(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡであって、酵母に導入されたときに、該酵母のγ−グルタミルシステイン蓄積量を増加させるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがフェニルアラニンに置換したアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがフェニルアラニンに置換し、かつ、５６９位以外の１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、請求項1に記載のDNAを保持する酵母。
【請求項３】
サッカロマイセス属に属する請求項２に記載の酵母。
【請求項４】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または同アミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAからなる野生型ＭＥＴ３０遺伝子と、請求項1に記載のDNAからなる変異型ＭＥＴ３０遺伝子とを保持するヘテロ体である請求項２または３に記載の酵母。
【請求項５】
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した請求項２〜４のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母を好適な条件で培養して得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ−グルタミルシステインを生産する酵母と同酵母の菌体を利用した食品に関するものである。γ−グルタミルシステインを含む素材及びそれから製造されるシステインを含む素材は、食品分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
システインは、食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。システインを食品の風味改善に用いることを目的として、システイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そのような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。一方、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すれば、システインを高含有する食品素材を得ることが可能であると報告されている（特許文献１）。
【０００３】
γ−グルタミルシステインは、γ−グルタミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグルタミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオンはグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシステインとグリシンを基質にして合成される。グルタチオン合成酵素遺伝子を破壊した酵母は、γ−グルタミルシステインを蓄積することが報告されている。（非特許文献１）
これまでに、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母は、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３などで報告されている。しかしながら、これらの方法では、γ−グルタミルシステインの生産量が必ずしも満足いくものではなかった。
【０００４】
ところで、酵母におけるMET25遺伝子の発現量を増大させると菌体内グルタチオン含有量が上昇することが報告されている。さらに、MET25遺伝子の発現量を増大させる方法については、変異型MET4遺伝子（非特許文献４、特許文献２）、変異型MET30遺伝子（非特許文献５）を利用する方法等が報告されている。
【０００５】
MET25遺伝子の発現については、次のように考えられている（非特許文献６、非特許文献７）。MET4産物は、MET25遺伝子に発現に正の因子として働く。通常は、MET4産物は、MET30産物及び他の数種のタンパク質とともにSCFMET30複合体を形成し、ユビキチン化を受け、26Sプロテアソームによるタンパク分解系によりMET30産物とともに分解されるため、MET25遺伝子の発現は抑制されている。一方、SCFMET30複合体の機能が低下すると、MET4産物及びMET30産物は分解を受けず、MET25遺伝子が発現する。
【０００６】
上記の知見から、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母においても、MET25遺伝子の発現量を増大させることにより、γ−グルタミルシステイン含有量が増大することが予測される。
【０００７】
しかしながら、MET4遺伝子は酵母の細胞周期を制御しており（非特許文献８）、MET4遺伝子が常時活性化している酵母は生育速度が悪くなる。その為、MET4遺伝子が変異した酵母は、工業生産に適していない。また、前述のように、MET30遺伝子によってコードされる蛋白質はMET4遺伝子産物の活性化に関与するが、これまでに知られている変異型MET30（非特許文献５）は、MET4遺伝子産物の活性化を厳格に制御するものであり、やはり酵母の生育速度を悪くするものである。
【０００８】
【特許文献１】
WO 00/30474号国際公開パンフレット
【特許文献２】
特開平10-33161号公報
【非特許文献１】
Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990
【非特許文献２】
クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997
【非特許文献３】
Inoue et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1395 (1998) 315-320）
【非特許文献４】
大村ら  FEBS Letters 387(1996) 179-183
【非特許文献５】
DOMINIQUEら、MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY, Dec 1995 p6526-6534
【非特許文献６】
Patton et al.,Genes Dev.12: 692-705, 1998
【非特許文献７】
Rouillon et al., EMBO Journal 19: 282-294, 2000
【非特許文献８】
E. Elizabeth Patton et al; The EMBO Journal Vol.19 No.7 pp1613-1624 2000
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の技術背景の下に、酵母のγ−グルタミルシステイン生産能を向上させることができ、かつ、同酵母の生育を悪化させない変異型MET30遺伝子、及びそれを保持する酵母、及び同酵母を利用したγ−グルタミルシステイン含有食品を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、蛋白質の569位のセリン残基が他のアミノ酸残基に変異したMET30遺伝子産物を保持する酵母は、γ−グルタミルシステインの蓄積量と酵母の生育速度を共に満足することを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換し、かつ、５６９位以外の１又は数箇所における１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質。
（２）前記他のアミノ酸がフェニルアラニンである（１）に記載のＤＮＡ。
（３）γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、コードされる蛋白質の５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換する変異を有する変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持する酵母。
（４）前記他のアミノ酸がフェニルアラニンである（３）に記載の酵母。
（５）サッカロマイセス属に属する（３）又は（４）に記載の酵母。
（６）野生型ＭＥＴ３０遺伝子と変異型ＭＥＴ３０遺伝子とを保持するヘテロ体である（３）〜（５）のいずれかに記載の酵母。
（７）細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した（３）〜（６）のいずれかに記載の酵母。
（８）（３）〜（７）のいずれかに記載の酵母を好適な条件で培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理によってシステインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
（９）飲食品がアルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料である請求項８に記載の飲食品。
（１０）（３）〜（７）のいずれかに記載の酵母を好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
（１１）（３）〜（７）のいずれかに記載の酵母を好適な条件で培養して得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵母は、コードされる蛋白質の５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換する変異を有する変異型MET30遺伝子（以下、単に「変異型MET30遺伝子」ともいう）を保持する酵母である。前記セリン以外の他のアミノ酸としては、フェニルアラニンが好ましい。
【００１３】
本発明において、MET30遺伝子とは、MET4産物及び他の数種のタンパク質とともにSCFMET30複合体を形成し、MET25遺伝子の発現に関与するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するサッカロマイセス・セレビシエ由来のMET30遺伝子、及びそのホモログが挙げられる。前記ホモログとしては、例えば配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００１４】
「５６９位のセリン」とは、配列番号２に示すMET30産物のアミノ酸配列において、５６９位に位置するセリン残基を意味する。また、アミノ酸配列におけるあるアミノ酸残基の位置は、その位置よりも上流側における配列中のアミノ酸残基の挿入、欠失等によって変化し得る。本発明において、「５６９位のセリン」とは、このように、アミノ酸配列中の絶対的位置が変わった場合であっても、配列番号２に示すアミノ酸配列における５６９位のセリン残基に相当するアミノ酸残基を含む。
【００１５】
本発明の酵母は、本発明を完成する過程においては、酵母を変異処理することによって取得されたが、本発明により必要な変異が特定されたので、同変異を有する酵母は遺伝子工学的手法によって容易、かつ、確実に取得することができる。例えば、本発明の酵母は、変異型MET30遺伝子を用いた遺伝子置換により創製することができる。また、本発明の酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばUV照射、あるいはN−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。得られた変異株が目的の変異を有していることは、例えばＰＣＲ法等により確認することができる。
【００１６】
前記遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる。変異型MET30遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換し、変異型MET30遺伝子と染色体上のMET30遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にし、さらに、酵母で機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
【００１７】
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、変異型MET30遺伝子と染色体上にもともと存在するMET30遺伝子との組換えを起こし、野生型MET30遺伝子と変異型MET30遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。本発明においては、後述するように、変異型MET30遺伝子と野生型MET30遺伝子が共存しても差し支えないので、前記融合遺伝子は両方とも染色体上に保持させたままでもよいが、安定性の上からは、変異型MET30遺伝子のみを染色体上に残すことが好ましい。
【００１８】
融合遺伝子２個のうち、変異型MET30遺伝子のみを残すために、２個のMET30遺伝子の組換えにより１コピーのMET30遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型MET30遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型MET30遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型MET30遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型MET30遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、PCRによりMET30遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
【００１９】
尚、遺伝子置換に用いる変異型MET30遺伝子は、MET30タンパク質全長をコードするものであってもよいが、変異部位を含む限り、タンパク質の一部をコードする遺伝子断片であってもよい。遺伝子断片を用いた場合も、上記と同様にして遺伝子置換を行うと、染色体ＤＮＡ上のMET30遺伝子に目的の変異が導入される。
【００２０】
染色体ＤＮＡ上のMET30遺伝子と、導入しようとする変異型MET30遺伝子が、遺伝子置換法を適用できない程度に相同性が低い場合には、染色体ＤＮＡ上のMET30遺伝子を破壊した後に、変異型MET30遺伝子をプラスミド上又は染色体ＤＮＡ上に保持させればよい。
【００２１】
目的の変異を有する変異型MET30遺伝子は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって取得することができる。サッカロマイセス・セレビシエのMET30遺伝子は塩基配列が報告されており（DOMIMIQUE et al., MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY Dec,1995, p6526-6534、配列番号１）、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから取得することができる。
【００２２】
本発明の変異型MET30遺伝子として具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２３】
本発明の変異型MET30遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６９位のセリンがセリン以外の他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする保存的バリアント（conservative variant）、すなわち５６９位以外の１又は数箇所の位置における１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、するMET30産物をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、２〜10個、好ましくは、２〜６個、より好ましくは２〜３個である。あるいは、変異型MET30遺伝子は、MET30産物のアミノ酸配列全体に対し、３０から４０％以上、好ましくは５５〜６５％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２４】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、MET30遺伝子を保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２５】
酵母の形質転換は、プロトプラスト法、ＫＵ法、ＫＵＲ法、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物  実験ライン31 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ10  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００２６】
本発明の酵母としては、γ−グルタミルシステインを生産することができるものであり、MET30遺伝子がγ−グルタミルシステインの生成に関与しているものであれば特に制限されないが、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス・ポンベ等のシゾサッカロマイセス属等に属する酵母が挙げられる。また、本発明の酵母は、２倍性またはそれ以上の倍数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。
【００２７】
本発明においては、２倍体以上の倍数性を有する酵母にあっては、変異型MET30遺伝子を２つ有するホモ型であってもよいし、変異型MET30遺伝子と野生型MET30遺伝子をそれぞれ有するヘテロ型であってもよいが、ヘテロ型であることが、生育が良好である点で好ましい。
【００２８】
２倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、上記変異型MET30遺伝子を保持する酵母の育種に用いた１倍体酵母と、野生型MET30遺伝子保持株の１倍体を接合させ、得られた２倍体酵母から、変異型MET30遺伝子を保持し、γ−グルタミルシステインを産生する株を選択することによって、取得することができる。同様にして、３倍性又はそれ以上の倍数性を有する酵母を取得することができる。
【００２９】
本発明の酵母は、変異型MET30遺伝子を保持することに加えて、さらにγ−グルタミルシステイン生産能が向上するように改変されていてもよい。例えば、γ−グルタミルシステイン生産能は、細胞内のグルタチオン合成酵素活性を低下又は消失させること、及び／又は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強することによって、向上させることができる。
【００３０】
グルタチオン合成酵素活性を消失させるには、上記と同様にして、グルタチオン合成酵素遺伝子を遺伝子置換により破壊する方法がある。サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子（GSH2）は塩基配列が報告されており（Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320、GenBank accession Y13804、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから取得することができる。
【００３１】
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下した酵母は、実施例に示すように、酵母を変異処理し、グルタチオン含有量が低下した変異株を選択することによって、取得することができる。
【００３２】
また、グルタチオン合成酵素遺伝子に、同酵素活性が低下するような変異を導入することによって、細胞内のグルタチオン合成酵素活性を低下させることができる。このような変異としては、例えば以下の変異が挙げられる。
【００３３】
（１）４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異。
（２）３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異。
（３）５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異。
上記変異は、単独でも、任意の組合せでもよいが、（１）と（３）の組合せ、及び（２）と（３）の組合せが好ましい。
【００３４】
グルタチオン合成酵素遺伝子への目的の変異の導入は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって行うことができる。
また、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強する方法としては、同酵素遺伝子を挿入したプラスミドで酵母を形質転換し、同遺伝子の細胞内のコピー数を高めるか、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーター置換する方法（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第50巻第10号、第989〜994頁、1992年）が挙げられる。
【００３５】
細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素性は、それぞれ、Jacksonの方法（Jackson, R.C., Biochem. J., 111, 309 (1969)）、及びGushimaらの方法（Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)）によって測定することができる。
【００３６】
上記のような酵母の育種、改変に関する操作は、「化学と生物  実験ライン31酵母の実験技術」初版  廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ10  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社、「METHODS in YEAST GENETICS 2000 Edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載されている。
【００３７】
上記のようにして得られる酵母を好適な条件で培養して得られた培養物は、γ−グルタミルシステインを含有する。このような培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
【００３８】
上記γ−グルタミルシステインを含む培養物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミルシステインからシステインを遊離させることができる。
培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されない。本発明の酵母は、グルタチオンを含まない培地でも良好に生育することができるので、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
【００３９】
本発明の酵母の培養条件は、通常の酵母の培養に用いられるものであってよいが、γ−グルタミルシステインの含有量と生育速度のバランスをとることが好ましい。
【００４０】
酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。
【００４１】
上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。
【００４２】
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４４】
【実施例１】
＜１＞グルタチオン合成酵素活性が低下した酵母の取得
食品用途に用いられる市販の２倍体のサッカロマイセス・セレビシエを常法にしたがい胞子形成させた。形成した胞子からランダムスポア法により１倍体酵母YN0001株（MATα）を取得した。YN0001株をEMSにより変異処理し、グルタチオン含有量が低下した変異株YN0002株（MATα）を取得した。４分子解析により、YN0002株のGSH2遺伝子が変異していることを確認した。また、グルタチオン含有量が低下した変異株YN0003株(MATa)も取得した。
【００４５】
尚、前記変異処理は、死滅率が90%になるような条件で行なった。YN0001株を50mlのYPD培地で30℃で1日間振とう培養し、酵母菌体を集菌した。酵母菌体を0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）で3回洗浄した。酵母菌体を0.2Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)9.2ml、40% D-グルコース0.5ml、EMS 0.3ml(ナカライテスク社Code155-19)を含む溶液に懸濁し、30℃で90分間振とう培養した。この懸濁液に、10%チオ硫酸ナトリウム（フィルター滅菌）を10ml加え、10分間室温に放置して変異剤を中和した。酵母菌体を集菌し、0.2Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で洗浄した。
【００４６】
前記YN0001株とYN0002株を各々YPD培地に植菌し、30℃で振とう培養した。培養産物をSD培地に2%植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期における菌体内グルタチオン含有量を測定した。その結果、YN0001株のグルタチオン含有量は0.52%であった。一方、YN0002株のグルタチオン含有量は0.006%以下であった。
【００４７】
＜２＞MET30遺伝子変異株の取得
前記１倍体酵母YN0001株（MATα）を、前記と同様にしてEMSにて変異処理し、MET25遺伝子の発現がメチオニンによって抑制されない変異株AJ14819株（MATα）を取得した。本菌株は、プライベートナンバーAJ14819が付与され、2002年９月 １１ 日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-19007が付与されている。なお、MET25遺伝子の発現がメチオニンによって抑制されるか否かは、セレンを含む培地での生育の有無によって判別することもできる（DOMINIQUEら、MOLLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY Dec, 1995, p6526-6534）。
【００４８】
具体的には、以下のようにして変異株の選択を行った。変異処理を行なった酵母をYPD寒天培地にスプレッドした。スプレッドは寒天培地に生育してくる酵母が100株前後になるように行なった。YPD培地に生育してきた酵母をセレンを含む培地とセレンを含まない培地（前記DOMINIQUEらに記載の寒天培地）にレプリカした。セレンを含む培地では生育しないが、セレンを含まない培地で生育する酵母菌株を選択した。
【００４９】
選択した酵母のMET25遺伝子発現量が上昇している事を以下のようにして確認した。選択した酵母菌株及びYN0001株をSD培地で培養し、その対数増殖期に集菌した。菌体内に含まれるRNAを回収し、RNA中に含まれるMET25遺伝子の転写産物の量を内部標準としてACT1遺伝子を用いて定量した。定量は、定量PCRであるPCR5700（Applied Biosystems社）を用い、TaqMan One-Step RT-PCRキット（Applied Biosystems社）を用いて行なった。TaqMan Probe（Applied Biosystems社）に、ACT1-986T（配列番号３）及びMET25-1077T（配列番号４）を用い、ACT1及びMET25遺伝子の増幅用にACT1-963F（配列番号５）とACT1-1039R（配列番号６）、及びMET251056F（配列番号７）とMET25-1134R（配列番号８）を用いた（以上、Applied Biosystems社）。このようにして、MET25遺伝子の発現量がYN0001株よりも2倍以上に上昇した酵母AJ14819株を取得した。
【００５０】
このようにして取得したAJ14819株の変異遺伝子を４分子解析により特定し、その遺伝子の配列を調べたところ、MET30遺伝子がコードするタンパク質の569位のセリン残基がフェニルアラニン残基に変異していた。このようにしてMET25遺伝子の発現がメチオニンによって抑制されない酵母AJ14819株を取得した。
【００５１】
＜３＞グルタチオン合成酵素活性が低下し、変異型MET30遺伝子を保持する酵母の作製
YN0002株とYN0003株を接合させる事により、グルタチオン合成酵素活性が低下した２倍体酵母G2M0株（gsh2/gsh2）を取得した。次に、AJ14189株とYN0003株を接合させて、２倍体を取得した。この２倍体を胞子形成させて、ランダムスポア法により、グルタチオン合成酵素活性が低下し、かつMET30遺伝子の569位のセリン残基がフェニルアラニン残基に変異した１倍体酵母YN0004株（MATα）、YN0005株（MATa）を各々取得した。
【００５２】
YN0002株とYN0005株を接合させる事により、グルタチオン合成酵素活性が低下し、変異型MET30遺伝子を１セット有する２倍体酵母G2M1株(gsh2/gsh2  met30/MET30)を取得した。また、YN0004株とYN0005株を接合させる事により、グルタチオン合成酵素活性が低下し、変異型MET30遺伝子を２セット有する２倍体酵母G2M2株(gsh2/gsh2 met30/met30)を取得した。
【００５３】
＜４＞γ−グルタミルシステイン生産能の評価
G2M0株、G2M1株、G2M2株をSD培地で培養し、酵母の増殖が対数増殖期であり、かつ、660nmの吸収が１以上になった後の生育及びγ−グルタミルシステイン（以下、「γGC」ともいう）蓄積量を測定した。各々の株の対数増殖期における乾燥酵母菌体あたりのγGC蓄積量は以下の表の通りであった。また、各菌株の比増殖速度（単位時間辺りに増殖した菌体の比較割合）は、G2M0株が1.27、G2M1株が1.27、G2M2株が1.22であった。
【００５４】
【表１】
0004228644.tif 000002
【００５５】
次に、単位時間あたりのγGCの生産性を測定した。単位時間あたりのγGCの生産性は、一定時間にSD培地50mlで各株を培養したときの坂口フラスコに含まれているγGCの量が、単位時間あたりにどれだけ増えたかによって測定した。
その結果、G2M0株は0.228mg/時間、G2M1株は0.323mg/時間、G2M2株は0.290mg/時間であった。
【００５６】
【比較例１】
G2M0株、G2M1株、G2M2株のホモシステイン合成酵素(MET25)活性を、DOMINIQUEら（MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY Dec,1995,p6526-6534）記載のrepressive条件（培地中に含まれるメチオニンによってMET25遺伝子の発現が抑制される条件。具体的には、1mMのメチオニンを含むSD培地でのホモシステイン合成酵素活性を調べる条件）で測定し、比較した。
【００５７】
【表２】
0004228644.tif 000003
【００５８】
G2M1株及びG2M2株のホモシステイン合成酵素活性は、DOMINIQUEらが報告しているCM100株（MET30/met30-1; met30-1は変異を有するMET30遺伝子）の酵素活性値180よりも有意に小さい。したがって、本発明のSer569Pheタイプの変異型MET30遺伝子は、MET25遺伝子の発現を穏やかに制御することにより、生育速度とγGC含有量を両立できると考えられる。
【００５９】
尚、DOMINIQUEらの変異型MET30遺伝子は、優性であると報告されていることからも、本発明の変異型MET30遺伝子とは異なることが示唆される。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、グルタチオン合成酵素が破壊又は弱化し、MET30遺伝子がコードする蛋白質の569位のセリン残基がフェニルアラニン残基に変異したサッカロマイセス・セレビシエが提供される。本発明の酵母を最適な条件で培養することにより、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母培養液が提供される。本発明の酵母及び酵母培養液は、γ−グルタミルシステイン含有食品又はシステイン含有食品の製造に利用することができる。
【００６１】
【配列表】
0004228644.tif 000004
0004228644.tif 000005
0004228644.tif 000006
0004228644.tif 000007
0004228644.tif 000008
0004228644.tif 000009
0004228644.tif 000010
0004228644.tif 000011
0004228644.tif 000012
0004228644.tif 000013
0004228644.tif 000014