(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列を分析する方法であって、
前記ペプチドの前記Ｃ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、前記Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定するステップと、
Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量と前記ペプチドの分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握して、前記分子量の減少量に基づき、前記Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析するステップと、
を含み、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチドを実質的にアルカン酸無水物に接触させることにより、前記Ｃ末端のアミノ酸を分解させることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記ペプチドの分子量を測定するステップを含み、
アミノ酸配列を分析する前記ステップは、ペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量とＣ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップの前に、前記Ｃ末端欠損ペプチドに水分子を作用させるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載のＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、水分子を作用させる前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドを、塩基性含窒素化合物または第三アミンを含む水溶液に接触させるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項５】
ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列を分析する方法であって、
前記ペプチドの前記Ｃ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、前記Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチドを所定の位置で切断し、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得るステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定するステップと、
Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量と前記ペプチドから得られるペプチド断片の分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握して、前記分子量の減少量に基づき、前記Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析するステップと、
を含み、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチドを実質的にアルカン酸無水物に接触させることにより、前記Ｃ末端のアミノ酸を分解させることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
前記ペプチドを前記所定の位置で切断し、ペプチド由来ペプチド断片を得るステップと、
前記ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定するステップと、
を含み、
アミノ酸配列を分析する前記ステップは、ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量とＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量の差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項７】
請求の範囲第５項または第６項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチド中の特定のアミノ酸残基を保護し、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップにおける前記切断に対する前記特定のアミノ酸残基の感受性を失わせるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドをプロテアーゼ処理するステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
前記プロテアーゼがトリプシンであって、
特定のアミノ酸残基の感受性を失わせる前記ステップは、前記ペプチドをＮ−アシル化するステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１０】
請求の範囲第７項乃至第９項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
前記保護は、前記ペプチドのＯ−アシル化およびＮ−アシル化であって、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップの前に、前記Ｏ−アシル化の脱保護を行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１１】
請求の範囲第５項乃至第１０項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップは、陽イオン種および陰イオン種による質量分析測定を行うステップを含み、
Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析する前記ステップは、前記陽イオン種による質量分析の結果と前記陰イオン種による質量分析の結果とを比較して、前記ペプチドの前記Ｃ末端に係る前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を識別するステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１２】
請求の範囲第５項乃至第１１項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップの前に、前記Ｃ末端欠損ペプチドに水分子を作用させるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、水分子を作用させる前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドを、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミンを含む水溶液に接触させるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項乃至第１３項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、
前記ペプチドをゲル中に保持させた状態で行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項乃至第４項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップより前のステップをゲル中で行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１６】
請求の範囲第５項乃至第１３項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップより前のステップをゲル中で行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１４項乃至１６項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの前に、前記ペプチドを架橋するステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１４項乃至第１７項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの前に、
前記ペプチドを含む混合物からポリアクリルアミドゲル電気泳動により前記ペプチドを分離するステップを有し、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、分離された前記ペプチドを前記ポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いた前記ゲル中に保持させた状態で行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１４項乃至第１８項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、
アルカン酸無水物の双極性非プロトン性溶媒の溶液に前記ゲルを浸漬させるステップを含むことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項乃至第１９項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、塩基性含窒素芳香環化合物の存在する系中で行うことを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項に記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、
前記塩基性含窒素芳香環化合物が、ピリジン塩基またはその誘導体であることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項乃至第２１項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記アルカン酸無水物が炭素数２以上６以下のアルカン酸の対称型酸無水物であることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１項乃至第２２項いずれかに記載のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記アルカン酸無水物が炭素数２以上６以下の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物であることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然より採取されるペプチドやタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、その生物学的性質や機能を研究する際に不可欠である。現在、ペプチドやタンパク質の全アミノ酸配列は、対応する遺伝子情報、すなわち、これらのペプチドをコードしているゲノム遺伝子やｍ−ＲＮＡより調製されたｃ−ＤＮＡの塩基配列に基づいて推定されるアミノ酸配列として決定されている。または、直接種々の方法によりタンパク質自体のアミノ酸配列が決定されている。その際、当該ペプチドをコードしているゲノム遺伝子やｍ−ＲＮＡより調製されたｃ−ＤＮＡを特定する上で、ペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見は、依然として必要である。【０００３】
このペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見として、一般に、ペプチドのＮ末端アミノ酸配列とＣ末端アミノ酸配列とが、特に有用とされている。たとえば、多数のｍ−ＲＮＡより調製されたｃ−ＤＮＡライブラリーから、目的とするペプチドをコードしているｃ−ＤＮＡを選別する際、仮に、Ｎ末端アミノ酸配列とＣ末端アミノ酸配列とが判明していると、両末端のアミノ酸配列に基づいて核酸プローブを作製し、得られたプローブを利用して目標とするｃ−ＤＮＡを選別することが可能となる。また、両末端のアミノ酸配列に基づき作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ＰＣＲ法を適用し、目標とするｃ−ＤＮＡを選択的に増幅することも可能となる。【０００４】
ここで、ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を解析する手法として、従来、エドマン分解法を利用して、Ｎ末端アミノ酸を逐次的に分解しつつ、生成するアミノ酸誘導体を同定する手法が利用されている。【０００５】
一方、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を解析する手段として、化学的手法によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解し、その反応産物として得られる短縮されたペプチドともとのペプチドとの分子量差から、分解されたＣ末端アミノ酸を特定する方法が提案されている（非特許文献１、２、３）。【０００６】
非特許文献１には、化学的手法によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する方法が提案されている。この方法は、乾燥したペプチドを９０℃に加熱し、ペンタフルオロプロパン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＯＯＨ）高濃度水溶液またはヘプタフルオロブタン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＦ2ＣＯＯＨ）高濃度水溶液から発生した蒸気を作用させて、Ｃ末端アミノ酸の選択的な加水分解を促進させる方法である。【０００７】
また、非特許文献２および非特許文献３では、パーフルオロアルカン酸高濃度水溶液に代えて、無水ペンタフルオロプロパン酸（（ＣＦ3ＣＦ2ＣＯ）2Ｏ）のアセトニトリル溶液、または無水ヘプタフルオロブタン酸（（ＣＦ3ＣＦ2ＣＦ2ＣＯ）2Ｏ）のアセトニトリル溶液を用いてＣ末端アミノ酸の選択的な分解を行わせる方法が提案されている。このとき、たとえば、−１８℃に冷却しつつ、この溶液から発生した蒸気を乾燥したペプチドに作用させ、系内に溶液から蒸発する水分子を含まないようにすることにより、副次的反応の発生を回避することができるとされている。【０００８】
これらの従来のＣ末端の分解手法では、下記反応式（Ｉ）で示される脱水反応により、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、オキサゾロン環構造がいったん形成されるとされている。次いで、パーフルオロアルカン酸がこのオキサゾロン環に作用し、下記反応式（ＩＩ）で示される反応が生じる。この結果、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると報告されている。【０００９】
そして、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、所定の処理時間が経過した時点で、もとのペプチドに対して１〜１０数アミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。この一連の反応産物を含む混合物に対して質量分析法を適用し、各反応産物に由来するイオン種の質量を測定すると、Ｃ末端からのアミノ酸配列を反映した質量差を示す一連のピークが測定される。【００１０】
たとえば、もとのペプチドからの逐次的なＣ末端アミノ酸分解反応により生成される各反応産物は、もとのペプチドから数アミノ酸残基が除去された反応産物までの、数種の一連の反応産物群となる。この反応産物群を質量分析に供すれば、対応するイオン種の質量を一括して分析することができる。そして、除去されたＣ末端側のアミノ酸に対応するイオン種の質量から、数アミノ酸残基分のＣ末端アミノ酸配列を一括して決定することができるとされている。【００１１】
【化１】
0004289355.tif 000002
【００１２】
【化２】
0004289355.tif 000003
【非特許文献１】Ｔｓｕｇｉｔａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９９２年，  ２０６，  ｐ．６９１−６９６
【非特許文献２】Ｔｓｕｇｉｔａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９２年，  ｐ．２３５−２３８
【非特許文献３】Ｔａｋａｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２８，  １９９５年，  ｐ．３６２−３７２
【００１３】
発明の開示【００１４】
乾燥したペプチドにパーフルオロアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸無水物の蒸気を気相から供給し、作用させる従来の手法は、有用なＣ末端アミノ酸配列の分析方法とされていた。ところが、本発明者がこれらの方法を用いて分析を行ったところ、汎用性の点で改善の余地があることが見出された。【００１５】
本発明者はこの原因について鋭意検討した。その結果、ペプチドＣ末端の逐次分解に用いるパーフルオロアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸無水物は、ペプチドに対する作用が比較的強いため、副反応を生じる可能性があることが見出された。【００１６】
たとえば、非特許文献１の方法では、ペプチド中のセリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−）において、α位のアミノ基（−ＮＨ−）とβ位のヒドロキシ基（−ＯＨ）の間で、Ｎ，Ｏ−アシル転位反応およびそれに引き続いて加水分解が進行する可能性があった。この加水分解が進行すると、セリン残基のＮ末端側でペプチドの切断が生じるという副反応が生じる。また、β位にヒドロキシ基が存在しているトレオニン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ）−ＣＯ−）においても、同様の機構による加水分解が進行し、トレオニン残基のＮ末端側でペプチドの切断が生じる可能性があった。【００１７】
また、ペプチド中のアスパラギン酸残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＯＯＨ）−ＣＯ−）において、Ｃ末端のカルボキシル基からβ位のカルボキシル基へのペプチド結合の転位と、それに引き続く加水分解が進行し、アスパラギン酸残基のＣ末端側でペプチドの切断が生じる可能性があった。【００１８】
これらの副反応により、長いペプチド鎖の切断が生じると、そのＮ末端側ペプチド断片に対しても、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解が同時に進行することになる。これらの副反応に由来する反応産物が共存すると、場合によっては、目的とする反応産物の質量分析に際して、その測定を阻害する要因ともなる。【００１９】
また、ペプチドの切断に至らなくとも、β位のヒドロキシ基へＮ末端側部分ペプチドが連結された分岐型ペプチドとなると、その部位では、アミド結合が失われる。このため、上記式（Ｉ）で示されるオキサゾロン環構造の形成がなされず、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応がそれ以上進行しないものとなる。【００２０】
一方、非特許文献２または非特許文献３に記載の方法は、系内に溶液から蒸発する水分子を含まないので、こうした副反応の発生を有効に回避できる利点を有していた。ただし、利用しているパーフルオロアルカン酸無水物の反応性が高く、副反応を抑制するために、処理温度を、たとえば、−１８℃のような低温に維持し、結露を防止する必要があった。このため、Ｃ末端の逐次分解の操作を簡素化するという点で改良の余地があった。【００２１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、穏和な条件でペプチドのＣ末端アミノ酸の逐次分解を行う技術を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ペプチドのＣ末端アミノ酸を確実に分析する汎用性の高い技術を提供することにある。【００２２】
本発明によれば、ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列を分析する方法であって、前記ペプチドの前記Ｃ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、前記Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るステップと、前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定するステップと、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量と前記ペプチドの分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握して、前記分子量の減少量に基づき、前記Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析するステップと、を含み、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチドを実質的にアルカン酸無水物に接触させることにより、前記Ｃ末端のアミノ酸を分解させることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法が提供される。【００２３】
本発明に係る方法では、実質的にアルカン酸無水物を用いてペプチドの逐次分解を行う。このため、たとえば、タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチドについて、パーフルオロアルカン酸等が実質的に含まれない緩和な条件で、化学的方法によりペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解し、Ｃ末端から逐次的にアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得ることができる。よって、逐次分解における副反応を抑制し、逐次的に除去される一連のアミノ酸に起因する分子量減少に基づいて、Ｃ末端アミノ酸配列を分析することができる。また、分子量の減少量に基づいてＣ末端からのアミノ酸配列を分析するため、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を高い汎用性で確実に分析することができる。【００２４】
本発明において、ペプチドに接触させるアルカン酸無水物として、置換または無置換のアルカン酸無水物を用いることができ、パーフルオロアルカン酸およびその無水物は含まない。なお、アルカン酸無水物の置換体を用いる場合は、ハロゲン以外の原子で置換されたアルカン酸無水物を用いることが好ましい。【００２５】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記ペプチドの分子量を測定するステップを含み、アミノ酸配列を分析する前記ステップは、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量とペプチドの分子量を測定する前記ステップで得られた分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握することができる。こうすることにより、分子量の差分から、Ｃ末端から除去されたアミノ酸残基の種類を確実に把握することができる。よって、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列をさらに確実に分析することができる。【００２６】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップの前に、前記Ｃ末端欠損ペプチドに水分子を作用させるステップを含んでもよい。こうすることにより、逐次分解を受けたＣ末端欠損ペプチドのＣ末端にカルボキシル基を確実に形成させることができる。【００２７】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、水分子を作用させる前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドを、塩基性含窒素化合物または第三アミンを含む水溶液に接触させるステップを含んでもよい。こうすることにより、水分子を作用させるステップにおける加水分解反応をさらに確実に行うことができる。【００２８】
本発明に係る逐次的なＣ末端アミノ酸分解反応により、たとえば、１０アミノ酸残基の除去に達する一連の反応産物を同時に含有する処理試料を調製することができる。たとえば、核酸プローブやプライマーの作製に利用するＣ末端アミノ酸配列の情報は、通常、アミノ酸配列をコードする塩基配列として、１８塩基長〜２４塩基長程度、したがって、６アミノ酸〜８アミノ酸程度であってもよい。このため、本発明の方法は、これらの用途に好適に用いられる。【００２９】
一方、解析対象のペプチドが、たとえば、タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチドである場合には、ペプチド自体の分子量が、質量分析測定に好適な試料の分子量範囲よりも大きい場合がある。または、ペプチドの分子量に対して、Ｃ末端側の１アミノ酸残基が除去された際の式量変化が相対的に少ないため、充分な測定精度が得られない場合がある。【００３０】
そこで、本発明において、タンパク質等の分子量の大きいペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析の際には、ペプチドを選択的に切断するステップを含む以下の手順を採用することができる。【００３１】
本発明によれば、ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列を分析する方法であって、前記ペプチドの前記Ｃ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、前記Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るステップと、前記Ｃ末端欠損ペプチドを所定の位置で切断し、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得るステップと、前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定するステップと、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量と前記ペプチドから得られるペプチド断片の分子量との差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握して、前記分子量の減少量に基づき、前記Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析するステップと、を含み、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチドを実質的にアルカン酸無水物に接触させることにより、前記Ｃ末端のアミノ酸を分解させることを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法が提供される。【００３２】
本発明に係る方法によれば、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解反応の後、もとのペプチドに対して所定の数のアミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物に対して、特定のアミノ酸部位において、選択的なペプチド鎖の切断を行う。このとき、たとえば切断部位特異性を有するプロテアーゼ、たとえば、トリプシンを利用し、長いペプチド鎖の酵素消化を施すことができる。そして、得られたペプチド断片について、質量分析を行う。【００３３】
こうすると、酵素消化を施して得られるペプチド断片の混合物には、もとのペプチドに由来するＣ末端側ペプチド断片と、それに対して、所定の数のアミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群が含まれる。そして、もとのペプチドおよび一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群に対して、質量分析法を適用して、各反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群イオン種の質量を測定すると、Ｃ末端アミノ酸配列を反映した質量差を示す一連のピークを、充分な分子量分解能で測定できる。【００３４】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記ペプチドを前記所定の位置で切断し、ペプチド由来ペプチド断片を得るステップと、前記ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定するステップと、を含み、アミノ酸配列を分析する前記ステップは、ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量とＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップで得られた分子量の差分から、逐次的な前記分解に伴う分子量の減少量を把握してもよい。こうすることにより、分子量の差分を、アミノ酸の分子量と比較して、ペプチドのＣ末端から欠損したアミノ酸残基の種類を分析することができる。【００３５】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの前に、前記ペプチド中の特定のアミノ酸残基を保護し、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップにおける前記切断に対する前記特定のアミノ酸残基の感受性を失わせるステップを含んでもよい。こうすることにより、ペプチドの断片化の位置の選択性を向上させることができる。【００３６】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドをプロテアーゼ処理するステップを含んでもよい。こうすることにより、ペプチドを所定の位置で選択的に切断することができる。【００３７】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記プロテアーゼがトリプシンであって、特定のアミノ酸残基の感受性を失わせる前記ステップは、前記ペプチドをＮ−アシル化するステップを含んでもよい。こうすることにより、ペプチドをアルギニン残基のＣ末端側で選択的に切断し、断片ペプチドを安定的に得ることができる。【００３８】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記保護は、前記ペプチドのＯ−アシル化およびＮ−アシル化であって、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップの前に、前記Ｏ−アシル化の脱保護を行う構成とすることができる。こうすることにより、Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析するステップにおいて、アミノ酸配列をより一層正確に分析することができる。【００３９】
ここで、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応を行った後、切断部位特異性を有するプロテアーゼを利用する酵素消化処理を付加し、得られるＣ末端側ペプチド断片の分子量測定を行う形態を採用する場合、酵素消化で必然的に副生される、Ｎ末端側のペプチド断片も質量分析スペクトル上に同時に観測されることになる。【００４０】
このため、もとのペプチドおよび一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークと、それ以外のＮ末端側のペプチド断片複数に起因するピークとを高い確度で識別した上で、目的とするもとのペプチドおよび一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークの各分子量をより精度よく決定可能な手法を採用することにより、汎用性のより一層の向上が可能となる。【００４１】
そこで本発明において、以下の構成とすることにより、Ｃ末端側のペプチド断片およびそのＣ末端アミノ酸の欠損ペプチドのペプチド断片を容易に識別することができる。【００４２】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップは、陽イオン種および陰イオン種による質量分析測定を行うステップを含み、Ｃ末端からのアミノ酸配列を分析する前記ステップは、前記陽イオン種による質量分析の結果と前記陰イオン種による質量分析の結果とを比較して、前記ペプチドの前記Ｃ末端に係る前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を識別するステップを含んでもよい。こうすることにより、ペプチドのアミノ酸配列を分析する際に、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片およびペプチド由来ペプチド断片をさらに容易に識別し、その分子量を得ることができる。このため、アミノ酸配列の分析をより一層確実に行うことができる。【００４３】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの後、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る前記ステップの前に、前記Ｃ末端欠損ペプチドに水分子を作用させるステップを含んでもよい。こうすることにより、逐次分解を受けたＣ末端欠損ペプチドのＣ末端にカルボキシル基を確実に形成させることができる。このため、分析の精度、確度を向上させることができる。【００４４】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、水分子を作用させる前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチドを、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミンを含む水溶液に接触させるステップを含んでもよい。こうすることにより、水分子を作用させるステップにおける加水分解反応をさらに確実に行うことができる。【００４５】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、前記ペプチドをゲル中に保持させた状態で行ってもよい。こうすることにより、ゲル電気泳動等によりゲル中に保持されたペプチドのＣ末端欠損ペプチドをさらに簡便に得ることができる。【００４６】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップより前のステップをゲル中で行ってもよい。また、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する前記ステップより前のステップをゲル中で行ってもよい。こうすることにより、簡便な操作で安定的に分子量の測定に供する試料を調製することができる。【００４７】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの前に、前記ペプチドを架橋するステップを含むことができる。こうすることにより、分析の精度、確度をさらに向上させることができる。【００４８】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップの前に、前記ペプチドを含む混合物からポリアクリルアミドゲル電気泳動により前記ペプチドを分離するステップを有し、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、分離された前記ペプチドを前記ポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いた前記ゲル中に保持させた状態で行ってもよい。【００４９】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップは、アルカン酸無水物の双極性非プロトン性溶媒の溶液に前記ゲルを浸漬させるステップを含んでもよい。こうすることにより、ペプチドのＣ末端のアミノ酸の逐次的な分解を穏和な条件で確実に行うことができる。【００５０】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップを、塩基性含窒素芳香環化合物の存在する系中で行ってもよい。こうすることにより、Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応の反応速度を向上させることができる。このため、穏和な条件でより一層汎用性の高いＣ末端アミノ酸配列の分析方法が実現される。【００５１】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記塩基性含窒素芳香環化合物が、ピリジン塩基またはその誘導体であってもよい。こうすることにより、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解の反応速度をさらに確実に増加させることができる。【００５２】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記アルカン酸無水物が炭素数２以上６以下のアルカン酸の対称型酸無水物であってもよい。また、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法において、前記アルカン酸無水物が炭素数２以上６以下の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物であってもよい。こうすることにより、Ｃ末端のアミノ酸の逐次的な分解を確実に行うことができる。【００５３】
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。【００５４】
たとえば、本発明において、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップは、前記ゲルに保持された前記ペプチドを前記アルカン酸無水物の双極性非プロトン性溶媒の溶液に浸漬するステップを含むことができる。こうすることにより、ペプチド中のアミノ基および水酸基のアシル化とＣ末端アミノ酸逐次分解とを確実に進行させることができる。よって、緩和な条件で選択的な逐次分解反応を安定的に進行させることができる。【００５５】
以上説明したように本発明によれば、実質的にアルカン酸無水物からなる反応試薬を用いることにより、穏和な条件でペプチドのＣ末端アミノ酸の逐次分解を行う技術が実現される。また、本発明によれば、ペプチドのＣ末端アミノ酸を確実に分析する汎用性の高い技術が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００５７】
【図１】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。
【図２】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。
【図３】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。
【図４】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。
【図５】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析における反応条件を示す図である。
【図６】本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。
【図７】ウマ・ミオグロビンを構成するグロビンペプチド鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】実施例に係るグロビンペプチド鎖の質量分析スペクトルを示す図である。
【図９】実施例に係るグロビンペプチド鎖の質量分析スペクトルを示す図である。
【図１０】実施例に係るグロビンペプチド鎖の質量分析スペクトルを示す図である。
【図１１】実施例に係るグロビンペプチド鎖の質量分析スペクトルを示す図である。
【図１２】実施例に係るトリプシンインヒビターの質量分析スペクトルを示す図である。
【図１３】実施例に係るトリプシンインヒビターの質量分析スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
図１は、本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸の分析手順を示す図である。【００５９】
図１において、まず、分析対象のペプチドに対し、ペプチドのＣ末端のアミノ酸を選択的に逐次分解する（Ｓ１０１）。分解により、もとのペプチドおよびＣ末端側の１個以上のアミノ酸が欠損したペプチドを含む一連の分解反応生成物が得られる。そして、この反応生成物に所定の後処理を施す（Ｓ１０２）。そして、質量分析により、反応生成物の分子量を測定する（Ｓ１０３）。そして、質量分析により得られた分子量に基づいて、もとのペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する（Ｓ１０４）。【００６０】
このように、図１の手順は、本実施形態の基本となるステップ１０１、ステップ１０３、およびステップ１０４と、ステップ１０１の後ステップ１０３の前に行われるステップ１０２とから構成されている。【００６１】
図２は、図１の分析手順において、ステップ１０１のＣ末端の逐次分解およびステップ１０２の後処理をより具体的に例示した図である。図２に示した手順では、ステップ１０１において、セリン残基またはトレオニン残基のβ−ＯＨ基の保護を行いつつ、逐次分解反応が行われる（Ｓ１１１）。逐次分解と同時にβ−ＯＨ基を保護することにより、後述するように、ペプチドの切断等の副反応を抑制することができる。なお、後述するように、通常の条件ではβ−ＯＨ基を保護する際に、ペプチドの末端および側鎖のアミノ基もまた保護される。【００６２】
また、図２の手順では、後処理として、反応生成物の水和およびβ−ＯＨ基の脱保護を行う（Ｓ１１２）。こうすることにより、１個以上のアミノ酸残基が除去された後のペプチドのＣ末端に、確実にカルボキシル基を形成させることができる。【００６３】
また、図３は、図１の分析手順を、タンパク質等の比較的分子量の大きいペプチドに適用する場合の手順を示す図である。以下、図３の手順の場合を例に、本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法について詳細に説明する。【００６４】
図３の手順は基本的には図２の手順と同様であるが、以下の点が異なる。まず、ステップ１１１に対応するステップ１１３においてβ−ＯＨ基の保護およびε−ＮＨ2基の保護を行うとともに、ペプチドをＣ末端から逐次分解する。そして、ステップ１０２の後処理に対応するステップ１１２において、水和反応を行うとともに、β−ＯＨ基の脱保護を行う。このとき、ε−ＮＨ2基は保護された状態として、続くトリプシンを用いてもとのペプチドおよびＣ末端が欠損したペプチドを所定の位置で断片化するステップを行う（Ｓ１１４）。断片化することにより、質量分析（Ｓ１０３）を好適に行うことができる。また、トリプシンを用いて断片化することにより、所定の位置において選択的にペプチドを切断し、断片化することができる。また、もとのペプチドとＣ末端が欠損したペプチドの切断位置を揃えることができる。【００６５】
以上の手順により、ペプチドの分子量が大きい場合にも、質量分析（Ｓ１０３）を高い精度および確度で行うことができる。また、Ｃ末端の逐次分解（Ｓ１０１）による分子量の減少量を高感度で検出することができる。【００６６】
図３に示した手順においては、以下に説明するように、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解（Ｓ１１３）を選択的に生じさせ、ペプチド鎖の途中でのペプチド結合切断という副反応を抑制することができる。【００６７】
分析対象のペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解除去するステップ１０１の反応では、水分を除去した環境でアルカン酸無水物をペプチド鎖Ｃ末端のカルボキシル基の活性化試薬として作用させる。このとき、ペプチドのＣ末端において、下記式（ＩＩＩ）で示される５−オキサゾロン構造が形成された後、この５−オキサゾロン環の開裂に伴いＣ末端アミノ酸の分解が生じる。ただし、下記式（ＩＩＩ）において、Ｒ１はペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、Ｒ２は当該Ｃ末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す。【００６８】
【化３】
0004289355.tif 000004
【００６９】
５−オキサゾロン環形成の反応は、下記式（Ｉ）で示される過程により進行すると推定される。【００７０】
【化４】
0004289355.tif 000005
【００７１】
上記式（Ｉ）では、下記式（Ｉａ）で示されるケト−エノール互換異性化の後、エノール型において表出されているヒドロキシ基とＣ末端カルボキシル基の間で、分子内エステル結合を形成し、５−オキサゾロン環が完成する。このとき、アルカン酸無水物を用いることにより、Ｃ末端カルボキシル基をたとえば、下記式（Ｉｂ）で例示されるような非対称型酸無水物へと変換し、活性化することができる。【００７２】
【化５】
0004289355.tif 000006
【００７３】
【化６】
0004289355.tif 000007
【００７４】
また、５−オキサゾロン環が形成された後、たとえば下記式（ＩＩ'）で示される反応等を経て、Ｃ末端のアミノ酸の離脱と反応中間体の形成が進行して、逐次的なＣ末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推定される。【００７５】
【化７】
0004289355.tif 000008
【００７６】
このように、本実施形態では、アルカン酸無水物という比較的穏和な試薬を用いてＣ末端カルボキシル基を活性化することができる。このため、従来用いられていたパーフルオロアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸無水物を含まない穏和な系中でＣ末端の逐次分解を進行させることができる。よって、Ｃ末端側以外でのペプチド結合が開裂する副反応の進行を抑制することができる。なお、逐次分解反応は、水分を含まない系で行うことができる。【００７７】
副反応として、たとえば、ペプチド中のセリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−）およびトレオニン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ）−ＣＯ−）では、側鎖のヒドロキシ基（−ＯＨ）に起因して、加熱環境で以下の反応が考えらえる。セリン残基のα位のアミノ基（−ＮＨ−）とβ位のヒドロキシ基の間で、Ｎ，Ｏ−アシル転位反応が生じると、引き続き、生成するエステル結合の分解が進行し、セリン残基のＮ末端側でペプチドの切断が生じるという副反応が生じる可能性がある。また、条件によっては、β位にヒドロキシ基が存在しているトレオニン残基においても、同様のＮ，Ｏ−アシル転位反応が契機となる反応機構によって、トレオニン残基のＮ末端側でペプチドの切断が生じるという副反応が生じる可能性がある。【００７８】
本実施形態の方法では、アルカン酸無水物を実質的に含む反応試薬を用いて脱水条件でステップ１１３の逐次分解を行うことにより、このような副反応の発生が抑制される。【００７９】
さらに、ステップ１１３では、逐次的なＣ末端アミノ酸の分解反応と同時に、β−ＯＨ基およびε−ＮＨ2の保護がなされる。β−ＯＨ基およびε−ＮＨ2の保護をＣ末端アミノ酸の逐次分解と同時に進めることにより、こうした副反応を確実に回避することができる。また、逐次分解とは別に保護を行う前処理の手順が不要となり、簡便な方法でＣ末端アミノ酸を安定的に分解することが可能となる。【００８０】
なお、リジン残基のε位のアミノ基が保護される条件では、通常、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基に対しても、アミノ基の保護が達成される。このような条件を選択することにより、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解反応において、そのＣ末端カルボキシル基の活性化がなされた際に、隣接するペプチド鎖のＮ末端のアミノ基と反応を起こす事態を予め防止することができる。【００８１】
ステップ１１４では、トリプシンを用いた断片化を行うことにより、所定の位置で選択的に反応生成物の断片化を行うことができる。よって、もとのペプチドの分子量が比較的大きい場合であっても、これを適当な大きさに断片化し、質量分析（Ｓ１０３）を行うことができる。よって、質量分析において、Ｃ末端アミノ酸残基の欠損を、より高感度で検出することができる。したがって、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列をより一層確実に分析することができる。【００８２】
また、トリプシンを用いたペプチドの断片化は、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側で選択的に生じるため、もとのペプチドとＣ末端アミノ酸が欠損したペプチドの切断位置を一致させることができる。このため、もとのペプチドに由来するＣ末端側の断片ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸が欠損したペプチドに由来するＣ末端側の断片ペプチドのＣ末端側にさらに所定の数のアミノ酸残基が付加された配列となる。よって、これらの分子量を比較し、逐次分解による分子量の減少量を算出することにより、除去されたアミノ酸残基の種類を特定することが可能となる。【００８３】
ここで、塩基性アミノ酸残基のうち、リジン残基はジメチル化、アセチル化等の天然の修飾を受けうる。修飾されたリジン残基はトリプシン消化を受けないことから、修飾の有無によりトリプシン消化により生じるペプチド断片が異なる。そこで、図３に示した分析方法においては、ステップ１１３においてリジン残基のε−アミノ基の保護を行うとともに、この保護基がステップ１１２で脱保護されないようにしている。こうすることにより、リジン残基のトリプシン感受性を消失させておくことができる。このため、アルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合での選択的な断片化が可能となる。【００８４】
よって、Ｃ末端側のアミノ酸が欠損した逐次分解生成物を、質量分析により一層好適な分子量範囲内の分子量を有するペプチド断片に分割することができる。したがって、Ｃ末端側ペプチド断片の分子量を調節する処理として、トリプシン処理を積極的に活用することができる。【００８５】
ステップ１１４のトリプシン処理後、試料を脱塩処理してペプチド断片を回収し、乾燥した後、質量分析装置を利用して、ペプチド断片の混合物に由来するイオン種の分子量を測定する。ここで、脱塩処理を行うことにより、回収、乾燥されるペプチド断片は、各種の塩を形成するものではなく、本来のペプチド部分単体とされている。そして、Ｃ末端の選択的な逐次分解によって得られる一連の反応生成物と、分解前のペプチドとをトリプシン消化して得られるペプチド断片のうち、それぞれのＣ末端側ペプチド断片の分子量同士を比較して、これらの差異に基づき、除去されたアミノ酸をＣ末端側から特定する。【００８６】
質量分析（Ｓ１０３）に用いる質量分析装置として、たとえば、イオントラップ質量分析計、四重極型質量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などを用いることができる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）法などが挙げられる。【００８７】
このうち、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが好適に用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、イオン化過程において、ペプチド断片を構成するアミノ酸残基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。また、測定対象のタンパク質を試料中からゲル電気泳動を用いて分離し、ゲル中で上述の処理を施した後、回収して測定に供する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンの両方を測定可能である。これらのことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うことができる。【００８８】
以下、質量分析にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合を例に、説明する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのイオン化過程では、ペプチド断片にプロトン（Ｈ+）が付加された陽イオン種と、ペプチド断片からプロトンが離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定することが可能となる。本実施形態では、測定モードを選択し、陽イオン種と陰イオン種とをそれぞれ個別に測定する。【００８９】
ここで、質量分析（Ｓ１０３）は、トリプシン処理（Ｓ１１４）の後に行われるので、Ｃ末端側ペプチド断片を構成するアミノ酸残基中にはアルギニン残基が含まれていない。一方、トリプシン処理（Ｓ１１４）で得られる他のペプチド断片にはプロトン受容能に富むグアニジノ基を持つアルギニン残基が含まれているため、これらに由来する陽イオン種の安定化が図られる。【００９０】
このため、質量分析において、陽イオン種を測定した結果と、陰イオン種を測定した結果とを比較すると、Ｃ末端側ペプチド断片と他のペプチド断片とは、その相対強度が異なる挙動を示す。この現象を利用すれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置によって測定される複数種のピーク中より、一連のＣ末端側ペプチド断片に起因するピークを識別し、特定することが可能となる。【００９１】
陽イオン種の質量分析スペクトル中では、Ｃ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。一方、アルギニン残基の存在してないＣ末端側ペプチド断片は、プロトン供与能を示すカルボキシル基をそのＣ末端に有する。このため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置で測定される陰イオン種の質量分析スペクトル中において、Ｃ末端側ペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。【００９２】
このように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおける陽イオン種の質量分析スペクトルおよび陰イオン種の質量分析スペクトルを対比した際の相対的強度の相違を利用して、その断片Ｃ末端にアルギニン残基を有し、Ｎ末端側アミノ酸配列が共通したペプチド断片群に起因するピークを区別することができる。また、陰イオン種の質量分析スペクトル中において、もとのペプチド鎖と、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解反応で生成する一連のＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークを容易に特定することができる。【００９３】
なお、ステップ１０３の質量分析に供するペプチド断片の長さは、たとえば２０〜３０アミノ酸残基以下とすることができる。こうすることにより、質量分析の際に、ペプチド断片のイオン化を確実に行うことができる。【００９４】
ステップ１０４のアミノ酸配列の分析においては、陰イオン種による分子量測定において相対的に大きな強度を与える一連のピークに基づき、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定し、対応する分子量変化を与えるアミノ酸種類の帰属を行う。【００９５】
なお、アルギニン残基を有しないＣ末端側ペプチド断片は、少なくとも、トリプシン消化処理によってそのＮ末端アミノ酸残基のα位のアミノ基を有している。そして、陽イオン種の質量分析スペクトル上でも、対応するピークを示す。このため、陽イオン種の質量分析スペクトルで観察される対応するピークの分子量を利用して、アミノ酸種類の帰属結果を検証することもできる。【００９６】
また、図３に示した手順では、ステップ１１４にてトリプシン処理を行うが、本実施形態において、もとのペプチドおよびそのＣ末端側のアミノ酸残基が欠損したペプチドを所定の位置で選択的に切断することができる方法を用いればよい。トリプシン処理以外の方法として、具体的には、たとえば、グルタミン酸残基のＣ末端側を切断するＶ８プロテアーゼ等、切断位置の特異性を有する他のプロテアーゼを用いた酵素消化を用いることができる。また、メチオニン残基のＣ末端側アミド結合における開裂に特異性を有するＣＮＢｒ等の化学的な試薬を用いた切断手法を用いることもできる。【００９７】
さらに、アミノ酸残基側鎖の保護および脱保護の方法についても、切断部位のアミノ酸残基の性質に依存して、適宜選択することができる。このとき、図１中のステップ１０１の前に適宜前処理のステップを設けてアミノ酸残基の保護を行ってもよい。【００９８】
以下、分析対象のペプチドが電気泳動等のゲル中に保持されている場合と、分析対象のペプチドが乾燥試料である場合とに分けて、本発明に係る分析方法についてさらに詳細に説明する。【００９９】
（第一の実施形態）
本実施形態では、ゲル中に保持されたペプチドをゲル中で処理し、質量分析を行う手順について説明する。図３において、ステップ１１３、ステップ１１２、およびステップ１１４の各ステップが、ゲルに保持された状態で行われる。【０１００】
このとき、予めゲル電気泳動法による分離がなされてもよい。電気泳動の後、ゲル中に保持されたペプチドをゲルから単離せず、ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応をゲルに保持された状態で行う。【０１０１】
図４は、本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法の手順を示す図である。図４において、「アセチル化・トランケーション」は、図３のステップ１１３に対応する。また、図４の「水和反応」は、図３のステップ１１２に対応する。また、図４の「ゲル中での断片化」は、図３のステップ１１４に対応する。そして、図４の「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」は、図３のステップ１０３に対応する。以下、図３および図４を参照して各手順を詳細に説明する。【０１０２】
まず、予めゲル電気泳動法による分離がなされ、ゲル中に保持された状態のペプチド試料に対して、保護基の導入を伴うＣ末端の逐次分解を行う（Ｓ１１３）。このとき、ゲルを予め細片化しておく。たとえば、ゲル片の大きさを、０．５〜数ｍｍ角程度とすることができる。【０１０３】
また、ゲル中の水分を予め除去する。こうすることにより、ステップ１１３の反応を安定的に行うことができる。ゲル電気泳動法によって分離されたペプチドは、ゲル中に形成される細孔の内部に保持されている。このため、ゲル中に含浸された水を除去する際に、ゲル状物質の溶解を引き起こさず、かつ、水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、水溶媒のみを極性非プロトン性溶媒中に希釈、溶出する手法を利用することができる。この方法を用いると、脱水処理操作を終えた後も、分析対象のペプチドを、分離されたスポットまたはバンドとしてゲル中に保持された状態に維持できる。【０１０４】
ポリアクリルアミドゲル等の場合、脱水処理に利用する極性非プロトン性溶媒とゲルとの親和性は、水系溶媒とゲルとの親和性より一般に劣っている。このため、図４に示したように、ゲルに対して溶媒和し、ゲルの微細な穴構造の間隙サイズを維持していた水溶媒の除去とともに、嵩体積の減少が進む。【０１０５】
以下、ゲルの材料がポリアクリルアミドである場合を例に説明する。ゲル片の材料がポリアクリルアミドである場合、脱水に利用する極性非プロトン性溶媒として、水に対する親和性に富むアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）などの炭素数４以下のニトリル類、アセトンなどの炭素数４以下のケトン類などを用いることができる。また、これらの極性非プロトン性溶媒は、水よりも蒸散し易い。極性非プロトン性溶媒が蒸散し、ゲルが乾固すると、その嵩体積が減少し、収縮する。【０１０６】
アセトニトリルを用いて脱水を行う場合、たとえば、ゲル片をアセトニトリル中に浸漬する操作を数回繰り返して行う。たとえば、ゲル片を室温にて２０分間浸漬する操作を３回行う。このとき、ゲル片がＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）等の色素により染色されていれば、溶媒置換に伴い色素が除去され、脱色する。このため、色の変化により溶媒置換の完了をおおむね把握することができる。【０１０７】
ステップ１１３では、ペプチドに保護基を導入するとともに、Ｃ末端のアミノ酸を逐次的に分解する。ペプチドへの保護基の導入と同時にＣ末端アミノ酸の逐次的な分解を同時に行う反応試薬として、アルカン酸無水物を用いる。具体的には、双極性非プロトン性溶媒中に、アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いる。この溶液にゲル片を浸漬することにより、ゲル中に保持されたペプチドにアルカン酸無水物を作用させ、ペプチドのＣ末端において、上記式（ＩＩＩ）で示される反応を生じさせることができる。この反応では、５−オキサゾロン構造を経て、５−オキサゾロン環の開裂に伴いＣ末端アミノ酸が逐次的に分解される。その際、アルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化を行い、たとえば、上記式（Ｉｂ）に示される非対称型酸無水物を形成する。【０１０８】
アルカン酸無水物の双極性非プロトン性溶媒の溶液を用いることにより、パーフルオロアルカン酸などの反応性の高い酸を用いることなく、穏和な条件で逐次反応を進行させることができる。そして、もとのペプチドおよびもとのペプチドからＣ末端のアミノ酸が１〜ｎ個（ｎは自然数）欠損したＣ末端欠損ペプチドの混合物が得られる。【０１０９】
また、一旦形成された５−オキサゾロン環から、たとえば、上記式（ＩＩ'）で示される反応などを経て、Ｃ末端のアミノ酸の離脱と、反応中間体の形成が進行する。そして、逐次的なＣ末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推定される。このため、反応を終えた後得られる反応産物は、Ｃ末端にカルボキシル基が形成されているもの以外に、中間産物である５−オキサゾロン環構造に留まるものや、反応中間体の一形態として、Ｃ末端が非対称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。【０１１０】
ステップ１０２の逐次的なＣ末端アミノ酸の分解反応は、少なくとも、上記式（Ｉｂ）で例示される５−オキサゾロン環構造の形成過程と、上記式（ＩＩ'）で例示される５−オキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の分離過程との二段階の素反応から構成される。そのため、全体の反応速度は、これら各過程の反応速度の双方に依存するものの、アルカン酸無水物の濃度および反応温度に依存する。また、一連の反応産物は逐次的な反応で形成されるため、短縮されるＣ末端アミノ酸配列の最大長は処理時間が長くなるとともに延長される。【０１１１】
従って、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解における処理時間は、主に、アルカン酸無水物の種類および濃度ならびに反応温度に応じて、また、解析すべきＣ末端アミノ酸配列の目標とするアミノ酸長をも考慮して、適宜選択することができる。【０１１２】
ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化に利用されるアルカン酸無水物として、炭素数２〜６程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、反応温度まで昇温した際に、適正な反応性が確保される。また、好ましくは、炭素数２〜４程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、立体障害を低減することができる。また、対称型酸無水物として、炭素数２〜６程度の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。また、好ましくは、炭素数２〜４程度の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、立体障害を低減することができる。さらに具体的には、炭素数２の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、すなわち無水酢酸を用いることができる。【０１１３】
また、アルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化を図り、５−オキサゾロン環形成に適する配置をとる上で、その配向における立体障害を生じることの少ない化合物とするとよい。その点でも、無水酢酸は好ましく用いられる。【０１１４】
なお、アルカン酸無水物は反応に従って消費されるため、予めゲルの膨潤に利用する双極性非プロトン性溶媒中に、ペプチドとの反応に消費される量に対して大過剰量を溶解しておき、その濃度低下を抑制することが望ましい。たとえば、図５に示した条件で逐次分解反応を行うことができる。反応溶液中のアルカン酸無水物の含有濃度を１体積％以上３０体積％以下、好ましくは１０体積％以上２０体積％以下とすることができる。また、反応温度は、たとえば５０℃以上、好ましくは６０℃以上とすることができる。こうすることにより、逐次分解を効率よく行うことができる。また、反応温度をたとえば１００℃以下、好ましくは８０℃以下とすることができる。こうすることにより、逐次分解を安定的に行うことができる。【０１１５】
また、反応時間は、反応温度や双極性非プロトン性溶媒中に含有されるアルカン酸無水物の濃度に依存する。反応温度が高いほど反応速度は増し、より短い処理時間で、目標とする最長のアミノ酸配列短縮量を達成した一連の反応産物の調製が可能となる。また、極性非プロトン性溶媒を利用する脱水処理に伴って収縮したゲルの膨潤に要する時間をも考慮して、適宜選択することができる。たとえば、ポリアクリルアミドゲル（１２．５質量％）に対してアセトニトリルを用いた脱水処理を施した後、後述するホルムアミドなどの双極性非プロトン性溶媒中に浸漬して、ゲルの再膨潤を達成するに要する時間は、４０℃において３時間程度である。このため、全体の反応時間を、ゲルの再膨潤を終えた後、所望のアミノ酸残基数だけＣ末端アミノ酸の選択的な分解を達成するに要する時間を加えたものとすることができる。【０１１６】
たとえば、無水酢酸を用いる場合、図５に示したように、４〜１１０時間程度の反応時間とすることができる。このとき、たとえば、反応条件を５０℃にて１１０時間、６０℃にて５０〜６０時間、８０℃にて２４時間、１００℃にて４時間等とすることができる。反応温度が低いほど、緩和な条件とすることができ、副反応をより一層抑制することができる。【０１１７】
一方、アルカン酸無水物を溶解させる双極性非プロトン性溶媒は、ゲルの脱水後、５０〜９０℃程度の温度においてゲル内に浸潤でき、膨潤状態に維持可能である溶媒とする。また、比較的分子サイズが小さく、ゲル片の材料に対する親和性に優れた有機溶媒が用いられる。上記式（Ｉ）に示した反応中のケト−エノール互換異性化の過程において、そのエノール体の比率を維持可能な高い双極性を示すとともに、溶質分子のアルカン酸無水物および反応副生成物であるアルカン酸に対して、優れた溶媒であってもよい。また、上述の反応温度において、揮発、蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒が好ましい。【０１１８】
具体的には、ホルムアミド（ＨＣＯＮＨ2）などは、ポリアクリルアミドゲルを用いる際、以上に述べた要件すべてを充分に満足するものである。【０１１９】
なお、ステップ１１３において、アルカン酸無水物および反応副生成物であるアルカン酸に対して優れた溶解性をもたらす双極性非プロトン性溶媒は、水をも容易に溶解することが可能である。上記式（Ｉｂ）に示される反応中間体や、上記式（ＩＩ'）に示される非対称型酸無水物に変換されて、活性化されたＣ末端カルボキシル基は、反応系内に水分子が混入すると、加水分解を受け、もとの末端にカルボキシル基を有する構造に戻ってしまう。この不活性化過程を回避するため、双極性非プロトン性溶媒の溶液中での反応処理に際して、反応系を、水分を除去した乾燥雰囲気下に保つことが好ましい。【０１２０】
また、たとえば、対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、メチオニンに存在するイオウが、系内に混入する酸素により酸化を受け、その式量が変化することもある。この酸素による酸化を防止することにより、質量分析（Ｓ１０４）による分子量測定の確度を向上させることができる。【０１２１】
水分に加えて酸素も除去された乾燥雰囲気下に反応系を保つ方法として、たとえば、反応を行う系を気密状態とし、系外からの水分および酸素の浸入を防止するとともに、反応に用いる液体の注入および排出操作も、乾燥処理した窒素、アルゴン等の不活性気体雰囲気下で行う方法が挙げられる。また、酸化防止効果を有するＤＴＴなどの還元性のスルファニル基（−ＳＨ）を含む化合物を利用して、酸化を回避することもできる。【０１２２】
また、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解とともに行われるβ−ＯＨ基およびε−ＮＨ2基の保護は、たとえばそれぞれＮ−アシル化およびＯ−アシル化とすることができる。これらのアシル化は、たとえばアルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物中でゲル片を攪拌することにより行うことができる。このとき、アルカン酸無水物が求電子的なアシル化剤となる。また、アルカン酸は、そのプロトン供与能によってアシル化反応の促進を図る触媒となる。アルカン酸の有するプロトン供与能により、アルカン酸無水物とアミノ基およびヒドロキシ基との反応が促進されて、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化がともに達成される。なお、図４では、アシル化がアセチル化である場合が例示されている。【０１２３】
ここで、アルカン酸無水物は、双極性非プロトン性溶媒中で分極する。このため、ペプチドのアミノ基およびヒドロキシ基に対して、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化反応が進行する。また、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化反応に付随して、アルカン酸無水物由来のアルカン酸が副生すると、そのアルカン酸の示す触媒作用によって、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化反応の促進がなされる。【０１２４】
このように、本実施形態では、ゲル片中で副生するアルカン酸の拡散および散逸が速やかには進まない点を利用し、ゲル片内に留まっている副生したアルカン酸を、反応の促進を図る触媒として利用することができる。よって、後述する第三の実施形態の場合と異なり、反応試薬として、アルカン酸無水物のみを使用すればよい。このため、Ｃ末端の逐次分解反応とアシル化を同時に行うことができる。【０１２５】
リジン残基側鎖のアミノ基に対するＮ−アシル化保護は、ステップ１１４のトリプシン消化処理を行った際に、リジン残基のＣ末端側ペプチド結合での切断を防止する目的を有する。このため、後述する加水処理（Ｓ１１２）において、リジン残基側鎖上のＮ−アシル基が脱保護されないアシル基を選択するとよい。また、同時になされるＯ−アシル化保護については、ステップ１１２において脱保護が充分に進行するアシル基を選択するとよい。【０１２６】
次に、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解反応およびアセチル化反応の停止は、反応系の温度を低下させるとともに、ゲル中に浸潤している反応試薬であるアルカン酸無水物を希釈、除去することにより行う。このとき、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解反応に利用した混合溶液を、ゲルの材料の溶解を引き起こさず、アルカン酸無水物および双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いることができる。【０１２７】
反応試薬の希釈、除去に、混合溶液の調製に利用する双極性非プロトン性溶媒を利用することも可能である。また、エノール型中間体の安定化に寄与の少ない極性非プロトン性溶媒を用いてもよい。こうすることにより、反応式（Ｉｂ）で例示される５−オキサゾロン環構造の形成過程を確実に停止することができる。たとえば、反応試薬の希釈、除去の最終段階で、極性非プロトン性溶媒を利用する希釈、除去の操作を設けることができる。たとえばポリアクリルアミドゲルを用いる場合、極性非プロトン性溶媒として、アセトニトリルなどの炭素数４以下のニトリル類、アセトンなどの炭素数４以下のケトン類などを挙げることができる。【０１２８】
次に、後処理として、ステップ１１２にて、Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応の生成物に対する水和処理を行う。このステップも、一連の反応生成物を含むペプチド混合物がゲル中に保持された状態で実施する。Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生成物を含む混合物をゲル中に保持させた状態のまま、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水溶液にゲル片を浸漬する。こうすることにより、塩基性の窒素含有有機化合物の共存下でもとのペプチドおよびＣ末端が欠損したペプチドに水分子を作用させて、これらの加水処理がなされる。【０１２９】
この加水処理において、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物は、上記式（ＩＩ'）に示される５−オキサゾロン環構造および反応中間体（酸無水物）の加水分解反応を触媒する。また、自身が５−オキサゾロン環構造または反応中間体（酸無水物体）と反応して副生物を生じることの抑制が図られる。このため、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物は好適な塩基触媒として機能する。加水分解反応により、下記式（ＩＶ）に示すように、ペプチドのＣ末端にカルボキシル基が形成される。【０１３０】
【化８】
0004289355.tif 000009
【０１３１】
また、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物は、たとえば、残留しているＣ末端が非対称型酸無水物に至ったものと反応してアミド結合を形成することがなく、また、水溶液とした際均一な溶液とできるので好ましく用いられる。【０１３２】
塩基性含窒素芳香環化合物として、極性非プロトン性溶媒に高い溶解性を示す、単環式の含窒素芳香環化合物を利用することができる。具体的には、ピリジンまたはピリジン塩基等が好適に用いられる。また、第三アミン化合物としては、ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程度の塩基性を有するものが用いられる。第三アミン化合物として、具体的には、たとえば、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノエタノール：（ＣＨ3）2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）などが好適に利用される。【０１３３】
たとえばピリジンを用いる場合、水溶液全体の体積に対して、ピリジンを５体積％以上１５体積％以下、より具体的には１０体積％に選択することができる。また、ＤＭＡＥを利用する場合、水溶液全体の体積に対して、ＤＭＡＥを１体積％以上２０体積％以下、より具体的には１０体積％に選択することができる。【０１３４】
単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、水溶液として、反応産物を保持しているゲルに作用させる。この後処理においては、親水性に富むゲル中に有機塩基を含有する水溶液が速やかに浸潤する。なお、速やかに加水反応を完了するためには、反応温度を５０℃以上に選択することができる。また、密閉された反応容器内で反応を行う場合、反応容器内の機械的強度を考慮すると、１００℃以下の範囲に選択することができる。【０１３５】
図５に示したように、たとえば、１０ｖ／ｖ％以上２０ｖ／ｖ％以下のＤＭＡＥ水溶液を用い、５０℃以上７０℃以下の温度で３０分以上１２０分以下水和反応を行うことができる。【０１３６】
この有機塩基を含有する水溶液を用いた加水処理は、反応産物のペプチド鎖のＣ末端にカルボキシル基を形成させることを主な目的としているが、ステップ１１３でなされたＯ−アシル化保護の脱保護がカルボキシル基の形成と同時に進行する条件が選択される。また、通常の反応条件では、ペプチドのＮ末端のアミノ基およびリジン残基側鎖のアミノ基に対するＮ−アシル基の脱保護が進行しない条件となっている。【０１３７】
なお、ゲル中に含浸される水溶液を、ゲルの溶解を引き起こさず、かつ、水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて希釈除去することにより、ゲルの再脱水処理を施すとともに、加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を水とともに希釈除去してもよい。こうすれば、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物が残存することが抑制される。このため、ペプチドのＣ末端に形成されたカルボキシル基に対して窒素塩基の付加塩が形成された物質の混在を抑制することができる。【０１３８】
再脱水処理においては、極性非プロトン性溶媒として、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物に対しても高い溶解性を有するものを用いることができる。たとえば、ポリアクリルアミドゲルを用いる際、再脱水処理用の極性非プロトン性溶媒として、アセトニトリルなどの炭素数４以下のニトリル類や、アセトンなどの炭素数４以下のケトン類などを挙げることができる。【０１３９】
また、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応の後、一旦、極性非プロトン性溶媒を利用する希釈、除去の操作を終えた後に加水処理を実施する方法に代えて、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応と加水処理とを連続して実施する方法としてもよい。【０１４０】
この場合、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応の反応温度を下げてその反応停止を図りつつ、有機塩基を含有する水溶液を加える。こうすると、アルカン酸無水物の不活化およびそのゲル中からの溶出が生じる。このため、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応の停止と、反応試薬の不活化、除去がなされる。引き続き、反応産物に対する加水処理を行い、最終的に、極性非プロトン性溶媒を利用する再脱水処理工程を施す。こうすれば、有機塩基を含有する水溶液とともに、アルカン酸無水物に対応するアルカン酸および双極性非プロトン性溶媒の除去と再脱水がなされる。このため、極性非プロトン性溶媒を利用する洗浄、除去操作を中間に設ける場合と、実質的に差異を持たない処理を簡便に行うことができる。【０１４１】
次に、ステップ１１４にて、もとのペプチドおよびそのＣ末端のアミノ酸残基が欠損したペプチドのトリプシン処理を行う。このステップでアミノ酸長が長いペプチド鎖を所定の位置で選択的に断片化することができる。そして、ステップ１０３において、断片化後回収されたトリプシン消化処理済みペプチド断片を含む乾燥混合物について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を利用し、イオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定および陰イオン種による分子量測定を行う。【０１４２】
ステップ１１４では、加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、再脱水処理後、ゲル中に保持された状態で、トリプシン消化処理の工程を行う。具体的には、トリプシンを溶解させた緩衝溶液中にゲル片を浸漬し、ゲル中のペプチド鎖にトリプシン酵素に特異的な消化処理を施す。このとき、ペプチドのＮ末端のアミノ基およびペプチド中のリジン残基側鎖のアミノ基に対しては、上述したＮ−アシル化が保持されている。このため、ペプチド中に存在するアルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合にてペプチドが選択的に断片化される。【０１４３】
また、二次元電気泳動法や一次元電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法などのゲル電気泳動法による分子量分離に利用されるゲルは、一定範囲以上のアミノ酸長を有するペプチドを保持する機能を有し、電気泳動速度に明確な差異を与える一方、ペプチドのアミノ酸長が閾値分子量より小さくなると、これを保持する機能が急速に失われる。【０１４４】
そこで、アミノ酸長の長いペプチ鎖を保持した状態を維持しながらＣ末端アミノ酸を逐次的に分解除去し、一連の反応産物を調製した後、トリプシン消化によってペプチドの断片化を行うことで、目的とする一群のＣ末端側のペプチド断片を、容易にゲル中から溶出させ、回収することができる。【０１４５】
ペプチドをアルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合で選択的に切断すると、アミノ酸長の長いペプチド鎖から、複数個のペプチド断片が生成する。その際、目的とする一群のＣ末端側ペプチド断片は、通常、もとのペプチド鎖の、数分の１のアミノ酸長となるため、ゲルから遊離し、トリプシン溶液中に溶出する。その後、脱塩処理を施し、緩衝溶液成分を除去して、トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、乾燥する。【０１４６】
ステップ１０３の質量分析では、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な除去により調製される一連の反応産物の分子量と、もとのペプチドの分子量との差異を、質量分析法による測定結果を利用して決定し、その分子量差に相当するアミノ酸を特定する。従って、通常、質量分析法による測定に供する混合物中に、もとのペプチドに由来する断片も、その分子量の特定が可能な程度残存する状態とすることができる。このため、ステップ１１３のペプチドの逐次分解の条件を、ステップ１０４におけるアミノ酸配列の分析に充分な程度のペプチドが残存する条件とすることができる。【０１４７】
また、ステップ１０４において、Ｃ末端が欠損したペプチドとともに、もとのペプチドを断片化することができる。こうすれば、もとのペプチドのＣ末端側の断片と、Ｃ末端から所定の数のアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドのＣ末端側の断片とをともにステップ１０３において質量分析に供することができる。【０１４８】
質量分析を行うことにより、たとえば、Ｃ末端アミノ酸配列として、最大１０数アミノ酸長程度までの解析を行うことができる。その際、対応する最大１０数種におよぶ一連の反応産物の含有比率として、最小の含有比率を有するものが最大含有比率のものの少なくともたとえば１／１０程度を下回らない状態とすることができる。また、もとのペプチドの残存量も、最大含有比率の反応産物に対して、少なくとも、１／１０程度を下回らない状態とすることができる。一方、必要とするＣ末端アミノ酸配列の情報は、通常、１０アミノ酸以内となることが多い。そこで、たとえば、１０アミノ酸程度の分解が進む程度に処理時間を選択すると、上述の含有比率に関する条件を好適に満たすことができる。【０１４９】
また、質量分析による分子量の測定に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用することができる。こうすれば、高分子量のペプチド鎖に関しても、その分子量を精度よく測定することができる。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を用いる際に、ペプチドのアミノ酸長の最大は、３０〜５０アミノ酸を超えない範囲とすることができる。こうすれば、ペプチド断片を確実にイオン化し、高い精度で測定を行うことができる。【０１５０】
また、Ｃ末端アミノ酸の除去がなされていないペプチドの分子量は、４０００を超えない範囲、好ましくは、３０００を超えない範囲とすることができる。こうすることにより、分子量差に基づいて対応するアミノ酸の特定を行う際に、たとえば、ＡｓｎとＡｓｐ、ＧｌｎとＧｌｕのように、式量の差異が１のアミノ酸残基相互の区別を高い精度で行うことができる。また、これをアミノ酸長に換算すると、４０アミノ酸を超えない範囲、好ましくは、３０アミノ酸を超えない範囲とすることができる。【０１５１】
本実施形態では、ステップ１１４において、トリプシン処理を行うため、目的とするＣ末端側ペプチド断片のアミノ酸長は、上述するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用する際、適当とされるアミノ酸数の範囲内とすることが可能である。このため、タンパク質などの長いアミノ酸長のペプチドについても、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な除去により調製される一連の反応産物の分子量と、もとのペプチドの分子量との差異を確実に測定することができる。また、トリプシン処理の際に、アルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合が選択的に切断されるため、得られるペプチド断片の総数が必要以上に多くなることを回避できる。【０１５２】
ステップ１０４のアミノ酸配列の分析においては、ステップ１０３における陽イオン種によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定および陰イオン種によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定の結果を用いる。このとき、陽イオン種による分子量測定において、トリプシン消化処理で生成したＣ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片のピークは、アルギニン残基に起因して、陰イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定することができる。また、もとのペプチドのＣ末端側のペプチド断片およびＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連のＣ末端欠損ペプチドのＣ末端側のペプチド断片にはアルギニン残基が存在しない。このため、これらのペプチド断片のイオン種のピークは、陰イオン種による分子量測定における強度は、陽イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定することができる。【０１５３】
このように、一連のＣ末端側のペプチド断片に対応する陰イオン種は、陰イオン種による分子量測定において相対的に大きな強度を与えるため、陰イオン種により測定された分子量に基づいて、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を簡便な方法で容易に把握することができる。このため、もとのペプチドからＣ末端１残基欠損ペプチド、Ｃ末端２残基欠損ペプチド、以下、順次Ｃ末端ｎ残基欠損ペプチド（ｎは自然数）までの各Ｃ末端欠損ペプチドについて、アミノ酸残基１個の欠損により生じる分子量の減少量を算出し、この減少量をアミノ酸残基の分子量と比較すれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。【０１５４】
なお、本実施形態において、グルタミン残基とリジン残基は同一の式量を有するものの、リジン残基の側鎖にＮ−アシル化を施すため、両者の識別が可能となっている。【０１５５】
また、Ｃ末端アミノ酸を除去する反応では、上記式（Ｉｂ）に示したように、アミド結合のエノール型への変換と、それに続く、５−オキサゾロン環構造の形成が必須であり、アミド結合を構成するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）とイミノ基（−ＮＨ−）が存在しない環状アミノ酸であるプロリン残基がＣ末端アミノ酸となった時点で分解反応が停止する。このため、処理時間を延長した際に、それ以上のＣ末端アミノ酸の除去が起きないことを確認することで、その要因となるアミノ酸残基がプロリンと推定することが可能である。【０１５６】
また、仮に、ペプチド中のセリン残基やトレオニン残基に存在するヒドロキシ基、Ｎ末端のアミノ基、リジン残基のε位のアミノ基に対して、ステップ１１３においてＯ−アシル化、Ｎ−アシル化保護がされなくとも、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解においてペプチドにアルカン酸無水物を作用させるため、逐次分解反応中に、これらＯ−アシル化、Ｎ−アシル化反応も併行的に進行する。そのため、セリン残基やトレオニン残基に存在するヒドロキシ基に起因する、Ｎ，Ｏ−アシル転位反応等の副反応に対する競争的な阻害効果が達成される。Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応工程と同時に、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化保護を行う条件を選択することにより、ペプチドの分断をより確実に防止することができる。このため、本実施形態の方法は、ペプチド断片の分子量をより一層確実に把握することができる方法となっている。【０１５７】
また、最終的に得られる反応産物において、セリン残基やトレオニン残基にアセチル化がなされたものが多数混入していると、多アセチル化体と、脱アセチルがなされたものとの分子量差は、式量４２の整数倍、具体的には、８４、１２６、１６８は、セリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−））の式量８７、グルタミン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＮＨ2）−ＣＯ−）の式量１２８、グルタミン酸残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ）−ＣＯ−）の式量１２９、Ｎ−アセチルリジン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−ＣＯＣＨ3）−ＣＯ−）の式量１７０と類似しており、場合によっては、多アセチル化体を主なピークと誤認し、脱アセチルがなされたものを、アミノ酸の除去がなされたものとする懸念がある。【０１５８】
本実施形態では、後処理のステップにおける加水処理において、セリン残基やトレオニン残基におけるＯ−アシル化保護に対する脱保護が充分に進行する条件が選択されている。このため、各ピークの同定を確実に行うことができる。また、残留しているアセチル基数の差と、類似する式量を示すアミノ酸残基の間では、式量差が２〜３である。本実施形態では、ペプチド断片化を行った後、分子量の測定を行うことで、測定される分子量を、式量差が１であるグルタミン残基とグルタミン酸残基との識別が可能な分析精度の測定がなされる範囲としているため、ピークの誤認を抑制することができる。【０１５９】
また、本実施形態の方法では、多種のタンパク質を含む試料中から、たとえば、二次元電気泳動法や一次元電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法などの、ゲル電気泳動法によって分析対象のタンパク質を分離する。このため、分離されたタンパク質に関しては、そのおおよその分子量は推定できる。よって、分離されたスポット（または、バンド）部分のゲルを切り出し、ゲルに保持した状態で、推定された分子量に応じてトリプシン処理等の断片化処理を含めた一連の化学的処理を行い、質量分析に適した断片を簡便な方法で得ることができる。【０１６０】
また、本実施形態では、ゲル上に保持された状態の対象とするペプチド試料にアルカン酸無水物を作用させることで、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化を達成している。この双極性非プロトン性溶媒中での液相反応は、プロトン供与能を有するアルカン酸の酸触媒作用を利用しなくとも、充分に進行する。よって、あらかじめ分離されたスポット（または、バンド）から分析対象のタンパク質を単離回収する操作を省き、簡便に分析を行うことができる。また、単離回収工程における回収収率に影響されることなく、同等の確度で、Ｃ末端アミノ酸配列の決定を実施することが可能である。【０１６１】
なお、本実施形態において、ゲル電気泳動法として、一次元方向に電気泳動をなす従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法はもちろんのこと、二次元泳動法を適用したものでもよい。二次元泳動法を適用して分離されるペプチド試料は、夾雑物の混入がさらに抑制されているため、より一層少ないサンプル量であっても、本実施形態に係る方法によってそのＣ末端アミノ酸配列を確実に決定することができる。【０１６２】
また、予めゲル電気泳動法による分離を行う場合、対象とするペプチド中に、分子内におけるシステイン残基相互間で−Ｓ−Ｓ−結合を形成するものは、２−スルファニルエタノール（ＨＳ−Ｃ2Ｈ2−ＯＨ：２−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール：トレオ−１，４−ジスルファニル−２，３−ブタンジオール）などの還元性試薬を添加して、還元状態で電気泳動を行い、単一のスポットを得てもよい。また、分子内におけるシステイン残基相互間での−Ｓ−Ｓ−結合を予め還元し、さらに、還元型のシステインに対してヨード酢酸などを用いたカルボキシメチル化などの処理を行い、単一のスポット化を行ってもよい。このように、分子内におけるシステイン残基相互間での−Ｓ−Ｓ−結合を形成していない鎖状ペプチドとすることで、トリプシン消化（Ｓ１１４）をさらに効率的に行うことができる。【０１６３】
また、本実施形態において、ステップ１１３を、ペプチドへの保護基の導入を行う前処理のステップと、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解を行うステップの２段階としてもよい。【０１６４】
この場合にも、前処理のステップでペプチドのＮ−アシル化およびＯ−アシル化反応を行う反応試薬として、求電子的なアシル化剤であるアルカン酸無水物が用いられる。アルカン酸無水物は、たとえば３０〜８０℃程度の温度でリジン残基側鎖のアミノ基に対するＮ−アシル化の反応性を有する物質とする。具体的には、炭素数２〜６程度のアルカン酸由来の対称型酸無水物を利用することができる。また、立体障害の低減の観点からは、炭素数２〜４程度のアルカン酸由来の対称型酸無水物が好ましく用いられる。【０１６５】
また、炭素数２〜６程度の直鎖アルカン酸由来の対称型無水物を利用することができる。また、立体障害の低減の観点からは、炭素数２〜４程度の直鎖アルカン酸由来の対称型無水物が好ましく用いられる。対称型のアルカン酸無水物を利用すると、副生するアルカン酸も同一種とすることができる。アルカン酸無水物とアルカン酸とを同一種とすることにより、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化反応の進行する間に仮にアシル基交換反応が生じても、最終的に得られるＮ−アシル化およびＯ−アシル化保護に、異なるアシル基が混在しないようにすることができる。このため、仮に、ステップ１１２における加水処理において、Ｏ−アシル化保護の脱保護が達成されないものが一部残留した場合にも、脱保護されたものとの分子量差は、予め判明しており、夾雑物に由来するピークの同定を容易に行うことができる。このようなアルカン酸無水物として、たとえば無水酢酸を用いることができる。【０１６６】
また、双極性非プロトン性溶媒はゲルの再膨潤を起こさせる溶媒とすることができる。このため、比較的に分子サイズが小さく、ゲルの材料に対する親和性に優れた有機溶媒を用いることができる。また、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化の反応過程において、アルカン酸無水物の分子内分極を誘起可能な、高い双極性を示す溶媒とすることができる。また、前処理反応を行う温度において、揮発、蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒とすることができる。たとえば、ホルムアミド（ＨＣＯＮＨ2）などは、ポリアクリルアミドゲルを用いる際に、以上に述べた要件すべてを充分に満足するものである。【０１６７】
双極性非プロトン性溶媒中では、アルカン酸無水物の分子内分極が誘起され、求電子反応試薬として、ペプチドのアミノ基に作用する。このため、３０℃程度の温度以上の比較的低温中でも、充分にＮ−アシル化反応は進行する。通常、反応の促進を図るためには、反応温度をたとえば５０℃以上に選択することができる。また、密閉された反応容器内でアシル化反応を行う場合、反応容器内の機械的強度を考慮すると、たとえば１００℃以下の範囲に選択することができる。【０１６８】
以上より、たとえば、２０ｖ／ｖ％無水酢酸のホルムアミド溶液を用い、５０〜６０℃程度の温度で２〜４時間程度アセチル化を行うことができる。こうして前処理を行った後、上述したステップ１１３の条件でＣ末端アミノ酸の逐次分解を行う。【０１６９】
（第二の実施形態）
第一の実施形態で説明した分析方法においては、アルカン酸無水物を用いた緩和な条件でＣ末端の逐次分解（Ｓ１１３）が行われる。このため、特に低温で逐次分解反応を行う場合、反応時間が長くなる。本実施形態では、第一の実施形態において、反応促進剤を添加することにより、逐次分解の反応時間を短縮する方法について説明する。【０１７０】
反応促進剤として塩基性含窒素芳香環化合物を用いる。塩基性含窒素芳香環化合物として、たとえばピリジン塩基またはその誘導体等を用いることができる。ピリジン塩基はプロトン受容体として機能するため、たとえば、アミノ基へのアシル化に伴い離脱すべきプロトンの除去がより速やかになされる。ピリジン塩基として、具体的には、たとえば、ピリジン、ピコリン（メチルピリジン）、ルチジン（ジメチルピリジン）、コリジン（トリメチルピリジン）、エチルメチルピリジン、パルボリン（テトラメチルピリジン）等を用いることができる。また、塩基性含窒素芳香環化合物として、縮合環系のアザアレーンを用いてもよい。具体的には、たとえば、キノリン、イソキノリン、インドール等の２環式塩基性含窒素芳香環化合物またはその誘導体を用いることができる。また、たとえば、ベンゾキノリン、ベンゾイソキノリン、アクリジン等のアザアントラセンやフェナントリジン等の３環式塩基性含窒素芳香環化合物またはその誘導体を用いることもできる。【０１７１】
図６は、本実施形態に係るＣ末端アミノ酸配列の分析手順を示す図である。図６の手順の基本構成は図４と同じであるが、ゲルの脱水の前にゲルをピリジン水溶液に浸漬する点が異なる。ゲルをピリジン水溶液に浸漬した後、脱水することにより、トランケーション（図３のステップ１１３）を促進することができる。これは、溶媒置換後も、ゲル中に微量のピリジンが保持されることによると推察される。【０１７２】
ゲルを予め浸漬するピリジン水溶液中のピリジンの濃度は、たとえば１ｖ／ｖ％以上４０ｖ／ｖ％以下、好ましくは１０ｖ／ｖ％以上３０ｖ／ｖ％以下とすることができる。こうすることにより、Ｃ末端の逐次分解の速度を確実に増加させることができる。また、浸漬は、室温中で２０分間を３回繰り返して行うことができる。このとき、ゲルがＣＢＢ等によって着色されている場合、その脱色の程度を観察して溶媒置換の程度を目視により把握することができる。たとえば、ゲルがほぼ脱色した段階で溶媒置換を終了することができる。【０１７３】
たとえば、１ｖ／ｖ％のピリジンにゲルを予め浸漬した場合、ステップ１１３の反応条件を、５０〜８０℃にて１０〜２０時間程度に短縮することができる。また、たとえば、２０ｖ／ｖ％のピリジンにゲルを予め浸漬した場合、ステップ１１３の反応条件を、５０〜８０℃にて５分〜４時間程度にまで、さらに具体的には、６０℃にて１０分〜１時間程度にまで短縮することができる。塩基性含窒素芳香環化合物にゲルを浸漬しておくことにより、ピリジンを用いない図５に示した条件と比較して、ステップ１１３の顕著な時間短縮が可能となる。【０１７４】
なお、ステップ１０２の逐次反応を促進する方法として、反応促進剤を添加する方法に代えて、反応を加圧条件にて行う方法を採用することもできる。このとき、反応溶液に浸漬させたゲルを、加圧チャンバ内に設置し、たとえば３００〜８００ＭＰａ程度、より具体的にはたとえば６００ＭＰａ程度の圧力を加えることにより、分解反応の促進が可能である。【０１７５】
（第三の実施形態）
以上の実施形態において、逐次分解を行う前に、架橋剤を用いてゲル中に存在するタンパク質同士を架橋し、ネットワークを形成させてもよい。このようにすれば、タンパク質からのゲルからの溶出を抑制することができる。このため、ゲル中でのＣ末端逐次分解反応において、ゲル中からサンプルが溶出することを抑制することができる。よって、図１〜図３を参照して前述したステップ１０３の質量分析におけるペプチド由来のシグナルの強度を向上させることができる。したがって、図１〜図３に示したステップ１０４のアミノ酸配列の分析における分析確度、分析精度をさらに向上させることができる。【０１７６】
架橋剤としては、たとえば、両末端に結合基をもつ化合物を用いることができる。また、たとえば、フォルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基をもつ化合物も効果的に使用できる。これらのアルデヒド基を有する化合物は、それら自身が重合してさまざまな長さの鎖となる。また、重合したアルデヒド鎖の両端や途中に存在するアルデヒド基がタンパク質中のリジン残基と結合してネットワークを形成する。このため、網目構造をもつゲル内でタンパク質同士が架橋されて、網目構造が形成される。これにより、ゲルとタンパク質とが絡まりあって、タンパク質の溶出を抑えることが可能となる。【０１７７】
なお、架橋反応においては、架橋剤の反応性を考慮して、ペプチドのＣ末端付近に存在するリジン残基の架橋反応が抑制された条件を選択するとよい。こうすれば、ステップ１０３の質量分析において、分析対象ペプチドに由来するシグナルの強度をさらに充分に確保することができる。【０１７８】
架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用した場合、たとえば図１におけるステップ１０１のＣ末端の逐次分解の前に、たとえば１ｐｍｏｌ／μＬ以上１０００ｎｍｏｌ／μＬ以下の濃度のグルタルアルデヒド水溶液中にゲルを３０分以上２時間以下の時間浸漬することにより、グルタルアルデヒドによる固定化を行うことができる。なお、グルタルアルデヒドを架橋剤として用いる場合の反応条件については、後述する実施例においてさらに詳細に説明する。【０１７９】
（第四の実施形態）
本実施形態では、分析対象のペプチドが乾燥試料である場合の分析手順について説明する。このようなペプチドとして、たとえば、あらかじめ単離生成されたタンパク質の乾燥試料を用いることができる。本実施形態では、第一の実施形態で用いたゲル中に反応試薬を浸潤させて液相反応を行わせる手法に代えて、乾燥蒸気を供給する手法を用いる。【０１８０】
本実施形態においても、ステップ１１３（図３）のβ−ＯＨ基およびε−ＮＨ2基の保護を、たとえばそれぞれＮ−アシル化およびＯ−アシル化とすることができる。また、本実施形態においては、ステップ１１３を、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化およびＣ末端アミノ酸の逐次分解の２段階の手順で行う。このため、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化は、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解の前処理に相当する。【０１８１】
本実施形態においても、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化は、具体的には、たとえばアセチル化とすることができる。アシル化反応は、たとえば、分析対象のペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１０〜６０℃程度の温度において、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させることで行うことができる。こうすることにより、ペプチドの切断等の副反応を引き起こすことなく、Ｎ−アシル化保護を施すことが可能となる。【０１８２】
また、ペプチド中に存在するセリン残基およびトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基においてもＯ−アシル化反応が進み、その保護がなされる。その他、ペプチド中に存在するチロシン残基側鎖のフェノール性ヒドロキシ基も、その反応性は相違するものの、部分的にＯ−アシル化がなされる。このため、リジン残基側鎖のアミノ基、セリン残基およびトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基をいずれも保護し、副反応に関与できない状態にすることができる。【０１８３】
アルカン酸無水物とアルカン酸の蒸気の供給方法は、たとえば、気密状態の反応容器内で、１０℃〜６０℃程度の温度に反応容器全体を加熱、保温して、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物から蒸散させる方法とすることができる。【０１８４】
このとき、アルカン酸およびアルカン酸無水物として、１０℃〜６０℃程度の温度で、所望の分圧を達成できる物質を用いることが好ましい。アルカン酸無水物として、具体的には、たとえば、第一の実施形態に記載の物質を用いることができる。【０１８５】
また、対称型のアルカン酸無水物は、少量添加されるアルカン酸に由来する対称型無水物であることがさらに好ましい。こうすることにより、アルカン酸無水物とアルカン酸とを同一種とすることができる。具体的には、たとえば、無水酢酸と酢酸の組み合わせなどを用いることができる。【０１８６】
また、ステップ１１３において、前処理の後に実施するＣ末端アミノ酸の逐次分解で利用するアルカン酸無水物と、同じアルカン酸無水物を用いてもよい。こうすれば、一連の反応における蒸気圧を好適に維持することができる。【０１８７】
また、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物中における、アルカン酸の添加比率は、アルカン酸無水物とアルカン酸との合計した体積に対して２〜１０体積％の範囲とすることができる。具体的には、たとえば、アルカン酸の添加比率を５体積％とすることができる。【０１８８】
なお、前処理の反応温度は、たとえば上述したように１０℃以上６０℃以下の温度とする。また、反応温度を室温付近、あるいは、室温より僅かに高い範囲内に選択することができる。たとえば、１５℃以上５０℃以下とすることができる。【０１８９】
また、アシル化反応の速度は、利用されるアルカン酸無水物とアルカン酸の分圧（気相濃度）および反応温度に依存する。このため、前処理の反応時間は、主に反応温度に応じて、適宜選択することができる。たとえば、反応温度を５０℃に選択する際には、反応時間を1時間以内、たとえば、３０分間に選択することができる。また、アルカン酸無水物とアルカン酸とによるアシル化反応を促進する目的で、触媒量のピリジン、たとえば、アルカン酸無水物とアルカン酸の合計に対して、０．１体積％以上１．０体積％以下のピリジンを添加してもよい。ピリジン塩基はプロトン受容体として機能するため、これを添加することにより、アミノ基へのアシル化に伴い離脱すべきプロトンの除去がより速やかになされる。【０１９０】
また、分析対象のペプチドが、たとえば、隣接するペプチドのシステインとの間で、酸化型の−Ｓ−Ｓ−結合を形成する場合や、同一分子内で−Ｓ−Ｓ−結合を形成しているシステインを含む場合には、予め常用の還元処理を施して架橋を解消し、還元型のシステインを含むペプチドに変換してもよい。また、ペプチド中に存在する還元型のシステインに対しては、その側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）にカルボキシメチル化やピリジルエチル化などを施し、予めその保護を行ってもよい。【０１９１】
たとえば、分析対象のペプチドがタンパク質である場合のように、ペプチドが二次構造、三次構造を構成している場合には、予め、デフォールディング処理を行うことができる。ペプチドの高次構造を予め破壊しておくことにより、Ｎ末端のアミノ基をＮ−アシル化保護する条件において、ペプチド中に存在するリジン残基側鎖のアミノ基のＮ−アシル化を確実に進行させることができる。また、タンパク質が分子内で−Ｓ−Ｓ−結合を形成しているシステインを含む可能性を有する場合には、予め常用の還元処理を施して架橋を解消し、還元型のシステインを含むペプチドに変換してもよい。また、ペプチド中に存在する還元型のシステインに対しては、その側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）にカルボキシメチル化やピリジルエチル化などを施し、予めその保護を行うことができる。【０１９２】
また、前処理における反応手順は、気密状態とできる反応容器内に、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加した液状混合物を入れ、この液状混合物を一旦冷却して、蒸気圧を低下した状態で、反応容器内を排気し、密閉して、反応温度まで昇温し、容器内にアルカン酸無水物を蒸発させる手法を用いてもよい。この手順を採用することにより、反応容器内への水分の混入をより一層確実に防止することができる。【０１９３】
また、反応系内に酸素が残留しないように真空排気を行ってもよい。こうすれば、対象とするペプチドがメチオニン残基を有する場合にも、メチオニン残基中に存在するイオウが酸素により酸化を受けてその式量が変化することを防止することができる。このため、分子量の測定における高い確度が達成される。【０１９４】
なお、前処理において、少量のピリジン蒸気を共存させてもよい。こうすることにより、ペプチドのＣ末端カルボキシル基に対してピリジン塩基が弱い付加塩を形成し、上記反応式（Ｉａ）で示されるＣ末端カルボキシル基の活性化反応やそれに起因する副反応に対する保護効果を持たせることが可能である。付加塩型の保護には、ピリジン塩基など、減圧下に簡単に留去可能で、弱塩基性の含窒素複素芳香環化合物を用いることができる。この付加塩型の保護は、前処理のステップを終える際にドライアップ操作を設けて、減圧下、ピリジン塩基の除去を行うことで、簡便に脱保護される。また、付加塩型の保護は、アミノ酸側鎖のカルボキシル基に対する保護機能を有するため、アミノ酸側鎖のカルボキシル基に起因する不要な副反応をも同時に抑制することができる。【０１９５】
前処理反応を終えた後、反応容器内に残余する反応試薬を除去した後、Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応に移行する。【０１９６】
この反応では、Ｎ−アシル化保護済みのペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下で、たとえば５０℃以上１００℃以下の範囲に選択される温度において、たとえば４時間以上１１０時間以下の時間、蒸気状のアルカン酸無水物を作用させる。すると、上記式（ＩＩＩ）に示される５−オキサゾロン構造を経て、５−オキサゾロン環の開裂に伴いＣ末端アミノ酸の分解反応が生じる。【０１９７】
アルカン酸無水物として、反応温度まで昇温した際に適正な蒸気圧を生じる限り、種々のものが利用可能である。上述の反応温度に選択する際に、充分な蒸気圧を与えるものが好ましい。たとえば、炭素数２〜６のアルカン酸の対称型酸無水物、好ましくは炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。対称型酸無水物として、たとえば、炭素数２〜６の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、好ましくは炭素数２〜４の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。具体的には、炭素数２の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、すなわち、無水酢酸とすることができる。また、アルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化に利用されるため、その際、立体障害を生じることの少ないものが好ましく、その点でも、無水酢酸は好ましく用いられる。【０１９８】
なお、本実施形態においても、第一の実施形態の場合と同様に、アルカン酸無水物によるペプチドのＮ末端のアミノ基に対するＮ−アシル化がこのステップにおいても生じ、系内においてＮ−アシル化保護がなされるものの、予め前述の方法で前処理を行うとよい。【０１９９】
また、アルカン酸無水物は反応に従って消費されるため、蒸気状態として供給するアルカン酸無水物の蒸気圧を所定の範囲に維持しつつ反応を行ってもよい。その手段として、反応を行う系を気密状態とし、系内に存在するアルカン酸無水物の蒸気圧を安定化する方法が用いられる。具体的には、たとえば、気密状態とできる反応容器内にアルカン酸無水物を入れ、これを一旦冷却して、蒸気圧を低下した状態で、反応容器内を排気し、密閉して、反応温度まで昇温し、容器内にアルカン酸無水物を蒸発させる手法が用いられる。こうすることにより、反応容器内への水分の混入を防止できる。【０２００】
また、この分解反応に利用される、５−オキサゾロン環が、系外から進入した水分により加水されて元に戻ることを回避するため、反応は乾燥雰囲気下で行う。その観点から、一般に、密閉された反応容器内で反応を行うことができる。【０２０１】
なお、このステップにおいても、真空排気を行うと、反応系内の酸素を除去し、ペプチドのメチオニン残基中のイオウの酸化を抑制することができる。このため、分子量の測定における高い確度が達成される。【０２０２】
また、一旦形成された５−オキサゾロン環から、たとえば、上記式（ＩＩ'）で表記される反応等の反応を経て、Ｃ末端のアミノ酸の離脱および反応中間体の形成を進行して、逐次的なＣ末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推定される。従って、分解反応により得られる反応産物は、Ｃ末端にカルボキシル基が形成されているもの以外に、中間産物である５−オキサゾロン環構造に留まるもの、あるいは、反応中間体の一形態として、Ｃ末端が非対称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。【０２０３】
逐次的なＣ末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における反応は、少なくとも、反応式（Ｉｂ）で例示される５−オキサゾロン環構造の形成過程と、反応式（ＩＩ'）で例示される５−オキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の分離過程との二段階の素反応から構成される。そのため、全体の反応速度は、これら各過程の反応速度の双方に依存するものの、主に、利用するアルカン酸無水物の蒸気分圧（気相濃度）および反応温度に依存している。【０２０４】
また、一連の反応産物は逐次的な反応で形成されるため、もとのペプチドから順次除去されるＣ末端アミノ酸配列の最大長は、処理時間が長くなるとともに、延長される。【０２０５】
従って、Ｃ末端アミノ酸の逐次分解反応の時間は、主に、利用するアルカン酸無水物の蒸気分圧（気相濃度）および反応温度に応じて、また、解析すべきＣ末端アミノ酸配列の目標とするアミノ酸長をも考慮して、適宜選択することができる。【０２０６】
反応温度が高いほど反応速度は増し、より短い処理時間で、目標とする最長のアミノ酸配列短縮量を達成した一連の反応産物の調製が可能となる。たとえば、反応条件を５０℃にて１１０時間、６０℃にて５０〜６０時間、８０℃にて２４時間、１００℃にて４時間等とすることができる。反応温度が低いほど、緩和な条件とすることができ、副反応をより一層抑制することができるため、好ましい。【０２０７】
次に、ステップ１１２において、後処理工程として加水処理を行う。まず、一連のＣ末端欠損ペプチドともとのペプチドの混合物に対して、残余するアルカン酸無水物を乾燥状態において除去する。そして、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物と水分子を供給して、ペプチドのＣ末端のアミノ酸残基にカルボキシル基を形成させる。【０２０８】
また、このとき、ペプチド鎖中に存在するセリン残基とトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基およびチロシン残基側鎖のフェノール性ヒドロキシ基では、その脱保護も進行する。一方、リジン残基側鎖のアミノ基およびペプチド鎖Ｎ末端のアミノ基に対するＮ−アシル化保護は、脱保護を受けず、残留される。【０２０９】
加水処理の際には、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物の水溶液を用いることができる。また、単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、水分子とともに蒸気として乾燥混合試料に作用させる。この後処理も密閉された反応容器内で反応を行うことが望ましい。塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を蒸気とすると、残留しているＣ末端が非対称型酸無水物に至ったものと反応してアミド結合を形成しないようにすることができる。また、水溶液とした際に均一な溶液を容易に得ることができる。【０２１０】
塩基性含窒素芳香環化合物として、たとえば充分な蒸気圧を与えることができる単環式の含窒素芳香環化合物を用いることができる。具体的には、たとえば、ピリジンなどを用いることができる。また、第三アミン化合物として、ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程度の塩基性を有するものが用いられる。具体的には、たとえば、ＤＭＡＥなどを用いることができる。【０２１１】
たとえば、水溶液全体の体積に対してピリジンを５〜１５体積％程度、より具体的には、１０体積％添加することができる。また、水溶液全体の体積に対してＤＭＡＥを１〜２０体積％程度、より具体的には、１０体積％程度添加することができる。【０２１２】
また、後処理では水分子を利用するため、その蒸気圧を一定以上とすることが必要となる。このため、たとえば、６０℃以上の温度とすることができる。また、反応容器内の機械的強度を考慮すると、たとえば、１００℃以下とすることができる。加水処理を速やかに完了するためには、たとえば１００℃またはそれより若干低い温度とすることができる。【０２１３】
加水処理を施した後、塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去し、乾燥する再乾燥後処理を行う。【０２１４】
なお、以上のステップ１１３およびステップ１１２の各ステップを、同一の反応器内で連続した形態で実施してもよい。また、各ステップを終えた段階で、ペプチド試料に、そのステップで利用した試薬の残留を回避するため、それぞれ、ドライアップ操作を設けることができる。このドライアップ操作は、減圧留去で行うことができる。また、その際、ステップ１１３にて分解されたＣ末端アミノ酸等の除去を同時に行ってもよい。【０２１５】
次に、ステップ１１４にて、もとのペプチドおよびそのＣ末端のアミノ酸残基が欠損したペプチドのトリプシン処理を行う。このステップでアミノ酸長の長いペプチド鎖を所定の位置で選択的に断片化することができる。トリプシン消化処理は、緩衝溶液中でペプチドにトリプシンを作用させることによって行うことができる。このとき、本実施形態においても、リジン残基側鎖のアミノ基に対するＮ−アシル化保護が保持されているため、Ｎ−アシル化保護リジン残基のＣ末端側ペプチド結合の切断は生じず、アルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合の選択的な切断が起こる。トリプシン消化処理後、脱塩処理を施し、緩衝溶液成分を除去して、トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、乾燥する。【０２１６】
これ以降の工程、すなわち、回収されたトリプシン消化処理済みペプチド断片を含む乾燥混合物について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を利用して、分子量測定およびその測定結果に基づくＣ末端アミノ酸配列の分析を行うステップ１０３およびステップ１０４の操作は、第一の実施形態と同様にして行うことができる。【０２１７】
本実施形態に係るペプチドのＣ末端アミノ酸配列の分析方法によれば、アルカン酸無水物を実質的に含む反応試薬を作用させるため、穏和な条件によりＣ末端のアミノ酸の選択的な分解を行うことができる。酸無水物の反応性が低いため、ペプチドのＣ末端以外におけるアミド結合の分断等の不要な副反応を抑制しつつ、ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解除去することが可能となる。このとき、Ｃ末端アミノ酸配列の分解は、５−オキサゾロン構造の形成と５−オキサゾロン環の開裂に伴うことが推定される。【０２１８】
また、分析対象のペプチドに対して、Ｎ末端アミノ基およびリジン残基側鎖のアミノ基に対してＮ−アシル化保護を行うとともに、セリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−）やトレオニン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ）−ＣＯ−）に存在するヒドロキシ基に対しても、Ｏ−アシル化保護を行う。このため、Ｎ−アシル化保護およびＯ−アシル化保護がなされた状態でＣ末端の逐次分解を行うため、副反応の生成をさらに確実に抑制することができる。【０２１９】
このように、本実施形態の方法では、ペプチドの途中におけるアミド結合の分断が抑制されるため、反応生成物中に、アミド結合の分断により派生するペプチド断片およびそのペプチド断片を起源とする反応産物が混入することを回避することができる。このため、ペプチドが乾燥試料である場合にも、緩和な条件で確実にＣ末端アミノ酸は配列の分析を行うことができる。【０２２０】
なお、本実施形態において、反応に用いる液体試薬それぞれを収納でき、試料容器中に保持されるペプチド試料に対して液体試薬を一定量づつ加えることが可能であって、試薬同士が直接接触しないように維持する液体試薬の保持機構を具えた反応装置を用いることができる。また、反応容器の内部を真空排気でき、また、反応終了後、残余する試薬を減圧下で除去することができ、反応時には気密構造とできる反応装置とすることができる。また、反応容器内で試薬の蒸気を発生させる際、容器壁と反応を生じることのない材質を用いることができる。このような反応容器として、たとえば、ガラスが好適に用いられる。また、密閉操作に利用されるコック類の材料として、たとえば、テフロン（登録商標）などが好適に利用される。【０２２１】
また、本実施形態の方法に第二の実施形態に記載の方法を適用し、Ｃ末端の逐次分解反応を促進することもできる。【０２２２】
以上、本発明を実施形態に基づき説明した。これらの実施形態は例示であり様々な変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。【０２２３】
たとえば、以下の各態様も、本発明の範囲内として有効である。
（１）解析対象とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列を解析する方法であって、
対象とするペプチドより、化学的手段によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、前記ペプチドとの分子量差を、質量分析法により分析し、前記Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、逐次的に分解された一連のアミノ酸を特定し、Ｃ末端より配列させて、Ｃ末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、
前記Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
対象とする前記ペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度において、
アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させ、
該ペプチドＮ末端のアミノ基および、該ペプチドに含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基に対して、前記アルカン酸無水物由来のアシル基によるＮ−アシル化を施す、Ｎ−アシル化保護を施すとともに、
前記Ｎ−アシル化保護済みの、対象とするペプチドの乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、５０℃以上１００℃以下の範囲に選択される温度において、
蒸気状のアルカン酸無水物を作用させ、
ペプチドのＣ末端において、上記一般式（ＩＩＩ）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴いＣ末端アミノ酸の分解を行う工程と、
前記Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を含む混合物に対して、
残余する前記アルカン酸無水物を乾燥状態において除去する後処理を施し、
次いで、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水溶液を利用し、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物と水分子を供給して、
前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、
前記の加水処理を施した後、前記一連の反応生成物を含む混合物に残余する、前記塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去、乾燥する再乾燥後処理を行うことからなる加水処理の工程とを、少なくとも含んでなり、
前記Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、
再乾燥処理後、前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、
緩衝溶液中において、トリプシンを作用させ、該ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基および、該ペプチド鎖に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基に対する上記Ｎ−アシル化保護が保持されている、該ペプチド鎖のトリプシン酵素に特異的な消化処理を施して、該ペプチド鎖中に存在するアルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合の選択的な切断によるペプチド断片化を行い、
脱塩処理を施し、前記緩衝溶液成分を除去して、該トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、乾燥する工程を設け、
次いで、前記回収された該トリプシン消化処理済みペプチド断片を含む乾燥混合物について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を利用し、該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定および陰イオン種による分子量測定を行い、
前記陽イオン種による分子量測定および陰イオン種による分子量測定において測定される、対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成するＣ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片のピークは、陽イオン種による分子量測定における強度は、陰イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、元となるペプチドに由来するＣ末端のペプチド断片および、Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来するＣ末端のペプチド断片のピークは、陰イオン種による分子量測定における強度は、陽イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
該陰イオン種による分子量測定において、相対的に大きな強度を与える一連のピークに基づき、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法を採用することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列解析方法。
（２）  前記アルカン酸無水物として、炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする方法。
（３）  前記炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物として、炭素数２〜４の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする方法。
（４）  前記アルカン酸無水物として、無水酢酸を用いることを特徴とする方法。
（５）  前記アルカン酸無水物を利用する処理に際して、前記乾燥雰囲気は、水分に加え、さらに酸素も除去された状態であることを特徴とする方法。
（６）  前記乾燥雰囲気は、気密容器内において、その内部の大気を真空排気することで、達成されていることを特徴とする方法。
（７）  前記アルカン酸無水物を利用する処理に際して、その温度は、５０℃以上８０℃以下の範囲に選択される温度とすることを特徴とする方法。
（８）  解析対象とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列を解析する方法であって、
対象とするペプチドより、化学的手段によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、元となるペプチドとの分子量差を、質量分析法により分析し、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、逐次的分解された一連のアミノ酸を特定し、Ｃ末端より配列させて、Ｃ末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、
前記Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、該ゲル担体上に保持された状態の対象とするペプチド試料に対して、前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、かつ、水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、希釈除去することにより、該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、該ゲル担体上に保持された状態の対象とするペプチド試料に対して、５０℃以上１００℃以下の範囲に選択される温度において、該ゲル状物質内に浸潤でき、膨潤状態に維持可能である、双極性非プロトン性溶媒中に、アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、該アルカン酸無水物溶液中に該ゲル担体を浸漬することにより、保持された状態の対象とするペプチド試料にアルカン酸無水物を作用させ、
対象とするペプチドのＮ末端のアミノ基および、該ペプチド中に含有される可能性のあるリジン残基側鎖上のアミノ基に、予め、前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するアシル基によるＮ−アシル化保護を施しつつ、
ペプチドのＣ末端において、上記一般式（ＩＩＩ）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴うＣ末端アミノ酸の逐次的分解を行い、
前記Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、かつ、前記アルカン酸無水物および双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、希釈除去することにより、分解反応の停止と反応試薬の除去を行う工程と、
さらに、前記Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生成物を含む混合物に対して、該ゲル担体上に保持された状態のまま、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水溶液を利用し、該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、加水処理を施すことからなる、付加的な加水処理の工程とを有し、
前記Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、
再脱水処理後、前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、
該ゲル担体上に保持された状態で、緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用させ、該ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基および、該ペプチド鎖に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基に対する上記Ｎ−アシル化保護が保持されている、該ペプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、該ペプチド鎖中に存在するアルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合の選択的な切断によるペプチド断片化を行って、
前記ゲル担体上から該ペプチド断片の遊離と、前記緩衝溶液中への溶出を行い、その後、脱塩処理を施し、前記緩衝溶液成分を除去して、該トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、乾燥する工程を設け、
次いで、前記回収された該トリプシン消化処理済みペプチド断片を含む乾燥混合物について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を利用し、該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定および陰イオン種による分子量測定を行い、
前記陽イオン種による分子量測定および陰イオン種による分子量測定において測定される、対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成するＣ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片のピークは、陽イオン種による分子量測定における強度は、陰イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、元となるペプチドに由来するＣ末端のペプチド断片および、Ｃ末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来するＣ末端のペプチド断片のピークは、陰イオン種による分子量測定における強度は、陽イオン種による分子量測定における強度と比較して、相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
該陰イオン種による分子量測定において、相対的に大きな強度を与える一連のピークに基づき、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法を採用することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列解析方法。
（９）  前記アルカン酸無水物として、炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする方法。
（１０）  前記炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物として、炭素数２〜４の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする方法。
（１１）  前記アルカン酸無水物として、無水酢酸を用いることを特徴とする方法。【０２２４】
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、実施例の具体的な構成に限定されるものではない。【０２２５】
（実施例１）
本実施例では、ゲル中に保持されているタンパク質のＣ末端アミノ酸配列の解析を行った。タンパク質として、ウマ由来のミオグロビン（配列番号１）を用いた。ウマ由来のミオグロビンは、１５３アミノ酸からなるヘムタンパク質である。まず、分析対象試料となるミオグロビンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一スポットとした。その後、第一の実施形態に記載の方法（図４、図５）および第二の実施形態（図６）に記載の方法を用いてＣ末端アミノ酸配列の決定を行った。【０２２６】
（ゲル電気泳動法による単離）
まず、市販のウマ・ミオグロビン標品について、０．２μｇ／μＬの濃度でグロビンペプチド鎖部分のみを含有するペプチド溶液を調製した。このペプチド溶液を、ゲル濃度１２．５質量％のポリアクリルアミドゲル上にスポットし、電気泳動した。そして、ＣＢＢ染色により、目的とするグロビンペプチド鎖のバンドを特定した。そして、染色バンド部のゲルを切り出して、Ｃ末端アミノ酸配列の分析に供した。【０２２７】
（ゲルの脱水）
切り出したゲル切片を１ｍｍ角にカットした。これを、気密性を有するチューブに入れて、アセトニトリル１ｍＬを注入し、１５分間攪拌した。その後、アセトニトリルをすてて、新たに、アセトニトリル１ｍＬを注入し、さらに１５分間攪拌した。このゲル中に含浸する水の抽出処理を合計３回行い、ゲルの脱水処理とした。脱水処理に伴い、ゲル体積の収縮が生じると同時に、ゲルの脱水処理がなされる。【０２２８】
（アセチル化およびＣ末端アミノ酸分解反応）
次いで、チューブ中で、脱水処理済みのゲル切片に、３０体積％濃度の無水酢酸のホルムアミド溶液１ｍＬを注入した。蜜栓したチューブを乾燥雰囲気下で攪拌しつつ、容器全体を５０℃に加熱し、そのまま５０℃で１１０時間保持した。【０２２９】
この加熱保持の間に、当初、体積収縮していたゲルは、ホルムアミドの浸潤に従って再膨潤した。この再膨潤したゲル中に保持されているグロビンペプチド鎖に対して、溶質の無水酢酸が、加熱温度で作用する結果、ペプチドのＮ末端アミノ基に選択的なアセチル化反応が進行する。また、ペプチド鎖内に含有される、リジン残基のε位のアミノ基へのＮ−アセチル化、同時に、セリン残基やトレオニン残基に存在するヒドロキシ基に対するＯ−アセチル化、チロシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシ基へのＯ−アセチル化がなされる。【０２３０】
さらに、再膨潤したゲル中に保持されているペプチド鎖Ｃ末端に対して無水酢酸を加熱温度で作用させると、アセチル化と同時にペプチド鎖のＣ末端アミノ酸の選択的分解反応が進行する。具体的には、ペプチドのＣ末端において、上記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（ＩＩ'）の反応経路を経て、５−オキサゾロン環形成を介するペプチド鎖のＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応が進行すると推定される。【０２３１】
Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解反応が進行すると、ゲル中には、段階的にＣ末端アミノ酸が除去された一連の反応産物と、アセチル化により保護されたもとのペプチドとが含まれた混合物が残される。【０２３２】
（後処理）
次いで、ゲル切片の入った容器内に、１０体積％のＤＭＡＥ水溶液１ｍＬを注入し、２０分間攪拌した。その後、ＤＭＡＥ水溶液をすてた。新たにＤＭＡＥ水溶液１ｍＬを注入し、さらに２０分間攪拌した後、ＤＭＡＥ水溶液をすてた。このＤＭＡＥ水溶液の注入、攪拌および除去の操作を合計３回行った。そして、新たにＤＭＡＥ水溶液を注入して２０分間攪拌した後、蜜栓した容器を攪拌しつつ、容器全体の温度を６０℃に加熱し、この温度に１時間保持した。この再膨潤したゲル中に保持されているペプチドに対して、塩基性窒素含有有機化合物の存在下、水分子を加熱温度で作用させることで、加水処理が進行する。【０２３３】
後処理工程を終えた後、容器内に残留する水溶液を除去し、容器中にアセトニトリル１ｍＬを注入し、１５分間攪拌した。その後、アセトニトリルをすて、新たにアセトニトリル１ｍＬを注入し、さらに１５分間攪拌した。ゲル中に含浸する水溶液の抽出処理を、合計３回行い、再膨潤ゲル中の脱水処理とした。脱水処理に伴い、ゲル体積の収縮が生じた。【０２３４】
（トリプシン消化によるペプチド断片化）
ウマ・ミオグロビンのグロビンペプチド鎖は、１５３アミノ酸からなる（配列番号１）。そこで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより一層適した分子量範囲とするため、トリプシン消化によるペプチドの断片化を行った。【０２３５】
後処理を施し、脱水済みのゲル切片を入れた容器内に、トリプシン含有水性溶液を加え、ゲル中に保持されている状態のまま、ペプチド鎖の断片化を行った。このとき、炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）中に、トリプシンを０．０６７μｇ／μＬの濃度で含有させたトリプシン含有水性溶液を用いた。ゲル片を３７℃で攪拌しつつ、４時間酵素反応を行った。その際、脱水処理されていたゲルは、溶媒水の浸潤に従って、速やかに再膨潤した。この再膨潤したゲル中に保持されているペプチドに対して、緩衝液とともにトリプシンを作用させることで、トリプシン特有の酵素消化が進行する。【０２３６】
なお、後処理工程における脱保護によっても、ペプチドのＮ末端のアミノ基に対するＮ−アセチル化、リジン残基のε位のアミノ基へのＮ−アセチル化は保持された状態であり、トリプシン消化によっては、Ｎ−アセチル化リジン残基のＣ末端側ペプチド結合の切断はなされず、アルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合切断が進行する。【０２３７】
ウマ・ミオグロビンのグロビンペプチド鎖が有するアミノ酸配列は既に判明しており、図７に示すようにアルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合切断に伴い、１５３アミノ酸からなるもとのペプチド鎖は、１−３１（配列番号２）、３２−１３９（配列番号３）、１４０−１５３（配列番号４）の各部分アミノ酸配列を含む断片にトリプシン消化を受ける。【０２３８】
トリプシン消化によってグロビンペプチド鎖が断片化されると、ペプチド断片はゲルから溶出し易くなり、容器内のトリプシン溶液中に溶出する。なお、トリプシン消化処理工程では、１４０−１５３アミノ酸の部分アミノ酸配列を含むＣ末端断片とともに、上述するＣ末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成される一連の反応産物に由来するＣ末端側断片も、容器内のトリプシン溶液中に溶出する。消化処理は、長いアミノ酸長のペプチド鎖から、そのＣ末端部分を、質量分析に適合する所望の分子量範囲のペプチド断片とするとともに、ペプチド断片を、ゲル中から高い収率で溶出、回収することを可能としている。【０２３９】
トリプシン消化処理工程を終えた後、溶出したペプチド断片を回収した。回収されたペプチド断片の混合物を含む溶液について、脱塩処理を施した後、真空乾燥処理を行った。【０２４０】
（質量分析およびＣ末端アミノ酸配列の分析）
以上の一連の処理により、グロビンペプチド鎖のＣ末端側の断片と、そのＣ末端アミノ酸の欠損断片との混合物が得られた。この混合物の質量分析を行い、各ペプチド断片の分子量の測定を行った。このとき、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用し、各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種ピークの質量と、その相対的な信号強度の測定、比較を行った。【０２４１】
なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用する測定では、イオン種の分別は、負帯電イオン種を検出器へ導く、いわゆるネガティブモードの測定と、正帯電イオン種を検出器へ導く、いわゆるポジティブモードの測定とが行われる。各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種として、陽イオン種と陰イオン種がある。本実施例では、ポジティブモードの測定において、プロトンが付加された陽イオン種に対応するスペクトルが得られた。また、ネガティブモードの測定において、プロトンが離脱した陰イオン種に対応するスペクトルが得られた。【０２４２】
ポジティブモードの測定と、ネガティブモードの測定とを対比したところ、ウマ・ミオグロビンのグロビンペプチド鎖に由来するトリプシン消化断片に相当する主な二つのピークとして、１−３１の部分アミノ酸配列および、１４０−１５３の部分アミノ酸配列を含む断片が見出された。ポジティブモードの測定において、その強度が相対的に大きなピークは、Ｃ末端にアルギニン残基を有する１−３１の部分アミノ酸配列のＮ末端側ペプチド断片に相当すると判定した。一方、ネガティブモードの測定において、その強度が相対的に大きなピークは、アルギニン残基を含まない１４０−１５３の部分アミノ酸配列のＣ末端側ペプチド断片に相当すると判定した。【０２４３】
また、３２−１３９の部分アミノ酸配列中、Ｎ−アセチル基の離脱されたリジン残基における切断で派生する７８−１０２の部分アミノ酸配列に相当するペプチド断片も見出された。このペプチド断片についても、ポジティブモードの測定において、その強度は相対的に大きなピークを示していた。その他、トリプシンの自己消化で生じるペプチド断片も見出され、同じく、ポジティブモードの測定において、その強度は相対的に大きなピークを示していた。【０２４４】
本実施例では、ポジティブモードとネガティブモードの測定結果を比較することにより、Ｃ末端に係るペプチド断片およびその逐次分解によるＣ末端アミノ酸欠損ペプチドを容易に識別し、特定することができた。【０２４５】
図８は、ネガティブモードの測定により得られたマススペクトルを示す図である。図８では、１４０−１５３の部分アミノ酸配列のＣ末端側ペプチド断片に加えて、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解処理を施した反応産物に由来する一連のＣ末端側ペプチド断片の強度も相対的に大きく測定されている。表１に、測定された各ピークの質量値およびもとのグロビンペプチド鎖のＣ末端側ペプチド断片に起因するピークの質量値との差異を示す。また、これらの差分から特定される、Ｃ末端から除去されたアミノ酸およびＣ末端欠損ペプチドの構成を示す。【０２４６】
【表１】
0004289355.tif 000010
【０２４７】
図８および表１より、無水酢酸を用いた本実施例に係る逐次分解により、Ｃ末端から６つのアミノ酸、すなわち、グリシン、グルタミン、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸が逐次的に分解された反応産物に由来するピークが確認された。これより、ゲル切片中のバンドとして分離されたペプチドはグロビンペプチド鎖であり、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解処理をゲルに保持した状態で実施できることが確かめられた。【０２４８】
以上より、第一の実施形態に記載の方法を利用することで、分析対象のペプチド鎖をゲル中に保持した状態で、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解を進めた際にも、高い測定精度および確度が達成されていることが確認された。【０２４９】
また、リジン残基におけるトリプシン消化を受けたペプチド断片がＣ末端アミノ酸配列の解析に用いる分子量範囲に混在していないため、目的とするＣ末端側のペプチド断片と、付随するＣ末端アミノ酸の逐次的分解処理がなされている一連のＣ末端側のペプチド断片の識別を容易に行うことができた。【０２５０】
なお、本実施例で用いたウマ・ミオグロビンのグロビンペプチド鎖部分には、ヒト・ミオグロビンと異なりシステイン残基は存在しないが、たとえば、ヒト・ミオグロビンなどのように、システイン残基を内在するペプチドに対しては、システイン残基のスルファニル基（−ＳＨ）の酸化による、−Ｓ−Ｓ−結合の形成を回避するため、２−スルファニルエタノールまたはＤＴＴなどの還元性試薬を添加するなどして、予め酸化防止処理を施してもよい。場合によっては、予め、システイン残基の還元後、スルファニル基に対して、カルボキシメチル化などの保護を施すこともできる。【０２５１】
（実施例２）
本実施例では、実施例１において、ピリジンを用いることによる逐次分解反応の促進を確認した。試料として、ウマ・ミオグロビンのグロビンペプチド鎖を用いた。そして、ゲルの脱水処理の前に、ゲルを１体積％のピリジン水溶液に浸漬した。浸漬中、チューブ内を攪拌した。２０分間の浸漬後、ピリジン水溶液を交換して、再度浸漬した。浸漬後の試料を上述の例の方法を用いて処理した。ただし、Ｃ末端の逐次分解の条件を、６０℃、１６時間とした。【０２５２】
得られた試料について、上述の例と同様にして質量分析を行った。図９は、ネガティブモードの測定により得られたマススペクトルを示す図である。また、表２は、測定されたピークの質量値、もとのグロビンペプチド鎖のＣ末端側断片に起因するピークの質量値との差異を示す図である。また、これらの差分から特定される、Ｃ末端から除去されたアミノ酸およびＣ末端欠損ペプチドの構成を示す。【０２５３】
【表２】
0004289355.tif 000011
【０２５４】
さらに、ゲルを２０体積％のピリジン水溶液に２時間浸漬し、Ｃ末端の逐次分解の条件を、６０℃、１６時間とした場合についても検討を行った。他の条件は上述の例と同様とした。図１０は、ネガティブモードの測定により得られたマススペクトルを示す図である。【０２５５】
さらに、ゲルを２０体積％のピリジン水溶液に３回浸漬し、Ｃ末端の逐次分解の条件を、６０℃、１時間とした場合についても検討を行った。他の条件は上述の例と同様とした。図１１は、ネガティブモードの測定により得られたマススペクトルを示す図である。【０２５６】
図９、図１０、図１１、および表２より、第二の実施形態に記載の方法を用いて予めゲルにピリジンを含ませる処理を行った場合についても、Ｃ末端から６つのアミノ酸、すなわち、グリシン、グルタミン、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸が逐次的に分解された反応産物に由来するピークが確認された。【０２５７】
また、ピリジンを用いた処理を行うことにより、逐次分解の反応時間を顕著に短縮化することが可能であった。逐次的分解の各反応過程において、両性溶媒であるホルムアミド中において、プロトンドナーとして機能する無水酢酸の触媒作用によって、その反応の促進がなされていると推察される。【０２５８】
また、図１０および図１１を図９と比較すると、２０体積％のピリジン水溶液を用いた場合、もとのペプチドのＣ末端側断片ペプチドに対してそのＣ末端アミノ酸欠損ペプチドのピークが顕著に大きくなっていることがわかる。このため、２０体積％のピリジン水溶液を用いることにより、逐次分解の反応時間をより一層短縮化することが可能である。図１１より、６０℃という比較的穏やかな加熱条件において、１時間でゲル中のペプチドを安定的に分解することができた。【０２５９】
（実施例３）
本実施例では、第三の実施形態を用いて前述した架橋剤を用いることによる質量分析シグナルの増強について検討した。架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用した。また、分析対象のタンパク質として、大豆トリプシンインヒビターを用いた。【０２６０】
（グルタルアルデヒド溶液の調製）
１．２５ｐｍｏｌ／μＬグルタルアルデヒド、１．１３Ｍ  ＮａＡｃ、３０ｖ／ｖ％エタノール、０．２ｗ／ｖ％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3の濃度の水溶液を調製した。ただし、グルタルアルデヒドは使用直前に配合した。このグルタルアルデヒド溶液にタンパク質の入っているゲルに浸漬し、室温で１時間反応させた。そして、水溶液で試薬を洗浄し、実施例１に記載の方法を用いて逐次分解反応に供した。【０２６１】
（質量分析）
グルタルアルデヒドによる回収率の改善について、タンパク質固定を行った場合と行わなかった場合の比較を行った。図１２はグルタルアルデヒドを用いた固定を行わずに逐次分解を行った試料の質量分析結果を示す図である。図１２においては、８μｇのトリプシンインヒビターをサンプルとした。また、図１３は、上述したグルタルアルデヒド水溶液を用いて固定を行った後、逐次分解を行った試料の質量分析結果を示す図である。図１３においては、５μｇのトリプシンインヒビターをサンプルとした。【０２６２】
図１２においては、トリプシンの自己消化物に対するサンプル由来のピークが比較的弱いことがわかる。これに対し、図１３においては、トリプシンの自己消化物に比べてサンプル由来のピークの強度が相対的に強く出現した。これより、Ｃ末端の逐次分解に先立ち、グルタルアルデヒド固定を行うことにより、Ｃ末端欠損ペプチドのペプチド断片の回収率が改善されていることがわかる。図１３では、Ｃ末端から４残基目までの逐次分解物のシグナルが確認された。【０２６３】
以上より、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用い、前述した条件で分析対象のタンパク質の架橋反応を行うことにより、逐次分解のＣ末端フラグメントを好適に得ることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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