(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体から調製した繊維状の直鎖ＤＮＡを基板に固定化したＤＮＡ固定化基板をγ線に曝し、該基板上のＤＮＡに生じる損傷を検出する環境モニタリング方法であって、ＤＮＡにインターカレーター蛍光色素YoYo-1を接触させた後にＤＮＡ固定化基板をγ線に曝し、ＤＮＡに生じる損傷を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＤＮＡ固定化基板は、ＤＮＡと基板表面の静電的相互作用により固定化されている請求項１の環境モニタリング方法。
【請求項３】
基板は、ガラス基板である請求項１または２のいずれかの環境モニタリング方法。
【請求項４】
基板は、シリコン基板である請求項１または２のいずれかの環境モニタリング方法。
【請求項５】
基板は、プラスチック基板である請求項１または２のいずれかの環境モニタリング方法。
【請求項６】
基板は、表面処理により、正電荷が付与されている請求項１ないし５のいずれかの環境モニタリング方法。
【請求項７】
基板は、アミノシラン溶液によって表面処理される請求項６の環境モニタリング方法。
【請求項８】
ＤＮＡに生じる損傷は、蛍光顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラおよび走査型プローブ顕微鏡から選択される少なくとも１つの検出手段により検出する請求項１の環境モニタリング方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかの環境モニタリング方法に使用するためのプローブであって、少なくとも基板表面にＤＮＡが固定化されたＤＮＡ固定化基板と蓋を有し、その間にインターカレーター蛍光色素YoYo-1が封入されていることを特徴とする環境モニタリング用プローブ。
【請求項１０】
請求項９の環境モニタリング用プローブの製造方法であって、基板表面にＤＮＡを固定化して得られるＤＮＡ固定化基板の表面にインターカレーター蛍光色素YoYo-1の溶液を塗布した後、蓋で覆って封入することを特徴とする環境モニタリング用プローブの製造方法。
【請求項１１】
ＤＮＡは、基板に正電荷を付与した後、ＤＮＡ含有溶液を塗布し、乾燥させて静電的相互作用により基板表面に固定化する請求項１０の環境モニタリング用プローブの製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれかの環境モニタリング方法を用いてγ線を測定するためのシステムであって、少なくとも請求項９の環境モニタリング測定用プローブと、該プローブにおけるＤＮＡの損傷を検出するための損傷検出手段と、検出結果解析手段を有することを特徴とする環境モニタリングシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、環境モニタリング方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、基板上に固定化した核酸をモニタリング対象環境に曝し、核酸に生じる損傷から環境をモニタリングする方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現代社会において我々が生活する環境には、化学物質や電子線、放射線等の電磁波等、様々な影響因子が存在する。近年、人体や環境に悪影響を及ぼすと考えられるこれらの因子に対する危機感が高まっており、様々な調査、報告がなされている。
【０００３】
化学物質は、今や産業廃棄物や工業排水、排ガスに限らず、保存料等の食品添加物、各種の医農薬品、洗剤等の香粧品、建築建材の防腐剤や塗料等のあらゆる形態で我々の生活に浸透しており、近年、これらの化学物質の人体や環境への影響が懸念されている。これらの化学物質の安全性については、従来、実験動物を用いた試験による評価が一般的に行われていた。また、大気や河川、あるいは各種製品中の化学物質の量については、種々の化学的分析方法により測定されている。これらの試験、測定方法はいずれも煩雑な操作と長期間を要し、リアルタイムでの測定が困難であるという問題があった。さらに、人体への直接的および遺伝的影響を正確に知るためには、過敏症等の症状があらわれた患者に対して種々の候補物質を接触あるいは投与して原因物質を特定したり、反応性を判断したりするしかなく、患者に多大な苦痛を強いる上検査結果が得られるまでに長時間を有するという問題があった。
【０００４】
一方、電磁波はその波長に応じて種類の異なる様々なものが、我々の生活における多様な分野で利用されている。波長〜１０-8ｍ程度のγ線（放射線、宇宙線）やＸ線、１０-8〜４×１０-7ｍの紫外線、４×１０-7〜８×１０-7ｍの可視光、８×１０-7〜１０-3ｍの赤外線、１０-3〜１０-1ｍのマイクロ波、１０-1〜１０4ｍの電波に分けられる。中でも、通信用に用いられる電波に関しては、携帯電話や携帯端末の普及とともに、近年、その人体に与える影響が懸念されている。また、電子レンジに利用されるマイクロ波についても、最近になってその人体への影響が心配されている。しかし腫瘍や免疫疾患等とこれらの電磁波の具体的な因果関係については、これまでのところ明らかになっていないのが実情である。さらに、放射線については、原子力施設や医療施設での放射能事故により、社会不安の大きな要因であるといわざるを得ない。
【０００５】
放射線には自然界の中に存在する自然放射線と人工的に作られた人工放射線がある。自然放射線は、人類が太古から浴びてきたものであり、太陽や銀河系宇宙から地球に降り注ぐさまざまな放射線（宇宙線）と、その大部分を占める高速の陽子線が大気中の窒素や酸素の原子核と衝突して作り出される高エネルギーの原子核、中性子、中間子、γ線といった二次宇宙線、さらには、大地に含まれるウラン、トリウム、カリウム４０等の自然の放射性同位元素から出されるγ線などがある。
【０００６】
一方、放射線は微量のものも含めれば、様々な分野で人工的に利用されている。例えば夜光時計の文字盤、蛍光灯のスタータ、カメラのストロボ充電表示用の表示管、煙探知器等は、いずれも微量のγ線やα線を放出する放射性同位体を利用したものである。また、テレビやパソコンのモニター等のブラウン管は、電子線を利用したものである。さらに、ほとんどすべての疾患に対して行われ、集団検診でも実施されるレントゲンでは、比較的大量の人工放射線が利用されている。したがって、一般的に認識されている以上に、我々は日常生活において放射線に曝されているのである。
【０００７】
１９９２年の調査によれば、日本人が被曝する放射線の発生源の平均的割合は、３９％が自然放射線、５９％がレントゲンやＣＴスキャン、放射線治療等の医療用放射線であり、残る２％に、職業上の被曝、原子力施設からの放射線、航空機の利用により曝されるもの、一般消費物によるもの等が含まれる。
【０００８】
近年、石油資源の枯渇が懸念され、新たなエネルギー源として、原子力が検討されている。また、癌治療を始めとする医療分野でも放射線の有効性がますます注目されている。しかし、原子力施設における放射能漏れ事故や患者の大量被曝等により、作業者や施設付近の住民の間で、放射線に対する不安感や危機感が高まっており、施設内の安全管理や作業環境および付近の放射線量の検地が社会的に重要な課題となっている。
【０００９】
放射線は、呼吸によって大気中の放射性同位元素を吸い込んだり、宇宙線や大地、放射性降下物からのγ線を体外から浴びたり、飲食物を通じて体内に取り込んだりすることにより、人体に影響を及ぼす。人体への影響は、大きく分けて、本人に現れる身体的、生理的影響とその子孫に影響が現れる遺伝的影響があり、身体的、生理的影響には急性効果と晩発効果がある。前記のとおりに、我々の日常生活における放射線被曝は、医療診断や自然界からのものが大半を占め、通常人体に影響を及ぼさない程度のものであるが、放射線には色も臭いもないため、放射線設備の安全管理、作業者や周辺住民の放射線防護、あるいは社会的不安の除去のためにも施設内外の放射線量の正確な測定が重要といえる。
【００１０】
従来の放射線量測定ではその蛍光、写真、電離作用を利用する方法が用いられてきた。具体的には、蛍光体に生じる蛍光を測定、記録するシンチレーションカウンター（蛍光作用）、フィルムバッジやオートラジオグラフ（写真作用）、気体の電離を測定するＧＭ計数管（電離作用）が代表的な放射線量測定方法として挙げられる。
【００１１】
しかし、従来の検出器はいずれも放射線の線質、線量に応じて異なったものが使用されており、人体への影響を評価する場合には、放射線荷重計数、組織荷重計数で補正し、実効線量を算出する必要があった。また、既存の方法は遺伝子への影響を直接的に測定するものではなく、間接的に評価しているにすぎないため、遺伝的影響や晩発効果に関わるより実際的な放射線量の測定ができないという問題があった。
【００１２】
原子力施設や放射線治療設備の安全管理や、作業者および付近住民の健康を守る上で、人体やＤＮＡを始めとする核酸への放射線の影響を直接的、かつ簡便に、精度高く測定できる方法の開発は重要と考えられる。
【００１３】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決するものとして、化学物質や電磁波、放射線等の環境による核酸への影響をも測定でき、高い検出感度を有する環境モニタリング方法を提供することを課題としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、核酸および核酸類似体からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を基板に固定化した核酸固定化基板をモニタリング対象環境に曝し、該基板上の核酸に生じる損傷を検出、測定することを特徴とする環境モニタリング方法を提供する。
【００１５】
この出願の発明は、第２には、核酸固定化基板は、核酸と基板表面の静電的相互作用により固定化されている環境モニタリング方法を、第３には、基板がガラス基板である前記の環境モニタリング方法を、第４には、基板がシリコン基板である前記の環境モニタリング方法を、また第５には、基板がプラスチック基板である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１６】
また、この出願の発明は、前記のいずれかの環境モニタリング方法において、第６には、基板が表面処理により、正電荷が付与されていること、および第７には、基板がアミノシラン溶液によって表面処理されることを態様として提供する。
【００１７】
この出願の発明は、また、第８には、モニタリング対象環境が放射線である前記の環境モニタリング方法を、第９には、モニタリング対象環境が化学物質である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１８】
第１０には、この出願の発明は、核酸に生じる損傷は、核酸にインターカレーターを接触させた後モニタリング対象環境に曝し、検出、測定する環境モニタリング方法を、第１１には、インターカレーターが蛍光色素である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１９】
この出願の発明は、さらに、第１２には、核酸に生じる損傷を、蛍光顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラおよび走査型プローブ顕微鏡から選択される少なくとも１つの検出手段により検出、測定すること、第１３には、核酸がＤＮＡであること、および第１４には、ＤＮＡが繊維状の環状ＤＮＡまたは繊維状の直線状ＤＮＡから選択されることを前記の環境モニタリング方法の態様として提供する。
【００２０】
さらに、この出願の発明は、第１５には、前記のいずれかの環境モニタリング方法において用いられるプローブであって、少なくとも基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板を有する環境モニタリング用プローブを、また、第１６には、前記のいずれかの環境モニタリング方法において用いられるプローブであって、少なくとも基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板と蓋を有し、その間にインターカレーターが封入されている環境モニタリング用プローブを提供する。
【００２１】
この出願の発明は、第１７には、前記の環境モニタリング用プローブの製造方法であって、基板表面に核酸を固定化することを特徴とする環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２２】
また、この出願の発明は、第１８には、前記の環境モニタリング用プローブの製造方法であって、基板表面に核酸を固定化して得られる核酸固定化基板の表面にインターカレーターを塗布した後、蓋で覆って封入することを特徴とする環境モニタリング用プローブの製造方法。
【００２３】
第１９には、この出願の発明は、核酸を、基板に正電荷を付与した後、核酸含有溶液を塗布し、乾燥させて静電的相互作用により基板表面に固定化する前記のいずれかの環境モニタリング用プローブの製造方法を提供し、第２０には、核酸が、ＤＮＡである前記のいずれかの環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２４】
この出願の発明は、第２１には、ＤＮＡを、任意の区画に分割されたＤＮＡについて各区画を増幅するプライマーを設計し、各区画の長さに相当する間隔で基板上にプライマーを固定化した後、該ＤＮＡを鋳型にＤＮＡ合成して基板表面に伸長、固定化する環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２５】
そして、第２２には、この出願の発明は、前記のいずれかの環境モニタリング方法を用いて放射線を測定するためのシステムであって、少なくとも前記の環境モニタリング測定用プローブと、該プローブにおける核酸の損傷を検出するための損傷検出手段と、検出結果解析手段を有する環境モニタリングシステムをも提供する。
【００２６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の放射線測定方法では、ＤＮＡ等の核酸に注目し、化学物質や放射線が核酸に与える損傷の度合いを検出することにより、環境と核酸損傷度の関係を明らかにし、化学種や線質の違いを考慮することなく生物への損傷度を評価できるものである。
【００２７】
従来、放射線測定方法として用いられてきたフィルムバッチやガラス線量計等では生物への影響を間接的に予測することが可能であったが、この出願の発明の環境モニタリング方法では、核酸への影響を直接測定できるため、極めて正確な測定が可能となる。また、この出願の発明の環境モニタリング方法は、核酸損傷の検出において煩雑な生化学的操作を必要とせず、微細な基板上に固定化した核酸を直接的に、あるいは蛍光色素等を用いて、可視化することにより損傷を簡便に検出、定量できる。
【００２８】
核酸の中でも遺伝子の本体であるＤＮＡを例に挙げれば、一般にＤＮＡの切断は放射線量が数Ｇｙ以下の場合でも起こるが、溶液中での吸光度変化や電気泳動などの生化学的手法によりＤＮＡ切断を検出するには１００Ｇｙ以上の放射線照射が必要となる。核酸の損傷を顕微鏡等の下で直読するこの出願の発明の環境モニタリング方法を用いることにより、放射線の検出感度を飛躍的に向上させることが可能なのである。同様に、化学物質についても、基板上に固定化されたＤＮＡ等の核酸を直接化学物質に曝露し、その損傷を直読することができることから、感度高い検出が可能となるのである。
【００２９】
この出願の発明の放射線測定方法は、基板上に放射線の影響を測定したい対象生物の細胞核や染色体から得られるＤＮＡ、クローニング、あるいは合成により得られるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸や核酸類似体を固定化し、この核酸固定化基板をモニタリングしたい環境下に曝した後、核酸固定化基板における核酸の損傷を検出、測定するものである。具体的には、例えば核酸としてＤＮＡやＲＮＡを用いるとき、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）固定化基板に放射線を照射したり、化学物質を含有する溶液を塗布したりして、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の断片化を蛍光顕微鏡や高感度ＣＣＤカメラ、走査型プローブ顕微鏡等で検出、測定できる。このとき、ＤＮＡ固定化基板にインターカレーターを接触させれば、ＤＮＡの螺旋構造が歪み、モニタリング環境による損傷を受けてＤＮＡの切断が生じやすくなるため、好ましい。また、インターカレーターとして蛍光色素を選択すれば、核酸の損傷が可視化されるため、蛍光顕微鏡や高感度ＣＣＤカメラ等での検出、測定が容易となる。蛍光色素ではないインターカレーターを用いる場合には、走査型プローブ顕微鏡で損傷を検出、測定できる。また、高線量の放射線を検出する場合や、長時間にわたって放射線を測定する場合など、目的に応じてインターカレーターは必要ない。
【００３０】
この出願の発明の環境モニタリング方法において、核酸固定化基板を環境モニタリング用プローブとして使用するためには、（１）核酸が絡まることなく固定されること、（２）核酸が操作中に物理的な切断を受けることなく、長さを保った状態にあること、および（３）顕微鏡等の手段により観察できる程度に可視化することが可能であることが必要である。したがって、ＤＮＡを核酸として用いる場合を例示すれば、基板表面に固定化されたＤＮＡは、繊維状態（直鎖状）を保持していることが好ましく、このような条件を満たすためには、ＤＮＡとして繊維状ＤＮＡを用いることが好ましい。このとき、繊維状ＤＮＡは、環状であっても直鎖状であってもよい。
【００３１】
このような種々の核酸を固定化する基板としては、その材質は固定化される核酸に影響を及ぼさず、モニタリング対象の環境を阻害したり、それにより劣化したりしないものであればよく、とくに限定されない。ガラス基板は入手が容易で安価であり、表面処理を施すことにより静電的にＤＮＡ等の核酸を固定化できるため、好ましく、シリコン基板は、フォトレジスト法等の半導体微細加工技術を応用してＤＮＡを伸長、固定化できるため、好ましい。また、シリコン基板は、体の形状に合わせた変形が可能であることから、体内の目的とする位置での測定も可能となる。さらに、基板は、種々の熱可塑性樹脂や熱硬化性樹脂からなるプラスチック基板であってもよい。これらのプラスチック基板は、表面にエポキシドを呈示させ、核酸塩基のグアニンのアミノ基と結合させることにより、核酸を固定化でき、好ましい。
【００３２】
また、このような基板については、その大きさもとくに限定されない。この出願の発明の放射線測定方法では、核酸の損傷を可視化できることから、顕微鏡や高感度カメラ（ＣＣＤカメラ）等によって観察、検出できる程度の大きさがあればよい。例えばガラス基板としては、汎用のスライドガラスが適用できる。
【００３３】
以上のとおりの基板表面に核酸を固定化する方法としては、ＤＮＡ等の核酸を基板表面に伸長、展開し、乾燥させる方法や化学的に結合させる方法等が考慮される。具体的には、基板表面を化学修飾することにより正電荷を付与させ、負電荷を有するＤＮＡとの間に静電的相互作用を生じさせてＤＮＡを固定化させる方法が好ましい。ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板のいずれの場合においても、基板表面をアミノシラン化することにより、正電荷を生じさせることができる。
【００３４】
また、基板上にＤＮＡを固定化する方法としては、オンチップＤＮＡ合成反応法も考慮される。具体的には、ＤＮＡが、任意の区画に分割されたＤＮＡについて、各区画を増幅するＤＮＡプライマーを設計し、各区画の長さに相当する間隔で基板上にプライマーを固定化した後、ＤＮＡ合成すれば、基板表面に伸長、固定化された状態でＤＮＡが合成されるのである。ＤＮＡ合成方法としては、ホットスタート法等の公知の合成手法が適用できる。もちろん、これ以外の種々の公知または新規の方法でＤＮＡ等の核酸を固定化してもよい。
【００３５】
この出願の発明の環境モニタリング方法では、得られた核酸固定化基板を化学物質、電子線、電磁波、放射線等のモニタリング対象環境に曝し、核酸に生じる損傷を可視化して直読することにより化学物質量、電子線量、電磁波量、放射線量等、さらには、それらによる該核酸への影響を定量できるのである。可視化方法としては、核酸固定化基板表面にインターカレータ−となる蛍光色素を塗布する方法が好ましく例示される。このような蛍光色素を塗布した核酸固定化基板をプローブとして用いれば、例えば、直鎖状に固定化された繊維状ＤＮＡに一定の線量の放射線を照射した際に、繊維状ＤＮＡ上に生じる二本鎖切断を可視化でき、蛍光顕微鏡を用いてただちに直読、定量できるのである。もちろん、核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや他の核酸類似体であってもよく、１種に限らず、複数種を併用してもよい。
【００３６】
可視化に用いられる蛍光色素としては、種々のものが考慮される。例えば、インターカレーターとしてＤＮＡのらせん構造内に取り込まれ、励起光下でＤＮＡを可視化する試薬等が考慮される。すなわち、ＤＮＡの切断を可視化できるプローブであれば、どのようなものであってもよい。前記（１）〜（３）の条件を満たすためには、蛍光色素は、ＤＡＰＩ、propidium iodide、YoYo-1等のインターカレーターであることが好ましい。
【００３７】
この出願の発明の環境モニタリング方法では、さらに、核酸固定化基板に前記の蛍光色素溶液を塗布し、その表面に蓋を施してもよい。蓋を施すことにより、塗布された蛍光色素溶液が乾固することを少なくとも一定時間防止でき、核酸の損傷を安定に検出、定量できるようになる。
【００３８】
以上のとおりに、核酸の損傷は、前記のとおりのインターカレーターにより可視化して検出されるが、検出方法としては、蛍光顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラ、および走査型プローブ顕微鏡（原子間力顕微鏡等）等の各種のものが例示される。好ましくは、断片化を蛍光色素であるインターカレーターにより可視化し、蛍光顕微鏡により確認し、高感度カメラにより画像化する方法で、これにより、ＤＮＡ断片化への線量や線質の影響を比較したり、経時的な断片化を測定したりできるようになる。また、走査型プローブ顕微鏡を用いる場合には、インターカレーターが蛍光色素である必要はない。さらに、このようにして得られた画像は、電子情報化し、コンピューター上に保存、あるいは解析、加工してもよい。
【００３９】
この出願の発明は、以上のとおりの方法により環境による核酸への影響を測定するための環境モニタリング用プローブをも提供する。すなわち、以上の環境モニタリングは、基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板を有するプローブ、あるいは、核酸固定化基板と蓋を有し、それらの間にインターカレーターが封入されたプローブを用いて行われるものなのである。
【００４０】
さらに、この出願の発明は、このような環境モニタリング用プローブの製造方法をも提供する。具体的には、基板表面に核酸を固定化して核酸固定化基板を得る、あるいはこの表面に、さらに蛍光色素の溶液を塗布し、蓋をする。このとき、核酸の固定化方法は、前記のＤＮＡプライマーの固定化方法に例示されるとおりの様々な方法が適用できる。
【００４１】
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの放射線測定方法を用いて放射線量を測定するためのシステムをも提供する。このようなシステムとしては、図１の概略図に示されるように、少なくとも前記の環境モニタリング用プローブ（１）における核酸の損傷を検出するための顕微鏡（２）や高感度ＣＣＤカメラ（３）等の検出手段と画像解析ソフト（４）等の検出結果解析手段を有するものであればよい。核酸の損傷を検出するための検出装置（２）としては、蛍光顕微鏡が好ましく例示される。このようなシステムを用いることにより、前記のとおりの環境モニタリングが簡便に、かつスムーズに実施できるだけでなく、コンピューター（４）上に様々な化学物質や放射線質、化学物質量や放射線量による核酸の損傷に関するデータベースを構築することも可能となり、これらの各種の因子による生物への直接的影響や遺伝的影響はもとより、遺伝子治療等の研究においても重要な知見が得られ、有用であるといえる。
【００４２】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００４３】
【実施例】
以下の実施例および比較例では、ＤＮＡとして、入手が容易で観察に適した長さをもつλファージＤＮＡ（宝酒造株式会社製）を用いた。また、蛍光色素としては、蛍光顕微鏡下での断片化ＤＮＡの直接観察が可能となる蛍光強度を有するYoYo-1（フナコシ株式会社製、YoYo-1 Iodide）を用いた。
【００４４】
また、各試薬や溶媒は、記載のない限り、和光純薬工業株式会社製のものを用いた。
＜実施例１＞
スライドガラス（松浪硝子工業株式会社7.6ｃｍ×2.6ｃｍ×0.8ｍｍ）を５％水酸化カリウム溶液中で３０分間超音波洗浄した後、イオン交換水で３０分、超純水でさらに３０分間洗浄した。洗浄後のガラスを８０℃のオーブン中で乾燥し、過酸化水素液・硫酸混合液（過酸化水素液（３０％）：硫酸（３６Ｎ）＝１：２）中で２０分間処理した。超純水で洗浄した後、アミノシラン溶液（エタノール：超純水：γ−アミノプロピルエトキシシラン＝５００：５００：１）中で１時間処理し、エタノールおよび超純水で洗浄して、オーブン（１２０℃）にて３０分乾燥した。
【００４５】
得られたアミノシラン化ガラス基板をλファージＤＮＡ溶液（６ｎｇ／ｍＬ純水溶液）に浸漬し、０．１５ｍｍ／ｓｅｃの速度でアミノシラン化ガラス基板を上昇させた、デシケーター中で乾燥させた。
【００４６】
蛍光色素YoYo-1（フナコシ株式会社製、YoYo-1 Iodide）を1μｇ／ｍＬの濃度になるように退色防止剤（ベクターシールド：Vector社製）を用いて調製し、得られたＤＮＡ固定化ガラス基板に滴下した後、直ちにカバーガラス（2.4ｃｍ×2.4ｃｍ×0.12ｍｍ）を乗せ、使用時まで遮光して保存した。
【００４７】
この放射線測定用ＤＮＡ線量計に60Ｃｏからの放射線（γ線）を照射し、ＤＮＡ切断を蛍光顕微鏡（ZEISS Axioplan2 Imaging）下で観察した。蛍光色素YoYo-1は４９１ｎｍの光で励起し、５０９ｎｍ付近に蛍光を発した。得られた画像は直ちにＣＣＤカメラ（Princeton Instruments, MODEL PTE/CCD-1401, MicroMax）で撮影し、電子情報化して保存した。
【００４８】
図２に２０Ｇｙのγ線を照射した際のλファージＤＮＡの切断を見た写真を示した。
作成されたＤＮＡ線量計の放射線（γ線）に対する感受性を確認するために、単位長さ（４８．５ｋｂ、１６．５μｍ）あたりの切断数を数え、ＤＮＡの損傷度を評価した。
【００４９】
図３に放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した。放射線照射線量と単位長さあたりのＤＮＡの切断数には相関が認められた。
また、図４に、０〜６．０Ｇｙの範囲における放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した。
＜比較例１＞
５０μＬλファージＤＮＡ溶液（３μｇ／ｍＬ純水溶液）に60Ｃｏからの放射線（γ線）を照射し、得られた溶液を、アガロースゲルを用いて電気泳動した。
【００５０】
図５に結果を示した。
図５より、１００ＧｙでＤＮＡの損傷が確認され、５００ＧｙでＤＮＡが完全に消失した。したがって、電気泳動法による検出範囲は、１００Ｇｙ以上であることが示された。
【００５１】
一方、この出願の発明のＤＮＡ線量計を用いると、０．１Ｇｙの線量でも検出が可能であることから（図４）、放射線検出感度は溶液状態のものを電気泳動で調べる方法に比べて極めて高いことが確認された。
＜実施例２＞  オンチップＤＮＡ合成によるＤＮＡ固定化基板の作成
シリコン基板にフォトレジスト法によりパタニングし、アビジン結合部位をアルミ蒸着により保護した。
【００５２】
２％フルオロシランをメタノールに溶解し、得られた処理基板を３０分間処理した後、超音波洗浄（３０分）し、MilliQイオン交換水でさらに洗浄した。
過酸化水素液・硫酸混合液（過酸化水素液（３０％）：硫酸（３６Ｎ）＝１：２）中で１０分間処理した後、イオン交換水で１０分間洗浄し、さらに、アミノシラン溶液（エタノール：超純水：γ−アミノプロピルエトキシシラン＝５０：５０：１）中で１時間、エタノールで１０分間処理した。その後１２０℃で３０分間熱処理し、得られた基板に、マイクロマニピュレーターを用いてビオチン化ＤＮＡプライマーを添加した。
【００５３】
ＤＮＡ合成を行ったところ、ＤＮＡが直線状に固定化されたことが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明により、化学物質や放射線等の環境因子の核酸への影響を精度高く直接測定できる新規なモニタリング方法が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の放射線測定システムを例示した概略模式図である。
【図２】この出願の発明の実施例において、γ線照射により切断されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した写真に代わる図である。
【図３】この出願の発明の実施例において、照射線量とλファージＤＮＡ単位長さあたりの切断数の関係を示した図である。
【図４】この出願の発明の実施例において、０〜６．０Ｇｙの範囲での放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した図である。
【図５】この出願の発明の実施例において、電気泳動により、ＤＮＡ損傷を確認した際のアガロースゲルの写真に代わる図である。
【符号の説明】
１  環境モニタリング用プローブ
２  蛍光顕微鏡
３  高感度ＣＣＤカメラ
４  画像解析ソフト（コンピューター）
ａ  λ／Hind III
ｂ  ０Ｇｙ
ｃ  ４Ｇｙ
ｄ  ２０Ｇｙ
ｅ  １００Ｇｙ
ｆ  ５００Ｇｙ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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