(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）に従って番号をつけたヒトＩＬ−２ムテインを含んでなり、ここで該ヒトＩＬ−２ムテインが野生型に対して位置２０、８８または１２６で置換されており、ここで位置２０における置換はイソロイシンまたはヒスチジンから選択され、位置８８における置換はアルギニン、イソロイシンまたはグリシンから選択され、そして位置１２６における置換はロイシンであり、それにより該ヒトＩＬ−２ムテインがナチュラルキラー細胞よりもＴ細胞を優先的に活性化するポリペプチド。
【請求項２】
製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて、野生型ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）に従って番号をつけたヒトＩＬ−２ムテインを含んでなり、ここで該ヒトＩＬ−２ムテインが野生型に対して位置８８でアルギニンにより置換されているポリペプチドを含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドで形質転換された原核宿主細胞。
【請求項５】
請求項３のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項６】
野生型ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）に従って番号をつけたヒトＩＬ−２ムテインを含んでなり、ここで該ヒトＩＬ−２ムテインが野生型に対して位置８８でアルギニンにより置換されているポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするＩＬ−２で処置可能な症状に悩む哺乳類を処置するための薬剤。
【請求項７】
ＩＬ−２で処置可能な症状が、ＨＩＶ、腎癌及び悪性黒色腫を包含する癌ならびに感染症よりなる群から選択される請求項６の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本願は、１９９８年５月１５日に出願された米国出願番号第０９／０８０，０８０号の一部継続出願である。
【０００２】
背景
１．発明の分野
本発明は、一般的に薬理学及び免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ｔ細胞（ＰＨＡ−芽細胞(blast)）を選択的に活性化し且つナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞の減少した活性化を有するための物質の新規な組成物に関する。これらの新規な組成物は、サイトカインファミリー、特にヒトインターロイキン−２（「ＩＬ−２」）の変異体を含む。
２．関連技術の記述
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球を包含する免疫系の様々な細胞を活性化する強力な免疫刺激薬である。ＩＬ−２はまた、Ｔ細胞の強力で且つ重要な増殖因子でもある。これらの活性に基づいて、ＩＬ−２は癌を処置するその能力に関して試験された。ヒトＩＬ−２は、転移性腎癌及び転移性黒色腫の処置のためのＦＤＡ認可薬である。適格患者におけるＩＬ−２の使用は、ＩＬ−２治療と関連する激しい毒性のために限定され；適格患者の多くても僅か２０％のみが実際に治療を受けると概算される。ＩＬ−２治療と関連するこれらの毒性には、激しい熱、悪心、嘔吐、血管漏出及び重い低血圧が包含される。しかしながら、これらの毒性にもかかわらず、ＩＬ−２はその認可された適応症に対して有効である（〜１７％の目標応答率（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ））。
【０００３】
マウスＩＬ−２の構造／機能分析は豊富であるが（Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．及びＺｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．（１９８９）Ｅｍｂｏ  Ｊ  ８：２５８３−９０；Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，（１９９０）Ｅｍｂｏ  Ｊ  ９：３８９９−９０５；Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：２５０−７；Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．及びＺｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．（１９９２）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １１：３９０５−１０；Ｚｕｒａｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２  ５１１３−５１１９（１９９３））、ヒトＩＬ−２の限られた分析のみが存在する。ヒトＩＬ−２ムテインを用いた大部分の研究はネズミ細胞に対して行われており；しかしながら、高親和性ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒαβγを発現するヒトＰＨＡ−芽細胞を用いた限られた研究が存在する。ＰＨＡ−芽細胞を用いたこれらの研究により、ヒトＩＬ−２の残基Ａｓｐ−２０及びＤ−ヘリックスの重要性が確かめられた。ヒトＩＬ−２の位置Ａｓｐ−２０及びＧｌｎ−１２６は、それぞれ、ＩＬ−２受容体β−及びγ−サブユニットとの相互作用を招く主要な残基であることが示されている（Ｔｈｅｅｚｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，４８１−４８６（１９９６）に概説される）。マウスＩＬ−２のＣ−ヘリックス中の残基はマウスＩＬ−２Ｒβとの相互作用に関与することが示されているが（Ｚｕｒａｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２  ５１１３−５１１９（１９９３））、ヒトＩＬ−２中の対応する残基は同じ特性を有することが示されていない（ヒトＩＬ−２中のこれらの残基はＡｓｐ−８４及びＡｓｎ−８８であると思われる）。ヒトとマウスのＩＬ−２間で著しい種特異性が示されるので（ヒトＩＬ−２はネズミ系において〜１００倍減少した活性を示す）、同じタイプの相互作用が種境界内で起こっているかどうかを予測することは難しい。ヒト中間親和性受容体ＩＬ−２Ｒβγのみを発現する細胞を用いるいかなる研究も知られていない。
【０００４】
いくつかのヒトＩＬ−２ムテインが、ヒトＰＨＡ芽細胞に対するそれらの活性に関して調べられている（Ｘｕ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，６，２３７−２４４（１９９５））。Ａｓｐ−２０のロイシン（Ｄ２０Ｌ）並びにアルギニン、アスパラギン及びリシンでの置換を含有するムテインは、ＰＨＡ−芽細胞の増殖を誘導するそれらの能力に重大な欠陥を有することが示された。従って、この技術は、Ａｓｐ−２０の置換が弱められた活性のムテインをもたらすことを教示する。さらに、Ｘｕ，ｅｔ  ａｌは、現在（１９９５）まで臨床または研究用途のいずれかのためにいかなる有用なＩＬ−２ムテインも同定されていないことを提示する。
【０００５】
Ｂｕｃｈｌｉ及びＣｉａｒｄｅｌｌｉ，Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，３０７（２）：４１１−４１５，（１９９３）により作製されたヒトＩＬ−２ Ｑ１２６Ｄムテインは、効能及びアゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）の両方において著しく弱められた活性を示し；ヒトＴ細胞アッセイにおいて、それはＩＬ−２より〜１，０００倍低い活性を示し、部分アゴニストとして作用した。ネズミＴ細胞アッセイにおいて、このムテインはほとんど不活性であった。試験した両方の細胞系は、ＩＬ−２受容体の高親和性型を発現した。Ｑ１２６Ｄは、ヒトＴ細胞アッセイでは部分的にのみであるが、両方の細胞タイプで、ＩＬ−２によりもたらされる活性を中和する能力を示した。
【０００６】
Ｚｈｉ−ｙｏｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２５（５）：５５８−５６０（Ｓｅｐｔ．１９９３）は、位置６２、６９、９９及び１２６でＩＬ−２に対する置換実験を行い、マウスＴ細胞アッセイ（ＣＴＬＬ−２）において、６２−Ｌｅｕ−ＩＬ−２及び１２６−Ａｓｐ−ＩＬ−２で、それぞれ、ｗｔ ＩＬ−２に比較して２０倍及び３０倍の活性の減少を示した。しかしながら、位置１２６での置換がＮＫ細胞よりＴ細胞選択的な活性を与えることができるいかなる教示もしくは示唆もなく、またはそのような変異がヒトＴ細胞に対して同様な作用を有するかどうかを示していない。
【０００７】
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：７７０９−７７１３（１９９８）は、位置２０のＡｓｐのＡｓｎ（Ｄ２０Ｎ）またはＬｙｓ（Ｄ２０Ｋ）のいずれかでの置換が高親和性受容体（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ  ａｌにおいてｐ５５／ｐ７０と呼ばれる、ＩＬ−２Ｒαβγ）及び中間親和性受容体（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ  ａｌにおいて「ｐ７０」と呼ばれる、ＩＬ−２Ｒβγ）の両方についてヒトＩＬ−２に対して〜１００ないし１，０００倍の結合の低下をもたらすことを報告した。ＩＬ−２Ｒαへの結合は、両方の突然変異体タンパク質に対して変わらないようであった。この研究は、中間親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）への結合の崩壊が、高親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）への結合の崩壊も引き起こすことを教示し、ＩＬ−２ＲβγまたはＩＬ−２Ｒαβγ間の差別結合または活性化を位置２０のＡｓｐの置換により達成できないことを示唆する。
【０００８】
Ｂｅｒｎｄｔ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（２１）：６５７１−６５７７（１９９４）は、中間親和性ＩＬ−２受容体と相互作用すると推測される天然のＩＬ−２の位置１７〜２１を同時に突然変異させるために無作為配列カセット突然変異誘発を用いた。２６１０個の評価したクローンのうち４２個のみが活性であった。位置２０及び２１が生物学的活性のために主として重要であることが見いだされた。Ｌ２１Ｖを除いて個々の置換のいかなる示唆または教示もない。
【０００９】
米国特許第５，２２９，１０９号（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ．）は、申し立てによると、免疫療法及び癌処置における使用のための低毒性ＩＬ−２類似体を開示している。（アラニンヘの）位置Ａｒｇ３８及び（リシンへの）Ｐｈｅ４２での置換を有する２つのＩＬ−２類似体の特性が分析され、天然のＩＬ−２のものに比較された。これらの類似体は、いわゆる「高親和性」受容体に最低限だけ結合しながら、中間ＩＬ−２受容体に結合するそれらの能力を維持できることが見いだされた。この時点で、中間親和性受容体はｐ７５（ＩＬ−２Ｒβ）のみからなると考えられ、そして高親和性受容体はｐ５５＋ｐ７５受容体複合体（ＩＬ−２Ｒαβ）のみからなると考えられた。これらの類似体はまた、末梢血単核細胞を刺激してリンホカイン活性化致死（ｋｉｌｌｉｎｇ）（ＬＡＫ）を引き起こすそれらの能力も維持した。注目すべきことに、ＩＬ−１β及びＴＮＦα分泌は、天然のＩＬ−２分子と比較した場合に、これらの類似体に応答して著しく減少した。この特許に記述されるアミノ酸残基はＩＬ−２Ｒα（ｐ５５）と特異的に相互作用すると思われるものであり；ＩＬ−２Ｒαとの相互作用の排除は高親和性ＩＬ−２受容体保有細胞に対する減少した活性をもたらし、そして中間親和性ＩＬ−２受容体保有細胞に対する活性に影響を及ぼさないと思われる。従って、（ＮＫ細胞に由来すると考えられる）ＬＡＫ細胞の生成は維持されるはずである。本明細書に記述するムテインはアミノ酸残基位置２０、８８及び１２６に関し；これらの位置はＩＬ−２Ｒβ（ｐ７５；位置２０及び８８）及びＩＬ−２Ｒγ（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ特許の出願時には知られていない；位置１２６）と特異的に相互作用すると考えられる。その結果、ＩＬ−２Ｒαとの相互作用は変わらないままである。機械論的に、Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌにより記述されたムテインは、ＩＬ−２高親和性受容体との減少した相互作用を有するが、ＩＬ−２中間親和性受容体に対するいかなる作用ももたないはずであり；本明細書に記述するムテインは反対の特性をもち、ＩＬ−２中間親和性受容体ＩＬ−２Ｒβγと相互作用するそれらの能力に顕著な欠陥をもち、そしてＩＬ−２高親和性受容体ＩＬ−２Ｒαβγとの機能的相互作用にはほとんどまたは全く欠陥を示さない。
【００１０】
米国特許第５，２０６，３４４号（Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）は、ＩＬ−２の成熟天然配列のアミノ酸の一つがシステイン残基で置換されているＩＬ−２のムテインを開示しており、それらは次に製造され、この置換されたシステイン残基を介してポリエチレングリコールホモポリマーまたはポリオキシエチル化ポリオールから選択されるポリマーに結合され、ここで、これらのホモポリマーは置換されていないかまたは一方の末端でアルキル基で置換されている。これらのムテインは、部位特異的突然変異誘発により親タンパク質の遺伝子から改変されているムテインをコードする突然変異体遺伝子の宿主発現により製造される。さらに、ＩＬ−２の生物学的活性のために必要ではない成熟ＩＬ−２タンパク質の位置１２５のシステイン残基を介してＩＬ−２の他の種類を結合することができる。減少した毒性を与える突然変異のいかなる開示もない。
【００１１】
米国特許第４，９５９，３１４号（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）は、分子間架橋または不適当な分子内ジスルフィド架橋形成の部位を除くために生物学的活性に必須ではないシステイン残基が削除されているかまたは他のアミノ酸で置換されているＩＦＮ−β及びＩＬ−２のような生物学的に活性のあるタンパク質のムテインを開示している。これらのムテインは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により親タンパク質の遺伝子から合成されたムテインをコードする突然変異体遺伝子の細菌発現により製造される。減少した毒性を与える突然変異のいかなる開示もない。
【００１２】
米国特許第５，１１６，９４３号（Ｈａｌｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）は、クロラミンＴまたは過酸化物酸化を受けやすい各メチオニル残基を保存的アミノ酸で置換することを含む方法により生物学的に活性のある対照治療タンパク質が酸化から保護されることを開示しており、ここで、さらなる非感受性メチオニル残基はそのように置換されない。このようにして製造される酸化抵抗性ムテインは好ましくはインターロイキン−２またはインターフェロン−βのヒトムテインであり、そして保存的アミノ酸は最も好ましくはアラニンである。減少した毒性を与える突然変異のいかなる開示もない。
【００１３】
米国特許第４，８５３，３３２号（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）は、分子間架橋または不適当な分子内ジスルフィド架橋形成の部位を除くために生物学的活性に必須ではないシステイン残基が削除されているかまたは他のアミノ酸で置換されているＩＦＮ−γ及びＩＬ−２ムテインに関する。この特許は、セリンへのシステイン１２５でのＩＬ−２における置換が天然のＩＬ−２に匹敵する活性を有するムテインをもたらすことを開示している。
【００１４】
米国特許第５，６９６，２３４号（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）は、哺乳類サイトカインのムテイン並びに哺乳類サイトカインのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。特に、ヒトＩＬ−２二重ムテインＰ８２Ａ／Ｑ１２６Ｄは、ヒトα及びβ ＩＬ−２Ｒサブユニットを共トランスフェクトしたネズミＢａｆ３細胞に対するアンタゴニスト活性を有するとして示される。ほんのわずかなアゴニスト活性が示される。また、ネズミＩＬ−２ムテイン、特にＱ１４１Ｄ、Ｑ１４１Ｋ、Ｑ１４１Ｖ及びＱ１４１Ｌが、ＨＴ２細胞に対する部分アゴニスト及びアンタゴニスト活性を示すことも示される。位置２０、８８及び１２６での突然変異に関する選択的アゴニスト作用を示すかまたは示唆するいかなるムテイン活性も記述されていない。
【００１５】
Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩＬ−２Ｒαβγを発現する細胞に対して活性があるが、ＩＬ−２Ｒβγを発現する細胞に対しては不活性であるという特性を有するネズミＩＬ−２ムテインを記述している（Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２５０−２５７（１９９１）；Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．及びＺｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．Ｅｍｂｏ．Ｊ．１１：３９０５−３９１０（１９９２））。これらの特性を示したネズミＩＬ−２ムテインは、ＳｅｒまたはＴｈｒへのＡｓｐ−３４及びＬｙｓへのＧｌｎ−１４１の置換を有した。マウスＩＬ−２のＡｓｐ−３４及びＧｌｎ−１４１は、それぞれ、ヒトＩＬ−２のＡｓｐ−２０及びＧｌｎ−１４１に相当すると思われる。これらの参考文献は、「選択的アゴニスト」ＩＬ−２ムテインに触れているが、それらの潜在能力を毒性が低いとして記述しておらず、むしろ内因性ＩＬ−２の可能性があるアンタゴニストとして記述している。
【００１６】
ＥＰ ０２６７ ７９５  Ａ２（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）は、生物学的に適当である最初の３０個のＮ末端アミノ酸残基内に欠失及び／または置換を含有するいくつかを包含する、配列の全体にわたる様々なマウスＩＬ−２ムテインを開示しているが、同等なマウスＩＬ−２残基での本明細書に開示するアミノ酸置換を包まず、説明せずまたは示唆していない。減少した毒性を有し、そしてより一般的に許容される改善されたＩＬ−２分子の必要性がある。
【００１７】
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国４，７３８，９２７は、ＩＬ−２の生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ、ここで、該活性は細胞傷害性Ｔリンパ球細胞系の増殖の促進である、及び原核または真核細胞中で増えることができ、該遺伝子のコーディング配列がプロモーター配列の下流の位置に配置されているベクターＤＮＡに関し、ここで、該ポリペプチドはポリペプチドのアミノ酸配列中に全部で１３２〜１３４アミノ酸を有する。それはまた、天然のＩＬ−２を組換え的に製造する遺伝子、組換えＤＮＡベクター、宿主細胞及び方法も記述している。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．は、いかなる変異体またはムテインも記述しておらず、そしてタンパク質中のどの位置がシグナリングまたは結合活性を招くかを教示していない。
【００１８】
先行技術の組換えＩＬ−２ムテインの用量を限定する毒性を示さないＩＬ−２ムテインが、このサイトカインの潜在能力を治療的に利用するために必要とされることは明らかである。
【００１９】
本発明の要約
本発明は、野生型ＩＬ−２に従って番号をつけたヒトＩＬ−２ムテインを含んでなるポリペプチドに関し、ここで、該ヒトＩＬ−２が位置２０、８８または１２６の少なくとも１つで置換されており、それにより該ムテインがＮＫ細胞よりＴ細胞を優先的に活性化する。本発明は、このインターロイキンのより大きい治療用途を可能にする毒性のより低いＩＬ−２ムテインを実現させる。
【００２０】
さらに、本発明は、位置アスパルテート２０、アスパラギン８８及びグルタミン１２６で単一の突然変異を有するＩＬ−２ムテインに関する。特定のムテインは名称Ｄ２０Ｘ、Ｎ８８Ｘ及びＱ１２６Ｘで表され、ここで、「Ｘ」は、ヒトＩＬ−２において置換した場合に、ＩＬ−２Ｒβγ受容体を発現する細胞（例えばＮＫ細胞）に優先してＩＬ−２Ｒαβγ受容体を発現する細胞（例えばＴ細胞）に対する選択的活性を与える特定のアミノ酸である。１，０００倍より大きい選択性を示すムテインには、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｒ及びＱ１２６Ｌが包含される。特に、これらのムテインは、本質的に、Ｔ細胞に対する野生型ＩＬ−２活性も示す。また、１，０００倍未満であるが１０倍より大きい選択性を与える他の突然変異も同定される。本発明はまた、本発明のムテインをコードするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドを含有するベクター、形質転換された宿主細胞、本発明のムテインを含んでなる製薬学的組成物及び本発明のムテインを用いる治療的処置方法も包含する。
【００２１】
本発明はまた、ＩＬ−２Ｒβγと比較してＩＬ−２Ｒαβγを利用するアッセイにおける評価によりＩＬ−２ムテインを選択する方法にも関し、ここで、ＩＬ−２ムテインの活性は、一方のアッセイより優先的に他方においてｗｔ ＩＬ−２に対して増大している。ＩＬ−２Ｒαβγ及びＩＬ−２Ｒβγは適切な組み合わせの個々の受容体サブユニット外部ドメインであり、そして各受容体複合体へのＩＬ−２ムテインの結合を直接測定するために用いられる。ＩＬ−２αβγアッセイはＩＬ−２αβγ保有細胞タイプからの応答を利用し、そしてＩＬ−２βγアッセイはＩＬ−２βγ保有細胞タイプからの応答を利用する。ＩＬ−２αβγ保有細胞はＰＨＡ−芽細胞であり、そしてＩＬ−２βγ保有細胞はＮＫ細胞である。アッセイは、ＩＬ−２αβγ保有細胞タイプ及びＩＬ−２βγ保有細胞タイプの両方の増殖である。
【００２２】
本発明はまた、本発明のムテインをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターにも関し、このベクターは、ＰＨＡ−芽細胞活性化活性を有するが減少したＮＫ細胞活性化活性を有するヒトＩＬ−２ムテインの発現を導き、標的生物のトランスフェクション及び続いて起こる該ポリヌクレオチドによりコードされる該ヒトＩＬ−２ムテインのin vivo発現を可能にすることができる。
【００２３】
本発明はまた、ＰＨＡ−芽細胞活性化活性を有するが減少したＮＫ細胞活性化活性を有する、野生型ＩＬ−２に従って番号をつけたヒトＩＬ−２ムテインの治療的に有効な量を投与することによるＩＬ−２で処置可能な症状に悩む患者の処置方法にも関する。この方法は、ＩＬ−２で処置可能な症状がＨＩＶ、癌、自己免疫疾患、感染症、癌ワクチン中のワクチンアジュバント及び通常のワクチン療法、中高年層もしくはそうでなければ免疫無防備状態における並びにヒトＳＣＩＤ患者における免疫刺激のため、または免疫系の刺激を必要とする他の治療用途である場合に適用することができる。
【００２４】
好適態様の記述
Ａ．背景
Ｔ細胞に対するＩＬ−２の作用は、ＩＬ−２受容体タンパク質への結合によりもたらされる。Ｔ細胞上の異なる細胞表面タンパク質がＩＬ−２に結合する。同定される第一のものは、ＩＬ−２Ｒαと呼ばれる単一のポリペプチドであり、それはＴ細胞活性化の際に現れる５５ｋＤポリペプチド（ｐ５５）であり、最初はＴａｃ（Ｔ活性化のための）抗原と呼ばれた。ＩＬ−２Ｒαは約１０-8ＭのＫdでＩＬ−２に結合し、「低親和性」ＩＬ−２受容体としても知られている。ＩＬ−２Ｒαのみを発現する細胞へのＩＬ−２の結合は、いかなる検出可能な生物学的応答も引き起こさない。
【００２５】
第二のＩＬ−２受容体は、ＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγから成る結合複合体であり；６４ｋＤポリペプチドのＩＬ−２Ｒγは、多数のサイトカイン受容体間で共有されるので共通γ（γc）鎖としても知られている。ＩＬ−２Ｒβは約７０〜７５ｋＤであり（ｐ７０またはｐ７５と様々に呼ばれ）、２個のシステイン／ＷＳＸＷＳモチーフを特徴とするＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。ＩＬ−２Ｒβはγcと同等に発現される。ＩＬ−２ＲβγcへのＩＬ−２の結合の親和性は、約１０-9ＭのＫdを有し、ＩＬ−２Ｒαへのものより高く；「中間親和性」ＩＬ−２受容体としても知られている。ＩＬ−２はＩＬ−２Ｒβγcを発現する細胞の増殖をもたらし、最大結合の半分をもたらすものと同じ濃度のＩＬ−２（すなわち、１ｘ１０-9Ｍ）で最大増殖刺激の半分が起こる。ＩＬ−２Ｒβγcは、ＩＬ−１５に結合することができるものと同じシグナリング受容体複合体である。
【００２６】
第三の既知のＩＬ−２受容体複合体はＩＬ−２Ｒαβγc複合体である。ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒβγcの両方を発現する細胞は、約１０-11ＭのＫdを有し、ＩＬ−２にいっそう緊密に結合することができ、それ故、「高親和性」複合体としても知られている。そのような細胞の増殖刺激は同様に低いＩＬ−２濃度で起こる。ＩＬ−２結合及び増殖刺激の両方をＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβまたはγcに対する抗体により、そして最も効果的には複数の受容体サブユニットに対する抗体の組み合わせにより妨げることができる。これらの結果は、ＩＬ−２ＲαがＩＬ−２Ｒβγcと複合体を形成し、ＩＬ−２のシグナリング受容体の親和性を高め、それにより増殖シグナルを著しくより低いＩＬ−２濃度で送達できることを示唆する。ＩＬ−２はまずＩＬ−２Ｒαに迅速に結合し、これによりＩＬ−２Ｒβγcとの会合が促進されると考えられる。休止Ｔ細胞はＩＬ−２Ｒβγcを発現するが、ほんの少量のＩＬ−２Ｒαを発現し；表面に発現されるＩＬ−２Ｒαを増やすことをＩＬ−２により刺激することができる。抗原受容体によりもたらされるＴ細胞活性化の際に、ＩＬ−２Ｒαは迅速に発現され、それにより増殖刺激のために必要とされるＩＬ−２の濃度を減らす。ＩＬ−２ＲαβγcへのＩＬ−２の結合は、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナリング経路によるシグナル伝達をもたらす。
【００２７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（中間親和性ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒβγを発現する細胞）に対してＴ細胞（ＰＨＡ−芽細胞；高親和性ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒαβγを発現する細胞）を優先的に活性化するヒトＩＬ−２のムテインが見いだされた。Ａｓｐ−２０をヒスチジン（Ｄ２０Ｈ）もしくはイソロイシン（Ｄ２０Ｉ）で、Ａｓｎ−８８をアルギニン（Ｎ８８Ｒ）、グリシン（Ｎ８８Ｇ）もしくはイソロイシン（Ｎ８８Ｉ）で、またはＧｌｎ−１２６をロイシン（Ｑ１２６Ｌ）もしくはグルタメート（Ｑ１２６Ｅ）で置換するムテインは、意外にも、ＰＨＡ−芽細胞に対する完全なＩＬ−２活性を示し、そしてＮＫ細胞に対しては（たとえあったとしても）ほんのわずかな活性しか示さない。ヒトＩＬ−２ムテインの以前の研究はネズミ細胞の分析系に頼っており、ヒト細胞が用いられている場合には、（ＮＫ細胞のような）ＩＬ−２Ｒβγのみを発現する細胞を利用していない。さらに、ヒトＰＨＡ−芽細胞を利用する研究により、Ａｓｐ−２０（Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＬｙｓで；Ｘｕ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，６，２３７−２４４（１９９５））またはＧｌｎ−１２６（Ａｓｐで；Ｂｕｃｈｌｉ及びＣｉａｒｄｅｌｌｉ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，３０７（２）：４１１−４１５，（１９９３））の置換が、激しく弱められた活性を有するヒトＩＬ−２ムテインをもたらすことが示されている。ネズミＩＬ−２を用いる以前の研究により、異なる活性を有するマウスＩＬ−２ムテインが同定された（Ｚｕｒａｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２  ５１１３−５１１９（１９９３）が、これらの結果をもたらした突然変異はいずれも、本明細書に記述する研究において同定されたものを示唆していなかった。ネズミＩＬ−２ムテインと同義位置で同じ突然変異を含有するヒトＩＬ−２ムテインは同様の活性を示さず、それ故、ネズミの実施例はヒト機能性を予示しないことを示唆する。ＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒαβγを発現するヒト細胞（例えばＰＨＡ−芽細胞）への相対活性をＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒβγを発現するもの（例えばＮＫ細胞）に対して比較するヒトＩＬ−２ムテインのいかなる研究も発明者等は知らない。in vivoでの分析により、記述する本発明のムテインが毒性の減少のために野生型ヒトＩＬ−２より改善された治療指数を有し、従って、免疫系刺激を必要とする疾病の処置のために治療的に有用な化合物を提供することが確かめられると考えられる。
【００２８】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、現在、転移性腎癌の処置のために診療所において使用されている。しかしながら、その激しい毒性によりその使用はほんの一組の最も健康な患者に限定されており、そして用量を限定する毒性はその全体的な効能を弱めると考えられる。ＩＬ−２の急性毒性はＮＫ細胞の活性化によりもたらされることが提示されており、一方、その効能はＴ細胞の直接的活性化によりもたらされる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（米国），Ｓｅｐ  １７  １９９６，９３（１９）ｐ１０４０５−１０；Ｓｍｉｔｈ  ＫＡ，Ｂｌｏｏｄ  １９９３，８１（６）ｐ１４１４−２３；Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（２）ｐ１５７−６２）。Ｔ細胞は、ＮＫ細胞と異なるＩＬ−２受容体を発現する（Ｔ細胞：ＩＬ−２Ｒαβγ、高親和性ＩＬ−２受容体；ＮＫ細胞：ＩＬ−２Ｒβγ、中間親和性ＩＬ−２受容体）。本明細書に記述するヒトＩＬ−２ムテインは、Ｔ細胞ＩＬ−２受容体を選択的に活性化し、ＮＫ細胞ＩＬ−２受容体にはそうしない。
【００２９】
いくらか成功して、ＮＫ細胞を直接活性化することを回避するためにＩＬ−２での低用量治療が利用されている（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１０４０５−１０）。この方策は、低用量のＩＬ−２では、中間親和性ＩＬ−２受容体を除外して高親和性ＩＬ−２受容体のみが活性化されるという概念を導入した。ＩＬ−２受容体の中間親和性型ＩＬ−２ＲβγはＮＫ細胞上に発現され、一方、Ｔ細胞は高親和性型ＩＬ−２Ｒαβγを発現する。
【００３０】
しかしながら、本発明者等は毒性の問題に異なる角度から取り組んだ。ＩＬ−２の結合表面上の特定の結合する残基の適切な改変によるＩＬ−２Ｒβ及び／またはＩＬ−２ＲγとＩＬ−２の相互作用の崩壊により、ＩＬ−２Ｒβγのみを発現する細胞への効果的な結合（従って、活性化）は妨げられると仮定した。しかしながら、ＩＬ−２Ｒαβγを発現する細胞上では、ＩＬ−２Ｒαへの最初の結合、従ってその細胞への結合が依然として起こり、それ故、Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．により提案された低用量治療ではなお有毒な副作用が現れる可能性がある。改変されたＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβ及び／またはＩＬ−２Ｒγとの損なわれた相互作用にもかかわらず、ＩＬ−２Ｒαへの結合によって、ＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγの効果的な漸増が細胞表面上で起こることができる。従って、シグナリング能力があるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体を形成することができる。ＮＫ細胞上の中間親和性ＩＬ−２受容体よりむしろＴ細胞上の高親和性ＩＬ−２受容体を選択的に活性化することができるＩＬ−２変異体は、減少した毒性プロフィールのために野生型ＩＬ−２より増加した治療指数を有することができると考えられる。増加した治療指数を有するＩＬ−２変異体は、癌（直接及び／または補助治療として）及び免疫不全症（例えばＨＩＶ及び結核）の処置の両方において著しく広げられた範囲の用途を有する。ＩＬ−２の他の可能性がある用途は、その免疫刺激活性に由来し、癌、ＨＩＶまたはヒトＳＣＩＤ患者のような免疫不全症の直接処置に加えて；結核のような感染症；「癌ワクチン」法におけるアジュバントとして；及び標準的なワクチン接種プロトコルを強化することまたは中高年層の処置のためような免疫系刺激適用のためを含む。
【００３１】
Ａｓｐ−２０、Ａｓｎ−８８またはＧｌｎ−１２６での適切な置換は、ＩＬ−２Ｒβ（Ａｓｐ−２０及びＡｓｎ−８８）またはＩＬ−２Ｒγ（Ｇｌｎ−１２６）のいずれかに対する結合相互作用を減少した。そのような置換の最終的な結果は、ヒトＴ細胞に対する活性を保持し且つヒトＮＫ細胞に対する減少した活性を有するＩＬ−２ムテインをもたらした。
【００３２】
Ｔ及びＮＫ細胞アッセイにおける評価の前に与えられた置換の結果を予測することはできなかったので、（Ｃｙｓを除いた）全ての可能な天然のアミノ酸置換を位置Ａｓｐ−２０、Ａｓｎ−８８及びＧｌｎ−１２６で実施し、そして限られているが多様な一組の突然変異を位置Ａｓｐ−８４で実施してそれらが実際にＩＬ−２Ｒβと相互作用するかどうかを試験した。見かけのＩＬ−２Ｒβ相互作用に対する影響が認められた場合には位置Ａｓｐ−８４でさらなる突然変異を試験する。これらの位置での４６の別個の置換のデータを以下の表１に示す。
【００３３】
野生型ヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡに対する部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異を導入した。適当なクローンを異種起源の系（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、酵母または例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞）における発現のために適当な発現ベクターにサブクローン化した。精製したタンパク質をＴ細胞（ＰＨＡ−芽細胞）増殖及びＮＫ増殖アッセイにおいて試験した。これらのアッセイ間で個々のムテインにより引き起こされる異なる応答、すなわちＥＣ50により、これらの活性をもたらす突然変異が示される。詳細には、（野生型ＩＬ−２に対する）ＮＫ細胞アッセイでの応答に比較した場合に（野生型ＩＬ−２に対する）ＰＨＡ−芽細胞（Ｔ細胞）アッセイにおいて比較的より強い応答を刺激するムテインにより、これらの細胞上に発現されるＩＬ−２Ｒαβγには結合して活性化するがＩＬ−２Ｒβγのみを発現する細胞には結合することができず従って活性化しない特定のムテインの能力に基づく細胞特異性を与える置換が示唆される。従って、この特性を示すＩＬ−２ムテインは、血管漏出及び低血圧の減少したＩＬ−２治療関連毒性と共にＩＬ−２の免疫刺激特性をin vivoで保有する。
Ｂ．定義
本明細書に記述する組換えタンパク質を生産するために用いたＣＨＯ細胞系の寄託を１９９９年５月５日にＡＴＣＣ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡで行った、受託番号 。付託した株はブダペスト条約の条件下で保有されているので、ブダペスト条約に署名した特許庁はそれを入手できる。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「野生型ＩＬ−２」は、このタンパク質を大腸菌(E. coli)において細胞内画分として発現させる場合には必ず含まれる付加的なＮ末端のメチオニンを含むかまたは含まない、アミノ酸配列がＦｕｊｉｔａ，ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８０，７４３７−７４４１（１９８３）に記述されている、（付加的な２０個のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを欠いた）天然のヒトＩＬ−２の１３３個の通常存在するアミノ酸配列を有する、天然のものにせよ組換え体にせよ、ＩＬ−２を意味する。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「ＩＬ−２ムテイン」は、ヒト成熟インターロイキン−２タンパク質に対する特定の置換がなされているポリペプチドを意味する。下記表１に、作製された４６の個々の置換ＩＬ−２ムテイン及びそれらの対応する相対活性データが開示される。好ましい態様には、少なくとも１００倍の相対活性を有するムテインが包含される。特に好ましい態様には、１０００倍より大きい相対活性を示す以下のものが包含される：野生型ＩＬ−２に従って番号をつけた場合に、位置２０のアスパルテート（Ａｓｐ）残基（Ｄ）（「Ｄ２０」）がイソロイシン（「Ｄ２０Ｉ」）またはヒスチジン（「Ｄ２０Ｈ」）で置換されている；位置８８のアスパラギン残基（Ａｓｎ）（Ｎ８８）がイソロイシン（Ｎ８８Ｉ）、グリシン（Ｎ８８Ｇ）またはアルギニン（Ｎ８８Ｒ）で置換されている；そして位置１２６のグルタミン残基（Ｇｌｎ）（Ｑ１２６）がロイシン（Ｑ１２６Ｌ）またはグルタメート（Ｑ１２６Ｅ）またはアスパルテート（Ｑ１２６Ｄ）で置換されている。好ましいＩＬ−２ムテインは、他の置換されていない残基で野生型ＩＬ−２と同じアミノ酸配列を有する。しかしながら、本発明のＩＬ−２ムテインはまた、天然のＩＬ−２ポリペプチド鎖の１つもしくはそれ以上の位置または他の残基でのアミノ酸の挿入、欠失、置換及び改変を特徴としてもよい。本発明ではあらゆるそのような挿入、欠失、置換及び改変は、ＮＫ細胞を活性化する減少した能力をもちながらＰＨＡ−芽細胞選択的活性を保持するＩＬ−２ムテインをもたらすことができ、本特許の範囲内に入る。
【００３６】
上記の好ましいまたは特に好ましい置換を単一の組換えＩＬ−２分子中に組み合わせることは、単一突然変異体により本明細書に開示されるものと同様な活性を有する組み合わせ突然変異体をもたらすことができる。例えば、表１から選択される２つまたはそれ以上の突然変異の組み合わせを有するＩＬ−２分子は、本明細書に開示される単一置換の相対活性と同様な相対活性を有するＴ細胞選択的ＩＬ−２アゴニストをもたらすことができると考えることができる。組み合わせ突然変異体は本発明の精神及び範囲内に入る。
【００３７】
ＩＬ−２の他の位置での保存的改変及び置換（すなわち、ムテインの二次または三次構造に対して最低限の影響を有するもの）が好ましい。そのような保存的置換には、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（１９７８）中にＤａｙｈｏｆｆにより、そしてＥＭＢＯ  Ｊ．，８：７７９−７８５（１９８９）中にＡｒｇｏｓにより記述されるものが包含される。例えば、以下のグループのいずれかに属するアミノ酸は保存的改変を表す：
- ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
- ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
- ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
- ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；
- ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；及び
- ａｓｐ、ｇｌｕ。
【００３８】
また、付加的な分子間架橋または不適当なジスルフィド結合形成の部位を導入しない改変または置換も好ましい。例えば、ＩＬ−２は、成熟配列の野生型位置５８、１０５及び１２５で３個のｃｙｓ残基を有することが知られている。
【００３９】
「野生型ＩＬ−２に従って番号をつけた」は、選択したアミノ酸が野生型ＩＬ−２の成熟配列において通常存在する位置を参照にしてそのアミノ酸を同定することを意味する。ＩＬ−２ムテインに挿入または欠失がなされている場合、位置２０で通常存在するＡｓｐがムテインでは位置が変わっている可能性があることを当業者は認識する。しかしながら、隣接するアミノ酸を野生型ＩＬ−２においてＡｓｐに隣接するものと共に調べ、相関させることにより、移動したＡｓｐの位置を容易に決定することができる。
【００４０】
「ＩＬ−２Ｒαβγ受容体を有する細胞タイプ」という用語は、この受容体タイプを有することが知られている細胞、すなわち、Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化単球及び活性化ＮＫ細胞を意味する。「ＩＬ−２Ｒβγ受容体を有する細胞タイプ」という用語は、この受容体タイプを有することが知られている細胞、すなわち、Ｂ細胞、休止単球及び休止ＮＫ細胞を意味する。
【００４１】
本発明のＩＬ−２ムテインは、当該技術分野において既知のあらゆる適当な方法により製造することができる。そのような方法には、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築すること及び適当に形質転換された宿主においてそれらの配列を発現させることが包含される。この方法により本発明の組換えムテインは製造される。しかしながら、優先度は低いが、本発明のムテインを化学合成または化学合成と組換えＤＮＡ技術の組み合わせにより製造することもできる。一般に、当該技術分野の技術の範囲内にはバッチ式製造または灌流製造(perfusion production)がある。Ｆｒｅｓｈｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ），「Ａｍｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，第２版，１９９２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｃａｌｅｕｐ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（０．５−５０  ｌｉｔｅｒｓ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：２１９−５２７（１９９８）；Ｈｕ，Ｗ．Ｓ．，及びＡｕｎｉｎｓ，Ｊ．Ｇ．，「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：１４８−１５３（１９９７）；Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖ，Ｋ．Ｂ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．，Ｍｏｌｅｓ，Ｄ．，Ｍａｔａｎｇｕｉｈａｎ，Ｒ．，「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｕｘｏｓｔａｔ．」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １２：１００−１０９（１９９６）を参照。  本発明のムテインを製造するための組換え法の一つの態様として、野生型ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列を単離するかまたは合成し、次に、部位特異的突然変異誘発によりＡｓｐ２０のコドンをイソロイシン（Ｉ）のコドンに変えることによりＤＮＡ配列を構築する。この技術は周知である。例えば、Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，ｐｐ，５６６２−６６（１９８４）；及び引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４．５８８，５８５号を参照。
【００４２】
本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築する別の方法は化学合成である。これには、例えば、本発明において記述する特性を示すＩＬ−２ムテインをコードするタンパク質配列の化学的手段によるペプチドの直接合成が包含される。この方法は、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２ＲγとＩＬ−２との相互作用に影響を与える位置で天然及び非天然の両方のアミノ酸を取り込むことができる。あるいはまた、所望するＩＬ−２ムテインをコードする遺伝子をオリゴヌクレオチド合成機を用いて化学的手段により合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望するＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列に基づいて、そして好ましくは、組換えムテインが生産される宿主細胞において好まれるコドンを選択して設計される。これに関連して、遺伝暗号は縮重しており、１つのアミノ酸が１つより多くのコドンによりコードされる可能性があることが十分に理解される。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドンＴＴＣまたはＴＴＴによりコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）はＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされ、そしてｈｉｓ（Ｈ）はＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は単一のコドンＴＧＧによりコードされる。従って、特定のＩＬ−２ムテインをコードする与えられたＤＮＡ配列に対して、そのＩＬ−２ムテインをコードする多数のＤＮＡ縮重配列があることが理解される。例えば、配列番号：１において示すムテインＤ２０Ｉの好ましいＤＮＡ配列に加えて、示したＩＬ−２ムテインをコードする多数の縮重ＤＮＡ配列があることが理解される。これらの縮重ＤＮＡ配列は本発明の範囲内と考えられる。従って、本発明の文脈上「その縮重変異体」は、特定のムテインをコードし、それによりその発現を可能にする全てのＤＮＡ配列を意味する。
【００４３】
本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発、化学合成または他の方法により製造されようと、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含んでも含まなくてもよい。そのようなシグナル配列は、存在する場合、ＩＬ−２ムテインの発現のために選択した細胞により認識されるものであるべきである。それは原核生物、真核生物またはそれら２つの組み合わせであってもよい。それはまた天然のＩＬ−２のシグナル配列であってもよい。シグナル配列の包含は、ＩＬ−２ムテインが生産される組換え細胞からそれを分泌することが所望されるかどうかにより決まる。選択した細胞が原核細胞である場合、一般に、ＤＮＡ配列がシグナル配列をコードしないことが好ましい。選択した細胞が真核細胞である場合、一般にシグナル配列がコードされること、最も好ましくは野生型ＩＬ−２シグナル配列が用いられることが好ましい。
【００４４】
本発明のＩＬ−２ムテインをコードする遺伝子を合成するために標準的な方法を適用することができる。例えば、逆翻訳した遺伝子を構築するために完全なアミノ酸配列を用いることができる。ＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望するポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、次に連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的組み立てのための５’または３’突出を含有する。
【００４５】
（合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法により）いったん組み立てられると、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列は発現ベクター中に挿入され、所望する形質転換宿主におけるＩＬ−２ムテインの発現のために適切な発現制御配列に操作可能に連結される。適切な組み立てをヌクレオチドシークエンシング、制限マッピング及び適当な宿主における生物学的に活性のあるポリペプチドの発現により確かめることができる。当該技術分野において周知であるように、宿主においてトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを得るためには、選択した発現宿主において機能することができる転写及び翻訳発現制御配列に遺伝子が操作可能に連結されなければならない。
【００４６】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択により決まる。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主のために有用な発現ベクターには、例えば、ＡＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含んでなるベクターが包含される。細菌宿主のために有用な発現ベクターには、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を包含する、大腸菌(E. coli)からのプラスミドのような既知の細菌プラスミド、ＲＰ４のようなより広い宿主範囲のプラスミド、ファージＤＮＡ、例えばラムダファージの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びにＭ１３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージが包含される。酵母細胞のために有用な発現ベクターには、２μプラスミド及びその誘導体が包含される。昆虫細胞のために有用なベクターには、ｐＶＬ９４１が包含される。ｐＦａｓｔＢａｃTM １（ＧｉｂｃｏＢＲＬ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が好ましい。Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｃｅｌｌ，４５，ｐｐ．６８５−９８（１９８６）。
【００４７】
さらに、これらのベクター中に多種多様な発現制御配列のいずれかを用いることができる。
【００４８】
そのような有用な発現制御配列には、前記の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列が包含される。有用な発現制御配列の例には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ラムダファージの主要なオペレーター及びプロモーター領域、例えばＰＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏＡ、酵母α−接合系のプロモーター、バキュロウイルスのポリヘドロンプロモーター、並びに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、並びにそれらの様々な組み合わせが包含される。
【００４９】
本発明のＩＬ−２ムテインを製造するために、細菌、（酵母を包含する）真菌、植物、昆虫、哺乳類、または他の適切な動物細胞もしくは細胞系、並びにトランスジェニック動物または植物を包含するあらゆる適当な宿主を用いることができる。より詳細には、これらの宿主には、E. coliの菌株、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、真菌、酵母、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）のような昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）のような動物細胞及びＮＳ／Ｏのようなマウス細胞、ＣＯＳ １  ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０及びＢＮＴ １０のようなアフリカミドリザル細胞、及びヒト細胞、並びに組織培養した植物細胞のような、よく知られている真核生物及び原核生物宿主を含むことができる。動物細胞発現のためには、培養したＣＨＯ細胞及びＣＯＳ７細胞、特にＣＨＯ細胞系ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）またはＨＫＢ系が好ましい。
【００５０】
もちろん、全てのベクター及び発現制御配列が、本明細書に記述するＤＮＡ配列を発現させるために同等に十分に機能するとは限らないことが理解されるはずである。全ての宿主もまた同じ発現系で同等に十分に機能するとは限らない。しかしながら、当業者は、過度の実験なしにこれらのベクター、発現制御配列及び宿主の中で選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択する際には、ベクターは宿主中で複製しなければならないので宿主を考慮に入れなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗生物質マーカーのような、ベクターによりコードされるあらゆる他のタンパク質の発現もまた考慮に入れなければならない。例えば、本発明における使用のために好ましいベクターには、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡをコピー数において増幅できるものが包含される。そのような増幅可能なベクターは当該技術分野において周知である。それらには、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，米国特許４，４７０，４６１、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．１３０４−１９（１９８２）を参照）またはグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許５，１２２，４６４及び欧州公開出願３３８，８４１を参照）により増幅することができるベクターが包含される。
【００５１】
発現制御配列を選択する際には、様々な因子も考慮に入れなければならない。これらには、例えば、配列の相対的な強さ、その制御能力、及び特に可能性がある二次構造に関して、本発明のＩＬ−２ムテインをコードする実際のＤＮＡ配列とのその適合性が包含される。宿主は、選択したベクターとそれらの適合性、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特性、ポリペプチドを正しく折りたたむそれらの能力、それらの発酵または培養条件、及びＤＮＡ配列によりコードされる産物の精製の容易さを考慮して選択されるべきである。  これらのパラメーターの範囲内で、当業者は、発酵でまたは例えばＣＨＯ細胞もしくはＣＯＳ７細胞を用いる大規模な動物培養において所望するＤＮＡ配列を発現させる様々なべクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを選択することができる。
【００５２】
本発明により得られるＩＬ−２ムテインは、このムテインを生産するために用いる宿主生物によりグリコシル化されるかまたはグリコシル化されない可能性がある。細菌が宿主として選択される場合、生産されるＩＬ−２ムテインはグリコシル化されない。一方、真核細胞は、おそらく天然のＩＬ−２がグリコシル化されるのと同じようにではないが、ＩＬ−２ムテインをグリコシル化する。形質転換された宿主により生産されるＩＬ−２ムテインは、あらゆる適当な方法に従って精製することができる。ＩＬ−２を精製するために様々な方法が知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ２．Ｅｄｓ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．Ｐｌｏｅｈｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｕｎｉｔ ６．５（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照。E. coliにおいて生じた封入体から、または陽イオン交換、ゲル濾過及び／もしくは逆相液体クロマトグラフィーを用いる与えられたムテインを生産する哺乳類もしくは酵母培養物のいずれかからのならし培地からの再生が好ましい。以下の実施例１（E. coli）及び１０（ＣＨＯ細胞灌流）を参照。
【００５３】
本発明のＩＬ−２ムテインの生物学的活性は、当該技術分野において既知のあらゆる適当な方法によりアッセイすることができる。そのようなアッセイには、ＰＨＡ−芽細胞増殖及びＮＫ細胞増殖が包含される。適切な活性の、すなわち、ＩＬ−２Ｒβγを保有する細胞に対しては減少した活性を有し、ＩＬ−２Ｒαβγに対しては完全に活性があるムテインは、これら２つのアッセイを用いて確かめられる。ムテインの「相対活性」は、野生型ＩＬ−２に対して測定され、そして実施例においてさらに記述するように、ＮＫ細胞増殖に対するＰＨＡ−芽細胞増殖の活性の比率である。
【００５４】
本発明のＩＬ−２ムテインは、野生型の天然のまたは組換えのＩＬ−２での治療において用いられるものとほぼ一致するかまたはそれより多い用量で投与される。好ましくは、有効量のＩＬ−２ムテインが投与される。「有効量」は、処置される症状または適応症の重さまたは蔓延を防ぐかまたは減らすことができる量を意味する。ＩＬ−２ムテインの有効量は、とりわけ、疾病、用量、ＩＬ−２ムテインの投与スケジュール、ＩＬ−２ムテインが単独でまたは他の治療薬と共に投与されるかどうか、組成物の血清半減期及び患者の一般的な健康により決まることが当業者に明らかである。
【００５５】
好ましくは、ＩＬ−２ムテインは、製薬学的に許容しうる担体を含む組成物中で投与される。「製薬学的に許容しうる担体」は、それが投与される患者においていかなる不都合な作用も引き起こさない担体を意味する。そのような製薬学的に許容しうる担体は当該技術分野において周知である。ｐＨ ７．０の２％ ＨＳＡ／ＰＢＳが好ましい。
【００５６】
本発明のＩＬ−２ムテインは、周知の方法により製薬学的組成物中に調合することができる。例えば、適当な製剤を記述している、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅを参照。ＩＬ−２ムテインの製薬学的組成物は、液体、ゲル、凍結乾燥したまたはあらゆる他の適当な形態を包含する様々な形態に調合することができる。好ましい形態は、処置される特定の適応症により決まり、そして当業者に明らかである。
【００５７】
ＩＬ−２ムテイン製薬学的組成物は、経口的に、エアロゾルにより、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、皮内にもしくは皮下にまたはあらゆる他の許容しうる方法において投与することができる。投与の好ましい方法は、処置される特定の適応症により決まり、そして当業者に明らかである。ＩＬ−２ムテインの製薬学的組成物は、他の治療薬と共に投与することができる。これらの薬剤は同じ製薬学的組成物の一部として含むことができ、または同時にもしくはあらゆる他の許容しうる処置スケジュールに従って、ＩＬ−２ムテインとは別個に投与することができる。さらに、ＩＬ−２ムテイン製薬学的組成物は、他の治療に対する補助薬として用いることができる。
【００５８】
従って、本発明は、あらゆる適当な動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおけるＨＩＶ、癌、自己免疫疾患、感染症の処置、癌ワクチンにおけるワクチンアジュバント及び通常のワクチン治療、中高年層もしくはそうでなければ免疫無防備状態の個体における並びにヒトＳＣＩＤ患者における免疫刺激のため、または免疫系の一般刺激を必要とする他の治療用途のための組成物及び方法を提供する。背景の項において先に記載したように、ＩＬ−２は多数の作用を有する。これらのうちのいくつかは、ＰＨＡ−芽細胞、休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球及びＮＫ細胞等の刺激であり；本明細書に記述するムテインは、休止Ｔ細胞のような、高親和性ＩＬ−２受容体のみを発現する細胞タイプに対する活性を有するが、ＮＫ細胞または単球のような、中間親和性ＩＬ−２受容体にはない。
【００５９】
同様に意図されるものは、遺伝子治療用途における本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列の使用である。意図される遺伝子治療用途には、ＩＬ−２がそのＴ細胞活性のために有効な治療を与えると考えられる疾病、例えば、ＨＩＶ、癌、自己免疫疾患、感染症の処置、癌ワクチンにおけるワクチンアジュバント及び通常のワクチン治療、中高年層もしくはそうでなければ免疫無防備状態における並びにヒトＳＣＩＤ患者における免疫刺激のため、並びにそうでなければＩＬ−２に応答する疾病またはＩＬ−２によりもたらされる免疫応答に感受性の感染性病原体が包含される。
【００６０】
遺伝子治療を用いるＩＬ−２ムテインの局所送達は、標的領域にこの治療薬を与えることができる。in vitro及びin vivoの両方の遺伝子治療方法論が意図される。特定の細胞集団に潜在的に治療に役立つ遺伝子を導入するためのいくつかの方法が知られている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，「Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−３１（１９９３）を参照。これらの方法には以下のものが包含される：
１）直接的遺伝子導入。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｉｎｔｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−６８（１９９０）を参照；
２）リポソームによりもたらされるＤＮＡ導入。例えば、Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＦＴＲ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｎａｓａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：３９−４６（１９９５）；Ｃｒｙｓｔａｌ，「Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ａｓ  Ａ  Ｄｒｕｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１５−１７（１９９５）；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ，「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１７９：２８０−８５（１９９１）を参照；
３）レトロウイルスによりもたらされるＤＮＡ導入。例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ：Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｆａｃｔｏｒ  IX−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｏｇｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：１１７−１９（１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８−１３（１９９２）を参照。
【００６１】
４）ＤＮＡウイルスによりもたらされるＤＮＡ導入。そのようなＤＮＡウイルスには、アデノウイルス（好ましくはＡｄ−２またはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）及びパルボウイルス（好ましくは「欠損」または非自律的パルボウイルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２に基づくベクター）が包含される。例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  ＤＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ａｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：３６７−８４（１９９５）；引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許４，７９７，３６８及び引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許５，１３９，９４１を参照。
【００６２】
目的の遺伝子を導入するための特定のベクター系の選択は様々な因子により決まる。１つの重要な因子は標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは詳細に研究されており、多数の遺伝子治療用途において用いられているが、一般的に、これらのベクターは分裂していない細胞に感染させるためには適していない。さらに、レトロウイルスは腫瘍原性の可能性を有する。
【００６３】
アデノウイルスは、広い宿主範囲を有するという利点があり、ニューロンまたは肝細胞のような、静止細胞または終末分化した細胞に感染することができ、そして本質的に非腫瘍原性であると思われる。例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記，ｐ．３６７を参照。アデノウイルスは宿主ゲノム中に組込まないようである。それらは染色体外で存在するので、挿入突然変異誘発の危険は大きく減少される。Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記，ｐ３７３。
【００６４】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスに基づくベクターと同様な利点を示す。しかしながら、ＡＡＶは、ヒト第１９染色体で部位特異的な組込みを示す。Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、ｐ．３７７。
【００６５】
好ましい態様として、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡは、ＨＩＶのような免疫不全症；結核のような感染症；及び腎癌のような癌の遺伝子治療において用いられる。
【００６６】
この態様では、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡでの遺伝子治療は、診断と同時にまたは直後に、治療を必要とする患者に与えられる。
【００６７】
この方法は、望ましくない毒性及び不都合な事象を防ぐために本発明のＩＬ−２ムテインの選択的活性を利用する。当業者は、ＩＬ−２ムテインＤＮＡを含有するあらゆる適当な遺伝子治療ベクターをこの態様に従って使用できることを認識する。そのようなベクターを構築するための技術は既知である。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３９２  ２５−３０（１９９８）；Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，及びＳｏｍｉａ，Ｎ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｐｒｏｍｉｓｅｓ，Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３８９  ２３９−２４２（１９９８）を参照。標的部位へのＩＬ−２ムテインＤＮＡを含有するベクターの導入は、既知の技術を用いて実施することができる。
【００６８】
本発明をより十分に理解できるように、以下の実施例を記述する。これらの実施例は、例示するという目的のためだけであり、本発明の範囲をいかようにも限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載した全ての公開は、全部引用することにより組み込まれる。
Ｃ．実施例
実施例１．エシェリキア・コリにおけるムテインの生産．  本質的にＫｕｎｋｅｌ  ＴＡ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＤ及びＺａｋｏｕｒ  ＲＡ，「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７−３８２により記述されたように、所望する突然変異に対応するコドンを含有するプライマーを用いて部位特異的突然変異誘発によりムテインを作製した。簡潔に言えば、制限酵素部位ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを含有するヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡを同じ部位を用いてＭ１３ファージベクターＭ１３ｍｐ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中にサブクローン化した。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間誘導したヒト末梢血リンパ球から単離したｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡプールからポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を用いて野生型ＩＬ−２ ｃＤＮＡを得た。用いたＰＣＲプライマーは、ＩＬ−２オープンリーディグフレームの５’末端には、
5'-CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3' (配列番号:３)；
そしてＩＬ−２オープンリーディグフレームの３’末端には、
5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' (配列番号:４)
であった。
【００６９】
各オリゴヌクレオチド中には制限酵素部位ＥｃｏＲＩ（５’末端）及びＢａｍＨＩ（３’末端）が含まれ、イタリック体で示される。用いたＰＣＲ条件は、９４℃で１分、５８．７℃で１分、そして７２℃で１分を２５サイクルであった。このようにして得られた正しいＩＬ−２ ｃＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｅｎａｓｅR（商標）シークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を製造業者により記述されたように用いてシークエンシングにより確かめた。ＩＬ−２ ｃＤＮＡを含有するＭ１３ ｍｐ１９でエシェリキア・コリ株ＣＪ２３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を形質転換することによりウラシルを含有する一本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＤＮＡ）を得た。部位特異的突然変異誘発は、一般に、突然変異誘発の標的とするコドン（１個または複数）の５’の鋳型Ｕ−ＤＮＡに相同な１５個のヌクレオチド、所望する変異を含むヌレクオチド及び最後の改変されるヌレクオチドの３’の鋳型Ｕ−ＤＮＡに相同なさらに１０個のヌレクオチドを含有するプライマーを利用した。まず、ヒトＩＬ−２の成熟配列の始めにＮｃｏＩ制限部位を導入するために部位特異的突然変異誘発を用いた。この制限部位の使用により、例えば発現ベクターｐＥＴ３ｄを用いてエシェリキア・コリの細胞質空間において発現を導くＮ末端のメチオニン残基が取り込まれる。この目的のために用いたプライマーは以下のものである：
5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (配列番号:５)
位置Ｄ２０、Ｎ８８及びＱ１２６で突然変異を含むために用いた特定のプライマーは以下のものである：
D20X:  5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3'   (配列番号:６)
N88X:  5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (配列番号:７)
Q126X: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3'   (配列番号:８)
ここで、ＮＮＮは、（位置Ｄ２０で）ヒスチジン（ＣＡＣ）もしくはイソロイシン（ＡＴＣ）、（位置Ｎ８８で）アルギニン（ＣＧＴ）、グリシン（ＧＧＴ）もしくはイソロイシン（ＡＴＣ）または（位置Ｑ１２６で）ロイシンの適切なコドンで置換された。他の突然変異は、同様の方法及び与えられた突然変異のために適切なコドンを利用した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して製造業者のプロトコルを用いてプライマーをリン酸化した。Ｕ−ＤＮＡ鋳型にプライマーをアニーリングさせ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で伸長した後、５μｌの反応混合物でエシェリキア・コリ株ＤＨ５αTM（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の細胞を形質転換し、０．７％の寒天を含有するＬＢ培地中で平板培養した。３７℃でインキュベーション後、単一プラークを抜き取り、２ｍｌのＬＢ培地に移すことによりプラークを広げ、３７℃で一晩増殖させた。Ｍ１３精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、ＳｅｑｕｅｎａｓｅRシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を製造業者のプロトコルに従って用いて一本鎖ＤＮＡをシークエンスすることにより所望する突然変異を含有するクローンを同定した。正しい突然変異配列を含有するプラークに対応する複製型ＤＮＡからＩＬ−２ムテインｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＸｂａＩを用いて単離し、プラスミドベクターｐＥＴ３ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｓｔｒａｔ）にサブクローン化した。ムテインを含有するｐＥＴ３ａベクターでエシェリキア・コリ株ＢＬ２１を形質転換し、０．６０〜１．０の間のＡＢＳ280まで増やし、その時点でＩＬ−２ムテイン生産を誘導するために０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えた。
実施例２．エシェリキア・コリからのＩＬ−２ムテインの抽出及び精製．
誘導後３時間で細胞を１０，０００ Ｘ ｇでの遠心分離により集めた。まず、これらの細胞を１０容量（体積／湿質量）のショ糖／Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー（０．３７５Ｍショ糖、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に分散させることにより組換えＩＬ−２ムテインを再生し、精製した。１インチの標準探針（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｂｅ）を備えたＭｉｓｓｏｎｉｘモデルＸＬ２０２０超音波処理装置を用いて、分散させた細胞を氷浴中で３０秒の休止間隔で３００Ｗで３回超音波処理した。次に、超音波処理した材料を４℃で１７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。この時点で色が白色のはずであるペレットをショ糖／Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー中で１回、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回再懸濁して遠心分離することにより洗浄し、そして最後に１０容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、ｐＨ ８．０バッファー中に再懸濁し（この時点でゲル分析のためにサンプルを取る）、１７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。  ３容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ ８．０）中８Ｍの塩化グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、及び０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２−メルカプトエタノールを加えることによりペレットを溶解した。室温で２時間のインキュベーション後、サンプルを１７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。得られた溶液を４℃で２０容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに対して約２０時間透析した。溶液を１７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離し、０．１％トリフルオロ酢酸に調整し、０．２２ミクロンフィルター装置で濾過した。シリコンで処理したボトルに溶液をすぐに移し、Ｃ８カラム（Ｖｙｄａｃ ２０８ＴＰ５４）上に添加した。０．１％ ＴＦＡ中４５〜８５％のアセトニトリルを使用する２０分の直線勾配を用いてＩＬ−２ムテインを精製した。溶出されたタンパク質の濃度をＡ２８０及びアミノ酸分析により決定した。次に、シリコンで処理したチューブ中にこのタンパク質を等分し（１００ｍＬ）、−２０℃で保存した。このようにして精製されたムテインは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で見た場合に典型的に単一のバンドであり、アミノ酸分析により定量した（精度は典型的に＞９０％）。
実施例３．Ｔ細胞増殖アッセイ．
冷えたダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まない；ＤＰＢＳ）中に１：２に希釈した約１００ｍＬの正常ヒト血液（Ｉｒｗｉｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を下に敷き、サンプルを遠心分離してＰＢＭＣを単離し、続いて冷えたＤＰＢＳ中でよく洗浄した。１％（ｗ／ｖ）の各々の以下のもの：Ｌ−グルタミン；非必須アミノ酸；ピルビン酸ナトリウム；及び抗生物質−抗真菌物質を加える、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ培地）中に細胞を１ ｘ １０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁することによりＰＨＡ芽細胞（活性化Ｔ細胞）を生成せしめた。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ；Ｓｉｇｍａ）を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、細胞を３７℃、５％ ＣＯ2で３日間インキュベートした。細胞を集め、ＤＰＢＳ中で２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、ＲＰＭＩ培地中の異なる濃度のＩＬ−２またはムテインと共に２００μｌ中１ｘ１０5細胞／ウェルの密度で９６穴平底プレート中に平板培養した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、１μＣｉ 3Ｈ−チミジン（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮR（商標），Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）／ウェルで６時間パルス標識し、集め、ガラス繊維フィルター上に細胞を集めた後で放射能を測定した。
実施例４．ＮＫ細胞増殖アッセイ．
冷えたダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まない；ＤＰＢＳ）中に１：２に希釈した約１００ｍＬの正常ヒト血液（Ｉｒｗｉｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を下に敷き、サンプルを遠心分離してＰＢＭＣを単離し、続いて冷えたＤＰＢＳ中でよく洗浄した。ＮＫ細胞を他の細胞から分離した。この目的のためには、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ’ｓ  ＮＫ細胞単離キット（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号４６５−０１）が好ましい。このキットは２つの試薬、分離カラム及び非常に強力な磁気カラム支持体からなる。第一の試薬は、マウスＩｇＧ１アイソタイプのハプテン結合したモノクローナルＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ３３抗体のカクテルである。これはＰＢＭＣからＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄性細胞を除くためである。これらの細胞タイプを認識する抗体のあらゆる適当な組を使用できることが予想される。第二の試薬は、抗パフテン抗体に結合したコロイド状超常磁性ＭＡＣｓミクロビーズからなる。０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）中に細胞を再懸濁する。懸濁液の容量は用いる細胞の数により決まり、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃにより表に示されている。典型的には、２〜５ｘ１０8 ＰＢＭＣの細胞数では、細胞を８００μＬのバッファー中に再懸濁し、次に２００μＬの各試薬を用いる。試薬とのインキュベーション後、（２ｍＬのバッファー中に再懸濁した）カラムに細胞を添加する。ＮＫ以外の細胞は磁石に付着し（除かれ）、そしてＮＫ細胞は単離され、流出物（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）中に集められる。細胞を洗浄し、（１％の各々の以下のもの：Ｌ−グルタミン；非必須アミノ酸；ピルビン酸ナトリウム；抗生物質−抗真菌物質（全てＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから）；１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を加えるＲＰＭＩ １６４０を含有する）ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、２００μｌ中１ ｘ １０5細胞／ウェルの密度で９６穴平底プレート中に平板培養した。細胞を集め、ＤＰＢＳ中で２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、ＲＰＭＩ培地中の異なる濃度のＩＬ−２またはムテインと共に２００μｌ中１ ｘ １０5細胞／ウェルの密度で９６穴平底プレート中に平板培養した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、１μＣｉ 3Ｈ−チミジン（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮR，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）／ウェルで６時間パルス標識し、集め、ガラス繊維フィルター上に細胞を集めた後で放射能を測定した。
実施例５．ＮＫ細胞よりＴ細胞を選択的に活性化するムテイン．
Ａｓｐ−２０、Ａｓｐ−８４、Ａｓｎ−８８及びＧｌｎ−１２６で部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７−３８２）を用いてムテインを作製し、ｐＥＴ−３ａ発現系を製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により記述されるように用いてエシェリキア・コリにおいて発現させた。先に記述したように、グアニジン−ＨＣＬ中での封入体の回収によりムテインを精製し、再生し、ＨＰＬＣを用いてクロマトグラフィーにより分離した。得られたタンパク質は銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％純粋であるようであり、アミノ酸分析により濃度及び純度に関して分析した（ＡＡＡ精度は典型的に＞９０％）。適切な活性を有するムテインを質量分析法分析を用いて順に確かめた。このようにして精製されたムテインを先に記述したＴ及びＮＫ細胞アッセイにおいてアッセイした。Ｔ及びＮＫ細胞アッセイにおけるＩＬ−２ムテインの相対活性を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0004276783.tif 000002
【００７１】
【表２】
0004276783.tif 000003
【００７２】
ムテインの活性は、最大応答の５０％を与えるために必要とされるムテイン（ＥＣ50）の同じアッセイにおけるｗｔ ＩＬ−２のＥＣ50と比較した相対濃度に関して記述され；同じムテインに対する複数のアッセイの場合には、それらの値の相乗平均を記載する。ｗｔ ＩＬ−２のＥＣ50値は、Ｔ細胞アッセイでは〜１０ｐＭないし１５０ｐＭ、ＮＫ細胞アッセイでは〜５０ｐＭないし〜２００ｐＭの間で変動した。ムテインのＮＫ細胞活性対するＴ細胞活性の比率は、ＮＫ細胞に対するムテインの相対活性で割ったＴ細胞に対するムテインの相対活性として表される。単一の提供者からの細胞を用いる定められたＴ及びＮＫ細胞アッセイから決定された活性のみを用いて各ムテインに対してこの比率を決定する。
【００７３】
ムテイン活性は、以下の６つの広いカテゴリーに分類することができる：１）１０００倍のＴ細胞選択性；２）１００〜＜１０００倍のＴ細胞選択性；３）１０〜＜１００倍のＴ細胞選択性；４）Ｔ細胞に対するＩＬ−２より向上した活性；５）ＮＫ細胞選択性；６）ＴまたはＮＫ細胞のいずれかに対する１０倍の選択性。
【００７４】
クラス１：Ｄ２０Ｈ、Ｉ及びＹ；Ｎ８８Ｇ、Ｉ及びＲ。
【００７５】
クラス２：Ｄ２０Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ及びＳ；Ｎ８８Ｍ及びＴ；Ｑ１２６Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ及びＶ。
【００７６】
クラス３：Ｄ２０Ｒ；Ｎ８８Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｓ及びＶ；Ｑ１２６Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｒ及びＳ。
【００７７】
クラス４：Ｄ２０Ｉ；Ｎ８８Ｇ；Ｑ１２６Ｅ、Ｌ、Ｍ、Ｎ及びＲ。
【００７８】
クラス５：Ｑ１２６Ａ、Ｈ。
【００７９】
クラス６：Ｄ２０Ａ、Ｔ及びＶ；Ｎ８８Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｗ及びＹ；Ｑ１２６Ｋ、Ｐ、Ｔ、Ｗ及びＹ。
【００８０】
クラス１〜３の中で好ましいムテインは、Ｔ細胞に対してｗｔ ＩＬ−２に近いかまたはそれより優れた活性を示すものである。クラス１ではＤ２０Ｈ及びＩ；Ｎ８８Ｇ、Ｉ及びＲがこれに含まれ；クラス２ではＮ８８Ｍ及びＴ、Ｑ１２６Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ及びＶがこれに含まれ；クラス３ではＮ８８Ａ、Ｑ１２６Ｆ及びＧがこれに含まれる。クラス４のムテインはインビボでｗｔ ＩＬ−２より大きい効能を有すると予測される。
【００８１】
表１から、いずれの単一突然変異も両方のアッセイにおいて不活性のＩＬ−２ムテインをもたらさなかったことを認めることができる。しかしながら、２個の異なる位置からの激しく弱められた活性をもたらした突然変異の組み合わせは、潜在的に、Ｔ細胞または他の高親和性ＩＬ−２受容体保有細胞タイプに対するアンタゴニストＩＬ−２活性をもたらすと推論することができる。これらの突然変異はＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγとの相互作用のみを改変するように設計されているのでこのデータからそのようなアンタゴニストが予測される。１つのそのような例は、二重ムテインＤ２０Ｒ／Ｑ１２６Ｔである。１つの分子における弱く活性のある突然変異の組み合わせは、事実上コンビネーションであると予測され、すなわち、Ｄ２０ＲはＴ細胞に対して０．０００１８の活性があり、Ｑ１２６ＴはＴ細胞に対して０．０００１の活性があり、二重ムテインＤ２０Ｒ／Ｑ１２６ＴはＴ細胞に対してｗｔ ＩＬ−２の０．０００００００１８の活性があると考えられる。示したデータから他の組み合わせを推論することができる。
実施例６．ｗｔ ＩＬ−２及びＩＬ−２ムテインの生物学的活性．
図１〜７は、ｗｔヒトＩＬ−２（ＩＬ−２）及びＤ２０Ｈ（図１）、ＩＬ−２及びＤ２０Ｉ（図２）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｇ（図３）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｉ（図４）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｒ（図５）、ＩＬ−２及びＱ１２６Ｅ（図６）並びにＩＬ−２及びＱ１２６Ｌ（図７）の用量−反応曲線を示す。Ａ：一次ヒトＴ細胞増殖アッセイ（ＰＨＡ−芽細胞）におけるＩＬ−２（閉じた丸）及びムテイン（開いた丸）の個々の用量反応。Ｂ：一次ヒトＮＫ細胞増殖アッセイにおけるＩＬ−２（閉じた三角）及びムテイン（開いた三角）の個々の用量反応。
【００８２】
図１について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜１．５Ｘ１０-10Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜１Ｘ１０-10Ｍである。Ｄ２０ＨのＥＣ50はこのＴ細胞アッセイでは〜２Ｘ１０-10Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは＞１Ｘ１０-5Ｍであると概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＤ２０ＨのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合＞５０，０００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８３】
図２について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜１．５Ｘ１０-10Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜３Ｘ１０-10Ｍである。Ｄ２０ＩのＥＣ50もこのＴ細胞アッセイにおいて〜１．５Ｘ１０-10Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜５Ｘ１０-6Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＤ２０ＩのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜１６，０００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８４】
図３について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜４Ｘ１０-11Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜２Ｘ１０-10Ｍである。Ｎ８８ＧのＥＣ50はこのＴ細胞アッセイでは〜５Ｘ１０-12Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜３Ｘ１０-8Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＮ８８ＧのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜１，２００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８５】
図４について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜１．５Ｘ１０-10Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜１Ｘ１０-10Ｍである。Ｎ８８ＩのＥＣ50もこのＴ細胞アッセイでは〜４Ｘ１０-10Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜５Ｘ１０-6Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＮ８８ＩのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜１８，０００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８６】
図５について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜１．５Ｘ１０-10Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜１Ｘ１０-10Ｍである。Ｎ８８ＲのＥＣ50はこのＴ細胞アッセイでは〜９Ｘ１０-11Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜３Ｘ１０-7Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＮ８８ＲのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜５，０００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８７】
図６について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜８Ｘ１０-12Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜５Ｘ１０-11Ｍである。Ｑ１２６ＥのＥＣ50はこのＴ細胞アッセイでは〜８Ｘ１０-13Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜２Ｘ１０-9Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＱ１２６ＥのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜４００倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
【００８８】
図７について詳細には、示した実験に関して、最大増殖の５０％を与えるｗｔ ＩＬ−２の用量（ＥＣ50）はＴ細胞（Ａ）では〜５Ｘ１０-11Ｍ、そしてＮＫ細胞（Ｂ）アッセイでは〜８Ｘ１０-11Ｍである。Ｑ１２６ＬのＥＣ50はこのＴ細胞アッセイでは〜２Ｘ１０-11Ｍであったが、このＮＫ細胞アッセイでは〜２Ｘ１０-8Ｍにすぎないと概算された。従って、ＮＫ細胞活性に対するＱ１２６ＬのＴ細胞活性の正味の向上は、このアッセイについて決定した場合〜６２５倍である。さらなる提供者からの血液で同様の結果が得られた（データは示されない）。
実施例７．チンパンジー毒性研究．
一次ヒトＴ及びＮＫ細胞アッセイにおいて示されたＴ細胞選択的アゴニスト活性のためにＩＬ−２／Ｎ８８Ｒを表１のＩＬ−２ムテインタンパク質から選択した。野生型ＩＬ−２に比較して、それはＮＫ細胞よりＴ細胞に対して〜６，０００倍活性があり、そしてＴ細胞に対してｗｔ ＩＬ−２と本質的に同等な活性を示す。ＩＬ−２／Ｎ８８ＲをＣＨＯ細胞において製造し、精製し、ＩＬ−２活性及び毒性のチンパンジーモデルにおいて評価した。このインビボモデルにおいて、それはＩＬ−２の市販されている組換え変異体（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮTM、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）に匹敵するＴ細胞活性を示したが、（客観的及び臨床パラメーターの両方の点で）比較してほんの軽い副作用のみを誘導した。
Ａ．実験設計
１．材料及び方法
この研究のｉｎ−ｌｉｆｅ部分はＮｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ，スポンサーＢａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）で行われ、２相の研究及び約４５〜７０ｋｇの体重を有する１１匹の若い成体〜成体のオスチンパンジーを含んだ。
【００８９】
研究のＩ相は用量決定段階であり、ビヒクルの皮下用量または１．２ｍｇ／ｍ2でＰＲＯＬＥＵＫＩＮの皮下用量を毎日２回（ＢＩＤ）５日間送達することを含んだ。研究のII相は、１２時間毎に（ｑ１２ｈ）５日間、皮下に与えたビヒクル、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの比較である。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの用量を薬物速度論分析に基づいてＰＲＯＬＥＵＫＩＮに匹敵する暴露量を与えるように選択した。血液の化学的性質、ＣＢＣ、血液学／凝固、並びに５及び６節に詳述するようなＴ及びＮＫ細胞集団のＦＡＣＳ分析のために血液サンプルを取った。
【００９０】
【表３】
0004276783.tif 000004
【００９１】
【表４】
0004276783.tif 000005
【００９２】
２．投与方法
血液を得る研究日には、試験品またはビヒクルの投与前に約１０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭケタミンを用いて動物に完全に麻酔をかけた。血液サンプリングを必要としない研究日には、試験品またはビヒクルの投与前に締めつけケージ（ｓｑｕｅｅｚｅ  ｃａｇｅ）を用いて動物を物理的に拘束した。用量を皮下注射により１２時間毎に５日間投与し、研究の１日目に注射部位の毛を刈った。この部位及び投与の時間を各用量に対して記録した。
【００９３】
３．臨床的観察
（ａ）毎日の観察及び食物消費．  各動物を毎日２回観察し、あらゆる異常な観察結果は研究責任者（Ｓｔｕｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒ）に報告された。病気と思われる動物は研究責任者、プロジェクト獣医及びスポンサー代表者（Ｓｐｏｎｓｏｒ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）に知らされた。食物消費を確かめ、肉眼での観察により毎日２回記録した。
【００９４】
（ｂ）体重．  研究前、１日目の投与前、そして血液収集のために動物に鎮静剤を投与する各場合に体重を測った。
【００９５】
（ｃ）注射部位の観察．  注射部位を毎日観察した。赤さまたは腫れのようなあらゆる異常な外観を記録した。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
４．サンプルの取り扱い
（ａ）血清の化学的性質．  上記の特定の時点で抗凝固剤を含まないチューブ中に各動物から約２ｍｌの血液サンプルを集めた。血液収集時間を記録し、血液を室温で凝固させた。次に、これらのサンプルを遠心分離し、血清を分離し、ＮＩＲＣ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送った。ＮＩＲＣ標準血清化学的性質パネルは表４に含まれる：
【００９８】
【表６】
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【００９９】
（ｂ）血液学．  上記の特定の時点でＥＤＴＡチューブ中に各動物から約２ｍｌの血液サンプルを集め、ＮＩＲＣ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送った。全血球数、分画及び血小板数を包含する標準ＮＩＲＣ血液学パネルを全てのサンプルに対して実施した。
【０１００】
（ｃ）スポンサーアッセイ．  上に特定した時間に抗凝固剤としてＥＤＴＡを含むチューブ中に約６ｍｌの血液サンプルを集めた。血液収集時間を記録した。これらのサンプルを遠心分離し、血漿を分離し、３本の別個のチューブ中に等分した。血漿を凍結して保存し（−６０℃またはそれ以下）、研究を終えるとすぐにＢａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡに送った。
【０１０１】
５．ＦＡＣＳ
（ａ）方法．  ＦＡＣＳ分析のために特定された時間に約５ｍｌの血液サンプルをヘパリンナトリウム抗凝固剤中に集めた。
【０１０２】
全血検体をＥＤＴＡ、ＡＣＤまたはヘパリンのいずれか中に得た。細胞数を２〜２０ｘ１０3／ｍｍ3の範囲であるように調整した。
【０１０３】
１２ Ｘ ７５のガラスまたはプラスチックチューブを試験する抗体パネルに対して適切に標識した。これらのチューブに抗体または抗体カクテルを製造業者の勧める容量に従って加えた。
【０１０４】
１００μｌのよく混合した血液検体をチューブごとに加え、光から防護して混合物を室温で３０分間インキュベートした。
【０１０５】
インキュベーション後、２ｍｌの溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳブランド溶解溶液、ＢＤ＃ ９２−０００２）を加え、混合物を穏やかにボルテックスし、室温で１０分間静置させた。次に、これらのチューブを室温で３００ Ｘ ｇで５分間遠心分離した。上清をデカントし、過剰の液体を吸い取り、各細胞ペレットに１ｍｌのＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ １４１９０−１４４）を加えた。穏やかにボルテックスした後、これらのチューブを室温で３００ Ｘ ｇで５分間遠心分離した。上清をデカントし、過剰の液体を吸い取り、その後、細胞ペレット上に１ｍｌの固定溶液（１０％ホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．＃０４１８）をＰＢＳバッファーで１：２０に希釈することにより調製した０．５％ホルムアルデヒド溶液）を加え、再懸濁のために穏やかにボルテックスした。次に、サンプルをＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＳＬ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
【０１０６】
研究のために用いた抗体：ＭＩｇＧ１／ＭＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３４９５２６）、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３４７４６４）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３４７３１３）、ＣＤ２５−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３０７９５Ｘ）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３４０１３３）、ＣＤ１６−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３４７６１７）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号＃３４７３４４）。
【０１０７】
６．凝固プロフィール
上記の特定の時点で抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを添加したチューブ中に約２ｍｌの全血サンプルを集めた。凝固プロフィールは、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びフィブリノーゲンからなった。
Ｂ．結果及び説明
１．ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ用量決定
この相の主要な目的は、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒとの比較のために最適なＰＲＯＬＥＵＫＩＮの用量を同定することであった。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮの最適用量は、理想的には、臨床的に重大であるが適度で且つ可逆的な毒性を引き起こす（最大許容用量より低い）許容できる用量であることを目標とした。異種間推定により与えられたＰＲＯＬＥＵＫＩＮの臨床用量処方計画、それらの対応する毒性及び実験室カニクイザル（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ用量−応答結果に基づいて１．２ｍｇ／Ｍ2、ＢＩＤのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ用量を初期用量として決定した。
【０１０８】
このようにして２匹のチンパンジーをＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置した。これらの動物は、投与の期間中にだんだん活動が減り、苦しみ、そして脱水状態になった。両方の動物は、減少した食欲、下痢、嘔吐を包含する、３または４日目に現れる激しい胃腸症状を示した。１匹の動物（番号Ｘ−１５９）への投与は、血液化学化学的性質に示される重い腎機能障害（図８Ａ及びＢ）及び中程度の肝機能障害（図８Ｃ及びＤ）のために投与の３日後に中止された。これらには、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン及び総ビリルビン、ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）が包含される。両方のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置動物に乳酸加リンガー溶液を蘇生法としてまたはさらなる脱水を防ぐために３及び４日目（動物Ｘ−１５９）並びに４日目のみ（動物Ｘ−１２４）にｉ．ｖ．投与した。動物番号Ｘ−１５９は、腎機能障害並びに（大腿部の）非常に最小限の脈拍により示されるような右脚での可能性がある血栓のために８日目に研究から除かれ、そして全ふくらはぎは冷たく、膨張していた。一方の動物では著しい毒性が観察されたが、もう一方の動物では重さのより低い事象が起こり、そして両方の動物の不都合な事象のプロフィールは可逆的であった。これに基づき、１．２ｍｇ／Ｍ2のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及び（暴露量に基づいて）同等な用量のＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ、ｑ１２ｈｒをこれら２つの化合物を比較するために適切な用量処方計画であると決定した。
２．ＰＲＯＬＥＵＫＩＮに対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの比較
臨床的観察．  表５にこの研究中に実施した臨床的観察を記載する。値は０〜５の尺度で報告され、ここで、５が重い。全てのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置動物は重い病気であり；１匹のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置に関連する死亡があった。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループの６日目後に報告する値は、残っている２匹の動物からのデータを示す。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ処置は表４に示すパラメーターに関してほんのわずかの毒性を誘導したが、処置の最も明らかな副作用は軽いＧＩ障害（嘔吐）であるようであった。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループの体重は６日目に６％減り、１０日目に１０％程度も減少し、そしてその後ゆっくりと回復した（図９参照）。それに反して、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ及びビヒクルグループはせいぜい単に１〜３％の体重減少であった。
【０１０９】
【表７】
0004276783.tif 000008
【０１１０】
（ａ）血液学．  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒは、特にリンパ球増加においてＰＲＯＬＥＵＫＩＮ活性化と一致する細胞性作用を誘導し（図１０Ａ）、また、白血球（図１０Ｂ）及び好中球（図１０Ｃ）の増加も見られた。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒは、研究の処置部分中にＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（最下点〜５０％）に比較してほんの最低限の血小板減少（〜１５％の最下点）を誘導した（図１０Ｄ）。
【０１１１】
（ｂ）腎機能．  ＢＵＮレベルは、６及び８日目に全てのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置動物において著しくより高かった（図１１Ａ）。ＢＵＮレベルはこれらの動物のうち２匹において１３０ｍｇ／ｄＬ以上であり；クレアチニンレベルもまた６及び８日目の両方でこれら２匹の動物において劇的に増加し（図１１Ｂ）、腎機能の完全な停止を示した。さらに、血清リン及びアニオン差の両方も６及び８日目にＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置グループにおいて増加した。それに反して、全てのＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ動物において、これらの腎パラメーターは研究の間中基本的に正常なままであった（図１１Ｃ及びＤ）。
【０１１２】
（ｃ）肝機能．  総ビリルビンは６日目にＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループにおいて３倍以上になり、１０日目まで高いままであった（図１２Ａ）。それに反して、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒグループ中の１匹の動物のみに３及び６日目に一時的なわずかな増加があった。血清ＳＧＴＰレベルは劇的に上昇し、６日目には全てのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ動物において１００Ｕ／Ｌ以上に達した（図１２Ｂ）。動物番号Ａ１９９におけるＳＧＴＰレベルは６５１Ｕ／Ｌに、そしてＳＧＯＴは２７８９Ｕ／Ｌに達し（Ｌａｂ  Ｎｏｔｅ  Ｂｏｏｋ：ＮＩＲＣ＃８７５４−９８５２−Ｐｈａｓｅ  II，表１  Ｉｎｄｉｖｉａｌ  ａｎｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｍｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖａｌｕｅｓ，表の２１の１７頁（ｐａｇｅ  １７  ｏｆ  ２１  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｂｌｅ））、重い肝不全を示した。
【０１１３】
（ｄ）凝固．  フィブリノーゲンレベルは、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒグループの両方において２倍以上になり、６日目に最大量に達した（図１２Ｃ）。この増加は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループにおいてＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ動物より早く起こっているようである。これは３日目の５％に対して５１％の増加により示される。同じ期間中に相応してＡＰＴＴまたはＰＴの意味のある変化はなかったので、フィブリノーゲンの変化は凝固欠陥よりむしろ急性タンパク質応答の結果である可能性がある（図１２Ｄ）。しかしながら、１０日目からＰＲＯＬＥＵＫＩＮ動物におけるＡＰＴＴレベルは、絶対値は正常範囲内のままであるが明らかな上昇傾向を示した。同じ傾向が、より少ない程度にではあるが、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒグループにおいても認められた。しかしながら、興味深いことに、フィブリノーゲンレベルは、両方のグループにおいて相応して同じ期間中により低く変動しているようであった。
【０１１４】
（ｅ）ホメオスタシス．  血清ナトリウムレベルは８日目に３匹のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ動物のうち２匹において１３５ＭＥＱ／Ｌ未満まで減少したが、残りの動物では正常なままであった（図１３Ａ）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループにおける塩化物レベルもまた３日目から９５ＭＥＱ／Ｌ未満まで減少し、１５日目まで低いままであった（図１３Ｂ）。カルシウムレベルは６及び８日目に３匹のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ動物のうち２匹においてより低く、動物Ａ１９９では４．９及び３．１ｍｇ／ｄＬと同程度に低くなった（図１３Ｃ）。研究から外す前にカリウムレベルが実際に７．２ＭＥＱ／Ｌの有毒なレベルまで増加した動物Ａ１９９を除いて、カリウムレベルは全てのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ処置動物において３〜１２日目に３ＭＥＱ／Ｌ未満まで減少した（図１３Ｄ）。
【０１１５】
（ｆ）血管漏出の徴候．  血清アルブミンレベルは、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（３７％）及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（１９％）グループの両方において減少した（図１４Ａ）。３及び６日目にＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループにおいてヘマトクリットレベルの増加が見られた（図１４Ｂ）。それに反して、ビヒクルコントロール及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒグループの両方におけるヘマトクリットレベルは同じ期間中に減少し、低いままであり、複数の血液サンプル収集のためと考えられる軽い貧血を示した（図１４Ｂ及びＣ）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループにおけるヘマトクリットの上昇は、アルブミンの減少と結びつけて考えると、毛細血管漏出症候群の発症と一致する。
【０１１６】
３．細胞の活性化
ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの効能をＣＤ２５陽性リンパ球の割合の変化（輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）＋増殖）及びＣＤ２５の蛍光の平均または与えられたＴ細胞の表面で発現されるＣＤ２５抗原の数により研究した（ＣＤ２５＝低親和性ＩＬ−２Ｒ）。ＣＤ２５発現を全Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋細胞）並びにＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋集団で研究した。
【０１１７】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）に対するＩＬ−２活性をＣＤ３−ＣＤ１６＋及びＣＤ３−ＣＤ２５＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の輸送の分析により研究した。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫ細胞の絶対数は、血液学分析中に得られたデータのこれらの細胞の割合にｍｍ3当たりのリンパ球の数を掛けることにより決定した。
【０１１８】
（ａ）Ｔ細胞表面上のＣＤ２５発現調節．  ＣＤ２５陽性細胞により示されるような活性化Ｔ細胞の割合は、主にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団上で、研究の６日目まではアップレギュレーションされた。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮは、６日目にＴ細胞の全ＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋亜集団のより高い割合に対してＣＤ２５の発現を誘導するようである。しかしながら、８日目までにＣＤ２５抗原を発現する細胞の％は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置したチンパンジー及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒで処置したチンパンジーのリンパ球に対して同一であった（図１５Ａ、Ｂ及びＣ）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮまたはＩＬ−２／Ｎ８８Ｒで処置したチンパンジーのどちらにおいてもナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団の表面でのＣＤ２５のいかなる染色も認められなかった。選択したＮＫ細胞集団（ＣＤ３−／ＣＤ１６＋）の表面でのＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５による細胞表面染色の標的となる抗原）の発現の欠如がこれらの結果を招くと思われる。
【０１１９】
ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の絶対数は、ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合と同様なパターンをたどり、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮはＩＬ−２／Ｎ８８Ｒより活性があるようであった（図１６Ａ）。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒにより誘導されるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球の絶対数のアップレギュレーションはＰＲＯＬＥＵＫＩＮで見られたアップレギュレーションと同一であったので（図１６Ｂ）、ＩＬ−２／Ｎ８８ＲはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団に対してＰＲＯＬＥＵＫＩＮと同様なＴ細胞活性化能力を示した。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮは、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒより大きくＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を増加するようであった（図１６Ｃ）。
【０１２０】
ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団上に発現されるＣＤ２５分子の数（蛍光の平均）は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮまたはＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ処置のどちらでも同じ速度論をたどった（図１７）。
【０１２１】
（ｂ）リンパ球輸送：ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ処置の影響．
Ｔ及びＮＫ細胞集団に対するＰＲＯＬＥＵＫＩＮ及びＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ活性を処置の前、間及び後の循環するリンパ球の絶対数の変化の分析により決定した（図１８）。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋循環リンパ球の絶対数を増加することに対してＰＲＯＬＥＵＫＩＮより大きい活性を（図１８Ａ）、そしてＣＤ３＋ＣＤ８＋循環リンパ球の絶対数を増加することに対してＰＲＯＬＥＵＫＩＮに比較してわずかに減少した活性を有するようであった（図１８Ｂ）。両方の化合物は、ＣＤ３＋リンパ球の総数を増加することに対してあまり大きくないが同様の作用を有した（図１８Ｃ）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮもＩＬ−２／Ｎ８８ＲもＮＫ細胞の輸送に影響を及ぼさなかった（図１８Ｄ）。
Ｃ．結論
ヒト一次Ｔ及びＮＫ細胞アッセイにおけるムテインＩＬ−２タンパク質の評価によりＩＬ−２／Ｎ８８Ｒを作製した。それはＮＫ細胞よりＴ細胞に〜６，０００倍のインビトロ選択性を示す。この細胞性プロフィールに基づき、それは著しいＴ細胞活性化を引き出す用量で投与した場合に軽い副作用のみを誘導すると仮定された。ＩＬ−２／Ｎ８８ＲにＰＲＯＬＥＵＫＩＮを比較するチンパンジーにおける実験により、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒが、Ｔ細胞活性化を誘導する匹敵する能力を保持しながら、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮより著しく優れた安全性プロフィールを有することが確かめられた。
実施例８：ネズミＣＴ−２６肺転移腫瘍モデルにおけるＩＬ−２の選択的アゴニストＮ８８Ｒの効能
プロトコル：マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、メス、６〜８週齢）に０日目に外側尾静脈中に０．２ｍｌのＰＢＳ中１ ｘ １０5のＣＴ−２６細胞（ネズミ結腸癌）を静脈内（ＩＶ）注射した。処置は、移植後１日目に始まり毎日１回８日間（ＱＤｘ８）ＩＶ送達される異なる用量（希釈剤：水中５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）））のＰＲＯＬＥＵＫＩＮもしくはＩＬ−２／Ｎ８８ＲまたはＤ５Ｗであった。ツベルクリン注射器を使用してシリコンで処理したバイアルを用いてＤ５Ｗ中への希釈によりＩＬ−２／Ｎ８８Ｒを室温で調製し、調製の２時間以内に動物に投与した。各バイアルに０．７ｍｌの注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）を加えることによりＰＲＯＬＥＵＫＩＮを調製した（最終濃度、１．８６ｍｇ／ｍｌ）。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒに対して記述したようにＤ５Ｗ中への希釈を行った（表６）。動物を１１日目に殺した。肺を取り出し、重さを量り、ＰＢＳ中ですすぎ、組織をブワン溶液に移した。２４時間後に、組織を１０％ホルマリンに移した。肺中の転移性コロニーの数を解剖顕微鏡下で数えた。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
表７は、個々のマウスにおいて数えられた転移の数を示す。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ及びＰＲＯＬＥＵＫＩＮの両方に対して同様な効能が認められた。高用量のＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（グループ８、６０ｍｇ／ｋｇ）では、１匹を除いて全てのマウスが１２またはそれより少ない転移を有し；これらのマウスのうち３匹はいかなる転移も示さなかった。これは、全ての生存するマウスが１２またはそれより多い転移を有した試験したＰＲＯＬＥＵＫＩＮの最大投与量と対照的である。
【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇの用量のＩＬ−２／Ｎ８８Ｒで処置したマウス（それぞれ、グループ６、７及び８）及び１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置したグループ（グループ３）において転移の有意な（Ｐ＜０．０５）減少が認められた。これらの結果を図１９にグラフを用いて示す。用量の対数を用いてデータをプロットし；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮに対しては、用量は３及び１０ｍｇ／ｋｇであり；ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒに対しては、用量は１、３、１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇであった。非線形方程式を用いる曲線調整により、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮでは５．２ｍｇ／ｋｇ、そしてＩＬ−２／Ｎ８８Ｒでは１０．９ｍｇ／ｋｇのＩＣ50値を得た。
【０１２６】
この実験のデータから、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの転移数の減少に関するＩＣ50は１０．９ｍｇ／ｋｇ（９５％の信頼性で８．６〜１３．９ｍｇ／ｋｇ）であり、そしてＰＲＯＬＥＵＫＩＮでは５．２ｍｇ／ｋｇ（９５％の信頼性で３．５〜７．７ｍｇ／ｋｇ）であると計算された。
【０１２７】
マウスの生存を表８に示す。１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＬＥＵＫＩＮグループでは、１匹のマウスが７日目に死亡し、そしてさらに５匹が８日目に死亡した。３または１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−２／Ｎ８８Ｒで処置したグループの各々では８日目に１匹のマウスが死亡し、そして１、３０または６０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−２／Ｎ８８Ｒのいずれでも死亡は見られなかった。さらに、３ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置した大部分のマウス及び１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置した全てのマウスが瀕死であり；ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒで処置したマウスではいかなる病的状態も見られなかった。
【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
ＰＲＯＬＥＵＫＩＮで処置した動物は両方のグループにおいて瀕死であった。いずれのＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ処置動物においても病的状態は認められなかった。
【０１３０】
要約すると、これらの研究により、ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒが（ＣＴ２６モデルにおける肺転移数により測定した場合に）腫瘍荷重を減らすことにＰＲＯＬＥＵＫＩＮと同様に有効であることが示される。さらに、ＩＬ−２／Ｎ８８ＲはＰＲＯＬＥＵＫＩＮより実質的に毒性が低いことが示された。
実施例９．ＩＬ２Ｎ８８Ｒを発現する安定な大量生産するＣＨＯ細胞系の開発．
図２０に示す発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号 ）でＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞をトランスフェクトすることにより大量のＩＬ２Ｎ８８Ｒムテインを分泌する安定な生産細胞系を開発した。ＩＬ２Ｎ８８Ｒ発現ベクターの個々の要素はプラスミド地図中に示される（図２０）。それにはＣＭＶｅ／ｐ＝サイトメガロウイルス初期プロモーター；ＰＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；及びＤＨＦＲ＝ジヒドロ葉酸レダクターゼ発現カセットが示される。
【０１３１】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてこのベクターを構築した。一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，１９９２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８５，Ｅｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９１を参照。この発現ベクターはＩＬ２Ｎ８８Ｒ遺伝子のための別個の発現カセット及び増幅可能で且つ選択可能な遺伝子ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を含有する。リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を製造業者の説明書に従って用いて約１ ｘ １０6のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に１０μｇのｐＢＣ１ＩＬ２ＳＡをトランスフェクトした。次に、これらの細胞を５０ｎＭのメトトレキセートの存在下で選択し、５％の透析したウシ胎仔血清を加えたチミジン及びヒポキサンチンを欠くＤＭＥ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）中で増やした。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて細胞集団をＩＬ２Ｎ８８Ｒ生産に関して評価した。増加する濃度のメトトレキセート（１００〜４００ｎＭのメトトレキセート）を含有する培地中で大量生産する集団をさらに選択し、ＩＬ２Ｎ８８Ｒの生産に関して評価した。次に、大量で且つ安定な生産性を有するクローンを得るために限界希釈クローニングを適用した。標準的な組織培養技術を用いてメトトレキセートの非存在下でクローニングを行った。
実施例１０．灌流バイオリアクターにおけるＩＬ２Ｎ８８Ｒの無血清生産．
連続灌流発酵によりＩＬ２Ｎ８８Ｒの連続生産を行った。１９リットルのＷｈｅａｔｏｎ発酵槽に実施例９の安定なＣＨＯ細胞系を２ ｘ １０6細胞／ｍｌで接種し、５リットル／日の培地交換率で灌流させた。生産培地は、組換えヒトインシュリン（１０μｇ／ｍｌ）（ＨＵＭＵＬＩＮTM、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）及びＦｅＳＯ4．ＥＤＴＡ（５０μＭ）を補足したＤＭＥ／Ｆ１２に基づく培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であった。細胞密度を４ ｘ １０6細胞／ｍｌで保った。発酵槽の平均日収量は〜２００ｍｇ／日であった。ＩＬ２Ｎ８８Ｒ生産は３０日間安定に保たれた。
実施例１１．ＣＨＯ細胞において生産されたＩＬ−２／Ｎ８８Ｒの精製．
上記の灌流溶出液に以下の方法を適用した。灌流培地を集め、Ｓ−セファロースカラムにかけた。カラムをｐＨ ７．０の５ミリモルＮａＣｌを含む２０ミリモルのリン酸塩バッファーで平衡化した。供給材料（「ＴＣＦ」）を水の添加で４ミリジーメンスの伝導率に調整し、リン酸で同じｐＨに調整する。
【０１３２】
ＴＣＦを添加した後、カラムを同じ平衡バッファー中で洗浄する。ｐＨ変化により溶出を実施する。２０ｍＭ エタノールアミン、ｐＨ １０．５でムテインを溶出し、カラムからムテインを洗い取ってＳ−溶出液を生成せしめた。
【０１３３】
ｐＨ１０．５の１０ｍＭ重炭酸塩バッファーで平衡化したＱＡＥ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムにＳ溶出液を通すことにより陰イオン交換を実施した。流速を２５０ｃｍ／時間で保った。ベースラインまで洗浄した後、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ ４．０でＩＬ−２ＳＡを溶出した。
【０１３４】
ｐＨ７．０の０．１０ｍＭリン酸塩で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイト（タイプII、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を充填したカラムに希釈したＱＡＥ溶出液（ＷＦＩで１：１）を通すことによりヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）クロマトグラフィーを実施した。流速を２５０ｃｍ／時間で保った。ベースラインまで洗浄した後、ｐＨ ７．０の１００ｍＭリン酸塩でＩＬ２ＳＡを溶出した。
【０１３５】
３個のＰＥＳ ５Ｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃｏｎ−２装置を用いてヒドロキシアパタイト溶出液を３００ｍｌの容量まで限外濾過した。
【０１３６】
限外濾過したＨＡＰ溶出液を３５ｃｍ／時間でＳ１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラムに通すことによりさらに精製した。カラムを１０ｍＭリン酸塩及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．０で平衡化した。
【０１３７】
ゲル濾過プールをＷＦＩで希釈して４．０ｍＭｈｏｓ／ｃｍの伝導率を得、先に記述した条件下でＳ−セファロースに再びかけた。ｐＨ ７．０の１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩バッファーでＩＬ２ＳＡを溶出した。
【０１３８】
最終的な陽イオン交換プールをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して一晩透析し、滅菌したＰＢＳで６ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。次に、最終的な希釈したプールを滅菌濾過し、等分し、次に−７０℃で凍結した。全回収率は６５％であった。
【０１３９】
本発明の他の態様は当業者に明らかになる。本発明は、本明細書には詳細に記述されないがＰＨＡ−芽細胞増殖により立証されるようなＴ細胞活性化及び減少したＮＫ細胞増殖をもたらすムテインをどのようにして得るかを教示しており、それによりこれらのムテインは本発明の精神及び範囲内に入る。本明細書に記述する概念及び実験方法は、異種起源のマルチマー受容体系を利用する他のサイトカイン、特に関連するサイトカインＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５、ＩＬ−１０、インターフェロンα並びにインターフェロンγに適用できるはずである。
【０１４０】
配列
以下の配列は本願内に含まれる：
配列番号：１：ｈＩＬ−２（アミノ酸）
配列番号：２：ｈＩＬ−２（ｃＤＮＡ）
配列番号：３：５’ＰＣＲプライマー、ＩＬ−２
配列番号：４：３’ＰＣＲプライマー、ＩＬ−２
配列番号：５：ＩＬ−２発現ベクターのための突然変異誘発プライマー
配列番号：６：Ｄ２０Ｘ突然変異のための突然変異誘発プライマー
配列番号：７：Ｎ８８Ｘ突然変異のための突然変異誘発プライマー
配列番号：８：Ｑ１２６Ｘ突然変異のための突然変異誘発プライマー
【０１４１】
【図面の簡単な説明】
【図１〜７】  ｗｔヒトＩＬ−２（ＩＬ−２）及びＤ２０Ｈ（図１）、ＩＬ−２及びＤ２０Ｉ（図２）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｇ（図３）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｉ（図４）、ＩＬ−２及びＮ８８Ｒ（図５）、ＩＬ−２及びＱ１２６Ｅ（図６）並びにＩＬ−２及びＱ１２６Ｌ（図７）の用量−応答曲線を示す。Ａ：一次ヒトＴ細胞増殖アッセイ（ＰＨＡ−芽細胞）におけるＩＬ−２（黒丸）及びムテイン（白丸）の個々の用量応答。Ｂ：一次ヒトＮＫ細胞増殖アッセイにおけるＩＬ−２（黒三角）及びムテイン（白三角）の個々の用量応答。
【図８Ａ〜８Ｄ】  ビヒクルコントロール（Ｘ−１２６、ひし形）と比較して、チンパンジーにおけるＰＲＯＬＥＵＫＩＮTMの毒性を２匹の動物（Ｘ−１５９、三角及びＸ−１２４、四角）において評価した。毒性を腎パラメーター（血液尿素窒素（ＢＵＮ）、Ａ；クレアチニン、Ｂ）及び肝機能（総ビリルビン、Ｃ；ＡＬＴ、Ｄ）により評価した。
【図９】  ３０日にわたる体重％変化のグラフ。ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物の体重を示した日に測定した。
【図１０Ａ〜１０Ｄ】  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物のリンパ球（Ａ）、全白血球（Ｂ）、好中球（Ｃ）及び血小板（Ｄ）を示した日に評価した。
【図１１Ａ〜１１Ｄ】  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物の血液尿素窒素（Ａ、ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｂ）、リン（Ｃ）及びアニオン差（Ｄ）を示した日に評価した。
【図１２Ａ〜１２Ｄ】  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物の総ビリルビン（Ａ）、ＡＬＴ（Ｂ）、フィブリノーゲン（Ｃ）及び活性化プロトロンビン時間（Ｄ）を示した日に評価した。
【図１３Ａ〜１３Ｄ】  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物のナトリウム（Ａ）、塩化物イオン（Ｂ）、カルシウム（Ｃ）及びカリウム（Ｄ）の血液レベルを示した日に評価した。
【図１４Ａ〜１４Ｃ】  ＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（三角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（四角）またはビヒクル（ひし形）で処置した動物の血液中のアルブミンレベル（Ａ）、ヘマトクリット（Ｂ）及びヘモグロビン（Ｃ）を示した日に評価した。
【図１５Ａ〜１５Ｃ】  全Ｔ細胞集団（Ａ、ＣＤ３＋細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団（Ｂ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団（Ｃ）に対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（四角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（ひし形）及びビヒクル（三角）の影響を示す。
【図１６Ａ〜１６Ｃ】  全Ｔ細胞集団（Ａ、ＣＤ３＋細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団（Ｂ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団（Ｃ）に対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（四角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（ひし形）及びビヒクル（三角）の影響を示す。
【図１７】  ＣＤ２５陽性細胞の蛍光の平均に関するＴ細胞活性化に対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ及びＰＲＯＬＥＵＫＩＮの影響。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団に対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（四角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（ひし形）及びビヒクル（三角）の影響を示す。ＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞集団に対する蛍光の平均を評価するためには不十分な数のＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞が得られた。
【図１８Ａ〜１８Ｄ】  ＣＤ４＋Ｔ細胞集団（Ａ、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団（Ｂ、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞）、全Ｔ細胞集団（Ｃ、ＣＤ３＋細胞）及びＮＫ細胞集団（Ｄ、ＣＤ３−／ＣＤ１６＋細胞）に対するＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（四角）、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（ひし形）及びビヒクル（三角）の影響を示す。
【図１９】  ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（白丸）またはＩＬ−２／Ｎ８８Ｒ（黒丸）で処置したマウスにおける用量に対する肺転移のグラフ。肺転移を研究の最後に数えた。
【図２０】ＩＬ２Ｎ８８ＲベクターｐＢＣ１ＩＬ２ＳＡのプラスミド地図。
【配列表】
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【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
0004276783.tif 000018
【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
0004276783.tif 000020
【図８Ａ−８Ｄ】
0004276783.tif 000021
【図９】
0004276783.tif 000022
【図１０Ａ−１０Ｄ】
0004276783.tif 000023
【図１１Ａ−１１Ｄ】
0004276783.tif 000024
【図１２Ａ−１２Ｄ】
0004276783.tif 000025
【図１３Ａ−１３Ｄ】
0004276783.tif 000026
【図１４Ａ−１４Ｃ】
0004276783.tif 000027
【図１５Ａ−１５Ｃ】
0004276783.tif 000028
【図１６Ａ−１６Ｃ】
0004276783.tif 000029
【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｄ】
0004276783.tif 000031
【図１９】
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【図２０】
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