(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インジゴフェラ・チンクトリア・リン（Indigofera tinctoria Linn)抽出液を有効成分とするカスパターゼ−３阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のカスパターゼ阻害剤を含んで成る養毛剤。
【請求項３】
脱毛抑制剤である、請求項２に記載の養毛剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアスパターゼ−３阻害剤に関し、さらに詳しくは毛周期の毛髪成長期延長活性を有する、植物抽出液を有効成分とするカスパターゼ類阻害剤、及びこれを含んでなる養毛剤、特に脱毛抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
男性の脱毛には男性ホルモン及びアポトーシスが関与することが知られている。一般に、細胞にアポトーシスの信号が伝わると、複数のカスパーゼから成るカスケードが活性化され、最下流において、前駆体カスパーゼ−３からカスパーゼ−３が生成し、これが細胞骨格タンパク質やＩＣＡＤ（In hibitor of Caspase-Activatel DNAse)が切断することにより、細胞は不可逆的な死（アポトーシス）に至ることが知られている。
しかしながら、男性ホルモンの関与からカスパーゼによるアポトーシスに至る脱毛のカスケードは解明されておらず、また脱毛とカスパーゼ−３との関係に解明されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、養毛剤、特に脱毛抑制剤の成分として有用な、新規なカスパーゼ類阻害剤を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、５αリダクターゼタイプ２（５αＲ−II）が男性ホルモン（ＤＨＴ）を産生を亢進し、この男性ホルモンが形質転換成長因子β２（TGF β２）産生を亢進し、TGF β２がカスパーゼ類を活性化し、これにより毛周期における成長期から退行期への移行、すなわちミニチュア化、軟毛化が促進され、脱毛に至るという、一連のカスケードを解明した。
【０００５】
従って、脱毛抑制剤のスクリーニングは、カスパーゼ類、特にカスケードの最下流に存在するカスパーゼ−３に対する阻害物質の選択のいずれかにより行うことができる。
従って本発明は、カスパーゼ−３に対する新規な阻害物質及びそれを有効成分とする養毛剤、特に脱毛抑制剤を提供する。このようなカスパーゼ−３阻害剤として、インジゴフェラ・チンクトリア・リン（Indigofera tinctoria Linn)の抽出物、ナンバンサイカチの抽出物、オドリコソウ抽出物、トルメンチラ抽出物、ブドウ葉抽出物、ボダイジュ抽出物、シモツチソン抽出物、アクチャララーテの抽出物、コウチャ抽出物、ウーロンチャ抽出物、ハトムギ抽出物、及びシコン抽出物が例示される。
【０００６】
しかしながら、上記の方法は、脱毛抑制剤としては、単にカスパーゼ−３阻害活性を有するのみならず、より直接的にアポトーシス阻害作用を有するものが好ましい。
従って本発明はまた、カスパーゼ−３に対する阻害活性を有し、さらにマウス表皮角化細胞の培養細胞におけるアポトーシスを抑制する活性を有する養毛剤成分を提供する。このような成分として、クアチャララーテ抽出液、シモツケソウ抽出液、コウチャ抽出液、ウーロンチャ抽出液、ハトムギ抽出液及びシコン抽出液が例示される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ヒトの毛髪の成長サイクルは５〜６年間の成長期、２〜３週間の退行期及び２〜３箇月の休止期を経て脱毛し、やがて新しい毛髪が発生してその成長期が始まる。本発明者らはまず、TGF-β2 が退行期を誘導・開始させること、すなわち成長期が短縮されることを実験的に証明した。すなわち、ヒト頭皮から得られた成長期の毛包をTGF-β2 の存在下及び不存在下で器官培養し、TGF-β2 の存在下で培養を行った場合に、自然状態での退行期への移行と同様の形態的変化が生ずることを確認した。
【０００８】
また、成長期にあるヒト毛包及び退行期にあるヒト毛包におけるTGF-β2 の分布を抗TGF-β2 抗体を用いた免疫組織染色により観察し、成長期のヒト毛包に比べて退行期の毛包に顕著にTGF-β2 が発現・分布していることを見出した（参考例１）。
さらに、TGF-β2 のアンタゴニストであることが知られている抗 -TGF-β抗体及びフェチュイン（Fetuin）の存在下及び非存在下で、ヒト毛包を器官培養し、毛の伸長を測定した。その結果、抗 -TGF-β2 抗体又はフェチュインの存在下では、これらの不存在下に比べて毛の伸長が大であり、TGF-β2 のアンタゴニストによりTGF-β2 が中和され、退行期への移行が抑制されることが確認された（参考例２）。
【０００９】
本発明者らはさらに、ヒト退行期毛包をＴＵＮＥＬ法により染色することにより、毛包が退縮する際に毛母細胞にアポトーシスが生じていることを参考例３において確認した。
次に、毛髪サイクルの各期におけるカスパーゼ−３を観察したところ、毛髪サイクル全体にわたってカスパーゼ−３が存在することが確認され、カスパーゼ−３がアポトーシスにおいて機能していることが示唆された。
【００１０】
そこで、ヒト毛包の器官培養において、カスパーゼ類の一般的な阻害物質であることが知られているカルボベンゾキシ−バリル−アラニル−β−メチル−アスパル−１−イル−フルオロメタン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）を添加することによる毛の伸長と毛球部の形態の保持を観察した。その結果、カスパーゼ−３阻害物質であるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが毛の伸長を促進し、毛球部の形態保持に関与していることが確認され、カスパーゼ−３阻害物質が毛周期における成長期を延長し、養毛効果を発揮することが見出された。
【００１１】
上記のことから、男性型脱毛は、５αＲ−IIによる男性ホルモン（ＤＨＴ）の産生亢進、男性ホルモンによるTGF β２の産生亢進、TGF β２によるカスパーゼの活性化、及びカスパーゼの活性化によるアポトーシスの進行というカスケードを介して生ずることが明らかになった。
【００１２】
従って、本発明の養毛剤は、カスパーゼ類、特にカスケードの最下流にあるカスパーゼ−３に対する阻害剤として選択することができる。このようなカスパーゼ−３阻害剤としては、クアチャララーテ抽出物、シモツケソウ抽出物、コウチャ抽出物、ウーロンチャ抽出物、ハトムギ抽出物、シコン抽出物、インジゴフェラ・チンクトリア・リン（Indigofera tinctoria Linn)抽出物、ナンバンサイカチの抽出物、オドリコソウ抽出物、トルメンチラ抽出物、ブドウ葉抽出物及びボダイジュ抽出物が挙げられる。
【００１３】
カスパーゼ−３の阻害は例えば次のようにして測定することができる。反応液用緩衝液として、例えば25mM HEPES（pH.75)を用い、これに10％シュークロース、0.1 ％の３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）（CHAPS)及び５mMジチオスレイトール（DTT)を含有せしめる。さらに基質として、合成した蛍光基質アセチル-Asp-Glu-Val-Asp- メチルクマリンアミド（Ac-DEVD-MCA)を最終濃度0.5mM に加える。次に、この溶液に被験試料を加え、一定時間、一定温度において（例えば37℃にて30分間）インキュベートし、反応停止液で反応を停止した後蛍光計（励起：355nm ；放射：460nm)により測定することができる。
【００１４】
本発明のアポトーシス抑制の測定は、例えば次のようにして行うことができる。まず、マウス表皮角化細胞の培養細胞を調製する。すなわち、新生BALB／ｃマウスの表皮角化細胞を、10％牛脂児血清（FCS)及び５倍濃度のアミノ酸及びビタミンを含有する高栄養培地（DMEM培地）中で培養を続ける。
【００１５】
これにより細胞境界の不明瞭な大きな細胞が優勢に増殖するが、培養表面の一部には、重層しケラチンに被われた細胞密度の高い部分が生ずる。上記細胞境界の不明瞭な大きな細胞をトリプシン処理により除去し、この操作を数ヶ月にわたり反復し、重層を呈する細胞集団を集める。これがPam212細胞である。継代の際には0.05％トリプシンと0.1 ％EDTAにより細胞を剥離して分散せしめ、コンフルエントな細胞を１：10に分割して新たなディッシュにまくと、２〜３日で再びコンフルエントに達する。
【００１６】
形態には正常な表皮より初代培養した角化細胞の特徴を有している。すなわち円形ないし多角形を呈する細胞が単層にコロニーを形成しながら増殖する。一部は重層する傾向を示す。オーバーコンフルエントな状態になると、細胞層全体がディッシュから剥離、脱落することが多い。
【００１７】
新生マウス表皮と同じ分子量（67，59，55，50kDa)のケラチンを発現する。オルニチン・デカルボキシラーゼ活性が初代培養表皮角化細胞より高く、ホルボールエステル処理により顕著に増強される。同系の新生マウスに接種すると100 ％の確率で扁平上皮癌を形成し、寒天中での増殖能を獲得する。初代培養の表皮角化細胞はCa2+濃度の高低により増殖、分化が調製されるが、Pam212ではその変化が明瞭でない。しかし、低濃度のCa2+（＜0.1mM)中では細胞間結合を形成せず、また細胞骨格にも変化が見られる。
【００１８】
上記の細胞は、腫瘍壊死因子α（TNF α）及びシクロヘキサミド（CHX)の存在下でアポトーシスを生じ、浮遊死細胞を生ずる。従って、アポトーシス抑制剤のスクリーニングにおいてはTNF α（10ng／ml) 及びCHX （10μｇ／ml）を含有するDMEM＋10％FCS 培地中でマウス表皮角化細胞の培養細胞、例えばPam212細胞を培養し、この際に被験物質を添加した培養と、被験物質を添加しない培養を行い、浮遊死細胞の発生状態を比較すればよい。
【００１９】
カスパーゼ−３阻害活性を有し、且つアポト−シス抑制活性を有する脱毛抑制剤としては、クアチャララータ抽出液、シモツケソウ抽出液、コウチャ抽出液、ウーロンチャ抽出液、ハトムギ抽出液、シコン抽出液等を挙げることができ、クアチャララータ抽出液が特に好ましい。
【００２０】
植物抽出液を得るには、好ましくは抽出植物材料を乾燥し、必要に応じて小片化又は破砕する。抽出剤としては、水、有機液剤、水に混和性の有機溶剤と水との混合溶剤等が使用でき、水に混和性の有機溶剤と水との混合溶液が特に好ましい。有機溶剤としては、エタノール、メタノール等が挙げられる。エタノール水溶液が好ましく、特に７０％エタノール水溶液が好ましい。抽出濃度としては、室温〜抽出剤の沸点までの温度を使用することができ、20℃〜37℃が特に好ましい。抽出は３時間〜７日間行われる。
【００２１】
抽出液は、減圧蒸発等常法に従って溶剤を除去して乾燥することもでき、また抽出溶剤として非毒性の溶剤、例えば、水、エタノール水溶液等を使用した場合には、抽出液をそのままで、又は適当に濃縮した後に脱毛抑制剤の成分として用いることができる。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明を、実施例及び参考例により具体的に説明する。
参考例１．退行期毛包におけるアポトーシスの確認
ヒト頭皮組織または器官培養した毛包をＰＢＳで洗浄したのち、４％パラフォルムアルデヒド−リン酸バッファー（ｐＨ７．２）で４時間固定し、エタノール系列で脱水、パラフィン包埋後、厚さ５μｍの組織切片を作製した。
ヒト退行期毛包をＴＵＮＥＬ法で染色すると、毛乳頭の周囲に存在する毛母細胞が染色されることから、毛包が退縮する際に毛母細胞にアポトーシスが起こっていることが分かる（図１）。
【００２３】
参考例２．前駆体カスパーゼ−３の分布
カスパーゼはすべて前駆体として生産され、カスケードの上流に存在する分子によって切断されて活性化される。そこで、前駆体カスパーゼ−３に対する抗体を用いて、毛包における前駆体カスパーゼ−３の局在を調べた。脱パラフィン処理およびエタノール系列で親水処理したヒト頭皮組織切片を用い、一次抗体としてマウス抗ヒト前駆体カスパーゼ−３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）、二次抗体としてパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧを用いて、アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法により、ヒト毛包におけるカスパーゼ−３の存在部位を免疫組織化学的に染色した。
【００２４】
図２に示す通り、ヒト毛周期を通じて毛包上皮系細胞の全域に前駆体カスパーゼ−３の免疫染色性が認められた。このことから、毛包上皮系細胞は常にカスパーゼ−３を産生しており、毛包のアポトーシスにおいてもカスパーゼ−３が働いているものと考えられた。
【００２５】
参考例３．カスパーゼ−３の活性阻害による毛髪成長期延長効果
毛母細胞を含む毛包上皮系細胞は常にカスパーゼ−３を産生していることから、アポトーシスの刺激が毛包に伝わり、毛乳頭周囲の毛母細胞でカスパーゼ−３の活性化が起こると、これらの（毛母）細胞にアポトーシスが誘導され、その結果、毛包は退縮（脱毛）へ至ると考えられる。
【００２６】
このことから、カスパーゼ−３の活性を阻害して毛母細胞や外毛根鞘細胞のアポトーシスを抑えれば、毛包の退縮を妨ぐもしくは遅らせることができると考えられる。つまり、カスパーゼ−３の活性阻害による毛髪成長期延長効果が期待される。具体的な効果の検証には、ヒト毛包器官培養法においてカスパーゼ−３の活性を抑制する物質を添加した場合に、毛伸長が促進される、もしくは退行期様の形態変化が抑制されるかどうかで毛髪成長期延長効果を検証した。
【００２７】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）にヘニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾール（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）の３種類の抗生物質を加え、さらに１０ng／mlヒドロコーチゾン、１０μｇ／mlインシュリン、１０ng／ml亜セレン酸ナトリウムおよび１０μｇ／mlトランスフェリンを添加した培地をインシュリン含有培地、添加しない培地を基礎培地としてヒト毛包器官培養に用いた。
【００２８】
実体顕微鏡下でマイクロせん刃を用いて、ヒト頭皮から成長期の毛包を単離した。単離した毛包は基礎培地で洗浄したのち長さを測定し、インシュリン含有培地（２４穴のマイクロプレート使用：１穴あたり１ml）中に沈ませて、３７℃、５％ＣＯ2 を含む空気の気相条件下で一晩培養した。再度長さを測定したのち、伸長が０．２５mm以上かつ成長期の形態が維持された毛包を選択し、伸長が均等になるように１０から１２本づつの群に分けた。それぞれの群について、被検物質を含む培地に交換したのち、上記の気相条件下で培養を継続した。
毛包の伸長は倒立顕微鏡の接眼鏡部にミクロメーターを挿入して経時的に測定した。毛包全体および毛球部の写真は、倒立顕微鏡に接続したカメラによって撮影した。
【００２９】
カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−β−メチル−アスパルト−１−イル−フルオロメタン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、ほとんどすべてのカスパーゼを阻害することが知られている。そこで、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの毛髪成長期延長効果を器官培養法により検証した。ＤＭＳＯに溶解させたｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（最終濃度１０，２０，１００μＭ）またはコントロールのＤＭＳＯを基礎培地に添加した培地に交換し、さらに７日間毛包の伸長と形態変化を観察しながら培養を続けた。図８に示したように、コントロールのＤＭＳＯ添加に比べて、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ添加で毛伸長は促進された。また、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ添加で、毛球部の形態が保持された毛包の割合が上昇した（表１）。
【００３０】
【表１】
0004321957.tif 000002
【００３１】
実施例１．カスパーゼ−３の阻害剤のスクリーニング
10％のシュークロース、0.1 ％のCHAPS 及び５mM DTTを含有する25mM HEPES緩衝液（pH 7.5) に基質Ac-DEVD-MCA （アセチル-Asp-Gln-Val-Asp- メチルクマリンアミド）を0.5mM を加えたもの16μｌに、被験サンプル２μｌ及びカスパーゼ−３酵素液２μｌを加え、合計20μｌの反応混合物を37℃にて30分間インキュベートし、200 μｌの反応停止液（0.1Mクロロ酢酸）を加えた後、蛍光計（励起波長355nm ；放射波長460nm)により測定した。
【００３２】
被験試料としては、クアチャララーテ、コンフリー、インジゴフェラ・チンクトリア・リン（Indigofera tinctoria Linn)、ナンバンサイカチ、オドリコソウ、シコン、ハトムギ、コウチャ、トルメンチラ、シモツケソウ、ブドウ葉、ボダイジュ及びウーロンチャの抽出液を用いた。結果を図４に示す。いずれもカスパーゼ−３に対する阻害作用を有していた。
【００３３】
実施例２．アポトーシス抑制剤のスクリーニング
新生BALB／ｃマウスの表皮角化細胞を、10％FCS 、並びに５倍濃度のアミノ酸類及びビタミン類を含む高栄養培地（DMEM培地）中で培養し、その結果、細胞境界の不明瞭な大きな細胞が優勢となったが、部分的に、ケラチンに被われた細胞密度の高い部分が生じた。細胞境界の不明瞭な大きな細胞をトリプシン処理により除去し、この操作を数ヶ月にわたって繰り返し、重層を呈する細胞集団を分離し、Pam212細胞とした。
【００３４】
上記のPam212細胞を、10ng／mlのTNF α及び10μg ／mlのシクロヘキサミド（CHX)を含有するDMEM＋10％FCS 培地中で培養し、アポトーシス発生実験系とした。なお、Pam212細胞はTNF α及びCHX を含有する培地中ではアポトーシスを生じさせるが、これらの添加物を含有しない培地で培養した場合にはアポトーシスを生じさせない。
【００３５】
被験サンプルとして、コンフリー抽出液、シモノケソウ抽出液及びクアチャララーテ抽出液を用いた。さらに、培養系にTNF α及びCHX を添加せず、さらに被験サンプルも添加しないものと「対照」とし、TNF α及びCHX を添加しない培養系に、被験サンプルを添加したものを、それぞれ、「シモツケソウ対照」及び「クアチャララータ対照」とした。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
0004321957.tif 000003
【００３７】
その結果、実施例１においてカスパーゼ−３阻害作用が認められたシモツケソウ抽出液及びクアチャララーテ抽出液にアポトーシス抑制効果が認められた。
【００３８】
例えば図５において、上段はPam212細胞の対照であり、中段はTNF α及びCHX を添加してPam212細胞を培養した場合であり、アポトーシスが生じていることがわかる。下段はさらにクアチャララーテ抽出物を加えた場合であり中段で生じたアポトーシスが、クアチャララーテ抽出物により抑制されていることがわかる。
【００３９】
さらに、図６は、上記のアポトーシスが生ずる条件（TNF α及びCHX を添加）においてクアチャララーテ抽出液又はＶＡＤ−ｆｍｋを添加して６時間インキュベートした後、抗−前駆体カスパーゼ−３抗体及び抗−活性化カスパーゼ−３抗体を用いて前駆体カスパーゼ−３及び活性化カスパーゼ−３を検出した結果である。ほぼすべての細胞において前駆体カスパーゼ−３が検出されたのに対して、活性化カスパーゼ−３は検出されなかった。このことは、クアチャララーテ抽出物及びＶＡＤ−ｆｍｋが、前駆体カスパーゼ−３の活性化を完全に抑制していることを示している。
【００４０】
【発明の効果】
以上の通り、カスパーゼ−３阻害及び所望によりさらにアポトーシス抑制を指標とすることにより、新規なカスパーゼ−３阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、退行期における毛乳頭周囲の毛母細胞がアポトーシスを起こしていることを示す、生物の形態を表わす図面代用写真である。
【図２】図２は、ヒト毛周期にわたる前駆体カスパーゼ−３の分布を示す、生物の形態を表わす図面代用写真である。
【図３】図３は、ヒト毛包器官培養法におけるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの毛伸長への影響を示すグラフである。
【図４】図４は、各種植物抽出液のカスパーゼ−３阻害作用を示すグラフである。
【図５】図５は、TNF α及びCHX の存在下でPam212細胞がアポトーシスを生ずる系において、クアチャララーテ抽出液の添加によりアポトーシスが抑制されることを示しており、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図６】図６は、TNF α及びCHX の存在下で培養したPam212細胞において、クアチャララーテ抽出液又はＶＡＤ−ｆｍｋの添加により前駆体カスパーゼ−３の活性化が抑制されることを示すものであり、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図１】
0004321957.tif 000004
【図２】
0004321957.tif 000005
【図３】
0004321957.tif 000006
【図４】
0004321957.tif 000007
【図５】
0004321957.tif 000008
【図６】
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