(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるマイコバクテリウム・ポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項２】
ファゴリソソーム脱出ドメインがリステリア属の生物に由来する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ファゴリソソーム脱出ドメインが、
(a) 配列番号１に示すヌクレオチド211-1722のヌクレオチド配列、
(b) (a)からの配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および、
(c) (a)または(b)からの配列の相補鎖配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
から選択される核酸分子によってコードされる、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
免疫応答を誘発する能力があるドメインがMHCクラスＩ拘束CD8Ｔ細胞応答を誘発する能力があるペプチドまたはポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
免疫応答を誘発する能力があるドメインがマイコバクテリウム抗原Ag85B（M.tuberculosis）、Ag85B（M.bovis）、Ag85A（M.tuberculosis）およびESAT-6（M.tuberculosis）から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
免疫応答を誘発する能力があるドメインが抗原 Ag85Bである、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
融合ポリペプチドがシグナルペプチド配列によって先行される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
免疫応答誘発ドメインとファゴリソソーム脱出ドメインの間にペプチドリンカーが位置する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子の少なくとも１コピーを含む組換えベクター。
【請求項１０】
核酸分子が発現制御配列に機能し得る形で連結されている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
発現制御配列がマイコバクテリア中で活性である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
染色体外ベクターである、請求項９、１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
染色体ベクターである、請求項９、１０または１１に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子または請求項９〜１３のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１５】
(a) 哺乳類中で免疫応答を誘発する能力がある少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの組換え核酸分子を含む、組換えMycobacterium bovis細胞。
【請求項１６】
ファゴリソソーム脱出ペプチドまたはファゴリソソーム脱出ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を少なくとも１つ含む、組換えMycobacterium bovis細胞。
【請求項１７】
哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるペプチドまたはポリペプチドをコードする別の組換え核酸分子を少なくとも１つ含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
免疫応答を誘発する能力があるドメインまたはペプチド若しくはポリペプチドが自己抗原、腫瘍抗原、ウイルス抗原、寄生体抗原、および細菌抗原から選択される、請求項１５または１７に記載の細胞。
【請求項１９】
少なくとも１つの前記組換え核酸分子を発現する能力がある、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
少なくとも１つの前記核酸分子によってコードされたポリペプチドを分泌する能力がある、請求項１４または１９に記載の細胞。
【請求項２１】
天然のマイコバクテリウム細胞の細胞内持続性に等しいかまたはそれよりも低い、感染マクロファージ中の細胞内持続性を有する、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされた組換え融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１４に記載の組換え細菌細胞の調製方法であって、
(i) (a)哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるマイコバクテリウム・ポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を細菌細胞中に挿入し、そして、
(ii) (i)によって取得した細胞を好適な条件下で培養する、
各ステップを含む方法。
【請求項２４】
細胞がM.bovis細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の組換え細菌細胞の調製方法であって、
(i) (a)哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子をMycobacterium bovis 細胞中に挿入し、そして、
(ii) (i)によって取得した細胞を好適な条件下で培養する、
各ステップを含む方法。
【請求項２６】
請求項１６に記載の組換え細菌細胞の調製方法であって、
(i) ファゴリソソーム脱出ペプチドまたはファゴリソソーム脱出ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を Mycobacterium bovis 細胞中に挿入し、そして、
(ii) (i)によって取得した細胞を好適な条件下で培養する、
各ステップを含む方法。
【請求項２７】
哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるペプチドまたはポリペプチドをコードする別の組換え核酸分子をMycobacterium bovis細胞に少なくとも１つ挿入することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答を誘発する能力があるドメインまたはペプチド若しくはポリペプチドが自己抗原、腫瘍抗原、ウイルス抗原、寄生体抗原、および細菌抗原から選択される、請求項２５または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は特に結核に対する防御免疫を提供する新規な組換えワクチンに関する。さらに、本発明は新規な組換え核酸分子、この核酸分子を含有するベクター、この核酸分子で形質転換した細胞、およびこの核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
Mycobacterium tuberculosisによって引き起こされる結核（TB）は重要でグローバルな問題のままである。世界の人口の三分の一が M.tuberculosisに感染し ているものと推定される（Kochi,1991）。多くの国で、TBの制御のための唯一の手段は M.bovis bacille Calmette-Guerin（BCG）でのワクチン接種であった。しかし、TBに対するBCGの総合的なワクチン効率は約50％であり、各種の実用試験間で0％〜80％の範囲の極端な変動がある（Rocheら、1995）。したがって、よりよいTB防御用のワクチンを提供するために、例えば遺伝子工学によってBCGを改良すべきである（Murrayら、1996；Hess and Kaufmann,1993）。多数の薬剤耐性 M.tuberculosis株の広範な出現によって、新規なTBワクチンへの緊急の要請がさらに強調されている（Grange,1996）。
【０００３】
M.tuberculosisは休止マクロファージのファゴソーム液胞内で複製される細胞内細菌の群に属するので、TBに対する防御はＴ細胞性免疫に依存する（Kaufmann,1993）。しかし、マウスおよびヒトにおけるいくつかの研究では、マイコバクテリアは抗原特異的な主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスIIまたはクラスI拘束CD4およびCD8Ｔ細胞をそれぞれ刺激することが示された（Kaufmann,1993 ）。
【０００４】
MHCクラスI拘束CD8Ｔ細胞の重要な役割は、β2-ミクログロブリン（β2m） 欠失マウスが実験的な M.tuberculosisの感染を防御することができないことに よって、説得力のある証明がなされた（Flynnら、1993）。これらの突然変異マ ウスはMHCクラスIを欠損しているので、機能性CD8Ｔ細胞が発生することができ ない。M.tuberculosisの感染とは対照的に、β2m-欠失マウスはBCGワクチン株の一定の感染性用量を制御することができる（Flynnら、1993；Ladelら、1995）。さらに、BCGで免疫したC57BL/6がTBに耐性であるところから、β2m-欠失マウス のBCGワクチン接種によって、その後の M.tuberculosisの感染の後の生存が延長された（Flynnら、1993）。M.tuberculosisおよびBCG間のこの差異のある CD8Ｔ細胞依存性は以下のように説明することができる：M.tuberculosis抗原はBCGか らの抗原よりも細胞質へのより良い接近手段を獲得して、より明白なMHCクラスIの提示が導かれる（Hess and Kaufmann、1993）。その結果、M.tuberculosisによ ってより効果的なCD8Ｔ細胞応答が産生される。この見解は、BCGによるよりも M.tuberculosisでの抗原提示細胞（APC）の同時感染によって、無関係な抗原、オボアルブミンのMHCクラスIの提示が増加することから、最近支持された（Mazzaccaroら、1996）。
【０００５】
M.tuberculosisの分泌タンパク質はMHCクラスI提示にとって有効な抗原の起源を含んでいる。最近、この分泌された抗原 Ag85AをコードするDNAワクチンがマ ウスにおいてMHCクラスI拘束CD8Ｔ細胞応答を誘発したので、これがTBに対す る防御に寄与するのかも知れない（Huygenら、1996）。一般的に、分泌されたM.tuberculosisのタンパク質抗原による免疫化がモルモットおよびマウスにおいてTBに対するなんらかの防御を誘導するという証拠が蓄積されてきている（Horwitz ら、1995；Andersen,1994）。したがって、BCGに基づく改良されたTBワクチンの開発の重要な目標は、分泌されたBCG特異的抗原の感染したAPCの細胞質への接近能力を増強することである。これらの分泌されたタンパク質から誘導されるペプチドのその後のMHCクラスI提示経路中への送達は、TB防御のためにすでに存在するBCG特異的免疫応答を増強すると考えられる。
【０００６】
L.monocytogenesのファゴリソソーム脱出(escape)はリステリア抗原のMHCクラスI抗原提示を助長するための独特の機構を説明するものである（Bercheら、1987；Portnoyら、1988）。細孔形成性のスルフヒドリルで活性化される細胞溶解素であるリステリオリシン(lysteriolysin)（Hly）は宿主細胞のファゴリソソーム液胞から細胞質ゾルへの L.monocytogenes微生物体の放出に必須である（Gaillardら、1987；Portnoyら、1988）。最近、この脱出機能が Bacillus subtilis および弱毒化 Salmonella ssp.株に移された（Bieleckiら、1991；Gentschevら、1995；Hess and Kaufmann,1997）。無胞子性 B.subtilis突然変異株によるかまたはSalmonella ssp.中でのHlyの発現の結果、J774マクロファージ様細胞のファゴリソソームから細胞質ゾル中に細菌が脱出する（Bieleckiら、1991；Gentschev ら、1995；Hess and Kaufmann,1997）。
【０００７】
このように、リソソーム脱出機能の異種微生物への転移は生成する組換え微生物の毒性の上昇の原因となることがある。この理由によって、組換え生ワクチンの調製のためのこれらのリソソーム脱出機能の使用はすぐには考慮に入れられなかった。
【０００８】
本発明において、溶血活性があるHlyを分泌する組換えBCG株を構築した。これは改良されたMHCクラスI拘束免疫応答を示し、そして驚くべきことに、改変しない天然のBCG株に比較して等しいかむしろ低い細胞傷害性を示す。すなわち、 これらの組換え生物はTBに対するワクチンの確実な候補である。
【０００９】
本発明の第１の態様は、哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるマイコバクテリウム・ポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメイン１種、を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子である。
【００１０】
この第１の態様の特定の１実施形態は配列番号１中の核酸分子である。この核酸分子はシグナルペプチド１種をコードする配列（ヌクレオチド1-120）、免疫 原性ドメインをコードする配列（ヌクレオチド121-153）、ペプチドリンカーを コードする配列（ヌクレオチド154-210）、ファゴリソソームドメインをコード する配列（ヌクレオチド211-1722）、別のペプチドリンカーをコードする配列（ヌクレオチド1723-1800）およびランダムペプチドをコードする配列（ヌクレオチド1801-1870）を含む。対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１１】
本発明の核酸はマイコバクテリウム属の生物、好ましくは Mycobacterium tuberculosisまたは Mycobacterium bovis由来のポリペプチド由来の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含有する。このドメインは長さ６以上、好ましくは８以上のアミノ酸を有する。この免疫原性ドメインは好ましくは天然の マイコバクテリウム・ポリペプチドの一部分である。しかし、天然の免疫原性ドメインから１または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または添加によって誘導される、修飾された免疫原性ドメインもまた本発明の範囲内である。
【００１２】
この免疫原性ドメインは哺乳類中に免疫応答を誘発することができる。この免疫応答はＢ細胞性免疫応答も可能である。しかし、好ましくはこの免疫原性ドメインはＴ細胞性免疫応答、より好ましくはMHCクラスI拘束CD8Ｔ細胞応答を誘 発する能力があるものである。
【００１３】
免疫応答を誘発することができるドメインは好ましくは M.bovisもしくは M.tuberculosisからの免疫原性ペプチドもしくはポリペプチド、またはこれらの免 疫原性フラグメントから選択される。好適な抗原の特定の例は、M.tuberculosis由来の Ag85B（p30）（Harthら、1996）、M.bovis BCG由来の Ag85B（α抗原） （Matsuoら、1988）、M.tuberculosis由来のAg85A（Huygenら、1996）および M.tuberculosi由来の ESAT-6（Sorensenら、1996、Harboeら、1996 および Andersenら、1995）である。さらに好ましくは、免疫原性ドメインは抗原 Ag85Bから誘導される。最も好ましくは免疫原性ドメインは配列番号２中のaa.41からaa.51の配列を含む。
【００１４】
本発明に従う組換え核酸分子はさらに、ファゴリソソーム脱出ドメイン、すなわち融合ポリペプチドを哺乳類細胞のファゴリソソームから細胞質ゾル中へ脱出させる手段を与えるポリペプチドドメインを含む。好ましくはこのファゴリソソーム脱出ドメインは リステリア属生物由来である。さらに好ましくは、ファゴリ ソソーム脱出ドメインは L.monocytogenes生物由来である。最も好ましくは、ファゴリソソーム脱出ドメインは、(a) 配列番号１中に示されるヌクレオチド211-1722からのヌクレオチド配列、(b) (a)からの配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および(c) (a)または(b)からの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、から選択される核酸分子によってコードされる。
【００１５】
配列番号１に図示するヌクレオチド配列とは別に、本発明はこれらとハイブリダイズする核酸配列をも含む。本発明において、用語「ハイブリダイゼーション」は Sambrookら（Molecular Cloning.A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),1.101-1.104）の定義にしたがって使用する。本発明において、用語「ハイブリダイゼーション」は、55℃、好ましくは62℃、さらに好ましくは68℃で１時間、 1×SSCおよび0.1％ SDS で、特に55℃、好ましくは62℃、さらに好ましくは68℃で１時間、 0.2×SSCおよび0.1％ SDS での洗浄後もなお陽性ハイブリダイゼーションシグナルを観察することができる場合に、使用する。こうした洗浄条件下で配列番号１によるヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列は、本発明にとって好ましい、ファゴリソソーム脱出ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
【００１６】
好ましくは、融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子はシグナルペプチドをコードする配列を含んでいる。さらに好ましくは、このシグナル配列はマイコバクテリア、好ましくは M.bovis中で活性なシグナル配列であり、例えば天然の M.bovisシグナル配列である。好適なシグナル配列の好ましい一例は、配列番号１中のヌクレオチド1-120で示される、Ag85Bシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００１７】
さらに、免疫原性ドメインとファゴリソソーム脱出ドメインとの間にペプチドリンカーを配置するのが好ましい。好ましくは、このペプチドリンカーは長さ5 から50のアミノ酸である。さらに好ましくは、配列番号１中のヌクレオチド154-210に示すリンカーをコードする配列、または遺伝コードの縮重性に関してこの 配列に相当する配列である。
【００１８】
本発明の別の主題は、上に定義した核酸分子の少なくとも１つのコピーを含む組換えベクターに関する。好ましくは、この組換えベクターは原核ベクター、すなわち原核細胞中での複製または／およびゲノムへの組み込みのためのエレメントを含有するベクターである。好ましくは、この組換えベクターは発現制御配列に機能し得るように連結した本発明の核酸分子を保有する。この発現制御配列は好ましくはマイコバクテリア、特に M.bovis中で活性な発現制御配列である。このベクターは染色体外ベクターまたは染色体中に組み込むのに好適なベクターとすることができる。こうしたベクターの例は当分野の技術者に知られており、例えば Sambrookら、上記、に記載されている。
【００１９】
本発明のさらに別の主題は、上に定義した組換え核酸またはベクターを含む細胞である。好ましくは、この細胞は原核細胞、特に マイコバクテリウムの細胞である。さらに、この細胞が本発明の核酸分子を発現することができることが好ましい。
【００２０】
本発明の第２の態様において、(a) 哺乳類中で免疫応答を誘発する能力がある少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの組換え核酸分子を含む、組換えMycobacterium bovis 細胞が提供される。この態様によれば、免疫原性ドメインはマイコバクテリウムの抗原に限定されるものではなく、自己抗原、腫瘍抗原、および一般的なウイルス抗原、寄生体抗原、細菌抗原などの病原体抗原、ならびにそれらの免疫原性フラグメントから選択することができる。好適な腫瘍抗原の特定の例は、p53腫 瘍サプレッサー遺伝子産物などのヒト腫瘍抗原（Houbiersら、1993）およびメラノサイト分化抗原、例えば Melan-A/MART-1および gp100である（van Elsasら、1996）。好適なウイルス抗原の特定の例は、ヒト乳頭腫ウイルス抗原、例えば抗原 E6およびE7などのヒト腫瘍ウイルス抗原（Boschら、1991）、インフルエンザウイルス抗原、例えばインフルエンザウイルス核タンパク質（Matsuiら、1995；Fuら、1997）またはHIV抗原、例えばHIV-1抗原p17、p24、RTおよび Envなどのレトロウイルス抗原（Harrerら、1996；Haasら、1996）である。好適な寄生体抗原の特定の例は、肝期(liver stage)抗原（LSA-1）などのマラリア原虫(Plasmodium)抗原、サーカムスポロゾイト(circumsporozoite)タンパク質（CSまたは対立変異体 cp26若しくは cp29）、トロンボスポンジン(thrombospondin)関連アモニマス(amonymous)タンパク質（TRAP）、Plasmodium falciparumからのスポロゾイトトレオニンおよびアスパラギンに富むタンパク質（STARP）（Aidooら、1995）ならびに Toxoplasma gondiiからのp30などの Toxoplasma抗原（Khanら、1991；Bulow and Boothroyd,1991）である。好適な細菌抗原の特定の例は Legionella pneumophilaからの主要分泌タンパク質（Blander and Horwitz,1991）などの レジオネラの抗原である。
【００２１】
本発明に従う細胞は好ましくは本発明の核酸分子によってコードされる融合タンパク質を分泌することができ、そしてMHCクラスI拘束抗原認識に好適な形態でそれを提供することができる。
本発明の第３の態様においては、ファゴリソソーム脱出ペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、組換えMycobacterium bovis 細胞が提供される。ファゴリソソーム脱出ペプチドまたはポリペプチドが抗原と融合しなくても、免疫原特性の驚くベき改善が見られる。
【００２２】
本発明にしたがって提供される組換えMycobacterium bovis細胞は、哺乳類中 で免疫応答を誘発する能力があるペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つのさらに別の組換え体、例えば異種核酸分子を含んでいてもよい。このさらに別の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドはマイコバクテリウムの抗原から、またはさらに広い意味で、自己抗原、腫瘍抗原、病原体抗原、およびそれらの免疫原性フラグメントから選択することができる。このさらに別のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子は融合遺伝子と同じベクター上に位置させてもよい。しかし、例えば融合遺伝子とは無関係に、別のプラスミド上に位置させてもよく、または染色体として統合してもよい。
【００２３】
驚くべきことに、本発明に従うマイコバクテリウムの細胞は感染した細胞、例えばマクロファージ中で細胞内持続性を有し、これは組換え核酸分子を含有しない、対応する天然の マイコバクテリウムの細胞の細胞内持続性に等しいかまたはこれより低いことがわかった。
【００２４】
本発明のさらに別の主題は、上の定義の核酸分子によってコードされた組換え融合ポリペプチドである。本発明に従うこの融合ポリペプチドは細胞に改善されたMHCクラスI拘束抗原認識の能力を与える。
【００２５】
本発明は活性成分として上の定義の細胞または融合ポリペプチドを、任意に薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントとともに含む医薬組成物にも関する。好ましくは、この組成物は哺乳類、好ましくはヒトに投与するのに好適な生ワクチンである。実際に選択されるワクチン接種経路はワクチン投与するベクターの選択に依存する。投与は一回の用量でまたは間隔をとって反復して実施してもよい。適切な投与量はワクチン用ベクター自体または投与経路などの各種のパラメーターに依存する。粘膜表面（例えば眼球、鼻腔内、経口、胃、腸、肛門、腟若しくは尿管）または非経口（例えば皮下、皮内、筋内、静脈内または腹腔内）投与を選択することができる。
【００２６】
さらに、本発明は上記定義の組換え細菌細胞の調製方法に関する。第１の態様によれば、この方法は、(i) (a)哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるマイコバクテリウム・ポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b) ファゴリソソーム脱出ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を細菌細胞中に挿入し、そして(ii) ステップ(i)によって取得した細胞を好適な条件下で培養する、ステップを含む。好ましくはこの核酸分子を発現することができる細胞を取得する。好ましくは、その細胞は M.bovis細胞である。
【００２７】
第２の態様によれば、この方法は、(i) (a)哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるポリペプチド由来の少なくとも１つのドメイン、および(b)ファゴリソソーム脱出ドメイン、を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を Mycobacterium bovis 細胞中に挿入し、そして(ii) (i)によって取得した細胞を好適な条件下で培養する、ステップを含む。
【００２８】
第３の態様によれば、この方法は、(i) ファゴリソソーム脱出ペプチドまたはポリペプチドをコードする組換え核酸分子を Mycobacterium bovis 細胞中に挿入し、そして(ii) (i)によって取得した細胞を好適な条件下で 培養する、ステップを含む。
【００２９】
所望ならば、本発明の方法に、哺乳類中で免疫応答を誘発する能力があるペプチドまたはポリペプチドをコードする、少なくとも１つの別の組換え核酸分子をさらに挿入することを含ませる。
【００３０】
最後に、本発明は、薬学的に有効な量の医薬として許容される希釈剤、担体および／またはアジュバント中の上記組換え細胞を製剤することを含む、生ワクチンの調製方法に関する。
【００３１】
本発明を以下の図面および配列表によってさらに説明する。
配列番号１：  本発明に従う核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２：  配列番号１の核酸分子に対応するアミノ酸配列を示す。
【００３２】
（実施例）
１．実験操作
１．１  細菌株およびプラスミド
Dubos培地用アルブミン（Difco）を補充したDubosブロスベース（Difco）中、37℃で、M.bovis BCG株 Chicago（ATCC 27289）を培養した。中期対数期の培養 物を分注し、使用時まで-70℃で保存した。G.B.Mackanessから最初に入手した L.monocytogenes EGD Sv 1/2a（Domann and Chakraborty,1989）を、脳心臓浸出 物（BHI）ブロス（Difco）中、37℃でエアレーションしながら増殖させた。プラスミド plLH-1は Dr.I.Gentschev および Dr.W.Goebel（W(rzburg大学、ドイツ ）の寛大な寄贈によった。マイコバクテリア-大腸菌シャトルベクター、pAT261 およびpMV306は MedImmune（Gaithersburg,U.S.A.）から入手した。
【００３３】
１．２  酵素および一般的な遺伝子技法
制限酵素（Boehringer Mannheim）およびT4 DNAリガーゼ（Pharmacia）を製造者の指示にしたがって使用した。分子クローニングおよび組換えDNA技法を標準 プロトコル（Sambrookら、1989）にしたがって実施した。
【００３４】
１．３  DNA操作およびシークエンシング
染色体外 pAT261（親ベクター pAB261；Stoverら、1993）および組み込み用(integrative) pMV306（親ベクター pMV361；Stoverら、1991）発現プラスミドをHly分泌のために使用した。プラスミド pAT261および pMV306は発現カセット１個、選択マーカーとしてカナマイシン耐性を与えるTn903由来の aph遺伝子、およびpUC19由来の大腸菌複製起源を含む、共通のエレメントを共有している。これらはマイコバクテリアプラスミドの複製起源（pAT261）かまたはマイコバクテリオファージL5の attPおよび int遺伝子（pMV306）の挿入について異なっている 。プラスミド構築物 pAT261中に挿入された M.bovis BCG特異的Ag85B遺伝子のDNA断片はBCG hsp60プロモーターの制御下にある。成熟Ag85Bタンパク質のための コード配列の下流の Pst I制限部位（位置4404、MedImmune）を使用して、L.monocytogenes EGDからの天然のHlyの溶血活性が維持され、N-末端 Ag85B特異的シ グナルペプチドによって移送される、Hly由来の融合物を構築した。pAT261:Hly の構築のために、プラスミド plLH-1（Gentschevら、1995；Hessら、1996）によってコードされた当初の遺伝子融合物 hly-hlyAの 1.7 kb Pst-I断片（当初の位置 1357および4277；Hessら、1986）を使用した。コードされている Ag85B-Hly ハイブリッドタンパク質のためのプラスミド pAT261:Hly中の hsp60プロモータ ーを含む完全 Xba I-Sal I DNA発現カセットをプラスミド pMV306中に導入した。この結果生成した構築物を pMV306:Hlyと命名した。以下のオリゴヌクレオチド、 BCG-Hly5-GCTTTGTCCTGCTGおよびBCG-Hly3-GGAAGTCAGGGTGA （Sequiserve,Vaterstetten,Germany）を使用して、これらのプラスミドの断片挿入部位の正しいDNA配列を決定した。DNA配列分析から、hly-hlyA遺伝子融合物の3'末端に11 aaをコードする短い Pst I-DNA断片のランダム挿入がわかった。
【００３５】
１．４  組換えM.bovis BCG株の特性決定
標準的なエレクトロポレーションプロトコル（Langermannら、1994）によって、プラスミド pAT261:Hlyまたは pMV306:Hlyを M.bovis BCG株 Chicago中に導入し、次にカナマイシン（15μg/ml）を補充した Middlebrook 7H10アガー上で組換え体コロニーを選択した。10％ Dubos培地用アルブミン（Difco）および15μg/mlカナマイシンを含有する Dubos液体培地（Difco）中で３週間、カナマイシン耐性コロニーを中期対数期まで増殖させた。Tween 80を含むリン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）中で細胞を洗浄した後、RIPAバッファー（1％ NP-40、0.5％ デオキシコール酸、0.1％ SDS、50 mM Tris、pH 8.0）中で細胞懸濁液を20倍に濃縮して、細胞を溶解した。これらの培養物の細菌を含まない上清（1 ml）を0.2μm  膜フィルターでろ過した。この上清中のHly融合タンパク質を、回転装置中、室温で30分、ブチルセファロース（Pharmacia）100μlとともにインキュベートすることによって、富化した（Schoelら、1994）。遠心分離（3000 rpm）後、ペレットを Laemmliバッファー（Laemmli,1970）中に溶解した。次に、前記（Laemmli,1970）にしたがい、10％ SDS／ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質を分離し、Hybond-PVDF膜（Amersham Life Science）に移した。抗Hly mAbH14-3（Natoら、1991）およびペルオキシダーゼと複合体化した２次抗体（Boehringer Mannheim）によって免疫染色を実施した。製造者[BM Western Blotting Kit(Mouse/Rabbit)(Boehringer Mannheim)]の記載にしたがって、洗浄操作およびケミルミネセンス免疫検出を実施した。Ｘ線フィルム（Kodak,XOMAT-AR)上での シグナルの現像を１分間実施した。
【００３６】
0.1％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）でサンプルを連続希釈することによって、BCG pAT261:Hly、BCG pMV306:Hly、BCGおよ び L.monocytogenesの上清および全細菌懸濁液の溶血活性を判定した。次に、希釈したサンプル（100μl）をシステイン（最終濃度 20 mM）の添加によって活性化し、96ウェルプレート中、37℃で45分間、ヒツジ赤血球（PBS中 6×108細胞／ml、pH6.0） 50μlとともにインキュベートした。溶血活性は、完全溶血を検出することができた最高希釈率の逆数と定義される、完全CHUである（Gentschevら、1995）。
【００３７】
１．５  マイコバクテリアの増殖のin vitro分析
それぞれヒトおよびマウスのマクロファージ様細胞である THP-1（ATCC TIB-202）および J774A.1（ATCC TIB-67）を24ウェルプレートに付着させた（１ウェ ルについて106）。THP-1の場合、感染の48時間前に 10 nM PMA（Sigma）で刺激 することによって、付着を成功させた。１細胞につき10マイコバクテリア（BCG 、BCG pAT261:HlyまたはBCG pMV306:Hly）の感染多重度（moi）で３時間、細胞に感染させた。感染直後に、Bacto Middlebrook OADC（Difco）および適切な 15μg/mlカナマイシンで富化した7H10アガー上に、上清および細胞溶解物の連続希釈物をプレーティングすることによって、CFUを測定した。マクロファージによるマイコバクテリアの取り込みは同程度だった。感染したマクロファージの残ったサンプルをPBSで洗浄し、200μg/mlゲンタマイシンの存在下でさらに14日間インキュベートした。感染後（p.i.）１、８または15日目に、CFU分析によって、組換えBCG株の細胞内増殖を判定した。
【００３８】
１．６  LDH放出
感染したJ774A.1マクロファージによるLDH放出を測定することによって、組換えBCG株および陽性対照としての L.Monocytogenes EGDの細胞傷害性を判定した。Promegaより入手した定量用キットを使用して、BCG、BCG pAT261:Hly、BCG pMV306:Hlyまたは L.monocytogenes EGDを感染させた J774A.1マクロファージの培養上清および細胞溶解物のLDH活性をアッセイした。J774A.1細胞（１ウェルについて104）を96ウェルプレートに播種し、10 moiで感染させた。感染後１時間目 に、サンプルにゲンタマイシン（最終濃度 200μg/ml）を添加した。製造者の指示にしたがって、p.i.３、４、５または24時間目にLDH活性を定量分析した。細 胞傷害性のパーセンテージを以下のようにして算出した：細胞傷害性％＝（感染J774A.1 - 自発的J774A.1）／（最大J774A.1 - 自発的J774A.1×100）。
【００３９】
２．  結果
２．１  マイコバクテリア-大腸菌シャトル発現ベクター pAT261:HlyおよびpMV306:Hlyの構築
[L.monocytogenes EGD Sv 1/2a(Domann and Chakraborty,1989)のHlyによって仲介される]ファゴリソソーム脱出機能をBCG Chicagoに転移させるため、２つの別の大腸菌-マイコバクテリアシャトルベクター、pAT261および pMV306を使用した。pMV261の誘導体である第２世代ベクター pAT261（Stoverら、1991）は１つのBCGゲノムについて約５プラスミドコピーの染色体外Hly発現を指令し、pMV361の誘導体 である組み込み用(integrative)プラスミド pMV306はHlyの安定な染色体内発現 を可能にする（図１）（Stoverら、1991）。
【００４０】
hly-hlyA（大腸菌 pHly152特異的溶血素Ａ）オープンリーディングフレーム（ORF）をコードする plLH-1由来の 1.7 kb Pst I-DNA断片をプラスミド pAT261のPst I部位に挿入した（Gentschevら、1995；Stoverら、1993）。これによって生成する遺伝子融合物は BCG特異的Ag85Bシグナルペプチド（Matsuoら、1990）によって上清に分泌するように指令されるタンパク質の発現をコードする。この構築物を pAT261:Hlyと命名し、次に hsp60マイコバクテリアプロモーターの転写制御下にあるそのXba I-Sal I DNA発現カセットを使用して、親pMV306ベクター中に挿入し、構築物 pMV306:Hlyを生成させた（図１）。BCG特異的Ag85Bシグナルペ プチド（Matsuoら、1990）のためのコード配列を含む、両マイコバクテリア発現プラスミド中の hly特異的挿入部位のDNA配列を分析した。誘導された完全Hly融合タンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。成熟Hly融合タンパク質は、融合体のN-末端に30アミノ酸（aa）、およびC-末端部分に52 aaの、元来大腸菌のHlyAに属するアミノ酸で構成される（Gentschevら、1995）。
【００４１】
続いて、各プラスミド構築物 pAT261:Hlyまたは pMV306:Hlyを BCG Chicago株中にエレクトロポレートし、それぞれプラスミドまたは染色体 Hly発現をする BCG pAT261:Hlyまたは BCG pMV306:Hlyを生成させた。
【００４２】
２．２  BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hly中のHly発現の分析
BCG pAT261:Hlyまたは BCG pMV306:Hly株による Hly分泌を特性付けるため、Stoverら（1993）にしたがって、中期対数期の増殖培養物の適切な上清およびマイコバクテリア溶菌液を調製した。免疫染色のために利用可能な抗Hlyモノクローナル抗体（mAb）に観察される交差反応性を克服するために、Hly融合体を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって富化した（Schoelら、1994；Natoら、1991）。両マイコバクテリア株、BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hlyの溶菌液 および上清において、Hly融合タンパク質が検出可能である（図３）。Hly由来のポリペプチドの推定サイズ、62 kDaは元来の L.monocytogenesの 58 kDa Hlyタ ンパク質よりもわずかに大きい。
【００４３】
BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hlyによって分泌されるHly融合タンパク質の細孔形成能力を特性付けるため、全細菌懸濁液および上清の溶血活性を判定した。BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hlyのサンプルはヒツジ赤血球に対して溶血活性を表し（表１）、これはマイコバクテリア種への細胞溶解性のHlyの機能の転移が成功したことを明白に証明するものである。
【００４４】
【表１】
0004255209.tif 000002
ａ  溶血活性は完全溶血の最高希釈の逆数として定義される、完全単位（CHU）
で与えられる。
ｂ  細胞外および膜結合溶血活性。
ｃ  ND、検出されない。
【００４５】
２．３  組換えBCG株のマクロファージ中の増殖
感染後（p.i.）１、８および15日目に、感染させたマクロファージのマイコバクテリア CFUによって、宿主細胞中の BCG pAT261:Hlyまたは BCG pMV306:Hly微生物の生存をモニターした。マイコバクテリアの標的細胞として、ヒト単球細胞系 THP-1（ATCC TIB-202）およびマウスマクロファージ様細胞系 J774A.1（ATCC TIB-67）を使用した。ホルボールミリステートアセテート（PMA）で刺激したTHP-1細胞は天然のヒト単球由来のマクロファージに類似している（Tsuchiyaら、1982）。THP-1または J774A.1細胞の感染後３時間目に、マイコバクテリア の食作用の効力を判定した。続いて200μg/mlゲンタマイシンの存在下で長期間の培養を実施して、上清中の放出されたかまたは食作用を受けなかったマイコバクテリアを死滅させた。図４に示すように、各BCG株、BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hlyはいずれの宿主細胞中でも増殖することができなかった。さらに、BCG pMV306:Hly細菌は親BCG株に比較して、THP-1および J774A.1宿主細胞中での細胞内持続性の減退を示した。THP-1マクロファージ中の BCG pMV306:Hly細菌の細胞内生存率は BCGまたは BCG pAT261:Hly感染サンプルの数値に関して p.i.１日目にすでに低下したことは注目に値する。
【００４６】
対照的に、BCG pMV306:Hlyの細胞内持続性は、THP-1中でのBCGに匹敵した（図４）。興味深いことに、p.i.15日目に可視 BCG pAT261:Hly細菌は感染した J774A.1細胞中で検出されず、少なくともゲンタマイシン存在下でのこれらのマイコバクテリア構築物の完全増殖阻害が示唆された。
【００４７】
BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hly株の減退した細胞内持続性の本質を究明するため、短期培養におけるこれらの組換えBCG株の J774A.1マクロファージに対する細胞傷害性を判定した。BCG；BCG pAT261:Hly；BCG pMV306:Hly；または L.monocytogenes EGDで感染させた宿主細胞の p.i.３、４、５および24時間目の上清中のラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）活性を測定することによって、細胞傷害性を分析した。p.i.24時間目、上清中に放出されたLDHの量は、親BCG、BCG pAT261:Hly若しくは BCG pMV306:Hlyで感染させるかまたは感染させない宿主細胞間で有意な差異はなかった（図４）。対照的に、増殖が早い溶血性 L.monocytogenes EGD株はp.i.24時間以内に上清中に顕著なLDH放出を引き起こした 。これらのデータは、組換えBCG株による溶血性Hlyの分泌は親BCG株の細胞傷害性を変性させなかったことを示唆している。むしろ、BCG pAT261:Hlyおよび BCG pMV306:Hly株の両者ともに非組換えBCG保有体に比較して、マウスマクロファージ中で減退した持続性を示した。
【００４８】
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Tweten,R.K.(1995)、グラム陽性細菌の細孔形成性毒素、細菌性病原体の毒性機構、J.A.Rothら(ed),American Society for Microbiology,Washington,D.C.,pp.207-228。
【０１０１】
van Elsas,A.,van der Burg,S.H.,Van der Minne,C.E.,Borghi,M.,Mourer,J.S.Melief,C.J.M.and Schrier,P.I.(1996)、ペプチドパルス(pulse)した樹状細胞 は健康なドナーから、Melan-A/MART-1自己抗原からの安定な HLA-A'0201-結合性ペプチドに対する腫瘍撲滅性(tumoricidal)細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発する、Eur.J.Immunol.26:1683。
【図面の簡単な説明】
【図１】  組換えBCG株によるHly分泌のためのプラスミドマップを示す。
Ａ．大腸菌-マイコバクテリアシャトルプラスミド pAT261:Hlyによる染色体外Hly発現。成熟Hlyタンパク質のDNA配列をコードするplLH-1由来の1.7 kb Pst I 断片の挿入。省略語：Mrep、マイコバクテリアレプリコン；Erep、大腸菌複製起源；kan、カナマイシン耐性遺伝子；hsp、熱ショックタンパク質プロモーター。  Ｂ．マイコバクテリアによるHly発現のための染色体組み込み用シャトルベク ター pMV306:Hly。挿入されるhsp60プロモーターを含むDNA制限断片（Xba I-Sal I）はプラスミド pAT261:Hly由来である。省略語：attP、マイコバクテリオフ ァージL5の付着部位；MCS、多重クローニング部位；int、マイコバクテリオファージL5のインテグラーゼ。
【図２】  BCG pAT261:Hlyまたは BCG pMV306:Hlyによって発現されるHly融合体のアミノ酸配列を示す。hly遺伝子特異的オープンリーディングフレームに対応するアミ ノ酸配列はマイコバクテリア発現プラスミド pAT261:Hlyまたは pMV306:HlyのDNA配列由来である。Hly融合タンパク質は以下の異なるポリペプチド配列で構成される：シグナルペプチドを含むBCG特異的 Ag85B、下線を付けた１文字コードの アミノ酸配列（以前はα抗原と称された；Matsuoら、1988）；大腸菌 pHly152特異的HlyA、イタリック文字、（Hessら、1986）；成熟Hly、太字、（Domann andChakraborty,1989）；ランダムアミノ酸配列、通常文字。対応する遺伝子融合体について使用する制限部位（Pst IおよびNsi I）をそのアミノ酸配列の下に示す。
【図３】  組換えBCGによるHly発現の分析を示す。BCG、BCG pAT261:Hlyまたは BCG pMV306:Hly株の溶菌液（L）または上清（S）中のHly融合タンパク質の免疫染色によ る検出。各種マイコバクテリア株の培養物溶菌液および富化した上清を SDS/10 ％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Hybond-PVDF膜に移した。62 kDa Hlyハ イブリッドタンパク質のケミルミネセンス免疫染色のために使用した一次抗体は抗Hly mAb H14-3（Natoら、1991）である。
【図４】  組換えBCG株の細胞内増殖および細胞傷害性を示す。
Ａ．ヒトマクロファージ様細胞 THP-1中の野生型BCG（■）、BCG pAT261:Hly （△）およびBCG pMV306:Hly（◆）株の生存。
Ｂ．マウス J774A.1マクロファージ様細胞中の野生型BCG（■）、BCG pAT261:Hly（△）およびBCG pMV306:Hly（◆）株の生存。感染３時間後に感染細胞溶解 液からrBCG特異的CFUを判定し、０日から15日目までモニターした。データを平 均±SD（ｎ＝３）で示す。
Ｃ．BCGまたはrBCG感染後のLDH活性について、J774A.1の上清および細胞溶解 液をアッセイした。J774A.1（□）、BCG（◇）、BCG pMV306:Hly（◆）、BCG pAT261:Hly（△）または L.monocytogenes EGD（■）。上清中で検出した総LDH活 性の累積パーセンテージで示す（平均±SD）。これは３つの実験の代表例である。上清中に放出されたLDHのパーセンテージを測定して細胞死の尺度とした。
【配列表】
配列番号１：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：1881塩基対
(B)配列の型：  核酸
(C)鎖の数：    両形態
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：      １..１８７８
(xi)配列：
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(2)配列番号２：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：６２６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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