(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、または配列番号９のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、または配列番号１０の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
細胞障害性Tリンパ球活性を増強できるポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、請求項1又は2に記載の核酸のヌクレオチド配列と少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項４】
UL-16に結合するアミノ酸配列をコードする、請求項3に記載の核酸分子。
【請求項５】
以下の核酸分子：
(a)配列番号２のアミノ酸30〜200又は配列番号４のアミノ酸30〜200を含むポリペプチドをコードする核酸、
(b)前記(a)の核酸の対立遺伝子変異型、
(c)前記(a)のポリペプチドに対して少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが細胞障害性Tリンパ球活性を増強できる核酸、
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１、２、３、４、又は５のいずれか1項に記載の核酸分子からなる群から選択される核酸分子の発現を指令する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、又は５のいずれか1項に記載の核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項８】
SDS-PAGEによる測定でおよそ31kDの分子量を有する請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
非グリコシル化形態にある請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号４又は配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する、単離された抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項１０に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
請求項６に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞。
【請求項１３】
異種調節エレメントと機能的に結合している請求項１〜５のいずれか1項記載の核酸を含む、遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項１４】
発現を促進する条件下で請求項１２または１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】
前記のポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２、配列番号４、または配列番号１０の断片を含むULBPポリペプチドであって、該断片が細胞障害性Tリンパ球活性を増強できる、該ULBPポリペプチド。
【請求項１７】
以下のポリペプチド：
(a)配列番号２のアミノ酸ｘ〜ｙを含むポリペプチド（ただし、ｘは20以上30以下から選択される整数であり、ｙは200以上227以下から選択される整数である）、
(b)配列番号４のアミノ酸ｘ'〜ｙ'を含むポリペプチド（ただし、ｘ'は20以上30以下から選択される整数であり、ｙ'は200以上227以下から選択される整数である）、
(c)配列番号１０のアミノ酸ｘ”〜ｙ”を含むポリペプチド（ただし、ｘ”は16以上26以下から選択される整数であり、ｙ”は196以上223以下から選択される整数である）、および
(d)ポリペプチド(a)〜(c)の少なくとも１つのアミノ酸に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、細胞障害性Tリンパ球活性を増強できるポリペプチド、
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
リンパ腫細胞を検出する方法であって、生物学的サンプルをULBP-1（配列番号２）、ULBP-2（配列番号４）、またはULBP-3（配列番号１０）に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、形成された複合体を検出することを含む、上記方法。
【請求項１９】
請求項7に記載のポリペプチドに結合するタンパク質の生物活性を阻害する薬剤製造のための請求項１０又は１１に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
請求項7に記載のポリペプチドに結合するタンパク質又は該タンパク質を発現する細胞を精製する、インビトロの方法であって、請求項７に記載のポリペプチドを細胞又はタンパク質の混合物と接触させる工程と、請求項7に記載のポリペプチドに結合する細胞又はタンパク質を混合物から単離する工程を含む、方法。
【請求項２１】
IFN-γ産生を上昇させる、ナチュラルキラー細胞の増殖を上昇させる、または細胞障害性Ｔリンパ球活性を上昇させるための、薬剤製造における請求項７に記載のULBPポリプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、いずれも参照によって本明細書に組み入れる、1997年12月17日に出願された米国仮出願第60/069,857号、及び1998年７月15日に出願された米国仮出願第60/092,946号の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は精製かつ単離されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、及び組み換え型の該ポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体、該ポリペプチドを含有する組成物、及び種々のアッセイにおけるこれらの使用に関する。特に、該ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、及び抗体はヒトB細胞リンパ腫の検出、インターフェロンγ（IFN-γ）産生の増大、NK細胞増殖の増大、及び細胞障害性Ｔリンパ球（CTLs）活性の増大のために有用である。
【０００３】
関連技術の記載
１．リンパ腫
悪性リンパ腫は、多様な形態学的及び臨床的発現を伴う複数の疾患を指す。形態学的分類スキームは、病歴、予後、及び治療に対する応答を知るために有効であることが示された。しかしながら、ある場合には特殊な形態学的実体が臨床的もしくは生物学的またはその双方で非常に密接に関連する場合があるが、一方、形態学的類似性を共有する他の疾患が臨床的及び生物学的に全く異なることもある。従って、免疫学的方法は、ある種のヒトの腫瘍の診断及び分類、特に白血病及びリンパ腫のために必須の手段となっている。
【０００４】
より具体的には、悪性腫瘍をもつ何人かの患者で、腫瘍関連または他の悪性細胞関連表面決定基に対する抗体、並びに種々の分化及び他の非腫瘍抗原に対する抗体が産生されていることが見出された。こうした抗体の検出のために、数種の非常に感度の高い免疫学的手法が開発された。
【０００５】
造血系悪性腫瘍の他の種々のマーカーによって、形態学的または組織化学的パラメーターでは不可能な、臨床的に価値のある分類が可能となる。これらのマーカーは免疫学的手法を用いて検出することもできる。腫瘍関連マーカーの測定のための他の方法よりもこれらの手法が優れている主要な点の一つは、ナノグラム、あるいはピコグラムレベルの物質でさえしばしば検出できる、高レベルの感度である。更に、免疫学的試験は、密接に関連した構造を有する物質の中で、通常非悪性状態で見出される腫瘍関連アナログを識別し、更に同定する能力を有する。
【０００６】
多くの腫瘍関連マーカーは、悪性腫瘍を有する患者の血清または他の体液中で検出されてきた。２〜３のこれらのマーカーは腫瘍を有する個人に限定され、悪性疾患の検出もしくは分化診断（またはその双方）に十分役立ってきた。しかしながら、ほとんどのマーカーは、非悪性疾患の患者でしばしばマーカーレベルの上昇が認められ（すなわち擬陽性結果）、こうした応用のための十分な特異性を欠いていることが見出された。
【０００７】
更に、悪性リンパ腫は通常新生物の要素及び正常な要素またはその双方の混合である。悪性リンパ腫から調製した細胞懸濁液は良性及び悪性細胞の混合物から構成され、悪性細胞は必ずしも多数派ではないことがある。悪性細胞の表現型を決定するためには、新生物細胞と関連したマーカーを同定することが必要である。
【０００８】
悪性状態と関連した更なる細胞表面マーカーの同定が当分野において必要とされていることは明らかである。特に、悪性リンパ腫と関連した細胞表面マーカーに対し、持続した需要がある。悪性リンパ腫と関連した特異的細胞表面マーカーの同定は、これらのマーカーと関連した悪性腫瘍の検出の一助となるであろう。
【０００９】
２．NK細胞
循環単核球細胞の主要な型の一つは、ナチュラルキラー、すなわちNK細胞である（M. Manoussakaら, Journal of Immunology 158:112-119, 1997）。NK細胞は、骨髄前駆体由来の細胞型である（O. Hallerら, Journal of Experimental Medicine 145:1411-1420, 1977）。NK細胞はT細胞に密接に関連していると考えられ、この２つの細胞型は多くの細胞表面マーカーを共有している（M. Manoussakaら, 1997）。NK細胞はある種のT細胞と同様に細胞障害性の細胞であるが、T細胞と異なり、NK細胞はT細胞受容体またはCD3成分を発現しない（P. Scott及びG. Trinichieri, Current Opinion in Immunology 7:34-40, 1995: G. Trinichieri, Adv. Immunology 47:187-376, 1989）。NK細胞は通常CD16及びCD56抗原を発現する（K. Oshimi, International Journal of Hematology 63:279-290, 1996）。細胞障害性T細胞（CTL）と同様に、NK細胞は種々の細胞型を溶解することによって細胞障害性の効果を示すことができる（G. Trinichieri, 1989）。NK細胞は、MHCに制限されずに細胞障害性を発揮する（E. Ciccioneら, J. Exp. Med. 172:47, 1990; A. Morettaら, J. Exp. Med. 172:1589, 1990; 及びE. Ciccioneら, J. Exp. Med. 175:709）。
【００１０】
NK細胞は、インターフェロンγ（IFN-γ）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、インターロイキン-３（IL-３）、及びIL-８等のサイトカインの分泌を介してその機能のいくつかを仲介する（P. Scott及びG. Trinichieri, 1995）。
【００１１】
IL-２、IL-12、TNF-α、及びIL-１を含むサイトカインはNK細胞を誘導してサイトカインを産生させる（P. Scott及びG. Trinichieri, 1995）。IFN-α及びIL-２はNK細胞の細胞障害性活性の強力な誘導物質である（G. Trichieriら, Journal of Experimental Medicine 160:1147-1169, 1984; G. Trichieri及びD. Santoli, Journal of Experimental Medicine 147:1314-1333, 1977）。NK細胞はIL-２の存在下で刺激され、増殖（expand）することができる（K.Oshimi, International Journal of Hematology 63:279-290, 1996）。IL-12は、Ｔ及びNK細胞からのサイトカイン産生を誘導し、NK細胞介在型細胞障害性を増大させることが示された（M. Kobayashiら, Journal of Experimental Medicine 170:827-846, 1989）。
【００１２】
NK細胞は、正常な幹細胞、感染細胞、及び形質転換細胞を含む、種々の細胞型を溶解させることができる（D. Seeら, Scand. J. Immunol., 46:217-224, 1997）。MHCクラスIを欠く細胞はNK細胞介在型溶解を受けやすい（H. Reyburnら, Immunol. Rev. 155:119-125, 1997）。この細胞溶解は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、及びパーフォリン（perforin）を含有する細胞質顆粒の作用を通して生じる（D. Seeら, 1997）。CD2及びCD11aに対する抗体はNK細胞の細胞障害性の効果を阻害する（O. Ramosら, J. Immunol. 142:4100-4104, 1989; C. Scottら, J. Immunol. 142:4105-4112, 1989）。NK細胞はまた、抗体依存型の細胞性細胞障害性によって細胞を溶解させることもできる（D. Seeら, 1997）。
【００１３】
NK細胞は、細胞外の原生動物、及び原生動物に感染した細胞の双方を破壊することが示された（T. Scharton-Kersten及びA. Sher, Current Opinion in Immunology 9:44-51, 1997）。ほとんどの場合、細胞障害性活性はリンホカインの活性化に依存しているようである（T. Scharton-Kersten及びA. Sher, 1997）。
【００１４】
NK細胞は、帯状疱疹性水痘（varicella zoster）、単純疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、B型肝炎、及びC型肝炎ウイルスによるヒトにおける感染に対する宿主の防御のメディエーターとして関わってきた（D. Seeら, 1997）。ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルスを含む多くのウイルスがNK細胞の細胞障害性を誘導する（C. Biron, Current Opinion in Immunology 9:24-34, 1997）。NK細胞活性の誘導は、ウイルス感染によるIFN-α/βの誘導の結果であり、NK細胞は多くのウイルス感染に対する初期の防御において重要である（C. Biron, 1997）。NK細胞のNK1+CD3-集団は、ウイルス感染によって活性化されるサブ集団である（C. Biron, 1997）。ウイルス感染に対するNK細胞の応答は、直接の細胞毒性及びIFN-γ及びTNF-α等の種々のサイトカインの産生を含む（C. Biron, 1997）。
【００１５】
ヒトのNK細胞のリンパ増殖性障害が数多く知られている。これらには、NK細胞系顆粒性リンパ球増殖性障害（NK-GLPD）、NK細胞リンパ腫、及びNK細胞系の急性白血病が挙げられる（K. Oshimi, International Journal of Hematology 63:279-290, 1996）。攻撃型のNK-GLPDの患者のほとんどは疾患のために死亡する（K. Oshimi, 1996）。NK細胞リンパ腫は組み合わせ化学療法に耐性である（K. Oshimi, 1996）。
【００１６】
IL-2で活性化されたNK細胞は、ヒト白血病細胞に対する活性を有することが示された（L. Sillaら, Journal of Hematotherapy 4:269-279, 1995）。更に、NK細胞は慢性骨髄性白血病の治療において役割を有しているように思われる（K. Oshimi, 1996）。
【００１７】
NK細胞は、癌の拡張に対する抵抗性及び調節の双方に関与している（T. Whiteside及びR. Herberman, Current Opinion in Immunology 7:704-710, 1995）。更に、NK細胞の存在及び活性化は、結果を左右するかも知れない。NK活性が低いか、または存在しないことは、ウイルス性疾患及び癌の高頻度と関連している（T. Whiteside及びR. Herberman, 1995）。
【００１８】
宿主の防御、腫瘍細胞の監視、及び自己免疫疾患において、in vivoでNK細胞及びＴ細胞が果たす重要な役割の観点から、当分野において、NK及びT細胞活性のin vivo及びin vitroでの増大のために好適なポリペプチドに対する需要が存在する。
【００１９】
３．インターフェロンγ
IFN-γの産生はＴ細胞及びNK細胞の機能であり、IFN-γは抗ウイルス免疫反応を活性化する（E. De Maeyer及びJ. De Maeyer-Guignard, The Cytokine Handbook, A. W. Thompson(編), Academic Press, 1994, pp.265-288）。IFN-γはTh2の増殖を優先的に阻害するが、Th1の増殖は阻害しない（T. F. Gajewski及びF. W. Fitch, J. Immunology 140:4245-4252, 1988）。IFN-γはまた、マクロファージの活性化においても重要な役割を果たしており、活性化Ｂ細胞の増殖を促進する（De Maeyer及びDe Maeyer-Guignard）。IFN-γのこれら及び他の効果から、IFN-γ産生のin vivoレベルの上昇が一般的免疫調節剤として機能することが示される。
【００２０】
IFN-γは、慢性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症（systemic achlerosis）、らい腫らい（lepratmatous leprosy）、尋常性ゆうぜい、Ｂ型肝炎感染症、骨髄性白血病、及び転移性黒色腫の治療において臨床的に使用されてきた（J. Mordentiら, Therapeutic Proteins, A.H.C.Kungら(編), W.H.Freeman及びCo., 1993, pp.187-199）。in vivoでIFN-γが免疫調節において果たす重要な役割を考慮すると、in vivo及びin vitroにおけるIFN-γレベルの増大のために好適なポリペプチドが当分野において必要とされている。
【００２１】
４．細胞障害性Ｔリンパ球
CTLは、ウイルス性、細菌性、及び癌性疾患に対する重要なin vivoの防御であり、外来抗原を保持する標的細胞を溶解させる（G. Berke, Fundamental Immunology, W. E. Paul(編) Raven Press Ltd., 1989, pp.735-764）。感染に対する免疫応答及び腫瘍サーベイランスにおけるCTLの果たす重要な役割から、in vivo及びin vitroのCTL活性の増大のために好適なポリペプチドに対する需要が当分野において存在する。
【００２２】
５．タンパク質の同定
もう一つの態様において、未知のタンパク質の一次構造または配列の同定は、根気強い実験を繰り返して得られるものである。未知のタンパク質の同定のために、研究者は、当業者に公知の種々の技術を使用した、この未知のタンパク質の既知のペプチドとの比較に依存することができる。例えば、タンパク質は通常、電気泳動、沈降、クロマトグラフィー、配列決定及び質量分析等の技術を使用して分析される。
【００２３】
特に、分子量既知のポリペプチドと未知のタンパク質とを比較することにより、未知のタンパク質のみかけの分子量を決定できる（T. D. Brock及びM. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)）。タンパク質の分子量標準は市販されており、未知のタンパク質の分子量評価に役立つ（New England Biolabs Inc. Catalog:130-131, 1995; J. L. Hartley, 米国特許第5,449,758号）。しかしながら、分子量標準は、みかけの分子量の正確な算定が可能なほどには未知のタンパク質にサイズが十分近接していない場合がある。化学的または酵素的手段によって断片化されているタンパク質、翻訳後修飾またはプロセシングによって修飾されているタンパク質、及び／または他のタンパク質と非共有的複合体として結合しているタンパク質の場合には、分子量算定の困難さは複雑になる。
【００２４】
更に、その特殊なアミノ酸構成の点でタンパク質の組成が独特な性質を有することから、そのタンパク質内の切断部位が独特な位置に生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特異的断片化によって、独特な「ペプチドフィンガープリント」が生じる（D. W. Clevelandら, J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977; M. Brownら, J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980）。従って、特異的部位における切断から、所与のタンパク質から正確な分子量を有するペプチドへの再現性のある断片化が生じる。更に、これらのペプチドは、そのペプチドの等電点ｐHを決定する独特な電荷特性を有している。これらの独特な性質を、種々の電気泳動及び他の技術を使用して利用することができる（T. D. Brock及びM. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)）。
【００２５】
タンパク質の断片化は、アミノ酸組成分析及びタンパク質の配列決定、特に「ブロックされた」N末端を有するタンパク質からの断片の作製に更に使用できる（P. Matsudiara, J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskornら, Electrophoresis 1988, 9:830-838, 1988）。更に、断片化タンパク質は、免疫感作、アフィニティー選択（R. A. Brown, 米国特許第5,151,412号）、修飾部位（例えばリン酸化）の決定、活性な生物学的化合物の作製（T. D. Brock及びM. T. Madigan, Biology of Microorganisms 300-301 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)）、及び相同タンパク質の分化（M. Brownら, J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980）のために使用することができる。
【００２６】
更に、未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られた場合、質量分析を使用した未知のタンパク質の同定を補助するために、これを既知タンパク質のデータベースと比較することができる（W. J. Henzelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; D. Fenyoら, Electrophoresis 19:998-1005, 1998）。これらの比較を容易にするための種々のコンピューターソフトウェアプログラムにインターネットを介してアクセスでき、例えばProtein Prospector（インターネットサイト：prospector.uscf.edu）、MultiIdent（インターネットサイト：www.expasy.ch/sprot/multiident.html）、PeptideSearch（インターネットサイト：www.mann.embl-heiedelberg.de…deSearch/FR_PeptideSearch Form.html）、及びProFound（インターネットサイト：www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html）が挙げられる。これらのプログラムによって、ユーザーは指定された許容度（tolerance）内の開裂剤及び断片化ペプチドの分子量を特定することができる。これらのプログラムによって、データベースに保存されたタンパク質分子量情報とこれらの分子量を比較して、未知のタンパク質のアイデンティティーの決定を補助する。正確な同定のためには、断片化ペプチドの数、及びこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。従って、断片化ペプチドの数及びそれらの分子量の決定における正確さが上がれば、未知のタンパク質の同定の成功確率が増大する。
【００２７】
更に、未知のタンパク質のペプチド分解物はタンデム質量分析（MS/MS）を使用して配列決定することができ、得られた配列をデータベースで検索することができる（J. K. Engら, J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann及びM. Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399 (1994); J. A. Taylor及びR. S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec. 11:1067-1075 (1997）。この方法において使用できる検索プログラムはインターネット上に存在しており、例えばLutefisk 97（インターネットサイト：www.1sbc.com:70/Lutefisk97.html）、及び上記のthe Protein Prospector、Peptide Search及びProFoundプログラムが挙げられる。従って、遺伝子の配列及びその推定タンパク質配列及びペプチド断片を配列データベースに追加することによって、タンデム質量分析を使用した未知のタンパク質の同定において役立ち得る。
【００２８】
従って、当分野において、ぺプチド断片化研究における使用のため、分子量測定における使用のため、及びタンデム質量分析を使用したタンパク質配列決定における使用のために好適なポリペプチドに対する需要も存在する。
【００２９】
発明の概要
本発明は、単離されたULBP核酸、及びこれらの核酸によってコードされたポリペプチドを提供することによって、当分野におけるこれら種々の需要を満たす一助となる。具体的には、本発明の一実施形態は、ヒトＢ細胞リンパ腫と関連する細胞表面糖タンパク質を提供する。広い意味において、本発明は、本明細書においてULBPポリペプチドという、ヒトＢ細胞リンパ腫の表面上に見られる新規ポリペプチドに関する。本発明は特に、単離されかつ精製された形態の哺乳類型ULBPポリペプチドに関する。本発明の特殊な実施形態は、配列番号１、配列番号３、または配列番号９のDNA配列を含む単離されたULBP核酸分子、及び配列番号２、配列番号４、または配列番号１０のアミノ酸配列をコードする単離されたULBP核酸分子、並びにこれらの配列に相補的な核酸分子に関する。本発明には一本鎖及び二本鎖RNA及びDNA核酸分子の双方、並びに配列番号１、配列番号３及び／または配列番号９の全てまたは一部を含む変性した二本鎖DNAにハイブリダイズする核酸分子が包含される。更に、配列番号１、配列番号３、または配列番号９の配列を含む核酸分子からin vitro突然変異誘発によって誘導される単離された核酸分子、配列番号１、配列番号３、または配列番号９の配列を含む核酸分子と縮重する単離された核酸分子、及び本発明のDNAの対立遺伝子変異型である単離された核酸分子も包含される。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指令する組み換えベクター、及びこれらのベクターで安定に、または一時的に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も包含する。
【００３０】
更に、本発明は、ULBP活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するため、ヒト第６番染色体を同定するため、ヒト第６番染色体上の遺伝子をマッピングするため、ヒト第６番染色体と関連するある種の疾患、症候群、または他のヒトの状態と関連する遺伝子を同定するため、更に細胞のシグナル伝達及びULBPシステムを研究するために、上記の核酸を使用する方法を包含する。
【００３１】
本発明はまた、ULBP遺伝子によってコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、配列番号１、配列番号３、または配列番号９の核酸由来のセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用をも包含する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、または配列番号９の可溶性ポリペプチド部分を含む、これらの核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド及びその断片を包含する。本発明は更に、発現を促進する条件下で宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収することを含む、これらのポリペプチドの製造方法を包含する。特に、これらのポリペプチドの細菌、酵母、植物、昆虫、及び動物細胞における発現が本発明に包含される。
【００３３】
一般に、本発明のポリペプチドは、免疫調節、細胞増殖、細胞死、細胞移動、細胞-細胞相互作用、及び炎症性応答等の細胞プロセスを研究するために使用することができる。更に、これらのポリペプチドを使用して、ULBPリガンド及びULBP受容体と関連するタンパク質を同定することができる。
【００３４】
更に別の態様において、本発明は、ポリペプチドの逆構造分子（polypeptide counter-structure molecules）と関連する活性の潜在的阻害剤をスクリーニングするためにこれらのポリペプチドを利用するアッセイ、及びULBPポリペプチドの逆構造分子によって仲介される疾患の治療のための治療剤としてこれらのポリペプチドを使用する方法を含む。更に、これらのポリペプチドの阻害剤の設計においてこれらのポリペプチドを使用する方法も本発明の一態様である。
【００３５】
本発明は更に、タンパク質または断片化タンパク質の分子量の算定を可能にする分子量マーカーとしてこれらのポリペプチドを使用する方法、並びに電気泳動を使用して本発明の分子量マーカーを視覚化する方法を提供する。本発明は更に、未知のタンパク質の等電点の決定のためのマーカー、並びにタンパク質の断片化の程度を確立するための対照として本発明のポリペプチドを使用する方法を包含する。
【００３６】
更に、これらの決定において有用なキットが本発明に包含される。
【００３７】
本発明のもう一つの態様は、電子的データベースをサーチしてサンプル核酸及び／またはタンパク質の同定に役立てるための、ULBP核酸配列、ポリペプチドもしくはその断片の推定アミノ酸配列、またはポリペプチド及びその断片の推定アミノ酸配列の組み合わせの使用である。
【００３８】
これらのポリペプチドに結合する単離されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、更にULBPポリペプチドの精製に役立てるためのこれらの抗体の使用もまた、本発明に包含される。抗体は、患者における悪性状態の有無と相関し得る、ヒトの細胞サンプル中におけるULBPポリペプチドの存在を検出するために有用である。
【００３９】
より一般的には、本発明は、本発明のポリペプチド、DNA、及び抗体を使用してＢ細胞リンパ腫を検出する方法を提供する。本方法は、例えば免疫学的技術、及びDNAハイブリダイゼーション及び増幅技術に基づいている。
【００４０】
更にまた、本発明はin vitro及びin vivoでIFN-γ産生を上昇させる方法、NK細胞増殖を上昇させる方法、及びCTL活性を上昇させる方法を提供する。
【００４１】
発明の詳細な説明
ULBP DNAは、新規細胞表面糖タンパク質をコードするヒトDNAである。ヒトULBPポリペプチドをコードするcDNAはヒトの細胞から単離、クローニングされた。ヒトULBPポリペプチドをコードするこれらのDNAの発見によって、これらのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの構築、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞、単離されかつ精製されたタンパク質及びポリペプチドとしての生物学的に活性なヒトULBPポリペプチド、及びポリペプチドと免疫反応性の抗体が提供される。
【００４２】
本発明の一つの特定の実施形態においては、ULBP-1と命名したULBP遺伝子をNamalwa（ヒトＢ細胞リンパ腫）cDNAライブラリーから発現クローニングした。これは、UL16-Fc融合タンパク質への結合によって行った。UL16は、ヒトサイトメガロウイルスによってコードされる１型膜糖タンパク質である（Kayeら, J. Virol. 66:6609, 1992）。OX40-Fcについて先に記載されているように（Baumら, EMBO J. 13:3992-4001, 1994）、UL16-FcはUL16の細胞外ドメインがIgG1 Fc（ムテイン型）に融合したものである。ULBP-1の発現クローニングは、CD27L及びOX40Lについて先に記載されている標準的な技術（Cell 73:447, 1993, EMBO J. 13:3992-4001, 1994）を用いて実施した。これら参考文献それぞれの開示は全て引用され、本明細書に参照によって組み入れられる。
【００４３】
StadenフォーマットのULBP-1遺伝子（コーディング領域のみ）のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００４４】
0004255211.tif 000002
0004255211.tif 000003
［配列番号１］
ULBP-1の等価アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４５】
ULBP-1ポリペプチド
0004255211.tif 000004
［配列番号２］
本発明の単離されかつ精製されたULBP-1ポリペプチドは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による測定でおよそ31kDの分子量を有している。ULBP-1ポリペプチド（アミノ酸1-21）のシグナルペプチドは、切断されてアミノ酸22で始まる成熟タンパク質を提供することができる。
【００４６】
本発明のもう一つ別の実施形態において、ULBP-2と命名されるULBP遺伝子は、ULBP-1遺伝子に相同なESTとして認識された（GenBank accession number R25716）。ESTデータベースにおける配列は正確ではなかった。更に、このESTは、他のいずれのタンパク質に関連するタンパク質をコードするものとしても認識されなかった。ESTクローンを得て完全に配列決定し、これが全長タンパク質配列をコードしていることが明らかになった。
【００４７】
ULBP-2遺伝子のヌクレオチド配列（コーディング配列のみ）は以下の通りである。
【００４８】
0004255211.tif 000005
0004255211.tif 000006
［配列番号３］
ULBP-2の等価アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４９】
ULBP-2ポリペプチド
0004255211.tif 000007
［配列番号４］
本発明に係る単離されかつ精製されたULBP-2ポリペプチドは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による測定でおよそ31kDの分子量を有している。このポリペプチドの場合、シグナルペプチドの切断はアミノ酸21及び22の間で生じる。
【００５０】
ULBP-1及びULBP-2ポリペプチドは、アミノ酸レベルで60％同一である。これらの配列における類似性及び差異は、以下の配列番号２のアミノ酸1-243及び配列番号４のアミノ酸1-245の配列アラインメントから明らかである。
【００５１】
0004255211.tif 000008
0004255211.tif 000009
本発明のもう一つ別の実施形態において、ULBP-3と命名されるULBP遺伝子は、ULBP-1遺伝子に相同なESTとして認識された（GenBank accession number AI091180）。ESTクローンを得て完全に配列決定し、これがリーダー配列の最初の５アミノ酸を欠くタンパク質配列をコードしていることが明らかになった。ULBP-3遺伝子のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００５２】
0004255211.tif 000010
［配列番号９］
ULBP-3の等価アミノ酸配列は以下の通りである。
【００５３】
0004255211.tif 000011
［配列番号１０］
ULBP-3はULBPファミリーのメンバーである。ULBP-1及びULBP-3は54％同一であり、ULBP-2及びULBP-3は54％同一である。このことは、以下のULBP-1（配列番号２）、ULBP-2（配列番号４）、及びULBP-3（配列番号１０）のアミノ酸配列の配列アラインメントから明らかである。
【００５４】
0004255211.tif 000012
0004255211.tif 000013
pepスコアリングマトリクスを用いたGCG GAPプログラムを使用した配列のアラインメントによって決定したように、「｜」はアミノ酸の同一を示し、「．」はアミノ酸の弱い保存を示し、「：」はアミノ酸の高い保存を示す。ギャップ生成ペナルティー＝30、ギャップ伸長ペナルティー＝１。
【００５５】
ULBP-1、ULBP-2、及びULBP-3ポリペプチドは多くのMHCクラス１タンパク質、特に非古典的クラス１分子、またはヒト以外の種のクラス１分子にやや（distantly）関連している。ULBP-1、ULBP-2、及びULBP-3ポリペプチドはMHCクラスIタンパク質のα１及びα２ドメインに相同な領域を含んでいる。しかしながら、これらはβ-2-ミクログロブリン結合のために必要なα３ドメインを欠くという点で他のクラス１分子と異なる構造を有している。α１ドメインは、ULBP-1及びULBP-2ではほぼアミノ酸30-117、ULBP-3ではほぼアミノ酸26-113からなる。α２ドメインは、ULBP-1及びULBP-2ではほぼアミノ酸118-200、ULBP-3ではほぼアミノ酸114-196からなる。更に、ULBP-1及びULBP-2遺伝子は染色体6q20-23にマッピングされ、これは他のMHCクラス１及び関連遺伝子と異なっている。
【００５６】
ULBP DNA、及びこのDNAによってコードされるタンパク質及びポリペプチドがULBP-1、ULBP-2、及びULBP-3に限定されないことは理解されるであろう。より詳しくは、用語「ULBP DNA」は、配列番号１、配列番号３、及び配列番号９と同じ配列を有するポリヌクレオチドの種類、並びにこうしたDNA配列と高い類似性（少なくとも90％の相同性）を有するポリヌクレオチドの種類を意味する。
【００５７】
同様に、用語「ULBPポリペプチド」は、配列番号２、配列番号４、または配列番号１０と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド及びタンパク質の種類、並びにこうしたアミノ酸配列と高い類似性（少なくとも90％の同一性）を有するポリペプチド及びタンパク質であって、そのタンパク質が生物学的に活性であるものを意味する。ULBPポリペプチドはまた、配列番号１、配列番号３、及び配列番号９のポリヌクレオチドの生物学的に活性な遺伝子産物を含む。本明細書で使用する場合、用語「ULBP」はULBP DNA、並びにULBPポリペプチドを包含するものと意図される。
【００５８】
本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの構築、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞、単離され精製された生物学的に活性なポリペプチド及びその断片、ULBP活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしての核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用、ヒト第６番染色体を同定するための核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用、ヒト第６番染色体上の遺伝子をマッピングするための核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用、ヒト第６番染色体と関連するある種の疾患、症候群または他のヒトの状態（色素性網膜炎-25(6q14-q21)、インスリン依存性真性糖尿病15(6q21)、小児進行性偽性リウマチ関節症(6q22)、先天性メロシン欠損型筋ジストロフィー(6q22-q23)、及び拡張型心筋症１F(6q23)）と関連する遺伝子を同定するための核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用、及びULBP遺伝子によってコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、該核酸由来の一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、が提供される。
【００５９】
核酸分子
特定の実施形態において、本発明は、内因性物質を汚染することのない特定の単離ヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」とは、分離断片の形態をとるポリヌクレオチド分子、または大きい核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。標準的な生化学的方法(例えばSambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd sed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989))によってその構成要素であるヌクレオチド配列の同定、操作および回収が可能な量または濃度で、実質的に純粋な形態として少なくとも一度は単離されたDNAまたはRNAから、核酸分子が得られる。このような配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列すなわちイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供および/または構築されることが好ましい。非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレームの5’側または3’側に存在し、コード領域の操作または発現を妨害しない。
【００６０】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖の両方の形態のDNA、ならびにこれらのRNA相補体を含む。DNAには、例えば、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたDNA、PCR増幅されたDNA、およびこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムDNAは、従来方法、例えば、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号９のcDNA、またはこれらの適切な断片をプローブとして用いることにより単離されうる。
【００６１】
本発明のDNA分子は、完全長遺伝子、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよび断片を含む。完全長遺伝子は、Ｎ-末端シグナルペプチドを含んでもよい。別の実施形態は、シグナルペプチドおよび/またはGPI結合を含むまたは含まない可溶性形態をコードする(例えば、タンパク質の細胞外ドメインをコードする)DNAを含む。
【００６２】
本発明の核酸は好ましくはヒト供給源に由来するが、非ヒト種に由来したものも本発明に含まれる。
【００６３】
好ましい配列
本発明の特に好ましい核酸配列は、前述した配列番号１、配列番号３または配列番号９である。配列番号１のDNAにコードされるアミノ酸の配列は、配列番号２に示されている。配列番号３のDNAにコードされるアミノ酸の配列は、配列番号４に示されている。配列番号９のDNAにコードされるアミノ酸の配列は、配列番号10に示されている。これらの配列は、ULBPファミリーの一員であるULBP-1、ULBP-2およびULBP-3ポリヌクレオチドを同定する。
【００６４】
さらなる配列
２つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードしうるという公知の遺伝子コードの縮重により、DNA配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すものとは異なりながら、配列番号２、配列番号４または配列番号10のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。このような変異DNA配列は、(例えば、PCR増幅の過程で生じる)サイレント突然変異により生じるか、または天然配列の意図的に突然変異誘発させた産物でありうる。
【００６５】
従って、本発明は、以下から選択される、本発明のポリペプチドをコードする単離DNA配列を提供する。すなわち、(a)配列番号１、配列番号３または配列番号９のヌクレオチド配列を含むDNA、(b) 配列番号２、配列番号４または配列番号10のポリペプチドをコードするDNA、(c)中度のストリンジェンシー条件下で(a)または(b)のDNAとハイブリダイゼーション可能で、かつ本発明のポリペプチドをコードするDNA、(d) 高ストリンジェンシー条件下で(a)または(b)のDNAとハイブリダイゼーション可能で、かつ本発明のポリペプチドをコードするDNA、ならびに(e)(a)、(b)、(c)または(d)で定義したDNAに対する遺伝子コードの結果縮重し、かつ本発明のポリペプチドをコードするDNA。当然、上記DNA配列によってコードされるポリペプチドは本発明に包含される。
【００６６】
従って、本発明は、以下から選択される、生物活性を有するULBPポリペプチドをコードする等価物の単離DNA配列を提供する。すなわち、(a)天然哺乳動物ULBP遺伝子のコード領域由来のDNA、(b)配列番号１のヌクレオチド配列1〜735、配列番号３のヌクレオチド配列1〜741、および配列番号９のヌクレオチド配列1〜717からなる群より選択されるDNA、(c)中度のストリンジェンシー条件下で(a)または(b)のDNAとハイブリダイゼーション可能で、かつ生物活性を有するULBPポリペプチドをコードするDNA、ならびに(d) (a)、(b)または(c)で定義されるDNAに対する遺伝子コードの結果縮重し、かつ生物活性を有するULBPポリペプチドをコードするDNA。上記DNA等価物の配列によってコードされるULBPポリペプチドは、本発明に包含される。他の哺乳動物種に由来し、配列番号１、配列番号３または配列番号９のDNAの相補体とハイブリダイズするDNAによってコードされるULBPポリペプチドも包含される。
【００６７】
本明細書で使用する、中度のストリンジェンシーの条件は、例えばDNAの長さに基づき、当業者が容易に決定できる。基本的な条件は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されており、これには、ニトロセルロースフィルターの予備洗浄溶液として5X SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)を使用すること、約42℃、50%ホルムアミド、6X SSC(あるいは、約42℃、約50%ホルムアミド中のスターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液)でのハイブリダイゼーション条件、ならびに約60℃、0.5X SSC、0.1% SDSでの洗浄条件が含まれる。高ストリンジェンシー条件も、例えばDNAの長さに基づき、当業者が容易に決定できる。一般的に、このような条件は、上記したハイブリダイゼーション条件として定義されており、約68℃、0.2X SSC、0.1%SDSでの洗浄を含む。当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因に応じて、必要であれば、調節できることを理解するであろう。
【００６８】
また本発明の実施形態には、以下に記載するように、不活性化Ｎ-グリコシル化部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位または保存性アミノ酸置換を含むポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするDNAが含まれる。
【００６９】
別の実施形態では、本発明の核酸分子はまた、天然配列に対して少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また、核酸分子が、天然配列に対して少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、または少なくとも99.9％の同一性を有する配列を含む実施形態も包含される。
【００７０】
同一性％は、目視検査および数学的計算によって決定できる。あるいはまた、２つの核酸配列の同一性％は、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)に記載され、University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から入手可能なGAPコンピュータプログラム(バージョン6.0)を使用し、配列情報を比較することによって決定できる。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。(1)SchwartzおよびDayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載されているような、ヌクレオチドについての単一分子比較マトリクス(unary comparison matrix)(同一の場合１、非同一の場合０の値を含む)、ならびにGribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の加重比較マトリクス(weighted comparison matrix)、(2)各ギャップに対して3.0のペナルティ、および各ギャップにある各記号に対して0.10の追加ペナルティ、ならびに(3)エンドギャップに対してはペナルティ無し。配列比較技術の当業者によって使用される他のプログラムも使用できる。
【００７１】
本発明はまた、ポリペプチドの生成に有用な単離核酸を提供する。このようなポリペプチドは、数ある従来技術のいずれによって調製してもよい。ULBPポリペプチドをコードするDNA配列、またはこれらの所望の断片を、発現ベクター中にサブクローニングし、該ポリペプチドまたは断片を生成してもよい。DNA配列は、適切なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合されることが有利である。あるいはまた、所望の断片を、公知技術を用いて化学的に融合してもよい。また、DNA断片は、完全長クローン化DNA配列を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって生成でき、アガロースゲル上での電気泳動によって単離できる。必要に応じて、所望位置に対して5’または3’末端を再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化によって生成されたDNA断片にライゲートしてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含み、コード配列のＮ-末端に開始コドン(ATG)を配置してもよい。
【００７２】
周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を採用して、所望のタンパク質断片をコードするDNA配列を単離および増幅してもよい。DNA断片の望ましい末端を画定するオリゴヌクレオチドを、5’および3’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドに、制限エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含ませて、増幅されたDNA断片を発現ベクターに挿入し易くしてもよい。PCR技術は、Saikiら、Science 239:487(1988)；Recombinant DNA Methodology、Wuら, ed., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp.189-196、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisら, eds., Academic Press, Inc. (1990) に記載されている。
【００７３】
ポリペプチドおよびこれらの断片
本発明は、様々な形態(天然に存在するもの、または組換えDNA技術が関与する方法などの様々な技術を介して生成されたものなど)のポリペプチドおよびこれらの断片を包含する。例えば、ULBPポリペプチドをコードするDNAは、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発(random mutagenesis)およびin vitro核酸合成を含むin vitro突然変異誘発により、配列番号１、配列番号３または配列番号９から誘導できる。上記形態には、誘導体、変異体、オリゴマー、ならびにこれらの融合タンパク質または断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
ポリペプチドおよびこれらの断片
本発明のポリペプチドには、上記した核酸配列によってコードされる完全長タンパク質が含まれる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号10のアミノ酸配列を含み、特に好ましい断片は、配列番号２のアミノ酸約22〜アミノ酸約219のアミノ酸、ならびに配列番号４のアミノ酸約22〜アミノ酸約223のアミノ酸を含む。
【００７５】
配列番号２、配列番号４および配列番号10のポリペプチドは、シグナルペプチドとして機能するＮ-末端疎水性領域を含む。コンピュータ分析により、このシグナルペプチドは、配列番号２および配列番号４の残基1〜21、ならびに配列番号10の残基1〜17に対応すると予測されている。従って、シグナルペプチドを切断することにより、配列番号２のアミノ酸22〜244、配列番号４のアミノ酸22〜246ならびに配列番号10のアミノ酸17〜239を含む成熟タンパク質が作製される。当業者であれば、ポリペプチドのこのような領域の上記境界がおおよそのものであり、領域の境界(これは専用コンピュータプログラムによって予測可能である)が上記したものと異なりうることを理解するであろう。
【００７６】
配列番号２、配列番号４および配列番号10のポリペプチドは、GPI結合として機能するＣ-末端疎水性領域を含む。予測されるGPI結合は、配列番号２、配列番号４および配列番号10の最後の20残基にほぼ対応する。従って、GPI結合を除去することにより、配列番号２のアミノ酸1〜約224、配列番号４のアミノ酸1〜約226および配列番号10のアミノ酸1〜約219を含むタンパク質が作製される。従って、シグナルペプチドおよびGPI結合の両方を除去することにより、配列番号２のアミノ酸約22〜約224、配列番号４のアミノ酸約22〜約226、ならびに配列番号10のアミノ酸約17〜約219を含むタンパク質が作製される。当業者は、ポリペプチドのこのような領域の上記境界がおおよそのもので、上記したものと異なりうることを理解するであろう。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、膜結合型でもよいし、または分泌型、つまり可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌されうる。一般的に、可溶性ポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現する無傷の細胞を培養培地から分離し(例えば、遠心分離により)、所望のポリペプチドの存在について培地(上清)をアッセイすることによって同定(そして、不溶性の膜結合したその片割れと区別)されうる。培地中にポリペプチドが存在するということは、ポリペプチドが細胞から分泌されており、従って可溶性形態タンパク質であることを示す。
【００７８】
一実施形態では、可溶性ポリペプチドおよびこれらの断片は、細胞外ドメインの全体または一部を含むが、細胞膜上にポリペプチドを保持させるGPI結合を欠く。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが生成される細胞から分泌されるのであれば、GPI結合の一部を含んでもよい。
【００７９】
従って、可溶性ポリペプチドとしては、Ｎ末端に配列番号２のアミノ酸20〜30を有し、Ｃ末端にアミノ酸200〜227を有するアミノ酸を含むポリペプチド、Ｎ末端に配列番号４のアミノ酸20〜30を有し、Ｃ末端にアミノ酸200〜227を有するアミノ酸を含むポリペプチド、ならびにＮ末端に配列番号10のアミノ酸16〜26を有し、Ｃ末端にアミノ酸196〜223を有するアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
一般的に、可溶性形態の使用は、特定の用途において有利である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からポリペプチドを精製し易くなる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に静脈内投与により適している。
【００８１】
本発明は、また、所望の生物活性を保持する細胞外ドメインのポリペプチドおよび断片を提供する。特定の実施形態は、ULBPカウンター構造(UL16など)に結合する能力を保持するポリペプチド断片に関する。上記断片は、上記したような可溶性ポリペプチドでもよい。別の実施形態において、ポリペプチドおよび断片は、上記したようなULBPファミリーに保存される領域を有利に含む。
【００８２】
また、本明細書では、配列番号２、配列番号４または配列番号10の配列の連続するアミノ酸を少なくとも20、または少なくとも30含むポリペプチド断片を提供する。ポリペプチド断片は、抗体を生成するための免疫原として使用してもよい。
【００８３】
変異体
上記ポリペプチドおよび断片の天然型変異体および誘導型変異体も本明細書中で提供する。
【００８４】
本明細書でいう「ULBP変異体」とは、天然ULBPポリペプチドと実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入または置換のために、天然ULBPポリペプチド(ヒト、マウスまたは他の哺乳動物種)とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異体は、天然ULBPポリペプチドアミノ酸配列と好ましくは少なくとも80％の同一性、最も好ましくは少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。同一性％は、例えば、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)に記載され、University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から入手可能なGAPコンピュータプログラム(バージョン6.0)を使用し、配列情報を比較することによって決定できる。GAPプログラムは、NeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)のアライメント法をSmithおよびWaterman(Adv.Appl. Math 2:482, 1981)が改良したものを利用する。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。(1)SchwartzおよびDayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載されているような、ヌクレオチドについての単一分子比較マトリクス(同一の場合１、非同一の場合０の値を含む)、ならびにGribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の加重比較マトリクス、(2)各ギャップに対して3.0のペナルティ、および各ギャップにある各記号に対して0.10の追加ペナルティ、ならびに(3)エンドギャップに対してはペナルティ無し。
【００８５】
また、変異体の実施形態には、好ましいポリペプチドまたはこれらの断片と少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、または少なくとも99.9％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは断片も包含される。同一性％は、上記したように決定できる。あるいはまた、２本のタンパク質配列の同一性％は、NeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Bio. 48:443, 1970)のアルゴリズムに基づき、University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から入手可能なGAPコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することによって決定できる。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。(1)HenikoffおよびHenikoff(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915, 1992)に記載される点数マトリクス(scoring matrix)であるblosum62、(2)ギャップ重量(gap weight)：12、(3)ギャップ長さ重量(gap length weight)：４、ならびに(4)エンドギャップにはペナルティ無し。配列比較技術の当業者に使用される他のプログラムも使用できる。
【００８６】
本発明の変異体には、例えば、選択的mRNAスプライシング事象、またはタンパク質分解切断により生じるものが含まれる。mRNAの選択的スプライシングにより、例えば、トランケートされているが、生物活性を有するタンパク質(例えば、天然型可溶性形態のタンパク質)が産生される。タンパク質分解による変異には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現の際に、タンパク質分解により１つ以上の末端アミノ酸(通常、1〜5の末端アミノ酸)がタンパク質から除去されることにより生じる、Ｎ-末端またはＣ-末端の違いが含まれる。遺伝子多型(タンパク質を生成する個体間での対立遺伝子多様性)によりアミノ酸配列において差異を有するタンパク質も本発明に包含される。
【００８７】
上記したように、本発明は、単離および精製された、または均一のULBPポリペプチドを、組換えおよび非組換えの両方の形態で提供する。所望の生物活性を保持する天然ULBPタンパク質の変異体および誘導体は、天然ULBPポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。天然アミノ酸配列の変化は、数ある従来方法のいずれによって達成されてもよい。天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に挟持された変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異を特定の遺伝子座に導入できる。ライゲーションの後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
【００８８】
あるいはまた、所定のコドンを置換、欠失または挿入することにより変異させるオリゴヌクレオチド指向型部位特異的突然変異誘導方法を利用して、変異遺伝子が得られる。上記変異を得るための方法の例は、Walderら(Gene 42:133, 1986)、Bauerら(Gene 37:73, 1985)、Craik(BioTechniques, January 1985, 12-19)、Smithら(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)、Kunkel(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488,1985)、Kunkelら(Methods in Enzymol. 154:367, 1987)、ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
ULBPポリペプチドは、他の化学部分(例えば、グリコシル基、ポリエチレングリコール(PEG)基、脂質、リン酸基、アセチル基など)と共有結合または凝集によるコンジュゲートを形成することによって修飾されて、ULBP誘導体が作製できる。ULBPポリペプチドの共有結合による誘導体は、化学部分を、ULBPアミノ酸側鎖上、またはULBPポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはこれらの細胞外ドメインの官能基と結合させることによって生成できる。本発明の範囲内にあるULBPポリペプチドの他の誘導体としては、組換え培養株中でのＮ末端またはＣ末端融合体の合成などにより得られる、ULBPポリペプチドまたはこれらの断片と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または凝集によるコンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲートは、ULBPポリペプチドのＮ末端において、シグナルまたはリーダーポリペプチド配列(例えば、Saccharomycesのα因子リーダー)を含みうる。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、コンジュゲートを合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の部位まで輸送する。
【００９０】
診断(検出可能)用または治療用薬剤が結合したコンジュゲートも本明細書に含まれ、以下に詳細に説明する。
【００９１】
他の誘導体としては、組換え培養株中でＮ末端またはＣ末端融合体として合成することなどにより得られた、ポリペプチドと、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または凝集によるコンジュゲートが含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと関連させて以下に記載する。さらに、融合タンパク質は、精製および同定し易くするために付加されるペプチドを含んでいてもよい。このようなペプチドには、例えば、米国特許第5,011,912号およびHoppら, Bio/Technology 6:1204, 1988に記載されているポリ-Hisまたは抗原同定ペプチドが含まれる。このようなペプチドの１つは、FLAG(登録商標)ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)である。このペプチドは、高い抗原性を有し、特異的なモノクローナル抗体によって可逆的に結合されたエピトープを提供して、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ、および容易な精製を可能にする。4E11と称されるマウスハイブリドーマは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,011,912号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、FLAG(登録商標)ペプチドを結合するモノクローナル抗体を生成する。4E11ハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collectionに受託番号HB9259として寄託されている。FLAG(登録商標)ペプチドを結合するモノクローナル抗体は、Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticutから入手可能である。
【００９２】
本明細書中で提供する変異ポリペプチドの１つは、天然生物活性を保持する天然型ポリペプチドの変異体、またはこれらの実質的等価物である。一例として、天然型と本質的に同じ結合親和性を有して結合する変異体が挙げられる。結合親和性は、米国特許第5,512,457号および以下に記載するように、従来の方法によって測定できる。
【００９３】
変異体には、天然型と実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入または置換のために天然型のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。特定の実施形態は、天然配列と比較した場合に、1〜10のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
所定のアミノ酸を、例えば、類似した物理化学的(physiochemical)特性を有する残基によって置き換えてもよい。このような保存的置換の例としては、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基と(例えば、Ile、Val、LeuもしくはAlaを互いと)置換すること、ある極性残基を別の極性残基と(例えば、LysとArg、GluとAsp、もしくはGlnとAsnとを)置換すること、または芳香族残基を別の芳香族残基と(例えば、Phe、Trp、もしくはTyrを互いと)置換すること、が挙げられる。その他の保存的置換(例えば、類似した疎水性特性を有する領域全体の置換が関与するものなど)は、よく知られている。
【００９５】
同様に、本発明のDNAには、１つ以上の欠失、挿入または置換のために天然DNA配列と異なるが、生物活性を有するポリペプチドをコードする変異体が含まれる。
【００９６】
本発明は、関連する天然型パターンのグリコシル化を伴うまたは伴わない本発明のポリペプチドをさらに含む。酵母または哺乳動物発現系(例えば、COS-1もしくはCOS-7細胞)中で発現されたポリペプチドは、発現系の選択によって、分子量およびグリコシル化パターンが、天然型ポリペプチドと類似するか、または有意に異なりうる。本発明のポリペプチドを、細菌発現系(大腸菌など)中で発現すると、非グリコシル化分子が得られる。さらに、得られる調製物は、異なってグリコシル化された複数種のタンパク質を含んでいてもよい。グリコシル基は、従来方法(特に、グリコペプチダーゼを使用する方法)によって除去できる。一般的に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰量のグリコペプチダーゼ(Boehringer Mannheim)とインキュベートできる。
【００９７】
同様に、アミノ酸残基もしくは配列の様々な付加もしくは置換を、または末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失をコードする類似したDNA構築物も本発明に包含される。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインにあるＮ-グリコシル化部位を、グリコシル化を阻むように修飾して、哺乳動物および酵母発現系において炭水化物が低減した類似体を発現させてもよい。真核生物ポリペプチドのＮ-グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn-X-Y(ただし、XはPro以外の任意のアミノ酸であり、YはSerまたはThrである)によって特徴付けられる。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Asn側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる。Asnを異なるアミノ酸によって置き換えるように選択された単一ヌクレオチドの変化は、例えば、Ｎ-グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいはまた、SerまたはThrを、別のアミノ酸(Alaなど)と置換してもよい。タンパク質におけるＮ-グリコシル化部位を不活性化するための公知の方法としては、参照することにより本明細書中に組み込まれる米国特許第5,071,972号および欧州特許第276,846号に記載されるものが挙げられる。
【００９８】
変異体の別の例では、生物活性のために必須ではないCys残基をコードする配列を変化させて、Cys残基が欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換されるようにして、折りたたみまたは再生の際の不適切な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。
【００９９】
その他の変異体は、隣接する二塩基性アミノ酸残基を改変して、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増強することによって作製できる。欧州特許第212,914号は、部位特異的突然変異誘発を使用して、タンパク質中のKEX2プロテアーゼプロセシング部位を不活性化することを開示している。KEX2プロテアーゼプロセシング部位は、残基を欠失、付加または置換し、Arg-Arg対、Arg-Lys対、およびLys-Arg対を変化させて、これらの隣接塩基性残基の発生を排除することによって不活性化される。Lys-Lys対合は、KEX2切断を極めて受け難く、またArg-LysもしくはLys-ArgをLys-Lysに転換することは、KEX2部位を不活性化するための保存的かつ好ましいアプローチである。
【０１００】
オリゴマー
本発明には、ULBPポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパク質が包含される。このようなオリゴマーは、共有結合または非共有結合した多量体(二量体、三量体、またはより高位のオリゴマー)の形態で存在しうる。上記したように、好ましいポリペプチドは、可溶性であり、従ってこれらのオリゴマーは、可溶性ポリペプチドを含みうる。本発明の一態様において、オリゴマーは、ポリペプチド構成要素の結合能を保持し、従って二価、三価などの結合部位を提供する。
【０１０１】
本発明の一実施形態は、ポリペプチドに融合されたペプチド部分間の共有結合的または非共有結合的相互作用を介して結合された複数のポリペプチドを含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー(スペーサー)、またはオリゴマー形成を促す性質を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー、および抗体から誘導された特定のポリペプチドは、結合したポリペプチドのオリゴマー形成を促し得るペプチドの１つであり、以下により詳細に説明する。
【０１０２】
免疫グロブリンをベースとするオリゴマー
１つの選択肢として、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して作製できる。抗体由来ポリペプチドの様々な部分(Fcドメインを含む)に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の作製は、例えば、Ashkenaziら(PNAS USA 88:10535, 1991)、Byrnら(Nature 344:677, 1990)、ならびにHollenbaughおよびAruffo(“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”、Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992)に記載されている。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、本発明のポリペプチドを、抗体から誘導したFcポリペプチドに融合させることによって作製された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポリペプチド/Fc融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクターに挿入する。ポリペプチド/Fc融合タンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で発現されて、より抗体分子らしくアセンブルされ、この時Fc部分間で鎖内ジスルフィド結合が形成されて二価分子を産生する。
【０１０４】
本明細書で使用する「Fcポリペプチド」という用語は、Fc領域のCHドメインのいずれかまたは全てを含む抗体のFc領域からなる天然型およびムテイン型のポリペプチドを含む。二量体化を促すヒンジ領域を含む、上記ポリペプチドのトランケート型形態も含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトIgG1抗体から誘導されたFcポリペプチドを含む。
【０１０５】
PCT出願WO93/10151(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される適切なFcポリペプチドの一つは、Ｎ-末端ヒンジ領域から、ヒトIgG1抗体のFc領域の天然型Ｃ-末端まで延びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なFcポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,457,035号およびBaumら(EMBO J. 13:3992-4001, 1994)に記載されているFcムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変わり、アミノ酸20がLeuからGluに変わり、アミノ酸22がGlyからAlaに変わること以外は、WO93/10151に提示されている天然型Fc配列のものと同一である。ムテインは、Fc受容体に対して低い親和性を示す。
【０１０６】
Fc部分(およびこれらから形成されるオリゴマー)を含む前述した融合タンパク質により、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点が得られる。
【０１０７】
別の実施形態において、抗体の重鎖または軽鎖の可変部分を本発明のポリペプチドと置き換えてもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方からなる場合、４つのULBP細胞外領域を有するオリゴマーを形成することができる。
【０１０８】
ULBP-1およびULBP-2ポリペプチドの両方とも、Fcムテインを使用してFc融合タンパク質として発現でき、以下の配列を有する融合ポリペプチドが得られる。
【０１０９】
ULBP1-Fc融合ポリペプチド
0004255211.tif 000014
[配列番号５]
ULBP2-Fc融合ポリペプチド
0004255211.tif 000015
[配列番号６]
ULBP-1およびULBP-2は、GPI結合によって細胞表面に保持される膜結合型糖タンパク質である。Yanら, J. Mol. Biol. 275:25-33 (1998)およびMedofら, FASEB J. 10:574-86(1996)を参照のこと。ULBPポリペプチドの約20のカルボキシ末端アミノ酸がGPI結合を特定する。ULBP-1およびULBP-2 Fc融合タンパク質においてこれらのアミノ酸が欠失すると、GPI結合を欠くタンパク質が生じる。
【０１１０】
本発明は、GPI結合を欠くULBPポリペプチドおよび断片を包含する。好ましいULBPポリペプチド断片は、アミノ酸配列のうち少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、好ましいULBPポリペプチド断片は、アミノ酸配列のうち少なくとも10、少なくとも20、または少なくとも100の連続したアミノ酸を含む。これらのポリペプチドは、可溶性形態として生成できる。
【０１１１】
ULBP-1およびULBP-2の両方ともUL16-Fcを結合する。さらに、ULBP-1およびULBP-2は、多数のヒト細胞型(マイトジェンで刺激されたヒトＴ細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む)に結合する。また、ULBP-Fcタンパク質は、未分化リンパ腫であるK299細胞に結合することが発見されている。ULBP1-Fcの方がULBP2-Fcよりもよく結合する。
【０１１２】
ペプチド-リンカーをベースとするオリゴマー
あるいはまた、オリゴマーは、ペプチドリンカー(スペーサーペプチド)を含むまたは含まない、複数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの１つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号に記載されているものである。所望のペプチドリンカーをコードするDNA配列を、任意の適切な従来技術を用いて、本発明のDNA配列の間に、それと同じリーディングフレーム内に挿入しうる。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを配列間に連結してもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ペプチドリンカーで隔てられた２〜４つの可溶性ULBPポリペプチドを含む。
【０１１３】
ロイシンジッパー
本発明のオリゴマーを作製するための別の方法では、ロイシンジッパーを使用する。ロイシンジッパードメインは、それらが内在するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、初めいくつかのDNA結合タンパク質中で同定され(Landschulzら, Science 240:1759, 1988)、以来、様々な異なるタンパク質中で見出されている。公知のロイシンジッパーの１つは、二量体化または三量体化する、天然に存在するペプチドおよびこれらの誘導体である。
【０１１４】
ジッパードメイン(本明細書中で、オリゴマー化ドメインまたはオリゴマー形成ドメインとも称する)は、通常４〜５のロイシン残基に他のアミノ酸が散在している反復する７つ組反復(heptad repeat)を含む。ジッパードメインの例として、酵母転写因子GCN4で見とめられるもの、およびラット肝臓で見とめられる熱安定性DNA結合タンパク質(C/EBP；Landschulzら, Science 243:1681, 1989)が挙げられる。fosおよびjunの２つの核トランスフォーミングタンパク質も、マウス癌原遺伝子の遺伝子産物であるc-mycと同様にジッパードメインを示す(Landschulzら, Science 240:1759, 1988)。核癌遺伝子であるfosおよびjunの産物は、ヘテロダイマーを優先的に形成するジッパードメインを含む(O’Sheaら, Science 245:646, 1989、TurnerおよびTjian, Science 243:1689, 1989)。ジッパードメインは、これらのタンパク質の生物活性(DNA結合)のために必要である。
【０１１５】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスなどを含むいくつかの異なるウイルスの融合誘導(fusogenic)タンパク質も、ジッパードメインを有する(BucklandおよびWild, Nature 338:547, 1989；Britton, Nature 353:394, 1991；DelwartおよびMosialos, AIDS Research and  Human Retroviruses 6:703, 1990)。これらの融合誘導ウイルスタンパク質中のジッパードメインは、タンパク質の膜貫通領域付近にある。ジッパードメインは、融合誘導タンパク質のオリゴマー構造に寄与しているかもしれないと示唆されている。融合誘導ウイルスタンパク質のオリゴマー形成は、融合孔(fusion pore)形成に関与している(Spruceら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88:3523, 1991)。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリゴマー形成に役割を果たすことも報告されている(Rabindranら, Science 259:230, 1993)。
【０１１６】
ジッパードメインは、短い平行コイルドコイル(coiled coils)として折りたたむ(O’Sheaら, Science 254:539; 1991)。平行コイルドコイルの一般的な構造は、よく特徴づけされており、1953年にCrick(Acta Crystallogr. 6:689)によって提案されたように「ノブが孔に(knobs-into-holes)」嵌合したものである。ジッパードメインにより形成される二量体は、７つ組反復 (McLachlanおよびStewart(J. Mol. Biol. 98:293; 1975)の表記法に従い (abcdefg)nと称される)により安定化される。このうち残基ａおよびｄは、通常、疎水性残基(ｄはロイシン)であり、ヘリックスの同じ面上で並ぶ。反対の電荷を帯びた残基は、通常、ｇおよびｅの位置で生じる。従って、２つのヘリカルジッパードメインから形成された平行コイルドコイルにおいて、第１のヘリックスの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は、第２のらせんの側鎖間に形成された「孔」に嵌合される。
【０１１７】
ｄの位置にある残基(ロイシンである場合が多い)は、大きい疎水性安定化エネルギーに寄与し、オリゴマー形成に重要である(Krystekら, Int. J. Peptide Res. 38:229, 1991)。Lovejoyら(Science 259:1288, 1993)は、最近、らせんの方向が上-上-下である三本鎖αヘリカル束(bundle)の合成を報告している。彼らの研究は、疎水性安定化エネルギーが、ヘリカル単量体からコイルドコイルを形成するための主要推進力を提供することを確認している。これらの研究はまた、静電相互作用が、コイルドコイルの化学量論および幾何学に寄与することも示している。ロイシンジッパーの構造に関するさらなる論議は、Harburyら(Science 262:1401, 1993年11月26日)に記載されている。
【０１１８】
可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、PCT出願WO94/10308に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ(lung surfactant protein D) (SPD)から誘導されるロイシンジッパーは、Hoppeら(FEBS Letters 344:191, 1994)に記載されている。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。融合している異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用は、Fanslowら(Semin. Immunol. 6:267-278, 1994)に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合した可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、形成される可溶性オリゴマーが培養上清から回収される。
【０１１９】
特定のロイシンジッパー部分は優先的に三量体を形成する。一例として、Hoppeら(FEBS Letters 344:191, 1994)および米国特許第5,716,805号(これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載される肺サーファクタントタンパク質Ｄ(SPD)に由来のロイシンジッパーが挙げられる。この肺SPD由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyrを含む。
【０１２０】
三量体形成を促すロイシンジッパーの別の例は、米国特許第5,716,805号に記載されている、アミノ酸配列Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Argを有するペプチドである。１つの代替的な実施形態では、Ｎ-末端Asp残基が追加され、別の実施形態では、ペプチドはＮ-末端Arg残基を欠く。
【０１２１】
オリゴマー形成を促す性質を保持する、前記ジッパーペプチドの断片も同様に使用できる。このような断片の例としては、前記アミノ酸配列に示すＮ-末端またはＣ-末端残基の１つまたは２つを欠くペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ロイシンジッパーは、天然に存在するロイシンジッパーペプチドから(例えば、天然型アミノ酸配列の保存的置換を介して)、ペプチドのオリゴマー形成促進能力は保持されたままで誘導できる。
【０１２２】
天然に存在する三量体タンパク質から誘導される他のペプチドは、三量体ULBPを作製するのに使用できる。あるいはまた、オリゴマー化を促す合成ペプチドが使用できる。特定の実施形態では、ロイシンジッパー部分にあるロイシン残基は、イソロイシン残基で置き換えられる。イソロイシンを含むこのようなペプチドは、イソロイシンジッパーと称することができるが、本明細書で使用する「ロイシンジッパー」という用語に包含する。
【０１２３】
ULBP-1およびULBP-2ポリペプチドの両方とも、ロイシンジッパーモチーフを使用して、以下の配列を有するロイシンジッパー融合タンパク質として発現できる。
【０１２４】
ULBP1-LZ融合ポリペプチド
0004255211.tif 000016
[配列番号７]
アミノ酸1〜19は、ULBP-1シグナルペプチドに置き換わる、ヒトIgκ由来のシグナルペプチドである。これにより、ある程度発現が改善されるが、天然型ULBP-1シグナルペプチドも、他の異種シグナルペプチドと同様に使用できる。アミノ酸20〜218はULBP-1(配列番号２)由来のもので、短いスペーサーであるPRSGSS、アミノ酸225〜257由来のロイシンジッパー(厳密にはイソロイシンジッパー)、スペーサー、および精製用タグとして機能する６つのヒスチジンが続く。
【０１２５】
ULBP2-LZ融合ポリペプチド
0004255211.tif 000017
[配列番号８]
アミノ酸1〜223は、ULBP-2ポリペプチド(配列番号４)由来のもので、その天然型シグナルペプチドを含み、スペーサー、ロイシンジッパーおよびポリHisは上記した通りである。
【０１２６】
ポリペプチドおよびこれらの断片の作製
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、以下を含む(これらに限定されない)任意の適切な技術により行うことができる。
【０１２７】
発現系
本発明は、DNAを含む組換えクローニングベクターおよび発現ベクター、ならびに組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。DNAを含む発現ベクターは、DNAによってコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を作製するために使用できる。ポリペプチドを作製するための方法は、ポリペプチドの発現を促す条件下で、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、次いで、発現されたポリペプチドを培養液から回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための方法が、使用する宿主細胞の種類に応じて、ならびにポリペプチドが膜結合型か、宿主細胞から分泌される可溶性型かに応じて異なることを理解するであろう。
【０１２８】
適切な発現系のいずれを使用してもよい。ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子などに由来する適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に結合した、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするDNAが含まれる。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。調節配列がDNA配列と機能的に関連していれば、ヌクレオチド配列は機能可能に結合する。つまり、プロモーターヌクレオチド配列がDNA配列の転写を制御すれば、プロモーターヌクレオチド配列はDNA配列に機能可能に結合している。所望の宿主細胞中で複製する能力を付与する複製起点、ならびに形質転換体を同定するための選択遺伝子が、通常発現ベクターに導入される。
【０１２９】
さらに、適切なシグナルペプチド(天然型または異種型)をコードする配列を発現ベクターに導入できる。シグナルペプチド(分泌リーダー)をコードするDNA配列を、本発明の核酸配列とフレームを合わせて融合することにより、DNAがまず転写され、mRNAがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されてもよい。目的とする宿主細胞中で機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促す。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌する際にポリペプチドから切断される。
【０１３０】
当業者は、シグナルペプチドが切断される位置が、コンピュータプログラムで予測されるものと異なる場合があり、組換えポリペプチドを発現するために使用する宿主細胞の種類などの要因によって変化しうることも理解するであろう。タンパク質調製物は、２部位以上でのシグナルペプチドの切断により生じる異なるＮ-末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含みうる。
【０１３１】
ポリペプチド発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物の細胞が含まれる。一般的に、哺乳動物または昆虫の細胞が宿主細胞として使用されることが好ましい。細菌、菌類、酵母、および哺乳動物の細胞宿主と共に使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。非細胞含有翻訳系も、本明細書中に開示するDNA構築物から誘導したRNAを用いて、ポリペプチドを作製するために使用できる。
【０１３２】
原核生物系
原核生物には、グラム陰性生物およびグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適切な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属およびStaphylococcus属に属する他の様々な種が含まれる。大腸菌などの原核生物宿主細胞中では、ポリペプチドはＮ-末端メチオニン残基を含むことにより、原核生物宿主中での組換えポリペプチドの発現を容易にできる。Ｎ-末端Metは、発現された組換えポリペプチドから切断されうる。
【０１３３】
原核生物宿主細胞で使用される発現ベクターは、通常、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与する、または独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞の有用な発現ベクターの例として、クローニングベクターpBR322(ATCC 37017)などの市販のプラスミドに由来したものが挙げられる。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性用の遺伝子を含んで、形質転換された細胞を同定するための簡易な手段を提供する。適切なプロモーターおよびDNA配列を、pBR322ベクターに挿入する。他の市販のベクターとしては、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)およびpGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)が挙げられる。
【０１３４】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列には、β-ラクタマーゼ (ペニシリナーゼ)、ラクトースプロモーター系(Changら, Nature 275:615, 1978；およびGoeddelら, Nature 281:544, 1979)、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980；および欧州特許出願第36776号)、ならびにtacプロモーター(Maniatis, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982)が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλPLプロモーターおよびcI857ts熱不安定性リプレッサー配列を使用する。λPLプロモーターの誘導体を組み込まれた、American Type Culture Collectionから入手可能なプラスミドベクターは、プラスミドpHUB2(大腸菌株JMB9、ATCC37092中に存在)およびpPLc28(大腸菌RR1、ATCC53082中に存在)を含む。
【０１３５】
ULBP DNAを、通常の細菌発現ベクターの複数のクローニング部位に、フレームを合わせてクローニングしてもよい。理想的には、ベクターは、クローニング部位の上流に誘導可能なプロモーターを含み、これにより、調査者の選択時に誘導物質を加えて組換えタンパク質の高度な作製が可能になる。タンパク質によっては、プロモーターと目的の遺伝子との間に、融合パートナー(例えば、ヘキサヒスチジンなど)をコードするコドンを組み込むことによって、発現レベルが増大する。得られる「発現プラスミド」は、様々な大腸菌株において増幅されうる。
【０１３６】
組換えタンパク質の発現のために、細菌細胞を、増殖培地中で、所定の光学密度に達するまで増殖させる。次に、例えば、lacオペレーター/プロモーターを含むプラスミドからのタンパク質の発現を活性化するIPTG(イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド)を添加することによって、組換えタンパク質の発現を誘導する。誘導後(通常１〜４時間後)、遠心分離(例えば、5,000×Ｇ、４℃にて20分間)でペレット化することによって細胞を収穫する。
【０１３７】
発現されたタンパク質を回収するために、ペレット化された細胞を、10容量の50mM Tris-HCl(pH 8)/1M NaCl中に再懸濁し、フレンチプレスに２、３回かける。最も高度に発現した組換えタンパク質は、封入体として知られる不溶性凝集体を形成する。封入体は、遠心分離器で(5,000×Ｇ、４℃にて20分間)ペレット化することによって可溶性タンパク質から精製除去できる。封入体ペレットは、50 mM Tris-HCl (pH 8)/1% Triton X-100で洗浄され、次いで50 mM Tris-HCl (pH 8)/8 M尿素/0.1 M DTTf中に溶解される。溶解不可能な物質はいずれも遠心分離(10,000×Ｇ、20℃にて、20分間)により除去される。目的のタンパク質は、ほとんどの場合、最終的な清澄上清中で最も豊富なタンパク質となる。このタンパク質は、50 mM Tris-HCl (pH 8)/5 mM CaCl2/5 mM Zn(OAc)2/1 mM GSSG/0.1 mM GSHに対して透析することにより、活性立体構造に「再生(refolding)」されてもよい。再生後、種々のクロマトグラフィー法(例えば、イオン交換またはゲル濾過など)により精製を行うことができる。プロトコールによっては、再生前に初期精製を行っても良い。例えば、ヘキサヒスチジンをタグ付けした融合タンパク質を、固定化ニッケル上で部分的に精製できる。
【０１３８】
先行する精製および再生処置は、タンパク質が封入体から回収されることを最善であると意図して行われているが、タンパク質精製技術の当業者は、多くの組換えタンパク質が、細胞溶解産物の可溶性分画から精製されることが最も良いことを理解するであろう。この場合、再生は必要でない場合が多く、標準的なクロマトグラフィー法による精製を直接行うことができる。
【０１３９】
酵母系
あるいはまた、ポリペプチドは、酵母宿主細胞、好ましくはSaccharomyces属(例えば、S.cerevisiae)中で発現されてもよい。PichiaまたはKluyveromycesなどの他の酵母属も使用できる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカー遺伝子を含むことが多い。酵母ベクターのために適したプロモーター配列は、とりわけメタロチオネイン、3-ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980)、または他の解糖酵素(エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ(phospho-glucose isomerase)、およびグルコキナーゼなど)(Hessら, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968；およびHollandら, Biochem. 17:4900, 1978)のためのプロモーターを含む。酵母発現に使用できるその他の適切なベクターおよびプロモーターは、Hitzeman、欧州特許出願第73,657号に記載されている。別の選択肢としては、Russellら(J. Biol. Chem. 258:2674, 1982)およびBeierら(Nature 300:724, 1982)に記載されているグルコース抑制ADH2プロモーターがある。大腸菌における選択および複製のためのpBR322由来のDNA配列(Ampr遺伝子および複製起点)を上記酵母ベクターに挿入することにより、酵母よび大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築してもよい。
【０１４０】
酵母α-因子リーダー配列を、ポリペプチドの分泌を指示するために使用できる。α-因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される場合が多い。例えば、Kurjanら, Cell 30:933, 1982およびBitterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易化するのに適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、3’側付近において１つ以上の制限部位を含むように修飾されてもよい。これにより、リーダー配列の構造遺伝子への融合が容易になる。
【０１４１】
酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。このようなプロトコールの１つは、Hinnenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。Hinnenらのプロトコールによれば、0.67%酵母窒素原基礎培地、0.5%カザミノ酸、2%グルコース、10 mg/mlアデニンおよび20 mg/mlウラシルからなる選択培地中でTrp+形質転換体を選択する。
【０１４２】
ADH2プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「富化(rich)」培地中で発現を誘導するために増殖されうる。富化培地の例として、1%酵母抽出液、2%ペプトン、および1%グルコースからなるものに、80 mg/mlアデニンおよび80 mg/mlウラシルを添加したものが挙げられる。ADH2プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から無くなったときに生じる。
【０１４３】
哺乳動物系または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系も、組換えポリペプチドを発現するために使用できる。昆虫細胞中で異種タンパク質を作製するためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers, Bio/Technology 6:47(1988)に概説されている。樹立された哺乳動物由来源細胞系も使用できる。適切な哺乳動物宿主細胞系には、サル腎細胞のCOS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzmanら, Cell 23:175, 1981)、Ｌ細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、およびBHK(ATCC CRL 10)細胞系、ならびにMcMahanら(EMBO J. 10:2821, 1991)に記載されているようにアフリカミドリザル(African green monkey)腎細胞系CV1(ATCC CCL70)から誘導したCV1/EBNA細胞系が含まれる。
【０１４４】
哺乳動物細胞にDNAを導入するために確立された方法は記載されている(Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69)。Lipofectamine脂質試薬(Gibco/BRL)またはLipofectamine-Plus脂質試薬などの市販の試薬を使用した別のプロトコールを、細胞をトランスフェクトするために使用できる(Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987)。さらに、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されるような従来方法により、エレクトロポーレーションを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトできる。例えば、細胞傷害性薬剤に対する耐性など当該分野で公知の方法を用いて、安定な形質転換体の選択を行える。Kaufmanら, Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)耐性などのいくつかの選択スキームを記載している。DHFR選択のために適切な宿主株は、DHFRが不足しているCHO株DX-B11でもよい(UrlaubおよびChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)。DHFR cDNAを発現するプラスミドをDX-B11株に導入し、プラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖できる。発現ベクターに組み込める選択マーカーの他の例として、抗生物質(G418およびハイグロマイシンＢなど)に対する耐性を付与するcDNAが挙げられる。ベクターを保持する細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択できる。
【０１４５】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。一般的に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマイウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス40(SV40)、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。SV40ウイルスゲノムから誘導されるDNA配列、例えば、SV40起源、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位などは、哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列を発現するための他の遺伝子エレメントを提供するために使用できる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方ともウイルスゲノムから断片として容易に得られるために、特に有用であり、さらにウイルス複製起点を含んでいてもよい(Fiersら, Nature 273:113, 1978；Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。SV40ウイルス複製起点部位に配置されたHindIII部位からBglI部位にわたる約250bpの配列が含まれれば、大小のSV40断片も使用できる。
【０１４６】
哺乳動物発現ベクターから異種遺伝子を発現することを改善することが示されている別の調節配列は、CHO細胞由来の発現増強配列エレメント(EASE)(Morrisら, Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534およびPCT出願WO97/25420)、ならびにアデノウイルス２由来の三部分(tripartite)リーダー(TPL)およびVA遺伝子RNA(Gingerasら, J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982)などのエレメントを含む。ウイルス起源の内部リボソームエントリー部位(IRES:Internal ribosome entry site)配列により、ジシストロン(dicistronic)mRNAが効率的に翻訳されることが可能になる(OhおよびSarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300, 1993；Rameshら, Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996)。ジシストロンmRNAの一部および後続する選択マーカー用の遺伝子(例えば、DHFR)として異種cDNAを発現することは、宿主のトランスフェクト性および異種cDNAの発現を改善することが示されている(Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。ジシストロンmRNAを使用する発現ベクターの例として、Mosserら, Biotechniques 22:150-161, 1997に記載されているpTR-DC/GFP、およびMorrisら, Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534に記載されているp2A5Iが挙げられる。
【０１４７】
有用な高度発現ベクターであるpCAVNOTが、Mosleyら, Cell 59:335-348, 1989に記載されている。哺乳動物宿主細胞に使用できる他の発現ベクターは、OkayamaおよびBerg(Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)に開示されているように構築できる。C127マウス乳上皮細胞における哺乳動物cDNAの安定した高度発現のために有用な系は、Cosmanら(Mol. Immunol. 23:935, 1986)に記載されているように実質的に構築できる。Cosmanら, Nature 312:768, 1984に記載されている有用な高度発現ベクターであるPMLSV N1/N4は、ATCC39890として寄託されている。別の有用な哺乳動物発現ベクターは、参照により本明細書中に組み込まれる欧州特許出願第0367566号、およびWO91/18982に記載されている。さらに別の選択肢として、ベクターはレトロウイルスから誘導できる。
【０１４８】
別の有用な発現ベクターであるpFLAG(登録商標)およびpDC311も使用できる。FLAG(登録商標)技術は、低分子量(1kD)で、親水性のFLAG(登録商標)マーカーペプチドを、pFLAG(登録商標)発現ベクターで発現された組換えタンパク質のＮ-末端に融合することを中心に構成されている。pDC311は、CHO細胞においてタンパク質を発現するために使用される別の専用ベクターである。pDC311は、目的の遺伝子、およびDHFR翻訳のための内部リボソーム結合部位を有するジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子を含むバイシストロン(bicistronic)配列、発現増強配列エレメント(EASE)、ヒトCMVプロモーター、三部分リーダー配列、ならびにポリアデニル化部位によって特徴付けられる。
【０１４９】
使用できるシグナルペプチドに関して、所望であれば、天然型シグナルペプチドを異種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを内部で生成する宿主細胞の種類などの要因に依存する。例示すると、哺乳動物宿主細胞において機能する異種シグナルペプチドの例として、米国特許第4,965,195号に記載のインターロイキン-7(IL-7)のためのシグナル配列、Cosmanら, Nature 312:768(1984)に記載のインターロイキン-２受容体のためのシグナル配列、欧州特許第367,566号に記載のインターロイキン-４受容体シグナルペプチド、米国特許第4,968,607号に記載のＩ型インターロイキン-１受容体シグナルペプチド、ならびに欧州特許第460,846号に記載のII型インターロイキン-１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【０１５０】
精製
また、本発明は、ポリペプチドおよびそれらの断片を単離精製する方法も包含する。本発明による単離精製ULBPポリペプチドは、前述したように組換え発現系によって生成するか、または天然に存在する細胞から精製される。ULBPポリペプチドは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による分析の際に単一タンパク質バンドとして示されて、実質的に精製できる。ULBPを生成するためのプロセスの１つは、ULBPの発現を促すのに十分な条件下で、ULBPポリペプチドをコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む。その後、ULBPポリペプチドを、使用する発現系に応じて、培養培地または細胞抽出物から回収する。
【０１５１】
単離精製
本明細書中で使用する「単離精製」という表現は、ULBPが、例えば、他のDNA、タンパク質またはポリペプチドと本質的に会合せずに、組換え宿主細胞培養物の精製産物または非組換え起源からの精製産物であることを意味する。本明細書中で使用する「実質的に精製された」という表現は、ULBPを含み、特異的な抗体を用いて除去できる公知のDNAまたはタンパク質の存在以外には他のDNA、タンパク質またはポリペプチドと本質的に会合しない混合物を指す。この実質的に精製されたULBPタンパク質は、生物活性を保持する。「精製ULBP」という用語は、「単離精製」形態のULBPまたは「実質的に精製された」形態のULBPのいずれか(ともに本明細書中に記載)を指す。
【０１５２】
ULBPタンパク質に関して使用される「生物活性」という用語は、ULBPタンパク質が、UL16と会合可能、またはUL16に対する抗体を使用してUL16と同時免疫沈降されることを意味する。同様に、ULBP-2タンパク質とUL16との会合は、ULBP-2タンパク質が生物活性を有することを示す。
【０１５３】
１つの好適な実施形態では、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発明のポリペプチドまたは断片と別のポリペプチドとの融合体を使用し、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を補助することによって達成される。このような融合体パートナーとしては、前述したポリ-Hisまたは他の抗原同定ペプチド、ならびに先に記載したFc部分が挙げられる。
【０１５４】
組換えポリペプチドまたは断片の精製方法は、いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られているように、使用される宿主細胞の種類、および組換えポリペプチドまたは断片が培養培地中に分泌されるか否かなどの要因に応じて、異なる。
【０１５５】
一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合は宿主細胞から単離され、または可溶性で分泌される場合は培地もしくは上清から単離できる。その後、濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップのうちの１つ以上を行う。これらのステップを行うための具体的な手段については、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター(例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットなど)を使用して、培養培地を濃縮してもよい。濃縮ステップの後、濃縮物を、ゲル濾過媒体などの精製マトリックスに塗布してもよい。あるいはまた、陰イオン交換樹脂(例えば、ジエチルアミノエチル側基を有するマトリックスまたは基質)を使用できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または、タンパク質精製に一般的に使用されている他の種類のものでもよい。あるいはまた、陽イオン交換ステップを利用できる。適切な陽イオン交換材として、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。また、等電点クロマトグラフィーステップを利用できる。あるいはまた、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップも利用できる。適切なマトリックスは、樹脂に結合したフェニル部分またはオクチル部分でもよい。さらに、組換えタンパク質を選択的に結合するマトリックスでのアフィニティークロマトグラフィーを利用できる。使用される上記樹脂の例として、レクチンカラム、ダイカラム、および金属キレートカラムが挙げられる。最後に、疎水性RP-HPLC媒体(例えば、シリカゲル、またはメチル、オクチル、オクチルデシルもしくは他の脂肪族側基を有するポリマー樹脂)を使用する逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)ステップを１回以上利用して、ポリペプチドをさらに精製できる。上記した精製ステップの一部または全てが、様々な組み合わせにおいて周知であり、単離精製組換えタンパク質を得るために使用できる。
【０１５６】
細菌培養液中で生成された組換えタンパク質は、通常、宿主細胞の最初の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドであれば細胞ペレットからの抽出あるいは可溶性ポリペプチドであれば上清液からの抽出、そして、濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップのうちの１つ以上によって単離される。最後に、RP-HPLCを、最終的な精製ステップのために利用できる。微生物細胞は、任意の使いやすい方法によって破壊でき、これには、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。
【０１５７】
精製を簡易化するために、形質転換された酵母宿主細胞を、ULBPを分泌ポリペプチドとして発現するために使用することが好ましい。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら(J. Chromatog. 296:171, 1984)に開示されているものと類似した方法により精製できる。Urdalらは、組換えヒトIL-2を分離用HPLCカラム上で精製するための、２つの連続した逆相HPLCステップを記載している。
【０１５８】
ULBPを組換え生成することに加えて、ULBPを、細胞系、特にNamalwaヒトＢ細胞リンパ腫細胞から単離精製することができる。
【０１５９】
また、本発明のポリペプチド結合タンパク質(例えば、本発明のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体など)を含むアフィニティーカラムを利用して、発現したポリペプチドをアフィニティー精製してもよい。これらのポリペプチドは、従来技術を用いてアフィニティーカラムから除去できる(例えば、高塩濃度溶出緩衝液において、その後低塩濃度緩衝液に透析して使用するか、または使用するアフィニティーマトリックスに応じて、pHまたは他の要素を変化させる)。あるいはまた、本発明で得たポリペプチドなど親和性部分の天然に存在する基質を使用して競合的に除去することができる。
【０１６０】
本発明のこの態様では、本発明の抗ポリペプチド抗体、または本発明のポリペプチドと相互作用しうる他のタンパク質などのポリペプチド結合タンパク質を、本発明のポリペプチドを表面上で発現する細胞の同定、分離または精製に適したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは類似した基質などの固相支持体に結合させてもよい。本発明のポリペプチド結合タンパク質の固相接触面への接着は、例えば、磁気マイクロスフィアを上記ポリペプチド結合タンパク質で被覆し、インキュベーション容器中に入れて磁界下に置くなどの任意の手段によって行うことができる。細胞混合物の懸濁液を、上記ポリペプチド結合タンパク質を表面上に有する固相と接触させる。表面上に本発明のポリペプチドを有する細胞は、固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、その後未結合細胞は洗浄される。この親和性結合方法は、上記ポリペプチド発現細胞を溶液から精製、スクリーニング、または分離するのに有用である。陽性選択された細胞を固相から離す方法は、当該分野で公知であり、例えば、酵素の使用が挙げられる。このような酵素は、好ましくは細胞に対して非毒性および無害であり、好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するようにされている。
【０１６１】
あるいはまた、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと思われる細胞の混合物を、まず、本発明のビオチン化ポリペプチド結合タンパク質とインキュベートしてもよい。インキュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするために、典型的に少なくとも１時間継続する。得られた混合物を、次いで、アビジンで被覆されたビーズを充填したカラムに通し、ビオチンのアビジンに対する高親和性によりポリペプチド結合細胞をビーズに結合させる。アビジン被覆ビーズの使用は当該分野において公知である。Berensonら, J. Cell. Biochem., 10D:239(1986)を参照のこと。未結合物質の洗浄、および結合細胞の分離は、従来方法を用いて行う。
【０１６２】
上記方法では、適切なULBP結合ポリペプチドは、抗-ULBP抗体およびULBPを高い親和性により結合できる他のタンパク質である。好ましいULBP結合タンパク質は、抗-ULBPモノクローナル抗体である。
【０１６３】
望ましい純度は、意図するタンパク質の用途に依拠する。例えば、ポリペプチドがin vivoで投与される場合には比較的高い純度が望ましい。この場合、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による分析の際に他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検出されないくらいにポリペプチドを精製する。関連分野の当業者は、示差的グリコシル化、示差的翻訳後プロセシングなどにより、ポリペプチドに対応する複数のバンドがSDS-PAGEによって可視化できることを理解するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEによる分析の際に単一タンパク質バンドとして示される実質的に均質な状態に精製される。タンパク質バンドは、銀染色法、クーマシーブルー染色法、または(タンパク質が放射能標識されてる場合には)オートラジオグラフィー法によって可視化してもよい。
【０１６４】
アッセイ
従来の結合アッセイなどの任意の適切なアッセイにより、本発明の精製ポリペプチド(タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の形態のものを含む)を、UL-16またはULBPカウンター構造分子を結合する能力について試験できる。例示すると、ポリペプチドを検出可能な試薬(例えば、放射能性核種、発色団、比色反応または蛍光反応などを触媒する酵素)で標識してもよい。標識ポリペプチドを、ULBPカウンター構造分子を発現する細胞と接触させる。次いで細胞を洗浄して、未結合標識ポリペプチドを除去し、標識の性質に応じて適切な技術により細胞結合標識の存在を決定する。
【０１６５】
結合アッセイ法の一例は以下の通りである。UL16 cDNAを含む組換え発現ベクターを構築する。UL16のDNAおよびアミノ酸配列情報は(Kayeら, J. Virol. 66:6609, 1992)に示されている。例えば、OX40-Fcについて先に記載されているように(Baumら, EMBO J. 13:3992-4001, 1994)、UL16-Fcは、UL16の細胞外ドメインをIgG-I Fc(突然変異タンパク質形態)に融合する。10 cm2皿中のCV1-EBNA-1細胞を組換え発現ベクターでトランスフェクトする。CV-1/EBNA-1細胞(ATCC CRL 10478)は、CMV前初期エンハンサー/プロモーターから誘導されたEBV核抗原-1を構成的に発現する。CV1-EBNA-1は、McMahanら(EMBO J. 10:2821, 1991)に記載されているように、アフリカミドリザル腎細胞系CV-1(ATCC CCL 70)から誘導する。
【０１６６】
トランスフェクトされた細胞を、24時間培養し、次いで各皿の細胞を24ウエルプレートに配分する。さらに48時間培養した後、トランスフェクトした細胞(約4×104細胞/ウエル)を、50 mg/mlの乾燥脱脂乳を添加された結合媒体(25 mg/mlウシ血清アルブミン，2 mg/mlアジ化ナトリウム、20 mM Hepes pH 7.2を含むRPMI 1640)であるBM-NFDMで洗浄する。次に、細胞を、例えば、前述したように作製された様々な濃度の可溶性ポリペプチド/Fc融合タンパク質と、37℃にて１時間インキュベートする。次に、細胞を、結合媒体中に一定飽和濃度で存在する125I-マウス抗ヒトIgGで、37℃にて１時間緩やかに攪拌して洗浄およびインキュベートする。十分に洗浄した後、トリプシン処理により細胞を解離する。
【０１６７】
上記利用したマウス抗-ヒトIgGを、ヒトIgGのFc領域に対して用いる。これは、Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PAから得られる。抗体を、標準的クロラミンＴ法を使用して放射性ヨウ素化する。抗体は、細胞に結合した任意のポリペプチド/Fcタンパク質のFc部分に結合する。全てのアッセイにおいて、Fc融合タンパク質/Fcの不在下、ならびにFc融合タンパク質および200倍モル過剰量の非標識マウス抗ヒトIgG抗体の存在下における、125I-抗体の非特異的結合についてアッセイした。
【０１６８】
細胞結合125I-抗体を、Packardオートガンマカウンターで定量した。親和性計算(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949)は、Microvaxコンピュータ上で実行されるRS/1(BBN Software, Boston, MA)で求められる。
【０１６９】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例示すると、UL16またはULBPカウンター構造を発現する細胞と結合する際の、天然型タンパク質と競合する能力について変異体をアッセイすることによって、変異体の生物活性を決定できる。
【０１７０】
競合結合アッセイは、従来方法によって行うことができる。競合結合アッセイ利用できる試薬としては、放射能標識されたUL16、および細胞表面上で(内因性または組換えの)ULBPを発現する無傷の細胞が挙げられる。例えば、放射能標識された可溶性ULBP断片を、細胞表面(結合パートナー)との結合を可溶性ULBP変異体と競合させるために使用できる。無傷細胞の代わりに、プロテインＡまたはプロテインＧとFc部分との(固相上での)相互作用を介して固相と結合した可溶性UL16/Fc融合タンパク質で置き換えてもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムとしては、Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJから入手可能なものが挙げられる。
【０１７１】
別の種類の競合結合アッセイは、放射能標識された可溶性UL16(例えば、可溶性UL16/Fc融合タンパク質など)およびULBPを発現する無傷の細胞を利用する。競合オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより定性結果が得られ、またScatchardプロット(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949)を利用して定量結果を生成してもよい。
【０１７２】
ULBP核酸またはオリゴヌクレオチドの使用
前述したようにポリペプチドを発現するために使用する以外に、DNAおよびそのオリゴヌクレオチドを含む本発明の核酸は、以下のことにも使用できる。
【０１７３】
- ULBP活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとして使用できる。
- ヒト第６染色体を同定するために使用できる。
- ヒト第６染色体上の遺伝子をマッピングするために使用できる。
- ヒト第６染色体に関連した特定の疾患、症状または他の状態を伴う遺伝子を同定するために使用できる。
- 一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ULBP遺伝子にコードされたポリペプチドの発現を阻害するために使用できる。
- 個体における欠陥遺伝子を検出するのを助けるために使用できる。
- 遺伝子治療のために使用できる。
【０１７４】
プローブ
本発明の核酸の使用の１つは、断片をプローブまたはプライマーとして使用することである。このような断片は、一般的に、DNA配列のうちの少なくとも約17の連続するヌクレオチドを含む。別の実施形態では、DNA断片は、DNA配列の少なくとも30、または少なくとも60の連続するヌクレオチドを含む。
【０１７５】
他の哺乳動物種に由来する、配列番号１、配列番号３および配列番号９の相同体も本明細書に含まれるため、配列番号１、配列番号３および配列番号９のDNA配列に基づくプローブを使用し、従来の交差種(cross-species)ハイブリダイゼーション技術を使用して他の哺乳動物種に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１７６】
前述したアミノ酸配列と合わせて遺伝子コードの知識を使用し、縮重オリゴヌクレオチドのセットが作製できる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などのプライマーとして有用であり、これによりDNA断片が単離され増幅される。
【０１７７】
染色体マッピング
ULBP-1およびULBP-2ポリペプチドは、いくつかのMHCクラス１タンパク質、特に非ヒト種の非古典的クラス１分子またはクラス１分子と遠縁の関係にある。ULBP-1およびULBP-2ポリペプチドは、MHCクラスＩタンパク質のα１およびα２ドメインに相同的な領域を含む。しかし、これらは、β-２-ミクログロブリンを結合するために必要なα-３ドメインを欠く点で、他のクラス１分子とは異なる構造を有する。さらに、ULBP-1およびULBP-2遺伝子は、他のMHCクラス１および関連遺伝子と区別される染色体6q20-23にマッピングされる。
【０１７８】
オリゴヌクレオチドを含む、配列番号１または配列番号３の核酸の全てまたは一部は、周知の技術を用いて当該分野の当業者によって使用されて、ULBPファミリーメンバーのDNAを含むヒト第６染色体およびその特定の遺伝子座を同定することができる。有用な技術には、放射能ハイブリッドマッピング(高解像度)、染色体長(spread)に対するin situハイブリダイゼーション(中度の解像度)、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞系に対するサザンブロットハイブリダイゼーション(低解像度)などの様々な周知技術において、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分をプローブとして使用することが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７９】
例えば、放射能ハイブリダイゼーションにより染色体をマッピングしてもよい。93の放射能ハイブリッドを含むWhitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4パネル(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html)を使用してPCRを行う。目的の遺伝子の推定上のエキソンに存在し、ヒトゲノムDNA由来の産物を増幅するが、ハムスターゲノムDNAは増幅しないプライマーを使用する。PCRの結果を、インターネット(http://www-seq.wi.mit.edu)上でWhitehead/MIT Radiation Mapping siteに寄託されたデータベクターに変換する。データをスコア付けし、公知の配列タグ部位(STS:Sequence Tag Site)マーカーに関連づけて、放射能ハイブリットマップ上での染色体評価および位置付けを行う。以下のウェブサイトは、放射能ハイブリッドマッピングについてさらなる情報を提供している：http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/07-97.INTRO.html)。
【０１８０】
関連疾患の同定
以下に記載するように、配列番号１および配列番号３は、第６染色体の6q20-23領域にマッピングされた。該領域は、網膜色素変性-25(6q14-q21)、インスリン依存性真性糖尿病、15(6q21)、幼児期の進行性擬性リウマチ関節症(6q22)、先天性メロシン欠損(merosin-deficient)筋ジストロフィー(6q22-q23)、ならびに拡張型心筋症、1F(6q23)などを含む(がこれらに限定されない)特定の疾患と関連している。従って、配列番号１もしくは配列番号３の核酸、またはそれらの断片を、周知技術を利用して当業者によって使用して、第６染色体への遺伝子マッピングに関連した異常を分析できる。これにより、該マーカーが再配列または欠失された状態を区別することが可能になる。さらに、配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチドまたはこれらの断片を位置マーカーとして使用して、他の未知配置の遺伝子をマッピングできる。
【０１８１】
上記DNAは、本発明の核酸に対応する遺伝子の欠陥または不足によって(直接的または間接的に)媒介される任意の障害の治療を開発するために使用できる。天然型ヌクレオチド配列についての本明細書の開示は、欠陥遺伝子の検出、および該遺伝子の正常遺伝子との置換を可能にする。欠陥遺伝子は、in vitro診断アッセイにおいて、また、本明細書に開示する天然型ヌクレオチド配列を、欠陥遺伝子を保持していると思われるヒトから得た該遺伝子のヌクレオチド配列と比較することによって検出できる。
【０１８２】
センス-アンチセンス
他の有用な核酸断片としては、標的mRNA(センス)またはDNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNAまたはDNAのいずれか)を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によれば、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、DNA(配列番号１、配列番号３または配列番号９)の断片を含む。該断片は、通常、少なくとも約14のヌクレオチド、好ましくは約14から約30ヌクレオチドを含む。任意のタンパク質をコードするcDNA配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、SteinおよびCohen(Cancer Res. 48:2659, 1988)ならびにvan der Krolら(BioTechniques 6:958, 1988)に記載されている。
【０１８３】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、いくつかある手段(RNAseHによるmRNAの増強された分解、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未成熟終結、または他の手段を含む)のうちの１つにより、タンパク質発現をブロックまたは阻害する二重らせんを形成する。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、タンパク質の発現をブロックするために使用してもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖-ホスホジエステル骨格(またはWO91/06629に記載のような他の糖結合)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。この糖結合は、内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を有する上記オリゴヌクレオチドは、in vivoで安定である(すなわち、酵素分解に耐性である)が、配列特異性は保持して標的ヌクレオチド配列に結合できる。
【０１８４】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例として、WO90/10448に記載されるような有機部分、およびポリ(L-リシン)などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加するような他の部分と共有結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、エリプチシンなどの介在物質、およびアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に対する結合特異性を変えてもよい。
【０１８５】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、任意の遺伝子導入方法、例えばリポフェクション、CaPO4-媒介型DNAトランスフェクション、エレクトロポーレーション、またはエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用によって、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。
【０１８６】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを適切なレトロウイルスベクターに挿入し、その後、挿入配列を含むレトロウイルスベクターに細胞をin vivoまたはex vivoのいずれかで接触させることによって標的核酸配列を含む細胞に導入されることが好ましい。適切なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスM-MuLV、N2(M-MuLV由来のレトロウイルス)、またはDCT5A、DCT5BおよびDCT5Cと称されるダブルコピーベクター(PCT出願US90/02656を参照のこと)が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８７】
また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されるように、リガンド結合分子と複合体を形成して、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入できる。適切なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体と結合する他のリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の複合体は、リガンド結合分子が対応する分子または受容体と結合する能力を実質的に妨害したり、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこれらの複合体形態が細胞に侵入するのをブロックしない。
【０１８８】
あるいはまた、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、WO90/10448に記載されるように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド脂質複合体は、内因性リパーゼにより、細胞内で解離されることが好ましい。特定の細胞型を指向させたモノクローナル抗体に
ULBPポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの用途
用途には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８９】
・癌検出用マーカーとして
・INF-γ産生およびNK細胞増殖の強化
・CTL活性の強化
・タンパク質の精製およびその活性の測定
・送達剤
・治療薬
・合理的な薬剤設計
・研究試薬
・分子量および等電点電気泳動マーカー
・ペプチド断片化の対照
・未知のタンパク質の同定
・抗体の調製
癌検出用マーカーとして
ULBP DNAおよびポリペプチドは、癌検出用マーカー（以下「ULBPマーカー」）として、特にB細胞リンパ腫検出用マーカーとして使用することができる。一般に、癌のマーカーは、正常な細胞から悪性細胞を区別する細胞の表現型における変化を表わす。マーカーは、癌の発生に関係するか、（例えば癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子における突然変異など）、あるいは腫瘍の進行中に獲得される二次的変化であってもよい。例えば、癌マーカーの使用について記載しているVincent T. DeVita, Jr. Samuel Hellman, and Steven A. Rosenberg, Cancer Principles & Practice of Oncology, 259-284 (5th ed. 1997)（本明細書中に参考として全て組み込まれる）を参照されたい。
【０１９０】
どちらの場合においても、ULBPマーカーは、癌、特にB細胞リンパ腫の検出、同定、診断または予後を容易とする。ULBPマーカーは、良性新生物から悪性新生物を見分けるため、および新生物細胞から浸潤性反応過程（infiltrating reactive process）を見分けるために、使用することができる。さらに、ULBPマーカーは、腫瘍の発生元となる正常な前駆細胞を、その腫瘍が示す組織分化の特徴を評価することによって同定することにより、腫瘍の診断を容易とすることができる。さらに、細胞および組織をULBPマーカーについて評価することは、腫瘍のサブタイプ化および段階化において有用であり、予後に関する重大な情報を提供する。ULBPマーカーは、治療後の後遺症および再発を監視するために使用することもできる。最後に、ULBPマーカーは、正常な組織の中のゲノム再配列を同定することにより、特定の癌タイプの発生に対する遺伝性疾病素質を有する患者を診断することができる。これに対し、非遺伝性、または散発性の腫瘍は、腫瘍サンプル中においてのみULBP遺伝子のゲノム再配列が起こっているだろう。
【０１９１】
癌検出のためにマーカーを使用する方法は、当業者に知られている。例えば、癌の特徴であるゲノム再配列は、ULBP  DNAを用いて検出することができる。ゲノム再配列は、本願において、ULBP遺伝子内もしくはその近く（たとえばプロモーター、イントロン配列および３’側非翻訳領域（UTR）など）における、欠失、挿入、転移、逆位、増幅、複製または点突然変異として定義される。ULBP  DNAを用いて新生物性細胞内のゲノム再配列を検出する方法は当業者に知られており、サザンハイブリダイゼーション、PCRに基づくアッセイ、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、DNA配列反応、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、RNアーゼ・プロテクション法、および立体配置の違い（例えば一本鎖高次構造多型（SSCP））に基づくアッセイ、変性濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）、および例えばMutS配列とリゾルバーゼ（resolvase）配列との間のミスマッチを特異的に検出する酵素などが挙げられるが、これらに限定されない（マーカーによる癌検出に使用される上記周知方法について概説したDeVita, pp.263-269を参照されたい）。ゲノム再配列は、ガラスチップに付着させたULBP  DNAを用いてサンプルを該チップにハイブリダイズさせることにより、検出することもできる。
【０１９２】
ULBP  DNAは、ULBP遺伝子の発現を検出するために使用することができる。多くの遺伝子は、癌の発生および進行に関わっていてもいなくても、その癌の発生元であると思われる細胞型において観察される発現パターンに比べて多くまたは少なく発現するか、あるいは全くない状態である。反対に、発現レベルは正常な発現パターンに匹敵する場合がある。しかしながら、メッセンジャーRNA（mRNA）は、野生型遺伝子では見られない突然変異（例えば停止突然変異、点突然変異または選択的スプライシング突然変異など）を含む。癌細胞におけるこれらの変化した発現パターンおよびmRNA種の検出は、その特定の癌タイプのマーカーとして使用することができる。
【０１９３】
ULBPヌクレオチド配列を使用して、癌細胞、特にB細胞リンパ腫における発現パターンおよびmRNA種を検出することができる。当業者であれば、ULBP遺伝子の発現パターンおよびmRNA種を検出するために既知の方法をどのように改変すればよいかが分かるであろう。１つの方法では、癌細胞からmRNAまたは全長RNAのいずれかを単離してからULBPヌクレオチドを用いてプロービングすることによって、ノーザンハイブリダイゼーションを行う。検出は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT‐PCR）に基づくアッセイ、またはRT‐PCRとサザンハイブリダイゼーションとの組み合わせにより行うこともできる。さらに、そのmRNA種における突然変異は、ゲノム再配列を検出するための上記方法により検出することができる。
【０１９４】
本発明においてULBP発現およびmRNA種の検出に使用されるその他の公知方法としては、in situハイブリダイゼーション（ISH）がある（DeVita, p.267を参照されたい）。例えば、患者から採取したパラフィン埋込み組織を、該mRNA1に相補的な標識したULBPヌクレオチドを用いてスクリーニングし、正常な組織に隣接する新生物細胞における発現パターンの比較を可能とすることができる。このように、本発明のULBPの配列を開示することにより、当業者は、正常な細胞および癌細胞におけるmRNA種を検出するためのマーカーを用いた既知の方法を簡単に改変することができる。
【０１９５】
ULBPヌクレオチドを癌検出用マーカーとして使用することができるだけでなく、ULBPポリペプチドを用いたアッセイを癌検出用として設計することもできる。１つの実施形態において、単離および精製したULBP‐１は、ULBP-1がリンパ腫細胞に結合できるような条件下においてリンパ腫細胞とともにインキュベートすることができる。結合しなかったULBP-1を洗浄ステップにより除去し、結合したULBP-1を、抗ULBP-1モノクローナル抗体を用いて検出することができる（Meyers ら, Leuk. and Lymph. 18:119-122を参照されたい）。
【０１９６】
他の実施形態において、ULBPポリペプチドから調製した抗体を用いたアッセイを、癌検出用に設計することができる（DeVita, p.260-262を参照されたい）。例えば、ULBPポリペプチドに対する抗体は、悪性増殖から良性増殖を区別するための免疫組織学的検査に使用することができる。これらの免疫組織学的検査は、もとの正常な細胞に比べた場合の、癌細胞中におけるULBPタンパク質の過剰産生、産生不足、または誤った画分化（miscompartmentalization）を検出することができる。野生型ULBPタンパク質の産生における変化の証拠は、より悪性の、または進行した段階の癌に関するマーカーとなり得る。
【０１９７】
同様に、異常に産生されたULBPタンパク質は、体液から採取したサンプル中のULBPタンパク質に対する抗体により検出することができる。例えば、異常産生されたULBPタンパク質は、細胞膜内に留まりきれずに、細胞からその患者の血流中に分泌されてしまうことがある。次に患者から採取した血液サンプルをULBP抗体を用いて分析し、フロー・サイトメーターによりその血液中における異常ULBPタンパク質の存在を測定する。血流中の異常ULBPタンパク質の存在は、癌患者、特にB細胞リンパ腫患者における治療のモニターおよび腫瘍の進行もしくは再発の検出に役立つであろう。
【０１９８】
IFN-γの産生およびNK細胞の増殖の強化
ULBPポリペプチドは、IFN-γの産生およびNK細胞の増殖を用量依存的に強化するために使用されていた（図１および図２）。従って、ULBPポリペプチドは、例えば実施例5に記載されるように、ULBPポリペプチドをNK細胞と共にインキュベートすることにより、IFN-γの産生およびNK細胞の増殖を強化するための方法において使用することができる。当業者であれば、ULBPポリペプチドは、in vitroおよびin vivoの両方において、IFN-γの産生およびNK細胞の増殖を強化するために使用できることが分かる。さらに、当業者であれば、ULBPポリペプチドによるIFN-γの産生およびNK細胞の増殖の強化により、例えばウイルス、細菌、寄生生物および腫瘍に対する免疫応答を調節することができることが分かるであろう。
【０１９９】
CTL活性の強化
ULBPポリペプチドは、CTL活性を用量依存的に強化するために使用されていた（図３および図４）。従って、ULBPポリペプチドは、例えば実施例６に記載されるように、ULBPポリペプチドをCTLと共にインキュベートすることによりCTL活性を強化させる方法において使用することができる。当業者であれば、ULBPポリペプチドを使用して、in vitroおよびin vivoの両方においてCTL活性を強化することができることが分かる。当業者であればさらに、ULBPポリペプチドによるCTL活性の強化により、例えばウイルス、細菌および腫瘍に対する免疫応答を調節することが可能であることが分かる。
【０２００】
精製試薬
本発明のポリペプチドの各々は、タンパク質精製試薬として使用することができる。これらのポリペプチドは、固相支持物質に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーによりULBPの逆構造分子（counter-structure molecule）を精製するために使用することができる。特定の実施形態において、（本明細書中に記載される、ULBP逆構造分子に結合することができるあらゆる形態の）ポリペプチドを、従来法により固相支持体に結合させる。１つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含むクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Pharmacia Biotech, Inc. ニュージャージー州ピスカタウェイ）。別法において、（上記の）ポリペプチド/Fcタンパク質を、Fc部分との相互作用によりタンパク質Aもしくはタンパク質Gを含むクロマトグラフィーカラムに結合させる。
【０２０１】
該ポリペプチドは、細胞表面上にULBP逆構造分子を発現する細胞を精製または同定するのに使用することもできる。ポリペプチドを、例えばカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の好適な基質などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球を該ポリペプチドでコーティングし、磁場を通してインキュベーション容器中に保つことができる。ULBP逆構造分子を発現する細胞を含む細胞混合物の懸濁液を、該ポリペプチドを表面上に有する固相に接触させる。細胞表面上にULBP逆構造分子を発現する細胞は、この固定されたポリペプチドに結合し、その後結合しなかった細胞を洗い流す。
【０２０２】
あるいは、該ポリペプチドを検出可能な成分にコンジュゲートさせたあと、ULBP逆構造分子の発現について検査しようとする細胞と共にインキュベートすることができる。インキュベーション後、結合しなかった標識物を除去し、その細胞上の該検出可能成分の存在または不在を測定する。
【０２０３】
さらに別法において、ULBP逆構造分子を発現する細胞を含むと思われる細胞の混合物を、ビオチン化ポリペプチドと共にインキュベートする。インキュベーションの時間は、十分な結合のために典型的には少なくとも1時間である。つぎに、アビジンでコーティングしたビーズを中に詰めたカラムにこの得られた混合物を通過させると、アビジンに対するビオチンの高い親和性により、所望の細胞が該ビーズに結合する。アビジンでコーティングしたビーズを使用する方法は公知である（Berensonら, J. Cell. Biochem., 10D：239, 1986を参照のこと）。結合しなかった物質を除去するための洗浄、および結合した細胞の解放は、従来法を用いて行う。
【０２０４】
活性の測定
ポリペプチドは、その結合親和性の観点から、ULBP逆構造分子の生物学的活性を測定するのに使用することもできる。このように、該ポリペプチドは、例えば異なる条件下におけるタンパク質の寿命および安定性をモニターするために、「品質保証」検査を行う場合に使用され得る。例えば、該ポリペプチドは、異なる温度で保存された、あるいは異なる細胞型において産生された、ULBP逆構造分子の生物学的活性を測定するための結合親和性検査で使用することができる。このタンパク質は、ULBP逆構造分子を改変（例えば化学的修飾、末端切断、突然変異など）した後に生物学的活性が維持されたかどうかを決定するために使用することもできる。改変されたULBP逆構造分子の結合親和性を未改変のULBP逆構造分子の結合親和性を比較して、その改変がULBP逆構造分子の生物学的活性に及ぼす悪影響を検出する。こうしてULBP逆構造分子の生物学的活性を、例えば調査研究で使用する前に確かめることができる。
【０２０５】
送達剤
in vitroまたはin vivo手法において、細胞表面上にULBP逆構造分子を発現することが判明したこのような細胞または細胞型に、診断薬または治療薬を送達するために、該ポリペプチドを使用することができる。例えば、ULBP1-Fcは、未分化の（anaplastic）リンパ腫に結合する。従って、ULBP-1ポリペプチドを毒素に結合させてリンパ腫細胞に結合させ、これらの細胞を特異的に殺すことができる。この方法論は、SCIDマウスにおける治療抵抗性B系急性リンパ芽球性白血病を治療するための抗CD72イムノトキシンの効果的な使用に類似しているかもしれない（Meyersら, Leuk. and Lymph. 18: 119-122）。
【０２０６】
さらに、ULBP1-FcおよびULBP2-Fcは、休止しているT細胞よりも活性化されたT細胞により強く結合する。従って、毒素に結合した場合、または放射性となった場合、これらはT細胞が活性化し過ぎている（自己免疫）疾患、例えば狼瘡、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬、移植片拒絶、および対宿主性移植片病等において活性化T細胞を殺すために使用することができる。これらはNK細胞にも結合するため、NK細胞を殺すために使用することもでき、これは移植片拒絶の治療に役立つと考えられる。
【０２０７】
ポリペプチドに結合させることができる検出可能薬（診断薬）および治療薬には、毒素、他の細胞障害薬、薬物、放射性核種、発色団、比色または蛍光反応を触媒する酵素などが含まれるが、これらに限定されない。具体的な薬は、意図される用途に応じて選択される。毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、Pseudomonas aeruginosaエンドトキシンA、リボソーム不活化タンパク質、トリコテセン等のマイコトキシン、ならびにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖等）が挙げられる。診断に使用するのに適した放射性核種には、123I、131I、99ｍTc、111Inおよび76Brが挙げられるがこれらに限定されない。治療的用途に適した放射性核種の例としては、131I、211At、77Br、186Re、188Re、212Pb、212Bi、109Pd、64Cuおよび67Cuが挙げられる。
【０２０８】
このような薬は、好適な従来法により該ポリペプチドに結合させることができる。該ポリペプチドは、所望の薬剤上の官能基と反応して例えば共有結合を形成することができる官能基を、アミノ酸側鎖上に含む。あるいは、該タンパク質または薬剤は、誘導体化されて、所望の反応性官能基を生成または結合することができる。この誘導体化は、種々の分子をタンパク質に結合させるのに利用することができる二官能性カップリング試薬のうちの１つの結合を含んでいても良い（Pierce Chemical Company, イリノイ州ロックフォード）。タンパク質を放射能標識するための多くの技法が知られている。放射性核種金属は、例えば好適な二官能性キレート剤を用いてポリペプチドに結合させることができる。
【０２０９】
このように、（好ましくは共有結合された）ポリペプチドおよび好適な診断薬または治療薬を含むコンジュゲートを調製する。このコンジュゲートは、具体的な用途に適した量で投与または使用される。
【０２１０】
治療薬
本発明のポリペプチドは、欠陥量すなわち不充分な量の該ポリペプチドにより（直接的または間接的に）媒介されるあらゆる障害の治療法を開発するのに使用することができる。これらのポリペプチドは、このような障害に罹った哺乳動物に投与することができる。
【０２１１】
該ポリペプチドは、in vitroまたはin vivoでの処理において、ULBP逆構造分子の生物学的活性を阻害するために使用することもできる。例えば、精製されたポリペプチドを使用して、ULBP逆構造分子が内因性細胞表面分子に結合するのを阻害することができる。内因性受容体へのULBP逆構造分子の結合により生じる生物学的影響は、このように阻害される。
【０２１２】
ULBPポリペプチドは、ULBP逆構造分子により媒介される障害を治療するために哺乳動物に投与することができる。このようなULBP逆構造分子媒介性障害には、ULBP逆構造分子により（直接的または間接的に）引き起こされる、または再燃する症状が含まれる。
【０２１３】
本発明の組成物は、本明細書に記載された任意の形態のポリペプチド、例えば天然タンパク質、変異型、誘導体、オリゴマーおよび生物学的に活性な断片等を含む。特定の実施形態において、該組成物は、可溶性ポリペプチドまたは可溶性ULBPポリペプチドを含むオリゴマーを含む。
【０２１４】
有効量の本発明のポリペプチドと、生理学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤などの他の成分とを組合せて含む組成物が、本明細書中に提供される。該ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために使用される既知の方法に従って製剤化することができる。これらは、唯一の活性物質として、または所与の適用（indication）に適した他の既知の活性物質と共に、製薬上許容可能な希釈剤（例えば食塩水、Tris-HCl、酢酸およびリン酸緩衝溶液など）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベンなど）、乳化剤、溶解補助剤、アジュバントおよび/または担体との混合物として組み合わせることができる。医薬組成物に適した処方としては、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されたものが挙げられる。
【０２１５】
さらに、このような組成物は、ポリエチレングリコール（PEG）、金属イオンと共に複合体形成させることもできるし、あるいはポリマー化合物（例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなど）、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層ベシクル、赤血球ゴーストまたはスフェロブラスト（spheroblast）の中に組み込むこともできる。このような組成物は、物理的な状態、可溶性、安定性、in vivoでの放出速度、およびin vivoでのクリアランス速度に影響を及ぼし得るため、意図する用途に応じて選択される。
【０２１６】
本発明の組成物は、任意の好適な方法、例えば局所的、非経口的または吸入により投与することができる。「非経口的」とは、注射（例えば皮下、静脈内、または筋肉内注射）、および（例えば疾患もしくは傷害部位への）局所投与を含む。インプラントからの持続性放出も考えられる。当業者であれば、適切な用量は、治療する障害の性質、患者の体重、年齢および体調、ならびに投与経路などのファクターによって異なることが分かるであろう。一次（preliminary）用量は、動物実験に従って決定することができ、ヒト投与のための用量の換算は、当分野で受け入れられている慣習に従って行われる。
【０２１７】
生理学的に許容可能な製剤中に核酸を含む組成物も考えられる。DNAを例えば注射用等に製剤化することができる。
【０２１８】
合理的な薬剤設計
さらに、ULBPポリペプチドは、ULBPインヒビターの構造に基づく設計に使用することもできる。このような構造に基づく設計は、「合理的薬剤設計」としても知られる。ULBPポリペプチドは、例えばＸ線結晶学、核磁気共鳴、または相同性モデリング（全て周知方法である）等により３次元解析することができる。インヒビターの設計およびインヒビター/ULBP相互作用を支援するための分子モデリング・ソフトウェアシステムにおけるULBP構造情報の使用も、本発明に包含される。このようなコンピューター支援モデリングおよび薬剤設計は、化学的な立体構造分析、分子の静電位、タンパク質の折畳み等の情報を使用することができる。例えば、メタロプロテアーゼのクラス特異的インヒビターの設計の多くは、触媒的な亜鉛原子をキレートまたは結合することに焦点を当てたものであった。合成インヒビターは通常、特定のプロテアーゼの特異性ポケットにフィットするように設計された一連の他の基が結合する負に荷電した部分を含むように設計される。本発明の具体的な方法は、基質の結合部位であると思われる箇所についてULBPの3次元構造を分析し、予想反応性部位を組み込んだ新しい分子を合成し、および先に記載したようにこの新しい分子をアッセイすることを含む。
【０２１９】
研究試薬
本発明のポリペプチドの他の用途は、ULBP/ULBP逆構造相互作用の阻害によりもたらされる、異なる細胞型に及ぼす生物学的影響を研究するための研究手段としてである。ポリペプチドは、ULBP逆構造分子、ULBPポリペプチド、またはその相互作用を検出するためのin vitroアッセイにおいて使用することもできる。
【０２２０】
ULBPは、（a）ULBPシグナル伝達に関与する、ULBPが結合するタンパク質、および（b）シグナル伝達経路に関与する、ULBPが相互作用する可能性がある他のタンパク質、を同定するための試薬として使用することもできる。これらの他のタンパク質は、シグナル伝達の他のインヒビターの研究に有用な手段となるであろう。ULBPは、組換えタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させることにより、またはそれをツーハイブリッド系におけるバイト（bait）として使用することにより、使用することができる。
【０２２１】
ULBPポリペプチドとその逆構造との間の相互作用は、ULBPポリペプチド/ULBP逆構造の会合を邪魔し、およびULBPポリペプチドまたはその逆構造の活性を阻害する小さな分子のスクリーニングを可能とする。例えば、（Fieldsらの米国特許第5,283,173号に記載された）SUNYで開発された酵母ツーハイブリッド系を使用して、以下のようにULBPのインヒビターをスクリーニングすることができる。ULBPポリペプチドおよびその逆構造、またはこれらの相互作用に関与するこれらの部分を、Gal4 DNA結合ドメインおよびGal4転写活性化ドメインにそれぞれ融合させ、ヒスチジンを含まないプレート上での増殖がGal4活性に依存する株の中に導入することができる。ULBPインヒビターを同定するために、増殖を妨げる化合物をスクリーニングすることができる。あるいは、ULBPポリペプチド/ULBPポリペプチド逆構造の相互作用が増殖を阻害するように、および相互作用の阻害により増殖を促すように、このスクリーニング法を改変してもよい。
【０２２２】
in vitro におけるULBP阻害の他のスクリーニング方法は、これらの成分のいずれか一方（ULBPポリペプチドまたはその逆構造のいずれか）をマイクロタイタープレートのウェル中に固定化し、簡単に検出されるインジケーターを他方の成分に結合させるものである。この相互作用のインヒビターは、ウェル中の検出可能インジケーターの不在により同定される。
【０２２３】
さらに、本発明のULBPポリペプチドは、ULBPインヒビターの構造に基づく設計に有用である。このような設計は、ULBPポリペプチドの3次元構造を決定するステップ、基質結合部位であると思われる箇所の3次元構造を解析するステップ、予想反応性部位を組み込んだ分子を合成するステップ、および該分子の阻害活性を測定するステップを含む。
【０２２４】
ULBP DNA、ULBPポリペプチド、およびULBPポリペプチドに対する抗体は、様々な研究プロトコールにおける試薬として使用することができる。このような研究プロトコールのサンプルは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に記載されている。例えば、これらの試薬はRNAまたはタンパク質の細胞特異的発現または組織特異的発現についてのマーカーとして使用することができる。同様に、これらの試薬は、ULBP RNAまたはポリペプチドの構成的および一過性発現を研究するために使用することができる。ULBP DNAは、ULBP DNAの染色体位置を決定するため、およびこの染色体位置に関して遺伝子をマッピングするために、使用することができる。ULBP DNAは、遺伝子フィンガープリンティングなどの技法を使用して遺伝的な異種性および遺伝を調査するため、ならびに遺伝子疾患に関するリスクを同定するために、使用することもできる。ULBP DNAはさらに、ULBP DNAに関連する更なる遺伝子を同定するため、および配列比較に基づく進化系統樹を確立するために、使用することができる。ULBP DNAおよびポリペプチドは、ULBP DNAまたはポリペプチドに相同なこれらの遺伝子またはタンパク質を、陽性スクリーニング法（例えばサザンブロッティングおよびイムノブロッティングなど）および陰性スクリーニング法（例えばサブトラクションなど）により選択するために使用することができる。
【０２２５】
分子量、等電点マーカー
化学的および酵素的手段により本発明のポリペプチドを断片化してより小さなペプチドにし、こうして生成されたペプチド断片を他のタンパク質またはポリペプチドの分析に使用することができる。例えば、このようなペプチド断片を、ペプチドの分子量マーカー、ペプチド等電点マーカーとして、またはペプチド断片化の程度の分析において、使用することができる。このように、本発明は、これらのポリペプチドおよびペプチド断片、ならびに未知のタンパク質の見かけ分子量および等電点の測定に役立つキットおよび未知のタンパク質の断片化の程度を評価するためのキットも含む。
【０２２６】
全ての断片化方法は本発明に包含されるが、好ましい実施形態は化学的断片化であり、中性および酸性条件下においてメチオニン残基で特異的切断が起こるように切断を行うために臭化シアンを使用することを含む（E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967）。これはさらに、システイン残基を非反応種へと変換させるためのカルボキシメチル化ステップなどの追加ステップを含むことができる。
【０２２７】
他の好適な実施形態は酵素による断片化であり、特定のアミノ酸残基での切断が起こる従来条件下における、アスパラギニレンド-ペプチダーゼ（Asparaginylendo-peptidase）、アルギニレンド-ペプチダーゼ（Arginylendo-peptidase）、AchromobacterプロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球菌 V8プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N、またはエンドプロテイナーゼLys-C等のプロテアーゼの使用を含む。アスパラギニレンド-ペプチダーゼは、本発明のポリペプチド内のアスパラギン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。アルギニレンド-ペプチダーゼは、これらのポリペプチド内のアルギニン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。AchromobacterプロテアーゼＩは、該ポリペプチド内のリジン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる（Sakiyama及びNakat, 米国特許第5,248,599号；T. Masakiら, Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masakiら, Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981）。トリプシンは、本発明のポリペプチド内のアルギニンおよびリシン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。酵素による断片化は、複数のアミノ酸残基で切断するプロテアーゼでも起こり得る。例えば、黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼは、ポリペプチド内のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる（D.W. Cleveland, J. Biol. Chem. 3:1102-1106, 1977）。エンドプロテイナーゼAsp-Nは、ポリペプチド内のアスパラギン残基のアミノ側を特異的に切断することができる。エンドプロテイナーゼLys-Cは、本発明のポリペプチド内のリシン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。これらのポリペプチドを特定のペプチドの独特なセットに特異的に断片化するために、他の酵素的および化学的処理を同様に使用することもできる。
【０２２８】
もちろん、本発明のポリペプチドのペプチドおよび断片は、当分野で周知である従来の組換え法および合成法により生成することもできる。組換え法に関して、本発明により包含されるポリペプチドおよびペプチド断片は、それらが発現される宿主細胞に応じて、様々な分子量を有することができる。様々な細胞型における本発明のポリペプチドおよびペプチド断片のグリコシル化により、改変の程度に応じて、これらの片の分子量にばらつきが生じ得る。これらの片のサイズは、該ポリペプチドの細胞外部分に由来するポリペプチドの断片で最も不均一になり得る。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、専ら膜貫通領域および細胞質領域から得たポリペプチドを用いることにより、Ｎ-グリカナーゼで予め処理してグリコシル化を除去することにより、または細菌宿主中で該ポリペプチドを発現させることにより、得られ得る。
【０２２９】
これらのポリペプチドの分子量も、本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に更なるペプチド配列を融合させることにより、変えることができる。本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端への追加ペプチド配列の融合は、これらのポリペプチドの発現を増大させるため、または該タンパク質の精製を補助するために、使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端への追加ペプチド配列の融合によって、酵素処理または化学処理により生成する該ポリペプチドの断片化ペプチドはいくらか改変されるが、通常は全部を変えるものではない。もちろん、分子生物学の常套手段および公知方法を用いて、本発明のポリペプチドに突然変異を導入することができる。例えば、特定の酵素によるタンパク分解切断部位、または特定の化学的に誘導された断片化方法による切断部位を除去するように、突然変異を設計することができる。該部位の除去により、特定の酵素法または化学法を用いた断片化による本発明のポリペプチドのペプチド・フィンガープリントが改変される。
【０２３０】
該ポリペプチドおよび得られた断片化ペプチドは、沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー、および質量分析法などの方法により分析してそれらの分子量を決定することができる。各片の独特なアミノ酸配列で分子量が特定されるため、これらの片はその後でこのような分析法を用いた分子量マーカーとして使われ、未知のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の分子量を決定するのに役立つ。本発明の分子量マーカーは、同じような見かけ分子量を有するタンパク質の見かけ分子量を推定するための分子量マーカーとして特に役立ち、その結果タンパク質の見かけ分子量の決定がより正確に行えるようになる。
【０２３１】
本発明がULBPポリペプチド断片および断片化ペプチドの分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカーは、好ましくは少なくとも10アミノ酸の大きさである。より好ましくは、これらの断片化ペプチド分子量マーカーは、10〜100アミノ酸の大きさである。さらにより好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、10〜50アミノ酸の大きさであり、特に10〜35アミノ酸の大きさである。最も好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、10〜20アミノ酸の大きさである。
【０２３２】
分子量の測定方法としては、沈降法、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー、および質量分析法が挙げられる。特に好ましい実施形態は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動である（U.K. Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970）。通常、この方法は、ドデシル硫酸ナトリウムを含み、6〜20％のアクリルアミド濃度のゲルの２つの別々のレーンを使用する。同一条件下においてマーカーおよびサンプルを同時に解像する能力により、精度が増す。もちろん、本発明のポリペプチドを用いて未知のタンパク質の分子量測定を行うためには多くの異なる技術を使用することができること、およびこの実施形態が本発明の範囲を限定するものではないことは理解されよう。
【０２３３】
各非グリコシル化ポリペプチドまたはその断片は、その独特なアミノ酸配列により固有に決定されるpIを有する（pIは当業者により、pI値を推定するために設計された現在入手可能な任意のコンピュータープログラムを用いて算定するか、任意の周知アミノ酸pKaテーブルを用いて計算するか、または実験的に測定することができる）。従って、これらのポリペプチドおよびその断片は、等電点電気泳動などの技法を用いた未知のタンパク質、ポリペプチド、または断片化ペプチドの等電点の測定に役立つ特定のマーカーとして使用することができる。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーの見かけ等電点に近い見かけ等電点を有する未知のタンパク質の見かけ等電点の推定に特に役立つ。
【０２３４】
等電点電気泳動の技法はさらに、分子量および電荷に基づいてタンパク質を同時に分離するためのゲル電気泳動などの他の技法と組み合わせることができる。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を同一条件下にて同時に解像する能力は、未知のタンパク質の見かけ等電点の測定をより正確なものとする。これは、2次元電気泳動（T.D. Brock及びM.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77(Prentice Hall, 6d ed. 1991)）等の技術において特に興味深く、当該文献では、該方法の特徴は、任意のマーカーを未知のタンパク質と同時に解像することであるとされている。さらに、このような方法を用いて、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質または断片化ペプチドの等電点および分子量の両方を測定するのに役立つことができる。
【０２３５】
ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質と分子量マーカーの判別を可能とする2つの異なる方法を用いて、可視化することができる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生成された抗体および従来のイムノブロッティング法を用いて可視化することができる。この検出は、未知のタンパク質の検出に至らない従来条件下において行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まないものもあるので、本発明の全てのポリペプチド断片に対する抗体を作成することは不可能であるかも知れないことを理解されたい。さらに、全ての抗体がこのアッセイで役立つわけではないことを理解されたい。しかし、本発明のポリペプチドおよび断片に結合することができるこれらの抗体は、従来法を用いて簡単に測定することができる。
【０２３６】
未知のタンパク質も、従来の染色法を用いて可視化される。本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドの分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰は、従来の染色法が該未知のタンパク質を主に検出する程度である。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドの分子量マーカーのレベルは、これらのマーカーが従来の染色法により僅かしか、または全く検出されないようなレベルである。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好適なモル過剰は、2〜100,000倍である。より好ましくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好適なモル過剰は、10〜10,000倍であり、特に100〜1,000倍である。
【０２３７】
もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いて、未知のタンパク質、ポリペプチドおよびその断片化ペプチドの分子量および等電点を測定および検出するために、多くの技法を使用することができること、ならびにこれらの実施形態は本発明の範囲を限定するものではないことを、理解されたい。
【０２３８】
他の実施形態において、例えば断片化反応の時間または温度を変えること等による、特定のペプチドへの本発明のポリペプチドの連続的な断片化の分析（D.W. Clevelandら, J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977）を、未知のタンパク質の切断の程度についての対照として使用することができる。例えば、同一条件下において同量のポリペプチドおよび未知のタンパク質を切断することにより、断片化の程度の直接比較が可能となる。該ポリペプチドの完全な断片化を生じる条件は、未知のタンパク質の完全な断片化を生じることもできる。
【０２３９】
分子量マーカーとしての本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの特定の使用に関して、臭化シアンを用いた配列番号2、配列番号4、または配列番号10のポリペプチドの断片化により、独特な分子量を有する断片化ペプチドの分子量マーカーからなる独特なセットが作成される。メチオニン残基の分布により各ペプチド中のアミノ酸数が決まり、および各ペプチドの独特なアミノ酸組成によりその分子量が決まる。
【０２４０】
さらに、本発明の好適な精製ポリペプチドは、グリコシル化の不在下において約31,000ダルトンの計算分子量を有する。
【０２４１】
インタクトなタンパク質を使用する場合、これらのポリペプチド分子量マーカーを用いることにより、31,000ダルトンに近い見かけ分子量を有するタンパク質の見かけ分子量の測定がより正確に行えるようになる。断片を使用する場合、その断片の分子量の範囲にわたる分子量の測定がより正確に行えるようになる。
【０２４２】
最後に、本発明に包含されるキットについて、このようなキットの構成要素は多種多様であるが、典型的には、該ポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量マーカーを含む。また、このようなキットは、断片化に必要な部位が除去されたポリペプチドを含み得る。さらに、該キットは、該ペプチドおよび未知のタンパク質の化学的もしくは酵素的切断による特異的切断のための試薬を含むことができる。キットはさらに、本発明のポリペプチドまたはその断片に対する抗体を含むことができる。
【０２４３】
未知のタンパク質の同定
上記に記載したように、ポリペプチドまたはペプチドのフィンガープリントを、質量分析法を用いた未知のタンパク質の同定に役立てるために既知のタンパク質のデータベース中に入力したり、これと比較したりすることができる（W.J. Henzelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011-5015, 1993; D. Fenyoら, Electrophoresis 19:998-1005, 1998）。これらの比較を容易にするための様々なコンピュータソフトウェア・プログラム、例えばProtein Prospector (インターネットサイト：prospector.uscf.edu)、MultiIdent（インターネットサイト：www.expasy.ch/sprot/multiident.html）、PeptideSearch（インターネットサイト：www.mann.embl-heiedelberg.de…deSearch/FR_PeptideSearchForm.html）およびProFound（インターネットサイト：www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html）等に、インターネットでアクセスすることができる。これらのプログラムにより、ユーザーは切断剤および指定された許容差内の断片化ペプチドの分子量を特定することができる。これらのプログラムは観測した分子量を配列データベースから得た推定ペプチド分子量と比較して、その未知のタンパク質の同定の決定に役立てる。
【０２４４】
さらに、ポリペプチドまたはペプチド消化物は、タンデム質量分析法（MS/MS）を用いて配列決定し、得られた配列をデータベースで検索することができる（J.K. Engら, J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989(1994); M. Mann及びM. Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399(1994);J.A. Taylor及びR.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec. 11:1067-1075(1997)）。このプロセスで使用することができる検索プログラムはインターネット上にあり、例えばLutefisk97（インターネットサイト：www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html）、ならびに上記のProtein Prospector, Peptide SearchおよびProFoundプログラム等がある。
【０２４５】
従って、遺伝子の配列およびその推定タンパク質配列およびペプチド断片を配列データベースに追加すれば、質量分析法を用いた未知のタンパク質の同定に役立つであろう。
【０２４６】
抗体
本発明のポリペプチドに対して免疫反応性である抗体が本明細書中に記載される。このような抗体は、（非特異的結合と異なり）該抗体の抗原結合部位を介して該ポリペプチドに特異的に結合する。このように、上記ポリペプチド、断片、変異型、融合タンパク質などは、それに対して免疫反応性である抗体を作製する際の免疫原として使用することができる。
【０２４７】
本発明の他の態様において、ULBPおよびULBPのアミノ酸配列に基づくペプチドを使用して、ULBPに特異的に結合する抗体を調製することができる。このような抗体調製の具体的な例は、本明細書中の実施例3および4に記載されている。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（例えばF(ab’)2およびFab断片など）、ならびに組換えにより生成したあらゆる結合パートナーを含むものとする。抗体は、それが約107Ｍ-1以上のKaでULBPポリペプチドに結合するときに、特異的に結合すると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、例えばScatchardら, Ann. N.Y Acad. Sci., 51:660(1949)に記載されたもののような従来法を用いて簡単に測定することができる。
【０２４８】
ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットなどの種々の起源から、当分野で周知の方法を用いて簡単に生成することができる。一般に、精製されたULBP、または適切にコンジュゲートされたULBPポリペプチドのアミノ酸配列に基づくペプチドを、典型的には非経口注入により宿主動物に投与する。ULBPポリペプチドの免疫原性は、例えばフロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用して強化することができる。ブースター免疫したあと、少量の血清サンプルを収集し、ULBPポリペプチドに対する反応性について検査する。このような測定に有用な様々なアッセイの例としては、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow及びLane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載された方法や、向流免疫電気泳動法（CIEP）、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）、ドットブロットアッセイ、およびサンドイッチアッセイなどの方法が挙げられる。米国特許第4,376,110号および第4,486,530号を参照されたい。
【０２４９】
モノクローナル抗体は、周知方法を用いて簡単に調製することができる。例えば米国特許第RE32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号および第4,411,993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, 及びBechtol (eds.), 1980 に記載された方法を参照されたい。まとめると、マウス等の宿主動物に少なくとも1回、好ましくは約3週間間隔で少なくとも2回、単離精製したULBPまたはコンジュゲート化ULBPペプチドを、場合によりアジュバントの存在下にて、腹腔内注射する。次にマウス血清を従来のドットブロット法または抗体捕捉法（ABC）により検査し、どの動物が融合に最も適しているかを決定する。およそ２〜３週間後、マウスの静脈内に、ULBPまたはコンジュゲート化ULBPペプチドのブースター投与を行う。後にマウスを犠牲にし、確立されたプロトコールに従って、Ag8.653（ATCC）等の市販されている骨髄腫細胞に脾臓細胞を融合させる。まとめると、骨髄腫細胞を培地で数回洗浄し、マウス脾臓細胞に、骨髄腫細胞１に対して脾臓細胞約３の割合で融合させる。融合剤は、当分野で使用される任意の好適な薬剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）等であってもよい。融合細胞の選択的増殖を可能とする培地を含むプレートに融合体をプレーティングする。つぎに、該融合細胞を約８日間増殖させることができる。得られたハイブリドーマから上清を収集し、まずヤギ抗-マウスIgでコーティングしたプレートに加える。洗浄したあと、125I-ULBP等の標識物を各ウェルに加え、インキュベートする。続いてオートラジオグラフィーにより陽性ウェルを検出する。陽性クローンを大量培養したあと、プロテインAカラム（ファルマシア社）にて上清を精製することができる。
【０２５０】
本発明のモノクローナル抗体は、他の方法、例えばAlting-Meesら, “Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas”, Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)に記載された方法（本明細書中に参考として組み込まれる）を用いて、生成することができる。同様に、組換えDNA技術を用いて、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むように、結合パートナーを構築することができる。このような技法は、Larrickら, Biotechnology, 7:394 (1989)に記載されている。
【０２５１】
このような抗体の抗原結合断片（従来法により生成することができる）も、本発明に包含される。このような断片の例としては、FabおよびF(ab’)2断片が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作技術により生成される抗体断片および誘導体も提供される。
【０２５２】
本発明のモノクローナル抗体は、例えばマウスモノクローナル抗体のヒト化型などのキメラ抗体を含む。このようなヒト化抗体は既知の方法により調製することができ、該抗体をヒトに投与した場合に免疫原性が低いという利点を提供する。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を含まない）を含んでいてもよい。キメラ抗体およびさらに遺伝子操作されたモノクローナル抗体の製造方法には、Riechmannら (Nature 332:323, 1988)、Liuら (PNAS 84:3439, 1987)、 Larrickら (Bio/Technology 7:934, 1989)、および Winter及びHarris (TIPS 14:139, May, 1993)に記載されたものが含まれる。遺伝子導入によって（transgenically）抗体を生成する方法は、GB2,272,440号、米国特許第5,569,825号および第5,545,806号、ならびにこれらを優先権主張のもととする関連特許（これらは全て本明細書中に参考として組み入れられる）に記載されている。
【０２５３】
１つの実施形態において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、他のタンパク質とは交差反応しない。このような抗体を同定できるスクリーニング方法は周知であり、例えばイムノアフィニティー・クロマトグラフィーが含まれる。
【０２５４】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も、本明細書において想定される。このようなハイブリドーマは、従来法により生成および同定され得る。このようなハイブリドーマ細胞系を生成するための１つの方法では、動物をポリペプチドで免疫し、該免疫動物から脾臓細胞を収集し、前記脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合してハイブリドーマ細胞を作成し、および該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。モノクローナル抗体は、従来法により回収することができる。
【０２５５】
本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書中に記載される。このような抗体は、（非特異的結合と異なり）該抗体の抗原結合部位を介して該ポリペプチドに特異的に結合する。このように、上記ポリペプチド、断片、変異型、融合タンパク質等は、これらに対して免疫反応性である抗体を生成する際の「免疫原」として使用することができる。より詳細には、該ポリペプチド、断片、変異型、融合タンパク質等は、抗体の形成を引き出す抗原決定基すなわちエピトープを含む。
【０２５６】
これらの抗原決定基すなわちエピトープは、線状（linear）であっても高次構造（非連続的）であってもよい。線状のエピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一のセクションからなるが、高次構造すなわち非連続的エピトープは、タンパク質の折り畳みにより互いに近接している該ポリペプチド鎖の複数の異なる領域からの複数のアミノ酸セクションからなる（C.A. Janeway, Jr.及びP. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)）。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多いが、タンパク質の立体構造および立体障害により、エピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（C.A. Janeway, Jr.及びP. Travers, Immuno Biology 2:14(Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)）。エピトープは、当分野で公知の方法を用いて同定することができる。
【０２５７】
このように、本発明の一態様は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。このようなエピトープは、抗体、特にモノクローナル抗体を産生するたに有用であり、その詳細については以下に記載する。さらに、本発明のポリペプチドのエピトープは、アッセイの研究試薬として、およびポリクローナル血清または培養したハイブリドーマからの上清などの物質から特異的結合抗体を精製するために、使用することができる。このようなエピトープまたはその変異型は、当分野で周知の方法、例えば固相合成法、ポリペプチドの化学的または酵素的切断等を用いて、あるいは組換えDNA技術を用いて、生成することができる。
【０２５８】
本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出すことができる抗体について、該エピトープが単離されているかまたは該ポリペプチドの一部として残っているかに関わらず、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は両方とも、従来法により調製することができる。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennetら, (eds.), Plenum Press, New York (1980);およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow及びLand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)を参照されたい。
【０２５９】
その用途
本発明の抗体は、in vitro または in vivo において本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するためのアッセイで使用することができる。該抗体は、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際に使用することもできる。
【０２６０】
さらに本発明のポリペプチドがULBP逆構造分子に結合するのをブロックすることができるこれらの抗体を使用して、このような結合により生じる生物学的活性を阻害することができる。このようなブロッキング抗体は、任意の好適なアッセイ法（例えばULBP逆構造分子を発現するある種の細胞へのULBPポリペプチドの結合を阻害する能力について抗体を検査することによる方法など）を用いて同定することができる。このような細胞の例には、NK細胞および細胞障害性Tリンパ球が挙げられる。あるいは、ブロッキング抗体は、標的細胞へのULBP逆構造分子の結合により生じる生物学的影響を阻害する能力についてのアッセイにおいて、同定することができる。例えば、ULBP逆構造分子が媒介する細胞溶解を阻害する能力について抗体をアッセイすることができる。
【０２６１】
このような抗体は、in vitroの方法で使用したり、または該抗体を生成したもの（entity）により媒介される生物学的活性を阻害するためにin vivo で投与したりすることができる。従って、ULBP逆構造分子と細胞表面（結合パートナー）受容体との相互作用により（直接的または間接的に）引き起こされまたは再燃する障害を治療することができる。治療法は、ULBP逆構造分子が媒介する生物学的活性を阻害するのに有効な量のブロッキング抗体を哺乳動物にin vivo 投与することを含む。モノクローナル抗体は、一般的にこのような治療法で使用するのに好適である。ある実施形態において、抗原結合抗体断片が使用される。
【０２６２】
抗体のアゴニスト的（すなわちリガンドを真似た）特性についてスクリーニングすることができる。このような抗体は、細胞表面のULBPポリペプチドに結合すると、ULBP逆構造分子が細胞表面ULBPポリペプチドに結合したときに誘導される生物学的効果に似た生物学的効果（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。
【０２６３】
ULBPポリペプチドに対する抗体、および生理学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、または担体を含む組成物が、本明細書中に記載される。このような組成物に適した成分は、ULBPポリペプチドを含む組成物について先に記載したものである。
【０２６４】
本明細書中には、該抗体に結合した検出可能薬（例えば診断薬）または治療薬を含むコンジュゲートも記載される。このような薬剤の例は、先に記載してある。該コンジュゲートは、in vitro または in vivo での方法において使用できる。
【０２６５】
本明細書中に引用した参考文献は、本明細書中に参考として全て組み込まれる。
【０２６６】
本明細書に記載した実施形態および以下の実施例は、本発明の実施形態の例を提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。当業者であれば、他の多くの実施形態が、請求の範囲に記載された発明に包含されることが分かるであろう。以下の実施例において、特に明記しない限り、記載された全ての方法は従来法である。
【０２６７】
実施例１
ヒトULBP-1の組換え発現
ヒトULBP1-Fc構築物を以下のように作成した。XhoI部位を含む上流プライマー（5’-GCAACTCGAGAGCTCCAGGTCTACAATGGCAG-3’）およびBglII部位を含む下流プライマー（5’-GATGAGATCTGGGTTGGGTTGTGCCTGGGGCCAG-3’）を用いたPCRにより、ヒトULBP-1ポリペプチドの細胞外ドメイン（1〜218残基）をコードするULBP-1 DNAを作成した。このヒトULBP-1 DNA断片を、5’ SalI部位および、BglII部位の後のヒトイムノグロブリンFc領域ムテイン（EMBO J. 13:3992, 1994に記載）を含むpDC409ベクター中にインフレームでクローニングした。
【０２６８】
Fanslowら, J. Immunol. 149:655, 1992（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されたように、ヒトULBP1-Fc融合ポリペプチドを製造および精製した。
【０２６９】
ULBP1-Fcポリペプチドに使用した発現ベクター、トランスフェクションおよび細胞培養法を用いて、ヒトULBP1-LZ融合ポリペプチドを製造した。精製では、ポリHisタグを使用して、製造業社の指示に従って該組換えタンパク質をニッケル-NTA樹脂（Qiagen社製造, http://www.qiagen.com/）に結合させる。この樹脂を30カラム体積の20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaCl + 5mMイミダゾールで洗浄する。次にこの組換えタンパク質を、イミダゾールの濃度を増加させて溶出させる。まず、5〜20mMイミダゾールの勾配、20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaClを使用し、続いて20mMイミダゾール、20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaClを使用し、次に20〜100mMイミダゾールの勾配、20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaClを使用し、次に100mMイミダゾール、20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaClを使用し、次に500mMイミダゾール、20mM NaPO4 pH7.4 + 300mM NaClを使用する。画分を回収し、SDS-PAGEで分析して該組換えタンパク質を含む画分を同定する。
【０２７０】
実施例２
ヒトULBP-2の組換え発現
ヒトULBP2-Fc構築物を以下のように生成した。XhoI部位を含む上流プライマー（5’-GATTCTCGAGTCCTTAATGGCAGCAGCC-3’）およびBamHI部位を含む下流プライマー（5’-ACAAGGATCCCCTGAGTTGGGTTGTGCC-3’）を用いたPCRにより、ヒトULBP-2ポリペプチドの細胞外ドメイン（1〜223残基）をコードするULBP2-DNAを生成した。5’SalI部位および、BglII部位の後のヒトイムノグロブリンFc領域ムテイン（EMBO J. 13: 3992, 1994に記載）を含むpDC409ベクター中にインフレームでヒトULBP-1 DNA断片をクローニングした。
【０２７１】
Fanslowら, J. Immunol. 149:655, 1992（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されたように、ヒトULBP2-Fc融合ポリペプチドを製造および精製した。
【０２７２】
ULBP1-LZ融合ポリペプチドについて先に記載したように、ヒトULBP2-LZ融合ポリペプチドを製造および精製した。
【０２７３】
実施例３
ULBP-1に対する抗体の調製
ULBP-1に対してモノクローナル抗体を生成した。Titermaxアジュバント（CytRx Corp., ジョージア州ノークロス）中のULBP1-Fc（1mg/mlストック、バッチ＃1）10μgで、Balb/cマウスを免疫した。この動物を2週間後に、フロイントの完全アジュバント（シグマ社）中の同タンパク質10μgでブーストした。2回目の免疫の12週間後に、食塩水中のULBP1-Fc(バッチ#3) 10μgを、一匹のマウスの静脈内にブースター投与した。4日後、マウスを犠牲にし、50％PEG/DMSO溶液を用いて脾臓およびリンパ節をNS1骨髄腫に融合した。HAT（シグマ社）選択培地を入れた96ウェルプレート（Costar社）に該融合細胞を接種した。ハイブリドーマ上清を、抗体捕捉アッセイ（ABC）により抗体産生についてスクリーニングした。まとめると、96ウェルプレート（Nunc）を、ヤギ-抗マウスIgG Fc specific（Pierce社）で一晩コーティングしたあと、PBSで4回洗浄した。上清を室温にて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。ULBP1-Fcを各ウェルに加え、室温にて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。ヤギ-抗ヒトIg Fc断片specific（Jackson社）を加えて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。プレートをTMB基質（KPL）を用いて現像し、プレート・リーダー上で650nmにて読取った。次に陽性のウェルを非関連Fcタンパク質に対してスクリーニングし、ヒトFcに対して反応性である抗体を除去した。これらを、フロー・サイトメトリーによってULBP-1でトランスフェクトしたCV-1細胞への結合についてもスクリーニングした。滴定および限界希釈法によって陽性ハイブリドーマをクローニングし、大量培養で増殖させた。プロテインAカラム（Bio-Rad）にて上清を精製し、-20℃にて保存した。
【０２７４】
実施例４
ULBP-2に対する抗体の調製
ULBP-2に対してモノクローナル抗体を生成した。Titermaxアジュバント（CytRX Corp., ジョージア州ノークロス）中のULBP2-Fc 10μgで、Balb/cマウスを免疫した。この動物を2週間後に、フロイントの完全アジュバント（シグマ社）中の同タンパク質10μgでブーストした。2回目の免疫の8週間後に、食塩水中のULBP2-Fc 6μgを一匹のマウスの静脈内にブースター投与した。4日後、マウスを犠牲にし、50％PEG/DMSO溶液を用いて脾臓およびリンパ節をNS1骨髄腫に融合した。HAT（シグマ社）選択培地を入れた96ウェルプレート（Costar社）に融合細胞を接種した。ハイブリドーマ上清を、抗体捕捉アッセイ（ABC）により抗体産生についてスクリーニングした。まとめると、96ウェルプレート（Nunc）を、ヤギ-抗マウスIgG Fc specific（Pierce社）で一晩コーティングしたあと、PBSで4回洗浄した。上清を室温にて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。ULBP2-Fcを各ウェルに加え、室温にて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。ヤギ-抗ヒトIg Fc断片specific（Jackson社）を加えて1時間インキュベートしたあと、PBSで5回洗浄した。プレートをTMB基質（KPL）を用いて現像し、プレート・リーダー上で650nmにて読取った。次に陽性のウェルを非関連Fcタンパク質に対してスクリーニングし、ヒトFcに対して反応性である抗体を除去した。これらを、フロー・サイトメトリーによりCon-Aで刺激したT細胞への結合について、およびULBP-2でトランスフェクトしたCV-1細胞の免疫沈降法により、スクリーニングした。陽性ハイブリドーマを滴定および限界希釈法によってクローニングし、大量培養で増殖させた。プロテインAカラム（Bio-Rad）にて上清を精製し、-20℃にて保存した。精製した抗体を、ELISA捕捉アッセイ（Mouse MonoAb-ID Kit, Zymed）によりアイソタイプ化（isotyped）した。
【０２７５】
実施例5
ULBPによるIFN-γ産生およびKN細胞増殖の強化
先に記載されたように、末梢血リンパ球の短期培養の後、NK細胞を生成した（B. Perussiaら, Nat. Immun. Cell Growth Rgulat. 6:171-188, 1987）。製造業社のプロトコールに従って、磁気細胞分離器および磁性ビーズ（Miltenyi Biotec., カリフォルニア州オーバーン（Auburn））を用いた陰性選択により、さらに富化を行った。この処理により、それぞれのPE-コンジュゲート化モノクローナル抗体（Pharmingen）で細胞を染色した後に行ったFACS分析により評価すると、CD3-、CD16+、CD56+ NK細胞が95％を超える集団となった。
【０２７６】
精製したNK細胞を、37℃の5%CO2を含む加湿インキュベーター内で、2×106細胞/mlの濃度で、抗生物質およびグルタミンを添加した、10％FCSを含むRPMI1640培地中にて50ng/mlのIL-15（Immunex Corp.）で20時間刺激した。PBSで3回洗浄したあと、細胞を、抗生物質およびグルタミンを添加した、10％FCSを含むRPMI1640培地が入った96ウェルプレート中で、100,000細胞/ウェル（250μl体積）、1ng/mlの濃度のrIL-12（R&Dシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）の存在下にて、単独で、あるいは図1および図2に示した濃度のULBP1-LZまたはULBP2-LZと共に、三重に培養した。
【０２７７】
48時間培養した後、IFN-γ特異的ELISAを使用し、B133.1モノクローナルおよびP3ポリクローナル抗-ヒトIFN-γ抗体を用いて、細胞を含まない上清のIFN-γ濃度について分析した。結果を図1に示す。細胞増殖を評価するために、48時間培養後、NK細胞を、40μCi/mlの[メチル-3H]チミジンを含む培地（30μl）で最後の16時間パルスし、収集し、β逆（Packard）でカウントした。結果を図2に示す。
【０２７８】
実施例6
ULBPによるCTL活性の強化
末梢血単核細胞（PBMC）を、Ficoll-Hypaqueでの遠心分離によりヘパリンで凝血防止した血液(heparinized blood)から単離し、培養培地（10%熱不活化ウシ胎児血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミンを添加したRPMI 1640）中で3回洗浄した。1,000,000個の照射（3500rads.）エフェクター細胞を1,000,000個のレスポンダー細胞および図3および図4に示した濃度のULBP1LZまたはULBP2LZタンパク質と共に共培養した。全量2mlの培養培地、37℃、5％CO2の加湿雰囲気下にて7日間、培養を行った。この時点で培養した細胞を洗浄して4時間クロム放出アッセイを行い、51Cr標識した3日目のPHA芽球に対する細胞溶解活性を先に記載したように評価した（M.R.Alderson, H.M. Sassenfeld及びM.B. Widmer. J. Exp. Med. 172:577-587, 1990）。結果は、連続希釈したレスポンダー細胞および固定数の標識した標的細胞を含むウェルからの51Cr放出比（％）として図3および図4に示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、NK細胞によるIFN-γ産生に対するULBPポリペプチドの影響を示す。
【図２】  図２は、チミジンの取り込みによって示すように、NK細胞の増殖に対するULBPポリペプチドの影響を示す。
【図３】  図３は、CTL活性に対するULBP-1ポリペプチドの影響を示す。
【図４】  図４は、CTL活性に対するULBP-2ポリペプチドの影響を示す。
【配列表】
0004255211.tif 000018
0004255211.tif 000019
0004255211.tif 000020
0004255211.tif 000021
0004255211.tif 000022
0004255211.tif 000023
0004255211.tif 000024
0004255211.tif 000025
0004255211.tif 000026
0004255211.tif 000027
0004255211.tif 000028
0004255211.tif 000029
0004255211.tif 000030
0004255211.tif 000031
0004255211.tif 000032
0004255211.tif 000033
0004255211.tif 000034
【図１】
0004255211.tif 000035
【図２】
0004255211.tif 000036
【図３】
0004255211.tif 000037
【図４】
0004255211.tif 000038