(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の蛍光染料で高分子ミクロスフェアを染色する方法であって、
（ａ）溶媒中に２つ以上の蛍光染料を混ぜ合わせることにより、脱水した複数の高分子ミクロスフェアを接触させると少なくとも部分的に膨張させるが溶解はさせない特性をもった、混合染料の溶剤を生成すること、
（ｂ）上記高分子ミクロスフェアの全部を上記２つ以上の蛍光染料で均一に染色するのに十分な時間、上記脱水した複数の高分子ミクロスフェアを上記混合染料の溶剤に接触させること、
を含み、
上記２つ以上の蛍光染料は、上記染色された複数の高分子ミクロスフェアを分離励起した時、各染料から別個の蛍光信号が発せられ、その発光信号の輝度が上記染色された複数の高分子ミクロスフェア中の上記染料の量と比例するように、選択されている方法。
【請求項２】
上記複数の高分子ミクロスフェアの脱水は、上記混合染料の溶剤に接触させる前に、アルコール溶剤により一度以上洗浄することを含む請求項１の方法。
【請求項３】
上記混合染料の溶剤に接触させる前に、上記洗浄した高分子ミクロスフェアを乾燥する、又は上記洗浄した高分子ミクロスフェアからアルコール溶剤を蒸発させることをさらに含む請求項２の方法。
【請求項４】
上記染色された複数の高分子ミクロスフェアを濾過又は遠心分離により分離することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項５】
上記蛍光染料の少なくとも１つが、上記染色された複数の高分子ミクロスフェアの全部の内部全体に拡散する請求項１の方法。
【請求項６】
上記２つ以上の蛍光染料が、上記染色された複数の高分子ミクロスェアの全部の内部全体に拡散する請求項１の方法。
【請求項７】
上記蛍光染料の少なくとも１つが、上記染色された複数の高分子ミクロスフェアの全部の内部の一部分にだけ拡散する請求項１の方法。
【請求項８】
上記２つ以上の蛍光染料を異なる所定の比率で含んだ一連の上記混合染料の溶剤を準備することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項９】
上記脱水した複数の高分子ミクロスフェアの別個の母集団を上記一連の混合染料の溶剤に接触させて、上記染色された複数の高分子ミクロスフェアの複数の別個の母集団又は部分集合を供給することをさらに含み、上記各別個の母集団又は部分集合は異なる所定の比率の上記２つ以上の蛍光染料を含むものである請求項８の方法。
【請求項１０】
上記２つ以上の蛍光染料から発せられる別個の蛍光信号は、少なくとも１０ｎｍ単位でそれぞれの波長が異なっている請求項１の方法。
【請求項１１】
上記２つ以上の蛍光染料から発せられる別個の蛍光信号は、少なくとも３０ｎｍ単位でそれぞれの波長が異なっている請求項１の方法。
【請求項１２】
上記２つ以上の蛍光染料から発せられる別個の蛍光信号は、少なくとも５０ｎｍ単位でそれぞれの波長が異なっている請求項１の方法。
【請求項１３】
上記発光信号の少なくとも１つはオレンジ色であり、少なくとももう１つの発光信号は赤色である請求項１の方法。
【請求項１４】
上記２つ以上の蛍光染料から発せられる別個の蛍光信号は、５００ｎｍ〜１，０００ｎｍの間の範囲にある波長を示すものである請求項１の方法。
【請求項１５】
上記２つ以上の蛍光染料を混ぜる溶媒は、アシル基含有、脂肪族、脂環式、芳香族、ハロゲン化、又は複素環式の炭化水素を含んだ少なくとも１つの有機溶剤及び少なくとも１つのアルコール溶剤を含んでなる請求項１の方法。
【請求項１６】
上記有機溶剤は、クロロホルム、トルエン、キシレン、ヘキサン、塩化メチレン、ペンタン、アセトン又はＤＭＳＯからなる群より選択される請求項１５の方法。
【請求項１７】
上記２つ以上の蛍光染料は、上記溶媒の有機溶剤において、類似した溶解特性を有するものである請求項１５の方法。
【請求項１８】
上記アルコール溶剤は、２−プロパノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、又はペンタノールからなる群より選択される請求項１５の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかの方法により２つ以上の蛍光染料で染色された高分子ミクロスフェアの母集団であって、
上記母集団の励起された各高分子ミクロスフェアは、上記２つ以上の蛍光染料に対応する２つ以上の別個の蛍光信号を発し、
上記２つ以上の発光信号の各輝度は、（ｉ）上記高分子ミクロスフェア中の対応する染料の量に比例し、（ii）上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は２０％を越えない、高分子ミクロスフェアの母集団。
【請求項２０】
上記２つ以上の発光信号の各輝度は上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は１５％を越えない請求項１９の母集団。
【請求項２１】
上記２つ以上の発光信号の各輝度は上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は１０％を越えない請求項１９の母集団。
【請求項２２】
上記２つ以上の発光信号の各輝度は上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は８％を越えない請求項１９の母集団。
【請求項２３】
上記２つ以上の発光信号の各輝度は上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は８％以下である請求項１９の母集団。
【請求項２４】
上記２つ以上の蛍光染料は疎水性である請求項１９の母集団。
【請求項２５】
上記２つ以上の蛍光染料はスクワリック酸塩染料を含んでなる請求項２４の母集団。
【請求項２６】
上記スクワリック酸塩染料は、シクロブテンジオン誘導体、対称及び非対称スクワレン、置換セファロスポリン化合物、蛍光スクワレン化合物、アルキルアルコキシスクワレン、又はスクワリリウム化合物から選択される請求項２５の母集団。
【請求項２７】
上記スクワリック酸塩染料は、赤色蛍光染料及びオレンジ色蛍光染料から選択される請求項２５の母集団。
【請求項２８】
上記赤色蛍光染料は１，３−ビス［（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル］−２，４−ジヒドロキシシクロブテンジイリウム，ビス（内部塩）を含んでなり、
上記オレンジ染料は２−（３，５−ジメチルピロール−２−イル）−４−（３，５−ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン）−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オンを含んでなる請求項２７の母集団。
【請求項２９】
上記高分子ミクロスフェアは、ポリスチレン、臭素化されたポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロライド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリグリシジルメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリル酸塩、またはそれらの共重合体、混合物、合成物、又は組合せを含んでなる請求項１９の母集団。
【請求項３０】
上記高分子ミクロスフェアはさらに、上記高分子ミクロスフェアの表面に存在しているか、上記高分子ミクロスフェアの表面に不動に吸着している官能基に共有結合している１つ以上の分析反応物を含む請求項１９の母集団。
【請求項３１】
上記高分子ミクロスフェアは１０ｎｍ〜１００μｍの間の直径を有する請求項１９の母集団。
【請求項３２】
（ａ）上記２つ以上の蛍光染料を異なる所定の比率で含んだ一連の上記混合染料の溶剤を準備すること、
（ｂ）上記高分子ミクロスフェアの別個の母集団を上記一連の混合染料の溶剤に接触させて、上記高分子ミクロスフェアの別個の母集団のコレクションを提供すること、
を含んだ方法により得られ、
上記コレクションに含まれた各母集団が励起されると、蛍光ビーズマップにおいて上記各母集団特有の発光スペクトラムを示す、複数の請求項１９の母集団。
【請求項３３】
上記高分子ミクロスフェアの８つ以上の別個の母集団を含んでなる請求項３２の複数の母集団。
【請求項３４】
上記高分子ミクロスフェアの１６以上の別個の母集団を含んでなる請求項３２の複数の母集団。
【請求項３５】
上記高分子ミクロスフェアの２４以上の別個の母集団を含んでなる請求項３２の複数の母集団。
【請求項３６】
上記高分子ミクロスフェアの３２以上の別個の母集団を含んでなる請求項３２の複数の母集団。
【請求項３７】
上記高分子ミクロスフェアの６４以上の別個の母集団を含んでなる請求項３２の複数の母集団。
【請求項３８】
上記高分子ミクロスフェアの上記６４以上の別個の母集団に関連する６４以上の上記発光スペクトラム間にオーバーラップがない請求項３７の複数の母集団。
【請求項３９】
対応する分析反応物により認識される複数の検体を１試料中に検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜１８のいずれかの方法により２つ以上の蛍光染料で染色された高分子ミクロスフェアの複数の母集団に、上記検体を含んだ試料を接触させることを含み、上記高分子ミクロスフェアの各母集団はその表面に結合される別個の分析反応物を有し、そして、上記高分子ミクロスフェアの各母集団の上記分析反応物は上記試料中の上記検体の特定のものと相互作用し、
（ｂ）特定の上記検体に結合する標識試薬を与え、上記高分子ミクロスフェアを分析して上記分析反応物に上記検体が結合していることを示す上記標識を検出し、そして
（ｃ）上記分析反応物が結合する上記各母集団の高分子ミクロスフェア内で上記所定の比率で混合された上記蛍光染料を有する上記高分子ミクロスフェアの母集団を判別することを含む方法（人間を診断する方法を除く）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般には直径が通常１００μｍよりも小さい多色蛍光染色された小粒子に関するものである。開示しているのは、染料濃度の試料内変動を実質的に最小限にするように、そのような粒子又はミクロスフェアを２つ以上の蛍光染料で染色又は着色する方法である。特に、本発明は、２つ以上の蛍光染料で染色されたミクロスフェアと、複数の検体の同時分析に上記ミクロスフェアを使用する方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
蛍光を発する微粒子、ミクロスフェア、ミクロビーズ、ビーズ又は粒子は現在非常に一般的であり、特にフローサイトメトリーに基づく方法と組み合わせた多数の実際的な応用に有益である。以後使用されるように、微粒子、ミクロスフェア、ミクロビーズ、ビーズ又は粒子という用語は互いに交換できるよう使用されており、同等の意味を有するものである。しばしばこれらの粒子はたった１つの蛍光染料で標識されることがある。一般に、そのような粒子は共重合方法で生成される。共重合方法では、モノマー、例えば不飽和のアルデヒドまたはアクリル酸塩を、反応混合液中で、蛍光染料、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が存在する状態で、重合することができる（例えば、レンバウムの合衆国特許４,２６７,２３４号、レンバウムらの４,２６７,２３５号、マーゲルらの４,５５２,８１２号、マーゲルの４,６７７,１３８号を参照されたい）。
【０００３】
当業者であれば、種々の比率の２つ以上の染料を用いて、単一粒子における染料の特有の組み合わせの置換数を増やすことができることを知っているであろう。この特有の特徴、例えば発光波長や蛍光輝度は、同じ試料で複数の検体の複数パラメータ分析を行うのに極めて有用である。多色蛍光ビーズの製造方法には３つの方法が報告されている。すなわち、(ａ)粒子表面に染料を共有結合付着する方法、（ｂ）粒子重合中に染料を内部混合する方法、及び（ｃ）粒子が重合された後に染色する方法、である。３つの方法は全て先行技術に開示されている。
【０００４】
最初の方法の例はチョンの合衆国特許５,１９４,３００号、シュワルツの４,７７４,１８９号にあるが、それらは１つ又は複数の蛍光染料を表面に共有結合付着することにより被覆されている蛍光ミクロスフェアを開示している。従って、これらの方法は、染料を粒子の内部に混和することに関する本発明とは関連しないものである。
【０００５】
２つ目の方法は、シュワルツの合衆国特許５，０７３，４９８号に見ることができるが、同特許は重合工程中に添加され、粒子本体内に無作為に分散される２つ以上の蛍光染料を開示している。しかしながら，そのような粒子が単一の励起波長にさらされると、１度に蛍光信号が１つだけ観察されるため、この粒子は特に単一の励起光源を有するフローサイトメトリー装置における複数パラメータ分析に有益ではない。フルワイラーの合衆国特許４，７１７，６５５号は、５つの異なる比率で混合され、１粒子に共重合された２つの染料を開示している。５つのビーズの母集団が入手できると特許請求されていたが、このビーズの蛍光特性は与えられておらず、当業者がそのようなビーズを製造使用するのを事実上妨げるものである。従って、フルワイラーの方法は実施手段を与えるものではないので概念上の方法にすぎない。さらに、この２つの方法のいずれも、すでに重合された粒子に蛍光染料を混和することを扱う本発明に関連するものではない。
【０００６】
３つ目の方法の原理、すなわち粒子がすでに重合された後に染料を内部に埋め込み又は拡散する方法は元々エル・ビー・バングズ（均一なラテックス粒子、セラゲン  ダイアグノスティックス  インク.１９８４年，４０ページ）により説明されたものであり、攪拌された微粒子に油溶性又は疎水性染料を添加し、温置後染料を洗い流すことからなる点で本発明に関連があるものである。この方法で使用されるミクロスフェアは本質的に疎水性である。このため、疎水性溶剤においてそのような粒子が膨張する現象を適用することができ、疎水性蛍光染料を含んでいてもよい。一度膨張すると、そのような粒子は、スポンジが水を吸収するように溶剤混合液に存在する染料を吸収することになる。膨張レベルと範囲は、温置時間、粒子が分解するのを防ぐ架橋剤、及び溶剤の性質及び量により制御される。これらのパラメータを変化させることにより、粒子中に染料を拡散させたり、好ましい形や大きさの蛍光染料を含む層や球形帯を得たりすることができる。溶剤を除去することにより染色工程は終了する。このように染色された微粒子は、水溶液中や、アニオン、非イオン、カチオン、両行性、及び双性イオンなどの水性溶剤や界面活性剤が存在する状態で染料を「浸出」しない。
【０００７】
ホーグランドらの合衆国特許５，７２３，２１８号は、バンの方法と本質的に類似した方法を用いて１つ以上のジピルロメテンボロンジフルオライド染料により微粒子を拡散的に染色することを開示している。しかしながら、２つの別個のジピルロメテンボロン染料で内部が染色されたビーズが４９０ｎｍの波長で励起されると、オーバーラップする発光スペクトラを示し、ビーズが多色ではなく単色性であることになる。ブリンクリーらの合衆国特許５，３２６，６９２号、ラーナーらの５，７１６，８５５号、及びシンガーらの５，５７３，９０９号は、２つ以上の蛍光染料で微粒子を蛍光染色することを開示している。しかしながら、その工程で用いられる染料はオーバーラップする励起及び発光スペクトラを有するため、最初に励起された染料から次の染料に、また一連の染料を通してエネルギーを伝達させ、その連続における最後の染料から光を発光することになる。この工程の目的は拡張されたストークスシフト、すなわち励起及び発光スペクトラ間に大きい溝を作ることであって、各染料から同時に蛍光を発光することではない。従って、染料間の相互作用、オーバーラップするスペクトラ、非ガウス発光特性及び隣接する染料間のエネルギー伝達といった種々の理由により、別個のピークで蛍光を同時に発光する多色ビーズに対する要望は満たされていなかった。チャンら（合衆国特許５，７８６，２１９号）は、２色の蛍光「環」を有するミクロスフェア、又は蛍光環と結合した蛍光球形「円盤」を含むミクロスフェアを考案している。しかしながら、そのようなビーズは、較正目的に意図されており、２つの染料は１つの固定比率だけで混合されているので、複数パラメータ分析で用いることはできない。フルワイラーの合衆国特許４，７１７，６５５号に関して上記に述べたように、２つ以上の染料を用いて今までに試みられた染料比率の最高数は５つを超えたことがなかった。従って、本発明が実施されるまで、２つ以上の染料が、種々の、正確に制御された比率で混合され、単一の励起波長にさらされると、複数の種々の輝度の蛍光信号を間隔の開いた光学的に離れた波長で発光することが証明された、一連のミクロスフェア母集団（ポピュレーション）又は部分集合（サブセット）を作り出す確実な手段はなかった。
【０００８】
言い換えれば、上記先行技術は、種々の色発光輝度を有する異なる色の種々の染料の組み合わせから生じる蛍光信号の微妙な変動により区別することができる、染色された多色微粒子の複数の限定された部分集合を作り出す手段を当業者に与えるような再生可能な方法を提供していなかった。以下使用されるように、染色されたミクロスフェアという用語は、ミクロスフェアを染色するのに用いられる複数の染料が、上記ミクロスフェア本体中に均一に拡散されているか、又は蛍光環、円盤及び他の幾何学的に異なるパターンを形成するように上記ミクロスフェアを貫通していることを意味する。
【０００９】
明らかに、一連の所定の比率で予め混合された２つ以上の染料により粒子を正確に染色又は着色する方法を有し、複数パラメータ用にそのように染色されたミクロスフェアの集まりを有することは、当該技術にとって重要な進歩である。染色工程におけるこの精度は通常、変動係数で表される。変動係数とは、蛍光粒子母集団の平均輝度に対する標準偏差比率である。この値を最小限にすることにより、オーバーラップせずに別個に染色された粒子のより多くの部分集合又は母集団を得ることができる。上記方法が、最小変動内で、好ましくは約２０％試料内変動以下、より好ましくは約１５％変動以下、最も好ましくは約８％変動以下で繰り返すことができ、又は再生できたならば、当該技術においてさらなる進歩になるであろう。
【００１０】
発明の要約
改良方法については、２つ以上の蛍光染料を、すでに重合されたミクロスフェアに混和することに関して説明される。ミクロスフェアにより吸収される各染料の量は正確に制御され、粒子の所定母集団内で正確な輝度と発光ピークを有する２つ以上の再生可能な蛍光信号を生じるようにしている。一連のそのようなビーズの母集団や部分集合はバッチで染色され、それぞれ２つ以上の蛍光染料の所定比率又は割合を有している。新規で、改良された染色方法により、同じバッチの粒子間の変動は大幅に低減されているので、光学的に均一な、しっかりと限定された集合内に存在する多色の蛍光ミクロスフェアの別個の母集団を前例のないほど多く生成することができる。
【００１１】
従って、同じ試料で複数の検体を同時分析するのに有用な、光学的に異なる精密染色されたミクロスフェアを含む集合も同じく特許請求されている。言い換えれば、上記ビーズは、先行技術に見られるような染色ビーズの使用を提供するにとどまらない。単一の試料部分を用いて単一の管で同時に測定できる検体の数は劇的に増加しているからである。独創的な染色方法により得られる蛍光微粒子は、粒子本体内に混合された２つ以上の蛍光染料を有し、それぞれが所定の色と輝度の多色の蛍光発光を同時に出すことができることを特徴とする。蛍光周波数帯単位で表現される蛍光色の所定の色と輝度に対応する発光ピークに関する概念の組み合わせは、一般的に蛍光信号と呼ばれる。１母集団の粒子内で混合される染料の特定の比率又は割合は、蛍光色及び輝度によりこの母集団を割り当てる蛍光図における上記母集団の位置を決める。２つだけの染料、例えばオレンジ色と赤色だけを用いることにより、ビーズの６４もの母集団を作ることができ、それぞれはフローサイトメトリー装置により認識される特有の蛍光特性における微妙な変動により互いに異なる。
【００１２】
２つ以上の蛍光信号により特徴付けられるそのようなビーズの各母集団が、臨床又はテスト試料で特定の検体を結合することができる分析反応物と結合されると、質的量的分析結果を与えることができる強力な分析手段が得られる。この分析方法も提供されているが、本発明により得られる多色蛍光ビーズの使用に基づくものである。１試料で複数の検体の多重分析に真に到達するために、対象となっている検体を結合することができる標識試薬に通常見られる、３つ目の種類の蛍光信号、例えば緑の蛍光信号が与えられる。従って、多色ビーズ、ビーズ自体、そのようなビーズの複数集合を製造する方法、及び1試料で複数の検体を分析する多重方法が本発明により特許請求される。
【００１３】
２つ以上の蛍光染料で高分子ミクロスフェアを染色する方法が開示されており、その方法は、（ａ）溶媒中に２つ以上の蛍光染料を混ぜ合わせることにより、脱水した複数の高分子ミクロスフェアを接触させると少なくとも部分的に膨張させるが溶解はさせない特性をもった、混合染料の溶剤を生成すること、（ｂ）上記高分子ミクロスフェアの全部を上記２つ以上の蛍光染料で均一に染色するのに十分な時間、上記脱水した複数の高分子ミクロスフェアを上記混合染料の溶剤に接触させること、を含んでなり、上記２つ以上の蛍光染料は、上記染色された複数の高分子ミクロスフェアを分離励起した時、各染料から別個の蛍光信号が発せられ、その発光信号の輝度が上記染色された複数の高分子ミクロスフェア中の上記染料の量と比例するように選択されている。
【００１４】
本発明の特定の実施態様において、上記方法はさらに、複数の高分子ミクロスフェアを脱水させることを含む。そのような脱水工程は、混合染料溶液に接触させる前に複数の高分子ミクロスフェアをアルコール溶剤で１度以上洗浄することにより達成される。さらに好ましい方法において、上記脱水工程は、混合染料溶液に接触させる前に洗浄されたミクロスフェアを乾燥するか、アルコール溶剤を、洗浄されたミクロスフェアから蒸発させることを含む。
【００１５】
通常、染色された複数の高分子ミクロスフェアは、濾過や遠心分離といった当該技術において公知の方法で分離されるがこれに限られない。染色された複数の高分子ミクロスフェアの実質的に全ての部分の内部全体に１つ以上の蛍光染料が拡散されていたり、染色された複数の高分子ミクロスフェアの実質的に全ての部分の内部全体に２つ以上の蛍光染料が拡散されている、染色された複数の高分子ミクロスフェアを得ることが好ましかった。さらに他の利点は、染色された複数の高分子ミクロスフェアの実質的に全ての部分の内部の１部のみに１つ以上の蛍光染料が拡散されている染色された複数の高分子ミクロスフェアを供給することにより得ることができる。
【００１６】
本発明の特定の方法において、染色工程はさらに、２つ以上の蛍光染料の種々の好ましい比率を有する一連の溶剤を製造することを含み、さらに複数の高分子ミクロスフェアの別個の母集団を一連の溶剤に接触させることにより、複数の高分子ミクロスフェアの別個の母集団又は部分集合を多数提供することを含み、各異なる母集団又は部分集合は２つ以上の蛍光染料の種々の好ましい比率を有する。
【００１７】
２つ以上の蛍光染料から出される異なる蛍光信号は、少なくとも約１０ｎｍ毎に、好ましくは約３０ｎｍ毎に、最も好ましくは約５０ｎｍ毎にそれぞれの波長が異なることが観察されてきた。
【００１８】
このように、本発明は、２つ以上の蛍光染料で実質的に均一に染色された１母集団の高分子ミクロスフェアを提供しており、上記母集団の励起された各高分子ミクロスフェアは、上記２つ以上の蛍光染料に対応する２つ以上の別個の蛍光信号を発し、上記２つ以上の発光信号の各輝度は、（ｉ）上記高分子ミクロスフェア中の対応する染料の量に比例し、（ｉｉ）上記母集団の全部のうちの変動係数を示し、該係数は２０％を越えないものである。特に、好ましい母集団は、２つ以上の発光信号の各輝度が、１５パーセントを越えない、好ましくは１０パーセントを越えない、最も好ましくは８パーセントを越えない、母集団の全部のうちの変動係数を示している母集団である。さらに他の実施態様では、２つ以上の発光信号の各輝度は８パーセント以下である母集団の全部のうちの変動係数を示している。
【００１９】
このように本発明は、上記仕様による高分子ミクロスフェアの別個の母集団のコレクションを提供するものであり、各母集団は、その母集団に特有な蛍光ビーズマップにおける発光スペクトラムを示すものである。特定の実施態様において、上記コレクションは８以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団を含み、好ましくは１６以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団を含み、より好ましくは２４以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団を含み、最も好ましくは３２以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団を含み、さらに好ましくは６４以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団を含んでいる。概して、上記コレクションはさらに、６５以上の別個の高分子ミクロスフェアの母集団に対応する６４以上の発光スペクトラ間にオーバーラップが実質的に存在しないことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明により意図されているのは、フローサイトメトリーにより、対応する分析反応物により認識される複数の検体を１試料中に検出する方法であって、（ａ）均一に染色された高分子ミクロスフェアの複数の母集団に上記試料を接触させることを含み、上記各母集団の高分子ミクロスフェアは、上記各母集団の高分子ミクロスフェアごとに所定の比率で混合した少なくとも２つの蛍光染料に、脱水した上記高分子ミクロスフェアを接触させることで均一に染色され、また、上記高分子ミクロスフェアの各母集団はその表面に結合される別個の分析反応物を有し、そして、上記高分子ミクロスフェアの各母集団の上記分析反応物は上記試料中の上記検体の特定のものと相互作用し、（ｂ）特定の上記検体に結合する標識試薬を与え、上記高分子ミクロスフェアを分析して上記分析反応物に上記検体が結合していることを示す上記標識を検出し、（ｃ）上記分析反応物が結合する上記各母集団の高分子ミクロスフェア内で上記所定の比率で混合された上記蛍光染料を有する上記高分子ミクロスフェアの母集団を判別することを含んでなる。
【００２１】
本発明の他の目的は、ここに示されるさらなる議論と詳細な説明により明らかとなるであろう。
【００２２】
本発明の概要及びその実施態様
最近の計器類の研究開発において、複数の蛍光信号を同時に出すことができる多数の正確に染色されたミクロスフェアを同時に開発する必要がある。この発明は、２つ以上のスクワリック(squaric)酸塩蛍光染料を高分子、すなわちポリスチレン粒子に吸収する技術を説明している。
【００２３】
本発明は直径約１０ｎｍから１００μｍの範囲の大きさのポリスチレンミクロスフェアを正確に染色する技術について説明している。粒子の大きさが本発明にとって重要ではないのは、染色工程の精度は影響されないからである。唯一の必要条件は、粒子が水に溶けない材料であって、適切な溶剤では溶解する材料から作られることである。染料には、近赤外線及び赤外線領域、またはそのどちらか、すなわち約１，０００ｎｍまで拡張する蛍光を示すスクワリック酸塩分子を用いるのが好ましい。他の染料を用いても、紫外線から赤外線までその範囲を拡張することができる。この方法により、２つ以上の独立濃度の染料が各ミクロスフェアに均一に吸収され、その結果ミクロスフェアに存在する染料の数の多数の蛍光信号が生じる、高再生が容易な方法が可能である。
【００２４】
開示されたこの技術は、特有の蛍光特性を有する一連の多色蛍光粒子を製造する手段を当業者に与え、そのような粒子を複数の検体の同時多数パラメータ分析するのに用いるものである。
【００２５】
特定の実施態様の詳細な説明
本発明は、２つ以上の発光染料を含む新しい高分子ビーズ又はミクロスフェアを提供するものである。本発明はさらに、光学的に別個の、多色ビーズの多数の母集団が形成されるように、上記ビーズを所定の比率で結合された２つ以上の蛍光染料と混合することにより上記ビーズを製造する改良方法を含んでいる。このビーズ母集団は、顕微鏡法などの視覚的検出により、又は好ましくはフローサイトメトリーにより、実質的にオーバーラップしていない集合として簡単に区別される。複数の検体を同時に多重パラメータ分析する方法も提供されており、それにより各別個の多色ビーズ母集団は、例えば抗体、抗原、又は核酸プローブなどの、複数の検体を含む１試料中の対象となる特定の検体と反応する分析反応物をさらに有している。
【００２６】
本発明で用いられる高分子ミクロスフェアは多数の販売業者から市場で入手でき、直径０．０１〜１００マイクロメーター（μｍ）の大きさの範囲がある。微粒子はいかなる大きさでもよいが、好ましい大きさは０．１〜５０μｍであり、より好ましくは1〜２０μｍであり、さらに好ましくは３〜９μｍである。１集合のビーズの大きさは均一でもよいし、大きさに基づきさらに部分集合に区別分類するために異なっていてもよい。微粒子の大きさは、いわゆる前方又は小角度散乱光により実質的にどのフローサイトメトリー装置においても測定することができる。この部分集合はさらに、微粒子の異なる形により区別することもできる。粒子の形はまた、フローサイトメトリー、例えば高解像度スリットスキャン方法により区別することができる。
【００２７】
ミクロスフェアの種類は、ポリスチレン又はラテックス材料であるのが好ましい。しかしながら、どのような種類の高分子から作られるミクロスフェアも許容でき、その中には臭素化されたポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロライド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリル酸塩、またはそれらの組み合わせなどが含まれる。
【００２８】
またミクロスフェアは、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリル酸塩、トリメチロールプロパントリメタクリル酸塩、又はＮ，Ｎ'メチレン−ビス−アクリルアミドといった架橋剤や、当該技術で公知の他の機能的に等価な薬品を１〜３０％含んでいる。好ましい実施態様において、ミクロスフェアはポリスチレンからなり、１〜３０％のジビニルベンゼンを含んでいる。
【００２９】
ビーズは、カルボン酸塩、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド類、アミン、酸化硫黄、酸化窒素、又はハロゲン化物などの、付加的な界面官能基をさらに含んでも含まなくてもよい。ミクロスフェアの界面基の機能は、分析反応物を化学的に結合することができる結合能力をミクロスフェアに与える。ミクロスフェア上の官能基に加えて、染料それ自体も化学反応官能基を有してもよく、その官能基は、上記に挙げた基に加えて、カルボン酸、カルボン酸スクシンイミジルエステル、カルボン酸無水物、スルホニルクロライド、スルホニルフルオライド、ヒドラジン誘導体、アシルアジド、イソシアン酸塩、ハロアセトアミド、フェノール類、チオール類、及びケトンを含んでもよい。これらの官能基は、分析反応物、つまり抗体、抗原（ハプテン）、ジゴキシゲニン、又は核酸プローブなどの従来から広く使用されている反応物の付着に有益である。これらはまた、アビジン−ビオチン、受容体−配位子、配位子−リゲイト、酵素−基質、レクチン−炭水化物、蛋白質Ａ−免疫グロブリンなどの、特定の親和性の高い接合を形成することができる反応物を含むこともある。フローシトメトリー分析用に、分析反応物は通常、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）又はローダミンなどの蛍光タッグ又は標識で標識付けされる。この染料及び分析反応物の発光接合物は標識試薬と呼ばれている。
【００３０】
分析反応物はまた、例えばヴァンデンエンらの合衆国特許５，７４７，３４９号に開示されているように、例えばＯ２、ＣＯ２、ｐＨ、Ｃａ＋＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＣｌ−といった種々の検体に反応することができる蛍光レポーター分子の中から選択することができる。
【００３１】
適切な溶媒は、対象となっている特定の種類の疎水性染料を溶解性にすることができる能力に基づき選択される。それらの溶解性特性は実質的に類似していることが好ましい。溶剤は、アシル、脂肪族、脂環式、芳香族又は複素環式の炭化水素であってもよいし、溶剤は、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素及び燐、又はそのいずれかを、末端基又は環や鎖の必須部分として有しても有さなくてもよい。特に、トルエン、キシレン、ヘキサン、ペンタン、アセトン、ＤＭＳＯ、又は塩化メチレンなどの溶剤を用いることができる。好ましい実施態様においては、塩素化溶剤、より好ましくはクロロホルムを用いて、本発明で用いられる好ましい染料であるスクワリック酸類の染料を可溶にしている。
【００３２】
一実施態様において、２つの蛍光スクワライン染料、例えば１，３−ビス［（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル］−２，４−ジヒドロキシ−シクロブテンジイリウム，ビス（内部塩）の赤色染料と、２−（３，５−ジメチルピロール−２−イル）−４−（３，５ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン）−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オンのオレンジ色染料が用いられている。ビーズで存在する第１及び第２の染料間のモル比は、約０〜１０，０００の間であるのが好ましく、また０，００００１〜２，０００の間であるのがより好ましい。両染料は、例えば紫外線から約８００ｎｍまでの範囲の同じ吸収波長で励起され、２つの別個の、１０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ、よし好ましくは５０ｎｍ以上離れた本質的にオーバーラップしない波長で蛍光を発するのが好ましい。例えば、染料＃１の発光ピークは５８５ｎｍであり、染料＃２のピーク発光は６３０ｎｍである。
【００３３】
スクワリック酸塩の蛍光染料は、上記文献に示される方法により合成することができる。例えば、スプレンガーらのアンジュー．ケム．，７９，５８１（１９６７）、アンジュー．ケム．，８０，５４１（１９６８）、及びマークスらのアンジュー  ケム．インターン．エディット．，５，８８８（１９６６）などを参照されたい。つまり、スクワリック酸（１，２−ジヒドロキシシクロブテンジオン）の１等量は、ピロール、インドリン又はアニリンなどの活性化合物の２等量と共に縮合され、反応混合物から水を取り除くことができる状態でアルコール及び（ベンゼンなどの）芳香族溶剤の混合液で還流される。その結果生じる染料は、再結晶化、蒸留、クロマトグラフィーなどの多くの標準的方法により収集し純化することができる。さらに、非対称に置換されたスクワリック酸化合物は、ローらのジェイ．オルグ．ケム．５７，３２７８，（１９９２）により説明されるような方法により合成することができる。そのような染料のいくつかを作る特定の方法は当該技術において公知であり、例えば合衆国特許５，７９５，９８１号、５，６５６，７５０号、５，４９２，７９５号、４，６７７，０４５号、５，２３７，４９８号及び５，３５４，８７３号に見ることができる。そのような染料は選択的に、活性エステル、イソシオシアネート、アミン、ヒドラジン、ハライド、酸、アジド、マレイミド、アルコール、アクリルアミド、ハロアセトアミド、フェノール類、チオール、酸、アルデヒド類及びケトンなどの生体分子又は高分子に通常見られる官能基により安定した蛍光生成物を形成することができる官能基を含む。
【００３４】
特定のスクワリック酸染料に加えて、この好ましい実施態様において用いられる関連染料は、シクロブテンジオン誘導体、置換セファロスポリン化合物、蛍光スクワライン組成物、対称及び非対称スクワライン、アルキルアルコキシスクワライン、又はスクワリリウム化合物からさらに選択することができる。この染料には、約１，０００ｎｍまでの発光スペクトラの範囲を実質的に拡張する赤外線波長だけでなく、近赤外線で蛍光を発することができるものもある。
【００３５】
スクワラインに加えて、すなわちスクワリック酸から誘導されて、フタロシアニン及びナフタロシアニンなどの疎水性染料を、長い波長で機能できるものとして選択することもできる。他の種類の蛍光色素も同じく、本発明による染料として用いるのに適している。このような染料のいくつかをここに挙げる。３−ヒドロキシピレン５,８,１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプトアミン、５−ヒドロキシトリプトアミン（５‐ＨＴ）、酸フーシン、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、ＡＦＡ（アクリフラビンフオルゲンＳＩＴＳＡ）、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、ＡＣＭＡ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アントロイルステアリン酸塩、アリール又はヘテロアリール置換ポリオレフィン、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、ベルベリン硫酸塩、ビスベンズアミド、ＢＯＢＯ１、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、ボジピーＦｌ、ＢＯＰＲＯ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルシエンブルー、カルシウムグリーン、カルコホールＲＷ溶液、カルコホールホワイト、カルコホールホワイトＡＢＴ溶液、カルコホールホワイト標準溶液、カルボシアニン、カルボスチリル、カスケードブルー、カスケードイエロー、カテコールアミン、シナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン、クマリン−ハロイジン、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ＤＡＰＩ、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピルロメテンボロンジフルオライド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エオシン、エリトロシンＩＴＣ、エチジウムブロマイド、エウチリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロサリック酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、ホークスト３３２５８（ＤＮＡに結合）、インド−１、イントラホワイトＣｆリキッド、ロイコホルＰＡＦ、ロイコホルＳＦ、ロイコホルＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミスラミシン、ＮＢＤアミン、ナイルレッド、ニトロベンズオキサジドール、ノルアドレナリン、ニュークリアファーストレッド、ニュークリアイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オレゴングリーン、オキサジン、オキサゾール、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（フォイルゲン）、ホルワ���トＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトレブ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フイコエリトリンＲ、ポリアザインダシンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、プロピジウムヨー化物、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザルブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、ローズベンガル、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソシオスルホニック酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢカンＣ、スルホローダミンＣエクストラ、テトラサイクリン、テキサスレッド、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、ＴＯＴＯ１、ＴＯＴＯ３、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ウビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、ＸＲＩＴＣ、ＹＯ  ＰＲＯ  １、又はそれらを組み合わせたもの。当業者であれば、そのような染料の中から、その疎水特性だけでなく好ましい発光及び吸収特性が適切である限り、どれを選択すべきかを明確に知るものである。蛍光染料のスペクトラ特性は、同じフローサイトメトリー装置を使用できるように、フルオレセイン又はローダミン誘導体と励起波長及び輝度が実質的に類似している必要がある。しかしながら、染料が有機溶剤において溶解性が高く、向上した光安定性及び量子収量を有することが好ましい。この染料は所定の比率で結合され、ミクロスフェアビヒクルに埋め込まれ、染料の全体量は約０．００００１％〜１５％粒子重までの間にある。しかしこの限定は、上記染料が染み込んだ粒子が安定しており、所期の目的に有用である限り、本発明にとってあまり重要ではない。
【００３６】
先行技術方法
先行技術方法は、単一の染料だけで担体粒子を染色することを教示している（図１参照）。しかしながら、意義ある比較をするために、また本発明の要点に一致させるために、上記方法を用いて２つの染料で同時に染色した。レイ  ビー．バンによる「均一ラテックス粒子」に述べられるような大きい高分子粒子（＞５ｕｍ）を染色する先行技術が実行されたが、その手順の概略は図１に示されており、得られた結果は図３に示されている。つまり、この方法は、水性媒体中の５ｍｌの染色されていないストックミクロスフェアをメンブレン被膜されたフリット漏斗に直接入れることにより始められる。１時間、真空ポンプで濾過紙に置かれたミクロスフェアから空気を抜いた。次に、乾燥したミクロスフェアを５０ｍｌの染料溶液に移し、一晩室温で覆いをかけられ、攪拌された。翌日、染料溶液からミクロスフェアを濾過により分離し、染色された粒子を約４時間真空乾燥機に入れて、残留溶剤を取り除いた。次に、２５０ｍｌのフラスコで、２００ｍｌのトリトンX‐１００と水溶液を乾燥した染色されたミクロスフェアに加える。溶剤を３時間かき混ぜる。溶剤を濾過し、濾液に染料が検出されなくなるまで洗浄を繰り返す。このように染色されたビーズは、フローサイトメトリーにより染色の均一性について試験される（図３）。３つの別個の実験（試験Ａ、Ｂ及びＣ）に基づき、ＦＬ２及びＦＬ３パラメータ（ＣＶ又は変動係数）におけるビーズ間変動がかなり高く不適切であるために、精密に染色された多色ミクロスフェアに対し高まる要望を満たしていないことが容易にわかる（表１）。
【００３７】
本発明の方法の概略
精密に染色された多色ミクロスフェアに対する需要が高まり応用が増えるにつれて、上記方法に代わる方法を開発することが必要となっている。その結果、先行技術の方法の応用が開発され、それが最も効果的なミクロスフェアの精密染色方法であることが証明されてきた（図２）。この方法では、前に述べた方法にかかった時間の十分の一以下の時間しかかからず、その精度を著しく高めている。以前のように、ミクロスフェアからほとんど全ての極微量の水を取り除くことが重要である。これを達成するため、水性媒体の多量のストックミクロスフェアを真空濾過メンブレン上にピペットで移し、液体を取り除いて捨てている。次に、１００ｍｌのリンス溶液（プロパノール、メタノール、エタノールなどの脂肪族アルコール）をミクロスフェアに添加する。ミクロスフェアは、超音波プローブを直接溶液に入れ、数秒間又は再懸濁に作用するのに必要なだけ電流を加えて再懸濁する。懸濁液を濾過し、前工程をもう一度繰り返す。ミクロスフェアの染色は、５０ｍｌの（以下に述べるように有機溶剤中の１つ以上の染料からなる）染料溶液を濾過カップに加え、以前のように再懸濁することにより行われる。懸濁液を、濾過カップ中に５分間置いておく。次に、５０ｍｌのリンス溶液を染料懸濁液に加え、超音波処理し濾過する。もう１００ｍｌのリンス溶媒を加え、再懸濁し濾過する。最後の工程をもう一度繰り返す。貯蔵用ミクロスフェアを生成するために、１００ｍｌの水性媒体をミクロスフェアに加え、超音波処理し濾過する。最後に、５０ｍｌの水性媒体をミクロスフェアに加え、超音波処理し、貯蔵容器に移す。
【００３８】
本発明の特定の実施態様において、２つのスクワリック酸塩染料を、クロロホルムなどの、両染料を完全分解するのに適した溶剤で混合する。エタノールを溶液に加え、ミクロスフェアの湿りを増加させ、方法によって変わるミクロスフェアよりも小さい最終溶剤濃度を作る。各染料の濃度は、２つの中央波長のそれぞれの、対象となる蛍光輝度の関数として経験に基づき決定される。このような濃度は、本発明の工程を通して相対輝度を維持する。
【００３９】
本発明の重要な側面には、染色作業の前にミクロスフェアを生成することがある。製造業者は水性媒体でミクロスフェアを供給することが多い。水性媒体で貯蔵されたミクロスフェアの表面は、有機化合物に浸透できるように処理しなければならないことは前からわかっていた。好ましい実施態様において、アルコールなどの一定量の極性有機溶剤をミクロスフェア溶液に加え、水性媒体と極性有機溶剤の約５０％混合液を得る。しかしながらこの比率は変えることができ、媒体及び溶剤の化学及び物理特性により求められる特定の必要性により、任意に調整される。
【００４０】
同等に効果的で精密な技術は、例えばメタノール、エタノール、２−プロパノール、リンスなどの一連のアルコールによりミクロスフェアを「乾燥する」ことを含む。この工程は、通常懸濁液中１０％固体であるミクロスフェアの水溶懸濁液をスピンダウンすることにより始まる。水性媒体を別の容器に移し、ビーズをメタノールで再び懸濁する。約５％固体のアルコール溶液を渦巻き、超音波処理し、スピンダウンする。この工程をもう１、２回行う。余分なアルコールをペレットから移し、残留溶剤を真空下で蒸発する。
【００４１】
０.０５グラムの乾燥ミクロスフェアからなる試験試料を用いて染料溶液を好ましい比率に調整する。乾燥した０．０５グラムのミクロスフェアを、対象となっている２つ以上の染料を含む０．５ｍｌの染料混合液で懸濁する。現在１０％固体であるミクロスフェアの懸濁液を渦巻き、超音波処理して懸濁液にする。懸濁中に一度、ミクロスフェアと染料の混合液を１時間混ぜ合わせる。その後、ミクロスフェアを遠心機を使って１分間スピンダウンする。染料溶液を主フラスコに移し戻し、０．０５ｇのミクロスフェアを例えばメタノールなどの１ｍｌの９０％アルコールで再び懸濁する。リンス工程では、２倍の染料溶液を用いることにより、５％固体溶液を保持する。試料を渦巻き、超音波処理し、スピンダウンする。メタノール上清を別の容器に移しかえる。９０％メタノールリンス工程をもう一度繰り返す。最後に、余分なメタノールをペレットから移し、ミクロスフェアを水性媒体で再び懸濁する。その結果生じる試験試料を試験し、標識されたビーズの蛍光活性／輝度を判定する。
【００４２】
染料溶液が正確な比率の好ましい染料を実際に有していることが試験試料からわかれば、大規模なバッチを行う。大規模精密検査の原理は、上記に述べたものと同一である。つまり、２５ｍｌの好ましい染料溶液を、２．５グラムの乾燥ミクロスフェアを含む５０ｍｌガラス瓶に移す。現在１０％固体のミクロスフェアを渦巻き、超音波処理する。ミクロスフェアを完全に懸濁したら、１時間混ぜ合わせる。その後ミクロスフェアを遠心機により染料溶液から取り出す。染料溶液を主フラスコに移し戻し、２．５グラムのミクロスフェアを５０ｍｌの９０％メタノールで再懸濁する。リンス工程では、２倍の染料溶液を用い、５％固体の混合を保持する。試料を渦巻き、超音波処理し、スピンダウンする。メタノール上清を別の容器に移しかえる。この工程をもう一度繰り返す。最後のメタノールリンスを別の容器に移し変えた後、ミクロスフェアを水性リンス中に入れる。水性上清を別の容器に移し替え、ビーズを再懸濁し、新しい水性媒体で貯蔵する。
【００４３】
以下の例は、本発明の利点を説明し、当業者が製造利用するのを補助するために提示される。この例は、これに基づき特許が認められた本開示又は保護の範囲を限定することを目的としていない。
【００４４】
例１．
２つの異なるスクワリック酸を含む単一の溶剤を生成する。１つ目の染料は赤蛍光染料１，３−ビス［（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル］−２，４−ジヒドロキシ−シクロブテンジイリウム，ビス（内部塩）であり、２つ目の染料はオレンジ蛍光染料であり、２−（３，５−ジメチルピロール−２−イル）−４−（３，５ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン）−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オンとなり得る。染料＃１のピーク発光は５８５ｎｍであり、染料＃２のピーク発光は６３０ｎｍである。これらの染料が選択されたのは、この革新的な新技術と比較される先行技術染色技術の精度を判定するのに用いられる測定装置である、ベクトン  ディッキンソン  ＦＡＣＳｃａｎ  フローサイトメーターの２つの蛍光周波数帯の中央に入るからである。しかしながら、蛍光周波数帯のこのような選択は相対的で重要ではない。なぜなら、他のフローサイトメトリー装置には異なる設定を有するものもあるからである。
【００４５】
染色されていないミクロスフェアの試料を２つ用意する。１つ目は（図２及び４に示されるように）この革新技術を用いてオレンジ色及び赤色染料の混合物で染色され、２つ目は先行技術を用いて染色される（図１及び３）。試料をＦＡＣＳｃａｎで測定し、Ｘ−Ｙ図を作成して各試料の相対的な均質を示す。Ｘ軸はオレンジ色染料の輝度及び蛍光輝度を示し、Ｙ軸は赤色染料の同じパラメータを示す。中間輝度及び変動係数も同じく測定される。従来の方法で染色されたビーズははるかに大きいＸ−Ｙ領域に広がっているのは明らかであり、オレンジ色及び赤色染料の比率が粒子間で変動していることを示している。対照的に、本発明の改良方法により染色されたビーズ母集団の変動係数ははるかに小さい。試験Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれにおいて、約１０，０００のビーズは、バンの方法で染色したビーズと平行になっている（表１）。
【００４６】
例２
異なる傾向特性を有する他のビーズ母集団を製造するために、得られる母集団が光学的に前の母集団とオーバーラップしないように、染料比率を適切に増やすことにより赤色／オレンジ色染料の比率を変える。先行技術は、不適切な染色工程から生じる不可避な試料内不均一により多色ビーズの複数母集団を与えておらず、所定の染色バッチ内の粒子から粒子へ染料がよく分散されないことになる。従って、光源により励起した後、１つ以上の染料を含む染色されたビーズは好ましい輝度の均一な蛍光信号を出していなかった。本発明はこの問題を克服し、たった２つの染料の比率を変えることにより光学的に区別されるビーズの６４もの部分集合を形成することを達成している。この例に限定されるものではなく、当業者であれば本教示を使用することでより少ない又はより多いビーズの部分集合を容易に生成できるであろう。当業者であれば、この達成に近いものであっても、実際に実行できるものではなかったことを認めるであろう。そのような結末は理論的には可能であると推測されていたが、先行技術は当業者にそれにたどり着く方法を教示しなかった。
【００４７】
本発明者は始めて、本発明を実行できたことになり、６４−ビーズ母集団を得た代表的実験結果は図６及び表２に示されている。図５に示される結果は、先行技術方法の染色工程を用いた多色ビーズを示している。染色技術が不正確であるために、ビーズ間の染料比が広く分散しており、６つの多色ビーズ母集団の部分集合だけが蛍光ビーズマップに適合することができる。対照的に、図６は、６４のビーズ母集団を含む蛍光ビーズマップを示しており、各領域に規定される境界内の各ビーズ部分集合蛍光特性が固まって分散していることを示している。種々の集合間のクロストークは最小限である。オーバーラップのほとんどは、より明るい信号を出すビーズ凝集が存在することによるものであるが、光の散乱に基づき大きさにより区別して取り除かれる。
【００４８】
通常、表２からすぐにわかるように、所定のビーズ母集団の２つの染料濃度とＸ−Ｙ図上の上記母集団の位置には明白な関係がある。各位置は、約470、580、690、750、800、900及び990に連続して存在する直線蛍光周波数帯で表現される赤色（ＦＬ３）又はオレンジ色（ＦＬ２）染料に関して割り当てられる。実際的な理由、すなわちビーズ集合の空間が限定されているために、最後の桁「０」は除かれる。各ビーズ母集団における最初の２桁はオレンジ色染料（ＦＬ２）の蛍光輝度を示し、最後の２桁は赤色染料（ＦＬ２）の輝度を示している。蛍光輝度は、数字が大きくなるにつれて大きくなる。最も低い輝度（４７２５）のビーズは左下隅にあり、最も明るいもの（９９９８）は右上隅にある。コラムを垂直に上るにつれてビーズの赤色及びオレンジ色染料量は増やさなければならない。これは、オレンジ染料から赤色へのエネルギー伝達量がかなりあるためである。列の左から右へ水平に移動すると、安定したＦＬ３値を保持するために赤色染料を減らさなければならない。これは、オレンジ色染料スペクトラムが赤色領域にオーバーラップするため、ＦＬ３信号を増加する必要があるためである。このように、複数のオーバーラップしないビーズの母集団が構成される。２つのパラメータ、すなわち蛍光色（赤色又はオレンジ色）と色強度又は輝度（蛍光周波数帯単位で表現される）は、得られたビーズを分類するのに不可欠であり、蛍光信号と呼ばれる。
【００４９】
このように、蛍光特性又は信号が蛍光ビーズマップに描写される所定の領域内にある、特定のビーズの母集団が供給される。通常、特定のビーズ母集団内の約８０％以上の個々のビーズは、好ましい領域で、好ましくは９０％以上、より好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上が蛍光特性を示す。各ビーズの集合に関しては、通常特定のビーズの集合内の１％以下の個々のビーズが、別の好ましくない領域で、好ましくは約０．５％以下、より好ましくは０．３％以下、最も好ましくは０．２％以下が蛍光特性を示す。
【００５０】
理論的にいかなる数の母集団又は部分集団も各ビーズマップに存在できるが、先行技術における限定のために、同時に共存する６を越える部分集団を得ることは可能ではない。理論的には、そのような部分集合は多重分析にとって極めて価値があると推測されてきたが（例えばセルバイオロジー，４２，パートＢ，（アカデミックプレス，１９９４）の方法におけるマクヒューの「複数溶解性検体の量的同時検出用フローミクロスフェア免疫測定」を参照されたい）、当該技術において触知できる多色ビーズの実現手段を与え、説明している公知例はなかった。２つの染料の種々の比率を含む、せいぜい１つかおそらく最大でも５つのビーズの母集団が可能なだけであった。例えば、合衆国特許４，７１７，６５５号はそのようなビーズを開示しているが、その開示は実行手段を与えられておらず、このビーズに染料を混合する方法は共重合方法によるものであり、このように本発明とは関連しないものである。対照的に、現存する方法を著しく改良することにより、１６部分集合、３２部分集合、６４部分集合またはそれ以上の数のビーズコレクションを本発明方法を使って得ることは現在技術的に可能である。
【００５１】
例えば、６４部分集合ビーズのコレクション又は６４ビーズ母集団を構成したが、各母集団はＸ−Ｙ図の別個の位置により互いに異なっている。この位置は本質的にオーバーラップしない。先行技術方法では１０〜２０％又はそれよりも高い比率の拡散が生じるのに対し、本発明方法ではたった０．２〜０．３％の拡散で本質的に均質なビーズの母集団を得ることができる。以後使われるように、本質的にオーバーラップしない母集団という用語が意味するのは、各母集団中約０．２〜０．３％のビーズだけが光パターン又は蛍光信号を表示することができることであり、それは隣り合うビーズ集合が、同じ集合の蛍光染料を有するが異なる比率で混合されていることに起因できる。これは先行技術に対する著しい改善である。
【００５２】
例３
多重分析能力は理論的には、フローサイトメトリー技術において多大な利益を与えるものであるが、十分な種類の多色のオーバーラップしない蛍光ビーズの部分集合を得ることにおける技術的限定により以前よりほとんど進歩が得られなかった。このような先行技術のあるものは、マクヒュー（上記参照）により提供されている。この方法は、２，３以上の異なる検体を分析することができる完全に多重された分析を行うのに用いるには不十分であった。先行技術において、ビーズを２つの染料の組み合わせに混合すると、５つだけのビーズの部分集合が得られた（フルワイラーの合衆国特許４，７１７，６５５号）。最大６つの部分集合を有する集合は、バンの方法（例１を参照）を用いて得られるが、真の多重分析にはまだ不十分である。
【００５３】
一連の抗体、抗原、又は拡散プローブを、以後まとめて分析反応物と呼ぶが、例えばメディカル  アンド  バイオロジカル  アプリケーションズ，１‐１３，ＣＲＣ，ボカ  ラトン，フロリダ，１９８８のコルビンらのミクロスフェアにおける「酵素及び免疫グロブリンの親水性ミクロスフェアへの共有結合」、アナル  バイオケム，１０５，３７５‐３８２（１９８０）のカンタレロらの「ポリスチレン用蛋白質の吸収特性及び固体相の免疫分析におけるその重要性」、メソッズ  イン  エンジモル,１１２,６７‐８４（１９８５）１１２,６７‐８４（１９８５）のイラムらの「モノクロナル抗体のミクロスフェアへの付着」などの、多くの従来手順のいずれかによりビーズに付着する。
【００５４】
反応物をビーズの表面に付着した後、各部分集合の部分を混合して、各部分集合内で公知の量のビーズを含むプールを生成する。このプールされた集合を各部分集合から同じ量のビーズで生成して、上記集合が各部分集合又は母集団から大体同じ数のビーズを含むようにするのが好ましい。このプールはその後、漿液又はプラズマなどの対象となっている液体試料で温置し、ビーズの抗原に反応する液体中の抗体が存在するかどうかを試験する。そのような温置は通常、ビーズ表面に抗原を有する液体試料において抗体の特定の反応を促進するような温度、ｐＨ、イオン濃度などの条件下で行われる。十分な時間の後、混合物のビーズは遠心分離され、洗浄され、例えばフルオレセイン標識されたヤギ抗−ヒト免疫グロブリンなどの「二次的な」抗体でさらなる時間温置される。二次的な抗体又は標識試薬は、ビーズの抗原に結合した抗体に結合し、蛍光標識付けをする。洗浄後（又は洗浄無しで）、ビーズはフローサイトメトリーにより処理され、４分類パラメータすなわち前方光錯乱、側方光散乱、赤色蛍光及びオレンジ色蛍光を測定して、各ビーズが属する部分集合又は母集団を識別するのに用いる。各ビーズの緑蛍光（測定パラメータ）の同時測定により、ビーズがそれに結合した抗体を有するかどうかを判定することができる。ビーズが属する部分集合は、例えば一連のガラスアレルゲン、種々の物質濫用薬など特定の抗原の存在と相互関連しているので、ビーズに結合した抗体の特異性をそれが属する部分集合の関数として容易に判定することができる。
【００５５】
置換又は競争アッセイ
臨床実験における多くの物質のアッセイは、特定の配位子−リゲイトや抗原−抗体の相互作用による干渉に基づくものである。このアッセイにおいて、配位子−リゲイト対の１部分を発蛍光団又は蛍光色素で標識付けし、１部分をビーズ上に固定する。配位子またはリゲイトである溶解性の標識付けされていない検体を反応混合物に加え、標識付けされた要素と固定された要素の相互作用を拮抗的に抑制する。通常、対のどの部分を標識付けし、どれを固定するかは重要ではないが、特定の分析においては、機能的利点が分析指向を要求することがある。この種類の分析の１例においては、各ビーズ部分集合は抗原と共に与えられる。抗原が被覆したビーズは、ビーズ表面の抗原に特有の標識付けされた抗体と反応させる。その後溶解性検体（抑制剤）を含む試験流体を加えて、溶解性検体の濃度に正比例してビーズから標識付けされた抗体を置きかえる。公知の検体濃度の標準曲線が、試験試料における検体を正確に定量化するのに用いられる。
【００５６】
核酸分析
ＰＣＲの能力及び反応性は、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を検出する必要がある種々の分析問題に適用されてきた。ＰＣＲ技術の主要な問題の１つは、最終生産物、つまり増幅されたＤＮＡの測定方法がわずらわしい性質のものであることである。フローサイトメトリックビーズベースハイブリダイゼーションでは、対象となる遺伝子配列を極めて迅速正確に検出することができる。この発明の好ましい実施態様において、対象となっている核酸部分が結合されるビーズが与えられる。対象となっているＰＣＲ生成品（又は他のＤＮＡ又はｃＤＮＡ部分）は、その能力により検出し、ビーズ上の核酸部分と相補蛍光ＤＮＡプローブ間の交雑を拮抗的に抑制する。この方法は反応性があり正確で、対象となっているＰＣＲ生成品又はＤＮＡの一点変異を検出することができる。複合されたＤＮＡ分析方法は、特定の多形や変異に関し対象となっているＰＣＲ生成品又は他のＤＮＡを検出するのに用いることができ、当業者であれば、罹病性に関連する組織適合対立遺伝子、遺伝病に関連する変異、自己免疫疾患、腫瘍形成に関連する腫瘍遺伝子の変異又は腫瘍形成の危険の有無など、様々な応用を想定することができる。同様に、バクテリア、ウイルス、菌腫、マイコプラズマ、リケッチア属、クラミジアル、又は原生動物病原体などの病原有機体から核酸部分を同時に検出することができる。
【００５７】
エンザイムアッセイ
本発明はまた、酵素、酵素抑制剤、及び他の検体の測定に有用である。例えば、ビーズから酵素切断した選択した蛍光基質によりビーズ部分集合を生成し、蛍光を損失させている。本発明を用いて検出測定できる酵素には、蛋白質分解酵素、グリコシダーゼ、ヌクレオチダーゼ、及び酸化還元酵素などがある。選択された結合を切断する酵素を測定することができる。代わりに、ビーズ結合基質の酵素が活動すると、反応混合物に存在する蛍光配位子用のリゲイトを形成、識別することになる。改良された基質を有するビーズは、蛍光配位子を新しく形成されたリゲイトに結合することによって蛍光になる。特有の基質を有する各種類のビーズを区別することができるので、ビーズ部分集合の混合物を用いて同じ反応混合物内で同時にいくつかの酵素活性を測定することができる。
【００５８】
この技術を用いて分析できる検体を有する流体又は試料には、血漿、漿液、涙、粘液、唾液、尿、胸膜液、脊髄液、胃液、汗、精液、膣分泌液、潰瘍及び他の表面発疹からの分泌液、水疱、膿瘍、及び正常、悪性、及び疑いがかけられた細胞の生検を含む細胞抽出物などがある。
【００５９】
上記例は、最も一般的な免疫診断及び核酸分析を実行するのに用いることができる。新薬発見用の組み合わせ化学ライブラリーの高度処理量スクリーニング、汚染物質の環境スクリーニング、薬品検査、食品安全関連調査、農業用複数検体分析試験など、他の応用が想定できる。
【００６０】
上記発明は、好ましい実施態様を例示することにより詳細に説明されているが、以下の請求項に述べられる本発明の真髄及び範囲を逸脱することなく、様々な修正、置き換え、変更が可能であると理解するべきである。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
【表２】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、先行技術を用いて高分子粒子を染色する連続工程のフローチャートを示している。
【図２】  図２は、本発明を用いて高分子粒子を染色する連続工程のフローチャートを示している。
【図３】  図３は、先行技術を用いて２色染色されたミクロスフェアの広い光学的分散を示す２次元フローシトメトリーチャートを示している。
【図４】  図４は、本発明を用いて２色染色されたミクロスフェアの固定した集合を示す２次元フローシトメトリーチャートを示している。
【図５】  図５は、先行技術方法が蛍光ビーズマップの多色ビーズ母集団の部分集合を６つ以下しか与えないことを示している。
【図６】  図６は、６４領域ビーズ集合の蛍光ビーズマップを示し、各領域に規定される境界内の各ビーズ部分集合蛍光特性の固定した分散を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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