(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
本名称で知られるＯＫＴ３抗体のカバット  ナンバリング  システムに従う位置Ｈ１００Ａにおけるシステインの他の極性アミノ酸への置換を特徴とする、モノクロナール抗体ＯＫＴ３に由来する抗体。
【請求項２】
極性アミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項３】
以下：
0004276302.tif 000002
に示す配列を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
ｓｃＦｖ抗体であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の抗体。
【請求項５】
ａ）  新たにサブクローニングしたＯＫＴ３のハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを得てｃＤＮＡに転写する工程、
ｂ）  好適なプライマーを用いてＰＣＲにより軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを増幅する工程、
ｃ）  部位特異的突然変異誘発に適合したベクターへのｂ）で得たＤＮＡのクローニング、ならびに好適なプライマーを用いて所望の突然変異を導入する工程、
ｄ）  ｃ）で得た突然変異ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、好適な発現系にて発現させる工程、
を特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の抗体の製造方法。
【請求項６】
プライマーＳＫ１  ５’−ＧＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣを工程ｃ）で用いる請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ｄ）で用いる発現ベクターがｐＨＯＧ２１である請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
発現を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で行う請求項５〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
臓器移植のレシピエントによる移植拒絶を低減又は排除するための医薬の製造における請求項１〜４いずれか記載の抗体の使用。
【請求項１０】
腫瘍の診断又は腫瘍の治療のための医薬の製造における請求項１〜４いずれか記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、位置Ｈ１００Ａで点突然変異させたＯＫＴ３抗体、その製造方法及びその使用に関する。
ＯＫＴ３は、マウス由来のモノクロナールＩｇＧ  ２ａ−型抗体であり、これは、ヒトＣＤ３複合体のε−サブユニットのエピトープを認識する（クン（Ｋｕｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０６、３４７〜３４９頁（１９７９）；バン・ウォーベ（Ｖａｎ  Ｗａｕｗｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４、２７０８〜２７１３頁（１９８０）；トランシー（Ｔｒａｎｓｙ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９、９４７〜９５０頁（１９８９））。対応するハイブリドーマからモノクロナール抗体を得る方法は、これらの刊行物に詳細に記載されている。さらに、ＯＫＴ３産生ハイブリドーマ細胞株は、欧州特許第００１８７９５号の所有者より、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、メリーランド、２０８５２、ロックビル、パークローン  ドライブ  １２３０１）に、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ８００１で、１９７９年４月２６日に寄託された。ＯＫＴ３は、長い間、Ｔ細胞応答の抑制に使用されており、これにより、移植の拒絶反応が回避される（ジスレットウェイト（Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３８、６９５〜７０１頁（１９８４）；ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５１、１２０７〜１２１２頁（１９９１））。一方、ＯＫＴ３も、Ｔ細胞の活性化及び増殖の引き金となり得、それはエフェクター細胞を刺激し、それは癌養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）に使用し得る（ヤネリー（Ｙａｎｎｅｌｌｙ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１、９１〜１００頁（１９９０））。ＯＫＴ３は、腫瘍細胞又はウィルス感染細胞に対し細胞障害性Ｔ細胞を指向けるため、そのままで、また、二重特異性抗体の成分として使用された（ニッタ（Ｎｉｔｔａ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３５、３６８〜３７６頁（１９９０）；サンナ（Ｓａｎｎａ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３、１２２１〜１２２４頁（１９９５））。さらに、ＣＯＳ細胞で発現させた、ＯＫＴ３−モノクロナール抗体をヒト化したものも知られている（ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８、２７５６〜２７６３頁（１９９２）；アデア（Ａｄｄａｉｒ）ら、Ｈｕｍａｎ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、４１〜４７頁（１９９４））。これまで、ＯＫＴ３は、十分な安定性がなく、特に、公知の組換え発現系において安定な形で十分な量を発現させることができないという問題がある。
したがって、本発明の目的は、ＯＫＴ３を組換え的に発現させ、満足のいく安定性を有する抗体を得ることであった。
この目的は、請求の範囲に規定される主題により達成される。
本発明者らは、ＯＫＴ３のアミノ酸配列の位置Ｈ１００Ａにおいて点突然変異を導入することにより、安定性が何倍も増大することを見出した。この点突然変異は、ＯＫＴ３のアミノ酸配列において、システインを他の極性アミノ酸、好ましくはセリンに置換することに関連する。
本発明の抗体の製造のために、新たにサブクローニングしたＯＫＴ３のハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡを、ベースとして使用した。ｃＤＮＡは、当業者に知られた方法により作製され、それは、例えば、デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５、８９〜９５頁（１９９４）に記載された。軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、好適なプライマーを用いて、例えば、κ−鎖の定常ドメインのアミノ−末端部及びκ−鎖の可変ドメインのフレームワーク１（ＦＲ１）領域にハイブリダイズする、プライマーＢｉ５及びＢｉ８によるＰＣＲによって作製することができる（デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、上記参照のこと）。重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡの増幅には、例えば、γ−鎖の定常ドメイン１のアミノ−末端部にハイブリダイズするプライマーＢｉ４（デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、上記参照のこと）及び重鎖のＦＲ１領域にハイブリダイズするプライマーＢｉ３ｆ（ゴッター（Ｇｏｔｔｅｒ）ら、Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １、１０７〜１１４頁（１９９５））を使用することができる。
その後、当業者によく知られているようにして、増幅ＤＮＡを、配列決定及び部位特異的突然変異誘発に適合したベクターに挿入する。例えば、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社により販売されているベクターｐＣＲ−Ｓｋｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）を使用することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発により、ＯＫＴ３由来のＶHドメインに挿入される。当業者は、この目的に必要な条件に精通しており、それらは、例えば、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７〜３８２頁（１９８７）にも記載されている。ＯＫＴ３の位置Ｈ１００Ａにおけるアミノ酸の置換（システインの置換）は、この位置でセリンへの置換を行う場合、プライマーＳＫ１  ５’−ＧＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣを用いて好適に行われる。
次いで、このように修飾されたＤＮＡを、ベクター及び発現ベクターのそれぞれに、クローニングすることができる。当業者は、その例に精通している。発現ベクターの場合、これらは、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体又はｐＥＴ３ｂである。酵母での発現には、例えば、ｐＹ１００及びＹｃｐａｄ１をあげるべきであるが、動物細胞での発現には、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８及びｐＣＥＶ４があげられる。バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−１は、昆虫細胞での発現に特に好適である。本発明によれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現が好ましく、その目的には、好ましくは、図１に示すベクターｐＨＯＧ２１（キプリヤノフ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６、５１〜６２頁（１９９６）が使用され、それには、突然変異させたＯＫＴ３単鎖（ＳｃＦｖ）遺伝子が、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片として挿入される。位置１００Ａ（カバット  ナンバリング  システム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ））で突然変異させた単鎖抗体ＯＫＴ３は、発現され、図２に示す配列を有する。
当業者は、発現ベクターに存在するＤＮＡの発現に適合する細胞に精通している。かかる細胞例には、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＩ２１及びＳＧ１３００９、酵母菌株サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び動物細胞３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ及びＨｅＬａ、ならびに昆虫細胞ｓｆ９が含まれる。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社により販売されているＸＬ１−Ｂｌｕｅ  大腸菌細胞の使用が好ましい。
ＤＮＡを発現ベクターに挿入する方法は、当業者には既知である。また、当業者は、このＤＮＡを、他のタンパク質及びペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡと組み合わせて挿入することができ、それにより、このＤＮＡを融合タンパク質の形で、例えば、Ｈｉｓ融合タンパク質の形で発現させることができるという事実に精通している。この目的のために必要な情報は、好ましく使用されるプラスミドｐＨＯＧ２１に含まれる。さらに、ＯＫＴ３の突然変異型は、二重特異性抗体の形で、例えば、ヒトＣＤ１９複合体に対する抗体との組み合わせで存在し得る。かかる二重特異性抗体の配列を図３に示す。
本発明による抗体は、組換え法により十分な量で製造され、突然変異されていないモノクロナール抗体ＯＫＴ３と比較してより大きな安定性を有するという点で特徴的である。この安定性は、例えば、突然変異された抗体は、ＰＢＳ中４℃で１ヶ月保存した後でさえ、初期の結合親和性をほとんど失わないが、ＯＫＴ３は、このような条件下において結合親和性が顕著に低下する（４６％）という点において表れる。さらに、本発明による抗体は、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）として、より迅速に血液から排除され、かつ、より良好な腫瘍貫通を行うという利点を有する。さらに、ＳｃＦｖは、医薬（ｐｈａｒｍａｃｏｎｓ）、毒素又は放射性核種の腫瘍部位への輸送に非常に有用な分子であり、それは、腫瘍の診断及び腫瘍の治療のために重要である。
本発明を図により、さらに説明する。
図１：プラスミドｐＨＯＧ２１
本明細書で使用される略語は以下の意味を有する；
ＡｐR：アンピシリン耐性遺伝子
ｃ−ｍｙｃ：モノクロナール抗体９Ｅ１０（ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ、英国、ケンブリッジ）により認識されるエピトープをコードする配列
ＣｏｌＥｌ：ＤＮＡ複製起点
ｆ１  ＩＧ：ｆ１ファージの遺伝子間領域
Ｈｉｓ6：６個のヒスチジン残基をコードする配列
リンカー：ＶH及びＶLドメインに連結する１７個のアミノ酸をコードする配列
ｐｅｌＢ：細菌性ペクチン酸リアーゼをコードするシグナルペプチド配列
Ｐ／Ｏ：野生型ｌａｃプロモーター／オペレーター
図２：突然変異させたＯＫＴ３単鎖抗体のヌクレオチド配列及び誘導アミノ酸配列
図３：突然変異させたＯＫＴ３及び抗−ＣＤ１９からなる二重特異性抗体
本発明を、実施例により、より詳細に説明する。
実施例  １：  本発明による抗体の製造
「デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５  ８９〜９５頁（１９９４）」に記載されているようにして、新たにサブクローニングしたＯＫＴ３のハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡの合成を行った。軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、κ−鎖の定常ドメインのアミノ−末端部及びκ−鎖の可変ドメインのフレームワーク１（ＦＲ１）領域にハイブリダイズするプライマーＢｉ５及びＢｉ８を用いてＰＣＲにより作製した。（デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、上記参照）。γ−鎖の定常ドメイン１のアミノ−末端部にハイブリダイズするプライマーＢｉ４（デューベル（Ｄｕｅｂｅｌ）ら、上記参照）、及び重鎖のＦＲ１領域にハイブリダイズするプライマーＢｉ３ｆ（ゴッター（Ｇｏｔｔｅｒ）ら、Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １、１０７〜１１４頁（１９９５））を、重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡの増幅に使用した。５０μｌの反応混合物は、１０ｐｍｏｌの各プライマー及び５０ｎｇのハイブリドーマｃＤＮＡ、１００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ベント（ｖｅｎｔ）緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５μｇのＢＳＡ及び１Ｕ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含むものとした。ＰＣＲサーモサイクラーにおいて、１サイクル９５℃で１分、５５℃で１分、７５℃で２分を、３０サイクル行った。増幅ＤＮＡを、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ））で、精製した。
その後、増幅ＤＮＡを、ＳｒｆＩ制限酵素で開裂させたストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社により販売されているベクターｐＣＲ−Ｓｋｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）に「平滑末端」でライゲートした。突然変異を、部位特異的突然変異誘発により、ＯＫＴ３由来のＶHドメインに挿入した（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７〜３８２頁（１９８７））。ＯＫＴ３の位置Ｈ１００Ａにおけるアミノ酸の置換（システインのセリンへの置換）を、プライマーＳＫ１  ５’−ＧＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣを用いることにより行った。
得られた突然変異させたＤＮＡの発現には、突然変異させたＯＫＴ３単鎖（ｓｃＦｖ）遺伝子がＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片として挿入されている、図１に示すベクターｐＨＯＧ２１（キプリヤノフ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６、５１〜６２頁（１９９６））を使用した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を、この発現ベクターで形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１００ｍＭのグルコース（２×ＹＴGA）を含む２×ＹＴ培地にて、３７℃で、一晩培養した。２×ＹＴGAにおける一夜培養物の希釈物（１：５０）を、３７℃で振とうしながら、３７℃で培養した。培養物がＯＤ600＝０．８に達したらすぐに、２０℃で１０分間、１，５００ｇで遠心分離することにより、細菌をペレット化し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．４Ｍのスクロースを含む同容量の新しい２×ＹＴ培地に再懸濁した。ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭとなるまで加え、室温で２０時間、培養を継続した。４℃で１０分間、５，０００ｇで遠心分離することにより、細胞を回収した。培養物の上清み液を氷上に保存した。可溶性ペリプラズムタンパク質を単離するため、ペレット化した細菌を、氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（初期容量の５％）に取り込んだ。ときどき攪拌しながら氷上で１時間インキュベーションした後、スフェロプラストを、４℃で３０分間、３０，０００ｇで遠心分離し、可溶性スフェロプラスト抽出物を上清みとして、スフェロプラスト及び不溶性ペリプラズム物質をペレットとして得た。氷上に保存した上述の培養物の上清み、及び可溶性ペリプラズム抽出物を合わせ、さらに遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、４０分間）することにより、清澄にした。孔サイズ１０〜１６μｍのグラスフィルターで、さらに孔サイズ０．２μｍのグラスフィルターで濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜（アミコン社、ウィッテン（Ａｍｉｃｏｎ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｔｔｅｎ）により、１０倍に濃縮した。濃縮した上清みを遠心分離により清澄にし、４℃で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対し透析した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、キレート化セファロースの５ｍｌ容カラム（ファルマシア社）を用い、４℃でＮｉ3+をチャージし、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（初発緩衝液）で平衡化した。カラムに吸着された物質を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０で溶出した。緩衝液を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０に変え、タンパク質を、ｍｏｎｏ  Ｓイオン交換カラム（ファルマシア社）でさらに精製した。本発明による精製ｓｃＦｖ抗体を、ＰＢＳ（１５ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に透析した。比較的長期間の保存のため、抗体をＢＳＡ（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下で凍結し、−８０℃で保存した。
【図１】
0004276302.tif 000003
【図２】
0004276302.tif 000004
【図３】
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