(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の１以上の標的分子の存在または非存在を検出する方法であって、電気泳動媒体が電場に曝された際に、前記標的分子が、適切な前記電気泳動媒体において特定の移動度を有し、かつ前記標的分子が、捕捉プローブとの結合複合体を形成でき、
ａ）電気泳動に適するマトリックスを形成し得る材料と１以上の捕捉プローブを共重合させ、電気泳動媒体と共有結合した固定化捕捉プローブを含む電気泳動媒体を形成する工程、ここで前記１以上の捕捉プローブは、５’アクリルアミド部分で修飾され、前記１以上の捕捉プローブは、電気泳動媒体内の２次元配列または３次元配列中に固定化される；
ｂ）前記試験試料を電気泳動媒体に導入する工程；
ｃ）前記標的分子が固定化プローブに結合するのに適する条件下、固定化捕捉プローブを含有する電気泳動媒体の１または複数の領域へと、前記試験試料の電気泳動移動をもたらす電場に、電気泳動媒体を供する工程；ならびに
ｄ）前記媒体中で固定された標的分子または標的分子／捕捉プローブ複合体の存在を検出する工程
を含む、試験試料中の１以上の標的分子の存在または非存在を検出する方法。
【請求項２】
固定化捕捉プローブを含有する電気泳動媒体の１または複数の領域において、標的分子または標的分子／捕捉プローブ複合体を検出することにより、試験試料中の標的分子が示される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）において、標的分子の移動速度または標的分子の移動速度に関連する特性を電気泳動媒体内で測定し、前記標的分子の移動速度が、標的分子の少なくとも１つの化学的特性または構造的特性を示す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
捕捉プローブが、核酸、修飾核酸および核酸アナログからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
標的が、核酸、修飾核酸、核酸アナログ、およびタンパク質からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
媒体が、少なくとも１つのタイプのポリマーから形成されているゲルである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
電気泳動媒体が、ポリアクリルアミド、アガロースおよびスターチからなる群より選ばれる少なくとも１つのクラスのポリマーを用いて形成されている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
複合試験試料から標的分子を精製または濃縮する方法であって、
ａ）電気泳動に適するマトリックスを形成し得る材料と５’アクリルアミド部分で修飾された１以上の捕捉プローブを共重合させ、電気泳動媒体と共有結合した固定化捕捉プローブを含む電気泳動媒体を形成する工程、ここで、前記１以上の捕捉プローブは、電気泳動媒体内の２次元配列または３次元配列中に固定化される；
ｂ）前記試験試料を電気泳動媒体に導入する工程；
ｃ）前記試験試料中の標的分子が捕捉プローブに特異的に結合し、その結果、標的分子／捕捉プローブ複合体が形成され、かつ前記試料の非特異的な成分が媒体を通過し、溶出するのに充分な条件および時間の下で、前記媒体を通して試験試料の電気泳動移動をもたらす電場に電気泳動媒体を供する工程、その際、標的分子のみが捕捉プローブに結合し、前記媒体中に固定され、それによって試験試料から標的分子を取り去る；
ｄ）下記：
i）１以上の捕捉プローブ、
ii）標的分子、または
iii）標的／捕捉プローブ結合複合体
の少なくとも１つを放出するよう電気泳動媒体を処理する工程；および
ｅ）次いで、工程ｄ）において前記媒体から放出された標的分子または標的／捕捉プローブ複合体を溶出する工程、
その結果、放出および溶出された標的分子が、実質的に純粋である、複合試験試料から標的分子を精製または濃縮する方法。
【請求項９】
工程ｄ）での放出処理を、前記媒体の温度を、標的／捕捉プローブ複合体を変性させるに充分な温度まで上昇させることにより行う、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）の放出処理を、媒体内で捕捉プローブを固定する化学的結合を化学的切断することにより行い、工程ｅ）において、放出された標的分子／捕捉プローブ複合体を前記媒体から溶出する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）の放出処理を、媒体内で捕捉プローブを固定する化学的結合を光化学的切断することにより行い、工程ｅ）において、放出された標的分子／捕捉（プローブ複合体を前記媒体から溶出する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
工程ｄ）の放出処理を、標的／捕捉プローブ複合体を分離させるに充分なレベルまで電気泳動場強度を増加することにより行う、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
工程ｄ）の放出処理を、標的と捕捉プローブとの間の結合を消去または減少する化学物質と媒体とを接触することにより行う、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
化学物質を電気泳動により媒体に導入することによりマトリックスを前記物質と接触させる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）において、捕捉プローブを、ポリエチレングリコールスペーサー基を介してアクリルアミドに結合する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）において、捕捉プローブを、電気泳動媒体の１または複数の別々の領域で共重合する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
標的分子が、一本鎖または二本鎖の核酸分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
標的分子が、核酸、修飾核酸、核酸アナログ、およびタンパク質からなる群より選ばれる、請求項８記載の方法。
【請求項１９】
試験試料中の１以上の標的分子の存在または非存在を検出する方法であって、電気泳動媒体が電場に曝された際、前記１以上の標的分子が前記電気泳動媒体中で特定の移動度を有し、前記１以上の標的分子が捕捉プローブとの結合複合体を形成でき、
ａ）１以上の捕捉プローブを電気泳動に適するマトリックスを形成し得る材料と共重合させる工程、ここで前記共重合が電気泳動媒体に共有結合された固定化捕捉プローブを含む電気泳動媒体を形成し、前記１以上の捕捉プローブが電気泳動に適するマトリックスを形成し得るモノマーで修飾され、１以上の捕捉プローブが電気泳動媒体内で２次元配列に固定化される；
ｂ）前記試験試料を電気泳動媒体に導入する工程；
ｃ）前記標的分子が固定化プローブに結合するのに適する条件下、固定化捕捉プローブを含有する電気泳動媒体の１または複数の別々の領域へと、前記試験試料の電気泳動移動をもたらす電場に、電気泳動媒体を供する工程；ならびに
ｄ）前記媒体中で固定された標的分子／捕捉プローブ複合体の存在を検出し、それによって試験試料中の１以上の標的分子の存在または非存在を検出する工程
を含む、試験試料中の１以上の標的分子の存在または非存在を検出する方法。
【請求項２０】
捕捉プローブが、核酸、修飾核酸および核酸アナログからなる群より選ばれる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
捕捉プローブが、一本鎖または二本鎖の核酸分子である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
捕捉プローブの５’リン酸末端が、Ｎ−（６−アミノヘキシル）メタクリルアミドにより共有結合的に修飾されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
標的分子が、核酸、修飾核酸、核酸アナログ、およびタンパク質からなる群より選ばれる、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
標的分子が、蛍光標識されている請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
捕捉プローブが、アプタマー捕捉プローブである請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ａ）１以上の捕捉プローブを電気泳動に適する材料と共重合する工程、ここで前記共重合が、電気泳動媒体と共有結合した固定化捕捉プローブを含む電気泳動媒体を形成し、前記１以上の捕捉プローブは、電気泳動に適するマトリックスを形成し得るモノマーで修飾され、１以上の捕捉プローブが電気泳動媒体内で２次元配列または３次元配列に固定化される；
ｂ）試験試料を電気泳動媒体に導入する工程；ならびに
ｃ）前記試験試料中の汚染標的分子が捕捉プローブに特異的に結合し、その結果、標的分子／捕捉プローブ複合体が形成され、かつ前記試料の非標的分子が媒体を通過し、溶出するのに充分な条件および時間の下で、前記媒体を通して試験試料の電気泳動移動をもたらす電場に電気泳動媒体を供する工程、その際、標的分子のみが捕捉プローブに結合し、媒体中に固定され、その結果、試料調製物から汚染標的分子を取り去る、
を含む、複合試験試料中の分子を精製するための方法。
【請求項２７】
前記電気泳動媒体が、多数のクラスの捕捉プローブを含み、捕捉プローブの各クラスが前記電気泳動媒体の別々の領域に固定化される、請求項１または８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は、１９９７年５月１６日出願の仮出願第６０／０４６，７０８号明細書に優先権を主張する、１９９７年８月８日出願の米国特許出願第０８／９７１，８４５号明細書の一部継続出願であり、それらの教示はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
核酸塩基対形成は、極めて親和力の高い特異的相互作用である。そのため、様々な診断用途に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイが考案されている。
実験室条件では、ハイブリダイゼーションアッセイは、感度が桁外れに高く、フェムトグラム量の特定分子を検出できる。しかし、市販用診断技術におけるハイブリダイゼーション分析の広範な使用は、いくつかの技術的制約によって妨げられてきた。
第一に、高活性なハイブリダイゼーションプローブを使用するには、ハイブリダイズしていない（または、不適切にハイブリダイズした）プローブとハイブリダイズしたプローブを分離するための厳密な処置が必要である。この分離は、試料核酸または目的の標的に相補的なプローブを固相に固定化する、固相ハイブリダイゼーション形式の使用によって、この分離を容易にすることが可能である。後者のストラテジーでは、固定化プローブ、以下「捕捉」プローブは、通常、標識されず、ハイブリダイゼーションは、該捕捉プローブによって認識される位置からは離れた位置で試料を結合する第二のハイブリダイゼーションプローブによって検出される。ハイブリダイズした分子種とハイブリダイズしていない分子種とは、支持体を洗浄することによって分離できる。
ハイブリダイゼーションアッセイの第二の制約は、低濃度の標的核酸を含む試料の効率のよいハイブリダイゼーションには、注意深く制御された条件下で（最長７時間もの）長いインキュベーションがしばしば必要なことである。固定化核酸は、実質上常に非固定化核酸よりも遅い速度論でハイブリダイズするので、残念ながら、固相アッセイの使用は、この問題を悪化させる。
これらの理由から、多くの研究者が、より良い速度論と効率で固相ハイブリダイゼーションを行うための方法を探索してきた。いくつかのグループが、硫酸デキストランやポリエチレングリコールなどの高分子量ポリマーの含有物が、固相アッセイの性能を（ささやかではあるが）向上させることを見出している（ＷｉｅｄｅｒおよびＷｅｔｍｕｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０：１５３７（１９８１）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１４：２５１７（１９７５）；ＹｏｋｏｔａおよびＯｉｓｈｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９８（１９９０））。いくつかのグループは、改善を示すクロマトグラフィー的固相ハイブリダイゼーション法を開発している。一般に、固定化された鎖を含む固形支持体の上（またはその中）に液相核酸を流すと、ハイブリダイゼーションの速度論と効率の両方が改善される。ＭａｃＭａｈｏｎとＧｏｒｄｏｎの米国特許第５，３１０，６５０号明細書には、ニトロセルロースフィルター上の固定化標的分子と、毛細管現象によりその固定化標的領域中を流れる標識プローブとが記載されている。同様の実験として、Ｒｅｉｎｈａｒｔｚら（Ｇｅｎｅ，１３６：２２１〜２２６（１９９３））は濾紙に捕捉プローブを固定化し、やはり毛細管現象を利用して、その捕捉プローブ領域に、標識された一本鎖ＰＣＲ産物を流した。他者は、捕捉プローブで共有結合的に修飾されたシリカ粒子を含有するＨＰＬＣカラムに試料を通すことによる改良されたハイブリダイゼーションアッセイを示している（Ｔｓｕｒｕｉら，Ｇｅｎｅ，８８：２３３〜２３９（１９９０））。
しかしながら、これらの進歩にもかかわらず、正確であるだけでなく、迅速で、効率がよく、簡単に使用できるハイブリダイゼーション分析法が今なお必要とされている。
発明の要約
本発明は、核酸と核酸アナログとを電気泳動媒体に共有結合的に付着（ａｔｔａｃｈ）（固定化）でき、かつ固定化した核酸もしくは核酸アナログに特異的に結合する（例えば会合する）標的分子または固定化した核酸もしくは核酸アナログによって特異的に結合される標的分子を分離、精製または分析するのに電気泳動を使用できるという発見に関する。本明細書において、固定された核酸または核酸アナログを捕捉プローブという。これらの固定化捕捉プローブは、様々な分子の分析に使用できる。本発明によって包含される特異的結合反応の一つは、ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの場合、捕捉プローブは、通常、特異的ハイブリダイゼーションが起こるように標的核酸のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含有した核酸である。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの核酸アナログを、捕捉プローブとして使用するために電気泳動媒体に共有結合的に付着することもできる。捕捉プローブを電気泳動分離用媒体内に固定化すると、その捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする標的核酸も、そのマトリックス内に固定化されることになる。本明細書に用いられる「マトリックス」という用語は、媒体の分子ふるい特性を提供し、かつ捕捉プローブの固定化手段をも提供する、電気泳動媒体の固定化されたポリマー成分を指す。好適なマトリックス物質の例示としては、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、スターチなどのゲル形成ポリマーが挙げられる。キャピラリー電気泳動アプリケーションに広く使用されているように、線状ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルセルロース）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ビニルアルコール）などの非ゲル形成ポリマーも、好適なマトリックスとしての目的にかなう。
本発明は、特に、液相標的分子を移動させて適当な電気泳動マトリックス上に固定化された捕捉プローブと接触させるのに電気泳動を使用する、本明細書に記載された分析法を実施するための方法と装置とに関する。
本発明の方法は、電気泳動することができ（例えば電気泳動用の電場に置かれたときに検出できる移動度を持つ荷電分子）かつ核酸に結合するまたは核酸によって結合される任意の化学的実体の分析に適用できる。そのような実体（例えば標的）としては、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ試料、核酸結合タンパク質、アプタマー結合パートナーが挙げられる（アプタマーは、ペプチド、タンパク質、薬物、炭水化物、多糖類および例えば、テオフィリンおよびカフェインの小さい有機分子などの特異的結合パートナーに結合するように選択された核酸である；Ｊｅｎｉｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：１４２５〜１４２９（１９９４））。例えば、本明細書に記載された方法は、固定化した捕捉プローブを用いる標的核酸の分析と精製とに使用でき、ここで特異的結合は、核酸ハイブリダイゼーションのように、試料核酸と捕捉プローブとの間の塩基対形成相互作用を伴う。決められた配列を持つ合成核酸は、タンパク質電気泳動に広く使用されるマトリックスに固定化できるので、本明細書に記載された方法は、配列特異的核酸結合タンパク質の精製にも有用である。
試験試料は、いかなる供給源からも得ることができ、捕捉プローブと結合複合体を形成できるいかなる分子をも含むことができる。特に、体組織（例えば、皮膚、毛髪、内臓）から既知の技術で得られる細胞を含む生物学的供給源由来の試料または体液（例えば、血液、血漿、尿、精液、汗）は、本発明に包含される。本発明の方法による分析に適した試料の他の供給源は、ウイルス、酵母、細菌などの微生物学的試料、プラスミド、単離核酸、ならびに組換え植物などの農学的供給源である。
前記試験試料は、当業者に公知の様式で、その試験試料中に含まれる標的分子が結合に利用可能になるように処理される。例えば、標的分子が細胞中に存在する核酸である場合、細胞溶解液を調製し、粗細胞溶解液（例えば、標的核酸、ならびにタンパク質、脂質などの他の細胞成分を含む）を分析することができる。一方、分析に先立って、標的核酸を単離する（標的核酸が他の細胞成分を実質的に含まないようにする）こともできる。単離は、既知の実験技術を用いて達成できる。標的核酸は、分析に先立って（例えばポリメラーゼ連鎖反応技術やリガーゼ連鎖反応技術により）増幅することもできる。
次に、その試験試料を適当な電気泳動媒体に導入する。捕捉プローブは、その媒体への直接的な付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、またはマトリックス内に懸濁およびトラップされる粒子への付着によって、電気泳動マトリックス内に固定化される。どちらの場合も、捕捉プローブは固定化される。すなわち、それらは適用される電場の影響を受けて移動することがない。
標的分子含有試験試料は、電気泳動ステップの前、途中または後に、検出しうるように標識できる。マトリックス中に固定化された標的分子／捕捉プローブ複合体の存在の検出は、捕捉プローブに特異的に結合するまたは捕捉プローブによって結合される標的分子の存在を示す。
試験試料を電気泳動媒体に導入したら、該試験試料に標的分子が存在する場合にそれが１以上の捕捉プローブに結合してそのマトリックス中に固定化された標的分子／捕捉プローブ複合体を生成するのに足りる条件と時間で、電場にさらすことにより、マトリックスを通して試験試料を電気泳動により移動させる。核酸電気泳動手法に使用される典型的な電圧勾配は、約１Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍの範囲である。高度に特殊化された一定の用途には、他の電界強度が有用でありうる。
標的の固定化は、標的／捕捉プローブ結合複合体の強さと寿命に応じて、一過的であるか、かなりの期間にわたって安定でありうる。本発明の一態様として、標的分子はマトリックス中に固定化された１以上の捕捉プローブに一時的に結合または会合する。この態様では、標的分子は、固定化された捕捉プローブを含有する電気泳動マトリックスのもう１つの領域を通って移動する間に複数回結合し、放出されうる。電気泳動により導かれる移動は、それによって妨害され遅延するので、そのような結合が起こらない場合よりも移動速度は遅くなり、対象領域とマトリックスとを通って移動するのに要する時間が増加する。電気泳動マトリックス内での標的分子の移動速度を測定し、それを参照（例えば対照）実験における標的分子の移動速度と比較できる。本明細書に用いられる対照実験は、捕捉プローブがマトリックスに固定化されていない点以外は、実質的に類似するまたは等価な材料と条件による同等な実験である。あるいは、対照実験は、試験実験の厳密な同等性からの相違について補正された類似の実験、または分析結果を得るのにそのような補正が必要でない十分に類似する実験でありうる。
特定の実験においてある分子の移動速度が参照実験におけるその分子の移動速度より遅いことがわかった場合、その遅延した移動は、その分子がマトリックスに含まれる１以上の捕捉プローブと会合する標的分子であることを示す。さらに、標的分子移動速度の低下または減少の程度は：下記に挙げること：標的分子の、１以上の捕捉プローブとの結合の親和力；マトリックス内に固定化された捕捉プローブの濃度；およびマトリックスを通って移動する際に横切られる１または複数の捕捉プローブ領域の程度、を示す。
一方、標的分子の移動速度と、その実験条件で既知の移動速度を持つ対照分子の移動速度とを比較してもよい。標的分子と会合する１以上の固定化捕捉プローブを有するマトリックスを通して移動する標的分子の相対移動時間と、実質的に類似するまたは同等な条件でのその対照分子の移動速度とは、実験的に決定されるか、もしくはそれらの分子特性から計算できる。
実験条件下で、同じ、または推定上の標的（例えば試験）分子と対照分子との相対移動速度が実質的に同じである場合（例えば正しい関係または予想される関係にある場合）、これは、試験分子は、実際に目的の標的分子であることおよびマトリックスが該標的分子と会合する１以上の捕捉プローブを含有することを示唆する。一方、同じ示唆は、実質的に類似する条件または実験的条件で同様の移動時間後に、対象捕捉プローブを含むマトリックス中で達成される、標的分子と試験分子に関する相対移動距離からも得られうる。
典型的な分析状況は、対照分子の移動速度が、固定化捕捉プローブを含有しないがその他の点では類似するマトリックスにおける標的分子の移動速度と実質的に同じまたは同等であるというものである。対照分子と試験分子とは、その試験分子が、１以上の捕捉プローブと会合する所望の標的分子でない場合は、類似する移動速度と移動時間とを達成するだろう。しかしながら、試験分子が標的分子である場合、対照分子は、固定化捕捉プローブを含むマトリックスの領域を通って移動する試験分子よりも速い移動速度と短い移動時間を達成するだろう。最も典型的には、そのような分析を並行して達成することができ、対照分子と試験分子の両方を同じマトリックスの１以上の領域を通して実質的に同時に電気泳動し、それらの相対移動速度または移動時間を連続的に監視または測定するか、１以上の固定された移動または期間後に測定する。
本明細書に記載の方法に有用な電気泳動マトリックスは、多くの異なる形式で提供できる。例えばマトリックスは、その物理的長さが、その幅または深さを著しく超える形式で、例えば、管に入れた形または細長い帯状にして提供できる。あるいは、マトリックスを、その長さと幅が深さを著しく超える形式で、例えば、ある表面上の比較的薄い層としてまたは平板状にして提供することもできる。あるいは、マトリックスを、基本的に、その長さ、幅および深さが同じ程度の固体として、例えば、実際にまたはほぼ直方体、多角体、球体、楕円体もしくは類似の物理形状としても提供できる。
本明細書に記載された方法に有用な固定化捕捉プローブの位置的配置も、多くの異なる形式で提供できる。例えば、マトリックスは、マトリックス全体にわたって、またはマトリックスの１以上の領域に、均一に分布した、１以上の捕捉プローブを含みうる。また、類似するまたは異なる固定化捕捉プローブもしくはプローブの組み合わせの２以上の領域を、マトリックスを通って移動する時に、試料が一連の捕捉プローブ領域を通って移動するように配置することもできる。あるいは、複数の固定化捕捉プローブ領域を、２以上の移動経路が形成され、そのそれぞれが一つのまたは一連の固定化捕捉プローブ領域を通り抜けるように配置することもできる。
このように、本明細書に記載された研究の結果として、ここに、標的分子に特異的に結合する固定化された捕捉プローブを用いる標的分子の迅速、効率的かつ正確な電気泳動分析法が利用できるようになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、固定化された捕捉プローブを用いる電気泳動分析の原理を図示したものである。
図２Ａは、捕捉プローブで均一に修飾されたゲルを示す概略図である。
図２Ｂは、三層に配置された３つの捕捉プローブの一次元配列を含むゲルを示す概略図である。
図２Ｃは、６つの捕捉プローブの二次元配列を含むゲルを示す概略図である。
図２Ｄは、８つの捕捉プローブの三次元配列を含むゲルを示す概略図である。
図３ＡおよびＢは、変異核酸配列の電気泳動分析の原理を図示したものである。図３Ａは正常な配列に相補的な固定化プローブを含むゲルを表す。図３Ｂは、変異配列に相補的な固定化プローブを含むゲルを表す。
図４はゲル固定化プローブへの核酸のハイブリダイゼーションを表す写真である。
発明の詳細な説明
本発明は、捕捉プローブが電気泳動マトリックスに共有結合的に付着（例えばそのマトリックス中に固定化）されている、特異的結合反応を分析するための電気泳動方法に関する。捕捉プローブは、試験試料中に存在する標的分子に特異的に結合もしくはハイブリダイズする核酸または核酸アナログである。試験試料を電気泳動マトリックスに導入し、捕捉プローブへの標的分子の特異的結合に適した条件で電場をかける。固定化プローブは、電気泳動マトリックスの全体にわたってその内部に付着され、結合はそのマトリックス内で起こる。図１は電気泳動捕捉分析の原理を図示した略図である。
電気泳動マトリックス
いかなる電気泳動に適したマトリックスをも本発明の方法に使用できる。好適なマトリックスとしては、アクリルアミドおよびアガロースが挙げられ、どちらも核酸電気泳動に広く使用されている。しかしながら、他の物質を使用してもよい。例示としては、化学修飾されたアクリルアミド、スターチ、デキストラン、セルロース系ポリマーがある。例示としては、修飾アクリルアミドおよびアクリル酸エステル（例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社のポリマー＆モノマー  カタログ、１９９６〜１９９７、ペンシルヴェニア州ウォリントン、を参照のこと）、スターチ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７１：５８５（１９５９）；製品番号Ｓ５６５１，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（ミズーリ州セントルイスを参照のこと）、デキストラン（例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のポリマー＆モノマー  カタログ、１９９６〜１９９７，ペンシルヴェニア州ウォリントンを参照のこと）、セルロース−べースポリマー（例えば、Ｑｕｅｓｄａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８２〜９３（１９９７）を参照のこと）が挙げられる。上に列挙されたこれらのポリマーは、本発明で使用される捕捉プローブの特異的付着が可能なように、いずれも化学修飾できる。
特に、核酸オブ（ｏｆ）核酸アナログの捕捉プローブとしての使用は、本発明に包含される。核酸含有ゲルを制作するために核酸をカップリングする方法は当業者に知られている。核酸と核酸アナログとは、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチポリマーに、臭化シアン活性化または塩化シアヌル活性化によってカップリングできる。カルボキシル基を含有するポリマーは、一級アミン基を持つ合成捕捉プローブに、カルボジイミドカップリングを用いてカップリングできる。一級アミンを持つポリマーは、アミン含有プローブに、グルタルアルデヒドまたは塩化シアヌルを使ってカップリングできる。多くのポリマーは、チオール含有合成プローブにカップリングできるチオール反応性基で修飾できる。他の多くの好適な方法が文献で知られている。（総論としては、Ｗｏｎｇ，“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州ボカラトン，１９９３を参照のこと）。
本明細書記載の捕捉プローブを重合性化学基に共有結合的に付着する方法も開発されている。重合性モノマー化合物の適当な混合物と共重合すると、高濃度の固定化核酸を含むマトリックスを製造できる。重合性化学基に核酸を共有結合的に付着する方法の実例は、「核酸含有重合性複合体」と題する米国特許出願第０８／８１２，１０５号明細書に見出され、その教示は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
一部の方法については、２以上のマトリックス形成材料の混合物を含む複合マトリックスを使用することが有効だろう。その一例は、複合アクリルアミド−アガロースゲルである。これらのゲルは、通常、２〜５％のアクリルアミドと０．５％〜１％のアガロースを含有する。これらのゲルでは、アクリルアミドが主たるふるい機能を与えるが、このように低濃度のアクリルアミドゲルは、アガロースなしでは取り扱いに好都合な機械的強度を欠く。アガロースは、アクリルアミドのふるい特性を有意に変化させることなく機械的支持を与える。このような場合は、成分が液相核酸標的と最も密に接触するので、ゲルのふるい機能を付与する成分に核酸を結合できる。
アガロース、架橋ポリアクリルアミドゲルなどのゲル形成マトリックスは、多くのアプリケーションに好ましいだろう。しかしながら、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）用には可溶性ポリマーを電気泳動マトリックスとして使用すると便利であり、再現性が得られうる。ＣＥ分析に有用であることがわかっている可溶性ポリマーの例示は、Ｑｕｅｓａｄａ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、８２〜９３頁、１９９７）に記載しているように、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルセルロース）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ビニルアルコール）の線状ポリマーである。これらの可溶性マトリックスは、本発明の方法を実施するためにも使用できる。固定化捕捉プローブを含む可溶性ポリマーマトリックスの調製には、「核酸含有重合性複合体」と題する米国特許出願第０８／８１２，１０５号明細書に見出される方法を使用することが、特に便利である。ポリマー形成中にエチレン含有捕捉プローブの共重合に関与する、本ストラテジーの詳細な例示を下記実施例５に記載する。予め形成させたポリアクリルアミドゲルにオリゴヌクレオチドプローブを付着するもう一つの方法（Ｔｉｍｆｅｅｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，３１４２〜３１４８，１９９６）も、前もって重合した可溶性線状ポリアクリルアミドに捕捉プローブを結合するために使用できる。
電気泳動マトリックスに組み込まれうる粒子に核酸を結合してもよい。前記粒子は、本来、肉眼的、顕微的またはコロイド性でありうる。（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．の１９９５〜１９９６パーティクルカタログ、ペンシルヴァニア州ウォリントンを参照のこと）。Ｃａｎｔｏｒらの米国特許第５，４８２，８６３号明細書には、懸濁液または粒子を含む電気泳動ゲルをキャストする方法が記載されている。前記粒子は、上述した方法に類似する方法で核酸に連結され、ゲル形成化合物と混合され、懸濁液として所望のマトリックス型にキャストされる。
ハイブリダイゼーション結合反応を分析するための固定化プローブ
本発明の方法において、様々な捕捉プローブを使用できる。通常、本発明の捕捉プローブは、捕捉プローブにハイブリダイズする標的分子に実質的に相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸を含有する。核酸捕捉プローブの相補性は、標的分子を特異的に結合し、かつ標的分子の存在または非存在を明示するのに十分でありさえすればよい。本発明での使用に適したプローブには、ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸アナログおよび核酸ともう一つの有機成分（例えばペプチド核酸）とを含有してなる混合型のキメラプローブを含有する。捕捉プローブは、一本鎖または二本鎖核酸でありうる。
本明細書で定義する「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本明細書で「単離された」核酸は、それらの起源（例えばそれは細胞中またはライブラリーなどの核酸混合物中に存在する）の成分から分離された核酸であり、それはさらなるプロセッシングを経ていてもよい。単離された核酸としては、当業者に公知の方法によって得られた核酸が挙げられる。これらの単離された核酸としては、実質的に純粋な核酸、化学合成によって製造された核酸、生物学的方法と化学的方法との併用により、製造された核酸および単離された組換え核酸が挙げられる。
本明細書で用いられる「核酸アナログ」には、修飾糖基、リン酸基または修飾塩基を含む核酸が含まれる。修飾塩基を持つ核酸の例示としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化またはメチル化された塩基（例えば、４−アセチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、１−メチルイノシン、ノルバリンまたはアロインロイシン）などがある。そのような核酸アナログは、当業者に公知である。
本明細書に定義するように、「実質的に相補」とは、捕捉プローブのヌクレオチド配列が標的分子の正確なヌクレオチド配列を反映する必要はないが、配列の同一性が、指定された条件で標的分子とハイブリダイズするに足りる程度に類似していなければならないことを意味する。例えば、配列がハイブリダイズするに足りる相補的塩基を持つものならば、非相補的な塩基または余分なヌクレオチドを配列中に散在させることができる。
ハイブリダイゼーションの指定条件は、当業者により経験的に決定できる。例えば、非特異的ハイブリダイゼーション反応を著しく減少させるストリンジェンシーの条件を選択すべきである。核酸ハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、第１巻、Ｓｕｐｐｌ．２６，１９９１に説明されており、その教示は、参照により、そのまま本明細書に組み込まれる。プローブの長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、温度、イオン強度などの因子は、核酸ハイブリッドの安定性に影響する。ストリンジェントな条件、例えば、中等度のまたは高いストリンジェンシーは、プローブと標的分子の特徴にも依存して、経験的に決定できる。
通常、捕捉プローブの長さは、少なくとも５ヌクレオチド長、より一般的には５〜５０ヌクレオチドであろうし、数千塩基長もの長さでもよい。
修飾ヌクレオチドを含むプローブも有用である。例えば、デアザグアニン塩基とウラシル塩基とを含むヌクレオチドを、ハイブリダイズしたプローブの熱的安定性を低下させるために、グアニンおよびチミン含有ヌクレオチドの代わりに使用しうる（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻、２２７〜２５９頁、１９９１）。熱的安定性の増したハイブリッドが望ましい場合は、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを使用できる（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻、２２７〜２５９頁、１９９１）。２’−Ｏ−メチル基の付加などのリボース糖基への修飾は、固定化されたＲＮＡプローブのヌクレアーゼ感受性を減少させうる（Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３７２，３３３〜３３５頁，１９９４）。ホスホジエステル骨格から負電荷を除去する修飾により、ハイブリッドの熱安定性を増加させることができる（Ｍｏｏｄｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１７，４７６９〜４７８２頁，１９８９；Ｉｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７０，１４７１２〜１４７１７頁，１９９５）。
核酸アナログも固定化プローブとして役立ちうる。有用な核酸アナログの一例は、反復するＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる修飾ペプチド骨格に標準的ＤＮＡ塩基が結合しているペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２５４巻、１４９７〜１５００頁、１９９１）。前記ペプチド骨格は、標準的なＤＮＡおよびＲＮＡ一本鎖との塩基対形成に適した距離に塩基を保持できる。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二本鎖は、おそらくＰＮＡ鎖には負に荷電したホスホジエステル結合がないという事実ゆえに、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の同等物よりもはるかに強い。また、その特殊な構造ゆえに、ＰＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対して極めて耐性である。これらの理由から、ＰＮＡ核酸アナログは固定化プローブアッセイに有用である。固定化プローブ試験に有用な特性を持つであろう他の核酸アナログを構築するにも同様の設計方針を使用できることは、当業者には明らかだろう。
一本鎖および二本鎖標的分子
本発明の１態様では、一本鎖標的分子と一本鎖固定化プローブとを使用する。この態様は、ＲＮＡ標的の分析にとりわけ有用である。これは、標的の再生が迅速でない場合に、複雑な試料からの特定標的の捕捉にも有用である。ＰＣＲ産物などの高濃縮標的は、迅速な再生ゆえに電気泳動直前の変性を必要とするであろう。例えば、１００〜２５０塩基対長のＰＣＲ産物を分析するには、試料を７５％ホルムアミド（体積／体積）にして、電気泳動直前に５分間６０℃で加熱するとよい。
本発明のもう１つの態様では、二本鎖標的を一本鎖固定化プローブで捕捉する。例えば二本鎖核酸と会合して三本鎖構造を形成するプローブを設計できる。第三の鎖は二本鎖の主溝に位置し、二本鎖の塩基とフーグスティーン型塩基対相互作用を形成する（ＨｏｇａｎおよびＫｅｓｓｌｅｒの米国特許第５，１７６，９６６号明細書ならびにＣａｎｔｏｒらの米国特許第５，４８２，８３６号明細書）。したがってプローブの設計は、それらの化学的相互作用を支配する制約を受ける。しかし、天然に存在する核酸における三本鎖構造を形成できる配列の頻度は十分に高いので、多くの標的はこのプローブ設計方針を使って特異的に捕捉できる。
別法として、置換ループ構造の形成によって二本鎖核酸と会合するプローブを設計できる。そのようなプローブは二本鎖核酸の一方の鎖にのみ結合し、二本鎖のプローブ相同二本鎖を部分的に置換する。この置換はプローブ−標的鎖相互作用が標的鎖間の相互作用よりはるかに有利である場合にのみ達成できる。そのようなプローブは、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２６，２２７〜２５９頁（１９９１）に記載の修飾塩基と技術、骨格修飾（Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１７巻、４７６９〜４７８２頁（１９８９））および核酸アナログ（Ｎｉｅｌｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７〜１５００頁（１９９１）を使って製造できる。天然に存在する核酸と異例に強固かつ特異的に塩基対形成するペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブの使用はこの態様でとりわけ有用だろう。
核酸結合タンパク質を分析するための固定化捕捉プローブと標的
本発明の方法は核酸結合タンパク質の分析にも有用である。これらの場合は、選択される核酸が、何らかの方法で、そのタンパク質の天然の結合基質を模倣する。
配列特異的核酸結合タンパク質と非配列特異的核酸結合タンパク質の両方を分析できる。配列特異的結合タンパク質を分析するには、その標的結合タンパク質によって認識される配列を含有するように捕捉プローブを設計する。非特異的相互作用を分析するには、観察される結合が特定の核酸配列に依存しないことを保証するために、捕捉プローブの混合物を使用できる。
電気泳動分析は、タンパク質がその未変性構造を保てるような、したがってそのタンパク質が電気泳動中に捕捉プローブに結合できるような条件下で行われる。電気泳動後、固定化捕捉プローブを含有するゲル領域内の該タンパク質の存在は、有色または蛍光色素による染色、オートラジオグラフィー（試料が放射活性標識されている場合）、銀染色、およびタンパク質電気泳動分野の当業者に周知の他の様々な標準的方法によって検出できる。
転写調節に重要な配列−特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出と分析には、二本鎖捕捉プローブを利用することがとりわけ有用である。この実施では、タンパク質標的によって認識されることが知られている（またはそのように推測される）配列を含有する二本鎖捕捉プローブを使用する。試験試料はその捕捉プローブを含有する領域を通して電気泳動される。電気泳動後に、ゲル内でのタンパク質の位置を決定する。捕捉プローブを含有するゲル領域にタンパク質が存在することは、その試料中にＤＮＡ結合タンパク質が存在することを示す。興味ある特定配列を持たないＤＮＡ捕捉プローブでは結合が起こらないことを示す対照実験を用いて、その結合の配列特異性を実証できる。
一本鎖捕捉プローブも役立ちうる。例えば一本鎖ＲＮＡ捕捉プローブは、特定のＲＮＡ配列に結合するタンパク質の検出と精製に使用できる。一本鎖ＤＮＡプローブは、一本鎖ＤＮＡゲノムを含有するウイルスの調節タンパク質や、複製起点内の一本鎖ＤＮＡ区間に特異的に結合するタンパク質を検出するのに役立ちうる。
アプタマー捕捉プローブ
いくつかのグループが、えり抜きの望ましい結合特性または触媒能を示す分子を求めて核酸のランダムライブラリーをスクリーニングする方法を開発している（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８〜８２２（１９９０）；Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ，８２：８３〜８７（１９８９）；ＴｕｅｒｋとＧｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５〜５０１（１９９０））。多くの応用例で、これらのライブラリーは、標準的な市販の核酸合成装置で作製されたオリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）のランダムプールからなる。２５塩基長の最大１０15の個々の配列からなるライブラリーを日常的に構築することができる（ＫｌｕｇとＦａｍｕｌｏｋ，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０：９７〜１０７，（１９９４））。次に、所望の標的への機能的結合について、このプールをスクリーニングする。標的を結合できるオリゴヌクレオチドは、カラムクロマトグラフィー、フィルター結合または他の適当なプローブ／標的結合複合体精製法によって分離される。結合したオリゴヌクレオチドを精製し、通常は、無作為配列の領域に隣接する特定の配列を認識するプライマーを用いて、その結合プールをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。高い親和力で結合するオリゴヌクレオチドプローブを濃縮するために、必要に応じて標的結合と再増幅のサイクルをさらに繰り返すことができる。最終プールの構成要素を組換えＤＮＡ技術でクローン化し、配列決定し、標的結合を担う配列要素を同定するための分析を行う。
アプタマーと呼ばれるこのタイプの核酸結合プローブは、事実上任意の標的分子に対して選択できる。現在までに、特定のタンパク質（Ｂａｒｔｅｌら，Ｃｅｌｌ，６７：５２９〜５３６（１９９１）；Ｇｉｖｅｒら，Ｇｅｎｅ，１３７：１９〜２４（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２９３〜２９９；Ｂｏｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：５６４〜５６６（１９９２））、アミノ酸（Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：１６９８〜１７０６（１９９４））、小分子薬物（Ｊｅｎｉｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：１４２５〜１４２９，１９９４））、ビタミン類（ＬｏｒｓｃｈとＳｚｏｓｔａｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：９７３〜９８２（１９９４））、ならびにヌクレオチドコファクター（ＳａｓｓａｎｆａｒとＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５５０〜５５３（１９９３））と特異的で強固な結合複合体を形成できるアプタマーが選択されている。
本発明は調製および分析用途でアプタマーを使用するための便利なプラットフォーム技術を提供する。いったん適切なアプタマーが選択されたら、捕捉プローブとして使用するために、それを適切な電気泳動媒体に結合することができる。その捕捉ゾーンを通して試験試料を電気泳動した後、その捕捉ゾーンを標的の存在について分析する。調製用途の場合は、非標的試料成分を媒体外へ移動させた後で、標的分子をその捕捉ゾーンから溶出させることができる。アプタマーは事実上任意の標的に対して選択できるので、アプタマー捕捉プローブを使用することにより、本発明の方法は多種多様な標的分子の電気泳動分析および精製に利用できる。どの分子でも、その分子が、適用した電場の影響を受けて移動するように電気泳動に使用する条件で帯電する（例えば標的分子が適当な電気泳動媒体中に置かれたときに検出可能な移動度を持つ）限り、本発明の方法での分析に適することに注目することが重要である。
標的分子分析用の均一に修飾された電気泳動媒体
本発明のこの態様では、図２Ａに模式的に示すように、媒体の実質的にすべてが１または複数の捕捉プローブで修飾される。捕捉プローブと電気泳動条件の選択は、捕捉プローブと標的分子の間の結合が一時的で、電気泳動分析の時間スケールで迅速に可逆的であるように行われる。これらの条件では、標的分子が電気泳動中に捕捉プローブへの結合、放出および再結合というサイクルを数多く起こす。この可逆的結合は、捕捉プローブの非存在下での移動度と比較して測定される標的の電気泳動移動度を減少させるという効果を持つ。捕捉プローブへの結合が強い場合、標的の移動度は大きく減少する。捕捉プローブへの結合が弱い場合、標的の移動度はわずかにしか減少しない。このようにして、捕捉プローブの非存在下では類似する電気泳動移動度を持つ構造的に関連する標的を、特定の捕捉プローブに対するそれらの親和力に基づいて区別することができる。この方法は後述するように核酸配列変異の分析にとりわけ有用である。
標的分子を分析するための一次元配列
本発明のこの態様では、図２Ｂに模式的に示すように、一連の不連続なマトリックス層であって、各層が少なくとも一つの捕捉プローブを含有するものを通して、標的分子を含有する試料を電気泳動する。例えばハイブリダイゼーション結合反応では、捕捉プローブに相補的な標的核酸が捕捉プローブにハイブリダイズし、そのゲル層に保持される。相補的でない試料核酸はその捕捉層を通過する。捕捉プローブと相補的な試料核酸とのハイブリッドの存在は、本明細書に記載の適当な標識法によって捕捉層内で検出される。
この一次元形式には重要な利点がいくつかある。第一に、試料のすべてが捕捉層を通過し、それゆえ試料のすべてがハイブリダイゼーションに利用されうる。これは他の大半の固相ハイブリダイゼーション法と比較して大きな利点である。高濃度の固定化プローブを使用することにより、小さなゲルバンド中にハイブリダイズ可能な試料核酸鎖のすべてを捕捉することが可能である。
第二に、この方法による分析には、別々の電気泳動移動度を持つ無傷の核酸種が必要でない。ハイブリダイゼーションと検出には短い配列相同性しか必要ないので、部分的に分解した核酸でもなおシグナルを与えるだろう。すべての標的核酸は、それらが分解されるかどうかにかかわらずマトリックス中の特定の位置に濃縮されるので、この属性は検出感度も増加させる。従来のゾーン電気泳動では、検出のためには、すべての試料核酸が別々のバンドとして移動しなければならない。
第三に、試料の体積は重要でない。本発明では、たとえ大量の試料を使用したとしても、すべての試料核酸が捕捉層を通過する。これは、検出の感度と分解能を最大にするには試料の体積が可能な限り小さい必要がある従来のゾーン電気泳動と比較して、有意な利点である。
この態様では、捕捉層が単一または複数の捕捉プローブを含有しうる。単一層に複数の捕捉プローブを使用することは、多数の異なる生物のうちのいずれか１つを検出する必要があるアッセイに有用である。例えば輸血に使用される血液試料にはどのような細菌の存在も望ましくない。したがって任意の細菌に関する一般的試験には、保存された細菌遺伝子配列の収集物を捕捉プローブとして使用しうる。特定の細菌の同定は重要でないので、そのプローブ収集物は、任意のそして全ての細菌が同じ捕捉層で検出されることを保証するのを助ける広域スペクトルの複数プローブからなりうる。
この態様では複数の捕捉層も使用できる。多重ハイブリダイゼーションアッセイを作製するには、同じゲル装置に複数の捕捉層を逐次的にキャストすることが簡単明瞭である。アッセイ中は、それらの層の全てを通して標的試料を電気泳動し、相補的な試料核酸を各層で捕捉する。各層中のハイブリッドの量は使用した捕捉プローブに関する試料組成を直接反映する。
適正にハイブリダイズした核酸だけが各層に保持されることを保証するように条件を割り出すことができる。２０塩基対程度の長さの捕捉プローブとの電気泳動ハイブリダイゼーションは、従来の非変性ゲルと緩衝液系を用いて室温で行うことができる。このサイズの完全に相補的なハイブリッドは何時間も安定なようである。しかし、尿素やホルムアミドなどの変性剤をゲルに添加するか、ゲルを高温で泳動することにより、さらなるストリンジェンシーを達成することができる。
二次元プローブ配列
一次元プローブ配列は限られた数の捕捉プローブを使用する分析に使用できる。より多数の配列を分析するには、固定化プローブの二次元配列を使用できる。この配列は多くの方法で形成させることができる。単純な二次元配列は例えば整列した複数の垂直なスペーサーを使って従来のスラブゲル装置にキャストでき、事実上、一次元配列の配列が生成する。この配置の一例を図２Ｃに示すが、ここでは、１つの試料が試料ウェルに充填され、その試料の一部が６つの別々の捕捉ゾーンを通過することになる。
より複雑な二次元配列は次の二段階で作製できる。すなわち、まず一つのプレート上で捕捉プローブ領域をマトリックス（例えばポリアクリルアミドゲル）ドットの配列として重合させ、次にその配列上に上部ゲルプレートを置いて、プローブドット間の空間を非修飾ゲルで満たすことにより、各ドットを「サンドイッチ状」にする。
いずれの場合も、試料はマトリックス上部の全長にわたって一つのバンドとして充填される。この態様では、試験試料全体が捕捉プローブのすべてと接触するわけではない。しかし、ライブラリースクリーニングや遺伝子発現分析など、二次元分析が望ましい用途ではほとんどの場合、試料核酸が高コピー数で存在するので、この問題は有意な障害にはならない。
三次元プローブ配列
本明細書に記載するハイブリダイゼーション法には、例えば高速処理および／または対費用効果などのための多重並列アッセイにとりわけ有用でありうるような三次元配列も包含されうる。このようなアッセイは、図２Ｄに模式的に示すような三次元固体の形式で提供でき、ここでは複数の試料を表面または面に適用し、次にその固体の容積中を、捕捉プローブの１以上の領域に出会うように移動させる。配列は各試料がその配列を通って移動する間に同じ配列の捕捉プローブに出会うように制作してもよいし、あるいは異なる試料混合物を分析するために、もしくは１以上の試料混合物内の異なる成分セットを分析するために、異なる配列の捕捉プローブを配置してもよい。
固定化プローブとのハイブリダイゼーションによる試料の精製／濃縮
本明細書に記載する電気泳動法は、粗混合物から特定標的分子を選択的に精製するのにとりわけ有用である。例えば、固定化捕捉プローブを含有するゲル上に粗混合物または細胞溶解液を置く。その混合物をそのゲルを通して電気泳動する。標的分子は捕捉プローブを含有する層に固定化される。標的と同じ電荷を持つ非標的分子は反対の極性を持つ電極（これをここでは「誘引電極」と呼ぶことにする）にひきつけられ、捕捉プローブ層を通過し、ついにはゲル外に電気泳動される。反対電荷の非−標的分子は、非−誘因電極に向かって試料ウェル外に移動する。帯電していない試料分子は試料ウェル中に残り、ゲルには入らない。全ての帯電非標的分子がゲルから除去されうる十分な電気泳動時間後に、捕捉された標的分子を次の方法の一つによりゲルから溶出させる：
１）変性条件での継続的電気泳動（例えばマトリックスの温度を上げるか、電気泳動電圧を増加させることによる）。捕捉プローブからの標的の放出は、例えば媒体の温度を、標的／捕捉プローブが変性するに足りる温度まで上げることによって達成される。
２）捕捉プローブとマトリックスの間の化学結合の化学的または光化学的切断後の継続的電気泳動。
３）標的と捕捉プローブの間の結合の除去。ここで、標的はプローブから放出される。例えば化合物または化学物質は標的に、またはプローブから標的を放出する捕捉プローブに競争的に結合できる；あるいは標的とプローブの間の結合が除去されるか十分に低下して標的が放出されるように媒体の条件を変化させる。例えば標的がタンパク質であり、固定化された捕捉プローブが核酸である場合は、固定化された捕捉プローブに相補的な可溶性非固定化核酸を媒体に導入するか、媒体と接触させることができる。その可溶性核酸は固定化プローブに対してより高い親和力を持ち、標的とプローブの間の結合が除去され、標的が放出される。プローブからの標的の放出を保証するために、通例、競争用化学物質は過剰に添加される。他の帯電または非帯電化合物も同様に働きうる。例えばホルムアミドをゲル媒体に吸収させることができ、それは標的の放出をもたらす。一態様として、化学物質を電気泳動によって媒体に導入する。例えば試料を媒体を通して溶出させ、標的が捕捉プローブに結合した後、次いで競争用化学物質をその媒体を通して電気泳動する。
溶出した標的分子は、いくつかの方法によって濃縮し、誘引電極槽から回収できる。例えば、非標識試料分子をゲル外に電気泳動した後、誘引電極槽内の非標的分子を適当な洗浄液で洗い流すことができ、標的分子を元の誘引電極槽中に直接溶出させることができる。別法として、一つが非標的成分を試料から除去するために使用され、もう一つが標的分子を溶出させるために使用されるように、電気泳動装置が２つの誘引電極を持ってもよい。別法として、非標的成分を除去した後、標的溶出を行うために誘引電極槽を新しいものと交換できるように、交換可能な誘引電極槽を持つ電気泳動装置を構築することができる。
この態様は、ハイブリダイゼーション法によって粗生体試料から特定の核酸を精製するのにとりわけよく適している。第一に、これらの方法は、所望の配列を持つ試料核酸の実質上全ての捕捉をもたらす。なぜなら全試験試料が捕捉ゾーンを通過しなければならないからであり、また、捕捉プローブの濃度は任意の高さにすることができ、それが捕捉の成功を保証するからである。
第二に、これらの方法は一段階で標的核酸の実質的精製をもたらす。なぜなら、帯電した試料夾雑物は電気泳動中に除去され、帯電していない夾雑物はマトリックス中に進入できないので除去されるからである。
第三に、極めて大きい試料を使用できる。核酸はポリマーマトリックス中と事実上同じ様式で自由な溶液状態で電気泳動を受ける。したがって大きい試料体積を使用できる。マトリックス層は高度に選択的なフィルターのように作用して、試料から所望の核酸のみを選択する。
第四に、本明細書に記載する方法を使用することで、極めて希薄な大量の試料を定量的に濃縮できる。
試料移動速度による変異の検出
この態様では、試料と固定化プローブが高親和力のゆっくりと解離する複合体を形成しない。そうではなくて試料とプローブは電気泳動中に一時的で比較的迅速に解離する会合を形成する。捕捉プローブはマトリックス全体に均一な濃度で配置される。試料核酸の電気泳動移動度は固定化プローブとの相補性の程度によって左右される。プローブに対して完全な相補性を持つ試料は、相補性の低い試料よりゆっくりとマトリックス中を移動する。標的試料と捕捉プローブの間の相互作用が一時的であることを保証するためにマトリックス中に変性剤を使用してもよい。
試料は、ハイブリダイゼーション分析に先立って、標識ヌクレオチド三リン酸を使ったＰＣＲ増幅により、簡便に調製、標識できる。
この態様は増幅可能な遺伝子断片内の一連の特定の変異部位を型別するのにとりわけ有用である。多くの物理的に分離された垂直のレーンを持つマトリックスが使用される。各レーンは異なる固定化プローブを含有する。各プローブは試験しようとする特定遺伝子領域の野生型配列を含有する。具体的一態様として、そのマトリックスで試験しようとする遺伝子の全領域を単一の断片として増幅できる。
例えば、この分析を実施するには、標識された一本鎖核酸産物を試験しようとする試料から、フルオレセイン標識ヌクレオチドを使った非対称ＰＣＲ法で調製する。そのフルオレセイン産物を非変異（野生型または正常）配列を持つローダミン標識内部標準ＰＣＲ産物と混合し、ゲルの上部に均等に充填する。電気泳動後、ゲルのカラーイメージを記録し、試料と内部標準を同定する（試験試料：黄緑色，内部標準：赤色）。所定のレーンで試験試料が内部標準より速く移動する場合、その試験試料は、その固定化プローブがカバーする配列内のどこかの位置での変異体である。大きな遺伝子の場合、すべての易変配列位置をカバーするには、一組になった数枚のゲルが必要だろう。（図３を参照のこと）。
検出方法
特異的結合反応の検出、例えば捕捉プローブに結合した固定化標的分子の検出は、多くの異なる方法で達成できる。例えば、結合反応に先立って試験分子を検出可能に標識することができる。直接標的標識に適した標識は、強い吸収性（例えば明るく色付く）、放射活性、蛍光、リン光、化学発光または触媒作用を持ちうる。修飾ヌクレオチドを用いた核酸試料の直接標的標識は、当業者に周知の数多くの酵素法によって達成できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に概説されている）。
別法として、それ自体が標識されているか検出可能なシグナルを生成できる第二の特異的結合体によって認識され得るリガンドを用いて、標的分子を間接的にも標識できる。そのような間接系の一例は、ビオチニル化ヌクレオチドを使った標識である。この系では、標準的な核酸標識技術とビオチニル化ヌクレオチドを使用して、試料を酵素的に標識する。得られたビオチン修飾核酸は、ストレプトアビジンまたはアビジンタンパク質分子のビオチン特異的結合によって検出できる。ストレプトアビジンまたはアビジン分子は、フルオレセインなどの蛍光標識や、適当な基質で化学発光シグナルまたは比色法的シグナルを生成するために使用できるアルカリ性ホスファターゼやセイヨウワサビペルオキシダーゼなどのリポーター酵素に結合できる（概観するには、ＫｅｌｌｅｒとＭａｎａｋ，「ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ」第二版，Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ロンドン，１９９３；Ｐｅｒｓｈｉｎｇら編「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」アメリカ微生物学会，ワシントンＤ．Ｃ．，１９９３を参照のこと）。もう一つの有用な検出系はアルカリフォスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を使用するジゴキシゲニン系であり、これは核酸に組み込まれているジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを認識する。（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．編，ｖｏｌ．１，§§３．１８．１〜３．１９．６，１９９５）。
検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、間接的標的標識としても使用できる。例えば電気泳動に先立って、検出可能に標識されたプローブ（以下、「サンドイッチ」プローブと呼ぶ）とのハイブリダイゼーションにより、標的核酸を間接的に標識することができる。このサンドイッチプローブは、捕捉プローブによって認識される領域とは重ならない標的の領域とハイブリダイズするように設計される。サンドイッチプローブは、電気泳動中に標的と会合したままであるように設計され、捕捉プローブには直接的には結合できない。
サンドイッチプローブは電気泳動捕捉後に標的分子を標識するためにも使用できる。この標識法では、非標識標的を電気泳動し、まず捕捉プローブにハイブリダイズさせる。次にサンドイッチプローブをその捕捉層を通して電気泳動する。捕捉された標識はここでは、事実上、サンドイッチプローブに対して新しい「捕捉」プローブとして作用する。捕捉された標的サンドイッチプローブ複合体は、サンドイッチプローブ標識を介して検出できるようになる。
ブロッティング技術を標的に結合した捕捉プローブの検出に適合させることもできる。例えば検出表面を、結合した試料成分を持つ分離媒体に近接させ、次に試料成分はその検出表面に移動し、任意に例えば溶媒または試薬交換などの化学的手段により補助し、移行した試料成分を例えば挿入した色素の光学的検出などの既知手段によって、またはハイブリダイズした放射活性種からの放射活性の検出によって、または他の既知手段によって検出する。
捕捉プローブに結合した試料成分の存在を検出するには、種々の光学的技術を使用できる。例えば捕捉プローブを直線配列に配置した場合、各シグナルの位置と強度は検出可能なシグナルの配列に沿って単一の検出器を機械的または光学的に走査することによって測定できる。別法として、検出可能なシグナルの直線配列は直線配列検出器によって、例えば配列検出器を検出可能なシグナルの配列に近接させること、またはシグナル配列の全部または一部を配列検出器に光学的に撮像することなどによって、検出できる。
検出可能なシグナルを持つ捕捉プローブが二次元配列として配置される場合、多くの検出法を使用できる。各点でのシグナルを測定するには、機械的または光学的走査または任意の組み合わせにより、単一の検出器を使用できる。別法として、並置または光学的撮像によって一組のシグナルを検出するには直線的光学検出配列を使用でき、複数組のそのようなシグナルはシグナル配列または検出器を機械的または光学的に走査することによって検出できる。別法として、捕捉プローブの二次元配列は、その全体または一部を二次元光学領域検出器により、固定化された捕捉プローブからの光学的シグナルの配列に近接させることによって、またはその光学的撮像によって、任意に検出してもよい。
捕捉プローブが三次元配列として配置される場合、個々のシグナルの検出は上述の方法により、任意に、配列の１以上の小区分をまず物理的に採取するという補助を行って、検出できる。別法として、共焦点顕微鏡技術などの光学的方法を使用してもよく、ここでは１または多数の検出可能なシグナルを他からの干渉を最小にして撮像および検出し、次に光学的調節後に他のシグナルを検出する。
マトリックスの形式とマトリックスの作製法
マトリックスは様々な形で形成させうる。例えば線状ゲルは溝や管などの線状支持体内での形成、この場合、ゲルはその支持体内での重合によって形成される、を含む技術によって、あるいは、他方、分割やチャンネル内での形成を含む、二次元ゲルを多数のストリップに細分することによって形成させることができる。溝、ストリップまたはチャンネル形式では、重合したゲル内に１以上の捕捉プローブを与えるためにゲル重合前またはゲル重合中に、多量の１以上の共重合性捕捉プローブをゲル材料に、任意に例えば定位的滴下技術により、空間的に規定された位置に添加できる。管形式では、一連のゲルモノマーおよびゲルモノマーと重合性捕捉プローブの混合物を、空間的に区別された一組の成分と濃度を与えるように、逐次、管に導入し、次いで、それをインサイチュで重合させて各成分の空間的関係を保つことができる。重合によって誘発される収縮中にゲルの完全性を保つために、ゲルの収縮中に横方向に収縮する弾性材料で管壁を作ることができる。別法として、収縮を補うように他方の端に新たな液体材料を添加しながら、管の一端から漸進的な重合を誘発してもよい。そのような漸進的重合は、重合触媒剤の拡散を含む手段によって、または、例えば放射線源の移動または放射線源への漸進的ばく露等、管の一端から他端への重合誘発性電磁気または他の放射線の漸進的適用によって誘導しうる。別法として、直線型ゲルは、二次元ゲルから直線状の切片を採取することにより、または後述のように作製される三次元ゲルから直線状の芯を採取することによって作製しうる。
二次元ゲルは、支持体の表面での形成または２つの支持体表面間での形成を含む技術によって形成させうる。ゲルモノマーの層を利用し、重合前または重合中に多量の共重合性捕捉プローブを、任意に、空間的に意味のある様式でその層に添加し、そのゲルにおけるそれらの空間的位置を保たれるように、それらをインサイチュで重合する。多量の重合性捕捉プローブの添加は、位置的にプログラム可能な滴下技術を含む既知の手段によって達成できる。重合中のゲル収縮は、支持体表面間の間隙の収縮を許し、補填のために側面から添加されるさらなる材料で横方向の収縮を許すなどといった手段によって調節できる。二次元ゲルは、ゲル形成の前、途中または後に仕切りを使用することによって、またはチャンネル中での形成によって、もしくは形成後により細い切片にスライスすることによって、多数のストリップに細分できる。
三次元ゲルは多くの技術によって形成させうる。それぞれが任意に局在化された捕捉プローブを含有してよい多数の線状ストリップまたは二次元層を上述のように反復して構築しうる。各ストリップまたは層は三次元の体積が生じるように下層の上に重合される。別法として、任意にその場に局在化された捕捉プローブを有してよい、多数の二次元ゲルを上述のように形成させ、三次元構造を与えるようにそれらを組み合わせることができる。
製造装置
本明細書に記載するマトリックスの作製には様々な装置を使用できる。例えばある装置は漸進的充填／収縮装置のアス（ｕｓ）により中心部にマトリックスを作製したり、または固体からマトリックスを抜き取ることができる。マトリックスは、固体表面で、プレートの間に、または物理的チャンネルを作るために成形プレートを使うことによって、形成させることができる。
本発明を以下の実施例によってさらに例証するが、決してこれら実施例を限定と解釈してはならない。
実施例１：一次元電気泳動ハイブリダイゼーション
ゲルを三区画に分けて重合した。最下層は０．５×ＴＢＥ（４５ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に２０％のアクリルアミド（重量比２９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド）を含有した。下部ゲルは厚さ０．１５ｍｍ、高さ約５ｃｍ、幅８ｃｍだった。いずれの場合も、重合はゲル溶液１ミリリットルにつき２μｌのＴＥＭＥＤと７μｌの１０％（重量／体積、水中）過硫酸アンモニウムを添加することによって達成した。最下層が重合した後、高さ０．５ｃｍ、幅２ｃｍ、厚さ０．１５ｍｍの３つの捕捉層を、２０、１０または４％アクリルアミド（すべて２０：１のモノマー：ビス）を使って、１０μＭの一本鎖合成オリゴヌクレオチド捕捉プローブ（５’−ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ａｃｇ  ｃａｇ  ｃｇａ  ｃｇａ  ｇｃａ  ｃｇａ  ｇａｇ−３’）（配列番号：１）および０．５×ＴＢＥ緩衝液の存在下に重合させた。捕捉プローブの５’−リン酸末端をＮ−（６−アミノヘキシル）メタクリルアミド基で共有結合的に修飾した。そのヘキシルメタクリルアミド基は、ヘキシルメタクリアミドホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、バージニア州スターリング）を使って自動ＤＮＡ合成中に付加された。この結合法を用いると、プローブは、５’末端メタクリルアミド基が存在するので、捕捉層の重合中にゲルマトリックスと共重合する。捕捉層の側面の境界は、厚さ０．１５ｃｍの薄いスペーサーをゲルプレートサンドイッチの上部からそれらが下部の２０％ゲルの上表面に接触するまで挿入することによって形成させた。捕捉層の重合後、ゲルの最上層を１０％アクリルアミド、０．５×ＴＢＥを使って注ぎ、試料ウェルを形成させるためにコームを挿入した。
電気泳動ハイブリダイゼーションは、相補的フルオレセイン標識一本鎖オリゴヌクレオチド（５’−フルオレセイン−ｃｔ  ｃｔｃ  ｇｔｇ  ｃｔｃ  ｇｔｃ  ｇｃｔ  ｇｃｇ  ｔ−３’）（配列番号：２）の２５および１００ピコモル試料（図４参照のこと）を充填して行った。各捕捉層を通して電気泳動した（図３のゲルの上部にある「相補的？」の表記、「Ｃ」レーンを参照のこと）。対照として、非相補的フルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（５’−フルオレセイン−ａｔ  ｔａｃ  ｇｔｔ  ｇａｔ  ａｔｔ  ｇｃｔ  ｇａｔ  ｔａ−３）（配列番号：３）の１００ピコモル試料も各捕捉ゾーンを通して電気泳動した。電気泳動は室温にて７Ｖ／ｃｍで２時間行い、その後、ゲルをＵＶ照明下で写真撮影した。
図３に示す結果は、相補的試料（「Ｃ」レーン）が捕捉層に完全に固定化され、一方、同じ長さの非相補的ＤＮＡ（「Ｎ」レーン）は捕捉層に保持されなかったことを示している。これは、相補的試料と捕捉プローブの間の相補的塩基対形成が捕捉層におけるフルオレセイン標識相補試料の固定化の原因であることを示唆している。
実施例２：固定化核酸プローブ含有多糖類ベース電気泳動媒体の塩化シアヌル製法
プロトコル１：活性化担体アプローチ
下記実施例は、ビアジオーニ（Ｂｉａｇｉｏｎｉ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第８９巻、６１６〜６１９頁、１９７８）の担体活性化法とスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびレンホッフ（Ｌｅｎｈｏｆｆ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第６１巻、３９２〜４１５頁）の担体活性化法とを用いる。セルロース支持体の使用が開発されたが、前記方法は、いかなる水酸基含有不溶性支持体に対しても一般的に適用可能である。本方法のための支持体の選択肢としては、スターチ、アガロース、デキストランおよびセルロースが挙げられる。
電気泳動用のほとんどのアガロース（例えば、Ｓｅａ  ＰｌａｑｕｅまたはＳｅａ  Ｋｅｍ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）とスターチ（カタログ番号Ｓ５６５１およびＳ４５０１、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）標品とが、水性溶媒および有機溶媒に不溶性な粉末として供給される。前記粉末を、ブフナーロト上で蒸留水により、よく洗浄する。洗浄された粉末を、１５分間室温で３Ｍ  水酸化ナトリウムに懸濁し、その後、溶液を濾過により除去する。膨潤アルカリ性粉末を、攪拌しながら、ジオキサンとキシレンとの１：１（体積／体積）混合物に溶解させた５％塩化シアヌル溶液に添加する。担体１ｇ（乾燥重量）あたり２０ミリリットルの５％塩化シアヌル溶液を用いる。室温で３０分間攪拌したのち、前記担体を下記溶媒：ジオキサン、酢酸/ジオキサン/水（１：２：１、ｗ／ｗ／ｗ）、およびアセトンのそれぞれでよく洗浄する。前記担体を真空下に乾燥し、乾燥保存する。所望の１または複数のプローブを含む０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液pH8.3に前記活性化担体を再懸濁することにより、５’または３’一級アミン末端を含むオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。好ましくは、前記プローブ濃度は、１グラムの乾燥活性化担体あたり５００ナノモルを超えるアミン末端オリゴヌクレオチドである。よく攪拌または振盪しながら、室温で12時間付着反応を行なう。付着させた後、エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を終濃度１Ｍまで添加し、担体をさらに１２時間振盪した。修飾担体を緩衝液でよく洗浄し、懸濁液として、好ましくは、電気泳動に用いられる緩衝液に保存する。
アガロースゲルおよびスターチゲルにおいて捕捉層をキャストするため、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ、１９８９）などの標準の参考文献に記載の非修飾担体と同様の方法を用いて、プローブ−修飾粉末化担体をゲル中にキャストすることができる。すなわち、プローブ−修飾粉末化担体をゲル緩衝液に懸濁し、加熱により融解し、ゲル型に注ぎ、冷却させる。多くの場合、前記ゲル型は、非誘導体化担体から調製されたゲル中にスロットがあるか、あるいは穴を切り込むであろう。本方法は、捕捉層との分離境界を提供し、本実験で用いられるべき修飾ゲルの体積を減少させる。
プロトコル２：活性化プローブアプローチ
本プロトコルは、粉末化担体と、ヒドロキシエチルセルロースなどの可溶性多糖類ポリマーとに有益である。原則として、本アプローチを用いることにより、水酸基または一級アミン基を有する、可溶性または不溶性のいかなる分離媒体をも修飾しうる。可溶性ポリマーは、クエサダ（Ｑｕｅｓａｄａ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、８２〜９３頁、１９９７）に記載のキャピラリー電気泳動アプリケーション用の置換可能な分離媒体としてますます重要になっている。
プローブ活性化プロトコルは、バン  ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１９巻、３３４５〜３３５０頁、１９９１）から改良される。反応物は、２００μｍの５’−または３’−アミノ−末端プローブ、０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）（ＳＢＢ）、１ｍＭ  塩化シアヌル（Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％  アセトニトリル（ｖ／ｖ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む。室温で１〜２時間、よく振盪しながら反応を行なう。未反応の塩化シアヌルを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ３（３０００ダルトンカットオフ、Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、遠心限外濾過と０．１Ｍ  ＳＢＢへの再懸濁との３サイクルにより除去する。活性化プローブは、４℃で保存され、２か月までは検出可能な活性の損失なく用いられうる。
粉末化媒体を蒸留水でよく洗浄し、ついで０．１Ｍ  ＳＢＢ  ｐＨ８．３で洗浄することにより、スターチおよびアガロースなどの不溶性（粉末化）媒体への付着を行なう。前記媒体を０．１Ｍ  ＳＢＢに懸濁し、塩化シアヌル−活性化プローブとともに室温で一晩振盪させる。好ましくは、活性化プローブの濃度は、ポリマー１ｇあたり５００ナノモルを超える。反応後、修飾媒体を０．１Ｍ  ＳＢＢでよく洗浄し、ついで電気泳動緩衝液で洗浄した。前述のプロトコルに記載のように、ゲル捕捉層をキャストする。
修飾セルロースなどの可溶性ポリマー媒体を水に溶解し、０．１Ｍ  ＳＢＢに対して透析する。透析後、前記ポリマーを活性化プローブと混合し、室温で一晩、よく振盪させる。好ましくは、活性化プローブの量はポリマー1gあたり500ナノモルを超える。付着反応の後、未反応プローブを透析または遠心限外濾過（ＣｅｎｔｒｉｃｏｎまたはＭｉｃｒｏｃｏｎ  ５０フィルター、５０，０００ダルトン分子量を超える媒体用、Ａｍｉｃｏｎ）により除去する。一方、未結合のプローブを試料の負荷前に媒体をプレ電気泳動することにより除去する。
実施例３：特定のタンパク質（ヒトトロンビン）の存在を決定するためのＤＮＡアプタマーゲル
本実施例は、特定のタンパク質、この場合、血液凝固カスケードに重要なプロテアーゼであるヒトトロンビンの存在について、試料を分析するための核酸アプタマーの使用を説明する。ゲルは、１）全ての層における全ゲル濃度が５％に下げられること［重量比２９：１のモノマー：ビスアシルアミド（ｂｉｓａｃｙｌａｍｉｄｅ）］、および２）ゲルが、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2中にキャストされ泳動されることを除き、実施例１に記載のように３セクションでキャストされる。捕捉層は、ブロック（Ｂｌｏｃｋ）ら、［Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４〜５６６（１９９２）］により同定された、下記:5’-ヘキシルアクリルアミド（Spacer9）6-GGGTTGGTGTGGTTGG-3’（配列番号：４）のように、ポリエチレングリコールスペーサー基（「Spacer9、Spacer Phosphoramidite 9、カタログ１０−１９０９−９０、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を介したヘキシルアクリルアミド基（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を付着したトロンビン−結合ＤＮＡアプタマーを含む。
前記アプタマーを１０μＭ〜１００μＭの濃度（鎖の濃度）で捕捉層に固定化する。緩衝液区分間の緩衝液再循環を伴う冷却された装置内で電気泳動を行なう。ヒト血清の未変性試料をゲルに負荷し、ゲル温度を25℃〜30℃の間に保ちながら、２〜５Ｖ／ｃｍで陽電極に対して電気泳動する。電気泳動は、全ての非トロンビンタンパク質が捕捉層を通過するに十分な長さで行なわれる。電気泳動後（Ｔ＼Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）、呈色試薬（クマシーブルーまたは銀染色、製品１６１−０４９９および１６１−０４００、それぞれＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）または蛍光試薬（ＳＹＰＲＯ  オレンジダイ、製品Ｓ−６６５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎ、ＯＲ）を用いてタンパク質の検出のために染色を行なう。捕捉層におけるタンパク質の存在は、試料中のトロンビンの存在を示す。
実施例４：遺伝子調節配列に結合しうるタンパク質をアッセイするための捕捉ゲル
本サンプルは、遺伝子調節配列、この場合、ラクトースオペレーター配列［ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）およびマキサム（Ｍａｘａｍ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７０：３５８１〜３５８４（１９７３）］に特異的に結合するであろうタンパク質の存在について試料を解析するための二本鎖ＤＮＡ捕捉プローブの使用を説明する。ゲルは、１）全ての層における全ゲル濃度が５％に下げられること（重量分配（ｒａｔｉｏｎ）２９：１のモノマー：ビスアクリルアミド）、および２）ゲルが、４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中でキャストされ泳動されることを除き、実施例１に記載のように３セクションでキャストされる。
捕捉層は、下記２つの合成一本鎖オリゴヌクレオチド：
5’-ヘキシルアクリルアミド-（Spacer9）6-
0004276301.tif 000002
ここで、下線を付された配列は、ｌａｃオペレーター配列［ギルバートおよびマキサム、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、７０：３５８１〜３５８４（１９７３）］を示し、ヘキシルアクリルアミド基は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ）由来であり、「Spacer9」はポリエチレングリコールスペーサー基（Spacer PHosphoramidite 9、カタログ１０−１９０９−９０、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ）を示す基をハイブリダイズすることにより形成された二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。二本鎖捕捉プローブを調製するために、前記２つのオリゴヌクレオチドを等モル比で混合し、該混合物を（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ中）９５℃まで加熱して３時間にわたって２５℃まで冷却することによりハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、準備用未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ハイブリダイゼーション混合物から二本鎖捕捉プローブを回収する。
二本鎖捕捉プローブは、１０〜１００μＭの濃度（二本鎖の濃度）で捕捉層に存在する。電気泳動は、緩衝液区分間の緩衝液循環を伴う冷却された装置中で行なう。できる限り、ｌａｃリプレッサータンパク質含有未変性試料をゲルに負荷し、ゲル温度を２５℃〜３０℃の間に保ちながら、２〜５Ｖ／ｃｍで陰電極に対して電気泳動する。電気泳動は、捕捉されることが望まれないものを除く全てのタンパク質が捕捉層を通過するに十分な長さで行なう。電気泳動後、呈色試薬（クマシーブルーまたは銀染色、製品１６１−０４９９および１６１−０４００、それぞれ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）または蛍光試薬（ＳＹＰＲＯ  オレンジ  ダイ、製品Ｓ−６６５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎ、ＯＲ）を用いてタンパク質の検出のためにゲルを染色する。捕捉層におけるタンパク質の存在は、試料中のｌａｃオペレーター結合タンパク質の存在を示す。
結合反応の特異性は、捕捉層がｌａｃオペレーターとは配列が関連しない捕捉プローブを含むものである他のゲルレーンで２連の試料を泳動することにより決定されうる。試料は、ｌａｃオペレータープローブへの結合を示すが、関連しないプローブへの結合を示さない場合、そのとき、結合活性は、ｌａｃオペレータープローブに特異的である。
実施例５：キャピラリー電気泳動実験における使用に好適な捕捉プローブ含有可溶性ポリマーマトリックスの調製
全ての手順を室温（約２２℃）で行なう。１０μＭ  5’−ヘキシルアクリルアミド合成オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、６％（重量／体積）モノマーアクリルアミド、および０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸  ｐＨ８．３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む3ミリリットル溶液を調製する。実施例１に記載されたヘキシルアクリルアミド誘導体化捕捉プローブを用いる（５’−ヘキシルアクリルアミド-ttt ttt ttt acg cag cga cga gca cga gag−３’）（配列番号：１）。窒素ガスを溶液に30分間通してバブリングさせ、溶解した酸素を除去する。窒素ガス大気中、プラスチックグローブバッグを用いて、脱酸素化およびつづく重合を行なう。３〜１０μlの新しく調製した１０％過硫酸アンモニウムと１〜３μｌのＴＥＭＥＤとを添加することにより重合を開始する。混合物を触媒添加および重合中、マグネチックスターラーで、ゆっくりと攪拌する。触媒添加および重合をさらに１時間続けた３０分後、溶液は、顕著に粘性を帯びるようになるであろう。ついで、ポリマー溶液を透析バッグ（分子量カットオフ：５０，０００ダルトン）に移し、水平型アガロースゲル電気泳動装置で０．５×ＴＢＥ緩衝液中、１Ｖ／ｃｍで１２時間電気泳動し、アクリルアミドポリマー中に共重合しなかった捕捉プローブを除く。
均等物
当業者は、本明細書に記載された発明の具体的態様の多くの均等物を認識するであろうし、あるいは単なる日常の実験を用いて確かめることができるであろう。かかる均等物は、下記請求項により包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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