(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）血液試料と水性試薬組成物とを混合して均一な反応混合物を形成させ、その試薬組成物は（ｉ）赤血細胞は溶解してヘモグロビンを放出させるが、その試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の９．３〜１７．３の親水性親油性比（ＨＬＢ値）を持つ非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、（ｉｉ）赤血細胞は溶解するが、その試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の硫酸ドデシルアルカリ金属である陰イオン性またはテトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）である双性イオン性類のイオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）白血細胞を化学的に橋かけさせるが、その試料中の溶解性の赤血細胞は橋かけしない有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドと、（ｉｖ）その試料中のリンパ球の検出性を増大させる有効濃度の糖または糖アルコールと、（ｖ）その反応混合物の中性または中性に近いｐＨを６．９〜７．６に保持するための緩衝剤または緩衝剤混合物を含有し、（ｂ）その段階（ａ）の反応混合物を６０〜７５℃の温度に加熱し、それによって試料中の赤血細胞を溶解し白血細胞を固定し、そして、（ｃ）その反応混合物中の白血細胞の少くとも一部分を染色し、その懸濁物中に染色された白血球母集団と染色されてない白血球母集団とを生じさせ、その場合、前記水性試薬混合物中における非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者の存在が、新鮮血液試料および採血後室温で少くとも１日貯蔵した時間を置いた血液試料に関し、正確で信頼性のある白血球分画計数結果を段階（ｃ）の後に与える
各段階を包含する、試料中の白血細胞分集団の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に基く、赤血細胞と白血細胞とを含有する新鮮または時間を置いた全血試料についての白血細胞分画計数および分集団分析のための改良された方法。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が９．５〜１７．３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が９．７〜１６．９である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）血液試料と水性試薬組成物とを混合して反応混合物を形成させ、その試薬組成物は（ｉ）９．３〜１７．３の親水性親油性比（ＨＬＢ値）を持ち、試料中の赤血細胞は溶解してヘモグロビンを放出させるが、白血細胞母集団は溶解しない有効濃度で存在する非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、（ｉｉ）試料中赤血細胞は溶解させるが白血細胞は溶解しない有効濃度の、硫酸ドデシルアルカリ金属である陰イオン性またはテトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）である双性イオン性類のイオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）試料中白血細胞は化学的に橋かけさせるが、溶解性の赤血細胞は橋かけさせない有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドと、（ｉｖ）試料中のリンパ球の検出性を増大させる有効量の糖または糖アルコールと、（ｖ）試薬混合物のｐＨを中性または中性に近いｐＨ６．９〜７．６に維持させる緩衝剤または緩衝剤混合物とを含有し、
（ｂ）段階（ａ）で調製されたその反応混合物を６０〜７５℃の温度に加熱し、それによって試料中の赤血細胞を溶解し、白血細胞を固定し、そして
（ｃ）その反応混合物中の少くとも一部分の白血細胞を染色して、懸濁物中に染色された白血細胞母集団と染色されていない白血球母集団とを生じさせ、その場合、水性試薬混合物中における非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者の存在が新鮮血液試料および採血後室温で少くとも１日貯蔵された、時間を置いた試料に関し、正確で信頼性のある白血細胞分画計数結果を段階（ｃ）の後に与える
各段階を包含する、試料中の白血球分集団の内因性ペルオキシダーゼ活性測定に基く、赤血細胞と白血細胞とを含有する新鮮あるいは時間を置いた全血試料に関する、白血細胞分画の計数と分集団分析とのための改良された方法。
【請求項５】
段階（ａ）（ｉ）における非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が９．５〜１７．３である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が９．７〜１６．９である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤を、ポリエチレングリコールにエーテル化された直鎖脂肪族疎水物と、ポリエチレングリコールにエーテル化された分枝鎖脂肪族または芳香族オクチルフェニル疎水物とからなる群から選択する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールにエーテル化された分枝鎖脂肪族または芳香族疎水物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（商標登録）−１００である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤が段階（ａ）の水性試薬組成物中に０．０９〜０．２１ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１３】
陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシルナトリウムである、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１４】
陰イオン性または双性イオン性界面活性剤が段階（ａ）の試薬溶液中０．０５０〜０．１２５ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ａ）の水性試薬組成物が更に多価金属イオンのキレート剤を包含する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１６】
多価金属イオンキレート剤が濃度１〜５ｍＭである、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、トリナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡあるいはテトラナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ａ）の試薬組成物が更にアルカリ金属塩化物を包含している、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）の試薬組成物中のアルカリ金属塩化物をＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとからなる群から選択する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
塩が試薬組成物中６．８〜１０．３ｍＭの量で存在するＮａＣｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ホルムアルデヒドは試薬組成物中に濃度５２〜５８ｇ／Ｌで存在する請求項１または４に記載の方法。
【請求項２１】
緩衝剤または緩衝剤混合物が水性試薬組成物のｐＨを７．０〜７．４に維持する請求項１または４に記載の方法。
【請求項２２】
緩衝剤がＮａ2ＨＰＯ4とＮａＨ2ＰＯ4との緩衝剤混合物を包含する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項２３】
染色段階がペルオキシダーゼ活性の白血細胞の染色を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項２４】
染色段階が反応混合物を過酸化水素及び色原体と混合することを包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
色原体が４−クロロ−１−ナフトールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
糖または糖アルコールを、スクロースとフラクトースとデキストロースとソルビトールとマンニトールとより成る群から選択する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項２７】
糖アルコールがソルビトールである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ソルビトールが段階（ａ）の試薬組成物中に１１０〜１２０ｇ／Ｌの量で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｃ）の、染色させた及び染色されていない白血細胞の懸濁液を電子ー光学的検出システムを通過させ、そしてその懸濁液中の白血細胞の白血細胞分画を得る段階を更に包含する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項３０】
その段階を自働化血液学分析器の反応室内で行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
更に、分画法の段階（ａ）から（ｃ）までを行った後、自働分析器のその室を、９５０〜４０００の分子量を有し、ポリオキシプロピレン９０〜２０％とポリオキシエチレン１０〜８０％を持つエチレンオキシドとプロピレンオキシドの共重合物である非溶血性非イオン性界面活性剤を包含する水性すすぎ試薬組成物ですすぐ段階（ｄ）を包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
すすぎ組成物を包含する界面活性剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）類の１つである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）がＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｐ１０５である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
すすぎ組成物が更に次の成分：ＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとからなる群から選択されるアルカリ金属塩化物、Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０（２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）とＰｒｏｃｌｉｎ３００（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）とＧｅｒｍａｌｌ  １１５（Ｎ，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル］尿素）とＤｏｗａｃｉｌ  ２００［１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド］とＢｒｏｎｏｐｏｌ（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）とよりなる群から選択される殺菌化合物、３，３´−チオジプロピオン酸と３，３´−ジチオ酢酸とＴｒｏｌｏｘ（登録商標）［６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−３−カルボン酸］またはビタミンＥ、ＢＨＴ［２、６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフフェノール］と、ＢＨＡ［２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール］とＭＥＨＱ［ｐ−メトキシフェノール］とよりなる群から選択される水溶性酸化防止剤、およびその水性すすぎ組成物のｐＨを６．９〜７．６に維持するための緩衝剤または緩衝剤混合物の１つまたはそれ以上を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
水性すすぎ組成物が２８５〜３０５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を持つ、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
水性すすぎ組成物がＮａＣｌとＰｒｏｃｌｉｎ１５０と３，３´−チオジプロピオン酸とｐＨを７．０〜７．５に維持するための緩衝剤または緩衝剤混合物とを包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
水性すすぎ組成物中に、ＮａＣｌが濃度７．４０〜８．０ｇ／Ｌで存在し、Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０が濃度０．２５〜０．６０ｍＬ／Ｌで存在し、３，３´−チオジプロピオン酸が濃度５０〜１５０ｍｇ／Ｌで存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
水性混合物中に
（ａ）赤色細胞を溶解してヘモグロビンを放出させるが、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の９．３〜１７．３の親水性親油性比（ＨＬＢ値）を持つ非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と
（ｂ）赤血細胞を溶解してヘモグロビンを放出させるが、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の硫酸ドデシルアルカリ金属である陰イオン性またはテトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）である双生イオン性界面活性剤と
（ｃ）試料中のリンパ球の検出性を増大する有効濃度の糖または糖または糖アルコールと（ｄ）白血細胞は化学的に橋かけするが、試料中の溶解性赤血細胞は橋かけしない有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドと
（ｅ）試薬組成物のｐＨを６．９〜７．６に維持するための緩衝剤または緩衝剤混合物とを包含する、全血試料中の白血球の分集団中の内因性ペルオキシダーゼ活性を測定することに基礎を置いた、全血試料中の白血球分画の測定と分集団分析のための赤血細胞の溶解と白血球の染色のための改良された試薬組成物。
【請求項３９】
非イオン性界面活性剤が親水性親油性比（ＨＬＢ値）９．３〜１７．３を持つ、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が９．７〜１６．９である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
更に、多価金属イオンのキレート剤を包含する請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
水性混合物中に
（ａ）親水性親油性比（ＨＬＢ値）９．３〜１７．３を持ち、赤色細胞を溶解してヘモグロビンを放出させるが、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、
（ｂ）赤血細胞を溶解してヘモグロビンを放出させるが、試料中の白血細胞は溶解しない有効濃度の硫酸ドデシルアルカリ金属である陰イオン性またはテトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）である双性イオン性界面活性剤と、
（ｃ）試料中のリンパ球の検出性を増大させるに有効濃度の糖または糖アルコールと、
（ｄ）白血細胞は化学的に橋かけするが、試料中の溶解性赤血細胞は橋かけしない有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドと、
（ｅ）試薬組成物のｐＨを６．９〜７．６に維持するための緩衝剤または緩衝混合物と
を包含する、血液試料中の白血球分集団における内因性ペルオキシダーゼ活性測定に基く、全血試料の白血球分画の測定と分集団分析とのための、赤血細胞の溶解と白血球の染色とのための改良された試薬組成物。
【請求項４３】
非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤を、ポリエチレングリコールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物と、ポリエチレングリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族または芳香族オクチルフェニル疎水物とからなる群から選択する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項４４】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物である請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルである請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族または芳香族疎水物である請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−１００である請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
非イオン性界面活性剤がその組成物中に０．０９〜０．２０ｇ／Ｌの量で存在する、請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項４９】
陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシルナトリウムである請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５０】
陰イオン性または双性イオン性界面活性剤が組成物中０．０５０〜０．１２５ｇ／Ｌの量で存在する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５１】
更にアルカリ金属塩化物を包含する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５２】
アルカリ金属塩化物をＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとからなる群から選択する請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
塩がＮａＣｌであり、試薬組成物中に６．８〜１０．３ｍＭの濃度で存在する請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
ホルムアルデヒドが組成物中５２〜５８ｇ／Ｌの濃度で存在する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５５】
緩衝剤がＮａ2ＨＰＯ4とＮａＨ2ＰＯ4との混合物を包含する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５６】
糖または糖アルコールをスクロースとフルクトースとデキストロースとソルビトールとマンニトールとからなる群から選択する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項５７】
糖アルコールがソルビトールである請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
ソルビトールが組成物中１１０〜１２０ｇ／Ｌの濃度で存在する請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
更に、多価金属イオンのキレート剤を包含する請求項３８または４２に記載の組成物。
【請求項６０】
多価金属キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、トリナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡあるいはテトラナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
キレート剤がジナトリウムＥＤＴＡであり、１〜５ｍＭの濃度で存在する請求項６０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は全血試料に関する、改良された白血球（即ち、白血細胞）分画計数方法とその方法に用いられる試薬組成物とに関する。本発明の白血球分画計数法と試薬組成物とは白血球の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に基いている。本発明の方法と組成物とは、試料を光散乱および光吸収流通サイトメトリー（cytometry)により電子−光学的に分析する際、新鮮血液試料および、約４８時間室温あるいは冷下で貯蔵された、時間をおいた試料について白血球分画計数を得ることの精度と確度とを維持する。
【０００２】
【発明の背景】
全血試料中に通常見出される白血細胞即ち白血球の５つの種類とは好中球とリンパ球と単核細胞と好酸球と好塩基球とである。白血細胞のこれら５つの正常型の相対的比率を測定するため、並びに全血試料中の異常細胞の存在および濃度を検出するため、医学的診断方法は因襲的に、顕微鏡スライド上の血液の乾燥し、染色された塗抹標本の検査を実行する。この方法は白血細胞分画と称せられ、Miale, J.B., "Laboratory Medicine-Hematology", (1967), C.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri, 822-830, 1126, 1127 および1130頁に記載されている。血液試料中の白血球の前記の５種類に加えて、白血細胞分画はまた巨大未染色細胞（large unstained cell) （“ＬＵＣ”）も検出し、測定する。ＬＵＣは正常血液試料中の白血細胞の小部分を表わし、巨大リンパ細胞と活性化されたリンパ細胞と血漿細胞と芽細胞とペルオキシダーゼ陰性単核細胞と好中球と好酸球とのような細胞型を包含する。
【０００３】
半自働化および完全自働化血液学方法およびそのための自働化流通システムは、Ansley等の米国特許第３，７４１，８７５号とKim の米国特許第４，０９９，９１７号とCrewins 等の米国特許第４，８０１，５４９と４，９７８，６２４号中に記載の如く、白血細胞分画と血液試料分析との負担を容易にするために開発された。その方法及びシステムは個別の細胞型を特異的に検出、同定、定量および識別するために電子−光学的および細胞化学的方法を用いる。その上、白血細胞分画のための手動の方法が技術で知られている。例えばMiale, J.B. "Laboratory Medicine-Hematology", (1967), C.V. Masby Company, St. Louis, Missouri.
【０００４】
Hamaguchi 等の米国特許第５，３８９，５４９号は白血球の分類のために用いられる方法と試薬とを記載していて、その方法は高周波数での電気的インピーダンスの変化または粒子と流体媒質との間の導電率の差の検出を包含し、試薬は、一分子当りオキシエチレン繰返し単位１８〜３０を持つ特異型の陰イオン性並びに非イオン性ポリオキシエチレン基礎の界面活性剤と、高−あるいは低−浸透性薬剤と、溶解剤とを含有する１成分または２成分溶液を必要とする。２成分試薬は第１希釈流体と第２溶解試薬流体とを要する。
【０００５】
Cremins 等の米国特許第４，８０１，５４９および４，９７８，６２４号は、より速やかに実行され、白血細胞を損うことなく全血試料中の赤血細胞を溶解し、細胞の最少限の細胞外沈澱あるいは凝集塊を起させる方法および試薬を記載している。その様な沈澱または細胞凝集塊は方法の細胞検出および識別段階において不明確さを生じさせる。記載されている方法（または“ペルオキシダーゼ法”）は白血球類を染色し、そして特別の細胞型を区別するために過酸化物（即ち過酸化水素）と適当な色原体とを包含する混合物を包含する。
【０００６】
これらの方法のどれにおいても、赤血細胞が、正常血液においては約１，０００倍も白血細胞に数では圧倒的であるから多くの赤血細胞を出来るだけ溶解することが絶対に必要である。この故に、１％の赤血細胞が残っていてさえ、確実な正確な白血細胞分画を達成するのが困難である。
【０００７】
米国特許第４，８０１，５４９および４，９７８，６２４号に開示されているペルオキシダーゼ法においては、全血試料を、唯１つの界面活性剤と、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒドの様な固定剤と、糖または糖アルコールと、ほぼ中性のｐＨを維持するための緩衝剤とを包含する溶液と混合した後、赤血細胞を溶解し、白血細胞を橋かけさせる。過酸化水素と電子供与体色原体例えば４−クロロ−１−ナフトールとは、ある白血細胞、即ち好中球と好塩基球と単核細胞との細胞質中にあるペルオキシダーゼ陽性顆粒中に暗紫色の沈澱を形成する。沈澱は不溶性の反応生成物で、その形成は細胞内顆粒中の内因性ペルオキシダーゼ酵素により接触作用を受ける。細胞の型を区別することは、細胞の大きさと染色の度合い（即ち前方散乱対吸光度）を細胞１つずつ測定され、サイトグラムにプロットされ、それから試料中の全白血細胞数と種々の型の白血細胞の分画と両者を得るために分析するという電子−光学的分析により行われる。その上、全白血細胞数は分画とは独立して得ることができる。
【０００８】
本発明により提供される改良と有利さとの以前に、アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤が記載され、特にTechnicon H6000TM 自働化分析システムで行われる白血細胞分類に関するアルカリ性ペルオキシダーゼ法中に用いられていた。以前のアルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤は主要な欠点例えば試薬成分の不安定性とその結果として短い保存性と貯蔵性とを持っていた。その上、利用者はアルカリ性ペルオキシダーゼ法実行のためアルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤の均一な作業溶液を調製する必要が要求された。このことは、利用者が高水準（即ち４．５％）の硫酸ドデシルナトリウムを含有する溶液と高水準（即ち３０％）のBrijTM３５を含有する溶液とを一緒に混合し、それによって２つの種類の高められた濃度を持つ作業アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤をもたらさなければないことにより達成されている。その様な調製は得られる均一な作業アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤が僅かに１週間だけしか安定でない故に、刺激性の希釈試薬成分のみならず煩雑で何回も行わなければならなかった。後で明らかになる様に、アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤の不安定性と短い貯蔵能力と利用者の取扱い問題並びにそれに関連した商業的不利はここに記載の本発明により非常に改良され、克服された。
【０００９】
本発明以前、細胞分離並びに定量方法、特に白血球分画のペルオキシダーゼ法の確度と信頼度とを妨げる主要な欠点は方法においての一定しないすすぎ液残余（rinse carryover)であった。すすぎ液残余がシステムからシステムに、分析から分析に変ることは知られている。特にペルオキシダーゼ反応法に基づく白血球分画分析（differential analysis)の確度と精度とは、方法におけるそのような一定しないすすぎ液残余の影響を蒙ることがしばしばである。技術に熟達した人達はすすぎ液残余は単に容積的希釈で方法に寄与し、すすぎ液残余は方法の反応段階において活性なあるいは機能的役割を演じないと推測していた。事実、本発明の創意に富む発見までは、熟達した従集者はすすぎ液残余が血液試料分析における単なる容積的効果以上のものであり、本発明により提起され、ここに記載する問題に対して解答を持たなかったこと悟らなかった。
【００１０】
更に、新鮮（即ち採血後８時間乃至それ以内）の血液試料と、また、約４８時間までの間室温に貯蔵された時間をおいた血液試料とを分析し、それからの有用な臨床的情報を抽出するための改良された試薬と方法とを技術には必要としている。また一定しないすすぎ液残余により生ずる新たに記載された問題を軽減し、特に、それには限定されないが、いろいろな血液試料型、例えば新鮮全血試料と時間をおいた全血試料と、異常全血試料（例えば病院または患者源の）と、種々な方法（例えば冷下または室温で）貯蔵された正常全血試料（例えば非病院または“健康”な供給者源の）との電子−光学分析業務において確度の高い、信頼性のある結果を生む成分を包含している適当な試薬溶液と組成物とを開発することも必要である。更に、非常に安定で、長い寿命と貯蔵寿命（例えば１週間以上）を持ち、白血球分画法を実施し、それからの結果を得るための使用に先立ち、利用者または客の調製または処理を要しない試薬組成物を技術において必要としている。また自働化分析機を用いて室温貯蔵または時間をおいた血液試料に関する分画を実施する場合、得られるサイトグラム源におけるノイズの受入れられる水準を達成しそして／または維持することも必要である。
【００１１】
【発明の要約】
本発明は電子−光学方法と流通式サイトメトリー（cytometry)分析とを用い、新鮮並びに時間をおいた全血試料両者における白血球を定量し、分画するための改良された試薬組成物と方法とを提供する。
【００１２】
本発明の目的は、１つの方法と他との間の望ましからぬ反応成分の残余の問題を回避し、そうして白血細胞分画を達成するのに用いる方法から得られるサイトグラム中の根源（origin）ノイズと細胞汚染との受入れ難い水準なしに細胞の型の明瞭な分離と定量とを可能にする。半−並びに完全−自働化システムに用いる、最適で改良された試薬組成物と方法とを提供することである。
【００１３】
更に本発明は、白血細胞分画法の反応段階において何等機能的役割を演じず、特にペルオキシダーゼ法に関して方法の反応化学に関与しないすすぎ試薬溶液を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、種々な血液試料の型例えば時間をおいた並びに新鮮な血液試料と異常および正常血液試料と冷下および室温中に貯蔵された試料について正確で確実な結果を生む自働化ペルオキシダーゼ法と試薬組成物とを提供することにある。
【００１５】
本発明の尚他の目的は、吸引流通式サイトメトリーにより、全血試料中の白血細胞型を数え上げそして区別するペルオキシダーゼ法に使用の、改良された試薬組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の尚他の目的は、自働化血液学分析と流通式サイトメトリーと共に内因性ペルオキシダーゼ染色を用いる、白血細胞分画と、全血試料の分集団分画との速くて効率的定量測定のための最適化され、改良された方法と試薬組成物とを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、白血細胞試料中の細胞の好酸球分集団の分離を改善する試薬調製物を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は時間をおいた全血試料のペルオキシダーゼ染色を包含する、白血細胞分画法の反応段階を最適化し、方法におけるすすぎ液残余のどんな負の影響も防止するためのバランスのとれた、安定な試薬組成物を提供することにある。
【００１９】
本発明の尚他の目的は、試薬組成物が便利で使用し易く、使用前に使用者または客により付加的な調製または混合を必要としない、安全で安定な試薬調製物と方法とを提供することにある。本発明の試薬組成物は安定であり、室温で長い貯蔵寿命および保存寿命（例えば１週間以上で少なくとも約１年）を維持する。他の目的は白血球分画法を能率的にし、方法の段階を実施するのに使用する必要のある試薬の数を減じることにある。
【００２０】
本発明が提供する更にその上の目的および有利さは以下の詳細な説明から明らかであろう。
【００２１】
【略語並びに術語】
次の略語および術語を技術に熟達した人々の便宜のために定義または説明するが、どんな方法ででも発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００２２】
ここに例示する自働化分析機で実施されるようなペルオキシダーゼ法中の赤血細胞の溶解は細胞膜に穴をあけ、ヘモグロビンの多くまたは全てを細胞外に漏れ出させると定義する。得られる赤血細胞幻影（ghost)はペルオキシダーゼ法の組成物中に存在する固定剤により橋かけまたは固定される。赤血細胞幻影はサイトグラムの根源領域におけるノイズとして検出することができ、それは流通式サイトメトリーを用いる、試料中の細胞の電子−光学的検出から生ずる。
【００２３】
ペルオキシダーゼは本明細書を通じて“Ｐｘ”と省略される。
【００２４】
ここに用いる如く、術語水性試薬組成物と試薬溶液と希釈剤とは同等である。
【００２５】
Ｒ１は白血細胞分画のＰｘ法の第１反応段階である。より詳細に説明するごとくＰｘ法のＲ１段階においては、全血試料を本発明に従って処方された第１水性試薬組成物（“ＰｘＲ１試薬組成物”または“ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物”）と混合する。Ｐｘ法のＲ１段階の間、試料の赤血細胞の全てあるいは多くは溶解され、白血細胞は化学的に、Ｒ１試薬組成物中に存在する固定剤により橋かけあるいは固定される。
【００２６】
新鮮血液試料は採血後８時間以内の分析に用いられる血液試料である。術語“新鮮血液試料”はここで用いる如く術語“ Day１試料”と同義である。
【００２７】
時間をおいた試料は採血後約４８時間まで室温に貯蔵された血液試料である。術語“時間をおいた試料”はここで用いる術語“ Day２血液試料”を包含すると考える。
【００２８】
【本発明の詳細な説明】
本発明は一般的に、白血細胞の特別な型の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に依存するペルオキシダーゼ（Ｐｘ）法による白血細胞分画の測定および定量化のための改良された方法と試薬組成物とに関する。本発明は特に半自働−および自働流通式サイトメトリー分析機と、白血細胞測定と分集団測定とのためのペルオキシダーゼ法における改良とに関する。
【００２９】
本発明の理解を助けるために、白血球分画の自働ペルオキシダーゼ法で起る細胞的および分子的事象の要約を提供する。ペルオキシダーゼ法の第１即ちＲ１段階において血液試料を水性第１試薬（Ｒ１）組成物（即ち、Ｒ１溶液または希釈剤）と混合し、その混合物を約１５〜２０秒間約７０℃に加熱する。その間赤血細胞は溶解し、そのヘモグロビンは漏出し、得られる血色細胞幻影は固定される。白血細胞は固定化合物例えばホルムアルデヒドにより化学的に橋かけされ、あるいは固定され、残りの反応の間の溶解に対する抵抗を提供する。一般に赤血細胞は白血細胞と血小板とより容易に溶解される。しかし、溶解並びに固定は同じ試料反応混合物中に起る過程と競合する故、方法の間に用いられる条件の下で橋かけされるようになるのは赤血細胞幻影と血小板とに関しては異常なことではない。この様にして、ペルオキシダーゼ法は血液試料中の赤血細胞の溶解と白血細胞の固定との間の微妙なバランスを要求する。もしＰｘＲ１試薬組成物の溶解力が強すぎると、赤血細胞と白血細胞との両者が損障される。逆にもし固定剤の濃度が大きすぎると、細胞の全てが赤色細胞溶解が起る前に固定されることになる。それにも拘らず、白血細胞分画は、特に本発明に従って開発されたような改良されたペルオキシダーゼ法についての速さと最適な反応条件と試薬処方との点から見て、細胞の型と細胞の数との高い水準での確度の高い、信頼性のある測定で得られ、半自働−および自働血液学システムを用いて現れる迅速な試料分析が実施される。
【００３０】
全血中においては赤血細胞対白血細胞の比は約１，０００：１である。従って全血試料分析のための自働ペルオキシダーゼ法の最適な実施については、本質的に全ての赤色細胞は分析の早期に試料アリコート中で溶解されるべきことは明らかである。従ってＲ１希釈剤を用いる第１の反応においては赤色細胞溶解と白色細胞の橋かけとの間に競合がある。若し赤色細胞が元のヘモグロビンを持ったまま生き残ると、得られるサイトグラムのリンパ球域の布置の理由で、リンパ球として正しくなく検出されるので、それらは分画において妨害になるようである。しかし、血液試料アリコート中の白血細胞がペルオキシダーゼ法のＲ１段階の間に溶液成分により攻撃あるいは劣化されないことは至難なことである。
【００３１】
ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に引き続く第２反応段階（またここでは“反応２”あるいは“Ｒ２”と呼ぶ）の間、過酸化水素と電子供与体例えば４−クロロ−１−ナフトールとの基質溶液をＲ１反応混合物に添加する。これらの化合物は、単核細胞と好中球と好酸球とを含む“染色する”白血細胞型中に差別的に存在する内因性細胞ペルオキシダーゼの基質である。リンパ球と巨大未染色細胞（ＬＵＣ）は内因性ペルオキシダーゼ酵素を含有せず、従ってその方法においては染色されない。内因性ペルオキシダーゼ酵素を含有していない、赤色細胞幻影と血小板との組合せは染色されず、全血細胞分析を包含する殆ど全ての方法について出合いそして入れられる根源ノイズに寄与してもよい。ヘモグロビンの幾らかあるいは全てが含有されている不完全に溶解された赤色細胞はＰｘ法から生ずるサイトグラムのリンパ球域で検出され、その方法を妨害する。血小板と血小板凝集塊もまたリンパ球域で検出され、妨害の付加的な源である。
【００３２】
ペルオキシダーゼ法においては、“染色”は電子供与体基質例えば４−クロロ−１−ナフトールが酸化され、細胞内に捕捉される深紫色反応生成物に重合される複雑な化学反応の結果である。細胞内の顆粒が紫色に染色され、それにより、もし顕微鏡下で検査（顕微鏡検査を用いると染色された細胞は裸眼に黒く見える）すると、細胞はペルオキシダーゼ反応混合物（“流出液”）中に観察することができる。自働血液学的分析機システム例えば商業的に商標TECHNICON Ｈ●１TM、Ｈ●２TM、Ｈ●３TMなどの下に商業的に入手でき、この発明の譲受人により販売されているＨ●TMシステムで例示されるものでは、検出は光吸収（紫色反応生成物による）と光散乱（細胞寸法による）との測定により電子−光学的に行われる。
【００３３】
本発明は、総括的なペルオキシダーゼ法の実施を改良し、最適化するため、試薬組成物への新たに添加される成分の存在の成果として、ペルオキシダーゼ法のＲ１段階においての使用のための単一の新試薬組成物を提供する。その成分は溶血性の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５である。新試薬組成物中でのイオン性界面活性剤と共にそのような非イオン性界面活性剤の存在は前記して略述したペルオキシダーゼ法の引き続く反応段階で他の試薬と共に用いて成功できる新規のＰｘ１試薬または希釈剤を提供する。技術に熟達した人達はＰｘ法のＲ１段階において界面活性剤の量並びに濃度が決定的なものであること、即ち余り多くの界面活性剤は試料中の白血細胞への攻撃を引き起し、余り少ない界面活性剤は赤血細胞を適当な方法で溶解せず、それで得られるサイトグラム中の根源ノイズの原因となることを認めるであろう。
【００３４】
発明の態様において本発明の新しいＲ１試薬組成物は、すすぎ溶液が溶血性非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を含有していないという条件の下で、水性すすぎ試薬を用いるすすぎのサイクルをペルオキシダーゼ法において実施する場合にうまく用いることができる。特に、本発明のＲ１組成物は、他の型の界面活性剤の完全な不存在の下（即ち、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳと非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５となしで）新しいすすぎ試薬組成物と一緒に用いることができる。
【００３５】
本発明の試薬組成物は以下に与えられる説明および実施例において明らかにされる次の問題を解決する。自働分析システム例えば前記のＨ●TMシステムで例示されるシステムで現今実施されているペルオキシダーゼ法を実行して、ペルオキシダーゼ法の１つの試料サイクルの終りに日常的に約８μL のすすぎ溶液の残余が存在することが本発明者によって確かめられた。この一見少量のすすぎ液残余は次の試料サイクルの部分になる。この体積はどんな機能的流儀でもその方法には影響しないということがその方法を実施する人達によって簡単に認められていた。
【００３６】
しかし、その様なすすぎ液残余が約１０μL の体積を越すと、ペルオキシダーゼ法の性能を低下することが新たに発見された。また、すすぎ溶液中に存在する（そして、Ｒ１試薬に持ち越される）非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５は方法の低下を実際に引き起すが、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳはこれを引き起こさないことが、本発明者により予期せられず発見された。判り易くいい、そして更に以下で説明するように、本発明者は、ペルオキシダーゼ法に通常用いられているBrijTM３５含有すすぎ液は非イオン性溶血性界面活性剤を方法のＲ１段階に送達することであり、BrijTM３５を方法の中で機能的であるが望ましくないやり方でその方法に関与することを許すということを発見した。これらの発見の結果として、本発見者は、ペルオキシダーゼ法に用いるすすぎ液がＰｘ法のＲ１段階に必要な成分（即ち非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５）を与えること、およびすすぎ液残余の体積がシステム間で変る場合、ペルオキシダーゼ法は不利に影響することを発見した。ここに説明する発見の開発に従い、本発明者はすすぎ液残余はペルオキシダーゼ法の実行に伴う単なる害のない現象ではないことを最初に認識した。
【００３７】
この知識が本発明者をしてペルオキシダーゼ法のＲ１段階中に用いるための、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者を含有する前記の改良されたＲ１試薬組成物を設計させた。その上、本発明者は、すすぎサイクルによりその方法に用いることが出来るすすぎ液から非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を除去することにより更に方法を改良した。その上、非溶血性の非イオン性界面活性剤例えばPluronicを含有するすすぎ溶液が、Ｐｘ法における新Ｒ１試薬組成物と一緒に用いて最も適当であることを見出した。すすぎ溶液から溶血性の非イオン性界面活性質を除くことにより（あるいはすすぎ液中の唯一の界面活性剤として非溶血性のPluronicを用いることにより）、そして適当な非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者を含有する新しいＰｘ１試薬組成物を処方することにより、Ｒ１試薬中の非イオン性界面活性剤を、Ｐｘ法において制御された速さで最適に送達できた。また、すすぎ液残余体積の変動が新しい方法から得られる結果に影響が出来ない。その結果、改良されたＲ１試薬とペルオキシダーゼ法とにおいて、方法のＲ１段階に用いる試薬組成物中には、活性の非イオン性界面活性剤成分のみが存在し、その機能活性は赤色細胞の溶解に必要である。更に、すすぎ液を方法に用いる場合、BrijTM３５を除いたすすぎ組成物（あるいは界面活性剤として非溶血性のPluronicのみを含有する）は、すすぎ溶液の有害な成分により引き起される受入れられないまたは利用できない結果が軽減されるから、ペルオキシダーゼ法で積極的に関与できるどんな界面活性剤も欠いていて最適である。
【００３８】
自働血液学方法における、すすぎ液残余とそれに伴う問題の発生を更に以下で検討する。自働血液学的分析機を用いる全血試料の分析においては、分析される血液試料の全てが試薬溶液と混合され通常の水力学的通路（例えばチャンネル）を通って流れる。そのチャンネルは多量のすすぎ液の導入により各試料サイクル間で清浄あるいはすすがれる。この工程においてチャンネルは決して完全にはすすぎ液はなくならないかあるいは乾燥されない。すすぎ工程の結果としてすすぎ液は後に残り、次の試料サイクルに入る。このことはすすぎ液残余現象を説明する。
【００３９】
こうして、すすぎ液残余は、ペルオキシダーゼ法を実行するのに用いるシステムにおいて、１つの試料サイクルから次の試料サイクルに一定しない量の反応成分を与えてもよいことは明らかである。これは種々なシステムを互いに他と比較した場合特に明らかである。すすぎ液残余量のシステムからシステムへの変動は鋭敏並びに著しい水準で変り得て自働分析機で実行される方法の結果に対し負に影響を与える。例えば後者の場合においては、すすぎ液残余のより余計の総体量（例えば約１０μL より多い）はその方法において粗末な結果を生じさせる。前者の場合には、すすぎ液残余量におけるシステムからシステムへのより鋭敏な変動（例えばシステム間での体積例えば７．５μL 、８．０μL 、８．３μL)は各システムに対しやや不同に行われる原因になる。記載の発明までは、すすぎ液残余体積の変動のこの種の両者は不利に影響し、現行のペルオキシダーゼ分画法における問題を引き起した。
【００４０】
前記に検討したごとく、本発明の以前は、変動するすすぎ液残余は単に方法を実行するのに起る寛大な体積残余であると、技術の人達により受入れられていた。しかし、ここに更に示すごとく、本発明者は残余体種の定量測定と、方法の反応成分並びに段階の分析を通して、すすぎ液残余（それがシステムからシステムへの、限定されているが種々な体積の形でより鋭敏であるがより潜行的に起るかどうか、あるいはシステムからシステムへのより劇的な体積変化として起るかどうか）は白血球の同定と定量とに関するペルオキシダーゼ法において方法に対し、単なる体積希釈以上のものを与え、現行の方法において偏向と欠点とを引き起し、そして不活発な役割というよりむしろ積極的な役割を演ずることにより方法の性能を損うことを発見した。
【００４１】
特別な実施例として、方法のＲ１段階における活性な界面活性剤の特別な水準を超すことは、サイトグラム（図４Ａ−４Ｆ）の好中球域に集まり、生ずる損障された好酸球により、並びに好中球の貧弱に染色された不規則の母集団により特徴づけられた、得られるサイトグラムのゆがみを引き起す。実施例５はすすぎ液残余Ｐｘ法のＲ１段階（赤血細胞の溶解と白血細胞の橋かけとを包含する）に種々な量の非イオン性界面活性剤BrijTM３５を与えることを示している。
【００４２】
従って本発明はすすぎ液から界面活性剤成分を除くことにより、Ｐｘ法中での、すすぎ液の界面活性剤による積極的な関与を軽減するのに成功し、方法を種々なすすぎ液残余の影響から解放した。このことは、単にＰｘＲ１試薬組成物（その送達はＰｘ法のＲ１段階において制御され、一定である）中にのみであって、すすぎ溶液（すすぎ試薬成分の試料サイクルによる送達は変動され、よりよくは制御されない）中には存在しない“活性”な界面活性剤成分を持つ最終的成果のＰｘＲ１試薬組成物の新しい処方を案出することにより達成された。従って、発明は正確な結果並びに、全体的方法においての、適当な型の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の一定濃度をもたらす。
【００４３】
本発明の試薬組成物と改良されたペルオキシダーゼ法との開発の他の目的はペルオキシダーゼ法および自働血液学的分析法を実行するのに現在使用されている種々な型のすすぎ液の数を減少させることにより自働分析機システムの設計を簡単にしようということである。若し１つのすすぎ試薬を開発し、それが多くの異なった血液分析法と自働システムに適合することが発見されると、システム設計は最終的により簡単でより経済的になるであろう。
【００４４】
最も簡単なすすぎ組成物は溶血性の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５なしで処方され得るが、単にどんな“BrijTM３５もない”すすぎ溶液は未だ、ペルオキシダーゼ法での使用には受入れられないことが見出された。例えば唯ＳＤＳのみを含有する水性すすぎ溶液は、ＳＤＳが冷温で結晶化される故に、方法での使用には受入れられないことが判った。ＳＤＳの挙動は、方法のすすぎ試薬組成物またはすすぎサイクルにおいてその成分または操作性に不利な影響なしに長期間貯蔵でなければならない、水性すすぎ組成物中への使用および安定性を妨げるだろう。こうして、受入れられるすすぎ試薬の処方には発見と工夫とが必要であった。従って、本発明の１つの態様はＰｘ法における新規の使用のために、唯非溶血性の界面活性剤Pluronicのみを含有する水性すすぎ組成物の処方である。
【００４５】
以下並びに実施例において詳細に述べる如く、すすぎサイクルを実行する場合の、２界面活性剤を含有するＰｘＲ１試薬組成物並びに適当なすすぎ溶液の使用は、新鮮および時間をおいた血液試料の分析の場合、受入れられる結果を与える改良されたペルオキシダーゼ法をもたらした。反対に、在来のＲ１試薬組成物（即ち、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５不存在で処方された）は、時間をおいた試料を分析する場合、高い水準の根源ノイズ形成という受入れられない結果をもたらした。新しいＰｘＲ１試薬組成物に用いられる非イオン性界面活性剤の濃度は現行のペルオキシダーゼ法におけるすすぎ液残余により、方法のＲ１段階に残ると発見された非イオン性界面活性剤BrijTM３５の濃度に近づけた。
【００４６】
本発明の改良されたＰｘ法に従うと、時間をおいた血液試料のサイトグラムにおける根源ノイズの受入れられる水準は、ＰｘＲ１反応混合物中に含まれる適当な非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の関数であることを発見した（図１Ａ−１Ｄおよび３Ａ−３Ｄ）。溶血性界面活性剤を欠くすすぎ溶液（あるいは適当な非溶血性界面活性剤例えばPluronicを含有する）の使用は、白血球分画のペルオキシダーゼ法において時間をおいた血液試料から有用な結果を達成し、根源ノイズの受入れられる水準を生む能力において助けになることを発見した。
【００４７】
新しいＲ１試薬組成物はペルオキシダーゼ法の好結果の実行と結果とに対し幾つかの有利さを達成している。例えば上記のごとく、水性Ｒ１試薬組成物は赤色細胞は溶解するが試料中の白色細胞母集団の分析には不利には影響しない充分な濃度で、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤の両者を含有するように処方されている。改良されている白血球分画法で使用のためのすすぎ溶液は、改良されたペルオキシダーゼ法の新規のＲ１希釈剤の操作性を改善することが発見された界面活性剤とは異なる非溶血性の界面活性剤を含有する。前記のすすぎ試薬と組合せてＲ１希釈剤試薬を用いることは、すすぎ液残余による活性界面活性剤乗換え効果と独立したペルオキシダーゼ法を提供する。かくして、すすぎ液残余は完全に除去あるいは軽減されないかもしれないが、非イオン性溶血性界面活性剤（例えばBrijTM３５）のないすすぎ液の使用は、すすぎ液残余の不利なまたは有害な効果を除去し、方法の実行におけるすすぎ液残余によるシステム間の変動を取り去る。さらに、前記の如き２つの界面活性剤を含有する様に処方された、本発明の新規の試薬組成物は、室温と冷下とで少なくとも約４８時間貯蔵された時間をおいた血液試料を分析する場合、分画分析（differential Analysis)の確度を維持し、並びに根源ノイズの受入れられる水準を達成するのに成功した。
【００４８】
本発明に従うと、好ましくは水性の、改良された新規のＲ１試薬組成物は、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤例えば長鎖アルキルエーテルポリエトキシラート例えばポリオキシエチレン（２−２０）ラウリルとセチルとミリスチルとステアリルとオレイルエーテル例えばBrijTM３５を、好ましくは炭素原子約１０〜１６個を持つ硫酸アルキルのアルカリ金属塩の種類のイオン性界面活性剤例えば硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）少なくとも１つと組合せた、２つの溶血性成分を含有している。ＰｘＲ１試薬組成物中に用いるのに適当なイオン性界面活性剤にはまた、炭素原子約１０〜１６個を持つ直鎖アルキル基を持つ双性イオン性スルホベタインの種類の界面活性剤例えばテトラデシルジメチルアンモニオプロピルスルホナート即ち、ＴＤＡＰＳあるいはドデシルジメチルアンモニオプロパン−スルホナート即ちＤＤＡＰＳを包含する。本発明のＰｘＲ１試薬混合物中に処方されている界面活性剤の組合わされた作用と適当な濃度とは、ここに記載の如く赤血細胞の適当な溶解と、溶解された赤色細胞のヘモグロビン内容物の漏洩と遺失とをもたらす。
【００４９】
改良されたＰｘ試薬組成物はまた固定あるいは橋かけ成分（例えばホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド）と、糖または糖アルコールと、試薬のｐＨを中性または中性近くの範囲に維持するための緩衝剤または緩衝剤混合物と、無機塩と、もし必要または所望ならば多価金属イオンのキレート剤とを包含する。反応のＲ１溶解段階における温度と反応時間とを含む、改良された試薬組成物の成分と方法との全てが、方法において改良された結果を達成するためにバランスを取られ、最適になっている。本発明により提供される改良は方法の結果の臨床的有用性を改善する。
【００５０】
ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に用いられるこの新しい２−界面活性剤含有試薬組成物は安定で長い保存性を持っている。例えば試薬組成物の長期の耐久性試験のため、新しいＲ１試薬組成物を調製し、６０℃で３０日間貯蔵した〔即ち、当業者にとって理解できるように、室温（即ち約２２−３０℃）で最終的には１年またはそれ以上の間安定であることを示す、促進安定試験の条件下で貯蔵した〕。この“長期間”貯蔵試薬を前記のペルオキシダーゼ法に用いた場合、得られた結果は尚受入れられそして有用であった。
【００５１】
本発明の試薬の開発と処方とにおいて、試験試薬は Day１および Day２血液試料、特に室温で時間をおいた試料を用いて調製、検査された。本発明のＲ１試薬組成物における非イオン性界面活性剤、特にポリエトキシラートの安定性の評価に用いられる化学的パラメーターは親水性親油性比即ちＨＬＢ値として知られている（ＨＬＢ値と分子式とに関しては、Michael and Irene Ash 編集、Encyclopedia of Surfactants, Chemical Publishing Company, New York, New York, 1980およびMcCutcheon's Emulsifiers and Defergents, McCutcheon Division, MC Publishing Company, Glen Rock, New Jersey, 1987参照）。界面活性剤の界面活性はＨＬＢ値に相関する。かくして、本発明の態様に従えば、与えられた界面活性剤のＨＬＢ値は、その界面活性剤が本発明の試薬組成物の成分として適当であるかどうかの有用な予報値として役立つ。特に、以下に説明の如く適当なＨＬＢは、少なくとも約２日間古く、室温で貯蔵された全血試料の分析と分画測定とにおける結果の改善に作用するであろうことを示している。
【００５２】
本発明の他の態様に従うと、余り大きすぎる親水性を示す、約１７．３〜１７．５より大きいＨＬＢ値を持つ非イオン性界面活性剤を含有する様に処方されている試薬組成物は、方法の改良された実行には不適当であった。本発明の試薬組成物に用いられて適当な界面活性剤のＨＬＢ値は約８．９〜１７．５、好ましくは約９．３〜１７．３、より好ましくは約９．５または９．６〜１６．９の範囲である。本発明の試薬組成物中の界面活性剤は、水不溶性油（即ち細胞膜からの脂質）が水性溶剤中に存在する界面活性剤ミセルにより“溶解”されている水中油型乳化適用に有用であるべきである。水性溶液中においては、ミセルは楕円形または球形であり、極性基が水溶剤に面し、疎水性の核が内部にある界面活性剤分子の集団（例えば約１００分子を含有する）である（M.J. Rosen, 1978, "Surfactant and Interfacial Phenomena" Wiley and Sons Interscience Publications, New York, New York)。約９．５〜１７．５のＨＬＢ値はその様な水中油型乳化における有用性を示している。前記の如く、約１７．３〜１７．５、特に１７．３より大きいＨＬＢ値は方法の性能を改良しない。表９及び表１０は自働分析機に種々な異なる界面活性剤を用いて行った本発明の白血球分画法の結果を示している（実施例７）。同様に約９．３以下のＨＬＢ値を持つ界面活性剤もまた一般的に、方法において有用ではなかった。
【００５３】
炭素原子約１０〜１６個を持つ硫酸アルキルのアルカリ金属塩のイオン性界面活性剤類については、本発明のＲ１試薬組成物の好ましいアルカリ金属陽イオンはナトリウムとカリウムとリチウムとである。より好ましいのは硫酸ドデシルアルカリ金属、最も好ましいのは硫酸ドデシルナトリウムである。使用に適当な陰イオン性界面活性剤の濃度範囲の例は約０．０３０〜０．１５０g/L 、好ましくは約０．０５０〜０．１２５g/L 、より好ましくは約０．０８５〜０．１０５g/L である。また炭素原子約１０〜１８個を持つ陰イオン性アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムも使用に有用である。本発明の使用に適当な他の陰イオン性界面活性剤の例はＮ−アシル−ｎ−アルキルタウラート（例えばＲ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3-Ｍ+ 、ここにＲ＝Ｃ10Ｈ23−Ｃ14Ｈ29；Ｒ1 ＝ＣＨ3 またはＨ；Ｍ+ ＝Ｌｉ+ 、Ｎａ+ またはＫ+)である。更に、双性イオン性界面活性剤、例えば同族のＣ16およびＣ12の成員（member）、例えばＴＤＡＰＳ（テトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホナート）を含むスルホベタイン族の成員は本発明における使用に適している（実施例８）。本発明に使用できる双性イオン性界面活性剤の他の例は、コール酸誘導体例えばＣＨＡＰＳＯ（３−〔（３−コーラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）と、炭素原子約１２〜１６個を持つ、Ｎ−オキシドと呼ばれるアルキル  Ｎ，Ｎ−ジメチル  Ｎ−オキシドとである。Ｎ−オキシドの特別な、しかし非限定的例はラウリルジメチルアミン  Ｎ−オキシド（ＬＯ）などである。ＴＤＡＰＳと類似であるがより少ない炭素原子例えばＣ12を持つ界面活性剤例えばＤＤＡＰＳ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート）もまた本発明のペルオキシダーゼ法並びに試薬に用いられてもよい。
【００５４】
本発明の試薬組成物中の使用に適当な非イオン性界面活性剤の一族は（１）ポリエチレングリコールまたはポリオキシエチレンエタノールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物を含むポリオキシエチレンアルキルまたはアリールエーテル（またポリエトキシラートとも呼ぶ）、例えばBrijTM３５と、（２）ポリエチレングリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族／芳香族（例えばオクチルフェノール）疎水物、例えばTritonＸTM−１００と、（３）ポリエチレングリコールにエーテル化されている直鎖脂肪族／芳香族（例えばｎ−ノニルフェノール）疎水物、例えばIgepalTMＣ０８９７と、（４）ポリエチレングリコールにエステル化されている直鎖脂肪族（例えばカルボン酸）疎水物、例えばMyrjTM５３である。これら４つの族の中、エステル型は水性溶液中で加水分解を受け、エーテル型界面活性剤よりやや安定でないと予想される。
【００５５】
第１の族の例は、それに限定する必要はないが、次のものが含まれる。
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（BrijTM３０）、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（BrijTM３５）、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（BrijTM５２）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（BrijTM５８）、ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（BrijTM７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル（BrijTM７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（BrijTM７８）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（BrijTM９２）、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（BrijTM９６）、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（BrijTM９８）、ポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル（BrijTM７２１）、ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル（BrijTM７００）。BrijTM界面活性剤の中最も好ましいのはBrijTM３５である。本発明の組成物中に使用が適しているが、ポリオキシエチエンオレイルエーテルは、分子中での、酸化に対して感受性にする二重結合の存在により、長期の貯蔵に対する安定が少ないかもしれない。最も適当な非イオン性界面活性剤は本発明に従うと前記の範囲内のＨＬＢ値を持つことになることを技術に熟達した人達により認められるだろう。第２の族の非イオン性界面活性剤の他の限定しない例にはTritonＸTM−１００（non-reduced 又はreduced)と、TritonTMＸ−１１４（non-reduced 又はreduced)とTritonＸTM−１６５と、TritonＸTM−３０５（non-reduced 又はreduced)とが含まれる。非イオン性界面活性剤は本発明の試薬組成物中に濃度約０．１０〜０．２０g/L 、より好ましくは濃度範囲約０．１０〜０．１６g/L 、最も好ましくは濃度範囲約０．１２〜０．１４g/L で存在すべきである。
【００５６】
組成物の糖または糖アルコールにはスクロースとフルクトースとデキストロースとソルビトールとマンニトールとが含まれる。デキストロースは試薬組成物中に用いられる好ましい糖である。しかし、糖アルコール例えばソルビトールがより好ましい。糖アルコールは糖アルコールの空気酸化不能性により時間に亘りより安定な試薬溶液を与える。糖または糖アルコールは試薬組成物中理想的には約１１０．０〜１２０．０g/L 、より好ましくは１１３．０g/L の濃度で存在する。もしデキストロース以外の糖あるいはソルビトール以外の糖アルコールが用いられるとすれば、その量は、代りの糖または糖アルコールがデキストロースまたはソルビトースとほぼ同じ濃度で（g/L)存在する様に調節すべきである。糖または糖アルコールは試薬溶液中に存在してノイズ（即ち、赤色細胞幻影と血小板）を越えてリンパ球の検出性を増大させる。糖あるいは糖アルコールの何れも、分析の本性と必要条件とによって用いられてもよい。
【００５７】
ホルムアルデヒドまたはパラアルデヒドは本発明の試薬溶液中に白血細胞用の固定剤（即ち、化学的橋かけ化合物）として用いられる。もしホルムアルデヒドが用いられるとそれはその溶液中約５０〜６０g/L の量で存在する。より好ましくはホルムアルデヒドは約５２〜５８g/L の濃度で存在する。
還元する糖例えばグルコースよりむしろ糖アルコールを用いた場合の、試薬溶液の増大する安定性は時間に亘るグルコース（糖アルコールではない）の、グルコン酸を形成する空気酸化の現象に関係する。例えばNishikido 等日本特許公報第８０４０，６０６号、Chem. Abst. 93: 22120d, (1950)および米国特許第４，８０１，５４９号参照。グルコン酸の存在は溶液のｐＨを低下させる。ｐＨが本発明の範囲の外に落ちる場合は、ここに説明した如く、方法は、試料中の赤血細胞の非溶解による妨害をうける。さらに、空気酸化され得ない糖アルコールはホルムアルデヒドと化学的に結合しポリアセタールを形成してもよく、それにより、若し生成されると試薬溶液のｐＨをも低下させるギ酸へのホルムアルデヒドの酸化を防止する（米国特許第４，８０１，５４９号）。
【００５８】
無機塩もまた試薬溶液中に含まれていてもよい。本発明中に用いるに適当な塩はアルカリ金属塩化物例えばＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとであってもよい。塩化ナトリウムＮａＣｌが好ましい塩である。その様な塩は、光散乱／吸収光学を用いるペルオキシダーゼ染色強度の差異を引き起すことにより好中球の好酸球からの識別を助けてもよい故に、随意に存在していてもよい。他のハロゲン塩（即ち、弗化物と臭化物と沃化物）は好中球のペルオキシダーゼ活性を過度に抑制し、それにより他の染色していない白血細胞（ＷＢＣ）からの好中球の識別を妨げる。用いる場合、塩例えばＮａＣｌは好ましくは約６．８〜１０．３mM（あるいは約０．４〜０．６g/L)の量で存在させるべきである。
【００５９】
本発明で有用な緩衝剤または緩衝剤混合物は試薬溶液のｐＨを約６．８〜８．０、好ましくは約６．９〜７．６、より好ましくは約７．０〜７．３に維持するために適当なものである。ｐＨが低すぎる、即ち約６．８以下の場合、赤血細胞の妨害がサイトグラム中に観察される。適当な緩衝剤にはリン酸ナトリウムまたはカリウム、マロン酸ジエチル、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−アセタミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。Ｎａ2 ＨＰＯ4(リン酸水素二ナトリウム）とＮａＨ2 ＰＯ4(リン酸二水素ナトリウム）との混合物が好ましい。示す如く、緩衝剤はこの発明の試薬溶液中溶液のｐＨをほぼ中性に維持するのに適当な量存在させるべきである。例えばＮａ2 ＨＰＯ4 とＮａＨ2 ＰＯ4 との混合物を用いる場合、ｐＨ範囲約６．９〜７．６、好ましくは約７．０〜７．３の一連の溶液を生成させるために、その混合物は、約２．０４：１〜０．８１：１のＮａ2 ＨＰＯ4 対ＮａＨ2 ＰＯ4 モル比を含有すべきである。本発明の試薬溶液中のそのような混合物の緩衝剤濃度は約７５〜１２５mMである。約１２５mM以上は得られるサイトグラム中で赤血細胞妨害を引き起してもよい。
【００６０】
本発明の実行に有用な試薬溶液は水性溶液で、好ましくは脱イオン水を用いる。溶液は水中で成分を混合して組合わせることにより調製する。溶液のｐＨが所望の範囲内にあることを確かめるため、ｐＨに精密な監視をしつづけるべきである。技術に熟達した人達はまた、所望の試薬溶液中に他の添加物を含めてもよい。特に、金属キレート剤例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とエチレンビス−（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸（ＥＧＴＡ）とのジナトリウムまたはトリナトリウム塩は、組成物の他の成分を、多価金属イオン接触自働酸化から防護するために、試薬組成物中に約１〜５mMの濃度で含めるのは価値のあることである。ＥＤＴＡに加えて、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡのジナトリウムとトリナトリウムとテトラナトリウムを、二水和物が好ましいが、ＥＤＴＡジナトリウムと共に組成物中に用いるのが適当である。例えばホルムアルデヒドとソルビトールとＳＤＳとBrijTM３５とは全て自動酸化に敏感である。多価金属イオン触媒、例えばＣｕ+2とＦｅ+3とは処方溶剤として用いる水中に ppb濃度でしばしば存在する（"Polymer Stabilization", 1972, Ed., W.L. Hawkins, Wiley-Interscience, New York, New York）。
【００６１】
ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に用いる不適当な試薬組成物の共通様式を次のように例示する、３３より大きいパーセント根源ノイズと、人為的に高められた白血細胞分画と、ゆがめられたパーセント好中球とパーセントリンパ球。新鮮および時間をおいた試料に対しての種々な界面活性剤を含有する多くの試薬処方物の検査およびその性能の評価に基づき、本発明の改良された試薬組成物と方法との適当な成分を決定した。
【００６２】
表１は本発明の２界面活性剤含有水性試薬組成物における好ましい成分と最適濃度とを与えている。技術における人達によって、掲げられている試薬成分それぞれの濃度と範囲とは組成物または方法における使用を不利益に影響することなく、約±５〜１０％逸脱してもよいことが認められよう。更に、表１に掲げられているような新しいＰｘＲ１試薬組成物の各成分については括弧内に好ましい１L 当りの量が与えられているが、限定を意図してはいない。
【００６３】
【表１】
0004361142.tif 000002
【００６４】
本発明の他の態様は方法へのすすぎサイクルの編入と適当な水性すすぎ試薬組成物の使用の結果としてのペルオキシダーゼ法の分析結果のさらなる改良に関する。改良された方法のすすぎサイクルへ用いるすすぎ試薬は、白血細胞分画のペルオキシダーゼ法を迅速に行う半自働および完全自働システム、特にTECHNICON Ｈ●１TMと●１２TMと●１３TMシステムなどにおいて特に有利であり、有用である。そのすすぎ試薬は、“全血試料の血液学的分析に用いる万能すすぎ試薬組成物”と題する、１９９５年５月１６日に、これと同時に提出され、本発明の譲受人に譲渡される同時係属米国特許出願番号第０８／４４２，３６３号に記載の発明の主題である。
【００６５】
改良された白血球分画法に用いることができるすすぎ試薬溶液は、生理学的値に近いｐＨと重量モル浸透圧濃度とを、例えばpH約６．９〜７．６、好ましくはpH約７．０〜７．３と重量モル浸透圧濃度値約３００mOsmol/kg を与えるための、１つまたはそれ以上の緩衝剤または化合物あるいはそれらの混合物、例えばリン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムと、微生物増殖を妨げるための抗微生物化合物と、非溶血性界面活性剤例えばpluronics 例えばＰ８４とＰ８５とＰ１０３とＰ１０４とＰ１０５とＰ１２３（Ｐ１０５はすすぎ溶液中に用いられる量で非溶解性により好ましく、分子量約３，０００を持ち、約５０wt% ポリオキシエチレンを包含する）と、アルカリ金属塩化物例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌなどとを包含する。適当な抗微生物剤の限定しない例にはProclin １５０（２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）とProclin ３００（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）（Rohm & Haas)と、Germall １１５（Ｎ，Ｎ´−メチレンビス〔Ｎ´−（１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル〕尿素）（Sutton Laboratories)と、Dowacil ２００〔１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド〕（Dow Chemical）と、Bronopol(Angus Chemical Company)とが含まれる。すすぎ組成物における使用にはProclin １５０が好ましい。
【００６６】
水溶性酸化防止剤例えば３，３´−チオシプロピオン酸と、３，３´−ジチオ酢酸と、TroloxTM（即ち水溶性ビタミンＥ、Hoffman-LaRoche)と、ＢＨＴ、ブチル化ヒドロキシトルエンまたは（２，６−ジ−tert−ブチル−４−メチルフェノール）と、ＢＨＡ、ブチルヒドロキシアニソールまたは（２−tert−４−メトキシフェノール）と、ＭＥＨＱ（ｐ−メトキシフェノール）、あるいはそれらの混合物もまたすすぎ試薬組成物中の非溶血性界面活性剤の安定化のために用いてもよい。組成物中の使用には３，３´−チオジプロピオン酸が好ましい。すすぎ溶液の最終的な重量モル浸透圧濃度は約２８５〜３０５mOsm/kg である。
【００６７】
最も簡単な処方においては、すすぎ試薬はリン酸塩緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝食塩水、pH６．８〜７．８）とPluronic族または界面活性剤類の非イオン性で非溶血性の界面活性剤を包含していてもよい。Pluronicはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとの、構造式（ＥＯ）x−（ＰＯ）y−（ＥＯ）xのブロック共重合体（Pluronic & Tetronic Surfactants, BASF Corporation, Parsippany, New Jersey, 1987 参照）で、プロピレンオキシドの制御された重合により、プロピレングリコール単位（ＰＯ)yを合成して形成される。Pluronicは分子量が９５０〜４，０００g/mol で変化でき、（ＰＯ）は約２０〜９０wt% 包含できる故、“ｙ”は約３〜６２単位の範囲であり得る。次にＥＯ重合鎖はポリ（ＰＯ）単位の両側に形成され、Pluronic共重合体を与える。技術の人達は、“ｘ”はPluronic各側または終端において本質的には同じであるように、ＥＯ重合を対称的に制御できることを知っている。一般的なすすぎ組成物中の使用に適当なPluronicに関する“ｘ”と“ｙ”との値の非限定的な例は、“ｘ”が１〜３６単位、より好ましくは約７〜２７で、“ｙ”は好ましくは約１４〜４８単位である。
【００６８】
すすぎ試薬中の使用に適当なPluronicは、約２，０００〜４，０００の分子量範囲と共に約２０〜８０wt％の範囲のwt％ＥＯ値を持つ。分子量約３，０００〜３，６００の範囲と共に約３０〜７０wt％範囲のwt％ＥＯ値がより好ましい。例えばPluronicＰ１０５とＰ８５とは％ＥＯ値約５０wt％、PluronicＰ１０４とＰ８４とは約４０wt％の％ＥＯ値を持つ。
【００６９】
表２は、ペルオキシダーゼ法を更に改良するために用いてもよいすすぎ試薬の例示的処方を示し、最終的試薬溶液の適当で有効なｐＨと重量モル浸透圧濃度とを与えるための各成分の好ましい量を含んでいる。技術の人達によって、掲げられているすすぎ溶液成分の各々の濃度と範囲とは改良された方法における組成物とその使用に対し不利益に影響することなく±約５〜１０％遍移してもよいことは認められるであろう。その上、前記の如く、表２に掲げられているすすぎ試薬組成物の各成分に関しては、１L 当りの好ましい量が括弧内に与えられているが、限定する意図はない。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
すすぎサイクルも用いるＰｘ法における改良された試薬の重要な有利さは、本発明の試薬組成物が、すすぎ液の界面活性剤成分が方法において望ましからぬそして受入れられない機能的役割を演ずる、一定しないすすぎ液残余に帰せられる不利な効果を除去するために設計され、最適化されているところにある。試薬処方物と方法とは、室温で２日間まで貯蔵した、時間をおいた血液試料を用い、受入れられない根源ノイズによる、結果の確度と精度と信頼性とを犠牲にすることなく、白血細胞分画の測定を可能にする。また本発明に従い処方された試薬組成物を、本発明に従うすすぎ溶液処方物と組合わせて使用すると、すすぎ溶液は、分画法のペルオキシダーゼ化学に関与することはない。
【００７２】
本発明により取り囲まれた方法を実行するには、試薬溶液を分析される試料と迅速に混合し、方法のＲ１段階の反応混合物を形成する。均一な混合物は試薬溶液と血液試料と互いに接触した時間約５秒以内に発生させるべきである。もしその２つを速やかに、そして均一に混合させないと、赤血細胞の固定水準の不均一が起り、それは赤血細胞の溶解を妨げ、それにより方法の実施から得られる白血細胞分画（differential  ＷＢＣ）の確度が損われる。
【００７３】
混合する時、試薬溶液と血液試料とは室温（例えば約５℃）よりやや温かである。それから反応混合物（血液試料を含んでいる）を、好ましくは、適当に高められた温度に維持されている、自働血液学的分析機の適当な室に注入することにより、急速に約６２〜７６℃、理想的には約７０〜７５℃に加熱する。反応混合物の加熱は約１５秒以内、好ましくは２０秒以内にすべきで、そうでないと赤血細胞の固定が起る。固定された赤色細胞は溶解せず、リンパ球として間違って検出され、それにより白血細胞分画の確度を妨害する。
【００７４】
その直後、過酸化水素と適当な色原体例えば４−クロロ−１−ナフトールとを包含する染色混合物を反応混合物と混合する。染色混合物の最初の温度は室温であってもよいが、理想的には、しかし必要ではないが、ペルオキシダーゼ活性である好中球と単核細胞と好酸球とを染色するために、染色混合物を反応混合物と混合後の温度を約３０秒以内、好ましくは約８〜１５秒以内に、約６２〜７２℃、好ましくは約６５〜７０℃に上げる。
【００７５】
実行において、反応は次の通り進行してもよい。自働血液学分析機反応室を約７２℃の温度に維持する。全血１２．０μL と本発明のＲ１試薬組成物２５０μL とを室温にあるシステム中に同時に注入し、それにより２つを迅速に混合し、反応混合物を形成させ、それを約３０秒以内、好ましくは１６秒まで温置し、その間混合物の温度を約６２℃から約７２℃に上げる。温置時間の終りに赤血細胞は最適に溶解され、白血細胞は固定（即ち橋かけ）される。
【００７６】
その直後、色原体混合物（例えばオキシジエタノール中の４−クロロ−１−ナフトール７０g/L)１２５μL を、過酸化水素３．０g/L 包含する過酸化水素溶液２５０μL と同時に注入する。両試薬は初め室温であるが、反応室の温度により、染色混合物温度は約３０秒以内に約６３℃から６９℃に上昇され、その時間に好中球と好酸球のペルオキシダーゼ染色は完結する。反応室とシステムハードウエアは、１つの試料分析サイクルから次への試薬および溶液の残余の軽減と、反応室中の汚染試薬存在によるゆがめられた結果を避けるために、開示したすすぎ溶液ですすぐ。自働反応法に関連したその他の事項は実施例６で説明する。
【００７７】
本発明の主題の試薬組成物と方法とを自働化装置を用いて説明したが、技術に熟達した人達には、本発明の内容は手動方法および半自働または完全自働法と組合わせての手動法にも適用できてもよいことは容易に明らかである。更に本発明の試薬組成物と方法とは全血を用いて説明し、白血細胞分画に帰着させた。本発明は特別に調製した血液細胞のストックカリブレーター（stock calibrator）と対照と他の溶液とを用いてもよく、校正および装置の確度維持のために商業的に役立ってもよいことは技術に熟達した人達によって認められよう。ここに用いられたように他の修飾語なしの術語“試料”はとりわけ、全血あるいは血液細胞を含有する他の溶液いずれをも包含する意図である。
【００７８】
【実施例】
次の実施例は本発明を説明する。それらは発明の概念の理解を容易にするが、いかなる方法ででも本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【００７９】
〔実施例１〕
非イオン性界面活性剤を含有せず、イオン性界面活性剤だけを含有する（例えばＳＤＳだけで、BrijTM３５なし）ペルオキシダーゼＲ１希釈試薬組成物の処方と試験
実験はペルオキシダーゼ法のＲ１段階での使用のための、ペルオキシダーゼ希釈溶液に対する最適処方の決定のために設計され、実施された。
【００８０】
受け入れられるそして有効であるＲ１組成物または希釈剤を処方する最初の方法は試薬組成にイオン性界面活性剤即ち陰イオン界面活性剤ＳＤＳを含有し、非イオン性界面活性剤即ちBrijTM３５の存在しない試薬溶液の調製と試験とを包含する。Ｒ１試薬溶液はＳＤＳ濃度を約０．１０５g/L から約０．１７〜０．２０g/L に増大させることに基づいて調製した。幾つかの研究は自働システムにより、処理量１０２個試料／時間と１２０個試料／時間で、高水準のＳＤＳを含有する“試験”試薬の性能の検査を完成させた。
【００８１】
特に、自働血液学分析機を用い、ＳＤＳ  ０．１６〜０．２０g/L(例えば０．１６と０．１７と０．１８と０．１９と０．２０g/L)含有する試験Ｒ１試薬溶液を調製し、指示したように Day１と Day２血液試料について試験した。ＳＤＳ試験Ｒ１希釈剤はBrijTM３５（例えば０．０g/L)含んでいない。この実験分析に用いられた血液試料はＫ3 ＥＤＴＡ存在のVacutainerTM管に集められた。その上、この試験を行うに当り、すすぎサイクルに用いられたすすぎ溶液にはBrijTM３５が含有されていない。記載の如く、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有するすすぎ溶液もまた用いた。これらの分析の結果は表３に呈示されていて、それは Day２血液試料に関し、全ての試験試薬によって、受入れられない結果が得られたことを示している。％好中球と％リンパ球とのパラメーターに関するデータが示されていて、すすぎ溶液がBrijTM３５を濃度３．０g/L で、ＳＤＳを濃度２．０g/L で含有する標準方法と比較されている。 Day２血液試料に関しては、これら２つのパラメーターのリカバリ（recovery）はＳＤＳ  ０．２０g/L の標準に近似する。しかし、濃度０．１６〜０．１９g/L のＳＤＳを用いると、確度はＰｘ法の受入れられない根源ノイズのために不充分であった。特殊な試料についての反復吸引（aspiration）間の差異が判る。
【００８２】
図１Ａ−１Ｄにおいて示される如く、 Day１血液試料を、ＳＤＳ（０．１０５g/L)を包含し、BrijTM３５を包含しない標準ペルオキシダーゼ試薬溶液を用い、そしてBrijTM３５を濃度３．０g/L と、ＳＤＳを濃度２．０g/L で包含するすすぎ溶液を使用するペルオキシダーゼ法で分析した場合、サイトグラムの結果は拡散せず、きれいに分離された細胞母集団と最低の根源ノイズとを示す（図１Ａ参照）。図１Ｂは Day２血液試料についての、図１Ａの結果について述べたと同じＰｘＲ１試薬溶液とすすぎ溶液とを用いた分析結果を示している。しかし、図１Ａの結果と対称的に、 Day２血液試料のサイトグラムは細胞母集団の拡散とより高い根源ノイズを示した。図１Ｃは、唯一つのイオン性界面活性剤を、ＳＤＳ  ０．１０５g/L の形で含有するＲ１試験溶液を用い、リン酸塩緩衝食塩水中非溶血性界面活性剤Ｐ１０５を含有するすすぎ試薬溶液を用いるすすぎサイクルを含む Day２血液試料の分析結果を示す。図１Ｃサイトグラムの結果は根源において受入れられないノイズを示す。受入れられない根源ノイズについての同じ問題は Day２血液試料分析のために、より高い量のイオン性界面活性剤（即ち、ＳＤＳ０．１７g/L)を含有し、BrijTMは含有しない試験試薬溶液を用い（図１Ｄ参照）、そして図１Ｃで記載の同じすすぎ溶液を用いても生ずる。かくして、イオン性界面活性剤（例えば陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ）のみを含有するペルオキシダーゼＲ１組成物は、“BrijTMのない”すすぎ液と一緒に、記載のリンパ球分画法に用いるには次善のものであると決定された。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
〔実施例２〕
非イオン性界面活性剤のみを含有し、イオン性界面活性剤を含有しない（例えば、BrijTM３５のみでＳＤＳのない）ペルオキシダーゼＲ１希釈試薬組成物の処方と試験
【００８５】
実施例１に記載の如く、ＳＤＳだけを含有し、非イオン性界面活性剤不存在のように処方された試験Ｒ１希釈組成物に加え、イオン性界面活性剤、例えば陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ不存在の下に、非イオン性界面活性剤即ちBrijTM３５のみの存在を試験するため試薬組成物も設計された。従ってBrijTM３５を濃度０．０g/L と０．１４g/L と０．２８g/L と０．４２g/L とを含有する幾つかの試験Ｒ１希釈試薬組成物が調製され、検定された。BrijTM３５のみをＲ１希釈溶液に用いた試験分析については、すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液は実施例１に記載の検定に用いられた非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有する。
【００８６】
種々なBrijTM３５含有Ｒ１試験溶液は次の如く処方された。BrijTM３５の３０．０g/L 原液を蒸留水中に調製する。ペルオキシダーゼＲ１組成物（非イオン性界面活性剤なし）５０mLアリコートには、BrijTM３５原液の次の体積を添加する。最終濃度０．０g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製にはBrijTM３５原液０．０mL；最終濃度０．１４g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製には原液０．２３３mL；最終濃度０．２８g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製には原液０．４６６mL；最終濃度０．４２g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製には原液０．６９９mL。溶液は混合され、ポリプロピレンねじ栓試験管に貯蔵される。
【００８７】
試験運転に関し、正常血液試料はVacutainerTM管中に採り、Ｋ3 ＥＤＴＡにより非凝固化する。試料は開栓管様式（open tubu mode）で検定する。同じ提供者セットからの開栓されていない試料を一夜室温で貯蔵し、 day２について（即ち、 Day２試料）検定する。データは自働血液学分析機を用い手動吸引で採る。標準的運転は１０２試料／時であり、試験運転は１２０試料／時である。重複の５組を含む運転について、標準偏差ＳＤ（複数の提供者に亘ってはよくないＳＤ）は次の式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここでｄは特別な試薬で得られた重複値間の差、Ｎはセットの試料の数、を用い、ペルオキシダーゼチャネル（channel）パラメーターについて計算する。
【００８８】
表４はこれらの実験から得られた数値データの要約である。ペルオキシダーゼ法試薬１−４の性能を、ペルオキシダーゼ法の標準Ｒ１試薬（即ち、ＳＤＳ濃度０．１０５g/L で含有する標準Ｒ１試薬）を用いた性能で比較した。 Day１血液試料分析に関しては試験試薬は一般に受入れられない結果を与える。試薬１（即ち、BrijTMもＳＤＳも包含していないペルオキシダーゼＲ１試薬）については溶解されない赤色細胞により引き起されるひどい妨害の結果として分画データは得られなかった。試験ＰｘＲ１試薬２〜４（即ち、試薬２：BrijTM３５濃度＝０．１４、ＳＤＳなし；試薬３：BrijTM３５濃度＝０．２８、ＳＤＳなし；試薬４：BrijTM３５濃度＝０．４２g/L 、ＳＤＳなし）に関しては、方法規格と比較して、有意の数の確度と不正確の欠点（※印により示す）があった。試薬１と２と３については、パーセントノイズは高い（即ち＞３４％）。 Day２血液試料については、BrijTM３５を包含し、ＳＤＳを包含していない試験試薬を用いると、数値データはまた受け入れられない。かくして、数値データは、BrijTM３５含有のペルオキシダーゼ法Ｒ１試薬（０．１４〜０．４２g/L でＳＤＳを含まず）を含めた試験試薬セットは受け入れられない性能を与えることを示している。
【００８９】
【表４】
0004361142.tif 000005
【００９０】
表４において※印は得られた値が方法を行うのに用いられた自働分析機の確度規格 ("acc spe")を越えたことを示している。“ＮＤ”は受入れられるまたは有用なデータが得られなかったことを示している。“ＷＢＣＰ”はペルオキシダーゼ法から測定された白血細胞数を示し、“％Ｎｅｕｔ”はパーセント好中球を示し、“％Ｌｙ”はパーセントリンパ球を示し、“％Ｍ”はパーセント単核細胞を示し、“％Ｅｏｓ”はパーセント好酸球を示し、“％ＬＵＣ”パーセント巨大未染色細胞を示し、“％Ｎｏｉｓ”はパーセント根源ノイズを示している。実施例２で記載の、 Day１および Day２血液試料分析からのサイトグラムの代表的セットを図２Ａ−２Ｊに示されている。図２Ａ−２Ｅは Day１血液試料分析を表わしている。図２Ｆ−Ｊは Day２血液試料分析を表わしている。記載の如く、血液試料はＫ3 ＥＤＴＡを含有するVacutainerTM管に引き取る。これらの分析に用いた試薬は次の如く得られたサイトグラムに対応する。図２Ａ（ Day１血液試料）と図２Ｆ（ Day２血液試料）：BrijTM３５  ０．１２g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを含むＲ１標準試薬と、図２Ｂ（ Day１血液試料）と図２Ｇ（ Day２血液試料）：BrijTM３５  ０．０g/L とＳＤＳ  ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｃ（ Day１血液試料）と図２Ｈ（ Day２血液試料）：BrijTM３５  ０．１４g/L とＳＤＳ  ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｄ（ Day１血液試料）と図２Ｉ（ Day２血液試料）：BrijTM３５  ０．２８g/L とＳＤＳ  ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｅ（ Day１血液試料）と図２Ｊ（ Day２血液試料）：BrijTM３５  ０．４２g/L とＳＤＳ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬。
【００９１】
Day１血液試料の分析において、BrijTM３５  ０．１２g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを包含するＰｘＲ１試薬組成物を用いて得られたサイトグラムは受入れられる。しかし、BrijTMもＳＤＳも存在しない場合（例えば試薬１）、その結果は方法の全般的失敗であり、分画情報は得られなかった。サイトグラムは非常に密なノイズ領域を示し非常に少しの白血細胞しか検出しなかった（図２Ｂ）。試薬１を用いる方法の失敗は、橋かけされ、高水準の根源ノイズに寄与する多数の溶解してない赤色細胞に帰着する界面活性剤不存在に帰せられる。高ノイズ水準についての考えられる理由は、ペルオキシダーゼ基質への白色細胞の透過性増加に界面活性剤が要求されるらしいことであってもよい。界面活性剤の不存在は白血細胞内部で起る染色反応の効果的妨害であるらしい。
【００９２】
試薬２（図２Ｃ）と３（図２Ｄ）と４（図２Ｅ）とは試薬１について記載と同じ受入れられないサイトグラム結果を与えた。これらの場合において、サイトグラムはリンパ球とノイズとの間に“谷”（valley）（即ち、密な地域間のきれいな地域）を示さず、散漫な細胞集団と幅広い“本体（trunk)”（即ち、ノイズとリンパ球との両方を含む大雑把にいって垂直なカラム）とを示す。BrijTM濃度が増大するに従い本体の密度は減ずるが、細胞母集団の散漫さは増大する。
【００９３】
一般に Day２或は時間をおいた試料は、新鮮血液に関する対応する結果に比較して、サイトグラムの悪化を示す。そのような Day２試料の分析において細胞は、細胞の個別的母集団のサイトグラム描写はより散漫になるように漏れ易く（leaky)なる。このことは特に好中球に関して目立たせられる。 Day１試料はどうかといえば、試薬１は方法の全般的失敗を与える（図２Ｇ）。本体の密度はＰｘＲ１試薬溶液におけるBrijTM濃度増大につれて減少する傾向がある（図２Ｈ−２Ｊ）。試薬２と３と４とはサイトグラム中に谷を示さず、試薬２（図２Ｈ）と４（図２Ｊ）とを用いて得られる分画において強いゆがみが存在する。
【００９４】
これらの実験の結果は、非イオン性界面活性剤、即ちBrijTM３５のみを濃度０．１４−０．４２g/L で含有し、ＳＤＳを含有しない試験ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物は、すすぎサイクルにBrijTMのないすすぎ溶液を用いた場合、受入れられない数値データとサイトグラムとを与えることを示す。同様に、実施例１で測定した如く、ＳＤＳのみ（０．１６−０．２０g/L)を含有し、BrijTM３５を含有しないＰｘＲ１希釈剤は、BrijTMを含有しないすすぎ液（例えばBrijTMのないすすぎ液）を用いた場合、有効な試薬ではない。かくして、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤いずれかを含有するＰｘＲ１希釈剤はＰｘ法において受入れられる結果を与えないであろうと結論される。事実、本発見は、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）および非イオン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の両者が、方法において確度と精度とのある結果を達成するためにはＰｘＲ１試薬組成物中に処方されなければならないことを示している。本発明はまた、その様なペルオキシダーゼＲ１試薬組成物は、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を、以下実施例３で更に詳しく記載するごとく、含有していないすすぎ溶液を包含するすすぎ試料サイクルと共に用いる場合、特に重要であるという知識と発見とを与えている。
【００９５】
〔実施例３〕
非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤とを含有するペルオキシダーゼＲ１希釈試薬組成物の処方と試験
【００９６】
第３の型のＲ１試薬組成物を、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との処方を、ペルオキシダーゼ組成物と方法とで試験するために調製した。２つの界面活性剤を含有するＲ１希釈剤処方のために、ＳＤＳを０．１０５g/L で含有するＲ１希釈組成物中に、BrijTM３５を０．０８０g/L と０．１２g/L と０．１６g/L との濃度で処方した。その２界面活性剤含有試薬組成物を、白血球分画のペルオキシダーゼ法を用い、 Day１と Day２血液試料との両者の試験のために使用した。
【００９７】
実験は、Ｋ3 ＥＤＴＡを含有するVacutainerTM管に採られた５つの血液試料セットについてこのＲ１試薬処方物を試験するために行った。 Day１および Day２試料両者自働分析機を用い１０２個試料／時で標準試薬を使って検定更にその上、ＳＤＳ  ０．１０５g/L と、BrijTM３５  ０．０８０と０．１２と０．１６g/L とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を用い、１２０個試料／時で Day１および Day２試料を検定した。 Day２試料に関しては、試験Ｒ１試薬処方物との比較のために、標準ＰｘＲ１試薬はＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有し、BrijTM３５は含まず、そしてリン酸塩緩衝食塩水中界面活性剤PluronicＰ１０５含有すすぎ溶液と共に用いられた。
【００９８】
確度あり、精度のあるデータが得られた（表５および図３Ａ−３Ｄ）。 Day１試料については、精度と確度とは全てのペルオキシダーゼチャネル（channel)パラメーターに関し方法規格内にある。 Day２試料については、確度（対 Day１試料および標準）はＳＤＳとBrijTM３５を０．１２g/L と０．１６g/L で含有する試験試薬については受入れられる。ＳＤＳと０．０８０g/L のBrijTM３５とを用いると、％好中球は確度規格外にある。前記の標準Ｐｘ試薬とすすぎ液とは１２０個試料／時において、高められたＷＢＣＰと％リンパ球そして低められた％好中球による知られたパターンの、受入れられない確度結果を与える。
【００９９】
この実験は、ＳＤＳを濃度０．１０５g/L 、BrijTM３５を濃度０．１２〜０．１６g/L の範囲で含有する試験ＰｘＲ１試薬溶液を用い、 Day１と Day２との試料について受入れられる精度と確度とが得られることを説明している。
【０１００】
図３Ａはペルオキシダーゼ法を用いる、 Day１血液試料についての白血球分画分析の受入れられる結果を描写している。図３Ａに示す分析のためのＲ１試薬組成物は標準物で、ＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有する。標準すすぎ試薬はBrijTM３５  ３．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L とを含有する。図３Ｂは、ＰｘＲ１試薬組成物がＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳＤＳ  ２．０g/L 含有し、BrijTM３５を含有しない、 Day１血液試料を用いる試験Ｐｘ法の実行結果を描写している。図３ＣはＰｘＲ１試薬組成物がＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳＤＳ  ２．０g/L 含有して、BrijTM３５を含有しない、 Day２血液試料を用いる試験Ｐｘ法の実行結果を描写している。図３Ｄは、ＰｘＲ１試薬組成物がBrijTM３５  ０．１２g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを含有し、すすぎ試薬がＳＤＳとBrijTM３５とを含有しないが、その代りにここで記載（表２）され、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を包含するすすぎ試薬組成物を含有する、 Day２試料を用いる試験Ｐｘ法の実行結果を描写する。図３Ｃと図３Ｄとの比較から判るように、Ｒ１試薬組成物に非イオン性界面活性剤BrijTM３５が存在する場合、ノイズ領域の濃度に有意の減少がある。
【０１０１】
【表５】
0004361142.tif 000006
【０１０２】
図３Ａと３Ｂとから決定されるように、 Day１血液試料に関して、イオン性界面活性剤（即ちＳＤＳ）のみを含有するＰｘＲ１試薬組成物と、BrijTMを持つあるいは持たないすすぎ試薬処方物とを用いると、根源ノイズは正常で、受入れられるものと思われる。しかし、室温で時間をおいた Day２試料を分析した場合、違った結果が観察される。その様な時間をおいた血液試料分析については、BrijTM３５は包含せず、ＳＤＳ  ２．０g/L を包含するすすぎ試薬と組合せた、ＳＤＳ  ０．１０５g/L 包含するＰｘＲ１試薬は受入れられない根源ノイズを示すサイトグラムを作る（図３Ｃ）。興味あり、ここの発明の発見に従うと、 Day２試料についてのノイズ問題は、Ｐｘ法におけるペルオキシダーゼＲ１試薬への非イオン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の添加により軽減される（図３Ｄ）。更に特別には、図３Ｄに用いたＰｘＲ１試薬組成物はBrijTM３５  ０．１２g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L を包含し、使用したすすぎ試薬はBrijTMもＳＤＳも含有しないが、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有している。それ故、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物に用いるための非イオン性およびイオン性界面活性剤の適当な濃度と、試料すすぎサイクルの最適な使用と、非溶血性界面活性剤例えばPluronicＰ１０５を、最終非イオン性界面活性剤濃度が血液試料の条件と体積とについて適当である様に包含する対応するすすぎ試薬とは、ペルオキシダーゼ分画法の実施並びにそれから得られる結果の確度と精度と容認可能性において相当な改良をもたらす。
【０１０３】
〔実施例４〕
試料すすぎサイクルと溶解性非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を持たないすすぎ溶液とを採用する、Ｐｘ法に使用のためのＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤についての最適濃度範囲の選定
【０１０４】
実験は典型的非イオン性界面活性剤としてBrijTM３５を用い、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５のないすすぎ液（表４）を含む試薬配置を用い、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤についての最適の濃度範囲を選択するために行われた。
【０１０５】
実施データは、２つの試料セット：１）非病院試料２６個と２）病院試料１４個とについて、BrijTM３５を最終濃度０．１０と０．１２と０．１４g/L で用いた実験で得られた。データは、採集し、抗凝固剤としてＫ3 ＥＤＴＡの存在するVacutainerTM管中に貯蔵した Day１と Day２試料との両者について得られた。数値データとサイトグラムとが考察される。
【０１０６】
BrijTM３５を０．１０と０．１２と０．１４g/L 含有するＰｘＲ１試験試薬溶液はペルオキシダーゼＲ１試薬混合物（界面活性剤はなし）のアリコートにBrijTM３５  ３０g/L をそれぞれ０．０８５と１．０２と１．１９mLとを加えることにより得られる。ここに記載の非溶解性Pluronic界面活性剤を含有するすすぎ溶液を、種々なＲ１試験試薬セットを用いるペルオキシダーゼ法の段階の実行につづいて採用した試料すすぎサイクルに用いた。標準または対照試薬配置に関しては、非イオン性界面活性剤不存在の下で、イオン性界面活性剤ＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有するＲ１希釈剤を用い、BrijTM３５とＳＤＳとの両者を包含するすすぎ試薬溶液を用いた。非病院試料は当然正常な篤志家から得られ、病院試料はWestchester County Medical Center, New York の患者から得られた。
【０１０７】
データは、手動の開栓管（open-tube)吸引を用いる、自働血液学分析機（例えばTECHNICON Ｈ●TMシリーズ）を用いて集めた。重複 Day１試料が各試薬セットより検定された。同じ提供者セットからの非開栓試料は室温で一夜貯蔵され、 Day２に開栓管吸引で、手動で検定された。標準運転のソフトウエアは１０２個試料／時（s/h)である。試験試料は１２０s/h で運転された。自働システムは、User's Manual 中に述べてある一般的保持指示に従い試料運転に先立って毎日洗浄された。システムの不正確さは試験試薬の評価の前後に、ソフトウエアと試薬との標準配置を用いて決定された。１つの新鮮非病院血液試料が１０回吸引され、全てのＣＢＣパラメーターについて、平均と標準偏差（ＳＤ）が決定（システムにより自働的に）された。ＳＤは、新鮮非病院血液について、システムの不正確さの規格と比較された。この手続きはこの研究の毎日続けられた。試験法の不正確さは、次の式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここにｄは特別な試薬を用いて得られた重複値間の差であり、Ｎはセット中の試料数、を用い、ペルオキシダーゼチャネルパラメーターについてのＳＤ（多数の提供者に亘ってのためられたＳＤ）を計算することによりオフラインで決められた。
【０１０８】
白血球分画（２６個の非病院試料）のペルオキシダーゼ法の結果に対するBrijTM３５濃度の影響
【０１０９】
この実験において、２６個の非病院試料を前記の標準ペルオキシダーゼＲ１試薬を用い、BrijTM３５を０．１０と０．１２と０．１４g/L とを含有する試験ペルオキシダーゼ法Ｒ１試薬を用いて、ペルオキシダーゼ法で試験した（表６）。 Day１血液試料については、臨床パラメーターはBrijTM３５濃度に対して影響されない。パーセント単核細胞は確度規格に対し低く、パーセントノイズはBrijTM３５濃度増加に従って減少する。％単核細胞を除けば、全ての他のパラメーターは確度と精度との規格を満足する。
【０１１０】
Day２血液試料に関し、％好酸球は標準法および全ての３つの試験法に対しての確度規格を下廻った。全ての他の臨床パラメーターは受入れ限度内にあった。％ノイズ対応は試験された Day１試料について観察されたと同じであった。このデータセットについて本質的に、BrijTM３５濃度範囲０．１０と０．１２と０．１４g/L に亘り、 Day１及び Day２試料について同じ数値データが得られた。BrijTMの０．１４g/L 対０．１０g/L の比較は％ノイズの減少：新鮮および時間をおいた血液についてそれぞれ１３％と１７％、について利益を示した。
【０１１１】
BrijTM３５濃度変動（１４個の病院試料）
この実験において病院血液試料１４個の試料セットが標準ペルオキシダーゼ法試薬とBrijTM３５  ０．１０と０．１２と０．１４g/L とを含有する試験ＰｘＲ１試薬とを用いて試験された（表７）。 Day１と Day２との血液試料について、本質的には試験試薬全てが確度規格を満足させた。
【０１１２】
【表６】
0004361142.tif 000007
【０１１３】
病院並びに非病院データセットから生成したサイトグラムは、次の特性：ノイズ／リンパ球分離と、好中球とリンパ球と単核細胞と好酸球とＬＵＣとの母集団のタイトネス（tightness)と、細胞母集団の染色強度とサイトグラム上の位置と、ノイズ帯とリンパ球帯間の浮動（floating）低しきい値の変動とに関して定性的に検査され、総体的な一般的外観を、ペルオキシダーゼ法の標準試薬を用いて、血液試料の分析から得られたサイトグラムと比較した。ペルオキシダーゼ法で検定された試料セットは Day１および Day２非病院試料（試料１１個）と病院試料（試料１４個）との両者を含む。
【０１１４】
得られたサイトグラムから推論される結論は、ペルオキシダーゼＲ１希釈剤中のBrijTM３５の０．１２g/L は細胞母集団の分離を受入れられる根源ノイズ水準とに関し、最良の総括的サイトグラムを作るということである。０．１０g/L と０．１４g/L とは０．１２g/L より望ましくないが、両者共方法での使用について受入れられるものと思われる。 Day２試料に関し、ＰｘＲ１試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１０g/L はBrijTM３５の０．１２g/L におけるよりやや高いパーセントノイズをもたらすが（即ち、 Day１試料について１６．７％に対し２１．７％、そして Day２試料について１７．７％に対し１８．９％）、BrijTM３５濃度０．１g/L は Day２血液の分析にはよりよい（即ち、細胞母集団領域がより密（tighter)である）と決められた。逆に、Ｒ１試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１４g/L はこの界面活性剤の０．１２g/L におけるよりやや低いパーセントノイズをもたらした（即ち、 Day１試料について、１６．７％に対し、１６．２％）。しかし、この界面活性剤の０．１４g/L 濃度は Day２試料について僅かに悪い（即ち、BrijTM３５の０．１４g/L は、より高い界面活性剤濃度による、細胞母集団における散漫さを引き起す）。定性的なサイトグラムの点検の結果は数値的分析と一致する。
【０１１５】
【表７】
0004361142.tif 000008
【０１１６】
同類の実験からのデータは試験されたBrijTM３５の５つの異なったロットが、 Day１および Day２の正常および病院血液試料について、本質的に同じ実行データを生むことを示した。従って、BrijTM３５のロット対ロットへの変動がこの非イオン性界面活性剤含有の試薬生成についての問題であることは予期されない。組合わされた数値結果とサイトグラムに基づき、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中のBrijTM３５の最適濃度範囲は約０．１０〜０．１５g/L 、より好ましくは約０．１１〜０．１３g/L であると選択された。試薬組成物中の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の濃度は、熟達した従事者により、分画法を行うのに採用される血液学分析システムに従って日常的に調節できることは理解される。
【０１１７】
〔実施例５〕
ペルオキシダーゼ法における２界面活性剤含有Ｒ１試薬組成物の使用と共に、非溶血性界面活性剤含有すすぎ溶液の使用による、変動するすすぎ液残余の問題の回避
【０１１８】
自働分析機での、ペルオキシダーゼ白血細胞分画法実施における、変動するすすぎ液残余の問題を回避するため、本発明のＲ１試薬組成物に含有する非イオン性界面活性剤とは異なる非イオン性非溶血性界面活性剤を含有するすすぎ溶液を包含させることにより、本発明の方法を更に改良してもよい。すすぎ溶液はここに前記されていてそれはペルオキシダーゼ法において不活性で非機能的な非溶血性界面活性剤例えばPluronicＰ１０５を包含し、方法に対しほんの少しの体積増加以上のものは寄与しない。試料間すすぎは析出物の形成を軽減し、半自働−および完全自働血液学分析機での、ペルオキシダーゼ白血球分画法実施の場合、多数の試料吸引後の、ペルオキシダーゼ反応室における試料／試薬混合物残余を除去する。
【０１１９】
すすぎ液残余の問題に関する特別な実例は次の通りである。改良された本発明の試薬と方法との設計の前に、本発明者により、試料間すすぎサイクル終了後、反応室にすすぎ溶液約８〜１０μL が残ることが見出された。すすぎ溶液が本発明に従い非イオン性界面活性剤BrijTM３５を含むように処方された場合、この一見小体積のすすぎ液（即ち８〜１０μL)は、サイトグラム中に描写される細胞分離結果に不利に影響するのに充分な程有意である量のBrijTM３５を方法のＲ１段階に加える原因であることが発見された。例えばすすぎ液残余の体積が約１０μL を越す場合は、好酸球母集団はサイトグラムの好中球母集団中に移動し、単核細胞とリンパ球とはサイトグラムで下にさがる。更に、すすぎ液残余の体積が約１３．３μL であると、ペルオキシダーゼ法はBrijTM３５の存在により完全に劣化する。方法の第１反応段階の間に加えられるＰｘＲ１試薬溶液の体積は０．２５mLであるから、ペルオキシダーゼ法の第１反応段階における計算されるBrijTM３５濃度は約０．０９３〜０．１２０g/L で、それはすすぎ液残余約８．０〜１０．０μL の体積に対応する。
【０１２０】
すすぎ液を通っての、Ｐｘ法のＲ１段階に移るBrijTM３５の濃度の定量はこれらの試験の過程の間に決定され、次の如くすすぎ液溶液はBrijTM３５  ３．０g/L 含有されると表わされている。名目上のすすぎ液残余体積は１０μL で、それはBrijTM３５の３０μg と等価である。ペルオキシダーゼ法のＲ１段階へのBrijTM３５  ３０μg の移動（即ち、ペルオキシダーゼＲ１希釈剤２５０μL ＋血液１２μL または血漿〜７μL ＋すすぎ溶液１０μL で全体積〜２６７μL)は、順繰り、方法のＲ１段階の間BrijTM３５濃度０．１１２g/L となる。試験ペルオキシダーゼＲ１試薬は、ペルオキシダーゼ法におけるBrijTM３５の一定濃度の送達を可能にする、本質的に同じBrijTM３５濃度を含有するよう全て処方されている。
【０１２１】
図４Ａ−４Ｆは、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５のない水性すすぎ組成物（図４Ａと４Ｃと４Ｅ）および非イオン性界面活性剤のある水性すすぎ組成物（図４Ｂと４Ｄと４Ｆ）を使用して、本発明のペルオキシダーゼ法における種々なすすぎ液残余体積の影響を示している。ペルオキシダーゼ法のＲ１とＲ２との段階においては、図４Ａ−４Ｆで示すごとく、方法のＲ１試薬はＳＤＳ  ０．１０５g/L を含有し、BrijTM３５は含有していない。図４Ａと４Ｂとは、ペルオキシダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬溶液の最終体積に７．９μL 寄与するすすぎ溶液残余のあるすすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写している（図４Ａ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｂ：すすぎ液中BrijTM３５存在）。図４Ｃと４Ｄとは、ペルオキシダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬溶液の最終体積に１０μL 寄与する、すすぎ溶液残余のあるすすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写している（図４Ｃ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｄ：すすぎ溶液中BrijTM３５存在）。図４Ｅと４Ｆとは、ペルオキシダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬溶液の最終溶液の最終体積に１３．３μL 寄与するすすぎ溶液残余のある、すすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写している（図４Ｅ：すすぎ溶液中BrijTM３５なし；図４Ｆ：すすぎ溶液中BrijTM３５存在）。結果から決定出来るように、すすぎ溶液中に存在するBrijTM３５とすすぎ液残余とはサイトグラム結果の一般的劣化を生む。この結果は、BrijTM３５存在下でのすすぎ液残余体積が増加した場合も、また、この結果が観察される。
【０１２２】
本発明の改良された試薬組成物と方法とを用いると、残余は微々たるものになる。それに加えて結果の確度と精度とが非常に満足すべきものである。非イオン性界面活性剤BrijTM３５は本発明人により、もしすすぎ組成物または溶液中に存在し、もしペルオキシダーゼ法で種々な量で持ちこされると、受入れられないサイトグラム結果を引き起し、特に、それがサイトグラム中白色細胞集団の劣化に際立たす薬剤であることが決定された。
【０１２３】
ここに説明した如く、ペルオキシダーゼ法におけるすすぎ溶液への非溶血性界面活性剤例えばPluronic（例えばPluronicＰ１０５）と、本発明の新規の、改良されたＲ１希釈試薬組成物の使用は、種々なすすぎ液残余の影響を軽減し、根源ノイズの受入れられる水準を維持し、 Day２血液試料を用いるＰｘ法で得られる、受入れられる結果を可能にする。こうして、本発明に従って、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）と非イオン性界面活性剤（例えばポリエトキシラートBrijTM３５）とを含有するＲ１試薬組成物は実験により室温で２４時間またはそれ以上経った血液試料に関して有用であることが見出された。更に本発明に従うと、Pluronicのような界面活性剤を含有するすすぎ溶液の使用はここに記載のような白血球分画法から得られる結果も改良する。
【０１２４】
〔実施例６〕
Ｒ１試薬組成物とペルオキシダーゼ法とを用いる、白血球分画法の自働分析
この実施例は自働血液学分析機と、本発明の改良された方法と試薬とを用いる迅速（即ち６０または１０２個試料／時に対し１２０個試料／時）白色細胞分画分析についての決定を記載する。技術に熟達した人達には、種々な分析機とシステムとが、本発明に従う方法と試薬とを用いて使用され、ここに記載の利益が提供されてもよいことが明らかになるであろう。
【０１２５】
全血試料を用いると、方法のＲ１反応段階において、試料１２μL に２界面活性剤含有Ｒ１試薬希釈剤２５０μL を与えられる。約１９秒後に、過酸化水素（３．０g/L)含有希釈剤２５０μL と４−クロロ−α−ナフトール（７０g/L)含有希釈剤１２５μL を加える。これは第２反応段階（Ｒ２）と考えられる。色原体含有試薬添加後約１３秒後、流出液を電子−光学的検出システムを通過させ、サイトグラムを調製する。白血細胞の大きさとその染色の度合いを、細胞１つずつについて測定（前方角散乱対吸収）し、サイトグラムにプロットする。サイトグラムはコンピューターにより分析し、全白色細胞数と、好中球と好酸球と単核細胞とリンパ球と巨大未染色細胞との分集団分画とを得る。図は、自働装置での、本発明の方法実施に用いた自働血液学分析機の電子−光学的検出システムから得られたサイトグラムを説明している。そのサイトグラムは、本発明の試薬と方法とにより、区別された白血球の型（すなわちＷＢＣ）１）リンパ球、２）単核細胞、３）好中球、４）好酸球、５）赤色細胞幻影と血小板とから得られる根源ノイズおよび６）ＬＵＣを示している。
【０１２６】
全血の最終的希釈は１：５３で、全反応時間は約３０−３２秒である。自働分析機で実行されるペルオキシダーゼ法の熱的側面の一般的で非限定的例は次の様なものである。即ち、方法のＲ１段階において、血液試料とＲ１試薬希釈剤とは約６９±２℃にあるペルオキシダーゼ室に入る。約１５〜２０秒の期間を持つＲ１反応段階の間、温度は約６５〜７５℃あるいは約６５〜７０℃に上昇する。その後、方法の第２段階（即ちＲ２）において、基質試薬が添加される。Ｒ２温度は約５０〜６５℃で、約５〜８秒の期間であり、その時間の間に温度は約７３±２℃に上昇させられ、これがペルオキシダーゼ法終了の最終温度である。すすぎ溶液はペルオキシダーゼ法のＲ２段階終了後、すすぎサイクルで用いられる。試料すすぎサイクルは、１つの試料サイクルから他への試料残余を防ぐためと、自働血液学分析機システムの流路（hydraulic)中の集積を防ぐために必要である。
【０１２７】
〔実施例７〕
本発明のＲ１試薬組成物および方法における適合性に関する種々な非イオン性界面活性剤の分析
本発明の改良された試薬と方法とにおける使用に適当な非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤の型を決めるため、次の実験を行った。
【０１２８】
方法の第１反応段階における使用のためのペルオキシダーゼＲ１試験試薬組成物は次のようにして調製された。蒸留水中の種々なポリエトキシラートの３．０g/L 溶液２００μL を、記載された段階１試薬組成物５０．０mLに添加し、６０mLポリプロピレンねじぶた遠心分離管に入れる。界面活性剤溶液を、蒸留水９７．０mLにポリエトキシラート３．０ｇ添加し、溶液が沸騰始めるまで加熱攪拌して調製する。約３０分間で室温にまで冷却後、その溶液２００μL をペルオキシダーゼＲ１試薬組成物の他の成分に添加し、Ｒ１試験試薬を作る。ここに試験したポリエトキシラートは種々な源から商業的に入手し得て、例えばBrijTM界面活性剤はＩＣＩとRuger から得られ、Macol 界面活性剤はMazer から得られ、Sipionic界面活性剤はAlcolac から得られ、TritonＸTM界面活性剤はSigma, Union CarbideまたはRohm & Haas から得られ、IgepalＣＯ８９７はＧＡＦから得られ、PluronicＰ１０５はＢＡＳＦから得られ、SurfonicＮ３１．５はHuntsmanから得られる。イオン性界面活性剤に関しては、ＴＤＡＰＳはBoehringer-Mannheim から得られ、ＴＴＡＢはSigma から得られる。
【０１２９】
表８に示すごとく、次のポリエトキシラートの族または類を用いた。
【０１３０】
【表８】
0004361142.tif 000009
【０１３１】
試薬セット当り１０個の血液試料はVacutainerTM管中に正常提供者から集め、Ｋ3 ＥＤＴＡにより抗凝固化された。データは開栓管吸引を用いる自働分析機で集めた。重複 Day１血液試料は各試薬セットを用い吸引した。同じ提供者セットからの開栓されていない試料は一夜室温で貯蔵され、 Day２（ Day２試料）で、手動で検定した。標準運転のソフトウエアは１０２個試料／時でおこり、試験試料と試薬とは１２０個試料／時の処理量で運転された。システムは運転指図書に従い、試料運転前毎日洗浄し、ペルオキシダーゼチャネル利得は、それぞれの用いられている自働システムに関する運転指図書に従って定めた。
【０１３２】
システム不正確さは試験試薬の評価の前と後との両方の、ソフトウエアと試薬との標準配置を用いて決めた。１つの Day１の血液試料は１０回吸引し、全てのパラメーターに関し、平均並びに標準偏差を決定（システムにより自働的に）した。標準偏差は新鮮血液について決定されている、システムの不正確さを規格に比較された。その手続きは研究の毎日行われた。
【０１３３】
試験方法不正確さ決定のため、１０個の試料が重複して吸引された。不正確さは次の式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここにｄは特別な試薬で得られた重複値の間の差であり、Ｎは１０試料セット中の試料の数である、を用いて、ペルオキシダーゼチャネルパラメーターに関する標準偏差、ＳＤ（多数の提供者に亘り集められたＳＤ）を計算することによりオフラインで算定された。
【０１３４】
試験ＰｘＲ１試薬は２セットで評価された。各セットについて、標準ペルオキシダーゼ法（例えばTECHNICON Ｈ●３TM自働分析機で行われた）が参考として包含されている。その参考値は本発明の改良された方法と試薬との不存在の下で得られた Day１平均値と定義されている。 Day１と Day２との試料に関する確度（"acc")はその参考に対して決定される。 Day１試料と Day２の時間をおいた試料とに関する確度基準は異なる。その上、不正確さは Day１血液試料についてのみ決定された（表９参照）。
【０１３５】
BrijTM５２はＨＬＢ５．３を持ち（表１０参照）、それ故疎水性で、通常油中水乳化適用には使用されない。Ｈ●３TM自働分析機で実施された自働ペルオキシダーゼ法は水中油乳化を用いている（即ち、赤色細胞と血小板膜の脂質材料は界面活性剤ミセルによりペルオキシダーゼ流出液の水性環境中に“溶解”されている）。
【０１３６】
【表９】
0004361142.tif 000010
【０１３７】
【表１０】
0004361142.tif 000011
【０１３８】
一般に、ペルオキシダーゼ流出液には次の成分、ＰｘＲ１試薬溶液、Ｐｘ１  ０．２５mLと、色原体含有試薬溶液、Ｐｘ２  ０．１２５mLと、過酸化水素含有試薬溶液Ｐｘ３  ０．２５mLと、血液試料１２μL とが包含されている。Ｐｘ１とＰｘ３（３．０g/L 水性過酸化水素）とは水性溶液であるが、Ｐｘ２はジエチレングリコール（非水性であるが水混合性溶剤）に溶解している４−クロロ−ナフトールの溶液である。
【０１３９】
ＨＬＢ３〜６の範囲の界面活性剤が油中水乳化に推薦される。対照的に水中油乳化に推薦されるＨＬＢ範囲は約８−１８である（M.J. Rosen, 1978, Surfactant and Interfacial Phenomena, Wiley-Interscience, 243-244 頁）。
【０１４０】
TritonＸTM−３０５はＨＬＢ  １７．３を持つので非常に親水性であることを示し、水中油乳化に適している。しかし、この界面活性剤の次善の性能は分析の条件の下で極端に親水性の結果であってもよい。多数のペルオキシダーゼ研究の結果として、本発明者は、赤色細胞が、試料の貯蔵の間に起る生化学的変化により、室温貯蔵の後溶解に対しより抵抗するようになることを観察した。新しく記載した方法と試薬との確度と信頼性とは、時間につれての血液試料の劣化と、最適以下の、時間をおいた試料条件にも拘らずその様な試料について検定を実行し、適当な結果を得るための必要性との見地から特に重要である。
【０１４１】
イオン性界面活性剤に加えて、次の非イオン性界面活性剤、BrijTM５８とIgepalTMＣＯ８９７とTritonＸTM−１００とSiponic Ｅ１５とTritonＸTM−４０５とBrijTM７６とMyrjTM５３を含有するペルオキシダーゼＲ１試薬組成物の全ては Day１血液試料の分析において正確に、受入れられる様に働く。しかし、 Day２試料については、IgepalTMＣＯ８９７とTritonＸTM−４０５とMyrjTM５３とを含有するＰｘＲ１試験試薬は受入れられない数値およびサイトグラム結果を与える様に見える（表９および１０参照）。これらのポリエトキシラートはそれぞれ１７．８と１７．９と１７．９のＨＬＢ値と、それぞれ３３．０と３３．３と３１．８との％ノイズ値とを持つ。それに加えて、これらの界面活性剤の使用で得られるサイトグラムの他の一般性状はＷＢＣＰを上昇させ、％好中球と％リンパ球とをゆがめる。示したようにMyrjTM５３はステアリン酸のカルボン酸エステルであり、それは水性溶液中、加水分解に対しより安定でないようである。表９と１０とで用いた略字は：ＷＢＣＰ：％全白血細胞、％ＮＥＵＴ：％好中球、％ＬＹＭＰＨ：％リンパ球、％ＭＯＮＯ：％単核細胞、％ＥＯＳ：％好酸球、％ＬＵＣ：％巨大未染色細胞、％ＮＯＩＳ：ペルオキシダーゼ法実行に随伴する根源ノイズ、ＨＬＢ：親水性親油性比値である。
【０１４２】
どういう方法ででも理論に縛られることはないが、ペルオキシダーゼ法に用いられるＲ１試薬組成物中の界面活性剤の可能性ある機能は次のものの１つまたは２つ、（１）赤色細胞と血小板との溶解となる膜透過と、（２）水不溶性４−クロロナフトールの複合体化と、この基質の、染色が起る細胞中への輸送と、（３）赤色細胞の残骸の乳化、それによるペルオキシダーゼチャンネル中における集積の減少、が包含されていてもよい。
【０１４３】
添付している図で描写している典型的サイトグラムにおいて、原点におけるノイズ／リンパ球本体（frunk)の幅と黒さ（細胞の数に関連する）は％ノイズの増加と共に増大する。一般に、時間をおいた血液試料で得られたサイトグラムは新鮮血液中の好中球の境界以下に落ちる好中球を示している。母集団に関しても時間をおいた血液において拡がる傾向がある。この実施例からの結果はサイトグラムは試験した種々なポリエトキシラート界面活性族の間では同等であることを示している（表８、実施例７参照）。しかし特に前記し、ＨＬＢが約９．６〜１６．９の範囲にある界面活性剤族１と２（例えばポリエチレングリコールにエーテル化されている直鎖または分枝オクチルフェニル疎水物）とから誘導される界面活性剤は Day１と Day２との血液試料の分析において受入れられる仕方で働く。これらの結果は、水中油乳化に関し、一般的に推薦される界面活性剤ＨＬＢ範囲約８〜１８と一致する。自働ペルオキシダーゼ法例えばＨ●３TMシステムで行われるペルオキシダーゼ法において、赤色細胞膜残骸は、水性環境中、界面活性剤ミセルにより乳化される脂質（“油質”）材料であり、それ故この型の分析についての効果のある様式は水中油乳化である。
【０１４４】
〔実施例８〕
白血球分画のＰｘＲ１試薬とペルオキシダーゼ法とへの適合性についての、低ＨＬＢ値を持つ界面活性剤の分析とPluronicの評価
【０１４５】
ＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有するＰｘＲ１試薬溶液中に処方されている、より低いＨＬＢ値をもつポリエトキシラート界面活性剤の潜在的利用と効果とを試験するため実験を行った。従ってＨＬＢ値５．３〜１７．９を持つ界面活性剤を試験した。
【０１４６】
試薬セットの一部としての、試験Ｒ１試薬組成物の性能を、５つの Day１非病院血液試料と、５つの、室温に貯蔵された後に検定された Day２非病院試料よりなる試料を用い決定された。性能は現在の自働分析機規格に対し、確度と精度とに関し判断された。次のパラメーター、ＷＢＣＰと％好中球（％ＮまたはＮｅｕｔ）と％リンパ球（％Ｌｙ）と％単核細胞と、％好酸球（％Ｅｏｓ）と％巨大未染色細胞（％ＬＵＣ）と％ペルオキシダーゼノイズ（％Ｎｏｉｓｅ）を追跡した。
【０１４７】
ＳＤＳを０．１０５g/L と、次の他の界面活性剤例えばBrijTM３５とMacolTM ＮＰ４とSurfonicTMＮ３１．５とPluronicＰ１０５とMacolTM ＴＤ３とTritonＸTM３５とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を、実施例７に記載の方法に従い調製した。典型的な試験界面活性剤とその対応するＨＬＢ値を示す。
【０１４８】
界面活性剤                  ＨＬＢ値
BrijTM３５                  １６．９
MacolTM ＮＰ４                ８．９
SurfonicTMＮ３１．５          ７．７
PluronicＰ１０５            １２−１８
MacolTM ＴＤ３                ８．０
TritonＸTM３５                ７．８
付加した研究が、本発明に従って処方されたペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤としてのBrijTM３５の代替物としてPluronic試験するために、行われた。
【０１４９】
実施例７で記載し、表９と１０とに示した如く、 Day１と Day２血液試料を用いる受入れられる自働ペルオキシダーゼ法結果はＨＬＢ値約９．３〜１６．９を持つ界面活性剤を用いて得られる。Ｒ１試薬組成物中の、ＨＬＢ値約１７．３以上並びに低ＨＬＢ値例えばＨＬＢ＝５．３を持つ界面活性剤は受入れられないデータをもたらした。
【０１５０】
Ｐ１０５を含むPluronicは、ここに記載の実験に用いられた他のポリエトキシラートとは明らかに異なる構造をもっている。Pluronicの構造においては、３つの領域：（ＰＯＥ)n−（ＰＯＰ）m−（ＰＯＥ）n、ここにＰＯＥとＰＯＰとはそれぞれポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンを表わす、がある。ＰＯＥ領域は親水性（即ち“親水部”）で、ＰＯＰ領域は疎水性（即ち“疎水部”）である。また１つのＰＯＥ領域の側面に配置されている２つのＰＯＰ領域がある“逆転”Pluronic即ち“Ｒ”シリーズも存在する（Pluronic & Tetronic Surfactants, BASF Corporation, 1987 参照）。PluronicにはＨＬＢ値が割り当てられている。Ｐ１０５に関してはＨＬＢ値は１２−１８である。Ｐ１０５に割り当てられている広いＨＬＢ範囲は、よりせまいＨＬＢ値を割り当てられている、２つの領域（domain）のポリエトキシラートのそれと鋭い対照にある。Pluronic構造は他の２領域ポリエトキシラート（ポリエトキシ化アルコールとフェノール）とは有意に異なっている故に、Pluronicはポリエトキシラートの別々の類を表わしている。従って、２領域と３領域ポリエトキシラート間の差異は、本発明のペルオキシダーゼ試薬と方法とに採用して成功できる潜在的非イオン性界面活性剤としての２領域ポリエトキシラートに関する効用の予報値としてのＨＬＢ尺度の利用を可能にする。
【０１５１】
ポリエトキシラートの２領域類は疎水部−Ｏ−（ＰＯＥ）n−ＯＨとして表わすことができる。その疎水部は長鎖、分枝鎖または直鎖アルコール例えばBrijTM３５の何れかであることが出来る。代って、他の普通に用いられる疎水構造は、直鎖または分枝鎖炭化水素がフェノール構造に結合されていて、それがこんどはＰＯＥ領域に結合されているオクチルフェニル（例えばTritonTMＸシリーズ）またはノナフェニル類（例えばTritonＮTMシリーズ、MacolTM ＮＰシリーズ、SurfonicTMＮＰシリーズなど）である。
【０１５２】
ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物がＳＤＳと、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエトキシ化アルコールまたはフェノールとの両者を含有するように処方され、この組成物が Day２血液試料の分析に用いられた場合、サイトグラムは何１つ、リンパ球領域とノイズ領域間に谷を示さない。それ故％リンパ球は４つ全ての場合高く、％好中球は３つの場合低い。その様な試薬の一連のセットはペルオキシダーゼ法のＲ１試薬組成物中での使用には受入れられないと判断された。観察された受入れられない性能の最もありそうな原因は、これらポリエトキシラート界面活性剤が、自働血液学分析機を用いるペルオキシダーゼ法適用のためには余りに疎水性すぎる（即ち、ＨＬＢが低すぎる）ということである。それ故、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳまたはＴＤＡＰＳ存在の下で、ポリエトキシ化アルコールまたはフェノールについては、要求されるＨＬＢ値は約９．３〜１７．３、より好ましくは約９．７〜１６．９であるべきであると結論された。Pluronicは非イオン性界面活性剤の別個の類を表わしているが、この類の一員、即ちPluronicＰ１０５はペルオキシダーゼ試薬と方法とにおいて有用でないことがわかった。当業者には違った構造あるいは性状をもつ他のPluronicが、本発明の試薬中での使用のために助けとなる充分な界面活性剤溶血性状を与える種々なＨＬＢ値を有する故に有用であるかもしれないことが理解できるはずである。
【０１５３】
従って、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中ＳＤＳ  ０．１０５g/L 存在の下での、０．１２g/L の２領域ポリエトキシラート非イオン性界面活性剤に関しては、ＨＬＢ約５．３〜８．９および約１７．３以上のものは方法での使用を受入れられないことを、これらの研究から決定した。対照的に、Ｒ１試薬に処方され、約９．７〜１６．９の範囲のＨＬＢ値を持つ界面活性剤（即ち、３つの通常の型の疎水部を含む構造を持つ界面活性剤）がこの方法において受入れられる結果を与える。Pluronicは３領域構造に基づくポリエトキシラートの別の類を包含する。PluronicＰ１０５は、このPluronicが２領域ポリエトキシラートの有用なＨＬＢ範囲と重なる広いＨＬＢ範囲１２〜１８を当てがわれている事実にも拘らず、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中に０．１２g/L で（ＳＤＳ  ０．１０５g/L 存在の下）処方された場合受入れられない。
【０１５４】
〔実施例９〕
白血球分画のＰｘＲ１試薬組成物とペルオキシダーゼ法においての適合性に関する、イオン性界面活性剤の他の類の分析
【０１５５】
イオン性界面活性剤の他の類（例えば陽イオン性または双性イオン性界面活性剤）が本発明の改良された試薬組成物および方法への使用が適当であるかどうかを決定するため、そのようなイオン性界面活性剤を用いて、付加的な実験を行った。これらの研究は、陰イオン性界面活性剤例えばＳＤＳよりはむしろ、陽イオン性および双性イオン性界面活性剤が、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中で、非イオン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）０．１２g/L と組合せての使用が適当であるかどうかを試験するために設計された。実験は自働血液分析機の情況の下で行われ、BrijTM３５のないすすぎ液を用いるすすぎサイクルを採用した。試験した１つの陽イオン性界面活性の例は臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム即ちＴＴＡＢであり、試験された双性イオン性界面活性剤の例はテトラデシルアンモニオプロパンスルホナート即ちＴＤＡＰＳである。
【０１５６】
ＳＤＳを含有しない（例えばＰｘ１／ＮｏＳＤＳ）試験Ｒ１試薬は、BrijTM３５（蒸留水中の３０g/L 溶液４．０mL）、ソルビトール１１３．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．０８ｇ（Mallinkrodt）、リン酸二水素ナトリウム１１．８９ｇ（Mallinkrodt）、ＮａＣｌ  ０．４８８ｇ（Mallinkrodt ７５８１ＫＭＥＲ）、Ｎａ2 ＥＤＴＡ  ０．７５０ｇ（Mallinkrodt ４９３１ＫＭＨＫ）、ホルムアルデヒド（３７％）１５０ml（Mallinkrodt)を含有させて調製した。検定の中間pHは７．２３であった。試験試薬は０．２ミクロンポリスルホン膜４７mm円板（Gelman Supor）を通して濾過した。イオン性界面活性剤は次の如くＰｘ１／ｎｏＳＤＳに添加した。ＴＤＡＰＳまたはＴＴＡＢいずれかの３０g/L 溶液２００μL を６０mlポリプロピレンねじ蓋管中の５０mlＰｘ１／ＮｏＳＤＳに添加する。PluronicＰ１０５含有すすぎ試薬は全ての試験分析すすぎサイクル中に用いられた。セット当り５つの正常血液試料が正常篤志家からVacutainerTM管中に採られ、Ｋ3 ＥＤＴＡにより抗凝固化された。データは手動開栓管吸引によるTECHNICON Ｈ●TMシリーズの自働血液学分析機で集められ、方法は実施例２に記載のように行われた。
【０１５７】
ここに記載の白血球分画の標準あるいは対照法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は唯一の界面活性剤としてＳＤＳを含有し、BrijTM３５はすすぎ液残余の結果として（即ちBrijTM３５とＳＤＳとの両者を含有するすすぎ液によって、実施例５参照）Ｒ１段階に供給されることが判った。本発明の知見に従って行われる試験方法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は陰イオン性界面活性剤ＳＤＳと非イオン性界面活性剤BrijTM３５との両者を含有し、すすぎ溶液はＳＤＳもBrijTMも含有しない。
【０１５８】
陰イオン性界面活性剤ＳＤＳが、濃度０．１２g/L の陽イオン性４級ハロゲン化アンモニウム界面活性剤ＴＴＡＢによるかあるいは、濃度０．１２g/L の双性イオン性界面活性剤ＴＴＡＢによるかの何れかによって置きかえられたＰｘ１試薬組成物を採用したＰｘ法の有効性が検定された。ＴＴＡＢ  ０．１２g/L とBrijTM３５  ０．１２g/L を含有するＲ１試薬（"Reagent１")を用いて得られた結果は意外であり、サイトグラムの左側における赤色細胞の“縞”（streak）になる赤血細胞の不充分な溶解の故に、ペルオキシダーゼデータが得られなかった。対照的に、ＴＤＡＰＳ濃度０．１２g/L とBrijTM３５  ０．１２g/L とを含有するＲ１試薬は、ペルオキシダーゼ法で検定された Day１と Day２血液試料両者に関し受入れられるデータを与えた（表１１参照）。これらの結果は、双性イオン性界面活性剤例えばＴＤＡＰＳが、本発明のペルオキシダーゼ法に用いられるＰｘＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤と共に用いるのに適していることを示した。
【０１５９】
【表１１】
0004361142.tif 000012
【０１６０】
要約すると、実施例７〜９で行われた実験に関しては、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエトキシ化アルコールおよびフェノールは、ＰｘＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の置換物として受入れられない。PluronicＰ１０５、ブロック共重合体（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン）もまた、ＰｘＲ１試薬組成物におけるイオン性界面活性剤と組合わせて不満足なものであった（サイトグラム中に高い５ノイズを生ずる）。陽イオン性界面活性剤例えばＴＴＡＢはＰｘＲ１試薬組成物中のＳＤＳの受入れられない置換物であることが判ったことは注目される。しかし、双性イオン性界面活性剤例えばＴＤＡＰＳはＳＤＳの受入れられる、有用な置換物である。
【０１６１】
全ての特許出願と発行された特許と原文と公表論文とここに引用した参考資料との内容はそっくりそのまま参考資料に組入れられている。
【０１６２】
種々な変化が前記の組成物と方法とに、本発明の範囲と精神とから逸脱することなく、作ることが出来るから、前記の説明中に含まれ、付随する図面中に示され、或は添付されている請求事項中に定義されている全ての内容は例証として解釈され、限定する意味ではないことを意図している。
【０１６３】
本発明を更に説明し、種々な態様を通じて理解を助けるために呈示した添付の図において、図は、本発明に従い、説明のように調製された種々な水性試薬組成物または希釈剤或はそれらの改良された試薬を、自働血液学分析機の電子−光学的検出装置を用いて白血細胞分画測定のペルオキシダーゼ法に利用した場合に得られるサイトグラムを描写している。図１Ａに描写されている数字の表示はサイトグラムの違った領域を確認するのに役立つものであり、各図において同一である。示している様に、数字１はリンパ球母集団の領域、数字２は単核細胞母集団の領域、数字３は好中球母集団の領域を示し、数字４は好酸球母集団を示し、数字５は血小板および赤色細胞幻影から起る根源ノイズの領域を示し、数字６はＬＵＣ母集団の領域を示す。
【０１６４】
図１Ａ−１Ｄはイオン性界面活性剤のみを含有するように処方されたペルオキシダーゼＲ１試薬組成物を用いる、白血細胞分画のＰｘ法の実行が受入れられる結果を与えるかどうかを試験するために行った実験結果を表わす。Ｐｘ法は更に、すすぎ液が非イオン性界面活性剤がないかあるいは非溶血性界面活性剤Pluronicを持つか何れかに処方されている、すすぎサイクルも含んでいる。図１Ａは Day１血液試料で行われたＰｘ法の結果を描写しているサイトグラムである。図１Ａで用いられたＲ１試薬組成物はＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）０．１０５g/L 含有し、図１Ａで用いられたすすぎ試薬溶液はBrijTM３５  ３．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L を含有した。図１Ｂは Day２血液試料で行われたＰｘ法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｂに用いられたＲ１試薬組成物はＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有し、図１Ｂで用いられたすすぎ試薬溶液はBrijTM３５  ３．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L を含有した。図１Ｃは Day２血液試料について行われた結果を示すサイトグラムである。図１Ｃに用いられたＲ１試薬組成物はＳＤＳ  ０．１０５g/L を含有した。図１Ａと１Ｂとに対して、図１Ｃに用いられた、すすぎ試薬溶液は、リン酸塩緩衝の食塩水中非溶血性界面活性剤Pluronic１０５  １．０g/L 含有した（表２参照）。図１Ｄは Day２血液試料について行ったＰｘ法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｃと同様に、図１Ｄ中で用いたＰｘ試薬組成物はＳＤＳを含有するが、より高濃度即ち０．１７g/L のＳＤＳであった。そのすすぎ液は図１Ｃについて説明したものと同一であった。図１Ａ−１Ｄの結果は、ＳＤＳのみを持つＲ１試薬組成物と、イオン性界面活性剤ＳＤＳおよび非イオン性界面活性剤BrijTM３５両者を持つすすぎ試薬とを用いて行った、 Day１試料分析の受入れられる結果（図１Ａ）と比較して、ＳＤＳのみを含有するよう処方されたＲ１試薬組成物と図１Ａで用いたと同じすすぎサイクル溶液とを用いて実行した Day２血液試料分析は、受入れられる根源ノイズを与えることを示している。対照的に、もしすすぎ液がPluronicＰ１０５界面活性剤のみを含有していると（図１Ｃと１Ｄ）、サイトグラムは受入れられない水準の根源ノイズを示す。図１Ｃと１ＤとはＰｘ試薬組成物中の唯一つのイオン性界面活性剤は、すすぎ液が非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を含有していない場合、Ｐｘ法からの受入れられ、有用な結果を得るのには不充分である。本発明者が測定した如く、図１Ｃと１Ｄとに示されている、 Day２血液試料の受入れられない結果はＲ１試料組成物中における非イオン性界面活性剤の欠除に帰すことができる。
【０１６５】
図２Ａ−２Ｊは、いろいろ変えた濃度の非イオン性界面活性剤のみを含有するように処方されたＲ１試薬組成物を用いるＰｘ法の実行が受入れられるデータおよび結果を与えるかどうかを試験するために行った実験結果を示している。示されるように図２Ａ−２Ｅは Day１血液試料で行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムであり、図２Ｆ−２Ｊは Day２血液試料で行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムである。図２Ａと２Ｆとに用いたＰｘＲ１試薬組成物は、BrijTM３５  ０．１２g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを含有し、 Day１と Day２血液試料分析とに関し、対照として役立つ。図２Ｂ−２Ｅおよび図２Ｇ−２Ｊ中に用いられるＰｘＲ１試験試薬組成物は非イオン性界面活性剤（即ち、０．０g/L ＳＤＳ）を含有する。この試験組成物は非イオン性界面活性剤BrijTM３５を次の量含有する。図２Ｂと２ＧはBrijTM３５  ０．０g/L 含有し、図Ｃと２ＨとはBrijTM３５  ０．１４g/L を含有し、図２Ｄと２ＩとはBrijTM３５  ０．２８g/L を含有し、図２Ｅと２ＪとはBrijTM３５  ０．４２g/L 含有する。図２Ａ−２Ｊ中に示す如く、受入れられないサイトグラムはＰｘＲ１試薬組成物中唯非イオン性界面活性剤を用いるＰｘ法の実行から得られる。それ故、非イオン性界面活性剤のみでは、Ｐｘ法から受入れられる結果を得るには充分でない。
【０１６６】
図３Ａ−３Ｄは、すすぎサイクルを含み、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤と両者を共に含有するよう処方されているＰｘＲ１試薬組成物を用いるＰｘ法の実行が受入れられるデータと結果とを、特に Day２血液試料を用いる分析で与えるかどうかを試験するために実行した実験結果を示す。示されるように、図３Ａと３Ｂとは、BrijTM３５  ０．０g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを包含するＰｘＲ１試薬組成物を用いる、 Day１血液試料について行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムである。図３Ａに示す分析に用いたすすぎ溶液はBrijTM３５  ３．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L とを包含する。図３Ｂに示す分析に用いたすすぎ溶液はBrijTM３５  ０．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L とを包含する。図３Ｃは、BrijTM３５  ０．０g/L とＳＤＳ  ０．１０５g/L とを含有するＰｘＲ１試薬組成物およびBrijTM３５  ０．０g/L とＳＤＳ  ２．０g/L を包含するすすぎサイクル試薬とを用いる、 Day２血液試料について行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムである。図３Ｄは、 Day２血液試料と、BrijTM３５  ０．１２g/L およびＳＤＳ  ０．１０５g/L の両者を包含するＰｘＲ１試薬組成物と、ＳＤＳもBrijTM３５も含有せず、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有する新たに開示されたすすぎ試薬溶液を用いたＰｘ法の実行結果を描写するサイトグラムである。図３Ａ−３Ｄの結果は、 Day２血液試料の分析から得られるサイトグラムの完全性（integrity)は、すすぎ溶液がBrijTM３５を含有していない場合、Ｒ１試薬組成物中のイオン性界面活性剤に加えて非イオン性界面活性剤の包含が必要であることを示している。
【０１６７】
図４Ａ−４Ｆは発明のペルオキシダーゼ法における種々なすすぎ液残余の影響を決定するために、全血試料について実行した実験結果を描写するサイトグラムである（実施例５）。図４Ａ−４Ｆに示した実験に用いたＰｘＲ１試薬組成物はＳＤＳ  ０．１０５g/L 含有する。すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液の組成は、すすぎ液がＳＤＳ  ２．０g/L(図４Ａと４Ｃと４Ｅとに示す如く）か、ＳＤＳ２．０g/L ＋BrijTM３５  ３．０g/L(図４Ｂと４Ｄと４Ｆとに示す如く）か何れかを含有するようにすすぎサイクルに用いるすすぎ溶液の組成が異なる。図４Ａと４ＢとはＰｘ法で用いられるすすぎサイクルからのすすぎ液残余量約７．９μL のサイトグラム結果を示す。図４Ｃと４ＤとはＰｘ法で用いられるすすぎサイクルからのすすぎ液残余量約１０．１μL のサイトグラム結果を示す。図４Ｅと４Ｆとは、Ｐｘ法に用いられるすすぎサイクルからのすすぎ液残余量約１３．３μL のサイトグラム結果を示す。サイトグラムはすすぎ溶液中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の存在は、もし残余量が約８．０μL を越えると受入れられない結果を生ずることを示している。
上記の図１Ａ〜図１Ｄはまとめて図１として、同様に図２Ａ〜図２Ｊは図２として、図３Ａ〜３Ｄは図３として、図４Ａ〜図４Ｆは図４として、添付図面中に示してある。
【図面の簡単な説明】
【図１】イオン性界面活性剤を使った実験結果を示すサイトグラムである。
【図２】非イオン性界面活性剤を使った実験結果を示すサイトグラムである。
【図３】イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を使った実験結果を示すサイトグラムである。
【図４】すすぎ液残余の影響を調べる実験結果を示すサイトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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