(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）に比較してアミノ酸配列が変更されており酵素活性を示さないが、免疫原性量のＳＣＰまたはそれの断片もしくは変異体を、生理学的に許容される非毒性の賦形剤と共に含んで成るワクチンであって、前記量がβ溶血連鎖球菌属に対して感受性哺乳類を免疫するのに有効な量であるワクチン。
【請求項２】
有効量の免疫アジュバントを更に含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記哺乳類がヒト、イヌ、ウシ、ブタおよびウマから成る群より選ばれる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記哺乳類がヒトである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記β溶血連鎖球菌属がＡ群連鎖球菌属、Ｂ群連鎖球菌属、Ｃ群連鎖球菌属およびＧ群連鎖球菌属から成る群より選ばれる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記β溶血連鎖球菌属がＡ群連鎖球菌属である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ペプチドに接合または連結された連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼまたはそれの断片もしくは変異体を含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
多糖に接合または連結された連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼまたはそれの断片もしくは変異体を含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
今までに同定されているβ溶血連鎖球菌には数種類の菌種が存在する。Ａ群連鎖球菌とも呼ばれるストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）は、普通のヒト病原菌である。主として小児の病気で、それはヒトに咽頭炎、膿痂疹および敗血症を含む種々の感染症を引き起こす。感染後、リウマチ熱や急性糸球体腎炎のような自己免疫合併症をヒトに引き起こし得る。この病原体はしょうこう熱、壊死性筋膜炎および中毒性ショックのような重度の急性疾患も引き起こす。
「連鎖球菌性咽頭炎」ともよばれるＡ群連鎖球菌により引き起こされる咽喉炎は、季節によって、一般病院における全来院者の少なくとも16％を占める。Hope-Simpson, E.,“Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975,”J.Hyg. Camb., 87:109-129（1981）。この種は最近の北米と別の４大陸における壊死性筋膜炎を伴う中毒性ショックの再流行の原因でもある。Stevens, D.L.,“Invasive group A streptococcus infections,”Clin. Infect. Dis., 14:2-13（1992）。Ｃ群とＧ群の連鎖球菌も連鎖球菌性咽頭炎の発生および時には中毒性ショックの発生に関係あるとされる。Hope-Simpson, E.,“Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975,”J. Hyg. Camb., 87:109-129（1981）。
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）としても知られるＢ群連鎖球菌は、新生児敗血症および髄膜炎の原因である。T.R. Marin他、“The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats”, J. Infect Dis., 165:306-314（1992）。しばしば新生児1000人あたり成人女性0.1〜0.5人の膣粘膜微生物叢のメンバーは出産中の感染後に重い病気を発症する。Ｂ群連鎖球菌感染からの高死亡率にもかかわらず、発病のメカニズムはあまり解明されていない。Martin,T.R.他、“The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of Group B streptococci from the lung of infant and adult rats”, J. Infect Dis., 165:306-314（1992）。
連鎖球菌感染は現在のところ抗体療法により治療されている。しかしながら、治療した者の25〜30％が病気を再発しそして／または粘膜分泌液中に微生物を放出する。今のところ連鎖球菌感染を予防する手段は全く利用できない。歴史的に、連鎖球菌ワクチン開発は細菌の細胞表面Ｍタンパク質に集中していた。Bessen, D.他，“Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci,”Infect. Immun., 56:2666-2672（1988）; Bronze, M.S.他，“Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice,”Journal of Immunology, 141:2767-2770（1988）。
２つの主な問題がＭタンパク質ワクチンの使用、販売、そしておそらくＦＤＡの許可を制限するだろう。第一に、Ｓ．ピオゲネスには80以上の異なるＭ血清型が存在し、新規血清型も次々と生まれてきている。Fischetti, V.A.,“Streptococcal M protein : molecular design and biological behavior,”Clin. Microbiol.Rev., 2:285-314（1989）。よって、ある血清型特異的Ｍタンパク質による接種は多分別のＭ血清型に対する防御に効果的でないだろう。第二の問題は、Ｍタンパク質ワクチンの安全性に関する。Ｍタンパク質の幾つかの領域はヒト組織、特に心臓組織と免疫交差反応する抗原エピトープを含む。Ｍタンパク質のＮ末端は高度に配列が可変的であり、抗原特異性である。この可変配列を代表する80種以上のペプチドをワクチン中に含めることが、Ａ群連鎖球菌感染に対する広域防御を獲得するために必要であろう。新たな変異型Ｍタンパク質がまだ発生し続けるだろうから、連鎖球菌疾患の進行中サーベイランスおよびワクチン組成の変化を必要とするだろう。対照的に、Ｍタンパク質のカルボキシル末端は配列が保存される。しかしながら、Ｍタンパク質のこの領域はヒト心臓組織と免疫交差反応性であるアミノ酸配列を含む。Ｍタンパク質のこの性質はリウマチ熱に伴う心臓弁の損傷の原因であると考えられる。P. Fenderson他、“Tropomyosin sharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins,”J. Immunol. 142:2475-2481（1989）。初期試験では、1979年にＭタンパク質をワクチン接種した子供はリウマチ熱および関連の心臓弁障害の発生率が10倍高かった。Massell, B.F.他、“Rheumatic fever following streptococcal vaccination,”JAMA，207:1115-1119（1969）。
ワクチン開発検討中の別のタンパク質は、発赤毒素である連鎖球菌発熱外毒素Ａおよび連鎖球菌発熱外毒素Ｂである。Lee, P.K.他、“Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxines in an amimal model of shock syndrome-like illness,”J. Clin. Microb., 27:1890-1892（1989）。それらのタンパク質に対する免疫は中毒性ショックの致死的症状を防ぐことができるが、連鎖球菌による定着を防止せず、おそらく連鎖球菌性咽頭炎の発生も低減しないだろう。中毒性ショック感染の発生率は人口100,000人あたり10〜20例であると見積もられており、従って、総人口を免疫するためのそれらのタンパク質の使用は、実用的でないし経済的に適当でもない。
よって、連鎖球菌感染を予防または改善するための有効な手段が引き続き求められている。より具体的には、連鎖球菌による宿主組織への定着（コロニー形成）を予防または改善し、それによって連鎖球菌性咽頭炎および膿痂疹の発生を少なくするためのワクチンとして有用な組成物を開発する必要性がある。リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、中毒性ショックおよび壊死性筋膜炎といった続発症の除去は、急性感染症の発生と生物体の伝染を減少させることの直接結果である。全てのβ溶血連鎖球菌種、すなわちＡ，Ｂ，ＣおよびＧ群により引き起こされる感染を予防または改善するためのワクチンに有用である組成物を開発する必要性もある。
発明の要約
本発明は、感受性の哺乳類（ヒトを含む）および家畜類（例えばイヌ、ウシ、ブタおよびウマ）においてβ溶血連鎖球菌属（Streptococcus）の発生を予防または改善するのに有効なワクチンとワクチン接種方法を提供する。該ワクチンは、生理学的に許容される非毒性の賦形剤と共に、免疫原性量の連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）、またはそれの１もしくは複数の免疫原性断片もしくは変異体を含有する。該ワクチンは、ＳＣＰ酵素活性を持たない断片または変異体ＳＣＰ（ｄＳＣＰ）を含んでもよい。それは免疫アジュバントを含んでもよい。該ワクチンはＡ群連鎖球菌属、Ｂ群連鎖球菌属、Ｃ群連鎖球菌属またはＧ群連鎖球菌属の定着を予防するために使うことができる。該ワクチンは、免疫原性ペプチドにもしくは免疫原性多糖に接合または連結された、免疫原性組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼを含んで成ることができる。
連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼワクチンは皮下または筋内注射により投与することができる。あるいは、該ワクチンは経口摂取または鼻内接種により投与することができる。
下記の実施例に記載するように、ＳＣＰ遺伝子（scpA49）をＥ．コリ発現ベクター（pGEX-4T-1）中にクローニングした。Ｅ．コリクローンからトランスフェラーゼ−ＳＣＰ融合タンパク質を発現させ、それを精製した。精製した組換えＳＣＰ（ｄＳＣＰ）をマウスの免疫処置に使用した。ワクチン接種したマウスと対照マウスグループを野性型連鎖球菌属でチャレンジした。組換えＳＣＰワクチンを投与したマウスは、感染後すぐに連鎖球菌から免れたが、一方対照グループの30〜50％は何日間も培養陽性であった。従って、組換えＳＣＰはβ溶血連鎖球菌属に対するワクチンとして効果的であった。
また、scpA49遺伝子の2908bp断片であるΔSCPA49を発現ベクターpGEX-4T-1に連結せしめ、Ｅ．コリ中で発現させた。精製したタンパク質は、相同Ｍ49連鎖球菌血清型、並びに非相同血清型Ｍ１，Ｍ６およびＭ12に関連したペプチダーゼ活性を試験管内で中和することができる高力価のウサギ抗体を誘導した。ΔSCPA49免疫原でのマウスの鼻内免疫処置は、相当なレベルの唾液IgＡおよび血清IgＧ特異抗体を刺激し、野性型Ｍ１，Ｍ２，Ｍ６，Ｍ11およびＭ49連鎖球菌の定着力を低下させた。かくしてＳＣＰタンパク質は連鎖球菌の数種類の血清型に対するワクチンとして効果的であった。
【図面の簡単な説明】
図１。β溶血連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼの構造。Ｄはアスパラギン酸残基；Ｈはヒスチジン残基；Ｓはセリン残基；Ｌはロイシン残基；Ｐはプロリン残基；Ｔはスレオニン残基；そしてＮはアスパラギン残基を表す。Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4は反復配列を表す。数字はペプチダーゼ中のアミノ酸残基位置を示す。
図２。Ａ群連鎖球菌株49、Ａ群連鎖球菌株12およびＢ群連鎖球菌（それぞれ配列番号１，２および３）からのＳＣＰのアミノ酸配列の整列。配列は指摘のアミノ酸位置を除いて同一である。三角形（▽）はシグナルペプチドの推定開裂位置を表す。酵素活性部位にあると推定されるアミノ酸は星印（＊）により表される。アミノ酸配列中の欠失はドットにより表され枠で囲まれている。
図３。ＳＣＰ挿入および欠失変異体の作製。黒い箱は欠失領域を表す。
図４。単色ＦＡＣＳ分析。ＰＭＮ上でのゲート操作により蛍光データを解析した。第二ゲートは、第一ゲートにより限定された高染色細胞を計数するために設定した。気嚢に１×106ＣＦＵを接種した。
図５。鼻内感染後の野性型およびＳＣＰＡ-の存続。
図６。ＳＰＣＡタンパク質でのCD-1マウスの鼻内免疫処置はＭ型49連鎖球菌による口腔定着を抑制する。
図７。鼻内感染後のマウスにおけるＡ群連鎖球菌のＳＣＰＡ-およびＭ-変異体の定着力の比較。２×１０7ＣＦＵのＭ６連鎖球菌を接種したBALB/cマウス（各実験グループにつき10匹）を比較する。ストレプトマイシンを含む血液寒天平板上で咽頭スワブを１日培養した。平板が１つのβ溶血コロニーを含んだ場合、マウスを陽性とみなした。χ2検定によりデータを統計分析した。
図８。ΔSCPA49ワクチンの作製および免疫処置プロトコール。
図９。精製ΔSCPA49タンパク質でのマウスの鼻内免疫処置後の血清IgＧおよび唾液IgＡ反応。SCPA49特異的IgＧの血清濃度と唾液濃度を間接ELISAにより測定した。各マウスからの血清はＰＢＳ中に１：2,560希釈し、そして唾液はＰＢＳ中に１：２希釈した。
図10。免疫処置および非免疫処置CD1雌マウスへの血清型Ｍ49連鎖球菌の定着力の比較。各実験グループは、2.0×108ＣＦＵで鼻内（i.n.）感染させた13匹のマウスを含んだ。χ2検定によりデータを統計分析した。*Ｐ＜0.05、**Ｐ＜0.01、***Ｐ＜0.001。
発明の詳細な説明
様々な細菌病原体による感染に対する重要な第一防御ラインは、感染部位における食作用性多形核白血球（ＰＭＮ）および単核細胞の蓄積である。それらの細胞の誘引は走化性刺激因子、例えば宿主因子または侵略生物により分泌される因子により媒介される。Ｃ５ａ化学誘引物質は哺乳類におけるこの炎症反応の刺激の中枢である。Ｃ５ａは補体の第５成分（Ｃ５）から開裂される74残基の糖ペプチドである。食細胞は直接的にＣ５ａの勾配に応答し、感染部位に蓄積する。Ｃ５ａは炎症過程中最も直接の食細胞誘引物質であるかもしれない。ＰＭＮが炎症病巣に浸潤するにつれて、それらは別のケモカイン、例えばＩＬ８を分泌し、それが更に炎症反応を増強する。
連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）は、Ｃ５ａが局所的に生産されると、病原性連鎖球菌の表面上に存在しそこでＣ５ａを分解するタンパク質酵素である。ＳＣＰは、Ｃ５ａ走化性因子をＰＭＮ結合部位のところ（Ｃ５ａのHis67−Lys68残基の間）で特異的に開裂せしめ、Ｃ５ａの最もＣ末端の７残基を遊離させる。ＰＭＮ結合部位のこの開裂は走化性シグナルを除去する。Cleary, P.他、“Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase,”Infect. Immun., 60:5219-5223（1992）; Wexler, D.E.他、“Mechanism of action of the group A streptococcal C5a inactivator,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8144-8148（1985）。
Ａ群連鎖球菌からのＳＣＰは、124,814ダルトンのＭrを有し、且つ多数のグラム陽性菌表面タンパク質に共通である細胞壁固定モチーフを有するサブチリシン様セリンプロテアーゼである。Ｃ５ａペプチダーゼの構造を図１に示す。ストレプトコッカス・ピオゲネスの連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列は既に発表されている。Chen, C. & Cleary, P.,“Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes,”J. Biol. Chem,, 265:3161-3167（1990）。サブチリシンとは異なり、ＳＣＰは非常に狭い基質特異性を有する。この狭い特異性は、両者の触媒領域間に顕著な類似性があることから見ると驚くべきことである。Cleary, P.他、“Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase,”Infect. Immun.60:5219-5223（1992）。結合ポケットの両側の残基のように、電荷移動に関係する残基は保存されているが、しかしＳＣＰの残りの残基はサブチリシンの残基とは無関連である。Ａ群連鎖球菌の40種以上の血清型がＳＣＰタンパク質を生産するかまたはその遺伝子を所有することがわかった。Cleary, P.他、“Streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci,”Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease p.179-180（S. KotamiおよびY. Shiokawa編；Reedbooks Ltd., Berkshire, England; 1984）; Podbielski, A.他、“The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structual vir regulon genes,”Infect. Immun,, 63:9-20（1995）。
Ｂ群連鎖球菌に関連するＣ５ａペプチダーゼ酵素も同定されている。Hill, H.R.他、“Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement,”J. Immunol. 141:3551-3556（1988）。scpBヌクレオチド配列の制限マッピングと比較は、scpBがscpAと97〜98％同じであることを示した。Ａ群連鎖球菌株49、Ａ群連鎖球菌株12およびＢ群連鎖球菌株からのＳＣＰのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１，２および３）の比較については図２を参照のこと。Ｂ群連鎖球菌の全血清型に相当する30株以上がscpB遺伝子を担持する。Cleary, P.他、“Similarity between the Group B and A streptococcal C5a Peptidase genes,”Infect. Immun,, 60:4239-4244（1992）; Suvorov A.N.他、“C5a peptidase gene from group B streptococci,”Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, p.230-232（G. Dunny, P. Cleary & L McKay編; American Society for Microbiology, Washington, D.C.（1991）。
Ｇ群およびＣ群連鎖球菌のヒト分離株もscpA様遺伝子を所有する。幾つかのＧ群株はそれらの表面上にＣ５ａ特異的プロテアーゼ活性を発現することが証明された。Cleary, P.P.他、“Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci,”Infect. Immun,, 59:2305-2310（1991）。従って、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌およびＧ群連鎖球菌の全血清型（＞80）がＳＣＰ酵素を生産する。
ＳＣＰは、感染部位への貧食白血球の流入を阻害することにより、連鎖球菌が潜在的感染部位（例えば鼻咽頭粘膜）に定着するのを助ける。これは宿主による連鎖球菌の初期クリアランスを妨げる。プロテアーゼ構造遺伝子中に明確に限定された変異を有する連鎖球菌株を使って、炎症、Ｃ５ａ白血球走化性および連鎖球菌ビルレンス（毒力）に対するＳＣＰの影響を調べた。標的プラスミド挿入によりおよび特定の内部欠失を含むscpAと野性型遺伝子との置換によりＳＣＰ変異体を作製した。該変異体はＣ５ａプロテアーゼ活性を欠き、Ｃ５ａに対するヒトまたはマウスＰＭＮの試験管内走化性応答を阻害しなかった。
マウス結合組織気嚢（air sac）モデルを使って、ＳＣＰが貧食細胞の流入および感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせることを確かめた。結合組織気嚢は、25ゲージ注射針を使って少量の空気とＰＢＳ（その中に連鎖球菌を含むかまたは含まない）をマウスの背中の皮下に注入することにより作製する。Boyle, M.D.P.他、“Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo,”Meth. Enzymol.162:101-115（1988）。実験の終わりに、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスから気嚢を切開し、気嚢を緩衝液中でホモジナイズした。気嚢モデルの利点は、気嚢が数日間膨張したままであり且つ刺激物質を注射しない限り炎症から免れることである。よって、注入した細菌およびそれから生じる炎症反応が短期感染期間に渡って局在化されたままである。
野性型ＳＣＰ+とＳＣＰ-連鎖球菌（すなわち、非機能的な変異型ＳＣＰを有するＡ群連鎖球菌）のクリアランスを比較しそして感染の初期の細胞浸潤物を分析するために気嚢モデルを変更した。血液寒天平板上での生存可能連鎖球菌について組織懸濁液を分析し、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）により細胞浸潤物を分析した。ＦＡＣＳ分析法では、懸濁液中の個々の細胞を単一特異性蛍光抗体で標識する。標識細胞のアリコートをFAC-Scan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器（特有の蛍光に基づいて細胞を計数する）中に注入する。気嚢モデルを使った実験は、ＳＣＰ+連鎖球菌がＳＣＰ-連鎖球菌よりも一層毒性であることを示した。
ヒト血清および唾液中のＳＣＰに対するヒト抗体（IgＧとIgＡの両方）の生産を測定する実験を行った。O’Connor, SP他、“The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase,”J. Infect. Dis. 163:109-116（1991）。一般に、未感染の乳幼児からの血清および唾液はＳＣＰに対する抗体を欠いていた。対照的に、健康な成人からの血清試料と唾液試料の大部分が、測定可能なレベルの抗ＳＣＰ IgＧおよびＳＣＰ特異的分泌IgＡ（抗ＳＣＰ IgＡ）を有した。連鎖球菌性咽頭炎を有する患者からの急性および回復期の対合血清は、健康な固体からの血清には含まれなかった高レベルの抗ＳＣＰ IgＧを有した。高濃度の抗ＳＣＰ免疫グロブリンを含む血清はＳＣＰ活性を中和することができた。連鎖球菌性咽頭炎に最近かかった小児から得られた唾液試料の＞90％においてこの抗体が検出されたことは、小児が抗体応答を生じ得ることを証明した。
ヒト被検者が自然連鎖球菌感染に応答してＳＣＰに対するIgＧおよびIgＡを生産したとしても、抗ＳＣＰ免疫グロブリンが感染に対する何らかの防御を提供するかどうかは未知であった。更にＳＣＰタンパク質がβ溶血連鎖球菌の定着または感染に対するワクチンとして作用できるかどうかもわからなかった。まず第一に、鼻咽頭への定着に際するＳＣＰの役割を調べるために実験を行った。生存Ａ群連鎖球菌による鼻内感染の後、10日目まで毎日咽頭培養物を採取した。野性型連鎖球菌および同系ＳＣＰ欠損変異型連鎖球菌を、この10日間に渡り咽頭に存続する能力について比較した。予想通り、ＳＣＰ欠損変異型連鎖球菌の方がより迅速に鼻咽頭から浄化された。
同じ鼻内マウスモデルを使って、定着を予防する免疫を誘導するＳＣＰの能力を試験した。組換えscpA49遺伝子の変異型（該遺伝子の５′末端から848-1033ヌクレオチドと３′末端から3941-4346ヌクレオチドを欠いている）を高発現ベクターpGEM-4T-1中にクローニングし、そこから発現させた。酵素活性欠損型ＳＣＰタンパク質（ｄＳＣＰ）をアフィニティークロマトグラフィーによりＥ．コリ組換え体から精製した。このタンパク質製剤を皮内にワクチン接種したウサギの血清は、試験管内でＳＣＰ活性を中和した。精製タンパク質（40μｇ）を５週間に渡りマウスに鼻内投与した。免疫処置マウスは１〜２日間で連鎖球菌を行かし、一方で非免疫処置マウスの咽頭培養物は10日間まで陽性のままであった。３種の異なるＳＣＰタンパク質製剤をワクチン接種した３組のマウスにおいてこの実験を繰り返した。
ある１つのＡ群血清型の連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼを使った動物の免疫処置が非相同の血清型による定着を予防するかどうかを調べるために別の実験を行った。scpA49遺伝子の2908bp断片を発現ベクター中でクローニングし、Ｅ．コリ中で発現させた。アフィニティー精製したΔSCPA49タンパク質は、マウスおよびウサギにおいて高度に免疫原性であることが証明された。精製ΔSCPA49免疫原は酵素活性を欠くけれども、それはＭ１，Ｍ６，Ｍ12およびＭ49連鎖球菌に関連したペプチダーゼ活性を試験管内で中和することができる高力価のウサギ抗体を誘導した。これにより、抗ペプチダーゼ抗体が交差中和抗体活性を有することが確証された。次いで、４組のマウスをΔSCPA49で免疫処置し、各々を別の血清型のＡ群連鎖球菌によりチャレンジした。欠失型SCPA49タンパク質によるマウスの免疫処置は、有意なレベルの特異的唾液IgＡ抗体と血清IgＧ抗体の生産を刺激し、そして野性型Ｍ１，Ｍ２，Ｍ６，Ｍ11およびＭ49連鎖球菌の定着力（コロニー形成活性）を減少させた。この実験は、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼワクチンによる免疫処置が鼻咽頭への定着を予防するのに有効であることを確証した。
従って、本発明は、β溶血連鎖球菌属の定着または感染に対して哺乳類を防御するために用いられるワクチンを提供する。本発明の一態様では、ワクチンに通例であるように、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、その変異体または断片は薬理学的に許容される賦形剤中で哺乳類に投与することができる。当業者の認識する通り、必ずしも完全なタンパク質を使用する必要はない。該ポリペプチドの特定部分（例えば、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼの一部分に相当する合成免疫原性ポリペプチド）を使用することができる。
同じく当業者の認識する通り、生来のＳＣＰアミノ酸配列と全く同一であるポリペプチドを使用する必要はない。免疫原性ポリペプチドのアミノ酸配列は生来のＳＣＰアミノ酸配列に本質的に一致すればよい。本明細書中で用いる「本質的に一致する」とは、生来のＳＣＰによって誘導される免疫応答と少なくとも実質的に等価である防御免疫応答を惹起するであろうポリペプチド配列を言う。組成物またはワクチンに対する免疫応答は、着目のポリペプチドまたはワクチンに対する宿主による細胞性免疫および／または抗体媒介免疫応答の発生である。通常、そのような応答は、着目の組成物またはワクチン中に含まれる１もしくは複数の抗原に特異的に向けられた、宿主産生抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞毒性Ｔ細胞から成る。本発明のワクチンは、免疫応答を増強することが知られている有効量の免疫アジュバントを含むこともできる。
あるいは、ＳＣＰを別のペプチドにもしくは多糖に接合または連結せしめることができる。例えば、当業界で周知である免疫原性タンパク質（「担体」としても知られる）を使うことができる。有用な免疫原性タンパク質としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒトγグロブリン、ニワトリ免疫グロブリンＧ、およびウシγグロブリンが挙げられる。有用な免疫原性多糖類としては、Ａ群連鎖球菌多糖、Ｂ群連鎖球菌からの多糖Ｃ、または肺炎連鎖球菌（Streptococci pneumoniae）の莢膜多糖が挙げられる。あるいは、ワクチンとして用いられる別の病原体の多糖をＳＣＰに接合または連結せしめることができる。
被検体を免疫処置するために、ＳＣＰまたはそれの免疫活性断片もしくは変異体は、非経口的に、通常は適当な賦形剤中での筋内もしくは皮下注射により、投与される。しかしながら、別の投与方法、例えば経口投与または鼻内投与も受け入れられる。ワクチン製剤は賦形剤中に有効量の活性成分を含有するだろう。その有効量は当業者により容易に決定され得る。活性成分は典型的には組成物の約１％〜約95％（w/w）の範囲であり、または適当ならばそれより多くまたは少なくてもよい。投与すべき量はワクチン接種を考えている動物またはヒトの年齢、体重および体調といった要因に依存する。投与すべき量は抗体を作る動物の免疫系の能力、および所望する防御の度合にも依存する。有効量は用量応答曲線を作成する通常の試験を通して当業者により容易に決定することができる。まず１または複数回でのＳＣＰまたはその断片を投与することにより被検者を免疫する。連鎖球菌に対する免疫の状態を維持するために必要とされるように複数回量投与してもよい。
鼻内用製剤は、鼻粘膜に刺激を引き起こしたり繊毛機能を有意に妨害したりしない賦形剤を含むことができる。希釈剤、例えば水、水性食塩溶液または既知の他の物質を本発明と共に使用できる。鼻用製剤は、非限定的にクロロブタノールや塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含んでもよい。鼻粘膜による目的タンパク質の吸収を高めるために界面活性剤が存在してもよい。
経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性の懸濁液剤、液剤、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形であってもよく、あるいは錠剤形に乾燥した製品としてまたは使用前に水もしくは他の適当な賦形剤で再構成される製品として提供してもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤（食用油を含んでもよい）または保存剤のような常用の賦形剤を含んでもよい。
ワクチンを調製するために、精製ＳＣＰ、それのサブユニットまたは変異体を単離し、凍結乾燥しそして安定化することができる。次いでＳＣＰペプチドを適当な濃度に調整し、所望により適当なワクチンアジュバントと組合せ、そして使用のために包装することができる。適当なアジュバントとしては、非限定的例として、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール；ポリアニオン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン、油状乳剤、ミョウバン、並びにそれらの混合物が挙げられる。別の考えられるアジュバントとしては、Ｅ．コリ熱不安定性毒素のまたはコレラ毒素のＢペプチドサブユニットが挙げられる。McGhee, J.R.他、“On vaccine development,”Sem. Hematol. 30:3-15（1993）。最終的に、免疫原性生成物はワクチン製剤用のリポソーム中に組み込まれるか、あるいはアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなタンパク質または他のポリマーに接合することができる。
定着に対する哺乳類のワクチン接種のためのＳＣＰ、それのサブユニットまたは変異体の使用は、他のワクチン候補を上回る利点を提供する。単一タンパク質の接種による定着または感染の予防は、連鎖球菌性咽頭炎および膿痂疹のごく一般的な問題の発生を減らすだけでなく、リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、中毒性ショックおよび壊死性筋膜炎といった続発症も排除するだろう。
下記の実施例は本発明を例証するためのものであって制限するためのものではない。
実施例１
scpA49およびscpA6の挿入および欠失変異体の作成
a)  菌株および培養条件。Ｓ．ピオゲネスCS101株は、血清型Ｍ49でＯＦ+の株である。CS159は、Ｍ遺伝子クラスターとscpAを通って広がる欠失を有する臨床分離株である。CS101株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体であるCS101Smは、ストレプトマイシン（200μg/ml）を含むトリプトース血液寒天培地上で定常期培養物から連鎖球菌を平板培養することにより選択された。CS101::pG+host5は、未知の位置であるがただしscpAとemm遺伝子クラスターの外側においてpG+host5が染色体中に組み込まれているCS101株である。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ER1821株（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから）を、自己不活化ベクタープラスミドpG+host5のための受容細胞として使用した。プラスミドpG+host5はAppligene, Inc., Pleasanton, CAから入手した。連鎖球菌は２％ネオペプトンもしくは１％酵母エキスが補足されたトッド−ヒューイットブロス中で、または５％ヒツジ血液を有するトリプトース寒天平板上で増殖させた。プラスミドpG+host5を含むＥ．コリER1821株は、エリスロマイシン（300μg/ml）を含むＬＢブロス中で増殖させた。プラスミドpG+host5を含む連鎖球菌は、１μg/mlのエリスロマイシン（Erm）含有１％酵母エキスが補足されたトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＹ）中で増殖させた。
ＳＣＰは、一般的にβ溶血連鎖球菌属からの連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼのことを言う。SCPA12, SCPA49およびSCPA6はそれぞれＡ群連鎖球菌Ｍ型12, 49および６株からの特異的ペプチダーゼである。scpAという語は、Ａ群連鎖球菌からのＳＣＰをコードする遺伝子のことを言う。scpA12, scpA6およびscpA49は、それぞれSCPA12, SCPA49およびSCPA６ペプチダーゼをコードする遺伝子である。SCPBおよびscpBは、Ｂ群連鎖球菌からのペプチダーゼと遺伝子である。SCPA49（配列番号１）、SCPA12（配列番号２）およびSCPB（配列番号３）のアミノ酸配列は図２に与えられる。
b)  scpA挿入変異体の作製。プラスミド挿入および遺伝子置換法を使って、明確に限定されたscpA挿入変異体を作製した。挿入標的である内部scpA49 BglII-BamHI断片を、熱感受性シャトルベクターpG+host5中に連結せしめてプラスミドpG::scpA1.2を作製し、それをＥ．コリER1821中に形質転換せしめた（図３）。pG+host5ベクターは、39℃で活性であるＥ．コリ複製開始点、温度感受性グラム陽性（Gram+）複製開始点（連鎖球菌中で30℃で活性であるが39℃で不活性である）、および選択用のエリスロマイシン耐性遺伝子を含有する。高温は、10-2〜10-3の範囲の頻度で起こる相同組換えによりＡ群連鎖球菌の染色体ＤＮＡ中に該プラスミドを強引に組み込ませる。
組換えプラスミドＤＮＡ pG::scpA1.2をCS101受容細胞中にエレクトロポレーション移入せしめた。形質転換体を１μg/mlエリスロマイシンを含むＴＨＹ−寒天平板上で30℃にて選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpAとの間での組換えから生じた染色体組込み体を、39℃でのエリスロマイシン耐性により選択した。２つの挿入変異体Ｍ14とＭ16を分析した。抗生物質を含まないＴＨＹ中での30℃での継代によりＭ14およびＭ16株のEmrS復帰変異体を得、最後にErm選択を使わずに37℃で平板培養した。プラスミドを失ってしまったコロニーを単離して、変異体の表現型が無関係の自然変異ではなくてscpA49中へのプラスミドの挿入に起因することを確かめた。
c)  scpA中への限定された欠失の導入。scpA中への挿入が正反対であるために下流遺伝子（細菌のビルレンスに寄与する可能性もある未知の遺伝子）の発現を低下させ得るという可能性を取り除くために、scpAの内部に明確に限定された欠失を有する変異体株を作製した。まず第一に、プライマー１（5′-GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATGGGAC-3′；配列番号４）およびプライマー２（5′-GGGGGGGAATTCGGGTGCTGCAATATCTGGC-3′；配列番号５）を使った裏返し（inside-out）ＰＣＲ法によりscpAのBglII-HindIII断片中に限定欠失を作った。下線を引いたヌクレオチドは、それぞれ座標2398および2322を有するscpA配列に相当し、そしてボールド体のヌクレオチドはEcoRI認識部位に相当する。これらのプライマーは、scpA遺伝子中に枠内（in-frame）欠失を生成するために選択された。これらのプライマーは反対方向でプラスミドＤＮＡを複製し、欠失の境界を限定する。Innis, M.A.他編、PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications（Academic Press, 1990）。プラスミドpG::scpA1.2 ＤＮＡを鋳型として使った。
増幅生成物をEcoRIで消化し、プラスミドpG+host5中に連結せしめた。得られたプラスミドpG::ΔscpA1.1は、scpAの内部に76bpの欠失を含んだ。この枠内欠失は、セリンプロテアーゼの推定触媒中心の一部を構成するセリンを含む、25アミノ酸を除去した。Chen,C. & Cleary, P.,“Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes,”J. Biol. Chem., 265:3161-3167（1990）。欠失の間際にEcoRV部位が作製された。この欠失部と重複するＤＮＡを配列決定して、欠失の境界を確かめた。
欠失を含むプラスミドpG::scpA1.1をＥ．コリER1821中に形質転換せしめた。ErmRについてコロニーを選択し、次いでEcoRIによって制限したミニプレププラスミドＤＮＡを使って適当なscpA欠失についてスクリーニングした。正確な欠失境界線をＤＮＡ配列分析により確かめた。プラスミドpG::ΔscpA1.1を上述のCS101Sm株中にエレクトロポレーションにより導入し、次いで39℃でのErm上での増殖により組込み体を選択した。Ｍ49株CS101Smの染色体中へのプラスミドの組込みは高温選択を使った。ＰＣＲにより挿入位置を確かめた。エリスロマイシン選択を使わない低温でのCS101Sm（pG::scpA1.1）の増殖は、ランダム欠失現象によるかまたは挿入によって生じる重複したscpA配列間での組換えから起こる切除によりプラスミドを失ってしまったErmS復帰変異体の高頻度分離を引き起こした。２つの欠失変異体、MJ2-5およびMJ3-15が同定され、それらを更に研究した。プラスミドpG::scpA1.1の組換え切除により後に残された染色体欠失を、ＰＣＲ法とEcoRVで消化したＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーション法により明らかにした。
d)  ＳＣＰに対する試験管内効果。ＳＣＰ抗原の発現およびペプチダーゼ活性に対する挿入と欠失の影響をウエスタンブロットおよびＰＭＮ付着アッセイにより評価した。連鎖球菌を100mlのＴＨＹ中で37℃にて一晩インキュベートした。培養ペレットを５mlの冷0.2M酢酸ナトリウム（pH5.2）中で２回洗浄し、次いで１mlのＴＥ−ショ糖緩衝液（20％ショ糖，10mM Tris, 1mM EDTA, pH7.0）および40μｌのムタノリシン中に懸濁した。この混合物を37℃で２時間回転させ、次いで4500rpmで５分間遠心分離した。上清はプロテアーゼ阻害剤として100mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含んだ。Laemmli, U.K.,“Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”Nature 227:680-685（1970）に記載された通りに、電気泳動およびウエスタンブロット法を実施した。コロニーブロットには、コロニーをＴＨＹ−寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロース膜へと移し（BioBlot-Nc, Costor, Cambridge, MA）、赤外線ランプ下で10分間固定し、そして抗体に暴露した。O’Connor, S.P. & Cleary, P.P.,“In vivo Streptococcus pyogenes C5a peptidase activity,”J. Infect. Dis. 156:495-506（1987）。ウエスタンブロットおよびコロニーブロット上でＳＣＰタンパク質を検出するために用いる一次抗血清は、精製済の組換えＳＣＰタンパク質でのウサギの免疫処置によって調製した。結合は抗ウサギ抗体−アルカリホスファターゼ接合体により検出した。
Ｃ５ａペプチダーゼ活性はＰＭＮ付着アッセイを使って測定した。Booth, S.A.他、“Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherence function,”J. Invest. Dermatol. 98:135-140（1992）。Ｃ５ａ（Sigma, St. Louis, MO）を連鎖球菌抽出物または精製プロテアーゼと共にインキュベートした後、残余Ｃ５ａはＰＭＮを活性化してＢＳＡ被覆ウエルに付着させることができる。初めに、マイクロタイタープレートウエルをＰＢＳ中0.5％ＢＳＡで被覆し、37℃で１時間インキュベートした。フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（Sigma, St.Louis, MO）中での遠心分離によりヒトＰＭＮを単離した。40μｌのそのままの連鎖球菌またはタンパク質抽出物を、１％グルコースと0.1％CaCl2を含むＰＢＳ 340μｌ中で、20μｌの５μM Ｃ５ａと共に37℃で45分間インキュベートした。ＢＳＡ被覆ウエルをＰＢＳで洗浄し、ＰＭＮを再懸濁させ、次いでウエルに残余Ｃ５ａを添加した。この混合物を７％CO2中で37℃で45分間インキュベートした。最後に、ウエルを洗浄して非付着性ＰＭＮを除去した。付着性ＰＭＮをクリスタルバイオレットで染色し、ELISAリーダー中でＯＤ570nmを読み取った。光学濃度は残余Ｃ５ａの量に比例し、またはＳＣＰ活性の量に反比例する。
挿入変異体は完全にSCPA49抗原を欠いていた。一方、ＭJ2-5およびＭJ3-15欠失変異体は予想通りＳＣＰ抗原を生産した。完全な細胞もＭ14，Ｍ16，ＭJ2-5およびＭJ3-15からのムタノリシン（mutanolysin）タンパク質抽出物も両方とも、マイクロタイタープレートへのｒＣ５ａ活性化ＰＭＮ付着を破壊する能力を欠いていた。変異体抽出物に関連した少量の残余阻害活性（10〜15％）は、好中球に対する該抽出物の毒性効果によるのかもしれない。
実施例２
ＳＣＰは食細胞の漸増および皮下感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせる
ＳＣＰがＣ５ａの不活性化を招くことを確かめるために、上記実施例１に記載した通りにscpAの挿入変異体および欠失変異体を作製し、そして活性試験した。scpA中に挿入または欠失を導入すると、変異体ＳＣＰはマイクロタイタープレートへのＰＭＮのＣ５ａ活性化付着を破壊することができなかった。
ビルレンスに対するscpA変異の影響を、連鎖球菌が局在化されたままでありそして炎症細胞の流入を分析することができる動物モデルを使って試験した。ＳＣＰがごく初期に生物体の初期クリアランスを遅らせる働きをするという仮定を検証するために、結合組織気嚢の接種後ちょうど４時間目にＳＣＰ+およびＳＣＰ-連鎖球菌の量を比較した。更に、この感染から短期間後のリンパ節および脾臓への連鎖球菌の散在も評価した。Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MAから入手したＣＤ１非近交系雄マウス（25g）を全ての実験に使用した。結合組織気嚢は、25ゲージの注射針を使ってマウスの背中の皮膚の下に空気0.9mlとＰＢＳ中に希釈したＡ群連鎖球菌0.1mlを注入することにより作製した。ある実験では、陽性対照としてＳＣＰ+CS101::pG+host5を使った。別の実験では陽性対照としてCS101Sm株を使った。感染後４時間目に頸部脱臼によりマウスを安楽死させた。指示した場合、４つの鼠径部リンパ節、脾臓および気嚢を動物から切開し、ＰＢＳ中でホモジナイズした。組織懸濁液を、１μg/mlエリスロマイシンまたは200μg/mlストレプトマイシンを含む血液寒天平板上で生存可能コロニー形成単位（ＣＦＵ）についてアッセイした。
予備実験において、気嚢をスライド上で固定し、ライト染料により染色し、顕微鏡検査した。この方法による顆粒球数は信頼できないけれども、固定化組織の中の残余ＳＣＰ-は野性型連鎖球菌よりも有意に少ないように見えた。この差を測るための試みとして追加の実験を行った。気嚢をＰＢＳ中で粉砕することにより気嚢の分散細胞集団を調製し、それらをナイロンモノフィラメントメッシュ（TETKO Co, New York）に通した。
300×gで５分間の遠心により細胞をペレットにし、それをFACS緩衝液（フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶液、0.1％NaN3、1.0％ＢＳＡ画分Ｖ）中に５×106／mlの密度に再懸濁した。細胞（1.0×106個）を１μgのFITC抗マウスMac-1で直接染色するかまたは１μgのビオチン接合抗マウスGr-1に続いて蛍光もしくはFITCで標識した１μgのストレプトアビジンにより間接標識した。モノクローナル抗体Mac-1とGr-1はPharmacia, Inc., CAから入手した。標識細胞を1.0％パラホルムアルデヒド中で固定した。FAC-Scan流動細胞計測器（フローサイトメーター）とConsort 32ソフトウエア（Becton Dickinson）を使って蛍光プロフィールを作成した。マウスＰＭＮを全血からフィコール−ハイパック密度勾配遠心により精製し、混成細胞集団中の限定ＰＭＮのための標準として使用した。特異的に標識された細胞の測定用に、各抗体マーカーについて平均蛍光を測定し、強く標識された細胞を映し出すためにゲートを設定した。対照は未染色の細胞、およびストレプトアビジン−FITCにのみ暴露された細胞を含んだ。
２つの実験を実施した。第一はscpA49挿入変異体Ｍ16をそれのＳＣＰ+親株であるCS101株と比較した。第二はscpA49欠失変異体ＭJ3-15を、それの親であるCS101Sm株と比較した（表１）。両実験とも、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種したマウスからホモジナイズした気嚢は、野性型連鎖球菌を接種した気嚢よりも、４時間後の連鎖球菌の数が少なかった。第一の実験は２分の１への減少を示し、第二の実験は４分の１への減少を示した。その差は、不対（Unpaired）ｔ検定を使った場合にそれぞれＰ＜0.05およびＰ＜0.001で統計的に有意であった。野性型ＳＣＰ+連鎖球菌が８匹のマウスのうちの７匹および８匹のマウスのうちの６匹からの脾臓ホモジネートにおいて検出され；一方、ＳＣＰ-変異体は脾臓中にまれにしか検出されなかった。リンパ節ホモジネートの場合は全く逆であった。
ＳＣＰ-連鎖球菌を接種した16匹のマウスのうち10匹からのリンパ節が生存可能な連鎖球菌を有していたのに対し、野性型連鎖球菌を感染させた16匹のマウスのうちのわずか４匹のリンパ節が生存可能菌を含んでいた。この差はフィッシャーの精密検定を使ってＰ＜0.05において統計的に有意であると決定された。
0004361606.tif 000002
気嚢からの連鎖球菌のより迅速なクリアランスはＰＭＮの強力な漸増に起因していた。気嚢中の全細胞集団数、Mac-1陽性顆粒球の比率〔Springer, G.他、“Mac-1: macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody,”Eur. J. Immunol.9:301-306（1979）〕、およびGr-1陽性ＰＭＮの比率〔Brummer, E.他、“Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungal killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in virto,”J. Leuko. Bio. 36:505-520（1984）〕を、単色FACS分析により比較した。Clark, J.M.,“A new method for quantitation of cell-mediated immunity in the mouse,”J. Reticuloendothel. Soc. 25:255-267（1979）。簡単に言えば、FACS分析において、懸濁液中の個々の細胞を特異的な蛍光単一抗体で標識する。標識された細胞のアリコートをFAC-Scan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器に注入し、それらの特有の蛍光に基づいて細胞数を計測する。
ＳＣＰ-欠失変異体を感染させた気嚢は、ＳＣＰ+連鎖球菌を接種したものの２倍の数の炎症細胞を含んでいた（図４）。接種サイズを100倍にしてもこの差に変化はなかった。１×106個のＳＣＰ-細胞（ＭJ3-15株）を感染させた気嚢は、ＳＣＰ+培養株を接種したものの３倍の数のGr-1陽性細胞を含んでいた。ＳＣＰ+連鎖球菌を接種した気嚢では、細胞の約６％がＰＭＮであり21％が別の種のMac-1+顆粒球（ＰＭＮを含む）であった。対比して、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種した気嚢は卓越的にＰＭＮを含んでいた。Gr-1陽性細胞はMac-1陽性細胞の数に等しいかまたはそれより多数であった。流動細胞計測器のゲートを高染色性顆粒球のみを測定するように設定した。いずれの抗体でも染色されなかった残りの70〜80％の細胞は多分、低染色性顆粒球、赤血球またはリンパ球のいずれかであるだろう。ライト染料で染色した気嚢調製物中に多数のリンパ球が顕微鏡下で観察された。
脾臓ホモジネートから現れた連鎖球菌のＳＣＰ+コロニーは、多くが莢膜に包まれており、水滴に似ていた。対照的に、リンパ節から生じた少数のＳＣＰ-コロニーは、より接種材料に似ていた。それらは非粘液性コロニーと中程度に粘液性のコロニーの混合物であった。これらのデータは、Ｍ+ＳＣＰ+莢膜封入連鎖球菌が感染後４時間以内に適応し、増殖しそして血流中に侵入することを示唆する。変異型連鎖球菌と野性型連鎖球菌の差別的往来（trafficking）の基本は、ＳＣＰ-菌に反応した食細胞の激しい流入のためであるかもしれない。マクロファージおよび／または皮膚樹状細胞がＳＣＰ連鎖球菌をより迅速に吸い込み、そしてそれらをリンパ節に運ぶのかもしれない。野性型に比較した変異型連鎖球菌の減少は意外な発見である。何故なら、ＳＣＰ-連鎖球菌はＭ+であり、試験管内のヒト好中球による食作用に耐性であるからである。
実施例３
ＳＣＰはマウス鼻咽頭への定着に必要である
野性型（ＳＣＰ+）およびＳＣＰ-連鎖球菌が鼻咽頭に定着する相対能力を評価するためにマウスの鼻内に接種した。ストレプトマイシン耐性Ｍ49株CS101および欠失変異体ＭJ3-15をこの実験に使用した。独特にマウス毒性であるが、存続がもはやＭタンパク質および／またはＳＣＰに依らないかもしれない変異体の選択を避けるために、培養物をマウスに継代しなかった。
CD1非近交系マウスに２×108ＣＦＵの定常期連鎖球菌を鼻内に接種した。麻酔したマウスの鼻咽頭を８〜10日間毎日スワブ標本をとり、スレプトマイシンを含む血液寒天上に画線した。ＳＣＰ+とＳＣＰ-の差は第１日目までに明らかであったが、しかし統計的に有意な差は第３日および第４日目までは観察されなかった（図５）。第４日目までに、Ｍ+ＳＣＰ+連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中９匹が陽性の咽喉培養物を生じたのに対して、Ｍ+ＳＣＰ-連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中２匹しか咽頭中に連鎖球菌を保持していなかった。18匹中４匹のマウスがＳＣＰ+連鎖球菌感染後に死亡した。ＳＣＰ-連鎖球菌感染後には１匹も感染により死ななかった。血液寒天平板上のコロニーの数もＳＣＰ-連鎖球菌の一層迅速なクリアランスと一致していた。例えば、第３日目に、７匹のマウスからの培養物が＞100ＳＣＰ+ＣＦＵを含んだのに対し、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種したマウスでは１匹だけが＞100ＣＦＵを含んでいた。
Ｍ49連鎖球菌は皮膚感染に頻繁に関連づけられるので、上記実験をＭ６株、すなわち咽喉感染と頻繁に関連づけられる血清型、を使って上記実験を繰り返した。Ｍ６株UAB200と実施例１に上述した方法を使って、挿入変異体AK1.4株を作製した。AK1.4株もまた、野性型Ｍ６培養物よりも迅速に鼻咽頭から浄化された。上記実験は、マウス鼻咽頭中でのＡ群連鎖球菌の存続がＳＣＰに依存するということを確証する。上記実験に使用した全てのＳＣＰ-変異体がＭ+であり、すなわち新鮮なヒト血液による食作用に耐性であった。それでもなお、それらは鼻咽頭から浄化された。
実施例４
精製組換えSCPA49によるマウスの鼻内免疫処置は鼻内チャレンジ後の定着を防止する
scpA49遺伝子の欠失形に相当するＰＣＲ断片を、CS101 Ｍ49型Ａ群連鎖球菌（dSCP）からクローニングした。この断片を、ヌクレオチド1033で始まる正プライマーとヌクレオチド3941で始まる逆プライマーを使ってＰＣＲにより増幅させた〔番号付け法はChen, C. &Cleary, P.,“Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes,”J. Biol.Chem., 265:3161-3167（1990）の方法に従った〕。該ＰＣＲ断片をPharmacia Inc.からのpGEX-4T-1高発現ベクター上のグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子のトロンビン結合部位に連結せしめた。scpAを含むpJC6と命名したプラスミドをブタペスト条約の規定に基づいて1996年10月15日にATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）（12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA）に寄託し、ATCC受託番号98225が付与された。
大腸菌クローンからトランスフェラーゼ−ＳＣＰ融合タンパク質を発現させ、グルタチオン−セファロース４ｂカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全ての方法が製造業者（Pharmacia）により記載されている。ハイブリッドタンパク質からトロンビン消化によりｄＳＣＰを開裂せしめた。ベンズアミジン−セファロース６Ｂカラム（Pharmacia）上でのクロマトグラフィーにより溶出ＳＣＰからトロンビンを除去した。アフィニティー精製されたタンパク質はSDS-PAGEとウエスタンブロットにより純粋なSCPA49であることが確認された。ウサギを使って精製SCPA49に対して向けられた高度免疫抗血清を調製した。組換えＳＣＰはペプチダーゼとして機能的でなかった。
合計40μgのタンパク質を５週間に渡り10μｌの容量で各外鼻孔に４回投与することにより、２グループのマウスを免疫した。対照マウスにはＰＢＳのみを投与した。感染前に５匹のマウスのグループからプールした血清は、ELISAにより高力価の抗SCPA49抗体を含むことが決定された。表２を参照のこと。
0004361606.tif 000003
最後の予防ブースター注射の７日後に、マウスを３×108ＣＦＵの野性型CS101Sm株によりチャレンジした。２つの別々の実験において、免疫マウスは感染の48時間後には連鎖球菌を含まなかった（図６；表３および４）。対照的に、ワクチン接種しなかった対照の30〜50％は、６日間培養陽性のままであり、ある対照は感染から10日後にもまだ陽性であった。それらの差はフィッシャー精密検定により統計的に有意であると決定された。免疫処置マウスと対照マウスの第三グループの感染も同様な結果を生じた。
この変異型SCPA49タンパク質に対して向けられた高力価ウサギ血清は、試験管内において完全なＭ１，Ｍ12およびＭ６連鎖球菌に関連するペプチダーゼ活性を中和することができた。これは該ペプチダーゼが血清型特異性を欠いていることを確証する。従って、ペプチダーゼとして機能的でないＳＣＰであってもワクチンとして有効である。鼻腔内（i.n.）接種前のＭ49連鎖球菌とウサギ抗ＳＣＰとの予備インキュベーションがコロニー形成を減少させなかったことに注目すべきである。
0004361606.tif 000004
0004361606.tif 000005
実施例５
Ｂ群連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼはＭ12およびＭ49Ａ群連鎖球菌からのものと配列がほとんど同じである
Ｂ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（SCPB）遺伝子をクローニングし、配列決定し、そしてＡ群連鎖球菌Ｍ12およびＭ49血清型からのものと比較した。上記実施例４に記載の方法を使ってscpA12配列の部分に相当するプライマーを用いたＰＣＲによりscpB遺伝子全体を増幅させた。SCPB遺伝子は、126,273ダルトンのＭrを有する1150アミノ酸のタンパク質を特定する3450bpの転写解読枠（ＯＲＦ）をコードする。SCPBのアミノ酸配列を図２に示す。Ｍ12およびＭ49のＡ群連鎖球菌からのものに対するscpBヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の比較は、それぞれ98％および97％という高い類似性を示した。scpBは２つのＣ末端反復配列と重なった50bpの欠失を含み、scpA遺伝子に対比して幾つかの別のわずかな相違を有した。両配列の整列は、scpA12が実際はscpA49よりもscpBの方に系統発生的に近いことを示した。血清型III，III／Ｒ，II，Ｉａ／ｃ，ＮＴ／ｃ，ＮＴ／ｃ／Ｒ１を表す30個の株は１コピーのscpBを担持している。
発現ベクタープラスミドpGEX-4T-1（ATCC受託番号98225）を使って組換えＳＣＰをＥ．コリ中で発現させると、親のＢ群連鎖球菌株78-471（型IIａ＋ｂ）から抽出された酵素と同一であることがわかった。ウエスタンブロット分析は、組換えＳＣＰがＢ群連鎖球菌から以前に精製されたＣ５ase酵素と同じであることを示唆した。
実施例６
ＳＣＰによる鼻内免疫処置は連鎖球菌感染に対する血清型無関係の免疫を誘導する
a)  菌株。連鎖球菌株CS101, CS210およびCS463は、血清乳白度陽性（ＯＦ+）で、クラスIIで、それぞれ血清型Ｍ49、Ｍ２およびＭ11株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体である。上記実施例１に記載したＭJ3-15は、SCPA49遺伝子中に内部枠内欠失を有するCS101株である。連鎖球菌90-131株とUAB200株はＯＦ-で、クラスＩで、それぞれＡ群連鎖球菌の血清型Ｍ１およびＭ６ヒト分離株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体である。連鎖球菌は２％ネオペプトンもしくは１％酵母エキスが補足されたトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＹ）中で、またはヒツジ血液寒天上で培養した。幾つかの実験では、ストレプトマイシン（200μg/ml）またはエリスロマイシン（１μg/ml）を含む培地中で連鎖球菌を増殖させた。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ER1821株（New England Biolabs,Inc., Beverly, MA）を、熱感受性自己不活化ベクタープラスミドpG+host5のための受容細胞として使用した。プラスミドpG+host5はAppligene, Inc., Pleasanton, CAから入手した。プラスミドpG+host5を含むＥ．コリER1821は、300μg/mlのエリスロマイシン（Erm）を含むルリア−ベルタニ（Luria-Bertani）ブロス中で39℃で増殖させた。
b)  scpA挿入変異体の作製。scpA6挿入変異体AK1.4は実施例１に上述した通りに作製した。組換えプラスミドＤＮＡ pG::scpA1.2はscpA遺伝子の内部BglII-HindIII断片を含有する。このプラスミドをUAB200受容細胞中にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体をエリスロマイシン含有ＴＨＹ寒天平板上で30℃にて選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpA6の間の組換えから生じたpG::scpA1.2の染色体組込み体であるAK1.4株を、エリスロマイシン含有寒天培地上での増殖により39℃にて選択した。scpA6中への挿入は、プローブとしてscpAを使ったサザンブロット法と、該プラスミドに特異的なＭ13万能プライマー（5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’）（配列番号６）とＧＡＳの染色体scpAに特異的なscpA For835プライマー（5’-AAGGACGACACATTGCGTA-3’）（配列番号７）を使ったＰＣＲにより確かめた。
c)  ΔSCPAの作製、発現および精製。scpA49の2.9kb断片（1033bpから3941bpまで）を、BamHI認識配列を含むscpA正プライマー（5’-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3’）（配列番号８）とscpA逆プライマー（5’-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3’）（配列番号９）を使ったＰＣＲにより増幅せしめた。得られたＰＣＲ生成物からSCPAタンパク質のシグナルペプチドと膜固定領域をコードする配列を削除した。まずＰＣＲ生成物をBamHIで消化し、Pharmacia Inc.（Piscataway, NJ）からのpGEX-4T-1高発現ベクター上のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子のトロンビン認識部位に連結せしめた。得られた組換えプラスミドをＥ．コリDH5α中に形質転換せしめた。１つの形質転換体Ｅ．コリ（pJC6）からのΔSCPA融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース４Ｂカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。トロンビンでの消化後、ベンズアミジン−セファロース６Ｂカラム上でのクロマトグラフィーによりトロンビンを除去した。発現および精製方法は製造業者により記載された通りであった。このアフィニティー精製された、端が切り取られたΔSCPAタンパク質は、ＰＭＮ付着アッセイ（上記実施例１に記載）により試験するとペプチダーゼ活性を欠いていた。
d)  ウエスタンブロット技術。連鎖球菌からのムタノリシン抽出物を上記実施例１に記載の通りに調製した。概説すると、連鎖球菌一晩培養物100mlをペレット化し、氷冷0.2Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.2）中で２回洗浄した。該ペレットを１mlのＴＥ−ショ糖緩衝液（1mM Tris, 1mM EDTAおよび20％ショ糖）中に40μｌのムタノリシンと共に懸濁した。該混合物を37℃で２時間回転した後、1500×ｇで５分間遠心分離した。得られた上清にフェニルメチルスルホニルフルオリド（100mM）を添加した。上記実施例１に記載したのと同様にウエスタンブロットを実施した。アフィニティー精製した組換えΔSCPAタンパク質を使ったウサギの免疫処置により、抗SCPA抗体を調製した。
e)  ＰＭＮ付着アッセイおよび中和アッセイ。ＰＭＮ付着アッセイを使ってSCPA活性を測定した。組換えヒトＣ５ａ（rhC5a; C5788;Sigma, St. Louis, Mo）を完全な細菌細胞と共に37℃で45分間インキュベートした。ＰＭＮを活性化する能力〔マイクロタイタープレートのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆ウエルに付着するようになる〕により残余rhC5aを測定した。S.A. Booth他、“Dapsone Suppresses Integrin-Mediated Neutrophil Adherence Function,”J. Invest. Dermatol., 98, 135-140頁（1992）。ＰＭＮは上記実施例１に記載した通りにフィコール−ハイパック中での密度勾配遠心により新鮮なヒト血液から単離した。ＰＭＮ付着アッセイを使ってウサギ抗SCPA血清によるSCPA活性の中和をアッセイした。0.5％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の約１×107個の加熱不活性化した死菌を1.4mlのウサギ抗ΔSCPA49血清または正常ウサギ血清と共に37℃で１時間回転させた。次いで40μｌの0.5％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、rhC5aと共に45分間インキュベートした後、ＰＢＳ付着アッセイにより残余の走化性因子を測定した。
f)  食作用アッセイ。試験管内ヒト血液食作用アッセイは、R.C. Lancefield,“Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test,”J. Exp. Med., 106:525-685頁（1957）に記載された通りに実施した。簡単に言えば、Ａ群連鎖球菌の対数期培養物をＴＨＹ中で103〜104ＣＦＵ／mlに希釈した。希釈した培養物の1/10mlとヒト血液0.9mlを混合し、37℃で３時間回転させた。血液寒天培地上での希釈試料の平板培養により、初期生存菌数と３時間回転後の生存菌数を測定した。
g)  マウス鼻内感染モデル。20％正常ウサギ血清を含むトッド−ヒューイットブロス中で増殖させそして10μｌのＰＢＳ中に再懸濁したチャレンジ用連鎖球菌株の16時間培養物（１×108〜９×108ＣＦＵ）を、体重25gの雌CD1マウス（Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA）またはBALB/cマウス（Sasco,Omaha, NE）の鼻内に投与した。血液寒天平板上での培養物希釈液の平板培養により生存菌数を測定した。麻酔したマウスから接種後６〜10日間に渡り毎日咽喉スワブ標本を採取し、200ug／mlストレプトマイシンを含む血液寒天平板上に画線した。37℃で一晩インキュベーションした後、平板上のβ溶血コロニーの数を計数した。ストレプトマイシン耐性により全てのチャレンジ株をマーキングして、それらの株と正常微生物叢中に存続するかもしれないβ溶血菌とを区別した。咽喉スワブ標本をストレプトマイシン含有の血液寒天上で培養した。１つのβ溶血コロニーの存在を陽性培養とみなした。
h)  免疫処置およびチャレンジプロトコール。４週齢の非近交系CD1雌マウスを、10μｌのＰＢＳ中の20μgのアフィニティー精製済ΔSCPA49を各々の外鼻孔に投与することにより免疫処置した。マウスを１日おきに３回免疫処置し、３回目の免疫処置から３週間後に再び追加免疫した。２週間あけた後、マウスを再び追加免疫した。D. Bessen他、“Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci,”Infect. Immun., 56, 2666-2672頁（1988）。対照マウスにはＰＢＳのみを投与した。感染前に、ΔSCPAタンパク質で免疫処置した全てのマウスをELISAにより測定すると、それらの血清および唾液中に高力価のΔSCPA抗原に対する抗体を有していた。Ａ群連鎖球菌のCS101株（2.0×108ＣＦＵ）、CS210株（3.6×108ＣＦＵ）、CS463株（7.8×108ＣＦＵ）、90-131株（3.4×108ＣＦＵ）およびUAB200株（9.6×108ＣＦＵ）を使って、最終ワクチン追加免疫の７日後にマウスを鼻内チャレンジした。動物実験はNational Institutes of Healthのガイドラインに従って実施した。
i)  試料採取およびELISA。免疫処置後に麻酔したマウスから血液試料と唾液試料を採取した。全ての血清を上述した通りにELISAによってSCPA49抗体の存在について試験した。S.P. O’Connor他、“The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptides,”J. Infect. Dis., 163, 109-116頁（1990）。0.05Ｍ炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中500ngの精製タンパク質を添加することにより、精製済SCPA49タンパク質をマイクロタイターウエルに結合させた。４℃で一晩インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、ＰＢＳ中0.5％ＢＳＡを使って１時間ブロックした。100μｌの0.1％ピロカルピン（Sigma）溶液の皮下注射によりマウスにおいて唾液分泌を刺激した。唾液試料を採取し、エッペンドルフ超遠心管中で14,000rpmにて５分間回転させた。その上清をΔSCPA49タンパク質に対する分泌型IgＡの存在についてELISAにより試験した。ELISA力価は、ＯＤ405≧0.1を有した各血清および唾液の最大希釈度を表す。
j)  統計分析。動物実験からのデータを解析するのにχ2検定を使った。＜0.05のＰ値を有意とみなした。
初めに、マウスの鼻咽頭における野性型および同系SCPA-変異型連鎖球菌の定着（コロニー形成）能力を調べた。親培養物と変異体培養物からの細胞表面タンパク質のムタノリシン抽出物を、SCPA特異血清を使ったウエスタンブロット法により分析した。変異体がSCPAを欠くことを確かめた。SCPA-変異体AK1.4およびMJ3-15の抽出物は抗SCPA血清と反応しなかった。野性型CS101株とUAB200株からの抽出物においては予想通りのサイズのSCPAタンパク質が観察された。rhC5aを破壊する能力を比較することにより、変異株AK1.4とMJ3-15がＣ５ａペプチダーゼ活性を生産できないことが確認された。単離されたＰＭＮをrhC5aに暴露すると、それらをＢＳＡ被覆マイクロタイターウエルに付着するように誘導した。連鎖球菌または精製SCPAとのインキュベーションはrhC5aを特異的に開裂せしめ、ＰＭＮを活性化するその能力を変更した。残余rhC5aに応答しそしてＢＳＡ被覆ウエルに結合したＰＭＮを染色し、次いで分光光度測定した。rhC5aと親培養物UAB200およびCS101とのインキュベーションは、rhC5aを破壊し、ＰＭＮ付着をそれぞれ58.8％および54.5％阻害した。対照的にSCPA-変異体AK1.4およびMJ3-15は、rhC5aを変更せずまたはＢＳＡ被覆ウエルへのＰＭＮの付着を変更しなかった（表５）。この実験は上記ウエスタンブロットの結果を確証し、そしてSCPA-培養物がrhC5aを分解するかもしれない別のプロテアーゼを含まないことを証明した。
0004361606.tif 000006
Ｍタンパク質発現がscpA中の突然変異により影響されるとは思われなかったけれども、SCPA-変異体連鎖球菌がまだＭタンパク質を発現するかどうかおよび食作用に耐える能力を有するかどうかを評価するためにアッセイを実施した。３時間インキュベーションによる新鮮なヒト血液中での連鎖球菌の増殖は、その表面上に抗食作用性Ｍタンパク質が存在することの現れである。R.C. Lancefield,“Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test,”J. Exp. Med., 106, 525-685頁（1957）。予想通り、親の連鎖球菌UAB200とCS101はそれぞれ40倍と49倍増加した（表５）。Ｍ+SCPA-培養株AK1.4およびMJ3-15は、それぞれ37.5倍と14倍増加した。このことは、scpA変異がＭタンパク質発現にもヒト全血中での食作用に対する耐性にもほとんど影響がなかったことを確証する。循環血液中での２つの変異体株の幾分弱い増殖は再現性があり、予想外であった。ヒト血漿中での変異体と親培養物の増殖速度は区別不可能であった。SCPAの不活性化がＣ５ａを循環血液中に蓄積させ、次いでそれがＰＭＮを活性化するのかもしれない。活性化されたＰＭＮはより一層食作用力があり、より多くＭ+連鎖球菌を殺すことができる。抗Ｍ49抗血清と抗Ｍ６抗血清を使ったウエスタンブロットにより分析すると表面タンパク質抽出物はＭ６およびＭ49抗原を含んでおり、これはSCPA中の変異がＭタンパク質発現を変更しないことを確証した。
次に、鼻咽頭への定着にＣ５ａペプチダーゼが必要であるかどうかを調べた。鼻咽頭に定着する野性型およびSCPA-連鎖球菌の相対能力を評価するためにCD-1非近交系マウスに鼻内接種した。麻酔したマウスから１〜10日間に渡り毎日咽喉スワブ標本を採取し、問題の株に選択的な抗生物質を含有する血液寒天平板上に画線した。Ｍ６株UAB200を使った先行研究を確かめるためにこの株の感染用にBALB/cマウスを使った。D. Bessen他、“Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci,”Infect. Immun., 56, 2666-2672頁（1988）。５日目までにマウスの約50％の定着を生じる接種材料サイズを最初に決定した。接種後３〜９日目にＭ+SCPA+型とＭ+SCPA-型の間に有意な差が観察された。４日目まで、株CS101を感染させたマウスの50％（18匹のうちの９匹）がまだ陽性咽喉培養物を生じ、一方でMJ3-15を感染させたマウスの11％（18匹のうち２匹）だけがそれらの咽喉中に連鎖球菌を保持していた。血液寒天平板上でのコロニーの数の差も、Ｍ+SCPA-型連鎖球菌の迅速なクリアランスと一致していた。野性型連鎖球菌を感染させたマウスからの陽性培養物の59％（54匹のうち31匹）が＞100ＣＦＵを含んだのに対し、SCPA-型連鎖球菌を感染させた動物からの陽性培養物のわずか14％（14匹のうち２匹）が＞100ＣＦＵを含んでいた（Ｐ＜0.001で統計的に有意）。更に、Ｍ+SCPA+型連鎖球菌感染からマウスの22％（18匹のうち２匹）が死亡した。Ｍ+SCPA-型連鎖球菌感染からは１匹のマウスも死亡しなかった。この差も統計的に有意であった（Ｐ＜0.05）。CS101株のSCPA49+変異体とSCPA49-変異体の比較をもう２回繰り返したが同様な結果を生じた。
〇Ｆ+株とＯＦ-株により生じる病気のスペクトルが有意に異なるために、ＯＦ-血清型であるＭ６型によるコロニー形成に対するSCPAの効果も調べた（図７）。同様にSCPA６-株AK1.4は親株のUAB200よりも迅速に浄化された。感染後４日目には全てのマウスが咽喉から完全にSCPA-連鎖球菌を浄化したのに対して、野性型連鎖球菌を感染させたマウスの30％が培養陽性のままであった。全ての陽性培養物の98％以上が、血液寒天平板上で複数個のコロニーを形成した。この実験では、接種後５日目までに全てのマウスが連鎖球菌から開放された。
次の段階は動物を免疫処置するのにＳＣＰが使用できるかどうかを調べることであった。初めに、免疫処置実験用にSCPA49タンパク質の酵素的不活性形態を作製した。ＰＣＲにより追加のBamHI認識配列を有する2908bp scpA49断片を得、それをBamHIとSmaIで消化しておいたプラスミドpGEX-4T-1中に連結せしめた。プラスミドpJC6と称するこの構成物中、scpA49配列はグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子に枠内融合された。連鎖球菌挿入断片はscpAシグナル配列または細胞壁固定配列を含まなかった（図８）。精製ΔSCPA49タンパク質のワクチン製剤をSDS-PAGEとウエスタンブロットにより評価して純度を確かめた。精製ΔSCPA49製剤中の幾つかのタンパク質バンドが、組換えΔSCPA49タンパク質に対して向けられたポリクローナルウサギ抗血清と反応した。その主要バンドのサイズは、SCPA49の欠失形態の推定サイズに相当する約100kDであった。それより小さいバンドはSCPAの分解生成物であると思われ、これはＥ．コリ中で過剰発現されるタンパク質に共通の特徴である。抗血清は、連鎖球菌挿入断片を持たないＥ．コリDH5α（pGEX-4T-1）から単離されたどのタンパク質とも反応しなかった。上述した手順は、定期的に１ｌの培養物から２〜３mgの高純度ΔSCPA49タンパク質を与えた。精製ΔSCPA49タンパク質はＰＭＮ付着アッセイにより評価するとＣ５ａペプチダーゼ活性を持たないことがわかった。
第二に、サブユニットΔSCPA49ワクチンの免疫原性を評価した。ウサギを精製ΔSCPA49により免疫処置した。ELISAにより測定するとそのウサギはΔSCPA49タンパク質に対する高レベルの抗体を産生した。精製ΔSCPA49免疫原は機能的活性を欠いているにもかかわらず、高度免疫ウサギ抗血清は試験管内で精製済の野性型SCPA49酵素のペプチダーゼ活性を中和することができた。更に、ΔSCPA49タンパク質に対する未希釈のウサギ抗血清は、非相同の血清型に関連するＣ５ａペプチダーゼ活性を中和することができた。無傷のＭ１，Ｍ６およびＭ12連鎖球菌に関連するＣ５ａペプチダーゼ活性がこの抗血清によって阻害されたことは、ΔSCPA49タンパク質に対する抗体が多くの異なる血清型に対して広い交差反応性を有するということの確証である。
また、10匹の免疫処置マウスと10匹の対照マウスから血清試料と唾液試料を採取し、アジュバントを使わない鼻内ルートによって投与した時のΔSCPA49タンパク質の免疫原性を評価した。精製ΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスは、ＰＢＳを投与した対照マウスに比べて高力価のSCPA特異的IgＧを血清中に産生した。ΔSCPA49に対して向けられた血清IgＧの力価は、１：10,240〜１：20,480であった。対比して、対照マウスのSCPA特異的IgＧ力価は血清中に検出できなかった。精製ΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスは、対照マウスに比較してSCPA49特異的唾液IgＡの有意な増加も示した。免疫処置マウスの唾液中の特異的IgＡ力価は１：16よりも大きかった。対比して、対照マウスの唾液中のSCPA49特異的IgＡは検出できなかった。それぞれ1/2560希釈した血清中および1/2希釈した唾液中のIgＧおよびIgＡの相対濃度を図９に示す。これらの結果は、精製ΔSCPA49タンパク質が、鼻内投与するとマウスに特異的な全身性および分泌型抗体応答を誘導する有効な免疫原であることを証明する。
第三に、Ｃ５ａペプチダーゼでの免疫処置が鼻咽頭からの連鎖球菌の浄化（クリアランス）を増強するかどうかを調べるために実験を行った。高レベルの抗SCPA抗体を含む高度免疫ウサギ血清およびヒト血清の両方が試験管内でSCPA活性を中和することができる。S.P. O’Connor他、“The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase,”J. Infect. Dis., 163, 109-116（1990）。SCPAが口腔粘膜への定着を有意に促進するという事実は、精製ΔSCPA49によるマウスの免疫処置が連鎖球菌の鼻咽頭定着能力を低下できることを示唆する。この可能性を調査するために、アフィニティー精製した遺伝子不活性化SCPAによりマウスを鼻内で免疫処置した。端が切り取られたタンパク質ΔSCPA49をアジュバントも担体も使わずに鼻内に投与した。野性型Ｍ+SCPA+連鎖球菌によるワクチン接種マウスの咽頭定着は、精製ΔSCPA49タンパク質の２種類の別製剤を使ってワクチン接種したマウスを使う３つの独立した実験において、ＰＢＳを投与したマウスとは有意に異なっていた（代表的データは図10に示される）。ΔSCPA49タンパク質で免疫処置した13匹のマウスのうちの１匹だけが、接種後10日目に連鎖球菌について培養陽性であった（図10）。対比して、ワクチン接種しない対照マウスの30〜58％が６日間培養陽性のままであり、何匹かは感染後10日目にまだ陽性であった。血液寒天平板上のβ溶血型でストレプトマイシン耐性のコロニーの数も、ΔSCPA49ワクチン接種マウスと対照マウスとの間に有意差を示した。別の免疫処置マウスのグループは、非免疫処置対照よりも鼻咽頭から有意に迅速に血清型Ｍ49連鎖球菌を浄化した。
最後に、ある血清型のＳＣＰが別の血清型からの感染に対して動物を予防するかどうかを調べた。Ａ群連鎖球菌の血清型は80種類以上存在する。有効なワクチンは複数の連鎖球菌血清型による感染を予防するものである。血清型Ｍ２，Ｍ11，Ｍ１およびＭ６のＡ群連鎖球菌のコロニー形成に対する交差感染防御が観察された。血清型Ｍ49連鎖球菌からのΔSCPA49タンパク質に対して向けられたウサギ血清が数種類の異なる血清型に関連したペプチダーゼ活性を中和したという事実は、単一のサブユニットワクチンによる鼻内免疫処置がそれらの血清型による咽頭定着を低減または排除するかもしれないということを示唆した。この可能性を調査するために、上述のアフィニティー精製したΔSCPA49タンパク質の鼻内接種により20匹のマウスから成る４グループを免疫処置した。対照マウスにはＰＢＳを投与した。連鎖球菌でチャレンジする前に、無作為に選んだ免疫処置マウスと対照マウスからの血清試料と唾液試料を抗SCPA抗体についてアッセイした。試験した全ての免疫処置マウスが強力な血清抗体応答と測定可能な唾液抗体応答を発生していた。４つの血清型の菌株によるΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスの咽頭コロニー形成が全て、非免疫処置対照に比較して減少した。その差は接種後３日目および５日目に有意であった（表６）。
0004361606.tif 000007
血清型Ｍ２，Ｍ11およびＭ１株を接種した免疫処置マウスと対照マウスとの間に統計的に有意な差が観察された。しかしながら、ＯＦ+血清型Ｍ２およびＭ11はＯＦ-株のＭ１およびＭ６よりも一層効率的に除去された。免疫処置マウスのＭ１連鎖球菌定着は、対照マウスに比較してかなり減少した。免疫処置マウスのわずか10.5％が感染後５日目に培養陽性であった。対比して、対照マウスの37％がこの株に関して培養陽性であった。免疫処置マウスはＭ６連鎖球菌をより迅速に除去したように見えるけれども、その差は統計的に有意でなかった。予備実験と同様に、血液寒天平板上のβ溶血連鎖球菌コロニーの数は対照動物から採取した試料よりもワクチン接種したマウスから採取した試料のほうが有意に少なかった。よって、ΔSCPA49タンパク質は別の連鎖球菌血清型に対して交差防御免疫を提供する有効なワクチンであった。
本発明を様々な特定の好ましい態様と技術に関して記載してきたが、本発明の範囲内において様々な変更および修正を行い得るということを理解すべきである。
配  列  表
一般情報
出願人の名称：Regents of the University of Minnesota
発明の名称：連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼワクチン
配列の総数：９
優先権の基礎となる出願：
出願番号：08/589,756
出願日：1996年１月22日
配列番号：１
配列の長さ：1164アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004361606.tif 000008
0004361606.tif 000009
0004361606.tif 000010
0004361606.tif 000011
0004361606.tif 000012
配列番号：２
配列の長さ：1167アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004361606.tif 000013
0004361606.tif 000014
0004361606.tif 000015
0004361606.tif 000016
配列番号：３
配列の長さ：1150アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004361606.tif 000017
0004361606.tif 000018
0004361606.tif 000019
0004361606.tif 000020
0004361606.tif 000021
配列番号：４
配列の長さ：31塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000022
配列番号：５
配列の長さ：31塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000023
配列番号：６
配列の長さ：17塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000024
配列番号：７
配列の長さ：19塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000025
配列番号：８
配列の長さ：31塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000026
配列番号：９
配列の長さ：18塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列：
0004361606.tif 000027
0004361606.tif 000028
【図１】
0004361606.tif 000029
【図２】
0004361606.tif 000030
【図３】
0004361606.tif 000031
【図４】
0004361606.tif 000032
【図５】
0004361606.tif 000033
【図６】
0004361606.tif 000034
【図７】
0004361606.tif 000035
【図８】
0004361606.tif 000036
【図９】
0004361606.tif 000037
【図１０】
0004361606.tif 000038