(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマトにおける澱粉合成の調節方法であって、
リコペルシコン・ヒルッスタム（Lycopersicon hirsutum）LA1777とリコベルシコン・エスクレンタム（Lycopesicon esculentum）ゲノタイプとの種間交雑に由来する植物の集団を提供し；そして
澱粉合成を高める、前記リコペルシコン・ヒルッスタム（Lycopersicon hirsutum）LA1777に由来するADPGPPアーゼ大サブユニットの遺伝子の対立遺伝子をそれぞれが含む集団の個体を選択する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記選択段階が、若い果実における前記ADPGPPアーゼの活性を測定し、そして前記ADPGPPアーゼの高い活性を有する若い果物を選択することを含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列（一文字表記）：
ＭＫＳＴＶＨＬＧＲＶ  ＳＴＧＧＦＮＮＧＥＫ  ＥＩＦＧＥＫＭＲＧＳ
ＬＮＮＮＬＲＩＮＱＬ  ＳＫＳＬＫＬＥＫＫＥ  ＫＫＩＫＰＧＶＡＹＳ
ＶＩＴＴＥＮＤＴＥＴ  ＶＦＶＤＭＰＲＬＥＲ  ＲＲＡＮＰＫＤＶＡＡ
ＶＩＬＧＧＧＥＧＴＫ  ＬＦＰＬＴＳＲＴＡＴ  ＰＡＶＰＶＧＧＣＹＲ
ＬＩＤＩＰＭＳＮＣＩ  ＮＳＡＩＮＫＩＦＶＬ  ＴＱＹＮＳＡＡＬＮＲ
ＨＩＡＲＴＹＦＧＮＧ  ＶＳＦＧＤＧＦＶＥＶ  ＬＡＡＴＱＴＰＧＥＡ
ＧＫＫＷＦＱＧＴＡＤ  ＡＶＲＫＦＩＷＶＦＥ  ＤＡＫＮＫＮＩＥＮＩ
ＬＶＬＳＧＤＨＬＹＲ  ＭＤＹＭＥＬＶＱＮＨ  ＩＤＲＮＡＤＩＴＬＳ
ＣＡＰＡＥＤＳＲＡＳ  ＤＦＧＬＶＫＩＤＳＲ  ＧＲＶＶＱＦＡＥＫＰ
ＫＧＦＥＬＫＡＭＱＶ  ＤＴＴＬＶＧＬＳＰＱ  ＤＡＫＫＳＰＹＩＡＳ
ＭＧＶＹＶＦＫＴＤＶ  ＬＬＫＬＬＫＷＳＹＰ  ＴＳＮＤＦＧＳＥＩＩ
ＰＡＡＩＤＤＹＮＶＱ  ＡＹＩＦＫＤＹＷＥＤ  ＩＧＴＩＫＳＦＹＮＡ
ＳＬＡＬＴＱＥＦＰＥ  ＦＱＦＹＤＰＫＴＰＦ  ＹＴＳＰＲＦＬＰＰＴ
ＫＩＤＮＣＫＩＫＤＡ  ＩＩＳＨＧＣＦＬＲＤ  ＣＳＶＥＨＳＩＶＧＥ
ＲＳＲＬＤＣＧＶＥＬ  ＫＤＴＦＭＭＧＡＤＹ  ＹＱＴＥＳＥＩＡＳＬ
ＬＡＥＧＫＶＰＩＧＩ  ＧＥＮＴＫＩＲＫＣＩ  ＩＤＫＮＡＫＩＧＫＮ
ＶＳＩＩＮＫＤＧＶＱ  ＥＡＤＲＰＥＥＧＦＹ  ＩＲＳＧＩＴＩＩＳＥ
ＫＡＴＩＲＤＧＴＶＩ
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、スクロース−澱粉代謝を制御する遺伝子。
【請求項４】
下記ヌクレオチド配列：
1  ATGAAATCGA CGGTTCATTT GGGGAGAGTG AGCACTGGTG GCTTTAACAA
51  TGGAGAGAAG GAGATTTTTG GGGAGAAGAT GAGAGGGAGT TTGAACAACA
101  ATCTCAGGAT TAATCAGTTG TCGAAAAGTT TGAAACTTGA GAAGAAGGAG
151  AAGAAGATTA AACCTGGGGT TGCTTACTCT GTGATCACTA CTGAAAATGA
201  CACAGAGACT GTGTTCGTAG ATATGCCACG TCTTGAGAGA CGCCGGGCAA
251  ATCCCAAGGA TGTGGCTGCA GTCATATTAG GAGGAGGCGA AGGGACCAAG
301  TTATTCCCAC TTACAAGTAG AACTGCAACC CCTGCTGTTC CGGTTGGAGG
351  ATGCTACAGG CTCATAGACA TCCCGATGAG CAACTGTATC AACAGTGCTA
401  TTAACAAGAT TTTTGTGCTG ACACAGTACA ATTCTGCTGC CCTGAATCGT
451  CACATTGCTC GAACGTATTT TGGCAATGGT GTGAGCTTTG GAGATGGATT
501  TGTCGAGGTA CTAGCTGCAA CTCAGACACC TGGGGAAGCA GGAAAAAAAT
551  GGTTTCAAGG AACAGCAGAT GCTGTCAGAA AATTTATATG GGTTTTTGAG
601  GACGCTAAGA ACAAGAATAT TGAAAATATC CTTGTATTAT CTGGGGATCA
651  TCTTTATAGG ATGGATTATA TGGAGTTGGT GCAGAACCAT ATTGACAGAA
701  ATGCTGATAT TACTCTTTCA TGTGCACCAG CTGAGGACAG CCGAGCATCA
751  GATTTTGGGC TGGTCAAGAT TGACAGCAGA GGCAGAGTTG TCCAGTTTGC
801  TGAAAAACCA AAAGGTTTTG AGCTTAAAGC AATGCAAGTA GATACTACTC
851  TTGTTGGATT ATCTCCACAA GATGCGAAGA AATCCCCTTA TATTGCTTCA
901  ATGGGAGTTT ATGTTTTCAA GACAGATGTA TTGCTGAAGC TCTTGAAATG
951  GAGCTACCCC ACTTCTAATG ATTTTGGCTC TGAAATTATA CCAGCAGCTA
1001  TTGATGATTA CAATGTCCAA GCATACATTT TCAAAGACTA TTGGGAGGAC
1051  ATTGGAACAA TTAAATCTTT CTATAATGCT AGCTTGGCGC TCACACAAGA
1101  GTTTCCAGAG TTCCAATTTT ATGATCCAAA AACACCTTTT TACACATCTC
1151  CTAGGTTCCT TCCACCAACC AAGATAGACA ATTGCAAGAT TAAGGATGCC
1201  ATAATTTCTC ATGGATGTTT CTTGCGAGAT TGCTCTGTGG AACACTCCAT
1251  AGTGGGTGAA AGATCACGCT TAGACTGTGG TGTTGAACTG AAGGATACTT
1301  TCATGATGGG AGCAGACTAC TACCAAACAG AATCTGAGAT TGCCTCCCTG
1351  TTAGCAGAGG GGAAAGTACC GATTGGGATT GGGGAAAATA CAAAAATAAG
1401  GAAATGTATC ATTGACAAGA ACGCAAAGAT AGGAAAAAAT GTTTCAATCA
1451  TTAATAAAGA TGGTGTTCAA GAGGCAGACC GACCAGAGGA AGGATTCTAC
1501  ATACGATCAG GGATAACCAT TATATCAGAG AAAGCCACAA TTAGAGATGG
1551  AACAGTTATA TGA
を有する、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
下記のアミノ酸配列（一文字表記）：
ＭＫＳＴＶＨＬＧＲＶ  ＳＴＧＧＦＮＮＧＥＫ  ＥＩＦＧＥＫＭＲＧＳ
ＬＮＮＮＬＲＩＮＱＬ  ＳＫＳＬＫＬＥＫＫＥ  ＫＫＩＫＰＧＶＡＹＳ
ＶＩＴＴＥＮＤＴＥＴ  ＶＦＶＤＭＰＲＬＥＲ  ＲＲＡＮＰＫＤＶＡＡ
ＶＩＬＧＧＧＥＧＴＫ  ＬＦＰＬＴＳＲＴＡＴ  ＰＡＶＰＶＧＧＣＹＲ
ＬＩＤＩＰＭＳＮＣＩ  ＮＳＡＩＮＫＩＦＶＬ  ＴＱＹＮＳＡＡＬＮＲ
ＨＩＡＲＴＹＦＧＮＧ  ＶＳＦＧＤＧＦＶＥＶ  ＬＡＡＴＱＴＰＧＥＡ
ＧＫＫＷＦＱＧＴＡＤ  ＡＶＲＫＦＩＷＶＦＥ  ＤＡＫＮＫＮＩＥＮＩ
ＬＶＬＳＧＤＨＬＹＲ  ＭＤＹＭＥＬＶＱＮＨ  ＩＤＲＮＡＤＩＴＬＳ
ＣＡＰＡＥＤＳＲＡＳ  ＤＦＧＬＶＫＩＤＳＲ  ＧＲＶＶＱＦＡＥＫＰ
ＫＧＦＥＬＫＡＭＱＶ  ＤＴＴＬＶＧＬＳＰＱ  ＤＡＫＫＳＰＹＩＡＳ
ＭＧＶＹＶＦＫＴＤＶ  ＬＬＫＬＬＫＷＳＹＰ  ＴＳＮＤＦＧＳＥＩＩ
ＰＡＡＩＤＤＹＮＶＱ  ＡＹＩＦＫＤＹＷＥＤ  ＩＧＴＩＫＳＦＹＮＡ
ＳＬＡＬＴＱＥＦＰＥ  ＦＱＦＹＤＰＫＴＰＦ  ＹＴＳＰＲＦＬＰＰＴ
ＫＩＤＮＣＫＩＫＤＡ  ＩＩＳＨＧＣＦＬＲＤ  ＣＳＶＥＨＳＩＶＧＥ
ＲＳＲＬＤＣＧＶＥＬ  ＫＤＴＦＭＭＧＡＤＹ  ＹＱＴＥＳＥＩＡＳＬ
ＬＡＥＧＫＶＰＩＧＩ  ＧＥＮＴＫＩＲＫＣＩ  ＩＤＫＮＡＫＩＧＫＮ
ＶＳＩＩＮＫＤＧＶＱ  ＥＡＤＲＰＥＥＧＦＹ  ＩＲＳＧＩＴＩＩＳＥ
ＫＡＴＩＲＤＧＴＶＩ
を含んで成る、スクロース−澱粉代謝を制御する蛋白質。
【請求項６】
請求項５に記載の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、シュークロース−澱粉代謝を制御する遺伝子。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の方法に従って生成される植物。
【請求項８】
請求項５に記載の蛋白質をコードする外来遺伝子を発現するトランスジェニック植物。
【請求項９】
請求項７に記載の植物により生成される果実。
【請求項１０】
請求項８に記載の植物により生成される果実。
【請求項１１】
増殖される場合、請求項７に記載の植物を生成する種子。
【請求項１２】
増殖される場合、請求項８に記載の植物を生成する種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、若い果実において澱粉含有率を高められ、そして続いて、成熟果実において可溶性固形物を高められているトマトを育種する方法に関する。さらに、本発明は、トマトにおける澱粉を高める遺伝子の使用にも関する。
【０００２】
発明の背景：
熟したトマト果実の固形分は、その品質の主要決定因子である。可溶性固形（主として、糖及び有機酸）分の上昇及びそれによる、産業用トマトの価値及び新鮮な市場トマトの味覚の改良が、長年、研究企画の目的であった。農業技術及び遺伝子操作を包含する、固体レベルを改良するためのいくつかのアプローチが取られて来た。
【０００３】
トマト果実の可溶性固形分は、主に糖、有機酸及び塩から構成される。集合的には、可溶性固形分は、産業用使用のための及び新鮮な市場消費のための果実品質の主要決定因子である。可溶性固形分の約半分は、リコペルシコン・エスクレンタムのすべての標準の栽培品種において、ほぼ等モル濃度で、単糖還元糖グルコース及びフルクトースから成る糖画分により与えられる
【０００４】
成熟トマトに果実における糖濃度を高めるためのいくつかの方法が研究されて来た。遺伝子操作は、リコペルシコンの野生種からの高い可溶性固体の不確定形質の移行（Rick C.M, 1974. Hilgardia 42: 493-510; 及びHewitt J.D. Dinar M. and Stevens M.A, 1982. J. Am. Soc. Hort. Sci. 107: 896-900）、及びより最近には、野生リコペルシコン・キミエレウスキー（Lycopersicon chmielewskii）（Yelle S., Hewitt J.D., Robinson N.L., Damon N.S. and Bennett A.B, 1988. PI. Physiol. 87: 737-740; 及びYelle S., Chetelat R.T., Dorais M., Daverna J.W. and Bennett A.B., 1991. PI. Physiol. 95:1026-1035）及びリコペルシコン・ヒルスタム（Miron D. and Schaffer A.A. 1991, PI. Physiol. 95: 623-637） からのスクロース蓄積物の遺伝子形質の移行、並びにリコペルシコン・ヒルスタムからの成熟果実における高いフルクトース：グルコース比の遺伝子形質の移行（アメリカ特許出願第08/530,216号；この開示は引用により本明細書に組み込まれる）を包含する。
【０００５】
後者のアプローチは、その改良が果実における高められた可溶性炭水化物含有率を導く生化学段階を同定することを包含する、トマト果実組織を開発することにおける炭水化物代謝の成分の研究により可能にされた（Yelleなど., 1988, 1991; Miron and Schaffer, 1991）。同定されると、それらの生化学工程は、遺伝型生化学形質についての選択により、又は分子遺伝子方法により助力された従来の遺伝子手段による修飾のために標的化され得る。
【０００６】
若い成長中のトマト果実は、果実組織の乾量の25％以上を付与することができる過渡的澱粉蓄積により特徴づけられる。澱粉濃度は、開花後、数日以内に上昇し始め、そして成熟緑色段階の前、ピーク濃度に達する（Schaffer, A.A. and Retreiov, M. 1997a, Plant Physiology 113: 739-746）。成熟段階で、この澱粉はトマト果実組織には実際的に不在である。過渡的に蓄積された澱粉は、成熟果実における可溶性糖の後での蓄積のための炭水化物の貯蔵物として作用することが推定された（Dinar M. and Stevens M.A., 1981m H, Am. Soc. Hort. Sci. 106: 415-418）。
【０００７】
Dinar and Stevensは、熟した果実における合計可溶性固体（TSS）値が4.6〜6.3°のブリックス範囲に及ぶトマトの7種の遺伝子型を比較する彼らの研究におけるこの仮説についての基礎を築いた。彼らは、熟した果実におけるTSS値が若い未成熟果実における澱粉含有率に明確に関連することを見出し、そして澱粉加水分解の生成物が可溶性糖の蓄積に寄与することを提案した。
【０００８】
トマト植物は、光合成物を、スクロースの形で果実に転流し（Walker L.J. and Ho L.C. 1977, Ann. Bot. 41: 813-823）、そして従って、澱粉の一時的な蓄積はたぶん、澱粉代謝に対するスクロースに関与するキー酸素の活性の一時的な変化により決定されるであろう。若いトマト果実における澱粉合成の酵素経路が研究され、そして記載されている（Schaffer, A.A. and Petreikov, M. 1997a, Plant Physioloh 113: 739-746; Schaffer, A.A. and Petreikov, M. 1997b, Physiologia Plantarum 101: 800-806）。
【０００９】
それらの果実における澱粉蓄積をたぶん制限する４種の酵素が、それらの絶対的な活性、及び澱粉レベルの発育的変化と一時的に関連するそれらの活性における発育的変化に基づいて同定された。それらの酵素は、若い果実におけるスクロース代謝の初期段階（スクロースシンターゼ、E.C. 2. 4. 1. 13 及びフルクトキナーゼ、E.C. 2. 7. 1. 4）及び澱粉合成の後期段階（ADP−グルコースピロホスホリラーゼ、E.C. 2. 7. 7. 27及び澱粉シンターゼ、E.C. 2. 4. 1. 21）を触媒するそれらの酵素を包含する。
【００１０】
さらに、Schaffer and Petreikvは、澱粉蓄積が組織特異的であり、柱軸及び内部囲心組織に主に位置することを示し、そして果実容積に対するそれらの組織の寄与が果実澱粉含有率い対して影響を与えることを提案した。
【００１１】
研究は、上記言及された酵素の１つ、すなわちADPGPPアーゼ（ATP−グルコースピロホスホリラーゼ）がトマト果実、及び他の澱粉蓄積組織、例えばジャガイモ塊茎における澱粉合成に制限されていることを明白に示した。Stark D.M., Barry G. F., and Kishore G. M. 1996, Ann. NY Cad. Sci. 792: 26-36においては、トランスジェニックトマト植物及びジャガイモ植物が、ADPGPPアーゼの細菌変異体（E.コリ’、GlyC16、グリコーゲン過剰生成体）により開発された。
【００１２】
トランスジェニックトマトは、未成熟果実におけるより高い澱粉含有率、及び成熟果実における高められた糖含有率を示した。同じ細菌遺伝子構造体を有するトランスジェニックトマト塊茎もまた、澱粉含有率の上昇を示した。相互的には、ADPGPPアーゼ活性の阻害がトランスジェニックジャガイモ塊茎の澱粉含有率を低め、このことは、澱粉蓄積の調節におけるADPGPPアーゼの重要性を示す。
【００１３】
細菌起源のADPGPPアーゼのための遺伝子の使用は、真核植物組織においてその遺伝子が機能する分子遺伝子操作を必要とする。例えば、原核遺伝子には存在しない特定のアミノ末端トランジットペプチド、並びに植物細胞転写終結において引き起こすであろう他のDNA配列付加、及びRNA配列の3’末端へのポリアデニル化されたヌクレオチドの付加を含む融合ポリペプチドをコードするであろう人工遺伝子構造体を開発することが必要である。比較すれば、類似する形質転換のための植物遺伝子の使用は、それらの操作を必要としない。
【００１４】
さらに、それらの遺伝子の天然に存在する対立遺伝子の従来の育種技法を通しての天然の移行に基づいて、それらの酵素の高められた又は変性された活性を有する植物の開発が、多くの利点から有益である。例えば、従来の育種技法は、興味ある遺伝子の天然の位置における所望する対立遺伝子の位置決定、遺伝子的安定性の誘導、及びトランスジェニック生物の開発の特徴的な予測できない“位置”効果の回避を導く。さらに、消費者の選択に関しては、トランスジェニック的に誘導されたトマト果実に比較して、天然において誘導された市販の生成物、例えばトマト果実には明白な利点が存在する。
【００１５】
フルクトキナーゼに関しては、トマト果実からの２種の遺伝子が同定され、クローン化され、そして配列決定されている（Kanayama, Y. など. 1997, Plant Physiology 113: 1379-1384）。それらの遺伝子の１つ、すなわちFK2は、澱粉合成に関連する代謝経路に特に包含される（Kanayamaなど. 1998, Plant Physiology 117: 85-90）。同様に、トマト果実からのスクロースシンターゼのための遺伝子は、クローン化され、そして配列決定されており（Wang, F., など. Plant Physiology 103; 1463-1464）、そしてシンク（sink）組織のスクロースシンターゼのための遺伝子であることが示されている（Fu, H. and Park, W.D. Plant Cell 7: 1369-1385）。
【００１６】
ADPGPPアーゼに関しては、その酵素は、独立した遺伝子制御下にある２つの大きなサブユニット及び２つの小さなサブユニットから構成されるヘテロテトラマーとして高等植物において機能する（Preiss, I. and Sivak, M. In: Photoassimilate Distribution in Plants and Crops, Zamski, E. and Schaffer, A. A., eds., Marcel Dekker Publ. NYC, pp. 63-96, 1996）。大きなサブユニットをコードする３種の別々のリコペルシコン・エスクレンタン遺伝子及び小さなサブユニットのための１つの遺伝子が、最近クローン化され、そして配列決定されている（Chen, B.Y. and Janes, H., 1995, Plant Physiology 109: 1498; Park, S.W. and Chung, W.I. 1998, Gene 206: 215-221。
【００１７】
例えば、トウモロコシにおけるように、澱粉含有率を改良することに寄与することができる植物におけるADPGPPアーゼ遺伝子の源を同定するために多くの努力が行われており（Giroux, M.J. など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5824-5829）、ここで、転位遺伝子Dsシステムを用いてのADPGPPアーゼの大きなサブユニットのための遺伝子の特定部位突然変異がADPGPPアーゼインヒビター、すなわちリン酸に対する低められた感受性を有するADPGPPアーゼの挿入突然変異を導いた。
【００１８】
アメリカ特許出願第08/530,216号に記載されるように、トマトにおける炭水化物代謝の変性のためへのリコペルシコンの野生種の使用に関しては、リコペルシコン・ヒルスタムにおけるフルクトース：グルコース比は高いけれども、フルクトースの実際の量は非常に低い。リコペルシコン・エスクレンタムからの高いグルコース及びフルクトースレベルの形質と共に、フルクトース：グルコース比の遺伝子形質の組換えは、高い比のフルクトース：グルコースと共に、高いレベルのヘキソースの不明確且つ所望の形質を生成した。
【００１９】
しかしながら、リコペルシコン・ヒルスタム果実は、栽培されたリコペルシコン・エスクレンタムに比較して、わずかに低い量の澱粉を蓄積する（Miron and Schaffer, 1991, Plant Physiology 95: 623-627）。同様に、リコペルシコンの他の野生種（すなわち、リコペルシコン・キミエリエウスキー（Lycopersicon Chmieliewskii）、Yelleなど. 1988, Plant Physiology 87: 737-740）はまた、澱粉をほとんど蓄積しない。従って、従来技術は、澱粉蓄積の上昇についての遺伝子変動性の可能な源として野生型トマトの使用を決して予測したことも又は考慮したこともない。
【００２０】
発明の要約：
本発明は、若い果実における高い澱粉含有率及び続く成熟果実における高い可溶性固体を有するトマトについての選択手段を提供する。
従って、本発明の好ましい態様によれば、リコペルシコンspp. (Lycopersicon spp.) とリコベルシコン・エスクレンタム（Lycopesicon esculentum）ゲノタイプとの種間交雑に由来する植物の集団を供給し；そして澱粉合成を高める、前記リコペルシコンspp. に起因する遺伝子の対立遺伝子をそれぞれが含む集団の個体を選択することを含んで成る、トマトにおける澱粉合成の調節方法が提供される。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、澱粉合成における代謝段階を触媒する酵素をコードする遺伝子の対立遺伝子を個々に含む個体を選択することを含んで成る。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、ADPGPPアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の対立遺伝子を個々に含む個体を選択することを含んで成る。
【００２２】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、リコペルシコン・ヒルスタム由来のADPGPPアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の対立遺伝子を個々に含む個体を選択することを含んで成る。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、前記遺伝子のための分子マーカーを用いることによって選択することを含んで成る。
本発明の好ましい態様によれば、前記分子マーカーは、リコペルシコン・ヒルスタム由来のADPGPPアーゼの大きなサブユニット（LS1）を含んで成る。
【００２３】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、若い果実における前記酵素の活性を測定し、そして高い活性の前記酵素を有するそれらの若い果物を選択することを含んで成る。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記選択段階は、前記若い果実のADPGPPアーゼ活性を測定し、そして高いADPGPPアーゼ活性を有するそれらの若い果実を選択することを含んで成る。
本発明の好ましい態様によれば、前記リコペルシコンspp. は、緑色に実をつけるエリオペルシコン亜属のリコペルシコンspp. を含んで成る。好ましくは，前記リコペルシコンspp. は、リコペルシコン・ヒルスタムを含んで成る。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、選択されたプロモーター、及び上記ADPGPPアーゼLS1タンパク質をコードするRNA配列の生成を引き起こす構造DNA配列を含んで成る組換え二本鎖DNA分子を、植物細胞のゲノム中に挿入し、形質転換された植物細胞を得、高められた澱粉含有率を有する、遺伝子的に形質転換された植物を、前記形質転換された植物細胞から再生する段階を含んで成る、高められた澱粉含有率を有する遺伝子的に形質転換された植物の生成方法が提供される。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、前記植物細胞は、トマト細胞、ジャガイモ細胞、ナス科植物からの細胞、マメ科細胞及び穀物細胞から成る群から選択される。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記プロモーターは、未成熟果実プロモーター、塊茎プロモーター及び種子プロモーターから成る群から選択される。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記再生段階は、未成熟果実における高められた澱粉含有率を有する、遺伝子的に形質転換された植物を再生することを含んで成る。
【００２６】
本発明の好ましい態様によれば、前記再生段階は、塊茎における高められた澱粉含有率を有する、遺伝子的に形質転換された植物を再生することを含んで成る。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前記再生段階は、種子における高められた澱粉含有率を有する、遺伝子的に形質転換された植物を再生することを含んで成る。
【００２７】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法はまた、前記集団中の固体又は前記遺伝子的に形質転換された植物を増殖せしめる段階を含んで成る。前記増殖は、栄養増殖又は，種子によることができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法のいずれかに従って生成された植物、そのような植物により生成される果実、及び増殖される場合、そのような植物を生成する種子がまた提供される。
【００２８】
さらに、次の表が提供される：
表３は、標準の栽培品種M−82に比較して、育種系900,901及び904の若いトマト果実におけるスクロースの澱粉への代謝に包含される、澱粉レベル及び酵素の活性を示す。★印は、M−82に比較される場合、個々の高澱粉系間での統計学的差異を示し、そして高澱粉系間の差異を示さない。酵素PGI（ホスホグルコイソメラーゼ）、PGM（ホスホグルコムターゼ）及びUDPGPPアーゼに関しては、わずか１つの果実が系当たり分析され、そしてすべての系における酵素活性は比較的高く且つ明らかに過剰（Schaffer and Petreikovにおけるように）であるので、有意な差異は想定されなかった。他のアッセイに関しては、個々の植物からの最少４個の果実がアッセイされた。
【００２９】
表４は、成熟果実のTSS値、及びM−82、 904、 それらの間での雑種、904と11遺伝子移入体系（テキストに記載される）との間の11の雑種の混合、及びM−82と同じ11遺伝子移入体系との間の11の同等の雑種の混合の未熟果実の澱粉レベルを示す。個々の雑種の個々からの少なくとも２個の果実を測定し、そして平均は、従って、最少の22個の個々の分析を表す。M−82、904及びそれらの間の雑種の個々からの少なくとも３個の果実を分析した。
【００３０】
表５は、M−82、904、それらの間での雑種、904と11遺伝子移入体系（テキストに記載される）との間の11の雑種のうち６の混合物、及びM−82と同じ遺伝子移入体系との間の雑種のうち６の混合物の未成熟果実の果皮の酵素活性を示す。M−82、904、及びそれらの間での雑種に関しては、個々の植物からの２個の果実をアッセイした。
【００３１】
表６は、ADPGPPアーゼの３個の大きなサブユニット及び１つの小さなサブユニットのPCR分析に使用される前方向及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列、及びリコペルシコン・ヒルスタム特異的対立遺伝子を得るためにPCR生成物を消化するのに使用される制限エンドヌクレアーゼを示す。
【００３２】
表７は、904系及びM−82の交雑からのF2植物のADPGPPアーゼの活性レベルを示す。植物のLS1遺伝子型は、本明細書においてさらに記載されるように、実生段階で特徴づけられた。ADPGPPアーゼ活性及び澱粉レベルは、個々のF2植物からの４個の果実（８−13gr.）からの平均である。TSS値は、個々の遺伝子型の最少５個の果実の平均である。
【００３３】
表８は、リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1（ADPグルコースピロホスホリラーゼ、大きなサブユニット１）のヌクレオチド配列である。
表９は、クコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1（ADPグルコースピロホスホリラーゼ、大きなサブユニット１）の誘導されたアミノ酸配列である。
【００３４】
好ましい態様の特定の記載：
次のものは、本発明を実施する１つの例である。リコペルシコン・エスクレンタム育種系1630（種間雑種の生成を単純化するために使用されるVolcani Institute 雄性不稔育種系）の植物が、野生種リコペルシコン・ヒルスタム（LA1777）の花粉により受粉された。雑種F1植物が増殖せしめられ、そして自家受粉を可能にされ、F2種が生成された。F2種子が種蒔きされ、そして約350の植物がスクリーンハウスにおいて生成せしめられ、そして自家受粉を可能にされた。
【００３５】
果実を生成する個々の植物からの熟した果実が、可溶性固体について分析された（屈性率測定による）。種間F２植物のうちわずか25個が自由に、果実を生成した。成熟果実における高い可溶性糖レベル（スクロース、グルコース及びフルクトースから構成される、新鮮な果実重量g当たりの可溶性糖71mg）により特徴づけられる１つの植物（F2−82）からの花粉が、戻し交雑−F1（BC−F1）集団の生成のための標準の産業型トマト（育種系A710）を受粉するために使用された。
【００３６】
100のBC−F1植物が畑で増殖され、そして個々の植物の成熟果実が可溶性固体及び上記のような可溶性糖について、屈折率測定法により分析された。系統単一種子集団選択プログラムが行われ、最高の合成可溶性固体及び可溶性糖レベルを有する植物が選択された。個々の世代は、少なくとも100個の植物から構成された。この選択技法は、標準の産業型栽培品種よりも高い固体レベルを有する育種系を導くBC−F7世代まで、６世代の間、実施された。
【００３７】
図１は、３種のBCF育種系が選択されたBCF６系を表す一連の柱状グラフを示す。BCF6 95−929は、4.8の平均TSS値を有し（11の植物、植物当たり５個の果実）、BCF6 95−931は、5.7の平均TSS値を有し（８の植物、植物当たり５個の果実）、そしてBCF6 95−935は6.1の平均TSS値を有し（15の植物、植物当たり５個の果実）、対照的に、標準栽培品種M−82は、3.5の平均TSS値を有した（10の植物、植物当たり５個の果実）。BCF系900を導いた個々の植物選択95−929−6は、9.1kgの果実の植物収量と共に、5.5のTSSを有した。BCF系901を導いたここの植物選択95−２は、7.2kgの果実の植物収穫と共に、6.5のTSSを有した。BCF7系904を導いた細胞個々の95−935−５は、4.7kgの果実の植物収穫と共に、6.6のTSSを有した。M-82の平均植物収穫は、６本の植物の平均に基づいて、6.1 kg であった。
【００３８】
BC−F7世代においては、未成熟果実（開花後、約15日）が、Schaffer and Petreikov (1997a) に記載のようにして、澱粉レベルについて測定された。900、901及び904系は、標準の産業型トマト栽培品種M−82の澱粉レベルによりも有意に高い未成熟澱粉レベルにより特徴づけられた（表１）。Schaffer and Petreikov (1997a) に記載のように、スクロース：澱粉代謝に関与する酵素活性の競争測定が、２種の育種系及び標準M−82の未成熟果実に対して行われた。
【００３９】
典型的な結果が表３に示され、そして育種系900が酵素ADPGPPアーゼ及びフルクトキナーゼの有意に高いレベルの活性により特徴づけられ、そして901及び904系が酵素ADPGPPアーゼのみの有意に高い活性により特徴づけられることを示す。904系は、本発明者が研究した系統間で、酵素ADPGPPアーゼの最高レベル活性により特徴づけられ、そしてトマト果実の澱粉蓄積及びTSSレベルにおけるADPGPPアーゼの役割のさらなる研究のために使用された。
【００４０】
高澱粉系904がさらに、11の独立したトマト育種系によりハイブリダイズされた。同時に、標準産業型トマト栽培品種M−82が、同時に、それらの11の系統の個々によりハイブリダイズされた。使用される11の系統は、リコペルシコン・ペネリイ（Lycopersicon pennellii）遺伝子移入体系（ILS）からであった。それらの遺伝子移入体系は、栽培されたリコペルシコン・エスクレンタムcv M−82のバックグラウンドにおける野生の緑色果実を生むリコペルシコン・ペネリイの小さな染色体セグメントをそれぞれ含む一組の単純種系である（Eshedなど., 1992, Theor. Appl. Genet., 83: 1027-1034）。
【００４１】
それらの系統は，リコペルシコン・ペネリイとリコペルシコン・エスクレンタムcv M−82との間での初期種間交雑から開発された。得られるF1個体が、リコペルシコン・エスクレンタムcv M−82に戻し交雑され、そして数世代の間、自家受粉された。この工程の間、リコペルシコン・ペネリイの染色体セグメントが、完全なトマトゲノムを含む制限フラグメントの長さの多型現像プローブを用いるために選択された。
【００４２】
従って、遺伝子移入体系は、野生−種ゲノムのセグメントのための一組のほぼ同遺伝子系を提供し、そして特定の野生−種染色セグメントと得られる形質との関係を可能にする（Eshed Y. and Zamiy D. 1994. Theor. Appl. Genet., 88: 891-897）。11のそのような遺伝子移入体系がこの研究のために使用された。広範囲の遺伝子を有する高澱粉904系の交雑、及び同じ同一の遺伝子型を有する同等のM−82の交雑は、904の遺伝子効果が識別され得る広範囲の遺伝子バックグラウンドを供給するであろう。
【００４３】
904系との11のハイブリッドの平均からの、未成熟果実の澱粉レベル及び成熟果実の可能性固体レベルは、M−82との同等のハイブリッドからの、未成熟果実の澱粉レベル及び成熟果実からの可溶性固体レベルにより有意に高かった。（表２）。904との高い澱粉ハイブリッド及びM−82との低い澱粉ハイブリッドを示す，それらの多くの未成熟果実が、未成熟トマト果実におけるスクロース：澱粉代謝に関与する酵素の詳細な酵素分析にゆだねられた（上記の様にして）。表３は、アッセイされる10種の酵素のうち、ADPGPPアーゼで活性のみが、M−82系とのハイブリッドに比較し、高澱粉系（904）とのハイブリッドにおいて有意に高かったことを示す。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
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【００４７】
未熟果実における高いADPGPPアーゼ活性について遺伝子形質をさらに研究するために、４種のADPGPPアーゼサブユニットのための遺伝子に対する特異的DNAプライマー（Chen and Janes, 1997; 及びCheung, 1988）を用いて、リコペルシコン・ヒルスタム由来遺伝子とリコペルシコン・エスクレンタム由来の遺伝子との間を、次の段階に記載のようにして区別することができる。
【００４８】
ADPGPPアーゼサブユニットのPCR分析：
ADPGPPアーゼサブユニットの増幅反応（25μlの最終体積）は、10ngの鋳型DNA、25mMのTAPS（25℃でpH＝9.3）、50mMのKCl、2.5mMのMgCl2、１mMのメルカプトエタノール、0.2mMのそれぞれ４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP, dGTP及びdTTP）、10ngのそれぞれ２種のプライマー（前方向及び逆方向プライマー；表４の参照のこと）、及び１単位の熱安定性Tgq DNAポリメラーゼ（SuperNova Taqポリメラーゼ、Madi Ltd., Rishon Le Zion, Israel）を含んだ。
【００４９】
反応を、自動サーモサイクラー（MJ Research Inc., Watertown, Massachusetts, USA）において行った。94℃で１分の初期インキュベーション、続いて94℃で１分の変性、55℃で１分のアニーリング及び72℃で１分45秒の重合（34サイクル）を行った。72℃での最終重合を、サイクルの完結後、７分間行った。10μlの増幅生成物を、リコペルシコン・ヒルスタム特異的対立遺伝子（表４）を生成することが見出された反応エンドヌクレアーゼ15単位により消化した。消化は、製造業者の推薦に従って行われた（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA）。消化生成物を、1.2％アガロースゲル上での電気泳動により可視化し、臭化エチジウムにより染色により検出した。
【００５０】
904系は、大きなサブユニット１（LS1）のためのリコペルシコン・ヒルスタム遺伝子を担持することが示され、そして904系におけるADPGPPアーゼのほかのサブユニットは、リコペルシコン、エスクレンタムに由来することが示された。
【００５１】
リコペルシコン・ヒルスタム由来のLS1が未成熟果実における高められたADPGPPアーゼ活性及び高められた澱粉レベルと相互関係していることを示すために、高澱粉904系と標準のM−82系との間での交雑からの64の植物のF2集団を成長せしめた。植物を、最初の真葉段階で遺伝子型的に分類し、それらがリコペルシコン・ヒルスタムADPGPPアーゼLS1対立遺伝子（HH）に対してホモ接合性であるか、リコペルシコン・エスクレンタム対立遺伝子（EE）に対してホモ接合であるか、又は両対立遺伝子を含む（HE）に対してヘテロ接合性であるかを決定した。
【００５２】
64のF2植物を、単一の遺伝子座が予測される場合、16：31：17の比でLS1について分離した。決定されたF2遺伝子型の最少４の個々からの未熟果実を、澱粉レベル及びADPGPPアーゼ活性についてアッセイした。結果は表５に示され、そして記載される特異的PCRプライマーにより特徴づけられるように、ADPGPPアーゼLS1のためのリコペルシコン・ヒルスタム対立遺伝子が、未成熟果実における高められたADPGPPアーゼ活性に関連していることを明白に示す。さらに、成熟果実のTSS値は同様に、LS1遺伝子の遺伝子型により影響された。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼの大きなサブユニット（LS1）をコードする遺伝子の配列決定：
完全なRNAを、ADPGPPアーゼの大きなサブユニット（LS1）に対してホモ接合性の個々の植物の若い果実（重量３g）から抽出した。RNA抽出は、TRIzol試験システム（GibcoBRL life technologies, Gaithersburg, MD, USA）を用いて行われた。その完全なRNAを、Superscript前増幅システム（GibcoBRL life technologies, Gaithersburg, MD, USA）を用いて、第１鎖cDNA合成のための鋳型として使用した。
【００５６】
その調節されたcDNAを、ADPGPPアーゼの大きなサブユニット（LS）をコードする遺伝子を増幅するために、PCR反応における鋳型として使用した。ADPGPPアーゼの大きなサブユニット（LS）を含むDNAフラグメントを、アガロースゲルから切り出し、そしてGENECLEAN II キット（BIO 101 inc., La Jolla CA, USA）を用いて精製した。次に、PCRバンドを、pGEM-T及び  pGEM−T Easy Vector Systemsを用いて、製造業者の推薦（Promega Corporation, Madison, WI, USA）に従って、pGEM−T Easyベクター中にクローン化した。そのDNAクローンを、自動配列決定機（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて配列決定した。
【００５７】
表８は、リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1（ADPグルコース  ピロホスホリラーゼ、大きなサブユニット１）のヌクレオチド配列である。表７は、リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1（ADPグルコース  ピロホスホリラーゼ、大きなサブユニット１）の誘導されたアミノ酸配列である。
表８：リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1（ADPグルコース  ピロホスホリラーゼ、大きなサブユニット１）：
【００５８】
【表８】
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【００５９】
表９：リコペルシコン・ヒルスタムからのADPGPPアーゼLS1についての誘導されたアミノ酸配列：
【００６０】
【表９】
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【００６１】
前記例においては、ADPGPPアーゼの大きなサブユニット１は、澱粉レベルを高めることが示された。特別には試験されていないが、本発明はまた、酵素の他の３種のサブユニットのいずれかのためのリコペルシコン・ヒルスタム遺伝子を、それらがまた澱粉を高めることができるので、それらの遺伝子の個々のために開発された特定のPCRマーカーを用いて、移行することによっても実施され得ることを想定することは道理に合っている。
【００６２】
さらに、リコペルシコン・ヒルスタム以外の他の野生トマト種からのADPGPPアーゼ遺伝子の移行はまた、リコペルシコン・エスクレンタムとの交雑により澱粉を高めることができる。さらに、野生種からの澱粉合成の他の酵素、例えばリコペルシコン・エスクレンタムからの遺伝子配列が知られているフルクトキナーゼ及びスクロースシンターゼについての遺伝子の移行がまた、澱粉レベルを高めることができる。
【００６３】
当業者は、記載された遺伝子が澱粉含有率を高めるために植物を遺伝子的に形質転換するために使用され得ることを認識するであろう。高められた澱粉含有率を有するように遺伝子的に形質転換され得る植物は、広範囲の農業的に重要な収穫物、例えば、ジャガイモ、トマト、トウモロコシ、小麦、綿、バナナ、大豆、エンドウ及び米を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６４】
形質転換の方法、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の使用、及び組織特異的プロモーターの使用を包含する構成物の開発方法を包含する植物形質転換技法は、十分に確立されており、そして最近、Christou, P. (“Transformation technology”, Trends in Plant Science, 1: 423-431) により再考されている。
【００６５】
構成プロモーター（CaMV）35S及びトウモロユビキチンプロモーターを包含する多くのプロモーターが現在入手できる。さらに、例えば、種子、塊茎、未熟果実、成熟果実、花粉、根及び他の器官における発現のための器官/組織特異的プロモーターが存在する。
上記例は、本発明の実施を良好に解明するために提供されており、そして本発明の範囲を制限すべきではない。当業者は、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、標準の栽培品種M−82に比較して、３種のBCF６系（95−929，95−931及び95−935）の個々の植物からのTSS（合計の可溶性固体）の柱状グラブである。個々の植物からのデータは、５つの個々の果実からの平均のTSS値である。95−929，95−931及び95−935からの単一の植物選択が、それぞれ、BCF７の高澱粉育種系900，901及び904を導いた。
【図１】
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