(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸のアミノ基を保護したＮ保護グルタミン酸無水物を、ジメチルスルホキシドを用いて当該無水物のγ位を選択的にエチルアミド化させてＮ保護テアニンとし、次いでＮ保護基を脱離させる工程を有するテアニンの製造方法。
【請求項２】
グルタミン酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）で保護したＺ−グルタミン酸無水物を、ジメチルスルホキシドを用いて当該無水物のγ位を選択的にエチルアミド化させてＺ−γ−エチルアミドグルタミン酸とし、次いでベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）を脱離させてテアニンとする工程を有するテアニンの製造方法。
【請求項３】
次の１）〜２）の工程を有するテアニンの製造方法。
１） グルタミン酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）で保護したＺ−グルタミン酸無水物を、エチルアミン塩酸塩とトリエチルアミン又は炭酸水素ナトリウムの混液とともに、ジメチルスルホキシド中に加えてＺ−γ−エチルアミドグルタミン酸を合成する工程、
２） 得られたＺ−γ−エチルアミドグルタミン酸のＺ基を脱離させる工程。
【請求項４】
上記のＺ−グルタミン酸無水物は、無水酢酸中にＺ-グルタミン酸を加え、この溶液を１０分〜４０分かけて５０℃〜６０℃まで加温するとともに、その温度を保持しつつ１０分〜３０分攪拌し、この反応溶液を濃縮して得ることを特徴とする請求項２又は３に記載のテアニンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ペプチド合成によりＬ−グルタミン酸−γ−エチルアミド（Ｌ−テアニン）を製造する方法であって、特に食品添加剤として安全に使用できるテアニンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
お茶のうま昧成分として知られているテアニンは、カフェイン興奮抑制作用、血圧降下作用、リラックス作用、脳機能改善作用などの有用性が知られている。しかし、茶葉中に含まれるテアニン量はわずかに０．５〜２重量％で、茶ポリフェノールが１０〜１５重量％含まれているのに比べると非常に少ない。よって、茶葉から抽出したテアニンを産業的に利用することは量的にもコスト的にも実用的でなく、従来から食品添加物や医薬品原料として安価で安全なテアニン製造方法が求められてきた。
【０００３】
従来のテアニンの化学合成法としては、実験室的製法として、グルタミン酸を塩酸存在下で無水エタノールと振り混ぜた後、低温下で過剰の塩酸とエタノールとを除き、析出した塩酸塩をメタノールに溶かし、この溶液に計算量のアンモニアを加えて冷却してＬグルタミン酸−γ−エチルエステルを得、これをクロロカルボキシル酸ベンジルエステルと反応させてＮカルボキシベンジル−Ｌグルタミン酸−γ−エチルエステルとし、次にこれをエチルアミンと反応させてＮ保護カルボキシベンジル−Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルアミドとし、次いで白金触媒下で水秦添加してＬ−グルタミン酸−γ−エチルアミド（Ｌ−テアニン）を得る方法が開示されている（酒戸弥二郎ら：日農化誌23,269(1950)）。
工業的製法としては、例えば特開平５−７０４１９号公報等において、Ｌ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基をベンジル化して保護すると共に、アミノ基をトリチル化して保護し、これをペプチド合成の出発原料とするテアニンの製造方法等が開示されている。
【０００４】
しかしながら、従来の製法の多くは、高純度のテアニンを得られたとしても工程数が多く煩雑でしかも収率が低く、得られるテアニンは高価なものとなってしまうのが現実であった。例えば、グルタミン酸をペプチド合成の出発原料に使用する場合、γ−カルボキシル基をベンジルエステルで保護するのが一般的であったが、ベンジル基の脱離が困難であるため、工程数が多くなるか、工程時間が長くなるか、或いは反応の条件が過酷となるなどの問題があった。
一方、得られたテアニンを食品添加物や医薬品原料として使用することを考慮すると、純度を高くすることは勿論、人体に有害な縮合剤や金属をできるだけ使用しない製法が望まれる。
【０００５】
そこで本発明者らは、より少ない工程で高純度のテアニンを高収率で得ることができ、しかも人体に有害な有機溶媒や金属をできるだけ使用しないテアニンの製造方法を提供すべく、特開２０００−２６３８３号において、グルタミン酸のα位のアミノ基をターシャルブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護し、かつカルボキシル基をターシャルブチルエステル基（ＯｔＢｕ基）で保護してなるグルタミン酸誘導体（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）をペプチド合成の出発原料とし、これを溶媒に溶解し、この溶液に縮合剤と水溶性活性エステル試薬とを加えて尿素誘導体を析出させ、更にエチルアミン塩酸塩とｐＨ調整剤との混液を加えてターシャルブチルオキシカルボニル−γ−エチルアミドグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ）を得、これを酸処理してα位のアミノ基及びカルボキシル基のＯｔＢｕ基を脱離させるテアニンの製造方法を開示した。
【０００６】
本発明は、上記開示方法とは異なる方法、具体的にはグルタミン酸無水物を出発物質とする方法によって、より一層少ない工程で安価かつ高純度のテアニンを高収率で得ることができ、しかも人体に有害な縮合剤や金属をできるだけ使用しないテアニンの製造方法を提供せんとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる目的のための本発明は、グルタミン酸のアミノ基を保護したＮ保護グルタミン酸無水物を、ジメチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」と略す。）を用いて当該無水物のγ位を選択的にエチルアミド化させてＮ保護テアニンとし、当該Ｎ保護基を脱離させてテアニンとするものである。
【０００８】
この製造方法の特徴は、グルタミン酸無水物をペプチド合成の出発原料とした点と、ＤＭＳＯを用いて当該無水物のγ位を選択的にエチルアミド化した点にある。グルタミン酸無水物を出発原料とすれば、保護基は１個だけで済むから、アミノ基とカルボキシル基の両方を保護した出発物質に比べて、保護基の除去工程を軽減することができる。更に、このグルタミン酸無水物は、ＤＭＳＯを用いることで、縮合剤を用いることなく開環及びアミノリシスをなさしめることができるから、その分製造コストを安価にすることができるばかりか、人体に対する安全性も高めることができる。また更に、ＤＭＳＯを用いることでγ位を選択的にすなわちα位よりもγ位をより有利にエチルアミド化させることができ、テアニンの純度及び収率を飛躍的に高めることができる。
【０００９】
本発明において、ペプチド合成の出発原料として用いる「グルタミン酸のアミノ基を保護したグルタミン酸無水物」としては、グルタミン酸のα位のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）で保護したＺ−グルタミン酸無水物（Ｚ−Ｇｌｕ−Ｏ）を用いるのが好ましい。このようにＺ基をアミノ保護基とすれば、保護基の導入や除去が容易であるばかりか、ラセミ化を抑制することもでき、Ｚ−グルタミン酸の結晶性もよい。しかも、接触還元のような温和で無害かつクリーンな方法で保護基を除去することもできる。
但し、本発明で用いるアミノ保護基は、Ｚ基のみに限定されるものではない。そのほか、通常のペプチド合成にアミノ保護基として用いられるもの、例えばターシャルブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基や、その他のウレタン型保護基、ホルミル基やトシル基のようなアシル型保護基、トリチル基のようなアルキル型保護基なども用いることは可能である。Ｂｏｃ基は、エステル化の心配がない点で有利である。
【００１０】
また、本発明において、グルタミン酸無水物のγ位を選択的にエチルアミド化させる具体的方法としては、例えば、Ｚ−グルタミン酸無水物（Ｚ−Ｇｌｕ−Ｏ）を、エチルアミン塩酸塩とトリエチルアミン又は炭酸水素ナトリウムの混液とともにＤＭＳＯ中に加える方法を好ましく例示することができる。ＤＭＳＯ中で無水物は開環し、エチルアミンによりアミノリシスを受ける。この際、α位よりもγ位により優位にエチルアミンが導入される。実際、γ体：α体＝３：１以上の割合でγ体を有利に得ることができることが実験で確かめられている。もっとも、α体とγ体は、シリカゲルクロマトグラフィーを使用すれば分離可能であることも本発明者は見出している。さらに、無水エチルアミンではなくエチルアミンの塩酸塩を用いることにより、通常のペプチド合成を行うときのように非常に穏和な条件下で反応を進めることができるメリットもある。
なお、トリエチルアミン、炭酸水素ナトリウムのいずれも使用することができるが、副生成物の生成が少ない点及び人体に対する安全性の点からすれば炭酸水素ナトリウムが優れている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ここでは、Ｚ−グルタミン酸無水物をペプチド合成の出発原料とし、以下の４工程を経て行うテアニン製造方法について説明する。
１）Ｚ−グルタミン酸の合成
２）Ｚ−グルタミン酸無水物の合成
３）Ｚ−γ−エチルアミドグルタミン酸の合成
４）保護基の脱離及び精製
【００１２】
１）Ｚ−グルタミン酸の合成：グルタミン酸のＺ化
グルタミン酸のＺ化は、現在公知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、塩化ベンジルオキシカルボニル（Ｚ−Ｃｌ）を用いるSchotten-Baumann法のほか、ｐ−ニトロフェニルエステル（Ｚ−ＯＮｐ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｚ−ＯＮＳｕ）その他の活性エステルを用いた方法などを挙げることができる。なお、市販のＺ−グルタミン酸を用いることもできる。
【００１３】
具体的合成例を挙げれば、グルタミン酸（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）、トリメチルアミン（ＮＥｔ３）及び水（Ｈ２Ｏ）を混ぜ合わせた溶液Ａに、ベンジルオキシカルボニルスクシンイミド（Ｚ−ＯＳｕ）、アセトニトリル及びトリエチルアミン（ＮＥｔ３）を混ぜ合わせた溶液Ｂを、攪拌させながら約２０分かけて加え、反応終了後、当該反応溶液に塩酸を加えてｐＨ２に調整し、これを水／酢酸エチルで分液抽出し、必要に応じて塩酸を加えて再び分液抽出し、得られた酢酸エチル層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、これを濾過し、減圧濃縮してオイルを得、氷冷下でエーテルを加えて結晶化させ、結晶を濾取することにより得ることができる。
【００１４】
２）Ｚ−グルタミン酸無水物の合成
無水酢酸中に、Ｚ−グルタミン酸(Ｚ−Ｇｌｕ−ＯＨ)を加え、加温し、得られた溶液を濃縮することによりＺ−グルタミン酸無水物(Ｚ−Ｇｌｕ−Ｏ）を得ることができる。
具体的には、無水酢酸（例えば７５ｍｌ）中に攪拌しながらＺ−グルタミン酸（１０．４ｇ）を加えて攪拌する（この際、溶液は懸濁する。）。この懸濁溶液の温度を非常にゆっくり（１０分〜４０分、好ましくは２５分〜３５分、中でも好ましいのは略３０分かけて）、約５０℃〜６０℃、好ましくは約５５℃付近まで上昇させ、この温度で約１０〜３０分、好ましくは１５分〜２５分、中でも好ましいのは約２０分間程度攪拌し続ける（溶液は透明になる）。反応終了を薄層クロマトグラフィー（以下「ＴＬＣ」と略す。）で確認した後、溶媒を濃縮し、得られたオイル状の物質を結晶化させることによりＺ−グルタミン酸無水物を得ることができる。
【００１５】
３）Ｚ−γ−エチルアミドグルタミン酸の合成
Ｚ−グルタミン酸無水物をＤＭＳＯに溶かす一方、エチルアミン塩酸塩とトリエチルアミン又は炭酸水素ナトリウムの混液をＤＭＳＯに溶かし、両方の溶液を加えて室温で２０分間攪拌し、その後抽出・精製を行えば、目的のＺ−γ−エチルアミドグルタミン酸を得ることができる。なお、この際使用するＤＭＳＯは、モレキュラーシーブ等で充分に乾燥させておく必要がある。
抽出・精製方法としては、例えば、炭酸水素ナトリウム（飽和１０ｍｌ）と水１０ｍｌとを加え、水層をジクロロメタルで数度（例えば２度）抽出し、水層がＰＨ１になるように酸性にする。その後、酢酸エチルで数度（例えば３度）抽出し、酢酸エチル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を除去し、残渣のオイルを得た。そしてこのオイルを少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカラムで分離精製すれば、白色結晶のＺ−γ−エチルアミドグルタミン酸を得ることができる。この際、酢酸エチルと酢酸（１００：１）とで、早く溶出する方がα体（α位がエチルアミド化）で、遅く溶出する方がγ体（γ位がエチルアミド化）となるが、上記の方法によれば、γ体：α体＝３：１以上の割合でγ位がエチルアミド化したγ体をより有利に得ることができる。
なお、溶出方法としては、溶離液を酢酸エチルのみで溶出させた後、その後５％メタノール酢酸エチル溶液、更にメタノール溶液で溶出させ、それぞれの分画溶液をＴＬＣで確認後、溶離液を濃縮するという方法も挙げることができる。
【００１６】
４）保護基の脱離及び精製
Ｚ基の除去は、接触還元（水素添加）が温和で無害かつクリーンな方法である点で好ましい。具体的には、Ｚ−γ-エチルアミドグルタミン酸を、塩酸を含むジオキサン溶液中でパラジウム等により接触還元すればよい。
なお、Ｚ基の除去は、上記接触還元のほか、液体ＨＦやスルホン酸類またはＨＢｒ／ＡｃＯＨなどの酸処理によっても行うことができる。
【００１７】
Ｚ基を脱離した後は、パラジウム等を濾過し、溶媒を濃縮した後、エーテルで結晶化し、その後イオン交換樹脂（陽イオン交換樹脂：アンバーライトＩＲ−１２４，Ｄｏｗｅｘ５０ｗ−ｘ１２）で精製すればよい。
【００１８】
（試験）
本試験では、Ｚ-Ｇｌｕ  ａｎｈｙｄｅｒｉｄｅ（無水物）の合成における反応時間と収率との関係について検討した。
【００１９】
１５ｍｌの無水酢酸にＺ−グルタミン酸（Ｚ−Ｇｌｕ−ＯＨ）１．９６９ｍｇを激しくかき混ぜながら加えて懸濁液を作成し、この懸濁液の温度をウォーターバスで室温〜５５℃まで所定時間（１０分、３０分、６０分）かけて上昇させた。そして、固体が全部溶解した後、２０分〜６０分間その温度を保って攪拌した。
その後、溶媒を減圧濃縮し、オイルを減圧デシケーター内の蒸発皿にて水酸化ナトリウムを入れたものと一緒に乾燥させた。
結晶化は、冷却しながらイソプロピルエーテル／石油エーテル（１／１，ｖ／ｖ）を少量ずつ加え、攪拌し続けた後、１時間で室温まで戻して結晶化させ、得られた結晶を冷却した石油エーテルで洗浄した。
下記表１には、昇温時間、反応時間及び収率の関係を示した。なお、表中の−は結晶として得ることができなかった結果を示している。
【００２０】
【表１】
0004290844.tif 000002
【００２１】
この結果、Ｚ−グルタミン酸無水物を得るためには、懸濁溶液の温度を非常にゆっくり（約３０分間かけて）５５℃まで上昇させ、この温度で２０分間程度攪拌し続けるのがよいことが判明した。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の製造は、ペプチド結合の出発物質として無水物を用いることで、カルボキシル保護基の導入・脱離工程を省くことができ、より一層少ない工程で高純度のテアニンを得ることができる。しかも、エチルアミンの導入は、無水物のアミノリシスによる開環反応で行うから、縮合剤を必要とせず、人体に対して安全であるばかりか、製造コストを非常に安価にすることができる。
また、アミノ基の保護基がＺ基１個だけで済み、しかもＺ基の脱離反応も接触還元（水素添加）で簡単に行うことができるメリットがある。
更に、人体に有害な有機溶媒や金属をほとんど使用してないから、食品添加物や医薬品原料として好適に利用することができる。