(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号：１の核酸配列を有する分離核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項３】
前記核酸が少なくとも１つのイントロンを含むことを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸によりコードされている分離タンパク質。
【請求項５】
配列識別番号：２のアミノ酸配列を有する請求項４に記載の分離タンパク質。
【請求項６】
腎臓の基底膜疾患に対する感受性を検出する方法であって、ネフリン遺伝子における、疾患を引き起こす変異を、ネフリンタンパク質が検出されないか、またはネフリンの機能を維持しない結果として検出することから成る、現存する腎臓の基底膜疾患の存在を検出するための方法。
【請求項７】
ネフリンタンパク質における変異を検出することから成る請求項６に記載されている方法。
【請求項８】
ネフリンタンパク質の存在ないしは存在しないことを検出することから成る請求項６に記載されている方法。
【請求項９】
前記腎臓の基底膜疾患がとくにフィンランド型の先天性ネフローゼ症候群であることを特徴とする請求項６に記載されている方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸を検出する少なくとも１つの核酸プローブを含有する、腎臓の基底膜疾患に対する感受性ないしは腎臓の基底膜疾患の存在について個々人をスクリーニングするためのキット。
【請求項１１】
免疫応答を刺激するために、請求項５のタンパク質の十分な用量によりヒトを除く動物を免疫化することによって産生されるネフリンタンパク質に特異的な抗体を含有するポリクローナル抗血清。
【請求項１２】
ネフリンタンパク質に特異的に結合するための候補分子をスクリーニングすることから成る腎臓疾患に関連しているタンパク尿の治療のための小分子治療薬を同定するための方法。
【請求項１３】
前記特異的な結合がネフリンタンパク質生物活性における変化に効果を及ぼすことを特徴とする請求項１２に記載されている方法。
【請求項１４】
核酸サンプルを分析して配列番号１の核酸配列を含むＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２における変異の存在を検出することを含む、腎臓の基底膜疾患の存在を検出する方法であって、前記変異が、前記エキソンにおいて未成熟停止コドンを生じ、かつ、前記エキソン２における変異が、前記ＮＰＨＳ１遺伝子のヌクレオチド１２１−１２２の２つの塩基対の欠失を含む、方法。
【請求項１５】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、エキソン２における変異の存在を検出する前に増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
増幅がＰＣＲにより、かつ、増幅に用いられるプライマーがＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２領域を特に増幅する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅に用いられるプライマーが、配列番号３または配列番号４を含むＤＮＡ配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸サンプルを分析して配列番号１の核酸配列を含むＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２６における変異の存在を検出することを含む、腎臓の基底膜疾患の存在を検出する方法であって、前記エキソン２６における変異が、単一の塩基変更を含み、かつ、前記単一の塩基対変更が、ノンセンス変異ＣＧＡ‐＞ＴＧＡを生じる、方法。
【請求項１９】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、エキソン２６における変異の存在を検出する前に増幅される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
増幅がＰＣＲにより、かつ、増幅に用いられるプライマーがＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２６領域を特に増幅する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
増幅に用いられるプライマーが、配列番号５または配列番号６を含むＤＮＡ配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物中で新規な制限部位が検出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
新規な制限部位が、ＤｄｅＩで分解されやすい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
個人から得た配列番号１の核酸配列を含むＮＰＨＳ１遺伝子を含む核酸サンプルを分析することを含む、前記個人がフィンランド型先天性ネフローゼ症候群の発症リスクを有するかどうかを決定するインビトロ方法であって、前記方法が、前記ＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２領域を分析することを含み、先天性ネフローゼ症候群の発症リスクを有する個人が、エキソン２に変異を有し、前記エキソン２における変異が、前記ＮＰＨＳ１遺伝子のヌクレオチド１２１−１２２の２つの塩基対の欠失を含む、方法。
【請求項２５】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、エキソン２における変異の存在を検出する前に増幅される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
増幅がＰＣＲにより、かつ、増幅に用いられるプライマーがＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２領域を特に増幅する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
増幅に用いられるプライマーが、配列番号３または配列番号４からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
個人から得た配列番号１の核酸配列を含むＮＰＨＳ１遺伝子を含む核酸サンプルを分析することを含む、前記個人がフィンランド型先天性ネフローゼ症候群の発症リスクを有するかどうかを決定するインビトロ方法であって、前記方法が、前記ＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２６領域を分析することを含み、先天性ネフローゼ症候群の発症リスクを有する個人が、エキソン２６に少なくとも１つの変異を有し、前記エキソン２６における変異が、単一の塩基変更を含み、かつ、前記単一の塩基変更が、ノンセンス変異ＣＧＡ‐＞ＴＧＡを生じる、方法。
【請求項２９】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、エキソン２６における変異の存在を検出する前に増幅される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
増幅がＰＣＲにより、かつ、増幅に用いられるプライマーがＮＰＨＳ１遺伝子のエキソン２６領域を特に増幅する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
増幅に用いられるプライマーが、配列番号５または配列番号６からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
増幅産物中で新規な制限部位が検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
新規な制限部位が、ＤｄｅＩで分解されやすい、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＰＨＳ１遺伝子における変異の有無を検出する方法であって、
配列番号１の核酸配列によりコードされるＮＰＨＳ１遺伝子を含む核酸試験サンプルの、前記遺伝子におけるエキソン２またはエキソン２６の少なくとも１つの変異を分析する工程と、
工程ａ）の前記試験サンプルの分析結果を、コントロールサンプルの分析結果と比較する工程であって、前記コントロールサンプルが、エキソン２またはエキソン２６に変異を有しない配列番号１の核酸配列によりコードされるＮＰＨＳ１遺伝子を含む工程と、および
前記試験サンプル中のエキソン２またはエキソン２６における少なくとも１つの変異の有無を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３５】
エキソン２における変異が、２塩基対の欠失であり、かつ、エキソン２６における変異が、単一の塩基変更であり、いずれの変異も、前記エキソンにおいて未成熟停止コドンを生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、分析の前に増幅される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
増幅が、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含むプライマーを用いるＰＣＲ増幅である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＮＰＨＳ１遺伝子における変異の有無を検出する方法であって、
ａ）配列番号２を含むネフリンタンパク質をコードする核酸を含むＮＰＨＳ１遺伝子を含む核酸試験サンプル、または前記遺伝子のその断片を、当該遺伝子またはその断片の少なくとも１つの変異について分析する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記試験サンプルの分析結果を、コントロールサンプルの分析結果と比較する工程であって、前記コントロールサンプルが、変異を有しないＮＰＨＳ１遺伝子またはその断片を含む、工程と、および
ｃ）前記試験サンプル中の前記ＮＰＨＳ１遺伝子またはその断片における少なくとも１つの変異の有無を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３９】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、配列番号１を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＮＰＨＳ１遺伝子が、分析の前に増幅される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の記載）
本出願は、１９９８年３月１８日に登録された米国特許出願第０９／０４０７７４号より付与される優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
フィンランド型先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ，  ＮＰＨＳ１，  ＭＩＭ  ２５６３００）は常染色体劣性障害であり、また先天性ネフローゼ症候群の間でも別個の存在である。これは、新生児期で大量のタンパク尿、また分娩時腎症により特徴付けられる。重要なことは、ＮＰＨＳ１は、単独で腎臓に影響を及ぼすようにみえることで、したがって、糸球体ろ過防御壁についての研究に関するユニークなモデルを提供する。
【０００３】
腎糸球体の血漿の限外ろ過に対する主な防御壁は、３つの層から成る。すなわち、有窓性内皮、３００から３５０ｎｍの厚さの糸球体基底膜（ＧＢＭ）、ろ過細隙、すなわち上皮細胞の小足の間に位置している隔膜である。この防御壁は高度に洗練されたサイズ選択分子篩であるが、その機能的な分子メカニズムはいまだに大部分わかっていない。ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドジェン、プロテオグリカンを軽く交差連結させた網である糸球体基底膜には、大きなタンパク質と細胞の穿通を制限する細隙が含まれていると予想されており、また付加的には、陰イオンヘパラン硫酸プロテオグリカン成分が巨大分子に対する電気的な防御壁として貢献していることが仮定されてきた（ＫａｓｉｎａｔｈとＫａｎｗａｒ、１９９３）。糸球体フィルターは、数多くの後天性および遺伝性疾患において影響を受け、血漿アルブミンと大きなタンパク質の漏洩拡大という結果になり、ネフローゼ症候群や腎臓疾患の終末病期につながる。糸球体ろ過プロセスとその病理学についての分子メカニズムを理解することは、臨床医学にとっては基本的に重要なことであり、それが、次には、腎臓の初期および二次的な疾患における合併症の診断と治療に関する新規な開発を容易にする。主な症状としてろ過防御壁に難点を有する遺伝子疾患は、こうした知識を提供するためのモデルとして役に立つことができる。
【０００４】
先天性ネフローゼ症候群（ＮＰＨＳ）は、分娩時ないしは分娩後の短い時間の大量のタンパク尿により特徴付けられる疾患の１つの異種グループを形成する（Ｒａｐｏｌａら、１９９２）。ネフローゼ症候群は、初期、後天性、ないしはほかの症候群の一部でありうる。フィンランド型先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ、ＮＰＨＳ１）は、ＮＰＨＳの間でも別個の存在である。これは、フィンランドでは１：１０，０００出生数という発生率を有する常染色体劣性障害であり、ほかの諸国ではかなりそれを下回る（Ｎｏｒｉｏ、１９９６；Ｈｕｔｔｕｎｅｎ、１９７６）。この疾患自体が、子宮内で糸球体ろ過防御壁の初期病変を示す重篤なタンパク尿を、胎児期にすでに顕示している。ＮＰＨＳ１の病因は不明瞭のままである。特有症候の病因の特徴はなく、ＮＰＨＳ１のもっとも典型的な組織学的発見は近位尿細管の拡張である（Ｈｕｔｔｕｎｅｎら、１９８０）。腎臓はまた、肥大し、同年齢対照群よりもネフロンを多く含んでいることが発見されている（ＴｒｙｇｇｖａｓｏｎとＫｏｕｖａｌａｉｎｅｎ、１９７５）。いずれの原因のネフローゼ症候群にも特徴的である発見である、糸球体上皮細胞の小足の喪失があるのだが、電子顕微鏡下では、糸球体基底膜自体の異常な特徴は明らかにされていない。ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの糸球体基底膜タンパク質の分析では、ＮＰＨＳ１のなかでの異常発見物は明らかにされていない（例えば、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら、１９９３；Ｋｅｓｔｉｌaら、１９９４ａ）。ＮＰＨＳ１は進行性疾患であり、通常生後２年間の間に死亡することに直結し、唯一の助命治療法は、腎臓移植である（Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、１９９５）。重要なことは、たいていの移植患者は、これまでのところは、腎臓外合併症を発症してはおらず、変異した遺伝子産物は、腎発症および／または糸球体ろ過機能に高度に特異的であることを示唆している。しかし、患者の約２０％は移植後ネフローゼを発症しているが、その原因は明らかではない（Ｌａｉｎｅら、１９９３；Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、１９９５）。
【０００５】
糸球体ろ過プロセスのその高度な特異性のために、ＮＰＨＳ１は、この重要な腎臓機能についての研究のためのユニークなモデル疾患を提供している。この疾患について、強力な候補となる遺伝子はなかったため、われわれは、ＣＮＦ遺伝子を同定するというわれわれの試みのなかで、位置クローニングアプローチ方法を使用し、また、染色体１９Ｑ１３．１上の１５０ｋｂ領域に遺伝子を局在化した（Ｋｅｓｔｉｌaら、１９９４ｂ；Ｍaｎｎｉｋｋoら、１９９５）。われわれは臨界領域に新規な遺伝子を同定し、また、それがＮＰＨＳ１において突然変異したものであることを示した。その遺伝子産物は、新規なトランスメンブランタンパク質であり、ヒト胚においては、腎糸球体で高い発現レベルを示している。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、新規なタンパク質ネフリンと、そのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明は、ネフリンタンパク質をコードする配列識別番号：１の核酸配列である新規なＤＮＡ核酸配列を包含する。本発明はまた、配列識別番号：２を有する配列識別番号：１の核酸配列のコード領域によりコードされるタンパク質を包含する。とくに、本発明はまた、シグナルペプチドが切断された成熟ネフリンタンパク質を包含する。
【０００７】
本発明は、診断、出生前スクリーニング、ないしは、糸球体ネフローゼないしは基底膜疾患に感受性に関する出生後スクリーニングのため、変異したネフリン遺伝子の存在に対するスクリーニング対象個人用の方法、試薬、キットを含んでいる。とくに、本発明は、フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群（ＮＰＨＳ１）に対するスクリーニング法を提供する。
【０００８】
本発明は、欠損性内在性ネフリン遺伝子産物に関連している基底膜疾患の治療薬による治療のための方法、試薬、キットを提供する。したがって、本発明は、ネフリンタンパク質を使用する治療薬による治療を提供し、またとくに組換えＤＮＡ方法により産生されるタンパク質を使用する治療薬による治療を提供する。さらに付け加えると、本発明は、ネフリン遺伝子、ないしは実質的に同様のそのＤＮＡ配列を含有している治療用核酸構築物を使用する遺伝子治療を提供する。
【０００９】
（発明を実施するための詳細な説明）
フィンランド型先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ、ＮＰＨＳ１、ＭＩＭ２５６３００）は、常染色体劣性障害であり、また先天性ネフローゼ症候群の間でも別個の存在である。これは胎児期の大量のタンパク尿と、分娩時ネフローゼにより特徴付けられる。重要なことは、ＮＰＨＳ１は単独で腎臓に影響を及ぼすようにみえることで、したがって、糸球体ろ過防御壁についての研究のユニークなモデルを提供する。ＮＰＨＳ１遺伝子は、１９ｑ１３．１に局在しており、また本研究では、連鎖不平衡が配列された１５０ｋｂに臨界領域を狭めるのに使用された。少なくとも１０個の新規な遺伝子と、タンパク質のようなアミロイド前駆体をコードする遺伝子がこの領域で同定された。遺伝子の５つは、それらのすべてが腎臓での何らかの発現を示し、ＮＰＨＳ１患者におけるすべての６３エキソンを配列決定することにより分析された。２つの変異、エキソン２における２‐ｂｐ欠失とエキソン２６における単一の塩基変更は、両方とも、未成熟停止コドンに結びつくが、新規な２９‐エキソン遺伝子で見つかった。その変異はホモ接合としてか、ないしは複合へテロ接合としてかのいずれかで、４９人の患者のうち４４人でみつかり、４人の患者は１つの対立遺伝子のなかで２ｂｐ欠失を有し、ほかの患者は、潜在的な変異がまだ不明であった。ネフリンと呼ばれる遺伝子産物は、ノーザンブロット法およびインシトゥハイブリダイゼーション法により、腎臓の糸球体に特異的であることが示された細胞接着分子の免疫グロブリンの１，２４１残基推定トランスメンブランタンパク質である。その結果からは腎臓ろ過防御壁の発症ないしは機能におけるネフリンの重大な役割が示されている。
【００１０】
本発明は、以下の実施例を検証することにより明確に理解されることであろうが、実施例は単に説明として述べるのであって、また制限されないことが意図されている。
【００１１】
（実施例１）
方法と手順
コスミドクローンの配列
Ｄ１９Ｓ２０８とＤ１９Ｓ６０８の間の領域にわたるコスミドクローンの分離が以前に報告されている（Ｏｌｓｅｎら、１９９６）。コスミドクローンのＤＮＡは、Ｆ１９５４１、Ｒ３３５０２、Ｆ１１５４９、Ｒ２８０５１、Ｆ１９３９９、Ｒ３１１５８、Ｒ３１８７４が噴霧により機械的にせん断され、また、ＡＢＩ  ３７７自動化ＤＮＡ配列を使用して無作為配列決定する前に、１０００から２０００ｂｐの断片は分離され、またＭ１３ファージのなかでサブクローン化された。
【００１２】
配列の分析
新しいマイクロサテライトマーカーを開発するために、反復領域が配列から探し出され、また、それらのうち３つ（Ｄ１９Ｓ１１７３、Ｄ１９Ｓ１１７５、Ｄ１９Ｓ１１７６）が多形態性であることがみつかっている。相同性比較がＢＬＡＳＴＸとＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行われた（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）。ＢＬＡＳＴＮ分析の前に、ヌクレオチド配列がＣＥＮＳＯＲを使用して（Ｊｕｒｋａら、１９９６）、Ａｌｕ配列のような反復領域を遮蔽するために、ろ過された。エキソン予測がＧＲＡＩＬ  ＩＩを使用して（ＵｂｅｒｂａｃｈｅｒとＭｕｒａｌ、１９９１）、ＧＥＮＳＣＡＮ（ＢｕｒｇｅとＫａｒｌｉｎ、１９９７）、ＦＧＥＮＥＨ、ＨＥＸＯＮ（Ｓｏｌｏｖｙｅｈら、１９９１）プログラムが行われ、またタンパク質構造の予測がＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）とＥＸＰＡＳＹ分子生物学サーバーを使用して行われた。変異検索が、ＧＣＧパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを使用して正常なゲノム配列と患者の配列を比較することにより行われた（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社、１９９６）。
【００１３】
ｃＤＮＡの分析
ｃＤＮＡは、エキソン配列をベースにしたプライマーを使用して異なった組織由来のポリ（Ａ）ＲＮＡからＰＣＲ法により生成された。ＰＣＲ断片は、配列決定され、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用に使用された。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）もまた、ｃＤＮＡの５’と３’末端を特徴付けるのに使用された。受容者と供与者スプライシング部位でのイントロン配列でそうであったように、イントロンのサイズを確定するために、ｃＤＮＡの比較とゲノム配列が行われた。
【００１４】
サザンおよびノーザンブロット法とインシトゥハイブリダイゼーション法による分析
サザン分析のために、１０μｇのゲノムＤＮＡを含有するサンプルが、異なった制限酵素により加水分解され、また１％アガロースゲル上で電気泳動法にかけ、ナイロン膜に移し、ｃＤＮＡプローブによりハイブリダイズされた。８人の成人と４人の胎児組織から得られた複数組織ノーザン分析ポリ（Ａ）ＲＮＡが調べられた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）。ハイブリダイゼーション法がエキソン１から１０を含むｃＤＮＡクローンを使用して、６５℃にてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ緩衝液のなかで行われた。
【００１５】
インシトゥハイブリダイゼーション法に関しては、ＮＰＨＳ１  ｃＤＮＡ  クローン由来の断片（エキソン１０に対応）がジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）により標識化され、アルカリ性加水分解により約１５０塩基対断片に切断され、またその後にプローブとして使用された。２３週ヒト胎児腎臓から得られた７μｍの組織切片が０．２５％（ｖ／ｖ）酢酸無水物と１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有する０．２Ｍ  ＨＣｌ、０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０により処理された。その切片は１６時間６２℃にてプローブによりハイブリダイズされた。５０％ホルムアミドと標準クエン酸ナトリウムで洗浄後、プローブは、アルカリ性リン酸化酵素に接合されたジゴキシゲナーゼに対する抗体により免疫学的に検出された（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）。着色はＮＢＴとＢＣＩＰによって顕色化された。
【００１６】
変異分析
本研究では、われわれは４９人のフィンランド型ＮＰＨＳ１患者、その親、そして合計で５４人の同胞の健常者を分析した。ＮＰＨＳ１の診断は、重篤なタンパク尿、大きな胎盤内胎児（分娩時体重の＞２５％）、生後数週間の間のネフローゼ症候群、そして、先天性ネフローゼ症候群のほかのタイプの除外をベースとして行われた（Ｋｏｓｈｋｉｍｉｅｓ，１９９０）。さらに、８３人の対照個人から得られたサンプルが分析された。
【００１７】
ＮＰＨＳ１遺伝子は、ゲノムＤＮＡ由来のすべてのエキソン領域をＰＣＲ増幅し、また配列決定することにより、分析された。エキソン２のプライマーの配列は、５’−ＧＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＣＧＣＡＧ３’（５’ＵＴＲ）と５’ＡＧＣＴＴＣＣＧＣ‐ＴＧＧＴＧＧＣＴ３’（イントロン２）また、エキソン２６のプライマーが５’ＣＴＣＧＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣ３’（イントロン２３）と、５’ＣＣＴＧＡＴＧＣＴＡＡＣＧＧ‐ＣＡＧＧＧＣ３’（イントロン２６）であった。ＰＣＲ反応は、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１  ｘ  ＡｍｐｌｉＴａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ社）、０．２ｍＭの各ヌクレオチド、５０ｎｇのプライマー、０．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを含む２５μｌの合計容量で行われた。反応は、１分間、９５℃にて変性、１分間６０℃にてアニーリング、１分間７２℃にて伸長を行う３０サイクルが実施された。最初のサイクルでは、１２分間変性が実施され、最終のサイクルでは伸長は８分間であった。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルにより分離され、スプライシングされ、ＱｉａｅｘＩＩシステム（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製された。精製されたＰＣＲ産物は、ｄローダミン染色ターミネーターの化学的性質を用いた特異的プライマーと、ＡＢＩ３７７自動化配列（Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ社）を使用して配列決定された。
【００１８】
親、同胞、対照群由来のＮＰＨＳ１フィンランド型多数症例変異についてのスクリーニングを行ったときに、エキソン２欠失部位を含む１００ｂｐ  ＰＣＲ産物が、放射能末端標識化プライマーを使用して増幅され、また６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられた。第２のＮＰＨＳ１フィンランド型少数症例タイプは、ＤｄｅＩに関する新規な制限部位を使用してスクリーニングすることが可能であった。１４０ｂｐ増幅ＰＣＲ産物はＤｄｅＩにより加水分解され、また産物（１４０ｂｐないしは９０ｂｐ＋５０ｂｐ）がアガロースゲル（１％  ＳｅａＫｅｍアガロース‐３％  ＮｕＳｉｅｖｅアガロース）上で分離された。
【００１９】
一般的には、分子生物学的また生物化学的技術を行うための方法と手順は当業者には公知のものであり、また、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、『分子クローニング：ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）』，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社刊，  ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ市、１９８９年）；  Ａｕｓｕｂｅｌら編『分子生物学における簡潔なプロトコル集（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）』、第２版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊，  １９９２年）；  Ｄａｖｉｓら『分子生物学における基礎的諸方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）』（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社刊、１９８６年）；  Ｄａｖｉｄ  Ｇｏｅｄｄｅｌ編『遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）』（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社刊、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ市、１９９１年）などの入手可能なテキストや参考文献にみつけることができる。
【００２０】
（実施例２）
ＣＮＦ遺伝子座における遺伝子の特徴付け
１９ｑ１３．１へのＮＰＨＳ１遺伝子の局在化の後、マーカーＤ１９Ｓ２０８とＤ１９Ｓ２２４の間にある関心の対象となっている間隔から重複コスミドクローンが分離された（Ｍａｎｎｉｋｋｏら、１９９５；Ｏｌｓｅｎら、１９９６）。本研究で同定された新しいマイクロサテライトマーカーＤ１９Ｓ１１７３、Ｄ１９Ｓ１１７５、Ｄ１９Ｓ１１７６だけではなく、Ｄ１９Ｓ６０８とＤ１９Ｓ６１０で観察された有意な連鎖不平衡をもベースとして、ＮＰＨＳ１遺伝子がＤ１９Ｓ１１７６とＤ１９Ｓ６１０の近傍にある、Ｄ１９Ｓ１１７５とＤ１９Ｓ６０８の間に微細に位置決めされた（図１）。ゲノムクローンによるＮＰＨＳ１患者ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション法による分析は、変異は明らかにはされなかったが、ＮＰＨＳ１変異は主要なゲノム上の再配置を表わすものではないことを示唆していた。１５０ｋｂ臨界領域が全体として配列決定され、またその配列が、エキソン予測プログラムとデータベースの類似性検索を使用して、潜在的な候補遺伝子として検索された。これらの分析をベースにして、臨界領域は１００潜在エキソンにわたって包含していると推測された。類似性検索が、以前から公知の１つの遺伝子、すなわち、アミロイド様タンパク質をコードするＡＰＬＰ１（Ｌｅｎｋｋｅｒｉら、印刷中）と、８つの明瞭な発現配列タグ（ＥＳＴ）が明らかにされた。まとめると、分析では、臨界領域における少なくとも１０個の新規な遺伝子の存在が示された。
【００２１】
図１は、１９ｑ１３．１にあるＮＰＨＳ１遺伝子座の物理的地図と、ＮＰＨＳ１遺伝子のゲノム組織が図示されている。図１Ａは、Ｄ１９Ｓ２０８とＤ１９Ｓ２２４の間にある９２０ｋｂ領域の物理的地図である。図１Ｂは、ＮＰＨＳ１遺伝子を含む１５０ｋｂ臨界領域にわたる重複コスミドクローンである。多形態性マーカーの位置は矢印により示されている。図１Ｃは、本研究での変異を特徴付け、また検索されたＮＰＨＳ１、ＡＰＬＰ１、Ａ、Ｂ、Ｃの５つの遺伝子の位置である。
【００２２】
ＧｒａｉｌとＧｅｎｓｃａｎエキソン予測プログラムとｃＤＮＡ由来の配列を使用して、５つの遺伝子、ＮＰＨＳ１（図１）、ＡＰＬＰ１、Ａ、Ｂ、Ｃ（図示せず）のエキソン／イントロン構造が求められた。ＮＰＨＳ１は例外として、またそのほかの組織でも例外はあったが、定常状態転写レベルが変化したにもかかわらず、腎臓におけるすべての遺伝子の発現が、ノーザンブロット法による分析で明らかになった。したがって、それらのうち１つも、ＮＰＨＳ１遺伝子として除外できるものはなく、またすべてが変異分析にかけられた。
【００２３】
（実施例３）
ＮＰＨＳ１遺伝子の同定
ＮＰＨＳ１染色体のハプロタイプ分析により、フィンランド型患者において２つの主要なクラスが明らかにされている（Ｍａｎｎｉｋｋｏら、１９９５；本研究）。ハプロタイプ１−１−１−６−ｇ−２−８−９と１−１−１−６−ｇ−６−４−２（それぞれマーカーＤ１９Ｓ１１７３、Ｄ１９Ｓ１１７５、Ｄ１９Ｓ１１７６、Ｄ１９Ｓ６１０、遺伝子ＢのＲＦＬＰ、Ｄ１９Ｓ６０８、Ｄ１９Ｓ２２０）を含む最初のクラスは、フィンランド型ＮＰＨＳ１染色体の７８％にみつかるもっとも一般的なものである。第２のハプロタイプクラス、３−５−３−６−ａ−８−１−ｘは、症例の１３％でみつかっている。観察されたハプロタイプの残りの９％は、まったく異なった対立遺伝子組み合わせを示し、またほかの変異を表現しているものと考えられた。Ｄ１９Ｓ６１０の対立遺伝子６を両方とも共有しているため、２つの主要なハプロタイプクラスは、同じ変異を表現することができた。しかし、本結果は、それらが２つの異なった変異を表現することを示した。
【００２４】
サザンハイブリダイゼーション法による分析は、いずれかの主要な遺伝子再配置を明らかにすることはなかったため、変異は、必要な場合は、この領域のすべての遺伝子のＰＣＲ増幅エキソン領域の直接配列決定により探索された。
【００２５】
Ｄ１９Ｓ６１０に遠位に位置している１７エキソンＡＰＬＰ１遺伝子は、患者群と対照群間で変異の違いは示さなかったし、ＮＰＨＳ１遺伝子として除外された（Ｌｅｎｋｋｅｒｉら、印刷中）。また、エキソン９、５、３エキソンをそれぞれ含む新規な遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃは、ＮＰＨＳ１により分離する配列変異を有してはおらず、またＮＰＨＳ１遺伝子として同様に除外することができた（データ図示せず）。約４．３ｋｂの転写をコードするＤ１９Ｓ６１０の近位に位置している第４番目の新規な遺伝子（ＮＰＨＳ１）は、ヒト胎児および成人腎臓において強く発現するのが示され、ほかの組織においては、背景の上に鮮明なシグナルはまったく観察されなかった（図２）。
【００２６】
図２は、ヒト胎児および成人の腎臓組織由来のｍＲＮＡによるネフリン発現のノーザン法分析の結果を図示している。４つの胎児と８つの成人組織由来のヒトポリ（Ａ）ＲＮＡ  ２μｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を含むノーザン法のフィルターが、胎児腎臓ポリ（Ａ）ＲＮＡからＲＴ‐ＰＣＲ法により作成された１，３７１ｂｐネフリンｃＤＮＡプローブ（エキソン１から１０）によりハイブリダイズされた。図２Ａでは、明白な発現が、胎児腎臓ＲＮＡ（矢印）でのみみることができる。図２Ｂでは、成人組織由来のＲＮＡを使用して、強いシグナルが、腎臓ＲＮＡ（矢印）で４．３ｋｂバンドにおいて唯一観察され、何らかの陽性シグナルである場合でもほかの組織では有意ではないもののみを示している。調べられた組織は、フィルターの上で標識され、また分子サイズマーカー（ｋｂ）がそのフィルターの両側に示されている。
【００２７】
したがって、この遺伝子はＮＰＨＳ１の強力な候補となった。転写のための完全長ｃＤＮＡが、胎児腎臓ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）と、予測エキソン構造をベースにして作成されたＰＣＲプライマーを使用して構築された。遺伝子は２６ｋｂのサイズを有し、また２９エキソンを含んでいるのが見つかっている（図１）。
【００２８】
エキソン配列分析からは、ＮＰＨＳ１染色体の９０％以上で２つの主要な変異の存在が明らかにされた（図３）。図３は、ＮＰＨＳ１遺伝子の変異分析を図示している。左：（Ａ）エキソン２における２‐ｂｐ欠失を有する罹患児があるＮＰＨＳ１家族系統。患者（ホモ接合）、親（ヘテロ接合）、同胞の健常者由来の欠失点の配列が示されている。右：（Ｂ）エキソン２６におけるノンセンス変異を有する罹患児がいるＮＰＨＳ１家族系統。変異した領域の配列が患者（ホモ接合）、親（ヘテロ接合）、同胞の健常者由来のものが示されている。
【００２９】
エキソン２における第１の変異、２‐ｂｐ欠失は、同じエキソン内にある停止コドンの生成という結果になるフレームシフトを引き起こす。この変異は、ハプロタイプ１−１−１−６−ｇ−２−８−９と１−１−１−６−ｇ−６−４−２を伴うすべてのＮＰＨＳ１染色体が見つかった（合計７６染色体）。８３人の対照群のうちの１人は、フィンランド型多数症例タイプ変異に対してヘテロ接合であった。ＮＰＨＳ１遺伝子でみつかった第２配列変異は、エキソン２６におけるノンセンス変異ＣＧＡ‐＞ＴＧＡであり、ハプロタイプ３−５−３−６−ａ−８−１０−ｘ（１３染色体）を有する患者に存在し、異なったハプロタイプを有する３人であった。親、同胞の健常者、ないしは対照群（合計２３０人の個人）には、本出願で同定された２つの変異に対してホモ接合ないしは複合へテロ接合であるものは１つもなかった。本研究においてクローン化された遺伝子は、遺伝性ネフローゼ症候群に関与しているものであったため、われわれはそれをＮＰＨＳ１遺伝子と呼んでいる。
【００３０】
調べられた４９人のＮＰＨＳ１患者のうち、３２人はエキソン２における２‐ｂｐ欠失に対してホモ接合（フィンランド型多数症例タイプ）であり、４人はエキソン２６におけるノンセンス変異に対してホモ接合（フィンランド型少数症例タイプ）であり、また８人は複合へテロ接合であった。４人の患者は１つの対立遺伝子のなかにフィンランド型少数症例タイプ変異を有しており、ほかの潜在的変異はまだわからないままであった。１人の患者は２つの変異のうちの１つも有していなかった。
【００３１】
（実施例４）
ＮＰＨＳ１遺伝子産物の特徴付け
ＮＰＨＳ１タンパク質（ネフリン）のｃＤＮＡ予測アミノ酸配列は、翻訳後修飾を行うことなく、算出された分子質量１３４，７４２を伴う１，２４１残基である（図４）。
【００３２】
図４は、ネフリンのヌクレオチド誘導アミノ酸配列と予測ドメイン構造（ＮＰＨＳ１遺伝子産物）を示す。図４Ａは、予測Ｎ末端シグナル配列は２２残基であり、その切断部位は矢印で示されている。推定トランスメンブランドメイン（残基１，０５９から１，０８６）が、太字と下線で示されている。タンパク質の推定細胞外部分には８つのＩｇ様モジュール（囲み）、と、トランスメンブランドメインに隣接している１つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様モジュール（太線で囲み）が含まれる。システイン残基は、黒点で示され、また、タンパク質の細胞外部分における１０推定Ｎグリコシル化部位は下線が施されている。図４Ｂは、正常ネフリンの予測ドメイン構造（ＮＰＨＳ１遺伝子産物）と、本研究において同定された２つの変異（フィンランド型多数症例タイプとフィンランド型少数症例タイプ）の予測効果が図示されている。Ｉｇ様モジュールは半円形で示されており、またフィブロネクチンタイプＩＩＩ様モチーフは六角形で示されている。トランスメンブランドメインは、膜脂質二重層に位置している黒い四辺形として示されている。３つの遊離システイン残基の位置が、末端に黒点を伴う線で示されている。主要ＮＰＨＳ１変異は、第１Ｉｇ様モジュールの一部のみを含む分泌タンパク質の産生という結果になる。フィンランド型少数症例タイプでは、細胞質ゾルドメインの一部を欠いているネフリン分子を生じる結果となる。
【００３３】
いくつかの類似性比較とタンパク質構造予測プログラムが、ＮＰＨＳ１タンパク質は、免疫グロブリンのスーパーファミリーのトランスメンブランタンパク質の１つであろうと予測している。暫定２２残基長Ｎ末端シグナルペプチド、８つの免疫グロブリン様ドメインを含む細胞外ドメイン、１つのフィブロネクチンＩＩＩドメイン様モジュールがあり、それに続いて、単一推定トランスメンブランドメイン様配列、細胞質ゾルＣ末端がある。公知の構造モジュールの存在（図４）にもかかわらず、データベースにおけるタンパク質の対応するドメインを伴う配列同定率は比較的低かった。タンパク質の暫定細胞外部分にはＮグリコシル化のための１０個のＮＸＳないしはＮＸＴ共通トリプレットが含まれる。さらには、へパラン硫酸の潜在的付着部位である７つのＳＧダブレットがある。
【００３４】
４つのヒト胎児と、８つの成人の組織由来のポリ（Ａ）ｍＲＮＡにより実施されたノーザンハイブリダイゼーション法による分析では、腎臓におけるＮＰＨＳ１遺伝子転写の高い定常状態レベルが明らかにされたが、しかし、ほかの組織においてはとくになかった（図２）。２３週齢のヒト胎児から得られる腎臓サンプルについて実施されたインシトゥハイブリダイゼーション法では、糸球体における強い発現シグナルが明らかにされている（図５Ａ）。より高い倍率では（図５Ｂ）、シグナルは、成熟と発症糸球体の周辺でみることができたが、一方、中央メサンギウム領域は陰性であった。陽性細胞は上皮有足突起であることが明らかである。抗センス制御プローブによっては、特異的なシグナルはまったく得られなかった。
【００３５】
図５は、インシトゥハイブリダイゼーション法により、ヒト胎児腎臓におけるネフリンｍＲＮＡの発現を図示している。図５Ａは、腎皮質全体の糸球体に強い発現がみられることを示しているが、ほかの構造で何らかの特異的な発現が観察される場合には、ほとんどみられなかった（４倍ｘ、対物レンズ倍率）。図５Ｂにおいては、より高い倍率では、個々の糸球体の周辺において強い発現（直線矢印）が明らかにされているが、おそらく、主に上皮細胞である。ボーマン嚢（曲線矢印）、近位尿細管（白矢印）、ないしは血管壁の内皮細胞では発現がまったくみられなかった（２０倍ｘ対物レンズ倍率）。
【００３６】
（実施例５）
ＮＰＨＳ１遺伝子とその遺伝子産物ネフリン
本研究において得られた証拠となるいくつｓかの系統では、われわれは、フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群に罹患している遺伝子を位置的にクローン化したことを示している。最初、欠失遺伝子が、染色体１９ｑ１３．１上にある臨界１５０ｋｂ領域に位置決めされているが、その遺伝子は連鎖不平衡分析（Ｋｅｓｔｉｌａら、１９９４ｂ；Ｍａｎｎｉｋｋｏら、１９９５；Ｋｅｓｔｉｌａら、未発表原稿）を使用して位置決めされた。２番目には、調べられていた４９人のフィンランド型患者のうちの４４人において、本研究で同定された２つの変異が、ホモ接合かないしは複合へテロ接合変異かのいずれかのものとして、存在していることが示された。残りの患者の４人は、１つの対立遺伝子のなかに主要な変異を有していたが、ほかの対立遺伝子のなかの変異はまだ同定されていない。２つの変異のいずれも有していなかった１人の患者は、ユニークなハプトタイプを有しており、またしたがって、おそらく異なった変異を担体しているものと考えられる。３番目には、変異に対するホモ接合ないしは複合へテロ接合は、２３０人の対照ＤＮＡにおいてはみつからなかった。さらに付け加えると、間接的証拠に関して言うと、それは強くて、また実質的な遺伝子の腎糸球体特異的発現であって、糸球体発育ないしは機能における遺伝子産物の関与を示唆している。
【００３７】
ＮＰＨＳ１遺伝子の同定
ＮＰＨＳ１遺伝子の本同定は、小さな変異を含む疾患遺伝子の位置クローニングにおける連鎖不平衡分析と直接ＤＮＡ配列決定の検出率を示す。本出願においては、分離フィンランド型集団などの同質性集団の個々人由来のＤＮＡが用いられる場合には（ｄｅ  ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ、１９９３）、連鎖不平衡遺伝子地図（Ｈａｓｔｂａｃｋａら、１９９４）が、１５０ｋｂゲノム分節にＮＰＨＳ１遺伝子を局在化される際に利用された。この領域に位置している遺伝子をみつけるために、その分節全体がまず配列決定され、また、エキソン予測プログラムと相同性比較分析の組み合わせを使用して、われわれは、ｃＤＮＡから証明された著しく正確な遺伝子構造を構築することができた。これらのｃＤＮＡは、ＥＳＴクローンを使用してか、ないしはｍＲＮＡからＰＣＲ法によりｃＤＮＡを構築するために予測エキソン配列を使用することによってかのいずれかにより分離することができた。この方法では、われわれは、ゲノム分節を含む１５０ｋｂＮＰＨＳ１内にある１１の遺伝子を迅速に同定することができた。１つの遺伝子も、ＮＰＨＳ１の明らかな候補とはならなかったため、また、欠失、挿入ないしは逆位などの主要な遺伝子再配置がまったく患者のＤＮＡのなかにはみつからなかったため、小さな変異を探索することを開始せざるを得ず、必要な場合には、１１の遺伝子すべてにおいて探索を開始せざるを得なかった。遺伝子のエキソンとｃＤＮＡ配列が決定されれば、小さな変異の同定に頻繁に使用されている、ＳＳＣＰやＤＧＧＥなどの方法が潜在的に代替可能なものとなった。しかし、Ａｌｐｏｒｔ症候群における小さな変異を検索するというわれわれの経験（Ｂａｒｋｅｒら、１９９０；Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ、１９９６）から、これらの方法では、頻繁に偽陽性を出す可能性が示唆されている。例えば、非常に大きな患者集団でのＳＳＣＰ分析では、たった３５から５０％の変異検出率のみであったことが明らかにされている（Ｋａｗａｉら、１９９６；Ｋｎｅｂｅｌｍａｎｎら、１９９６；Ｒｅｎｉｅｒｉら、１９９６）が、一方、ＰＣＲ増幅エキソン領域についてのわれわれの直接配列決定では、８０％を超える検出率を生んでいる。われわれは、したがって、ＮＰＨＳ１変異をみつけるためにエキソン領域の直接配列決定を使用することに決定した。われわれはいくつかの遺伝子の非常に数多くのエキソンを配列決定しなければならなかったが、これは比較的すぐに、１つの遺伝子において、２つの小さな変異を同定するという結果を生んだ。大きな候補遺伝子領域の配列決定であっても、その遺伝子の直接配列決定は魅力があり、また何はともあれ、とくにほとんど変異が数個しか存在することが期待できない場合には、位置クローニングにおける小さな変異を検索するのには信頼できる方法であると、われわれは結論を出している。
【００３８】
ＮＰＨＳ１の遺伝学
ＮＰＨＳ１遺伝子の成功裡に行われる位置クローニングで非常に重要な構成要素は、家族サンプルを信頼性をもって収集することを可能にしている、小さな分離集団であり、良好な臨床記録、また平等で、質の高い保健ケアシステムであった。集団分離における典型的な状況は、症例の１００％近くが、同一変異により引き起こされており、またこの現象はすでにハプロタイプ分析においてみることができる。創始者ハプロタイプにおいて観察される変化は、歴史的な組換えにより引き起こされたものであり、臨界染色体領域を短いゲノム分節に制限しておく際に使用することができる。したがって、主要ＮＰＨＳ１ハプロタイプ１−１−１−６−ｇ−２−８−９における差異により、ＮＰＨＳ１遺伝子の分離につながるこの間隔を実質的に狭めることができた。この主要ＮＰＨＳ１変異は、主要な疾患対立遺伝子の９５から９８％を有する、多くのほかの「フィンランド病」とは対照的に、症例の７８％のみしか引き起こしていない（例えば、Ｉｋｏｎｅｎら、１９９１）。しかし、本研究において特徴付けられている２つの主要なＮＰＨＳ１変異は、フィンランドの症例の９４％にのぼっている。
【００３９】
フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群は、フィンランド人口においては多くなっているが、しかし、いくつかの症例は世界的規模でもみることができる。かなりの移民がフィンランドからミネソタ州に渡り、またＮＰＨＳ１の米国への拡散を引き起こした（Ｎｏｒｉｏ、１９６６；Ｍａｈａｎら、１９８４）。さらに、いくつかの先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ）症例は異なった欧州諸国で診断されており、また連結研究が同じ染色体１９遺伝子座に対する分析された家族の関連性を支持している（Ｆｕｃｈｓｈｕｂｅｒら、１９９６）。
【００４０】
ＮＰＨＳ１遺伝子と変異を引き起こす疾患の同定は、それらが、ＮＰＨＳ１のための正確なＤＮＡをベースにした診断やキャリアスクリーニングの開発を可能にしたため、すぐにも臨床上の意義を有することになる。羊水におけるα‐フェトプロテイン値の測定をベースにしたＮＰＨＳ１に対してフィンランドにおいて広範に使用されているスクリーニング方法が、偽陽性結果を招く可能性があり、またそれに続く、健常者ＮＰＨＳ１キャリアの流産を招く可能性があるため、これはとくに重要なことである（Ｍaｎｎｉｋｋoら、１９９７）。
【００４１】
ネフリン‐糸球体特異的細胞接着受容体
ネフロンの近位部分である糸球体との発現ならびに病理学的な高い関連性を有しているため、われわれはＮＰＨＳ１遺伝子産物をネフリンと命名した。ネフリンの役割はわからないままであるが、しかし、そのドメイン構造が、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着受容体の大きなグループのそれに似ていることから、接着受容体の１つであり、またシグナルタンパク質であるように考えられる（ＢｒｕｍｍｅｎｄｏｔｔとＲａｔｈｊｅｎ、１９９４）。
【００４２】
ネフリンのＩｇ様ドメインは、細胞‐細胞ないしは細胞‐マトリックス相互作用に参加しているタンパク質でとくにみつかっているタイプＣのすべてである。６番目と７番目のＩｇ様ドメインの間には、不対システインを含む約１３０残基のスペーサーがあり、またフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメインにおけるもう１つの不対システインがある。それらＳＨ基は、ｃｉｓホモ／ヘテロ二量体の形成に関与している可能性があり、未知の構造物とのチオエーテル、ないしはチオエステル結合に参加し、ないしは、ＢｒｕｍｍｅｎｄｏｔｔとＲａｔｈｊｅｎ（１９９４）により示唆されているように、そのドメイン内に埋め込まれている可能性がある。
【００４３】
データベース検索により、ネフリンの９個のチロシン残基を含む細胞質ゾルドメインは、ほかのわからないタンパク質との有意な相同性を有していないことが明らかになった。しかし、チロシンを取り囲む配列モチーフは、チロシン１１７６、１１９２、１２１７が、ネフリンのリガンド結合の間にリン酸化されることが可能であることを示唆している（Ｓｏｎｇｙａｎｇら、１９９３参照）。その場合においては、Ｓｒｃ‐ファミリーキナーゼ、Ａｂｌ‐キナーゼのＳＨ２‐ドメインの結合部位および、アダプタータンパク質Ｎｃｋが作り出される場合が考えられる（チロシン１１７６と１１９２はモチーフＤＥＶに後続され、またチロシン１２１７はＤＱＶにより後続される）。ネフリンの細胞内ドメインに対する非常に重要な役割については、１５５残基のうち１３２残基を喪失する結果になるフィンランド型少数症例タイプ変異では、完全に傷んだＮＰＨＳ１という結果が生じるという事実により強調される。
【００４４】
ＮＰＨＳ１の病因は、第一義的に、ないしは第二義的に、高度に陰イオングリコサミノグリカンを伴っていることであると考えられてきたが、それは糸球体ろ過プロセスに関して重要であると考えられているこうした分子の内容が、タンパク尿では糸球体基底膜において減少していることが報告されているためである（ＫａｓｉｎａｔｈとＫａｎｗａｒ、１９９３）。基底膜プロテオグリカンパールカンにある３つの大きなヘパラン硫酸側鎖に対する主要な付着配列であるトリプレットＳＧＤを含む、ヘパラン硫酸側鎖のいくつかＳＧ共通部位を有しているので、ネフリンはプロテオグリカンの１つであるということを除外することはできない（Ｎｏｏｎａｎら、１９９０；ＫａｌｌｕｎｋｉとＴｒｙｇｇｖａｓｏｎ、１９９２；Ｄｏｌａｎら、１９９７）。しかし、これまでのところ、グリコサミノグリカンを含むことが報告されているＩｇ様受容体はない。
【００４５】
ネフリン機能はどのようなもので、また糸球体機能におけるその役割はどんなものであるのか。同様の受容体のほとんどのものは、同種親和性ないしは異種親和性の様式でほかの膜タンパク質と相互作用する。しかし、受容体のいくつかは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と相互作用することが示されている。例えば、その細胞外ドメインが５つのＩｇ様ドメインを含むミエリン関連糖タンパク質ＭＡＧが異なったタイプのコラーゲンやグリコサミノグリカンと相互作用する（Ｆａｈｒｉｇら、１９８７）。さらに、軸索糖タンパク質Ｆ１１とｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ（ＤＣＣ；大腸直腸癌における欠失）タンパク質の両方が、テネイシンおよびネトリンにそれぞれ結合することが示されている（Ｚｉｓｃｈら、１９９２；Ｐｅｓｈｅｖａら、１９９３；Ｋｅｉｎｏ‐Ｍａｓｕ、１９９６）。ネフリンは、別の膜タンパク質か、ないしはＥＣＭのタンパク質か、この場合は糸球体基底膜であるが、のいずれかに結合することが可能であるため、特異的なリガンドを検索することに着手する前に免疫電子顕微鏡法によりネフリンを局在化することが重要になってくる。
【００４６】
その機能が何であれ、インシトゥハイブリダイゼーション法による分析は、糸球体毛細血管の外側を部分的に覆う小足を形成する糸球体上皮細胞において，ネフリンが産生されることが強く示唆された。血漿巨大分子に対する最終的なろ過防御壁は、小足の間にあるろ過細隙を覆う隔膜に位置している。ほかの原因のＮＰＨＳ１およびネフローゼ症候群においては、小足の融合は一般的にみられ、またろ過細隙の構造ないしは機能は結果としてタンパク尿によりいくらか影響を受ける。血漿膜タンパク質ネフリンは、糸球体上皮細胞の小足の統合を保持するためには重要であり、ないしは、糸球体基底膜の構成要素に対して、それらをつなぎ止めるものとして非常に重要である。
【００４７】
結論
ＮＰＨＳ１遺伝子の同定が行われれば、疾患診断への適用がすぐにみつかるであろう。遺伝子産物ネフリンについての研究は、推定細胞接着およびシグナル受容体はまた、数十年間にわたる研究調査ではいまだに乏しい理解しかされていないが、しかし糸球体ろ過の分子メカニズムに関する新しい基本的な知識に対する１つの鍵を提供する可能性がある。ろ過防御壁の異常な機能の１つは、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎などの数多くの臨床上重要な腎臓疾患における主要な合併症の１つとなり、本研究は臨床腎臓学により一般的なインパクトを与える可能性がある。すぐにもそれに関する疑問点が起きてくるが、それは発生上の発現とタンパク質の位置に関しているものであり、それに答えるには動物や細胞培養システムにおける抗体やヌクレオチドプローブの生成が必要となるであろう。
【００４８】
（実施例６）
基底膜疾患に対する遺伝子スクリーニング
糸球体腎症に関連している基底膜疾患における非常に重要な構成要素としてのネフリンの同定と特徴付けにより、個人のスクリーニングについては、変異したネフリン遺伝子ないしはタンパク質を検出することにより基底膜疾患に対する感受性の分娩前および分娩後スクリーニングの両方が現在では可能になっている。こうした情報はスクリーニングされた個人における疾患状態の将来的な診断、将来の疾患に可能な封じ込めの予防策計画に関係する医療実施者には有用であろう。こうした情報は、現在活動的な疾患状態の診断には有用であろう。本発明は、変異したネフリン遺伝子を検出することにより、基底膜疾患に関係しているような、現在活動的な疾患状態の診断を可能にする。ネフリン遺伝子の発見は、個人におけるネフリン遺伝子の存在を検出するための手段、上記遺伝子における何らかの変異の存在を判定するための手段を提供する。こうした検出のための手段は、ネフリン遺伝子配列全体、ないしは上記ネフリン遺伝子に特異的にハイブリダイズされるその断片、ないしは緊縮条件下で上記ネフリン遺伝子からのｍＲＮＡ転写物を有する核酸から成る。ネフリン遺伝子とその変異体の検出のための付加的な手段は、上記遺伝子の特異的な連続断片と、標識化された遺伝子配列を増幅するためのプライマーとして使用するために組み合わせることができる相補的遺伝子配列から成る。ネフリン遺伝子における変異の検出のための上記手段はまた、標的遺伝子による正常遺伝子の直接ハイブリダイゼーション法と、それに続く成功裡に行われたハイブリダイゼーション法による検出から成る。すべての場合で、標的遺伝子は、試験される個人から分離された増幅ないしは増幅されていないＤＮＡないしはＲＮＡである。
【００４９】
組織とサンプルの抗体スクリーニング
ＮＰＨＳ１遺伝子配列を有することにより、組換えネフリンタンパク質、ないしは融合タンパク質を産生するであろう発現ベクターを構築し、また使用し、このタンパク質を精製し、またネフリンに特異的に反応する抗体を産生する既存の分子生物学と生物化学的技術を使用することは、熟練した当業者の技術内でうまく行うことができる。細菌、酵母菌、昆虫、哺乳動物の細胞におけるタンパク質の発現は、当業者に公知のものである。発現した遺伝子が１つないしはそれ以上のイントロンをそのなかに含む発現ベクターをどのように構築し、また使用するのかは当業者であれば公知のことである。モノクローナル抗体の産生は当業者であれば衆知のことであり、また組織サンプルのなかのタンパク質の免疫組織化学的検出のためのポリクローナルならびにモノクローナル抗体の使用法は日常的な手順である。検出可能な標識の広範でさまざまな種類のものは、均一化組織、血液、血清、尿、ないしは、ほかの身体的体液などのサンプル中のタンパク質の検出用の免疫組織化学的染色と免疫測定に使用するために入手可能である。
【００５０】
当業者であれば、本発明により企図されているスクリーニング方法を実施するための適当な測定法や検出計画を設計するために、本発明の教示を容易に使用することができる。
【００５１】
遺伝子治療
本発明の教示が得られれば、ネフリン遺伝子ないしは遺伝子治療によるタンパク質、ないしは組換え遺伝子タンパク質を使用した治療に取り組むことが可能になるであろう。タンパク質の投与と遺伝子治療の方法は、当業者には公知のものである。
【００５２】
ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号
特徴付けられているコスミドクローンに対する受入れ番号は、Ｆ１９５４１＝Ｕ９５０９０、Ｒ３３５０２＝ＡＣ００２１３３、Ｒ２８０５１＝ＡＤ０００８６４、Ｆ１９３９９＝ＡＤ０００８３３３、Ｒ３１１５８＝ＡＤ０００８２７、Ｒ３１８７４＝ＡＤ００８２３。ネフリンｃＤＮＡ配列に対する受入れ番号は、ＡＦ０３５８３５である。
【００５３】
当業者であれば、これら開示されているものと機能的に同等なものになるであろう適当な核酸配列を設計し、また構築するために本発明の教示を容易に使用することが可能であろう。当業者であれば、同等の機能を有するネフリンタンパク質をさらにコードする開示されている核酸配列の対立遺伝子変異体が数多く存在することは公知のことであろう。本発明の教示は、ネフリン遺伝子とそれをコードした修飾タンパク質における変異を発見することが可能になる。
【００５４】
（実施例７）
小分子治療薬のためのスクリーニング
腎臓病理学とタンパク尿、またこのように数多くの腎臓疾患に関係ありとされているものにおける非常に重要な構成要素としてのネフリンの同定と特徴付けにより、ネフリンとネフリン遺伝子を使用する小分子治療薬のためにスクリーニングすることは現在では可能である。こうした治療薬に対するスクリーニングは、ネフリンに特異的にハイブリダイズされる、ないしは特異的にネフリン遺伝子の発現に効果を及ぼす活性および分子を配列選択的にスクリーニングすることにより達成することができる。選択的なスクリーニングは、標準的な結合化学により生成される小分子化合物のプール上で、公知の分子上で、ないしはネフリンタンパク質構造と理性的な薬剤設計のコンピュータモデリングを組み合わせて行うことができる。こうした方法と技術は当業者には公知のものである。
【００５５】
（引用文献）
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Ｄｏｌａｎ，  Ｍ．，  Ｈｏｒｃｈａｒ，  Ｔ．，  Ｒｉｇａｔｔｉ，  Ｂ，．  Ｈａｓｓｅｌｌ，  Ｊ．，  Ｒ．（１９９７）「へパラン硫酸合成を調節するドメインＩパールカンにおける部位の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  Ｉ  ｐｅｒｌｅｃａｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．）」  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ４３１６−４３２２．
【００５８】
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Ｆｕｃｈｓｈｕｂｅｒ，Ａ．，Ｎｉａｕｄｅｔ，Ｐ．，Ｇｒｉｂｏｕｖａｌ，  Ｏ．，  Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ，  Ｊ．，  Ｇｕｂｌｅｒ，  Ｍ−Ｃ．，  Ｂｒｏｙｅｒ，  Ｍ．  Ａｎｔｉｇｎａｃ，  Ｃ．（１９９６）「フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群：非フィンランド人集団でのその遺伝子座に対する連鎖（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ：  ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎ−Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．）」Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １０：１３５−１３８．
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Ｈａｓｔｂａｃｋａ，  Ｊ．，  ｄｅ  ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ，  Ａ．，  Ｍａｈｔａｎｉ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｃｌｉｎｅｓ，  Ｇ．，  Ｒｅｅｖｅ−Ｄａｌｙ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｄａｌｙ，  Ｍ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｂ．  Ａ．，  Ｋｕｓｕｍｉ，  Ｋ．，  Ｔｒｉｖｅｄｉ，  Ｂ．，  Ｗｅａｖｅｒ，  Ａ．，  Ｃｏｌｏｍａ，  Ａ．，  Ｌｏｖｅｔｔ，  Ｍ．，  Ｂｕｃｋｌｅｒ，  Ａ．，  Ｋａｉｔｉｌ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｌａｎｄｅｒ，  Ｅ．  Ｓ．（１９９４）「変形異形成遺伝子が新規な硫酸トランスポーターをコードする：微細構造連鎖不平衡地図作成による位置クローニング（Ｔｈｅ  ｄｉａｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｆｉｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｍａｐｐｉｎｇ．）」Ｃｅｌｌ  ７８，  １０７３−１０８７．
【００６０】
Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｃ．，Ａｎｔｉｋａｉｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｒｏｎｎｈｏｌｍ，  Ｋ．，  Ａｌａ−Ｈｏｕｈａｌａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｊａｌａｎｋｏ，  Ｈ．（１９９５）「フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群の管理（Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ．）」  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ９：８７−９３．
Ｈｕｔｔｕｎｅｎ，Ｎ．Ｐ．，  Ｒａｐｏｌａ，  Ｊ．，  Ｖｉｌｓｋａ，  Ｊ．  Ｈａｌｌｍａｎ，  Ｎ．（１９８０）「フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群における腎臓病理学：５０人の患者に関する定量的光学顕微鏡下研究（Ｒｅｎａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ：  ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ５０  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｎｅｐｈｒ．  １：１０−１６．
【００６１】
Ｉｋｏｎｅｎ，  Ｅ．，  Ｂａｕｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｇｒｏｎ，  Ｋ．，  Ｓｙｖａｎｅｎ，  Ａ−Ｃ．，  Ｅｎｏｍａａ，  Ｎ．，  Ｈａｌｉｌａ，  Ｒ．，  Ａｕｌａ，  Ｐ．  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，  Ｌ．（１９９１）「アスパルチルグリコサミン尿症：ヒトアスパルグリコサミニダーゼをコードするｃＤＮＡと疾患を引き起こすミスセンス変異（Ａｓｐａｒｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｕｒｉａ：  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｓｐａｒｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：５１−５８．
Ｊｕｒｋａ，  Ｊ．，  Ｋｌｏｎｏｗｓｋｉ，  Ｐ．，  Ｄａｇｍａｎ，  Ｖ．，  Ｐｅｌｔｏｎ，  Ｐ．（１９９６）「ＣＥＮＳＯＲ：ＤＮＡ配列から反復要素を同定し、除外するためのプログラム（ＣＥＮＳＯＲ  −  ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．）」Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２０（Ｎｏ．１）：１１９−１２２．
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Ｋａｗａｉ，  Ｓ．，  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｈａｒａｎｏ，  Ｔ．，  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，  Ｔ．，  Ｏｓａｗａ，  Ｇ．（１９９６）「日本のＡｌｐｏｒｔ症候群患者におけるＣＯＬ４Ａ５遺伝子：全エキソンの変異のスペクトル（Ｔｈｅ  ＣＯＬ４Ａ５  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ａｌｐｏｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｅｘｏｎ．）」Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ４９，  ８１４−８２２．
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Ｋｅｓｔｌａ，  Ｍ．，  Ｍａｎｎｉｋｋｏ，  Ｍ．，  Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，  Ｃ．，  Ｇｙａｐａｙ，  Ｇ．，  Ｗｅｉｓｓｅｎｂｃａｈ，  Ｊ．，  Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ，  Ｅ．  Ｒ．，  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，  Ｌ．，  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．（１９９４ｂ）「フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群は染色体１９の長腕に地図作成する（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ  ｍａｐｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ  ａｒｍ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９．）」Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５４，７５７−７６４．
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Ｋｏｓｋｉｍｉｅｓ，  Ｏ．（１９９０）「先天性および初期乳児ネフローゼ症候群の遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．）」はＳｐｉｔｚｅｒ，  Ａ．，  Ａｖｎｅｒ，  Ｅ．  Ｄ．編『腎臓と尿路疾患の遺伝（Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｕｒｉｔａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．）』、Ｋｌｕｗｅｒ刊の中、Ｂｏｓｔｏｎ，
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Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，  Ｕ．，  Ｋｅｓｔｉｌａ，  Ｍ．，  Ｌａｍｅｒｄｉｎ，  Ｊ．，  ＭｃＣｒｅａｄｙ，  Ｐ．，  Ａｄａｍｓｏｎ，  Ａ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ａ．，  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．  「１９ｑ１３．１におけるヒトアミロイド前駆体様タンパク質遺伝子ＡＰＬＰ１の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ＡＰＬＰ１  ａｔ  １９ｑ１３．１．）」Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ刊，  印刷中．
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Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ，  Ｐ．，  Ｊａｌａｎｋ，  Ｈ．，  Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｈｏｆｅｒ，  Ｈ．（１９９３）「フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ）：糸球体基底膜と培養メサンギウム細胞のマトリックス構成要素（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ（ＣＮＦ）：  ｍａｔｒｉｘ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２５：  ６０６−６１２．
Ｍａｈａｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｍａｕｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｓｉｂｌｅｙ，  Ｒ．  Ｋ．，  Ｖｅｒｎｉｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．（１９８４）「先天性ネフローゼ症候群：腎移植の医療上の管理と成績の進展（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．）」Ｊ．  Ｐｅｄｉａｒｔ．  １０５：５４９−５５７．
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Ｍａｎｎｉｋｋｏ，  Ｍ．，  Ｋｅｓｔｌａ，  Ｍ．，  Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，  Ｃ．，  Ｎｏｒｉｏ，  Ｒ．，  Ｒｙｙｎａｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ａ．，  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，  Ｌ．，  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．（１９９５）「染色体１９ｑ１３．１上の先天性ネフローゼ症候群に関する遺伝子座の微細地図作成とハプロタイプ分析（Ｆｉｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９ｑ１３．１．）」Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５７：１３７７−１３８３．
Ｍaｎｎｉｋｋo，  Ｍ．，  Ｋｅｓｔｌａ，  Ｍ．，  Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，  Ｕ．，  Ａｌａｋｕｒｔｔｉ，  Ｈ．，    Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，  Ｃ．，  Ｌｅｉｓｔｉ，  Ｊ．，  Ｓａｌｏｎｅｎ，  Ｒ．，  Ａｕｌａ，  Ｐ．，  Ｍｕｓｔｏｎｅｎ，  Ａ．，  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，  Ｌ．，  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．（１９９７）「ＤＮＡ分析をベースにしたフィンランド型の先天性ネフローゼ症候群についての改良型出生前診断法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｔｙｐｅ  ｎａｓｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５１：８６８−８７２．
【００６９】
Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．，  Ｈｅｉｓｋａｒｉ，  Ｎ．，  Ｈｅｒｔｚ，  Ｊ．−Ｍ−，  Ａｔｋｉｎ，  Ｃ．，  Ｂａｒｋｅｒ，  Ｄ．，  ら、「Ａｌｐｏｒｔ症候群を疑われた患者におけるＣＯＬ４Ａ５コラーゲン遺伝子変異調査（Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｕｔａｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＯＬ４Ａ５  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  Ａｌｐｏｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｌ  ５１  ｅｘｏｎ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｏｖｅｒ  ８０  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ．）」（未発表原稿）．
Ｎｏｏｎａｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｆｕｌｌｅ，  Ａ．，  Ｖａｌｅｎｔｅ，  Ｐ．，  Ｃａｉ，  Ｓ．，  Ｈｏｒｉｇａｎ，  Ｅ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｍ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｙ．，  Ｈａｓｓｅｌｌ，  Ｊ．  Ｒ．（１９９１）「基底膜へパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンの完全配列は、低密度リポタンパク質受容体であるラミニンＡ鎖および神経細胞接着分子との容量類似性を明らかにする（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｌｅｃａｎ，  ａ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ，  ｒｅｖｅａｌｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｎｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ，  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．）」Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  ２２９３９−２２９４７．
【００７０】
Ｎｏｒｉｏ，  Ｒ．（１９６６）「先天性ネフローゼ症候群についての遺伝（Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．）」Ａｎｎ．  Ｐａｅｄｉａｒ．  Ｆｅｎｎ．  １２（ｓｕｐｐｌ  ２７）：  １−９４．
Ｏｌｓｅｎ，  Ａ．，  Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ，  Ａ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｃａｒｒａｎｏ，  Ａ．  Ｖ．（１９９６）「１９ｑ１３．１．におけるフィンランド型先天性ネフローゼ（ＮＰＨＳ１）に関する候補領域にわたる１−Ｍｂ制限地図作成コスミド連続体の集合（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  １−Ｍｂ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｍａｐｐｅｄ  ｃｏｓｍｉｄ  ｃｏｎｔｉｇ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ（ＮＰＨＳ１）  ｉｎ  １９ｑ１３．１．）」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４：２２３−２２５．
【００７１】
Ｐｅｓｈｅｖａ，  Ｐ．，  Ｇｅｎｎａｒｉｎｉ，  Ｇ．，  Ｇｏｒｉｄｉｓ，  Ｃ．，  Ｓｃｈａｃｈｅｒ，  Ｍ．（１９９３）「Ｆ３／１１細胞接着分子は、細胞外マトリックス糖タンパク質Ｊ１−１６０／１８０によるニューロンの反発を仲介する（Ｔｈｅ  Ｆ３／１１  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ１−１６０／１８０）」，  Ｎｅｕｒｏｎ  １０，６９−８２．
Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ  Ｐ．，  Ｋｅｓｔｉｌa，Ｍ．，  Ｈａｋｏｌａ  Ｐ，．  Ｊａｒｖｉ  ．，  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｐｅａｌｏｔｉｅ  Ｌ．  「ＰＬＯ‐ＳＬ遺伝子座の微細スケール地図作成（Ｆｉｎｅ−ｓｃａｌｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＬＯ−ＳＬ  ｌｏｃｕｓ．）」（未発表原稿）
【００７２】
Ｒａｐｏｌａ，  Ｊ．，  Ｈｕｔｔｕｎｅｎ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｈａｌｌｍａｎ，  Ｎ．（１９９２）「先天性および乳児ネフローゼ症候群（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．）」は、Ｅｄｅｌｍａｎ  ＣＭ  編『小児の腎臓疾患（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）』、第２版、Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ刊の中，  Ｂｏｓｔｏｎ．  Ｖｏｌ  ２：１２９１−１３０５．
Ｒｅｎｉｅｒｉ，  Ａ．，  Ｂｒｕｔｔｉｎｉ，  Ｍ．，  Ｇａｌｌｉ，  Ｌ．，  Ｚａｎｅｌｌｉ，  Ｐ．，  Ｎｅｒ，  Ｔ．ら（１９９６）「Ｘ染色体性Ａｌｐｏｒｔ症候群：ＣＯＬ４Ａ５遺伝子の５１エキソンについてのＳＳＣＰをベースにした変異調査（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｌｐｏｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ａｎ  ＳＳＣＰ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｖｅｒ  ａｌｌ  ５１  ｅｘｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＯＬ４Ａ５  ｇｅｎｅ．）」Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５８，  １１９２−１２０４．
【００７３】
Ｓｏｌｏｖｙｅｖ，  Ｖ．  Ｖ．，  Ｓａｌａｍｏｖ，  Ａ．  Ａ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｃ．  Ｂ．，（１９９４）「スプライシング可能なオープンリーディングフレームのオリゴヌクレオチド成分と識別分析による予測内部エキソン（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｘｏｎｓ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｅａｂｌｅ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ．）」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２（２４）：５１５６−５１６３．
Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．（１９９６）「Ａｌｐｏｒｔ症候群におけるＩＩ型コラーゲン遺伝子の変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｌｐｏｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．）」はＫ．  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ編『分子病理学とＡｌｐｏｒｔ症候群の遺伝学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｌｐｏｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）』の中、Ｃｏｎｔｒｉｂ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，  １１７，  １５４−１７１，  Ｋａｒｇｅｒ刊，  Ｂａｓｅｌ．
【００７４】
Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，  Ｋ．  とＫｏｕｖａｌａｉｎｅｎ，  Ｋ．（１９７５）「正常ヒト腎臓と先天性ネフローゼ症候群患者の腎臓におけるネフロンの数（Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｎｅｐｈｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｄｎｅｙｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．）」Ｎｅｐｈｒｏｎ  １５：６２−６８．
Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，  Ｅ．  Ｃ．  とＭｕｒａｌ，  Ｒ．  Ｊ．（１９９１）「複数感覚器‐神経回路アプローチによるヒトＤＮＡ配列におけるタンパク質コード領域の局在化（Ｌｏｃａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｎｓｏｒ−ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１１２６１−１１２６５．
【００７５】
Ｚｉｓｃｈ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｄ’Ａｌｌｅｓｓａｎｄｒｉ，  Ｌ．，  Ｒａｎｓｃｈｔ，  Ｂ．，  Ｆａｌｃｈｅｔｔｏ，  Ｒ．，  Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，  Ｋ．  Ｈ．，  Ｖａｕｈａｎ，  Ｌ．（１９９２）「神経細胞接着分子コンタクチン／Ｆ１１はその免疫グロブリン様ドメインを介してテネイシンに結合する（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｎｔａｃｔｉｎ／Ｆ１１  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｅｎａｓｃｉｎ  ｖｉａ  ｉｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．）」Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１９，  ２０３−２１３．
【００７６】
【配列表】
0004368061.tif 000002
【００７７】
0004368061.tif 000003
【００７８】
0004368061.tif 000004
【００７９】
0004368061.tif 000005
【００８０】
0004368061.tif 000006
【００８１】
0004368061.tif 000007
【００８２】
0004368061.tif 000008
【００８３】
0004368061.tif 000009
【００８４】
0004368061.tif 000010
【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
0004368061.tif 000013
【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図面に鑑みてよりよい理解が得られることであろう。
【図１】  ＮＰＨＳ１  １９ｑ１３．１遺伝子座の物理的地図と、ＮＰＨＳ１遺伝子のゲノム組織を示す。
図１Ａは、マーカーＤ１９Ｓ２０８とＤ１９Ｓ２２４の間の９０２ｋｂ領域の物理的地図である。
図１Ｂは、ＮＰＨＳ１遺伝子を含むｋｂ臨界領域にわたる重複コスミドクローンの図である。多形態性マーカーの位置が矢印により示されている。
図１Ｃは、この研究において特徴付けられ、また探索されていた５つの遺伝子、ＮＰＨＳ１、ＡＰＬＰ１、Ａ、Ｂ、Ｃを示す図である。
図１Ｄは、ＮＰＨＳ１遺伝子の略構造図を示す。
【図２】  ヒト胎児と、成人の組織から得られるｍＲＮＡにより、ネフリン発現（ＮＰＨＳ１遺伝子産物）のノーザンブロット法の分析を示す。４つの胎児と８つの成人の組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から得られるヒトポリ（Ａ）ＲＮＡの２μｇを含むノーザンフィルターは、胎児腎臓ＲＮＡポリ（Ａ）ＲＮＡからＲＴ‐ＰＣＲ法により作成された１，３７１ｂｐネフリンｃＤＮＡプローブ（エキソン１から１０）によりハイブリダイズされた。
図２Ａは、胎児性腎臓ＲＮＡ（矢印）によってのみはっきりとした発現がみることができることを示す。
図２Ｂは、成人組織由来のＲＮＡを使用した結果から、強いシグナルは腎臓ＲＮＡ（矢印）  の４．３ｋｂバンドにおいてのみ観察され、ほかの組織はいずれの陽性シグナルであっても有意ではないことのみを呈示することが示される。研究された組織は、フィルターの上にマーカーされ、また分子サイズマーカー（ｋｂ）はフィルターの両側に示される。
【図３】  ＮＰＨＳ１遺伝子の変異分析の図である。左：（Ａ）エキソン２に２‐ｂｐ欠失を有する罹患児がいるＮＰＨＳ１家族系統。患者（ホモ接合）、親（ヘテロ接合）、同胞の健常者から示された欠失点の配列。右：（Ｂ）エキソン２６にノンセンス変異を有する患児がいるＮＰＨＳ１家族系統。患者（ホモ接合）親（ヘテロ接合）、同胞健常者から示された変異領域の配列である。
【図４】  ネフリン（ＮＰＨＳ１遺伝子産物）のヌクレオチド誘導アミノ酸配列の図であり、ドメイン構造を予測している。
図４Ａは、予測されたＮ末端シグナル配列は２２残基であり、切断部位は矢印で標識されている。推定トランスメンブランドメイン（残基１，０５９から１，０８６にわたる）が太字と下線で示されている。そのタンパク質の推定細胞外部分には、８  Ｉｇ様モジュール（囲み）と、トランスメンブランドメイン（太線で囲んである、残基９４１から１，０２５）に隣接している１フィブロネクチンタイプＩＩＩ様モジュールが含まれる。システイン残基が、黒点で示されており、またタンパク質の細胞外部分にある１０推定Ｎグリコシル化部位には下線が引かれている。
図４Ｂは、正常ネフリンの予測ドメイン構造と、この研究で同定された２つの変異（フィンランド型多数症例タイプとフィンランド型少数症例タイプ）の予測された効果を示す。Ｉｇ様モジュールは半円の印で、フィブロネクチンタイプＩＩＩ様モチーフは六角形の印で示す。２つの遊離システイン残基の位置が、末端に黒点を伴う線により示されている。フィンランド型多数症例タイプの変異は、シグナルペプチドの一部と、短いノンセンス配列の産生という結果を生じる。フィンランド型少数症例タイプの変異は細胞質ゾルドメインの一部を欠くネフリン分子を結果的に生じる。
【図５】  インシトゥハイブリダイゼーション法により、ヒト胎児腎臓におけるネフリンｍＲＮＡの発現の結果を示す。
図５Ａは、腎皮質全体で糸球体における強い発現を、いずれかの発現が、ほかの構造で観察された場合には発現がほとんどないことを示している。（４倍ｘ対物レンズ倍率）。
図５Ｂは、個々の糸球体（直線矢印）の周辺に、おそらく主に上皮細胞のなかで強い発現が現れるさらに高い倍率での写真図である。発現はボーマン嚢（曲線矢印）、近位尿細管（白矢印）、ないしは血管壁内皮細胞にみられる。（２０倍ｘ対物レンズ倍率）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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