(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア属に属し、Ｌ−ヒスチジンの生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ヒスチジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−ヒスチジンを採取することを特徴とする、Ｌ−ヒスチジンの製造法。
【請求項２】
アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれら物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、請求項１記載のＬ−ヒスチジンの製造法。
【請求項３】
微生物がエシェリヒア・コリＨ−９３４１(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４)である、請求項１記載のＬ−ヒスチジンの製造方法。
【請求項４】
Ｌ−ヒスチジンの生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有するエシェリヒア属に属する微生物。
【請求項５】
アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれら物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、請求項４記載の微生物。
【請求項６】
エシェリヒア・コリＨ−９３４１(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、発酵法によるアミノ酸の工業的に効率の良い製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖から直接Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させる直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アースロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変異株を用いる方法が知られている。例えばＬ−アミノ酸生産性変異株としては、アミノ酸等の栄養要求性を有した菌株（特公昭５６-１００３７）、アミノ酸のアナログやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特開昭５６-１３４９９３、特開昭６２-４４１９３）、栄養要求性変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特開昭５０-３１０９３、特開昭５６-１３４９９３）、分解能の低下した菌株（特開昭６３-２７３４８７、特公昭５２-４８１９５）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株（特開平４-３３０２７５）等が知られている。
【０００３】
さらにアミノ酸の生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された菌株を用いることで、アミノ酸の生産性を向上することができることが知られている（特開昭５８-８９３、特開昭６０-１２９９５、特開昭６０-２１０９９４、特開昭６０-３０６９３、特開昭６１-１９５６９５、特開昭６１−２７１９８１、特開平２-４５８、特開平２-４２９８８、特公平１-４２６７６、特公平５-１１９６０、特公平５-２６４６７）。
【０００４】
Ｌ−トリプトファンの製造においては、アミノキノリン誘導体またはフェノチアジン誘導体に対する耐性を付与することでアミノ酸生産性を向上させた例が報告されている（特開平４−１１２７９５）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の目的は、医薬品、化学品、食品および飼料添加物などとして有用なアミノ酸の工業的に効率のよい製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本願発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）  Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸（以下、本願発明にかかわるアミノ酸と略す）の生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴とする、該アミノ酸の製造法。
（２）  アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれら物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、上記（１）のアミノ酸の製造法。
（３）  アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、上記（１）のアミノ酸の製造法。
【０００７】
（４）  微生物がセラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属からなる群より選ばれる微生物である、上記（１）のアミノ酸の製造方法。
（５）  微生物がエシェリヒア・コリＨ−９３４１(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４)である、上記（４）のアミノ酸の製造方法。
（６）  本願発明にかかわるアミノ酸の生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物。
（７）  アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジアキン、ペンタキン、プリマキンおよびこれら物質のアルカリ金属塩からなる群より選ばれるアミノキノリン誘導体である、上記（６）の微生物。
（８）  アミノ酸がＬ−ヒスチジンである、上記（６）の微生物。
（９）  微生物がセラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属からなる群より選ばれる微生物である、上記（６）〜（８）いずれか１つに記載の微生物。
（１０）  エシェリヒア・コリＨ−９３４１(ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４)。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本願発明にかかわるアミノ酸の生産菌（以下、本願発明の微生物という）としては、本願発明にかかわるアミノ酸の生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物であればいずれも用いることができる。該微生物としては、例えば、セラチア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属に属する微生物、例えばSerratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Microbacterium ammoniaphilum、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Escherichia coli等をあげることができる。
【０００９】
本願発明に用いられるアミノキノリン誘導体は、アミノキノリン骨格を有する物質であればいずれでも用いられる。例えば、クロロキン(chloroquine)、アモジアキン(amodiaquine)などの４-アミノキノリン誘導体や、ペンタキン(pentaquine)、プリマキン(primaquine)などの８-アミノキノリン誘導体などが用いられる。また、これら物質のアルカリ金属塩などの塩も用いられる。これら物質は、いずれも抗マラリア薬(antimalarial drugs)として知られている。ここで、アルカリ金属はナトリウム、カリウム等のアルカリ金属であればいずれでも用いられる。
【００１０】
本願発明の微生物は、本願発明にかかわるアミノ酸を生産する能力を有する微生物に紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）などの突然変異誘発剤による通常の変異処理を施し、該変異株を親株が生育できないか、または生育が不良となる濃度のアミノキノリン誘導体を含む寒天平板培地上で通常の条件下で培養し、生じたコロニーのうちで親株よりも生育が速いか大きなコロニーを生ずる株を選択することにより、アミノキノリン誘導体に対する耐性の付与された株として取得することができる。
【００１１】
上記のアミノ酸生産能を有する微生物として、本願発明にかかわるアミノ酸の生産能を有する微生物を用いても良いし、また、公知の方法により新たに野生型株から取得しても良い。公知の方法としては、上記の変異処理法の他に、細胞融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法[いずれもMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）]等をあげることができる。
【００１２】
また、本願発明の微生物は、アミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を通常の変異処理法を用いて取得した後、該微生物に本願発明にかかわるアミノ酸生産能を上記方法により付与することによっても取得することができる。
本願発明の微生物として、具体的にはエシェリヒア・コリＨ−９３４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７４）をあげることができる。
【００１３】
本願発明の微生物を用いた本願発明にかかわるアミノ酸の生産は、通常の細菌培養法にて実施することができる。
本願発明にかかわるアミノ酸の生産に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
【００１４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなどのアルコールなどが用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
【００１５】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられる。
培養は、振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨはｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中に本願発明にかかわるアミノ酸が生成蓄積する。
【００１６】
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液から該アミノ酸を回収することができる。
本願発明により得られるアミノ酸としては先にあげた本願発明にかかわるアミノ酸であれば特に限定されないが、例えばＬ−ヒスチジンをあげることができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
実施例１  アミノキノリン誘導体に対する耐性を有するＬ−ヒスチジン生産性変異株の取得
ブタペスト条約に基いて平成１１年 ３月９日付けで、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７３ として工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている、メチオニン要求性のエシェリヒア・コリＡＴＣＣ２１３１８より誘導した１，２，４−トリアゾールアラニンに対する耐性を有するＬ−ヒスチジン生産性変異株Ｈ−９３４０に、常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）による変異処理（０．２ｍｇ／ｍｌ、３０℃、３０分間）を施した後、プリマキン二ナトリウム塩を１５０ｍｇ／Ｌ含む寒天平板培地〔グルコース ０．２％、リン酸一カリウム ０．３％、リン酸二ナトリウム ０．６％，硫酸マグネシウム ０．０１％、塩化ナトリウム ０．０５％，塩化アンモニウム ０．１％、 栄養要求物質（ＤＬ−メチオニン）５０ｍｇ／Ｌ、寒天 １．５％、ｐＨ７．２〕に塗布した。
【００１８】
菌体を塗布した上記寒天平板培地を３０℃で２〜６日間培養し、生育してきた大きなコロニーを釣菌分離し、Ｈ−９３４１を取得した。この菌株はブタペスト条約に基いて平成１１年３月９日付けで、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７４ として工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
実施例２  プリマキンを含む寒天平板培地での生育比較試験
実施例１で取得した変異株Ｈ−９３４１のプリマキン含有寒天平板培地での生育を親株Ｈ−９３４０と比較した。
【００１９】
それぞれの変異株を取得した時と同濃度のプリマキン二ナトリウム塩を含む上記寒天平板培地上に、天然培地で２４時間培養した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2になるように塗布し、３３℃、４日間培養した。
該培養による生育の可否を第１表に示した。
親株であるＨ−９３４０は、プリマキンを含む寒天培地上では生育できなかった。
【００２０】
【表１】
0004245746.tif 000002
【００２１】
実施例３  Ｌ−ヒスチジンの製造
実施例１で取得した変異株Ｈ−９３４１または親株Ｈ−９３４０を用いたＬ−ヒスチジンの製造を以下の方法で行った。
Ｈ−９３４０とＨ−９３４１を、それぞれ太型試験管中の種培地（グルコース２％、糖蜜０．５％、コーンスチープリカー １％、硫安 １．２％、リン酸一カリウム ０．３％、硫酸マグネシウム ０．０１５％、ＤＬ−メチオニン ６００ｍｇ／Ｌ、アデニン １００ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ３％、ｐＨ６．２）６ｍｌに接種して、３０℃で１２時間振盪培養した。
【００２２】
得られた種培養液０．１ｍｌを、それぞれ太型試験管中の生産培地（グルコース ６％、コーンスチープリカー １％、硫酸アンモニウム ２．４％、リン酸一カリウム ０．４％、硫酸マグネシウム ０．０１５％、チアミン塩酸塩 １０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ３％、ｐＨ６．５）５ｍｌに接種して、３０℃で４８時間振盪培養した。
【００２３】
培養後、培養液中のＬ−ヒスチジンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
結果を第２表に示した。
親株Ｈ−９３４０に比べ変異株Ｈ−９３４１のＬ−ヒスチジン生産性は向上していた。
【００２４】
【表２】
0004245746.tif 000003
【００２５】
【発明の効果】
本願発明により、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸（以下、本願発明にかかわるアミノ酸と略す）の生産能を有し、かつアミノキノリン誘導体に対する耐性を有する微生物を取得し、培地で培養することで、本願発明にかかわるアミノ酸の生産性を向上させることができ、本願発明にかかわるアミノ酸を工業的に効率よく、かつ安価に製造することができる。