(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する天然型のビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなるビタミンK依存性ポリペプチドであって、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を含むものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸置換がアミノ酸11または34にある、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドがプロテインCまたは活性型プロテインCからなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがさらにアミノ酸33において置換されたグルタミン酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換がアミノ酸33にグルタミン酸残基、およびアミノ酸34にアスパラギン酸残基を含む（配列番号19）、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸置換がアミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸33におけるグルタミン酸残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸残基を含む、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸11にグルタミンを含む（配列番号20）、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸11にグルタミン酸を含む（配列番号21）、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸置換がさらにアミノ酸12にグリシンを含む（配列番号24または配列番号35）、請求項７または８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが第VII因子または第VIIa因子からなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがさらにアミノ酸33において置換されたグルタミン酸残基を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換がアミノ酸11にグルタミン残基、およびアミノ酸33にグルタミン酸残基を含む（配列番号30）、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸29にフェニルアラニン残基を含む（配列番号33）、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記改変型GLAドメインが、カルシウム飽和状態で、電気陰性電荷のかさ(halo)と共に陽イオン性のコアを有する三次構造を形成するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項１５】
ビタミンK依存性ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ビタミンK依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記核酸。
【請求項１６】
ビタミンK依存性ポリペプチドをコードする核酸ベクターを含有する哺乳動物宿主細胞であって、該ビタミンK依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記宿主細胞。
【請求項１７】
製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を阻止するのに有効な量のプロテインCまたは活性型プロテインCポリペプチドを含有する医薬組成物であって、該プロテインCまたは活性型プロテインCポリペプチドが、対応する天然型プロテインCまたは活性型プロテインCポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記医薬組成物。
【請求項１８】
製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有効な量の第VII因子または第VIIa因子ポリペプチドを含有する医薬組成物であって、該第VII因子または第VIIa因子ポリペプチドが、対応する天然型第VII因子または第VIIa因子ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記医薬組成物。
【請求項１９】
凝血障害の治療に使用するためのビタミンK依存性ポリペプチドであって、該ビタミンK依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記ポリペプチド。
【請求項２０】
凝血障害治療用の医薬を製造する際のビタミンK依存性ポリペプチドの使用であって、該ビタミンK依存性ポリペプチドが、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなり、該改変型のGLAドメインがアミノ酸11におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、若しくはグルタミン残基、アミノ酸12におけるグリシン残基、アミノ酸29におけるフェニルアラニン残基、およびアミノ酸34におけるアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものであり、前記番号は配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連する、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ビタミンＫ依存性タンパク質は、アミノ末端の45残基中に９〜13個のγ−カルボキシグルタミン酸残基（Gla）を含む。Gla残基は、肝臓内の酵素によって、ビタミンＫを用いて、タンパク質前駆体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化することにより産生される。ビタミンＫ依存性タンパク質は、いくらかの生物学的プロセスに関与している。それらの中でも血液凝固が最もよく記述されている（Frie,B.とFurie,B.C.，によって総説されている。1988，Cell, 53: 505-518）。ビタミンＫ依存性タンパク質は、プロテインＺ、プロテインＳ、プロトロンビン、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、Gas６などがある。後の方のタンパク質は、細胞成長の調節において機能する（Matsubaraら、1996，Dev. Biol., 180：499-510)。 Gla残基は、これらのタンパク質による適当なカルシウム結合と膜相互作用に必要である。第X因子の膜接触部位は、アミノ酸残基1〜37に存在すると考えられている(EvansとNelsestuen, 1996，Protein Science 5 : suppl. 1 ,163 Abs)。血漿タンパク質のGlaを含む領域は、高い配列相同性を示すが,膜親和力においては、少なくとも1000倍の分布幅を持つ(McDonald,J.F.ら、1997， Biochemistry, 36 ：5120-5137)。
【０００２】
第VII因子は、血液凝固の初期反応において機能し、血塊を形成する際のきっかけとなる要素である。不活性型前駆体、つまりチモーゲンは、酵素活性が低いが、タンパク質分解の切断によって、活性は大幅に増し、第VIIａ因子を形成する。この活性化は、第VIIa組織因子だけでなく、第Xa因子（これらは、いくらかの細胞型に見られる内在性膜タンパク質である）によっても触媒され得る( Fiore,M.M.ら、1994, J. Biol. Chem.,269 ： 143-149)。第VIIa組織因子による活性化は、自己賦活であると言われる。それは、該活性化（第VII因子からの第VIIa因子の形成）と、第VIIa因子のその後の活性の、両方に関係する。in vivoでの、活性化のための最も重要な経路は知られていない。第VIIａ因子は、血液凝固第IX因子と第X因子を活性化し得る。
【０００３】
組織因子は、いくらかの腫瘍細胞の表面上に、高レベルで発現される。組織因子と第VIIa因子は、腫瘍の発達と組織の浸潤における役割が考えられる(Vrana, J. A .ら、Cancer Res., 56： 5063-5070)。 組織因子の細胞発現作用は、内毒素性ショックに対する中毒反応の主要な要因でもある（Dackiw , A . A .ら、1996 , Arch. Surg., 131 : 1273-1278)。
【０００４】
プロテインＣは、内皮細胞の内在性膜タンパク質であるトロンボモジュリンの存在下で、トロンビンによって活性化される( Esmon，N.L.ら、1982, J. Biol. Chem.,257：859-864)。 活性型プロテインＣ（APC）は、その補因子であるプロテインＳと協同して、第Ｖａ因子と第VIIIａ因子を分解する。APCに対する抵抗性は、先天的な血栓症の最も一般的な形態である( Dahlback, B.,1995，Blood，85 : 607-614)。 ビタミンＫ阻害剤は、一般的には、血栓症の予防のために投与される。
【０００５】
ビタミンＫ依存性タンパク質は、ある型の血友病を治療するのに用いられる。血友病Ａは、活性型第VIII因子、第VIIIa因子の欠損、また第VIII因子の阻害剤の存在により特徴づけられる。血友病Bは、活性型第IX因子、第IXa因子の欠損により特徴づけられる。第VII因子の欠損は、まれにしか見られないが、第VII因子の投与に対してよく応答する( Baur, K. A.,1996，Haemostasis , 26 : 155-158, suppl. 1)。 一部の患者においては、第VIII因子置換療法は、高力価の阻害性第VIII因子抗体が生ずることにより制限される。その代わりに、第VIIa因子を血友病AとBの治療に使うことができる。第IXa因子と第VIIIa因子は、第X因子を活性化する。第VIIa因子は、第X因子を直接活性化することにより第IX因子と第VIII因子の必要性を排除し、ほとんど免疫学的な結果をもたらすことなく第IX因子と第VIII因子の欠損の問題を克服することができる( Hednerら、1993, Transfus. Medi. Rev.,7 : 78-83 ; Nicolaisen, E. M.ら、1996, Thromb. Haemost., 76 : 200-204.)。第VIIa因子の有効な投与量はしばしば高く（体重1kgに対して45〜90μg）、数時間ごとに繰り返し投与する必要があるかもしれない(Shulmav, S. ら、1996, Thromb. Haemost., 75 : 432-436)。
【０００６】
膜接触領域を含まない組織因子の可溶性形態（可溶性組織因子、sTFと略す）は、第VIIa因子と共に投与されると、血友病の治療において有効であることが見出されている。( 米国特許第 5,504,064号 ) イヌの場合、sTFは、血友病の治療に必要とされる第VIIa因子の量を、減じることが示された。sTF-VIIaによる膜会合は、第VII因子の膜接触部位に完全に依存する。これは、組織因子とVII(a)の両方を介して膜に結合する正常の組織因子と第VIIa因子との複合体と対照的である。
【０００７】
（発明の概要）
ビタミンＫ依存性ポリペプチドのγ−カルボキシグルタミン酸(GLA)ドメイン内の改変は該ポリペプチドの膜結合親和力を増強することが見出された。このような方法で改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドは増強された活性を有し、抗凝血剤、前凝血剤(pro-coagulant)としてまたはビタミンＫ依存性タンパク質を利用するその他の機能のために使用することができる。例えば、改良された第VII因子分子は必要とされるVIIaの投与量、相対的投与回数を低減させることにより、かつ／または欠損状態のより有効な治療を可能にする質的変化をもたらすことにより、いくつかの利点を提供する。
【０００８】
本発明は、対応する天然型ビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含んでなるビタミンＫ依存性ポリペプチドを特徴とする。改変型GLAドメインはアミノ酸１付近からアミノ酸45付近までであり、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。例えば、アミノ酸置換はアミノ酸11、12、29、33または34に存在し得る。好ましくは、この置換はアミノ酸11、33または34に存在する。改変型GLAドメインは、カルシウム飽和状態で、電気陰性電荷のかさ(halo)と共に陽イオン性のコアを有する三次構造を形成するアミノ酸配列を含むことができる。
【０００９】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、例えば、プロテインＣ、活性型プロテインＣ、第IX因子、第IXa因子、第VII因子、第VIIa因子または活性部位改変型第VIIa因子であり得る。プロテインＣまたは活性型プロテインＣの改変型GLAドメインは、アミノ酸33にグルタミン酸残基およびアミノ酸34にアスパラギン酸残基を含むことができる（配列番号19）。プロテインＣまたは活性型プロテインＣの改変型GLAドメインはまた、アミノ酸11にグルタミンまたはグルタミン酸残基を含んでいてもよい（それぞれ配列番号20および配列番号21）。さらに、プロテインＣまたは活性型プロテインＣのGLAドメイン内のアミノ酸12においてグリシン残基と置換してもよい（配列番号24または配列番号35）。第VII因子、第VIIa因子および活性部位改変型第VIIa因子の改変型GLAドメインは、アミノ酸11および33に置換を含むことができる。例えば、アミノ酸11でグルタミン残基と、そしてアミノ酸33でグルタミン酸残基と置換してもよい（配列番号30）。
【００１０】
本発明はまた、ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする単離された核酸を特徴とする。本明細書中で用いる「単離された（精製された）」という用語は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする遺伝子の一部または全部に相当する配列をさし、哺乳動物ゲノム中の該遺伝子の一端または両端に通常隣接している配列は含まれない。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。
【００１１】
本発明はさらに、ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードする核酸ベクターを含有する哺乳動物宿主細胞を特徴とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは、例えばアミノ酸11、12、29、33または34に、少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えば第VII因子または第VIIa因子であり得、アミノ酸11とアミノ酸33にアミノ酸置換を有する。例えば、アミノ酸置換はアミノ酸11にグルタミン残基およびアミノ酸33にグルタミン酸残基を含むことができる（配列番号30）。
【００１２】
本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を阻止するのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えばプロテインＣ、活性型プロテインＣまたは活性部位改変型第VIIa因子であり得る。プロテインＣまたは活性型プロテインＣは例えばアミノ酸33にグルタミン酸残基およびアミノ酸34にアスパラギン酸残基を含むことができる（配列番号19）。プロテインＣまたは活性型プロテインＣはさらにアミノ酸11にグルタミン（配列番号20）を含んでいてもよく、また、アミノ酸11にグルタミン酸（配列番号21）を含んでいてもよい。さらに、アミノ酸置換はアミノ酸12にグリシンを含んでいてもよい（配列番号24または配列番号35）。活性部位改変型第VIIa因子は、例えば、アミノ酸11にグルタミン残基およびアミノ酸33にグルタミン酸残基を含むことができる（配列番号30）。
【００１３】
本発明はまた、製薬上許容される担体および哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を特徴とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えば第VII因子、第VIIa因子、第IX因子または第IXa因子であり得る。この医薬組成物は可溶性の組織因子を含んでいてもよい。第VII因子または第VIIa因子はアミノ酸11とアミノ酸33にアミノ酸置換を含むことができる。例えば、アミノ酸11ではグルタミン残基と置換することができ、アミノ酸33ではグルタミン酸残基と置換することができる（配列番号30）。
【００１４】
凝血障害の治療に使用するためのビタミンＫ依存性ポリペプチドも開示される。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。有用な改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドとしては、例えば、上記のようなプロテインＣ、活性型プロテインＣ、第VII因子、第VIIa因子、活性部位改変型第VIIa因子、第IX因子、第IXa因子などがある。
【００１５】
本発明はまた、凝血障害治療用の医薬を製造する際のビタミンＫ依存性ポリペプチドの使用を特徴とする。このビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。有用な改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドとしては、例えば、上記のようなプロテインＣ、活性型プロテインＣ、第VII因子、第VIIa因子、活性部位改変型第VIIa因子、第IX因子、第IXa因子などがある。
【００１６】
哺乳動物において血塊の形成を低減させる方法も開示される。この方法は哺乳動物において血塊の形成を低減させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを投与することを含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えばプロテインＣ、活性型プロテインＣまたは活性部位改変型第VIIa因子であり得る。プロテインＣまたは活性型プロテインＣはアミノ酸33にグルタミン酸残基およびアミノ酸34にアスパラギン酸残基を含むことができる（配列番号19）。プロテインＣまたは活性型プロテインＣでは、さらにグルタミンまたはグルタミン酸と置換されてもよい（それぞれ配列番号20または配列番号21）。さらに、アミノ酸12においてグリシンと置換されてもよい（配列番号24または配列番号35）。活性部位改変型第VIIa因子はアミノ酸11にグルタミン残基およびアミノ酸33にグルタミン酸残基を含むことができる（配列番号30）。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物において血塊の形成を増加させる方法を特徴とする。この方法は哺乳動物に血塊の形成を増加させるのに有効な量のビタミンＫ依存性ポリペプチドを投与することを含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べて、該ポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型のGLAドメインを含む。改変型のGLAドメインは少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものである。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは例えば第VII因子、第VIIa因子、第IX因子または第IXa因子であり得る。第VII因子または第VIIa因子はアミノ酸11とアミノ酸33にアミノ酸置換を含むことができる。例えば、アミノ酸置換はアミノ酸11にグルタミン残基およびアミノ酸33にグルタミン酸残基を含んでいてよい（配列番号30）。
【００１８】
特にほかで定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有する。本発明の実施にあたって、ここに記載するものと類似したまたは等価の方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で挙げた刊行物、特許出願明細書、特許明細書、その他の文献はすべて、その全体を参照によりここに含めるものとする。対立する場合には、定義を含む本明細書が優先するだろう。加えて、材料、方法および実施例は単なる例示であって、限定するものではない。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００２０】
野生型VIIaおよびVIIQ11E33のGLAドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号30に示される。ウシ第Ｘ因子、ウシプロテインＣ、ヒトプロテインＣおよびウシプロテインC-H11のGLAドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号18、配列番号２、配列番号１および配列番号23に示される。プロテインC VQ33E,N34DのGLAドメインのアミノ酸配列は配列番号19に示される。
【００２１】
（詳細な説明）
一つの態様において本発明は、対応する天然型のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含むビタミンＫ依存性ポリペプチドを特徴とする。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、それらの生合成過程において、ビタミンＫを利用してタンパク質前躯体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化するタンパク質群である。GLAドメインはポリペプチドのN末端領域において、典型的にはアミノ酸１からアミノ酸45付近に9〜13のγ−カルボキシグルタミン酸残基を含む。ビタミンＫ依存性ポリペプチドの例としては、プロテインZ、プロテインS、第X因子、第II因子（プロトロンビン：prothrombin）、第IX因子、プロテインC、第VII因子およびGas６がある。本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸位置は、第IX因子に従って番号を付けた。プロテインS、プロテインC、第X因子、第VII因子およびヒトプロトロンビンのいずれもアミノ酸が1つ少ない（第4位）ので、それらの番号付けを調整しなければならない。例として、ウシプロテインCの事実上の第10位はプロリンであるが、容易に比較するために本明細書においては全体にわたってアミノ酸11と番号を付ける。本明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる語は、アミノ酸長または翻訳後修飾に拘わらず、任意のアミノ酸鎖のことである。本明細書においてアミノ酸は標準の3文字または1文字略号により表記している。
【００２２】
GLAドメインにおける改変は少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。その置換は保存的または非保存的である。保存的アミノ酸置換では1アミノ酸が同種の1アミノ酸と置き換わるが、非保存的アミノ酸置換では1アミノ酸が異種の1アミノ酸と置き換わる。非保存的置換の結果、ポリペプチドの疎水性またはアミノ酸残基側鎖の嵩だかさの実質的な変化が生じることもある。さらに、非保存的置換は、ポリペプチドの電荷において電気的陽性電荷を減少または電気的陰性電荷を導入するような実質的な変化を生じさせることもある。非保存的置換の例として、非極性アミノ酸に対して塩基性アミノ酸または酸性アミノ酸に対して極性アミノ酸が含まれる。そのアミノ酸置換はアミノ酸11、12、29、33または34において生じることができる。好ましくは、アミノ酸11、33または34においてアミノ酸置換が生じる。改変型GLAドメインは、カルシウム飽和状態において電気的陰性電荷のかさ（halo）と共に陽イオン性のコア（core）を有する三次構造の形成に寄与するアミノ酸配列を含みうる。特定の理論に拘束されずに、電気的陰性の表面に完全に取り囲まれた電気的陽性のコアからなる特定の静電気パターンにより、増強された膜親和力が生じることもある。
【００２３】
多数のビタミンＫ依存性ポリペプチドは膜結合酵素の基質である。ビタミンＫ依存性ポリペプチドは最大ポテンシャル（potential）のGLAドメイン膜結合親和力を全く示さないので、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの全ては結合親和力を減少させるためのアミノ酸を含む必要がある。結果的に、多数のビタミンＫ依存性ポリペプチドは最大親和力の見地からすれば最適でないアミノ酸を含んでいる。これらのアミノ酸残基は結合部位を効果的に壊し、酵素反応のためのより迅速な代謝回転を提供する。
【００２４】
低下した膜親和力はいくつかの目的に役立つ効果がある。高い親和力には反応速度を制限しうるゆっくりとした交換（slow exchange）が伴う。例えば、プロトロンビナーゼ酵素が基質に対して高い親和力をもって膜上に集合した際に、酵素触媒作用よりむしろ膜からのタンパク質の交換が律速である。Lu, Y.および Nelsestuen, G.L. (1996) Biochemistry, 35:8201-8209を参照されたい。あるいは、非最適アミノ酸による置換によって膜親和力を調節すると、前血液凝固（procoagulation）（第X、第IX、第VII因子およびプロトロンビン）と抗血液凝固（anticoagulation）（プロテインＣ、S）との競合過程のバランスを保つことができる。天然タンパク質の膜親和力は通常状態においては最適であるが、膜親和力の増強により、in vivoにおける病理学的症状において血液凝固を制御するための治療の改善とならびにin vitro研究において有用なタンパク質を産生可能とする。
【００２５】
GLAドメインのが改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの種々の例を以下に記載する。
【００２６】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドはプロテインCまたは活性化プロテインC（APC）でありうるだろう。表1に野生型ヒトプロテインC（hC）およびウシプロテインC（bC）GLAドメインのアミノ酸配列を示した。XはGlaまたはGlu残基である。一般的に、第11、33および34位において中性残基（例えばQである）または塩基性残基（例えばD、Eである）を含むタンパク質は、膜親和力が高い。
【００２７】
【表１】
0004276379.tif 000002
【００２８】
例えば、プロテインCまたはAPCの改変型GLAドメインはアミノ酸33においてグルタミン酸残基をおよびアミノ酸34においてアスパラギン酸残基を含みうる（配列番号19）。第33位のグルタミン酸はin vivoにおいて更にγ−カルボキシグルタミン酸に修飾されうる。最適活性のために、改変型GLAドメインはアミノ酸11において更なる置換を含んでもよい。例えば、グルタミン残基はアミノ酸11において置換（配列番号20）され、または代わりに、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基が置換（それぞれ配列番号21および配列番号22）されてもよい。ヒスチジン残基はウシプロテインCにおけるアミノ酸12において置換（配列番号23）されてもよい。グリシン残基のアミノ酸12におけるセリンの置換（配列番号24および配列番号35）は更なる改変として含まれ得る。プロトロンビンに見られるアミノ酸であるフェニルアラニンによるアミノ酸29の置換（配列番号25）は、もう一つの有用な改変である。増強された膜結合親和力をもつ改変型プロテインCは、へパリンのような他の注射可能な抗血液凝固剤（anticoagulant）の代用として利用できるだろう。へパリンは典型的に大部分のタイプの外科手術において用いられるが、低い効力／毒性（efficacy／toxicity）比を有している。更に、増強された膜親和力をもつ改変型プロテインCはクマリン（coumarin）ファミリーにおけるワルファリン（warfarin）のような経口抗血液凝固剤の代用として利用できるだろう。
【００２９】
活性部位改変型APCでは、上記の改変もなし得る。化学的には、例えば、N−ダンシル−グルタミルグリシルアルギニルクロロメチルケトン（DEGR）によりまたは活性部位の部位特異的突然変異誘発により、APCの活性部位を不活性にすることができる。Sorensen, B.B.ら, (1997) J. Biol. Chem., 272:11863-11868を参照されたい。活性部位改変型APCはプロトロンビナーゼ複合体のインヒビターとして機能する。活性部位改変型APCの増強された膜親和力は、治療においてより効果的なポリペプチドとなしうる。
【００３０】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドは第VII因子または活性型の第VII因子、第VIIa因子であるだろう。本来のすなわち天然の第VII因子ポリペプチドは膜に対し、低い親和力をもつ。表２に野生型ヒト第VII因子（hVII）およびウシ第VII因子（ｂVII）GLAドメインのアミノ酸配列を示した。
【００３１】
【表２】
0004276379.tif 000003
【００３２】
第VII因子または第VIIa因子の改変型GLAドメインは、例として、アミノ酸11においてグルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含む（それぞれ配列番号26および配列番号27）か、アミノ酸29においてフェニルアラニン残基を含む（配列番号28）か、またはアミノ酸33においてアスパラギン酸残基を含む（配列番号29）ことができる。好ましくは、第VII因子または第VIIa因子の改変型GLAドメインはアミノ酸11においてグルタミン残基（配列番号30）およびアミノ酸33においてグルタミン酸残基を含む（配列番号30）のがよい。このように、改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドは、天然または野生型のポリペプチドよりも膜に対してはるかに高い親和力がある。ビタミンＫ依存性ポリペプチドはまた、自己活性化、第Xa因子生成、および複数の血液凝固アッセイにおいてはるかに高い活性を示す。活性は組織因子および／またはリン脂質の低レベルのような限界の血液凝固状態において、特に増強される。例として、改変型第VII因子は最適トロンボプラスチンレベルにおいて天然の第VIIa因子より約4倍効果的であるが、トロンボプラスチンの最適レベルの１％においては約20倍効果的である。限界に近い前血液凝固シグナルがおそらくin vivoにおいてもっとも支配的であろう。トロンボプラスチンの最適レベルを用いた現在使用可能な血液凝固アッセイでは、正常な血漿と血友病患者の血漿の凝固時間の差を検出することができない。そのようなサンプル間における凝固の差は、血液凝固アッセイにおいてトロンボプラスチンの非最適レベルまたは希釈トロンボプラスチンを用いたときにのみ検出できる。
【００３３】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドのもう一つの例として、活性部位改変型第VIIa因子がある。第VIIa因子の活性部位は、例えばDEGRによりまたは活性部位の部位特異的突然変異誘発により、化学的に改変され得る。DEGR改変型第VII因子はいくつかの投与経路による血液凝固の効果的なインヒビターである。Arnljots, B.ら (1997) J. Vasc. Surg., 25:341-346を参照されたい。GLAドメインの改変は、それによる高い膜親和力のために、活性部位改変型第VIIa因子をより有効にさせうる。活性部位改変型第VIIa因子の改変型GLAドメインは、例えば、アミノ酸11においてグルタミン残基をおよびアミノ酸33においてグルタミン酸残基を含むことができる（配列番号30）。
【００３４】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドはまた第IX因子または活性型の第IX因子、第IXa因子でありうる。活性部位改変型第VIIa因子と同様に活性部位改変型IXaおよびXaは血液凝固のインヒビターとなりうる。表3に野生型ヒト第IX因子（hIX）およびウシ第IX因子（bIX）GLAドメインのアミノ酸配列を示した。例として、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基はアミノ酸11において置換（それぞれ配列番号31および配列番号32）され、アミノ酸29においてフェニルアラニン残基が置換（配列番号33）され、またはアミノ酸34においてアスパラギン酸残基が置換（配列番号34）される。
【００３５】
【表３】
0004276379.tif 000004
【００３６】
もう一つの態様において、本発明は対応する天然型のビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親和力を増強した改変型GLAドメインをもつビタミンK依存性ポリペプチドを含む哺乳動物宿主細胞を特徴とする。改変型GLAドメインは上記のように少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。例えば、哺乳動物宿主細胞は改変型第VII因子または改変型第VIIa因子を含みうる。改変型第VII因子または改変型第VIIa因子のGLAドメインは、アミノ酸11およびアミノ酸33において1個のアミノ酸置換を含んでもよい。好ましくは、そのアミノ酸置換がアミノ酸11においてグルタミン残基をおよびアミノ酸33においてグルタミン酸残基を含む（配列番号30）。
【００３７】
適当な哺乳動物宿主細胞はビタミンK依存性ポリペプチドのグルタミン酸残基をγ−カルボキシグルタミン酸に改変することができる。腎臓および肝臓由来の哺乳動物細胞は宿主細胞として特に有用である。
【００３８】
本発明はまた、製薬上許容されうる担体および哺乳動物において血塊の形成を阻害するのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を特徴とする。ビタミンK依存性ポリペプチドは、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親和力を増強し、少なくとも1個のアミノ酸置換をもつ改変型GLAドメインを含む。医薬組成物の有用な改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、上記のように、プロテインCまたはAPC、活性部位改変型APC、活性部位改変型第VIIa因子、活性部位改変型第IXa因子および活性部位改変型第Xa因子を含むことができるがそれらに限定されない。
【００３９】
哺乳動物において血塊の形成を阻害するのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドの濃度は、投与される組成物の好ましい投与量、使用する組成物の化学的特性、賦形剤化合物の配合および投与経路を含む多くの要因により変化しうる。投与すべき医薬組成物の最適な投与量もまた、特定の患者の全体的な健康状態および選択した化合物の関連する生物学的効能などのような可変因子に依存しうる。このような医薬組成物はin vivoにおける血液凝固を調節するために使用できる。例えば、その医薬組成物は血栓症の治療のために一般的に用いてもよい。上記のように、一般的に、ポリペプチドのほんの少しのアミノ酸を改変することは、ポリペプチド変異体の抗原性に有意な影響を及ぼさない。
【００４０】
改変型GLAドメインを含むビタミンK依存性ポリペプチドは製薬上許容される非毒性の賦形剤または担体との混合により医薬組成物に調製されてもよい。そのような混合物および組成物は、非経口投与用には特に水性生理学的緩衝液中の溶液剤または懸濁剤の形態で、経口投与用には特に錠剤またはカプセルの形態で、または鼻腔内投与用には特に粉末剤、点鼻剤またはエアロゾールの形態で調製されてもよい。他の投与経路用の組成物は標準の方法を用いて所望しうるように調製されてもよい。
【００４１】
非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として無菌水または生理食塩水、例えばポリエチレングリコールを含むポリアルキレングリコール、植物性油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。特に、in vivoにおける本発明の化合物を制御放出するための賦形剤の例としては、生物適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーがある。他の適当な非経口デリバリーシステムにはエチレンビニルアセテートコポリマー分子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームが挙げられる。吸入投与用製剤は所望であればラクトースのような賦形剤を含むことができる。吸入製剤は、例えばポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココーレートおよびデオキシコーレートを含む水溶液であってもよく、または吸入製剤は点鼻剤の形態で投与される油性溶液であってもよい。所望ならば、これらの化合物は鼻腔内に使用されるゲル剤として調製できる。非経口投与用製剤はまた舌下投与用にグリココーレートを含んでもよい。
【００４２】
代替の実施形態において、本発明はまた製薬上許容されうる担体および哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを含有する医薬組成物を特徴とする。ビタミンK依存性ポリペプチドは、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親和力を増強する少なくとも1個のアミノ酸置換を有する改変型GLAドメインを含む。このような医薬組成物は血友病A、血友病Bおよび肝臓疾患のような凝血障害の治療に有用である。
【００４３】
この実施形態において、医薬組成物の有用なビタミンK依存性ポリペプチドは第VII因子および活性型第VII因子、第VIIa因子を含むがそれらに限定されない。第VII因子および第VIIa因子の改変型GLAドメインはアミノ酸11およびアミノ酸33において置換を含んでもよく、例えば、アミノ酸11においてグルタミン残基がおよびアミノ酸33においてグルタミン酸残基を含む（配列番号30）ことができる。この医薬組成物は更に可溶性組織因子を含有してもよい。第VII因子は、凝血カスケードの開始における該因子の位置および第IX因子および第X因子の二つのタンパク質を活性化するその能力のために、血液凝固に対し特に決定的である。第IX因子および第VIII因子を伴う過程は完全に無視されるので、第VIIa因子による第X因子の直接的な活性化は主要な形態であるAおよびBタイプ血友病の可能な治療に重要である。第VII因子の患者への投与は血友病のいくつかの形態の治療に有効であることが認められている。GLAドメインの改変による第VII因子および第VIIa因子の膜親和力の改良は、ポリペプチドが多くの血液凝固条件により反応しやすくさせ、必要な第VII／VIIa因子投与量を少なくし、第VII／VIIa因子を投与すべき時間間隔を長くし、および結果としてより効果的な治療となる更なる質的変化を提供する可能性を提供する。総体的に、第VII因子の膜接触部位の改良によって、第X因子または第IX因子において第VIIa因子の活性が改良され、ならびに、その活性化速度が高まる。これらの過程は、in vivoにおける全体的な血液凝固速度に倍数的な効果があり、結果的に第VIIa因子は数種の凝血障害の優れた治療にとても有効となりうる。
【００４４】
血塊形成を高める他の有用なビタミンK依存性ポリペプチドには第IX因子および第IXa因子が挙げられる。
【００４５】
もう一つの態様においては、哺乳動物において血塊の形成を低減させる方法を記載する。その方法は哺乳動物において血塊形成を低減させるのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを投与することを含む。ビタミンK依存性ポリペプチドは対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含む。改変型GLAドメインは少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。改変型プロテインCまたはAPC、または活性部位を遮断した改変型第VIIa、IXa、Xa因子およびAPCを本方法に使用できる。
【００４６】
別の態様において、本発明は哺乳動物において血塊の形成を増加させるのに有効な量のビタミンK依存性ポリペプチドを投与することを含む哺乳動物において血塊の形成を増加させる方法を特徴とする。ビタミンK依存性ポリペプチドは、対応する天然型ビタミンK依存性ポリペプチドと比べてポリペプチドの膜結合親和力を増強する改変型GLAドメインを含む。改変型GLAドメインは少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。改変型第VII因子または第VIIa因子および改変型第IX因子または第IXa因子を本方法に使用できる。
【００４７】
本発明を下記の実施例において更に説明するが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
【００４８】
（実施例）
実施例１  膜親和力と活性の増強された第VII因子
ヒト血液凝固第VII因子の膜結合親和力は、部位直接的な突然変異誘発によって増強され得ることが見出された。P11Q,K33E変異体〔本明細書中では、第VIIQ11E33因子または、変異型第VII因子という（配列番号30）〕の性質が特徴づけられた。膜親和力は、野生型タンパク質に対して約20倍増強された。変異体による自己活性化は、野生型第VII因子に比べて、少なくとも100倍増強された。活性型のVIIQ11E33（ VIIaQ11E33とする ）は、第X因子に対して約10倍高い活性を示した。正常血漿中の可溶性組織因子存在下でのVIIaQ11E33の凝血活性は、野生型VIIaの活性より約10倍高かった。正常な組織因子（トロンボプラスチン‐HSの1：100希釈物として供給）存在下における、チモーゲン、VIIQ11E33の凝血活性は、野生型第VII因子に比べて20倍高かった。活性が増強される程度は諸条件に左右され、凝血刺激が低い条件下でVIIQ11E33は特に活性であった。
【００４９】
一般的に、タンパク質濃度は、標準品としてウシ血清アルブミンを使用するブラドフォードアッセイによって測定した( Bradford, M. M., 1976, Analyt. Biochem. 248-254)。 モル濃度は、分子量を第VII因子については50,000、第X因子については55,000として得られた。指示されない限り、全ての活性測定は、標準バッファー（0.05 M  Tris, pH 7.5, 100mM NaCl)中で実施した。
【００５０】
変異型第VII因子の産生
変異型第VII因子を、野生型第VII因子cDNA（GenBank受け入れ番号M13232, NID g182799）から作製した(Petersenら、1990,Biochemistry 29 : 3451-3457)。 P11Q変異（アミノ酸11のプロリン残基のグルタミン残基への変換）とK33E変異（アミノ酸33のリシン残基のグルタミン酸残基への変換）を、PCR法で、野生型第VII因子cDNAに誘導した。(Valletteら、1989, Nucreic Acid Res. 17:723-733)。この工程において、変異診断用XmaIII制限酵素部位が排除された。4つのPCRプライマーを、M13232の２つの変異フラグメント（一方は位置221〜301のMluIからBglIIまで、他方は位置302〜787のBglIIをからSstIIまで）の合成を開始するために設計した。これらのプライマーを用いて、標準のPCRサイクル条件（GENEAMP, Perkin Elmer）において、フラグメントの合成を開始した。その際鋳型として１ ngの野生型第VII因子cDNAを用いた。得られたフラグメントをゲル精製し、MluIとBglII、またはBglIIとSstIIで消化した。そして、２つの精製したフラグメントを発現ベクター Zem219b（対応する野生型配列を、MluI-SstIIフラグメンとして取り除いてある）中の第VIII因子cDNAに結合した（ Petersenら、1990, 前掲)。変異したフラグメントの全体の配列決定を行って、P11QとK33Eの置換を確認し、PCRに誘導されるその他の配列変化の可能性を排除した。
【００５１】
トランスフェクション、選択、精製
ベビーハムスター腎（BHK）細胞を、10％のウシ胎児血清とペニシリンストレプトマイシンを補ったダルベッコ改良イーグル培地に増殖させた。サブコンフルエントな細胞を、製造業者の薦めにより、リポフェクトアミン（lipofectAMINE; Gibco BRL )を用いて第VII因子発現プラスミドでトランスフェクトした。２日間、あらかじめトランスフェクトした後、細胞をトリプシンで処理し、１μMのメトトレキセート(MTX)を含む選択培地に希釈した。安定にトランスフェクトされたBHK細胞を、続いて、ペニシリンストレプトマイシン、５μg/ｍLのビタミンＫ1、そして１μMのMTXを補った血清を含まないダルベッコ改良イーグル培地で培養し、ならし培地を回収した。ならし培地は、Affi-Gel 10に結合したカルシウム依存性モノクロナール抗体(CaFVII22)を含む免疫アフィニティーカラムに2度アプライした( Nagasakiら、1991, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。 最終的に精製された第VIIQ11E33因子は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において、単一のバンドとして泳動し、調製物中には、第VIIa因子の形跡はなかった。純粋なVII（P11Q,K33E)変異体は1400〜2800 第VII因子units/mgを示した。
【００５２】
第VII因子の活性化
活性型第VIIaQ11E33因子は、VIIQ11E33を第Xa因子で開裂することによって生成した（ 重量比1：100、37℃で1時間インキュベーション）。または、第VIIaQ11E33因子は、７μMのVIIQ11E33と0.7μMのsTFとリン脂質〔ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン（PS/PC), 25/75, タンパク質1gあたり0.1 g〕の混合物中で、自己活性化により得られた（37℃，20 分)。
【００５３】
野生型第VIIa因子は、均一な組換えタンパク質である（NOVO Nordisk)。２つの調製物は、市販の凍結乾燥製品と非凍結乾燥製品からなるものである。後者のタンパク質を、FPLC mono-Qでさらに精製したところ、80,000 units/mg の特異的な活性（Geroge King NPP 標準でキャリブレーション）を示した。
【００５４】
第VIIQ11E33因子によって増強された膜相互作用
リン脂質の調製、タンパク質−膜結合のアッセイと測定はNelsestuenとLimによって開示された方法で実施した（1977, Biochemistry, 30 : 10819-10824)。大きな単ラメラ小胞（LUV)と小さな単ラメラ小胞（SUV)は、以前に開示された方法で調製した(Hope, M.J.ら、Bilchem. Biophys. Acta., 812 : 55-65 ; Huang, C., 1969, Biochemistry, 8 : 344-352)。 高純度のホスファチジルセリン（ウシ脳）と卵ホスファチジルコリン(Sigma Chemical Co.)をクロロホルム中で混合した。溶媒は、窒素ガス流で取り除いた。乾燥させたリン脂質をバッファー中で懸濁させた。SUVは、超音波処理とゲル濾過によって作製し、一方、LUVは凍結−融解と押出しによって作製した。リン脂質の濃度は、リン：リン脂質重量比を25と仮定して、有機リン酸アッセイにより決定した。
【００５５】
PS/PC (25/75)またはPS/PC (10/90)のいずれかのSUVを調製した。タンパク質を図１に示す重量比でリン脂質に加えた。タンパク質-膜結合は、Nelsestuen とLimの方法（1977,前掲）で90℃において光散乱によってアッセイした。簡単に言うと、リン脂質小胞単独（I1）とタンパク質を加えたもの（I2）の光散乱強度を測定し、バッファーと未結合のタンパク質によるバックグラウンドについて、補正した。タンパク質-小胞複合体(M2)の小胞単独のもの(M1)に対する分子量比を、式１の関係から見積もることができる。この式において、δn/δcは個々の種の屈折率である。
0004276379.tif 000005
リン脂質とタンパク質の濃度がわかっていれば、結合したタンパク質 [P*PL] と遊離のタンパク質 [P] の濃度を見積もることができる。これらの値を、小胞のタンパク質結合能の最大値 [P*PLmax]（すべてのタンパク質に関して1.0 g/gであると仮定する）とともに用いることにより、式 ２の関係から、タンパク質と膜の相互作用の平衡定数が得られる。式 ２において、全ての濃度は、モルタンパク質またはタンパク質結合部位として表されている。
0004276379.tif 000006
結合を、5 mMのカルシウムで評価し、M2/M1の比で表した。
【００５６】
図１は、野生型第VIIa因子（白丸）と第VIIQ11E33因子（黒丸）のPS/PC=25/75, 25μg/ml(図1A）または、PS/PC = 10/90 , 25μg/ml（図1B)の膜への結合を示している。VIIQ11E33は、野生型タンパク質よりも、かなり高い親和力を有していた。PS/PC (25/75)への結合は、定量的なレベルだったので、実質的に[Proteinfree]はゼロであった。解離定数(Kd)をこのデータから見積もることはできなかった。ウシ第X因子（黒三角）の膜結合は、図1に対照標準として示す。ウシ第X因子はこのファミリーのなかで、最も親和力のあるタンパク質のうちのひとつであり、カルシウム2 ｍMのとき、PS/PC (20/80)の解離定数(Kd) 40 nMを与える(McDonald ら、1997, Biochemistry, 36 : 5120-5127) 。タンパク質/リン脂質の比が0.55であるときの結果(図1）から得られたウシ第Ｘ因子の解離定数(Kd)は、0.025μMだった。
【００５７】
また、野生型および変種型第VII因子のPS/PC (10/90)の膜への結合も測定された（図1B）。VIIQ11E33は、定量的なレベルよりも低いレベルで結合するので結合定数を式 3の関係より見積もることができた。
0004276379.tif 000007
[Binding sitesfree]は、 M2/M1の最大値を1.0と仮定し、式4の関係から見積もった（すなわち、[Binding sitestotal] = [Phospholipidweight conc./ProteinMW])。これは、このファミリーに属する種々のタンパク質にみられる共通の値である（McDonaldら、1997, 前掲)。
0004276379.tif 000008
これらの仮定およびタンパク質：リン脂質比0.37であるときのデータを用いると、解離定数（Kd)の値はウシ第X因子については0.7μM、野生型第VII因子については5.5μM、VIIQ11E33については0.23μMであった。これより、第VIIQ11E33因子の膜結合力は野生型第VII因子に比べ大幅に増強されたことが明らかとなり、ビタミンＫ依存性タンパク質の中で最も高い膜結合力を持つもののひとつであるといえる。
【００５８】
第VIIQ11E33因子の増強された活性
凝血の最初のステップは、第VII因子の活性化を必要とする。VIIの自己活性化を、100 nMのsTF〔 Walter Kisiel博士から入手した高純度の組換え産物（Fiore ら、1994, J.Biol.Chem., 269: 143-149)〕、36 nMのVIIQ11E33および PS/PC (25/75, 22μg/mL)を含む溶液中で行った。0.15 mmの基質 S-2288(Kabi社)を加えて、p-ニトロフェニルホスフェート生成物の放出速度を405 nMにおける吸光度変化によって評価することにより、VIIaQ11E33の活性を様々な時間的間隔において評価した。VIIQ11E33調製物におけるの初期の活性は、十分に活性のあるVIIaQ11E33の活性の4％にも満たなかった。
【００５９】
VIIQ11E33は野生型VII因子よりも活性化のための一層優れた基質であることが見出された。図2 は、VIIQ11E33の自己活性化を示す。このデータを、式 5の関係により解析した（ Fioreら、1994, 前掲 における式 7 ）。
0004276379.tif 000009
ln[VIIa]tは時間tにおける第VIIa因子の濃度、kcatは第VIIa因子がVIIに作用するときの触媒速度定数、そしてｙはVIIa部位の飽和率である。野生型第VIIa因子について、この関係および1 μMのsTFから、0.0045/sのkcatおよび7*103M-1s-1のkcat/Km 比が得られた(Fioreら、1994, 前掲)。 VIIQ11E33酵素については、自己活性化が速く（図2）、kcatの下限を見積もることしかできなかった。これは、第VIIa因子の約25秒の倍化時間から得られた〔kcat = (ln2)/t1/2〕。得られた値（kcatmin=0.03/s)と、この反応における基質濃度（3.6*10-8 M）およびy=1.0とする仮定から、kcat / [S] =  8 * 105 M-1 s-1の値が得られた。この値は、実際のVIIaQ11E33のkcat/Kmの値よりもかなり低いものであるといえる。しかし、Fioreら（1994、前掲)によって見積もれらた野生型VIIa/sTF因子のkcat/Kmの値よりは、約100倍大きいものであった。従って、凝血の活性化ステップにおいては、VIIaQ11E33酵素と基質第VIIQ11E33因子の組合せは、野生型タンパク質よりも優れていた。これは、最低限の凝血条件において、VIIQ11E33が野生型タンパク質よりも優れていることを示唆していた。
【００６０】
VIIaQ11E33の増強された活性
ひとたび生成されると、第VIIa因子は、第X因子か第IX因子のいずれかを活性化する。ウシ第X因子(0.1μM）の第VIIa因子による活性化を、pH 7.5の50 ｍM Tris HClバッファー〔100 mMのNaCl、5 mMのカルシウム、様々な量のリン脂質 (PS/PC, 25/75)、1 mg/mLのウシ血清アルブミンを含む〕中22.5℃で行った。第VIIa因子( 0.06 nMのVIIaQ11E33または0.6 nMの野生型VIIa ）をゼロ時間に加え、1分、3分および5分時点におけるXaの活性を測定した。反応混合物のうちの一定量（0.2ｍL）を10 mMのEDTAおよび第Xa因子に対する色原体基質である0.4 mMのS-2222（Kabi社）を含むバッファー(0.2 mL)と混合した。とした。405 nmにおける吸光度の変化をBeckman DU8 分光光度計で測定した。生成した第Xa因子の量は、p-ニトロフェニルホスフェートの反応生成物の吸光係数(1 * 104 M-1 cm-1 )およびこのアッセイ条件下での精製ウシXaによる基質加水分解の速度（33/sec）より算出した。
【００６１】
図3は、野生型第VIIa因子（白丸）とVIIaQ11E33（黒丸）が精製系において第X因子を活性化する能力を比較したものである。この反応においても、再び、VIIaQ11E33の方が野生型第VIIa因子よりもずっと優れていた。この差は、リン脂質の濃度が低いときに最大になり、リン脂質が1 mlあたり200 μgのときは2倍にまで低減した。高い膜濃度では高い割合で野生型VIIaの膜への結合が引き起こされるという事実からも、このような結果は予想された。さらにまた、VIIaQ11E33の増強された機能は、リン脂質が少ない条件下で最も顕著であった。
【００６２】
VIIaQ11E33の優れた凝血性
凝血アッセイを、血塊の形成を検出するため、ハンドチルト法（hand tilt method)を用いて37℃において行った。ヒト血漿(0.1 mL)は、37℃で1分間、平衡化させた。様々な試薬を0.1 mL容の標準バッファー中に加えた。可溶性組織因子（50 nM)とリン脂質(PS/PC, 10/90, 75 μg/mL)を第VIIa因子と共に血漿に加えた。なお、第VIIa因子の濃度は、図４に示すとおりである（0.1〜32 nM)。最後に0.1 mLの25 mM CaCl2を加え反応を開始させた。血塊が形成される時間を測定した。ほとんどの場合複数回数測定した試料の平均値と標準偏差を記録した。
【００６３】
図４は、正常なヒト血漿中のVIIaQ11E33に対する野生型VIIa因子の凝血時間を示したものである。凝血はsTFと添加したリン脂質小胞によって促進された。内因性野生型第VIIa因子の濃度はおよそ10 nMで、実質的には、凝血時間になんら影響を及ぼさなかった。sTF存在下、非存在下におけるバックグラウンド凝血は、120秒であった。第VIIaQ11E33因子は、これらのアッセイ条件において野生型VIIaよりもおよそ8倍高い活性を示した。同様の結果が第VIII因子欠損血漿においても得られ、この系のおもな凝血経路には、第VIIa因子による第X因子の直接の活性化が必要であることが示唆された。全体的に見て、第VIIaQ11E33因子は膜小胞と可溶性組織因子が促進する前凝血活性において野生型VIIaより優れていた。野生型チモーゲンは、同様の2分であるバックグラウンド凝血時間が示すように、sTFを加えたかどうかにかかわらず、これらの条件下で、事実上全く活性を示さなかった。
【００６４】
正常な組織因子存在下における前凝血活性
VIIaおよび/またVIIQ11E33のsTF存在下における活性を、正常なヒト血漿中で測定した。このアッセイで、内因性第VII因子は凝血時間にまったく影響を及ぼさないよういみえた。可溶性組織因子の存在または非存在にかかわらず、血漿の凝血時間のバックグラウンドは2分だった。可溶性組織因子（最終濃度は50 nM)とVIIaをカルシウム溶液の前に血漿に加えた。凝血時間を、様々な量のVIIaまたはVIIaQ11E33を含む試料について測定した。2つのヒト血漿試料、（正常な血漿、および第VIII因子欠損血漿）についてテストした。
【００６５】
正常な組織因子によって促進される凝血はカルシウムを含む標準ウサギ脳トロンボプラスチン-HS（HSは高感度を意味する）（Sigma Chemical Co.）でアッセイした。この混合物は、リン脂質と膜結合型組織因子の両方を含む。ウサギ脳トロンボプラスチン-HSをバッファーで1:100に希釈し、VII（10 nMの第VII因子を含む正常ヒト血漿の形で添加）およびVIIQ11E33（純粋なタンパク質として添加）のアッセイに用いた。トロンボプラスチン(0.2 mL)を血漿(0.1 mL)に加えて反応を開始させ、血塊を形成するのに要する時間を測定した。また、製造元が示したように十分な濃度のトロンボプラスチンを用いてアッセイを行った。
【００６６】
ヒトトロンボプラスチンの最適なレベルでは、野生型VIIは正常なレベルの活性（約1500 unit/mg）を示した。これは、野生型第VIIa因子の活性（80,000 unit/mg）のおよそ25分の1である。VIIQ11E33は標準のアッセイ条件においては1 mgあたりおよそ1500〜3000ユニットで、野生型VIIの2倍にすぎなかった。
【００６７】
野生型VIIとVIIQ11E33の差は、凝血条件が最適状態に及ばないときはさらに大きいものであった。図5は正常なトロンボプラスチンの量の0.01倍を含むアッセイにおける凝血時間とチモーゲンの濃度を示す。これらの条件下で、VIIQ11E33は野生型第VII因子に比べおよそ20倍の活性があった。このように、VIIQ11E33変異体のより大きな効力は、in vivoでの多くの状況に関連する制限された凝血条件下において特にはっきりあらわれた。
【００６８】
DEGR-VIIaQ11E33の抗凝血活性
標準的な凝血アッセイは正常なヒト血清とバッファーに1:10で希釈したヒトトロンボプラスチンを用いて行った。第VIIaQ11E33因子の活性部位をSorenson, B.B.ら、（1997,前掲）が記載するように、DEGRで改変した。前掲)。図6はカルシウムバッファー中、血漿を加える前に15秒間トロンボプラスチンと共にでインキュベートしたDEGR-VIIaQ11E33(0〜4 nm)の凝血時間を示す。血塊を形成する時間は、ハンドチルト法（hand tilt method)で評価した。凝血時間は、約1 nMのDEGR-VIIaQ11E33でおよそ45秒だった。
【００６９】
実施例２ ラットにおける第VIIQ11E33因子の循環時間
０時間において、ナトリウムネンブタールで麻酔したSprague Dawleyラット（325〜350g）２匹に、36μgの第VIIQ11E33因子を注射した。注射はカニューレがはめ込まれた頸静脈に行った。図７に示す時間毎に、手術によってカニューレを挿入した頸動脈から血液を採取した。ヒト第VII因子欠損血漿にラット血漿の1：10希釈物を1 μL加え、その凝血時間によって循環中の第VIIQ11E33因子の量を見積もった。ウサギ脳トロンボプラスチン-HS（Sigma Chemical Co.)の1：100希釈物を用いた。凝血は、実施例1に記載の手動チューブチルト法によって評価した。第VIIQ11E33因子を注入する前の血漿中の第VII因子活性の量を測定し、ブランクとみなして差し引いた。循環中の第VIIQ11E33因子の濃度は、log nMで与えられる。3番目の動物に手術を施し、カニューレは挿入しても第VIIQ11E33因子を注入しない模擬実験を実施した。その動物内の第VII因子活性の量は、実験時間（100分）を通して変化しなかった。実験の最後に動物は、過剰のナトリウムネンブタールによって安楽死させた。
【００７０】
ラットは、実験を通じて、凝血の形跡もなく正常のように見えた。つまり、第VIIQ11E33因子は手術後のラットにおいてさえ、やたらに凝血を引き起こさなかった。第VIIQ11E33因子の循環寿命は正常で（図７）、おおよそ40％のタンパク質が約60分で消失し、残ったタンパク質はさらにゆっくりと消失した。これは、ラットからウシのプロトロンビンが消失する速度に近い。( NelsestuenとSuttie, 1971, Biochem, Biophys. Res. Commun.,45: 198-203 )これは、機能アッセイの循環半減期が20分〜45分である野生型組換え第VIIa因子よりも優れている。( Thomsen,M.K.ら、1993, Thromb. Haemost., 70 : 458-464 )これは、第VIIQ11E33因子が異常なタンパク質として認識されず、そのため、凝固活性によって急速に破壊されなかったことを示した。第VIIQ11E33因子は正常なタンパク質として出し、動物のなかで標準の循環寿命を有するといえる。
【００７１】
実施例３  膜部位の亢進とプロテインCの活性
ウシおよびヒトのプロテインCは、ヒトタンパク質の膜親和力が約10倍高いにも関わらず、それらのGLAドメイン（アミノ末端44残基）のアミノ酸は高度の相同性を示す。ウシプロテインCは位置11にプロリンを含有するのに対し、ヒトプロテインCは位置11にヒスチジンを含有する。ウシプロテインCのプロリン-11をヒスチジンに置き換えることおよびヒトプロテインCにおけるその逆の変化の影響を試験した。両事例ともに、プロリン-11を含有するタンパク質はより低い膜親和力を示し、ウシプロテインCについては約10倍、そしてヒトプロテインCについては5倍であった。位置11にプロリンを含有する活性型ヒトプロテインC（hAPC）は野生型hAPCより、使用したアッセイによるが、2.4〜3.5倍低い活性を示した。ヒスチジン-11を含有するウシAPCは、野生型bAPCより15倍までの高い活性を提示した。これは、変異により膜接触および活性の両方を改善する能力を実証した。
【００７２】
プロテインCの突然変異誘発
全長ヒトプロテインC cDNAクローンは、ヨハン・ステンフロ博士（Dr. Johan Stenflo, Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmo, Sweden）より提供を受けた。ウシプロテインC cDNAクローンは、ドナルド・フォスター博士（Dr. Donald Foster, ZymoGenetics, Inc., USA）より提供を受けた。GenBank受託番号は、ウシプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2435, NID g163486、そしてヒトプロテインCのヌクレオチド配列についてはKO2059, NID g190322である。
【００７３】
部位特異的突然変異誘発をPCR法により実施した。ヒトプロテインCのヒスチジン-11のプロリンへの変異誘発のために、次のオリゴヌクレオチドを合成した：A、5'-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3'（配列番号７）、（ベクターpRc/CMV中のヌクレオチド860-895に対応）pRc/CMVとプロテインCの間にHind III部位を作るためである。B、5'-GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA-3'（配列番号８）（ヒトプロテインCのアミノ酸残基4-17に対応し、この配列の第8残基は下線で示したようにヒトプロテインCの残基からウシプロテインCの残基に変異を受けている）。
【００７４】
ウシプロテインCのプロリン-11のヒスチジンへの突然変異誘発のために、次のオリゴヌクレオチドを合成した：A、（上記のとおり）；C、5'-ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3'（配列番号９）（ウシプロテインCのアミノ酸残基4-15に対応し、第6残基は下線でマークしたようにウシプロテインCの残基からヒトプロテインCの残基に変異を受けている）；D、5'-TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3'（配列番号10）（ウシプロテインCのアミノ酸残基4-15に対応し、第7残基はウシプロテインCの残基からヒトプロテインCの残基に変異を受けている；変異を受けたヌクレオチドは下線が引かれている）；E、5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3'（配列番号11）（ベクターpRc/CMV中のヌクレオチド984-1019に対応し、pRc/CMVとプロテインCの間にXba I部位を作る）。
【００７５】
ヒトおよびウシプロテインC cDNAの両方を、発現ベクターpRc/CMVのHind IIIおよびXba I部位中にクローニングした。5'末端からアミノ酸-17までを含有するヒトプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAならびにプライマーAおよびBを用いてPCR増幅した。PCR反応液の容積は100μlで、Tris-HClバッファー（10mM Tris、25mM KCl、5mM (NH4)2SO4、および2mM MgSO4、pH 8.85）中に、鋳型DNAの0.25μg、4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステルそれぞれの200μM、各プライマーの0.5mMおよびPwo-DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）の2.5Uを含有した。サンプルを、94℃で変性2分間、55℃でアニーリング2分間、および72℃で伸長2分間からなるPCRの30サイクルにかけた。増幅後、該DNAを、1mM EDTAを含有する40mM Tris-酢酸バッファー中で0.8%アガロースゲルに電気泳動した。PCR産物をJETプラスミド・ミニプレップキット（JET Plasmid Miniprep-Kit, Saveen Biotech AB, Sweden)を用いて精製した。それぞれの変異を含有するヒトプロテインC cDNAをHind IIIおよびBsr BIによって切断し、これを、その後、Hind III/Xba Iにより切断されかつBsr BIから3'末端までのヒトプロテインC断片を含有するpRc/CMVベクター中にクローニングして、変異をもつヒトプロテインC全長cDNAを作製した。
【００７６】
5'末端からアミノ酸-11までを含有するウシプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAならびにプライマーAおよびCを用いてPCR増幅した。アミノ酸11から3'末端までのウシプロテインC cDNAを、無傷のヒトプロテインC cDNAならびにプライマーDおよびEを用いてPCR増幅した。これら２つのcDNA断片を鋳型として使って、変異アミノ酸を含有する全長ウシプロテインC cDNAをプライマーAおよびEを用いて増幅した。PCR反応条件は、hAPCに使ったものと同一であった。各変異を含有するウシプロテインC cDNAを、Hind IIIおよびBsu 36Iで切断し、得たHind III/Bsu36I断片を、Bsu 36Iから3'末端までの無傷のウシプロテインC断片を含有するpRc/CMVベクター中にクローニングして、変異を含有する全長ウシプロテインC cDNAを作製した。トランスフェクションの前に全ての変異をDNA配列決定により確認した。
【００７７】
細胞培養と発現
アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系293を、10%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシンおよび10 μg/mlビタミンK1を補給したDMEM培地中で増殖した。トランスフェクションをリポフェクチン法を使って実施した（Felgner, P.L.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417）。DNAの2μgを、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地を用いて0.1mLに希釈した。リポフェクチン（1 mg/ml）の10μLを、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地の100 μLに加えた。DNAとリポフェクチンを混合し、室温で10〜15分間放置した。細胞単層（5cmペトリディッシュ中で25〜50%コンフルエンス）を2 mM L-グルタミン培養液を含むDMEM培地で２回洗浄した。DNA/脂質混合物を、2 mM L-グルタミン培養液を含有するDMEM培地で1.8 mLに希釈し、細胞に加え、16時間インキュベートした。細胞に10%子ウシ血清を含有する完全培地の2mLを補給し、さらに48〜72時間放置して回復させ、その後、トリプシン処理し、選択培地（10%血清およびGeneticinの400 μg/mLを含有するDMEM）を容れた10cmディッシュ中に1：5でまいた（Yan, S.C.B.ら, 1990, Bio/Technology 655-661）。Geneticin耐性コロニーが3〜5週間の選択の後に得られた。それぞれのDNAトランスフェクションから24コロニーを拾い、コンフルエンスまで増殖し、そして該培地を、モノクローナル抗体HPC4（ヒトプロテインCに対して）およびモノクローナル抗体BPC5（ウシプロテインCに対して）を使うドット-ブロットアッセイにより、プロテインC発現についてスクリーニングした。大量のタンパク質を産生するクローンを単離し、ビタミンK1の10 μg/mLの存在下でコンフルエンスまで増殖した。
【００７８】
ウシ組換プロテインCおよびその変異体の精製は先に開示された方法に基づき、若干の修正を施した（Rezair, A.R.,およびEsmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem., 267:26104-26109）。安定してトランスフェクトした細胞の無血清ならし培地（conditioned serum-free medium）を5000rpmで、4℃、10分間遠心分離した。上清を0.45μmの硝酸セルロース膜（Micro Filtration Systems,日本）を通して濾過した。EDTA（最終濃度、5mM）とPPACK（最終濃度、0.2μM）を239の細胞からのならし培地に加え、その後、Millipore Con Sep LC100（Millipore, USA）を使い、室温でPharmacia FFQ陰イオン交換カラムに通過させた。該タンパク質をCaCl2勾配（出発溶液、20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7.4; 限定溶液、20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/30 mM CaCl2, pH 7.4）を用いて溶離した。透析およびChelex 100処理によりCaCl2を除去した後、該タンパク質を第２FFQカラムに再吸収させ、その後、NaCl勾配（出発溶液、20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7.4; 限定溶液、20 mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 7.4）を用いて溶離した。精製のこの時点で、野生型および変異型組換ウシプロテインCは、SDS-PAGEにより確認したところ均一であった。
【００７９】
野生型および変異型組換ヒトプロテインCの精製に使った第１カラムは、ウシプロテインCについて記載したものと同じであった。レゼールおよびエスモン（Rezair and Esmon）が記載したクロマトグラフィー法に、ウシプロテインS精製の方法として記載された若干の改良を施して使用した（Rezair, A.R.,およびEsmon, C.T., 1992,前掲；He, Z.ら, , 1995, Eur. J. Biochem., 227:443-440）。陰イオン交換クロマトグラフィーからのプロテインCを含有する画分をドット-プロットにより確認した。ポジティブの画分をプールし、Ca2+依存性抗体HPC-4を含有するアフィニティカラムにアプライした。該カラムは、5 mMベンズアミジン-HClおよび2 mM CaCl2を含有する20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4で平衡化した。アプライ後、カラムを1M NaClを含有する同じバッファーで洗浄した。その後、プロテインCを、5 mMベンズアミジン-HClを含有する20 mM Tris-HCl, 150 mM NaClおよび5 mM EDTA, pH 7.4を用いて溶離した。精製後、全てのヒトおよびウシ組換プロテインC調製物の純度をSDS-PAGEと続いて銀染色により評価した。タンパク質をYM 10フィルター(Amicon)を使って濃縮し、その後、バッファー（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4）に対して12時間透析し、-70℃で貯蔵した。タンパク質濃度は280nmにおける吸収により測定した。
【００８０】
正常および変異型プロテインC分子と膜との結合
LUVおよびSUVを実施例１に記載した方法により調製した。VII因子について記載したように、入射光に対し90°の光散乱を使ってタンパク質-膜結合を定量した（5mM カルシウムで、PS/PC、(25/75)の25 μg/mL、(0.05 M Trisバッファー-0.1 M NaCl, pH 7.5)）。
【００８１】
位置11にヒスチジンを含有するウシプロテインCは、野生型タンパク質より約10倍高い親和力で膜と相互作用した。式２に合わせると、該データは、プロテインC‐H11に対して930±80 nM、そして野生型プロテインCに対して9200±950 nMのKD値を得た（図8A）。親和力の差は、25℃で約1.4 kcal/molに相当した。実際、ウシプロテインC-H11の膜親和力は天然のヒトプロテインCのそれとほとんど同一であった（660 nM、図8B）。これは、プロリン11がヒトとウシタンパク質の間の膜結合部位の違いの主たる根拠であることを示唆した。
【００８２】
逆置換、すなわちヒトプロテインCのHis-11のプロリンによる置き換えは、膜親和力を低下させる（図8B）。式２に合わせると、これらのデータは野生型ヒトプロテインCに対して660±90 nM、そしてヒトプロテインC-P11に対して3350±110 nMのKD値を得た。プロリン導入の影響は、ウシタンパク質におけるプロリンの影響よりごくわずか小さかった。
【００８３】
活性型プロテインCの活性に対するプロリン-11の影響
活性型プロテインCは、トロンビン切断により、野生型および変異タンパク質の両方に同一の条件を使って作製することができる。各種のプロテインC調製物（1 mg/mL）の約150μgを、ウシトロンビン（3 μg）と混合し、37℃で5時間インキュベートした。反応産物を0.025 M Trisバッファー0.05 M NaClに希釈し、SP-Sephadex C-50の1 mLカラムにアプライした。カラムを同じバッファー 1 mLで洗浄し、通過物を活性型プロテインCとしてプールした。カラムにアプライしたタンパク質の約65-80%が回収された。APC活性を、25℃でS2366（0.1 mM）のタンパク質分解（proteolysis）により決定した。調製物を、もっと大規模で得た標準調製物と比較した。標準ヒトAPCはウォルター・キジェル博士（Dr. Walter Kisiel）から提供を受けた。ウシタンパク質については、標準物はトロンビン活性型APCの大規模調製物であった。ウシAPCの活性は、正常および変異タンパク質の全ての調製物と一致した（±5%）。ウシAPCの２つの調製物を比較に使った。トロンビンから作製したヒトAPCは、標準に対して55〜60%の活性があった。この研究で提示された濃度は、S2366に対する活性に基いており、標準の活性と関連させた。
【００８４】
標準APTT試験は、ウシまたはヒト血漿および標準APTT試薬（Sigma Chemical Co.）を、製造者の指示書に従って使用した。あるいは、リン脂質は高度に精製されたリン脂質から形成された小胞の形で提供された。このアッセイにおいて、ウシ血漿（0.1 mL）を、カオリン（0.05 M Trisバッファー、0.1 M NaCl、pH 7.5中に5 mg/mLの0.1 mL）またはエラギン酸（ellagic acid）（バッファー中に0.1 mM）のいずれかで5分間、35℃でインキュベートした。凝固は、リン脂質を含有するバッファーの0.1 mLおよび示されたAPCの量を加えることにより開始し、その後、25 mM塩化カルシウムの0.1 mLを加えた。全ての試薬は、0.05 M Trisバッファー、0.1 M NaCl、pH 7.5を含有する標準バッファー中で使った。該H11変異体の影響を再現するには、平均で14倍高い濃度の野生型bAPCを要した。10 nM bAPC-H11での凝固時間は120分より長かった。この血漿について、標準APTT試薬（Sigma Chemical Co.）は、35℃で約61秒の凝血時間をあたえた。血塊形成に要する時間をマニュアルで記録した。リン脂質の量がアッセイの制限要素となり、示された血塊形成時間を与えるように設計した。使ったリン脂質は、SUV（最終アッセイで45 μg/0.4 mL、PS/PC、10/90）またはLUV（最終アッセイで120 μg/0.4 mL、PS/PC、25/75）であった。
【００８５】
活性型プロテインCの抗凝固活性を複数の方法で試験した。図9は、リン脂質を限定して実施した、APTTアッセイに与える影響を示す。このアッセイ条件のもとで、凝固時間は、リン脂質濃度とともにほぼ反比例関係で低下した。ウシAPC-H11と効果を等しくするために、約14倍量の野生型ウシAPCを必要とした。
【００８６】
図9の研究の一部を、PS/PC（27/75, LUV）の膜に対して繰返した。再び、活性をリン脂質により制限し、かつその濃度を360秒の制御血塊形成時間をあたえる様に調節した（0.4 mLアッセイで25% PSの120 μg）。H11変異体と影響を等しくするために、約15倍量を超える野生型酵素を必要とした。最後に、標準APTT試薬（Sigma Chemical Co.、標準血塊形成時間50±2秒）を使った。凝固時間を2倍の102±5秒にするために、約10.0±0.7 nMの野生型酵素を必要とした。同じ影響は、2.2±0.1 nMのウシAPC-H11により与えられた。標準アッセイでは、リン脂質は律速でなかったので、膜親和力に与える影響は小さいと考えてよい。
【００８７】
ヒトタンパク質の結果を図8Bに示す。凝固を野生型APCの程度にまで延長するために、プロリン-11を含有するヒトAPCを約2.5倍必要とした。プロリン-11導入の影響が低いのは、ヒトタンパク質の膜親和力の差が小さいことを反映するのであろう（図9B）。
【００８８】
第Va因子の不活性化
第Va因子不活性化をニコラスら（Nicolaesら, 1996, Thrombosis and Haemostasis, 76:404-410）の方法によりアッセイした。簡単に説明すると、ウシタンパク質については、ウシ血漿を、0.05 M Tris、0.1 M NaCl、1 mg/mLウシ血清アルブミンおよび5 mMカルシウム、pH 7.5により1000倍に希釈した。第V因子を活性化するために、リン脂質小胞（5 μg/0.24 mLアッセイ）および190 nMトロンビンの5 μLを加えた。37℃で10分間インキュベーションの後、APCを加え、インキュベーションを6分間続けた。ウシプロトロンビン（最終濃度10 μMに）および第Xa因子（最終濃度0.3 nM）を加えて、該反応物を37℃で1分間インキュベートした。この活性化反応物の20μLサンプルを、S2288基質（60μM）を含有するバッファー（0.05 M Tris, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5）の0.38ｍLに加えた。トロンビンの量を405 nMの吸収の変化により定量した（ε=1.0*104 M-1s-1、トロンビン=100/sに対するkCAT）。ヒトタンパク質については、ヒトプロテインS-欠損血漿（Biopool Canada, Inc.）を100倍希釈し、第Va因子をヒトトロンビンにより活性化し、そして産生した第Va因子をウシタンパク質に対して使用した試薬を用いてアッセイした。
【００８９】
ウシAPC-H11は、第Va因子の不活性化において、野生型（図10A）より9.2倍活性が高かった。膜結合(上記)に関して、ヒトタンパク質についてはプロリン-11の影響はそれより小さく、野生型とP11変異体に対して引いた曲線間には平均2.4倍の差があった（図10B）。同様な結果を正常なヒト血漿で得た。
【００９０】
実施例４  ビタミンＫ依存性タンパク質の膜接触部位に対する原型膜親和力の同定
様々なヒトおよびウシプロテインＣ変異体ならびに他のビタミンＫ依存性ポリペプチドを比較して、膜接触部位原型（membrane contact site archetype）を提案するに至った。静電気原型は、結合カルシウムイオンにより作られたタンパク質表面上の電気陽性コアからなり、タンパク質のアミノ酸からくる電気陰性電荷のかさ（halo）により囲まれている。このタンパク質ファミリーのメンバーがこの静電気パターンに接近しているほど、膜に対する親和力は高い。
【００９１】
リン脂質小胞、野生型ウシプロテインＣ、タンパク質-膜相互作用研究、プロテインＣの活性化および定量、ならびに活性分析は、実施例3に記載の通りであった。
【００９２】
組換え、変異型プロテインＣを次の方法によって作製した。部位特異的突然変異誘発は、PCR法で実施した。次のオリゴヌクレオチドを合成した；A、実施例３に記載のとおり。F、5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3'（配列番号11）（ベクターpRc/CMV中のヌクレオチド984-1019に相当する）、pRc/CMVとプロテインＣの間のXbaI部位を作る；G、5'-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC-3'（配列番号12）（ウシプロテインＣのアミノ酸残基40-27に対応し、第8および第9アミノ酸は下線でマークしたようにQNからEDに変異されている）；H、5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3'（配列番号13）（ヒトプロテインＣのアミノ酸残基38-27に対応し、第6および第7アミノ酸は下線で示したようにQNからEDに変異されている）、I、5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3'（配列番号14）（ヒトプロテインＣのアミノ酸残基27-38に対応し、この配列の第6および第7アミノ酸は下線で示したようにQNからEDに変異されている）；J、5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3'（配列番号15）（ヒトプロテインＣのアミノ酸残基38-27に対応し、この配列の第7アミノ酸は下線で示したようにQからEに変異されている）；Ｋ、5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG-3'（配列番号16）（ヒトプロテインＣのアミノ酸残基27-38に対応し、この配列の第6アミノ酸は下線で示したようにQからEに変異されている）。
【００９３】
ウシおよびヒトプロテインＣ両方の全長cDNAを、ベクターpRc/CMVのHind IIIおよびXba I部位中にクローニングした。ウシプロテインＣ変異体E33D34を取得するために、標的DNAのPCR増幅を次のように実施した。5'末端から位置40のアミノ酸までを含有するウシプロテインＣ cDNAを、無傷のウシプロテインＣ cDNAならびにプライマーAおよびCを用いて増幅した。PCR反応条件は、実施例3に記載のとおりであった。サンプルを、94℃で変性2分間、55℃でアニーリング2分間、および72℃で伸長2分間からなるPCRの30サイクルにかけた。増幅後、DNAを、1mM EDTAを含有する40mM Tris-酢酸バッファー中で0.8%アガロースゲルを通して電気泳動した。PCR産物をThe Geneclean IIIキット（BIO 101, Inc. USA）を用いて精製し、それぞれの変異を含有するウシプロテインＣ cDNAのPCR断片をHind IIIおよびBbs Iで切断した。Hind III/Bbs I断片およびヒトプロテインＣ断片（Bbs I-3'末端）を、pRc/CMVベクターのHindIIおよびXba I部位中にクローニングして、変異をもつ全長ウシプロテインＣ cDNAを作った。ウシプロテインＣ変異体H11 E33 D34を同じ方法で作製したが、ウシプロテインＣ変異体H11をPCR反応の鋳型として使った。
【００９４】
5'末端からアミノ酸38までを含有するヒトプロテインＣ cDNAを、無傷のヒトプロテインＣ cDNAならびにプライマーAおよびDを用いてPCR増幅した。アミノ酸27から3'末端までのヒトプロテインＣ cDNAを、無傷のヒトプロテインＣ cDNAならびにプライマーBおよびEを用いて増幅した。これらの２つのcDNA断片を鋳型として使って、プライマーAおよびBを用いて、変異アミノ酸（E33 D34）を含有する全長ウシプロテインＣ cDNAを増幅した。ヒトプロテインＣ変異体E33は次のステップにより得た；5'末端からアミノ酸38までを含有するヒトプロテインＣ cDNAを、無傷のヒトプロテインＣ cDNAならびにプライマーAおよびFを用いて増幅した。アミノ酸27から3'末端までのヒトプロテインＣ cDNAを、無傷のヒトプロテインＣ cDNAならびにプライマーBおよびGを用いて増幅した。これらの２つのcDNA断片を鋳型として使って、プライマーAおよびBを用いて、変異アミノ酸（E33）を含有する全長ウシプロテインＣ cDNAを増幅した。PCR混合物とプログラムは上に記載した通りであった。それぞれの変異体を含有するヒトプロテインＣのPCR産物をHind IIIおよびSal Iで切断し、その後、該断片（Hind III - Sal I）を無傷のヒトプロテインＣ断片（Sal I - 3'末端）と一緒に、pRc/CMVベクターのHind IIIおよびXba I部位中にクローニングして、それぞれの変異をもつ全長ヒトプロテインＣ cDNAを作製した。トランスフェクションの前に、全ての変異体をDNA配列決定によって確認した。
【００９５】
アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系293を、実施例３に記載したように、培養し、トランスフェクトした。ウシおよびヒト組換えプロテインＣおよび変異体を、実施例３に記載のように、精製した。
【００９６】
ビタミンＫ依存性タンパク質を、標準膜に対する親和力を基準として４グループに分類した（表４）。ヒトプロテインＣ（hＣ）、ウシプロテインＣ（bＣ）、ウシプロトロンビン（bPT）、ウシ第X因子（bX)、およびヒト第VII因子（hVII）を含む複数の関連タンパク質のアミノ末端残基の配列を、参照のために掲げたが、ここで、XはGla（γカルボキシグルタミン酸）またはGluである。
【００９７】
0004276379.tif 000010
【００９８】
【表４】
0004276379.tif 000011
a 高い方の親和力値はＫdissociation/1*107M-1s-1に等しく、分母は他のタンパク質との典型的なＫassociationである。
【００９９】
表４で、ビタミンＫ依存性ポリペプチド変異体は太字である。全電荷（残基1-34）は７個のカルシウムイオン（+14）およびアミノ末端(+1)を含む。
【０１００】
プロテインZは、解離速度定数が他のタンパク質のものより100-1000倍遅いことに基づいてクラス1に割り当てた。もしプロテインZが通常の会合速度定数（約107 M-1s-1）を示せば、ＫDは約10-10Mとなる（M. Wei, G. J.ら, 1982, Biochemistry, 21:1949-1959）。後者の親和力はビタミンＫタンパク質にとって可能な最大値であろう。クラスIVタンパク質はクラスIIIと、非静電的手段により親和力を変化しうるプロリン-11の存在する点で異なった。
【０１０１】
膜親和力と残基1-34の実効負電荷の間に相対的に弱い相関であるが、残基５、11、29、33および34だけを考えると優れた相関が見られる（表４）。後者のアミノ酸はタンパク質の表面に位置している。複数のタンパク質をプロトロンビン構造中へのアミノ酸置換によってモデル化し、その静電気ポテンシャルをデルフィプログラム（program DelPhi）によって計算した。ウシプロテインZの静電気ポテンシャルに従いパターン化したスケッチを図11に示す。７、８、26、30、33、34および11の電気陰性部位は電気陰性電荷のかさを作り、カルシウムライニングされた細孔により作られる陽イオン性コアを囲んでいる（図11）。タンパク質構造がこの構造に近づくほど、膜に対する親和力が高くなる。この相関は、野生型タンパク質、変異体および化学的に改変されたタンパク質から明らかである。
【０１０２】
他の構造のパターンは、他のタンパク質には存在しない電荷群を検証して外挿することができる。例えば、ウシプロトロンビンのLys-11およびArg-10はその近傍に高い電気的陽性領域を作り；プロテインＣおよび第VII因子のGla-33の欠如はこれらのタンパク質領域により低い電気的陰性電場を作る。全ての場合で、最高の親和力は、プロテインZについて示されるように電気的陰性タンパク質表面により完全に囲まれた電気的陽性コアをもつ構造に対応する。このパターンの例外は、構造的影響により親和力を低下させうるPro-11およびユニークな無荷電残基であるser-12を備えたタンパク質（ヒトプロテインＣ）である。
【０１０３】
さらに静電気分布についての原型の仮説を試験するために、部位特異的突然変異誘発を使ってウシおよびヒトプロテインＣのGln33Asn34を、Glu33Asp34（配列番号19）で置き換えた。Glu33はタンパク質プロセシング中にさらにGlaへ改変されるであろう。これらの変化は、ウシプロテインＣの静電気ポテンシャルを、ウシ第X因子のそれに変えた。変異タンパク質の膜親和力は、プロリン-11の存在によって第X因子のそれより低下することが予測された。実際、ウシプロテインＣ変異体は、ウシプロトロンビンのそれと同様な膜親和力を与え（図12A）、ウシ第X因子のそれよりわずかに低かった（表４）。
【０１０４】
さらに重要なのは、変異体に対するAPCによる凝血阻止は、野生型酵素に対するより大きかった（図12B、C）。実施例３からのウシプロテインＣのP11H変異体に対する結果を考慮すると、位置11,33および34のアミノ酸置換を変えることにより、それぞれ異なる膜親和力と活性をもつタンパク質のファミリーを作ることができるであろう。
【０１０５】
E33およびE33D34を含有するヒトプロテインＣ変異体は、膜結合親和力の小さな増加をもたらした（図13a）。これらの変異体の活性は野生型酵素よりわずかに低かった（図13b）。ウシプロテインＣの変異体の結果は、ヒトタンパク質のE33D34変異の不全（failure）が該タンパク質中のH11および／または他のユニークなアミノ酸から起こりうることを示唆する。図14Aは、ウシプロテインＣのH11変異体は野生型タンパク質より約10倍高い親和力で、またE33D34変異体は約70倍の親和力で膜に結合したこと、しかし三重変異体であるH11E33D34はH11変異体よりわずかに良好であったことを示す。この関係はこれらの変異体から形成されるAPCの活性に反映された（図14B）。この結果は、H11の存在が膜結合親和力に対するE33D34の影響を低下させることを示した。
【０１０６】
これらの結果は、E33D34の導入は全てのタンパク質にとって最適とは限らないことを示した。従って、E33D34を使いかつ最も増加した膜親和力を有するヒトプロテインＣを作製するための他の変異が望ましいであろう。ウシタンパク質についての結果は、ヒスチジン11がこの現象の主要原因であることを示唆した。従って、E33D34変異とともに、ヒトプロテインＣ中のH11をグルタミンまたは他のアミノ酸に変えることができる。親和力に影響を与えうる他のアミノ酸は、ヒトプロテインＣにとって全くユニークなアミノ酸である位置12のセリンである。これらの更なる改変は増強した膜親和力をもつタンパク質を作るであろう。
【０１０７】
静電気原型を、ヒトおよびウシ第X因子の比較によっても試験した。ヒト第X因子中にリシン-11が存在すると、ウシ第X因子より低い親和力を有するであろうことが示唆された。この予測は、図15に示した結果により支持された。
【０１０８】
今までの研究は、ウシおよびヒトプロトロンビン断片1のトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）改変は、膜親和力に相対的に小さい影響（0から5倍）を与えることを示してきた（Weber, D.J.ら, 1992, J. Biol. Chem., 267:4564-4569; Welsch, D.J.ら, 1988, Biochemistry, 27:4933-4938）。該反応に使われた条件はアミノ末端の誘導体化、すなわち膜親和力低下と結びつく変化をもたらした（Welsch, D.J.およびNelsestuen, G.L., 1988, Biochemistry, 27:4939-4945）。アミノ末端を保護するカルシウムの存在下でのタンパク質改変は天然の断片1より遥かに高い膜との親和力をもつTNBS改変タンパク質をもたらした。
【０１０９】
プロテインZが原型を構成するという示唆は、解離速度定数に基づきかつ正常な会合速度はＫD=10-10Mであろうということに基づいた。この値に到達しうるかは定かではない。不適当なタンパク質折りたたみ（folding）によりプロテインZの会合速度が遅くなり、低い膜結合コンフォメーション濃度を生じることは可能である。もし条件を変更してタンパク質折りたたみを改善することができれば、プロテインZの会合速度は改善されるであろう。実際、プロテインZの会合速度定数は、pHの変更により改善された。この観察の根拠は、アミノ末端（pH 7.5で+1）がカルシウムイオン2および3に近接して位置するプロトロンビン構造の異常な特徴と関係しているのであろう。アミノ末端の+1電荷は、図11のCa-1の丁度上のわずかな電気的陽性領域に原因がある。Caとアミノ末端の間の電荷反撥がタンパク質折りたたみを不安定化し、低い折りたたみ安定性をもつタンパク質にとって深刻な問題となりうるであろう。
【０１１０】
表５は、さらに原型モデルを支持する。ストロンチウムイオン1および8（プロトロンビンのSr X線結晶構造で見出されるカルシウム1および余分の二価金属イオンに対応する）からのイオン性基の距離の間の関係を示す。該パターンは、イオン性基がこれらの金属イオンに近いほど、その膜親和力に対する影響は高くなることを示唆する。例外は、電気的陽性コアの電荷に寄与するArg-16である。他の全ての部位では、高い親和力は電気的陰性電荷と相関がある。この相関はまた、GLA残基にも適用される。
【０１１１】
【表５】
0004276379.tif 000012
a  距離は、ウシプロトロンビンのこの原子（測定に使ったプロトロンビンの残基は括弧中に記載されている）から、Sr-プロトロンビン断片1構造のストロンチウム1および8迄である（Seshadriら, 1994, Biochemistry, 33:1087-1092）。
b  16-R以外の全てについて、陽イオンは親和力を低下しかつ陰イオンは親和力を増加する。
c  Thariathら, 1997, Biochem. J. 322:309-315。
d  GluのAsp変異に対する影響、距離はγ-カルボキシ-炭素に対する平均である。ＫD(ＫM)データは、Ratcliffeら, 1993 J. Biol. Chem. 268:24339-45からのものである。
e  結合はより低い力のものかまたは凝集を引き起こし、比較をより不確かにしている。
【０１１２】
図15Cの結果は、プロテインZに対する会合速度が、アミノ末端が無電荷となるpH9で実質的に改善されたことを示す。これらのデータから得たpH9における速度定数は、pH7.5におけるより約12倍高かった（図15C）。
【０１１３】
（他の実施態様）
本発明はその詳細な説明と関連づけて記載されているが、以上の記載は説明することを意図したものであり、添付した請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型VIIa（白丸）、VIIQ11E33（黒丸）およびウシ第Ｘ因子（黒三角）の膜への結合を、標準偏差と共に、示す。
【図２】  VIIQ11E33の自己活性化を示す。破線はリン脂質の非存在下での活性を示す。
【図３】  第VIIa因子による第Ｘ因子の活性化を示す。濃度0.06nMの場合の野生型第VIIa因子（白丸）およびVIIaQ11E33（黒丸）の結果を示す。
【図４】  可溶性の組織因子を含むVIIaおよびVIIaQ11E33によるヒト血漿の凝固を示す。
【図５】  第VII因子チモーゲンおよび通常の組織因子による血漿の凝固を示す。
【図６】  活性部位改変型第VIIaQ11E33因子(DEGR-VIIaQ11E33)による血塊形成の阻止を示す。
【図７】  ラットにおける第VIIQ11E33因子の循環時間を示す。
【図８】  通常のタンパク質および改変型のタンパク質による膜相互作用を示す。パネルＡは野生型ウシプロテインＣ（白丸）およびウシプロテインC-H11（黒丸）と小胞との相互作用を示す。パネルＢは野生型ヒトプロテインＣ（白丸）およびヒトプロテインC-P11（黒丸）と膜との相互作用を示す。両ケースにおいて、破線は、添加したタンパク質の全部が膜に結合したときの結果を示す。
【図９】  凝固時間に及ぼす活性型プロテインＣの影響を示す。パネルＡには、ウシ血漿の凝固時間の３回の測定値の平均および標準偏差を、野生型ウシAPC（白丸）およびbAPC-H11（黒丸）について示してある。パネルＢには、ヒト血漿の凝固時間の３回の測定値の平均および標準偏差を、野生型ヒト（白丸）およびヒトAPC-P11（黒丸）について示してある。
【図１０】  ウシおよびヒトAPCによる第Va因子の不活性化を示す。パネルＡは、野生型ウシAPC（白丸）およびウシAPC-H11（黒丸）による第Va因子の不活性化を示す。パネルＢは、野生型ヒトAPC（白丸）およびヒトAPC-H11（黒丸）によるプロテインＳ欠損血漿中のヒト第Va因子の不活性化を示す。
【図１１】  プロテインＺの静電的分布を示す。垂直線は電気陽性領域を表し、水平線は電気陰性領域を表す。
【図１２】  種々のプロテインＣの膜結合および活性を示す。パネルＡは、野生型プロテインＣ（白丸）、P11H変異型のプロテインＣ（黒四角）、Q33E,N34D変異型（黒丸）およびウシプロトロンビン（白四角）による膜結合を示す。パネルＢは、これらの変異型による血液凝固の阻止を示す。パネルＣは、第Va因子の不活性化を示す。
【図１３】  ヒトプロテインＣ変異型の膜結合および活性を比較したものである。パネルＡは、野生型（白丸）、E33（白三角）およびE33D34（黒丸）の膜結合を比較したものである。パネルＢは、野生型（白三角）、E33（白丸）およびE33D34（黒丸）を用いて凝固時間を比較したものである。
【図１４】  ウシプロテインＣの野生型（白四角）、H11（黒丸）、E33D34（白三角）および三重H11E33D34変異型（白丸）を用いて膜結合（パネルＡ）ならびに凝固阻止（パネルＢ）を比較したものである。
【図１５】  種々のビタミンＫ依存性タンパク質の膜相互作用特性を示す。パネルＡは、ヒト（黒丸）およびウシ（白丸）の第Ｘ因子の膜相互作用を比較したものである。パネルＢは、正常なウシプロトロンビン断片１（白丸）、カルシウムの非存在下でTNBSにより改変した断片１（黒丸）および25mMのカルシウムの存在下でTNBSにより改変した断片１（黒四角）による膜相互作用を示す。パネルＣは、pH９（黒丸）およびpH7.5（白丸）におけるプロテインＺの小胞への結合率を示す。
【配列表】
0004276379.tif 000013
0004276379.tif 000014
0004276379.tif 000015
0004276379.tif 000016
0004276379.tif 000017
0004276379.tif 000018
0004276379.tif 000019
0004276379.tif 000020
0004276379.tif 000021
【図１】
0004276379.tif 000022
【図２】
0004276379.tif 000023
【図３】
0004276379.tif 000024
【図４】
0004276379.tif 000025
【図５】
0004276379.tif 000026
【図６】
0004276379.tif 000027
【図７】
0004276379.tif 000028
【図８】
0004276379.tif 000029
【図９】
0004276379.tif 000030
【図１０】
0004276379.tif 000031
【図１１】
0004276379.tif 000032
【図１２】
0004276379.tif 000033
【図１３】
0004276379.tif 000034
【図１４】
0004276379.tif 000035
【図１５】
0004276379.tif 000036