０．９％  ＮａＣｌで１：１０に希釈し、そして０．５Ｎ  ＨＣｌまたは０．５Ｎ  ＮａＯＨの１：１００希釈で６．３−６．４のｐＨに滴定することによった。ｐＨは６．５８だった。
【０１３０】
ｐＨを調整するため、０．９％  ＮａＣｌ中の滴定剤（ｔｉｔｒａｎｔ）０．５Ｎ  ＨＣｌの１．８ｍＬを添加し、そして最終ｐＨは６．３１だった。調整が必要な場合、バルクのｐＨを調整するのに必要とされる未希釈０．５Ｎ試薬の量を以下のように計算する：
【０１３１】
【数２２】
0004255210.tif 000024
【０１３２】
またはこの場合：
【０１３３】
【数２３】
0004255210.tif 000025
【０１３４】
認められている方法にしたがい、Viresolve-180フィルターモジュールに対し、完全性試験を行った。完全性試験バルブは、ｅ１．２でなければならず、そしてモジュールは上述のように塩素で殺菌され、そしてリンスされていなければならない。
【０１３５】
１００Ｘチメロサル溶液の必要体積を計算した：
【０１３６】
【数２４】
0004255210.tif 000026
【０１３７】
または
【０１３８】
【数２５】
0004255210.tif 000027
【０１３９】
【数２６】
0004255210.tif 000028
【０１４０】
【数２７】
0004255210.tif 000029
【０１４１】
バルクを均一に混合しながら９９．７ｍＬの１００Ｘチメロサルを添加した。
【０１４２】
ウイルス除去５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液０．７０Ｌで、計算された必要最終体積にバルクを調整し、そして１０分間混合した。ｐＨ測定のため、バルク産物の１０．５ｍＬアリコットを無菌的に除いた。ｐＨは６．３−６．４でなければならない。実際のｐＨは６．５４だった。ｐＨが述べた範囲の外だったため、アリコットを希釈し、そして先のような許容しうるｐＨに滴定し、そして未希釈０．５Ｎ試薬の必要量を計算し、そして上述のように、混合しながらバルクに添加しなおさなければならない。
【０１４３】
【数２８】
0004255210.tif 000030
【０１４４】
最終ｐＨ６．３５に達するための滴定剤の体積は、１．７ｍＬだった。
【０１４５】
最終タンパク質産物は以下のように許容規準に一致した：
タンパク質＝５．０％
ｐＨ＝６．３
２つの試験（Ａ319）に対するポリソルベート８０は１０４．６および１０６．７であり；平均は１０５．７だった。
【０１４６】
ガスクロマトグラムで測定されるようなメタノール含量は３２．４ｐｐｍだった。
【０１４７】
実施例１Ａ
実施例１に使用した１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液は、以下のように調製した：
調製すべき緩衝液の適切な量は、以下のように計算した：
【０１４８】
【数２９】
0004255210.tif 000031
【０１４９】
【数３０】
0004255210.tif 000032
【０１５０】
必要とされる成分の量を決定し、そして較正された（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）脱発熱物質（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）容器に計り入れた：
【０１５１】
【表２】
0004255210.tif 000033
【０１５２】
全部でおよそ２リットルのインジェクション用水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．で何度かｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ重量測定容器をリンスし、そして各リンスアリコットをバッチに添加した。全部で１０Ｌを添加した。以下の成分量を決定した：
【０１５３】
【表３】
0004255210.tif 000034
【０１５４】
混合物をインジェクション用水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．で体積に希釈し、そして最終量を６０分間混合した。ｐＨを測定した；必要条件は６．３−６．５であり、ｐＨは６．４６だった。必要条件に一致していなければ、必要なｐＨが得られるまで、１．０Ｎ  ＨＣｌまたは１．０Ｎ  ＮａＯＨを添加することが必要である；溶液は各添加後、１５−３０分間混合し、そしてｐＨ測定を確認しなければならない。
【０１５５】
デジタル特定コンダクタンス測定を行った；２５℃の必要条件は、１４．１５から１５．５９×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍである。結果は１５．３８×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍだった。必要条件に一致していなければ、廃棄し、そして新たな試薬を調製することが必要である。
【０１５６】
ポリソルベート８０測定を行った；試験試料は、１５から２４ｐｐｍ  ポリソルベート８０でなければならない。濃度は２２．８ｐｐｍだった。
【０１５７】
実施例２
限外濾過によるウイルス除去ＲｈｏＧＡＭ（登録商標）の製造は、以下の修飾を含み、上述の実施例２のように進んだ。
【０１５８】
修飾Ｃｏｈｎ精製法を用い、段階「沈澱ＩＩペースト」まで精製したＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン６．８０２ｋｇを、インジェクション用水（ＷＦＩ）、Ｕ．Ｓ．Ｐ．  ２０．４０６Ｌに再懸濁し、４℃に冷却した。混合物を（泡を作らず）４時間ボルテックスし、そしてさらに使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１５９】
ＳＩＰ法にしたがい、体積およそ２７．２０８Ｌの再懸濁沈澱ＩＩ体積に対し、Viresolve-180Ｒモジュール（Millipore Corporation）（２０スタック）を取り付けた。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＣＩＰ／ＳＩＰモジュールの代わりに２つのＢｉｏｍａｘ−５０カセットを取り付けた。Viresolve-180モジュールを上述のように塩素で殺菌し、そしてリンスした。ＷＦＩ、Ｕ．Ｓ．Ｐ．でＢｉｏｍａｘ−５０膜を洗い流した。最終浸透洗い流し試料に対し塩化ベンザルコニウム測定（Ｒｏｃｃａｌ）を行い；塩化ベンザルコニウム含量は８ｐｐｍであった。Ｂｉｏｍａｘ−５０カセットに対し、拡散試験を行った；放出速度は、上述のように計算した；放出された総体積は、５分間で２２ｃｃであり、そして実際の放出速度は４．４ｃｃ／分だった。
【０１６０】
５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液２４５Ｌに対し、Viresolve-180を用いたウイルス除去限外濾過を行った。ウイルス除去再循環タンク（Ｔ−１）に５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液２４５Ｌを装填した。先に殺菌してあるオフラインの５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液貯蔵タンクに緩衝液浸透物を集める間、緩衝液を再循環させた。集めた浸透緩衝液の体積は、２１３Ｌだった。ウイルス除去緩衝液は、約６３−７８°Ｆの室温で貯蔵した。
【０１６１】
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液（調製には実施例２Ａを参照されたい）の洗い流しは、ウイルス除去再循環タンク（Ｔ−１）に緩衝液供給タンクを結びつけることにより、行った。Ｔ−１は、洗い流しのため、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液６０Ｌを装填した。
【０１６２】
沈澱ＩＩ再懸濁物は、以下のように処理した。沈澱ＩＩ（６．８０２ｋｇ）を泡立てず、渦を生成する速度で、完全に懸濁されるまで５５分間混合した。屈折率によるパーセントタンパク質（ｍｇ／ｍＬタンパク質）測定を、沈澱ＩＩ再懸濁に対し、手で持ったプロトメーターで行い、そして５９ｍｇ／ｍＬであった。
【０１６３】
５．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を達成するための希釈沈澱ＩＩの必要体積を計算した：
【０１６４】
【数３１】
0004255210.tif 000035
【０１６５】
または
【０１６６】
【数３２】
0004255210.tif 000036
【０１６７】
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液の必要体積を、以下の式にしたがい、計算した：
【０１６８】
【数３３】
0004255210.tif 000037
【０１６９】
または
【０１７０】
【数３４】
0004255210.tif 000038
【０１７１】
タンパク質濃度は約５．９％だった。
【０１７２】
希釈沈澱ＩＩ  ２７．２０８Ｌに緩衝液（２９３．８４６Ｌ）を添加し、そして泡立てず、渦を生成するのに十分な速度で、３０分間混合した。
【０１７３】
ウイルス除去再循環タンクに希釈沈澱ＩＩ  １０７Ｌを装填した。使用される２０スタックのViresolve-180モジュールに対し、８０％の供給ポンプ速度で、ウイルス除去再循環タンク（ポンプ第１番）を始動した。ウイルス除去浸透ポンプ流速（ポンプ第２番）は、＜１．６ｐｓｉの最初の膜貫通圧（ＴＭＰ）を維持するため、２０スタックのモジュールに対し、０．９１ＬＰＭ（２０％）に傾斜させた。維持された実際の圧は、１．２ｐｓｉだった。産物ポンプ速度（ポンプ第３番）は、コントロール速度と同じになるように調整した。ウイルス除去再循環タンクの貯留側のタンパク質濃度をモニターすることにより、過程を通じ、ＴＭＰを＜３．０ｐｓｉに維持した。直列ＵＶモニターを観察し、そしてタンパク質含量４．５−５．５ｍｇ／ｍＬに対応するように、６．４−７．７吸光度単位の範囲に維持した。
【０１７４】
ウイルス除去タンクからおよそ７５Ｌの浸透物を限外濾過タンク（ＵＦ）に装填した後、限外濾過供給ポンプ（ポンプ第５番）を１０％で始動した。ＵＦ浸透物流速がウイルス除去浸透物の流速と等しくなるまでポンプ速度を（２５％に）増加させ、その後体積を維持するため、２５％にセットした。ＵＦ浸透物流速は０．９１  ＬＰＭであり、そしてＶＣ浸透物流速は０．９１  ＬＰＭだった。維持されたＵＦタンク定体積は、１５２Ｌだった。ＵＦ供給圧は４．０ｐｓｉであり、ＵＦ浸透圧は０．１ｐｓｉであり、そしてＵＦ貯留圧は０．７ｐｓｉだった。
【０１７５】
タンクが約１５−２０Ｌ含むと直ちに、定体積分離濾過をＴ−１で行った。分離濾過は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  グリシン緩衝液の最小限の３回の緩衝液交換で維持された（約６０Ｌの総体積）。分離濾過が完了したとき、ウイルス除去タンクポンプおよびミキサーを止めた。維持されたＶＣ再循環タンク定体積は１５Ｌだった。交換された総緩衝液体積は４５Ｌだった。
【０１７６】
Ｔ−２のバルクを再循環させ、そしてそれにより、ウイルス除去ロットの５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液で、Ｔ−２における定体積分離濾過により濃縮した。バルクをそれによりだいたい再懸濁沈澱ＩＩの元来の出発体積に濃縮した。浸透バルブは完全に開いており、そしてＵＦ供給ポンプ速度は７０％だった；供給圧は３０ｐｓｉ未満に維持され、そして圧差は貯留ループに背圧を適用することにより、１４−１７ｐｓｉに維持した。維持されたＵＦ定カラムは２２Ｌであり、そして交換された総緩衝液体積は、１２１．２Ｌだった。ＵＦ浸透試料に対し、デジタル特定コンダクタンス測定を行うため、Ｔ−２から試料を抜き出した。結果は５．４７×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍであった。体積レベルが一致すると直ちに、ＵＦ浸透を止め、そしてバルクを再循環により混合し、そして１０．５ｍＬの試料を無菌的に除いた。屈折率による、パーセントタンパク質測定を、試料の０．５ｍＬアリコットに対し、手で持ったプロトメーターで行った。タンパク質濃度は７．９％だった。
【０１７７】
Ｔ−２のバルクを仮バルク容器に除き、そして全容器を重量測定した（総重量）。バルクをＴ−２に戻し、そして空の仮バルク容器を重量測定した：
【０１７８】
【数３５】
0004255210.tif 000039
【０１７９】
または
【０１８０】
【数３６】
0004255210.tif 000040
【０１８１】
５％タンパク質含量を達成するためのバルクの必要最終体積を以下のように計算した：
【０１８２】
【数３７】
0004255210.tif 000041
【０１８３】
または
【０１８４】
【数３８】
0004255210.tif 000042
【０１８５】
最初のｐＨ測定は、残存試料アリコットに対して行い、まずアリコットを０．９％  ＮａＣｌで１：１０に希釈し、そして０．５Ｎ  ＨＣｌまたは０．５Ｎ  ＮａＯＨの１：１００希釈で６．３−６．４のｐＨに滴定することによった。ｐＨは６．５５だった。
【０１８６】
ｐＨを調整するため、０．９％  ＮａＣｌ中の滴定剤０．５Ｎ  ＨＣｌの１．３５ｍＬを添加し、そして最終ｐＨは６．３５だった。調整が必要な場合、バルクのｐＨを調整するのに必要とされる未希釈０．５Ｎ試薬の量を以下のように計算する：
【０１８７】
【数３９】
0004255210.tif 000043
【０１８８】
またはこの場合：
【０１８９】
【数４０】
0004255210.tif 000044
【０１９０】
認められている方法にしたがい、Viresolve-180フィルターモジュールに対し、完全性試験を行った。完全性試験バルブは、１．２以上でなければならず、そしてモジュールは上述のように塩素で殺菌され、そしてリンスされていなければならない。
【０１９１】
１００Ｘチメロサル溶液の必要体積を計算した：
【０１９２】
【数４１】
0004255210.tif 000045
【０１９３】
または
【０１９４】
【数４２】
0004255210.tif 000046
【０１９５】
バルクを均一に混合しながら３４１ｍＬの１００Ｘチメロサルを添加した。ウイルス除去５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液０．８０１Ｌで、計算された必要最終体積にバルクを調整し、そして１０分間混合した。
【０１９６】
ｐＨ測定のため、バルク産物の１０．５ｍＬアリコットを無菌的に除いた。ｐＨは６．３−６．４でなければならない。２つの読み取りに対する実際のｐＨは６．３８および６．３４５だった。
【０１９７】
最終タンパク質産物は以下のように許容規準に一致した：
タンパク質＝５．３％
ｐＨ＝上述
ガスクロマトグラムで測定されるようなメタノール含量は５３．９ｐｐｍだった。２つの試験に関しポリソルベート８０＝１０１．７ｐｐｍ、１０２．２ｐｐｍ；平均は１０１．９ｐｐｍだった。
【０１９８】
実施例２Ａ
実施例２に使用した１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液は、以下のように調製した：
調製すべき緩衝液の適切な量は、以下のように計算した：
【０１９９】
【数４３】
0004255210.tif 000047
【０２００】
【数４４】
0004255210.tif 000048
【０２０１】
必要とされる成分の量を決定し、そして較正された脱発熱物質容器に計り入れた：
【０２０２】
【表４】
0004255210.tif 000049
【０２０３】
全部でおよそ２リットルのインジェクション用水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．で何度かｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ重量測定容器をリンスし、そして各リンスアリコットをバッチに添加し、そしてｑｓを６０４．１６Ｌにした。以下の成分量を決定した：
【０２０４】
【表５】
0004255210.tif 000050
【０２０５】
混合物をインジェクション用水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．で体積に希釈し、そして最終量を６０分間混合した。ｐＨを測定した；必要条件は６．３−６．５であり、ｐＨは６．３８だった。必要条件に一致していなければ、必要なｐＨが得られるまで、１．０Ｎ  ＨＣｌまたは１．０Ｎ  ＮａＯＨを添加することが必要である；溶液は各添加後、１５−３０分間混合し、そしてｐＨ測定を確認しなければならない。
【０２０６】
デジタル特定コンダクタンス測定を行った；２５℃の必要条件は、１４．１５から１５．５９×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍである。結果は１５．１８×１０-3  ｍｈｏｓ／ｃｍだった。必要条件に一致していなければ、廃棄し、そして新たな試薬を調製することが必要である。
【０２０７】
ポリソルベート８０測定を行った；試験試料は、１５から２４ｐｐｍ  ポリソルベート８０でなければならない。濃度は１９．５ｐｐｍだった。
【０２０８】
比較実施例
ポリソルベート８０対ポリソルベート８０なし
比較実施例１Ａ−ポリソルベート８０を含む
沈澱ＩＩペースト（１０ｇ）をＷＦＩ  ３０ｍＬに懸濁した。こうした再懸濁ペーストを最終体積４００ｍＬになるよう、１００ｐｐｍ（０．１ｇ／Ｌ）ポリソルベート８０を含む、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液（希釈１０Ｘ）３６０ｍＬと混合した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘポンプ吸水プラットホーム（１／３平方フィートモジュール）を通る浸透物流を、２１．８ｍＬ／分で作動させ、一方、流動は０．０６ｍＬ／分／平方ｃｍだった。作動３９分後、膜貫通圧は１．３ｐｓｉ未満のままであり、ふるい係数は８０％より大きかった。ポリソルベート８０を含む高イオン強度緩衝系を用い、ＩｇＧポリクローナル抗Ｄ成分の自由通過を保証した。
【０２０９】
比較実施例１Ｂ−ポリソルベート８０を含まない
沈澱ＩＩペースト（１０ｇ）をＷＦＩ  ３０ｍＬに懸濁した。こうした再懸濁ペースト（４０ｍＬ）を最終体積４００ｍＬになるよう、ポリソルベート８０を含まない、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液（希釈１０Ｘ）３６０ｍＬと混合した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘポンプ吸水プラットホーム（１／３平方フィートモジュール）を通る浸透物流を、２１．８ｍＬ／分で作動させ、一方、流動は０．０６ｍＬ／分／平方ｃｍだった。作動３９分後、膜貫通圧は６．１ｐｓｉであり、ふるい係数は急速におよそ６０％に減少した。ポリソルベート８０を含む高イオン強度緩衝系を用い、ＩｇＧポリクローナル抗Ｄ成分の自由通過を保証した。
【０２１０】
本比較研究の結果は、高イオン強度緩衝系中にポリソルベート８０が存在する必要性を示す。
【０２１１】
比較実施例２
低イオン強度対高イオン強度緩衝液
比較実施例２Ａ−低イオン強度緩衝液
沈澱ＩＩペースト（１．３５ｇ）をＷＦＩ  ４．５ｍＬに懸濁した。こうした再懸濁ペースト（５．０ｍＬ）を最終体積５０ｍＬになるよう０．１ｇ／Ｌ  ポリソルベート８０を含む、５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液４５ｍＬと混合した。Viresolve-180小面積モジュール（ＳＡＭ、１０平方ｃｍ）（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通る浸透物流を、１５．６ｍＬ／分の横断流（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ）で作動させ、一方、流動は０．６４ｍＬ／分／平方ｃｍだった。作動２８分後、ふるい係数は急速におよそ３１％に減少した。
【０２１２】
比較実施例２Ｂ−高イオン強度緩衝液
比較実施例２Ａ由来の１００ｐｐｍ（０．０１％）ポリソルベート８０を含む５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液中の再懸濁沈澱ＩＩペースト（４６．０ｍＬ）に、０．２９ｇのＮａＣｌを加え、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液にしたものを使用した。Viresolve-180小面積モジュール（ＳＡＭ、１０平方ｃｍ）（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通る浸透物流を、１５．６ｍＬ／分で作動させ、一方、流動は０．６４ｍＬ／分／平方ｃｍだった。作動４０分後、ふるい係数は８６％だった。
【０２１３】
比較実施例２Ａおよび２Ｂに開示されるような、低対高イオン強度緩衝系の本比較研究の結果は、処理中の緩衝系のイオン濃度は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ膜を通じたタンパク質の通過点に対し、かなり重要でそして有意な影響を有することを立証する。
【０２１４】
比較実施例３
ＷＦＩ、低イオン強度に溶解された、凍結乾燥再沈澱ＩＩペースト産物
まとめ
ヒトＩｇＧ産物をＶｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０  １／３  ｆｔ2モジュールで試験し、本モジュールでの膜の性能特性を決定した。２種の実験を行った；流動振幅（ｆｌｕｘ  ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ）および体積減少である。最初の試験は、流動の機能として、タンパク質ふるいを測定することにより、基本的膜データを提供した。流動振幅からのデータは、処理作動を模倣するため、体積減少実験に用いた。インジェクション用水（ＷＦＩ）中の産物に対する流動振幅中、タンパク質通過は見られなかった。以下の実験ではグリシン緩衝液（０．０１％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を含む）中の産物を利用した。本溶液を用い、８３．３％の体積増加で、８９．１％のタンパク質量回収が達成された。
【０２１５】
目的
本実験は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０モジュールを通じ処理した際の、ふるい係数および産物のタンパク質量回収を評価するため、行った。これらの実験から生成されたデータは、系作動条件を決定するのに用いた。
【０２１６】
実験
最初の実験は、ＷＦＩに溶解されている産物を用い、４℃の低温室で行った。続く実験はすべて、１／３  ｆｔ2  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０モジュールを用い、室温で行った。総タンパク質濃度はすべて、２８０  ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取ることにより、測定した。試料はすべて、産物緩衝液で希釈し、そして該緩衝液に対し読み取った。
【０２１７】
流動振幅
１）系は、ロット＃Ｋ２ＥＭ０５３６のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０モジュール＃００１０（Millipore Corporation、マサチューセッツ州ベッドフォード）を用い、図３Ａに示されるように組み立てた。
２）およそ１％タンパク質濃度の、ＷＦＩ中で凍結乾燥された沈澱ＩＩ凍結乾燥粉末５００ｍＬを、１０００ｍＬ容量供給バッグにポンプで入れた。産物の試料を取り、最初のタンパク質濃度を測定した。バッグを系につなぎ、そして配管を準備し、空気を除いた。
３）横断流速５００ｍＬ／分で、産物を３０分間再循環させた。（浸透ポンプは止めてあった。）
４）貯留ポートから試料１ｍＬを抜き取り、有意なタンパク質吸収が起こっているか決定した（Ｒ０）。注：取った試料はすべて、他に言及されない限り１ｍＬだった。
５）流速１．０９ｍＬ／分で浸透物流を開始した（Ｊ＝０．００３ｍＬ／分／ｃｍ2）。浸透物流は、３０８ＭＣ／ＡポンプヘッドのＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ５０３Ｕポンプにより調節した。産物は、３５分間、供給ループに再循環させた。
６）３５分間の再循環の後、１つの貯留物（Ｒ１）および１つの浸透物（Ｐ１）試料を集めた。この時点で、処理を低温室からのぞき、そして室温に置いた。同じ流速で、再循環を３０分間続けた。
７）室温での３０分間の再循環の後、１つの貯留物（Ｒ２）および１つの浸透物（Ｐ２）を集めた。
８）その後、横断流をおよそ６００ｍＬ／分に増加させ、そして１５分間再循環させた。１つの貯留物（Ｒ３）および１つの浸透物（Ｐ３）試料を集めた。
９）産物を産物緩衝液で０．５％に希釈した。横断流速および浸透物流速は、一定のままだった。２０分間の再循環の後、１つの貯留物（Ｒ４）および１つの浸透物（Ｐ４）を集めた。
１０）２つのさらなる浸透物流速を試験した。０．００５ｍＬ／分／ｃｍ2（１．８２ｍＬ／分）および０．０１ｍＬ／分／ｃｍ2（３．６３ｍＬ／分）である。各々、少なくとも３０分間再循環させた。
【０２１８】
組み合わせた流動振幅および体積減少
グリシン緩衝液に溶解したヒトＩｇＧに対し、第二の実験を行った。
１）系は、ロット＃Ｋ２ＥＭ０５３６のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０モジュール＃０００９を用い、図３Ａに示されるように組み立てた。
２）およそ０．１％の産物９９０ｍＬを、１  Ｌ容量供給バッグにポンプで入れた。試料１ｍＬを抜き取り、実際のタンパク質濃度を測定した。注：取った試料はすべて、他に言及されない限り１ｍＬだった。バッグを系につなぎ、そして配管を準備し、空気を除いた。
３）横断流速５０ｍＬ／分で、産物を３０分間再循環させた。（浸透ポンプは止めてあった）。横断流速は、５０１ＲＬポンプヘッドのＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ５０３Ｕポンプにより調節した。再循環後、試料（Ｒ０）を集め、タンパク質吸収に関し、試験した。
４）４つの浸透物流速を試験した。０．００３、０．００５、０．０３０．および０．０５０ｍＬ／分／ｃｍ2である。産物は、各浸透物流速で、３０分間再循環させた。横断流は、０．０５ｍＬ／分／ｃｍ2流速になるように６００ｍＬ／分に増加させた。３０分後、１つの浸透物および１つの貯留物試料を抜き取った。
５）実験の流動振幅部分が終わった後、浸透ポンプを止めた。系を図３Ｂに見られるように、再形成した。最初の試料１５ｍＬを抜き取った。
６）産物をその後、０．０５ｍＬ／分／ｃｍ2（１８．２ｍＬ／分）の流動で処理した。注：測定された流動は０．０４３ｍＬ／分／ｃｍ2（１５．７ｍＬ／分）だった。
７）処理産物１００、２５０、および５００ｍＬで貯留物および浸透物試料を集めた。
８）ＩｇＧ溶液６４５ｍＬの処理の後、産物緩衝液での分離濾過（浸透物流速で）を開始した。この分離濾過は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０モジュールを通じ処理される総量５００ｍＬに関し、続けた。処理された７４５、８９５、および１１４５ｍＬで貯留物および浸透物試料を集めた。
９）残存溶液を体積減少モードで系の停止体積まで下げるよう処理した。総処理体積の１２４５、および１４７５ｍＬで貯留物および浸透物試料を取った。
１０）最終分離濾過段階を行い、停止体積に濃縮されている産物を回収した。分離濾過を、全部で４つの５０ｍＬ体積に関し、続けた。各分離濾過体積は別個に集めた。
１１）プールされたバルク浸透物の試料およびプールされた分離濾過体積の各々からの試料を集めた。最終貯留物試料もまた、実験終了時に抜き取り、供給バッグに残存する産物の濃度を測定した。
【０２１９】
結果
流動振幅
最初の流動振幅実験中、産物通過は観察されなかった。産物溶解性を改善するため、該処理は室温で（最初は４℃で）行った。産物通過の増加は見られなかった。タンパク質通過を誘導する他の方法には、横断流を上昇させること、産物を希釈することおよびタンパク質通過を強いるため、浸透物流速を増加させることが含まれた。すべての試験条件に関し、ふるい係数はゼロのままだった。
【０２２０】
最初の産物試料をＷＦＩに懸濁した。溶液は、濁って見え、そして溶解性に問題があることが疑われた。その後、さらなる産物をグリシン緩衝液に溶解した；本溶液を、残りの試験に用いた。
【０２２１】
組み合わせた流動振幅および体積減少
表６はグリシン緩衝液に懸濁されているＩｇＧに対し行った流動振幅実験の結果を示す。本表は、およそ０．１％総タンパク質の産物に対し集めたデータを表す。本表は、吸光単位（ＡＵ）に換算した産物濃度値を示す。希釈因子は、値の中に計算されている。
【０２２２】
最初の濃度：１．６８  ＡＵ
Ｒ０濃度：１．８１  ＡＵ
【０２２３】
【表６】
0004255210.tif 000051
【０２２４】
グリシン緩衝液中のＩｇＧに関するふるい係数対流動曲線は、図４にプロットされている。
【０２２５】
以下は、体積減少実験からの産物濃度データ（ＡＵ）である。
【０２２６】
最初の処理体積：９６３ｍＬ
最初の濃度：〜０．１％（１．８０  ＡＵ）総タンパク質
横断流速：６００ｍＬ／分
測定された流動：０．０４３ｍＬ／分／ｃｍ2
（流速：１５．７ｍＬ／分）
バルク１浸透物体積：６４５ｍＬ
処理分離濾過体積：５００ｍＬ
バルク２浸透物体積：３３０ｍＬ
表７は、体積減少実験中に集めたタンパク質濃度およびふるい係数データを提供した。本表は、吸光単位（ＡＵ）に換算した産物濃度値を示す。希釈因子は、値の中に計算されている。
【０２２７】
【表７】
0004255210.tif 000052
【０２２８】
表８は、体積減少実験の各段階からの総タンパク質濃度データを提供する。希釈因子は、値の中に計算されている。
【０２２９】
【表８】
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【０２３０】
体積減少実験に関するふるい係数対濾過体積曲線は、図５にプロットされている。
【０２３１】
考察
タンパク質量回収
【０２３２】
【数４５】
0004255210.tif 000054
【０２３３】
【表９】
0004255210.tif 000055
【０２３４】
貯留物試料の総タンパク質量：２０．６  ＡＵ
浸透物試料の総タンパク質量：６．２  ＡＵ
【０２３５】
【数４６】
0004255210.tif 000056
【０２３６】
【数４７】
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【０２３７】
【数４８】
0004255210.tif 000058
【０２３８】
【数４９】
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【０２３９】
【数５０】
0004255210.tif 000060
【０２４０】
分離濾過はより大きいタンパク質量回収を提供したが、産物体積の増加および産物希釈を生じる。各分離濾過段階のパーセント体積増加は以下の通りである：
処理分離濾過：５５．７％体積増加
１最終分離濾過：６１．３％体積増加
２最終分離濾過：６７．６％体積増加
３最終分離濾過：７２．８％体積増加
４最終分離濾過：８３．３％体積増加
実験により生じるタンパク質ふるいデータに基づき、以下の情報が得られた：
１）Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０に対するタンパク質吸収は、無視できるようである。
２）ＷＦＩに懸濁した産物溶液に見られる濁りに加え、本溶液ではタンパク質通過がないという事実は、本産物およびＷＦＩには安定性の問題があることを示す。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ膜を通じたタンパク質通過は、グリシン緩衝液に懸濁されたタンパク質で達成された。
３）ふるい係数は、処理中、タンパク質が膜の上流側に濃縮されるにつれ、規則的に下降した。
４）処理終了時の低いふるい係数（〜２５％）は、膜表面で有意なタンパク質分極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が発生していることを示す。
【０２４１】
結論
２つの異なる緩衝液：ＷＦＩ、およびグリシン緩衝液に懸濁されているヒトＩｇＧ産物を用い、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０膜で、実行可能性研究を行った。ＷＦＩに懸濁した産物を用いると、タンパク質通過は見られなかった。出発溶液に関連し、わずかな濁りがあり、該タンパク質が溶液中で完全でないことを示した。これは、膜を直ちに分極化させ、タンパク質通過に対し膜を遮断するであろう。流動振幅の結果、これが実際起こっていたことが示唆される；未溶解タンパク質が膜を隠し、タンパク質通過を妨げた。
【０２４２】
グリシン緩衝液中の産物を含む溶液の透明度には顕著な相違があった；本溶液は濁っていなかった。本溶液に関する流動振幅は、試験されたすべての流速（０．００３ｍＬ／分／ｃｍ2から０．５ｍＬ／分／ｃｍ2）に対し、およそ５０％のふるい係数を提供した。グリシン緩衝液中の産物濃度は、およそ０．１％（総タンパク質）だった。
【０２４３】
０．１％溶液を用い、体積減少実験を行った。８３．３％体積増加で、８９．１％の産物回収が達成された。処理中の膜の上流側でのタンパク質濃縮を制限するため、処理中の分離濾過段階を利用した。最終分離濾過段階もまた使用し、系の停止体積中のタンパク質を回収した。
【０２４４】
ふるい係数は、処理中に、最初のふるい係数５７．８％から最終ふるい係数２６．９％に、規則的に下降した。これは、処理中に、実質的なタンパク質膜が膜上に作られることを示す。処理中の分離濾過は、ふるい係数の減少を遅らせたが、該係数を増加させまたは安定して維持しなかった。最終分離濾過段階は、停止体積および膜表面からのタンパク質をいくらか回収した。これらの最終分離濾過体積のタンパク質濃度は、最初の出発溶液のおよそ２５から５０％だった；これは、分離濾過の新鮮な緩衝液洗浄が、膜のタンパク質分極層をゆっくりと除去することを示す。分離濾過中、膜からより多くの産物がはずれることが望ましい。これは産物希釈および処理時間を減少させる。最終分離濾過を延長すると、より多くのタンパク質が回収されるであろうが、より大きい産物希釈を生じるであろう。
【０２４５】
試験されたような産物は、溶液中に５−１２％の二量体を有した。これらの二量体は、活性産物からなる。二量体の存在は、疑問の余地なく膜表面上のタンパク質分極を生じるであろうし、そして二量体が損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ままであれば、上流に捉えられるであろう。
【０２４６】
本比較実施例は、凍結乾燥出発成分および低イオン強度緩衝液を利用する条件下で、より低いふるい係数が得られたことを示し、非常に希釈された条件でもタンパク質は、５０％より低い効率でフィルターを通過することが立証された。実施例１および２の最適化された許可しうる過程に提供されるのと同じ時間で本成分を処理するには、より大きいフィルター面積を含む装置が必要とされるであろう。
【０２４７】
当業者には、前述の説明および実施例は本発明の実施の例示であり、そしていかなる点でも限定しないことが理解されるであろう。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に示される詳細の変動を作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、抗Ｒｈグロブリンを得るためのヒト血漿の分別方法を示すフローシートである。
【図２】  図２は、本発明のウイルスクリアランス法で用いられる Viresolve／限外濾過システムを示すスキーム図である。図２は、製品保持タンクを１として、ウイルスクリアランスフィルターホルダーを２とし、限外濾過フィルターホルダーを３とし、５０ｍＭ  ＮａＣｌ−グリシン緩衝液貯蔵タンクを４とし、Ｔ−１再循環タンクを５とし、Ｔ−２  ＵＦ再循環タンクを６とし、Ｐ１ Viresolve １８０供給ポンプを７とし、Viresolve １８０パーミエートポンプを８とし、ＵＶメーターＩを９とし、ＵＦ供給ポンプを１０、ＵＦパーミエートを１１、試料入口を１２、製品回収・インライン滅菌濾過を１３として示す。
【図３】  図３Ａは、低イオン強度緩衝液およびポリソルベート−８０を含む比較例３について組み立てられる Viresolve−１８０システムのスキーム図である。
図３Ｂは、比較例３のフラックス迂回部の終結後に再配置される Viresolve １８０システムのスキーム図である。
【図４】  図４は、比較例３のフラックス迂回実験における低イオン強度緩衝液中の免疫グロブリンＧに関する篩分け係数対フラックスを示すグラフである。
【図５】  図５は、比較例３の容量減少実験における低イオン強度緩衝液中の免疫グロブリンＧに関する篩分け係数対濾過容量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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