(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞中で発現される標的プレ−ｍＲＮＡをトランス−スプライスさせるために適し、かつ該標的細胞中で核スプライス成分により認識され得る核酸分子であって、
ａ）該核酸分子の該標的プレ−ｍＲＮＡへの結合を仲介する、１つ以上の標的結合ドメイン；
ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス部位を含む３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｄ）前記３’スプライス部位の片側又は両側と結合する１つ以上の相補的配列を含む安全配列；及び
ｅ）該標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列
を含む、上記核酸分子。
【請求項２】
標的細胞中で発現される標的プレ−ｍＲＮＡをトランス−スプライスさせるために適し、かつ該標的細胞中で核スプライス成分により認識され得る核酸分子であって、
ａ）該核酸分子の該標的プレ−ｍＲＮＡへの結合を仲介する、１つ以上の標的結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｄ）前記５’スプライス部位の片側又は両側と結合する１つ以上の相補的配列を含む安全配列；及び
ｅ）該標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列
を含む、上記核酸分子。
【請求項３】
標的細胞中で発現される標的プレ−ｍＲＮＡをトランス−スプライスさせるために適し、かつ該標的細胞中で核スプライス成分により認識され得る核酸分子であって、
ａ）該核酸分子の該標的プレ−ｍＲＮＡへの結合を仲介する、１つ以上の標的結合ドメイン；
ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス部位を含む３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｄ）５’スプライス部位；
ｅ）該５’スプライス部位を前記標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｆ）前記３’スプライス部位の片側又は両側と結合する１つ以上の相補的配列を含む安全配列；及び
ｇ）該標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列
を含む、上記核酸分子。
【請求項４】
標的細胞中で発現される標的プレ−ｍＲＮＡをトランス−スプライスさせるために適し、かつ該標的細胞中で核スプライス成分により認識され得る核酸分子であって、
ａ）該核酸分子の該標的プレ−ｍＲＮＡへの結合を仲介する、１つ以上の標的結合ドメイン；
ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス部位を含む３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｄ）５’スプライス部位；
ｅ）該５’スプライス部位を前記標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
ｆ）前記５’スプライス部位の片側又は両側と結合する１つ以上の相補的配列を含む安全配列；及び
ｇ）該標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列
を含む、上記核酸分子。
【請求項５】
治療効果を有するタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記治療効果が、トランス−スプライシングの後の標的細胞の選択的殺傷である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記コードされたタンパク質が、前記標的細胞を殺傷するための毒素である、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記毒素が、ジフテリア毒素のＡサブユニットである、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記スペーサー領域が、翻訳停止コドンを含むヌクレオチド配列を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ＤＮＡの形態である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記標的プレ−ｍＲＮＡが、ヒトのものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
細胞の核スプライス成分により認識されて治療的に有用なキメラＲＮＡを生成するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、治療効果を有するタンパク質をコードする、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、標的細胞を選択的に殺傷する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
細胞の核スプライス成分により認識されてマーカーとして機能するキメラＲＮＡを生成するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、前記標的細胞で発現される活性のある治療用分子を提供する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１、３及び４のいずれか一項、又は請求項１、３又は４に係る場合の請求項５〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子を発現する、ＤＮＡベクター又はウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項２又は４に記載の、又は請求項２又は４に係る場合の請求項５〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子を発現する、ＤＮＡベクター又はウイルスベクター。
【請求項１９】
細胞の核スプライス成分により認識されて治療的に有用なキメラＲＮＡを生成する核酸分子を発現させるための、請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、治療効果を有するタンパク質をコードする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、標的細胞を選択的に殺傷する、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
細胞の核スプライス成分により認識されてマーカーとして機能するキメラＲＮＡを生成する核酸分子を発現させるための、請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２３】
前記治療的に有用なキメラＲＮＡが、前記標的細胞で発現される活性のある治療用分子を提供する、請求項１９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明の分子および方法は、細胞の選択されたサブセットにおける異種遺伝子を発現する手段を提供する。本発明の前駆体−治療用分子（ＰＴＭ）は、前駆体治療用分子とプレ−ｍＲＮＡ分子（これは、特定の標的細胞でユニークに発現される）との間の標的であるかまたは規定されたトランス−スプライス反応の基質である。ＰＴＭは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のような他の分子であってよい。インビボのトランス−スプライス反応は、標的細胞で発現される活性のある治療用分子を提供する。ｍＲＮＡの発現生成物は、細胞に対して治療用価値を有するタンパク質、または特定の細胞を死滅させる毒素でもよい。あるいは、治療用ＲＮＡ（ｔｈ−ＲＮＡ）または他の分子は、それ自身が治療的機能を果たしてもよい。本発明の別の実施態様において、治療効果を達成するために、複数のＰＴＭが組合せて使用される。
関連技術の説明
癌やＡＩＤＳのような多くの生命に関わる疾患の治療における最も大きな問題の１つは、生命体の他の細胞に治療用分子を投与することなく、この分子を特異的な標的細胞に投与することである。この問題を解決するための従来の試みには、ウイルスベクターを用いる遺伝子治療、薬物送達、またはモノクローナル抗体に結合した毒素などがある。今日までこれらの方法は、必ずしも成功していない。
本発明の方法は、標的細胞のみへの送達を必要としない。治療用分子の前駆体分子は、生命体のすべての細胞に送達され、生命体のすべての細胞に摂取されるが、治療用ｍＲＮＡは、インビボで特異的な標的細胞でのみ作成される。この治療法の特異性は、標的細胞中の標的プレ−ｍＲＮＡのユニークな（限定された）転写に依存する。正常細胞（標的ではない）は、標的遺伝子を転写しない（または、ほんのわずかに転写する）。従って、そのような正常細胞では治療用分子の選択的な生成は起きない（または、ほんのわずかに起きる）。
遺伝子含量が実質的に同一であるにもかかわらず、同じ生物の真核細胞が互いに異なる１つの重要な方法は、これらが異なる遺伝子または遺伝子の異なる部分を発現するためである。遺伝子発現の制御は、多くのレベルで起き、遺伝子発現に関する古典的な研究は、転写および翻訳のレベルで制御されることを証明している。さらに最近の研究は、細胞は、遺伝子コピー数およびスプライスの制御により、遺伝子発現を制御する能力を有することを、示している。
染色体内でＤＮＡ配列として保存されている遺伝子は、コード領域（エキソン）とまた一般的に介在する非コード領域（イントロン）とを含有するプレ−ｍＲＮＡ中に転写される。プレ−ｍＲＮＡは核内でプロセシングされ、イントロンが不要なエキソンとともに除去される。残りのエキソンは一緒にスプライスされ、ｍＲＮＡを生成し、これが核から細胞質に出て、リボゾームによりタンパク質に翻訳される。例えば、エム・ジェイ・ムーア（Moore, M.J.）、シー・シー・クエリー（C.C. Query）、およびピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）、Ｃｅｌｌ、７７：８０５−８１５（１９９４）；エム・ジェイ・ムーア（Moore, M.J.）、シー・シー・クエリー（C.C. Query）、およびピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）、Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、３０３−３５８（１９９３）を参照されたい。
イントロンは、スプライスと呼ばれる正確なプロセスによりプレ−ｍＲＮＡから除去される。エル・ティー・チョウ（Chow, L.T.）、アール・イー・ゲリナス（R.E. Gelinas）、ティー・アール・ブローカー（T.R. Broker）、アール・ジェイ・ロバーツ（R.J. Roberts）、（１９７７）  Ｃｅｌｌ，１２：１−８；およびエス・エム・ベルゲット（Berget, S.M.）、シー・ムーア（C. Moore）およびピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）、（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：３１７１−３１７５。プレ−ｍＲＮＡスプライスは、２工程の機構で進行する。第１の工程では、５’スプライス部位が切断され、「遊離」の５’エキソンとラリアット中間体が放出される（エム・ジェイ・ムーア（Moore, M.J.）とピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）、Ｎａｔｕｒｅ，３６５：３６４−３６８，１９９３）。イントロンの５’ヌクレオチド（通常グアニン）は、イントロン中の分岐点ヌクレオチド（通常アデノシン）と２’，５’−ホスホジエステル結合を介して、ラリアット中間体を形成する。第２の工程では、５’エキソンは、ラリアット生成物としてイントロンを放出しながら３’エキソンに結合する。これらの工程は、小さな核リボヌクレオタンパク質とスプライソソーム（spliceosome）と呼ばれるタンパク質との複合体中で触媒される（ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ）。
エステル交換スプライス反応部位は、５’および３’スプライス部位の周りの共通配列（consensus sequences）により規定される。５’スプライス部位共通配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵである（ここで、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン、Ｙ＝ピリミジン、および／＝スプライス部位である）。ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ。下線を引いたヌクレオチド配列は、ほとんどすべてのプレ−ｍＲＮＡイントロンに対して共通であり、まれに例外的にＧＵの代わりにＧＣが存在することがある。３’スプライス部位は、３つの異なる配列成分からなる：分岐点または分岐部位、ポリピリミジン領域、および３’共通配列。これらの成分は、３’スプライス部位領域をゆるく規定し、これは３’スプライス部位の上流の１００ヌクレオチドのイントロンを含むこともある。哺乳動物の分岐点共通配列は、ＹＮＣＵＧＡＣである。下線を引いたＡは、分岐形成の部位である（ＢＰＡ＝分岐点アデノシン）。３’スプライス共通配列は、ＹＡＧ／Ｇである。分岐点とスプライス部位の間に、通常ポリピリミジン領域があり、これは、効率的な分岐点利用と３’スプライス部位認識のために哺乳動物系において重要である（アール・ロスシグノ（Roscigno, R.）、エム・ウェイナー（M. Weiner）およびエム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A. Garcia-Blanco）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１４：１１２２２−１１２２９，１９９３）。分岐点とポリピリミジン領域の下流の最初のＹＡＧジヌクレオチドは、最も一般的に使用される３’スプライス部位である。シー・ダブリュー・ジェイ・スミス（Smith, C.W.J.）、イー・ビー・ポッロ（E.B. Porro）、ジェイ・ジー・パットン（J.G. Patton）およびビー・ナダール−ギナンド（B. Nadal-Ginand）（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：２４３−２４７。
シス対トランス−スプライス
通常エキソンは、同じプレ−ｍＲＮＡ中の他のエキソンに結合し（シス−スプライス）、他のプレ−ｍＲＮＡ中のエキソンには結合（トランス−スプライス）しない。しかし、相補的配列を使用して、プレ−ｍＲＮＡの半分ずつをつなぐことによりインビトロで効率的なトランス−スプライスを観察することが可能である。これらは、「ワトソン−クリック」様の塩基対合により安定な２本鎖の幹を形成する。エム・エム・コナルスカ（Konarsk, M.M.）、アール・エー・パジェット（R.A. Padgett）、およびピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）（１９８５）、Ｃｅｌｌ  ４２：１６５−１７１。このタイプのトランス−スプライスは、インビボでは明確には観察されていない。
「スペース」を介するスプライス部位の接近の機構は、例えば、トリパノソーマや線虫中に一般的に観察されるトランス−スプライスの、スプライス部位間のイントロンには存在しない。アール・イー・スットン（Sutton, R.E.）とジェイ・シー・ブースロイド（J.C. Boothroyd）、Ｃｅｌｌ  ４７：５２７−５３５（１９８６）；ダブリュー・ジェイ・マーフィー（W.J. Murphy）ら、Ｃｅｌｌ４７：５１７−５２５（１９８６）；エム・クラウセ（Krause, M.）とディー・ハーシュ（D. Hirsh)、Ｃｅｌｌ  ４９：７５３−７６１（１９８７）。これらの非常に特殊な場合に、ショートリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを含有する５’スプライス部位は、小さな核リボヌクレオタンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）を形成し、これは大きなプレ−ｍＲＮＡ中のイントロンの３’末端と相互作用する（ジェイ・ピー・ブルジック（Bruzik, J.P.）とジェイ・エー・ステイツ（J.A. Steitz）、Ｃｅｌｌ  ６２：８８９−８９９（１９９０）；ジェイ・ピー・ブルジック（Bruzik, J.P.）とティー・マニアティス（T. Maniatis）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：６９２−６９５（１９９２））。このタイプのスプライスは、哺乳動物細胞で自然に起きることは観察されていない。
コナルスカ（Konarska）ら（１９８５）、ディー・ソルニク（D. Solnik）（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４２：１５７−１６４は、ＳＬ  ＲＮＡに似ていないＲＮＡを使用して、インビトロでトランス−スプライスを検出した。前駆体をつないでいるＲＮＡ−ＲＮＡ二次構造は、トランス−スプライス反応の効率を大きく上昇させた（野生型のシス−スプライス効率の＜１％から１５〜３０％まで）。
相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡのユニークな標的配列と特異的に塩基対合することができる。結合の特異性は、結合部位の配列、相補的領域、および二次構造により影響を受ける。結合特異性を得るために、ユニークな配列が標的として選択される。結合特異性を達成するのに１７ヌクレオチドの鎖の長さが、充分であることが計算されている（すなわち、ヒトのハプロイドゲノム中でのユニークなポリヌクレオチド標的は、統計的には３×１０9塩基対に１回起きる）。エム・スミス（M. Smith）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、エス・エム・ワイズマン（S.M. weissman）編、プレーガー（Praeger）、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国、３９頁（１９８３）。２本鎖の安定性は、２００ヌクレオチド以上の相補的配列については長さに依存しない［アール・エフ・スタイナー（Steiner, R.F.）とアール・ジェイ・ビアーズ・ジュニア（Beers, R.J. Jr.）（１９８６）］。Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（エルセビア（Elsevier）、アムステルダム）。長い相補的配列は、２本鎖の安定性を上昇させるが、非常に長い領域は、わずかに５〜１０の連続的な塩基を介して複数のｍＲＮＡと相互作用し、こうしてその特異性を低下させることがある。相補的配列は、その５’末端および／または３’末端に、非結合性ＲＮＡまたはＤＮＡ配列または他の核酸類似体または化学基を有することがある。結合はまた、他の機構、例えば３本鎖らせん形成、およびタンパク質−核酸相互作用（例えば、遺伝子プロモーターとＤＮＡの間の相互作用）によっても行われる。組織特異的プロモーターの例には、ブリンスター（Brinster）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：３３２−３３６（１９８３）が記載した免疫グロブリンプロモーターや、ブッチーニ（Bucchini）ら、ＰＮＡＳ  ８３：２５１１−２５１５（１９８６）が記載したインスリンプロモーターがある。当業者に公知の結合の他の手段を使用してもよい。
ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、シュードモナス（Pseudomonas）毒素、シガ毒素、およびコレラ毒素のような毒素は、極めて強力である。１つのＤＴの分子が、細胞質内で酵素的に作用して、細胞を死滅させることができる。エム・ヤマイズミ（Yamaizumi, M.）、イー・メカダ（E. Mekada）、ティー・ウチダ（T. Uchida）およびワイ・オカダ（Y. Okada）、Ｃｅｌｌ  １５：２４５−２５０（１９７８）。これらの毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットからなる同様の基本構造を有しているようであり、ここで、Ｂサブユニットは細胞表面に結合し、細胞へのＡサブユニットの移動を促進し、Ａサブユニットは酵素的毒素活性を有する。アール・コリア（Collier, R.）とジェイ・コンデル（J. Kondel）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９６−１５０３（１９７１）；およびディー・ギル（Gill, D.）とエー・パッペンハイマー（A. Pappenheimer）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９２−１４９５（１９７１）。ＤＴのＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）は、伸長因子２中のＮＡＤから通常のアミノ酸（ジプタミド（dipthamide））へのＡＤＰ−リボゾームの移動を触媒する。ティー・ホンジョー（Honjo, T.）、ワイ・ニシズカ（Y. Nishizuka）およびオー・ハヤイシ（O. Hayaishi）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５３−３５５５（１９６８）；およびディー・ギル（Gill, D.）、エー・パッペンハイマー（A. Pappenheimer）、アール・ブラウン（R. Brown）およびジェイ・クルニック（J. Krunick）、Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２９：１−２１（１９６９）。そのような結合は、細胞のタンパク質合成を停止させ、細胞にとって致命的である。選択された細胞内にＤＴ−Ａを送達するかこの発現を試みる多くの治療上の方策があり、例えばＤＴ−Ａの遺伝子発現の転写制御がある。（ディー・エフ・ロビンソン（Robinson, D.F.）、ティー・エィチ・マクスウェル（T.H. Maxwell）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（６）２：１３７−１４５，１９９５；ディー・アール・クック（Cook D.R.）ら、
Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．９（２）：１３１−１４１、１９９４；ティー・ジェイ・クリエル（Curiel, T.J.）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（６）：７４１−７４７，１９９３）。
発明の要約
本発明は、トランス−スプライス機構を介してユニークなｔｈ−ｍＲＮＡを作成することによる、目的の標的細胞中の異種遺伝子産物の制御発現のための新規方法を提供する。このユニークｍＲＮＡは、以下の機能の１つを有する：治療効果のあるタンパク質をコードする、標的細胞を選択的に死滅させる、マーカーとして機能する、または通常は標的細胞中には存在しない新規遺伝子産物を提供する。
トランス−スプライスに使用されるＲＮＡ、ＤＮＡ、またはヌクレオチド類似体は、トランス−スプライス後のその発現産物が細胞の死を引き起こすものである（例えば、ジフテリア毒素サブユニットＡの１つの分子の発現は、ヒトの細胞を死滅させるであろう）。別の実施態様において、発現産物は、細胞により分泌される。さらなる実施態様において、治療用ＲＮＡ自身が、細胞内で目的の機能を果たす。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、本発明のプレ−治療用分子の構造を示す。
これらの構造は、５つの主要な特徴を有する：
１）標的結合領域：
選択されたプレ−ｍＲＮＡの標的領域に対して相補的であるかまたはアンチセンス配向にある、少なくとも１５〜３０（数百まで）ヌクレオチドの１つまたは２つの結合ドメイン（第２の標的結合領域は、分子の３’末端に位置してもよい）。他の結合ドメインは、ＰＴＭに取り込まれることができる。結合ドメインは、標的ｍＲＮＡ中の下流のエキソンをスプライスするのに必要な部位（例えば、分岐点アデノシン、スプライソソーム結合部位、ポリピリミジン領域、またはスプライス部位）を覆うかまたは阻止する能力のような特徴により増強される。
２）スペーサー領域：
治療用ＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインから分離するためのスペーサー領域。スペーサー領域は、スプライスされていない治療用ＲＮＡの翻訳を阻止する停止コドン、および標的へのスプライスを増強する配列のような特徴を有してもよい。
プレ−治療用分子（ＰＴＭ）のための「安全装置」を、スペーサー、結合ドメイン、またはＰＴＭ内のいずれかに取り込んでもよい（図１−Ｂ）。これは、比較的弱い相補性によりＰＴＭの３’スプライス部位および／または５’スプライス部位の成分を覆って、非特異的トランス−スプライスを防ぐ、ＰＴＭの領域である。ＰＴＭの結合／標的部分のハイブリダイゼーションにより、３’スプライス部位が露出し、充分に活性になる（図１−Ｃを参照）。
「安全装置」は、シス−配列の１つまたはそれ以上の相補的区間（または、第２の異なる核酸鎖）からなり、ＰＴＭの分岐点片側または両側、ピリミジン領域、および／または３’スプライス部位（スプライス成分）に弱く結合するか、またはスプライス成分自身の一部に結合できる。この「安全装置」結合は、スプライス成分が活性になるのを防止するであろう（すなわち、Ｕ２  ｓｎＲＮＰまたは他のスプライス成分が、ＰＴＭスプライス部位認識成分に結合するのを阻止する）。「安全装置」の結合は、ＰＴＭの標的結合領域が標的プレ−ｍＲＮＡに結合し、こうしてＰＴＭスプライス成分を露出させ活性化（これらが、標的プレ−ｍＲＮＡにトランス−スプライスされることを可能にする）することにより、破壊される。
３）３’スプライス部位および／または５’スプライス部位
これは、分岐点、ピリミジン領域および３’または５’スプライス部位を含有する。
４）治療用遺伝子：
標的ｍＲＮＡ内でスプライスされ次に発現されて、細胞の死滅のような治療効果を現す、１つまたはそれ以上の例えばジフテリア毒素のような治療用遺伝子（治療用遺伝子は、例えば、欠失している機能の回復、マーカーとして作用、または不要な細胞の死滅、のような臨床的に有用な機能を与えるものであり得る）。
５）スプライスおよび翻訳を調節する配列
スプライスを増強するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプライス配列、追加の結合領域、「安全装置」−自己相補的領域、追加のスプライス部位、または分子の安定性を調節する（分解を防ぐ）保護基のような、追加の特徴を、毒素遺伝子の後（または前）に付加することができる。
図２は、プレ−治療用ＲＮＡの結合とトランス−スプライスを示す。
２ａ）細胞が次にＡ−Ｂタンパク質を発現するための正常な経路である、Ａ−Ｂプレ−ｍＲＮＡからＡ−Ｂ  ｍＲＮＡへのシス−スプライス産物。
２ｂ）相補的塩基対合によりＡ−Ｂ  プレ−ｍＲＮＡに結合したプレ−ｔｈ−ＲＮＡ分子。この例では、結合領域はシス−分岐点アデノシンを阻止し、５’オーバーハングはシス−ピリミジン領域を部分的に妨害する。これは、エキソンＢのシス−スプライスを破壊し、トランス−スプライスの候補としてプレ−ｔｈ−ＲＮＡ毒素遺伝子を、エキソンＡに提示する。
２ｃ）Ａ−Ｂ  プレ−ｍＲＮＡとプレ−ｔｈ−ＲＮＡのトランス−スプライス産物。エキソンＡは毒素遺伝子に結合し、これは充分に機能する異種治療用ＲＮＡ分子（ｔｈ−ｍＲＮＡ）中で発現される。このｍＲＮＡの翻訳は、発現する細胞を死滅させる。
図３Ａ及び図３Ｂは、ジフテリア毒素の地図と配列を示す。サブユニットＡのコード領域は、ヌクレオチド３１２〜８９０である。
図４は、本発明のプレ−治療用分子の作製を示す。標的結合領域（βＨＣＧイントロン１、ヌクレオチド９０３〜８８６に相補的）、スペーサー領域（斜体）、分岐点（大きいフォントの分岐点アデノシン（Adenosine））、ピリミジン領域（Ｐｙ）、および３’スプライス部位（ＡＧ／）を示す、実験的プレ−治療用分子（ＰＴＭ）の部分配列を示す。配列（／ＧＧＣＧＣＴ・・・・・）は、ジフテリア毒素サブユニットＡの全コード配列を表す。ピリミジン領域、３’スプライス部位ＡＧが欠失した変異体作成体の配列および挿入された停止コドンも示される。
（１）ＰＴＭ＋：βＨＣＧのイントロン１分岐点に相補的な結合ドメインを有する。
（２）ＰＴＭ＋スペーサー：相補的結合ドメインと分岐点の間に３０ヌクレオチドのスペーサーを有する。
（３）ＰＴＭ−：βＨＣＧイントロン１分岐点に対して弱い相補性を有する。
（４）「粘着しない」ＰＴＭ、スペーサーを有するＴＢ：βＨＣＧイントロン１に対して相補性なし。
（５）ＰＴＭ＋Ｐｙ領域（−）ＡＧ（−）突然変異体：いずれのピリミジン領域のスプライスアクセプターも変異して３’スプライス部位の機能性が排除された他は、（２）と同一。
（６）停止コドンを有するＰＴＭ＋Ｐｙ領域（−）ＡＧ（−）突然変異体：変異したピリミジン領域（ＣＣＧＴＧＡＴＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＡＡＣ）が３つのフレーム内停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を含む他は、（５）と同じ。
（７）ＰＴＭ＋ＡＧ（−）変異体：３’スプライスアクセプターＡＧが欠失している（↑）他は、（２）と同じ。
図５Ａ及び図５Ｂは、ベータＨＣＧの地図と配列を示す。
図６ＡとＢは、トランス−スプライス反応の結果を示す。図６Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲルを示す。図６Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅したトランス−スプライスされた生成物断片のヌクレオチド配列を示す。ＲＴ−ＰＣＲにより２０７塩基対生成物を増幅し、これをＤＴ−３逆プライマー、α−33ＰｄＡＴＰおよびシーケナーゼ（Sequenase）キット（アマーシャム、ライフサイエンス（Amersham, Life Science））を使用して直接配列決定し、この生成物をゲル電気泳道により分離した。矢印は、トランス−スプライスした生成物の接合部の位置を示す。
発明の詳細な説明
前述のように、本発明は、細胞内で治療用分子を産生する手段としての、標的とされたプレ−メッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）トランス−スプライスの使用に関する。治療用分子自身は、目的の機能を提供するか、または特定の型の細胞で遺伝子産物を産生する。遺伝子産物は、臨床的有用性を有する遺伝子（例えば、治療用遺伝子またはマーカー遺伝子、および毒素）を含む任意の遺伝子である。本発明の１つの実施態様において、送達される遺伝子は、毒素遺伝子であり、ここで１つの分子の発現は、標的とされたプレ−ｍＲＮＡを含有する細胞に対して致死的である。
１つの実施態様において、本発明は、特異的ｍＲＮＡを作成して、選択された細胞集団内で治療用毒素遺伝子を発現させ、その結果その特定の細胞を破壊する方法に関する。標的とされる細胞には、ウイルスまたは他の感染性物質に感染したもの、良性または悪性新生物、または自己免疫疾患もしくは組織拒絶に関与する免疫系の成分があるが、これらに限定されない。特異性は、標的に結合するようにＰＴＭの結合ドメインを修飾することにより達成される。
本発明の方法の１つの実施態様を含む工程は：
ｉ）当業者により使用される任意の型の前駆体分子、治療用ＲＮＡ分子（または、ＲＮＡに転写されるＤＮＡベクター、または合成類似体）を、細胞の核に伝達する工程であって、ここで前駆体治療用ＲＮＡ（プレ−ｔｈＲＮＡ）は、異なる機構により、標的プレ−ｍＲＮＡ、スプライス部位、治療用遺伝子に結合する結合領域を含有し、かつポリアデニル化シグナル、エンハンサー、または他の調節配列成分を含有してもよい［図１のパートＡ、Ｂ、およびＣを参照］；
ii）標的とされたプレ−ｍＲＮＡにより前駆体治療用ＲＮＡ分子をトランス−スプライスして、治療用翻訳可能なｍＲＮＡを作成する工程［図２ｂを参照］；そして
iii）標的細胞内でトランス−スプライスされた治療用ｍＲＮＡを発現（翻訳）する工程［図２ｃを参照］。
標的細胞は、プレ−ｍＲＮＡのユニークな集団を発現することが知られている任意の細胞であり、プレ−ｍＲＮＡはトランス−スプライス反応の基質として使用することができる。このユニークな集団は、１つのユニークな型のＲＮＡであるか、または、他の型のいかなる細胞中でも、群として一緒には発現されないいくつかのものである。前駆体治療用ＲＮＡは、標的とされたプレ−ｍＲＮＡに特異的な結合領域を含有するであろう。
プレ−治療用分子は、任意の送達方法、例えば、ウイルス介在、電気穿孔法、微量注入法、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、リポソーム、サイトフェクチンにより、または直接、細胞に投与される。プレ−治療用分子は、治療用分子自身の目的の量を産生するのに有効な量で投与されるであろう。投与される正確な量は、送達システムの詳細に依存して変化してもよい。有効量はまた、欠失している機能（例えば、遺伝的疾患の治療における）、細胞死滅（例えば、癌の治療における）、または細胞制御（異なるタイプの疾患とともに使用されてもよい）を提供する。有効量は、患者の体重１kg当たり０．００１ピコグラムまたはそれ以下から１．０ｇ核酸の範囲でもよい。
治療用分子は、臨床的に有用な何らかの機能（例えば、欠失している機能の回復、マーカーとしての作用、または不要な細胞の死滅）を提供するものであり得る。
１つの実施態様において、プレ−治療用ＲＮＡ分子は、４つの主要な特徴を有する翻訳不可能な１本鎖ＲＮＡである：１）ユニークなプレ−ｍＲＮＡの標的とされた領域に対して相補的であり、かつアンチセンス配向にある少なくとも１５〜３０ヌクレオチド（および、最高数百ヌクレオチドまたはそれ以上）の１つまたは２つの結合ドメイン。これは、結合の特異性を与え、プレ−治療用ＲＮＡをスペース内に密接に固定して、核のスプライソソームのプロセシング機構が、これを標的プレ−ｍＲＮＡにトランス−スプライスすることができるようにする。結合ドメインは、標的プレ−ｍＲＮＡ中の下流のエキソンをシス−スプライスするのに必要な部位（例えば、分岐点アデノシン、スプライソソーム結合部位、ポリピリミジン領域、または真正３’もしくは５’スプライス部位）を被覆するかまたは阻止する能力のような特徴により増強し得る。２）プレ−治療用ＲＮＡスプライス部位を、標的と並ばせるためのスペーサー領域。このスペーサー領域は、スプライスされていないプレ−治療用ＲＮＡの翻訳を阻止する停止コドン、および標的へのスプライスを増強する配列のような特徴を有することができる。このスペーサーはまた、スプライス部位から結合ドメインを分離する作用を有する（および、「安全装置」ドメインを含有してもよい）。３）３’スプライス部位。４）ジフテリア毒素のような１つまたはそれ以上の治療用遺伝子であり、これは、スプライスされて標的ｍＲＮＡになり、次に発現されて、治療効果（例えば、悪性腫瘍を治療している時に好ましい細胞死滅）を示す。必要に応じて毒素遺伝子（読みとり枠）の後に、分子に追加の特徴（例えば、スプライス、翻訳および発現につながる工程を増強するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプライス配列）があってよい。スプライスされたＲＮＡ自身が治療用分子である本発明の実施態様において、治療用遺伝子はないかも知れないが、目的の効果を有するＲＮＡはある。トランス−スプライスは、任意の公知の機構により仲介される（群Ｉ、群II、またはスプライソソーム）。
本発明の方法は、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、および他の重篤なウイルス感染症、自己免疫疾患、ならびに特定の型の細胞の変更または排除が有効である他の病状の治療において、大きな臨床的用途を有する。この例としては、良性の前立腺肥大、および他の前癌症状がある。さらに、本方法はまた、遺伝的疾患（例えば、少量の欠失しているかまたは突然変異遺伝子産物の発現が正常の表現型を示すゴーシェ病）の治療に使用することもできる。
別の実施態様において、ＰＴＭは、前述の特徴を有する翻訳不可能な１本鎖ＲＮＡである：１）１つまたは２つの結合ドメイン；２）スペーサー領域；３）５’スプライス部位、および４）１つまたはそれ以上の治療用遺伝子、および追加の特徴（他の例で記載したように）を与える追加の配列がある。トランス−スプライスは任意の公知の機構（例えば、群Ｉ、群II、またはスプライソソーム）により仲介される。
トランス−スプライスの最大化
１．プレ−ｔｈ−ＲＮＡは、ＢＰＡから５’および３’を捕足し結合するように作製され、分岐点アデノシン（これを阻止する）を含有してもしなくてもよい。これは、最適化アンチセンス結合ドメインを見つけることを可能にする。
２．ＰＴＭを、プレ−ｔｈＲＮＡ中の分岐点アデノシンを含有させてまたは含有させずに作成し、ＢＰＡを含有させることにより（非標的ｍＲＮＡ内に）非選択性スプライスが起きるかどうかを決定する。
３．ＰＴＭを、結合ドメインとスプライス部位の間の領域に停止コドンまたは他の成分を含有させてまたは含有させなくて作成し、そのような成分がスプライスされていないプレ−ｔｈＲＮＡ発現を必ず防止するかどうかを決定する。
４．ＰＴＭを、毒素遺伝子の強いポリアデニル化シグナルまたは下流のエンハンサーまたは下流の５’スプライス配列を含有させたまたは含有させなくて作成し、これらの成分がトランス−スプライスを促進するかどうかを決定する。
５．ＰＴＭを、毒素遺伝子の下流に第２のアンチセンス結合ドメインを含有させてまたは含有させなくて作成し、このような成分が３’標的エキソンへの結合を促進し、かつ伸長を促進して真正シス−３’スプライス部位（Ｕ５および／またはＵ１結合部位）を阻止するかどうかを決定する。ＰＴＭはまた、トランス−スプライスされた産物の発現のための第２のトランス−スプライスを必要とするように作成してもよい。
６．さらなる成分（例えば、３’ヘアピン構造、環状化ＲＮＡ、ヌクレオチド塩基修飾、または合成類似体）を作製体中に取り込んで、核局在化やスプライソソーム取り込み、および細胞内安定性を促進させる。
７．最終治療用作製体は、外部の細胞膜から送達されて、核に移動して標的プレ−ｍＲＮＡのスプライソソームに取り込まれる必要があるか、またはこれらは、前駆体分子（ＤＮＡベクター、ＲＮＡウイルスなど）から細胞自身により産生されてもよい。
送達システム
本発明は、他の遺伝子治療またはアンチセンス法のために開発された任意の公知の送達システムを使用することができる。プレ−治療用ＲＮＡは、作成し、パッケージングし、細胞への取り込みのために試験する必要がある。化学合成は約１００ヌクレオチドに限定されているように、現在完全長プレ−ｔｈ−ＲＮＡの化学合成は現実的ではないが、可能であろう。完全長プレ−ｔｈ−ＲＮＡは、ＰＣＲ増幅した鋳型から（高忠実度酵素を使用して）、または適切なプロモーターが取り込まれたクローン化したＤＮＡから転写される。また使用可能なＱ−β増幅法のようなＲＮＡ増幅法がある。スプライスされたｔｈ−ＲＮＡは精製して、配列決定するか、または標的をトランス−スプライスし、インビトロ系で毒素またはマーカーを産生する能力により試験する。
リポソーム、電気穿孔法。およびサイトフェクチンは、ＲＮＡを細胞に直接導入する方法である。これらは、アンチセンスＲＮＡ送達プロコトルで広く使用されている。裸のまたはパッケージングされたＤＮＡは、送達の別の可能な手段である。ウイルス送達システムも使用される。ただし、これらは、増殖および操作することがより高価であり、一般には容易に利用できないかも知れない。一過性発現を有するウイルスベクター（例えば、ゲノム内に組み込まれないアデノウイルスやアデノ関連ウイルス）は、問題がより少ないかも知れない。核酸ポリマーはまた、これらを複製が不可能なウイルスの空の殻に結合させて送達することができる。ディー・アール・クック（Cook, D.R.）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．９（２）：１３１−１４１（１９９４）。
例１：治療用遺伝子の選択
治療用遺伝子は、いくつかの新規機能（例えば、欠失している機能の回復、マーカーとして作用、または不要な細胞の死滅）を提供する任意の遺伝子である。欠失している機能の回復のための遺伝子は、既知の遺伝疾患で欠失しているかまたは変更されている遺伝子産物を、コードする遺伝子であってよい。マーカー遺伝子は、細胞を同定またはイメージングするために使用される特異的な異種タンパク質またはペプチドの発現を引き起こす遺伝子であってよい。細胞を死滅させる遺伝子は、以後の治療（例えば、放射線照射または化学療法）に対する細胞の感受性を増強する機能を提供する、単純な毒素または他の遺伝子であってよい。
ジフテリア毒素は、単純な毒素の良い例である。未変性のＤＴは、ＡサブユニットとＢサブユニットから構成される。ジフテリア毒素のサブユニットＡは、酵素的毒素活性を含有し、発現されるかヒト細胞に送達されるなら機能する。Ｂサブユニットは、ヒト細胞への経膜的移動のために必要である。サブユニットＡは、単独で完全な細胞に入ることができない。サブユニットＡは、Ｂサブユニット無しで細胞膜の脂質二重層を通過することができないため、単独では非常に毒性が低い。ジェイ・エム・シモン・ドノバン（Donoban, J.M. Simon）とエム・モンタル（M. Montal）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８８１７−８８２３（１９８５）。Ａサブユニットは、いくつかのコンフォメーションで存在することができる。ジフテリア毒素のサブユニットＡのための遺伝子は、長さが６００ｎｔ未満である。エル・グリーンフィールド（Greenfield, L.）、エム・ビヨン（M. Bjorn）、ジー・ホーン（G. Horn）、ディー・フォング（D. Fong）、ジー・バック（G. Buck）、アール・コリア（R. Collier）、およびディー・カプラン（D. Kaplan）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６８５３−６８５７（１９８３）。図３を参照されたい。ＤＴ−Ａペプチドは、異種ペプチド配列が結合しており活性である。ビー・レケット（Leckett, B）、およびアール・ジェイ・ゲルミナリオ（R.J. Germinario）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２）：１２５−１３６（１９９２）。追加の安全策として、細胞外の環境に放出されたＤＴ−Ａに対する免疫化が可能である。ジェイ・ティー・バルビエリ（Barbieri, J.T.）、ディー・アルメリニ（D. Armellini）、ジェイ・モルケンチン（J. Molkentin）、およびアール・ラプオリ（R. Rappuoli）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（１２）：５０７１−５０７７（１９９２）。本発明で使用できる、多くの他の公知の毒素がある。
例２：プレ−治療用分子の作製
インビトロのモデル系を使用して、最も効率的なトランス−スプライスのためのプレ−治療用分子と標的ｍＲＮＡのパラメータを決定する。
１．ＰＴＭ１〜８の作製：
実験的モデル標的プレ−ｍＲＮＡ、βＨＣＧ遺伝子６は、ＳａｃＩで制限切断してｐＢＳ−（ストラタジーン（Stratagene））にクローン化した。これは、５’非翻訳領域、開始コドン、エキソン１、イントロン１、エキソン２、およびイントロン２の大部分を含む、ヌクレオチド４６０〜１２６５からの８０５塩基対の挿入体を産生した。ＲＮＡ転写体は、これらのｐＢＳ−クローンからＴ７ポリメラーゼ転写キット（ストラタジーン）を使用して生成する。
無細胞トランス−スプライス実験のために、プレ−治療用分子もｐＢＳ−で作成した。ジフテリア毒素サブユニットＡ（ＤＴＡ）を、プライマーの、５’末端にＰｓｔＩ部位を有するＤＴ−１（ＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧ）、およびＰＣＲ産物の３’末端にＢａｍＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加するＤＴ−２（ＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅したＤＴＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化して、ｐＢＳ−にクローン化した。生じたｐＢＳ−ＤＴＡクローンをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断して、以下のオリゴヌクレオチドを連結して、ＰＴＭ＋（ＰＴＭ１）を作製した。
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これらのオリゴは、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、およびＰｓｔＩの制限部位を含有する。ＩＮ２−４は、ＩＮ３−１に相補的である。ＩＮ３−１のオーバーハングを使用して、ｐＢＳ−ＤＴＡクローンのＥｃｏＲＩ部位に連結する。ＩＮ３−１の３’オーバーハングを使用して、ｐＢＳ−ＤＴＡクローンのＰｓｔＩ部位に連結して、ＰＴＭ１を形成する。
ＰＴＭ−（ＰＴＭ３）は、ＰＴＭ１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで制限消化し、小さな結合ドメイン断片をゲル電気泳動で除去し、以下の２つのオリゴを連結することにより作製する。
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ＰＴＭ＋スペーサー（ＰＴＭ２）は、ＰＴＭ１をＸｈｏＩで切断し、以下のオリゴを連結することにより作製した。ｐＢＳ−のＴ７プロモーターからセンス方向にスペーサーＢを有するクローンをＰＴＭ２として選択した。
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スペーサーを有する「粘着しない」ＰＴＭ（ＰＴＭ４）は、ＰＴＭ３をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで制限消化し、以下のオリゴを連結することにより作製した。ｐＢＳ−のＴ７のプロモーターからセンス方向にスペーサーＢを有するクローンをＰＴＭ４として選択した。
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スペーサーを伴うＣＲＭ（ＰＴＭ８）は、プライマーＤＴ−１およびＤＴ−２を使用して、ジフテリア毒素サブユニットＡ変異体であるＣＲＭ１９７  ＤＴＡ（これは、アミノ酸５２のＧｌｙからＧｌｕへの突然変異であり、これにより毒素活性を排除している、ウチダ（Uchida）ら，１９７３，ＪＢＣ  ２４８，３８３８−３８４４）のＰＣＲ増幅により作製した。この産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化して、ＰＴＭ２から野生型毒素遺伝子を除去するためのアガロースゲル電気泳動後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＴＭ２にクローン化した。
ＰＴＭ＋Ｐｙ領域（−）ＡＧ（−）（ＰＴＭ５）突然変異体は、ＰＴＭ２クローンをＰｓｔＩおよび大豆ヌクレアーゼ（Mung Bean Nuclease）で消化し、次にデルタＡＧ−１およびデルタＡＧ−２オリゴを連結することにより作製した。デルタＡＧ−１は、ユニークなＨｐａＩ制限部位を有する。
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停止コドンを伴うＰＴＭ＋Ｐｙ領域（−）ＡＧ（−）（ＰＴＭ６）は、ＰＴＭ２をＰｓｔＩおよび大豆ヌクレアーゼ（Mung Bean Nuclease）で消化し、次にデルタＡＧ−３およびデルタＡＧ−４オリゴを連結することにより作製した。デルタＡＧ−３は、フレーム内に３つの停止コドン「ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ」を含有し、ユニークなＨｐａＩ制限部位を有する。
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ＰＴＭ＋ＡＧ（−）（ＰＴＭ７）変異体は、プライマーの、３’スプライスアクセプターＡＧが欠失したデルタＡＧ−５（ＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧ）、および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＤＴ−２（ＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧ）を使用して、ＰＴＭ２のジフテリア毒素サブユニットＡのＰＣＲ増幅により作製した。この産物をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＰＴＭ２から野生型毒素遺伝子を除去するためのアガロースゲル電気泳動後に、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＴＭ２にクローン化した。
組織培養において細胞を含む試験用には、種々のクローン化ＰＴＭをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次にＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１−（インビトロゲン（Invitrogen））（これは、形質転換選択マーカー（Ｇ４１８）を含有する哺乳動物発現ベクターである）に連結した。種々のＰＴＭの配列は、ＤＮＡ配列決定法により確認した。
２．凡例：
・インビトロのトランス−スプライス：２５０ngのゲル精製したβＨＣＧプレ−ｍＲＮＡおよび５００ngのＰＴＭ  ＲＮＡを、４０mM  ＫＣｌおよび２mM  ＭｇＣｌ2の存在下で９８℃に加熱し、３０℃までゆっくり冷却することによりアニーリングした。スプライス反応は、１×スプライス緩衝液（４０mM  ＫＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ2、５mMクレアチニンリン酸および１mM  ＡＴＰ）を含有する２５μl反応容量中の２２５ngのアニーリングしたＲＮＡ試料、および８μlのヒーラスパイス（HeLa Spice）核抽出物（プロメガ（Promega））を３０℃でインキュベートすることにより実施した。所定の時点でアリコートを取り出し、等容量の高塩緩衝液（７Ｍ尿素、０．５％ＳＤＳ、１００mM  ＬｉＣｌ、１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０mM  ＥＤＴＡ）を加えることにより反応を停止させた。ＲＮＡ試料をフェノール：クロロホルム、次にクロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿させ、７０％エタノールで洗浄して空気乾燥した。
・ＲＴ−ＰＣＲ解析：ＰＣＲ解析と組合せた逆転写（ＲＴ）は、１酵素プロトコール−ＥＺ−ＲＴ  ＰＣＲキット（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer））、または２つのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ社（Gibco-BRL））およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー）を使用して、パーキン−エルマーのサーマルサイクラーにより行った。典型的なＲＴ反応容量は、２０μｌであり、これは、１５ngのスプライスした、およびトランス−スプライスしたＲＮＡ、０．１μｇの３’特異的プライマー（これは、トランス−スプライスしたＲＮＡのジフテリア毒素（ＤＴＡのヌクレオチド１４５〜１２５）部分に相補的である）（ＤＴ−３、５’−ＣＡＴＣＧＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧ）、５mM  ＭｇＣｌ2、１mMの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（５０mM  ＫＣｌおよび１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）および１０Ｕの逆転写酵素を含有した。ＲＴ反応は、４２℃で１５分間行い、そしてＭ−ＭＬＶを使用するＲＴには、９５℃に５分間加熱することにより酵素を不活性化した。次にｃＤＮＡを、１００μｌ反応容量中の、トランス−スプライスしたｍＲＮＡの標的成分に特異的な０．１μｇの５’プライマー、βＨＣＧ  ＲＮＡエキソン１（ＨＣＧ−Ｆ、５’−ビオチン−ＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧ、ヌクレオチド５１４−５３４）、および２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲにより増幅した。３５サイクルの増幅に使用した温度プロフィールは、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で４０秒間のアニーリングおよび７２℃で４５秒間の伸長、続いて７２℃で最後７分間の伸長とした。反応産物は、２％アガロースゲル上で解析した。トランス−スプライスの予測される生成物は２０７塩基対である。
３．トランス−スプライスの証明：プレ−ｍＲＮＡ（これは、標的の分岐点アデノシン（ＢＰＡ）を含有し、従ってシス下流のエキソンのスプライスを阻止する）に対して相補的なアンチセンス結合ドメインを含有する実験的プレ−ｔｈＲＮＡ分子（ＰＴＭ）（図４、１．ＰＴＭ１〜８の作成及び２．凡例を参照）、露出したＢＰＡを含有する種々のスペーサー領域、３’スプライス部位およびマーカー遺伝子（ジフテリア毒素サブユニットＡ−（ＤＴＡ））は、すべての核スプライス成分と標的とされたプレ−ｍＲＮＡ（ベータＨＣＧ）を含有するインビトロ系に添加される。図５を参照されたい。トランス−スプライスは、ベータＨＣＧの５’エキソン１に相補的な１つのプライマーとマーカー遺伝子（ＤＴＡ）に相補的な第２の（逆）プライマーを使用する、逆転写酵素ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により証明される。ＰＣＲ産物は配列決定して、上流の５’エキソンとマーカー遺伝子の正しいトランス−スプライス産物を証明した。
図６−Ａは、ＨｅＬａ核抽出物スプライス反応で６０分目に、ＰＴＭ＋スペーサー（ＰＴＭ２）は、ＰＴＭ１（ＰＴＭ＋）またはＰＴＭ４（ＴＢ＋スペーサー）より実質的に多いトランス−スプライスされたＨＣＧ／ＤＴＡ産物を産生し、９０分の反応後にＰＴＭ１またはＰＴＭ４より５倍多いトランス−スプライスされたＨＣＧ／ＤＴＡを産生したことを示す。ＰＴＭ１とＰＴＭ４は、９０分のインキュベーション後に、ほぼ等量のトランス−スプライス産物を産生した。この実験は、１８ｎｔの結合領域は、結合ドメインと分岐部位の間のスペーサー領域と一緒に使用される時、トランス−スプライスの特異性を顕著に上昇させることを証明している。ＰＴＭ１がＰＴＭ３（データは示していない）またはＰＴＭ４に対してトランス−スプライスが上昇していないのは、結合ドメインがＰＴＭ１中の分岐点に近いためであり、これらの部位を分離するのはわずかに６ｎｔであるため、スプライス因子が、隣接する分岐点に近づくのを、標的遺伝子への結合が阻止するためである。比較的弱い哺乳動物のコンセンサスであるＹＮＹＵＲＡＣ（ここで、Ａは分岐形成部位であり、Ｙ＝ピリミジン、Ｎ＝任意のヌクレオチド、およびＲ＝プリン）より活性の強い、酵母コンセンサス分岐部位を使用してＰＴＭ作製体１〜４が産生されたため、ベータＨＣＧのプレ−ｍＲＮＡとＰＴＭ３またはＰＴＭ４の間で少量の非標的トランス−スプライスが観察されることは、予測できないことではなかった。さらに、ＰＴＭ作製体１〜４は、非常に強いピリミジン領域を含有する。この分岐部位−ピリミジン領域の組合せは、スプライス因子（例えば、Ｕ２  ＡＦおよびＵ２  ｓｎＲＮＰ）への結合傾向、および非常に効率的にスプライスする傾向の強いＰＴＭを与える。さらに、標的ベータＨＣＧプレ−ｍＲＮＡとプレ−治療用分子の濃度は、この実験では生理的濃度以上であり、これは非標的（つながった）トランス−スプライスの確率を上げる。
ＰＴＭとベータＨＣＧのエキソン１との結合はトランス−スプライスの結果であることを証明するために、ＰＴＭ５とＰＴＭ６は、ピリミジン領域と３’スプライス部位を排除するように設計されている。ＰＴＭ７は、３’ＡＧスプライス部位のみを除去するために作成した。ビー・パッターソン（Patterson B）とシー・ガスリー（Guthrie C）、Ｃｅｌｌ  ６４：１８１−７（１９９１）。完全な細胞内の特異性は治療への応用により関係があるため、ＰＴＭ５〜７は、トランスフェクションされた組織培養実験で試験されている。
この実験モデルのイントロンは、５’スプライス部位、分岐点、ピリミジン領域、および３’スプライス部位を含有する、アデノウイルス２主要後期プロモーターリーダー１およびリーダー２スプライスユニットの部分にクローン化する。この配列は、上流にＴ７  ＲＮＡプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３，１（インビトロゲン社（Invitrogen Corp.）のような発現ベクター内にクローン化し、その結果、スプライスユニットのＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を使用して転写できる。このような挿入体の１つのヌクレオチド（ＤＮＡ）配列は次の通りである：
ｐｃＤＮＡＩＩ−Ｔ７プロモーター  5’-
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３’マーカー配列
記号：
＊＝５’スプライス部位；CATACT..＝結合の標的領域；ＢＰＡ＝分岐点アデノシン；＃＝Ｐｙ領域；**＝３’スプライス部位
モデルイントロンの３’末端は、マーカー配列（例えば、Ｓｐ６プロモーターまたは発現可能なペプチド選択マーカー）を含有し、その結果正しくスプライスされた生成物は、スプライスされていないＴ７転写体より短いｍＲＮＡ配列として電気泳動分離により検出できる。スプライスされた生成物はまた、Ｔ７およびＳｐ６配列に対するプライマー（または、使用されるマーカーに対する適切なプライマー）を使用してＰＣＲ増幅により検出できる。
プレ−治療用ＲＮＡ分子のいくつかの領域は変化しており、特異的にトランス−スプライスする能力について試験し、トランス−スプライスの頻度を測定する。
ａ）結合ドメイン−ピリミジン領域と分岐点の標的化：
CATACTTATCCTGGGCCCTTTT  ＝  ５’から３’配向のアデノウイルス２主要後期プロモーターの標的配列
3’-TTTTCCCGGGTCCTATTCATAC-5’  逆配向の標的配列
モデルプレ−ｔｈＲＮＡ分子
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記号：
AAAAGG..＝結合の標的領域；+++++＝スペーサー領域；ＢＰＡ＝分岐点アデノシン；＃＝Ｐｙ領域；**＝３’スプライス部位；ACCCAG＝ＨＳＶタンパク質マーカー；CACCAC...＝ヒスチジンタンパク質マーカー；！＝停止コドン。
ヒスチジンタンパク質マーカーを含有させると、金属キレートクロマトグラフィーを使用して検出が可能になり、ＨＳＶタンパク質マーカーは、モノクローナル抗体を使用する検出を可能にする。これらの試薬はノバゲン社（Novagen, Inc.）から入手できる。
ｂ）上記と類似であり、異なる相補的結合領域を有する、標的／阻止に対する最適化領域を確認するためにかつトランス−スプライス反応を増強するために、標的分子内でより５’または３’にハイブリダイズするようにシフトしている、追加のモデルプレ−治療用ＲＮＡ分子が作成される。トランス−スプライスの効率を上げたり下げたりするために、スプライスを調節する他の配列成分が加えられる。
例３：インビトロスプライス反応
これらのＤＮＡ配列は、発現プラスミドと宿主にクローン化した。配列は、サンガー（Sanger）のジデオキシＤＮＡ配列決定により証明した。ＲＮＡはプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅した鋳型から作成し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写した。標的またはプレ−ｔｈ−ＲＮＡを［α32Ｐ］ＵＴＰの存在下で合成される。完全長プレ−ｍＲＮＡと標的は、ゲル電気泳動により精製される。エス・エフ・ジャミソン（Jamison, S.F.）、エー・クロウ（A. Crow）、およびエム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A． Garcia-Blanco）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４２７９−４２８７（１９９２）
ジェイ・ディー・ディグナム（Dignam，J.D．）ら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：１４７５−１４８９、１９８３）の方法を使用して核抽出物を作成した。インビトロスプライス測定法は、エム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A. Garcia-Blanco）、エス・エフ・ジャミソン（Jamison, S.F.）、ピー・エー・シャープ（P.A. Sharp）（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．３：１８７４−１８８６、１９８９）のように行った。スプライス反応物は、種々の時間インキュベートする。終了後、反応生成物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分離する。スプライス複合体は、非変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィーで視覚化する。インビトロのスプライス産物は、変性アクリルアミドゲルで解析する。ジャミソン（Jamison）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４２７９−４２８７（１９９２）。
スプライスした生成物は、未変性のシス−スプライスした生成物に対して特異的であるか、またはハイブリッドトランス−スプライスした生成物に対して特異的なプライマーを使用して、別の反応中で逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、標的ｍＲＮＡ５’エキソンに相補的な５’プライマー、およびトランス−スプライスしたマーカーまたは治療用遺伝子に対して相補的な３’プライマーを用いて解析した。同じ５’プライマーを使用して、シスおよびトランス−スプライスした生成物を検出した。結合ドメインの特異性により提供されるトランス−スプライスが上昇している（ゲル、図６Ａを参照）。
スプライスした生成物はまた、無細胞翻訳系で発現され、トランス−スプライスした生成物は、ある条件下で（すなわち、もしトランス−スプライスの速度が、検出のためのマーカータンパク質の充分な濃度を産生するのに充分なだけ高いなら）ウェスタンブロットとタンパク質配列決定により検出される。
例４：競合的インビトロスプライス反応
本例は例３と同じであるが、ほんのわずかの限定された量の標的とされたプレ−ｍＲＮＡを有するプレ−ｍＲＮＡ分子の混合物を含有する。これは、おそらく好適なシス−スプライス反応の存在下でトランス−スプライス反応の証明を可能にする。ＲＴ−ＰＣＲは、競合する標的ではないプレ−ｍＲＮＡの存在下で、標的プレ−ｍＲＮＡとプレ−ｔｈＲＮＡとの間のトランス−スプライスの特異性を測定するのに使用される。可能なランダムトランス−スプライスを検出するために、マーカー配列に対するプライマーおよび標的ではないプレ−ｍＲＮＡに対して特異的なプライマーを使用して、追加のＲＴ−ＰＣＲ増幅が行われる。
例５：ヒト肺癌培養細胞中のトランス−スプライス反応
ユニークな遺伝子（プレ−ｍＲＮＡ）を発現する標的細胞の治療的除去（死滅）は、本発明のプレ−治療的毒素分子を使用して行われることを証明するために、ヒト肺癌の細胞培養モデルを使用した。以下の細胞性疾患モデルの凡例及び結果を参照されたい。混合細胞実験を使用して、標的細胞のみが排除されることを証明する。インビトロ実験で同定されるうまくいったプレ−ｔｈＲＮＡ作製体は、細胞培養実験で使用するために適当に修飾された。細胞死滅の特異性を改良（例えば、「安全装置」の追加）するための実験が、現在進行中である。
予備的実験は、第１世代のＰＴＭは、標的ではない（無差別の）トランス−スプライスが高率に有することを示唆する。第１世代ＰＴＭはスプライス効率を最大にするように設計されているため、これは予測しなかった結果ではない。特異性を改良するためのいくつかの修飾が試験されている。これらには、以下のものがある：
１．ＰＴＭのスプライス成分の一部またはすべてを被覆するための「安全装置」の追加。
２．効率がより低いスプライス成分になるように、分岐点とピリミジン領域の配列を変化させる。
３．ベータＨＣＧの末端抽出物の３’スプライス部位に対する５’ドナースプライス部位として作用して、細胞質への排出および治療用キメラタンパク質の翻訳に必要なポリアデニル化シグナルが得て、ポリアデニル化シグナルを含まないように、しかし第２のトランス−スプライス反応を受けることができるように、ＰＴＭの３’末端を変化させる。
４．誘導性発現ベクターへのＰＴＭのクローニング、ここで転写されるＰＴＭの量は制御可能である（おそらく、トランス−スプライスは普通に起きることである）。
細胞性疾患モデル：
ヒト癌の細胞培養モデルを使用して、本発明のプレ−治療用分子を使用することにより、ユニークな遺伝子（プレ−ｍＲＮＡ）を発現する標的細胞の治療的除去（致死）が達成されることを証明した。この系において、肺癌株（Ｈ１２９９）、子宮頸癌に由来する株（ヒーラ（HeLa）Ｓ３）、およびいくつかの膵臓癌株（Ｃ１４６９、Ｃ１９９７、Ｈ１３４およびＣ１６８２）を含む種々の癌細胞株を試験した。これら全ての細胞株は、ＲＴ／ＰＣＲおよび免疫染色測定法により測定するときβＨＣＧ標的分子を発現することが判っている。６０mm組織培養プレートに１×１０5の密度で細胞を蒔き、最低２４時間増殖させた。リプフェクタミン（lipfectamine）（ギブコ社（Gibco-BRL））を使用して標準法により、ＣＭＶおよびＰＴＭベクターＤＮＡ（４ug/プレート）のトランスフェクションを行った。４日目に、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理し、Ｇ４１８（５００ug/ml）を含有する培地に１：１０で通した。Ｇ４１８を含有する新鮮培地を３〜７日毎に補足した。１８日目に、Ｇ４１８選択後に残存したコロニーをＰＢＳ−（シグマ（Sigma））で洗浄し、３：１のメタノール／酢酸溶液に１０分間固定し、１０分間空気乾燥した。次に０．０３％メチレンブルー溶液を１０分間加えてコロニーを染色した。コロニーをＰＢＳ−で洗浄し、空気乾燥し、そして５０細胞を超えるコロニーを計数した。
凡例：
・Ｈ１２９９細胞のトランスフェクション：Ｈ１２９９肺腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ培地中で３７℃で５％  ＣＯ2インキュベーター中で増殖させた。リポフェクタミン（lipofectamine）（ギブコ社（Gibco-BRL））を使用して、製造業者の標準法により、トランスフェクションを行った。Ｈ１２９９およびヒーラＳ３細胞を６０mmシャーレに１×１０5の密度で蒔き、少なくとも２４時間増殖させた。細胞をＤＮＡを加えることなくモックトランスフェクションするか、または４μｇ以下のベクターＤＮＡによりトランスフェクションした：ｐｃ３．１−ＰＴＭ２（ｐｃ３．１−にクローン化したＰＴＭ２）、ｐｃ３．１−ＰＴＭ４（ｐｃ３．１−にクローン化したＰＴＭ４）、ｐｃ３．１−ＰＴＭ８（ＤＴＡのアミノ酸５２位にＧｌｙからＧｌｕの突然変異を起こして、全毒素酵素活性を排除する点突然変異の他は、ｐｃ３．１−ＰＴＭ２と同一）、ｐｃＤＮＡ３．１（ベクター対照）、ｐＣＭＶ  ｐ５３（ｐＣＭＶにクローン化したｐ５３）、およびｐＣＭＶ（ベクター対照）。４日目に、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理して、Ｇ４１８（５００μg/ml）を含有する培地に１：１０で通した。培地を３〜７日毎に交換して、少なくとも２週間選択を続けた。１８日目に、Ｇ４１８選択後に残存したコロニーをＰＢＳ−（シグマ（Sigma））で洗浄し、メタノール／酢酸溶液（３：１）で１０分間固定し、１０分間空気乾燥した。次に０．０３％メチレンブルーを１０分間加えてコロニーを染色し、次にこれらをＰＢＳ−で洗浄し、空気乾燥して、５０細胞を超えるコロニーを計数した。
Ｈ１２９９（肺癌細胞株）による最初の実験の結果は以下の通りである：
結果：
トランスフェクション毒性測定法：
0004321877.tif 000010
例６：ヒト子宮頚癌細胞株でのトランス−スプライス反応
安定性と、特異的部位に結合し、スプライスが好ましい細胞の部位でプレ−治療用分子が産生、そこに移送、および／または送達されることを確保する能力について、作製体は最適化される。核内でプレ−ｔｈ−ＲＮＡ作製体を産生する、真核生物発現プラスミドを使用して予備試験を行い、従って特異的結合、標的とされたトランス−スプライス、および安定性は、最初のプレ−治療用分子の設計目標である。誘導性プロモーターを含有するベクターは、便利性について、または細胞中のＰＴＭの濃度を制御するために使用される。プレ−治療用ＲＮＡの誘導は、培地への単純な非毒素化学物質の導入により達成される。例えば、ＩＰＴＧは、ｐＯＰ１３  ＣＡＴ（ストラタジーン（Stratagene））中の挿入体の転写を誘導する。追加の第２の選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性）もまた取り込まれる；このようなマーカーにより、ベクターを摂取した細胞のみが、選択増殖条件下で生存するであろう。
ユニークな遺伝子標的を有する他の可能な疾患モデルは以下のものがある：パピローマウイルスウイルスＥ６またはＥ７タンパク質を発現するヒト子宮頚癌細胞株、前立腺特異的抗原を発現する前立腺癌細胞株、ＣＥＡタンパク質を発現するヒト肝臓癌細胞、または組織特異的遺伝子産物（膵臓、肝臓、乳房、大腸、黒色腫）を発現するか、悪性腫瘍関連タンパク質（例えば、ＨＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン））を産生するか、ｂｃｒａｂｌ融合遺伝子産物（９ａ３４；２２ｑ１１）を有する白血病、または他の染色体転座融合遺伝子を産生する他の細胞株。
次にパピローマウイルスモデル系を試験する。子宮頚部異形成および子宮頚癌の治療は、大きな臨床的な問題である。このモデルは、癌およびウイルス感染症の両方に対する有効性を証明する能力を提供する。Ｅ６およびＥ７遺伝子を発現するパピローマウイルスの血清型１６または１８で感染した女性は、子宮頚癌を発症するリスクが高い。
最初の研究は、選択可能な発現プラスミドでトランスフェクションされる細胞株で行われる（Ｅ６とＥ７を含有するパピローマウイルス１８型の連続的領域および５’スプライス部位、ＢＰ、ピリミジン領域および標的の３’スプライス部位を含有するスプライス領域がクローン化されている、プラスミドｐＲＥＰ４  （ストラタジーン（Stratagene）から入手できる（プラスミド１））により与えられるヒグロマイシン耐性のような、通常は毒性のある抗生物質の存在下で増殖する能力）。
トランス−スプライスの証明：上記細胞株は、異なる選択マーカー（例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ  Ｎｅｏ（ストラタジーン（Stratagene））により提供されるＧ４１８（ネオマイシン）耐性）、および発現プラスミド１により作成されるプレ−治療用ＲＮＡをコードする発現カセットを有する、第２の発現プラスミド（プラスミド２）でトランスフェクションされる。前述のように、プレ−ｔｈＲＮＡ分子は、アンチセンス結合ドメイン（標的プレ−ｍＲＮＡのＢＰＡを阻止する）、スペーサー領域、分岐点、ピリミジン領域、３’スプライス部位およびマーカーもしくは毒素遺伝子、およびスプライス調節配列を有する。トランス−スプライスされる遺伝子が毒素遺伝子である場合、これらの細胞はあまり長く生存できないと予測される。トランス−スプライスは、マーカータンパク質（マーカー遺伝子の場合）または毒素の発現により証明される。毒素は、抗体により検出できるか、またはハイブリッドｍＲＮＡの存在はＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
トランスフェクションされた細胞は、エル−デイリー（El-Deiry）ら（Ｃｅｌｌ  ７５：８１７−８２５．１９９３）の方法に従う増殖阻害測定法により測定した。細胞を発現プラスミドでトランスフェクションした。コロニーは、Ｇ４１８の存在下での増殖に基づいて選択される。細胞を拡張し、３つの群に分け、以下を含有するプラスミドでトランスフェクションした：ａ）真正毒素遺伝子を有するプレ−ｔｈＲＮＡに結合する標的（ＰＴＭ２）、ｂ）突然変異したまたはアンチセンス配向毒素遺伝子を有するプレ−ｔｈＲＮＡ（ＰＴＭ８）、ｃ）挿入体無し（ｐｃ３．１ベクター対照）、またはｄ）非標的結合（非均一）ＰＴＭであるＰＴＭ４。増殖阻害は、作成される抗生物質耐性コロニーの数の減少として測定される。ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ベースのベクターは、標的細胞でのトランスフェクション遺伝子の構成的高レベルの発現を可能にする。結果を以下の細胞性疾患モデルに示す。まずプラスミド２でそして完全なまたは突然変異した標的プラスミド（プラスミド１）でトランスフェクションした細胞で始めて、逆実験を行うことができる。
細胞性疾患モデル：
ヒト癌の細胞培養モデルを使用して、本発明のプレ−治療用分子を使用することにより、ユニークな遺伝子（プレ−ｍＲＮＡ）を発現する標的細胞の治療的除去（致死）が達成されることを証明した。この系において、肺癌株（Ｈ１２９９）、子宮頸癌に由来する株（ヒーラ（HeLa）Ｓ３）、およびいくつかの膵臓癌株（Ｃ１４６９、Ｃ１９９７、Ｈ１３４およびＣ１６８２）を含む種々の癌細胞株を試験した。これら全ての細胞株は、ＲＴ／ＰＣＲおよび免疫染色測定法により測定するときβＨＣＧ標的分子を発現することが判っている。６０mm組織培養プレートに１×１０5の密度で細胞を蒔き、最低２４時間増殖させた。リプフェクタミン（lipfectamine）（ギブコ社（Gibco-BRL））を使用して標準法により、ＣＭＶおよびＰＴＭベクターＤＮＡ（４ug/プレート）のトランスフェクションを行った。４日目に、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理し、Ｇ４１８（５００ug/ml）を含有する培地に１：１０で通した。Ｇ４１８を含有する新鮮培地を３〜７日毎に補足した。１８日目に、Ｇ４１８選択後に残存したコロニーをＰＢＳ−（シグマ（Sigma））で洗浄し、３：１のメタノール／酢酸溶液に１０分間固定し、１０分間空気乾燥した。次に０．０３％メチレンブルー溶液を１０分間加えてコロニーを染色した。コロニーをＰＢＳ−で洗浄し、空気乾燥し、そして５０細胞を超えるコロニーを計数した。
凡例：
・ヒーラ（HeLa）Ｓ３細胞のトランスフェクション：子宮頸癌由来のヒーラＳ３を、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ培地中で３７℃で５％  ＣＯ2インキュベーター中で増殖させた。リポフェクタミン（lipofectamine）（ギブコ社（Gibco-BRL））を使用して、製造業者の標準法により、トランスフェクションを行った。Ｈ１２９９およびヒーラＳ３細胞を６０mmシャーレに１×１０5の密度で蒔き、少なくとも２４時間増殖させた。細胞をＤＮＡを加えることなくモックトランスフェクションするか、または４μｇの以下のベクターＤＮＡによりトランスフェクションした：ｐｃ３．１−ＰＴＭ２（ｐｃ３．１−にクローン化したＰＴＭ２）、ｐｃ３．１−ＰＴＭ４（ｐｃ３．１−にクローン化したＰＴＭ４）、ｐｃ３．１−ＰＴＭ８（ＤＴＡのアミノ酸５２位にＧｌｙからＧｌｕの突然変異を起こして、全毒素酵素活性を排除する点突然変異の他は、ｐｃ３．１−ＰＴＭ２と同一）、ｐｃＤＮＡ３．１（ベクター対照）、ｐＣＭＶ  ｐ５３（ｐＣＭＶにクローン化したｐ５３）、およびｐＣＭＶ（ベクター対照）。４日目に、トランスフェクションした細胞をトリプシン処理して、Ｇ４１８（５００μg/ml）を含有する培地に１：１０で通した。培地を３〜７日毎に交換して、少なくとも２週間選択を続けた。１８日目に、Ｇ４１８選択後に残存したコロニーをＰＢＳ−（シグマ（Sigma））で洗浄し、メタノール／酢酸溶液（３：１）で１０分間固定し、１０分間空気乾燥した。次に０，０３％メチレンブルーを１０分間加えてコロニーを染色し、次にこれらをＰＢＳ−で洗浄し、空気乾燥して、５０細胞を超えるコロニーを計数した。
ヒーラ（HeLa）Ｓ３（子宮頸癌由来）による最初の実験の結果は以下の通りである：
結果：
0004321877.tif 000011
２重トランスフェクション実験の簡単な説明：細胞をシャーレに入れ、一定量のプラスミド１（ヒグロマイシン耐性を有する標的）、通常２μｇのＤＮＡ、および種々の濃度のプラスミド２（プレ−ｔｈ−ＲＮＡとＧ４１８耐性を含有する）でトランスフェクションする。Ｇ４１８および／またはヒグロマイシンで２〜３週間インキュベートして耐性コロニーの選択。コロニーをメチレンブルーで染色し、計測する。
測定結果−理論値：
１．対照（トランスフェクション無し）−コロニー無し
２．対照（２μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー
３．対照（毒素遺伝子［欠失しているかまたは突然変異している］の無い２μｇのプラスミド２、および２μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー
４．２μｇのプラスミド１および２μｇのプラスミド２−２０〜５０コロニー
５．２μｇのプラスミド１および２０μｇのプラスミド２−２〜５コロニー
結論：プラスミド２（プレ−ｔｈＲＮＡ分子中に機能性毒素遺伝子を含有する）は、これらの細胞の増殖を阻害する。
交互トランスフェクション実験の簡単な説明：細胞をシャーレに入れ、種々の濃度のプラスミド２（プレ−ｔｈ−ＲＮＡとＧ４１８耐性を含有する）でトランスフェクションする。Ｇ４１８および／またはヒグロマイシンで２〜３週間インキュベートして耐性コロニーの選択。コロニーをメチレンブルーで染色し、計測する。
測定結果−理論値：
１．対照（トランスフェクション無し）−コロニー無し
２．対照（４μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー
３．対照（毒素遺伝子［欠失しているかまたは突然変異している］の無い４μｇのプラスミド２、および４μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー
４．４μｇのプラスミド１および４μｇのプラスミド２−２０〜５０コロニー
５．４μｇのプラスミド１および２０μｇのプラスミド２−２〜５コロニー
結論：プラスミド２（プレ−ｔｈＲＮＡ分子中に機能性毒素遺伝子を含有する）は、これらの細胞の増殖を阻害する。
細胞増殖阻害は、毒素の発現の結果であり。２本鎖ＲＮＡが細胞内に存在する時に予測されるようなサイトカイン（例えばインターフェロン）産生の結果ではないことを証明するために、対照実験を行う。これらの実験において、結合性がなくなるように結合ドメインを変化させるか、フレームシフトナンセンス点突然変異の挿入、もしくはアンチセンス配向の毒素遺伝子の挿入により発現できなくなるように、毒素遺伝子を突然変異させる（しかし、残りの作製体は変化がない）。プラスミド１と結合ドメインの無いまたは発現できない毒素遺伝子を有するプラスミド２でトランスフェクションした細胞は、プレ−ｔｈＲＮＡ作製体の無い細胞と同様に増殖する。
混合細胞実験を行う。これらには、プラスミド１の無い細胞を、プラスミド１を有する細胞とともにプラスミド２でトランスフェクションする研究を含む。最終集団は、Ｇ４１８（プラスミド２が与える耐性）の存在下で充分増殖するが、選択的物質１の存在下では増殖しない（両方のプラスミドを含有する細胞は、トランス−スプライスされた毒素により排除される）。隣接する細胞内での毒素の発現は、標的ではない細胞の生存に影響を与えないことを証明するために、追加の混合培養を行ってもよい。
例７：動物実験
第１相（マウス）
誘導性プレ−ｔｈＲＮＡプラスミドで形質転換した細胞をマウスに投与する。これらの細胞は、上記の細胞培養モデルで成長させ、トランス−スプライス可能な作製体の前で誘導性プロモーターを有する、病気になった動物を得る。次にベクターを誘導し、毒素を発現させて疾患細胞を死滅させると動物は健康なままである。この後者の点は、毒素遺伝子の誘導は全身的な副作用を有さないことを証明するのに重要である。疾患細胞の一部はまた誘導後まもなく調べて、毒素遺伝子発現の証拠について抗体で検索し、逆転写ＰＣＲを行ってトランス−スプライスが起きたことを証明する。長期の生存と可能な毒性についてマウスを追跡する。無胸腺マウスを使用して、ヒト細胞を増殖させる。あるいは、電気穿孔法またはリポソームによりＰＴＭを投与することもできる。
第２相−治療用概念の証明
この相では、形質転換していない疾患細胞を有する動物を使用する（好ましくは、無胸腺マウス中のヒト細胞）。ベータＨＣＧを発現するヒト膵臓または肺癌細胞を、前述の実験について開発したＰＴＭとともに使用する。上記細胞モデルで使用したパピローマウイルス１８型の標的領域を含有するヒト子宮頚癌細胞を使用することができる。ヒト膵臓癌または子宮頚癌を有する無胸腺マウスに、送達可能な型のプレ−治療用ＲＮＡ作製体を注入する化または電気穿孔を行う。対照動物には、発現不可能な毒素遺伝子を有するプレ−ｔｈ−ＲＮＡすなわちシャム（非標的結合）プレ−ｔｈ−ＲＮＡを投与する。前述のように長期生存と毒性について動物を調べる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
0004321877.tif 000018
【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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