(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｉｒｕｍ）、
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、
エルビニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、
ロドコッカス・ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、
クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、
シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、
クリプトコッカス・アルビドゥス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ  ｖａｒ．ａｌｂｉｄｕｓ）、
トリコスポロン・グラシル（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｇｒａｃｉｌｅ）、
ロドスポリジウム・ジオボヴァツム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ）、
スポロブロマイセス・サーモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、
トレメラ・フォリアセア（Ｔｒｅｍｅｌａ  ｆｏｌｉａｃｅａ）、
トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ステリグマトマイセス・エルヴィアエ（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｖｉａｅ）、および
ロドトルラ・インゲニオサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）
から選ばれるいずれかに属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を含む溶液中に添加して、ジペプチドを生成せしめる、ジペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記Ｌ−アミノ酸アミドは、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸−α−アミドからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項４】
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを生成せしめる工程を含み、
前記酵素が、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質である、ジペプチドの製造方法。
（Ａ）アミノ酸配列が配列表の配列番号５に記載の配列からなるタンパク質
（Ｂ）アミノ酸配列が、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）のタンパク質からなる群から選ばれる１種または２種以上のタンパク質を発現する形質転換された微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を、前記Ｌ−アミノ酸アミドおよび前記Ｌ−アミノ酸を含む溶液中に添加して酵素反応を行う、請求項４に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸アミドは、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸−α−アミドからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求の範囲第４項から第６項のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ安価にジペプチドを製造する方法に関し、より詳細には、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを製造する方法、当該ジペプチドの製造方法に使用するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼおよびその製造方法に関する。
背景技術
ジペプチドは、医薬品素材、機能性食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは無血清培地の成分として有用であり、Ｌ−グルタミンに比べ安定で、水溶性も高いことから輸液成分に用いられる。
ジペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは中間体の合成が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。
また、微生物酵素系を用いたジペプチドの製造法としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンのメチルエステルを用いる方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、アスパラギン酸アミドとフェニルアラニンのメチルエステルを用いる方法（特開平１０−１３６９９２号公報）が知られている。その他、酵素的プロセスによってジペプチドを生産する方法としてＥＰＡ０２７８７８７、ＷＯ９０／０１５５５が知られている。
しかしながら、いずれの微生物酵素系においても、出発物質として保護基のついたアミノ酸を用いる必要があり、比較的安価に入手可能な原料を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明は、比較的安価に入手可能な出発原料を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、ある種の微生物が、比較的安価に入手可能なＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
〔２〕  前記酵素または酵素含有物が、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔３〕  前記微生物は、バチルス属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、シュードモナス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属またはロドトルラ属に属することを特徴とする上記〔２〕に記載のジペプチドの製造方法。
〔４〕  前記酵素が、下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質。
〔５〕  前記酵素が、下記（Ｃ）のＤＮＡでコードされるタンパク質である、上記〔１〕に記載のジペプチドの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔６〕  前記微生物が、下記（Ａ）（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質を発現可能に形質転換された微生物である、上記〔２〕に記載のジペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
〔７〕  前記Ｌ−アミノ酸アミドは、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸−α−アミドからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
〔８〕  前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載のジペプチドの製造方法。
〔９〕  エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属またはロドトルラ属に属する微生物から得られ、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒することを特徴とするＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ。
〔１０〕  エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属またはロドトルラ属に属する微生物を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを蓄積させることを特徴とするＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの製造方法。
〔１１〕  下記（Ａ）（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質を発現可能に形質転換された微生物を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを蓄積させることを特徴とするＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質
発明を実施するための最良の形態
本発明のジペプチドの製造方法は、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物、具体的には、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または、該微生物の菌体処理物を用いることを特徴とする。本発明のジペプチドの製造方法における反応は下記反応式により表される。下記化学式に例示されるように、本明細書において「ジペプチド」とは、ペプチド結合を１つ有するペプチドポリマーのことをいう。
0004289151.tif 000002
（Ｒ１はＬ−アミノ酸アミドのアミノ酸側鎖を、Ｒ２はＬ−アミノ酸のアミノ酸側鎖を表す。）
アミノ酸アミドは、市販品として比較的安価に入手可能な化合物である。アミノ酸アミドと無保護アミノ酸を出発原料として用いる本発明の方法は、従来にはない全く新しいジペプチドの製造方法であり、医薬品素材、機能性食品として有用なジペプチドをより安価に提供することを可能とするものである。
以下、本発明のジペプチドの製造方法を、
〔Ｉ〕Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
〔ＩＩ〕Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの性質
〔ＩＩＩ〕Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔ＩＶ〕ジペプチドの製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
〔Ｉ〕Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
本発明に使用する微生物としては、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物としてはバチルス属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、ロドコッカス属、クリセオバクテリウム属、ミクロコッカス属、シュードモナス属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、スポロブロマイセス属、トレメラ属、トルラスポラ属、ステリグマトマイセス属、ロドトルラ属に属する微生物を挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
バチルス・メガテリウム  ＡＪ３２８４      ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９０
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｉｒｕｍ）
コリネバクテリウム・グルタミカム          ＡＴＣＣ１３２８６
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
エルビニア・カロトボーラ  ＡＪ２７１９    ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８９
（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）
ロドコッカス・ロドクロス                  ＡＴＣＣ１９１４９
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム  ＡＴＣＣ１３２５３
（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）
ミクロコッカス・ルテウス                  ＡＴＣＣ９３４１
（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）
シュードモナス・サッカロフィラ            ＡＴＣＣ１５９４６
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）
クリプトコッカス・アルビドゥス            ＩＦＯ０３７８
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ  ｖａｒ．ａｌｂｉｄｕｓ）
トリコスポロン・グラシル                  ＡＴＣＣ２４６６０
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｇｒａｃｉｌｅ）
ロドスポリジウム・ジオボヴァツム          ＡＴＣＣ２２２６４
（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ）
スポロブロマイセス・サーモニカラー        ＩＦＯ１０３８
（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）
トレメラ・フォリアセア                    ＩＦＯ９２９７
（Ｔｒｅｍｅｌａ  ｆｏｌｉａｃｅａ）
トルラスポラ・デルブレッキイ              ＩＦＯ１０８３
（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）
ステリグマトマイセス・エルヴィアエ        ＩＦＯ１８４３
（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｖｉａｅ）
ロドトルラ・インゲニオサ                  ＡＴＣＣ２２９９３
（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）
上記微生物の寄託機関は次のとおりである。
独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）
財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ（ＩＦＯ）、日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｐ．Ｏ．ＢＯＸ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）
なお、バチルス・メガテリウム  ＡＪ３２８４株は、２００１年７月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ１８４２１が付与され、さらに平成１４年６月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０９０が付与された微生物である。また、エルビニア・カロトボーラ  ＡＪ２７１９株は、２００１年７月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ１８４２０が付与され、さらに平成１４年６月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８９が付与された微生物である。
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培地には、更にＬ−アミノ酸アミドを添加することにより、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性の高い菌体が得られる場合がある。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度２０〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
〔ＩＩ〕Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの性質
つぎに、上記微生物のうち、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株を例として、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する酵素として精製されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの性質について説明する。
当該Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、Ｌ−アミノ酸アミドを加水分解し、Ｌ−アミノ酸を生成する活性、および、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とを基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。Ｌ−アラニンアミドとＬ−グルタミンとを原料（基質）とする場合を例に取ると、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、少なくともＬ−アラニンアミドを加水分解しＬ−アラニンを生成する活性、Ｌ−アラニンアミドとＬ−グルタミンとを基質としＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する。また、Ｌ−アラニンアミドとＬ−アスパラギンとを原料とする場合を例に取ると、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、少なくともＬ−アラニンアミドを加水分解しＬ−アラニンを生成する活性、Ｌ−アラニンアミドとＬ−アスパラギンとを基質としＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンを生成する活性を有する。
作用としては、Ｌ−アラニンアミドと、Ｌ−グルタミンまたはＬ−アスパラギンを原料とする場合を例に取ると、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、Ｌ−アラニンアミド１分子を加水分解して、Ｌ−アラニン１分子とアンモニア１分子を生成、Ｌ−アラニンアミド１分子とＬ−グルタミン１分子からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン１分子とアンモニア１分子を生成、Ｌ−アラニンアミド１分子とＬ−アスパラギン１分子からＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギン１分子とアンモニア１分子を生成する。
至適ｐＨは６．０から１０．０付近にあり、至適温度は３０から５０℃付近にある。サブユニットの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって４２，０００〜４６，０００と算出される。
〔ＩＩＩ〕Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等。
本発明で用いられる、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する反応を触媒する酵素または酵素含有物は、当該酵素を有する上記の微生物群から遺伝子工学的な手法を用いて、当該酵素をコードするＤＮＡ単離し、形質転換体を作製することによっても得ることができる。
一例として、コリネバクテリウム  グルタミカムから単離されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ〔ＩＩＩ−１〕およびこれを導入した形質転換体〔ＩＩＩ−２〕について説明する。
〔ＩＩＩ−１〕ＤＮＡの単離
はじめに、精製されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２７（１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼについて、Ｎ末端、あるいは、リジルエンドペプチダーゼ等の処理により得られたペプチドの約１０から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９（１９８１）に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法で染色体ＤＮＡからＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡを増幅することができる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡ全長を遺伝子ライブラリーから単離する。
あるいは、遺伝子の塩基配列の一部が既知である場合には、その既知配列を有するＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を染色体遺伝子ライブラリーから単離することができる。
さらに、遺伝子の塩基配列が既知配列と相同性を有する場合には、その既知配列を有するＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を染色体遺伝子ライブラリーから単離することができる。
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
単離されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。このようにしてコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から単離されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡを配列表配列番号４に示す。配列表配列番号４の塩基配列のうち塩基番号５７〜１２９５からなる塩基配列がＣＤＳ（コード領域）である（本明細書において、「配列番号４に記載の塩基配列」とは、特に断らない限りＣＤＳ部分を指す）。なお、配列番号４に記載のアミノ酸アミドハイドロラーゼは、もともとアラニンアミドハイドロラーゼ活性を指標に精製された酵素に基づいて遺伝子を単離したものであるが、その基質特異性はアラニンアミドに限らず非常に幅広いためアミノ酸アミドハイドロラーゼという。
本発明で用い得るＤＮＡは、配列表配列番号４で特定されるＤＮＡのみではない。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から単離された配列表配列番号４のＤＮＡについていえば、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株の染色体ＤＮＡから単離されたＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Ｍｅｔｈｏｄ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４（１９８７）に記載されている部位特異的変異導入法がある。
また、配列表配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いることができるＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの活性については既に上記にて説明したとおりである。ただし、配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％、好ましくは５０％程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡがコードするＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼと実質的に同一のタンパク質も本発明で用いることができる。したがって、「配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡも本発明において用いることができる。ここで「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの活性については、既に説明した通りである。ただし、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％、好ましくは５０％程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
上記のように、例えばコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株に由来するＤＮＡを単離した場合、本発明では下記のＤＮＡを好適に用いることができる。
（ｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｉｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｖ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔ＩＩＩ−２〕形質転換体の作製
次に、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
本発明の方法で用いることができる形質転換体としては、例えば下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）などのタンパク質を発現することができる形質転換体が好適なものとして挙げられる。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
上記（Ａ）〜（Ｃ）のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記〔ＩＩＩ−１〕の欄に示した（ｉ）〜（ｉｖ）のＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のＤＮＡを宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌などの腸内細菌、好ましくはエシェリヒア  コリが用いられる。大腸菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを製造する方法の一形態を説明する。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを融合タンパク質封入体として生産させるためには、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、および場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えばエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号４に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼが生産される。
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの文献に記載された手法に準拠して実施することができる。
〔ＩＶ〕ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物、より具体的には、微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、または、該微生物の菌体処理物を用いて、Ｌ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを製造するものである。
上記Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、Ｌ−アミノ酸アミドを加水分解してＬ−アミノ酸を生成する活性を有するとともに、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸を基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。
第１図は、本発明のジペプチドの製造方法のフローチャートである。
先ず、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを生成蓄積させる（ステップＳ１）。
次に、Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを回収・精製することによって精製Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを製造する（ステップＳ２）。
続いて、ステップＳ２で生産した精製Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼまたはステップＳ１で蓄積したＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼにＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を添加して反応を進行させることでジペプチドを大量に製造することができる（ステップＳ３）。
上記微生物の産生するＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼをＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸に作用せしめる方法としては、上記微生物を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、微生物培養物から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を添加して反応させてもよい。あるいは、ポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができる。
また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体を用いてもよい。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
さらに、当該微生物菌体処理物からＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、必要に応じて、酵素を精製して用いてもよい。培養物からの精製法としては通常の酵素精製法をもちいることができる。具体的には遠心分離等によって菌体を集め、超音波処理、ガラスビーズ、ダイノミルなどの機械的方法によって菌体を破砕し、細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵素を得て、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を行うことによって上述のＬ−アラニンアミドハイドロラーゼが精製される。
すなわち、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化物を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄菌体を用いる場合は反応液１リットル当たり１〜５００ｇである。
Ｌ−アミノ酸アミドとしては、当該Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの基質特異性において加水分解できるＬ−アミノ酸アミドであればいかなるものも使用でき、例えば、天然型のアミノ酸に対応したＬ−アミノ酸アミドだけでなく、非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応するＬ−アミノ酸アミドをも使用可能である。また、本発明で用いるＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、ラセミ体のアミノ酸アミドを不斉加水分解してＬ−アミノ酸を与えるため、ストレッカー法で安価に合成可能なラセミ体のアミノ酸アミドを用いることもできる。本発明においては、Ｌ−アミノ酸アミドとして好ましいものを例示すると、Ｌ−アラニンアミド、グリシンアミドおよびＬ−アスパラギン酸アミドなどが挙げられ、特に好ましくは、Ｌ−アラニンアミドなどが挙げられる。
Ｌ−アミノ酸としては、当該Ｌ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの基質特異性においてＬ−アミノ酸アミドとジペプチドを形成するものであれば特に限定なく公知のものを使用できる。Ｌ−アミノ酸として好ましいものを例示すると、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸などが挙げられ、特に好ましくはＬ−グルタミンまたはＬ−アスパラギンなどが挙げられる。
上記Ｌ−アミノ酸アミド、Ｌ−アミノ酸は、それぞれ１種を選択してジペプチドを生成させてもよいし、また２種以上を選択してジペプチドを生成させてもよい。
出発原料であるＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜２Ｍであるが、Ｌ−アミノ酸アミドに対してＬ−アミノ酸を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、必要ならば、例えば基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応の間、これらを阻害しない濃度にして逐次添加する事ができる。
反応温度は１０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応ｐＨはｐＨ２〜１２好ましくはｐＨ３〜１１である。かくして２〜４８時間程度反応を行うことにより、反応混合物中にジペプチドが生成蓄積する。ジペプチド生成反応は平衡反応であるため、効率的生産を図るために生成するジペプチド、アンモニアを分離し、反応をさらに進行させてもよい。
実施例
以下実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるＬ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンまたはＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製  ＩｎｅｒｔｓｉＬ  ＯＤＳ−２、溶離液：リン酸水溶液（ｐＨ２．１）、２．５ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム／メタノール＝１０／１、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）により行った。
（実施例１）  Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギンの製造
酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩０．５％（ｗ／ｖ）（ｐＨ７．０）の培地５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分殺菌した。これに酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩０．５％（ｗ／ｖ）、寒天２％（ｗ／ｖ）（ｐＨ７．０）を含む斜面培地で３０℃、２４時間培養した表１に示した微生物の菌体を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で２０時間振とう培養を行った。培養後、菌体を遠心分離し、培養液と等量の生理食塩水にて２回洗浄し、再び遠心分離して菌体を集め、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁し１０ｍＬとした。菌体懸濁液１ｍＬをＬ−アラニンアミド塩酸塩６２．５ｍＭ、及びＬ−アスパラギン２５０ｍＭを含む上記緩衝液４ｍＬに添加し、全量を５ｍＬとした後、３０℃にて２４時間反応をおこなった。対照実験として菌体無添加区を設定した。結果を表１に示した。
0004289151.tif 000003
（実施例２）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株からのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼの精製
酵素の力価の測定は以下のように行った。トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μｍｏｌ、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩５０μｍｏｌおよび適当量の酵素液を加え、全量が１ｍｌとなるように混合し、３０℃にて、６０分間反応させた後、リン酸水溶液（ｐＨ２．１）を４ｍｌ加え反応を停止した。生成したＬ−アラニンは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニンを生成する酵素量を１単位とした。
実施例１と同様にして、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株を８Ｌ培養し、遠心分離により菌体を集めた。以下の操作は氷上あるいは４℃にて行った。菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、０．１ｍｍ径のガラスビーズをもちいて約１０分間破砕処理を行った。ガラスビーズと菌体破砕液を分離し、２０，０００×ｇ、３０分の遠心分離にて破砕菌体片を除去し、無細胞抽出液を得た。更に２００，０００×ｇ、６０分の超遠心分離にて不溶性画分を除去し、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分に硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように添加し、２０，０００×ｇ、３０分の遠心分離によって沈殿を回収した。得られた沈殿を少量の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。この酵素液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムに供し、０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分を集め、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムに供し、同緩衝液で酵素を溶出させた。活性画分を集め、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行い、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムに供した。０．５〜０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分を集め、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、これを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＭｏｎｏＱカラムに供し、０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。こうしてＬ−アラニンアミドハイドロラーゼを電気泳動的に均一に精製した。各精製過程における総タンパク量および比活性を表２に示す。
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（実施例３）Ｌ−アラニンハイドロラーゼの分子量の評価
実施例２の方法により得られた精製酵素標品０．５μｇ相当をポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動緩衝液には０．３％（ｗ／ｖ）トリス、１．４４％（ｗ／ｖ）グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを、ポリアクリルアミドゲルはゲル濃度１０〜２０％の濃度勾配ゲル（マルチゲル１０〜２０、第一化学薬品製）、分子量マーカーはバイオラッド製プレシジョンプレステインドスタンダードをもちいた。電気泳動終了後、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によってゲルを染色し、分子量４２，０００〜４６，０００と算出される位置に均一なバンドが検出された。
（実施例４）  Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ至適ｐＨの評価
実施例２で均一に精製されたＬ−アラニンアミドハイドロラーゼをもちいて、Ｌ−アラニンアミドを加水分解し、Ｌ−アラニンを生成する反応について反応ｐＨの評価を以下のように行った。緩衝液として、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜１０．０）、および、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を２００μｍｏｌ、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩５０μｍｏｌおよび適当量の酵素液を加え、全量が１ｍｌとなるように混合し、３０℃にて、６０分間反応させ酵素活性を評価した。トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をもちいた場合の活性を１００％とした結果を第２図に示した。
（実施例５）  Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ反応温度の評価
実施例２で均一に精製されたＬ−アラニンアミドハイドロラーゼをもちいて、Ｌ−アラニンアミドを加水分解し、Ｌ−アラニンを生成する反応について反応温度の評価を以下のように行った。トリス塩酸緩衝液を２００μｍｏｌ、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩５０μｍｏｌ、および適当量の酵素液を加え、全量が１ｍｌとなるように混合し、２５、３０、４０、５０、６０℃にて、６０分間反応させ酵素活性を評価した。反応温度４０℃の場合の活性を１００％とした結果を第３図に示した。
（実施例６）  Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの製造
実施例２で均一に精製されたＬ−アラニンアミドハイドロラーゼを、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩とＬ−アスパラギン、もしくは、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩とＬ−グルタミンに作用させＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギン、もしくは、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成せしめた。Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギンを得る場合はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μｍｏｌ、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩５０μｍｏｌ、Ｌ−アスパラギン１５０μｍｏｌおよびＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性０．０８単位の酵素液を加え、全量が１ｍｌとなるように混合した。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを得る場合は、Ｌ−アスパラギン１５０μｍｏｌのかわりにＬ−グルタミン１５０μｍｏｌをもちいる以外はＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンを得る場合と同条件にて混合した。対照実験として基質のいずれか一方のみを用いるか、酵素無添加区を設定した。反応温度３０℃、１０時間反応し、目的生成物を定量した結果を表３に示した。
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（実施例７）  Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子の単離
以下、Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子の単離とＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）でのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼの発現について述べるが、菌株は、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３２８６株を用いた。遺伝子の単離、Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼの発現とも、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
１．決定アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株由来のＬ−アラニンアミドハイドロラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表配列番号１）をもとに、配列表配列番号２、３にそれぞれ示すミックスプライマーを作製した。
２．菌体の取得
コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株をＣＭ２Ｇｌｙ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ  グリセロール、１．０ｇ／ｄｌ  酵母エキス、１．０ｇ／ｄｌ  ペプトン、０．５ｇ／ｄｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／ｄｌ  寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養し菌をリフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇｌｙ液体培地を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振盪培養した。
３．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、遠心分離操作により菌体を回収した。再び、この菌体を１０ｍｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。さらに、この懸濁液に、０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。このインキュベートした溶液に、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で飽和したフェノールを等量加えて除タンパクを行った。この分離した水層に対して、等量の２−プロパノールを加えて、ＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）０．５ｍｌに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、この溶液に等量の１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で飽和したフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に等量の２４：１  クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ  ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）に溶解させた。
４．カセットＰＣＲ法によるＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
カセットＰＣＲ法によるＬ−アラニンアミドハイドロラーゼをコードする遺伝子（ａａｈ）を含むＤＮＡ分子の単離・増幅には、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いた。以下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。カセットＰＣＲ法において、プライマー１（１ｓｔ  ＰＣＲ、配列番号２）と２（２ｎｄ  ＰＣＲ、配列番号３）をプライマーとした場合に、Ｅｃｏ  ＲＩカセットとの間で約０．５ｋｂのバンド（フラグメント１）が増幅した。この断片の塩基配列を決定することにより、フラグメント１がａａｈの一部分であることを確認した。
５．遺伝子ライブラリーからのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子のクローニング
次に、ａａｈの全長取得のために、フラグメント１をプローブとしてまず、サザンハイブリダイゼーションを行った。
プローブとなるＤＮＡ断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、プロトコールに準じて３７℃で２４時間インキュベートしてプローブの標識を行った。
染色体ＤＮＡ  １μｇを各種制限酵素の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）にブロッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行い、５０℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。
その結果、Ｂｇｌ  ＩＩの切断物においては、約７ｋｂの位置にバンドが検出された。この７ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリー（１２０株）を作製した。以下定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎｙ  ａｎｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に転写し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをｂｕｆｆｅｒ中に浸し、４２℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述の標識プローブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒでの洗浄後、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてポジティブクローン１株を選抜した。
６．コリネバクテリウム  グルタミカム  ＡＴＣＣ１３２８６由来Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子の塩基配列
選抜した形質転換体が保有するプラスミドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される方法に従って調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼの３０残基のＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼをコードする遺伝子ａａｈであることを確認した。Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表配列番号４に示した。得られたＯＲＦはＧｅｎｅｔｙｘを用いて相同性を調べたところ、既知のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌由来のプロリンイミノペプチダーゼ（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）と塩基配列で５７．６％の相同性を示した。
（実施例８）  Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ａａｈをＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にａａｈを連結したプラスミドｐＵＣＡＡＨを構築した。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株染色体ＤＮＡを鋳型とし、表４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＳａｃ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉで処理し、ｐＵＣ１８のＳａｃ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＵＣＡＡＨと命名した。
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ｐＵＣＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉでのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼの発現形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間、シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコに、この前培養液を１ｍｌシードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始２時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１８０Ｗ、３０分間、超音波破砕した。溶液を回収し、１２，０００ｒｐｍにて１０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
（実施例９）  Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性測定
培養終了後、無細胞抽出液を調製し、これを酵素源としてＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性の測定を行った。Ｌ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性の測定は、５０ｍＭ  Ｌ−アラニンアミド、１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素溶液を含む反応液を３０℃で６０分インキュベートした後、この反応液の４倍容のリン酸水（ｐＨ１．５）を添加することにより反応を停止させた。ＨＰＬＣにてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン量を定量することによった。酵素活性の単位として、この条件にて１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する酵素活性をもって１ユニット（Ｕ）と定義した。
分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通り。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２
移動相：（リン酸水溶液（ｐＨ２．１）），２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ−１−ｏｃｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ／ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１０／１
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
その結果、ｐＵＣ１８  ＡＡＨを導入した場合に０．０５Ｕ／ｍｇのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性が検出され、クローニングしたａａｈ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＵＣ１８のみを導入した場合には、活性は検出されなかった。
（実施例１０）  Ｈｉｓ−ＴａｇＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ａａｈをＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にＨｉｓ−ＴａｇタンパクとしてＬ−アラニンアミドハイドロラーゼを発現させるプラスミドｐＱＥＡＡＨを構築した。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＳａｃ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉで処理し、ｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ社）のＳａｃ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＱＥＡＡＨと命名した。
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ｐＱＥＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉでのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼの発現形質転換体を上記と同様の方法で活性測定したところ、０．４８Ｕ／ｍｇのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ活性を示した。
（実施例１１）  Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製酵素の調製
ｐＱＥＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の培養液１５０ｍｌから、上記の方法で菌体破砕し、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、その添付プロトコールに従ってＨｉｓ−ＴａｇＬ−アラニンアミドハイドロラーゼを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドを示すタンパクが２４ｍｇ取得され、そのＬ−アラニンアミドハイドロラーゼ比活性は１３．４Ｕ／ｍｇであった。Ａｌａ−Ｇｌｎの生成収率はＬ−アラニンアミドに対して７．２％であった。
（実施例１２）  Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製酵素を用いた基質特異性の検討
取得したＬ−アラニンアミドハイドロラーゼによる実施例６に示したＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンおよびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン以外のペプチド合成についてＨｉｓ−Ｔａｇ精製酵素を用いて検討を行った。
（１）Ｌ−アラニンアミドと他のＬ−アミノ酸からのペプチド合成
合成反応は、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンアミド、１５０ｍＭ供試アミノ酸、１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素溶液（０．００４５Ｕ／ｍｌ）を含む反応液を２５℃で３時間インキュベートし、生成したペプチドをＨＰＬＣで定量した。その結果、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギンおよびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの他にも以下の様に多くのペプチドが合成された。共試アミノ酸としてグリシンを用いた場合には、７．５４ｍＭのＬ−アラニル−グリシン、Ｌ−アラニンを用いた場合には、１０．１１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンを用いた場合には、９．７２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンを用いた場合には、９．６０ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンを用いた場合には、１４．１１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンを用いた場合には、１４．４９ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリンを用いた場合には、０．８１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニンを用いた場合には、１３．４２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンを用いた場合には、１０．０９ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリンを用いた場合には、２４．６７ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニンを用いた場合には、２０．７６ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンを用いた場合には、１．５２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−チロシン、Ｌ−リジンを用いた場合には、１８．８３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンを用いた場合には、２７．６９ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンを用いた場合には、１２．５２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン、およびＬ−グルタミン酸を用いた場合には、１．２０ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン酸が合成された。
（２）他のＬ−アミノ酸アミドとＬ−グルタミンからのペプチド合成
Ｌ−アラニンアミドに代えて、グリシンアミド、Ｌ−アスパラギン酸−α−アミドを用いて、ペプチド合成を行った。
合成反応は、１００ｍＭ供試アミノ酸アミド、１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素（０．００４５Ｕ／ｍｌ）を含む反応液を２５℃で３時間インキュベートし、生成したペプチドをＨＰＬＣで定量した。その結果、グリシンアミドを用いた場合には１７．７ｍＭのグリシル−Ｌ−グルタミンが生成した。また、Ｌ−アスパラギン酸−α−アミドを用いた場合は２１．２ｍＭのα−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−グルタミンが生成した。
以上のように、上記のようにして得られたＬ−アラニンアミドハイドロラーゼが様々な種類のＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を基質とし得ることが明らかとなった。このことから、得られた酵素はＬ−アラニンアミドハイドロラーゼというよりもＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼというほうが適切であることが判明した。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のＬ−アラニンアミドハイドロラーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのＣＤＳ配列
配列番号５：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼのアミノ酸配列
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
産業上の利用の可能性
本発明のジペプチドの製造方法により、複雑な合成方法を経ることなく、比較的安価に入手可能なＬ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸を用いてジペプチドを製造することができ、医薬品素材、機能性食品等として有用なジペプチドの製造コストダウンが可能となる。また、本発明のジペプチドの製造方法によれば、様々な種類のＬ−アミノ酸アミドおよびＬ−アミノ酸を原料として、種々のタイプのジペプチドを生成することができる。また、本発明のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼは、本発明のジペプチドの製造方法に好適に使用することができるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のジペプチドの製造工程を示すフローチャートである。
第２図は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６由来のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの至適ｐＨ曲線を示す図である。
第３図は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６由来のＬ−アミノ酸アミドハイドロラーゼの至適温度曲線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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