(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．３（配列番号７）から成る群から選択される塩基配列からなる核酸（又はそれに相補的な配列からなる核酸）。
【請求項２】
ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、ＧＣＩＲ−ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−ＡＲ５．３（配列番号１０）から成る群から選択される塩基配列からなる核酸（又はそれに相補的な配列からなる核酸）。
【請求項３】
ＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）から成る群から選択される塩基配列からなる核酸（又はそれに相補的な配列からなる核酸）。
【請求項４】
ＧＣＩＲ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）から成る群から選択される塩基配列からなる核酸（又はそれに相補的な配列からなる核酸）。
【請求項５】
ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配列番号１７）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ８（配列番号１６）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番号１８）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ６（配列番号１９）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ２（配列番号２０）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２１）から成る群から選択される塩基配列からなる核酸（又はそれに相補的な配列からなる核酸）。
【請求項６】
ａ）ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．３（配列番号７）から成る群から選択される塩基配列からなる１種以上のプライマーと、
ｂ）ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、ＧＣＩＲ−ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−ＡＲ５．３（配列番号１０）から成る群から選択される塩基配列からなる１種以上のプライマーと、
ｃ）ＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）から選択される塩基配列からなるバンパープライマーと、
ｄ）ＧＣＩＲ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配列番号１７）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ８（配列番号１６）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番号１８）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ６（配列番号１９）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ２（配列番号２０）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２１）から成る群から選択される塩基配列（又はそれに相補的な配列）からなる１種以上の検出用プライマー（またはプローブ）と
を含んでなるキット。
【請求項７】
ａ）ＧＣＩＲ−ＡＬ５．３（配列番号７）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号８）から選択される塩基配列からなるプライマーと、
ｂ）ＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）から選択される塩基配列からなるバンパープライマーと、
ｃ）ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）の塩基配列（又はそれに相補的な配列）からなる１種以上の検出用プライマー（またはプローブ）と
を含むキット。
【請求項８】
試料中の淋菌(ネイセリア・ゴノルホア；Neisseria gonorrhoea)の有無を検出する方法であって、
ａ）ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．３（配列番号７）から成る群から選択される塩基配列からなる第１のプライマーと、ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、ＧＣＩＲ−ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−ＡＲ５．３（配列番号１０）から成る群から選択される塩基配列からなる第２のプライマーとからなる一対の核酸プライマーをＳＤＡ反応で使用して前記試料を処理するステップと、
ｂ）増幅生成物の検出が淋菌の存在を示すあらゆる増幅核酸生成物を検出するステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記ＳＤＡ反応がＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）の塩基配列からなる核酸をバンパープライマーとして使用する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅核酸生成物の検出が、ＧＣＩＲ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配列番号１７）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ８（配列番号１６）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番号１８）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ６（配列番号１９）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ２（配列番号２０）、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２１）から成る群から選択される塩基配列からなる（又はそれに相補的な配列からなる）検出用プライマー（またはプローブ）と、前記増幅核酸生成物とのハイブリッド形成によって実行されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、患者に淋菌（ネイセリア・ゴノルホア；Neisseria gonorrhoea）が存在するか否かを決定する方法に関する。本方法は、好ましくは鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification;ＳＤＡ）、好熱性鎖置換増幅(thermophilic Strand Displacement Amplification;ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタイムｔＳＤＡ(fluorescent real time tＳＤＡ)の技術を使用して、淋菌のＤＮＡを特異的に増幅するために核酸プライマーを使用することを含む。
【０００２】
【従来の技術】
Neisseria gonorrhoeaは、性行為感染症淋病の原因因子である。淋病は、抗生物質治療にも拘わらず、ヒトについて報告されている最も流行している性行為感染症の１つである。この微生物の診断および検出は、今でも臨床スワブを一晩培養した後の化学的および／または顕微鏡的同定に依存している。N. gonorrhoeaは、他の近縁関係にあるNeisseria属の種と極めて高度の相同性を共有する。N. gonorrhoeaに特異的なプライマーをデザインしようとするとき、難しい問題がある。本発明は、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に使用されるN. gonorrhoeaに特異的なプライマーの開発について記載する。
【０００３】
Doneganらは、N. gonorrhoeaのゲノムＤＮＡ由来のＭ１３ライブラリーの「サンドイッチハイブリッド形成」スクリーニングによって、数種のN. gonorrhoeaに特異的なＤＮＡフラグメントを同定した（Donegan et al., Mol. Cell. Prob.3:13-26 (1989);米国特許第４，７５５，４５８号）。米国特許第５，１０８，８９５号には、このフラグメントの１つがさらにマッピングされ、特徴付されている。
【０００４】
サザンハイブリダイゼーションやドットブロットなどのオリゴヌクレオチドプローブに基づくアッセイは、迅速な結果を（すなわち、１日以内）、細菌感染の診断に反映することができる。通常、核酸の増幅に基づくアッセイはさらに敏感であり、さらに迅速に、多くの場合１時間以内に、結果を提供することが可能である。N. gonorrhoea感染を診断する場合、このような方法は、この種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの開発を必要とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Neisseria gonorrhoeaの種特異的な検出および同定のための増幅プライマーおよびアッセイプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを提供する。種特異性は、本発明のプライマーが、他種の近縁関係にある微生物の標的配列をほとんどまたは全く検出可能に増幅せずに、Neisseria gonorrhoeaの核酸の標的配列を増幅することを意味する。本発明のプライマーは、Neisseria gonorrhoeaの標的配列を独自に増幅するが、他の細菌の標的配列を増幅せず、そのため、Neisseria gonorrhoeaを敏感に検出および同定することができる。ｔＳＤＡに合うようにプライマーを最適化すると、短い反応時間で増幅効率を高めることができる。
【０００６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後、培養された生物の同一性を確認する手段として使用することが可能である。あるいは、このオリゴヌクレオチドは、既知の増幅方法を使用してNeisseria gonorrhoeaの核酸を検出および同定するための培養前に、または培養の代わりに使用することが可能である。いずれの場合にも、本発明のオリゴヌクレオチドおよびアッセイ方法はNeisseria gonorrhoeaと他種の微生物とを識別する手段を提供し、開業医は、慣例上頼みにしている時間のかかる表現型手法および生化学的手法を実施しなくても、この微生物を迅速に同定することができる。感染に関与する特異的な病因がこのように迅速に同定できれば、適切な治療法の決定に使用することができる情報を短時間のうちに得ることができる。
【０００７】
本願明細書では、以下の用語を次のように定義する。
増幅プライマーは、標的配列にハイブリッド形成後、プライマーの伸長によって標的配列を増幅するためのプライマーである。一般に、増幅プライマーは長さ約１０〜７５ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約１５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ用の増幅プライマーの全長は、一般に約２５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ増幅プライマー（標的結合配列）の３(末端は、標的配列の５(末端でハイブリッド形成する。標的結合配列は長さ約１０〜２５ヌクレオチドであり、増幅プライマーにハイブリッド形成について特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位５(から標的結合配列までをさらに含む。
【０００８】
G. Walkerらが記載している通り（PNAS 89: 392-396 (1992)および、Nucl. Acids  Res.20: 1691-1696 (1992)）、認識部位が半修飾されているとき、認識部位はＤＮＡ二重らせんの鎖１本をニックする制限エンドヌクレアーゼとして用いられる。
ＳＤＡ中に増幅プライマーの残りがニックされて置換されるとき、５(から制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド（「尾部」）は、ポリメラーゼリプライミング部位の役割をする。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能によってＳＤＡ反応が維持され、１つの標的分子から多重アンプリコンを合成することが可能になる。尾部は一般に長さ約１０〜２５ヌクレオチドである。標的結合配列は、その標的特異性を決定するプライマーの一部であるため、標的の末端に専用の配列を必要としない増幅方法の場合、一般に増幅プライマーは本質的に標的結合配列のみで構成される。ニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびＳＤＡの尾部以外の標的に追加された、専用の配列（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転写ベースの増殖用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を必要とする増幅方法では、ルーチンのオリゴヌクレオチド調製方法を使用して、プライマーのハイブリッド形成特異性を変えずに、必要とする専用の配列を標的結合配列に連結させることが可能である。
【０００９】
バンパープライマーまたは外部プライマーは、等温増幅反応でプライマー伸長生成物を置換するために使用される。このバンパープライマーは、バンパープライマーの伸長が下流の増殖プライマーとその伸長生成物を置換するという具合に、増幅プライマーの上流の標的配列にアニーリングする。
【００１０】
標的または標的配列は、増幅すべき核酸配列を指す。これは、増幅すべき最初の核酸配列、増幅すべき最初の核酸配列の第２鎖および増幅反応によって産生された最初の配列のコピーのいずれかの鎖を含む。これらのコピーは、増幅プライマーがハイブリッド形成する対象である配列のコピーを含むという理由で、増幅可能な標的の役割をする。
【００１１】
増幅反応中に生じた標的配列のコピーは、増幅生成物、アンプリマー、またはアンプリコンと呼ばれる。
伸長生成物という用語は、プライマーのハイブリッド形成および標的配列を鋳型として使用するポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生じる標的配列のコピーを指す。
【００１２】
種特異性という用語は、同じ属の他種または異なる属の種では実質的に検出、増幅またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成しないが、ある生物種または一群の関連種ついては検出、増幅またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成することを指す。
アッセイプローブという用語は、核酸の検出または同定を容易にするために使用されるオリゴヌクレオチドを指す。たとえば、本発明では、アッセイプローブはN. gonorrhoea核酸の検出および同定に使用される。以下に記載の検出プローブ、検出用プライマー、捕捉プライマーおよびシグナルプライマーは、アッセイプローブの例である。
添付の図面と一緒に読むと、以下の詳細な説明から本発明の様々な目的、長所および斬新な特徴が容易に理解できるであろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸増幅反応でNeisseria gonorrhoeaについて特異性を示すオリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよびアッセイプローブを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドを使用してNeisseria gonorrhoeaの核酸を検出および同定する方法も提供する。好ましい方法はｔＳＤＡおよび均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ反応でオリゴヌクレオチドを使用することである。以上の方法は米国特許第５，５４７，８６１号、米国特許第５，６４８，２１１号、１９９７年５月３０日に提出された米国特許出願第０８／８６５，６７５号、および１９９７年５月１３日に提出された米国特許出願番号第０８／８５５，０８５号により教示されており、引用することによりこの開示内容は本明細書の一部をなすものとする。
【００１４】
本発明は、Neisseria gonorrhoeaゲノムＤＮＡを特異的に増幅して検出する３種のｔＳＤＡシステム（ＧＣＩＲ５、ＧＣＩＲＳＬおよびＧＣ０２）を提供する。各システムについて数種プライマーの組み合わせをデザインし、統計学的にデザインされた実験で試験した。各システムについて最良のプライマーの組み合わせで、特異性、感度および交差反応性の実験を行った。
【００１５】
N. gonorrhoeaゲノムＤＮＡの８００塩基対領域を対象に配列分析を実施した。
プライマーGC 1.3、5'-CTGATATCTGCATGGAGGCAA-3'(配列番号１)およびGC 2.3、 5'-GATCGTAATCTCCGCCTTTCTT-3'(配列番号２) を使用して、８００bp領域を作成し、IR.R.2、5'-CCGCAGCATACGCGCAAATCAA-3'(配列番号３)およびIRLI、5'- GGTATGGTTTCAAGACGCTTCA-3'(配列番号４)を使用して、その内部の２００bp領域を作成した。しかし、このフラグメント内に、Neisseria種との交差反応性領域が幾つか同定された。この情報に基づいて、３種のｔＳＤＡシステムをデザインした。
【００１６】
Neisseria gonorrhoea核酸の８００bpフラグメントに基づいて、プライマーをデザインした。最適条件に合うように、プライマーの組み合わせをスクリーニングした。様々な検出用プローブのｔＳＤＡ反応および蛍光リアルタイムｔＳＤＡ反応における特異性および感度を試験した。
【００１７】
核酸はハイブリッド形成に完全な相補性を必要としないため、本願明細書に開示されているプローブ配列およびプライマー配列は、Neisseria gonorrhoeaに特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性を喪失せずに、ある程度修飾できることが理解されるであろう。当該技術において周知の通り、ハイブリッド形成条件（すなわち、ハイブリッド形成温度または緩衝液の塩含有量）を調節してストリンジェンシーを増大または低減することにより、相補的核酸配列および部分的相補的核酸配列のハイブリッド形成を達成することが可能である。開示された配列のこのような些細な修飾およびNeisseria gonorrhoeaについての特異性を維持するために必要なハイブリッド形成条件の調節は、ルーチンの実験のみを必要とし、且つ当該技術上通常の熟練の範囲内である。
【００１８】
本発明のプライマーを使用して製作した増幅生成物は、独特のサイズによってたとえば、臭化エチジウムで染色したポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で、検出することが可能である。あるいは、検出可能な標識で標識したオリゴヌクレオチドであるアッセイプローブを使用して、増幅されたN. gonorrhoea標的配列を検出することが可能である。１つの実施態様では、少なくとも１つのアッセイプローブを、ハイブリッド形成（検出用プローブ）、Walker et al., Nucl. Acids Res.,前出に記載のハイブリッド形成および伸長（検出用プライマー）、または欧州特許第0 678 582号に記載のハイブリッド形成、伸長および二本鎖型への変換（シグナルプライマー）によって増幅された標的配列の検出に使用することが可能である。好ましくは、アッセイプローブは、増幅プライマーの間にある標的の配列にハイブリッド形成するように選択される、すなわち、アッセイプローブは内部アッセイプローブでなければならない。あるいは、増幅プライマーまたはその標的結合配列を、アッセイプローブとして使用することが可能である。
【００１９】
アッセイプローブの検出可能な標識は、標的核酸が存在する指標として、直接または間接に検出することができる部分である。標識の直接検出の場合、アッセイプローブを放射性同位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出するか、または蛍光部分で標識して当該技術上周知の蛍光で検出することが可能である。あるいは、アッセイプローブを検出可能にするために別の試薬を必要とする標識で標識することによって、アッセイプローブを間接的に検出することが可能である。間接的に検出可能な標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応生成物を生じる酵素および標識された特異的結合パートナー（たとえば、抗体または抗原／ハプテン）に結合することによって検出することが可能なリガンド（たとえば、ハプテン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、検出を容易にするために、リガンド−標識オリゴヌクレオチドを固相に固定するのにも有用である（捕捉プローブ）。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合することによって検出できる）および西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素（酵素基質を加えて有色反応生成物を生ずることによって検出できる）などがある。オリゴヌクレオチドに、このような標識を加えたりこのような標識を含める方法は当該技術上周知であり、これらの方法のいずれも本発明について使用するのに適している。
【００２０】
使用することが可能な特異的検出方法の例としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載されているビオチン化された捕捉プローブおよび酵素複合検出用プローブを使用して増幅生成物を検出する化学発光法がある。上記２つのアッセイプローブを、標的配列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマーの結合部位の間）にハイブリッド形成した後、捕捉プローブを使用して、この複合体をストレプトアビジンでコートした微量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを発生させて照度計で読む。増幅生成物を検出する別の代わりとして、欧州特許第0 678 582号に記載のシグナルプライマーがＳＤＡ反応に含まれていてもよい。この実施態様では、標識された二次増幅生成物が、標的の増幅に依存的な様式でＳＤＡ中に作られ、これを、関連標識を使用して標的増幅の目安として検出することができる。
【００２１】
商業的に便利なため、N. gonorrhoea核酸の特異的検出および同定のための増幅プライマーをキットの形で提供することが可能である。一般に、このようなキットは、本発明による増幅プライマーを少なくとも１対含む。N. gonorrhoeaに特異的な増幅プライマーと共に、核酸増幅反応を実施するための試薬たとえば、緩衝液、別のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素なども含んでもよい。キットの成分は、普通の容器内に一緒に包装されており、場合に応じて、本発明の方法の個々の実施態様を実施するための説明書が入っている。他の任意の成分、たとえば、アッセイプローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための試薬または方法も、キットに含めることができる。
【００２２】
検出用プローブと関連した増幅プライマーの標的結合配列は、ハイブリッド形成の種特異性をオリゴヌクレオチドに与えることができ、したがって増幅に基づくアッセイに種特異性を与えることができる。選択された増幅反応の実施に必要であれば、オリゴヌクレオチドの種特異性を変えずに、他の配列を、本願明細書に開示されている標的結合配列に任意に加えることが可能である。例として、本発明のN. gonorrhoeaに特異的な増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックされる制限エンドヌクレアーゼBsoB1の認識部位を含んでもよい。欧州特許第0 648 315号に記載の認識部位を含むがこれに限定されない、他のニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位をBsoB1認識部位の代わりに用いてもよいことが当業者には明白であろう。好ましくは、認識部位は、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）の条件下で増幅反応を実施することができるように好熱性制限エンドヌクレアーゼとして用いられる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（５(から制限エンドヌクレアーゼ認識部位まで）は一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用される制限部位および自身の標的結合配列または他のプライマーのいずれかにハイブリッド形成する配列は避けなければならない。したがって、本発明によるＳＤＡ用の増幅プライマーは、３(標的結合配列、ニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位５(から標的結合配列まで、および長さ約１０〜２５ヌクレオチドの尾部配列から制限エンドヌクレアーゼ認識部位までで構成される。ニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびテイル配列は、ＳＤＡ反応に必要な配列である。他の増幅反応の場合、本発明による増幅プライマーは、開示されている標的結合配列のみで構成されてもよく（たとえば、ＰＣＲの場合）、または標的結合配列と選択された増幅反応に必要な別の配列（たとえば、上述のＳＤＡに必要な配列または３ＳＲ用ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター）とで構成されてもよい。
【００２３】
ＳＤＡでは、バンパープライマーは下流の種特異的増殖プライマーと置換する作用をするため、バンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。バンパープライマーが伸長されるとき、ハンパープライマーが増幅プライマーとその伸長生成物を置換えるために、バンパープライマーが増幅プライマーから上流の標的にハイブリッド形成できることのみが必要である。したがって、バンパープライマーの個々の配列は、一般に重要ではなく、バンパープライマーが伸長するとすぐに、増幅プライマー伸長生成物を置換できるほど、増幅プライマーの結合部位に十分に近い任意の上流標的配列から誘導することが可能である。バンパープライマーが相変わらず特定の標的配列にハイブリッド形成できる限り、バンパープライマー配列における標的と時にミスマッチがあったとしても、または非標的配列との若干の交差ハイブリッドを形成しても、一般に、それらのことが増幅効率に負の影響を及ぼすことはない。しかし、本願明細書に記載のバンパープライマーはN. gonorrhoeaに特異的であり、したがって要望があれば、増幅プライマーの標的結合配列としても使用することができる。
【００２４】
本発明のプライマーを使用する増幅反応は、Walkerら（前出）による教示通り、チミンを含んでもよく、あるいは、たとえば欧州特許第0 624 643号に教示されている通りに、ＴＴＰの代わりに2(-デオキシウリジン5(-三リン酸を全体的にまたは部分的に反応に用いて、次の増幅反応の交差汚染を減少させることが可能である。ｄＵ（ウリジン）は増幅生成物中に組込まれるため、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）処理によって切り取ることができる。これらの非塩基性部位は、次の増幅反応で増幅生成物を非増幅可能にさせる。次の増幅を実施する前に、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（Ｕgi）によってＵＤＧを失活させ、新たに形成された増幅生成物におけるｄUの切除を防止することができる。
【００２５】
プライマー、バンパーおよび検出用配列の異なる組み合わせを使用して、ｔＳＤＡを実施するための他のシステムを開発した。しかし、他のシステムは、特性が十分にないこと、最適条件の範囲が狭いこと、安定でないことなど様々な理由で好ましくなかった。
N. gonorrhoea核酸配列の均一な核酸増幅およびリアルタイム検出を実施するのに有用であったシステムを、下記のプライマーおよび検出用配列から開発した。
【００２６】
【表１】
0004209977.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004209977.tif 000003
【００２８】
【表３】
0004209977.tif 000004
【００２９】
蛍光リアルタイムｔＳＤＡ技術を使用して、Neisseria gonorrhoeaの分析を実施した。ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬ用にデザインしたプライマー、バンパーおよび検出用配列を、それぞれ図１および図２に示す。ＤＮＡ配列の上または下の四角で、増幅プライマーおよび蛍光検出用配列のアニーリング領域を示す。最適感度を得るために、蛍光ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬのｔＳＤＡの条件を継続的に修飾した。下記は、ＧＣＩＲ５用のこのような１組の最適条件およびＧＣＩＲＳＬ用のこのような１組の最適条件である。
【００３０】
ＧＣＩＲ５
７％グリセロール
８％ＤＭＳＯ
４５mMリン酸カリウム
(0.1mM)dATP、(0.1mM)dGTP、(0.25mM)dUTP、(0.7mM)α−チオdCTP
５mM酢酸マグネシウム
１００μg/mlＢＳＡ
１．８２％トレハロース
３６０μM ＤＴＴ
２４００ngヒトＤＮＡ
３２０単位BsoBI制限エンドヌクレアーゼ
２０単位Bstポリメラーゼ
１単位ウラシル−N−グリコシラーゼ
５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター
２００nM検出用配列（ＦＤ１０）（配列番号１５）
５００nM増幅プライマー（GCIR-AL5.3（配列番号７）およびGCIR-AR5.1（配列番号８））
５０nMバンパー（GCIR-BL5.1（配列番号１１）およびGCIR-BR5.1（配列番号１２））
【００３１】
反応体積１００μl
除染を４５℃で２０分間実施した
増幅を５２℃で６０分間実施した
【００３２】
ＧＣＩＲＳＬ
７％グリセロール
５％ＤＭＳＯ
２５mMリン酸カリウム
(0.2mM)dATP、(0.2mM)dGTP、(0.5mM)dUTP、(1.4mM)α−チオdCTP
６mM酢酸マグネシウム
１００μg/mlＢＳＡ
１．８２％トレハロース
３６０μM ＤＴＴ
２０００ngヒトＤＮＡ
１単位ウラシル−N−グリコシラーゼ
５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター
４８０単位BsoBI
３０単位Bst
２００nM検出用配列（ＧＣＩＲＳＬ．ＦＤ１（配列番号３１））
５００nM増幅プライマー（GCIRSL-APL1（配列番号２２）およびGCIRSL.APR1（配列番号２４））
５０nMバンパー（GCIRSL.BL（配列番号２７）およびGCIRSL.BR（配列番号２８））
【００３３】
反応体積１００ul
除染を４５℃で２０分間実施した
増幅を５２℃で６０分間実施した
【００３４】
例に詳細に説明する通り、検出用配列GCIR5-FD10（配列番号１５）およびGCIRSL-FD1（配列番号３１）と、標的ＤＮＡ源としてのプラスミドＧＣ１０とを使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬの感度を評価した。プラスミドＧＣ１０は、ｐUC18に挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲノムの８００塩基対領域を含む。ＧＣ１０プラスミドの２５０コピー、５０コピー、２５コピーおよび１２コピーの滴定を使用して、蛍光ｔＳＤＡを実施した。ＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５は、下は２５コピーのＧＣ１０プラスミドまで検出することができた。リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲＳＬの感度は、２５０コピーのＧＣ１０プラスミドであると決定された。陽性であるという反応の判定は、試料反応のＲＦＵ値とネガティブコントロール（標的ＤＮＡを全く加えない）のＲＦＵ値を比較することによって決定した。ＧＣ１０との反応によって、ネガティブコントロールの平均ＲＦＵ値の２〜３倍より大きいＲＦＵ値が生じれば、その時は陽性であると考えた。
【００３５】
ＧＣＩＲ５の他の検出用配列は、別の実験で試験されていた。ＦＤ１（配列番号２１）、ＦＤ２（配列番号２０）、ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ６（配列番号１９）、ＦＤ８（配列番号１６）、ＦＤ１１（配列番号１８）。ＦＤ８、ＦＤ３およびＦＤ１は、２５０コピーのレベルでＧＣ１０プラスミドを検出することができたが、ＦＤ１１，ＦＤ６およびＦＤ２などの他のものは、この同一標的濃度で、ＲＦＵ値が低かった。このことから、最高の感度を得るためには、複数の検出用配列／長さを試験することが重要なことがわかり、結果として、GCIR5-FD10（配列番号１５）をリアルタイム蛍光ｔＳＤＡで使用する一次検出用として選択した。
【００３６】
様々なNeisseria gonorrhoea菌株、他のNeisseria種、および無関係の細菌およびウイルスを試験することによって、ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬの特異性および交差反応性を決定した。Neisseria gonorrhoeakin１２菌株を１×１０4ゲノムで試験した。全ての交差反応体ＤＮＡを約１〜１０7ゲノムコピーに希釈した。Neisseria gonorrhoea１２菌株を１×１０4ゲノムで試験した。全ての交差反応物ＤＮＡを約１×１０7ゲノムコピーに希釈した。複数の実験による特異性および交差反応性を表９にまとめる。
【００３７】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プライマーの伸長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位のニッキング、１本鎖伸長生成物の置換、プライマーの伸長生成物（または最初の標的配列）へのアニーリング、および次のプライマーの伸長が反応混合物中で同時に起こる等温核酸増幅法である。これは、反応の温度循環特性の結果として、反応の諸段階が不連続な相またはサイクルで起こるポリメラーゼ連鎖反応とは違う。ＳＤＡは、１）制限エンドヌクレアーゼが、ヘミチオリン酸型の二本鎖認識／開裂部位の未修飾鎖をニックできること、２）あるポリメラーゼが、ニックで複製を開始し、下流の非鋳型鎖を置換できることに基づいている。プライマーアニーリング用の二本鎖標的配列を変性させるため、高温（約９５℃）で初回インキュベーション後、その後の重合および新たに合成された鎖の置換は一定の温度で行われる。標的配列の各新しいコピーの生産は、５つの段階で構成される。１）増幅プライマーを、最初の標的配列または予め重合させて置換した一本鎖伸長生成物に結合させること、２）α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組み込む５(−３(エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによるプライマーの伸長、３）半修飾二本鎖制限部位のニッキング、４）ニック部位からの制限酵素の分離、および５）５(−３(エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによる、ニックの３(末端からの伸長と、下流の新たに合成された鎖の置換。ニックからの伸長によって別のニック可能な制限部位が発生するため、ニッキング、重合および置換は一定の温度で同時に且つ連続的に起こる。一対の増幅プライマーを使用し、その各々が二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリッド形成するとき、増幅は指数関数的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が、次の回の増幅で反対側のプライマーの鋳型の役割を果たすためである。増幅プライマーを１個使用するとき、鎖１本のみがプライマー伸長の鋳型の役割をするため、増幅は直線的である。α−チオｄＮＴＰが組み込まれるとき、二本鎖認識／開裂部位をニックする制限エンドヌクレアーゼの例は、HincII、HindII、AvaI、NciIおよびFnu4HIである。以上の制限エンドヌクレアーゼ全てと、必要なニッキング活性を示す他の制限エンドヌクレアーゼは、従来のＳＤＡで使用するのに適している。しかし、これらは比較的に熱に不安定であり、約４０℃を超えると活性を失う傾向がある。
【００３８】
標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼで制限することによって、より大きい核酸を分割することによって、ＳＤＡによる増幅の標的を調製することが可能である。しかし、Walkerら（Nuc. Acids Res. (1992)前出）および米国特許第５，２７０，１８４号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の通りに、ＳＤＡ反応におけるニッキング用に選択された制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標的核酸を調製することが一般に好ましい。簡単に説明すると、標的配列が二本鎖の場合、４種のプライマーが標的配列にハイブリッド形成する。そのプライマーのうち２種（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、２種（Ｂ1およびＢ2）は外部プライマーまたはバンパープライマーである。Ｓ1とＳ2は、標的配列に隣接する二本鎖核酸の反対の鎖に結合する。Ｂ1とＢ2は、それぞれＳ1およびＳ2の標的配列５(（すなわち、上流）に結合する。３種のデオキシヌクレオシド三リン酸および少なくとも１種の修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（たとえば、２(−デオキシアデノシン５(−O−(１−チオ三リン酸)、「ｄＡＴＰαＳ」）が存在する条件下で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを使用して４種のプライマー全てを同時に伸長させる。置換された、増幅プライマーの一本鎖伸長生成物は、反対の増幅プライマーおよびバンパープライマーを結合する標的の役割をする（たとえば、Ｓ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2を結合する）。次の伸長および置換のサイクルで、各末端に半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する２つの二本鎖核酸フラグメントが生じる。これらは、ＳＤＡによる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様、標的生成反応の個々の段階は同時に且つ連続的に起こり、ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な末端に認識／開裂部位を有する標的配列が生じる。ＳＤＡ反応の成分の全てが既に標的生成反応に存在するため、自動的且つ連続的に発生した標的配列はＳＤＡサイクルに入って増幅される。
【００３９】
１つのＳＤＡ反応が別の増幅生成物によって交差汚染されるのを防止するために、増幅反応を阻害せずに、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み込むことが可能である。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによって、ウラシル修飾核酸を特異的に認識させ失活させることが可能である。したがって、先行反応でＳＤＡ増幅ＤＮＡにｄＵＴＰが組み込まれる場合、二本鎖標的を増幅する前に、後続のあらゆるＳＤＡ反応をＵＤＧで処理し、以前の増幅反応由来のｄＵ含有ＤＮＡを増幅不可能にさせることができる。その後の反応で増幅すべき標的ＤＮＡはｄＵを含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次に、標的を増幅する前にUgiで処理することにより、ＵＤＧを阻害することが可能である。あるいは、UDGを熱失活させてもよい。好熱性ＳＤＡでは、より高い反応温度そのもの（≧５０℃）を使用してＵＤＧ失活と標的の増幅を同時に行うことができる。
【００４０】
ＳＤＡには、５(−３(エキソヌクレアーゼ活性がなく、二本鎖核酸の一本鎖ニックで重合を開始し、ニックの下流で鎖を置換すると同時に、非ニック鎖を鋳型として使用して新しい相補鎖を生成するポリメラーゼが必要である。非結合３(−ＯＨにヌクレオチドを加えることによって、このポリメラーゼを伸長させなければならい。ＳＤＡ反応を最適化させるためには、ポリメラーゼが極めて前進的であり、増幅することが可能な標的配列の長さを最大にすることが望ましい。極めて前進的なポリメラーゼは、伸長生成物の分離および合成停止前に、かなりの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性は、コピーのさらなる合成に標的を利用できるようにし、指数関数的な増幅反応で第二の増幅プライマーをハイブリッド形成することが可能な対象である一本鎖伸長生成物を生成するため、増幅反応に置換活性は不可欠である。反応を永続させ、次回の標的増幅を開始させるのはニッキングであるため、ニッキング活性も非常に重要である。
【００４１】
好熱性ＳＤＡは、望ましい熱安定なポリメラーゼおよび熱安定な制限エンドヌクレアーゼを置き換えて、Walkerら（PNASおよびNuc. Acids Res. (1992)前出）に記載の従来のＳＤＡと本質的に同様に実施される。もちろん、置換された酵素に適したより高い温度に反応温度を調節し、HincII制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を、選択された熱安定なエンドヌクレアーゼの適当な制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位と置換する。また、Walkerらとは違って、酵素が変性温度で十分に安定であれば、初回変性ステップの前に、臨床医は反応混合物に酵素を含めることが可能である。好熱性ＳＤＡで使用するのに好ましい制限エンドヌクレアーゼはBsrI、BstNI、BsmAIおよびBsoB1（New England BioLabs）、およびBstOI（Promega）である。好ましい好熱性ポリメラーゼはBca (Panvera)およびBst（New England BioLabs）である。
【００４２】
均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡはｔＳＤＡの改良型である。この方法は検出用オリゴヌクレオチドを使用して、蛍光消光を標的依存性様式で減少させる。検出用オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下で蛍光消光が起こるように結合されたドナー／アクセプター色素対を含む。標的の存在下で検出用オリゴヌクレオチドの分子内塩基対二次構造が開いて線状化する(linearize)と、色素間の距離が増大し、蛍光消光が減少する。一般に、塩基対二次構造の展開は、二次構造が少なくとも部分的に崩壊されるような、二次構造の配列と相補鎖との間の分子内塩基対形成を含む。塩基対二次構造は、十分な長さの相補鎖の存在下で完全に線状化すると考えられる。好ましい実施態様で、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Restriction endonuclease recognition site;ＲＥＲＳ）は２つの色素の間に存在し、二次構造と相補鎖との間の分子内塩基対はＲＥＲＳも二本鎖にして、制限エンドヌクレアーゼで開裂可能にする。制限エンドヌクレアーゼによる開裂またはニッキングは、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸フラグメント上に分け、さらに消光を減少させる一因となる。いずれの実施態様でも、関連する蛍光パラメータの変化（たとえば、ドナー蛍光強度の増加、アクセプター蛍光強度の低減または展開前後の蛍光の比率）を標的配列の存在の指標としてモニタリングする。一般にドナー蛍光強度の変化はアクセプター蛍光強度の変化よりも大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタリングすることが好ましい。蛍光寿命の変化など、他の蛍光パラメータをモニタリングしてもよい。
【００４３】
均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出用オリゴヌクレオチドは、標的配列（標的結合配列）にハイブリッド形成する一本鎖５(セクションまたは３(セクションを含むオリゴヌクレオチドであり、標的結合配列に隣接する分子内塩基対二次構造である。本発明のオリゴヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成するとき蛍光が消え、二次構造が開いて線状化すると蛍光消光が減少するという具合に、検出用オリゴヌクレオチドに結合したドナー／アクセプター色素対をさらに含む。オリゴヌクレオチドの開裂は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖のホスホジエステル結合の破壊または一本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合の破壊を指す。これは、ＤＮＡ二重らせんの鎖２本のうちの１本のみのホスホジエステル結合の破壊を指すニッキングとは違う。
【００４４】
均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の発明の検出用オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長またはハイブリッド形成のために選択された反応条件で分子内塩基対二次構造を形成する配列を含む。この二次構造は、標的結合配列の少なくとも一部が一本鎖３(テイルまたは５(テイルを形成するように、検出オリゴヌクレオチドの標的結合配列に隣接して位置する。本願明細書で使用されるとき、用語「標的結合配列に隣接した」は標的結合配列の全部または一部が、標的へのハイブリッド形成に利用できる５(尾部または３(尾部中に一本鎖のまま残されることを意味する。すなわち、二次構造は標的結合配列全体を含まない。標的結合配列の一部が二次構造の分子内塩基対形成に含まれてもよく、二次構造の分子内塩基対形成に含まれる第１の配列の全部または一部を含んでもよいが、その相補的配列内に伸長しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌクレオチドの標的結合配列が一本鎖３(尾部として存在する場合、標的結合配列もステムの第１アームの全部または一部、および場合に応じて、ループの全部または一部に伸長してもよい。しかし、標的結合配列は、ステム分子内塩基対形成に関与する配列の第２アーム内に伸長しないことが好ましい。すなわち、標的にハイブリッド形成することができる二次構造の分子内塩基対形成に関与する両配列を具有しないことが望ましい。検出用オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対部分が不適当な組み合わせの場合、標的の存在下で蛍光の変化の大きさが低減するが、アッセイの感度が問題でなければ、容認できる。一本鎖尾部の標的結合配列の不適当な組み合わせも容認できるが、同様にアッセイの感度および／または特異性が低減する可能性がある。しかし、二次構造と標的結合配列の両者における完全な塩基対形成が反応を犠牲にしないことが本発明の特徴である。ハイブリッド形成に関与する配列が完全に適合すると、反応速度論に負の影響を及ぼすことなく、分析の特異性が向上する。
【００４５】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドシグナルプライマーを増幅反応に加えると、増幅プライマーのハイブリッド形成および伸長によって二本鎖型に変換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構造を開いたり線状化したりし、相補鎖の合成によってこれを二本鎖型に変換する。ＲＥＲＳは、存在すれば、二本鎖で且つ制限エンドヌクレアーゼで開裂可能またはニック可能になる。ポリメラーゼの鎖置換活性によって二次構造が展開されたり線状化されたりすると、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離が増大し、その結果ドナー蛍光の消光が低減する。関連した、ドナー色素またはアクセプター色素のいずれかの蛍光の変化を、標的配列の増幅の指標としてモニタリングしたり検出したりすることが可能である。一般に、ＲＥＲＳが開裂またはニックすると、二本鎖二次増幅生成物の別々のフラグメントが２個生じ、各々に２種の色素のうちの１種が結合しているため、蛍光の変化の大きさがさらに増大する。このフラグメントは反応溶液中で自由に拡散でき、ドナー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。ドナー蛍光強度の増大またはアクセプター蛍光強度の低減は、標的増幅が起こっているまたは起こった指標として、検出および／またはモニタリングすることができるが、ドナー／アクセプター色素対の近接によって影響を受ける他の蛍光パラメータもモニタリングすることが可能である。ドナーまたはアクセプターの蛍光強度の変化も、ドナーおよび／またはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出することが可能である。たとえば、ａ）二次構造を線状化または展開した後のドナー発蛍光団蛍光と、線状化または展開する前の検出用オリゴヌクレオチドにおけるドナー発蛍光団蛍光との比率の増加、またはｂ）線状化(linearization)または展開した後のアクセプター色素蛍光と、線状化または展開する前の検出用オリゴヌクレオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低減として、蛍光強度の変化を検出することが可能である。
【００４６】
ＳＤＡのほかにも、本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡ）におけるシグナルプライマー用に改変することが可能である。たとえば、ＰＣＲ増幅プライマーおよび５(→３(エキソヌクレアーゼ活性のない鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、PrimegaのSequencing Grade TaqまたはNew England BioLabsのexo-Ventまたはexo-Deep VentをＰＣＲで使用することによって、この方法をＰＣＲ用に改変することが可能である。検出用オリゴヌクレオチドシグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的にハイブリッド形成し、置換されて、本質的にＳＤＡに関する記載と同様に二本鎖になる。一般に、ＲＥＲＳの開裂よりむしろニッキングを誘導すると考えられる修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸が全く存在しないため、ＰＣＲでは、場合に応じて検出用オリゴヌクレオチド用ＲＥＲＳを選択することが可能である。温度周期はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限エンドヌクレアーゼは、最終周期のプライマーアニーリングおよび増幅のエンドポイント検出のための伸長の後に低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通して活性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼは、増幅中ずっと存在することができ、即時アッセイを実施することが可能である。ＳＤＡシステムの場合と同様、二次構造の線状化および色素対の分離によって蛍光消光が低減し、強度などの蛍光パラメータの変化は標的増幅の指標の役割をする。
【００４７】
検出用オリゴヌクレオチドの展開または線状化に起因する蛍光の変化は、選択された反応のエンドポイントで検出することが可能である。しかし、線状化された二次構造はハイブリッド形成およびプライマー伸長と同時に生じるため、反応が起こるにつれて、すなわち「リアルタイム」に、蛍光の変化もモニタリングすることが可能である。この均一リアルタイムアッセイフォーマットを使用して、存在する標的の初期量に関する半定量的または定量的情報を提供することができる。たとえば、（標的増幅の一部として、または非増幅検出方法で）展開反応中または直線反応中に蛍光強度が変化する速度は、初期標的レベルの指標である。結果として、存在する標的配列の初期コピーが多いほど、ドナー蛍光は選択された閾値に速やかに（すなわち、短時間で確実に）達する。同様に、アクセプター蛍光の減少は短時間で確実に達し、選択された最小値に達するのに要する時間として検出される。さらに、反応経過中の蛍光パラメータの変化の速度は、初期標的含有量が少ない試料よりも初期標的含有量が多い試料で迅速である（すなわち、上昇勾配の蛍光曲線）。当該技術上周知の通り、これらの測定または他の測定を、標的が存在する指標として、あるいは標的増幅の指標として行うことができる。一般に、標的の初期量は、実験結果と既知量の標的の結果とを比較することによって決定される。
【００４８】
本発明の方法による選択された標的配列の存在のアッセイは、溶液または固相で実施することができる。検出用オリゴヌクレオチドがプライマーの役割をするリアルタイムまたはエンドポイント均一アッセイは一般に溶液で行われる。本発明の検出用オリゴヌクレオチドを使用するハイブリッド形成アッセイは溶液でも実施することが可能である（たとえば、均一リアルタイムアッセイとして）が、標的のリアルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相アッセイに特に適している。固相アッセイでは、当該技術上周知の方法を使用した内部標識または末端標識によって検出用オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビーズ、膜または反応容器）に固定することが可能である。たとえば、ビオチン標識検出用オリゴヌクレオチドをアビジン修飾固相に固定することが可能であり、この場合、適切なハイブリッド形成条件で標的に曝露したとき蛍光を変化させる。この様式で標識を捕捉すると、試料から標的を分離することが容易になり、シグナルの検出またはアッセイの他の局面を妨害する可能性がある試料注の物質を除去することができる。
【００４９】
以下の実施例は本願明細書に記載の本発明の詳細な実施例を示す。当業者には明白であろうが、様々な変化および修正が可能であり、様々な変化および修正は記載されている本発明の範囲内であると考えられる。
【００５０】
【実施例】
例１
ｔＳＤＡプライマーセットのデザイン
ｔＳＤＡプライマーセットのデザインに関して、同定された８００bpのN. gonorrhoea配列を試験した。ＧＣ伸長またはＡＴ伸長、および／またはプライマー間の強力な相互作用を引起こす小さい反復が存在するため、ゲノムのある領域を避けた。ΔＧ値が高いプライマー／プライマー相互作用のため、潜在的に問題がある可能性のあるｔＳＤＡセットを、ソフトウエアプログラムOligoTM（National Biosciences, Inc., Plymouth, Minnesota）を使用して選別除去した。様々なプライマーセットを領域内にデザインした。数セットは直ちに退けられ、幾つかは本格的な相互作用が欠如していた。試験した全セットの中から、さらなる研究用に１つ−ＧＣＩＲ５を選択した。左増幅プライマーと右増幅プライマーの両者の３種の変異体を含むＧＣＩＲ５を設計した（図１）。これによって、様々な組み合わせのプライマーを試験することが可能になり、その各々は異なるTmを有していた。ＧＣＩＲ５システムを包含する全てのプライマーおよびその位置を図１の線図に示す。
【００５１】
例２
ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡ反応条件のデザイン
異なる濃度の補助溶剤の存在下および異なる温度で、６種のＧＣＩＲ５プライマーの組み合わせを試験するために、統計学的にデザインされた実験を実施した。この実験を使用して、広い条件スペクトル全域にわたって、どのプライマー対が最も優れた増幅惹起能力を有するかを決定した。次の変数を試験した：リン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、ＤＭＳＯ（３％および８％）、グリセロール（３．５％および７％）、ヒトＤＮＡ（６５0ngおよび１０５０ng）、増幅温度（５２℃および５４℃）。結果から、次のｔＳＤＡ条件で最大の増幅が得られることがわかる。
【００５２】
【表４】
0004209977.tif 000005
【００５３】
試験した増幅プライマー全部が有効であったため、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）など、他のプライマーも有効であると考えられる。さらに、ＤＩＬの代わりにＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）を32P検出用プローブとして使用することが可能である。ＧＣＩＲ−ＡＬ５．３とＧＣＩＲ−ＡＲ５．１の組み合わせが最適プライマーセットであった。試験したプライマーセットは全て１×１０6ゲノムでN. gonorrhoea BDMS 2900を増幅することができたが、ある条件下では、他より有効なものも数セットあった。これらのプライマーセットを用いて、戦略的デザインに基づいてさらに実験した結果、ＤＭＳＯおよびグリセロールの濃度をＤＭＳＯ５．５％、グリセロール５．２％に変えることにより、上記反応条件が最適化された。他の全ての補助溶剤濃度および酵素濃度は上記の通りであった。
【００５４】
例３
ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡ感度のアッセイ
例２に記載の最適ｔＳＤＡ条件を使用して、検出実験の限界を設定した。１×１０6ゲノム／反応から下は１ゲノム／反応まで、N. gonorrhoea菌株BDM2900の滴定を実施した。滴定パネルを試験した。６５０ng／反応および１２５０ng／反応のヒトＤＮＡの存在下、ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡシステムを用いて滴定パネルを試験した。１×１０6、１×１０5および１×１０4ゲノム／反応の試料を１検体試験し、１×１０3ゲノム／反応を二重に試験し、１００、１０および１ゲノムを三重に試験した。陰性コントロールも実験に含めた。１つの試料における増幅の欠如がシステムの感度を示すと考えないことを確実にするために、コピー数が少ないN. gonorrhoeaゲノムを複数の反応で試験する方法を実施した。感度実験の結果は、ＧＣＩＲ５は下は１０ゲノム／反応を３回中３回検出でき、１ゲノム／反応を３回中１回検出できたということであった。
【００５５】
例４
N. gonorrhoea ｔＳＤＡ特異性および交差反応性のアッセイ
ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡシステムの特異性および交差反応性を試験するために、実験を計画した。例２に記載の最適プライマーセットをこの実験で使用した。Neisseria gonorrhoea数菌株を１×１０6ゲノム／反応で試験した。ＧＣＩＲ５は、表２に記載の被験種をことごとく増幅することができた。このｔＳＤＡシステムの特異性は申し分なかった。次に、他のNeisseria種または非Neisseria細菌と交差反応性があるかどうかを決定した。これを実施するために、全ての非交差反応物細菌を１×１０7ゲノム／反応のレベルで試験した。増幅生成物が検出された反応は皆無であった（表６〜７）。
【００５６】
【表５】
0004209977.tif 000006
【００５７】
【表６】
0004209977.tif 000007
【００５８】
【表７】
0004209977.tif 000008
【００５９】
例５
蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるGCIR5プライマー
蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用して、Neisseria gonorrhoeaのアッセイを実施した。このためにデザインしたプライマー、バンパーおよび検出用配列を図１に示す。検出用ＦＤ１（配列番号２１）を用いたＧＣＩＲ５の感度および交差反応性を分析した（表８）。ｐＵＣ１８に挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲノムの８００塩基対領域を含むプラスミド（ＧＣ１０）を標的として使用した。１０００〜２５コピーのプラスミドを用いて試験を実施した。ｔＳＤＡの条件は次の通りであった。
【００６０】
５．２％グリセロール
５．５％ＤＭＳＯ
３５mMリン酸カリウム
２０００ngヒトＤＮＡ
３２０単位BsoB1
２０単位Bst
２００nM検出用配列（ＦＤ１）
５００nM増幅プライマー（AL5.3（配列番号７）およびAR5.1（配列番号８））
５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1（配列番号１２））
除染を４５℃で２０分間実施した
増幅を５２℃で６０分間実施した
【００６１】
PerSeptive Biosystem CytoFluor Series 400 Multiwellプレート読取り装置（「PerSeptive Instrument」）を使用した。１００μLの反応をLab Systems Microtiter Stripに移した。ＧＣ１０の場合、ＦＤ１を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria gonorrhoeaＤＮＡ５０コピーの範囲内である。表４に、GCIR5-FD1を用いて試験した交差反応物を全て記載する。これらの各反応物は、５×１０7ゲノムで試験した（表８）。あるN. meningitidis菌株およびN. lactamica菌株は、時間が経過すると蛍光を生じた。以上の結果から、交差反応性に関連する問題が明らかになり、このため、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１の組み合わせが、蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用する有用なアッセイシステムの候補になる公算は低い
【００６２】
【表８】
0004209977.tif 000009
【００６３】
例６
検出用ＦＤ８およびＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の蛍光リアルタイムｔＳＤＡアッセイにおける感度
検出用プローブＦＤ８（配列番号１６）およびFD10（配列番号１５）を使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲ５の感度を評価した。上記２種のプローブを図１に示す。プラスミドＧＣ１０を標的として使用した。ｔＳＤＡ反応の条件は次の通りであった。
【００６４】
５．２％グリセロール
５．５％ＤＭＳＯ
３５mMリン酸カリウム
２０００ngヒトＤＮＡ
３２０単位BsoB1
２０単位Bst
２００nM検出用ＦＤ８またはＦＤ１０
５００nM増幅プライマーAL5.3（配列番号７）およびAR5.1（配列番号８）
５０nMバンパーBL5.1（配列番号１１）およびBR5.1（配列番号１２）
除染は４５℃で２０分間であった
増幅は５２℃で６０分間であった
【００６５】
PerSeptive Instrumentを上記アッセイに使用した。Lab Systems Microtiter Plate StripをPerSeptive Instrumentと一緒に使用した。反応の体積は１００μLであった。ＧＣＩＲ５−ＦＤ８の組み合わせもＧＣＩＲ５−ＦＤ１０の組み合わせも下は１２コピーのＧＣ１０プラスミドを検出することができた。このデータを表９に示す。上記バックグラウンドの２〜３倍のＲＦＵ値を陽性と考えた。
【００６６】
【表９】
0004209977.tif 000010
【００６７】
例７
リアルタイム蛍光ｔＳＤＡにおける検出用FD3、FD8またはFD10を用いたGCIRの交差反応性の分析
検出用ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ８（配列番号１６）またはＦＤ１０（配列番号１５）のいずれか１つと組合せたＧＣＩＲ５の交差反応性をリアルタイム蛍光ｔＳＤＡで分析した。上記３種のプローブを図１に示す。例５で、ＦＤ１（配列番号２１）と組合せたＧＣＩＲ５は特定のN. meningitidis菌株およびLactamica菌株と交差反応性を示さなかった。標的プラスミドＧＣ１０を使用してｔＳＤＡを実施した。２５０コピーの陽性コントロールを、全ての蛍光検出用について試験した。陰性コントロールも試験した。Neisseria meningitidis ATCC 13090、Neisseria lactamica ATCC 23971、23972および49142は全て１×１０7ゲノムコピーで試験した。試験したｔＳＤＡ条件は次の通りであった。
【００６８】
５．２％グリセロール
５．５％ＤＭＳＯ
３５mMリン酸カリウム
２５００ngヒトＤＮＡ
３２０単位BsoB1
２０単位Bst
１６７nM検出用配列（ＦＤ３、ＦＤ８またはＦＤ１０のいずれか）
５００nM増幅プライマー（AL5.3（配列番号７）およびAR5.1（配列番号８））
５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1（配列番号１２））
除染は４５℃で２０分間であった
増幅は５２℃で６０分間であった
【００６９】
PerSeptive Instrumentを上記アッセイに使用した。１００μLの反応をLab Systems Microtiter Stripに移した。ＦＤ３、ＦＤ８またはＦＤ１０を使用するアッセイの中で、試験した菌株と有意な交差反応性を示すものは皆無であった。上記検出用配列は全て、２５０コピーのＧＣ１０で陽性の結果を示した。反対に、検出用ＦＤ１１（配列番号１８）およびＦＤ６（配列番号１９）では、使用したプライマーとバンパーを組合せた場合、有用な結果を与えないことを示す結果が得られた。ＦＤ１１は若干の交差反応性を示したが、ＦＤ６はコントロール標的を用いても、陽性の結果を示すことができなかった。以上の結果を表６に示す。ＦＤ３検出用プローブアッセイを二重に実施した。
【００７０】
【表１０】
0004209977.tif 000011
【００７１】
例８
リアルタイム蛍光ｔＳＤＡアッセイにおけるＦＤ８またはＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の感度
リアルタイム蛍光ｔＳＤＡアッセイにおけるＧＣＩＲ５−ＦＤ８（配列番号１６）およびＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）システムの感度を分析するために、２５０〜６．２５コピーのＧＣ１０プラスミドの滴定を実施した。感度を確実にするために、各滴定濃度を三重に試験した。使用したｔＳＤＡ条件は例７と同じであった。
PerSeptive Instrumentを上記アッセイに使用した。１００μLの反応をLab Systems Microtiter Stripに移した。結果を表１１に示す。ＦＤ８およびＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria gonorrhoeaＤＮＡが１２〜２５コピーの範囲内であった。２５０コピーのＧＣ１０のＲＦＵ値は全て、陰性コントロールでみられるバックグラウンド値より十分に高かった。若干の試料で反応は陽性と思われたが、他はバックグラウンドレベルの蛍光のままであった。
【００７２】
【表１１】
0004209977.tif 000012
【００７３】
例９
ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ用のプライマーのスクリーニング
例２〜５は、ＧＣＩＲ５を用いて実施する実験向けであったが、この例ならびに次の例（６〜８）は、ＧＣＩＲＳＬを使用して得られる結果に向けたものである。異なるプライマーの組み合わせ全部（図２）から、ＧＣＩＲＳＬに最も適したプライマー対を評価するために統計学的にデザインした実験を実施した。このデザインは、リン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、ｈＤＮＡ（５０0ngおよび１２００ng）、温度（５２℃および５４℃）、グリセロール（３％および７％）およびＤＭＳＯ（３％および７％）について各々２種のレベルを試験した。プライマーの組み合わせは全て、反応当たり１０6ゲノムのNeisseria gonorrhoea菌株BDMS 2900を増幅した。広範囲の条件にわたって最高の増幅を示したプライマーの組み合わせは、ＧＣＩＲＳＬ．ＡＰＬ１（配列番号２２）／ＧＣＩＲＳＬＡＰＲ３（配列番号２６）であった。感度実験、特異性実験および交差反応性実験で最大の増幅を示した条件を選択し、これを以下に示す。
【００７４】
ＧＣＩＲＳＬのｔＳＤＡ反応条件（５０uL）
２５mMリン酸カリウムｐH７．６
７％グリセロール
３％ＤＭＳＯ
６mM酢酸マグネシウム
５００ngｈＤＮＡ
１００μg／mL  アセチル化ＢＳＡ
３６０μM ＤＴＴ
０．５mMｄＵＴＰ
０．２mMｄＡＴＰ
０．２mMｄＧＴＰ
０．２mMα−チオ−ｄＣＴＰ
０．５μM ｔＳＤＡプライマー
０．０５μM ｔＳＤＡバンパー
BsoB1１６０単位
Bstポリメラーゼ９単位
ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ１単位
ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼインヒビター５単位
１．８２％トレハロース
４５℃で３０分間除染
５４℃で６０分間増幅
【００７５】
例１０
ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ感度のアッセイ
ｔＳＤＡで増幅し検出することが可能な最小数のゲノムを決定するために、N. gonorrhoea菌株BDMS 2990に対してゲノム滴定を実施した。Neisseria gonorrhoeaＤＮＡを単離し、１０ng／μLヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。１０5、１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノム／反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。ＧＣＩＲＳＬの検出限界は１０ゲノム／反応であった。
【００７６】
例１１
ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡの特異性のアッセイ
Neisseria gonorrhoea１２菌株を１０6ゲノム／反応で使用して、ＧＣＩＲＳＬシステムの特異性を試験した。Neisseria gonorrhoea１２菌株全てが検出された。結果を上記の表５に記載する。
【００７７】
例１２
ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ交差反応性のアッセイ
４３のNeisseria種および非Neisseria種の交差反応性実験を１０7ゲノム／反応で実施した。試験した４３の交差反応体のいずれでも、交差反応性は全くみられなかった。結果を上記の表６〜７にまとめる。
【００７８】
例１３
蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲＳＬプライマー
蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用して、Neisseria gonorrhoeaを分析した。このためにデザインしたプライマー、バンパーおよび検出用配列を図２に示す。検出用ＦＤ１（配列番号３１）を用いたＧＣＩＲＳＬの感度を分析した。ＧＣ１０を標的として使用し、５００〜２５０コピーのプラスミドを試験した。ｔＳＤＡの条件は次の通りであった。
【００７９】
３５mMリン酸カリウムｐH７．６
７％グリセロール
７％ＤＭＳＯ
６mM MgAc
１４５０ngλＤＮＡ
１００μg／ml  アセチル化ＢＳＡ
３６０mMＤＴＴ
０．５mMｄＵＴＰ、０．２mMｄＡＴＰ、０．２mMｄＧＴＰおよび１．４mMα−チオ−ｄＣＴＰ
０．５μMおよび０．０５μMのｔＳＤＡプライマー（ＡＰＬ１（配列番号２２）およびＡＰＲ３（配列番号２６）およびバンパー（ＢＬ（配列番号２７）およびＢＲ（配列番号２８））
１００nM検出用配列（ＦＤ１）
BsoB1 ４８０単位
Bst ３０単位
除染を４５℃で２０分間実施した。
増幅を５２℃で６０分間実施した。
【００８０】
「PerSeptive Instrument」を使用した。体積１００μLの反応をLab Systems Microtiter Stripに移した。結果を表８に示す。ＦＤ１を用いたＧＣＩＲＳＬの感度は、クローン化Neisseria gonorrhoeaプラスミドＧＣ１０１００コピーの範囲内であった。
【００８１】
【表１２】
0004209977.tif 000013
【００８２】
例１４
ＧＣ０２のｔＳＤＡプライマー評価
ＧＣＩＲ５セットおよびＧＣＩＲＳＬセットのプライマーのほかに、三番目のプライマーセットも試験した。２種の左端プライマーと２種の右端プライマーとの可能なプライマーの組み合わせを全て試験するために、戦略的にデザインした実験を実施した。次の変数も使用した。リン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、グリセロール（３．１％および８％）、ＤＭＳＯ（３％および８％）および温度（５２℃および５４℃）。全てのプライマーセットが１０6ゲノムのＧＣ３５２０１を増幅した。更なる実験ののために選択された最も強健なプライマーの組み合わせは、Ｏ２ＡＬ４２．１（配列番号３３）およびＯ２ＡＲ４２．１（配列番号３５）であった。最も高感度の検出用プローブはＯ２ＤＬ４２．１（配列番号３８）であり、これをさらなる実験に使用した。感度、特異性および交差反応性を試験するために選択した条件を以下に列挙する。
【００８３】
ｔＳＤＡ反応混合物
３５mMリン酸カリウムｐH７．６
８％グリセロール
３％ＤＭＳＯ
６mM酢酸マグネシウム
６５０ngヒト胎盤ＤＮＡ
１．４mMα−チオ−ｄＣＴＰ
０．５mMｄＵＴＰ
０．２mMｄＡＴＰ
０．２mMｄＧＴＰ
Bst ポリメラーゼ９単位
BsoB1制限酵素１６単位
ウラシル−N−グリコシラーゼ１単位
ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター２単位
０．５μM ｔＳＤＡプライマー
０．５μM ｔＳＤＡバンパー０２ＢＬ４２．１（配列番号３６）および０２ＢＲ４２．１（配列番号３７）
１．８２％トレハロース
０．３６mMジチオトレイトール
１００μg／ml  アセチル化ウシ血清アルブミン
０．０１５％消泡剤
除染は４５℃で３０分間であった
増幅は５２℃で６０分間であった
【００８４】
例１５
ＧＣ０２ｔＳＤＡ感度の分析
ＧＣ０２ｔＳＤＡシステムで増幅され、検出されるＧＣ菌株ＢＤＭＳ２９００の最小ゲノムコピー数を決定するために、ゲノム滴定を実施した。ＧＣゲノムＤＮＡを単離し、ヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。ｔＳＤＡ反応を実施した。１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノムコピー／反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。ＧＣ０２システムで、１００ゲノムコピーの感度が得られた。
【００８５】
例１６
ＧＣ０２ｔＳＤＡ特異性の分析
Neisseria gonorrhoea１１菌株を１０6ゲノム／反応で使用して、ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記の表５に示す通り、１１菌株全てが検出された。
【００８６】
例１７
ＧＣ０２ｔＳＤＡ交差反応性の分析
４４の関連細菌菌株を１０7ゲノム／反応で使用して、ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記の表６〜７に示す通り、交差反応物種は全く検出されなかった。
【００８７】
本発明をかなり具体的に説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明白な修正を行うことが可能である。本発明の様々な特徴を特許請求の範囲に記載する。
【００８８】
【配列表】
0004209977.tif 000014
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１０３塩基対領域全域の、システムＧＣＩＲ５プライマー、バンパーおよび検出用配列の相対的な位置を示す図である。
【図２】図２は、１００塩基対領域全域の、システムＧＣＩＲＳＬプライマー、バンパーおよび検出用配列の相対的な位置を示す図である。
【図３】図３は、９８塩基対領域全域のＧＣ０２プライマー、バンパーおよび検出用配列の相対的な位置を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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