(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＡＣＣにＮo.96021514で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株またはＥＣＡＣＣにＮo.96021513で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株から得られうる、Ｇ型免疫グロブリン、Ｍ型免疫グロブリン及びＡ型免疫グロブリンより選択され、メチシリン耐性系を含む黄色ブドウ球菌に特異的なモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＥＣＡＣＣにＮo.96021514で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株から得られうる請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＥＣＡＣＣにＮo.96021513で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株から得られうる請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＥＣＡＣＣにＮo.96021514で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株、Ｎo.96021513で1996年2月15日に寄託したハイブリドーマ細胞株、またはこれらの細胞の子孫のハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
少なくとも一の請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する、メチシリン耐性系を含む黄色ブドウ球菌の検出のための試薬。
【請求項６】
抗体が支持体またはマーカーに付着または共役されていることを特徴とする請求項５記載の試薬。
【請求項７】
支持体またはマーカーに付着または共役されるフィブリノーゲンをさらに含む、請求項５または請求項６記載の試薬。
【請求項８】
黄色ブドウ球菌プロテインＡによって認識され、支持体またはマーカーに付着、共役される１以上の抗体を更に含む請求項５から請求項７のいずれかに記載の試薬。
【請求項９】
生物学的試料における、メチシリン耐性系を含む黄色ブドウ球菌の検出方法において、
−上記の試料は、請求項５から請求項８のいずれかに記載の試薬に接触せしめられ、
−凝集体の生成が観察される、
検出方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は黄色ブドウ球菌、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出に関連するものである。
“検出”は、生物学的分析物、本発明の場合は、黄色ブドウ球菌を、定性及び／または定量的に同定し、もしくは濃縮、精製または分離ことを可能にする全ての手法を総合的に意味するものと理解される。
EP-A-0 323 331によると、メチシリン耐性系を含む黄色ブドウ球菌の検出試薬には、すでに知られており、該試薬は：
−フィブリノーゲン、
−黄色ブドウ球菌のプロテインAによって認識される抗体、
−5型膜血清型黄色ブドウ球菌を特異的に認識する抗体、または8型膜血清型黄色ブドウ球菌を特異的に認識する抗体、及び好ましくは、これらの２抗体の混合物、
を含む。
本発明は、多様な膜血清型黄色ブドウ球菌系、特にメチシリン耐性系に共通の抗原決定基を特異的に認識するモノクロナールまたはポリクローナル抗体を提供する。この抗体は、G型免疫グロブリン、M型免疫グロブリン及びA型免疫グロブリンから選択される。
本発明に係る抗体の特に有利な用途は、メチシリン耐性系を含む黄色ブドウ球菌を特異的に検出するための試薬に含有せしめることである。EP-A-0 323 331に比較し、本発明の試薬の感受性は、膜血清型に対する認識力がより大きいため優れている。
従って、本発明においては：
−膜血清型の多様な黄色ブドウ球菌系、特にメチシリン耐性系に共通する抗原決定基に特異的なモノクロナールまたはポリクローナル抗体であって、上記の抗体は、G型免疫グロブリン、M型免疫グロブリン及びA型免疫グロブリンから選択され；該抗体が、同時に上記の少なくとも２つの異なる膜血清型を特異的に認識するもので；好ましくは、これらの抗体がG型免疫グロブリン及びM型免疫グロブリンから選択されるものであり；
−上記黄色ブドウ球菌系の少なくとも5型膜血清型及び8型膜血清型を特異的に認識する上述のモノクロナールまたはポリクローナル抗体、
−Galfeら（Nature, 266, 522-550,（1977））が記載の手法に従い、融合のための初期細胞株として、ミエローマ株SP2/0-Ag14（ATCC CRL1581）を用いて得られたモノクロナール抗体；ここで融合は、5型黄色ブドウ球菌系で免疫した、BALB/C系を種として、BALB/CBYJICO系とかけ合わせたマウス（IFFA Credo社により市販）の脾臓細胞を用い、通常の手法によった；得られたクローンは免疫的手法でスクリーニングし（ELISA）；選抜されたクローンは腹腔内経路で、事前に用意した腹水産生用のマウスに再注入し；個々のモノクロナール抗体は、ラテックス粒子の感作に用いられ、黄色ブドウ球菌の多糖類の莢膜の特異的な認識性についての試験に用いられた；P2G7A1E5及びP6D8D12E1と称されるモノクロナール抗体が、種々の膜血清型特に5及び8型に共通する抗原決定基を特異的に認識するために各々選ばれた；
−ECACCに1996年2月15日にNo.96021514で寄託したハイブリドーマ細胞株から入手可能なまたは入手されたモノクロナール抗体；
−ECACCに1996年2月15日にNo.96021513で寄託したハイブリドーマ細胞株から入手可能なまたは入手されたモノクロナール抗体；
−ハイブリドーマ細胞株は、1996年2月15日にNo.96021514で寄託した、または1996年2月15日にNo.96021514で寄託したもの、またはその他任意のハイブリドーマ細胞株、例えば、これらの細胞の子孫；細胞株並びに任意の誘導細胞株、すなわち、本発明記載のものと同じ免疫学的特徴を示す抗体を産生し得る細胞株が請求される；
−黄色ブドウ球菌、特にメチシリン耐性系の検出のための特異的な試薬であって、多様な膜血清型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌系の種々の膜血清型に共通の少なくとも１つの抗原決定基を特異的に認識する少なくとも１つの抗体を有し、該試薬は、上述したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を少なくとも１つ含み；上記抗体は支持体またはマーカーに付着または共役等ができ；モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上述の抗体並びに後者に交差特異性を示す任意の抗体を意味する；
−黄色ブドウ球菌、特に、メチシリン耐性系の検出に特異的な試薬で、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲンに基づく化合物を含み、フィブリノーゲンに対する黄色ブドウ球菌親和性因子を認識する能力を有し、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン化合物が支持体またはマーカーに付着もしくは共役等をすることができる；
−黄色ブドウ球菌、特にメチシリン耐性系の検出に特異的な試薬で、黄色ブドウ球菌プロテインAによって認識される免疫グロブリンまたはそれらのFc断片を含み、支持体またはマーカーに付着もしくは共役等がなされるもの。
全ての種類の支持体またはマーカーが、本発明において考えられる。
懸濁した粒子が用いられる。これらの粒子は、特にラテックス粒子、例えば、ポリスチレンビーズまたは同様の粒子で、好ましくは、2μm未満のサイズを持つ、例をあげると、RHONE−POULENC社市販のエスタポア粒子で、
例えば、
−粒径が0.8μmのポリスチレンK080粒子、
−粒径が0.8μmのポリスチレンK109粒子、
−粒径が0.8μmのカルボキシル基を有するポリスチレン粒子であるPSI480。
磁性ゲル、例えば磁性粒子を含むポリアクリルアミド及び／またはアガロースゲルを用いることもできる。加えて、IBF社のウルトロゲル及びマグノゲル（商標）のようなゲルを用いることも可能である。
本発明に係る試薬に用いられる支持体は、赤血球細胞、例えばヒツジからのものも用いることができる。
支持体は、プレート、錐体、細長板の形、例えば、ポリスチレン製、またはスチレンベース共重合体製のもの、ガラス管等でよい。
抗体及びフィブリノーゲンの懸濁液中の粒子、特に、ラテックスへの付着は、下記の手法によって達成できる。
−受動的に吸着するが、抗体及びフィブリノーゲンを含む溶液におけるラテックス粒子のインキュベーションの間に、自発的付着が可能となり；インキュベーションは、例えば、20℃で約２時間で十分である；
−共有結合により、ラテックス粒子上存在する反応基と抗体との間に共有結合を形成することにより付着が達成される。例えば、カルボジイミドを用い共有結合が起こり、共有結合ができる。
支持体が赤血球細胞からなるときは、これらの細胞は、フィブリノーゲンまたはその他任意の適切な分子によって、通常の手法に従って、予め感作させてもよい。
ラテックス粒子へ付着される抗体の濃度は、個々の抗体について既知の方法により決定されるが、通常は溶液においてラテックス1ml当たり0.1μgないし100μgの間の抗体タンパク質である。
本発明の試薬にあっては、抗体及びフィブリノーゲンが、単一の粒子懸濁液、例えばラテックスに付着でき、または懸濁液のそれぞれ異なる粒子、例えば、赤血球とラテックス粒子、または次いで混合されて試薬をなす多様なラテックスに付着される。
マーカーは、生物学的または化学的分子、例えば酵素、ハプテン、オリゴヌクレオチド、放射性エレメントなどであり得る。
本発明の他の主題は、次の通りである。
−黄色ブドウ球菌プロテインAへ付着し得るFc断片を含む免疫グロブリン型抗体及び／または上記菌のフィブリノーゲンに対する親和性因子を持ち、反応性であるフィブリノゲンまたはその誘導体に基づく他の化合物を含み、該試薬は、さらに、多様な膜血清型黄色ブドウ球菌、特に５型及び８型の血清型を特異的に認識できるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体を少なくとも１つ含む。
−生物学的試料中における黄色ブドウ球菌、特にメチシリン耐性系を検出する方法で、次の特徴を有する方法。
*上述の検出用試薬は入手可能で、
*上記試料は上記試薬に接触させられ、
*凝集体の形成が観察される。
本発明の主題の特徴及び有利な主題は、下記の実施例１〜３によって述べられ例証される。
実施例１：本発明の試薬の組成物をSLIDEX STAPH PLUSと称す。
黄色ブドウ球菌プロテインAへ付着し得るFc断片を含む免疫グロブリン型抗体及び／または上記菌のフィブリノーゲンに対する親和性因子を持ち、反応性であるフィブリノゲンまたはその誘導体に基づく他の化合物を含み、該試薬は、さらに、多様な膜血清型黄色ブドウ球菌、特に５型及び８型の血清型を特異的に認識できるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体を少なくとも１つ含む。
実施例２：実施例１の試薬に含まれている抗体の産生方法
a）黄色ブドウ球菌系で免疫したマウスからの脾臓細胞の調製
*材料：
CIP103313 ５型膜血清型及びCIP108314 ８型膜血清型黄色ブドウ球菌
培地：コロンビア（Columbia）寒天+5％ヒツジの血液
*方法
−80℃に保存された系統をヒツジ血液寒天で２回培養した。
コロニーを生理食塩水で懸濁し、3×109微生物/mlの濃度にした。
不活性化方法：70℃で1時間、不活性化した。
ワクチンは、新鮮に調製した。
*培養細胞のオリジン：
−５型膜血清型黄色ブドウ球菌系
−動物の免疫化：BALB/C系を種として、BALB/CBYJICO系とかけ合わせた雌のマウス（IFFA Credoにより提供）
−ミエローマ株SP2/0-AG14。
*免疫化プロトコル：
J=0             3×108微生物＋CFA(1:1)        IP
J=7.14          3×108微生物                  IP
J=28.76         3×108微生物                  IP
J=204    9％NaClにブースター3×108微生物      IV
J=207    93年1月29日融合    マウスNo.1シリーズ010
*懸濁液の中で培養
*倍数性：異数体
*培養条件：
−基礎培地：Iscove’s Modified Dulbecco培地
炭酸水素ナトリウム（3024mg/l）、10％
ウシ胎児血清（FCS）、pH6.7から7.3、温度25℃
−添加試薬：インシュリン（5μg/l）、2−メルカプトエタノール（10μM）、エタノールアミン（20μM）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（50μg/ml）
−継代手法：細胞の継代は２または３日ごとに行った。
*細胞の凍結
−培地の組成：IMDMは、10％FCS及び10％DMSO（ジメチルスルホキシド−Sigma）
−細胞の濃度：１アンプル当たり3.6×106細胞（2×106細胞/ml）
−方法：IMDM培地−10％FCS−10％DMSOで、24時間から72時間-80℃の徐冷凍結後、液体窒素-180℃で貯蔵。
b）安定なハイブリドーマの同定
*クローニングの回数：２
*クローン名：6D8D12El
*アイソタイプ：IgG2b,K
*合成能力：Igによって分泌されたレベルの上清：ND
*抗原特異性：
間接ＥＬＩＳＡ（１）
−NUNC-maxisorbプレートに50μlのSTAPH、5微生物（109g/ml）を被覆し、37℃でオーバーナイトで乾燥させた。
−飽和１％のPBS−ミルク100μlを37℃で１時間、
−飽和１％のPBS−ウマ血清100μlを37℃で１時間インキュベートする、
−上清またはPBS-Tween20 0.05％液体で希釈した腹水の上清を100μl加え、37℃で１時間インキュベートし、
−Igの抗マウスIg（H+L）を100μl加え、PBS-BSA1％+ウマ血清1％を1/2000で希釈したALP（Jackson研究室バッチ24724）と37℃で１時間で接合させ、
0004213213.tif 000002
を100μl加え、濃度2mg/mlの
0004213213.tif 000003
pH9.8、37℃、30分間インキュベートし、
−100μlの1N NaOHで反応を停止させる。
NB：各ステップの間に、0.05％のPbs-tween 20を300μlで3回洗浄し、PNPPを加える前に、付加的に蒸留水で洗浄する。
（1）の結果：この抗体は、S. aureusに特異的で、S. Warneri.、S. Hominis.、S. Epidermidis.、S. CohniiまたはS. Haemolyticusのいずれも認識しない。
これはS. aureus ５型、８型、B型、A型及びMC31型、非５型及び非８型系（例えば：系1033, K8, 16N15）を認識する。
直接凝集手法（２）
丸底プレート
0004213213.tif 000004
に、一部50μlのPBSで希釈した上清+一部50μlの5×108g/ml微生物を入れ、プレートを振とうしながら、22℃でインキュベートする。約１５時間後、肉眼で判定する。
（2）の結果：肉眼可視の凝集体（4+）
c）in vivoでの抗体の産生
*用いた動物：BALB/Cを種とし、BALB/CBYJICO系とかけ合わせによる4から6週齢の雌マウス（IFFA Credo）。
*種菌の標本：細胞の懸濁液を200gで、25℃、10分間遠心した。細胞を9％NaClで再懸濁し、106細胞/mlにする。
*20匹のマウスに106細胞/マウスで腹腔内注射した。
*腹水の液体の採集時期：10日＋2日
*腹水の量：245.5ml
*プールの量：230.5ml
*収量：93.9％
実施例３：様々の黄色ブドウ球菌系の検出における市販されている種々の試薬と、SLIDEX STAPH PLUS試薬感受性との特異性の比較
SLIDEX STAPH PLUS試薬を次の試薬と比較した。
−SLIDEX STAPHキット：ref. 7 311 2バッチ674145 B（exp. 4/96）、出願人が市販しているもの、
−STAPHYSLIDE：ref. 5 508 1バッチ674775 A（exp. 9/96）、出願人が市販しているもの、
−ダイアンノスチック・パスツール（Diagnostic Pasteur）によって市販されているPASTOREX STAPH PLUS：ref. 56356バッチ4L042R（exp. 2/96）及びバッチSE 047 R（exp. 7/96）
−Murexによって市販されているSTAPHAUREX PLUS：ref. ZL 33バッチK61691 0（exp. 1 1/95）及びバッチK9251 1 0（exp. 8/96）
次に346の黄色ブドウ球菌系に対する試薬ごとの感受性の確認の試験をした。
−118メチシリン耐性S. aureus系、親和性因子を有しないフィブリノーゲン（凝集塊因子陰性）（起源：フランス、ドイツ、イギリス、ベネルクス、イタリア、スペイン、アメリカ、アメリカ・カンサス）。
−131メチシリン耐性S. aureus系、親和性因子を有するフィブリノーゲン（凝集塊因子陽性）（起源：フランス、ドイツ、イギリス、ベネルクス、イタリア、スペイン、アメリカ、オーストラリア、香港）。
−97メチシリン感受性S. aureus系（起源：フランス、イギリス、ベネルクス、イタリア、スペイン、ポーランド、オーストラリア、香港）。
さらに加えて、各試薬の特異性は、155 Staphylococcus非-aureus系（起源：フランス、ドイツ、イギリス、ベネルクス、イタリア、スペイン、ポーランド、アメリカ、オーストラリア、香港）によって決定した。
これらの系は、コロンビア寒天+5％ヒツジ血液にて培養した。
a）フィブリノーゲン親和性因子を有しない118メチシリン耐性S. aureus系より得られた感受性の結果
表１に集計結果を示す。
0004213213.tif 000005
unint.は“判定不能”を意味する。
表１によると、SLIDEX STAPHキット（79.67％）、PASTOREX STAPH PLUS（90.6%）及びSTAPHAUREX PLUS（82.9％）に対し、SLIDEX STAPH PLUSは顕著に高感受性（98.30％）を示している。
b）フィブリノーゲンに親和性因子を有する131メチシリン耐性S. aureus系より得られた感受性の結果
表２に集計結果を示す。
0004213213.tif 000006
unint.は“判定不能”を意味する。
c）97メチシリン耐性S. aureus系より得られた結果
表３に集計結果を示す。
0004213213.tif 000007
unint.は“判定不能”を意味する。
この表によれば、全ての系について検出され、どの試薬も感受性が100％である。
d）155 S.非-aureus系より得られた結果
表４に集計結果を示す。
0004213213.tif 000008
S. epidermidis、S. simulans、S. hyicus種は莢膜を有する。
S. lugdunensis、S. schleiferi、S. hyicus、S. intermedius種はフィブリノゲン親和性因子を有してもよい。
特異性はPASTOREX STAPH PLUSとSTAPHAUREXとが同一（88.44％）であるが、STAPHY SLIDE（91.37％）及びSLIDEX STAPH PLUS（92.57％）より低い。
e）試薬の性能
次の表５に各試薬の感受性及び特異性を示す。
0004213213.tif 000009
この表に、表の中に記載されているmeti R、meti Sは、それぞれ“メチシリン耐性”、“メチシリン感受性”を意味する。
この表からSLIDEX STAPH PLUS（99.2％）は、他の試薬に対し顕著な感受性を有することが明らかであり、この優れた性能は、本質的にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出での良き性能、フィブリノーゲンに対する親和性因子を有しないことによる。