(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡにより遺伝子発現を観察するＤＮＡマイクロアレイ法によって
1,4-ジオキサン、ｐ−ノニルフェノール、ホウ酸、N,N-ジメチルホルムアミド、シアン化カリウム、エチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレンテトラアミン、トリエチルアミン、モノクロロ酢酸、フェノール、モリブデン酸ナトリウム、塩化アンチモン(III)、エピクロロヒドリン、o-ニトロフェノール、p-ニトロフェノール、3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール、エチレングリコール、ビスフェノールA、ホルムアルデヒドおよび1,3-ジクロロ-2-プロパノールよりなる群から選択される毒性物質を同定するために用いられる、照合データとしての遺伝子発現解析データを作成する方法であって、
（１）種々の毒性物質について希釈系列を作成し、酵母のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ酵母の生育に影響を与える適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の毒性物質とともに酵母を一定期間培養し、
（３）培養した酵母からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法によりYBR054w、YBR093c、YBR147w、YBR296c、YCL018w、YCR021c、YDL079c、YDL030w、YDL204w、YDL243c、YDL244w、YDR034w-b、YDR070c、YDR277c、YDR342c、YDR343c、YDR369c、YDR405w、YDR444w、YDR534c、YEL011w、YEL039c、YER007w、YER053c、YER067w、YER091c、YER121w、YER150w、YFL014w、YFL057c、YFR053c、YGL121c、YGL158w、YGR003w、YGR035c、YGR043c、YGR087c、YGR088w、YGR213c、YGR224w、YHL047c、YHR085w、YIL057c、YIL165c、YJL052w、YJR134c、YKL071w、YKR097w、YLR134w、YLR279w、YLR303w、YLR327c、YMR090w、YMR096w、YMR180c、YNL160w、YNL194c、YOL151w、YOL162w、YOR049c、YOR153w、YOR178c、YOR190w、YOR298w、YOR382w、YPL054w、YPL250c、YPR002w、YPR037c、YPR167c、YPR200cおよびYPR201w遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）（３）で得られた該遺伝子の発現レベルをそれぞれの毒性物質に対する遺伝子発現解析データとしてまとめる、
ことを特徴とする照合用遺伝子発現解析データの作成方法。
【請求項２】
前記毒性物質の適当な濃度が、毒性物質不存在下での酵母の生菌数と比較して５０−９５％を与える濃度である、請求項１記載の照合用遺伝子発現解析データの作成方法。
【請求項３】
被検試料中の化学物質のなかから1,4-ジオキサン、ｐ−ノニルフェノール、ホウ酸、N,N-ジメチルホルムアミド、シアン化カリウム、エチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレンテトラアミン、トリエチルアミン、モノクロロ酢酸、フェノール、モリブデン酸ナトリウム、塩化アンチモン(III)、エピクロロヒドリン、o-ニトロフェノール、p-ニトロフェノール、3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール、エチレングリコール、ビスフェノールA、ホルムアルデヒドおよび1,3-ジクロロ-2-プロパノールよりなる群から選択される毒性物質を同定する方法であって、
（１）既知の化学物質の希釈系列を作成し、酵母のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ酵母の生育に影響を与える、化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに酵母を一定期間培養し、
（３）培養した酵母からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法によりYBR054w、YBR093c、YBR147w、YBR296c、YCL018w、YCR021c、YDL079c、YDL030w、YDL204w、YDL243c、YDL244w、YDR034w-b、YDR070c、YDR277c、YDR342c、YDR343c、YDR369c、YDR405w、YDR444w、YDR534c、YEL011w、YEL039c、YER007w、YER053c、YER067w、YER091c、YER121w、YER150w、YFL014w、YFL057c、YFR053c、YGL121c、YGL158w、YGR003w、YGR035c、YGR043c、YGR087c、YGR088w、YGR213c、YGR224w、YHL047c、YHR085w、YIL057c、YIL165c、YJL052w、YJR134c、YKL071w、YKR097w、YLR134w、YLR279w、YLR303w、YLR327c、YMR090w、YMR096w、YMR180c、YNL160w、YNL194c、YOL151w、YOL162w、YOR049c、YOR153w、YOR178c、YOR190w、YOR298w、YOR382w、YPL054w、YPL250c、YPR002w、YPR037c、YPR167c、YPR200cおよびYPR201w遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）（３）で得られた該遺伝子の発現レベルをデータ化し、照合用の遺伝子発現解析データを収集し、
（５）被検試料の希釈系列を作成し、酵母のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ酵母の生育に影響を与える、被検試料中の適当な濃度を決定し、
（６）適当な濃度の被検試料とともに酵母を一定期間培養し、
（７）培養した酵母からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法によりYBR054w、YBR093c、YBR147w、YBR296c、YCL018w、YCR021c、YDL079c、YDL030w、YDL204w、YDL243c、YDL244w、YDR034w-b、YDR070c、YDR277c、YDR342c、YDR343c、YDR369c、YDR405w、YDR444w、YDR534c、YEL011w、YEL039c、YER007w、YER053c、YER067w、YER091c、YER121w、YER150w、YFL014w、YFL057c、YFR053c、YGL121c、YGL158w、YGR003w、YGR035c、YGR043c、YGR087c、YGR088w、YGR213c、YGR224w、YHL047c、YHR085w、YIL057c、YIL165c、YJL052w、YJR134c、YKL071w、YKR097w、YLR134w、YLR279w、YLR303w、YLR327c、YMR090w、YMR096w、YMR180c、YNL160w、YNL194c、YOL151w、YOL162w、YOR049c、YOR153w、YOR178c、YOR190w、YOR298w、YOR382w、YPL054w、YPL250c、YPR002w、YPR037c、YPR167c、YPR200cおよびYPR201w遺伝子の発現レベルを測定し、
（８）（７）で得られた該遺伝子の発現レベルをデータ化した遺伝子発現解析データを収集し、
（９）前記収集された遺伝子発現解析データと照合用の遺伝子発現解析データを比較することによって、前記被検試料の毒性物質を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人類がこれまでに作りだした化学物質は膨大な数にのぼり、さらに年々新しい化学物質が開発されている。これら化学物質は現代生活のあらゆる面で利用され、人類の生活向上に役立っている。その反面、化学物質の中には、その製造、流通、使用、廃棄等の様々な段階で環境中に放出され、環境中での残留、食物連鎖による生物学的濃縮などを通じ、人の健康や生態系に有害な影響を及ぼすものがあり、環境汚染は社会問題化している。よって、化学物質について人体や生態系に与える影響を評価する要請がある。
【０００３】
その評価方法として、従来、主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標とするバイオアッセイが行われている。しかし、これらの方法は、環境中の化学物質による毒性の有無が判定できるに過ぎない。環境中の化学物質による毒性の有無のみならず、毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するアプローチとして、種々の濃度の複数種の指標化学物質とその存在下における複数種の指標微生物の生育状態との関係付けを利用する手法が報告されている（特許文献１：特開２００１−２３８６９４）。また、特定の毒性指標（エンドポイント）を検出するために開発されたバイオアッセイ法もある。例えば、既知発がん性物質の９割以上が陽性となる遺伝子突然変異試験であるames法（非特許文献１：「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、1989第３刷、p.319）、および内分泌撹乱物質のスクリーニングのため、生体内ホルモンが受容体に結合したときに起きる遺伝子転写活性を測定する試験法（非特許文献２：Yamasaki K, Takeyoshi M, Yakabe Y, Sawaki M, Imatanaka N, Takatsuki M.: Comparison of reporter gene assay and immature rat uterotrophic assay of twenty-three chemicals. Toxicology. 2002 Jan 15;170(1-2):21-30.）である。しかし、これらの方法は、特定の毒性を有する化学物質の検出には有効ではあるが、その毒性指標以外の毒性を有する化学物質の検出を行うことは出来ない。
【０００４】
DNAマイクロアレイ法とは、数千から数万の遺伝子をスライドガラスもしくはシリコン基板上に異なるスポットとして固定させたものに、DNAあるいは細胞由来のmRNAもしくはmRNAを鋳型にして合成したcDNAをハイブリダイズさせ、DNAもしくはRNAの発現状態を定量的もしくは定性的に解析する方法である。（非特許文献４：DNAマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、2000、pp13）
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６９４号公報
【非特許文献１】
「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、1989第３刷、p.319
【非特許文献２】
Yamasaki K, et al., Toxicology. 2002 Jan 15;170(1-2):21-30.
【非特許文献３】
Mao X, et al., Curr Microbiol 2002 Jul;45(1):37-40
【非特許文献４】
DNAマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、2000、pp13
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境中の化学物質による毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するための方法を提供する。さらに本発明は、合成化学物質の毒性の程度および性質の評価、浄化処理の効果確認の方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる膨大な遺伝子発現情報を利用すれば、環境中の毒性物質が簡便に同定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は一つの態様として、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法を提供する。
本発明の毒性物質同定方法においては、被検試料についてデータ化された遺伝子発現解析データに対し、照合される遺伝子発現解析のデータベースが重要である。本発明は別の態様として、そのようなデータベースおよびその使用方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の毒性物質同定方法を行うには、被検試料についてデータ化された遺伝子発現解析データに対して照合されるデータベースが用いられる。
Ｉ．データベース
本発明のデータベースを作成するには、
（１）種々の毒性物質について希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の毒性物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた発現レベルを遺伝子発現解析データとしてまとめる。
以下、各工程について説明する。
【００１０】
（１）毒性物質の適当な濃度の決定
毒性物質の毒性を測定するには、希釈系列を作成し、適当な濃度の試料を選択する。これは、毒性物質によって毒性を示す濃度が異なるため、同じ重量％またはモル濃度の試料を試験しても意味の有る結果が得られない為である。また、微生物の生育に影響を与える濃度は、厳密には実験ごとに異なる。そこで、同じ毒性の影響を与える濃度を厳密に比較するという観点から、遺伝子発現解析データを収集する同一試料について毒性物質の適当な濃度を決定する。
【００１１】
毒性物質の濃度は、濃すぎると抽出するｍＲＮＡの状態が悪く、DNAマイクロアレイ解析の結果が得られないという問題を生じる。
よって、本発明において毒性物質の適当な濃度は、「微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える」適当な濃度である。ここに、「ｍＲＮＡが抽出可能」とは、ｍＲＮＡの抽出が困難ではない状態を示す。過度の化学物質負荷はｍＲＮＡの抽出を困難とし、マイクロアレイの結果が得られない場合がある。これは、化学物質負荷により細胞の代謝速度が変わること、ＲＮＡ分解酵素活性が高くなること、また化学物質がｍＲＮＡに直接損傷を与える等、さまざまな理由が考えられる。毒性物質の適当な濃度は、毒性物質不存在下での微生物の生菌数と比較して５０−９５％を与える濃度が好ましい。
この濃度は例えば、微生物のコロニー形成単位（CFU）を測定することにより決定できる。微生物を適当な培地、例えばYPD培地にて対数増殖期（OD660=0.8〜1.0）となるまで培養し、この時のCFUを測定する（このCFUをCFU-beforeと呼ぶ）。
毒性物質の希釈系列を作成し、対数増殖期にある細胞（OD660=0.8〜1.0）に負荷し、培養する。希釈系列は、通常、２倍または３倍希釈し、異なる濃度のものを作成する。
化学物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とする。２時間後、各希釈系列の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、数日後にCFUを測定する（化学物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料CFU-contと呼ぶ）。
【００１２】
酵母の場合、倍加時間（doubling time）は2時間程度なので、CFU-contは2時間培養によりCFU-beforeの２倍程度になる。希釈系列の化学物質を負荷した場合、細胞の生育に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの50%から95％を与える濃度、望ましくは75.5%に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する。細胞が死滅する濃度ではCFUは0%であり、生育に影響を与えない濃度ではCFUは対照区と等しく100%となる。CFUにより定めた濃度の化学物質を負荷し凍結した細胞試料について以下のようにしてDNAマイクロアレイ解析を行う。
【００１３】
あるいは、CFUは結果が出るまで時間がかかるので、「微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える」適当な濃度は、他の方法により生細胞のみを計数できる方法で決定できる。例えば、染色により生細胞のみを染色できるキットが市販されており（LIVE/DEAD Yeast Viability Kit L-7009, Molecular probe社）、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて計数できる。
【００１４】
データベース作成に用いる「毒性物質」は、農薬、医薬品、染料、塗料、接着剤等の産業用途を有し環境に放出され可能性の高い化学物質および消毒・焼却の過程により非意図的に生成される化学物質であり、毒性を有することが懸念されるものである。これらの物質の毒性作用として、内分泌撹乱物作用、変異原性、発がん性、遺伝毒性、生態毒性、免疫毒性、細胞機能障害毒性等が知られている。例えば、図１に示す物質が挙げられる。
データベース作成の際には、選択する毒性物質は多ければ多い方が良いが、好ましくは20個から30個以上、選択する。
【００１５】
（２）微生物の培養
次に、先に決定した適当な濃度の毒性物質とともに微生物を一定期間培養する。
データベース作成に用いる「微生物」は、天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。ここに、野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
「微生物の培養」は通常、２時間、２５℃にて行う。
【００１６】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ法による特定遺伝子の発現レベル測定
ＤＮＡマイクロアレイは１枚のスライドガラス上に数千から数万の遺伝子を異なるスポットとして固定させたものである。ここに、細胞由来のmRNAもしくはmRNAを鋳型にして合成したcDNAをハイブリダイズさせ、遺伝子の発現パターンを同時に観察する。
遺伝子発現解析に用いるマイクロアレイはスポット用DNAとしてクローン、PCRによる増幅断片、合成オリゴヌクレオテチドなどを使用して作製できる。また、マイクロアレイはaffimetrix社、株式会社DNAチップ研究所、宝酒造株式会社などから市販されている。
【００１７】
本発明のデータベース作成の際には、常法により上記培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、当該微生物の特定遺伝子の発現レベルをＤＮＡマイクロアレイ法により測定する。特定遺伝子は、用いるマイクロアレイにより異なるが、特定遺伝子は、用いるマイクロアレイにより異なるが、酵母細胞は約6000の全遺伝子が一枚のスライドグラス上にスポットされているものが市販されている。
ＤＮＡマイクロアレイ法のさらなる説明はhttp://www.grt.kyusyu-u.ac.jp/MicroArray/array-doc/array.htmに詳しい。
【００１８】
（４）遺伝子発現解析データの収集とまとめ
対照区との遺伝子発現を比較する場合、対照区と処理区のｍRNAをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で蛍光標識したヌクレオチドを用いて逆転写し、逆転写の際に異なる蛍光色素を取り込ませた標識ｃDNAを得る。こうして得られた２種類のｃDNAを１枚のDNAマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせ、マイクロアレイ用のスキャナー（GenePix(Axon Instruments)、等）で画像データとして読み取り、マイクロアレイ上の蛍光発光量を測定する。
測定されたマイクロアレイの画像データから各スポットの定量を行わなければいけない。一般的にはスキャナーに定量化のソフトウェアが付随されている。そのソフトウェアの使い勝手は様々であるが、一般にはスポット測定のためのゲージの作成や、バックグラウンド測定法の指定などを行う。各々のスポット上の対照区と処理区の蛍光強度を別々に測定し、スポット以外の場所の蛍光強度からバックグラウンドを算出してノイズとして差し引く。処理区の蛍光強度と対照区の蛍光強度を求め、発現mRNAの強度比すなわち処理区における発現ｍRNA量／対照区における発現ｍRNA量を算出するという解析を行う。ここで得られた数値データを蓄積して、データベース化する。本明細書の最後尾の表がデータ例である。
このようにして、収集・解析により得られる遺伝子発現情報は大量なので、遺伝子発現データを分析、視覚化するにはワークベンチソフトウェア（GeneSpring(Silicon Genetix社)など）を用いる。これは、実験を行った処理区と対照区の間の発現の違いを求める、さらに遺伝子名と機能を関連づけたデータベースを用いてより生物学的な解析を行うといった機能を有するソフトウェアである。
【００１９】
マイクロアレイで得られたデータの解析手法の一つとして、クラスタリングが挙げられる。クラスタリングとは多くのデータをグループに分ける統計的手法であり、DNAマイクロアレイの遺伝子発現情報解析以外にも広く用いられている方法である（DNAマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、2000、pp134）。データ間の類似度（例えばユークリッド距離あるいは相関係数など）を定義し、その類似度を用いてクラスタリングを行えば、同じような性質を持つ遺伝子の集合を得ることができる。図２はGeneSpringを用いたデータ解析により得られた化学物質負荷時の遺伝子発現データをクラスタリングして得られた系統樹である。GeneSpringでは系統樹と一緒に遺伝子ごとの誘導、抑制が色分けされ遺伝子発現状態を視覚化した図も示される。
【００２０】
電子情報化されたデータベースはコンピューター等に入力すれば、被検試料から得られるデータとの照合に当たり簡便に利用できる。この態様において、本発明は、本発明のデータベースが入力された装置をも提供する。
【００２１】
本発明は、上記のようにして作成された本発明データベースの使用方法であって、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法においてその遺伝子発現解析データに対して照合する方法をも提供する。
【００２２】
２）毒性物質の同定方法
本発明はさらに、被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）それを、本発明のデータベースと照合し、
それにより、該データベースにおけるデータと同じデータを示す該被検試料中の化学物質を、該データベース中の該当する毒性物質と同定する方法、に関する。
【００２３】
本発明はまた、被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）その遺伝子発現解析データに基づいて、該被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定する方法に関する。
【００２４】
本発明の毒性物質の同定方法において「化学物質の適当な濃度」の決定は上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。ただし、ここでは、被検試料の希釈系列の作成に際し、必要なら試料を一旦濃縮した後に希釈系列を作成することができる。
本発明の毒性物質の同定方法において「毒性物質」、「微生物およびその培養」、「ＤＮＡマイクロアレイ法」は、上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。
【００２５】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２６】
実施例１
酵母におけるデータベースの作成
１．化学物質濃度の決定
酵母細胞はSaccharomyces cerevisiae S288C (IFO1136, αSUC2 mal mel gal2 CUP1)を使用した。酵母細胞をYPD培地(2% ポリペプトン、1% 酵母エキスおよび2%グルコース) を用いて25℃で対数増殖期（OD660=0.8〜1.0）となるまで培養した。培養液の一部を取り、YPD寒天培地（YPD培地に2%の寒天を加えてオートクレーブで加熱滅菌し、プラスチックシャーレに注ぎ固まらせた固体培地）に播種し、コロニー形成単位（以下、CFU）を測定した。この時のCFUをCFU-beforeとする。
化学物質の希釈系列をそれぞれ作成し、対数増殖期にある細胞（OD660=0.8〜1.0）に負荷し、25℃で２時間培養した。この時、化学物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とした。２時間後、各希釈系列の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定した。化学物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料CFU-contと呼ぶ。
【００２７】
試料の残りについて遠心を行い細胞を収集し、-80 oCで凍結保存する。酵母の倍加時間は2時間程度なので、CFU-contは通常CFU-beforeの２倍程度になる。希釈系列の化学物質を負荷した場合、細胞の生育に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの75.5%に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する。CFUにより定めた濃度の化学物質を負荷し凍結した細胞試料について以下のようにしてDNAマイクロアレイ解析を行った。
【００２８】
２．DNAマイクロアレイ解析
細胞試料に、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。
この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３’末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit,Takara）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014,GibcoBRL）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ(Amersham-Pharmacia Biotech)を取りりこませて標識ｃＤＮＡを得た。
【００２９】
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（10mM Tris・HCl/1mM EDTA, pH8.0）に溶解し、ＤＮＡマイクロアレイに滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ研究所製）を用いた。 このアレイは5880のcDNAプローブ（Research Genetics)のプライマーを用いてPCR増幅したもの）がスライドグラス上に載っている。にこのＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度を共焦点レーザースキャナー( ScanArray 4000 system:GSI Lumonics)で読み取った。
得られたイメージデータはGenePix (Axon Instruments)により解析を行った。それぞれのスポットの蛍光強度からバックグランウンドを差し引き、化学物質を負荷しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量とした。得られたデータを明細書の最後尾に表として示す。
表中のデータをさらにGeneSpring（Silicon Genetics社、Redwood ）を用いて解析を行った。GeneSpringは統計学的な手法の一つであるクラスター解析機能を有する。クラスター解析により、各化学物質負荷時の遺伝子発現パターンの類似性を視覚化できる（図２）。図２はいずれかの化学物質負荷により10倍以上誘導された遺伝子についてクラスター解析を行い得られたクラスター解析図である。なお、図２には表には無いデータもあわせてクラスタリングしている。
【００３０】
酵母に対する毒性作用が似ている化学物質は、同じような遺伝子発現パターンを有することが予想される。カドミニウムとヒ素は共に酵母では小胞へ輸送されることにより無毒化されることが知られている（Li ZS, Lu YP, Zhen RG, Szczypka M, Thiele DJ, Rea PA.： A new pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1-catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jan 7;94(1):42-7.）(Rosen BP. : Families of arsenic transporters. Trends Microbiol. 1999 May;7(5):207-12.)。SDS（CAS:151-21-3）は界面活性剤であり、ラウンドアップ（図中RUと表示）はその成分の59％は界面活性剤である（ラウンドアップ：（N-ホスホメチル）グリシナートアンモニウム41.0％、界面活性剤59％）。さらに、チウラム（CAS:137-26-8）、マネブ（CAS:12427-38-2）、ジネブ（CAS:12122-67-7）はいずれもチオカルバメート構造を有する農薬である。図２は、これらの組みはいずれも似た遺伝子発現パターンを有することを示している。
【００３１】
実施例２
被検試料中の毒性物質同定
被検試料について、実施例１と同様、適当な濃度を決定し、適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、ｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、データ化し、遺伝子発現解析データを収集する。それを実施例１により作成したデータベースと照合することにより、同じ遺伝子発現パターンを示す化学物質が特定でき、被検試料中に存在し得る化学物質が推定される。
「照合」するには、表の化学物質のデータのうち、5倍以上誘導される遺伝子を抽出し、実験間の階層型クラスタリングを行う。
【００３２】
被検試料中に複数の毒性物質が含まれる場合、毒性の種類の組合わせによって微生物が示す応答は相加もしくは相乗されることがある。しかし、実際的には同じ影響濃度の複数の毒性物質という条件は非常に稀であるため、一番毒性の強い状態の化学物質が検出されると考えられる。また必要に応じて一定の割合で複数化学物質を混合したものを被験試料として希釈系列を作成し、単一の化学物質の場合と同様に遺伝子発現解析を行い、データベース化を行う。このデータベースを用いれば、複合毒性を有する化学物質または複数の毒性物質を含む試料の毒性評価に有用である。
【００３３】
以下の表は、ＤＮＡマイクロアレイ法による得られる遺伝子発現解析データの例である。左端の列は特定遺伝子名であり、一列に一種類の化学物質（一番上の行に記載）の遺伝子発現データを記載している。数値は、化学物質負荷時のｍRNA発現量を化学物質を負荷しないｍRNA発現量で割った値である。表中、括弧内の数字は図１の数字に対応する。
【表１】
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【表２】
0004290438.tif 000003
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
0004290438.tif 000009
【表９】
0004290438.tif 000010
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
0004290438.tif 000020
【表２０】
0004290438.tif 000021
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
0004290438.tif 000093
【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
0004290438.tif 000106
【表１０６】
0004290438.tif 000107
【表１０７】
0004290438.tif 000108
【表１０８】
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【表１０９】
0004290438.tif 000110
【表１１０】
0004290438.tif 000111
【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
0004290438.tif 000114
【表１１４】
0004290438.tif 000115
【表１１５】
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【表１１６】
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【表１１７】
0004290438.tif 000118
【表１１８】
0004290438.tif 000119
【表１１９】
0004290438.tif 000120
【表１２０】
0004290438.tif 000121
【表１２１】
0004290438.tif 000122
【表１２２】
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【表１２３】
0004290438.tif 000124
【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
0004290438.tif 000127
【表１２７】
0004290438.tif 000128
【表１２８】
0004290438.tif 000129
【表１２９】
0004290438.tif 000130
【表１３０】
0004290438.tif 000131
【表１３１】
0004290438.tif 000132
【表１３２】
0004290438.tif 000133
【表１３３】
0004290438.tif 000134
【表１３４】
0004290438.tif 000135
【表１３５】
0004290438.tif 000136
【表１３６】
0004290438.tif 000137
【表１３７】
0004290438.tif 000138
【表１３８】
0004290438.tif 000139
【表１３９】
0004290438.tif 000140
【表１４０】
0004290438.tif 000141
【表１４１】
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【表１４２】
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【表１４３】
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【表１４４】
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【表１４５】
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【表１４６】
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【表１４７】
0004290438.tif 000148
【表１４８】
0004290438.tif 000149
【表１４９】
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【表１５０】
0004290438.tif 000151
【表１５１】
0004290438.tif 000152
【表１５２】
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【表１５３】
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【表１５４】
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【表１５５】
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【表１５６】
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【表１５７】
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【表１５８】
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【表１５９】
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【表１６０】
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【表１６１】
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【表１６２】
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【表１６３】
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【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【表１６７】
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【表１６８】
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【表１６９】
0004290438.tif 000170
【表１７０】
0004290438.tif 000171
【表１７１】
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【表１７２】
0004290438.tif 000173
【表１７３】
0004290438.tif 000174
【表１７４】
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【表１７５】
0004290438.tif 000176
【表１７６】
0004290438.tif 000177
【表１７７】
0004290438.tif 000178
【表１７８】
0004290438.tif 000179
【表１７９】
0004290438.tif 000180
【表１８０】
0004290438.tif 000181
【表１８１】
0004290438.tif 000182
【表１８２】
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【表１８３】
0004290438.tif 000184
【表１８４】
0004290438.tif 000185
【表１８５】
0004290438.tif 000186
【表１８６】
0004290438.tif 000187
【表１８７】
0004290438.tif 000188
【表１８８】
0004290438.tif 000189
【表１８９】
0004290438.tif 000190
【表１９０】
0004290438.tif 000191
【表１９１】
0004290438.tif 000192
【表１９２】
0004290438.tif 000193
【表１９３】
0004290438.tif 000194
【表１９４】
0004290438.tif 000195
【表１９５】
0004290438.tif 000196
【表１９６】
0004290438.tif 000197
【表１９７】
0004290438.tif 000198
【表１９８】
0004290438.tif 000199
【表１９９】
0004290438.tif 000200
【表２００】
0004290438.tif 000201
【表２０１】
0004290438.tif 000202
【表２０２】
0004290438.tif 000203
【表２０３】
0004290438.tif 000204
【表２０４】
0004290438.tif 000205
【表２０５】
0004290438.tif 000206
【表２０６】
0004290438.tif 000207
【表２０７】
0004290438.tif 000208
【表２０８】
0004290438.tif 000209
【表２０９】
0004290438.tif 000210
【表２１０】
0004290438.tif 000211
【表２１１】
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【表２１２】
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【表２１３】
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【表２１４】
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【表２１５】
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【表２１６】
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【表２１７】
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【表２１８】
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【表２１９】
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【表２２０】
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【表２２１】
0004290438.tif 000222
【表２２２】
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【表２２３】
0004290438.tif 000224
【表２２４】
0004290438.tif 000225
【表２２５】
0004290438.tif 000226
【表２２６】
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【表２２７】
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【表２２８】
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【表２２９】
0004290438.tif 000230
【表２３０】
0004290438.tif 000231
【表２３１】
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【表２３２】
0004290438.tif 000233
【表２３３】
0004290438.tif 000234
【表２３４】
0004290438.tif 000235
【表２３５】
0004290438.tif 000236
【表２３６】
0004290438.tif 000237
【表２３７】
0004290438.tif 000238
【表２３８】
0004290438.tif 000239
【表２３９】
0004290438.tif 000240
【表２４０】
0004290438.tif 000241
【表２４１】
0004290438.tif 000242
【表２４２】
0004290438.tif 000243
【表２４３】
0004290438.tif 000244
【表２４４】
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【表２４５】
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【表２４６】
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【表２４７】
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【表３４０】
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【表３４９】
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【表３５０】
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【表３５１】
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【表３５３】
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【表３５９】
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【表３６０】
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【表３６１】
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【表３６２】
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【表３６３】
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【表３６４】
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【表３６５】
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【表３６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の毒性物質同定方法およびデータベース作成に用いることのできる毒性物質の例示である。
【図２】  遺伝子発現解析データのクラスター解析図である。
【図１】
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【図２】
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