(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり、ここで、
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、
及びここで、
それぞれの軽鎖可変ドメインは他方と同一であるか、又はそれぞれの軽鎖可変ドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側で他方と同一であり、且つ、ＣＤＲの外側で他方と異なり、これらの軽鎖可変ドメインは、互いに少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、結合特異性を維持し、
工程：
（ｉ）上記ポリペプチドと軽鎖をコードしている核酸を含む宿主細胞を培養すること、ここで該核酸が発現され且つ該ポリペプチドと軽鎖が生産され；及び
（ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、
を含む方法。
【請求項２】
上記第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸又は上記第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸、又は両方が、コードされたアミノ酸配列を変更するような核酸の変更により提供される請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記第１のポリペプチド、上記第２のポリペプチド、又は両方のマルチマー化ドメインをコードしている核酸が、上記第１及び／又は第２のポリペプチドのそれぞれの該マルチマー化ドメインが、上記第１及び／又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含むように変更される請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み、該方法は工程（ｉ）の前に：
より大きな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に隆起を生成するように核酸を置換することによって該第１のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、および
より小さな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に相補的な空洞を生成するように核酸を置換することによって該第２のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ファージディスプレー選択によって、隆起を有するマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプチド、空洞を有するマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチド、又は両方をコードする核酸を準備する請求項４記載の方法。
【請求項６】
より大きな側鎖容量を有する移入残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）からなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択され、且つ該移入残基がシステイン（Ｃ）ではない、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ＣH３ドメインとＩｇＧ定常ドメインからなる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）に先行する工程をさらに含み、ここで上記核酸が宿主細胞内に導入される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
それぞれの軽鎖可変ドメインが他方と同一である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２の異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここで
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、
及びここで、
それぞれの軽鎖可変ドメインは他方と同一であるか、又はそれぞれの軽鎖可変ドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側で他方と同一であり、且つ、ＣＤＲの外側で他方と異なり、これらの軽鎖可変ドメインは、互いに少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、結合特異性を維持する、多重特異性抗体。
【請求項１４】
該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメイン又は該第２のポリペプチドのマルチマー化ドメイン、又は両方が、アミノ酸の変更により提供される請求項１３記載の多重特異性抗体。
【請求項１５】
上記第１又は第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインが、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含む請求項１４記載の多重特異性抗体。
【請求項１６】
上記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み且つ該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインが隆起を含み且つ第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインが相補的な空洞を含む請求項１４記載の多重特異性抗体。
【請求項１７】
該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１及び第２のポリペプチド中に移入される置換によって生成される請求項１６記載の多重特異性抗体。
【請求項１８】
各々の軽鎖可変ドメインが他方と同じである請求項１３記載の多重特異性抗体。
【請求項１９】
請求項１３記載の多重特異性抗体とキャリアとを含んでいる組成物。
【請求項２０】
請求項１３記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
第１の分子に結合する第１の結合ドメインと第２の分子に結合する第２の結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり：
（ａ）第１の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプチドをコードしている第１の核酸を選択すること、及び第２の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードしている第２の核酸を選択すること、ここで該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なっており、且つ上記第１及び第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインは、上記第１及び第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのアミノ酸残基と特異的に相互作用するアミノ酸残基を含み、それによって該第１及び第２のポリペプチド間に安定な相互作用を生成する；
（ｂ）（ｉ）１つの可変軽鎖をコードしている核酸を選択すること、ここで該可変軽鎖は、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれと相互作用して、上記第１及び第２の結合ドメインを形成する、又は
（ｉｉ）第１の可変軽鎖ドメイン-コード化核酸と第２の可変軽鎖ドメイン-コード化核酸を選択すること、ここでそれぞれの可変軽鎖ドメインは他方と同一であるか、又はそれぞれの軽鎖可変ドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側で他方と同一であり、且つ、ＣＤＲの外側で他方と異なり、これらの軽鎖可変ドメインは、互いに少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、結合特異性を維持する；
（ｃ）上記ポリペプチドと軽鎖をコードしている核酸を宿主細胞中に導入すること、及び該細胞を、該核酸が発現し且つ該ポリペプチドと軽鎖が生産されるように培養すること；
（ｄ）該細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、
を含む方法。
【請求項２３】
該第１のポリペプチドをコードしている上記第１の核酸、該第２のポリペプチドをコードしている上記第２の核酸、又は両方が、コードされたアミノ酸配列を変更するように変えられた核酸から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該第１及び第２のポリペプチドが、空洞への隆起相互作用によって相互作用する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該第１の核酸、該第２の核酸、又は両方が、そのコードされたアミノ酸配列中にフリーのチオール含有残基を移入するように変更される請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該第１及び第２のポリペプチドが抗体定常ドメインをそれぞれ含む請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
抗体定常ドメインがＣH３ドメインである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
抗体定常ドメインがヒトＩｇＧからのものである請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
核酸が（ｉ）に従って選択される請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
核酸が（ｉｉ）に従って選択される請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドの混合物からヘテロマルチマー多重特異性抗体の形成を測定する方法であり、ここで該多重特異性抗体は少なくとも２の結合ドメインを含み、ここで
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し且つ第２の結合ドメインは第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは上記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、ここで上記第１又は第２のポリペプチドのぞれぞれのマルチマー化ドメインは、上記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含み、
及びここで、
それぞれの軽鎖可変ドメインは他方と同一であるか、又はそれぞれの軽鎖可変ドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側で他方と同一であり、且つ、ＣＤＲの外側で他方と異なり、これらの軽鎖可変ドメインは、互いに少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、結合特異性を維持し、
工程：
（ａ）それぞれの多重特異性抗体をゲルマトリックスにおいて移動させること；及び
（ｂ）該第１及び第２ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を有する多重特異性抗体に対応するバンドと、該第１及び第２のポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロマルチマーに対応する、遅く移動するバンドの相対量を測定すること、を含む方法。
【請求項３２】
上記ポリペプチドのマルチマー化が、該マルチマー化ドメイン間の空洞への隆起相互作用によって促進される請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
それぞれの軽鎖可変ドメインが他方と同じである請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ（Ｏｂ-Ｒ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ（Ｍｐｌ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３５】
抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ（Ｏｂ-Ｒ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ（Ｍｐｌ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項１３記載の多重特異性抗体。
【請求項３６】
請求項３５記載の多重特異性抗体と担体を含む組成物。
【請求項３７】
該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ（Ｏｂ-Ｒ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ（Ｍｐｌ）／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項２０記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ヘテロマルチマー重鎖成分および共通する軽鎖成分を有する多重特異性抗体の作製方法に関する。このような多重特異性抗体として、二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因子、ならびに本発明の方法を使用して作製される抗体−免疫付着因子キメラおよびヘテロマルチマーポリペプチドなどが挙げられる。
発明の背景
二重特異性抗体
少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、インビトロおよびインビボでの免疫診断および治療に必要な標的化薬剤として、そして診断的な免疫アッセイに必要な標的化薬剤としての広範囲の診療適用における大きな可能性を有している。
診断領域において、二重特異性抗体は、細胞表面分子の機能的特性を探る際に、そして細胞傷害性を媒介する様々なＦｃレセプターの能力を明らかにする際に非常に有用である（Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１〜１２４（１９９２））。Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１〜１１（１９９０）は、ＢｓＡｂに関する他の診断適用を記載する。特に、ＢｓＡｂは、酵素免疫アッセイで使用される酵素を固定化するために構築することができる。これを達成するために、ＢｓＡｂの一方のアーム（腕）は、酵素表面の特定のエピトープに結合するように設計することができ、その結果、結合による酵素阻害は生じない。ＢｓＡｂのもう一方のアームは、所望の部位において高い酵素密度を確実にする固定化マトリックスに結合する。そのような診断的ＢｓＡｂの例には、表面抗原を探し出すために使用された、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１〜１４７３（１９６８）によって記載されたウサギ抗ＩｇＧ／抗フェリチンＢｓＡｂが含まれる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ならびにホルモンに対する結合特異性を有するＢｓＡｂもまた開発されている。ＢｓＡｂに関する別の可能な免疫化学的適用には、二部位免疫アッセイにおけるその使用が含まれる。例えば、分析対象タンパク質の表面にある２つの異なるエピトープに結合する２つのＢｓＡｂが作製されている− 一方のＢｓＡｂは複合体を不溶性マトリックスに結合させ、もう一方は指示酵素と結合する（Ｎｏｌａｎら（上記）を参照）。
二重特異性抗体はまた、ガンなどの様々な疾患のインビボ免疫診断またはインビトロ免疫診断を行うために使用することができる（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５（１９９０））。ＢｓＡｂのこのような診断的使用を容易にするために、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍関連抗原と結合することができ、もう一方のアームは、放射性核種と強固に結合するキレート化剤などの検出可能なマーカーと結合することができる。このような方法を使用して、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌらは、結腸直腸ガンおよび甲状腺（ｔｈｒｙｏｉｄ）ガンの放射免疫検出に有用なＢｓＡｂを作製した。このＢｓＡｂは、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）と結合するアームを一方に有し、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）と結合するアームをもう一方に有する。Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５８〜６２（１９９２）およびＬｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２〜１６７１（１９９３）を参照。Ｓｔｉｃｋｎｅｙらは、放射免疫検出を使用してＣＥＡを発現する結腸直腸ガンを検出するための方策を同様に記載する。この研究者らは、ＣＥＡならびにヒドロキシエチルチオ尿素−ベンジル−ＥＤＴＡ（ＥＯＴＵＢＥ）と結合するＢｓＡｂを記載する。Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０〜６６５５（１９９１）を参照。
二重特異性抗体はまた、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）と結合する一方のアーム、およびＴ細胞レセプターまたはＦｃγレセプターなどの細胞傷害性誘引因子分子と結合するもう一方のアームを備えることによって、細胞傷害性の対象を変えることでヒトの治療に有用であり得る。従って、二重特異性抗体を使用して、患者の細胞性免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体に特異的に向けさせることができる。このような方策を使用して、ＦｃγＲＩＩＩ（または、ＣＤ１６）に結合する二重特異性抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞によってインビトロでの腫瘍細胞殺傷を媒介することができ、インビボで腫瘍増殖を防止するのに効果的であることが明らかにされた。Ｓｅｇａｌら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１７９（１９８９）およびＳｅｇａｌら、ガンの生物学的治療（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）２（４）、ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９２）、１頁。同様に、ＦｃγＲＩＩＩと結合する一方のアームと、ＨＥＲ２レセプターに結合するもう一方のアームとを有する二重特異性抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣腫瘍および乳腫瘍を治療するために開発された。（Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：６８３２〜６８３９（１９９２）およびＷｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：９４〜１００（１９９３））。二重特異性抗体はまた、Ｔ細胞による殺傷を媒介することができる。通常、二重特異性抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合させる。抗ｐ１８５HER2に結合した抗ＣＤ３からなる完全にヒト化されたＦ（ａｂ’）2ＢｓＡｂを使用して、Ｔ細胞の標的化が、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞を殺傷するために行われた。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１）：２１７（１９９２）。二重特異性抗体は、いくつかの初期の臨床試験において調べられ、有望な結果が得られている。１つの臨床試験において、肺ガン、卵巣ガンまたは乳ガンの１２名の患者が、抗ＣＤ３／抗腫瘍（ＭＯＣ３１）の二重特異性抗体で標的化された活性化Ｔリンパ球を注入することによって処置された。ｄｅＬｅｉｊら、「二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｉｅｎｈａｒｔ（１９９１）２４９頁。標的化された細胞において、腫瘍細胞の相当の局所的な溶解、穏和な炎症反応が誘導されたが、毒性の副作用または抗マウス抗体の応答は誘導されなかった。Ｂ細胞の悪性疾患の患者での抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９二重特異性抗体の非常に予備的な試験において、末梢の腫瘍細胞数の大きな減少もまた達成された。Ｃｌａｒｋら、「二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｉｅｎｈａｒｔ（１９９１）２４３頁。ＢｓＡｂの治療的適用に関してはＫｒｏｅｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：４００〜４０７（１９９３）、Ｋｒｏｅｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：６５２〜６６１（１９９４）、���よびＷｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５（１９９４）もまた参照。
二重特異性抗体はまた、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして使用することができる。さらに、このような抗体は、感染性疾患の処置において、（例えば、エフェクター細胞を、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスに感染した細胞あるいはトキソプラズマ  ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物に対して標的化するために）使用することができ、あるいはイムノトキシンを腫瘍細胞に送達するために、あるいは免疫複合体を細胞表面レセプターに標的化するために使用することができる（Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照）。
ＢｓＡｂの使用は、ＢｓＡｂを十分な量および純度で得ることが困難であるということによって著しく妨げられている。従来、二重特異性抗体は、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７〜５３９（１９８３））を使用して作製された。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は無作為に組み合わされるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、このうちの１個のみが、正しい二重特異性構造を有する（図１Ａを参照）。この正しい分子の精製は、通常的にはアフィニティークロマトグラフィー工程によって行われているが、かなり面倒であり、生成物の収量は少ない。例えば、（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．ら（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４：８７〜９８；およびＭａｓｓｉｍｏ，Ｙ．Ｓ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：５７〜６６）を参照。従って、より大きな収量のＢｓＡｂを産生するための技術が開発されている。抗体フラグメントの化学的な連結を行うために、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを得る方法を記載する。このようなフラグメントは、ジチオール複合化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、近傍のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド結合が形成されないようにする。次いで、得られたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体が、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換され、もう１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合されて、ＢｓＡｂを形成する。生成したＢｓＡｂは、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
近年の進歩は、二重特異性抗体を得るために化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収することを容易にした。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、ｐ１８５HER2と結合する一方のアームおよびＣＤ３と結合するもう一方のアームを有する完全にヒト化されたＢｓＡｂのＦ（ａｂ’）2分子の産生を記載する。ＢｓＡｂを形成するために、それぞれのＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別個に分泌させ、インビトロでの指向された化学的結合反応に供した。このようにして形成されたＢｓＡｂは、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合させて、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を開始させることができた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ．）７：４５〜５０（１９９２）もまた参照。
ＢｓＡｂフラグメントを作製し、組換え細胞の培養物から直接分離するための様々な技術もまた記載されている。例えば、二重特異性のＦ（ａｂ’）2ヘテロダイマーが、ロイシンジッパーを使用して産生されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２））。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって抗ＣＤ３抗体および抗インターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）抗体のＦａｂ’部分に連結された。ホモダイマーの抗体をヒンジ部で還元してモノマーを形成させ、次いで、再酸化してヘテロダイマーの抗体を形成させた。このようなＢｓＡｂは、インビトロでＨｕＴ−１０２細胞を溶解するために、細胞傷害性Ｔ細胞を呼び寄せるのに非常に効果的であることが見出された。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４〜６４４８（１９９３）により記載される「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術の出現は、ＢｓＡｂフラグメントを作製するための代わりの機構をもたらした。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖の表面にある２つのドメインの間での対形成ができないリンカーによって軽鎖の可変ドメイン（ＶL）に連結された重鎖の可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、１つのフラグメントのＶHドメインおよびＶLドメインは、別のフラグメントの相補的なＶHドメインおよびＶLドメインと対形成することを強いられ、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）のダイマーの使用によるＢｓＡｂフラグメントを作製するための別の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照。この研究者らは、２５アミノ酸残基のリンカーによって抗フルオレセイン抗体のＶHドメインおよびＶLドメインに連結されたＴ細胞レセプターに対する抗体のＶHドメインおよびＶLドメインを含む抗体を設計した。再生された分子は、フルオレセインおよびＴ細胞レセプターに結合し、フルオレセインがその表面に共有結合しているヒト腫瘍細胞を溶解させた。
組換え細胞の培養物から直接回収することができる二重特異性抗体フラグメントを作製するためのいくつかの技術が報告されているようである。しかし、完全長のＢｓＡｂは、その血清半減期がより長いと考えられることおよび可能なエフェクター機能のために、多くの診療的適用に関しては、ＢｓＡｂフラグメントよりも好ましいとされ得る。
免疫付着因子（Immunoadhesins）
免疫付着因子（Ｉａ）は、細胞表面レセプターまたはリガンド（「付着因子」（adhesin））などのタンパク質の結合ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能とともに併せ持つ抗体様分子である。免疫付着因子は、ヒト抗体の多くの貴重な化学的特性および生物学的特性を有し得る。免疫付着因子は、適当なヒト免疫グロブリンのヒンジ配列および定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトのタンパク質配列から構築することができるので、目的とする結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成することができる。そのような免疫付着因子は、患者に対する免疫原性は最小であり、安全に長期間または繰り返し使用される。
文献に報告されている免疫付着因子には下記が含まれる。Ｔ細胞レセプターの融合体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６〜２９４０（１９８７））；ＣＤ４の融合体（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５〜５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８〜７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７〜３５３（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７〜６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチンまたはホーミングレセプターの融合体（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１〜２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４〜１６７（１９９１））；ＣＤ４４の融合体（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３〜１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７の融合体（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４の融合体（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１〜５６９（１９９１））；ＣＤ２２の融合体（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３〜１１４４（１９９１））；ＴＮＦレセプターの融合体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９（１９９１））；ＮＰレセプターの融合体（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０〜２３０６７（１９９１））；インターフェロンγレセプターの融合体（Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４〜９３６０（１９９２））；４−１ＢＢの融合体（Ｃｈａｌｕｐｎｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：１０３６０〜１０３６４（１９９２））およびＩｇＥレセプターαの融合体（ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１５巻、抄録番号１４４８（１９９１））。
治療的使用について記載されている免疫付着因子の例には、細胞表面ＣＤ４に対するＨＩＶの結合を阻止するためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子が含まれる。ＣＤ４−ＩｇＧを出産直前の妊娠女性に投与した第Ｉ相臨床試験から得られたデータにより、この免疫付着因子は、ＨＩＶの母−胎児間移動を防止することにおいて有用であり得ることが示唆されている。Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９〜２２７（１９９３）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と結合する免疫付着因子もまた開発された。ＴＮＦは、敗血症性ショックの主要なメディエーターであることが明らかにされている前炎症性サイトカインである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免疫付着因子は、敗血症性ショックの処置において臨床的に使用するための候補物として有望であることが明らかにされた（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記）。免疫付着因子は、治療以外にもまた使用される。例えば、Ｌ−セレクチンレセプター免疫付着因子は、末梢リンパ節の高内皮細静脈（ＨＥＶ）の組織化学的染色を行うための試薬として使用された。この試薬はまた、Ｌ−セレクチンのリガンドを分離してその特徴づけを行うために使用された（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記）。免疫付着因子構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、免疫付着因子は、二重特異性抗体に対する類推によって「二重特異性免疫付着因子」と呼ばれる。Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６２：１２３（１９９３）は、接着分子（Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン）の細胞外ドメインを併せ持つそのような二重特異性免疫付着因子を記載する。結合性の研究により、そのようにして得られた二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、それが誘導された単一特異性の免疫付着因子と比較して、骨髄性細胞系に対する結合能が高まったことが示された。
抗体−免疫付着因子のキメラ
抗体−免疫付着因子（Ａｂ／Ｉａ）キメラもまた文献に記載されている。このような分子は、免疫付着因子の結合領域を抗体の結合ドメインとともに併せ持つ。
Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３〜４７２７（１９９１）は、マウスのＣＤ４−ＩｇＧから誘導された二重特異性の抗体−免疫付着因子キメラを作製した。この研究者らは、２つのアームを有する四量体分子を構築した。一方のアームは、抗体軽鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４とともに、抗体重鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４からなった。もう一方のアームは、抗ＣＤ３抗体の完全な軽鎖とともに、抗ＣＤ３抗体の完全な重鎖からなった。ＣＤ４−ＩｇＧのアームによって、この二重特異性分子は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面にあるＣＤ３に結合する。細胞傷害性細胞およびＨＩＶ感染細胞を一緒にすると、ＨＩＶ感染細胞が特異的に殺傷される。
Ｂｅｒｇら（上記）は四量体構造の二重特異性分子を記載しているが、１個のＣＤ４−ＩｇＧ融合体のみを含有するトリマーのハイブリッド分子を作製することができる。Ｃｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）を参照。この構築物の第１のアームは、ヒト化された抗ＣＤ３κ軽鎖およびヒト化された抗ＣＤ３γ重鎖によって形成される。第２のアームは、ＩｇＧのＦｃドメインによるｇｐ１２０の結合を担うＣＤ４の細胞外ドメインの一部を併せ持つＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子である。得られるＡｂ／Ｉａキメラは、ＨＩＶ感染細胞の殺傷を、純粋な細胞傷害性Ｔ細胞調製物、またはＦｃレセプターを産生する大顆粒状リンパ球エフェクター細胞をさらに含む全末梢血リンパ球（ＰＢＬ）画分のいずれかを使用して媒介した。
多重特異性抗体ヘテロマルチマーの製造においては、ホモマルチマーよりも、所望のヘテロマルチマーの産生を増大させることが望ましい。Ｆｃ含有のＢｓＡｂを得るために選択される現在の方法は、依然として、２つの抗体を同時に発現するハイブリッドハイブリドーマである（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７〜５４０（１９８３））。
ハイブリッドハイブリドーマにおいて、重（Ｈ）鎖は、典型的には、所望のヘテロダイマーと同様に、ホモダイマーを形成する。さらに、軽（Ｌ）鎖は、同系でない重鎖との誤った対形成を形成することが多い。従って、２つの抗体が同時に発現すると、重鎖および軽鎖の１０個までの対形成が生じ得る（Ｓｕｒｅｓｈ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０〜２２８（１９８６））。これらの望ましくない鎖の対形成は、ＢｓＡｂの産生を低下させ、そして重大で、ときには克服できない精製問題を必然的に強いる（Ｓｍｉｔｈら（１９９２）上記、およびＭａｓｓｉｍｏら（１９９７）上記）。
抗体重鎖は、立体的に相補的な変異をマルチマー化ドメインのＣH３ドメイン界面に導入することによるヘテロダイマー化（Ｒｉｄｇｗａｙら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９：６１７〜６２１（１９９６））、および本明細書中に記載されるファージディスプレーによる最適化を行うために以前に操作されている。改変されたＣH３ドメインを含有する鎖によって、抗体／免疫付着因子ハイブリッド（Ａｂ／Ｉａ）の生成により判断されるように、約９０％までのヘテロダイマーが生じる。ヘテロダイマー化した重鎖は、依然として、同系でない軽鎖との誤った対形成を形成し得るので、目的のＢｓＡｂの回収が妨げられる。
発明の要旨
本出願は、モノマー混合物から所望するヘテロマルチマー二重特異性抗体の形成を高めるのに役立つ方法を記載する。この方法は、ヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界面を操作し、かつ、共通する可変軽鎖を提供して二重特異性抗体のヘテロマーの各可変重鎖領域と相互作用させることによる。３つの可能なヘテロマルチマーおよびホモマルチマーが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから形成され得る。そのようなポリペプチドのそれぞれは、同様に、第１の軽鎖および第２の軽鎖とそれぞれ会合する。これにより、鎖の対形成は合計で１０通りが可能である（図１Ａ）。所望のヘテロマルチマー形成を高める方法によって、その産生を、望ましくないヘテロマルチマーおよびホモマルチマーよりも大きく高めることができる。
ヘテロマルチマー抗体の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも一部を含む。界面で相互作用する第１および第２の各ポリペプチドのドメインは、マルチマー化ドメインと呼ばれる。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの産生を増大させる（図１Ｂ）。相互作用は、空洞への隆起（protuberance-into-cavity）の相補的な領域の形成；天然に存在しないジスルフィド結合の形成；ロイシンジッパー；疎水性領域；および親水性領域によって接触面で促進され得る。「隆起」（protuberance）は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代替的な「空洞」（cavity）は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。適切に配置され、そして適切な大きさを有する隆起または空洞が第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかの界面に存在する場合、隣接する接触面において、それぞれ、対応する空洞または隆起の設計が必要とされるだけである。天然に存在しないジスルフィド結合は、第１のポリペプチドにおいて、天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊離（フリーの）チオールを含有する残基と置換して、遊離チオールが第２のポリペプチドの別の遊離チオール含有側鎖と相互作用し、そしてジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成されるようにすることによって構築される（図１Ｂ）。
大きな非免疫化ファージディスプレーライブラリー（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に由来する単鎖Ｆｖフラグメントは、Ｖ-遺伝子の使用を明らかにした。この場合、いくつかの生殖系列のＶ-遺伝子セグメントに由来するＶH配列およびＶL配列が優勢であり、ファミリーがレパートリーにおいて優勢であった。異なるパートナー鎖との組合せで特定の重鎖または軽鎖が見出されるレパートリーにおいて、鎖の入り交じった状態の例が認められた（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）上記）。
所望するヘテロマルチマー多重特異性抗体の調製は、共通する軽鎖が多重特異性抗体の可変重鎖のそれぞれと対形成するように提供される場合に増強されることが本明細書中に開示される。共通する可変軽鎖の使用によって、抗原結合ドメインを形成するために正しく対形成しなければならないモノマーの数が減少する。これは、軽鎖の数を、（本発明が開示される前の二重特異性抗体または多重特異性抗体のそれぞれにおける）２つ以上の軽鎖から、（本発明の多重特異性抗体（図１Ｃを参照）における）１つの軽鎖に制限することによる。
従って、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法に関する。この抗体は、下記の１）および２）を含む：１）界面で接する第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド（および抗体の多重度に従ってさらなるポリペプチド）、ただし、第１のポリペプチドおよびさらなるポリペプチド（または、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）のそれぞれは、第１のポリペプチドと第２の（または、少なくとも１つのさらなる）ポリペプチドとの間の界面を形成するマルチマー化ドメインを含み、そしてこのマルチマー化ドメインは、第１のポリペプチドとさらなるポリペプチドとの間の安定な相互作用を促進する；および２）前記の第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）のそれぞれの結合ドメイン、ただし、各結合ドメインは可変重鎖および可変軽鎖を含み、第１のポリペプチドの可変軽鎖および第２のポリペプチドの可変軽鎖は共通するアミノ酸配列を有し、そしてそのような共通する配列は、前記ポリペプチドのそれぞれの元の軽鎖に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性のアミノ酸配列同一性を有する。この方法は下記の工程を含む：
（ｉ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび共通する軽鎖をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、この培養によって核酸を発現させる工程；および
（ｉｉ）宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。
本発明の関連する実施態様において、第１のポリペプチドをコードする核酸または第２のポリペプチドをコードする核酸、あるいはその両方は、その界面またはその一部をコードするように元の核酸から変更されている。
本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドの界面は、第２のポリペプチドの界面の遊離チオール含有残基と相互作用するように配置され、そうすることによってジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成される遊離チオール含有残基を含む。本発明により、第１のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいは第２のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいはその両方である。
本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）の両方をコードする核酸は、それぞれ、隆起および空洞をコードするように変更されている。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、それぞれ、好ましくは、ヒトＩｇＧ1のＣH３ドメインなどの抗体の定常ドメインを含む。
別の態様において、本発明は、界面で接する第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むヘテロマルチマー（二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因子または抗体／免疫付着因子キメラなど）を提供する。第１のポリペプチドの界面は、少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）上のマルチマー化ドメインと相互作用するように配置されて、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの界面を形成するマルチマー化ドメインを含む。本発明の好ましい実施態様において、マルチマー化ドメインは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用が促進されるように変更される。そのような変更には、隆起または空洞あるいはその両方の生成；天然に存在しないジスルフィド結合の生成；相補的な疎水性領域の生成；および相補的な親水性領域の生成が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロマルチマー多重特異性抗体は、薬学的に受容可能な担体をさらに含む組成物の形態で提供され得る。
本発明はまた、前記のヘテロマルチマー多重特異性抗体をコードする核酸を含む宿主細胞に関する：この場合、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）をコードするこの核酸は、１つのベクターまたは別個のベクターに存在する。宿主細胞は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を作製する方法で使用することができる。この方法は、核酸を発現するように宿主細胞を培養すること、およびその細胞培養物からヘテロマルチマー抗体を回収することを含む。
さらなる態様において、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法を提供し、この方法は下記の工程を含む：
（ａ）少なくとも１つのさらなるポリペプチドの界面のアミノ酸と相互作用するように配置されているアミノ酸残基を第１のポリペプチドの界面に含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を選択する工程。実施態様において、核酸は、相互作用するアミノ酸残基をコードするように元の核酸から変更されている。別の実施態様において、第１の核酸は、より大きな側鎖容量を有するアミノ酸をコードするように変更され、それによって、隆起が第１のポリペプチドに形成される；
（ｂ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を変更し、その結果、第２のポリペプチドの界面内のアミノ酸残基を、より小さな側鎖容量を有するアミノ酸残基と置換し、それによって、第２のポリペプチドに空洞を形成させる工程。この場合、前記の隆起は、この空洞と相互作用するように配置される；
（ｃ）前記の第１の核酸および第２の核酸を宿主細胞に導入して、前記の第１の核酸および第２の核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程；および
（ｄ）細胞培養物から生成したヘテロマルチマー抗体を回収する工程。
前記の抗体が組み込まれた多重特性抗体（二重特異性抗体など）を構築することもまた望ましいことであり得る。このような状況下では、元の軽鎖と対形成する場合、目的の第２の抗原に特異的に結合する重鎖を同定することは望ましい。Ｆｉｇｉｎｉらの方法（Ｆｉｇｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：６８〜７８、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）を使用して、そのような重鎖を同定することができる。最初に、ファージライブラリーをグアニジン塩酸で処理して、元の軽鎖を解離させる。次に、ファージにディスプレーされた重鎖を、（透析などにより）変性剤を除くことによって目的の軽鎖と再構成させる。次いで、目的の第２の抗原に対して選別を行い、所望の重鎖を同定する。本発明はさらに、選択された軽鎖と対形成するように重鎖を選択するこの方法によって調製される多重特異性抗体、そのような抗体をコードする核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を含む。
本発明は、望ましくないヘテロマルチマーおよび／またはホモマルチマーなどの他の望ましくない最終産物よりもヘテロマルチマーの産生を増大させるための機構を提供する（図１Ａ〜図１Ｃを参照）。組換え細胞の培養物から回収される所望のヘテロマルチマーの産生量は、好ましくは、副生成物の望ましくないヘテロダイマーまたはホモマルチマーと比較して、少なくとも８０重量％を超え、好ましくは少なくとも９０重量％を超える。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜図１Ｃ。図１Ａは、ホモマルチマー化よりもヘテロマルチマー化を増強させるための操作が行われない場合において、Ｆｃを含有する二重特異性抗体の形成を示す略図である。図１Ｂは、所望のヘテロマルチマー化が、望ましくないヘテロマルチマー化およびホモマルチマー化よりも好ましいように、重（Ｈ）鎖が操作される場合に生じる対形成を示す略図である。図１Ｃは、同じ軽（Ｌ）鎖を有する抗体を選択して、同系でない重鎖と対形成する軽鎖の問題が回避される場合に生じる対形成を示す略図である。
図２Ａ〜図２Ｃ。図２Ａは、ファージディスプレーベクターｐＲＡ２を使用するＣH３ヘテロダイマーの選択反応図式を図示する。安定なＣH３ヘテロダイマーをディスプレーするファージは、ｇＤフラッグに対する抗体を使用して捕獲される。図２Ｂは、合成された遺伝子から発現されるＣH３が、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質との融合タンパク質として、天然の遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１〜４０７９（１９８２））から発現されるＣH３の第２の複製物とともに同時に分泌されるジシストロン性オペロンを図示する。合成されたＣH３遺伝子は、単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄから誘導されるペプチドをコードする配列（ｇＤフラッグ、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＤｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．Ｊ．（１９８４）ＤＮＡ  ３：２３〜２９；Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４９０〜１４９２）、および部位特異的なプロテアーゼのゲネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ）Ｉの開裂（Ｇ）部位（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０〜２４８）の下流に置かれる。図２Ｃは、翻訳されるＣH３遺伝子の残基に、ＫａｂａｔらのＥｕ方式に従って番号を付けた図２Ｂのジシストロン性オペロンの核酸配列（配列番号１）である。「免疫学的に関心が持たれるタンパク質の配列」、第５版、第１巻、６８８〜６９６頁、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。隆起の変異Ｔ３６６Ｗを示す。そのような残基は、天然のＣH３遺伝子における無作為化のために標的化される（３６６、３６８および４０７）。
図３Ａ〜図３Ｃ。図３Ａおよび図３Ｂは、免疫付着因子（Ia）とともに抗体（Ab）の重鎖および軽鎖の共-移入から得られるプロテインＡ精製された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥをデンシトメトリー分析で走査した結果の棒グラフである。示したデータは、２つの独立した実験の平均である。ｘ軸は、投入したＤＮＡの質量比（Ｉａ：Ｈ：Ｌ）を示し、ｙ軸は、全生成物タンパク質に対する生成物マルチマーの各タイプの割合を示す。図３Ｃは、可能な生成物マルチマーを図示する。
図４は、Ａｘ１、Ｒｓｅ、ＩｇＥＲ、Ｏｂ−ＲおよびＶＥＧＦに対する特異性を有する８個の異なる抗体のＶL配列の比較である。配列定義（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１〜９１７）に従った抗原結合ＣＤＲ残基の位置を、それぞれ、下線および＃によって示す。Ａｘ１．７８配列と異なる残基を二重下線によって示す。
図５は、選択された抗Ｏｂ−Ｒクローンおよび抗ＨＥＲ３クローンの重鎖および軽鎖の比較である。二重特異性抗体の構築に使用した抗Ｏｂ-Ｒクローン２６および抗ＨＥＲ３クローン１８のＶH配列および共通するＶL配列を示す。
図６。Ｍｐｌ−ＩｇＧおよびＨＥＲ３−ＩｇＧに対する同時結合を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ。試験した抗体は、Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６’Ｗ：Ｓ３５４’Ｃの変異を含有する抗Ｍｐｌ×抗ＨＥＲ３のＢｓＩｇＧであり、Ｆｃ領域を変異させた対応する元の抗Ｍｐｌまたは抗ＨＥＲ３のＩｇＧとともに使用した。
図７は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の研究結果の棒グラフである。ＡＤＣＣは、変異型（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖ）または野生型のＦｃあるいはアイソタイプが一致するコントロール抗体（Ｅ２５、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２）のいずれかを含有するｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：４２８５〜４２８９）によって媒介された。抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）を、ヒト末梢血単核エフェクター細胞およびＳＫ−ＢＲ−３標的細胞とともに示した比でインキュベーションした。示したデータは、３連の測定値および３つの異なる実験の平均である。
図８は、ＨＥＲ３に対して生起された抗体の軽鎖とＯｂ−Ｒに対して生起された抗体の軽鎖との間のアミノ酸配列同一性を示す行列である。配列同一性が１００％である軽鎖を有する抗体を黒四角に示す。配列同一性が９８％〜９９％である軽鎖を有する抗体を白四角に示す。抗体クローンの正体を行列の下部に示す。
Ｉ．定義
一般に、下記の用語または表現は、本説明、実施例および請求項において使用される場合には下記の意味を有する。
「ヘテロマルチマー」，「ヘテロマルチマーポリペプチド」または「ヘテロマルチマー多重特異性抗体」は、少なくとも、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子である。この場合、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列において、第１のポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。好ましくはヘテロマルチマーは、少なくとも２つの異なるリガンドまたは結合部位に対する複数の結合特異性を有する。ヘテロマルチマーは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロダイマー」を含むことができ、あるいはポリペプチドが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド以外に、さらに存在する場合には、より高次の三次構造を形成することができる。ヘテロマルチマーに関する例示的な構造には、ヘテロダイマー（例えば、Ｄｉｅｔｓｃｈら（上記）によって記載される二重特異性免疫付着因子）、ヘテロトリマー（例えば、Ｃｈａｍｏｗら（上記）によって記載されるＡｂ／Ｉａキメラ）、ヘテロ四量体（例えば二重特異性抗体）及び更なるオリゴマー構造が含まれる。
本明細書中で使用されている「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマーの各ポリペプチドの領域をいう。「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマー複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの形成が増強され、そして望ましくないヘテロマルチマーまたはホモマルチマーの形成の可能性が実質的に低下する。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラなヘテロマルチマーのキメラ分子間での分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用することができる。遊離チオールは、ポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にする位置において、ポリペプチドの天然に存在する残基を、例えば、システインと置換することによって１つまたは複数の相互作用ポリペプチドの界面に導入することができる。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリンの定常部を含むことができる。本発明において有用で可能なマルチマー化ドメインが、ハイブリッドの免疫グロブリンを記載する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８４９号（これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に開示されている。さらに、マルチマー化領域は、立体的な相互作用によって、安定な相互作用が促進されるだけでなく、モノマーの混合物に由来するホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成がさらに促進されるように設計することができる。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）を参照。これは、ヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界面に関する「空洞への隆起」法を開示する。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代償的な「空洞」は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンの定常ドメインであることが好ましいが、必ずしも、免疫グロブリンの定常ドメインである必要はない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4が好ましい。
「遊離（フリーの）チオール含有化合物」は、本発明のポリペプチド界面のアミノ酸に組み込むことができるか、またはそのようなアミノ酸と反応することができる化合物であって、この化合物の遊離チオール部分が、本発明のさらなるポリペプチドの界面において遊離チオール部分と相互作用して、ジスルフィド結合を形成するように配置されている化合物を意味する。遊離チオール含有化合物は、好ましくは、システインである。
用語「エピトープ標識化」は、本明細書で使用される場合、「標識ポリペプチド」に融合したキメラなヘテロ付着因子の全体またはそのフラグメントを含むキメラなポリペプチドを示す。標識ポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、キメラなヘテロ付着因子の活性を妨げないように十分に短い。標識ポリペプチドは、好ましくは、非常に特徴的であり、その結果、それに対する抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切な標識ポリペプチドは、一般には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は、８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約９残基〜３０残基の間）を有する。本発明の実施態様は、エピトープ標識に結合したキメラなヘテロ付着因子を含み、そのような標識を使用して、サンプル中の付着因子の検出またはサンプルからの付着因子の回収が行われる。
本明細書中で使用されている「共通する軽鎖」または「軽鎖の共通するアミノ酸配列」は、本発明の多重特異性抗体における軽鎖のアミノ酸配列をいう。抗体パネルが、ファージディスプレーライブラリーの選別を行うことによって、少なくとも２つの異なる抗原に対して作製された。そのようなファージディスプレーライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）（上記）により記載されている（これは、ファージミドライブラリーを選択する方法を特に参照して、参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）。軽鎖配列を、可変軽鎖アミノ酸配列に関して比較した。比較されたパネルに由来する有用な軽鎖は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖である。共通する軽鎖配列は、比較された２つの軽鎖配列の近似であるように設計された配列である。比較される軽鎖が、アミノ酸レベルで１００％の配列同一性である場合、共通する軽鎖は、軽鎖が多重特異性抗体の異なる結合ドメインにおいて機能するとしても、選択されたライブラリーのクローンに由来する軽鎖と同一である。比較される軽鎖が上記と異なる場合、共通する軽鎖は、ライブラリーのクローンに由来する比較される軽鎖の１つまたはもう一方、あるいはその両方と異なり得る。共通する軽鎖が、ライブラリーのクローンの１つまたはもう一方と、あるいはその両方と異なる場合、異なる残基は、抗体軽鎖の抗原結合ＣＤＲ残基の外側に存在することが好ましい。例えば、抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、配列定義（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に従って決定することができる。
本明細書中で用いている「アミノ酸配列同一性」は、１つの配列のアミノ酸が第２のアミノ酸配列のアミノ酸とどのくらい同じであるかの割合をいう。ポリペプチド鎖の間において１００％の配列同一性は、鎖が同一であることを意味する。
本明細書中で使用されている「ポリペプチド」は、一般に、約１０個よりも多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、哺乳動物のポリペプチド（哺乳生物から最初に得られたポリペプチド）が使用され、より好ましくは、培地に直接分泌されるポリペプチドである。細菌のポリペプチドの例には、例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれる。哺乳動物のポリペプチドの例には、レニン、成長ホルモンなどの分子が含まれ、下記が含まれる：ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺接触面活性物質；ウロキナーゼまたはヒトウリンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長（増殖）因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５またはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、あるいはＮＧＦ−βなどの神経増殖因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの繊維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インシュリン様増殖因子−Ｉおよびインシュリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）類、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）類、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上記のポリペプチドのいずれかのフラグメント。
「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと結合し得る任意のポリペプチドである。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、「界面」（下記において定義）で接する。界面に加えて、第１のポリペプチドは、「結合ドメイン」（例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメインまたは酵素活性ドメイン）、またはＣH２、ＣH１およびＣLドメインを含む抗体の定常ドメイン（またはその一部）などのさらなるドメインを１つまたは複数含むことができる。通常、第１のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体のＣH３ドメインなどの定常ドメインであり、第１のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第１のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併せ持つキメラ（すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照）、レセプターポリペプチド（特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド）、リガンドポリペプチド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）：２７８３３〜２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２（４８）：１３５０（１９９３）参照）、および抗体の可変ドメインポリペプチド（例えば、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））。好ましい第１のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した抗体の重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第２のポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように界面において変更されている。
「第２のポリペプチド」は、「界面」を介して第１のポリペプチドと会合し得る任意のポリペプチドである。界面に加えて、第２のポリペプチドは、「結合ドメイン」（例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または酵素活性ドメイン）、またはＣH２ドメイン、ＣH１ドメインおよびＣLドメインを含む抗体の定常ドメイン（または、その一部）などのさらなるドメインを含むことができる。通常、第２のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体のＣH３ドメインなどの定常領域であり、第２のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第２のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併せ持つキメラ（すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照）、レセプターポリペプチド（特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド）、リガンドポリペプチド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）：２７８３３〜２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２（４８）：１３５０（１９９３））、および抗体の可変ドメインポリペプチド（例えば、ジアボディ）。好ましい第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した抗体の重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第１のポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように界面において変更されている。
「結合ドメイン」は、目的の分子（例えば、抗原、リガンド、レセプター、基質または阻害剤）との選択的な結合を担うポリペプチドの任意の領域を含む。例示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメインおよび酵素活性ドメインが含まれる。好ましい実施態様において、結合ドメインは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を含む。本発明の二重特異性抗体およびその作製方法により、二重特異性抗体の各結合ドメインに関する軽鎖は、共通する軽鎖であり、それによって重鎖および軽鎖の誤った対形成が存在する望ましくないヘテロマルチマーの形成が避けられる。
用語「抗体」は、それが本発明に関連する場合、目的の抗原のエピトープと結合するドメインを１つまたは複数含有するポリペプチドを意味するものとする。この場合、そのようなドメインは、抗体の可変部から誘導されるか、または抗体の可変部との配列同一性を有する。抗体の例には、全長の抗体、抗体フラグメント、単鎖分子、二重特異性分子または二機能性分子、ジアボディー、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体およびＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTM抗体）および免疫付着因子が含まれる。「抗体フラグメント」には、Ｆｖ、Ｆｖ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2のフラグメントが含まれる。
「ヒト化（された）」形態の非ヒト（例えば、齧歯類または霊長類）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含有する特異的でキメラな免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。その大部分において、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体あるいは持ち込まれたＣＤＲ配列または枠組み構造配列のいずれにおいても見出されない残基を含むことができる。このような改変は、抗体の能力を改良して最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。そのような可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒトの免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、好ましくは、免疫グロブリンの定常部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、目的の抗原でマカク（ｍａｃａｑｕｅ）サルを免疫化することによって産生される抗体から誘導されるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTM抗体を含む。
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する分子である。そのような分子は、通常、２つの抗原と結合するだけである（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）が、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体も、本明細書中で使用される場合にはこの表現に含まれる。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞の抗原に対する一方のアームと、細胞傷害誘引因子分子に対するもう一方のアームとを有する下記のような二重特異性抗体が含まれる。例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５HER2／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５HER2、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸ガン）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞付着因子分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎カルシノーマ関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ−３；腫瘍抗原に特異的に結合するアームと、毒素に結合するアームとを有するＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど；変換酵素によって活性化されるプロドラッグに対するＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（これは、マイトマイシンホスフェートプロドラッグのマイトマシンアルコールへの変換を触媒する）など；フィブリン溶解剤として使用することができるＢｓＡｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など；細胞表面レセプターに対して免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂ、例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）など；感染性疾患の治療において使用されるＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど；インビトロまたはインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５HER2／抗ハプテン；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ（Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照）；および診断用具としてのＢｓＡｂ、例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら（上記）を参照）など。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。
本明細書中で使用されている用語「免疫付着因子」は、免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能とともに、異種タンパク質（「付着因子」、例えば、レセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を併せ持つ抗体様の分子を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識部位および結合部位（抗原結合部位）以外である（すなわち、「異種である」）所望の結合特異性を有する付着因子のアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫付着因子における免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3もしくはＩｇＧ4のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
本明細書中で使用されている用語「リガンド結合ドメイン」は、定量的なリガンド結合能、および好ましくは対応する天然のレセプターの生物学的活性を少なくとも保持する任意の天然の細胞表面レセプターまたはその任意の領域もしくは誘導体をいう。特定の実施態様において、レセプターは、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相同的な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それにもかかわらず、この定義によって具体的に含まれる他の代表的なレセプターは、サイトカインに対するレセプターであり、特にチロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）であり、そしてヘマトポイエチンおよび神経増殖因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞付着因子分子、例えば、（Ｅ、ＬおよびＰ−）セレクチンである。
用語「レセプター結合ドメイン」は、定量的なレセプター結合能、および好ましくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を少なくとも保持するレセプターに対する任意の天然のリガンド（細胞付着因子分子を含む）またはその任意の領域もしくは誘導体を示すために使用される。この定義は、特に、具体的には、上記のレセプターに対するリガンドに由来する結合配列を含む。
本明細書中で使用されている用語「多重特異性免疫付着因子」は、少なくとも２つの結合特異性を有する（すなわち、２つ以上の付着因子結合ドメインを併せ持つ）（上記に定義されている）免疫付着因子を示す。多重特異性免疫付着因子は、本質的には、国際特許公開第ＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）、欧州特許ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）および米国特許第５，１１６，９６４号（１９９２年５月２日発行）に開示されているように、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロ四量体として組み立てることができる。好ましい多重特異性免疫付着因子は二重特異性である。二重特異性免疫付着因子の例には、ＣＤ４−ＩｇＧ／ＴＮＦレセプター−ＩｇＧおよびＣＤ４−ＩｇＧ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。後者の分子は、リンパ球ホーミングレセプター（ＬＨＲ、Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能と、ＣＤ４のＨＩＶ結合機能とを併せ持ち、ＨＩＶ感染、関連する症状の予防または処置において、または診断薬としての適用の可能性が見出されている。
「抗体−免疫付着因子キメラ（Ａｂ／Ｉａキメラ）」は、（本出願において定義されている）少なくとも１つの免疫付着因子とともに、（上記に定義されている）抗体の少なくとも１つの結合ドメインを併せ持つ分子を含む。例示的なＡｂ／Ｉａキメラは、Ｂｅｒｇら（上記）およびＣｈａｍｏｗら（上記）によって記載されている二重特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
「界面」は、第２のポリペプチドの界面内において１つまたは複数の「接触」アミノ酸残基（または、アミノ酸でない他の基）と相互作用する第１のポリペプチドにおける「接触」アミノ酸残基（あるいは、炭水化物基、ＮＡＤＨ、ビオチン、ＦＡＤまたはヘム基などのアミノ酸でない他の基）を含む。好ましい界面は、可変ドメインまたは定常ドメイン（またはその領域）などの免疫グロブリンのドメインである。しかし、ヘテロマルチマーレセプターを形成するポリペプチド間の界面、またはＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦなどの２つ以上のリガンドの間の界面も、この用語の範囲に含まれる。好ましい界面は、好ましくはＩｇＧ抗体から誘導され、最も好ましくはヒトＩｇＧ1抗体から誘導される免疫グロブリンのＣH３ドメインを含む。
「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さな側鎖容量または大きな側鎖容量を有し得る「移入」残基によって置換されるアミノ酸残基である。移入アミノ酸残基は、天然存在アミノ酸残基または非天然存在アミノ酸残基であり得るが、天然存在アミノ酸残基が好ましい。「天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に取込まれる）の表１に列記されるアミノ酸残基である。「非天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされていないが、ポリペプチド鎖で隣のアミノ酸残基と共有結合することができる残基を意味する。非天然存在アミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載されるアミノ酸残基アナログなどの他のアミノ酸残基のアナログが挙げられる。天然に存在しないそのようなアミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（上記）の方法を使用することができる。簡単に記載すると、この方法は、非天然存在アミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、インビトロでＲＮＡの転写および翻訳を行うことを含む。本発明の方法には、少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置換することが含まれるが、２つ以上の元の残基を置換することができる。通常は、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面におけるすべての残基が、置換される元のアミノ酸残基を含むにすぎない。置換に好ましい元の残基は「埋もれている」。「埋もれている」は、残基が本質的には溶媒と接触できないことを意味する。移入残基は、好ましくは、酸化または誤ったジスルフィド結合の形成の可能性を避けるために、システインではない。
「元の核酸」は、アミノ酸側鎖が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で界面で相互作用して、ポリペプチド間の安定な相互作用を促進させるアミノ酸がマルチマー化ドメイン内でコードされるように変更することができる、目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。そのような変更によって、空洞への隆起、天然に存在しないジスルフィド結合、ロイシンジッパー、疎水性相互作用および親水性相互作用のような安定な相互作用に限定されないが、そのような安定な相互作用を生じさせることができる。このような変更は、好ましくは、目的とする第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の特異的な相互作用を促進し、望ましくないヘテロマーの対形成またはホモマーの形成が生じる相互作用を効果的に除くように選択される。元の核酸または出発核酸は、天然に存在する核酸であり得るか、または以前に変更が行われた核酸（例えば、ヒト化抗体フラグメント）を含み得る。核酸を「変更する」は、元の核酸を、目的のアミノ酸残基をコードしているコドンの少なくとも１つの挿入、欠失または置換による遺伝子操作または変異処理を行うことを意味する。通常、元の残基をコードしているコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。このようにＤＮＡを遺伝子的に改変するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９９１）に総説されており、例えば、部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発法を含む。
隆起、空洞、または（ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基などの）遊離（フリーの）チオールは、合成的手段によって、例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、前記の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するためのそのような技術、ペプチドの酵素的または化学的な連結、あるいはこれらの技術のいくつかの組合せによって、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に「導入する」ことができる。従って、「導入される」隆起、空洞、または遊離チオールは、「天然に存在しない」、すなわち、「非天然」である。これは、自然界または元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）に存在しないことを意味する。
隆起を形成するために移入アミノ酸残基は、比較的少数（例えば、約３個〜６個）の「回転異性体」を有することが好ましい。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に有利な立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数は、ＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５〜７９１（１９８７）に総説されている。
「分離された」ヘテロマルチマーは、その天然の細胞培養環境の成分からの同定および分離および／または回収が行われたヘテロマルチマーを意味する。その天然環境の混入成分は、ヘテロマルチマーに関する診断使用または治療使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶解物を含み得る。好ましい実施態様において、ヘテロマルチマーは、（１）ローリー法によって測定されるように９５重量％を超えるように、最も好ましくは９９重量％を超えるように、あるいは（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基が得られるのに十分な程度に、あるいは（３）クマシーブルー染色、または好ましくは銀染色を使用して、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。
本発明のヘテロマルチマーは、一般には、実質的に均一になるまで精製される。「実質的に均一」、「実質的に均一な形態」および「実質的な均一性」という表現は、生成物が、望ましくないポリペプチドの組合せ物に由来する副生成物（例えば、ホモマルチマー）を実質的に有していないことを示すために使用される。純度に関して表現される場合、実質的な均一性は、副生成物の量が、１０％を超えないこと、好ましくは５％未満であること、より好ましくは１％未満であること、最も好ましくは０．５％未満であることを意味する。ただし、割合は重量比である。
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボソーム結合部位、および可能であれば、未だあまりよく理解されていない他の配列が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に「機能的に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、ＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを、そして分泌リーダーの場合には、読み取り相で連続していることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位で結合させることによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実施に従って使用される。
ＩＩ．ヘテロマルチマーの調製
１．出発材料の調製
最初の工程として、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド（およびヘテロマルチマーを形成する任意のさらなるポリペプチド）が選択される。通常、これらのポリペプチドをコードする核酸は分離しなければならず、その結果、核酸は、本明細書中で定義されているように、隆起または空洞またはその両方をコードするように変更することができる。しかし、変異は、合成的な手段を使用することによって、例えば、ペプチド合成を使用することによって導入することができる。同様に、移入残基が天然に存在しない残基である場合には、Ｎｏｒｅｎら（上記）の方法を、そのような置換を有するポリペプチドを作製するために用いることができる。さらに、ヘテロマルチマーの一部は、細胞培養で組換え的に適切に作製され、そのような分子の他の部分は、上記のそのような技術によって作製される。
抗体の分離および免疫付着因子の調製に関する技法が次に行われる。しかし、ヘテロマルチマーは、当技術分野で知られている技術を使用して、他のポリペプチドから形成され得るか、または他のポリペプチドを組み込むことができることが理解される。例えば、目的のポリペプチド（例えば、リガンド、レセプターまたは酵素）をコードする核酸は、ポリペプチドのｍＲＮＡを有し、そのｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現していると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから分離することができる。ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、抗体または約２０塩基〜８０塩基のオリゴヌクレオチドなど）を用いてスクリーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）の第１０章〜第１２章に記載される標準的な手順を使用して行うことができる。
（１）抗体の調製
抗体の産生に関する技術がいくつか記載されている。そのような技術には、モノクローナル抗体を作製するための従来のハイブリドーマ法、抗体（キメラ抗体、例えば、ヒト化抗体を含む）を作製するための組換え技術、トランスジェニック動物での抗体産生、および「完全なヒト」抗体を調製するために近年記載されたファージディスプレー技術が含まれる。これらの技術を下記に簡単に記載する。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、一般には、抗原およびアジュバントの皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射を多数回行うことによって動物に生起させることができる。抗原（または、標的アミノ酸配列を含有するフラグメント）を、免疫化される種において免疫原であるタンパク質（例えば、キーホルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズのトリプシン阻害剤）に、二官能性薬剤または誘導化剤を使用して結合させることは有用であり得る。そのような二官能性薬剤または誘導化剤は、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ただし、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）である。動物は、免疫原性のコンジュゲートまたは誘導体に対して、（ウサギまたはマウスに関して、それぞれ）１ｍｇのコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと一緒にして、その溶液を皮下に多数の部位に注射することによって免疫化される。１ヶ月後、動物は、フロイント完全アジュバント中のコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０を用いて、多数の部位に皮下注射することによって追加免疫される。７日〜１４日の後に、動物は採血され、血清を抗体力価についてアッセイする。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。動物は、好ましくは、同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に結合させたコンジュゲートおよび／または異なる架橋剤によるコンジュゲートで追加免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質の融合体として、組換え細胞培養で作製することができる。同様に、ミョウバンなどの凝集化剤を使用して、免疫応答を増強することができる。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載されたハイブリドーマ法を使用して実質的に均一な抗体集団から得られるか、または、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主動物を上記のように免疫化して、免疫化のために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球が誘導される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合化剤を使用してリンパ球をミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない元のミエローマ細胞の生育または生存を阻害する物質を１つまたは複数含有することが好ましい適切な培養培地に播種して、増殖させる。例えば、元のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。好ましいミエローマ細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定で高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性を有するミエローマ細胞である。このような細胞の中で、好ましいミエローマ細胞株は、ネズミのミエローマ細胞株であり、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１のマウス腫瘍から誘導されるミエローマ細胞株、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ−２細胞などである。ヒトのミエローマ細胞株およびマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトのモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋａｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）。ヒトモノクローナル抗体の産生技術に関しては、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）８６：〜９５（１９９１）および国際特許公開第ＷＯ９１／１７７６９号（１９９１年１１月２８日公開）もまた参照。ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、目的の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特���性は、免疫沈降によって、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｎｄのスキャッチャード分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０））によって測定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンを限界稀釈法によってサブクローニングを行い、標準的な方法によって生育させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）。この目的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の体内において腹水腫瘍としてインビボで生育させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって適切に分離される。
あるいは、免疫化したときに、内因性の免疫グロブリンを産生することなく、完全なレパートリーのヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製が現在可能である。例えば、キメラな生殖系列の変異マウスにおける抗体の重鎖連結領域（ＪH）遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒトの生殖系列の免疫グロブリン遺伝子列をそのような生殖系列の変異マウスに移すことによって、ヒト抗体が、抗原を投与したときに産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：８４５〜８５１；およびＭｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６を参照。
さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５２２〜５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから、目的の抗原を使用して、適切な抗体または抗体フラグメントに関する選択を行うことによって分離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用するマウス抗体およびヒト抗体の分離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライブラリーを構築するための方法として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３（１９９２））、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えによる高い親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生を記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５〜３２６０；およびＶａｕｇｈａｎら（１９９６）上記）。従って、これらの技術は、本発明により含まれる「モノクローナル」抗体（特に、ヒト抗体）の分離に関する、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
本発明の抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離され、そして配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として有用である。ＤＮＡが一旦分離されると、そのＤＮＡは、発現ベクター内に配置することができ、次いで、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成物が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、相同的なマウス配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列に置換することによって改変することができる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４）。そのようにして、本明細書中の抗抗原モノクローナル抗体の結合特異性を有する“キメラ”抗体が調製される。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では十分に知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からヒト化抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置換することによって行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラな抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ、上記）、実質的には完全とまではいかないヒトの可変ドメインが、ヒトでない種に由来する対応の配列によって置換されている。実際、典型的には、ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、および、おそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体の類似する部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。抗体は、抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持してヒト化されることが重要である。このような目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、元の配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、元の配列および様々な考えられるヒト化配列を解析することによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、当業者には熟知されている。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能性のある三次元の立体配置構造を図示して表示するコンピュータープログラムを入手することができる。このような表示を検討することによって、候補の免疫グロブリン配列の機能発現における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補の免疫グロブリンのその抗原に対する結合能に影響する残基の分析が可能になる。このように、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および持ち込み配列からの選択および組合せを行うことができ、その結果、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成される。さらなる詳細については、国際特許公開第ＷＯ９２／２２６５３号（１９９２年１２月２３日公開）を参照。
（ｉｉ）免疫付着因子調製
免疫グロブリン（Ｉｇ）、およびその変異体が知られており、その多くが、組換え細胞培養によって調製されている。例えば、米国特許第４，７４５，０５５号；欧州特許第２５６，６５４号；Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６（１９８２）；欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７９３（１９７９）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０）；Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：２０７３（１９８１）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４）；欧州特許第２５５，６９４号；欧州特許第２６６，６６３号；および国際特許公開第８８／０３５５９号を参照。再編成された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号；国際特許公開第８８／０３５６５号；および欧州特許第６８，７６３号、ならびに、それらで引用されている参考文献を参照。
付着因子結合ドメインの配列を、適当な免疫グロブリン定常ドメイン位配列に連結させて構築したキメラ（免疫付着因子）が当技術分野において知られている。文献で報告されている免疫付着因子には、Ｔ細胞レセプターとの融合タンパク質（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４との融合タンパク質（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）；およびＢｙｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）との融合タンパク質（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４との融合タンパク質（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８とＢ７との融合タンパク質（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４との融合タンパク質（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２との融合タンパク質（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦレセプターとの融合タンパク質（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；およびＩｇＥレセプターαとの融合タンパク質（ＲｉｄｇｗａｙとＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））などがある。
もっとも単純で、もっとも素直な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））を、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とＦｃ領域に結合させるものである。通常、本発明の免疫付着因子を調製するときには、付着因子の結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸のＣ末端に融合させるが、Ｎ末端の融合も可能である。
典型的には、このような融合配列において、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも機能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣH２およびＣH３ドメインを保持している。定常ドメインのＦｃ部のＣ末端側で融合させたり、重鎖のＣH１のすぐＮ末端側、または軽鎖の対応領域で融合させたりする。正確にどの位置で融合させるかは重要ではないが、特定の部位がよく知られていて、生物学的活性、分泌、またはＩａの結合特性を最適なものにするように選択することができる。
好ましい実施態様において、免疫グロブリンＧ1（ＩｇＧ1）のＦｃドメインのＮ末端に付着因子の配列を融合させる。重鎖の定常領域全体を付着因子の配列に融合させることも可能である。しかし、より好ましくは、化学的にＩｇＧ  Ｆｃを画定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の最初の残基を１１４とすると残基２１６にあたる）のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まる配列、または、他の免疫グロブリンの同様の部位を融合に用いる。特に好ましい実施態様においては、付着因子のアミノ酸配列を、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、またはＩｇＧ3の重鎖の（ａ）ヒンジ領域、およびＣH２とＣH３からなる領域に、または、（ｂ）ＣH１、ヒンジ、ＣH２、およびＣH３ドメインに融合させる。融合させる正確な部位は重要ではなく、最適な部位を通常の実験によって決定することができる。
二重特異性免疫付着因子では、免疫付着因子はマルチマーとして集合し、ヘテロダイマーまたはヘテロ四量体として集合する。一般的には、これらの分子集合した免疫グロブリンは、既知のユニット構造をもっているはずである。基本的な４本鎖の構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに見られる構造である。高分子量の免疫グロブリンでは、４本鎖の構造単位が繰り返される。すなわち、ＩｇＭは、一般的に、４本鎖の基本ユニットをジスルフィド結合によって結合させた五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、場合によってはＩｇＧグロブリンも、血清中ではマルチマーの形で存在することがある。マルチマーの場合、４本鎖ユニットは同じものであることもあれば、異なることもある。
本明細書の範囲に含まれる集合免疫付着因子のさまざまな例を以下に概略的に示す：
(a)ACL-ACL；
(b)ACH-[ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；
(c)ACL-ACH-[ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,またはVLCL-VHCH]；
(d)ACL-VHCH-[ACH,またはACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；
(e)VLCL-ACH-[ACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；および
(f)[A-Y]n-[VLCL-VHCH]2；
ここで、Ａは、それぞれ、同一か異なった付着因子のアミノ酸配列を表しており、
ＶLは、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインであり；
ＶHは、免疫グロブリン重鎖の可変ドメインであり；
ＣLは、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインであり；
ＣHは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインであり；
ｎは、１よりも大きい整数であり；
Ｙは、共有結合的な架橋剤の残基を示している。
簡潔を期するために、上記の構造は、主要な特徴を示しているにすぎず、結合ドメイン（Ｊ）や、免疫グロブリンのその他のドメインは示されていない。さらに、ジスルフィド結合も示されていない。しかし、このようなドメインが結合活性にとって必要である場合には、それらが、免疫グロブリン分子の中で占める通常の位置に提示されるよう構成されるべきである。
または、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の配列の間に付着因子の配列を挿入することも可能である。この実施態様では、免疫グロブリンの各アームにおける、免疫グロブリン重鎖のヒンジとＣH２ドメインの間か、またはＣH２とＣH３ドメインの間の３’末端に付着因子の配列を融合させる。同様の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
免疫グロブリンの軽鎖が、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に結合しているか、または、付着因子に直接融合するかして存在することもあろう。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、典型的には、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡとともに発現する。分泌されるときに、ハイブリッドの重鎖と軽鎖が共有的結合して、二つのジスルフィド結合で結ばれた免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造物が提供される。このような構造物を調製するのに適した方法は、例えば、１９８９年３月２８日公開の米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
好ましい実施態様において、本発明の免疫付着因子の構築に用いる免疫グロブリンの配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の定常ドメインに由来する。ヒトの免疫付着因子については、ヒトＩｇＧ1およびＩｇＧ3免疫グロブリンの配列が好ましい。ＩｇＧ1を使用することの主な利点は、固定したプロテインＡ上で、ＩｇＧ1免疫付着因子を効率的に精製できることにある。これに対して、ＩｇＧ3の精製には、これよりもかなり使い勝手の悪い媒体であるプロテインＧが必要となる。しかし、特定の免疫付着因子構築物のＩｇの融合相手を選ぶときには、免疫グロブリンのこの他の構造的性質および機能的性質も考慮すべきである。例えば、ＩｇＧ3のヒンジは、より長く、柔軟性もより高いため、ＩｇＧ1に融合させると折り畳まれずに正しく機能することができないような大きな”付着因子”ドメインを受け入れることができる。もう一つ考慮すべきなのは、結合価である。ＩｇＧ免疫付着因子は２価性のホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭなどのＩｇサブタイプは、それぞれ、基本的なＩｇホモダイマーユニットからなるダイマーと五量体を生じよう。インビボでの実用に供するために設計された免疫付着因子では、Ｆｃ領域によって特定される薬理動態的性質およびエフェクター機能も重要である。ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびＩｇＧ4はすべて、インビボでの半減期が２１日で、補体系を活性化する相対的能力はそれぞれ異なる。ＩｇＧ4は、補体を活性化せず、ＩｇＧ2は、ＩｇＧ1よりもかなり弱くしか補体活性を活性化しない。さらに、ＩｇＧ1とは異なって、ＩｇＧ2は、単核球または好中球上のＦｃレセプターには結合しない。補体の活性化に関しては、ＩｇＧ3が最適であるが、インビボでの半減期が、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。ヒトの治療薬として使用するために、免疫付着因子を設計するときに考慮すべき他の重要な点は、特定のアイソタイプがもつアロタイプ変異体の数である。一般的には、血清学的に区別されるアロタイプの数が少ないＩｇＧのアイソタイプほど好ましい。例えば、ＩｇＧ1は、血清学的に区別されるアロタイプ部位を４つしかもっておらず、これらのうち２つは（Ｇ１ｍと２）はＦｃ領域に位置しているが、このうちの１つの部位であるＧ１ｍ１は、免疫原性がない。これに対して、ＩｇＧ3には１２の血清学的に区別されるアロタイプがあり、それらのすべてがＦｃ領域中にあって、その内の３つの部位（Ｇ３ｍ５、１１および２１）だけが免疫原性のない一つのアロタイプをもっている。したがって、γ１免疫付着因子よりも、γ３免疫付着因子の方が免疫原としての可能性が高い。
付着因子部分をフレームにコードするｃＤＮＡ配列を、ＩｇのｃＤＮＡ配列にフレームを合わせて融合させることによって、もっとも好都合に免疫付着因子が構築される。しかし、ゲノムのＩｇフラグメントに融合させることもできる（例えば、Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０）；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））参照）。後者のタイプの融合には、発現のためのＩｇ調節配列が存在することが必要である。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓または末梢血のリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの公開された配列をもとに、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって分離することができる。免疫付着因子の”付着因子”とＩｇ部分をコードするｃＤＮＡを、選んだ宿主細胞の中で効率的に発現させるためのプラスミドベクターの中にひとつながりになるように挿入する。
２．隆起および／または空洞の作出
隆起および／または空洞を形成するもととなる残基を選択するための最初の工程として、Ｘ線結晶解析やＮＭＲなど、当技術分野において既知の技術を用いて、ヘテロマルチマーの三次元構造を得る。三次元構造に基づいて、当業者は、接触面の残基を同定することができる。
好ましい接触面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣH３ドメインである。各種のＩｇＧサブタイプの接触面残基と”埋もれた”残基が同定されていたため、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣH３ドメインの接触面の残基が同定されており（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８を参照、その全文が、参照してここに組み込まれる）、それらを含むことは、取り入れる残基と置換するのに最適である。ＣH３接触面を改変するための基礎となるのは、Ｘ線結晶解析によって、ヒトＩｇＧ1重鎖の間に生じるＦｃ領域での分子間結合が、ＣH３ドメイン間では広範なタンパク質／タンパク質間相互作用を含むのに対して、グリコシル化されたＣH２ドメインでは、その炭水化物を介して結合するということが示されたことである。（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１−２３７０（１９８１））。さらに、重鎖が切断されて、ＣH２およびＣH３ドメインが除去されないかぎり、哺乳動物細胞における抗体発現の際に効率的に形成される二つの重鎖間ジスルフィド結合が存在する（Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７（１９９２））。したがって、重鎖の集合は、ジスルフィド結合を促進すると考えられ、その逆ではないと考えられる。これらの構造および機能に関するデータをまとめて考えると、抗体の重鎖の結合はＣH３部位によってもたらされるという仮説に至る。さらに、ＣH３ドメイン間の接触面を改変して、異なった重鎖のヘテロマルチマーの形成を促進して、対応するホモマルチマーの集合を阻害することができるかもしれないという推測がなされた。本明細書で説明する実験によって、この方法を用いれば、ホモマルチマーよりもヘテロマルチマーの形成を促進することが可能なことが示された。したがって、目的のポリペプチドと抗体のＣH３部位とを含むポリペプチド融合体を作出して、第一または第二のポリペプチドを形成させることができる。好ましいＣH３ドメインは、ヒトＩｇＧ1のようなＩｇＧ抗体に由来するものである。
隆起または空洞を形成するための候補となりうる接触面残基が同定されている。”埋もれた”残基を選んで置き換えることが好ましい。ある残基が埋込まれているか否かを判定するために、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００（１９７１）の表面接触プログラムを用いて、接触面にある残基と溶媒との接触可能性（ＳＡ）を計算することができる。そして、第一と第二のポリペプチドのそれぞれの残基について、他のポリペプチドを除いた上で、ＳＡを別々に計算することができる。そして、ＳＡ（ダイマー）−ＳＡ（モノマー）という等式を用いて、接触面のモノマー型とダイマー型の間の各残基のＳＡの差異を計算することができる。これによって、ダイマーを形成するときにＳＡが減少する残基のリストが示される。ダイマーの各残基のＳＡを、同じアミノ酸のトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙのＳＡの理論値と比較する。ただし、Ｘ＝目的のアミノ酸（Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８３４−８３８（１９８５））。（ａ）モノマーに較べてダイマーでＳＡ減少した残基、および（ｂ）ＳＡが、対応するトリペプチドにおけるＳＡの２６％よりも少ない残基を接触面残基と考える。２つの分類を明らかにすることができる。すなわち、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも低いＳＡをもつ残基（すなわち、”埋もれた”残基）、および、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも高く２５％よりは低いＳＡをもつ残基（すなわち、”一部埋もれた”残基）である（下記の表１参照）
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ポリペプチド鎖構造に対する残基置換の効果は、ＩｎｓｉｇｈｔTMプログラム（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの分子図形モデリングプログラムを用いて、調べることができる。このプログラムを用いて、第一のポリペプチドの接触面中に埋もれた残基で、側鎖容量の小さい残基を、例えば、より大きな側鎖容量をもつ残基（すなわち、隆起）に変えることができる。そして、第二のポリペプチドの接触面中の残基で、隆起に隣接する残基を調べて、空洞を形成するために適した残基を見つける。通常、この残基は側鎖容量が大きいので、側鎖容量の小さな残基と置き換える。一定の実施態様において、接触面の三次元構造を調べると、第一のポリペプチドの接触面上に適当な位置に置かれた、適当な大きさの隆起、または第二のポリペプチドの接触面上の空洞が明らかになるはずである。これらの例では、単一突然変異体、すなわち、合成によって導入された隆起または空洞をモデル化する必要があるだけである。
第一および第二のポリペプチドがそれぞれＣH３ドメインを含む場合に、置換することのできる元の残基を選択することに関しては、ヒトＩｇＧ1のＣH３／ＣH３の接触面は、各表面から１０９０Å2埋もれた４つの逆平行β鎖上にある各ドメイン上の１６の残基を含んでいる（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，上記、およびＭｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：９６５（１９９０）。突然変異は、好ましくは、二つの中央の逆平行β鎖上にある残基を標的とする。この目的は、作出した隆起が、相手方のＣH３ドメインの相補的な空洞の中に入らずに、周囲の溶媒の中に突出して親和してしまう危険を最小限にするためである。
分子モデリングによって、好ましい元／取り込み残基が一旦同定されたら、当技術分野において周知の技術を用いて、ポリペプチドの中にアミノ酸置換を導入する。通常は、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、突然変異誘発：実用的方法（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、上記、に記載されている技術を用いて遺伝子工学により改変する。
オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発が、第一または第二のポリペプチドをコードするＤＮＡの置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）によって説明されているように、当技術分野において周知の技術である。簡単に述べると、所望の変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることによって、第一または第二のポリペプチドＤＮＡを改変する。この鋳型ＤＮＡは、ヘテロマルチマーの未変更または天然のＤＮＡ配列を含む、一本鎖のプラスミドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、かつ、ヘテロマルチマーＤＮＡにおいて選択された変異をコードする、前記鋳型の第二の相補鎖の全長を合成する。
Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）が述べるところにしたがって、目的とするＤＮＡ領域を、相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて作製した合成変異フラグメントで置換することによって、カセット突然変異誘発を行なうことができる。ＰＣＲ突然変異も、第一または第二ポリペプチドＤＮＡの変異配列を作製するのに適している。以下の考察においてはＤＮＡを引用しているが、この技術は、ＲＮＡでも応用することができると解される。ＰＣＲ技術とは、一般的には、次の手順をさす（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−１６５０（１９９１）、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉが担当した章、ｐ．６１−７０を参照）。
隆起または空洞の突然変異以外にも、本発明は、ヘテロマルチマーのＤＮＡの中に適当なヌクレオチド変異を導入するか、または所望のヘテロマルチマーポリペプチドを合成することによって調製することのできるヘテロマルチマーのアミノ酸配列の変異配列を含む。このような変異配列には、例えば、ヘテロマルチマーを形成する第一および第二のポリペプチドのアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入、または置換が含まれる。最終的な構築物が望ましい抗原結合特性をもっているとすれば、最終的な構築物ができるように、欠失、挿入および置換を組み合わせる。グリコシル化部位の数と位置を変更したりして、アミノ酸を変えることによっても、ヘテロマルチマーの翻訳後のプロセッシングを変えることができる。
突然変異を誘発するのに好ましい位置にある、ヘテロマルチマーポリペプチドの所定の残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって述べられている“アラニンスキャニング突然変異誘発法”といわれるものである。ここで、標的残基の残基またはそのグループが同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ｌｙｓおよびＧｌｕなどの荷電性残基）、中性のアミノ酸または負に荷電したアミノ酸（もっとも好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えて、アミノ酸と、細胞の内外の周囲の水性環境との相互作用に影響を与える。そして、置換部位においてさらに、またはそれに代えて別の変異残基を導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示すドメインをさらに明確にすることができる。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決まっていても、突然変異の性質そのものを予め決める必要はない。
通常、突然変異には、ヘテロマルチマーの非機能的な領域における保存的なアミノ酸置換が含まれる。突然変異の例を表２に示す。
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ヘテロマルチマーのポリペプチドの共有修飾も、本発明の範囲に含まれる。ヘテロマルチマーの共有修飾は、ヘテロマルチマー、またはそのフラグメントの標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮ末端またはＣ末端の残基と反応することのできる有機的誘導化剤と反応させて、分子の中に導入することができる。ヘテロマルチマーポリペプチドの別のタイプの共有修飾で、本発明の範囲に含まれるものには、ポリペプチドの本来のグリコシル化パターンを改変することが含まれる。改変とは、もとのヘテロマルチマーの中に見られる炭水化物部分を一つ以上欠失させるか、および／または、もとのヘテロマルチマーには存在しないグルコシル化部位を一つ以上付加することを意味する。ヘテロマルチマーポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位が含まれるよう、アミノ酸配列を改変することによって適宜行われる。一つ以上のセリンまたはトレオニン残基を、もとのヘテロマルチマー配列に付加または置換することによって改変を行なうこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位）。簡単にするために、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを作出するよう、ヘテロマルチマーポリペプチドをコードするＤＮＡの予め決定された塩基において変異させることによって、ヘテロマルチマーのアミノ酸配列を改変する。ヘテロマルチマーポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の方法は、化学結合または酵素結合によってグリコシドをポリペプチドに結合させることである。これらの方法については、１９８７年９月１１日発行の国際特許公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。ヘテロマルチマーに存在する炭水化物部分の削除は、化学的または酵素的に行なうことができる。
ヘテロマルチマーの別のタイプの共有修飾には、ヘテロマルチマーポリペプチドを、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４，１７９，３３７号において提示されている方法で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、さまざまな非タンパク質性ポリマーの一つに結合させることが含まれる。
変異ヘテロマルチマーの特性を前もって予測することは困難であるため、回収された変異体をスクリーニングして、最適な変異体を選抜することが必要であると認められよう。
３．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの発現
ＤＮＡを突然変異させて、本明細書で開示されているような共通の軽鎖を選抜した後、当技術分野において広く利用可能な組換え技術を用いて、この分子をコードするＤＮＡを発現させる。しばしば、優れた発現系は、ヘテロマルチマーを適切にグルコシル化するための（例えば、グリコシル化されている抗体ドメインを含むヘテロマルチマーの場合など）、哺乳動物細胞の発現ベクターと宿主とを含んでいる。しかし、下で詳述するように、この分子は、原核生物の発現系で産生させることもできる。通常、一つのベクター、または別々のベクター上に存在する、第一ポリペプチド、第二ポリペプチド、共通の軽鎖ポリペプチド、および、ヘテロマルチマーを形成するのに必要な別のポリペプチドのすべてコードするＤＮＡによっての宿主細胞を形質転換する。しかし、第一ポリペプチド、第二ポリペプチド、および共通の軽鎖ポリペプチド（ヘテロマルチマーの成分）を、別々の発現系で発現させ、発現したポリペプチドをインビトロで結合させることも可能である。
ヘテロマルチマーと共通の軽鎖をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために、複製可能なベクターの中に挿入する。多くのベクターを利用することができる。一般的に、ベクターの構成要素として、次のものを一つ以上含むが、これらに限定はされない。すなわち、シグナル配列、複製開始点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列。
ヘテロマルチマーの成分であるポリペプチドは、シグナル配列、または、それ以外で、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位をもつポリペプチドに融合したポリペプチドとして作製することができる。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であるか、または、ベクターの中に挿入されるＤＮＡの一部であろう。好んで選ばれる異種由来のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって開裂される）配列である。原核生物の宿主細胞では、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩの先導配列からなるグループから選択される、原核生物のシグナル配列で置き換えることができる。酵母での分泌を行なわせるためには、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子の先導配列（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子の先導配列、後者については、１９９１年４月２３日公開の米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、または酸性ホスファターゼの先導配列、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼの先導配列（１９９０年４月４日公開の欧州特許第３６２，１７９号）、または、１９９０年１１月１５日発行の国際特許公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルなどによって置換することができる。哺乳動物細胞で発現させるときには、本来のシグナル配列（例えば、抗体または付着因子のプレ配列で、通常、インビボで、これらの分子をヒト細胞から分泌させる配列）で十分であるが、哺乳動物の別のシグナル配列も適しているし、また、例えば、単純ヘルペスのｇＤシグナルのような、ウイルスの分泌リーダーも適当であろう。このような前駆体領域に対するＤＮＡを、読み枠において、ヘテロマルチマーを形成するポリペプチドをコードするＤＮＡと連結させる。
発現ベクターもクローニングベクターも、一つ以上の選ばれた宿主細胞の中でベクターの複製が可能になる塩基配列を含んでいる。一般的に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立に、ベクターが複製できるようにする配列であり、複製開始点または自律複製配列を含む配列である。このような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に適合し、２μプラスミドの開始点は酵母に適合し、また、さまざまなウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞でのクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点という構成因子は、哺乳動物の発現ベクターには不要である（ＳＶ４０の複製開始点は、初期プロモーターを含んでいるというだけの理由で一般的には用いられている）。
発現ベクターとクローニングベクターは、選抜可能マーカーとも言われる選抜用遺伝子を持っていなければならない。典型的な選抜用遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他の毒素に対する抵抗性を付与するタンパク、（ｂ）栄養要求性欠損を補うタンパク、または（ｃ）例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地からは摂取できない重要な栄養分を供給するタンパクをコードする。選抜計画の一例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬剤を利用する。異種由来の遺伝子によって形質転換するのに成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それによって、選抜試験を生き残る。このような優性選抜の例では、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、マイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））という薬剤が用いられる。上記の３つの例は、それぞれ、Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、Ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）、またはハイグロマイシンという、適当な薬剤に対する抵抗性を持ち込むために、真核生物の遺伝子の調節下に置かれた細菌遺伝子が用いられている。
哺乳動物細胞にとって適当な選抜マーカーのもう一つの例は、ＤＨＦＲ、またはチミジンキナーゼのように、ヘテロマルチマーの核酸を取り込む細胞成分の同定を可能にする選抜マーカーである。マーカーを取り込んだために、形質転換体だけが、唯一、適応して生き残れるという選択圧の下に、哺乳動物細胞の形質転換体を置く。培地の中の選抜用薬剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選抜用遺伝子とヘテロマルチマーをコードするＤＮＡの両方の増幅がもたらされるような条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧をかける。増幅されたＤＮＡからは大量のヘテロマルチマーが合成される。この他に増幅可能な遺伝子の例には、メタロチオネイン−Ｉおよび−２、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどがある。
例えば、まず、ＤＨＦＲの競合的な拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地の中で、全部の形質転換細胞を培養して、ＤＨＦＲ選抜用遺伝子によって形質転換された細胞を同定する。野生型のＤＨＦＲを用いるときに、適当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０）による説明にしたがって、調製および増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のＤＨＦＲ活性欠損株である。次に、形質転換された細胞を、濃度を上げたメトトレキセートに曝す。これによって、ＤＨＦＲ遺伝子のコピーが多数合成されるようになり、同時に、ヘテロマルチマーの成分をコードするＤＮＡなど、発現ベクターを含むその他の遺伝子のコピーも多数合成されるようになる。この増幅技術は、例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６２、ＣＨＯ−Ｋ１などの適当な宿主とともに用いることができ、Ｍｔｘに高い耐性をもつ変異ＤＨＦＲ遺伝子を用いるならば、内生的なＤＨＦＲがあったとしても構わない（欧州特許第１１７，０６０号）。
または、ヘテロマルチマー、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの選抜マーカーをコードするＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内生ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などのアミノグリコシド系抗生物質選抜マーカーに対する選抜用薬剤を含む培地の中で細胞を増殖させることによって選抜することができる。米国特許第４，９６５，１９９号参照。
酵母の中で用いるための適当な選抜用遺伝子は、酵母のプラスミドＹＲｐ７の中にあるｔｒｐ１遺伝子である。（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；または、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンの中では増殖できない酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  ４４０７６、またはＰＥＰ４−１に対する選抜マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））。酵母宿主ゲノムにｔｒｐ１障害があることによって、トリプトファンなしで増殖させることによって、形質転換体を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ−２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子をもつ既知のプラスミドによって相補される。
さらに、クルイベロマイセス属の酵母を形質転換するためには、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを用いることができる。Ｂｉａｎｃｈｉら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ  １２：１８５（１９８７）。さらに最近、組換えウシキモシンの大量生産のための発現系が報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５（１９９０）。クルイベロマイセス属の工業用菌株により成熟組換えヒト血清アルブミンを分泌させるための、安定したマルチコピー発現ベクターも開示されている（Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５（１９９１））。
発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ヘテロマルチマーの核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。宿主に可能性のある、さまざまな細胞によって認識されるプロモーターが多数ある。制限酵素消化によって、もととなるＤＮＡからプロモーターを除去し、分離したプロモーターをベクターに挿入にして、これらのプロモーターは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結する。
原核生物宿主で使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースのプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）、および欧州特許第３６，７７６号）、および、ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３））が含まれる。しかし、細菌のこれ以外の既知のプロモーターが適当である。それらの塩基配列は公開されているので、当業者は、必要な制限酵素部位をもたらすためのリンカーまたはアダプターを用いて、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的にプロモーターを連結させることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０））。また、細菌の系で使用するためのプロモーターは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含んでいる。
プロモーターの配列は、真核生物で知られている。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写開始部位から約２５から３０塩基上流にあるＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始点から上流７０から８０塩基のところに見つかっている別の配列とはＣＸＣＡＡＴ領域である、ただし、Ｘを任意のヌクレオチドである。殆どの真核生物遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルらしいＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列はすべて、真核生物の発現ベクターの中に適当に挿入する。
酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど、その他の解糖酵素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；および、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））が含まれる。
この他の酵母プロモーターで、増殖条件によって転写を調節するという、さらに別の利点をもつ誘導的プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母での発現に用いるのに適したベクターとプロモーターについては、Ｈｉｔｚｅｍａｎら、欧州特許第７３，６５７Ａ号でさらに説明されている。また、酵母のエンハンサーも、酵母プロモーターとともに適宜用いられる。
哺乳動物の宿主細胞での、ベクターからのヘテロマルチマーの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日発行の英国特許第２，２１１，５０４号）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および、もっとも好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなど、異種由来の哺乳動物のプロモーター、または、ヒートショックプロモーターによって調節される。
ＳＶ４０ウイルスの前者および後者のプロモーターは、都合のよいことに、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素フラグメントとして得られる。Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３（１９７８）；ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：７３９８−７４０２（１９８１）。ヒトサイトメガロウイルス最早期プロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限酵素フラグメントとして得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２）。ウシパピローマウイルスをベクターとして用いた、哺乳動物の宿主の中でＤＮＡを発現させるための系が米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。この系を改変したものが、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡのサル細胞での発現については、Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：５０３−５０８（１９８２）；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下での、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡのマウス細胞における発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）；ヒトインターフェロンβ１遺伝子の培養マウス細胞とウサギ細胞における発現についてはＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５１６６−５１７０（１９８２）；および、マウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（長い末端反復配列）をプロモーターとして用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における、細菌のＣＡＴ配列の発現についてはＧｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７−６７８１（１９８２）も参照。
高等真核生物による、ヘテロマルチマー成分をコードするＤＮＡの転写は、ベクターの中にエンハンサー配列を挿入することによって亢進することがよくある。エンハンサーは、方向や位置に比較的無関係であり、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：９９３（１９８１））、３’側（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））イントロンの内部（Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、および、コーディング配列そのものの中（Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にも見つかっている。今では、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞のウイルスに由来するエンハンサーが使用される。例としては、複製開始点の後方側（１００−２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製開始点の後方側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーなどがある。また、真核生物のプロモーターを活性化するための促進因子については（Ｙａｎｉｖら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）を参照。エンハンサーは、ベクターの中のヘテロマルチマーをコードする配列の５’側か３’側の位置に挿入することができるが、好ましくは、プロモーターの５’側の部位に存在する。
真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終結、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側にある非翻訳領域から広く利用することができる。これらの領域には、ヘテロマルチマーをコードするｍＲＮＡの非翻訳部位のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチド分節が含まれる。
上記で挙げた構成要素を一つ以上含む適当なベクターを構築するには、標準的なライゲーション技術を用いる。分離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とするプラスミドを作出するのに望ましい形になるように、開裂し、加工してから再連結する。
構築したプラスミドの配列が正しいことを確認するための解析を行なうために、ライゲーション混合液を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換して、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によって選抜された、形質転換に成功した株が適正なものである。形質転換からプラスミドを調製して、制限酵素消化によって解析し、および／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１）の方法、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９（１９８０）の方法によって配列決定を行なう。
本発明の実施において特に有用なのは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞の中で一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般的には、一過性発現には、宿主細胞が多くの発現ベクターのコピーをもち、次いで、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを大量に合成するように、宿主細胞の中で効率的に複製することのできる発現ベクターを使用することが含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２。適当な発現ベクターと宿主細胞を含む一過的発現系によって、クローニングされたＤＮＡによってコードされているポリペプチドを便利に陽性のものを同定することと、所望の結合特性／親和性、または、本発明によって作出される、非天然のジスルフィド結合をもたないヘテロマルチマーまたホモマルチマーに対して、所期のゲル泳動度をもつヘテロマルチマーを迅速にスクリーニングすることが可能になる。
脊椎動物の組換え細胞培養でヘテロマルチマーを合成するように調整するのに適した、この他の方法、ベクター、および宿主細胞については、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：４０−４６（１９７９）；欧州特許第１１７，０６０号；および欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。哺乳動物の培養細胞でヘテロマルチマーを発現させるのに特に役立つプラスミドは、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＰＣＴ国際特許公開第９１／０８２９１号）である。
ヘテロマルチマーを発現させるために、どの宿主細胞系を選択するかは、主に、発現ベクターによって決まる。もう一つ考慮すべきなのは、必要とするタンパク質量である。ミリグラム単位の量を、一過的形質転換によって産生することができる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ−によって形質転換された２９３ヒト胚腎臓細胞系を、ヘテロマルチマーの効率的な発現が可能になるよう、リン酸カルシウム法を修正した方法によって、ｐＲＫ５を基本とするベクターで一過的に形質転換することができる。ＣＤＭ８を基本とするベクターを用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣＯＳ細胞を形質転換することができる（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０）；および、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（ＵＳ）９：３４７−３５３（１９９０））。より大量のタンパク質が必要ならば、宿主細胞系を安定的に形質転換させた後、免疫付着因子を発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５を基本とするベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする別のプラスミドの存在下で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に導入して、Ｇ４１８に対する抵抗性を付与することができる。Ｇ４１８に抵抗性のクローンは、培養によって選抜することができる。これらのクローンを、ＤＨＦＲのインヒビターであるメトトレキセートの量を増加させながら培養して、ＤＨＦＲとヘテロマルチマーの配列をコードする遺伝子のコピー数が共に増幅されているクローンを選抜する。免疫付着因子が、Ｎ末端に疎水性のリーダー配列をもっていれば、形質転換された細胞によって加工されて分泌される可能性が高い。より複雑な構造をもつ免疫付着因子の発現には、特に適した宿主細胞が必要となろう。例えば、軽鎖またはＪ鎖などの構成成分は、一定のミエローマまたはハイブリドーマの宿主細胞によって提供されよう（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；およびＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３５６１−３５６８（１９９３））。
本明細書のベクターをクローニングし、発現させるのに適した、この他の宿主細胞は、上記のような原核生物、酵母、または、高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌で、例えば、腸内細菌である、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシアラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラティア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０で開示されているＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）などのバシラス属、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などである。好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、その他、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの菌株も適している。これらの例は、例示のためのものであり、制限のためのものではない。菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物の発酵のための一般的な宿主菌株であるため、この菌株は、特に好ましい宿主、または宿主の親株である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するものでなければならない。例えば、Ｗ３１１０株を改変してタンパク質をコードする遺伝子に遺伝的変異を生じさせることができる。そのような宿主の例として、大腸菌Ｗ３１１０の２７Ｃ７株などがある。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔｏｎＡΔｐｔｒ３  ｐｈｏＡΔＥ１５  Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｏｍｐＴΔｄｅｇＰ４１ｋａｎrである。２７Ｃ７株は、１９９１年１０月３０日に、ＡＴＣＣ番号５５，２４４として、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された。または、１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号で開示されている、ペリプラズマプロテアーゼの変異体をもつ大腸菌の菌株を用いることもできる。または、例えば、ＰＣＲ、または、別の核酸のポリメラーゼ反応などのクローニング法が適している。
原核生物の他に、糸状菌類または酵母のような真核生物微生物が、ヘテロマルチマーをコードするベクターに適したクローニングおよび発現のための宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中で、もっとも一般的に用いられている。しかし、本明細書においては、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：１４０（１９８１）；１９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９，３８３号）；クルイベロマイセス属の宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、上記）で、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７３７（１９８３））、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｅｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｈｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、上記）、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８（１９８８））；カンジダ属；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５２５９−５２６３（１９７９））；シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオマイセス属（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３８号）；および、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌（１９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５７号）、ならびに、アウペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４）、およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５））など、この他数多くの属、種、および株を用いることが可能であり、また有用でもある。
グリコシル化されたヘテロマルチマーを発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。そのような宿主細胞は、複雑なプロセッシングを行なうことができ、グリコシル化活性をもつ。原則として、脊椎動物由来でも、無脊椎動物由来でも、どのような高等真核生物の細胞培養を使うこともできる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞、昆虫細胞などがある。多数のバキュロウイルス株とその変異株、および対応する昆虫宿主許容細胞として、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などが確認されている。例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８）；Ｓｅｔｌｏｗら編、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ）第８巻より、Ｍｉｌｌｅｒら、ｐｐ．２７７−２７９（プレナムパブリッシング社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、１９８６年）；および、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照。例えば、アウトグラファ・カリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異株、およびカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ）のＢｍ−５株など、形質転換用のさまざまなウイルス株が一般に利用可能であり、そのようなウイルスは、本明細書において、本発明に記載されているウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の形質転換に用いることができる。
ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物培養細胞を宿主として利用することができる。典型的には、予め、ヘテロマルチマーＤＮＡを持つように操作してあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌の一定の菌株とインキュベートして、植物細胞を形質転換する。植物培養細胞をＡ．ツメファシエンスとインキュベートしている間に、ヘテロマルチマーをコードしているＤＮＡが植物細胞宿主に移行して、それを形質転換し、適当な条件の下でヘテロマルチマーＤＮＡを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプロモーター、およびポリアデニル化シグナル配列のように、植物細胞に適した調節配列とシグナル配列を利用することができる。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：５６１（１９８２）。なお、Ｔ−ＤＮＡ  ７８０遺伝子の上流領域から分離したＤＮＡ分節は、組換えＤＮＡを含む植物組織において、植物で発現する遺伝子の転写レベルを活性化あるいは上昇させることができる。１９８９年６月２１日発行の欧州特許第３２１，１９６号。
好ましい宿主は脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の細胞を培養して増殖させること（組織培養）は、近年では日常的な処理になっている（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）（１９７３））。有用な哺乳動物の宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系統（２９３、または、懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザルの腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部ガン細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳ガン（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
宿主細胞を本発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換して、プロモーターを誘導したり、形質転換体を選抜したり、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適合するように修正した通常の培地で培養する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した標準的な技術を用いて形質転換を行なう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記の１．８２節で説明されているように、一般的には、実質的な細胞壁という障壁を含む、原核生物またはその他の細胞に対して、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはエレクトロポレーションを用いる。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ  ２３：３１５（１９８３）、および１９８９年６月２９日発行の国際特許公開第８９／０５８５９号に記載されているようにして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染を、一定の植物細胞を形質転換するために用いる。さらに、１９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５８号に記載されているようにして、超音波を用いて、植物を形質転換することができる。
このような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍとｖａｎｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様を、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号において、Ａｘｅｌが記述している。酵母への形質転換は、一般的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６（１９７７）、およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３８２９（１９７９）の方法にしたがって行われる。ＤＮＡを細胞の中に導入するために、核へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無処理の細胞とバクテリアのプロトプラストとの融合、または、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンのような別の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するためのさまざまな技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７−５３７（１９９０）、およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。
本発明のヘテロマルチマーポリペプチドを産生するために用いた原核生物細胞を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記において、一般的に説明されているところにしたがって、適当な培地で培養する。
本発明のヘテロマルチマーを産生するために用いた哺乳動物宿主細胞は、さまざまな培地で培養することができる。宿主細胞を培養するには、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、最小必須培地（（ＭＥＭ）、シグマ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）、およびダルベッコの修正イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ社）などの市販の培地が適当である。さらに、それらの開示内容がすべて、参照してここに組み込まれる、ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；または、第４，５６０，６５５号；国際特許公開第９０／０３４３０号；国際特許公開第８７／００１９５号；米国特許第４，７９１，１９２号；および米国特許（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｒｅ．）第３０，９８５号；または、米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞用の培養培地として用いることができる。これらの培地はどれも、必要ならば、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インシュリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（登録商標ゲンタマイシン薬剤）、微量要素（最終濃度がマイクロモルの単位で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加することもできる。この他の添加物も、当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選ばれた宿主細胞によって以前用いられた条件であり、当業者にとっては明らかである。
一般的に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実際の技術については、ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、哺乳動物細胞のバイオテクノロジー：実際的方法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）に書かれている。
本開示で言及されている宿主細胞は培養細胞だけでなく、宿主動物の中の細胞も含む。
４．ヘテロマルチマーの回収
ヘテロマルチマーは、好ましくは、一般的に、分泌ポリペプチドとして、培養培地から回収するが、分泌シグナルなしに、直接産生されたときには、宿主細胞溶解物から回収する。ヘテロマルチマーに膜結合があるときには、適当な界面活性剤（例：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて膜から解離することができる。
ヒトに由来しない組換え細胞の中でヘテロマルチマーが産生されたときには、ヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、組換え細胞のタンパク質やポリペプチドからヘテロマルチマーを精製して、ヘテロマルチマーについて実質的に均質な調製物を得る必要がある。最初の工程として、培養培地または細胞溶解物を普通に遠心分離して、微粒子化した細胞残滓を取り除く。
抗体の定常部位をもつヘテロダイマーは、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、都合のよいように精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。ヘテロマルチマーがＣH３部位を含むときは、登録商標ベーカーボンド  ＡＢＸ（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ））が、精製するために有用である。この他に、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースによるクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿などのタンパク質精製技術も、回収するポリペプチドによっては利用可能である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、キメラで用いられた免疫グロブリンＦｃドメインの種類およびアイソタイプによって異なる。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、またはγ４のＨ鎖に基づいて、免疫付着因子を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。マウスのアイソタイプのすべてとヒトγ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））には、プロテインＧが推奨されている。親和性リガンドが結合する基質は、もっとも普通にはアガロースであるが、その他の基質を用いることもできる。調節された多孔性ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスなら、アガロースを用いるよりも流速が早くなり、短い処理時間でできる。プロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに免疫付着因子を結合させる条件は、Ｆｃドメインの特徴によって全面的に決定される。すなわち、その分子種とアイソタイプによって決まる。一般的には、適正なリガンドが選択されれば、直接、条件付けていない培養溶液からでも、効率的な結合が起こる。免疫付着因子の顕著な特徴の一つは、ヒトγ１分子で、同じＦｃ型の抗体に較べて、プロテインＡに対する結合能力が幾分低下することである。結合した免疫付着因子は、酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）で、または、僅かにカオトロピックな塩を含む中性ｐＨの緩衝液の中で効率的に溶出することできる。このアフィニティークロマトグラフィー工程によって、＞９５％純粋なヘテロダイマー調製物を作製することができる。
５．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの多官能性抗体の使用
ヘテロマルチマーについては、治療薬としての多くの応用が考えられる。例えば、細胞傷害性を切り換える（例：腫瘍細胞を殺す）ために、ワクチンのアジュバントして、血栓溶解剤を血餅まで輸送するために、標的部位（例えば、腫瘍）で、酵素的に活性化されたプロドラッグを転化するために、感染病を治療するために、免疫複合体を細胞表面レセプターへと向かわせるために、または、腫瘍細胞にイムノトキシンを輸送するためにヘテロマルチマーを用いることができる。例えば、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体であるモデル内皮抗原を標的とすることによって、抗体−リシンイムノトキシンによって、腫瘍の脈管構造を標的とすることができた（Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８９９６−９０００）。抗−内皮イムノトキシンを腫瘍細胞そのものに対する別のイムノトキシンと組み合わせることによって、有意に高い効能が得られた（Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）上記）。最近、二重特異性抗体を用いて、組織因子を腫瘍脈管構造に向かわせることに成功し、かなり高い抗腫瘍効果を生じる局所的な血栓症を引き起こした（Ｈｕａｎｇ，Ｘら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５４７−５５０）。さらに、二重特異性ジアボディを用いて、細胞傷害性Ｔ細胞に、インビトロで、標的乳ガン細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞を殺させることに成功した（Ｚｈｕ，Ｚ．ら、（１９９６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１９２−１９６；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇｉｎ．９：２９９−３０５）。
望ましい精製度をもつヘテロマルチマーを、任意に、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合して、凍結乾燥した固形または水溶液の形状で保存するために、ヘテロマルチマーの治療用処方剤を調製する。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量と濃度では受容者にとって非毒性で、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などを含む緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類；二糖類；および、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール、またはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；および／または、トィーン（Ｔｗｅｅｎ）、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤を含んでいる。
ヘテロマルチマーは、例えば、コアセルベート化技術、または界面ポリマー化（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、または、それぞれ、ゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−［メチルメトアシレート］マイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセルの中に取り込んだり、コロイド剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込んだり、または、マクロエマルジョンの中に取り込んだりすることができる。このような技術については、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、上記で開示されている。
インビボでの投与に用いるヘテロマルチマーは、滅菌されていなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前か後に、滅菌フィルター膜で濾過すれば簡単に行なえる。ヘテロマルチマーは、通常、凍結乾燥状態か水溶液の状態で保存する。
治療用ヘテロマルチマー組成物は、一般的に、滅菌的に接触することのできる通路をもった容器、例えば、静脈注射用のバック、または皮下注射用の注射針によって貫通することのできる栓をもったバイアルの中に置かれる。
ヘテロマルチマーの投与経路は、例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内などの経路による注射または点滴のような既知の方法、または下記に示すような徐放性システムによる。ヘテロマルチマーは、点滴またはボーラス注射によって、連続的に投与する。
徐放性調製物の適当な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性基質で、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような形のあるものになっている基質を含む。徐放性基質の例は、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）に記載されているポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、非分解性エチレン−ビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、登録商標ルプロンデポット（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）のような分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）などがある。
エチレン−ビニル酢酸、および乳酸−グリコール酸などのコポリマーは、１００日間にわたって分子を放出することが可能であるが、ある種のヒドロゲルでは、タンパク質を放出する期間が短くなる。カプセルに入ったタンパク質は、長時間体内に残留して、３７℃で湿気に曝される結果、変性するか凝集して、生物学的活性を失うことになり、免疫原性にも変化が生じうる。関係するメカニズムによって、タンパク質を安定化させるための合理的な方策を考え出すことができる。例えば、凝集を起こすメカニズムが、チオ−ジスルフィドインターチェンジの分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されていれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適当な添加剤を使用し、また、特異的なポリマー基質組成物を開発することによって、安定させることができる。
また、徐放性ヘテロマルチマー組成物は、リポソームによって取り込まれたヘテロマルチマーでもよい。ヘテロマルチマーを含むリポソームは、それ自体は既知の方法：独国特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号によって調製される。通常、リポソームは、小さな（２００−８００オングストローム）均一ラメラ型で、脂質成分が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも高く、ヘテロマルチマー治療を最適なものにするために、選ばれた比率を調節する。
治療に用いるヘテロマルチマーの効果的な用量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状によって変わる。したがって、至適な治療効果を得るためには、治療者が用量を希釈したり、投与経路を変更することが必要となろう。典型的な毎日の投与量は、上記の要素によって、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇかそれよりも多い量になろう。典型的には、臨床医は、所期の効果を納めるまで、ヘテロマルチマーの投薬を続けることになろう。この治療の進行状況は、常法によって容易に観察される。
本明細書に記述されているヘテロマルチマーは、酵素免疫測定法で用いることもできる。それを行なうためには、結合によって、酵素を阻害しないように、ヘテロマルチマーの一方のアームを、酵素上の特異的なエピトープに結合するように設計し、ヘテロマルチマーのもう一方のアームを、所望の部位で高い酵素密度とする固定基質に結合するように設計することができる。このような診断用ヘテロマルチマーの例としては、ＩｇＧ、およびフェリチンに対する特性を持ったヘテロマルチマー、および、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ならびに、例えば、ホルモンに対する結合特異性をもつヘテロマルチマーなどがある。
このヘテロマルチマーは、２部位免疫測定法に用いるよう設計することもできる。例えば、二重特異的な２つのヘテロマルチマーを、解析するタンパク質上の２つの別々のエピトープに結合するように産生し、一方のヘテロマルチマーは、不溶性の基質にその複合体を結合させ、もう一方は、指示酵素に結合する。
また、ヘテロマルチマーは、ガンなど、さまざまな病気のインビトロおよびインビボでの免疫診断に用いることもできる。この診断への使用を容易にするために、ヘテロマルチマーの一方のアームを腫瘍関連抗原に結合するように設計し、もう一方のアームを検出用マーカー（例えば、放射性核種に結合するキレート剤）に結合するように設計することができる。例えば、腫瘍関連抗原ＣＥＡ、および二価性ハプテンに対して特異性をもつヘテロマルチマーは、結腸直腸ガンと甲状腺ガンを画像化するために用いることができる。この他にも、ヘテロマルチマーを、治療ではなく診断に使用できることは当業者にとって明らかであろう。
診断に応用するためには、ヘテロマルチマーの少なくとも一方のアームが、典型的には、直接的または間接的に、検出可能な部分によって標識されている。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じるものとすることができる。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉなどの放射性同位元素；フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光化合物または化学発光化合物；または、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素であろう。
ヘテロマルチマーを検出可能な部分に別々に結合させるために、当技術分野において既知の方法を用いることができるが、そのような方法には、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；および、Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載されている方法などがある。
本発明のヘテロマルチマーは、競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイッチアッセイ法、および免疫沈殿法など、既知のアッセイ法に用いることができる。Ｚｏｌａ、モノクローナル抗体：技術マニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）
競合結合アッセイ法は、限られた量のヘテロマルチマーへの結合をめぐって、標識された標準化合物が、解析対象の試験用サンプルと競合できることに基づいている。試験サンプル中の解析化合物の量は、ヘテロマルチマーに結合した標準化合物の量に反比例する。結合した標準化合物の量を容易に決定するために、ヘテロマルチマーは、一般的に、競合の前か後に不溶化して、ヘテロマルチマーに結合している標準化合物と解析化合物が、非結合のままの標準化合物と解析化合物とから都合良く分離できるようにする。
このヘテロマルチマーは、それぞれが、検出すべきサンプルの異なった免疫原部分またはエピトープに結合することのできる２種類の分子を使用することを含むサンドイッチアッセイ法にとって、特に有用である。サンドイッチアッセイ法において、試験用サンプルの解析化合物は、固体担体上に固定されたヘテロマルチマーの一方のアームに結合していて、その後、ヘテロマルチマーのもう一方のアームが解析化合物に結合して、３つの部分からなる不溶性の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。ヘテロマルチマー自体の第二のアームを、検出可能部分によって標識する（直接的サンドイッチアッセイ法）か、または、検出可能部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することができる（間接的サンドイッチアッセイ法）。例えば、サンドイッチアッセイ法の一つのタイプは、ＥＬＩＳＡ法であるが、この場合には、検出可能部分は酵素である。
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示目的のだけに示されているのであって、いかなる意味でも、本発明の範囲を制限するためのものではない。
本明細書において引用されている刊行物、特許、および特許出願は、上記のものも下記のものもすべてが参照してここに組み込まれる。
実施例
Ｆｃ-含有ＢｓＡｂ（図1C）を製造する方法を提供する。この計画において、我々はそれがヘテロダイマー化するがホモダイマー化されないように抗体重鎖のＣH３を設計した。これは、論理的設計（Ridgwayら, 上記（1996））及びここに記載した通りのファージディスプレー選択によって得られた立体的相補変異と共同してＣH３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合を設けることによって達成された。両方の抗原結合特異性用の単軽鎖の使用は、軽鎖誤対合の問題を避ける（図1A-1C）。同じ軽鎖を持った抗体は、非常に大きなヒトｓｃＦｖライブラリーを選別することによって容易に分離された（Vaughan, T.J.ら,（1996）上記）。
実施例１：空洞への隆起（protuberance-into-cavity）ヘテロマルチマー免疫付着因子の生成
Chamowら, J. Imminol. 153: 4268（1994）により先に記載されたヒト化抗-ＣＤ３／ＣＤ４-ＩｇＧキメラ間のＣH３界面は、回収できたヘテロマルチマーのパーセンテージを最大化するように構築した。空洞への隆起及び野生型ＣH３変異体は、ヒト化抗体-免疫付着因子キメラ（Ab/Ia）抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した。
かくして変異体は、ヒト化抗-ＣＤ３抗体重鎖のＣH３ドメインに及びミスマッチオリゴヌクレオチドを用いたサイト-誘導変異誘発（Kunkelら, Methods Enzymol. 154:367（1987）とP. Carter, in Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., IRL Press, Oxford, UK, pp.1-25（1991））によってＣＤ４-ＩｇＧ中で構築され、且つジデオキシヌクレオチド配列によって実証した（Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463（1977））。次の表３を参照
0004213224.tif 000004
残基Ｔ３６６は、パートナーＣH３ドメイン上の残基Ｙ４０７の水素結合間隔内にある。実際は、残基Ｔ３６６への主要な分子間接触は、残基Ｙ４０７に対するものであり逆の場合も同じである。一つの空洞への隆起ペアは、一つのＣH３ドメイン中のＴ３６６Ｙとそのパートナードメイン中のＹ４０７Ｔの相互の変異を持ったこれらの残基を逆転することによって創製され、かくしてその界面で側鎖の容量が維持される。変異は、Kabat数付与システム（Kabatら,（1991）上記）を用いて、野生型残基の後にその位置が示され、さらにその後に一文字コードの置換残基として示されている。複数変異は、コロンによって分けられた単一変異成分をリスト化することによって定義される。
抗-ＣＤ３軽鎖（L）と重鎖（H）変異体（Shalabyら, J. Exp. Med. 175:217（1992）とRodrigesら, Int. J. Cancer（上記）7:45（1992））をコードしているファージミドは、以前に記載された通り（Chamowら, J. Immunol. 153:4268（1994））、ファージミドをコードしているＣＤ４-ＩｇＧ変異体（Byrnら, Nature 344:667（1990））と一緒に、ヒト胎児性腎細胞，２９３Ｓ中に共移入（co-transfected）した。移入されたファージミドＤＮＡの全量は固定した一方、異なるＤＮＡの比率はＡｂ／Ｉａキメラの生産を最大化するように変えた。Ｉａ：重鎖：軽鎖インプットＤＮＡ（15μgトータル）の割合（質量で）は以下の通り：8:1:3；7:1:3；6:1:3；5:1:3；4:1:3；3:1:3；1:0:0；0:1:3。
その生産物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ後のレーザーデンシトメトリースキャニングによる分析の前にスタヒロコッカス蛋白質（ProSep A, BioProcessing Ltd, UK）を用いてアフィニティー精製した。重鎖ＤＮＡを超える過剰軽鎖を、軽鎖が制限化されないように用いた。生産物の同定は、ＰＶＤＦ膜（Matsudaira, J. Biol. Chem. 262:10035（1987））での電気ブロッティング後にアミノ末端配列決定によって証明した。
軽鎖のファージミドと野生型ＣH３を組み込んでいるＩａおよび重鎖のファージミドとの共移入（コトランスフェクション）は、予期した通り、Ａｂ／Ｉａキメラ，ＩｇＧとＩａホモダイマー生産物の混合物を生じる（Chamowら, J. Immunol. 153:4268（1994））。抗体重鎖プラス軽鎖またはＩａをコードしている投入ＤＮＡのフラクションが多いほど、回収された対応するホモダイマーのフラクションが多くなる。Ｉａ：Ｈ：Ｌの６：１：３の投入ＤＮＡ比では、Ｉａホモダイマー（22.5％）とＩｇＧ（23.0％）の類似フラクションと共に54.5％のＡｂ／Ｉａキメラを生じた。これらの比率は、各鎖の等モル発現の後に、分析方法によって導入される偏りを伴わない重鎖のランダムな分類から予期された比率：50％ Ａｂ／Ｉａキメラ、25％ Ｉａホモダイマー及び25％ ＩｇＧとよく一致する。
野生型ＣH３を含有している鎖に対して、Ａｂ／Ｉａキメラは、抗-ＣＤ３重鎖とＣＤ４-ＩｇＧ Ｉａが、それぞれＹ４０７Ｔ空洞とＴ３６６Ｙ隆起変異を含有する共移入体から92％までの収率で回収された。もしこれらの相互変異が重鎖の隆起及びＩａ中の空洞により設けられたならば、抗体/免疫付着因子キメラの同様の収量が得られた。両方のケースにおいてモノマーは、隆起を含むが空洞のないその鎖で観測された。いずれか１つの理論に制限することなしに、Ｔ３６６Ｙ隆起がＹ４０７Ｔ空洞よりもホモダイマー形成に対してより分裂的であると確信する。Ａｂ／Ｉａハイブリッドのフラクションは、隆起と空洞（Ａｂ Ｔ３６６Ｗ，Ｉａ Ｙ４０７Ａ）の両者のサイズを増加することによって有意に変更されることはない。第２の隆起と空洞ペア（Ａｂ Ｆ４０５Ａ，ＩａＴ３９４Ｗ）は、ホモダイマー化するＩａ Ｔ３９４Ｗ隆起変異体の予期しない傾向を補うための投入ＤＮＡの小さいフラクションを用いてＡｂ／Ｉａの71％までを生じた。２つの独立した空洞への隆起変異体ペア（Ab T366Y：F405A、Ia T394W：Y407T）の組合せは、Ａｂ Ｔ３６６Ｙ，Ｉａ Ｙ４０７Ｔペア以上にはＡｂ／Ｉａハイブリッドの生産を改善しなかった。
Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアにより得られたＡｂ／Ｉａキメラのフラクションは、試験した範囲にわたり、投入ＤＮＡｓの比に実質的に非従属であった。さらに汚染している種は、mono S HR 5/5カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）上でイオン交換クロマトグラフィー（20mMトリス塩酸,pH8.0中0-300mM ＮａＣｌ）によってＡｂ／Ｉａキメラから容易に除去された。これは、ＡｂとＩａの相対的な発現レベルが一時的な発現系におけるよりも容易な操作性が劣る、安定な細胞系を用いて大量のＡｂ／Ｉａキメラの製造のために良好であると予想する。
同定した空洞への隆起変異体は、得られた生産物の混合物の複雑性を可能性のある１０の主要な種（Sureshら, Methods Enzymol. 121:210（1990））から４又はそれ以下にまで減じることによって、Ｆｃ-含有ＢｓＡｂの潜在的な適用を増加することが予期される（図1A-1B）。Ｔ３６６とＹ４０７が完全に保存され且つＩｇＧ1のＣH３ドメイン界面で他の残基が高度に保存されることから、Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアは、他のヒトＩｇＧアイソタイプ（IgG2, IgG3又はIgG4のような）のヘテロマルチマーを生産するために有用とされるであろう。
実施例２：ヘテロマルチマーの免疫付着因子中の非天然存在ジスルフィド結合の生成
Ａ．  ＣH３鎖間-ジスルフィド結合の設計
３つの基準を、パートナーＣH３ドメイン間のジスルフィド結合を作るための残基のペアを同定するために使用した：ｉ）Ｃα分離は、好ましくは自然ジスルフィド結合中に見出されるそれに類似している（5.0から6.8Å）（Srinivasan, N.等, Int. J. Peptides Protein Res. 36:147-155（1990））。7.6Åまでの間隔は、主鎖移動を許すことおよび低い分解能の結晶構造での原子の位置の不確実性を考慮することを許した（Deisenfofer, Biochemistry 20:2361-2370（1981））。ii）Ｃα原子は、２つのＣH３ドメイン上の異なる残基上にあるべきである。iii）その残基はジスルフィド結合を与えるように位置付けられる（Srinivasan, N.ら, 上記）。
Ｂ．  ジスルフィド結合のモデル化。ジスルフィド結合は、Insight II release 95.0（Biosym/MSI）を用いてhumAb4D5-Fvについて記載された通り（Rodriguesら, Cancer Res. 55:63-70（1995））、ヒトＩｇＧ1 Ｆｃ（Deisenhofer, 上記）中にモデル化した。
Ｃ．  ＣH３変異体の構成。変異は、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて、特定部位の突然変異誘発（Kunkelら, Methods Enzymol. 154:367-382（1987））によってヒト化した抗-ＣＤ３重鎖又はＣＤ４-ＩｇＧのＣH３ドメイン中に導入した：
0004213224.tif 000005
変異は、アミノ酸残基と番号（Kabatら, 上記（1991）のＥｕ番号付与スキーム）次いで、置換アミノ酸で表した。多重変異は、コロンによって分けた単一の変異によって表される。変異体は、シーケナーゼversion 2.0（United States Biochemicals, Cleveland, OH）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定（Sangerら, 上記（1977））によって確証した。
Ｄ．  鎖間ジスルフィドはヘテロダイマー形成を増大する。ＣH３ドメイン中に鎖間ジスルフィド結合を含んでいる６ペアの分子（”ジスルフィド-ＣH３”変異体；v1-v6, 表４）は、Ａｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgG（Chamowら, 上記（1994））の形成を導くその能力において親の分子と比較した。ＣＤ４-ＩｇＧ及び抗-ＣＤ３重鎖変異体をコードしているプラスミドは、抗-ＣＤ３軽鎖をコードしている過剰のプラスミドと一緒に、２９３Ｓ細胞中に共移入した。ヘテロダイマーの収量は、ある範囲のＩａ：Ｈ鎖：Ｌ鎖ＤＮＡ比で移入することにより至適化した。Ａｂ／Ｉａヘテロダイマー、ＩｇＧ及びＩａホモダイマー生産物は、ブドウ球菌プロテインＡアフィニティー-精製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとレーザーデンシトメトリースキャニング（Ridgwayら, 上記（1996））によって定量した。
それぞれのジスルフィド-ＣH３ペアは、親の分子に類似した、３つの主要な種を生じる。しかしながら、ジスルフィド-ＣH３変異体からのＡｂ／Ｉａヘテロダイマーは、ＣH３ドメイン中の鎖間ジスルフィドの形成に一致して、電気泳動の移動でシフトした。ジスルフィド結合形成の更なる証拠は、ヒンジにおける鎖間ジスルフィドによって提供された。共有結合したＡｂ／Ｉａハイブリッドは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりジスルフィドＣH３変異体が観察されたが、ヒンジシステインがセリンに変異した野生型ＣH３ドメインを持った分子はＳＤＳ-ＰＡＧＥによって観測されなかった。ジスルフィドＣH３変異体を製造し、Y349C/S354’C, Y349C/E356’C, Y349C/E357’C, L351C/E354’C, T394C/E397’C,及びD399C/K392Cと定義した。唯一の変異体（D399C/K392’C）は、該変異体のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析による測定として野生型を越えるＡｂ／Ｉａハイブリッドの収量を実質的に増加した（それぞれ７６％対５２％）。変異は、アミノ酸残基と番号（Kabatら, 上記（1991）のＥｕ番号付与スキーム）、それに次ぐ置換アミノ酸によって表した。ＣH３の第１及び第２のコピー中の変異は、それぞれ前後にスラッシュを付す。ＣH３の第２のコピー中の残基は、プライム符号（’）によって表示される。この改善は、該変異体K392S/D399’Sが野生型と比較して類似したＡｂ／Ｉａ収量とＡｂ／Ｉａ電気泳動移動性の両方を与えたことから、残基Ｋ３９２とＤ３９９の置換というよりむしろ、ジスルフィド結合形成を明らかに反映する。ホモダイマーは、野生型Ｆｃドメインを持つものと同様に移動し、これはヘテロダイマーのＣH３ドメイン中に鎖間ジスルフィド結合形成が優先して行われたことを実証している。全てのジスルフィドＣH３変異体は、２９３Ｓ細胞中において親分子とほぼ同じレベルで発現した。
Ｅ．  空洞への隆起計画と組み合わされたジスルフィドは９５％までヘテロダイマーの収率を増加する。最良のジスルフィドペアは、７６％までヘテロダイマーのパーセンテージを増加し、空洞への隆起方法は８７％までヘテロダイマーのパーセンテージを増加した（表４；Ridgwayら,（1996）上記も参照）。これら２つの方法は、異なる原理に基づいて、ヘテロダイマー生成の確率を増加する。従って、我々はヘテロダイマーにおける収率を更に改善することを意図して、その２つの方法を組み合わせた。Ｌ３５１Ｃ又はＴ３９４Ｃを含む、２つのモデル化したジスルフィドは、ジスルフィド結合ヘテロダイマー（L351C/S354’CとT394C/V397’C）と同じくジスルフィド結合ホモダイマーを潜在的に形成でき、利用価値が低い。残る４つのジスルフィドペアは、ファージ選択したヘテロダイマー（変異体ｖ９-ｖ１６）中に配置し、ヘテロダイマーの収率を分析した（表４）。ヘテロダイマーのほぼ９５％の収率が得られた。さらに、該ヘテロダイマーは、野生型及びｖ８変異体に匹敵する電気泳動移動シフトを示した。
0004213224.tif 000006
実施例３：ヘテロマルチマー中のタンパク質-タンパク質相互作用を増大する相補の変異のための構造-誘導ファージディスプレー選択
以下の方法は、マルチマー化ドメインを経て界面で相互作用するポリペプチド中の相補の変異の選択において有用である。その方法は、相補的な空洞への隆起変異の選択にそれを適用するとして次に説明される。しかしながら、その実施例は制限するためのものではなく、その方法は非天然存在ジスルフィド結合、ロイシンジッパーモチーフ、疎水性相互作用、親水性相互作用などの形成に適当な変異の選択に同様に適用することができる。
Ａ．  ファージディスプレー選択。ファージディスプレー方法は、安定なＣH３ヘテロダイマーの選択用に開発され、図２中に概要が示されている。その選択は、Ｍ１３遺伝子IIIタンパクに融合したＣH３の第２のコピーと共発現されるペプチドフラッグに融合した（ｇＤペプチドフラッグ、例えばLasky, L.A.とDowbenko, D.J.（1984）DNA 3:23-29；及びBerman, P.W.ら,（1985）Science 227:1490-1492）隆起変異体、T366W（Ridgwayら,上記（1996））を用いる。空洞変異体のライブラリーは、第１のＣH３ドメイン上の隆起に最も近い残基の無作為化によってＣH３のこの第２のコピー中に創製した。次いで、安定なＣH３ヘテロダイマーを提示しているファージを、抗-フラッグＡｂを用いて補足した。
ＣH３ファージディスプレーライブラリーの1.1 x 105の独立クローンは、ＰＣＲフラグメントによる自然ＣH３遺伝子のセグメントの置換によって構築した。そのフラグメントは、標準的な技術を用いて位置366、368と407を無作為化するために分解プライマーを用いてＰＣＲ増幅化により得られた。
２から５ラウンドの選択の後、完全長クローンのフラクションは、一本鎖ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によると、それぞれ９０％、６０％、５０％及び１０％だった。完全長クローンを含むファージミドは、５ラウンドの選択の後にゲル-精製した。二千の形質転換体がＸＬ１-ＢＬＵＥTM細胞（Stratagene）を再形質転換後に得られた。
各クローンの平均＞１０6コピーを、選択（panning）のラウンド当たりに使用した。かくして、該ライブラリーにおいて各クローンの多数のコピーが、たとえ幾つかの削除変異体が選択の間に生じたとしても、選択のために利用可能であろう。
７ラウンドの選択の後、得られたＣH３変異体は、無作為化した残基でコンセンサスアミノ酸配列に近づいた。実際に全てのクローンは、残基366でセリン又はトレオニンを有し、この位置でβ-ヒドロキシルに非常に強い優先性を示した。疎水性残基のための強い優先性は、バリンとアラニンが優位を占める残基368と407で観測された。６の異なるアミノ酸の組み合わせは、１１度回収された、三重変異体、T366S:L368A:Y407Vを含む、少なくとも２度回収された。これらのファージ選択物はいずれも、先に定義されたヘテロダイマー、T366W/Y407’A（Ridgway, J.B.B.ら,（1996）, 上記）と同一の配列を有しない。そのファージ選択物は、ドメイン界面残基の全側鎖容量において40-80Å3減少により判断されるように野生型ＣH３ホモダイマーよりも劣る緊密性で詰め込まれ得る。
発現プラスミドｐＡＫ１９（Carterら, 1992）上にコードされたＣH３変異体を、大腸菌３３Ｂ６株中に導入し、発現させ、培養槽中で高い細胞密度に増殖した大腸菌から分泌させた。ＤＥＡＥ-セファロースＦＦ、ＡＢｘ及びResource Sクロマトグラフィーによって精製したT366S:L368A:Y407V変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥの後に単一の主要なバンドを与えた。他のＣH３変異体は、同様の純度で回収した。高解析度電気スプレー質量分析法によって測定した野生型ＣH３、T366S：L368A：Y407V、T366W及びY407A変異体の分子質量は、予期した通りであった。
Ｂ．  ファージ選択したヘテロダイマー安定性。ＣH３ヘテロダイマーの安定性を、グアニジン塩酸によって相当するファージを滴定することによって最初に評価し、次いで希釈し、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）によって残るヘテロダイマーを定量した。ＣH３-ファージによるグアニジン塩酸分解アッセイは、選択物を直ちにスクリーンするための手段を提供する。
ファージは、７ラウンドの選択の後の個別クローンから調製し、また、コントロールベクター、ｐＲＡ１からも調製した。概略的には、XL1-BLUETM中のファージミドを、109pfu/ml M13K07の存在中で50μg/mlカルベニシリンと10μg/mlテトラサイクリンを含有する25ml ＬＢ培地に接種するために使用し、３７℃で一晩インキュベーションした。その細胞は遠心分離（6000g、10分、４℃）によってペレット化した。ファージは、５ｍｌの20％（w/v）ＰＥＧ、2.5M ＮａＣｌによって沈殿し遠心分離（12000g、10分、４℃）の後に上清から回収され、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。ＰＢＳ中0-6Mのグアニジン塩酸180μlが20μlファージ調製物に加えられ、5.0分間ほぼ〜25℃でインキュベーションした。各ファージサンプルのアリコート（20μl）は、水で十倍に希釈した。ＣH３のヘテロダイマーの存在は、５Ｂ６-被覆プレートを用い及び基質としてo-フェニレンジアミンを用いたホースラディッシュペルオキシダーゼに接合した抗-Ｍ１３ポリクローナルＡｂによってファージを検出するＥＬＩＳＡによって測定した。その反応は、2.5M Ｈ2ＳＯ4 50μlの添加によって抑止し、492nmで吸光度を測定した。その吸光度データは、その溶融の間にグアニジン塩酸濃度に対してプロットし、且つKaleidagraph 3.0.5（Synergy Software）を用いた非線形最小二乗法によって四つのパラメーターモデルに適用した。
最も頻繁に回収されたヘテロダイマー、T366W/T366’S：L368’A：Y407’Vは、他のファージ-選択したヘテロダイマーと安定性において類似する。このファージ-選択したヘテロダイマーは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407’Aよりも有意により安定であるが、しかし野生型ＣH３よりは安定性に劣る。全てのＣH３変異体、個別及び組み合わせの両方は、これら同じ分子が熱量測定法によって研究された条件下にサイズ排除クロマトグラフィーによってダイマーであることが見出された（1.75mg/ml、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中）。唯一の例外は、ＣH３ダイマーよりもわずかに短い保持時間を有したT366S：L368A：Y407V変異体のみであった。
Ｔ３６６Ｗ隆起、及びT366S：L368A：Y407V空洞変異体の１：１混合物は、69.4℃における単独転移で溶融し、サブユニット交換及び安定なヘテロダイマーの形成と一致する。一方、Ｔ３６６Ｗ隆起ホモダイマーは、T366W/T366’S：L368’A：Y407’V空洞への隆起ヘテロダイマー（ΔＴm＝−15.0℃）よりも安定性に劣る。それ自身の上のT366S：L368A：Y407V空洞変異体は、加熱によって集合する傾向があり、滑らかな溶融転移を成さない。
設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａは、Ｔ３６６Ｗ隆起変異体の不在下及び存在下でそれぞれ58.8℃及び65.4℃で溶融する。これは、サブユニット交換とＴ３６６Ｗ（ΔＴm＝11.0℃）又はＹ４０７Ａ（ΔＴm＝6.6℃）ホモダイマーより大きな安定性を有するT366W/Y407’Aホモダイマーの形成に一致する。ファージ選択したヘテロダイマー、T366W/T366’S：L368’A：Y407’Vは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407’A,（ΔＴm＝4.0℃）よりも一層安定であるが、しかし、野生型ＣH３ホモダイマー（ΔＴm＝−11.0℃）よりも安定性が劣る。
Ｃ．  インビボでのファージ-選択した抗体免疫付着因子（Ａｂ／Ｉａ）のマルチマー化。ファージ選択され、かつ設計されたＣH３変異体は、インビボでＡｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した（Chamowら, （1994）,上記。これは、ＣＤ４-ＩｇＧと一緒にヒト化した抗-ＣＤ３軽鎖（L）と重鎖の共発現により達成した。ヘテロダイマーとホモダイマーの形成は、プロテインＡ精製後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとスキャニングレーザーデンシトメトリー（Ridgway,ら,（1996）,上記）によって評価した。Ａｂ／Ｉａハイブリッドの比較できる収量が、抗-ＣＤ３重鎖が設計した隆起変異体Ｔ３６６Ｗを含み、Ｉａがファージ-選択した変異体、T366S：L368A：Y407V、又は設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａのいずれかを含んだ共移入体から回収された（図３）。
ファージ-選択され、かつ、設計されたＣH３変異体は、次にホモダイマーを形成する傾向において評価した。隆起変異体、Ｔ３６６Ｗは、相当する抗体重鎖と軽鎖の共移入がＩｇＧを越える過剰のＨＬモノマー（非-ジスルフィド結合ＩｇＧを含み得る）に至ることから、ホモダイマー化に対して明らかに破壊的である。一方、ＨＬモノマーではないＩｇＧが、野生型ＣH３ドメインを含む同じ抗体に観測された。空洞変異体、T366S：L368A：Y407Vは、相当するファージミドの遺伝子移入が幾つかのＩａモノマーを持つ優性なＩａダイマーの混合物を導くことから、多少ホモダイマー化を崩壊させる。空洞変異体、Y407Aは、相当するファージミドの移入後にＩａモノマーではないＩａダイマーの存在による判断として、ホモダイマー化を最小限崩壊する。
ここに記載したファージディスプレー選択方法は、安定したヘテロダイマーを形成するＣH３変異体の援助での選択及び安定なホモダイマーを形成する変異体に対しての選択を可能にする。ホモダイマーに対するカウンター選択は、“遊離”ＣH３変異体が、利用可能なＣH３変異体-遺伝子III融合タンパク質への結合のためにフラッグ化ＣH３ノブ変異体と競合するであろうことから生じる。遊離ＣH３変異体は、自然ＣH３遺伝子とＭ１３遺伝子IIIの間のアンバー変異の結果として生じる。XL1-Blueのようなアンバー抑制宿主において、ＣH３遺伝子III融合タンパクと対応するフリーのＣH３の両方が分泌されるだろう。
グアニジン塩酸分解は、ファージ上のＣH３ヘテロダイマー安定性を最初にスクリーニングするために有用なツールであることを立証した。ファージは、5Mグアニジン塩酸にさらした後でも大腸菌への感染性を維持する（Figiniら, J. Mol. Biol. 239:68-78（1994））。かくして、グアニジンは変異体選択の厳密さを増加するためにも有用となり得る。
ファージディスプレーライブラリーの合理的な設計とスクリーニングは、ヘテロダイマー化を促進するためにホモダイマーのドメイン界面を再モデル化するための相補的なアプローチである。ＣH３ドメインのケースにおいて、設計した変異体は、ヘテロダイマー化を促進するために補充されたドメイン界面残基を同定した。ファージディスプレーは、ヘテロダイマーを最も有効に形成する組み合わせのために固定した隆起の近くの３つの残基の置換をサーチするためにここに用いた。ファージ選択物は、ドメイン界面の更なる合理的な再設計を促進するために有効とされる一方、ここに記載したファージ選択方法は、タンパク質-タンパク質界面を再モデル化するためのその有用性を実証する。
実施例４：共通の軽鎖を有するヘテロマルチマー抗体又は抗体／免疫付着因子の生成と組立
以下の実施例は、本発明に従う同じ軽鎖を共有するヘテロマルチマー二重特異性抗体の調製とその標的抗原に結合する抗体の能力を実証する。
Ａ．  同じ軽鎖を共有する抗体の同定：１１の抗原に対して生じた抗体ライブラリーの比較
大きいヒト一本鎖Ｆｖ（scFV）抗体ライブラリー（Vaughanら（1996）上記）を、Ａｘ１（ヒトレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ）、ＧＣＳＦ-Ｒ（ヒト顆粒球コロニー刺激因子レセプターＥＣＤ）、ＩｇＥ（ネズミＩｇＥ）、ＩｇＥ-Ｒ（ヒトＩｇＥレセプターα-鎖）、ＭＰＬ（ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ）、ＭｕｓＫ（ヒト筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼＥＣＤ）、ＮｐｏＲ（ヒトオルファンレセプターＮｐｏＲ ＥＣＤ）、Ｒｓｅ（ヒトレセプターチロシンキナーゼ、Ｒｓｅ，ＥＣＤ）、ＨＥＲ３（ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３／c-erbB3 ＥＣＤ）、Ｏｂ-Ｒ（ヒトレプチンレセプターＥＣＤ）、及びＶＥＧＦ（ヒト脈管内皮成長因子）、［ＥＣＤは細胞外ドメインに関する］を含む１１の抗原に特異的な抗体について選択した。各抗原に対して生じた抗体の集団からｓｃＦｖフラグメントのヌクレオチド配列データを翻訳して、相当するタンパク質配列を誘導した。ＶL配列は、鎖の全てのペア様態組み合わせ間の同一性パーセンテージを計算するためにFengとDoolittle（1985,1987,1990）のアルゴリズムを有するプログラム“アライン”を用いて比較した（Feng, D.F.とDoolittle, R.F.（1985）J. Mol. Evol. 21:l12-123；Feng, D.F.とDoolittle, R.F.（1987）J. Mol. Evol. 25:351-360；及びFeng, D.F.とDoolittle, R.F.（1990）Method Enzymol. 183:375-387）。各ペア様態軽鎖アミノ酸配列比較の配列同一パーセントの結果は、マトリックスフォーマット中に調整した（追記参照）。
ほとんどのペア様態の比較に、少なくとも１の共通軽鎖配列が見出された。表５は、l17ＶLアミノ酸配列のアラインメントによって決定した同じ軽鎖を共有する（100％同一性）ｓｃＦｖの頻度を示しているＶL鎖の比較である。例えば、そのエントリー４／９（ＨＥＲ３ｘＯｂ-Ｒ、黒いボックスで表した）は、ＨＥＲ３を結合する４つのクローンが１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-ＲクローンとＶL配列を共有することが見出されたが、Ｏｂ-Ｒを結合する９のクローンは、１又はそれ以上の抗-ＨＥＲ３クローンとＶL配列を共有することを表す。対角線上のエントリーは、その集団中の１又はそれ以上のクローンとＶL配列を共有する集団内の抗体クローンの数を表す。例えば、ＭＰＬクローンの調査は、１又はそれ以上の他のＭＰＬクローンとＶL配列を共有した５つのクローンを明らかにした。（IgE x Ax1）又は（NpoR x IgE-R）のように、共通の軽鎖が観察されないケースにおいて、少なくとも１の特異性について比較されるフラグメントの数は非常に少なかった（５以下）。見出された共通の軽鎖の数が与えられ、もし十分な数のクローンが比較されるなら、いずれかのＶL比較物について、共通の軽鎖が見出されるだろう。
軽鎖のアミノ酸配列は、選択した共通の軽鎖に対しての配列同一性が98％と99％であった場合、アミノ酸残基差異の位置について調べられた。図４は、Ａｘ１（クローンAx1.78）、Ｒｓｅ（クローンRse.23, Rse.04, Rse.20,及びRse.15）、ＩｇＥＲ（クローンIgER. MAT2C1G11）、Ｏｂ-Ｒ（クローンobr.4）、及びＶＥＧＦ（クローンvegf.5）に特異性を持つ８つの異なる抗体のＶL配列の比較である。配列の定義（Kabat, G.A.ら（1991）上記）又は構造の定義（ChothiaとLesk,（1987）J. Mol. Biol. 196:901-917）に従う抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と＃によって示した。Ax1.78配列と異なる軽鎖残基は二重下線により示した。比較した９つ軽鎖の、６つが同一である。Rse.04とobr.4の軽鎖（ほぼ99％配列相同性）は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の１残基で相違する。Rse.20の軽鎖（ほぼ98％配列同一性）は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の２残基で異なる。該アミノ酸残基の変化は、抗原結合性において殆ど、あるいは全く影響しない。かくしてこれらの軽鎖の配列類似性が、それらを本発明の共通の軽鎖のための候補とする。代替的に、本発明に従えば、期待される対になったｓｃＦｖ（例えばAx1.78）の軽鎖と98-99％配列同一性を有する軽鎖が、対になった軽鎖と置換され、且つ結合特異性を保持し得る。
Ｂ．  同じ軽鎖を共有する抗体の同定と、その軽鎖を共有する二重特異性抗体の作製：抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３。
ヒトレプチンレセプター（Ｏｂ-Ｒ）又はHER3/c-erbB3遺伝子生産物（ＨＥＲ３）の細胞外ドメインを結合したＳｃＦｖフラグメントは、大きいヒトｓｃＦｖファージライブラリーを用いた選別の３つのラウンドによって得られた（Vaughanら（1996）, 上記）。レプチンレセプター-ＩｇＧとＨＥＲ３-ＩｇＧ（lmlＰＢＳ中10μg）を、４℃で一晩、分離イムノチューブ（Nunc;Maxisorp）を被覆するために使用した。選別とファージ解放は、以下の修正を伴い、Vaugham（1996）, 上記により記載されたように実行した。ヒト化した抗体、huMAb4D5-8（Carter, P.ら（1992）PNAS USA 89:4285-4289）又はヒト化した抗-ＩｇＥ（Presta, L.ら（1993）J.Immunol.151:2623-2632）を、1mg/mlの濃度で、Ｆｃ-結合ファージを吸着するための各選別工程中に含めた。加えて、溶液における選別（Hawkins, R.E.ら（1992）J.Mol. Biol. 226:889-896）も、ｓｃＦｖ結合レプチンレセプターを同定するために使用した。そのレプチンレセプターを、工作したプロテアーゼ、ジェネナーゼ（Carter, P.ら（1989）Proteins: Structure, Function and Genetics 6:240-248）によるレプチンレセプター-ＩｇＧの部位特異的蛋白分解およびその後のプロテインＡセファロースクロマトグラフィーによってＦｃから分離した。そのレプチンレセプターをビオチン化し、それぞれ、第１，第２，及び第３ラウンドの選別用に100nM、25nM及び5nMの濃度で使用した。ファージ結合ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン-被覆パラ磁性ビーズ（Dynabeads, Dynal, Oslo, Norway）を用いて捕捉した。
それぞれの選別のラウンド２及び３からのクローンを、対応する抗原及びコントロールの免疫付着因子又は抗体を用いたファージ及びｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡによってスクリーンした。抗原-陽性クローンの多様性を、プライマー、fdtetseqおよびPUCリバース（Vaughamら（1996）, 上記）を用いるｓｃＦｖ挿入物のＰＣＲ-増幅及びBstNIによる切断（Marksら（1991）上記）によって分析した。BstNIフィンガープリント当たり１から５のクローンをＰＣＲ重リンクとmyc seq 10プライマー（Vaughamら（1996）上記）を用いて蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター（Applied Biosystems）を用いてサイクル配列決定した。サンプルは、Applied Biosystems Automated DNA Sequencerを用いて分析し且つ配列をSeqEdを用いて分析した。グアニジン塩酸抗体変性及びファージディスプレー選択と組み合わせたFiginiのインビトロでの鎖シャフリング方法が同じ軽鎖を有する抗体を選択する方法として有用であることにも注目される（Figini, M.ら（1994）, 上記、その全体が参照によりここに併合される）。
上記の方法を用いて、１１の異なる抗-ＨＥＲ３クローンと１８の抗-Ｏｂ-Ｒクローン（そのうちの１１は被覆した抗原を用いた選別から得られ、７つはビオチニル化抗原を用いた選別から得られた）が得られた。そのクローンは、各結合ドメインと結合した軽鎖の配列を決定するための標準技術により配列決定した（図５）。その配列は、二重特異性抗体を構成するために使用した抗-Ｏｂ-Ｒクローン26と抗-ＨＥＲ３クローン１８のVH及び共通のVL配列である（後記参照）。その残基は（Kabat, E.A.ら（1991）上記）に従い番号付けされる。配列の定義（Kabat, E.A.ら（1991）上記）又は構造の定義（ChothiaとLesk,（1987）J. Mol.Biol.（1987）196:901-917）に従った抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と上線によって示される。VH配列中の残基間の同一は、*によって表示した。
軽鎖の配列は、多重抗-Ｏｂ-Ｒクローンに対する多重抗-ＨＥＲ３クローンと比較した（図８及び表５）。１１の抗-ＨＥＲ３クローンのうちの４つが、１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-Ｒレセプタークローンと同じVLを共有することが観測された。反対に、１８の抗-Ｏｂ-Ｒクローンのうちの９つが抗-ＨＥＲ３クローンの一つと同じVLを共有する（表５、黒い箱を参照）。
0004213224.tif 000007
抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３（共通の軽鎖を有する二重特異性抗体）の構築は以下の通り実行した。相補の隆起と空洞、同じく第１及び第２のポリペプチド間の非天然存在ジスルフィド結合を有する変更したＣH３第１及び第２のポリペプチドを、Ｆｃ-含有二重特異性抗体の構築において用いた。同じ軽鎖を共有するクローンである、抗-Ｏｂ-Ｒクローン＃２６と抗-ＨＥＲ３クローン＃１８からのＶL、並びに各抗体の重鎖を、ここに記載した手順に従って二重特異性抗体を製造するために用いた。
この抗体は、非天然存在ジスルフィド結合を生じる変更を欠くことによってのみ異なる二重特異性抗体と比べて、見かけの分子量において電気泳動移動性シフトを有した。非天然存在ジスルフィド結合を持った及び持たないヘテロダイマーの抗体変異体の８％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルは、野生型ヘテロダイマーのほぼ230の見かけ上のＭＷから、一つの非天然ジスルフィド結合を有しているヘテロダイマーのほぼ200の見かけ上のＭＷまでの移動シフトを示した。そのＭＷシフトは非天然ジスルフィド結合を首尾良く形成するそれぞれの変異体のパーセントを与えるために十分であった。
二重特異性抗体のＯｂ-Ｒ及びＨＥＲ３の両方へ結合特異性は、以下の方法のような標準ＥＬＩＳＡ法によって試験される。Ｏｂ-Ｒ結合は、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質として存在するＯｂ-ＲによってＥＬＩＳＡアッセイで実証される。該Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質は、９６-ウェルのミクロタイター板のウェル上に被覆され、そして二重特異性抗体が加えられる。
そのウェルは、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇへの非特異的結合を取り除くために数回洗浄される。このアッセイにおける第２の成分として、ビオチニル化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質が加えられ、そしてビオチニル化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質に結合するストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体によって測定される。結合は、過酸化水素及びＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）の添加における着色の変化の生成により測定される。
ここに記載した条件下、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方への二重特異性抗体の結合は、固定化Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ／二重特異性抗体／ＨＥＲ３-Ｉｇビオチン／検出可能に標識したストレプトアビジンを含む複合体の形成によりミクロタイターウェルの表面上に固定化した検出可能な標識として観測される。Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇと結合するが、ＨＥＲ３-Ｉｇとは結合しない抗体は、上記複合体を形成せず、陰性の結果を示す。同様に、ＨＥＲ３-Ｉｇと結合するが、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇとは結合しない抗体は、上記複合体を形成せず、陰性の結果を示す。一方、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方に結合することが予期される二重特異性抗体は、該アッセイにおいて陽性の結果を生じる複合体を形成し、これは共通の軽鎖を有する二重特異性抗体がＨＥＲ３とＯｂ-Ｒの両方に結合することを証明する。
抗-（Ｏｂ-Ｒ／ＨＥＲ３）二重特異性抗体の発現と精製は、以下の通り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞を、それぞれ独立に抗-Ｏｂ-Ｒ重鎖、抗-ＨＥＲ３重鎖、又は上述した通りそれぞれの抗体に共通であったクローン２６又は１８からの軽鎖をコードしている３つのプラスミドＤＮＡを用いて移入（トランスフェクション）した。それぞれの移入のために、重鎖コード化ＤＮＡに対する軽鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３二重特異性抗体の組立を制限しないように１：３とした。両方の重鎖を、互いに対して１：１の比で移入した。12μgのトータルのプラスミドＤＮＡを、次いでリン酸カルシウム沈降によって293S細胞中に共移入（co-transfected）した（Gorman, C., DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, ed., IRL Press, Oxford, p.143（1985））。その細胞を、ＰＢＳで洗浄した後に、タンパク質発現の増大を意図して増殖培地に加えた。Ｆｃ-含有タンパク質は、固定化したプロテインＡ（ProSep A, BioProcessing Ltd., UK）を用いて細胞上清から精製し、そしてＰＢＳにバッファー交換した。ジスルフィド結合の再シャフリングを防止するためにヨードアセトアミドを50mMの最終濃度までタンパク質調製物に加えた。
さらなる実施例として、抗-（CD3/CD4）抗体／免疫付着因子の発現と精製を以下の通り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞を、３つのプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。各プラスミドは抗-ＣＤ３軽鎖、抗-ＣＤ３ ＩｇＧ1重鎖、又は抗-ＣＤ４ ＩｇＧ1免疫付着因子を独立にコードする。それぞれの移入のために、軽鎖コード化ＤＮＡに対する重鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-ＣＤ３ ＩｇＧの組立を制限しないように、３：１とした。加えて、免疫付着因子があまり発現されないために、免疫付着因子コード化プラスミドの比率を、重鎖コード化プラスミドに過剰に加えた。試験した比率は、免疫付着因子：重鎖：軽鎖ファージミドに対し、3:1:3から8:1:3間の範囲とした。トータルで10μgのプラスミドＤＮＡは、移入前にＰＢＳで細胞を洗浄し、リン酸カルシウム沈降（Gorman, C.（1985）,上記）により293S細胞中に共移入した。Ｆｃ-含有タンパク質は、固定化したプロテインＡ（ProSep A, BioProcessing Ltd., UK）を用いて細胞上清から精製し、そしてＰＢＳ中にバッファー交換した。ジスルフィド結合の再シャフリングを防止するために、ヨードアセトアミドを50mMの最終濃度までタンパク質調製物に加えた。
上記それぞれの調製において、タンパク質サンプルは、８％ポリアクリルアミドゲル（Novex）で電気泳動し、Serva blueによる染色によって可視化した。ゲルを脱色して、マイナーな不純物の可視化及び定量化を可能にすべく僅かなバックグラウンドとした。乾燥したゲルを、スキャニングデンシトメーター（GS-670, BioRad）によってスキャンし、そしてタンパク質製造物をMolecular Analystソフトウェアによって定量化した。
ＣH３ドメイン中に導入した非天然（工作した）ジスルフィド結合は、ヘテロダイマー形成を増大するためにここに開示されている。一対のポリペプチド、K392/D399’Cは、ヘテロダイマー形成を増大し、７６％までのヘテロダイマーを生成した（表４、変異体ｖ６）。さらに、鎖間ジスルフィド結合の存在が空洞への隆起技術と結び付けられた場合、ほぼ９５％のヘテロダイマーが得られた（表４変異体ｖ１１，ｖ１２，及びｖ１６）。かくして、二重特異性抗体の第１と第２のポリペプチド間の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を増加する本発明の方法は、望まれるヘテロマルチマーの収量を増加すると共に、望ましくないヘテロマルチマー又はホモマルチマーの形成を最小化する。
加えて、電気泳動の移動度の分析によって生産物ヘテロマルチマーを特徴付ける方法は、望ましくない生産物に対する、所望のヘテロマルチマーの相対的な量の測定を可能にする。
ここに記載したような共通の軽鎖の選択は、多重特異性抗体の可変の重鎖と軽鎖の間の誤対合の可能性を削除することによって望まれるヘテロマルチマーの収量をさらに増加する。
Ｃ．  同一の軽鎖を共有する抗体の同定とその軽鎖を共有している二重特異性抗体の構築：抗-Mpl/抗-HER3。
本発明の別の二重特異性抗体の同定、構築及び発現がここに示される。この実施例のパートＡとＢ中に記載した方法を、抗-Mpl/抗-HER3二重特異性抗体の製造用に利用した。
この実施例のセクションＡ中に記載した方法（１１の抗原に対して生じた抗体ライブラリーの比較）、上記、を用い、抗-ＨＥＲ３ｓｃＦｖのＶHとＶLアミノ酸配列を、ヒトトロンボポイエチンレセプター、ｃ-Ｍｐｌに結合する２３ ｓｃＦｖと比較した。１１の抗-ＨＥＲ３クローンの５つは、１又はそれ以上のＭｐｌ-結合クローンと同一のＶLアミノ酸配列を共有する。反対に、２３の抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖの７つは、抗-ＨＥＲ３クローンの一つと同じＶLを共有していた（表５、上記、白枠を参照）。対照的に、ＶHアミノ酸配列は、抗-Ｍｐｌと抗-ＨＥＲ３クローンの間に４０から９０％の同一性レベルを持ち、より多様であった。
その抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ，１２Ｂ５（Genbank accession number AG048775；配列番号：２７）と抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖクローンＨ６（Genbank accession number AG048774；配列番号：２８）は、同一のＶL配列及び実質的に異なるＶH配列を利用する。これらのｓｃＦｖフラグメントは、共有した軽鎖、並びに、孔-ノブ変異体の使用（ここに記載した）及びＣH３ドメイン間に設計されたジスルフィド結合の使用により、有効なヘテロダイマー化ができる抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３二重特異性ＩｇＧ抗体を構築するために用いられた。同じＬ鎖を共有する抗体は、非-同系Ｈ鎖と対合するＬ鎖の問題を避けるために選択した。２つの天然存在ヒンジ領域ジスルフィド結合もまた存在した。その共通のＬ鎖は、変異体ｖ１１からのＣH３変異を含んでいる２つのＨ鎖と共移入した。そのＩｇＧ生産物は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、且つ標準技法を用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。
二重特異性ＩｇＧ抗体（ＢｓＩｇＧ）調製物は、野生型ＣH３ドメインを含有するＩｇＧよりも、より大きい移動性を示す単一の主要バンドを生じた。電気泳動移動性におけるこの増加は、よりコンパクトなタンパク質種を形成するＢｓＩｇＧ中に作られたジスルフィド結合の形成と一致した。
ＭｐｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原の両方に結合する工作した抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ＢｓＩｇＧ抗体の能力は、以下の通りＥＬＩＳＡを用いて評価した。全ての工程でＰＢＳ緩衝液を用い、９６-ウェル板（Maxisorp, Nunc）の個々のウェルは、5μg/mlのＨＥＲ３-ＩｇＧ又はＭｐｌ-ＩｇＧで一晩被覆し、洗浄し次いで0.5％（w/v）ＢＳＡで１時間ブロック化した。その最初の抗体は、変異Y349C：T366S：L368A：Y407V/T366’W：S354’Cを含む抗-Ｍｐｌｘ抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧおよび変異したＦｃ領域を持つ対応する親の抗-Ｍｐｌ又は抗ＨＥＲ３ ＩｇＧとした。最初の抗体（1μg/mL）は、ビオチニル化ＨＥＲ３-ＩｇＧ及びストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体（Boehringer Mannheim）の1:5000希釈液と共に23℃で２時間、別個にインキュベーションし、次いで各ウェルに加え、23℃でさらに１時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性は、販売者（Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）によって指示された通りにＴＭＢ試薬によって検出した。
予想した通り、抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧは、個別にＭＰｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原のそれぞれに効率的且つ同時に、同じく両方の抗原に同時に結合した。これに対して、親の抗-Ｍｐｌと親の抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧは、対応する同系抗原にのみ結合した（図６）。
Ｄ．  工作したＦｃ領域を含んでいる抗体は、有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力がある。
本発明の実例化した二重特異性抗体の生成において用いた工作したＦc領域（ＣH３変異体、上記）が有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力があることを実証するため、以下の実験を実行した。
そのＣH３変異は、Lewis, G.D.ら（Lewis, G.D,ら（1993）Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263,その全部が参考により組込まれる）の方法を用いて示した通り、効率的な抗体-依存細胞-介在細胞毒性（ADCC）をサポートする能力を維持する。概略的には、細胞毒性アッセイは、51Ｃｒ-標識したＳＫ-ＢＲ-３及びＨＢＬ-１００標的細胞（それぞれATCC受託番号HTB-30と45509）及びエフェクター細胞としてヒト末梢血液リンパ球を用いて実行した。しかしながら、Lewisらと異なり、そのリンパ球はＩＬ-２で活性化されなかった。
ＣH３変異体S354:T366W及びY349C：T366S：L368A：Y407Vは、Carterら（Carter, P.ら（1992）PNAS USA 89:4285-4289）により製造されたヒト化抗-ＨＥＲ２抗体、huMAb4D5-5のＨ鎖中に別個に導入した。再モデル化した及び野生型Ｆｃ領域を含む抗体は、ＨＥＲ２-過剰発現乳癌細胞系、SK-BR-3によりＡＤＣＣ中で類似の能力を有した（図７）。再モデル化した及び野生型抗体の両方は、通常の胸部上皮細胞系に対して、低い活性を示した。Ｈ鎖における効果は、結合ドメインから独立しており、このことから、これらBsIgG’sが抗体-依存細胞-介在細胞毒性において機能するといえる。
本発明は、最も実践的、且つ好適な実施態様であるとして考慮される何れかにおいてここに示され且つ記載される。それは、しかしながら、発展は本発明の範囲内から作製できること、及び自明な修正がこの開示を熟読した当業者に生起することが認識される。ここに用いた全ての参考文献はそれの全体において参考によってここに組込まれる。
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：ジェネンテック、インコーポレーテッド
（ii）発明の名称：ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
（iii）配列の数：２８
（iv）住所
（A）住所：ジェネンテック、インコーポレーテッド
（B）ストリート：１  ディー・エヌ・エー  ウェイ
（C）市：サウス  サン  フランシスコ
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：９４０８０
（v）コンピューター読解可能形式：
（A）媒体形式：３．５インチ、１．４４Ｍｂフロッピーディスク
（B）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパーチブル
（C）オペレーティングシステム：  ＰＣ-ＤＯＳ／ＭＳ-ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：ＷｉｎＰａｔｉｎ（ジェネンテック）
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９８／０８７６２
（B）出願日：１９９８年４月３０日
（C）分類：
（vii）基礎出願データ：
（A）出願番号：０８／８５００８５
（B）出願日：１９９７年２月５日
（viii）代理人情報：
（A）名称：コンリー，ディアドリー  エル
（B）登録番号：３６，４８７
（C）参考／整理番号：Ｐ１０９９Ｒ２ＰＣＴ
（ix）テレコミュニケーション情報：
（A）電話：６５０／２２５−２０６６
（B）テレファックス：６５０／９５２−９８８１
（２）配列番号；１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３６塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１：
0004213224.tif 000008
（２）配列番号：２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２：
0004213224.tif 000009
（２）配列番号：３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：３：
0004213224.tif 000010
（２）配列番号：４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２４塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：４：
0004213224.tif 000011
（２）配列番号：５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３０塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：５：
0004213224.tif 000012
（２）配列番号：６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：６：
0004213224.tif 000013
（２）配列番号：７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３９塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：７：
0004213224.tif 000014
（２）配列番号：８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３３塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：８：
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（２）配列番号：９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：９：
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（２）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１０：
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（２）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２４塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１１：
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（２）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：３８塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１２：
0004213224.tif 000019
（２）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：８２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１３：
0004213224.tif 000020
（２）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１４：
0004213224.tif 000021
（２）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１５：
0004213224.tif 000022
（２）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１６：
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（２）配列番号：１７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１７：
0004213224.tif 000024
（２）配列番号：１８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１８：
0004213224.tif 000025
（２）配列番号：１９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：１９：
0004213224.tif 000026
（２）配列番号：２０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２０：
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（２）配列番号：２１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２１：
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（２）配列番号：２２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２２：
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（２）配列番号：２３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：６２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２３：
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（２）配列番号：２４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：６２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２４：
0004213224.tif 000031
（２）配列番号：２５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：１０７アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２５：
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（２）配列番号：２６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：２６１アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２６：
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（２）配列番号：２７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：７１７塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２７：
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（２）配列番号：２８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：７３２塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の詳細：配列番号：２８：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２】
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【図２Ｃ−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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