(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の特性：
（１）溶血活性を有し；
（２）分子量が約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳゲル電気泳動法による）であり；
（３）アミノ酸配列として、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する；
を有する蛋白質。
【請求項２】
アンドンクラゲ（Ｃａｒｙｂｄｅａ  ｒａｓｔｏｎｉｉ）の刺胞より得られる、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載の溶血活性蛋白質と同一のアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、遺伝子組換え技術によって造成された形質転換細胞の培養物から得られる溶血活性を有する蛋白質。
【請求項４】
配列番号５に示すアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつ溶血活性を有する蛋白質。
【請求項５】
アンドンクラゲ（Ｃａｒｙｂｄｅａ  ｒａｓｔｏｎｉｉ）の刺胞をリン酸緩衝液中で超音波処理し、遠心分離したその上清を、０Ｍ〜０．８ＭのＮａＣｌ濃度によるグラジエントによって溶出するイオン交換高速液体クロマトグラフィー、および０．８ＭのＮａＣｌ濃度によって溶出するゲル濾過高速液体クロマトグラフィーにより抽出・精製して採取することからなる請求項１、２または４に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項６】
刺胞の超音波処理が、０．１Ｍ以上のＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中リン酸緩衝液中１０℃以下で行う超音波処理であり、イオン交換高速液体クロマトグラフィー処理が、０Ｍ〜０．８ＭのＮａＣｌ濃度によるグラジエント（１０ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ６．０）によって１０℃以下で溶出するイオン交換高速液体クロマトグラフィーであり、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー処理が、０．８ＭのＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、１０℃以下で行うことを特徴とする、請求項５に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の溶血活性を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿主（但し、ヒトの宿主は除く）。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主を培養し、または生育させ、そして該宿主から溶血活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の蛋白質またはそれらの部分ペプチドを抗原とする抗体。
【請求項１２】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の蛋白質を有効成分とする農薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、溶血活性を有する蛋白質およびそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳細には、本発明は、溶血活性を有する新規蛋白質、その製造方法およびその使用に関する。
背景技術
海水浴中におけるクラゲによる刺傷被害は、世界各地で発生しており、我が国でも毎年夏場の海水浴シーズンにアンドンクラゲ（Ｃａｒｙｂｄｅａ  ｒａｓｔｏｎｉｉ）やカツオノエボシ（Ｐｈｙｓａｌｉａ  ｐｈｙｓａｌｉｓ）による刺傷被害が頻発している。刺傷による症状はクラゲの種類や、患者の個人差により程度が異なるが、その第一は、刺傷部位の疼痛、発赤、丘疹、小水泡などの皮膚症状である。重症例では、出血斑、壊死を起こし頭痛、発熱、吐気、呼吸困難、脈拍の変動などの全身症状を伴い死亡することもある。このような被害の多さにもかかわらず、その毒成分を明らかにするとともに、毒成分の薬理学的性質を解明し、クラゲによる刺傷時の治療用薬剤などの開発につなげようとすることはあまり行われていない。
アンドンクラゲの毒成分については、佐藤らによって研究が行われており、アンドンクラゲの触手の凍結乾燥物から調製した粗抽出液中には、溶血、血小板凝集、肥満細胞脱顆粒、血管平滑筋収縮、皮膚壊死、心臓毒性および致死などの活性を示す成分が存在することを明らかにし、その毒成分の血小板凝集作用および血管平滑筋収縮作用について検討がなされている（佐藤昭彦：アンドンクラゲの毒成分の研究、お茶の水医学雑誌，３３巻，２号，１３１−１５１頁，昭和６０年６月）。
一方、クラゲ毒の成分としては、その刺胞毒が酸、アルカリ処理、加熱処理、有機溶媒処理、プロテアーゼ処理などで失活し、透析されない高分子物質であることから、その主体は蛋白質であると考えられていた。
そして、これまでクラゲ由来の蛋白毒の精製も試みられてきたが、クラゲ毒自体は非常に失活しやすいことから、これまではこれらの活性成分について、例えば、その溶血活性を保持したままで単離、精製することは行われておらず、その物理的、化学的な性質も明らかにされていなかった。
クラゲ毒成分の詳細を解明することは、その蛋白質が有する多種多様な生理活性、なかでも特異的溶血活性、血小板凝集作用を応用した医薬品等の開発のために、極めて重要な事項である。したがって、溶血活性を有する蛋白質の構造−活性相関、種特異性等の研究のために、できるだけ多くの溶血活性を有する蛋白質またはペプチドを、その生理活性を保持したまま単離し、これらの発生学上または構造上の類似点を究明する手段を与えるとともに、クラゲによる刺傷被害の治療に使用することができる医薬品等の開発へのアプローチを与えることが、本発明が解決しようとする課題である。
発明の開示
本発明者らは、アンドンクラゲの刺胞からその溶血活性を指標に、溶血活性を有する蛋白質を、活性を保持したまま単離すべく鋭意研究を行い、活性を保持したままの蛋白質を単離、精製する方法を見出すとともに、その部分化学構造が次のアミノ酸配列式（１）〜（３）：
アミノ酸配列式（１）：
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
アミノ酸配列式（２）：
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
アミノ酸配列式（３）：
Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
（上記の各式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める３文字表記により表記する）
であり、分子量が約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳゲル電気泳動法による）である蛋白質であることを明らかにした。そしてさらに、これらの部分化学構造をもとにプライマーを作成し、アンドンクラゲの触手より調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、約１０００塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法を用いて５’末端および３’末端側の遺伝子配列を解明することにより、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質の全一次アミノ酸配列および該溶血活性蛋白をコードする遺伝子配列を決定して、本発明を完成した。
したがって、本発明の一つの態様としては、上記した生理活性および物理的、化学的性質を特性として有し、配列番号５で表わされるアミノ酸配列、またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有する特異的蛋白質を提供し、また別の態様としてかかる蛋白質の製造方法を提供する。さらに別の態様としては、かかる蛋白質をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を用いた特異的蛋白質の製造方法、ならびにこの遺伝子を利用した医薬または農薬を提供する。本発明はさらにまた、これらの特性を利用した医薬組成物、特に血小板凝集作用等を有する医薬組成物、または農薬を提供する。また、本溶血活性蛋白質を用いれば、公知の方法（細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」：秀潤社）により、特異的抗体を得ることもでき、当該抗体を利用した医薬組成物も提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明が提供する特異的生理活性を有する蛋白質は、具体的には次のようにして単離、精製することができる。例えば、アンドンクラゲの刺胞をリン酸緩衝液中で超音波処理した後、遠心分離して上清を集め粗抽出物を得る。この粗抽出物をＴＳＫ−ＧＥＬ（東ソー社製）を用いたイオン交換高速液体クロマトグラフィーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付して目的とする蛋白質を分離、精製することができる。
かくして得られた本発明が提供する蛋白質の構造は、酵素を用いた選択的分解によるアミノ酸配列の解析手法、およびＰＣＲ法などを用いた遺伝子配列の解析手法を組み合わせることによって決定することができる。例えば、上記によって分離、精製した蛋白質をリジルエンドペプチダーゼで処理し、高速液体クロマトグラフィーによりその断片を分取後、アミノ酸シークエンサーなどを用いて分析することによってアミノ酸配列を決定することができる。次に、明らかになったアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、これを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などにより、遺伝子配列を決定することができる。最後に遺伝子配列をもとにアミノ酸配列を決定すれば、蛋白質の全一次アミノ酸配列を決定することができる。
かかる分析によって、本発明が提供する蛋白質は、その分子量が約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳゲル電気泳動法による）であり、その部分アミノ酸配列が上記したアミノ酸配列式（１）〜（３）を有するものであることが確認された。
この部分アミノ酸配列についてホモロジー検索を行った結果、今まで報告されている蛋白質と極めて相同性が低いものであった。したがって、本発明が提供する溶血活性を有する蛋白質は、既知の蛋白質には似ていない全く新しい蛋白質であることが示唆された。
次に、この部分アミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、アンドンクラゲの触手より調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、約１０００塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法を用いて５’末端および３’末端側の遺伝子配列を解明することにより、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質は、配列番号５で示される全一次アミノ酸配列を有するものであること、および該溶血活性蛋白質をコードする遺伝子は配列番号４に示される塩基配列を有するものであることを明らかにした。
さらに、この全一次アミノ酸配列についてもホモロジー検索を行った結果、これまでに報告されている蛋白質との相同性は低いものであった。
本発明の特異的蛋白質の分離・精製による製法は、特にその溶血活性を保持したままの状態で行われることを特徴とする。かかる溶血活性を保持したままの分離・精製は、具体的には、上記したリン酸緩衝液による超音波処理、あるいは各種高速液体クロマトグラフィー等の処理を行うに際して、０．１Ｍ以上、好ましくは０．３Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上のＮａＣｌ含有の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、１０℃以下、好ましくは５℃以下で行うことによって達成される。
したがって、本発明のアンドンクラゲの刺胞からの蛋白質の抽出・精製による製造方法においては、その生理活性を保持したままの製造方法を提供するものでもある。
さらに、本発明の特異的蛋白質は遺伝子組換え法によっても製造することができる。遺伝子組換え法によって製造を行う場合は、常法に従って、例えば配列番号４で示される遺伝子を組み込んだベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主から目的の溶血活性を有する蛋白質を単離、精製して採取すれば良い。
本発明が提供する蛋白質は、溶血活性を有する蛋白質であり、例えば血小板凝集作用等を有する医薬品としてばかりでなく、溶血に関する研究用の試薬として利用できる。さらにはクラゲによる刺傷時の治療用薬剤など医薬品開発や、溶血活性を利用した殺虫剤等の農薬開発への新たなアプローチを与える。
実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１）アンドンクラゲ刺胞の抽出
神奈川県三浦海岸で採取し、マイナス８０℃で凍結保存されていたアンドンクラゲの刺胞２００ｍｇを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）８ｍｌ中に入れ、超音波（井内社製  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｌｅａｎｅｒ  ＶＳ１５０）中で１５分間処理した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２０分間）し、その上清を集めた。この操作を計３回行った。さらに、１Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）８ｍｌにより同様の抽出操作をさらに３回繰り返し、そのすべての上清を集めた。この抽出操作後、直ちに次の精製段階であるイオン交換ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を行った。
２）イオン交換ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＣＭ６５０Ｓ，カラムサイズ：２０×２２０ｍｍ）による精製
標記カラムを、０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化した。平衡化後、次いで、上記１）の操作により抽出して得た上清を合わせて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で４倍に希釈した後、上記カラムに、流速３ｍｌ／分にて供した。サンプルアプライ後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌで洗浄した。洗浄後、６０分間で０Ｍから０．７ＭのＮａＣｌ濃度によるグラジエント（１０ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ６．０）にて溶出を行った。グラジエント開始後、４５分から６５分の間に多くの溶血活性フラクションが溶出した。なお、溶血活性はヒツジ血球に対する溶血作用で調べた（後記実施例２を参照）。
３）イオン交換ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＣＭ５ＰＷ，カラムサイズ：７．５×７５ｍｍ）による精製
標記カラムを、０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でよく平衡化した。上記２）の精製操作により得られた溶血活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で４倍に希釈後、上記カラムに、流速２ｍｌ／分にて供した。サンプルアプライ後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌで洗浄した。洗浄後、６０分間で０Ｍから０．８ＭのＮａＣｌ濃度によるグラジエント（１０ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ６．０）にて溶出を行った。グラジエント開始後、２５分から３５分の間に多くの溶血活性フラクションが溶出した。分取した溶血活性を有する各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、活性成分の分離具合を確認し、よく分離している部分を集めて次のステップにまわし、分離していない部分については、分離するまで再クロマトグラフィーを繰り返した。
４）イオン交換ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＣＭ５ＰＷ，カラムサイズ：７．５×７５ｍｍ）による溶血活性成分の濃縮
カラムは、０．３Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でよく平衡化した。上記３）の精製操作で得られた溶血活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で４倍に希釈後、上記カラムに、流速２ｍｌ／分にて供した。サンプルアプライ後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．８Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を流し、カラムに吸着したサンプルを溶出させた。溶媒を交換後５分前後に溶血活性成分が濃縮されて一気に溶出するので、その部分を分取した。
５）ゲル濾過ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５，カラムサイズ：１６×６００ｍｍ）による精製
イオン交換ＨＰＬＣによって濃縮されたサンプルを、０．８Ｍ  ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ６．０）で平衡化した上記カラムに０．５−１．０ｍｌずつ供し、流速１ｍｌ／分で溶出させた。サンプルを注入後、５０分から６０分の溶出フラクションに強い溶血活性が見出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離状況を確認後、活性画分を集め、ここで溶血毒である、本発明の蛋白質が単離された（約１マイクログラム）。
実施例２：溶血活性の測定
上記の実施例１における各精製段階での溶血活性の測定、ならびに最終的に得られた本発明の蛋白質の溶血活性の測定は、以下のようにして行った。
１）方法
溶血活性は、ヒツジ赤血球に対する溶血により測定した。すなわち、０．８％のヒツジ赤血球を含むＰＢＳ（＋）緩衝液を９６穴のマイクロウェルプレート（丸底タイプ）に２００μｌ溶液ずつ入れ、そこに、上記実施例１の各精製段階で得られた両分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた溶液１０μｌを加え、室温下に３時間放置し、各プレートのヒツジ赤血球の溶血状態を観察した。なお、溶血活性を保持しているか否かは、各精製段階で得られた画分について、完全溶血を示すか、示さないかで判断を行った。
２）結果
２−１）上記実施例１の各精製段階で得られた両分は、ヒツジ赤血球に対し、完全溶血を示し、その溶血活性が保持されていることが判明した。
２−２）また、上記実施例１の５）の精製操作で最終的に得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質については、その１００ｎｇ／ｍｌ  （約２ｎＭ）以下の濃度で、ヒツジ赤血球に対して完全溶血を引き起こした。
実施例３：蛋白質の分子量の決定と部分構造の決定
３−１）分子量の決定
実施例１の５）の精製操作で得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質を、常法に従ってＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）させたときに現れるシングルバンドと、蛋白質分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）との比較により、本発明の蛋白質は、その分子量が約５０，０００Ｄａの蛋白質であることが確認された。
３−２）リジルエンドペプチダーゼによる分解
上記実施例１の５）の精製操作で得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質１０μｇに、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ  Ｍ４９７−１株由来：宝酒造社製）３ｐＭを加え、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で３０℃にて２０時間インキュベートして、蛋白質の分解を行った。この酵素消化された蛋白質を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ｗｉｄｅ  ｐｏｒｅ  ＯＤＳ）に付し、６０分間で１０％から６２％のアセトニトリル濃度によるグラジエント（０．１％トリフロロ酢酸含有水）にて、流速０．７ｍｌ／分で分離した。その結果、保持時間１９，２３および２７分に各々溶出した３種類のペプチドフラグメントを得た。
３−３）各フラグメントのアミノ酸シークエンサーによる構造決定
以上のようにして得られた３種のペプチドフラグメントについて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＰＳＱ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（島津製作所社製）を使用して、常法に従ってそのアミノ酸配列を決定した。
その結果、３種のフラグメントは、以下のアミノ酸配列式（１）〜（３）を有しているものであることが判明した。
アミノ酸配列式（１）：
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
アミノ酸配列式（２）：
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
アミノ酸配列式（３）：
Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
（上記の各式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める３文字表記により表記する）
上記によりアミノ酸配列が決定された各フラグメントについて、ホモロジー検索を行った結果、これらのフラグメントはこれまでに報告されている蛋白質と極めて相同性が低く、したがって、アンドンクラゲの刺胞よりその溶血活性を保持したまま分取した本発明の特異的な蛋白質は、全く新しい蛋白質であることが示唆された。
実施例４：蛋白質の全アミノ酸構造およびそれをコードする遺伝子の決定
４−１）アンドンクラゲｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
アンドンクラゲの触手（湿重量約０．５ｇ）を液体窒素中で粉砕し、５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）中でホモジナイズした。１ｍｌのクロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機（佐久間製作所社製）で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。上層の水層を分取して２．５ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で１０分静置した。冷却遠心機で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した後、上清を除いて５ｍｌの７５％エタノールを加え、再度遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清を除いて約１０分間風乾し、１００μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え、６０℃で１０分間インキュベートしてＲＮＡを溶解した。以上の方法で約０．５ｍｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。
４−２）部分ｃＤＮＡのクローニング
アミノ酸配列式（１）、アミノ酸配列式（２）、アミノ酸配列式（３）を基に、以下の縮重プライマーを設計し、常法により合成した。
７−Ｆ；ＧＡＲ  ＡＴＨ  ＣＡＲ  ＡＣＩ  ＡＡＲ  ＣＣＩ  Ｇ
７−Ｒ；ＣＩＧ  ＧＹＴ  ＴＩＧ  ＴＹＴ  ＧＤＡ  ＴＹＴ  Ｃ
１２−Ｆ；ＧＣＩ  ＧＴＩ  ＧＡＲ  ＡＡＹ  ＧＣＩ  ＡＡＹ  ＭＧ
１２−Ｒ；ＣＫＲ  ＴＴＩ  ＧＣＲ  ＴＴＹ  ＴＣＩ  ＡＣＩ  ＧＣ
１４−１−Ｆ；ＧＡＹ  ＧＧＩ  ＴＴＹ  ＴＡＹ  ＡＣＩ  ＡＴＧ  Ｇ
１４−１−Ｒ；ＣＣＡ  ＴＩＧ  ＴＲＴ  ＡＲＡ  ＡＩＣ  ＣＲＴ  Ｃ
１４−２−Ｆ；ＧＡＹ  ＧＧＩ  ＴＴＹ  ＴＡＹ  ＡＣＩ  ＡＴＧ  ＧＡＲ  ＡＡ
１４−２−Ｒ；ＴＴＹ  ＴＣＣ  ＡＴＩ  ＧＴＲ  ＴＡＲ  ＡＡＩ  ＣＣＲ  ＴＣ
（上記の各式中の英文字は、「ヌクレオチド略語表」による（細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤社））
次に、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  １ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを用いて、以下の手順で１本鎖ｃＤＮＡ（１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）を合成した。すなわち、１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８、ＤＥＰＣ−処理水を混合し、７０℃で１０分間処理した後、さらにＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、０．１Ｍ  ＤＴＴを加えて４２℃で５分間プレインキュベートした。そこに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（２００ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて、さらに４２℃で５０分間インキュベートし、７０℃で１５分間処理した。そこに、ＲＮａｓｅ  Ｈを加えて３７℃で２０分間インキュベートし、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを得た。
続いて、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。即ち、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、ｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２（ここで、ｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２とは、上記８種類の任意のプライマーである）、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標−宝酒造社製）、水を混合し、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃２分間で３サイクル、さらに、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間で２７サイクルの後、７２℃で５分間反応させた。
反応液を０．８％アガロースゲルで電気泳動した結果、７−Ｆと１２−Ｒ、７−Ｆと１４−１−Ｒ、７−Ｆと１４−２−Ｒ、１２−Ｆと１４−１−Ｒ、１２−Ｆと１４−２一Ｒの組み合わせで、ＰＣＲ産物の増幅がみられた。各ＰＣＲ産物のサイズは、順に約６００ｂｐ、１０００ｂｐ、１０００ｂｐ、４００ｂｐ、４００ｂｐであった。
４−３）部分ｃＤＮＡの塩基配列の決定
各ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）に挿入し、組換え体を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換してＬＢ（５０μｇ／μｌアンピシリンを含む）寒天培地上で培養した。得られたコロニーを鋳型に、Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いて以下の条件でｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲを行った。大腸菌の菌体、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、Ｍ１３  ＦＷ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｍ１３  ＲＶ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標−宝酒造社製）、水を混合し、９０℃１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。反応液を０．８％アガロースゲルで電気泳動後、目的のｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ産物をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｓ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いたスピンカラムで精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンシングを行った。
得られた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用いて解析した結果、約１０００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明でき、アミノ酸配列式（１）、アミノ酸配列式（２）およびアミノ酸配列式（３）の各部分構造は、蛋白質のＮ末端側からこの順番で位置していることが明らかになった。
４−４）全長ｃＤＮＡの塩基配列決定
部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成した。
５’−ＲＡＣＥ−４Ｒ；ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣ
５’−ＲＡＣＥ−５Ｒ；ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＴＣ
５’−ＲＡＣＥ−６Ｒ；ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＴＡＧ  ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＣＧ
３’−ＲＡＣＥ−１Ｆ；ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＣＧ
３’−ＲＡＣＥ−２Ｆ；ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣ
次に、５’／３’ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、以下の手順で５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥを行った。
（ａ）５’ＲＡＣＥ
１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、５’−ＲＡＣＥ−６Ｒ、ＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＤＥＰＣ−処理水を混合し、５５℃で６０分間インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。
次いで、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをスピンカラムで精製した後、ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ  ｄＡＴＰを加えて９４℃で３分間処理した。そこに、ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１０  ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベート後、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、５’−ＲＡＣＥ−５Ｒ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ、水を混合し、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。続いて、１ｓｔ−ＰＣＲ産物を鋳型にし、５’−ＲＡＣＥ−４ＲとＰＣＲ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、１ｓｔ−ＰＣＲと同条件でｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。
１ｓｔ−ＰＣＲ産物、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約５００ｂｐのバンドが確認できた。このｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターに挿入し、上記の４−３）に記載するｃＤＮＡの塩基配列の決定に従って、シークエンシングを行い、配列を解析した。
（ｂ）３’ＲＡＣＥ
１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ、ＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＤＥＰＣ−処理水を混合し、５５℃で６０分間インキュベート後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。
続いて以下の条件で１ｓｔ−ＰＣＲを行った。１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、３’−ＲＡＣＥ−１Ｆ、ＰＣＲ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標−宝酒造社製）、水を混合し、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。続いて、１ｓｔ−ＰＣＲ産物を鋳型にし、３’−ＲＡＣＥ−２ＦとＰＣＲ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、１ｓｔ−ＰＣＲと同条件でｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。
１ｓｔ−ＰＣＲ産物、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約６００ｂｐのバンドが確認できた。このｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターに挿入し、上記の４−３）に記載するｃＤＮＡの塩基配列の決定に従って、シークエンシングを行い、配列を解析した。
以上の結果から、アンドンクラゲの新規溶血活性蛋白質をコードするｃＤＮＡのサイズ（１６１０ｂｐ）と配列、アミノ酸の数（４５０ａａ）と配列が明らかになり、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、溶血活性蛋白質をコードする遺伝子は配列番号４で示される塩基配列を有するものであった。
アミノ酸配列式（１）（配列番号１）が、配列番号５のアミノ酸番号５６から６９に、アミノ酸配列式（２）（配列番号２）が、配列番号５のアミノ酸番号２５０から２６７に、アミノ酸配列式（３）（配列番号３）が、配列番号５のアミノ酸番号３６３から３７７に対応していた。さらに、配列番号４のヌクレオチド番号１６００以降にポリＡ配列が存在した。
以上のようにして得られた本発明の新規な蛋白質は、上記した実施例に記載のように、その生理活性および物理的、化学的特性として；
（ａ）溶血活性を有するものであり、
（ｂ）分子量が約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳゲル電気泳動法による）を有し、
（ｃ）その部分アミノ酸配列として、上記したアミノ酸配列式（１）〜（３）を有し、
（ｄ）その全アミノ酸配列として、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を有する特異的な蛋白質である。
産業上の利用可能性
本発明が提供するアンドンクラゲの刺胞由来の溶血活性を有する蛋白質は、その部分アミノ酸配列および全一次アミノ酸配列からホモロジー検索を行った結果から、既知の蛋白質には似ていない新しい蛋白質であり、例えば溶血のメカニズム等を解明するための生化学試薬として有用である。
また、分子レベルでの構造活性相関の研究や、当該蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体の研究などにより、例えばクラゲによる刺傷時の治療用薬剤など医薬品開発への新たなアプローチを与えるものであり、さらに血小板凝集作用等を有する医薬品や、溶血活性を利用した農薬として有用なものでもある。
【配列表】
0004245804.tif 000002
0004245804.tif 000003
0004245804.tif 000004
0004245804.tif 000005
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