(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Porphyromonas gingivalisに対して免疫応答を生じさせる使用のための組成物であって、適切なアジュバントおよび／または許容される担体もしくは賦形剤ならびに
FNGGISLANYTGHGSETAWGT;
LNTGVSFANYTAHGSETAWADP;
PYQPVSNLTATTQGQKVTLKWDAPSTK;
SYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVAA;および
VTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPNPGTTTLSESF;
からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む組成物。
【請求項２】
該組成物が請求項１に記載の群から選択される２以上のペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該組成物が請求項１に記載の群から選択される１つ以上の異なるペプチドの多量体を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
個人におけるP.gingivalis感染の見込みおよび/または疾患の重症度を低減するための医薬製造における請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、歯周病に関連する口腔内細菌Porphyromonas gingivalis病原体の影響を抑制するための経口組成および免疫原組成に関する。本発明は、歯肉下プラークサンプル中のPorphyromonas gingivalisおよび血清中のP.gingivalis抗原に対する特異的抗体の存在についての診断試験にも関する。該組成物は、Porphyromonas gingivalisのPrtR-PrtKプロテイナーゼ-接着物複合体の構造的および機能的に意味のある領域に対応する合成ペプチド構築物を含んでなる。該合成ペプチド構築物を調製する方法も開示される。該合成ペプチドは、P.gingivalisに対する免疫応答を生じる免疫原として有用であり、受動免疫用におよび試薬として診断アッセイ用に有用なタンパク質特異的およびペプチド特異的抗血清を作製するために使うことができる。
発明の背景
歯周病は、細菌に関連する歯の支持組織の炎症疾患であり、比較的穏やかな形態の歯肉炎である非特定的かつ可逆的な歯肉組織の炎症から、歯支持構造体の破壊により特徴付けられるもっと攻撃的な形態の歯周病まである。歯周病は、歯根膜の破壊に導く特定のグラム陰性菌のコンソーシアムの歯肉下感染に関連し、重要な公衆衛生問題である。大きな関心を呼んでいる１つの細菌はPorphyromonas gingivalisであり、その理由は、この微生物の成人歯周病病変部からの回収は歯肉下の嫌気性培養が可能なフローラの50％にまで達しうるが、P.gingivalisは健康部位からは稀にしかも少数しか回収されないからである。歯肉下プラーク中のP.gingivalisレベルは歯周病重症度に関連して比例的に増加し、該疾患が回復すると培養可能な歯肉下微生物集団からの該微生物は根絶される。P.gingivalisの歯肉下移植による、非ヒト霊長類の歯周病病変の進行が実証されている。動物およびヒトの両方に対するこれらの知見は、成人の歯周病発達におけるP.gingivalisの重要な役割を示唆する。
P.gingivalisは黒色、嫌気性、タンパク質分解性グラム陰性桿菌であり、特定アミノ酸の代謝からエネルギーを得る。該微生物は、鉄を、好ましくはヘムもしくはFe（III）酸化産物ヘミンの形態で、絶対増殖要求し、過剰ヘミンの条件下で増殖すると、実験動物に高度に毒性（virulent）がある。P.gingivalisの病原性（pathogenicity）には、カプセル、接着、細胞毒および細胞外加水分解性酵素を含む数多くの毒性因子（virulence factor）が関係している。P.gingivalisコロニー化を予防する効果的かつ安全なワクチンを開発するためには、毒性に関わり、中和抗体を作製する免疫原として効用のある効果的な抗原を同定することが必要である。
本発明者らは、P.gingivalisの主要毒性因子（virulence factor）であるシステインプロテイナーゼと接着物の300kDa多タンパク質複合体を精製し、特性を決定した。この複合体は、生化学的に特性が決定されて、国際特許出願番号PCT/AU96/00673に開示されたが、その開示は本明細書に参照により組み入れられる。該複合体は、C末端接着ドメインをもつ160kDa Arg特異的プロテイナーゼ（PrtRと名付ける）が同様にＣ末端接着ドメインをもつ163kDa Lys特異的プロテイナーゼ（PrtKと名付ける）と結合したものからなる。PrtRおよびPrtKのＣ末端接着ドメインは、HagAと名付けたP.gingivalis由来のヘマグルチニンと相同性を有する。HagAをコードする遺伝子は、国際特許WO96/17936に開示されており、この開示は本明細書に参照により組み入れられる。
発明の概要
本発明者は、P.gingivalisに対する主要毒性因子（virulence factor）であるシステインプロテイナーゼおよび接着物の300kDa多タンパク質複合体から、複数の構造的かつ機能的に意味のある配列を同定した。これらの配列を表１に掲げた。
0004276300.tif 000002
0004276300.tif 000003
したがって、第一の様態では、本発明は、Porphyromonas gingivalisに対する免疫応答を生じさせる使用のための組成であり、該組成は適切なアジュバントおよび／または許容される担体もしくは賦形剤ならびに少なくとも
0004276300.tif 000004
0004276300.tif 000005
からなる群から選択される１のペプチドを含む。
本発明の第１の様態の好ましい実施態様では、組成は少なくとも
0004276300.tif 000006
からなる群から選択される１のペプチドを含む。
該組成が１つ以上のペプチドを含む場合、該ペプチドは該組成中に個々のペプチドとしてまたは多量体の形で存在することができる。多量体の形が使われる場合、該多量体は同じペプチドの多数コピーを含んでよいが、多量体は異なるペプチドを含むことが好ましい。
表１のペプチド（PAS1及びPAS2）は、Cys-His触媒ダイアッド（dyad）を含有する活性部位を形成するArg特異的（PrtR45）およびLys特異的（PrtK48）システインプロテイナーゼの配列を表す、
残りのペプチド（ABMペプチド）は、PrtR-PrtKタンパク質-接着複合体の接着結合モチーフおよびHagAを表し、プロテイナーゼ活性部位配列と一緒に、合成ペプチドワクチンとして有効であることが立証されている。
第２の様態では、本発明は一つのペプチドであり、該ペプチドは、
0004276300.tif 000007
0004276300.tif 000008
からなる群から選ばれる。
本発明の第２の様態の好ましい実施様態では、ペプチドは
0004276300.tif 000009
からなる群から選ばれる。
当業者であればすぐ明らかであるように、これらのペプチドは、診断試験の抗原として、または製剤の免疫原として使うことができる。
第３の様態では、本発明は、本発明の第１の様態または本発明の第２の様態の組成に対する特異的な抗体を含んでなる抗体調製にある。該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。
第４の様態では、本発明は、Porphyromonas gingivalis感染に罹った患者を治療する方法であり、該方法は患者に有効な量の第３の様態の抗体調製物を投与することを含んでなる。
好ましい実施様態では、抗体調製物は口洗浄剤または歯磨剤として投与される。
第５の様態では、本発明は、Porphyromonas gingivalis感染に罹った患者を治療する方法であり、該方法は患者に本発明の第１の様態の組成または本発明の第２の様態のペプチドの有効量を投与することを含んでなる。
好ましい実施様態では、該組成またはペプチドは口洗浄剤または歯磨剤として投与される。
第６の様態では、本発明は、個人におけるP.gingivalis感染の見込みおよび／または疾患の重症度を低減する方法であり、該方法は、P.gingivalisに対する個人の免疫応答を誘起するに有効な第１の様態の組成の量を個人に投与することを含んでなる。
本明細書を通じて、もし文脈が他を要求することがなければ、言葉「含んでなる（copmrise）」またはその変化「comprises」もしくは「comprising」は、述べられた要素（element）もしくは完全体（integer）または要素もしくは完全体の群の包含を意味するが、他の要素もしくは完全体（integer）または要素もしくは完全体の群の除外を意味しないと理解されるであろう。
ペプチドは、t-ブチルオキシカルボニルアミノ酸を使う（Mitchellら,1978,J.Org.Chem.43:2845-2852）、ポリアミド支持体上の9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）アミノ酸を使う（Drulandら,1986,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1125-137）、pepscan合成による（Geysenら,1987,J.Immunol Methods 03:259;1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998）標準固相ペプチド合成；または標準液相合成を含む当業界で公知のペプチド合成の複数の方法の１つを使って、合成することが可能である。
多価／多ペプチド高分子量ペプチド分子の合成の各種の方法をペプチド抗原を合成するために使うことができる。これは当業界で公知および新規の連結反応方法を使って達成されるであろう。
合成ペプチドの調製
表１からのペプチドは、同じかまたは異なってよく、相補的リガンドであってもそうでなくてもよい２つのリガンドを含有するように合成することができる。これらの２モードペプチドは、どのリガンドを結合させることも可能であり、したがって、チオエーテル、チオエステル、ヒドラゾン、オキシム、チアゾリジンのような結合を、多ペプチド構築物の合成に利用することができる（ShaoおよびTam.,1995,J.Am.Chem.Soc.117,3893-3899;Roseら,1996,Bioconjugate Chem.7（5）552-556;Rose.K.,1994,J.Am.Chem.Soc.116:30-33;Canne.ら,1995,J.Am.Chem.Soc.117:2998-3007;Lu.ら,1991,Mol.Immunol 28（6）:623-630;LiuおよびTam.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91.:6584-6588）。新規の連結反応方法は、チオアニソールとアクリロイルペプチドの間の公知の反応（O’Brien-Simpsonら,1997,J.Am.Chem.Soc.119（6））を使い、酸性条件で二重結合によりチオアニソールのパラ置換をもたらす。アクリロイル-ペプチドおよびフェニルチオアセチルペプチドを合成し、混合し、そしてそれらを酸性条件に曝すことにより、フリーデルクラフト（Friedel-Craft）アルキル化反応により連結反応を進めることができる。連結反応は、ペプチド間でかつリガンドの１つにより誘導体化されたオリゴリシン支持体上で、実施することができる。連結反応の条件は、当業界で公知のフリーデルクラフト反応条件および公知のペプチド開裂条件から構成することができる。
２モードペプチドを形成するためのリガンド基の導入は、ペプチドのNもしくはＣ末端でまたはペプチド配列内で、当業界で公知であるリガンドの遊離アミノ基へのカップリングにより達成することができる。これは、例えば、Fmoc（Fmoc）2,3ジアミノプロピオン酸もしくはFmoc Lys（Fmoc）-OHもしくはFmoc Lys（Mtt）-OHのような直角に保護されたリシン残基を、標準ペプチドカップリングプロトコルを使ってN末端へカップリングすることにより達成し、またはＣ末端もしくはペプチド配列内に導入することができる。脱保護の後に、リガンド基をアミノ基にカップリングさせることが可能であり、例えばFmoc Lys（Mtt）の選択的脱保護により、各種のリガンドを単一のペプチドにカップリングさせることができる。合成のどの点においても、ペプチドとリガンドの間および／またはリガンド間にスペーサー部分を導入して、連結反応の立体障害を低減するために使うことができる。図１は、合成プロトコルを示す。
ペプチド連結反応は、溶液中または固相上で達成することができる。各種のリガンドの結合および１つのリガンドの選択的保護により、ペプチドを逐次的に連結されて、多価、多ペプチド構築物の合成が可能になる。この方法は、連結されるペプチドの配向と順序がわかり制御可能であるという利点がある。リガンドの保護基は、標準開裂条件で安定であるが塩基性条件もしくは触媒的アリル移動下で容易に除去される例えば、Fmoc、アリルオキシカルボニル（Aloc）またはニトロシナミルオキシカルボニル（Noc）を使うことができる。図２は、２モードペプチドを使った多価ペプチド構築物合成のための連結反応スキームを示す。該プロトコルは、ペプチドにカップリングして２モードペプチドを形成するリガンドを変えるだけで様々な連結反応化学に適用することができる。
各ペプチドの段階的付加を、固相上で達成することができる。これは、塩基に不安定なハンドル、例えば、4-ヒドロキシメチル安息香酸を介して固相支持体上でペプチドを合成することにより達成できる。これにより、固体支持体に付着して残留するペプチドの全側鎖脱保護が可能となる。これにより、リガンド産物の未反応２モードペプチドからの分離が単に固相支持体を洗浄することにより達成できることを除けば、溶液相連結反応に使われる溶媒と同じ様な水溶媒中ででも連結反応を実施することが可能になる。反応はニンヒドリンまたはトリニトロベンゼンスルホン酸試験によりモニターすることが可能であり、それにより、２モードペプチド内のリシン残基は、例えば、酸開裂に安定であるが、ヒドラジンにより除去することができる（4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキス-1-イリデン）エチル（Dde）で保護する必要があろう。図３は、固相用の連結反応方法を示す。
２モードペプチドは、リガンドがN末端およびＣ末端になるように合成することができる。これは、NとNおよびCとC末端またはNとC末端を一緒にそれぞれ連結することにより、環状ペプチドの調製およびペプチドがお互いに平行にまたは反平行に走ることができるジペプチド構築物の形成を可能にする（図４）。
多価ペプチド構築物合成のための他の技術は、ペプチドをオリゴリシン支持体上に連結することである（Roseら,1996,Bioconjugate Chem.7（5）552-556;Canne.ら,1995,J.Am.Chem.Soc.117:2998-3007;Lu.ら,1991,Mol.Immunol 28（6）:623-630）。複数の各種のリガンドおよび／または保護リガンドをリシン支持体上に結合することにより、ペプチドを支持体上の特定の位置に連結させることができる。ハロアシル化およびフリーデルクラフトアルキル化によるオキシムまたはヒドラゾンのような連結反応化学を、逐次的にリガンドを保護する必要なく使うことができる。リガンド保護を使って、リシン支持体上に結合される異なるペプチドの数を増加することができる。図５は、その合成プロトコルを示す。
当業界で公知の他の方法は、アクリロイルペプチドの合成およびそれらのアクリルアミド（O’Brien-Simpsonら,1997,J.Am.Chem.Soc.119（6））またはアクリロイルアミノ酸との重合である。表１に掲げたPrtR-PrtKタンパク質複合体は、アクリロイル化して単独または組合せて重合することができる。この方法は複数のペプチドを一緒に重合することを可能にするが、ペプチドの結合される順序を制御することはできない。
最終ペプチド構築物は、表１に掲げたペプチドの全て、ほとんどまたは部分を含有してもまたはしなくてもよい。また、該構築物は、当業界で公知の乱交雑Ｔ細胞エピトープ（Kaumayaら,1994,in Solid Phase Synthesis.,Epton,R編）またはMHCクラスII結合ペプチドの構築物／結合モチーフから誘導される配列（O’Sullivantら,1991,J.Immunol.147:2663-2669、Hammerら,1993,Cell,74:197-203およびAlexanderら,1994,Immunity,1:751-761）を含有してもまたしなくてもよい。さらに、ペプチド構築物の免疫原性を強化するために、パルミチン酸またはコレステロールのような脂質部分を含むことができる。当業界で公知の酵素開裂配列（Duncanら，参考文献）または開裂モチーフから誘導された配列（Van NoortおよびVan Der Drift.,参考文献）もペプチド構築物に結合させることができる。
表１の同定された合成ペプチド抗原は、診断用ならびに中和抗体を含有する経口組成物を介しての受動免疫によるおよびワクチン開発による中和用に特に重要である。先に開示されたP.gingivalis抗原に対するこれらの合成ペプチド抗原の優秀性は、これらの配列が、主要なP.gingivalis毒性因子（virulence factor）であるPrtR-PrtKプロテイナーゼ接着物複合体の構造的かつ機能的に意味のある領域に相同性を有することにある。該ペプチドは、プロテイナーゼの活性部位および接着物の結合ドメインと関連した配列を表し、これらのペプチドを診断および免疫予防製品として理想的なものにしている。
抗原に対する抗体は、抗原を中和し疾患を予防するために、歯磨ペーストおよび口洗浄剤のような経口組成物に使うことができる。抗原特異的な抗体は、診断アッセイによる歯肉下プラークサンプル中のP.gingivalisの早期検出に使うこともできる。これらの抗原に基づくワクチンおよび適切なアジュバントは、鼻スプレー、経口または注射により、これらの抗原に対する特異的免疫応答を生じさせ、それによりP.gingivalisのコロニー形成および毒性を低減し、それにより疾患を予防するために送達することができる。本発明のペプチド抗原は、予防および／もしくは治療ワクチン製剤の免疫原として；または、P.gingivalis特異的抗体の血清力価の増加を測定することによるP.gingivalis感染の検出を目的とした診断イムノアッセイの抗原として使うことができる。また、本発明の合成ペプチドは、受動免疫付与に有効でありうる抗原特異的抗体を作製するために、かつ、歯肉下プラークサンプルのような臨床標本中のP.gingivalisの存在の検出を目的とした診断アッセイ用試薬として使うことができる。
全P.gingivalis細胞または他のいままでに調製された抗原とは異なり、本明細書に記載された合成ペプチド抗原は、P.gingivalisに関係する歯周病の予防のためのワクチンの調製に安全かつ有効な抗原である。
【図面の簡単な説明】
図１：  ２モードペプチドの合成。本明細書には特定的な例を示すが、どのリガンドでもリシンのａまたはｅアミノ基に導入することができる。（a）アシル化；例えば、ジメチルホルムアミド（DMF）中のアミノ酸:HOBt:HBTU:DIPEA 1:1:1:1.5。（b）Fmoc脱保護；例えば、DMF中の20％ピペリジン。（c）ジクロロメタン（DCM）中のレブリン酸:ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）2:1、１時間。（d）Mtt除去；DCM中の3x1％ TFA、３分間。（e）DCM中のFmoc-ヒドラジノ安息香酸:DIC 2:1、１時間。（f）酸開裂；例えばTFA:水95:5。
図２：  ２モードペプチドを使う多価ペプチド構築物の合成。（a）連結反応；８Ｍ尿素および0.1M NaH2PO4（pH範囲3〜4.7）。連結反応は逆相分析HPLCおよび質量分光分析計によりモニターすることができる。（b）脱保護；例えば、Alocをパラジウム（O）触媒作用による塩基性受容体へのアリル基移動により除去する。連結反応産物は調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥することができる。（c）連結反応；（a）に記載したのと同様な条件。ペプチドは、様々なリガンドで合成し、かつ非相補的リガンドを同じペプチド上に合成し、その際に保護リガンドを避けることにより、様々な連結反応化学を使うことができる。四角のシンボルは保護、（L）はリガンド、（P）はペプチドを示す。
図３：  固相による２モードペプチドを使う多価ペプチド構築物の合成。（a）脱保護および連結反応；S-アセチル保護基を0.05Mヒドロキシルアミン水溶液、pH7.3により除去する。洗浄後、第１ペプチドをSH基に連結させることができる、6Mグアニジン塩酸塩水溶液および0.05M EDTA、1M Tris.HClによりpH6.4-6.5に調節、窒素下。連結反応バッファーはアセトニトリルのような誘起溶媒を含有することができる。（b）脱保護；S-アセチル保護基はヒドキシアミン水溶液0.05M、pH7.3により除去することができる。（c）連結反応；（a）に記載した通りであるが、ペプチドは、様々なリガンドで合成し、かつ非相補的リガンドを同じペプチド上に合成し、その際に保護リガンドを避けることにより、様々な連結反応化学を使うことができる。四角のシンボルは保護、（L）はリガンド、（P）はペプチド、（B）は塩基に不安定なハンドル、4-ヒドロキシメチル安息香酸を示す。
図４：  ２モードペプチドを使う環化。（a）脱保護および環化；NおよびC末端に相補的リガンドを有する２モードペプチドの合成は、水溶液バッファー中のこれらのペプチドの環化を可能にする。（i）連結反応。（ii）脱保護および連結反応。（iii）塩基に不安定なハンドルから環化ペプチドの開裂。例：示されたペプチドは、表１からのものであり、prtR45由来の活性部位ペプチドを発現する。（a）連結反応；95％TFA水溶液。連結反応は逆相分析用HPLCおよび質量分光分析計によりモニターすることができる。連結反応条件は変えることが可能であり、一般的にペプチド合成で使われるスカベンジャーおよびフリーデルクラフト（Friedel-Craft）アルキル化を促進する様々な酸性条件を含む。（b）脱保護および連結反応；S-アセチル保護基は、0.05Mヒドロキシルアミン水溶液、pH7.3により除去することができる。連結反応;6Mグアニジン塩酸塩水溶液および0.05M EDTA、1M Tris.HClにより調節したpH6.4-6.5、窒素下。連結反応方法は、固相上で実施することもできる。どのリガンドをNおよびC末端に導入するかを選択することにより、平行におよび反平行な環状ペプチドを合成することができる。
図５：  代りの連結反応化学を使う多価多重抗原ペプチド（MAP）の合成。様々な連結反応方法を使うことにより、各種のペプチドを単一多価多重抗原ペプチド上に連結することができる。示された例は、表１に掲げたペプチドについてである。（a）連結反応；95％TFA水溶液。連結反応は逆相分析HPLCおよび質量分光分析計によりモニターすることができる。脱保護；Alocは、パラジウム（O）触媒作用による塩基性受容体へのアリル基移動により除去することができる。精製後、第２ペプチドをMAP上に連結することができる、（c）8M尿素および0.1M NaH2PO4（pH範囲3〜4.7）。
図６：  Ｑセファロース陰イオン交換FPLCから溶出するプールされかつ濃縮された画分のゲル濾過FPLC。160〜246mM NaClの間に溶出しタンパク質分解／アミド分解活性の主ピークのリーディングエッジを表す陰イオン交換画分をプールし、pH7.4の50mM NaClを含有するTCバッファーに平衡化し、濃縮して、同じバッファーを使って0.3mlmin-1の流量でSuperose 12HR 10/30ゲル濾過カラムにかけた。画分（0.5ml）をアゾカゼイン、Bz-L-Arg-pNAおよびz-L-Lys-pNAを使い、タンパク質分解／アミド分解活性についてアッセイした。Bz-L-pNAについての各0.5ml画分のアミド分解活性をヒストグラムにより示した。
図７：  200mM NaClで溶出しArg特異的活性のみを含有する陰イオン交換（Mono Q）ピークのSDS-PAGE（煮沸／還元済み条件）。レーン１、ファルマシア製（Pharmacia）低分子質量標準；レーン２、精製50kDa Arg特異的プロテイナーゼ、PrtRII50．
図８：  最適類似性における、PrtRII50、PrtR45 Arg特異的プロテイナーゼおよびPrtK48 Lys特異的プロテイナーゼの推定アミノ酸配列のアラインメント。PrtRII50のアミノアシル残基は、成熟タンパク質のN末端残基から番号を付した。
＊はPrtRII50と同一の残基を示す。下線が引かれた残基は推定接着結合モチーフを示す。推定触媒His残基及びCys残基は四角で囲まれている。
図９：  prtRII、prtR、及びprtK遺伝子の略図。生じるPrtRポリタンパク質は、リーダー配列及びプロ断片に続くPrtR45Arg特異的プロテイナーゼ及びPrtR44、PrtR15、PrtR17及びPrtR27接着ドメインからなる。生じるPrtKポリタンパク質は同様に、リーダー配列、プロ断片及びPrtK48Lys特異的プロテイナーゼ及びPrtK39、PrtK15及びPrtK44の接着ドメインから成る。生じるPrtRIIポリタンパク質は、結合した関連接着物を持たず、リーダー配列、プロ断片及びPrtRII50Arg特異的プロテイナーゼのみからなる。Ｂは推定接着結合モチーフの相対位置を示す。Ｈ及びＣはプロテイナーゼの推定触媒His、Cysダイアド（dyad）の位置を表す。
図10：  推定接着結合モチーフ（ABM）対応合成ペプチドに対する、TLCK不活性化PrtR-PrtKプロテイナーゼ-接着物複合体の結合を実証する競合結合アッセイ。-●-●-ABM合成ペプチド。
PYQPVSNLTATTQGQKVTLKWDAPSTK。-■-■-対照ペプチド、
FNGGISLANYTGHGSETAWGTは、PrtR45の残基428〜448に対応する。
-▲-▲-カゼイン。詳細は、材料と方法の項を参照すること。
図11：  マウス化膿モデル（mouse abscess model）におけるPorphyromonas gingivalisでチャレンジしたマウスの平均病変サイズ。BALB/cマウス（6匹／群）にCFAおよびIFAに乳化した抗原の50μgを、第１回および第２回接種として接種（皮下注射）し、その後、P.gingivalis株33277の8 X 109細胞でチャレンジ（皮下注射）した。
ABM1（R45）-DT、（□）；ABM2（K39）-KT、（○）；ABM3（R44）-DT、（＊）；ABM4（R17）-DT、（●）；ABM5（R15）-DT、（◆）；ABM6（K39）-DT、（◇）；PAS1（R45）-DT、（▲）；PAS1（K48）-DT、（■）；対照ペプチド-DT、（-◇-）；ホルマリン死滅P.gingivalis株33277、（＋）；DT、（--△--）；アジュバント、（×）。
明確にするために、誤差バーは示してない。
発明の詳細な説明
本発明は、歯周病に関係する口腔内細菌Porphyromonas gingivalis病原体の影響を抑制するための経口組成および免疫原組成に関する。本発明は、歯肉下プラークサンプル中のPorphyromonas gingivalisおよび血清中の特異的抗P.gingivalis抗体の存在に対する診断試験にも関する。表１のペプチド抗原は、個々に、または多量体もしくは多ペプチド構築物として合成することができる。
合成ペプチド抗原は、標準技術を使ってポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製するために使うことができる。抗体作製のために使われる動物はマウス、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、ウシその他であってよい。イムノアッセイで抗原に対する高い抗体力価が検出されると、動物から採血しまたは卵もしくは乳を採取し、血清を調製し、および／または標準技術を使って抗体を精製し、または標準技術を使って脾細胞を骨髄腫細胞に融合することによりモノクローナル抗体を作製する。抗体（免疫グロブリン画分）は、培養または腹水液、血清、乳または卵から、塩析、ゲル濾過、イオン交換および／またはアフィニティクロマトグラフィーなどにより分離することができ、塩析が好ましい。塩析法では、抗血清または乳を硫酸アンモニウムで飽和して沈降物を作り、その後、沈降物を生理的塩類溶液に対して透析することによって特異的抗体を伴なう精製免疫グロブリン画分を得る。好ましい抗体は、ウマ抗血清およびウシ抗血清ならびに乳から得られる。本発明においては、抗原により動物を免疫感作させることにより得られる抗血清および乳に含有される抗体を経口組成物にブレンドする。この場合、抗血清および乳ならびに抗血清および乳から分離精製された抗体を使うことができる。これらの物質のそれぞれは単独または２つ以上の組合わせで使うことができる。該抗体は、P.gingivalisを中和し疾患を予防するために歯磨ペーストおよび口洗浄剤のような経口組成物で使うことができる。該抗体は、傍らの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）による歯肉下プラークサンプル中のP.gingivalisの早期検出のためにも使うことできる。
経口組成物としては投与される上記抗体の量は0.0001〜50g/kg/dであり、上記抗体の含量は組成物の重量で0.0002〜10％、好ましくは重量で0.002〜5％であることが好ましい。上記の血清または乳抗体を含有する本発明の経口組成物は、歯磨ペースト、歯磨粉および液状歯磨剤、口洗浄剤、トローチ、チューインガム、歯科ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠、乳製品ならびに他の食品のような口に応用可能な様々な形態に調製して使うことができる。本発明による経口組成物は、さらに追加の周知の特定の経口組成物のタイプおよび形態に依存する添加剤を含んでよい。
本発明の高度に好ましいある特定の形態では、経口組成は、口洗浄剤またはリンス液のように実質的に性状が液体であってよい。このような調製では、ビヒクルは典型的には水-アルコール混合物であり、好ましくは以下に記載した湿潤剤（humectant）を含む。一般的に、水対アルコールの重量比は約1：1〜約20：１の範囲にある。このタイプの調製における水-アルコール混合物の総量は、典型的に調製物の約70〜約99.9重量％の範囲にある。アルコールは典型的にエタノールまたはイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
本発明のこのような液および他の調製物のpHは、一般的に約4.5〜約9の範囲であり、典型的には約5.5〜8である。pHは好ましくは約6〜8.0、好ましくは7.4である。pHは酸（例えば、クエン酸もしくは安息香酸）もしくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）またはバッファー（クエン酸ナトリウム、安息香酸塩、炭酸塩もしくは重炭酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムその他）により調節することができる。
本発明の他の望ましい形態である経口組成物は、歯磨粉、歯科錠または歯磨ペースト（歯科クリーム）もしくはゲル歯磨剤である歯磨剤のような実質的に性状が固体またはペーストであってよい。このような固体またはペーストの経口調製物のビヒクルは、一般的に歯科用に許容される研磨材を含有する。研磨材の例は、水不溶メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、二水和リン酸カルシウム、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、水和アルミナ、か焼アルミナ、珪酸アルミニウム、珪酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびこれらの混合物である。他の適切な研磨材は、メラミン-、フェノール-、尿素-ホルムアルデヒドのような特定の熱硬化樹脂、および架橋ポリエポキシドおよびポリエステルを含む。好ましい研磨剤は、約5ミクロンまでの粒子サイズ、約1.1ミクロンまでの平均粒子サイズ、そして約50,000cm2/gまでの表面積を有する結晶シリカ、シリカゲルまたはコロイダルシリカ、および複合不定形アルカリ金属アルミノ珪酸塩を含む。
視覚的に清澄なゲルを使うときは、登録商標SYLOIDでSyloid 72およびSyloid 74としてまたは登録商標SANTOCELでSantocel 100として販売されるコロイド状シリカ研磨剤、アルカリ金属アルミノ珪酸塩複合体は、歯磨剤に通常使われるゲル化剤−液（水および／または湿潤剤を含む）系の屈折率に近い屈折率を有するので、特に有用である。
多くのいわゆる「水不溶性」研磨材は性状が陰イオン性であり、小量の可溶物質も含む。そして、不溶性メタリン酸ナトリウムはソープの応用化学辞書（Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry,Volume 9,4th Edition.pp.510-511）に説明されたどれか適切な方法で作ることができる。さらに、マドレル塩（Madrell’s salt）およびクロール塩（Kurrol’s salt）として知られる不溶性メタリン酸ナトリウムの形態は適切な材料の例である。これらのメタリン酸塩は水中で僅かな溶解度しか示さず、したがって、通常、不溶メタリン酸塩（IMP）と呼ばれる。それらには、小量の可溶リン酸塩材料が不純物として、通常、4重量％までの数％存在する。不溶メタリン酸塩の場合に可溶性トリメタリン酸ナトリウムを含むと考えられる可溶リン酸塩材料の量は、もし所望であれば、水洗により低減または消去することができる。不溶アルカリ金属メタリン酸塩は、典型的には、37ミクロンより大きい材料が1％を越えない粒子サイズの粉末形状で使用される。
研磨材料は一般的に固体またはペースト組成物に、約10％〜約99％の重量濃度で存在する。好ましくは、それは歯磨ペースト中に約10％〜約75％、歯磨粉中に約70％〜約99％の量で存在する。歯磨ペーストには、研磨剤が性状が珪素質であれば、一般的に約10〜30重量％の量で存在する。他の研磨剤は典型的には約30〜75重量％で存在する。
歯磨ペーストでは、液状ビヒクルは、水および湿潤剤を典型的には調製物の約10重量％〜約80重量％の範囲の量で含んでなる。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールおよびポリプロピレングリコールは適切な湿潤剤／担体の例である。また、水、グリセリンおよびソルビトールの液体混合物も有利である。屈折率が重要な考慮事項である清澄なゲルでは、約2.5〜30％w/wの水、0〜約70％w/wのグリセリンおよび約20〜80％w/wのソルビトールを用いるのが好ましい。
歯磨ペースト、クリームおよびゲルは、典型的には天然または合成の増粘剤またはゲル化剤を約0.1〜約10、好ましくは約0.5〜約5％w/wの比率で含有する。適切な増粘剤は合成ヘクトライト、すなわち合成コロイド状珪酸マグネシウムアルカリ金属複合体粘土であり、これは例えばラポナイト社（Laponite Industries Limited）から市販されるLaponite（例えば、CP、SP 2002、D）として入手可能である。Laponite Dは、近似的に重量で58.00％ SiO2、25.40％ MgO、3.05％ Na2O、0.98％Li2O、ならびに若干の水および微量金属である。その真比重は2.53で、見かけ嵩密度は、8％湿分で1.0g/mlを有する。
他の適切な増粘剤は、アイリッシュモス（Irish moss）、イオタカラギーナン（iota carrageenan）、トラガカントガム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、Natrosolとして入手可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および細かく粉砕されたSyloid（例えば244）のようなコロイド状シリカを含む。可溶化剤は、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールおよびヘキシレングリコールのような湿潤剤ポリオール、メチルセロソルブおよびエチルセロソルブのようなセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油およびワセリンのような少なくとも12個の炭素を直鎖に含有する植物油およびワックス、ならびに酢酸アミル、酢酸エチルおよび安息香酸ベンジルのようなエステルも含んでよい。
通常そうであるように、経口調製物は、適切なラベルを付した包装で販売されまたは配布されることは理解されるであろう。したがって、ロリンス液の壜は、ロリンス液もしくは口洗浄液のような物質について記載するラベルが付いており、その使用に関する指示書を有するであろう：そして歯磨ペースト、クリームまたはゲルは、通常、潰すことができるチューブ、典型的にはアルミニウム、ライニングした鉛もしくはプラスチック、または他の内容物を計り出す押出器、ポンプもしくは加圧ディスペンサー中にあり、歯磨ペースト、ゲルもしくは歯科用クリームのような物質について記載するラベルが付いている。
有機界面活性剤が本発明の組成物に使用され、予防作用の増加を達成し、口腔全体に活性薬の十分で完全な分散の達成を助け、本発明組成物をより化粧的（cosmetically）に許容されるものにする。有機界面活性物質は、好ましくは陰イオン性、非イオン性または両性で、本発明の抗体を変性しない性質であり、そして、界面活性剤として、抗体を変性することなく洗浄および発泡物性を組成物に付与する洗浄材料を使用することが好ましい。適切な陰イオン界面活性剤の例は、水素化ココナッツオイル脂肪酸のモノ硫酸エステル化モノグリセライドのような高級脂肪酸モノグリセライドモノ硫酸エステルの水溶性塩、ラウリル硫酸ナトリウムのような高級アルキル硫酸塩、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムのようなアルキルアリールスルホン酸塩、高級アルキルスルホ酢酸エステル、1,2-ジヒドロキシプロパンスルホン酸の高級脂肪酸エステル、および低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキルもしくはアシル基に12〜16個の炭素を有するもの、その他である。最後に記述したアミドの例は、N-ラウロイルサルコシン、およびN-ラウロリル、N-ミリストイル、またはN-パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウム、およびエタノールアミン塩であり、実質的に石鹸または同様な高級脂肪酸物質を含まない。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト化合物の使用は、これらの物質が、炭水化物分解による口腔内の酸形成阻害に長い顕著な効果をあらわすのに加えて酸性溶液中の歯エナメル質の溶解度の低下に作用するので特に有利である。抗体との使用に適切な水溶性非イオン界面活性剤の例は、エチレンオキサイドと各種反応性水素を含有し長い疎水鎖（例えば、約12〜20個の炭素原子の脂肪族鎖）を有することにより反応性がある化合物との縮合生成物であって、その縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamer）」）は、ポリ（エチレンオキサイド）と脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、ポリヒドリックアルコール（例えば、ソルビタンモノステアレート）およびポリプロピレンオキサイド（例えばプロン酸物質（Pluronic materials））との縮合生成物のような親水性ポリオキシエチレン部分を含有する。
界面活性剤は、典型的には約0.1〜5重量％の量存在する。注目すべきは、界面活性剤は本発明の抗体の溶解を助け、それにより必要な可溶化湿潤剤の量を削減できることである。
本発明の経口調製物には、増白剤、保存剤、シリコーン、クロロフィル化合物および／または尿素、リン酸二アンモニウムのようなアンモニア化物、ならびにそれらの混合物のような様々な他の材料を組入れることができる。これらのアジュバントは、存在する場合には、所望の物性および特性に実質的に悪影響をあたえない量で調製物に組込まれる。
適切な風味剤または甘味物も用いることができる。適切な風味組成物の例は、風味をあたえる油、例えば、スパーミント（spermint）、ペパーミント（peppermint）、ヒメコウジ（wintergreen）、ササフラス（sssafras）、チョウジ（clove）、セージ（sage）、ユーカリノキ（eucalyptus）、マヨラナ（marjoram）、シナモン、レモン、およびオレンジ、ならびにサリチル酸メチルである。適切な甘味剤は、ショ糖、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、サイクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン（perillartine）、AMP（アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル）、サッカリン、およびその他を含む。適切には、風味剤および甘味剤は、それぞれもしくは一緒に、調製物の約0.1％〜5％以上を含んでなる。
本発明の好ましい実施では、本発明の組成を含有する口洗浄剤または歯磨剤のような本発明による経口組成は、好ましくは、毎日または毎第２日または毎第３日または好ましくは毎日１〜３回のように規則的に、約4.5〜約9、一般的には約5.5〜約8のpHで、少なくとも２週間〜８週間もしくはそれ以上生涯にわたって、歯ぐきおよび歯に使用される。
本発明の組成物は、トローチ剤にまたはチューインガムもしくは他の製品に組込むことが可能であり、例えば暖かいガムベース中へ攪拌するかまたはガムベースの外表面をコーティングすることにより、ガムベースの例はジェルトン（jelutong）、ゴムラテックス、ビニライト（vinylite）樹脂、その他が挙げられ、所望によっては汎用の可塑剤または軟化剤、糖または他の甘味剤またはグルコース、ソルビトールなどを伴なう。
本発明の他の重要な形態は、合成ペプチド抗原および適切なアジュバントに基く免疫原性組成物であり、鼻スプレー、経口または注射により送達されて、抗原に対する特異的免疫応答を産生させ、P.gingivalisのコロニー形成を低減し、疾患を予防する。全P.gingivalis細胞または他の今まで調製された抗原と異なり、本明細書に記載したペプチド抗原は、P.gingivalisに関連する歯周病の予防用ワクチンの調製に対して安全であり、有効な抗原である。さらに、本発明によると、産生した抗原ペプチドは、P.gingivalisにより起される歯周病および感染に対する受動免疫用に有用なP.gingivalis抗血清を作製するために使うことができる。
以下の実施例は本発明の特質をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものでないことは明らかである。本明細書および添付した請求の範囲で参照される全ての量および比率は、他に示してなければ重量による。
実施例１
プロテイナーゼ活性部位および接着結合モチーフの同定を、P.gingivalis W50のArg特異的プロテイナーゼをコードする第２遺伝子のクローニングおよび特性決定により実施した。
材料
O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、1ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（TFA）、および9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）-保護アミノ酸は、アウスペプ・プティ社（Auspep Pty Ltd.,Melbourne,Australia）から入手した。トリイソプロピルシラン（TIPS）およびエタンジチオール（EDT）は、アルドリッチ（Aldrich,New South Wales,Australia）から入手した。1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン（DBU）は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company,New South Wales,Australia）から入手した。フェノールおよびジエチルエーテルは、BDH（Poole,UK）から入手した。他に記載のない限り、化学品はペプチド合成グレードまたはその相当品であった。
細菌株および増殖条件
Porphyromonas gingivalis W50の凍結乾燥培養物は、マーシュ教授（Prof.P.Marsh,PHLS,Centre for Applied Microbiology and Research,Witshire,UK）の好意により提供された。P.gingivalis W50は嫌気的に増殖させ（Bhogalら,1997）、Escherichia coli JM109およびLE392株は先に記載された方法に従って増殖させた（Slakeskiら,1996）。
50kDa Arg特異的プロテイナーゼの精製
P.gingivalis W50をバッチ培養（5L）で増殖させ、後期対数期に遠心分離（5,000xg,20分、4℃）により収穫した。細胞を50mM NaClを含有する150ml TCバッファー（20mM Tris-HCl pH7.4および5mM CaCl2）で１回洗浄し、先に記載されたように音波処理（sonicate）した（Bhogalら,1997）。音波処理物を遠心分離し（100,000xg,30分、4℃）、陰イオン交換FPLCに先だって上清を濾過（0.22μm）した。音波処理物を、4℃に冷却した陰イオン交換カラム（Hiload XK 16/10 Q Sepharose,Pharmacia-LKB）に、多重注入で、50mlスーパーループ（Parmacia-LKB）を使ってアプライした。音波処理物を、0〜100％バッファーBの直線勾配を使って、90分にわたり、2.0ml min-1で溶出させた。吸収を280nmでモニターし、溶出物を4℃、6ml画分でFrac 100フラクションコレクター（Pharmacia-LKB）を使って採取した。バッファーAは、50mM NaClを含有するTCバッファーであり、バッファーＢは500mM NaClを含有するTCバッファーであった。画分をタンパク質分解およびアミド分解活性について、アゾカゼイン（A-2765,Sigma Chemical Co.St Louise,MO）、ベンゾイル-L-Arg-p-ニトロアニリド（Bz-L-Arg-pNA,Sigma）およびベンジルオキシカルボニル-L-Lys-p-ニトロアニリド（z-L-Lys-pNA,Calbiochem,Melbourne,Australia）を使って、各画分を基質添加前に10mMシステインで10分間25℃で前培養したことを除いて先に記載されたように（Bhogalら,1997）分析した。アミド分解アッセイについては、吸収は先に記載されたように（Bhogalら,1997）410nmでモニターし、アミド分解活性はU（ここに、U=μmol（25℃で転化した基質）min-1）として表現した。最高比のArg特異活性対Lys特異活性を含有する160〜246mM NaClの間で溶出する陰イオン交換画分は、洗浄して150mM NaClを含有するTCバッファーでセントリペップ（cetrripep）およびセントリコン（centricon）10濃縮器（Amicon）を使って濃縮し、ゲル濾過カラム（Superose 12,HR 10/30,Pharmacia-LKB）に、150mM NaClを含有するTCバッファーを使い、0.3ml min-1の流量でアプライした。吸収は280nmでモニターし、画分を4℃でFrac 100フラクションコレクターを使って採取した。溶出ピークのMr値をゲル濾過用分子量スタンダード（Pharmacia-LKB）を使って決定した。Arg特異的アミド分解活性のみを含有する50kDaの溶出ピークは、50mM NaClを含有するTCバッファーにcentricon 10濃縮器（Amicon）を使って洗浄し、Mono Q（HR5/5）陰イオン交換カラムに5mlループを使ってアプライし、0〜100％バッファーBの直線勾配を使って、流速1.0ml min-1で溶出させた。バッファーAは、150mM NaClを含有するTCバッファーであり、バッファーBは500mM NaClを含有するTCバッファーであった。吸収は280nmでモニターし、画分を4℃でFrac 100フラクションコレクターを使って採取した。
SDS-PAGE。タンパク質転写ブロットおよびN末端配列解析
SDS-PAGEは、Mini protean II電気泳動システム（Biorad）を使い、5％スタッキングゲルでオーバーレイした12％（w/v）、1mm分離ゲルで実施し（Laemmli,1970）、タンパク質を転写ブロットし、そして先に記載された方法（Bhogalら,1997）を使ってN末端で配列決定した。
クローニングおよびヌクレオチド配列解析
先に記載された（Slakeskiら,1996）P.gingivalis W50 LambdaGEM（登録商標）-12ゲノムライブラリーを、PrtR45のN末端配列に対応するprtRのヌクレオチド配列から誘導された合成オリゴヌクレオチド（Slakeskiら,1996）を使ってスクリーニングした。オリゴヌクレオチドプローブを、γ32P ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを使って5’末端を標識した。ほぼ1.5 x 104ファージを、ナイロンメンブランフィルター上にリフトし、放射標識したオリゴヌクレオチドで一夜、ハイブリダイゼーションバッファー（6 x SSC（SSCは15mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl pH8.0）、0.25％SDS、5 x Denhardt’s溶液（Sambrookら,1989）および100μg/mlサケ精子DNA）中で、49℃でハイブリダイズして、スクリーニングした。フィルターを、0.1％SDS（w/v）を含有する2 x SSCの溶液中で49℃で広範に洗浄した。ポジティブにハイブリダイズしたプラークからのファージを標準の方法（Sambrookら,1989）で精製した。ファージDNAをEco72Iで消化し、生じた断片をSma I-BAO pUC18（Pharmacia,Sydney,Australia）に連結し、これを用いて熱ショック手法（Sambrookら,1989）を使いE.Coli JM109を形質転換した。２本鎖テンプレートDNAを先に記載したように配列決定した（Slakeskiら,1996）。
PCRを用いて、prtRIIによりコードされた内部Eco 72I部位を含有する991塩基対断片を２つのオリゴヌクレオチドプライマー5’-CGGCTTCCGTAAAGTC-3’（PrtRII配列の塩基657〜672と同一のフォワードプライマー）および5’-TGGCTACGATGACGATCATACGAC-3’（PrtRIIの塩基1624〜1647と96％同一性をもつリバースプライマー）を使い増幅した。PCRは、100μlの最終容積で実施し、各反応混合物は、100ng P.gingivalis W50ゲノムDNA、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2、各プライマーの100pmol、20mM Tris-HCl、pH8.4、50mM KClおよび2.5U Taq DNAポリメラーゼ（Gibco BRL）を含有した。反応混合物を95℃で3分間加熱し、その後、95℃で30秒間のDNA変性、40℃で1分間のプライマーアニーリングおよび72℃で2分間の伸長を25サイクル実施した。サイクリング後、反応混合物を最終的に72℃で5分間加熱した。増幅したDNAをPCRスピンクリーン（Spinclean）キット（Progen）を使って精製し、Eco 72I部位を両方向に横切る配列を決定した。
Arg特異的およびLys特異的プロテイナーゼと接着物の高分子量複合体（PrtR-PrtK複合体）の精製
P.gingivalis W50の高分子量の、細胞に関連したプロテイナーゼ-接着物複合体（PrtR-PrtK複合体）を、陰イオン交換、ゲル濾過およびArg-セファロースアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせを使って、先に記載した細胞音波処理物（Bhogalら,1997）から精製した。該複合体をSDS-PAGE、転写ブロッティングおよび配列解析を使って特性決定し、Bz-L-Arg-pNAおよびZ-L-Lys-pNA基質を使って酵素活性をアッセイした（Bhogalら,1997）。
固相ペプチド合成
ペプチドを手動で標準Fmoc固相ペプチド合成プロトコルを使って合成した。該ペプチドは、カルボキシアミド形としてFmoc-Pal-Peg-PS樹脂（PerSeptive Biosystems Inc.,Framingham,MA）を使って構築した。カップリングは、HBTU/HOBt活性化により4当量のFmoc-アミノ酸および6当量のDIPEAを使って実施した。Fmoc基は、2％ v/vピペリジンを含有するDMF中の2％ v/v DBUにより除去した。ペプチドの樹脂支持体からの開裂は、TFA：フェノール：TIPS：EDT：水（92：2：2：2：2）開裂カクテルを使い、2.5時間実施した。開裂後、樹脂を濾過により除去し，濾液をほぼ1mlに窒素気流下で濃縮した。ペプチド産物を冷エーテル中に沈殿させた後、遠心分離にかけ、３回洗浄した。その後、ペプチド沈降物は0.1％ v/v TFAを含有する10mlの水中に溶解し、不溶残査を遠心分離して除去した。
合成ペプチドの精製は、Waters HPLCシステム内にインストールしたBrownlee C18 Aquapore ODSカラム（250 x l00mm）を使って実施した。クロマトグラムを、流速5.0ml min-1で、水中0.1％ v/v TFA（溶媒A）および90％アセトニトリル水溶液中0.1％ v/v TFA（溶媒B）を使って展開した。ペプチドを10〜30％溶媒Bの勾配で、40分間にわたり溶出した。分析用HPLCをApplied Biosystems HPLCシステム内にインストールしたBrownlee C8 Aquapore RP-300カラム（220 x 4.6mm）を使って実施した。溶媒Aおよび溶媒Bを使いクロマトグラムを流速1.0ml min-1および溶媒Bの0〜100％直線勾配を使って30分間にわたり展開した。カラムから溶出した物質は214nmの吸収によりモニターした。ペプチドは、質量分光分析によりPerSeptive Biosystems Voyager DEMALDI-TOFを使って分析した。
競合結合アッセイ
平底ポリビニル製マイクロタイタープレート（Microtitre,Dynatech Laboratories,VA）のウエルを、一夜、4℃で、0.1％ v/v Tween 20（PBST）および0.1％w/vアジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸バッファー塩類溶液、pH7.4中の接着結合モチーフ（ABM）ペプチドの溶液（5mg/ml）を使ってコーティングした。コーティング溶液を除去した後、PBST中の2％ w/vスキムミルク粉を加えて、残りの未コーティングプラスチックを1時間室温でブロックし、その後洗浄した（4 x PBST）。（1mM TLCKで不活性化した）PrtR-PrtKプロテイナーゼ-接着物複合体の溶液（1mg/ml）を既知濃度のABMペプチド、対照ペプチドおよびカゼインで1時間でインキュベートし、その後、ABMペプチドでコーティングしたマイクロタイタープレートに移した。2時間、37℃でのインキュベーション後に、プレートを洗浄した（5 x PBST）。その後、1％ w/vスキムミルク粉を含有するPBST中のウサギ抗PrtR-PrtK抗血清の1/10,000希釈物を、洗浄したウエルに加えて２時間、37℃でインキュベートした。結合した抗体は、ウサギIg（Biorad,Richmond,CA）に対する西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ免疫グロブリン（Ig）との1.5時間、37℃でのインキュベーションによって検出した。洗浄（5 x PBST）後、基質（0.004％ v/v過酸化水素を含有する0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸バッファー中の0.4mM 3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン）を加え、発色を2M H2SO4の添加により停止した。450nmの光学密度（O.D.）を、BioRadマイクロプレートリーダーモデル450を使って測定した。
結果
PrtRII50 Arg特異的プロテイナーゼ精製および特性決定
P.gingivalis W50細胞音波処理物は、0.36mg ml-1タンパク質ならびに1.0mM Bz-L-Arg-pNAおよびz-L-Lys-pNAをそれぞれ基質として25℃で2.4および1.1μmol min-1タンパク質mg-1の活性を含有した。音波処理物をQセファロース陰イオン交換FPLCにかけて、160〜246mM NaClの間に溶出するタンパク質分解／アミド分解活性物を採取し、セントリペップおよびセントリコン-10（Amicon, Sydney, Australia）を使って濃縮した。この画分は、タンパク質分解／アミド分解活性の主ピークのリーディングエッジを表し、Arg特異活性対Lys特異活性の最高比を含有した。濃縮後に、該画分をSuperose 12ゲル濾過カラムにアプライした（図６）。ArgおよびLys比活性は、先に報じられたように（Bhogalら,1997）、0.6〜2.O x 106 Daおよび300kDaのMr値をもつピークに対応する高分子量溶出物質と関係した。しかし、Arg特異活性のみを発現する50kDaのより低い分子量ピークも観察され、このピークを採取してさらに精製した。50kDaゲル濾過ピークを、Mono Q陰イオン交換カラムにアプライし、NaCl勾配を応用すると、Arg特異活性は、200mM NaClのNaCl濃度において別のピークに、元来の粗音波処理物に対し28倍精製で溶出した。Arg特異活性を含有するピークをSDS-PAGEにかけ、単一の50kDaタンパク質バンドを確認した（図７）。この50kDaバンドを転写ブロットしてN末端配列解析にかけ、アミノアシル配列
YTPVEEKENGRMIVIVPKKYEEDIEDを得た。アルギニル残基に対する50kDaプロテイナーゼの特異性は、z-L-Lys-pNAでなくBz-L-Arg-pNAを開裂する酵素により確認された。該Arg特異的50kDa酵素はチオール（特にシステイン）により活性化され、セリンプロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオライドまたは4-（2-アミノエチル）-ベンゼンスルホニルフルオライドにより阻害されなかったが、スルフィドリルに対する試薬であるロイペプチンおよびEDTAにより、PrtR45が阻害されたのと同様な濃度（Bhogalら,1997）で阻害された。EDTAによる阻害は、過剰Ca2+の添加により逆転することができ、酵素の最適pHは8.0であり、pH6.0未満で最小活性であった。
分子クローニングおよびprtRII遺伝子の配列解析
PrtR45のN末端に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使うP.gingivalisゲノムライブラリーのスクリーニングにより、複数のポジティブクローンを同定した。これらのクローンからのDNAを抽出してサザン分析にかけ、第２Arg特異的プロテイナーゼをコードする遺伝子に対応すると先に提起された12kb BamHI断片（Slakeskiら,1996）を含有するDNAを同定した。さらに分析するために、12kb BamHI断片を含有するラムダクローン18を選択し、このクローンからDNAを単離し、Eco 72 Iで消化し、プラスミドSmaI-BAP pUC 18中に無作為にクローニングした。隣接する3.3および1.2kb Eco 72 Iゲノム断片を両方向に配列決定して、全prtRIIヌクレオチド配列を作製した（GeneBank受託番号AF007124）。991塩基対PCR断片を作製し配列決定して内部Eco 72 I部位を包含する配列を確認した。
prtRII ORFは、2208塩基対（736アミノ酸残基）を含んでなり、推定リーダー配列よりなるプレプロタンパク質およびプロ断片をコードし、その後に精製50kDa酵素（PrtRII50）に対して得られた正確なN末端アミノアシル配列を含有する成熟Arg特異的プロテイナーゼ（507アミノ酸残基）が続く。PrtR45のような成熟タンパク質N末端配列は、プロ断片のArg残基のすぐ後についている。
prtRII遺伝子は、PrtR45およびその関連接着物（図８および９）をコードするprtR遺伝子の５分の２と、5’において高度の類似性を示す。２つの翻訳配列を比較すると、翻訳プレプロ断片およびプロテイナーゼドメインに対してそれぞれ76％および80％の全類似性が示される。しかし、prtRIIは、prtRおよびprtK遺伝子によりコードされるいずれのC末端ヘマグルチニン／接着ドメインもコードせず、精製PrtRII50プロテイナーゼは接着と関係がないという知見と一致する。翻訳されたprtRII遺伝子配列から推定したPrtRII50成熟プロテイナーゼのMrは、55.6kDaであり、これはSDS-PAGEより得た50kDa（図７）と一致し、PrtR45に対する53.9kDaの推定Mrより僅かに大きい（Bhogalら,1997）。
PrtRII50の推定アミノアシル配列のPrtR45Arg特異的プロテイナーゼおよびPrtK48Lys特異的プロテイナーゼとの配列アラインメント（Slakeskiら,1996；Bhogalら,1997）により、PrtRII50は接着に関連しているPrtR45プロテイナーゼに対してC末端80アミノアシル残基を除くと高い配列類似性（97.5％同一性）を示すことがわかる（図８）。実際、PrtRII50のこのC末端80残基配列は、PrtRの最後のドメインであるPrtR27接着ドメインのC末端80残基配列と類似（47％同一性）である。PrtRII50およびPrtR45プロテイナーゼの高い配列同一性とは対照的に、２つの接着に関連しているPrtR45とPrtK48プロテイナーゼとの間には、モチーフGEPNPYQPVSNLTATTQGQKVTLKWDAPSTK-（図８中の下線部分）が両プロテイナーゼでほとんど同一であるが、PrtRII50には存在しないC末端領域周辺を除くと、より低い全体類似性（25％）しかない。同様のモチーフは、PrtRおよびPrtKのPrtR44、PrtR17、PrtK39およびPrtK44接着ドメインにも存在し（表１  ABM1ペプチド）、このことから本発明者らは、このモチーフはPrtRおよびPrtKプロテイナーゼならびに接着物の大複合体への結合に関わる接着結合モチーフであることを提起するに至った。
PrtR-PrtK複合体の推定接着結合モチーフに対応する合成ペプチドに対する結合
提起された接着結合モチーフPYQPVSNLTATTQGQKVTLKWDAPSTKに対応するペプチド（ABM1[45]）を合成し、PrtR-PrtK複合体の結合を測定するために使った。ABMペプチドに対するTLCK不活性化PrtR-PrtK複合体の特異的結合を競合結合アッセイにおいて実証したが、マイクロタイタープレート上に吸着されたABMペプチドに対する複合体の結合を阻害するために溶液中にABMペプチドの5〜100倍モル過剰が必要であった（図10）。PrtR45の残基428〜448に対応する対照ペプチドのFNGGISLANYTGHGSETAWGTならびにカゼインは、吸着されたABMペプチドへのTLCK不活性化PrtR-PrtK複合体の結合を阻害しなかった。抗PrtR-PrtK抗血清は、PrtR-PrtK複合体が不在であるとABMペプチドに結合しなかった。TLCKによる不活性化は、該複合体がプロテイナーゼの活性部位を通してペプチドに結合しないことを保証した。このことは、カゼインおよびABMペプチドと同様なサイズ及びリシン含量であるが無関係な配列の非特異的ペプチドへのPrtR-PrtK複合体の結合が起らないことによっても確認された。したがって、ABMペプチドに対するTLCK不活性化PrtR-PrtK複合体の特異的結合を実証するこれらの結果は、提起されたPrtRおよびPrtKプロテイナーゼと接着物の大複合体への結合におけるこの保存モチーフの役割と一致する。
考察
P.gingivalis W50細胞音波処理物を使って、本発明者らは第２の、細胞に関連したArg特異的、カルシウム安定化システインプロテイナーゼを精製し特性決定し、これは先に特性決定したArg特異的システインプロテイナーゼPrtR45（Bhogalら,1997）とほとんど同一であった。しかし、PrtR45に対してほとんど同一な酵素特性および阻害剤／活性化剤プロフィールにも関らず、第２の酵素は、いくつかの重要な相異を表した。第１に、PrtRII50と名付けた第２の酵素は、接着物と結合していない別の酵素である。Arg特異的システインプロテイナーゼPrtR45は、ArgおよびLys特異的プロテイナーゼと接着物との大きな多タンパク質複合体の45kDa成分（Bhogalら,1997）である。第２に、PrtRII50は、SDS-PAGE上でPrtR45より僅かに大きく（Mr50kDa）、第３に、PrtRII50の最初の25個のN末端残基中に４つのアミノ酸置換がある。PrtRII50は、PrtR45と比較すると、位置８にGlnの代りにGluを、位置17にAlaの代りにProを、位置22にGlyの代りにGluを、位置25にLysの代りにGluを有する。サイズおよびN末端アミノアシル配列のこれらの相異は、第２Arg特異的プロテイナーゼをコードするPrtRII遺伝子のクローニングおよび配列解析によって確認された。
prtRII遺伝子の推定アミノ酸配列は、最近報じられたP.gingivalis ATCC33277（Nakayama,1997）からのrgpB遺伝子のそれと98％同一性を示し、両方の遺伝子は、２つの異なる株における同じ遺伝子座を表すことを示唆する。しかし、rgpB遺伝子の成熟プロテイナーゼに対する配列は、prtRII遺伝子産物中に見出されたN末端アミノアシル置換の３つを含有せず、位置８のGln→Glu置換のみを有する。該遺伝子産物がprtR（rgpA）の成熟PrtR45プロテイナーゼからのN末端配列解析により明確に差別化されることを可能としたPrtRII50に見出される位置17、22および25における置換は、rgpBには見出されなかった。最近の研究では、成熟プロテイナーゼのN末端配列およびサイズの相異は、別の50kDa Arg特異的プロテイナーゼ（PrtRII50）を接着物に関連して見出された45kDa Arg特異的プロテイナーゼ（PrtR45）から、差別化することを可能にした。２つのプロテイナーゼ（PrtR45およびPrtRII50）の２つの遺伝子（それぞれprtRおよびprtRII）への帰属は、別のPrtRII50には見出されない２つの接着に関連したプロテイナーゼ（PrtR45およびPrtR48）中の保存モチーフの同定を可能とした。保存モチーフはprtRおよびprtKの複数の接着物中にも見出されているので、本発明者らは、それがprtRおよびprtKプロテイナーゼと接着物の大複合体への結合に関わる接着結合モチーフであると提起する。この提起は、保存モチーフに対応する合成ペプチドがTLCK不活性化PrtR-PrtK複合体に特異的に結合するという実証により支持される。
接着結合モチーフ１内の保存モチーフPVXNLT.....LKWXAPの同定により、本発明者らは相補的モチーフは疎水性で負に帯電しているであろうことを提起する。したがって、疎水性で負荷電の残基を含有する繰返しモチーフを合成用に、例えば、TATTFEEDGVA（ABM 2、表１）およびWKTIDADGDG（ABM 5、表１）に対して選択した。研究のために選択した他のモチーフは、疎水性および／または荷電および／または中性極性残基の他の繰返しモチーフ、例えば、VYRDGTKIKE（ABM2、表１）、WEIRTVDLPAGTKYV（ABM4、表１）およびEFAPVQNLTGSA（ABM6、表１）であった。
PrtRII50の推定アミノアシル配列とPrtR45Arg特異的プロテイナーゼおよびPrtK48Lys特異的プロテイナーゼの触媒ドメインのアラインメントをさらに検証すると、いくつかのさらなる興味深い類似性領域が現れた（図８）。P.gingivalis由来のこれら３つのシステインプロテイナーゼは、他の既知のファミリーのシステインプロテイナーゼと類似性を有しないが、１個のHis残基と２個のCys残基が３つの配列に関係した酵素中に保存されているので、触媒残基の同一性を予測することは可能である。したがって、これら酵素の触媒Cys、Hisダイアド（dyad）は、３つのプロテイナーゼの唯一の保存HisであるPrtRII50のH440、から成ると考えられる。また触媒Cysは、３つの配列に関係したプロテイナーゼの２個の保存システイン残基C473およびC484の１つであると考えられる。
実施例２
プロテイナーゼ活性部位および接着結合モチーフペプチドの合成ならびにマウス病変モデルにおける試験
表１に掲げたプロテアーゼ活性部位およびそれぞれの接着結合モチーフを代表する次のペプチドを合成し、コンジュゲートし、そしてマウス病変モデル（表２）で試験した。
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材料
他に記載の無い限り、化学品はペプチド合成グレードまたその相当品である。O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、1ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（TFA）、および9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）保護アミノ酸は、アウスペプ・プティ社（Auspep Pty Ltd.,Melbourne,Australia）から入手した。トリイソプロピルシラン（TIPS）およびエタンジチオール（EDT）は、アルドリッチ（Aldrich,New South Wales,Australia）から入手した。1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン（DBU）は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company,New South Wales,Australia）から入手した。フェノールおよびジエチルエーテルは、BDH（Poole,UK）から入手した。
固相ペプチド合成
ペプチドを手動でまたは431A ABIペプチド合成器を使って合成した。Fmoc化学のための標準固相ペプチド合成プロトコルを全体に使った。ペプチドは、カルボキシアミド形としてFmoc-Pal-Peg-PS樹脂（PerSeptive Biosystems Inc.,Framingham,MA）を使って構築した。カップリングは、HBTU/HOBt活性化により、4当量のFmoc-アミノ酸および6当量のDIPEAを使って実施した。Fmoc基は、2％ v/vピペリジンを含有するDMF中の2％ v/v DBUにより除去した。ペプチドの樹脂支持体からの開裂は、TFA：フェノール：TIPS：EDT：水（92：2：2：2：2）開裂カクテルを使い、該ペプチドのアルギニン含量に依存して2.5時間または4時間実施した。開裂後、樹脂を濾過より除去し,濾液をほぼ1mlに窒素気流下で濃縮した。ペプチド産物を冷エーテル中に沈殿させた後、遠心分離にかけ、３回洗浄した。その後、ペプチド沈降物は0.1％ v/v TFAを含有する5〜10mLの水に溶解し、不溶残査を遠心分離により除去した。
S-アセチルメルカプト酢酸ペプチドの合成
ペプチドを保持する樹脂をDMF中で膨潤させ、N末端Fmoc基を2％ v/vピペリジンを含有するDMF中の2％ v/v DBUにより除去した。S-アセチルメルカプト酢酸（SAMA）基を、5当量のSAMA-OPfpNおよび5当量のHOBtを使ってN末端アミノ基に導入した。反応は、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBSA）試験によりモニターした。TNBSA試験がネガティブになれば、樹脂を洗浄した（5 x DMF、3 x DCMおよび3 x ジエチルエーテル）。樹脂を真空下で乾燥し、SAMA-ペプチドを樹脂支持体から上記のように開裂した。
ペプチド精製
合成ペプチドの精製は、Waters HPLCシステム内にインストールしたBrownlee C18 Aquapore ODSカラム（250 x l00mm）を使って実施した。クロマトグラムを、流速5mL/minで、水中0.1％ v/v TFA（溶媒A）および90％アセトニトリル水溶液中0.1％ v/v TFA（溶媒B）を使って展開した。ペプチドは、40分間にわたって形成した10〜30％溶媒Bの勾配で溶出した。分析用HPLCはApplied Biosystems HPLCシステム内にインストールしたBrownlee C8 Aquapore RP-300カラム（220 x 4.6mm）を使って実施した。クロマトグラムは、溶媒Aおよび溶媒Bを使い流速1mL/minおよび30分間にわたって形成した溶媒Bの0〜100％直線勾配を使って展開した。カラムから溶出した物質は214nmの吸収を測定して検出した。ペプチド画分はプールして凍結乾燥した。ペプチドは、質量分光分析によりPerSeptive Biosystems Voyager DE MALDI-TOFを使って分析した。
SAMA-ペプチドのジフテリアトキソイドへのコンジュゲーション
ジフテリアトキソイド（DT）は、I.Barr博士（CSL Pty.Ltd.Melbourne,Australia）から入手し、62kDa分子当り9当量のアミノ基を含有した。リン酸緩衝化生理食塩水（0.1Mリン酸ナトリウム、0.9％ NaCl；pH7.4）中に10mg/mLのDTを含有する溶液に、DMF中の1％ w/v溶液m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）の0.1mLを加えた。30分後、未反応MBSを除去し、MBS修正DTを、ゲル濾過により、コンジュゲーションバッファー（0.1Mリン酸ナトリウム、5mM EDTA；pH6.0）に平衡化したPD10カラム（Pharmacia,NSW,Australia）を使って採取した。精製SAMA-ペプチド（1.3μmole）を、0.5M Tris;2mM EDTA,pH6を含有する200μL 6MグアニジンHCl中に溶解し、800μL MilliQ水で希釈し、MilliQ水中に溶解した2M NH2OH（40当量）の25μLを加えてin situ脱保護した。採取したMBS-DTを、脱保護したSAMA-ペプチドとすぐ反応させ、室温で１時間攪拌した。ペプチド-DTコンジュゲートを、未反応ペプチドからゲル濾過によりPBS pH7.4中で平衡に達したPD10カラムを使って分離し、凍結乾燥した。反応は、エルマン試験（Ellmanstest）を使ってモニターした。SAMA-ペプチドのMBS-DTへのコンジュゲーション収率は、34％〜45％の範囲であり、DT１分子当り３〜４個のペプチドがカップリングしたことを示した。
免疫感作およびマウス病変モデルプロトコル
6〜8週齢のBALB/cマウスに、ペプチド-DTコンジュゲート50μg、DT50μgまたはPorphyromonas gingivalis株33277のホルマリン死滅細胞2 x 109を完全フロイントアジュバント（CFA）中に乳化し皮下注射して免疫感作した。30日後に、マウスに抗原（ペプチド-DTコンジュゲート50μg、DT50μgまたはPorphyromonas gingivalis株33277のホルマリン死滅細胞2 x 109）を不完全フロイントアジュバント（IFA）中に乳化して皮下注射し、そして12日後に球後神経叢（retrobulbar plexus）から採血した。全マウスに、P.gingivalis（200μL）の8 x 109細胞を腹部に皮下注射してチャレンジし、10日間にわたり、体重および病変サイズを測定した。病変サイズはmm2として表現し、クラスカル・ウォリス（Kruskal-Wallis）ワンウエーANOVAおよびマン・ホィットニーU・ウィルコクソン（Mann-Whitney U-Wilcoxon）ランクサムW検定を使って統計的に解析した。
ペプチド-DTコンジュゲートを使ってBALB/cマウスを免疫感作し、マウス病変モデルでのPorphyromonas gingivalisチャレンジに対する保護有効性を評価した。図６は、担体タンパク質ジフテリアトキソイドのみで免疫感作したマウスは、アジュバントのみで免疫感作したマウス（対照）と同様の平均病変サイズを有したことを示す。これは、DT単独ではP.gingivalisに対する保護を与えないこと、さらに、ペプチド-DTコンジュゲートにより与えられる保護はペプチドにより誘導された免疫応答に帰属しうることを示した。対照ペプチド-DTコンジュゲートは、平均病変サイズはDTまたはアジュバント単独（対照）で免疫感作したマウスのそれと有意差がなかったので、P.gingivalisに対する保護を与えていなかった。DT（PAS1（R45）およびPAS1（K48））にコンジュゲートしたプロテイナーゼ活性部位ペプチドでの免疫感作は両方とも、DT対照と比較してP.gingivalisチャレンジから生じた病変サイズを有意に低減した（表３）。全ての接着結合モチーフペプチドは、免疫原として使うと病変サイズを低減したが、ABM1（R45）、ABM2（K39）およびABM3（R44）だけが、使用動物数に対して有意（p<0.05）に達した（表３）。
これらの結果は、マウス病変モデルにおけるP.gingivalisによるチャレンジを予防する免疫原とし使うときに、PrtR-PrtKプロテイナーゼ活性部位ペプチドおよび接着結合モチーフペプチドの有効性を実証した。したがって、これらの結果は、これらのペプチドがヒトのP.gingivalis関連疾患（例えば、歯周病）の予防のワクチンとして有用性を有しうることを示唆する。
PAS1ペプチドに対する抗血清は、ArgおよびLys両方の特異的タンパク質分解活性を阻害し、したがってこれらのペプチドによる免疫感作により与えられる優れた保護を説明することができる。抗PAS1抗血清によるタンパク質分解活性の阻害は、これらの抗体が口洗浄剤、歯磨きペーストまたはP.gingivalisプロテアーゼおよびそれらの破壊効果を中和する他の口腔内送達ビヒクルに有用であり得ることを示唆する。同様に、接着結合モチーフ、特にABM1、ABM2およびABM3に対する抗血清は、経口ケア製品およびP.gingivalisの接着およびしたがってコロニー化をブロックするための医薬品に有用であり得る。
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実施例３
（１）ペプチド抗原および多重構築物の合成
表１のペプチドを標準FmocまたはtBoc合成方法を使って合成し、そして多ペプチド構築物を図１〜５に概要を述べた方法を使って合成した。
（２）抗体の調製
血清抗体は、ウマ、ウサギ、ヒツジまたは乳牛を免疫感作することにより取得した。
免疫感作は標準の方法を使って実施した。初期免疫感作は抗原とフロイント不完全アジュバントの混合物で実施した。抗体は動物血清または乳から標準の方法を使って回収することができた。
実施例４
抗原ペプチドを診断イムノアッセイに使う方法
本明細書に記載されたP.gingivalisペプチド抗原は、ワクチン製剤中の免疫原として；および診断アッセイのためまたは治療および／もしくは診断に使うP.gingivalis特異的抗血清を作製するための抗原として、使用するために合成することができる。
表１に開示したペプチドは、当該技術分野において周知の複数の方法のどれかを使って個々にまたは化学的に結合して合成することができる。使用可能な複数の方法の例を図１〜５に掲げた。該ペプチドは当該技術分野において公知のペプチド合成の複数の方法の１つを使って合成することが可能であり、tertブチルオキシカルボニルアミノ酸を使う（Mitchellら,1978,J.Org.Chem.43:2845-2852）か、ポリアミド支持体上の9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸を使う（Drylandら,1986,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 125-137）標準固相ペプチド合成；ペプスカン（pepscan）合成（Geysenら,1987,J.Immunol Methods 03:259;1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998）；または標準液相ペプチド合成を含む。アミノ酸の欠失および置換（およびアミノ酸への伸長および付加を含む）および他の方法によるペプチドまたはオリゴペプチドの修正は、該ペプチドもしくはオリゴペプチドの免疫学的物性を実質的に損なわないように行うことができる。特に、本明細書に記載された抗原のアミノ酸配列は、ペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラの物理化学的（physicochemical）挙動に観察される差異がサイレントな変化をもたらす機能的に等価のアミノ酸で、１つ以上のアミノ酸を置き換えることにより変更することができる。機能的に等価のアミノ酸は、当該技術分野においては同様な極性または電荷で関係づけられるおよび／または有するアミノ酸として知られる。したがって、実質的に本明細書の配列表に記述されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列は、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはキメラの主要な生物学的機能を変えることのない機能的に等価のアミノ酸による置換を含有するアミノ酸配列を意味する。
精製した合成ペプチドは、P.gingivalisにより起った感染を有する疑いのある個体の体液中に存在するP.gingivalis特異的抗血清の検出用のイムノアッセイに抗原として使うことができる。イムノアッセイによる抗原または関係ペプチドの検出は、当該技術分野において公知のどのイムノアッセイも含み、限定されるものでないがラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、「サンドイッチ」アッセイ、沈降反応、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、および化学発光に基くイムノアッセイを含む。
実施例５
合成ペプチド抗原および多ペプチド構築物に関係するワクチン製剤のための方法および化合物
本発明のこの実施様態は、P.gingivalisにより生じた感染に対して保護またはそれを治療するための能動免疫用の予防および／または治療ワクチンに免疫原として使うため、表１のペプチド抗原を提供する。ワクチン目的のためには、合成ペプチド構築物を含んでなるP.gingivalisの抗原は、免疫原性であって、エピトープがP.gingivalis株内で保存されている場合、無傷の細菌上の１つ以上の表面に曝された該エピトープを指向する機能的抗体を誘起しなければならない。
本発明の１つの例であるワクチン抗原の望ましい物性を有するジペプチドPAS1-PAS2構築物（図４）は、該ジペプチドを本明細書の実施例３に記載した方法を使って合成することができる。
該合成ペプチドは、適切な免疫原性物質としてワクチン製剤に、免疫応答を誘起する治療的に有効な量が含まれる。免疫感作すべきヒトまたは動物中へのワクチン製剤の導入のための多くの方法が公知である。これらには、限定されるものでないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、眼球内、鼻腔内、および経口投与を含む。さらにワクチンは、溶液、ポリマーもしくはリポソームのような生理学的担体；およびアジュバント、またはそれらの組合わせを含んでなる。
ワクチン製剤と結合して各種のアジュバントが使われる。アジュバントは、免疫応答を調節することにより、また、より少量のワクチン抗原またはワクチン抗原が単独投与される場合より少ない用量を使って、より耐久性のあるより高いレベルの免疫を達成することを助ける。アジュバントの例として、不完全フロイントアジュバント（IFA）、アジュバント65（ピーナッツオイル、モノオレイン酸マンナイド（mannide monooleate）およびモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、油エマルジョン、リビ（Ribi）アジュバント、プルロン酸ポリオール、ポリアミン、アブリジン（Avridine）、クイル（Quil）A、サポニン、MPL、QS-21、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムのような無機質ゲル等が挙げられる。
本発明のこの様式の他の実施様態は、ハプテンすなわちそれ自身では免疫応答を誘発できない分子としての抗特異的アミノ酸配列の産生に関わる。このような場合、ハプテンを担体または他の免疫原性分子と共有結合させ、免疫系に曝されたとき、カップリングしたハプテンに免疫原性を与えるようにすることができる。このようにして、担体分子に結合した抗原特異的ハプテンは、ワクチン製剤において免疫原になることができる。
能動免疫の代りとして、免疫感作は、受動、すなわち合成ペプチドに対する抗体を含有する精製免疫グロブリンの投与を含んでなる免疫感作であり得る。
実施例６
以下は、抗ペプチド抗体を含有する提起された歯磨ペースト製剤の一例である。
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実施例７
以下は、提起された歯磨ペースト製剤の一例である。
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実施例８
以下は、提起された歯磨ペースト製剤の一例である。
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実施例９
以下は、提起された歯磨ペースト製剤の一例である。
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実施例10
以下は、提起された液状歯磨ペースト製剤の一例である。
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実施例11
以下は、提起された口洗浄液製剤の一例である。
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実施例12
以下は、提起された口洗浄液製剤の一例である。
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実施例13
以下は、提起されたトローチ製剤の一例である。
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実施例14
以下は、提起された歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
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実施例15
以下は、提起されたチューインガム製剤の一例である。
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当業者には、特定の実施例に示された本発明は、広範に記載された本発明の思想または範囲から逸脱することなく、数多くの改変および／または修正が行われうることが明らかであろう。したがって、本明細書の実施様態は、全ての点で例示としてであり限定としてではないと考えられねばならない。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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