(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法であって、該方法は：
（ａ）以下の、
（１）少なくとも１つの融合タンパク質を含む固相であって、但し該少なくとも１つの融合タンパク質は、ヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭと特異的に結合する少なくとも１つのヒトサイトメガロウイルスエピトープを有する少なくとも１つのペプチドを含んで成るところのＡ１Ｃ２及びＦ３含有融合タンパク質である前記固相、
（２）患者試料、及び
（３）ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３
の混合物を用意するステップ；
（ｂ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を、前記少なくとも１つの融合タンパク質並びに前記ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３に特異的に結合させるステップ；
（ｃ）前記固相上に含まれた前記少なくとも１つの融合タンパク質と特異的に結合したＩｇＭ抗体を検出するためにＩｇＭコンジュゲートを加えるステップ；及び
（ｄ）患者試料中のヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体のレベルを測定するために前記固相に結合したＩｇＭ抗体を検出するステップ；
を含み、
但し、前記ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の添加量は、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記固相上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するのに十分な量であるが、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記固相上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するには不十分な量であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのヒトサイトメガロウイルスエピトープがｐｐ１５０由来であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記固相がヒトサイトメガロウイルスｐｐ５２由来Ｈ１０／ｐｐ１５０由来Ａ１Ｃ２（配列番号５）／ｐｐ１５０由来Ｆ３（配列番号６）の融合タンパクを含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３がヒトサイトメガロウイルスｐｐ１５０由来Ａ１Ｃ２（配列番号５）及びｐｐ１５０由来Ｆ３（配列番号６）から成ることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項５】
固相がミクロ粒子からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
固相が材料のストリップからなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の濃度が、それぞれの少なくとも１つペプチドについて１μｇ／ｍｌから２５μｇ/ｍｌである、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
ヒトサイトメガロウイルス感染の検出に適した試薬であって、該試薬は、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有する希釈剤中に懸濁されたミクロ粒子を含み、但し該ミクロ粒子はヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭと特異的に結合する少なくとも１つのヒトサイトメガロウイルスエピトープを有する少なくとも１つのペプチドを含んで成るところのＡ１Ｃ２及びＦ３含有融合タンパク質によりコートされており、且つ、前記希釈剤中のペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の含有量は、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ミクロ粒子上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するのに十分な量であるが、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ミクロ粒子上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するには不十分な量であることを特徴とする前記試薬。
【請求項９】
前記ヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭと特異的に結合する少なくとも１つのヒトサイトメガロウイルスエピトープを有する少なくとも１つのペプチドにおいて、ヒトサイトメガロウイルスｐｐ１５０由来エピトープにｐｐ５２由来Ｈ１０が更に融合されていることを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の試薬。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのペプチドがＡ１Ｃ２（配列番号５）及びＦ３（配列番号６）を含むことを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の試薬。
【請求項１１】
前記希釈剤中のペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の濃度が、それぞれの少なくとも１つペプチドについて１μｇ／ｍｌから２５μｇ/ｍｌである、請求の範囲第８項に記載の試薬。
【請求項１２】
ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含む試薬であって、但し該ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の含有量が、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と固相上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するのに十分な量であるが、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と固相上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するには不十分な量であることを特徴とする前記試薬。
【請求項１３】
前記ペプチドがＡ１Ｃ２（配列番号５）及びＦ３（配列番号６）を含むことを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の試薬。
【請求項１４】
ヒトサイトメガロウイルス感染の検出に適したキットであって、該キットは、
（ａ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有する希釈剤中に懸濁されたミクロ粒子であって、該ミクロ粒子はヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭと特異的に結合する少なくとも１つのヒトサイトメガロウイルスエピトープを有する少なくとも１つのペプチドを含んで成るところのＡ１Ｃ２及びＦ３含有融合タンパク質によりコートされており、且つ、該希釈剤は、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ミクロ粒子上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するのに十分な量であるが、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ミクロ粒子上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するには不十分な量で前記ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有することを特徴とする、該希釈剤中に懸濁されたミクロ粒子、
（ｂ）希釈液中のＩｇＭコンジュゲート、及び
（ｃ）遮断剤を含有する緩衝希釈剤
を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのペプチドがｐｐ１５０由来であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項１６】
前記ヒトサイトメガロウイルスが精製組換えヒトサイトメガロウイルス抗原を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのペプチドがペプチドＡ１Ｃ２（配列番号５）及びＦ３（配列番号６）を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項１８】
前記（ａ）の希釈剤が緩衝スクロース／仔ウシ血清希釈剤であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項１９】
前記（ｂ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ酵素コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項２０】
前記（ｂ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ蛍光コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項２１】
前記（ｂ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ化学発光コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項２２】
前記（ｂ）の希釈液が緩衝仔ウシ血清であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項２３】
前記（ｃ）の遮断剤が仔ウシ血清であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のキット。
【請求項２４】
ヒトサイトメガロウイルス感染の検出に適したキットであって、該キットは、
（ａ）ヒトサイトメガロウイルス抗原を含む材料のストリップ、
（ｂ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有する試料希釈緩衝剤であって、但し該ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドの含有量が、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ストリップ上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するのに十分な量であるが、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体と前記ストリップ上のヒトサイトメガロウイルス抗原とが結合することを防止するには不十分な量である、前記希釈緩衝剤、
（ｃ）希釈液中のＩｇＭコンジュゲート、
（ｄ）緩衝洗浄液、及び
（ｅ）発色試薬
を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのペプチドがペプチドＡ１Ｃ２（配列番号５）及びＦ３（配列番号６）を含むことを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【請求項２６】
前記材料のストリップがニトロセルロースからなることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【請求項２７】
前記ヒトサイトメガロウイルス抗原が精製したウイルス及び組換えヒトサイトメガロウイルス抗原からなることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【請求項２８】
前記（ｃ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ酵素コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【請求項２９】
前記（ｃ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ蛍光コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【請求項３０】
前記（ｃ）のコンジュゲートが抗−ヒトＩｇＭ化学発光コンジュゲートであることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、ヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体の検出用酵素イムノアッセイの特異性を改善するためのヘルペスウイルスタンパク質由来のペプチドの使用に関する。
【０００２】
２．従来技術の検討
ヘルペスウイルス感染は、通常血清学的方法、すなわち今まで血清反応が陰性であった被検者におけるヘルペスウイルスに対する抗体の出現の証明、により診断されている。ヘルペスウイルスＩｇＭ抗体は、免疫コンピテント被検者における一次ヘルペスウイルス感染の鋭敏で特異的なインジケータである。しかしながら、数人の患者においては低レベルのＩｇＭ抗体しか生じないので、前記抗体の検出は大きく変化する。
【０００３】
ヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出するためにヘルペスウイルス抗原を使用するアッセイの問題は、低リスクの被検者中に存在する低レベルのヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体がしばしば検出されるほど鋭敏なことである。換言すると、前記アッセイでは、余りに多くの偽陽性結果を示す。例えば０〜８ヶ月のような最近のヘルペスウイルス感染の診断は疑わしい。なぜならば、以前被ったヘルペスウイルス感染に起因する無症候性再活性化を経験している被験者中に存在する低レベルのＩｇＭ抗体も検出され得るからである。アッセイの特異性を改善するために試薬中のヘルペスウイルス抗原量を低減すると、アッセイの感度も低下する。換言すると、過去８ヶ月以内に感染を被っていない無症候性患者において陽性結果が得られることは望ましくない。従って、最近の感染を示すＩｇＭ抗体を検出するが、最近の感染を示さないＩｇＭ抗体は検出しないヘルペスウイルス用アッセイを提供することが望ましい。
【０００４】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヒトに偏在するヘルペスウイルスである。ＨＣＭＶが健康な成人において病因となることはまれであるが、（ＨＩＶ感染したヒトや移植レシピエントのような）免疫低下した被検者では幾つかの病気に関係している。また、ＨＣＭＶはヒトにおける先天性感染の最も一般的な病因である。ダウン症候群を除けば、子宮内一次感染が知能遅延の公知の原因の第一位である。二次感染により、余り重篤でない合併症が生ずる。感染は無症状であったりＨＣＭＶに特異的でない（発熱や白血球減少のような）症状を伴うので、臨床検査方法は急性ＨＣＭＶ感染を診断する唯一の手段である。ＨＣＭＶ感染は、病理学的材料中のウイルスまたはウイルス成分を直接検出するか、または血清学的に間接的に検出することにより診断され得る。一次ＨＣＭＶ感染は、専ら血清学的方法、すなわち今まで血清反応が陰性であった被検者におけるＨＣＭＶに対する抗体の出現を証明することにより診断されている。ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭは免疫コンピテント被検者における一次ＨＣＭＶ感染の鋭敏で特異的なインジケータであり、移植レシピエントでは活性ウイルスの再活性化中に非常にしばしば生ずる。しかしながら、その検出は大きく異なり、異なる市販キットを使用して得られる結果は殆ど一致しないことが判明している。
【０００５】
欧州特許出願第２６２５３１号明細書には、ウイルス遺伝子のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｙ／Ｎ断片中に局在する遺伝子によりコードされる、１５０ｋＤのＨＣＭＶ構造リンタンパク質の免疫原性部分を開示している。この欧州特許出願によれば、前記したｐｐ１５０の免疫原性部分は、ＡＤ  １６９菌株のＨＣＭＶゲノムからＥｃｏＲＩ−Ｙ断片の内側に局在する特に約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ１断片によりコードされる。しかしながら、その後のより徹底的な研究により、欧州特許出願第２６２５３１号明細書の開示内容は以下の点で誤りであることが分かった。タンパク質ｐｐ１５０はＵＬ  ３２によりコードされることが判明し、１．５ｋｂよりもかなり長いことが判明し、最後にＡＤ  １６９菌株のＥｃｏＲＩ−Ｙ断片内に規定されるようにＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片のかなり外側にあることが判明したからである。更に、ＥｃｏＲＩ−Ｙ断片はＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｙ／Ｎ断片の完全に外側にある。
【０００６】
１９９６年１２月２７日に出願された米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書によれば、（実質的に未測定のためにポリペプチドを正しく同定していない）上記欧州特許出願明細書に記載されているタンパク質材料により示される免疫原性と、後に同定される（Ｎｏｖａｋ，Ｊ．Ｐ．ら，“ヒトサイトメガロウイルスリンタンパク質ｐｐ１５０の血清学的に関連領域の合成ペプチドを用いるマッピング(Mapping of serologically relevant regions of human cytomegalovirus phosphoprotein pp150 using synthetic peptides)”，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１４０９−１４１３（１９９１））、５’→３’方向にＵＬ３２ヌクレオチド１７８２−１８４２によりコードされるエピトープＡ１Ｃ２、すなわちｐｐＵＬ３２のアミノ酸５９５−６１４に相当する領域のペプチドへの封入とは相関関係がある。
【０００７】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は、ヒトサイトメガロウイルスに対して産生した抗体、特にＩｇＭ及びＩｇＧとの免疫反応により結合し得、適切な血清学的試験において前記抗体を検出するための抗原として使用され得、ウイルス及び／または感染細胞ライゼートと実質的に同じ力価を有する組換えタンパク質材料、特に融合タンパク質を開示している。米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は更に、前記タンパク質材料から誘導される診断試薬及びキットも開示している。
【０００８】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は、酵素イムノアッセイによりヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭを検出するための組換え抗原、特に融合タンパク質を開示している。米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は更に、前記タンパク質材料から誘導される診断試薬及びキットも開示している。
【０００９】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書によれば、タンパク質ｐｐ５２の５’→３’方向に読んでａａ２２−ａａ４３４の範囲の配列の少なくとも一部を有する第１領域、タンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ１００６−ａａ１０４８の範囲の配列の少なくとも一部を有する第２領域、及びタンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ５９５−ａａ６１４の範囲の配列の少なくとも一部を有する第３領域から構成されることを特徴とするヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対する抗体と結合し得る組換えタンパク質材料が提供される。前記領域は、融合タンパク質内で相互に変更可能に配置され得る。
【００１０】
前記領域がｐｐ５２及びｐｐ１５０の配列を完全に含んでいることが好ましく、好ましい実施態様によれば、米国特許第０８／７６５，８５６号明細書の融合タンパク質は５’→３’方向に順次、第１領域、その直ぐ下流に位置する第３領域及びこの第３領域から下流にある第２領域を含み、第３と第２領域の間には架橋配列が挿入されている。前記架橋配列は、５’→３’方向にｌｙｓ  ｌｅｕ  ｇｌｎ  ｇｌｕ  ｐｈｅのアミノ酸配列からなる。配列番号７参照。
【００１１】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は更に、上に定義した融合タンパク質を含む、ＨＣＭＶ感染を血清学的方法により診断するための試薬も提供する。特に、前記診断試薬は、そのアミノ酸配列の少なくとも一部がヌクレオチド００１−ヌクレオチド９００までの配列番号１として配列表に記載したヌクレオチド配列によりコードされる融合タンパク質を含む。
【００１２】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書はまた、前記融合タンパク質に対する少なくとも１つの単一特異性ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体（ＭａＢ）を含む、ＨＣＭＶを血清学的に直接検出するための診断試薬にも関する。
【００１３】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書の別の態様によれば、ヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭを酵素イムノアッセイにより検出するための組換え抗原混合物が提供される。前記混合物は、
（ｉ）ウイルスタンパク質ｐｐ５２の５’→３’方向に読んでａａ２０２−ａａ４３４の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ｈ１０）を有する第１領域と、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ１００６−ａａ１０４８の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ｆ３）を有する第２領域と、同じウイルスタンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ５９５−ａａ６１４の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ａ１Ｃ２）を有する第３領域とを含む第１融合タンパク質であって、前記領域が第１融合タンパク質内で相互に変更可能に配置され得る第１融合タンパク質、
（ｉｉ）ウイルス遺伝子ＵＬ８３によりコードされる主要マトリックスタンパク質ｐｐ６５の５’→３’方向に読んでａａ２９７−ａａ５１０の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列から構成される免疫原領域を含む第２融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ウイルス遺伝子ＵＬ８０ａによりコードされるウイルス集合タンパク質ｐｐ３８の５’→３’方向に読んでａａ１１７−ａａ３７３の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列から構成される免疫原領域を含む第３融合タンパク質
を組合せて含むことを特徴とする。
【００１４】
特に、前記領域は、タンパク質ＣＫＳまたはその少なくとも一部と融合して、ｐｐ５２、ｐｐ１５０、ｐｐ６５及びｐｐ３８のアミノ酸配列を完全に含む。
【００１５】
最後に、米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は、ヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭを酵素イムノアッセイにより検出するためのモノ−及びポリ−エピトープ融合タンパク質の混合物の使用に関する。前記混合物は、
（ｉ）ウイルスタンパク質ｐｐ５２の５’→３’方向に読んでａａ２０２−ａａ４３４の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ｈ１０）を有する第１領域と、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ１００６−ａａ１０４８の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ｆ３）を有する第２領域と、同じウイルスタンパク質ｐｐ１５０の５’→３’方向に読んでａａ５９５−ａａ６１４の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列（Ａ１Ｃ２）を有する第３領域とを含む第１融合タンパク質であって、前記領域が第１融合タンパク質内で相互に変更可能に配置され得る第１融合タンパク質、
（ｉｉ）ウイルス遺伝子ＵＬ８３によりコードされる主要マトリックスタンパク質ｐｐ６５の５’→３’方向に読んでａａ２９７−ａａ５１０の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列から構成される免疫原領域を含む第２融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ウイルス遺伝子ＵＬ８０ａによりコードされるウイルス集合タンパク質ｐｐ３８の５’→３’方向に読んでａａ１１７−ａａ３７３の範囲の配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列から構成される免疫原領域を含む第３融合タンパク質
を組合せて含むことを特徴とする。
【００１６】
米国特許第０８／７６５，８５６号明細書は更に、上記した融合タンパク質混合物の、ヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭを酵素イムノアッセイにより検出するための診断キットを製造するための使用にも関する。
【００１７】
前記融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３のＩｇＧ及びＩｇＭ反応性は、１つの単一試験キット中に３つの異なるエピトープを有するタンパク質を適切に組合せて得られる場合に比してかなり高いことが判明した。従って、相乗効果が生ずる。これは多分、通常遠く離れている前記エピトープを同じウイルスタンパク質（例えば、ｐｐＵＬ３２のＡ１Ｃ２及びＦ３）または異なるタンパク質（例えば、ｐｐＵＬ４４のＨ１０）上に相互に接近して配置することにより、元の完全ウイルスタンパク質中及び／またはビリオン上に存在するように配座エピトープが擬態するためであろう。
【００１８】
上記配列を含む新規な融合タンパク質は、感染被検者のＩｇＧ及びＩｇＭとの結合において精製ビリオンと同様に活性であり、従って品質及び量の点で実際ＨＣＭＶ感染の血清診断用診断キットを製造する際に精製ビリオン及び／または感染細胞と置換され得る標準化抗原が作成され得ることが実際判明している。明らかに、前記したエピトープは、配列番号２の順でまたはその間に配列番号１のヌクレオチド７５７−７７１に対応するような架橋配列を挿入し得る他の配列で米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載されているような新規な融合タンパク質に含められ得る。
【００１９】
米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書の発明の別の態様に従い、上記した結果から出発して、発明の第１の態様のポリエピトープタンパク質を更に研究し、前記領域を異なる様式で配置し、タンパク質ＣＫＳと一緒に融合発現させた組換え材料を他のＨＣＭＶタンパク質の免疫原領域と組合せてＩｇＭに対して非常に有効な融合タンパク質混合物を得た。
【００２０】
米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書の融合タンパク質は、そのＨＣＭＶ  ＩｇＭ、特に感染の初期相中に産生されるＨＣＭＶ  ＩｇＭを効果的に結合させる能力が実質的に１００％であるので、ＨＣＭＶ特異的抗体を血清学的に検出するための診断試薬を直接製造するために単独でまたは混合して使用され得る。前記試薬は、米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明の融合タンパク質の混合物を最後には他のＨＣＭＶ抗原及び／または複数回反復された免疫原配列を含めたより複雑な融合タンパク質と組合せて含み得る。
【００２１】
米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明の融合タンパク質により表されるタンパク質材料は、ヒトサイトメガロウイルス及び／または各種方法により得られる米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明のタンパク質に対する特異的ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体（ＭａＢ）により表される検出用抗原を血清学的に検出するための診断試薬を公知の方法を用いて製造するために更に使用され得る。
【００２２】
米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明のタンパク質を含む上記診断試薬は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対する抗体の産生を血清学的方法により検出するための診断キットを製造するために使用され得、ここで試薬はニトロセルロース紙（ブロッティング）上に吸着されている。最後に、米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明のタンパク質は、精製後、手動または完全もしくは部分自動化されている、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテックス凝集試験、ＲＩＡ及びＨＣＭＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの存在を血清学的にスクリーニングするための公知方法において使用され得る。
【００２３】
融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３を使用するアッセイの問題は、低リスクの被検者中に存在する低レベルのＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体もしばしば検出される程鋭敏であることである。換言すると、前記アッセイは、余りに多くの偽陽性結果を示す。以前被ったＨＣＭＶ感染のために無症候性再活性化を経験している被験者中に存在する低レベルのＩｇＭ抗体が検出されるおそれがあるので、０〜８ヶ月のような最近のＨＣＭＶ感染の診断は疑わしい。アッセイの特異性を改善するために試薬中の融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３の量を低減すると、アッセイの感度も低下する。換言すると、過去８ヶ月以内に感染を被っていない無症候患者において陽性結果が得られることは望ましくない。従って、最近の感染を示すＩｇＭ抗体を検出するが、最近の感染を示さないＩｇＭ抗体は検出しないＨＣＭＶのアッセイを提供することが望まれている。
【００２４】
（発明の要旨）
１つの態様で、本発明は、低リスクの被検者中に存在する低レベルのヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体は検出せずに最近の感染を示すヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出する方法を提供する。本発明はまた、低リスクの被検者中に存在する低レベルのヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体は検出せずに最近の感染を示すヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出する際に使用する試薬をも提供する。
【００２５】
本発明の前記方法は、
（ａ）ヘルペスウイルス抗原の少なくとも一部を含む固相を用意するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の固相に患者試料を導入するステップ、
（ｃ）ヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体をステップ（ａ）の固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを導入するステップ、
（ｄ）ヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を、前記したヘルペスウイルス抗原の一部及び前記したヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得るペプチドに特異的に結合させるステップ、
（ｅ）患者試料中のヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体のレベルを測定するステップ
を含む。
【００２６】
本発明の１実施態様において、前記固相はミクロ粒子である。この実施態様では、ヘルペスウイルス抗原をコートしたミクロ粒子を、ヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得るペプチドを含有する希釈剤中に懸濁させる。患者試料を緩衝液で希釈し、次いで希釈剤中に懸濁させたコートミクロ粒子とインキュベートする。ヘルペスウイルス抗原に対するヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体は、ミクロ粒子（固相）及びヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得るペプチド（液相）に結合させる。次いで、固相と液相を分離し、ミクロ粒子に結合したＩｇＭ抗体のみをヒトＩｇＭ特異的コンジュゲートを用いて検出する。
【００２７】
本発明の別の態様において、固相は材料のストリップである。この実施態様では、ニトロセルロースストリップにヘルペスウイルスから精製したヘルペスウイルス抗原を含浸させる。患者試料を、ヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得るペプチドを含有する緩衝液で希釈する。次いで、ヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得るペプチドを含有する希釈試料をニトロセルロースストリップに適用する。ヘルペスウイルス抗原に対するヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体は、ニトロセルロース（固相）及びヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得るペプチド（液相）に結合させる。次いで、固相と液相を分離し、ニトロセルロースに結合したＩｇＭ抗体のみをヒトＩｇＭ特異的コンジュゲートを用いて検出する。
【００２８】
本発明の１実施態様において使用するのに適した試薬は、ヘルペス抗原の少なくとも一部をコートしたミクロ粒子を含有する溶液を、ヘルペスウイルス抗原に対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有する希釈剤中に懸濁して含む。本発明の別の実施態様において使用するのに適した試薬は、ヘルペスウイルス抗原に対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有する試料希釈剤を含む。
【００２９】
自動化装置において本発明で使用するのに適したキットは、
（ａ）ヘルペスウイルス抗原、好ましくはヘルペスウイルス抗原に対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを含有する希釈剤中に懸濁させたヘルペスウイルス抗原の少なくとも一部をコートしたミクロ粒子、
（ｂ）希釈剤中のＩｇＭコンジュゲート、及び
（ｃ）遮断剤を含有する緩衝希釈剤
を含む。
【００３０】
前記方法、試薬及びキットにおいて、前記したヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドの量は、急性または最近のヘルペスウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を結合させるのに十分であるが、前記したヘルペスウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドが急性または最近のヘルペスウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を結合させる程多くない。
【００３１】
１つの特定の態様において、本発明は、低リスクの被検者中に存在する低レベルのＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体は検出せずに最近の感染を示すＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体を検出する方法を提供する。本発明はまた、低リスクの被検者中に存在する低レベルのＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体は検出せずに最近の感染を示すＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体を検出する際に使用するための試薬をも提供する。
【００３２】
本発明のこの態様の方法は、
（ａ）ヒトサイトメガロウイルスの少なくとも一部、好ましくはｐｐ１５０タンパク質（以下、“ｐｐ１５０”）を含む固相を用意するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の固相に患者試料を導入するステップ、
（ｃ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体をステップ（ａ）の固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドを導入するステップ、
（ｄ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を、前記したヒトサイトメガロウイルスの一部（好ましくは、ｐｐ１５０）及び前記したヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得るペプチドに特異的に結合させるステップ、
（ｅ）患者試料中のヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体のレベルを測定するステップ
を含む。
【００３３】
本発明のこの態様の好ましい実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ１５０の融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３を含む固相を用意するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の固相に患者試料を導入するステップ、
（ｃ）ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ１５０のペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３をステップ（ａ）の固相に導入するステップ、
（ｄ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を、融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３及びペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３に特異的に結合させるステップ、
（ｅ）患者試料中のヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体のレベルを測定するステップ
を含む。
【００３４】
本発明の１つの好ましい実施態様において、固相はミクロ粒子である。この好ましい実施態様では、融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３をコートしたミクロ粒子を、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有する緩衝スクロース／仔ウシ血清希釈剤中に懸濁させる。生物学的サンプルを緩衝液で希釈し、次いで緩衝スクロース／仔ウシ血清／ペプチド希釈剤中に懸濁させたコートミクロ粒子とインキュベートする。ｐｐ１５０に対するＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体はミクロ粒子（固相）及びペプチド（液相）に結合させる。次いで、固相と液相を分離し、ミクロ粒子に結合したＩｇＭ抗体のみをヤギ抗−ヒトＩｇＭ特異的コンジュゲートを用いて検出する。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施態様において、固相は材料のストリップである。この実施態様では、ニトロセルロースストリップにウイルスから精製したｐｐ１５０及び融合タンパク質Ａ１Ｃ２／Ｆ３を含浸させる。生物学的サンプルを、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有する緩衝液で希釈する。次いで、ペプチドを含有する希釈サンプルをニトロセルロースストリップに適用する。ｐｐ１５０に対するＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体は、ニトロセルロース（固相）及びペプチド（液相）に結合させる。次いで、固相と液相を分離し、ニトロセルロースに結合したＩｇＭ抗体のみをヤギ抗−ヒトＩｇＭ特異的コンジュゲートを用いて検出する。上記実施態様は、援用により本明細書に含まれるとするＰＣＴ／ＵＳ  ９７／１３９４２に記載されている。
【００３６】
本発明の１つの実施態様で使用するのに適した試薬は、ヒトサイトメガロウイルスの少なくとも一部、好ましくはｐｐ１５０、より好ましくは融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３をコートしたミクロ粒子を含有する溶液を、ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチド、好ましくはペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有する希釈剤中に懸濁して含む。本発明の別の実施態様で使用するのに適した試薬は、ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチド、好ましくはペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有するサンプル希釈剤を含む。
【００３７】
自動化装置において本発明で使用するのに適したキットは、
（ａ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチド（好ましくは、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３）を含有する希釈剤中に懸濁させた、ヒトサイトメガロウイルスの少なくとも一部（好ましくはｐｐ１５０、より好ましくは精製組換えＨＣＭＶ抗原）をコートしたミクロ粒子、
（ｂ）希釈剤中のＩｇＭコンジュゲート、及び
（ｃ）遮断剤を含有する緩衝希釈剤
を含む。（ａ）の希釈剤が緩衝スクロース／仔ウシ希釈剤であることが好ましい。（ｂ）のコンジュゲートがヤギ抗−ヒトＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲートであり、（ｂ）の希釈剤は緩衝仔ウシ血清であることが好ましい。（ｃ）の遮断剤は仔ウシ血清であることが好ましい。
【００３８】
本発明の別の実施態様で使用するのに適したキットは、
（ａ）ＨＣＭＶ抗原（好ましくは、精製ウイルス及び組換えＨＣＭＶ抗原）を含む材料のストリップ（好ましくは、ニトロセルロース製ストリップ）、
（ｂ）ヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチド（好ましくは、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３）を含有するサンプル希釈緩衝液、
（ｃ）希釈剤中のＩｇＭコンジュゲート（好ましくは、緩衝仔ウシ血清希釈剤中のヤギ抗−ヒトＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲート）、
（ｄ）緩衝洗浄液、及び
（ｅ）発色試薬
を含む。
【００３９】
前記方法、試薬及びキットにおいて、前記したヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドの量は、急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体を結合させるのに十分でなければならないが、前記したヒトサイトメガロウイルスに対するＩｇＭ抗体を固相に特異的に結合させ得る少なくとも１つのペプチドが急性または最近のヒトサイトメガロウイルス感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのヒトサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ抗体を結合させる程多くてはならない。
【００４０】
本発明は、患者試料中のヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出するための診断イムノアッセイの性能を改善する。改善された性能には、高い診断アッセイ特異性と高い診断アッセイ感度、低い偽陽性及び偽陰性結果、急性及び最近の感染を示すヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体の改良された検出、急性及び最近の感染を示さないヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体の改良された非検出、及びウイルス単離、抗原血またはＰＣＲにより測定されるようなウイルス学的診断との良好な相関関係が含まれるが、これらに限定されない。ヒトサイトメガロウイルスの場合、最近の感染は過去８ヶ月間に被った感染である。
【００４１】
（詳細な記載）
本明細書中、用語「ヘルペスウイルス」は、１型及び２型単純ヘルペスウイルス、水瘡ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス並びにヒト６型、７型及び８型ヘルペスウイルスを含めたヒトヘルペスウイルスを指す。これらの大きな包膜ＤＮＡウイルスは広スペクトルに亘る病気に関与し、一次感染後体内に潜伏するようになり、ある不特定の時間経過後に再活性化する可能性があるという独自の特徴を有する。ヘルペスウイルスは、援用により本明細書に含まれるとするＪｏｋｌｉｋ，Ｗｉｌｌｅｔｔ及びＡｍｏｓ編、Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１８版、コネチカット州ノーウォークに所在のＡｐｐｌｅｔｏｎ−ＣｅｎｔｕｒｙＣｒｏｆｔｓ（１９８４）発行、ｐｐ．９９７−１０１２に詳細に記載されている。
【００４２】
本明細書中、用語「低リスク」は、最近ＨＣＭＶ感染を被らなかった被検者を指す。「最近」とは過去０〜８ヶ月以内を指す。
【００４３】
本明細書中、用語「固相」は、そこにアナライト、アナライト複合体またはアッセイ試薬が結合するようになり、そこから未反応のアッセイ試薬、試験サンプルまたは試験溶液が分離され得る任意の材料を指す。固相は通常「固相試薬」を形成すべくその表面に結合した特定の結合メンバーを有しており、その結合メンバーによりアナライトまたは別のアッセイ試薬が結合し得る。固相に結合させる特定結合メンバーは、直接アナライトに結合するかまたは補助的特異的結合メンバーを用いて間接的にアナライトに結合するように選択され得、固相試薬が試験サンプル及び／または他のアッセイ試薬と接触する前、その間またはその後に固相試薬に結合し得る。
【００４４】
勿論、固相は複数の成分を含んでいてもよく、固定化特異的結合メンバーは固相の任意の成分またはすべての成分に直接結合し得ると理解されたい。例えば、固相の複数成分には、固相の二次または補助成分内に物理的、化学的または生化学的手段により物理的に捕捉もしくは保持及び固定化される固相試薬が含まれ得る。別の例として、アナライト特異的結合メンバーは不溶性ミクロ粒子に結合し得、その後このミクロ粒子は多孔質材料により保持される。「保持」とは、一旦多孔質材料上に保持されたミクロ粒子は多孔質材料内の別の場所に実質的に移動することができないことを意味する。それ自体が固相試薬であり得る第１固相成分は、第１固相成分が試験サンプル及び／または他のアッセイ試薬と接触する前、その間またはその後に固相の補助成分により保持され得る。しかしながら、多くの実施態様では、特異的結合メンバーは単一の固相成分に結合または付着し、その後こうして形成された可動性固相試薬を試験サンプルまたは他のアッセイ試薬と接触させている。
【００４５】
特異的結合メンバーを、例えば固相に対して特異的結合メンバーを受動的に非共有結合させるような物理的手段により、または共有結合を介するような化学的手段により固相に結合させてもよい。特異的結合メンバーは、その後の反応及び洗浄ステップ中に特異的結合メンバーが実質的に全く脱着しないように固相に結合していなければならない。選択される特異的結合メンバー及びカップリング方法に関係なく、特異的結合メンバーは固相にカップリングさせた後抗体に結合し得るものでなければならない。
【００４６】
本発明の固相は、ミクロ粒子に化学的または物理的に結合した抗体に対して特異的な結合メンバーを有するミクロ粒子の混合物であり得る。本発明で使用され得るミクロ粒子は好ましくはポリマー材料から構成され、より好ましくはスチレン単位を有するポリマーまたはアクリレート単位を有するポリマーから誘導されるミクロ粒子である。好ましいミクロ粒子は実質的に球形であり、好ましくは約０．１μｍ〜約０．２５インチの半径を有する。試料サンプルからミクロ粒子を分離するための好ましい方法は、多孔質マトリックス（例えば、ガラス繊維）上にミクロ粒子を取り込むことを含む。
【００４７】
本発明で使用され得る他の固相には、ミクロ粒子に化学的または物理的に結合した抗体に対して特異的な結合メンバーを有する磁化ミクロ粒子の混合物が含まれる。本発明において有用な磁化ミクロ粒子は酸化鉄または酸化クロムからなるコアとポリマーコーティングを有する。前記コーティングがスチレン単位を有するホモポリマー及びコポリマー、カルボキシル化スチレン単位を有するホモポリマー及びコポリマー、または（メタ）アクリレート単位を有するホモポリマー及びコポリマーからなることが好ましい。
【００４８】
当業者に公知の他の固相には、反応トレーのウェルの壁、微量滴定トレーのウェル、チューブ、ポリマービーズ、ニトロセルロースストリップ、膜等が含まれる。天然材料、合成材料及び合成的に改質した天然材料が固相材料として使用され得る。前記材料には、多糖類、例えば紙のようなセルロース材料及び酢酸セルロースやニトロセルロースのようなセルロース誘導体；シリカ；無機材料、例えば失活アルミナ、ケイソウ土、ＭｇＳＯ４、または多孔質ポリマーマトリックス（ここで、マトリックスは１つ以上のポリマー、例えばポリ塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマーや塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーのような塩化ビニルのホモポリマー及びコポリマーから構成され得る）中に均一に分散させた他の無機微細材料；天然繊維（例えば、綿）及び合成繊維（例えば、ナイロン）；多孔質ゲル、例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン；ポリマーフィルム、例えばポリアクリルアミド；等が含まれる。いずれにせよ、固相は所望の物理的形態を維持するのに十分な強度を有していなければならず、検出可能な信号の発生を妨害してはならない。強度は支持体を用いても付与され得る。
【００４９】
本明細書中、用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基により結合した２つ以上のアミノ酸を含む天然もしくは合成化合物を指す。本発明で使用するのに適したペプチドは、化学的合成により、組換え方法により製造され得る。
【００５０】
本明細書中、用語「コンジュゲート」は、２つ以上の分子が共有結合してハイブリッド分子を形成しているもの、例えば標識基に結合した抗体を指す。用語「標識」は、抗体とアナライトまたはアナライトアナログとの間の反応が検出され得るように抗体、アラナイトまたはアラナイトアナログに結合させる基を指す。代表的な標識の例には、酵素、放射性標識、フルオレセイン、及び光を発する化学物質が含まれる。標識は、抗体または抗体誘導体に結合し得且つ肉眼でまたは道具を用いて検出され得る信号を発生し得る任意の物質である。本発明で使用するのに適した標識は多種であり、その中には触媒、酵素、リポソーム、及び信号発生物質（例えば、色素源、触媒、蛍光化合物、化学ルミネセント化合物、酵素等）を含有する他の小胞が含まれる。標識として使用するのに適した多数の酵素が、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第４，２７５，１４９号明細書に記載されている。前記酵素には、フルオレセインジ（ガラクトピラノシド）、ニトロブルーテトラゾリウム、３，５’，５，５’−テトラニトロベンジジン、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、国際特許出願公開第８８１００６９４号明細書及び欧州特許出願公開第０−２５４−０５１号明細書に記載されているジオキセタンのような化学ルミネセント酵素基質、並びにそれらの誘導体及びアナログのような酵素基質と一緒に使用されるグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ及びペルオキシダーゼ（例えば、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれる。好ましくは、標識は酵素であり、最も好ましい酵素はアルカリホスファターゼである。
【００５１】
本明細書中、融合タンパク質中の命名タンパク質またはペプチド、例えばＨ１０、Ａ１Ｃ２、Ｆ３が斜線“／”で分かれているときには、その命名タンパク質が融合タンパク質中に任意の順序で存在することを意味する。融合タンパク質中の命名タンパク質またはペプチド、例えばＨ１０、Ａ１Ｃ２、Ｆ３がハイホン“−”で分かれているときには、その命名タンパク質が融合タンパク質中に指定の順序で存在していなければならないことを意味する。
【００５２】
本発明はヘルペスウイルスのすべての種に関する。本発明の説明を簡潔にするために、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）について詳細に検討する。しかしながら、ヒトサイトメガロウイルスに関連して検討した原理は他のすべての種のヘルペスウイルスにも向けられることに留意されるべきである。
【００５３】
ｐｐ１５０としても公知の１５０Ｋｄを有するリン酸化構造タンパク質はＨＣＭＶの構成成分である。タンパク質ｐｐ１５０は、ＵＬ８２遺伝子によりコードされる１０４８アミノ酸から構成され、ＨＣＭＶ疾患の患者から得られる試料中に存在するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に対して反応性であることが判明している数個の免疫原領域を含む。ｐｐ１５０の免疫原領域は、ウイルス感染細胞、感染細胞から得られるウイルスライゼート及び精製ビリオンから入手可能である。ｐｐ１５０の免疫原領域はまた、ｐｐ１５０アミノ酸配列に由来するペプチドを化学的に合成することにより、または発現パートナー（融合タンパク質）に融合しているかまたはしていないＵＬ３２遺伝子またはその一部を適当な原核または真核宿主中で発現システムを用いて発現させることにより得られ得る。ＵＬ３２遺伝子に由来するｐｐ１５０の免疫原領域は宿主生物から精製され得る。こうして得られ得るｐｐ１５０の免疫原領域は、ＨＣＭＶ感染被検者中の抗体を検出するために固相と結合させた免疫試薬として使用され得る。
【００５４】
ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３の目的は、急性または最近感染を示さない低レベルのｐｐ１５０  ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体に結合し、これにより固相への結合及びその後のＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイでの検出を防止することである。
【００５５】
本発明で使用するのに適したペプチドには、Ａ１Ｃ２及びＦ３が含まれる。ペプチドＡ１Ｃ２は以下のアミノ酸配列（配列番号５）
（ｐｐ１５０の５９５−６１４ａａ）：
ＴＰＴＰＶＮＰＳＴＡＰＡＰＡＰＴＰＴＦＡ
を有する。ペフチドＦ３は以下のアミノ酸配列（配列番号６）
（ｐｐ１５０の１０    ０６−１０４８ａａ）：
ＧＳＳＰＱＫＳＧＴＧＰＱＰＧＳＡＧＭＧＧＡＫＴＰＳＤＡＶＱＮＩＬＱＫＩＥＫＩＫＮＴＥＥ
を有する。
【００５６】
ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３は、市販されている自動ペプチド合成装置を用いる合成方法により製造され得る。前記製造方法は当業者に公知である。或いは、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第０８／７６５，８５６号明細書に記載されているような組換え方法により製造され得る。簡単に説明すると、Ａ１Ｃ２及びＦ３アミノ酸配列をコードする遺伝子を、宿主生物中で該遺伝子の発現に適した発現ベクターを用いてクローニングする。次いで、タンパク質を宿主生物から当業者に公知の技術に従って精製する。
【００５７】
本発明で使用するのに好ましいペプチドの最適量はアッセイ毎に決定されなければならない。通常、ペプチドの量は、急性または最近ＨＣＭＶ感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのｐｐ１５０  ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体を結合させるのに十分でなければならない。しかしながら、ペプチドの量は、急性または最近ＨＣＭＶ感染を示す患者試料中に存在する中〜高レベルのｐｐ１５０  ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体を結合させる程多くてはならない。融合タンパク質に対するペプチドの重量比は、好ましくは約０．３：１〜約３：１の範囲である。Ａ１Ｃ２対Ｆ３の重量比は、好ましくは約１：２〜約２：１である。
【００５８】
ペプチドは、通常粉末の形態で供給される。本発明で使用するのに適したペプチドは市販されており、カリフォルニア州サンホセに所在のＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ペプチドは水に溶解後試薬に形成される。
【００５９】
本発明のアッセイを実施するために必要な他の成分には、少なくとも１つの遮断剤が含まれる。遮断剤の目的は、イムノグロブリンの固相への非特異的結合を低下させることにある。本発明で好ましい遮断剤は仔ウシ血清である。仔ウシ血清は幾つかのソース、例えばＧＩＢＣＯから市販されている。
【００６０】
自動化アッセイにおいて使用するのに適した典型的なＨＣＭＶは比較例Ａに後記されている。
【００６１】
本発明で使用するのに適した試薬を製造するために、ペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を水に溶解する。次いで、溶解したペプチドを、ＨＣＭＶ試薬中の各添加ペプチド１ｍｌあたり約１μｇ〜約１０μｇ、好ましくは約６μｇの最終濃度を与えるように比較例Ａに記載の試薬に添加する。勿論、成分の濃度は、別のアッセイフォーマットのためには組成を最適化するために変更することができる。
【００６２】
ＨＣＭＶの自動分析のために必要な他の試薬には、
（１）コンジュゲート、好ましくは緩衝仔ウシ血清希釈剤中のヤギ抗−ヒトＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲート（イムノグロブリンに対して酵素を架橋させるためのＴｒａｕｔのスルホ−ＳＭＣＣ架橋剤）、
（２）希釈剤、好ましくは緩衝仔ウシ血清希釈剤
が含まれる。
【００６３】
ＨＣＭＶ  ＩｇＭ低陽性血清（すなわ、インデックス較正物質）を患者の結果（インデックス値）を計算するために使用する。ＨＣＭＶ  ＩｇＭ陽性血清の瓶及びＨＣＭＶ  ＩｇＭ陰性血清の瓶をコントロールとして使用する。インデックス較正物質を使用して、サンプル結果、すなわちサンプルのインデックス値を計算する前に計器を校正する。すべてのサンプルを計器を用いて測定し、サンプル中に存在するＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体の量に比例するレートカウントとして表す。患者試料のインデックス値は次のようにして計算され得る。
【００６４】
インデックス値＝患者試料のレートカウント／インデックス較正物質のレートカウント。
【００６５】
典型的なカットオフ値は次の通りである：
インデックス値  ０〜０．３９９＝ＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陰性、
インデックス値  ０．４〜０．４９９＝ＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について疑わしい、
インデックス値  ０．５以上＝ＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性。
【００６６】
カットオフ値は、アッセイ感度及び特異性を最適化するためにアッセイの特定環境に従って変更され得る。
【００６７】
ＨＣＭＶのようなヘルペスウイルスを検出するのに適した自動化アッセイは、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３５８，６９１号明細書に記載されている。ヘルペスウイルス（例えば、ＨＣＭＶ）ＩｇＭ抗体のアッセイは、自動化無作為アクセスのミクロ粒子イムノアッセイ技術(automated random access Microparticle Enzyme Immunoassay Technology)に基づいている。前記アッセイのために必要な試薬、例えばミクロ粒子、コンジュゲート及びアッセイ試薬は試薬パック中に収容されている。他のすべてのアッセイ成分、例えば反応容器、マトリックス細胞、直線希釈剤、ミクロ粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）緩衝液及び４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）は装置に備えられている。前記アッセイは通常次のように実施される。
【００６８】
（１）キット中心のピペッティングプローブを用いて、サンプル及び直線希釈剤（約０．０７ｍｌ）を反応容器のサンプルウェルに入れる。
【００６９】
（２）次いで、プローブを用いて、アッセイのために必要な適当容量のアッセイ希釈剤（約０．２５ｍｌ）及びコンジュゲート（約０．０８５ｍｌ）を試薬パックから反応容器の指定ウェルに加える。
【００７０】
（３）ついで、プローブにより、試薬パックからヘルペスウイルス抗原コートミクロ粒子（約０．０９ｍｌ）及び希釈サンプルのアリコート（約０．０６ｍｌ）を反応容器の指定ウェルに入れる。
【００７１】
（４）次いで、反応容器を方法カルーセルに移す。ヘルペスウイルス特異的抗体はヘルペスウイルス抗原をコートしたミクロ粒子に結合して抗原−抗体複合体を形成する。
【００７２】
（５）アッセイ希釈剤のアリコート（約０．０５ｍｌ）を補助カルーセル中のガラス繊維マトリックスに移す。アッセイ希釈剤の別のアリコート（約０．１ｍｌ）を反応混合物に添加する。次いで、反応混合物（約０．１２ｍｌ）をガラス繊維マトリックスに移す。ミクロ粒子はマトリックスに不可逆的に結合させる。
【００７３】
（６）マトリックスをＭＥＩＡ緩衝液で洗浄して、固相のミクロ粒子上のコートヘルペスウイルス抗原に特異的に結合していない抗体を除去する。次いで、アッセイ希釈剤のアリコート（約０．０５ｍｌ）をマトリックスに移す。
【００７４】
（７）マトリックスに、ヤギ抗−ヒトＩｇＭ（μ鎖特異的）抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲートを添加する。このコンジュゲートは、ミクロ粒子上の組換えヘルペスウイルス抗原に結合したＩｇＭ抗体に結合する。
【００７５】
（８）次いで、マトリックスをＭＥＩＡ緩衝液で洗浄して、未結合の酵素−抗体コンジュゲートを除去する。
【００７６】
（９）酵素基質である４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）をマトリックスに添加する。ヤギ抗−ヒトＩｇＭに結合したマトリックス上に存在するアルカリホスファターゼ酵素はＭＵＰ由来のホスホリル部分の加水分解を触媒して、計器の光学システムにより測定される高蛍光産物を生成する。信号強度は、患者試料中に存在するヘルペスウイルス特異的ＩｇＭ抗体の量に比例する。
【００７７】
自動化イムノアッセイによるＨＣＭＶ検出用試薬の製造
ＨＣＭＶ検出用アッセイのために適した試薬の製造についての以下の記載は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に既に記載されている。
【００７８】
試薬、酵素及び培地
制限酵素のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、ポリヌクレオチドキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片は、マサチューセッツ州Ｂａｖｅｒｌｙに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．またはインディアナ州インディアナポリスに所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．から購入した。ＤＮＡ及びタンパク質分子量基準、Ｄａｉｉｃｈｉプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル、及び緩衝液を含むＳｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、マサチューセッツ州ナティックに所在のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシデ（ＩＰＴＧ）、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、４−クロロ−１−ナフトール及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、カリフォルニア州リッチモンドに所在のＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗体は、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在のＫｉｒｋｅｇｅａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した。“ＥＰＩＣＵＲＥＡＮ  ＣＯＬＩ  ＸＬ−１  ＢＬＵＥ”（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃｑＺｄＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）スーパーコンピテント大腸菌細胞、ＤＮＡ単離キット、ＲＮＡ単離キット及びＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットは、カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から入手した。ＧｅｎｅＡｍｐ試薬及びＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、コネチカット州ノーウォークに所在のＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓから購入した。シークエナーゼ及び７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰを有するＤＮＡ配列決定用ヌクレオチドキット及びシークエナーゼｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼは、オハイオ州クリーブランドに所在のＵ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．から入手した。ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡ精製キットは、ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＰｈａｒｍａｒｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入した。アンピシリンを含むルリアブロスプレート（ＬｉＳａｍｐプレート）は、イリノイ州ロンバードに所在のＭｉｃｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から購入した。“ＯＰＴＩ−ＭＥＭ”培地、ウシ胎仔血清、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、コンピテント大腸菌ＤＨ５α（Ｆ−φ８０ｄｌａｃＺｄＭ１５  ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｐｈｏＡ  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  λ−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１）及び“ＵＬＴＲＡＰＵＲＥ”アガロースは、ニューヨーク州グランドアイランドに所在のＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｂａｃｔｏ−トリプトン、Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物及びＢａｃｔｏ−寒天は、ミシガン州デトロイトに所在のＤｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。“ＮＹＺ”ブロスは、メリーランド州Ｃｏｃｋｅｙｖｉｌｌｅに所在のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。サケ精子ＤＮＡ、リゾチーム、アンピシリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、チメロサール、緩衝液、カゼイン酸加水分解物、尿素、“ＴＷＥＥＮ  ２０”のような界面活性剤、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）及び無機塩は、ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ  ＩＩ”は、１１．２５ｇ／Ｌのトリプトン、２２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１１．４ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、１．７ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１０ｍｌ／Ｌのグリセロールを含んでおり、水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調節されている。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）は、２０ｍＭ  トリス及び１５０ｍｌのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）から構成されていた。トリス緩衝生理食塩水“ＴＷＥＥＮ  ２０”は、ＴＢＳ＋０．０５％  “ＴＷＥＥＮ  ２０”から構成されていた。膜ブロッキング溶液は、ＴＢＳ中１％  ウシ血清アルブミン、１％  カゼイン酸加水分解物、０．０５％  “ＴＷＥＥＮ  ２０”から構成されていた。Ｒｕｂａｚｙｍｅ試料希釈緩衝液（Ｒｕｂａｚｙｍｅ  ＳＤＳ）は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  “ＴＷＥＥＮ  ２０”、０．０１％  チメロサール及び４％  仔ウシ血清から構成されていた。Ｒｕｂａｚｙｍｅコンジュゲート希釈剤希釈緩衝液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  チメロサール及び１０％  仔ウシ血清から構成されていた。“ＨＲＰ”発色溶液は、ＴＢＳ中０．０６％  ４−クロロ−１−ナフトール、０．０２％  Ｈ２０２及び０．２％  メタノールから構成されていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液は、６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０％  グリセロール、５％  β−メルカプトエタノール及び０．１％  ブロモフェノールブルーから構成されていた。ＴＥ緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）から構成されていた。ポリスチレンミクロ粒子は、ペンシルバニア州ウォーリントンに所在のＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【００７９】
ウイルス増殖及びｃＤＮＡの作成
ＣＭＶ菌株ＡＤ  １６９及びＴｏｗｎｅを、５％ウシ胎仔血清を補充した“ＯＰＩ−ＭＥＭ”培地中で生長させたヒト繊維芽細胞において増殖させた。感染から６日後、感染細胞を遠心により収集し、ＰＢＳで洗浄し、ガラス−ＰＴＦＥ（“ＴＥＦＬＯＮ”）ホモジナイザーを用いて均質化した。全ウイルスＤＮＡを、Ｍｏｃａｒｓｋｉ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：１２６６（１９８５）に記載されているようにして単離した。全ＲＮＡはＲＮＡ単離キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて均質化細胞から単離し、ポリＡ＋  ＲＮＡはｍＲＮＡ単離キット（ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて単離した。ＨＣＭＶ  ｃＤＮＡは、“ＺＡＰ−ｃＤＮＡ”合成キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製ウイルスｍＲＮＡから合成した。
【００８０】
一般的方法
ＤＮＡの酵素消化はすべて、供給元の指示に従って実施した。ＤＮＡ１μｇあたり少なくとも５単位の酵素を使用し、ＤＮＡを完全に消化させるために十分なインキュベーション時間を設けた。ＤＮＡ及びＲＮＡの操作に使用した各種キット及びＤＮＡのＰＣＲ及び配列決定は、供給元のプロトコルに従った。（１）大腸菌からのプラスミドＤＮＡの小規模及び大規模作成、（２）ファージλを感染させた大腸菌細胞からのファージライゼートＤＮＡの作成、（３）抗−大腸菌抗体の吸収用ファージライゼートの作成、（４）フェノール−クロロホルムを用いる抽出、（５）ＤＮＡのエタノールを用いる沈殿、（６）アガロースゲル上でのＤＮＡの制限分析、（７）アガロース及びポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の精製、（８）ＤＮＡの制限酵素を用いる消化により生じた陥凹３’末端の、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片を用いる充填、（９）ＤＮＡ断片のＴ４  ＤＮＡリガーゼによる連結、及び（１０）援用により本明細書に含まれるとするＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験手順(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、第２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているコンピテント大腸菌ＴＢ１細胞（Ｆ−ａｒａ  ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ  φ８０ｄｌａｃＺｄＭ１５  ｈｓｄＲ１７）の作成については、標準的方法を使用した。ＰＣＲ増幅により作成したプラスミドにクローニングするためのＤＮＡ断片をフェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた後、ＰＣＲ反応混合物を制限酵素で消化した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定のためのオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、モデル３９０Ｂまたは３９４を用いて製造業者のプロトコルに従って合成した。
【００８１】
ｌａｃＺ−Ｈ１０発現ベクターｐＲＯＳＨ１０の構築（製造方法Ａ）
Ｍａｎｉａｔｉｓら（「分子クローニング：実験手順(Molecular cloning:a laboratory manual)，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）発行）に記載されている組換えＤＮＡ標準方法に従って、他の著者（Ｅｌｌｉｎｇｅｒら参照）から供給されたプラスミドｐＲＯＳから、ＣＭＶ陽性血清に対して高い反応性の、β−ガラクトシダーゼを有する融合タンパク質を産生するファージλＧｔ１１を発現する初期遺伝子から得たクローンのゲノムを精製した。次いで、前記ゲノムを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、ファージが発現したＤＮＡ断片を抽出した。次いで、前記断片をベクターｐＵＣ１８にクローニングし、配列決定した。前記配列は、ｐｐ５２（ＵＬ４４）のＣＯＯＨ末端で２３３アミノ酸を発現する６９９塩基対の断片を表した。次いで、図２に概略的に示すように前記断片をＥｃｏＲＩ末端に充填後、前記断片を発現ベクターｐＲＯＳのＳｍａｌサイトでクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＲＯＳＨ１０と命名した。
【００８２】
ｌａｃＺ−Ｆ３発現ベクターｐＧＴ１の構築（製造方法Ｂ）
製造方法Ａに記載の方法に従って、ＣＭＶ陽性血清に対して高い反応性の、β−ガラクトシダーゼと融合タンパク質を産生するファージλＧｔ１１を発現する初期遺伝子から得たクローンのゲノムを精製した。次いで、前記ゲノムを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、ファージが発現したＤＮＡ断片を抽出した。次いで、前記断片をベクターｐＵＣ１８にクローニングし、配列決定した。前記配列は、ｐ１５０（ＵＬ３２）のＣＯＯＨ末端で４４アミノ酸を発現する１３２塩基対の断片を表した。次いで、製造方法Ａで参照した図２に概略的に示すように前記断片のＥｃｏＲＩ末端に充填後、前記断片を発現ベクターｐＲＯＳのＳｍａＩサイトでクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＧＴ１と命名した。
【００８３】
ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３発現ベクターｐＭＢ３４の構築（製造方法Ｃ）
プラスミドｐＭＢ３４は、Ｅｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，２７：９７１（１９８９）に記載されているｌａｃＺ発現ベクターｐＲＯＳの誘導体である。このベクターは、ｌａｃＺ遺伝子（１−３７５アミノ酸）の下流に位置するポリリンカークローニングサイトを有するｌａｃＺ遺伝子の切頭形態を含む。このｐＭＢ３４プラスミドは、ＨＣＭＶの１５０ｋＤの塩基性リンタンパク質をコードするｐｐＵＬ３２の２つの領域をｐＲＯＳ中のｌａｃＺ遺伝子の３’末端に結合させることにより２段階で構築した。
【００８４】
Ａ．  ｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築
プラスミドｐＭＢ２８は、図３に示すようにプラスミドｐＲＯＳの誘導体である。このプラスミドは、ｐｐ１５０（ヌクレオチド１７６３−１８４２）のアミノ酸５９５−６１４をコードするｐｐＵＬ３２の領域由来のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅して得たＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２含有ＤＮＡ断片をｐＲＯＳのポリリンカー領域にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＲＯＳ）を、一般的方法に記載したように操作してＤＨ５α細胞から単離した。プラスミドｐＲＯＳをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳａｌＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３から始まるセンスプライマー及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１８４２から始まるアンチセンスプライマーを合成し、ゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ａ１Ｃ２（ヌクレオチド１７３３−１８４２）を含有する６０塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。次いで、この精製断片を精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｌａｚＺ遺伝子の末端におけるｐＲＯＳ中の６０塩基対断片の存在についてスクリーニングした。Ａ１Ｃ２断片を含むプラスミドｐＭＢ２８を単離した。ｐＭＢ２８中のＡ１Ｃ２のＤＮＡ配列を確認し、Ａ１Ｃ２コーディング領域はｌａｃＺコーディング配列とインフレームにあった。
【００８５】
Ｂ．  ｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築
プラスミドｐＭＢ３４は、図４に示すようにプラスミドｐＭＢ２８の誘導体である。このプラスミドｐＭＢ３４は、Ｍｏｃａｒｓｋｉ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：１２６６（１９８５）のλｇｔ１１ライブラリーから誘導したｐｐＵＬ３２（ヌクレオチド３０１６−３１４４）のアミノ酸１００６−１０４３をコードするｐｐＵＬ３２のλｇｔ１１サブクローンから得たＨＣＭＶ−Ｆ３を含有するＤＮＡ断片をＡ１Ｃ２  ＤＮＡ配列の直ぐ下流のｐＭＢ２８のポリリンカー領域にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ２８）を、一般的方法に記載したようにしてＤＨ５α細胞から単離した。ファージライゼートＤＮＡは、一般的方法に記載したようにしてファージλｇｔ１１  クローンλ−Ｆ３から作成した。プラスミドｐＭＢ２８をＳｔｕＩで消化し、平滑末端を有するベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ファージλ−Ｆ３  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、陥凹３’末端をＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片で充填し、平滑末端が残った。平滑末端を有する１２９塩基対λ−Ｆ３断片をアガロースゲルを用いて精製し、平滑末端をｐＭＢ２８／ＳｔｕＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、正しい配向でのｌａｃＺ遺伝子の末端におけるｐＭＢ２８中の１２９塩基対断片の存在についてスクリーニングした。正しい配向でＦ３断片を含有するプラスミドｐＭＢ３４を単離した。プラスミドｐＭＢ３４中のＦ３のＤＮＡ配列を確認し、Ｆ３コーディング領域はｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２コーディング領域とインフレームにあった。ｐＭＢ３４中のｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３構築物のコーディング領域は、アミノ酸に関する国際標準１文字体系（これによると、ＬはＬｅｕであり、ＱはＧｌｎであり、ＫはＬｙｓであり、ＥはＧｌｕであり、ＦはＰｈｅである）を用いて以下に示すようにＡ１Ｃ２とＦ３の間に５アミノ酸の架橋を含む。(1)  ｌａｃＺ（１−３７５ａａ）−Ａ１Ｃ２（５９５−６１４ａａ，ｐｐ１５０）−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３（１００６−１０４８ａａ，ｐｐ１５０）
【００８６】
ｌａｃＺ−Ｈ１０Ａ１Ｃ２Ｆ３発現ベクターｐＭＢ４０の構築（製造方法Ｄ）
上記したプラスミドを出発材料とし、上記製造方法Ａ、Ｂ及びＣに記載し、図５に示す方法に従って、２対のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、それぞれプラスミドｐＲＯＳＨ１０及びｐＭＢ３４中に局在するＨ１０及びＡ１Ｃ２−Ｆ３配列のＰＣＲによる連鎖増幅に使用することができる。前記プライマーを構成するオリゴヌクレオチド配列は次の通りである。すなわち、ｐＲＯＳＨ１０由来のＨ１０を増幅し、増幅配列中の５’にＥｃｏＲＩサイト及び増幅断片中の３’にＡ１Ｃ２と相同の１２塩基対の配列を導入するための
【００８７】
【化１】
0004290327.tif 000002
及びプラスミドｐＭＢ３４由来のＡ１Ｃ２−Ｆ３断片を増幅し、増幅産物中の５’にＨ１０と相同の配列及び３’にＥｃｏＲＩサイトを導入するための
【００８８】
【化２】
0004290327.tif 000003
である。次いで、前記した２つの独立した増幅物（ＥＣＯＨ１０Ａ１Ｃ２及びＨ１０Ａ１Ｃ２−Ｆ３ＥＣＯ）から生じた２つの断片を外部プライマーＥＣＯＨ１０及びＦ３ＥＣＯと一緒に混合し、更に増幅した。相補的な配列３’ＥＣＯＨ１０Ａ１Ｃ２及び５’Ｈ１０Ａ１Ｃ２−Ｆ３ＥＣＯのために、増幅産物は３つすべてのエピトーブを含み、各末端にＥｃｏＲＩサイトを有する。次いで、増幅配列をｐＲＯＳにクローニングし、そこから誘導したプラスミド（ｐＭＢ４０と命名）は対応するサイトＳｍａＩに関連してヌクレオチド００２〜９０７に相当するＤＮＡ配列（配列番号１）を含む。
【００８９】
上記製造方法Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに記載したプラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌に挿入し、クローニングした。次いで、所望の融合タンパク質の合成をＩＰＴＧを添加することにより誘発し、得られたタンパク質を細菌細胞の溶解及び細胞ライゼートをＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールを用いて変性してコンピテントとした。次いで、タンパク質を９〜１２％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ニトロセルロースに移し、そこで免疫反応を実施した。多数の血清サンプルの予備スクリーニングを、Ｍｉｎｉｂｌｏｔｔｅｒ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジに所在のＩｍｍｕｎｅｔｉｃｓ）により実施した。精製ＩｇＧ（オーストリア国ウィーンに所在のＩｍｍｕｎｏ  ＡＧの“Ｅｎｄｏｂｕｌｉｎ”）及びＩｇＭ高陽性血清を１：１００の希釈度で使用した。各ヒト血清サンプルをＩｇＧ及びＩｇＭ検出のために１：８０で希釈した。ペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ｇまたは抗−μ鎖を二次抗体として使用した。
【００９０】
２つのグループのヒト血清サンプルを使用した。第１グループの血清は１７個のＨＣＭＶ陽性サンプルから構成され、そのうち８個はＨＣＭＶに対して高いＩｇＧ力価を有し、７個は中〜低レベルのＨＣＭＶ特異的ＩｇＧを有するとＥＬＩＳＡで検出された。ＨＣＭＶ特異的ＩｇＧの存在はイムノブロッティングにより確認した。第２グループの血清は１９個のＨＣＭＶ陽性サンプルから構成され、そのうちの１０個はＨＣＭＶに対して高いＩｇＭ力価を有し、９個は中〜低レベルのＨＣＭＶ特異的ＩｇＭを有するとＥＬＩＳＡで検出された。また、この場合も、ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭの存在はイムノブロッティングにより確認した。
【００９１】
抗ＨＣＭＶ  ＩｇＧは、Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅに所在）のＣＭＶキットを用いて評価した。プレートを“ｍｉｃｒｏＥＬＩＳＡ”自動リーダー（米国バージニア州アレキサンドリアに所在のＤｙｎａｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で測定した。直線回帰分析を実施し、試験ランを標準化するために、各プレートには３つの血清較正物質を含めた。抗ＨＣＭＶ  ＩｇＭを、Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ドイツ国ハンブルクに所在）のＣＭＶ  ＩｇＭ“ＥＬＡ”キットを用いて評価した。結果は製造業者が指示するようにして解明した。
【００９２】
偽陽性結果を避けるために、すべてのサンプルをラテックス凝集によりリウマチ因子（英国Ｄａｒｔｆｏｒｄｉｄに所在のＷｅｌｌｃｏｍｅのＲｈｅｕｍａ−Ｗｅｌｌｃｏテスト）を検出するための試験にかけ、陰性サンプルのみを比較のために使用した。結果を図６の表１（ＩｇＧ）及び図７の表２（ＩｇＭ）に示す。
【００９３】
提示したデータから明らかなように、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３を用いて得た結果は、ＩｇＧ及びＩｇＭのいずれについても他の融合タンパク質で得た結果に比して顕著な改善を示し、すべてのウイルスからなる抗原で得た結果に完全に重なり得る。
【００９４】
ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の構築
ＣＫＳ発現ベクタ−ｐＪＯ２００により、組換えタンパク質をＣＭＲ−ＫＤＤシンテターゼ（ＣＫＳ）タンパク質に融合させることができる。ＣＫＳをコードする構造遺伝子（ｋｄｓＢ遺伝子）のＤＮＡ配列は、Ｇｏｌｄｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１５８３１（１９８６）に公表されている。このＤＮＡ配列から誘導されたＣＫＳのアミノ酸配列（全部で２４８）も同一文献に記載されている。このｐＪＯ２００ベクターは、Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａｎｄｅｃｋｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：４６８（１９９０）に記載されているプラスミドｐＴＢ２０１（図８）から３段階方法により構築される。プラスミドｐＪＯ２００の構築プランは、２つの制限酵素サイトの除去及びＣＫＳ遺伝子の３’末端へのマルチクローニングサイトの付加を含む。これは、ＣＫＳ遺伝子の３’末端でのタンパク質抗原をコードするＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）遺伝子のクローニングを容易にするために実施した。完成したベクターは、元のｋｄｓＢ遺伝子の２４０アミノ酸とポリリンカーＤＮＡ配列からのＣＫＳ遺伝子の末端の追加の１２アミノ酸（全部で２６０アミノ酸）に対するコーディング配列を含む。
【００９５】
Ａ．  ｐＪＯ２１０の構築
プラスミドｐＪＯ２１０は、ＣＫＳ発現ベクターｐＴＢ２０１の誘導体である。このプラスミドは、ＣＫＳ遺伝子のプロモーターから上流に位置するｐＴＢ２０１中に存在する１つのＥｃｏＲＩサイトを除去することにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＴＢ２０１）を上の「一般的方法」の欄に記載されている方法を用いてＴＢ１細胞から単離した。前記ＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に消化し、ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。次いで、精製ｐＴＢ２０１／ＥｃｏＲＩ断片を、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片を用いて処理した。この酵素は、ＥｃｏＲＩで消化後生じた陥凹３’末端を充填し、平滑末端を残した。クレノウ断片で処理後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中に再懸濁し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で４時間連結した。連結混合物をコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ＥｃｏＲＩサイトの消失についてスクリーニングした。ＥｃｏＲＩサイトが消失したプラスミドｐＪＯ２１０を単離した。
【００９６】
Ｂ．  ｐＪＯ２１５の構築
プラスミドｐＪＯ２１５は、プラスミドｐＪＯ２１０の誘導体である（図８）。このプラスミドは、ＣＫＳ遺伝子のプロモータ中に存在する１つのＢａｍＨ−Ｉサイトを架橋突然変異誘発（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３７１７７（１９８６））を用いて除去することにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２１０）を、一般的方法に記載されているようにしてＴＢ１細胞から単離した。前記ＤＮＡをＢａＭＨ−Ｉで完全に消化し、アクリルアミドゲルを用いて精製した。次いで、精製ｐＪＯ２１０／ＢａｍＨ−Ｉ断片を、ＢａｍＨ−Ｉサイトに広がるプラスミド領域においてｐＪＯ２１０の１つのＤＮＡ鎖に相補的な下記する突然変異オリゴヌクレオチドと混合した。
(2)  ５’ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴ  ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡ  ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴ３’
【００９７】
このオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＪＯ２１０に挿入したときＢａｍＨ−Ｉサイトを破壊する（下線をつけた）１つの塩基変化を含む。突然変異オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２１０／ＢａｍＨ−Ｉと混合後、混合物を３分間煮沸し、室温に５分間冷却し、その後コンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ＢａｍＨ−Ｉサイトの消失についてスクリーニングした。ＢａｍＨ−Ｉサイトが消失したプラスミドｐＪＯ２１５を単離した。
【００９８】
Ｃ．  ｐＭＣ２００の構築
プラスミドｐＭＣ２００は、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇ，Ｇｅｎｅ，６８：１０１（１９８８）に記載されているプラスミドｐＭＷ５０７の誘導体である（図９）。このプラスミドは、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇ（１９８８）に記載されている遺伝子合成のＦｏｋｌ方法を用いてマルチクローニングサイトを含む合成オリゴクレオチドをｐＭＷ５０７にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＭＷ５０７）を、一般的方法に記載されているようにしてＴＢ１細胞から単離した。前記ＤＮＡをＳｍａＩで完全に消化し、次いで下記するように
(4)  ５’Ｆｏｋｌアーム−ＢｇｌＩＩ付着末端−ＳａｌＩ／ＡｃｃＩ／ＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ−ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ／Ｘｍａｌ−ＢａｍＨ−Ｉ／Ｘｂａｌ−ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ−停止コドン−ＢｇｌＩＩ付着末端−Ｆｏｋｌアーム３’
末端にＦｏｋｌアームと数個の制限酵素サイトを含む下記するオリゴヌクレオチドと混合した。
【００９９】
【化３】
0004290327.tif 000004
オリゴヌクレオチドをＰＭＷ５０７／ＳｍａＩと混合後、混合物を３時間煮沸し、室温に５分間冷却し、次いでコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、マルチクローニングサイトの存在についてスクリーニングした。マルチクローニングサイトを含むプラスミドｐＭＣ２００を単離した。マルチクローニングサイトのＤＮＡ配列を確認した。
【０１００】
Ｄ．  ｐＪＯ２００の構築
プラスミドｐＪＯ２００は、プラスミドｐＪＯ２１５の誘導体である（図１０）。このプラスミドは、ｐＭＣ２００からマルチクローニングサイトを除去し、前記サイトをｐＪＯ２１５中のＣＫＳ遺伝子の３’末端でクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＭＣ２００及びｐＪＯ２１５）を、一般的方法に記載されているようにしてＴＢ１細胞から単離した。プラスミドｐＪＯ２１５をＢｇｌＩＩで完全に消化し、その後連結反応中のプラスミドの再環状化を防止するために仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理した。プラスミドｐＭＣ２００をＦｏｋＩで消化し、次いでマルチクローニングサイト（１０６塩基対）を含有するｐＭＣ２００／Ｆｏｋｌ  ＤＮＡ及びｐＪＯ２１５／ＢｇｌＩＩ／ＣＩＡＰ  ＤＮＡをポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。プラスミドｐＭＣ２００をＦｏｋｌで消化すると、プラスミドからマルチクローニングサイトＤＮＡが放出される。このＤＮＡは、ＢｇｌＩＩで消化したｐＪＯ２１５  ＤＮＡに容易に連結するＢｇｌＩＩ付着末端を含有する。この精製ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩連結させた。翌日、連結混合物をコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ＢｇｌＩＩサイトにおける正しい配向でのマルチクローニングサイトの存在をスクリーニングした。正しい配向でマルチクローニングサイトを含むプラスミドｐＪＯ２００を単離した。ＢｇｌＩＩサイトにおけるｐＪＯ２００中のマルチクローニングサイトのＤＮＡ配列を確認した。
【０１０１】
ｌａｃＺ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）発現ベクターｐＭＢ３８の構築
プラスミドｐＭＢ３８は、ｌａｃＺ発現ベクターｐＲＯＳの誘導体である（図１１）。このプラスミドは、ｐｐ３８（ヌクレオチド３１６−１１１９）のアミノ酸（１０６−３７３ａａ）をコードするｐｐＵＬ８０ａの領域からゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡをＰＣＲ増幅して得たＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含有するＤＮＡ断片をポリリンカー領域ｐＲＯＳにクローニングすることにより構築した。ｐｐＵＬ８０ａ領域は、ＨＣＭＶの３８ｋＤのリン酸化をコードする。プラスミドｐＲＯＳをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳａｌＩサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３１６から始まるセンスプライマー及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド１１１９から始まるアンチセンスプライマーを合成し、ゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含有する８０４塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。次いで、この精製断片を精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から生成し、ｌａｃＺ遺伝子の末端におけるｐＲＯＳ中の８０４塩基対ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）の存在についてスクリーニングした。ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）断片を含むプラスミドｐＭＢ３８を単離した。ｐＭＢ３８中のｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）のＤＮＡ配列を確認し、ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）コーディング領域はｌａｃＺコーディング領域とインフレームにあった。
【０１０２】
ｐＪＯ２００に基づくＣＫＳ−ＣＭＶ発現ベクターの構築（製造方法Ｅ）
ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００は、一連の５つのＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合構築物に対するビルディングブロックである。２種のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドを構築した。１方のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドは、ＣＭＶ遺伝子配列が下記するようにｐＪＯ２００のヌクレオチド６３８（ＣＫＳのアミノ酸１７１）においてＣＫＳ遺伝子内に嵌入されるように構築した。
(5)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ＣＭＶ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１０３】
このＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合物構築方法は、エピトープ嵌入と称されている。この構築物から大腸菌において発現させた融合タンパク質は、ＣＫＳアミノ酸配列内に完全に嵌入されている抗原のエピトープを含む。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａはこのようにして構築した。
【０１０４】
他方のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドは、ＣＭＶ遺伝子ＤＮＡ配列が下記するようにアミノ酸２４８においてＣＫＳ遺伝子の３’末端に連結するように構築した。
(6)  ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ＣＭＶ
【０１０５】
プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ、ｐＣＭＶ−４、ｐＣＭＶ−９び４ｐＣＭＶ−２６はこのようにして構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２００）を、下記する構築物に対して一般的方法を用いて単離した。
【０１０６】
Ａ．  ｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−１Ａは、ｐＪＯ２００の誘導体である（図１２）。このプラスミドは、プラスミドｐＭＢ３４中に含まれるＡ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡをＰＣＲ増幅して得たＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含有するＤＮＡ断片をｐＪＯ２００のＳｔｕＩサイトにクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）を一般的方法により単離した。プラスミドｐＪＯ２００をＳｔｕＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。この消化により、連結反応で回復されるであろうＣＫＳ遺伝子の３’末端部分が除去される。このベクターバックボーン中に、２つのＰＣＲ由来ＤＮＡ断片を３通りの連結反応でクローニングする。Ａ１Ｃ２Ｆ３はＳｔｕＬ／ＭｌｕＩ  ＤＮＡ断片としてクローニングされ、ＣＫＳ遺伝子の残りの３’部分はＭｌｕＩ／ＢａｍＨ−Ｉ  ＤＮＡ断片としてクローニングされ、完全ＣＫＳ遺伝子が回復する。ＳｔｕＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８から始まるセンスプライマー及びＭｌｕＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含有する２４塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。ＭｌｕＩサイトを含有するｐＪＯ２００のヌクレオチド６４０から始まるセンスプライマー及びＢａｍＨ−Ｉサイトを含むｐＪＯ２００のヌクレオチド９０５から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＪＯ２００を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ反応後、反応混合物をＭｌｕＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ＣＫＳ遺伝子の３’部分を含有する２６６塩基対断片をゲル精製した。次いで、精製したＰＣＲ由来ＤＮＡ断片をｐＪＯ２００／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨ−Ｉに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩサイトに挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３の存在についてスクリーニングした。ＳｔｕＩサイトに挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３を含有するプラスミドｐＣＭＶ−１Ａを単離した。Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳ遺伝子の３’末端のＤＮＡ配列を確認した。ｐＣＭＶ−１Ａ中のＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳのコーディング領域は、Ａ１Ｃ２Ｆ３とＣＫＳ遺伝子の３’末端の間のＭｌｕＩサイトに由来する２アミノ酸（スレオニン及びアルギニン）架橋を含む。更に、ＣＫＳのアミノ酸１７１は、以下に示すように構築物中で複製されている。
(7)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ１Ｃ２−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１０７】
Ｂ．ｐＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ−Ｈ１０の構築
プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂは、プラスミドｐＪＯ２００の誘導体である（図１３Ａ及び１３Ｃ）。このプラスミドは、製造方法Ａ（Ｒｉｐａｌｔｉら，Ｊ．Ｖｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６：３９（１９９４）も参照）に記載されているプラスミドｐＲＯＳＨ１０由来のＨＣＭＶ−Ｈ１０を含有するＤＮＡ断片をｐＪＯ２００にクローニングすることにより構築した。Ｈ１０  ＤＮＡ配列は、ＨＣＭＶの５２ｋＤのリンタンパク質をコードするｐｐＵＬ４４に誘導される。ｐＲＯＳＨ１０中のｐｐＵＬ４４のＨ１０部分は、ヌクレオチド６０４−１２９９（アミノ酸２０２−４３４）を含有する。Ｈ１０は、リンタンパク質ｐｐ５２のＣ−末端半分をコードする。プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂは、Ｈ１０  ＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅して得たｐＲＯＳＨ１０由来のＨ１０  ＤＮＡをｐＪＯのＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉサイトにクローニングすることにより構築した。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳａｃＩサイトを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４から始まるセンスプライマー及びＨ１０コーディング配列の末端に停止コドンとＢａｍＨ−Ｉサイトを含有するｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、Ｈ１０を含有する６９６塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製し、その後ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉに１６℃で一晩連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ＳａｃＩ／ＢａｍＨ−ＩサイトにおけるｐＪＯ２００中の６９６塩基対断片の存在についてスクリーニングした。ＣＫＳ遺伝子とインフレーム融合したＨ１０断片を含有するプラスミドｐＣＭＶ−３Ｂを単離した。Ｈ１０及びＣＫＳ遺伝子の３’末端のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物を以下に示す。
(8)  ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ｈ１０
【０１０８】
Ｃ．  ｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０の構築
プラスミドｐＣＭＶ−４は、ｐＪＯ２００の誘導体である（図１３Ａ及び１３Ｃ）。このプラスミドは、それぞれｐＭＢ３４及びｐＲＯＳＨ１０に由来するＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３（Ａ１Ｃ２Ｆ３と略記）及びＨＣＭＶ−Ｈ１０を含有するＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＪＯ２００にクローニングすることにより構築した。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。このベクターバックボーン中に、２つのＰＣＲ由来ＤＮＡ断片を３通りの連結反応でクローニングする。Ａ１Ｃ２−架橋−Ｆ３はＳａｃＩ／ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片として、Ｈ１０はＰｓｔＩ／ＢａｍＨ−Ｉ  ＤＮＡ断片としてクローニングされる。ＳａｃＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３から始まるセンスプライマー及びＰｓｔＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含有する２０４塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。ＰｓｔＩサイトを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４から始まるセンスプライマー及びＨ１０コーディング配列の末端に停止コドンとＢａｍＨ−Ｉサイトを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、Ｈ１０を含有する６９６塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。次いで、この精製ＰＣＲ由来ＤＮＡ断片をｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉサイトに挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０の存在についてスクリーニングした。ｐＪＯ２００中のＣＫＳ遺伝子の末端にＡ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０を含有するプラスミドｐＣＭＶ−４を単離した。Ａ１Ｃ２−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３及びＨ１０のＤＮＡ配列を確認した。ｐＣＭＶ−４中のＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０構築物のコーディング領域は、Ａ１Ｃ２Ｆ３とＨ１０の間にＰｓｔＩサイト由来の２アミノ酸の架橋を含む。このＣＫＳ−ＣＭＷ融合構築物を以下に示す。
(9)  ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ａ１Ｃ２−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０
【０１０９】
Ｄ．  ｐＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の構築
プラスミドｐＣＭＶ−９は、ｐＪＯ２００の誘導体である（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。このプラスミドは、ｐｐ６５（ヌクレオチド８８９−１５３０）のアミノ酸２９７−５１０をコードするｐｐＵＬ８３の領域からのＨＣＭＶ  ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して得られるＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有するＤＮＡ断片をｐＪＯ２００にクローニングすることにより構築した。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＨＣＭＶ  ｃＤＮＡを鋳型として使用してＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡを作成するために、２段階入れ子ＰＣＲ反応を使用した。外側入れ子ＰＣＲ増幅反応のために、ｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８０７で始まるセンスプライマー及びｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５７２で始まるアンチセンスプライマーを合成し、ＨＣＭＶ  ｃＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、外側入れ子ＰＣＲ反応混合物を内側入れ子ＰＣＲ増幅反応のための鋳型ＤＮＡとして使用した。内側入れ子ＰＣＲ増幅反応のために、ＳａｃＩサイトを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９から始まるセンスプライマー及びｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）コーディング配列の末端に停止コドンとＢａｍＨ−Ｉサイトを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０から始まるアンチセンスプライマーを合成し、外側入れ子増幅したＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有する６４２塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。次いで、この精製ＤＮＡ断片をｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉサイトに挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の存在についてスクリーニングした。ｐＪＯ２００中のＣＫＳ遺伝子の末端にｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有するプラスミドｐＣＭＶ−９を単離した。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物を以下に示す。
(10)  ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）
【０１１０】
Ｅ．  ｐＣＭＶ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築
プラスミドｐＣＭＶ−２６は、ｐＪＯ２００の誘導体である（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。このプラスミドを、ｐＭＢ３８由来のｐｐ３８（ヌクレオチド３４９−１１１９）のアミノ酸１１７−３７３をコードするｐｐＵＬ８０ａの領域からのｐｐ３８  ＤＮＡをＰＣＲ増幅して得たＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有するＤＮＡ断片をｐＪＯ２００にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）を一般的方法に記載したようにして単離した。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳａｃＩサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３４９から始まるセンスプライマー及びＢａｍＨ−Ｉサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド１１１９から始まるアンチレンスプライマーを合成し、ｐＭＢ３８  ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有する７７１塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。次いで、この精製ＤＮＡ断片をｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨ――Ｉに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨ−Ｉサイトに挿入されたｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の存在についてスクリーニングした。ｐＪＯ２００中のＣＫＳ遺伝子の末端にｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有するプラスミドｐＣＭＶ−２６を単離した。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物を以下に示す。
(11)  ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）
【０１１１】
ＣＫＳエピトープ嵌入発現ベクターｐＥＥ１の構築
ＣＫＳエピトープ嵌入発現ベクターｐＥＥ１により、エピトープ含有組換えタンパク質を以下に示すようにＣＫＳタンパク質内に嵌入させることができる。
(12)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−組換えタンパク質−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１１２】
このｐＥＥ１タンパク質は、ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００を出発材料として２段階で構築した。第１段階では、突然変異原性オリゴヌクレオチドを、ｐＪＯ２００中のＣＫＳ遺伝子の５’末端の近くに位置する一対の隣接ＭｌｕＩサイトにクローニングし、ＭｌｕＩサイト及びＳａｌＩサイトを除去する。このｐＪＯへの修飾により、次段階でＣＫＳ遺伝子中の更に下流に導入するためにユニークなＭｌｕＩクローニングサイトを使用することができる。第２段階では、ｐＣＭＶ−１Ａ由来のＤＮＡ断片を前記修飾ｐＪＯ２００ベクターにクローニングし、よってＣＫＳ遺伝子中にＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ断片として遺伝子を嵌入させることができる。
【０１１３】
Ａ．  ｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩの構築
プラスミドｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩは、ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の誘導体である（図１４Ａ）。このプラスミドは、以下に示すｐＪＯ２００  ＤＮＡ配列中のヌクレオチド１６１−１７４（１１−１５アミノ酸）に位置する一対の隣接するＭｌｕＩサイト及びＳａｌＩサイトを突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて除去することにより構築した。
【０１１４】
【化４】
0004290327.tif 000005
５’→３’方向にみて天然ｐＪＯ２００  ＤＮＡ配列ヌクレオチド。
【０１１５】
プラスミドｐＪＯ２００をＭｌｕＩで消化し、次いでエタノール沈殿させ、アルカリホスファターゼ緩衝液中に再懸濁させた。次いで、自己連結を防ぐために、プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理して５’ホスフェート基を除去した。ＣＩＡＰで処理後、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた後、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＡＰに連結させるための製造において下記する突然変異腹性オリゴヌクレオチドを合成した。
(14)  ５’ＣＧＣＧＡＣＧＴ３’
【０１１６】
このオリゴヌクレオチドはその３’末端で自己相補性であり、熱変性ステップ及びその後のアニーリングステップ後下記する２本鎖構造が形成されるであろう。
【０１１７】
【化５】
0004290327.tif 000006
このオリゴヌクレオチドは、ＭｌｕＩ消化ｐＪＯ２００  ＤＮＡに連結され得るＭｌｕＩ付着末端を含む。このオリゴヌクレオチドの配列は、天然ｐＪＯ２００  ＤＮＡ配列（１３）中の下線を付けた“Ｔ”及び“Ａ”残基が下線を付したように突然変異原性オリゴヌクレオチドでは逆になっている点で天然ｐＪＯ２００  ＤＮＡとは異なる。従って、ｐＪＯ２００のＭｌｕＩサイトにクローニングしたとき、突然変異原性オリゴヌクレオチドはＭｌｕＩサイト及びＳａｌＩサイトの両方を壊すであろう。オリゴヌクレオチドを合成後、合成オリゴヌクレオチドをその５’末端においてポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この酵素で処理後、リン酸化オリゴヌクレオチドを６５℃に２０分間加熱してキナーゼを失活させた。室温に冷却後、リン酸化オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰと混合し、６５℃で５分間加熱後、徐々に室温に冷却してリン酸化オリゴヌクレオチドをそれ自体にアニーリングさせた。次いで、連結緩衝液及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを混合物に添加し、２０〜４℃の温度範囲で一晩インキュベートした。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ＭｕｌＩ及びＳａｌＩサイトの消失についてスクリーニングした。上記した制限酵素サイトが消失したプラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩを単離した。ＣＫＳ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を確認した。ＭｌｕＩ及びＳａｌＩサイトの除去に加えて、突然変異原性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１６６−１７１によりコードされるアミノ酸を以下に示すようにＳｅｒ−ＴｈｒからＴｈｒ−Ｓｅｒに変化させる。
【０１１８】
【化６】
0004290327.tif 000007
５→３’方向にみて、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ  ＤＮＡ配列ヌクレオチド１５１−１８０。
【０１１９】
Ｂ．  ｐＥＥ１の構築
プラスミドｐＥＥ１は、プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩの誘導体である（図１５）。このプラスミドは、ＣＫＳ遺伝子内に嵌入したＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含有するｐＣＭＶ−１Ａ由来のＳｔｕＩ／ＢａＭＨ−Ｉ断片をｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのＳｔｕＩ／ＢａｍＨ−Ｉサイトにクローニングすることにより構築した。ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ中に存在するＣＫＳコーディング領域内のＳｔｕＩ／ＢａｍＨ−Ｉ  ＤＮＡをｐＣＭＶ−１Ａ由来のＳｔｕＩ／ＢａｍＨ−Ｉ断片で置換することにより、生じたプラスミドｐＥＥ１はＣＫＳ遺伝子内に嵌入したＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含有する。プラスミドｐＥＥ１は、ｐＥＥ１がＣＫＳ遺伝子の５’末端に存在する上流ＭｌｕＩサイトを含んでいない点でプラスミドｐＣＭＶ−１Ａと異なる。従って、ｐＥＥ１をＳｔｕｌＩ及びＭｌｕＩで消化すると、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｄ３  ＤＮＡ断片が放出され、アガロースゲルを用いて精製後、ＣＫＳ遺伝子中に平滑／ＭｌｕＩ相容性付着末端ＤＮＡ断片として嵌入させるために他の遺伝子を受容することができるベクターバックボーンが生ずるであろう。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ及びｐＣＭＶ−１Ａ）を、一般的方法に記載されているようにして単離した。プラスミドｐＣＭＶ−１ＡをＳｔｕＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳ遺伝子の３’末端を含有する４６１塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩをＳｔｕＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。次いで、これらの精製ＤＮＡ断片を一緒に混合し、１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換から作成し、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ中の４６１塩基対Ａ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡ断片の存在についてスクリーニングした。Ａ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡ断片を含み、ＣＫＳ遺伝子の５’末端にＭｕｌＩサイトを含まないプラスミドｐＥＥ１を単離した。ＣＫＳ遺伝子の３’末端及びＡ１Ｃ２Ｆ３断片のＤＮＡ配列を確認した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＢａｍＨ−Ｉで消化後、アガロースゲルを用いてベクターバックボーンを精製すると、他のＤＮＡ断片との連結のための製造においてＡ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡ断片が除去される。この精製ベクターバックボーンは、下記するフォーマットで正しい読み取り枠内でＣＫＳ遺伝子を嵌入するためにＤＮＡ断片を受容し得る。
(16)  ５’Ｘ−興味ある遺伝子−Ｙ３’。
ここで、Ｘは平滑であり、ＹはＭｌｕＩは相容性付着末端、例えばＭｌｕＩまたはＢｓｓＨＩＩである。
【０１２０】
ＰＥＥ１に基づくＣＫＳ−エピトープ嵌入発現ベクターの構築（製造方法Ｆ）
ＣＫＳ発現ベクターはｐＥＥ１は、一連の３種のＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ遺伝子融合構築物に対するビルディングブロックである。各構築物のために、プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクターバックボーンを精製した。このバックボーンは、５’末端にＳｔｕＩサイト及び３’末端にＭｌｕＩサイトを有するＰＣＲにより生成したＣＭＶ遺伝子断片を受容することができる。ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化後、ＰＣＲ断片をｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｕｌＩバックボーンにインフレームでクローニングする。このベクターから発現したＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合タンパク質を以下に示すが、ここでＴ及びＲはそれぞれスレオニン及びアルギニン残基であり、ベクターに導入された合成ＭｌｕＩサイトによりコードされる。
(17)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ＣＭＶ−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１２１】
Ａ．  ｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２７は、ｐＥＥ１の誘導体である（図１６Ａ及び１６Ｂ）。このプラスミドは、ｐＣＭＶ−４由来のＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含有する（よって、Ａ１Ｃ２とＦ３の間に架橋ＫＬＱＥＦを含有する）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＥ１にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−４）を一般的方法に記載したようにして単離した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳｔｕＩサイトを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３から始まるセンスプライマー及びＭｌｕＩサイトを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−４を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含有する９０６塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。この精製ＤＮＡ断片をｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０  ＤＮＡの存在についてスクリーニングした。ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに嵌入したＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含有するプラスミドｐＣＭＶ−２７を単離した。Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列を確認した。配列番号３及び配列番号４を参照されたい。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物を以下に示すが、ここでＬ、Ｑ、Ｔ及びＲはそれぞれロイシン、グルタミン、スレオニン及びアルギニン残基であり、ベクター中に導入された合成ＰｓｔＩ及びＭｕｌＩサイトによりコードされる。
(18)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ１Ｃ２−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１２２】
Ｂ．  ｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２８は、ｐＥＥ１の誘導体である（図１６Ａ及び１６Ｂ）。このプラスミドは、ｐＣＭＶ−９由来のＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有するＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をｐＥＥ１にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−９）を一般的方法により精製した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩを消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳｔｕＩサイトを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９から始まるセンスプライマー及びＭｌｕＩサイトを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラストミドｐＣＭＶ−９を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有する６４２塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。この精製ＤＮＡ断片をｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡ断片の存在についてスクリーニングした。ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに嵌入したｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含有するプラスミドｐＣＭＶ−２８を単離した。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物を以下に示すが、ここでＴ及びＲはそれぞれスレオニン及びアルギニン残基であり、ベクター中に導入された合成ＭｕｌＩサイトによりコードされる。
(19)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１２３】
Ｃ．  ｐＣＭＶ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２９は、ｐＥＥ１の誘導体である（図１６Ａ及び１６Ｂ）。このプラスミドは、ｐＣＭＶ−２６由来のＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有するＰＣＲ増幅ＤＮＡをｐＥＥ１にクローニングすることにより構築した。大量プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−２６）を一般的方法に記載されているようにして単離した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクターバックボーンをアガロースゲルを用いて精製した。ＳｔｕＩサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３４９から始まるセンスプライマー及びＭｕｌＩサイトを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド１１１９から始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−２６を含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有する７７１塩基対断片をアガロースゲルを用いて精製した。この精製ＤＮＡ断片をｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに１６℃で一晩かけて連結した。翌日、連結混合物をコンピテントＸＬ−１  ブルー細胞に形質転換した。少量ＤＮＡを形質転換体から作成し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに挿入されたｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ断片の存在についてスクリーニングした。ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩサイトに嵌入したｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含有するプラスミドｐＣＭＶ−２９を単離した。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物を以下に示すが、ここでＴ及びＲはそれぞれスレオニン及びアルギニン残基であり、ベクター中に導入された合成ＭｕｌＩサイトによりコードされる。
(20)  ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
【０１２４】
組換えＣＭＶ抗原の作成（製造方法Ｇ）
Ａ．  ＨＣＭＶ遺伝子の発現
製造方法ＦのＨＣＭＶ融合タンパク質を発現する細菌クローン、非融合ＣＫＳを発現する対照細菌菌株及び製造方法ＥのＨＣＭＶ融合タンパク質を発現する細菌クローンを、ログ相に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ  ＩＩ”培地で増殖させ、ＣＫＳ−ＨＣＭＶ融合タンパク質の合成をＲｏｂｉｎｓｏｎ  ＩＭ，Ｐｉｌｏｔ−Ｍａｔｉａｓ  ＴＩ，Ｐｒａｔｔ  ＳＤ，Ｐａｔｅｌ  ＣＢ，Ｂｅｖｉｒｔ  ＴＳ，Ｈｕｎｔ  ＪＣ、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｅｆｅｒｉ；ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｌｙｍｅ  ｄｉａｓｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｓｙｐｈｉｌｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３１：６２９−６３５（１９９３）に記載されているようにＩＰＴＧを添加して誘発させた。誘発から４時間後、細胞を収集し、細胞ペレットをタンパク質精製まで−８０℃で保存した。すべての発現タンパク質の関連データを表３に示す。
【０１２５】
Ｂ．  非融合ＣＫＳ及び組換えＣＫＳ−ＨＣＭＶ融合タンパク質の精製
複数回の洗剤洗浄により溶解し、その後８Ｍ尿素中に可溶化した後、不溶性ＣＫＳ−ＨＣＭＶ融合タンパク質（ｒｐＣＭＶ−１Ａ、ｒｐＣＭＶ−３Ｂ、ｒｐＣＭＶ−４、ｒｐＣＭＶ−９、ｒｐＣＭＶ−２７、ｒｐＣＭＶ−２８、ｒｐＣＭＶ−２９）を精製した。８Ｍ尿素中に可溶化後、融合タンパク質をＱ−セファロースクロマトグラフィー（ニュージャージ州ピスカタウェーに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により精製した。融合タンパク質４（ｒｐＣＭＶ−４）及び９（ｒｐＣＭＶ−９）をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００クロマトグラフィー（ニュージャージ州ピスカタウェーに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により更に精製した。可溶性ＣＫＳ−ＨＣＭＶ融合タンパク質２６（ｒｐＣＭＶ−２６）を、細胞溶解後ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ（カリフォルニア州リッチモンドに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分取ＳＤＳ−ＰＡＧで精製した。不溶性融合タンパク質（ｒｐＣＭＶ−２７、ｒｐＣＭＶ−２８、ｒｐＣＭＶ−２９）も、複数回洗剤洗浄し、その後１％  ＳＤＳ中に可溶化することにより精製し、更にＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲクロマトグラフィー（ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により精製した。可溶性ＣＫＳタンパク質は、細胞溶解後硫酸アンモニウム沈殿させ、その後ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製した。
【０１２６】
（実施例）
比較例Ａ
自動化ＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイ
ＨＣＭＶゲノムのｐｐＵＬ３２、ｐｐＵＬ４４、ｐｐＵＬ８３及びｐｐＵＬ８０ａ領域内にエピトープを含む組換えポリペプチドを使用すると、改善された感度を有し、ウイルス由来のエピトープを用いるＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイよりも高特異性であり得るイムノアッセイが提供される。
【０１２７】
自動化ＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイでは、ＨＣＭＶゲノムの４つの異なる領域を表す３種の大腸菌発現組換えタンパク質ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２７）、ＣＫＳ−ｐｐ６５−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２８）及びＣＫＳ−ｐｐ３８−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２９）を使用した。３種の組換えポリペプチドの各々を製造方法Ｆ（Ａ、Ｂ及びＣ）及び製造方法Ｇ（Ａ及びＢ）に従って製造した。自動化イムノアッセイでは、ポリスチレンミクロ粒子を別々に上記した３種の組換え抗原の各々で１ミクロ粒子あたり１抗原としてコートした。その後、自動化イムノアッセイは逐次操作モードまたは複合操作モードで実施され得る。自動化イムノアッセイの改変では、３種の内２種の組換え抗原（ｒｐＣＭＶ−２７及びｒｐＣＭＶ−２９）を一緒に同一のポリスチレンミクロ粒子上にコートし、次いで第３の組換え抗原（ｒｐＣＭＶ−２８）をコートしたミクロ粒子と混合してもよい。その後、改変した自動化イムノアッセイは複合操作モードで実施し得る。
【０１２８】
蒸留水中のポリスチレンミクロ粒子（大きさ２．６５μｍ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム及び０．１％  アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の溶液に導入した。次いで、ポリスチレンミクロ粒子を、ｒｐＣＭＶ−２７、ｒｐＣＭＶ−２８及びｒｐＣＭＶ−２９と呼ぶ３つの別々の瓶に分配した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中の組換え体ｒｐＣＭＶ−２７を最終濃度１００μｇ／ｍｌを与えるようにｒｐＣＭＶ−２７を収容している瓶に添加した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中の組換え体ｒｐＣＭＶ−２８を最終濃度１００μｇ／ｍｌを与えるようにｒｐＣＭＶ−２８を収容している瓶に添加した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中の組換え体ｒｐＣＭＶ−２９を最終濃度１００μｇ／ｍｌを与えるようにｒｐＣＭＶ−２９を収容している瓶に添加した。各瓶中のポリスチレンミクロ粒子の最終濃度は１〜３％固体であった。瓶を室温（１９〜２２℃）で２時間回転させた（３０〜５０ｒｐｍ）後、室温で１０，０００〜１５，０００×ｇで１０分間遠心した。次いで、ペレット形態のミクロ粒子を、最終濃度０．１〜０．２５％固体を与えるように９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、６％  スクロース、０．１８％  ＴＷＥＥＮ−２０、５０％ウシ胎仔血清（ＣＭＶ抗体なし）、３５ｍｇ／ｍｌ  ＣＫＳタンパク質を含有する混合物（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。次いで、ミクロ粒子をプラスチック製瓶に充填した。
【０１２９】
ｒｐＣＭＶ−２７、ｒｐＣＭＶ−２８及びｒｐＣＭＶ−２９をコートしたポリスチレンミクロ粒子を、ＡＢＢＯＴＴ“ＩＭｘ”計器（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施される自動化イムノアッセイにおいて抗体捕捉フォーマットで使用した。前記したコートミクロ粒子は、ＡＢＢＯＴＴ“ＡｘＳＹＭ”計器（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施される自動化イムノアッセイにおいて抗体捕捉フォーマットで使用することができる。
【０１３０】
前記システムは、血清サンプル及び試薬を自動的に分配するピペッティングデバイスを使用する。前記計器は、サンプルマトリックスからの４４８ｎｍにおける蛍光発光反射率を測定することができる光学リーダーを使用する。逐次操作モードでは、血清サンプルを３種のコートミクロ粒子の各々と別々にインキュベートする。複合操作モードでは、３種のコートミクロ粒子の各々を等容量ずつ混合した後、血清サンプルとインキュベートする。いずれのモードでも、適当なストックミクロ粒子をプラスチック製瓶に分配し、計器にかける。
【０１３１】
好ましいコンジュゲートは、ヤギ抗−ヒトＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲートである。前記コンジュゲートを０．２〜１．５μｇ／ｍｌの作業濃度を測定するために滴定する。コンジュゲート希釈剤は、９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、５％  ウシ胎仔血清、０．１％  アジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）を含む。コンジュゲートを滅菌濾過し、プラスチック製瓶に入れ、計器にかける。コンジュゲートに対する好ましい基質は４−メチルウンベリフェリルホスフェートである。
【０１３２】
抗ＨＣＭＶ陽性インデックス較正物質を、ＨＣＭＶに対する抗体が陽性の血漿単位から作成する。プールした単位を再び石灰化し、等分にし、−２０℃または２〜８℃で保存する。陽性インデックス較正物質の各ロットについて、ストック溶液を、保存料として０．１％  アジ化ナトリウムを含有する陰性コントロールで希釈する。最終材料を滅菌濾過し、プラスチック製瓶に充填する。
【０１３３】
抗ＨＣＭＶ陰性コントロールをＨＣＭＶに対する抗体が陰性の再石灰化ヒト血漿から作成する。前記血漿はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体についてもＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）についても陰性である。単位をプールし、保存料として０．１％  アジ化ナトリウムを添加する。最終材料を滅菌濾過し、プラスチック製瓶に充填する。
【０１３４】
試験すべき血清サンプルを計器の反応容器に分配する。自動化ＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイを実施するための適当なコードを付した後、アッセイを始める。計器により、血清サンプルは直線希釈剤（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１％  アジ化ナトリウム（ｐＨ７．５）または０．３Ｍ  塩化ナトリウム、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１％  アジ化ナトリウム（ｐＨ７．５））中に希釈され、次いで希釈した血清サンプルにミクロ粒子が添加される。５〜１０分間インキュベート後、混合物を反応容器マトリックスに移す。前記マトリックスを直線希釈剤で洗浄し、その後反応容器マトリックスにコンジュゲートを添加する。８〜１０分間インキュベート後、マトリックスを直線希釈剤で洗浄し、その後前記コンジュゲートに対する基質を添加する。サンプルマトリックスからの４４８ｎｍにおける蛍光発光反射率を直ちに読み、計器により各サンプルのレートカウント値及びインデックス値を記録する。インデックス値は、サンプルのレートカウント値を陽性インデックス較正物質のレートカウント値で割った値である。許容され得るアッセイ特異性を維持するためには、アッセイのカットオフ値は、陰性サンプルのインデックス値の平均より少なくとも３〜４標準偏差高くなければならない。自動化ＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイのカットオフ値を０．６のインデックス値で設定した。０．６以上のインデックス値を有するサンプルはＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性と見做した。０．５００〜０．５９９のインデックス値を有するサンプルはＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について疑わしいと見做し、０．５００未満のインデックス値を有するサンプルはＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陰性と見做した。本アッセイで使用した融合タンパク質の特徴を表３に記載する。
【０１３５】
以下の実施例では、ＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体アッセイのいずれの成分がＨＣＭＶ感染の測定において偽陽性結果を与える原因成分であるか、また擬陽性結果の割合をどのように減らすことができるかを示す。
【０１３６】
実施例１
本発明のイムノアッセイを構築するために、米国特許出願第０８／７６５，８５６号のＡｘＳＹＭ  ＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイのいずれの成分が診断アッセイ特異性の欠乏ほもたらすかをまず調べる必要があった。無作為血液ドナー（低リスク集団の３０８人のドナー）からの血清試料を３種の市販されているＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイ（共通アッセイ）及び米国特許出願第０８／７６５，８５６号のＡｘＳＹＭ  ＨＣＭＶ  ＩｇＭイムノアッセイを用いて試験して、擬陽性結果を与えた因子を取り出した。共通アッセイで陽性（３試料）、疑わしい（２試料）及び陰性（４試料）と判定された血清試料を以下の研究のために選択した。
【０１３７】
次いで、３種のコートミクロ粒子を、以下の組換えＨＣＭＶ抗原の各種組合せを用いて製造した。
【０１３８】
Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ１Ｃ２／Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
Ａ１Ｃ２（５９５−６１４ａａ）、Ｆ３（１００６−１０４８ａａ）（ＵＬ３２）、Ｈ１０（２０２−４３４ａａ）（ＵＬ４４）
【０１３９】
Ｈ１０
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ｈ１０−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
Ｈ１０（２０２−４３４ａａ）（ＵＬ４４）
【０１４０】
ｐｐ６５
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ６５−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
ｐｐ６５（２９７−５１０ａ）（ＵＬ８３）
【０１４１】
ｐｐ３８
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ３８−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）（ＵＬ８０ａ）
【０１４２】
ミクロ粒子に対して以下のコーティングを製造した。
【０１４３】
コーティング番号１（ＡＨのみ）
Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原のみをコートしたミクロ粒子。
【０１４４】
コーティング番号２（Ｈのみ）
Ｈ１０抗原のみをコートしたミクロ粒子。
【０１４５】
コーティング番号３（完全）
Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原、ｐｐ６５抗原及びｐｐ３８抗原（ｒｐＣＭＶ２７、ｒｐＣＭＶ２８、ｒｐＣＭＶ２９）をコートしたミクロ粒子。
【０１４６】
３つの別々の実験で、表１の試料を自動化“ＡｘＳＹＭ”計器にて上記した３種のミクロ粒子を含む試薬パックを用いて同じアッセイプロトコルに従って試験した。３種のコートミクロ粒子を用いて試料から得たレートカウントを表１に示す。これらの実験におけるアッセイのカットオフ値は約２５０レートカウントであった。
【０１４７】
試料１３２及び２２１（共通アッセイによるとＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陰性、“ＡｘＳＹＭ”計器によるとＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性）及び試料１７７及び２１５（共通アッセイによるとＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について疑わしい、“ＡｘＳＹＭ”機器によるとＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性）から分かるように、“ＡｘＳＹＭ”計器で生じた陽性信号はＨ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原コートミクロ粒子からのみ誘導された（コーティング番号１（ＡＨミクロ粒子）から与えられる信号とコーティング番号３（完全ミクロ粒子）から与えられる信号を比較されたい）。これら４つの試料のそれぞれにおいて、ＡＨミクロ粒子は完全ミクロ粒子とほぼ同量の信号を与え、よってＨ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原をコートしたミクロ粒子に対する分析は狭くなった。診断アッセイ特異性を欠如させる成分を更に、Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原として同定した。なぜならば、上記４つの試料においてＨ１０抗原だけでは陽性信号を与えなかったからである（コーティング番号１（ＡＨミクロ粒子）で生ずる信号をコーティング番号２（Ｈミクロ粒子）で信号を比較されたい）。
【０１４８】
【表１】
0004290327.tif 000008
表１のデーターは、過剰量の偽陽性結果は融合タンパク質Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３のＡ１Ｃ２Ｆ３部分に起因したことを示す。
【０１４９】
実施例２
融合タンパク質のＡ１Ｃ２Ｆ３を低いアッセイ特異性の原因として同定した後、米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載されている“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイにおけるＨ１０／Ａ１Ｃ２Ｆ３コートミクロ粒子の量を約２／１〜１／３に低減させた。
【０１５０】
次いで、完全抗原カクテルを含有する２つの試薬パックを作成した。これらの試薬パックは、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原をコートしたミクロ粒子の濃度の点でのみ異なっていた。“ＡｘＳＹＭノーマル”とのラベルを付した試薬パックにはコートミクロ粒子を通常濃度で含有させ、“ＡｘＳＹＭ低減ＡＨ”とのラベルを付した試薬パックにはｐｐ６５及びｐｐ３８をコートしたミクロ粒子を通常濃度で、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２Ｆ３抗原をコートしたミクロ粒子を低濃度（２／１〜１／３）で含有させた。
【０１５１】
次いで、無作為血液ドナー（低リスク集団の３０８人のドナー）からの血清試料を自動化“ＡｘＳＹＭ”計器にて両試薬パックを用いて同一アッセイプロトコルに従って別々の実験で試験した。両試薬パックと同一のアッセイカットオフ値（０．６）及びインデックス較正物質を用いると、“ＡｘＳＹＭノーマル”試薬パックを用いるアッセイでは試料の９．７％がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であったと判定され、“ＡｘＳＹＭ低減ＲＨ”試薬パックを用いるアッセイでは試料の２．３％がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であったと判定された。実施例１に記載の共通アッセイでは、試料の１．６％がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であったと判定された。従って、“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイにおいてＨ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原をコートしたミクロ粒子の濃度を低下させると、アッセイ特異性が大きく改善され、共通アッセイと良く一致した。
【０１５２】
次段階では、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３をコートしたミクロ粒子を低レベル用いる“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイの感度が抗原を低減させることにより影響されるかを、共通アッセイで測定して異なる量のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体を用いて患者試料を試験することにより調べた（感度パネル）。その後、感度パネルからの血清試料を自動化“ＡｘＳＹＭ”計器にて両試薬パック（“ＡｘＳＹＭノーマル”及び“ＡｘＳＹＭ低減ＡＨ”）を用いて同一のアッセイプロトコルに従って別々の実験で試験した。両試薬パックと同一のカットオフ値（０．６）及びインデックス較正物質を使用した。結果を表２に示す。
【０１５３】
【表２】
0004290327.tif 000009
共通アッセイでＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性と判定された７つの試料を“ＡｘＳＹＭノーマル”試薬パックを用いるプロトコルに従って測定したところ、７つの試料すべてがＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であったと判定され、“ＡｘＳＹＭ低減ＡＨ”試薬パックによると７つの試料のうち１つのみがＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であったと判定された。従って、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３抗原を低減させると、アッセイ特異性は改善されるが、アッセイ感度は低下する。
【０１５４】
実施例３
実施例２の結果は、Ｈ１０／Ａ１Ｃ２／Ｆ３コートミクロ粒子の量を低減するとアッセイ感度を犠牲にしてアッセイ特異性が改善されたことを明確に示している。米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載されている“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイの特異性を改善するために、本アッセイにおいてミクロ粒子希釈剤に限定量のＡ１Ｃ２及びＦ３合成ペプチドを添加するときの影響を試験して、急性または最近のＨＣＭＶ感染を示さない患者試料中に存在する低レベルのＩｇＭが前記ペプチドの存在により選択的且つ競合的に抑制され得るかを調べた。
【０１５５】
合成ペプチドＡ１Ｃ２（２０ｍｅｒ）及びＦ３（４３ｍｅｒ）を、０、０．１、１．０、１０及び２５μｇ／ｍｌの各濃度で等量のミクロ粒子希釈剤に添加した。最近のＨＣＭＶ感染の被検者（Ｐｏｓパネル番号１〜１４）及び無作為に選択した血液ドナー（ＲＢＤパネル番号１〜４）から得たコントロールの陽性パネル血清試料を、ペプチドが無作為血液ドナー試料（低リスク集団）に対する信号を選択的に低下させるかを調べるために試験した。ミクロ粒子希釈剤中のペプチドレベルを変化させた試料から得たレートカウントを表３に示す。これらの実験におけるアッセイのカットオフは約２５０レートカットオフである。
【０１５６】
【表３】
0004290327.tif 000010
陽性パネル試料（Ｐｏｓパネル番号１〜４）からの信号は、ミクロ粒子希釈剤中のＡ１Ｃ２及びＦ３ペプチドの存在により影響されなかった。最高濃度のペプチドでは、数個の陽性パネル試料では信号が適度に増加する。反対に、無作為血液ドナー試料からの信号は、ミクロ粒子希釈剤中に最高１０μｇ／ｍｌの濃度までＡ１Ｃ２及びＦ３ペプチドが存在すると減少する。３つの試料（ＲＢＤパネル番号１、２及び３）の場合、これらのペプチドをミクロ粒子希釈剤に添加するとＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陰性であると判定された。上記パネルメンバー等を用いて更なる実験を実施して、急性または最近のＨＣＭＶ感染の被検者から得た陽性試料からの信号に対する負の影響を最小限とし、急性または最近のＨＣＭＶ感染を有さない被検者から得た無作為血液ドナー試料からの信号に対する負の影響を最大限とするミクロ粒子希釈剤中の各ペプチドの最適量を決定した。各ペプチドについて使用した濃度範囲は１〜１２μｇ／ｍｌであった。各ペプチドの最適量は、ＨＣＭＶ組換え抗原コートミクロ粒子（コーティング番号１、実施例１）を０．２％固体濃度で含有するミクロ粒子希釈剤において６μｇ／ｍｌであると決定された。
【０１５７】
ミクロ粒子希釈剤中のペフチド濃度を最適化した後、本発明の改善“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイを上で試験したと同じ無作為血液ドナー試料に対して更に試験し、その性能を、ミクロ粒子希釈剤中にペプチドＡ１Ｃ２及びＦ３を含有しない米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイの性能と比較した。改善“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイでは試料の３．３％がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であると判定され、米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイでは試料の９．７％がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であると判定された。ペフチドの添加により、ＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であると判定された陽性試料の数が３／１に減った。これは、１．６％という共通アッセイの数に非常に近い。本発明の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイは、米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の従来のアッセイに比して有意に改善された診断アッセイ特異性を有する。
【０１５８】
本発明の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイを、実施例２、表２に記載されている同じ感度パネルメンバーを用いても試験し、その性能を米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイの性能と比較した。結果を表４に示す。
【０１５９】
【表４】
0004290327.tif 000011
共通アッセイ及び米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイでＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性である７つの試料のうち、本発明の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイによると５試料がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であり、２試料がＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について疑わしい。これは、７つの陽性試料のうちの１つのみがＨＣＭＶ  ＩｇＭ抗体について陽性であると判定された低減ＡＨ抗原アッセイ（実施例２、表２参照）と対比される。結局、本発明の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイは、米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書に記載の従来の“ＡｘＳＹＭ”ＨＣＭＶ  ＩｇＭアッセイと比較して著しく改善された診断アッセイ特異性及び匹敵する診断アッセイ感度を有する。
【０１６０】
本発明の範囲及び趣旨を逸脱しない本発明の各種変更及び改変は当業者には自明であり、本発明が本明細書に記載の例示的実施態様に不適当に限定されないことを理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ウイルス菌株ＡＤ１６９のＥｃｏＲＩ−Ｙ断片中に含まれる遺伝子ＵＬ３２における、米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明の融合タンパク質の１つを特徴付ける２つの部分をコードするＤＮＡ断片の位置を概略的に示す。
【図２】  米国特許出願第０８／７６５，８５６号で使用されているプラスミドの作成方法を概略的に示す。
【図３】  プラスミドｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築の概略図である。
【図４】  プラスミドｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築の概略図である。
【図５】  米国特許出願第０８／７６５，８５６号で使用されているプラスミドの作成方法を概略的に示す。
【図６】  全ウイルスまたは米国特許出願第０８／７６５，８５６号の発明の第１態様の組換え融合タンパク質を含めた各種組換え融合タンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイによるＨＣＭＶ感染被検者からのＩｇＧの検出に関する実験データを比較する表である。
【図７】  米国特許出願第０８／７６５，８５６号明細書の発明の第１態様の融合タンパク質を含めた全ウイルスまたは各種組換え融合タンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイによるＨＣＭＶ感染被検者からのＩｇＭの検出に関する実験データを比較する表である。
【図８】  プラスミドｐＪＯ２１０及びｐＪＯ２１５の構築の概略図である。
【図９】  プラスミドｐＭＣ２００の構築の概略図である。
【図１０】  プラスミドｐＪＯ２００の構築の概略図である。
【図１１】  プラスミドｐＭＢ３８：ｌａｃＺｐｐ３８（１０６−３７７ａａ）の構築の概略図である。
【図１２】  プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築の概略図である。
【図１３Ａ】  Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０  ＤＮＡ配列を含むＰＣＲ断片の作成を示す。
【図１３Ｂ】  ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲ断片の作成を示す。
【図１３Ｃ】  プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ−Ｈ１０、プラスミドｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０、プラスミドｐＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びプラスミドｐＣＭＶ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築の概略図である。
【図１４Ａ】  プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕｌの構築の概略図である。
【図１４Ｂ】  プラスミド残基１５１−１８０（５’→３’）での意図する修飾を含むプラスミドｐＪＯ２００のヌクレオチド配列を示す。
【図１４Ｃ】  プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰに連結させるために合成した突然変異原性オリゴヌクレオチド５’ＣＧＣＧＡＣＧＴ３’の二本鎖構造を示す。
【図１４Ｄ】  修飾残基１５１−１８０（５’→３’）を含めたプラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのヌクレオチド配列を示す。
【図１５】  プラスミドｐＥＥ１の構築の概略図である。
【図１６Ａ】  Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲ断片の作成を示す。
【図１６Ｂ】  プラスミドｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ、プラスミドｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ及びプラスミドｐＣＭＶ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳの構築の概略図である。
【配列表】
0004290327.tif 000012
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0004290327.tif 000020
0004290327.tif 000021
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004290327.tif 000031
【図１１】
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【図１２】
0004290327.tif 000033
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
0004290327.tif 000038
【図１４Ｃ】
0004290327.tif 000039
【図１４Ｄ】
0004290327.tif 000040
【図１５】
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【図１６Ａ】
0004290327.tif 000042
【図１６Ｂ】
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