(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ大脳の膜分画を調製し、緩衝液で洗浄し、カチオン性界面活性剤で抽出した後、微小管を含む液を上記抽出液に添加し、次いで共沈させることにより得ることができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする、微小管結合タンパク質。
【請求項２】
ウシ大脳のマイクログリア細胞およびウシ小脳のプルキンエ細胞に存在することを特徴とする、請求項１に記載の微小管結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微小管結合タンパク質と反応する抗体。
【請求項４】
ウシ大脳の膜分画にグリセロールを添加して微小管を重合させて沈殿として回収した後、微小管を脱重合させて変性タンパク質を除去した後に、再度微小管を重合させて得た沈殿を緩衝液に懸濁することによって得られる微小管結合タンパク質（ＭＡＰｓ）を含む分画とは反応しないことを特徴とする請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３または４に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微小管結合タンパク質、さらに詳しくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質に関するものである。本発明はまた、上記タンパク質と反応する抗体、並びに上記のタンパク質または抗体を含む医薬または診断薬に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
真核細胞に普遍的に存在する微小管は、外径約２５ｎｍの細長い管状構造体であり、細胞骨格の一員として細胞の形態の形成や維持に関与し、また、染色体の分配、繊毛や鞭毛の運動、軸索輸送などの細胞運動において中心的役割を担うことが知られている。
微小管は、主要成分であるチューブリンと副成分である微小管結合タンパク質（ＭＡＰｓ）とから構成されており、ここでＭＡＰｓとはチューブリン重合体に結合しているタンパク質の総称を意味する。チューブリンの一次構造が、生物種間、細胞種間でよく保存されているのに対し、ＭＡＰｓは細胞によって多様性に富んでおり、微小管の機能の多様性は主としてＭＡＰｓの多様性によるものと考えられているため、ＭＡＰｓの構造および機能を解明することは微小管の機能を解明する上で興味深い。
【０００３】
現在までのＭＡＰｓの構造および機能の研究によれば、ＭＡＰｓは、チューブリンの重合を促進し、形成された微小管に結合してそれを安定化させる働きを持つとともに、微小管だけではなく、他の細胞内構造体とも結合し、それによって両者を結び付け、細胞内に高次構造を構築する働きを持つことが知られている。従って、ＭＡＰｓの構造および機能の解明が進めば、微小管が関与すると考えられている細胞分裂または細胞貪食などの機構の解明につながると考えられる。
【０００４】
哺乳類の脳は他の器官に比べて微小管含量が高いため、ＭＡＰｓについての現在までの研究は主に哺乳類の脳を用いて行われてきた。脳の主要なＭＡＰｓは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、およびｔａｕの３種に分類されている。ＭＡＰ１は、分子量が約３５０ｋＤａの３種類のポリペプチドの総称であり、ＭＡＰ２は分子量が約３００ｋＤａの２種類のポリペプチドの総称であり、タウは分子量が約５０〜７０ｋＤａの数種類のタンパク質の総称である。
また、脳以外の臓器に存在するＭＡＰｓについては、ＭＡＰ４と総称されるものが報告されている。ＭＡＰ４は分子量が約１９０〜２００ｋＤａであり、副腎髄質および皮質、脳下垂体前葉、肝臓、ＨｅＬａ細胞などの培養細胞などにおいて多様なＭＡＰｓ（これらがＭＡＰ４と総称的に称されている）の存在が報告されている（生体の科学43(4), 281-289 (1992)室伏著、および当該文献中に引用されている文献）。
【０００５】
以上のように、微小管結合タンパク質（ＭＡＰｓ）は哺乳類の脳および脳以外の臓器から多くの種類が同定されているが、未だその全てが単離同定されているわけではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、新規な微小管結合タンパク質を単離および同定することである。
本発明のもう一つ別の目的は、上記タンパク質と反応する抗体を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、上記タンパク質および抗体を用いた医薬または診断薬を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ウシ大脳の膜分画を調製し、これに微小管を添加し、共沈させることにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が約１００ｋＤａである新規なタンパク質を単離同定することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明によれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質が提供される。
本発明の微小管結合タンパク質は、それが存在する任意の生体材料から単離することができ、その原材料は特には限定されないものの、本発明の好ましい一つの態様としては、ウシ大脳の膜分画から単離することができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質が提供される。
【０００９】
また、本発明のタンパク質の特徴の一つとしては、ウシの大脳のマイクログリア細胞および小脳のプルキンエ細胞に存在することが確認されている。
また、本発明のタンパク質はその単離方法によって特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質の単離のための一つの好ましい態様としては、ウシ大脳の膜分画を調製し、緩衝液で洗浄し、カチオン性界面活性剤で抽出した後、微小管を含む液を上記抽出液に添加し、次いで共沈させることにより本発明のタンパク質を単離することが挙げられる。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、本発明によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質と反応する抗体が提供される。
抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、当業者に周知の方法を用いて調製できる。
【００１１】
また、本発明の抗体の特徴の一つとして、従来公知の微小管結合タンパク質（ＭＡＰｓ）とは反応しないことが挙げられる。ここで「従来公知の微小管結合タンパク質」とは、ウシ大脳の膜分画にグリセロールを添加して微小管を重合させて沈殿として回収した後、微小管を脱重合させて変性タンパク質を除去した後に、再度微小管を重合させて得た沈殿を緩衝液に懸濁することによって得られる、以下の文献に列記されているものを意味する（蛋白質  核酸  酵素 Vol.34, No.12 (1989), p1447-1454, 藍澤および室伏著; Shelanski, M.L., Gaskin, F., Cantor, C.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 70, 756-768 (1973); Murphy, D.B., Borisy, G.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2696-2700 (1975); Weingarten, M.D., Lookwood, A.H., Hwo, S.Y., Kirschner, M.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1858-1862 (1975); Murphy, D.B., Lohnson, K.A., Borisy, G.G., J. Mol. Biol., 117, 33-52 (1977)などを参照）。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質またはそれと反応する抗体を有効成分として含むことを特徴とする医薬または診断薬が提供される。
医薬および診断薬の具体的用途としては微小管の機能に関与する疾患の治療および診断などが考えられ、例えば、医薬としては抗腫瘍薬および細胞膜の不安定化による疾患の治療薬、診断薬としては、脳腫瘍（特にはプルキンエ由来の脳腫瘍）またはグリオーム（特にはマイクログリアおよびアストログリア由来のグリオーム）の診断薬としての用途が考えられる。
有効成分の投与量は、患者の容体、性別、体重などに応じて適宜選択できるが、一般的には約１μｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質は、以下の実施例ではウシ大脳から単離精製されているが、これは本発明の一つの実施例を示すものにすぎない。
脳には一般的に非常に多くの微小管が含まれていることが知られていることから微小管結合タンパク質もそれに付随して多量に存在することが予測されるため、脳は好ましい原料の一つである。しかしながら、原料は脳に限定されるものではなく、本タンパク質を発現している限りは他の任意の器官および組織などからも単離精製することが可能であると考えるべきである。あるいはまた、本発明のタンパク質を発現している培養細胞から単離精製することも可能であると考えられる。
【００１４】
脳などの原料から本発明のタンパク質を単離するためには、先ず、その膜分画を調製することが好ましい。本明細書中で用いる「膜分画」とは、当業者に慣用的な細胞分画法を用いて得られる細胞中の膜成分を含有する分画のことを意味する。膜分画は、一般的には、ロイペプチンおよび／またはペプスタチンＡなどのプロテアーゼ阻害剤を含み適当な浸透圧（スクロース濃度などで調整可能）を有する緩衝液を原料に加えて、粉砕した後、適当な回数だけ遠心分離することによって調製することができる。
次いで、得られた膜分画を適当な緩衝液（ＰＩＰＥＳ、ＰＭＳＦ、ロイペプチンおよびペプスタチンＡを含む緩衝液など）を用いて攪拌および遠心を適当な回数（例えば、本明細書中以下の実施例では３回）だけ繰り返し、洗浄する。
【００１５】
次いで、セチルピリジニウムクロライドなどのカチオン性界面活性剤を含む適当な緩衝液を用いて静置および遠心による抽出を適当な回数（例えば、本明細書中以下の実施例では３回）だけ繰り返すことにより、本発明のタンパク質を抽出することができる。
【００１６】
本発明のタンパク質は、新規な微小管結合タンパク質を単離するという目的の下で得られたものである。即ち、上記で得た膜タンパク質含有分画に微小管を添加してその結合体を沈殿させること（共沈させること）によって得ることができる。
なお、本発明のタンパク質を上記のように共沈させる際に用いる微小管は、チューブリンをインビトロで重合させることによって調製することができる。より具体的には、緩衝液中のチューブリン溶液にＧＴＰを加え、ＤＭＳＯを加えた後、静置してチューブリンを重合させることによって調製することができる。
【００１７】
チューブリンの調製方法については特には限定されないが、例えば、本明細書中上記したような従来公知のＭＡＰｓを含む分画の調製方法と同様に、ウシ大脳の膜分画にグリセロールを添加して微小管を重合させて沈殿として回収した後、微小管を脱重合させて変性タンパク質を除去した後に、再度微小管を重合させて得た沈殿を緩衝液に懸濁することによって、ＭＡＰｓおよびチューブリンを含有する分画を得ることができる。この分画をさらに、ＤＥＡＥセファロースカラムなどの適当なカラムに充填して、Ｏ．７ＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させることによってチューブリン分画を得ることができる。
【００１８】
本発明の別の側面によれば、本発明の新規な微小管結合タンパク質と反応する抗体が提供される。
抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
なお、モノクローナル抗体は、ヒト型化抗体、キメラ抗体、抗体の断片、Ｆａｂフラグメントなどでもよい。
【００１９】
新規なタンパク質と反応する抗体は、当業者に知られる慣用的方法を用いて入手できる。
例えば、ポリクローナル抗体を作製するためには、先ず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで単離したタンパク質をゲルから切り出すか、あるいはゲルからニトロセルロース膜などの膜へウエスタンブロットした後に切り出す。次いで、ゲルまたは膜からタンパク質を抽出した後、フロイントのアジュバントなどを適宜添加してエマルジョンとし、適当な免疫動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギなど）に注入する。
【００２０】
免疫動物へのタンパク質の注入は、当業者に知られる一般的な範囲内の注入量で行うことができる。例えば、ウサギに免疫する場合には、タンパク質の量に関して５μｇ／匹〜１００μｇ／匹の範囲で行えばよい。
注入は適当な期間（例えば、２週間以上）ごとに行い、注入後の適当な期間（例えば、１週間から２週間）経過後に、採血することによって本発明のタンパク質に対する抗血清を得ることができる。
【００２１】
なお、この抗血清からアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用手段によりＩｇＧフラクションを単離することによりポリクローナル抗体を調製することができる。
【００２２】
また、モノクローナル抗体を作製するための方法も特に限定されず、当業者が通常使用する方法を用いることができる。具体的には、免疫動物への抗原（１００ｋＤａタンパク質）の注入はポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができ、かかる免疫感作の後、免疫した動物よりハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞を単離する。なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環しているが、脾臓などに蓄積されることも知られている。従って、免疫した動物の脾臓を摘出して、そこから抗体産生細胞を調製するのが好ましいが、必ずしも脾臓でなくてもよくＢ細胞が多く存在する部分を使用することもできる。
次いで、このようにして得た抗体産生細胞をミエローマ細胞（パートナー細胞）と融合し、不死化する。
【００２３】
細胞融合技術としては、当業者に公知の技術を用いることができる。
細胞融合は、一般的には、抗体産生細胞とヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損無限増殖性細胞株であるミエローマ細胞とを、融合促進剤を含有する培地中で保温することにより行われる。
【００２４】
ミエローマ細胞の種類は特には限定されず、公知のものを使用することができ、例えばマウスのものとしては、Ａｇ８．６５３、Ｐ３Ｕ１などが挙げられる。ミエローマ細胞の選択の際には抗体産生細胞との適合性を考慮するのが好ましい。
融合促進剤としては、ポリエチレングリコールなどの化学物質、センダイウイルスなどの細胞融合媒介ウイルスを用いることができ、さらに融合効率を高めるための補助剤を添加してもよい。
【００２５】
上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを適当な比率、一般的には抗体産生細胞：ミエローマ細胞が１：１から１：１００、好ましくは２：１から１０：１の比率で、細胞培養培地中で混合した後に、融合促進剤を添加することにより細胞融合を行う。次いで、適当な培地の添加、および上清の除去を繰り返すことによりハイブリドーマを形成する。
次いで、ヒポキサンチンアミノプリテンチミジン（ＨＡＴ）培養液中で培養し、融合細胞のみを選択する。ＨＡＴ培地での細胞の培養は、ハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な期間行えばよく、通常は数日から数週間の期間行えばよい。
【００２６】
なお、抗体産生細胞の不死化は、細胞融合（ハイブリドーマの作製）によるものに限定されるわけではなく、その他の公知の技術を用いることができる。
例えば、抗体産生細胞としてのヒトのＢリンパ球を用いる場合には、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を用いて形質転換することにより不死化を行ってもよい。
【００２７】
次いで、上記により得られたハイブリドーマについて、本発明の１００ｋＤａタンパク質を認識する抗体を産生する単一のクローンを得るためにスクリーニングを行う。単一のクローンを得るためのクローニング法は当業者に知られる方法を用いればよく、例えば、限界希釈法、軟寒天法などを用いることができる。
また、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得るためのスクリーニング法も当業者に知られる方法を用いればよく、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法、プラーク法、凝集反応法、ＲＩＡ法、免疫組織化学染色法などの抗体を検出するための各種方法により行うことができる。
【００２８】
スクリーニングは、作業効率の向上などの観点から１次スクリーニングと２次スクリーニングなどのように段階的に行ってもよい。
上記のようにして得られた所望の抗体を産生する細胞株は、通常の培地において継代培養が可能であり、また液体窒素中などで長期保存が可能である。
【００２９】
本発明による１００ｋＤａのタンパク質を認識するモノクローナル抗体を、上記のようにして得たハイブリドーマから得るための方法の例としては、以下の２つの方法が挙げられる。
第１の方法によれば、上記のハイブリドーマを一定の時間、適当な培地中で培養し、その培養上清から、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどを用いてそのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を単離精製することができる。
【００３０】
あるいは第２の方法によれば、上記のハイブリドーマをそれと適合性のある（即ち、同質遺伝子または半同質遺伝子を有する）哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔内に注射し、一定時間後に、その動物の血清または腹水からそのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を単離精製することができる。
【００３１】
また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られる抗体産生細胞を細胞融合させて生ずるハイブリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ等に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、Vandamme, A-M.ら、Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990 を参照）。
以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
実施例１：本発明の微小管結合タンパク質（１００ｋＤａ微小管結合タンパク質）の単離
脳膜および血管を取り除いたウシ大脳をＰＢＳで洗浄し、これに０．５２Ｍのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌのロイペプチン、３μｇ／ｍｌのペプスタチンＡの溶液（水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整）を０．７容量（ｖ／ｗ）加えて、ミキサーで粉砕し、これを１２，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離した。
得られた上清に、４℃の１ＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＧＴＰの溶液（ｐＨ６．８）を１／９容量（ｖ／ｖ）加え、８，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離してウシ大脳の膜分画を得た。
【００３３】
この膜分画を３回、１０容量（ｖ／ｗ）の洗浄緩衝液（０．１ＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）；１ｍＭのＰＭＳＦ；３μｇ／ｍｌのロイペプチン；３μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ）で攪拌し、８０，０００ｇで２０℃で３０分間遠心分離することによって洗浄した。
次いで、０．１％のセチルピリジニウムクロライド（ＣＰＣ）を加えた洗浄緩衝液で６０分間常温で静置した後、８０，０００ｇで２０℃で３０分間遠心分離した。この操作は３回行い、通常３回目の抽出で１００ｋＤａのタンパク質が抽出される。
【００３４】
一方上記操作とは別に、０．１ＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ4中のチューブリン（４ｍｇ／ｍｌ；以下の参考例１の工程（９）で得られたもの）溶液に１ｍＭのＧＴＰを加え、３７℃で１５分間静置した後、３７℃のＤＭＳＯを８％になるように加え、３７℃で３０分間静置してチューブリンを重合させた。次いで、この溶液にさらにタキソールを加え（１０μＭ）、安定化させた微小管を含む液を調製した。
先にＣＰＣによる抽出で得られた１００ｋＤａのタンパク質を含む抽出液に、上記のようにして調製した微小管を含む液を１／１０容量（ｖ／ｖ）加えた。
【００３５】
この混合液を軽く攪拌した後、３７℃で３０分間静置し、８０，０００ｇで３４℃で３０分間遠心分離し、ペレットを得た（このペレットが、以下の実施例３のイムノブロット分析において、Ｃ３Ｐと称される試料である）。そのペレットを０．３ＭのＮａＣｌで抽出した後に得られた試料を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた結果を図１に示す。
図１中において両端のレーンは分子量マーカーを示し、分子量の大きい方から順に（図中では上から順に）２０２ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａおよび４５ｋＤａのサイズを示す。
図１の結果から分かるように、分子量が約１００ｋＤａのタンパク質が単離されたことが確認された。
【００３７】
この共沈実験のコントロールとしては、０．１％セチルピリジニウムクロライド抽出液にチューブリンの添加を省略する以外は同一の条件で同一の実験を行った。
その結果、沈殿する数種類のタンパク質は確認されたが、本発明の１００ｋＤａのタンパク質はこの条件では全く沈殿しないことが確認された。
【００３８】
また本発明の１００ｋＤａのタンパク質と微小管との親和性が強いことは、共沈したペレットに洗浄緩衝液（プロテイナーゼ阻害剤を含まない）を加えて強く攪拌しても、再度遠心分離しても全くはずれてこないことにより確認された。
なお本発明の１００ｋＤａのタンパク質と微小管との結合は、１ＭのＮａＣｌによって完全に解離することも確認された。
【００３９】
実施例２：本発明の１００ｋＤａ微小管結合タンパク質に対する抗血清の作製
本発明の１００ｋＤａ微小管結合タンパク質と微小管との共沈分画を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜上にセミドライにて（２００ｍＡ；５時間；０．１Ｍのトリス塩酸、０．１９２Ｍのグリシン、０．０５％のＳＤＳ、１０％のメタノール）ウエスタンブロットを行った。
ニトロセルロース膜上の１００ｋＤａのタンパク質は切り取られ、ＰＢＳ中でソニケーションおよびＤＭＳＯによって抽出し、等量のフロイント完全アジュバントを加えてエマルジョンにし、またゲル中に残った１００ｋＤａタンパク質も同様に切り取られ、ＰＢＳ中でホモジナイズし、ウサギ（１．５ｋｇ、雌、Japanese white）の皮下に２１ゲージの針を用いて、共に約１０μｇずつ注射された。
【００４０】
追加免疫は、２週間おきに行われ、各追加免疫の１０日後に採血し、その抗血清の力価をイムノブロットによって確認した。その結果、得られた抗血清を１／２００〜１／５００に希釈して用いた場合は、本発明の１００ｋＤａ微小管結合タンパク質を認識できることが確認された。
【００４１】
参考例１：従来公知のチューブリンおよびＭＡＰｓを含有する精製分画の調製、並びに上記分画からのチューブリン分画およびＭＡＰｓ分画の単離
以下の実施例３は、上記実施例２で得た抗血清を用いたイムノブロット分析により本発明の１００ｋＤａタンパク質が従来のＭＡＰｓとは異なるものであることを示すものである。以下の実施例３で従来のＭＡＰｓを含む分画として用いた試料の調製、並びに、本発明の１００ｋＤａのタンパク質を単離する際に用いたチューブリンの調製は、以下に記載する工程（１）〜（９）の手順に従って行った。
【００４２】
（１）ウシの脳を屠殺場より取ってくる。
（２）ウシの脳より脳膜および血管を除き、ＰＢＳで洗浄後、０．７倍体積の０．５２Ｍのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌのロイペプチン、３μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ（ｐＨ７．０）を加えてミキサーで破砕する。
【００４３】
（３）このホモジネートを１２，０００ｇで４℃で２０分間遠心（８，０００ｒｐｍ；日立ＲＰＲ９−２）し、この上清に４℃の１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＧＴＰを１／９量加え、８０，０００ｇで４℃で３０分間遠心（３０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ３０−２）する。
（４）この上清に、１／３量のグリセロールを加え、３７℃で３０分間保温し、微小管を重合させ、これを８０，０００ｇで３７℃で９０分間遠心（３０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ３０−２）し、微小管を沈殿として回収する。
【００４４】
（５）この沈殿に４℃の０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌのロイペプチン、３μｇ／ｍｌのペプスタチンＡを加え、４℃ですりつぶし、氷中に３０分間置いて微小管を脱重合させ、８０，０００ｇで４℃で９０分間遠心（３０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ３０−２）して、変性タンパク質を沈殿させ取り除く。
（６）上清に１／３量のグリセロールを加え、３７℃で３０分間保温して微小管を重合させ、これらを８０，０００ｇで３７℃で９０分間遠心（３０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ３０−２）し、微小管を沈殿として回収する。
【００４５】
（７）この沈殿に４℃のＣＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）、８０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌのロイペプチン、３μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ）を加えて、４℃でホモジネートし、そして１００，０００ｇで４℃で３０分間遠心（４０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ４０）して、上清に微小管タンパク質分画を得る（上記沈殿を工程（５）で使った緩衝液ですりつぶしたものが図２中のレーン１０に示されるＣ３Ｘと称される分画で、この分画には従来公知のチューブリンとＭＡＰｓとが含まれている）。
【００４６】
（８）この微小管タンパク質分画をＣＳ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムを用いてＭＡＰｓ分画（０．３ＭのＮａＣｌを含むＣＳ緩衝液で溶出）とチューブリン分画（０．７ＭのＮａＣｌを含むＣＳ緩衝液で溶出）とに分離させる。ここで得られたＭＡＰｓ分画が、図２中のレーン１２に泳動したものである。
（９）チューブリン分画を１００ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ4、４Ｍのグリセロール、０．２ｍＭのＧＴＰ、０．３ｍＭのＰＭＳＦで６〜７時間透析し、透析後、ＧＴＰを１ｍＭになるように加え、３７℃で３０分間保温し、微小管を重合させ、これを１００，０００ｇで３７℃で９０分間遠心（４０，０００ｒｐｍ；日立ＲＰ４０）し、沈殿を回収する。こうして得られたチューブリンを実施例１で共沈の際に用いた微小管を作製するために用いた。
【００４７】
実施例３：抗血清を用いたイムノブロット分析
実施例２で得た抗血清を用いたイムノブロット分析により、ウシ大脳の可溶性分画からの各精製段階における試料（実施例１に示した工程中の各段階のもの）、および従来公知のＭＡＰｓを含む試料（参考例１で得られたもの）中における本発明の１００ｋＤａのタンパク質の存在を下記のようにして試験した。
【００４８】
実施例１で得た各精製段階における試料、参考例１で得られた従来公知のＭＡＰｓを含む試料、およびプロテインスタンダード（分子量マーカー）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した。電気泳動後のゲルを染色した結果を図２に示す。一番下のレーン（レーン１）および上から２番目のレーン（レーン１１）がプロテインスタンダード（分子量マーカー）で、分子量の大きい方（図中では左から）から順番に２０２ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａおよび４５ｋＤａの大きさを示す。
【００４９】
各レーンの試料は以下の通りである。
レーン１：プロテインスタンダード
レーン２：Ｗ１(大脳膜分画を洗浄緩衝液で最初に洗って遠心分離した上清）
レーン３：Ｗ２(大脳膜分画を洗浄緩衝液で２回目に洗って遠心分離した上清）
レーン４：Ｗ３(大脳膜分画を洗浄緩衝液で３回目に洗って遠心分離した上清）
レーン５：Ｃ１(３回洗浄緩衝液で洗った後、最初に０．１％ＣＰＣで１時間常温で抽出したもの）
レーン６：Ｃ２(３回洗浄緩衝液で洗った後、２回目に０．１％ＣＰＣで１時間常温で抽出したもの）
レーン７：Ｃ３(３回洗浄緩衝液で洗った後、３回目に０．１％ＣＰＣで１時間常温で抽出したもの）
レーン８：ウシ大脳可溶分画（大脳膜分画を分離した際にでる上清；チューブリン、ＭＡＰｓを豊富に含む）
レーン９：Ｃ３Ｐ（Ｃ３とチューブリンの共沈分画）
レーン１０：Ｃ３Ｘ（チューブリン＋ＭＡＰｓの分画）
レーン１１：プロテインスタンダード
レーン１２：ＭＡＰｓ（チューブリンとＭＡＰｓの結合したもの（Ｃ３Ｘ）よりＭＡＰｓを０．３ＭのＮａＣｌで溶出したもの）
【００５０】
次いで、上記の泳動を終えたゲルをＴＢＳ（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）と０．１５ＭのＮａＣｌ）中の５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次いで、実施例２で得られた抗１００ｋＤａタンパク質ウサギ血清（５％スキムミルクを含むＴＢＳで１／２００に希釈したもの）を１次抗体として使用して、これとともに室温で一晩インキュベーションした。
【００５１】
次いで、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（５％スキムミルクを含むＴＢＳで１／５００に希釈したもの）を２次抗体として使用して、これとともに室温で２時間インキュベーションした。
次いで、ジアミノベンチジンにより染色した。得られた結果を図３に示す。なお、図３の各レーンの試料は図２の各レーンの試料と対応したものである。
【００５２】
図３に示される結果の通り、本発明の１００ｋＤａのタンパク質に対する抗血清は、Ｃ３およびＣ３Ｐと称されるレーンにおいて、分子量約１００ｋＤａのタンパク質と結合している一方、従来のＭＡＰｓを含有する分画であるＣ３ＸおよびＭＡＰｓと称されるレーンではバンドが検出されなかったことが分かる。
この結果から、本発明の１００ｋＤａのタンパク質は、既知のＭＡＰｓではないこと、また精製の途中で失われていないことが確認された。
【００５３】
実施例４：免疫組織染色法による１００ｋＤａタンパク質の脳組織中における存在の分析
組織（ウシ大脳および小脳）を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、常法に従って脱水、脱脂し、パラフィンで包埋して薄切し、標本とした。
１００ｋＤａタンパク質の酵素組織化学は、正常ヤギ血清、過酸化水素でブロッキングした後、抗１００ｋＤａ抗体（実施例２で得た抗血清を１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳで１／４に希釈したもの）でインキュベーション（４℃、一晩）した。
翌日、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（２次抗体）とともに３７℃で１時間インキュベーションし、過酸化水素を加えて、ジアミノベンチジンで褐色に発色させた。
【００５４】
チューブリンの方は、ＤＡＫＯ社製のＬＳＡＢ（Ｒ）キットを用いた。標本は、１００ｋＤａタンパク質の場合と同じように、ブロッキングし、抗チューブリンモノクローナル抗体（重合および非重合のチューブリンを共に認識するもの；Transformation Research. Inc.から入手；１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１／２００に希釈したもの) で４℃で一晩インキュベーションした。
翌日、２次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、基質とＡＥＣ（３−アミン−９−エチル−カスタゾール）色原体を加えて、赤色に発色させた。
【００５５】
得られた結果を図４から図７に示す。
図４は、ウシ大脳組織標本を抗チューブリンモノクローナル抗体で染色したサンプル、図５は、ウシ大脳組織標本を抗１００ｋＤａタンパク質抗体で染色したサンプル、図６は、ウシ小脳組織標本を抗チューブリンモノクローナル抗体で染色したサンプル、図７は、ウシ小脳組織標本を抗１００ｋＤａタンパク質抗体で染色したサンプルの写真を示す。
【００５６】
図４〜図７の結果から得られる所見をまとめると以下の表１の通りになる。
【表１】
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【００５７】
図４〜図７に示される結果から分かるように、本発明の１００ｋＤａのタンパク質は、大脳のグリア細胞の一部、小脳の神経細胞（プルキンエ細胞）および顆粒細胞に存在することが確認された。
【００５８】
実施例５：本発明の１００ｋＤａ微小管結合タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫
実施例２と同様に、ニトロセルロース膜上の１００ｋＤａのタンパク質を切り出し、ＰＢＳ中でのソニケーションによって抽出し、等量のフロイント完全アジュバンドを加えてエマルジョンにし、マウス（Ｂａｌｂ／雌、３週令）の腹腔内へ２１ゲージの針を用いて約２．５μずつ注射された。
追加免疫は、上記の方法で用意された（完全アジュバンドの代わりに不完全アジュバンドを使用した）抗原とアジュバンドとのエマルジョンを用いて、２週間毎に３回行い、各追加免疫の約１０日後に採血し、その抗血清の力価をイムノブロットによって確認した。
【００５９】
（２）脾細胞の調製
マススをエーテル麻酔処理し、目から採血し、頸椎脱臼を７０％エタノールにつけた。脾臓を取り出し、培地［ＧＩＴ：ＧＩＡ培地とは、通産省次世代産業基盤技術開発制度（塚本ほか、第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー−予稿集１７５、１９８４、培養細胞による抗体産生；北野ほか、第３回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー−予稿集１５５、１９８５、ヘテロハイブリドーマによるヒトモノクローナル抗体の生産）に基づき、武田薬品工業株式会社が研究推進の過程で開発した細胞培養用培地である（S.Sasai et al., Abst. 3rd International Cell Culture Congress (Sendai) P.46, 1985, Establishment of a medium for mass culture of mammalian cells；特開昭６０−１４５０８８）。］１０ｍｌを分注したシャーレに保存した。脾臓内へ５ｍｌ注射筒・２３Ｇ針で培養液を流して、脾臓細胞を採取した。メッシュを通して組織を除き、遠心管に移し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した。沈殿を培地１０ｍｌで２回洗浄した。赤血球溶解緩衝液（０．９％ＮＨ4Ｃｌ）２ｍｌで２分間溶血し、培地１５ｍｌを添加し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した。沈殿に培地１０ｍｌを添加して、細胞数を測定した。
【００６０】
（３）パートナー細胞（Ａｇ８．６５３）の調製
脾細胞との融合の予定日の約１週間前に凍結保存されていた細胞Ａｇ８．６５３細胞を３７℃でインキュベーションすることにより急速に解凍した。培地（ＧＩＴ）で１回洗浄後、１,２００ｒｐｍで５分間遠心した。融合の時期に合わせて継代培養した。融合の当日、細胞を採取し、培地１０ｍｌで１回洗浄した。培地を１０ｍｌ添加し、細胞数を測定した。
【００６１】
（４）細胞融合
上記（２）および（３）で各々調製した脾細胞とパートナー細胞とを、脾細胞：Ａｇ８．６５３細胞との比率が１０：１になるように混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した。培地を吸引除去した後、ペレットを十分にほぐした。ＰＥＧ（５０％Ｗ／Ｖ）１ｍｌを回しながら添加し、１分間振盪した。１分間静置した後、培地（ＧＩＴ）２５ｍｌを添加して、ピペッティングし、細胞を分散させた。この細胞分散液を８００〜９００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引除去し、脾細胞１×１０8個当たりＨＡＴ培地５０ｍｌを添加した。これを４×１０5脾細胞／２００μｌ／ウエルずつ９６穴プレートに分注した。約１０日後、早く増殖している細胞がウエル一面に増殖した時点で（増殖したウエルは培地の色が黄色に変色する）、培地を交換した。１５０μｌの上清を除き、ＨＡＴ培地１５０μｌ添加した。１〜２日後、上清を除去し、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロット法により陽性のウエルを選択し、２４穴プレート（１％ＢＣを含む培地１ｍｌ／ウエル）にスケールアップした。２〜３日後に下記の軟寒天培地法によるクローニングを行った。
【００６２】
（５）細胞クローニング（軟寒天培地法）
バクトアガー２．５ｇを５００ｍｌビンに入れ、再蒸留水を加え、スターラーで攪拌し、静置後、上清を捨てる。この洗浄操作を２〜３回繰り返し、再蒸留水を加え、１００ｍｌとし（２．５％アガー）、冷蔵保存した。必要量をアガー用１０ｍｌピペットで培地ビンにとり、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、冷却してアガーが固まる前に、ＨＴ培地（１０％ＦＣＳおよび０．８％ＢＣを含むＧＩＴ）を最終濃度が０．２５％アガーになるように添加し、使用するまでこれを３７℃で水浴した。
【００６３】
２４穴プレート中の細胞を懸濁させた後、１５ｍｌチューブ中に培地５０μｌ（細胞数に応じて量を増やす）をとり、０．２５％アガー培地３．５ｍｌを混合後、３ｍｌをＦａｌｃｏｎ３００１ｄｉｓｈ（商品名）に移した。チューブの残りへ、アガー培地３ｍｌを添加し、全量をＦａｌｃｏｎ３００１ｄｉｓｈ（商品名）に移した。これを直ちに冷蔵庫（４℃）に入れて３０分から１時間冷却し、次いで３７℃のＣＯ2インキュベーター中に置いた。
【００６４】
約１０日後、軟寒天中にコロニーがでてきたら（肉眼で確認可能）、顕微鏡下、注射針により採取し（６〜１２コロニー／クローン）、２４穴プレート（ＨＴ培地）で培養した。２〜３日後、細胞がウエル一面になった時に上清を取り、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロット法により陽性のウエルを選択し、再度、軟寒天培地法によるクローニングを行った。７〜１０日後、軟寒天中にコロニーがでてきたら、注射針により採取し（６コロニー／クローン）、２４穴プレートでカルチャーした。２〜３日後、細胞がウエル一面になった時点で、上清をとり、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロット法により全てのコロニーが陽性であることを確認した。
【００６５】
実施例６：本発明のモノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析
イムノブロット分析により実施例５で得たモノクローナル抗体が本発明の１００ｋＤａ微小管結合タンパク質を認識することを以下のようにして確認した。
ウシ大脳可溶画分（ＭＡＰＳを豊富に含む）、ウシ大脳膜分画Ｃ３（実施例３を参照；本発明の１００ｋＤａタンパク質を含む）および部分精製した１００ｋＤａタンパク質を含む画分（Ｃ３Ｐ）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した。電気泳動後のゲルを染色した結果を図８に示す。各レーンの試料は以下の通りである。
レーン１：ウシ大脳可溶画分（ＭＡＰＳを豊富に含む）
レーン２：ウシ大脳膜分画Ｃ３（実施例３を参照；本発明の１００ｋＤａタンパク質を含む）
レーン３：部分精製した１００ｋＤａタンパク質を含む画分
なお、両端のレーンはプロテインスタンダードを示す。
【００６６】
上記泳動を終えたゲルを、５％スキムミルクを含むＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。次いで、実施例５で得られた抗１００ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体（培養上清液を５％スキムミルクを含むＴＢＳで１／５０に希釈したもの）を１次抗体として使用し、これとともに、４℃で一晩インキュベーションした。
次いで、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＭ（５％スキムミルクを含むＴＢＳで１／５００に希釈したもの）を２次抗体として使用し、これとともに、３７℃で１．５時間インキュベーションした。
【００６７】
ＴＴＢＳで洗浄後（５分の洗浄を５回）、ジアミノベンチジンにより染色した。得られた結果を図９に示す。図９の各レーンの試料は図８の各レーンの試料と対応したものである。
図９に示される通り、実施例５で得られたモノクローナル抗体は、本発明の１００ｋＤａのタンパク質を認識することが分かる。
【００６８】
実施例７：本発明のモノクローナル抗体を用いた組織染色
実施例４と同様に、組織（ウシ大脳および小脳）を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、常法に従って脱水、脱脂し、パラフィンで包埋して薄切し、標本とした。
１００ｋＤａタンパク質の酵素組織化学は、正常ヤギ血清、過酸化水素でブロッキングした後、抗１００ｋＤａモノクローナル抗体（実施例５で得たハイブリドーマの培養上清を１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳで１／４に希釈したもの）でインキュベーション（４℃、一晩）した。
翌日、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（２次抗体）とともに３７℃で１時間インキュベーションし、過酸化水素を加えて、ジアミノベンチジンで褐色に発色させた。
【００６９】
得られた結果を図１０から図１４に示す。図１０から図１４の結果から得られる所見は以下の通りである。
即ち、本発明のモノクローナル抗体は、ウシ小脳のプルキンエ細胞、小脳グリア細胞の一部および神経繊維の髄鞘、ウシ大脳の基底核の一部の神経細胞とグリア細胞、脳室上皮、脈絡叢の上皮および神経繊維の髄鞘において、本発明の微小管結合タンパク質を認識することが分かった。
【００７０】
実施例８：本発明のモノクローナル抗体を用いた凍結切片の組織染色
適当な大きさ（５ｍｍ×５ｍｍ）に切ったウシ大脳にO.T.C.化合物を加え凍結し、その標本をクリオスタットで５μｍの厚さで薄切しスライドガラス上に貼付し常温で風乾した。それを１００％エタノールで３０秒間固定し、風乾した後１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。そしてこの標本を抗１００ｋＤａモノクローナル抗体を含む培養上清（１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳで１／２に希釈）で４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＤＡＫＯ社製のＬＳＡＢ（Ｒ）キットを用いて３−アミン−９−エチル−カスタゾール色原体で赤色に発色させた。
【００７１】
得られた結果を図１５〜図１７に示す。図１５〜図１７から分かるように、パラホルムアルデヒドで固定した標本では均一に染色されなかったウシ大脳において、髄膜上皮・軸索、およびミクログリア、アストログリア等と見られるグリア細胞が強く染色されていた。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１００ｋＤａであることを特徴とする微小管結合タンパク質は、従来から知られていた微小管結合タンパク質（ＭＡＰｓ）とは区別される新規なタンパク質である。
本発明の１００ｋＤａのタンパク質は微小管と結合することにより、チューブリンの重合を安定化させ、またその脱重合を阻止することができるものと考えられ、これにより細胞分裂を抑制することにより細胞増殖を阻害できる可能性がある。
【００７３】
また、本発明の１００ｋＤａの微小管結合タンパク質と反応する抗体は当該タンパク質を検出するために用いることができることから、各種組織における当該タンパク質の存在を検出するために使用することができ、当該タンパク質の存在の有無および存在量の異常に起因もしくは帰結する疾患の診断などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の１００ｋＤａの微小管結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した結果の写真である。
【図２】図２は、イムノブロット分析に用いた各試料の電気泳動の写真である。
【図３】図３は、本発明の１００ｋＤａの微小管結合タンパク質に対する抗血清と各試料との反応性を示すイムノブロット分析の結果を示す写真である。
【図４】図４は、ウシ大脳組織標本を抗チューブリンモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図５】図５は、ウシ大脳組織標本を抗１００ｋＤａタンパク質抗体で染色したサンプルの写真である。
【図６】図６は、ウシ小脳組織標本を抗チューブリンモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図７】図７は、ウシ小脳組織標本を抗１００ｋＤａタンパク質抗体で染色したサンプルの写真である。
【図８】図８は、イムノブロット分析に用いた各試料の電気泳動の写真である。
【図９】図９は、本発明のモノクローナル抗体と各試料との反応性を示すイムノブロット分析の結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ウシ小脳分子層（molecular layer）のグリア細胞の組織標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図１１】図１１は、ウシ小脳プルキンエ細胞の組織標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図１２】図１２は、ウシ大脳神経繊維の髄鞘および小脳神経繊維の髄鞘の組織標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図１３】図１３は、ウシ大脳脳室上皮と脈絡叢の上皮の組織標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図１４】図１４は、ウシ大脳の一部のグリア細胞と大脳基底核の一部の神経細胞と一部のグリア細胞の組織標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真である。
【図１５】図１５は、ウシ大脳の凍結切片標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真（１００倍）である。
【図１６】図１６は、ウシ大脳の凍結切片標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真（２００倍）である。
【図１７】図１７は、ウシ大脳の凍結切片標本を本発明のモノクローナル抗体で染色したサンプルの写真（４００倍）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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