(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含む組成物であって、該ウイルスが、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列と、プロモーター／調節配列と、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部と、第IX因子をコードし且つ5’および3’非翻訳領域を伴う単離DNAと、転写停止シグナルとを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクター（AAV-F.IX）からなる、上記組成物。
【請求項２】
前記第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部が、約0.3kb〜約1.7kbの長さである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記第IX因子をコードする単離DNAが、成熟第IX因子の初めから５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする突然変異を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
薬剤学的に許容される担体をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記プロモーター／調節配列が、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記転写停止シグナルがSV40転写停止シグナルである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
請求項１記載の組成物を含むキット。
【請求項８】
哺乳動物の血友病の治療のための薬剤の製造における、組換えアデノ関連ウイルスベクター（rAAV）からなるウイルスおよび薬剤学的に許容される担体を含む組成物の使用であって、該rAAVが、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列と、第IX因子をコードし且つ5’および3’非翻訳領域を伴う核酸配列に作動可能なように連結されたプロモーター／調節配列と、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部と、転写停止シグナルとを含有する（AAV-F.IX）、上記使用。
【請求項９】
前記組換えアデノ関連ウイルスベクターが、哺乳動物の少なくとも２つの部位に前記ベクターを注入することにより投与される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記組換えアデノ関連ウイルスベクターが、哺乳動物の少なくとも６つの部位に前記ベクターを注入することにより投与される、請求項８記載の使用。
【請求項１１】
前記組換えアデノ関連ウイルスベクターが、哺乳動物１匹当たり約１×108〜約５×1016個のウイルスベクターゲノムの用量で投与される、請求項８記載の使用。
【請求項１２】
前記第IX因子がヒト第IX因子である、請求項８記載の使用。
【請求項１３】
前記プロモーター／調節配列が、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される、請求項8記載の使用。
【請求項１４】
前記第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部が、約0.3kb〜約1.7kbの長さである、請求項８記載の使用。
【請求項１５】
前記第IX因子をコードする核酸が、成熟第IX因子の初めから５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする突然変異を含む、請求項８記載の使用。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８記載の使用。
【請求項１７】
前記投与が哺乳動物の筋肉組織への投与である、請求項９記載の使用。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターが野生型AAVによって有意に汚染されていない、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターがAAV-F.IXの109ゲノムあたり１感染単位未満しか野生型AAVを含まない、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
前記ウイルスベクターが野生型AAVによって有意に汚染されていない、請求項８記載の使用。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターがAAV-F.IXの109ゲノムあたり１感染単位未満しか野生型AAVを含まない、請求項20記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、血流中のタンパク質の欠損が関与する疾患の治療のための遺伝子治療法である。
発明の背景
血液凝固の過程には、カスケード様式に作用して凝血塊を形成させる血液凝固タンパク質として知られている一連のタンパク質が関与する。血友病は、血液凝固因子をコードする遺伝子が、そのコードされるタンパク質がカスケード過程で正常に機能しないような突然変異を有する、ヒトおよび他の哺乳動物の疾患である。具体的には、遺伝性疾患である血友病Ｂは、血液凝固タンパク質である第IX因子（F.IX）をコードする遺伝子の突然変異を特徴とする。F.IXは、Highらが総説を書いている（1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編，Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor IX”）。
アデノウイルスベクターは遺伝子治療で周知であり、該ウイルスを免疫抑制剤とともに投与した時、免疫不全マウスまたは免疫適格マウスで高レベルのイヌ第IX因子を発現するのに使用されている。免疫抑制剤の非存在下でアデノウイルスベクターを免疫適格マウスに投与すると、これらのベクターは強い炎症性および細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答を誘導（Daiら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405）し、これが治療の有効な作用を無効にする。さらに、複製欠陥アデノウイルスを筋肉内注入すると、トランスジーンが自己タンパク質（すなわち宿主タンパク質）をコードするなら強い宿主免疫応答が回避されるようにトランスジーンが長期発現を提供することを示唆する報告がある（Tripathyら、1996, Nature Med. 2:545-550; Yangら、1996, Hum. Mol. Genet. 5:1703-1712）。すなわち遺伝子治療の分野において、骨格筋へアデノウイルスベクターを直接注入した後の選択されたトランスジーンのin vitro発現で大きな進歩があるが、これらの免疫学的研究を考慮すると、アデノウイルスベクターの使用は遺伝子治療の最適の治療法ではないかもしれない。
レトロウイルスベクターもまた、血友病Ｂ治療のモデルとして実験的に使用されている。しかしこれらのベクターからのF.IXの発現レベルはあまりにも低く、治療的価値がないと報告されている（Kayら、1993, Science 262:117-119）。
マウスの筋肉に注入されたプラスミドDNAは、エリスロポエチン（Epo）を直接発現させることが実証されている（Tripathyら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10876-10880）が、この遺伝子治療法は治療効果を示すためには明らかに、循環中で（Epoに比較して）比較的高レベルが必要とされるF.IXのような遺伝子産物の発現には充分に効率的ではない。
アデノ関連ウイルス（adeno-associated virus; AAV）は、筋肉への遺伝子の送達のためのアデノウイルスの代替ビヒクルである。組換えAAV（rAAV）はウイルスタンパク質をコードする配列を含有せず、宿主細胞の染色体DNAに組み込まれる能力を有する（Carter, 1992, Curr. Opin. Biotech. 3:533-539; Skulimowskiら、1995, Method Mol. Genet. 7:7-12）。野生型AAVまたはヘルパーアデノウイルスにより大きく汚染されていない純粋なrAAVの産生を促進する産生法および精製法が、現在利用できる（Skulimowskiら、1995、前述；Fisherら、1996, J. Virol. 70:520-532；Samulskiら、1989, J. Virol. 63:3822-3828）。本明細書に記載したように、哺乳動物へのアデノウイルスの投与は前記の免疫学的問題を伴う。
肝細胞や気道上皮細胞についてはヘルパーウイルスの非存在下ではrAAVによるin vivo形質導入の効率は低い（Fisher, 1996、前述）が、ニューロン（Kaplittら、1994, Nature Genet. 8:148-154）や骨格筋繊維（Xiaoら、J. Virol. 70:8098-8108）のような有糸分裂後の特定の細胞は、このベクターで有効に形質導入される。1.5年までのlacZの安定な発現が報告されている（Xiaoら、前述）。アデノウイルスベクターとは対照的に、免疫適格動物にrAAVを筋肉内注入しても、形質導入された筋肉繊維に対してCTL応答は起こらず、細胞内lacZ遺伝子産物に対する循環抗体も存在しない。
rAAVの筋肉内注入後の分泌タンパク質Epoの発現がKesslerら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14082-14087）で報告されている。しかし報告されたタンパク質発現のレベルは、F.IXが仲介する治療効果に必要なレベルより１桁〜２桁低かった。
血友病の現在の治療法では、出血が起きると必ず凝固因子濃縮製剤を静脈内に注入する。この治療法は面倒で不便でかつ高価である。濃縮製剤だけで平均的患者は毎年約100,000ドル支払う。さらに濃縮製剤は間欠的に患者に投与されるだけであるため、タイミングよく投与治療しないと致命的となる生死に関わる出血の危険が残る。
治療効果が達成されるように、血友病を有する哺乳動物特に血友病を有するヒトにF.IXを投与する方法に対する長年のかつ深刻なニーズがある。本発明はこのニーズを満たすものである。
発明の概要
本発明は、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列（adeno-associated virus inverted terminal repeat）、プロモーター／調節配列と、第IX因子をコードし且つ5’および3’非翻訳領域を伴う単離DNAと、転写停止シグナルとを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターを含んでなる組成物に関する。
１つの態様において本組成物は、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部をさらに含む。好適には第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbの長さである。
別の態様において、第IX因子をコードする単離DNAは、そのコードされた第IX因子をコラーゲンIVに結合できなくする突然変異を有する。
１つの実施形態において突然変異DNA中の突然変異は、成熟F.IXの初めから５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする。
さらに別の態様において本組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含む。
別の態様においてプロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される。さらに転写停止シグナルはSV40転写停止シグナルである。
また本発明には、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列と、プロモーター／調節配列と、第IX因子をコードし且つ5’および3’非翻訳領域を伴う単離DNAと、転写停止シグナルとを含有するベクター、ならびに、使用説明書を含むキットが包含される。
本発明はまた、哺乳動物の血友病の治療法を含む。この方法は、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列、プロモーター／調節配列、第IX因子をコードし且つ5’非翻訳領域および3’非翻訳領域を伴う単離DNA、および転写停止シグナルを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターと、薬剤学的に許容される担体とを含んでなる組成物を哺乳動物の筋肉組織に投与することを含む。
１つの態様において組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少なくとも２つの部位に組成物を注入することにより投与される。
好適な実施形態において組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少なくとも６つの部位に組成物を注入することにより投与される。
別の態様において組換えアデノウイルスベクターは、哺乳動物１匹当たり約１×108〜約５×1016のウイルスベクターゲノムの用量で投与される。
好適な実施形態において哺乳動物はヒトであり、第IX因子はヒト第IX因子である。
さらに別の態様においてプロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される。
別の態様において本組成物はさらに、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部を含む。好ましくは第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbである。
さらに別の態様において第IX因子をコードする単離DNAは、そのコードされた第IX因子がコラーゲンIVに結合できなくなるようにする突然変異を含む。
好適な実施形態において突然変異されたDNA中の突然変異は、成熟F.IXの初めから５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする。さらに好ましくは哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスにAAV-hF.IXを筋肉内注入した後の時間の関数としての、実験マウスの血漿中のヒトF.IX（hF.IX）の濃度の分析を示す一連のグラフである。各線は個々のマウスを示す。
図1Aは、２×1011のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM）注入後のC57BL/6マウスを示す。
図1Bは、２×1011のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM）注入後のRag1マウスを示す。マウスo-oは、注入の５週間後に外傷性瀉血後に死んだ。
図1Cは、１×1010のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM）注入後のRag1マウスを示す。
図２は、２×1011のAAV-hF.IXウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝３）の筋肉内（IM）注入後のC57BL/6マウス中の循環（血漿）抗hF.IX抗体の量の経時変化試験を示すグラフである。抗体のレベルは、標準物質としてマウスモノクローナル抗hF.IX（Boehringer Mannheim）を使用してELISAで測定した。各線は個々の動物を示す。
図３は、種々のウイルスベクターを筋肉内（IM）注入した後のC57BL/6マウスの血漿中のhF.IXに特異的な抗体の存在を示すウェスタンブロットの図である。レーン１は、AAV-lacZを筋肉内（IM）注入した動物であり、注入後18日目に採血した血清を使用した。レーン２は、組換えアデノウイルス−hF.IX（Walterら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3056-3061）を筋肉内（IM）注入した動物であり、注入後20日目に採血した血清を使用した。レーン３〜10は、AAV-hF.IXを筋肉内（IM）注入した動物である。レーン３〜７は、注入後11、18、32、54、および60日目に分析した同じ動物である。レーン８〜10は、注入後18日目に分析した異なる動物である。
図４は、C57BL/6マウスの前脛骨筋の免疫蛍光染色（hF.IXに対する抗体を使用した。）を示す一連の図である。パネルＡは注入しなかった筋肉を示す。パネルＢ、Ｃ、およびＤは、AAV-hF.IXを注入してから３ヶ月後に染色した筋肉を示す。注入部位当たり3.3×1010のウイルスベクターゲノムをインキュベートした。倍率は200×である。
図５は、AAV-hF.IXを注入したC57BL/6マウスの前脛骨筋の筋肉切片の免疫蛍光染色を示す一連の図である。分析は、注入後３月目に行なった。筋肉切片を、hF.IXに特異的なFITC結合抗体とコラーゲンIVに対するローダミン結合抗体複合体を用いて同時染色した。パネルＡは、筋肉繊維と間質腔（interstitial space）中のhF.IXの存在を示すFITC（緑）の蛍光を表す。パネルＢは、筋肉繊維の細胞外マトリックス中のコラーゲンIVを示すローダミン（赤）の蛍光を表す。パネルＣは、両方の蛍光標識の同時励起を示す。hF.IXとコラーゲンIVは筋肉組織中で同じスペースをしめることを示す、間質腔中の黄色シグナルの存在に注意されたい。倍率は400×である。
図６は、AAV-hF.IXを注入した筋肉から単離したDNAの分析である。
図6Aは、２つのAAV-hF.IXベクターゲノムの頭尾（head-to-tail）縦列繰り返しを示す図である。AAV逆方向末端繰り返し（ITR）配列、CMVプロモーター／エンハンサー（CMV）、コーディング配列を含有するヒトF.IX cDNA、および228塩基対（bp）の3’非翻訳領域、イントロンＩの1.4kb部分、サルウイルス40ポリアデニル化シグナル（SV40）、および２つのゲノムの接合（junction）部位（Ｊ）を図に示す。イントロンＩからの1.2kbのEcoRV-EcoRI断片とCMVプロモーターから得られた0.7kbのBglII断片を、サザンブロットハイブリダイゼーションのプローブとして選択した。プライマー005（正方向プライマー）、013および017（ともに逆方向プライマー）の結合部位の相対的位置も示す。
図6Bは、AAV-hF.IX注入の６週間後のRag1マウスの筋肉から単離されたゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションの図である。hF.IXのイントロンＩからの放射性標識EcoRV-EcoRI断片をプローブとして使用した。レーン１は、pAAV-F.IXプラスミドDNAである。レーン２と３は、AAV-hF.IXを注入したマウスから単離したDNAである。レーン４と５は、非注入動物から単離したＤＮＡである。レーン１、２および４は、EcoRVで消化したDNAである。レーン３と５は未消化DNAである。レーン２〜５にレーン当たり15μgのゲノムDNAを加えた。DNAを１％アガロースゲルで分離した後ナイロン膜上に移した（Schleicher and Schuell）。端のサイズマーカーは、１kb DNAラダー（ladder）断片を示す。
図6Cは、PCRにより増幅したAAV-hF.IXの頭尾（head-to-tail）コンカテマー（concatamer）の接合部（junction）断片のサザンブロットハイブリダイゼーションの図である。プライマー対005-013（奇数レーン）またはプライマー対005-017（偶数レーン）を使用してゲノムDNAから増幅したPCR産物を示す。レーン１と２は注入しなかった動物である。レーン３〜６は、AAV-hF.IXを筋肉内（IM）注入したC57BL/6マウスである。レーン７〜10はAAV-hF.IXを筋肉（IM）内注入したRag1マウスである。PCR産物は、前脛骨筋（レーン３、４、７および８）または大腿四頭筋（レーン５、６、９および10）のDNAから得られたDNAから得られた。レーン11と12は、頭尾（head-to-tail）配置で組み込まれたAAV-lacZの少なくとも２つのモノマーコピーを含有する細胞株10-3.AV5から得られたDNAから得られたPCR産物である。PCR産物を２％アガロースゲルで分離後ナイロン膜にブロットした。CMVプロモーターから得られた0.7kb BglII断片をプローブとして使用した。注入して６〜８週間後にゲノム筋肉DNAを単離した。
図７は、AAV-cF.IX（すなわち、AAVベクター中のイヌF.IX）の略図である。
図８は、それぞれイヌB45に８×1011のおよびイヌB46に１×1013のAAV-cF.IXを筋肉内注入した後の時間の関数としての全血液凝固時間（WBCT）を示す一連のグラフである。血液試料が60分以内に完全に凝固しなかったなら、WBCTは65分とした。星印（*）は部分的凝固を示す。未治療の血友病ＢのイヌのWBCTは＞60分（点線）であり、正常なイヌでは６〜８分（破線）の範囲である。縦の矢印は、出血に対して正常な血漿で治療したことを示す。
図９は、イヌB45とB46から得られた血漿試料の活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）による凝固時間を示す一連のグラフである。正常のイヌ：13〜18秒（破線）。未治療の血友病Ｂのイヌ：50〜80秒（点線）。縦の矢印は出血に対して正常な血漿で治療したことを示す。
図10は、血友病ＢのイヌB45とイヌB46にそれぞれ８×1011のAAV-cF.IXまたは１×1013のAAV-cF.IXを筋肉内注入した後のイヌ第IX因子の血漿レベルを示す一連のグラフである。イヌ第IX因子濃度はELISAにより測定した。縦の矢印は出血に対して正常な血漿で治療したことを示す。第９週〜12週のB46での高値は、部分的に正常な血漿による治療のためである。
図11は、イヌB45の骨格筋中のcF.IXの免疫蛍光染色を示す一連の図である。パネルＡ：注入しなかった筋肉。パネルＢ〜Ｄ：第７週に５×1010のAAV-cF.IXの１つの注入部位から得られた前脛骨筋。
図12は、AAV-mF.IX（すなわち、AAVベクター中のマウスF.IX）の略図である。
図13は、mF.IXに特異的なマウス血漿中の抗体の検出のためのウェスタンブロットの図である。mF.IXをニトロセルロース膜に移し、種々のマウス血漿試料の存在下でインキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGとともにインキュベートし、ECLで検出した。レーン１−Ad-hF.IXの静脈内注入後にhF.IXに特異的な抗体が生じた血友病Ｂマウスからの、CD-1バックグランドに対して出血して得られた血漿。これらの抗体はマウス第IX因子と交差反応した。レーン２〜10−AAV-mF.IXを筋肉内注入したマウスから得られた血漿。レーン２〜４−BALB/cマウス。レーン５〜７−C57BL/6マウス。レーン８〜10−CD-1マウス。すべての試料は、注入の60日後にマウスから得られた。
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子送達ビヒクルとしてrAAVベクターを使用して哺乳動物の筋肉組織にhF.IXを送達すると、筋肉組織中で治療レベルのhF.IXが長期間発現されるという知見に基づく。発現されたタンパク質は、長期間哺乳動物の血漿中に存在し、従って血友病Ｂを有する哺乳動物にとって非常に大きな治療的利益がある。
本発明は、血友病Ｂの治療のためのF.IXの送達のみに限定されない。むしろ本発明は、他の血液凝固因子をコードするAAVベクターを包含し、これは本発明の方法を使用して、血友病の治療のために血友病を有する哺乳動物の細胞に送達される。すなわち本発明は、血友病Ａの治療のために哺乳動物への第VIII因子の送達（Tuddenham, 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor VIII”）；第VII因子欠損の治療のための第VII因子の送達（Petersenら、1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor VII”）；第Ｘ因子欠損の治療のための第Ｘ因子の送達（Watzkeら、1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor X”）；第XI因子欠損の治療のための第XI因子の送達（Fukikawaら、1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor XI”）；第XIII因子欠損の治療のための第XIII因子の送達（Laiら、1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Factor XIII”）；プロテインＣ欠損の治療のためのプロテインＣの送達（Suzukiら、1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker, Inc.）中の”Protein C”）を包含する。
哺乳動物の細胞への上記タンパク質のそれぞれの送達は、まず所望のタンパク質をコードするDNAを含むAAVベクターを作成し、次にこのベクターを哺乳動物に投与することにより行われる。すなわち本発明は、第XI因子、第VIII因子、第Ｘ因子、第VII因子、第XI因子、第XIII因子、またはプロテインＣのいずれか１つをコードするDNAを含むAAVベクターを含む。本発明があれば、これらのタンパク質をコードするDNAを含むAAVベクターの作成は、当業者には明らかであろう。
さらに本発明は、血液凝固タンパク質をコードする単離されたDNAを含むrAAVベクターのみに限定するように解されるべきではない。むしろ本発明は、他のタンパク質をコードし、好ましくは哺乳動物の筋肉組織に投与されるDNAを含むrAAVベクターを含む。すなわち本発明は、哺乳動物の他の病状の治療に有用な遺伝子産物をコードするDNAを含むと解されるべきである。このようなDNAおよび関連する病状は以下のものを含むがこれらに限定されない：グリコーゲン貯蔵欠陥タイプ1Aに関連する、グルコース-6-ホスファターゼをコードするDNA；ペプク（Pepck）欠損に関連する、ホスホエノールピルベート−カルボキシキナーゼをコードするDNA；ガラクトース血症に関連する、ガラクトース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードするDNA；フェニルケトン尿症に関連する、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするDNA；メープルシロップ尿症に関連する、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA；チロシン血症タイプＩに関連する、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼをコードするDNA；メチルマロン酸血症に関連する、メチルマロニル-CoAムターゼをコードするDNA；中鎖アセチルCoA欠損に関連する、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNA；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損に関連する、オルニチントランスカルバミラーゼをコードするDNA；シトルリン血症に関連する、アルギニノコハク酸シンセターゼをコードするDNA；家族性高コレステロール血症に関連する、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするDNA；クリグラー-ナジャー（Crigler-Najjar）病に関連する、UDP-グルコウロノシルトランスフェラーゼをコードするDNA；重症複合免疫不全症に関連する、アデノシンデアミナーゼをコードするDNA；通風とレッシュ-ナイハン（Lesch-Nyan）症候群に関連する、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするDNA；ビオチニダーゼ欠損に関連する、ビオチニダーゼをコードするDNA；ゴーシェ病に関連する、β−グルコセレブロシダーゼをコードするDNA；スライ（Sly）症候群に関連する、β−グルクロニダーゼをコードするDNA；ツェルヴェーガー（Zellweger）症候群に関連する、ペルオキシソーム膜タンパク質70kDaをコードするDNA；急性間欠性ポルフィリン症に関連する、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼをコードするDNA；α-1アンチトリプシン欠損（肺気腫）の治療のためのα1アンチトリプシンをコードするDNA；サラセミアまたは腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチンをコードするDNA；および、糖尿病の治療のためのインスリンをコードするDNA。このようなDNAおよび関連疾患は、Kayら（1994, T.I.G. 10:253-257）とParker Ponder（1996, Gene Transfer in Cardiovascular Biology:Experimental Approaches and Therapeutic Implications”（Keith March編）中の”Gene Therapy for Blood Protein Deficiencies”）の総説がある。
明瞭にするためにかつ最良の実施形態の要件を満たすために、以後の説明は哺乳動物の筋肉組織に送達する好適なタンパク質として第IX因子を例示する。
本発明はまた、本発明のrAAVベクターをコードするhF.IXを哺乳動物の筋肉組織の複数の部位に注入すると、哺乳動物でhF.IXの高レベルの長期の発現が起き、哺乳動物に対して治療上の利益を提供するという知見に基づく。
本発明はさらに、hF.IXは哺乳動物の筋肉組織中の間質腔のコラーゲンIVに結合するという追加の知見に基づく。本発明のrAAVベクターを介して哺乳動物の筋肉組織に突然変異型のhF.IX（この突然変異型はコラーゲンIVに結合しない）を送達することも、血友病を有する哺乳動物に対して治療上の利益を提供する。
本発明は、血友病の治療に使用するためのF.IXまたはその生物活性のある断片をコードするDNAを含むrAAVベクターを含む。
本発明はまた、血友病Ｂを有する哺乳動物好ましくはヒトの治療法を含む。この方法は、本発明のrAAVベクターを哺乳動物の筋肉組織に投与することを含む。
本発明のrAAVベクターは、いくつかの基本的なDNA要素を含む。これらのDNA要素は、少なくとも２コピーのAAV ITR配列、プロモーター／エンハンサー要素、転写停止シグナル、F.IXまたはその生物活性を有する断片をコードするDNAをフランキングするいずれの必要な5’または3’非翻訳領域、を含む。本発明のrAAVベクターはまたイントロンＩの一部を含む。また、本発明のrAAVベクターは随時、コラーゲンへの突然変異F.IXの結合が実質的に低下しているかまたは完全に排除されるように、突然変異を含有するF.IXをコードするDNAを含む。これらの要素を詳細に説明する。
ベクターは、多くの異なるタイプの細胞において異種遺伝子の高レベル発現を駆動させることができる無差別プロモーターを含むプロモーター／調節配列を含む。このようなプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）即時型初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルスプロモーター／エンハンサー配列などを含むがこれらに限定されない。本発明のrAAVベクター中のプロモーター／調節配列は、好ましくはCMV即時型初期プロモーター／エンハンサーである。しかし異種遺伝子の発現を駆動させるのに使用されるプロモーター配列は、誘導性プロモーター（例えばステロイド誘導性プロモーターがあるがこれらに限定されない）、組織特異的プロモーター（例えば、筋肉組織特異的な骨格筋α−アクチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーなどがあるが、これらに限定されない）などでもよい。
本明細書において用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能なように結合された遺伝子の発現に必要なDNA配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列でもよく、他の場合はこの配列はまた、エンハンサー配列および誘導性／抑制性にまたは組織特異的に遺伝子の発現に必要な他の調節要素を含んでもよい。
本明細書において２つのDNAが「作動可能なように結合」しているという説明は、１本鎖または２本鎖DNAが２つのDNAのそれぞれからなり、このDNA配列の少なくとも１つがもう一方の配列により特徴付けられる生理学的作用を示すことができるように、DNA内で２つのDNAが配置されていることを意味する。
本発明のrAAVベクターはまた転写停止シグナルを含む。転写停止シグナルは本発明のベクター中に含まれてよいが、好ましくは転写停止シグナルはSV40転写停止シグナルである。
このベクターはまたイントロンＩの一部を含む。hF.IXの配列についてイントロンＩは、PvuII部位（ヌクレオチド番号1098）までのイントロンの5’末端と、ヌクレオチド番号5882のPvuII部位で始まりエキソン２との接合部まで伸びるイントロンの3’末端とを含むDNAの断片である（Yoshitakeら、1985, Biochemistry 24:3736-3750；Kurachiら、1995, J. Biol. Chem. 270:5276-5281；Jallatら、1990, EMBO J. 9:3295-3301）。
F.IXをコードするプラスミドまたはウイルスベクター中にイントロン要素を含めることはF.IXの発現を、イントロン要素の非存在下でのプラスミドまたはウイルス要素でのF.IXの発現と比較して、２〜10倍増強させる（Kurachiら、1995、前述）。AAVベクターは典型的には、一般に約４kb〜約4.8kbである規定のサイズ範囲を有するDNAの挿入体を受け入れ、F.IX遺伝子のコーディング領域は約1.5kbを含む。すなわち、AAVベクターについて許容されるDNAの必要な長さを達成するために挿入体断片中に追加のDNAを含むことが必要である。F.IXイントロンＩ断片はこの要件を満たし、AAVベクターゲノムのバックグランドに位置するF.IXの発現を増強する。すなわち、本発明は本発明のrAAVベクター中にイントロンＩ配列を含めることに限定されず、イントロンＩの一部の代わりに他のイントロンまたは他のDNA断片配列を包含すると解されるべきである。
本明細書で使用される用語「イントロンの一部」とは、約0.3kb〜約1.7kbの長さのヌクレオチドを有するイントロンＩの領域を意味し、この領域はイントロンＩの一部の非存在下でのF.IXの発現と比較すると、プラスミドまたはウイルスベクター鋳型上でF.IXの発現を少なくとも約1.5倍上昇させることを意味する。好ましくは本発明において有用なイントロンＩの一部は、約1.4kbの長さである。
本発明のrAAVベクターはまた、hF.IX DNA配列をフランキングするDNAの5’および3’非翻訳領域を含む。実験例のセクションに例示するrAAV-hF.IXベクターにおいて、hF.IX配列をフランキングする5’非翻訳領域は以下の通りである：F.IX配列の5’末端で、配列GGTACCを有するKpnI部位まで3’末端でCMVプロモーターエンハンサー配列が続く。この領域のすぐ下流に、配列AGATCTCCACC［配列番号１］を有する短いポリリンカー配列が続き、これ自身はすぐ下流に、アミノ酸番号-46で始まるhF.IX配列（このコドンはYoshitakeら（1985、前述）の番号付けに従うATGである）が続く。
実験の詳細のセクションで例示されるrAAV-hF.IXベクターにおいて、hF.IX配列をフランキングする3’非翻訳領域は以下の通りである：翻訳停止シグナルの末端で、SV40ポリＡシグナル配列にスプライシングされるhF.IXの3’非翻訳領域の最初の228ヌクレオチドが存在する。
特にhF.IX以外のタンパク質をコードするDNAが本発明のrAAVベクターで使用される時、DNAの他の5’および3’非翻訳領域がhF.IXの場合に記載したものの代わりに使用される。
本発明の好適なrAAVベクターはまた、F.IXまたは生物活性のあるF.IX断片をコードする単離されたDNAを含む。F.IXをコードするDNAは好ましくはhF.IXであるが、本発明は既知または未知のすべての哺乳動物F.IX配列を含むと解されるべきである。F.IX配列の例は以下の論文に記載されている：Yoshitakeら、1985、前述；Kurachiら、1995、前述；Jallatら、1990、前述；Kurachiら、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464；Jayeら、1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335；Ansonら、1984、EMBO J. 3:1053-1060；Wuら、1990, Gene 86:275-278；Evansら、1989、Blood 74:207-212；Pendurthiら、1992, Thromb. Res. 65:177-186；Sakarら、1990, Genomics 1990, 6:133-143；およびKatayamaら、1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994。すなわち本発明は、F.IXは本明細書に記載のhF.IXと実質的に同様に機能する、ヒト以外の哺乳動物からのF.IX遺伝子も含むと解されるべきである。好ましくはF.IXをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、本明細書に記載されその配列はYoshitakeら（1985、前述）が提供しているhF.IXをコードする遺伝子と、約50％相同であり、より好ましくは約70％相同であり、さらに好ましくは約80％相同であり、最も好ましくは約90％相同である。
用語「コードするDNA」は、所望のタンパク質をコードするDNA配列と実際のコーディング配列に伴う5’または3’非翻訳領域を含む。
さらに本発明は、本発明の遺伝子治療法において、コードされる変異体または突然変異体を完全長hF.IXとして治療上有効にするか、または完全長hF.IXよりさらに治療上有効にする、野生型hF.IX DNA配列の天然に存在する変異体または組換え法で得られた突然変異体を含む。
例えば本明細書に記載の実験から明らかなように、コラーゲンIVは、rAAVベクターを介して哺乳動物の筋肉組織に導入されるhF.IXを捕捉するのに役立つ。従ってこのように導入されたhF.IXの一部は、コラーゲンIVにより筋肉組織中の間質腔中に保持されるため、血液凝固に参加するためには利用不能である。コードされるタンパク質がコラーゲンIVに結合しないように、hF.IX DNAの配列に突然変異を導入することは可能である。そのような突然変異体は本発明の遺伝子治療法において、筋肉組織の間質腔中に捕捉されない型のhF.IXをコードする点で、血友病の治療に有用である。好ましくは成熟タンパク質の最初から５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアミノ酸アラニンを含むhF.IXタンパク質をコードする突然変異体hF.IX遺伝子は、コラーゲンIVに対するhF.IXの結合を低下または排除するために、本発明のrAAVベクターで有用である。
本発明はまた、hF.IX生物活性を保持するhF.IXの変異体をコードするDNAを含む。そのような変異体（すなわち、hF.IXのタンパク質またはポリペプチドの類似体）は、タンパク質またはポリペプチドが、本明細書に記載の方法での使用の適合性を向上させる追加の性質を有するように、組換えDNA技術を使用して修飾されているかまたは修飾されてよいタンパク質またはポリペプチド（例えば、血漿中のタンパク質に安定性の向上とタンパク質の比活性の向上を与える変異体があるが、これらに限定されない）を含む。類似体は、保存的アミノ酸配列の差異もしくは配列に影響を与えない修飾、またはその両方により、天然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なってもよい。例えば、タンパク質またはペプチドの１次配列を変化させるが通常はその機能を変化させない保存的アミノ酸の変化を作成してもよい。保存的アミノ酸置換は、典型的には以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、スレオニン；
リジン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくはhF.IX類似体のアミノ酸配列は、Yoshitakeら（1985、前述）が記載したhF.IXのアミノ酸配列と、約70％相同であり、より好ましくは約80％相同であり、さらに好ましくは約90％相同であり、さらに好ましくは約95％、最も好ましくは約99％相同である。
本明細書で使用される「相同」とは、２つのポリマー分子の間、例えば２つの核酸分子（例えば、２つのDNA分子または２つのRNA分子）の間、または２つのポリペプチド分子の間の、サブユニット配列の類似性を意味する。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる時（例えば、もし２つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められるなら）、これらはその位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、一致するかまたは相同的な位置の数の直接の関数であり、例えば２つの化合物の配列中の位置の半分（例えば、10サブユニットの長さのポリマー中の５つの位置）が相同であるなら、２つの配列は50％相同であり、位置の90％（例えば、10のうち９）が一致しているかまたは相同であるなら、２つの配列は90％の相同性を有する。例えば、DNA配列3’ATTGCC5’と3’TATGCG5’は50％相同である。
F.IXの突然変異体または変異体型の作成のために、任意の数の方法が使用される。例えばからコラーゲンIVに結合しないhF.IXの突然変異体型の作成は、任意の分子生物学のマニュアル、例えばSambrookら（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY）に記載の通常の組換えDNA技術を使用して、プラスミド鋳型上のF.IX遺伝子に欠失、置換または挿入突然変異を導入することにより行われる。こうして作成した突然変異体F.IXを発現させ、得られるタンパク質を、例えばCheungら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11068-11073）が記載したようなコラーゲンIV結合アッセイを用いて、コラーゲンIVへの結合能力を評価する。次にコラーゲンIVに結合しない突然変異タンパク質を、本明細書で定義したようにF.IX生物活性について試験する。コラーゲンIVに結合しないがF.IX生物活性を保持する突然変異F.IXタンパク質をコードするDNAは、本発明のrAAVベクターでの使用に適している。
ポリペプチドをコードするDNA配列を変化させてタンパク質またはポリペプチド中にアミノ酸の変化を導入する方法は、当該分野で周知であり、Sambrookら（1989、前述）にも記載されている。
本明細書において「単離核酸」とは、天然に存在する状態でフランキングする配列から分離された核酸配列、セグメント、または断片［例えば通常その断片に隣接する配列（例えば、天然のゲノム中の断片に隣接する配列）から除去されているDNA断片］を意味する。この用語はまた、核酸を自然に伴う他の成分（例えば、細胞中に自然に伴うRNAまたはDNAまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも当てはまる。この用語は従って、例えばベクター中に；自律的に複製するプラスミドまたはウイルス中に；または原核生物または真核生物のゲノムDNA中に取り込まれているか；または他の配列から独立して別の分子として（例えば、PCRまたは制限酵素消化により産生されるcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片として）存在する、組換えDNAを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。
本明細書において「生物活性のあるF.IX」とは、血液凝固測定法で血液の凝固を仲介することができるF.IXタンパク質を意味する。血液凝固測定法は当該分野で周知であり、例えばWalterら（1996、前述）およびHathawayとGoodnight（1993, Disorders of Hemostasis and Thrombosis: A Clinical Guide, pp.21-29のLaboratory Measurement of Hemostasis and Thrombosis）に記載されている。
本明細書においてF.IXについて「治療効果」とは、出血後の哺乳動物の血液の凝固を意味する。
本発明は、実験例で例示される特定のrAAVベクターに限定されず、本発明は任意の適当なAAVベクター（例えば、AAV-1、AAV-3，AAV-4，およびAAV-6などに基づくベクターを含むが、これらに限定されない）を含む。
また本発明には、血液凝固測定法で血液の凝固を仲介する治療効果を提供するのに有効な量で、血友病を有する哺乳動物を治療する方法も含まれる。この方法は、哺乳動物にF.IXを含むrAAVベクターを投与することを含む。好ましくは哺乳動物はヒトであり、rAAVベクターは、アミノ酸番号５（成熟タンパク質の最初から付けた番号）はリジンの代わりにアラニンであるような突然変異を随時含むhF.IXを含む。
本発明によれば、血友病を有する哺乳動物の治療にはいくつかの方法があることが知見された。本発明の１つの方法において、F.IXを含むrAAVベクターの調製物が、投与当たり１つの部位で動物の筋肉組織に注入され、別の方法では、rAAVの調製物が動物の筋肉組織に同時にまたは数時間かけて複数の筋肉組織部位に注入される。後者の場合、方法がウイルスベクターゲノムを同時に複数注入を含む時、筋肉組織の異なる領域がrAAVベクターを同時に受けるように複数の送達注入装置が使用される。
典型的には、１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は約１×108〜約５×1016の範囲である。好ましくは１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は約１×1010〜約１×1015の範囲であり、より好ましくは１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は約５×1011〜約５×1015の範囲であり、最も好ましくは１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は約５×1013〜約５×1014の範囲である。
本発明の方法が、複数の部位への同時注入または数時間（例えば、約１時間未満から約２または３時間まで）にわたって異なる筋肉部位への注入を含むいくつかの複数の部位への注入を含む時、投与されるウイルスベクターゲノムの総数は、単一部位注入法で記載のものと同じである。
単一部位への注入で本発明のrAAVベクターを投与するには、ウイルスの懸濁液が直接筋肉内に注入される。
複数の部位への注入のためには、針が哺乳動物の筋肉組織に挿入される。実質的に連続的に針のトラックに沿って、１回の注入で一連の筋肉内部位が注入されるようにベクターは注入され、従って各部位は前の部位よりさらに筋肉組織内の位置にある。各注入は、針のトラックに沿って約５〜約30部位を標的とし、患者は全部で約50回の注入を受ける。従ってこの方法は、麻酔下で行うことが好ましい鍼療法に似ている。
rAAVの複数の部位への注入はまた、結核感染の検出に通常使用されるような複数注入装置を使用して行われる。
哺乳動物への投与のために、F.IXを含むrAAVベクターは薬剤学的に許容される担体（例えば、pH約7.8のヘペス緩衝化食塩水）に懸濁される。他の有用な薬剤学的に許容される担体には、グリセロール、水、食塩水、エタノール、および他の薬剤学的に許容される塩（例えばリン酸塩、および有機酸の塩）があるが、これらに限定されない。これらのおよび他の薬剤学的に許容される担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Science（1991, Mack Publicaion Co., New Jersey）に記載されている。
本発明のrAAVベクターはまた、例えば乾燥した塩調製物中のベクターの凍結乾燥調製物、ベクター／塩組成物の懸濁のための無菌水、およびベクターの懸濁とその哺乳動物への投与のための説明書とを含むキットの形で提供されてもよい。
以下の実験例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は例示目的で提供されるのみであり、特に明示しない場合は決して本発明を限定するものではない。すなわち本発明は、決して以下の実施例に限定されるものではなく、本明細書の教示の結果として明らかになるすべての変形も包含するものと解されるべきである。
実施例１：組換えアデノ関連ウイルスの筋肉内注入後のヒト血液凝固第IX因子の安定な遺伝子導入と発現
本実施例に記載の実験は以下のように要約される。ヒトF.IXを発現する組換えAAV（rAAV）ベクターの筋肉内注入が治療的レベルのヒトF.IXの発現を指令できるかどうかを調べるために、以下の実験を行なった。hF.IXを発現する高力価（1012〜1013ベクターゲノム／ml）のrAAVを調製し、精製し、C57BL/6マウスとRag1マウスの後ろ足の筋肉内に注入した。免疫適格C57B/6マウスで、注入の３ヶ月後に採取した筋肉の免疫蛍光染色はhF.IXタンパク質の存在を証明し、筋肉DNAのPCR解析はAAV DNAについて陽性であったが、マウス血漿中にhF.IXは検出されなかった。さらにこれらのマウスがhF.IXに対する循環抗体を産生することが観察された。リコンビナーゼ活性化遺伝子の突然変異を有し従って機能的Ｂ細胞とＴ細胞が欠如したRag1での追跡実験で、筋肉のDNA解析により同様の結果が見られたが、これらのマウスは血漿内に治療的レベル（200〜350ng／ml）のhF.IXも証明した。hF.IX発現の経時変化は、数週間にわたってレベルが徐々に上昇した後プラトー（最初の注入後約６ヶ月安定である）に達することを証明している。他の実験では、筋肉繊維間の間質腔でhF.IXとコラーゲンIVの同時局在が観察された。コラーゲンIVはhF.IX結合タンパク質として同定された。すなわちこの知見は、hF.IXの免疫蛍光染色の異常パターンを説明している。これらの実験は、筋肉内注入後の治療的レベルのhF.IXの安定な発現を指令するのにrAAVを使用することができ、これは血友病Ｂを有する患者の治療のための実用的な方策であることを示している。
この実施例で提示した実験で使用した材料と方法と以下に記載する。
rAAVの産生と精製
Fisherら（1996、前述）が記載したように、F.IXシスプラスミド（pAAV-FIX）とトランス作用性プラスミドpAAV/Ad（Skulimowskiら、1995、前述）を、E1欠失アデノウイルスを感染させたヒト胚腎（293）細胞中に同時トランスフェクションさせて、組換えAAVを作成した。pAAV-FIXはpsub201（Skulimowskiら、1995、前述）から得られ、CMVプロモーター／エンハンサー、イントロンＩの1.4kb断片を含むヒトF.IXコード配列（Kurachiら、1995、前述）、およびSV40ポリアデニル化シグナルを、AAV ITR配列にフランキングされて含有する。AAV repとcap遺伝子機能は、pAAV/Adによりトランスで供給された。E1欠失アデノウイルスは、ヘルパーウイルスによるrAAVストックの混入の可能性の同定を促進するために、lacZまたはアルカリ性ホスファターゼレポーター遺伝子を含有する。トランスフェクションの48時間後超音波処理して細胞を溶解し、放出されたウイルス粒子を、Fisherら（1996、前述）が記載したようにCsCl密度勾配遠心分離を４回行って精製した。
AAV-hF.IX粒子の密度は、1.37〜1.40g/mlであった。精製したAAV-hF.IXの力価を、CMVプロモーターまたはイントロンＩ配列に特異的なプローブを使用してスロットブロットハイブリダイゼーションにより測定した。対照は、既知濃度のpAAV-hF.IXプラスミドDNAの標準物質を含む。in vitroで細胞を形質導入するAAV-hF.IXの能力を、増殖しているHeLa細胞を形質導入し、感染後36時間目の培養上清中のhF.IXの濃度をhF.IXに特異的なELISA（Walterら、1996、前述）で測定して確認した。AAV-hF.IX（1012〜1013ゲノム/ml）を、５％グリセロールを含有するヘペス緩衝食塩水（pH7.8）中で-79℃で保存した。
Fisherら（1996、前述）が記載したように293細胞の形質導入後にアルカリ性ホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼについて染色して解析すると、精製したAAV-hF.IXにはいつも、検出可能な混入アデノウイルスはなかった。野生型AAVは、AAV-hF.IXの109ゲノム当たり＜１感染単位で検出された。
野生型AAVの測定は以下のように行なった：チャンバースライド上で増殖させた293細胞をアデノウイルスと精製AAV-hF.IXのアリコートとで同時感染させた。感染後24時間目に免疫蛍光染色のために細胞を固定した。AAVキャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（American Research Products, Belmont, MA）を１次抗体とし、１：40希釈の抗マウスIgG（DAKO Corporation、Carpinteria, CA）を２次抗体とした。
動物実験
rAAVの筋肉内注入用に選択したマウス株は、C57BL/6（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）、ならびにB6、129およびRag1（Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine）であった。雌のマウス（４〜６週齢）を、ケタミン（70mg/kg）とキシラジン（10mg/kg）を腹腔内注入して麻酔し、後肢を縦に１cm切開した。AAV-hF.IX（ヘペス緩衝化食塩水（pH7.8）中２×1011または１×1010ウイルスベクターゲノム／動物）を、ハミルトン（Hamilton）シリンジを使用して各脚の前脛骨筋（25μl）と四頭筋（50μl）に注入した。4-0 Vicryl縫合で切開部分を閉じた。７日間隔で眼窩後神経叢（retro-orbital plexus）から血液試料をミクロヘマトクリット毛管に集め、血漿をELISAによりhF.IXについて測定した。免疫蛍光染色とDNA解析のために、選択した時点で動物を屠殺し、注入した筋肉組織と注入していない筋肉組織を切り出した。組織をO.C.T.包埋化合物（Miles Corporation, Elkart, Indiana）中に入れ、液体窒素で冷却したイソペンタンで７秒間スナップ凍結し、直ちに液体窒素に移した。
hF.IXの測定
マウス血漿中のヒトF.IX抗原を、Walterら（1996、前述）が記載したようにELISAにより評価した。このELISAはマウスF.IXとは交差反応しなかった。すべての試料は二重測定で評価した。注入したマウスの筋肉から得られたタンパク質抽出物を、ロイペプチン（0.5mg/ml）を含有するPBS中で筋肉を砕いて次に超音波処理して調製した。細胞破片を微量遠心分離により除去し、タンパク質抽出物の１：10希釈物をELISAでhF.IXについて測定した。AAV-lacZ注入筋肉から得られた抽出物を陰性対照として使用した。タンパク質濃度をBIORADプロテインアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）で測定した。
組織切片の免疫蛍光染色
筋肉組織の凍結切片（６μg）を、PBS（pH7.4）中の３％パラホルムアルデヒド中で15分固定し、PBSで５分リンスし、メタノールで10分インキュベートし、PBSで３回洗浄し、次にPBS／３％BSAで１時間ブロックした。
組織切片を、PBS/１％BSAで１：1000希釈した親和性精製したヤギ抗ヒトF.IX抗体（Affinity Biologicals, Hamilton, Ontario, Canada）の存在下で一晩インキュベートした。PBS/１％BSAで10分間の洗浄を３回行なった後、２次抗体を90分間適用した。この抗体の調製物は、PBS/１％BSAで１：200希釈したFITC−結合ウサギ抗ヤギIgG（DAKO Corporation、Carpinteria, CA）を含有した。PBS/１％BSAでさらに３回洗浄後、切片を蒸留水でリンスし、空気乾燥し、Fluoromount Gマウントメディウム（Fisher Scientific）でマウントした。すべてのインキュベーション工程は室温で行なったが、１次抗体とのインキュベーションは４℃で行なった。ウサギ抗ヒトコラーゲンIVを１次抗体（Chemicon, Temecula, CA）として１：500希釈で、そしてFITC−結合抗ウサギIgGを２次抗体として、切片を染色した時に同じプロトコールを使用した。
同時局在化試験のために、FITCに結合したヤギ抗hF.IX抗体（Affinity Biologicals）を、抗コラーゲンIV抗体と同時に適用した。ローダミン結合抗ウサギIgG（Chemicon）を使用して、コラーゲンIV抗体複合体を検出した。Nikon FXA顕微鏡を使用して蛍光顕微鏡観察を行なった。
循環抗hF.IX抗体についての試験
AAV-hF.IXを筋肉内注入したC57BL/6マウスの血漿試料を、ELISAを使用してhF.IXに対する抗体の存在について試験した。マイクロタイタープレートをhF.IX（0.1M NaHCO3中１μg/ml、pH9.2）でコーティングした。希釈した血漿試料（１：16）を二重測定で適用し、hF.IXに反応性である抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合抗マウスIgG（Zymed, San Francisco, CA）を１：2000希釈で使用して検出した。緩衝液条件は既に記載されている通りである（Walterら、1996、前述）。抗hF.IX抗体のレベルは、最終濃度１μg/mlに希釈したマウス抗hF.IXモノクローナル抗体（Boehringer Mannheim）の吸光度値の比較により推定した。
抗hF.IX抗体の存在はまた、ウェスタンブロット解析により評価した。これらはDaiら（1995、前述）が記載したように行なったが、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Boehringer-Mannheim）を２次抗体として使用し、増強化学発光（ECL）試薬（Amersham, MA）とのhF.IX抗体複合体の検出を促進した。マウス血漿の試料は１：500希釈した。
DNA解析
Sambrookら（1989、前述）に記載のように、注入した筋肉組織からゲノムDNAを単離した。rAAV縦列繰り返し配列の頭尾接合部（head-to-tail junction）を増幅するためにPCR反応を行なった。正方向プライマー005（5’-ATAAGCTGCAATAAACAAGT-3’［配列番号２］はSV40ポリアデニル化シグナル（塩基対8014〜8033位）にアニーリングし、逆方向プライマー013（5’-CATGGTAATAGCGATGACTA-3’［配列番号３］）と017（5’-GCTCTGCTTATATAGACCTC-3’［配列番号４］）は、CMVプロモーター（塩基対4625〜4606位と4828〜4809位）にアニーリングする。1.5mM MgCl2と0.5μMのプライマー対005/013または005/017を含む総反応量100μl中で100ngのゲノムDNAを使用して、PCR反応を行なった。初期の変性工程（94℃で４分）後、以下のプロフィール：すなわち94℃で１分変性、52℃で１分アニーリング、および72℃で90秒伸長（最終サイクルの間は10分）を35サイクル行なった。PCR産物を、T/Aクローニングキット（Invitrogen, San Diego, CA）を使用してDNA配列解析のためにクローン化した。CMVプロモーター（PCR断片とのハイブリダイゼーション用）またはAAV-hF.IX中に存在するようなhF.IXのイントロンＩ（マウスのゲノムDNAとのハイブリダイゼーション用）に特異的な32Ｐ-dCTPランダムプライム標識プローブを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーションを行なった。
この実施例に示した実験の結果を説明する。
免疫適格マウスでのhF.IXの発現
in vivo実験のために選択した組換えAAVベクターは、CMV極早期遺伝子プロモーター／エンハンサーとSV40転写停止シグナルの制御下でヒトF.IX cDNA（イントロンＩの一部を含有する）を含有する。この発現カセットはAAV ITR配列でフランキングされ、AAVタンパク質コード配列を完全に欠如する。
免疫適格C57BL/6マウスにAAV-hF.IXを筋肉内注入した後、hF.IXは、注入した動物の血漿中に一時的に検出されたかまたは全く検出されなかった（図1A）。同じ血漿試料をhF.IXに特異的な抗体について試験した時、すべての注入動物で注入後11日目に開始して強い抗体応答が観察された（図２と３）。実験の期間中、高レベルの循環抗体が持続した。
注入後１ヶ月目に屠殺した動物の注入した筋肉（前脛骨筋と四頭筋）からのタンパク質抽出物は、1.8〜2.1ngのhF.IX／mg組織（40〜50ng hF.IX／mgタンパク質）の存在を示した。この知見（すなわち、タンパク質抽出物についてELISAで証明された筋肉組織中のhF.IXの存在）は、組織切片についての免疫蛍光試験により確認された。図４のパネルＢ〜Ｄは、注入後３ヶ月目のC57BL/6マウスの筋肉繊維中のヒトF.IXの発現を示す。hF.IXは筋肉繊維自体に存在するのみでなく、それが蓄積すると思われる繊維の間の間質腔にも存在することに注意されたい。
筋肉組織中のhF.IXの上記間質染色パターンは、ヒトコラーゲンIVに特異的なポリクローナル抗体を使用して同じ組織で見られたものと同じであった（図５、パネルＢ）。hF.IXとコラーゲンIVの抗体染色の同時局在は、２つの異なる蛍光標識物を使用する同時染色実験で確認された（図５、パネルＣ）。コラーゲンIVはin vitroでhF.IXに結合することが報告されている（Cheungら、1996、前述）。第IX因子は注入していない筋肉では検出されず（図４、パネルＡ）、AAV-lacZを注入した筋肉でも検出されなかった。
上記の組織切片でもヘマトキシリン−エオシン染色で解析した切片でも、組換えアデノウイルスを注入した骨格筋について記載したような、炎症または広範な組織傷害は観察されなかった。
免疫不全マウスにおけるhF.IXの発現
C57BL/6マウスについて上述した方法を使用して、Rag1の筋肉組織にAAV-hF.IXを送達した。これらのマウスは、リコンビナーゼ活性化遺伝子１の突然変異についてホモ接合性である。従ってRag1マウスは、機能的に重症複合免疫不全症（SCID）マウスと同等であり、成熟Ｂ細胞やＴ細胞を産生しない。
Rag1マウス１匹当たり２×1011ウイルスベクターゲノムの用量により、マウス血漿中でhF.IXの安定な発現が得られた（図1B）。注入の２週目まずELISAによりヒトF.IXが検出され、以後徐々に上昇した。200〜350ng hF.IX/mlマウス血漿の用量で注入後５〜７週目に、血漿レベルはプラトーに達した。このレベルは実験の期間（これは注入後４ヶ月まで延長された）中維持された。全部で１×1010ウイルスベクターゲノムを注入すると、hF.IXの発現は２×1011のゲノムを注入後に観察されたものより３〜４倍低かった。しかしより低い用量を使用しても、ある動物では治療レベル（＞100ng/ml）が達成された（図1C）。これらの結果は、より低い用量のAAV-hF.IXを動物に投与して治療効果を達成することが可能である、という事実を確立している。さらにこの結果は、ウイルスのある閾値用量で、あらゆる所与の注入部位がウイルスで飽和され、閾値レベルより上の量のウイルスを注入しても、血漿中の循環hF.IXの量は比例して増加することはないことを示唆する。従って血漿中の循環hF.IXの量を増加させるためには、異なる筋肉の部位に少量のウイルスを複数回投与することが好ましい。
骨格筋中に導入されたDNAの解析
注入した筋肉組織から得られたゲノムDNAを、注入の６〜８週間後に単離した。組織中に導入したベクターDNAの存在は、DNAをEcoRVで消化（これは、完全な1.4kbイントロンＩ配列を含有するベクター構築物から1.8kbの断片を放出する）して証明した。イントロンＩに特異的なプローブはこの断片にハイブリダイズした（図6B、レーン２、３）が、注入しなかったマウスから得られたマウスDNAとは交差ハイブリダイズしなかった（レーン４、５）。消化しなかったDNA（図6B、レーン３）は、高分子量DNA中でハイブリダイゼーションシグナルを示した。さらに形質導入した細胞（図4A）中に存在する組換えAAVの頭尾コンカテマーの接合部配列を増幅するために設計したPCRプライマーは、AAV-hF.IX形質導入組織（免疫不全および免疫適格動物の前脛骨筋と四頭筋）から単離した筋肉DNA中のこれらの配列をうまく増幅した。
CMVプロモーター／エンハンサー配列に特異的なプローブを使用するサザンブロットハイブリダイゼーションにより、このPCR産物を視覚化した（図6C、レーン３〜10）。プライマー対005-013は1.0kb以下の断片を増幅し、プライマー対005-017は1.2kb以下の断片を増幅した。予測したようにこれらのPCR反応は、前記サイズの明確なバンドを産生しなかったが、最大のサイズを有する一連の増幅産物を産生した。この結果は、これらの縦列繰り返し配列中に存在するAAVゲノムの不正確な結合により予測できた（McLaughlinら、1988, J. Virol. 62:1963-1973）。この不正確な結合は、クローン化したPCR産物のDNA配列決定から確認されるように、ジャンクション部位でのITR配列の種々の欠失のために生じる。
本明細書に示したデータは、血友病Ｂを有する患者の遺伝子治療プロトコールの開発についていくつかの意味を有する。まず本明細書に記載の実験で得られたhF.IXの発現レベルは、ヒトで治療効果を達成するのに充分であり、産生され得るrAAVの量によってのみ限定される。第２にこれらのデータから、単一部位への注入より複数の筋肉内部位への注入が好ましいことは明らかである。筋肉組織は豊富にあるため、これは、AAVベクターを使用して血友病の患者を治療するための障害とはならない。
本明細書に記載のhF.IXの発現の経時変化は、hF.IXを発現するアデノウイルスベクターを使用した時観察されるものとは非常に異なる。後者の場合、ほとんど瞬的に治療法レベルのhF.IXが達成される（Walterら、1996、前述；Kayら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2353-2357）。しかしこのアプローチの免疫学的結果は好ましくない。AAV-hF.IXの場合、数週間にわたって血漿hF.IXレベルが徐々に上昇することは、患者が筋肉内AAVベクター治療近辺の極初期にはhF.IX濃縮物の使用を続けることが好ましいことを示す。これは治療の障害にはならない。外から投与したhF.IXのｔ1/2は約12時間であり、このため血漿hF.IXレベルは、トランスジーンの発現の結果として上昇する前にベースラインに戻る。さらにクロススピーシズの境界（cross-species boundary）を超えないなら、筋肉組織中のrAAV導入したトランスジーンの発現は長期間続く（Kesslerら、1996、前述）。これらのすべての理由のために、血友病Ｂを有する患者にhF.IXを発現するrAAVベクターを投与することは、この疾患の治療の実現可能な方策である。
また、上記以外にhF.IXがコラーゲンIVと同時局在するという観察結果は、血友病Ｂを有する患者の治療にとって重要な意味を有する。この知見は、F.IXで見られる染色パターンに関するのみでなく、循環中への筋肉細胞合成F.IXの輸送効率が低いという従来報告されている知見を説明しているようであるために興味深い。間質腔中のコラーゲンIVがhF.IXの高親和性結合部位になるなら、この領域は実際に筋肉中で合成されたhF.IXの「シンク」として機能するかも知れない。しかしコラーゲンIVによる間質腔中のhF.IXの捕捉は明らかに、Rag1マウスでの実験が証明するように、遺伝子治療に対して超えられない障害ではない。さらに前記したように、hF.IXをコラーゲンIVに結合できなくする突然変異を含むhF.IXをコードするAAV-hF.IXベクターを作成することは可能であり、こうしてこの潜在的な欠点を克服することができる。
実施例２：血友病Ｂを有するイヌでの試験
本実施例に示す実験は以下のように要約される。
これはモデル研究に基づくと、タンパク質を不安定にすると思われるF.IX遺伝子の触媒ドメイン中の点突然変異を有するイヌは、重症の血友病Ｂを有する（Evansら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10095-10099）。３匹のそのようなイヌに、イヌF.IX（cF.IX）遺伝子を有するAAV-cF.IXを筋肉内注入した。イヌB45に８×1011のAAV-cF.IXを投与すると、F.IXの血漿レベルがちょうど検出の閾値になった（約１〜３ngイヌF.IX/ml血漿）。ベクター投与後種々の時点で、全血凝固時間（WBCT）は一時的に短くなった。注入の16週後に開始して、WBCTの持続性の部分的な補正が観察され、非常に低レベルの血漿cF.IXが少なくとも６ヶ月続くことが観察された。生検した筋肉から得られた切片の免疫蛍光染色を行うと、形質導入した筋肉繊維中のcF.IXの発現が観察された。ウェスタンブロット解析、ELISA、または凝固インヒビタースクリーニングを行っても、cF.IXに特異的な抗体の産生の証拠は得られなかった。イヌB46に１×1013のAAV-cF.IXを筋肉内注入すると、cF.IXの血漿レベルが約17ng cF.IX/mlとなり、これは注入後９週目に観察された。WBCTの部分的修正はまず注入後２週目に観察され、以後安定であった。正常な血漿による治療がない場合の最も短いWBCT（16分）は８週目に測定された。凝固時間の改善はaPTTアッセイによって確認され、注入後７週目に低下は明らかであった。ここでも、cF.IXに特異的な抗体の産生の証拠はなかった。止血パラメータの改善にもかかわらず、今日までに達成されたcF.IXのレベルは正常な場合の＜１％であり、これらの治療されたイヌが出血を経験したことは驚くべきことではない。増加した用量のF.IXをイヌに投与すると治療的効果が達成されるであろう。実際最近イヌＢ48に７×1013のAAV cF.IXを筋肉内注入したが、まだプラトーレベルに達していない。このイヌは、cF.IXに対して非阻害性抗体を産生した。この抗体はまず注入の14日後に検出され、注入の42日後に消失した。抗体の消失と一致して、WBCTは15〜20分の範囲まで短くなり、これは以後45日間維持された（すなわち、合計90日間の観察）。すべてのイヌは現在試験中である。
Ａ．AAVベクター中のイヌF.IXの筋肉内投与
本実施例に示す実験で使用した材料と方法を説明する。
ウイルスベクター
図７に略図で示すようにAAV-cF.IXを作成した。このベクターは、以下の発現カセットをフランキングするAAV逆方向末端繰り返し配列（ITR）を含有する：サイトメガロウイルス極早期エンハンサー／プロモーター（P［CMV］）、CMVスプライスドナー／β-グロビンスプライスアクセプター（βglob）、ヌクレオチド2565位のEcoRI部位までのcF.IX cDNA、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（hGH）。
cF.IXの機能的完全性
ビタミンＫ（６μg/ml培地）の存在下での293細胞の一過性トランスフェクションを使用して、cF.IX構築物が機能性cF.IXの発現と分泌を指令することを証明した。cF.IXの存在は、トランスフェクション後96時間目の培地で評価し、調整培地の添加後のF.IX欠損ヒト血漿のaPTT凝固時間の短縮によっても確認された。AAV-cF.IXの異なる調製物を、293細胞により、E1欠失アデノウイルスの存在下または非存在下で種々の感染多重度で同数のベクターと比較した。産生されたcF.IXの量は、試験した異なる調製物について同様であった。アデノウイルスの非存在下で感染多重度４×103でAAV-cF.IXで形質導入した293細胞は、1.2μgのcF.IX／ml培地／24時間を産生した。１ウェルあたり９×109のAAV-cF.IXで形質導入した24ウェルプレート中の分化させたマウスC2C12筋管は、感染後８〜15日目に測定した時、30〜80ng cF.IX／ml培地／24時間を産生した。
血友病Ｂのイヌ
イヌの第IX因子遺伝子の触媒性ドメインの点突然変異についてヘミ接合性である雄とホモ接合性である雌からなる重症の血友病Ｂを有するイヌのコロニーが、University of North Carolina（Chapel Hill）で20年以上維持されている（Evansら1989、Blood 74:207-212）。これらのイヌの止血パラメータは充分記載されており、血漿F.IX抗原の欠如、全血凝固時間が＞60分（正常なイヌは６〜８分）、および50〜80秒の活性化部分トロンボプラスチン時間の延長（正常なイヌは13〜18秒）を含む。これらのイヌは、再発する自発性の出血を経験している。典型的には大きな出血は、10ml/kgの正常イヌ血漿の単回静脈内注入によりうまく管理されているが、たまに出血を制御するために繰り返し注入が必要なこともある。
筋肉内注入
全身麻酔下で雄の血友病Ｂのイヌ（B45とB46）と雌の血友病のイヌＢ48（すべて同腹子）に、AAV-cF.IXを経皮注射した。この操作の間、動物には正常イヌ血漿を投与しなかった。
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血液試料の分析
全血凝固時間（WBCT）は、血漿中のcF.IXについてELISAのように評価した。ELISAの感度は３ng/mlまでである。cF.IXに特異的な抗体はELISAとウェスタンブロットにより測定した。活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）を測定した。凝固インヒビタースクリーニングも行なった。治療した血友病のイヌと正常なイヌから得られた血漿を等量混合し、37℃で２時間インキュベートした。aPTT凝固時間が対照より３秒以上長い場合、インヒビターのスクリーニングは陽性とした（正常イヌ血漿はイミダゾール緩衝液とインキュベートし、治療前の血友病イヌ血漿は正常イヌ血漿とインキュベートした）。AAVベクターに対する中和抗体力価を評価した。
免疫蛍光染色
イヌB45から得られた生検した筋肉を、冷凍バイアル中のOptimal Cutting Temperature TM（OCT）（Tissue-TeK（登録商標））OCT4583 Compound（Sakura Finetek, Torrance CA）中に入れ、液体窒素で冷却した2-メチルブタン中で７〜10秒間急速凍結し、次に直ちに液体窒素に移し、以後-80℃で保存した。凍結筋肉の凍結切片を、１次抗体として１：100希釈のウサギ抗cF.IX（Affinity Biologicals）と２次抗体として１：30希釈のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合ブタ抗ウサギIgG（Dako Corp.）を使用して、本明細書に記載のように染色した。凍結切片はまた、ヘマトキシリンとエオシン（H & E）染色のための使用した。
ベクター放出（shedding）
スワブを採取し、試料を組織培養培地に再懸濁した。スワブ試料は、涙、鼻、直腸、唾液、および尿である。血清試料も採取した。Centricon-100バイアルを使用して試料を最終容量200μlに濃縮し、Qiamp血液キット（Qiagen）を使用してDNAを抽出した。DNAを200μlのTEで溶出し、10μlを、最終容量50μl中のAmpliTaq PCRキット（Perkin Elmer）を使用してPCR増幅のために使用した。PCRプライマーは以下の通りである：上流プライマー、cF.IXのcDNA中の配列に基づく5’-ATA GCA GCT ACA ATC CAG CTA CCA TTC TGC-3’［配列番号５］、および下流プライマー、β-グロビンスプライスアクセプターの配列から得られる5’-TGG TAT CCC GTA GTA CAG GAA CAA ACC ACC-3’［配列番号６］。これらのプライマーにより増幅したPCR産物は698塩基対であった。95℃で２分間変性後、95℃／60℃／72℃でそれぞれ30秒／30秒／１分を40サイクル行い、次に72℃で７分インキュベートした。PCR産物を、臭化エチジウムの存在下でアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
本明細書に示す実験の結果を以下に説明する。
イヌB45に８×1011のAAV-cF.IXを筋肉内（IM）注入すると、止血パラメータに一貫性のない影響を与えた。全血凝固時間（WBCT）は変動しており、断続的に約20分〜＞60分の範囲で変動した（図８）。活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）は、３週目の１つの値（これは48秒であった）を除いて50秒より大きかった（図９）。ELISAで評価したcF.IXのレベルは、ベクター注入の３週目から開始して検出閾値（１〜３ng/ml）であった（図10）。投与の７週後に注入部位の筋肉生検を行い、特異的免疫蛍光染色によりcF.IXの筋肉内産生を確認した（図11）。生検前の出血は、46日と47日に正常のイヌ血漿で治療することによりうまく管理された。注入の16週後に開始して、WBCTの持続性部分的補正が観察された。
高用量のAAV-cF.IX（１×1013）の筋肉内投与後に、イヌB46は止血パラメータの大幅な改善を示し、これはELISAによるcF.IXの血漿レベルの持続的増加と相関した。WBCTは、ベクター投与の２週後に開始して絶えず20分より低く、ベクター注入の12週後に16分の最下点に達した（図８）。活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）は７週目までに43秒まで低下し、次に上昇した（図９）。ELISAで評価した血漿cF.IX抗原濃度は、注入後最初の９週間にかけて増加し、約17ng/mlのレベルに達した（図10）。第10週の間、このイヌは右の肩甲骨領域で出血し、これは正常イヌ血漿を繰り返し注入することにより解消した。出血後の３週間のより高いcF.IX値は血漿注入による可能性がある（図10）。
イヌＢ48には最も高い筋肉内用量のAAV-cF.IX（７×1013）を投与した。このイヌはベクター投与後注入部位から出血し、４日目に正常イヌ血漿を投与した。注入後４週目（血漿注入により影響されない時点）に入手できたデータは、低下したWBCT（21.5分）とイヌ第IX因子レベル（15ng/ml）を示した。このイヌはまだ試験中であり、まだプラトーレベルに達していない。本明細書に記載のように、このイヌはcF.IXに対する非阻害性抗体を一時的に合成した。
イヌB45とB46は、治療前にAAVキャプシドに特異的な測定可能な中和抗体は示さなかった。各イヌで、ベクター投与後の７日目に高力価の抗AAV中和抗体（103〜104）が生じ、試験期間中持続した（B45とB46についてそれぞれ17週と８週）。
イヌB45ではcF.IXに特異的な抗体を検出するための分析（ウェスタンブロッティング、ELISA測定法、および凝固インヒビタースクリーニングを含む）は、第７、13、17および20週で陰性であった。高用量イヌB46は、ELISAで測定した時９週目までcF.IXに特異的な抗体は検出されなかった。
PCRにより検出したウイルス放出は、イヌB45から得られた１日目の血清、直腸、および唾液試料と、イヌB46の１日目の血清で陽性であった。得られた他のすべて試料は、治療前と注入後の＞１日は陰性であった。
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本実施例に示したデータは、血友病Ｂを有するイヌが、AAV-cF.IXの筋肉内単回投与後に持続性血漿レベルのcF.IXを合成することができることを証明している。長期（＞４ヶ月）の全身のcF.IXレベルは、止血パラメータの中程度の改善に関連していた。しかし治療したイヌは自発性の出血を経験し、これらのレベルが治療量以下であることを示している。イヌB46でプラトーレベルまでの延長した経時変化とこれらのイヌにおける用量応答の示唆は、イヌとマウスモデルの間の類似性を証明している。形質導入したイヌの筋肉により分泌されるF.IXは、WBCTとaPTTの短縮に基づき、生物活性がある。要約すると、血友病Ｂを有するこれらのイヌでのAAV-cF.IXの筋肉内投与は充分許容される。
Ｂ．AAVベクター中のcF.IXの門脈投与
この実施例に示した実験で使用した材料と方法を以下に記載する。
ウイルスベクター
通常の分子生物学的技術を使用してAAV-EF1α-cF.IXを作成した。このベクターは、ヒト伸長因子１α遺伝子（EF1α）の2.5kb断片を含有し、これはエンハンサー、プロモーター、第１のエキソンおよび第１のイントロン、ならびにエキソン２の非コード領域の一部を含む。EF1αプロモーターを含有するベクターは門脈投与後にトランスジーン発現の上昇を示すため、EF1αプロモーターを選択した。EF1αのこの領域は、cF.IX cDNAとヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（hGH）の上流（1731ntのEcoRI部位まで）に位置する。全発現カセットは、AAV逆方向末端繰り返し配列（ITR）によりフランキングされる。このベクターの機能的完全性は、293細胞中で産生されるF.IXのELISA解析により証明された。
門脈投与
全身麻酔下で血友病イヌＢ44の腹部を無菌手術により開き、門脈に３×1012のAAV-EF1-cF.IXの単回注入を行なった。正常イヌ血漿の静脈内投与により、このイヌを手術周辺時期の出血から保護した。イヌに鎮静剤を与え、挿管して全身麻酔を誘導し、腹部の毛を剃り、準備した。開腹後脾臓を手術フィールドに移した。脾臓静脈をさがし、静脈の小さい末端の切り目の近くでゆるく縫合した。静脈に迅速に誘導針を挿入し、次に縫合をゆるめ、門脈分岐の近くの静脈内位置に5Fカニューレを通した。止血の確保後、カテーテルバルーンをふくらませ、PBS中で希釈した約5.0mlのベクターを５分間隔で門脈中に注入した。ベクター注入後、食塩水5.0mlを注入した。バルーンをしぼませ、カニューレを取り出し、静脈止血を確保した。次に脾臓を戻し、出血血管を焼灼して手術の傷を閉じた。手術に充分耐えた動物から抜管した。
筋肉内注入について本明細書に記載したように血液試料を分析した。
本明細書に示した実験の結果を以下に説明する。
循環F.IXの証拠はELISAによって検出されず、動物に注入後４ヶ月まで止血パラメータに及ぼす作用は明らかではなかった。
動物にベクターを投与後に急性または慢性の毒性の臨床的症状は明らかではなく、このベクターの血管内注入が充分許容され、おそらく非毒性であることを示している。インヒビターは検出されなかった。
実施例３：AAV-mF.IXの筋肉内注入後のマウス中のインヒビターの欠如
哺乳動物にAAV-hF.IXを筋肉内投与すると、その哺乳動物中でF.IXに対するインヒビターが出現するリスクが伴う。F.IX合成の通常の部位は肝臓である。異所性発現に基づくアプローチについて当然懸念されることは、生合成により、タンパク質が非機能的または免疫原性（例えば翻訳後プロセシングの変化によって）になるような変化がタンパク質中に生じるかどうかである。この可能性を試験するために、３つの株の免疫適格マウスの筋肉にAAV-マウスF.IX（mF.IX）を投与し、自己のトランスジーン産物に対する抗体が生成するかどうかを調べてマウスを評価した。マウスで抗mF.IX抗体（すなわち、インヒビター）が出現しなかったことを証明するために、２つの方法を使用した。AAV-mF.IXに対する抗体の存在は、ウェスタンブロッティングにより評価した。この方法では抗AAV-mF.IX抗体は検出されなかった。マウスでインヒビターが合成されるかどうかを評価するために凝固インヒビタースクリーニングを使用し、この試験でも、これらの動物でインヒビターが合成されないことが確認された。マウス筋肉中でmF.IXが合成されるとタンパク質が産生され、これは自己タンパク質として免疫系により観察された。すなわちこのアプローチの使用（すなわち、AAVベクターを使用する筋肉組織へのF.IXの送達）は、血友病の治療の臨床的に有効な方法である。
この実施例に示した実験で使用される材料と方法を以下に説明する。
ウイルスベクター
AAV-mF.IX（図12）は、以下の発現カセットをフランキングする２つのAAV逆方向末端繰り返し配列（ITR）を含有した：サイトメガロウイルス極早期エンハンサー／プロモーター（P［CMV〕）、CMVスプライスドナー／β-グロビンスプライスアクセプター（βglob）、2.7kbのマウス第IX因子cDNA、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（hGH）。mF.IX cDNA（Wuら、1990, Gene 86:275-278）は、PCRにより導入された多くのエラーを含有した。野生型配列を回復するために部位特異的突然変異誘発を使用し、これはDNA配列決定により確認された。このベクターによりコードされるmF.IXの機能的完全性は、293細胞株84-31を形質導入し、aPTT測定法でビタミンＫ含有調整培地を評価して試験した。形質導入した細胞から得られた上清をmF.IX欠失血漿に添加すると、凝固時間が短縮した。対照細胞から得られた上清を使用した時は、これは起きなかった。
動物操作方法
免疫適格な５月齢の老齢な雌のCD-1マウス、５月齢の雌のC57BL/6マウス（Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA）および５週齢の雄の老齢なBALB/cマウス（The Jackson Laboratories）（各株についてｎ＝３）をこの試験で使用した。マウスの後肢両方の前脛骨筋と四頭筋に、本明細書に記載の総用量１×1011のAAV-mF.IXを注入した。同腹子に同じ方法で２×1011のAAV-mF.IXを注入した。眼窩後出血を使用して、既に記載されている（Walterら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3056-3061）ように血漿試料を集めた。
血漿試料のウェスタンブロット解析によるマウス抗体の検出
SDS-PAGEゲルで100ngのhF.IX（Mononine**血漿由来第IX因子、Armour）またはmF.IX（安定にトランスフェクションした293細胞から得られた組織培養培地から精製した）を分離し、次にタンパク質をHybond-ECL膜（Amersham）に移して、ウェスタンブロットを行なった。BLOTTO（５％無脂肪乾燥ミルク、10mMトリス−塩酸、ｐＨ8.0、２mM CaCl2、0.05％ツイーン−20）を使用してブロッキングを２時間行なった。BLOTTOで１：200希釈した血漿試料を、膜とともに１時間インキュベートした。BLOTTOで１：1000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG（Boehringer Mannheim）を２次抗体とした。抗第IX因子をECL検出とフィルム現像（Amersham）により視覚化した。このウェスタンブロットの陽性対照血漿は、ヒト第IX因子の遺伝子を含有するアデノウイルスベクター（Kungら、1998, Blood 91:784-790）の静脈内注入後、mF.IXとhF.IXの両方に対して抗体を産生した血友病Ｂマウスから得られた。
aPTT測定法
尾静脈から出血中にクエン酸緩衝液中にマウス血漿を集めた。aPTT測定の凝固時間測定は、50μlのaPTT試薬（Organon Teknika, Durham, NC）を50μlのマウス血漿と混合することにより行なった。混合物を37℃で３分インキュベートし、50μlの25mM CaCl2を加えた。凝固時間はフィブロメーター（BBL FibroSystem）を使用して測定した。
凝固インヒビタースクリーニング
ベクターを注入したマウスから得られた血漿を等量の正常プールマウス血漿と混合し、37℃で２時間インキュベートした。アリコートを取り、aPTT試薬と混合した。aPTT凝固時間が対照より３秒以上長い場合、インヒビターのスクリーニングは陽性とした（正常イヌ血漿はイミダゾール緩衝液とインキュベートした）。
本実施例に示した実験の結果を以下に説明する。
AAV-mF.IXを注入したマウスは、注入後18日目と60日目にウェスタンブロッティング法により測定した時、いずれもmF.IXに特異的な抗体を産生しなかった（図13、レーン２〜10）。ベクターを注入したすべてのマウスの血漿試料のaPTTによる凝固時間は、注入後60日目に測定した時正常範囲（約25秒）内であった。注入マウスについてのインヒビター測定でもインヒビターの欠如が証明された。AAV-hF.IXを注入した対照マウスはすべて、注入後最初の２週以内にhF.IXに特異的な抗体を産生し、これらの動物の免疫適格性を証明していた。
これらのデータは、AAV-F.IXを注入されたマウスはF.IXに対するインヒビターを合成しなかったことを確認している。
実施例４：骨格筋により産生されるヒト第IX因子の生化学的解析
F.IX合成の自然の部位は肝細胞内である。本明細書に記載の実験アプローチは、F.IX産生の部位として骨格筋の筋管を標的としている。ヒトF.IXは、細胞をAAV-CMV-hF.IXでトランスフェクションした後に組織培養で維持したヒト筋管の調整培地から精製される。今日までに行われた予備試験は、これらの細胞中ではＮ−末端で筋管合成F.IXが正しくプロセシングされており、γ−カルボキシル化されていることを示している。さらに調整培地はヒトF.IX欠損血漿に加えられる時aPTTを修正する。
実施例５：ヒトへのAAV-hF.IX投与の臨床的プロトコールの要約
凝固因子濃縮物で治療した患者の臨床的研究は、循環凝固因子のレベルの小さな上昇が疾患の罹患率と死亡率のほとんどを防止するのに充分であることを証明した。最も包括的なデータは、スエーデンの予防研究（Lofqvistら、1997, J. Int. Med. 241:395-400）中に含まれ、ここでは1958年以来スエーデンの多くの血友病患者は、出血に応答してではなく定期的に凝固因子を注入する処方で維持されている。遺伝子治療の目標は、正常の１％より大きいF.IXの一貫したレベルを維持することである。重症の血友病（特に血友病Ｂ）を有する患者の治療法として本明細書に記載の遺伝子治療は、患者の血流中で一定且つ治療的レベルのF.IXを維持するという充分証明された利点を提供している。
フェーズＩ臨床試験では、最初の治験を、インヒビターの出現の履歴がなくその寿命が疾患のために縮められる重症の患者（すなわち、F.IXの循環レベルが正常の１％未満である）に限定するように提唱されている。
試験中、筋肉内投与されるAAV-F.IXの患者間の用量の増加の安全性が追跡される。局所的および全身的なベクターの送達に関連する毒性が評価される。本明細書に記載のプロトコールに従って、トランスジーン産物の生物学的および生理的活性を測定することにより各用量群の薬効が追跡される。注入部位でのF.IX遺伝子およびタンパク質発現の存在を検出するために、分析が行われる。
初期の試験では、少なくとも12名の患者が含まれる。これらの患者は、３名ずつの群に割り当てられ、各群の各患者は同じ用量のAAV-hF.IXを投与される。第１群の患者は、ラットでの毒性を決定するための試験結果に基づき総量が投与される。ラット毒性試験は、フェーズＩ臨床治験の開始前に、認可された動物毒性試験プロトコールに従って行われる（21 C.F.R. §58中のFood and Drug Administration Good Laboratory Practices）。患者の出発用量は、ラットへの投与で許容できない毒性を生じる最低用量より、キログラムベースで少なくとも10倍低い。ラットに投与した最も高い用量で毒性が観察されないなら、ヒト患者の出発用量は、この最も高い用量より少なくとも10倍低い。第１群の患者で用量限定性の毒性および遺伝子発現の証拠が観察されず、かつ最後の患者の治療後少なくとも８週が経過した後、第２群の患者が第１群の患者の用量より１対数高い用量で治療される。用量限定性の毒性または発現が観察されないなら、用量限定性の毒性の不在下で発現が観察されるまでこのスケジュールが繰り返される。次に許容されない毒性の不在下で生物学的および生理的効果の証拠があるまで、半対数ずつの増分で用量が増加される。
ベクター投与前の２時間以内に患者に、患者のF.IXレベルを100％に上げると計算される用量の高度に精製した凝固F.IX濃縮物を注入する。筋肉内注入は、病院のプロトコールに従って意識的な鎮静の形で麻酔下で行われる。各注入部位に0.5mlの容量が投与される。ベクター濃度と注入部位の数は、用量に関連して変化する。低用量群では約６部位に注入され、最も高い用量群では約20部位に注入される。患者は２〜３日間入院する。イヌでの研究は、注入後24時間を超えてもベクターの放出がないことを示す。しかし入院の間標準的逆隔離法が行われる。
追跡治療において患者は、ベクター注入後の約12時間目に正常の50％のレベルを達成するためにF.IX濃縮物を投与され、臨床的評価に依存して以後３〜７日間24時間毎に投与される。
本明細書で引用した各々のおよびすべての特許、特許出願ならびに刊行物の開示内容は、その全体を参照することにより本明細書の一部とする。
本発明を具体的な実施形態について開示したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の他の実施形態や変更形態が当業者には明らかであろう。添付の請求の範囲は、そのような実施形態や同等の変更形態のすべてを含むものと解するべきである。
配列番号：１
配列の長さ：11
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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配列番号：２
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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配列番号：３
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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配列番号：４
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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配列番号：５
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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配列番号：６
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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