(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
0004317975.tif 000015
式中、Ｒ1からＲ4は、互いに同一または異なって、水素原子、アルキル基またはアリール基を表し、これらの基はハロゲン原子またはヒドロキシル基により置換されていてもよく、Ｒ1およびＲ2はさらに一緒になってブリッジ−（ＣＨ2）m−（ここでｍは１から５の整数）を表すことができ、
Ａ1およびＡ2はそれぞれ基−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ、または−ＰＯ3Ｈ2、またはそれらのエステル類もしくはアミド類を表す、
に対応することを特徴とする、特にグルタメート作動性受容体に対して作動的、拮抗的または逆作動的性質をもつ化合物。
【請求項２】
Ｒ1およびＲ2の炭素が一緒になってブリッジを形成しない式Ｉに対応することを特徴とする、請求項１による化合物。
【請求項３】
Ａ1およびＡ2が２個ともカルボキシル基またはそのエステル類もしくはアミド類を表すことを特徴とする、請求項１または２による化合物。
【請求項４】
Ｒ1からＲ4が水素原子を表すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項による化合物。
【請求項５】
場合によりラセミ体のような、種々のジアステレオ異性体、場合によりエナンチオマーの１種の形での、アキラルまたはキラル分子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項による化合物。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）
0004317975.tif 000016
にそれぞれ対応する１−アミノシクロペンタン−１、３、４−トリカルボン酸ＡＣＰＴ−Ｉ、ＡＣＰＴ−ＩＩ、ＡＣＰＴ−ＩＩＩａおよびＡＣＰＴ−ＩＩＩｂであることを特徴とする、請求項４による化合物。
【請求項７】
・ブヒャラー・ベルク法にしたがって、式（Ｖ）
0004317975.tif 000017
式中、Ｒ1からＲ4は式Ｉにおいて定義した意味であり、Ａ3およびＡ4は−ＣＯＯＲ5、ＰＯ3（Ｒ5）2、ＰＯ3ＨＲ5またはＳＯ3Ｒ5基を表し、ここでＲ5は水素原子またはアルキル基である
で示されるケトンを、シアン化物および塩基性炭酸アンモニウムと反応させること、または
・ストレッカー法にしたがって、ケトン（Ｖ）をアンモニウム塩およびシアン化物と反応させ、次いで反応混合物に炭酸アンモニウムを添加すること、これらの反応は式（ＶＩ）
0004317975.tif 000018
のヒダントインを導く条件下に実施されること、
・つぎに、こうして得られたヒダントイン、または−ＮＨ基類が保護基によりブロックされているヒダントイン誘導体を加水分解すること、この加水分解は、
・種々のジアステレオ異性体を包含する混合物の取得、
・種々の化合物の分離、および所望によりラセミ体の分割に導くこと、
を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項による化合物の合成方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項による化合物の少なくとも１種の有効量を含有することを特徴とする代謝型グルタメート作動性受容体に対する作動、拮抗または逆作動剤。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか１項による化合物少なくとも１種の有効量を医薬的に許容される担体と共に含有することを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は、特に神経興奮薬性アミノ酸（ＥＡＡ）、とりわけグルタメート（glutamate、グルタミン酸塩またはグルタミン酸エステル）（Ｇｌｕ）に感受性をもつ中枢神経系受容体のエフェクターを構成する化合物、その製造およびその生物学的利用に関するものである。
それは、さらに具体的には、この受容体に対する作動性、拮抗性または逆作動性化合物に関するものである。
グルタメートが数々の中枢神経機能に関与することが知られている。
それゆえ、特に神経性流入伝導、シナプス可塑性、中枢神経系の発育、学習および記憶における重要な役割が、グルタメート作動性受容体に帰せられる。
グルタメートは同様に、虚血、低血圧、癲癇発作または大脳の外傷後に見られるニューロン死の原因をなす、主要な内因性神経毒である。それゆえ、グルタメート受容体が種々の中枢神経系障害および神経変性疾患に関与すると考えられることは驚くに当たらない。
それゆえ、標的としてグルタメート作動性受容体を使用して中枢神経系中におけるグルタメートの作用を修飾する手段を用意することの利点が評価される。
グルタメート作動性受容体に関して２種の主要なタイプが確認されている：チャンネル型受容体と代謝型受容体である。チャンネル型受容体は、グルタメートにより活性化されシナプス後細胞の急速な脱分極の直接的原因をなすカチオン性チャンネルである。それは、種々のサブユニットから構成され、その薬理学的および機能的性質にしたがって３種のグループに分類される化合物である。また、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸）およびカイネート（kainate、カイニン酸塩またはカイニン酸エステル）受容体が区別される。代謝型受容体（ｍＧｌｕＲ類）は、極めて最近明らかにされたもので（１９８５年）、１−アミノシクロペンタン−１、３−ジカルボン酸すなわちＡＣＰＤが発見されるまでは、特異的作動薬を欠くためあまり研究されていなかった。それは、イオンチャンネルまたはＧＴＰに結合するＧ蛋白質を介して２次メッセンジャーを生産する酵素の活性を調節する。それは一般的に急速なシナプス伝達に直接関与するものではないが、この受容体は、シナプス後イオンチャンネルおよびその受容体、またはグルタメートの遊離もしくは再捕獲を調節することにより、このシナプスの効率を調節する。それゆえ、ｍＧｌｕＲ類は、特に、圧受容反射の調節、空間学習、動作学習、姿勢および運動統合における、シナプス伝達の長期増強および長期抑制の誘導において、重要な役割を演ずる。また、それはおそらく、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踏病のような急性または慢性変性疾患に関与する。
現在までに８種のｍＧｌｕＲ類がクローンされており、その配列の相同性、その薬理学的性質およびそのシグナル伝達機構にしたがって３種のグループに分類することができる。
代謝型受容体は、グルタメートの作用の調節に関する標的として絶大な関心を提供するが、グルタメートが関与する様々な生理学的反応におけるその役割は、完全に特異的な用具（tool）がないため、現在まであまり確認されていない。種々のリガンド、すなわちグルタメートの類似体が最近報告され、代謝型受容体の薬理学的および生理学的特性確認のために使用されたが、充分に選択的でなく、かつ受容体に属するグループまたはグループ内のサブグループの完全な識別が出来ないことが明らかになった。
チャンネル型および代謝型受容体の識別ができる新規な分子に対する需要がある。また、代謝型受容体ファミリー内において、その受容体の探索と研究、それらおのおのに固有の生物活性構造の明確化、および薬理学的に活性な新規分子の作成ができる、極めて選択的な分子を用意することが重要である。
このような状況において、この発明者は、狭い範囲の立体配座をもつグルタメートの環状類似体について研究し、限定された位置におけるある種の基の存在が、結果として生ずる立体化学的な可能性と一緒になって、グルタメート作動性受容体に対する強力なおよび／または新規な活性を備えた化合物を導くことを確認した。
それゆえ、この発明は、中枢神経系の受容体に対して有利な効果を有する新規化合物を提供することに関するものである。
またそれは、工業的規模において容易かつ有利に使用されるこれらの化合物の合成方法を提供することに関するものである。
またそれは、探索と研究の標的としてまたは医薬として使用可能な、これらの受容体の作動薬または拮抗薬の作成のために、これら新規化合物の性質を利用することに関するものである。
この発明の化合物は、式（Ｉ）：
0004317975.tif 000002
式中、Ｒ1からＲ4は、互いに同一または異なって、水素原子、アルキル基またはアリール基を表し、これらの基はハロゲン原子またはヒドロキシル基により置換されていてもよく、Ｒ1およびＲ2はさらに一緒になってブリッジ−（ＣＨ2）m−（ここでｍは１から５の整数）を表すことができ、
Ａ1およびＡ2はそれぞれ基−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ、または−ＰＯ3Ｈ2、またはそれらのエステル類もしくはアミド類を表す、
に対応することを特徴とする。
一つの好ましいファミリーは単環式化合物で形成されるものである。それは、Ｒ1およびＲ2を有する炭素がそれらの間で結合して前記のブリッジの一つを形成しない式Ｉの化合物である。
これら種々のファミリーの化合物の好ましいグループにおいて、Ａ1およびＡ2は同一である。このグループの好ましい化合物において、Ａ1およびＡ2は２個ともカルボキシル基または対応するエステル類もしくはアミド類を表す。
別のグループにおいて、Ａ1およびＡ2は先に定義されたものであるが、互いに異なっている。
これらのファミリーおよびグループの有利な化合物は、アルキルまたはアリール基を表しこれらの基が場合により置換されている置換基Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3およびＲ4を含むものである。
「アルキル」基は、この発明によると、炭素原子１から１０個、特に炭素原子１から５個の基を意味する。「アリール」基は、単環または多環式芳香族基を意味する。好ましいアリール基は、フェニル基により構成される。
アルキル基およびアリール基は、例えばハロゲン原子またはヒドロキシル基により置換されていてもよい。
別の有利な化合物において、Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3およびＲ4は水素原子を表す。
上記定義の化合物は、種々のジアステレオ異性体、場合によりラセミ体の形で、場合によりエナンチオマーの形で、アキラルまたはキラル分子として存在することができる。
この発明は、特に、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）
0004317975.tif 000003
にそれぞれ対応する１−アミノシクロペンタン−１、３、４−トリカルボン酸ＡＣＰＴ−Ｉ、ＡＣＰＴ−ＩＩ、ＡＣＰＴ−ＩＩＩａおよびＡＣＰＴ−ＩＩＩｂに関する。
この発明はまた、上記定義の化合物の合成方法に関する。
有利にはブヒャラー・ベルク反応またはストレッッカー反応により実施されるこの合成は、
・ブヒャラー・ベルク法にしたがって、式（Ｖ）
0004317975.tif 000004
式中、Ｒ1からＲ4は式Ｉにおいて定義した意味であり、Ａ3およびＡ4は−ＣＯＯＲ5、ＰＯ3（Ｒ5）2、ＰＯ3ＨＲ5またはＳＯ3Ｒ5基を表し、ここでＲ5は水素原子またはアルキル基である
で示されるケトンを、シアン化物および塩基性炭酸アンモニウムと反応させること、または
・ストレッカー法にしたがって、ケトン（Ｖ）をアンモニウム塩およびシアン化物と反応させ、次いで反応混合物に炭酸アンモニウムを添加すること、これらの反応は式（ＶＩ）
0004317975.tif 000005
のヒダントインを導く条件下に実施されること、
・つぎに、こうして得られたヒダントイン、または−ＮＨ基類が保護基によりブロックされているヒダントイン誘導体を加水分解すること、この加水分解は、
・種々のジアステレオ異性体を包含する混合物の取得、
・種々の化合物の分離、および所望によりラセミ体の分割に導くこと、
を含むことを特徴とする。
実施形態としては、ケトン（Ｖ）を炭酸アンモニウムおよびシアン化物と反応させ、加熱工程後に、生成する反応媒質を酸性にする。
ケトンは、アルコール型溶媒中、特にメタノール中に溶解されている。
炭酸アンモニウムは、ケトンに対してほぼ３から１０当量、好ましくは５当量の過剰で使用される。
適当なシアン化物としては、シアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムのような無機シアン化物が挙げられる。シアン化物は、ケトンに対して１当量または小過剰の割合で使用される。
好ましくは水溶液の形の上記化合物をケトンに加えて得られる反応混合物を、ほぼ４０℃より高く９０℃より低い温度にする。
混合物の加熱は、冷却しながら最初の温度範囲で実施し、その後冷却せずに高い温度で実施して、過剰のアンモニウム塩を除去するようにすることができる。
満足な生成物は、混合物を冷却しながら約５０から７０℃、特に約５５−６０℃に約８から１５時間、その後冷却せずに７５から９０℃程度の温度で０．５から３時間、特に約８０℃で１時間加熱することにより得られる。
反応混合物を次に酸性にする。例えば、混合物を酸の添加後に攪拌するが、これは１０から６０分、特に約１５から３０分程度の反応時間を選択することになる。有利には、ｐＨが約３から４になるように酸を加える。
別の実施方法として、ヒダントインの取得は、まず最初に出発ケトン（Ｖ）にアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、およびシアン化物を加えて対応するアミノニトリル誘導体を生成させ、その後炭酸アンモニウムを加え、次いで反応後に媒質を酸性化することにより、実施される。
ここでケトンは特に水溶液として使用される。アンモニウム塩およびシアン化物は、同様に水溶液として、ケトンに加えられる。室温で攪拌下に操作すると、対応するアミノニトリルの取得に導く反応は、約１から３日間で行われる。
次いで炭酸アンモニウムを反応混合物に加え、数時間の攪拌後に、得られた溶液をｐＨほぼ３から４の酸性にする。
ヒダントインから対応するアミノ酸への変換は、加水分解により実施される。
変法として、先に得られたヒダントインに酸性または塩基性溶液を加える。
好ましくは、ヒダントインを含む酸性溶液をあらかじめ蒸発乾固し、残留物を、塩の少なくとも一部を除去するために抽出工程に付する。
抽出は、例えば、メタノールのようなアルコールを用いて実施する。
回収した濾液を蒸発させ、酸性または塩基性溶液に溶解し、加熱工程に付する。有利には、２から８規定、好ましくは６規定の塩酸もしくは硫酸、または２から８規定、好ましくは６規定の水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム、または水酸化バリウム飽和溶液を使用する。
閉鎖容器中、５０℃より高い温度、とりわけほぼ１００から１３０℃、特に１１０℃または１２０℃程度の温度で操作すると、処理は数日、特に２から６日で行われる。
別の変法として、ヒダントインのＮＨ基類をまずはじめに保護基によりブロックし、その後こうして得られた誘導体を塩基性で行う加水分解工程に付する。
前に記載した合成工程の終了後に得られたヒダントイン溶液は、蒸発乾固し、生成するヒダントインを、例えばメタノール中の１規定乾燥ＨＣｌによりエステル化する。蒸発後、残留物を酢酸エチルのような有機溶媒に取り、飽和塩溶液で洗浄する。有機相は、ヒダントインのエステルを含有する。
エステル化されたヒダントインは、乾燥後に蒸発工程に付し、ＣＨ3ＣＮのような有機溶媒に溶解する。
ＮＨ基類のブロックを行うためには、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下にカルバミン酸アルキルの生成を行う。
この保護は、ジ−ｔ−ブチルジカーボネートを使用してブチルオキシカルボニル誘導体の形で行うのが特に有利である。
約１から２時間の反応後に、ブロック化合物が、例えばクロマトグラフィーカラムの通過後に回収される。
このようにして保護されたヒダントインは、アセトニトリルに溶解し、その加水分解を、好ましくは１規定濃度溶液の形の水酸化リチウムのような塩基を添加して実施し、その後１規定ＨＣｌのような酸で中和し、蒸発乾固し、残留物を例えばＨＣｌ／ＣＨ3ＣＯＯＨから構成される酸の溶液で処理する。
アミノ酸混合物のジアステレオ異性体分離は、有利には、アニオン交換体カラムによるクロマトグラフィーによって行う。有利には、この工程はカチオン交換クロマトグラフィーにより実施する精製法で処理する。
この発明の方法を使用するために種々の選択がなされる：
・ブヒャラー・ベルク反応による選択またはストレッカー法による選択は、シスまたはトランス（Ａ1およびＡ2に対する１位−ＣＯＯＨ基の位置）、（例えばメソアミノ酸の場合）の優勢立体配置を選択することにより決定される；
・出発ケトンの立体化学による選択は、合成しようとする化合物に望まれる最終的立体配置により決定される（Ａ1およびＡ2が例えば相対的トランス立体配置をもつアミノ酸の場合）。
グルタメート感受性をもつ中枢神経系受容体に対するこの発明の化合物の生物活性の研究は、それらの代謝型受容体に対する特異性を明らかにした。
実際、これらの化合物を用いて実施した試験は、それらがチャンネル型受容体に対して作動活性または拮抗活性をもたないこと（通常１００μｍのＮＭＤＡまたはカイネートで活性化される小脳顆粒細胞に対して１ｍＭで行った試験）を示した。
その代わりに、この化合物は、実施例に記載した結果が示すように、代謝型受容体に対する作動または拮抗活性を発揮する。重要な利点をもたらす特徴に従えば、この反応は、与えられた化合物において、受容体のサブグループに対し選択的である。
すなわち、ＡＣＰＴ-Ｉは、ｍＧｌｕＲ４の作動薬である。ＡＣＰＴ−ＩＩは、試験したすべてのｍＧｌｕＲ（ｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａ）の一般的拮抗薬であり、ｍＧｌｕＲ１に逆作動性を備えている。ＡＣＰＴ−ＩＩＩａはｍＧｌｕＲ４の拮抗薬であり、ＡＣＴＰ−ＩＩＩｂはｍＧｌｕＲ４の作動薬であり、これらＡＣＴＰ−ＩＩＩａおよびＡＣＴＰ−ＩＩＩｂの２種はｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ２の拮抗薬である。
それ故、この発明は、代謝型グルタメート作動性受容体に特異的な作動薬または拮抗薬としての、上記定義の化合物の利用に関する。
これらの薬剤は、特に、それぞれの代謝型受容体グループおよびサブグループを識別しそれぞれの特異的な生理学的役割を明らかにすることにより具体的に研究するための用具として使用できる。
このような用具の使用に基づく利用は、上記定義の化合物と上記受容体を発現する細胞の培養物を、研究している作動性、拮抗性または逆作動性反応の実現が可能な条件下に接触させることを含む。
この発明の化合物の有利な効果は、マウスで実施したアッセイによると、実質上無毒性を伴う。
それ故、この発明は、医薬組成物の製造のために、酸の形、またはそれらのアミド類もしくはエステル類であるプロドラッグとして、これらの化合物の性質を利用することに関する。
この発明の医薬組成物は、上記定義のような化合物少なくとも１種の有効量を医薬的に不活性な担体と共に含有することを特徴とする。
この組成物は、場合により他の医薬の有効成分を含有する。
この発明の組成物は、例えば記憶障害、老人性痴呆、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神経疾患および運動障害の処置において、グルタメートの作用を修飾するのに特に適する。
販売のための包装、特にラベルおよび使用説明書、並びに有利にはラッピングは、予想される治療用途に応じて作成される。
この発明の医薬組成物は、種々の形態で、特に経口もしくは注射、さらには経鼻経路により、投与することができる。
経口投与の場合、特に圧縮錠、丸剤、錠剤、ゼラチンカプセル、滴剤、さらにはリポソームによる。この組成物は、有利には投与単位当たり有効成分１から１００ｍｇ、好ましくは２．５から５０ｍｇを含有する。
別の投与形態は、滅菌のまたは滅菌可能な溶液から作った、静脈内、皮下または筋肉内経路で注射できる液剤を含む。それはまた、懸濁液または乳化液であり得る。
この注射用形態は、投与単位当たり有効成分０．５から５０ｍｇ、好ましくは１から３０ｍｇを含有する。
参考として、人の場合使用できる投薬量は、下記容量に対応する：すなわち、例えば患者に５から３００ｍｇ／日を、１回または複数回の用量で投与する。
この発明の別の特徴および利点は、下記の実施例に示すが、それは図１から５を参照するものであり、それらは、それぞれ
・図１ａから１ｃは、ＡＣＰＴによる受容体ｍＧｌｕＲ類の活性化を示し、
・図２ａは、Ｇｌｕが誘導するＩＰ生成のＡＣＰＴによる阻害を示し、
・図３ａから３ｃは、ｍＧｌｕＲ類に対するＡＣＰＴ−ＩＩの種々の濃度における拮抗作用および拮抗定数の測定を示し、図３ｄから３ｆは、対応するシルド（Shild）のグラフ化を示し、
・図４ａから４ｃは、ＡＣＰＴ−ＩＩＩの受容体ｍＧｌｕＲ類に対する阻害作用を示し、
・図５は、ＡＣＰＴの受容体ｍＧｌｕＲ１ａに対する作動作用を示す。
これらの例は、ＡＣＰＴ−Ｉ（１Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（１Ｒ、３Ｒ、４Ｓ）、（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ、（３Ｒ、４Ｒ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ、および（３Ｓ、４Ｓ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩに関するものである。これらの化合物は、ブヒャラー・ベルク反応またはストレッカー反応により、ケト酸５、（±）−８、（３Ｒ、４Ｒ）−８または（３Ｓ、４Ｓ）−８（後記式１ａおよび１ｂ、２並びに３）から出発し、生成するヒダントインの加水分解が続き（式４）、アニオン交換体クロマトグラフィーによるＡＣＰＴの分離で合成した。
・ケトジエステル５の合成
Ｈ．Ｊ．ガイス；Ｇ．ビュロー；Ａ．ザトルスキ；Ｍ．ジェンツ；Ｐ．メドニス；Ｈ．Ｊ．ヘマール、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、１９８９年、５４巻、５１１５−５１２２頁；Ｈ．ヘマール、論文、ユニバーシテット・フライブルク・イム・ブリスゴー、ドイツ国、１９９０年にしたがって操作する。
この合成法は、下記式１ａにより説明される：
0004317975.tif 000006
ａ：Ｈ2ＳＯ4／ＭｅＯＨ；ｂ：ＫＭｎＯ4；ｃ：ＡｃＯＮａ／Ａｃ2Ｏ、１４０℃
・ケトジエステル（±）８の合成
Ａ．ローゼンキスト；Ｉ．クバルンストレーム；Ｓ．Ｃ．Ｔ．スベンソン；Ｂ．クラッソン；Ｂ．サミュエルソン、アクタ・ケミカ・スカンジナビカ、１９９２年、４６巻、１１２７−１１２９頁にしたがって操作する。
この合成法は、下記式１ｂにより説明される：
0004317975.tif 000007
ｄ：封管中、１００℃（Ｔ．Ｅ．サンプル；Ｌ．Ｆ．ハッチ、オーガニック・シンセシス・コレクティブ・ボリュームＶＩ、１９８８年、４５４頁）；ｅ：ＫＭｎＯ4；ｆ：ＡｃＯＮａ／Ａｃ2Ｏ、１４０℃
・ケトジエステル（３Ｒ、４Ｒ）−８および（３Ｓ、４Ｓ）−８の合成
Ｈ．スエムネ；Ｍ．タナカ；Ｈ．オバイシ；Ｋ．サカイ、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ビュレチン、１９８８年、３６巻、１５−２１頁；Ａ．ローゼンキスト；Ｉ．クバルンストレーム；Ｓ．Ｃ．Ｔ．スベンソン；Ｂ．クラッソン；Ｂ．サミュエルソン、アクタ・ケミカ・スカンジナビカ、１９９２年、４６巻、１１２７−１１２９頁にしたがって操作する。
この合成法は、下記式２により説明される：
0004317975.tif 000008
ａ：ぶた肝臓エステラーゼ、ｐＨ７．０；；ｂ：ＣＨ3Ｎ2／ＣＨ2Ｃｌ2
・対応するアミノニトリルを経由するブヒャラー・ベルク法またはストレッカー法によるヒダントインの合成
ストレッカーの合成により、シス−ケトエステル５から出発して、カルボキシラートに対してシスのアミノ基を有する生成物に関してブヒャラー・ベルク反応より有利に低い比率のアミノ基を導入することを可能にする（ＡＣＰＴ−Ｉ、２０％の代りに３９％、実施例４参照）
この合成法は、下記式３により説明される：
0004317975.tif 000009
・ヒダントインから対応するアミノ酸への変換
ヒダントインの直接加水分解は、１個（または複数の）カルボキシル基のシス→トランスエピマー化を顕著に導き（平衡状態で２５：７５）、またトランスエナンチオマーのラセミ化をも導き得る。正しい立体化学構造を得、最初に使用したケト酸のものに合致させるためには、ヒダントインのジＢｏｃ誘導体のアルカリ加水分解法（Ｓ．クビック；Ｒ．Ｓ．マイスナー；Ｊ．レベック・ジュニア、テトラヘドロン・レターズ、１９９４年、３５巻、６６３５−６６３８頁）が、極めて僅かなエピマー化（またはラセミ化）しか起こさないので、好ましいはずである（実施例４、シス−ケトエステル５から生ずるヒダントイン、または実施例６および７、エナンチオマー的に純粋なトランスケトエステル（３Ｒ、４Ｒ）−８または（３Ｓ、４Ｓ）−８から生ずるヒダントインの場合の応用参照）。
この合成法は、下記式４により説明される：
0004317975.tif 000010
下記に、ケトジエステルから出発するＡＣＰＴの詳細な合成法を記載する。
実施例１
ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）に溶解したシス−ケトジエステル５（０．２ｇ、１ｍｍｏｌ）に、水（１．５ｍｌ）に溶解した（ＮＨ4）2ＣＯ3（０．４８ｇ、５当量）およびＫＣＮ（０．０７７ｇ、１．２当量）を加える。混合物を５５−６０℃において冷却しながら１夜、その後８０℃において冷却せずに１時間加熱し（過剰の（ＮＨ4）2ＣＯ3を除去するため）、濃ＨＣｌ溶液で酸性にする。酸性溶液を室温で０．５時間攪拌する。蒸発乾固後に得られた残留物をＭｅＯＨで抽出し（塩の一部を除去するため）、蒸発した濾液（０．２３ｇ）を口螺で気密にした容器中で６規定ＨＣｌ溶液（２０ｍｌ）に溶解し、１１０℃で５日間加熱する。溶液を蒸発し、水２００ｍｌで希釈し、酸性のｐＨ（ほぼｐＨ２−３）においてカチオン交換体Ｄｏｗｅｘ５０Ｘ４のカラム（H+、２０−５０メッシュ、２×１４ｃｍ）にかける。カラムを水（２００ｍｌ）ですすぎ、ＡＣＰＴ混合物を０．５Ｍアンモニア溶液で溶離する。ニンヒドリン陽性フラクションを蒸発し（０．２ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）、煮沸水（２００ｍｌ）に再溶解した混合物を塩基性ｐＨにおいて（ほぼｐＨ９−１０）アニオン交換体ＡＧ１Ｘ４のカラム（ＡｃＯ-、２００−４００メッシュ、２×１６ｃｍ）にかける。煮沸水ですすいだ後、ＡＣＰＴ−１（１０ｍｇ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（３０ｍｇ）および（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（１２０ｍｇ）を、それぞれ０．５Ｍ、０．８Ｍおよび１ＭのＡｃＯＨ溶液で溶離する。総収率：ケトエステルに対して６４．１％。
Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ，Ｏ´ジイソプロピルエステルの形における気相クロマトグラフィー分析（Ｍ．モールス、Ｃ．デュクロック、Ａ．リギニ−タピーおよびＲ．アゼラド、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、２５巻、１９８５年、４４４−４４９頁）：
キャピラリーカラムＯＶ−１７０１上（Flexibond、登録商標、ピエルス）（１５ｍ×０．２ｍｍ、フィルム厚０．２５ｍｍ）１９０℃：Ｒｔ（保持時間）１３．５分［（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ］、１６．４分（ＡＣＰＴ−ＩＩ）、１９．２分、（ＡＣＰＴ−Ｉ）。
キャピラリーカラム・ウルトラ−２（登録商標）上（ヒューレット・パッカード）（２５ｍ×０．２ｍｍ、フィルム厚０．３３ｍｍ）１４０℃２分間、その後徐々に１４０から３００℃（１０℃／分）、その後３００℃に５分間：Ｒｔ（保持時間）１３．７分［（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ］、１３．９分（ＡＣＰＴ−Ｉ）、１４．２分、（ＡＣＰＴ−ＩＩ）。
キャピラリーカラム・キラシル−バル（登録商標）上（５０ｍ×０．３２ｍｍ、フィルム厚０．２ｍｍ）１９０℃：Ｒｔ（保持時間）１５．０分［（３Ｓ、４Ｓ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ］および１５．１分［（３Ｒ、４Ｒ）-ＡＣＰＴ-ＩＩＩ］、１８．３分［（１Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）−（ＡＣＰＴ−ＩＩ）］、２２．４分［（１Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）−（ＡＣＰＴ−Ｉ）］0１５０℃：Ｒｔ（保持時間）８４．７分［（３Ｓ、４Ｓ）−（ＡＣＰＴ−ＩＩＩ）］および８６．１分［（３Ｒ、４Ｒ）−（ＡＣＰＴ−ＩＩＩ）］。
（１Ｒ、３Ｒ、４Ｓ）ＡＣＰＴ−Ｉ．ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（基準値に対するピークの％）：３５２（４）、３３８（７）、２９６（３０）、２６８（７）、２５０（２６）、２２２（１００）、２０４（１６）、１７７（２７）。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ、ＮＨ4+塩）：３．２０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−４）、２．６３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５）、２．２４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５）。
13Ｃ−ＮＭＲ：１８３．８および１７９．０（ＣＯ）、７０．０（Ｃ−１）、５０．８（Ｃ−３、Ｃ-４）、４２．１（Ｃ−２、Ｃ-５）。
元素分析：Ｃ8Ｈ11ＮＯ6・２Ｈ2Ｏに対する計算値％
Ｃ３７．９５；Ｈ５．９７；Ｎ５．５３
実験値％Ｃ３８．６１；Ｈ５．４６；Ｎ５．５９
（１Ｒ、３Ｒ、４Ｓ）ＡＣＰＴ−ＩＩ．ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（基準値に対するピークの％）：３８０（１）、３５２（１２）、３３８（１０）、３１０（３）、２９６（２１）、２６８（５）、２５０（３０）、２２２（１００）、２０４（１４）、１７７（２２）。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ、ＮＨ4+塩）：３．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−４）、２．５２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５）、２．３２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５）。
13Ｃ−ＮＭＲ：１８３．６および１８０．４（ＣＯ）、６９．２（Ｃ−１）、５３．７（Ｃ−３、Ｃ-４）、４２．３（Ｃ−２、Ｃ-５）。
元素分析：Ｃ8Ｈ11ＮＯ6・２Ｈ2Ｏに対する計算値％
Ｃ３７．９５；Ｈ５．９７；Ｎ５．５３
実験値％Ｃ３８．５３；Ｈ５．３９；Ｎ５．５７
（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ．ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（基準値に対するピークの％）：４４０（０．０１）、３８０（２）、３５２（１５）、３３８（８）、３１０（１４）、２９６（１２）、２６８（６５）、２５０（２０）、２２２（１００）、２０４（１８）、１７７（２８）。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ、ＮＨ4+塩）：３．１９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−４）、２．５９、２．４２および２．１０（３ｍ、４Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５）。
13Ｃ−ＮＭＲ：１８５．９、１８３．９および１７９．２（ＣＯ）、６９．９（Ｃ−１）、５３．２（Ｃ−３、Ｃ-４）、４３．３および４２．８（Ｃ−２、Ｃ-５）。
元素分析：Ｃ8Ｈ11ＮＯ6・２Ｈ2Ｏに対する計算値％
Ｃ３７．９５；Ｈ５．９７；Ｎ５．５３
実験値％Ｃ３８．４７；Ｈ５．３１；Ｎ５．５４
実施例２
ＭｅＯＨ（４ｍｌ）に溶解したシス−ケトジエステル５（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）を、実施例１と同様に（ＮＨ4）2ＣＯ3（０．９６ｇ、５当量）およびＫＣＮ（０．０１５４ｇ、１．２当量）で処理する。蒸発乾固後に得られた残留物を口螺で気密にした容器中で水酸化バリウム水溶液（水４０ｍｌ中３．０ｇ）に溶解し、１２０℃で２日間加熱する。溶液を冷却し、希Ｈ2ＳＯ4溶液で酸性にし、セライトを通して濾過し、水２００ｍｌで希釈し、カチオン交換体Ｄｏｗｅｘ５０Ｘ４のカラム（H+、２０−５０メッシュ、３×１７ｃｍ）にかける。カラムを水（３００ｍｌ）ですすぎ、ＡＣＰＴ混合物を０．５Ｍアンモニア溶液で溶離する。ニンヒドリン陽性フラクションを蒸発し（０．４８０ｇ）、煮沸水（２５０ｍｌ）に再溶解した混合物を塩基性ｐＨにおいてアニオン交換体ＡＧ１Ｘ４のカラム（ＡｃＯ-、２００−４００メッシュ、３×１９ｃｍ）にかける。煮沸水ですすいだ後、ＡＣＰＴ−Ｉ（１７．２ｍｇ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（３２ｍｇ）および（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（３２４ｍｇ）を、実施例１記載の酢酸溶液で溶離する。総収率：７５．１％。
実施例３
ＭｅＯＨ（４ｍｌ）に溶解したシス−ケトジエステル５（０．４０ｇ、２ｍｍｏｌ）に、水（３ｍｌ）に溶解した（ＮＨ4）2ＣＯ3（０．９６ｇ、５当量）およびＫＣＮ（０．１５４ｇ、１．２当量）を加える。混合物を５５−６０℃において冷却しながら２．５時間加熱し、その後希ＨＣｌ溶液でｐＨ３−４の酸性にする。室温で１５分間攪拌後、溶液を濃縮し、ＮａＣｌ水溶液（２０ｍｌ）で希釈し、ＡｃＯＥｔ（５０ｍｌ×２）で抽出する。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発し、真空乾燥する（０．４０７ｇ、１．５ｍｍｏｌ、粗収率７５．４％）。ＣＨ3ＣＮ（２０ｍｌ）に溶解したヒダントイン混合物に、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（１．１５ｍｌ、３当量）およびＤＭＡＰ（１５ｍｇ、０．０８当量）［Ｓ．クビック；Ｒ．Ｓ．マイスナー；Ｊ．レベック・ジュニア、テトラヘドロン・レターズ、１９９４年、３５巻、６６３５−６６３８頁］を加える。１．５時間後溶媒を蒸発し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍｌ）中にとり、シリカの小カラム（２×１３ｃｍ）を通して急速濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍｌ）、次いでＣＨ2Ｃｌ2／ＡｃＯＥｔ（４：１）（１５０ｍｌ）で溶離する。薄層上でＴＤＭ（Ｅ．フォナークス；ｍ．フェイエル；Ｍ．Ｊ．ブリューガー、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、１９７６年、１２０巻、２２４−２２８頁）により検出したジＢｏｃエステルを蒸発し、（０．５３３ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、次いでＣＨ3ＣＮ（３ｍｌ）および１規定ＬｉＯＨ（１２ｍｌ）に溶解する。濁った溶液を室温で５時間攪拌し、０℃に冷却し、１規定ＨＣｌ（１２ｍｌ）で中和し、蒸発乾固する。残留物を酢酸中の気体ＨＣｌ溶液（〜１規定）で処理し（０．５時間）、次いで蒸発乾固する。ＡＣＰＴ−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの混合物を、必要ならばＮａＨＣＯ3でｐＨ４に調整した水（１リットル）に溶解し、Ｄｏｗｅｘ５０Ｘ４のカラム（H+、２０−５０メッシュ、３×１７ｃｍ）（０．１７７ｇ）で精製し、次いで前記のようにＡＧ１Ｘのカラム（ＡｃＯ-、２００−４００メッシュ）で分離すると、ＡＣＰＴ−Ｉ（０．０３５ｇ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（０．１１６ｇ）および（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（０．０２９ｇ）を得る。総収率：３６．１％。
実施例４
水（５ｍｌ）に溶解したシス−ケトジエステル５（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）に、ＮＨ4Ｃｌ（１．０８ｇ、１０当量）およびＫＣＮ（０．１３ｇ、１当量）を加える。室温で３日間攪拌後、（ＮＨ4）2ＣＯ3（０．２１１ｇ、２．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、攪拌を３０時間続ける。次いで溶液を１規定ＨＣｌでｐＨ４の酸性にし、蒸発乾固する。残留物を口螺で気密にした容器に移し、ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液（８ｍｌ）に懸濁し、６０℃で１．５時間加熱する。不溶の塩を濾過し、ＭｅＯＨですすぎ、濾液を蒸発し、ＫＯＨ（０．７４２ｇ）上で真空乾燥する。ヒダントインエステルの粗混合物をＡｃＯＥｔ（２０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを中性に保つためＮａＨＣＯ3を加えた飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。洗浄した水相をＡｃＯＥｔ（１０ｍｌ）で再抽出する。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発する。ＣＨ3ＣＮ（２５ｍｌ）に溶解したヒダントインメチルエステル混合物に、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（１．５ｍｌ、３当量）およびＤＭＡＰ（２１ｍｇ、０．０８当量）を加える。溶液を１夜攪拌し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、２３０−４００メッシュ、２×１０ｃｍ、溶離剤ＣＨ2Ｃｌ2、次いでＣＨ2Ｃｌ2／ＡｃＯＥｔ、４：１）により急速精製し、総収率５３．５％（０．５０３ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）に導く。完全に保護されたヒダントインの混合物をＬｉＯＨ、ＨＣｌ／ＡｃＯＨで処理し、前記のように精製し分離する：ＡＣＰＴ−Ｉ（０．０６２ｇ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（０．０９６ｇ）、（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（０．０３５ｇ）。総収率：ケトジエステルに対して３８．８％。
実施例５
トランス−ケトジエステル（±）−８（０．２ｇ、１ｍｍｏｌ）を実施例１記載のように処理し、ＡＣＰＴ−Ｉ（０．０１５ｇ）、ＡＣＰＴ−ＩＩ（０．０２ｇ）および（±）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（０．１５ｇ）に導く。総収率：ケトジエステルに対して７４．２％。
実施例６
トランス−ケトジエステル−（−）−（３Ｒ、４Ｒ）−８（０．１３４ｇ、０．６７ｍｍｏｌ、ｅｅ＞９８％）を、（ＮＨ4）2ＣＯ3およびＫＣＮで実施例３記載のように５時間処理し、次いで実施例４記載のように再エステル化して無色油状物を得（０．１４９ｇ、０．５５２ｍｍｏｌ、収率８２％）、これをＢｏｃ2Ｏ／ＤＭＡＰ、次いでＬｉＯＨおよびＨＣｌ／ＡｃＯＨで処理し、実施例３記載のように精製する。カチオン交換体のカラム処理後、主として（−）−（３Ｒ、４Ｒ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（９７．５％）（これはアニオン交換体上のカラムクロマトグラフィーで精製（０．０８３ｇ、０．３３３ｍｍｏｌ、ｅｅ９９．２％））、および少量のＡＣＰＴ−Ｉ（０．６％）とＡＣＰＴ−ＩＩ（１．９％）を含む混合物（０．０９１ｇ、５４．１％）を得る。
（−）−（３Ｒ、４Ｒ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ：［α］D22＝−３２．３（ｃ０．７３、Ｈ2Ｏ）。
実施例７
トランス−ケトジエステル−（＋）−（３Ｓ、４Ｓ）−８（０．１７２ｇ、０．８５８ｍｍｏｌ、ｅｅ＞９９．８％）を、実施例６記載のように処理する。カチオン交換体のカラム処理後、主として（＋）−（３Ｓ、４Ｓ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（９８．２％）（これはアニオン交換体上のカラムクロマトグラフィーで精製（０．１０５ｇ、０．４５１ｍｍｏｌ、ｅｅ９８．３％））、および少量のＡＣＰＴ−Ｉ（＜０．４％）とＡＣＰＴ−ＩＩ（１．８％）を含む混合物（０．１０９ｇ、５０．６％）を得る。
（＋）−（３Ｓ、４Ｓ）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ：［α］D22＝＋２６．４（ｃ０．６４、Ｈ2Ｏ）。
実施例８：生物活性の研究
グループＩ、ＩＩまたはＩＩＩの代謝型受容体のプロトタイプとして選択された、トランスフェクションされｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ2またはｍＧｌｕＲ４ａを発現しているＨＥＫ２９３細胞に対するＡＣＰＴ−Ｉ、−ＩＩおよび−ＩＩＩの生物活性を試験した。
ホスホリパーゼＣの活性化作用（イノシトール燐酸の蓄積）について測定した。
１）材料および方法
・ＨＥＫ２９３細胞の培養とトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％子牛胎児血清を補足したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＢＭ、ギブコＢＲＬ）中で培養し，ゴメザら、モレキュラー・ファーマコロジー、１９９６、５０巻、９２３−９３０頁（１９９６年）に記載された方法のような電気穿孔法によりトランスフェクションする。
電気穿孔法は、ｍＧｌｕＲ１ａ（０．３μｇ）、ｍＧｌｕＲ２（２μｇ）またはｍＧｌｕＲ４ａ（５μｇ）および細胞１０7個を含むプラスミドＤＮＡからなるＤＮＡ１０μｇの媒体（supporting DNA）を含む総容量３００μｌ中で実施する。
ｃＡＭＰの産生阻害より測定が容易な作用である、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａによるホスホリパーゼＣの活性化を可能とするため、ゴメザが記載したように、これらの受容体にG蛋白質キメラＧｑｏ５およびＧｑｉ９を同時発現させる。この方法にしたがって測定されたこれら２種の受容体の薬理学的プロフィルは、ｃＡＭＰの生成阻害の測定で確認されたものと同様であることが既に報告されている。
・イノシトール燐酸（ＩＰ）蓄積の測定
トランスフェクションした細胞内におけるＩＰ蓄積の測定は、［3Ｈ］−ミオ−イノシトールで細胞を約１４時間にわたり標識化した後（２３．４Ｃｉ／ｍｏｌ、ＮＥＮ、フランス）、ゴメザが記載したように実施した。
刺激は、試験薬物の存在下、１０ｍＭ  ＬｉＣｌ含有媒質中で３０分間実施する。細胞が放出するＧｌｕによる可能な作用を回避するために、１０ｍＭ  ＬｉＣｌおよびグルタメート（Ｇｌｕ）を分解するピルビン酸グルタミン酸トランスアミナーゼ（１Ｕ／ｍｌ）および２ｍＭのピルベート（pyruvate、ピルビン酸塩またはピルビン酸エステル）の存在下、３０分間のインキュベーション後に、基準ＩＰ生成を測定する。結果は、細胞膜内に存在する放射能にに比較したＩＰ酸生物の量で表す。
・小脳顆粒細胞の培養と記録
小脳顆粒細胞は、Ｂ．Ｊ．ファン−ブリエット、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、１９８９年、５２巻、１２２９−１２３９頁の記載のように、７日令のマウス幼獣から培養する。
記録は、全細胞配置中「パッチクランプ」と称する技術を使用して行い、分子は急速適用法を用いて適用する。
２）結果
まずはじめに、アッセイは、チャンネル型受容体に対してＡＣＰＴが活性化または拮抗作用を発揮できるかを確認するために実施した。このアッセイは、１ｍＭの濃度で小脳顆粒細胞と接触させたとき、ＡＣＰＴのエナンチオマーのいずれもが電流を誘導しないことを示した。
同じバッチ処理において、逆に、ＮＭＤＡおよび非ＮＭＤＡ受容体の活性化を考慮すると、予想されるように、ＮＭＤＡ（１００μＭ）またはカイネート（１００μＭ、ＡＭＰＡおよびカイネートの場合に活性化が可能な濃度）により誘導される電流が観察される。ＡＣＰＴ-Ｉ、ＡＣＰＴ-ＩＩおよびＡＣＰＴ-ＩＩＩ（１ｍＭ）の拮抗作用も同様にＮＭＤＡおよびカイネート（１００ｍＭ）により誘導される反応について試験した。ＡＣＰＴ-ＩＩおよびＡＣＰＴ-ＩＩＩについては顕著な急性阻害が見られなかった。それに引き代え、ＡＣＰＴ-Ｉ（１ｍＭ）の存在下でＮＭＤＡまたはカイネートが誘導する反応の１０％程度の弱い阻害に気付くことができた。
試験した種々のＡＣＰＴの作用を、次いでグループＩ、ＩＩおよびＩＩＩの代表であるｍＧｌｕＲ類すなわちｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａについて分析した。
得られた結果は、図１ａから１ｃに示し表２に要約する。
図１ａは、１ｍＭ濃度の（Ｇｌｕ）で誘導されるものと比較したこれらの分子（３ｍＭ）により誘導される燐酸イノシトール（ＩＰ）の蓄積を示す。この図において、■は幼獣の基準（ＩＰ）値、□はＧｌｕ存在下の測定値、
0004317975.tif 000011
はＡＣＰＴ-Ｉの存在下、
0004317975.tif 000012
はＡＣＰＴ-ＩＩの存在下、
0004317975.tif 000013
はＡＣＰＴ-ＩＩＩの存在下を示す。
図１ｂおよび１ｃは、使用薬剤のμＭ濃度に応じた、最高作用の％で示すＩＰ産生反応を表す。
図１ｂは、種々の濃度におけるＡＣＰＴ−Ｉ（▲）および（±）ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（〇）のｍＧｌｕ４ａに対する作動性作用を示し、図１ｃは、種々の濃度におけるＡＣＰＴ−ＩＩＩエナンチオマー（〇：（＋）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩ；●：（−）−ＡＣＰＹ−ＩＩＩ）についての作動性作用を示す。
図１ａが示すように、ＡＣＰＴのいずれの分子もｍＧｌｕＲ1ａまたはｍＧｌｕＲ2を活性化しない。
それに引き代え、ＡＣＰＴ−ＩおよびＡＣＰＴ−ＩＩＩは、ＣＥ50（最高作用の５０％にあたる作用の濃度）それぞれ７．２±２．３および４０±８μＭ（ｎ＝３）で、用量依存的にｍＧｌｕＲ４ａを活性化する（図１ａおよび１ｂ）。
（＋）ＡＣＰＴ−ＩＩＩのみがＣＥ50８．８±３．２μＭ（ｎ＝２）で、ｍＧｌｕＲ４ａに対する作動薬の性質をもつことが注目される（図１ｃ）。
図２において、ＡＣＰＴの作用下でＧｌｕにより誘導されるＩＰ生成の阻害を示した（記号は図１ａのものと同じ）。
ＡＣＰＴ−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩが、ｍＧｌｕＲ１ａを発現する細胞中でＧｌｕにより誘導されるＩＰ生成を阻害することが確認される。これらの化合物はすべて、競合的拮抗薬で予期されるような、Ｇｌｕの用量反応曲線の右側への移動を惹き起こす。
化合物ＡＣＰＴ−ＩＩおよびＩＩＩが、ｍＧｌｕＲ２を発現する細胞中でＧｌｕにより誘導される反応をも阻害することが確認される。この結果は、ＡＣＰＴ−Ｉでは得られない。ＡＣＰＴ−ＩＩは、ＡＣＰＴ−ＩＩＩより活性が高いと思われる。
その上、化合物ＡＣＰＴ-ＩＩが、同時にｍＧｌｕＲ４ａへのＧｌｕの作用に対して拮抗作用を発揮することがわかり、それゆえ代謝型グルタメート作動性受容体一般に拮抗性であると思われよう。
上記結果全体を下記表２に要約し、そこにｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａに対するＡＣＰＴの作動作用（ＣＥ50、μＭ）または拮抗作用（ＫB、μＭ）を示す。
0004317975.tif 000014
図３ａから３ｃおよび３ｄから３ｆは、ｍＧｌｕＲ１ａ（図３ａおよび３ｄ）、ｍＧｌｕＲ２（図３ｂおよび３ｅ）およびｍＧｌｕＲ４（図３ｃおよび３ｆ）受容体に対するＡＣＰＴ-ＩＩの拮抗作用および阻害定数の測定を説明する。図３ａから３ｃは、単独（対照）または一定濃度のＡＣＰＴ−ＩＩの存在下における、μＭ（対数目盛）で示すＧｌｕ濃度に応じた（総放射能に比較した）ＩＰ産生を示す。記号は下記の意味をもつ：（●）：対照、（□）：＋１００μＭ（ｍＧｌｕＲ１ａに対しては２００μＭ）、（▲）：＋３００μＭ（ｍＧｌｕＲ１ａに対しては５００μＭ）、〇：＋１０００μＭ。
図３ｄから３ｆのグラフは、図３ａから３ｃの用量反応曲線から得られたシルド（Shild）のグラフ化を示し、Ｌｏｇ（Ｂ）に応じたＬｏｇ（Ａ’／Ａ−１）であり，ここでＡ’は濃度ＢのＡＣＰＴ-ＩＩの存在下において測定したＧｌｕのＣＥ50値、ＡはＡＣＰＴ-ＩＩ、すなわち拮抗薬の不存在下において測定したＧｌｕのＣＥ50値である。
化合物ＡＣＰＴ−ＩＩが、ｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａに対した同様な作用を発揮することが確認される。各々の場合において、傾斜は競合的拮抗に対して予想される全体像に類似のものである。シルドの表示により測定されるそれぞれのＫB値は、それぞれｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａに対して１１５±２、８８±２１、７７±９μＭ（ｎ＝３）である。
同時に、ｍＧｌｕＲ１ａおよびｍＧｌｕＲ２に対する２種のエナンチオマーからなるＡＣＰＴ-ＩＩＩの活性を考慮して、これらの受容体に対する（＋）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩおよび（−）−ＡＣＰＴ−ＩＩＩの作用を研究した。
上記に示すように一つのエナンチオマー（＋）はこの受容体の作動薬であることがわかったので、ｍＧｌｕＲ４ａに対する化合物（−）ＡＣＰＴ−ＩＩＩの可能な拮抗作用を同様に研究した。
得られた結果は図３ａから３ｃに示す。これらの図はそれぞれｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ４ａについて得られた結果に関するものである。記号は下記の通りである：（●）：化合物（＋）ＡＣＰＴ−ＩＩＩの拮抗作用、（〇）：化合物（−）ＡＣＰＴのｍＧｌｕＲ類に対する作用。ＡＣＰＴ-ＩＩＩの濃度はμＭ単位で表す。
ＡＣＰＴ−ＩＩＩ（＋）および（−）が、ｍＧｌｕＲ１ａおよびｍＧｌｕＲ２を発現する細胞内において弱い力でＧｌｕの反応を阻害することが確認される。ｍＧｌｕＲ４ａに対しては、化合物（−）ＡＣＰＴ−ＩＩＩはＧｌｕのもの（図４ｃ）に対して拮抗作用を発揮し、シルド曲線の分析は、ＫB値２２０μＭで競合的阻害（勾配＝０．８７７）を示す。
Ｇ蛋白質と結合した数々の他の受容体について既に報告されているように、ｍＧｌｕＲ１ａ受容体に基づく活性を検出することが可能である（プレゾーら、モレキュラー・ファーマコロジー、１９９６年、４９巻、４２２−４２９頁）。実際、作用薬が全くない時と同じく、ホスホリパーゼＣの増大した活性が、ｍＧｌｕＲ１ａを発現する細胞において検出可能である。しかし、Ｇ蛋白質と結合した他の受容体で観察されるのとは逆に、ｍＧｌｕＲ１について知られた競合的拮抗薬はいずれもこの受容体に構成的な活性を阻害することができない。それゆえ、これらの分子はいずれも逆作動薬として振舞うものではない。逆に、１ｍＭ濃度におけるＡＣＰＴ−ＩＩの適用（ただしＡＣＰＴ−ＩまたはＡＣＰＴ−ＩＩＩのそれではない）は、抑制条件下で、または受容体がＧｑ蛋白質のサブユニットアルファと同時発現されているときに、それと測定されたｍＧｌｕＲ１ａの基準活性を阻害する。これらの結果は図５ａおよび５ｂに記載する。図５ａにおいて、受容体ｍＧｌｕＲ１ａ受容体を発現しているＨＥＫ２９３細胞で測定したホスホリパーゼＣの基準活性をＡＣＰＴ-ＩＩのみが顕著に阻害することがわかる。図５ｂは、ｍＧｌｕＲ１ａを発現しＧｑ蛋白質のサブユニットアルファを過剰発現する細胞で得られた結果を示す。この観察結果は、ＡＣＰＴ-ＩＩがこの受容体に逆作用活性もつ唯一つの既知ｍＧｌｕＲ１ａ拮抗薬であることを示す。
【図１ａ】
0004317975.tif 000019
【図１ｂ】
0004317975.tif 000020
【図１ｃ】
0004317975.tif 000021
【図２】
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【図３ａ】
0004317975.tif 000023
【図３ｂ】
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【図３ｄ】
0004317975.tif 000025
【図３ｅ】
0004317975.tif 000026
【図３ｃ】
0004317975.tif 000027
【図３ｆ】
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【図４ａ】
0004317975.tif 000029
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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