(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性または急性の気道炎症によって特徴付けられる疾患の治療用医薬の製造のための、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール−３−メチルエーテルおよび４−メトキシエストラジオールよりなる群から選択されるステロイドまたはステロイド類似体の使用。
【請求項２】
該ステロイドが２−メトキシエストラジオールである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
治療すべき疾患が喘息、気道過剰応答性、気管支収縮、気腫、肺炎、アトピー性疾患および肺感染症よりなる群から選択される請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該疾患が喘息である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
該アトピー牲疾患がアレルギー性鼻炎である請求項３に記載の使用。
【請求項６】
２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール−３−メチルエーテルおよび４−メトキシエストラジオールよりなる群から選択されるステロイドまたはステロイド類似体を製薬学的に許容し得る担体と共に含み、吸入による投与に適している組成物。
【請求項７】
治療用である請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は喘息状態を含む慢性および急性の気道の炎症を治療する方法に関する。本発明はまた、該治療に使用されるステロイドまたはステロイド類似体およびこれらの化合物を活性成分として含む医薬組成物にも関する。好ましい態様において、該活性成分は気道壁における炎症および平滑筋細胞増殖を阻害する。また、抗血管形成、抗酸化および微小管の形成を中断させる能力から選択される他の少なくとも１つの活性も有する。
発明の背景
別個の２種類の試薬が現在喘息の治療に使用されている。サルブタモール（salbutamol）およびサルメテロール（salmeterol）などのβ2−アドレノセプターアゴニストを含む気管支拡張剤を用いて徴候緩和が提供される。他の気管支拡張性特性を有する薬剤にはムスカリン受容体アンタゴニスト、イプラトロピウムブロミド（ipratropium bromide）およびテオフィリンのようなホスホジエステラーゼインヒビターを含む。
第２の試薬の種類は予防的であり、ベクロメタゾン（beclomethasone）ジプロピオネートなどのグルココルチコイドを含む。クロモグリク酸ナトリウムおよびネドクロミルソディウム（Nedocromil sodium）もまた、たとえこれらがグルココルチコイドより効果が少ないとしても使用される。
しかしながら、これらの試薬のうち、１つも完全には気道の過剰反応を解消せず、またはすべての患者において喘息がもたらす生命を脅かし、かつ致死的な悲劇的な出来事を妨害しない。これらの条件が普及し、かつ時にはこれらが死の原因となるという事実は、これら試薬からの利益がほぼ最適であるという事実を強調する。
喘息は現在好酸球性気管支炎によって特徴付けられた慢性の気道炎症疾患としてみなされている［フリガス（Frigas）ら、１９９１］。他の慢性炎症性疾患と同様に、喘息における炎症は、組織の再構築ではなく、気道に関して死後研究にて（ダニル（Dunnill）ら、１９６９）および生存供与者からの気管支生検によって（ブリュースター（Brewster）ら、１９９０；バイ（Bai）& Pare（ペア）、１９９５］明らかに記載されている。再構築には以下が含まれる；上皮の発芽；粘膜への好酸球の顕著な浸潤；粘液腺の増大；上皮の真性基底膜直下および粘膜全体にわたる傷型コラーゲンの沈殿；および筋繊維芽細胞の数の増加にかかわる。さらに、喘息性の気道における血管の容積および数の増加があり、これは血管形成が再構築プロセスを伴うことを示唆している［クワノ（Kuwano）ら、１９９３］。気道の全体の容量は過剰栄養および過剰可塑性応答の両方から生じる結果である気道の平滑筋の容量における増加［クワノら、１９９３］に関係して［エビナ（Ebina）ら、１９９３］増加する［ジェームス（James）ら、１９８９］。
気道過剰応答性（AHR）は、多様多大な刺激に対する喘息患者の過剰な気管支収縮応答である。気道壁肥厚がAHRの進行の中心であるという概念は近年１０年において同意が得られている。気道の肥厚は、平滑筋短縮の所定量が計算され、数学的モデル研究によって示され、平滑筋の短縮の結果を増幅し、健常者に比較して喘息患者における気道の耐性において多大な増加を引き起こす（例えば、４０％の短縮は健常者において１５倍の増加を与えるが、喘息患者においては２９０倍である）［ジェームズら、１９８９］。筋肉は２−３倍まで容積増加し、増加の程度は喘息の重篤度に関係する［クワノら、１９９３］。変化の性質は広範囲には調査されないが、肥厚および過従属栄養の両方を含む［エビナら、１９９３］。長期にわたるアレルギー性喘息によるアレルゲン回避後は、健常被験体において観察されるレベルに対し、気道の過剰応答における減少が証明され、その徴候の解消に伴うものである［プラッツ−ミルズ（Platts-Mills）ら、１９８７］。このような研究は喘息性の気道における構造上の変化も可逆的であるという概念に一致する。
これらの喘息性の気道における長期にわたる変化は治療的発明のための新しい標的を提供する「スチュアート（Stewart）ら、１９９３］。その結果として、この気道再構築応答に関する機能同定することに相当な興味が注がれ、かつ存在する抗喘息剤の影響がこれらのプロセスに及ぼされる。多数の因子がマイトジェンとして確立され、気道の平滑筋細胞が多様な種から培養され、それにはヒトも含まれる［スチュアートら、概説のため参照］。期待されるように、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（PDGFaa）および上皮増殖因子（EGF）を含む増殖因子ファミリーに属し、このファミリーは最も効果的な増殖剤である［ハースト（Hirst）ら、１９９２；スチュアートら、１９９５ａ］。トロンビンはまた有効な増殖因子である［トムリンソン（Tomlinson）ら、１９９４」、他方、気管支収縮剤、例えばエンドテリン−１およびトロンボキサンＡ、模倣物、Ｕ４６６１９などはたった一週間しか活性がなく、ついでいくつかの他の収縮剤、例えばヒスタミンおよびニューロキニンは完全に不活性である［スチュアートら、１９９５ａ］。
ヒトの培養された気道平滑筋において、β−アドレノレセプラーアンタゴニストに対する連続暴露は、トロンビン、ＥＧＦおよびトロンボキサンＡ2類似体、Ｕ４６６１９を含む広範囲のマイトジェンに対する増殖応答を減少させる［トムリンソン（Tomlinson）ら、１９９４；１９９５］。さらにデキサメタゾンおよび他の抗炎症ステロイドはまた培養された気道の平滑筋に抗増殖効果を及ぼす［スチュアートら、１９９５ｂ］が、阻害の重要性は最初の例において増殖を刺激するマイトジェンに阻害の程度が依存する。抗炎症性ステロイドを吸入された長期治療が、ＡＨＲを中程度しか低減しないということに対する注目は重要であり［ソトメーヤー（Sotomayor）ら、１９８４；ラングレン（Lungren）ら、１９８８］、他方β2−アゴニストはＡＨＲに対して全く影響を及ぼさないか、またはＡＨＲを増大させると報告されている［ワヘドナ（Wahedna）ら、１９９３］。従って、喘息の治療に関して、２つの最も一般的に使用され有効である薬剤の分類はＡＨＲにほぼ最大の効果を有するか、それゆえ該状態の進行および発展に貢献している気道の再構築に関連する構造の変化を調節することにおいて有効ではない。
本発明者らは、再構築の工程を阻害または調節する有効な方法を調査し、ついで驚くべきことにこの目的に適したステロイドおよびその類似体を同定した。
発明の要約
２−メトキシエストラジオールは、ヒトにおいては生理学的エストロゲンである１７β−エストラジオールの天然代謝物である。
２段階工程において該物質は製造され、エストロゲンを水酸化し、カテコールエストロゲンを製造し、さらにメトキシ化してチトクロムｐ４５０経路を誘発することによって対応するメトキシエストロゲンを製造することを含む［スピンク（Spink）ら、１９９４］。今までそれに生物学的に不活性であると考えられ［ロスナー（Rosner）ら、１９９１］、細胞培養実験において、２−メトキシエストラジオールはある形質転換した細胞株の増殖を阻害する［ロッタリング（Lottering）ら、１９９２］および積極的に増殖または静止していない内皮細胞および繊維芽細胞の増殖を阻害することを確立した［フォトシス（Fotsis）ら、１９９４］。フォトシスらはまた２−メトキシエストラジオールの投与は、２−メトキシエストラジオールが、腫瘍細胞の直接的阻害によってよりもむしろ腫瘍誘発性血管形成を抑圧することによって腫瘍の増殖を阻害することも示した。該化合物は基底膜の破壊を減少させ、従って細胞外マトリクスに細胞の移動を妨害し、かつ固形腫瘍または血管形成疾患治療のための可能な抗血管形成薬剤にすることを提供する。腫瘍血管新生の阻害はまた、クラウバー（Klauber）ら、１９９７においても示された。
２−メトキシエストラジオールのウサギの大動脈からの培養された平滑筋細胞への抗増殖効果［ニシガキ（Nisigaki）ら、１９９５］はまたこの化合物のアテローム性動脈硬化症の妨害および進行に有用であることを示唆しており、喘息およびＡＨＲにおいて見られるものと異なる細胞事象によって引起される疾患を示唆している。
抗−増殖効果のメカニズムはまだ確立していない。ロッタリングら（１９９２）はサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の上昇は２−メトキシエストラジオールのＤＮＡ合成の阻害効果を説明するが、一方、有糸分裂の間の紡錘型形成間の微小管アセンブリーの阻害は細胞分裂の阻害効果を説明すると考えられている［フォトシスら、１９９４］。他の生物学的な２−メトキシエストラジオールの効果は広範囲には特徴付けられていない。ブタ子宮内膜細胞培養物において、２−メトキシエストラジオールはＰＧＦ2αの合成を阻害する［ザン（Zhang）およびデービス（Davis）、１９９２］。２−メトキシエストラジオールの非ゲノム作用は微小管におけるコルチシン部位での結合を介して微小管の崩壊を含み［ダマト（D’Amato）ら、１９９４；アイズ−ヨコタ（Aizu-Yokota）ら、１９９５］、および血管平滑筋の弛緩を含む［ゴヤチェ（Goyache）ら、１９９５］。
国際出願公開番号ＷＯ９５／０４５３５において、イン・ビトロでの微小管ポリマー化を阻害することによる抗有糸分裂効果を与えるエストラジオール誘導体を開示している。該化合物は内皮細胞増殖を阻害することがイン・ビトロでの実験から推定される。
本発明は２−メトキシエストラジオールの効果および炎症性細胞活性化の抑制に関する。それは特に喘息などの気道の疾患の治療または妨害に関する。
上記の本発明を示唆または開示した参考の文献は全くない。例えば、平滑筋細胞増殖の抑制および気道の炎症性細胞の活性化はＷＯ９５／０４５３５に記載のイン・ビトロの観察によって推定できず、これらの活性のメカニズムは微小管アセンブリーへの作用に関連しないようである。
２−メトキシエストラジオールのウサギ血管平滑筋への抗増殖効果［ニシガキら、上記］はまた、気道の平滑筋に推定されることができない。というのはこれらの２つの異なる源からの細胞の応答性において公知の差異が存在するからである。
内皮細胞増殖を増強する薬剤、例えばヘパリンなどのうちのいくつかは，実際に気道の平滑筋細胞の増殖を阻害する。それゆえ、内皮細胞中の該２−メトキシエストラジオールの抗増殖効果［フォトシスら、ＷＯ９５／０４５３５、上記］は平滑筋が同様に応答するであろうことを示唆しない。
本発明者らは、２−メトキシエストラジオールがヒト末梢血管から得られた多型核白血球からのミエロペルオキシダーゼの放出ならびにこれらの細胞の食細胞性活性を見出した。これらの細胞中での食細胞性活性の低下は、抗炎症性の証拠を提供する。驚くべきことにこれは、特に２−メトキシエストラジオールがそのグルココルチコイドまたはエストロゲン受容体にアフィニティーを有意に持つとは知られていないからである［メリアム（Merriam）ら、１９８０］。
これらの特性は、２−メトキシエストラジオールおよびその関連化合物を喘息、慢性障害性起動疾患および炎症によって特徴付けられる他の気道疾患に限るものではないが、それらを含む病態に有利にする。本発明の方法により治療され易い他の状態は、例えば、気腫、肺炎または例えば好中球浸潤などの増殖性および炎症性病態の１つまたは両方、または肺感染症の徴候または耐性および炎症性細胞の活性化から引き起こされる後遺症を含む。
アレルギー性鼻炎などの病状はまた治療される。というのは、本発明者らはまた、２−メトキシエストラジオールは巨大細胞関連細胞RBL2H3の分解を阻害するからである。この２−メトキシエストラジオールの阻害効果は、抗原刺激放出に選択的である。というのはプロテインキナーゼＣ刺激剤であるＰＭＡに対する応答およびカルシウムイオン透過担体であるＡ２３１８７に対する応答は影響されないからである。従って、抗原の放出への影響は、微小管依存性顆粒噴出への非特異的な作用の結果でないようである。本結果は２−メトキシエストラジオールおよびこれらの活性を有する関連ステロイドが、鼻炎およびアトピー性皮膚病態に限るものではないが、これらを含むアレルギー条件を治療するのに有用であることを示している。作用の任意のメカニズムにとらわれずに、これらのデータは特定の、受容体に関わるシグナル伝達機構が気道における炎症に関与し、その阻害に貢献することを示唆している。
本発明者らはさらに、２−メトキシエストラジオールがＦＣＳおよびｂＦＧＦを含む増殖因子の範囲で刺激された気道の平滑筋におけるＤＮＡ合成および細胞分裂を阻害することを見出した。さらに、タンパク質合成速度におけるセロトニン刺激による増加は２−メトキシエストラジオールによって阻害され、細胞増殖の阻害に加えて抗−過剰栄養効果の可能性を高める。本発明者らの観察は２−メトキシエストラジオールの抗−血管形成活性とともに、これおよび関連化合物が、上記の炎症によって特徴付けられる気道の疾患の治療、特に慢性喘息の治療に、気道壁再構築におよびそれゆえ気道の過剰応答性にインパクトを与えることによって特徴付けられる。２−メトキシエストラジオールの類似体はまたＤＮＡ合成を阻害する能力を試験し、ついでその結果はこれらもまた治療上の価値があることを示唆している。
最初の局面において、本発明は慢性または急性の気道の炎症によって特徴付けられる疾患の治療方法を提供し、その方法には治療を必要とする哺乳類の気道の再構築を調節するための能力を有するステロイドまたはステロイド類似体を投与する工程を含む。好ましくは、該哺乳類はヒト、ネコ、ウマまたはウシであり、より好ましくはヒトである。該ステロイド２−メトキシエストラジオールは本発明の方法に従って使用するのに特に好ましい。本発明の方法に従って使用される投薬レベルでの有効なグルココルチコイド活性を持たないステロイドまたはその類似体が特に好ましい。
第２の局面において、本発明は慢性または急性気道炎症によって特徴付けられる疾患を治療する方法、該方法にはそのような治療を必要とする哺乳類にステロイドまたはステロイド類似体（該ステロイドまたはステロイド類似体は多形核白血球の食細胞活性を阻害する）を投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、白血球からのミエロペルオキシダーゼの放出はまた阻害される。マクロファージの活性化はまた阻害される。
一態様において、本発明による方法はさらに平滑筋細胞増殖および炎症を阻害することによって気道の再構築を調節する。再構築はさらに血管形成、オキシダントの形成および気道壁における微小管の機能からなる群から選択される１またはそれ以上の活性の阻害によって調節されるであろう。
特に好ましい態様において、本発明の方法は喘息、気道過剰反応性、気管支収縮、気腫、肺炎、アレルギー性鼻炎および肺感染症などのアトピー疾患からなる群から選択される疾患の治療において使用される。
第３の局面において、本発明は気道壁の炎症を阻害することによって再構築される気道を調節するステロイドまたはステロイド類似体を提供する。好ましくは該化合物はまた気道平滑筋細胞の増殖を阻害する能力を有し、特にマイトジェン刺激に応答する。
第４の局面において、本発明は食細胞活性を阻害することによって再構築される気道を調節するステロイドまたはステロイド類似体に関する。好ましい態様において、多形核白血球の食細胞活性は２−メトキシエストラジオールによって阻害される。他の態様において、多形核白血球からのミエロペルオキシダーゼの放出はまた抑圧される。特に好ましい態様において、ステロイドまたはステロイド類似体はグルココルチコイド活性を示さない。
第５の局面において、本発明は上記のステロイドまたはステロイド類似体を提供し、さらに抗−血管形成活性および／または抗−オキシダント活性を有する。特に好ましい態様において、本発明のステロイドまたはステロイド類似体はまた、気道壁における微小管を破壊する能力を有する。
第６の局面において、本発明は上記のステロイドまたはステロイド化合物を含む組成物を提供し、ときには製薬学的に許容し得る担体および賦形剤を共に含む。そのような担体および賦形剤の例には、以下に限るものではないが、ラクトースと共に乾燥微小化粉末（micronised powder）、または最近開発されたヒドロフルオロアルカンが含まれる。本発明の組成物は、気道疾患または喘息の治療において使用される標準的な経路のいずれか、例えば、局所、経口、鼻腔投与または吸入による投与を介しての投与のための製剤において使用されてよい。これらの製剤はカプセル、カシェ剤、錠剤、エアロゾル剤、粉末顆粒、微小化物質または溶液などの従来の形態のいずれかであってよい。時に、該ステロイドまたはステロイド類似体はシクロデキストリンで複雑化し、硫酸塩、酢酸塩、安息香酸塩などの製薬学的に許容し得る酸と形成されたエステルの形態であってよい。当業者は、標準的テキスト、例えばレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ（Remington’s Pharmaceutical Sciences）第１７版を参照することによって製剤がいかに作成されるか、およびこれらがいかに投与されるかを決定することができる。
投与すべきステロイドまたはステロイド類似体の用量は、治療すべき状態の程度および投与の経路に依存し、担当の医師または獣医の裁量で決定する。そのような医師または獣医は適切な用量、様式および投与頻度を容易に決定できる。本発明の組成物は、喘息、気道過剰反応（ＡＨＲ）または気管支収縮を含む慢性または急性気道炎症状態を治療するために使用されてよい。
本発明の特に好ましい態様において、喘息患者の気道壁における平滑筋細胞の炎症および増殖は、２−メトキシエストラジオールを含む組成物を投与することによって阻害される。
本発明は特定の２−メトキシエストラジオールについて記載するが、この化合物は本発明で使用されてもよい必要な生物学的活性を有する化合物の類似物であると理解されるであろう。これらには以下に限定されるものではないが、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール−３メチルエーテルおよび４−メトキシエストラジオールが含まれる。
多様な化合物は他の組織において抗増殖および／または抗血管形成活性を有するエストラジオール誘導体として同定されている。例えば、ＷＯ９５／０４５３５の全開示物（参照することにより本明細書に包含する）を参照。
そのような化合物は本発明の使用に適当な候補物であってよく、ステロイド、本発明の目的のための方法内にあり、ステロイド類似体またはステロイド様化合物である。好ましい化合物はステロイド骨格の２位でメトキシ基を有する。
さらに、これまで公知でなかった化合物は本発明の範囲から逸脱しない生物学的活性を有する本発明の２−メトキシステロイドまたはステロイド様化合物に十分構造上類似である化合物が考えられる。本明細書の目的のため、「ステロイド」、「ステロイド類似体」または「ステロイド様」なる語句は、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール−３−メチルエーテル、４−メトキシエストラジオールおよび本発明の目的のために使用されるであろう適切な生物活性を有するステロイド核などに基づく他の化合物を含むと理解すべきである。他の化合物は２−メトキシエストラジオールに十分構造上類似および／または電気的類似（電荷分布）であり、かつ例えばＷＯ９５／０４５３５などの本発明の目的のためのステロイド類似体であると考えられるような化合物であり、ステロイド核を厳密には持たない本発明の範囲内で生物学的活性を有する。そのような活性を有する化合物は、本明細書の至るところに記載される活性の型を示すことができるアッセイを用いて容易に同定することができる。一例として、気道平滑筋細胞増殖を測定することによって慢性呼吸器障害疾患への影響を試験してよく；アレルギー性鼻炎および感染性疾患への影響は、例えば鼻炎に関して巨大細胞および感染性疾患に関して好中球などの炎症性細胞活性の阻害を決定することによって試験されてよい。
当業者ならば別の試験に気づくであろうし、本発明の使用のための化合物を用意にスクリーニングすることができる。
発明の詳細な説明
本発明は以下の図面を参照して例示により詳細に記載されるであろう。その図面とは以下の通りである。
図１はテトラメチルベンジジンの西洋ワサビペルオキシダーゼ媒介による酸化への２−メトキシエストラジオールが及ぼす効果の欠如を示す。
図２は培養されたヒト気道平滑筋細胞における［3Ｈ］−チミジンのマイトジェン誘発取り込みへの２−メトキシエストラジオール（０．３−１０μM、３０分前処理した）が及ぼす効果を示す。試験されたマイトジェンは０．３U／mlのトロンビン、１％FCS、３００ｐＭ ｂＦＧＦ（図２ａ）および１０％ＦＣＳ、3nM ＥＧＦ（図２ｂ）であった。図２aおよびbに記載されるものに同一に設計されたさらなる実験が行われ、この後者のデータ組み合わせは図２Cに示されている。２−メトキシエストラジオール（３μM）のトロンビン（０．３U／ｍｌ）誘発ＤＮＡ合成への有効性もまた調査された（２ｄ）。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における［3Ｈ］−チミジン取り込みのパーセンテージとして示す。
図３はマイトジェン誘発［3Ｈ］−ロイシン取り込みへの２−メトキシエストラジオール（０．３−１０μM、３０分前処理した）が及ぼす効果を示す。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における［3Ｈ］−ロイシン取り込みのパーセンテージとして示す。
図４は（ａ）ＦＣＳ（１％）または（ｂ）ｂＦＧＦ（３００ｐＭ）の存在下の細胞数に２−メトキシエストラジオール（０．３−１０μM、３０分間前処理した）が及ぼす効果を示す。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における細胞数増加のパーセンテージとして示す。
図５はＦＣＳ（１％）−誘発ＤＮＡ合成の２−メトキシエストラジオール（３μM）へのステロイド受容体アンタゴニストRU486（1μＭ）が及ぼす影響を示す。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における［3Ｈ］−チミジン取り込みのパーセンテージとして示す。RU４８６をＦＣＳ添加の３０分前に添加した２−エストラジオールの３０分前に添加した。
図６はＦＣＳ（１％）−誘発［3Ｈ］−チミジンへの１７β−エストラジオールおよび２−ヒドロキシエストラジオール（０．３−１０μM、３０分前処理した）が及ぼす効果を示す。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における［3Ｈ］−チミジン取り込みのパーセンテージとして示す。２−エストラジオールに関連するデータは比較を容易にするために図１から模写している。
図７はトロンビン（０．３Ｕ／ml）−誘発［3Ｈ］−チミジンへの２−メトキシエステロンおよび２−メトキシエストラジオール（０．３−１０μM、３０分前処理した）が及ぼす効果を示す。データを３つの別個の培養における３実験の平均および平均の標準偏差として示し、非前処理細胞における［3Ｈ］−チミジン取り込みのパーセンテージとして示す。２−メトキシエストラジオールに関連するデータは比較を容易にするために図２ａから模写している。
図８はモルモット腹膜マクロファージ中に放出されたスーパーオキサイドアニオンへの２−メトキシエストラジオールが及ぼす効果を示す。この化合物はチモサンへのスーパーオキサイドアニオンマクロファージの応答を完全に阻害し、ｆＭＬＰに対する応答を低減した。
図９はモルモット腹膜マクロファージ中のプロスタサイクリン放出への２−メトキシエストラジオールが及ぼす効果を示す。その結果はエストラジオールがｆＭＬＰに対する応答を完全に阻害する一方、ＰＭＡに対する応答は５０％阻害されることを示している。
図１０はオブアルブミン（DNP-OA）の多様な濃度への影響および巨大細胞（ＲＢＬ２Ｈ３）分解および２−メトキシエストラジオールによる阻害を示したプロットである。
図１１は２−メトキシエストラジオールがモルモット腹膜マクロファージからのオブアルブミン（ＤＮＰ−ＯＡ）−刺激［3Ｈ］−５ＨＴ放出を低減させるがＰＭＡに対する応答にての放出には影響を及ぼさないことを示している。
略語：本明細書で使用する略語は以下の通りである：
ＡＨＲ          気道過剰応答
ｂＦＧＦ        塩基性繊維芽細胞増殖因子
ＤＮＰ−ＯＡ    ジニトロ−フェニル処理オブアルブミン
ＥＧＦ          上皮増殖因子
ｆＭＬＰ        ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン
ｐＤＥＰ        血小板由来増殖因子
ＰＭＡ          ホルボールミリステートアセテート
５ＨＴ          セロトニン
一般的方法
細胞培養
ヒト気管支気道平滑筋をアルフレッド・ホスピタル（Alfred Hospital）（メルボルン）によって提供された肺移植ドナーまたはレシピエントからの通常の巨視的肺切除で得た。培養物を以前に詳細に記載した通りに調製した（トムリンソンら、１９９４）。端的には、組織を特に、３ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（DMEM）［２mM Ｌ−グルタミン、１００μｇ／mlのストレプトマイシンＢ、および０．２５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補う］中で３７℃で３０分間、部分的に消化させ、ついで約０．５ｇの平滑筋をさらに２時間０．５mg／mlのエラスターゼ中で３７℃でインキュベートし、ついでコラゲナーゼ（３mg／ml）中で３７℃で１８時間インキュベートすることによって消化した。細胞懸濁液を遠心（１０分、１００×ｇ、２５℃）し、補ったＤＭＥＭで３回洗浄し、再度１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む２５mlのＤＭＥＭ中に再懸濁させ、２５cm2ファルコン培養フラスコ（Falcon culture flask）に播種し、単層がコンフルエンスに達するまで７から１０日間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2）した。ついで細胞を一週間ごとに回収して０．５％トリプシン、１ｍＭＥＤＴＡに１０分間暴露し、ついで７５cm2ファルコン培養フラスコに１：３スプリット割合で継代した。継代３から１５での細胞を実験に使用した。
免疫化学
細胞を８ウェルガラス組織培養チャンバースライド（ラープテク（Labtek））にサブ培養し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中での１００％コンフルエンシーまで増殖させた。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、氷冷アセトン中で２０秒間固定し、ついで染色まで４℃で４週間保存した。ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．２５％）中で２０分間再度脱水した後、細胞を０．５％ Triton X-100（ＰＢＳ中）にインキュベーションすることによって透過させ、第１抗体を６０分間２２℃でインキュベートし、ついで細胞を２２℃で少なくとも６０分間第２抗体に暴露させた（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲートヤギ抗マウス；ＩｇＦ（ａｂ’）２断片またはヤギ抗−ウサギＩｇＧ）。コントロールをＰＢＳ／ＢＳＡ（０．２５％）のための第１抗体を置換することによって提供した。固定した細胞の染色を光学顕微鏡（ビデオプロ３２イメージ分析システム（VifroPro 32 image analysis system）に接続したオリンパスＢＨ２、フォールディング・イメージング、クレイトン、ビクトリア）によって分析した。培養液中の平滑筋を同定するために使用される抗体の特徴をそのままの気道壁標本上に確立した。使用された抗体をα−アクチン、ミオシン、カルポニン（すべては平滑筋に特異的である）、サイトケラチン（上皮細胞）およびＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１、内皮細胞のマーカーである）に対して作成された。
平滑筋α−アクチン、ミオシンおよびカルポニンの発現を本実験で使用されたすべての培養中で観察した。これらの培養は検出可能なＰＥＣＡＮ−１染色を示さず、ついで細胞のうちの５％より少数がサイトケラチンに対するモノクローナル抗体での染色に陽性であった。培養の産生のため使用された気道近隣のパラフィン包埋切片を気道平滑筋および血管の束の平滑筋α−アクチンおよびミオシンに関して陽性に染色した。ＰＥＣＡＭ−１に対する抗体は血管内皮を染色し、一方、該抗体は上皮のみをサイトケラチンで染色し、それにより標的抗原に関するこれらの抗体の特異性を確認する。
ＤＮＡおよびタンパク質合成
細胞を１：３の割合で２４ウェルプレートにサブ培養し、３７℃で５％ＣＯ2雰囲気下で７２〜９６時間かけて単層コンフルエンシーに達するまで増殖させた。血清含有培地を２４時間無血清ＤＭＥＭで置換して増殖停止とさせた。いくつかの実験において細胞を２−メトキシエストラジオールで処理した３０分後にマイトジェンを付加した。刺激剤（マイトジェン）をインシュリン、トランスフェリンおよびセレニウム（Monomed A、１％ｖ／ｖ）を含む補足物とともに適当なウェルに加えた。Monomed Aを加えてトロンビン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの増殖因子のマイトジェン活性に不可欠である増殖因子を提供するため加えた（スチュアートら、１９９５ａ）。マイトジェンおよびインヒビターを実験の終了時まで付加時間からの細胞と接触させて、逆を示さない限り残した。細胞を２４時間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ2）、［3Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ml、４時間）でパルスして本発明者らが以前に行った研究により新規に合成されたＤＮＡに放射線標識がとり込まれるのを示す（スチュアートら、１９９５）。放射線の取り込みをパルスラベリング時間の終わりに濾過することによって決定した。放射線を含む培地を吸気させ、細胞を０．１ＭNaOH ２００μlを付加することによって溶解させた。そのＤＮＡをガラスファイバーフィルター（パッカード（Packerd）、標準）上の結合ハーベスター（パッカード・フィルターメート１９６（Packerd Filtermate １９６）上に結合して、濾過によって固定化し、ついで３×３ml容量の蒸留水で洗浄し、ついで１ml容量の１００％エタノールで一回洗浄した。乾燥したフィルターをパッカード・トップコート液体シンチレーションカウンターで数を数えた。タンパク質合成割合を上記のような類似の計画した実験で決定したが、４時間のパルスインキュベーションでは［3Ｈ］−チミジンのかわりに［3Ｈ］−ロイシンで置換した。さらに、タンパク質合成の割合へのマイトジェンおよび２−メトキシエストラジオールの及ぼす影響を決定するための実験において、マイトジェンとのインキュベーションを４８時間行った。これらの実験の持続期間が長いほど細胞分裂が起こるのに十分な時間が必要であった。
細胞数の計算
有糸分裂の間の細胞周期を通して、気道平滑筋細胞の増殖の進行をＤＮＡ合成に使用したのと類似設計された実験（マイトジェンと一緒にインキュベートを４８時間続けたことを除いて類似である）における細胞数の変化を測定することによって決定した。細胞をこれらの実験において使用した６−ウェル培養皿の各ウェルから１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の２００μｌの０．５％トリプシンに、正確な数の計算か可能になるように培養皿から互いが完全に超音波処理されないことを確実にするために３０−４５分間暴露して除去した。この時間の終了時に、さらに２００μｌのＰＢＳ（２０％ＦＣＳ）を加えてトリプシンによる細胞の溶解を妨害し、ついで細胞を血球測定計で直接カウントした。
統計学的分析
個々の実験の各処理をＤＮＡおよびタンパク質合成実験のために４回ずつ行った。各実験を少なくとも３つの別個の個体から得た３つの異なる培養において行った。細胞の計算に関して、１回のインキュベーションを３つの培養において行った。結果を多数の培養からのグループ化したデータとして提示し、平均±ｎ培養の標準偏差として表した。増加程度を同じ２４ウェルプレート上のコントロールウェルの応答によって処理されたウェルの応答を分割することによって計算した。グループ化されたデータを対数形質転換によって標準化をした後に両ｔ−検定で分析した。複数の比較のためにボンフェロニ（Bonferroni）適正を必要な場合には使用した。差異はｐ<０．０５の場合に有意であると考えられた。
材料
使用したすべての化学物質は分析用等級またはそれより高い等級のものであった。使用した化合物およびその出所は以下の通りである：２−メトキシエストラジオール（１，３，５，［１０］−エストリエン２，３，１７−トリオール２−メトキシルエーテルロット８３Ｈ４０６５）；１７β−エストラジオール（（１，３，５，［１０］−エストリエン−３、１７β−ジオール、cat No.Ｅ８８７６）；２−メトキシエストリオール（１，３，５，［１０］−エストリエン−２，３，１６α、１７β−テトロール、ロット２６Ｆ４０３８；２−メトキシエステロン、（２，３−ジヒドロキシ１，３，５，［１０］−エストリエン−１７−オン、ロット１１０Ｆ４００３）；２−ヒドロキシエストラジオール（１，３，５，［１０］−エストリエン２，３，１７β−トリオールロット７５Ｈ０８５３）；Ｌ−グルタミン、特に無脂肪酸ウシ血清アルブミンフラクションＶ（ＢＳＡ）、トロンビン（ウシ血漿）、シグマ、ＵＳＡ；Ｌ−グルタミン、無ウシ血清アルブミンフラクションＶ不可欠無脂肪酸（ＢＳＡ）、シグマＵＳＡ；アムフォテリシンＢ（ファンギゾン（Fungizone））、ヒト組換え塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、プロメガ、ＵＳＡ；コラゲナーゼＣＬＳ１型、エラスターゼ、ワーチトンバイオケミカル（Worhington Biochemical）、ＵＳＡ；ダルベッコＡリン酸緩衝食塩水（ＲＢＳ）、オキソイド、英国；トリプシン、ベルゼネ、ペニシリン−Ｇ、ストレプトマイシン、MonomedA）、ＣＳＬオーストラリア、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、フラウ・ラボラトリーズ、オーストラリア；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、フラウラボラトリーズ、スコットランド。［６−3Ｈ］−チミジン（１８５ＧＢｑ／mmol、５Ｃｉ／mmol）アマシャム、英国；ミクロシント−Ｏシンチラント（Microscint-O scinitllant）、キャンベラ−パッカード、オーストラリア。免疫化学に使用した抗体は抗−平滑筋α−アクチン（マウスモノクローナル）（Dako M851）、モノクローナルマウス抗−PECAM-1（ＤＡＫＯ−ＣＤ３１、JC/70A）（DakoM823）、ダコ（Ｄａｋｏ）・コーポレーション、米国；抗−サイトケラチン（マウスモノクローナルＣＹ９０、シグマ、米国）抗−マウスＩｇＦ（ａｂ’）２断片ＦＩＴＣ−コンジュゲート（宿主ヒツジ）、ヒツジ抗−ウサギＩｇＨＲＰ−コンジュゲート（シレナス（Silenus）DDAF）、シレナス、オーストラリアおよび抗−平滑筋ミオシン（ウサギポリクローナル）、ウェスタンオーストラリア、パース、スパロー教授（Ｍ Sparrow）により提供された。
実施例  １
白血球活性への２−メトキシエストラジオールの効果
白血球の活性化は喘息の病理の特徴である。チューブリンのコリチシン結合部位への２−メトキシエストラジオールの結合は食菌およびロコモーションなどの白血球機能と相互作用する可能性を高める。
２−メトキシエストラジオールの機能的な効果はヒト末梢血から得た多形核白血球（ＰＭＮ）および接着性単球に関して調べた。スーパーオキシドアニオンの産生はスーパーオキシドジムスターゼにより−チトクロムＣの感作減退によって決定された（スチュアートおよびハリス（Harris）、１９９２）。ミエロペルオキシダーゼの放出をテトラメチル−ベンジジンの酸化によって決定した（メネガッチ（Menegazzi）ら１９９２）。食菌作用をチモサン粒子の放射性ヨウ素化によって決定した（シェルトン（Shelton）およびホスキング（Hosking）、１９７５）。
モルモット腹膜マクロファージを回収し、ついで本発明者らの以前の研究により培養した（スチュアートおよびフィリップス（Phillips）、１９８９）。細胞を走化性トリペプチド、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ、１００nM）、チモサン（４００μｇ／ｍｌ）またはホルボールミリステートアセテート（PMA、１００nM）を含む刺激剤で２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）の存在下または不在下で３０分間インキュベートした１５分後に刺激剤を加えた。スーパーオキシドアニオンをチトクロムｃのスーパーオキシドジムスターゼ感受性還元により決定し（スチュアートおよびハリス、１９９２）、およびプロスタサイクリンの安定代謝物である６−オキソ−ＰＦＧＩを放射線イムノアッセイにより測定した（スチュアートおよびフィリップス、１９８９）。すべての個々のインキュベーションは２回同じく行われ、かつ実験は５匹のモルモットからのマクロファージで行われた。
ＲＢＬ２Ｈ３細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０において培養し、ついで実験のために２４ウェルプレートで継代した。その細胞を４８時間リンパ球細胞株分泌抗−ＤＮＰオブアルブミン抗体からの５０％（ｗ／ｖ）で条件づけた培地とともに感作させた。このインキュベーションの最後の２４時間に、［3Ｈ］−５ＨＴ（１μＣｉ／ｍｌ）を各ウェルに加えて顆粒アミン保存物を標識した。インキュベーション時間の終了時に、その培地を吸引し、細胞をＲＰＭＩ１６４０中で２回洗浄し、ついで１５分間２−メトキシエストラジオールの不在下または存在下でＲＰＭＩ１６４０（０．２５％ＢＳＡ）中でインキュベーションし、その後ＤＮＰ−処理したオブアルブミン、Ａ２３１８７またはＰＭＡで上清が回収されるときに３０分間刺激し、遠心（１０００×ｇ、４℃、５分）にかけ、ついでアリコートをとり、放出された［3Ｈ］−５ＨＴの量を決定した。すべての実験は４回行われた。
結果は、２−メトキシエストラジオール（３μＭ）は表１に示すようにチモサン（４００μｇ／ｍｌ）またはｆＭＬＰのいずれかで刺激された白血球中のテトラメチル−ベンジジンの酸化を減少させることを示した。ｆＭＬＰからの無細胞上清はテトラメチル−ベンジジンによって決定されるようなミエロペルオキシダーゼ活性をまた含んだ白血球を刺激するが、この活性は２−メトキシエストラジオールの最も高い濃度（１０μＭ）によってのみ減少する。さらに、実験は精製した西洋ワサビペルオキシダーゼによるテトラメチル−ベンジジンの直接的効果があるか否かを調べるために行われた。２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）がこのアッセイにおいて全く無効化であった。結果を図１にまとめる。
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データを絶対値での変化として表す。アッセイを０．５mlのバッファー中の２×１０6ＰＭＮを用いて行った。
ＰＭＮにおいて、ｆＭＬＰ（１００nＭ）またはチモサン（４００μｇ／ml）に対する応答におけるスーパーオキシドアニオンの産生は１０μＭまでの２−メトキシエストラジオールの濃度により減少しなかった。ＰＭＮによる粒子を表２に示すように３および１０μＭの両方で観察される有意な効果を有する２−メトキシエストラジオールによって減少させた。
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接着性単球においてホルボールミリステートアセテート（１μＭ）ＰＭＡまたはチモサン（４００μｇ／ml）に対する応答中のテトラメチルベンジジンの酸化は１０μＭの２−メトキシエストラジオールによって影響されなかった。さらに、ＰＭＡへの応答中で産生されるスーパーオキシドアニオンはまたこの細胞型において影響されなかった。しかしながらチモサン-刺激スーパーオキシドアニオンの産生は少なくともドナーのいくつかからの白血球における２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）によって顕著に阻害されるようである。
チモサンまたはｆＭＬＰに対するモルモットのマクロファージの応答は図８に示されるように２−メトキシエストラジオールにより減少した。しかしながら、ＰＭＡ（１００nM）に対する応答は影響されなかった。さらに、６−オキソ−ＰＧＦ１α産生におけるｆＭＬＰ（１００nM）−誘発増加は２−メトキシエストラジオールによって完全に阻害される一方、ＰＭＡに対する応答は５０％のみ減少し、ついでチモサンは図９に示すようにプロスタサイクリン代謝物のレベルにおいて増加を刺激しなかった。
オブアルブミン（ＤＮＰ−ＯＡ）は図１０に見られるように１０μＭの２−メトキシエストラジオールにより減少される［3Ｈ］−５ＨＴの濃度依存性放出を引き出す。しかしながら、図１１に示すように［3Ｈ］−５ＨＴの基礎的放出およびＰＭＡ（１００nM）またはカルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７（１０μＭ）のいずれかに対する応答中の放出は２−メトキシエストラジオールによって影響されなかった。
ＰＭＮミエロペルオキシダーゼ放出および活性、食菌作用低減への２−メトキシエストラジオールの阻害効果はその化合物がイン・ビボでの抗−炎症性効果を有することを示している。チモサン-刺激スーパーオキシドアニオン産生の選択的な阻害はこの食菌刺激に及ぼす特定の効果を示唆している。マクロファージ昨日への阻害効果を示しているこれらの観察および本発明者らの実験は喘息および他の慢性的気道疾患障害、特に証明可能なＰＭＮ関与において利益があり、抗−免疫の明らかな証拠の特性を提供している。
実施例  ２
ＤＮＡ合成に及ぼす２−メトキシエストラジオールの効果
ヒト培養気道平滑筋細胞を０．３−１０μＭの２−メトキシエストラジオールと共に３０分間インキュベートした後、マイトジェンを付加し、ついで実験のノ故意２８時間中、図２aにおいて示すように、［3Ｈ］−チミジンのトロンビン（０．３Ｕ／ml）−刺激性取り込みの濃度依存的な減少を引起す。使用した２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）の最も高い濃度で、トロンビンに対する応答はコントロールレベルの約１０％に減少した。この２−メトキシエストラジオールがＤＮＡ合成に及ぼす効果をトロンビンの存在に限定されなかった。というのは２−メトキシエストラジオールの類似の濃度関連阻害がウシ胎児血清（ＦＣＳ、１％v／v）または塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、３００ｐＭ）（図２ａおよび２ｂ）のいずれかで刺激された細胞中で観察された。しかしながらＥＧＦ（３nM）または１０％ＦＣＳの存在下でのＤＮＡ合成をトロンビン、ｂＦＧＦまたはＦＣＳの低濃度に対する応答より有意に低い程度に阻害された（図２ｃ）。１０％ＦＣＳ（［3Ｈ］−チミジン取り込みの刺激されていないレベルより２７．２±７．８倍多い）に対するＤＮＡ合成は、０．３Ｕ／mlトロンビン（８．４±３．１倍）、３nM ＥＧＦ（４．５±０．７倍）または１％ＦＣＳ（１２．７±０．４倍）に対する応答より有意に多大である（０．０５<、ｔ−スチューデントの両検定）が、３００ｐＭ ｂＦＧＦ（２２．５±５．３倍）に対する応答とは有意に異なる。
時間経過実験もまた、マイトジェンを暴露した後、２−メトキシエストラジオールの付加がＤＮＡ合成をなお阻害するか否か決定するために行われる。トロンビン（０．３Ｕ／ml）−刺激ＤＮＡ合成は、２−メトキシエストラジオール（３μＭ）をトロンビン付加の２時間後に最大の阻害が見られた後のトロンビン付加の４時間後まで加えられる場合に阻害された。トロンビンの阻害が少なくなった後（〜２０％）４〜１４時間２−メトキシエストラジオールの添加は、１８時間でまたはそれより後の添加は、図２ＤＮＡにおいて示されるように、このマイトジェンの存在下でＤＮＡ合成に全く影響を及ぼさなかった。引き続き、さらなる時点が試験され、ついでこれらの実験は２−メトキシエストラジオールが自発的またはトロンビン付加の１時間後のいずれかで添加されるがトロンビン付加（図２ｄ）の６時間後まで固執して有意な阻害が見られた。
実施例  ３
タンパク質合成および細胞数への２−メトキシエストラジオールの影響
ＤＮＡ合成の阻害がまた、有糸分裂の細胞周期進行および阻害を停止する結果となることを決定するために、マイトジェンとのインキュベーションの４８時間後にタンパク質合成および細胞数の両方を測定した。トロンビン（０．３／ｍｌ、FCS（１０％ v／v））またはｂＦＧＦ（３００ｐＭ）の存在下での［3Ｈ］−ロイシン取り込み阻害のための濃度閾値は、［3Ｈ］−チミジン取り込みの阻害から生じるものと類似であった。約３０％応答の最大のパーセンテージの減少はＤＮＡ合成と共に観察される値より少なく、３μＭであった。１０μＭでは図３に示すようにトロンビンまたはｂＦＧＦの存在下での有意な抑制効果を持たなかった。２−メトキシエストラジオール単独は０．３μＭで［3Ｈ］−ロイシン取り込みのわずかな刺激を引き起こした。濃度が高いほど（１および３μＭ）はわずかな阻害効果しか持たず、１０μＭでは全く効果が無かった。これらの結果は表３にまとめてある。対照的に、ＦＣＳ（１％、v／v）またはｂＦＧＦ（３００ｐＭ）のいずれかに応答した細胞数における増加は、図４a、４bにおいて示されるように３μＭで観察している増殖であった。
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実施例  ４
平滑筋細胞中におけるセロトニン刺激された［3Ｈ］−ロイシン取り込み
０．１nM〜１０μＭｍｇ／ｍｌでの濃度でのセロトニン（５ＨＴ）は［3Ｈ］−チミジン取り込みに全く影響を及ぼさなかったが、１０nMの５ＨＴは［3Ｈ］−ロイシン取り込みを増加させた。０．３〜１０μＭの２−メトキシエストラジオールでの前もってのインキュベーションは表４にまとめたように濃度依存性のやり方でタンパク質合成において５ＨＴ（１０nM）−刺激による増加を減少させた。
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実施例  ５
２−メトキシエストラジオールの形態学的効果
通常は紡錘型をした細胞の丸い外形の発現を含む形態学上の変化は３および１０μＭの濃度の２−メトキシエストラジオールで観察された。形の変化は相対的に開始から迅速であり、６時間以内に観察され、その変化はインキュベートが続く間中維持された。これらの形の変化はコルチシン（０．１−１０μＭ）などの微小管の集合の媒体で細胞をインキュベートすることによって引き出されるものと同様である。ステロイド受容体アンタゴニストＲＵ４８６は［スチュアートら、１９９５ｂ］、コルチシンまたは２−メトキシエストラジオールのいずれかに応答する形の変化を減少させるが、２−メトキシエストラジオールによるＤＮＡ合成の阻害には全く影響を及ぼさない。これらの結果を図５に説明する。
実施例  ６
２−メトキシエストラジオールの類似体の効果
２−メトキシエストラジオールに関連したいくつかの化合物を、親化合物である１７β−エストラジオールおよび直前の前駆体、２−ヒドロキシエストラジオールを含むＦＣＳ（１％，ｖ/ｖ）−刺激ＤＮＡ合成の阻害のために調べた。これらの化合物個々の低い濃度は図６に示すようにＦＣＳ（１％）−刺激ＤＮＡ合成を増強した。高濃度で、その増強は逆転し、ついで阻害がこれらの１０μＭの化合物で観察された。２−ヒドロキシエストラジオール（１０μＭ）の阻害効果をは２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）に等量であった。２相効果が２−メトキシエステロンおよび２−メトキシエストリオールを含む類似体とともに観察され、それは３μＭまでの濃度でトロンビン刺激ＤＮＡ合成を増強したが、図７に示すように１０μＭで増強のレベルが衰退した。タンパク質合成への１７β−エストラジオールオリゴヌクレオチドおよび２−ヒドロキシエストラジオールの効果を表５に示す。
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本発明者らは本明細書中で２−メトキシエストラジオール（以前には不活性であると考えられていた１７β−エストラジオールの天然代謝物）が抗−炎症活性を有し、かつヒト気管支から培養された気道平滑筋細胞のＤＮＡおよび連続した分割を阻害することを示した。
抗−炎症性特性は、例えば喘息の治療、および他の慢性の傷害性起動疾患、特にＰＭＮに関連がなかった。
ＤＮＡ合成への阻害効果は、細胞毒性の結果ではない。というのは、２−メトキシエストラジオール（１０μＭ）の最高濃度および培養皿から細胞のインキュベーションにより変化せず、この濃度において、細胞培養皿からの細胞の分離は全く見られなかった。観察された利点に関する任意に提案されたメカニズムによって結合されることを望まないならば、ＤＮＡ合成の阻害を最大に引き起こす細胞周期のＧ１相（有糸分裂２．０時間後）の初期においてステロイドが細胞を阻害することを可能にしている。２−メトキシエストラジオールの有糸分裂後の付加が抗−増殖効果を含むか否かを確立させることが残されたままである。２−メトキシエストラジオールはｂＦＧＦ、トロンビンおよび同様の可能性を有するＦＣＳ（１％）に対する応答を阻害し、そのことはその効果は全くマイトジェンに特異的ではないことを示している。この観察は２−メトキシエストラジオールがこれらのマイトジェンの個々によって使用された初期の細胞内シグナル工程で作用することを示す。それにもかかわらず、ＤＮＡ合成に及ぼす阻害効果は、２−メトキシエストラコールで前もってインキュベートすることによってほとんど有意には阻害されないでいるＦＣＳ（１０％）のいっそう高い濃度で克服可能であった。この耐性は一層高濃度のＦＣＳに対する多大な応答によって説明され得るが、同様の議論はマイトジェンがＥＧＦ（トロンビンによって引き出されるよりも一層小さな応答を引き出す）、ＦＣＳ（１％）またはｂＦＧＦである場合に阻害に対する耐性に関してなされることはできない。しかしながら、ＥＧＦおよび１０％ＦＣＳの増殖効果は２−メトキシエストラジオールによって阻害されるべきである。しかし本発明者らはＤＮＡ合成の阻害を細胞増殖の阻害に結合させる証拠を全く有していない。しかしながら、後者の効果は２−メトキシエストラジオールの低濃度で観察されるという事実が、２−メトキシエストラジオールによってＤＮＡ合成以外の作用がその抗−増殖作用にも貢献しているのである。２−メトキシエストラジオールのいくつかの類似体は、それらが抗−増殖効果と共有しているか否かを決定するために調べられた。両者の親化合物１７β−エストラジオールおよび直前の前駆体、２−ヒドロキシエストラジオールは低濃度でＦＣＳ（１％）に対する応答でＤＮＡ合成を増加させ、ついで３および１０μＭでＤＮＡ合成を阻害した。ＤＮＡ合成におけるこれらの変化が細胞増殖における変化に対応しているか否かはいまだ確立されていない。２−メトキシエステロンおよび２−メトキシエストリオールによるトロンビン刺激ＤＮＡ合成の増強は、高濃度での低い効果と共にベル型の濃度応答曲線を示す。集合的には本発明者らは２−メトキシエストラジオールが調べた類似体のうち、最も可能性のあるものであり、内皮細胞の増殖応答に関する初期の観察と一致する［フォトシス（Fotsis）ら、１９９４］。
親化合物１７β−エストラジオールと活性化合物へと代謝物を誘発する薬剤を投与することも可能である。例えば、ｐ４５０チトクロムの誘発剤およびカテコラミンメチルトランスフェラーゼの誘発剤を使用するかもしれない。アリールサルファターゼもまた考慮されるかもしれない。
２−メトキシエストラジオールの抗−増殖効果およびタンパク質合成における５Ｈｔ−誘発増加を減少させる能力は可塑的であり抗−過剰栄養効果を両方示している。喘息気道において可塑性および過剰影響に関する抗い難い証拠が存在し［エビナら、１９９３］、ＡＨＲの減少の大部分を説明する［ジェームス（James）ら、１９８９］。ＡＨＲにおける減少はいくつかの喘息における徴候の完全な解明に関係している［プラッツ−ミルズ（Platts-Mills）ら、１９８７］。さらに、喘息におけるモデルを再構築する気道壁に示す構造上の変化のすべては気道の平滑筋における増加が最も重要であると考えられる［ペア（Ｐare）およびバイ（Bai）、１９９５］。従って、２−メトキシエストラジオールなどの化合物は、気道平滑筋の増殖応答を阻害するものであり、それゆえ喘息の徴候を減少させる。さらに、２−メトキシエストラジオールの抗−血管形成活性［フォトシスら、１９９４］は再構築応答を制限するようである。というのは、再構築に対する血管形成成分が存在することが確実であるからである［クワノ（Kuwano）ら、１９９３］。この血管形成が増大した組織重量の代謝の必要性を指示するために必要であるようである。それゆえ、血管形成の妨害は２−メトキシエストラジオールの平滑筋および他の細胞型へ及ぼす直接的な任意の阻害効果と独立して再構築応答を停止させるかもしれない。
２−メトキシエストラジオールの他の多数の特性は、喘息の治療における治療上の利益であるようなものであり、微小管の形成を破壊できるような確立した能力を含み［ダマト（D’Amato）ら、１９９４］、それは巨大細胞、マクロファージおよび好中球からの炎症性媒介体の細胞外放出を減少させるかもしれない。
本発明者らのデータは２−メトキシエストラジオールが抗原−誘発巨大細胞分解を阻害することを示す。この活性は、広範囲なアレルギー状態（アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎状態を含む）における２−メトキシエストラジオールの使用を支持する。モルモット腹膜マクロファージ活性のｆＭＰＬによる阻害は、ｆＭＬＰが食菌作用よりＧ−タンパク質結合受容体ヲ活性化するので、２−メトキシエストラジオールの作用が細胞骨格と関連した事象を超えて広がるかもしれないことを示している。
さらに、２−メトキシエストラジオールの抗−酸化活性はまた利益である。というのは、気道の炎症に関連する３つの重要な炎症性細胞型は個々に大量の酸素ラジカルを産生する能力を有し、一酸化窒素は重要な酸化の傷害を引起すかもしれないのである。これらの活性はまた、慢性障害性起動疾患の治療における２−メトキシエストラジオールの使用を支持し、酸素ラジカルの重要な役割は確立され、気道壁再構築の証拠が存在する［クワノら、１９９８］。最終的に、いくつかの実験は２−メトキシエストラジオールオリゴヌクレオチドおよび関連化合物は平滑筋にカルシウム流入を減少させる［ゴヤチェら、１９９５］、気道平滑筋が証明された場合、喘息における気管支痙攣を解消するであろう。
実施例は明瞭性および理解の目的のために幾分詳細に記載されているが、それらの例はガイドラインにすぎない。当業者は本明細書に記載されている態様に多様な変更および改変が本発明の範囲から逸脱せずになされるであろうことを認識するであろう。
本明細書に引用した参照文献を以下のページに挙げる。
参照文献
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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