(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的であり、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する２Ｃ１０である抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項２】
捕獲収集工程において、抗体を該抗体と親和性を有する固相に結合させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる請求の範囲第１項に記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項３】
固相が、プロテインＡカラムである請求の範囲第２項に記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項４】
捕獲収集工程において、抗体を予め固相に結合させておき、試料を該固相と接触させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる請求の範囲第１項に記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項５】
単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を回収してモノヌクレオソームを単離精製する請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項６】
捕獲収集工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項７】
解離回収工程後、単離精製工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項８】
ヌクレアーゼが、マイクロコッカル・ヌクレアーゼである請求の範囲第６又は第７項に記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項９】
細胞を低塩濃度の溶液中で破砕させ、溶液中にヌクレオソームを放出させる放出工程と、
前記ヌクレオソームを収集する収集工程と、
収集した前記ヌクレオソームを低塩濃度の溶液に懸濁し、モノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理するヌクレアーゼ処理工程と、
前記ヌクレアーゼ処理後の溶液からモノヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的であり、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する２Ｃ１０である抗体を用いて、及び／又は分子量に基づいて製造する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項１０】
単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を分離する請求の範囲第９項に記載のモノヌクレオソームの製造方法。
【請求項１１】
試料中に含まれるヌクレオソームを捕獲収集するための該ヌクレオソームに特異的であり、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する２Ｃ１０である抗体と、
捕獲収集したヌクレオソームから分子量に基づきモノヌクレオソームを単離するためのカラムと、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソーム製造用キット。
【請求項１２】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により被検試料から得たモノヌクレオソームより被検ヒストンを回収し、該被検ヒストンの電気泳動パターンと対照ヒストンの電気泳動パターンとを比較することを含むことを特徴とするヒストン検査方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１４】
モノヌクレオソームが、アポトーシス由来のヌクレオソームである請求の範囲第１３項に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１５】
被検試料が、自己免疫病患者の血清又は血漿である請求の範囲第１３項又は第１４項に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１６】
固相化工程において、固相化したモノヌクレオソームを少なくともスキムミルクを含むブロッキング液でブロッキングさせ、反応工程において、試料を少なくともスキムミルクを含む反応液で稀釈してから該試料を、前記固相化されたモノヌクレオソームと反応させる請求の範囲第１３項から第１５項のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１７】
反応液が、トリス、ＮａＣｌ、ＮａＮ３、血清アルブミン、スキムミルク、及びＥＤＴＡを含有する請求の範囲第１６項に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１８】
測定工程において、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として反応させる請求の範囲第１３項から第１７項のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造したモノヌクレオソームを固相化してなる固相と、緩衝液と、プレート及びカラムのいずれかとを含むことを特徴とする自己免疫病診断用キット。
【請求項２０】
試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的であり、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する２Ｃ１０である抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
単離・精製されたモノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離・精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法からなるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法であって、試料がヒト由来の試料であるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡをプレート上に固相化する固相化工程と、
を含むことを特徴とするＤＮＡプレート製造方法。
【請求項２３】
固相化工程において、プレート上に、ヌクレオソームＤＮＡを０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加する請求の範囲第２２項に記載のＤＮＡプレート製造方法。
【請求項２４】
プレート上に、請求の範囲第２０項又は第２１項に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであってヒト由来のヌクレオソームＤＮＡを、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加することにより固相化することを特徴とするＤＮＡプレート製造方法。
【請求項２５】
プレート上に、請求の範囲第２０項又は第２１項に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであって、ヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなるＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする抗ＤＮＡ抗体測定法。
【請求項２６】
プレート上に、請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームであって、ヒト由来のモノヌクレオソームから単離精製されたヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなるＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする抗ＤＮＡ抗体測定法。
【請求項２７】
モノヌクレオソームは、純度が９８％以上である請求の範囲第２６項に記載の抗ＤＮＡ抗体測定法。
【請求項２８】
ヌクレオソームＤＮＡが、ヌクレオソーム構成２本鎖ＤＮＡであり、ヌクレオソームＤＮＡの平均鎖長が１４５ｂｐ以上２００ｂｐ以下である請求の範囲第２５項から第２７項のいずれかに記載の抗ＤＮＡ抗体測定法。
【請求項２９】
ヌクレオソームＤＮＡが、プレート上に直接固相化されてなる請求の範囲第２５項から第２８項のいずれかに記載の抗ＤＮＡ抗体測定法。
【請求項３０】
プレートが、ポリスチレンを含んでなる請求の範囲第２５項から第２９項のいずれかに記載の抗ＤＮＡ抗体測定法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、自己免疫病診断に好適なモノヌクレオソーム及びヌクレオソームＤＮＡ、並びに前記モノヌクレオソーム及び前記ヌクレオソームＤＮＡのいずれかを利用する診断方法に関し、更に詳しくは、前記モノヌクレオソーム及びヌクレオソームＤＮＡの効率的な製造方法、前記モノヌクレオソオームの製造方法により製造され診断等に好適なモノヌクレオソーム、前記モノヌクレオソームを効果的に製造し得るモノヌクレオソーム製造用キット、モノヌクレオソームの分析等に有用なヒストン検査方法、前記モノヌクレオソームを含むヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法、簡便かつ確実な自己免疫病診断方法、取扱性に優れた自己免疫病診断用キット、前記ヌクレオソームＤＮＡを有し自己免疫病診断等に好適なＤＮＡプレート、前記ＤＮＡプレートの効率的な製造方法、及び、自己免疫病診断等に好適な抗ＤＮＡ抗体測定法に関する。
背景技術
ヌクレオソーム（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）とは、クロマチン（染色質）の基本構造をなす単位構造体である。ヌクレオソームは、ヒストンＨ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３及びＨ４各２分子ずつの会合体であるヒストン８量体の周りにＤＮＡが１．７５巻回してなるヌクレオソームコアと、ＤＮＡの巻き始めと巻き終わりの部位に結合した１分子のＨ１ヒストンとで構成されている。Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３及びＨ４ヒストンは、主として分子中央からＣ末端側で相互作用し、Ｎ末端領域でＤＮＡとイオン結合している。各ヌクレオソームは、リンカーＤＮＡにより互いに連結され、規則的に配置している。細胞より単離した核をヌクレアーゼ処理すると、リンカーＤＮＡが切断され、ヌクレオソームを単位として単量体（即ち、モノヌクレオソーム）、及び二量体、三量体等の多量体が切り出される。
前記単量体のリンカーＤＮＡを完全に切断すると、Ｈ１ヒストンが離脱し、その他の４種のヒストン８分子の会合体と１４６塩基対ＤＮＡとを含む、直径１１ｎｍ、高さ５、５ｎｍの円筒形のヌクレオソームコアとなる。ヌクレオソームは連なって直径約１ｎｍの繊維（ヌクレオフィラメント）を形成し、更に高次構造をとることにより直径３０ｎｍの繊維を形成していると考えられている。
前記ヌクレオソームの概念及び実体は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．：クロマチン構造：ヒストン及びＤＮＡの反復単位（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ａ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８４：８６８−８７１（１９７４）によって明確にされ、ここからヌクレオソーム研究の歴史がスタートした。
ヌクレオソームの分離・精製については、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．ら；ヌクレオソーム及びクロマチンの調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ），Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７０：３−１４（１９８９）に記載されている。これは、臓器又は組織から細胞核を分離し、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；以下、ＭＮと略称する）で消化し、ショ糖濃度勾配・超遠心法によってモノヌクレオソームからポリヌクレオソームまでを時間をかけて分離するという古典的な方法である。
前記Ｋｏｒｎｂｅｒｇらの方法を簡易化したものとしては、Ｗｉｄｌｕｎｄ，Ｈ．Ｒ．ら；ゲノムヌクレオソーム・ポジショニング配列の同定と解析（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ），Ｊ．Ｍｏ．Ｂｉｏｌ．，２６７：８０７−８１７（１９９７）に記載されている。
しかし、この方法は、クロマチンからヒストンＨ１を除去し、ＭＮで切断されたヌクレオソームをアガロースゲル電気泳動で分離した後、ゲルを切り出してヌクレオソームを抽出することが必要であり、操作が煩雑な上に時間も要するという問題があった。また、ヌクレオソームの回収率も純度も低く、リンカーＤＮＡを回収することも不可能であるという問題があった。
なお、従来、二本鎖ＤＮＡに特異的であると信じられていた４種類のモノクローナル抗体を詳細に解析した結果、その２種類が二本鎖ＤＮＡよりもヌクレオソームに強い親和性を有する、抗ヌクレオソーム抗体であったことが明らかにされた（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｓｔｅｍｍｅｒら；二本鎖ＤＮＡ及びヒストンＨ３の短いセグメントに対する幾つかのモノクローナル抗ヌクレオソーム自己抗体の二重活性（Ｄｕａｌｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２１２５７−２１２６１（１９９６）参照）。
Ｆｒａｎｅｋ，Ｆ．及びＤｏｒｎｉｃｏｖａ，Ｊ．，タンパク質を含まないハイブリドーマ細胞培養上清中に生じるヌクレオソーム：プログラムされた細胞死の実証（Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｏｃｃｕｒｒｌｉｎｇ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ），ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．２８４：２８５−２８７（１９９１）には、抗ＤＮＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養液中にヌクレオソームとモノクローナル抗体との免疫複合体が形成されることが報告されている。
最近、膠原病である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の病態形成に重要と考えられている抗クロマチン抗体産生に関連して、ヌクレオソームの形態を保持したまま細胞が崩壊してゆくアポトーシスとの関係が注目されている。生体は血液細胞を例に取り上げても、一分間に少なくとも百万細胞単位で生死を繰り返している。その一方の死がアポトーシスである。このようなアポトーシスに由来するヌクレオソームが抗ヌクレオソーム抗体産生及び抗ＤＮＡ抗体産生のための自己抗原として作用しているという説が注目されるようになった（総説としては、Ａｍｏｕｒａ，Ｚ．ら，ＳＬＥにおけるヌクレオソームの重要な役割［Ｔｈｅ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｌｎｐｕｓ］，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４２：８３３−８４３（１９９９）参照）。
また、全身性エリテマトーデスの早期診断・病態把握の上で、抗ＤＮＡ抗体と並んで抗ヌクレオソーム抗体が非常に重要な臨床的意義を有することが報告されている（Ｃｏｒｉｓｔｓｉｄｉｓ，Ｇ．Ｎ．ら、ヌクレオソームの糸球体取り込み：レセプター仲介メサンギウム細胞結合の証拠［Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ］，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，４７：１２５８−１２６５（１９９５）；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ，Ｒ．Ｗ．ら、ネズミＳＬＥにおける抗クロマチン自己抗体の起源と産生は自己抗原によるＴ細胞依存性免疫による［Ｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｈｒｏｍａｔｉｎａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎ］，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：１６８７−１６９６（１９９３）；及びＡｍｏｕｒａ，Ｚ．ら、ＳＬＥモデルであるＭＲＬ／ｌｐｒ及びその対照として使われるＭＲＬ／ｎが蛋白尿を呈する場合、抗ヌクレオソーム抗体は抗ＤＮＡ抗体や抗ヒストン抗体に先んじて検出される［Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ  ａｎｄ／ｏｒ  ａｎｔｉｈｉｓｔｏｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ＭＲＬ−Ｍｐ  ｌｐｒ／ｌｐｒ  ａｎｄ  ＋／＋  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ］，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３７：１６８４−１６８８（１９９４）参照）。
また、抗ヌクレオソーム自己抗体の正確な検出にはアポトーシス由来のヌクレオソームが理想とされる。自然又は病的状態で生じるアポトーシスの結果得られるヌクレオソームと、正常な構造を保持しているクロマチンを人工的にエンドヌクレアーゼで切断して得られたヌクレオソームとでは、詳細な点で構造が異なっていると考えられる。自己免疫現象を考える場合、アポトーシスによって得られたヌクレオソームは種々の修飾を受け、いわゆる自己抗原性を獲得し易くなると考えられる。したがって、代表的自己免疫疾患であるＳＬＥで最近注目されている抗ヌクレオソーム抗体の出現は、このような修飾ヌクレオソームが抗原になっていると考えられる。修飾ヌクレオソームの本体は、コアヒストンの修飾、例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、ユビキチン化などが考えられる。修飾ヌクレオソームが高純度で単離できれば、修飾の状態が１５〜１７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいは０．５％アガロースゲル電気泳動などによる移動度の変化から検索可能である。
このような、自己免疫疾患のメカニズムの解明のためには、自己抗原となり得る修飾ヌクレオソームを高純度・高収率で単離することができる方法が必要とされ、従来のヌクレオソームの単離・精製方法では不十分であるという問題があった。
一方、全身性自己免疫疾患、なかでも全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断並びにその病態把握のための抗ＤＮＡ抗体の測定法としては、従来から多くの手法が試みられてきた（Ｋａｎａｉ，：代謝、２０巻：２５３−２６１，１９８３）。その一覧を表１に示した。
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これらの手法の中でも、正確な測定法として定評のあるのがＦａｒｒ法であるが、Ｆａｒｒ法においてはＤＮＡ抗原を放射性物質で標識することが必要とされ、高度の医療施設でないと測定できない欠点がある。これに対して、現在特に実験室レベルで頻用されているのがＥＬＩＳＡ法である。Ｆａｒｒ法が液状で抗原抗体反応を行うのに対し、ＥＬＩＳＡ法は抗原をプラスチックプレートなどに付着させて行うものである。ＤＮＡ抗原を固相に効率よく付着させるために、一般的には塩基性タンパク質、例えばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）で予めプラスチックプレートを被覆してからＤＮＡを付着させる手法が用いられている。
しかし、この方法で抗体を測定した場合には、測定された抗体の中に、ＰＬＬとＤＮＡのイオン結合によって形成されるヌクレオソーム様構造や人工的な未知の抗原に対する抗体が含まれる可能性を否定できないという欠点がある。
正確な抗ＤＮＡ抗体の測定にＰＬＬのようなスペーサーを用いずに直接プレートに付着させる方法の開発がなされたが、まだ実用には至っていない。
前述したように、ＳＬＥの病態形成に重要と考えられている抗ＤＮＡを主とする抗クロマチン抗体産生に関連して、アポトーシスに由来するヌクレオソームが抗ＤＮＡ抗体産生のための自己抗原として作用しているという説が注目されるようになった（Ａｍｏｕｒａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ，：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４２：８３３−８４３，１９９９）。
このように、ヒトのヌクレオソームが自己抗原であると指摘されていながら、現在抗ＤＮＡ抗体の測定には、ヒトのヌクレオソームＤＮＡではなく、仔牛胸腺由来ＤＮＡや組換えＤＮＡが抗原として使用されており、必ずしも正確な診断ができない問題点があった。これは、ヒトヌクレオソームＤＮＡを抗原として調製することが容易でないことに起因している。
本発明は、従来における、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームを、形態安定性を維持し、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるモノヌクレオソームの製造方法、前記モノヌクレオソオームの製造方法により製造されたモノヌクレオソーム、取扱性に優れたモノヌクレオソーム製造用キット、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等に好適なヒストン検査方法、前記モノヌクレオソームを含む、ヌクレオソームに特異的で各種診断等に好適な抗体の測定方法、簡便かつ確実な自己免疫病診断方法、高性能で取扱性に優れた自己免疫病診断用キット、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームＤＮＡを、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるヌクレオソームＤＮＡ製造方法、高性能で取扱性に優れたＤＮＡプレート、前記ＤＮＡプレートの効率的な製造方法、及び、自己免疫病診断等に好適な抗ＤＮＡ抗体測定法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、ヌクレオソームを、前記ヌクレオソームに特異的な抗体を介してプロテインＡカラム等に吸着させた後、高濃度の塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液等を用いて溶出させ、ヌクレオソーム集合体をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ等で処理してモノヌクレオソームにした後、ＨＰＬＣ等によってモノヌクレオソームのみを回収することによって、モノヌクレオソームを簡易にかつ効率よく、しかも高純度で製造することができるという知見である。
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は以下の通りである。即ち、
＜１＞  試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法である。
＜２＞  抗体が、抗ヌクレオソーム抗体、抗ＤＮＡ抗体、及び抗ヒストン抗体から選択される少なくとも一種である前記＜１＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜３＞  抗体が、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する前記＜１＞又は＜２＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜４＞  抗体が、２Ｃ１０の可変域のアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において１以上２０以内のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、２Ｃ１０の抗原特異性を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜５＞  抗体が、２Ｃ１０である前記＜４＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜６＞  捕獲収集工程において、抗体を該抗体と親和性を有する固相に結合させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜７＞  固相が、プロテインＡカラムである前記＜６＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜８＞  捕獲収集工程において、抗体を予め固相に結合させておき、試料を該固相と接触させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜９＞  単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を回収してモノヌクレオソームを単離・精製する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１０＞  捕獲収集工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１１＞  解離回収工程後、単離精製工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１２＞  ヌクレアーゼが、マイクロコッカル・ヌクレアーゼである前記＜１０＞又は＜１１＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１３＞  細胞を低塩濃度の溶液中で破砕させ、溶液中にヌクレオソームを放出させる放出工程と、
前記ヌクレオソームを収集する収集工程と、
収集した前記ヌクレオソームを低塩濃度の溶液に懸濁し、モノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理するヌクレアーゼ処理工程と、
前記ヌクレアーゼ処理後の溶液からモノヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体を用いて、及び／又は分子量に基づいて製造する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１４＞  単離精製工程で用いる抗体が、２Ｃ１０である前記＜１３＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１５＞  単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を分離する前記＜１３＞又は＜１４＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１６＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたことを特徴とするモノヌクレオソームである。
＜１７＞  純度が９８％以上である前記＜１６＞に記載のモノヌクレオソームである。
＜１８＞  試料中に含まれるヌクレオソームを捕獲収集するための該ヌクレオソームに特異的な抗体と、
捕獲収集したヌクレオソームから分子量に基づきモノヌクレオソームを単離するためのカラムと、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソーム製造用キットである。
＜１９＞  前記抗体が、２Ｃ１０である前記＜１８＞に記載のモノヌクレオソーム製造用キットである。
＜２０＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により被検試料から得たモノヌクレオソームより被検ヒストンを回収し、該被検ヒストンの電気泳動パターンと対照ヒストンの電気泳動パターンとを比較することを含むことを特徴とするヒストン検査方法である。
＜２１＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２２＞  モノヌクレオソームが、アポトーシス由来のヌクレオソームである前記＜２１＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２３＞  被検試料が、自己免疫病患者の血清又は血漿である前記＜２１＞又は＜２２＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２４＞  固相化工程において、固相化したモノヌクレオソームを少なくともスキムミルクを含むブロッキング液でブロッキングさせ、反応工程において、試料を少なくともスキムミルクを含む反応液で稀釈してから該試料を、前記固相化されたモノヌクレオソームと反応させる前記＜２１＞から＜２３＞のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２５＞  反応液が、トリス、ＮａＣｌ、ＮａＮ３、血清アルブミン、スキムミルク、及びＥＤＴＡを含有する前記＜２４＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２６＞  測定工程において、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として反応させる前記＜２１＞から＜２５＞のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２７＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
その抗体価を評価する評価工程と、
を含むことを特徴とする自己免疫病診断方法である。
＜２８＞  前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造したモノヌクレオソームを固相化してなる固相と、緩衝液と、プレート及びカラムのいずれかと、を含むことを特徴とする自己免疫病診断用キットである。
＜２９＞  試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
単離・精製されたモノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離・精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法である。
＜３０＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法からなるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程とを含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法である。
＜３１＞  プレート上に、前記＜２９＞又は＜３０＞に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであって、ヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートである。
＜３２＞  プレート上に、前記＜１６＞又は＜１７＞に記載のモノヌクレオソームであって、ヒト由来のモノヌクレオソームから単離精製されたヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートである。
＜３３＞  ヌクレオソームＤＮＡが、ヌクレオソーム構成２本鎖ＤＮＡであり、ヌクレオソームＤＮＡの平均鎖長が、１４５ｂｐ以上２００ｂｐ以下である前記＜３１＞又は＜３２＞に記載のＤＮＡプレートである。
＜３４＞  ヌクレオソームＤＮＡが、プレート上に直接固相化されてなる前記＜３１＞から＜３３＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートである。
＜３５＞  プレートが、ポリスチレンを含んでなる前記＜３１＞から＜３４＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートである。
＜３６＞  前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法であって、試料がヒト由来の試料であるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡをプレート上に固相化する固相化工程と、
を含むことを特徴とするＤＮＡプレート製造方法である。
＜３７＞  固相化工程において、プレート上に、ヌクレオソームＤＮＡを０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加する前記＜３６＞に記載のＤＮＡプレート製造方法である。
＜３８＞  プレート上に、前記＜２９＞又は＜３０＞に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであってヒト由来のヌクレオソームＤＮＡを、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加することにより固相化することを特徴とするＤＮＡプレート製造方法である。
＜３９＞  前記＜３１＞から＜３５＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする抗ＤＮＡ抗体測定法である。
発明を実施するための最良の形態
（モノヌクレオソームの製造方法）
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、を含む。
本発明において、「ヌクレオソーム」とは、ヌクレオソームを単位とする単量体（モノヌクレオソーム）のみならず、二量体、三量体等の多量体、これらの混合物、更には、総てのヌクレオソームを含有する試料（即ち、ヌクレオソーム供給源）をも意味する。
前記ヌクレオソーム含有試料としては、例えば、ヒトや動物の臓器又は組織から直接分離した細胞から細胞核を分離したもの、一般の培養細胞から細胞核を分離したもの、ヌクレオソームを分泌する培養細胞（ＫＭＬ１−７細胞（Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｕｐｕｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ，３２：４３−４８，１９９２）あるいはＨＬ−６０細胞（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２７０：３４７−３４９，１９９７））の培養上清、等が挙げられる。
本発明において、「モノヌクレオソーム」とは、約１４６塩基対の二本鎖ＤＮＡとコアヒストン（Ｈ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ及びＨ４）とからなる、ヌクレオソームの単量体をいう。
前記捕獲収集工程は、試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する工程である。
本発明において、「ヌクレオソームに特異的な抗体（以下、単に「抗体」ということがある）」とは、ＤＮＡとヒストンとの複合体であるヌクレオソームに特異的な反応を示す抗体を意味し、ヌクレオソームと共に免疫複合体を形成できるものであればよく、ヌクレオソーム自体、ヌクレオソームを構成している二本鎖ＤＮＡ、及びヌクレオソームを構成しているヒストンのいずれに親和性を有するものであってもよいし、ヌクレオソームと特異的な反応を示すと共に二本鎖ＤＮＡの単体やヒストン単体とも反応を示すものであってもよい。前記ヌクレオソームに特異的な抗体の中には、二本鎖ＤＮＡに特異的であると信じられていたが、むしろヌクレオソームにより高い親和性を有することが判明した公知の抗体も含まれる。前記ヌクレオソームに特異的な抗体としては、二本鎖ＤＮＡよりも、ヌクレオソームにより強く反応するものが好ましく、また、その抗体のＦｃを介してプロテインＡカラム等のアフィニティーカラムに吸着できるものが好ましい。
なお、前記アフィニティーカラムとしては、プロテインＡ以外に、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＰＢ）Ｈｉｔｒａｐ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎなどが挙げられ、具体的には、Ｈｉｔｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄの１ｍｌ又は５ｍｌのカラムが好適に挙げられる。前記ヌクレオソームに特異的な抗体の前記アフィニティーカラムへの吸着（カップリング）の方法としては、特に制限はないが、該抗体として後述の２Ｃ１０を使用する場合には、例えば、カップリングバッファー（０．２ＭＮａＨＣＯ３／０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．３）で０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌになるように２Ｃ１０を調整して行うことができ、吸着カップリング後の操作はアフィニティーカラム毎に指定されたプロトコールに準じて行うことができる。
前記ヌクレオソームに特異的な抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高塩濃度においても抗原との結合能を有するものが、高塩濃度溶液での洗浄によりカラムに非特異的に結合したタンパク質を除去することができる点で好ましく、自己免疫疾患モデルとして知られているＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来Ｂ細胞ハイブリドーマの産生する自己抗体であるモノクローナル抗体２Ｃ１０（ＩｇＧ２ｂに属する）が、高塩濃度においても抗原との結合能を有する点で、特に好ましい。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、二本鎖ＤＮＡに特異的であり（Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：５３−５８，１９８６を参照されたい）、本発明者らのグループによって作製されたものであり、その製造方法については、前記Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｌｅｔｔ．を参照することができ、詳細な性質等については、Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ，ら、２つの抗二本鎖ＤＮＡ抗体の結合部位によるＤＮＡの酸化的開裂の促進（Ｅｎｈａｂｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉ−ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：６５５５−６５６１（１９９６）に記載されている。
また、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の軽鎖可変域のアミノ酸配列は、以下の通り同定されている（Ｊａｎｇ  ＹＪ，Ｓｔｏｌｌａｒ  ＢＤ他、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｄｅｃ；３５（１８）：１２０７−１２１７）。
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前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の抗原特異性を有するものは、２Ｃ１０の可変域を有するヒト型抗体等や、前記２Ｃ１０の可変域の１個から２０個程度の、より容易には１又は数個の、アミノ酸を欠失、置換、若しくは付加した変異型を作製することにより、当業者であれば容易に得ることができる。前記モノヌクレオソームを含むヌクレオソームに特異的な抗体には、前記変異型も含まれる。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の製造方法を以下に簡単に述べる。
６ケ月齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓を培養液（ＤＭＥＭ）の入ったプラスチックデッシュの中で眼科せん刀を用いて細切した後、２枚のスライドグラスのフロスト面で細切を圧挫し、結合組織からリンパ球を遊離させる。数分後に浮遊細胞を遠心分離する。直ちに４４．４質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下でマウスミエローマ細胞（ＳＰ２）とリンパ球との細胞融合を二分間かけて行う。融合後、直ちに培養液でＰＥＧを稀釈・除去し、最後に選別培地であるＨＡＴに置き換え、２００μｌずつ９６穴のマイクロタイタープレートに加え、３７℃のＣＯ２インキュベーター（５質量％ＣＯ２存在下）で培養する。二週間後、コロニーの増殖した各ウエルの培養上清の抗ＤＮＡ抗体価をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）にて測定し、該抗ＤＮＡ抗体価の高いウエル中の２Ｃ１０ハイブリドーマを選択し、該２Ｃ１０ハイブリドーマを適宜培養することにより前記モノクローナル抗体２Ｃ１０が得られる（Ｔ．Ｋｕｂｏｔａ他、Ｉｍｍｕｎｏ  ｌｅｔｔ．，１４：５３−５８，１９８６／１９８７）。
次に、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の性質を以下に簡単に述べる。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、一本鎖ＤＮＡ中の二本鎖部分と反応するが、二本鎖ＤＮＡの雛型である、ΦＸ１７４プラスミドＤＮＡに対し強い親和性を示し、かつ塩基配列のＡ・Ｔを好む、優れた抗二本鎖ＤＮＡ抗体である。
なお、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、これまで二本鎖ＤＮＡに特異的であると考えられていたが、本発明に到達するまでの研究において、プロテインＡカラムによる抗二本鎖ＤＮＡ抗体精製過程で、二本鎖ＤＮＡと並びヌクレオソームに対しても強い親和性を有することが判明した。このことから、本発明のモノヌクレオソームの製造方法において、二本鎖ＤＮＡに特異的な抗体のみならず、ヌクレオソームに特異的な抗体や、二本鎖ＤＮＡ及びヌクレオソームの両者に特異的な抗体を用いることができると考えられる。
前記「プロテインＡカラム」とは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細菌壁に由来する分子量４２，０００のタンパク質であるプロテインＡを固相化したものをカラムに充填したものである。前記プロテインＡは、ＩｇＧの定常領域（Ｆｃフラグメント）に結合するので抗原抗体反応を妨害せずに、免疫複合体と結合することができる。この性質を利用して、前記プロテインＡによって免疫複合体を捕獲するプロテインＡカラム法は、ＩｇＧの精製法として確立された手法である。本発明で用いることができる市販のプロテインＡカラムとしては、例えば、ヒットラップ（Ｈｉｔｒａｐ）プロテインＡカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）等が挙げられる。
本発明において、ヌクレオソームをプロテインＡカラム等のカラムに吸着させる媒介物となる抗体は、ヌクレオソームを含む培養液等の液中に遊離の形で存在していてもよいし、プロテインＡカラム等のカラムに予め固定化されていてもよい。なお、前記カラムは、前記プロテインＡカラム以外に、担体カラムでもよい。前記抗体が遊離の形で液中に存在する場合は、液中で免疫複合体を形成した後、形成された免疫複合体をプロテインＡカラム等のカラムに流すことにより、該抗体は、そのＦＣ部分を介してプロテインＡカラムに吸着される。前記抗体がプロテインＡカラム又は適当な担体カラムに固定化されている場合には、ヌクレオソームを含む液をカラムに流すことによって、プロテインＡカラムに固定化されている抗体を介してヌクレオソームを吸着することができる。
前記抗体をプロテインＡカラムに固定化する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、プロテインＡカラムをｐＨ６．８〜８．３までのレンジでＴｒｉｓを主体とした緩衝液で平衡化し、予め同じ緩衝液で平衡化した抗体又は抗体−ヌクレオソーム複合体をそれに流入し、それを同カラムに数回循環させた後、抗体又は抗体−免疫複合体を含まないＴｒｉｓ緩衝液でカラムを洗浄する。洗浄後のカラム通過液はＡ２６０＝０．０が好ましい。
ヌクレオソーム及び抗体（免疫複合体）が培養液上清等に含まれている場合には、限外濾過等の手段によって上清をプロテインＡカラムに注ぐ前に濃縮しておくことが好ましい。濃縮を行うことによって、より効率的なモノヌクレオソームの製造が達成できる。限外濾過によって濃縮を行う場合、例えば、分子量３０，０００カットオフのダイアフロー膜（ＰＨ３０）（ミリポア社製）等を用いることができる。
前記解離回収工程は、前記捕獲収集工程において捕獲収集されたヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる工程である。前記解離回収は、ヌクレオソームに特異的な抗体とヌクレオソームとの結合を高濃度塩化ナトリウム液等を用いて解離させることにより行うことができ、その結果、ヌクレオソームのみを分離することができる。
ヌクレオソームを解離させるために用いられる溶出液としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、塩化ナトリウム濃度が０．８〜１．２Ｍ程度であり、好ましくは０．６〜０．８Ｍであり、特に好ましくは１．２Ｍであり、ｐＨが、ｐＨ４．５〜９．０程度であり、好ましくはｐＨ６〜８であり、特に好ましくはｐＨ７〜７．５である緩衝液などが好適に挙げられ、具体的には、濃度が２５〜１００ｍＭ程度であり、好ましくは２５〜７５ｍＭであり、特に好ましくは２５〜５０ｍＭであるトリス緩衝液が好適に挙げられる。
前記溶出液中の塩の種類や緩衝液の種類としては、特に制限はなく、適宜選択でき、上記以外には、例えば、リン酸緩衝液や、炭酸緩衝液などが挙げられる。
なお、プロテインＡカラムなどの担体からヌクレオソームを解離させる前に、カラムに非特異的に結合しているタンパク質を洗浄によって完全に除去することが不可欠である。その際用いる洗浄液としては、例えば、トリス緩衝液（２５ｍＭトリス、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）等が挙げられるが、種々の条件によって濃度、塩類の種類、ｐＨ等を適宜調整することができる。非特異結合タンパク質が完全に除去されたか否かは、例えば、２６０ｎｍでの吸光度が０．００であることによって確認することができる。
プロテインＡに結合した２Ｃ１０・クロマチン複合体（２Ｃ１０ハイブリドーマ自身がこれに該当する）又は２Ｃ１０を予め結合したプロテインＡカラムあるいは２Ｃ１０を共有結合で固定化したアフィニティーカラムに結合した培養上清中の総てのヌクレオソーム（モノマーからオリゴ又はポリマーまで）は、１．２Ｍの塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．０４質量％ＮａＮ３，ｐＨ７．４）（以後、これを緩衝液Ｂと呼ぶ）を溶出液として用いて、解離させることができる。この溶出液をウルトラフリー膜（分子量３万カットオフ、ミリポア社）を用いて濃縮、それを０．２５Ｍ塩化ナトリウム添加トリス緩衝液Ａ（以下、これを「緩衝液Ｃ」と呼ぶ）で平衡化したスーパーデックス２００のカラムを用いたＨＰＬＣによりモノヌクレオソームのみを分離することができる。しかし、培養上清中にはそれよりもオリゴマーやポリマーが圧倒的に多く、効率良くモノマーを回収するには緩衝液Ａでの溶出液（濃縮後）をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で消化し、できるだけモノマーにしてから反応を停止する。このモノマーを前記ＨＰＬＣにより分離するのが好ましい。その際、従来のショ糖濃度勾配超遠心法やゲル切り出し法では、回収することはできなかったヌクレオソームを繋いでいるリンカーＤＮＡも、本クロマトグラフィーで分子量約１０Ｋ位の所に溶出される（図３）。この切断されたリンカーＤＮＡは、遺伝子情報を知るためのクローニングに最適である。
前記単離精製工程は、前記解離回収工程において回収したモノヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離精製する工程であり、具体的には、ヌクレオソームを含むプロテインＡカラム溶出液を、所望によりヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼ（例えば、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）など）で消化した後、回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて精製する工程である。
前記分子量に基づく精製は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、モノヌクレオソームのみを高収率に回収することにより行うことができ、又は、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を回収することにより行うことができる。
前記ＨＰＬＣ用カラムとしては、分子量１０，０００〜１，０００，０００までを分離できるものが好ましく、例えば、スーパーデックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）スーパーデックス１００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテックス社製）等が挙げられる。
前記ＨＰＬＣの展開溶媒としては、塩化ナトリウム濃度が１４０〜１２００ｍＭ程度であり、好ましくは２５０ｍＭであり；アジ化ナトリウム等の濃度が０．０２〜０．１質量％程度であり、好ましくは０．０４質量％である、２５〜７５ｍＭ、好ましくは２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．８〜８．３、好ましくはｐＨ７，４）が挙げられる。なお、前記濃度、ｐＨ等は、目的に応じて適宜選択することができる。
ＨＰＬＣカラムを上記展開溶媒で平衡化した後、プロテインＡカラム溶出液を流し、モノヌクレオソームのピーク画分を集めると、単離・精製されたモノヌクレオソームが得られる。保存用としてのモノヌクレオソームのタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピース（ＰＩＥＲＣＥ）社製）で測定した場合、１００〜１０００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、５００μｇ／ｍｌであることがより好ましい。
モノヌクレオソームの検出は、１５％ＳＤＳ・ＰＡＧＥ電気泳動でＨ１を除くコアヒストンＨ３、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ４及びその修飾産物の同定並びにヌクレオソームから抽出したＤＮＡの大きさが１５０〜２００ｂｐの点にのみ集簇していることを１〜２％アガロースゲル電気泳動にて確かめることによって行うことができる。
なお、プロテインＡカラム溶出液をそのままＨＰＬＣにかけてもある程度のモノヌクレオソームを回収できるが、その前に、溶出液をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理（消化）することが好ましい。これによって、重合しているヌクレオソームをモノヌクレオソームに分解することによって、モノヌクレオソームの回収率を顕著に高めることができる。溶出液の消化に用いることができるマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）としては、例えば、マイクロコッカル・ヌクレアーゼＥＣ３．１３１．１（シグマ社製）、等が挙げられる。消化されるヌクレオソームを含む溶液の濃度としては、１〜１００ユニット／ｍｌ、程度が好ましく、５〜５０ユニット／ｍｌがより好ましい。
マイクロコッカル・ヌクレアーゼによる消化は、溶出液にＣａ２＋を１〜１０ｍＭ程度、好ましくは２．５ｍＭ、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）を０．２５〜１Ｕ、好ましくは０．５Ｕ添加し、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で、４５〜１２０分間、好ましくは６０分間保温することによって行うことができる。反応容量は適宜設定することができ、例えば２００μｌとすることができる。保温終了後、直ちに５ｍＭ（ＥＧＴＡ）を添加してマイクロコッカル・ヌクレアーゼを失活させ反応を停止させる。不溶物をマイクロヒュージ（１３Ｋｒｐｍ、５分）で除去し、上清をＨＰＬＣにかけ単離精製工程を行う。
なお、抗体がプロテインＡカラムに固定化されている場合、前記捕獲収集工程の前に、ヌクレオソームを含むサンプルをマイクロコッカル・ヌクレアーゼによって処理（消化）してもよい。これによって、前記単離精製工程の前に処理（消化）するのと同様にモノヌクレオソームの回収率を高めることができる。
本発明によって得られたモノヌクレオソームの純度は、通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上である。なお、得られたモノヌクレオソームのピーク画分に含まれるものがモノヌクレオソームであることは、Ｉｓｈｉｚａｋａらの方法（Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５７９２，１９９１）によって該画分から抽出されたＤＮＡが、２質量％アガロースゲル電気泳動で１５０〜２００塩基対のサイズに集中して検出されること、及び１５質量％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでコアヒストン（ヒストンＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ、及びＨ４）のみが検出され、ヒストンＨ１は検出されないことによって証明される。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、モノヌクレオソームの分離が極めて厳格であるため、得られたヌクレオソームから分離されるＤＮＡの純度が高く、その遺伝子情報入手のためのクローニングの能率化に寄与することができる。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、自己免疫疾患等で注目されている修飾ヌクレオソームを製造することができるため、それらの疾患のメカニズム、アポトーシスの生理的意義等の解明に貢献でき、学術的にも大きな意義を有する。
また、ゲノムプロジェクトの一環として、疾患感受性、薬剤抵抗性の解明が、単一ヌクレオチド多形態（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の点から大規模に進められている。しかし、それは全ゲノムが対象で、膨大な人力と資金を要する。これに対し、ヌクレオソーム単位でのＳＮＰの解析は、より低コストで且つ効率が良いと考えられる。したがって、ヌクレオソーム単位でのＳＮＰ解析を行うに当たって、本発明のモノヌクレオソームの製造方法は大きく貢献できる。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法の他の態様としては、細胞を低塩濃度の溶液中で破砕させ、溶液中にヌクレオソームを放出させる放出工程と、
前記ヌクレオソームを収集する収集工程と、
収集した前記ヌクレオソームを低塩濃度の溶液に懸濁し、モノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理するヌクレアーゼ処理工程と、
前記ヌクレアーゼ処理後の溶液からモノヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体を用いて、及び／又は分子量に基づいて製造する単離精製工程と、を含む。
通常の状態ではヌクレオソームを培養液中に放出しない細胞からモノヌクレオソームを製造する場合には、前記放出工程により、溶液中にヌクレオソームを放出させてから、モノヌクレオソームを単離すればよい。前記ヌクレアーゼ処理工程は、前記ヌクレアーゼを用いた処理（消化）と同様に行うことができ、前記単離精製工程は、上述したとおり行うことができる。
（モノヌクレオソーム）
本発明のモノヌクレオソームは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造される。
本発明のモノヌクレオソームは、厳格な条件により製造されるため、純度が通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上と高く、保存安定性に優れ、モノヌクレオソーム本来の形態をよく維持している（形態維持性に優れる）。したがって、各種測定乃至診断に好適に用いることができる。
また、本発明のモノヌクレオソームは長期間安定に保存することができる。具体的には、トリス、ＮａＣｌ及びＮａＮ３からなるＮａＣｌ添加トリス緩衝液（ＴＢＳ）中で、又は、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＢＳ中で、４℃で２ヶ月間保存しても前記モノヌクレオソームは、なおかつ抗原性を維持した。ヌクレオソームは、一般的に安定性が低く、また、凍結すると破壊されるため、前記安定性は大きな利点である。
また、アポトーシス由来のモノヌクレオソームは、アポトーシスによる修飾を保持しており、自己抗原性を獲得し易いため、自己免疫病患者の抗体測定（自己免疫病診断）に、特に好適に利用できる。
（モノヌクレオソーム製造用キット）
本発明のモノヌクレオソーム製造用キットは、試料中に含まれるヌクレオソームを捕獲収集するための該ヌクレオソームに特異的な抗体と、
捕獲収集したヌクレオソームから分子量に基づきモノヌクレオソームを単離するためのカラムと、を含む。
本発明のモノヌクレオソーム製造用キットを本発明のモノヌクレオソームの製造方法に使用することにより、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適で、保存安定性に優れたモノヌクレオソームを、形態安定性よく、簡易にかつ効率よく、しかも高純度で製造することができる。
（ヒストン検査方法）
本発明のヒストン検査方法は、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により得たモノヌクレオソームより被検ヒストンを回収し、該被検ヒストンの電気泳動パターンと対照ヒストンの電気泳動パターンとを比較することを含む。
自己免疫疾患における、自己免疫現象は、アポトーシスにより修飾されたヌクレオソームが抗原となっていると考えられ、この修飾ヌクレオソームの本体はコアヒストンの修飾であると考えられる。したがって、モノヌクレオソームのコアヒストンの修飾を検査することで、ヌクレオソームの修飾状態を把握し、自己免疫疾患の診断、解明に利用することができる。
前記ヒストン検査方法は、具体的には、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により被検試料から得られるモノヌクレオソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する。この解析結果を、正常細胞から得られるヒストンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果と比較することにより行うことができる。
（ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法）
本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、を含む。
前記固相化工程においては、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを用いる。このモノヌクレオソームは、純度が通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上と高く、モノヌクレオソームの形態をよく保持している（形状安定性に優れる）。したがって、ヌクレオソームに特異的な抗体に対する抗原として好適である。
また、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により得られる、アポトーシス由来のモノヌクレオソームは、アポトーシスによる修飾を保持しており、自己抗原性を獲得し易いため、自己免疫病患者の抗体測定に、特に好適である。
前記モノヌクレオソームの固定化緩衝液としては、モノヌクレオソームの形態を変化させないものであれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えば、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を使用することができる。
前記固相化工程に用いられる固相としては、モノヌクレオソームを固定化できるものであれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えばポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製  Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）等が、好適に使用することができる。前記モノヌクレオソームの前記固相化の条件としては、固相の種類等に応じて適宜選択することができ、前記固相化の具体例としては、前記ポリスチレン製マイクロタイタープレートを固相として使用する場合には、従来からｄｓＤＮＡ抗原のプレートへの吸着に用いられているポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（１μｇ／ｍｌ蒸留水）を介して、１μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩吸着させ、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液洗浄する方法等が、好適に挙げられる。
前記固相化工程においては、モノヌクレオソームの固定化されていない固相を遮蔽し、非特異性反応を防止するため、モノヌクレオソームの固相への固定化後に固相をブロッキング液でブロッキングすることが好ましい。ヌクレオソームは複雑な高次構造を有するため、特に非特異性反応の影響が大きく、ブロッキングの役割は大きい。前記ブロッキングは、前記固相とブロッキング液とを反応させた後、洗浄することにより行うことができる。前記ブロッキング液としては、少なくともスキムミルクを含む溶液が好ましく、トリス、ＮａＣｌ及びＮａＮ３からなるＮａＣｌ添加トリス緩衝液（ＴＢＳ）に、０．１〜０．３質量％のスキムミルクを含む溶液が特に好ましい。
固相化工程の終了後、直ちに反応工程を開始しない場合には、各ウエルにＴＢＳ又は後述の反応液を加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存することができる。
前記反応工程は、被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる工程であるが、該被検試料としては、健常者又は患者の血清又は血漿が好ましく、自己免疫病等の病気の診断に利用できる点で、自己免疫病の疑いのある患者の血清又は血漿が特に好ましい。
前記試料を前記モノヌクレオソームと反応させる方法については、前記試料中のヌクレオソームに特異的な抗体が前記モノヌクレオソームに結合できる方法であれば特に制限はなく、適宜選択することができる。例えば、前記マイクロタイタープレートを用いた場合には、試料を反応液で稀釈し、振盪しながら反応させ、前記反応後吸引除去し、洗浄する等の方法により行うことができる。
なお、試料を稀釈する反応液としては、前記非特異性反応を防止する観点から、スキムミルクを含むことが好ましく、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＢＳであることが特に好ましい。前記ＢＳＡは、アルブミン  フラクション  Ｖ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｆｒａｋｔｉｏｎ  Ｖ，ベーリンガーマンハイム社製  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が好ましく、前記ブロックエースは、大日本製薬株式会社製が好ましく、前記ＥＤＴＡはＥＤＴＡ二ナトリウム塩（同仁化学製）が好ましい。
前記測定工程は、前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する工程であるが、前記モノヌクレオソームに結合する抗体を測定することができれば特に制限はなく、目的に合わせて適宜選択することができる。なお、前記測定工程においては、前記抗体の代りに、前記モノヌクレオソームに結合する抗体を認識する二次抗体を測定してもよい。例えば、前記マイクロタイタープレートを用いた場合には、前記洗浄後、直ちに、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）稀釈液を、各ウエルに加え、振盪反応させ、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル  ホスフェイト（ＰＮＰ）（シグマ社製  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬を各ウエルに添加し、再び振盪反応させ、発色させる等の方法により行うことができる。なお、前記発色は、反応直後に発色の度合（吸光度）を、オートリーダーを用いて、吸光波長４０５ｎｍで測定する。対照又は盲検は、前記一連の反応系で、血清又は血漿を加えなかった時に得られる吸光度とし、各資料における吸光度からこれを差し引いた値が実測値となる。抗体価は、前記吸光度の実測値として表すことも可能であるが、高力価の血清で予め標準曲線を作成し、それとの対比により試料における抗体価をユニット単位で表示することが好ましい。
前記測定工程は、また、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として反応させる工程を含んでもよく、この場合にはサブクラス別の抗体の測定が可能となる点で、特に好ましい。
即ち、ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四種類のサブクラスがあり、患者の有する、ヌクレオソームに特異的な抗体の、サブクラスの片寄りが、疾患病態を特徴付けることがある。したがって、サブクラス別抗体の測定が可能であれば、疾患病態をよりよく把握することができる。
前記サブクラス別抗体の測定には、例えばビオチン標識した抗ヒトサブクラス抗体（マウス）（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を前記アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）の代りに使用して反応及び洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を反応させ、前記と同様に基質のＰＮＰを加えて、発色させ、オートリーダーで吸光度を測定することができる。
本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法は、純度が高く、本来の形態をよく保持したモノヌクレオソームを用いることにより、自己抗原が陽性の場合にはヌクレオソームに対する極めて高い抗体価を示し、自己抗原が陰性の場合には常に低い抗体価しか示さない、極めて精度の良い測定方法である。また、必要に応じて、ブロッキング剤、及び反応液の組成を調整することによっても、非特異性反応を防ぎバックグラウンドの閾値を低くすることができる。更に必要に応じて、サブクラス別に抗体を測定することにより、ＳＬＥ等の自己免疫病患者病態をより詳しく分析することができる。
本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法は、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、自己免疫病、特にＳＬＥの診断、ループス腎炎、血管炎、ＣＮＳループス、小児ＳＬＥの診断に極めて有効である。
（自己免疫病診断方法）
本発明の自己免疫病診断方法は、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
その抗体価を評価する評価工程と、を含む。
前記自己免疫病診断方法は、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法において記載した方法により、ヌクレオソームに特異的な抗体を測定し、その測定された抗体価を評価する。前記抗体価の評価は、例えば、平均値＋標準偏差の３倍などにより、予め設定した所定閾を超えるか否かにより陽性か陰性かを評価することができる。
また、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として使用して、ヌクレオソームに特異的な抗体をＩｇＧのサブクラスごとに測定し、それぞれの抗体価がＩｇＧのサブクラスごとに予め設定した各々の所定閾を超えるか否かを評価することもできる。また、サブクラス別の抗体価のパターンを分析して評価することもできる。サブクラスごとの評価は、病態をより詳しく表すものである。
（自己免疫病診断用キット）
本発明の自己免疫病診断用キットは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造したモノヌクレオソームを固相化してなる固相と、緩衝液と、プレート及びカラムのいずれかを含む。
前記自己免疫病診断用キットは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造され、形態安定性に優れたモノヌクレオソームを高純度で含むため、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、自己免疫病、特にＳＬＥの診断に極めて有効である。また、前記自己免疫検査キットは、緩衝液を満たして密封シールすることができ、前記ヌクレオソームの保存安定性が高いことからその保存安定性に優れている。前記自己免疫病診断用キットは、必要に応じて、反応液、稀釈液、洗浄液、二次抗体等を更に含んでいてもよい。また、前記二次抗体が抗ヒトサブクラス抗体であってもよい。
前記自己免疫病診断用キットは、例えば、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法の固相化工程で説明した方法等により作製することができる。
（ヌクレオソームＤＮＡ製造方法）
本発明のヌクレオソームＤＮＡ製造方法は、前記本発明のモノヌクレオソームの製造方法からなるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程とを含むこと以外は特に制限はない。
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程は、公知の方法から適宜選択して行うことができる（Ｋａｎａｉ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ  ｍｉｃｅ：ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．４６：２０７−２１４，１９９５）。例えば、一定量の精製ヌクレオソームを、１％ＳＤＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを含むトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、室温で６０分間処理する。次に、６ＭのＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）を含む変性剤を３倍量加え、６０℃で１５分間加熱する。この操作で可溶化したＤＮＡを５０％イソプロピルアルコールで沈殿させ、沈殿したＤＮＡを上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、少量のＲＮａｓｅを添加し、混在する可能性のあるＲＮＡを分解する方法を用いることができる。
前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡは、前述したような純度が高くかつ形態をよく保持したモノヌクレオソームから抽出されるため、モノヌクレオソームに由来する純度の高いＤＮＡである。前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法の一例により製造されたヌクレオソームＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によると、１５０ｂｐ付近に強いバンドがあり、これはモノヌクレオソームの２本鎖ＤＮＡであると考えられる。これらのヌクレオソームＤＮＡの平均鎖長は、１４５ｂｐ〜２００ｂｐであることが好ましく、３２０〜４００ｂｐのＤＮＡをわずかに含んでいることもある。
前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡは、ヒト由来の試料から製造すればヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが得られるため、ＳＬＥ等の病態判断のための抗原として、異種のＤＮＡを用いることに起因する非特異的反応を排除できる点、近年注目されているように抗ＤＮＡ抗体産生の自己抗原となる可能性が強いヌクレオソームのＤＮＡである点で優れている。本発明のヌクレオソームＤＮＡ製造方法は、今まで必ずしも製造が容易ではなかったこのようなヌクレオソームＤＮＡの製造を容易に、かつ、精度よく行う方法を提供したものであり、これによりＳＬＥ等の診断に好適なヌクレオソームＤＮＡを提供することができる。
（ＤＮＡプレート）
本発明のＤＮＡプレートは、プレート上に、前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであって、ヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなること以外は特に制限はない。また、本発明のＤＮＡプレートは、プレート上に前記ヒト由来のモノヌクレオソームから単離精製されたヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートであってもよい。これらのＤＮＡプレートは、ＳＬＥ等の病態判断のための抗原として、ヒトのＤＮＡを用いることにより、異種のＤＮＡを用いることに起因する非特異的反応を排除できる点、近年注目されているように抗ＤＮＡ抗体産生の自己抗原となる可能性が強いヌクレオソームのＤＮＡを用いる点で優れている。
前記ＤＮＡプレートは、ヌクレオソームＤＮＡがプレート上に直接固相化されてなることが、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）等の塩基性タンパク質を介してＤＮＡを付着させた従来プレートが有する、ＰＬＬに対する抗体及びＰＬＬ−ＤＮＡ複合体が形成する未知の抗原構造に対する抗体反応による問題点を排除できる点で好ましい。プレートの材質は、ポリスチレンを含むことがＤＮＡを直接付着させやすい点で好ましく、マイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ、Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＨＢ及びＩｍｍｕｌｏｎＨＢ（ダイネックステクノロジー社製  Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が特に好ましい。
このように、本発明のＤＮＡプレートは正常血清のバックグランドが減少するため、目的とする疾患血清の抗体価の信頼性が高くなり、ＳＬＥ等の病態判断のための抗ＤＮＡ抗体反応の測定に極めて好適に用いることができる。
（ＤＮＡプレート製造方法）
本発明のＤＮＡプレート製造方法は、前記モノヌクレオソームの製造方法であって、試料がヒト由来の試料であるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡをプレート上に固相化する固相化工程とを含むこと以外は特に制限はない。
前記固相化工程は、ＰＬＬ等の前処理なしに、プレート上に、直接ヌクレオソームＤＮＡを付着させることが好ましい。
前記モノヌクレオソームの固定化緩衝液としては、ヌクレオソームＤＮＡの形態を変化させないものであれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＰＬＬ等の前処理なしに、ヌクレオソームＤＮＡを付着させる観点から、固定化緩衝液は、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液又はホウ酸−カセイソーダ緩衝液であることが好ましく、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含むトリス緩衝液がより好ましい。ＮａＣｌの濃度は０．２５Ｍ以上であることがコーティング効率、及び製造されたＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応性の面から特に好ましい。
前記固相化工程に用いられる固相としては、ヌクレオソームＤＮＡを固定化できるものであれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、前記、ヌクレオソームＤＮＡを直接プレートに付着させる観点から、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートであることが好ましく、Ｉｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製  Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が、特に好ましい。前記ヌクレオソームＤＮＡの前記固相化の条件としては、固相の種類等に応じて適宜選択することができ、前記固相化の具体例としては、前記ポリスチレン製マイクロタイタープレートを固相として使用する場合には、ヌクレオソームＤＮＡを０．５μｇ／ｍｌの濃度で０．２５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液に溶解した溶液で、４℃で一晩吸着させ、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液洗浄する方法等が、好適に挙げられる。
ブロッキングは、前記ヌクレオソームの固定化の場合に準じて行うことができる。
本発明のＤＮＡプレート製造方法は、プレート上に、前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであってヒト由来のヌクレオソームＤＮＡを、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加することにより固相化するものであってもよい。
（抗ＤＮＡ抗体測定法）
本発明の抗ＤＮＡ抗体測定法は、前記ＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むものであれば、特に制限はなく、前記測定工程は、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定法に準じて適宜選択することができる。
実施例
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の効果を害しない限り適宜変更することができる。
（実施例１）
抗二本鎖ＤＮＡ抗体産生ハイブリドーマ培養細胞上清からのモノヌクレオソームの製造
自己免疫疾患モデルとして知られているＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来Ｂ細胞ハイブリドーマの産生する、二本鎖ＤＮＡに特異的な自己抗体２Ｃ１０（ＩｇＧ２ｂに属する）を、ＩｇＧ抗体の分離・精製法として既に確立されているプロテインＡカラム法を用いて上記ハイブリドーマの培養上清から分離し、分離した抗体をＳＤＳ−ボリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動で、その成分を調べると、ヒストンをはじめとするＤＮＡ結合タンパク質（核タンパク質複合体）を含んでいることが知られている（金井ほか：ハイブリドーマモノクローナル抗体からの自己抗原の分離とその応用、厚生省特定疾患  混合性結合組織病調査研究班  平成５年度研究報告書  ｐｐ５６−５９、１９９４）。
前記２Ｃ１０−核タンパク質複合体が捕獲されているプロテインＡカラムを、１．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この１．２Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ａ」という）を溶出液として用いて解離溶出させ、その溶出液を濃縮し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ抽出物を、２％アガロースゲル電気泳動で調べたところ、モノヌクレオソームＤＮＡ（約１５０塩基対）及びその重合体が検出された（図１）。
一方、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＨ（１５％）で調べたところ、コアヒストン、即ち、ヒストンＨ３、Ｈ２ｂ、Ｈ２ａ及びＨ４のみが検出された。これらの結果から、この溶出液中には、モノヌクレオソーム及びその種々の重合度の多量体が存在することが明らかになった。
上記事実に基づき、スケールを上げてモノヌクレオソームの回収を試みた。２Ｃ１０ハイブリドーマを無血清培地（培地は、５質量％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ通常培地でもよい）で大量培養（約１リットル）し、培養上清を分子量３０，０００カットオフのダイアフロー膜ＰＭ３０（ミリポア社製）を用いた限外濾過法により２０倍に濃縮した。この濃縮液を上記ヒットラップ（Ｈｉｔｒａｐ）プロテインＡカラム（５ｍｌ）（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に注いで核タンパク質複合体を捕獲し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この１４０ｍＭ塩化ナトリウム含有２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ｃ」という）（ｐＨ７．４）で洗浄し、非特異的結合タンパク質を完全に除去した。非特異的結合タンパク質の除去は、２６０ｎｍでの吸光度が０．００となったときに完了とした。次に、緩衝液Ａでヌクレオソームを溶出させた。この溶出液には、モノヌクレオソーム、及びモノヌクレオソームが２個以上連なったオリゴ乃至ポリヌクレオソームが含まれていた。
次に、モノヌクレオソームのみを単離するため、分子量１０，０００〜１，０００，０００までの分子を分離できるスーパーデックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を導入した。展開溶媒としては、２５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０４質量％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この２５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０４質量％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ｂ」という）（ｐＨ７．４）を使用した。
溶出画分の吸光度のプロファイルを図２に示す。ポリヌクレオソーム画分の大きなピークに遅れてモノヌクレオソーム画分のピークが分子量２０万から２５万の位置に検出された。
モノヌクレオソームの収率を上げるために、ポリヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に消化することを行った。具体的には、得られた溶出液にＣａ２＋を２．５ｍＭ、マイクロコッカル・ヌクレアーゼを０．５ユニット／ｍｌになるように添加して２００μｌとし、３７℃で４５分間保温した。保温終了後、直ちにＨＧＴＡを５ｍＭになるように添加して反応を停止した。不溶物をマイクロヒュージ（１５ｋ  ｒｐｍ）で除去した。
得られた上清を、緩衝液Ｂで平衡化したスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣ（３２１ポンプ、ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製を使用）にかけた。溶出画分の吸光度のプロファイルを図３に示す。ゲルろ過カラムにかける前にヌクレアーゼ処理することにより、モノヌクレオソームの画分を増加させることができた。この画分を再度クロマトグラフィーにかけた結果を図４に示す。ほぼ単一なピークとして精製することができた。一方、この方法を用いることにより同時にモノヌクレオソームの間をつなぐリンカーＤＮＡも回収することができた（図３）。
モノヌクレオソームのピーク画分をウルトラフリー（ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ）（５０ｋカットオフ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）で濃縮した。濃縮液のタンパク質濃度を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピース（ＰＩＥＲＣＥ）社製）で測定したところ、３００〜５００μｇ／ｍｌであった。
なお、濃縮前の細胞培養液以外は総て、タンパク質分解を防止するためにプロデアーゼ阻害剤カクテル、コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＴＭ，ＥＤＴＡフリー（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）を処方通り添加し、更にセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド）（シグマ社製）を１００μＭになるように添加した。以下の実施例でも同様である。
（実施例２）
一般培養細胞上清からのモノヌクレオソームの製造
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、二本鎖ＤＮＡ及び／又はヌクレオソームに特異的な抗体を生産しない一般の樹立細胞又はヒトを含む動物組織から直接分離した細胞（一次培養細胞）にも適用できる。
自己免疫疾患モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来株価細胞ＫＭＬ１−７（Ｋａｎａｉら、Ｉｎｔｌ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：９２−９４，１９８６）は、血清添加培地及び無血清培地の如何に係わらず、無刺激でその培養上清中にヌクレオソームを分泌することが知られている。したがって、この培養上清がそのままヌクレオソームの供給源として使用することができる。
また、樹立されている市販の各種癌細胞株又は一次培養細胞でもアポトーシス誘導剤の添加培養によって培養上清中にヌクレオソームを放出させることができ、上記と同様に、培養上清をヌクレオソームの供給源として使用することができる。
この培養上清を適切な濃度（１０〜２０倍）まで濃縮した後、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理（消化）し、モノクローナル抗体２Ｃ１０が固定化されたプロテインＡカラムに流す。
前記プロテインＡカラムを、緩衝液Ｃで洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、緩衝液Ａで溶出する。溶出液を直ちに緩衝液Ｂに対して透析した後、濃縮を行う。この濃縮は、大容量であれば前記ダイアフロー膜ＰＭ３０を用いた限外濾過で行うことができ、少量であれば前記ウルトラフリーを用いて行うことができる。
以下、実施例１と同様にして、上記濃縮液をスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにかけ、モノヌクレオソームを回収した。ＨＰＬＣによる分画パターンは図３及び図４と同様であった。
なお、モノクローナル抗体２Ｃ１０の固定化は、次のようにして行った。
段落番号００６０に記したトリス緩衝液でプロテインＡカラムを平衡化しておき、それにトリス緩衝液で調製した２Ｃ１０（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）をチャージした。カラム中の流速は５ｍｌ／分で、サイクルは２回である（２回目で吸着は完璧となる）。吸着・固定化の後、再度カラムは、トリス緩衝液で平衡化した。
（実施例３）
培養細胞又は末梢血単核球からのヌクレオソームの製造
低張緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ２−ＭＥ、０．２５Ｍショ糖、０．２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．０４質量％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ｐＨ７．４）１０ｍｌ当たり２×１０８個の細胞を懸濁し、ポッター・テフロン（Ｒ）製ホモジナイザー（２０ストローク）で手動でホモジナイズする。これを５００ｇで７分間遠心分離し、細胞核を沈降させた。細胞核を上記緩衝液にて一度洗浄して不純物を除去した。
次いで、洗浄した核を、ショ糖を含まない以外は上記緩衝液と同じ組成の緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）１．２５Ｕ／ｍｌ及び５ｍＭＣａ２＋を添加し、実施例１と同様に酵素消化し、ＥＧＴＡが５ｍＭになるように添加して反応を停止させた。１３ｋで５分間還心分離し、得られた沈渣に緩衝液Ｂを添加し、可溶性画分を１３ｋの遠心分離で回収した。前記可溶性画分を直ちにモノクローナル抗体２Ｃ１０結合プロテインＡカラムにかけ、結合したヌクレオソームのみを上記溶出液（緩衝液Ａ）にて選択的に溶出させた。得られた溶出液を濃縮後、実施例２と同様のスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにかけ、モノヌクレオソームを単離した。ＨＰＬＣによるモノヌクレオソームの単離の結果を図５に示す。
更に、ここで得られたモノヌクレオソーム画分を再度、スーパーデックス２００カラムにかけると図６に示すほぼ単一なピークとして精製された。
一方、モノヌクレオソームは、抗体２Ｃ１０結合カラムを用いずに、直接スーパーデックス２００カラムにかけ、分子量２０万から２５万の画分を分画することによっても精製することができた。２Ｃ１０結合カラムを用いずに精製した場合は、２Ｃ１０結合カラムを用いて精製した場合に比して若干純度が劣るが、再度ＨＰＬＣにかけると２Ｃ１０カラムの場合とほぼ同様の効果が得られた。
（実施例４）
本実施例４では、上記実施例２で得られたアポトーシスを起こした培養細胞由来のモノヌクレオソームと、実施例３で得られた正常な培養細胞由来のモノヌクレオソームとの比較解析を行った。
両ヌクレオソームを０．５％アガロース電気泳動により分画した。図７に示すように、正常な細胞由来のモノヌクレオソームに比較してアポトーシスを起こした細胞由来のヌクレオソームは、ブロードなバンドとして泳動された。
更に、これらモノヌクレオソームを詳細に分析するために、モノヌクレオソームを構成するコアヒストン、ＤＮＡをそれぞれ解析した。
ＤＮＡについては、アガロースゲル電気泳動によりその泳動パターン、位置などを比較したところ、大きな差異は観られなかった（図８）。
一方、コアヒストンについては１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画ヒストン成分を分画して解析した。結果を図９に示す。正常な細胞由来のヒストンは、図１０に示すＨ３、Ｈ２ｂ、Ｈ２ａ及びＨ４の通常のパターンと同様の分画パターンが示された。しかし、一方のアポトーシスを起こした細胞由来のコアヒストンは、分画パターンに異常が観られた。即ち、Ｈ２ｂに相当するバンドが減少し、Ｈ４のバンドを挟むように２本の新たなバンドが現れた。
このようにモノヌクレオソーム単位の製造が簡便になったことから、従来のその単離が困難であったヒストンの分離も簡便となった。更には上記のようなヒストンに基づいた生物現象の解析や疾患の診断や解明をも簡便に行うことが可能となる。
（実施例５）
ヌクレオソームのＥＬＩＳＡプレートへの固相化
自己抗原に対する免疫応答を調べる場合のＥＬＩＳＡプレートへの抗原の固相化条件を検討した。まず、抗原付着用溶媒の検討を行った。経験上、抗原のプレートへの固相化には、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）が使用される場合が多いことから、該炭酸緩衝液が、本プレートの抗原付着用溶媒として適するかを、該緩衝液によるヌクレオソームの形態的変化の有無により調べた。具体的には、ヌクレオソームの溶媒である０．５ＭＮａＣｌを該５０ｍＭ炭酸緩衝液に置換し、当該緩衝液で平衡化したスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにより調べた。その結果、溶液の置換に伴う溶出位置及びパターンに変化は観られなかった。これにより、当該緩衝液を、抗原付着用溶媒として用いることができることが判った。
次に、抗原の支持体としてポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製  Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用い、ヌクレオソームを、該支持体に、従来からｄｓＤＮＡ抗原のプレートへの吸着に用いられているポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（シグマ社製  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１ｇ／ｍｌ蒸留水）を介して、２μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩吸着させた。吸着後、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液（２５ｍＭ  トリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０４質量％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。１プレート当たり約１０ｍｌのＴＢＳを使用した。洗浄後、各ウエル当たり１００μｌのブロッキング溶液（２質量％スキムミルク（ディフコ社製  Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＴＢＳ）を加えて、一時間反応させ、抗原の付着していない部位を遮蔽した。最後に先の抗原吸着後の洗浄と同様にＴＢＳで４回洗浄することにより、抗原付着プレートを作製した。使用に供するまで、各ウエルにＴＢＳを１００μｌずつ加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存した。
（実施例６）
患者血清中の抗ヌクレオソーム抗体測定
加療中の１２例のＳＬＥ患者及び２６例の健常者の血清を対象として抗ヌクレオソーム抗体の測定を行った。
血清は、１２人のＳＬＥ患者及び２６人の健常者からそれぞれ血清を採取した。
反応液［１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＢＳ］にて血清を１００倍に稀釈し、マイクロタイタープレートの各ウエルに５０μｌずつ加えた。前記ＢＳＡは、アルブミン  フラクション  Ｖ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｆｒａｋｔｉｏｎ  Ｖ，ベーリンガーマンハイム社製  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、前記ブロックエースは、大日本製薬株式会社製、前記ＥＤＴＡはＥＤＴＡ二ナトリウム塩（同仁化学製）を使用した。
前記マイクロタイタープレートを、水平振盪器上で軽く振盪しながら、室温で３０分反応させた。反応後、直ちに反応液を吸引除去し、今度は０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０を含有したＴＢＳで、抗原付着後のプレートの洗浄と同様の手技で、プレートを４回洗浄した。
前記洗浄後、直ちに、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）（ジムド社製  Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を前記反応液にて２０００倍稀釈し、各ウエルに加え、前記血清の場合と同様に室温で３０分振盪反応させた。前記血清の場合と同様に洗浄した後、２．５ｍＭ  Ｍｇ２＋添加炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌになるように調整したＡＰの基質である、ｐ−ニトロフェニル  ホスフェイト（ＰＮＰ）（シグマ社製  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬を１００μｌずつ各ウエルに添加し、前記血清の場合と同様に、室温で３０分振盪反応させた。
反応直後に発色の度合（吸光度）を、オートリーダーを用いて、吸光波長４０５ｎｍで測定した。なお、対照又は盲検は、前記一連の反応系で、血清を加えなかった時に得られる吸光度とし、これを差し引いた価を実測地とした。抗体価は吸光度で表した。
測定結果を、図１１に表した。加療中のＳＬＥ患者から採取した１２例の血清うち、２例の血清が、ヌクレオソームに対する極めて高い抗体価を示し、陽性と判定された。健常者から採取した２６例の血清は、いずれも低い抗体価しか示さず、これらの平均値＋３倍の標準偏差（ｍ＋３ＳＤ）で定義したバックグラウンドの閾値は二例の陽性血清の抗体価よりも極めて低かった。なお、２例の陽性と判定された患者以外のＳＬＥ患者からの血清が、高い力価を示さないのは、加療中処方されている薬剤の影響により既に治癒に近い状態である等の理由により、既に血清中にヌクレオソームに特異的な抗体が多く存在しないことを示すものである。
以上の結果から、本発明の測定方法により、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法がＳＬＥの診断に極めて有効であることが実証された。
（実施例７）
抗体サブクラス別の測定法
ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四種類のサブクラスがある。患者の有する、ヌクレオソームに特異的な抗体のサブクラスの片寄りが、疾患病態を特徴付けることがある。したがって、サブクラス別抗体の測定が疾患病態を把握する上で重要である。
実施例６の図１１でヌクレオソーム抗体の最高値を呈した症例について、サブクラス別抗体の測定を行った。
前記サブクラス別抗体の測定には、ビオチン標識した抗ヒトサブクラス抗体（マウス）（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を実施例６のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）の代りに使用した。反応様式・反応時間は上記と同様に行った。次に、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を反応させ、最後に実施例６と同様に基質のＰＮＰを加えて、発色させ、オートリーダーで吸光度を測定した。
測定結果を図１２に表した。
（実施例８）
ヌクレオソームＤＮＡの製造
ヒト前骨髄性白血病細胞培養株ＨＬ−６０クロマチンから、実施例１と同様にモノヌクレオソームを製造し、さらに、ヌクレオソームＤＮＡを抽出した。ヌクレオソームＤＮＡの抽出は、公知の方法により行った（Ｋａｎａｉ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ  ｍｉｃｅ：ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．４６：２０７−２１４，１９９５）。具体的には、一定量の精製ヌクレオソームを、１％ＳＤＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを含むトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、室温で６０分間処理した。次に、６ＭのＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）を含む変性剤を３倍量加え、６０℃で１５分間加熱した。この操作で可溶化したＤＮＡを５０％イソプロピルアルコールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、少量のＲＮａｓｅを添加し、混在する可能性のあるＲＮＡを分解した。
このヌクレオソームＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを図１３に示した。１５０ｂｐ付近に単一のバンドが見られ、モノヌクレオソームのＤＮＡが抽出されたことがわかる。
（実施例９）
ヌクレオソームＤＮＡのＥＬＩＳＡプレートへの固相化
実施例８で得られたヌクレオソームＤＮＡ、その母体であるＨＬ−６０細胞のゲノムＤＮＡ、及び、従来使用されてきた仔牛胸腺ＤＮＡをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。ＨＬ−６０細胞のゲノムＤＮＡは、前記細胞のクロマチンから、前記ヌクレオソームからのＤＮＡの抽出法に準じて抽出した。ゲノムＤＮＡの大きさは、ヌクレオソームＤＮＡがおよそ１５０ｂｐであるのに対して、およそ２０ｋｂｐであった。
次に、抗原の支持体としてポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製  Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用い、前記ＤＮＡを、該支持体に、０．５μｇ／ｍｌの濃度で０．２５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、それを２５ｎｇ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩吸着させた。吸着後、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液（２５ｍＭ  トリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０４質量％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。１プレート当たり約１０ｍｌのＴＢＳを使用した。洗浄後、各ウエル当たり１００μｌのブロッキング溶液（２質量％スキムミルク（ディフコ社製  Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＴＢＳ）を加えて、一時間反応させ、抗原の付着していない部位を遮蔽した。最後に先の抗原吸着後の洗浄と同様にＴＢＳで４回洗浄することにより、抗原付着プレートを作製した。使用に供するまで、各ウエルにＴＢＳを１００μｌずつ加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存した。
（実施例１０）
ＤＮＡプレートによる抗ＤＮＡ抗体の測定
ＳＬＥ患者１症例の血清について、実施例９の各マイクロタイタープレートにより、実施例６の抗ヌクレオソーム抗体測定と同様に、抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。測定結果を図１４に表す。前記患者のヒトヌクレオソームＤＮＡに対する免疫応答は、仔牛胸腺ＤＮＡに対するより遥かに強いことが分かった。さらに、ヒトゲノムＤＮＡと比較してもヌクレオソームＤＮＡの方が免疫応答が強いことが分かった。この傾向は抗ＤＮＡ抗体価の高い他の３例のＳＬＥ患者症例でも認められた。
（実施例１１）
抗体の抑制実験
実施例１０で用いた血清につき、予め血清中の抗体を、抗原を用いて溶液中で吸収した後、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性の測定を行う抑制実験を行った。抗原には、それぞれ、ヌクレオソームＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。抑制実験の結果を図１５に表す。抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性を４０％阻害するのに要する仔牛胸腺ＤＮＡの量はヌクレオソームＤＮＡの３倍であったことから、異種ＤＮＡの抗原性の弱さが明確になった。
同様の抑制実験を、マイクロタイタープレートをＰＬＬで前処理してからヌクレオソームＤＮＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートに添加して作製したプレートについて行った。抑制実験の結果を図１６に表す。この場合は、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性を４０％阻害するのに要する仔牛胸腺ＤＮＡの量はヌクレオソームＤＮＡの１．３倍とＰＬＬで前処理しないプレートの場合に比べて低く、異種ＤＮＡとの差が目立たなくなる。このことは、ＰＬＬによるＤＮＡ抗原構造の修飾によるものと考えられる。即ち、ＰＬＬで前処理したＤＮＡプレートにより測定された抗体活性が、ＤＮＡとＰＬＬとで新たに形成された未知の抗原に対する反応を含むため、本来のＤＮＡ抗原による抑制効果が目立たなくなったものと考えられる。
（実施例１２）
ＰＬＬで前処理せずにＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してＤＮＡを付着させたプレートとの抗原性の差についてさらに調べた。
２４例のＳＬＥ患者の血清と、２４例の健常者の血清とについて、ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとにおいて抗ＤＮＡ抗体反応を測定した。また、それぞれのプレートでヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させないプレートにおいても抗ＤＮＡ抗体反応を測定した。ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートにおける測定結果を図１７に、ＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートにおける測定結果を図１８に表す。
ＰＬＬで前処理したプレートでは、ヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させないプレート（図中−Ａｇ）に対するＳＬＥ患者の血清の反応性が高かった。また、ヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させたプレート（図中＋Ａｇ）に対する健常者の血清の反応性も高かった。このことから、ＰＬＬで前処理したプレートにおいては、非特異的反応が排除できないことが分かった。
前記ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとにおいて、各々で測定された健常者の平均＋３ＳＤを正常域として、ＳＬＥ患者の測定値を比較した結果を図１９に表す。前者における陽性率が４１．６％（１０／２４）であったのに対し、後者における陽性率は１６．６％（４／２４）であり、ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートがＳＬＥの診断に関して格段に優れていることが明確になった。
これらのことから、ＰＬＬで前処理しないＤＮＡプレート、即ち、ＰＬＬを介さずに付着されたＤＮＡプレートがより正確にＤＮＡ抗原に対する免疫応答を測定することができ、ＳＬＥ等の正確な診断に用いることができることが明らかになった。
（実施例１３）
ヌクレオソームＤＮＡをプレートに直接吸着（コーティング）する場合の溶媒中のＮａＣｌ濃度と抗体反応度、つまり、コーティング効率について、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体価の高い１例のＳＬＥ患者の血清を用いて調べた。
０．１４Ｍ、０．２５Ｍ及び０．５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝に、それぞれヌクレオソームＤＮＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を溶解してプレートに吸着させた場合について、抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。測定結果を図２０に表す。０．２５Ｍの場合が最も抗ＤＮＡ抗体の反応性がよく、コーティング効率がよいことが分かる。
さらに、２４例のＳＬＥ患者及び２４例の健常者を対象とした前記３種の濃度で作製されたプレートにおける抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。０．１４ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２１に、０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２２に、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２３にそれぞれ表す。０．２５Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で作製したプレートにおいて、特に抗ＤＮＡ抗体の検出に優れていることが分かった。
本発明によると、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームを、形態安定性を維持し、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるモノヌクレオソームの製造方法、前記モノヌクレオソオームの製造方法により製造されたモノヌクレオソーム、取扱性に優れたモノヌクレオソーム製造用キット、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等に好適なヒストン検査方法、前記モノヌクレオソームを含む、ヌクレオソームに特異的で各種診断等に好適な抗体の測定方法、簡便かつ確実な自己免疫病診断方法、高性能で取扱性に優れた自己免疫病診断用キット、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームＤＮＡを、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるヌクレオソームＤＮＡ製造方法、高性能で取扱性に優れたＤＮＡプレート、前記ＤＮＡプレートの効率的な製造方法、及び、自己免疫病診断等に好適な抗ＤＮＡ抗体測定法を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、２Ｃ１０−核タンパク質複合体が捕獲されているプロテインＡカラムの洗浄液を濃縮し、そこから得たＤＮＡ抽出物を、２％アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
図２は、２Ｃ１０−プロテインＡカラム溶出液を濃縮し、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにて解析したヌクレオソームのプロファイル（マイクロコッカル・ヌクレアーゼ処理前）を示すグラフである。
図３は、図２のサンプルをマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理した後のスーパーデックス２００−ＨＰＬＣクロマトグラフィーのプロファイル（モノヌクレオソームと、ＭＮで切断されたリンカーＤＮＡの形成がよくわかる）を示すグラフである。
図４は、図３のモノヌクレオソームに相当する部分（−）の、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図５は、培養細胞又は末梢リンパ球から得られたヌクレオソームのＳｎｐｅｒｄｅｘ２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィー（代表例）の結果を示すグラフである。
図６は、図５のモノヌクレオソームに相当する部分（−）の、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図７は、アポトーシスを起こした培養細胞由来のモノヌクレオソームと、正常な培養細胞由来のモノヌクレオソームを０．５％アガロース電気泳動により分画した結果を示す写真である。
図８は、モノヌクレオソームを構成するＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す写真である。
図９は、モノヌクレオソームを構成するコアヒストンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して解析した結果を示す写真である。
図１０は、正常な細胞由来の全ヒストン（Ｈ１を含む）の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動像を示す写真である。
図１１は、ＥＬＩＳＡによるモノヌクレオソームに特異的な抗体の測定結果を示すグラフである。
図１２は、ＥＬＩＳＡによるモノヌクレオソームに特異的な抗体のサブクラス別測定結果を示すグラフである。
図１３は、ヌクレオソームＤＮＡをアガロース電気泳動した結果を示す写真である。
図１４は、ヌクレオソームＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び仔牛胸腺ＤＮＡをそれぞれＤＮＡ抗原とするＤＮＡプレートに対する、ＳＬＥ患者血清の免疫応答を示すグラフである。
図１５は、ＰＬＬ前処理なしのプレートにおける抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体反応の抑制効果を示すグラフである。
図１６は、ＰＬＬ前処理したプレートにおける抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体反応の抑制効果を示すグラフである。
図１７は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートにＰＬＬ前処理なしでヌクレオソームＤＮＡをコートしたプレート及びコートしないプレートに対するＳＬＥ患者血清の抗体反応を示す図である。
図１８は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートにＰＬＬ前処理してヌクレオソームＤＮＡをコートしたプレート及びコートしないプレートに対するＳＬＥ患者血清の抗体反応を示す図である。
図１９は、ＰＬＬ前処理の有無と抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体価の関係を示す図である。
図２０は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートにヒトヌクレオソームＤＮＡをコーティングする場合のＮａＣｌ濃度の効果を抗ＤＮＡ抗体価により測定した結果を示すグラフである。
図２１は、０．１４ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。
図２２は、０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。
図２３は、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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