(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれるＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン、その類似化合物及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも一つの化合物に、Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素を作用させる反応工程と、前記工程によって生成した生成物を定量することによって前記検体に含まれるＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミンを測定する測定工程と、を含むＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン測定方法。
【請求項２】
前記検体が血清又は透析外液である請求項１記載のＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン測定方法。
【請求項３】
前記検体中の糖類を選択的に除去する糖類除去工程を含む請求項１又は２記載のＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン測定方法。
【請求項４】
Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミンが、腎機能障害の疾患マーカーであることを特徴とする、請求項１〜３の何れかに記載のＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン測定方法。
【請求項５】
腎機能検査用試薬キットであって、
Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素を含有することを特徴し、
該酵素が、検体に含まれるＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン、その類似化合物及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも一つの化合物に作用し、前記化合物と前記酵素の反応生成物を定量する腎機能検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規疾患検出マーカー、特に腎機能障害の診断に有用な新規マーカー、検出方法、及びキット、さらに例えば家畜飼料などに有用な本物質の測定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
腎機能障害を検出するマーカーとして、イヌリン−クリアランス、クレアチニン−クリアランス、尿素窒素量等が、現在、臨床上利用されている。しかしこれらのマーカーには、検査前に物質を投与する必要があること、また生体内成分の影響を受けるという欠点が指摘されている（検査と技術、Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．１２、１９９１年１１月、１０１９〜１０２２）（検査と技術、Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．５、１９９６年５月、４０３〜４０８）。
【０００３】
Ｎ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）は、古くより公知の化合物であって（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３８３７〜３８４１，１９６０）、反芻胃における代謝（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１６，４４５〜４５０，１９８０）との関係等において基礎的な検討が行われていた。
【０００４】
本物質の検出、測定はこれまでＨＰＬＣ法による方法しか知られておらず、簡便な測定法の開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決すべくなされたものであり、本発明の目的は、生体内成分の影響を受けない、また検査前の物質投与を必要としない簡便な、腎機能障害を検出する新たな手段の提供と、Ｎ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）又はその誘導体又はその類似化合物の簡便な測定方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、特定の疾患群患者（透析患者、腎疾患患者、糖尿病患者の一部）にのみ、Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン等の存在を確認し、腎機能障害に関連した疾患の新規マーカーとしての有用性を確認し、また、その検出において簡易な酵素反応を利用することができることを確認し、本発明を完成した。すなわち、本発明はマーカーとしてＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン、その類似化合物及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を利用すること，及び当該物質を簡便に測定することを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の新規マーカー化合物であるＮ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミンは、図２の構造式を示し、グルコースの１位に尿素が結合した構造を持つ。この化合物の特徴としては、１位に尿素が結合していることであり、グルコースの代わりにフルクトースその他の糖が結合したものでも、その疾患との関係において要時利用可能である。また、１位の尿素結合の関連が推定される限りは、いかなる誘導体（分解物質を含む）、類似化合物であっても、本発明のマーカー化合物になりうる。無論、これら関連化合物を標識化した化合物も利用できる。
【０００８】
本発明マーカー化合物を、マーカーとして、それ自体を利用又は該化合物を検出することは、各種疾患の検出に有用である。疾患として例えば、糖尿病、腎疾患、腎不全等が例示されるが、今後、本発明化合物をマーカーにして、新規に見つかるであろう各種疾患の診断にも利用可能である。
【０００９】
本発明マーカー化合物の測定は、ＨＰＬＣ法、ガスクロマトグラフィー法,アンぺトリ型センサーを用いた方法により、定量することができる。
【００１０】
また、Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素（ＥＣ1.1.99.13）を用いて、本物質のピラノース環３位の水酸基を酸化し、還元生成される電子受容体を、従来公知の方法（Ｔｓｕｇａｗａ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，２６９−２７４，１９９８）で定量することができる。Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素（ＥＣ1.1.99.13）は、例えば、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属（Ｔｓｕｇａｗａ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，２６９−２７４，１９９８）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５６，３０１〜３１０，１９９６）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１００，１０４９〜１０５５，１９８６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，３６６５〜３６７２，１９６７）等の微生物にその存在が知られている。これらの微生物を培養し、その菌体から精製抽出することにより、本酵素を得ることができる。
【００１１】
別の測定方法としては、アラントイカーゼ（ＥＣ3.5.3.4）を本物質に作用させ、生成されるグルコースもしくは尿素を定量する測定法を挙げることができる。また、アラントイナーゼ（ＥＣ3.5.2.5）又は、アラントエートデイミナーゼ（ＥＣ3.5.3.9）を本物質に作用させ、生成したグルコースもしくはアンモニアを定量することにより本物質を測定することができる。さらに、これら酵素を組み合わせて用いることも可能である。
【００１２】
また、本物質に直接作用する代謝酵素により、その酵素反応に起因する生成物量を測定することによって、本物質を定量することができる。
【００１３】
その他の測定法の事例としては、本物質の尿素−グルコースの結合を化学的に分解することによって、その生産物を従来公知の方法で定量することによっても行われる（Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．，４８，２８７〜３０４，１９８２）（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９０，９３〜９８，１９９５）（検査と技術、Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．１２、１９９１年１１月、１０１９〜１０２２）（臨床化学・補冊、１９８６年、２５〜３４）。
【００１４】
検体中の糖類を選択的に除去するためには、夾雑糖例えばグルコース、マルト−ス、シュークロース、１，５−ＡＧと区別する必要があるが、これらは各糖代謝異常について既知の一般的測定法又は／及び消去法を利用すればよい（特許第２７０１１７６号、特開平２−１０４２９８）。
【００１５】
本発明の新規マーカーは、例えば被検血液サンプル中に、存在が確認されることによって、より明確には約１μｇ／ｍｌ以上の、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在することによって疾患との関連が推定される。
【００１６】
本発明の試薬キットは、Ｎ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）及びその類似化合物及びその誘導体から選ばれる化合物自体、又はこのマーカー物質に対する特異的認識化合物、又はマーカー物質を測定するために組み合わされた各種試薬を適宜選択して調製する。
【００１７】
以下に、本発明を具体的実施例をもって説明するが、本発明の本質は疾患におけるマーカーとして、Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン、その類似化合物及びその誘導体なる群より選択される少なくとも一つの化合物を利用すること、及び当該物質を簡便に測定することを特徴とするものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
【実施例１】
（血清中の存在確認と分離）
透析患者血清１０ｍｌに２０ｍｌのアセトニトリルを混和して、除蛋白処理した後、ＯＨ型に平衡化した樹脂量５ｍｌのダウエックス１ｘ８（５０〜１００メッシュ、ダウケミカル社製）及びＨ型に平衡化した樹脂量５ｍｌのダウエックス５０Ｗｘ８（５０〜１００メッシュ、ダウケミカル社製）に順次添加したのち、精製水で非吸着画分を洗出、回収した。回収した画分を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、凍結乾燥した。
【００１９】
得られた上記凍結乾燥品を精製水５００μｌで溶解し、ＨＰＬＣで分離した。ＨＰＬＣでの分離条件は、カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（内径４．６ｍｍｘ２５ｃｍ、東ソー製）を用い、カラム温度は約６０℃に調整し、溶離液として８０％のアセトニトリルを０．８ｍｌ／分の速度で展開させた。検出器には、示差屈折計（ＲＩ−８０２０、東ソー製）を用いた。そのクロマトグラムを図１に示す。
【００２０】
溶出時間２１．２６分のピークは、１Ｈ−ＮＭＲ（図５）、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＦＡＢ／ＭＳその他の解析により、Ｎ−カルバモイル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンであることが確認された。
【００２１】
【実施例２】
（定量性の確認）
Ｎ−カルバモイル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンを、ＢＥＮＮ，Ｍ．Ｈ．他の文献（Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３８３７〜３８４１，１９６０）の方法によって合成した。合成された本物質を、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭの各濃度になるように精製水に溶解し、これらを実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で測定し、そのピーク面積から定量性を検討した。その結果を図３に示す。本法により、２ｍＭまで良好な定量性が確認された。
【００２２】
【実施例３】
（各種疾患患者でのＮ−カルバモイル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの測定）
図４は、各疾患の患者血清及び健康人の血清中の、本物質の出現頻度を、実施例１で示したＨＰＬＣ法で測定した結果を示したものである。検体数は、疾患群によって異なるが、６４〜２２５例について測定した。
【００２３】
その結果、腎機能関連疾患のうち、透析患者については殆どの検体に５〜２０μｇ／ｍｌの濃度で本物質が認められた。また、腎疾患患者から採取した検体にも、高頻度に検出された。糖尿病患者から採取した検体の一部にも検出された。一方、腎機能に関係のないその他の疾患患者又は健常人の血清中には、殆ど検出されず、本物質と腎機能障害との関連が示唆された。
【００２４】
また、透析患者の透析外液に本物質が透析されることを確認しており、透析外液の本物質濃度を測定することにより、透析のモニタリングへの使用の可能性が示唆された。
【００２５】
【実施例４】
（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．α−１５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８９２）由来のＤ−グルコシド−３−脱水素酵素の取得法）
培養
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．α−１５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８９２）（Ｔｓｕｇａｗａ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，２６９−２７４，１９９８）を、１リットル当たり１０ｇポリペプトン、１ｇ酵母抽出物、３０ｇ塩化ナトリウム、２ｇリン酸水素二カリウム、１０ｇ  α−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地（ｐＨ７．０）中で、３０℃にて１２〜４８時間好気的に培養した。培養細胞を分離し、３％塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。１リットルの培養液から約１０ｇ（湿潤重量）の細胞を得た。
【００２６】
酵素の分離・精製
後期対数期にある上記の培養細胞をフレンチプレスした後、超遠心（４℃、６９，８００×ｇ、９０分間）して上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して析出物を廃棄し、水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析した。透析後の水溶液は、ＤＥＡＥ−トヨパールカラムに付し、さらに１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（内径５ｍｍ×５ｃｍ）に付した。０〜０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線勾配法で溶出したところ、目的物質は０．３Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した。溶出液を、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＳＫゲル  Ｇ３０００カラム（内径８ｍｍ×３０ｃｍ）に付し、活性画分を分離して、Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素を含む溶液を得た。
【００２７】
【実施例５】
（Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミンの酵素法（Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素）での定量性）
合成したＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）を０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭの各濃度になるように精製水に溶解し、これを被検液として、次の様に測定したところ、図６のように良好な直線性が得られた。
【００２８】
１０μＬの各濃度のＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）に、２４０μＬの発色基質液（１．０ｍＭ  ＷＳＴ−１（同仁化学）、０．０２ｍＭ  ＰＭＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１％トライトンＸ−１００）を添加し、３７℃、５分間、予備加温した。５分後に、８０μＬの酵素液（５Ｕ／ｍｌ  Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．α−１５株由来）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０）を添加しさらに、３７℃、５分間加温し、この間の４５０ｎｍの吸光度の変化量を測定した。
【００２９】
【実施例６】
（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属ＩＡＭ１３００９株由来のＤ−グルコシド−３−脱水素酵素の取得法）
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属ＩＡＭ１３００９株を用い、実施例４と同様に培養・精製を行って、Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素を含む溶液を得た。
【００３０】
【実施例７】
（血清検体の、妨害糖類除去反応を含むＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）酵素測定法と、ＨＰＬＣ法との相関）
血清、血漿、尿など、測定に干渉する糖類を含む試料中のＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）を定量する場合、従来公知の糖類の消去反応を実施例５の反応に組み合わせて、Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミンのみを定量することができる。例えば、血清を被検液とする場合、血清中に存在するグルコースや、１，５−ＡＧ等をリン酸化酵素によってリン酸化し除去するか、酸化酵素によって除去することができる。以下に測定方法、試薬組成を示す。
【００３１】
血清１０μＬに、２４０μＬの前処理試薬（１．０ｍＭ  ＷＳＴ−１（同仁化学）、０．０２ｍＭ  ＰＭＳ、５Ｕ／ｍｌ  ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（旭化成工業）、１０ｍＭ  ＡＤＰ、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１％トライトンＸ−１００）を添加し、３７℃、５分間、予備加温した。５分後に、８０μＬの酵素液（５Ｕ／ｍｌ  Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属ＩＡＭ１３００９株由来）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０）を添加しさらに、３７℃、５分間加温し、この間の４５０ｎｍの吸光度の変化量を測定した。
【００３２】
透析患者を含むヒト血清２５例について、Ｎ−カルバモイル−β−グルコピラノシルアミン量を測定したところ、図７のように、ＨＰＬＣ法での測定値と、回帰式Ｙ＝１．００９Ｘ＋０．１８８、相関係数ｒ＝０．９９１と、良好な相関性を示した。また、本測定法の、グルコースと１，５−ＡＧの消去能を調べたところ、グルコースは５００ｍｇ／ｄｌまで、１，５−ＡＧは３００μｇ／ｍｌまで、測定値に影響しないことが確認された。結果は図８及び９に示す。
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、新規なマーカーとしてＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）及び／又はその類似化合物及び／又はその誘導体の有用性を見出したものであり、特に疾患マーカーとして臨床診断分野に新たな可能性を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】透析患者血清の示差屈折計によるＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】Ｎ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）の化学構造式を示す図である
【図３】ＨＰＬＣ法の定量性を示す図である。
【図４】疾患における本発明マーカーの出現傾向を示す図である。
【図５】透析患者血清から抽出した２１．２６分溶出物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを示す図である
【図６】Ｎ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）の酵素法（Ｄ−グルコシド−３−脱水素酵素）での定量性を示す図である。
【図７】血清検体の、妨害糖類除去反応を含むＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）酵素測定法と、ＨＰＬＣ法との相関を示す図である。
【図８】妨害糖類除去反応を含むＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）酵素測定法の、グルコース消去能を示す図である。
【図９】妨害糖類除去反応を含むＮ−カルバモイル（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−β−グルコピラノシルアミン（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌａｍｉｎｅ）酵素測定法の、１，５−ＡＧ消去能を示す図である。
【図１】
0004213822.tif 000002
【図２】
0004213822.tif 000003
【図３】
0004213822.tif 000004
【図４】
0004213822.tif 000005
【図５】
0004213822.tif 000006
【図６】
0004213822.tif 000007
【図７】
0004213822.tif 000008
【図８】
0004213822.tif 000009
【図９】
0004213822.tif 000010