(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックから成る基体ならびに複数の独立した反応部位を有して成り、各反応部位は基体に共有結合的に結合したリガンドを有し、反応部位間の基体表面は分析物に対して不活性である、複数の分析物のアッセイを実施するための固体状態のデバイスを製造する方法であって、
基体表面を活性化すること及び疎水性にすること、ならびに
活性化された、疎水性の表面に、水に含まれた形態のリガンドのアレイを適用して、独立した反応部位を形成すること
を含む、方法。
【請求項２】
基体の表面が一様でなく、そのことによって、リガンド−分析物の相互作用から増幅した信号を得ることが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基体の表面が、反応のためのチャンネル、畝状部、柱状部、スポット、チャンバー、ディンプル、ウェルまたはピットのアレイを有して成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
デバイスの面積が１cm2以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各反応部位の面積が１mm2以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
反応部位間の活性化された表面をブロックすることを更に含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
リガンドの適用は、活性化された表面にオルガノシランを接触させる第一の過程を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
オルガノシランが、一般式（ＲＯ）3Ｓｉ−（ＣＨ2）n−Ｘ（Ｒ：炭化水素基、ｎ：整数、Ｘ：官能基）で表わされるものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
オルガノシランへの生物学的リガンドの共有結合的な付着を促進にする二官能性架橋剤の使用を含む請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
求核性もしくは求電子性末端基をもつオルガノシランと反応させるために、光活性架橋剤を使用する請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分析物のアッセイを阻害する物質を結合するリガンドを適用することをさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、複数の分析物のアッセイを実施するための固体状態のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は複数、好ましくは多数の分析物又は分析対象（以下、多重分析物ともいう）の同時検出のためのデバイスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、構造的に異なる複数の分析物は、酵素イムノアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、酵素的な方法もしくは比色法等の特殊な方法によって分析されてきた。これらの方法は、主として、一分析物を、一試験方法で分析するものである。
【０００３】
また、分析のオートメーション化は、バッチ式あるいはランダム式アクセスアナライザーに集中してきた。それらのアナライザーでは、いくつかに分けた試験サンプルについてそれぞれ異なる試験方法を逐次利用して、多重分析がなされる。従って、この方法では、複数個の試験キットからなるパックを必要とする。加えて、いくつかの異なるタイプの装置、例えば、臨床化学アナライザー、ＨＰＬＣ、ＧＣＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析計）、自動イムノアッセイ装置、もしくは原子吸収（又は原子吸光）装置が分析に際して必要とされる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
多重分析物分析システムは、試験サンプルに含まれるいくつかの分析物の同時分析を行う手段を具備すべきである。そして、かかる分析は、試験サンプルに含まれる個々の分析物を同定し、かつ各分析物の定量を可能にする結果を提供すべきである。多重分析物分析の方法は、しばしば提案されるものの、一般的に、それらは分析物の同定及び定量について満足のいく結果を与えないものである。
【０００５】
多重分析物分析システムにおいて、典型的な基体は、それぞれが異なる結合リガンドをもつ個々の試験反応部位を複数有する。試験サンプルは、各反応ゾーンと接触し、その後、分析物を同定するために所定の検出技術が実行される。ここで重要なことは、実行された検出方法が、各分析物の定量も可能にするものであるということである。
【０００６】
多重分析物用の、生物学的に活性なリガンドをもつ空間的に分離したエリアのアレイ（または配列）を基体上に形成するために、フォトリソグラフィー（写真平版）技術を利用した方法が最も一般的になされてきた。基体は光活性（または光不安定）なリンカーで覆われる。理論的には、このリンカーは、適当な波長の光の照射後にのみ、結合リガンドに対して反応的になるべきである。空間的な分離は、基体に物理的なマスク（通常はクロムから製造される）を置くことによって可能となる。マスクの孔のパターンが基体上の結合領域のパターンを決定する。
【０００７】
各々の生物学的なリガンドが固定されるための一般的な手順は、
第一の部位へ光を照射する；
固定されるべき第一のリガンドとともに照射した基体をインキュベーションする；
ゆるく結合したリガンドを除去するために洗浄する；
光の照射によって活性化した未反応部位をブロックする；
第二の生物学的リガンドが固定されるべき領域へ光を照射する；
続いて、第一のリガンドを固定したのと同じ方法を繰り返す
である。空間的な分離は、光の照射部位の制御、即ちレーザーから得られる干渉性紫外線光源を用いて照射部位を制御するか、もしくは多数の物理的マスクと非干渉性光源と用いることによって基体上に現れる。この方法によれば、多数の生物学的リガンドを固定するためには、多くの時間が必要となる。フォトリソグラフィ−を利用する方法においてもう一つ不利な点は、高価な物理的マスクあるいはレーザー光源を必要とすることである。さらに、非特異的結合が高い割合で存在することも挙げられる。
【０００８】
例えば、アリールアジド、フルオロアリールアジド及びベンゾフェノンを使用する場合、高い割合の非特異的結合が伴ってきた。高い割合の非特異的結合は、アッセイバックグラウンドを高くし、多重分析物アッセイの各々のダイナミックレンジを著しく減少させることに繋がる。非特異的結合は、主として、活性化されていない光活性なリンカー表面に、分子がイオン間相互作用やファンデルワールス力等を通じて消極的（または受動的）に吸着するために生じるものである。
【０００９】
Ｗ０−Ａ−９５１６２０４は、高い割合の非特異的結合と関連した問題を減少させるフォトリソグラフィー技術を利用した方法について記述している。この方法において、表面にリンクする分子はアビジンであり、光活性な分子はフォトビオチンもしくはその誘導体である。非特異的結合が減少したと記載されている一方、この技術は依然として上述したような時間を消費する一連の処理を必要とする。即ち、各々異なるリガンドが固定されるために光の照射、結合、ブロッキング、および洗浄ステップが基本的に必要であると仮定すれば、２０の異なる生物学的リガンドの固定に計８０のステップが必要とされる。
【００１０】
空間的な分離は消極的な吸着によっても達成される。例えば、ＵＳ−Ａ−５４３２０９９は、イオン間相互作用、疎水性相互作用およびファンデルワールス力の組合せによる基体表面へのリガンドの結合を開示している。消極的な吸着プロセスは、温度、イオン強度及びｐＨの変化ならびに使用される基体の種類に左右されるため、その結合プロセスを制御することはより困難である。この方法の大きな欠点は、生物学的アッセイの洗浄ステップ、インキュベーションステップの間に一部の弱く固定されたリガンドが脱離しやすいことであり、それによってイントラアッセイおよびインターアッセイの精度が低下することである。
【００１１】
多くの刊行物で紹介されている架橋剤（cross-linker）またはリンカーはグルタルアルデヒドである。このリンカーは、タンパク質の機能を変えるようなタンパク質間の架橋をするという傾向を含め、多くの欠点を呈する。さらなる欠点は、結合過程が還元ステップを含むことである。そのステップは、時間のかかるものであり、かつ、還元剤として例えばナトリウムシアノボロハイドライドを用いた場合には、潜在的に非常に危険なものとなる。ヘテロ二官能性リンカーはこれまでもずっと使われてきたが、多くの場合、このリンカーは、結合されるプロテインにおいて遊離スルフヒドリル基を必要とする。このことは、固定前にタンパク質の変性を必要とするものである。
【００１２】
多重分析物アッセイにおいては、定性的及び定量的な結果を提供することが望ましい。多重分析物アッセイは、例えば抗生物質ついて行われる。これらは、主として、微生物抑制（または阻害）アッセイに基づくものである。かかるアッセイでは、サンプル中のある抗生物質がバクテリアの成長を阻害し、サンプル中に存在する抗生物質の濃度に比例してバクテリアが除去されたゾーン（a  zone  of  clearance）を形成する。しかしながら、この方法はその抗生物質を同定するための「標示」を全く提供することができず、また、この方法では抗生物質の濃度を正確に決定することができない。微生物抑制方法は、非常に遅く、方法が終了するには数日要する。
【００１３】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくはガス／液体クロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ／ＬＣＭＳ）のような化学的スクリーニング手法によって、ペニシリン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン等の各々の抗生物質のグループの構造的な相違／極性の差に適合しようとする試みもある。加えて、クロマトグラフ法においては、要求される検出限界が達成されるようなシグナル対ノイズの比となるために、手間を要するサンプル調製を必要とする。
【００１４】
市販の多重分析物用デバイスには、Ｔｒｉａｇｅ（Clinical  Chemistry  38(9):1678-1684  (1992)参照）及びＡｄｖｉｓｏｒ（Clinical  Chemistry  39(9):1889-1903  (1993)参照）が含まれる。これらのデバイスは定性分析にのみ適している。
【００１５】
Ｔｒｉａｇｅなるデバイスは、人の尿に含まれている７種の有害薬物を同時検出するパネルである。各デバイスは、一つの尿サンプルを分析することができるだけである。分析の終了時に、オペレーターは、赤いバーの有無により、各薬物を特定するテストゾーンを視覚的に検査する。アッセイ手順のすべてのステップは、オペレーターによって手動で行われる。試験結果のハードコピーも得られない。
【００１６】
Ａｄｖｉｓｏｒなるデバイスの適用対象は、Ｔｒｉａｇｅなるデバイスのそれと同様である。Ａｄｖｉｓｏｒなるデバイスは、５種類の異なるクラスの有害薬物をスクリーンする。このデバイスは凝集アッセイ原理を利用してサンプルを分析し、各薬物に対して個々のチャンネルを用いる。アッセイ手順のすべてのステップは、オペレーターによって実行される。陰性のサンプルは凝集粒子を含み、陽性薬物サンプルは凝集しない粒子のパターンを与える。
【００１７】
生物学的用途に用いるバイオセンサー／微細加工されたデバイスの大半には、基体としてシリコン（silicon）が採用されている。その他のデバイスには、ガラスや石英の基体が用いられている。シリコンは、明確な結晶面をもつ高度に制御された結晶構造を有する。シリコン基体が均一であるがゆえに、多重分析物試験デバイスの発展にとって、シリコンの選択は理想的なものとなっている。
【００１８】
しかしながら、シリコンのような色の濃い基体は、いわゆる黒体効果を与える。蛍光による検出の場合、発蛍光団は特定の波長の光を用いて励起されるが、色の濃い基体は入射する励起光エネルギーを吸収する場合もあり、その結果、発蛍光団から放出される光は減少することになる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、複数（例えば多数）の分析物のアッセイ（または検定）を実施するデバイスは、基体、複数（例えば多数）の不連続な（または独立した）反応部位を含み、各反応部位は基体に共有的に結合したリガンドを有し、反応部位の間の基体表面は分析物に対して不活性である。従って、本発明は固体状態の複数の分析物用デバイスを提供し、これは非特異的結合を殆どまたは実質的に全く示さない。
【００２０】
本発明のデバイスは、適当な基体の表面を活性化し、基体表面の不連続な部位にリガンドのアレイ（または配列）を適用、例えば形成することによって製造される。必要に応じて、その他の活性部位はブロックしてよい。リガンドは水系で適用（または塗布）してもよく、他の部分は疎水性であることが好ましい。リガンドは、リンカー（linker、例えばつなぐ機能を有するもの）を介して基体に結合されていてもよい。特に、活性化された表面を、オルガノシラン、二官能性リンカーおよびリガンドと順に反応させることが好ましい。
【００２１】
本発明の一形態として、微細加工されたシリコンもしくはセラミックの基体（または基材）に共有的結合的に固定化されたオルガノシランとの間で、非常に効率のよいカップリング反応を提供するために、二官能性リンカー、例えばヘテロ二官能性リンカーが使用される。その結果、生物学的なリガンドは、多重分析物のアレイに固定され得る。
【００２２】
本発明は、多数の個々の試験試薬キット及びいくつかの種類の装置を必要とせず、それにより、一つのサンプルで多重分析物の同時検出が可能となる。本発明は、広い範囲の化学物質または化学的性質の同時検出を提供することが可能な一つに統合された分析デバイスを提供する。加えて、試験試薬は、特別な分析パネルを形成するように、組み合わされた形態で提供される。
【００２３】
本発明では、化学的に活性化された基体に、リガンドを含む液体を微量液体ディスペンサーで供給することによって、複数の生物学的なリガンドが、空間的な境界が定められたパターンのスポットもしくはラインに固定される。生物学的なリガンドは、基体に共有結合的に付着させられる。生物学的なリガンドのカップリング効率によれば、化学反応は数分以内で完了し得る。この固定処理は、生物学的なリガンドがその生物学的な活性を、短期間でも長期間でも保持することを確保できる。
【００２４】
本発明は、また、多重分析物の形態において、幅広い分析物を同時検出するための統合された分析装置システムを提供する。この分析装置システムは多数の末端使用者にとって便利なように設計され、各試験サンプルから多重分析物の同定と定量を可能にしている。好ましい分析装置システムは、Ｘ−Ｙ方向の並進台と、サンプル取り扱い（ハンドリング）ユニット、液体取り扱い／流れ制御手段、温度が制御される暗箱、ＣＣＤカメラ、及び画像処理ソフトウェアの組み合わせからなる。並進台は、分析処理の各段階において、デバイスを位置決めするために、１０μmの精度を達成するように、ステッパー電動機と組み合わせて用いられてもよい。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明のデバイスで使用される基体は、例えば、シリコン、石英、ガラスもしくはセラミックからなるものであってもよい。セラミックの基体（例えば、酸化アルミニウム）は、蛍光的検出及び化学発光的検出法をともに首尾よく用いることができることから、シリコンの基体の優れた代替物を提供する。セラミック材料に関する結晶学は、このような基体を直ちに選択することを示していないので、これらの知見は予期されなかったものである。
【００２６】
セラミックの基体は、所定の範囲の粒状物寸法、例えば粒径（例えば、１〜３０μm）を有するきめを与えるように製造されてもよい。本発明で用いられるセラミックの基体の好ましい粒子寸法は２０μm以下、より好ましくは１０μm以下である。この小さな粒子寸法は、表面の均一性をより向上させ、ひいては、質の高い生物学的アッセイの実施を可能にする。セラミックの基体のその他の重要な特徴には、表面トポグラフィー（例えば微細構造）公差（surface  topography  tolerance）、多孔度、真空気密、および水のゼロ吸収が含まれる。
【００２７】
好ましいセラミック材料は、粒子寸法（例えば粒径）が４〜８μmの範囲にある９４％のアルミナ（Ａｌ2Ｏ3）を含むものである。この材料は、研削した場合、トポグラフィー公差が０．６〜０．８μmの表面トポグラフィー（または凹凸）を有する。表面の均一性は研磨（ポリッシング）処理によって向上させることができ、変動量が０．４〜０．５μmの表面が得られる。更なる改良は、ラップ仕上（lapping）及び研磨処理によって達成され、その場合、変動量は０．０５〜０．１μmとなる。
【００２８】
あるセラミックの基体の性能は、粒子寸法の特色に左右されることが見出された。優れたアッセイ性能は、８μmまでの粒子寸法、例えば４〜８μmの粒子寸法のセラミック材料を用いたときに得られることがわかった。そして、これより大きな粒子寸法の材料を用いたアッセイの結果はそれほど満足のいくものではないことがわかった。粒子寸法約１μmのセラミックの基体についても評価したが、４〜８μmの粒子寸法の基体を用いた場合よりもよい結果は得られなかった。非常に小さい粒子で構成されるセラミックの場合、コストがかなり高いため（約５倍）、その使用はそれほど有利ではない。
【００２９】
シリコン基体は、例えば１００nmの酸化物膜の場合は、例えば許容誤差が±２nmであるような正確な厚みの酸化物膜を用いて製造される。酸化物フィルムの厚みは、５０〜５００nmであって、好ましくは２００nm以下、より好ましくは１００nmの範囲であってよい。
【００３０】
基体は、微細加工された固体状態のデバイスの一部分として形成されてもよく、獣医学的もしくは臨床的診断へ応用できる広範なパネル試験に用いられる。各固体状態の試験デバイスは、反応領域のアレイ（配列物）を有する。各反応領域は、個々の分析物に対して特異的である。この反応領域は、スポット(spot)、チャンネルまたは溝、ディンプルまたはくぼみ、ピット、ウェルまたは井戸状のもの、チャンバーまたは小室の形状であってもよい。反応領域は、生物学的な分子を基体の上に固定することによって形成される。
【００３１】
一般に、本発明のデバイスは、面積が１cm2までである。各反応部位の面積は、一般に１mm2以下である。
【００３２】
固体である基体は、ポート（ports）、チャンバー、ウェル、ディンプル等の複雑なネットワークを提供するように加工されることが好ましい。チャンネルもしくはウェル内に柱状部（pillar）を形成することも好ましいことがある。このような凸凹は、結合した生物学的なリガンドと試験試薬との間の相互作用する表面積を最大限にするのに役立ち得、その結果、競合的免疫学的検定（イムノアッセイ）及びサンドイッチイムノアッセイ等のためのインキュベーション時間が大幅に減少する。
【００３３】
シリコンもしくはセラミックの基体にディンプルもしくはチャンネルを設ける代わりに、あるいはそれらに加えて、基体の表面は、ナノリットルからミリリットルの混合用チャンバー／リザーバー（貯蔵部）／チャンネルを設けるために、微細加工されてもよい。例えば、シリコンの表面は、酸化膜を形成するために、まず酸化される。それから、所望のパターンが形成されるようにフォトレジストの膜を付着する。酸化膜の上にパターンが形成された後、フォトレジストが取り除かれる。それから、例えばフッ化水素を使用して、シリコンにエッチングが施され、そして酸化膜が取り除かれる。最後に、シリコンウェハー全体上に酸化フィルムが均一に形成される。
【００３４】
図１において、その過程が例示されている。ステップ（i）では、シリコンウェハー（１）が酸化され、酸化膜（２）が形成される。；ステップ（ii）では、フォトレジストの膜（３）が塗布される。；ステップ（iii）では、光が照射されて酸化膜にパターンが形成される。；ステップ（iv）では、フォトレジストが取り除かれる。；ステップ（ｖ）では、ウェハー（１）にエッチング処理が施される。；ステップ（vi）では、酸化フィルムが取り除かれる。；ステップ（vii）では、連続した酸化フィルム（２ａ）が再形成される。
【００３５】
生物学的なリガンドは共有結合的に固定されることが好ましい。消極的な吸着相互作用を利用してもよいが、それは温度、イオン強度及びｐＨの変化に左右され、また、ある場合には、インキュベーション及び洗浄ステップの間に弱く結合したリガンドが解離することもあり得、そのことは、アッセイの再現性低下の原因となる。固定化された後も、生物学的リガンドは最大限の活性を有することが当然に望ましい。
【００３６】
化学的に活性化させる前に、基体の表面は十分に洗浄されるべきである。洗浄の最初のステップは、アルカリ性洗剤中での超音波処理による表面洗浄を含むことが好ましく、続いて、二回脱イオン処理された水で十分に洗浄することが望ましい。その後、基体は、クロム酸溶液で処理される。クロム酸溶液は表面をさらに浄化するとともに、図２に示すように表面のエポキシド基（またはエポキシ基）を開環させる役割をも果たす。エポキシド基は、他の方法によって開環されてもよく、例えば１時間の超音波処理によっても開環される。
【００３７】
このようにして形成される表面の水酸基は、その後、派生物の形成（または誘導化）に利用される。例えば、図３に示すように、一連の反応では、オルガノシラン、次いで二官能性リンカー、例えばヘテロ二官能性架橋剤Ｚ−Ｒ−Ｙが使用されて高い反応性を有する中間体が生成され、最後に官能性を有するリガンドが使用されてそれが共有結合的に固定される。
【００３８】
より詳しくいえば、一般式（ＲＯ）3Ｓｉ−（ＣＨ2）n−Ｘで表わされるオルガノシランにおいて、各ＲはＣＨ3もしくはＣＨ2ＣＨ3のようなアルキル基、炭化水素基またはその他のヒドロカルビル基であり、ｎは整数（例えば１〜１８）であり、Ｘはエポキシシクロヘキシル基、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＨ、ＳＨ、ｐ−クロロベンジル基、ｍ−クロロベンジル基、Ｂｒ、Ｃｌ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2、２，３−エポキシプロポキシル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓまたはｐ−クロロスルホニルフェニル基等の官能基である。これらのオルガノシランは、生物学的分子とともに共有結合を形成することが可能な反応性末端基か、またはＮＨ2のように反応性がより小さい部分のいずれかを提供する。反応性が小さな部分は、適当な末端基を形成させるために、二官能性リンカーを用いた活性化処理がさらに必要とされる。求電子性の末端官能基を有するオルガノシランは、二官能性架橋剤を用いた活性化処理を必要としない。なぜならば、生物学的なリガンドは、それが有する求核性基によって共有結合的に固定され得るからである。
【００３９】
オルガノシランが求核性基を有する場合には、あまたある二官能性架橋剤のいずれもが、生物学的な分子もしくはリガンドが共有結合的に固定され得るような非常に反応性の高い化学基を形成するために使用され得る。本発明には、化学的に活性化された基体を大量生産する際に用いることが可能で、かつ生物学的な分子もしくはバインダーリガンドが共有結合的に固定される前において長期間の保存が可能なほど十分に安定している二官能性リンカーを使用することが含まれる。好ましいリンカーは、通常の周囲条件（例えば常圧下）では不活性であると同時に、固定されるべき生物学的なリガンドの官能基と極めて短い時間（一般には１０分未満）で共有結合を形成するほど十分な反応性を有するものである。
【００４０】
二官能性リンカーは、例えば、ホスゲン、チオホスゲン、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボナート（Ｎ，Ｎ−disuccinimidyl  carbonate）、キシリレンジアミン、１，６−ジアミノヘキサン、１，１２−ジアミノドデカン、１，６−ジイソシアナトヘキサン、１，１２−ジイソシアナトドデカン、１，４−フェニレンジチオイソシアナート、シアヌル酸クロリド、テレフタルアルデヒド、ｐ−ニトロベンゾイルクロリド、スルファニル酸、２−フルオロメチルピリジニウムｐ−トルエンスルホナート、３−アミノフェニルボロン酸、ｐ−ブロモフェニルボロン酸、ジ炭酸ジエチル（diethyl  pyrocarbonate）、クロロギ酸エチル、ｐ−ブロモアニリン、ｐ−ブロモフェニルヒドラジド、ｐ−ブロモベンズアルデヒド、ｐ−ブロモベンズアルデヒドの１，２−エチレングリコール、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール、テレフタロイルクロリド、エピクロロヒドリン、１，４−ジヨードベンゼン、１，４−ジブロモベンゼン、もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの誘導体（例えば、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ブロモ安息香酸、ｐ−ブロモフェニル酢酸、ｐ−ブロモエチル安息香酸、ｐ−ブロモメチル安息香酸、ｐ−ホルミル安息香酸、ｐ−ヒドロキシメチル安息香酸、ｐ−ホルミル安息香酸の１，２−エチレングリコール、ｐ−ブロモジヒドロケイ皮酸またはｐ−ヒドロキシジヒドロケイ皮酸から誘導されるもの、例えばエステル）であればよい。光活性架橋剤を、求核性もしくは求電子性の末端基を有するオルガノシランと反応させるために用いてもよい。そのような架橋剤は、例えば、ｐ−アミノベンゾフェノンまたはｐ−アジド安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例えば、ｐ−アジド安息香酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルである。
【００４１】
二官能性リンカーを使用する代わりに、もしくはそれに加えて、ラテックス粒子の層を共有結合的に固定することが有利である。ラテックス粒子の直径は、５００nm以下であることが好ましく、１５０nm以下であることがより好ましい。
ラテックス粒子は、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨＯ、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−クロロスチリル基、−Ｎ＝ＮＨ、−ＮＨ−ＮＨ2、もしくは−ＮＨ2等の官能基を有していてもよい。ラテックス粒子は、濃度約０．５〜１％  w/vで、適当なオルガノシランにより変性された基体とともにインキュベーションしてよい。このとき、先に述べた二官能性リンカーは存在していてもいなくてもよい。
【００４２】
図４は、ラテックスの固定に関する二種の反応スキームを示したものである。いずれも、ラテックスの固定後、第二のリンカーでラテックスを活性化して生物学的分子を固定させてもよいし、あるいは、例えば抗体を共有的に直接固定させてもよい。
【００４３】
ポリスチレンラテックス粒子を使用する代わりに、シラン化された基体に既に固定されたポリエチレングリコールの誘導体に生物学的なリガンドを共有的に固定してもよい。例えば、エポキシまたはカルボニルイミダゾールのような求電子的な基を二つ有するポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧという場合がある）の誘導体は、選択した基体上の、アミノプロピルトリエトキシシラン（aminopropyltriethoxysilane:ＡＰＴＥＳ）のように末端基に−ＮＨ2を有するシランと反応する。適当な一連の反応の一例を図５に示す。
【００４４】
また、生物学的なリガンドを直接シラン層に共有的に固定させることも有利な場合がある。それにより、シランを高分子材料または二官能性リンカーで活性化させる必要がなくなる。その場合、オルガノシランは、生物学的なリガンドに存在する化学基、例えばＮＨ2、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ＝ＮＨ2等によって求核攻撃を受けやすいものでなければならない。生物学的なリガンドの直接的な結合に適したオルガノシランは、ハロゲン化物、エポキシ、イソシアナト、アルデヒド、トシラートまたはトシルのような官能基を有していてよい。この反応は、図６に示されている。図６中、Ｅはオルガノシランに存在する求電子的な基である。Ｅの例としては、Ｂｒ、Ｃｌ、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＮＣＯ、−ＣＨＯ、ｐ−クロロスルホニルフェニルが挙げられる。
【００４５】
グリシドキシのような求電子的な基を有するオルガノシランはまた、オルガノシランのメトキシもしくはエトキシの攻撃に利用できる求核性の基が存在しないために、シラン化処理の間、重合しにくいという利点を有する。従って、基体の表面は、重合したオルガノシランを含まない。
【００４６】
基体表面での化学反応は、表面の化学的な官能基と、固定されるべき生物学的な分子において立体的に好ましい位置に存在する適当な化学的な基との間の共有結合が迅速に形成されるために、空間的な分離を達成する手段を提供している。生物学的な分子は、微量液体ディスペンサーによって、一つ一つの小滴の形で、もしくは、線を形成する連続小滴の形で基体の表面に供給されることが好ましい。ディスペンサーから取り出される液滴の体積は、約１〜１００nlであり、好ましくは５０nl以下であり、例えば１０nl程度でもよい。共有結合形成の迅速性は、共有的な固定が、基体の表面に供給された小滴もしくは小滴で形成された線が蒸発する前に、数分間で達成されるほどのものである。液体の小滴もしくは線は、正しい位置に供給されなければならず、その許容差は±２０μmである。
【００４７】
特に、リガンドを水溶液または分散液として供給する場合には、ディスペンサーから供給された液体の小滴もしくは線の側方拡散を防止するために、表面を疎水性にすることが望ましい。表面が疎水性であることは、優秀なスポット品質、また、再現性向上に寄与する。また、表面を疎水性にすることにより、共有的に固定されるべき生物学的な分子の単位表面積あたりのスポット数を多くすることができる。
【００４８】
本発明は、紫外線もしくは物理的マスクを使用せずに、空間的に分離した生物学的なリガンドのスポットの形成を可能にしたことで、常用のフォトリソグラフィーに関連する問題を解決したものである。先に述べたとおり、空間的な分離は、微量液体供給（ディスペンス）技術によって達成される。固定された生物学的なリガンドの側方拡散を除き空間的に不連続な領域において生物学的なリガンドが高い効率でカップリングするのを確保するためには、共有的なカップリング反応の迅速性が重要である。
【００４９】
リガンドの結合後、基体上の未反応の化学的部位は、例えば当業者に知られているブロッキング分子でブロックされてもよい。ブロックに適した分子には、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン等のタンパク質、もしくはグリシンやグルタミン等のより小さい分子量のブロッカーが含まれる。
【００５０】
光活性リンカーもまた使用され得る。例えば、基体の表面のオルガノシランを、暗所で光活性リンカー（例えば、ベンゾフェノン、アリールアジド等）と反応させる。それから、表面は生物学的なリガンドで所望のようにスポットされ、そして短時間の紫外線照射、もしくはより長い時間の可視光線照射の後で共有的な付着が達成される。基体の表面に残っている領域は、紫外線もしくは可視光線の存在下で、先に述べた分子に類似するブロッカーを用いてブロックされる。
【００５１】
基体−固定された生物学的な分子間は、安定化させてもよく、安定化の方法としては、例えば、トレハロースのような糖の溶液中で短時間（例えば、１時間）インキュベーションし、その後、３７℃で１６時間乾燥させる方法が挙げられる。続いて、安定化された基体は、箔製の小袋の中に乾燥剤とともに密封・保存される。固定化された生物学的な分子は６〜１２ヶ月以上安定であり、例えば、２〜８℃で保存された場合には例えば２年もしくはそれ以上安定である。
【００５２】
デバイスは、試験試薬の混合の効率を制御する特徴を組み込んだ種々の異なるキャリヤーに配置してよい。液体試験試薬の流れは、毛管引力、遠心力、真空力、電気浸透的な流れによって達成される。電気浸透的な流れは、バルブを必要とせず、可動機械部品は使用されない。
【００５３】
閉鎖されたチャンネルを、微細加工された表面にガラス板を接着することによって形成してもよい。その場合、生物学的な分子はガラス板を接着する前に共有的に固定される。例えば陽極接着のように、多くの接合処理は、生物学的な分子を破壊するかもしれない温度の上昇を伴う。従って、接着技術は固定された生物学的な分子を変性させないものでなければならない。一つの適した方法は間接接着である。間接接着方法の例として、ウェハーを例えばエポキシ接着剤のような適当な接着剤でガラス板に接着する方法が挙げられる。
【００５４】
デバイスは、それから適当なキャリヤーに据え付けてよい。種々の適当なそのようなキャリヤーを図７及び図８に示す。例えば、図８に示されたキャリヤーの寸法は、４８．６２mm×４８．６２mmであり、このキャリヤーは内径が１０mm、外径が１２．８２mmのウェルを有する。各ウェルの中心間の距離は１５．３６mmである。
【００５５】
デバイスは、試験試薬、サンプル等の混合をより促進する特徴を有していてもよい。そのようなデバイスは図９に示されている。このデバイスでは、試薬添加部位（１１）、試薬が流れるチャンネル（１２）、試験反応部位（１３）が含まれている。
【００５６】
図１０に示すデバイスは、試薬貯蔵部（２１）、供給マニホールド（２２）、試薬供給チャンネル試験部位（２３）及び廃液貯蔵部（２４）を含む。図１１に示すデバイスは、同様のパーツを有する４−チャンネル試験構造のデバイスである。
【００５７】
本発明は、広範な分子量の分析物、多様な構造を有する分析物および極性の異なる分析物を同時に定量検出するための完全に統合されたシステムを提供する。分析物用パネルは臨床／獣医科的診断もしくは薬物のスクリーニングに適したものである。
【００５８】
分析物に応じて、結合リガンドは適宜に選択される。リガンドは、当該分野の技術及び知見を参照して選択することができる。本発明においてアッセイするのに適した分析物は以下のとおりである。
【００５９】
（１）抗生物質：例  テトラサイクリン、スルホンアミド、イオノホア、アミノグリコシド、ペニシリンまたはフルオロキノロン
（２）ホルモン：例  黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン（ＰＬ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
（３）心臓病の標識（markers  of  cardiac  damage）：ミオグロビン、カルボニックアンヒドラーゼ、トロポニンＩ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、ＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼ  ＭＢ  サブユニット）、タンパク質結合脂肪酸またはトロポニンＴ
（４）伝染病の標識
（５）アレルギーの標識
（６）有害薬物
（７）酵素
（８）ウイルス
（９）ヌクレオチド、及び
（10）ペプチド
【００６０】
例えば、一つのパネルは、スルホンアミド系抗生物質の検出に用いられる。本発明は、例えば、２０までの異なるスルホンアミド系抗生物質の同時定量的同定の方法を提供する。その他の例には、心臓病、妊性、伝染病パネルが含まれる。
【００６１】
本発明は、構造が類似しない場合がある、例えば２０の分析物を同時に検出することを可能にするものである。アッセイされるサンプルの母体は、血清、血漿、尿、胆汁、便、組織、水、食品、全血及び食物である。アッセイに必要なサンプルの量は極めて少なく、一般的には一分析物につき１．５μl未満である。酵素ラベルされた抗体、酵素ラベルされたハプテン、蛍光ラベルされた抗体または蛍光ラベルされたハプテンのような試験試薬は、すべて一つの試薬貯蔵部に含まれていてもよく、このことは液体取り扱いの必要性を大幅に減少させる。
【００６２】
黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン等のサンドイッチアッセイにおいて、サンプルは、アッセイ緩衝液と一緒に加えられ、短い時間、一般に３０分以下、好ましくは１０分以下インキュベートされる。洗浄ステップの後、ラベルされた検出抗体の混合物が加えられ、一定時間インキュベートされる。この時間は先と同様に、３０分以下、より好ましくは１０分以下である。続いて、結合されていないラベルを取り除くためにデバイスは洗浄され、シグナルが定量される
【００６３】
あるアッセイのためには、リューマチ因子干渉のような潜在的な干渉を取り除くために、微細加工されたデバイスの中に機構または手段を組み込んでもよい。リューマチ因子の除去は、例えば、試験サンプルを反応領域に接触させる前に、これを免疫グロブリンが固定された領域に接触させることによって達成される。
【００６４】
さらに、ヒト−抗マウス−抗体（ＨＡＭＡ）の干渉が例として挙げられる。これらの抗体は、モノクローナルマウス抗体を利用するアッセイを実施する際に、重大な問題を生じさせる。従来から実施されている解決法は、その問題となる抗体を中和させるために高価な添加剤を試験試薬に加えることである。本発明では試験サンプルが反応領域に達する前に、試験サンプルを、微細加工されたデバイス上に設けられた問題となる抗体を除去するための領域と接触させることによって、ＨＡＭＡの干渉を有利に取り除くことができる。
【００６５】
より一般的に言えば、不純物質と結合するリガンドを、デバイス上の一部分に設けてもよい。これは、例えばチャンネルのように、デバイスの表面で境界が定められた領域内で展開が許容される場合に特に有用である。干渉成分を取り除き得ることは、得られる結果の正確さを高める。
【００６６】
検出ラベルはデンドリマー（dendrimer）分子の表面に固定されてもよい。デンドリマー分子は本質的に高分子であり、小さな成分分子（building  molecules）が繰り返し結合することによって合成されるものである。それらは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによって販売されており、ＮＨ2またはＣＯＯＨのような末端官能基を選択して種々の分子量のものを入手することが可能である。そして、ヘテロ二官能性リンカーまたは二官能性リンカーは、常用の化学的な結合方法と組み合わされて使用され、その結果、検出ラベル複合体が形成される。例えば、β−アゴニスト、アナボリックステロイドもしくは抗生物質等の小さなハプテン分子の場合、小さなデンドリマー、好ましくは表面基が１６以下のものを、一般的に表面基が６４以上の大きなデンドリマーに結合させることが好ましい。１０００ダルトン以下の低分子量のハプテンは小さなデンドリマー上の化学的な基に結合され、その後、検出ラベルが共有的に付着する。デンドリマーの複合体は透析もしくはゲル透過クロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【００６７】
特定の試験パネルにふさわしいように、試験試薬は複数の成分を含む。例えば酵素ラベルされた抗体、蛍光ラベルされた抗体、ラテックスが固定された抗体、デンドリマー抗体−発蛍光団複合体、デンドリマー抗体−酵素複合体、酵素ラベルされたハプテン、蛍光ラベルされたハプテン等である。試験パネルは、非常に多様であり、所定の臨床診断もしくは獣医科的診断に基づいて、適当なものを選ぶことができる。例えば、一つの好ましいパネルは、伝染病を検出するためのものである。ここでいう伝染病とは、例えば、肝炎、ＨＩＶ、梅毒等である。他のパネルは、妊性ホルモン、心臓病の標識、アレルギーの標識、タンパク質等の検出に用いられる。臨床的なパラメーターと同様に、残留している薬物を検出することも可能である。
【００６８】
本発明によれば、抗生物質のような化合物を個々に同定することも可能である。例えば、定量的な結果は、表面面積１ｃｍ2のデバイスにおいて２０までの抗生物質について、概して数分の時間枠の中で得られる。その感度は、ＨＰＬＣ／ＧＣＭＳ法のそれよりも優れており、常用の単一パラメーター酵素免疫学的検査のそれに匹敵するものである。この方法は、アナボリックステロイド、β−アゴニスト、β−ブロッカー、殺虫剤、治療用薬物等についても可能である。
【００６９】
分析については、化学発光、生物発光、蛍光を利用することが適当であり得る。蛍光及び化学発光のどちらも測定するために、検出システムに電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが備え付けられていることが望ましい。簡単に言えば、ＣＣＤカメラは、微細加工されたデバイスの試験エリアから発せられる光信号を捕集し、これを相対光単位（ＲＬＵｓ、relative  light  units）に変換する。
【００７０】
蛍光をベースとする検出システムでは、ラベル発蛍光団のための適当な光学的フィルターを使って、直接蛍光を測定してもよい。
【００７１】
好ましい化学発光試薬は、ルミノールである。これは、４３３〜４４５nmの波長で分析され得る。化学発光は、また、１，２−ジオキセタンを用いてアルカリ性ホスファターゼでラベルした生物学的な分子の検出に基づいて観察され得る。
【００７２】
分析物の検出を容易にするために、本発明では、ＣＣＤカメラを用いた化学発光検出システムを用いることが好ましい。化学発光を伴う光反応によって発せられる光の波長における捕集効率を向上するために、バックイルミネートカメラ（バック照明カメラ）を用いることが好ましい。ルミノールの場合、光の波長は約４３３〜４４５nmである。
【００７３】
システム全体は、パーソナルコンピューターで操作されてもよい。この場合、特別に設計されたプログラムが、Ｘ−Ｙ方向に動くテーブル、ディスペンサーユニット、試料のハンドリング、温度コントロール、インキュベーションの時間及びＣＣＤカメラを制御する。図１２〜１４は、それらのシステムの構成を示している。
【００７４】
図１２は、２つの制御ユニット（３１）（３２）を有するパーソナルコンピューター（ＰＣ）の相互作用の概要を示している。ユニット（３１）は、ＣＣＤ画像システム（３３）との間で情報をやりとりしている。ユニット（３２）は、ディスペンサーユニット（３４）及びサンプルトレイを備えたＸ−Ｙ並進台（３５）との間で情報をやりとりしている。
【００７５】
図１３は、Ｘ−Ｙ方向の並進台の概要を示したものである。この図は、リニアアクチュエーター（４２）に据え付けられたサンプル台（４１）を示している。Ｘ−Ｙ方向の移動は、各駆動装置（４５）（４６）に連結されたステッパー電動機（４３）（４４）の制御下で行われる。移動は、「ホームポジション」センサー（４７）（４８）によって制限される。
【００７６】
ラベルされた生物学的な分子及びラベルされていないある生物学的な分子の光に対する感度によっては、アッセイを光が存在しない条件下で行う必要がある場合がある。光が存在しないようにするためには、光が漏れないようにケースを形成するとよい。また、満足のいくアッセイ精度及びアッセイの正確さを保証するために、光が漏れない環境は、温度制御されることが好ましい。温度制御の許容差は、±０．２℃、より好ましくは±０．１℃である。
【００７７】
図１４の（Ａ）は装置の斜視図、図１４の（Ｂ）は部分平面図、図１４の（Ｃ）は一部破断側面図である。特に、図１４の（Ａ）は試薬貯蔵容器（５１）、光を漏らさないドア（５２）、取り外し可能なカバー（５４）を備えたカメラ本体（５３）を示している。カメラの大部分は箱のケーシングの外側にあってよいが、レンズはケーシングの開口の中にある。
【００７８】
図１４の（Ｂ）は、サンプルトレイ（５５）上のサンプルの概略を示している。この概略では、廃物を入れるエリア（５６）および画像読み取りエリア（５７）が示されている。カメラ（５３）は、これらのエリアの上に位置される。図１４の（Ｃ）は、容器（５１）に加えて、カメラ（５３）、Ｘ−Ｙ方向に動くテーブル（４１）、ステッパー電動機（４３）、ディスペンサーポンプ（５８）を示している。
【００７９】
図１４に示されているシステムの設計は、３×３のサンプルラックホルダーを基準とするものであり、２０のホルダーを同時に保持できるように設計されている。このことは、もし、微細加工された各基体１cm2あたりに２０の個別の反応部位が設けられれば、一つのサンプルについて同時に合計３６００の分析が実施されることを意味している。もしくは、１８０のサンプルが同時に２０の異なる試験パラメーターについて分析されることを意味している。
【００８０】
上述のように、分析物はラベルされてもよい。リガンドもまたラベルされてもよく、部分的な占有による分析を可能にしている。
以下の実施例は、本発明を説明するものである。
【００８１】
【実施例】
実施例１  スルホンアミドアッセイ
この実施例では、それぞれが一つのスルホンアミドに対して特異的である１２種類の抗体を、化学的に変性された表面を有する平坦な酸化アルミ製セラミック基体の離れた領域に対する接触相互作用によって、共有結合的に固定させた。複数の分析物のアッセイは、競合的イムノアッセイ方式により実施した。
【００８２】
より詳しく説明すると、ここでは１cm×１cmのセラミック基体を使用した。この基体を、アルカリ性洗浄剤（ＲＢＳ３５、５％  v/v）を用いて超音波によって洗浄し、さらに２回脱イオン処理された水で洗浄し、それから６Ｍの塩酸の中に１６時間放置した。続いて、この基体を、クロム酸を入れた超音波浴の中に１時間置いて洗浄した。
【００８３】
それから、この基体を、２回脱イオン処理した水及びアセトンを用いて十分に洗浄し、１２０℃で乾燥機内で２時間乾燥させた。この前処理の後、無水トルエンに濃度１０％（v/v）になるように溶解させたＹ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Ｙ−glycidoxypropyl  trimethoxysilane）、１．２５g/Ｌの４−ジメチルアミノピリジン及び１％（v/v）のトリエチルアミンを用いて基体をシラン化させた。この混合物を、４時間還流した後一晩室温にて放置した。次いで、この基体を、トルエンとアセトンで洗浄した後、１２０℃で４時間キュアリングした。
【００８４】
キュアリングの後、基体を容器に入れ、スルホンアミド抗体をスポッティングする前まで、室温下で保存した。そして、スルホンアミド抗体を、ＢＩＯＤＯＴＸＹ３０００ディスペンサーを用いてスポットした。アッセイされる１２種類のスルホンアミドは、スルファドキシン（ＳＤ）、スルファメチゾール（ＳＭＺ）、スルファクロロピリダジン（ＳＣＰ）、スルファメトキシピリダジン（ＳＭＰ）、スルファメラジン（ＳＭ）、スルファピリジン（ＳＰ）、スルフイソキサゾール（ＳＳ）、スルファチアゾール（ＳＴ）、スルファメタジン（ＳＭＴ）、スルファキノキサリン（ＳＱ）、スルファジメトキシン（ＳＤＭ）及びスルファジアジン（ＳＺ）である。
【００８５】
各スルホンアミド抗体は、約２０nlをディスペンスした。１cm2の基体に１２個の不連続なエリアを形成した１２種のスルホンアミド抗体を、３７℃で２時間インキュベートした。続いて、基体を２％（w/v）のカゼインを含むｐＨ７．２のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、同緩衝溶液中で２〜８℃の温度下で放置してブロックした。そして、ＰＥＧ３００を０．０５％（v/v）含むＰＢＳで洗浄した後、デバイスをキャリヤーに置いた。
【００８６】
複数のスルホンアミドを含む標準液２００μlと、スルホンアミド−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体のカクテル１００μlを各デバイスを含む反応ウェルに適当に加え、室温で１５分間インキュベートした。標準液は、１２種類のスルホンアミドを、それぞれ５、１０、５０、１００ng／ml含んでいた。
【００８７】
続いて、複数のスルホンアミドが結合されたデバイスをＰＢＳ／ＰＥＧ緩衝溶液で洗浄して余分な試薬を取り除き、１デバイス当たり１．４mＭのルミノールと９．６mＭの過酸化水素尿素を含む３００μlの化学発光基質を加えた。各デバイスは、ＣＣＤカメラを使用してイメージ処理された。このときの露光時間は４分間までであった。その結果、１２種類の各スルホンアミドについて標準曲線を得ることができた。１２種類の各スルホンアミドについての検量線を図１５に示す。Ｙ軸にプロットした％  Ｂ／Ｂo値は、スルホンアミドの濃度がゼロである標準液から得られる相対光単位（ＲＬＵｓ）に対する、Ｘ軸にｌｏｇ10で示される各スルホンアミド標準液によりもたらされる阻害割合を％で示したものである。
【００８８】
実施例２  ホルモンアッセイ
この例では、大きな分子量を有する３つのホルモン、すなわちプロラクチン（ＰＬ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）について多重分析物アッセイを行った。本実施例は、サンドイッチ型イムノアッセイ利用した多重分析物アッセイを示す例である。なお、これらのホルモンが同じパネルで検出される際、問題となるような交差反応性はほとんど認められなかった。
【００８９】
化学的な前処理及びシラン化処理は実施例１と同様な方法で行った。ＰＬ、ＦＳＨまたはＬＨの各モノクローナル抗体を、約２０nlずつ、化学的に変性された基体表面に、不連続なエリアを形成するように固定した。複数分析物アッセイは、実施例１で用いたものと同じエポキシド表面を有するセラミック及びシリコン基体上で実施した。
【００９０】
このアッセイでは、ＬＨ／ＰＬ／ＦＳＨの血清ベースの標準液１５０μlと希釈アッセイ緩衝液１５０μlをデバイスに供給し、室温で１５分間インキュベートした。これを洗浄した後、ＬＨ−ＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合体／ＰＬ−ＨＲＰＯ複合体／ＦＳＨ−ＨＲＰＯ複合体を含む単一の複合体カクテル３００μlを加え、１５分間インキュベートした。その後、過剰な試薬を取り除くために、デバイスを洗浄し、１．４mＭのルミノールと９．６mＭの過酸化水素尿素を含む化学発光試薬を加えた。デバイスは、ＣＣＤカメラを使用してイメージ処理した。このときの露光時間は４分間までであった。イメージ処理後、各ホルモンについて標準曲線を得ることができた。
【００９１】
実施例３  スルホンアミドアッセイ
実施例１と異なり、本実施例では、微細溝（マイクロチャンネル）を使って複数のスルホンアミドのアッセイを行った。デバイスは図１１に示されるものである。本実施例では、タテ×ヨコが２mm×２mm、深さが３００μmである容積１．２μlの試薬添加保持器（２１）と、それぞれ長さが５mm、幅が２００μm、深さが１００μmである容積１００nlの溝（２３）と、タテ×ヨコが１．９mm×８．６mm、深さが３００μmである容積４．９μlの保持器（２４）とで構成されている。
【００９２】
基体表面の化学的な変性は、実施例１と同じように行った。そして、抗体を各溝に供給し、３７℃で２時間インキュベートした。それから、実施例１と同じ方法で基体をブロックし、洗浄した。
【００９３】
複数のスルホンアミドを含む標準液２００μlとスルホンアミド−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体１００μlを混合した。この混合液を１μlずつ、４つの保持器にピペットで注ぎ入れ、各スルホンアミドに対して抗体を被覆させた溝に供給した。標準液は、各スルホンアミドの濃度が１０ng／mlのものと、各スルホンアミドの濃度が１００ng／mlのものの二種類を用意した。
【００９４】
サンプルは、毛管作用によって流れた。２分間のインキュベーションの後、ＰＢＳ／ＰＥＧを用いてデバイスを５回洗浄し、１．４mＭのルミノールと９．６mＭの過酸化水素尿素を含む化学発光試薬を加えた。
【００９５】
デバイスは、ＣＣＤカメラを使用してイメージ処理された。このときの露光時間は４分間までであった。４つのスルホンアミドについて得られた％  Ｂ／Ｂｏの値を表１に示す。
【００９６】
【表１】
0004209494.tif 000002
【００９７】
フォトリソグラフィ−と比較した場合の本発明の有用性は、ベンゾフェノンで処理された光活性な基体上における生物学的分子の非特異的吸着の程度によって示される。その結果を表２に示す。
【００９８】
【表２】
0004209494.tif 000003
【００９９】
ここでは、抗マウス−ＨＲＰＯ複合体を使用し、ＣＣＤカメラを用いて化学発光を検出することにより、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を検出した。光が存在しない条件で反応させると、光活性なリンカーであるベンゾフェノンを固定したシリコンもしくはセラミック基体はマウスＩｇＧを結合しない。しかしながら、非特異的な結合は生じている。なぜならば、紫外線下でマウスＩｇＧ結合が行われたときに得られるグレイミーン（grey  mean）ＲＬＵの約８０％が消極的な結合相互作用に由来するといえるからである。本発明の共有的な相互作用によって固定された生物学的な分子のアレイは、従来の技術と明らかに異なるものである。
【０１００】
共有的な付着を立証するための証拠は、以下で説明される実施例において提供される。最初の例において、セラミック基体はＡＰＴＥＳでシラン化された後、ビオチン−ＬＣ−スルホ−ＮＨＳと反応させた。ここで、ＬＣは長鎖（long-chain）を、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを意味する。比較のために、ＡＰＴＥＳで処理していないセラミック基体を用意した。この比較基体には、求核的な末端−ＮＨ2基がないため、ビオチンの誘導体であるスクシンイミドエステルと反応することができない。本実施例では、これらの基体を、アビジン−フルオレスセインイソチオシアネート（fluorescein  isothiocyanate;  ＦＩＴＣ）複合体と反応させ、ＣＣＤカメラで蛍光を測定した。その結果を表３に示す。表中、ＮＳは蛍光信号が検出されなかったことを示している。
【０１０１】
【表３】
0004209494.tif 000004
【０１０２】
この結果は、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳの特異的な結合を明らかに証明している。なお、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳの濃度が５００μg／mlであるときのＲＬＵ値が増加していないことから、基体に結合され得るビオチン−ＬＣ−ＮＨＳの最大濃度は１００μg／mlであるといえる。
【０１０３】
さらに、ＡＰＴＥＳでシラン化されたセラミック基体をジヒドラジドリンカーと反応させた例を示す。ここでは、スルホンアミド抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、ヒドラジドリンカーに対する反応性を付与した。比較のために、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム緩衝液と接触させて透析処理しただけのスルホンアミド抗体を用意した。過ヨウ素酸ナトリウムで処理していないものについてのＲＬＵ値を表４に、過ヨウ素酸ナトリウムで処理したものについてのＲＬＵ値を表５に示す。
【０１０４】
【表４】
0004209494.tif 000005
【０１０５】
【表５】
0004209494.tif 000006
【０１０６】
この結果は、ヒドラジドリンカーがセラミック基体表面に首尾よく結合したことを示している。過ヨウ素酸塩で活性化させなかった比較抗体の測定結果は、共有的に固定されたスルホンアミド抗体と比較して、不十分な標準曲線しか与えなかった。
【０１０７】
共有的相互作用もしくは消極的相互作用に帰する結合のパーセンテージを、表６及び表７にて比較する。表６及び表７中、共有的相互作用はスルホンアミド抗体をグリシドキシシラン表面に直接スポットしたことによるものであり、消極的相互作用は抗体を、ジクロロジメチルシランでシラン化された基体表面に直接スポットしたことによるものである。共有的相互作用の全体の結合に対する割合は平均８１．８％であり、スルホンアミド抗体が共有結合していることを明らかに示していた。
【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
0004209494.tif 000008
【０１１０】
これから明らかなとおり、共有結合的手法は、消極的結合手法よりも優れた結果を与える。消極的結合手法により得られる結果は、スルホンアミド抗体を酸前処理することで約２倍向上させ得るが、それでもなお共有結合的手法よりも劣っている。
【０１１１】
化学的に変性されたシリコン基体及びセラミック基体をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）により確認的に分析した。各基体サンプルにつき２つの任意のエリアからのサーベイスペクトルを記録し、これより各基体表面の化学組成を決定した。その結果を表８に示す。表８は、各原子の存在割合をパーセンテージ（原子％）で示している。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
原子組成の結果から、母体となるシリコン及びセラミック基体はＡＰＴＥＳによってかなり良好に変換されているといえる。また、各サンプルの２つのエリアにおける表面組成の良好な再現性も示されている。ＦＩＴＣによりラベルした基体は、シリコンについては７０％、セラミックについては７７％のラベリングを示した。
【０１１４】
次に、ダーク・シリコン基体における蛍光測定の定量方法を、白色セラミック（酸化アルミニウム）基体におけるそれと比較した例を示す。フックらがラングミュア（Langmuir）１９９１、Vol  ７、１４２〜１５１で示した方法によって蛍光分子（ＦＩＴＣ）を取り除いた後、各基体に共有的に結合している蛍光分子（ＦＩＴＣ）についてのＣＣＤ測定からＲＬＵ結果を定量方法と比較した。その結果を表９に示す。
【０１１５】
【表９】
0004209494.tif 000010
【０１１６】
基体からＦＩＴＣラベルを取り除いた後、ＣＣＤカメラで信号を検出するという手法を用いて得た蛍光ラベルの定量分析の結果は、セラミック基体から検出される信号がシリコン基体のそれの１０００倍であるにもかかわらず、シリコン基体上にはセラミック基体よりも明らかに多くのＦＩＴＣが存在しているということを示している。
【０１１７】
この現象は、別の実施例によっても認められた。この実施例では、シグナルを検出するためにプロラクチン検出抗体に蛍光ラテックス粒子を結合したシリコン及びセラミック基体上でプロラクチンのアッセイを行った。アッセイの結果、得られたＲＬＵ値を表１０に示す。いずれも、露光時間は２０秒間である。
【０１１８】
【表１０】
0004209494.tif 000011
【０１１９】
この測定結果も、蛍光検出法を用いた場合には、セラミック基体がシリコン基体よりも優れた結果を与えることを示している。さらに言うなれば、蛍光検出で問題となるシリコンのダークボディ効果（dark  body  effect）は、検出方法に化学発光を利用することで解決され得る。例えば、シリコン基体及びセラミック基体の両方において、化学発光を利用してＦＳＨをアッセイしたとき、シリコン基体の露光時間をセラミック基体の露光時間の２倍にすると、シリコン基体から検出されるＲＬＵ値はセラミック基体から検出される値と同じになった。
【０１２０】
【発明の効果】
本発明によれば、構造が異なる複数の分析物を、高い精度で、同時にしかも短時間で、同定・定量することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  一様でない基体の表面を形成する過程を示すものである。
【図２】  基体の表面で基が活性化される過程を示すものである。
【図３】  基体の表面にリガンドが共有的に固定される過程を示すものである。
【図４】  基体の表面におけるラテックスの使用の過程を示すものである。
【図５】  基体の表面にポリエチレングリコールの誘導体を介してリガンドが共有的に固定される過程を示すものである。
【図６】  基体の表面にリガンドが共有的に固定される過程を示すものである。
【図７】  本発明のデバイスのキャリヤーの一例を示すものである。
【図８】  本発明のデバイスのキャリヤーの一例を示すものである。
【図９】  本発明のデバイスの一例を示すものである。
【図１０】  本発明のデバイスの一例を示すものである。
【図１１】  本発明のデバイスの一例を示すものである。
【図１２】  本発明のデバイスを分析するのに適当なシステムの構成の一例を模式的に示すものである。
【図１３】  本発明のデバイスを分析するのに適当なシステムの構成の一例を模式的に示すのものである。
【図１４】  本発明のデバイスを分析するのに適当なシステムの構成の一例を示すものである。
【図１５】  実施例１で得た１２種類のスルホンアミドの検量線である。
【符号の説明】
１．．．シリコンウェハー、２．．．酸化膜、２ａ．．．酸化フィルム、３．．．フォトレジストの膜、１１．．．試薬添加部位、１２．．．チャンネル、１３．．．試験反応部位、２１．．．試薬貯蔵部、２２．．．供給マニホールド、２３、試薬供給チャンネル試験部位、２４．．．廃液貯蔵部、３１、３２．．．制御ユニット、３３．．．ＣＣＤ画像システム、３４．．．ディスペンサーユニット、３５．．．Ｘ−Ｙ並進台、４１．．．サンプル台、４２．．．リニアアクチュエーター、４３、４４．．．ステッパー電動機、４５、４６．．．駆動装置、４７，４８．．．ホームポジションセンター、５１．．．試薬貯蔵容器、５２．．．光を漏らさないドア、５３．．．カメラ、５４．．．取り外し可能なカバー、５５．．．サンプルトレイ、５６．．．廃物を入れるエリア、５７．．．画像読み取りエリア、５８．．．ディスペンサーポンプ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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