(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型からのＤＮＡの重合を触媒し、３’−５’エキソヌクレアーゼ（プルーフ  リーディング）活性を有し、９２０００〜９６０００ダルトンの見かけの分子量を有し、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）から得られるＤＮＡポリメラーゼより少なくとも２倍高い複製忠実度を示すことを特徴とする、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＳＭ８９７６から得られる、精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
安定剤の存在下に９５℃で２時間インキュベーション後に、その活性の９０％を保持する、請求項１に記載の精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＳＭ８９７６から得られる請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号６に示す式で表される、単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３〜４のいずれか１項に記載の単離されたＤＮＡを含有するベクターであって、該ベクターが該ＤＮＡを含有するプラスミドpBTac2である、前記ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された微生物宿主であって、該微生物宿主が大腸菌（E. coli）LE392 pUBS 520（DSM No.11328）に由来する、前記微生物宿主。
【請求項７】
請求項１〜２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法であって、
（ａ）天然株テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＳＭ８９７６を培養し、
（ｂ）天然株の細胞を緩衝液中に懸濁し、
（ｃ）細胞を破砕し、
（ｄ）いくつかのクロマトグラフィー工程によりＤＮＡポリメラーゼを精製する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項８】
請求項６に記載の微生物宿主株を増殖させ、それからＤＮＡポリメラーゼを精製することを含んでなる、請求項１〜２のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼの調製方法。
【請求項９】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
【請求項１０】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、ＤＮＡ塩基配列決定法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、極めて熱安定性の高い酵素に関する。さらに詳しくは本発明は、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から得られる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
ＤＮＡポリメラーゼは、特にＤＮＡの複製と修復に関与する酵素のファミリーである。大腸菌（E. coli）のような中温性の微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離について広範な研究が行われている（例えば、Bessman et al.（1957）J. Biol. Chem. 223: 171-177、およびButtin and Kornberg,（1966）J. Biol. Chem. 241: 5419-5427を参照されたい）。
テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）のような好熱性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離と精製についても研究が行われている（Chien, A. et al.,（1976）, J. Bacteriol. 127: 1550-1557）。さらにテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）ＹＴ１株からの最適温度が８０℃のＤＮＡポリメラーゼの単離と精製が報告されている（ＥＰ０２５８０１７およびＵＳ４，８８９，８１９）。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは５’−３’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有するが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは３’−５’プルーフリーディング（校正）エキソヌクレアーゼ機能を持たないことが研究により示されている（Lawyer, F.C. et al.,（1989）J. Biol. Chem., 264: 6427-6437. Bernad A., et al.（1989）Cell 59: 219）。その結果、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは塩基取り込みエラーを起こしやすく、いくつかの応用ではその使用が好ましくない。例えば、どの遺伝子のコピーも、ランダムな誤った取り込み現象によるエラーを含みうるため、増幅された遺伝子をクローニングしようとすることは問題が多い。ＰＣＲサイクルのどこ（例えば、複製サイクルの初期）でエラーが起きるかにより、増幅された全ＤＮＡが、誤って取り込まれた塩基を含有し、従って突然変異した遺伝子産物を生成する可能性がある。さらに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの熱安定性が１００℃で数分以内であることが研究により示されている。
合成された核酸配列の誤って取り込まれたかまたは一致しない塩基は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により排除されるため、この活性は一般に好ましいと考えられている。従って３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用するＰＣＲの忠実度は向上する。このような酵素は、例えばピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のＤＮＡポリメラーゼである（Lundberg et al.,（1991）Gene., 108: p.1-6）。
他のより最近の研究は、テルモコッカス（Thermococcus）種のような始原細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの単離と精製（ＥＰ０４５５４３０）に集中し、特にテルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）から得られる精製したＤＮＡポリメラーゼが報告されている。また組換え的調製とこの酵素をコードする遺伝子は当該分野で公知である（ＥＰ０５４７９２０）。
ＥＰ０４５５４３０号では、ピロコッカス（Pyrococcus）種のＤＮＡポリメラーゼも報告され、その遺伝子は、大腸菌（E. coli）において機能性酵素の発現のために除去されるイントロンをも含有する。
ＥＰ０７０１０００ＡとProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, No.11,（1996）pg. 5281-5285では、非常に強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ９°Ｎ７が記載されている。しかし９°Ｎ７ポリメラーゼは、１本鎖ＤＮＡ（プライマー）を分解する傾向を示すことが観察されている。従ってエキソヌクレアーゼ活性が調節されており、天然の酵素として多くの用途により有用な突然変異９°Ｎｍポリメラーゼが得られている。しかしＰＣＲのために９°Ｎｍポリメラーゼを使用すると（図６を参照）、例えばＴａｑポリメラーゼを使用する時に起きる規定されたＰＣＲ産物ではなく、（ゲル中で観察される高分子スメアから推定されるように（図６））プライマー−鋳型非依存性のＤＮＡ合成が起きるようである。従って天然のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ調節された９°Ｎ７ポリメラーゼも、ＰＣＲではうまく使用されていない。
ＷＯ９２／０３５５６には、プルーフリーディング活性を示す、真正細菌テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが記載されている。しかし、他のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰｆｕポリメラーゼまたはＴｇｏポリメラーゼ）と比較して、Ｔｍａポリメラーゼは比較的低い忠実度を示す（Flaman, J.M., Frebourg, T., Moreau, V., Charbonnier, F., Martin, C., Ishioka, C., Friend, S.J. and Iggo, R.（1994）Nucl. Acids. Res. 22, 3259-3260；Cline, J., Braman, J C. and Hogrefe, H.H.（1996）Nucl. Acids. Res. 24, 3546-3551）。
ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）から得られるＤＮＡポリメラーゼは、ＷＯ９２／０９６８９に記載され、これは比較的高い忠実度を示す。
従って当該分野では、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、かつＰＣＲ法の改良するのに適した、精製された高い熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを取得し、生産したいという要求がある。
本発明は、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）（Ｔｇｏ）のＤＮＡポリメラーゼを、関連するＤＮＡおよびアミノ酸配列情報、組換え発現ベクターおよび該ＤＮＡポリメラーゼの精製プロトコールとともに提供することにより、この要求を満たすものである。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えばピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）から得られるような既知のＤＮＡポリメラーゼより２倍以上の複製忠実度を示す。さらなる利点は、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼに見られる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はまた、非特異的配列に結合したプライマーのデフレイド（defrayed）末端を分解し、その結果ヘリックスの長さを短縮するためにプライマーの結合を不安定にすることにより、ＰＣＲの非特異的バックグランド増幅を低下させることができることである。従って予想外にも、Ｔｇｏポリメラーゼは、高忠実度のＤＮＡ合成を必要とする増幅プロトコールにおいて既知のＤＮＡポリメラーゼより優れている（図８〜１０を参照）。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）のＤＮＡポリメラーゼの別の有利な性質は、遺伝子は、大腸菌（E. coli）中で発現させるために除去しなければならない介在配列を含有しないことである。
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）から得られる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡの鋳型指令重合を触媒し、見かけの分子量約９２，０００〜９６，０００ダルトンを有し、非イオン性界面活性剤［例えば、０．０１％Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）（ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ）または０．０１％ノニデットＰ４０（登録商標）（エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ）］のような安定剤の存在下で９５℃で２時間インキュベートした後にその活性の９０％を保持している。
さらに、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から得られる９２，０００〜９６，０００ダルトンの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡが単離され、これは大腸菌（E. coli）中で発現させることにより本発明の熱安定性酵素を得ることを可能にする。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から得られたＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を、配列番号６に示す。組換えテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼはまた、３’−５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有する。さらにテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）からのＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は介在配列を含有しない。
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）は、ロシア科学アカデミー（Russian Academy of Scineces）（モスクワ、ロシア）の微生物研究所（Institute of Microbiology）のE.A. Bonch-OsmolovskayaとV.A. Svetlichnyにより単離された。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）は、ニュージーランドの熱噴気口から単離された新株である。この株は、Ｔ・セラー（T. celer）、Ｔ・リトラリス（T. litoralis）またはＴ・ステテリ（T. stetteri）とＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を示さない（E.A. Bonch-Osmolovskaya、未公表データ）。
本明細書の好適な熱安定性酵素は、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＳＭ８９７６（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweigに寄託されている）から得られるＤＮＡポリメラーゼである。この微生物は、５５℃〜９８℃の範囲で増殖する、極めて好熱性でイオウ代謝性の始原細菌である。
この酵素の好適な単離・精製法は、以下の多段工程法を使用して、すべての増殖後に行われる。
まず凍結細胞を融解し、緩衝液Ａ（４０mMトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４；０．１mM  ＥＤＴＡ、７mM  ２−メルカプトエタノール；１mM  Pefabloc SC（登録商標）（４−（２−アミノエチル）−ベンゾールスルホニルフルオリド））のような適切な緩衝液中に懸濁し、１，２００バールの高圧で破砕する。抽出物にＫＣｌを最終濃度４００mMになるように加え、溶液を遠心分離して清澄化する。次に上清を、核酸結合性タンパク質に対して強い親和性を有するヘパリンセファロースＣ１  ６Ｂカラム（Pharmacia）に通す。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）の上清溶液中に存在する核酸と他のタンパク質の多くはカラムを通過し、２カラム容量の緩衝液Ａでカラムを洗浄することにより除去される。洗浄後、緩衝液Ａ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液で酵素を溶出する。ピークＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、ＤＥＡＥセファセルカラム（Pharmacia）にアプライする。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、洗浄後、緩衝液Ａ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液で酵素活性を溶出する。ピークＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、セルロースホスフェートカラム（Whatman）にアプライする。再度緩衝液Ａ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液で酵素を溶出する。この段階で酵素は約４０％の純度である。
大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩおよびテルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼのような既知の分子量のＤＮＡポリメラーゼと比較すると、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から得られるＤＮＡポリメラーゼの見かけの分子量は、約９２，０００〜９６，０００ダルトンである。しかし極端に好熱性の微生物由来のタンパク質として、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼは、完全には変性しないかまたは他の固有の性質のために、電気泳動中に異常な相対的分子量で泳動することがあることを理解されたい。本発明の熱安定性酵素の正確な分子量は、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード配列から決定される。このＤＮＡポリメラーゼの分子量は、任意の技術、例えばSpanos, A. and Hubscher, U.,（1983）Methods in Enzymology 91: 263-277に記載のようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、in situ分析により決定される。
ポリメラーゼ活性は、放射能標識したデオキシヌクレオチドのＤＮＡｓｅ処理したかまたは活性化したＤＮＡへの取り込み、次にＤＮＡ基質からの取り込まれていないデオキシヌクレオチドの分離により、測定した。Lehman, I.R., et al.（1958）J. Biol. Chem. 233: 163に記載のように、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡを含む酸不溶性画分中の放射能の量に比例するか、またはHoltke, H.-J; Sagner, G; Kessler, C.; and Schmitz, G.,（1992）Biotechniques 12: 104-113に記載の方法に従って化学発光を使用して、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取り込みと取り込まれたジゴキシゲニン−ｄＵＴＰの測定による。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、９５℃で非常に高い熱安定性を有する。これは、安定剤の存在下で９５℃で１２０分間インキュベート後に、その活性の約９０％を保持する。熱安定性は、単一の放射能標識デオキシヌクレオチドを除いたすべてのアッセイ成分（緩衝液、ＭｇＣｌ2、デオキシヌクレオチド、活性化ＤＮＡ、および０．０１％Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）や０．０１％ノニデットＰ４０（登録商標）のような安定剤）の存在下で、目的の温度で酵素をプレインキュベートすることにより測定される。１〜１２０分のあらかじめ決められた時間間隔で、少量のアリコートを取り出し、前記の方法の１つを使用してポリメラーゼ活性を測定する。
本発明の熱安定性酵素はまた、この酵素をコードする遺伝子がテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ゲノムＤＮＡからクローン化されているため、組換えＤＮＡ技術によっても産生される。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの完全なコード配列は、約２．３ｋＢのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限断片上にプラスミドｐＢＴａｃ２Ｔｇｏから得られる。
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの組換え体の産生は、以下の工程を含む。活性型のポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離する。これは、例えばプローブとして配列番号１に記載のＤＮＡ配列を使用して、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）のゲノムＤＮＡから得られるＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより行われる。プローブにハイブリダイズするテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）のＤＮＡ断片を含有するクローンを単離し、プラスミド挿入物のヌクレオチド配列を決定する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード領域と両側に位置するフランキング配列の完全な単離は、初回のスクリーニングのようにして別の制限酵素を用いてテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡを制限断片化し、逆ＰＣＲにより行うことができる（Innis et al.,（1990）PCR Protocols, Academic Press, Inc., p. 219-227）。これは、遺伝子部分の外側のＤＮＡ配列で結合する合成オリゴヌクレオチドプライマー（しかし、例えば配列番号２および３とは反対の方向のもの）を用いて行われる。鋳型としては、制限消化により切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと接触させて環状化したテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡを用いる。全ポリメラーゼ遺伝子のコード領域を単離するために、配列番号４および５に示すプライマーを使用してゲノムＤＮＡから直接的に完全なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を増幅し、線状化した発現ベクターに適合する末端を導入して、別のＰＣＲを行う。
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遺伝子は、原核生物または真核生物宿主／ベクター系で発現できるように、適切な制御配列に機能しうる形で連結される。ベクターは好ましくは、適切な宿主での形質転換と維持に必要なすべての機能をコードし、ポリメラーゼ発現のための選択マーカーおよび／または制御配列をコードしてもよい。活性な組換え体熱安定性ポリメラーゼは、連続的にまたは発現の誘導後に、形質転換された宿主培養物により産生され得る。活性熱安定性ポリメラーゼが細胞膜を通って分泌されるなら、宿主細胞または培養物から回収することができる。
また、クローニングと発現の間、大腸菌（E. coli）中でテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）熱安定性ポリメラーゼ発現が厳密に調節されることが好ましい。本発明の実施に有用なベクターは、以下の調節の特徴の一部またはすべてを提供することにより、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ポリメラーゼの種々の程度の調節発現を提供すべきである：（Ｉ）ポリメラーゼ遺伝子の開始部に直接隣接するかまたは融合タンパク質としての、プロモーターまたは転写開始部位、（２）遺伝子発現を開始または停止するのに使用されるオペレーター、（３）翻訳を高めるためのリボソーム結合部位、および（４）安定性を高めるための転写または翻訳停止部位。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ポリメラーゼのクローニングおよび発現に使用される適切なベクターには、例えばファージやプラスミドがある。ファージの例としては、ラムダｇｔ１１（Promega）、ラムダダッシュ（Stratagene）、ラムダＺａｐII（Stratagene）がある。プラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＴａｃ２（Boehringer Mannheim）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）、ｐＳＰ７３（Promega）、ｐＥＴ３Ａ（Rosenberg, A.H. et al.,（1987）Gene 56: 125-135）およびｐＥＴ１１Ｃ（Studier, F.W. et al.（1990）Methods in Enzymology, 185: 60-89）がある。本発明によれば、プラスミドの使用（特にｐＢＴａｃ２）が有利であると分かった。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を担うプラスミドｐＢＴａｃ２は、ｐＢＴａｃ２Ｔｇｏと呼ばれる。
形質転換、ファージ感染そして細胞培養には、標準的プロトコールが存在する（Maniatis, et al.（1982）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。プラスミド形質転換に使用できる多数の大腸菌（E. coli）株の中で好適な株は、ＪＭ１１０（ＡＴＣＣ  ４７０１３）、ＬＥ３９２ｐＵＢＳ５２０（Maniatis et al. 前掲；Brinkmann et al.,（1989）Gene 85: 109-114）、ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３８７６）、ＸＬ１（Stratagene）、およびＲＲ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１３４３）、およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（Studier, F.W. et al.,（1990）Methods in Enzymology,前掲）がある。本発明によれば大腸菌（E. coli）株ＬＥ３９２ｐＵＢＳ５２０が有利であると分かった。プラスミドｐＢＴａｃ２Ｔｇｏで形質転換された大腸菌（E. coli）株ＬＥ３９２ｐＵＢＳ５２０は、大腸菌（E. coli）ｐＢｔａｃ２Ｔｇｏ（ＤＳＭ  Ｎｏ．１１３２８）と呼ばれる。大腸菌（E. coli）株ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Stratagene）は、ラムダファージのために使用できる株の１つであり、Ｙ１０８９は、ラムダｇｔ１１溶原性のために使用できる。形質転換された細胞は好ましくは３７℃で増殖させ、クローン化した遺伝子の発現をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を用いて誘導する。
組換え体ＤＮＡポリメラーゼの単離は、標準的方法により行われる。大腸菌（E. coli）抽出物からのＤＮＡポリメラーゼの分離と精製は、標準的方法により行われる。これらの方法は例えば、塩沈殿や溶媒沈殿のような溶解度を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特異的相互作用を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、および等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法がある。
組換え酵素の単離と精製のための１つの好適な方法は、以下の多段階法を使用して行われる。
凍結細胞を融解し、最終濃度１mMのPefabloc SCの存在下で緩衝液Ａ（４０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５；０．１mM  ＥＤＴＡ；７mM  ２−メルカプトエタノール）のような適切な緩衝液中に懸濁し、リゾチーム（２００μg/ml）を４℃で３０分攪拌しながら添加して溶解する。デオキシコール酸ナトリウムを、最終濃度０．０５％となるように加える。さらに３０分インキュベートした後、ＫＣｌを最終濃度０．７５Ｍとなるように加える。懸濁液を７２℃で１５分間インキュベートし、遠心分離する。上清を硫酸アンモニウムで２５％飽和に調整し、次にTSK Butyl Toyopearl 650C（TosoHaas）のような疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにアプライする。核酸と非特異的タンパク質の大部分は、カラムの通り抜け画分と洗浄液部分にあり、ポリメラーゼは、緩衝液Ａ（１０％グリセロールをさらに含む）中の硫酸アンモニウムの３０％〜０％飽和の次第に低下する勾配液の最後に溶出する。ポリメラーゼ活性画分をプールし、１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａに対して透析し、１０mM塩化マグネシウムに調整し、Fractogel TSK AF-Blueカラム（Merck）のようなヌクレオチド結合性酵素用の高アフィニティカラムにアプライする。カラムを、１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａで洗浄し、ポリメラーゼタンパク質を緩衝液（１０％グリセロールをさらに含む）中の０〜３Ｍ  ＮａＣｌ線形勾配液で溶出する。ポリメラーゼ画分をプールし、保存緩衝液Ｂ（２０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．０；０．１mM  ＥＤＴＡ；１０mM  ２−メルカプトエタノール；５０mM硫酸アンモニウム；５０％グリセロール）に対して透析し、−２０℃で保存する。
本発明のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼは、酵素が必要であるかまたは所望される任意の目的に使用される。例えば、ｃＤＮＡクローニングおよびＤＮＡ配列決定における第２鎖ｃＤＮＡ合成を含む組換えＤＮＡ技術において使用できる。Maniatis et al.（前掲）を参照のこと。
本発明のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）は、３’−５’エキソヌクレアーゼ機能を不活性化するために、化学的または遺伝的（部位特異的またはランダム）に修飾することができ、このような修飾酵素が所望される任意の目的（例えば、ＤＮＡ配列決定またはＤＮＡ標識化）に使用される。
さらに、本発明のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼはまた、例えばＥＰ０２００３６２、ＥＰ０２０１１８４およびＥＰ０６９３０７８に開示される方法により、ＤＮＡを増幅するのに使用される。
以下の実施例は、現在その実施が好適である本発明の実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は例示のためであり、決して請求の範囲以外の記載を限定するものであると解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
図１：
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）由来の部分精製したおよび精製した組換え体ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析。
レーン１：１μｌの粗抽出物。
レーン２：１回目のクロマトグラフィー工程（TSK Butyl Toyopearl 650C）後に得られた５μｌのポリメラーゼ画分。
レーン３：２回目のクロマトグラフィー工程（Fractogel Blue）後に得られた５μｌの画分。
レーン４：２回目のクロマトグラフィー工程（Fractogel Blue）後に得られた１０μｌの画分。
レーン５：テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）由来の１０単位のＤＮＡポリメラーゼ。
レーン６：分子量マーカー。
レーン７：ピロコッカス・ウーゼイ（Pyrococcus woesei）由来の１０単位のＤＮＡポリメラーゼ。
レーン８：分子量マーカー。
図２：
大腸菌（E. coli）のクレノウ断片、ＰｏｌＩ、および実施例１に記載のテルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼと比較した、天然および組換え体テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼのin situ活性分析。天然および組換え体テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼは、同じ電気泳動移動度を有する。
図３：
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号６）と推定アミノ酸配列（配列番号７）
図４：
実施例５に記載のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼの熱安定性の測定。
図５：
実施例６に記載の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の分析。
デスオキシヌクレオチド三リン酸の非存在下（−ｄＮＴＰ）および存在下で（＋ｄＮＴＰ）で、種々の量（単位は図に示す）のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ断片とインキュベートした。対照１および２：ＤＮＡポリメラーゼのない対照反応。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はｄＮＴＰの有無に依存する。
図６：
Ｃｙ５−ｄＵＴＰの取り込みに関する種々の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、９°Ｎｍ、Ｔａｑ）の比較。反応混合物は、２mM塩化マグネシウム、３０nMずつの各プライマー、１ng  ＤＮＡおよび２００μＭデオキシヌクレオチドを含有した。緩衝液の条件は、酵素の供給業者が推薦するとおりに使用した。マウスのβ−アクチン遺伝子が挿入されているプラスミドＤＮＡを使用した。ＴＴＰは部分的にＣｙ５−ｄＵＴＰで置き換えられた。反応混合物はＣｙ５−ｄＵＴＰ：ＴＴＰを以下の比で含有した：６５：３５（レーン１）、５０：５０（レーン２）、３５：６５（レーン３）、１５：８５（レーン４）。対照として上記反応を、修飾ヌクレオシド三リン酸無しで行なった（レーン５）。
図７：
さまざまな量のＴｇｏポリメラーゼと異なる塩化マグネシウム濃度を用いたＰＣＲにおけるＴｇｏポリメラーゼの使用。
図８：
さまざまな量のＴｇｏポリメラーゼを用いたＰＣＲにおけるＴｇｏポリメラーゼの使用：ＴｇｏとＰｆｕポリメラーゼの比較。
図９：
λ−ＤＮＡの増幅；ＴｇｏとＰｆｕポリメラーゼの比較。
図１０：
ＴｇｏとＰｆｕポリメラーゼの比較；ＰＣＲに及ぼすＫＣｌ濃度の影響の試験；各アッセイで２．５Ｕのポリメラーゼを使用した。
実施例１
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの精製
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）（ＤＳＭ８９７６）を、以下のように調製した培地中で増幅させた：ＫＣｌ、３２５mg/l；ＭｇＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２．７５mg/l；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３．４５mg/l；ＮＨ4Ｃｌ、０．２５mg/l；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．１５mg/l；ＫＨ2ＰＯ4、０．１５mg/l；ＮａＣｌ、１８g/l；ＮａＨＣＯ3、１g/l；微量元素、４ml/l（Balch et al.,（1979）Micobiol. Rev. 43: 260）、ビタミン、４ml/l（Balch、前述）；Rezazurin、１mg/l；０．２％のＦｅ（ＮＨ2）2（ＳＯ4）2・７Ｈ2Ｏ溶液０．４ml/lを含有するミネラル溶液を沸騰させ、冷却した。以下の成分を記載した最終濃度で加えた：ペプトン、５g/l；酵母エキス、１g/l；Ｎａ2Ｓ・９Ｈ2Ｏ、２５０mg/lおよびシステイン−ＨＣｌ、２５０mg/l、ｐＨは６．２〜６．４に調整した。インキュベーション温度は８８℃であった。細胞を室温に冷却し、遠心分離して集め、−７０℃に保存した。細胞６ｇを、１mM  Pefabloc SC（登録商標）を含有する１２mlの緩衝液Ａ（４０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５；０．１mM  ＥＤＴＡ；７mM  ２−メルカプトエタノール）中に懸濁し、１２００バールの圧力で破砕した。ＫＣｌを最終濃度４００mMとなるまで加え、溶解し、この溶液を４８，２００ｘｇ、４℃で３０分遠心分離した。上清を３１mlのヘパリンセファロースＣ１６Ｂカラム（Pharmacia）に通した。次にカラムを６２mlの緩衝液Ｂ（１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａ）で洗浄した。カラムを、緩衝液Ｂ中０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液３１０mlで溶出した。ＤＮＡポリメラーゼは、３０〜４５mS/cmの間で溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む画分をプールし、それぞれ６００mlの緩衝液Ｂで２回透析し、１８mlのＤＥＡＥセファセルカラム（Pharmacia）にアプライした。カラムを２カラム容量の緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ｂ中０〜０，９Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液１６０mlで溶出した。ポリメラーゼ活性は４〜１４mS/cmの間で溶出した。画分をプールし、緩衝液Ｂ（各２００ml）に対して２回透析し、４mlのセルロースリン酸Ｐ１１カラム（Whatman）にアプライした。カラムを８mlの緩衝液Ｂで洗浄し、活性を０〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液４０mlで溶出した。１３〜３２mS/cmの間で溶出する活性画分をプールし、２５％飽和の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液Ｂに対して透析し、４mlのTSK Butyl Toyopearl 650Cカラム（TosoHaas）にアプライした。カラムを８mlの２５％硫酸アンモニウム飽和緩衝液Ｂで洗浄し、２５％〜０％硫酸アンモニウム飽和緩衝液Ｂの次第に低下する勾配液４０mlで溶出した。ポリメラーゼは７４〜３１mS/cmの間で溶出し、プールを緩衝液Ｂに対して透析し、４mlのFractogel TSK AF-Orangeカラム（Merck）にアプライした。カラムを８mlの緩衝液Ｂで洗浄し、０〜２．０Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液８０mlで溶出した。活性画分（７６〜１０４mS/cmの間）をプールし、保存緩衝液Ｃ（２０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．０；０．１mM  ＥＤＴＡ；１０mM  ２−メルカプトエタノール；５０mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；５０％グリセロール）に対して透析し、−２０℃で保存した。この工程の後、ＤＮＡポリメラーゼの純度は約４０％であった。
単離したＤＮＡポリメラーゼの分子量は、Spanos, A. and Hubscher, U.（前掲）が記載した方法の変法に従って、「活性ゲル分析」（activity gel analysis）により測定した。ＤＮＡポリメラーゼ試料を、活性化ウシ胸腺ＤＮＡを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．８；１mM  ＥＤＴＡ；３mM  ２−メルカプトエタノール；５０mM  ＫＣｌ；５％グリセロール中のゲル中でポリメラーゼを復元した。Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を用いるＤＮＡの標識付けは、次の緩衝液（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．８；７mM  ＭｇＣｌ2；３mM  ２−メルカプトエタノール；１００mM  ＫＣｌ；１２μＭ  ｄＧＴＰ；１２μＭ  ｄＣＴＰ；１２μＭ  ｄＡＴＰ；６μＭ  ｄＴＴＰ；６μＭ  Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）１０ml中で行なった。まずゲルを室温で（３０分）攪拌しながらインキュベートし、次に５℃ずつの温度上昇で７２℃までゆっくり加熱した。中温性調節ポリメラーゼのポリメラーゼ活性も検出するために、各温度間隔でＤＮＡ合成を３０分間進行させた。次にゲルを洗浄し、ＤＮＡをナイロン膜（Boehringer Mannheim）にブロットし、ＵＶで架橋した。「Boehringer Mannheim’s Dig System User’s Guide for Filter Hybridization」に記載のプロトコールを使用して、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡを検出した。同じゲルで、分子量マーカーである大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、テルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウ断片を分析した。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）から単離したＤＮＡポリメラーゼは、図２に示すように９２，０００〜９６，０００ダルトンの範囲の見かけの分子量を有する。
実施例２
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼのクローニング
１．Lawyer, F.C. et al.（1989）J. Biol. Chem. 264: 6427-6437に記載の方法により、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）からのＤＮＡを単離し精製した。
２．ＤＮＡをＢａｍＨＩで制限切断し、低融点アガロースゲルで分離し、変性させ、ナイロン膜上にブロットした。ブロットを、配列番号１に示す配列のジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドでつり上げた。シグナルが検出され、ハイブリダイゼーションシグナルに対応する領域を、ゲルから切り出した。ゲル片を溶かし、エタノール沈殿によりＤＮＡを単離した。
３．単離したＤＮＡ断片をプラスミドベクターに結合させ、配列番号１とハイブリダイズさせた。陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、挿入物の核酸配列を決定した。次に得られたＤＮＡ配列を、Braithwaite, D.K. and Ito J.（1993）, Nucl. Acids Res. 21: 787-802に公表されているＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列と比較した。
４．Braithwaite, et al.（前掲）の文献に記載のＢ型ＤＮＡポリメラーゼと高度の相同性を示すクローン化断片の１つの配列から、プライマーである配列番号２と３を設計した。これらのプライマーは、環状鋳型ＤＮＡのフランキングゲノム配列の増幅を可能にするように相反する方向で、クローン化ＤＮＡ断片の末端の近傍に結合する。
５．これらのプライマーを用いて、ＥｃｏＲＩで切断しＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化した、工程ＩからのＤＮＡを用いて、Innis, M.A.（前掲）の方法に従って、「逆ＰＣＲ」を行なった。この方法により、２つの断片が生成し、配列を決定した。読みとり枠が同定できた。推定アミノ酸配列は、ｐｏｌＢ型の既知のＤＮＡポリメラーゼと強い相同性を示した。
６．工程５で同定されたＤＮＡ断片の配列から、新しいプライマーを設計し、これらの配列を配列番号４と５に示すが、これらは読みとり枠の最初と最後に対して相補的であった。プライマーは、産物がプロモーターの転写および翻訳制御下に置かれるような方向で、ＰＣＲ産物中にクローン化可能な末端を導入するための制限部位を有する追加の非相補的５’配列を含有した。
７．ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、精製し、ベクターｐＢＴａｃ２に結合させた。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）からのＤＮＡポリメラーゼを発現するこのクローンを、ｐＢＴａｃ２Ｔｇｏと命名した。
0004308324.tif 000003
実施例３
組換えテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡの発現
実施例２からのベクターを大腸菌（E. coli）株ＬＥ３９２ｐＵＢＳ５２０に形質転換し、発酵槽中で適切な抗生物質を含有する富化培地中で培養した。０．５mM  ＩＰＴＧを用いて光学密度１．２５Ａ540で誘導を行なった。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）からのＤＮＡポリメラーゼは他の方法でもクローン化し、発現させた。
遠心分離して５．４Ａ540の光学密度で細胞を採取し、必要があるまで凍結するか、またはリゾチームで処理して溶解して、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する粗細胞抽出物を調製した。
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する粗抽出物を、実施例１に記載の方法により精製するか、または他の方法（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー）により精製した。
実施例４
組換えテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの精製
２０g/lトリプトン、１０g/l酵母エキス、５g/l ＮａＣｌおよび１００mg/lアンピシリンを含有する培地中で１０リットルの発酵槽中で、大腸菌（E. coli）（ＬＥ３９２ｐＵＢＳ５２０）ｐＢＴａｃ２Ｔｇｏ（ＤＳＭ  Ｎｏ．１１３２８）を増殖させ、指数増殖期の中期で０．５mM  ＩＰＴＧにより誘導し、さらに４時間インキュベートした。遠心分離して約４５ｇの細胞を採取し、−７０℃で保存した。
細胞２ｇを融解し、室温で４mlの緩衝液Ａ（４０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５；０．１mM  ＥＤＴＡ；７mM  ２−メルカプトエタノール；１mM  Pefabloc SC）中に懸濁した。リゾチーム１．２mgを加え、細胞を４℃で３０分間攪拌しながら溶解した。４．５６mgのデオキシコール酸ナトリウムを加え、懸濁液を室温で１０分間インキュベートし、次に０℃で２０分間インキュベートした。粗抽出物を７５０mM  ＫＣｌに調整し、７２℃で１５分間加熱し、遠心分離して変性タンパク質を除去した。
上清を２５％飽和硫酸アンモニウムに調整し、緩衝液Ｂ（１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａ）で平衡化し３０％硫酸アンモニウム飽和にしたTSK Butyl Toyopearl 650Cカラム（１．５×１０cm；１７．７mlベッド容量）にアプライした。カラムを７０mlの緩衝液Ｂで洗浄し、ポリメラーゼを３０％〜０％硫酸アンモニウム飽和と０〜０．２％Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）（v/v）を含有する緩衝液Ｂの１７７mlの線形勾配液で溶出した。
カラム画分をＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、新たに合成されたＤＮＡへのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取り込みにより測定し、取り込まれたジゴキシゲニンの検出と定量は、基本的に以下に記載するように行なった。反応は、５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．５；１５mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；７mM  ＭｇＣｌ2；１０mM  ２−メルカプトエタノール；それぞれ１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２００μg/mlのＢＳＡ；ウシ胸腺からの１２μgのＤＮＡｓｅ活性化ＤＮＡおよび０．０３６μＭのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰおよびテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）からの希釈（０．０５Ｕ〜０．０１Ｕ）した１または２μｌのＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応容量中で行なった。試料を７２℃で３０分間インキュベートし、２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、チューブを氷上に置いた。８μｌの５Ｍ  ＮａＣｌと１５０μｌのエタノール（あらかじめ−２０℃で冷却した）を加えた後、ＤＮＡを氷上で１５分間インキュベートして沈殿させ、１３，０００rpm、４℃で１０分間遠心分離してペレットにした。ペレットを１００μｌの７０％エタノール（あらかじめ−２０℃で冷却した）と０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、再度遠心分離し、真空下で乾燥した。ペレットを５０μｌのトリス／ＥＤＴＡ（１０mM／０．１mM；ｐＨ７．５）に溶解した。試料５μｌをナイロン膜底の白色マイクロウェルプレート（Pall Filtraionstechnik GmbH, Dreieich, FRG, 製品番号：ＳＭ０４５ＢＷＰ）のウェルにスポットした。７０℃で１０分間ベーキングしてＤＮＡを膜に固定した。ＤＮＡを入れたウェルに、０．４５μｍフィルターで濾過した１％ブロッキング溶液（マレイン酸、１００mM；ＮａＣｌ、１５０mM；カゼイン、１％（w/v）；ｐＨ７．５）１００μｌを満たした。以後のすべてのインキュベーション工程は、室温で行なう。２分間インキュベーション後、溶液を真空マニホールドにより−０．４バールで膜を通して吸引した。洗浄工程を１回繰り返してから、上記のようにブロッキング溶液で希釈した１：１０，０００希釈の抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片（Boehringer Mannheim、FRG、Ｎｏ．１０９３２７４）１００μｌでウェルを満たす。２分間インキュベートし膜を通して溶液を吸引した後、この工程を１回繰り返す。ウェルを真空下で２００μｌの洗浄緩衝液１（マレイン酸、１００mM；ＮａＣｌ、１５０mM；ツイーン（登録商標）２０、０．３％（v/v）；ｐＨ７．５）で２回洗浄する。真空下で２００μｌの洗浄緩衝液２（トリス−塩酸、１０mM；ＮａＣｌ、１００mM；ＭｇＣｌ2、５０mM；ｐＨ９．５）でさらに２回洗浄後、洗浄緩衝液２で１：１００希釈した５０μｌのＳＣＰＤ（登録商標）（Boehringer Mannheim、Ｎｏ：１６５５８８４）（これは以後のアルカリ性ホスファターゼ反応の化学発光基質として働く）と共にウェルを５分間インキュベートする。
膜を通して溶液を吸引し、１０分インキュベート後、ＲＬＵ／ｓ（相対的光単位／秒）をルミノメーター（例えばMicroLumat LB 96P（EG&G Berthold, Wilbad， FRG））で検出する。
一般的に定義されているポリメラーゼ単位に対して相対的光単位を相関付けるために、標準酵素としてＴａｑＤＮＡポリメラーゼの連続希釈物を使用して標準曲線を作成した。Ｔａｑポリメラーゼは、供給業者の推奨する緩衝液中でアッセイした。標準曲線の直線範囲を使用して、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ調製物の相対的活性を測定した。
活性画分をプールし、５００mlの緩衝液Ｂに対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したFractogel TSK Butyl AF-Blueカラム（１×１０、７．８mlベッド容量）にアプライした。１５mlの緩衝液Ｂで洗浄後、０．０５％Ｔｈｅｓｉｔを補足した緩衝液Ｂ中の０〜３Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配液１５６mlで溶出した。活性画分をプールし、保存緩衝液Ｃ（２０mMトリス−塩酸、ｐＨ８，２：１０mM  ２−メルカプトエタノール；０．１mM  ＥＤＴＡ；５０mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；５０％グリセロール）に対して透析した。０．５％のノニデット（登録商標）Ｐ４０（v/v）と０．５％のＴｈｅｓｉｔ（登録商標）（v/v）を加えた後、調製物を−２０℃に保存した。
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）からの組換えＤＮＡポリメラーゼの特性決定
組換え体および天然のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼは、８〜２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルで電気泳動した時、同じ見かけの分子量を有した。組換えテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼは、天然の酵素の熱安定性を保持している。組換えテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼは、天然のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼと同じ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、過剰のｄＮＴＰによる阻害に対しても感受性である。
実施例５
テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性
実施例１に記載のように精製したテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）からのＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を、以下のように測定した。５単位のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ポリメラーゼを、１００μｌの以下の緩衝液（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．８（２５℃で）；１５mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；７mM  ＭｇＣｌ2；１０mM  ２−メルカプトエタノール；２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ；０．１％ノニデットＰ４０、０．１％Ｔｈｅｓｉｔ；２５μｇ  ＤＮＡｓｅ処理子牛胸腺ＤＮＡ）中９５℃でインキュベートした。０、５、１０、１５、３０、４５、６０および１２０分に１５μｌの試料を採取した。残りのポリメラーゼ活性は、実施例４に記載のように、１５０ｎＣｉの3Ｈ−ＴＴＰをさらに含有する上記のインキュベーション混合物５０μｌ中のＤＮＡへの標識3Ｈ−ＴＴＰの取り込みを定量することにより測定した。７２℃で３０分インキュベーション後、３００μｌの１０％ＴＣＡを加えて反応を停止させ、０℃で１０分後、混合物を３ＭＭフィルター（Whatman）にアプライした。フィルターを、各回約１０mlの５％ＴＣＡで３回洗浄し、７５℃で１０分乾燥し、各フィルターのＤＮＡに結合した放射能を、ＬＫＢラックベータ１２１７／１２１８（Pharmacia）中のシンチレーションバイアル中の５mlのシンチレーション液で測定した。
図４に示すように、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼは、９５℃で１２０分インキュベーション後に、その初期の活性のほぼ９０％を維持した。Ｐｗｏポリメラーゼは同様の安定性を有し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは約１６％のみの残存活性を有した。
実施例６
３’−５’プルーフリーディング活性の測定
一連の単位のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼ（図５を参照）を、５０μｌの以下の緩衝液（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．８；１０mM  ＭｇＣｌ2；７mM  ２−メルカプトエタノールにパラフィンを重曹）中の１mMずつのｄＮＴＰの存在下または非存在下で、１μgのＤＮＡ分子量マーカーVI（Boehringer Mannheim）とともに、７２℃で４時間インキュベートした。１０μｌの停止溶液を添加後、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離した。ｄＮＴＰの非存在下ではＤＮＡ断片のスメアが検出されたかまたはＤＮＡは検出されなかったが、ｄＮＴＰの存在下ではＤＮＡ断片は分解されなかった。
実施例７
ＰＣＲ法におけるテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの忠実度
ＰＣＲ法におけるテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を、機能性ｌａｃＩq対立遺伝子（Frey, B. and Suppmann B.（1995）Biochemica 2: 34-35）を含有するｐＵＣ１９誘導体ｐＵＣＩＱ１７の増幅、環状化および形質転換に基づくアッセイ法で測定した。ｌａｃＩ中のＰＣＲ誘導突然変異は、ｌａｃＺαの発現の脱抑制を引き起こし、次に機能性β−ガラクトシダーゼ酵素が生成され、これはＸ−Ｇａｌ指示プレート上で容易に検出することができる。このｌａｃＩに基づくＰＣＲ忠実度アッセイで測定されるエラー率は、３．４〜２．２・１０-6の範囲であった。
プラスミドｐＵＣＩＱ１７を、テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）のＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅の基質として作用させるために、ＤｒａIIで消化して線状化した。使用した両プライマーは、５プライム末端にＣｌａＩ部位を有した：
0004308324.tif 000004
得られるＰＣＲ産物の長さは３４９３塩基対である。
ＰＣＲは、１．５mM  ＭｇＣｌ2、５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．５（２５℃）、１２．５mM（ＮＨ4）2ＳＯ4、３５mM  ＫＣｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、および２．５単位のテルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼの存在下に、５０μｌの最終容量で行なった。テルモコッカス・ゴルゴナリウス（T. gorgonarius）ＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅反応の条件は、以下の通りである。
サイクル条件は以下の通りである：
0004308324.tif 000005
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物をＰＥＧで沈殿させ（Barnes, W.M.（1992）Gene 112: 229）、ＤＮＡをＣｌａＩで制限切断し、アガロースゲル電気泳動で精製した。単離したＤＮＡを、Rapid DNA Ligation Kit（Boehringer Mannheim GmbH）を使用して連結し、連結生成物を大腸菌（E. coli）ＤＨ５α中に形質転換し、ＴＮＡｍｐＸ−Ｇａｌプレートにまいた。得られたプラスミドｐＵＣＩＱ１７（３６３２塩基対）で形質転換したα補足性大腸菌（E. coli）株ＤＨ５αは、アンピシリン（１００μg/ml）とＸ−Ｇａｌ（０．００４％w/v）を含有するＴＮプレート（１．５％バクトトリプトン、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で白色（ｌａｃＩ+）コロニーを示す。突然変異により青色コロニーが生じる。
３７℃で一晩インキュベーション後、青色および白色コロニーを計測した。１塩基対あたりのエラー率（ｆ）は、Keohavong and Thilly（Keohavong, P. and Thilly, W.（1989）PNAS USA 86: 9253）により公表されている再配列式を用いて計算した：
Ｆ＝−１ｎＦ／ｄ×ｂ塩基対
ここで、Ｆは白色コロニーの割合である：
Ｆ＝白色（ｌａｃＩ＋）コロニー／総コロニー数；
ｄはＤＮＡ重複の数である：
２d＝出力ＤＮＡ／入力ＤＮＡ
および、ｂは、（１０８０塩基対）ｌａｃＩ遺伝子の有効標的サイズであり、これはProvostら（Provost et al.（1993）Mut. Res. 288: 133）によれば３４９塩基対である。
実施例８
忠実度アッセイ
ＰＣＲ条件下のピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）およびテルモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）からのＤＮＡポリメラーゼの取り込みエラー率の測定
多くのＤＮＡポリメラーゼのエラー率が公表されている。例えばピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のＤＮＡポリメラーゼについて、種々のエラー率が測定された（文献１〜５）。これらは、使用される条件（例えば、ヌクレオシド三リン酸濃度、酵素調製物、緩衝液条件、およびもちろん使用した方法）、重複の数の測定、および取り込みエラー率の計算方法により異なる。
従って、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene）およびＴｇｏ（Boehringer Mannheim GmbH）を、同じ系で平行して分析した（プロトコール：Frey, B. and Suppmann B. Boehringer Mannheim Biochemica Information, Nr. 96-1995, 21-23）。
0004308324.tif 000006
結果：
これらのデータは、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼの突然変異頻度はＰｆｕのそれより低く、忠実度（塩基対あたりのエラーで計算）は、いずれの計算方法を使用しても高い。
Ｐｆｕのエラー率を記載する文献：
１．Lundberg, K.S., Shoemaker, D.D., Adams M.W.W. Short, J.M., Sorge, J.A. and 2 Mathur, E.J.（1991）Gene 108, 1-6（１．６×１０-6エラー／塩基）
２．Flaman, J.-M., Frebourg, T., Moreau, V., Charbonnier, F., Martin, C., Ishioka, C., Friend, S.H. and Iggo, R.（1994）NAR 22, 3259-3260。Ｔｌｉ（Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼについて（２×１０-6エラー／塩基）（エラー率の変動はアッセイに依存する）
３．Cariello, N.F., Swenberg. J.A. and Skopek, T.R.（1991）NAR 19, 4193-4198。（２．４×１０-5エラー／塩基）
４．Ling, L.L., Keohavong, P., Dias, C. and Thilly, W.G.（1991）PCR Methods Appl. 1, 63-69。（４．５×１０-5エラー／塩基）
５．Matilla, P., korpela, J., Tenkanen, T. and Pitkanen, K.（1991）NAR 19, 4967-4971。（５．７×１０-5エラー／塩基）
配列表
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：26塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000007
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：24塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000008
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：18塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000009
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：42塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000010
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：33塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000011
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：2322塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..2322
（xi）配列：
0004308324.tif 000012
0004308324.tif 000013
0004308324.tif 000014
0004308324.tif 000015
0004308324.tif 000016
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：773アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：
0004308324.tif 000017
0004308324.tif 000018
0004308324.tif 000019
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：34塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000020
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：36塩基
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=“オリゴヌクレオチド”
（xi）配列：
0004308324.tif 000021
【図１】
0004308324.tif 000022
【図２】
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【図３】
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0004308324.tif 000025
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0004308324.tif 000029
0004308324.tif 000030
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004308324.tif 000037