(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度を測定することを特徴とする、破水の検出方法。
【請求項２】
体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、免疫学的測定法により行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体を用いるサンドイッチELISA法により測定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
体液試料が頚管分泌液または膣内分泌液である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
破水が前期破水である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、破水の検出方法、詳しくは、既存の方法では正確に検出できないような破水をも正確に検出することのできる破水の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】
妊娠22週から37週未満での分娩を早産といい、全妊娠の約10%に起こるといわれている。陣痛が起こる前の破水を前期破水(PROM)といい、37週未満に破水が起きたものをpreterm PROM(PPROM)と呼ぶ。PPROMは全妊娠の1-2%に起こり、早産の30-40%はPPROMが原因であると報告されている(Arias F. and Tomich P., Obstet Gynecol, 60, 277-281, 1982)。
【０００３】
PPROMに合併する重篤な症状としては、母体の敗血症や死亡、胎盤早期剥離、高い帝王切開率、胎児の死亡、奇形、関節拘縮、新生児の肺低形成や呼吸窮迫症候群、新生児の敗血症や脳室内出血などが挙げられる。また、新生児に精神的、肉体的な欠陥を長期的に残す場合がある。一方、妊娠37週以降に起こる破水であるterm PROMでは、母体の子宮内感染症や胎児の臍帯圧迫などが問題となる場合がある。従って、母体や胎児(新生児)をこれら合併症から守るために、PROMに対して適切かつ迅速な処置を行う必要がある。
【０００４】
破水の原因と予後には妊娠週数が重要な意味を持つことから、そのマネジメントは妊娠週数によって異なる(French J.I. and McGregor J.A., Semin Perinatol, 20, 344-368, 1996)。従って、破水時期を正確に知ることは、PROMのマネジメントにおいて非常に重要であると考えられている。
【０００５】
従来、破水の診断は、膣鏡を用いて膣内に漏出してきた羊水を確認することにより行われてきた。また、これを補完するために、Nitrazine testやFern testが行われている(Friedman M.L. and McElin T.W., Obste Gynecol, 104, 544-550, 1996)。前者は、Nitrazine paperを用いて膣分泌液のpHを測定するもので、通常pH4.5-6.0の膣分泌液にpH7.1-7.3の羊水が漏出してくるとpHが上昇することによって破水を判断する。しかしながら、精液の混入やアルカリ性抗菌剤、細菌性膣症の影響を受け易く、偽陽性率は17.4%であり、偽陰性率は9.7%であると報告されている（Atterbury J.L., Groome L.J., and Hoff C., Obstet Gynecol, 92, 384-389, 1998)。後者のFern testは、後膣円蓋部のぬぐい液をスライドグラス上に塗布し乾燥させると、破水している場合には羊歯状結晶が形成される(ferning)ことを利用している。本法の偽陽性率は5.8%、偽陰性率は12.9%と報告されている(Atterbury J.L., Groome L.J., and Hoff C., Obstet Gynecol, 92, 384-389, 1998)。しかしながら、いずれの方法においても、膣鏡検査において分泌液の存在が確認できないような場合には、診断が困難であるとされている。
【０００６】
しかも、このような診断困難な状況は、PPROMが疑われた患者の25%に昇るとの報告があり(Ladfors L., Mattsson L.A., Eriksson M., and Falle O., Acta Obstet Gynecol Scand, 76, 739-742, 1997)、大きな問題となっている。このような状況下でFern testを行うと、偽陽性率が21%、偽陰性率が41%にはねあがるとの報告もある(DeHaan H.H., Offermans P.M., Smits F., Schouten H.P., and Peeters U., Am J Perinatol, 11, 45-50, 1994)。
【０００７】
このような状況下において、破水の診断を正確かつ迅速に行える方法が望まれており、ジアミノオキシダーゼ、α-フェトプロテイン、癌胎児性フィブロネクチン(以下fFNという)などが破水を検出しうる候補化合物として挙げられている(Arias F., Gonzalez-Ruiz A.R., and Jacobson R.L., Curr Opin Obstet Gynecol, 11, 141-147, 1999)。しかしながら、精液や血液の混入による影響や、膣炎、頚管炎の影響を受けやすいなど問題点も多く、現状では未だ満足できる診断方法は確立されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上述した検査法より正確かつ迅速であり、被験者に対する負担が少なく破水を検出できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するためにヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素(以下L-PGDSということもある)に着目した。
【００１０】
L-PGDSは、各種プロスタグランジン類の共通の前駆体であるPGH2から、睡眠誘発作用をはじめとした各種生理作用を示すPGD2への異性化を触媒する酵素である（Urade Y., Fujimoto N., and Hayaishi O., J. Biol. Chem., 260, 12410-12415, 1985; Urade Y., Watanabe K., and Hayaishi O., J. Lipid Mediator Cell Signaling, 12, 257-273, 1995）。近年、このL-PGDSが、ヒト脳脊髄液(CSF)中に多量に存在することが知られていたβ-トレースと同一であることが明らかにされた（Hoffmann A., Conradt H.S., Gross G., Nimtz M., Lottspeich F., and Wurster U, J. Neurochem., 61, 451-456, 1993; Zahn M., Mader M., Schmidt B., Bollensen E., and Felgenhauer K., Neurosci. Let., 154, 93-95, 1993; Watanabe, K., Urade Y., Mader M., Murphy C., and Hayaishi O., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203, 1110-1116, 1994）。
【００１１】
L-PGDSがβ-トレースと呼ばれていた時代より、本タンパクが羊水中に存在することが知られていたが(Olsson J.E., Sherman M.S., and Kjessler B., Lancet, ii, 347-348, 1974、Adinolfi M., Haddad S.A., Beck S.E., Fung I.L., and Osserman E., Experimentia, 32, 53-55, 1976)、破水との関連性に関する検討は全く行われていなかった。そこで本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、妊婦の体液中のL-PGDS濃度を測定し、その測定値を指標とすることより、正確かつ迅速に破水を検出できることを見い出し、本研究を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度を測定することを特徴とする、破水の検出方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、免疫学的測定法により行うことを特徴とする、前記方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体を用いるサンドイッチELISA法により測定する、前記方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、体液試料が頚管分泌液または膣内分泌液である、前記方法を提供する。
本発明はさらに、破水が前期破水である、前記方法を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明においてL-PGDSを測定する試料は被験者から採取した体液であり、具体的には膣内分泌液や頚管分泌液などが挙げられる。
【００１７】
体液中のL-PGDS濃度を測定する方法としては、L-PGDS濃度を正確に反映する測定法であれば特に限定はされず、例えば免疫学的測定法、酵素活性測定法が挙げられる。しかしながら、実際の臨床現場において、簡便に且つ多量の試料を同時に測定する必要性の観点から、L-PGDSに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いたEIA、ELISA、RIA、FIA、ラテックス比濁法、ラテックス凝集法、免疫比濁法、免役比ろう法等の免疫学的測定法によるのが好適である。
【００１８】
上記の免疫学的測定法のうち、特に、L-PGDS特異的モノクローナル抗体を使用したサンドイッチELISA法が好ましく、該モノクローナル抗体としては、具体的には、ハイブリドーマ細胞株1B7（FERM BP-5709）、7F5（FERM BP-5711）、6F5（FERM BP-5710）、9A6（FERM BP-5712）、10A3（FERM BP-5713）より産生される抗体が挙げられる。
【００１９】
ELISA法においては、まず上記モノクローナル抗体のいずれかを第一抗体として担体に固定化する。担体としては固体担体が好ましく、例えばスチレンやポリスチレンなどの高分子担体を用いて成型されたELISAプレートなどの容器を使用できる。モノクローナル抗体の担体への固定化は、例えばモノクローナル抗体を炭酸緩衝液やホウ酸緩衝液などの緩衝液に溶解して担体に吸着させることにより実施できる。他方、第二抗体としては、ポリクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAとすることができる。あるいは、後述する実施例で記載するように、本発明のモノクローナル抗体の１つを第一抗体とし、別のモノクローナル抗体を第二抗体として用いるサンドイッチELISAを用いると、L-PGDSをより確実に精度よく検出できる。
【００２０】
本発明によるL-PGDSの測定方法の一例を以下に説明する。
まず抗体吸着用緩衝液を用いて第一抗体をマイクロプレートに分注してインキュベートし、上清を除去した後、洗浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッキング溶液、測定用試料溶液、標識化第二抗体の順に分注、インキュベート、洗浄を繰り返す。最後に基質溶液を分注し、室温又は37℃で保持した後、405nmと490nmにおける吸光度の差（A405nm-A490nm）を測定し、別途L-PGDSの標準希釈系列から作成した標準曲線を用いることにより、L-PGDSの濃度を算定することができる。
【００２１】
また、サンドイッチ法による測定に際しては、既に本発明者らにより確立されている、上記モノクローナル抗体を含むL-PGDS検出キットを利用すればさらに簡単かつ正確に測定することができる（国際公開番号WO97/16461）。
【００２２】
本発明の方法では、上記手段で測定した被験者の体液中のL-PGDS濃度をもとに、破水を正確に検出することができる。特に、本発明の方法は、癌胎児性フィブロネクチン（fFN）測定では正確に検出できない破水状況でも、早期に、かつ正確に検出できることが明らかとなった。本発明の方法により破水時期を正確に知ることができるようになり、前期破水（PROM）のマネジメントを容易に行うことが可能になる。
【００２３】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
参考例：体液中L-PGDS濃度の測定
（１）標準曲線の作成
まず、L-PGDSと結合可能な抗L-PGDSモノクローナル抗体（クローン：7F5）を50mM炭酸緩衝液（pH 9.6）に4.4μg/mlになるように希釈し、96ウエルマイクロタイタープレートに300μl/ウエルずつ加えて、4℃で一晩放置し固相化した。このプレートをリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4、以下PBS）で3回洗浄した後、0.2%カゼインを含むPBS（pH 7.4、以下ブロッキング液）を300μl/ウエル加えて30℃で90分インキュベートし、ブロッキングを行った。
【００２５】
次いで、ブロッキング後のプレートを0.05%Tween20を含むPBS（T-PBS）で3回洗浄した後、100μlの標準L-PGDS溶液（CSFより純化したL-PGDSをブロッキング液で段階希釈することにより調製）を各ウエルに加え、30℃で90分間インキュベートした。反応後、T-PBSで3回洗浄し、ブロッキング液で0.5μg/mlになるように希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗L-PGDSモノクローナル抗体（クローン：1B7）100μlを各ウエルに加え、30℃で90分間インキュベートした。T-PBSで3回洗浄した後、発色液（ABTS solution：ベーリンガーマンハイム社製）100μlを各ウエルに加え、30℃で30分間インキュベートした後、停止液（ 1.5%シュウ酸）を100μlずつウエルに加え、プレートミキサーで撹拌して反応を停止させた。市販のプレートリーダー（スペクトラマックス250、モレキュラーデバイス社製）により405nmと490nmにおける吸光度の差（A405nm-A490nm）を測定し、標準曲線を作成した。
【００２６】
上記サンドイッチELISA法に用いたモノクローナル抗体（クローン：1B7、7F5）は、マウス腹腔内にプリスタン1.0mlを注射し、その後2週間目にそれぞれの抗体産生細胞株を1×108個マウスの腹腔内に移植し、2週間後に腹水を採取し、得られた腹水をプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィー操作にかけることにより得た（3〜10mg/ml）。  尚、上記モノクローナル抗体を産生する細胞株はそれぞれ上記モノクローナル抗体名に一致し、それぞれの細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、1B7についてはFERM BP-5709（原寄託日平成7年9月21日）、7F5についてはFERM BP-5711（原寄託日平成8年6月6日）として寄託されている。
（２）試料中のL-PGDS濃度の測定
被験者より採取した膣内分泌液あるいは頚管分泌液を用い、上記のサンドイッチELISA法に従ってL-PGDS濃度を測定した。
【００２７】
膣内分泌液あるいは頚管分泌液の調製は以下の通り実施した。即ち、滅菌した綿棒を後膣円蓋部あるいは子宮頚管内に挿入し、約10秒間回して液体を吸着させた。次いで、綿棒を1mlの50mM Tris緩衝液(pH7.5)に浸し、吸着した液体を分散させたものを測定用試料とした。
【００２８】
実施例１：頚管分泌液中L-PGDS濃度と膣内分泌液中L-PGDS濃度の関係
参考例の方法に従って、妊娠36週〜40週の妊婦16名の頚管分泌液および膣内分泌液中のL-PGDS濃度を測定した。
【００２９】
その結果、図１に示したように、両者の間には有意な相関性が認められることが明かとなった(r=0.832、p=0.0001)。このことより、破水との関連性を検討するための検体は、頚管分泌液と膣内分泌液のどちらを用いても良いことが示唆された。
【００３０】
実施例２：膣内分泌液中のL-PGDS濃度とfFN濃度の関係
妊娠19週〜41週の妊婦78名を対象として、膣内分泌液中のL-PGDS濃度とfFN濃度を測定した。L-PGDSの測定は参考例の方法に従い、fFNの測定は癌胎児性フィブロネクチン測定キット(PTDチェック、ADEZA BIOMEDICAL社製)を用いて行った。
【００３１】
その結果、図２に示したように、両者の間には有意な相関性が認められることが明かとなった(r=0.604、p<0.0001)。このことより、膣内分泌液中のL-PGDSを測定することによって、破水の検出を行える可能性が示された。
【００３２】
実施例３：破水状況による膣内分泌液中L-PGDS濃度の変動
実施例２で検討した症例の破水状況を、外子宮口よりの羊水流出の有無、Nitrazine test、およびFern testによって確認した。その結果を元に、各症例を、破水なし(61名)、破水兆候あり(５名)、破水あり(12名)の３群に分類した。破水兆候ありは、陣痛が既にあり、子宮口が4cm以上開大し、胎胞形成のある症例で、検体採取の後数時間以内に破水が確認された症例とした。各群におけるL-PGDS濃度をMann-WhitneyのU検定によって比較した結果を、図３に示す。
【００３３】
膣内分泌液中のL-PGDS濃度は、破水あり群で0.245±0.171(平均±標準偏差、以下同じ)μg/mlと、破水なし群の0.052±0.069μg/mlと比し有意に高値を示すことが明かとなった(p<0.0001)。更に、破水兆候あり群(0.200±0.068μg/ml)においても破水なし群と比し有意に高値を示すことが判明した(p<0.001)。一方、fFN濃度を検討したところ、ほぼ同様の結果が得られることが確認された(図４)。
【００３４】
以上の結果より、膣内分泌液中L-PGDS濃度を測定することによって、少なくともfFNと同様に、破水の検出を早期に行えることが明かとなった。
実施例４：母体血液混入の影響の検討
fFN測定による破水の検出では、母体血液混入による擬陽性が大きな問題とされている。そこで実施例３で分類した破水なし群の出血状況を調査し、膣内分泌液への母体血液混入の影響を検討した。結果は、Mann-WhitneyのU検定によって解析した(図５及び図６)。
【００３５】
破水なし群のL-PGDS濃度は、出血なし群で0.050±0.069μg/ml(n=53)、出血あり群で0.066±0.074μg/ml(n=8)となり、両者の間に有意差は認められなかった（図５）。また、出血なし群と出血あり群の何れにおいても、破水兆候あり群または破水あり群との間に有意差が認められた(出血なし群vs破水兆候あり群：p<0.001、出血なし群vs破水あり群：p<0.0001、出血あり群vs破水兆候あり群：p<0.01、出血あり群vs破水あり群：p<0.005)。一方、fFN濃度は、出血なし群と出血あり群の間で有意差を認めた(図６、p<0.01)。更に、出血なし群は、破水兆候あり群(p<0.005)または破水あり群(p<0.0001)との間に有意差を認めた。しかしながら、出血あり群は、破水兆候あり群または破水あり群との間に有意差を認めなかった。
【００３６】
以上の結果より、fFN測定では正確に検出できない破水状況でさえも、L-PGDS測定によって正確に検出することが可能であることが明かとなった。
実施例５：頚管分泌液を用いた検討
実施例１で検討した症例の破水状況を実施例３と同様に調査したところ、１名が破水ありで、他15名は破水なしであった。これら被験者の頚管分泌液中L-PGDS濃度は、破水なし：0.034±0.023μg/mlに対し、破水あり：0.151μg/mlと、破水ありで顕著に高値を示した。
【００３７】
一方、これら症例の出血状況を調査したところ、破水なし15名の内１名で出血が認められた。本症例の頚管分泌液中L-PGDS濃度は0.057μg/ml、fFN濃度は1060ng/mlであった。破水および出血の認められなかった症例の頚管分泌液中L-PGDS濃度は0.032±0.023μg/mlと、出血症例と比べ大きな相違は見られなかったが、fFN濃度は76±180ng/mlと、出血症例より顕著に低値であった。
【００３８】
以上の結果より、頚管分泌液中のL-PGDSを測定することによっても、fFNでは正確に検出することのできないような状況を含む破水検出を、正確に行うことが可能であることが判明した。
【００３９】
【発明の効果】
被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度を測定することを特徴とする、本発明の破水の検出方法では、破水を早期に正確に検出することができる。特に、本発明の方法は、癌胎児性フィブロネクチン（fFN）測定では正確に検出できない破水状況でも、早期に、かつ正確に検出できることが明らかとなった。本発明の方法により破水時期を正確に知ることができるようになり、前期破水（PROM）のマネジメントを容易に行うことが可能になる。従って、臨床面での利用が可能であり、本発明の産業上の利用可能性は極めて多大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】膣内分泌液と頸管分泌液におけるL-PGDS濃度の関係を示す図である。
【図２】膣内分泌液中のL-PGDS濃度とfFN濃度の関係を示す図である。
【図３】破水状況と膣内分泌液中L-PGDS濃度の関係を示す図である。
【図４】破水状況と膣内分泌液中fFN濃度の関係を示す図である。
【図５】血液混入状況とL-PGDS濃度の関係を示す図である。
【図６】血液混入状況とfFN濃度の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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