(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化エストロゲン混合物の製造方法であって、
（ａ）一般式III：
【化１】
0004361976.tif 000005
〔式中、Ｒ1は、シリル（アルキル）3又はテトラヒドロピラニルであり；
Ｒ2とＲ3は一緒になってＯを表すか；
あるいはＲ2とＲ3は一緒になってアセタール又は環状アセタールを表す〕
を有する化合物を、エチレンジアミンのリチウム塩、又はジメチルスルホキシド中のリチウムアミドで、一般式Ｉ：
【化２】
0004361976.tif 000006
〔式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は先に定義の通りである〕
の化合物に部分異性化するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた化合物を変換する（ここで、Ｒ1置換基はＨとなり、Ｒ2とＲ3は一緒になってＯを表す）ステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた化合物を硫酸化するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）で得られた化合物を、１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７α−エストラジオール及び１７β−エストラジオールからなる群の１種以上のモノアシル誘導体との混合物として硫酸化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）が、テトラヒドロフランと混合したエチレンジアミンのリチウム塩で異性化することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ2とＲ3が一緒になってＯを表す、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸化エストロゲン混合物の製造法、より特定的には、３−ヒドロキシ−エストラ−１，３，５（１０），８（９）−テトラ−エン−１７−オンを含む混合物〔δ（８，９）−デヒドロエストロン；δ（８，９）ＤＨＥ；δ（８）−エストロン；８，９−デヒドロエストロン；ＣＡＳ第６１６１２−８３−７〕の硫酸化に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エストロンのδ（８，９）誘導体〔δ（８，９）ＤＨＥＳ〕の硫酸ナトリウムは、天然抱合型エストロゲン組成物、例えば、ホルモン代謝療法に用いられている市販製品プレマリン（登録商標）中に約３〜４％という微量で存在する。
【０００３】
天然抱合型エストロゲン組成物においては、エストロン硫酸ナトリウムの他に数種の成分、例えば、エキリン硫酸ナトリウム（２２．５〜３０．５％）、１７α−ジヒドロエキリン硫酸ナトリウム（１３．３〜１９．５％）、１７β−ジヒドロエキリン硫酸ナトリウム（０．５〜４．０％）、１７α−エストラジオール硫酸ナトリウム（２．５〜９．５％）、１７β−エストラジオール硫酸ナトリウム（<４．５％）及びδ（８，９）−デヒドロエストロン硫酸ナトリウム（<１２．５％）が同定されている（米国薬局方，１９９５，６２７ページ）。
【０００４】
ＳＣＲＩＰ第２０４９号（１９９５）の１５ページに、微量のδ（８，９）ＤＨＥＳが抱合型エストロゲンの作用に有意に関与し得ることが示唆されている。さらに、エストロゲン受容体に対する親和性が比較的低いδ（８，９）ＤＨＥＳは、高い機能性を有し、報告されている抱合型エストロゲン、特にプレマリン（登録商標）のＬＤＬ−コレステロール減少特性及び心血管作用になんらかの役割を果たしている可能性があることも示唆されている。δ（８，９）ＤＨＥＳがプレマリンの循環性エストロゲンの約１８％を構成することがデータから明らかになっている。従って、硫酸化δ（８，９）ＤＨＥ混合物を容易に製造し得る方法を得ることが重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
Ｊ．Ｃ．Ｊａｃｑｕｅｓｙら，Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．７６ （１９７２），１５４０００ｆにより、面倒な全合成ではなく、高酸性媒体中でエキリンを異性化する方法が開示された。δ（８，９）ＤＨＥへの変換は、−３０℃でフッ化水素又はフッ化水素／フッ化アンチモンを用いて行なわれた。そのような危険な反応条件はδ（８，９）ＤＨＥの大量生産には全く不適であり且つ許容し得ないものであることは明らかである。さらに、Ｊａｃｑｕｅｓｙの方法を用いた米国特許第５，３９５，８３１号において、該フッ化水素法では純粋なδ（８，９）ＤＨＥが得られないばかりか、１０％もの不要なδ（９，１１）異性体も生成することが明らかにされた。従って、エキリンの異性化を介するか否かに拘わらず、商業的に許容し得る製造法はまだ開示されていない。
【０００６】
ステロイドの硫酸エステルの合成法が文献に記載されている。Ｊｅｎｋｉｎｓ及びＳａｎｄｂｅｒｇ（Ｍｅｔｈｏｄｓ of Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５，３５１−３５８，１９６９）に概説されているように、該方法の１つは、ピリジン／硫酸複合体を用い、モノ−及びジヒドロキシ Ｃ−１８及びＣ−１９ステロイド化合物を硫酸化することを含む。しかし、この方法は、他のステロイド化合物を含まない単一のステロイド化合物に適用された。
【０００７】
本発明の方法は、単一の反応混合物中で、数種の硫酸化エストロゲンを特定の比率で得ることができるという利点を有している。驚くべきことには、天然抱合型エストロゲン製剤中に存在するエストロゲンが結晶化挙動や溶解度などの異なる物性を有し、硫酸化反応混合物中の硫酸化生成物の比率が投入される成分の量を反映していることが知見された。従って、硫酸化エストロゲン混合物を製造するには、ワンポット（one pot）反応で十分である。さらに、適切な場合には、該反応の後、そのまま、δ（８，９）ＤＨＥを製造する異性化反応、即ちエキリン又はその誘導体の前記誘導体への異性化を行うことができる。該反応においては、エキリン又はその誘導体をエチレンジアミンのリチウム塩又はジメチルスルホキシド中のリチウムアミドで処理する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、エキリン又はその誘導体の異性化により得られるδ（８，９）ＤＨＥ又はその誘導体を含むエストロゲン混合物を硫酸化することによる、δ（８，９）ＤＨＥを含む硫酸化ステロイド混合物の最初の容易且つ低コスト製造法を提供する。
【０００９】
従って、一般式Ｉ：
【００１０】
【化７】
0004361976.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｒ1はＨであり；
Ｒ2はＨで、Ｒ3はＯ−アシルであるか；又は
Ｒ3がＨで、Ｒ2がＯ−アシルであり；あるいは
Ｒ2とＲ3は一緒になってＯを表す〕
の化合物を含むエストロゲン混合物は、一般式II：
【００１２】
【化８】
0004361976.tif 000003
【００１３】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は先に定義の通りであり；７−８位の破線は任意の二重結合を表す〕
の化合物群から選択される１種以上の化合物との混合物として硫酸化し得る。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、式Ｉ及び／又は式IIのＲ2及びＲ3は一緒になってＯを表す。δ（８，９）−エストロンをエキリンとの混合物として硫酸化するのがより好ましい。
【００１５】
本発明の別の実施態様によれば、一般式IIの化合物は、１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７α−エストラジオール及び１７β−エストラジオールの硫酸エステルなどの天然抱合型エストロゲン混合物中に存在する微量成分の１種以上の前駆体である。
【００１６】
反応混合物中の該化合物の比率は、経済的な理由を除いては重要ではないが、好ましい比率は、天然混合物中に存在する場合の比率と同じである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
一般式Ｉの化合物は、式III：
【００１８】
【化９】
0004361976.tif 000004
【００１９】
〔式中、Ｒ1はシリル（アルキル）3又はＯ−テトラヒドロピラニルであり、Ｒ2及びＲ3は一緒になってＯを表すか；あるいは、Ｒ2とＲ3は一緒になってアセタール若しくは環状アセタールを表す〕
で示されるエキリン及び前記誘導体を異性化することにより製造し得る。
【００２０】
式の定義に用いられている用語「アルキル」とは、好ましくは１〜７個の炭素原子を有する分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、例えば、ヘキシル、イソブチル、第３級ブチル、プロピル、イソプロピル、エチル及びメチルを意味する。シリル（アルキル）3はＳｉ（Ｍｅ）2第３級ブチルであるのが好ましい。用語「アシル」とは、アルキルカルボン酸（そのアルキル部分は先に定義の意味を有する）由来又はギ酸由来のアシル基を意味する。アセタールは、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアルコール由来である。
【００２１】
混合アセタール又は混合ヘミチオアセタールとも等価の「テトラヒドロピラニル」という用語は、Ｔｈ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｗｕｔｓにより，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９１）第２章，１４−８７ページに記載されているように、例えば、エトキシエチル、メトキシエチル（ＭＯＭ）、メチルメトキシエチル、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、テトラヒドロフラニル、メチルチオメチル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオフラニル又はエーテル、例えばメチル及びｔ−ブチルを意味する。
【００２２】
異性化は、エチレンジアミンのリチウム塩を用いて実施し得る。この方法により、極めて純粋なδ（８，９）ＤＨＥが得られる。そのようなリチウム塩は、エチレンジアミンをリチウム又はアルキルリチウム、好ましくはメチルリチウムで処理して製造し得る。テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの（補助）溶媒を加えてもよい。（補助）溶液を加えると、通常、δ（８，９）ＤＨＥとエキリンの誘導体混合物が得られる。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のリチウムアミドによってもδ（８，９）ＤＨＥとエキリン又はその誘導体の混合物が得られる。本発明に従って該混合物をその硫酸ナトリウムに変換して抱合型エストロゲンを含む医薬組成物の製造に用いる。
【００２３】
Ｃ３位はテトラヒドロピラニルエーテルが占めるのが好ましい。というのは、そのようなエーテルは、芳香族基上で容易に製造し得、異性化条件下に安定であり、且つ、異性化後に、硫酸化用のヒドロキシル基を製造するために容易に除去し得るからである。
【００２４】
式IIIにおいてＲ1がシリル（アルキル）3である場合、異性化は、好ましくは約０〜９０℃の温度で行う。より好ましくは、エキリン又はその誘導体をエチレンジアミンのリチウム塩で処理する場合には約３０℃の温度で、またエキリン又はその誘導体をジメチルスルホキシド中のリチウムアミドで処理する場合には約６５℃で行う。一方、Ｒ1がテトラヒドロピラニルである場合、補助溶媒としてＴＨＦを用い、約−７８〜５０℃の温度、好ましくは約０〜−２０℃の温度で、基質混合物及び上記溶媒をエチレンジアミンのリチウム塩で処理する。
【００２５】
異性化反応を部分的にのみ行う場合、一般式IIIの化合物とδ（８，９）誘導体の混合物を形成し、該混合物をさらに処理して、硫酸化抱合型エストロゲン混合物を得る。場合によって、さらに一般式IIの誘導体を加えてもよく、１回の反応で全ての化合物を同時に硫酸化し得る。本発明に従って異性化・硫酸化するのに好ましい化合物は、式中、Ｒ2とＲ3が一緒になってＯを表す化合物である。
【００２６】
式IIIの化合物において、Ｒ1がシリル（アルキル）3又はテトラヒドロピラニルを表す場合、該誘導体を異性化し、次いで、Ｔｈ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．ＷｕｔｓによりＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９１），第２章，１４−８７ページに記載されているように、ＴＨＦ、アセトン、塩化メチレン、エタノールなどの補助溶媒を用い、稀（≦０．２Ｎ）塩酸、５０％酢酸などの穏和な酸で処理するか、又は塩化メチレン中のヨウ化トリメチルシリル／臭化トリメチルシリル；アセトン、Ｈ2Ｏ、ＮａＨＣＯ3中のヨウ化メチル；ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム、ｔ−ブタノール；塩化メチレン中のフッ化テトラブチルアンモニウム；アセトン中のＡｇＮＯ3などの中性条件下に該誘導体を処理して加水分解し、式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物と式III（式中、Ｒ1はＨである）の化合物との混合物を得る。
【００２７】
このようにして得られたエストロゲン誘導体混合物は、本発明に従い、１７α−ジヒドロエキリン、１７β−ジヒドロエキリン、１７α−エストラジオール及び１７β−エストラジオールからなる群の１種以上のアシル誘導体との混合物として硫酸化し得る。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００２９】
実施例１
窒素雰囲気下に９５℃でエチレンジアミン（９２０ｍｌ）にリチウム（１３ｇ）を少しずつ加え、混合物を３０分間１００℃で攪拌した。反応混合物を２３℃に冷却した後、エキリン（１００ｇ）を≦３０℃の温度で加えた。混合物を３０℃でさらに２時間攪拌した。懸濁液を氷水（２．５Ｌ）中に注ぎ、ｐＨが７になるまで≦２５℃で酢酸を加えた。水性層を酢酸エチル（２．５Ｌ）で３回抽出した。有機層を水で洗浄し、活性炭素〔Ｎｏｒｉｔ（登録商標）〕（５ｇ）を加え、懸濁液を２１℃で３０分間攪拌した。懸濁液をジカライト（dicalite）を通して濾過し、約５００ｍｌ容量になるまで濾液を真空蒸発させた。懸濁液を０℃で１時間攪拌した後、結晶性物質を濾去し、酢酸エチルで洗浄、４０℃で真空乾燥し、約９５％の純度を有するδ（８，９）−デヒドロエストロン（８１ｇ）を得た。
【００３０】
1Ｈ−ＮＭＲ分光分析法を用い、δ（８，９）ＤＨＥ及びエキリンの含有量を定量した。その特徴的ピークは、δ（８，９）ＤＨＥの場合には０．９０ｐｐｍ（Ｃ１８）、エキリンの場合には５．５３ｐｐｍ（Ｃ７）及び０．７９（Ｃ１８）である。
【００３１】
実施例２
ＤＭＳＯ（１５０ｍｌ）中のエキリン（５ｇ）の混合物にリチウムアミド（５ｇ）を加えた。混合物を６５℃に加熱し、７０分間攪拌した。反応混合物を水（５００ｍｌ）中に注ぎ、４Ｎの塩酸を用いてｐＨを６．５に酸性化した。結晶を濾去し、水で洗浄、４０℃で真空乾燥して、エキリンとδ（８，９）−デヒドロエストロンの１：１混合物（５ｇ）を得た。
【００３２】
実施例３
窒素雰囲気下に約２５℃の温度で、ジエチルエーテル（２３．５ｍｌ）中のメチルリチウム−リチウムブロミド複合体の６％溶液を約１５分かけてエチレンジアミン（４６ｍｌ）に加えた。混合物の温度を５５℃に温め、ジエチルエーテルを蒸留除去した。次いで、反応混合物を５５℃で１時間攪拌した。混合物を２０℃に冷却し、エキリン（２．５ｇ）を加えた。混合物を３０℃でさらに９０分間攪拌した。
【００３３】
懸濁液を氷水中に注ぎ、混合物を酢酸エチルで抽出した。容量が２０ｍｌになるまで酢酸エチル抽出物を蒸発させた後、０℃に冷却し、結晶性δ（８）−エストロン（２ｇ）を単離した。
【００３４】
実施例４
窒素雰囲気下に１００℃で、エチレンジアミン（８０ｍｌ）にリチウム（１．１ｇ）を少しずつ加え、混合物を３０分間１００℃で攪拌した。反応混合物を２３℃に冷却した後、１７β−ジヒドロエキリン（４ｇ）を≦３０℃の温度で加えた。混合物を３０℃でさらに４時間攪拌した。懸濁液を氷水（２５０ｍｌ）中に注ぎ、ｐＨが７になるまで≦２５℃の温度で酢酸を加えた。懸濁液を５℃に冷却し、結晶を濾去した。結晶を水（１５０ｍｌ）に懸濁し、酢酸エチル（１００ｍｌ）を加えた。層を分離し、容量が２０ｍｌになるまで酢酸エチル溶液を真空蒸発させた。懸濁液を−１５℃で１時間攪拌した後、結晶を濾去し、酢酸エチルで洗浄、４０℃で真空乾燥して、≧９５％の純度を有する８，９−デヒドロ−１７β−エストラジオール（２．５ｇ）を得た。
【００３５】
実施例５
窒素雰囲気下に３６℃で、エチレンジアミン（４０ｍｌ）にジエチルエーテル中のメチルリチウム−リチウムブロミドの溶液（２０ｍｌ，２．１Ｍ）を１０分かけて加えた。混合物の温度を５５℃に温め、ジエチルエーテルを蒸留除去した。混合物を５５℃で１時間攪拌した。反応混合物を３℃に冷却した後、エキリン−３−メチルエーテル（２ｇ）を≦１０℃の温度で加えた。混合物を１２℃でさらに２時間攪拌した後、氷水（２００ｍｌ）を加えた。混合物に、ｐＨが８になるまで酢酸を加えた。懸濁液を１５℃で１時間攪拌した後、結晶を濾去し、水で洗浄、４５０℃で真空乾燥して、約８０％の純度を有する８，９−デヒドロ−エストロン−３−メチルエーテル（２．０ｇ）を得た。
【００３６】
実施例６
実施例５に記載の手順に従い、３０℃で、１７β−ジヒドロエキリン ３，１７−ジアセテートをメチルリチウム／エチレンジアミンで処理して、定量的に約９０％の純度を有する８，９−デヒドロ−１７β−エストラジオールを得た。
【００３７】
実施例７
実施例４に記載の手順に従い、エキリン−１７−ネオペンチルアセタールを２０℃でリチウム／エチレンジアミンで処理し、約９０％の純度を有する８，９−デヒドロ−エストロン−１７−ネオペンチルアセタールを９０％の収率で得た。
【００３８】
実施例８
実施例４に記載の手順に従い、１７β−ジヒドロエキリン−３，１７−ジ（トリメチルシリルエーテル）をリチウム／エチレンジアミンで処理して、定量的に約９０％の純度を有する８，９−デヒドロ−１７β−エストラジオールを得た。
【００３９】
実施例９
塩化メチレン（８０ｍｌ）中のエキリン（５ｇ）の懸濁液に、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１３．３ｍｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（３６ｍｇ）を０℃で加えた。混合物を０℃で９０分間攪拌した後、トリエチルアミン（１．３ｍｌ）を加えた。反応混合物を水で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固した。粗なエキリン−３−テトラヒドロピラニルエーテル（６．５ｇ）を異性化に用いた。
【００４０】
実施例１０
窒素雰囲気下に３６℃で、エチレンジアミン（１６．２ｍｌ）にジエチルエーテル中のメチルリチウム−リチウムブロミドの溶液（８．１ｍｌ，２．１Ｍ）を１０分かけて加えた。混合物の温度を５５℃に温め、ジエチルエーテルを蒸留除去した。混合物を５５℃でさらに１時間攪拌し、次いで、３℃に冷却した。テトラヒドロフラン（３４．４ｍｌ）を加えた後、混合物を−１０℃に冷却し、エキリン−３−テトラヒドロピラニルエーテル（１．１５ｇ）を≦−５℃の温度で加えた。混合物を−１０℃でさらに３時間攪拌した後、氷水（４５ｍｌ）を加えた。次いで、テトラヒドロフランを真空下に蒸留除去し、残留懸濁液を１５℃で１時間攪拌した。結晶を濾去し、水で洗浄、４５℃で真空乾燥して、δ（８，９）−デヒドロ−エストロン−３−テトラヒドロピラニルエーテル（１．０ｇ）を得た。
【００４１】
実施例１１
酢酸／アセトン／水（４：２：１，３５．７ｍｌ）中のδ（８，９）−デヒドロ−エストロン−３−テトラヒドロピラニルエーテル（０．７３ｇ）の懸濁液を加熱還流させ、還流温度で９０分間攪拌した。２０℃に冷却した後、水（３６．５ｍｌ）を加え、結晶性生成物を濾過し、水で洗浄、真空乾燥して、δ（８，９）−デヒドロ−エストロン（０．４６ｇ）を得た。
【００４２】
実施例１２
硫酸（８．２ｍｌ）及び無水酢酸（１４．５ｍｌ）を、窒素雰囲気下に<３０℃の温度でピリジン（８０ｍｌ）に加えた。混合物を５０℃で１時間攪拌し、トロメタモール（０．６ｇ）を加え、混合物を清澄になるまで攪拌した。δ（８，９）−デヒドロエストロン（４ｇ）及び１７α−ジヒドロエキリンモノアセテート（２０．２ｇ）、次いでピリジン（２１ｍｌ）を加え、混合物を５０℃で３時間攪拌した。反応完了後、混合物を５℃に冷却し、ジエチルエーテル（３００ｍｌ）ですり砕くと、油層と上層が形成された。上層をデカントし、残留物をメタノール（３７５ｍｌ）に溶解した。メタノール（０．３Ｌ）中の水酸化ナトリウム（１２．８ｇ）の溶液を加え、混合物を還流温度で２．５時間攪拌した。反応完了後、混合物を２０℃に冷却し、ｎ−ブタノール（０．６５Ｌ）と水（０．１５Ｌ）の混合物を加えた。メタノールを真空蒸発させ、有機層を水性５％塩化ナトリウムと水で洗浄した。有機層を蒸発乾固した後、残留物を１００％エタノール（０．２９Ｌ）に６０℃で溶解し、混合物を活性炭素（０．６ｇ）の存在下に３０分間６０℃で攪拌した。懸濁液を濾過し、濾液を真空下に部分濃縮した。溶液を１０℃に冷却し、ジエチルエーテル（０．２７Ｌ）ですり砕いた。沈降物を濾去し、ジエチルエーテルで洗浄、真空乾燥して、δ（８，９）−デヒドロエストロン硫酸ナトリウムと１７α−ジヒドロエキリン硫酸ナトリウムの１：５混合物（１５．５ｇ）を得た。ＧＬＣ分析にかけると、装入した全てのステロイドが完全に回収されたことが示された。
【００４３】
実施例１３
実施例１２に記載の手順に従い、δ（８，９）−デヒドロエストロン（１２．５ｇ）とエキリン（１２．５ｇ）の混合物を硫酸／無水酢酸／ピリジンで硫酸化した。粗な硫酸ピリジンをけん化し、実施例１２に記載のように硫酸ナトリウムとメタノール中の水酸化ナトリウムの対応混合物に変換し、δ（８，９）−デヒドロエストロン硫酸ナトリウムとエキリン硫酸ナトリウムの１：１混合物（２７．５ｇ）を得た。ＧＬＣ分析にかけると、装入したステロイドが完全に回収されたことが示された。
【００４４】
実施例１４
実施例１２に記載の手順に従い、δ（８，９）−デヒドロエストロン（６．１ｇ）、１７α−ジヒドロエキリンモノアセテート（３５．８ｇ）、１７β−ジヒドロエキリンモノアセテート（３．５ｇ）、１７α−エストラジオールモノアセテート（９．５ｇ）及び１７β−エストラジオールモノアセテート（１．２ｇ）の混合物を、硫酸／無水酢酸／ピリジンで硫酸化した。粗な硫酸ピリジン混合物をメタノール中の水酸化ナトリウムで処理し、実施例１２に記載のようにワークアップして、δ（８，９）−デヒドロエストロン硫酸ナトリウム：１７α−ジヒドロエキリン硫酸ナトリウム：１７β−ジヒドロエキリン硫酸ナトリウム：１７α−エストラジオール硫酸ナトリウム及び１７β−エストラジオール硫酸ナトリウムの６：８：１：３１：３混合物（４４．４ｇ）を得た。ＧＬＣ分析にかけると、装入した全てのステロイドが完全に回収されたことが示された。