(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NUR 2 117.7と呼称し、受託番号I-1698として1996年４月23日付でパスツール・インスティチュートに寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体117.7。
【請求項２】
NUR 2 234.14と呼称し、受託番号I-1699として1996年４月23日付でパスツール・インスティチュートに寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体234.14。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項記載の抗体をコードするＤＮＡセグメントからなるＤＮＡ分子。
【請求項４】
ＤＮＡが組換えＤＮＡ分子である、請求の範囲第３項記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記抗体をコードするＤＮＡセグメントが、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結されている、請求の範囲第３項記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求の範囲第４項記載の組換えＤＮＡ分子からなる発現ベクター。
【請求項７】
請求の範囲第６項記載の発現ベクターを担持し、抗体を発現できる宿主細胞。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載の宿主細胞を培養し抗体を発現させることからなる抗体の製造法。
【請求項９】
請求の範囲第１項または第２項記載の抗体と薬学的に許容し得る担体からなる、IFN-αの生物学的活性をモジュレートするためまたはブロッキングするための医薬組成物。
【請求項１０】
有効量の請求の範囲第９項記載の医薬組成物をIFN-αの生物学的活性をモジュレートするまたはブロックする必要がある対象（ヒトを除く）に投与する工程からなる、前記活性をモジュレートするまたはブロックする方法。
【請求項１１】
NUR 2 117.7と呼称し、受託番号I-1698として1996年４月23日付でパスツール・インスティチュートに寄託された、請求の範囲第１項記載の抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項１２】
NUR 2 234.14と呼称し、受託番号I-1699として1996年４月23日付でパスツール・インスティチュートに寄託された、請求の範囲第２項記載の抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項１３】
受託番号I-1697としてパスツール・インスティチュートに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体46.10および受託番号I-1698としてパスツール・インスティチュートに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体117.7のいずれかの第１のコーティング、および受託番号I-1699としてパスツール・インスティチュートに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体234.14の第２のコーティングを備えるマイクロタイタープレートからなるIFNAB-BPIおよび／またはIFNAB/BPIIのELISA試験具。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、種々のＩ型インターフェロンの活性を選択的にモジュレートできるインターフェロン−α／β受容体のリガンド結合成分に対する抗体に関する。
欧州特許出願公開第588,177号明細書（EP publication No.588,177）には、分子量約40,000の可溶性IFN-α受容体について記載されており、この受容体は125I-IFN-α2と交差結合（cross-linking）し、抗IFN-αモノクローナル抗体と免疫沈降することにより同定されたものである。血清から取得したとき、この種の受容体の分子量は50Ｋであった。同明細書にはまた、前記40,000IFN-α結合タンパク質（以下、「IFNAB-BP」または「IFNAB-BPII」という）が尿から均一な状態で得られ、既知の他のいかなるタンパク質とも異なる配列を有することも記載されている。このIFNAB-BPは、多種のIFN-αサブタイプと結合し、それらの活性をブロックするが、これはただ１種であるIFN-βに対しても同様である。
欧州特許出願公開第676,413号明細書には、IFNAB-BPの前駆体をコードする２つのcDNA分子のクローニングと配列決定について記載されている。この２つのcDNAは、おそらく同じ遺伝子から、たとえば、別のスプライシングを受けて生じたものであろう。この２つの組換えタンパク質（IFNAB-BPIとIFNAB-BPIIと呼称される）の哺乳動物細胞および他の宿主細胞における産生についても記載されている。IFNAB-BPに対する抗体であって、IFN受容体のブロッキング、IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIのイムノアッセイおよび免疫精製に有用なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体についても開示されている。
本発明においては、２つのグループの中和抗体について記載するが、これらはヒト細胞上のＩ型インターフェロン受容体と結合する、IFNAB-BPIIに対して作製されたものである。前記抗体の１つのグループは、IFN-αのサブタイプとIFN-βとの両方の活性をブロックできる。もう１つのグループの抗体は、ヒト細胞中のインターフェロン−αの種々のサブタイプの活性を選択的にブロックできるが、インターフェロン−βの活性に影響を与えることはない。このように、これらの抗体のうちの１つのグループは、IFN-αの望ましくない効果を阻害し得るが、IFN-βの活性にはほとんど影響を与えない。
背景技術
Ｉ型インターフェロン類（IFNs）（IFN-α、IFN-βおよびIFN-ω）は、構造的に関連するサイトカイン類のファミリーを形成し、通常、ウイルス感染に対する耐性を付与する能力で定義される。Ｉ型IFNsの他の生物学的活性に関する報告は多く、たとえば、細胞増殖の阻害、クラスＩ MHC抗原の誘発およびいくつかの他の免疫調節活性が含まれる（1）。IFN-αおよびIFN-βは、いくつかのウイルス性疾患の治療に有用であり、たとえば、Ｃ型肝炎（2、3）およびウイルス性のイボ（4、5）ならびに特定の悪性腫瘍、たとえば、ヘアリーセル白血病（6）、慢性骨髄性白血病（7）およびカポジ肉腫（8）等に用いられる。
IFN-αは全身性エリテマトーデス（9）等の自己免疫疾患に罹っている種々の患者およびエイズ患者（10）の血清から検出された。IFN-αは若年性糖尿病の進行にも関連していた（11）。さらにIFN-α療法は、ある場合には望ましくない副作用、たとえば、発熱および神経学的障害を呈する場合があった（12）。それゆえ、IFN-αの活性の中和が患者にとって有益であるような病理学的な状況がある。
他のサイトカイン類の場合と同様に、IFN-αも細胞表面の受容体と結合することによってその生物学的活性を示すが、前記受容体は、IFN-βに対して特異的であると同様に、すべてのIFN-αサブタイプに対しても特異的である（13）。ヒトIFN-α受容体（IFNAR）は、ダウディ（Daudi）細胞から同定されクローン化された（14）。クローン化された受容体は１つのトランスメンブランドメインと、細胞外ドメインならびに細胞内ドメインを有している。マウス細胞で発現したとき、この受容体はヒトIFN-αＢに反応性を付与するが、他のIFN-α種およびIFN-β種に対しては有意に反応性を付与しない。このことは、付加的成分がIFN-βおよび種々のIFN-αサブタイプとの反応性に関与し得ることを示している。
いくつかの他の研究によって、IFN-αおよびIFN-βとの結合には付加的成分または、受容体サブユニットが関与していることが示されている（15〜17）。それにもかかわらず、既述の受容体（14）がすべてのIFN-α種およびIFN-β種の結合に関与していると報告されている（18）。実際、IFN-α／β受容体と呼ばれる第２の受容体成分が最近同定されクローン化された（欧州特許出願公開第676,413号明細書および参考文献19）。本発明者らは、細胞外ドメインがIFNAB-BPIと同じ配列を有するIFN-α／β受容体が、Ｉ型インターフェロン受容体の主なリガンド結合成分であることを論証した。さらに、インターフェロン−α／β受容体とIFNARとが協働してリガンド結合し、細胞表面上でＩ型インターフェロン類と三次元構造を形成する（20）。
IFNARに対するモノクローナル抗体であってＩ型インターフェロン類の活性を非選択的にブロックし得るモノクローナル抗体は既に記載されている（21）。未同定の受容体成分に対する他のモノクローナル抗体も記載されていた。この抗体はＩ型インターフェロン類の活性を非選択的にブロックした（22）。
発明の要約
本発明は、IFN-αとIFN-βに対する共通の受容体であるIFN-α／β受容体に対するモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、ヒト細胞上に発現するか、可溶性の形態IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIとして発現する受容体のいくつかの形態と結合する。２つのタイプの中和モノクローナル抗体を開発した。１つのタイプは、IFN-αおよびIFN-βの両方の抗ウイルス活性をブロックするのに使用するとき、高い力価（titer）を示す。第２のタイプは、驚くべきことに、IFN-αの抗ウイルス活性に関してのみ高いブロック力価を示すが、IFN-βの活性に関しては非常に低い力価しか示さない。このように、予測できない第２のタイプのモノクローナル抗体を特定の濃度範囲で、IFN-αの活性を選択的にブロックするために用い得るが、IFN-βの活性には影響を与えない。
また、本発明はヒト細胞上に発現するIFN-α／β受容体、IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIに対するヒト化モノクローナル抗体を提供する。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス−ヒトのハイブリッド抗体分子であって、可変ドメインがマウス抗体由来であり、不変ドメインがヒト由来である。
本発明はまた、IFN-α／β受容体、IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIに対するモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体をコードするDNA分子を提供する。
さらに、本発明は前記DNA分子を含有する複製可能な発現ビヒクル、前記ビヒクルで形質転換された宿主および前記形質転換宿主により産生されたタンパク質を提供する。「DNA分子」という用語は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびこれらの組み合せを含む。
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で前記DNA分子とハイブリダイズし、IFN-α／β受容体、IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIに対するモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするDNA分子に関する。
また、本発明はIFN-α／β受容体、IFNAB-BPIおよびIFNAB-BPIIに対する機能的なモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を産生し得る宿主細胞の調製方法を提供する。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト細胞中でヒトインターフェロン−αの生物学的活性を阻害するが、ヒトインターフェロン−βの生物学的活性には影響を与えない。生物学的活性は、ヒトWISH細胞と水疱性口内炎ウイルスとを用いる細胞変性効果の阻害アッセイを用いて試験したときの、抗体の阻害効果を定量的に評価して決定した。
発明の詳細な説明
イスラエル特許出願第106591号明細書にしたがい、分子量40,000のIFN-α／β結合タンパク質（IFNAB-BP）は正常な尿（normal urine）からの２段階のクロマトグラフィーによって単離した。粗尿タンパク質を、IFN-α２を結合させたアガロースからなるカラムにかけた。前記カラムを洗浄して無関係なタンパク質を取り除き、ついで結合したタンパク質を低pHで溶出した。さらに、溶出したタンパク質をサイズ排除HPLCで分離し、いくつかのタンパク質のピークを得た。その１つは125I-IFN-α2と特異的に反応する能力とIFN-αおよびIFN-βの抗ウイルス活性をブロックする能力で特徴付けた。このタンパク質をN−末端ミクロ配列分析にかけてさらに特徴付けた。得られた配列は、既知のIFNAR受容体の配列（14）と比較したところ、前記既知配列とは異なっていることが確認された。得られたタンパク質は他の既知のどのタンパク質とも異なっており、既知のどのDNA配列によってもコードされていなかった。これはFastAプログラム（23）を用いて、SwissprotおよびGenebankデータライブラリーと比較して決定した。
尿IFNAB-BPの均一な調製物を免疫原として用いて抗体を調製した。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（Mabs）、キメラ抗体、可溶性形態でまたは結合した形態でラベルできる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Id）抗体、ならびにそれらの活性画分を含む。前記活性画分は、既知のあらゆる技法、たとえば、これらに限定されるわけではないが、酵素的分解、ペプチド合成または組換え技術により提供される。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の異種の集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含んでおり、この集団は実質的に同種のエピトープ結合部位を含んでいる。Mabsは、当業者に公知の方法で得てもよい。たとえば、コラー（Kohler）およびマイルステイン（Milstein）、Nature 256:495-497（1975）；米国特許第4,376,110号明細書；アウスベル（Ausubel）ら編、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン（Greene）出版協会およびウィレイ  インターサイエンス（Wiley Interscience）、ニューヨーク（1987-1996）；ハーロー（Harlow）およびラン（Lane）、ANTIBODIES;A LABORATORY MANUAL、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1988）；およびコリガン（Colligan）ら編、Current Protocols in Immunology、グリーン出版協会およびウィレイ  インターサイエンス、ニューヨーク（1992-1996）を参照のこと。これらの参考文献の内容は全体的に参考として本明細書に援用する。このような抗体は免疫グロブリンのいずれのクラスでもあり得、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDおよびそれらのいずれかのサブクラスをも含む。本発明のMabを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュまたはインビボで培養され得る。インビボまたはインサイチュでの高い力価のMabの産生は、本発明の好ましい産生方法である。
キメラ抗体は、その異なる部位が異なる動物種に由来する分子であり、たとえば、マウスのMabに由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する。キメラ抗体は、適用したときに免疫原性を低下させ、産生収率を増加するのに主に用いられる。たとえば、マウスのMabsは、ハイブリドーマからより高い収率で得られるが、ヒトではより高い免疫原性を有するので、たとえば、ヒト／マウスキメラMabsが用いられる。キメラ抗体とその調製方法は当該技術分野で公知である（カビレイ（Cabilly）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277（1984）；モリソン（Morrison）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855（1984）；ボウリアン（Boulianne）ら、Nature 312:643-646（1984）；カビレイら、欧州特許出願第125023号明細書（European Patent Application 125023）（1984年11月14日公開）；ニューバーガー（Neuberger）ら、Nature 314:268-270（1985）；タニグチ（Taniguchi）ら、欧州特許出願第171496号明細書（1985年2月19日公開）；モリソンら、欧州特許出願第173494号明細書（1986年3月5日公開）；ニューバーガーら、PCT出願（PCT Application）WO8601533（1986年3月13日公開）；クドウ（Kudo）ら、欧州特許出願第184187号明細書（1986年6月11日公開）；モリソンら、欧州特許出願第173494号明細書（1986年3月5日公開）；サハガン（Sahagan）ら、J.Immunol.137:1066-1074（1986）；ハロビンソン（Robinson）ら、国際特許公開公報（International Patent Publication）、WO9702671（1987年5月7日公開）；リウ（Liu）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443（1987）；サン（Sun）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218（1987）；ベター（Better）ら、Science 240:1041-1043（1988）；および、ハーローおよびラン、ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL、同上）。これらの参考文献は、すべて参考として本明細書に援用する。
抗イディオタイプ（抗Id）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般的に関連しているユニークな抗原決定基を認識する抗体である。Id抗体は、同種および同遺伝子型の動物（たとえば、マウス系統）をMabのソースとして、抗Idが調製されるべきMabを用いて前記動物を免疫することにより調製することができる。免疫した動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Id抗体）を産生することによって免疫化に用いた抗体のイディオタイプ決定基を認識し反応する。たとえば、米国特許第4,699,880号明細書を参照のこと。この文献は全体的に参考として本明細書に援用する。
抗Id抗体はまた、「免疫原」として使用され、さらに別の動物において免疫反応を誘発し、いわゆる抗−抗Id抗体を産生し得る。抗−抗Idは抗Idを誘発するオリジナルのMabとエピトープについては同一であり得る。したがって、Mabのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
このように、IFNAB-BPI、IFNAB-BPII、および本発明の関連タンパク質に対して生じたMabsを用いて、適切な動物、たとえばBALB/cマウス中で、抗Id抗体を誘発し得る。このようにして免疫したマウス由来の脾臓細胞を用いて、抗Id Mabsを分泌する抗Idハイブリドーマを作製する。さらに、抗Id Mabsを、キャリアー、たとえば、キーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）と結合させ、さらに他のBALB/cマウスを免疫するのに使用できる。これらのマウス由来の血清は、抗−抗Id抗体を含むが、これらの抗体はもとのMabの結合特性を有しており、IFNAB-BPIあるいはIFNAB-BPIIのエピトープに対して特異的である。
このように抗Id Mabは、自分自身のイディオタイプのエピトープ、すなわち「イディオトープ」を有し、これはIFNAB-BPIまたはIFNAB-BPIIと評価されるエピトープと構造的に類似する。
「抗体」という用語はまた、完全な分子およびその活性画分、たとえば、FabおよびF（ab’）2などの抗原と結合できる画分を含む。FabおよびF（ab’）2フラグメントは、完全な抗体のFcフラグメントが欠落しており、循環血（circulation）から速やかに消失し、完全な抗体よりも非特異的な組織結合が少ないようである（ワール（Wahl）ら、J.Nucl.Med.24:316-325（1983））。
FabおよびF（ab’）2、ならびに本発明において有用な抗体のその他のフラグメントを用いて、完全な抗体分子に関して本明細書に記載された方法にしたがって、IFN-αの生物学的活性を選択的にブロックし得ることが理解される。このようなフラグメントは、典型的には、酵素、たとえば、パパインを（Fabフラグメントを産生するために）またはペプシンを（F（ab’）2フラグメントを産生するために）用いるタンパク質の開裂により産生される。
抗体が分子と特異的に反応し、それによって前記分子が前記抗体と結合できるならば、そのような抗体を前記分子と「結合可能」であるという。「エピトープ」という用語は、抗体が結合し得る分子のいずれかの一部であって、その抗体が認識もし得る部分をいう。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、アミノ酸または糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面群性体（surfacegrouping）からなり、特異的な三次元構造的特徴と特異的な電荷的特徴を有している。
「抗原」とは、抗体が結合可能な分子または分子の一部であって、さらに動物にその抗原のエピトープと結合可能な抗体を産生させることができる。抗原は１または２以上のエピトープを有し得る。前記の特異的反応は、高い選択性で抗原が対応する抗体と反応するが、他の抗原によって生じた多くの他の抗体とは反応しないことをいう。
本発明に有用な抗体（その抗体のフラグメントも含めて）を用いて、インターフェロン−βに対してほとんど作用せずにIFN-αサブタイプの生物学的活性をブロックし得る。
本発明はまた、前記で定義した本発明の抗体のいずれかをコードするDNA分子、前記DNA分子のいずれかからなる複製可能な発現ビヒクル、ならびに原核細胞および真核細胞および宿主細胞を含む前記発現ビヒクルのいずれかで形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、本発明のハイブリドーマを培養し分泌されたモノクローナル抗体を回収することによる、本発明の抗体のいずれかを産生する方法を含む。
本発明はまた、本発明の形質転換細胞を培養し分泌された抗体を回収することによる、本発明の抗体のいずれかを産生する方法を含む。前記抗体は前記DNA分子および前記形質転換宿主細胞内の前記発現ビヒクルによってコードされている。
本発明はさらに、本発明の抗体の活性ムテインおよび活性画分に関するものであり、他のポリペプチドまたはタンパク質と融合し、Ｉ型IFNsの生物学的活性をブロックする同様の能力を示す、野生型の抗体からなる融合タンパク質、またはそれらの活性ムテインもしくはそれらの活性画分に関する。
本発明の抗体、それらの活性画分、ムテインまたは融合タンパク質をコードするDNAと作動可能に連結された転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、真核細胞のベクターに挿入される。このベクターは宿主細胞の染色体に所望の遺伝子配列を組み込むことができる。導入されたDNAが安定に染色体に組み込まれた細胞を選択できるようにするために、発現ベクターを含む宿主細胞の選択ができるような１または２以上のマーカーを使用する。そのマーカーは、栄養要求性の宿主に独立栄養性を提供し得る、または生物致死剤（たとえば抗生物質など）に対する耐性もしくは重金属（たとえば銅など）に対する耐性、などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきDNA遺伝子配列と直接直結できるか、同じ細胞にコトランスフェクションで導入できる。付加的なエレメントもまた、一本鎖の結合タンパク質mRNAの最適な合成に必要で有り得る。これらのエレメントは転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルに加えて、スプライスシグナルを含み得る（24）。
本発明の抗体、それらの活性画分または活性誘導体を発現させる目的のために、選択した細胞に導入されるべきDNA分子を好ましくは受容宿主で自律増殖可能なプラスミドまたはウイルスベクターに導入する。
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するのに重要なファクターは以下のものを含む：ベクターを含む受容細胞を認識し、ベクターを含まない受容細胞と選別することが容易であること；特定の宿主における望まれるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターが「行き来」できることが望まれるか否か。好ましい原核細胞ベクターは、以下のプラスミドを含む。たとえば、pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184などのE.coliで複製可能なプラスミド（25）；たとえば、pC194、pC221、pT127などのBacillusのプラスミド（26）；pIJ101を含むStreptomycesのプラスミド（27）；たとえばIC31などのStreptomycesのバクテリオファージ（28）、およびPseudomonasのプラスミド（29、30）を含む。
好ましい真核細胞のプラスミドには、BPV、ワクシニア、SV40、２ミクロン環状物等のプラスミドまたはそれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当業者に周知である（31〜35）。
構築物を含有するDNA配列またはベクターを発現用に調製すれば、この発現ベクターを種々の適切な手段のいずれかで適切な宿主細胞に導入してもよい。この手段としては、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等が挙げられる。
本発明に用いる宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。好適な原核細胞宿主としては、バクテリア、たとえば、E.coli、Bacillus、Streptomyces、Pseudomonas、Salmonella、Serratia等が含まれる。最も好ましい原核細胞宿主はE.coliである。とくに有用なバクテリアの宿主は、E.coli K12株 294（ATCC 31446）、E.coli X1776（ATCC 31537）、E.coli W3110（F-,λ-,独立栄養性（ATCC 27325））を含み、他の腸内細菌、たとえば、Salmonella typhimuriumまたはSerratia marcescensおよび種々のPseudomonasの種も含む。この条件ではタンパク質はグリコシル化されない。原核細胞宿主は、発現プラスミド中のレプリコンおよびコントロール配列と和合性がなければならない。
好ましい真核細胞宿主は、哺乳動物細胞、たとえば、ヒト、サル、マウス、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。なぜならば、これらはタンパク質分子の翻訳後修飾の機能を有しており、正しい折りたたみ、正しいジスルフィド結合の形成、ならびに正しい部位のグリコシル化が行われるからである。酵母細胞および昆虫細胞もまた翻訳後ペプチド修飾を行うことができ、高いマンノース含量のグリコシル化を含む。組換えDNA戦略は多数あり、強力なプロモーター配列と多コピー数のプラスミドを用いて、酵母細胞における、および昆虫細胞における所望のタンパク質の産生に利用できる。酵母細胞は、クローン化された哺乳動物遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する。ベクターを導入した後、宿主細胞を選択培地で生育させ、生育してくるベクター含有細胞を選択する。クローン化された遺伝子配列が発現すると、本発明の抗体、融合タンパク質、またはムテインもしくはこれらの活性画分が産生される。ついで、発現した抗体は単離され、精製される。単離、精製法としては、たとえば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等の通常用いられるあらゆる方法、またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
本明細書において用いる、「ムテイン」という用語は、本発明の抗体の類似体を意味し、本発明の抗体またはそれらの活性画分の１または２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換され、あるいは欠失し、または１または２以上のアミノ酸残基が本発明の抗体のオリジナルの配列に付加されているが、生じた産物の活性は野生型の抗体またはそれらの活性画分と比較しても大きく変化していないものをいう。これらムテインは公知の合成方法および／または部位特異的突然変異技術、もしくは公知の適切な方法のいずれかで調製される。
これらのムテインはいずれも、好ましくは、本発明の抗体またはその活性画分と実質的に同様の活性を有するほど本発明の抗体のアミノ酸配列と充分に重複するアミノ酸配列を有している。本発明の抗体の１つのグループは、ヒトIFN-α2およびヒトIFN-βの抗ウイルス活性をブロックできる。本発明の抗体のもう１つのグループはヒトIFN-α2の抗ウイルス活性はブロックできるが、ヒトIFN-βの活性はほぼ完全に残っている。したがって、得られたムテインのいずれもが、本発明の抗体と実質的に同じ活性を有しているかどうかは、このようなムテインを、たとえば、単純な抗ウイルスアッセイにかけることからなる通常の実験方法で決定できる。Ｉ型インターフェロンのどの種をもブロックするムテインは本発明の抗体の充分な活性を保持し、それゆえ、本発明の抗体の少なくとも１つの開示した有用性を有しているので、実質的に同様の活性を有する。
好適な実施態様においては、このようなムテインのいずれもが、本発明の抗体の１つの配列と40％以上の同一性または相同性を有している。より好ましくは、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または最も好ましくは、90％以上の同一性または相同性を有している。
本発明に使用できる本発明の抗体のムテインまたはそれらの活性画分、またはそれらをコードする核酸は、置換されるペプチドまたはポリヌクレオチドの配列に実質的に相当する配列の限定されたセットを含む。前記配列は、本明細書の教示および指針にもとづいて、当業者が過度の実験を行うことなく、通常の方法で作製することができる。タンパク質の化学と構造の詳細な記述については、シュルツ ジーイー（Schulz G.E.）ら、Principles of Protein Structure、スプリンガー−バーラグ（Springer-Verlag）、ニューヨーク、1978；およびクレイトン、ティーイー（Creighton,T.E.）Proteins：Structure and Molecular Properties、ダブリュー エイチ フリーマン社（W.H.Freeman & Co.）、サンフランシスコ、1983を参照のこと。これらは本明細書に参考として援用する。核酸配列の置換に関する報告は、たとえば、コドンの選択、アウスベルら、同上§§A.1.1〜A 1.24、およびサムブルック（Sambrook）ら、同上の付録CおよびDを参照のこと。
本発明によれば、ムテインの好ましい変化は「保存的」置換として知られている。本発明の抗体、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの活性画分の保存的アミノ酸置換は、あるグループ中の同族のアミノ酸を含み得る。同族のアミノ酸は充分に類似した物理化学的性質を有し、そのグループのメンバー間における置換はその分子の生物学的機能を保存する（グランサム（Grantham）、Science,Vol.185,pp.862-864（1））。また、先に定義した配列に、それらの機能を変えることなく、アミノ酸の挿入および欠失を行い得ることは明らかであり、とくに挿入または欠失に少数のアミノ酸のみが関与する場合、たとえば、30以下、そして好ましくは10以下の場合、機能的なコンフォメーションに対して決定的なアミノ酸、たとえばシステイン残基を取り除かないか置換しないのであれば可能である（アンフィンセン（Anfinsen、「タンパク質鎖の折りたたみを支配する原理（Principles That Govern The Folding of Protein Chains）」、Science,Vol.181,pp.223-230（1973））。このような欠失および／または挿入によって調製されるタンパク質およびムテインは本発明の範囲内にある。
好ましくは、同族のアミノ酸のグループは表Ｉに示すとおりである。より好ましくは、同族のアミノ酸のグループは表IIに示すとおりであり、最も好ましくは、同族のアミノ酸のグループは表IIIに示すとおりである。
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本発明の抗体のムテインまたはそれらの活性画分を得るために用いることができるタンパク質中のアミノ酸の置換を行う具体例は、あらゆる既知の方法工程を含み、たとえば、マーク（Mark）らの米国特許第RE33,653号、同第4.959,314号、同第4,588,585号および同第4,737,462号各明細書；コス（Koths）らの米国特許第5,116,943号明細書；ナメン（Namen）らの米国特許第4,965,195号明細書；チョン（Chong）らの米国特許第4,879,111号明細書；およびリー（Lee）らの米国特許第5,017,691号明細書に記載されており、リジン置換タンパク質が米国特許第4,904,584号明細書（ショー（Shaw）ら）に記載されている。
本発明の他の好適な実施態様においては、本発明の抗体のムテインまたはそれらの活性画分はいずれも、本発明の抗体のアミノ酸配列と本質的に一致するアミノ酸配列を有している。「本質的に一致する」という用語は、とくにIFN-αおよびIFN-βの活性を完全にあるいは選択的にブロックする能力が関与する範囲で、天然のタンパク質の基本的な性質に影響を与えない、天然のタンパク質の配列に対するマイナーな変化を有するタンパク質を包含することを意図する。一般的に「本質的に一致する」という表現に含まれると考えられる変化のタイプは、これらの抗体をコードするDNAの従来の変異技術から生じる変化であり、少しのマイナーな修飾を生じ、前記方法で所望の活性についてスクリーニングされる。
本発明のムテインは、本発明の抗体をコードするDNAまたはRNAによってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（たとえば、DNAまたはRNA）によってコードされるタンパク質を包含する。本発明はまた、所望の核酸の同定および精製のためのプローブとしても有用な核酸を包含する。さらにこのような核酸は、本発明の抗体の機能的な活性を保持しているポリペプチドをコードしているか否かを決定するための第一の候補である。「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーションとそれに続く洗浄条件であって、当業者が通常「ストリンジェント」であるという条件をいう。アウスベルら、Current Protocols in Molecular Biology,同上、インターサイエンス、ニューヨーク、§§6.3および6.4（1987,1992）ならびにサムブルック（Sambrook）ら、同上を参照のこと。以下に限定されないが、ストリンジェントな条件の具体例は、洗浄条件が12〜20℃で、ハイブリッドのTmの計算値以下であり、実験では、たとえば、2*SSCおよび0.5% SDSで5分間、2*SSCおよび0.1% SDSで15分間、0.1*SSCおよび0.5% SDS、37℃で30〜60分間、ついで0.1*SSCおよび0.5% SDS、68℃で30〜60分間である。当業者には、ストリンジェント条件もDNA配列、オリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、10〜40塩基）あるいは混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することが理解される。混合プローブを用いる場合、SSCの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を用いることが好ましい。アウスベル、同上を参照。
「融合タンパク質」という用語は、本発明の抗体もしくはそれらの活性画分またはそれらのムテインを含むポリペプチドであって、他のタンパク質（たとえば、体液中での持続時間が長くなったタンパク質）と融合したポリペプチドをいう。したがって、前記抗体またはそれらの活性画分は、他のタンパク質、ポリペプチド等と融合され得る。
本明細書における「塩」という用語は、本発明の抗体、それらの活性画分、ムテインまたはそれらの融合タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は当業者に公知の手段で形成され得る、たとえば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩または亜鉛塩等の無機塩、およびたとえば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカイン等のアミン類との塩などの有機塩基との塩を含む。酸付加塩は、具体的には、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、たとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。もちろん、これらの塩のいずれも本発明の抗体またはそれらの活性画分と実質的に同様の活性を有していなければならない。
本明細書において用いる「機能的誘導体」は、本発明の抗体またはそれらの活性画分の誘導体、ならびにそれらのムテインおよび融合タンパク質を包含する。前記機能的誘導体は、残基の側鎖として生じる官能基またはN末端の基もしくはC末端の基から当該技術分野で公知の方法で調製してもよく、薬学的な許容可能性を保持している限り、すなわち本発明の抗体の活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊することなく、前記機能的誘導体を含む組成物が毒性を生じることがない限り、本発明に含まれる。これらの誘導体は、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含んでいてもよく、それによって抗原部位をマスクし、本発明の抗体またはそれらの活性画分の体液中における持続時間を延長し得る。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第１級アミンもしくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基あるい炭素環式アロイル基）とアミノ酸残基の遊離のアミノ基とで形成されるN−アシル誘導体あるいは、遊離のヒドロキシル基（たとえば、セリル残基あるいはスレオニル残基のヒドロキシル基）とアシル部分とで形成されるO−アシル誘導体を含む。
本発明の抗体、ムテインおよび融合タンパク質の「活性画分」として、本発明では、本発明の抗体のポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントもしくは前駆体、または本発明の抗体の前記フラグメントのいずれかを含む融合タンパク質を包含し、これらは単独でもよく、また、関連する分子またはこれらに結合する残基、たとえば、糖残基またはリン酸塩残基と結合したものでもよく、または前記いずれかの抗体の凝集体であって、本発明の抗体と実質的に同様の活性を有するものを含む。
さらに本発明は医薬組成物に関し、この組成物は薬学的に許容し得る担体と本発明の抗体またはそれらの活性ムテイン、融合タンパク質およびそれらの塩、それらの機能的誘導体もしくは活性画分を含む。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはその誘導体と、生理学的に許容し得る担体、および／または安定剤および／または賦形剤とを混合することにより、投与形態に調製され、たとえば、投与バイアル中で凍結乾燥して投与形態に調製される。投与方法は、同様の薬剤の投与についての許容される方法のいずれでも経由でき、処置されるべき条件に依存して、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下に、局所注入もしくは局部適用、または連続注入等により行われる。投与される活性化合物の量は、投与経路、処置すべき疾患および患者の状態に依存する。たとえば、局所注射は静脈注入に比べて、体重当りより低いタンパク質の量しか必要としない。
本発明の抗体は、IFN-αが異常に発現している、たとえば、Ｉ型糖尿病、種々の自己免疫疾患、移植拒絶、エイズおよび類似の疾患において、種々のIFN-αサブタイプの生物学的活性をモジュレートするまたはブロックするのに有用である。すなわち、本発明の抗体は、過剰のIFN-αが内因的に産生されるか外因的に投与されるようなあらゆる状態に使用され得る。
したがって、本発明の抗体、ヒト化抗体、これらの活性画分、ムテイン、融合タンパク質およびそれらの塩、機能的誘導体、ならびにそれらの活性画分、自己免疫疾患の治療用に、他の哺乳動物の炎症用に、インターフェロンαまたはインターフェロンβの投与により引き起こされる毒性の処置用に、若年性糖尿病用に、全身性エリテマトーデス用におよびエイズ用に処方される。
以下、実施例にもとづいて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１：IFNAB-BPを用いたマウスの免疫およびミエローマ細胞を用いた融合
雌性Balc/Cマウス（３月令）に、まず完全フロインドアジュバントのエマルジョン中の２μｇの精製したIFNAB-BPを注射し、３週間後不完全フロインドアジュバント中の２μｇの精製したIFNAB-BPを皮下注射した。さらに５回の注射を、10日間隔で、PBS中で皮下的に行った。これらマウスの血清はIsRIAにより決定したように結合力価１：100,000を有していた（以下、参照）。前記抗血清は、以下の手順によって決定したように、IFN-αおよびIFN-βの両方の抗ウイルス活性をブロックした。96ウェルプレート中の予備的に形成した単層のヒトWISH細胞を２倍希釈した抗血清（またはモノクローナル抗体）とともに2時間37℃でインキュベートした。ついで、IFN-α２またはIFN-β（10U/ml最終；NIH標準に対して較正した）を全てのウェルに加え、プレートをさらに4時間インキュベートした。前記細胞を水疱性口内炎ウイルス（VSV）で刺激し、IFNを欠いたコントロールウェル中に完全な細胞変性効果が認められるまで一晩インキュベートした。50%CPEを示すウェル中に抗体の中和力価を９単位／mlとして得た。したがって、１ブロッキング単位／mlはこれらのアッセイ条件下でIFNの１U/mlの活性をブロックするのに必要な抗体濃度である。免疫したマウスの血清はIFN-α２およびIFN-βの両方に対して120,000U/mlの中和力価を有していた。
ついで精製したIFNAB-BPの最終的なブースターは融合の４日前および３日前に腹腔内に行った。融合はNSO/1ミエローマ細胞系と、融合パートナーとして免疫したマウスの脾臓およびリンパ節の両方から調製したリンパ球を用いて行った。融合細胞は96ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマをHATおよび15%ウマ血清を添加したDMEM中で選択した。
実施例２：ハイブリドーマのスクリーニングおよびモノクローナル抗体の特徴付け
抗IFNAB-BPモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは以下のように行った。ハイブリドーマ上清を以下のように逆固相ラジオイムノアッセイ（sRIA）により抗IFNAB-BP抗体の存在について試験した。PVCマイクロタイタープレート（ダイナテック  ラボラトリーズ（Dynatech Laboratories）、アレクサンドリア、バージニア）をアフィニティで精製したヤギ抗マウス血清F（ab）2抗体（ジャクソン  ラブズ（Jackson Labs）、米国）（10μｇ/ml、100μｌ/ウェル）を用いてコートした。４℃で一晩インキュベートしたのち、プレートをBSA（0.5%）およびTween20（0.05%）を含有するPBSで２回洗浄し、少なくとも２時間37℃で洗浄溶液中でブロックした。ハイブリドーマ培養上清（100μｌ/ウェル）を加え、前記プレートを４時間37℃でインキュベートした。ついでこのプレートを３回洗浄溶液で洗浄し125I-IFNAB-BP（100μｌ、105cpm）を加えさらに16時間４℃でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、個々のウェルを切り離し、ガンマーカウンター中で計測した。ネガティブコントロール値よりも５倍以上高いカウントを示すサンプルをポジティブとした（表IV）。全てのポジティブクローンを選択しサブクローンした。個々のサブクローンを、プリスタンで腹水の生成を活性化しているBalb/Cマウスに注射した。イムノグロブリンを腹水液から硫酸アンモニウム（50%飽和）で沈殿させることにより単離した。抗体のイソタイプを市販のELISAキット（アマシャム（Amersham）、イギリス（UK））を用いて定義した。
種々のモノクローナル抗体、すなわちハイブリドーマ上清、濃縮したハイブリドーマ上清、腹水液または腹水液由来のイムノグロブリンとしての各々のモノクローナル抗体について、免疫したマウスの血清について前記したように、IFN-α２およびIFN-βの受容体をブロックし、IFN-α２およびIFN-βの抗ウイルス活性を妨害するこれらの抗体の能力に関してさらに試験した。結果を表IVに示す。このように、モノクローナル抗体16.3、53.2および392.1はIFN-α２およびIFN-βの両方の抗ウイルス活性を類似の力価でブロックすることが確認されたが、モノクローナル抗体35.9、51.44および234.14のIFN-α２に対する力価はIFN-βに対するこれら抗体の力価よりも有意に高いことが確認された。これは予期しないことであった。したがって、モノクローナル抗体35.9、51.44および234.14は、ある濃度範囲で、IFN-βの活性には影響を与えずにIFN-αの活性を選択的にブロックするために用い得る。
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実施例３：IFNAB-BPIIのELISA試験へのモノクローナル抗体の使用
マイクロタイタープレート（ダイナテックまたはマクシソルブ（Maxisorb）、ビーヌンク（bNunc））を抗IFNAB-BPモノクローナル抗体を用いて一晩４℃でコートした。第一のコーティングはモノクローナル抗体No.46.10（Ig画分、120μｇ/ウェル、10μｇ/ml PBS中）を用いても行うことができる。モノクローナル抗体No.46.10は欧州特許出願公開第676,413号明細書に記載されている。
前記以外に、モノクローナル抗体No.117.7を第１のコーティングに用いてもよい。前記プレートをBSA（0.5%）、Tween20（0.05%）およびNaN3（0.02%）を含有するPBS（ブロッキング溶液（Blocking Solution））で洗浄し、同溶液中で一晩37℃でブロックした。供試サンプルを0.1%NP40および0.65M NaClを含有するブロッキング溶液中で段階的に2倍希釈し（１：４から開始）、ウェル（100μｌ/）に加え４時間37℃でインキュベートした。ついで前記プレートを３回0.05％Tween20含有PBS（PBS／Tween）で洗浄し、続いてビオチンをつけたモノクローナル抗体No.234.14（NaN3を含まないブロッキング溶液中１：1000、100μｇ/ウェル）を加え、さらに一晩４℃でインキュベートした。前記プレートを３回PBS/Tweenで洗浄し、（100μｇ/ウェル）、ストレプタビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼの接合物（ジャクソン  ラブズ、PBS/Tween中１：10,000、100μｌ/ウェル）を加え、２時間室温でインキュベートした。前記プレートを３回PBS/Tweenで洗浄し、各ウェルに基質としてＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホニック・アシッド、シグマ（Sigma）、10mg；6.4ml H2O；2.2mlの0.2M Na2HPO4；1.4mlの0.2Mクエン酸；１μｌのH2O2）の新たに調製した溶液100mlを加えることにより発色させた。30分で発色し、反応は0.2Mクエン酸を100μｌ/ウェルで加えることによって停止し得る。前記プレートを自動ELISAリーダーにより405nmで読み取り、630nmでの非特異的な読み取りについて補正した。このアッセイの検出の下限は30pg/mlであった。
特定の実施態様についての前記記載により本発明の一般的性質が明らかになるので、第三者は最新の知識を適用することによって、本発明の包括的な概念から逸脱することなく、前記の特定の実施態様を容易に修飾し、および／または様々な適用に適合させることができる。したがって、このような適合および修飾は開示した実施態様の均等の範囲と意味に包含されるべきであり、包含されることを意図するものである。本明細書に用いた表現または用語は開示（description）の目的のためのものであって限定目的ではないことが理解される。
ハイブリドーマ46.10、117.7および234.14は各々受託番号I-1697、I-1698およびI-1699として1996年４月23日付でパスツール・インスティチュート（Pasteur Institut）（CNCM）に寄託されている。
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