(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールとの混合物からなり、その混合比が１：５〜50（重量比）である骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物。
【請求項２】
前記骨誘導因子ヒトMP52が遺伝子工学的方法により産生されたものである請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項３】
骨誘導因子ヒトMP52精製物溶液に骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールの混合比が１：５〜50（重量比）となるようにマンニトールを加え、得られた混合物溶液を凍結乾燥することからなる骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物の製造方法。
【請求項４】
前記骨誘導因子ヒトMP52が遺伝子工学的方法により産生されたものである請求項３に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物およびその製法に関する。さらに詳しくは、本発明は骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールとの混合物からなる骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物およびその製法に関する。
背景技術
骨誘導因子ヒトMP52はTGF−βスーパーファミリーに属する骨形成関連因子として1994年にそのcDNAが初めて単離された（Biochem.Biophy.Res.Comm.,Vol.204,No.2,1994）。続いて遺伝子組換え技術により骨誘導活性を失うことなく骨誘導因子ヒトMP52が得られた（WO96／33215）。骨誘導因子ヒトMP52は凍結乾燥して保存されるが、保存中にその体積が減少（萎縮）し、再溶解時に粉末が凝集するという問題がある。
このような問題を解決するために、同じTGF−βスーパーファミリーに属する蛋白質であり、骨誘導因子ヒトMP52に最も近い性質を有するといわれるBMP−２においては、添加物としてアミノ酸、糖類または多価アルコールが用いられている（特表平６−508777）。そこで本発明者らは、これらの添加剤の骨誘導因子ヒトMP52への適用を試みたが上記問題を解決することはできなかった。即ち、アラニン、バリン、リジン等の中性または塩基性アミノ酸0.5〜2.5％を骨誘導因子ヒトMP52に添加して凍結乾燥しても、再溶解時に凝集が認められた。庶糖、デキストラン等の糖類0.5〜１％を同様に添加し凍結乾燥すると、凍結乾燥品に淡黄緑色の着色および萎縮が認められ、また、多価アルコールであるソルビトール0.5〜１％を同様に添加し凍結乾燥すると、凍結乾燥中に骨誘導因子ヒトMP52が溶解し、凍結乾燥品とすることができなかった。
発明の開示
本発明者らは、上記問題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、骨誘導因子ヒトMP52にマンニトールを添加して凍結乾燥すると、凍結乾燥品の保存中における着色や萎縮が認められず、再溶解時における凝集がないことを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールとの混合物からなる骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物よりなる。本発明の骨誘導因子ヒトMP52としては、WO96／33215で開示されている遺伝子工学的方法により製造された骨誘導因子ヒトMP52（以下rhMP52ということもある）が好適に使用される。マンニトールとしては日本薬局方にＤ−マンニトールとして規定されているものが好適に使用される。骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールとの混合比は１：５〜50（重量比）が好ましい。
本発明の組成物は、骨誘導因子ヒトMP52とマンニトールとの混合物溶液を常法にしたがって凍結乾燥することにより容易に製造される。詳しくは、骨誘導因子ヒトMP52精製物の塩酸溶液に所定量のマンニトールを加えて混合し、得られた混合物溶液を濾過した後、無菌バイアルに充填し、凍結乾燥することにより本発明の組成物が得られる。
本発明の組成物は、これを用時注射用蒸留水又は弱酸（pH３付近）、例えば塩酸溶液やクエン酸緩衝液等で溶解し治療上有効な量が患者に投与される。
本発明の組成物のマンニトールの好ましい配合量は安定性試験により決定した。安定性試験は日本薬局方第13局に従って作成した標準操作手順書の方法に従って行われ、試験開始時および３ヶ月後の外観の性状、溶状、電気泳動、水分含量及び６ヶ月保存後の異所性骨形成能を測定することにより行われた。
その結果、試験開始時および３ヶ月後外観において性状および溶状に変化はみられなかった。また、電気泳動の結果および水分含量の結果から、マンニトールを前記の重量比で含有する製剤はいずれも試験開始時と３ヶ月後の比較において安定であった。
凍結乾燥品の水分含量は一般的に２％以下が好ましいとされている。以上のことから骨誘導因子ヒトMP52、１mg当たりマンニトールを５〜50mg、望ましくは10mg含有する骨誘導因子ヒトMP52組成物が医薬品原体として好ましいと判断された。
さらに、マンニトールを10、25、50mg添加した骨誘導因子ヒトMP52凍結乾燥組成物を６ヶ月保存した後の異所性骨形成能について測定した。その結果、保存温度及びマンニトール添加量に拘わらずいずれも骨形成が認められた。これらの試験結果から骨誘導因子ヒトMP52にマンニトールを配合して凍結乾燥した場合、骨誘導因子ヒトMP52には何らの悪影響を与えず、長期間にわたり安定であることが確認された。
発明を実施するための最良の形態
次に、実施例を示して本発明の効果を具体的に説明する。
実施例１  rhMP52組成物の調製
WO96／33215で開示されている製造方法により得られたrhMP52精製物10mM塩酸溶液１mg／mlに日本薬局方のＤ−マンニトール10、25及び50mgを加えて混合し、混合物を濾過（0.22μmメンブランフィルター使用）後、濾液を無菌的に１mlずつバイアルに充填した。それらを凍結乾燥して医薬品原体形態の本発明の組成物を調製した。
実施例２  rhMP52組成物の安定性試験
実施例１で得られたrhMP52凍結乾燥組成物をバイアル瓶（気密、透明）容器に詰め、２〜８℃、25℃及び40℃下にそれぞれ保存した。安定性の判定は、下記判定基準に基づいて３ヶ月間それぞれ保存後に評価した。判定基準は下記のとおりである。
性  状：
（外観）：試験時と同じく、白色のケーキであり、着色のみられないものを「変化なし」と判定した。
（溶状）：注射用蒸留水１mlにとかした溶液が、無色澄明であり、凝集が認められないものを「変化なし」と判定した。
電気泳動：赤色フィルムを用いた透過によるフィルムスキャナーで画像を取り込み、各バンドのインテグレーション・オプチカル・デンシティ（Integration Optical Density：IOD）％を求め、面積百分率により主バンドの純度を算出した。
水分含量：微量水分計を用いてその水分含量を測定した。
結果は性状として、本発明の組成物は外観および溶状は変化なしであったが、rhMP52単独の凍結乾燥品では凝集が見られた。電気泳動における安定性（％）の結果はいずれも良好であった。
水分含有率（％）の結果を表１に示す。表１は水分含有率にはいずれも大きな変化がないことを示している。本発明組成物はrhMP52単独品に比較して製造時および保存後の水分含有率が低く、萎縮がおこりにくいことを示している。
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実施例３  rhMP52の異所性骨形成能
実施例１で得られたrhMP52組成物１バイアル（１mg／バイアル）を４℃および25℃でそれぞれ６ヶ月保存後、これらに注射用蒸留水１mlを加えて投与液を調製し、これらをICRマウス（日本クレア（株）より購入）に20μg／20μl筋注し、２週間後に骨形成の有無を軟Ｘ線撮影で観察した（ｎ＝２）。その結果を表２に示す。
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産業上の利用可能性
骨誘導因子ヒトMP52は凍結乾燥品が保存時に着色あるいは萎縮し、また再溶解時に凝集するという問題がある。しかるに本発明の凍結乾燥組成物においては、上記の問題点はみられない。本発明の凍結乾燥組成物中の骨誘導因子ヒトMP52は、長期保存しても安定であり、純度、水分含有率、異所性骨形成能においてほとんど変化はみられない。従って、本発明は医薬製造分野において利用可能である。