(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
Xn-C1-X1-X2-G-W-V-G-X3-C2-X4-X5-W-Xc
[式中、Xnは、Xn1-Xn2-Xn3-Xn4であり、ここで
Xn1は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び酸性の天然α−アミノ酸から成る群から選択され、又は任意には、Xn1は不在であり；
Xn2は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び塩基性の天然α−アミノ酸から成る群から選択され、又は任意には、Xn1が不在である場合、Xn2は不在であり；
Xn3は、天然α−アミノ酸から成る群から選択され；そして
Xn4は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び酸性の天然α−アミノ酸から成る群から選択され；
X1は、中性及び疎水性、中性及び極性、又は塩基性のアミノ酸であり；
X2は、中性及び疎水性、中性及び極性又は塩基性のアミノ酸であり；
X3は、中性及び極性、又は塩基性のアミノ酸であり；
X4は、中性及び極性、塩基性、又は酸性のアミノ酸であり；
X5は、中性及び極性、中性及び疎水性、又は酸性のアミノ酸であり；そして
Xcは、Xc1-Xc2であり、そしてXc1が中性及び極性、又は中性及び疎水性アミノ酸であり、そしてXc2が中性及び極性、中性及び疎水性、又は塩基性のアミノ酸である]
で表され、C1とC2との間の分子内ジスルフィド結合におより環化している、ヒトエリトロポエチン受容体に結合することができる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
Xn1がE, G, N, S, D, Q, L, Y又はA であり；
Xn2がF, V, A, K, R, G, S, I又はL であり；
Xn3がH, Q, E, G, D, A又はV であり；そして
Xn4がE, G, V, A, P, D, T 又はM である；
請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
Xn1が不在であり；
Xn2がF, V, A, K, R, G, S, I又はL であり；
Xn3がH, Q, E, G, D, A又はV であり；そして
Xn4がE, G, V, A, P, D, T 又はM である；
請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
Xn1が酸性アミノ酸である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
Xn2が枝分かれ鎖のアミノ酸又はK である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
Xn3が酸性アミノ酸又はV である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
Xn4がV 又はG である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
X1がR, I, G, Q, L, T又はS である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
X1がR 又はL である請求項８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
X2がR, P, W, G, L 又はN である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
X2がR である請求項10記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
X3がH, Q又はN である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
X4がQ, N, S, K又はE である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
X4がK 又はN である請求項13記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
X5がV, A, Y, D又はE である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
X5がD 又はE である請求項15記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
Xc1がL, I, P, F, M, Q又はG である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
Xc1がL 又はQ である請求項17記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
Xc2がM, W, T, S, G, N又はR である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
Xc2がG 又はR である請求項19記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号81のアミノ酸配列を有し、分子内ジスルフィド結合により環化している単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号82のアミノ酸配列を有し、分子内ジスルフィド結合により環化している単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬理学及び薬物発見の分野に関する。より特定には、本発明は、ヒトエリトロポエチン受容体に結合し、そして活性化することができる新規ペプチド組成物、及び設計の鋳型としての、上記のペプチド組成物を用いてのエリトロポエチン受容体の小分子アゴニストの製造方法に関する。
【０００２】
発明の背景
薬物の発見は従来、新規薬物先導体を同定するために多数の化合物の高処理量スクリーニングに依存して来た。より最近には、化学的又は生物学的手段により構成される組み合わせのライブラリーが、スクリーニングのために利用できる化合物の数を拡張してきた。ランダムに指図された半−ランダム配列の生物学的ライブリー、たとえばファージ表示されたペプチドライブラリーは、特に分子多様性の特に豊富な源を表し、そして好都合には、自己複製する能力を有する。
【０００３】
自己複製システムにより、高い親和性先導体についての研究は、初期ライブラリーに偶然存在するメンバーに限定されない。下記でより十分に論ぜられるように、初期配列の所望する特徴は、連続的段階の突然変異誘発、親和性選択及び増幅を用いることによって非常に改良され得る。それらのアプローチは最近、いくつかのサイトカイン受容体を結合できる小さなペプチドを発見するために使用されて来た。
【０００４】
エリトロポエチン（EPO ）は、前駆細胞（progenitor cell)の増幅及び分化を誘発することによって赤血球細胞の形成を刺激するサイトカインである。ヒトEPO の組換えバージョンは、いくつかの病理学的状態、たとえば慢性腎不全、化学療法の悪性度又は効果、HIV 及びリウマチ様関節炎に関係する貧血を処理するために有用な価値ある治療剤である。治療的に使用される場合、EPO は静脈又は皮下注射により投与されるべきである。EPO が比較的大きな糖タンパク質である事実は、製造の費用、分子の薬理学的性質及びこの治療剤の多様性の態様に悪影響を及ぼす。
【０００５】
エリトロポエチン受容体（EPOR）は、通常の構造的特徴、たとえば細胞外リガンド結合ドメイン、単一のトランスメンブラン−拡張領域、及び細胞内細胞質ドメインを共有するサイトカイン受容体スーパーファミリーメンバーに属する。細胞外ドメイン（ECD ）は、受容体−リガンド結合を仲介するのに十分である。従って、たとえばファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによって受容体結合分子を同定するために有用な試薬を生成するために、分泌されたタンパク質との融合体としてECD をコードするDNA を合成することが、組換えDNA 技法を通して可能になる。
【０００６】
ランダム又は半ランダムペプチド及びバクテリオファージコートタンパク質の融合体を発現するファージ表示ライブラリーは、受容体リガンドを同定するためにスクリーニングされ得る組み合わせのライブラリーの従来バージョンを表す。ファージ粒子の感染及びアセンブリーに基づいて、ランダムポリペプチドは、抗体又は他の受容体プローブとの相互作用のために表面的に配置される。ファージ粒子は融合タンパク質をコードする核酸を含むので、融合タンパク質の配列を同定する遺伝子情報は、融合タンパク質に物理的に連結される。
【０００７】
そのようなファージ発現ライブラリーの作製及びスクリーニングは、良く知られており、そしてたとえば、Sawyerなど., Protein Engineering 4: 947-953 (1991); Akamatsuなど., J. Immunol. 151: 4651-59 (1993); Smith など., Methods in Enzymol. 217: 228-257 (1993); Clacksonなど., Trends Biotechnol. 12: 173-184 (1994); 及びアメリカ特許第5,427,908 号（Dower など）にこれまで記載されている。
【０００８】
スクリーニング方法の１つの例においては、EPORの可溶形が、EPO 様性質を有する候補体性質を同定するためにファージ表示ライブラリーをプローブするために使用された。Wrightonなど. Science 273: 458 (1996) は、ライブラリースクリーニングプロトコールにおいて、EPOR細胞外ドメイン及びヒト胎盤アルカリホスファターゼを含んで成る融合タンパク質の使用を記載している。この目的のために使用されるライブラリーは、線状（filamentous)ファージのpVIII コートタンパク質との融合体として環状８−残基ペプチドを示した。
【０００９】
続いて、EPORのための高い親和性を有する性質がpIIIタンパク質融合を示した突然変異誘発ライブラリーから単離された。このアプローチは、マウスにおいてエリトロポエチン合成を刺激するいくつかの性質の同定を導く。これらのアゴニストは、最小のコンセンサス配列YXCXXGPXTWXCXP (配列番号１) （ここで、X はいくつかのアミノ酸のいずれかにより支配され得る位置である）を有するジスルフィド−結合された環状ペプチドであった。
これはEPORリガンドの同定に進行しているにもかかわらず、卓越した受容体−結合性質を示すリガンド、及びこれまで未知の接触部位を用いて受容体に結合するリガンドを同定する必要性が残っている。
【００１０】
発明の要約
本発明の１つの観点によれば、下記式：
X n -C-X1-X2-G-W-V-G-X3-C-X4-X5-W-X c
[ 式中、X n は長さ２〜４個の天然α−アミノ酸のN −末端ペプチドであり；
X c はC −末端ジペプチドであり、そして
X1, X2, X3, X4, 及びX5は天然のα−アミノ酸から成る群から独立して選択される]
で表される、ヒトエリトロポエチン受容体を結合することができる単離されたポリペプチドが開示される。
【００１１】
単離されたポリペプチドの好ましい態様においては、アミノ末端X n は、X n1-Xn2-Xn3-Xn4であり、ここでX n1は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び酸性の天然α−アミノ酸から成る群から選択され、又は任意には、X n1は不在であり；X n2は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び塩基性の天然α−アミノ酸から成る群から選択され、又は任意には、X n2は、X n1が不在である場合、不在であり；X n3は、天然α−アミノ酸から成る群から選択され；そしてX n4は、中性及び極性、中性及び疎水性、及び酸性の天然α−アミノ酸から成る群から選択される。
【００１２】
より好ましくは、X n1はE, G, N, S, D, Q, L, Y又はA であり；X n2はF, V, A, K, R, G, S, I又はL であり；X n3はH, Q, E, G, D, A又はV であり；そしてX n4はE, G, V, A, P, D, T 又はM である。他の好ましい態様においては、X n1は不在であり；X n2はF, V, A, K, R, G, S, I又はL であり；X n3はH, Q, E, G, D, A又はV であり；そしてX n4はE, G, V, A, P, D, T 又はM である。1 つの態様においては、X n1は酸性アミノ酸である。もう1 つの態様においては、X n2は枝分かれ鎖のアミノ酸又はK である。さらにもう1 つの態様においては、X n3は酸性アミノ酸又はV である。1 つの態様においては、X n4はV 又はG である。
【００１３】
好ましい態様においては、X1は、中性及び疎水性、中性及び極性、又は塩基性のアミノ酸であり；より好ましくは、X1はR, I, G, Q, L, T又はS であり；そして最も好ましくは、R 又はL である。好ましい態様においては、X2は中性及び疎水性、中性及び極性又は塩基性のアミノ酸であり；より好ましくは、X2はR, P, W, G, L 又はN であり；そして最も好ましくは、R である。好ましい態様においては、X3は中性及び極性、又は塩基性のアミノ酸であり；そして好ましくは、H, Q又はN である。
【００１４】
好ましい態様においては、X4は中性及び極性、塩基性、又は酸性のアミノ酸であり；より好ましくは、Q, N, S, K又はE であり；そして最も好ましくは、K 又はN である。好ましい態様においては、X5は中性及び極性、中性及び疎水性、又は酸性のアミノ酸であり；より好ましくは、V, A, Y, D又はE であり；そして最も好ましくは、D 又はE である。
【００１５】
好ましい態様においては、カルボキシ−末端X c はX c1-Xc2であり、そしてX c1は中性及び極性、又は中性及び疎水性アミノ酸であり、そしてX c2は中性及び極性、中性及び疎水性、又は塩基性のアミノ酸である。好ましい態様においては、X c1がL, I, P, F, M, Q又はG であり；そしてより好ましくは、L 又はQ である。好ましい態様においては、X c2はM, W, T, S, G, N又はR であり；そしてより好ましくは、G 又はR である。
【００１６】
本発明の他の観点は、配列番号８２のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドである。
本発明のもう1 つの観点によれば、その表面上にエリトロポエチン受容体を有する細胞と、エリトロポエチンのペプチド模倣体とを接触せしめ、ここで前記ペプチド模倣体は下記式：
X n -C-X1-X2-G-W-V-G-X3-C-X4-X5-W-X c
[ 式中、X n は２〜４個の長さの天然のα−アミノ酸のN −末端ペプチドであり；X c はC −末端ジペプチドであり、そしてX1, X2, X3, X4, 及びX5は天然のα−アミノ酸から成る群から独立して選択される] で表される一般式を有する化合物であり；そして
前記ペプチド模倣体と前記エリトロポエチン受容体との結合を可能にし、それにより、前記エリトロポエチン受容体の活性化を開始せしめる；
段階を含んで成るヒトエリトロポエチン受容体を活性化するための方法が開示される。
【００１７】
本発明のもう1 つの観点によれば、エリトロポエチン受容体へのエリトロポエチンの結合を阻害するための方法が提供され、ここで前記方法は、
下記式：
X n -C-X1-X2-G-W-V-G-X3-C-X4-X5-W-X c
[ 式中、X n は２〜４個の長さの天然のα−アミノ酸のN −末端ペプチドであり；X c はC −末端ジペプチドであり、そしてX1, X2, X3, X4, 及びX5は天然のα−アミノ酸から成る群から独立して選択される] で表される一般式を有するペプチド模倣体を、エリトロポエチン受容体への結合のためにエリトロポエチンと競争する十分な量、供給し；そして
前記エリトロポエチン受容体と前記ペプチド模倣体との相互作用を可能にし、それにより、前記エリトロポエチン受容体へのエリトロポエチンの結合を阻害する段階を含んで成る。好ましい態様においては、エリトロポエチン受容体は、ヒトに由来する。
【００１８】
本発明のもう1 つの観点は、エリトロポエチンを模倣する薬物を発見するための方法であり、ここで前記方法は、融合タンパク質がアミノ酸のランダム配列から成るペプチド及びファージタンパク質を含んで成るファージ表示ライブラリーを作製し；ヒトエリトロポエチン受容体プローブに結合する少なくとも１つのクローンについて前記ファージ表示ライブラリーをスクリーンし；
ヒトエリトロポエチン受容体プローブに結合する前記クローンを単離し；
前記融合タンパク質内に含まれる前記ペプチドをコードする前記クローンからの核酸配列を決定し；
【００１９】
前記融合タンパク質内に含まれる前記ペプチドをコードする前記核酸配列のインビトロ突然変異誘発により、発生されたファージ表示ライブラリーを構成し；
ヒトエリトロポエチン受容体プローブに結合するクローンについて前記発生されたファージ表示ライブラリーをスクリーニングし；
前記発生されたファージ表示ライブラリイーから前記クローンを単離し；
前記クローンから核酸配列を決定し、ここで個々の核酸は前記クローンの融合タンパク質内に含まれるペプチドをコードし；
コンセンサスアミノ酸配列を同定するために、前記核酸配列を比較し；そして
前記コンセンサスアミノ酸配列を模倣する化合物を合成する；
段階を含んで成る。
【００２０】
好ましい態様においては、前記合成段階は、有機化合物；好ましくはペプチドである化合物を合成することを含んで成る。より好ましくは、合成されるペプチドは、環状ペプチドである。
【００２１】
好ましい態様の詳細な記載：
本明細書において、本発明者は、ヒトEPORを結合し、そして活性化できる新規ペプチド、及び設計の鋳型として、ペプチドリガンドを用いてEPO の小分子類似体を製造するための方法を開示する。意外には、それらのペプチドリガンドの一次アミノ酸配列は、真のEPO タンパク質の一次アミノ酸配列に関係しない。
【００２２】
さらに、本明細書に開示されるペプチドはまた、ファージ表示ライブラリーからのこれまで単離されたEPO 結合ペプチドに無関係である。本明細書において同定される新規ペプチドは、候補体治療剤としてのみならず、さらに、EPO アゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する小分子を設計するためのモデルとしても作用する。明確には、EPO の生物学的性質を模倣するペプチド又は他の小分子は、薬種に価値ある付加を提供する。
【００２３】
EPORに結合し、そしてエリトロポエチンの薬理学活性を模倣する環状ペプチドの収合が同定された。１つのEPOR−結合クローンは最初に、pIIIキャプシドタンパク質のN −末端に融合される38個のランダムアミノ酸を表示するM13 ファージライブラリーから単離された。この初期単離物のEPOR−結合ペプチドをコードする配列を用いる場合、ペプチドの完全な長さにわたって種々のアミノ酸置換を含む発生されたライブラリーが、追加のEPOR−結合クローンを単離するために生物分離法を用いて製造され、そしてスクリーニングされた。結合ペプチドをコードする配列及び非結合対照が決定された。
【００２４】
初期単離物も又発生されたライブラリーから単離されたEPOR−結合クローンのいずれも、EPO の一次アミノ酸配列との有意な配列類似性を共有しなかった。EPO −結合クローンの配列は、非結合クローンに不在であるコンセンサス配列を含んだ。このコンセンサス配列（配列番号12）は、12マーペプチドをコードするが、但し追加のアミノ酸残基もまた、EPORに結合する効率に寄与する。
【００２５】
前記コンセンサス配列に基づいて、最長の38−マー結合ペプチドの活性を保持する長さ18個のアミノ酸の切断されたペプチドが合成された。コンセンサス12−マー配列に基づいてアミノ酸配列を有する２種の典型的な合成ペプチドは、インビトロアッセイにおいて、キメラIg−EPORへの真のEPO の結合を阻害した。さらに、それらの誘導体ペプチドはまた、培養物において、EPO −応答細胞の増殖を刺激した。
【００２６】
１又は複数のN −末端による18−マー合成ペプチドの１つの切断は、受容体−結合及び生物学的アッセイにおけるペプチド活性を低めた。従って、少なくとも18−マーアミノ酸配列を含む長いペプチドはEPORに対して結合する高い親和性を示すが、より短いペプチド（たとえば、N −末端側のコンセンサス配列側に位置する３個のアミノ酸を有する）は、EPORを活性する能力を保持した。
【００２７】
手短には、本明細書に開示されるEPORリガンドは、（１）EPO に結合するキメラ受容体プローブを創造し；（２）多数の標的ランダムペプチドを発現するファージ表示ライブラリーを創造し；（３）受容体−結合活性を有する１又は複数の先導ペプチドを同定するためにキメラ受容体プローブによりライブラリーをスクリーニングし；そして（４）EPO 受容体を結合し、そして/ 又は活性化する変異体分子に共有する構造特徴を同定するために先導ペプチドの誘導体を創造し、そして試験することを包含する複数段階方法により同定された。新規EPORアゴニストを得るために使用される方法の一般的特徴が下記に記載されている。
【００２８】
EPO 結合活性を有するキメラ受容体プローブ
受容体リガンドを同定するための方法は、抗−リガンド抗体又はスクリーニングアッセイの結果を本質的に変更するかも知れない生来の受容体リガンドのサブフラグメントの結合に依存して来た。たとえば、わずか６〜10個の長さのアミノ酸の線状ペプチドが抗体の組み合わせ部位中に適合され得るので、受容体−結合リガンドの決定的な構造特徴である三次構造を表すペプチドを同定することは困難である。
【００２９】
同様に、既知のリガンドのサブフラグメントは、同種リガンド構造特徴を有するか又はそれを表す決定的な高いオーダーに構造体を表すことができない。たとえば、受容体−結合リガンドの三次構造体は、抗体又は他のリガンドの連続したアミノ酸に完全に含まれ得ない。
【００３０】
結合アッセイにおいて同定され得る組み合わせ分子の構造に対する不必要な制限を回避するために、本発明者は、生来の受容体の細胞外ドメインを含むプローブを創造した。スクリーニングアッセイにおける便利さのために、本発明者はまた、リガンドを結合するのみならず、また二次プローブにより同定され得るプローブを使用した。本発明者は、EPO 受容体（“EPOR”）及びヒンジ領域のリガンド結合ドメイン、すなわちネズミIgG １抗体のCH2 及びCH3 ドメインを組み込んでいるキメラタンパク質を創造した。
【００３１】
下記に示されるように、このキメラ受容体（“Ig−EPOR”）は、生来のリガンドを結合し、そしてまた、抗−ネズミIgG により認識された。この配列は、受容体相互作用のために必要とされ、そしてまた、第２抗体を用いて検出され得る生来のリガンドの決定的な最小構造特徴を示す新規リガンドのプローブへの結合を可能にした。
好都合には、生来の受容体のリガンド結合ドメインを含むプローブの使用は、生来のリガンドと同じ大きさの、又は受容体結合のために必要とされる最小の決定的構造体と同じほどの小さな構造体の結合を可能にした。
【００３２】
ファージ表示ライブラリーの作製及びスクリーニング
本発明者は、薬物発見のための分子多様性の源として高い複雑性のファージ表示ライブラリーを使用している。有機化合物の従来のライブラリーは、候補体薬物分子を同定するために、一度に１つの化合物をスクリーンするが、ファージ表示ライブラリーは、高処理量スクリーニングアッセイを用いて、急速にスクリーンされ得る豊富な源の多様性を付与する。
【００３３】
下記に開示されるスクリーニング方法に使用されるライブラリーは、ファージM13 のpIIIマイナーコートタンパク質との融合を示した。pIII分子のN −末端ドメインは細菌F 繊毛に結合し、そして感染のために必要とされるが、C −末端ドメインはファージキャプシドにおけるタンパク質を固定する。好都合には、大きなサイズ範囲の融合体pIIIタンパク質を包含する構造体において許容され得、それにより、ライブラリーの分子多様性を増強する。比較的長いランダムアミノ酸配列（約30〜約50個の残基）は、スクリーニングのためのランダム配列を含んで成る比較的長いペプチドを表示するためにpIIIタンパク質に融合され得る。
【００３４】
長いランダムペプチドのライブラリーは、隣接するアミノ酸残基の“スライディング窓”を提供し、そしてまた、複合体タンパク質における断続的エピトープを表す三次構造を提供する可能性も有する。複雑性のこの付加されたレベルは、複雑な標的物、たとえば細胞表面受容体と相互作用することができる分子についてスクリーンする場合、重要であり得る。さらに、長いランダムペプチドのライブラリーは、複雑な標的物を結合することができる複数の接触部位の形成を可能にする。
【００３５】
先導ペプチドの誘導体の生成及び試験
本発明者は、先導ペプチドとしてファージ表示ライブラリーの１つから初期単離物を同定し、そして単離し、そして次に、その先導ペプチドの分子変異体を構成し、そして類似するか又は増強された生物学的活性を示すクローンについてスクリーンした。すなわち、本発明者は、38−マーの先導ペプチドにおけるコドン位置のほぼすべてが、変異体分子のライブラリーを生成するために、予測される50％の頻度でランダム化されているファージ表示ライブラリーを創造した。変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明者は、EPO 受容体プローブをまた結合した多数の追加のペプチドを同定した。
【００３６】
変異体のDNA 配列から推定されるペプチド配列の整列は、所望する機能的特徴を有する分子のためのアミノ酸のコンセンサス配列の同定を可能にした。この点で、先導ペプチドをコードする核酸配列に基づいて変異体ペプチドのライブラリーを創造するこの方法は、“分子進化”として言及される。この方法を用いて、本発明者は興味ある受容体と相互作用する高められた能力を有する変異体クローン（すなわち、先導クローンの結合親和性に対してEPORについての高められた結合親和性を有するクローン）を同定した。
【００３７】
分子進化方法は、追加の機能的ペプチドを同定するために100,000,000 個以上のタンパク質変異体のスクリーンを可能にした。それらの追加のペプチドのアミノ酸配列の整列及びコンセンサス配列の同定は、最適化された受容体結合性質を同定するための基本原理として作用した。好ましくは、それらの最適化されたペプチドは、先導単離物に存在するペプチドよりも小さく、そしてより好ましくは、最適化されたペプチドは分子進化を用いることによって同定される変異体よりも小さい。
【００３８】
定義
“キメラタンパク質”とは、少なくとも２種の異なったタンパク質又はポリペプチドからの、又は1 つのタンパク質又はポリペプチドからのアミノ酸配列のいくつか又はすべてを含んで成る、天然に存在しないタンパク質又はポリペプチド、及び天然に存在しないポリペプチド鎖を意味する。本明細書において使用される場合、キメラタンパク質が、設計され、遺伝子工学により構成され、合成され、又は他方では、意図的に選択され、そして少なくとも２種のドメイン（すなわち、少なくとも第１ドメイン及び第２ドメイン、個々のドメインは他のドメインに存在しないいくつかの構造的及び/ 又は機能的特徴を有する）を含む。
【００３９】
“直接的に又は間接的にラベルされる”とは、分子が直接的に検出され得るシグナルを発するラベル成分（たとえば、放射性同位体、色素、又は蛍光又は化学ルミネセンス成分）を含むことができ、又はいくつかの追加の反応を通して（すなわち、間接的に）、検出できる成分（たとえば、結合された酵素、リガンド、たとえばビオチン、酵素基質、エピトープ又はヌクレオチド配列）を含むことができることを意味する。
“第２分子”とは、キメラタンパク質の第２ドメインの少なくとも一部に結合することができ、それにより、キメラタンパク質の検出又は精製を可能にする分子を意味する。
【００４０】
“ヒンジ領域”又は“免疫グロブリンH 鎖ヒンジ領域”とは、多くの哺乳類免疫グロブリンH 鎖のC H2及びC H1領域間に存在するプロリン−含有及びシステイン含有アミノ酸領域のファミリーの1 つ、又はそれらに基づくそれらのアミノ酸配列の類似体を意味し、ここで前記ヒンジのアミノ−及びカルボキシル−末端側の領域は、他の分子への別々の及び同時の特異的結合を促進するために、ポリペプチド鎖における回転又はよじれにより空間的に分離される。
【００４１】
“リガンド”とは、もう１つの所定の分子又は分子複合体（すなわち、その標的物）に特異的に結合することができる分子又はマルチマー分子複合体を意味する。しばしば、必ずしも必要ではないが、リガンドは可溶性であり、同時に、その標的物は、たとえば細胞膜中に固定されるアンカードメインにより同定される。
【００４２】
“受容体”とは、その生来の環境下で、細胞膜中に同定されるアンカードメインを有し、そし所定の分子又は分子複合体を結合することができる、分子又はマルチマー分子複合体の少なくとも一部を意味する。しばしば、受容体は、リガンド結合に応答して、細胞内シグナルを伝達する（transdncing)ことができる。多くの受容体は、受容体又はリガンドのいずれか又は両者がホモマルチマー又はヘテロマルチマー形（たとえば、ダイマー）で存在する場合、リガンドに対して特に高い親和性を有する。
【００４３】
“固体支持体”とは、性質的に生物学的な不溶性マトリックス、たとえば細胞又はバクテリオファージ粒子（但し、それらだけには限定されない）、又は合成の不溶性マトリックス、たとえばアクリルアミド誘導体、セルロース、ナイロン、シリカ及び磁気粒子（但し、それらだけには限定されない）（不溶性分子が連結されるか又は結合され得る）を意味する。
“修飾された”とは、天然に存在しないか、又は天然に存在する化合物から逸脱する手段で変更されることを意味する。
【００４４】
“分子進化”とは、所望する機能的特徴を有する先導ペプチドをコードする核酸配列の、調節された速度のランダム化により変異体ペプチドのライブラリーを製造する方法を意味する。
“分子”とは、天然に存在するか又は合成的に生成され得る、分子−サイズ分類された無機又は有機化合物、たとえばペプチド、タンパク質、格さん、脂肪又は脂肪酸を意味する。
“マルチマー分子複合体”とは、少なくとも２種の分子成分を含んで成る複合体を意味し、ここで前記個々の成分はペプチド、タンパク質、核酸、脂肪又は脂肪酸であり、前記複合体は共有結合、非共有結合又は他の既知の化学的相互作用により一緒に保持される。
【００４５】
３文字（又は１文字）の略語により記載されるアミノ酸は、それらの側基の性質にしたがって分離される（Genes V. B. Lews, Oxford University Press, Inc., New York, NY. 1994 に記載されるようにして）。それらの基は次の通りである：Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Trp(W), Phe(F)及びMet(M)を包含する“中性及び疎水性”基；Gly(G), Ser(S), Thr(T), Tyr(Y), Cys(C), Glu (Q) 及びAsn(N)を包含する“中性及び極性”基；Lys(K), Arg(R)及びHis(H)を包含する“塩基性”基；およびAsp(D)及びGlu(E)を包含する“酸性”基。“枝分かれ鎖のアミノ酸”とは、I, L及びV を言及する。
【００４６】
特にことわらない限り、本明細書において使用されるすべての化学及び技術的用語は、当業者により通常理解されるので同じ意味を有する。本明細書に使用される多くの用語の一般的定義は、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, and ed. (Singletonなど., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY),及びThe Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY), 及び下記に列挙されるプロトコールマニュアルに提供される。
【００４７】
EPOR結合ペプチドの同定
本明細書に記載される方法は、ヒト及び動物を処理するための受容体アゴニストとして、及び類似する適用性を有する小分子EPO 類似体の設計のための構造体鋳型として使用され得るEPOR結合ペプチドを同定するために使用された。赤血球生成を刺激する短いペプチド又は小さな分子EPO 擬似体は、供給の便利さ、薬物動態及び生成費用に関して、組換えEPO よりも明白な利点を有するであろう。
【００４８】
本発明者は、EPOR結合ペプチドを同定するために高い複雑性（約108 の多様性）のファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによってEPO のペプチド模倣体を同定した。ライブラリーは、M13 ファージ粒子の表面上に発現されるpIII融合タンパク質としてランダムペプチド配列を表示した。所望する結合活性を有するファージは、非常に過剰の非結合ファージから親和性精製され、そして精製されたファージのDNA が、表示されたペプチドのアミノ酸配列を決定するために、単離され、増幅され、そして配列決定された。
【００４９】
典型的なファージ表示ライブラリーにおいては、ランダムペプチドは、主要（たとえば、pVIII)又はマイナー（たとえば、pIII）なコートタンパク質上に発現さえるN −末端融合体としてバクテリオファージM13 の表面上に表示される。所望の結合特徴を有する個々のバクテリオファージ粒子表示配列は、標準の実験技法を用いて、親和性精製され、そしてクローン化され得る。ほとんどのファージライブラリーは、pIII又はpVIII 融合タンパク質として、わずか６〜８個の長さのアミノ酸のランダム配列を示すよう構成される。
【００５０】
しかしながら、ファージライブラリー上に表示されるより長いランダムペプチドは、“スライディング窓”効果（たとえば、38マーのペプチドは32のオーバーラップヘキサマーを含む）、及びペプチドが融合される生来のファージタンパク質とは無関係の三次構造を仮定する能力のために、高められた複雑性を包含する可能性ある利点を有する。
【００５１】
本明細書に開示されるように、本発明者は、初期の及び発生されたEPO ペプチド類似体を同定し、そして単離するために、IgG −EPO 受容体融合タンパク質を用いて、比較的に長いペプチドを表示するファージ表示ライブラリーをスクリーンした。下記に使用される方法は一般的に、実質的にいずれかの受容体、特にいずれかのタイプI サイトカイン又は成長因子受容体を結合するペプチドの発見に適用できるけれども、この経路により発見されたペプチドの構造は、そのペプチドをコードするクローンの実質的な単離及び配列決定に先立って、予測され得ない。
【００５２】
EPORプローブに結合される、発生されたライブラリーから単離されたクローンにおけるDN及び予測されるアミノ酸配列、及びこのプローブに結合されないクローンからの配列を決定することによって、アミノ酸の12−マーコンセンサス配列が、EPORプローブに結合されるクローンのすべてに存在するものとして同定された。コンセンサス配列は、CXXGWVGXCXXW (ここで、X は種々のアミノ酸をあらわす) である。
【００５３】
12−マーコンセンサス配列の他に、結合クローン（binding clone)（図４を参照のこと）の38−マーペプチドのアミノ酸の試験は、最初の残基が酸性、又は中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、D, E, G, N, S, Q, L, Y又はA 及びより好ましくは、D であることを示した。
第２残基は、塩基性、又は中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、L, V, I, K, A, F, R, G又はS 、より好ましくは、枝分かれ鎖のアミノ酸、最も好ましくはL であった。
【００５４】
第３残基は、それらの側鎖の性質により特徴づけられる４種の一般型のアミノ酸のいずれかであり、そして好ましくは、E, D, Q, G, H, V又はA 、より好ましくはE 又はQ であった。
第４残基は酸性、又は中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、G, T, V, A, P, M, D 又はE,及びより好ましくはV 又はG であった。
第５残基はコンセンサス配列のC であった。
第６残基は、塩基性、又は中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、R, L, I, G, Q, T又はS 、及びより好ましくは、R であった。
【００５５】
第7 残基は、塩基性、又は中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、R, G, N, P, W,又はL 、及びより好ましくは、R であった。
残基８〜11は、保存された12−マーのGWVG配列である。
残基12はH, Q又はN 、好ましくは、H であり、そして
第13残基は12−マーの保存されたC であった。
第14残基は、酸性、又は塩基性又は中性及び極性、好ましくは、E, K, N, Q又はS 、より好ましくはN 又はK であった。
【００５６】
第15残基は、酸性、中性及び極性、又は中性及び疎水性アミノ酸、好ましくは、D, E, Y, V又はY 、及びより好ましくはD 又はE 、最も好ましくはD であった。
第16残基は、コンセンサス12マーのW であり、そして
第17残基は、中性及び極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくは、Q, G, L, I, P, F又はM 、及びより好ましくはL であった。
【００５７】
第18の残基は、塩基性、又は中性極性、又は中性及び疎水性のアミノ酸、好ましくはR, G, N, T, S, M又はW 、及びより好ましくはR 又はG であった。
残基19〜21は、使用される突然変異誘発スキーム（下記例７を参照のこと）により、ペプチドのすべてに保存される不変のDEY であった。
【００５８】
図４に示されるペプチドの残基22〜38はまた、20個の天然に存在するα−アミノ酸のサブセットを含んだ。
特に残基22は、A, T, N, S又はE,好ましくはA であり；
残基23は、K, R, S, N又はI,好ましくはK 又はR であり；残基24は、P, I, N, T, Q, K, H, R又はE,好ましくはN であり；
残基25は、P, T, R 又はH,好ましくはP であり；
残基26は、I, P, S, G, T, N, R 又はK,好ましくはR 又はG であり；
残基27は、L, S, N, T, Y, H又はK,好ましくはY であり；
残基28は、P, A, Q, G又はS,好ましくはP であり；
【００５９】
残基29は、枝分かれ鎖のアミノ酸、たとえばA, M, F, N, T, E又はD,好ましくはV であり；
残基30は、P, A, V, T, Q, R又はE 好ましくはP であり；
残基31は、P, N, Q, H, K, R又はD,好ましくはP であり；
残基32は、I, G, S, N, T, Q又はR,好ましくはG 又はS であり；
残基33は、L, V, f, T, Y, N, S, Q, K, H, E 又はD であり、そしてN, Y又はK が最も頻繁に現れる。
【００６０】
残基34は、L, V, P, A, Y, S, K, R, H, D又はE,好ましくはS であり；
残基35は、L, V, P, M, Y, N, S, R又はH,好ましくは１つの枝分かれ鎖のアミノ酸、より好ましくはL であった。
残基36は、I, N, G, Q, S, T又はK,好ましくは、中性及び極性のアミノ酸、及びより好ましくはN であった。
残基37は、P, L, T, G, S 又はR であり、そして
残基38は、P, L, A, T, S, H又はR であった。両残基37及び38は、好ましくはP であった。
【００６１】
それらのアミノ酸残基は、22個のEPOR結合クローンの集団の配列を表し、結合ペプチドを表すそれらのアミノ酸配列は図４に示される。従って、EPOR結合ペプチドにおける一定の傾向が、特に、いくつかの残基のための好ましいアミノ酸について、それらの配列の試験により識別され得るけれども、それらは限定的ではなく、そして図４において結合クローンについて示される配列のいずれによっても示されないフランキング配列を有する保存された12−マー配列を保存するEPOR結合ペプチドは、本発明の範囲内である。
【００６２】
それらの発生されたペプチドにおける特定の残基位置で好ましくは現れるアミノ酸の多くは、例７に記載される突然変異誘発スキーム（親ヌクレオチドの73％及び他の３種のヌクレオチドの９％を有する核酸配列を合成する）、及び遺伝子コードの冗長性に影響を及ぼすことができる、出発ペプチドにおけるその位置で存在するアミノ酸と同じであった（たとえば、残基５でのR,及び残基25でのP ）。
【００６３】
しかしながら、いくつかの残基に関しては、その位置（たとえば、残基33）で出現したアミノ酸、及び非結合クローンにおけるその位置で一般的に見出されなかった１又は複数のアミノ酸に選択的に変化すると思われる、結合クローンにおけるいくつかの残基に相当の変性が存在した。たとえば、結合クローンにおける残基23は好ましくは、中性親S 残基からの変化を表す、塩基性アミノ酸K 又はR であり、そしてK 及びR は非結合における残基23で高く提供されなかった。同様に、非結合クローンは、結合クローンよりも残基31で親クローンをより高い％で保持した。したがって、保存された12−マーの配列の他に、発生された結合クローンに存在し、又は好ましくは、非結合クローンに比較して存在しない追加のアミノ酸は、たぶん、クローンに特有のEPOR結合に寄与する。
【００６４】
本明細書に記載される材料及び方法に類似するか又は同等の材料及び方法が本発明の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料は次の例に記載される。本明細書に記載される遺伝子工学及び他の方法を実施するために当業者により使用され得る標準の方法は、Moleular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook など. Eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel など. Eds., Greene Publishing Associates and wiley- Interscience 1987)、並びに他の良く知られている文献に見出される。
【００６５】
よく知られているイムノアッセイ方法、たとえば多数のペプチド及び他の化合物を急速にスクリーニングするために適切な固相イムノアッセイはまた当業者に知られている（Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Sprinng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 特にChapt. 14, pp. 553〜612 ）。
本発明は、好ましい態様を代表するが、しかし本発明の範囲を限定するものとして構成されていない次の例により良好に理解され得る。
【００６６】
例１は、ファージ表示ライブラリーをプローブするために使用されるキメラIgG −EPORタンパク質の一部をコードするプラスミドクローニングベクター、すなわちpcDNA −IgG の構成を記載する。このプラスミドベクターは、ネズミIgG1H 鎖の一部をコードし、そしてEPORのリガンド−結合ドメインをコードするポリヌクレオチドカセットを受けるよう企画された。
【００６７】
実施例
例１．ネズミIgG １H 鎖のC H2, C H3及びヒンジドメインをコードする発現ベクター
プラスミドベクター、pcDNA ３は、ネオマイシン及びアンピシリン耐薬物性（選択マーカー）遺伝子、複数のCalE１, f1及びSV40起点、及びHindIII, KpnI, BstXI, EcoRI, EcoRV, NotI, XhoI, XbaI及びApaIのための複数のクローニング部位含有制限にエンドヌクレアーゼ認識配列を含み、ここで複数のクローニング部位領域中にクローン化されるDNA フラグメントはベクター配列に含まれるCMV プロモーターを用いることによって発現され得る（Invitrogen Corp., San Diego CA）。
【００６８】
プラスミドpcDNA ３をNotI及びXhoI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてその消化された生成物を、TBE 緩衝液（89mMのトリス、pH8.0, 89mM の硼酸、2mM のEDTA（エチレンジアミン四酢酸））を用いて、１％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。前記消化物の最大のDNA フラグメントを、ゲル精製し、エタノール沈殿せしめ、ペレット化し、そしてすぐに乾燥せしめた。精製されたDNA フラグメントの乾燥されたペレトを、TE緩衝液（10mMのトリス、pH 7.5, 1mM のEDTA）において再懸濁し、そして−20℃で貯蔵した。この線状化されたプラスミドを、ネズミ免疫グロブリン（Ig）H 鎖の一部をコードするポリヌクレオチドを受けるために使用した。
【００６９】
ネズミIgG １H 鎖の不変領域CH2, CH3及びヒンジドメインをコードするポリヌクレオチドを、次の配列を有するプライマーを用いるPCR プロトコールを用いてゲノムDNA から増幅した。
第１鎖プライマーは次の通りであった（配列番号２）：
5'−AGCTTCGAGCGGCCGCCGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAG −3'
逆鎖プライマーは次の通りであった（配列番号３）：
5'−GATCCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCT −3'
【００７０】
配列番号２の下線部分は、NotI制限エンドヌクレアーゼ分解部位に対応し、そして配列番号３の太字下線部分は、XhoI制限エンドヌクレアーゼ分解部位に対応する。
マウスゲノムDNA を、標準の実験方法を用いて、凍結されたNIH3T3細胞の溶解物から調製した。手短には、細胞（５×105 ）を、遠心分離によりペレット化し、リン酸緩衝液により洗浄し、0.5 ％（v/v ）の非イオン性界面活性剤（Tween(商標）−20）及び10μg のプロテイナーゼK を含む低張緩衝液（50mMのKCl, 10mM のトリスHCl （pH8.4 ）、1.5mM のMgCl2 ）100 μl に再懸濁した。その混合物を56℃で45分間インキュベートし、95℃に10分間、加熱し、そしてその後、4 ℃で貯蔵した。
【００７１】
ネズミIgG １H 鎖のCH2 、CH3 及びヒンジドメインをコードするポリヌクレオチド領域を増幅するためのPCR 反応を、次の順序で0.6ml の無菌微小管において次の試薬を組合すことによって調製した：10μl の10×PCR 緩衝液II（100mM のトリスHCｌ（pH8.3 ）、500mM のKCl ）、6 μl の25mMのMgCl2 、個々のdNTPの10mM溶液２μl, 2.5μl の10nMのネズミIgG １第１鎖プライマー（配列番号２）、2.5 μl の10nMのネズミIgG １逆鎖プライマー（配列番号３）、0.5 μl （2.5 単位）の熱安定性DNA ポリメタ−ゼ（AMPLITAQ（商標）, Perkin Elmer Corp., Foster City CA）、66.5μl の超純粋水、及び１つのワックスビーズ。
【００７２】
マックスビーズを溶融するために70℃で反応混合物をインキュベートした後、ゲノムDN鋳型を含む溶解物10μl を管に添加した。その反応混合物を次の通りに30サイクルインキュベートした：94℃で１分間、55℃で１分間、及び72℃で1.5 分間（Perkin Elmer 4BO Thermal Cycler ）。完結された反応混合物を、使用まで4 ℃で貯蔵した。
【００７３】
PCR 反応からの増幅されたDNA を、TBE 中、１％アガロースゲルを通しての電気泳動によりゲル精製した。増幅されたDNA に対応するバンドをゲルから切除し、そして40μl の水に溶出した。次に、約１kbの増幅されたIgG １遺伝子フラグメントをNotI及びXhoI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そして消化生成物を１％アガロース/TBEゲル上で電気泳動した。約１kbのDNA フラグメントを再び、ゲルから精製し、そして40μl の水に溶出した。精製されたフラグメントの収率を、260nm で溶液の光学密度を測定することによって決定した（Beckman DU600 スペクトロメーター）。
【００７４】
XhoI及びNotI消化されたIgG １ PCR生成物を、室温で一晩インキュベートされた、50mMのトリス−HCl （pH7.8 ）、10mMのMgCl2 、 10mM のジチオトレイトール  （DTT ）、1mM のATP 、25μg/mlウシ血清アルブミン（BSA ）及び１単位のDNA リガーゼに、約100ng の個々のpcDNA3ベクター及びIgG １増幅されたDNA フラグメントを含む連結反応物20μl におけるXhoI及びNotI消化されたpcDNA3ベクター中に結合した。
【００７５】
前記連結混合物の１μl アリコートを用いて、標準の実験方法に従って、コンピテントE.コリ細胞（SURE（商標） EPICUREAN COLI(商標）, Stratagene, La Jolla, CA) を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン含有LBプレート上での増殖により選択した。いくつかの独立したクローンから単離されたプラスミドDNA を、NotI及びXhoIにより消化し、そして１％アガロース/TBE分析ゲル上に溶解し、ネズミIgG １不変及びヒンジ領域をコードするポリヌクレオチドセグメントの存在について調べた。NotI/XhoI を含むクローンからのプラスミドDNA を、核酸配列決定のために調製した。
【００７６】
NotI/XhoI 挿入体の核酸配列決定を、ジデオキシ配列決定プロトコールを用いて行った。配列決定反応混合物を、ウレアを含む４％アクリルアミド変性ゲル上で10時間、展開し、そしてフラグメントの完全な配列を決定した。pcDNA3−IgG1（配列番号４）として命名されたクローンの１つが正しい配列を有する挿入体（すなわち、ネズミIgG １ CH2, C H3及びヒンジ領域）を含むことを確証した後、大規模プラスミド調製を行った。
【００７７】
pcDNA3−IgG1発現ベクターを用いて、例２に記載のようにして、リガンドのためのファージ表示又は他の組み合わせライブラリーをプローブするために有用なキメラEPURタンパク質をコードする新規発現プラスミドを創造した。pcDNA3−IgG1ベクターが他のペプチドをコードする配列のための受容体DNA として使用され得、それにより、類似するタイプのプロ−ビングアッセイにおいて有用な他のキメラタンパク質の容易な創造を可能にすることは当業者において理解されるであろう。すなわち、pcDNA3−IgG １ベクターは、ネズミの一部を含むキメラタンパク質を生成するための一般的目的である。
【００７８】
次の例は、ネズミIgG １のC H2, C H3及びヒンジ領域、及びヒトEPORのリガンド−結合ドメインを有するキメラタンパク質をコードするプラスミド発現ベクターを構成するために使用される方法を記載する。
【００７９】
例２．EPORリガンド結合ドメインを組み込むキメラ受容体をコードする発現ベクター
ヒトRPORの細胞外部分をコードするDNA フラグメントを、ヒト白血球全RNA から合成されたcDNAのPCR 増幅により得た。RNA を、次のものを含む反応混合物において逆転写した：１μg のRNA, 12.5mM の個々のdNTP, 50mMのトリス−HCl （pH8.3 ）、40mMのKCl 、5mM のDTT （ジチオトレイトール）、20p モルのランダムデオキシリボヌクレオチドヘキサマー、及び100 単位の逆転写酵素（SUPERSCRIPT(商標）, Life Technologies Gibco/BRL, Grand Island, NY ）。その混合物を42℃で１時間インキュベートし、95℃で５分間、熱処理し、そして次に、使用まで、4 ℃で貯蔵した。PCR 反応を次のプライマーを用いて行った。
【００８０】
第１鎖プライマーは次の通りであった：
5'−GATCGGATCCATGGACCACCTCGGGGCGTCCCTC−3'（配列番号５）。
逆鎖プライマーは次の通りであった：
5'−AGCTTCGAGCGGCCGCGGGGTCCAGGTCGCTAGGCGTCAG−3' (配列番号６) 。
第１鎖プライマー（配列番号５）は、増幅生成物中に、ATG 翻訳開始コドン（上記下線で示される）及び開始コドンのすぐ上流に位置するBamHI 認識配列（上記に太文字で示される）を組み込んだ。逆鎖プライマー（配列番号６）は、増幅されたフラグメントの下流末端でNotI制限エンドヌクレアーゼ分解部位（上記に太文字で示される）を導入した。
【００８１】
PCR 反応を、例１に実質的に記載される通りの条件であるが、しかし配列番号５及び６の配列のプライマーを用いて行い、そして配列番号７の配列を有する、増幅されたEPOR DNAフラグメントを生成した。増幅されたEPOR DNAフラグメント（すなわち、PCR 生成物）及びpcDNA3−IgG １プラスミドを、BamHI 及びNotIによりそれぞれ消化し、個々の反応の大きなDNA フラグメントを、例１に記載のような方法を用いてゲル精製した。次に、精製されたEPOR DNAフラグメント及びプラスミドベクターを、例１に実質的に記載のような連結条件を用いて、連結し、pcDNA3−IgG1−EPORと称するキメラ発現ベクターを生成した。
【００８２】
このキメラ発現ベクターを、例１に実質的に記載のようにして、標準方法を用いて、コンピテントE.コリ細胞中にトランスフェクトした。ベクター担持のCMV プロモーターから転写されたRNA を、トランスフェクトされた細胞内で翻訳し、ネズミIgG1に対応するドメイン、及びヒトEPORの細胞ドメイン（ECD ）を有する融合タンパク質を生成した。ベクター構成を、標準の方法を用いての診断制限消化及び核酸配列決定により確かめた。大規模プラスミド調製を、pcDNA3−IgG1−EPORプラスミドを有する形質転換されたE.コリクローンから実施した。
【００８３】
次の例は、真核細胞内で上記pcDNA3−IgG1−EPORプラスミドによりコードされるキメラIg−EPORタンパク質を生成するために使用される方法を記載する。COS −７宿主細胞はそれらの方法に使用されたが、当業者は、多種の他の培養された細胞が容易に置換され得ることを理解するであろう。
【００８４】
例３．pcDNA3−IgG1−EPOR構造体のトランスフェクション及びキメラIg−EP ORタンパク質の発現
COP −７細胞を、4500mg/lのD −グルコース、584mg/mlのL −グルタミン及び10％ウシ胎児血清（FBS ）により補充されたダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）において増殖した。トランスフェクションの調製においては、細胞を、20mlの体積においてはT −150 当たり約２〜４×105 個の細胞で接種し、そして約50％〜70％の集密性まで、５％CO2 雰囲気下で37℃で湿潤されたインキュベーターにおいて増殖せしめた。
【００８５】
プレートを血清フリー培地により洗浄し、そしてDMEMにおいて正に荷電された及び中性の脂質（LIPOFECTAMINE(商標）, GibcoBRL, Grand Island, NY）を含んで成る、10μg のpcDNA3−IgG1−EPORプラスミドDNA 及び31μl の標準のトランスフェクション試薬の混合物を、前記細胞に添加し、次にインキュベーターに５時間、戻した。続いて、トランスフェクション培地を、DMEM及び10％FBS により置換した。安定したトランスフェクトを、標準の実験方法を用いてG418の存在下で薬物選択した。
【００８６】
48〜72時間後、細胞フリー培地を、次の例に記載されるELISA プロトコールを用いてIg−EPORタンパク質の存在についてアッセイした。それらのアッセイの結果は、細胞フリー上清液におけるタンパク質が純粋なEPO に結合できる１つの成分、及び抗−IgG 抗体に結合できるもう１つの成分を含むことを示した。すなわち、pcDNA3−IgG1−EPORプラスミドを含むトランスフェクタントは、機能的IgG １及びEPOR領域を含むキメラタンパク質を発現した。
【００８７】
例４は、キメラIg−EPORタンパク質がpcDNA3−IgG1−EPORプラスミドによりトランスフェクトされた細胞から分泌されたことを確認するために使用されるELISA 方法を記載し、そしてキメラタンパク質が純粋なEPO 及びラベルされた抗−IgG 抗体を同時に結合できることを示すために使用される方法を記載する。
【００８８】
例４．キメラIg−EPOR−タンパク質の生成及び組み込みを確かめるためのELISA プロトコール
（１）分泌されたタンパク質の相対量
標準の96−ウェルプレート（IMMULON(商標）2, Dynatech ）のウェルを、hAd がPBS において1/1,000 に希釈されているヤギ抗−ネズミIgG により被覆した。PBS 中、１％BSA 及び0.05％Tween(商標）−20の溶液を用いて非特異的結合についてウェルをブロックした後、トランスフェクトからの細胞フリー上清液の連続して希釈されたサンプルをウェルに添加し、そして固定された抗体の接触を可能にした。
【００８９】
結合されなかったキメラタンパク質を洗浄により除去した後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）によりラベルされた抗−ネズミIgG1検出抗体を添加し、そしてキメラタンパク質のIgG 部分の結合を可能にした。キメラタンパク質に結合される、HRP ラベルされた抗体を、標準の方法により、TMB ペルオキシダーゼ基質（Kirkegard & Perry, Gaithersburg MD）を用いて検出した。活性を、450nm 〜650nm での分光光度測定により計算した。すなわち、キメラタンパク質の濃度を、既知の抗体の標準曲線に対して計算した。特に、450nm での個々の希釈溶液の吸光度を測定し、そして650nm での吸光度を引き算し。非特定源（すなわち、細胞残骸及びダスト）からの吸光度を排除した。
【００９０】
それらの方法の結果は、タンパク質濃度が、培養物の集密度及び上清液収穫の頻度に依存して、125 〜4,000ng/mlの範囲であることを示した。
形質転換された細胞が抗−ネズミIgG 抗体と同一のドメインを有するタンパク質を分泌したことを確認した場合、本発明者は、キメラタンパク質がまた、EPO リガンドを結合することができることを確かめることに取りかかった。
【００９１】
（２）キメラ受容体のEPO −結合活性
96−ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、PBS に希釈された組換えヒトEPO （R & D Systems, minneapolis MN ）の3.1 単位/ml 溶液により被覆した。ウェルを、0.05％（v/v ）のTween(商標）−20非イオン性界面活性剤を含むPBS により３度洗浄し、そして次に、PBS （ブロッキング緩衝液）中、１％（w/v ）BSA 及び0.05%Tween（商標）−20によりブロックし、非特異的結合を妨げた。過剰のブロッキング緩衝液を、１度洗浄することによって除去した。
【００９２】
培養培地をブロッキング緩衝液により連続的に希釈し、そして個々の希釈溶液50μl を、前記被覆され、そしてブロックされたウェルに添加した。希釈されていない培地に受けるウェルは対照として使用された。１組の被覆されていないウェルはまた、希釈された細胞フリー培地を受けた。次に、プレートを室温で２時間インキュベートし、そして上記のようにして３度洗浄した。
【００９３】
洗浄により結合されなかったキメラ受容体を除去した後、結合されたキメラタンパク質を、100 μl のHRP ラベルされた抗−ネズミIgG 抗体を用いて、実質的に上記のようにしてアッセイした。色の進行を、TMB ペルオキシダーゼ基質100 μl の添加により開始し、そしてペルオキシダーゼの反応の程度を、上記のようにして450nm 及び650nm で分光光学的に測定した。
それらの方法の結果は、キメラ受容体タンパク質がEPO に結合し、そしてラベルされた抗−ネズミIgG 抗体を用いることによって検出できることを示した。対照のウェルは色の進行を示さなかったが、ところがEPO/Ig−EPOR複合体が形成したウェルは、明確に、青〜紫色であった。
【００９４】
それらの結果は、キメラIgG −EPORタンパク質がEPORリガンドを同定するためのプローブとして適切であることを示した。すなわち、キメラIg−EPORはEPO に対する特異的結合を示し、そしてまた、抗−ネズミIgG 抗体を結合した。
次の例は、EPORリガンドを同定するために使用されるキメラIg−EPORタンパク質を精製するために使用される方法を記載する。
【００９５】
例５．キメラIg−EPORタンパク質の精製
キメラ受容体タンパク質を含む無菌培養物上清液を、PBS により平衡化された抗−ネズミIgG １に親和性カラム（SEPHAROSE(商標）親和性カラム、Zymed Laboratories, San Francisco CA）上に負荷した。負荷の後、カラムをリン酸緩衝溶液（PBS ）により洗浄し、非特異的に結合されたタンパク質を除去した。抗−IgG に結合されたタンパク質を、0.15M のNaCl及び0.1Mのグリシン（pH2.4 ）を含む緩衝液により溶出することにおいてカラムから除いた。
【００９６】
タンパク質含有画分をプールし、濃縮し、そして標準の方法（CENTRICON(商標）50カートリッジ、Amicon, Beverly, MA ）を用いて、緩衝液をPBS に交換した。Ig−EPORキメラの相対的タンパク質濃度を、IgG サンドイッチELISA 及び既知濃度の抗体を用いて決定し、すべては例４に実質的に記載されるようにして標準の実験方法に従った。キメラタンパク質の組み込みを、４％のトリス−グリシン予備キャストされたアクリルアミドゲル上でのPAGE及び銀染色（Bio-Red, Hercules CA）により決定し、そして標準の実験方法に従って、Ig−EPORタンパク質を検出するために、HRP ラベルされたヤギ抗−ネズミIgG １を用いてイムノブロットした。
【００９７】
それらの方法の結果は、主要タンパク質種が約59KDa の分子量を有することを示した。ゲル上の汚染性バンド及び分解生成物を最少にした。Biacore 分析により調査された結合運動学は、既知の親和性値（0.1 〜1.1 ×10-9k ）と良好に一致した（Karlssonなど., 1991, J. Immunol. Methods 145 (1-2): 229-240 ）。Ig−EPORタンパク質は、上記方法を用いて、μg の量で回収できた。
【００９８】
プローブとして精製されたキメラIg−EPORタンパク質を用いて、本発明者は、ファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによって、EPORを結合したファージクロオ−ンを単離した。タンパク質プローブを磁気ビーズに固定し、但し他の固体支持体も使用され得る。前記磁気ビーズが使用されたのは、マトリックスの高い表面積が固定されたプローブとファージとの間の効果的な接触を促進し、そして磁気分離が処理段階間の効果的な洗浄を可能にするからである。
例６は、キメラIg−EPORプローブを結合できる融合タンパク質を発現する組換えファージを単離するために使用される方法を記載する。
【００９９】
例６．バイオパンニング方法及び磁気ビーズELISA
pIII融合タンパク質としてランダムペプチドを発現した４種のM13 ファージ表示ライブラリーを、Ig−EPORプローブによるバイオパンニングを用いてそれぞれスクリーンした。XC8, XC13, X38, XC43として命名されたそれらのライブラリーを、前記方法（McConnell など., Molec. Diversity 1: 165-176, 1996）を用いて構成した。XC8 及びXC13ライブラリーは、システイン残基を端に有する、それぞれ８及び13個の残基のランダムアミノ酸配列を示した。
【０１００】
XC38ライブラリーは、ペプチド配列における位置22での不変のアラニン取り込む37個のランダムアミノ酸を示す融合タンパク質を発現した。XC43ライブラリーは、残基21, 22及び23での不変のGly −Gys −Gly 配列を取り囲む40個のランダムアミノ酸を含んで成る43マーのペプチドを示し、これは示されるペプチドの分子内ジスルフィドループの形成を可能にした。
【０１０１】
ファージライブラリーを、標準のバイオパンニング方法により、プローブとして上記キメラIg−EPORタンパク質を用いて、EPOR結合クローンについてスクリーンした。バイオパンニングを、標準の方法により、磁気ビーズ（DYNABEADS(商標）M-45ラット抗−ネズミIgG １ビーズ、Dynal, Inc. ）に固定されたキメラ受容体タンパク質を用いて行った。pcDNA3−IgG １−EPORプラスミドによりトランスフェクトされた細胞からの透明な上清液10mlに含まれるキメラIg−EPORタンパク質（500ng/ml）を、磁気ビーズ400 μl と共に混合し、そしてその混合物を軽く振盪しながら一晩4 ℃でインキュベートした。
【０１０２】
続いて、ビーズを、標準のトリス−緩衝溶液ブロッキング媒体（TBS SUPERBLOCK（商標）, Pierce Chemical, Chicago IL ）において温室で１時間ブロックした。ビーズをさらに、ネズミIgG （10μg/ml）のFcフラグメントの添加により、室温で1 時間処理し、キメラプローブのIgG ドメインを非特異的に結合する高い親和性部位をブロックした。ビーズをTBST（0.1 ％（v/v ）Tween(商標）−20を含むトリス緩衝溶液）により３度洗浄し、そして次に1ml のブロッキング媒体（TBS SUPERBLOCk（商標))に懸濁した。約１×1010プラークの形成単位（pfu ）を含む100 μl アリコート中のファージをビーズに添加し、そしてその混合物を室温で２時間、軽く回転せしめた。
【０１０３】
TBSTによる５回のビーズの洗浄の後、ファージを500mM のグリシン緩衝液（pH2.2 ）30μl により室温で10分間溶出した。溶出されたファージをすぐに、pH調節されていない２M のトリス塩基８μl により中和し、混合し、そして4 ℃で貯蔵した。バイオパンニングにより単離されたファージを、等体積の溶出されたファージ及びE.コリ株JS5 の一晩の培養物を混合し、その混合物を、テトラサイクリン（12.0μg/ml）を含む２×YT（20ml）により希釈し、そして37℃で振盪しながら一晩インキュベートすることによって増幅した。
【０１０４】
得られるファージ溶解物を、微小管における５分間の遠心分離により細胞残骸を除去し、そして得られる上清液溶解物100 μl を、続くバイオパンニングのために使用した。すべてのファージ滴定を、２×YT上部寒天及び寒天プレート上にプレートされたJS5 細菌を用いて行った。
【０１０５】
ライブラリースクリーニング法の結果は、４種のライブラリーの１つから単離されたファージクローンがキメラIg−EPORプローブを結合したことを示した。ERB １（“EPO 受容体結合剤１”に関して）と命名されたこのクローンは、プローブに結合されるpIII融合タンパク質をコードするDNA を有した。ERB １クローンは、pIIIコートタンパク質をコードする配列に融合された配列番号８の配列を有するポリヌクレオチドを含んだ。ERB １クローン内に含まれるEPOR−結合ペプチドのアミノ酸配列は、次の通りであった：
【０１０６】
DFDVCRRGWVGHCKDWLSDEYASNPSYPVPHSYYLNPP（配列番号９）。ERB1コードのペプチドのアミノ酸配列はEPO のアミノ酸配列に無関係であるが、ERB １ファージクローンはIgEPORタンパク質に特異的に結合した。
磁気ビーズELISA プロトコールを用いて、ERB １ファージクローンが特定の相互作用によりキメラIg−EPORプローブに結合したことを確かめた。キメラIg−EPORプローブは、実質的に上記のようにして、ラット抗−ネズミIgG １を示す磁気ビーズに結合されたファージ溶解物の１：２希釈溶液（PBS 及び１％BSA ）のサンプル（100 μl ）を、ビーズと共に組合し、そしてファージを、室温で1 時間、固定されたプローブの結合を可能にした。
【０１０７】
この方法で使用されるファージは、ERB １及び次の２種の負の対照ファージであった：HPKF、すなわち市販の抗−IL−８mAb に対しては特異的に結合するクローン、及びIL6 −B26 、すなわちヒトIL−６受容体に対して特異的に結合するクローン。結合されなかったファージを、200 μl のアリコートのTBST（25nMのトリスHCl 、pH7.2, 0.15MのNaCl、0.1 ％のTweenR−20）により４度洗浄することによって除去した後、PBS に1 ：5,000 に希釈されたHRP −接合された抗−M13 検出抗体（Pharmacia ）を添加した。
【０１０８】
インキュベーションの後（室温で1 時間）、過剰の検出抗体を洗浄により除去し、そして個々の洗浄されたビーズ複合体10μl を、反応容器として作用するマイクロタイターウェル（FALCON（商標）3912, MICROTEST III, Beckton Dicknson, Oxnard CA）に移した。個々のウェルを、TMB ペルオキシダーゼ基質を用いて展開し、そしてペルオキシダーゼ反応の程度を、例４に記載のようにして、分光光学的に測定した。
【０１０９】
図１に示される結果は、ERB1ファージクローン及びIg−EPORプローブが特に上昇したことを示した。ELISA アッセイで読み取られた光学密度（O. D. ）とファージ希釈の程度との間の逆の関係は、ERB1ファージの前進的により希釈したサンプルが抗−M13 検出抗体の相応じて低い結合をもたらしたことを示した。対照の方法は、ERB １クローンが、磁気ビーズのみ、又は腫瘍壊死因子（INFR）又はインターロイキン−６（IL−６R ）のための受容体の細胞外ドメインに結合しなかったことを示した（結果は示されていない）。さらに、抗−IL−８mAb 又はIL−６受容体のいずれかに対する特異性を有する対照ファージは、Ig−EPORプローブへの結合を示さなかった。従って、ERB １クローンは、Ig−EPORプローブに特異的に結合した。
【０１１０】
本発明者はまた、Ig−EPORプローブとERB １ファージクローンとの間の相互作用がプローブのリガンド結合ドメインを包含したことを確かめた。この決定を行うために、磁気ビーズをまず、実質的に上記方法を用いて、キメラIg−EPORタンパク質、又はキメラIg−IL−６受容体タンパク質である負の対照により被覆した（Brown など., 1997, "A versitile expression system for the extracellular somain of type I cytokine receptors" (submitted for publication)により記載される）。
【０１１１】
約１×108pfuのERB １及びIL6 −B26 ファージクローンを、上昇する量のEPO と共にそれぞれ混合し、そしてその混合物を被覆されたビーズと接触せしめた。結合されなかったファージ及びEPO を除去するために洗浄した後、HRP −接合された抗−M13 検出抗体をすべてのサンプルに添加し、そしてインキュベートし（室温で１時間）、そして次に、過剰の検出抗体を洗浄により除去した。洗浄されたビーズ複合体（10μl ）を、96−ウェルマイクロタイターウェルに移し、TMB ペルオキシダーゼを用いて展開し、そしてその反応を、実質的に上記のようにして、分光光学的に測定した。
【０１１２】
図２に示される結果は、ERB １ファージクローン及びEPO の両者がIg−EPORプローブのリガンド結合ドメインに結合したことを確証した。その結果は、上昇する濃度のEPO がプローブへの結合のためにERB １と競争することを示した。EPO の濃度の上昇は、プローブに結合したERB １ファージクローンの数を低めた。上昇する濃度のEPO は、未関係のファージ/ プローブ組み合わせの結合を阻害しなかった。従って、ERB1ファージクローンとIg−EPORとの間の相互作用は、特異的であり、そして純粋なEPO リガンドにより競争せしめられ得た。さらに、本明細書に記載されるキメラIg−EPORプローブは、EPORの結合特性を表し、そしてキメラプローブを結合した分子はEPORに結合することが予測された。
【０１１３】
ERB1クローンに類似するか、又はそのクローンよりもEPORに対して高い親和性を有するファージクローンを得るために、及びEPOR結合に寄与するERB1融合タンパク質内の副配列を同定するために、発生されるライブラリーを、元のERB1配列の飽和オリゴ又はヌクレオチドドーピング突然変異誘発を用いて創造し、そして発生されるライブラリーをキメラIg−EPORプローブを用いてスクリーンした。次の例は、ERB1ファージクローンにより発現される融合タンパク質に関連する38−マーペプチドのファージ表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーンするために使用される方法を記載する。
例７．ERB1進化ライブラリーの構成及びスクリーニング
進化したライブラリーを、前記に実質的に記載のような方法を用いて構成した（McCOnnell など., 1996, Molecular Diversity 1:165）。手短には、本発明者は、38−マーERB1 EPOR −結合ペプチドの個々のアミノ酸位置に対応するコドンが予定された頻度でランダムアミノ酸によりそれぞれ置換される（但し、ERB1配列の中心近くのDEY 内部アミノ酸配列を除く）よう、オリゴヌクレオチドの収集物を合成した。それらの方法を用いれば、38−マーペプチドにおけるいずれかの単一の位置でのランダムアミノ酸の置換を示すコドン（但し、DEY トリペプチドをコードするアミノ酸を除く）は、約50％の頻度で生じることが予測された。
【０１１４】
ポリヌクレオチドを、図３に示されるドーピングスキームに従って合成した。手短には、図３A のオリゴヌクレオチド（配列番号10及び11）により示される冗長性オリゴヌクレオチドの２つの収集物を、それらの２種のグループのオリゴヌクレオチドがそれらの3'末端で存在する短い相補的配列を用いて、お互いアニーリングされ得るように合成した。それらの相補的配列は、ERB １ペプチドの内部D −E −Y アミノ酸をコードし、従って、得られる発生ライブラリーの個々のクローンにこのトリペプチドを保持する。
【０１１５】
次に、アニーリングされたオリゴヌクレオチドの集団の相補的鎖を、一定集団の二本鎖DNA フラグメントを創造するために、標準のインビトロDNA 延長方法により合成した。それらのDNA フラグメントを、適切なM13 ベクター（たとえば、McConellなど.,前記のMsM1）中にクローン化し、pIII融合タンパク質を発現するファージ表示ライブラリーを生成し、ここで個々の融合タンパク質はERB1ペプチド配列に由来するN −末端38−マーペプチドを含む。
【０１１６】
ERB1オリゴヌクレオチドの個々のコドンの最初の２つの位置のために、冗長性オリゴヌクレオチドを、ERB1オリゴヌクレオチド配列の位置に使用されるヌクレオチドに対して同一のヌクレオチドの73％及び他の３種のヌクレオチドの9 ％を用いて合成した。冗長性オリゴヌクレオチド配列において下部に示される個々の延期に対応するヌクレオチド組成物は、図３B に示される。個々のコドンの第３位置（図３A 及び３B において“S ”により示される）を、dGTP及びdCTPの等モル混合物を用いて合成した。
【０１１７】
このドーピングスキームは、その時間の約50％のERB1 38 −マーペプチドの個々の位置で元のアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットを生成した。その時間の残りの50％、すなわち元のアミノ酸をコードしないコドンを、ほかの19個のアミノ酸のランダム混合物により置換した。
【０１１８】
得られるERB1進化ライブラリーを、キメラIg−EPORプローブを結合したクローンを同定するために例6 に実質的に記載のようにして、バイオパンニングによりスクリーンした。いくつかのランダムファージクローンをまた、非結合クロオ−ンを表すために、前記進化したライブラリーから単離した。EPOR−特異的磁気ビーズELISA 試験（例６に記載のような）の結果により判断される場合、前記パンニングされたグループから選択されたクローンの約88％がEPOR結合について陽性であり、ところがパンニングされていないグループからのランダムに選択されたクローンのすべてはEPOR結合について陰性であった。
【０１１９】
これは、発生されたライブラリーにおけるランダムに選択されたクローンはEPORを結合しそうでないが、しかしパンニング方法により選択されたクローンは非常に高い頻度でEPOR結合を示した。従って、本明細書に記載されるスクリーニング方法は、リガンド官能性を示すファージクローンを同定し、そして単離するために有用であり；この場合、クローンはEPORに結合することができる。
【０１２０】
合計48の結合（パンニングされたグループ）及び24の非結合（パンニングされていないグループ）クローンを、発生されたライブラリーから単離した。それらのクローンの融合ペプチドの38−マー領域をコードするDNA 配列を、標準の方法を用いて、ジデオキシ配列決定により決定した。それらの72の単離物の中で、34のユニーク配列を見出した（パンニングされたグループに関しては21の配列、及びパンニングされていないグループに関しては13の配列）。
【０１２１】
それらの34のユニークDNA 配列は、配列番号13〜46に開示されており、そしてそれらの配列によりコードされることが予測されるアミノ酸配列は、配列番号47〜80に開示される。それらのペプチド配列は、図４に示される。B １〜B21 （配列番号47〜67）と命名された合計21種の異なった結合クローンを、最初に選択された48の結合クローンから単離し；そしてN1〜N13 （配列番号68〜80）として命名された13種の異なった非結合クローンを、最初に選択された24の非結合クローンから単離した。
【０１２２】
EPOR結合及び非結合クローンの整列されたペプチド配列から、すべての結合クローンに存在し、そして非結合クローンに不在のコンセンサス配列を決定した。使用される突然変異誘発原因スキーム（図３A を参照のこと）によりクローンのすべてに存在したDEY トリペプチドを排除すれば、コンセンサス配列は、CXXGWVGXCXXW（配列番号12）（ここで、X は種々のアミノ酸を許容できる位置を示す）であった。結合クローンに見出されるコンセンサス配列における不変の残基は図４において太字で示される。非結合クローンにおいては、いくつかの不変残基がまた存在したが（図４において下線が引かれている）、しかしコンセンサス配列の完全なモチーフは存在いなかった。
【０１２３】
結合及び非結合クローンのすべては同じpIIIタンパク質配列を含むもので、EPORプローブへのファージクローンの結合は、プローブとpIII配列との間の相互作用にはよらなかった。代わりに、Ig−EPORプローブへのファージクローンの結合は、融合タンパク質の追加のペプチド配列（たとえば、図４におけるクローンB1〜B21 について示されるそれらの配列）によるべきである。従って、12−マーコンセンサス配列を含むペプチドは、ヒトEPORのリガンド結合ドメインに結合し、そして配列番号12の配列を含んで成るペプチドはEPO ペプチド擬似物を表した。
【０１２４】
EPORに対する結合特異性を有するファージ単離物を良好に特徴化するために、本発明者は、ファージELISA 方法を用いて、図４に示される結合クローンの相対的親和性を比較した。結合クローンのファージストックを、個々の溶解物についてpfu/mlの濃度を正確に決定するために、三重反復して滴下した。次に異なった単離物を、標準化されたファージ濃度を用いてのELISA のよりアッセイし、その結果、すべてのクローンを同等数のファージを用いて試験した。次にERB1試験における50％最大応答に対応するELISA における光学密度を、異なったファージ単離物の個々について決定した。
【０１２５】
50％ERB １最大応答でのファージ当たりの光学密度×１×108 は、ERB1についての1.0 の値を付与し、そしてB １〜B21 単離物の相対的結合親和性を測定するための標準を表した。個々のクローンについての標準化された相対的親和性（“Rel. Aff. ”）は図４におけるクローンのペプチド配列の右側に示される。非結合クローンの個々に関しては、その相対的親和性は、それらの個々がEPOR結合に関して陰性であるので、＜0.1 として列挙される。
【０１２６】
図５A 〜５D は、クローンB1〜B2のELISA 結果をグラフにより示す。B7及びB8を包含するいくつかのクローンは、親ERB １クローンの親和性よりも約20倍高い親和性を有するキメラIg−EPORタンパク質を結合した。B3, B15 及びB19 を包含するほかのクローンはERB1に類似する親和性を有するEPORを結合し、そして２種のクローン（B20 及びB21 ）は、ERB1に比較して、幾分低い結合親和性を有した。
【０１２７】
その異なった相対的親和性はたぶん、異なったクローン間のアミノ酸差異に起因する。従って、発生されたライブラリーから単離された多くの結合クローンは、ERB1親クローンに比較して高められた親和性を有するヒトEPO 受容体のリガンド結合ドメインに結合した。結合クローンのすべては、配列番号12により同定される12−マーコンセンサス配列を含むペプチドを有した。
次の例は、上記にクローンの配列に由来するアミノ酸配列を有する合成ペプチドがIg−EPORへの結合のために純粋なEPO と競争することを示すために使用される方法を記載する。
【０１２８】
例８．ペプチド阻害ELISA
この例は、配列番号12のコンセンサス配列を含む合成ペプチドがEPOR結合についてEPO と競争することを示す。コンセンサス配列は保存されたDEY 残基のアミノ末端側鎖上に位置するので、ペプチドは、キメラIg−EPORプローブについて高い親和性結合を示す２種の典型的なクローンのアミノ末端配列に基づいて合成された。そのペプチドは環状形で合成され、そしてB7及びB8クローンのアミノ末端の18個のアミノ酸に対応する配列を含む。
【０１２９】
配列DREGCRRGWVGQCKAWFN (配列番号81) 及びDVEACGGGWVGHCNYWLR（配列番号82）を有する合成ペプチドを、標準の方法（Peninsula Laboratories, Belmont, CA ）を用いて、環状（ジスルフィド結合された）形で合成した。18−マーペプチド配列は、B7及びB8クローンに由来し、そしてそれらのペプチドは、それぞれ“ERB1−７”（配列番号81）及び“ERB1−８”（配列番号82）として本明細書において言及される。HPLCにより判断される場合、それぞれ95％以上の純度である、２種の精製されたペプチドの構造を、質量分析法により確かめた。
【０１３０】
ペプチドを、EPO −被覆されたポリスチレンプレートのIg−EPORタンパク質の結合を阻害するそれらの能力について上記EPO 特異的サンドイッチELISA プロトコールにおいて別々に試験した。図６に示される結果は、ERB1−７及びERB1−８合成ペプチドがキメラIg−EPORタンパク質に結合するためにEPO と競争したことを示す。両ペプチドは、アッセイにおいて、約45nMのIC50値を有した。
【０１３１】
これは、上記で同定されたコンセンサス12−マー配列を含む、結合クローンの配列に由来する合成18−マーペプチド（図４を参照のこと）が、M13pIII 融合タンパク質の内容物から除去される場合でさえ、EPORを結合したことを証明した。それらの結果は、コンセンサス12−マー配列（配列番号12）、及びコンセンサス配列のアミノ酸末端側上の４個のアミノ酸及びカルボキシル末端上の２個のアミノ酸を含む18−マーペプチドがEPOR結合組成物である結論を支持する。そのような合成ペプチドはEPO 擬似体である。
【０１３２】
機能的EPO ペプチド模倣体のサイズ限界を同定するために、より短い形のERB1−７を合成し、そしてペプチドサイズ及び受容体結合活性の関係を決定するために試験した。次の例に記載されるように、ERB1−７の一連のN −末端切断部分を合成し、そして上記EPO 特異的阻害ELISA において試験した。
【０１３３】
例９．12−マーコンセンサス外の残基が合成ペプチドとEPORとの間の高親和性相互作用のために必要とされる
この例は、上記で同定された12マーコンセンサス配列の限界外に位置するアミノ酸残基がIg−EPORプローブを結合する合成ペプチドの能力に寄与することを示す。ERB1−７の配列に対応するが、しかし1, 2, 3 又は４個のN −末端アミノ酸のいずれかを欠いている合成ペプチドを、ペプチド阻害ELISA プロトコールにおいて試験した。次のペプチドを合成し、そして例８に実質的に記載のようにして試験した：
【０１３４】
DREGCRRGWVGQCKAWFN (配列番号81) から成る18−マーペプチドERB1−７；
REGCRRGWVGQCKAWFN ( 配列番号83) から成る17−マーペプチド７N −１；
EGCRRGWVGQCKAWFN (配列番号84) から成る16−マーペプチド７N −２；
GCRRGWVGQCKAWFN ( 配列番85) から成る15−マーペプチド７N −３；
CRRGWVGQCKAWFN (配列番号86) から成る14−マーペプチド７N −４。
【０１３５】
図7 に示される結果は、12−マーコンセンサスの他のアミノ酸がIg−EPORタンパク質に結合するためにEPO との効果的な競争に寄与することを示す。すなわち、18−マーについてのIC50値は約45mMであるが、ところが17−マーペプチドは91nMの低められたIC50を示した。さらに、切断物は、約3700nMのIC50を有する16−マーを生成した。さらなる切断物（すなわち、15−マー及び14−マーペプチド）は、EPOR結合活性を完全に破壊した。
【０１３６】
ERB1−７ペプチドの切断物はペプチドとIg−EPORとの間の物理的相互作用を妨害するだけでなく、また例10に記載のように、ペプチドの生物学的活性も妨害する。従って、配列番号12により与えられるコンセンサス12−マーペプチドが必要であるが、しかしEPORのための高い親和性を有する合成ペプチドを創造するためには十分ではない。
次の例は、EPORを結合した合成ペプチドがインビトロ細胞培養システムにおいてEPO −様薬理学的活性をまた示したことを例示するために使用される方法を記載する。
【０１３７】
例10．ERB1及び発生されたペプチドがEPO −応答細胞系において増殖を刺激する
12−マーコンセンサス配列を含む２種の代表的な合成ペプチドの生物学的活性を評価するために、ペプチドERB1−７及びERB １−８を、EPO −応答細胞系（TF−１）の増殖を刺激するそれらの能力について試験した。当業者は、TF−１細胞系がEPO 生物学的活性を検出し、そして定量化するために有用である（但し、他のEPO −応答細胞も置換され得る）ことを理解するであろう。TF−１細胞系が、汎血球減少症を有する35才の男性から単離されたヘパリン化された骨髄吸引物から確立した（Kitamuraなど., 1989, J. Physiol. 140: 323 ）。
【０１３８】
TF−１細胞を、10％のBCS 及び５ng/ml のCM−CSF を含むRPMI1640において増殖した。残留GM−CSF を除去するためにPBS により２度洗浄した後、5,000 個の細胞を、0.5 単位のEPO/mlの存在下で96−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに配置し、そして標準の条件下で３日間培養した（Kitamuraなど., 1989, Blood 73: 375-380）。
【０１３９】
EPO に応答しての増殖を、標準のXXT アッセイ（ナトリウム3'−（−1 −（フェニルアミノカルボニル）−3, 4−テトラゾリウム）−ビス（4 −メトキシ−6 −ニトロ）ベンゼンスルホン酸水和物に基づくアッセイ；Promega, Madison WI ）を用いて決定した。類似する方法に従って、EPO の代わりにERB1−７（配列番号81）又はERB1−8 合成ペプチド（配列番号82）を用いた。また、負の対照として、次の配列を有するIL−6 ペプチドを試験した：
GGAFCEAVGCGPDRNFYGG （配列番号87）。ペプチド濃度を、0.02〜20μM の1,000 培濃度範囲にわたって試験した。
【０１４０】
図８A 及び８B に示される結果は、EPORを結合した合成ペプチドがまた、生物学的アッセイにおいてEPO −様薬理学的活性を示したことを示す。陽性対照、すなわち精製されたEPO は、TF−１細胞がEPO 応答性であったことを確認した。0.05〜0.1 単位/ml の範囲のEPO において半分の最大応答（ED50）を有するTF−1 細胞は増殖した（図８A ）。両ペプチドは、１〜10μM の濃度でTF−１細胞において用量−依存性態様で増殖応答を生成するEPORアゴニストであった（図８B ）。対照的に、EPORを結合しなかった不適切なIL−６ペプチドは、20μM までのいずれかの試験された濃度でTF−１細胞増殖を刺激しなかった。
【０１４１】
これは、アッセイにおける非特異的相互作用が合成EPO 擬似体により見出された増殖結果に寄与しなかったことを示した。従って、コンセンサス12−マーの配列番号12及びフランキングアミノ酸を含む合成ペプチドは、EPO に類似する生物学的活性を示した。本発明の特定の態様が詳細に記載されて来たが、それらの態様は例示的であって、本発明の範囲を限定するものではないことが当業者に明らかであろう。
【０１４２】
【配列表】
（１）一般情報：
（i ）出願人：McCONNELL, Stephen, J. and SPINELLA, Dominic, G.
（ii）発明の名称：エクトロポエチン受容体のためのペプチドリガンド
（iii ）配列の数：87
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0004361684.tif 000002
【０１４３】
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004361684.tif 000003
【０１４４】
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号３：
0004361684.tif 000004
【０１４５】
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６３３８個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
【化１】
0004361684.tif 000005
【化２】
0004361684.tif 000006
【化３】
0004361684.tif 000007
【０１４６】
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0004361684.tif 000008
【０１４７】
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0004361684.tif 000009
【０１４８】
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７５０個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
【化４】
0004361684.tif 000010
【０１４９】
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
【化５】
0004361684.tif 000011
【０１５０】
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号９：
【化６】
0004361684.tif 000012
【０１５１】
（２）配列番号１０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６３個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号１０：
【化７】
0004361684.tif 000013
【０１５２】
（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６０個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号１１：
【化８】
0004361684.tif 000014
【０１５３】
（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号１２：
0004361684.tif 000015
【０１５４】
（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１３：
【化９】
0004361684.tif 000016
【０１５５】
（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１４：
【化１０】
0004361684.tif 000017
【０１５６】
（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１５：
【化１１】
0004361684.tif 000018
【０１５７】
（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１６：
【化１２】
0004361684.tif 000019
【０１５８】
（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１７：
【化１３】
0004361684.tif 000020
【０１５９】
（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１８：
【化１４】
0004361684.tif 000021
【０１６０】
（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１９：
【化１５】
0004361684.tif 000022
【０１６１】
（２）配列番号２０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２０：
【化１６】
0004361684.tif 000023
【０１６２】
（２）配列番号２１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２１：
【化１７】
0004361684.tif 000024
【０１６３】
（２）配列番号２２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２２：
【化１８】
0004361684.tif 000025
【０１６４】
（２）配列番号２３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２３：
【化１９】
0004361684.tif 000026
【０１６５】
（２）配列番号２４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２４：
【化２０】
0004361684.tif 000027
【０１６６】
（２）配列番号２５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２５：
【化２１】
0004361684.tif 000028
【０１６７】
（２）配列番号２６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２６：
【化２２】
0004361684.tif 000029
【０１６８】
（２）配列番号２７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２７：
【化２３】
0004361684.tif 000030
【０１６９】
（２）配列番号２８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２８：
【化２４】
0004361684.tif 000031
【０１７０】
（２）配列番号２９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２９：
【化２５】
0004361684.tif 000032
【０１７１】
（２）配列番号３０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３０：
【化２６】
0004361684.tif 000033
【０１７２】
（２）配列番号３１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３１：
【化２７】
0004361684.tif 000034
【０１７３】
（２）配列番号３２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３２：
【化２８】
0004361684.tif 000035
【０１７４】
（２）配列番号３３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３３：
【化２９】
0004361684.tif 000036
【０１７５】
（２）配列番号３４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３４：
【化３０】
0004361684.tif 000037
【０１７６】
（２）配列番号３５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３５：
【化３１】
0004361684.tif 000038
【０１７７】
（２）配列番号３６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３６：
【化３２】
0004361684.tif 000039
【０１７８】
（２）配列番号３７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３７：
【化３３】
0004361684.tif 000040
【０１７９】
（２）配列番号３８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３８：
【化３４】
0004361684.tif 000041
【０１８０】
（２）配列番号３９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３９：
【化３５】
0004361684.tif 000042
【０１８１】
（２）配列番号４０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４０：
【化３６】
0004361684.tif 000043
【０１８２】
（２）配列番号４１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４１：
【化３７】
0004361684.tif 000044
【０１８３】
（２）配列番号４２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４２：
【化３８】
0004361684.tif 000045
【０１８４】
（２）配列番号４３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４３：
【化３９】
0004361684.tif 000046
【０１８５】
（２）配列番号４４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４４：
【化４０】
0004361684.tif 000047
【０１８６】
（２）配列番号４５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４５：
【化４１】
0004361684.tif 000048
【０１８７】
（２）配列番号４６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４６：
【化４２】
0004361684.tif 000049
【０１８８】
（２）配列番号４７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号４７：
【化４３】
0004361684.tif 000050
【０１８９】
（２）配列番号４８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号４８：
【化４４】
0004361684.tif 000051
【０１９０】
（２）配列番号４９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号４９：
【化４５】
0004361684.tif 000052
【０１９１】
（２）配列番号５０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５０：
【化４６】
0004361684.tif 000053
【０１９２】
（２）配列番号５１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５１：
【化４７】
0004361684.tif 000054
【０１９３】
（２）配列番号５２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５２：
【化４８】
0004361684.tif 000055
【０１９４】
（２）配列番号５３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５３：
【化４９】
0004361684.tif 000056
【０１９５】
（２）配列番号５４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５４：
【化５０】
0004361684.tif 000057
【０１９６】
（２）配列番号５５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５５：
【化５１】
0004361684.tif 000058
【０１９７】
（２）配列番号５６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５６：
【化５２】
0004361684.tif 000059
【０１９８】
（２）配列番号５７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５７：
【化５３】
0004361684.tif 000060
【０１９９】
（２）配列番号５８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５８：
【化５４】
0004361684.tif 000061
【０２００】
（２）配列番号５９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号５９：
【化５５】
0004361684.tif 000062
【０２０１】
（２）配列番号６０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６０：
【化５６】
0004361684.tif 000063
【０２０２】
（２）配列番号６１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６１：
【化５７】
0004361684.tif 000064
【０２０３】
（２）配列番号６２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６２：
【化５８】
0004361684.tif 000065
【０２０４】
（２）配列番号６３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６３：
【化５９】
0004361684.tif 000066
【０２０５】
（２）配列番号６４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６４：
【化６０】
0004361684.tif 000067
【０２０６】
（２）配列番号６５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６５：
【化６１】
0004361684.tif 000068
【０２０７】
（２）配列番号６６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６６：
【化６２】
0004361684.tif 000069
【０２０８】
（２）配列番号６７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６７：
【化６３】
0004361684.tif 000070
【０２０９】
（２）配列番号６８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６８：
【化６４】
0004361684.tif 000071
【０２１０】
（２）配列番号６９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号６９：
【化６５】
0004361684.tif 000072
【０２１１】
（２）配列番号７０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７０：
【化６６】
0004361684.tif 000073
【０２１２】
（２）配列番号７１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７１：
【化６７】
0004361684.tif 000074
【０２１３】
（２）配列番号７２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７２：
【化６８】
0004361684.tif 000075
【０２１４】
（２）配列番号７３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７３：
【化６９】
0004361684.tif 000076
【０２１５】
（２）配列番号７４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７４：
【化７０】
0004361684.tif 000077
【０２１６】
（２）配列番号７５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７５：
【化７１】
0004361684.tif 000078
【０２１７】
（２）配列番号７６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７６：
【化７２】
0004361684.tif 000079
【０２１８】
（２）配列番号７７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７７：
【化７３】
0004361684.tif 000080
【０２１９】
（２）配列番号７８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７８：
【化７４】
0004361684.tif 000081
【０２２０】
（２）配列番号７９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号７９：
【化７５】
0004361684.tif 000082
【０２２１】
（２）配列番号８０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８０：
【化７６】
0004361684.tif 000083
【０２２２】
（２）配列番号８１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８１：
0004361684.tif 000084
【０２２３】
（２）配列番号８２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８２：
0004361684.tif 000085
【０２２４】
（２）配列番号８３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８３：
0004361684.tif 000086
【０２２５】
（２）配列番号８４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８４：
0004361684.tif 000087
【０２２６】
（２）配列番号８５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８５：
0004361684.tif 000088
【０２２７】
（２）配列番号８６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８６：
0004361684.tif 000089
【０２２８】
（２）配列番号８７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ナシ
（xi）配列：配列番号８７：
0004361684.tif 000090
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ERB １ファージクローンがキメラIg−EPORプローブと特異的に結合することを確かめるEPOR−特異的ファージELISA からの結果を示す線グラフである。グラフは、Ig−EPORプローブを用いて単離されたファージクローン（ERB1、黒三角形）；抗−IL−８抗体に対して特異的に結合するファージクローン（HPKF、◆）；及びヒトIL−６受容体に対して特異的に結合するファージクローン（IL−６−B26 、黒四角形）について、異なったファージ希釈度でのELISA （O. D. ）により測定されるような、Ig−EPORに対する結合を示す。
【図２】  図２は、異なった濃度（単位/ml ）での組換えEPO がIg−EPORに結合するためにERB1ファージ（◆）と競争するが、しかしIL−６受容体に結合したファージ（●）に対して効果を有さなかったELISA （O. D. ）の結果を示す線グラフである。
【図３Ａ】  図３A は、ERB1発生されたライブラリーを創造するために使用されたアプローチを示す。図３A は、第１の線上のERB1クローンにおけるpIIIタンパク質に融合されたペプチドのアミノ酸配列、及び第２及び第３の線上のERB1クローンの発生されたライブラリーを創造するために使用された冗長性オリゴヌクレオチドの収集物の配列を示す。オリゴヌクレオチドは、ERB1ペプチドにおけるアミノ酸に対応するコドンを示すために、及び配列の3'末端で９個の相補的塩基を用いてのオリゴヌクレオチドのアニーリングを示すために整列された。
【図３Ｂ】  図３B は、ERB1発生されたライブラリーを創造するために使用されたアプローチを示す。図３B は、冗長性オリゴヌクレオチドにおいて“g ”、“a ”、“ｔ”、“ｃ”及び“ｓ”として表される個々の塩基のために冗長性オリゴヌクレオチドを合成するために使用されたヌクレオチド組成物を示す。ERB1クローンにおけるpIIIタンパク質に融合されたペプチドのアミノ酸配列、及びERB1ペプチド配列の変異体をコードしたオリゴヌクレオチドの収集物を創造するために使用されたスキームが示される。
【図４】  図４は、ERB1発生されたライブラリーに由来するファージクローンのアミノ酸配列、及びIg−EPORのためのクローンの相対的親和性を示す。クローンB1〜B21 は、Ig−EPORに結合することによって単離され、そしてファージクローンN1〜N13 は発生されたライブラリーに由来するが、しかし選択工程の間、Ig−EPORに結合しなかった。相対的親和性は、図５A 〜５D に示されるデータの数的な要約である。
【図５Ａ】  図５A は、元のERB1単離物に関して、Ig−EROPのためのいくつかの独立したファージクローンの親和性を示す一連の線グラフである。図５A はクローンB1〜B5及びERB1についての結果を示す。
【図５Ｂ】  図５B は、元のERB1単離物に関して、Ig−EROPのためのいくつかの独立したファージクローンの親和性を示す一連の線グラフである。図５B はクローンB6〜B10 及びERB1についての結果を示す。
【図５Ｃ】  図５c は、元のERB1単離物に関して、Ig−EROPのためのいくつかの独立したファージクローンの親和性を示す一連の線グラフである。図５C はクローンB11 〜B15 及びERB1についての結果を示す。
【図５Ｄ】  図５D は、元のERB1単離物に関して、Ig−EROPのためのいくつかの独立したファージクローンの親和性を示す一連の線グラフである。図５D はB16 〜B21 及びERB1についての結果を示す。
【図６】  図６は、固定されたEPO へのキメラIg−EPORプローブの結合が、添加されるペプチドの不在（◆）及びIL−６受容体に結合する不適切なペプチドの添加（×）に比較して、競争体ペプチド（ペプチドERB1−７、黒四角形；ペプチドERB1−８、●）により阻害される、ペプチド阻害ELISA からの結果を示す線グラフである。
【図７】  図７は、N −末端切断されたERB1−７ペプチド（17−マー、黒四角形；16−マー、黒三角形；15−マー×；14−マー、★）のIg−EPORへの結合に比較して、及びIL−６受容体に結合する不適切なペプチドの添加又は添加されるインヒビターの不在（＋）に比較して、Ig−EPORへのERB １−7 18−マーペプチド（◆）の結合を示す線グラフである。
【図８Ａ】  図８A は、TF−１細胞増幅アッセイからの結果を示す線グラフである。図８A は、組換えEPO の異なった濃度（単位）でのTF−１細胞（450nm でのO. D. ）の増殖についての用量応答曲線を示す。
【図８Ｂ】  図８B は、TF−１細胞増幅アッセイからの結果を示す線グラフである。図８B は、IL−６受容体に結合する不適切なペプチドの添加（×）に比較して、合成ペプチドERB1−７（黒四角形）及びERB1−８（黒三角形）の異なった濃度（μM ）でのTF−１細胞（450nm でのO. D. ）の増殖についての用量応答曲線を示します。
【図１】
0004361684.tif 000091
【図２】
0004361684.tif 000092
【図３Ａ】
0004361684.tif 000093
【図３Ｂ】
0004361684.tif 000094
【図４】
0004361684.tif 000095
【図５Ａ】
0004361684.tif 000096
【図５Ｂ】
0004361684.tif 000097
【図５Ｃ】
0004361684.tif 000098
【図５Ｄ】
0004361684.tif 000099
【図６】
0004361684.tif 000100
【図７】
0004361684.tif 000101
【図８Ａ】
0004361684.tif 000102
【図８Ｂ】
0004361684.tif 000103