(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌にはAgaricus blazei Murillもしくは Lentinus edodesの子実体の乾燥物を用い、この担子菌乾燥物を温水中に浸漬するとともに、この浸漬の当初から、または浸漬中、あるいは浸漬終了後、前記浸漬液中にグルタミン酸ナトリウムを１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌほど添加し、ｐＨ４．０〜９．０、３０℃〜５０℃の温度において２時間〜８時間保持したのち、
γ−アミノ酪酸の生産量を増大させた前記浸漬液を濾過、または加熱、あるいは乾燥して前記γ−アミノ酪酸を回収し含有させることを特徴とするγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法。
【請求項２】
前記温水の温度を３７℃、前記浸漬時間を４時間にした請求項１記載のγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法。
【請求項３】
前記浸漬液中に、デンプン、糖類等の固形分を投入しあるいは固形分を投入せずに、加熱あるいは真空乾燥することにより、γ−アミノ酪酸の固形分を回収し、食品中に含
有させる請求項１または２に記載のγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担子菌の生産する生理活性物質に関し、詳しくは同生理活性物質を主成分とし、とくに高血圧を改善するγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
担子菌 Agaricus属および Lentinus属は、現在、免疫賦活剤、抗ガン剤、などとして健康食品等に利用されている。その有効成分は、免疫賦活剤、抗ガン剤においては菌体中の糖質に由来していると推定される。
【０００３】
しかしながら、担子菌の生産するγ-アミノ酸に由来する高血圧改善作用および糖尿病改善作用などは報告されていない。
【０００４】
一方、子嚢菌類のあるものが、神経伝達物質として知られるγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡともいう）を生産することは分かっており、健康食品等として商業的に利用されているが、担子菌が、大量のγ−アミノ酪酸を生産することは報告されていない。
【０００５】
また、穀物胚芽および茶葉の酵素がグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換することは知られているが、担子菌のあるものが同様の変換を行い、また大量のγ−アミノ酪酸を生産することは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが本発明者らは、担子菌の生理活性物質について種々研究を重ねる間に、担子菌 Agaricus属および Lentinus属が、これらの子嚢菌類以上に高濃度のγ−アミノ酪酸を生産することを見い出し、さらにγ−アミノ酪酸の生産量を著しく増大させる方法を発明した。
【０００７】
γ−アミノ酪酸は、神経伝達物質として知られ、高血圧改善効果があり、また、γ−アミノ酪酸の生産不全がある種の糖尿病発症と関係していることは広く知られている。しかし、化学合成によらないγ−アミノ酪酸の生産が、胚芽、子嚢菌培養によって可能であることは既に提案されているが、その低い生産性のために、商業的には小規模にしか行われていない。
【０００８】
本発明は、従来から行われている胚芽、子嚢菌培養による方法に比して数倍の生産性をもってγ−アミノ酪酸を大量に含有させることができ、高血圧改善および糖尿病改善に有効なγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明で使用する担子菌には、Agaricus blazei Murillもしくは Lentinus edodesの子実体の乾燥物を用いる。使用する担子菌乾燥物は、市販の食用、または健康食品としての抽出飲用のもの、若しくは医薬品製造用のものが使用でき、好適には７０℃以下の温度で乾燥されたものが望ましい。
【００１０】
担子菌乾燥物は次工程を容易にするために、任意に切断あるいは粉砕してよい。本発明の特徴であるγ-アミノ酪酸の生産量を増大する方法は、担子菌の乾燥物を温水中に浸漬し、温水をｐＨ４．０〜９．０、３０℃〜５０℃の温度、好適には３７℃において２時間〜８時間、好適には４時間保持することによって、担子菌の酵素を作用させ、たんぱく質を酵素分解させ、さらに、これにより生成するアミノ酸（グルタミン酸）をγ-アミノ酪酸に酵素変換させることによる。この工程により、浸漬前に含有されていた、γ−アミノ酪酸に加え、酵素により生成されたγ−アミノ酪酸が加わり、著しいγ−アミノ酪酸の生産量の増大が図られる。ｐＨ４．０〜９．０に保つのは、グルタミン酸脱炭酵素はｐＨ４．０を下まわると活性を示さないためＧＡＢＡは生産されなくなる一方、ｐＨ９．０を超えるとタンパク質が変性するからである。
【００１１】
γ−アミノ酪酸は水溶性であるため、主として浸漬液中から回収する。方法としては、遠心分離機若しくはフィルタープレス等の濾過機を用いたエキスの回収方法、若しくは、浸漬物中に、デンプン、糖類等の固形分を投入して、あるいは固形分を投入せずに、加熱あるいは真空乾燥によって固形分の回収を行う。
【００１２】
また、γ−アミノ酪酸は酸化安定性が高いため、回収エキスからの噴霧乾燥等による粉末化などが可能である。
【００１３】
さらにγ−アミノ酪酸の生産量を増大するために、上記工程中の浸漬液中にグルタミン酸ナトリウムを１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ ほど添加する。これは浸漬当初からでもよく、浸漬中、あるいは浸漬終了後、浸漬物の固形分分離前に行なってもよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
▲１▼  キノコ子実体のグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、ＧＡＤという）活性：市販のキノコ子実体を凍結乾燥または５０℃の温度で乾燥して３０メッシュのふるいをかけた。キノコ乾燥物１０ｇに水道水１００ｍｌを試験管に入れ、必要に応じてグルタミン酸ナトリウムを５００ｍｇ添加して３７℃の温度下で、４時間酵素反応を行った。続いて１００℃にて３０分間沸騰させたのち、冷めてから濾過してＨＰＬＣ法でアミノ酸分析を行った。その結果を表１に示す。ＧＡＤ酵素活性は１ｇの 乾燥キノコが４時間３７℃酵素反応によって生成されるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）１ｍｇを１単位とした。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
▲２▼  キノコ子実体のプロテアーゼ活性： 上記乾燥条件にて乾燥して得られたキノコ乾燥物を用いて国税庁所定分析法に準じてプロテアーゼ活性を測定した。酵素抽出条件は酢酸緩衝液（ｐＨ５.０）にて１５〜２０℃で３時間抽出して固液分離後その濾液を分析サンプルとした。プロテアーゼ活性は１ｇのキノコ乾燥物が４０℃で６０分間に１μｇチロシン相当量の呈色を示す活性を１単位とした。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
▲３▼  Agaricus blaze1 M.の子実体乾燥物５種類を、各々卓上ブレンダーを用いて室温で粉砕した。５種の粉砕物をそれぞれサンプル１、２、３、４、５とし、各サンプルにγ−アミノ酪酸の生産量を増大させる浸漬処理を行わないものを各々無処理区とし、各無処理区に対応する粉砕物に当該処理を行うものを処理区とした。さらに、当該浸漬処理において、グルタミン酸ソーダを添加したものを各々添加処理区とした。各処理区の粉砕物は各１０ｇをビーカ中で１００ｍｌの水に攪拌して分散させ、５０％乳酸を用いてｐＨ５.５に調整し、３７℃に昇温して攪拌しながら４時間保持した後、１００℃で３０分間加熱し、冷却後、遠心分離機をもちいて固形分を除いた上澄みを、No.２濾紙を用いて濾過し、その濾液を得て、その濾液中のγ−アミノ酪酸濃度はアミノ酸分析機を用いて測定した。γ−アミノ酪酸量は、濾液中の濃度から、粉砕物１００ｇ当たりから得られる重量として換算し、ｍｇ／１００ｇを単位として得た。
【００１９】
各添加処理区においては粉砕物を水に分散後、グルタミン酸ソーダを各０.５ｇ添加してから５０％乳酸を用いて、ｐＨ５.５に調整した。他の処理はすべて処理区と同様である。各無処理区においては５０％乳酸を用いて、ｐＨ５.５に調整後直ちに１００℃で３０分間加熱した。その他の処理はすべて処理区と同様である。
【００２０】
以上の結果を表３に示した。
【表３】
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表３に示すとおり、浸漬処理により、γ−アミノ酪酸の生産量が増大し、かつグルタミン酸ソーダを添加することによりさらにγ−アミノ酪酸の生産量が増大する。
【００２１】
▲４▼   Lentinus edodesの子実体乾燥物の５種類を各々卓上ブレンダーを用いて室温で粉砕した。５種の粉砕物をそれぞれサンプル１、２、３、４、５とし、各サンプルにγ−アミノ酪酸を増大させる浸漬処理を行わないものを各々無処理区とし、各無処理区に対応する粉砕物に当該処理を行うものを処理区とした。さらに、当該浸漬処理において、グルタミン酸ソーダを添加したものを各々添加処理区とした。
【００２２】
各処理区の粉砕物は各１０ｇをビーカ中で１００ｍｌの水に攪拌して分散させ、５０％乳酸を用いてｐＨ５.５に調整し、３７℃に昇温し攪拌しながら４時間保持した後、１００℃で３０分間加熱し、冷却後、遠心分離機をもちいて固形分を除いた上澄みをNo.２濾紙を用いて濾過し、その濾液を得て、その濾液中のγ−アミノ酪酸濃度はアミノ 酸分析機を用いて測定した。
【００２３】
γ−アミノ酪酸量は、濾液中の濃度から、粉砕物１００ｇ当たりから得られる重量として換算し、ｍｇ／１００ｇを単位として得た。
【００２４】
各添加処理区においては粉砕物を水に分散後、グルタミン酸ソーダを各０.２５ｇ添加してから５０％乳酸を用いて、ｐＨ５.５に調整した。他の処理はすべて処理区と同様である。各無処理区においては５０％乳酸を用いて、ｐＨ５.５に調整後、直ちに１００℃で３０分間加熱した。
【００２５】
その他の処理はすべて処理区と同様である。 以上の結果を表４に示した。
【表４】
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表４に示すとおり、浸漬処理により、γ−アミノ酪酸の生産量が増大し、かつグルタミン酸ソーダを添加することによりさらにγ−アミノ酪酸の生産量が増大する。
【００２６】
▲５▼  上記表３および表４で示した各区の濾液を乾燥、希釈して得られた乾燥物と市販のγ−アミノ酪酸含有天然物のγ−アミノ酪酸含有量の分析値を示す。
濾液の乾燥は１００ｍｌあたり１０ｇのデキストリン分散の上減圧乾燥した。
【表５】
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【００２７】
実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
１．  Agaricus blaze1 M.の子実体乾燥物８４０ｇを卓上ブレンダーで室温で粉砕した。
粉砕物を１５ｌステンレススチールの容器中で８４００ｍｌの水に攪拌して分散後、グルタミン酸ソーダを４２ｇ添加し、５０％乳酸を用いてｐＨ５.５に調整し、３７℃に昇温して５０ｒｐｍで攪拌しながら４時間保持した後、１００℃で１時間加熱し、冷却後、遠心分離機を用いて固形分を除いた上澄みを減圧濃縮機を用いて濃縮液を得、この濃縮液をγ−アミノ酸濃度２.０％となるように精製水で希釈し、γ−アミノ酸２.０％含有担子菌エキス８６５ｍｌを得た。
【００２８】
２．  Lentinus edodes の子実体乾燥物１０００ｇを卓上ブレンダーを用いて室温で粉砕した。粉砕物を１５ｌステンレススチールの容器中で１０ｌの水に攪拌して分散後、グルタミン酸ソーダを２５ｇ添加し、５０％乳酸を用いてｐＨ５.５に調整し、３７℃に昇温し５０ｒｐｍで攪拌しながら４時間保持した後、１００℃で１時間加熱し、冷却後、遠心分離機を用いて固形分を除いた上澄みを減圧濃縮機を用いて濃縮液を得、この濃縮液をγ−アミノ酸濃度１０％となるように、精製水で希釈しγ−アミノ酸１０％を含有した担子菌エキス９５０ｍｌを得た。
【００２９】
ところで、上記した本発明にかかる健康食品は、いわゆる機能性を有する新規な食品と言えるが、本発明の健康食品についてその開発（発明に至る）過程で、次の結果が得られた。
（１）入手可能な食用微生物を調べたところ、担子菌 Agaricus属および Lentinus属が血圧低下作用を示すＧＡＢＡを生産することが確認された。とくに  Agaricus blazei Murill（以下、アガリクスという。）がＧＡＢＡを高濃度に生産することが確認された。
（２）アガリクスを液体培養することによってアガリクスにＧＡＢＡを生産させることができた（以下、このアガリスクをアガリクス菌糸体という。）。
（３）アガリクス子実体においても、自己消化により高濃度（３％以上）のＧＡＢＡを蓄積させることができた（以下、このアガリスクをＧＡＢＡ蓄積アガリクスという）。
【００３０】
そこで、ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体について、動物実験を行って血圧降下作用を有するか否かについて確認した。
【００３１】
実験動物について
実験動物は星野試験飼育所から入手した雄性本態性高血圧自然発症ラット（以下、ＳＨＲという）を用いた。飼育および保管に関しては総理府告示第６号の基準に沿って行った。２５週齢のラットを用いて１群５匹として、温度は２８±１℃、照明は１２時間おきに自動的に明（７：００〜１９：００）暗に切り替わる部屋で個別に飼育した。飲料水は水道水を用いて飼料とともに自由摂取とした。
【００３２】
飼料組成について
飼料の基本組成は実験１では表６に示したように、また実験２では表７に示したようにＡＩＮ組成に基づき、また血圧を上昇させるために食塩１％を加えた。アガリクス菌糸体およびＧＡＢＡ蓄積アガリクスを５％添加し、サッカロースを加えることで１００（重量）％になるように調整した。また、実験飼料の給餌期間以外は、市販の固形飼料を与えた。固形飼料で１週間飼育後、試験飼料に切り替え３週間飼育した。
【００３３】
【表６】
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【００３４】
【表７】
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【００３５】
血圧測定と血清脂質測定法について
血圧は１週間ごとに無加温型非観血式血圧計Ｍｏｄｅｌ−２０００を用いて、２３℃以上の室温で尾動脈圧の収縮期血圧を無麻酔下の間接（カフ）法により測定した。血液は血圧測定後、尾部より採血した。血清脂質（総コレステロール）（ＴＣ）、高密度リポ蛋白質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、トリグリセライド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ））は、酵素法により定量した。ＴＣからＨＤＬ−Ｃを差し引き、超低比重リポ蛋白質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）＋低比重リポ蛋白質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）とした。ＨＤＬ−Ｃと（ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ）の比から動脈硬化指数（ＡＩ）を算出した。
【００３６】
アンジオテンシン変換酵素阻害実験
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害実験は、ヒプリルヒスチジルロイシン（ＨＨＬ）を基質にＡＣＥにより酵素反応させ、生成した馬尿酸を定量することにより測定した。定量にはキャピラリー電気泳動を用い、馬尿酸のピーク面積が半減した濃度（ＩＣ５０）をＡＣＥ活性阻害濃度として算出した。
【００３７】
統計処理
各群とも平均値±標準偏差（ＳＤ）で示し、群間の有意差検定にはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行い、ｐ＜０．０５で判定した。
【００３８】
結果
（実験１：予備実験）
▲１▼  ＧＡＢＡ蓄積アガリクスのＳＨＲへの血圧上昇に対する影響
図１はＧＡＢＡ蓄積アガリクスを食餌成分として投与したＳＨＲの３週間にわたる血圧の経時変化を示す線図である。同図に示すようにコントロール群では経時的に血圧が上昇したのに対して、ＧＡＢＡ蓄積アガリクス投与群ではいずれにおいても血圧の上昇を抑制させる傾向を示した。
【００３９】
（実験２：本実験）
▲２▼  ＧＡＢＡ蓄積アガリクスとアガリクス菌糸体がＳＨＲの生育に及ぼす影響
図２はＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体を食餌成分として与えた場合のＳＨＲ体重変化を示す線図である。図２に示すようにＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体投与において、ＳＨＲの体重が著しく低下するような変化は認められなかった。
【００４０】
▲３▼  ＧＡＢＡ蓄積アガリクスとアガリクス菌糸体のＳＨＲへの血圧上昇に対する影響
図３はＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体を食餌成分として投与したＳＨＲの３週間にわたる血圧の経過変化を示す線図である。図３に示すようにコントロール群では経時的に血圧が上昇したのに対して、ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体投与群ではいずれにおいても血圧の上昇を抑制させる傾向を示した。３週間試験をおこなった結果、最終的にはコントロール群で２３６±１０ｍｍＨｇ、アガリクス菌糸体投与群で２１２±１１ｍｍＨｇ、ＧＡＢＡ蓄積アガリクス群で２０７±１２ｍｍＨｇとなった。以上の結果からアガリクスには、ＳＨＲに対する優れた血圧降下作用があることが認められる。
【００４１】
▲４▼  ＧＡＢＡ蓄積アガリクスとアガリクス菌糸体がＳＨＲの血清脂質に及ぼす影響
図４にＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体を食餌成分としてＳＨＲに投与し、尾部採血から測定した試験最終時の血清脂質結果を示した。コントロール群に比べて、ＧＡＢＡ蓄積アガリクスとアガリクス菌糸体投与群ではＴＣ、ＴＧ、ＡＩの値を低下させる傾向を示した。このようにアガリクスの投与により、ＴＣ、ＴＧの低下作用も認められた。
【００４２】
▲５▼  ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体のＡＣＥ阻害活性
ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体のＡＣＥ活性阻害濃度を表８に示した。ＡＣＥ活性阻害作用の程度を知るために、高血圧症、うっ血性心不全の治療薬であるカプトプリルについても同様に調べた。カプトプリルのＡＣＥ活性阻害作用におけるＩＣ５０は、０．０２ｍｇ／ｍｌであったが、ＧＡＢＡ蓄積アガリクスとアガリクス菌糸体は、いずれもカプトプリルに比べるとその効果は小さかった。ＧＡＢＡについてもＡＣＥ活性阻害作用におけるＩＣ５０を測定したが、ＧＡＢＡはＡＣＥ阻害作用をほとんど示さなかった。
ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体についてＡＣＥ活性阻害濃度が、高血圧症の治療薬であるカプトプリルに比べると小さいことから、ＧＡＢＡにはＡＣＥ活性阻害効果はないと考えられる。
【００４３】
【表８】
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【００４４】
【発明の効果】
以上説明したことから明らかなように、本発明にかかるγ−アミノ酪酸を主成分とする健康食品の製造方法には、次のような優れた効果がある。
（１）担子菌の生産するγ−アミノ酪酸を主成分とした健康食品であるので、高血圧改善作用がある。
【００４５】
（２）また、前記担子菌がハラタケ科 Agaricus blazei Murillもしくはヒラタケ科( シメジ科 )の担子菌 Lentinus edodesであると、とくに高血圧改善作用が高い。
【００４６】
（３）担子菌にはAgaricus blazei Murillもしくは Lentinus edodesの子実体の乾燥物を用い、この担子菌乾燥物を温水中に浸漬し、３０℃〜５０℃の温度において２時間〜８時間保持したのち、前記浸漬液中から遠心分離機若しくはフィルタープレス等の濾過機を用いてγ−アミノ酪酸を回収することにより、浸漬前に含有されていたγ−アミノ酪酸に加え、酵素により生成されたγ−アミノ酪酸が加わり、著しいγ−アミノ酪酸の生産量の増大が図られる。
【００４７】
（４）前記温水の温度を３７℃、前記浸漬時間を４時間にすれば、γ−アミノ酪酸の生産量の増大効果が一層向上する。
【００４８】
（５）前記浸漬液中にグルタミン酸ナトリウムを１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ ほど添加すると、γ−アミノ酪酸の生産量をさらに増大することができる。
【００４９】
（６）前記浸漬液中に、デンプン、糖類等の固形分を投入し、あるいは固形分を投入せずに、加熱あるいは真空乾燥すると、γ−アミノ酪酸の固形分を回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびコントロール群（比較例）を食餌成分として投与したＳＨＲの３週間にわたる血圧の経時変化を示す線図である。
【図２】ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体ならびにコントロール群（比較例）を食餌成分として与えた場合のＳＨＲ体重変化を示す線図である。
【図３】ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体ならびにコントロール群（比較例）を食餌成分として投与したＳＨＲの３週間にわたる血圧の経過変化を示す線図である。
【図４】ＧＡＢＡ蓄積アガリクスおよびアガリクス菌糸体ならびにコントロール群（比較例）を食餌成分としてＳＨＲに投与し、尾部採血から測定した試験最終時の血清脂質結果（ＴＣ、ＴＧ、ＰＬ、ＡＩ、ＨＤＬ−ＣおよびＴＧ）を示す棒グラフである。
【符号の説明】
Ａ：コントロール群
Ｂ：ＧＡＢＡ蓄積アガリクス
Ｃ：アガリクス菌糸体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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