(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化または非グリコシル化された、アゴニストタンパク質またはアンタゴニストタンパク質であって、以下：
β１−（リンカー１）ｍ−α−（リンカー２）ｎ−β２  （１）；または
β１−（リンカー１）ｍ−β２−（リンカー２）ｎ−α  （２）；または
α−（リンカー１）ｍ−β１−（リンカー２）ｎ−β２  （３）
の式を有し、ここで各β１およびβ２は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）から選択される脊椎動物糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列、または、欠失または保存的アミノ酸置換である１〜５個のアミノ酸変異を有する該βサブユニットのいずれかの改変体のアミノ酸配列を有し；
「α」は、該脊椎動物糖タンパク質ホルモンに共通のαサブユニット、または、欠失または保存的アミノ酸置換である１〜５個のアミノ酸変異を有する該αサブユニットの改変体を示し；
ここで、該βサブユニットの改変体またはαサブユニットの改変体は、アゴニストまたはアンタゴニストとしての式（１）、（２）、または、（３）の活性を保持し；
「リンカー」とは、該αサブユニットから、およびお互いから、アゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を保持するような距離で該β１サブユニットおよびβ２サブユニットに間隔を保つ１００アミノ酸未満の共有結合したペプチドをいい、ここで、該リンカーは、該サブユニット間の相互作用の妨げにならないように溶液中に存在するように親水性であり、そして
各ｍおよびｎは、独立して０または１である、タンパク質。
【請求項２】
前記ｍおよびｎの少なくとも一つが１である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ｍおよびｎの両方が１である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
各リンカーは、ヒトｃＣＧ（ＣＴＰ）のカルボキシ末端ペプチドまたはその改変体であり；ここで、該改変体は、欠失または保存的アミノ酸置換である１〜５個のアミノ酸変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
少なくとも１つの前記リンカー部分が前記糖タンパク質ホルモンのレセプターに標的化されるべき薬物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
適切な薬学的賦形剤と混合して、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を含有する、薬学的組成物。
【請求項７】
固体支持体と結合された、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質に対して免疫特異的な、抗体。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１０】
糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの産生のための発現系であって、該発現系は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする第１ヌクレオチド配列を、該第１ヌクレオチド配列の発現に影響し得る制御配列と作動可能に連結して含む、発現系。
【請求項１１】
前記第１ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と作動可能に連結した、シグナルペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の発現系を含むように改変された、宿主細胞。
【請求項１３】
糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニストである単鎖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該タンパク質が産生される条件下で、請求項１２に記載の細胞を培養する工程および該培養物から該タンパク質を回収する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府援助の記述）
本発明は、一部、国立衛生研究所より奨励金を得て、ＮＩＨ契約番号ＮＯ１−ＨＤ−９−２９２２で政府援助の下でなされた。政府は本発明に一部権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質工学の分野、特に通常、ヘテロダイマーとして存在する特定の糖タンパク質ホルモンの改変された形態に関する。本発明は、２つの効果または機能を提供し得、あるいはネイティブなホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして一般に挙動し得る絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の改変された単鎖形態に関する。
【０００３】
（背景技術）
ヒトにおける、重要な４つの糖タンパク質ホルモンヘテロダイマー（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＣＧ）は、同じαサブユニットおよび異なるβサブユニットを有する。これらのホルモンのうち３つは、事実上他の全ての脊椎動物種にも存在し、ＣＧは、今までには、霊長類および妊娠した雌馬の胎盤および尿にしか認められていない。
【０００４】
１９９０年９月７日に公開され、本明細書に参考として援用されるＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０９８００号は、これらのホルモンの多くの改変形態を記載する。重要な１つの改変は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンあるいはその改変体のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）による、βサブユニットのＣ末端伸長である。これらのホルモンの他のムテインもまた記載されている。ＣＴＰは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２〜１１８位の任意の位置から１４５位までにわたるアミノ酸配列である。このＰＣＴ出願は、ＣＴＰのクリアランス特性を変える能力が破壊されないような、保存アミノ酸置換により得られるＣＴＰ伸長の改変体を記載している。さらに、本明細書に参考として援用される、１９９４年１０月２７日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２４１４８号は、Ｃ末端以外の位置でのＣＴＰの伸長あるいは挿入による、これらのホルモンの改変、および１１２〜１１８位から１４５位にわたる配列より短いＣＴＰフラグメントを記載する。
【０００５】
ＦＳＨのＣＴＰ伸長βサブユニットもまた、本明細書中に出願者による２つの報文に記載される：ＬａＰｏｌｔ，  Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  （１９９２）  １３１：２５１４−２５２０およびＦａｒｅｓ，  Ｆ．Ａ．ら；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９９２）  ８９：４３０４−４３０８。これらの両報文は、本明細書中に参考として援用される。
【０００６】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのヘテロダイマー形態の結晶構造は、ほぼ同時期の論文中に公開され；１つは、Ｌａｐｔｈｏｒｎ，  Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  （１９９４）  ３６９：４５５−４６１であり、もう一方は、Ｗｕ，  Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （１９９４）  ２：５４５−５５８である。これらの論文の結果は、Ｐａｔｅｌ，  Ｄ．Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９４）  ３６９：４３８−４３９に要約される。
【０００７】
１９９１年１１月１４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１６９２２号は、多くのキメラおよび他の改変形態のヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンを記載する。概して、この開示は、それぞれに種々のαまたはβ鎖部分を含有するαサブユニットあるいはβサブユニットのキメラを重点的に取り扱っている。この出願に単に列挙されるだけで他には記載されていない１つの構築物は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖の実質的に全体を、αサブユニットプレタンパク質（すなわち、このサブユニットの分泌シグナル配列を含有する）に融合する。
【０００８】
公開された２つのさらなるＰＣＴ出願は、このαユニットおよびβユニットが共有結合されて、以下の一般式の融合ペプチドを生じる、これらのホルモンの単鎖形態を記載する：
β（リンカー）nα、または
α（リンカー）nβ
ここでｎは０または１であり、そしてαおよびβはこれらのホルモンのそれぞれのサブユニットを示す（Ｍｏｙｌｅ、Ｗ．Ｒ．、１９９５年８月２４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２２３４０号、および本明細書中の発明者の出願である、１９９６年２月２２日に公開された第ＷＯ９６／０５２２４号）。これらの書類の開示もまた、本明細書中に参考として援用される。
【０００９】
シスチン架橋数が使い尽くされた、上記に記載の単鎖糖タンパク質ホルモンの形態は、１９９７年９月１９日に出願され、そして本明細書中に参考として援用される米国特許第０８／９３３，６９３号に開示される。
【００１０】
アゴニスト活性および／またはアンタゴニスト活性を増強し、ならびに／あるいは糖タンパク質が共通のαサブユニットを共有するように、単鎖中に２つのβサブユニットを含むことによって二官能性である糖タンパク質ホルモンの一本鎖形態を構築することが可能であることが現在認められた。これらの形態は、種々のＣＴＰ伸長およびＣＴＰ挿入、ならびに上記に示す書類中に記載されるような、このαおよびβサブユニットのネイティブ形態の改変体、ならびにＣＴＰのネイティブ形態の改変体を含み得る。
【００１１】
（発明の開示）
本発明は、同じまたは異なり得る２つのβサブユニットを含む、糖タンパク質ホルモンの単鎖形態を提供する。本発明の一本鎖形態は、グリコシル化、部分グリコシル化、または非グリコシル化のいずれかであり得、そしてネイティブな糖タンパク質ホルモンまたはそれらの改変体に存在するα鎖およびβ鎖は、必要に応じてリンカー部分を介して連結され得る。特に好ましいリンカー部分は、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）ユニットを完全なユニットまたはそれらの部分のみを示す改変体を含む改変体のいずれかとして含む。得られた単鎖ホルモンは、非改変ヘテロダイマー形態の活性を保持するか、または増強するかのいずれかであり、あるいはこの活性のアンタゴニストである。この２つのβサブユニットが異なる場合、これらはアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして二官能性である。
【００１２】
従って、１つの局面では、本発明は、以下の式のグリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質に関し：
β1−（リンカー1）m−α−（リンカー2）n−β2  （１）；または
β1−（リンカー1）m−β2−（リンカー2）n−α  （２）；または
α−（リンカー1）m−β1−（リンカー2）n−β2  （３）
ここで各β1およびβ2は、脊椎動物糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのアミノ酸配列または上記アミノ酸配列の改変体を有し、ここで上記改変体は本明細書中で規定される。「α」は、脊椎動物糖タンパク質ホルモンまたはその改変体のαサブユニットを示し；「リンカー」とは、上記αサブユニットおよびお互いから、適切な距離でこのβ1サブユニットおよびβ2サブユニットに間隔を保つ、共有結合した部分をいう。各ｍおよびｎは、独立して０または１である。
【００１３】
前記のすべての場合において、この単鎖形態は、この単鎖形態における完全なサブユニットの含有が不必要なようにコンホメーションを保存する。従って、本発明は、αサブユニットおよび／またはβサブユニットのフラグメントを含む式（１）、（２）および（３）の化合物を包含し、ここでこれらの形態は、完全なサブユニットを含む対応する形態によって示される生物学的活性を保持する。
【００１４】
他の局面では、本発明は、本発明のタンパク質を産生するための組換え材料および方法、それらを含有する薬学的組成物、それらに特異的な抗体、およびそれらの使用に関する。
【００１５】
（発明を実施するための形態）
ヒトの４つの「糖タンパク質」ホルモンは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含むファミリーを提供する。本明細書で使用されるように、「糖タンパク質ホルモン」とは、このファミリーのすべてのメンバーをいう。これらのホルモンは全て、所定の種について、グループ中のアミノ酸配列が同じであるαサブユニット、およびファミリーのメンバーに従って異なるβサブユニットから構成されたヘテロダイマーである。従って、通常これらの糖タンパク質ホルモンは、会合されているが共有結合されていないαサブユニットおよびβサブユニットから構成されたヘテロダイマーとして存在する。ほとんどの脊椎動物は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨを産生し、絨毛性性腺刺激ホルモンは、ヒトを含む霊長類および妊娠した雌馬にのみ認められている。
【００１６】
動物において、各ホルモンのαサブユニットおよびβサブユニットは、異なった遺伝子でコードされ、そして別に合成され、次いで非共有結合へテロダイマー複合体にアッセンブリされる。本発明の化合物において、このβサブユニットは直接αサブユニットと連結され、１次構造において本質的に直鎖状である単鎖分子となる。２次構造および３次構造的考察、ならびにコンホメーションによって与えられる３次元構造は、ヘテロダイマー形態と見かけ上、十分に類似し、βサブユニットによって表されるヘテロダイマーの機能性が示されることを可能にする。しかし、このサブユニットの構造の適切な変化によって、本発明の化合物は、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有し得る。例えば、このβサブユニットが異なる場合、この化合物は、１つの糖タンパク質ホルモンのレセプターに関してアンタゴニスト活性を示し得るが、別の糖タンパク質ホルモンのレセプターに関してはアゴニスト活性を示し得るか、あるいは両方の糖タンパク質ホルモンに関してアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有し得る。本発明の化合物によって示される活性のスペクトルは、個々のαサブユニットおよびβサブユニットの選択、ならびにリンカー部分の性質ならびにαサブユニットおよびβサブユニットの配向に依存する。
【００１７】
本発明の最も好ましい実施態様において、式（１）、（２）または（３）の化合物は、このαサブユニットおよびβサブユニットが直接かまたはペプチドリンカーを介してのいずれかで頭−尾連結された融合タンパク質である。遺伝子コードアミノ酸がこの配列を含む場合のみ、この化合物は、組換えで合成され得る。しかし、この様式において本発明の化合物を制限する必要はない。このαサブユニットおよびβサブユニット、ならびにこのリンカーは、コードされた遺伝子でないアミノ酸を含み得る。さらにこのリンカーは、ジカルボン酸または無水物、ジアミン、または二官能性リンカー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬなどによって販売されるリンカー）のようなペプチド以外であり得る。さらにこのサブユニットは、融合タンパク質において必要とされる場合、頭−頭または尾−尾配置、ならびに頭−尾配置で、直接またはリンカーを介してのいずれかで連結され得る。これらの状況下で、頭−頭配置について、２つのアミノ基は、無水物を介して、または任意のジカルボン酸誘導体を介して連結され得る。２つのカルボキシル基は、標準の活性化技術を使用してジアミンまたはジオールを介して連結され得る。
【００１８】
しかし、便宜のために、最も好ましい形態は、頭−尾配置であり、ここで標準的なペプチド結合が充分であり、そして化合物は、融合タンパク質として組換えにより、または合成ペプチド技術を使用して、１つの連続した反応において、または好ましくは配列全体の個々の部分を連結することのいずれかにおいて調製され得る。
【００１９】
どのような実施態様であろうと、αサブユニットおよびβサブユニットは、残りの分子にそのＮ末端およびＣ末端に近い位置で連結される。これらのサブユニットが、直接その末端で連結されることが好ましいが、しかし、この連結は、単に「近接」し得る。一般に、「近接」とは、末端の１０アミノ酸以内に、好ましくは５アミノ酸以内に、より好ましくは２アミノ酸以内にある、そして最も好ましくは末端自体である位置を示す。
【００２０】
（サブユニット成分）
本明細書で使用されている場合、共通のαサブユニット、およびＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、およびＣＧβサブユニット、ならびにヘテロダイマー形態は、それらの従来からの定義を有し、示されるグリコシル化パターンまたはアミノ酸側鎖の他の誘導体化にかかわらず、それ自体が当該分野で公知のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらの対立遺伝子改変体をいう。
【００２１】
これらのペプチドの「ネイティブ」形態は、関連の脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有し、それ自身が既知配列を有する形態、またはそれらの対立遺伝子改変体の形態である。
【００２２】
これらのタンパク質およびＣＴＰユニット（下記を参照のこと）の「改変体」形態は、例えば、部位特異変異誘発もしくは他の組換え操作によって生産された、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列中の意図的な改変（切断を含む）を有するタンパク質、または合成的に調製されたタンパク質である。
【００２３】
これらの改変は、１〜１０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の、欠失、挿入および置換を含む変化、最も好ましくは保存的アミノ酸置換からなる。得られる改変体は、ネイティブホルモンの対応活性に影響する活性を保持しなければならない、すなわち、これらは、アゴニストとして挙動するようにネイティブホルモンの生物学的活性を保持しなければならないか、または概してネイティブホルモンのレセプターに結合し得るがシグナル伝達に影響する能力を欠くことにより、アンタゴニストとして挙動しなければならない。
【００２４】
「保存アナログ」は、従来の意味で、置換される残基が、置換がなされる残基と同じ一般的なアミノ酸カテゴリーにあるアナログを意味する。アミノ酸は、当該分野で理解されているように、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．ら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７２）５：８９−９９によって、このようなグループに分類された。一般的には、酸性アミノ酸は、１つのグループに帰属し；塩基性アミノ酸は別のグループに；中性の親水性アミノ酸は別のグループに、などに帰属する。より詳細な分類は、上記で参考として援用されるＷＯ９６／０５２２４に記載される。
【００２５】
好ましい改変体の１つのセットは、αまたはβサブユニットのいずれかまたはその両方のグリコシル化部位が改変された改変体である。本明細書に記載されているホルモンカルテットのいくつかの有用な改変体は、１９９３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１９３号に記載されており、そしてこれは本明細書に参考として援用される。その特許に示されているように、グリコシル化パターンは、関連部位の破壊、あるいは代替的に、タンパク質が生産される宿主細胞の選択によって、改変され得る。
【００２６】
アミノ酸配列中の改変はまた、挿入および欠失の両方を包含する。従って、ホルモンの切断形態、例えば、Ｃ末端で、８５〜９２位のいくつかまたは全部のアミノ酸が欠失しているαサブユニットの改変体は、改変体中に包含される。さらに、１〜１０アミノ酸がＮ末端から欠失されたαサブユニットが包含される。
【００２７】
改変体はまた、非重要領域が改変または除去された改変体を包含する。このような欠失および改変はループ全体を含み得、その結果、１０個よりかなり多いアミノ酸の配列が欠失または変更され得る。しかし、得られる改変体は、少なくともレセプター結合ドメインおよび／またはシグナル伝達に関与する領域を保持しなければならない。
【００２８】
糖タンパク質ホルモンの改変体についてのかなりの文献が存在し、この文献から、アゴニストおよびアンタゴニスト活性の両方を生じる多くの可能な改変体が調製され得ることが、明白である。このような改変体は、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９２）６：９１４−９１９；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１３０３４−１３０４２；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：１７７４１−１７７４３；Ｐｕｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｌｕｓｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）１２２−１３４；Ｋｕｅｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．ら、（同書）１０３−１１７頁；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９０）１２６：２５５５−２５６０；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（抄録１８４４）に開示されている。
【００２９】
他の改変体は、１つ以上のシスチン結合が、代表的には、結合に関与する一方または両方のシステインを中性アミノ酸で置換することによって、欠失される改変体を包含する。欠失され得る特に好ましいシスチン結合は、２６位と１１０位との間、および２３位と７２位との間のシスチン結合である。
【００３０】
さらに、ホルモンカルテットのβサブユニットは、キメラの両成分の生物学的機能、または一般的には、改変された生物学的機能のホルモンを提供するように、キメラ形態に構築され得ることが実証された。従って、ＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの両活性を示すキメラ分子は、Ｍｏｙｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９１）８８：７６０−７６４；Ｍｏｙｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８：２５１−２５５に記載のように構築され得る。これらの報文に開示されているように、ＦＳＨ−βの１０１〜１０９位のアミノ酸でＣＧ−βサブユニット中の対応残基を置換することにより、ｈＣＧおよびＦＳＨの両活性を有するアナログが得られる。
【００３１】
本明細書で使用されているように、「ペプチド」および「タンパク質」は、それらの間の長さの区別は恣意的であるので、互換的に使用される。
【００３２】
上記のように、連結部分を有するかまたは有さない、本発明の化合物の形成においてαサブユニットおよびβサブユニットとして用いられる「改変体」は、サブユニットの完全なアミノ酸配列またはその部分のみを表し得る。
【００３３】
「改変体」はまた、非重要領域に挿入されたＣＴＰ（またはＣＴＰの改変体）を含むα鎖および／またはβ鎖を含む。
【００３４】
αサブユニットおよびβサブユニットの「非重要」領域は、生物活性（アゴニストおよびアンタゴニスト活性を含む）に必要とされない分子領域である。一般的には、これらの領域は結合部位、前駆体切断部位、および触媒領域から切り離される。適切な折り畳みの誘導、レセプターへの結合、触媒活性などに対して重要な領域は評価されるべきである。ダイマーの場合に重要であるいくつかの領域は、この分子によって課されるコンフォメーション上の制限がこれらの領域に対する必要性を取り除き得るので、単鎖形態では非重要となることは、注目されるべきである。非重要領域の確認は、候補領域の欠失または改変、および、所望の活性についての適切なアッセイの遂行によって、容易に達成される。改変が活性の損失を生じる領域は重要であり、改変が同じかあるいは同様の活性（アンタゴニスト活性を含む）を生じる領域は非重要であると考えられる。
【００３５】
「生物学的活性」によって、ネイティブホルモンの活性に対してアゴニストまたはアンタゴニスト性のいずれかである活性が意味されることが再度強調されるべきである。従って、アンタゴニストは、ホルモンの生理学的効果を直接提供し得ないが、特定の領域は、アンタゴニストとしての改変体の挙動に対して重要である。
【００３６】
例えば、αサブユニットについては、３３〜５９位がシグナル伝達に必要であると考えられ、そしてカルボキシ末端の２０アミノ酸ストレッチがシグナル伝達／レセプター結合に必要とされる。βサブユニットとの組立てに重要な残基は、少なくとも残基３３〜５８、特に残基３７〜４０を含む。
【００３７】
非重要領域がＮ末端またはＣ末端に「近接する」場合、挿入は、末端の１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内の任意の位置に存在し、そして最も好ましくは末端自体に存在する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ＣＴＰユニット」とは、アミノ酸１１２〜１１８位からＣ末端の残基１４５にまで、またはその部分にまで広がる、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットのカルボキシ末端に見出されるアミノ酸配列をいう。従って、各「完全」ＣＴＰユニットは、ＣＴＰのＮ末端に依存して、２８〜３４個のアミノ酸を含有する。
【００３９】
「部分」ＣＴＰユニットによって、１１２〜１１８位から１４５位まで（１４５位を含む）の間に存在するが、最も短い可能な「完全」ＣＴＰユニットから（すなわち、１１８位〜１４５位から）少なくとも１つのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列が意味される。これらの「部分」配列は、「改変体」の定義に含まれる。「部分」ＣＴＰユニットは、好ましくは、少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。ホルモンのいくつかの非グリコシル化形態はアンタゴニストであり、そしてそれ自体有用である。そのＣＴＰユニットは、１２１位（部位１）；１２７位（部位２）；１３２位（部位３）；および１３８位（部位４）のセリン残基に、４つのグリコシル化部位を含む。アゴニストに有用なＣＴＰの部分形態は、ネイティブＣＴＰ配列に見られる順序に整列された、これらの部位のうちの１つ以上を含有するが、介在部位は削除され得る。
【００４０】
いくつかの場合には、ＣＴＰユニットは、縦並びのリンカーとして挿入または使用され得る。「縦並びの」挿入物または伸長物によって、挿入物または伸長物が少なくとも２つの「ＣＴＰユニット」を含有することが意味される。各ＣＴＰユニットは、完全またはフラグメントであり得、ネイティブまたは改変体であり得る。縦並びの伸長物または挿入物中の全ＣＴＰユニットは、互いに同じであり得るかまたは異なり得る。
【００４１】
「リンカー部分」は、他の場合にはヘテロダイマーのメンバーと同じα鎖およびβ鎖によって示される活性、またはその活性をアゴニスト活性からアンタゴニスト活性へと転換する活性を妨害せずに、α配列とβ配列とを接続する部分である。活性レベルは理にかなった範囲内で変化し得るが、リンカーの存在は、単鎖形態から実質的なアゴニストおよび実質的なアンタゴニストの両活性を奪うものではあり得ない。単鎖形態は、プロペプチドを示さず、成熟タンパク質を示し、そしてヘテロダイマーのホルモン活性に適切な活性を示さねばならず、そのエレメントは、その成分を形成する。
【００４２】
（二官能性ホルモンの好ましい実施態様）
本発明の二官能性ホルモンは、組換え技術を用いて最も効率的および経済的に生産される。従って、これらの形態のα鎖およびβ鎖、ＣＴＰユニット、および遺伝子にコードされるアミノ酸のみを含む他のリンカー部分を含む融合タンパク質が好ましい。しかし、上記のように、合成ペプチド技術または他の有機合成技術を用いて単鎖ホルモンの少なくとも一部を構築することは可能であり、それゆえに、非遺伝子コードアミノ酸および非ペプチドベースのリンカーを含む改変体もまた、本発明の範囲内である。
【００４３】
最も好ましい実施態様では、β1サブユニットのＣ末端は、必要に応じてリンカーを介して、成熟αサブユニットのＮ末端に共有結合で連結される。成熟αサブユニットのＮ末端は今度は、必要に応じてαリンカーを介してβ2サブユニットに共有結合で連結される。この連結は、一方のサブユニットのＣ末端アミノ酸が他方のサブユニットのＮ末端にペプチド結合を介して直接連結される、直接ペプチド連結であり得るが、しかし、多くの例においては、２つの末端間にリンカー部分を含むことが好ましい。多くの例では、リンカー部分は、２つの鎖間に少なくとも１つのβターンを提供する。それゆえに、リンカー内のプロリン残基の存在は、有利であり得る。
【００４４】
（単鎖形態を含むサブユニットの末端間の連結の考察においては、１つ以上の末端が、上記のような置換および／または欠失によって改変され得ることが理解されるべきである。）
実施態様の特に好ましい１つのセットでは、連結は頭−尾であり、そしてそのリンカー部分は、１つ以上のＣＴＰユニットおよび／またはそれらの改変体もしくは切断形態を含む。このようなリンカー部分に使用されるＣＴＰユニットの好ましい形態は本明細書中下記に記載されている。
【００４５】
さらに、リンカー部分は、共有結合により、好ましくは放出可能に、リンカー部分に結合された薬物を含み得る。薬物のリンカー部分へのカップリング手段、およびその放出を提供する手段は従来の手段である。
【００４６】
リンカー部分でのそれらの存在に加えて、ＣＴＰおよびその改変体はまた、上記のような単鎖ホルモンを構成するサブユニットの任意の非重要領域に含まれ得る。
【００４７】
ＣＴＰユニットは、リンカー部分中の好ましい含有物であるが、リンカーは、αサブユニットとβサブユニットとの間に適切な空間関係を提供する任意の適切な共有結合物質であり得ることが理解される。従って、頭−尾配置には、リンカーは、一般的に、溶液中で適当な空間およびコンホメーションを提供するために適切な親水性／疎水性比を有する、任意数の、しかし代表的には１００個未満、より好ましくは５０個未満のアミノ酸を含有するペプチドのような二価の部分またはこれらの特徴を付与する非ペプチド性リンカーであり得る。一般的に、リンカーは、周囲溶液中に存在し、そしてαサブユニットとβサブユニットとの間、または２つのβサブユニット間の相互作用の妨げにならないように、結局は親水性であるべきである。リンカーは、代表的にはペプチドリンカー中のプロリン残基によって提供されるβターンを含むか、またはセリンおよび／またはグリシン残基を含むことが好ましい。上記の正確な特徴を有する、ペプチドリンカーを含む、任意の適切なポリマーが使用され得る。
【００４８】
本発明の二官能性ホルモンの特に好ましい実施態様は、下記の頭−尾配置などを包含する：
【００４９】
【化１】
0004255618.tif 000002
サブユニットのヒト形態もまた特に好ましい。上記の構築物では、「ＣＴＰ」とは、第９６／０５２２４号に記載されるように、ＣＴＰまたはその改変体（切断型を含む）をいう。
【００５０】
ヒトでの使用に関しては、ヒト型のαサブユニットおよびβサブユニットが望ましいが、他の脊椎動物における対応形態が獣医学的状況において有用であることに留意すべきである。従って、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、および他の種に特有なＦＳＨ、ＴＳＨ、およびＬＨのサブユニットは、これらの種自体に影響を与える指標に適切である。
【００５１】
リンカー部分に含まれ得る適切な薬物は、インスリン様増殖因子；上皮増殖因子；酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子；血小板由来増殖因子；種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球ＣＳＦ、マクロファージＣＳＦなど）；ならびに種々のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、および過剰なさらなるインターロイキンタンパク質）；種々のインターフェロン；腫瘍壊死因子などのような、ペプチドまたはタンパク質を包含する。これらの薬物の放出に適切な切断部位（例えば、標的部位がαサブユニットおよびβサブユニットに存在しない、プロテアーゼの標的配列）が含まれ得る。ペプチドベースまたはタンパク質ベースの薬物は、構築物全体が、１つの遺伝子の組換え発現によって容易に生産され得るという利点を有する。さらに、抗生物質、抗炎症剤、トキシンなどのような低分子薬物が、使用され得る。
【００５２】
一般的に、リンカー部分内に含まれる薬物は、ホルモンが通常結合するレセプターに近接して作用することが望まれる薬物である。リンカー内での含有からの薬物の放出の適切な供給は、例えば、本明細書中以下の調製方法の題の節にさらに詳細に記載されているような、酵素触媒による溶解の部位を含有させることによっても、提供される。
【００５３】
（他の改変）
本発明の単鎖タンパク質は、リン酸化、グリコシル化、通常グリコシル化された形態の脱グリコシル化、アシル化、アミノ酸側鎖の改変（例えば、プロリンのヒドロキシプロリンへの転換）、および、一般的に生じることが認められている翻訳後の事象に類似した同様の改変のような、アミノ酸配列を誘導体化すると一般的に理解されている方法で、さらに結合体化または誘導体化され得る。
【００５４】
本発明のホルモンのグリコシル化状態は、特に重要である。ホルモンは、原核生物宿主中で生産すること、またはサブユニットおよび／もしくは存在し得る任意のＣＴＰユニットに通常存在するグリコシル化部位を変異させることのいずれかによって、非グリコシル化バージョンで調製され得る。非グリコシル化形態および部分的にグリコシル化された形態のホルモンの両方は、グリコシル化部位を操作することによって調製され得る。通常は、無論のこと、グリコシル化形態もまた、本発明の範囲内に包含される。
【００５５】
当該分野で一般に公知のように、本発明の単鎖タンパク質はまた、所望の適用に応じて、標識、キャリア、固体支持体などにカップリングされ得る。標識形態は、それらの代謝運命の追跡に使用され得る。この目的のための適切な標識は、特に、ヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１などのようなラジオアイソトープ標識を包含する。標識はまた、アッセイ系中の単鎖タンパク質の検出を媒介するために使用され得る。この場合、ラジオアイソトープはまた、酵素標識、蛍光標識、発色標識などと同様に使用され得る。このような標識の使用は、関連のレセプターの局在化を可能にする。なぜなら、これらは、このようなレセプターに関する標的化剤として使用され得るからである。
【００５６】
本発明のタンパク質はまた、これらの新規な改変形態と特異的に免疫反応する抗体の調製において、それらの免疫原性を増強するために、キャリアにカップリングされ得る。この目的のための適切なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジフテリアトキソイドなどを包含する。二官能性リンカーの使用を含む、本発明の改変ペプチドをキャリアに連結させるための標準的なカップリング技術が、使用され得る。
【００５７】
他の技術とともに、同様の結合技術が、本発明のタンパク質を固体支持体にカップリングさせるために使用され得る。カップリングされる場合、これらのタンパク質は、次いで、特異的反応が示される所望の成分を分離するためのアフィニティー試薬として使用され得る。従って、これらは、適切なβサブユニットが相互作用するレセプターの精製および単離において有用である。
【００５８】
（調製方法）
本発明のタンパク質を構築するための方法は、当該分野で周知である。上記に示すように、遺伝子がコードするアミノ酸のみが含まれ、単鎖が頭−尾配置である場合、現在最も実用的なアプローチは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの発現によってこれらの物質を組換え法により合成することである。改変体を含む単鎖形態をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡは、ネイティブ配列から調製され得るか、またはデノボで、もしくはこれらの技術の組み合わせを用いて合成され得る。部位特異的変異誘発、さらなる配列の連結、ＰＣＲによるような増幅、および適切な発現系の構築のための技術は、現在までに全て当該分野で周知である。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの部分あるいは全部は、好ましくは連結を容易にするための制限部位を含むように、標準的な固相法によって合成して構築され得る。含まれるコード配列の転写および翻訳のための適切な制御エレメントが、ＤＮＡコード配列に提供され得る。周知のように、発現系は、広範囲の宿主（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのような原核生物宿主、および酵母、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのような他の真菌、植物細胞、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞、鳥類細胞などのような真核生物宿主を含む）に適したものが、現在入手可能である。
【００５９】
宿主の選択は、特に翻訳後の事象（最も具体的にはグリコシル化を含む）に対して適切である。グリコシル化の位置は、分子内のグリコシル化部位の性質によって、ほとんどの場合制御される。しかし、この部位を占める糖の性質は、主として宿主の性質によって制御される。従って、本発明のホルモンの特性の微調整は、宿主の適切な選択によって達成され得る。
【００６０】
αサブユニット部分の遺伝子の特に好ましい形態（αサブユニットは改変されるか、あるいは改変されない）は、「ミニ遺伝子」構築物である。本明細書で使用される場合、αサブユニット「ミニ遺伝子」は、ｐＭ2／ＣＧαあるいはｐＭ2／Ｉの構築物の記載において、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）２：９５−１００に開示されている遺伝子構築物のことである。
【００６１】
組換え産生については、発現系を用いる改変宿主細胞が使用され、所望のタンパク質を産生するために培養される。これらの用語は、本明細書では以下のように使用される。
【００６２】
「改変（された）」組換え宿主細胞、すなわち、本発明の組換え発現系を「含むように改変された」細胞とは、その発現系を導入するために、トランスフェクション、ウイルス感染などを含む任意の都合のよい様式によって、この発現系を含むように改変された宿主細胞のことである。「改変（された）細胞」とは、この発現系を含有する細胞のことであり、系は染色体中に組み込まれるか、あるいは染色体外性である。「改変された細胞」は、発現系の含有に関して安定であり得るか、あるいはコード配列は一過的に発現され得る。簡単には、本発明の発現系を用いて「改変された」組換え宿主細胞とは、この取り込みをもたらす様式に関係なくネイティブでは含まない場合、この発現系を含ませる操作の結果として、この発現系を含む細胞をいう。
【００６３】
「発現系」とは、発現されるべきコードヌクレオチド配列、および、コード配列の発現をもたらすのに必要なこれらが伴う制御配列を含むＤＮＡ分子のことである。代表的には、これらの制御は、プロモーター、終止調節配列、および、いくつかの場合には、オペレーターあるいは発現を調節するその他の機構を含む。制御配列は、特定の標的組換え宿主細胞で機能的であるように設計されたものであり、従って、宿主細胞が、構築された発現系で制御配列に適するように選択されなければならない。
【００６４】
産生されたタンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列もまた、プレタンパク質を産生するために所望の単鎖ホルモンに作動可能に連結される、シグナルペプチドを産生するように含まれる。分泌に際して、シグナルペプチドは、成熟単鎖ホルモンを放出するために切断される。
【００６５】
本明細書で使用されているように、「細胞」、「細胞培養（物）」および「細胞系」は、意味の微妙な差に特に注意を払うことなく、互換的に使用される。それらの間の区別が重要な場合、その区別は文脈から明白である。任意が意味される場合、全てが包含されることが意図される。
【００６６】
産生されたタンパク質は、細胞内で産生されるときは細胞溶解物から、あるいは、分泌されるときは培地から回収され得る。細胞培養物から組換えタンパク質を回収する方法は、当該分野で周知であり、これらのタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、選択沈降などのような公知の方法によって、精製され得る。
【００６７】
本発明のホルモンの全体あるいは一部は、当該分野で公知のペプチド合成法によって直接合成され得る。合成された部分は連結され得、リンカー部分に含まれる任意の薬剤のための放出部位は、標準的な化学手段によって導入され得る。遺伝子によってコードされないアミノ酸を含有するこれらの実施態様および頭−頭または尾−尾の配置が用いられるそれらの実施態様については、当然、その合成はタンパク質レベルで少なくとも部分的でなければならない。天然Ｎ末端あるいは天然Ｎ末端近接位置での頭と頭との接続は、ジカルボン酸誘導体のような、アミノ基と反応する官能基を含有するリンカーを介してもたらされ得る。Ｃ末端あるいはＣ末端近接位置での尾−尾配置は、ジアミン、ジオール、またはそれらの組合せであるリンカーを介してもたらされ得る。
【００６８】
（抗体）
本発明のタンパク質は、これらの新規化合物と特異的に免疫反応する抗体を生成するために使用され得る。これらの抗体は、種々の診断および治療適用に有用である。
【００６９】
抗体は、一般的に、ウサギ、マウス、ヒツジ、あるいはラットのような哺乳動物での標準免疫プロトコールによって調製され、そして抗体は、十分な免疫を確実にするためにポリクローナル抗血清として力価測定される。次に、ポリクローナル抗血清は、例えば、イムノアッセイでの使用のために、採取される。宿主からの抗体分泌細胞、例えば、脾細胞または末梢血白血球は、公知の方法によって不死化され得、そして本発明のタンパク質に免疫特異性であるモノクローナル抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。「抗体」は、必要とされる免疫特異性を維持する任意のフラグメント（例えば、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、Ｆvなど）を包含する。従って、この抗体はまた、組換え技術（代表的には、少なくとも適切な特異性を有するモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を単離すること、および適切な発現系を構築することによる）を用いて調製され得る。このアプローチは、Ｆv形態、キメラ形態、「ヒト化」形態などの産生のような任意の所望の改変を可能にする。
【００７０】
「本発明のタンパク質に免疫特異的な」によって、本発明の参照化合物を特異的に結合するが、ヘテロダイマーにも、含まれるサブユニット自体または任意の単鎖形態（これは、親和性または非親和性を決定するために考慮される一般的なパラメーター内で単一のβサブユニットのみを含む）のいずれにも結合しない抗体を意味する。特異性とは、相対的な用語であって、１００倍以上の特異的結合の差異のような、任意の限定が選択され得ることが理解される。従って、本発明内に包含される免疫特異的抗体は、単鎖タンパク質に対し、対応のヘテロダイマーである従来技術の単鎖形態または別個のサブユニットに対するよりも、少なくとも１００倍反応性である。このような抗体は、例えば、本発明の化合物を結合するものについてスクリーニングすること、およびヘテロダイマー、サブユニットまたはＷＯ９５／２２３４０およびＷＯ９６／０５２２４に記載される従来技術の単鎖形態にも結合するものを捨てることによって入手され得る。
【００７１】
（処方および使用方法）
本発明のタンパク質は、それらに対応するヘテロダイマーについて公知である方法と同様の方法によって、処方および投与され得る。従って、処方および投与方法は、使用される特定のホルモンまたは使用されるホルモンの組み合わせに従って変動する。しかし、用量レベルおよび投与頻度は、特にＣＴＰユニットがその存在に起因して延長される生物学的半減期を考慮して存在するときには、ヘテロダイマーに比較して変化され得る。
【００７２】
本発明のタンパク質の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ、  ＰＡ中に見出されるような、タンパク質またはペプチド薬物に代表的な処方である。一般的に、タンパク質は、注射、代表的には静脈内、筋肉内、皮下、もしくは腹腔内注射により、または経粘膜もしくは経皮送達のための処方を用いて、投与される。これらの処方物は一般的に、界面活性剤あるいは浸透剤（例えば、胆汁酸塩、フシジン酸など）を含有する。これらの処方物はエアロゾルあるいは坐薬、あるいは経皮投与の場合には、皮膚パッチの形態で投与され得る。経口投与もまた、その処方物が消化系における分解から本発明のペプチドを保護する限り可能である。
【００７３】
投与レジメおよび処方の最適化は、当該分野での慣用様式および一般的に実施されているように実行される。これらの処方物はまた、動物用途について適切なものに含まれるように改変され得る。
【００７４】
本発明の化合物は、多数の方法において、最も顕著には、ホルモンのヘテロダイマーの形態についての代用物として、使用され得る。従って、ヘテロダイマーのように、本発明の単鎖ホルモンのアゴニスト形態は、不妊症の処置において、インビトロ受精技術およびネイティブホルモンに関連する他の治療方法の補助として、使用され得る。これらの技術は、ヒトおよび他の動物に対して適用可能である。その種誘導化を考慮した単鎖抗体の選択は、当然に、その方法が適用される被験体に依存する。２つの異なるβサブユニットを含むそれらの化合物に与えられる二重機能性が、これまで利用不可能であった治療についての機会を付与する。
【００７５】
本発明の化合物はまた、ヘテロダイマーに関して使用されるものと類似した様式において試薬として有用である。
【００７６】
さらに、本発明の化合物は，生物学的サンプル中でそのような抗体がこれらの単鎖化合物の関連部分に結合する程度に、ネイティブタンパク質に結合する抗体の存在または非存在を検出するための診断ツールとして使用され得る。  これらはまた、種々のサンプルにおいてこれらのホルモンのレベルを評価するためのアッセイキットにおいてコントロール試薬として有用である。ホルモン自体のレベルまたはそれらに対して惹起された抗体のレベルを評価するためのプロトコルは、当該分野で一般に公知の標準的な免疫アッセイプロトコルである。種々の競合的アッセイ方法および直接的なアッセイ方法が使用され、これは、放射性同位体標識，蛍光標識，酵素標識などを含む種々の標識技術を含む。
【００７７】
本発明の化合物はまた、ネイティブのホルモンが結合するレセプターを検出することおよび精製することにおいて有用である。従って、本発明の化合物は固体支持体に結合され得、そしてレセプターまたは抗ホルモン抗体のアフィニティークロマトグラフィー調製において使用され得る。得られたレセプター自体は、治療剤候補および試薬候補についてのスクリーニング試験において候補薬物についてホルモン活性を評価するにおいて有用である。当然、量は、βサブユニットが異なる場合、任意のこれらの化合物におけるβサブユニットの二重特異性を考慮しなければならない。しかし、２つのサブユニットが同一である場合、それらは、関連レセプターについての強力なアフィニティー精製ツールを提供する。
【００７８】
最後に、本発明の化合物と独特に反応する抗体は、次の調製においてこれらの物質を単離するための、精製手段として使用され得る。それらもまた、薬物として投与されたこれらの化合物のレベルをモニターするのに使用され得る。
【００７９】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図するが、限定することは意図しない。
【００８０】
（実施例１）
（ＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨβの調製）
標記の化合物をコードするヌクレオチド配列を、そのサブユニットの関連部分について利用可能なヌクレオチド配列を用いて調製した。ＣＧβ領域は、ヒトＣＧβの１４５アミノ酸をコードし；αサブユニットコードヌクレオチド配列は、ミニ遺伝子としてヒトαの９２アミノ酸をコードし；ＣＴＰコード配列は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの１１８位〜１４５位を表す２８のアミノ酸をコードし；そしてＦＳＨβコード領域は、ヒトＦＳＨβサブユニットの１１１アミノ酸をコードする。
【００８１】
ＣＧβのエキソン３、αミニ遺伝子、ＣＴＰおよびβＦＳＨを含む増幅されたフラグメントを、ｐＭ2に由来し、そしてＣＧβエキソン１および２をＳａｃｈａｉｓ、β  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９３）  ２６８：２３１９に記載される様式で含む発現ベクターであるｐＭ2ＨＡ−ＣＧβｅｘｏｎ１，２のＳａｌＩ部位に、挿入した。ＣＧβエキソン１および２を含むｐＭ2は、Ｍａｔｚｕｋ、Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：６３５４−６３５８およびＭａｔｚｕｋ、Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８８）１０６：１０４９−１０５９に記載される。第一に、ＣＧβエキソン３の下流にαミニ遺伝子を含むフラグメントを、このベクターに挿入して、ｐＭ2−ＨＡＣＧβαを得た。次いで、ｐＭ2−ＨＡＣＧβαをＳａｃＩで切断し、そしてＳａｌＩ制限したｐＢＩＩＫＳ（＋）α−ＣＴＰ−ＦＳＨと連結した。得られた発現ベクターｐＭ2−ＨＡＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨは、適切な宿主に挿入される場合、標記化合物を産生する。
【００８２】
（実施例２）
（ＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨβの産生および活性）
実施例１において構築した発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトし、そしてそのタンパク質の産生を、ＳＤＳゲル上で放射標識したタンパク質の免疫沈降によって評価した。
【００８３】
培養培地を採取し、濃縮し、そしてヒトＬＨレセプター（βＣＧ−α部分を結合すると予測される）への結合について試験した。
【００８４】
このアッセイのために、ＬＨレセプターを、ヒトＬＨレセプターの全体をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＭＸに挿入することによって調製した（Ｏｉｋａｗａ、Ｊ．Ｘ−Ｃ．ら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９１）５：７５９−７６８）。対数増殖期の２９３細胞をこのベクターでＣｈｅｎ、Ｃ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８７）７：２７４５−２７５２の方法を用いてトランスフェクトし、表面上でのＬＨレセプターの発現を生じた。
【００８５】
このアッセイにおいて、ヒトＬＨレセプターを発現する細胞（２×１０5／チューブ）を、１ｎｇの標識ｈＣＧとともに、漸増濃度の非標識ｈＣＧまたは漸増濃度の試験されるサンプルとの競合において、２２℃で１８時間インキュベートした。サンプルの存在下での標識の減少は、そのサンプルにおける結合能力を測定する。このアッセイにおいて、２９３細胞におけるヒトＬＨレセプターに関して、ヘテロダイマー性ｈＣＧは、以前に決定したような野生型に代表的な活性を有し、そしてＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨβ含有培地もまた、活性を示した。これらの結果を図１に示す。示すように、ヘテロダイマー性（黒四角）ｈＣＧおよび本発明の二機能性単鎖タンパク質（黒丸）の両方は、ＬＨレセプターについて、標識ｈＣＧと首尾よく競合した。二機能性化合物は、αサブユニットのカルボキシ末端の改変に起因してあまり強力ではない。
【００８６】
図１にはまた、このアッセイの結果が示され、ここで、２つの発現系を含むように改変された細胞由来の培養上清の種々の量が試験された。１つの発現系は、単鎖ＦＳＨβ−αを産生し；他方はｈＣＧのβサブユニットを産生した。得られた非共有結合単鎖ＦＳＨα−β／ＣＧβ複合体（黒三角）もまた、結合について首尾よく競合した。
【００８７】
類似の様式において、ＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨβを含む培養培地由来の上清を、２９３細胞において発現されたＦＳＨに対するレセプターへの結合について試験した。このアッセイを、ヒトＦＳＨレセプターを発現する細胞を、ヒトＬＨレセプターを発現する細胞に代え、そして標識したＦＳＨを競合物として使用したこと以外は上記に記載の様式において実施した。このアッセイの結果を、図２に示す。
【００８８】
示すように、単鎖の標記化合物（黒丸）は、結合についてＦＳＨ（黒四角）と首尾よく競合した。また図２において示す無関連の実験において、異なる型の複合体の混合物（すなわち、ＣＧβと非共有結合したする単鎖ＦＳＨβ−α）（これは、複合体化していない過剰の単鎖ＦＳＨβ−αと混合されている）（黒三角）は、卓越した競合物であった。
【００８９】
（実施例３）
（さらなる発現ベクターの構築）
実施例１に示される様式と類似した様式において、単鎖の二機能性ＦＳＨβ−ＣＴＰ−α−ＣＧβの産生についての発現ベクター；α−ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＧ−β、ＣＧβ−βＦＳＨ−ＣＴＰ−α、およびβＬＨ−ＣＴＰ−βＦＳＨ−ＣＴＰ−αを調製し、そしてＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。この培養上清を、ＬＨレセプターおよびＦＳＨレセプターの両方に関して上記に記載のように培養し、そして試験する。これらの化合物もまた、両方のレセプターに結合する能力を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＬＨレセプターに対する、化合物ＣＧβ−α−ＣＴＰ−ＦＳＨβの、ｈＣＧと競合した、結合を示す。
【図２】  図２は、ＦＳＨレセプターに対する、図１に示される化合物の、ＦＳＨと競合した、結合を示す。
【図１】
0004255618.tif 000003
【図２】
0004255618.tif 000004