(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（a）被検体由来の末梢血からリンパ球分画を調製する工程、
（b）リンパ球分画をシイタケ菌糸体抽出物を用いて処理することにより生成されるLAK誘導サンプルと、シイタケ菌糸体抽出物を含まない条件下で生成される対照サンプルを用意する工程、そして
（c）前記LAK誘導サンプルのLAK活性と前記対照サンプルのLAK活性とを算出して互いを比較して、前記被検体に対するシイタケ菌糸体抽出物のin vitroでのLAK活性増強作用を決定する工程、
を含む、経口投与したシイタケ菌糸体抽出物が前記被検体に適したLAK活性増強作用を有するかどうかをin vitroで決定するための方法。
【請求項２】
シイタケ菌糸体抽出物が、以下の工程：
バカスと脱脂米糠を基材とする固体培地であってシイタケ菌糸体を含むものを、水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される酵素の存在下で粉砕、擂潰して、懸濁状液体を調製する工程；そして
次に90〜95℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させる工程；
を含む方法により調製される、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍免疫学の分野に関する。特定すれば、本発明は、抗腫瘍および／または抗癌活性を有する免疫療法剤をスクリーニングするための物質およびその方法に関する。さらに特定すれば、本発明は、インビトロにおいてインビボにおけるＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated Killer Cell：リンホカイン活性化キラー細胞）の活性増強効果が得られるかどうかを判断するためのスクリーニング物質およびその方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍免疫学における基本的概念は、腫瘍細胞が腫瘍抗原を有するということである。即ち、腫瘍細胞に特異な抗原（TSA：Tumor Specific Antigen）、または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA：Tumor Associated Antigen）の存在がわかっている。このような腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法がもっとも一般的であり、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は正常細胞よりもＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の方が高く、またＮＫ細胞の活性も免疫療法により増強されることが知られている。ＮＫ細胞は正常個体中にも存在する細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対してＭＨＣ抗原に拘束されずに障害活性を示すことが知られているが、ＮＫ細胞でも殺傷し得ない腫瘍細胞の存在も明らかとなった。
【０００３】
米国ＮＣＩのＳ．Rosenbergは、リンパ球をインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に培養すると、広い範囲の腫瘍細胞に細胞障害性を示す、ＮＫ細胞でも殺傷不可能な腫瘍細胞を殺傷するキラー細胞が誘導されることを発見した（特開昭62‐116518号参照）。このキラー細胞はＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated Killer Cell：リンホカイン活性化キラー細胞）と命名された。ＬＡＫ細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、ＮＫ細胞系やキラーＴ細胞系の細胞集団であることが知られている。近年は、ＬＡＫ細胞を用いた養子免疫が試みられており（ＬＡＫ療法）、ＬＡＫ細胞の繰り返し投与により末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。しかしながら、ＬＡＫ療法の効果は個体差があり、ほとんど効果を享受できない場合もあり、苦痛を伴うＬＡＫ療法を行っても、効果が出ないことがあった。ましてＩＬ−２によってＬＡＫ療法を行う場合、多量の白血球分離に対する肉体的負担や高濃度のＩＬ−２投与による重篤な副作用があり、大量培養に関する経済的負担も大きい。
具体的には、ＩＬ−２を用いたＬＡＫ養子免疫療法はＩＬ−２を単独で用いた場合よりも副作用が強く、全身倦怠、悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加などの症状は必発である。さらに注目すべきは、重大ないくつかの副作用の発現にＬＡＫ細胞の正常細胞に対する傷害活性が関与している可能性が高いことで、造血幹細胞傷害による貧血や血小板現象のほか、リンパ球、マクロファージや血管内皮細胞に対するインビトロ傷害も報告されている。このようなＬＡＫ療法を行わないで、直接投与によってＬＡＫ活性を増強させ得るかどうかをインビトロにおいてスクリーニングすることができる物質の存在が望まれていた。たとえ、ＩＬ−２を用いてインビトロでスクリーニングを行なっても、不経済である上、前述のようにＩＬ−２を直接投与した際の副作用が大きく、そのスクリーニングによって投与した後インビボで得られると思っていたＬＡＫ活性増強による効果を帳消しにしてしまうからであった。
【０００４】
抗癌剤の開発においては、副作用を回避する目的で、古くから抗癌作用を有することがわかっている安全な細菌類あるいは食品等に含まれる抗癌作用物質が模索されている。例えば、細菌により癌を制圧しようとする試みは既に1900年代から始められており、セラチア菌と溶連菌の培養濾液を用いたColey´sトキシン（1964）、ＢＣＧによる白血病治療（Mathe, G., Adv. Cancer Res., 14, 1, 1971）およびモルモットにおける癌腫瘤の退縮（Zbar, B.,et al., J. Natl. Cancer Inst., 48, 831, 1971）、および酵母壁多糖体の投与によるサルコーマ180等の移植癌に対する有効性等が報告されている。
【０００５】
特に、多糖体に関しては、酵母グルカン、酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担子菌類の多糖体における抗癌効果の追求に多大な労力が注がれてきた。これらのうちで抗癌免疫増強薬として現在市販されているものとしては、担子菌類のサルノコシカケ科のカワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン（呉羽化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）およびシイタケ多糖体のレンチナン並びにスエヒロタケ多糖体などがある。また、シイタケ（Lentinus edodes）は日本並びに中国を代表する食用キノコであって日本では約300年も前から人工栽培が行われてきたが、その薬理効果並びに薬効成分がごく最近解明されつつあり、例えば、ラット・マウスにおける大腸および肝臓等の移植腫瘍細胞の増殖抑制効果（Sugano, N, et al., Cancer Letter, 27: 1, 1985；鈴木康将ら、日本大腸肛門病会誌、43: 178、 1990）およびマイトジェン効果（Tabata, T. et al., Immunopharmacology, 24: 57, 1992；Hibino, et al., Immunopharmacology, 28: 77, 1994）などが報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強効果をインビトロでスクリーニングすることができるスクリーニング物質およびその方法を提供すべく、シイタケの持つＬＡＫ活性増強効果（抗腫瘍および／または抗癌活性）に着目した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シイタケの食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並びに抗腫瘍および／または抗癌活性があることを見いだし、しかも当該抽出物をＩＬ−２の代替物としてインビトロにおけるいてＬＡＫ活性誘導物質として使用することにより、当該抽出物を直接投与した際のインビボにおける抗腫瘍および／または抗癌作用、特にＬＡＫ活性増強作用をスクニーリングできることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、シイタケ菌糸体抽出物を含む抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、特にＬＡＫ活性増強のための製剤の直接投与によるＬＡＫ活性増強効果を期待できるか否かを、直接投与前にインビトロにおいて判断することができる、シイタケの菌糸体抽出物を含有するスクリーニング物質およびそのスクリーニング方法に関する。よって、本発明のスクリーニング物質およびスクリーニング法は、ヒトのみならず家畜にも使用可能である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明による、スクリーニング物質として用いられるシイタケ菌体抽出物とは、シイタケ菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、分解して得られる抽出物を言う。
【００１０】
シイタケ菌糸体抽出物は、好ましくは以下の方法により得られたものを使用するが、これに限定されない。即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるように解束し、この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される酵素１種またはそれ以上を３０−３５℃の温度に保ちながら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくとも７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにして、次に９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過することによりシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌糸体抽出物はそのまま本発明の免疫療法剤に用いてよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特異な味と匂いを有する。
【００１１】
このようにして得られるシイタケ菌糸体抽出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を２５．３％（重量／重量）、ローリー法によるタンパク質分析によりタンパク質を１９．７％（重量／重量）、没食子酸を規準とするFolon‐Denis法によりポリフェノールを２．６％（重量／重量）含んでいた。シイタケ菌糸体抽出物には、その他に粗脂肪８％、粗灰分２２％、糖質以外の可溶性無窒素物を約２０％含んでいた。
【００１２】
また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成（５）は以下のとおりであった。
Ｘｙｌ：１５．２；Ａｒａ：８．２；Ｍａｎ：８．４；Ｇｕｌ：３９．４；Ｇａｌ：５．４；ＧｌｃＮ：１２．０ＧＬｕＵＡ：１１．３。
【００１３】
本発明のスクリーニング物質に含有されるシイタケ菌糸体抽出物は、末梢血から得られるリンパ球分画に対して直接添加することができるが、添加の前にアセトンによる無菌処理を行うことが好ましい。本発明のスクリーニング物質に含有されるシイタケ菌糸体抽出物の直接添加する際の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００１４】
本発明のスクリーニング剤を用いてスクリーニングを行う方法としては、高木らの方法に従い（臨床免疫、１９：２４５−２４９，１９８７）、ＩＬ−２に代えてシイタケ菌糸体抽出物を含有する本発明のスクリーニング物質を用いることができる。
【００１５】
即ち、本発明のＬＡＫ活性増強スクリーニング法は、以下の工程：
（ａ）末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単核球を分離し、
（ｂ）非付着性細胞を回収してリンパ球分画を得て、
（ｃ）リンパ球分画に本発明のスクリーニング物質を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加える誘導サンプルと何も加えない対照サンプルを用意して、それぞれの群を３日間室温において静置培養するが、その際、両サンプルに関して自然解離群、最大解離群および実験解離群を分け、
（ｄ）標的細胞に100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加し、
（ｅ）工程（ｃ）の最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加え、自然解離群には何も加えず、そして実験解離群には工程（ｄ）で得られた標的細胞を加え、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養し、
（ｆ）培養上清を採取して放射活性を測定し、そして、
（ｇ）以下の計算式：
0004308350.tif 000002
を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算出して互いを比較すること
を含む。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、各工程は以下のとおりに実施するが、適切な変更および修飾がなされてよいことは、当業者には認識される。
【００１７】
工程（ａ）：被験者から採血した末梢血にヘパリンを加え、Ficoll‐Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離する。
【００１８】
工程（ｂ）：分離された単核球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２〜３回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）に懸濁する。自己血清（血漿）を３７℃１５分処理してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養する。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画とする。
【００１９】
工程（ｃ）：エフェクター細胞を１ウエルあたりの最終個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に浮遊させる。最終培養細胞濃度が１×１０6／ｍｌを越えないようにする。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加える。本発明のスクリーニング法において、シイタケ菌糸体抽出物は末梢血に対して直接添加することができるが、添加の前にアセトンによる無菌処理を行うことが好ましい。スクリーニング物質に含有されるシイタケ菌糸体抽出物の直接添加する際の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。９６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器で培養するこの際、自然解離用と最大解離用のウエルを用意して全体がプレートの中央にまとまるようにする。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入れる。培養は、３日間室温において静置する。対照は何も加えない。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁する（１×１０6／ｍｌ）。
【００２０】
工程（ｄ）：標的細胞である継代培養細胞、好ましくはDaudiあるいはRajiを遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加する。５％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養する。培養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁する。
【００２１】
工程（ｅ）：上記マイクロテストプレートの各ウエルについて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注する。プレート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離して、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養する。
【００２２】
工程（ｆ）：培養したプレートからSOKEN‐PET Σ‐96にて各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーションカウンターにより放射活性を測定する。
【００２３】
工程（ｇ）：ＬＡＫ活性は、以下の表に従って算出する。
0004308350.tif 000003
【００２４】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。
【００２５】
【実施例】
実施例１：シイタケ菌糸体抽出物の調製
バカス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、純水３．５ｌおよび精製シルラーゼ２．０ｇを、固体培地を４０℃にた持ちながら加えて培地含有混合物とした。
【００２６】
次いで、培地含有混合物を変速ギヤー付ポンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分において粉砕および擂潰作用を２００分間程度加えて、バカス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地含有混合物をさらに９０℃まで加熱して酵素を失活せしめると同時に滅菌して、９０℃に３０分間放置した。得られた培地含有混合液を６０メッシュ濾布により濾過してシイタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥粉末を得た。
実施例２：ＬＡＫ活性の測定
被験者Ａ、ＢおよびＣからシイタケ菌糸体抽出物服用前の末梢血を採血した。
【００２７】
被験者Ａ、ＢおよびＣ各々に、シイタケ菌糸体抽出物１２００ｍｇを毎日３回、１週間投与した。
【００２８】
被験者Ａ、ＢおよびＣからシイタケ菌糸体抽出物服用後に採血した。これらの末梢血にヘパリンを加え、Ficoll‐Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）に懸濁した。
【００２９】
標的細胞である継代培養細胞（Daudi）を遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁した。
【００３０】
上記マイクロテストプレートの各ウエルについて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離して、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養した。
【００３１】
培養したプレートからSOKEN‐PET Σ‐96にて各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
【００３２】
ＬＡＫ活性は以下の表に従って算出した。
0004308350.tif 000004
【００３３】
結果を表１並びに図１に示す。
【００３４】
一方、スクリーニングするためには、被験者Ａ、ＢおよびＣから採血したシイタケ菌糸体抽出物服用前の末梢血にヘパリンを加え、Ficoll‐Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）に懸濁した。自己血清（血漿）を３７℃５分処理してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養した。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画とした。
【００３５】
エフェクター細胞を１ウエルあたりの最終個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に浮遊させた。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物を最終濃度１０μｇ／ｍｌにて加えた。９６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器で培養した。この際、自然解離用と最大解離用のウエルを用意した。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入れた。培養は、３日間室温において静置した。尚、対照は何も加えなかった。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁した（１×１０6／ｍｌ）。
【００３６】
標的細胞である継代培養細胞（Daudi）を遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁した。
【００３７】
上記マイクロテストプレートの各ウエルについて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離して、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養した。
【００３８】
培養したプレートからSOKEN‐PET Σ‐96にて各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
【００３９】
ＬＡＫ活性は以下の表に従って算出した。
0004308350.tif 000005
【００４０】
この結果も合せて表１並びに図１に示す。
【００４１】
【表１】
0004308350.tif 000006
【００４２】
【発明の効果】
被験者ＡおよびＢにおいては、本発明のスクリーニング物質を使用したスクリーニングにおいてＬＡＫ活性の増強効果が認められたため、シイタケ菌糸体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ活性の増強効果が期待できることが判明した。実際にシイタケ菌糸体含有物を経口投与したところ、インビボにおいてもＬＡＫ活性が増強していることが確認され、スクリーニングの妥当性を確認することができた。一方、被験者Ｃにおいては、本発明のスクリーニング物質を使用したスクリーニングにおいてＬＡＫ活性の増強効果が認められなかったため、シイタケ菌糸体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ活性の増強効果は期待できないことが判明した。実際にシイタケ菌糸体含有物を経口投与したところ、インビボにおいてもＬＡＫ活性が増強していないことが確認され、スクリーニングの妥当性を確認することができた。シイタケ菌糸体抽出物を含有するスクリーニング物質を用いて、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強効果をインビトロでスクリーニングすることができた。
【００４３】
よって、本発明のスクリーニング物質に、シイタケ菌糸体抽出物を使用することができるといえる。これにより、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強効果を直接投与する事前にインビトロで簡便に判断することができ、ＬＡＫ活性増強効果の期待できる被験者に対して、ＬＡＫ活性増強物質の効果的な投与を迅速に行うことができるだけでなく、ＬＡＫ活性増強効果の期待できない被験者に対しては、ＬＡＫ活性増強物質の無駄な投与を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物を用いたＬＡＫ活性増強スクリーニングの結果を示す表１のデータを棒グラフにより表す。
【図１】
0004308350.tif 000007