(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MK遺伝子から転写された一本鎖mRNAのセグメントに結合し細胞内のMKタンパク合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを主成分として含む、血管狭窄の予防、または治療のための医薬組成物。
【請求項２】
血管狭窄が、動脈硬化、およびPTCA術後の血管再狭窄からなる群から選択される原因によるものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
次の工程を含む、血管狭窄の予防、または治療のための化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）MK発現細胞を候補化合物と接触させる工程（ｂ）MKの機能を阻害する化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管内膜肥厚に起因する疾患の治療・予防剤に関し、さらに詳しくは、ＭＫまたはその阻害剤を有効成分とする治療・予防剤に関する。
背景技術
近年、動脈硬化、特に冠動脈硬化が原因で起こる狭心症や心筋梗塞といった、虚血性心疾患の発症頻度が増加の一途を辿っている。動脈硬化の主要な病理組織像は、局所性に生ずる内膜肥厚や弾性の低下である。この結果、循環障害が生じ、心筋組織への栄養不足及び酸素不足をもたらし、上記病態を引き起こす。
内膜肥厚の病理発生に関して多数の重要な発見がある。その代表的なものが、例えば、肥厚内膜の主な構成細胞は、中膜から遊走してきた平滑筋細胞であることの発見である（Ｐａｒｋｅｒ，Ｆ．：Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，３６：１９−５３，１９６０；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｗ．Ｓ．，Ｓ．Ｐ．Ｂｉｓｈｏｐ  ＆  Ｊ．Ｃ．Ｇｅｅｒ：Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７６：２４５−２６４，１９７４）。さらに、動脈硬化の進展が、傷害に対する修復反応の結果であるとする説（Ｒｏｓｓ，Ｒ．：Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１４：４８８−５００，１９８６）は、現在においても動脈硬化の理解の基本となっている。
このような内膜肥厚による血管の狭窄部をバルーンで膨らませ、物理的に血管を拡張させる治療法、すなわち、経皮的冠状動脈形成術（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ；ＰＴＣＡ）が現在盛んに行われている。ＰＴＣＡ術は、症状改善率９０％以上という優れた効果を実現しているが、ＰＴＣＡ施行後６カ月以内に、同じ部位で３０〜６０％の頻度で再狭窄を生じている。これは、動脈壁傷害部位に対する新生内膜の形成という修復機転が過剰に生じた結果であると病理学的に認識されている（Ｎｏｂｕｙｏｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１７：４３３−４３９，１９９１；）。さらに、この新生内膜は、中膜からの血管平滑筋細胞の遊走、増殖、および細胞外マトリックス増生などによって形成されていることが明らかにされた。一方、新生内膜の形成過程における分子生物学的な機構については、次のような知見が得られている。まず血管平滑筋細胞において、収縮型から合成型への形質転換が観察される。また、細胞増殖を促す次のような物質やそのレセプターの過剰発現が報告されている。
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの各種増殖因子、
インターロイキンや腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などのサイトカイン、
アンジオテンシンＩＩ、
トロンビン
このような背景に基づいて、血管平滑筋細胞の遊走と増殖の抑制によって再狭窄が予防できると考えられた。そして動物実験で多くの薬剤の内膜増殖抑制効果が検討され、有効なものについて臨床試験が実施された。しかし、いずれの薬剤も臨床的に有効性が立証されていない（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．８６：１００−１１０，１９９２；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｗ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１３３１−１３３７，１９９４）。
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ；ＭＫ）は、レチノイン酸による胚性腫瘍細胞の分化誘導過程で、早期に発現が誘導される遺伝子の産物として発見された（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：１３１２−１３１８，１９８８）。プレイオトロフィン（ＰＴＮ；別名ＨＢ−ＧＡＭ）は、神経細胞突起伸長能をもつ結合タンパク質として、新生ラットの脳に発見された（Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．，８：２９３３−２９４１，１９８９）。ＭＫとＰＴＮは、発生過程における細胞増殖、生存、及び分化を制御するヘパリン結合性のタンパク質（Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０；Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｉｅｎｃｅ  ２５０：１６９０−１６９４，１９９０；Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．，８：２９３３−２９４１，１９８９；Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２５８２−２５８７，１９９２）であり、およそ５０％の配列相同性をもち（Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０；  Ｋｕｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８７４９−１８７５２；Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６：７９２−７９７，１９９１）、ＭＫファミリーを形成する（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．：Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，３６：１−８，１９９４）。
成熟ＭＫタンパク質は、塩基性アミノ酸とシステインに富む、１２１アミノ酸からなる分子量１３０００タンパク質で、その機能は多岐にわたり、神経細胞の生存促進、神経突起伸長、血管内皮細胞における線溶系亢進、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換、などを挙げることができる。これらに加えて、最近、ＭＫの組織再構築への関与が注目されている。すなわち、脳梗塞巣周囲のグリア細胞や、発生途上で上皮一間質間相互作用が起こるところの主に上皮側などでＭＫの発現が観察されている。
しかし、動脈硬化やＰＴＣＡ術後の血管再狭窄とＭＫタンパク質との関連性についての報告は無い。
発明の開示
本発明は、血管内膜の新生を調節するための新規な薬剤、特に動脈硬化の治療やＰＴＣＡ術後の血管再狭窄防止効果を持つ新規な薬剤の提供を課題とする。
本発明者らは、次のような知見に基づいて、血管内膜の新生におけるＭＫの役割を明らかにした。すなわち、ラットの総頸動脈の内皮傷害モデルの血管組織から調製したｍＲＮＡについて、ＲＴ−ＰＣＲ及びＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲを実施したところ、傷害後７日から１０日にかけて、ＭＫ  ｍＲＮＡの発現が増大していることを確認した。また、野生型マウス及びＭＫノックアウトマウスから作製した新生内膜形成モデルにおいて、野生型マウスの新生内膜が、ＭＫノックアウトマウスのそれに比して著名に増大していた。更に、ＭＫノックアウトマウスにＭＫを注入すると新生内膜の増大が観察された。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、血管内膜の肥厚に、ＭＫが重要な役割を果たしていると考えた。そして細胞におけるＭＫの機能を阻害することにより、対応する増殖−刺激活性が抑えられ、ＭＫが関与する動脈硬化や、ＰＴＣＡ術後の血管再狭窄防止を実現できることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の医薬組成物、並びにそのための化合物をスクリーニングする方法に関する。
（１）  ＭＫの機能を阻害する化合物を主成分として含む、血管狭窄の予防、または治療のための医薬組成物。
（２）  ＭＫの機能を阻害する化合物が、ＭＫ遺伝子から転写された一本鎖ｍＲＮＡのセグメントに結合し細胞内のＭＫタンパク合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである（１）に記載の医薬組成物。
（３）  ＭＫの機能を阻害する化合物が、ＭＫタンパク質に対する抗体、またはその可変領域を含む断片である（１）に記載の医薬組成物。
（４）  血管狭窄が、動脈効果、およびＰＴＣＡ術後の血管再狭窄からなる群から選択される原因によるものである（１）に記載の医薬組成物。
（５）  次の工程を含む、血管狭窄の予防、または治療のための化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）ＭＫ発現細胞を候補化合物と接触させる工程
（ｂ）ＭＫの機能を阻害する化合物を選択する工程
（６）  （５）に記載の方法によって選択された化合物を有効成分として含む血管狭窄の予防、または治療のための医薬組成物。
本発明は、ＭＫの機能を阻害する化合物を主成分として含む血管再狭窄の予防、または治療のための医薬組成物である。あるいは本発明は、ＭＫの機能を阻害する化合物の、血管再狭窄の予防、または治療における使用に関する。更に本発明は、ＭＫの機能を阻害する化合物の、血管再狭窄の予防、または治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。
本発明において、ＭＫの機能とは、ＭＫ遺伝子が転写され、タンパク質に翻訳されてその活性を発現する一連の過程の全てを含む。したがってＭＫの機能の阻害とは、これらの一連の過程を構成するいずれかのステップにおいてそのステップを阻害することを意味する。本発明において利用可能な化合物を具体的に示せば、たとえば遺伝子の転写とタンパク質への翻訳を阻害するＭＫ遺伝子のアンチセンス核酸やデコイ核酸、ＭＫをコードするｍＲＮＡを傷害するリボザイム、ＭＫタンパク質の活性発現に干渉するＭＫタンパク質結合性の化合物等が考えられる。
本発明者らは、ラット頸動脈の内皮傷害モデルの血管組織より調製したｍＲＮＡを試料として、ＭＫ、ＨＢ−ＧＡＭ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ；Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、Ｓｙｎｄｅｃａｎファミリー（Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−３、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−４）、ＲＰＴＰ−β（ＰＴＮの受容体の一つ）、及びグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ；ハウスキーピング遺伝子）（内部標準）についてＲＴ−ＰＣＲによってこれらのタンパク質の発現を調べた。その結果、ＭＫについては、７日から１４日にかけてｍＲＮＡ発現が増大していることが認められた（図１ａ）。またＳｙｎｄｅｃａｎ−１は、ＭＫの発現パターンと併せて３日目から１４日目にｍＲＮＡの強い発現が認められる。Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１は、ＭＫのレセプターのような働きをすると考えられているＳｙｎｄｅｃａｎファミリーの一つである。
一方、ＭＫファミリーであるＰＴＮの発現は、７日目頃に一過性に発現が増大している。また、ＰＴＮのレセプターと考えられるＲＰＴＰ−β（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２１４４６−２１４５２，１９９６）は、やはりＨＢ−ＧＡＭの発現が上昇しピークに達すると考えられる術後３日から７日にかけてｍＲＮＡが強く発現していることが認められる。内部標準としたＧＡＰＤＨは、術後の日数に関係なく一定の発現を示していることが認められる（図１ｅ）。
また、術後のＭＫの発現量の変化を、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲで調べると、ＧＡＰＤＨは、術後１４日目まで常に同様の発現量を示していることが認められる（１０５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ）のに対して、ＭＫは術後７日目に発現が１０倍増大していることが認められる（図２）。すなわち、ＭＫは、術後７日目にｍＲＮＡの発現が最高に達するような発現形式で出現することが示される。３日目、７日目、１４日目の各組織をウエスタン・ブロット解析してみると、確かにＭＫタンパク質が確認され、術後７日目にも多くの量のＭＫタンパク質が発現することが明らかである（図２）。以上の結果から、ＭＫは、そのファミリーであるＰＴＮとは、ｍＲＮＡの発現パターンを異にし、ＭＫのみが新生内膜の形成に協調した形で発現してきていると考えられる。
内皮傷害後の新生内膜の形成について（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６：４３３３−４３４２，１９９７）、１４日目のラットの血管組織をヘマトキシリン・エオジン染色してみると、内膜が形成されず、外膜の次に中膜がそのまま増大しており、血管平滑筋の増殖が確認された（図４ｂ，ｃ）。これに対し、処置を施していないラットの血管内膜部は、血管がきれいに外膜、中膜、および内膜とから形成されていた（図４ａ）。さらに、１４日目のラットの血管組織における、抗ＭＫ抗体（特願平９−２０５３３２）による免疫組織化学的染色の結果では、この増殖している血管平滑筋細胞の部分が染色された（図４ｄ）。これらの結果から、平滑筋細胞の増殖にはＭＫが関与していることが明らかである。したがって、ＭＫの機能を阻害することでＰＴＣＡ術後の再狭窄の予防を実現できると考えられる。また、ＰＴＣＡ術後の血管の狭窄と同様の機構が動脈硬化巣においても生じていると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８０１−８０９，１９９３；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｒｅｓ．，７７：４４５−４６５，１９９５）ことから、ＭＫの機能の阻害を通じて動脈硬化の予防や治療を達成することもできる。
ＭＫの機能の阻害は、たとえばＭＫタンパク質合成そのものの阻害によって達成することができる。ＭＫタンパク質合成は、ＭＫ遺伝子の転写、発現、あるいは翻訳の抑制によって阻害される。この目的のために、たとえばアンチセンス核酸やデコイ型核酸を利用することができる。アンチセンス核酸技術は、遺伝子の相補性を利用し、特定の遺伝子の発現を抑制するために、目的の遺伝子とハイブリダイズする核酸配列をもった遺伝子か、人工的に合成した短い核酸（アンチセンスオリゴ）を導入するものである。それに対し、デコイ型核酸医薬は、特定の転写調節因子の結合部位への結合を阻害し、活性化される遺伝子群の抑制を行うものである。
アンチセンス技術は、遺伝子産物を阻害する非常に特異的で効力の強い方法を提供する（Ｓｔｅｉｎ  ＆Ｃｈａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４−１０１２，１９９３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡ標的物にハイブリダイズさせると、相応する遺伝子産物の発現を多重機構で阻害することができる。「翻訳停止」状態では、標的ｍＲＮＡとオリゴの相互作用によってリボソーム複合体の作用が抑えられ、それによりｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が阻止される（Ｈａｅｕｐｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：１４２７，１９８６）。ホスホジエステルＤＮＡまたはホスホロチオエートＤＮＡオリゴの場合では、標的となるＲＮＡ配列がそのＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズすると、細胞内ＲＮａｓｅ  Ｈがその標的ＲＮＡ配列を速やかに消化することができる（Ｗａｌｄｅｒ  ＆  Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５０１１，１９８８）。ある種のオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノムＤＮＡとともに「トリプレックス」すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼによる転写が妨げられる（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：１００１３，１９９３）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には短いＤＮＡ配列であり、通常その長さは１０〜５０塩基であって、相応する標的ｍＲＮＡの特異的な領域に相補的である。標的転写物とアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対を形成する結果、高い特異性を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、標的部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの接近しやすさ、化学修飾、及び二次構造等に影響される（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：２６５９，１９８８）。
発現を抑制すべきｍＲＮＡに対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さを選択するためには、次のような要素を考慮する必要がある。まず、１０〜１５塩基のような短いオリゴヌクレオチドは、高い細胞侵入性を示す一方、遺伝子特異性が低い。これとは対照的に、２０〜３０塩基の長いオリゴヌクレオチドは、良好な特異性を示す一方、細胞への取り込み速度は、小さくなる。ｍＲＮＡ標的配列に接近する能力も重要である。たとえば標的とされるｍＲＮＡに存在するループ形成領域は、１本鎖で存在する可能性が高いためにアンチセンスオリゴヌクレオチドの接近が容易であり、標的塩基配列として有望である。これらの要素を考慮して、適切な標的配列とアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを選択することは、当業者には自明である。
本明細書における「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、またはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、もしくは他の結合により結合したアナログによって、結合したリボヌクレオチドモノマーに基づいていればよい。またそれらは、基本構造または他の修飾は変化しているが、天然に存在するＤＮＡ構造およびＲＮＡ構造に結合する能力を保持したままである、モノマー部分を有していてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法、例えば市販の機械およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄｓＢｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。これらの装置は、１００塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドをナノモル単位で合成することができる。
ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血中で、あるいは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすい。そのため好適な態様において、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であることが明らかになっているホスホロチオエート結合またはメチロホスホネート結合したアナログである（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：２６５９，１９８８）。
また、アンチセンスＲＮＡの形態でのＭＫオリゴヌクレオチドを、目的とする細胞内で標準的なＤＮＡ発現ベクターから一時的に発現させることができる。ＭＫ  ＤＮＡ配列は、標準的なプラスミドから発現ベクターへとクローニングすることができ、その発現ベクターは、内在するオリゴヌクレオチドをより高いレベルで、または、より効果的に発現できるような特性を備えている。最低限、これらの構築物は、挿入されたＤＮＡ配列の転写を開始させる真核生物のプロモーター配列を必要とする。好ましい発現ベクターは、発現を高レベルにまで誘導することができるものである。これは、適当な宿主細胞において、下流の配列の転写を増加させるような調節領域を付加することによって達成される。
例えば、ＭＫアンチセンスオリゴ発現ベクターは、プラスミドｐＨＩＬ３０１−ＭＫの一本鎖ｃＤＮＡから得られる適切な断片を増幅させるＰＣＲを利用して構築することができる。ＰＣＲ反応を行う際に好適なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列は当業者であれば適切な配列をＭＫのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＪＯ５４４７）に基づいて設定することができる。オリゴヌクレオチドの合成法および精製法は、公知である。ＰＣＲ産物は、プラスミドにサブクローニングされる。これに関連して「クローニングベクター」は、プラスミド、コスミド、または、バクテリオファージのようなＤＮＡ分子であり、それは、原核生物の宿主内で自律複製できる。クローニングベクターは、一般的に、そのクローニングベクターを用いて形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子だけでなはく、そのベクターの必須の生物機能を失わずに、外来のＤＮＡ配列が検出可能な状態で挿入され得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位を一個所または少数個所含んでいる。マーカー遺伝子は、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性の遺伝子を含む。クローニングされたアンチセンス断片は、適当な細菌細胞をクローニングベクターを用いて形質転換し、適切な抗生物質の存在下でその細菌の宿主細胞を増殖させることによって増幅される。続いて、細菌の宿主細胞に対してＰＣＲ法を行い、ＭＫアンチセンス配向クローンについてスクリーニングする。
クローニングしたアンチセンス断片は、クローニングベクターより開裂され、そして発現ベクターに挿入される。好適な発現ベクターには、一般的に、（１）細菌宿主の複製開始点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核細胞のＤＮＡ因子、（２）プロモーターのような転写の開始を調節する因子、および（３）転写の終結／ポリアデニル化配列のような転写工程を調節するＤＮＡ因子が含まれる。哺乳動物の宿主では、転写調節および翻訳調節シグナルは、好ましくは、例えば、アデノウイルス、ウシのパピローマウイルス、または類似のウイルスなどのウイルス源由来である。これらのウイルスにおいて、調節シグナルは、高レベルの発現をもたらす特定の遺伝子に関与している。好適な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオニン遺伝子といった、哺乳動物の遺伝子から得ることもできる。転写調節配列は、ＲＮＡ合成をうまく開始させることのできるプロモーター領域を含んでいる。好適な真核細胞のプロモーターには、マウスメタロチオニン１遺伝子のプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。
また、バクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのような原核細胞のプロモーターは、その原核細胞のプロモーターが真核細胞のプロモーターによって調節されるのであれば、融合遺伝子発現を調節する際に用いることができる。
哺乳動物細胞における発現に好適なベクターは、哺乳類のエンハンサープロモーター配列から高レベルの転写を提供するベクターである。クローニングされたＭＫアンチセンスベクターは、細菌宿主細胞内で増幅され、細胞から単離され、前述のようにして解析される。
アンチセンス配列を利用するためのもう一つの可能な方法は、遺伝子治療によるものである。通常レトロウイルス由来であるウイルス様ベクターは、血管肥厚組織や血管内膜へのアンチセンス構築物の取り込みおよび発現のための担体として有用であることが示されるであろう。一般的に、該ベクターは、インビボで非複製性であり、目的としない非標的細胞の感染を妨げる。このような場合、欠如している複製能をインビトロで与え、それによりアンチセンスベクターを増幅させ包み込むことができるヘルパー細胞系が供給される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＫ  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームのいかなる部分に由来するものであってもよい。好ましくは、（１）翻訳開始部位の周辺にあり、（２）ループ構造を形成する、ｍＲＮＡ配列が標的とされる。ヒトゲノムのサイズに基づく、統計解析により、およそ１４−１５塩基対の長さのＤＮＡセグメントがゲノム内に特有の配列を有していることが示されている。したがって、ＭＫ  ＲＮＡの標的配列の特異性を確実にするためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを少なくとも１４塩基、好ましくは１５塩基とするのが望ましい。したがって、本発明により企画されるオリゴヌクレオチドには、ＭＫのｃＤＮＡ配列の１−１４位、１−１５位、１−１６位、１−１７位、１−１８１位、１−１９位、２−１６位、３−１７位などに相当するヌクレオチドが含まれる。
本発明におけるＭＫの機能を阻害する化合物には、ＭＫタンパク質に結合してその活性の発現に干渉する物質を利用することもできる。このような化合物には、ＭＫ中和抗体、ヘパリン（Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９，１１５０−１１５６（１９９６）参照）、あるいはＭＫの結合部位を奪って活性を抑えるヒト・リュードカン（Ｈｕｍａｎ  Ｒｙｕｄｏｃａｎ）（Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，Ｋａｔｓｕｍｉ，Ａ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｎａｇａｓａｋａ，Ｔ．，Ｏｈｓｕｍｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１０，５９１４−５９２０（１９９６）参照）等を挙げることができる。
本発明で使用される抗ＭＫタンパク質抗体は、公知の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＭＫタンパク質抗体として、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、公知の方法に準じて作製することができる。例えばヒトＭＫのｃＤＮＡはクローニングされ、そのＤＮＡ配列とそれにコードされるアミノ酸配列が報告されている。モノクローナル抗体は、ＭＫタンパク抗原全体に対しても、或いはその一部に対しても作製することができる。特に好ましいのは、可溶性型のヒトＭＫタンパク抗原に対して作製された抗体である。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、ＭＫタンパクを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるＭＫタンパクは、ヒトＭＫについては、特開平９−９５４５４に記載のＭＫ遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＭＫは、本発明で使用される抗ＭＫ抗体取得のための抗原として使用される限りそのアミノ酸残基数を問わない。ＭＫ遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＭＫタンパクを公知の方法で精製し、この精製ＭＫタンパクを感作抗原として用いればよい。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
ＭＫを動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、ＭＫを哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、ＭＫをＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、免疫時に適当な担体を使用することができる。このようにして免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、哺乳動物から免疫細胞を取り出して細胞融合に用いる。好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、公知の各々の細胞株、例えばＰ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｋｅａｒｎｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８１：１−７，１９７８）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１５，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．＆  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）、等が好適である。
上記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は、基本的には、公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。具体的には、前記細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等が使用され、さらに、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することができる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株に好適なＲＰＭＩ  １６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を、通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングが行われる。
また、本発明では、組換え型抗体や改変抗体が使用できる。組換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．＆  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０）。改変抗体としては、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得られる（ＥＰ  １２５０２３，ＰＣＴ  ＷＯ９６／０２５７６）。
本発明で使用される抗体は、ＭＫに結合しＭＫの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
本発明において、ＭＫの機能を阻害する物質として、抗ＭＫ抗体を用いる場合の使用形態は、一般の抗体療法（例えば、静注点滴）に準じる。
ＭＫの機能を阻害する化合物を有効成分とする本発明による薬組成物は、公知の製剤学的製造法によって製剤化した後に、血管内膜肥厚に起因する疾患などの予防又は治療を目的として投与される。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）または保存剤（パラベン）等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤や、浸透圧ポンプに封入した形等で提供できる。
注射剤は、有効成分である化合物を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
経口投与用の錠剤は、有効成分である化合物に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
本発明による医薬組成物を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
本発明の医薬組成物における有効成分の含有量は、その投与形態と必要な投与量とに基づいて決定される。たとえば、経口の場合、通例容認される１日の有効経口用量は、抗ＭＫタンパク質抗体として、約０．１〜約１０００ｍｇ／日、さらに一般的には、約５０〜約２００ｍｇ／日であろう。
本発明は、血管再狭窄の予防、または治療のための化合物をスクリーニングする方法をも提供する。ＭＫの機能の阻害を通じて、血管再狭窄の予防、または治療効果が達成されることから、ＭＫの機能の阻害を指標とすることにより、有効な化合物のスクリーニングを行うことができる。ＭＫ合成の阻害について候補化合物をスクリーニングすることができるいくつかの方法がある。例えば、ＭＫの合成が盛んな数多くの細胞系が存在する。これらの細胞により産生されるＭＫのレベルは、例えば、放射免疫沈降、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡにより測定することができる。ＭＫ産生細胞を有効な候補化合物で処理することにより、ＭＫレベルの減少が引き起こされる。
また、ＭＫ活性を直接、解析することが可能である。前述のように、ＭＫのレベルが上昇した細胞系が利用可能である。これらの細胞は、また、軟寒天内コロニー形成のようなある異常な挙動により特徴づけられる。特に内皮細胞の増殖の増加を測定することができ、これはインビボの血管形成のための有用なインビトロモデルである。このような細胞を有効な候補化合物で処理することにより、細胞の挙動の変化が生じ、有用な化合物を同定するために利用することができる。前述のようなアッセイは、体内の血管内皮細胞増殖のための標準的なモデルとして有用である。選択された候補化合物は、動物モデル系でインビボの効率および安全性を試験することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］再狭窄モデルの作製
以下の方法でラット頸動脈ｂａｌｌｏｏｎ  ｉｎｊｕｒｙモデルを作製した。
１５〜２０週令の雄性ウイスターラット（体重：３５０〜４００ｇ）は、腹腔内にネンブタール５０ｍｇ／ｋｇを投与して麻酔した。ラットの四肢を固定板に固定した。頸部を正中切開し外頸動脈を剖出させた。つぎに、総頸動脈から、内頸動脈と外頸動脈に分岐する部分の外頸動脈を、２本の糸で適当な間隔をあけて一周させる。遠位部は結紮し、近位部は結紮できるようにしておく。そして、２本の糸間の外頸動脈を小さく切開した。この切開部から、２Ｆフォガテイーカテーテルを挿入し、総頸動脈までカテーテルを進め、さらにその起始部まで進めた。そして、総頸動脈の起始部で、バルーンを、生理食塩水で少し抵抗があるくらいに膨らませ、そのまま回転させながらゆっくりと頸動脈部分岐部までバルーンを引き戻した。バルーンを収縮させた後、再びカテーテルを起始部まで進め、バルーンを膨らませ引き戻す、という操作を、さらに２回繰り返した。この操作により血管内皮が剥離され、中膜平滑筋に傷害が加わり、肥厚内膜が形成される。カテーテルを引き抜くと同時に近位部の糸を結紮した。手術部を縫合して、ラット頸動脈ｂａｌｌｏｏｎ  ｉｎｊｕｒｙモデル（再狭窄モデル）を作製を完了した。ラットは麻酔から回復した後、個別のケージに戻した。
［実施例２］血管内膜肥厚とＭＫ発現との解析
再狭窄モデルを用いて、内膜肥厚とＭＫ発現との関連を、１）ＰＣＲ、２）ウエスタン・ブロット、及び３）組織形態観察により解析した。
（１）ＰＣＲによるＭＫ発現の検出
コントロール群として正常ラット（３匹）、再狭窄モデル群として、カテーテルによる傷害後、３時間、３日、７日、及び１４日経過した各モデル（各３匹）を設定した。
（ａ）ＲＴ−ＰＣＲによる血管組織の各タンパク質ｍＲＮＡの検出
コントロール群、再狭窄モデル群（３時間、３日、７日、及び１４日経過）における血管組織のＭＫ、ＰＴＮ、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−３、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−４、ＲＰＴＰ−β、及びＧＡＰＤＨ（内部標準）のｍＲＮＡ発現量を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。各組織よりｍＲＮＡを調製し、これを出発材料としてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーは、既知の部分の最適と考えられる部分を選び設定した（クラボウ株式会社）。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＭＫセンスプライマー
５’−ｇｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｇｃａｃｃｇａｇｇｃｔｔｃｔｔｃ−３’（３０ｍｅｒ）（配列番号：１）
ＭＫアンチセンスプライマー
５’−ａｃｔａｇｃａｔａａｔｃａｇｇａａｃａｔｃａｔａｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｔｔｔ−３’（４２ｍｅｒ）（配列番号：２）
ＰＴＮセンスプライマー
５’−ａｃｔｇｇｔｇｃｃｇａｇｔｇｃａａａｃａａ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：３）
ＰＴＮアンチセンスプライマー
５’−ｇａｇｔｔｔｇｃｃａｃａｇｇｇｃｔｔｇｇａ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：４）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−１センスプライマー
５’−ｇｇａｇｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｃａｔｃａａ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号：５）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−１アンチセンスプライマー
５’−ａｇｃａｃｔｔｃｃｔｔｃｃｔｇｔｃｃａａ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号：６）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−３センスプライマー
５’−ｇａｔｇａｇｃｃａｇａｇｇｔｇｃｃａｇｔ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号：７）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−３アンチセンスプライマー
５’−ｇｃｃａｃｃｔａｃｇａｔｃａｃａｇｃｔａ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号：８）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−４（ｒｙｕｄｏｃａｎ）センスプライマー
５’−ｇａａｇａｃｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｔｔｇａｇ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：９）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−４（ｒｙｕｄｏｃａｎ）アンチセンスプライマー
５’−ｔｃｔｇａｇｇｇｇａｃａｃｇｇａｔｇｃｃａ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：１０）
ＲＰＴＰ−βセンスプライマー
５’−ａｔｃｇｇａｔｃｃｃｃｇｔｔｃｔｃａａｃａｃａｔｃｃｃｔｇａａｔ−３’（３２ｍｅｒ）（配列番号：１１）
ＲＰＴＰ−βアンチセンスプライマー
５’−ｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｔａａｇｃａｔｃｔｇｇａｇａａａａｔｇｔｃｔｃ−３’（３３ｍｅｒ）（配列番号：１２）
ＧＡＰＤＨセンスプライマー
５’−ｇａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：１３）
ＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー
５’−ｇｔａｇｃｃｇｔａｔｔｃａｔｔｇｔｃａｔａｃｃ−３’（２３ｍｅｒ）（配列番号：１４）
ＰＣＲ反応は、熱変性：９４℃３０秒（１サイクル目は１分）、アニーリング：５５℃３０秒、伸長反応：７２℃３０秒をＭＫの場合２８サイクル、ＰＴＮの場合３５サイクル、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、３、及び４の場合３３サイクル、ＲＰＴＰ−βの場合３５サイクル、ＧＡＰＤＨの場合上記全ての条件のサイクル、を繰り返した。以上のＲＴ−ＰＣＲの結果を図１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に示す。
（ｂ）ｃｏｍｐｅｔｉｖｅ  ＰＣＲ（競合的ＰＣＲ）によるＭＫｍＲＮＡの定量
コントロール群、再狭窄モデル群（３時間、３日、７日、及び１４日経過）における血管組織のＭＫ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を、競合的ＰＣＲ法によって定量的に調べた（図２のａ及びｂ）。ｔａｒｇｅｔ及びｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒのバンドの濃さは目視で判定した。すべて上、下（ｔａｒｇｅｔとｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）２つのバンドがほぼ同じ濃さのものが、それぞれ中央に位置するように並べた。ＭＫについては、コントロール群（Ｃ）でｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒのコピー数が１０７でｔａｒｇｅｔと同じであったのが、３時間後では１０６と同じとむしろ減少するが、７日後には１０８と同じとなり増加している。すなわち、ＭＫでは７日後にはコントロールの約１０倍量のｍＲＮＡが発現していることが認められた。これに対し、ＧＡＰＤＨでは、コントロール群（Ｃ）、３時間後、３日後、７日後、１４日後の全てにおいて１０５と同量であり、解析に使用した各サンプル間の全ＲＮＡ量にばらつきがないことが認められた。
（２）ウエスタンブロット解析
コントロール群として正常ラット（２匹）、再狭窄モデル群として、カテーテルによる傷害後、３日、７日、及び１４日経過した各モデル（各２匹）を設定した。
血管組織でのＭＫタンパク発現量をウエスタンブロット法により解析した（図３）。図３から、再狭窄モデル作製後３時間経過においては、ＭＫタンパク発現量は、対照群と差が認められないが、７日経過においては、ＭＫ発現量は最大となり、１４日経過においては、発現量は減少しているものの、なお、対照群に比較してＭＫタンパク発現量の増加が認められる。
（３）組織形態の解析
コントロール群として正常ラット（３匹）、再狭窄モデル群として、カテーテルによる傷害後、３日（３匹）、７日（４匹）、及び１４日経過（３匹）した各モデルを設定した。
（ａ）ヘマトキシリン・エオジン染色
４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）固定液を用いて血管組織切片を作製した。全自動包埋機を使用してパラフィン包埋後、５μｍ切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（以下、Ｈ．Ｅ染色と称する）した（図４ａ、ｂ、およびｃ）。ａは対照群におけるＨ．Ｅ図を、ｂはカテーテルによる傷害後１４日経過におけるＨ．Ｅ図を、ｃはａの拡大図を、それぞれ示す。図から明らかなように、コントロール群においては、内膜の肥厚が認められなかったのに対し、カテーテルによる傷害後１４日経過した再狭窄モデルにおいては、顕著な肥厚が観察された。
（ｂ）免疫組織化学
カテーテルによる傷害後１４日経過における血管組織切片を、抗ＭＫポリクローナル抗体、及び２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて免疫組織化学染色した（図５）。図から明らかなように、新生内膜部分に著明なＭＫタンパク質の発現が認められる。
［実施例３］ＭＫノックアウトマウスの血管内膜新生に対するＭＫの影響
再狭窄とＭＫ発現との関連を、よりｉｎ  ｖｉｖｏに近い状態で調べるため、ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスを用いて、血管内膜の新生に対するＭＫの影響を調べた。ＭＫは、特開平９−９５４５４の実施例に記載の方法で作製したＭＫを用いた。
ＭＫノックアウトマウスは、ＭＫ遺伝子のエクソン２の一部と３の一部を破壊したノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）（Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９８Ｄｅｃ；３（１２）：８１１−８２２）（１２９／Ｓｖ系、１０〜１２週令の雄性（２５〜３０ｇ））を用いた。
野生型マウス（１２９／Ｓｖ系、１０〜１２週令の雄性（２５〜３０ｇ））（１０匹）、ＭＫノックアウトマウス（１０匹）、ＭＫノックアウトマウス（生理食塩水注入ポンプ植え込み）（１０匹）、ＭＫノックアウトマウス（ＭＫ注入ポンプ植え込み）（１０匹）の４群を設定した。
各群は、ネンブタール５０ｍｇ／ｋｇをマウスの腹腔内に投与し、麻酔をかけた。マウスは、総頸動脈分岐部を結紮し、新生内膜形成モデルを作製した。マウスは相対的に血圧が高いためか、血栓による完全閉塞は起こりにくく、圧負荷による刺激で新生内膜が形成される（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１７：２２３８−２２４４）。
新生内膜を病理学的に解析したところ、野生型マウスの新生内膜が、ＭＫノックアウトマウスの新生内膜に比べ、顕著に増大していることが観察された。これらの結果と、実施例１の結果から、ＭＫが血管新生内膜形成に関与している可能性が推察された。
そこで、ＭＫノックアウトマウスを、ＭＫ投与群と生理食塩水投与群（コントロール群）の２群（１群１０匹）に分け、新生内膜形成モデルを作製した。ＭＫ０．８ｍｇ／ｍＬを１００μＬ注入したポンプ（Ｍｉｃｒｏ−Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐ”ａｌｅｔ−ＭＯＤＥＬ  １００７０”：ａｌｚａ；０．５μＬ／ｈｒ．で７日間有効）、あるいは生理食塩水を注入したポンプをマウス腹部皮下に植え込み、７日で交換、１４日目まで留置した後、屠殺して血管内膜の形成状態を解析した。
血管は、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）で固定した。全自動包埋機を使用してパラフィン包埋後、５μｍ切片を作製し、Ｈ．Ｅ．染色して観察した。その結果、ＭＫ投与群は、新生内膜が、コントロール群に比較して過剰に形成されていた。この結果により、ＭＫが血管拡張術後再狭窄に関与していることが、ノックアウトマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験で間接的に証明された。
産業上の利用の可能性
本発明による医薬組成物の投与によって、動脈硬化やＰＴＣＡ術後の血管再狭窄に起因する血管の狭窄症状が効果的に予防される。あるいは本発明の医薬組成物は、進行した血管の狭窄症状を緩和するための治療用途においても有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ラットの実験的再狭窄モデルの血管組織における経時的なｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す図である。
（ａ）はＭＫの、（ｂ）はＰｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎｎ（ＰＴＮ）の、（ｃ）は、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−３、及びＳｙｎｄｅｃａｎ−４の、（ｄ）は−βの、（ｅ）はＧＡＰＤＨのそれぞれについてのｍＲＮＡの経時的な発現の変化を示す。
図２は、ラットの実験的再狭窄モデルの血管組織におけるｍＲＮＡの経時的な発現の変化を競合的ＰＣＲ法により定量的に検出した図である。ＧＡＰＤＨは内部標準として利用した。
図３は、ラットの実験的再狭窄モデルの血管組織におけるＭＫタンパク質発現量の経時的な変化をウエスタン・ブロット法によって解析した結果を示す図である。
図４のａ〜ｃは、ラットのカテーテル傷害後、１４日経過における血管組織のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ．Ｅ）染色パラフィン切片を示し、ａは対照群の１４日経過におけるＨ．Ｅ図を、ｂは再狭窄モデル作製後１４日経過におけるＨ．Ｅ図を、ｃはａの拡大図を、それぞれ示す。
図５は、ラットのカテーテル傷害後、１４日経過における血管組織の血管組織のパラフィン切片を、抗ＭＫポリクローナル抗体、及び２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて免疫組織化学染色した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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