(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基Ａを提示する多孔性マトリックスに基Ａと試薬Ｉとの反応で官能基を導入することによる多孔性マトリックスの製造方法であって、基Ａと比較して不足した量の試薬Ｉにマトリックスを接触させて、官能基の異なる１以上の層を内部に有するマトリックスを生じさせ、基Ａが炭素−炭素二重結合であり、試薬ＩがＸ2又はＸＯＨ(式中、Ｘは塩素、臭素及びヨウ素から選択されるハロゲンである。)であることを特徴とする方法。
【請求項２】
マトリックスが親水性であり、親水性基をその内部表面及び外部表面に提示することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マトリックスがヒドロキシル基をその内部表面及び外部表面に提示することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マトリックスがポリヒドロキシポリマーから構築されたものであることを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
マトリックスがポリサッカライドから構築されたものであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
基Ａと試薬Ｉの反応を水性媒体中で行うことを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
導入される官能基が、続く段階でマトリックスに、イオン交換基、バイオアフィニティー基、疎水性基、共有結合クロマトグラフィーに使用できる基、硫黄含有基、キレートもしくはキレート形成基、π−π相互作用を発生させる芳香族系を有する基、水素結合を供与する基、架橋基、親水性基又は重合基のいずれかの基を生じる化合物Ｂと反応する反応性基であることを特徴とする、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
化合物Ｂが親和性及び／又はゲル濾過を基本にした１以上の分離特性を導入することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は請求項８記載の方法で製造したマトリックスを、分離に際して成分混合物から１種類の成分を捕獲するのに使用する方法。
【請求項１０】
前記分離がクロマトグラフィーを用いることを特徴とする、請求項９記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の技術的分野および使用
本発明は、多官能性多孔性マトリックスの製造法に関する。現在、本発明のマトリックスの主な使用は、液体に溶解したまたは分散した成分の混合物からの１個またはそれ以上の成分の分離である。マトリックスは、ａ)オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成、ｂ)親和性反応を使用した分析および測定法等に、固相としても使用できる。また他の使用も存在する。
現在の分離は、成分(複数も有る)を含む液体をマトリックスと接触させ、分離する成分(複数もある)をマトリックスに分配し、それにより、マトリックスへの分配が異なる(全く分配されないものも含む)残りの成分から除去することを含む。
“マトリックスへの分配”なる表現は、成分がマトリックスに結合するか、そうでなければマトリックス上／内に吸着されることを意味する。
成分は、全細胞およびその一部を含む、個々の物質／複合体構造を意味する。
技術的背景−分離マトリックスの合成および関連する問題
十分に高い純度の成分を得るために、異なる官能の数個のマトリックスがしばしば分離工程で使用されなければならない。これが、分離工程の数の減少をさせる多官能性マトリックスの製造という考えを導いている。例えば、本願と共に現在出願されている我々の特許出願“分離用マトリックスおよび該マトリックスを利用した分離法”参照。我々は、それで、異なる関連する分離特性の二個またはそれ以上の別の相を含むマトリックスを記載している。
一定の分離特性のマトリックスの合成は、しばしば、官能基Ａを提示するベースマトリックスと、試薬Ｉとの反応を含み、基Ａとの反応を介して、マトリックスは新規官能性を得る。Ａはしばしばヒドロキシ、アミノ(１級、２級および３級)、チオール、カルボキシ(−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ-)、アリルの中ようなアルケニル、ハロゲン等および対応する活性化(反応性)形である。基Ａがしばしばマトリックスにくまなく存在するため、以前に既知の方法は、挿入した官能性がマトリックス全体に渡り同様に位置することに関連している。挿入した官能性は、反応性基またはマトリックスの分離特性に寄与する基を意味する。挿入された反応性基は、マトリックスの分離特性、またはマトリックス結合形で使用することが望まれる他の特性に寄与する基の形成に利用される。
以前に既知の方法に従っては、多孔性マトリックスに層状官能性を挿入することは不可能であった。
本発明の目的
本発明の主な目的は、内部に異なる官能性の層を示す、通常異なる分離官能性の層となる(分離層)分離マトリックスのための多孔性マトリックスの製造を可能にすることである。
本発明
本発明は、技術的背景に記載の方法に従った多孔性マトリックスへの官能性の挿入法である。本発明は、マトリックス内の１個またはそれ以上の十分に定義された層に所望の官能性を挿入することを可能にする。本発明は、
ａ)マトリックスが接触する試薬Ｉの量が、試薬Ｉとの反応に先立って存在する基Ａと比較して不足している、そして
ｂ)試薬Ｉと基Ａの間の反応が、試薬Ｉのマトリックス内への輸送と比較して速いように、試薬Ｉと反応条件を選択する(基Ａとの反応が、試薬Ｉのマトリックス内への分散と比較して速い)
ことを特徴とする。
不足しているは、試薬Ｉの用量がマトリックス内の全Ａ基との反応に不充分であることを意味する。新規官能性の層が試薬Ｉにより挿入される際に、同時にマトリックスの内部層は未反応のまま残る。不足を計算するとき、試薬Ｉが、蒸発などを介した副反応により不足し得ることを考慮しなければならない。
基Ａと試薬Ｉの間の速い反応は、また試薬Ｉが速い物理化学的反応で基Ａに局所的に吸着されると理解される。この場合、試薬Ｉは、マトリックスへの局所結合を促進する１個またはそれ以上の反応物の添加によりマトリックスに安定化できる。
本発明の基Ａの典型的例は、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ(−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ-)、メルカプト、炭素−炭素二重結合などである。
試薬Ｉは、意図される官能基を挿入する限り、マトリックスに分配するよりも速くマトリックスに結合できる任意の化合物であり得る。分配の速度とＡとの反応の速度の比は、層官能化が試薬Ｉの基Ａに対する反応性の増加により、また試薬Ｉのサイズの増加により促進されることを考慮して、試薬Ｉの適当な選択により最適化できる。反応はしばしば溶媒、ｐＨ、温度等に影響される。適当な条件は、各試薬および行う反応のタイプの慣用の経験により選択される。非極性および極性有機溶媒および中間の極性の有機溶媒およびそれらの混合物、および適当な場合また水との混合物が、本発明の工程で純水よりも適している場合がしばしばある。
試薬Ｉは、起こるための適当な条件に適合する限り(マトリックス内の輸送と比較して、速い基との反応)、所望の官能性を挿入する化合物であり得る。分離マトリックスの合成のために、試薬ＩとＡとの反応の場合、予定された層に分離特性を挿入する。
試薬Ｉはまたいわゆる活性化試薬でもよい。これらは、通常更なる官能化、および導入部に従ったマトリックスの使用に必要な反応性基の挿入に利用する。活性化試薬は求電子剤、求核剤、遊離ラジカルに基づくものであり得る。
優先日当時、我々は求電子試薬の形の試薬Ｉでほとんど作業している。例は、Ｘ2またはＸＯＨ(Ｘは塩素、臭素、ヨウ素のようなハロゲン)または陽性荷電または非荷電ハロゲンを容易に分配するハロゲン化試薬である。ほとんどのハロゲン化試薬、特にＸ2またはＸＯＨは、炭素−炭素二重結合と瞬時の反応をする。炭素−炭素二重結合はまた反応性基として近接ジハライドまたはハロヒドリンをもたらし得、それは容易に反応性エポキシ基に変換する。
通常、反応性基それ自体は有用な分離特性に寄与しない。従って、それらはしばしば更に本発明に従って活性化された層内に所望の分離特性を挿入する化合物Ｂと反応する。化合物Ｂの使用により挿入できる特定の分離特性は、下記の“導入された分離特性”の標題の場所に記載する。化合物Ｂは、反応性基を挿入し、次ぎに化合物Ｃとの反応を介した分離特性の挿入に利用できるように選択し得る。理論的に、長い反応シーケンスを使用することが可能であり得る。化合物Ｂ、Ｃ等が先に挿入された基との反応よりも遅く分散されるように配置できる限り、本発明はまた化合物Ｂ、Ｃなどと先に挿入された反応基の間の反応の各々にも適応できる。
必要な場合、後に除去できる保護基の挿入が適していることがある。例えば、試薬(試薬Ｉ、化合物Ｂ、Ｃ等)が、その中にそれらが存在する層を介して輸送される際に、基が試薬を破壊する場合である。
架橋の程度、マトリックスの密度または多孔性は、官能性の特別な種類である。化合物Ｂの添加無しに、層様に変化できる。基Ａとしての炭素−炭素二重結合と試薬ＩとしてのＸ2またはＸＯＨの組み合わせに関して、架橋は、本発明に従った、活性化後(実際にはＯＨ-(＝化合物Ｂ)の添加)の単純なｐＨの変化による層活性化で達成できる。あるいは、ある場合、活性化は架橋を可能にするｐＨで達成できる。
親水性表面層が、化合物Ｂが水、ＯＨ-または挿入された反応基と反応できる他の親水性低分子求核剤である場合、通常得られる。所望により、マトリックスの内部の残りの基Ａは、次いで、例えば、本発明に従った官能化に利用できる。
分離特性を層に挿入した後、他の分離特性の層を挿入できる。例えば、マトリックスの更新された活性化により、化合物Ｂで得られる以外の分離特性を挿入する化合物Ｂ’と反応させる。付加層は、必ずしも本発明の工程に従って挿入される必要はない。この場合、また、保護基の挿入が必要であり得る。
本発明で使用し得るベースマトリックス。
適当なベースマトリックスは、しばしば粒子の形である。それらは不溶性でなければならないが、濡らすことができ、しばしばそれらをその中で使用する液体媒体中で膨張性でもある。その内部および外部表面は、疎水性から親水性のものであり得る。親水性特性は、その内部および外部表面がヒドロキシ(−ＯＨ)、アミノ−(ＮＨ2)、カルボキシ(−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ-)、アミド(−ＣＯＮＨ2)、反復基−ＯＣＨ2ＣＨ2−および−ＯＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＯＣＨ2ＣＨ2(ＣＨ3)−等のような親水性基を提示する場合、達成される。疎水性特性は、疎水性基、例えば、２個またはそれ以上の炭素原子を有する炭化水素基が対応して存在する場合、達成できる。中間の親水性／疎水性に関して、マトリックスの表面がしばしば両方のタイプの基を提示する。
マトリックスは、典型的に合成または生物学的起源であり得る有機または無機ポリマーの構築物である。特に、いわゆるバイオポリマーを特記し得る。
既知の親水性有機マトリックスは、多くの上記のタイプの親水性基を提示するポリマーである。既知の親水性ポリマーは、いわゆるポリヒドロキシポリマーおよびポリアミドであり、水性媒体に不溶性であり、例えばポリビニリックアルコール、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)および対応するアクリレート、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸アミド(例えば、トリスアクリル酸アミドおよびトリスメタクリル酸アミド(トリス＝(ＨＯＣＨ2ＣＨ2)3ＣＮＨ3)、アガロース、デキストラン、プルランおよびセルロースのようなポリサッカライドを基本にしており、所望により分離マトリックスとして適するように架橋する。
既知の疎水性有機マトリックスは、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ポリ(アルキルメタクリレート)、過フッ素化炭化水素(ＰＦＣ)のポリマー等の多孔性形である。
分離マトリックスの無機変異体は、ガラス、ゼオライト、シリカゲル、混成物質、酸化ジルコニウム等の多孔性形を基本にし得る。
親水性マトリックス、疎水性マトリックス、無機マトリックス等は親水化／疎水化を介して所望の親水性／疎水性とし得る。
優先日当時の最も好ましいマトリックスは、
ａ)所望により架橋し、所望によりまたデキストランで孔中を誘導体化された、例えば、それぞれSepharose▲Ｒ▼およびSuperdex▲Ｒ▼の名前で市販されている等級のビーズの形のアガロース、
ｂ)例えば、Sephadex▲Ｒ▼の名前で市販されている等級のビーズの形の架橋デキストラン、
ｃ)例えば、Sephacel▲Ｒ▼の名前で市販されている等級のセルロース、
ｄ)デキストランで孔を誘導体化されたポリアクリルアミドの架橋多孔性粒子、例えば、Sephacryl▲Ｒ▼、そして
ｅ)例えば、MonoBeads▲Ｒ▼およびSource▲Ｒ▼の名前で市販されている等級の、親水化された、とりわけ、実質的に疎水性物質、例えばスチレン−ジミビルベンゼンポリマーの単分散および多分散多孔性粒子
に基づいている。
これらの商標は、Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Swedenの製品に対応する。
マトリックスの密度はそれらをその中で使用する液体媒体より高い、低いまたは同じであり得る(液体媒体で飽和されたマトリックスの密度)。粒子の形のマトリックスは、その密度を決める充填剤を含み得る。例えば、WO-A-9200799(Kem-En-Tek-Upfront Chromatography)およびWO9118237(Pharmacia Biotech AB)参照。
分離マトリックスの多孔性(排除限界)に関する要求は、主に分離する化合物のモル重量および形により決定される。本発明に関して、多孔性が試薬Ｉおよびまたしばしば化合物Ｂのマトリックス内の輸送を可能にしなければならないことも重要である。
興味深い排除限界は、一般に３−１０6Åの間である。本出願人、および将来の特許権者の技術的分野内で、少なくとも１０Åの排除限界が特に有利であり得る。
挿入された分離特性
マトリックスの分離特性は、しばしばそれが担持する基により決定される。この意味で一般的な基は：
１．イオン交換基
２．バイオアフィニティー基
３．疎水性基
４．共有結合クロマトグラフィーに使用できる基
５．例えば、いわゆるチオフィリック相互作用の硫黄含有基
６．キレートまたはキレート形成基
７．異なる化合物といわゆるπ−π相互作用を発生させる芳香族系を有する基
８．水素結合を供与する基
９．架橋基
１０．親水性基等
１１．重合基である。
本発明の内容で、化合物ＢまたはＢ’または対応する物質が、連続反応中で１−１１の基のいずれかを示すように、しばしば配置される。これらの基は、また化合物Ｂと先の工程で本発明に従って層内に挿入された反応性基の間の反応の結果としても製造される。後者は特にタイプ１またはタイプ３−９のより小さい基で当てはまる。ある場合、基はまた直接試薬Ｉにより挿入できる。
イオン交換基は、１級、２級、３級、４級アンモニウム基、スルホニウム基等のようなアニオン交換またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-)、ホスホネートまたはホスフェート(それぞれ−ＰＯ32-および−ＯＰＯ32-)、スルホネートまたはスルフェート(それぞれ、−ＳＯ3-および−ＯＳＯ3-)等のカチオン交換であり得る。基−ＣＯＯ-、−ＰＯ32-、ＯＰＯ32-、−ＳＯ3-および−ＯＳＯ3-において、遊離原子価は直接炭素原子に結合する。
既知のバイオアフィニティー基は、ａ)抗原／ハプテンおよび抗体(その抗原またはハプテン結合フラグメントを含む)、ｂ)核酸およびその相補的対応物、ｃ)レクチンおよび炭素水和物(carbonhydrate)構造、ｄ)ＩｇＧ結合タンパク質およびこのようなタンパク質に結合するＩｇＧの一部を提示するタンパク質、ｅ)センスおよびアンチセンスをベースにしたアフィニティーシステム等のペアの一つのメンバーである。バイオアフィニティー基はまた合成的に製造した有機分子由来の基であり、天然に存在する生物特異的親和性を“模倣”する、いわゆる“模倣物”も含む。
疎水性基は、しばしば数個の酸素、窒素または硫黄原子を含むか、含まない炭化水素基である。疎水性基の典型的な例は、直鎖、分枝鎖および環状飽和、不飽和または芳香族炭化水素基である。
共有結合クロマトグラフィーに使用できる基の中で、ジスルフィド基、主に反応性ジスルフィド基(−Ｓ−Ｓ−Ｒ1)および遊離チオール基(−ＳＨ)を特記できる。Ｒ1の例は２−ピリジルである。Ｒ1の更なる例は、例えば、US4,647,655(Pharmacia AB)参照。
チオフィリック相互作用に利用できる硫黄含有基の中で、特記できる基は、本質的に疎水性であるが、１個またはそれ以上のチオエーテル構造がその中に存在するものである。例えば、Oscarsson & Porath WO-A-9533557 ; Porath EP-A-165912；およびPorath EP-A-168363参照。
水素結合基は、先に使用されている
0004368424.tif 000002
(引用して包含させる)。このタイプの基は、しばしばアンモニウム窒素と２または３炭素原子の距離のヒドロキシ基と共に、弱いアニオン交換アンモニウム基(１級、２級または３級)を示す。
架橋基は、試薬Ｉの使用により直接挿入できる。上記参照。あるいは、同時に２個またはそれ以上の反応性基と結合できる化合物Ｂを使用できる。
本発明の親水性基は、主に１個のヒドロキシおよび１個またはそれ以上のヒドロキシまたは反復基−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−を有する低級ヒドロキシアルキルである。この基は、しばしば低級分子、例えば、２５炭素原子より小さい。
リガンド有りまたは無しの重合基は、ゲル濾過特性を付与できる。ポリマーは架橋できる。
適当な基は、典型的に、既知の方法に従って種々の構造であり得る架橋を介してマトリックスに結合する。橋構造は、上記の１−１１の１個またはそれ以上の基を各橋に有する、重合、例えば、親水性または疎水性ポリマーであり得る。一般的な橋名は、触手、“エクステンダ”、フルーフ、“リンカー”、“スペーサー”等である。疎水性橋は主に疎水性液体媒体に適し、しばしば１−１１の基の挿入に良好な有用性および能力を有する。親水性液体媒体と組み合わせた疎水性橋も対応が当てはまる。親水性ポリマー橋の例は、デキストランのようなポリサッカライドおよび他の水溶性ポリヒドロキシポリマーである。
本発明の更なる態様
本発明の一つの態様は、本発明に従って製造できるマトリックスである。これらのマトリックスは異なる官能性を有する１個またはそれ以上の層を含む。一つの層における少なくとも一つのリガンドの１−１１の基での置換の程度は、他の層での同じリガンドの置換の程度としばしば異なる。本発明のマトリックスの多くの態様において、表面層の置換の程度は０かほとんど０であるが、同時に内部層に同じリガンドが存在する。またこの逆も真実であり得る。
本発明の別の態様は、導入部に従った分離のためのマトリックスの使用である。
マトリックスの選択および挿入された基(上記参照)に依存する分離は、アフィニティークロマトグラフィーとしてまたは分離する化合物のサイズおよび形に基づいたクロマトグラフィーとして(ゲル濾過)、または対応するバッチ式方法として設計できる。充填床および安定化流動／伸長床が使用できる。アフィニティークロマトグラフィーの例は、イオン交換クロマトグラフィー(アニオン交換、カチオン交換)、バイオアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)、共有結合クロマトグラフィー、チオフィリッククロマトグラフィー、キレートをベースにしたクロマトグラフィー、π−π相互作用を基本にしたクロマトグラフィー等である。原則として、条件およびプロトコールは分離法の各々のタイプの先の知識に従って選択する。
分離は、類似のまたは非常に異なる成分を含む混合物から行い得、すべて一つの小分子から、粒子凝集、バイオアフィニティー複合体、動物および植物細胞ならびにその一部、微生物およびその一部等においてのように、互いに複合的に結合した個々の成分である。関心の物質は、取り分け、オリゴヌクレオチドを含む核酸、ペプチドを含むタンパク質、脂質および他の有機および無機化合物である。
分離は、興味の成分がａ)マトリックスに分配されるが、望まない物質は液体媒体に残ったままであるかまたはｂ)液体媒体に残るが、望まない物質がマトリックスに分配されることを含み得る。
本発明を多くの非限定的実施例と共に示す。本発明は、明細書の一部を構成する添付の請求の範囲に定義される。
実験部分
実施例１：ビーズの外部層内にロックを有するＱセファロース４ファーストフローイオン交換体の製造
Ａ．粒子形の架橋アリル化アガロースの製造(アリル化セファロース４ファーストフロー)。セファロース４ファーストフローはAmersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden由来であった。平均粒子サイズ９０μmの架橋アガロースを含むマトリックスを、エピクロロヒドリンとアガロースのＮａＯＨ存在下でのPorath et al.(J. Chromatog. 60(1971)167-77およびUS-A-3,959,251)に従った反応により製造した。アリル化は、完成した粒子とアリルグリシジルエーテルと塩基としてのＮａＯＨを、０．２６mmole／mLゲルのアリルレベル(ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−)まで反応させて達成させる。
Ｂ．秤量平均分子量５０００００のデキストランの溶解。デキストランＴ５００は、Amersham Pharmacia Biotech ABから商品として入手可能であり、Leuconostoc mesenteroides由来の加水分解および分画粗デキストランを含む。デキストランＴ５００  １２．８ｇを、三首フラスコ内の蒸留水２５０mLに撹拌しながら溶解する。
Ｃ．架橋アリル化アガロースの部分的臭素化。工程Ａに従って製造した排出したアリル化アガロース３０mL、蒸留水３０mLおよび無水ＮａＯＡｃ  ０．６４ｇを１００mL反応容器中に入れる。続いて、臭素化を、激しく撹拌しながら臭素０．２５mLを添加することにより達成する。臭素の量の計算において、一部の揮発性臭素が蒸発することを考慮する。反応は、混合物が純水に白色になるまで数分続ける。臭素化後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水で洗浄する。
Ｄ．デキストランＴ５００の結合。工程Ｃ由来のゲルを吸引乾燥し、工程Ｂ由来の溶解デキストランＴ５００を含む反応容器に注意深く撹拌しながら添加する。混合物を１時間平衡化させる。続いて、反応を蒸留Ｈ2Ｏ  ２７．２mLに溶解したＮａＯＨ  ２．９８ｇおよびＮａＢＨ4  ０．１２ｇの添加により開始する。温度を３５℃に調節し、反応を一晩(例えば１６時間)、注意深く撹拌しながら続ける。撹拌を停止し、反応混合物をガラスフィルターで濾過する。ほとんどのデキストランＴ５００が、蒸留水で洗い出された後、数mLの濃ＨＯＡｃで、直接濾過漏斗をｐＨ＜７に、好ましくは５−６にして中和を行い、次いでゲルを再び蒸留水で洗浄する。結合後、残りのアリルレベルは０．１９mmole／mLであった。
Ｅ．残りのアリル基の臭素化。工程Ｄに従って製造した、ビーズの外部のデキストランＴ５００の層で修飾させた吸引されたアリル化アガロース２０mL、蒸留水４．５３mLおよび無水ＮＡＯＡｃ  ０．８ｇおよび臭素０．４mLを、激しく撹拌しながら三首フラスコに添加する。撹拌を黄色着色／過剰の臭素が無くなるまで続ける。
Ｆ．残りのアリル基を介したイオン交換基の挿入。アニオン交換４級アミン基(ＣＨ3)3Ｎ+ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−の挿入を、Ｅと同じ三首フラスコで直接続ける。６５％トリメチルアンモニウムクロライド(TMAC)９．９ｇをフラスコに入れる。１０分撹拌し、次いで蒸留水３．０ｇに溶解したＮａＯＨ  ３．０ｇを入れる。この５０％ＮａＯＨ溶液の添加において、混合物は薄黄色になる。その直後、ＮａＢＨ4  ０．０６ｇをそれに入れる。温度を２４℃に調節し、撹拌を開始する。反応を一晩(例えば１６時間)続ける。反応を、数mLの濃ＨＯＡｃでの直接フラスコ内のｐＨ＜７、好ましくはｐＨ５−６への中和により停止し、次いでゲルを蒸留水および数ゲル容量の１．０Ｍ  ＮａＣｌで繰り返し洗浄する。最後に、ゲルを再び蒸留水で繰り返し洗浄する。イオン交換の能力を、０．１３２mmole／mLへの塩化銀滴定により測定する。
Ｇ．ビーズの外部層内にロックを有するＱセファロース４ファーストフローイオン交換体の顕微鏡評価。全顕微鏡評価は、２００の倍率での相コントラストの可変調節可能な顕微鏡で行った。実施例１の出発マトリックスであるセファロース４ファーストフローおよび完成した実施例１のロックを有するＱセファロース４ファーストフローイオン交換体を、比較のためにヘマトキシリンで染色した。後者の場合、ロックは撮った顕微鏡写真で、ビーズの外部相に明らかに見えた。ロックビーズが働く光学の観察を可能にするために、完成したＱセファロース４ファーストフローロックイオン交換体を数分ウシＣＯ−ヘモグロビンと、ｐＨ８．２；０．０２０Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液でインキュベートした。過剰のＣＯ−ヘモグロビンを同じ緩衝液で洗い出した。次いでビーズを先の付加的染色無しに顕微鏡で観察した。顕微鏡写真において、ビーズの内部の赤色ＣＯ−ヘモグロビンが見られたが、ビーズのデキストランＴ５００ロック層では見られない。
実施例２：ビーズの外部層内にロックを有するＱセファロース６ファーストフローイオン交換体の製造
Ａ．粒子形の架橋アリル化アガロースの製造(アリル化セファロース６ファーストフロー)。セファロース６ファーストフローはAmersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden由来であった。平均粒子サイズ９０μmの架橋アガロースを含むマトリックスを、エピクロロヒドリンとアガロースのＮａＯＨ存在下でのPorath et al.(J. Chromatog. 60(1971)167-77およびUS-A-3,959,251)に従った反応により製造した。アリル化は、完成した粒子とアリルグリシジルエーテルと塩基としてのＮａＯＨを、０．２７mmole／mLゲルのアリルレベル(ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−)まで反応させて達成させる。
Ｂ．秤量平均分子量５０００００のデキストランの溶解。デキストランＴ５００は、Amersham Pharmacia Biotech ABから商品として入手可能であり、Leuconostoc mesenteroides由来の加水分解および分画粗デキストランを含む。デキストランＴ５００  ５７．７ｇを、三首フラスコ内の蒸留水１５７mLにゆっくり撹拌しながら溶解する。
Ｃ．架橋アリル化アガロースの部分的臭素化。工程Ａに従って製造した排出したアリル化アガロース９０mL、蒸留水９０mLおよび無水ＮａＯＡｃ  １．９２ｇを５００mL三首フラスコに入れる。続いて、臭素化を、激しく撹拌しながら臭素０．６９mLを添加することにより達成する。臭素の量の計算において、一部の揮発性臭素が蒸発することを考慮する。反応は、混合物が純水に白色になるまで数分続ける。臭素化後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水で洗浄する。
Ｄ．デキストランＴ５００の結合。工程Ｃ由来のゲルを吸引乾燥し、工程Ｂ由来の溶解デキストランＴ５００を含む反応容器に注意深く撹拌しながら添加する。混合物を１時間平衡化させる。続いて、反応を蒸留Ｈ2Ｏ  ４１．６mLに溶解したＮａＯＨ  １０．３９ｇおよびＮａＢＨ4  ０．３６ｇの添加により開始する。温度を３５℃に調節し、反応を一晩(例えば１６時間)、注意深く撹拌しながら続ける。撹拌を停止し、反応混合物をガラスフィルターで濾過する。ほとんどのデキストランＴ５００が、蒸留水で洗い出された後、数mLの濃ＨＯＡｃで、直接濾過漏斗をｐＨ＜７に、好ましくは５−６にして中和を行い、次いでゲルを再び蒸留水で洗浄する。結合後、残りのアリルレベルは０．１８mmole／mLであった。
Ｅ．残りのアリル基の臭素化。工程Ｄに従って製造した、ビーズの外部のデキストランＴ５００の層で修飾させた吸引されたアリル化アガロース２０mL、蒸留水９．０６mLおよび無水ＮＡＯＡｃ  １．６ｇおよび臭素１．０mLを、激しく撹拌しながら２５０mL三首フラスコに添加する。撹拌を黄色着色／過剰の臭素が無くなるまで続ける。
Ｆ．残りのアリル基を介したイオン交換基の挿入。アニオン交換４級アミン基(ＣＨ3)3Ｎ+ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−の挿入を、Ｅと同じ三首フラスコで直接続ける。６５％トリメチルアンモニウムクロライド(TMAC)１９．９ｇをフラスコに入れる。１０分撹拌し、次いで蒸留水６．０ｇに溶解したＮａＯＨ  ６．０ｇを入れる。この５０％ＮａＯＨ溶液の添加において、混合物は薄黄色になる。その直後、ＮａＢＨ4  ０．１２ｇを入れる。温度を２４℃に調節し、撹拌を１３０RPMで開始し、反応を一晩(例えば１６時間)続ける。反応を、数mLの濃ＨＯＡｃでの直接フラスコ内のｐＨ＜７、好ましくはｐＨ５−６への中和により停止し、次いでゲルを蒸留水および数ゲル容量の１．０Ｍ  ＮａＣｌで繰り返し洗浄する。最後に、ゲルを再び蒸留水で繰り返し洗浄する。イオン交換の能力を、０．１４２mmole／mLへの塩化銀滴定により測定する。
Ｇ．デキストランＴ５００Ｑセファロース６ＦＦのクロマトグラフィー評価。外部デキストラン層の硬化は、約１mLのイオン交換体を充填されたHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech AB)で、勾配流を使用して行った。大きなタンパク質チオグロブリン６６０kDおよび小さなα−ラクトアルブミン１４．４kDを、サンプルとして両方とも陰性に荷電しているｐＨ８．２で使用した。図１は、慣用の強度のアニオン交換体であるＱセファロースＨＰで流した勾配での両方のタンパク質の分離を、陽性に荷電したＱリガンドの利用性のサイズに基づいた制限無しで示す。ここで、α−ラクトアルブミン(ピーク１)は、チログロブリン(ピーク２)より前に溶出する。図２は、本実施例に従ったデキストランＴ５００Ｑセファロース６ＦＦイオン交換体上での、チログロブリンの勾配流の結果を示す。この大きなタンパク質は、吸着させることなくカラムを通して右に移動する。同様の方法で流した小さいα−ラクトアルブミンは、吸着され、勾配で溶出する(ピーク２)。図３参照。
実施例３：層活性化を使用したcat-アニオン交換体の合成
Ａ．合成。実施例１および２の方法と同様にして、セファロースHPとアリルグリシジルエーテルを水中で、塩基としての水酸化ナトリウムと共に反応させることにより製造したアリルレベル約０．２mmole／mLのアリル化セファロースHPを、ガラス反応容器中の蒸留水２０mLに懸濁し、それを０．３mmole元素状態臭素と激しく撹拌して臭素化した。次いで、部分的に臭素化したゲルを、亜硫酸ナトリウムで飽和した０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液２５mLと反応させた。反応は４０℃で一晩であった。反応を酢酸で中和して停止させ、続いて約１００mL蒸留水でガラスフィルター漏斗で洗浄した。部分的に官能化されたマトリックスの残りのアリル基を、ゲル懸濁液の残存する黄色着色が得られるまで元素状態臭素を滴下することにより、２０mL蒸留水中、過剰の臭素で臭素化した。臭素化され部分的に官能化されたマトリックスを次いでガラスフィルター漏斗で蒸留水で洗浄し、次いでビス−(３−アミノプロピル)アミンの５０％溶液２５mLに入れた。反応を５０％塩酸で中和することにより停止させ、続いて約１００mL蒸留水でガラスフィルター漏斗で洗浄した。
Ｂ．層状cat-アニオン交換体のクロマトグラフィー評価。上記の詳述に従って製造したcat-アニオン交換体約1mLをHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech AB)に充填し、FPLCシステムに接続し、ｐＨ６．０緩衝液で平衡化した。タンパク質サンプルを吸着させ、次いでまたｐＨ６．０の塩勾配を使用して溶出した。
サンプルＡ．ｐＨ６．０で陽性に荷電したタンパク質であるリソザイムを上記に従って流した。リソザイムがマトリックスの陰性スルフォネートリガンドに結合でき、次いで溶出できることを示す図４のクロマトグラム参照。
サンプルＢ．ｐＨ６．０で陰性に荷電したタンパク質であるトランスフェリン、卵白アルブミンおよびβ−ラクトグロブリンを上記に従って流した。ランスフェリン、卵白アルブミンおよびβ−ラクトグロブリンがマトリックスの陽性荷電アミンリガンドに結合でき、次いで溶出できることを示す図５のクロマトグラム参照。
クロマトグラフィー試験ＡおよびＢの結果は、粒子内に陽性荷電基のみを含む領域／層および陰性荷電基のみの領域／層が存在することを示す。
図
図１．ＱセファロースＨＰを含み、ベッド高５．９cmのHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech)の０．５mg／mL  α−ラクトアルブミン(ピーク１)および０．５mg／mLチログロブリン(ピーク２)を含む５０μlサンプル流のクロマトグラム。
緩衝液Ａ：２０mMトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．２。
緩衝液Ｂ：２０mMトリス−ＨＣｌ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ
流速：１mL／分
図２．実施例２のデキストランＴ５００Ｑセファロース６ＦＦを含み、ベッド高６．５cmのHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech)の０．２５mg／mLα−ラクトアルブミンを含む２００μlサンプル流のクロマトグラム。
緩衝液Ａ：２０mMトリス−ＨＣｌ、５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ８．２。
緩衝液Ｂ：２０mMトリス−ＨＣｌ＋１  ＮａＣｌ
流速：０．２mL／分
図３．実施例２のデキストランＴ５００Ｑセファロース６ＦＦを含み、ベッド高６．５cmのHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech)の１mg／mLチログロブリンを含む２００μlサンプル流のクロマトグラム。
緩衝液Ａ：２０mMトリス−ＨＣｌ、５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ８．２。
緩衝液Ｂ：２０mMトリス−ＨＣｌ＋１  ＮａＣｌ
流速：０．２mL／分
図４．実施例３のcat-アニオン交換体を含み、ベッド高４．２cmのHR5/5カラム(Amersham Pharmacia Biotech)の１mg／mLリソザイムを含む５０μlサンプル流のクロマトグラム。
緩衝液Ａ：２０mMピペラジン−ＨＣｌ  ｐＨ６．０。
緩衝液Ｂ：２０mMピペラジン−ＨＣｌ＋１  ＮａＣｌ
流速：０．５mL／分
図５．実施例３のcat-アニオン交換体で、ベッド高４．２cmの０．１mg／mLトランスフェリン(ピーク１)、０．２mg／mL卵白アルブミン(ピーク２および３)および０．２mg／mL  β−ラクトグロブリン(ピーク４)を含む５０μlサンプル流のクロマトグラム。
緩衝液Ａ：２０mMピペラジン−ＨＣｌ  ｐＨ６．０。
緩衝液Ｂ：２０mMピペラジン−ＨＣｌ＋１  ＮａＣｌ
流速：０．５mL／分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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