(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シス-ポリ不飽和脂肪酸及びリルゾールの少なくとも１種によって活性化された機械的感受性を有するカリウムチャンネルであることを特徴とするタンパク質であって、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
シス-ポリ不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサへキサエン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む精製された核酸分子。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載された配列のうちヌクレオチド284と1477の間に含まれる配列、またはその相補的配列を含む請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列の制御に有効である請求項４または５に記載の少なくとも１つの核酸分子を含有するベクター。
【請求項７】
請求項１または２に記載されたカリウムチャンネルであるタンパク質を産生する方法であって、
請求項４または５に記載の核酸分子、または請求項６に記載のベクターを宿主細胞内に移送する工程、および
前記カリウムチャンネルであるタンパク質の産生が可能な条件下において、前記宿主細胞を培養する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のカリウムチャンネルを発現する方法であって、
請求項４または５に記載の核酸分子、または請求項６に記載のベクターを宿主細胞内に移送する工程、および
前記カリウムチャンネルの産生が可能な条件下において、前記宿主細胞を培養する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法に包含される移送工程及び培養工程において得られる宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のリルゾール及びシス-ポリ不飽和脂肪酸の少なくとも１種によって活性化される機械的感受性カリウムチャンネルの活性調節能物質をスクリーニングする方法であって、
請求項９に記載の細胞と可変量の試験物質を接触させた後、前記試験物質が前記チャンネルの電流に対して奏する効果を測定することを特徴とする方法。
【請求項１１】
ヒトまたは動物の被験体における心臓系疾患または神経系疾患を予防または治療する能力を備えた物質のスクリーニングに応用されるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
心臓系疾患及び血管系疾患、虚血及び低酸素症に付随する神経変性疾患、ホルモン分泌異常に付随する内分泌疾患、および筋肉疾患を予防または治療する能力を備えた物質のスクリーニングに応用されるものである請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸によって活性化される新しいクラスの機械的感受性カリウムチャンネルに関するものである。本発明は、ポリ不飽和脂肪酸、更には神経保護剤であるリルゾールによっても活性化されるTWICKに関連したAA活性化K+チャンネルの為のTRAAKと呼ばれる新規な機械的感受性カリウムチャンネルの発見に基づくものである。TRAAKチャンネルファミリーの特性およびその組成分布は、これらのチャンネルに対し、多数の細胞型におけるカリウム輸送において最も重要な役割を果たしている。
【０００２】
【従来の技術】
カリウムチャンネルはどこにでも存在するタンパク質であり、優れた機能的多様性を有する為、多くの生物学的プロセスにおいて理想的な指標となっている。これらは特に、神経単位及び筋肉における興奮性の調節、心律動及びホルモン分泌に関与している。哺乳動物では、構造的に３つのタイプのカリウムチャンネルが報告されている。第１のタイプは、イオン孔の形成に関与するドメインP及び6つの膜内外セグメントを有するサブユニットで構成されている「Shaker(シェーカ)」タイプである。第２のタイプは、ドメインP及び２つの膜内外セグメントを有するIRKタイプである。第３のタイプは、２つのドメインP及び４つの膜内外セグメントを有するTWIKタイプに対応するもので、極く最近、報告されたものである。上記タイプの３つのチャンネルが同定された。即ち、TWIK-1 (Fink, M. et al. EMBO J. 15, 6854-6862 (1996)、Lesage, F. et al. EMBO J. 15, 1004-1011 (1996)、およびTREK-1 et TASK (Duprat, F. et al. EMBO J. 16, 5464-5471 (1997)である。全体構造は保たれているにもかかわらず、これらは20〜25%のアミノ酸同一性しか有していないことから、一次構造は殆ど類似していない。
【０００３】
【発明の目的および構成】
本発明は、TWIKチャンネルファミリーの一員であるTRAAKと呼ばれる新しいチャンネルの発見、及びクローニングに関するものである。上記チャンネルをコードする遺伝子は、アミノ酸配列レベルで38%のアミノ酸同一性を有するTREK-1チャンネルに対し、より一層特定的に相同性を有する。更に本発明は、上記２つのチャンネルTREK-1及びTRAAKの独特の電気生理学的特性に関するものである。実際のところ、これらのチャンネルは共に、機械的感受性チャンネルと呼ばれるチャンネルである細胞膜に加えられた張力によって、或いは特に細胞内及び細胞外伝達の基本メッセンジャーであって神経単位の興奮性の重要な調節因子であるアラキドン酸等のポリ不飽和脂肪酸を適用することによって活性化されるカリウムに対し、選択的電流を発生する（Ordway, R. W., Singer, J.J. et Walsh, J. V. 14, 96-100 (1991), Bliss, T. V. P. et Collingridge, G. L. Nature 31-39 (1993), Piomelli, D. Curr. Opin. Cell. Biol. 5, 274-280 (1993), Meves, H. Prog. Neurobiol. 43, 175-186 (1994), Piomelli, D. Crit. Rev. Neurobiol. 8, 65-83 (1994)）。更に上記チャンネルは、筋萎縮性側索硬化症患者の延命目的で臨床的に用いられる神経保護剤リルゾールによっても活性化される（Malgouris, C. et al. j. Neurosci. 9, 3720-3727 (1989), Pratt, J. et al. Neurosci. Lett. 140, 225-230 (1992)）。
【０００４】
上記新しいクラスのカリウムチャンネル及び該チャンネルの非相同的発現を立証することは、特に、上記カリウムチャンネルの活性制御へと導くものであり、ひいては、てんかん、心臓疾患（不整脈）及び血管疾患、神経変性、特に虚血及び低酸素症に付随する神経変性、ホルモン分泌異常に付随する内分泌疾患、筋肉疾患等の上記チャンネルが関与する疾病を予防または治療する能力を備えた薬物を、スクリーニングして探究する為の新規な方法を提供することが可能になる。
【０００５】
従って本発明の目的は、ポリ不飽和脂肪酸、特にアラキドン酸及びリルゾールによって活性化された機械的感受性を有するカリウムチャンネルを含有する精製タンパク質を提供することにある。より具体的には本発明は、配列番号１の配列表に記載されたアミノ酸配列を有し、TRAAKチャンネルを有するタンパク質または該タンパク質と機能的に同等な誘導体に関するものである。
【０００６】
この様な誘導体とは、TRAAKチャンネルの特性を変えない限りにおいて、１個または複数のアミノ酸残基が欠失及び／または置換及び／または付加された配列を包含するものである。上記誘導体は、TRAAKチャンネルの薬学的特性及び生物物理学的特性を実証し得る下記実施例に記載の技術に従って、当業者によって分析され得るものである。より具体的には、上記誘導体は、配列番号２の配列表に記載されたアミノ酸配列を有するTREK-1チャンネルである。
【０００７】
本発明のイオンチャンネルを有する少なくとも１つのタンパク質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、文献に記載された従来方法によって調製することができる。これらの抗体は、ヒトまたは動物の様々な組織中における本発明イオンチャンネルの存在を探究するのに有用であるが、更に、その特異性により、生体内でTRAAKチャンネル及び／または誘導体を阻害または活性化させることから、治療分野にも応用することができる。
【０００８】
更に本発明は、ポリ不飽和脂肪酸、特にアラキドン酸及びリルゾールによって活性化された機械的感受性を有するカリウムチャンネルを含有するタンパク質をコードする核酸配列を含むか、または該核酸配列によって構成される精製された核酸分子の提供も目的とするものである。より具体的には本発明は、配列番号１の配列表に記載されたアミノ酸配列を有するTRAAKチャンネルを含有するタンパク質、または該タンパク質と機能的に同等な誘導体をコードする少なくとも１つの配列を含む核酸分子に関するものである。TRAAKタンパク質をコードする配列を含むDNA分子は、配列番号１の配列表に記載された配列またはその相補的配列を有するものである。上記核酸配列は、より具体的には、配列番号１のヌクレオチド284と1477の間に含まれる配列またはその相補的配列を有するものである。
【０００９】
本発明によるもう１つの核酸配列は、配列番号２の配列表に記載されたアミノ酸配列を有するTREK-1チャンネルを含有するタンパク質、または該タンパク質と機能的に同等な誘導体をコードする少なくとも１つの配列を含むものである。TREK-1タンパク質をコードする配列を含むDNA分子は、配列番号２の配列表に記載された配列またはその相補的配列を有している。より具体的には上記核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド484と1596の間に含まれる配列を有するものである。
【００１０】
更に本発明は、配列の制御に有用な上記少なくとも１つの核酸分子を含むベクター、および本発明のイオンチャンネルを有するタンパク質の宿主細胞内での産生方法または発現方法に関するものである。上記ベクターの調製および本発明チャンネルの宿主における産生または発現は、当業者に周知な分子生物学技術及び遺伝子工学技術によって実施することができる。
【００１１】
例えば、本発明のカチオンチャンネルを有するタンパク質の産生方法は、
−本発明の核酸分子または該分子を含むベクターを宿主細胞内に移送する工程、
−上記カリウムチャンネルを有するタンパク質の産生が可能な条件下において、
上記宿主細胞を培養する工程、および
−本発明のカリウムチャンネルを有するタンパク質を適切な任意の手段で分離する工程
を包含するものである。
【００１２】
また、本発明のイオンチャンネルの発現方法とは、例えば、
−本発明の核酸分子または該分子を含むベクターを宿主細胞内に移送する工程、
および
−本発明カリウムチャンネルの発現が可能な条件下で上記宿主細胞を培養する    工程
を包含するものである。
【００１３】
上記方法に用いられる宿主細胞は、原核生物または真核生物のうち、特に細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞または昆虫細胞のなかから選択することができる。
【００１４】
本発明に用いられるベクターは、移送予定の宿主に応じて選択することができる。従って、プラスミド等の任意のベクターも含まれる。
【００１５】
更に本発明は、上記方法によって得られたTRAAKチャンネルと同じタイプの構造及び特性を有するカリウムチャンネルを発現する宿主細胞、より具体的には形質転換された細胞に関するものである。これらの細胞は、TRAAKチャンネルの電流調節能物質をスクリーニングするのにも有用である。上記スクリーニングは、本発明のチャンネルを発現する細胞と可変量の試験物質を接触させた後、必要に応じて、適切な任意の手段により、上記カリウムチャンネルの電流に対し、上記物質が奏する効果を測定することにより実施することができる。上記研究は電気生理学的技術にも応用され得、TRAAKチャンネルまたはその誘導体を用いる限り、本発明の範囲内に包含される。上記スクリーニング方法により、本発明のカリウムチャンネル活性調節能を有する薬物、ひいては、上記チャンネルが関与する疾患を予防または治療し得る薬物を同定することが可能になる。上記方法によって同定され検出される物質及び該物質を薬剤として利用する方法もまた、本発明の範囲内に包含される。
【００１６】
より具体的には本発明は、心臓疾患（不整脈）及び血管疾患、神経変性、特に虚血及び低酸素症に付随する神経変性、ホルモン分泌異常に付随する内分泌疾患、筋肉疾患等のヒトまたは動物の被験体における心臓系疾患または神経系疾患の予防または治療に有用な薬剤を調製し得る、本発明カリウムチャンネルの電流制御能を備えた化学物質または生物学的物質に関するものである。
【００１７】
更に、TRAAKチャンネルまたはその誘導体を有するタンパク質をコードする核酸分子または該核酸分子を含むベクター、およびTRAAKチャンネルを発現する細胞は、遺伝子導入動物の調製にも有用である。即ち、上記チャンネルを過剰発現する動物、特に「ノックアウト」と呼ばれる上記チャンネルが欠損した動物である。この様な遺伝子導入動物は当業者間では周知であり、TRAAKチャンネルに由来する動物の疾病研究用生体モデルが入手可能になる。
【００１８】
これらの遺伝子導入動物は、上記宿主細胞と同様、TRAAKチャンネルタイプのカリウムチャンネルが過剰発現したり、カリウムチャンネルが欠損しているので、ポリ不飽和脂肪酸によって活性化された機械的感受性を有するカリウムチャンネル由来の疾病研究用モデルとして有用である。
【００１９】
更に、TRAAK神経単位イオンチャンネルを有するタンパク質は、上記チャンネルが関与する疾病の治療または予防を目的とする医薬の製造にも有用であり得る。従って、本発明は、必要に応じて生理学的に適用可能な媒体に結合させたタンパク質の少なくとも１つを有効成分として含む薬学組成物を提供するものである。
【００２０】
更に、本発明の核酸分子または該核酸分子によって形質転換された細胞は、患者の組織レベルで、単数または複数のTRAAKチャンネルの欠失を補う目的で、遺伝子治療計画に利用され得る可能性もある。従って本発明は、更に、TRAAKチャンネル及びその誘導体が関与する疾病の治療を目的として、本発明の核酸分子または該核酸分子によって形質転換された細胞を含む薬剤を提供するものである。
【００２１】
本発明におけるその他の利点及び特徴は、脂肪酸によって活性化された上記機械的感受性を有するカリウムチャンネルの同定、及び特徴付けに導いた研究にも及ぶが、これらは、添付の配列表及び図面を参照しながら、下記実施例を参酌することによって明瞭になる。
【００２２】
Ｉ−TRAAKのクローニング、一次構造及び組織分布
BLAST配列プログラムを用い、DNA公開データバンク（Genbank及びEMBL）内において、TWIK-1チャンネルの配列と相同性を有する配列を探究した。その結果、ヒトTAGとして表わされる配列が同定されたが、これは、マウスの脳内cDNAバンクをスクリーニングするのに役立った。複数のクローンを分離し、特徴を決定した。最も長いものを配列決定した結果、下記特徴が明らかになった。
【００２３】
−分離したcDNAは、398個のポリペプチド残基をコードする1197個のヌクレオチドのフレームを含有している。ヌクレオチド及びタンパク質の配列は図1に示す通りである。
【００２４】
−上記タンパク質は、潜在的に4つの膜内外セグメント及び２つのドメインPを含有することから、これは、TWIK-1、TREK-1及びTASKチャンネルと同じ全体構造を有している。更に上記タンパク質は、これらのチャンネルと相同性を有する配列を示している。即ち、TWIK-1及びTASKとは約20〜25%の同一性を、TREK-1とは38%の同一性を有している。クローニングされた全てのカリウムチャンネル内に存在するドメインPを除き、上記タンパク質は、Shakerタイプ及びIRKタイプのチャンネルとの間に著しい配列相同性は見られない。従って、上記タンパク質はTWIK-1ファミリーに属しており、最も近い相同体はTREK-1である。これらの関係は、図２に示すタンパク質の配列レベル、および上記配列より決定される樹状図によって表される。図２は、哺乳動物を用いて実際にクローニングしたTWIKタイプの４つのチャンネルTWIK-1、TREK-1、TASK及びTRAAKの配列、および該配列から決定された樹状図であり、図中、同一残基は黒色で、保たれた残基は灰色で表している。従って、TRAAK及びTREK-1は、TWIK-1ファミリーの内部で構造的にはサブクラスを形成している。
【００２５】
−異なるオリゴヌクレオチドの配列は、TRAAK配列により決定した。これらのオリゴヌクレオチドにより、RT-PCR法による、成熟したマウス組織内のTRAAKをコードする転写の分布に関する研究が可能になる。図３に、成熟したマウス組織中のTREK-1及びTRAAKの分布をRT-PCR法で分析した結果を示す。TREK-1及びTRAAKをコードする転写フラグメントは、特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCR法によって増幅され、ナイロン膜に移された後、32Ｐで標識された内部オリゴヌクレオチドでプローブ探査されている。図３に示す様にTRAAKは、脳、小脳、脊髄及び網膜等の神経系組織中において、例外的に発現している。上記分布は、TREK-1チャンネルに最も近い相同体の分布とは全く異なっている。上記チャンネルは概ねどこにでも分布しており、非興奮性組織のみならず興奮性組織内にも存在する。
【００２６】
II−TRAAK機能の発現
機能性を研究する為に、TRAAKのコード配列をpEXOベクター内に導入して相補的RNA（cRNA）を合成した後、ツメガエルの卵母細胞内に注入した。COS細胞内で発現させる為、真核生物プロモータを制御しつつ発現ベクター内でTRAAK配列をサブクローニングし、細胞内にトランスフェクションした。卵母細胞及び対照細胞が無いときの非不活性化電流は、図4に示す様な強制電位技術で測定した。図４は、TRAAKのcRNAを導入したアフリカツメガエルの卵母細胞（a, b, c）、及びTRAAK発現ベクターでトランスフェクションしたCOS細胞（d, e, f）に電圧をかけたときに記録されたTRAAK電流の電気生理学的特性を示す図である。図４(a)では、卵母細胞は-80mVの電圧に維持されており、次いで、20mV単位で電圧を増加し、-150から+50mVまで電圧をかけたときの電流を記録した。記録は、K+を2mMまたは74mMの濃度で含有する外部媒質中で行った。(b)に、(a)と同じ手順に従ったときの電流−電圧の関係を示す。(c)に、K+の外部濃度に応じたTRAAK電流の電圧の逆数（Erev）を示す。(d)には、(a)と同じ手順に従い、TRAAKでトランスフェクションしたCOS細胞上で記録された電流を示す。(e)に、(d)と同じ手順に従い、電流−電位の関係を示す。図４に示す通り、活性化は瞬時であり、電圧をかけると、最初に記録された電流の容量性放電でマスクされている為、分解できない。電流−電位の関係は、K+の外部濃度が2mMに等しくなった時点で、退出の方向に制御される。K+の外部濃度が増加した時点で流入電流が観察される。この濃度の如何にかかわらず、電流−電位曲線は、Goldman-Hodgkin-Katz の関係に完全に準拠している。このことは即ち、TRAAK電流は、膜の各々の側におけるK+の非対称濃度に起因するもの以外による制御を受けないこと、及びTRAAKが電位に左右されないチャンネルであることを実証するものである。TRAAKチャンネルは、カリウムに対して選択的である。電流の電位の逆数は、K+の平衡電位に追従しており、K+濃度の10の変化は、Nernstの方程式によって予測されるものに合致する電位の逆数を変化させる（10毎に48.7+/-0.7mv、n=4）。
【００２７】
TRAAKの特性、活性化及び不活性化の反応速度の欠如、並びに全ての膜電位に対する開放は、所謂漏洩カリウムチャンネルの特徴を示すものである。上記タイプのチャンネルで予想される様に、卵母細胞内での発現は、強い分極に関与している。膜の休止電位は、対照用卵母細胞内における-43±2.4mV（n=7）から、トランスフェクションした卵母細胞内における-88±1.4mV（n=23）（カリウムの平衡電位に近い値である）まで移行する。同様にTRAAKは、トランスフェクションしたCOS-M6細胞内でも発現した。この系でも同様に、TRAAK電流は瞬時であり、不活性化しない。「アウトサイドアウト」構成における「パッチ」の記録は、45.5±3.7pS（n=10）に等しいTRAAKのコンダクタンス単位で示す。
【００２８】
III−TREK-1及びTRAAKは機械的感受性チャンネルを有する。
【００２９】
K+チャンネル、TREK-1及びTRAAKによって形成された構造的サブクラスは、TWIKタイプのK+チャンネルにおける独特の電気生理学特性に関与していることが立証された。実際のところ、TREK-1チャンネル及びTRAAKチャンネルは、原形質膜に加わる張力によって活性化される。この張力は、外部媒質のオスモル濃度、ひいては細胞の体積を変化させることによって間接的に、または記録用ピペット内に圧力を加えることによってより直接的に得られる。下記特徴が明らかになった。
【００３０】
図５に、TREK-1またはTASKのcRNAを導入した卵母細胞に及ぼす外部媒質のオスモル濃度の影響を示す。同図より、低張性媒質内に維持されたツメガエルの卵母細胞内TREK-1チャンネルの発現は、非不活性化電流を瞬間的に誘発することが分かる。図５(A)は、対照卵母細胞（CD8）、及びTASKまたはTREK-1を発現する卵母細胞に及ぼす高張溶液（マンニトール添加、417mOsm）の影響を比較したものである。電流は、-80から+80mVまで電圧をかけて測定される。挿入図には、高張溶液の適用前後（矢印で表わされている）におけるTREK-1電流を示す。(B)に、600msec の持続する電位勾配によって決定される電流−電位の関係に及ぼす高張溶液（スクロース添加による、434mOsm）の可逆的効果を示す。挿入図に、高張溶液によって発生する反応速度を示す。電流は80mVで測定される。同図より、マンニトールを添加して外部媒質のオスモル濃度が増加した時点で、TREK-1電流の振幅の大幅な減少が観察されるが、このことは、細胞体積に対するチャンネルの感応性を実証するものである。TASKチャンネルについては、外部媒質のオスモル濃度によって影響を受けない。
【００３１】
−図６は、トランスフェクションしたCOS細胞内において、TREK-1が機械的感受性を有するカリウムチャンネルであることを示す。即ち、同図より、TREK-1チャンネルが機械的感受性を有することが明らかにされている。図６(B)は、対照細胞（CD8）、またはTREK-1及びTASKによってトランスフェクションした細胞からの付着細胞中に得られた、0mVに維持された膜の「パッチ」内チャンネル活性（N*Po）を表す。(C)より、膜の伸長は、TASKチャンネルの活性化に影響を及ぼさない（付着細胞構成）。「パッチ」は50mVに維持されている。(D)では、TREK-1チャンネルは休止状態で無音であるが、膜に張力を加えると開放される。「パッチ」は+50mVに維持される。(E)は、膜に張力を加えると発生し、(G)に例示されたチャンネル活性の振幅を表すヒストグラムである。(F)は、TREK-1に独特のチャンネル電位と電流の関係を示す（n=6）。0と80mVの間では、81pSのコンダクタンスが算出された。(G)は、「インサイドアウト」構成における膜の伸長（30mmHg）によるTREK-1の活性化を示す。維持電位は100mVである。(H)に、TREK-1を発現する「パッチ」が電流−電位関係に及ぼす影響を示すが、多少の差こそあれ、張力が大きいと（持続時間5秒）効果が見られる。(I)は、張力によるTREK-1活性化の用量−効果曲線（n=6）を示す。この曲線は、Boltzmannの関係に準拠した実験ポイントに沿ってプロットされたものである。トランスフェクションしたCOS細胞では、休止条件下において、TREK-1活性は、付着細胞構成では検出不可能であるのに対し、TASK活性は同一条件下で、容易に測定可能である。それでも、記録用ピペットで膜に加えた圧力によって、TREK-1チャンネルの開放が始動する様になる。この様な効果は、TASKでは見られない。張力によって誘発されるTREK-1の活性化は、同様に「インサイドアウト」構成においても、即ち、「パッチ」が切除されて膜の内部面が外部媒質と再び接触状態にある場合にも同様に得られる。上記構成におけるチャンネルの活性は、膜に張力を加えない場合、同様に０となるか、または非常に弱いものである。張力による効果は漸進的であり、最大活性値の半分に等しい活性は、水銀柱23mmと等しい圧力下で検出される。一方、図6hは、伸長によって誘発される活性化は、膜の電位とは独立したものであることを示す。
【００３２】
−同様に図７は、TRAAKが伸長によって活性化されるチャンネルであることを示している。図７は、トランスフェクションしたCOS細胞内の細胞膜伸長によるTRAAK活性化を示す図であり、電流は「インサイドアウト」構成において0mVで記録される。記録用ピペットで加えた圧力をプロットの右側に示す。圧力が０または低い値では、TRAAKチャンネルは不活性である。より高い値になると、チャンネルは活性化され、電流が記録される。圧力負荷時点におけるチャンネル活性化の減少は、TREK-1の場合と同様、観察可能である。
【００３３】
IV−TREK-1及びTRAAKは、アラキドン酸及びその他のポリ不飽和脂肪酸によって活性化される。
【００３４】
膜の機械的伸長によるTREK-1チャンネル及びTRAAKチャンネルの活性化は、アラキドン酸及びその他のポリ不飽和脂肪酸を適用することにより発生するが、飽和脂肪酸を適用しても発生しない。下記特徴が明らかになった。
【００３５】
−図８は、トランスフェクションしたCOS細胞内アラキドン酸によるTREK-1の活性化を示しており、TREK-1はアラキドン酸（AA）によって活性化されることを明らかにしている。図８(A)では、TREK-1活性は、付着細胞構成中に記録される。「パッチ」は、800msecの間5秒毎に電位勾配で刺激される。電流は80mVで測定される。アラキドン酸（AA, 10μM）の適用を水平の棒線で示す。実験中、「パッチ」は、50mmHg張力（矢印に示す）による刺激を受けた。9分後に、「パッチ」を「インサイドアウト」構成で切除した。(B)に、(A)に記載の実験に対応する電流−電位関係を示す。(C)は、ピペット中の100μMのAAを用いて、付着細胞構成におけるTREK-1活性を示す。電位勾配は800msec続き、電流は80mVで測定される。(D)に、ピペットが膜上に置かれた瞬間、または「インサイドアウト」構成で「パッチ」を切除してから1分後及び20分後におけるチャンネル電位と電流の独特な関係を示す。(E)に、全細胞で記録されたTREK-1電流に及ぼすAA（10μM）の影響を示す。電流は80ｍVで測定される。(F)によれば、AAがピペット内にあるときは、全細胞で測定されたTREK-1電流に対する効果は全く見られない。電流は、800msecの電位勾配により「パッチ」（対照プロット）を破断してから30分後に測定する。その後、外部媒質内でAAを1分間適用した後（AAプロット）、電流を測定した。対照細胞（CD8）では、AAの適用による効果は見られない。膜の伸長及びAAの適用によって得られた活性化は、振幅が類似しているものの相加的なものではない。２つの活性化タイプは、付着細胞構成では抑圧されている。記録用ピペット中にAAを含有するとき、「インサイドアウト」構成において「パッチ」を切除すると、再現可能な態様で、TREK-1活性が大幅に上昇する。同様に、記録用ピペット内に加わった圧力によって誘発される活性化の振幅は、「パッチ」が切除されたときには、一層大きくなる。最後に、全細胞において、内部AAはTREK-1を活性化しないことが観察された。細胞を30分もの長い周期で透析した場合、外部媒質内ではAAを適用すると数秒後に活性化が観察されたものの、内部AAによるチャンネルの活性化は全く見られなかった。これらの結果は、AAが膜の外部面上に適用された場合のみ、TREK-1を活性化することを示している。
【００３６】
−図９に、トランスフェクションしたCOS細胞内で発現されたTRAAKチャンネルに及ぼすアラキドン酸及びその他の脂肪酸の影響を示す。同図より、TREK-1と同じ要領で、TRAAKチャンネルがAAによって活性化されることが明らかになった。図９(a)は、AAの適用（10μM）後及び洗浄後において、-150から+50mVの500msecの電位勾配から得られた電流−電位関係を示す。挿入図に、20mV単位で-130から+50mVまで電位が上昇するのに伴う電流を示す。維持電位は-80mVである。(b)に、AAによるTRAAK活性化の用量−効果関係を示す。(c)に、「アウトサイドアウト」構成において、(a)の様にして得られた電流−電位関係を示す。挿入図に、20mVにおけるAAの効果を示す。(e)は、異なる脂肪酸（10μM）を適用した後に得られる電流の上昇倍率を表わすヒストグラムである。(f)は、TWIK-1、TASK、TREK-1及びTRAAKで過剰にトランスフェクションした細胞、及びTRAAKで安定した形でトランスフェクションした細胞に、AAを適用した前後の全細胞構成に記録された電流値を表すヒストグラムである。各ケース毎に上昇倍率を示す。同図より、活性化は可逆的であり、適用濃度によって左右される。同様にこの活性化は、「アウトサイドアウト」構成においても見られる。AA灌流液中に、AA代謝阻害物の混合物（リポオキシゲナーゼについてはノルジヒドログアヤレチン酸(guaiaretique)、シクロオキシゲナーゼについてはインドメタシン、エポキシゲナーゼについてはクロトリマゾール、及びAA代謝経路全体を阻害するETYA、全て10mM）が含まれているときには、AAによるTRAAKの活性化は始まらない。これらの条件下では、AAによって誘発される電流の増大は（+50mVで）6.6±0.5倍（n=3）である。AA無しの条件下で、阻害物質カクテルを投与すると、基底カリウム電流の1.7±0.4倍（n=3）の増大が観察された。この結果は、AAによる活性化が、エイコサノイドへのAAの変換を必要としないことを明らかにしている。
【００３７】
−同様に図9は、AA以外の脂肪酸がチャンネルを活性化することを明らかにしている。この活性化は、cis-ポリ不飽和脂肪酸に特異的であり、オレイン酸（C18Δ9），リノール酸（C18Δ9,12），リノレン酸（C18Δ9,12,15），エイコサペンタエン酸（EPA,C20Δ5,8,11,14,17）及びドコサへキサエン酸（DOHA,C20Δ4,7,10,13,16,19）について、10mMの濃度で見られる。パルミチン酸（C16），ステアリン酸（C18）及びアラキジン酸（C20）等の飽和酸については、効果が見られない。カルボキシル官能基がアルコール官能基（AA-OH）またはメチルエステル（AA-ME,DOHA-ME）で置換されたドコサヘキサエン酸及びAAの誘導体についても同様に、TRAAK上では活性を示さない。TRAAKに対するAAの効果は、安定してトランスフェクションした場合と同様、過剰態様でトランスフェクションした細胞上でも観察可能である（安定な独立した3つの細胞系を試験した）。
【００３８】
−最後に図９は、AAによる活性化効果は、TREK-1及びTRAAKに特異的であることを示す。同様の効果は、TWIK-1チャンネル及びTASKチャンネルでは全く見られない。
【００３９】
卵母細胞内では、TRAAKは、テトラエチルアンモニウム（TEA,1mM），4-アミノピリジン（4-AP,1mM）、及びキニン（100mM）等の如き従来のカリウムチャンネルを遮断する作用物質に対し、感受性を有しない。これに対し、Ba2+（1mM）は、+40mVで、TRAAK電流の56.7±4.6%，n=5を遮断する。
【００４０】
Ｖ−TREK-1及びTRAAKチャンネルは、神経保護剤リルゾールによって活性化される。
【００４１】
リルゾールは、筋萎縮性側索硬化症患者の延命目的で利用される神経保護剤である。図１０は、TREK-1電流、及びTREK-2と呼ばれるTRAAKリルゾ
ール、、TREK-1チャンネル及びTRAAKチャンネルを開く
ことを明らかにしている。電流−電位の関係は、図9aの場合と同様、トランスフェクションしたCOS細胞にリルゾール（100μM）を適用した前後で得られたものである。挿入図に、「アウトサイドアウト」構成で記録されたリルゾールの効果を示す。TREK-1及びTRAAKは、その活性がリルゾールにより刺激される最初のイオンチャンネルである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、TRAAKのcDNAのヌクレオチド配列及びコードされたアミノ酸配列を示す図である。
【図２】  図２は、哺乳動物を用いて実際にクローニングしたTWIKタイプの４つのチャンネルTWIK-1、TREK-1、TASK及びTRAAKの配列、および該配列から決定された樹状図である。
【図３】  図３は、成熟したマウス組織中のTREK-1及びTRAAKの分布をRT-PCR法で分析した結果を示すである。
【図４】  図４は、TRAAKのcRNAが注入されたアフリカツメガエルの卵母細胞上（a, b, c）、及びTRAAK発現ベクターでトランスフェクションしたCOS細胞（d, e, f）に電圧をかけたときに記録されたTRAAK電流の電気生理学的特性を示す図である。
【図５】  図５は、TREK-1またはTASKのcRNAが導入された卵母細胞に及ぼす外部媒質のオスモル濃度の影響をを示すものである。
【図６】  図６は、トランスフェクションしたCOS細胞内において、TREK-1が機械的感受性を有するカリウムチャンネルであることを示す図である。
【図７】  図７は、トランスフェクションしたCOS細胞内の細胞膜伸長によるTRAAKの活性化を示す図である。
【図８】  図８は、トランスフェクションしたCOS細胞内のアラキドン酸によるTREK-1の活性化を示す図である。
【図９】  図９は、トランスフェクションしたCOS細胞内で発現されたTRAAKチャンネルに及ぼすアラキドン酸及びその他の脂肪酸の影響を示す図である。
【図１０】  図１０は、TREK-1電流、及びTREK-2と呼ばれるTRAAK電流に及ぼすリルゾールの影響を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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