(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つフラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号２、４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項６】
請求項４に記載の宿主を培養し、又は生育させ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織。
【請求項８】
請求項７に記載の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切り花。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物において、花色、紫外線からの保護、微生物との共生などに影響をおよぼすフラボンの生合成を、遺伝子工学の技術を用いて、制御、利用することに関するものである。より詳しくはフラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
精神的豊かさが求められる今日、多様な花色の花々は人々の心に潤いを与えるものの１つである。また、人口増加に伴ない必要な食料増産のための１つの手段として、微生物との共生促進による植物の成長促進や、窒素固定を行なう根粒菌の増加、その結果として生じる土壌窒素含量増加による植物生産性の向上が考えられる。より環境にやさしい農業を実現するためには、無農薬、減農薬が好まれ、上記のような生物学的手段による土壌の改良や、植物自身の抗菌性の向上が必要とされる。またオゾン層破壊から植物を保護する手段として紫外線に対する防御機能の高い植物が期待されている。
【０００３】
フラボノイドは、C6-C3-C6の炭素骨格を持った一群の化合物の総称で、植物細胞に広く分布している。フラボノイドの機能としては、昆虫などのポリネーターを呼んだり、紫外線から植物体を保護したり、土壌微生物との相互作用にかかわったりすることが知られている（BioEssays, 16 (1994) Koes et al., p.123 ； Trends in Plant Science, 1 (1997) Shirley, B.W., p.377 ）。
【０００４】
フラボノイドのうちフラボンは、特にマメ科においては、根粒菌との共生の初期過程にかかわるなど、微生物との相互作用を行なう上で重要である（Plant Cell, 7 (1995) Dixon and Paiva, p.1085； Annu. Rev. Phytopathol., 33 (1995) Spaink, p.345 ）。また、花弁におけるフラボンは、昆虫に認識される役割や、アントシアニンと複合体を形成するコピグメントとして、働いている（現代化学、（1998年5 月）本田と斉藤、p.25； Prog. Chem. Org. Natl. Prod., 52 (1987) Goto,T., p.114 ）。フラボンは、アントシアニンと複合体を形成すると、アントシアニンの吸収極大値を長波長側にシフトさせる、すなわち青くすることが知られている。
【０００５】
フラボノイドの生合成経路についてはよく研究されており（Plant Cell, 7 (1995) Holton and Cornish, p.1071 ）、例えばアントシアニジン３‐グルコシドやフラボノールの生合成にかかわる酵素の遺伝子はすべて単離されている。しかしながら、フラボンの生合成にかかわる遺伝子はいまだに単離されていない。フラボンを合成する酵素には、2 ‐オキソグルタール酸に依存するジオキシゲナーゼファミリーに属する酵素（フラボン合成酵素I)とチトクロームP450ファミリーに属するモノオキシゲナーゼ酵素（フラボン合成酵素II) があることが知られている。これらの酵素は構造においてもホモロジーがなく、全く別の酵素である。
【０００６】
パセリにおいては、2-オキソグルタール酸に依存性のジオキシゲナーゼが、フラバノンの一種であるナリンゲニンからフラボンの一種であるアピゲニンを生成する反応を触媒すると報告されている（Z.Naturforsch., 36c (1981) Britsch et al., p.742； Arch. Biochem. Biophys., 282 (1990) Britsch, p.152)。もう一種のフラボン合成酵素IIは、キンギョソウ（Z.Naturforsch., 36c (1981) Stotz and Forkmann, p.737）及びダイズ（Z.Naturforsch., 42c (1987) Kochs and Grisebach, p.343 ； Planta, 171 (1987) Kochs et al., p.519 ）での存在が知られている。また、近年ガーベラで遺伝子座と花弁のフラボン合成酵素II活性に相関があることが報告されている（Phytochemistry, 49 (1998) Martens and Forkmann, p.1953）。しかし、これらのフラボン合成酵素I あるいはIIの遺伝子が単離されたり、フラボン合成酵素IIが純粋に精製された例はない。
【０００７】
マメ科カンゾウ（Glycyrrhiza echinata）の培養細胞をエリシター処理した際に誘導されるリコジオン合成活性を持つチトクロームP450タンパク質の性質が調べられている。このタンパク質によって5-デオキシフラバノンであるリクイリチゲニンの２位が水酸化され、続いて非酵素的なヘミアセタール開環が起こり、リコジオンを生成すると考えられた（Plant Physiol., 105 (1994) Otani et al., p.1427 ）。リコジオン合成酵素をクローニングするために、エリシター処理したカンゾウ培養細胞からcDNAライブラリーが作製され、チトクロームP450をコードする遺伝子断片が８種クローニングされている（Plant Science, 126 (1997) Akashi et al., p.39 ）。
【０００８】
このうち当時機能が未知であったチトクロームP450をコードする２種類の完全長cDNAが取得された。すなわち、CYPGe-3 （チトクロームP450番号CYP81E1 ）及びCYPGe-5 （チトクロームP450番号CYP93B1 、以下CYP93B1 と表記）である（Plant Physiol., 115 (1997) Akashi et al., p.1288）。さらに、昆虫の培養細胞を用いる系でCYP93B1 cDNAを発現させることにより、この遺伝子に由来する蛋白質はフラバノンの１種であるリクイリチゲニンからリコジオンを、また同じくフラバノンの１種ナリンゲニンから２−ヒドロキシナリンゲニンを合成する反応を触媒することが示された。
【０００９】
2-ヒドロキシナリンゲニンは10% 塩酸（室温、2 時間）の酸処理で、フラボンの一種であるアピゲニンに転換された。また、エリオジクチオールは、CYP93B1 を発現している酵母のミクロソームと反応させ、その後酸処理を行うことによってフラボンの一種であるルテオリンに変換された。したがってこのチトクロームP450遺伝子はフラバノン‐2 ‐水酸化酵素活性の機能をコードしていることが明らかになった（FEBS Lett., 431 (1998) Akashi et al., p.287 ）。この場合、ナリンゲニンからアピゲニンを生産するためにはCYP93B1 に加えて、さらに別の未知の酵素が必要であり、計２種の酵素が必要と考えられた。
【００１０】
しかしながら、酸処理を行うことなく、フラバノン（たとえば、ナリンゲニン）から直接フラボン（たとえば、アピゲニン）を合成する活性を有する酵素の遺伝子は、いまだに得られていない。よって、植物体において多様な作用を有するフラボンであるにもかかわらず、植物体内においてその生合成を制御し、花色をはじめとするフラボンがかかわる生体機能を改変する技術はこれまで報告されていなかった。フラバノンからフラボンへの合成を一種の酵素で行なうことができるような酵素を見出しその遺伝子を取得し、たとえばその遺伝子を植物に導入することは、フラバノンからフラボンへの合成に関わる２種の酵素の遺伝子を植物に導入するよりは、実際的であり、産業上有用である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、フラボン合成酵素遺伝子、好ましくはフラボン合成酵素II遺伝子、より好ましくはフラバノンから直接フラボンを合成する活性を有するフラボン合成酵素の遺伝子を得ることを課題とした。得られるフラボン合成酵素の遺伝子を植物に導入し、過剰発現させることで、花色を変化させることが可能である。
【００１２】
また、従来フラボンを多量に含有する花の花弁において、フラボン合成酵素遺伝子の発現をアンチセンス法やコサプレッション法で抑制することで花色を変化させることも期待できる。さらに、フラボンのもつ抗菌作用や土壌微生物との相互作用への影響に着目し、適当な器官においてフラボン合成酵素の遺伝子を発現させることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物との共生促進によるマメ科植物の窒素固定能の向上、紫外線や光に対する防御効果などが期待される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、フラバノンから直接フラボンを合成することができるタンパク質をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子は、具体的には、フラバノンからフラボンを単独の酵素による反応で合成することができるフラボン合成酵素II（以下、フラボン合成酵素IIと称する）をコードする遺伝子である。
【００１４】
より具体的には、本発明は、配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するP450タンパク質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して55% 以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号：１，３又は７のいずれかに記載の塩基配列の一部または全部に対して、５ x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得られる、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はさらに、前記いずれかの遺伝子を含んでなるベクター、特に発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明はまた、上記のベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらに、上記いずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
本発明はさらに、上記の宿主を培養し、又は生育させ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記いずれかの遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織、例えば切り花を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子を用いてフラボノイド成分と量を変更する方法；前記の遺伝子を用いてフラボン量を変化させる方法；前記の遺伝子を用いて花の色を変える方法；前記の遺伝子を用いて花の色を青くする方法；前記の遺伝子を用いて花の色を赤くする方法；前記の遺伝子を用いて植物の光感受性を改変する方法；並びに前記の遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
カンゾウのCYP93B1 遺伝子にコードされるフラバノン- ２- 水酸化酵素が、フラバノンを基質として2-ヒドロキシフラバノンを生成し、この生成物を酸処理することによってフラボンが生じる。本発明者らは、本発明で課題とするフラボン合成酵素IIをコードする遺伝子を得るには、このカンゾウ由来のcDNA、CYP93B1 を用い、例えばフラボンを多量に含む花のcDNAライブラリーをスクリーニングすれば、フラバノンを基質として直接フラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードするcDNAを得ることができると考えた。
【００１９】
本発明においては、フラボンを多量に含むキンギョソウのcDNAライブラリーをカンゾウ由来のcDNA、CYP93B1 をプローブとしてスクリーニングし、新たなチトクロームP450をコードするcDNAを得た（実施例１参照）。次に、こうして得られたキンギョソウのcDNA，ANFNS2と先のカンゾウのCYP93B1 cDNAを混合プローブとして用い、トレニア花弁cDNAライブラリーから新たなチトクロームP450をコードするcDNA, TFNS5 を得た（実施例２参照）。
【００２０】
このトレニア由来のcDNAを酵母で発現し、フラバノンの一種であるナリンゲニンを基質として反応させたところ、2-ヒドロキシナリンゲニンではなく、フラボンであるアピゲニンが酸処理なしに生産された（実施例３参照）。つまり、この酵素は、酸処理なしにフラバノンからフラボンを直接生産でき、この遺伝子は今までクローニングされたことのないフラボン合成酵素IIであることが証明された。また、実施例１のキンギョソウ由来のANFNS2がコードするアミノ酸配列は、TFNS5 のコードするフラボン合成酵素IIと77％の高い相同性を示し、フラボン合成酵素IIの酵素活性を示した（実施例４）。さらにシソ由来のcDNAがコードするアミノ酸配列もTFNS5 およびANFNS2とそれぞれ76％，75％の高い相同性を示すことから（実施例８）、このcDNAがコードするタンパク質もTFNS5 やANFNS2がコードするフラボン合成酵素と同様の酵素活性をもつことが類推される。
【００２１】
本発明の遺伝子としては、例えば配列表：２，４又は８のいずれかに記載するアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、もとのタンパク質と同様の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、フラバノンから直接フラボンを生成する活性を維持しているタンパク質である限り、配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号：１，３又は７のいずれかに記載の塩基配列もしくはそこに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分に対して、例えば5xSSC 、50℃の条件下でハイブリダイズし、かつフラバノンからフラボンを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸６個をコードする18塩基からなるDNA フラグメントをプローブとした場合には50℃以下の温度が好ましい。
【００２３】
このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えば、キンギョソウやトレニア、シソ由来の遺伝子が挙げられるが、他の植物、例えばリンドウやバーベナ、キク、アイリスなどの遺伝子であってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はcDNAであってもよく、ゲノムDNA であってもよい。
本発明はさらに配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して55％以上、好ましくは70％以上、例えば80％以上、場合によっては90％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラバノンからフラボンを合成する活性を示すタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。
【００２４】
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするDNA は生来の塩基配列を有するDNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発やPCR 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいDNA 断片を生来のcDNAまたはゲノムDNA の制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPCR 法を実施し、所望の修飾を導入したDNA 断片を得る。その後、この変異を導入したDNA 断片を目的とする酵素の他の部分をコードするDNA 断片と連結すればよい。
【００２５】
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするDNA を得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするDNA を所望の制限酵素により切断し、その結果得られたDNA 断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるDNA 断片を合成し、連結すればよい。
【００２６】
得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られた遺伝子がフラボン合成酵素をコードすることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝子産物であるフラボン合成酵素タンパク質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２，４又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部あるいは一部に対する抗体を用いても、フラボン合成酵素のタンパク質を得ることができ、抗体を用いて他の生物のフラボン合成酵素遺伝子をクローン化することもできる。
【００２７】
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス. スブシルス（Bacillus subtilis ）など常用の宿主を用いることができる。
【００２８】
真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属微生物、例えばサッカロミセス. セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus ）属微生物、例えばアスペルギルス. オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス. ニガー（Aspergillus niger ）、ペニシリウム（Penicillium ）属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００２９】
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばtrc プロモーター、tac プロモーター、lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC等が使用される。また動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモーター、SV40レートプロモーター等が使用される。
【００３０】
発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
前記の発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培または飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とするタンパク質を回収、精製することができる。
【００３１】
本明細書においてはキンギョソウ、トレニア及びシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIについて述べているが、チトクロームP450遺伝子はスーパーファミリーを形成しており（DNA and Cell Biology, 12 (1993) Nelson et al., p.1）、同じファミリー内のチトクロームP450はアミノ酸配列で40% 以上の相同性を有し、あるいはサブファミリー内のチトクロームP450はアミノ酸配列で55% 以上の相同性を有し、遺伝子は互いにハイブリダイズすることが知られている（Pharmacogenetics, 6 (1996) Nelson et al., p1）。
【００３２】
たとえば、チトクロームP450の一種でやはりフラボノイド合成経路に属するフラボノイド3'，5'水酸化酵素遺伝子は、最初にペチュニアから単離されたが（Nature, 366 (1993) Holton et al., p.276 ）、ペチュニアのフラボノイド3'，5'水酸化酵素遺伝子をプローブに用いて、リンドウ（Plant Cell Physiol., 37 (1996) Tanaka et al., p.711 ）、トルコギキョウ、ベルフラワー（WO93/18155 (1993) Kikuchi et al.）、ラベンダー、トレニア、バーベナ（植物の化学調節、33 (1998) 田中ら、p.55）のフラボノイド3'，5'水酸化酵素遺伝子が容易に単離されている。
【００３３】
よって、本発明に係るキンギョソウ、トレニアあるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素II遺伝子の一部または全部をプローブとして用いることによって、別種の植物から、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝子を得ることができる。また、本明細書において示したキンギョソウ、トレニアまたはシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIを精製し、常法に従って当該酵素に対する抗体を得ることにより、その抗体と反応する別のフラボン合成酵素IIのタンパク質を得、当該タンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。
【００３４】
従って、本発明はキンギョソウ、トレニアあるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝子のみに限定されるものではなく、広く他の植物由来の、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIに関するものである。このようなフラボン合成酵素II遺伝子の起源としては、ここで述べたキンギョソウ、トレニア及びシソ以外にも、リンドウ、バーベナ、キク、アイリス、シソ、ツユクサ、ヤグルマギク、サルビア、ネモフィラなどがあるが、本発明の範囲はこれらの植物に限定されるものではない。
【００３５】
さらに本発明は、フラバノンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝子を導入することにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明でクローニングしたフラボン合成酵素IIあるいはその遺伝子を用いると、フラボンを全く、あるいはわずかしか生産していない植物種、あるいは品種においてフラボンを生産することができる。花弁において本フラボン合成酵素II遺伝子を発現させることによって、花弁においてフラボンの量を増やすことができ、その結果、たとえば花の色を青い方向に改変できる。
【００３６】
また、花弁においてフラボンの合成を抑制すれば、花の色をたとえば赤い方向に改変することができる。ただし、フラボンが花色におよぼす効果は多彩であり花の色の変化はここに述べたものに限定されるものではない。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。
【００３７】
形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
【００３８】
また、フラボンは前述のようにさまざまな生理活性を有するので、植物に新しい生理活性や経済的価値を付与することができる。例えば根において本遺伝子を発現させフラボンを生産すれば、植物にとって有益な微生物の増殖を促すことができ、植物の生育を促進することができる。また、ヒトや動物、昆虫に対し生理活性を示すフラボン類を合成させることもできる。
【００３９】
【実施例】
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cloning （Sambrook et al., 1989 ）に依った。
実施例１．キンギョソウフラボン合成酵素II遺伝子のクローニング
キンギョソウ、エローバタフライ（販売名：株式会社サカタのタネ）の若いつぼみ約５ｇからRNA を抽出し、オリゴテックスによりポリA+RNA を得た。このポリA+RNA を鋳型とし、ラムダZAPII cDNAライブラリー合成キット（Stratagene社) を用いて、Stratagene社の推奨する方法（Stratagene社 Instruction Manual, Revision ＃065001）によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーをCYP93B1 のcDNA全長をプローブとしてスクリーニングした。スクリーニングならびに陽性クローンの検出は、DIG-DNA 標識検出キット（ベーリンガー社）を用いて、同社が推奨する方法を基本とし、下記のような低ストリンジェントな条件で行った。
【００４０】
すなわち、ハイブリダイゼーションバッファー（5 x SSC, 30%ホルムアミド、50 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）、1% SDS、2%ブロッキング試薬（ベーリンガー社）、0.1%ラウロイルサルコシン、80μg/mlサケ精子DNA ）を用い、42℃で2 時間プレハイブリダイゼーションを行った後、DIG 標識したプローブを加え、さらに一晩保持した。メンブレンは1% SDSを含む 5 x SSC洗浄液中、65℃で1.5 時間洗浄した。1 個の陽性クローンが得られ、ANFNS1と命名した。ANFNS1の5'末端の塩基配列を決定したところANFNS1はカンゾウCYP93B1 のコードするフラバノン‐2 ‐水酸化酵素と高い相同性を有する配列をコードしており、フラバノン‐2 ‐水酸化酵素と類似の機能をもつP450をコードするものと推測された。
【００４１】
しかし、CYP93B1 にコードされるフラバノン‐2 ‐水酸化酵素のアミノ酸配列との比較の結果、ANFNS1の cDNA は開始メチオニンから約65アミノ酸残基に相当する部分を欠く、不完全長のcDNAであると考えられた。そこで、ANFNS1の cDNA をプローブとして再度キンギョソウのcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、全長のアミノ酸配列を含むと考えられるcDNA (ANFNS2) を得た。ここで得られたANFNS2にコードされるタンパク質はカンゾウのCYP93B1 にコードされるフラバノン‐2 ‐水酸化酵素とアミノ酸レベルで53％のホモロジーを示した。ANFNS2の塩基配列を配列番号：１に示し、そしてそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４２】
実施例２．トレニアフラボン合成酵素II遺伝子のクローニング
トレニア品種（品種名称：サンレニブ、種苗法による品種登録出願番号：7433号、サントリー株式会社）のつぼみ約2gからRNA を抽出し、オリゴテックスによりポリA+RNA を得た。このポリA+RNA を鋳型とし、ラムダZAPII cDNAライブラリー合成キット（Stratagene社) を用いて、実施例１で述べたようにStratagene社の推奨する方法によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーを前述のCYP93B1 cDNAならびに ANFNS1 cDNAの混液をプローブとしてスクリーニングした。スクリーニングならびに陽性クローンの検出は、実施例1 で述べた緩い条件で行なった。
【００４３】
１種類の陽性クローンが得られ、TFNS5 と命名した。TFNS5 cDNAの全塩基配列を決定したところ、TFNS5 cDNAにコードされるタンパク質は、カンゾウCYP93B1 にコードされるフラバノン‐2 ‐水酸化酵素とアミノ酸レベルで52% の相同性を示した。また、このTFNS5 cDNAは、実施例１で得られたキンギョソウ由来のcDNA、ANFNS ２にコードされるタンパク質とは77％の高い相同性があった。決定した塩基配列を配列番号：３に示し、そしてそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００４４】
実施例３．トレニアフラボン合成酵素II遺伝子の酵母における発現
実施例２で得られたトレニアのcDNAであるTFNS5 にコードされるタンパク質の酵素活性を検出するために、以下の実験を行なった。この遺伝子の翻訳領域の外側の一部を改変して制限酵素部位を導入したセンスプライマー（5'-AAATAGGATCCAAGCatgGACACAGTCTTAA-3' ；下線、BamHI 部位；小文字、開始コドン）（配列番号：５）及びアンチセンスプライマー(5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3'；下線、XbaI部位；小文字、終始コドン）（配列番号：６）、並びにKOD ポリメラーゼ（東洋紡）を用いてPCR を行った。PCR 条件は98℃ 1分、（98℃ 15 秒、55℃ 10 秒、74℃ 30 秒）を20サイクル、74℃ 10 分である。
【００４５】
得られたPCR 産物はpBluescriptII SK‐（Stratagene社）のEcoRV 部位に導入後、制限酵素BamHI とXbaIにより消化し、酵母発現ベクターpYES2 （Invitrogen社) のBamHI-XbaIに導入した。得られたプラスミドを酵母BJ2168（日本ジーン社）へ導入した。明石らの文献に述べられた方法（FEBS Lett., 431 (1998) Akashi et al., p.287 ）で酵素活性を測定した。すなわち、得られた形質転換酵母を20 ml の選択培地（6.7 mg/ml yeast nitrogen base without amino acids  (Difco 社) 、20mg/ml グルコース、30μg/mlロイシン、20μg/mlトリプトファン、5 mg/ml カザミノ酸）で、30℃ 24 時間培養した。
【００４６】
酵母細胞を遠心して回収後、その回収酵母を発現培地（10 mg/ml酵母エキス、10 mg/mlペプトン、2 μg/mlヘミン、20 mg/mlガラクトース）で30℃、48時間培養した。この酵母を集菌後、水に懸濁し、再び集菌することにより洗浄した。ガラスビーズを用いて10分間破砕し、8,000xg 、10分間遠心した。この上清をさらに15,000xgで10分間遠心することにより粗酵素画分を得た。
【００４７】
15μg (R,S) −ナリンゲニン（30μl の2-メトキシエタノールに溶解）、1 mlの粗酵素液及び1 mMの NADPHを混合し（総反応液量1.05ml）、30℃にて 2時間反応させた。30μl の酢酸を加えて反応を停止した後、1 mlの酢酸エチルを加え、混合した。遠心分離後、酢酸エチル層をエバポレーターで乾燥させた。これを100 μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。分析は明石らの文献に依った。酸処理は、エバポレーターで乾燥させた標品を150 μl の10％の塩酸を含むエタノールに溶解し30分間攪拌した。これを1.3 mlの水で希釈し、さらに800 μl の酢酸エチルを加えて混合し、遠心後、酢酸エチル層を回収した。これを乾燥した後、200 μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。
【００４８】
カンゾウのCYP93B1 を発現している酵母ではナリンゲニンから２−ヒドロキシナリンゲニンが生じ、アピゲニンは生産されていなかった（図１、Ａ）。この反応液を酸処理することによって２−ヒドロキシナリンゲニンからアピゲニンがはじめて生じた（図１、Ｂ）。これに対して、トレニアTFNS5 を発現している酵母では、反応液の酸処理なしに、ナリンゲニンからアピゲニンが生産された（図１、Ｃ）。このことからTFNS5 はフラボン合成酵素IIをコードしていることが明らかとなった。
【００４９】
実施例４．キンギョソウフラボン合成酵素II遺伝子の酵母における発現
ANFNS2 cDNA をBamHI とSphIで消化して得られる約1400bpのDNA 断片と、SphIとBamHI で消化して得られる約350bp のDNA 断片と、BamHI とXhoIで消化したpYES2 とをライゲーションして得られたプラスミドを、実施例３に記載と同様な方法で酵母へ導入した。得られた組換え酵母を用いて、実施例３に記載と同様の方法でフラボン合成活性を測定した。キンギョソウ由来のANFNS2を発現している酵母では、酸処理無しに、アピゲニンが生産され、ANFNS2はフラボン合成酵素IIをコードしていることが明らかとなった。
【００５０】
実施例５．植物での発現ベクターの構築
実施例２で得られたトレニアのcDNA、TFNS5 を植物体へ導入するため、植物発現ベクターを構築した。まず、pBE2113 −GUS (Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuhara et al., p.49) をSacIで消化後、ブランティングキット（タカラ）を用いて、平滑末端にした後、XhoIリンカー（東洋紡）を挿入した。得られたプラスミドをHindIII とEcoRI で消化し、約3kb のDNA 断片を回収した。このDNA 断片をバイナリーベクター pBINPLUS のHindIII/EcoRI サイトに連結し、pBE2113'とした。なお、今回用いたベクターpBINPLUSは、アグロバクテリウムを介した植物への遺伝子導入の際に広く用いられているバイナリーベクターBin19 （Nucl. Acids. Res., 12 (1984) Bevan, p.8711）を、Engelen らの報告（Transgenic Research, 4 (1995) van Engelen et al., p.288 ）のように改変して得られたものである。
【００５１】
TFNS5 cDNAをBamHI/XhoI切断によってSK−ベクターから切り出し、得られた約1.7kb フラグメントを前述のバイナリーベクターpBE2113'のBamHI/XhoIサイトに連結した。このようにして得られたコンストラクト、pSPB441 は、エンハンサー配列を2 回繰り返した35S カリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下(Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuhara et al., p.49) 、TFNS5 cDNAをセンス方向に発現させるものである。
【００５２】
実施例６．トレニアの花色変化
トレニア品種（品種名称：サンレニブ、種苗法による品種登録出願番号：7433号、サントリー株式会社）を間らの方法（Breeding Science, 45 (1995) Aida et al., p.71 ）に従い、上の実施例５で構築したpSPB441 で形質転換した。得られた形質転換体の95％以上で、花の色が元株の濃い紫色から薄い紫色に変化していた。４枚の花弁のうち、左右の花弁の色を測定した。元株の花弁の色はイギリス王立園芸協会カラーチャート（The Royal Horticultural Society Color Chart ）ナンバー８９A であったが、形質転換体の花弁の代表的な色は、82C 、87D 、87C 、88D 、91A などであった。この結果、TFNS5 を植物体へ導入することにより、花色を改変できることが示された。
【００５３】
これら形質転換体の個体では、フラボンの量が宿主の５分の１から１０分の１に、アントシアニンの量が宿主の約３分の１程度に減少していた。また、宿主では検出されなかったフラボン生合成の前駆体であるフラバノン（ナリンゲニン、エリオジクチオールおよびペンタヒドロキシフラバノン）が検出された。
【００５４】
実施例７．ペチュニアでのフラボン合成酵素の発現
ペチュニア（品種名称：レボリューション・バイオレットミニ、種苗法による品種登録出願番号：9217号、サントリー株式会社）にNapoliら（Plant Cell, 2,（1990）Napoli et al., p.279）らの方法により、pSPB441 を導入した。得られた形質転換体のうち２株で、花色の変化が認められ、花色が薄くなった。元株の花色は、イギリス王立園芸協会カラーチャートナンバー88Ａであったが、これらの形質転換株では87Ａであった。また、元株ではフラボンが検出されなかったが、これら形質転換体の株ではフラボンの一種であるルテオリンが検出された。
【００５５】
実施例８．シソフラボン合成酵素II遺伝子のクローニング
赤ジソ（Perilla   frutescens）の葉からGong等の方法（Plant Mol. Biol., 35, （1997）Gong et al., p.915）で作製したλgt10（Stratagene社）をベクターにしたcDNAライブラリーを実施例１に記載したような方法でスクリーニングした。得られたファージクローン＃３をGong等の方法（Plant Mol. Biol., 35, （1997）Gong et al., p.915）にしたがって培養、DNA 調製、サブクローニングを行ない、塩基配列を決定、配列番号：７に示した。この塩基配列がコードすると推定されるアミノ酸配列を配列番号：８に示した。このアミノ酸配列は、TFNS5, ANFNS2 に対して、それぞれ76％、75％の相同性を示した。また、CYP93B1 に対しては52％の相同性を示した。
【００５６】
実施例９．シソフラボン合成酵素II遺伝子の酵母での発現
実施例８で得たファージクローン＃３を鋳型にし、ラムダアームプライマー（Stratagene社）を用い、実施例３に述べたような方法によりPCR を行なった。増幅されたDNA 断片をpBluescript KS−のEcoRV サイトにサブクローニングした。pBluescript KS−上のSalIサイト側にシソフラボン合成酵素IIcDNAの開始コドンがあるクローンを選択し、これをpFS3と称した。pFS3の挿入cDNAの塩基配列を決定し、PCR によるエラーがないことを確認した。
【００５７】
pFS3をSalIとXbaIで消化して得られる約1.8kb のDNA 断片とXhoIとXbaIで消化したpYES2 （実施例３）をライゲーションして得られたプラスミドをpYFS3 とし、これを実施例３に述べたような方法で酵母BJ2168に導入した。この組換え酵母を用いて、フラボン合成酵素活性を実施例３に述べたような方法で測定したところ、ナリンゲニンからアピゲニンの生成が認められ、シソファージクローン＃３のcDNAがフラボン合成酵素II活性をコードしていることが示された。
【００５８】
【発明の効果】
本発明のcDNAを適当な植物発現ベクターに接続し、植物に導入し、フラボン合成酵素を発現させたり、発現を抑制することにより、花色を改変出来るようになった。さらに、花弁だけではなく植物体全体または適当な器官において本フラボン合成酵素遺伝子を発現させることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物との共生促進によるマメ科植物の窒素固定能、植物の紫外線や光に対する防御効果の向上などが可能となる。
【００５９】
【配列表】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はCYP93B1 及びTFNS5 にコードされるタンパク質によって、
ナリンゲニンを基質として生じる生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
Ａ及びＢ：CYP93B1 を発現している酵母の粗酵素画分を添加したもの
Ｃ及びＤ：TFNS5 を発現している酵母の粗酵素画分を添加したもの
Ａ及びＣ：酵素画分添加による直接の生成物
Ｂ：Ａの反応後、酸処理を行った場合の生成物
Ｄ：Ｃの反応後、酸処理を行った場合の生成物
【図１】
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