(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ ハルジアナム（Trichoderma harzianum）を栄養培地で４８時間、１５℃〜３０℃で培養した後、該栄養培地から菌糸体を分離し、ついで分離した菌糸体から栄養成分を除去し、この栄養成分を除去した菌糸体をビタミン類のないショ糖、ＫＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＦｅＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３よりなる液状飢餓培地内において通常培養と同一環境内で７２時間〜１７０時間、１５℃〜３０℃で培養した後、生成された厚膜胞子を分離することを特徴としたトリコデルマ ハルジアナムの厚膜胞子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、通常培養で得た菌糸体を液状飢餓培地で培養し、効率よく厚膜胞子を得ることを目的としたトリコデルマ ハルジアナム（Trichoderma harzianum）の厚膜胞子の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来菌糸体微生物には、微量の厚膜胞子が含まれていることが知られていた。前記厚膜胞子は、環境対応性が高く、低温はもとより、高温においても対抗性が高いことが知られていた。またニンビヤ  スシルピコラＫ−００４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４４８）の厚膜胞子及びその誘導培地に関する発明の提案がある（特開平７−３０３４８１号）。
【０００３】
更に本特許出願人は、先に菌糸体微生物を飢餓培養して厚膜胞子を製造する発明を提案した（特願平１０−２０３８７６号）。
【０００４】
【発明により解決しようとする課題】
前記に示した天然に存在する厚膜胞子は、極めて微量である為に、これを有効使用できる程多量に集めて有効利用することは至難であった。
【０００５】
また前記公開発明に示された培地では、当該微生物には適応性があっても、一般に知られている菌糸体微生物の厚膜胞子を高い効率で多量生産することは困難であった。
【０００６】
前記出願人の先願発明は、一般的菌糸体微生物の厚膜胞子を多量生産できる点で劃期的であり、工業化により多大の効果が期待できるのであるが、より効率よく多量生産するについて改善の余地があった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記問題点の改善に鑑み、本発明者等は、トリコデルマ ハルジアナムについて鋭意研究の結果、液状飢餓培地による培養が可能であり、その倍養環境は普通環境で十分生育できる知見を得ると共に、飢餓培地にビタミン無添加で厚膜胞子が効率よく多量生産できる知見を得て更に研究の結果、この発明を完成したのである。
【０００８】
即ちこの発明は、トリコデルマ ハルジアナム（Trichoderma harzianum）を栄養培地で４８時間、１５℃〜３０℃で培養した後、該栄養培地から菌糸体を分離し、ついで分離した菌糸体から栄養成分を除去し、この栄養成分を除去した菌糸体をビタミン類のないショ糖、ＫＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＦｅＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３よりなる液状飢餓培地内において通常培養と同一環境内で７２時間〜１７０時間、１５℃〜３０℃で培養した後、生成された厚膜胞子を分離することを特徴としたトリコデルマ ハルジアナムの厚膜胞子の製造方法である。
【０００９】
次に、請求項１記載の製造方法で得たトリコデルマハルジアナムの厚膜胞子と炭酸カルシウム、脱脂した米糠及びふすまにパーライトを加えた混合物に前記厚膜胞子を０．０１％（重量）〜１００％（重量）加え、水分６％〜１２％とした微生物資材として使用する。
【００１０】
この発明で使用する栄養培地は、公知のＬｅｏｎｉａｎ培地と、ポテトデキストロース培地などを使用することができる。
【００１１】
次にこの発明で使用する飢餓培地としては、ショ糖（又はグルコース、マルトース等の炭素源）、ＫＮＯ3 （又はＮａＮｏ3 等の窒素源）、ＫＨ2 ＰＯ4 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、ＣａＣｌ2 、ＺｎＳＯ4 、ＣｕＣｌ2 、ＦｅＳＯ4 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、Ｈ3 ＢＯ3 及び水よりなるビタミン類を含まない液状飢餓培地が有効である。
【００１２】
次に前記微生物資材は、炭酸カルシウム、脱脂した米ぬか及びびふすまを重量比で１：１：１で混合して微粉砕し、これに拡散剤（例えば市販の「エーロゾルＯＴ」（商標）、和光純薬工業株式会社）、展着剤（例えば市販の「新リノー」（商標）、日本農薬株式会社）を加え、これに同量のパーライトを混合し、厚膜胞子を加えたものである。
【００１３】
前記混合物の割合も重量比で１：１：１の混合比に限定されることはない。即ち厚膜胞子の発芽、成長に際しての栄養源としての役割を果たすものとなっていれば良いので、発芽環境に応じて適宜選択する。また前記混合物を、水分を６％〜１２％にして、一定量宛カプセルに封入し、製品とすれば、保存、移送及び使用に便利である。
【００１４】
前記栄養成分はこれに限定されることなく、厚膜胞子の発芽、成長に資するものは適宜使用し、かつ割合を変えることができる。前記栄養成分に加入する厚膜胞子の量は、使用目的に応じ、０．０１％（重量）〜１００％（重量）の割合に混入し、あるいは施用処理物によって１〜１万倍に希釈される場合もあるが、何れにしても、保存中又は輸送中の資材は、水分を６％〜１２％に保ち、中途の発芽を未然に防止する必要がある。
【００１５】
前記のように、施用条件によって厚膜胞子量が著しく相違するのは、施用後の発芽増殖の見込みにより異なるからである。今後の継続的研究により病源菌の種類、施用環境、発芽増殖の可能性など、各種実験を経ることにより、最も経済的かつ有効な使用方法が判明することになる。
【００１６】
この発明が提案する厚膜胞子は、菌糸体微生物を飢餓培養して得た厚膜胞子を施用処理物へ０．０１〜１００重量％混入させ、若しくは前記厚膜胞子を施用処理物で１〜１万倍に希釈して使用する。ここで、厚膜胞子を施用処理物へ混入し、あるいは、厚膜胞子を施用処理物で希釈する前記範囲の下限は、厚膜胞子を発芽させて病原微生物の活動を抑えるという効果を期待する上で、最低でもこの程度の割合とすることが好ましいものであり、前記上限を越えても効果に大きな差が生じなくなることから定められるものである。なお、この範囲において、費用対効果の観点から検討して、最も好ましい範囲は、厚膜胞子を施用処理物へ１〜２０重量％混入させ、若しくは厚膜胞子を施用処理物にて５〜１００倍に希釈して使用する場合である。
【００１７】
前記における施用処理物は、厚膜胞子の栄養源となる物質を含むようにして構成することが好ましい。栄養源を、例えば、０．１〜１．０μｍ程度のサイズに微粉砕し、これを含めて前記施用処理物を構成しておけば、栄養素が吸収されやすくなり、厚膜胞子の発芽、成長にとって有利である。
【００１８】
この発明における厚膜胞子とは、菌糸体の先端または中間の細胞に貯蔵物質が集積して、形が大きく、しかも細胞壁が厚くなり、多くは壁が二重化した無性胞子である。また不適切な環境に耐えて生きるための胞子であって、本来は分散、生殖細胞的意味の胞子ではないが、固体に多数生じる場合には増殖にも役立つことが判明した。
【００１９】
この発明による厚膜胞子の収率は３×１０7 個／ｍｌ以上であって、先願発明より更に高収率である。また厚膜胞子の土壌中における発芽率は５０％〜９９％であった。
【００２０】
この発明における厚膜胞子は、熱耐性が大きく、例えば−５℃〜＋７０℃位までは、保存中に破壊されるおそれはない。尤も瞬間的には１００℃でも耐えられることが判明した。従って、この発明の厚膜胞子は、地球上における通常の生物生活温度に耐え得るということであり、特に微生物使用地帯又は使用時期の温度は１５℃〜４０℃程度であるから、厚膜胞子を多量生産し、地球上の如何なる場所へ発送しても輸送中の熱条件によって失効を招くおそれはなく、発芽率低下のおそれもない。
【００２１】
ただし、この発明の厚膜胞子は、保存中あるいは輸送中などにおける発芽を防止するために、保存中、輸送中などにおいては、その水分が６％〜１２％の範囲におさまるように取り扱う必要がある。
【００２２】
従来、病原微生物の活動を抑える有用な微生物は各種提案されていたが、何れも菌糸体及び分生胞子を使用していたので、発芽率が悪いのみならず、輸送又は保存中の熱管理不十分の為に、一層発芽が悪くなり十分の効力を発揮できない場合があり、効力の安定性について不十分であった。
【００２３】
しかしながら、病原微生物の活動を抑える有用な微生物の厚膜胞子を用いることにより、輸送又は保存の後であっても、少くとも厚膜胞子は予定通り発芽してその性能を十分発揮することができるので、病原微生物の活動を抑えるという効果の安定性が保たれることが判明した。
【００２４】
一般に病原微生物の活動を抑える有用な微生物は、化学農薬と比較して下記のように幾多の利点がある。
【００２５】
１．病原微生物に対する選択性が高く、生態系を乱す恐れがない。
２．作物に被害を生じるおそれがない。
３．人畜・魚介類に対し危害がない。
４．病害虫の病原菌に対する抵抗性を与えない。
５．水や土壌や作物への汚染や蓄積がない（長期使用による耐性の生成がない）。
【００２６】
前記において、特に病原微生物に対する抵抗性を与えない点は、長期間使用しても効力の減少又は消滅がないことを意味し、微生物の使用に重要な特性である。
【００２７】
例えば土壌菌から抽出し、又はその生成物を利用する抗生物質は、人類を病気から護る点で抜群の効果があるが、これを連続して使用することによって病原菌に耐性を付与し、抗生物質に耐性のある病原菌が出て来ているので、これに対し新規抗生物質の開発を余儀なくさせていることは、しばしば経験する所である。この一点だけでも厚膜胞子が如何に優れているかが判る。
【００２８】
前記厚膜胞子の製品化については、単独又は分生胞子と混合してマイクロカプセルに封入したり、あるいは顆粒化、錠剤化、微粉化するなど、従来公知の商品形態は何れも使用することができる。この発明の厚膜胞子は、水分が６％〜１２％の範囲におさまるような乾燥状態で保存することが唯一の条件であり、長期保存（１年以上）であっても、乾燥状態におけば、発芽率の低下は認められなかった。
【００２９】
【実施例】
トリコデルマ ハルジアナムＳＫ５５（ＦＥＲＭ ＢＰ４３４６）を、タンク内の下記培地に接種し、４８時間、１５℃〜３０℃で好気的に培養した後、前記培地から菌糸体（例えば５μ以下の大きさ）を分離し、菌糸体の５倍〜１００倍の滅菌した水又は生理食塩水に入れて洗浄し、菌糸体の表面に付着している栄養分を悉く除去する。
【００３０】
栄養培地の配合割合
グルコース                ６．２５  ｇ
麦芽エキス                ６．２５  ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4               １．２５  ｇ
酵母エキス                １．０    ｇ
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ      ０．６２５ｇ
ペプトン                  ０．６２５ｇ
蒸留水                    １０００ｍｌ
前記のようにして栄養分を除去した菌糸体を、下記飢餓培地に接種し、７２時間〜１７０時間、１５℃〜３０℃で好気的に培養した。
【００３１】
飢餓培地の配合割合
ショ糖                          ２０  ｇ
ＫＮＯ3                       １．０  ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4                   １．０  ｇ
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ          ０．５  ｇ
ＣａＣｌ2                     ０．１  ｇ
ＺｎＳＯ4                     ２．０ｍｇ
ＣｕＣｌ2                     ０．１ｍｇ
ＦｅＳＯ4                     ０．２ｍｇ
Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ      ０．２ｍｇ
Ｈ3 ＢＯ3                   ０．０１ｍｇ
蒸留水                      １０００ｍｌ
前記のようにして培養したならば、ミクロフィルターにより篩い分ける（例えば大きさ５μ〜１０μの厚膜胞子を分離する）。
【００３２】
前記と同一条件で数回実験した所、厚膜胞子の収量は、３×１０7 個／ｍｌ以上であった。この発明において、極限環境（温度、ｐＨ）における厚膜胞子の形成率は、通常の条件に比べて悪いことを確認した。
【００３３】
（実験例）
前記実施例と同様に通常培養した菌糸体から栄養分を洗除した後、下記飢餓培地に接種し、７２時間〜１７０時間、１５℃〜３０℃で好気的にで培養した。
【００３４】
飢餓培地の配合割合
ショ糖                          ２０  ｇ
ＫＮＯ3                       １．０  ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4                   １．０  ｇ
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ          ０．５  ｇ
ＣａＣｌ2                     ０．１  ｇ
ＺｎＳＯ4                     ２．０ｍｇ
ＣｕＣｌ2                     ０．１ｍｇ
ＦｅＳＯ4                     ０．１ｍｇ
Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ      ０．２ｍｇ
Ｈ3 ＢＯ3                   ０．０１ｍｇ
ビオチン                      ４．０ｍｇ
チアミン                      ２．０ｍｇ
蒸留水                      １０００ｍｌ
前記培養後、厚膜胞子を分離した所、５×１０6 個／ｍｌ以下であった。前記によりビタミン類の添加によって厚膜胞子の収量が低下することが明らかとなった。
【００３５】
前記ビタミンは、少量（例えば１／２以下）ならば添加しても収量に影響がないのか、少しでもあれば収量に影響があるのか、不明である。更に培養環境を飢餓環境（例えば温度を３５℃〜４５℃としたり、ｐＨを５〜４にする）とする必要がないことは確認したが、培養環境の変化による影響については今後の研究課題となる。
【００３６】
【発明の効果】
この発明は液状飢餓培地を用いると共に、飢餓培地にビタミン類を含ませないようにしたので、厚膜胞子の収量を著しく増大させた効果がある。
【００３７】
また飢餓培地による培養環境を通常環境（一般栄養培地による培養環境）としたので、厚膜胞子の培養が容易となり、かつ容易に多量の厚膜胞子を製造し得る効果がある。この発明の微生物資材は、必要な場所に散布し、水分を付与するのみで厚膜胞子が容易かつ活性のある発芽をして病源菌を制圧できる効果がある。