(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンを加水分解する工程と、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画する工程と、分画した各キトサンオリゴ糖画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖を除去する工程とを含むことを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記キトサン加水分解物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満になるまで脱塩した後、イオン交換クロマトグラフィーを行なう、請求項１に記載のキトサンオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画した後、各キトサンオリゴ糖画分を脱塩する、請求項１又は２に記載のキトサンオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記脱塩を、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％の逆浸透膜を用いて行なう、請求項２又は３に記載のキトサンオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
キトサンを加水分解する工程と、キトサン加水分解物を還元処理する工程と、還元処理したキトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画する工程と、分画した各キトサンオリゴ糖アルコール体画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を除去する工程とを含むことを特徴とするキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【請求項６】
前記還元処理を、キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して、その２０質量％以上の水素化ホウ素ナトリウムを用いて行なう、請求項５に記載のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【請求項７】
前記還元処理したキトサン加水分解物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満になるまで脱塩した後、イオン交換クロマトグラフィーを行なう、請求項５又は６に記載のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【請求項８】
還元処理したキトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画した後、各キトサンオリゴ糖アルコール体画分を脱塩する、請求項５〜７のいずれか一つに記載のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【請求項９】
前記脱塩を、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％の逆浸透膜を用いて行なう、請求項７又は８に記載のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高純度のキトサンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖アルコール体を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合したオリゴ糖であるキトサンオリゴ糖は様々な生理活性を有し、飲食品、医薬品、化粧品等への利用が提案されている。例えば、本出願人は、キトサンオリゴ糖を有効成分として含有する肝機能障害予防改善剤（特開平１０−２８７５７２号公報）、抗糖尿病剤（特開平１１−２９４８４号公報）、抗酸化剤（特開２０００−２４８２７６号公報）等を開示している。
【０００３】
キトサンオリゴ糖は、工業的にはカニやエビ等の甲殻類の殻に含まれるキチンの脱アセチル化物であるキトサンを酸又は酵素で加水分解して製造されている。このキトサンの加水分解物は重合度の異なる様々なキトサンオリゴ糖の混合物であり、これをカラムクロマトグラフィーや溶剤分画等の方法によって分画することにより、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、キトヘキサオース等の重合度の異なるキトサンオリゴ糖を得ることができる。
【０００４】
また、キトサンオリゴ糖は分子内に遊離アミノ基及び還元性アルデヒド基を有し、特に水溶液状態で着色・褐変しやすいため、キトサンオリゴ糖を水素還元して、そのアルデヒド基をアルコールに変換することにより、安定性を高めた還元キトサンオリゴ糖も提案されている（特開平１−７９１９４号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の方法によって精製されたキトサンオリゴ糖は、通常９８％程度の純度であり、本発明者らが、キトサンオリゴ糖をＨＰＬＣ法（示差屈折検出）で分析したところ、原料（キトサン）に由来する不純物が混入していることが明らかとなった。例えば、キトトリオースは１分子中に３モルのアミノ基を有しているが、イオン交換クロマトグラフィーで分離したキトトリオース画分には、１分子中に３モルのアミノ基及び１モルのアセチル基を有するモノアセチルキトテトラオースや、１分子中に３モルのアミノ基と２モルのアセチル基を有するジアセチルキトペンタオースが不純物として見い出された。
【０００６】
このような現象が起こる理由は、脱アセチル化度の測定方法（コロイド滴定法）が厳密な測定方法ではないため、脱アセチル化度１００％のキトサンであっても実際は微量のアセチル基が残存しており、キトサンを加水分解することにより、キトサンオリゴ糖だけでなく上記のような部分アセチル化キトオリゴ糖も生成してしまうためである。この部分アセチル化キトオリゴ糖はイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーで除去することは困難であり、研究用試薬、医薬品や化粧品原料等として高純度（純度９９％以上）のキトサンオリゴ糖が必要とされる場合には特に問題となる。
【０００７】
また、還元キトサンオリゴ糖（本発明においてはキトサンオリゴ糖アルコール体という。）においては、原料となるキトサンオリゴ糖の純度の問題に加えて、還元率の問題から更に純度の低いもの（通常、純度９５％程度）しか製造することができなかった。
【０００８】
更に、上述したようにキトサンオリゴ糖は比較的不安定な物質であるため、キトサンオリゴ糖やキトサンオリゴ糖アルコール体を製造する過程で着色しやすいという問題もあった。
【０００９】
一方、Ｄ−グルコサミン塩酸塩を出発物質としたキトビオース、キトテトラオース及びキトヘキサオースの化学合成法も報告されている（丸山ら：島津評論，51，303-311，1995）が、グリコシル化反応の前後でアミノ基の保護・脱保護の工程が必要であるなど工業的生産方法としては適していない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、原料に由来する部分アセチル化キトオリゴ糖などの不純物を効率よく除去することができると共に製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色を防止することができ、高純度のキトサンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖アルコール体を効率よく製造できる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のキトサンオリゴ糖の製造方法は、キトサンを加水分解する工程と、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画する工程と、分画した各キトサンオリゴ糖画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖を除去する工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明のキトサンオリゴ糖の製造方法によれば、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画した後、活性炭処理することにより、部分アセチル化キトオリゴ糖を効率よく除去することができる。
【００１３】
上記キトサンオリゴ糖の製造方法においては、前記キトサン加水分解物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満になるまで脱塩した後、イオン交換クロマトグラフィーを行なうことが好ましい。この態様によれば、各重合度のキトサンオリゴ糖をより良好に分離することができる。
【００１４】
また、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画した後、各キトサンオリゴ糖画分を脱塩することが好ましい。この態様によれば、より灰分の少ないキトサンオリゴ糖を得ることができる。
【００１５】
更に、前記脱塩を、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％の逆浸透膜を用いて行なうことが好ましい。この態様によれば、短時間で効率よく脱塩でき、脱塩処理工程におけるキトサンオリゴ糖の着色や褐変を防止することができる。
【００１６】
また、本発明のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法は、キトサンを加水分解する工程と、キトサン加水分解物を還元処理する工程と、還元処理したキトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画する工程と、分画した各キトサンオリゴ糖アルコール体画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を除去する工程とを含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法によれば、キトサン加水分解物を還元処理した後、イオン交換クロマトグラフィーに供することにより、製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色や褐変を防止することができる。また、キトサン加水分解物の還元処理物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画した後、活性炭処理することにより、部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を効率よく除去することができる。
【００１８】
上記キトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法においては、前記還元処理を、キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して、その２０質量％以上の水素化ホウ素ナトリウムを用いて行なうことが好ましい。この態様によれば、キトサンオリゴ糖の還元率を９９．９％以上に向上することができ、より高純度のキトサンオリゴ糖アルコール体を得ることができる。
【００１９】
また、前記還元処理したキトサン加水分解物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満になるまで脱塩した後、イオン交換クロマトグラフィーを行なうことが好ましい。この態様によれば、各重合度のキトサンオリゴ糖アルコール体をより良好に分離することができる。
【００２０】
更に、還元処理したキトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画した後、各キトサンオリゴ糖アルコール体画分を脱塩することが好ましい。この態様によれば、より灰分の少ないキトサンオリゴ糖アルコール体を得ることができる。
【００２１】
更にまた、前記脱塩を、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％の逆浸透膜を用いて行なうことが好ましい。この態様によれば、短時間で効率よく脱塩することができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のキトサンオリゴ糖の製造方法は、キトサンを加水分解する工程と、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画する工程と、分画した各キトサンオリゴ糖画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖を除去する工程とを含む。以下、キトサンオリゴ糖の製造方法の各工程について説明する。
【００２３】
・キトサンを加水分解する工程
本発明において、原料として用いられるキトサンは、例えばキチンを熱濃アルカリ処理する方法等の常法に従って脱アセチル化することにより調製することができるが、市販のものを用いることもできる。キトサンの脱アセチル化度は８０〜１００％が好ましい。なお、上述したようにアセチル化度の測定方法の問題により、脱アセチル化度１００％のキトサンであっても微量のアセチル基が残存している。
【００２４】
キトサンの加水分解は、酸加水分解や酵素分解等の公知の方法によって行なうことができる（Distler, J. J. et al: Method Carbohydr. Chem., 1, 305-309, 1962、Izume, M. et al: Agric. Biol. Chem., 51, 1189-1191, 1987）。
【００２５】
例えば、キトサンを酸加水分解する場合は、キトサンに、その質量の１０〜１００倍量の酸を加え、４０〜９０℃で１〜１２０時間反応させた後、濾過して不溶物を除去し、酸を除去又はアルカリで中和することによりキトサン加水分解物を調製することができる。
上記酸としては、例えば、塩酸、酢酸、ギ酸、硫酸、リン酸等を用いることができる。
【００２６】
また、キトサンを酵素分解する場合は、キトサンに希酸を加えて溶解した後、所定量のキトサン分解酵素（キトサナーゼ、Ｄ−グルコサミニダーゼ等）を加えて酵素反応を行ない、酵素失活させた後、反応液を濾過して不溶物を除去し、ｐＨを中性に調整することによりキトサン加水分解物を調製することができる。
【００２７】
上記酵素は市販の酵素を用いることができ、例えば「キトサナーゼ−ＲＤ」（商品名、ピアス株式会社製、Bacillus sp. PI-7S由来）、「キトサナーゼ」（商品名、シグマアルドリッチ株式会社製、Streptomyces griseus由来）等を用いることができる。
【００２８】
上記のようにして得られるキトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖は、通常、重合度２〜８程度の混合物、すなわちキトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、キトヘキサオース、キトヘプタオース、キトオクタオース等の混合物である。
【００２９】
・キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画する工程
上記のようにして調製したキトサン加水分解物を、常法に従ってイオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖を重合度別に分画する。
【００３０】
本発明においては、例えばキトサンを酸加水分解してアルカリで中和した場合など、キトサン加水分解物が大量の塩類を含む場合は、キトサン加水分解物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満、より好ましくは５．０質量％以下になるまで予め脱塩してからイオン交換クロマトグラフィーに供することが好ましい。これにより、イオン交換クロマトグラフィーの分離能を向上することができる。なお、本発明でいう塩類とは、キトサンを加水分解する際に用いた無機酸や有機酸を中和することにより生じる塩（後述のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法においては、還元処理により生じる塩も含む。）を意味する。
【００３１】
脱塩の方法は公知の方法を採用できるが、電気透析法は効率が悪く、またキトサンオリゴ糖の着色や褐変を生じやすいため、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％の逆浸透膜（以下、ＲＯ膜という。）を用いて行なうことが好ましい。ＲＯ膜を用いることにより、効率よく脱塩することができ、キトサンオリゴ糖の着色や褐変も防止できる。
【００３２】
イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、Uchida et al: Chitin and Chitosan, edited by Skjak-braek, G., Anthonsen, T. and Sandford, P., p373-382, 1989, Elsevier Applied Science, London and Ney York等に記載された方法で行なうことができる。すなわち、キトサン加水分解物を、強酸性イオン交換樹脂（例えば「AG50W×8（H+ form, 200-400 mesh）」（商品名、Bio Rad Ｌaboratories製）、「Dowex 50W×4（H+ form，200-400 mesh）」（商品名、ダウケミカルカンパニー製）等）を充填したカラムに展開し、０〜５．５Ｎの塩酸で濃度勾配溶出することにより、重合度の小さいキトサンオリゴ糖から順に溶出され、重合度別にキトサンオリゴ糖を分画することができる。また、各キトサンオリゴ糖画分に含まれる塩酸はエバポレーションして除去、又はアルカリで中和しておくことが好ましい。なお、アルカリで中和した場合、後述する活性炭処理の前あるいは後に前記と同様にＲＯ膜を用いて脱塩することが好ましい。
【００３３】
・分画した各キトサンオリゴ糖画分を活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖を除去する工程
前記工程で得られた各キトサンオリゴ糖画分には、原料に由来する不純物、すなわち部分アセチル化キトオリゴ糖が含まれている。この部分アセチル化キトオリゴ糖は、各画分に含まれるキトサンオリゴ糖と１分子中のアミノ基数が同一であり、分子量もほとんど同一であるため、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等で分離除去することは困難であるが、活性炭処理することにより、効率よく除去することができる。なお、キトサン加水分解物を分画せずにそのまま活性炭処理した場合は、疎水性色素や中分子オリゴ糖（分子量数千）等の他の不純物が優先して活性炭に吸着されるため、部分アセチル化キトオリゴ糖を除去することはできない。
【００３４】
活性炭処理は、▲１▼各キトサンオリゴ糖画分に活性炭を加えて撹拌する、▲２▼各キトサンオリゴ糖画分を活性炭を充填したカラムに通すことにより行なうことができる。例えば、上記▲１▼の方法は、各キトサンオリゴ糖画分に含まれるオリゴ糖（キトサンオリゴ糖及び部分アセチル化キトオリゴ糖をいう。以下同じ。）の質量に対して、５０〜２００％、より好ましくは５０〜１００％の活性炭を加えて、１０〜９０℃で０．５〜５０時間撹拌した後、濾過して濾液を回収すればよい。
【００３５】
本発明で用いられる活性炭は、飲食品の製造に使用可能な活性炭であれば特に制限なく用いることができるが、医薬・酒造の脱色精製に使用されるタイプのものが好ましく用いられる。市販品としては、例えば「タケコール５０ＷＲ」、「精製白鷺」（いずれも商品名、武田薬品工業製）等を用いることができる。
【００３６】
本発明のキトサンオリゴ糖の製造方法によれば、製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色を防止できると共に部分アセチル化キトオリゴ糖を簡単な操作で除去することができ、高純度（示差屈折検出によるＨＰＬＣ法において９９％以上）のキトサンオリゴ糖を効率よく得ることができる。
【００３７】
次に、本発明のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法について説明するが、前記キトサンオリゴ糖の製造方法で説明した方法と基本的に同じ操作を行なう工程については、説明を省略するか簡単に説明するに留める。
【００３８】
・キトサンの加水分解工程
本工程は、前記キトサンオリゴ糖の製造方法で説明した方法と同じであるので説明を省略する。
【００３９】
・キトサン加水分解物を還元処理する工程
キトサン加水分解物を還元処理する方法は、公知の方法を採用できるが、本発明においては、以下の理由から水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を用いる方法が好ましく採用される。
【００４０】
▲１▼水素化ホウ素ナトリウムは、キトサンオリゴ糖のアミノ基には作用せず、還元末端に特異的な還元剤であり、取り扱いが簡単で安価である。
【００４１】
▲２▼還元処理の条件が温和で、キトサンオリゴ糖のグリコシル結合の加水分解が起こる危険性がない。
【００４２】
▲３▼還元処理後にホウ酸ナトリウム塩として除去することができ、また、万一微量に残存しても安全性が高い。
【００４３】
水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元処理は、例えばCampbell, B. J. et al: J. Chromatogr., 622, 137-146（1993）に記載された方法に従って行なうことができる。すなわち、キトサンを加水分解した反応液をｐＨ７〜９に調整して所定量の水素化ホウ素ナトリウムを加え、減圧下、１０〜４０℃で３〜１８時間還元反応を行なった後、ｐＨ３〜６に調整して反応を停止すればよい。本発明においては、還元率を高く（９９．９％以上）するために、キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して、その２０質量％以上の水素化ホウ素ナトリウムを用いることが好ましい。水素化ホウ素ナトリウムの使用量が上記より少ないと、還元率が低下（９８％程度）してしまうため好ましくない。なお、本発明でいうキトサンオリゴ糖ミクスチャーとは、キトサンを加水分解することにより生じるグルコサミン及びキトサンオリゴ糖の混合物を意味する。
【００４４】
このように、キトサン加水分解物をそのまま還元処理することにより、後工程（イオン交換クロマトグラフィー、脱塩等）での着色や褐変を防止できる。
【００４５】
・還元処理したキトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画する工程
本工程は、前記キトサンオリゴ糖の製造方法で説明した方法と同様の方法で行なうことができる。すなわち、還元処理したキトサン加水分解物を、例えば、上記の強酸性イオン交換樹脂を充填したカラムに展開し、０〜５．５Ｎの塩酸で濃度勾配溶出することにより、重合度の小さいキトサンオリゴ糖アルコール体から順に溶出され、重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画することができる。なお、各キトサンオリゴ糖アルコール体画分に含まれる塩酸はエバポレーションして除去、又はアルカリで中和しておくことが好ましい。
【００４６】
本発明においては、例えばキトサンを酸加水分解してアルカリで中和したキトサン加水分解物を還元処理した場合や、キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して、その１０質量％以上の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム）を用いて還元処理を行なった場合など、キトサン加水分解物の還元処理物が大量の塩類を含む場合は、キトサン加水分解物の還元処理物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％未満、より好ましくは５．０質量％以下になるまで予め脱塩してからイオン交換クロマトグラフィーに供することが好ましい。これにより、イオン交換クロマトグラフィーの分離能を向上することができる。特に、還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを用いた場合に生じるホウ酸ナトリウムが大量に含まれる場合、その溶出ピークがキトビイトールの溶出ピークと重なるため、できる限り除去しておくことが好ましい。
【００４７】
脱塩の方法は、公知の方法を採用できるが、電気透析法による脱塩は効率が悪く非常に時間がかかるため、前記と同様にＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％のＲＯ膜を用いて行なうことが好ましい。
【００４８】
また、イオン交換クロマトグラフィーにより分画した各キトサンオリゴ糖アルコール体画分に含まれる塩酸をアルカリで中和した場合、後述する活性炭処理の前あるいは後に前記と同様にＲＯ膜を用いて脱塩することが好ましい。
【００４９】
・分画した各キトサンオリゴ糖アルコール体画分をそれぞれ活性炭処理して部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を除去する工程
前記工程で得られる各キトサンオリゴ糖アルコール体画分には、部分アセチル化キトオリゴ糖に由来する不純物、すなわち部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体が含まれている。この部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体は、各画分に含まれるキトサンオリゴ糖アルコール体と１分子中のアミノ基数が同一であり、分子量もほとんど同一であるため、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーで分離除去することは困難であるが、活性炭処理することにより、効率よく除去することができる。
【００５０】
活性炭処理は、前記キトサンオリゴ糖の製造方法で説明した方法と同様の方法で行なうことができる。例えば、各キトサンオリゴ糖アルコール体画分に活性炭を加えて撹拌することにより活性炭処理を行なう場合は、各キトサンオリゴ糖アルコール体画分に含まれるオリゴ糖アルコール体（キトサンオリゴ糖アルコール体及び部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体をいう。以下同じ。）の質量に対して、５０〜２００％、より好ましくは５０〜１００％の活性炭を加えて、１０〜６０℃で０．５〜４８時間撹拌した後、濾過して濾液を回収すればよい。
【００５１】
本発明のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法によれば、製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色を防止できると共に部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を簡単な操作で除去することができ、従来に比べてより高純度のキトサンオリゴ糖アルコール体を効率よく得ることができる。
【００５２】
なお、本発明の方法により製造されたキトサンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖アルコール体は遊離体であっても塩を形成していてもよい。塩としては、例えば塩酸塩、乳酸塩、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩等が挙げられるが、特に最終製品の塩形態を限定するものではない。また、最終製品の形態は、特に制限されず、必要に応じて溶液、ペースト、粉末等を選択できる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１（キトサンオリゴ糖の製造）
脱アセチル化度（以下ＤＡＣと略す。）８８．５％のキトサン２００ｇを、濃塩酸２Ｌを用いて８０℃で１時間加水分解した後、反応液を冷却し、蒸留水２Ｌを加え、不溶物をブフナー濾過器で除去した。得られた濾液をエバポレーターで減圧濃縮乾固して塩酸を除去し、キトサン加水分解物９６ｇを得た。
【００５４】
このキトサン加水分解物を１Ｌの水に溶解して、イオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖を分画した。具体的には、上記キトサン加水分解物の水溶液をイオン交換樹脂（商品名「Dowex 50W×4，H+ form，200-400 mesh」、ダウケミカルカンパニー製、以下同じ。）を充填した２５Ｌ容カラムに通して、キトサンオリゴ糖を吸着させた後、カラムの２倍容の脱イオン水で洗浄した。その後、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、２．５Ｌずつフラクションコレクターで分取し、キトサンオリゴ糖をニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ）で検出した。その分離クロマトグラムを図１に示す。
【００５５】
図１に示されるように、キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供することにより、グルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオースが重合度別に分画されていることが分かる。
【００５６】
そして、図１に示す分画番号４５〜５１のフラクションを回収して、減圧濃縮乾固して塩酸を除去し、キトビオースに相当する画分を得た。
【００５７】
このキトビオースに相当する画分の一部を脱イオン水に溶解して、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行なった（なお、以下の例において、キトサンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖アルコール体の純度は、特に断りのない限り、この条件で測定した。）。
【００５８】
カラム：Shodex製の商品名「Asahipak NH2P-50 4E」（4.6mm ID×250mm L）
移動相：ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／５Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＫ（vol）＝７０／３０／０．２５
温度：３５℃
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：示差屈折（ＲＩ）及び紫外部（２１０ｎｍ）
その結果を図２に示す。図２に示されるように、ＲＩで検出されたメインピークは、標準品の溶出時間（Ｒ.Ｔ.＝７．４分）と一致することからキトビオースと判断した。しかしながら、Ｒ.Ｔ.が１３．５分の付近に認められるピークは、アセチル基に由来するＵＶ（２１０ｎｍ）吸収を持っていることから、部分アセチル化キトオリゴ糖であると判断した。この部分アセチル化キトオリゴ糖は、原料キトサンに残存していたアセチル基が原因で生成したものである。
【００５９】
そこで、上記のキトビオースに相当する画分の一部を脱イオン水に溶解して、オリゴ糖に対して質量比で５０％の活性炭（商品名「タケコール５０ＷＲ」、武田薬品工業製、以下同じ。）を添加して１時間撹拌した後、活性炭を除去して得られた濾液について、上記と同様の条件でＨＰＬＣ分析した。その結果を図３に示す。
【００６０】
図３に示されるように、活性炭処理することにより、部分アセチル化キトオリゴ糖が選択的に除去されていることが分かる。この活性炭処理により、キトビオースの純度を９９％以上に精製することができた（活性炭処理前の純度は６７％）。なお、活性炭処理前後におけるキトビオースの回収率は９２．８％であった。
【００６１】
実施例２（脱塩方法）
・ＲＯ膜による脱塩
実施例１に準じてキトサン加水分解物を調製してイオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖を重合度別に分離した。そして、キトトリオースに相当する画分を回収し、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液でｐＨ５．５に調整して、中和液４０Ｌ（キトトリオース３５０ｇ、ＮａＣｌ ５．３ｋｇ含有）を得た。
【００６２】
この中和液を実施例１と同様にして活性炭処理した後、ＲＯ膜を用いて脱塩を行なった。具体的には、ＲＯ膜装置（商品名「メンブレンマスター RUW-7」、日東電工株式会社製）に、塩阻止率９３％のＲＯ膜モジュール（商品名「NTR-729HG（２インチ）」、日東電工株式会社製）を１本セットして、操作圧力２．０ＭＰａ、循環流量６．０Ｌ／ｍｉｎ、温度１８℃の条件下で、原液タンクに透過液量と同量の水を加えながら原液（濃縮液）量を一定に保持するダイアフィルトレーション方式で脱塩を行なった。
【００６３】
そして、透過液量が２００Ｌになった時点で脱塩を終了し、ｐＨ調整後、凍結乾燥してキトトリオース塩酸塩の粉末（純度９９．７％）を得た。この粉末の灰分（ＮａＣｌが主成分）を分析したところ０．０５質量％であった。
【００６４】
・電気透析膜による脱塩
上記と同様にして中和液（キトトリオース３５０ｇ、ＮａＣｌ ５．３ｋｇ含有）を調製して活性炭処理を行なった。その一部（５Ｌ）を「セレミオン電気透析装置DS-0」（商品名、旭硝子株式会社製）を用いて脱塩した。なお、イオン交換膜として「AMV」及び「CMV」（商品名、旭硝子株式会社製）をそれぞれ２０枚用い、循環流量３．５Ｌ／ｍｉｎ、電圧１５Ｖに設定した。
【００６５】
そして、脱塩液の電流値が０．３Ａとなった時点で電気透析を終了し、ｐＨ調整後、凍結乾燥してキトトリオース塩酸塩の粉末（純度９９．８％）を得た。この粉末について灰分を分析したところ１．６質量％であった。
【００６６】
以上の結果から、ＲＯ膜を用いることにより、キトサン加水分解物を効率よく脱塩できることが分かる。また、ＲＯ膜で脱塩して得られたキトトリオース塩酸塩は白色で着色が認められなかったのに対して、電気透析膜で脱塩して得られたものは着色（淡黄色）が認められた。
【００６７】
実施例３（キトサンオリゴ糖アルコール体の製造）
ＤＡＣ ８８．５％のキトサン２００ｇを、実施例１と同様の方法で加水分解し、減圧濃縮乾固してキトサン加水分解物９６ｇを得た。
【００６８】
このキトサン加水分解物を５Ｌの水に溶解して、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．５に調整し、還元剤としてＮａＢＨ4（関東化学株式会社製、以下同じ。）を４．８ｇ（キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して５．０質量％の量）添加して、室温、減圧下で６時間撹拌して還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整して反応を停止した。
【００６９】
このキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）をイオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖アルコール体を分画した。具体的には、上記還元処理物（水溶液）をイオン交換樹脂を充填した２５Ｌ容カラムに通して、キトサンオリゴ糖アルコール体を吸着させた後、カラムの２倍容の脱イオン水で洗浄した。その後、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、２．５Ｌずつフラクションコレクターで分取し、キトサンオリゴ糖アルコール体をニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ）で検出した。
【００７０】
そして、キトトリイトールに相当するフラクションを回収し、エバポレーターで減圧濃縮乾固して塩酸を除去した。この画分の一部を少量の脱イオン水に溶解して、実施例１に記載した条件でＨＰＬＣ分析を行なった。その結果を図４に示す。
【００７１】
図４に示されるように、ＲＩで検出されたメインピークは標準品のＲ.Ｔ.（９．６分）と一致するため、キトトリイトールと判断した。しかしながら、Ｒ.Ｔ.が１４．８分と１７．３分付近に認められるピークはアセチル基に由来するＵＶ（２１０ｎｍ）吸収を持っていることから、部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体であると判断した。この部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体は、原料キトサンを加水分解した際に生じる部分アセチル化キトオリゴ糖に由来するものである。
【００７２】
そこで、上記のキトトリイトールに相当する画分の一部を脱イオン水に溶解して、オリゴ糖アルコール体に対して質量比で５０％の活性炭を添加して１時間撹拌した後、活性炭を除去して得られた濾液について、上記と同様の条件でＨＰＬＣ分析を行なった。その結果を図５に示す。
【００７３】
図５に示されるように、活性炭処理することにより部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体が選択的に除去されていることが分かる。この活性炭処理により、キトトリイトールの純度を９９％以上に精製することができた（活性炭処理前の純度は６２％）。なお、活性炭処理前後におけるキトトリイトールの回収率は８７．７％であった。
【００７４】
実施例４（還元処理工程の順番）
ＤＡＣ ９９．８％のキトサン４０ｇを、水４Ｌに分散させて撹拌しながら酢酸を加えて溶解させた（ｐＨ５．０）。この溶液に、キトサナーゼ（商品名「キトサナーゼ−ＲＤ」、ピアス株式会社製、以下同じ。）を４０Ｕ加え、５５℃で２４時間反応させた。酵素を失活させて濾過して不溶物を除去した後、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．５に調整してキトサン加水分解物（水溶液）を得た。
【００７５】
このキトサン加水分解物（水溶液）の半分を用いて還元処理を行なった。具体的には、還元剤としてＮａＢＨ4を１．０ｇ（キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して５．０質量％の量）添加して、室温、減圧下で６時間撹拌して還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整して反応を停止した。
【００７６】
このキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）をイオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖アルコール体を分画した。具体的には、上記還元処理物（水溶液）をイオン交換樹脂を充填した１Ｌ容カラムに通して、キトサンオリゴ糖アルコール体を吸着させた後、カラムの２倍容の脱イオン水で洗浄した。その後、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、７０ｍＬずつフラクションコレクターで分取し、キトサンオリゴ糖アルコール体をニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ）で検出した。
【００７７】
そして、キトテトライトールに相当する画分を回収し、エバポレーターで減圧濃縮乾固して過剰な塩酸を除去した後、脱イオン水を加えて溶解し、実施例３と同様にして活性炭処理を行なった。そして、ｐＨ調整後、凍結乾燥してキトテトライトール塩酸塩の粉末（純度９９．９％、以下サンプル１という）０．５５ｇを得た。
【００７８】
一方、残りの半分のキトサン加水分解物を還元処理せずに上記と同様にイオン交換カラムに供して分画して、キトテトラオースに相当する画分を回収した。エバポレーターで減圧濃縮乾固して過剰な塩酸を除去した後、脱イオン水を加えて溶解し、オリゴ糖に対して５．０質量％の量のＮａＢＨ4を添加して、上記と同様にして還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整して反応を停止した。
【００７９】
この反応液を、電気透析機（商品名「マイクロアシライザー」、旭化成株式会社）を用いて脱塩した。なお、イオン交換膜（カートリッジ膜）は「ＡＣ−１２０−１０」（商品名、旭化成株式会社製）を使用した。
【００８０】
得られた脱塩液を活性炭処理した後、ｐＨ調整して凍結乾燥してキトテトライトール塩酸塩の粉末（純度９９．９％、以下サンプル２という）０．５０ｇを得た。
【００８１】
得られた各サンプルを１０％（ｗ／ｖ）となるように脱イオン水に溶解し、着色度（ＯＤ３５０ｎｍを指標）を測定したところ、サンプル１の着色度は０．５３、サンプル２の着色度は１．５８であった。なお、還元剤由来のホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ2）をクルクミン法で定量したところ、サンプル１には検出されなかったが、サンプル２には２５０ｐｐｍのホウ酸ナトリウムが検出された。
【００８２】
以上の結果から、キトサン加水分解物を還元処理した後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖アルコール体を分画することにより、キトサンオリゴ糖の着色を防止できることが分かる。また、電気透析では、ホウ酸ナトリウムを効率よく除去できないことが分かる。
【００８３】
実施例５（脱塩方法）
ＤＡＣ８５.６％のキトサン２０ｋｇを、濃塩酸２００Ｌを用いて８０℃で１時間加水分解した後、反応液を冷却し、２００Ｌの蒸留水を加えて不溶物をフィルタープレス濾過機で除去した。得られた濾液を減圧濃縮乾固して塩酸を除去し、キトサン加水分解物１３ｋｇを得た。
【００８４】
このキトサン加水分解物に水１００Ｌを加えて溶解し、６Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．６に調整した後、ＮａＢＨ4を６５０ｇ（キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して５．０質量％の量）を添加して室温、減圧下で６時間撹拌して還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ５．５に調整して反応を停止した。
【００８５】
このキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液、１３０ｇオリゴ糖／Ｌ）の半分を用いてＲＯ膜装置で脱塩した。具体的には、キトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）５０Ｌを、塩阻止率５５％のＲＯ膜モジュール（商品名「SU-610（４インチ）」、東レ株式会社製）を２本セットした装置（商品名「FVY-1002型」、東レ株式会社製）の原液タンクに投入し、操作圧力０．３ＭＰａ、循環流量１０Ｌ／ｍｉｎ、温度２４℃の条件下でダイアフィルトレーション方式で脱塩を行なった。
【００８６】
透過液量が０、４０、８０、１２０Ｌの時点で原液タンク内（濃縮液）からサンプリングして、キトサンオリゴ糖アルコール体をニンヒドリン法で定量し、ホウ酸ナトリウムをクルクミン法で定量した。その結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
表１から、１２分間の処理で、キトサンオリゴ糖アルコール体に対するホウ酸ナトリウムの比率（100×b/a）は６．５％から０．０８％に減少していることが分かる。また、脱塩処理による溶液の着色は全く起こらなかった。
【００８９】
次に、脱塩処理したキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）の一部（２．５Ｌ）をイオン交換樹脂を充填した２５Ｌ容カラムに通して、キトサンオリゴ糖アルコール体を吸着させた後、カラムの２倍容の脱イオン水で洗浄した。その後、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、２．５Ｌずつフラクションコレクターで分取した。各フラクションに含まれるキトサンオリゴ糖アルコール体をニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ）で検出し、グルコサミニイトール、キトビイトール、キトトリイトール、キトテトライトールの順に溶出し、重合度別に分離していることを確認した。
【００９０】
そして、キトビイトールに相当する画分を回収し、減圧濃縮乾固して塩酸を除去し、粉末６４ｇを得た。この粉末を脱イオン水１Ｌに溶解し、活性炭３２ｇを加えて２時間撹拌した後、活性炭を除去した。得られた濾液のｐＨを４．５に調整後、凍結乾燥して白色粉末５４．４ｇを得た（活性炭処理による回収率８５％）。この粉末を実施例１に記載した条件でＨＰＬＣ分析を行なったところ、キトビイトールの純度は１００％であった。
【００９１】
一方、上記キトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）の一部（５Ｌ）を「セレミオン電気透析装置DS-0」（商品名、旭硝子株式会社製）を用いて脱塩を行ない、上記と同様にしてキトサンオリゴ糖アルコール体及びホウ酸ナトリウムを定量した。なお、イオン交換膜として「AMV」及び「CMV」（商品名、旭硝子株式会社製）をそれぞれ２０枚用い、循環流量３．５Ｌ／ｍｉｎ、電圧１５Ｖに設定した。その結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
表２から、キトサンオリゴ糖アルコール体に対するホウ酸ナトリウムの比率（100×b/a）は１８０分経過しても１．１％であることが分かる（ホウ酸ナトリウムの８４％を除去）。更に、３００分まで脱塩処理を継続しても電流値は０．３Ａ以下にならず、これ以上は脱塩できないものと判断した。また、溶液の着色が若干認められた。
【００９４】
以上の結果から、ＲＯ膜を用いることにより、キトサン加水分解物の還元処理物を効率よく脱塩できることが分かる。
【００９５】
実施例６（脱塩の有無による分離能の差）
ＤＡＣ ９９．８％のキトサン４ｇを、水４００ｍＬに分散させて撹拌しながら酢酸を加えて溶解させた（ｐＨ５．０）。この溶液に、キトサナーゼを４Ｕ加え、５５℃で２４時間反応させた後、酵素を失活させて濾過して不溶物を除去した後、ｐＨを７．５に調整してキトサン加水分解物（水溶液）を得た。
【００９６】
このキトサン加水分解物（水溶液）にＮａＢＨ4を０．４ｇ（キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して１０質量％の量）添加して、室温、減圧下で６時間撹拌して還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整して反応を停止した。
【００９７】
得られたキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）の半分を、電気透析機（商品名「マイクロアシライザー」、旭化成株式会社製）を用いて脱塩した。なお、イオン交換膜（カートリッジ膜）は、商品名「AC-120-10」（旭化成株式会社製）を用いた。
【００９８】
次に、この脱塩液（塩類（主にホウ酸ナトリウム）の含量は５質量％）をイオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖アルコール体を分画した。具体的には、上記脱塩液をイオン交換樹脂を充填した１００ｍＬ容カラムに通してキトサンオリゴ糖アルコール体を吸着させた後、カラムの２倍容の脱イオン水で洗浄した。その後、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、１０ｍＬずつフラクションコレクターで分取し、キトサンオリゴ糖アルコール体をニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ）で検出した。その分離クロマトグラムを図６に示した。
【００９９】
図６から、キトサンオリゴ糖アルコール体は重合度別に分離されており、ホウ酸ナトリウムのピークは、キトビイトールのピークと完全に分離していることが分かる。
【０１００】
そして、キトトライトールに相当する画分を回収し、減圧濃縮乾固して塩酸を除去し、粉末２３０ｍｇを得た。この粉末を脱イオン水１００ｍＬに溶解し、活性炭２３０ｍｇを加えて１時間撹拌した後、活性炭を除去した。得られた濾液のｐＨを４．５に調整後、凍結乾燥して、白色粉末２１４ｍｇを得た（活性炭処理による回収率９３％）。この粉末を実施例１に記載した条件でＨＰＬＣ分析を行なったところ、キトトライトールの純度は１００％であった。
【０１０１】
一方、得られたキトサン加水分解物の還元処理物（水溶液）を、脱塩を行なわずにそのままイオン交換クロマトグラフィーに供し、キトサンオリゴ糖アルコール体を分画した。その分離クロマトグラムを図７に示した。なお、イオン交換クロマトグラフィーは上記と同様にして行なった。
【０１０２】
図７に示すように、キトビイトール、キトトリイトール、キトテトライトール相互の分離性が不良であることが分かる。また、ホウ酸ナトリウムのピークの一部がキトビイトールのピークと重なっていることが分かる。
【０１０３】
以上の結果から、キトサン加水分解物の還元処理物に含まれる塩類が固形分当たり１０質量％以上の状態でイオン交換クロマトグラフィーを行なった場合、各キトサンオリゴ糖アルコール体の分離性の低下やホウ酸ナトリウムの混入の問題が発生することが分かる。
【０１０４】
実施例７
ＤＡＣ １００％のキトサン３０ｇを、水３Ｌに分散させて撹拌しながら酢酸を加えて溶解させた（ｐＨ５．０）。この溶液に、キトサナーゼを１５Ｕ加え、５５℃で２４時間反応して酵素を失活させた後、濾過して不溶物を除去し、キトサン加水分解物（水溶液）を得た。
【０１０５】
このキトサン加水分解物（水溶液）を１Ｎ ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．５に調整した後、３分割して、各々にＮａＢＨ4を１．０ｇ、１．５ｇ、及び２．０ｇ（キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して、それぞれ１０、１５、及び２０質量％の量）加え、室温、減圧下で６時間撹拌して還元処理を行ない、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整して反応を停止した。
【０１０６】
各還元処理物（水溶液）を脱塩した後（キトサン加水分解物の還元処理物に含まれる塩類は固形分当たり１〜３質量％）、各々２００ｍＬ容のイオン交換カラムに供し、０〜４Ｎの塩酸による濃度勾配溶出を行ない、キトペンタイトールに相当する画分を回収した。エバポレーターで過剰な塩酸を除去後、活性炭処理し、ｐＨ調整して凍結乾燥してキトペンタイトール塩酸塩の粉末を、それぞれ４２ｍｇ、４６ｍｇ、及び４０ｍｇ得た。
【０１０７】
これらの粉末中に残存する未還元体（キトペンタオース）の含量をソモジーネルソン法により測定した。その結果を表３に示す。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
表３から、キトサン加水分解物に含まれるキトサンオリゴ糖ミクスチャーに対して２０質量％以上の量のＮａＢＨ4を用いることにより、９９．９％以上の還元率を達成できることが分かる。
【０１１０】
なお、上記の各キトペンタイトール塩酸塩を実施例１に記載した条件でＨＰＬＣ分析を行なったところ、純度１００％であった。これは、ＨＰＬＣ法では還元体と未還元体の分離できないためである。
【０１１１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のキトサンオリゴ糖の製造方法によれば、キトサンの加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖を分画した後、活性炭処理をすることにより、イオン交換クロマトグラフィーで除去することが困難な部分アセチル化キトオリゴ糖を効率よく除去することができ、高純度のキトサンオリゴ糖を効率よく調製することができる。
【０１１２】
また、本発明のキトサンオリゴ糖アルコール体の製造方法によれば、キトサン加水分解物を還元処理した後に、イオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画することにより、製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色や褐変を防止することができる。そして、イオン交換クロマトグラフィーに供して重合度別にキトサンオリゴ糖アルコール体を分画した後に、活性炭処理をすることにより、部分アセチル化キトオリゴ糖アルコール体を効率よく除去することができ、高純度のキトサンオリゴ糖アルコール体を効率よく調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画した結果を示す図である。
【図２】  キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画して得られたキトビオース画分をＨＰＬＣ分析した結果を示す図である。
【図３】  キトサン加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画して得られたキトビオース画分を活性炭処理したものをＨＰＬＣ分析した結果を示す図である。
【図４】  キトサン加水分解物の還元処理物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画して得られたキトトリイトール画分をＨＰＬＣ分析した結果を示す図である。
【図５】  キトサン加水分解物の還元処理物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画して得られたキトトリイトール画分を活性炭処理したものをＨＰＬＣ分析した結果を示す図である。
【図６】  キトサン加水分解物の還元処理物を脱塩してからイオン交換クロマトグラフィーにより分画した結果を示す図である。
【図７】  キトサン加水分解物の還元処理物を脱塩せずにイオン交換クロマトグラフィーにより分画した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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