(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然型Ｘａ因子活性化切断部位の領域に修飾を有していることを特徴とするＸ因子類似体であって、該修飾は、配列番号２７で示されるＸ因子配列におけるＧｌｙ２２８−Ｒ６−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３−Ｒ２−Ａｒｇ２３４−Ｒ１
（ここに、
ａ）Ｒ１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａから選択されたアミノ酸であり；
ｂ）Ｒ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択されたアミノ酸であり；
ｃ）Ｒ３はＰｈｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＰｒｏから選択されたアミノ酸であり；
ｄ）Ｒ４はＡｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｒｇまたはＬｙｓから選択されたアミノ酸であり；
ｅ）Ｒ５はＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇから選択されたアミノ酸であり；および
ｆ）Ｒ６はＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒから選択されたアミノ酸である）
で示される配列によって表される、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群；またはＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼのためのプロセッシング部位を表すもの。
【請求項２】
さらなる修飾を前記Ｘ因子アミノ酸配列のＣ末端の領域に有することを特徴とする請求項１のＸ因子類似体。
【請求項３】
修飾をβ−ペプチド切断部位のＣ末端領域に有することを特徴とする請求項２のＸ因子類似体。
【請求項４】
その修飾が前記Ｘ因子アミノ酸配列のアミノ酸位置Ａｒｇ４６９とＳｅｒ４７６との間の領域における突然変異、欠失、または挿入であることを特徴とする請求項３のＸ因子類似体。
【請求項５】
その修飾がβ−ペプチドの切取を防止するものであることを特徴とする請求項２から請求項４までのいずれか一つのＸ因子類似体。
【請求項６】
Ｘ因子のβ−ペプチドの欠失を有することを特徴とする請求項２のＸ因子類似体。
【請求項７】
前記Ｘ因子配列のＣ末端領域に翻訳停止シグナルを有することを特徴とする請求項２のＸ因子類似体。
【請求項８】
前記Ｘ因子配列のアミノ酸Ｇｌｙ４７０をコードするコドンＧＧＣが翻訳停止シグナルで置換されていることを特徴とする請求項７のＸ因子類似体。
【請求項９】
前記修飾がＸ因子類似体からＸａ因子類似体への試験管内活性化を可能にすることを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれか一つのＸ因子類似体。
【請求項１０】
その修飾が、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群；またはＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼによる活性化を可能にすることを特徴とする請求項９のＸ因子類似体。
【請求項１１】
その修飾がＸ因子類似体からＸａ因子類似体への生体内活性化を可能にすることを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれか一つのＸ因子類似体。
【請求項１２】
その修飾がＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、ＩＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼによる活性化を可能にすることを特徴とする請求項１１のＸ因子類似体。
【請求項１３】
無変化のβ−ペプチドを有するＸ因子類似体またはアミノ酸４７０からアミノ酸４８８が欠失した短縮されたＣ末端を有するＸ因子類似体として提供されることを特徴とする請求項１から請求項１２までのいずれか一つのＸ因子類似体。
【請求項１４】
単鎖型の分子として提供されることを特徴とする請求項１から請求項１３までのいずれか一つのＸ因子類似体。
【請求項１５】
コードされたプロテインの組換え発現のためのベクターに含まれている請求項１から請求項１４までのいずれか一つのＸ因子類似体をコードする組換えＤＮＡ。
【請求項１６】
天然型Ｘａ因子活性化部位の領域に修飾を有する精製Ｘ因子類似体またはその前駆体蛋白質を含有する調製物であって、該修飾は、配列番号２７で示されるＸ因子酸配列におけるＧｌｙ２２８−Ｒ６−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３−Ｒ２−Ａｒｇ２３４−Ｒ１
（ここに、
ａ）Ｒ１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａから選択されたアミノ酸であり；
ｂ）Ｒ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択されたアミノ酸であり；
ｃ）Ｒ３はＰｈｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＰｒｏから選択されたアミノ酸であり；
ｄ）Ｒ４はＡｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｒｇまたはＬｙｓから選択されたアミノ酸であり；
ｅ）Ｒ５はＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇから選択されたアミノ酸であり；および
ｆ）Ｒ６はＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒから選択されたアミノ酸である）
で示される配列によって表される、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群；またはＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼのプロセッシング部位を表すもの。
【請求項１７】
Ｘ因子類似体がＦＸａα類似体として提供されることを特徴とする請求項１６の調製物。
【請求項１８】
そのＸ因子類似体がアミノ酸４７０からアミノ酸４８８が欠失した短縮されたＣ末端を有するＸ因子類似体として提供されるものであることを特徴とする請求項１６または１７の調製物。
【請求項１９】
単離された単鎖型分子としてＸ因子類似体を含有することを特徴とする請求項１６から請求項１８までのいずれか一つの調製物。
【請求項２０】
少なくとも８０％の純度を有し、また非特異的プロセッシングによって形成されるＸ因子／Ｘａ因子類似体の中間体を含有せず、細胞内プロテアーゼによりＸａ因子に活性化されない単鎖型分子のＸ因子類似体を含有することを特徴とする請求項１６から請求項１９までのいずれか一つの調製物。
【請求項２１】
少なくとも９０％の純度を有する前記Ｘ因子類似体を含有することを特徴とする請求項２０の調製物。
【請求項２２】
少なくとも９５％の純度を有する前記Ｘ因子類似体を含有することを特徴とする請求項２０の調製物。
【請求項２３】
単離された二重鎖型分子としてＸ因子類似体を含有することを特徴とする請求項１６から請求項２２までのいずれか一つの調製物。
【請求項２４】
Ｘ因子類似体からＸａ因子類似体への試験管内活性化を可能とする修飾を有するＸ因子類似体を含有することを特徴とする請求項１６から請求項２３までのいずれか一つの調製物。
【請求項２５】
ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群；またはＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子、ＩＩａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼと組合せて適当な用具中で提供されることを特徴とする請求項１６から請求項２４までのいずれか一つの調製物。
【請求項２６】
投与用の用具中で提供されることを特徴とする請求項２５の調製物。
【請求項２７】
各成分が別々に分けて提供されることを特徴とする請求項２５または２６の調製物。
【請求項２８】
Ｘ因子類似体からＸａ因子類似体への生体内活性化を可能にする修飾を有するＸ因子類似体を含有することを特徴とする請求項１６から請求項２３までのいずれか一つの調製物。
【請求項２９】
Ｘａ因子類似体を含有する調製物であって、請求項１から請求項１４までのいずれか一つのＸ因子類似体の活性化によって得られ、非特異的プロセッシングによって形成されるＸ因子／Ｘａ因子類似体の中間体およびＸａβ因子およびＸａγ因子を含有しないもの。
【請求項３０】
生理学的に許容される担体を含有し、安定に貯蔵可能な型で提供されることを特徴とする請求項１６から請求項２９までのいずれか一つの調製物。
【請求項３１】
次の各工程を包含することを特徴とする精製された組換えＸ因子類似体を含有する調製物の製造法：
−  請求項１５の組換えＤＮＡを提供する。
−  適当な細胞を形質転換する。
−  Ｘ因子類似体を発現する。
−  そのＸ因子類似体を分離する。および
−  クロマトグラフィー法によってそのＸ因子類似体を精製する。
【請求項３２】
Ｘ因子類似体を発現させた後に、そのＸ因子類似体をプロテアーゼとインキュベーションする工程を含む請求項３１の製造法。
【請求項３３】
そのＸ因子類似体を二重鎖分子として分離することを特徴とする請求項３１または３２の製造法。
【請求項３４】
Ｘ因子類似体がＸａ因子類似体へと切断される条件下に、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群；またはＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなるセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼと該Ｘ因子類似体を接触させることを特徴とする請求項３２または３３に記載の製造法。
【請求項３５】
その細胞が単鎖型からＸ因子類似体の軽鎖および重鎖まで切断できるプロテアーゼを発現しない細胞であることを特徴とする請求項３４の製造法。
【請求項３６】
前記細胞がプロテアーゼを欠損するものである請求項３５の製造法。
【請求項３７】
その細胞が、ケキシン、フリンまたはＰＡＣＥから選択されるエンドプロテアーゼを発現しないことを特徴とする請求項３５または３６の製造法。
【請求項３８】
そのＸ因子類似体を単鎖型分子として分離することを特徴とする請求項３１の製造法。
【請求項３９】
単鎖型のＸ因子類似体と、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４およびＬＰＣ／ＰＣ７からなるエンドプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼとを、単鎖型のＸ因子類似体が切断されて二重鎖Ｘ因子型になる条件下に、接触させることを特徴とする請求項３８の製造法。
【請求項４０】
単鎖型のＸ因子類似体が単離されている請求項３９の製造法。
【請求項４１】
単鎖型のＸ因子類似体を直接的にＸａ因子類似体にまで活性化することを特徴とする請求項３９または４０の製造法。
【請求項４２】
前記単鎖型のＸ因子類似体がプロテアーゼと接触させることにより活性化される、請求項４１の製造法。
【請求項４３】
二重鎖型のＸ因子類似体を第一のプロテアーゼとは異なる別のプロテアーゼと接触させて、Ｘａ因子類似体にまで活性化することを特徴とする請求項３９または４０の製造法。
【請求項４４】
そのプロテアーゼが固定化されていることを特徴とする請求項３１から請求項４３までのいずれか一つの製造法。
【請求項４５】
請求項３１から請求項４０までのいずれか一つの製造法に従って製造したＸ因子類似体を活性化工程に付すことを特徴とする、Ｘａ因子類似体を含有する調製物の製造法。
【請求項４６】
精製されたＸａ因子類似体であって、非特異的プロセッシングによって形成されるＸ因子／Ｘａ因子類似体の中間体を含まないものを得ることを特徴とする請求項４５の製造法。
【発明の詳細な説明】
本発明は活性化ペプチドの一定領域に修飾を有するＸ因子類似体、本発明のＸ因子類似体を含有する製品および単鎖型および二鎖型であるＸ因子類似体の製法に関する。
血液凝固過程が開始されると、血液中で血液凝固経路は種々のプロエンザイム（チモーゲン）の活性型、すなわちセリンプロテアーゼ群への順序立った活性化を経て進行する。この中には、就中、ＸＩＩ因子／ＸＩＩａ因子、ＸＩ因子／ＸＩａ因子、ＩＸ因子／ＩＸａ因子、Ｘ因子／Ｘａ因子、ＶＩＩ因子／ＶＩＩａ因子、およびプロトロンビン／トロンビンがある。生理学的条件下では、これらの酵素の殆どは複合体として膜表面と会合する時にのみ活性になる。Ｃａイオンはこれらの過程の多くに関与している。血液凝固は蛋白質成分全てが血液中に存在する内因性経路によるか、または細胞膜の組織因子が重要な役割を演じる外因性経路によることとなる。最後に、外傷はフィブリノーゲンをフィブリンに切断するトロンビンによって閉鎖されることになる。
プロトロンビナーゼ複合体はプロトロンビンをトロンビンに活性化する原因である。トロンビンは凝固促進剤として、ならびに抗凝固剤として作用できる重要な酵素である。プロトロンビナーゼ複合体、就中、Ｖａ因子（コファクターとして）およびＸａ因子（セリンプロテアーゼとして）が関与するものは、ホスホリピド表面でのＣａ依存性会合に関与する。Ｘａ因子はプロトロンビナーゼ複合体の触媒的成分であると議論されている。
Ｘ因子（Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｒｏｗｅｒ因子）はビタミンＫ依存性凝固糖蛋白質の１種であって、これによって内因性および外因性の血液凝固経路が活性化されることができる。Ｘ因子の一次翻訳生成物（プレプロＦＸ）は４８８個のアミノ酸を持ち、最初に肝臓またはヒトのヘパトーマ細胞によって７５ｋＤの単鎖型前駆体蛋白質として合成される。血中では、Ｘ因子は殆どが二鎖型の分子として存在する（Ｆａｉｒ、ほか著、１９８４年、Ｂｌｏｏｄ誌、６４巻：１９４〜２０４頁）。
生合成の過程で、シグナルペプチダーゼによるプレ配列の切断（Ｓｅｒ２３／Ｌｅｕ２４の間）、およびプロペプチドの切断（Ａｒｇ４０／Ａｌａ４１の間）の後、単鎖型Ｘ因子の分子をプロセッシングおよびトリペプチドＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２の除去、によって切断すると、約２２ｋＤの軽鎖と約５０ｋＤの重鎖とから構成され、ジスルフィド橋を経て結合する二鎖型となる（図１）。それ故、Ｘ因子は血中では二鎖型の分子として循環している。
血液凝固過程では、Ｘ因子は特定のプロテイン分解によって不活性チモーゲンから活性型プロテアーゼＸａ因子へと変換される。ここではＸ因子は膜会合性の複合体２種：外因性のＶＩＩａ因子−組織因子複合体または内因性のＶＩＩＩａ因子−ＩＸａ因子−ホスホリピド−Ｃａ−複合体、または「テナーゼ複合体」のいずれかにおいてＸａ因子にまで活性化されることができる（Ｍｅｒｔｅｎｓ、ほか著、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８５巻：６４７〜６５８頁）。アミノ酸Ａｒｇ２３４／Ｉｌｅ２３５の間でのプロテイン分解的切断は重鎖のＮ−末端からアミノ酸５２個の長さの活性化ペプチドを放出し、こうして活性酵素Ｘａ因子を形成する。Ｘａ因子の触媒中心は重鎖に存在する。
ＶＩＩａ因子−ＴＦ（外因性）複合体による活性化はＸａα因子（３５ｋＤ）およびＸａβ因子（３１ｋＤ）の形成をもたらすが、複合体中のＶＩＩａ因子の濃度が低いと４２（ｋＤ）ポリペプチドも形成する。Ｘａα因子は重鎖のＡｒｇ２３４／Ｉｌｅ２３５での切断によって形成され、Ｘ因子からＸａ因子への活性化が現れる。Ｘａβ因子の存在は、おそらくＸａα因子の重鎖Ｃ末端にあるＡｒｇ４６９／Ｇｌｙ４７０での自己触媒的切断および４．５ｋＤペプチドの除去、の結果である。Ｘａα因子と同様に、Ｘａβ因子は触媒活性を示す。しかしながら、プラスミノーゲン結合部位がＸａα因子からＸａβ因子への切断によって形成されることおよびＸａβ因子がフィブリン分解活性を有するかまたはフィブリン分解に補助因子として関与することが証明されている。しかしながら、Ｘａα因子からＸａβ因子への変換はトロンビンの形成よりも遅いので、凝血が形成される以前のフィブリン分解の開始が防止される（Ｐｒｙｚｄｉａｌ、ほか著、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻：１６６１４〜１６６２０頁；Ｐｒｙｚｄｉａｌ、ほか著、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻：１６６２１〜１６６２６頁）。
４２ｋＤのポリペプチドはＡｒｇ２３４／Ｉｌｅ２３５間での予備的プロセッシングなしに行われる重鎖Ｃ末端のＡｒｇ４６９／Ｇｌｙ４７０間でのプロセッシングに由来する。Ｌｙｓ３７０での蛋白質分解で形成されるＸａγ因子断片と同様に、この中間体は触媒活性を示さない（Ｍｅｒｔｅｎｓ、ほか著、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８５巻：６４７〜６５８頁；Ｐｒｙｚｄｉａｌ、ほか著、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻：１６６１４〜１６６２０頁）。
内因性のＸ因子活性化はＩＸａ因子−ＶＩＩＩａ因子複合体によって触媒される。これら同じプロセッシング生成物は活性化の間に得られるが、Ｘａβ因子生成物は他のＸ因子プロセッシング生成物と比べて多量に得られる（Ｊｅｓｔｙ、ほか著、１９７４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９巻：５６１４頁）。
試験管内ではＸ因子は、例えば、ラッセルのクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ）またはトリプシンによって（Ｂａｊａｊ、ほか著、１９７３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８巻：７７２９〜７７４１頁）、またはたとえばＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体またはＩＸａ因子−ＶＩＩＩａ因子複合体（Ｍｅｒｔｅｎｓ、ほか著、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８５巻：６４７〜６５８頁）のような精製された生理学的活性化剤によって、活性化できる。
商業的に購入できるＸ因子製品は血漿から製造され、その殆どがＸａα因子とＸａβ因子との混合物を含有する。なぜなら、Ｘ因子をＸａ因子まで活性化すると主としてＸａα因子が形成され、これが次に自己触媒工程によってＸａβ因子にまで切断されるからである。構造的に高度な完全さを有する単一なＸａ因子生成物を製造するためには、欧州特許第０６５１０５４号はＸ因子を長時間にわたってＲＶＶで活性化して、得られる最終生成物が実質的にＸａβ因子を含むようにすること、を示唆する。続いて、例えばＸａα因子ならびにプロテアーゼなどの副生成物を数工程のクロマトグラフィーで除去する。
Ｘ因子のｃＤＮＡは分離され、特性解析されている（Ｌｅｙｔｕｓ、ほか著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：３６９９〜３７０２頁；Ｆｕｎｇ、ほか著、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：３５９１〜３５９５頁）。ヒトのＸ因子は、たとえばヒトの胚腎臓細胞またはＣＨＯ細胞のように種々の細胞型において試験管内で発現される（Ｒｕｄｏｌｐｈ、ほか著、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、１０巻：３７３〜３７８頁；Ｗｏｌｆ、ほか著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６頁：１３７２６〜１３７３０頁）。しかしながら、生体内での状況とは対照的にヒトＸ因子の組換え発現ではＡｒｇ４０／Ａｌａ４１位でのプロセッシングは効果がないことおよびＸ因子の軽鎖に様々なＮ末端ができることが見出されている（Ｗｏｌｆ、ほか著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６頁：１３７２６〜１３７３０頁）。試験管内では組換えＸ因子（ｒＦＸ）はＲＶＶによってｒＸａ因子（ｒＦＸａ）まで活性化され、またアミノ酸１８３からアミノ酸２３４までが除去され、トリペプチドと置換された活性化ペプチドで、二重鎖ｒＦＸａ型への直接プロセッシング可能になってｒＦＸａは直接に発現される。精製ｒＦＸの約７０％がプロセッシングされて軽鎖と重鎖になるが、一方では残りの３０％は７５ｋＤの単鎖型ｒＦＸを表す。ｒＦＸａの直接的発現は活性なＸａ因子の形成を起こが、不活性中間体も形成する。Ｗｏｌｆ、ほかは（１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６頁：１３７２６〜１３７３０頁）活性がさらに低下した組換えＸ因子を検出し、これを彼等はＲＶＶによって活性化されるべきｒＦＸの活性が弱いこと、および不活性な蛋白質および単鎖型の前駆体分子のポリペプチド数量とを原因とした。殊に、彼等は組換え細胞で発現した時のｒＦＸａの高度な不安定性を見出し、彼等はこれを自己蛋白質分解が高速な原因であるとした。
Ｘａα因子のＣ末端ペプチドの機能を研究するために、Ｅｂｙ、ほか（１９９２年、Ｂｌｏｏｄ、８０巻（補１）：１２１４Ａ頁）はＸ因子配列のＧｌｙ４３０に停止コドンを導入した。しかしながら、β−ペプチドによるＸａ因子（ＦＸａα）の活性化とβ−ペプチドを持たない欠損突然変異体の活性化速度との間に相違を見出せなかった。
Ｘａ因子はプロトロンビナーゼ複合体の重要な成分であって、それ故、たとえば血友病のような血液凝固疾患に罹患した患者を処置するために使用できよう。
特に、ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子が欠乏している血友病患者を血漿から製造した因子濃縮物で処置すると長期にわたる療法の間にこれらの因子に対する阻止抗体を形成するようになって悪化することが多い。それ故、血友病を処置するためにバイパス活性を有する因子を有する代替品が多数開発されてきた。プロトロンビン複合体濃縮物、部分的に活性化されたプロトロンビナーゼ複合体（ＡＰＰＣ）、ＶＩＩａ因子またはＦＥＩＢＡの使用が示唆されている。ＶＩＩＩ因子のバイパス活性を有する商業製品（ＦＥＩＢＡ）は、例えばＦＥＩＢＡ（商標）またはＡｕｔｏｐｌｅｘ（商標）である。ＦＥＩＢＡ（商標）は匹敵する単位のＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子およびＦＥＩＢＡ、少量のＶＩＩＩ因子およびＶ因子、および痕跡量の活性化凝固因子、たとえばトロンビンおよびＸａ因子またはＸ因子様活性を有する因子のような因子を含有する（Ｅｌｓｉｎｇｅｒ著、１９８２年、「活性化プロトロンビン複合体濃縮物（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ・Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ・Ｃｏｍｐｌｅｘ・Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）」、Ｍａｒｉａｎｉ、Ｒｕｓｓｏ、Ｍａｎｄｅｌｌｉ編、７７〜８７頁）。Ｅｌｓｉｎｇｅｒは特にＦＥＩＢＡ（商標）の「Ｘａ因子様」活性の重要性を指摘する。ＶＩＩＩ因子のバイパス活性はＧｉｌｅｓ、ほかが精製Ｘａ因子とホスホリピドとの組合せについて動物モデルで証明した（１９８８年、Ｂｒｉｔｉｓｈ・Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、９巻：４９１〜４９７頁）。
それ故に、Ｘ因子／Ｘａ因子またはＸ因子／Ｘａ因子様蛋白質は単独でまたは凝固複合体の成分として需要が多く、止血療法における利用の様々な分野で使用できる。
試験管内でと同様に生体内ではＸａ因子の半減期はチモーゲンの半減期と比較するとかなり短い。例えば、Ｘ因子はグリセリン中で１８ケ月安定に貯蔵できるが、Ｘａ因子は同一条件下では５ケ月しか安定ではなく（Ｂａｊａｊ、ほか著、１９７３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８巻：７７２９〜７７４１頁）、４℃のグリセリン中では８ケ月後には６０％を超える活性低下が見られる（Ｔｅｎｇ、ほか著、１９８１年、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ・Ｒｅｓ．、２２巻：２１３〜２２０頁）。血清中ではＸａ因子の半減期は僅か３０秒ほどに過ぎない。
Ｘａ因子が不安定なので、Ｘ因子製剤の投与が示唆されている（米国特許第４５０１７３１号）。しかしながら、特に血友病患者のように出血が深刻で、患者が死ぬほどあれば、Ｘ因子の投与は有効ではない。血液凝固の内因性経路での機能的「テナーゼ複合体」欠乏のために、Ｘ因子がＸａ因子にまで十分に活性化されることができず、また、外因性経路を経る活性化は迅速に効果を示すには遅すぎることが多い。さらにその上、血友病患者は十分な量のＸ因子を有するが、そのプロトロンビナーゼ活性はＸａ因子のものよりも１０００倍も弱い。このような場合には活性化されたＸａ因子を、所望ならば、Ｇｉｌｅｓ、ほか（１９８８年、Ｂｒｉｔｉｓｈ・Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、９巻：４９１〜４９７頁）が記載しているようにホスホリピドと組合せて、または、たとえばＶＩＩＩ因子バイパス活性を持つその他の凝固因子などとともに、直接に投与することが必要である。
Ｘ因子からＸａ因子を製造するためには活性化は、今まで主として、たとえばＲＶＶまたはトリプシンのような動物起源の非生理学的活性化剤によって行われてきたので、最終生成物にはこれらプロテアーゼを絶対的に含まないことを確証することが必要であった。前記の通り、Ｘ因子をＸａ因子にまで活性化する時には、全く数多くの中間体、その幾つかは不活性であるが、が形成される（Ｂａｊａｊ、ほか著、１９７３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８巻：７７２９〜７７４１頁；Ｍｅｒｔｅｎｓ、ほか著、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８５巻：６４７〜６５８頁）。そのような中間体の存在は生成物の比活性を低下させ、活性なセリンプロテアーゼ拮抗剤として機能できる中間体を生成するかもしれない。それ故、通常の方法に従って比活性の高い均質で純粋な生成物を製造するには活性化およびクロマトグラフィー精製に複雑な工程が必要である。
そこで、本発明の目的はＸ因子／Ｘａ因子活性を有し、安定性の高度なポリペプチドを含有する製品であって、通常のプロテアーゼ、特に、たとえばＲＶＶまたはトリプシンのような動物起源プロテアーゼ、をいずれも全く使用せずに、活性化されてＸａ因子にまで活性化できるものを提供する点にある。別の目的はＶＩＩＩ因子バイパス活性を有する医薬的製品を提供する点にある。
本発明に従えば、前記目的は天然型Ｘａ因子活性化切断部位の領域に修飾を有するＸ因子類似体を提供することによって達成される。この活性化切断部位の領域における修飾はそのプロテアーゼにとって新規な認識部位であり、かつプロセッシング部位である。その部位はこのポリペプチドのこの位置には天然には存在せず、また、このプロテアーゼは通常、この部位ではこのポリペプチドを切断しないものである。
本発明のＸ因子類似体は特に活性化ペプチドが修飾されており、その活性化ペプチドはＸ因子がＸａ因子にまで活性化される時に除去されるものである。Ｘ因子の活性化ペプチドのアミノ酸配列の中にあるアミノ酸少なくとも１個が修飾される。前記修飾は特に前記活性化ペプチドのＣ末端領域に存在し、少なくとも、Ｘ因子アミノ酸配列のＧｌｙ２２８とＡｒｇ２３４との間の位置でアミノ酸少なくとも１個の置換を表す。このアミノ酸の位置は図１に示すＭｅｔ１に始まり、Ｌｙｓ４８８に終わる配列に従った番号付けに基づく。
本発明のＸ因子類似体におけるこの修飾は、好ましくは種々のプロテアーゼの別の切断部位に対するこの位置に存在するＶＩＩａ因子／ＩＸａ因子プロセッシング部位の交換である。この修飾はアミノ酸少なくとも１個の置換であることができ、またはプロテアーゼ認識部位または切断部位を表すペプチド配列の挿入であることができる。本発明のＸ因子類似体において、この修飾は好ましくはそれが、たとえばケキシン／ＫＥＸ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７（Ｂａｒｒ、ほか著、１９９１年、Ｃｅｌｌ、６６巻：１〜３頁；または米国特許第５４６０９５０号に記載）のような一群のエンドプロテアーゼの群；たとえばＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、ＩＩａ因子、Ｘａ因子のようなセリンプロテアーゼの群；カリクレインの群；またはこれらのプロテアーゼ誘導体の群；からのプロテアーゼに対する検出配列または切断配列を表すものである。
好ましくは、この修飾はこれらのプロテアーゼによるプロセッシングが在来型Ｘａ因子に対応するポリペプチドを招来するように選択される。この在来型Ｘａ因子は実質的に天然型Ｘａ因子配列と等しく、またＸａ因子活性を現すものである。
最適なプロセッシングについては各個の場合についてアミノ酸Ｉｌｅ２３５も置換することが必要になりうる。しかしながら、好ましくは重鎖のＮＨ2末端アミノ酸であるイソロイシンは活性化後も存在しなければならない。このアミノ酸は基質結合ポケットの形成に必須な機能を果たすからである（Ｗａｔｚｋｅ、ほか著、１９９５年、「血栓症および止血の分子的基盤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂａｓｉｓ・ｏｆ・Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ・ａｎｄ・Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ・ＨｉｇｈとＨａｒｏｌｄ・Ｒｏｂｅｒｔｓ編）。本発明のＸ因子類似体は在来型Ｘ因子配列と比べると殊にアミノ酸のレベルでは構造的な相違を有する。しかし、それらは同じ様式で天然型のＸ因子にまで活性化されることができ、また活性化の後にはＸａ因子活性を示す。
本発明は天然型のＸ因子配列に関して活性化ペプチドにおいて修飾を有し、また異なるプロテアーゼ特異性を有するＸ因子類似体の例示多数を提供する。
修飾は図１に示すＭｅｔ１に始まり、Ｌｙｓ４８８に終わる配列番号に従ったＸ因子配列番号によればアミノ酸Ｇｌｙ２２８とアミノ酸Ａｒｇ２３４との間の領域および、所望ならばＩｌｅ２３５における部位１個またはそれ以上に存在できる。アミノ酸置換はＩｌｅ２３５（Ｒ１）、Ａｒｇ２３４、Ｔｈｒ２３３（Ｒ２）、Ｌｅｕ２３２（Ｒ３）、Ａｓｎ２３１（Ｒ４）、Ａｓｎ２３０（Ｒ５）、Ａｓｐ２２９（Ｒ６）の位置に存在できるが、Ａｒｇ２３４は未変化のままにするのが好ましい。
本発明のＸ因子類似体は、好ましくはＧｌｙ２２８−Ｒ６−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３−Ｒ２−Ａｒｇ２３４を有するＸ因子配列を含む。ここに、Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇ；Ｒ３＝Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＰｒｏ；Ｒ４＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇ；Ｒ５＝Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇ；およびＲ６＝Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒである。
本発明のＸ因子類似体の好適な態様は次の修飾を有するＸ因子類似体である：
ａ）Ｒ１＝Ｖａｌ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｐｈｅ、Ｒ４＝Ａｓｐ、Ｒ５＝Ａｓｎおよび所望ならばＲ６＝Ｐｈｅ（図２Ａ）であって、ＸＩａ因子によってプロセッシングされる；
ｂ）Ｒ１＝Ｓｅｒ、Ｒ２＝Ａｒｇ、Ｒ３＝Ｔｈｒ、Ｒ４＝Ｌｅｕ（図２Ｂ）であって、ＩＩａ因子によってプロセッシングされる；
ｃ）Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｐｒｏ、Ｒ３＝Ｌｙｓ、Ｒ４＝Ｉｌｅ、および所望ならばＲ５＝Ｌｙｓおよび／またはＲ６＝Ｔｈｒ（図２Ｃ）であるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｓｅｒ、Ｒ４＝Ｔｈｒ、および所望ならばＲ５＝Ｌｙｓおよび／またはＲ６＝Ｔｈｒ（図２Ｉ）であって、ＸＩＩａ因子によってプロセッシングされる；
ｄ）Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｍｅｔ、Ｒ４＝Ｓｅｒ、および所望ならばＲ５＝Ｓｅｒおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕ（図２Ｄ）であって、カリクレインによってプロセッシングされる；
ｅ）Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｇｌｙ、Ｒ３＝Ｇｌｎ、Ｒ４＝Ｐｒｏ、および所望ならばＲ５＝Ｌｙｓおよび／またはＲ６＝Ｓｅｒ（図２Ｈ）であるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｌｙｓ、およびＲ４＝Ｍｅｔ（図２Ｅ）であるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｇｌｙ、Ｒ３＝Ｇｌｕ、およびＲ４＝Ｉｌｅ（図２Ｆ）であって、Ｘａ因子によってプロセッシングされる；
ｆ）Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｌｙｓ、Ｒ３＝Ａｒｇ、Ｒ４＝Ａｒｇ、および所望ならばＲ５＝Ｇｌｕおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｖａｌ、Ｒ４＝Ａｒｇ、および所望ならばＲ５＝Ａｌａおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ａｒｇ、Ｒ３＝Ｖａｌ、Ｒ４＝Ａｒｇ、および所望ならばＲ５＝Ｇｌｎおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ａｒｇ、Ｒ３＝Ａｒｇ、Ｒ４＝Ａｒｇ、および所望ならばＲ５＝Ｈｉｓおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｌｙｓ、Ｒ３＝Ｐｒｏ、Ｒ４＝Ａｒｇ、および所望ならばＲ５＝Ａｓｎおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｌｙｓ、Ｒ３＝Ａｒｇ、Ｒ４＝Ｉｌｅ、および所望ならばＲ５＝Ａｒｇおよび／またはＲ６＝Ｌｅｕであるか；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｌｙｓ、Ｒ３＝Ｓｅｒ、およびＲ４＝Ａｒｇ；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｔｈｒ、Ｒ３＝Ｖａｌ、およびＲ４＝Ａｒｇ；または
Ｒ１＝Ｉｌｅ、Ｒ２＝Ｌｙｓ、Ｒ３＝Ｌｅｕ、およびＲ４＝Ａｒｇ（すべて図２Ｇ）。
ここに、ｆ）の項に示したものについては例えばフリン、ＰＡＣＥ、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７、またはこれらのプロテアーゼの１種の誘導体のような二塩基性エンドプロテアーゼによってプロセッシングされる。
図２Ａ〜図２Ｉは可能性のある修飾の選択および種々のプロテアーゼ特異性を招来するアミノ酸置換を示す。
前記修飾は、例えば直接的な試験管内突然変異誘発、ＰＣＲまたはその他の当技術分野で現在知られている遺伝子操作法を目指し、指定するアミノ酸置換のためにＤＮＡ配列を特異的に変化させるのに適する方法などによって実施できる。
本発明によれば、本発明のＸ因子類似体は活性化されて、好ましくはたとえばケキシン／ＫＥＸ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のような一群のエンドプロテアーゼから選択されたプロテアーゼ；たとえばＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子、ＩＩａ因子またはカリクレインのような一群のセリンプロテアーゼから選択されたプロテアーゼ；またはこれらのプロテアーゼの誘導体によって在来型のＸａ因子またはＸａ因子類似体になる。
活性のあるＸａ因子を製造するに当たって遭遇する困難の一つはその不安定性にある。というのはＸａα因子およびＸａβ因子の他にも、不活性な中間体が自己触媒反応によって形成されるからである。活性のある実質的に無傷なＸ因子／Ｘａ因子およびＸ因子／Ｘａ因子様分子各々の製造のためには安定な最終生成物を招来する蛋白質のみが得られることが望ましい筈である。
Ｘａα因子（ＦＸａα）からＸａβ因子（ＦＸａβ）へのプロセッシングに好適な切断部位は、Ａｒｇ４６９／Ｇｌｙ４７０の間にあることがよく知られている。Ｅｂｙ、ほか（１９９２年、Ｂｌｏｏｄ、８０巻、補１：１２１４頁）の研究によれば、Ｘ因子の明確なカルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基４７６〜４８７）の隣に、別の短いペプチド（アミノ酸残基４７４〜４７７）があり、これはＸａα因子の自己触媒反応によって形成される。無傷なＸ因子から不活性なプロセッシング中間体を副生することなく本質的に活性なＸａ因子へと指向するプロセッシングに集中させるために本発明のＸ因子類似体は、所望ならば追加的な修飾を有する。
それ故、特定的態様の一つでは、本発明のＸ因子類似体はＸ因子アミノ酸配列のＣ末端領域にもう一つの修飾を有する。
態様の一つによれば、前記Ｘ因子類似体は無傷なβ−ペプチド（ＦＸα）を有する。本発明のこのＸ因子類似体は、殊にＣ末端β−ペプチド切断部位の領域に修飾を有し、これがＸ因子からＸａ因子への活性化後におけるＸ因子からのβ−ペプチドの切り取りを防止する。そこで、Ｘａ因子の分子が得られるが、これは無傷のＸａα因子分子として１００％までが分離可能である。
この修飾はＸ因子アミノ酸配列のアミノ酸Ａｒｇ４６９とＳｅｒ４７６との間の位置、および所望によりアミノ酸Ｌｙｓ３７０の領域における突然変異、欠失または挿入であることができる。しかしながら、アミノ酸置換の結果としてこれが蛋白質の構造および、さらに可能性として機能および活性に影響を与えることになるポリペプチドの不正な折畳みを防止するアミノ酸置換が好適である。
態様の一つによれば、本発明のＸ因子類似体はＡｒｇ４６９および／またはＧｌｙ４７０の位置のアミノ酸１個が置換されており、好ましくはＡｒｇ４６９がＬｙｓ、ＨｉｓまたはＩｌｅに交換され、または好ましくはＧｌｙ４７０はＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒに交換されている。
Ａｒｇ４６９および／またはＧｌｙ４７０の位置の突然変異の他に、本発明のＸ因子類似体はその他の突然変異をＬｙｓ３７０および／またはＬｙｓ４７５、および／またはＳｅｒ４７６の位置に有することができる。
これらの位置の１個所におけるアミノ酸置換は各々Ｘａα因子からＸａβ因子またはＸａγ因子へのプロセッシングを防止する。なぜならカルボキシ末端ペプチドの偶発的な自己触媒的切断反応が不可能になるように天然型のプロセッシング配列が修飾されるからである。
別の態様の一つによれば、本発明のＸ因子類似体はカルボキシ末端β−ペプチド（ＦＸβ）が除去されている。このようなＸ因子類似体はＸ因子類似体をコードするｃＤＮＡを組換え発現系内で発現して、アミノ酸Ｍｅｔ１からＡｒｇ４６９までをコードする配列のみをクローニングすれば製造できる。
別の態様の一つによれば、本発明のＸ因子類似体は翻訳停止シグナルをＸ因子配列のＣ末端領域に有する。好ましくはこの翻訳停止シグナルは天然型プロセッシング後に形成されるＣ末端アミノ酸の後の位置に存在する。それ故、好ましくは翻訳停止シグナルはＸ因子配列のアミノ酸４７０の位置に存在し、Ｘａβ因子の末端Ａｒｇ４６９が留保される。この目的のためには、アミノ酸Ｇｌｙ４７０をコードするコドンＧＧＣをＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡに置換する。
本発明の別の側面は試験管内で適当なプロテアーゼで処理して活性化すると、在来型Ｘ因子またはＸａ因子類似体を与えるＸ因子類似体に関する。実用され、活性化されるＸ因子類似体に依存して、在来型のＸａ因子に対応し、これと本質的に同一なポリペプチド、またはＸａ因子活性を有し、また在来型Ｘａ因子配列に関連するがその生物学的活性が限定されない修飾を有するポリペプチドが得られる。活性化ペプチド配列の中で活性化ペプチドの領域が修飾されたＸ因子類似体が活性化される時には、在来型のＸａ因子の分子に対応するポリペプチドのみが得られる。そのようなＸ因子類似体が追加的に翻訳停止シグナルをβ−ペプチドのＣ末端領域に有するならば、Ｘａβ因子同族体の分子が得られる。しかしながら、切断されないβ−ペプチドをもたらす修飾をβ−ペプチド配列内に有するＸ因子類似体が採用されるならば、分子のＣ末端にアミノ酸交換を有するＸａα因子類似体が得られる。
本発明のＸ因子類似体は活性化さるべき性能についての特異性は変化させるが活性には影響を与えない修飾のみを有する。それ故に、いずれの場合も生物学的におよび機能的に活性なＸａ因子の分子またはＸａ因子類似体がおのおの得られる。
試験管内での活性化は、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のようなエンドプロテアーゼの群；たとえばＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子、またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群；またはこれらのプロテアーゼの誘導体から選択されたプロテアーゼによって実現できる。ＲＶＶ、トリプシン、ＩＸａ因子またはＶＩＩａ因子を除いて、本発明のＸ因子類似体をＸａ因子にまでプロセッシングするのに適切である限り、いかなるプロテアーゼを使用することも本発明の範囲内である。
本発明の別の態様によれば、このＸ因子類似体はＸ因子類似体からＸａ因子、好ましくは在来型のＸａ因子、への生体内での活性化を可能にする修飾を含む。これに関連して、「在来型」のＸａ因子は本発明のＸ因子類似体から誘導された活性化されたＸａ因子が在来型のＸａ因子に対応し、同族体であるアミノ酸配列を有し、Ｘａ因子としての活性を有することを意味する。この修飾はＸ因子が生体内、すなわち体内に存在するプロテアーゼ、好ましくは血液凝固経路内に存在するプロテアーゼによってプロセッシングされてＸａ因子となるように選択される。このプロテアーゼは、たとえばＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子、ＩＩａ因子またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼであることができる。活性化ペプチドにおける修飾以外にＸ因子分子のＣ末端領域における修飾を有するＸ因子類似体は生体内でも前記の通りに対応するＸａ因子類似体にまで活性化される。
例えばＷｏｌｆ、ほか（１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１３７２６〜１３７３０９頁）は、たとえばＫｅｘ２、フリンまたはＰＡＣＥのようなエンドペプチダーゼがこの研究室が報告したＸａ因子欠損突然変異体のプロセッシングに関与すると推測したが、彼等はＸ因子のプロセッシングに与えるこれらのプロテアーゼの影響に関しては示唆を与えなかった。同様にして、米国特許第５６６０９５０号にはＰＡＣＥの組換え生産およびこのプロテアーゼを使用してビタミンＫ依存性蛋白質のプロセッシングを改善することが記載されている。血液因子の長大なリストの中にはＸ因子が指摘されてはいるが、この陳述を証明するデータは提供されていない。
本発明はＸ因子の成熟過程に必要なプロテアーゼが二塩基性エンドプロテアーゼ、特に内因性フリン、であることを初めて明確に証明する。生体内では、このエンドプロテアーゼは主として単鎖型のＸ因子の分子から重鎖と軽鎖とから構成される成熟型への切断を媒介する。試験管内では、それはＸ因子プロペプチド配列の切断も媒介する（実施例２）。
天然には細胞内に存在しないプロテアーゼについてのプロテアーゼ切断部位を有する本発明のＸ因子類似体は在来型のＸ因子においても切断される部位でのみ選択的なプロセッシング反応によって切断される。そこで、２２ｋＤの軽鎖と約５０ｋＤ重鎖とから構成され、非特異的プロセッシングによって形成されるような不活性なＸ因子分子を持たない組換えＸ因子分子が得られる。在来型のＸ因子分子と同様にして、これらの修飾されたＸ因子分子は細胞内プロテアーゼによってＸａ因子に活性化されることはない。これは適当なプロテアーゼ（すなわち、好ましくはセリンプロテアーゼまたはスブチリシン−関連プロテアーゼ）によってのみＸａ因子に活性化される。
そこで、態様の一つによって二鎖型のＸ因子類似体が提供される。
特定の態様によれば、好ましくは単鎖型分子として精製された型で存在するＸ因子類似体が提供される。二塩基性プロテアーゼ欠損細胞中でＸ因子類似体を発現することによって、プロＸ因子が単鎖型の分子として得られる。この単鎖型のＸ因子分子は高度な安定性および分子の完全さによって特徴付けられる。今までは単鎖型のＸ因子分子は二鎖型にまで急速にプロセッシングされるので精製された型では分離できなかった（Ｆａｉｒ、ほか著、１９８４年、Ｂｌｏｏｄ、６４年：１９４〜２０４頁）。単鎖型の組換えＸ因子類似体は特定的プロセッシングによって二鎖型のＸ因子にまでプロセッシングでき、これが続いて各々Ｘａ因子またはＸａ因子類似体にまで活性化される。これは、プロテアーゼ欠損細胞から分離した単鎖型組換えＸ因子の分子と、たとえばフリン／ＰＡＣＥまたはＫｅｘ２のような、二塩基性プロテアーゼとが接触して、二鎖型のＸ因子類似体にまでプロセッシングすることによって達成できる。
二鎖型のＸ因子類似体は各々Ｘａ因子またはＸａ因子類似体にまで活性化できる。これは、たとえば活性化ペプチドの領域における修飾によってフリン特異的切断部位を有するＸ因子類似体をフリン欠損細胞から単鎖型分子として分離し、続いてそれをプロセッシングして活性化されたＸａ因子の分子を得て、これとこのエンドプロテアーゼとを接触させることによって実行できる。
同様にして活性化ペプチドの中にセリンプロテアーゼまたはカリクレインの群から選択したプロテアーゼによる別種のプロセッシングを可能にする修飾を有する分離された単鎖型のＸ因子類似体は、たとえばフリンのような二塩基性エンドプロテアーゼで処理することによってのみ切断されて二鎖型のＸ分子を得るが、この二鎖型のＸ因子の分子とセリンプロテアーゼとを経路のその後の経過において接触させて、Ｘａ因子またはＸａ因子類似体にまで各々活性化を起こすようにすることができる。
二鎖型の分子として細胞培養物から分離したＸ因子類似体は、活性化のために特異的なプロテアーゼで処理できる。
選択的かつ指向性のプロセッシング反応によって、このようにして得られるＸ因子またはＸａ因子類似体は高い安定性および構造的完全さを有し、さらに殊に不活性なＸ因子／Ｘａ因子類似体中間体および自己蛋白質分解性分解産物を含まない。
本発明の別の側面は、本発明のＸ因子類似体をコードする組換えＤＮＡに関する。この組換えＤＮＡは発現の後にプロセッシング特異性およびプロセッシング産物に影響を与える修飾を除いてヒトのＸ因子に対応するアミノ酸配列を有するＸ因子類似体を与えるが、その生物学的凝血活性は基本的に変化していない。
さらに別の側面によれば、前記の組換えＤＮＡを含有する形質転換細胞も提供される。
本発明のさらに別の側面は天然型Ｘａ因子活性化部位内の領域に修飾を有する精製されたＸ因子類似体またはその前駆体蛋白質を含有する製品に関する。この活性化切断部位の領域における修飾はポリペプチドのこの位置には天然には存在せず、通常はこのポリペプチドをこの位置ではプロセッシングしないプロテアーゼの新規な認識および切断の部位である。この製品は単鎖または二重鎖のＸ因子類似体の精製品であることができる；このポリペプチドは細胞培養上清液または細胞培養抽出物のいずれかの細胞培養系から分離した後に取得できる。細胞培養系から予備精製した組換えＸ因子類似体は先行技術から知られている方法によってさらに精製できる。たとえばゲル濾過、イオン交換または親和性のクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法は特にこの目的に適する。
態様の一つによれば、本発明の製品は分離された型の単鎖型の分子としてＸ因子類似体を含有する。このような製品は、好ましくはエンドプロテアーゼであって単鎖分子を重鎖および軽鎖へとプロセッシングするものが欠損した細胞の細胞培養物である細胞系から単鎖型の分子として、組換え製法で得られるＸ因子類似体を、分離することによって製造される。
特別な側面によれば、この製品は、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のような二塩基性エンドプロテアーゼからからなる群から選択されたプロテアーゼの一種によるＸａ因子への試験管内活性化を可能にする修飾を有する単鎖型のＸ因子類似体を含有する。この活性化はＸ因子類似体と前記プロテアーゼとを接触させることによって実行され、それによって天然型のプロセッシングである成熟型Ｘ因子型への切断が行われ、また修飾の結果として、活性化ペプチドが切出されてＸａ因子またはＸａ因子類似体が形成される。
本発明の製品では単鎖分子としてのＸ因子類似体はＸα因子（ＦＸα）またはβ−ペプチドが欠損したものとしても存在できる。この製品は殊に酵素的に不活性な型のＸ因子類似体を含有し、純度は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、殊に好ましくは少なくとも９５％であって、Ｘ因子／Ｘａ因子類似体のいかなる不活性な、蛋白質分解された中間体も含有しない。
別の態様によれば、本発明の製品はＸ因子類似体を、好ましくは二重鎖分子として、分離された型で含有する。この目的のためには、例えば細胞系から単鎖分子として組換え製法によって得られたＸ因子類似体を、試験管内、即ち細胞外でプロテアーゼ、好ましくは二塩基性プロテアーゼによって二重鎖型に切断する。これはＸ因子類似体を発現するクローンの培養上清液を前記プロテアーゼと直接混合することによって、または精製プロテアーゼまたは前記プロテアーゼを組換え型で発現する細胞培養物の細胞培養上清液のいずれかと混合することにより、またはＸ因子類似体とプロテアーゼ発現クローンとを共培養することによって、実行できる。
同様にして、Ｘ因子類似体を含有する細胞培養上清液または精製Ｘ因子類似体を固定化プロテアーゼと接触させて、そこで二重鎖型へのプロセッシングを起こさせることもできる。この工法では、好ましくはプロテアーゼをマトリックスに結合し、Ｘ因子類似体を含有する細胞培養上清液または精製品をこのマトリックス上を通過させる。しかしながら、Ｘ因子類似体を固定化し、プロテアーゼを移動相に入れることも可能である。同様に、反応物（Ｘ因子類似体およびプロテアーゼ）を混合して一定時間インキュベーションすることも可能である。続いて、たとえば親和性クロマトグラフィーによるなどの方法で、プロテアーゼを混合物から除去する。
Ｘ因子類似体の二重鎖型は一定の細胞中で直接にプロテアーゼとＸ因子類似体とを共発現し、また、所望ならばそれを精製することによっても製造できる。
本発明の特殊な態様によれば、本製品は試験管内でＸａ因子またはＸａ因子類似体への活性化を可能にする修飾を有する単鎖または二重鎖のＸ因子類似体を含有する。Ｘ因子類似体のＸａ因子またはＸａ因子類似体への活性化には各々、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のような二塩基性エンドプロテアーゼの群；たとえばＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、ＩＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群；またはこれらのプロテアーゼの誘導体から選択されたプロテアーゼと接触させることによって実行できる。このプロテアーゼは担体上に固定化することもできる。
本発明の製品はＸａ因子を製造するための出発材料に役立てることができる。大量生産には単鎖または二重鎖のＸ因子類似体を含む製品と、例えば所望ならば固定化されたプロテアーゼとを、Ｘ因子類似体からＸａ因子類似体への活性化を至適に可能化する条件下に接触させて、Ｘａ因子またはＸａ因子類似体を製造する。続いて、こうして得られるＸａ因子／Ｘａ因子類似体を一般に知られた方法によって医薬的組成物に製剤化する。
特殊な態様によれば、精製された単鎖または二重鎖のＸ因子類似体を含有する製品は生理学的に許容される担体を含有し、所望ならば医薬的製品として製剤化される。この製剤化はそれ自体が普通の方法に従って実行でき、またそれを、たとえばＮａＣｌ、ＣａＣｌ2のような塩、たとえばグリシンおよび／またはリジンのようなアミノ酸などを含有する緩衝液とｐＨ範囲６から８で混合し、医薬的製品として製剤化することもできる。Ｘ因子類似体を含有する精製製品は調製済溶液の型、凍結乾燥物の型または冷凍物の型で最終的な使用まで貯蔵可能な生産物として提供できる。好ましくはこの製品は凍結乾燥物の型で保存して、適当な再構成用溶液に溶解して視覚的に透明な溶液とする。
本発明の製品は液体製品としてまたは冷凍液の型としても提供できる。
本発明の製品は殊に安定である。すなわち、溶解した型で使用するまで長期間放置できる。本発明の製剤はその活性が数時間から数日間低下しないことが証明されている。
本発明の製品は適切な用具、好ましくは投与用の用具中、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のようなエンドプロテアーゼの群；たとえばＩＩａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群；またはこれらのプロテアーゼの誘導体、から選択されたプロテアーゼと組合せて提供できる。
Ｘ因子類似体からＸａ因子またはＸａ因子類似体へと活性化することができるプロテアーゼと組合せてＸ因子類似体を含有する本発明の製品は、所望ならば小さいカラムの型であってもよい、担体に固定化したプロテアーゼを入れた容器、またはプロテアーゼを装着した注射筒とＸ因子類似体の医薬的製品を入れた容器とから構成される複合製品として提供できる。Ｘ因子類似体を活性化するためにはＸ因子類似体を含む溶液を、例えば固定化プロテアーゼ上を通過させる。製品を貯蔵しておく間はＸ因子類似体を含有する溶液はプロテアーゼとは分離しておくのが好ましい。本発明の製品は他の成分を含むプロテアーゼと同じ容器内に存在させることもできるが、しかしながら使用に際して容易に除去できる不浸透性分離壁によって空間的に分離しておく。各溶液はまた個別の容器に貯蔵して使用直前に接触させることもできる。
特殊な態様では、活性化のために使用するプロテアーゼは、たとえばＸＩＩａ因子またはＸＩａ因子、ＩＩａ因子、Ｘａ因子のように活性化されたＸａ因子類似体から使用前に分離する必要がなく、それと同時に投与できる天然の血液凝固に関与するセリンプロテアーゼである。
Ｘ因子類似体は使用直前に、すなわち患者に投与する直前に、Ｘａ因子にまで活性化できる。この活性化は前記を固定化プロテアーゼと接触させるか、またはそれぞれプロテアーゼを含む溶液とＸ因子類似体を含む溶液とを混合することによって実行できる。そこで、この二成分を相互に異なる溶液中に保存し、適当な点滴装置によってそれらを混合することが可能である。この点滴装置では両成分が通過中に互いに接触して分子をＸａ因子またはＸａ因子類似体にまで活性化できるものである。患者はＸａ因子とさらに活性化を媒介したセリンプロテアーゼとを投与されることになる。内因性Ｘ因子もセリンプロテアーゼの追加的な投与によって活性化されて凝血時間が短縮されることもあるので、用量に関しては特別の注意が必要である。
好適な態様によれば、この医薬的製品は凍結された液体型または凍結乾燥型として、好ましくは投与用具である、適切な用具中で提供される。適切な投与用具はオーストリア特許第３６６９１６号またはオーストリア特許第３８２７８３号に記載されている二室注射筒であることができる。
本発明の一側面によれば、本製品はＸ因子類似体からＸａ因子への生体内での活性化を可能にする修飾を有するＸ因子類似体を含有する。本発明の製品におけるＸ因子類似体は殊に、たとえばＸＩＩａ因子、ＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼの認識部位／切断部位を表す修飾を有し、生体内で前記プロテアーゼの一種によって切断されて、在来型のＸａ因子またはＸａ因子類似体を与える。殊に治療的使用のためには、血液凝固経路内にあるＶＩＩａ因子／組織因子複合体およびテナーゼ複合体とは無関係なプロテアーゼの認識部位／切断部位を持つＸ因子類似体が有利である。それ故、本発明の製品はＩＸ因子およびＶＩＩ因子、ならびにＶＩＩＩ因子が欠乏している患者での出血を制御するために使用できる。ＸＩ因子またはＸＩＩ因子欠乏症に起因する血液凝固疾患の患者には、ＸＩＩａ因子またはＸＩａ因子によって活性化されることができるＸ因子類似体を含有する医薬的製品を投与してはならない。ＸＩ因子欠乏症の症例では、例えばＸＩＩａ因子切断部位を有するＸ因子類似体は使用できるであろう。
本発明のもう一つの側面によれば、本発明の製品は、所望ならば追加的成分としてのチモーゲンまたは活性セリンプロテアーゼの型での血液因子を含有する。好適な追加的成分はＶＩＩＩ因子バイパス活性を有する成分である。これらには殊にＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｖ因子および／または活性セリンプロテアーゼがある。追加的成分はまた、ホスホリピド類、Ｃａイオン、その他であることができる。本発明の特殊な態様によれば、本発明の製品はＶＩＩＩ因子バイパス活性を有する追加的成分少なくとも１種を含有する。
本発明による製品は単一成分製剤としてまたは他の因子との組合せによる多成分製剤としてのＸａ因子活性を有する医薬的製品として提供できる。
医薬的製品にプロセッシングする前に、精製された蛋白質を通常は品質制御に付してから治療的に投与可能な剤型にする。好ましくは欧州特許第０７１４９８７号に記載された方法により、組換え製造では精製した製品を殊に細胞性および発現ベクター由来の核酸の不在について検査する。
原理的にはいかなる生物学的材料にも病原性物質が混入することがあるので、本製品を安全な製品として製造するには、所望ならばウイルスを不活性化または消耗させる処理を行う。
本発明のさらに別の側面によれば、高度な安定性と構造的完全さを有しているＸａ因子類似体を含有する製品が提供される。これは殊に不活性なＸ因子／Ｘａ因子類似体中間体および自己蛋白質分解的分解産物が存在せず、前記定義の型のＸ因子類似体が活性化されて適当な製品が得られるように製造される。
本発明の別の側面の一つは医薬的薬剤の製造において前記の型の製品を使用することに関連する。本発明のＸ因子類似体またはＸａ因子類似体を含有する治療用薬剤は血液凝固疾患、たとえば血友病に罹患している患者およびそれに加えて処置に普通に使用され、殊に、ＶＩＩＩ因子バイパス活性を持つ製剤として使用されるＶＩＩＩ因子および／またはＩＸ因子に対する阻害抗体を産生する可能性のある患者、の処置には殊に有用である。
本発明の別の側面の一つは本発明のＸ因子類似体の配列をコードするものを含む核酸を医薬品製造のために使用することに関する。その核酸が適切な発現制御配列を持つ限り、それは裸の核酸として利用でき、組換え用発現ベクターに組込むか、または燐脂質またはウイルス粒子のいずれかである担体に結合することができる。この核酸は、たとえば血友病、または阻害抗体産生を併発する血友病のような血液凝固疾患に罹患している患者の処置に殊に有用な治療用薬剤の製造のために使用できる。この核酸は遺伝子治療に使用することも可能である。
本発明の別の側面の一つは本発明のＸ因子類似体およびＸ因子類似体を含有する本発明の製品の製造法に関する。このＸ因子類似体をコードする配列を適当な発現系に挿入し、適当な細胞、好ましくは永久細胞系列にこの組換えＤＮＡを遺伝子移入する。この細胞を遺伝子発現のために適する条件下に培養し、細胞培養抽出物から、または細胞培養上清液からＸ因子類似体を分離する。この組換え分子はさらに、たとえばアニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィー、またはこれらの組合せのような、あらゆる知られているクロマトグラフィー法を駆使して精製する。
本発明のＸ因子類似体を製造するにはＸ因子をコードする全ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングする。これは一般的に知られているクローニング技術に従って行う。続いてＸ因子をコードするヌクレオチド配列を修飾して、活性化ペプチドの領域におけるコード配列および、所望ならばＣ末端β−ペプチドの領域におけるコード配列を前に定義した型のＸ因子分子が産生されるように修飾する。これは、たとえば部位特異的試験管内突然変異誘発または配列の欠失、たとえばエンドヌクレアーゼによる制限消化、および別個の変化した配列の挿入、またはＰＣＲによるものなどのような先行技術で知られている遺伝子工学技術によって実行される。次に、こうして得られたＸ因子類似体を組換え発現のために適する発現系に挿入して発現させる。
本発明のＸ因子類似体は化学的合成法によっても製造できる。
Ｘ因子類似体は好ましくは組換え発現によって製造する。それは遺伝子工学によって、たとえば永久細胞系列またはウイルス発現系のような、通常の発現系のいずれを用いても製造できる。永久細胞系列は、たとえばＶｅｒｏ、ＭＲＣ５、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、Ｓｋ−Ｈｅｐｌ、殊に肝細胞および腎細胞など、宿主細胞染色体への外来ＤＮＡの安定な組込みによって；または、たとえばパピローマウイルスに由来する、エピソームベクターによって作製される。たとえばワクチニアウイルス、バキュロウイルスまたはレトロウイルスの系のようなウイルス発現系も採用できる。細胞系列としてはＶｅｒｏ、ＭＲＣ５、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、Ｓｋ−Ｈｅｐｌ、腺、肝および腎の細胞が通常使用される。真核生物の発現系としては、酵母、内生の腺（たとえば、トランスジェニック動物の腺）、およびその他の型の細胞も使用できる。勿論、トランスジェニック動物も本発明のポリペプチドまたはその誘導体を発現するために使用できる。組換え蛋白質を発現するためにはＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞が殊に有用であることが証明されている（Ｕｒｌａｕｂ、ほか著、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６〜４２２０頁）。
本発明のＸ因子類似体を組換え製造するには原核生物発現系をも使用できる。大腸菌または枯草菌中での発現を可能にする系は殊に有用である。
Ｘ因子類似体は各発現系の中で適当なプロモーターの制御下に発現される。真核生物での発現については、たとえばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＨＳＶ、ＥＢＶ、β−アクチン・ｈＧＨまたは、たとえばｈｓｐまたはメタロチオネインプロモーターのような、誘導可能プロモーター、のような知られているプロモーターは全て好適である。ＣＨＯ細胞ではＸ因子類似体は、好ましくはβ−アクチンプロモーターの制御下に発現される。
本発明の一態様によれば、本発明の製品を製造する方法には次の段階を含む：Ｘ因子類似体をコードするＤＮＡを提供すること；組換えＤＮＡで細胞を形質転換すること；Ｘ因子類似体を発現すること；所望ならばプロテアーゼの存在下にＸ因子類似体を分離すること、および所望ならばクロマトグラフィー法によって精製すること。
この工程の一態様ではＸ因子類似体を二重鎖分子として分離する。Ｘ因子類似体はプロＸ因子類似体から二重鎖Ｘ因子類似体へのプロセッシングを可能にする細胞中で発現される。この細胞は好ましくは、たとえばフリンまたはその誘導体のような、たとえば二塩基性プロテアーゼなどの、Ｘ因子類似体前駆体をプロセッシングすることのできるプロテアーゼを発現する細胞である。プロセッシング効率を改善または強化するためには、所望ならば細胞をそのプロテアーゼ発現が強化されるように修飾する。たとえばこの修飾は、たとえばフリン／ＰＡＣＥ、Ｋｅｘ２またはその誘導体のような対応する二塩基性エンドプロテアーゼの共発現によって実行される。本発明のＸ因子類似体はまた、内因的には正常なプロテアーゼ濃度、すなわちプロセッシング用には最適に達しない濃度、を有する細胞中でも発現できるが、その結果、二重鎖型へのプロセッシングは不完全となる。この場合、前記のように単鎖型のＸ因子類似体が細胞上清液に分泌される限り、それに続く軽鎖および重鎖へのプロセッシングはプロテアーゼ発現細胞とともに共培養するか、または所望ならば固定化されたプロテアーゼと接触させることによっても行われる。細胞上清液はプロテアーゼを結合した担体マトリックス上を通過させて二重鎖のＸ因子類似体を溶離液中に得ることもできる。また、反応物を溶液中で混合させて、一定時間インキュベーションし、次に、たとえば親和性マトリックスを用いて、プロテアーゼを除去できる。
こうして得られた二重鎖型のＸ因子類似体は、続いて前記のように分離し、精製し、その後の使用まで安定に貯蔵できる。
特定的態様では二重型の、所望ならば精製されたＸ因子類似体を試験管内で、Ｘ因子類似体を活性化して在来型のＸａ因子またはＸａ因子類似体とする条件下に、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のようなエンドプロテアーゼの群；たとえばＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子、ＩＩａ因子、またはカリクレインのようなセリンプロテアーゼの群；またはこれらのプロテアーゼの誘導体から選択されたプロテアーゼと接触させる。
一態様においては、活性化はクロマトグラフィー段階で行うが、その場合にはプロテアーゼを担体に固定化する。精製二重鎖型Ｘ因子類似体はプロテアーゼが結合したマトリックス上を通過させて、精製されたＸａ因子類似体を溶離液から分離する。
別の一態様によれば、各成分を混合し、混合物からプロテアーゼを選択的に除去する。
勿論、一工程での単鎖型のプロＸ因子類似体から二重鎖型のＸ因子類似体型へのプロセッシングおよびＸａ因子への活性化の組合せも可能である。単鎖型のＸ因子類似体またはその前駆体を直接に二塩基性プロテアーゼ、好ましくはフリンまたはその誘導体と接触させて、軽鎖と重鎖へのプロセッシングおよびＸａ因子への活性化を可能にする。活性化ペプチド中にフリンまたはその誘導体に対する切断部位を持たないＸ因子類似体は、所望なら第一のプロテアーゼとは異なり、活性化が可能な別のプロテアーゼと接触させる。これらのプロテアーゼは、たとえばフリンとＸＩａ因子との混合物などの混合物としても存在できる。
活性化は、順次に整列させ、相互に直接的に連結した用具、好ましくはたとえばプロテアーゼを固定化したカラムのようなキャリヤー、による二工程の組合せによっても実行できる。第一のキャリヤーではＸ因子を重鎖と軽鎖とにまで切断し、第二のキャリヤーでは固定化したプロテアーゼによってＸ因子をＸａ因子にまで活性化する。これらのキャリヤーは第一カラムの出口と第二カラムの入口とを直接的に結合することによって連結できる。
プロセッシング反応および活性化の反応条件は当技術分野の熟練者にとっては実験の設定と所与の基本的条件とに従って容易に最適化できる。接触時間については、本反応剤の流速は殊に重要である。理想的にはそれは０．０１ｍＬ／分と１ｍＬ／分との間かと思われる。さらに重要な要因は温度、ｐＨ値、および溶離条件である。通過した後に、活性化されたＸａ因子は、所望ならば選択的クロマトグラフィーによってさらに精製する。好ましくはクロマトグラフィーカラムなどのキャリヤーを使用する時には、反応の設定は追加的な精製段階が可能になるので、キャリヤーに結合したプロテアーゼを用いてこの工程を実行するのが殊に有利である。
Ｘ因子類似体製造の別の一側面によれば、Ｘ因子類似体を単鎖型の分子として分離する。単鎖型のＸ因子類似体をプロセッシングして重鎖−軽鎖としない細胞内でＸ因子類似体を発現する。この細胞には、好ましくは、たとえばケキシン、フリン、ＰＡＣＥのような二塩基性プロテアーゼが欠損している。本発明を実行するに当り、軽鎖および重鎖にＸ因子を切断する原因である必須プロテアーゼの一つがフリンであることが発見された。このようなエンドプロテアーゼが欠損する突然変異細胞からはＸ因子類似体は単鎖型の分子として分離できる。続いて、こうして分離し、所望により精製したＸ因子類似体と、たとえばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７のような二塩基性エンドプロテアーゼの群から選択されたプロテアーゼとを単鎖型のＸ因子類似体が切断されて二重鎖型Ｘ因子型になる条件の下に、接触させる。活性化ペプチドの領域にこれらのエンドプロテアーゼの１種による切断を可能にする修飾を有する本発明のＸ因子類似体は、所望であればこの方法によってエンドプロテアーゼと接触させればＸａ因子またはＸａ因子類似体にまで直接に活性化できる。
セリンプロテアーゼまたはカリクレインによる切断を可能にする修飾を活性化ペプチドの領域に有する本発明のＸ因子類似体は二重鎖型のＸ因子類似体として製造した後に、最初のプロテアーゼとは異なる別のプロテアーゼと接触させて、これをＸａ因子類似体にまで活性化する。
本発明の一側面によれば、活性なＸａ因子または活性なＸａ因子類似体を含有する製品の製造においては、前記のように製造したＸ因子類似体の一種を活性化工程に付し、さらに活性化ポリペプチドを精製された製品にまでプロセッシングし、所望ならばこれを医薬的組成物として製剤化することによって得られる。
前記の工法によって活性化された本発明のＸ因子類似体を用いて、高い安定性と構造的完全さとを有し、ことに不活性なＸ因子／Ｘａ因子中間体不含のＸａ因子、精製されたＸａ因子、またはＸａ因子類似体が得られる。
本発明を以下の実施例と図面とによってさらに詳記するが、本発明はこれらの特定的な実例に限定されるものではない。
実施例１はｒＸ因子の構築と発現とを例示する。実施例２はフリンによるｒＸ因子の重鎖と軽鎖とへのプロセッシングを例示する。実施例３は固定化プロテアーゼによるプロＸ因子のプロセッシングを例示する。実施例４は試験管内でプロセッシングされたｒＸ因子の活性を例示する。実施例５はフリン欠損細胞中でのｒＸ因子の発現を例示する。実施例６はｒＸ因子類似体の構築を例示する。実施例７はＸ因子プロセッシング生成物のＮ−末端の構造決定を例示する。実施例８はフリン切断部位Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅ（ｒＦＸRRKR/I）を有するＸ因子類似体の発現および特性解析を例示する。実施例９はｒ−フリン誘導体によるｒＦＸRRKR/I蛋白質の試験管内活性化を例示する。実施例１０は試験管内で活性化された組換えＦＸ類似体ｒＦＸRRKR/Iの機能を例示する。実施例１１はＸＩａ因子に対する切断部位Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／Ｖａｌを有するｒＦＸ類似体の試験管内活性化を例示する。
図面：
図１：Ｘ因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
図２：活性化ペプチドの領域内に修飾されたプロテアーゼ切断部位を有するＸ因子類似体の図式的表示。
図３：発現ベクターｐｈＡｃｔ−ｒＦＸの図式的表示。
図４：増幅の前および後にＣＨＯ細胞内に発現されたｒＸ因子のウェスタンブロット分析。
図５：フリン誘導体によって試験管内で切断された後のｒＸ因子のウェスタンブロット分析。
図６：フリン含有細胞およびフリン欠損細胞中で発現されたｒＸ因子分子のウェスタンブロット分析。
図７：重鎖Ｃ末端が修飾されたｒＦＸ／ｒＦＸａ類似体構築物の図式的表示。
図８：組換えフリンで処理する前および後での、フリン含有およびフリン欠損ＣＨＯ細胞のｒＸ因子プロセッシング生成物のＮ末端の図式的表示。
図９：ＣＨＯ細胞中に発現されたｒ因子、ＦＸRRKR/Iのウェスタンブロット分析。
図１０：フリン誘導体を用いて試験管内活性化した後のｒ因子、ＦＸRRKR/Iのウェスタンブロット分析。
図１１：フリン誘導体を用いて試験管内活性化した後のｒ因子、ＦＸDFTR/Vのウェスタンブロット分析。
発現ベクターは標準的なクローニング技術によって製造した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ほか著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング−実験室便覧）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、米国、１９９３年）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の製造は一般法に従った（Ｃｌａｃｋｓｏｎ、ほか著、１９９１年、「ＰＣＲ−Ａ・ｐｒａｃｔｉｃａｌ・ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰＣＲ−実際的手法）」、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅ、Ｔａｙｌｏｒ編、１８７〜２１４頁）。
実施例１：単鎖型ｒＦＸの発現およびｒＦＸ軽鎖／重鎖へのプロセッシング
ａ．ｒＦＸ発現ベクターの構築
組換えＦＸ（ｒＦＸ）の製造には、Ｍｅｓｓｉｅｒ、ほか（１９９１年、Ｇｅｎｅ、９９巻：２９１〜２９４頁）が記載した方法で、ＦＸのｃＤＮＡをヒトの肝ラムダーｃＤＮＡライブラリーから分離した。陽性クローンからオリゴヌクレオチド＃２９１１（５’−ＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧ−３’）（配列番号１）を５’−プライマーとして、またオリゴヌクレオチド＃２９１２（５’−ＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’）（配列番号２）を３’−プライマーとして用いるＰＣＲによってＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片はＦＸをコードする１４６７ｋＢの配列と３９ｂｐの３’−非翻訳領域とを含み、これに５’−末端にＸｈｏＩ切断部位を、３’−末端にＭｆｅＩ切断部位を結合している。これに加え、プライマー＃２９１１によって配列ＡＣＣをＦＸにあるＡＴＧの前に導入して、最適なＫｏｚａｋ翻訳開始配列を作らせた。続いて、このＰＣＲ生成物を発現ベクターｐｈＡｃｔ中にはＸｈｏＩ／ＭｆｅＩ断片としてクローニングして、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。得られた発現プラスミドをｐｈＡｃｔ−ｒＦＸ（図３）と命名した。発現ベクターｐｈＡｃｔにはヒトのβ−アクチンプロモーター７８ｂｐ５’−ＵＴＲおよびイントロン、多重クローニング切断部位およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有する。
ｂ．ＣＨＯ細胞におけるｒＦＸの発現
安定なｒＦＸ発現細胞系列を樹立するために、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に発現プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒＦＸと選択マーカープラスミドｐＳＶ−ｄｈｆｒとを共遺伝子移入した。以下の発現および機能分析の全てでは、細胞を血清不含選択培地を用いてビタミンＫ１０μｇ／ｍＬの存在下に２４時間インキュベーションした。得られた細胞クローン中のｒＦＸの発現は抗原の量（ＥＬＩＳＡ、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）によって検出し、組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４Ａおよび図４Ｂ）で特性解析した。ウェスタンブロットから明らかなように（図４Ａ）、最初のクローンおよびそのサブクローンでは２２ｋＤの軽鎖（ＬＣ）と約５０ｋＤの重鎖（ＨＣ）の形での組換えＦＸ蛋白質が存在し、これらはサイズが血中Ｘ因子鎖のものと一致する。これに加え、蛋白質バンドが７５ｋＤに見られるが、これは単鎖型の分子に対応し、その存在はＦＸを遺伝子移入したＣＨＯ細胞（Ｗｏｌｆ、ほか著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１３７２６〜１３７３０頁、１９９１年）およびヒトの血漿（Ｆａｉｒ、ほか著、Ｂｌｏｏｄ、６４巻：１９４〜２０４頁、１９８４年）について報告されている。発現の高度なクローンを産生するためには、最初のクローンをメトトレキセートの量を増加させながら増幅し、続いて安定化のためにサブクローニングした。発現量は２４時間におのおの約２００〜５００ｎｇ／１０Ｅ６細胞および１μｇ／ｍＬからおのおの約７８μｇ／１０Ｅ６細胞および１２０μｇ／ｍＬまで増加できた。発現の高度なこれらの細胞クローンの上清液をウェスタンブロット分析すると（図４Ｂおよび図５Ａ、レーン２）、単鎖型のｒＦＸ分子の量が増加することおよび別な型の軽鎖が存在することが判明した。軽鎖は血漿型（完全カルボキシル化され、プロペプチドなし）に対応する２２ｋＤ型のほかに、別な型の軽鎖変異体が約２１ｋＤ、約２２．５ｋＤおよび約２０ｋＤの３種が存在する。組換え物質のＮ末端配列決定によって、これらのクローンにおける軽鎖の異質性はプロペプチドの不完全な切断（ここに：ｒＦＸ材料の約５０％）および不完全なカルボキシル化（ここに：ｒＦＸの約５０％）に起因する。２１ｋＤに現れる蛋白質はカルボキシル化が不完全なプロペプチド含有型の軽鎖であり、２０ｋＤに現れる蛋白質はカルボキシル化が不完全なプロペプチド不含型の軽鎖であるが、一方では２２．５ｋＤに現れるバンドはカルボキシル化は完全であるが、プロペプチドを含有するＬＣ型である。
実施例２：ｒフリン誘導体による単鎖型ｒＦＸからｒＦＸ軽鎖／重鎖へのプロセッシング
Ｘ因子のプロペプチド／軽鎖Ｎ末端（ＲＶＴＲ↓Ａ）および軽鎖／重鎖（ＲＲＫＲ↓Ｓ）間の切断部位とフリンの共通認識配列（ＲＸＫ／ＲＲ↓Ｘ）との類似性によって、ｒフリン誘導体による単鎖型ならびにｒＦＸ分子を含むプロペプチドの試験管内プロセッシングの改善が可能になるものと思われる。文献では、２段階のプロセッシング工程にプロテアーゼが推測されているが、しかしながら、これらはフリンではない（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ、ほか著、１９９２年、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：２３４９〜２３５５頁；Ｗａｌｌｉｎ、ほか著、１９９４年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、１９９４年：３９５〜４０３頁）。
ＣＨＯ−ｒＦＸおよびＣＨＯ−ｒフリン・ΔＴＭ６ｘＨｉｓ（欧州特許ＥＰ０７７５７５０号Ａ２）ならびにＣＨＯ−ｒＦＸおよび非遺伝子移入ＣＨＯ（ネガティブ対照として）の細胞培養上清液を１：１の比率で混合して３７℃でインキュベーションした。反応混合物の適量を採取し、プロセッシングされたｒＥＸの量をインキュベーション前（ｔ＝０時間）および所定のインキュベーション時間（ｔ＝２、４、６時間）後にウェスタンブロット分析により検査した（図５）。ｒＦＸは抗ヒトＦＸ抗血清によって（図５Ａ）、またＦＸの軽鎖に特異的なモノクローナル抗体（図５Ｂ）によって細胞培養上清液中に検出された。
ＣＨＯ−ｒＦＸ／ＣＨＯ混合物とは異なって、ＣＨＯ−ｒＦＸ／ＣＨＯ−ｒフリンは３７℃でのインキュベーション２時間後には殆ど完全なプロセッシングを示した（図５Ａ、レーン７；図５Ｂ、レーン８）。単鎖型のｒＦＸは主に軽鎖型と重鎖型とに変換された。軽鎖の領域では２２ｋＤのプロセッシングされたプロペプチド不含型（カルボキシル化型）および２０ｋＤ（カルボキシル化不全型）のみが約５０：５０の比率で見出された。細胞培養条件を最適化することによって、この比率はカルボキシル化型が増加する方向に改善された。Ａｒｇ１とＡｌａ＋１との間で行われるプロ配列の正常な切断と軽鎖Ｎ末端の均質性とはＮ末端の配列決定によって判定された。ＣＨＯ−ｒＦＸとＣＨＯ−上清液とを混合した対照実験では、インキュベーション６時間後にもｒＦＸバンドのパターンに変化は見られなかった（図５Ａのレーン５；図５Ｂのレーン６）。これはＣＨＯ細胞上清液中のｒフリンが生物学的に活性であって、プロペプチドならびにｒＦＸの重鎖／軽鎖をプロセッシングできることを証明する。
実施例３：キレート−テンタクルにゲル固定化したｒフリンによるＸ因子のプロセッシング
カラムに結合したｒフリン誘導体によって基質を切断できるかどうかを研究するために、カラムのマトリックスとしてＮｉ2+−ＮＴＡアガロースの代わりに、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ・ＥＭＤ（商標）テンタクルゲル（Ｍｅｒｃｋ社製）が実験設定に使用できるかどうかに関する研究を行った。この金属イオンは実用したカラムマトリックスからＮｉ2+−ＮＴＡアガロースの場合よりもさらに離れているので、結合したｒフリン誘導体への基質の立体的接近を改善できると思われた。今回の実験設定では、プロＸ因子はテンタクルゲルに結合したｒフリン誘導体によってプロセッシングされた。製造社の指示書に従ってＮｉ2+イオンをＦｒａｃｔｏｇｅｌ・ＥＭＤ（商標）テンタクルゲルに負荷し、新鮮な血清不含細胞培養培地と平衡させた。続いて、このカラムに血清不含ＣＨＯ−ｒフリン誘導体上清液を負荷した。洗浄段階は添加するイミダゾール濃度を４０ｍＭまで徐々に上昇させながら血清不含細胞培養培地によって行った。次にカラムに血清不含ＣＨＯ上清液としてプロ−Ｘ因子を通過させた。プロ−Ｘ因子から二重鎖型のＸ因子へのプロセッシングは特異的Ｘ因子抗血清によるウェスタンブロット分析によってカラムの溶離液中に検出した。
実施例４：試験管内でプロセッシングされた組換えＸ因子の活性
組換えＸ因子前駆体をｒフリンの存在および不在下に４℃でインキュベーションした。所定の時間に試料を採取して−２０℃で凍結した。インキュベーションの完了後（４日間後）、全試料についてＦＸ・Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｋｉｔ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を使用してＦＸ活性を検査した。各５０μＬの上清液をＦＸ欠損ヒト血漿５０μＬと混合し、製造社の指示に従ってＣａＣｌ2存在下にヘビ毒（ＲＶＶ）でｒＦＸをｒＦＸａにまで活性化し；次にｒＦＸａを使用して発色性基質（Ｓ−２３３７）を加水分解して黄色のパラニトロアニリンを放出させた。着色の強度とｒＦＸａの量とは相互に比例するので、ｒＦＸａまで活性化されたｒＦＸの量／ｍＬ細胞培養上清液は、血漿希釈系の値から補正曲線に内挿して測定できる。これらの結果とｒＦＸ抗原の既知量（ＥＬＩＳＡデータ）とを用いて、Ｘａ因子にまで活性化されたｒＸ因子の比率を％で算出できる。その結果を表１に示す。
ＣＨＯおよびＣＨＯ−ｒフリン上清液に存在する非特異的な蛋白質分解的活性を排除するために、これら二種の細胞培養上清液も検査した。
４日後でも、対照としてのＣＨＯ上清液（ｒフリン不在）とともにインキュベーションしたＣＨＯ−ｒＦＸはｒＦＸ活性に実質的な変化を示さなかった。このｒＦＸ活性は約８００ｍＵ／ｍＬであり、実験的な変動に依存して機能的ｒＦＸの５５〜６１％に対応する。これとは対照的に、ＣＨＯ−ｒＦＸをＣＨＯ−ｒフリンとインキュベーションする時にはｒＦＸ活性はインキュベーションの間に着実に向上して６１％（Ｔ＝０）から８６％にまで上昇した（表１）。これは発現の高度なクローンから得たＣＨＯ−ｒＦＸについてはｒフリン誘導体を使用する試験管内プロセッシングが機能性のあるｒＦＸａへと活性化されるｒＦＸの比率を実質的に改善することを証明する。
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実施例５：フリン欠損細胞中における組換えＸ因子の発現
前実施例に記載したようにＸ因子前駆体蛋白質の場合にはフリンは試験管内ではプロペプチドの切断ならびに単鎖型から軽鎖／重鎖への切断を媒介する。これは発現されるｒＸ因子の量に依存する様々な効率で、遍在するフリンによって、これらの切断が細胞内でも内在的に行われることを示唆する。これによって異質なｒＸ因子型の混合物が産生される。
できるだけ均質で安定なｒＸ因子分子の型を製造する方法の一つは内在性のプロテアーゼ、特にフリン、によるｒＸ因子の切断を防止し、機能的には不活性なｒＸ因子前駆体（この前駆体は後に、理想的には使用の直前に、下流のプロセッシングによって機能的に活性な型に転換される）を産生させることである。この方法は本来の活性化部位の代わりにフリン切断部位を含有するＸ因子類似体を産生するに当たっては殊に有用となる。このような構築物においては組換えｒＦＸ突然変異体は生体内で内在性フリンによって活性化でき、活性化された、不安定性が高い型のｒＦＸを分泌するものである。これらの型からの分解反応は、たとえば細胞培養上清液の貯蔵の間または精製工程の間に起きるＣＨＯプロテアーゼによる、または自己蛋白質分解による、高度な細胞溶解の細胞培養条件下などでは不活性な分解産物を与えることになる（Ｗｏｌｆ、ほか著、１９９１年）。
この目的は、例えば、細胞内フリン活性を削減ないし防止できる薬剤を細胞培養培地に添加することによって達成できる。
もう一つの方法は最初からフリンが欠損している細胞
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を使用ものことである。
この目的のためには、フリンが欠損したＣＨＯ細胞のクローンＦＤ１１（Ｇｏｒｄｏｎ、ほか著、１９９５年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３巻：８２〜８７頁）にｐｈＡｃｔ−ＦＸを２０μｇとｐＵＣＳＶ−ｎｅｏ（ｐＵＣベクター中にＳＶ４０プロモーターに制御されるネオマイシン耐性遺伝子を含む）を１μｇとを共遺伝子移入した。安定なクローンを得るため、培地にはｍＬ当り０．８μｇのＧ４１８を添加した。フリン含有ＣＨＯクローンおよびフリン欠損ＣＨＯクローンの血清不含上清液中に分泌されたｒＸ因子分子を比較するウェスタンブロットはｒＸ因子前駆体がフリン欠損細胞中ではプロセッシングされないことおよび単鎖型のＸ因子前駆体のみが存在すること（図６）を証明した；これとは対照的に、中庸な発現では「正常な」細胞によってｒＸ因子は完全にプロセッシングされたが、高度な発現ではフリンが内在するにも関わらずプロセッシングは非常に僅かであった。この分析に使用した細胞クローンのｒＦＸ発現レベルが低かったので、このブロットにはｒＸ因子の軽鎖は目視できなかった。
実施例６：Ｘ因子類似体の製造（出願時点では出願人はこれを本発明実施の最適態様であると見做している）
６．１．Ｘ因子類似体製造用発現プラスミドの構築
組換えｒＸ因子類似体の製造のためには、Ｘ因子からＸａ因子に至る活性化に役立つ切断部位Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／Ｉｌｅ（アミノ酸２３１から２３５まで）を、たとえばフリン、ＦＸＩａ、ＦＸａ、ＦＸＩＩａ、ＦＩＩまたはカリクレインのような種々のプロテアーゼに特異的な切断部位に置換する。これらのＸ因子類似体に対する発現プラスミドは全てプラスミドｐｈＡｃｔ−ＦＸ（実施例１に記載）から誘導する。
Ｘ因子発現プラスミドのクローニングを単純化するために、Ｘ因子をコードする位置番号＋１から＋１１１６までの領域を含むｐｈＡｃｔ−ＦＸ発現プラスミドからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮａｅＩのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ制限切断部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＵＣ／ＦＸと命名した。
そこで位置５０８から７０５までのヌクレオチド（アミノ酸１６０から２３５まで）のＸ因子配列をｐＵＣ／ＦＸプラスミドから容易に除去でき、種々の突然変異体Ｘ因子ＤＮＡ断片で置換できた。これらのＤＮＡ断片は、新しい切断部位をコードする位置６９１から７０５まで（アミノ酸２３１から２３５まで）を除けば除去した野生型Ｘ因子の配列と同一である。
ｐＵＣ／ＦＸプラスミドからＢｓｐ１２０ＩとＢｓｔＸＩの制限消化によって
野生型のＸ因子配列を除去した。これに加えて、ＢｓｔＸＩ部位の３’−オーバーハングを緑豆ヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂ社製）で除去した。
突然変異体Ｘ因子ＤＮＡ断片はＰＣＲ法によって製造した。５’−プライマーは全てのクローニングについて同一であって、Ｘ因子配列の位置４９６から５１６までを含む。３’−プライマーはＸ因子（位置６７６から６９０まで）に相補的な配列および新らしい切断部位および制限切断部位の配列を有する非相補的な５’−末端を含む。増幅したＰＣＲ生成物を続いて適当な制限酵素で消化して、前に製造したｐＵＣ／ＦＸベクター（前記参照）にクローニングした。
続いて、突然変異Ｘ因子ＤＮＡ断片をｐＵＣ／ＦＸプラスミドからのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｇｅＩでｐｈＡｃｔ−ＦＸベクターに再クローニングした。図２．１および図２．２に最終的な各構築物を図式的に示す。野生型のＸ因子を構築物の対照として示す。アミノ酸は１文字表記とし、これに加えて、突然変異した位置を影付き文字とした。Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／ＶａｌのＦＸＩａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、およびオリゴヌクレオチド＃１００２（５’−ＡＣＣＡＧＴＴ  ＡＡＣＣＣＴＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号４）を３’−プライマーとして使用した。こうして、Ｘ因子配列の位置２３１、２３２および２３５にあるアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕおよびＩｌｅをＡｓｐ、ＰｈｅおよびＶａｌと置換した。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０ＩおよびＨｐａＩによって平滑断端とした（図２Ａ）。
Ａｒｇ／ＳｅｒのＦＩＩａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００３（５’−ＡＣＣＡ  ＴＣＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ−３’）（配列番号５）を３’−プライマーとして用いた。こうして、位置２３５のアミノ酸ＩｌｅをＳｅｒに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０ＩおよびＮｒｕＩによって平滑断端とした（図２Ｂ）。
Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／ＩｌｅのＦＸＩＩａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００４（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号６）を３’−プライマーとして使用した。こうして、ＦＸ配列の位置２３１、２３２および２３３のアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕおよびＴｈｒをＩｌｅ、ＬｙｓおよびＰｒｏに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｃ）。
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのカリクレイン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００５（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号７）を３’−プライマーとして使用した。こうして、Ｘ因子配列の位置２３１、２３２のアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕをＳｅｒ、Ｍｅｔに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｄ）。
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ／ＩｌｅのＦＸａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１６（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号８）を３’−プライマーとして使用した。こうして、ＦＸ蛋白質の位置２３１、２３２および２３３のアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕおよびＴｈｒをＰｒｏ、ＧｌｎおよびＧｌｙに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｈ）。
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／ＩｌｅのＦＸａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１４（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号９）を３’−プライマーとして使用した。こうして、ＦＸ蛋白質の位置２３１、２３２のアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕをＭｅｔ、Ｌｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｅ）。
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ／ＩｌｅのＦＸａ切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１５（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１０）を３’−プライマーとして使用した。こうして、ＦＸ蛋白質の位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒをＩｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｆ）。
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００６（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１１）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＡｒｇ、ＡｒｇおよびＬｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００７（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１２）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＡｒｇ、ＶａｌおよびＡｒｇに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００８（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１３）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＡｒｇ、ＡｒｇおよびＡｒｇに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１００９（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１４）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＡｒｇ、ＰｒｏおよびＬｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１０（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１５）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＩｌｅ、ＡｒｇおよびＬｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１１（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１６）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１から２３３までのアミノ酸Ａｓｎ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒをＡｒｇ、ＳｅｒおよびＬｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１２（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１７）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１、２３２のアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕをＡｒｇ、Ｖａｌに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅのフリン切断部位を製造するためには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１３（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１８）を３’−プライマーとして使用した。こうして、位置２３１および２３３のアミノ酸ＡｓｎおよびＴｈｒをＡｒｇおよびＬｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｐ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／ＩｌｅのＦＸＩＩａ切断部位を製造するには、オリゴヌクレオチド＃１００１（５’−ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ−３’）（配列番号３）を５’−プライマーとして使用し、オリゴヌクレオチド＃１０１７（５’−ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号１９）を３’−プライマーとして使用した。こうして、ＦＸ蛋白質の位置２３１、２３２にあるアミノ酸Ａｓｎ、ＬｅｕをＩｌｅ、Ｌｙｓに突然変異させた。このＰＣＲ断片はＢｓｔ１２０Ｉおよび部分的にＸｍｎＩを用いて平滑断端とした（図２Ｇ）。
６．２．ＦＸβ類似体製造用発現プラスミドの構築
これらの構築物は前記のＸ因子類似体構築物の位置４７０にＴＧＡ停止コドンを導入して誘導したものである。ｃＤＮＡレベルで、位置４５７から停止コドンまでのアミノ酸をＳｐｅＩおよび部分的ＢｓｔＥＩＩ消化によって除去し、オリゴヌクレオチドのペア＃０００３（５’−ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  Ａ−３’）（配列番号２０）および＃０００４（５’−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＧＣＧ−３’）（配列番号２１）によって置換した。図７はＸβ因子類似体構築物の図式的な表示である。図を単純化するために、Ｘβ因子類似体は全て一般的構築物として表示し、そこでは切断部位領域における変化可能なアミノ酸は影付き文字の「Ｘ」として表示してある。
６．３．ＦＸａ類似体製造用発現プラスミドの構築
重鎖Ｎ末端にある４．５ｋＤａ活性化ペプチドの除去によってＸ因子を活性化することによって、Ｘａα因子型が作製される。この型は続いて自己蛋白分解活性によって重鎖Ｃ末端のＡｒｇ４６９とＧｌｙ４７０との間で切断されてＦＸａβ型に変換される。活性化された後に無傷のβ−ペプチドを有し、完全にＦＸａα型にまで活性化されるＸ因子の製造を導くＸ因子発現プラスミドを製造するため、重鎖のこの領域がさらに分解されないようにアミノ酸Ａｒｇ４６９をＬｙｓに突然変異させた。
この目的のためには、Ｘ因子の位置１３６３から停止シグナルまでのＣ−末端アミノ酸配列を部分的なＢｓｔＥＩＩ−ＳｐｅＩ消化によって除去し、連結したオリゴヌクレオチドペア２本に置換した。オリゴヌクレオチド＃０００５（５’−ＧＴＣ  ＡＣＣＧＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ−３’）（配列番号２２）およびオリゴヌクレオチド＃０００６（５’−ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＧＣＧ−３’）（配列番号２３）を、オリゴヌクレオチド＃０００７（５’−ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  Ａ−３’）（配列番号２４）およびオリゴヌクレオチド＃０００８（５’−ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ−３’）（配列番号２５）で連結した。アミノ酸Ａｒｇ４６９の突然変異はオリゴヌクレオチドペア＃０００５〜＃０００６によって導入した。図７にこのＦＸ類似体を図式的に表示する。
実施例７：Ｘ因子のＮ末端およびｒフリンの存在および不在下でのプロセッシング生成物の構造決定
実施例１に記載のように内在性フリンを有するＣＨＯ細胞、および実施例５に記載のフリン欠損細胞中で、組換えＸ因子を発現した。ｒＸ因子を発現の高度なＣＨＯ−ｒＦＸクローンの細胞培養上清液であって、ａ）処置しないもの、ｂ）３７℃で１２時間延長インキュベーションしたもの、ｃ）ＣＨＯ−ｒフリン上清液とともに３７℃で１２時間インキュベーションしたものから、ならびにＣＨＯ−ＦＤ１１−ｒＦＸクローンの細胞培養上清液であって、ｄ）処置しないもの、ｅ）ＣＨＯ−ｒフリン上清液とともに３７℃で１２時間インキュベーションしたものから、分離した。Ｘ因子のＮ末端アミノ酸および各反応混合物ａ）からｅ）までのプロセッシング生成物をエドマン分析によって測定した。この結果を図８に図式的に表示する。
発現の高度なＣＨＯ細胞から得たｒＸ因子は成熟した重鎖および軽鎖の型ならびに単鎖型で存在するがその一部はまだプロペプチドを含む。これらの細胞培養上清液を３７℃でインキュベーションした後（ｂ）、すでにＷｏｌｆ、ほか（１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１３７２６〜１３７３０頁）が記載しているように付加的アミノ酸３個Ｖａｌ３８−Ｔｈｒ３９−Ａｒｇ４０を持つ別のｒＦＸ軽鎖の不完全なＮ末端が形成される。これらの潜在末端はＣＨＯ−Ｆ１１細胞から無処置で得たｒＦＸ物質（ｄ）を配列決定した時にも見出される。この観察はこれらの不完全なＮ末端の形成がＣＨＯプロテアーゼによるｒＦＸの蛋白質分解を削減するように条件、すなわち細胞培養条件、貯蔵および精製工程、を最適化することによって防止できることを示す。
ＣＨＯ細胞から得た精製材料ａ）およびｂ）とは反対に、非増幅、フリン欠損細胞から得たｒＦＸ（ｄ）はプロセッシングされていない単鎖型前駆体の形でのみ存在する。プロペプチド部分に対応するＮ末端配列はいずれも見出されていない。これはフリン欠損ＣＨＯ細胞中（ｄ）では単鎖型のｒＦＸ前駆体はそれ以上には軽鎖／重鎖へのプロセッシングを受けないことを証明し、これは生体内におけるエンドプロテアーゼであるフリンのこのプロセッシング段階での中心的役割を示唆する。これに加えて、これはプロペプチドを含むｒＦＸ分子もフリン欠損ＣＨＯ細胞中でプロセッシングされること、すなわち生体内のこのプロセッシング段階ではフリンは本質的役割を果たしていないこと、を示す。フリンの存在下には、ＣＨＯ細胞からのｒＦＸ（ｃ）およびＣＨＯ−ＦＤ１１細胞からのｒＦＸ（ｅ）のインキュベーション後には、正常なＮ末端を有する軽鎖および重鎖のみが見出される。これは単鎖型のＦＸ前駆体ならびにプロペプチドを含むｒＦＸ分子は試験管内プロセッシングによって均質な成熟Ｘ因子に変換されることを証明する。そこでフリンの存在下にプロセッシングされたＸ因子は例外的な構造的完全性および均質性を示す。
実施例８：フリン切断部位Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅを有するＦＸ類似体（ｒＦＸRRKR/I）の発現および特性解析
組換えｒＦＸRRKR/I蛋白質を製造するために切断部位Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅを有するＦＸ発現プラスミド（実施例６．１、図２Ｇ参照）および実施例１に記載した選択プラスミドｐＳＶ／ｄｈｆｒをＣＨＯ細胞中に共遺伝子移入した。この細胞培養上清液のウェスタンブロット分析（図９）は組換え蛋白質が主として二重鎖型で存在することを示す。血漿ＦＸと比べて重鎖は５０ｋＤではなくて４６ｋＤとして移動するが、これはこの組換え蛋白質のグリコシル化における変化に起因すると思われる。これに加えて、少量の単鎖型の前駆体（ＳＣ）が出現し、また野生型のｒＦＸを発現した時に観察されたもの（実施例１．ｂ）と同様な軽鎖のＬＣ４アイソフォームが出現した。ｒＦＸ類似体のこれらの分子型は内在性プロテアーゼによる単鎖型のＦＸ前駆体のプロセッシングならびに軽鎖のγ−カルボキシル化は限定されたものであることを示唆する。ＦＸ類似体に導入された切断部位はフリンの共通配列を表すが、この蛋白質の活性化型に対応するものであるかもしれない蛋白質のバンド（３５ｋＤ、３１ｋＤ）は見られない。切断部位領域の構造またはその近辺のアミノ酸配列は、生体内でのフリンによる修正活性化部位のプロセッシングについては最適以下の配置を表すと思われる。
実施例９：ｒフリン誘導体によるｒＦＸRRKR/I蛋白質の試験管内活性化
試験管内でｒフリンによって組換えＦＸ類似体がＦＸａのα型（３５ｋＤ）とβ型（３１ｋＤ）とにまで活性化される性能を、実施例２に記載したような混合実験によって試験した。しかしながら、この試験は、ＣＨＯ−ｒフリン上清液を使用する代わりに、欧州特許ＥＰ０７７５７５０−Ａ２に記載されている精製ｒフリン誘導体であるｒフリンΔＣｙｓ−スペーサー−１０×Ｈｉｓを１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＣａＣｌ2、および０．２％ＢＳＡを含有する１０ｍＭ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０中で使用した点で相違する。ｒフリン不在の対照実験では１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＣａＣｌ2、および０．２％ＢＳＡを含有する緩衝液１０ｍＭ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０とＣＨＯ−ｒＦＸ類似体上清液とを比率１：１で混合した。反応混合物の適量をインキュベーション前および３７℃で６時間、２４時間、４８時間、および７２時間のインキュベーション後（ｔ＝０、６、２４、４８、７２）にウェスタンブロット分析を使用してｒＦＸ活性化について試験した（図１０）。ｒフリン誘導体の不在下では、７２時間のインキュベーション後にもｒＦＸRRKR/Iのバンドパターンは不変であった（図１０Ｂ）が、他方ではｒフリンの存在下には血漿ＦＸのα型に対応する３５ｋＤ重鎖蛋白質バンド（図１０Ａ、レーン９）が６時間後には既に出現していた（図１０Ａ、レーン５）。インキュベーションの過程で、このα型が蓄積して、７２時間のインキュベーション後（図１０Ａ、レーン８）には出発物質（ＨＣ）の約５０％が活性化型に変換された。約２４時間後に出現し、および活性化血漿ＦＸのβ−型（図１０Ａ、レーン９）に対応する別の３１ｋＤ重鎖蛋白質バンド（図１０Ａ、レーン６）は、組換えＦＸ類似体から作製されたα型は自己蛋白質分解活性を持ち、それで機能的であることを示す。
これらの結果はｒＦＸ類似体の異種活性化切断部位Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ／Ｉｌｅが試験管内でｒフリン誘導体によって特異的に認識され、正常に切断されるので、ｒＦＸ類似体をα型およびβ型のＦＸａ分子にまで活性化するために適していることが証明される。
実施例１０：試験管内で活性化された組換えＦＸ類似体ｒＦＸRRKR/Iの機能性
実施例９の混合実験で得た試料の適量を色素原試験によりＦＸａ活性について試験した。被験物質の適量を１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３中で、色素原基質Ｓ２３３７（６００μＭ）と混合した。３７℃で３分間インキュベーションした後、２０％酢酸で反応を停止し、次にＯＤを４０５ｎｍで測定した。反応混合物中にある組換えＦＸａ活性の量は精製ＲＶＶ活性化血漿ＦＸａで作製した補正曲線と比較して決定した。この分析の結果、使用した抗原の量（ＥＬＩＳＡデータ）、およびそれらから算出した比活性を表２に示す。
ｒフリン溶液およびＣＨＯ細胞培養上清液中の不都合なアミド分解活性を除外するため、非遺伝子移入ＣＨＯ細胞の上清液と精製ｒフリン誘導体との混合物もＦＸａ活性について試験した（ＣＨＯ＋ｒフリン）。この混合物中では厳密にｒＦＸ類似体／緩衝液混合物におけるものと同様にして（ｒＦＸRRKR/I＋緩衝液）インキュベーション７２時間の後にもＦＸａ活性は検出されなかった。これとは対照的に、ｒＦＸRRKR/I／ｒフリン反応の場合には、６時間のインキュベーション後にはすでに５６ｍＵのｒＦＸａ活性が検出され、これはインキュベーションの進行につれて定常的に増加し、７２時間後には１３３ｍＵに達した。この点ではウェスタンブロットによれば、ｒＦＸ類似体の約半分だけが反応して活性化されたα型およびβ型になっていた（図１０Ａ、レーン８）のであるが、試験管内で活性化されたｒＦＸ類似体物質はＲＶＶで完全に活性化された血漿ＦＸ（１５３ｍＵ／μｇ）よりも高い比活性である１９０ｍＵ／μｇを示した。測定された活性増加はウェスタンブロット中にあるα型およびβ型の出現（図１０Ａ、レーン５〜８）に対応する。
これは各プロテアーゼが認識し、切断する異種プロテアーゼ切断部位をＦＸに導入できること、および機能可能な型における高品質なｒＦＸａ（または所望ならば、ＦＸａ活性を有するｒＦＸａ類似体）が組換え技術によって製造できることを証明する。
0004317976.tif 000004
実施例１１：ＦＸＩａ切断部位Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ／Ｖａｌ（ｒＦＸDFTR/V）を有するｒＦＸａ類似体の血漿ＦＸＩａによる試験管内活性化
ＦＸ活性化配列からＦＸＩａ切断部位への突然変異誘発によってＦＸ構築物を製造した。続いて、これらの分子を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを樹立した。１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、８ｍＭ−ＣａＣｌ2、ＰＣＰＳおよび０．１％ＢＳＡを含有する１０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．３の存在下、ｒＦＸDFTR/Vを含むＣＨＯ細胞培養物上清液を精製血漿ＦＸＩａ（１００μｇ／ｍＬ）と混合し、３７℃で所定の時間インキュベーションした。ネガティブ対照として、細胞培養上清液をＢＳＡ含有緩衝液のみとインキュベーションした。ｒＦＸDFTR/V蛋白質および得られる活性化生成物をウェスタンブロット分析によって分析した（図１１）。インキュベーション前（ｔ＝０）のＦＸＩａ不含混合物に見られるように、組換え蛋白質（図１１、レーン５）は二重鎖型の血漿のＦＸとほとんど同一であって（レーン２）、唯一の相違は実施例８でｒＦＸRRKRの場合に観察されたように重鎖（ＨＣ）の分子量が５０ｋＤよりもわずかに少ないことである。この混合物の３７℃におけるインキュベーションの間には（図１１、レーン６）、バンドのパターンに顕著な変化は現れなかった。ＣＨＯ−ｒＦＸ類似体／ＦＸＩａ混合物においては、精製ＦＸＩａを添加した後であって、細胞培養上清液と実際にインキュベーションをする前に３５ｋＤおよび３１ｋＤの蛋白質バンドが急速に現れる（図１１、レーン３）。これらのバンドはそのサイズから血漿にある重鎖のα型およびβ型に対応する（図１１、レーン９）。これら二つの型はＦＸＩａとのインキュベーション４時間の後にはかなり増加する（図１１、レーン４）。
これは血液凝固経路において活性な蛋白質分解酵素に関する異種プロテアーゼ切断部位を有するＦＸ類似体が後者によって成功裏にプロセッシングできることを証明する。
これに加えて、ｒＦＸａα類似体の自己蛋白質分解活性の結果であるｒＦＸａβバンドの存在によって、得られたｒＦＸａα類似体の機能的な活性を証明することに成功した。
配列表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１：
0004317976.tif 000005
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２：
0004317976.tif 000006
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号３：
0004317976.tif 000007
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号４：
0004317976.tif 000008
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号５：
0004317976.tif 000009
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号６：
0004317976.tif 000010
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号７：
0004317976.tif 000011
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号８：
0004317976.tif 000012
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号９：
0004317976.tif 000013
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１０：
0004317976.tif 000014
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１１：
0004317976.tif 000015
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１２：
0004317976.tif 000016
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１３：
0004317976.tif 000017
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１４：
0004317976.tif 000018
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１５：
0004317976.tif 000019
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１６：
0004317976.tif 000020
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１７：
0004317976.tif 000021
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１８：
0004317976.tif 000022
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号１９：
0004317976.tif 000023
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２０：
0004317976.tif 000024
（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２１：
0004317976.tif 000025
（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２２：
0004317976.tif 000026
（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２３：
0004317976.tif 000027
（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２４：
0004317976.tif 000028
（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列：配列番号２５：
0004317976.tif 000029
（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４６７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１４６７
（ｘｉ）配列：配列番号２６：
0004317976.tif 000030
0004317976.tif 000031
0004317976.tif 000032
（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４８９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列番号２７：
0004317976.tif 000033
0004317976.tif 000034
0004317976.tif 000035
【図１−１】
0004317976.tif 000036
【図１−２】
0004317976.tif 000037
【図２．１】
0004317976.tif 000038
【図２．２】
0004317976.tif 000039
【図３】
0004317976.tif 000040
【図４】
0004317976.tif 000041
【図５】
0004317976.tif 000042
【図６】
0004317976.tif 000043
【図７】
0004317976.tif 000044
【図８】
0004317976.tif 000045
【図９】
0004317976.tif 000046
【図１０】
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【図１１】
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