(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液または組織抽出液から選択されるある試料中の同じ固相上で、組み込み膜蛋白または脂質である第１の固相会合ファクターＦｘおよび膜会合蛋白である第２の固相会合ファクターＦｙがともに会合して形成されるＦｘおよびＦｙからなる複合体の検出または測定方法であって、
Ｆｘへの結合アフィニティーを有するリガンドＬｘ少なくとも１個とトランスミッターＴよりなる第１の安定な複合体少なくとも１種、そして更に、Ｆｙへの結合アフィニティーを有するリガンドＬｙ少なくとも１個とレシーバーＲよりなる第２の安定な複合体に、複合体Ｆｘ−Ｌｘ−Ｔおよび複合体Ｆｙ−Ｌｙ−Ｒが形成されるように、そして、ＦｘとＦｙとが複合体を形成してＴとＲが相互に十分近接した場合に生じるシグナルが測定されるように、試料を接触させることからなる前記方法。
【請求項２】
安定な複合体Ｌｘ−ＴまたはＬｙ−Ｒが各々粒子を有し、ＬｘがＴと共に第１の粒子に固定され、ＬｙがＲと共に第２の粒子に固定される請求項１記載の方法。
【請求項３】
固相が細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞が赤血球、白血球、顆粒球、リンパ球、単球、血小板のような血液細胞または他の組織または臓器由来の細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞が外因性細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
細胞が細菌、寄生虫またはウイルスである請求項５記載の方法。
【請求項７】
組み込み膜蛋白がインテグリンまたはセレクチンであるか、または、ＭＨＣ複合体由来であるか、またはクラスター表示による他の蛋白質である請求項１記載の方法。
【請求項８】
膜会合蛋白がフィブリノーゲン、抗体、補体因子、レクチン、ＭＨＣ複合体の処理抗原、凝固系酵素またはアネキシンファミリーの蛋白である請求項１記載の方法。
【請求項９】
脂質がアシルグリセロール、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワックス、テルペン、ステロイドおよび／またはプロスタグランジングループから誘導される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
脂質がリン脂質でありＬｘがアネキシンファミリーの蛋白であるか、または凝固系の反応性蛋白である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
リン脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンであり、Ｌｘが蛋白Ｃまたは蛋白Ｔである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
リガンドが媒介結合成分を介してＦｘまたはＦｙに結合する請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＬｘまたはＬｙがビオチン−アビジン架橋を介して粒子に結合する請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＬｘまたはＬｙが抗体、抗原、レクチン、補酵素、アポ蛋白、受容体のリガンド、基質類縁体またはアネキシンである請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
エネルギー転移がＴとＲとの間で起こる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
エネルギー転移を、放射活性過程により、または感光性染料の励起およびそれにより起こる直接または間接の電子移動により行うことができる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
電子移動を活性酸素を用いて行う請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
エネルギー転移によりレシーバーに発光、化学ルミネセンスまたは蛍光が生じる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
シグナル生成を調節する物質を添加する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞型、サブグループまたは細胞の活性化状態の特徴を調べるのに用いる請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細菌の表面抗原の検出を病原体の同定に用いる請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞の表面マーカーの検出に用いる請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
クラミジアの検出に用いる請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
組織のタイピングまたは組織適合性の特定に用いる請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
生じたシグナルをルミノメータで測定する請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は同一の固相に多数会合した固相会合ファクター（Solid phase-associated factors）の検出または測定のための方法に関する。本発明によれば、試料を、固相会合ファクターへの結合アフィニティーを有するリガンド少なくとも１個とトランスミッターが固定化されているトランスミッター粒子、および、上記固相会合ファクターへの結合アフィニティーを有するリガンド少なくとも１個とレシーバーが固定化されているレシーバー粒子に接触させ、次いで、トランスミッターとレシーバーが相互に十分接近した場合に生じるシグナルを測定する。特に、本発明は細胞型の決定または細胞活性化状態の測定に用いることのできる細胞の表面受容体の検出に関する。即ち、現在まで広く一般的に用いられているフローサイトメトリー（flow cytometry）をより簡単な方法に置き換えることが可能である。
【０００２】
血液細胞、特に白血球の分画（顆粒球、単球およびリンパ球）は診断において日常的に用いられている重要な手段である。これは特に種々の細胞型が異なる表面抗原、例えばインテグリンファミリーの膜蛋白を特徴とするとことにあるものである（Hynes RO. Integrins: a family of cell surface receptors. Cell 1987; 48: 549-554）。これらの膜蛋白の大部分はCD（クラスターデシグネーション）番号により示されている。
膜蛋白または細胞刺激後の表面上に発現されるか、または細胞内小胞との表面との融合により分泌されうる。例えばセレクチングループの蛋白の場合である（Bevilacqua MP and Nelson RM, Endothelial-Leukocyte adhesion molecules in inflammation and metastasis. Thromb. Haemost. 1993; 70: 152-154）。
【０００３】
血小板の場合は、例えばＧＭＰ−１４０（Ｐセレクチン；ＤＣ６２Ｐ）が活性化マーカーである。更に、活性化状態においては、例えば、フォンビルブラント因子またはフィブリノーゲンに結合する糖蛋白ＧＰ Ｉｂ／ＩｘまたはＧＰ IIｂ／IIIａの活性化血小板複合体の場合のように、細胞受容体とリガンドとの特徴的な複合体が形成される（例えばClemetson KJ. Biochemistry of Platelet membrane glycoproteins, Prog. Clin. Biol. Res. 1988; 283: 33-75参照）。活性化の後、凝固因子または他のリン脂質結合蛋白（例えばアネキシンファミリーのもの）が結合することのできるホスファチジルセリン含有脂質膜も血小板上に発現される。
【０００４】
以前の方法では、これらの表面抗原に対する標識された抗体または他の標識された反応性のリガンド、例えばアネキシンを、血液に添加することによりホスファチジルセリン含有脂質膜を検出していた（Roemisch J等., Anticoagulant properties of placenta protein 4 (annexin V); Thromb. Res. 1990; 60: 355-366）。次いでフローサイトメトリーにより細胞を大きさにより分類し、その際平行して所定数と比率の１つ以上の細胞型の上の標識の検出を介して同時に結論が引出される。使用される標識はそれ自体当業者には既知の物質、特に化学ルミネセンス化合物（一般的検索のためには例えばMichelson, A.D. and Barnard. M.R., US 5552290参照）。
【０００５】
上記したフローサイトメトリーは確立された方法であるが、細胞の計数および／またはタイピングという特定の目的のためにのみ使用可能であるという不都合な点を有する。従って通常は特定の実験室において確立されているのみである。しかしながら臨床的検討のためには細胞の分画およびその活性化状態をより広範に利用することが望ましい。通常の使用のためには、一般的な実験室の慣用の臨床化学分析装置または他の自動装置への応用が必要である。
従って本発明は均一な免疫化学的方法において細胞表面抗原の測定を可能にする、これまでの慣用のフローサイトメトリー法の代替法を得ることを目的とする。
【０００６】
抗原および抗体の測定のための均一な免疫化学的方法が既に多く知られており、例えば、FRATシステム（Syva)、EMITシステム、酵素チャンネル免疫検定、蛍光エネルギー転移免疫検定（FETI、例えばTRASE' Technology; CIS bio International社製）、酵素阻害剤免疫検定（Hoffmann LaRoche, Abbott Laboratories社製）または蛍光分極免疫検定（Dandlicker）が挙げられる。これらの均一な方法は分離および／または洗浄工程を伴わずに実施できる方法を得るために開発された。これらの方法の一部は感度が限られており、また複数のエピトープを有する高分子量の分析対象には適していない。
【０００７】
発現シンチレーション近接度検定（expression scintillation proxymity assay (SPA))はHiram E. Hart and Elaine B. Greenwald (Molecular Immunology 1979; 16: 265-267）により、特定の均一ラジオイムノアッセイを説明するために導入された。この方法では、異なる２種の重合体ビーズを用い、これらに特定の結合成分を担持させる。これらのビーズのうち第１のものには更に染料を担持させ、第２のビーズには更にトリチウムを担持させる。染料は3Ｈβ−放射（Auger electrons社製）で刺激されると即座に光パルスを発する性質を有する。しかしながら、この放射は水溶液中では数ミクロンの範囲しか有しないので、両方の種類のビーズを含有する希薄懸濁液中では１種のビーズ数個のみが他の種類のビーズに十分近接したものとして検知される。その結果、全体で僅かな蛍光シグナルが生じるのみである。しかしながら２種のビーズの特定の結合成分と反応することのできる反応体の添加により、ビーズの凝集が起こり、これにより多くの第１種ビーズ（トリチウムビーズ）が第２種ビーズ（蛍光団ビーズ）の近接部に移送され、これにより全体で高値のシグナルが生じるのである。生じたシグナルはシンチレーションカウンターで検知される。この方法を125ヨウ素標識特異的結合成分を用いて更に開発した例が、Udenfriend, S. 等により報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. 1985; 82: 8672-8676）。
【０００８】
更に別の方法として発光酵素チャンネル免疫検定（LOCI）が報告されている（EP-O-515194 A2; Ullman等., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994; 91: 5426-5430; Ullman等., Clinical Chemistry 1996; 42: 1518-1526）。これにおいては、２種の粒子を使用し、うち１種は光増感剤を含有し（増感剤ビーズ）、他方は化学ルミネセンス成分を含有している（レセプタービーズ）。光増感剤は１重項状態の酵素を発生させ、化学ルミネセンス成分が十分接近すればこれを活性化させる。活性化された化学ルミネセンス成分は光を発生し、これを測定シグナルとして検知することができる。
Bystrak、 Ｓ等（Analytical Biochemistry 1995; 225: 127-134）は、単層の小胞に結合する蛍光基質の一重項状態の酸素による光酸化が起こる均一な方法を記載している。特異的結合成分は小胞の表面に共有結合している。
【０００９】
これらの方法は全て、結合成分への粒子の特異的結合を包含している。原則として、これらの結合成分の結合は例えば免疫化学的検出のための抗原または抗体のような適切な特異的リガンドによる粒子のコーティングを介して行う。現在まで、これらの方法は可溶性（体液性）因子の検出にのみ用いられていた。これらの因子（例えば蛋白）への結合により、トランスミッター粒子とレシーバー粒子は、トランスミッターにより発生されたエネルギーのトランスファー粒子への転移を可能にする空間的近接度をもたらす。不溶性の固相会合ファクター、例えば、細胞の表面抗原の検出のための使用はこれまで指摘されていない。
【００１０】
【発明の要旨】
意外にも、本発明において、トランスミッター粒子とレシーバー粒子が、エネルギー転移に必要な空間的近接度が固相の大きさとは無関係に達成されるように、言い換えれば、エネルギー転移がなお起こり得るトランスミッター粒子とレシーバー粒子との間の最大距離を超えないように、多数会合した固相会合ファクターに結合できることが解った。固相は例えば、細胞であってよく、そして、固相会合ファクターは例えば細胞の表面抗原であってよい。即ち意外にも、現在までもっぱら体液因子の検出に限定されていた均一免疫化学的検出法の範囲を細胞の表面マーカーの検出にまで拡張することが可能になり、これによりフローサイトメトリーの原理意外の原理に基づいた装置でその測定が行えるようになった。
【００１１】
従って本発明は、ある試料において同じ固相に多数会合している固相会合ファクターＦの検出または測定のための方法に関する。本発明によれば、試料を、Ｆへの結合アフィニティーを有するリガンドＬ少なくとも１個およびトランスミッターＴよりなる第１の安定な複合体、ならびに、Ｆへの結合アフィニティーを有するリガンドＬ少なくとも１個およびレシーバーＲよりなる第２の安定な複合体と、複合体Ｆ−Ｌ−ＴおよびＦ−Ｌ−Ｒが形成されるように接触させる。ＴとＲが相互に十分近接している場合に生じるシグナルを測定する。
【００１２】
本発明は更に、ある試料中の同じ固相に第１の固相会合ファクターＦｘと第２の固相会合ファクターＦｙが会合している場合の、Ｆｘ少なくとも１個およびＦｙの同時検出または同時測定のための方法に関する。本発明によれば、試料を、Ｆｘへの結合アフィニティーを有するリガンドＬｘ少なくとも１個およびトランスミッターＴよりなる第１の安定な複合体少なくとも１個、そして更に、Ｆｙへの結合アフィニティーを有するリガンドＬｙ少なくとも１個およびレシーバーＲよりなる第２の安定な複合体に、複合体Ｆｘ−Ｌｘ−Ｔおよび複合体Ｆｙ−Ｌｙ−Ｒが形成されるように接触させる。ＴとＲが相互に十分近接している場合に生じるシグナルを測定する。
【００１３】
好ましい実施態様によれば、安定な複合体Ｌ−Ｔ、Ｌ−Ｒ、Ｌｘ−ＴまたはＬｙ−Ｒは各々粒子を有し、ＬまたはＬｘはＴと共に第１の粒子に固定され、ＬまたはＬｙはＲと共に第２の粒子に固定される。
より好ましくは、固相は細胞、例えば、赤血球、白血球、顆粒球、リンパ球、単球、血小板、または、他の組織または臓器由来の細胞である。しかしながら、本発明によれば、細胞という用語は細菌や寄生虫のような原核生物または真核生物の外因性細胞、または、亜細胞寄生体、例えばウイルスをも指すものとする。
固相会合ファクターとは、固相へ組み込まれたファクター、および、固相に組み込まれていないが他の相互作用により固相と会合するファクターの両方を指すものとする。
考えられる試料としては、体液、組織抽出液、またはex-vivoの培養物である。ここでは、体液とは好ましくは、血液、滑液、脳脊髄液、腹水または尿、特に好ましくは全血または富血小板血漿である。
【００１４】
本発明は更に、Ｆ、Ｆｘおよび／またはＦｙが膜内在性蛋白、膜会合蛋白、糖構造または脂質である方法に関する。ここで膜内在性蛋白は例えばインテグリン、セレクチン、ＭＨＣ複合体由来の蛋白質またはクラスターデシグネーションによる別の知られた蛋白質である。膜会合蛋白は膜に組み込まれてはいないが、特定のリガンド／レセプター相互作用を介して表面上で検出可能であり、例えば、フィブリノーゲンレセプター上のフィブリノーゲン、膜蛋白に対する抗体、膜表面上の炭水化物構造および／または膜蛋白に対する補体因子またはレクチン、または抗原提示細胞上のＭＨＣ複合体中の処理抗原である。膜会合蛋白は更に静電気的相互作用を介して表面上で検出される蛋白、例えば、凝固系の活性酵素、またはアネキシンファミリーの蛋白である。本発明の脂質は当業者に知られた物質であり、アシルグリセロール、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワックス、テルペン、ステロイドおよび／またはプロスタグランジングループから選択される。本発明によれば、表面膜のリン脂質の組成、例えばホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンの比率は、アネキシンファミリーの蛋白のような親和性リガンドを結合することにより、または凝固系の親和性蛋白、例えば活性化ＣまたはＳ蛋白を結合することにより適宜検出される。
【００１５】
本発明は更にリガンドが媒介結合成分を介してＦ、ＦｘまたはＦｙに結合する方法に関する。
本発明は更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙがビオチン−アビジン架橋を介して粒子に結合する方法に関する。
本発明は更にまた、Ｌ、ＬｘまたはＬｙが抗体、抗原、レクチン、補酵素、アポ蛋白、受容体のリガンド、基質類縁体またはアネキシンである方法に関する。
本発明の好ましい実施態様によれば、エネルギーの転移はトランスミッターＴとレセプターＲとの間で起こる。これは例えば、放射活性工程により、または感光性染料の励起およびそれにより起こる直接または間接の電子転移により、例えば活性酵素を用いることにより行うことができる。本発明の更に別の実施態様によれば、レシーバー粒子におけるエネルギー転移により例えば発光反応、好ましくは化学ルミネセンス、または蛍光発光が起こり、これが検出可能であり、そしてトランスミッター粒子とレシーバー粒子の空間的近接度の尺度となる。
【００１６】
本発明によれば特定の系における当業者に知られたエネルギー転移調節物質、例えばダンピング物質、例えば染料または抗酸化剤を添加することにより、トランスミッター粒子とレシーバー粒子との間で必要な最小距離を低減し、これにより測定値／バックグウンド値のシグナル比を改善することができる。
本発明の方法は、例えば、細胞型、サブグループまたは細胞の活性化状態の特徴を調べるため、および、表面マーカーまたは表面抗原、例えば、細胞上の腫瘍形成の過程におけるネオエピトープの検出のために用いることができる。さらにまた、組織のタイピングまたは組織適合性の特定のために用いることができる。特に本発明はまた外因性細胞、一般的には細菌のような病原体の同定に関する。本発明の方法は、クラミジアの同定に特に適している。
【００１７】
「トランスミッター（transmitter)」および「レシーバー（receiver)」の用語は本発明においては、空間的近接域において相互に作用できる生物学的または化学的物質に分類されるものを指し、例えば、光増感剤および化学ルミネセンス体（EP-0515194; Ullman等（1996）Clinical Chemistry 42; 1518-1526）、光増感剤および発蛍光団（WO 95／06877; Bystrak等, (1995), Anal. Biochem. 225: 127-134）または放射性ヨウ素125および発蛍光団（S. Udenfriend等, (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676）、または発蛍光団および発蛍光団（Mathis, G. (1993), Clin. Chem. 39: 1953-1959）または発蛍光団および蛍光クエンチング剤（US 3996345）のようなエネルギー供与体およびエネルギー受容体の形態である。この場合、エネルギーの転移は一方の物質から他方の物質へ起こるが、エネルギー転移の経路となる種々の物質のカスケードも可能である。
【００１８】
トランスミッターとレシーバーとの間の相互作用は、特にエネルギーの転移、即ち、例えば光または電子の放射を用いた、そしてまた反応性化学分子を用いた、トランスミッターとレシーバーとの間のエネルギーの直接の転移である。
更に、トランスミッターとレシーバーとの間の相互作用の考え方は酵素カスケードを指すものとしても理解される。この場合、物質は酵素であり、うち少なくとも１つは別の酵素の基質を与えるものである。
これにはまた、物質の活性が別の物質１種以上により抑制または増強される過程、例えば酵素活性の抑制または増強、または、反応物質により発生した光の抑制、増強または変動（例えば波長シフト）が含まれる。
トランスミッターとレシーバーとの間の効果的な相互作用はこれらが空間的に隣接している場合に、即ち例えば数ミクロンの距離範囲内、特に６００nm未満、好ましくは400nm未満、特に好ましくは２００nmの距離範囲内にある場合に起こる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様におては、トランスミッターとレシーバーとの間の相互作用はエネルギー転移として、例えば以下の手段により生じる。
＊短命分子、例えば一重項酸素（EP 0515194; Ullman等（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5426-5430; Ullman等（1996）Clinical Chemistry 42: 1518-1526, WO 95／06877およびBystrak等（1995）Anal. Biochem. 225: 127-134参照）、
＊低範囲の放射線、例えば放射性β線（Hart & Greenwald（1979）Molecular Immunology 16: 265-267およびUdenfriend等（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676参照）、および／またはFoersterのエネルギー転移（Mathis, G（1993）Clin. Chem. 39: 1953-1959; US 5527684）。
【００２０】
本発明の方法には、粒子表面を調製後に更に修飾したり、そして／あるいは粒子を、例えば蛋白、炭水化物、新油性性物質、生体重合体、有機性重合体またはこれらの混合物の１種以上の共有結合的にまたは吸着により結合した層またはシェルにより被覆することにより、例えば懸濁安定性、貯蔵安定性、形状安定性、またはＵＶ光、微生物または他の破壊性物質への耐性に関する改善を行う実施態様も含まれる。ここで修飾および被覆は同様に反応容器表面および特に蛋白（例えばアルブミンまたは抗体）または細胞構成成分（例えばリン脂質または核酸）のような蛋白成分表面への非特異的結合を低減ないしは抑制するために使用できる。更に修飾および被覆は粒子表面の疎水性または粒子表面の負荷を増大または低減するために使用できる。
【００２１】
本発明の更に別の実施態様は、トランスミッターまたはレシーバーとして、光増感剤、例えばアセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９,１０−ジブロモアントラセン、クロロフィル、バックミンスターフレレン（Buckminsterfullerene）、メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタロシアニンおよび／またはその誘導体、そして、化学ルミネセンス化合物として例えばオレフィン、９−アルキリデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキサン、アリールイミダゾールおよび／またはルシゲニンを用いることを包含し、光増感剤から発生する一重項酸素は化学ルミネセンス化合物を活性化して光を発することができる。さらにまた本発明では、一重項酸素と反応して光放射技術分野でよく知られた試薬と反応できる中間体が得られる物質、例えばルミノールおよびオキサレートエステルを使用することも好適である。
【００２２】
原則として、化学ルミネセンス化合物は３００nmを超える波長領域の光を発する。プラズマ蛍光は５００nmからの領域に属し、５５０nmを超えると除外される。より長い波長が必要な場合は、本発明の化学ルミネセンス化合物は、活性化化学ルミネセンス化合物により励起され、より長い波長で発することのできる発蛍光団と接触させることもできる。適当な発蛍光団は例えば、ローダミン、臭化エチジウム、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル、ユーロピウムと試薬３−（２−チエノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトンとのキレート〔Eu(TTA)3(TTA＝３−（２−チエノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン）〕またはルテニウムと試薬２,２′−ジピリジルとのキレート〔Ru（bpy)3++（bpy＝２,２′−ジピリジル）〕である。
【００２３】
本発明の更に別の実施態様は物質として光増感剤および蛍光化合物を用いることを包含し、光発生のための蛍光化合物は光増感剤により発生する一重項酸素の光発生を活性化したり、あるいは、消光過程では抑制することができる。特に本発明の方法は、例えば１,３−ジフェニルイソベンゾフランのような一重項酸素との反応により光酸化−光漂白されるか、あるいは、光活性前駆体として一重項酸素と反応することにより例えばオキセンウンベリフェリルエーテルまたはウンベリフェリルセレニドのような発蛍光団を生じる蛍光化合物を使用することを包含する。
本発明の方法に適する粒子、光増感剤、化学ルミネセンス物質または蛍光化合物の更に別の例は、特に、EP 0515194, Ullman等 (Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5426-5430 1994）およびUllman等（Clinical Chemistry 42: 1518-1526, 1996, WO 95／06877）を参照することができる。
【００２４】
【発明の詳述】
本発明における固相、例えば細胞は、固相会合ファクター、例えば表面エピトープに対して多価であると考えることができるため、必ずしも２種の結合成分をトランスミッター粒子とレシーバー粒子に適用する必要はない。即ち、トランスミッターとレシーバーの粒子上の結合成分が同じであっても、特定の固相結合ファクター例えば抗原またはリガンドの検出には十分である。従って、特定の細胞型の測定または細胞表面上に特定のファクターの発現を伴う特定の活性化状態の測定が可能である。
【００２５】
更に一方、２種以上の異なる結合成分をトランスミッターとレシーバーの粒子に適用することも可能であり、これにより更に個々のファクター例えば個々の抗原の検出のための識別を更に進めることができる。ただしこれを行うには、有効エネルギー転移の半径は、それが極めて近接したトランスミッターとレシーバーの粒子の間で容易に起こるだけで、そして固相自体の多価度が、例えば結合成分の過剰蓄積により望ましくないエネルギー転移をもたらすことのないような、小さいものでなければならない。有効エネルギー転移の半径は使用する検出系により異なり、この半径を減少させるには、当業者に知られる添加剤を用いて、粒子の性質を変えるか、または、周囲の溶液の消光作用を変えればよい。
【００２６】
図１を参照して、より詳細な説明を以下に行う。図１Ａでは、トランスミッターとレシーバーの粒子にＧＰIIｂに対する同じ抗体を担持させた。トランスミッターからレシーバーへのエネルギーの転移、即ちシグナルの発信は、分子相互間の平均距離がトランスミッターとレシーバーの粒子間のエネルギー転移がなお可能である最大半径より小さくなるようにＧＰIIｂ分子が細胞表面上に密に配列している場合に起こるのみである。そのため、シグナルの転移はＧＰIIｂによる本発明の例における特定の表面エピトープの量（表面上の頻度）の尺度となる。
例えば白血球分画のためのＴ４およびＴ８のような個々の表面抗原、アレルギー反応検出のためのＩｇＥ受容体の測定、または、臓器または組織の移植の前の細胞抽出液または溶解物における組織適合性抗原の測定、または、表面活性蛋白またはネオペプチドの継続性または新たに出現した膜内在性蛋白の変化の検知による細胞の活性化状態の診断に好都合である。
【００２７】
図１Ｂに示すような、トランスミッターとレシーバーの粒子に２種の異なるリガンドを担持させた場合、例えば、トランスミッターはＧＰIIｂに対する抗体、レシーバーにはＧＰIIIａに対する抗体を担持させた場合には、２種の異なるリガンドが相互に十分近接した場合に、即ち、この例では完全なフィブリノーゲン受容体ＧＰIIｂ／IIIａが細胞上に存在する場合に、シグナルが発せられるのみである。
検出対象となりうる他の複合体は例えば、凝固酵素およびそのコファクター、または凝固酵素および生理活性表面、またはＭＨＣ（主要組織適合性複合体）の成分、または免疫細胞上のＴ３、ＴｒおよびＴ４またはＴ８、または補体系、例えば、補体因子Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびビトロネクチン（Ｔ蛋白）よりなるＭＡＣ（膜攻撃複合体）の成分よりなるものである。最後の例では、例えば、補体系の現在の溶解活性の測定を、それ自体の上のＣ９に対する抗体またはこれらの成分の２種以上に対する抗体の組合わせを用いることにより行うことが考えられ、例えば、この方法により複合体形成（例えばＣ５ｂ−Ｃ６、Ｃ５ｂ−Ｃ７、Ｃ５ｂ−Ｃ８、Ｃ５ｂ−Ｃ９）の完成度を識別することが可能となる。
【００２８】
本発明の方法は微生物の検出を簡易化するのにも使用できる。以下に本発明の原理をクラミジア検出を例に説明するが、本発明はこの微生物の検出に限定されるわけではない。
多くのクラミジア検出法が既に報告されており、例えば細胞培養においてクラミジアを培養する方法、免疫検定、核酸を用いる方法（ＤＮＡ検出法）がある。免疫学的試験法は、例えば臨床診断を行うなめのクラミジアの特異的検出を目的としている。ここでは本質的に２通りの方法を用いるが、最初の方法では、酵素標識抗体を予め放出されたクラミジア抗原において測定し、第２の方法では、スライドに固定されたクラミジアを、クラミジアになお結合しつづけている非遊離抗原を用いて蛍光標識抗体により顕微鏡的に検出した。
【００２９】
現在まで知られている全ての方法について、試験のための試料調製中または試験中に数工程を行うことが必要である。その一部を以下に記載するが、試験の準備段階で検出すべきクラミジア抗原を抽出しなければならない。これは洗剤を用いるか（例えばEP-0392865参照）または同時アルカリ条件下に洗剤を用いる（例えばEP-0402396参照）ことにより行う。他の方法は抽出工程の他に、試験中洗浄工程を設けて未結合のクラミジア特異的抗体を除去することが必要である（例えば米国特許No. 4497899号参照）。
他の既知方法では、検出のためのクラミジア特異的抗原を放出するために１５分間１００℃に加熱することが必要である（EP-0371049）。他の種々の方法では抗原を抽出し、免疫複合体を形成し、次にこれを濾過して特異的抗体を介した検出に付し、その後、洗浄段階により未結合抗体を除去する（EP-0451687）。
更に別の既知法では、酵素的に放出された抗原を多孔性膜を通して輸送し、その中でクラミジア特異的抗体が放出された抗原に結合し、次段階の方法により検出にされる（EP-0444303）。
【００３０】
ＬＯＣＩ法を使用することにより、免疫化学的に不溶性の抗原を予備放出しないでクラミジア細胞上で直接検出できることも解った。緩衝液中にクラミジア細胞を分散させ、この細胞懸濁液の一部の中で免疫化学的にトランスミッターとレシーバーの粒子を結合させ、別途洗浄工程を設けることなくシグナルを測定すればよい。２種の異なる抗体がクラミジア細胞中の異なる構造成分を認識するため、本発明による検出を行うためには、シグナルの形成は双方、即ちトランスミッターとレシーバーの粒子の両方が、クラミジア細胞上で相互に隣合わせるように結合することができる。同時にこのことは、クラミジア細胞の構造をもはや時間のかかる方法により破壊する必要がないことを意味しており、他の試験法と同様、クラミジア細胞構造の個々の構成要素が検出できるように所望の抗原を検出できる（実施例１参照）。このことは、必要な労力と誤差原因の低減に加え、前処理のためにこれまでは不可能であった通常の装置への適用を可能にする。
【００３１】
従って本発明はまた試料中に含まれるクラミジア細胞をトランスミッターとレシーバーの粒子に接触させる方法に関し、各々の場合、両方の粒子はクラミジア細胞に対する結合アフィニティーを有するリガンド少なくとも１個を有し、トランスミッター粒子は更にトランスミッターを有し、そしてレシーバー粒子は更にレシーバーを有する。そして、トランスミッターとレシーバーが相互に十分近接した場合に生じるシグナルが測定される。
以下の実施例は本発明を更に説明するためのものであり、本発明をこれに限定しようとするものでは決してない。均一な免疫化学的方法の例としてＬＯＣＩ法を選択した。
【００３２】
【実施例】
懸濁中のクラミジアの表面抗原の検出
ＬＯＣＩ法に従って、トランスミッターとレシーバーの粒子として、増感剤と化学ルミネセンス粒子をそれぞれ用いた。粒子はSyva Business Unit（Behring Diagnostics Inc., San Lose）より入手した。調製は欧州特許 0515194号に記載の方法に従い、Ullman等の方法（Clin Chem. (1996) 42：9, 1518-1526およびNatl. Acad. Sci. (1994) 91, 5426-5430）を参考にして行った。アクセプター粒子はリポ多糖類（LPS）特異的抗体でコーティングした。コーティング方法はUllman等（（1996) 42：9, 1518-1526）に記載の通りにした。これと平行して、主要な外部膜蛋白（MOMP）に対する特異的抗体をビオチンで標識した。増感剤粒子はアビジンでコーティングした。これらの方法は同様にUllman等（(1996) 42：9, 1518-1526）に記載の通りにした。
試験開始前に、クラミジア、アクセプタービーズ、ビオチニル化抗体および増感剤を０.１ＭトリスＨｃｌ；０.５Ｍ ＮａＣｌ；０.０２５Ｍ ＥＤＴＡ；１.６％ ＢＴＡを組成とする緩衝液（pH７.６）で希釈した。
【００３３】
試験を実施するために、成分を混合し、以下の通りインキュベートした。これに必要な装置はUllman等（（1996) 42：9, 1518-1526）に記載の通りである。
クラミジア懸濁液２５μlをアクセプタービーズ（１００μｇ／ml）２５μlと混合し、６分間３７℃でインキュベートした。次にビオチニル化抗体（１０μｇ／ml）３５μlを添加し、混合物を再度６分間３７℃でインキュベートした。次に増感剤粒子（４００μｇ／ml）５０μlを添加し、生じた化学ルミネセンスをルミノメーターで測定した。
比較のために、クラミジアのないテスドバッチを用いた。
２つのバッチのシグナルは以下の通りであった。
試料緩衝液（対照）のシグナル  ：  ８６９８
クラミジア細胞のシグナル      ：  １３２２１
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞表面上の特定のファクターの発現に伴う特定の活性化状態の測定を行なう場合の模式図であり、１Ａはトランスミッターおよびレシーバーの粒子上の同一の抗体を示し、１Ｂはトランスミッターおよびレシーバーの粒子上の異なる抗体を示す。
【図１】
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