(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
0004308918.tif 000080
｛式中、リンカーは、−O−、−NH−アルキル−C（=O）−NH−、−NH−、−NRG−アルキル−、−NRH−アリール−、−アルキル−C（=O）−NH−、−アリールアルキル−C（=O）−NH−、−NH（CH2）qNH−、−NH（CH2）qNH（C=O）（CH2）jS−、２から２０のヒドロキシアシル残基を含んでなるオリゴエステルフラグメント、２から２０のアミノアシル残基を含んでなるペプチドフラグメント、または直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールカルボン酸エステルであり；ｊおよびｑは独立して１−８の整数であり；および、各RGは、水素、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換、環状または非環状のアルキル部分であり；およびRHは、水素またはアリールであり；
クロスリンカーは、リンカーのチオールとキャリアの表面アミンを結合することができる架橋剤に由来する部分であり；
キャリアはタンパク質または脂質であり；
ｎは１、２、または３であり；
ｓ’は０または１であり；
RA、RB、およびRCの各々は独立に、Hまたはメチルであり；および
RD、RE、およびRFの各々は独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインを含有し；
0004308918.tif 000081
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは各々独立に0、1、2または3であり、ただし、RD、RE、およびRFが、独立してフラノースまたはピラノース部分からなる炭水化物であり、ｂおよびｃの合計が１または２であり、ｄおよびｆの合計が１または２であり、ｇおよびiの合計が１または２であり、および、ただし、ｘ、ｙ、およびｚが同時に０であることはなく；R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；各R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；各Riは独立して水素、CHO、COORii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000082
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびｗはそれぞれ独立に0、1または2であり、ただし、ｖおよびｗの続きの構造は、フラノースまたはピラノース部分を示し、ｌおよびｋの合計は１または２であり、ｓおよびuの合計は１または２であり、および、ただし、ｖおよびｗは同時に０ではなく；R’0は水素、直鎖または分枝鎖アルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に、水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；各Riiiは独立して、水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；
ここで、RD、RE、およびRFの各々は、炭水化物ドメイン、または、腫瘍細胞に存在する、その先端を切断したまたは伸長した変形体を含有する、
ただし、（i）ｓ’が０であり、リンカーが−NH（CH2）2-O-（CH2）2NH-であり、かつ、キャリアがKLHまたはヒト血清アルブミンである場合、RD、RE、及びRFは同時にSTnであることはない、および、（ii）ｓ’が０であり、リンカーが−NH（CH2）3（C＝O）-であり、かつ、キャリアがヒツジ血清アルブミンである場合、RD、RE、及びRFは同時にTnであることはない｝
を有する複合糖質。
【請求項２】
クロスリンカーが、構造：
0004308918.tif 000083
を有するフラグメントである、請求項１記載の複合糖質。
【請求項３】
クロスリンカーがなく、リンカーが、−NH（CH2）qNH−であり、式中、ｑは１−８の整数であり、キャリアが脂質である、請求項１記載の複合糖質。
【請求項４】
リンカーが、−NH（CH2）qNH（C=O）（CH2）jS−、式中、ｊおよびｑは独立して１−８の整数であり、キャリアはタンパク質であり、およびクロスリンカーは下記構造：
0004308918.tif 000084
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項５】
ｎが１であり、ｓ’が１であり、リンカーが、−NH（CH2）qNH−（C=O）（CH2）jS−であり、および、複合糖質が下記構造：
0004308918.tif 000085
式中、ｊおよびｑは独立して１および８までの間の整数である、
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項６】
下記構造：
0004308918.tif 000086
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項７】
ｎが１であり、ｓ’が０であり、リンカーが、−NH（CH2）qNH−であり、キャリアが脂質であり、および、複合糖質が下記構造：
0004308918.tif 000087
式中、ｍ’、ｎ’、およびｐ’は独立して、８および２０までの間の整数であり；
ｑは１および８までの間の整数であり；
RV、RA、RB、およびRCの各々は独立に、水素、置換または非置換、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたは置換または非置換フェニルであり；および
RD、RE、およびRFは、請求項１に規定した通りである、
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項８】
炭水化物ドメインが独立して、単糖類または二糖類である、請求項１および３ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項９】
ｍ’、ｎ’、およびｐ’は各々１４であり；およびｑは３である、請求項７記載の複合糖質。
【請求項１０】
各アミノアシル残基がL体を有する、請求項１および３ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１１】
RD、RE、およびRFは、独立して、Tn、STｎ、2,3−ST、2,6−ST、3−Ley、６−Ley、T（TF）、T、下記構造：
0004308918.tif 000088
を有する炭水化物、下記構造：
0004308918.tif 000089
を有するグリコホリン炭水化物、下記構造：
0004308918.tif 000090
式中、j’およびk’は各々独立して０または１である、
を有するGlabo-H炭水化物；および、Ley抗原は下記構造：
0004308918.tif 000091
式中、l’は０または１である、
からなる群から選択される炭水化物ドメインである、請求項１および３ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１２】
RA、RB、およびRCは各々独立に、Hである、請求項１および３ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１３】
RA、RB、およびRCは各々独立に、Meである、請求項１および３ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１４】
キャリアはタンパク質であり、タンパク質は、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである、請求項１および３ないし５のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１５】
キャリアは脂質であり、脂質は、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニルセリンである、請求項１および３ないし５のいずれか1項に記載の複合糖質。
【請求項１６】
下記の構造：
0004308918.tif 000092
式中、Rは水素またはメチルである、
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項１７】
下記の構造：
0004308918.tif 000093
式中、Rは水素またはメチルである、
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項１８】
下記の構造：
0004308918.tif 000094
を有する、請求項１記載の複合糖質。
【請求項１９】
請求項１ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質と、医薬上許容されるキャリアを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
さらに免疫アジュバントを含有する、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アジュバントがバクテリアまたはリポソームである、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
アジュバントがサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）細胞、ＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）、またはQS21である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
患者に抗体を誘導するための医薬品の製造における、請求項１ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、複合糖質が、前記抗体がヒト腫瘍細胞と特異的に結合でき、抗体を誘導するのに効果的な量で使用される、使用。
【請求項２４】
誘導された抗体が、Tn、STｎ、2,3−ST、2,6−ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T（TF）、TおよびGlobo−H六糖類からなる群より選択される抗原に結合するものである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
患者が臨床上緩解にあるか、または患者が外科手術により処置され、限定された切除できない疾病を有している請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
癌患者において癌を治療するための医薬組成物の製造における、請求項１ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、前記医薬組成物が、治療に有効量の前記複合糖質、および任意に医薬上許容されるキャリアを含む、使用。
【請求項２７】
癌が固形癌である請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
癌が上皮癌である請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
患者における上皮癌の再発を予防するための医薬品の製造における、請求項１ないし６のいずれか1項に記載の複合糖質の使用であって、上皮癌細胞抗原に対する抗体を誘導するのに有効量の前記複合糖質が使用される、使用。
【請求項３０】
誘導された抗体が、Tn、STｎ、2,3−ST、2,6−ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T（TF）、TおよびGlobo−H六糖類からなる群より選択された抗原に結合するものである、請求項２９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、1997年4月16日に出願された暫定米国特許出願第60/043,713号に基づき、それによりその内容は出典明示して本出願の一部とみなす。本発明は、国際衛生局から認可CA-28824、HL-25848およびAI-16943の下、政府の援助を得てなされた。従って米国政府は本発明の一定の権利を有する。
発明の分野
本発明はα-O-結合糖ペプチドの分野にある。詳しくは本発明は、抗癌治療薬として有用な糖ドメインクラスター（clustered glycodomains）を有するα-O-結合複合糖質の製造方法に関する。本発明はまた、かかるα-O-結合複合糖質を含んでなる新規組成物、およびこれらの複合糖質（glycoconjugates）を用いる癌の治療方法に関する。
本出願において、本発明が属する現行の技術水準をさらに十分に記載するために種々の刊行物が引用されているが、その各々はそのまま出典明示して本出願の一部とみなされる。
発明の背景
最近、生物学的プロセスに関するシグナル分子としての炭水化物の役割が注目されている。文献：M.L. Phillips, et al., Science, 1990, 250, 1130; M.J. Polleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88, 6224: T.Takiら, J. Biol. Chem., 1996, 261, 3075; Y. Hirabayashi, A, Hyogo, T. Nakao, K. Tsuchiya, Y. Suzuki, M. Matsumoto, K. Kon, S. Ando, 同書, 1990, 265, 8144; O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R.U. Lemieux, Carbohydr. Res. 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemineux,同書, 1988, 174, 211．細胞の相互作用の仲介における炭水化物の関わりの範囲を解明することは、最新の生物医学的研究における重要な調査領域である。詳細な構造情報をもたらす炭水化物分子は、遊離物質としてではなくむしろ複合糖質（糖タンパク質および糖脂質参照）として存在する傾向がある。しばしば複合体を均質な形で単離することを伴う錯形成性、及び、これら天然に存在する複合体から完全な形の炭水化物を回収することの困難性があるとすれば、合成的アプローチの方が適切であることは明白である（グリコシル化の最近の概説に関しては、文献：Paulsen, H.; Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 1982, 21, 155; Schmidt, R.R., Angew. Chemie Int.Ed. Engl. 1986, 25, 212; Schmidt, R.R., Comprehensive Organic Synthesis, 第6巻，第1（2）章, Pergamon Press, Oxford, 1991; Schmidt, R.R., Carbohydrates, Synthetic Methods and Application in Medicinal Chemistry, 第1巻，第4章, VCH Publishers, Weinheim, New York, 1992を参照。グリコシド合成におけるグリコシル供与体としてのグリカール類の使用に関しては、文献：Lemieux, R.U., Can. J. Chem., 1964, 42, 1417; Lemieux, R.U., Fraiser-Reid, B., Can.J. Chem. 1965, 43, 1460; Lemieux, R.U.; Morgan, A.R.,Can.J. Chem.1965, 43, 2190; Thiem, J.ら, Synthesis 1978, 696; Thiem, J. Ossowski, P., Carbohydr. Chem., 1984, 3, 287; Thiem, J.ら, Liebigs Ann. Chem., 1986, 1044; Thiem, J. Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry, Horton, D.ら編, ACS Symposium Series No. 386, American Chemical Society, Washington, D.C., 1989,第8章を参照）。
糖タンパク質および糖脂質の双方に含まれる血液型物質の炭水化物ドメインは、赤血球、上皮細胞および種々の分泌物に分配される。これらの系に対する初期の焦点は、それらの中心を血液型の特異性を決定することに置かれていた。文献：R.R. Race; R. Sanger, Blood Groups in Man, 第6版, Blackwell, Oxford, 1975．しかしながら、かかる決定因子は概ね細胞の付着および結合現象に関わりがあることがわかっている（例えば、文献：M.L. Phillipsら, Science 1990, 250, 1130）。さらに、複合形態にある血液型物質に関する集合体は、種々の腫瘍の発生のマーカーとして見出される。文献：K.O. Lloyd, Am. J. Clinical Path., 1987, 87, 129; K.O. Lloyd, Cancer Biol., 1991, 2, 421。炭水化物に基づく腫瘍抗原性因子は、診断レベルで、ドラッグデリバリーにおいて、または理想的には免疫療法における供給源としての用途を持っている。文献：Toyokuni, T.ら, J. Am.Chem Soc. 1994, 116, 395; Dranoff, G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 3539; Tao, M-H.; Levy, R., Nature 1993, 362, 755; Boon, T., Int. J. Cancer 1993, 54, 177; Livingston, P.O., Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 624; Hakomori, S., Annu. Rev. Immunol. 1984, 2, 103; K. Shigetaら, J. Biol. Chem. 1987, 262, 1358．
本発明は、糖ペプチド合成の新しい戦略およびプロトコールを提供する。その目的は、複合体ドメインを比較的高い立体特異性で会合させ得るよう製法を簡略化することにある。主に複合糖質合成の進展には、高度の収斂とブロッキング基の操作と関連した負荷からの除去を達成することが必要である。もう１つの必要条件として、タンパク質または脂質を運ぶための適当な結合の提供を伴って炭水化物決定因子を送達することである。文献：Bernstein, M.A. ; Hall, L.D., Carbohydr. Res. 1980, 78, Cl; Lemieux, R.U., Chem. Soc. Rev. 1978, 7, 423; R.U. Lemieuxら, J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 4076．合成により得られた炭水化物を臨床用途に適した担体に組み込もうとするならば、このことは決定的な条件となる。
癌細胞に選択的な（または理想的には特異的な）抗原は、有効な免疫を惹起するのに有用であることがわかっている。文献：Hakomori, S., Cancer Res., 1985, 45, 2405-2414; Feizi, T., Cancer Surveys 1985, 4, 245-269．新規炭水化物パターンはしばしば、細胞表面糖タンパク質、または膜を足場とする糖脂質のいずれかとして形質転換細胞により提供される。原則として、抗体生産を刺激する合成複合糖質を十分に選択すれば、それらの細胞表面に同じタイプの構造が存在する癌に対して有効な免疫性を与えることが可能であった。文献：Dennis, J., Oxford Glycostems Glyconews,第2版, 1992; Lloyd, K.O., Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58頁．標的細胞に対する抗原の限定を増強することで治療を首尾よく改良する見込みがある。例えば、かかる特異的抗原の１つに、Hakomoriおよび共同研究者により、乳癌細胞系統MCF-7から単離され、モノクローナル抗体MBrlとして免疫同定されたグリコスフィンゴ脂質がある。文献：Bremer, E.G.ら, J. Biol. Chem. 1984, 259, 14773-14777; Menard. S.ら, Cancer Res. 1983, 43, 1295-1300．
糖タンパク質における注目されるサージ（文献：M.J. McPhersonら編, PCR A Practical Approach, 1994, Oxford University Press, Oxford, G.M. Blackburn; M.J Gait編, Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 1990, Oxford University press, Oxford; A.M. Bray; A.G. Jhingran; R.M. Valero; N.J. Maeji, J. Org. Chem. 1994, 59, 2197; G. Jung; A.G. Beck-Sickinger, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 367; M.A. Gallop; R.W. Barrett; W.J. Dower; S.P.A. Fodor; E.M. Gordon, J. Med. Chem. 1994, 37, 1233; H.P. Nestler; P.A. Bartlett; W.C. Still, J. Org. Chem. 1994, 59, 4723; M. Meldal, Curr. Opin. Struct. Biol. 1994, 4,673）は、細胞成長の調節、病原体の細胞への結合（文献：O.P. Bahl, Glycoconjugates: Composition, structure and function, H.J. Allen, E.C. Kisailus編, 1992, Marcel Dekker, Inc., New York, 1頁）、細胞内伝達および転移（文献：A. Kobata, Acc. Chem. Res. 1993, 26, 319）を含む種々の生物学的プロセスにおけるそれらの重要性がよく知られることからもたらされた。糖タンパク質は細胞分化マーカーとして働き、おそらくはタンパク質分解に対する保護を与えることにより、タンパク質の折りたたみおよび輸送に加わる。文献：G. Opdenakkerら, FASEB J. 1993, 7, 1330．単離技術および構造解明法の改良（文献：A. De; K-H. Khoo, Curr. Opin. Struct. Biol. 1993, 3, 687）により、天然で生産される糖タンパク質における高レベルの微細な不均一性が明らかとなった。文献：R.A. Dwekら, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 65．単一真核細胞系統がしばしば、所定のタンパク質配列のいずれかを多くの糖形態で産生する。例えば、貧血症に対して臨床上有効な赤血球刺激剤であるエリトロポエチン（EPO）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）で発現させた場合、13を越える公知の種のオリゴ糖鎖によりグリコシル化される（文献：Y.C. Lee; R.T. Lee編, Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, 1994, Academic Press, London）。エリトロポエチンの効力は、グリコシル化のタイプおよび程度にもよるが強力である（文献：E. Watsonら, Glycobiology, 1994, 4, 227）。
ある糖タンパク質のオリゴ糖鎖の生物学的な適切性を解明するには、純品を入手する必要があり、これまでは単離によって得るしかなかった。糖タンパク質の不均一性はこの工程を特に集中的な労力の要るものする。しかしながら、特定の細胞系統を選択すれば、構造活性研究のため、より均一な糖タンパク質を生産することができる。米国特許第5,272,070号。しかしながら天然の供給源からの単離は依然、困難であるという問題がある。
受容体は通常、所定の高分子複合糖質の小断片しか認識しない。その結果として、より小さいが十分に定義された推定糖ペプチドリガンドの合成が、重要な構造情報のソースとしての単離と競合するものとしてもたらされた（文献：Y.C. Lee; R.T. Lee編，前記）。
すべて合成により製造された複合糖質は、ネズミ免疫系で体液性応答の起動を誘発することが知られている。文献：Ragupathi, G.ら, Angew. Cnem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125; Toyokuni, T.; Singhal, A.K., Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 231; Angew. Cnem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381．糖ペプチドは、大部分の糖脂質や炭水化物自体とは対照的に、好都合な場合では主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合し、T細胞を刺激することが知られている。文献：Deck, B.ら, J. Immunology 1995, 1074; Haurum, J.S.ら, L. Exp. Med. 1994, 180, 739; Sieling, P.A.ら, Science 1995, 269, 227（CD1に限定される微生物糖脂質のT細胞認識を示す）。適当に刺激されたT細胞は糖ペプチドの炭水化物部分を特異的に認識する受容体を発現する。本発明は、ペプチド結合の使用により炭水化物の免疫原性を増強させる手段を実証するものである。
糖ペプチドおよび糖タンパク質を含む、化学的に均一な複合糖質の製造は、極めて重要な挑戦である。文献：Bill, R.M.; Flitsch, S.L.; Chem. & Biol. 1996, 3, 145。これらの目的を達成するため、確立されたクローニングのアプローチの進展が意欲的に行われている。種々の発現系（細菌、酵母および細胞系統を含む）がこの目的に向けたアプローチを提供するが、前記のように不均一な糖タンパク質をもたらす。文献：Jenkins, N.ら, Nature Biotech. 1996, 14, 975。かくして化学合成が均一な形態にあるかかる２つのドメインからなる構築体への好ましい接近手段を示す。さらに、合成は、選択された糖形態がペプチド鎖の望ましいいずれの位置においても組み込まれる構築体の集合を可能とするものである。
主題の発明に先立ち、Kunz他により、液相および固相の双方において目的の均一系へ合成により接近することが可能となる、糖ペプチド合成法が開発された（文献：M. Meldal, Curr. Opin. Struct. Biol, 1994, 4, 710; M. Meldal, Neoglycoconjugates: Preparation and Applications,前記; S.J. Danishefsky; J.Y. Roberge, Glycopeptides and Related Compounds: Chemical Synthesis, Analysis and Applications, 1995, D.G. Large, C.D. Warren編, Marcel Dekker, New York; S.T. Cohen-Anisfeld and P.T. Lansbury, Jr., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10531; S.T. Anisfeld; P.T. Lansbury Jr. Org. Chem, 1990, 55, 5560; D. Vetterら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 1995, 34, 60-63）. Cohen-AnisfeldおよびLansburyは、収斂溶液に基づく、選択されたすでに入手可能な糖類とペプチドとの結合を開示している。文献：S.T. Cohen-Anisfeld; P.T. Lansbury, Jr., J. Am. Chem. Soc.,前記。
このように、α-O-結合複合糖質の効果的な製造方法は、本発明に先行してはほとんど知られていない。文献：Nakahara, Y.ら, Synthetic Oligosaccharides, ACS Symp. Ser. 560, 1994, 249-266頁; Garg, H.G.ら, Adv. Carb. Chem. Biochem. 1994, 50, 277。ほとんどすべてのアプローチが、単糖段階でアミノ酸（セリンまたはトレオニン）を組み込むものであった。この構築の後にペプチジルおよび炭水化物ドメインの合成が漸次行われる。文献：Qui, D.; Koganty, R.R.; Tetrahedron Lett. 1997, 38, 45. Eloffson, M.ら, Tetrahedron 1997, 53, 369. Meinjohanns, E.ら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1996, 985. Wang, Z-G.ら、Carbohydr. Res. 1996, 295, 25. Szabo, L.ら, Carbohydr. Res. 1995, 274, 11．合成的な問題の範囲は当技術分野で十分公知であるが、ほとんど進展していない。本発明は、別の、より単純でよりよく収斂するアプローチを提供する（図2）。
文献：Toyokuniら, J.Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 395は、Tn発現糖タンパク質に対して免疫応答を惹起する効力を有する二量体Tn抗原-リポペプチド複合体を含んでなる合成ワクチンを製造した。しかしながら、本発明者らの研究の以前には、前立腺癌細胞の表面が、セリン残基ではなくトレオニンを介して結合したTnクラスターを含んでなる糖タンパク質を与えることは認識されていなかった。従って本発明は、予期されないほど高い抗癌効力を有するワクチンを提供する。
発明の概要
従って本発明の１つの目的は、糖ペプチドをはじめとする新規α-O-結合複合糖質および抗癌治療薬として有用な関連化合物を提供することにある。
本発明のもう１つの目的は、かかる複合糖質を製造する合成方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、本発明の製造方法によって得られる複合糖質のいずれかを、所望により医薬担体と組み合わせて含んでなる、癌患者の治療に有用な組成物を提供することにある。
本発明はまた、ヒトにおいて有効な免疫を惹起することができる完全合成炭水化物ワクチンを提供することを意図するものである。
本発明のさらなる目的は、本発明の製造方法によって得られる複合糖質のいずれかを、所望により医薬担体と組み合わせて用いて癌患者を治療する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
図1は、ムチン中に存在する場合のα-O-結合複合糖質の概略的構造を示している。
図2は、ムチン複合糖質への一般的な合成戦略を示している。
図3は、鍵となる中間体β-フェニルチオグリコシド11を製造するための合成経路を示している。反応条件：（a）（1）DMDO, CH2Cl2;（2）6-O-TIPS-ガラクタール, ZnCl2, -78℃ないし0℃;（3）Ac2O, Et3N, DMAP, 75％,（b）TBAF/AcOH/THT; 80％;（c）5（1.3当量）, TMSOTf（0.1当量）, THF:トルエン 1:1, -60℃ないし-45℃, 84％, α:β 4:1;（d）NaN3, CAN, CH3CN, -15℃, 60％;（e）LiBr, CH3CN, 75％;（f）（1）1PhSH, iPr2NEt, CH3CN,82％ （2）CCl3CN, K2CO3, CH2Cl2, 80％;（g）（1）PhSH, iPr2NEt;（2）CIP（OEt2）, iPr2NEt, THF,（不安定な化合物, 2段階で-72％）;（h）（1）LiBr, CH3CN, 75％;（2）LiSPh, THF, 0℃, 70％）。
図4は、複合糖質ムチン1への合成経路を示している。
反応条件：（a）CH3COSH, 78％;（b）H2/10％ Pd-C, MeOH, H2O,定量的;（c）H2N-Ala-Val-OBn, IIDQ, CH2Cl2, 85％;（d）KF, DMF, 18-クラウン-6, 95％;（e）15, IIDQ, 87％;（f）KF, DMF, 18-クラウン-6, 93％;（g）14, IIDQ,90％;（h）（1）KF, DMF,18-クラウン-6;（2）Ac2O, CH2Cl2;（i）H2/10％ Pd-C, MeOH, H2O, 92％（3段階）;（j）NaOH, H2O, 80％。
図5は、断片結合による複合糖質を製造する合成経路を示している。
試薬：（a）IIDQ, CH2Cl2, 室温, 80％;（b）H2/Pd-C, MeOH, H2O, 95％;（c）CF3COOH, CH2Cl2;（d）NaOH, H2O, MeOH。
図6は、ヨードスルホンアミノ化/4+2経路によるLeyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。
図7は、アジドニトロ化/4+2経路によるLeyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。
図8および9は、本発明の方法によって誘導された糖ペプチドの例を示している。
図10は、糖ペプチドSTNおよびT（TF）を製造する合成経路を示している。
図11は、糖ペプチド（2,3）STを製造する合成経路を示している。
図12は、糖ペプチドグリコホリンを製造する合成経路を示している。
図13は、糖ペプチド3-Leyおよび6-Leyを製造する合成経路を示している。
図14は、T抗原を製造する合成経路を示している。
図15は、T抗原のαクラスターを製造する合成経路を示している。
図16は、T抗原のβクラスターを製造する合成経路を示している。反応の順序は図15に示された通り。
図17、18および19は、Leyエピトープのα-O-結合糖ペプチド複合体の合成を示している。Rは図18に定義されている。
図20は、Tn三量体糖ペプチドのPamCysリポペプチドとの結合を示している；（B）新規ワクチン構築体の一般表示；（C）はPamCys Tn三量体。
図21では、（A）PamCys-Tn三量体の合成方法；（B）架橋結合を介するKLHとBSA複合体の製造方法（12,13）を示している。
図22では、（A）はムチンに関連するF1α抗原およびその製造方法のための逆合成的アプローチを；（B）は中間体5’および6’の製造方法を示している。条件：i）NaN3, CAN, CH3CN, -20℃,一晩, 40％, α（4a’）;β（4b’）1:1; ii）PhSH, EtN（i-Pr）2, CH3, CN, 0℃, 1時間, 99.8％, iii）K2CO3, CCl3CN, CH2Cl2,室温, 5時間, 84％, 5a’:5b’1:5; iv）DAST, CH2Cl2, 0℃, 1時間, 93％, 6a’:6b’1:1。
図23は、中間体1’および2’の製造方法を示している。条件：i）TBAF, HOAc, THF,室温, 3d, 9’については収率100％, 10’については収率94％; ii）11’, BF3, Et2O, -30℃,一晩, iii）AcSH,ピリジン,室温,一晩, 11’の50％転化に基づき収率72％, 12’の48％転化に基づき収率58％（2段階）; iv）80％ HOAc水溶液,一晩,室温-40℃; v）Ac2O,ピリジン,室温,一晩; vi）10％ Pd/C, H2, MeOH-H2O,室温, 4時間; vii）モルホリン, DMF,室温,一晩; viii）NaOMe, MeOH-THF,室温,一晩,1’については収率64％, 2’については収率72％（5段階）。
図24は、F1α抗原の合成における中間体の製造方法を示している。条件：i）（sym-コリジン）2ClO4, PhSO2NH2, 0℃; LiHMDS<EtSH, -40℃ないし室温, 2段階で収率88％; ii）MeOTf, DTBP, 0℃, 20’については収率86％およびα異性体の収率8％; 21’については収率85％およびα異性体の収率6％; iii）Na, NH3, 78℃; Ac2O2, Py,室温, 22’については2段階で59％; iv）NaN3, CAN, CH3CN, -20℃; v）PhSH, EtN（i-Pr）2; CCl3CN, K2CO3; 23’について, 3段階で2:7 α/βの収率17％；24’については3段階で3:1 α/βの収率30％; vi）LiBr, CH3CN, 25’についてはαのみ収率46％; vii）Ac2O, Py; Na-Hg, Na2HPO4, 2段階で収率94％, NaN3, CAN,収率26％, PhSH, EtN（i-Pr）2; K2CO3, CCl3CN, 2段階で収率53％（27’）; viii）LiSPh, THF,収率60％,βのみ（26’）。
発明の詳細な説明
主題の発明は、癌の予防および治療に有用な、新規α−O-結合複合糖質を提供する。
本発明は、構造：
A-Bm-Cn-Dp-Eq-F
｛式中、m、n、pおよびqは0、1、2または3であってm+n+p+q≦6であり；A、B、C、D、EおよびFは独立にアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基であり、AはNまたはO末端であり、Aがアミノアシルの場合には遊離アミンまたはアンモニウムの形態のいずれかであり、またはAがヒドロキシアシルの場合には遊離ヒドロキシであり、あるいはAはアルキル化、アリール化またはアシル化されており；Fは遊離カルボン酸、第1級カルボキシアミド、モノまたはジアルキルカルボキシアミド、モノまたはジアリールカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の（カルボキシ）アルキルカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の（アルコキシカルボニル）アルキル−カルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の（カルボキシ）アリールアルキルカルボキシアミド、直鎖または分枝鎖の（アルコキシカルボニル）アルキルカルボキシアミド、2ないし約20個のヒドロキシアシル残基を含んでなるオリゴエステル断片、2ないし約20個のアミノアシル残基を含んでなるペプチド断片、または直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールカルボン酸エステルのいずれかであり；1ないし約5個の当該アミノアシルまたはヒドロキシアシル残基は以下の構造を有する炭水化物ドメインで置換されており、
0004308918.tif 000002
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に0、1、2または3であり；炭水化物ドメインはOH、COOHおよびNH2からなる群より選択される側鎖置換基の置換によってそれぞれアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基と結合しており；R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000003
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり；R’0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である｝
を有する複合糖質を提供する。
ある具体例では、本発明は、少なくとも１つの炭水化物ドメインが細胞表面エピトープのオリゴ糖構造を有する、前記の複合糖質を提供する。特定の具体例では、本発明は、エピトープがLea、Leb、LexまたはLeyである複合糖質を提供する。もう１つの特定の具体例では、本発明は、エピトープがMBr1、末端切断型MBr1五糖類または末端切断型MBr1四糖類である場合糖質を提供する。
もう１つの具体例では、本発明は、アミノアシル残基が天然のアミノ酸に由来する複合糖質を提供する。もう１つの具体例では、本発明は、少なくとも１つのアミノアシル残基が式：-NH-Ar-CO-を有する複合糖質を提供する。特殊な具体例では、Ar部分はp-フェニレンである。
もう１つ具体例では、本発明は、少なくとも１つのアミノアシルまたはヒドロキシアシル残基が構造：
0004308918.tif 000004
｛式中、M、NおよびPは独立に0、1または2であり；XはNHまたはOであり；YはOH、NHまたはCOOHであり；R’およびR”は独立に水素、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリールである｝を有する複合糖質を提供する。特殊な具体例では、炭水化物ドメインと結合したアミノアシル残基はSerまたはThrである。
もう１つの具体例では、本発明は、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14およびR15の１以上が1RS,2RS,3-トリヒドロキシ-プロピルである複合糖質を提供する。
本発明はまた、前記の複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、治療上有効量の前記複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。本治療方法は癌が固形腫瘍または上皮癌である場合に効果的である。
本発明はまた、構造：
0004308918.tif 000005
｛式中、R1、R3、R4、R5、R6およびR7はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、N3、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；RiはH、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R2は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R8は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；Riiは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；かつ、Xはハロゲン化物、トリハロアセトアミデート、アルキルもしくはアリールスルフィドまたはジアルキル亜リン酸塩である｝を有する三糖類を提供する。好ましい具体例では、本発明は、Xがトリエチル亜リン酸塩である前記の三糖類を提供する。本発明はさらに、R7が1RS,2RS,3-トリヒドロキシプロピルまたは1RS,2RS,3-トリアセトキシプロピルである三糖類を提供する。さらに本発明は、R8がCOOHである三糖類を提供する。
本発明はまた、構造：
0004308918.tif 000006
｛式中、R1、R3、R4、R5、R6およびR7はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、N3、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；RiはH、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R2は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R8は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；Riiは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R0は塩基に不安定なN保護基であり；かつ、R’は水素または低級アルキル基である｝を有する三糖類アミノ酸を提供する。種々のN保護基が、前記の三糖類アミノ酸の製造に許容される。R0は、好ましくは数種の塩基に影響を受けやすい保護基の１つであってよいが、さらに好ましくはフルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）であってもよい。
本発明は、ヒト患者において抗体を誘導する方法を提供し、抗体はヒト腫瘍細胞と特異的に結合することができ、それは抗体を誘導するために効果的な本明細書中に開示された複合糖質の一定量を患者に投与することを含んでなる。ある具体例では、本発明は、複合糖質が好適な担体タンパク質と結合している、抗体誘導法を提供する。特に、担体タンパク質の好ましい例としては、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHが挙げられる。
もう１つの具体例では、本発明は、さらに免疫アジュバントをともに投与することを含む、抗体誘導法を考案する。ある具体例では、アジュバントは細菌またはリポソームである。特に、好ましいアジュバントとしては、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21が挙げられる。誘導される抗体は典型的には、（2,6）-シアリルT抗原、Lea、Leb、Lex、Ley、GM1、SSEA-3およびMBr1抗体からなる群より選択される。抗体を誘導する方法は、患者が臨床上緩解にある場合、または患者が外科手術によって処置され、限定された切除できない疾患を有している場合に有用である。
本発明はまた、抗体を誘導するために有効な量の前記複合糖質を用いて患者にワクチン接種することを含んでなる、患者における上皮癌の再発を予防する方法を提供する。この方法を実施する際には、複合糖質を単独で使用してもよいし、または好適な担体タンパク質と結合させてもよい。本発明に用いられる担体タンパク質の特異な例としては、ウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHが挙げられる。ある具体例では、上皮癌の再発を予防する本方法には、免疫アジュバントをともに投与するさらなる工程が含まれる。特に、アジュバントは細菌またはリポソームである。好ましいアジュバントとしては、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21が挙げられる。本方法によって誘導される抗体は典型的には、（2,6）-シアリルT抗原、Lea、Leb、Lex、Ley、GM1、SSEA-3およびMBr1抗体からなる群より選択される。
本発明はさらに、構造：
0004308918.tif 000007
｛式中、XはOまたはNRであり；RはH、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアシルであり；A、BおよびCは独立に、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアシル、-CO-（CH2）p-OHまたはアリールであり、あるいは下記構造を有し、
0004308918.tif 000008
式中、YはOまたはNRであり；DおよびEは構造：-（CH2）pOHまたは-CO（CH2）pOHを有し；ｎおよびｐは独立に、0ないし12の整数であり；DおよびE、ならびにA、BおよびCは、これらのいずれか１つが-CO（CH2）pOHである場合には、独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインによって置換されており、
0004308918.tif 000009
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり；炭水化物ドメインは末端OH置換基の置換によってそれぞれのヒドロキシアシル残基と結合し；Roは水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000010
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり；R’0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である｝を有する複合糖質を提供する。ある具体例では、本発明は、少なくとも１つの炭水化物ドメインが細胞表面エピトープのオリゴ糖構造を有している、前記の複合糖質を提供する。１つの具体例では、エピトープはLea、Leb、LexまたはLeyである。もう１つの具体例では、エピトープはMBr1、末端切断型MBr1五糖類または末端切断型MBr1四糖類である。特定の具体例では、本発明は、１つ以上のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14およびR15が1RS,2RS,3-トリヒドロキシ-プロピルである前記複合糖質を提供する。
本発明はまた、前記の複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、治療上有効量の前記の複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。本方法は癌が固形腫瘍または上皮癌である場合に効果的である。
本発明はまた、コア構造および炭水化物ドメインを含んでなる複合糖質であって、そのコア構造が、
0004308918.tif 000011
｛式中、Mは約2ないし約5,000の整数であり；Nは1、2、3または4であり；AおよびBは直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基を含む、好適な重合体の末端基であり；コア構造は、下記構造を有する炭水化物ドメインによって置換されており、
0004308918.tif 000012
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり；炭水化物ドメインはOH置換基の置換によってコア構造と結合し；R0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；Riは水素、CHO、COORii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000013
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり；R’0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアリール基であり；Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立にH、あるいは置換または非置換、直鎖または分枝鎖のアルキル、アリールアルキルまたはアリール基である｝である複合糖質を提供する。
特殊な具体例では、本発明は、細胞表面糖タンパク質のムチンファミリーに関連する糖ペプチドを製造する方法を提供する。ムチンは、セリンおよびトレオニン残基にα-O-結合した炭水化物のクラスター配列を有する異常なα-O-グリコシデーションパターンによって特徴づけられている。図1。ムチンは上皮癌（例えば、前立腺癌および乳癌）ならびにある血液細胞癌の一般的マーカーである。文献：Finn,O.J.ら,Immunol.Rev.1995,145,61．
（2,6）-シアリルT抗原（ST抗原）は、α-O-結合糖ペプチドの「グリコホリンファミリー」の例である（図2）。それは骨髄性白血病細胞で選択的に発現する。文献：Fukuda,M.ら,J.Biol.Chem.1986,261,12796.Saitoh,O.ら,Cancer Res.1991,51,2854．従って、特殊な具体例では、本発明は、CD43（ロイコシアリン）糖タンパク質のN末端に由来する、ペンタペプチド1への合成経路を提供する。文献：Pallant,A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,1328．
特に、本発明は、ブロックアプローチによるα-O-結合（2,6）-STグリコシルセリンおよびトレオニンの立体選択的製剤を提供する。さらに本発明は、STエピトープクラスター（1,20）を有するかかるグリコシル単位を組み込むO-結合糖ペプチドを提供する。
広範囲の炭水化物ドメインが、本発明によって考案されている。特に記載すれば、以下の細胞表面エピトープおよび抗原に由来する炭水化物ドメインがある：MBr1エピトープ；
Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glu→Ocer末端切断型
MBr1エピトープ五糖類：Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galａ1→4Galβ1末端切断型MBr1エピトープ四糖類：Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1SSEA-3抗原：2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1Leyエピトープ：
Fucα1→2Galβ1→4（Fucα1→3）GalＮAcβ1GM1エピトー
プ：Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4（NeuAcα2→3）Glu→Ocer
固相方式に基づく炭水化物ドメインの製造方法は、米国特許第5,543,505号および同第5,708,163号、ならびにPCT国際出願第PCT/US96/10229号に開示されており、それらの内容は出典明示して本明細書の一部とみなす。
本発明はまた、構造：
0004308918.tif 000014
｛式中、m、nおよびpは役8ないし約20の整数であり；qは約1ないし約8の整数であり；RV、RW、RXおよびRYは独立に、水素、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、あるいは所望により置換されていてもよいフェニルであり；RA、RBおよびRCは独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインであり、
0004308918.tif 000015
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり；R0は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；Riは水素、CHO、COORii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000016
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり；R’0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリール基であり；Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立に、水素、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基である｝を有する複合糖質を提供する。ある具体例では、本発明は、RV、RW、RXおよびRYがメチルである複合糖質を提供する。
ある他の具体例では、炭化水素ドメインは独立に、単糖類または二糖類であってもよい。１つの具体例では、本発明は、yおよびzが0であり；xが1であり；かつ、R3がNHAcである複合糖質を提供する。もう１つの具体例では、本発明は、hが0であり；gおよびiが1であり；R7がOHであり；R0が水素であり；かつ、R8がヒドロキシメチルである複合糖質を提供する。さらにもう１つの具体例では、m、nおよびpは14であり；かつ、qは3である。好ましい具体例では、複合糖質の各アミノアシル残基がその中にL-配置を有する。
特殊な例では、複合糖質の炭水化物ドメインは、独立に、
0004308918.tif 000017
である。
もう１つの例では、炭水化物ドメインは、独立に、
0004308918.tif 000018
である。
さらに、炭水化物ドメインは、独立に、
0004308918.tif 000019
である。
炭水化物ドメインはまた、独立に、
0004308918.tif 000020
である。
炭水化物ドメインは、独立に、
0004308918.tif 000021
である。
また、炭水化物ドメインは、独立に、
0004308918.tif 000022
であってもよい。
炭水化物ドメインはまた、独立に、
0004308918.tif 000023
である。
本発明は、構造：
0004308918.tif 000024
｛式中、担体はタンパク質であり；架橋剤は担体およびチオールの表面アミンと結合することができる架橋剤に由来する部分であり；m、nおよびpは約8ないし約20の整数であり；jおよびqは独立に、約1ないし約8の整数であり；RV、RW、RXおよびRYは独立に、水素、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、あるいは所望により置換されていてもよいフェニルであり；RA、RBおよびRCは独立に、下記構造を有する炭水化物ドメインであり、
0004308918.tif 000025
式中、a、b、c、d、e、f、g、h、i、x、yおよびzは独立に、0、1、2または3であり；R0は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アシル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立に、水素、OH、ORi、NH2、NHCORi、F、CH2OH、CH2ORi、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；Riは水素、CHO、COORii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基、あるいは下記構造を有する糖類部分であり、
0004308918.tif 000026
式中、YおよびZは独立にNHまたはOであり；k、l、r、s、t、u、vおよびwはそれぞれ独立に0、1または2であり；R’0は水素、直鎖または分枝鎖のアルキル、アシル、アリールアルキル、またはアリール基であり；R10、R11、R12、R13、R14およびR15はそれぞれ独立に水素、OH、ORiii、NH2、NHCORiii、F、CH2OH、CH2ORiii、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、（モノ、ジまたはトリ）ヒドロキシアルキル、（モノ、ジまたはトリ）アシロキシアルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；R16は水素、COOH、COORii、CONHRii、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリール基であり；Riiiは水素、CHO、COORiv、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基であり；かつ、RiiおよびRivはそれぞれ独立に、水素、あるいは所望により置換されていてもよい直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アリールアルキルまたはアリール基である｝を有する複合糖質を提供する。
種々のタンパク質が好適であると考えられ、ウシ血清アルブミン、KLH、およびヒト血清アルブミンが含まれる。本発明に適する架橋剤は当技術分野において広く知られており、ブロモ酢酸NHSエステル、6-（ヨードアセトアミド）カプロン酸NHSエステル、マレイミド酢酸NHSエステル、マレイミド安息香酸NHSエステルなどが含まれる。１つの具体例では、複合糖質は、構造：
0004308918.tif 000027
を有する。
１つの具体例では、本発明は、Rv、RW、RXおよびRYがメチルである複合糖質を提供する。もう１つの具体例では、本発明は、炭水化物ドメインが単糖類または二糖類である複合糖質を提供する。もう１つの具体例では、本発明は、yおよびzが0であり；xが１であり；R3がNHAcである複合糖質を提供する。さらなる具体例では、本発明は、hが0であり；gおよびiが１であり；R7がOHであり；R0が水素であり；m、nおよびpが14であり；qが3であり；かつ、R8がヒドロキシメチルである複合糖質を提供する。
ある具体例では、本発明は、タンパク質がBSAまたはKLHである、開示されたような複合糖質を提供する。好ましい具体例では、複合糖質のそれぞれのアミノアシル残基はL-配置を有する。
複合糖質の特殊な例には、以下の炭水化物ドメインのいずれもが含まれ、それはいずれの具体例においても同一であっても異なっていてもよい。
0004308918.tif 000028
0004308918.tif 000029
0004308918.tif 000030
本発明はさらに、前記で開示した複合糖質および医薬上好適な担体を含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。
本発明はまた、治療上有効量の前記で開示した複合糖質および医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。ある具体例では、本発明は癌が固形癌である場合の方法を提供する。特に明示すれば、本方法は癌が上皮癌である場合に適用できる。特に、前立腺癌の治療への適用が効果的である。
本発明はまた、抗体を誘導するのに効果的な前記で開示した複合糖質の一定量を患者に投与することを含んでなる、ヒト患者において抗体を誘導する方法を提供し、ここで抗体はヒト腫瘍細胞と特異的に結合できる。ある具体例では、本発明は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである方法を提供する。
さらに本発明は、免疫アジュバントをともに投与することをさらに含んでなる、関連の抗体誘導法を提供する。アジュバントは、好ましくは細菌またはリポソームである。特に、アジュバントは、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21である。誘導される抗体は好ましくは、Tn、STN、（2,3）ST、グリコホリン、3-Lyy、6-Ley、T（TF）およびT抗体からなる群より選択される。
本発明はさらに、患者が臨床上緩解にある場合に、または患者が外科手術により処置され、限定された切除できない疾病を有している場合に抗体を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、抗体を誘導するのに効果的な量で前記で開示した複合糖質を用いて患者にワクチン接種することを含んでなる、患者における上皮癌の再発を予防する方法を提供する。担体タンパク質がウシ血清アルブミン、ポリリジンまたはKLHである本方法が実施され得る。さらに本発明は、免疫アジュバントをともに投与することをさらに含んでなる、関連の上皮癌再発予防方法を提供する。好ましくは、アジュバントは細菌またはリポソームである。特に明示すれば、好ましいアジュバントは、サルモネラ・ミネソタ細胞、バチルスCalmette-GuerinまたはQS21である。本方法の実施において誘導される抗体は、Tn、STN、（2,3）ST、グリコホリン、3-Ley、6-Ley、T（TF）およびT抗体からなる群より選択される。
本発明はまた、保護されたO-結合Ley複合糖質を形成するのに好適な条件下で、構造：
0004308918.tif 000031
｛式中、Rは水素、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいアリールであり；R1はt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチレンオキシカルボニル、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールであり；R2は直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールである｝を有する保護されたO-結合Ley複合糖質を製造する方法であって、該方法は構造：
0004308918.tif 000032
（式中、R3は直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールであり、かつ、R4は水素、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいアリールまたはベンジルであり、あるいは所望により置換されていてもよいアリールスルホニルである）を有する硫化四糖類と、構造：
0004308918.tif 000033
を有するO-結合グリコシルアミノアシル成分を結合させることを含んでなる、方法を提供する。
本発明の１つの具体例においては、前記の硫化四糖類は、（a）ハロスルホンアミノ化四糖類を形成するのに好適な条件下で、構造：
0004308918.tif 000034
を有する四糖類グリカールをハロスルホンアミノ化し、次いで（b）メルカプタンおよび硫化四糖類を形成するのに好適な塩基で、ハロスルホンアミノ化物を処理することによって製造してもよい。特に、メルカプタンが直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールであり；かつ、塩基が水素化ナトリウム、水素化リチウム、水素化カリウム、リチウムジエチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、またはリチウムヘキサメチルジシラジドである本方法が実施され得る。
本発明はまた、開示された方法によって製造されたO-結合複合糖質を提供する。
特に、本発明は、構造：
0004308918.tif 000035
｛式中、R4は直鎖または分枝鎖の低級アシルであり；かつ、Rは水素、あるいは直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアリールである｝を有するO-結合複合糖質を提供する。糖ペプチドのペプチド部分の変更は本発明の範囲内である。特殊な具体例では、本発明は、R4がアセチルであるO-結合糖ペプチドを提供する。
本発明は、保護されたO-結合Ley複合糖質を形成するのに好適な条件下で、構造：
0004308918.tif 000036
｛式中、Rは水素、置換または非置換の直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいアリールであり；R1はt-ブチルオキシカルボニル、フルオレニルメチレンオキシカルボニル、直鎖または分枝鎖の低級アルキルまたはアシル、所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールであり；かつ、R2は直鎖または分枝鎖の低級アルキル、または所望により置換されていてもよいベンジルまたはアリールである｝を有する保護されたO-結合Ley複合糖質を製造する方法であって、該方法は構造：
0004308918.tif 000037
を有するアジドイミノ化四糖類と、構造：
0004308918.tif 000038
を有するO-結合グリコシルアミノアシル成分を結合させることを含んでなる方法を提供する。
好ましくは、アジゾイミノ化四糖類は、（a）アジドアルコールを形成するのに好適な条件下で、構造：
0004308918.tif 000039
を有するアジドニトロ化四糖類を処理し、次いで（b）アジゾイミノ化物を形成するのに好適な条件下で、アジドアルコールをイミドアシル化剤と反応させることにより製造する。アジドニトロ化四糖類は、（a）好適な条件下で、構造：
0004308918.tif 000040
を有する四糖類グリカールを、構造：
0004308918.tif 000041
を有する過アセチル化四糖類グリカールに変換し、次いで（b）アジドニトロ化四糖類を形成するのに好適な条件下で、工程（a）で生じたグリカールをアジドニトロ化することにより製造してもよい。工程（b）は好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化リチウム、アジ化カリウム、アジ化テトラメチルアンモニウムおよびアジ化テトラエチルアンモニウムからなる群より選択されるアジ化塩の存在下で、ニトロ化セリウムアンモニウムを用いて達成される。
さらに本発明は、前記した通りに製造したO-結合複合糖質を提供する。
一旦、O-保持アミノアシル側鎖と共有結合した炭水化物ドメインを製造すれば、主題の発明の複合糖質は、液相または固相合成プロトコールのいずれかを用いて製造してもよく、それら双方は簡単なペプチドを合成する技術分野では十分に公知である。他の方法の中で、本発明において有用な広く用いられている液相ペプチド合成法は、FMOC保護基を除去するための、α-アミノ置換基；アンモニア、第1級または第2級アミン（モルホリンなど）に対する保護基としてのFMOC（または関連するカルバミン酸塩）、および好適な有機溶媒中でペプチドまたはペプチド誘導体のCからNへの合成用カップリング剤としての置換カルボジイミド（N,N’-ジシクロヘキシル-または-ジイソプロピルカルボジイミドなど）を使用する。NからC方向でのO-結合複合糖質の液相および固相合成もまた、本発明の範囲内である。
固相合成については、数種の異なる樹脂支持体が当分野で標準として採用されている。オリジナルのMerrifieldのクロロメチル化ポリスチレンの他にも、他の種の樹脂がペプチドアミドおよび酸を製造するために広く用いられており、ベンズヒドリルアミンおよびヒドロキシメチル樹脂（文献：Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., 1984, Rockford, IL; Piettaら, J. Chem. Soc. D., 1970, 650-651; Orlowskiら, J. Org. Chem., 1976, 50, 3701-5; Matsuedaら, Peptides, 1981, 2, 45-50; およびTam, J. Org. Chem., 1985, 50, 5291-8）ならびに官能化ポリスチレンでグラフトした重合体基質からなる樹脂（米国特許第5,258,454号）が含まれる。これらの固相は酸に不安定である（文献：Albericioら, Int. J. Peptide Research. 1987, 30, 206-216）。本発明を実施する際に容易に利用できる別の酸に不安定な樹脂は、FMOCで保護したアミノ酸との結合におけるトリアルコキシジ-フェニルメチルエステル部分を使用する（文献：Rink, Tetrahedron Letters, 1987, 28, 3787-90; 米国特許第4,859,736号および米国特許第5,004,781号）。ペプチドは結局、トリフルオロ酢酸での切断によって放出される。酸に不安定なN保護基であれ塩基の影響を受けやすいN保護基であれ、本発明の方法の特定の樹脂プロトコールへの適用には適合する保護基の選択が含まれ、それは化学分野の当業者の技術の範囲内である。
本明細書に開示されたように製造された複合糖質は、種々の形態の癌の治療および予防において有用である。従って、本発明は、治療上有効量の本明細書に開示されたα-O-結合複合糖質のいずれかを、所望により医薬上好適な担体と組み合わせて患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。癌が固形癌または上皮癌、または白血病である場合に、本方法を適用してもよい。特に、癌が乳癌であり、適切なエピトープがMBr1である場合に、本方法を適用できる。
主題の発明はまた、有効成分として前記で開示したα-O-結合複合糖質のいずれかを、所望によるが典型的には、医薬上好適な担体と組み合わせて含んでなる、癌治療用の医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、他の治療上有効な成分をさらに含んでなってもよい。
主題の発明はさらに、前記α-O-結合複合糖質のいずれかの治療上有効量と、医薬上好適な担体を患者に投与することを含んでなる、癌患者において癌を治療する方法を提供する。
α-O-結合複合糖質に関連する前記で教示された化合物は、in vivoおよびin vitroの双方での癌の治療に有用である。これらの化合物が組織培養において癌細胞の増殖を阻害し、腫瘍の大きさを小さくすることができることは、本化合物が癌患者において癌を治療、予防または改善するために有用であることを示す。
さらに、本明細書に開示された方法によって製造された複合糖質は、アジュバント治療において種々の上皮癌および白血病細胞で抗体を免疫反応性とすることができるワクチンとして有用な抗原である。かかるアジュバント治療によって、上皮癌および白血病の再発率を小さくし、外科手術後の生存率を上昇させる可能性がある。癌を外科的に処置した患者に、次いで免疫化に先立って抗体を欠く患者において見出された細胞表面分化抗原から作成したワクチンで処置する臨床上の試みで、無病間隔が極めて著しく長くなることが認められる可能性がある。文献：P.O. Livingstonら, J. Clin. Oncol., 1994, 12, 1036を参照。
本発明の化合物の治療用量は、治療すべき病状の性質および重篤さにより、また特定の化合物およびその投与経路により異なると考えられる。一般に、抗癌活性に対する１日用量範囲は、１回または複用量で、哺乳類の体重の0.001ないし25mg/kg、好ましくは0.001ないし10mg/kg、最も好ましくは0.001ないし1.0mg/kgの範囲内である。特殊な場合には、25mg/kgより多い量を投与する必要があるかも知れない。
本明細書で開示された化合物の有効用量を、哺乳類、特にヒトに与えるには、いずれの好適な投与経路を使用してもよい。例えば、経口、直腸、局所、非経口、目、肺、鼻などの経路を使用してもよい。投与形態としては、錠剤、トローチ剤、分散液、懸濁液、水剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エアゾル剤などが挙げられる。
組成物には、経口、直腸、局所（経皮装置、エアゾル、クリーム、軟膏、ローションおよび散剤を含む）、非経口（皮下、筋肉内および静脈内を含む）、目（眼）、肺（鼻または口腔内吸入）または鼻腔投与に好適な組成物が含まれる。所定の場合のいずれかにおいて最も好適な経路は、治療すべき病状の性質および重篤さならびに有効成分の性質に依存するところが大きい。便宜にはそれらを単位投与形で提供してもよく、製薬分野で十分公知のいずれの方法によって調製してもよい。
経口投与形態を調製する際、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤および水剤）の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤などの通常でない薬剤媒体を用いてもよく；また、散剤、カプセル剤および錠剤などの経口固形製剤の方が、液体経口製剤よりも好ましい場合には、デンプン、糖類、微晶質セルロース、賦形剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など担体のような特殊な医薬媒質を使用してもよい。所望であれば、カプセルを標準的な水性または非水性法によって被覆してもよい。前記の投与形態に加えて、本発明の化合物を徐放手段および装置によって投与してもよい。
経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、所定量の有効成分を粉末または顆粒形態でそれぞれ含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤、あるいは溶液、または水溶液もしくは非水溶液中の懸濁液、または油中水型もしくは水中油型エマルションのような個別単位として調製してもよい。かかる組成物は製薬分野で公知のいずれの方法によって調製してもよい。一般に、組成物は有効成分を、液体担体、細かく砕いた固形担体、またはその双方と均一かつ十分に混合することにより調製し、次いで必要であれば生成物を成形して所望の形態にする。例えば、錠剤は、所望により１以上の補助成分とともに圧縮または成形することにより調製してもよい。圧縮錠剤は、所望により結合剤、滑沢剤、不活性賦形剤または界面活性剤もしくは分散剤と混合した粉末または細粒などのさらさらした形態の有効成分を好適な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠剤は、不活性な液体賦形剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することにより製造してもよい。
本発明は、以下の実験の詳細からさらに理解されるであろう。しかしながら、当業者ならば、議論された特異な方法および結果がその後に続く請求の範囲に記載されている発明の単なる例示であることが容易に理解できるであろう。α-O-結合複合糖質を調製するための本発明の方法は当技術分野で公知の種々の代替保護基の使用を包含することが理解されるであろう。下記実施例を含む開示の中で用いられた保護基は単なる例示である。
実験の詳細：一般法
空気および湿気の影響を受けやすい反応は、特に断らない限り、アルゴン雰囲気下で火炎乾燥した装置で実施した。空気に影響を受けやすい液体および溶液はシリンジまたはカニューレで移した。可能な限り、反応は、薄層クロマトグラフィー（TLC）で監視した。大まかな溶媒除去は、”Buchi”式ロータリーエバポレータにおいて吸引真空下の真空中で行い、痕跡溶媒は高真空ポンプにより0.1-0.5mmHgで除去した。
融点（mp）は補正せず、”Electro thermal”シリーズIA9100デジタル融点装置を用いて軟質ガラス製の毛細管中で行った。赤外線（IR）は、”Perkin-Elmer 1600”シリーズフーリエ変換装置を用いて記録した。特に断らない限り、サンプルは、NaClプレート上のニートの膜として調製した。吸収バンドは波数（cm1）で報告する。適切なで妥当なバンドのみを報告する。
プロトン核磁気共鳴（1H NMR）スペクトルは、”Bruker AMX-400”型分光計を用いて400MHzを用いて測定した。化学シフトは、ロック標準（δ=7.25ppm）として残留CHCl3を用い、テトラメチルシラン（TMS;δ=0ppm）からの100万分の1（ppm）の低磁場で報告する。多重度は通常の様式で、s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線、br=幅広して略記する。炭素核磁気共鳴（13C NMR）スペクトルは、”Bruker AMX-400”型分光計にて、合成パルスデカップリングにより100MHzで行った。サンプルは1H NMRスペクトルの場合と同様に調製し、化学シフトはTMS（0ppm）と比較して報告し、残留CHCl3は内部標準（δ=77.0ppm）として用いた。高分解能質量スペクトル（HRMS）分析は、内部標準としてペルフルオロケロセン（PFK）を用い、”JEOL JMS-DX 303HF”型質量分析計にて電子衝撃イオン化（EI）により測定した。低分解能質量スペクトル（MS）は、”Delsi-Nermag R-10-10”型質量分析計にて、指示されたキャリヤーガス（アンモニアまたはメタン）を用い、電子衝撃イオン化（EI）または化学イオン化（CI）のいずれかによって測定した。ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル（GCMS）については、キャリヤーガスとしてのヘリウムとともに、DB-5接合毛細管カラム（30m, 厚さ0.25mm）を使用した。典型的な条件としては、40℃/分で60ないし250℃の温度プログラムを使用した。
薄層クロマトグラフィー（TLC）は、プレコートガラスプレート（シリカゲル60、厚さ0.25mm）を用いて行った。視覚化は、254nm UVランプを照射することにより、またはアニスアルデヒド染料（3.5mLの酢酸、12.5mLの濃硫酸および338mLの95％エタノール（EtOH）中の9.2mLのp-アニスアルデヒド）中に浸漬し、加熱して発色させることにより行った。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーは、標準プロトコールに従って行った。
特に断らない限り、すべての溶媒および試薬は市販の等級であり、以下、括弧内に挙げた乾燥方法を用いてアルゴン下で溶媒を蒸留することを示した場合以外は、受け取ったまま使用した：CH2Cl2（CaH2）；ベンゼン（CaH2）；THF（Na/ケチル）；Et2O（Na/ケチル）；ジイソプロピルアミン（CaH2）。
略号
TLC             薄層クロマトグラフィー
EtOAc           酢酸エチル
TIPS            トリイソプロピルシリル
PMB             p-メトキシベンジル
Bn              ベンジル
Ac              酢酸塩
hex             ヘキサン
THF             テトラヒドロフラン
coll            コリジン
LiHMDS          リチウムヘキサメチルジシラジド
DMF             N,N-ジメチルホルムアミド
DMAP            2-ジメチルアミノピリジン
DDQ             2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノリン
TBAF            テトラ-n-ブチルアンモニウムフロリド
M.S.            モレキュラーシーブス
r.t.            室温
r.b.            丸底フラスコ
実施例１
２，６−ジ−O−アセチル−３，４−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル−（１−３）−６−O−（トリイソプロピルシリル）−４−O−アセチル−ガラクタール（３）。
ガラクタール２（１．９５９g，９．８９mmol，１．２当量）を１００mLの無水ジクロロメタンに溶解し、０℃に冷却した。ジメチルジオキシラン（アセトン中約０．０６M溶液、２００mL）をカニュレを経由して反応フラスコに添加した。１時間後、出発原料が消費されたことをTLCで確認した。溶媒を窒素気流によって除去し、粗エポキシドを真空下、１時間室温で乾燥した。粗残さ（TLCでは１つのスポット）を３３mLのTHFに取り込み、２０mLのTHF中の６−O−トリイソプロピル−ガラクタールアクセプタ（２．５０g，８．２４mmol）を添加した。反応混合物を−７８℃に冷却し、ZnCl2（９．８mLのエーテル中の１M溶液）を滴下した。反応混合物をゆっくりと室温まで昇温し、一昼夜撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次いで食塩水で洗浄し、最後に硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒蒸発後、粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（４０−４５−５０−６０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製すると、直ちにアセチル化される純粋な生成物が得られた。３．３６gを乾燥したジクロロメタン、５０mLに溶解し、トリエチルアミン（１９．２mL）、触媒量のDMAP（約２０mg）を添加し、溶液を０℃に冷却した。無水酢酸（９．９mL）を０℃で滴下した。反応混合物を一昼夜、室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗材料をクロマトグラフにかける（５０％酢酸エチル／ヘキサン）と、グリカール３（３．３g，７５％）が得られた：1H  NMR（５００MHz，CDCl3）δ６．４２（d，J＝６．３Hz，１H，H−１，グリカール），４．３５（１／２AB，dd，J＝６．８Hz，１１．５Hz，１H，H−６’a），４．２８（１／２AB，dd，J＝６．１，１１．５Hz，１H，H−６’b）。
実施例２
２，６−ジ−O−アセチル−３，４−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル−（１−３）−４−O−アセチル−ガラクタール（４）。
化合物３（１．５g，２．４３mmol）を２４mLのTHFに溶解し、０℃に冷却した。TBAF（５．８mL，５．８３mmol，２．４当量）と酢酸（３３６mL，２．４当量）の混合物を０℃で先の混合物に添加した。反応混合物を３０℃で５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄し、次いで、硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物をクロマトグラフィー（８０−８５−９０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製すると、化合物４が得られた（０．９g，８０％）：1H  NMR（５００MHz，CDCl3）δ６．３８（dd，Ｊ＝１．８，６．３Hz，１H，H−１，グリカール），５．３９（m，１H，H−４），２．２２（ｓ，３H，アセテート），２．１６（ｓ，３H，アセテート），２．１３（ｓ，３H，アセテート）。
実施例３
［（メチル＝５−アセタミド−４，７，８，９−O−アセチル−３，５−ジデオキシ−O−グリセロ−α−D−ガラクト−２−ノヌロピラノシロナート）−（２−６）］−（２，６−ジ−O−アセチル−３，４−O−カルボニル−β−D−ガラクトピラノシル）−（１−３）−４−O−アセチル−ガラクタール（６）。
火炎乾燥したフラスコに、シアリルホスファイトドナー５（６９mg，０．１１mmol，１．３当量）とアクセプタ４（４０mg，０．０８５mmol）を、ドライボックス（アルゴン雰囲気）中で充填した。混合物を０．６mLの乾燥THFに溶解した。０．６mLの乾燥トルエンを添加し、溶液をゆっくり−６０℃まで冷却し、沈殿を避けた。トリメチルシリル＝トリフラート（２．４μL，０．１１当量）を添加し、混合物を−４５℃で撹拌した。２時間後（TLCで反応完了確認後）、−４５℃で、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、２mLで反応を止め、水が溶解するまで昇温し、混合物を過剰の酢酸エチルに注いだ。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物の1H  NMRから、α：β異性体が４：１の比率であることが判明した（６６．４mg，８４％）。混合物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（２−２．５−３−３．５−４％（メタノール／ジクロロメタン）で精製すると、化合物６（５０mg，６３％収率）が得られた。
0004308918.tif 000042
実施例４
アジノニトラートのα／β混合物（７）。
化合物６（３７０mg，０．３９６mmol）を２．２mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、溶液を−２０℃に冷却した。アジドナトリウム（NaN3，３８．６mg，０．５９４，１．５当量）とセリウム＝アンモニウム＝ニトラート（CAN，６５１．３，１．１８８mmol，３当量）を添加し、混合物を激しく−１５℃で１２時間撹拌した。不均一混合物を酢酸エチルで希釈し、２回、氷水で洗浄して、硫酸ナトリウムで乾燥すると、４００mgの粗性生物が得られた。フラッシュクロマトグラフィーで精製すると、混合物７（２４６mg，６０％収率）が得られた：
0004308918.tif 000043
実施例５
α−アジドブロミド（８）。
化合物７（１５０mg，０．１４５mmol）の０．６mLの乾燥アセトニトリル中の溶液を、臭化リチウム（６２．７mg，０．７２５mmol，５当量）と混合し、暗所で室温で３時間撹拌した。不均一混合物をジクロロメタンで希釈し、２回、水で洗浄して、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を加熱することなく蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（５％メタノール，ジクロロメタン）で精製すると、α−ブロミド８（１２０mg，７５％収率）が単離され、−８０℃のアルゴン雰囲気下で保存した：
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実施例６
アジド−トリクロロアセタミダート（９）。
化合物７（６００mg，０．５７８mmol）を３．６mLのアセトニトリルに溶解し、溶液をチオフェノール（１８０μL）とジイソプロピルエチルアミン（１００μL）で処理した。１０分後、溶媒を窒素気流で除去した。粗性生物をクロマトグラフィー（２−２．５−３−３．５％メタノール／ジクロロメタン）で精製すると、４７２mg（８２％）の中間ヘミアセタールが得られた。６０mg（０．０６mmol）のこの中間体を２００mLのジクロロメタンに取り込み、トリクロロアセトニトリル（６０μL）と６０mgの炭酸カリウムで処理した。６時間後、混合物をジクロロメタンで希釈し、溶液をピペットで除去し、過剰の炭酸カリウムをジクロロメタンで３回洗浄した。溶媒蒸発後、粗性生物をフラッシュクロマトグラフィー（５％メタノール／ジクロロメタン）で精製すると、９（５３．２mg，６４％収率（２工程），α／βアノマー１：１混合物）が得られた。アノマーをフラッシュクロマトグラフィーで、勾配溶媒系（８５−９０−９５−１００％酢酸エチル／ヘキサン）で分離可能である。
実施例７
グリコシルブロミド８を用いたAgClO4−プロモート化グリコシド化によるグリコシル−L−スレオニン１３の調製。
火炎乾燥したフラスコに、銀パークロラート（２７．３mg，２当量）と１１５mgの４Åモレキュラーシーブと、N−FMOC−L−スレオニンベンジルエステル（３７．３mg，０．０８６mmol，１．２当量）を、ドライボックス中で充填した。０．７２mLのジクロロメタンをフラスコに添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。４６０μLジクロロメタン中のドナー８（７６mg，０．０７２mmol）をゆっくり４０分かけて添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。混合物を次いでジクロロメタンで希釈し、セライトでろ過した。沈殿をジクロロメタンで完全に洗浄し、ろ液を蒸発させて、粗材料をシリカゲルカラムで精製する（１−１．５−２−２．５％メタノール／ジクロロメタン）と、１３（７４mg，７４％収率）が得られた。所望しないβ−アノマーは、粗材料の1H NMRおよびHPLC分析からは検出されなかった。
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実施例８
グリコシル−L−セリン（１２）。
トリクロロアセタミダート９を用いたBF3・OEt2プロモート化グリコシド化。
火炎乾燥したフラスコに、ドナー９（５０mg，０．０４４mmol）、８０mgの４Åモレキュラーシーブ、N−FMOC−L−セリンベンジルエステル（２７．５mg，０．０６６mmol）を、ドライボックス中で充填した。０．６mLのTHFをフラスコに添加し、混合物を−３０℃に冷却した。BF3・OEt2（２．８mL，０．０２２mmol，０．５当量）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で撹拌した。３時間中で、混合物を−１０℃まで昇温し、次いで酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で冷却したまま洗浄した。粗材料をシリカゲルカラムで精製する（２−２．５−３％メタノール／ジクロロメタン）と、１２（４０mg，６６％収率）が４：１のα：β異性体比で得られた。純粋なα−アノマーは、フラッシュクロマトグラフィーで分離した（８０−８５−９０−１００％酢酸エチル／ヘキサン）。
実施例９
グリコシル−L−スレオニン（１５）。
化合物１３（４７mg，３３．４２μmol）をチオール酢酸（３mL，３回蒸留）で２７時間、室温で処理した。チオール酢酸を窒素気流で除去し、次いでトルエン蒸発（４回）した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１．５−２−２．５−３−３．５％メタノール／ジクロロメタン）で精製すると、３７mg（７８％）の中間体が得られ、これを７．６mLのメタノールと０．５mLの水に直ちに溶解した。アルゴンで反応系を浄化した後、６．５mgのパラジウム触媒（１０％Pd−C）を添加し、水素のバルーンを取り付けた。８時間後、水素をアルゴンによって除去し、触媒をろ紙で除去して、溶媒蒸発させると粗材料が得られた。フラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノール／ジクロロメタン）にかけると、純粋な化合物１５（３６mg，７８％）が得られた：
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実施例１０
グリコシル−L−セリン（１４）。
化合物１４は、１２から、以下の１５の方法と同様にして８０％の収率で得られた。
実施例１１
ペプチドカップリングの一般方法：
グリコシルアミノ酸１４または１５（１当量）とフリーのアミノ基を有するペプチド（１．２当量）をジクロロメタン（２２mL／１mmol）に溶解した。溶液を０℃に冷却し、IIDQ（１．１５−１．３当量）を添加した（約２０mLジクロロメタン中の１mg）。反応混合物を室温で８時間撹拌した。混合物を直接シリカゲルカラムに添加した。
実施例１２
FMOC脱保護の一般方法：
サブストレート（３６mLのDMF中１mmol）を無水DMFに溶解し、次いでKF（１０当量）と１８−クラウン−６エーテル（触媒量）を添加した。混合物を次いで室温で４８時間撹拌した。DMFを真空中で除去し、次いでシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにふした。
実施例１３
グリコペプチド（１６）。
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実施例１４
グリコペプチド（１）。
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実施例１５
グリコペプチド（１９）。
MS（EI）計算値（C178H249N15O94Na2）４１４６（M＋２Na），実測値４１４７，負イオンモードから正確な分子量を確かめた；MALDI（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization）から、質量４１３１，４１６３。
実施例１６
グリコペプチド（２０）。
MS（FAB）C119H193N15O70N 2975（M+Na）
実施例１７
アジドニトラート（４’）の調製：
保護されたガラクタール３’（４．１４g，１２．１mmol）の−２０℃の無水アセトニトリルの６０mL中の溶液に、NaN3（１．１８g，１８．１mmol）とCAN（１９．８g，３６．２mmol）の混合物を添加した。反応混合物を−２０℃で一昼夜、激しく撹拌した。次いで反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、冷水、次いで食塩水で洗浄した。最後に、溶液を無水の硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルのクロマトグラフィーで分離した。α及びβ異性体（４’）の混合物（２．１７g，４０％収率）が得られた。α異性体とβ異性体の比率は、1H  NMRに基づくと、ほぼ１：１であった。
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実施例１８
トリクロロアセチミダート（５a’）および（５b’）の調製：
アジドニトラート（４’）の混合物（１．３６g，３．０４mmol）の０℃での無水アセトニトリル、１０mL中の溶液に、ゆっくりと、ジイソプロピルエチルアミン（０．５３mL，３．０５mmol）とPhSH（０．９４ml，９．１３mmol）を順次、添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで溶媒を真空下で室温で蒸発させた。残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ヘミアセタール（１．２２g，９９．８％収率）が得られた。このヘミアセタール（６０３mg，１．５０mmol）の０℃での１５mLの無水ジクロロメタン溶液に、炭酸カリウム（１．０４g，７．５０mmol）およびCCl3CN（１．５０ml，１５．０２mmol）を添加した。反応混合物を室温で０℃で５時間撹拌した。懸濁液をセライトのパッドを通過させてろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。ろ液を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−トリクロロアセチミダート５a’（１１８mg，１４％収率）、β−トリクロロアセチミダート５b’（５７２mg，７０％収率）が得られ、ヘミアセタール（７２mg）が回収された。
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実施例１９
グリコシルフルオリド６a’および６b’の調製：
先に調製したヘミアセタール（６８．０mg，０．１６９mmol）の０℃での３mLの無水ジクロロメタン溶液に、DAST（１３４ml，１．０２mmol）をゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。次いで、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で順次洗浄した。最後に、溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−フルオリド６a’（３０．２mg，４４％収率）およびβ−フルオリド６b’（３３．７mg，４９％収率）が得られた。
0004308918.tif 000051
実施例２０
保護されたセリン誘導体７’とのβ−トリクロロアセチミダート５b’のカップリング：
９a’および９b’の合成：
β−トリクロロアセチミダート５b’（５２．３mg，０．０９６mmol）、セリン誘導体７’（４４．０mg，０．１０５mmol）、および２００mgの４Åモレキュラーシブの、−７８℃での２mLの無水ジクロロメタンと２mLの無水ヘキサンとの混合物中の懸濁液に、TMSOTf（１．９１μl，０．０１mmol）の３６μLのジクロロメタン溶液を添加した。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで、３時間、室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止めた。懸濁液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物９a’（５５mg，７１％収率）およびβ−生成物９b’（２２mg，２９％収率）が得られた。
0004308918.tif 000052
実施例２１
TMSOTf（０．５当量）によってプロモートされたTHF中の保護されたセリン誘導体７’とのβ−トリクロロアセチミダート５b’のカップリング：
トリクロロアセチミダート５b’（１４．４mg，０．０２７mmol）、セリン誘導体７’（１６．７mg，０．０４０mmol）、および５０mgの４Åモレキュラーシブの、−７８℃での０．２mLの無水THF中の懸濁液に、TMSOTf（２．７μl，０．０１３mmol）の５０μLのTHF溶液を添加した。反応混合物を−７８℃で２時間撹拌し、トリエチルアミンで中性化した。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物９a’（１８．５mg，８６％収率）が得られた。
実施例２２
TMSOTf（０．５当量）によってプロモートされたTHF中の保護されたセリン誘導体７’とのα−トリクロロアセチミダート５aのカップリング：
トリクロロアセチミダート５a’（１２．３mg，０．０２３mmol）、セリン誘導体７’（１４．１mg，０．０３４mmol）、および５０mgの４Åモレキュラーシブの、−７８℃での０．２mLの無水THF中の懸濁液に、TMSOTf（２．２μl，０．０１１mmol）の４５μLのTHF溶液を添加した。反応混合物を−７８℃で４時間撹拌し、トリエチルアミンで中性化した。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物９a’（１１．８mg，６６％収率）が得られた。
実施例２３
保護されたスレオニン誘導体８とβ−トリクロロアセチミダート５b’のカップリング：
１０a’および１０b’の合成：
β−トリクロロアセチミダート５b’（５０．６mg，０．０９３mmol）、スレオニン誘導体８’（４４．０mg，０．１０２mmol）、および２００mgの４Åモレキュラーシブの、−７８℃での２mLの無水ジクロロメタンおよび２mLの無水ヘキサンの混合物中の懸濁液に、TMSOTf（１．８５μl，０．００９mmol）の３５μLのジクロロメタン溶液を添加した。反応混合物を−７８℃で半時間撹拌し、４時間室温に昇温した。反応をトリエチルアミンで止めた。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、スレオニン誘導体７’（２８．０mg）、α−生成物１０a’（２２．０mg，２９％収率）、及びβ−生成物１０b’（３．０mg，４％収率）が得られた。
0004308918.tif 000053
実施例２４
（Cp）2ZrCl2−AgClO4によってプロモートされたジクロロメタン中の保護されたスレオニン誘導体８’とα−グリコシルフルオリド６a’のカップリング：
AgClO4（２５．１mg，０．１２１mmol）、（Cp）2ZrCl2（１７．８mg，０．０６mmol）、および１５０mgの４Åモレキュラーシブの、−３０℃での１mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、α−グリコシルフルオリド６a’（１６．３mg，０．００４mmol）およびスレオニン誘導体８’（１９．２mg，０．０４５mmol）の４．０mLの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−３０℃で６時間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。溶液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物１０a’（２４．８mg，７５％収率）及びβ−生成物１０b’（３．９mg，１２％収率）が得られた。
実施例２５
（Cp）2ZrCl2−AgClO4によってプロモートされたジクロロメタン中の保護されたスレオニン誘導体８’とβ−グリコシルフルオリド６b’のカップリング：
AgClO4（２４．４mg，０．１１８mmol）、（Cp）2ZrCl2（１７．２mg，０．０５９mmol）、および２００mgの４Åモレキュラーシブの、−３０℃での１mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、β−グリコシルフルオリド６b’（１５．８mg，０．０３９１８mmol）およびスレオニン誘導体８’（２０．３mg，０．０４７０２mmol）の４．０mLの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−３０℃で１０時間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で反応を止めた。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、α−生成物１０a’（２２．３mg，７０％収率）及びβ−生成物１０b’（３．９mg，１２％収率）が得られた。
実施例２６
９a’のシリル基の脱保護：
α−生成物９a’（１５．０mg，０．０１８７３mmol）の０℃での２mLのTHF溶液に、HOAc（５６μl，０．９７８mmol）および１MのTBAF（２４０μl，０．２４０mmol）を添加した。反応を０℃で１時間行い、３日間、室温まで昇温した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望の生成物１１’（１２．４mg，１００％収率）が得られた。１１’：
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実施例２７
１０a’のシリル基の脱保護：
α−生成物１０a’（１６．０mg，０．０２mmol）の０℃での３mLのTHF溶液に、HOAc（６７μl，１．１８mmol）および１MのTBAF（３００μl，０．３０００mmol）を添加した。反応を０℃で１時間行い、次いで、３日間、室温まで昇温した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望の生成物１２’（１２．１mg，９４％収率）が得られた。１２’：
0004308918.tif 000055
実施例２８
化合物１４’の調製：
トリクロロアセチミダート１３’（３３２．０mg，０．４３５mmol）、アクセプター１１’（１４０．２mg，０．２１８mmol）、および１．０gの４Åモレキュラーシブの、−３０℃での４mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、BF3・Et2O（１３．８μl，０．１０９mmol）の１２０μlの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−３０℃で一昼夜撹拌し、次いで３時間室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止め、反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗の回収アクセプター１１’（これはさらに化合物９a’に変換した）（８７．０mg，０．１０９mmol）と粗カップリング生成物が得られ、カップリング生成物はピリジンおよびチオール酢酸によって化合物１４’に還元された。粗カップリング生成物を１mLのピリジンおよび１mLのチオール酢酸に０℃で溶解した。反応混合物を一昼夜室温で撹拌した。溶媒を室温で真空下に蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物１４’（９９．６mg，７２％収率、アクセプター１１’の５０％変換に基づく）が得られた。１４’：
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実施例２９
化合物１５’の調製：
トリクロロアセチミダート１３’（３０５．０mg，０．３９９６mmol）、アクセプター１２’（１３１．６mg，０．１９９８mmol）、および１．０gの４Åモレキュラーシブの、−３０℃での４mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、BF3・Et2O（１２．７μl，０．１０mmol）の１１５μlの無水ジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を−３０℃で一昼夜撹拌し、次いで３時間室温まで昇温した。反応をトリエチルアミンで止め、反応混合物をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗の回収アクセプター１２’（これはさらに化合物１０a’に変換した）（８５．０mg，０．１０４mmol）と粗カップリング生成物が得られ、カップリング生成物はピリジンおよびチオール酢酸によって化合物１５’に還元された。粗カップリング生成物を１mLの無水ピリジンおよび１mLのチオール酢酸に０℃で溶解した。反応混合物を一昼夜室温で撹拌した。溶媒を室温で真空下に蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物１５’（７１．１mg，５８％収率、アクセプター１２’の４８％変換に基づく）が得られた。１５’：
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実施例３０
化合物１’の合成：
トリサッカリド１４’（１０５．８mg，０．０８３mmol）を室温で、８０％HOAc水溶液、５mLに溶解した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、次いで４０℃で３時間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ジオール（９３．０mg，９１％収率）が得られた。このジオール（９１．５mg，０．０７４mmol）の１０mLの無水ジクロロメタンの０℃での溶液中に、触媒のDMAP（４．５mg，０．０３７mmol）、トリエチルアミン（１０３μl，０．７４mmmol）およびAc2O（２８μl，０．３０mmol）を順次添加した。反応を室温で一昼夜行った。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化化合物（８８．８mg，９１％収率）が得られた。１０％Pd／C（５．０mg）の１mLメタノール及び０．１mL水の混合物中の懸濁液に、過アセチル化化合物（３８．５mg，０．０３mmol）の４．０mLのメタノール溶液を添加した。反応を水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのショートカラムに通し、触媒を除去して、メタノールで洗浄した。溶媒除去後、残さを１．５mLのDMFに溶解し、この溶液に０．５mLのモルホリンを０℃でゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。溶媒を真空下で除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２９．０mgの材料が得られ、これは、塩基性条件化で脱アセチル化した。この予め得られた材料を５０mLの無水THFおよび５mLの無水メタノール中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、NaOMe（１４．０mg，０．２６mmol）の５mL無水メタノール溶液を添加した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、５０％HOAc水溶液で止めた。溶媒蒸発後、残さを逆相シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗生成物が得られ、これをさらに、”Sephadex LH-20”でゲルパーミエーションろ過して精製すると、最終生成物１’（１５．１mg，７７％収率）が得られた。
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実施例３１
化合物２’の合成：
トリサッカリド１５’（７０．２mg，０．０５４mmol）を室温で、８０％HOAc水溶液、５mLに溶解した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、次いで４０℃で３時間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、ジオール（６７．１mg，９９％収率）が得られた。このジオール（６５．１mg，０．０５２mmol）の８mLの無水ジクロロメタンの０℃での溶液中に、触媒のDMAP（３．２mg，０．０２６mmol）、トリエチルアミン（７２μl，０．５２mmol）およびAc2O（２０μl，０．２１mmol）を順次添加した。反応を室温で一昼夜行った。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化化合物（６６．０mg，９５％収率）が得られた。１０％Pd／C（５．０mg）の１mLメタノール及び０．１mL水の混合物中の懸濁液に、過アセチル化化合物（２２．１mg，０．０１７mmol）の４．０mLのメタノール溶液を添加した。反応混合物を水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのショートカラムに通し、触媒を除去して、メタノールで洗浄した。溶媒除去後、残さを１．５mLのDMFに溶解し、この溶液に０．５mLのモルホリンを０℃でゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。溶媒を真空下で除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２９．０mgの材料が得られ、これは、塩基性条件化で脱アセチル化した。この予め得られた材料を５０mLの無水THFおよび５mLの無水メタノール中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、NaOMe（１４．９mg，０．２７６mmol）の５mL無水メタノール溶液を添加した。反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、５０％HOAc水溶液で止めた。溶媒蒸発後、残さを逆相シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、粗性生物が得られ、これをさらに、”Sephadex LH-20”でゲルパーミエーションろ過によって精製すると、最終生成物２’（８．４mg，７４％収率）が得られた。
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実施例３２
チオグリコシド１７’の調製：
過ベンジル化ラクタール１６’（４２０mg，０．４９mmol）および６００mgの４Åモレキュラーシブの、５mLの無水ジクロロメタン中の懸濁液に、ベンゼンスルホンアミド（１１６mg，０．７４mmol）を室温で添加した。１０分後、懸濁液を０℃に冷却し、I（sym−コリジン）2ClO4を一部添加した。１５分後、溶液をセライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。有機溶液をNa2S2O3、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、５００mgのヨードスルホンアミダート誘導体（９０％収率）が得られた。−４０℃の、エタンチオール（１５０μl，１．９８mmol）の４mLの無水DMF中の溶液に、LiHMDS（０．８８ml，０．８８mmol）溶液を添加した。１５分後、ヨードスルホンアミダート（４５０mg，０．３９７mmol）の６mLの無水DMF中の溶液を、ゆっくりと室温で添加した。反応混合物を−４０℃で４時間撹拌し、水で反応を止めた。水溶液を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層を水、食塩水で洗浄して、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望のチオグリコシド１７’（３５０mg，８３％収率）が得られ、ヨードスルホンアミダート（６０mg）が回収された。
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実施例３３
トリサッカリド２０’の調製：
丸底フラスコに、チオグリコシド１７’（２．１０g，１．９７mmol）、アクセプター１８’（９６４mg，２．９５mmol）、ジ−t−ブチルピリジン（２．６５ml，１１．８１mmol）および７．０gの４Åモレキュラーシブを入れた。混合物を１０mLの無水ジクロロメタンおよび２０mLの無水エチルエーテルに溶解した。溶液を０℃に冷却し、次いでMeOTf（１．１１mL，８．８５mmol）をゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で一昼夜撹拌した。セライトにパッドでろ過し、有機相を水性ワークアップした。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２０α’（２０６mg，８％）および２０β’（２．２６g，８６％）が得られた。
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実施例３４
トリサッカリド２１’の調製：
丸底フラスコに、チオグリコシド１７’（９６６mg，０．９０６mmol）、アクセプター１９’（２１９mg，１．１８mmol）、ジ−t−ブチルピリジン（１．２２ml，５．４４mmol）および２．５gの４Åモレキュラーシブを入れた。混合物を５mLの無水ジクロロメタンおよび１０mLの無水エチルエーテルに溶解した。溶液を０℃に冷却し、次いでMeOTf（０．５１mL，４．５３mmol）をゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で５時間撹拌した。セライトのパッドでろ過し、有機層を水性ワークアップした。酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２１α’（５９mg，６％）および２１β’（９１０mg，８４％）が得られた。
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実施例３５
トリサッカリド２２’の調製：
火炎乾燥フラスコに、−７８℃で３０mLの無水アンモニアを凝縮させた。この液体アンモニアに、金属ナトリウム（３２０mg，１３．９５mmol）を一部入れた。１５分後、ドライアイス−エタノール浴をはずし、暗青色溶液を２０分間還流した。再度、−７８℃に冷却し、トリサッカリド２０’（６１９mg，０．４７mmol）の６mLの無水THF溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を３０分間、−３０℃で還流し、１０mLのメタノールで反応を止めた。アンモニアを蒸発させた後、塩基性溶液をDowexレジンによって中性化した。有機溶液をろ過し、蒸発させて粗生成物を得て、これをアセチル化にふした。粗生成物を、３．０mLのピリジンと２．０mLのAc2Oに、０℃で１０mgのDMAPの存在下に溶解させた。反応混合物を０℃から室温まで、一昼夜かけて撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、過アセチル化トリサッカリド２２’（２３３mg，５９％）が得られた。
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実施例３６
トリサッカリドドナー２３’の調製：
−２５℃の、トリサッカリドグリカール２０’（４６０mg，０．３４６mmol）の３mLの無水アセトニトリル中の溶液に、NaN3（３４mg，０．５１９mmol）およびCAN（５６９mg，１．４mmol）を順次添加した。混合物を−２５℃で８時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、アジドニトラート誘導体（１３４mg，２７％）の混合物が得られた。このアジドニトラート混合物を還元条件下において加水分解した。アジドニトラートを２mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１６μl，０．０９１mmol）およびPhSH（２８μl，０．２７２mmol）を順次添加した。１５分後、反応は完了し、溶媒を室温で蒸発させた。ヘミアセタール誘導体（１０３mg，７４％）がシリカゲルクロマトグラフィー後に得られた。このヘミアセタール（９５mg，０．０６８mmol）を２mLの無水ジクロロメタンに溶解した。この溶液に、１mLのCCl3CNと０．５gのK2CO3を室温で添加した。反応を一昼夜行った。セライトのパッドでろ過した後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２３α’（１８mg，１７％）および２３β’（７０mg，６７％）が得られた。
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実施例３７
トリサッカリドドナー２４’の調製：
−１５℃の、トリサッカリドグリカール２１’（２２５mg，０．２６４mmol）の２mLの無水アセトニトリル中の溶液に、NaN3（２６mg，０．４０mmol）およびCAN（４３６mg，０．７９４mmol）を順次添加した。混合物を−１５℃で一昼夜撹拌した。水性ワークアップ後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒蒸発後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、アジドニトラート誘導体（１３０mg，５１％）の混合物が得られた。このアジドニトラート混合物を還元条件下において加水分解した。アジドニトラート（１２５mg，０．１２９mmol）を５mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（２５μl，０．１４７mmol）およびPhSH（４５μl，０．４４１mmol）を順次添加した。１５分後、反応は完了し、溶媒を室温で蒸発させた。ヘミアセタール誘導体（９２mg，７７％）がシリカゲルクロマトグラフィー後に得られた。このヘミアセタール（８０mg，０．０８７mmol）を５mLの無水ジクロロメタンに溶解した。この溶液に、０．９mLのCCl3CNと０．１２gのK2CO3を室温で添加した。反応を一昼夜行った。セライトのパッドでろ過した後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２４’のαおよびβ異性体の混合物（７１mg，７７％，α：β＝３：１）が得られた。
２４’：1H  NMR（３００MHz，CDCl3）δ９．５５（s，１H，β異性体のNH），８．７１（s，１H，α異性体のNH），６．５４（d，J＝３．６Hz，α異性体のアノマーH）．
実施例３８
トリサッカリドドナー２５’の調製：
過アセチル化トリサッカリド２１’からのアジドニトラート誘導体（１００mg，０．１０３mmol）を０．５mLの無水アセトニトリルに室温で溶解した。この溶液に、無水LiBr（４５mg，０．５２mmol）を添加した。混合物を３時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機溶媒を蒸発させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物２５’（９１mg，９０％）が得られた。
２５’：1H  NMR（３００MHz，CDCl3）δ６．０４（d，J＝３．６Hz，１H，アノマーH）．
実施例３９
トリサッカリドドナー２６’の調製：
トリサッカリドドナー２５’（９１mg，０．０９３mmol）を２mLの無水THFに０℃で溶解した。この溶液に、LiSPh（１００mL，０．１０３mmol）を添加した。反応を０℃で３０分間行った。溶媒を除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、化合物２６’（６１mg，６６％）が得られた。
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実施例４０
トリサッカリドドナー２７’の調製：
トリサッカリドドナー２１’（８６０mg，０．７２２mmol）を、２mLのピリジンと１mLのAc2Oに、１０mgのDMAPの存在下に溶解させた。反応混合物を０℃から室温まで、一昼夜かけて撹拌した。水性ワークアップ後、溶媒を除去し、残さを室温で１０mLのメタノールおよび５mLの酢酸エチルに溶解した。この溶液に、Na2HPO4（４１０mg，２．８９mmol）および２０％NaHg（１．０g，４．３５mmol）を添加した。反応を２時間行って、水性ワークアップイした。有機溶媒を除去後、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、N−アセチルトリサッカリドグリカール（７４０mg，９４％）が得られた。トリサッカリドグリカール（６２４mg，０．５７１mmol）を３mLの無水アセトニトリルに−４０℃で溶解した。この溶液に、NaN3（５６mg，０．８６mmol）およびCAN（９３９mg，１．７１mmol）を順次添加した。混合物を−４０℃で４時間撹拌した。水性ワークアップ後、有機溶媒を除去し、残さをシリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、αおよびβアジドニトラートアノマーの混合物（１９１mg，２７％）が得られた。アノマーのこの混合物（１７２mg，０．１３７mmol）を室温で１mLのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２４μl，０．１３７mmol）とPhSH（４２μl，０．４１０mmol）を順次添加した。反応は３０分で完了し、溶媒を蒸発させた。カラムによる分離によって、所望のヘミアセタール（１７０mg）が得られた。このヘミアセタールを１mLのジクロロメタンに室温で溶解した。この溶液に、１mLのCCl3CNおよび５００mgの炭酸カリウムを添加した。反応を室温で一昼夜行った。セライトのパッドでろ過後、有機溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、所望のα−トリクロロアセチミダート２７’（７０mg，４２％）が得られた。
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実施例４１
メチル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２３α’のカップリング：
トリサッカリドドナー２３α’（７０mg，０．０４６mmol）、メチル＝N−Fmocセリナート（２３．４mg，０．０６８mmol）および３００mgの４Åモレキュラーシーブの、−７８℃での０．５mLのTHF溶液に、TMSOTf（４．６μl，０．０２３mmol）を添加した。反応を−３５℃で一昼夜撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、溶液をセライトのパッドでろ過した。ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、２９α’（７０mg，９０％）および２９β’（７．０mg，９．０％）が得られた。
実施例４２
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２４’のカップリング：
トリサッカリドドナー２４’（３３mg，０．０３０mmol）、ベンジル＝N−Fmocセリナート（３３．０mg，０．０７５mmol）および１００mgの４Åモレキュラーシーブの、−７８℃での０．３mLのTHF溶液に、TMSOTf（６．０μl，０．０３０mmol）を添加した。反応を−７８℃から室温まで、２時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、溶液をセライトのパッドでろ過した。ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、３０’（８．６mg，２２％，α：β＝２：１）が得られた。
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実施例４３
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２５α’のカップリング：
ベンジル＝N−Fmocセリナート（４５mg，０．１０７mmol）、AgClO4（３７．０mg，０．１７９mmol）および２００mgの４Åモレキュラーシーブの、０．６mLの無水ジクロロメタン溶液に、トリサッカリドドナー２５α’（８８mg，０．０８９３mmol）の０．５mLのジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応を室温で一昼夜行った。セライトのパッドでろ過後、溶媒を除去し、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、カップリング生成物３０’（６６mg，５６％，α：β＝３．５：１）が得られた。
実施例４４
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２６β’のカップリング：
ベンジル＝N−Fmocセリナート（４５mg，０．１０７mmol）、トリサッカリドドナー２６β’（２３mg，０．０２３mmol）、および５０mgの４Åモレキュラーシーブの、０℃での１．０mLの無水ジクロロメタン溶液に、NIS（６．２mg，０．０２７mmol）およびTfOH（０．２４μl，０．００３mmol）の０．５mLジクロロメタン溶液をゆっくりと添加した。反応を０℃で１時間行った。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。有機溶媒を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒除去後、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、カップリング生成物３０’（１２．１mg，４０％，α：β＝２：１）が得られた。
実施例４５
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２７α’のカップリング：
トリサッカリドドナー２７α’（４０．１mg，０．０２９mmol）、ベンジル＝N−Fmocセリナート（１８．０mg，０．０４４mmol）、および２００mgの４Åモレキュラーシーブの、−２０℃での２．０mLのTHF溶液に、TMSOTf（１．８μl，０．００９mmol）を添加した。反応混合物を−２０℃から室温まで３時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、３１’（２４mg，５１％）が得られた。
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実施例４６
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２８’のカップリング：
トリサッカリドドナー２８’（α：β＝１：１）（１６２mg，０．１６３mmol）、ベンジル＝N−Fmocセリナート（４８．０mg，０．０９７mmol）、および３００mgの４Åモレキュラーシーブの、−７８℃での２．０mLのTHF溶液に、ジクロロメタン中のBF3・Et2O（０．５当量，０．０８２mmol）を添加した。反応混合物を−７８℃から室温まで２時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、３２’（８１mg，６７％）が得られた。
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実施例４７
ベンジル＝N−Fmocセリナートを用いたトリサッカリドドナー２８β’のカップリング：
トリサッカリドドナー２８β’（１２mg，０．０１２mmol）、ベンジル＝N−Fmocセリナート（９．０mg，０．０２２mmol）、および１００mgの４Åモレキュラーシーブの、−４０℃での０．５mLのTHF溶液に、ジクロロメタン中のBF3・Et2O（１．５当量，０．０１８mmol）を添加した。反応混合物を−４０℃から室温まで２時間撹拌した。反応をトリエチルアミンで止め、水性ワークアップした。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を蒸発させ、残さを、シリカゲルクロマトグラフィーで分離すると、３２’（５．２mg，３５％）が得られた。
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2,3-ST抗原前駆体
チオエチルグリコシル供与体30（52mg,0.064mmol）および6-TBDMS受容体31（94mg,0.13mmol）混合物をベンゼン（4x50mL）とともに共沸混合し、次いで高真空下に１時間置いた。この混合物を窒素下に置き、その時点で４Åモレキュラーシーブス（0.5g）、CH2Cl2（5mL）、およびNIS（36mg,0.16mmol）を加えた。混合物を0℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸（CH2Cl2中1％,0.96mL,0.064mmol）を５分間にわたって滴下した。懸濁液を添加後直ちに周囲温度まで温め、２０分攪拌した。この混合物をEtOAc（50mL）と飽和NaHCO3（50mL）で分液した。これらの相を分離し、有機相を食塩水（50mL）で洗浄、乾燥（Na2SO4）、濃縮した。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（4:1、EtOAc:ヘキサン）により精製し、無色の結晶性固体として三糖類32、59mg（62％）を得た。
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Ley抗原前駆体
チオ供与体32（44.0mg,29.5μmol）および受容体31（42.4mg,59.0μmol）（トルエンとともに３度共沸混合）にCH2Cl2および新たに活性化した４Åモレキュラーシーブスを加えた。この混合物を２０分間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。N-ヨードスクシンイミド（16.6mg,73.8μmol）を加え、次いでCH2Cl2中のTfOHの1％溶液を滴下した。この赤色混合物を0℃で5分間攪拌し、さらにEtOAcで希釈した。有機相を飽和NaHCO3、飽和Na2S2O3、および食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、さらに真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（1:1 EtOAc:CH2Cl2から2:1 EtOAc:CH2Cl2）により、カップリング生成物34、43.2mg（68％）を得た。
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b-トリクロロアセトイミデートの保護トレオニンとのカップリング
無水CH2Cl26ml中のトリクロロアセトイミデート35（98mg,0.13mmol）、トレオニン誘導体36（70mg,0.167mmol）および4Åモレキュラーシーブス100mgの溶液に−30℃でTMSOTf（14mL,0.07mmol）を加えた。この反応物を−30℃で１時間攪拌し、次いでEt3Nで中和した。反応混合物をセライトのパッドで濾過し、EtOAcで洗浄した。濾過物をH2Oおよびブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより分離し、β生成物37β（56mg,42％）およびα生成物37α（57mg,42％）を得た。
考察
本発明で採用される合成アプローチは、4段階を包含する（図2）。まず、全糖ドメインを改良型グリカールの形で構築する。次ぎに、セリン、トレオニンまたは類似の残基との効率的なカップリングを行う。第3段階として、全グリコシルドメインアミノ酸をペプチド主鎖に組み込むペプチドの構築を含む。最終の段階として、同時にかまたは逐次かのいずれかでの全体の脱保護を含む。
合成開始点は、容易に入手可能なグリカール2（図3）であった。この化合物のジメチルジオキシランによる酸化および続いて起こる得られたエポキシドの6-O-TIPS-ガラクタールとのカップリングは標準的な方法でZnCl2により促進させた。文献：Toyokuni, T.; Singhal, A. K.; Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 231．粗生成物のアセチル化により高収率および立体選択性のある二糖類3を得た。緩やかな条件下でのTIPS保護基の除去により、シアル酸の受容体4への結合のための準備をする。触媒量のTMSOTfによる促進下、供与体として亜リン酸シアリル5を使用すると、一貫して高収率（80ないし85％）の生成物の4:1混合物が得られた。文献：Martin, T. J.ら, Glycoconjugate J. 1993, 10, 16. Sim, M. Mら, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 2260．かくして、改良型グリカール6（「2,6-STグリカール」）は４工程で非常に効率よく入手できる。
三糖類グリカール6は示されるように（図3）アジドニトロ化させた。このようにして収率60％で得られた化合物7は種々の供与体構築物への変換に有用であった（8から11を参照）。例えば、α-ブロミド8は供与体として直接使用できるか、またはリチウムチオフェノキシドにより立体選択的にβ-フェニルチオグリコシド11へ変換され得る。別法としては、硝酸塩7の混合物を加水分解し、得られたヘミアセタールをα:βトリクロロアセトアミデート（9）と亜リン酸ジエチル（10）の1:1混合物へ高収率で変換した（図3）。（硝酸塩加水分解: 文献：Gauffeny, F.ら, Carbohydr. Chem. 1991, 219, 237.トリクロロアセトアミデートの製造および使用：文献：Schmidt, R. R.およびKinzy, W.: Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, 21.亜リン酸塩供与体：文献：Kondo, H.ら；J. Org. Chem. 1994, 59, 864.）
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種々の供与体タイプ（8から11）の入手が可能となったことにより、（2,6）-ST三糖類のN-Fmoc-保護L-セリンおよびL-トレオニンのベンジルエステルへの直接的なカップリングの研究が可能になった。結果は表1に要約する。受容体としてFmoc保護L-トレオニンを用い、あらゆる供与体が高い立体選択性でα-Oグリコシルトレオニン系を提供した。これに対し、同様な保護L-セリン受容体とのカップリング反応の結果は、その供与体の特徴および反応条件に依存していた。あらゆる場合において、所望のα-アノマー12が主生成物であった（β-アノマーが主生成物として単離される、三糖類供与体をセリンへ結合させる先の試みについては、文献：Paulsen, H.ら, Liebigs. Ann. Chem. 1988, 75; Iijima, H.; Ogawa, T.,Carbohydr. Res. 1989, 186, 95.を参照）。供与体10を用いる場合の所望のα-生成物：所望でないβ−グリコシドの比率は約３０：１であった。
構築単位14および15を用いて糖ペプチド構築段階に入り、これにより最終の糖ペプチドに対して実施されるはずの必要な化学操作数が減る。このように、化合物14および15は、12および13それぞれから2段階で得られた。アジド官能基はCH3COSHの作用により、収率78-80％で、直接N-アセチル基に変換し、ベンジルエステルを水素添加分解により定量的に除去した（図4）。文献：Paulsen, H.ら, Liebigs. Ann. Chem. 1994, 381．
糖ペプチド主鎖はC→N末端方向に構築した（図4）。ペプチドのN末端および保護グリコシルアミノ酸間のカップリング工程の反復、次いでFMOC保護基の除去により、保護されたペンタペプチド16を得た。12および13のようなブロック構造のペプチドカップリング工程は優れた収率で進行した。IIDQおよびDICDの両カップリング試薬は十分に作用した（85ないし90％）。FMOC脱保護は18-クラウン-6の存在下でDMF中のKFを用い、緩やかな処理の下で行った。文献：Jiang, J.ら, Synth. Commun. 1994, 24, 187．糖ペプチドの16の2回の脱ブロッキングは3段階：（i）KFによるFmoc除去およびアセチル基を有するアミノ末端の保護；（ii）ベンジルエステルの水素添加分解；および（iii）糖ペプチドムチンモデル1へ導くNaOH水溶液による3のメチルエステル、環式カーボネートおよびアセチル保護物の加水分解で完了した（図4）。
NおよびC両末端のオルト位の露出により、断片連結による糖ペプチド構築体のさらなる伸長の機会が得られた。かかる請求の範囲の可能性を実証する目的で、ST三価元素19を持つノナペプチドは、トリペプチド18とヘキサペプチド17とのカップリングにより作製した（図5参照）。前記の脱保護プロトコールにより、O-グリコシル化セリン−トレオニン三価元素がペプチドの中央に組み込まれたノナペプチドムチンモデル20が得られた。
マウスにおけるTnクラスター構築体のワクチン接種
本発明は、本明細書に開示された糖ペプチド抗原はリポペプチド担体PamCysへ結合している抗癌ワクチンを提供する。抗原の新たな担体への結合は、従来のタンパク質担体と比較して主要には簡略化される。表2および3では、新しい構築体の免疫原性をマウスのタンパク質担体ワクチンと比較する。これらの新規構築体はマウスに免疫原性をもたらした。表に示されるように、マウスの３度目の予防接種後、Tn-PamCys構築体は高力価のIgMおよびIgG双方を惹起する。５度目の予防接種後、いっそう高い力価が誘導される。Tn-KLHワクチンはより強力な全体的な応答をもたらす。しかしながら、IgM/IgG比率は２種のワクチン間で異なる。Tn-KLHはTn PamCysより高いIgM/IgG比率をもたらす。相対的に、新規Tn-PamCysはより強いIgG応答を惹起する。タンパク質担体ワクチンに比べ、アジュバントQS-21では免疫原性のさらなる増大はもたらされない。従って、PamCysポリペプチド担体は、「組み込まれた」免疫刺激剤／アジュバントと考えられるであろう。さらに、QS-21がIgG力価を犠牲にして、Tn-PamCysに対するIgM応答を増大させることが示されよう。PamCys担体を基にしたワクチンは前立腺癌に向けられる。
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抗原0.3μg/ウェルをアルコール中で平板培養; 3度目のワクチン接種後11日に抜き取った血清
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ムチン関連F1α抗原の全合成
本発明は、主として糖タンパク質のムチンファミリーに基づく腫瘍組織表面の誘導模擬物を提供する（文献：Ragupathi, G.ら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125.（この分野の概説としては、文献：Toyokuni, T.; Singhal, A.K. Chem. Soc. Rev.1995, 24, 231; Dwek, R.A. Chem. Rev. 1996, 96, 683.を参照）。上皮細胞表面で発現が高く、かつ、O-結合炭水化物クラスターが高含量であるため、ムチンは抗癌免疫学的研究に関する重要な標的となる。上皮癌におけるムチンはしばしば異常型α-O-結合炭水化物を有する。文献：Finn, O.J.ら,Immunol. Rev. 1995, 145, 61; Saitoh, O.ら, Cancer Res. 1991, 51, 2854; Carlstedt, I.; Davies, J.R. Biochem. Soc. Trans. 1997, 25, 214．同定されたF1α抗原1’および2’は、胃腺癌と関連するムチン上で見い出された異常型炭水化物エピトープの例を示す（図22A）。文献：Yamashita, Y.ら, J. Nat. Cancer Inst. 1995, 87, 441; Yamashita, Y.ら,Int. J. Cancer. 1994, 58, 349．従って本発明は、合成によりF1αエピトープを構築する方法を提供する。F1αの前記合成は、文献：Qui, D.; Koganty, R.R. Tetrahedron Lett. 1997, 38,45によるものである。先行するα-O-結合糖ペプチドへの他のアプローチとしては、文献：Nakahara, Y.ら，ライフサイエンスに関わる合成オリゴ糖類において不可欠なプローブ ACS Symp. Ser. 560, 249-266頁（1994）; Garg, H.G.ら,Adv. Carb. Chem. Biochem. 1994, 50, 277; Paulsen, H.ら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 281,; Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618; Elofsson,M.ら, Tetrahedron 1997, 53, 369; Meinjohanns, E.ら,J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1996, 985; Wang, Z.G.ら, Carbohydr. Res. 1996, 295, 25; Szabo, L.ら, Carbohydr. Res. 1995, 274, 11が挙げられる。
F1α構造は、3つの主要な構成単位I-IIIより構築され得る（図22A）。かかる一般的なプランにより、2つの選択的実行モデルが可能となる。（グリカール構築体の包括的な総論については、文献：Bilodeau, M.T.; Danishefsky, S.J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381.を参照。炭水化物腫瘍抗原に基づくワクチンの合成への応用については、文献：Sames, D.ら, Nature 1997, 389, 587; Park, T.K.ら, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488;およびDeshpande,P.P.; Danishefsky, S.J. Nature 1997, 387, 164.を参照。）まず、GalNAc-セリン／トレオニン構築物は最初の段階で構築してよい。これに次いで「非還元末端」で伸長が起こる（II+III、次いでI）。別法としては、まず全糖ドメインを三糖類グリカールの形で構築することが可能であろう（I+II）。この工程に次いで得られた三糖類供与体とセリンまたはトレオニンアミノ残基とのカップリングが行われるであろう（II参照）。両方法は本明細書で開示される。
第1の合成アプローチは、単糖類供与体5a’/b’および6a’/b’の製造で開始した（図22B）。ガラクタールの保護基（II参照）はいくつかの必要条件を満たすように慎重に選択した。それらは試薬およびアジドニトロ化プロトコール（下記参照）の条件に安定でなければならない。また、保護官能基はグリコシルアミノ酸へと導くカップリング工程を低下させてはならない。いくつかの開始試験の後、ガラクタール3’が出発物質として選択された。アジドニトロ化プロトコール（NaN3,CAN CH3CN,-20℃）により4a’および4b’の1:1混合物が40％の収率で得られる。文献：Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244．両アノマーを加水分解し、次いで十分な収率（84％）でトリクロロアセトイミデート5a’および5b’の1:5混合物へと変換した。文献：Schmidt, R.R.; Kinzy, W. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.1994, 50, 84．別法としては、硝酸塩4’の加水分解、次いでDAST試薬の使用（文献：Rosenbrook, Jr. W.ら, Tetrahedron Lett., 1985, 26, 3; Posner, G. H.; Haines, S. R. Tetrahedron Lett. 1985, 26,5）により、フルオリド供与体6a’および6b’の1:1混合物が得られた。両場合においてα/βアノマーは分離でき、かくしてカップリング事象におけるそれらの挙動について一連の研究がなされた。保護されたカルボキシおよびアミノ部分を持つ、遊離側鎖アルコールを有する供与体5’-6’のセリンまたはトレオニン受容体とのカップリングにより得られた最良の結果を表5aで要約する。
トリクロロアセトイミデート供与体タイプ5’は、セリン誘導アルコール7’とのカップリング反応で優れた収率をもたらした。最適化した後、THF中のTMSOTfの存在下での供与体5b’（エントリー2、表5a）により、86％の収率で純粋なα-生成物9’を得られた。興味深いことに、供与体5a’はまた、α-グリコシド9’のみを独占してもたらした。供与体5b’のトレオニンとのカップリングは立体選択性にもかかわらず、低収率であった。この場合、幾分低下した選択性によるにもかかわらず、フルオリド供与体6a’および6b’はCp2ZrCl2/AgClO4により促進させると、所望のグリコシルトレオニン10’が優れた収率（82ないし87％）で得られた（6:1, α:β）。文献：Ogawa, t. Carbohydrate Res. 1996, 295, 25．このように、互いの相補性を与える供与体セットとグリコシルトレオニン10’ならびにグリコシルセリン9’が高収率、かつ優れた立体選択性限界をもって得られた。これらの供与体のアノマー中心での配座による、それらのカップリング工程の立体化学的な結果への実質的な影響はないということがわかった。この結果は一般に2-デオキシ-2-アジド-トリ-O-アセチルガラクトース-1-O-トリクロロアセトイミデートを用いる試験結果とは異なる。文献：Schmidt, R. R.; Kinzy, W., id.を参照。その場合、各アノマーにより異なる比率のα/β生成物が得られる（下記参照）。
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6位のTIPS基をTBAFおよびAcOHで定量的に除去し、受容体11’および12’を得た（図23）。ラクトサミン供与体13’への最終カップリングは、THF中のBF3OEt2の存在下で行った。この見かけの立体選択的カップリング工程からの粗生成物をチオール酢酸によりそれぞれ化合物14’および15’へと変換した。文献：Paulsen, H.ら, Liebigs Ann. Chem. 1994,381．これらのグリコシルアミノ酸は、糖ペプチド構築体の好適な単位を示す。それらの構造を確認するために、発明者らは、全体的な脱保護を行った。これは遊離F1α抗原1’および2’がそれぞれ70％および73％の収率で得られる５工程で完了した（図23）。グリコシド結合は、酸性および塩基性脱保護プロトコールの条件下では妥協点はなかった。
直接的カップリングはグリカール構築体により、適切に保護されたセリンまたはトレオニンアミノ酸を用いて合成される三糖類供与体（文献：Bilodeau, M. T.; Danishefsky, S. J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1381）から提供される。この論理は式I+II、ついでIIIとのカップリングのもとで初期に検討された。図24で概説するように、三糖類供与体23’-27’を製造した。容易に入手可能なラクタール16’（文献：Kinzy, W.; Schmidt, R. R. Carbohydrate Res. 1987, 164, 265）を一連のヨード−スルホンアミノ化、次いでLiHMDSの存在におけるエタンチオールでの後の再配置によりチオ-供与体17’へと変換した。文献：Park, T. K.ら, J. Amer. Chem. Soc., 1996, 118, 11488．ガラクタール18’および19’へのMeOTfにより促進されるカップリングにより、優れた収率かつ立体選択性で三糖類グリカール20’および21’が得られた。20’のベンジル基およびスルホンアミドの還元脱保護および粗生成物の一連の均一なアセチル化によりグリカール22’が得られた。グリカール20’-22’のアジドニトロ化により中間体アジドニトレートが得られ、それを対応する供与体23’-27’へと変換した。
これらの三糖類供与体の適切なセリン／トレオニン誘導受容体とのカップリングの結果を表6に要約する。さらに保護パターンは、カップリングの反応性および立体選択性へ大きな影響を及ぼした。アノマー中心のラクトースドメインのヒドロキシル基および他の官能基間の距離が見かけ上離れているにもかかわらず、これらの置換基は立体化学的な結果へ多大な影響を及ぼす。定性的に電子供与基（ベンジル参照）による官能基の均一な保護が、推定されるオキソニウム陽イオンを安定化させることにより、非常に反応性のある供与体が得られる。これに対し、電子吸引性保護基はカップリング工程において供与体を失活させる傾向がある。文献：Andrews, C. W.ら, J. Org. Chem. 1996, 61, 5280; Halcomb, R. L.; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6656．かかる失活はまた、アノマー中心の供与体官能基の元の立体化学へのカップリングの感受性に関して供与体にいくらかの立体化学的復元力を与える可能性がある。表6で示されるように、ペル-O-ベンジル-保護供与体23’は−78℃で高い反応性があり、90％の収率で、高い選択性（10:1,第1エントリー、表6）をもって生成物28’が得られた。供与体24’の場合において実証されたように、ペル-O-ベンジルからペル-O-アセチル基までの全体的な保護の変化において劇的な差が見られた。カップリング工程の収率および立体選択性は低下した。これに匹敵する結果が供与体25’および26’でも得られた。
化合物27’および28’の場合、ガラクトサミン環は環状アセトニドの3-および4-位の結合により、コンホメーションが制限され、さらに驚くべき知見が示された。ペル-O-ベンジル保護ラクトサミン二糖類を有する供与体27α’によっては、所望のα-アノマー31’のみが得られた。しかしながら、純粋な28’のβ-アノマーとトリクロロアセトイミデートの混合物によっては、所望されないβ-アノマー32’のみが生じた。従って、（供与体官能基を含む環の）第2および第3炭水化物単位上の比較的離れた部位での保護パターンの修飾により、グリコシド化の立体選択性へ大きな逆作用が働いた。環状保護基により供与体集団内の環に強いられるコンホメーションの制限は、加水分解速度により判断されるように供与体反応性に影響を及ぼし得る。文献：Wilson, B. G.; Fraser-Reid, B. J. Org. Chem. 1995, 60, 317; Fraser-Reid, B.ら,J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 1434．保護基は、それらの電子的、立体的およびコンホメーション的影響により、溶媒和合作用とともにグリコシル供与体の特性を著しく変調する。従ってより長期の作用はセリンおよびトレオニン側鎖ヒドロキシル基のグリコシド化に先立っては厳密に推定できない。
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従って本発明は、予め構築した立体特異的合成α-O-結合セリンまたはトレオニングリコシド（例えば9’および10’）を使用して糖質構築体を完成させるカセットアプローチに対する予期されないほどの優位性を実証するものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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