(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境中にエタノールを吹付けるようにしたことにより、このエタノールを利用したダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを変性して失活させることを特徴とするアレルゲン除去方法。
【請求項２】
環境中にエタノールを吹付けるようにしたことにより、このエタノールを利用したダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを変性してアレルゲンを不溶化させることを特徴とするアレルゲン除去方法。
【請求項３】
濃度が２０ｖ／ｖ％〜１００ｖ／ｖ％のエタノールを利用したことを特徴とする請求項１または２記載のアレルゲン除去方法。
【請求項４】
エタノールを主成分とし、このエタノールを利用したダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを変性して失活させることを特徴とするアレルゲン除去製剤。
【請求項５】
エタノールを主成分とし、このエタノールを利用したダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを変性してアレルゲンを不溶化させることを特徴とするアレルゲン除去製剤。
【請求項６】
濃度が２０ｖ／ｖ％〜１００ｖ／ｖ％のエタノールを利用したことを特徴とする請求項４または５記載のアレルゲン除去製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレルギー、アトピー、喘息等の予防技術に関し、特には、環境中に存在するダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを失活させる、あるいはアレルゲンを不溶化させるアレルゲン除去方法及び製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アレルギー患者数は年々増加傾向にあり、国内の患者は７５０万人ともいわれ、現在非常に大きな問題となっている。アレルギー疾患の対策は、アレルギー疾患者の治療と、アレルゲンそのもののを除去する方法とに分けられる。
【０００３】
アレルギー疾患者の治療としては、ステロイド剤や抗ヒスタミン剤の投与が行われているが、効果や副作用を考慮すると決して満足できるレベルではない。また、体質を改善する治療法も検討されているが、その手法が確立されるまでには至っていない。
一方、環境中からアレルゲンを除去することはアレルギー発症の予防に大変有効であるとの報告がある（アレルギー４１  １４０５〜１４１２、ＴＨＥＬＡＮＣＥＴ  ３３６  ８９５〜８９７）。環境中のアレルゲン密度を低下させるために、殺ダニ剤、殺菌剤および殺ダニ効果を謳った掃除機、ふとん乾燥器等が市販されている。また、特開昭６１−４４８２１号公報や特開平６−２７９２７３号公報には、タンニン酸や類似構造を有する物質で環境を処理することにより、アレルゲンを除去する方法が示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記に挙げた商品はダニやカビそのものの増殖の抑制には有効であるが、アレルゲンはカビ本体やダニの死骸並びに排泄物に多く含まれているため、単にダニやカビを殺すだけでは室内のアレルゲン量は低下しない。そのため、アレルギー発症を抑制するには、これらのアレルゲンを除去させる必要がある。アレルゲンの除去するには掃除機による吸引やふとんたたき、クリーニング等で行うのが一般的である。しかし、前記の方法を通常通り行ってアレルゲンを除去するのは非常に困難で、最も効果の高いクリーニングにおいても手間やコストがかかる（アレルギー４０  ４３９〜４４３）。また、タンニン酸等の物質で環境を処理すると多価フェノール基が金属イオンとキレートを形成し、特異的な定色反応が起こるため、壁や敷物等が着色し、実使用に至るまでには解決すべき問題が山積している。以上より、安価で簡便なアレルゲン除去方法が望まれている。
【０００５】
本発明は、前記従来技術の問題点を改善・解決するものであり、アレルギーの発症予防に効果を有するのみならず、副作用を抑え環境中に有害物を残留させず、しかも広範囲なアレルゲンに利用できる新規技術を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、タンパク質で構成されているアレルゲンはエアゾール等の吹付けによってエタノールを接触させることで、その生理活性に変化を来すことを発見した。また、溶媒蒸気においても同様の効果があることも明確となった。
【０００８】
また、前記アレルゲンは、環境中に存在するダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを対象にすると著しい効果がある。
【０００９】
また、エタノールを利用したことで、特異的な定色反応が起こるのを防止し、着色等の汚染をなくすことができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。しかし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００１１】
＜実施例１＞
実施例１は溶剤に浸漬した場合であり、その効果は以下の通りである。
ダニ培養物から分離、凍結乾燥したダニ虫体１ｍｇを０、５０、１００ｖ／ｖ％エタノール溶液１ｍｌに１０分間浸漬し、ＥＬＩＳＡ法にてアレルギー患者ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）との結合能を調査した。このＥＬＩＳＡ法は次の通りである。
【００１２】
重炭酸塩緩衝液（Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で１０μｇ／ｍｌに希釈した抗原液をマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ３９１２，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）のウェルに５０μｌ加え、２５℃で２時間静置して抗原の固定化を行った。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＰＢＳで洗浄後、２００μｌの阻止緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳＴ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５％ｓｋｉｎ  ｍｉｌｋ）を加え、２５℃で２時間静置した。再び、ＰＢＳＴ、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳで４、８、１６倍に希釈したダニ喘息患者プール血清をそれぞれ５０μｌずつ加え、２５℃で１２時間静置した。ＰＢＳＴ、ＰＢＳで洗浄後、１０００倍に希釈したアフィニティー分離山羊抗体抗−（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｔｉ−（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｃｈａｉｎ））ビオチン抱合体（Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））をプレートにそれぞれ５０μｌずつアプライし、２５℃で２時間静置した。ＰＢＳＴ、ＰＢＳで洗浄後、１０００倍に希釈したＨＰＲ−ストレプタヴィディン（ＨＰＲ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｚｙｍｅｄ）を５０μｌアプライし、２５℃で１時間静置した。ＰＢＳＴ、ＰＢＳで洗浄後、１００μｌの発色液を加えて発色させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００１３】
その結果を、溶剤に浸漬した場合の効果を示す下記の表１及びエタノール浸漬処理におけるＩｇＥ結合能（水処理区（水浸漬区）のＩｇＥ結合能を１００％とした結合能）を示す図１に示す。
【００１４】
【表１】
0004247418.tif 000002
【００１５】
表１及び図１から明らかなように、５０％エタノール溶液によって結合能は水処理区（水浸漬区）の４０％まで低下した。
本結果は、エタノールがアレルゲンに作用し、アレルギー患者ｌｇＥとの結合価を低下させたかもしくはアレルゲンとマイクロプレートとの結合性を低下させたことを示しており、従来の生理活性に変化を来したことは明確である。
【００１６】
＜実施例２＞
実施例２は溶剤蒸気と接触させた場合であり、その効果は以下の通りである。密閉容器に０、８、２２、１００ｖ／ｖ％エタノール溶液を入れ、十分容器内を飽和させた後、ダニ虫体１ｍｇを取り分けたガラスシャーレを入れ、２５℃で１０時間飽和エタノール蒸気と接触させた。
【００１７】
その結果を、各抗原濃度における水処理区を基準にしたヒスタミン遊離比率を示す下記の表２及びエタノールを空間接触させたアレルゲンのヒスタミン遊離率を示す図２、各抗原濃度における水処理区を基準にしたヒスタミン遊離比率を示す図３、５０％ヒスタミン遊離時の抗原濃度を示す図４にそれぞれ示す。
【００１８】
【表２】
0004247418.tif 000003
【００１９】
図２から明らかなように、２２％エタノール溶液（気中エタノール濃度約７０％）において最も活性を低下させた。
【００２０】
また、表２及び図３から明らかなように、活性低下の割合は抗原濃度が低いほど顕著で、最も効果が現れたのは抗原濃度が０．０５μｇ／ｍｌのときで、活性は５分の１に低下した。
【００２１】
また、図４から明らかなように、ヒスタミン遊離率（このヒスタミン遊離率の測定法については後述する）が５０％となる時に要する抗原濃度は、水処理区では０．９μｇ／ｍｌであったが、２２％エタノール処理区では２．１μｇ／ｍｌであった。つまり、生体に取り込まれた抗原量が２．３倍であるにも関わらず、抗原としての活性は同じであったことになる。
【００２２】
このようにエタノール溶液において濃度が２０ｖ／ｖ％〜１００ｖ／ｖ％のときにアレルゲンをきわめて効果的に失活させることができる。
【００２３】
次に、ヒスタミン遊離率の測定法について述べる。
アレルギーは、好塩基球に結合しているＩｇＥ抗体が抗原と結合することによって架橋され、好塩基球からヒスタミンなどの化学伝達物質が放出されることで発症する。そのため、アレルゲン活性が低下した抗原では、ＩｇＥとの結合が低下するので血球から遊離されるヒスタミン量が低下する。
そこで、抗原をエタノール処理し、アレルギー患者血球からの遊離されるヒスタミン量を高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
【００２４】
・エタノールの処理方法と抗原液の調製
ダニ培養物から分離、凍結乾燥したダニ虫体を１ｍｇずつ直径６ｃｍのガラスシャーレに取り分け、密閉容器（５１０ｍｌ）に０、８、２２、１００ｖ／ｖ％エタノール溶液５０ｍｌを注ぎ、各濃度エタノールで十分容器内を飽和させた。それぞれの容器内に抗原の入ったシャーレを入れ、２５℃で１０時間放置することで、気中エタノールと接触させた。接触終了後、ハンクス緩衝液（Ｈａｎｋｓ′ｂｕｆｆｅｒ）を加えて懸濁し、抗原を回収した。
【００２５】
・アレルギー患者血球液の調製
アレルギー患者血液を１４００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、血球と血漿とに分けた。血球は５倍量のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋｓ′ｂｕｆｆｅｒ）を加え、１４００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を取り除いて３回洗浄した。分離した血漿を洗浄した血球に加え、血球液として抗原刺激に用いた。
【００２６】
・遊離ヒスタミン量測定サンプルの調製
調製した抗原をハンクス緩衝液（Ｈａｎｋｓ′ｂｕｆｆｅｒ）で０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、５０、１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、チューブに１２０μｌ分注した。各希釈液に前記アレルギー患者血球液の調製で調製した血球液を１２０μｌ加え、３７℃、３０分間培養した。１４００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、上清１２０μｌに６０％ＨＣｌＯ４を１２μｌ加え、撹拌して蛋白成分を沈殿させた後、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した上清１００μｌを定量用試料とした。同時に、血球液１２０μｌに等量のハンクス緩衝液（Ｈａｎｋｓ′ｂｕｆｆｅｒ）を加えた後、６０％ＨＣｌＯ４を２４μｌ加え、血球を破壊した後、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上清１００μｌを全ヒスタミン定量用試料とした。ブランクとして抗原刺激しない場合のヒスタミン遊離量を測定した。
【００２７】
・高速液体クロマトグラフィーによる遊離ヒスタミン量の測定
ヒスタミン測定システムは日立製作所高速液体クロマトグラフ分析システムを用いた。前処理カラムとしてＷＨ−Ｃ１８（４．６ｍｍＩＤ×５０ｍｍＬ）、分析用カラムとしてＣＭ−８２５（８．０ｍｍＩＤ×７５ｍｍＬ）、蛍光検出器としてＦ−１０５０を用い定量した。
【００２８】
１００μｌの血球液中の全ヒスタミン量に対する、各濃度の抗原刺激によって遊離されたヒスタミン量（各サンプルヒスタミン量）の割合をヒスタミン遊離率として以下の式で算出した。
ヒスタミン遊離率（％）＝（各サンプルヒスタミン量−ブランク）／（全ヒスタミン量−ブランク）×１００
【００２９】
＜実施例３＞
実施例３はアレルゲンを不溶化した場合であり、その効果は以下の通りである。
ダニ培養物から分離、凍結乾燥したダニ虫体２ｍｇを直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレに取り分け、これに０（水処理区）、５０、７５、１００ｖ／ｖ％エタノール溶液１ｍｌを注ぎ、２５℃８時間処理すると共に、シャーレ内の水分を蒸発させた。１ｍｌのＰＢＳで抗原を回収し、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、上清である可溶性抗原液のタンパク量の測定を行った。このタンパク量の測定は次の通りである。
【００３０】
プロテインアッセイ試薬（バイオラッド社）を用い、そのプロトコールに従ってブラッドフォード（Ｂｒａｄ  ｆｏｒｄ）法にて各エタノール処理区の可溶性タンパク量を測定した。即ち、１０μｌのサンプルに対し、２００μｌの染色液を加え、撹拌した。１５分間室温で静置後、ＯＤ６００ｎｍの吸収を測定した。
【００３１】
水処理区に対する各エタノール処理区の抗原不溶化率を以下の式にて算出した。
抗原不溶化率（％）＝｛１−（各処理区の測定値−ブランク）／（水処理区の測定値−ブランク）｝×１００
【００３２】
その結果を、水処理区に対する各エタノール処理区の抗原不溶化率を示す図５に示す。
【００３３】
図５から明らかなように、７５ｖ／ｖ％エタノールを処理した場合、約４５％の不溶化が認められた。アレルゲンが不溶化することによって、粘膜の透過率が低下すること、凝集沈殿効果によって環境中からのアレルゲンの除去が容易になることが推測される。事実、不溶化したアレルゲンは遠心分離時に低いＧでも短時間で回収され、一定のポアサイズの膜を使用して容易に回収することができた。
このようにアレルゲンを不溶化させることで、アレルゲンの除去を容易にする。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のエタノールを主成分として単独でもしくは共力剤を加えた形で利用したアレルゲン除去方法及び製剤によれば、副作用を伴わない、環境中に有害物質を残さず、かつタンニン酸等のキレート形成による着色等の汚染もなく、環境中に存在するダニ、スギ花粉、ゴキブリ、カビのアレルゲンを効果的に変性して失活させることかでき、アレルゲン除去において著しい効果を生じさせることができる。
しかも、本発明は非常に簡便で汎用性に富み、安価に環境中のアレルゲン量を低下させることができると共に、アレルゲンを不溶化させることで、アレルゲンの除去を容易にし、ひいてはアレルギーの発症予防に有効である。
【００３７】
また、エタノールは、濃度が２０ｖ／ｖ％〜１００ｖ／ｖ％のエタノールを利用することで、アレルゲンをきわめて効果的に失活させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エタノール浸漬処理におけるＩｇＥ結合能を示す図表。
【図２】エタノールを空間接触させたアレルゲンのヒスタミン遊離率を示す図表。
【図３】各抗原濃度における水処理区を基準にしたヒスタミン遊離比率を示す図表。
【図４】５０％ヒスタミン遊離時の抗原濃度を示す図表。
【図５】水処理区に対する各エタノール処理区の抗原不溶化率を示す図表。
【図１】
0004247418.tif 000004
【図２】
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【図３】
0004247418.tif 000006
【図４】
0004247418.tif 000007
【図５】
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