(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）以下の群より選択される第一の受容体のリガンド結合ドメインを含む、機能的ドメイン：
低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体、
アセチル化ＬＤＬ受容体、
腫瘍壊死因子α受容体、
トランスフォーミング増殖因子β受容体、
サイトカイン受容体、
ホルモン受容体、
グルコース受容体、
糖脂質受容体、および
グリコサミノグリカン受容体、ならびに
（ｂ）該第一の受容体以外の哺乳類細胞表面受容体に結合するアミノ酸配列を含む担体ドメインであって、該哺乳類細胞表面受容体が以下の群より選択される、担体ドメイン：
低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体、
トランスフェリン受容体、
ＣＤ４、
リポ蛋白質（ａ）受容体、
LDLR様蛋白質（LRP）受容体、
アセチル化ＬＤＬ受容体、
マンノース受容体、および
マンノース−６−リン酸受容体
を含む、キメラ蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のキメラ蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを発現する、遺伝的に改変された哺乳類細胞。
【請求項４】
哺乳類細胞が、ヒト細胞、ブタ細胞、ハムスター細胞、ウシ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ネコ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、およびチンパンジー細胞からなる群より選択される、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
哺乳類細胞が、ヒト線維芽細胞、ヒト表皮角化細胞、ヒト上皮細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト内皮細胞、ヒトグリア細胞、ヒト神経細胞、血液の有形要素、ヒト筋細胞、ヒト肝細胞、およびこれらのヒト細胞種の前駆体からなる群より選択される、請求項３記載の細胞。
【請求項６】
不死化細胞である、請求項３、４、または５記載の細胞。
【請求項７】
一次細胞または二次細胞である、請求項３、４、または５記載の細胞。
【請求項８】
機能ドメインが低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体のリガンド結合ドメインを含み、かつ担体ドメインがトランスフェリン受容体に結合するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項９】
機能ドメインがグリコサミノグリカン受容体のリガンド結合ドメインを含み、かつ担体ドメインがトランスフェリン受容体に結合するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１０】
機能ドメインが糖脂質受容体のリガンド結合ドメインを含み、かつ担体ドメインがトランスフェリン受容体に結合するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１１】
低密度リポ蛋白質を細胞内へ輸送するための組成物の製造における、請求項１に記載のキメラ蛋白質の使用であって、低密度リポ蛋白質と低密度リポ蛋白質のリガンド結合ドメインとの結合、および該キメラ蛋白質の担体ドメインのアミノ酸配列とヒト細胞上の細胞表面受容体との結合に適した条件であって、その結合によって該キメラ蛋白質と低密度リポ蛋白質との複合体が形成され、該複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に輸送される条件下において、
低密度リポ蛋白質が、
a）ヒト低密度リポ蛋白質受容体のリガンド結合ドメインを含む機能的ドメインと、ヒト低密度リポ蛋白質受容体以外のヒト細胞表面受容体に結合するアミノ酸配列を含む担体ドメインとを含む該キメラ蛋白質、および
b）該キメラ蛋白質の担体ドメインのアミノ酸配列に結合する表面受容体を保持するヒト細胞
と結合することによって、低密度リポ蛋白質が細胞内へ輸送されるものである、使用。
【請求項１２】
担体ドメインが、ヒトトランスフェリン受容体に結合するヒトトランスフェリンのアミノ酸配列を含む、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
個体の血流内の低密度リポ蛋白質のレベルを低下させるための組成物の製造における、請求項１に記載のキメラ蛋白質の使用であって、該キメラ蛋白質はヒト低密度リポ蛋白質受容体のリガンド結合ドメインを含む機能的ドメインと、ヒト低密度リポ蛋白質受容体以外のヒト細胞表面受容体に結合するアミノ酸配列を含む担体ドメインとを含み、該個体の血流内の低密度リポ蛋白質が該キメラ蛋白質中の低密度リポ蛋白質のリガンド結合ドメインに結合し、該キメラ蛋白質の担体ドメインがヒト細胞表面受容体に結合し、それによって低密度リポ蛋白質を結合させたキメラ蛋白質が該細胞表面受容体を保持する細胞内に輸送され、それによって該個体の血流内の低密度リポ蛋白質のレベルが低下するものである、使用。
【請求項１４】
担体ドメインが、ヒトトランスフェリン受容体に結合するヒトトランスフェリンのアミノ酸配列を含む、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
選択物質を哺乳類細胞内に導入するための組成物の製造における、請求項１に記載のキメラ蛋白質の使用であって、細胞表面受容体、該キメラ蛋白質および選択物質が複合体を形成し、該複合体が細胞表面受容体に結合して、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞内に輸送されるように、哺乳類細胞が機能的ドメインで選択物質に結合し担体ドメインで哺乳類細胞上の細胞表面受容体に結合する該キメラ蛋白質と接触し、それによって選択物質が哺乳類細胞内に導入されるものである、使用。
【発明の詳細な説明】
説明
関連出願
本出願は、1995年6月6日に申請された、マイケル・W・ハートライン（Michael W. Heartlein）、ジェフリー・F・レモント（Jeffery F. Lemontt）およびマイケル・F・コンシノ（Michael F. Concino）による米国特許出願第08/470,058号、表題「選択された物質の細胞内への輸送に用いるためのキメラ蛋白質（Chimeric Protein For Use in Transport of a Selected Substance Into Cells）」の継続出願であり、その開示内容はすべて参照として本明細書に組み込まれる。
発明の背景
細胞膜を介した分子の輸送は、細胞および全体としての生物体のレベルでの恒常性を媒介する、生理的機構における重要な構成要素である。細胞の構成要素の集合体において直接的または間接的に用いられる分子は、通常、選択された物質と結合して特異的な細胞型への取り込みを媒介する特異的な細胞表面受容体の作用によって、細胞外液から細胞内に輸送される。また、細胞の活性に影響を及ぼす多くのホルモン、酵素および薬物が、特異的な細胞表面受容体によって細胞内へ輸送される。さらに、生体内で産生される（正常または防御性の代謝経路を介して）、または消化もしくは曝露によって導入される毒性分子は、特定の細胞によって取り込まれ、隔離または代謝を受ける。
内因性産物および外来性物質の両方の物質の、血液またはリンパ液などの細胞外液からの除去は、生理的に適切に行われることが多い。しかし、多くの状況では、除去に障害が生じたり、望ましい程度に達しないことから疾患が生じる。その1つの例は、異常高値およびそれに付随する有害作用を避けるために一定の制御速度で除去されなければならない天然物質であるLDLコレステロールに関するものである。ヒトにおける高コレステロール血症は、血清総コレステロール値の上昇を特徴とする病態である。本症は一般に、低密度リポ蛋白質（LDL）コレステロールの過剰、または高密度リポ蛋白質（HDL）コレステロールの不足によって起こり、動脈硬化および冠動脈疾患につながることが多い。LDLは肝臓で産生されるアポリポ蛋白質を材料として血液中で連続的に形成される。一定の定常レベルを維持するために、LDLは形成速度と同じ速度で血液から除去される。LDLの除去に障害が起こると、LDLの血中レベルは上昇し、動脈硬化の危険性が高まる。動脈硬化は米国において他を圧する最大の死因であり、全死亡数の過半数を占める（Harrison’s Priciples of Internal Medicine（ハリソン内科学）、J. D. Wilsonら編、第12版、p. 995、McGraw-Hill、New York、1991）。
LDL粒子は、血清総コレステロールのうちほぼ60〜70％を運んでいる。LDLは、ほぼ1500個のコレステロール分子を含む油性の核を有する大きな球状粒子であり、それぞれのコレステロール分子はエステル結合によって長鎖脂肪酸と結合している。核の周囲は、リン脂質および非エステル化状態のコレステロール分子が、リン脂質の親水性頭部が外側を向く様式で配列して取り囲んでおり、このためにLDLは血液または細胞間液中に溶解しうるようになっている。それぞれのLDL粒子には、巨大蛋白質分子であるアポリポ蛋白質B-100（ApoB-100）1分子が、LDLの親水性被膜部分に埋め込まれて存在する。ApoB-100は、細胞表面に存在するLDL受容体によって認識され、これと結合する。LDL受容体と結合したLDLは細胞内に運び込まれ、そこでこの2つは分離する。LDL受容体は細胞表面で再利用され、LDLはリソソームに輸送される。リソソーム中でLDLは処理を受け、非エステル化状態のコレステロールが遊離される。遊離したコレステロールは、すべての細胞において、新たに合成された細胞膜に取り込まれ、特殊な細胞ではその他の目的にも使用される（例えば、ステロイドホルモンの合成、胆汁酸の産生）。
血清LDLの定常レベルの大部分は、循環液中のLDLの除去に中心的な役割を果たす機能的肝LDL受容体（LDLR）の数によって決まる（Brown, M. S. およびGoldstein, J. L.、Science、232：34〜47（1986））。家族性高コレステロール血症（FH）の個体は、欠損型LDLRをもたらす変異に関してヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかが存在し、結果としてこれらの個体の血清LDLは過剰となると考えられる。血清LDLレベルが上昇しているその他の個体は、漏出性もしくはこれまで特定されていないLDLRの変異を有するか、または食事からの脂肪摂取量が高いために過剰なLDLが産生されている可能性がある。FH患者および上記の非FH患者はいずれも心血管系の危険性が高く、細胞取り込みの増加の結果としてLDL代謝を増加させることに基づく治療法によって利益を受けると考えられる。
したがって、選択された物質の細胞内への取り込みを増加させる方法を開発する必要性がある。これらの物質は、上記のように代謝されるものでもよく、細胞内過程に影響を及ぼすように設計され、このことから調節因子と考えられるものでもよい。このため、特定の細胞内過程を変化させる新たな調節因子を受容側の細胞に導入することにより、細胞活性を変化させることもできる。例えば、適切な調節因子を細胞内に導入することにより、蛋白質のリン酸化、特定の細胞内遺伝子の発現、および細胞の増殖性に関する細胞のパターンを変化させることができる。これらの調節因子は、酵素活性を有する蛋白質でも、特定の細胞標的と結合する蛋白質でもよく、この標的には核酸、蛋白質、炭水化物、脂質、または糖脂質を含むことができる。
発明の概要
細胞表面受容体は、選択された物質を細胞内に導入するための経路を提供する。受容体の天然のリガンドは、リガンドドメインを、細胞内で所望の効果を発揮し、インビボで治療的となる蛋白質ドメインと機能的に結合させたキメラ蛋白質の一部でもよい。または、この蛋白質ドメインは、代謝またはその他の代謝的処理のために細胞外液から除去される必要のある選択物質と結合していてもよい。
本発明は、血液またはリンパ液などの細胞外液中に存在する選択物質の細胞内への輸送に有用なキメラ蛋白質、キメラ蛋白質を用いての選択物質の定量分析、キメラ蛋白質をコードするDNA、キメラ蛋白質をコードするDNAを含むプラスミド、キメラ蛋白質をコードするDNAを含むように改変され、キメラ蛋白質を発現し、選択的には分泌する哺乳類細胞、キメラ蛋白質を産生する方法、キメラ蛋白質の単離の方法、選択物質を解析するためのキメラ蛋白質の使用法、およびキメラ蛋白質の投与によって選択物質の細胞内への輸送を引き起こし、選択物質の細胞外レベルを低下させる方法に関する。また、本発明は、キメラ蛋白質を発現および分泌している哺乳類細胞を個体に移植し、そこでキメラ蛋白質の発現および分泌を起こさせ、選択物質と結合させる遺伝子治療の方法にも関する。これによって生じる選択物質とキメラ蛋白質の複合体は体細胞に取り込まれ、その結果、選択物質の細胞外レベルは低下する。
選択される物質は、栄養分、代謝物、天然型ホルモン、もしくはリポ蛋白質などのように血液中に通常生じる（内因性に産生される）成分でも、または病原体、毒素、環境汚染物質、薬物もしくは薬学的製剤などのような外来性成分でもよい。いずれの場合においても、選択物質は、選択物質と選択的に結合するとともに1つまたはそれ以上の型の体細胞、特にヒト体細胞上に存在する細胞表面受容体とも結合するキメラ蛋白質によって、血液またはリンパ液などの細胞外液から除去される。この結果生じるキメラ蛋白質-選択物質複合体は、細胞表面受容体と結合して細胞内に輸送され、そこで隔離または代謝を受け、その結果として選択物質の細胞外レベルは低下する。
本発明のキメラ蛋白質は少なくとも2つの要素を含み、それは機能的ドメインおよび担体ドメインである。機能的ドメインは、細胞内に輸送させようとする選択物質と結合するアミノ酸（ポリペプチド）配列、または標的細胞に特殊な様式で影響を及ぼす配列を含む。担体ドメインは、1つまたはそれ以上の型の体細胞上に存在する細胞表面受容体と結合するアミノ酸（ポリペプチド）配列を含む。機能的ドメインであるアミノ酸配列は、選択物質のリガンド結合ドメインであってもよい。担体ドメインであるアミノ酸配列は、細胞表面受容体と結合することができる、すなわち細胞表面受容体リガンドであってもよい。機能的ドメインおよび担体ドメインは両方とも転写後修飾、例えば特定部位のグリコシル化を受けたものでもよい。選択物質が血液、リンパ液、または細胞外液の天然の構成要素である場合には、選択物質と結合するリガンド結合ドメインは、選択物質と通常の状態で結合する（すなわち、ヒト体内において選択物質と結合する）アミノ酸配列、そのような配列の結合特性を変化させた改変型のもの、またはヒト体内には通常は認められないが、合成的または遺伝子工学の手法によって産生され、選択物質と結合するアミノ酸配列である。例えば、機能的ドメインおよび/または担体ドメインは、コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーまたはファージ提示ライブラリー（phage display library）から選択されるアミノ酸配列であってよい。また、機能的ドメインおよび/または担体ドメインには、所望の選択物質または細胞表面受容体を認識する免疫グロブリンまたは単鎖抗体中の抗原結合ドメインである、免疫グロブリンまたは単鎖抗体の抗原結合ドメインも含まれる。選択物質が外来性成分である場合には、選択物質と結合するアミノ酸配列は、外来性成分と結合する天然のリガンド結合ドメイン、または外来性成分と結合するように設計されたアミノ酸配列から選択されたものである。細胞表面受容体と結合するアミノ酸配列は、典型的には、選択物質が通常結合する受容体以外の細胞表面受容体と結合する。このため、この方法は、生物体において通常使用されるものとは異なる経路による、選択物質の細胞への進入をもたらす。
キメラ蛋白質のドメインは、結果として生じるキメラ蛋白質が、選択物質および細胞表面受容体の両方と結合することができる限り、種々の配置をとって結合することができる。典型的には、この2つのドメインは組換えDNA分子中の単一のリーディングフレームによってコードされ、2つのドメインはペプチド結合によって結合する。この2つのドメインは、オープンリーディングフレームによってコードされる1つまたはそれ以上のアミノ酸によって分割されていてもよい。または、この2つのドメインは、別々のDNA分子から発現し、インビトロまたはインビボにおいて、非共有（例えば、疎水性またはイオン性の相互作用）または共有（例えばジスルフィド）結合のいずれかによって結合されてもよい。
選択物質がいったんキメラ蛋白質のリガンド結合ドメインと結合した場合、その結果として生じた複合体を、選択物質-キメラ蛋白質複合体と呼ぶ。選択物質-キメラ蛋白質複合体中に存在する細胞表面受容体リガンドは、その細胞表面受容体と結合し、複合体は細胞内に輸送され（例えばエンドサイトーシスによって）、このために選択物質の循環レベルは低下する。
1つの態様において、本発明は、LDLの細胞内への輸送に有用なキメラ蛋白質、キメラ蛋白質を含む薬学的組成物、キメラ蛋白質を用いてのLDLのアッセイ、キメラ蛋白質をコードするDNA、キメラ蛋白質をコードするDNAを含むプラスミド、キメラ蛋白質をコードするDNAを含むように改変され、キメラ蛋白質を発現し、選択的には分泌する哺乳類細胞（遺伝的に改変された細胞）、キメラ蛋白質の産生の方法、キメラ蛋白質の単離の方法、LDLを解析するためのキメラ蛋白質の使用法、およびLDLを細胞内に輸送させるキメラ蛋白質の投与によってLDLコレステロール（LDL）の細胞外レベルを低下させる方法に関する。
細胞外LDLレベルを低下させる1つの態様においては、LDL、およびLDL受容体（LDLR）以外の細胞表面受容体と結合するキメラ蛋白質を、血清コレステロールレベルを低下させる必要のあるヒト患者に投与する。細胞外LDLレベルを低下させるもう1つの態様では、キメラ蛋白質をコードするDNAを含むように改変された細胞を、個体に移植する。この個体では、キメラ蛋白質が遺伝的に改変された細胞中で発現し、そこから分泌され、血液中のLDLと結合してLDL-キメラ蛋白質複合体を形成し、遺伝的に改変されていない細胞内に輸送されることによって血清LDLコレステロールのレベルが低下する。
LDLの輸送および試料中のLDLのアッセイのために有用な本発明のキメラ蛋白質は、少なくとも2つの要素、すなわちLDLRのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を含む機能的ドメイン、および1つまたはそれ以上の型の体細胞、特にヒト体細胞上に存在するLDLR以外の細胞表面受容体と結合するアミノ酸配列を含む担体ドメインを含む。LDLの細胞内への取り込みを増加させるために有用なキメラ蛋白質の1つの態様においては、LDLRのリガンド結合ドメインを含むアミノ端配列（すなわち、LDL結合ドメイン）を、細胞表面受容体リガンドを含むC端配列と連結させる。LDL結合ドメインのカルボキシ末端は、細胞表面受容体リガンドドメインのアミノ末端と連結させる。
キメラ蛋白質の1つの態様においては、2つの要素は、ヒトLDLRのリガンド結合ドメインおよびヒトトランスフェリンである。LDLRのLDL結合ドメインを、成熟型ヒトトランスフェリン・ポリペプチドのアミノ末端と連結させる。このキメラ蛋白質は、LDLおよびトランスフェリン受容体の両方との結合能を有する。肝細胞などの細胞の表面にあるトランスフェリン受容体といったん結合すると、このキメラ蛋白質、およびキメラ蛋白質のLDLR要素と結合したLDLは、トランスフェリン受容体を介したエンドサイトーシスによるエンドサイトーシスを受け、その結果、LDLが細胞内に進入し、細胞外LDL濃度が低下する。トランスフェリン受容体は、幅広くさまざまな哺乳類細胞種に存在しており、キメラ蛋白質による、幅広いさまざまな哺乳類細胞におけるLDLの取り込みの促進を可能とする。
第2の態様において、キメラ蛋白質は、LDLRのリガンド結合ドメインである機能的ドメイン、および、血清アルブミン受容体、アシアロ糖蛋白質受容体、アデノウイルス受容体、レトロウイルス受容体、CD4、リポ蛋白質（a）、免疫グロブリンFc受容体、a-フェトプロテイン受容体、LDLR様蛋白質（LRP）受容体、アセチル化LDL受容体、マンノース受容体、またはマンノース-6-リン酸受容体などの、トランスフェリン受容体以外の細胞表面受容体と結合するアミノ酸配列である担体ドメインを含む。一般に、リガンドと結合し、インターナリゼーションを行うことができる任意の受容体と結合するアミノ酸配列を用いることができる。これらのキメラ蛋白質はLDLおよび細胞表面受容体の両方と結合し、幅広いさまざまな細胞内へのLDLの取り込みを増強させるために用いることができる。いったん受容体と結合すると、このキメラ蛋白質-LDL複合体はエンドサイトーシスを受け、その結果、LDLは細胞内に進入し、細胞外LDL濃度が低下する。
本発明のキメラ蛋白質は、キメラ蛋白質をコードするDNAを含む適当な哺乳類細胞によって産生される。本発明の改変された哺乳類細胞（すなわち、本発明のキメラ蛋白質をコードする核酸を含むように改変された哺乳類細胞）には、キメラ蛋白質をコードするDNAもしくはRNAを含むプラスミド、核酸断片、またはウイルスベクターを含むその他のベクターにより、安定的もしくは一時的なトランスフェクションまたは感染を受けた哺乳類細胞、またはキメラ蛋白質をコードするDNAもしくはRNA（例えば、DNAまたはRNAを含むプラスミド、核酸断片、またはウイルスベクターを含むその他のベクター）を含む改変された哺乳類細胞の前駆細胞に（直接的または間接的に）由来する哺乳類細胞が含まれる。
キメラ蛋白質を産生する本方法の1つの態様では、使用する哺乳類細胞は、キメラ蛋白質をコードするDNAを含んで発現する、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株などの細胞系である。選択的には、キメラ蛋白質は、トランスフェクションを受けたCHO細胞が培養されている培地中に分泌される。キメラ蛋白質を産生する本方法の第2の態様では、改変された哺乳類宿主細胞は、キメラ蛋白質をコードするDNAによるトランスフェクションもしくは感染を受けた一次または二次ヒト線維芽細胞などの、一次細胞または二次細胞である。改変された細胞（例えば、トランスフェクションもしくは感染を受けた一次または二次ヒト線維芽細胞）は、コードしているキメラ蛋白質を発現し、選択的にはそれを培地中に分泌する。または、トランスフェクションもしくは感染を受けた一次または二次細胞をヒトなどの個体に移植し、その体内でキメラ蛋白質を治療目的のために分泌させてもよい。
培養された改変細胞によって産生されるキメラ蛋白質は、任意の適当な方法によって細胞溶解物または培地から単離されたものでもよい。本明細書に記載するこのような1つの方法では、細胞表面受容体リガンドに対する抗体を用いて調製した抗体カラムとの第1の結合、溶出、および引き続いての、キメラ蛋白質のリガンド結合ドメインと結合する選択物質を保持するカラムとの結合によってキメラ蛋白質が単離されるアフィニティクロマトグラフィーに基づく。例えば、LDLおよびトランスフェリンに対する細胞表面受容体と結合するキメラ蛋白質は、抗トランスフェリン抗体カラムとの結合によってまず分離し、引き続いて抗LDL抗体カラムと結合させたLDLと結合させることによって単離することができる。この単離法の結果として、精製された完全なキメラ蛋白質を得ることができる。または、第1の分離段階において、キメラ蛋白質のリガンド結合ドメインが結合する選択物質を保持するカラムにキメラ蛋白質を結合させ、第2の分離段階において、それを細胞表面受容体リガンドに対する抗体を保持するカラムに結合させる。本明細書に記載するように、LDLRおよびトランスフェリンの両方のドメインを含むキメラ蛋白質が精製されている。
本発明のキメラ蛋白質は、選択物質であるLDLを肝細胞などの細胞内に輸送させ、それによってLDLの細胞外レベルを低下させるために有用である。これは、高コレステロール血症の個体などのヒトにおける血清LDLレベルの制御または低下などを行う場合に臨床的または治療的用途を有する。キメラ蛋白質の利用を通じて細胞内にLDLが輸送される本発明の方法の1つの態様においては、キメラ蛋白質を発現している細胞を、血清LDLレベルを低下させる必要のある個体に移植する。この個体の体内で、細胞はキメラ蛋白質を産生し、それが間質液に進入する。キメラ蛋白質は間質からリンパ液、および最終的には血流内に進入することができ、そこでLDLと結合し、その結果、キメラ蛋白質-LDL複合体を形成する。この複合体は、トランスフェリン受容体を有する細胞（例えば肝細胞）に（例えば血流を介して）到達し、トランスフェリンドメイン-トランスフェリン受容体相互作用の結果として細胞と結合する。キメラ蛋白質-LDL複合体は、通常トランスフェリンのインターナリゼーションに作用するトランスフェリン受容体を介したエンドサイトーシス経路によって取り込まれる。本方法のもう1つの態様では、精製された、または部分的に精製されたキメラ蛋白質を、細胞内へのLDLの輸送の増強が必要と考えられる個体（特にヒト）に投与する。
キメラ蛋白質は、内因性に産生される正常なもしくは異常な代謝物または栄養分（例えば、アセチル化低密度リポ蛋白質、アポリポ蛋白質E4、腫瘍壊死因子a、トランスフォーミング増殖因子β、サイトカイン、免疫グロブリン、ホルモン、グルコース、胆汁酸塩、糖脂質[ゴーシェ病の患者で蓄積するグルコセレブロシド、またはファブリ病の患者で蓄積するセラミドトリヘキソシドなど]、またはグリコサミノグリカン［ハンター症候群、ハーラー症候群、またはスライ症候群の患者で蓄積するものなど］）、または外来性物質（例えば、病原体、環境汚染物質、またはアルコール）の循環レベルを低下させる場合などにおいて、幅広いさまざまなその他の臨床的または治療的用途を有する。
本発明のキメラ蛋白質は、リガンド結合ドメインと結合する選択物質のアッセイ、特に定量分析にも有用である。例えば、血液中のLDL、免疫グロブリン、成長ホルモン、およびアポリポ蛋白質Eの濃度を決定するためのアッセイにこれを用いてもよい。また例えば、選択物質を解析するために、キメラ蛋白質を酵素結合アッセイなどの公知の方法における要素として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
図1は、正常なLDL受容体を介した経路（LDLR経路）、およびトランスフェリン受容体を介した経路（TFR経路）を通してのLDLの取り込みを、模式的に示したものである。
図2は、LDLR/TF発現プラスミドpEFBOS/LDLrTF1. Sを、模式的に示したものである。プラスミド中の特定の領域は、陰影または線で示している。pEF-BOSのXba-I断端を大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片で処理して平滑化し、EcoNI部位を同様に平滑末端化した融合遺伝子を含むEcoNI-SmaI断片、ライゲーションした結果、失われた制限酵素部位は、括弧内に示している。
図3A〜3Eは、pEFBOS/LDLrTF1. S中のキメラcDNAの核酸塩基配列（配列番号：1）およびこれに対応するアミノ酸配列（配列番号：2）であり、この中で、開始メチオニンは、融合タンパク質の最初のアミノ酸として示している；...は終止（ストップ）コドンを示す；下線を施したコドンは、キメラタンパク質の中のヒト  トランスフェリン部分を示す；下線のないコドンは、キメラタンパク質中のLDLR部分を示す、塩基配列第1〜13：LDLRの5’非翻訳配列、塩基配列第3236〜3428：トランスフェリンの3’非翻訳配列。
図4は、LDLR/TF発現プラスミドpEFBOS-LDLR/TF-710を模式的に示し、この中で、プラスミド中の特定の領域は、陰影または線で示している。
図5A〜5Fは、pEFBOS-LDLR/TF1-710中のキメラcDNAの核酸塩基配列（配列番号：3）およびこれに対応するアミノ酸配列（配列番号：4）であり、この中で、開始メチオニンは、融合タンパク質の最初のアミノ酸として示している；...は終止（ストップ）コドンを示す；下線を施したコドンは、キメラタンパク質の中のヒト  トランスフェリン部分を示す；下線のないコドンは、キメラタンパク質中のLDLR部分を示す；塩基配列第1〜13：LDLRの5’非翻訳配列および塩基配列第4244〜4603：トランスフェリンの3’非翻訳配列を示す。
図6は、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞で産生された、様々なLDLR/TFキメラタンパク質を、免疫親和性（IA）による精製の各段階において、非還元SDS-PAGE法およびウエスタンブロット法により解析した結果を示す。
図7は、表示したLDL濃度における、ヒトLDLのLDLR/TFキメラタンパク質に対する特異的な結合を、図示したものである。
図8は、キメラタンパク質のLDLに対する結合について、マイクロプレート結合解析を行った結果を、図示したものである。
図9は、LDLR/TFキメラタンパク質のウェスタンブロット法による解析結果を示したものである。
発明の詳細な説明
本発明の例示となるものは、インビボでの治療法のために選択物質を細胞に導入する方法である。さらに、本発明は、選択物質を細胞内に輸送するために設計された治療的蛋白質を産生させるための遺伝子治療の使用をも教示する。
本明細書に記載した通り、本発明者らは、キメラ蛋白質の使用、および選択物質の細胞への取り込みには通常用いられない機構によって、選択物質を細胞に取り込ませるための新たな戦略を開発した。このキメラ蛋白質は選択物質と結合し、また体細胞、特にヒト体細胞上に存在する細胞表面受容体とも結合する。キメラ蛋白質と選択物質との結合により、キメラ蛋白質-選択物質複合体が形成され、これは細胞表面受容体と結合し、受容体を有する細胞内に輸送される。選択される物質は、血液またはリンパ液などの細胞外液の天然の（内因性に産生される）成分、または薬物もしくは毒素などの外来性成分であってよい。本発明のキメラ蛋白質は、それ自体が個体に輸送もしくは投与されるか、または、キメラ蛋白質を発現して分泌する細胞を個体に導入し、そこでキメラ蛋白質を産生および分泌させる遺伝子治療の方法によって個体に提供される。このキメラ蛋白質は、その個体の細胞外液（例えば、血液、リンパ液）中で、選択物質と選択的に結合し、その結果、選択物質-キメラ蛋白質複合体を生じる。この複合体のリガンド結合ドメインは、個体の体細胞上の細胞表面受容体と結合する。複合体は、それが結合した細胞内に輸送され、その結果、選択物質の細胞外レベルは低下する。
血清LDLレベルを低下させるためのキメラ蛋白質
1つの態様において、本発明者らは、ヒト体内では通常起こらず、家族性高コレステロール血症の個体に生じることが知られる、欠損型LDLRから回避する、またはLDLRのレベルの低下を補い、細胞（正常な数の機能的LDLRを有する細胞、およびLDLRの数が異常である細胞）がLDLを取り込む能力を補強または増加させる、ヒトLDLの取り込みのための新たな戦略を開発した。この新たな方法は、機能的LDLRの数が異常であるか正常であるかにかかわらず、肝細胞内へのLDLの輸送を増強させる。本発明者らは、ヒト細胞表面膜上に存在する受容体を、肝細胞などの細胞内へのLDLの輸送を可能にするための手段として用いることができることを確認した。細胞内にLDLを輸送するための手段としては、トランスフェリン受容体、血清アルブミン受容体、アシアロ糖蛋白質受容体、アデノウイルス受容体、レトロウイルス受容体、CD4、リポ蛋白質（a）受容体、免疫グロブリンFc受容体、a-フェトプロテイン受容体、LDLR様蛋白質（LRP）受容体、アセチル化LDL受容体、マンノース受容体、またはマンノース-6-リン酸受容体などの細胞表面受容体を用いることができる。これらの受容体は、それぞれ、幅広くさまざまに異なる細胞種に存在し、幅広いさまざまな細胞種へのLDLの取り込みを可能とする。
本発明者らは、細胞内へのLDLの輸送に有用なキメラ蛋白質を産生した。これらのキメラ蛋白質は本発明の対象であり、そのキメラ蛋白質をコードする核酸配列、細胞内で発現するキメラ蛋白質をコードするDNA（またはRNA）を含む哺乳類宿主細胞、キメラ蛋白質の産生の方法、キメラ蛋白質の単離の方法、LDLの定量分析のためにキメラ蛋白質を用いる方法、および個体における血清LDLレベルを低下させる治療的方法を含む、細胞外LDLレベルを低下させる方法も同様である。この治療的方法においては、LDLおよびヒトLDLR以外のヒト細胞表面受容体と結合するキメラ蛋白質が、キメラ蛋白質自体の投与、またはキメラ蛋白質を発現および分泌する細胞の投与（例えば、移植）のいずれかによって、個体に提供される。いずれの場合にも、キメラ蛋白質はLDLおよびヒト細胞表面受容体と結合し、この複合体はそれが結合した細胞内に輸送され、LDLの細胞外レベルが低下する。
1つの態様においては、このキメラ蛋白質は、LDLRのリガンド結合ドメインである第1のドメイン、およびトランスフェリン（TF）である第2のドメインを含む。ヒトトランスフェリン受容体は、そのリガンドに対して非常に高い親和性を有し、平衡解離定数（Kd）は2〜7nMである（Trowbridge, I. S. ら、Biochem. Pharmacol., 33：925〜993（1984））。トランスフェリンは、血液総蛋白質濃度と比較してトランスフェリン濃度が非常に低い場合でも、その受容体と結合する能力を有する。同様に、LDL受容体もそのリガンドに対する高い親和性を有する（肝細胞受容体ではKd=7.2nM（Krampler, F. ら、J. Clin. Invest., 80：401〜408（1987））、線維芽細胞受容体ではKd=2.8nM（Innerarity, T. L. ら、Meth. Enzymol., 129：542〜565（1986））。このため、本態様のキメラ蛋白質は、トランスフェリン受容体を介したエンドサイトーシスによってLDLが細胞内に輸送されるために同時に存在する必要がある2つの成分（ヒトLDLおよびヒトトランスフェリン受容体）に対する高い親和性を有する。LDLR-トランスフェリン（LDLR/TF）キメラ蛋白質が、トランスフェリンを介してLDLの取り込みをいかにして促進するように働くかを描いた模式図を図1に示した。いずれの経路によって取り込まれたLDLも、代謝されて、コレステロールおよび遊離アミノ酸を放出する。LDLR経路では、LDLRはLDLを放出した後に細胞表面で再利用される。TFR経路では、LDLを放出すると、TFRおよびLDLR/TFキメラ蛋白質は細胞表面で再利用される。
キメラ蛋白質にはヒトトランスフェリン蛋白質の全体が存在することができる。または、鉄およびヒト細胞上に存在するヒトトランスフェリン受容体との結合に必要なヒトトランスフェリンの一部のみがキメラ蛋白質に含まれていてもよい。中性pHでは、それぞれのTFRは、鉄2分子を有する（すなわち、鉄飽和状態の）TF分子2分子と結合する。結合部位は、それぞれのTFのN端ドメインに存在する。鉄1分子を有するTFでは、TFRとの結合性が低下し、apoTF（すなわち、鉄が結合していないTF）はTFRと結合しない。これに対して、鉄がリソソームの酸性環境内に放出された場合には、受容体およびApoTFの細胞表面での再利用のために、apoTFはTFRと結合した状態のままである。本明細書で用いる「ヒトトランスフェリン」という用語は、ヒトトランスフェリン分子の全体、または鉄およびヒト細胞表面膜上のトランスフェリン受容体との結合に必要なその蛋白質の部分を意味する。
1つの態様において、ヒトLDL受容体のリガンド結合ドメインは、成熟型TF分子のN末端でヒトトランスフェリンと連結される。このリガンド結合ドメインは、天然の受容体蛋白質中に存在するその他のLDL受容体の領域を含んでいてもよい。
キメラ蛋白質の産生
細胞内にLDLを輸送するためのキメラ蛋白質などの本発明のキメラ蛋白質は、キメラ蛋白質の全体をコードする単一の核酸、または、それぞれがキメラ蛋白質の1つのドメイン、および選択的には、各ドメインを結合するために役立つ単一または複数のアミノ酸をコードする、2つ以上の核酸配列を発現している宿主細胞を用いて産生することができる。また、キメラ蛋白質を、化学合成によって産生することもできる。
A. 宿主細胞
キメラ蛋白質を産生するために用いられる宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、非哺乳類脊椎動物、または哺乳類の細胞である。哺乳類細胞には、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヒトの細胞が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞は、不死化細胞（細胞系）、または不死化していない（一次または二次）細胞のいずれでもよく、線維芽細胞、表皮角化細胞（keratinocyte）、上皮細胞（例えば、哺乳類上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞もしくはCHO細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞、およびこれらの体細胞種の前駆細胞などの幅広くさまざまな細胞種であってもよく、これらに限定されない。
キメラ蛋白質をコードするDNAまたはRNAを含んで発現する細胞を、本明細書では遺伝的に改変された細胞と呼ぶ。キメラ蛋白質をコードするDNAまたはRNAを含んで発現する哺乳類細胞を、遺伝的に改変された哺乳類細胞と呼ぶ。DNAまたはRNAの細胞への導入は、電気穿孔法、マイクロインジェクション、微粒子射入、改変カルシウムリン酸沈降法、カチオン性脂質による処置（cationic lipid treatment）、光穿孔法（photoporation）、細胞融合法、受容体を介した伝達、またはポリブレン沈降法などの、既知のトランスフェクション法による。または、ウイルスベクターによる感染によって、DNAまたはRNAを導入することもできる。キメラ蛋白質をコードするDNAまたはRNAを発現する、哺乳類細胞を含む細胞を産生する方法は、リチャード・F・セルデン（Richard F. Selden）、ダグラス・A・トレコ（Douglas A. Treco）およびマイケル・W・ハートライン（Michael W. Heartlein）による米国特許出願第08/334,797号、表題「遺伝子治療のためのインビボでの蛋白質の産生および送達系（In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy）」（1994年11月4日出願）、リチャード・F・セルデン（Richard F. Selden）、ダグラス・A・トレコ（Douglas A. Treco）およびマイケル・W・ハートライン（Michael W. Heartlein）による米国特許出願第08/334,455号、表題「遺伝子治療のためのインビボでのエリスロポエチンまたはインスリノトロピンの産生および送達系（In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for Gene Therapy）」（1994年11月4日出願）、およびダグラス・A・トレコ（Douglas A. Treco）、マイケル・W・ハートライン（Michael W. Heartlein）およびリチャード・F・セルデン（Richard F. Selden）による米国特許出願第08/231,439号、表題「遺伝子治療のための、DNAの一次または二次細胞への標的導入（Targeted Introduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for Gene Therapy）」（1994年4月20日出願）に記載されている。これらの出願のそれぞれの教示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
B. 核酸構築物
キメラ蛋白質を発現させるために用いる核酸構築物は、トランスフェクションを受けた哺乳類細胞において染色体外性（エピソーム性）に発現されるもの、または、受容側細胞のゲノム中のランダムな部位もしくはあらかじめ選択された標的部位に相同組換えによって組み込まれるものでもよい。染色体外性に発現する構築物は、キメラ蛋白質をコードする配列のほかに、細胞内での蛋白質の発現、および選択的には、構築物の複製のために十分な配列を含む。これは典型的にはプロモーター、キメラ蛋白質をコードするDNA、およびポリアデニル化部位を含む。構築物中において、キメラ蛋白質をコードするDNAは、その発現がプロモーターの制御下にあるような位置に置かれる。選択的には、構築物は以下の1つまたはそれ以上のものなどの付加的な成分を含んでもよい：スプライス部位、エンハンサー配列、適当なプロモーターの制御下にある選択可能なマーカー遺伝子、および適当なプロモーターの制御下にある増幅可能なマーカー遺伝子。
細胞のゲノム中にDNA構築物が組み込まれるこれらの態様において、含まれる必要があるのはキメラ蛋白質をコードする核酸配列のみである。選択的には、これには、プロモーターならびにエンハンサー配列、単一もしくは複数のポリアデニル化部位、単一もしくは複数のスプライス部位、単一もしくは複数の選択可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列、単一もしくは複数の増幅可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列、および/または、ゲノム中の選択された部位を標的とするDNAの組み込み（DNAまたはDNA配列の標的化）のための受容側細胞のゲノムDNAと相同なDNAが含まれる。
C. 細胞培養の方法
キメラ蛋白質をコードするDNAまたはRNAを含む哺乳類細胞を、細胞の増殖、およびDNAまたはRNAの発現のために適当な条件下で培養する。キメラ蛋白質を発現するこれらの細胞は、周知の方法および本明細書に記載した方法を用いて同定することができ、キメラ蛋白質は、キメラ蛋白質の産生の増幅の存在下または非存在下のいずれかにおいて、周知の方法および本明細書に記載した方法を用いて単離または精製される。同定は、例えば、キメラ蛋白質をコードするDNAもしくはRNAの存在を示す表現型を提示している遺伝的に改変された哺乳類細胞に対する、PCスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、またはキメラ蛋白質の発現に関するスクリーニングなどのスクリーニングによって実施することができる。キメラ蛋白質をコードするDNAが組み込まれた細胞の選択は、DNA構築物中に選択可能なマーカーを含ませ、選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみの生存に適当な条件下において、選択可能なマーカー遺伝子を含む、トランスフェクションまたは感染を受けた細胞を培養することによって実現してもよい。導入したDNA構築物のさらなる増幅は、遺伝的に改変された哺乳類細胞を、増幅に適当な条件下において培養すること（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子を含む遺伝的に改変された哺乳類細胞を、複数コピーの増幅可能なマーカー遺伝子を含む細胞のみが生存することができる濃度の薬物の存在下において培養すること）によってもたらされる。
キメラ蛋白質を発現している遺伝的に改変された哺乳類細胞は、本明細書に記載した通り、発現産物の検出によって同定することができる。例えば、第2のドメインがトランスフェリンであるキメラ蛋白質を発現している哺乳類細胞は、LDL結合ドメインに特異的なモノクローナル抗体との結合によって、キメラ蛋白質をマイクロタイター用プレートに捕捉させ、ヒトTFドメインに特異的な抗ヒトTFモノクローナル抗体との結合によって結合状態のキメラ蛋白質を検出する、サンドイッチ酵素イムノアッセイ（sandwich enzyme immunoassay）によって同定することができる。通常ではヒトTFを合成しない、遺伝的に改変された哺乳類細胞種の大部分におけるキメラ蛋白質の濃度の定常的な解析は、発現するそれぞれのキメラ蛋白質が解析可能なTFドメインを含むため、ヒトTFを検出するELISAによって実施することができる（実施例6）。または、キメラ蛋白質を発現している哺乳類細胞を、LDL結合アッセイによって同定することもできる（実施例9）。さらに、当業者に周知のその他の方法の1つを用いてそれらを同定することもできる（Sambrook, J. ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989、およびAusubel, F. A. ら編、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最新プロトコール）、Wiley、New York、1994）。
D. キメラ蛋白質の精製
遺伝的に改変された哺乳類細胞によって産生されたキメラ蛋白質は、当業者に周知の方法のほか、本明細書に記載する方法を用いて、細胞から単離し、精製または部分的な精製を行うことができる。実施例7に記載したように、キメラ蛋白質の両方のドメインとの直接的な結合に基づく方法によって、キメラ蛋白質を、それが発現している細胞から得ている。この方法には2つの段階が含まれ、その1つはトランスフェリン受容体の結合に関与するトランスフェリンのエピトープとの免疫親和性結合を含み、もう1つはLDLRドメインとのリガンド（LDL）親和性結合を含む。LDLRリガンド結合ドメイン-トランスフェリンキメラ蛋白質を精製するために、この方法を以下の通りに実施した。キメラ蛋白質を発現している細胞を培養した培地を細胞から分離し、一般的には、接線方向限外濾過（tangential flow ultrafiltration）によって濃縮する。その結果として得られる、キメラ蛋白質が豊富な、またはそれが濃縮された培地を、カラム基質に結合させた抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（抗TF Mab）と接触させると、その結果、トランスフェリンエピトープを含む培地中のすべての蛋白質が結合する。結合した蛋白質をイムノアフィニティーカラムから溶出させ、続いて、その結果得られたイムノアフィニティー精製キメラ蛋白質を、LDL-LDLR結合に適当な条件下において、カラム基質に結合させた抗LDL抗体を介してカラム基質と間接的に結合したLDLと接触させるリガンドアフィニティー精製の段階にかける。その結果、トランスフェリンおよび完全なLDLRリガンド結合ドメインを含むキメラ蛋白質がLDLと結合する。このキメラ蛋白質をカラムから溶出させることにより、高度に精製されたキメラ蛋白質の調製物が得られる。実施例7で示した通り、この過程により、トランスフェリンを含み、LDLと結合する完全なキメラ蛋白質が分離された。この方法を、第1のドメインがLDLRリガンド結合部位以外のリガンド結合ドメインであり、第2のドメインがトランスフェリン以外の細胞表面受容体リガンドである、キメラ蛋白質を精製するために改変することもできる。
完全なLDLR結合ドメインおよびトランスフェリンを含むキメラ蛋白質を精製する本方法の1つの態様では、精製は以下の通りに実施される。キメラ蛋白質を発現している宿主細胞を含む培地を宿主細胞から分離し、分子量カットオフ値が100,000ダルトンのメンブランを用いる接線方向限外濾過（tangential flow ultrafiltration）によって濃縮する。1回の実験で、培地はほぼ32倍に濃縮される。
抗TF Mab（例えば、実施例7に記載した、腹水から単離されたHTF-14、Biodesign、Kennebunk、ME）を、ポリスチレンビーズ（例えば、臭化シアン（CNbr）活性化セファロース4B）などの固相支持体に結合させて、イムノアフィニティーカラムを作製する。HFT-14イムノアフィニティーカラム上に培地を載せ、適当な条件下において、培地中のキメラ蛋白質のトランスフェリンドメインが抗TF Mabと結合するために（すなわち、キメラ蛋白質のトランスフェリンドメインとの相互作用を介して、キメラ蛋白質がMTF-14と結合するために）十分な時間、抗TF Mabとの接触を維持することによって、濃縮した培地を、固相支持体に結合させた抗TF Mabと接触させる。その結果、トランスフェリンを含むキメラ蛋白質は、固相支持体（例えば、HTF-14を結合させたビーズ）と非共有的に結合する。キメラ蛋白質を溶出させるために、固相支持体に結合したキメラ蛋白質を適当な条件下（例えば、pH2.3の0.1Mグリシンによる洗浄）におき、それを採取する。
実施例7に記載した態様では、キメラ蛋白質が結合したHTF-14イムノアフィニティーカラムを、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、pH7.4（TBS）を用いて洗浄し、続いてpH2.3の0.1Mグリシンによって溶出させる。その分画2mlを採取し、溶出緩衝液を中和するために適当なpHの緩衝液に加え、分画の一部を保存する。分析の結果、この段階により、キメラ蛋白質が濃縮された培地からほぼ8000倍に精製されたことが示された。結果として得られたイムノアフィニティー精製キメラ蛋白質は、実施例7に記載した通り、トランスフェリンおよび完全なLDLR結合ドメインを含むキメラ蛋白質、ならびにセリンプロテアーゼによって分解され、そのために完全なLDLR結合ドメインを含まないキメラ蛋白質の混合物であった。この精製過程における第2の段階は、完全なLDLR結合ドメインを含まないキメラ蛋白質から、トランスフェリンおよび完全なLDLR結合ドメインを含むキメラ蛋白質を分離するための、リガンド親和性（LDL親和性）に基づく段階である。この段階では、イムノアフィニティー精製キメラ蛋白質の混合物を、ヒトLDL（hLDL）を結合させた（例えば、ビーズ上に固定したウサギ抗ヒトLDLポリクローナル抗体を用いて）CNBr活性化セファロースビーズを含むリガンドアフィニティーカラム上に載せた。イムノアフィニティー精製キメラ蛋白質を抗LDL（LDL）リガンドアフィニティーカラムに載せ、ビーズ上のLDLがキメラ蛋白質中のLDLRと結合するために十分な時間、適当な条件下に置いて、キメラ蛋白質をカラムと非共有的に結合させた。カラムをTBSを用いて洗浄し、20mM EDTAを含むpH7.4のTBSを用いて溶出させた。分画を採取して解析したところ、分画2および3に蛋白質濃度のピークが存在することが示された。
E. インビトロでのキメラ蛋白質の特徴分析
本明細書に記載した方法（実施例10参照）によって産生されたキメラ蛋白質の分析により、これが、LDL-LDLR結合性相互作用に関して証明された性質である2価陽イオン依存的な様式でLDLと結合することが示された。さらに分析した結果、キメラ蛋白質のLDLとの結合は酸性緩衝液条件下では起こらず、EDTAおよび酸性緩衝液がそれぞれ、LDLと結合したキメラ蛋白質の解離に有効であることが示された（実施例10）。インビボの酸性エンドソーム区画内では、LDLがLDLRから放出されることも、LDL-LDLR結合性相互作用に関して証明された性質である。このことは、キメラ蛋白質が細胞内で同様の方法で作用する能力を有し、その結果、細胞内でキメラ蛋白質からLDLが放出されるという可能性が示唆される。以上を総合すると、これらの所見は、血清LDLとの結合、およびその後の代謝のための細胞内への取り込みに関するキメラ蛋白質の機能を支持するものである。
別の分析（実施例9）では、LDL濃度がほぼ3nMである場合に、最大値の半分の結合が生じることが示されたが、これは固相結合アッセイにおける精製LDLRでの値（Innerarity, T. L. ら、Meth. Enzymol., 129：542〜565（1986））のほか、ヒト線維芽細胞におけるLDLのLDLRからの解離に関して発表されたKd値とも近い値である。このことは、キメラ蛋白質のLDLとの結合親和性は、原形質膜に結合した完全長のLDLRのLDLとの結合親和性と近いという考え方を支持する。
第1のドメインがLDLRのリガンド結合ドメインであり、第2のドメインがトランスフェリンであるキメラ蛋白質の機能的活性は、実施例11、13、および14に記載したような方法で評価される。キメラ蛋白質が、トランスフェリンを介したLDLの細胞への取り込みをもたらす能力を有するか否かを決定するためには、HepG2などの肝細胞系が用いられる。実施例13に記載したように、インビトロで肝細胞およびLDLをキメラ蛋白質およびLDLに曝露させた。キメラ蛋白質が、培地中でヒトLDLと結合し、トランスフェリン受容体を介した肝細胞への取り込みを媒介する能力を有するか否かを決定するためには、実施例13に記載した通り、非標識LDLまたは非標識トランスフェリンが、キメラ蛋白質の存在下において、標識LDL（例えば125I-LDL）の細胞への取り込みを抑制する能力を評価する。トランスフェリン受容体によって取り込まれたLDLが代謝されてコレステロールプールに貯蔵されるか否かも、実施例13に記載した方法によって評価することができる。例えば、LDL取り込みの結果としてのコレステロール生合成の抑制については、細胞へのコレステロールの過剰供給によってダウンレギュレーション（抑制）を受ける、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素（HMG CoA還元酵素）などの酵素の産生を測定することによって評価することができる。または、トランスフェリン受容体によってLDLが取り込まれ、コレステロールに代謝されるか否かを評価するために、細胞内のコレステロールの増加に反応して増加するアシル-補酵素Aコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ACAT）などの酵素の濃度または活性の測定を用いることもできる。ACAT活性の上昇は、細胞内のコレステロール濃度が増加したことを示す。
F. インビボでのキメラ蛋白質の特徴分析
キメラ蛋白質の抗高コレステロール作用は、実施例14に記載したような方法で評価することができる。簡潔に言えば、キメラ蛋白質を、LDLRノックアウトマウスまたはワタナベラビットなどのヒト家族性高コレステロール血症の動物モデル系に投与し、血清コレステロール濃度に対する影響を判定する。LDLRノックアウトマウスまたはワタナベラビットに対して適当量のキメラ蛋白質を投与した後に血清コレステロール値の低下が認められれば、そのキメラ蛋白質がコレステロールを細胞内に輸送させる能力を有することを示す。
G. キメラ蛋白質の治療的使用
本発明のキメラ蛋白質は、肝細胞などの細胞内へのLDLの輸送を増強させるために有用である。LDLRリガンド結合ドメインをトランスフェリンドメインと融合させたものなどのキメラ蛋白質は、LDL代謝を増強させる必要のある個体に対して投与することができる。キメラ蛋白質は適当な担体中に存在する状態で投与されるが、この担体は生理的食塩水もしくは水、または安定剤、またはアルブミンもしくは低分子量の糖などの賦形剤を混合したものでよい。これは周知の技法を用いて、筋肉内、静脈内、腹腔内注射などのさまざまな経路によって投与される。または、キメラ蛋白質を発現している遺伝的に改変された哺乳類細胞を個体に移植することもできる。トランスフェクションには、不死化していない細胞（一次または二次細胞）および/または不死化細胞を用いることができる。これには、線維芽細胞、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、哺乳類上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞すなわちCHO細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞、およびこれらの体細胞種の前駆細胞などが含まれるが、これらに限定されない。また、本方法によって不死化細胞にトランスフェクションを施し、蛋白質産生または遺伝子療法のいずれかに用いることも可能である。本方法による蛋白質産生または遺伝子療法に有用な不死化ヒト細胞系の例には、HT1080、HeLa、MCF-7乳癌細胞、K-562白血病細胞、KB癌細胞、2780AD卵巣癌細胞、Raji細胞（ATCC CCL 86）、Jurkat細胞（ATCC CCL 152）、Namalwa細胞（ATCC CCL 1432）、HL-60細胞（ATCC CCL 240）、Daudi細胞（ATCC CCL 213）、RPMI 8226細胞（ATCC CCL 155）、およびMOLT-4細胞（ATCC CCL 1582）が含まれるが、これらに限定されない。遺伝的に改変された不死化細胞を遺伝子治療に用いる場合には、この細胞を、キメラ蛋白質が拡散によって放出されるような半透過性障壁装置の内部に封入してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子治療の方法に用いる細胞（例えば線維芽細胞）は、治療すべき個体から採取する。この細胞には、ドメイン1がヒトLDLRのリガンド結合ドメインであり、ドメイン2がトランスフェリンに由来するアミノ酸配列であるキメラ蛋白質を含むDNA構築物などの、本発明のDNA構築物の導入による改変が加えられる。この結果として得られる遺伝的に改変された細胞を培養によって増殖させた後、個体の体内に導入する。このようなキメラ蛋白質をコードするDNAを発現している細胞は、同時係属中のリチャード・F・セルデン（Richard F. Selden）、ダグラス・A・トレコ（Douglas A. Treco）およびマイケル・W・ハートライン（Michael W. Heartlein）による米国特許出願第07/787,840号、表題「遺伝子治療のためのインビボでの蛋白質の産生および送達系（In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy）」（1991年11月5日出願）に記載された方法によって産生することができ、その教示内容は参照として本明細書に組み入れられる。この細胞は、LDLと結合してトランスフェリン受容体をその表面に有する細胞へと輸送するキメラ蛋白質を発現し、分泌する。キメラ蛋白質-LDL複合体のトランスフェリン受容体を介したエンドサイトーシスにより、細胞へのLDLの導入および細胞外LDLレベルの低下がもたらされると考えられる。第2のドメインが、上記の通りのトランスフェリン以外の細胞表面受容体リガンドであるキメラ蛋白質をコードするDNAを哺乳類細胞に導入することも可能である。キメラ蛋白質を発現し、分泌する遺伝的に改変された哺乳類宿主細胞を、個体に移植し、その体内でキメラ蛋白質をLDLと結合させることができる。結果として得られたキメラ蛋白質-LDL複合体は、第2のドメインのアミノ酸配列がリガンドである受容体を有する細胞と結合し、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞内に進入する。このため、循環性LDLレベルは低下すると考えられる。
個体に移植された遺伝的に改変された哺乳類宿主細胞の数は、送達されるキメラ蛋白質の量、および細胞によるその発現レベルによって決定される。個体が必要とする量は、年齢、身体の大きさ、性別、血清LDLレベル、およびキメラ蛋白質の血清中半減期などの事項によって異なる。必要な用量は、経験的、またはキメラ蛋白質に関して確定している薬力学的性質に基づいた計算によって決定される。
その他の関連するキメラ蛋白質は、総LDLの中で臨床的に有意な分画である酸化LDLを、血液から取り除くために用いることができる。初期の動脈硬化斑形成は、循環中の高レベルのLDLが血管内の内皮細胞と相互作用し、そこでフリーラジカルの攻撃によってapoB-100のアミン基（例えば、リジンおよびアルギニン残基）が酸化された場合に起こると考えられている。LDL粒子におけるapoB-100の酸化（アセチル化も含む）は、LDL受容体に対する親和性を低下させることが知られている。酸化LDLは肝臓によって除去されず、その代わりに、マクロファージ上に主に認められるスカベンジャー受容体（AcLDLR、以前はアセチルLDL受容体として知られていた）と相互作用するまで循環液中に蓄積する。多量の酸化LDLを取り込んだマクロファージは脂質性の空胞によって肥大化し、これは「泡沫細胞」として知られる。内皮に付着するための細胞表面決定基を有する泡沫細胞は、動脈硬化斑の初期発生に一定の役割を果たすと考えられており、種々の段階の斑において実際に認められる。
スカベンジャー受容体リガンド結合ドメインをヒトトランスフェリンと融合させたものを含むキメラ蛋白質（AcLDLR/TF）は、肝臓における酸化LDLとの結合およびトランスフェリン受容体を介した酸化LDLの除去に働くため、治療的に有用である。さらに、このキメラ蛋白質は高濃度で与えることができるため、酸化LDLの大部分がマクロファージ上のAcLDLRと結合した状態ではなく、AcLDLR/TFと結合するように、マクロファージAcLDLRの競合因子として作用させることができる。この方法では、マクロファージにおける酸化LDLの蓄積が低下し、このために心血管内皮において認められる泡沫細胞の数も減少し、それによって初期の動脈硬化斑の形成が妨げられると考えられる。
さらに一般的には、その他のキメラ蛋白質が、特定の疾患状態に付随するその他の生化学的物質のレベルを低下させるために治療的に有用である。キメラ蛋白質の高親和性リガンド結合ドメインは、既知の受容体分子（例えば、LDLRまたはAcLDLR）のものに限定される必要はなく、蛋白質リガンドまたは低分子に対する高い結合親和性を有するその他の種類の蛋白質を含んでもよい。抗体の抗原結合性を有する分子（例えば、単鎖抗体）、または可逆的な結合性を有するその他の蛋白質を、ヒトトランスフェリンまたはその他の細胞受容体リガンドと結合するリガンドを有するキメラ蛋白質をコードする配列を構築するために用いることができる。
1つの態様において、このキメラ蛋白質は、アポリポ蛋白質E4（apoE4）に対する高親和性の結合特異性を有するが、apoE3およびapoE2に対してはその性質を示さない。アルツハイマー病の全症例のうちほぼ半数はapoEの特殊な対立形質との関連が認められ、apoEのE4対立形質は、脳内のアミロイド繊維中に蓄積することが判明している本疾患のリスク因子である。apoE2およびapoE3の対立形質はリスクの増加を伴わず、疾患抵抗性に一定の役割を果たしていると考えられる。apoE4の濃度を低下させることができるキメラ蛋白質は、アルツハイマー病の発症を遅らせるために治療的に使用されうる。本明細書に記載した方法によって、apoE4結合ドメインを含むキメラ蛋白質をトランスフェリンと融合させ、循環液からapoE4を除去し、最終的には末梢組織中で生じる蓄積を逆転させる能力を有する分子を産生することができると考えられる。
キメラ蛋白質の診断的利用
キメラ蛋白質は、生化学的アッセイにおける診断薬としても有用である。例えば、生物学的試料（例えば、細胞溶解物、血液、リンパ液、尿、体液、または乳汁）における、LDLなどの選択物質の量を決定するためにキメラ蛋白質を用いることができる。分析対象の生物学的試料には、選択物質が、適当なキメラ蛋白質（例えば、LDLについては、第1のドメインがヒトLDLRのリガンド結合ドメインであるもの）の第1のドメインと結合することができるように、必要に応じて処理を施し、第1のドメインと選択物質との結合に適当な条件下においてキメラ蛋白質と接触させる。一般的に、このキメラ蛋白質は、マイクロタイター用プレート、ポリマー製ビーズ、またはその他の表面などの固体表面に、選択物質とキメラ蛋白質の第1のドメインとの結合に用いられる条件下において表面に結合し続けるような様式で結合される。選択物質が生物学的試料中に存在する場合、それはキメラ蛋白質と結合し、その結果得られる選択物質-キメラ蛋白質複合体は、周知の手段を用いて検出される（例えば、選択物質と結合し、活性酵素または放射性核種と共有結合（共役）するものを用いる。酵素活性は、例えば、発色性または発蛍光性の物質の分裂を測定することによってモニターする）。キメラ蛋白質により、マイクロタイター用プレート形式などの好都合な形式において高度な特異性を持たせた直接的アッセイにおいて物質を検出することもできる。本明細書に提示した1つの例では、LDLを、マイクロタイター用プレートに結合させたLDLR/TFキメラ蛋白質結合させることによって定量する。その結果得られる結合状態のLDLは、抗LDL抗体を用いる反応によって検出する。
その他の態様では、ELISAアッセイにおける抗体の代わりにキメラ蛋白質を用いる。例えば、プレートに直接的または間接的に結合させたLDLは、LDLRリガンドドメインを有するキメラ蛋白質を捕捉する能力を有する。捕捉されたこのキメラ蛋白質を、続いてキメラ蛋白質の第2のドメインに対するHRP共役抗体との反応によって検出する。例えば、LDLR/TFキメラ蛋白質を用いた場合には、抗TF抗体はTFドメインと反応することができる。もう1つの例として、ヒト免疫不全ウイルスの成分と結合するキメラ蛋白質を、血液または組織調製物などの複合的な生物学的試料におけるウイルスの存在を検出するために用いてもよい。
本発明を以下の実施例によって説明するが、これはいかなる意味でもその範囲を限定するものではない。
実施例1 ヒトLDLRの1〜374番目のアミノ酸をヒトトランスフェリンの20〜698番目のアミノ酸に融合させたLDLR/TFキメラ蛋白質をコードするプラスミドの構築
本実施例において、成熟型ヒトLDLRの1〜374番目のアミノ酸を、ヒトトランスフェリンの20〜698番目のアミノ酸に融合させた、LDLR/TFキメラ蛋白質をコードする遺伝子の組み立ておよび、LDLR/TFを発現するプラスミドの構築について記載する。
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オリゴヌクレオチド1〜4を、ヒトLDL受容体の第1〜8エクソンに対応するcDNA配列を、ヒトトランスフェリンをコードするcDNA配列に融合させ、融合断片を作るための、ポリメラーゼ連鎖反応に用いた。まず初めに、オリゴヌクレオチド1および2を用いて、pLDLR2（ATCC #39966）からLDL受容体cDNAの522bp部位を増幅した。次に、オリゴヌクレオチド3および4を用い、プラスミドTfR27A（ATCC #53106）を鋳型として、トランスフェリン配列を構成する372bpの断片を増幅した。最後に、増幅された2種の断片を混合し、オリゴヌクレオチド2および3を用いて、さらに増幅することにより、最終的に834bpの融合断片を作成した。PCRを用いた融合により、LDL受容体配列の374番目のバリン（LDLR成熟蛋白質の配列に対応して番号を付けた）を、トランスフェリン配列の20番目のバリンに結合した。この融合断片をBamHIで部分的に、およびEcoRIで完全に切断した。既に発表されているLDLR cDNA配列（Genbank登録番号K02573）およびTF cDNA配列（Genbank登録番号M12530）の解析から、PCRで作成した融合断片をこのように切断すると、734bpの断片となることが予測された。クローニングするために、この734bpの産物をゲル精製した。
ヒトLDL受容体の最初の374アミノ酸とヒトトランスフェリンの20〜698番目のアミノ酸をコードするDNA配列とを完全に融合させるために、2種類の中間段階プラスミドを構築した。まず初めに、PstIで部分切断することにより、TfR27AからトランスフェリンcDNA全体を切り出した。TF cDNAを含む2.3Kbの断片を、PstIで切断したpBSIISK+（Stratagene, La Jolla, CA）にライゲーションした。ライゲーション反応液で大腸菌を形質転換し、2.3kbのトランスフェリンcDNAの挿入配列を一つ含むクローンを単離して、これをpBSIITFとした。次に、pBSIITFをEcoRIおよびSacIで切断し、トランスフェリンcDNA配列に対応する断片を作成した。この断片をゲルで精製し、EcoRIおよびSacIで切断したpLDLR2にライゲーションした。このライゲーション反応液で大腸菌を形質転換し、EcoRI部位でLDL受容体配列に結合している1.4kbのトランスフェリンcDNAを含む1つのクローンを単離し、これをpLT1.5とした。さらに、TfR27AをEcoRIおよびBamHIで切断したものから、トランスフェリンcDNAの574bpの断片を、ゲル精製により得た。この断片および734bpのLDL受容体/トランスフェリン融合断片（前記のPCR産物をEcoRIおよび部分的にBamHIで切断して作成した）を、EcoRIで切断したpLT1.5にライゲーションした。このライゲーション反応液で大腸菌を形質転換し、成熟型トランスフェリンの全長をコードする配列（アミノ酸20〜698）に融合したヒトLDL受容体の最初の395アミノ酸（成熟蛋白質の374アミノ酸に21アミノ酸のシグナルペプチドがついたもの）をコードする配列を含む1つのクローンを単離した。このプラスミドをpLDLrTF1とした。
哺乳類細胞でキメラ蛋白質を発現させるのに有用なプラスミドを構築するために、SmaIおよびEcoN1で切断したプラスミドpLDLrTF1から、キメラ蛋白質をコードする配列を分離した。EcoNIによる切断でできた付着末端を、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いて平滑化した。切断したDNAを、1％の低融点アガロースゲルで電気泳動し、キメラcDNAに対応する3.4kbのDNA断片を抽出した。この断片を、XbaIで切断し、クレノウで処理した後に、ゲルで精製したプラスミドpEF-BOS（Mizushima, S. およびNagata, S., Nucleic Acids Res. 18：5322（1990））に、ライゲーションした。プラスミドpEF-BOSは、伸長因子-1a（EF-1a）遺伝子由来のプロモーター配列を利用している。このライゲーション反応液で、コンピテント大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌を、制限酵素解析によってスクリーニングし、プラスミドpEF-BOS中に、LDLR/TF融合遺伝子が望ましい方向（コードする配列がEF-1aプロモーターから3’下流にむけて入っている方向）である1クローンを単離して、pEFBOS/LDLrTF1. Sとした（図2）。プラスミドpEFBOS/LDLrTF1. S中のLDLR/TF融合遺伝子の全核酸配列は、図3に示した。
実施例2 ヒトLDLRの1〜710番目のアミノ酸をヒトトランスフェリンの20〜698番目のアミノ酸に融合させたLDLR/TFキメラ蛋白質をコードするプラスミドの構築
本実施例は、ヒトLDLRの1〜710番目のアミノ酸を、ヒトトランスフェリンの20〜698番目のアミノ酸に融合させたLDLR/TFキメラ蛋白質をコードする、遺伝子の組み立て、およびLDLR/TF発現プラスミドの構築を述べている。LDL受容体-トランスフェリン（LDLR/TF）キメラ蛋白質に関する本実施例では、成熟型LDLRポリペプチドの731番目のバリンのコドンの後に、融合部位がある。ATCCから得たプラスミドpLDLR2（ATCC #39966）は、ヒトLDL受容体（LDLR）のcDNA配列を含んでいる。キメラ遺伝子の構築を容易にするために、以下の手順で、cDNA配列を、プラスミドpBS（Stratagene, La Jolla, CA）に挿入した。pLDLR2を、EcoNIで切断し、断端を大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片で処理して平滑化した。さらに、処理したDNAをBglIIで切断した。LDLR cDNAの5’側1,721bpおよび5’側非翻訳隣接配列を含む、1,735bpのEcoNI-BglII断片を単離した。pLDLR2をBglIIとNaeIで切断した後、cDNAの残りの925bpおよび3’側非翻訳隣接配列を含む、976bpのDNA断片を単離した。プラスミドpBSをEcoRVで切断して直線化し、単離した1,735bpの5’側LDLRおよび976bpの3’側LDLR断片を、T4 DNAリガーゼを用いて、EcoRVで切断したpBSにライゲーションすることにより、LDLR cDNA配列を再構成した。ライゲーション反応液でコンピテント大腸菌細胞を形質転換した後、個々の細菌クローンを制限酵素を用いて解析した。LDLR cDNAが正しく構成された1クローンを、pBSL-1とした。
ヒトトランスフェリンcDNA配列は、ATCC寄託#53106、クローンTfR27Aから得た。TfR27AをPstIで切断して、2.3kbのトランスフェリンcDNA配列を切り出し、クローニングプラスミドpBSIISK+（Stratagene）のPstI部位に挿入して、プラスミドpBSIITFとした。
LDLRの731番のアミノ酸（成熟蛋白質のアミノ酸配列に対応して番号を付けた）とTFの20番アミノ酸との間の融合部位を含むDNA断片を得るために、オリゴヌクレオチドLDLRTF710-1,-2,-3,および-4を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。
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pBSIITFをSalIで、およびpBSL1をNotIで切断することによって、PCR反応に用いるためのプラスミド鋳型を直線化した。コードする配列が融合したものを含む断片の作成に、2つの段階を経た。第1段階では、Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を10μl、直線化したpBSIITFおよびpBSL1 DNAを各々1ng、2.5mM dNTPを12μl、オリゴヌクレオチドLDLRTF710-2および-4を0.3μl、オリゴヌクレオチドLDLRTF710-1および-3を1μl、ならびに最終体積が100μlになるようにH2Oを加えた反応液を用いた。このPCR増幅で得られる1.4kbの融合断片を、さらに、オリゴヌクレオチドLDLRTF710-2および-4で増幅した。増幅された1.4kbの断片をゲルで精製し、EcoNIおよびEcoRIで切断して、pBSL1から得たLDLR配列を含む2.18kbのSalI-EcoNI断片、pBSIITF（TF cDNA配列を含む）から得た1.55kbのEcoRI-XbaI断片、およびpBSIISK（Stratagene, La Jolla, CA）を切断したSalI-XbaIとライゲーションした。ライゲーション反応液でコンピテント大腸菌を形質転換した。4箇所のライゲーションによって正しく構成された断片を含むクローンを、pLDLRTF-710とした。
哺乳類細胞でこのキメラcDNAを発現させるために、pLDLRTF-710のキメラcDNAを、伸長因子-1a（EF-1a）遺伝子のプロモーター配列を利用した発現プラスミドpEF-BOS（Mizushima, S. およびNagata, S., Nucleic Acids Res. 18：5322（1990））に、サブクローニングした。
450bpの介在断片を除去するために、pEF-BOSをXbaIで切断した。pBSIISK+とpLDLRTF-710のLDLR配列との接続部分に存在するSalI部位に、XbaIリンカーを加えて改変した。この改変断片をXbaIで切断すると、LDLR/TF融合遺伝子を含む、4.4kbのXbaI断片が生成する。4.4kbのXbaI断片を精製して、XbaIで切断したpEF-BOSにライゲーションした。ライゲーション反応液でコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。プラスミドpEF-BOSの中でLDLR/TF融合遺伝子のXbaI断片が正しい方向（コードする配列がEF-1aプロモーターの3’側から下流に向かっている方向）となっている1クローンを、pEFBOS-LDLR/TF-710とした（図4）。プラスミドpEFBOS-LDLR/TF-710中のLDLR/TF融合遺伝子の、全核酸配列を、図5に示す。
実施例3 LDLR/TFキメラ蛋白質をコードするプラスミドの哺乳類細胞へのトランスフェクションおよびLDLR/TFキメラ蛋白質の発現クローンの同定
A. 初代ヒト皮膚線維芽細胞へのトランスフェクション
本実施例では、ヒト新生児の陰茎包皮から得た正常な皮膚線維芽細胞を、DMEM（Cellgro 50-013）、15％ウシ胎児血清（Hyclone）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco 15070-014）を各々25単位/ml、および2.25％Hepes緩衝液（Gibco 15630-015）を含む培地で培養した。増殖細胞をエレクトロポレーション緩衝液（137mM NaCl、6mMグルコース、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、1mg/mlアセチル化BSA[Sigma B-2518]、20mM Hepes緩衝液、pH7.3）で洗浄し、600万細胞/mlでエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。エレクトロポレーションキュベット（BIO-RAD 165-2085）に、プラスミドDNA（合計100μg）を50μl以下の容量で加え、さらに0.5mlの細胞懸濁液（合計300万個の細胞）を加えた。
プラスミドDNAは、キメラ蛋白質をコードするプラスミド（本実施例ではpEFBOS/LDLrTF1. S（8.66kb）を61.2μg実施例1参照）および優性選択が可能な薬剤耐性マーカーを有するプラスミド、即ち本実施例ではpSV2neoプラスミド（5.50kb；ATCC #37149）を38.8μgを、等モルで混合したものである。プラスミドpSV2neoは、安定的にトランスフェクトした細胞を、薬剤G418に対する耐性に基づいて、陽性選択するために用いた。
キュベットを電気パルス（250ボルト、960μFaradにキャパシタンス設定）にかけ、細胞内にDNAを効率的に導入した。細胞を希釈して、0.4mg/mlのG418（GENETICINR, Gibco 860-1811）を加えた同様の増殖用培地を含む組織培養ディッシュに移した。pSV2neoまたはpSV2neoおよびpEFBOS/LDLrTF1. Sの両方が安定的にトランスフェクトされた細胞のみが、この培地中でコロニーを形成することができる。pSV2neoをゲノム内に組み込むことのできなかった細胞はこの薬剤により殺され、クローンを形成できない。優性選択が可能な薬剤耐性を与えるこのほかのプラスミドを、同時にトランスフェクションすることもできる。
2〜3週間の培養の後、G-418耐性細胞クローンを視覚的に同定し、薬剤を含む培地中で更に増殖させるために、これをマルチウェルプレートに移した。更に、単離した、薬剤耐性を有するトランスフェクトされたクローンについて、共発現および、キメラ蛋白質をコードするプラスミド、即ち本実施例ではpEFBOS/LDLrTF1. Sに由来するキメラ蛋白質の分泌に関して、スクリーニングを行った。
キメラ蛋白質の発現クローンを同定するため、本実施例では、細胞受容体リガンド領域、即ち本実施例ではヒトトランスフェリンの検出に基づく解析により、各クローンの培養上清について、キメラ蛋白質の有無を調べた。ヒトトランスフェリンに対するサンドイッチ酵素免疫測定法（TF ELISA；実施例6参照）を用いて、培養上清中のキメラ蛋白質を検出した。LDLR/TF発現が陽性のクローンを、単独に培養し、キメラ蛋白質の発現レベルを定量的に解析した。
一つの実験では、0.4mg/mlのG418を含む培地で増殖するトランスフェクトしたクローン206個を、クローニングリングを用いて単離し、96ウェルの培養ディッシュに移した。細胞を増殖させた後、TF ELISAにより、培養上清中のTF抗原の存在を検出したところ、22が陽性であった。陰性対照の培養（G418非存在下で増殖したトランスフェクトしていない細胞クローン、またはpSV2neoをトランスフェクトした後に単離した、G418耐性クローン）は、検出可能なヒトTF抗原を発現していなかった。22の陽性クローンのうち16を、更に解析するために増殖させた。T-25フラスコがほぼ一杯になるまで細胞を培養し、新しい培地に交換した。24時間後、TF ELISAでキメラ蛋白質レベルを定量するために、培地を分離した。その後細胞をトリプシン処理し、Coulterカウンターを用いて、細胞数を測定した。各フラスコの培養上清中に存在するキメラ蛋白質の総量を計算し（ナノグラム（ng）トランスフェリン等量[TFeq]で）、各フラスコ中の細胞総数でわって、ng TFeq/106細胞/日で表される発現率の定量的指標とした。15の発現クローンのキメラ蛋白質発現レベルを測定した結果は、以下の通りであった：2、7、11、21、49、52、90、93、99、131、175、193、200、206、および231ng TFeq/106細胞/日。
B. チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞へのトランスフェクション
リン酸カルシウム沈殿法（Graham, F. L. およびvan der Eb, A. J., Virology, 52：456（1973）、ChuおよびSharp, Gene, 13：197（1981））により、キメラ蛋白質発現プラスミド、即ち本実施例ではpEFBOS/LDLrTF1. S、を、CHO細胞にトランスフェクトした。ホストのCHO細胞株であるDUKX-B11（Chasin, L. およびUrlaub, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216（1980））中のジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子は機能を持たないため、これを相補することで優性選択マーカーとして働くプラスミド、pSV2dhfrも同時にトランスフェクトして、安定的にトランスフェクトされた細胞のクローン選択に用いた。以下に記した実験では、dhfrがSV40プロモーターにより発現するプラスミドである、pSV2dhfr（S. Subramaniら、Mol. Cell. Biol., 2：854〜864（1981））に組み込んだdhfr遺伝子を用いた。
DUKX-B11由来の細胞を、aMEM（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まない、Sigma M-4526）、10％ウシ胎児血清（Hyclone A-1111）、4mM L-グルタミン（Gibco 25030-016）、各々50単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco 15070-014）、15μg/ml L-プロリン（Sigma P-4655）、10μg/mlアデノシン（Sigma A-4036）、10μg/mlチミジン（Sigma T-1895）、ならびに10μg/mlデオキシアデノシン（Sigma D-8668）を含む完全培地で培養した。
20mlの完全培地を入れたT75フラスコで、約60〜70％の密度まで増殖させた細胞を、10mlの新しい完全培地に交換し、37℃で4時間培養した。この4時間の培養の終了30分前に、リン酸カルシウムの微細な沈殿およびプラスミドDNAの懸濁液を、以下のように調整した：
プラスミドpERFBOS/LDLrTF1. S（50μg）およびpSV2dhfr（1μg）を、0.25M CaCl2を含むTE緩衝液（1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA,pH7.9）総容量0.5ml中で混合した。この溶液に、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、50mM Hepes、pH7.1を含む別の溶液0.5mlを滴下した。リン酸カルシウムの沈殿を形成させるため、この1mlの混合液を、室温で30分間静置した。この1mlの懸濁液を、細胞を4時間培養した培地10mlに加えた。粒子を拡散させるために培地を揺すり、更に37℃で4時間培養した。培地を吸引除去し、20％グリセロールを含む完全培地5mlに、室温で1分間細胞を浸した。その後15mlの完全培地を加えてグリセロールを除去し、更に、1回に20mlの完全培地を用いて細胞を2回洗浄した。その後、細胞に20mlの完全培地を加え、トランスフェクトしたプラスミドDNAを染色体へ組み込み発現させるため、37℃で24時間培養した。24時間後、細胞をトリプシン処理し、DHFR選択培地による、同じサイズの培養7個（即ちプールA〜G）に分割した。
DHFR選択培地は、プラスミドpSV2dhfr（pEFBOS/LDLrTF1. Sと共にまたは単独で）を取り込み発現している細胞のみを、陽性に選択する。DHFRを発現していない細胞は、この選択培地中では増殖しない。DHFR選択培地は、aMEM（上記参照）、10％の透析ウシ胎児血清、4mM L-グルタミン、各々50単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンならびに15μg/ml L-プロリンを含む。この培地は、0.1％グルコースおよび0.22％炭酸ナトリウムを含む。
プールA〜Gを、DHFR選択培地中でほぼ一杯になるまで17日間培養し、この間3または4日ごとに、新しい選択培地を補給した。その後、各プールの細胞を、20mlの新しい選択培地に置き換え、24時間培養して培養上清を回収し、TF ELISAによってキメラ蛋白質のレベルを調べた。
この選択培地中に含まれるウシトランスフェリン抗原は、TF ELISAに用いているヒトトランスフェリンに対する抗体と交差反応しない。そのうえ、トランスフェクトしていないホストのCHO細胞株であるDUKX-B11は、この解析で検出できる分泌型トランスフェリン抗原を合成しない。従って、トランスフェクトされた細胞集団から得た培養上清中に、この解析の基底レベル以上（1ng/ml）の濃度でトランスフェリン抗原が検出されれば、トランスフェクトされた集団が、LDLR/TFキメラ蛋白質を発現し分泌している証拠となる。
DHFR選択培地中で17日間培養した後、プールA〜Gの細胞を24時間培養して得た培養上清には、キメラ蛋白質が、検出可能な濃度で含まれていた。本実施例では、この1日の培養期間終了時、プールA〜Gは、それぞれ、53、52、52、79、74、75、および33ng TFeq/mlを産生した。このように、全てのプールは、同程度ではあるが同一ではないレベルのキメラ蛋白質を産生した。このことから、かなりの細胞が、両方のプラスミドを発現可能な形態で組み込んでいるため、pSV2dhfrがコードするDHFR酵素を発現するものを選択すれば、pEFBOS/LDLrTF1. Sに由来するキメラ蛋白質も共発現していることになる。
続いてA〜Gの細胞集団を、様々な、既に確立されたDHFR遺伝子増幅のプロトコール（Kaufman, R. J. およびSharp, P. A., J. Mol. Biol., 159：601（1982））のうちのどれか一つで処理した。これは、DHFR酵素をより高いレベルで発現している亜集団を選択するもので、このことは、有毒な葉酸拮抗剤であるメソトレキセート（MTX）に対する耐性が増加することと、相関している。本実施例では、各プールを、まず、20nM MTX、次に50nM MTX（Sigma M-8407）に対する耐性により選択した。各々の段階で、各々の亜集団において分泌されているキメラ蛋白質の共発現のレベルを、TF ELISAによってモニターした。キメラ蛋白質の発現が増加している亜集団は、ある種の高発現細胞を含んでいる可能性があり、これは、細胞のクローニングによって、亜集団から単離することができる。
本実施例では、プールEおよびFの亜集団で、他のプールに比べて、20nM MTXおよび50nM MTXでのキメラ蛋白質の発現が、強く増加していた。50nM MTXで選択したプールEおよびF由来の細胞を、続いて、限界希釈法によってクローニングした；単離し、マルチウェル培養プレートを用いてキメラ蛋白質の産生をTF ELISA法によって調べた多くのクローンの中から、最も産生量の多いものとして、プールEに由来する9つ、およびプールFに由来する14の細胞クローンを同定した。プールEに由来する最も産生量の多い2つのクローン（E77およびE117）、および、プールFに由来する最も産生量の多い2つのクローン（F3およびF57）を含むこれら23のクローンについて、さらにDHFR遺伝子の増幅を繰り返した後に、産生量が増加したか否かを、さらに評価した（実施例4）。
実施例4 産生細胞株の同定およびキメラ蛋白質産生の可能性のある修飾剤の評価
A.  産生細胞株の同定
dhfr欠損CHO細胞株DUKX-B11に由来する、メソトレキセート（MTX）耐性CHO細胞株を、100nM MTX（Sigma M-8407）存在下で、DHFR選択培地（実施例3）で増殖させた。この培地は、0.1％グルコースを含む。さらに2mM酪酸ナトリウム（Fluka 19364）、もしくはセリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン（Boehringer Mannheim 981-532）またはPefablock SC（Boehringer Mannheim 1429-876）を含む培地も使用した。
プールEのうちで、最も発現の高いクローン2つ（6ウエルプレートで4日間培養し、約1.5μg TFeq/mlを産生したE77、および、6ウエルプレートで4日間培養し、1.1μg TFeq/mlを産生したE117）を独立に培養し、100nM MTXに対する抵抗性により選択して増幅させ、キメラ蛋白質の産生が増加するか否かを調べた。一方、プールEから得た9つのクローン全てを合わせて、プールHと称する新しいプールとし、これを100nM MTXに対する抵抗性により選択して、増幅させた。同様にして、プールFから得た最も発現の高いクローン2つ（F3およびF57）を、100nM MTXに対する抵抗性により選択して増幅させ、Fから得た14クローンすべてを合わせてプールJと称する新しいプールとし、これも同様に増幅させた。
DHFRの増幅が増加した結果として、T75培養フラスコで培養した4つのクローン（E77、E117、F3、およびF57）ならびにプールHおよびプールJによる産生（ng TFeq/106細胞/日）の増加を評価した。キメラ蛋白質の産生は、TF ELISAにより解析した。さらに、同レベルのMTX耐性でその後サブカルチャーした際の産物を測定することにより、そのような産生力の安定性をモニターした。
結果（表1参照）から、クローンE77が、最も産生量の多い安定な産生株であると思われた。その後200nMおよび500nMのMTX存在下で増幅させたが、キメラ蛋白質の産生が高まることはなかった。同様に、プールHおよびJの場合にも、MTX耐性の増加したものを選択しても、産生の多い亜集団を選択することはできなかった。
クローンE77は、100nM MTX存在下で良く増殖すると考えられたため、ローラーボトルを用いる際の産生細胞株としてこれを選択した。
表1  MTX濃度の作用とトランスフェクションされたCHOプールおよびクローンにおけるキメラ蛋白質産生能（ng TFeq/106細胞/日）ならびにサブカルチャーの培養段階
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B. キメラ蛋白質産生の可能性のある修飾剤の評価
細胞株E77が産生するキメラ蛋白質の量および質を、Tフラスコおよびローラーボトルで調べた。
先に行った免疫沈降の実験から、プラスミドpEFBOS/LDLrTF1. Sをトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の培養上清から、免疫沈降した少量の蛋白質分画はTF領域は保持しているが、完全なLDLR領域はもたないことが示された。CHO細胞株E77が分泌するキメラ蛋白質についても、（トランスフェクションされたCHOの他のクローンおよびプールの場合と同様に）同様であることがわかった。この小さな産物が、LDLR領域内に存在するある部位における、特異的エンドペプチダーゼの作用によるものだという仮説を、特異的なプロテアーゼ阻害剤がこの分子種の蓄積を阻害できるか否かを調べることにより、または加熱非動化した血清を用いることにより評価した。セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンを0.002％で用いると、この小さな分子種を相対的に減少させる効果が少し見られた。続いて、より高い濃度（0.5％）のアプロチニンを用いて調べた。
DMEMおよび100nM MTXを含む3種の異なる培地で、細胞をT75フラスコに一杯になるまで増殖させた。培地Aは、10％の透析したFBS（ウシ胎児血清）だけを含み、培地Bは、10％の加熱非慟化し透析したFBSを含むものであるが、一方培地Cは、0.5％のアプロチニンを含む以外は培地Aと同じものであった。培地A、B、およびCを各々培養液として、培養を行った。培地交換後1および2日の時点で少量の培養上清を検体として採取し、これを37℃で7日間インキュベートした。インキュベート後、各検体を非還元SDS/ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移して、ヒツジ抗ヒトTFを結合したホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）との結合により、検出した。
この結果、培地Aでは、2日後に小さな分子種の蓄積がみられたが、これは1日後の時点では、3種の条件全てにおいて、少量ながら認められていた。培地B（加熱非慟化した血清）で培養した場合も、このインビトロのタンパク分解は防げず、このことは、蛋白質を分解する成分が、血清中の加熱非慟化を受ける構成成分ではないという考えと一致した。しかしながら、0.5％のアプロチニンを加えると（培地C）、タンパク分解の程度は有意に減少した。このことは、一杯に増殖した細胞の培養上清を調整している間に観察された、全長のキメラ蛋白質の分解が、細胞から分泌された、特異的なエンドペプチダーゼ活性を有するセリンプロテアーゼによって起こる、という考えを支持する。
もうひとつの阻害剤（Pefablock SC；PB）を用いた場合にもまた、セリンプロテアーゼ活性は阻害された。3日間調整した培養上清をウエスタンブロット法で解析したところ、培地中のPB濃度が増すと、100kdの分解産物は相対的に減少していた。0.3〜0.5mMのPBでも、分解は有意に減少するが、0.6mMのPBは、非常に強い抑制効果があるものと考えられる。
実施例5 LDLR/TFキメラ蛋白質のローラーボトルによる産生
キメラ蛋白質の産生をスケールアップする際に、最初に、表面積の広い（1450cm2）ローラーボトル（Falcon 3069）20本に、各々250mlずつ培地をいれ、1分当たりの角速度0.3で各々を回転させることを試みた。E77細胞を一杯になるまで増殖させ、毎週培地を交換して回収した（実施例4）。20本のボトルを、3種の処理群に分割した。ローラーボトルRB8からRB12は、100nM MTXを含む培地で増殖させた。RB3〜RB7は、MTXを含まない培地で増殖させた。RB13〜RB22は、SC7と称するE77のサブクローンを、100nM MTXを含む培地で増殖させた。
全体として、96mg TFeqまたは149mgのキメラ蛋白質を含む48.5リットルの培養液が得られ、キメラ蛋白質の産生量は、1リットル当たり平均3.1mgであった。RB13〜RB22は、キメラ蛋白質の平均濃度が2.2mg/リットルと最も低かったが、RB3〜RB7およびRB8〜12の群の平均産生量は、各々、3.3mg/リットルおよび3.8mg/リットルであった。これらの結果から、選択試薬であるMTXを除去しても、産生量は増加しないものと考えられる。RB3〜RB22から回収した48.5リットルの培養上清を全てプールし、その後の精製のために濃縮した。
実施例6 TF ELISA
キメラ蛋白質内に含まれるヒトTF抗原を検出するための、サンドイッチ酵素免疫測定法（TF ELISA）においては、モノクローナル抗体HTF-14（Biodesign H61016M）を1 x PBS（Gibco 310-4200AJ）で1：1000に希釈したものを、プレートに固相した。標準品としては、ヒトapo-TF（Sigma T-1147）をELISAブロッキング緩衝液（PBS、2％BSA、0.05％ Tween-20）に溶解したものを用いた。ヒトホロTF（鉄で飽和したもの）は、apo-TF（鉄で飽和していないもの）と同じ標準曲線を示した。検出のための酵素結合物質としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）-ヒツジ抗ヒトTF（Biodesign K90070P）を、ELISAブロッキング緩衝液で1：5000に希釈したものを用いた。HRPの基質には、OPD（Dako S-2000）8mgを、0.0125％H2O2を含むpH5.0の0.1Mクエン酸-リン酸緩衝液12mlに溶解したOPDを用いた。
TF ELISAにより、ヒトapo-TF標準品との比較に基づいて、キメラ蛋白質のモル濃度を効果的に測定できる。キメラ蛋白質の構成蛋白質の分子量（116.3キロダルトン）は、ヒトTFの分子量（75.1kd）よりも55％大きい。キメラ蛋白質が、モノクローナル抗体HTF-14およびHRP-ヒツジ抗ヒトTFに対して、ヒトTF標準品と同じ親和性を有すると仮定すれば、キメラ蛋白質の濃度を、1ml当たりのTF等量ナノグラム（即ち、ng TFeq/ml）で表すことができる。故に、本件の場合、ng/mlで表したキメラ蛋白質の実際の濃度は、約55％高い。
実施例7 LDLR/TFキメラ蛋白質の精製
本実施例では、以下に述べる材料及び方法を用いた。腹水のモノクローナル抗体HTF-14からのIgGの精製には、ヤギ抗マウスIgGアガロースビーズ（Hyclone EK-4081）を用いた。マウスIgGは、HRP結合ヒツジ抗マウスIgG（Cappel 55565）により検出した。HTF-14 IgGを、臭化シアンにより活性化したセファロースと反応させて、セファロースビーズに抗体を共有結合させ、TF抗原決定基を含むキメラ蛋白質の、免疫アフィニティー（IA）精製に用いた。LDLの結合に基づくIAクロマトグラフィーには、アフィニティー精製したウサギ抗ヒトLDL抗体（Biomedical Technologies BT-905）を、最初に、臭化シアンにより活性化したセファロースに反応させて共有結合させた後、精製ヒトLDL（Biomedical Technologies TB-903）を、非共有的に固相化するために用いた。ウサギIgGは、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Cappel 55689）により検出した。
A. 抗TF免疫アフィニティークロマトグラフィーによる精製
1. 腹水モノクローナル抗体HTF-14からのIgG分離
抗トランスフェリンモノクローナル抗体HTF-14を、Monoclonal Antibody Affinity Isolation System（モノクローナル抗体アフィニティー分離システム、Hyclone, EK-4081）を用いて、腹水（Biodesign, H61016M, IgG1サブクラス）より分離した。このシステムは、腹水中のモノクローナル抗体を結合し分離するために、抗体として、抗マウスIgGを固相化したアガロースビーズを用いている。抗体は、85％NaClを含む50mlの30mM酢酸中で一段階で溶出し、最終濃度が0.1Mホウ酸ナトリウム、30mM酢酸、85％NaClとなるよう固体のホウ酸ナトリウム中に滴下した。プールを直ちに12-14kdのカットオフ値をもつ透析チューブに入れ、4℃で一晩透析した後、-20℃で凍結した。プールを溶解し、あわせて、Amicon Centriprep 50を用いて、4.36mg蛋白質/mlの溶液12.5mlに濃縮した。112mlの腹水から、54mgの抗トランスフェリンモノクローナル抗体が精製された。この精製段階での収率は、利用可能な抗体の99％であった。
2. 臭化シアンで活性化したセファロースへのHTF-14の固相化
精製抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（HTF-14）を、臭化シアンで活性化したセファロース4B（CN-Br 4B）（Pharmacia）に共有結合させた。12gの支持体を、0.01NのHClで膨潤させて37mlとした。ビーズは、10倍量0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3 pH8.3で洗浄した。HTF-14を、0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3 pH8.3中に4.36mg/mlの割合で含む抗体溶液を加え、自動回転台上で4℃で20時間穏やかに振とうし、反応させた。遊離アミンは、1MエタノールアミンpH8.5を30ml加え、3時間振とうすることにより阻害した。
3. 濃縮培養上清プールからのキメラ蛋白質の結合及び溶出
支持体を脱気し、50mlのファーマシア社製エコノカラム（Pharmachia Econo-Column）に注入した。これをTBS pH7.4で平衡化した。培養上清は、先に32倍に濃縮した（48.5リットルを1.5リットルへ）。これを再度解析し、62.3mgのトランスフェリン等量及び1,044gの総蛋白質量を含むことが示された。この培養上清を10,000rpmで遠心し、0.22μMのフィルターで濾過した。これを直接100mls/時間、40時間のサイクルでHTF-14の免疫アフィニティーカラムにのせた。カラム容積の10倍量のTBS pH7.4でカラムを洗浄した。次にこのカラムを0.1MグリシンpH2.3で溶出した。溶出緩衝液を中和するために1mlの2M Tris-HCl pH8.5を入れたチューブに、2mlずつ分画した。分画の7-30番目をプールした。このプールは、総蛋白質54mg中に26.4mgのキメラ蛋白質（非分解物およびプロテアーゼ分解物の両分画）を含み、これは精製純度49％で、一段階の操作で、培養上清から8,193倍精製したことに相当することが明らかとなった。
B. LDLリガンドアフィニティークロマトグラフィー
1. 臭化シアンで活性化したセファロースへのウサギ抗ヒトLDL抗体の固相化
ウサギ抗ヒトLDLポリクローナル抗体（Biomedical Technologies, BT-905）5mgを、臭化シアンで活性化したセファロース4B（CN-Br 4B）（Pharmacia）へ結合させた。ウサギ抗ヒトLDLポリクローナル抗体は、0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3 pH8.3に透析した。支持体350μgを0.01NのHClで膨潤させた。この支持体を次に、10倍量0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3 pH8.3で洗浄した。抗体溶液を加え、4℃で24時間穏やかに混合して反応させた。その後、1MエタノールアミンpH8.5を2ml加え、1時間穏やかに混合することにより、遊離アミンを阻害した。利用可能な抗体の99％がカラムに結合し、5mgの抗ヒトLDL抗体が共有結合した、1mlの抗ヒトLDL抗体を作成した。
2. LDLの結合
50mM Tris, 0.15M NaClおよび0.3mM EDTAに、10mgのLDL（Biomedical Technologies, BT-903）を5mg/mlの濃度で含む溶液を得た。これを2mM CaCl2を含むTBSに透析した。10mgのLDLを、2mg/mlの濃度で、10回繰り返して抗ヒトLDL抗体カラムにかけた。3.2mgのLDLが流出液に残存しており、これは約6.8mgのヒトLDLがカラムに結合したことを示していた。
3. IAプールからのキメラ蛋白質の結合及び溶出
138μgのキメラ蛋白質を含む、免疫アフィニティー精製した（抗TF IAカラムで精製した）キメラ蛋白質の濃縮プール1mlを、1mlの抗ヒトLDL/LDLリガンドアフィニティーカラムに10回繰り返しかけた。分解されていない蛋白質の、蛋白質分解過程によって切断された蛋白質に対する比を1：1と仮定すると、これは67μgの完全な蛋白質を含むことになる。流出液には29μgまたは21％のキメラ蛋白質が含まれていた。カラムを容積の20倍のTBS pH7.4で洗浄した後、20mM EDTAを含むTBS pH7.4で溶出した。これを1mlずつ分画した。280nmにおける吸光度から、分画2および3に蛋白質のピークが含まれることがわかった。Amicon Centriprep 100の濾過ユニットを用いて、これらの分画を1000rpmで30分間遠心し、濃縮した。10.2μgの完全なキメラ蛋白質が、ピーク分画に溶出されたことがわかった。
実施例8 プロテアーゼ阻害および結合したウシLDLの除去を利用したLDLR/TFキメラ蛋白質の精製
前実施例においては、ローラーボトルで培養したCHO産生細胞株E77から、分解されていないLDLR/TFキメラ蛋白質を、以下の段階を経て分離する精製プロトコールを述べた：1）培養上清の蓄積および濃縮、2）免疫アフィニティークロマトグラフィー（固相化したHTF-14モノクローナル抗体への、キメラ蛋白質ヒトトランスフェリン領域の特異的結合）、および3）リガンドアフィニティークロマトグラフィー（固相化したヒトLDLへの、キメラ蛋白質のヒトLDLR領域の特異的結合）。前実施例では、LDLR/TFキメラ蛋白質の分離を二段階で行う手順について述べているが、LDLリガンドアフィニティークロマトグラフィーの段階は、相対的に効率が良くなかった（即ち、カラムにかけた蛋白質の一部しか回収されなかった）。これはおそらく、免疫アフィニティー精製したキメラ蛋白質が、結合したコレステロールを含有しているという事実によるもので、このコレステロールは、おそらくは細胞培養に用いた透析済みのウシ胎児血清に由来するウシLDL粒子の形で存在する。このため、血清由来のウシLDL-コレステロールによりキメラ蛋白質分子の分画では、ヒトLDLの結合が阻害されている可能性がある。本実施例で示したプロトコールには、固相化した抗ヒトLDLへの結合に先立って、キメラ蛋白質からウシLDLを分離することを含む。
セリンプロテアーゼ阻害剤であるPefablockR SC（0.2mMの濃度で新鮮な培地に添加した）を含む培地に、キメラ蛋白質を蓄積させた。この阻害剤は、キメラ蛋白質の総産生量には重大な影響は与えないが、完全LDLR/TFの相対的産生量は増加させる。培養上清を濃縮して、HTF-14免疫アフィニティーカラムにかけた。キメラ蛋白質のLDLR領域へのLDLの結合は、2価の陽イオン依存性であるが、一方、キメラ蛋白質TF領域へのHTF-14モノクローナル抗体の結合は、2価の陽イオンには非依存性であるため、結合したキメラ蛋白質を含むカラムを、EDTAで洗浄し、キメラ蛋白質に結合したウシLDLを特異的に溶出した。EDTAによる洗浄後、実施例7で示したように、0.1Mグリシン（pH2.3）でキメラ蛋白質を溶出した結果、LDLR/TF産物が含む結合コレステロールの量は、はるかに少なくなった。この試料は、インビボおよびインビトロの実験または治療目的に、有用である。場合によっては、ヒトLDLリガンドアフィニティークロマトグラフィーを用いて更に精製し、LDL結合領域を喪失した分解産物を除去することも可能である。
免疫アフィニティー精製したキメラ蛋白質で、ウシLDLの結合しているもの（実施例7）、および免疫アフィニティー精製したキメラ蛋白質で、ウシLDLを除去したもの（本実施例）の違いを明らかにするため、プロテアーゼ阻害剤存在下で産生したキメラ蛋白質を、最初にHTF-14免疫アフィニティーカラムに結合させた後溶出し、再度HTF-14カラムにかけた。0.2mM PefablockR SC存在下で産生され、56.1mgのキメラ蛋白質を含む、総量43.51リットルの培養上清を、分子量100,000ダルトンのカットオフ値を有するフィルターカセットを装着したPellicon Tangential-Flow Filter System（Millipore）を用いて濃縮し、50.8mgのキメラ蛋白質を含む1.17リットルの溶液とした（回収率91％）。濃縮液（キメラ蛋白質50.8mg、総蛋白量90.7g）をHTF-14カラムにかけ（87％結合）、前実施例で述べたように、0.1Mグリシン（pH2.3）で溶出した。キメラ蛋白質は、ほとんどが、最初の24の分画に溶出された。これらの分画をプールしたところ、35.9mgのキメラ蛋白質および総蛋白質量82.6mgを含んでおり、これは71％の回収率で776倍の精製度に相当するものであった。このキメラ蛋白質の溶出プール（IA1とする）は、キメラ蛋白質1mg当たり2.9mgの総コレステロールを含むことが分かった。
プールIA1のうち24.4mgのキメラ蛋白質を、再度HTF-14カラムにかけた（99.9％結合）。20mM EDTAによる溶出では、キメラ蛋白質はほとんど溶出されなかった（結合したキメラ蛋白質の総量のうち0.005％が放出された）。続いて0.1Mグリシン（pH2.3）でキメラ蛋白質を溶出し、主要な溶出ピークの分画をプールして、これをPBSに対して透析したところ、総量で19.13mg（回収率78％）のキメラ蛋白質を含むプールを得た。このキメラ蛋白質の溶出プール（IA2とする）は、キメラ蛋白質1mg当たりたった0.13mgしか総コレステロールを含んでいないことが分かった。このため、キメラ蛋白質に結合していたコレステロールの95％以上が、グリシンで溶出する前に20mM EDTAでカラムを洗浄することにより、除去されたことになる。
さらに精製するために、キメラ蛋白質のIA2標品を、2価の陽イオン存在下でヒトLDLリガンドアフィニティーカラムにかけ、実施例7のように、過剰量のEDTA存在下で溶出した。カラムにかけた標品は、ウシLDLが除去されているため、キメラ蛋白質に結合したウシLDLによってカラムへの結合及び回収が阻害された、実施例7で述べた標品と比較して、全体的な回収率が高かった。
図6に、CHO細胞で産生されたLDLR/TFキメラ蛋白質の、免疫アフィニティー（IA）精製の様々な段階における状態ならびに非還元SDS/PAGE及びウエスタンブロット解析結果を示す。電気的にニトロセルロースにブロットした蛋白質に、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトトランスフェリン抗体を結合させ、ペルオキシダーゼによる化学発光を検出した。主要なバンドはLDLR/TFキメラ蛋白質であるが、より小さな弱いバンドは、LDLR結合領域を喪失した産物を表す。
レーン1は、LDLR/TFキメラ蛋白質を発現しているCHO細胞から得た培養上清を、濃縮したものを示す。レーン2は、実施例7の方法によってCHO細胞の培養上清から精製した、LDLR/TFキメラ蛋白質を示す。使用した試料は、IA（モノクローナル抗体HTF-14）カラムから溶出した蛋白質分画のプールの一部である。レーン3は、レーン2のLDLR/TFキメラ蛋白のプールを、TBSに対して透析した後のものを示す。レーン4は、実施例7に述べた方法によってCHO細胞の培養上清から精製した、LDLR/TFキメラ蛋白質を示す。濃縮した培養上清を、抗ヒトトランスフェリン免疫アフィニティーカラムに結合させて溶出した後、ヒトLDLリガンドアフィニティーカラムに結合させて溶出した。免疫反応を示す試料の低分子量側のバンドがないことに注意。レーン5は、結合したウシLDLの分離を含む、実施例8で述べた方法により、CHO細胞の培養上清から精製した、LDLR/TFキメラ蛋白質を示す。レーン3に示したプールから得たキメラ蛋白質（IA1）を、再度IAカラムに結合させた後、20mM EDTAを含むTBSでカラムを洗浄することにより、結合したウシLDLを除去した。ここに示したキメラ蛋白質（IA2とする）は、EDTAによる洗浄後に、IAカラムより溶出された蛋白質分画のプールを表している。レーン1、2、3、および5の試料は、セリンプロテアーゼ阻害剤であるPefablock SC存在下で増殖させたCHO細胞から分離した。
実施例9 インビトロ結合解析によるLDLのLDLR/TFへの結合の測定
LDLのLDLR/TFに対する結合親和性について調べるため、マイクロプレート結合解析を開発した。この解析では、各ウェルに固相した抗TFモノクローナル抗体を介してプレートに結合したキメラ蛋白質により、ヒトLDLをプレート上に結合させる。その後、ヒトLDLを、抗LDL抗体との反応により検出する。この解析は、TFおよびLDLRの両方の領域を含むキメラ蛋白質によるものである。
96ウェルのELISA用マイクロプレートに、モノクローナル抗体HTF-14（50mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH8.0で1：500に希釈したもの）を、37℃で45分間固相化した後、B液（50mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH8.0, 0.5％BSA, 0.05％Tween-20）で3回洗浄した。ウェルをブロッキング液（50mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH8.0, 1％BSA, 0.05％Tween-20）で、37℃で45分間インキュベートした。ブロッキング液を除去し、様々な結合培地を加えて、37℃で30分間インキュベートした。結合培地には、B液中にヒトLDLを0.5μg/ml（0.97nM apoB-100）から50μg/ml（97nM apoB-100）の濃度で含み、これに、更に1.55μg/ml（13.3nM）のキメラ蛋白質、1μg/ml（13.3nM）のヒトトランスフェリンを加えるか、または何も加えないものを用いた。プレートをB液で3回洗浄した後、ヒトLDLに特異的なヒツジポリクローナル抗体（IgG）（B液で1：1000に希釈；Biomedical Technologies, Inc.、BT-999）存在下で、37℃で30分間インキュベートした。プレートをB液で3回洗浄後、ペルオキシダーゼを結合させた、ヒツジIgG特異的なウサギポリクローナル抗体（B液で1：5000に希釈；Cappel、55184）存在下で、37℃で20分間インキュベートした。プレートをB液で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質である1,2-フェニレンジアミン（0.1Mクエン酸-リン酸溶液，pH5.0に、0.67mg/mlの濃度で溶解したもの）で37℃で5分間インキュベートした。最終濃度0.8NのH2SO4を加えて反応を停止し、その後マイクロプレートリーダーを用いて、490nmでの吸光度を測定した。各LDL濃度で、ヒトトランスフェリンを含む結合培地で得られたシグナルは、トランスフェリンまたはキメラ蛋白質非存在下において得られたシグナルと同程度であり、これが非特異的結合の基底レベルを示すものと考えられた。各LDL濃度における、非特異的結合による吸光度の平均値を、キメラ蛋白質存在下で得られたシグナルから差し引いて、LDLのキメラ蛋白質への特異的結合を表す吸光度値を算出した。この吸光度値をLDL濃度に対してプロットしたものを、図7に示した。50μg/mlでのシグナルが結合の最大値を示すものと仮定すると、最大値の半分の結合は、LDLの濃度が約1.6μg/ml（3.1nM）で観察された。
実施例10 LDLR/TFキメラ蛋白質の結合および解離特性
LDL：LDLRの相互作用はこれまでに詳細に解析されており、Ca++または他の2価の陽イオンを必要とすることが示されている。更に、LDLRへのLDLリガンドの結合はpH依存性であるため、低いpHでは解離が起こる（J. L. GoldsteinおよびM. S. Brown, Ann. Rev. Biochem., 46：897（1997））。この後者の特徴は生理学的に重要で、LDLRが酸性のエンドソーム区画内に入ることでLDLを放出し、受容体の再利用がなされる。このため、LDL：LDLRの相互作用を研究するために特異的に作成されたインビトロ解析を用いて、LDLR/TFキメラ蛋白質へのLDLの、結合、およびそこからの解離について、pHおよび陽イオンに対する非依存性を調べた。
実施例8に述べたようにLDLR/TFキメラ蛋白質を産生および精製し、そのLDL結合特性を調べた。特に、EDTA存在下および非存在下での結合を調べることにより、LDLの、キメラ蛋白質のLDLR領域への結合の、陽イオン依存性を調べた。EDTA存在下および非存在下での結合後の洗浄の段階の効果を調べることにより、LDLのキメラ蛋白質のLDLR領域への結合の、陽イオン依存性を調べた。同様に、結合中および結合後の洗浄段階を、pH8.0およびpH5.2で行い、それぞれの効果を比較することにより、LDLのキメラ蛋白質への結合のpH依存性を調べた。低いpHで結合が減少することは、エンドソームの酸性環境において、LDLがLDLR/TF：TFR複合体から放出され複合体が再利用される可能性があることを示すものと考えられる。これらの作用を調べるためにマイクロプレート結合解析を開発し、その結果を図8に示した。
マイクロプレート結合解析は、抗LDL抗体を固相化したEHSAプレート上に固定したLDLに結合する、キメラ蛋白質の量を検出するものである。96ウェルマイクロタイタープレートに、50mM Tris-HCl, pH8.0, 2mM CaCl2（A液）に、5μg/mlの濃度でヒツジ抗ヒトLDL抗体（Biomedical Technologies, Inc., BT-999）を溶解したものを固相化した。A液に0.5％BSAを加えたもので洗浄した後、A液に1％BSAを加えたもので、37℃で30分間ブロッキングを行った。陰性対照用の検体ウェルには、抗ヒトLDL抗体を固相化しなかった（抗体なし）。結合しなかったLDLを、A液に0.5％BSAを加えたもので洗浄して除去した。LDL：抗LDL抗体の結合は2価の陽イオン濃度には非感受性であると予想されるため、対照用ウェルの一部は、代わりに、A液に0.5％BSAおよび20mM EDTAを加えたもので洗浄した（EDTA存在下の予備洗浄）。次に、A液に0.5％BSAを加えたものに、1μg/mlの濃度でキメラ蛋白質を溶解して、すべてのウェルに加え（未処理）、37℃で30分間インキュベートした。一部のウェルを、A液に0.5％BSAおよび20mM EDTAを加えたものに溶解したキメラ蛋白質で処理した（EDTA存在下の結合）が、その他のウエルは、25mM酢酸ナトリウム, 150mM NaCl, および2mM CaCl2を含むpH5.2の緩衝液に溶解したキメラ蛋白質で処理した（pH5.2での結合）。その後、検体ウェルを以下の3種のうちの1種の溶液で洗浄した：1）A液に0.5％BSAを加えたもの（未処理）、2）A液に0.5％BSAおよび20mM EDTAを加えたもの（EDTA存在下の洗浄）、または3）25mM酢酸ナトリウム（pH5.2）, 150mM NaCl, および2mM CaCl2（pH5.2での洗浄）。その後、ウェルにHRP結合ヒツジ抗ヒトトランスフェリン抗体（Bildesign K90070P, A液に0.5％BSAを加えたもので1：5000に希釈）を加えて37℃で30分間インキュベートした後、A液に0.5％BSAを加えた（未処理）液で、徹底的に洗浄した。一部のウェルは、A液に0.5％BSAおよび20mM EDTAを加えたもので（EDTA存在下のHRP後の洗浄）、一方、その他のウエルは、25mM酢酸ナトリウム（pH5.2）, 150mM NaCl, および2mM CaCl2で（pH5.2でのHRP後の洗浄）、洗浄した。最後の洗浄段階の後、基質のオルソ-フェニレンジアミンで、37℃5分間インキュベートして発色させた。2N H2SO4を加えて反応を停止させ、プレートを490nmでの吸光度について解析した。
図8に見られるように、抗体（抗LDL）でコートしていない場合（抗体なし）には、キメラ蛋白質の結合が基底レベルに過ぎなかったことから、キメラ蛋白質のプレート（未処理）への結合は、プレートに結合したLDLに全面的に依存している。更に、EDTAは、最終的なキメラ蛋白質の結合シグナルには殆ど影響を及ぼさなかったことから（EDTAによる予備洗浄）、コートしている抗体へのLDLの結合を殆ど解離させなかった。
プレートに固相化したLDLへのキメラ蛋白質の結合は、この結合段階を、Ca++に対して10倍量の過剰なEDTAの存在下（EDTA存在下の結合）、酸性条件下（EDTA存在下の結合）、または酸性条件下（pH5.2での結合）で行うと、基底またはそれに近いレベルにまで、劇的に減少した。このことは、キメラ蛋白質：LDLの結合の相互作用が、インビトロまたインビボで観察されたLDL：LDLRの結合の相互作用と同様に、キレート化していない2価の陽イオンの存在およびpHに、依存していることを示している。
キメラ蛋白質を結合可能な条件下で結合させた後の洗浄を、EDTA存在下（EDTA存在下の洗浄）または酸性条件下（pH5.2での洗浄）で行うことは、キメラ蛋白質を、基底レベルまたはそれに近いレベルまで、結合していたLDLから解離させるのに有用であった。これらの結果は、LDLRについてインビトロおよびインビボで観察されたように、キメラ蛋白質は、酸性条件下では、結合しているLDLを放出しうることを示唆している。
キメラ蛋白質を結合し洗浄して、HRP結合抗ヒトトランスフェリン抗体に結合した後の洗浄段階を、EDTA存在下（EDTA存在下のHRP後の洗浄）または酸性条件下（pH5.2でのHRP後の洗浄）で行った場合、キメラ蛋白質の一部がLDLから解離されたに過ぎなかった。このことから、これらの結果は、pHおよびEDTAの効果は、LDL：キメラ蛋白質複合体が解離することによるもので、既に構成されているLDL：キメラ蛋白質複合体のTF領域への、HRP結合抗ヒトトランスフェリン抗体の結合を、阻害するためではないことを示している。更に、これらの結果から、キメラ蛋白質のTF領域への抗体の結合が、LDLR領域に対して、（LDL親和性を増すような）アロステリックな効果を有するか、または、おそらく、（解離条件下でのLDL：キメラ蛋白質複合体の安定性を増して）解離試薬を立体的に阻害する可能性が示唆される。
実施例11 哺乳類細胞で発見させたLDLR/TFキメラ蛋白質は完全なLDLRおよびTFの構造領域を含む
本実施例では、一つのLDLR/TFキメラ蛋白質がLDLRおよびTFの両方の構造領域を含み、これらの構造領域が、各々、LDLおよびTFRに対して機能的結合能を保持していることを、特異性が既に知られているモノクローナル抗体を用いて示した仕事について、述べている。
3’末端に、フレームを合わせて、成熟型ヒトトランスフェリンをコードするcDNAの全塩基配列を融合させたヒトLDLRcDNA塩基配列の5’部分（374アミノ酸からなるリガンド結合領域）を含む融合遺伝子を、哺乳類細胞にトランスフェクトし、LDLR/TFキメラ蛋白質を発現させた。キメラ蛋白質が、天然のLDLRおよびTF蛋白質に見られる構造的特徴を保持していることを示すため、本発明者らはここで、LDLR/TFキメラ蛋白質の分子種が、2種の異なるモノクローナル抗体：HTF-14（抗ヒトTF、Biodesign H61061M）およびC7（抗ヒトLDLR、Amersham RPN 537）によって免疫沈降できることを示す。
モノクローナル抗体HTF-14は、ヒトTFの、TFR結合部位またはその近傍に位置する構造的な（および非還元状態での）抗原決定基に、特異的に反応することが知られている。HTF-14がTFに結合すると、TFRの結合が阻害される。モノクローナル抗体HTF-14がLDLR/TFキメラ蛋白質に結合することは、キメラ蛋白質のTF領域がほぼ完全な状態である証拠とすることができ、LDLR/TFにおける、この構造もTFRに対する結合能を有することを示唆する。実施例12は、LDLR/TFキメラ蛋白質が、実際にヒトTFRに結合することを示すデータについて述べている。
モノクローナル抗体C7は、ヒトLDLRのLDL（リガンド）-結合部位またはその近傍のリガンド結合領域に、特異的に反応することが知られている。C7がLDLRに結合すると、LDLの結合が阻害され、また逆に、LDLがLDLRに結合すると、C7の結合が阻害される。モノクローナル抗体C7がLDLR/TFキメラ蛋白質に結合することは、キメラ蛋白質のLDLR領域がほぼ完全である証拠とすることができ、LDLR/TFにおいても、この部位がLDL結合能を有することを示唆する。他の実施例（実施例9）で既に、LDLR/TFキメラ蛋白質が、実際にヒトLDLに結合することを示した。
pSV2neo（陰性対照）を単独で、またはpEFBPS/LDLrTF1. SとpSV2neoとを同時にトランスフェクトした、正常ヒト線維芽細胞クローンの培養上清1mlを、まず、1％NP-40を含むTBSに浸したヤギ抗マウスIgGアガロースビーズ（Hyclone EGK-1060）を用いて、予備洗浄した後、モノクローナル抗体HTF-14、モノクローナル抗体C7、または無関係なモノクローナル抗体（抗ヒト第IX因子、Hematologic Technologies, Inc. AHIX-5041）のいずれかを加えた。抗体を結合させた後、ヤギ抗マウスIgGアガロースビーズを加えて抗原-抗体の複合体を沈降させた。ビーズを洗浄して非結合物質を除去し、SDSを含むSDS/PAGE試料緩衝液中で煮沸することにより、ビーズから蛋白質を溶出した。溶出液をSDS/PAGE（8％ゲル）で電気泳動して、支持体であるニトロセルロース膜フィルター（Schleicher and Schunell BA-S-85）に電気的にブロットし、そのフィルターを、0.05％Tween-20および5％（w/v）脱脂粉乳を含むTBSで、数時間ブロッキングした。ブロッキングしたフィルターを、HTF-14が認識する抗原決定基を含む、ヒトTFの様々な抗原決定基をもつタンパク種を検出できる、HRP結合ヒツジ抗ヒトTF（Biodesign K90070P）で処理した。ここでは、抗体の結合は、0.05％Tween-20を含むTBS中で行った。結合後、0.05％Tween-20を含むTBSで、フィルターを数回洗浄し、その後TBSで2回洗浄した。化学発光試薬（Amersham RPN 2106）でHRP結合を検出した後、フィルムを感光させ、これを現像してスキャンを行った（図9）。レーン1は、陰性対照のヒト線維芽細胞クローン（pSV2neoをトランスフェクトしたもの）から得た培養上清1mlを、モノクローナル抗体HTF-14で免疫沈降したものである。キメラ蛋白質の分子種は認められない。レーン1で認められる物質は、結合培地に2％脱脂粉乳を用いた場合には認められず、このことから、これはキメラ蛋白質と関係のあるものとは思われない。レーン2は、pEFBOS/LDLrTF1. SとpSV2neoとを同時にトランスフェクトしたヒト線維芽細胞クローンの培養上清1mlを、モノクローナル抗体HTF-14で免疫沈降したものである。主要な蛋白質の分子種（約116kd）およびより少量の分子種一つ（約100kd）が、明らかに認められる。少量の分子種は、LDLR領域でのセリンプロテアーゼによる特異的切断によって、主要な分子種から由来したものである。レーン3は、レーン2で用いたものと同じヒト線維芽細胞クローンの培養上清1mlを用いているが、モノクローナル抗体C7で免疫沈降したものである。モノクローナル抗体HTF-14により免疫沈降された主要産物と同じ分子サイズを有する、主要な蛋白質分子種（約116kd）一つが明らかに認められる。このことは、一つのLDLR/TFキメラ蛋白質が、LDLR領域（C7により免疫沈降できる）およびTF領域（HTF-14を用いたウエスタンブロットの解析で検出できる）の両方を含んでいることを示す。レーン3に認められる少量の分子種は、完全なTF領域は保持しているが完全なLDL領域は持っていないため、モノクローナル抗体C7では免疫沈降しない。レーン4は、レーン2および3で用いたものと同じヒト線維芽細胞クローンの培養上清1mlを用いているが、この場合は、LDLRまたはTFのいずれとも結合することは知られていない、ヒト第IX因子に特異的なモノクローナル抗体で、免疫沈降したものである。予想通り、LDLR/TFキメラ蛋白質は、この抗体では免疫沈降されない。
実施例12 インビトロにおけるヒト肝細胞のトランスフェリン受容体に対するLDLR/TFキメラ蛋白質の結合
実施例8で述べたようにして精製したLDLR/TFキメラ蛋白質の機能性を、ヒト肝細胞表面に存在するトランスフェリン受容体（TFR）に対する結合能により調べた。本実施例で述べるように、LDLR/TFキメラ蛋白質は、細胞へのTFの結合を阻害するが、このことは、このキメラ蛋白質が、ヒト肝細胞の表面に存在するTFRに結合することを示す。Hep G2細胞は、TFRを含めて、正常のヒト肝臓の肝細胞が通常産生する蛋白質の殆どを合成するため、肝細胞のインビトロの研究には有用である。
Hep G2細胞（ATCC番号HB 8065）を、DMEM（Cellgro 50-013）、10％ウシ胎児血清（Hyclone A-1111）、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン各50単位/ml（GibcoBRL 15070-014）を含む培地で増殖させた。放射性同位元素で標識したトランスフェリンリガンドは、Amershamより（IM 194）、（3-［125I］インドチロシル）-トランスフェリン（ヒト）として、比活性700〜800Ci/mmolのものを入手した。この125I-TFは鉄で飽和しており（即ち  ホロTF）、80％DMEM（Cellgro 50-013）、これを、0.5％のプロテアーゼを含まないウシアルブミン（Sigma A-3059）、および20％リン酸緩衝液（PBS；GibcoBRL 14200-026）を含む結合培地に溶解した。放射性同位元素で標識したTFの結合阻害剤は、PBSで希釈して、培地中のPBSに代えて培地に加えた。本実施例においては、キメラ蛋白質および標識していないホロTFの阻害活性について調べた。
6ウェルの組織培養プレート（直径35mm）に、1ウェル当たり2 x 105個のHep G2細胞を撒き、3日間増殖させた。その後細胞を1〜2回DMEMで洗浄し、続いて5mlのDMEMを加えて、37℃で30分間インキュベートした。この洗浄および処理の段階は、除去しなければTFRに結合して、結合解析を阻害する可能性のあるTFを含む、ウシ胎児血清とともに混入してくる血清成分を除去するのに役立つ。30分間のインキュベート後、プレートを氷上に移し、培地を吸引除去した。各ウェルに1mlずつ氷冷した結合培地を加え、4℃で2時間、振とうまたは揺動させて、穏やかにプレートを撹拌した（結合期間）。
2時間の結合期間の後、プレートを氷上に置き、その後の洗浄段階を氷上で行った。細胞から結合していない標識を除去するため、各ウェルを、0.5％BSAを含むPBSで3回洗浄した後、さらに3回PBSで洗浄した。各ウェルの細胞を、1mlの1 N NaOHで溶解し、溶解液を12 x 75mmのポリスチレンチューブ（Falcon 2052）に移した。ウェルをさらに1mlの1 N NaOHで洗浄し、これを、相当する溶解液を入れたポリスチレンチューブに加えた。溶解液中に存在する放射活性を有するTFの量を、ガンマ計数器（Beckman）によりガンマ放射を定量することにより計測した。結合段階を終えた細胞を氷上に置くと、放射性標識TFの、細胞への取り込みが阻害されるため、ガンマ放射の計数値は、結合段階終了時に細胞表面に存在する放射性標識TFの量を反映する。溶解液もまた中和し、BCA Protein Assay（BCAタンパク解析）（Pierce 23225G）を用いて、ウシアルブミンを標準品として、総タンパク含量を測定した。総タンパク含量（ミリグラムで表示）に対する総放射活性（毎分あたりのカウントで表示；cpm）の比は、リガンド結合能の有用な推定値となる。
Hep G2細胞における、TFのTFRに対する結合の平衡解離定数（Kd）は、7nMである（Trowbridge, I. S. ら、Biochem. Pharmacol.、33：925〜993（1984））。非標識TFが、125I-TFのTFRへの結合の競合的阻害剤として7nM存在するならば、リガンドの結合（cpm/mgで表示）は、約50％阻害されると考えられる。更に、（約7nMの濃度で存在する）非標識リガンドが全て、TF（即ちLDLR/TF）と同程度の親和性でTFRに結合するならば、結合が約50％阻害されることになる。非標識リガンドが高濃度（即ちKd値の50〜100倍）で存在すれば、ほぼ全ての受容体結合部位が占領され、細胞に結合したリガンドはすべて、非特異的な部位（即ちTFR以外の部位）に結合したものであることになる。非標識リガンドがTFRに結合しなければ、結合阻害は認められないと考えられる。このため、TFRとは直接相互作用しないヒトのLDLは、125I-TFに対するTFRの結合に対して、阻害作用を示さない。
このリガンド結合解析を用いて、Hep G2細胞において、LDLR/TFキメラ蛋白質は、125I-TFへのTFRの結合を競合的に阻害し、その結果から、ヒトTFRに特異的に結合しうることを示した。
一つの実験においては、Hep G2細胞を、阻害剤非存在下、またはホロTF存在下、または精製LDLR/TFキメラ蛋白質［ヒトLDLRの第1〜395アミノ酸を、ヒトトランスフェリンの第20〜698アミノ酸に融合させた、LDLR/TFキメラ蛋白質を発現する、CHO細胞より精製したもの（実施例3参照）］存在下のいずれかの条件でインキュベートし、これらの蛋白質の阻害効果を評価した。ホロTFおよびキメラ蛋白質については、TFまたはLDLR/TFキメラ蛋白質の鉄結合部位を更に飽和させるため、10μM FeCl3存在下で、5nM、50nMまたは500nMの濃度で実験を行った。
結果を、表2に示す（以下に記載）：
表2  Hep G2細胞bへの125I-ホロTFaの結合（溶解液中の総蛋白質1mg当たりの結合cpm）
0004276295.tif 000005
括弧内の数値は、阻害剤非存在下での結合（100％とする）に対する結合計数値の百分率を示す。
a 0.3nMの標識TF
b 35mmウェルに2 x 105細胞を撒いたもの
これらの結果は、ホロTFおよびLDLR/TFキメラ蛋白質は、いずれも、標識TFの結合に対する有力な阻害剤であることを示している。故に、本リガンド結合解析により、LDLR/TFキメラ蛋白質が、Hep G2細胞において、TFRの125I-TFへの結合を競合的に阻害し、その結果ヒトTFRに特異的に結合しうることが示された。
同様の解析を用いて、キメラ蛋白質がまた、ヒト線維芽細胞およびその他の種類の細胞の表面に存在するTFRにも、結合しうることを証明できる。
実施例13 インビトロにおけるヒト肝細胞へのLDLの取り込み
前実施例に述べたようにして精製したLDLR/TFキメラ蛋白質が、TFRを介した経路を経て、細胞のLDLの取り込みを促進するような方法で、ヒトLDLおよびヒトTFRの両方に結合する能力を調べることができる。更に、キメラ蛋白質による更なるLDLの取り込みは、TFの競合作用により阻害されうる。
Hep G2細胞株におけるLDLの取り込みを定量するため、実施例12でTFRの結合について述べた方法とほとんど同様にして、細胞を結合培地に入れ、洗浄して、溶解した後、放射活性および総タンパク含量を解析した。しかしながら、本解析においては、放射活性で標識したLDLを用い、37℃でインキュベートして、結合後の細胞への取り込みを調べた。インキュベーション中に、標識LDLはLDLRに結合し、正常なLDLRの経路を経て細胞に入る。更に、標識LDLはまた、キメラ蛋白質に結合することも可能で、LDLR/TF-LDLの複合体は、TFRに結合した後、TFRの取り込み経路を経て、細胞に入る。このため、非標識LDLは、標識LDLの、LDLRおよびキメラ蛋白質の両方に対する結合を阻害するが、一方、ヒトホロTFは、LDLR/TF-LDL複合体のTFRへの結合のみ阻害する。
200cpm/ngLDL蛋白質以上の比活性で放射性標識した（125I）ヒトLDL（Biomedical Technologies, Inc. ；BT-913R）を、80％DMEM、0.5％のプロテアーゼを含まないウシアルブミン、および20％PBSを含む培地で希釈する。放射性標識LDLの結合および取り込みの阻害剤は、PBSで希釈し、この培地中のPBSと置換する形で加えた。本実施例においては、キメラ蛋白質の存在下または非存在下、および、非標識阻害剤としてのホロヒトTF（Sigma T-3400）もしくはLDL（Biomedical Technologies, Inc. BT-903）の存在下および非存在下で、125IヒトLDLの取り込みを測定した。
6ウェルの組織培養プレート（直径35mm）に、1ウェル当たり2 x 105個のHep G2細胞を撒き、DMEM（Cellgro 50-013）、10％ウシ胎児血清（Hyclone A-1111）、および各々50単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン（GibcoBRL 15070-014）を含む培地で3日間増殖させた。その後細胞を1〜2回DMEMで洗浄し、5mlのDMEMを加えて、37℃で30分間インキュベートした。この洗浄および処理の段階は、除去しなければTFRに結合して結合解析を阻害する可能性のあるトランスフェリンを含めて、ウシ胎児血清とともに混入してくる血清成分を除去するのに役立つ。30分間のインキュベート後、各ウェルの培地を吸引除去し、取り込み用培地1mlに置換した。プレートを37℃の標準組織培養用インキュベーターに入れて、標識LDLの取り込みおよび蓄積を行わせた。
取り込み期間後、プレートを氷上に置き、その後の洗浄段階を氷上で行った。細胞から結合していない標識を除去するため、各ウェルを、0.5％BSAを含むPBSで3回洗浄した後、さらに3回PBSで洗浄した。その後各ウェルの細胞を、1mlの1 N NaOHで溶解し、溶解液を12 x 75mmのポリスチレンチューブ（Falcon 2052）に移した。ウェルをさらに1mlの1 N NaOHで洗浄し、これを、相当する溶解液を入れたポリスチレンチューブに加えた。溶解液中に存在する放射性標識LDLの量を、ガンマ計数器（Beckman）によりガンマ放射を定量することで計測した。細胞が標識LDLを取り込むため、ガンマ放射の計数値は、取り込み段階終了時に細胞表面に存在する、完全な標識LDLの量と同様に、細胞内の標識LDLの量またはその代謝産物の量を反映する。溶解液もまた、中和し、BCA Protein Assay（Pierce 23225G）を用いて、総タンパク含量を測定した。総タンパク含量（mg）に対する総放射活性（cpm）の比は、LDLの取り込みの有用な推定値となる。本解析を用いて、LDLR/TFキメラ蛋白質が、Hep G2細胞への放射活標識LDLの取り込みを促進し、非標識TFまたはLDLが、この取り込み促進作用の競合的阻害剤として機能することを証明できる。
細胞へのLDLの取り込みはまた、既に確立されたプロトコール（Goldstein, J. L. ら、Meth. Enzmol.、98：241〜260（1983））に従って、取り込まれたLDLの、細胞内での過程および遺伝子発現に及ぼす効果を測定することによっても、モニターすることができる。LDLから、直接またはコレステリルエステルの加水分解によって、遊離コレステロールが放出されると、調整用コレステロールの備蓄ができ、これが3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素（HMG-CoA還元酵素）をコードする遺伝子の発現を抑制するばかりでなく、アシル-CoA：コレステロールO-アシル基転移酵素（ACAT）をコードする遺伝子の発現を活性化する。HMG-CoA還元酵素は、コレステロール生合成における律速段階を触媒するため、この酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されると、LDLR/TFによって取り込みが促進されるために細胞内コレステロールレベルが上昇し、このため、コレステロールのデノボの生合成が減少する。更に、過剰の遊離コレステロールをエステル化して、細胞質内にコレステリルエステル滴（主にオレイン酸コレステロール）として貯蔵させる酵素であるACATの発現が増加すると、細胞のコレステロール貯蔵能が増加する。最終的に、遊離コレステロールの調整用備蓄が増加することにより、LDLRの合成は抑制される。このように、コレステロール代謝に及ぼす、コレステロールの細胞内備蓄が増加するという3つの二次的な作用が、生物がコレステロールの過剰生成を防御する、コレステロール恒常性の機構を構成している。
TFRが仲介するエンドサイトーシス経路において、キメラ蛋白質が機能した結果としてLDLの取り込みが起こると、放出された遊離コレステロールは、LDLRの合成は抑制するが、TFRの合成は抑制しない。この抑制効果は、最終的には細胞内コレステロールの減少を招き（LDLRの数が減少することにより取り込みが低下するため）、引き続いて、HMG-CoA還元酵素の活性の増加、および、ACAT活性の低下によるコレステロール備蓄能の減少により、コレステロールの生合成が増加することになる。キメラ蛋白質存在下では、TFRが仲介するエンドサイトーシス経路を経て、持続的にLDLの取り込みが起こる可能性があり、この結果、持続的に、HMG-CoA還元酵素の抑制およびACATの活性化が起こる。このため、正常なLDL取り込み経路を迂回する場合、細胞内コレステロールの生合成および貯蔵の各々の増減を、長期にわたって維持することができ、この結果、血清中の総コレステロールレベルを、低く維持することができる。
実施例14 インビボでのマウスのコレステロールレベルに対するLDLR/TFキメラ蛋白質の作用
LDLR/TFキメラ蛋白質が、インビボのモデル系において、抗高コレステロール血症作用を有するか否かを明らかにするため、精製したキメラ蛋白質を静脈注射した後、1回またはそれ以上の時間間隔をおいて、コレステロールレベルを測定する。LDLR/TFのように外部から投与した蛋白質は、動物の体内における循環寿命が限られているため、大量の蛋白質を一度に注射しても、LDLコレステロールのレベルを低下させる作用は一過性のものに過ぎず、注射した蛋白質が循環から除去されてしまえば、レベルは基準値に戻る。しかしながら、徐放剤の使用または遺伝子治療（キメラ蛋白質を分泌するように遺伝子操作を施した細胞を移植すること）によって、キメラ蛋白質を持続的に供給すれば、LDLコレステロールに対する作用を、長期間または永続的に発揮させることができる。
イシバシら（J. Clin. Invest. 92：883〜893（1993））は、LDLRのノックアウトマウスは、殆どの系統の実験用マウスと比較して、総コレステロールおよびLDLコレステロールの両方のレベルが増加している、と報告している。ホモ接合LDLR遺伝子を欠損しているこの系統のマウスを、哺乳類の種におけるLDLR/TFの生物学的な作用に関する、インビボの研究に用いた。
正常なマウスにおいては、循環コレステロールのほとんどがHDLによって運ばれるが、ヒトでは、ほとんどのコレステロールはLDLによって運ばれる。しかしながら、ヒトとは異なり、マウスでは、LDL分画の70％は、LDLRに対する結合部位を欠損したアポリポ蛋白質Bの短縮型変異体である、apoB-48に関連しており、一方で30％は、LDLRの結合領域を含むapoB-100と関連している。これに対して、ヒトLDLの98％は、apoB-100を含んでいる。重量百分率でいえば、マウスのLDLは、9.5％の非エステル化コレステロール、23.5％のコレステリルエステル、および20.5％の蛋白質を、ヒトLDLは、9.2％の非エステル化コレステロール、37％のコレステリルエステル、および22％の蛋白質を含んでいる（Chapman, M.、J. Meth. Enzymol. 128：70〜143（1996））。
ホモ接合LDLR遺伝子を欠失させることによりLDL（apoB-100）の消失（clearance）が完全に阻害され、その結果、LDLの定常状態レベルが上昇する。ホモ接合LDLRノックアウト雌マウスでは、総コレステロールレベルが、対照である正常ホモ接合遺伝子を有する野生型より139mg/dl高い（イシバシらJ. Clin. Invest. 92：883〜893（1993））。機能的LDLRは、apoB-100LDL分画と相互作用するが、apoB-48LDL分画とは相互作用しないため、過剰分の総コレステロール139mg/dlが全てapoB-100LDL分画に含まれていると仮定すると、各マウスにおいて、約1mlの血清に、少なくとも1.39mgの総コレステロールが、LDLR/TFが結合する標的分子である、apoB-100の分画に含まれていることになる。コレステロールが重量にしてLDLの33％をしめ、LDLのこの分画が20.5％の蛋白質を含み、および、apoB-100分子の分子量が514kdであると仮定すれば、マウス一匹当たりでは、1.39mgの総コレステロールは、約1.68mmolのapoB-100に相当する（LDL粒子あたり1分子のapoB-100）。LDLR/TF（炭化水素を除いた分子量は116.3kd）に1分子が結合する場合には、マウス当たり1.68nmolのLDLR/TFは、195μgのLDLR/TFに相当する。例えば、LDLRノックアウトマウスの体内を循環しているLDL（apoB-100）粒子数の10％等量（0.168mol）のLDLR/TFを供給するためには、マウス当たり19.5μgのLDLR/TF融合蛋白質を注射することが必要である。
総コレステロール、HDLコレステロール、およびLDLコレステロールの基準レベルを確立するため、キメラ蛋白質または陰性対照を注射する前の特定時に、動物を麻酔し、眼窩後部から採血した。各動物の凝固血から血清を分離し、比色定量法と組み合わせた酵素アッセイ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を用いて、総コレステロールおよびHDLコレステロールのレベルを測定した。マニュアルの手順を96ウェルのマイクロタイタープレート用の方式に応用して、mg/dlで表される総コレステロール濃度を定量する。血清および標準コレステロールを、通常の生理食塩水で希釈し、各々10μlずつ96ウェルマイクロタイタープレートに二重測定、三重測定で分注する。コレステロール試薬（Sigma 352-20）200μlを各ウェルに加え、プレートを37℃で10分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで、490nmの吸光度を測定する。本解析では、吸光度は、0〜200mg/dlの間で直線を示し（標準曲線は、標準コレステロール；Sigma C-0534を用いて作成した）、この範囲内に納まるよう検体を希釈する。
mg/dlで表したHDLコレステロール濃度は、LDLおよびVLDLコレステロール分画を、HDLコレステロール試薬（Sigma 352-3）を用いて沈殿させた後、総コレステロールと同様にして（上記のように）定量する。血清を10分の1容量のHDLコレステロール試薬と混合し、室温で約5分間放置する。マイクロ遠心機で、高速で2分間遠心した後、上清の一部を採取し通常の生理食塩水で希釈し、上記の方法で、総コレステロールを測定した。もとの血清中におけるHDLコレステロールの濃度を算出するため、解析した上清中の総コレステロール濃度に1.1を乗じ、HDLコレステロール試薬の添加による10％の増量分を補正する。LDLコレステロールは、HDLコレステロール試薬で血清を処理してLDLおよびVLDL分画を除去する前に得られた総コレステロール値から、HDLコレステロールとして得られた値を差し引いて、算出する。
注射前の血清コレステロールの基準レベルを決定した後、相当量のLDLR/TFキメラ蛋白質を含む溶液（リン酸緩衝食塩液；PBSに溶解したもの）各50μlを、麻酔したLDLRノックアウトマウスの尾静脈に注射する。麻酔および注射の影響を評価するため、別のLDLRノックアウトマウスに、陰性対照として、PBS50μlを注射する。TF受容体と投与したTF領域との相互作用が、リポ蛋白質の代謝に影響を与えるか否かを明らかにするため、更に別の陰性対照として、LDLR/TFと同じモル濃度のヒトホロトランスフェリン（ホロTF）を含む50μlのPBS溶液を、LDLRノックアウトマウスに注射する。ヒトホロTFは、LDLR/TFキメラ蛋白質に含まれているものと同じTF領域を含んでいるが、LDLR領域を持たないため、LDLとは結合できない。この種の陰性対照により、ヒト蛋白質またはヒトTF抗原の等量を注射した結果として起こる可能性のある全ての作用を、評価することができる。
キメラ蛋白質または陰性対照物質を注射した後、予定した採取容量および採集頻度に従い、適当な時間間隔をおいて、再度、眼窩後部からの採血を行う。注射後の採血で得られた血清について、総コレステロールおよびHDLコレステロールの濃度を調べる。LDL（即ちLDLとVLDLとを合わせたもの）コレステロールのレベルは、総コレステロールとHDLコレステロール濃度との算術的な差として算出する。この方式によれば、LDLR/TFが特定の血清コレステロール分画を減少させる作用を、定量できる可能性がある。
注射後の採血により得られた血清はまた、循環血中に残存するLDLR/TFキメラ蛋白質の濃度を解析するのに用いることもできる。解析に用いた抗体はマウストランスフェリンと交差反応しないため、ヒトTFのELISA（実施例6）を用いることができる。マウス血清中からキメラ蛋白質が消失する速度を測定すれば、キメラ蛋白質の循環血中の半減期を推定することができる。
特定のキメラ蛋白質が、リポ蛋白質の消失速度に及ぼす影響についてもまた、調べることができる。イシバシら（J. Clin. Invest. 92：883〜893（1993））は、マウスがLDLRを欠損すると、放射性標識LDLまたはVLDLを注射した場合の消失速度は有意に低下するが、放射性標識HDLを注射した場合の消失速度は影響を受けないことを示している。キメラ蛋白質を投与したために起きる、リポ蛋白質の消失速度の増加を定量するため、キメラ蛋白質を供給（大量を一度にまたは持続的に注入）した後の消失速度を、この方法で調べることができる。
LDLRノックアウトマウスに加えて、LDL受容体に欠陥を有し、LDL代謝の欠陥による高コレステロール血症を発症するワタナベウサギは、LDLR/TFキメラ蛋白質が、コレステロールレベルに与えるインビボでの影響を評価するのに用いることができる可能性がある。
等価事項
当業者は、日常的な実験以上のものを用いることなく、本明細書に述べた本発明の特定の態様に等価な数多くの事項を、認識または確認できると思われる。そのような等価事項は、以下の請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
0004276295.tif 000006
【図２】
0004276295.tif 000007
【図３Ａ】
0004276295.tif 000008
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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