(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（I）で表されるオリゴヌクレオチド及び下記の式（II）で表されるオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−Ｓ−Ｏ１−３’ （I）
（式中、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、5'-gcgucuagccauggcguua-3'（配列番号１９）、5'-ggacgaccggguccuuucu-3'（配列番号２１）、5'-ggccuugugguacugccug-3'（配列番号２３）又は5'-ggucucguagaccgugcac-3'（配列番号２５）の配列を含む連続した塩基数１９〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１は塩基数１〜４個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
３’−Ｏ２−Ａ−５’ （II）
（式中、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１９〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ２は塩基数１〜４個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
【請求項２】
下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ） Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ） Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
【請求項３】
Ｓ及びＡが塩基数１９〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項１又は２記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Ｓ及びＡが塩基数１９〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項３記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｓ及びＡが塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項４記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列である請求項１〜５のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列である請求項１〜５のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
Ｏ1及びＯ2の塩基配列が下記の塩基配列(III)からなる請求項１〜７のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−（Ｔ）ｍ−３’ （ＩＩＩ）
（配列(III)において、mは１〜１０のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
【請求項９】
下記の(i)〜(iv)からなる群より選択される請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
(i)式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-gcgucuagccauggcguuaTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含み、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTcgcagaucgguaccgcaau-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
(ii) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggacgaccggguccuuucuTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含み、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccugcuggcccaggaaaga-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
(iii) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggccuugugguacugccugTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含み、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccggaacaccaugacggac-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
(iv) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggucucguagaccgugcacTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含み、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccagagcaucuggcacgug-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
プロモーターの制御下で、ステムループ型のＲＮＡを発現することができる請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
式（I）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと式（II）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築した請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
スペーサー領域の塩基配列が配列番号１４又は１６の塩基配列からなる請求項１２記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
式（II）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結した請求項１２又は１３記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
ターミネーターが下記の塩基配列（IV）を有するＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’ （ＩＶ） （配列（IV）において、pは４〜８のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5’は5’末端を表し、3’は3’末端を表す。）
【請求項１６】
プロモーターの制御下で、タンデム型のＲＮＡを発現することができる請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
式（I）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの3’末端側にターミネーターを連結したもの及び式（II）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの3’末端側にターミネーターを連結したものをそれぞれプロモーターの制御下に置くように構築した請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
ターミネーターが下記の塩基配列（IV）を有するＤＮＡである請求項１７記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’ （ＩＶ）
（配列（IV）において、pは４〜８のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5’は5’末端を表し、3’は3’末端を表す。）
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターを保持する細胞。
【請求項２１】
哺乳動物細胞である請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物であるＲＮＡ。
【請求項２３】
下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する請求項２２記載のＲＮＡ。
（Ａ） Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ） Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１９記載の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項２５】
Ｃ型肝炎の予防および／または治療のために用いられる請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１９記載の発現ベクターを有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制することができる二本鎖オリゴヌクレオチド、それをコードするＤＮＡ、その発現ベクター、並びに該二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及び発現ベクターの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
C型肝炎ウイルス(HCV)は肝臓に関連する罹病率および死亡率の主要な原因である。このウイルスは肝臓に持続感染し、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞性癌を発症する(非特許文献１)。HCV感染に対する安全・確実な治療はいまだに開発されていない。なぜなら、HCVに関する研究は安定した細胞培養系が無いこと、および小動物モデルが無いことによって妨げられてきたからである。最近報告されたHCVレプリコンは、ヒト肝癌Huh7細胞中で効率的かつ連続的に複製する選択可能なサブゲノムHCV-RNAである(非特許文献２)。このレプリコンシステムの開発はHCV複製、宿主-細胞相互作用および抗ウイルス療法に関する種々の分子的研究を可能とした。
【０００３】
RNA干渉(RNAi)とは、二本鎖RNA (dsRNA)によって開始される、配列特異的な、メッセンジャーRNA(mRNA)転写後に起こる遺伝子抑制プロセスである。RNAiは21-23個のヌクレオチドからなるRNA（siRNA）を介した多段階プロセスにより、siRNAに相補的なRNAの分解をもたらす(非特許文献３)。しかし、哺乳動物細胞において二重鎖RNAは強い細胞傷害性応答を誘発し、RNA転写産物の非特異的分解および宿主細胞タンパク質翻訳の非特異的低下をもたらす(非特許文献４及び５)。この問題は、遺伝子特異的抑制を媒介するに十分長いが、長いdsRNAの悪影響を回避するに十分短いin vitroで合成されたsiRNAの使用によって最近克服された(非特許文献６)。RNAiは遺伝子機能解析・および遺伝子抑制治療へ応用できる強力な道具となった。最近、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびポリオウイルスの複製をsiRNAによって有効に抑制したことが報告されている(非特許文献７及び８)。
【０００４】
【非特許文献１】
Alter, M.J. (1997) epidemiology of hepatitis C. Hepatology, 26, 62S-65S.
【０００５】
【非特許文献２】
Lohmann, V., Koerner, F., Koch, J., -O., Herian, U., Theilmann, L. and Bartenschlager, R. (1999) Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science, 285, 110-113.
【０００６】
【非特許文献３】
Sharp, P.A. (2001) RNA interference. Genes Dev., 15, 485-490.
【０００７】
【非特許文献４】
Baglioni, C. and Nilsen, T.W. (1983) Mechanisms of antiviral action of interferon. Interferon, 5, 23-42.
【０００８】
【非特許文献５】
Williams, B.R. (1997) Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem. Soc.Trans., 25, 509-513.
【０００９】
【非特許文献６】
Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T. (2001a)
【００１０】
【非特許文献７】
Gitlin, L., Karelsky, S. and Andino, R. (2002) Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells. Nature, 418, 430-434.
【００１１】
【非特許文献８】
Jacque, J.M., Triques, K. and Stevenson, M. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature, 418, 435-438.
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、siRNAを利用してＨＣＶの複製を抑制することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
HCVゲノムは、ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする1個の長いオープンリーディングフレームを含むプラス鎖RNAである。ウイルスゲノムの翻訳は5'末端非翻訳領域(5'-UTR)に位置するリボソーム結合進入部位(IRES)によって媒介される(Tsukiyama-Koharaら, 1992)。HCVゲノムは異なるHCV株の間で相当の変異性がある。しかし、5'-UTRおよびコア領域の上流は99.6%の相同性を有し、最も保存されている(Chooら, 1991; Katoら, 1990; Okamotoら, 1991)。siRNAと標的の間の配列ミスマッチはRNAiの効果に重大な影響を及ぼすため、5'-UTRはsiRNAの理想的な標的であると考えられる。本発明者は、HCV-RNAの5'-UTRを標的とするsiRNA、およびsiRNAを発現するDNAに基づくベクターを作製し、ルシフェラーゼリポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子のキメラタンパク質を発現するHCVレプリコンを用いてウイルス複製に対する効果を評価した。その結果、HCVゲノムの保存された5'-UTRを標的とするsiRNAによってウイルス複製が著明に抑制された。本発明は上記の知見により、完成されたものである。
【００１４】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  下記の式(I)で表されるオリゴヌクレオチド及び下記の式(II)で表されるオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
5'-Ｓ−Ｏ1-3'    (I)
（式中、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個のRNA配列であり、Ｏ1は塩基数１〜１０個のDNA配列であり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
3'-Ｏ2−Ａ-5'    (II)
（式中、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜３０個のRNA配列であり、Ｏ2は塩基数１〜１０個のDNA配列であり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
（２）  下記(A)及び／又は(B)の作用を有する（１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
(A) Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
(B) Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
（３）  Ｓ及びＡが塩基数１９〜５０個のRNA配列であり、Ｏ1及びＯ2が塩基数２個のDNA配列である（１）又は（２）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（４）  Ｓ及びＡが塩基数１９〜３０個のRNA配列であり、Ｏ1及びＯ2が塩基数２個のDNA配列である（３）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（５）  Ｓ及びＡが塩基数１９個のRNA配列であり、Ｏ1及びＯ2が塩基数２個のDNA配列である（４）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（６）  Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のRNA配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のRNA配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（７）  Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のRNA配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のRNA配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（８）  Ｏ1及びＯ2が下記の塩基配列(III)を有する（１）〜（７）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
5'-(T)m-3'    (III)
（配列(III)において、mは１〜１０のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
（９）  下記の(i)〜(iv)からなる群より選択される（１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
(i)式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-gcgucuagccauggcguuaTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有し、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTcgcagaucgguaccgcaau-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
(ii) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggacgaccggguccuuucuTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有し、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccugcuggcccaggaaaga-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
(iii) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggccuugugguacugccugTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有し、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccggaacaccaugacggac-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
(iv) 式(I)で表されるオリゴヌクレオチドが5'-ggucucguagaccgugcacTT-3'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有し、式(II)で表されるオリゴヌクレオチドが3'-TTccagagcaucuggcacgug-5'（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Tはチミンであり、小文字のアルファベットはRNAを表し、大文字のアルファベットはDNAを表し、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（１０）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡ。
（１１）  プロモーターの制御下で、ステムループ型のRNAを発現することができる（１０）記載のＤＮＡ。
（１２）  式(I)で表されるオリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡと式(II)で表されるオリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築した（１１）記載のＤＮＡ。
（１３）  スペーサー領域が配列番号１４又は１６の塩基配列を有する（１２）記載のＤＮＡ。
（１４）  式(II)で表されるオリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡの3'末端側にターミネーターを連結した（１２）又は（１３）記載のＤＮＡ。
（１５）  ターミネーターが下記の塩基配列(IV)を有するＤＮＡである（１４）記載のＤＮＡ。
5'-(T)p-3'  (IV)
（配列(IV)において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
（１６）  プロモーターの制御下で、タンデム型のRNAを発現することができる（１０）記載のＤＮＡ。
（１７）  式(I)で表されるオリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡの3'末端側にターミネーターを連結したもの及び式(II)で表されるオリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡの3'末端側にターミネーターを連結したものをそれぞれプロモーターの制御下に置くように構築した（１６）記載のＤＮＡ。
（１８）  ターミネーターが下記の塩基配列(IV)を有するＤＮＡである（１７）記載のＤＮＡ。
5'-(T)p-3'  (IV)
（配列(IV)において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Tはチミンであり、5'は5'末端を表し、3'は3'末端を表す。）
（１９）  （１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（２０）  （１９）記載の発現ベクターを保持する細胞。
（２１）  哺乳動物細胞である（２０）記載の細胞。
（２２）  （１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物であるＲＮＡ。
（２３）  下記(A)及び／又は(B)の作用を有する（２２）記載のＲＮＡ。
(A) Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
(B) Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
（２４）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、（１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１９）記載の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
（２５）  Ｃ型肝炎の予防および／または治療のために用いられる（２４）記載の医薬組成物。
（２６）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、（１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１９）記載の発現ベクターを有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制するための薬剤。
【００１５】
式(I)において、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個、好ましくは１９〜５０個、より好ましくは１９〜３０個、最も好ましくは１９個のRNA配列である。Ｏ1は塩基数１〜１０個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個のDNA配列である。
【００１６】
式(II)において、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜５０個、好ましくは１９〜５０個、より好ましくは１９〜３０個、最も好ましくは１９個のRNA配列である。Ｏ2は塩基数１〜１０個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個のDNA配列である。
【００１７】
式(I)で表されるオリゴヌクレオチド及び式(II)で表されるオリゴヌクレオチドの5'末端及び3'末端は水酸基であるとよいが、それに限定されるわけではなく、所望の効果を有する限り、種々の置換、修飾等がなされていてもよい。置換及び修飾の例としては、5'末端を5'モノリン酸化すること、3'末端の2'水酸基を2'-デオキシ、2'-O-メチル、ビオチン、2',3'-ダイデオキシシトシン、アミノプロピルホスホエステルに変えることなどを挙げることができる。
【００１８】
また、式(I)で表されるオリゴヌクレオチドと式(II)で表されるオリゴヌクレオチドとは連結されていてもよい。この連結は、式(I)で表されるオリゴヌクレオチドの3'末端側と式(II)で表されるオリゴヌクレオチドの5'末端側が、直接あるいは塩基数１〜１００個、好ましくは３〜３０個、より好ましくは５〜２０個のRNA又はDNA配列を介して、結合する様式であるとよい。式(I)で表されるオリゴヌクレオチドと式(II)で表されるオリゴヌクレオチドを連結するRNA又はDNA配列としては、配列番号１４及び１６の塩基配列を有するDNAがコードするRNA又はDNA配列を挙げることができる。
【００１９】
配列(III)において、ｍは１〜１０のいずれかの整数であるが、好ましくは１〜４のいずれかの整数であり、より好ましくは２である。
【００２０】
本明細書において、「二本鎖」とは、通常、２本の分子鎖が相補的な塩基対（すなわち、二本鎖RNAの場合、グアニンとシトシンの組合せ、またはアデニンとウラシルの組合せの塩基対）をつくることによって、１本の軸のまわりにらせん構造を形成している状態をいうが、１本の分子鎖が折り畳まれることにより、同一鎖内に二本鎖が形成されることもあるので、この態様も含まれるものとする。
【００２１】
「スペーサー領域」とは、遺伝子と遺伝子との間に存在する配列を意味する。ここで、「遺伝子」とは、転写されるＲＮＡ分子の全体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの部分をいう。
【００２２】
「対向する」とは、２つの配列が互いに逆方向となるように配置されていることをいう。一般に、核酸の配列について、方向とは５'末端から３'末端に向かう向きを意味する。
【００２３】
「プロモーター」とは、転写開始反応に関与するＤＮＡ領域を含む概念であり、プロモーターは、転写開始反応に関与するＤＮＡ領域のみならず、転写開始反応の効率に影響を与える様々なＤＮＡエレメント（すなわち、調節配列）を含んでもよい。
【００２４】
「プロモーターの制御下に置く」とは、プロモーターからの転写を受けて、所望のＤＮＡの転写産物が生成するように、ＤＮＡとプロモーターが結合していることをいう。従って、ＤＮＡに対するプロモーターの位置は、その下流、上流を問わないが、通常、上流に位置する。また、ＤＮＡとプロモーターとの間には、ＤＮＡの転写が起こりえる限り、任意の他のＤＮＡ配列が存在してもよい。
【００２５】
「ターミネーター」とは、転写を終結させるのに必要なＤＮＡ配列である。
【００２６】
「ステムループ」とは、一本鎖RNA上に存在する逆方向反復配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分（ステム;stem）とそれに挟まれるループの部分から成る構造をいい、ヘアピンループとも呼ばれる。ステムループ型RNA分子は、ステム領域が二本鎖RNA構造をしており、細胞質において、ダイサー(Dicer)を含むリボヌクレアーゼIII複合体(RISC)によって処理され、RNAi効果を有するsi(短鎖干渉;short interfering)RNAが生成されうると考えられる。siRNAは、通常20bp程度の二本鎖RNA分子であり、RNAi効果を有することが知られているが、20bp程度の大きさのものに限定されるものではない。ダイサーおよびRISCは、細胞質に局在しているものと考えられているので、ステムループ型RNA分子を細胞質へ移行させることは、RNAi効果を発揮させるために重要である。
【００２７】
「タンデム」とは、一本鎖RNA上に存在する逆方向反復配列が直列に結合している構造をいう。
【００２８】
なお、本明細書において、「siRNA」とは、RNA干渉作用を有する（すなわち、標的とするmRNAを切断する活性を有する）短い二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。siRNAの塩基数は、通常５０個以下であり、好ましくは１０〜４０個であり、より好ましくは１０〜３０個である。siRNAは、RNA分子に限定されるわけではなく、RNA分子と他のヌクレオチド（例えば、DNAなど）とのキメラ分子であってもよく、また、これらの分子の置換体又は修飾体であってもよい。RNA及びDNA分子の置換体及び修飾体の例としては、5'末端を5'モノリン酸化したもの、3'末端の2'水酸基を2'-デオキシ、2'-O-メチル、ビオチン、2',3'-ダイデオキシシトシン、アミノプロピルホスホエステルに変えたものなどを挙げることができる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド及び本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするDNAの転写産物であるＲＮＡは、RNA干渉作用を有するので、siRNAとみなすことができる。
【００２９】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、これは、本発明の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００３１】
１．二本鎖オリゴヌクレオチドの製造
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは化学的合成法で製造することができる。その方法の一例を簡単に説明する。まず、式(I)で表されるオリゴヌクレオチド（センス鎖）および式(II)で表されるオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）のぞれぞれを公知のオリゴヌクレオチド合成法で合成する（Elbashir SM et al. Nature 411, 494-498, 2001）。その後、センス鎖およびアンチセンス鎖を混合し、90〜98℃で1〜4分間アニーリングし、次いで、Mg2+を含有する緩衝液中で冷却する。以上の操作により、二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
【００３２】
２．二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡの製造
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列（すなわち、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜３０個のRNA配列（センス配列）及び前記RNA配列に相補的なRNA配列（アンチセンス配列））をコードするＤＮＡは、随意のプロモーター、センス配列をコードするＤＮＡ、アンチセンス配列をコードするＤＮＡ、随意のターミネーターを含むとよい。
【００３３】
本発明の一実施態様において、センス配列をコードするＤＮＡとアンチセンス配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築する。このように構築したＤＮＡは、プロモーターの制御下で、ステムループ型のＲＮＡを発現することができる。
【００３４】
本発明の別の一実施態様においては、センス配列をコードするＤＮＡの3'末端側にターミネーターを連結したもの及びアンチセンス配列をコードするＤＮＡの3'末端側にターミネーターを連結したもののそれぞれをプロモーターの制御下に置くように構築する。このように構築したＤＮＡは、プロモーターの制御下で、タンデム型のＲＮＡを発現することができる。
【００３５】
プロモーターは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列部分をコードするＤＮＡより対応するRNAを産生し得るものであれば、特に限定されるものではないが、siRNAのような短いRNAの発現に適したpol III系を用いることが好ましい。
【００３６】
polIII系のプロモーターとしては、例えば、U6プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ ＲＮＡプロモーター、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。
【００３７】
U6プロモーターの塩基配列を以下に記載する。
gAA TTCAAGGTCG GGCAGGAAGA GGGCCTATTT TCCATGATTC CTTCATATTT GCATATACGA TACAAGGCTG TTAGAGAGAT AATTAGAATT AATTTGACTG TAAACACAAA GATATTAGTA CAAAATACGT GACGTAGAAA GTAATAATTT CTTGGGTAGT TTGCAGTTTT AAAATTATGT TTTAAAATGG ACTATCATAT GCTTACCGTA ACTTGAAAGT ATTTCGATTT CTTGGCTTTA TATATCTT（配列番号１５）
【００３８】
また、プロモーターとして、誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイミングでsiRNAを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンで誘導可能なU6プロモーター（Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)）等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいはCre-LoxPシステムのようなDNA組み換えのシステムを用いて、組織特異的にsiRNAの発現を誘導してもよい。
【００３９】
ターミネーターは、プロモーターの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、T(チミン)塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができる。
【００４０】
スペーサー領域を構成するDNAは、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をし得る限り、その長さは特に制限されないが、通常1〜100塩基、好ましくは、3〜30塩基であり、より好ましくは5〜20塩基である。スペーサー領域を構成するDNAの塩基配列は、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をし得る限り、特に規定されず、任意の配列とすることができる。スペーサー領域は、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をした結果、ループ構造をとる。スペーサー領域のDNAの塩基配列としては、以下のものを挙げることができる。
TTCAAGAGA    (配列番号１４)
TAGAATTACATCAAGGGAGAT    （配列番号１６）
【００４１】
上記の構成要素を含む本発明のDNAは、公知のオリゴヌクレオチド合成法で合成することができる（Elbashir SM et al. Nature 411, 494-498, 2001）。
【００４２】
３．発現ベクターの構築
本発明のDNAは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内で発現させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記DNAをベクターに保持させることが好ましい。本発明のDNAを含むベクターもまた、本発明に含まれる。ベクターは、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、バキュロウイルスベクター（PNAS 1995; 92: 10099）などのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Niitsu Y. et al., Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。
【００４３】
ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、GFPなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、EGFレセプター、B7-2などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよい。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、本発明のベクターが導入された細胞のみを選択することが可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、本発明のDNAからの細胞内での安定的なRNA分子の供給を行うことが可能となる。
【００４４】
４．細胞へのDNA導入
本発明のDNAまたは該DNAを含むベクターを宿主細胞へ導入することにより、宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体に本発明のDNAの転写産物を生産させることができる。宿主となる細胞は、特に限定されず、細菌、動物細胞、植物細胞、菌類（酵母など）等のいかなる細胞を使用してもよいが、哺乳動物細胞が好ましい。
【００４５】
本発明のDNAまたは該DNAを含むベクターの細胞への導入方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法(Virology, Vol.52, p.456 (1973))、エレクトロポレーション法(Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987))
、リポフェクション法(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (198 9))、ウィルスにより感染導入方法(Sci.Am., p.34, March (19 94)) 、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法(Nature, Vol.319, p.791 (1986)) 、ポリエチレングリコール法(EMBO J., Vol.3, p.2717 (1984))、パーティクルガン法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo l.85, p.8502 (1988))、アグロバクテリュウムを介した方法(Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711 (1984)) 等により行うことができる。
【００４６】
本発明のDNAまたは該DNAを含むベクターが導入された細胞を選択する方法としては、本発明のDNAまたは該DNAを含むベクターに特異的なDNA配列をプローブあるいはプライマーとして用いるハイブリダイゼーション、PCR法等の公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターに本発明のDNAが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
【００４７】
５．細胞培養および生成した転写産物の活性測定
本発明のDNAまたは該DNAを含むベクターが導入された細胞を培地で培養し、その培養物から転写産物であるRNAを単離することができる。培地の種類、培養の条件は、細胞の種類により、適宜選択することができる。単離したＲＮＡは、公知の方法により、精製することができる。
【００４８】
生成した転写産物RNAによるＨＣＶの複製を抑制する効果は、後述の実施例に記載のように、ルシフェラーゼアッセイにより測定することができる。
【００４９】
生成した転写産物RNAによるＨＣＶタンパク質の合成を抑制する効果は、後述の実施例に記載のように、ノーザンおよびウェスタンブロッティングにより測定することができる。
【００５０】
６．二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡ及びその発現ベクターの利用
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する効果および／またはＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する効果を有する。また、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターからの転写により生じたＲＮＡも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する効果および／またはＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する効果を有する。従って、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターは、医薬品として、ヒト、その他の動物に投与したり、実験用の試薬として用いることができる。例えば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターをＣ型肝炎の予防および／または治療のために用いることができる。
【００５１】
HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターを導入することによって、細胞中のHCVタンパク質の合成を抑制および／またはHCVの複製を抑制することができる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（"Lipidic vector systems for gene transfer"(1997) R.J. Lee and L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14, 173-206；中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999))、リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、in vitroで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約１０７pfu/ml以上である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法については、例えば、"Viral vectors in gene therapy" (1997) A.E. Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807-838に記載されている。
【００５２】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのRNA配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
材料および方法
siRNAおよびsiRNAを発現するDNAに基づくベクターの調製：siRNAオリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を合成し、95℃で1分間アニーリングし、次に2 mM MgCl2を含有するリン酸緩衝化食塩水（pH 6.8）中でゆっくり冷却した。siRNAを発現するベクターを構築するため、タンデムな形でヒトU6プロモーターを含むインサート、またはセンスおよびアンチセンスsiRNA配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートをPCRによって作製した。これらのインサートをpUC19のU6プロモーターのすぐ下流に挿入した。陰性対照として、無関係な標的であるマチャド-ジョゼフ病遺伝子に対するsiRNAまたはsiRNA発現ベクターを用いた。
タンデムな形でヒトU6プロモーターを含むインサートの塩基配列は以下の通りである。
gAA TTCAAGGTCG GGCAGGAAGA GGGCCTATTT TCCATGATTC CTTCATATTT GCATATACGA TACAAGGCTG TTAGAGAGAT AATTAGAATT AATTTGACTG TAAACACAAA GATATTAGTA CAAAATACGT GACGTAGAAA GTAATAATTT CTTGGGTAGT TTGCAGTTTT AAAATTATGT TTTAAAATGG ACTATCATAT GCTTACCGTA ACTTGAAAGT ATTTCGATTT CTTGGCTTTA TATATCTTgt ggaaaggacg aaacaccNNN NNNNNNNNNN NNNNNNtttt tcAATTCAAG GTCGGGCAGG AAGAGGGCCT ATTTTCCATG ATTCCTTCAT ATTTGCATAT ACGATACAAG GCTGTTAGAG AGATAATTAG AATTAATTTG ACTGTAAACA CAAAGATATT AGTACAAAAT ACGTGACGTA GAAAGTAATA ATTTCTTGGG TAGTTTGCAG TTTTAAAATT ATGTTTTAAA ATGGACTATC ATATGCTTAC CGTAACTTGA AAGTATTTCG ATTTCTTGGC TTTATATATC TTgtggaaag gacgaaacac cNNNNNNNNN NNNNNNNNNN ttttt（配列番号１７）
なお、配列番号１７の塩基配列において、最初および最後のNNN NNNNNNNNNN NNNNNNの配列は、それぞれ、siRNA12、siRNA82、siRNA189、siRNA286、siRNA331または対照siRNAのセンスおよびアンチセンスsiRNA配列である。
センスおよびアンチセンスsiRNA配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートの塩基配列は以下の通りである。
gAATTCAAGGTCG GGCAGGAAGA GGGCCTATTT TCCATGATTC CTTCATATTT GCATATACGA TACAAGGCTG TTAGAGAGAT AATTAGAATT AATTTGACTG TAAACACAAA GATATTAGTA CAAAATACGT GACGTAGAAA GTAATAATTT CTTGGGTAGT TTGCAGTTTT AAAATTATGT TTTAAAATGG ACTATCATAT GCTTACCGTA ACTTGAAAGT ATTTCGATTT CTTGGCTTTA TATATCTT gt ggaaaggacg aaacacc NNN NNNNNNNNNN NNNNNN ttcagaga NNN NNNNNNNNNN NNNNNN ttttt（配列番号１８）
なお、配列番号１８の塩基配列において、最初および最後のNNN NNNNNNNNNN NNNNNNの配列は、それぞれ、siRNA12、siRNA82、siRNA189、siRNA286、siRNA331または対照siRNAのセンスおよびアンチセンスsiRNA配列である。
キメラリポーター遺伝子を発現するHCVレプリコン：HCVレプリコンプラスミドpHCVIbneo-delSは感染性HCVクローンであるHC-N、遺伝子型Ibに由来するものであった(Guoら, 2001)。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPT)遺伝子をFlucおよびNPTからなる融合遺伝子と置換することによってpHCVIbneo-delSを再構築した（pRep-Feo、図1C）。
細胞培養およびトランスフェクション：ヒト肝癌細胞系Huh7（ATCCより入手）およびヒト胎児腎細胞系293T（ATCCより入手）を、10%ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変最小必須培地(Sigma, St. Louis, Missouri)中で37℃で5% CO2下で維持した。siRNAオリゴヌクレオチドおよびプラスミドのトランスフェクションは24ウエルプレート中で、Lipofectamine 2000試薬(Life Technologies, Rockville, MD)を製造者のマニュアルに従って用いて実施した。30 ngのpIRES-Flucおよび2.5-125 nMのsiRNAまたは0.5μgのsiRNA発現ベクターを10 ngのウミシイタケ(renilla)ルシフェラーゼ発現プラスミド(pRL-RSV; Promega)と共に一過性にトランスフェクトした。Huh7/Rep-Feoへのトランスフェクションには、2.5-125 nMのsiRNAまたは0.5μgのsiRNA発現ベクターを10 ngのpRL-RSVと共にトランスフェクトした。
ルシフェラーゼアッセイ：Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega)を用いてルミノメーター(Lumat LB9501, Promega)によりルシフェラーゼ活性を定量した。アッセイはそれぞれ3回実施し、平均値±SDとして対照の百分率で表わした。
MTTアッセイ：siRNAの細胞傷害作用を評価するため、siRNAトランスフェクションの48時間目にCell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)を用いてMTTアッセイを実施した。
ノーザンハイブリダイゼーション：ISOGEN（和光純薬、大阪）を用いて細胞からRNAを抽出した。このRNAをアガロース-ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分離し、Hybond-N+ナイロンメンブレン(Amersham-Pharmacia Biotec, Piscataway, NJ)に転写した。HCVレプリコンRNAを含むメンブレンの上部をレプリコン配列に特異的なジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイズさせ、またメンブレンの下部をβ-アクチン特異的プローブとハイブリダイズさせた。Digoxigenin Luminescent Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)を用いた化学発光反応によりシグナルを検出し、Fluoro-Imager (Roche)により可視化した。
ウエスタンブロッティング：10μgの細胞タンパク質溶出液をNuPAGE 4.12% Bis-TrisGel (Invitrogen, Carlsbad, CA)上で分離し、Immobilon PVDF Membrane (Roche)にブロットした。このメンブレンをモノクローナル抗NS5A抗体(BioDesign, Saco, ME)と共にインキュベートし、化学発光反応(BM Chemiluminescence Blotting Substrate; POD, Roche)により検出した。
統計学的分析：スチューデントのt検定を用いて統計学的分析を実施した；p値が0.05未満で統計学的に有意とみなした。
【００５５】
結果
HCV 5'-UTRを標的としたsiRNA：HCV-RNAの5'-UTRを標的としてsiRNAを設計した（表１）。
【００５６】
【表１】
0004228071.tif 000002
siRNA12のセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示す。
siRNA12のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示す。
siRNA82のセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示す。
siRNA82のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示す。
siRNA189のセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示す。
siRNA189のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示す。
siRNA286のセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示す。
siRNA286のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示す。
siRNA331のセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示す。
siRNA331のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示す。
対照siRNAのセンス鎖の塩基配列を配列番号１１に示す。
対照siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１２に示す。
siRNAのターゲッティング配列は、Brownら(Brownら, 1992)に基づく5'-UTRの二次RNA構造の1本鎖領域に向けられた（図1A）。この領域からGC含量が70％未満である(AA/CA/GA)N19という形の配列を選択した(Elbashir, 2001b)。5'- AA/CA/GAの後のグアニンは、これがDNAに基づくベクターによって発現された場合に、RNAポリメラーゼによる効率的な重合開始に必要とされる。19個のヌクレオチドからなる選択されたRNA分子の最後にTTを付けたものを化学的に合成し、ゲル精製した。
pIRES-Flucに対するsiRNAオリゴヌクレオチドの効果：まず始めに、HCVを標的として設計したsiRNAのHCV IRES媒介翻訳を抑制する能力を試験した。
HCV-IRES-リポーター遺伝子の発現ベクターであるpIRES-Flucを標的として用いた。このベクターは、HCV 5'-UTRおよびホタルルシフェラーゼ(Fluc)遺伝子と読み枠を合わせて連結されたコア領域の上流部分(ヌクレオチド1-377)からなるmRNAを発現するものであった(図1C)。pIRES-FlucおよびsiRNAオリゴヌクレオチドを293T細胞にコトランスフェクションした。siRNA189およびsiRNA331は2.5から125 nMにわたる範囲で用量依存的にルシフェラーゼ活性の発現を有意に抑制した（図2A）。翻訳開始コドンのすぐ上流に向けられたsiRNA331は最も効果的で、ルシフェラーゼ活性を対照の74%分減少させた。対照的に、siRNA12は濃度125 nMでルシフェラーゼ活性を増大させた。
Feo-レプリコン細胞に対するsiRNAの効果：HCVの細胞内複製に対するsiRNAの効果を評価するため、レプリコンの恒常発現しているHuh7細胞(Huh7/Rep-Feo)を標的として用いた。このレプリコンはネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびホタル・ルシフェラーゼからなるキメラタンパク質を発現する（図1C）。Feoと称するこの融合タンパク質は、レプリコン持続増殖細胞の選択およびルシフェラーゼ活性測定による複製レベルの定量が可能である。HCVレプリコンを安定に発現するHuh7/Rep-Feo細胞へsiRNAをトランスフェクションすることにより、siRNA82、189、286および331が用量依存的にHCV-RNAの複製を有意に抑制することを示した（図2B）。Huh7/Rep-Feo細胞を用いたアッセイによって得られたルシフェラーゼ発現の抑制パターンは、siRNAおよびpIRES-Flucのコトランスフェクションによって得られた抑制パターンによく似ていた。最も効果的なsiRNA331はルシフェラーゼ活性を94%抑制した。これらのHCVを標的としたsiRNAはHCV-レプリコンの発現をpIRES-Flucの発現よりも有効に抑制した。濃度125 nMでは、siRNA82はHCV-レプリコンを82%抑制したのに対し、pIRES-Flucを17%抑制した；siRNA189はHCV-レプリコンを77％抑制したのに対し、pIRES-Flucを50%抑制した；また、siRNA331はHCV-レプリコンを94%抑制したのに対し、pIRES-Flucを75%抑制した（図２）。
HCV-RNA配列と無関係な対照siRNAはIRES-Flucリポーター活性にもHCVレプリコンの複製にも何ら影響を及ぼさなかった。siRNAをトランスフェクトした細胞のMTTアッセイは細胞増殖および生存率に対する重大な影響を何ら示さなかった（データは掲載していない）。これらのデータは、ルシフェラーゼ活性の低下はHCV複製に対するsiRNAの特異的抑制効果によるものであって、siRNAによって誘導された細胞死によるものではないことを示していた。
ノーザンおよびウエスタンブロッティング：ノーザンブロッティング分析において、9.6 kbのFeo-レプリコンRNAは濃度2.5、25および125 nMのsiRNA331のトランスフェクションによってそれぞれ減少した（図3A）。このレプリコンRNAのデンシトメトリー分析は、Huh7/Rep-Feoのルシフェラーゼ活性とよく相関していた。同様にウエスタンブロッティングにおいても、HCVレプリコンから翻訳されるHCV NS5Aタンパク質がsiRNA331によって用量依存的に減少していた（図3B）。
siRNAを発現するDNAに基づくベクターの、HCV RNAの発現および複製に対する抑制効果：siRNAオリゴヌクレオチドの上記成果に基づいて、タンデム型(MiyagishiおよびTaira, 2002)およびステムループ型(Brummelkampら, 2002)を含む2つの異なるベクターを用いて、報告された方法の改変法により、siRNA331の配列を発現するDNAに基づくベクターを構築した。タンデム型ベクターは、5個のウリジンからなる3'オーバーハングを有する、siRNAの19ヌクレオチドからなるセンスおよびアンチセンス配列を含んでいた；各配列はU6プロモーターの制御下に置かれていた。ステムループ型ベクターはU6プロモーターの制御下でsiRNAヘアピンを発現した。これらのsiRNAヘアピンは、9個のヌクレオチドからなるループ配列（配列番号１４）によって連結されたセンス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端を含んでいた（図1B）。
siRNA331を発現するベクターをpIRES-Flucと共に293T細胞にコトランスフェクションした。タンデム型およびステムループ型siRNA発現ベクターの両者ともルシフェラーゼ発現を抑制したが、ステムループ型の方がタンデム型よりも効果的であった（図4A）。また、レプリコン細胞においても、タンデム型およびステムループ型の両方のベクターがHCV-RNA複製を有意に抑制した（図4B）。
【００５７】
考察
RNAiはウイルスまたはトランスポゾン等の外来遺伝子の発現を抑制するための、植物や無脊椎動物細胞に古代から備わっている防御機構の1つである(Sharp, 2001)。RNAiが哺乳動物細胞においても抗ウイルス防御に役割を果たすのかどうかは不明である。なぜなら、長いdsRNAは一般にインターフェロン応答等の細胞傷害性作用を誘発するからである。しかし、合成siRNAを用いた分化哺乳動物細胞のトランスフェクションは高度に配列特異的なRNA干渉をもたらすことが最近見いだされた(Elbashirら, 2001a)。そして、ヒトの病原性ウイルス、例えばHIV (Jacqueら, 2002)およびポリオウイルス(Gitlinら, 2002)は作製されたsiRNAの良好な標的であることが示された。
【００５８】
最近、siRNAと共に流体力学的注入ハイドロダイナミックインジェクションによってマウス肝臓中に一過性にコトランスフェクションされたHCV NS5B RNAポリメラーゼ遺伝子の断片がsiRNAによって切断されることが報告された（McCaffreyら, 2002）。しかし、この実験は外部からトランスフェクトされたプラスミドからのタンパク質発現の抑制を示したにすぎず、また該siRNAがHCVの複製そのものをブロックできたのかどうかも示されていない。今回の研究によって、新たに開発されたHCVレプリコン系を利用して、HCV 5'-UTRに向けられたsiRNAが効率的かつ特異的にその標的を切断することが証明された。さらに重要なことに、HCV-RNAのこの切断はウイルスタンパク質の合成を抑制するばかりでなく、ウイルスのサブゲノムRNAの複製をブロックすることを示した。
【００５９】
ウイルス、特にHCV等のRNAウイルスは複製により変異を起こすことが広く知られており、免疫防御機構から逃れるために突然変異したウイルスタンパク質を連続的に産生する(Carmichael, 2002)。これらの突然変異によりsiRNAの攻撃から逃れる可能性がある。なぜなら、siRNAとその標的の間のたった１つの配列ミスマッチが、触媒作用をし、標的を切断する効果に決定的な影響を与えるからである。HCVゲノムのタンパク質をコードする領域配列、例えば上記の研究（McCaffreyら, 2002）において標的とされたNS5B領域は、異なるHCV遺伝子型の間で、また同一遺伝子型の株間においてすら相当の変異性がある(Okamotoら, 1991)。さらに、プルーフリーディング活性を持たないウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼの高いエラー率を考えるならば、タンパク質コード配列中にサイレント突然変異を有するsiRNA耐性変異がすぐに出現しうるであろう。それとは対照的に、本研究において選択された標的である5'-UTRは知られているHCV遺伝子型の間で、ほとんど同一である(Chooら, 1991; Katoら, 1990; Okamotoら, 1991)。さらに、リボソーム結合およびウイルスタンパク質の翻訳を開始するという機能からくる5'-UTRの構造的制限は、その活性を保持するために耐性変異を許さないであろう。よって、HCVゲノムの5'-UTRは臨床利用のためのsiRNAにとって理想的な標的であると思われる。
【００６０】
HCV 5'-UTRに向けられた全てのsiRNAが等しく効果的というわけではなかった。試験したsiRNAの中で、開始コドンの上流に向けられたsiRNA331が最も効果的であった。他方、UTRの5'先端に向けられたsiRNA82はウイルスゲノム発現に対して殆ど効果を示さなかった。これらの結果は、部分的には、siRNAが結合・切断しうる1本鎖ギャップを少数しか残さないIRESの高度に折りたたまれた構造のためであるかもしれない。本発明者らは以前に、siRNA331の上記標的領域は触媒性RNAであるハンマーヘッド型リボザイムがHCVタンパク質発現を抑制するための効果的な標的部位でもあることを報告した(Sakamotoら, 1996)。HCV RNAゲノムの二次構造がsiRNAの効果に影響を及ぼすことが示唆されている。
【００６１】
今回の結果は、siRNAがHCV-レプリコンの発現をIRES-リポーターベクターの発現よりも一層有効に抑制することを示した（図2）。HCVレプリコン系は、NS3ヘリカーゼおよびNS5B RNA依存性RNAポリメラーゼを含む自己によってコードされる非構造タンパク質により触媒されるウイルスゲノムRNA鎖の自律複製を刺激する(BartenschlagerおよびLohmann, 2000)。本研究において見いだされた、HCVレプリコンに対するsiRNAのより強い抑制効果は、ウイルスの自律複製機構に対する多重効果によるものであるかもしれない；ウイルスRNA合成に必須のタンパク質のIRES媒介合成をブロックすること、および相補RNA鎖合成の開始に必要な5'-UTR中のエレメントの切断は、ウイルス複製のさらなる抑制をもたらすかもしれない。このように、本発明のsiRNAはウイルスタンパク質の合成を減少させたばかりでなく、ウイルスゲノムRNAの細胞内複製を抑制し、その結果、RNAiは持続感染した宿主細胞からウイルスを排除しうるという可能性を高めた。
【００６２】
siRNAによるHCV-IRESの切断は、タンパク質の翻訳に対して複雑な効果をもたらしうる。高用量のsiRNA12（5'-UTRのヘリックスIに向けられている；図1A参照）を用いた処理はHCVタンパク質発現およびウイルス複製の増大をもたらした。HCV IRESの正確な機構は解明されていないが、5'-UTRの5'端（ヘリックスIを含む）の欠失は翻訳を増大させた(Fukushiら, 1994; Rijnbrandら, 1995; Wangら, 1993)。さらに、この領域はIRES依存性翻訳を負に調節することもある（Hondaら, 1996; Kamoshitaら, 1997）。それゆえ、IRESのシスまたはトランスに作用する陰性調節エレメントがsiRNAによって不活性化される、すなわち切断されるのであろうと推測される。これらの結果は、最大の効果を達成するためばかりでなく治療上の使用に際して副作用を避けるためにも、ウイルスまたは他の標的に対するsiRNAのターゲッティング配列の注意深い選択が必要であることを示唆している。
【００６３】
全ての感染細胞におけるHCV複製を抑制するに十分効果的でかつ安全な、siRNAの細胞へのin vivoデリバリー方法はまだ確立されていない。siRNAを発現するDNAベクターもまた細胞中のHCV複製を抑制するのに有効であった。本発明者らは現在siRNA331 DNA構築物をアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターに挿入し、より有効なデリバリーベクターとして非ウイルス性2本鎖DNA構築物を作製しようとしている。最近、カチオン性脂質キャリアを必要とせずにデリバリーすることが可能な血清リボヌクレアーゼ耐性の化学的に改変されたsiRNA (Capodiciら, 2002)、または脳および肝臓におけるsiRNAのアデノウイルス媒介デリバリー(Xiaら, 2002)が報告された。デリバリーは未だに大きな障害物であるが、細胞中でHCV複製を抑制する本発明のsiRNAおよびsiRNA発現ベクターの効果は、siRNAによるRNAを標的とするアプローチがHCV感染に対する可能性のある効果的な治療オプションを提供することを示唆している。
【００６４】
引用文献
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【００６５】
【発明の効果】
本発明により、siRNAを利用して、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の合成を抑制することが可能となった。
【００６６】
【配列表】
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【００６７】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、siRNA12のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号２】
配列番号２は、siRNA12のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号３】
配列番号３は、siRNA82のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号４】
配列番号４は、siRNA82のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号５】
配列番号５は、siRNA189のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号６】
配列番号６は、siRNA189のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号７】
配列番号７は、siRNA286のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号８】
配列番号８は、siRNA286のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号９】
配列番号９は、siRNA331のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号１０】
配列番号１０は、siRNA331のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号１１】
配列番号１１は、対照siRNAのセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号１２】
配列番号１２は、対照siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号１３】
配列番号１３は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの5'末端非翻訳領域の一部の塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号１４】
配列番号１４は、スペーサー領域の塩基配列を示す。
【００８１】
【配列番号１５】
配列番号１５は、U6プロモーターの塩基配列を示す。
【００８２】
【配列番号１６】
配列番号１６は、スペーサー領域の塩基配列を示す。
【００８３】
【配列番号１７】
配列番号１７は、実施例で用いた、タンデムな形でヒトU6プロモーターを含むインサートの塩基配列を示す。
【００８４】
【配列番号１８】
配列番号１８は、センスおよびアンチセンスsiRNA配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートの塩基配列を示す。
【００８５】
【配列番号１９】
配列番号１９は、siRNA82のセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００８６】
【配列番号２０】
配列番号２０は、siRNA82のアンチセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００８７】
【配列番号２１】
配列番号２１は、siRNA189のセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００８８】
【配列番号２２】
配列番号２２は、siRNA189のアンチセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００８９】
【配列番号２３】
配列番号２３は、siRNA286のセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００９０】
【配列番号２４】
配列番号２４は、siRNA286のアンチセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００９１】
【配列番号２５】
配列番号２５は、siRNA331のセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【００９２】
【配列番号２６】
配列番号２６は、siRNA331のアンチセンス鎖のRNA部分の塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】パネルA：HCVゲノムの5'-UTRに存在する5'-IRESの予測される二次構造およびsiRNAの標的部位(Brownら, 1992)。
パネルB：siRNA発現ベクターの構造。
パネルC：HCV-IRES-リポータープラスミドおよびレプリコンプラスミドの構造。CMV-P/E、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー；△C、末端切断型HCVコア領域（ヌクレオチド342-377）; Fluc、ホタルルシフェラーゼ遺伝子；BGH pA、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位；pT7、T7プロモーター；5'-UTR、5'末端非翻訳領域（ヌクレオチド1-341）；NPT、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；NS3、NS4、NS5AおよびNS5B、HCV非構造タンパク質；3'-UTR、 3'末端非翻訳領域；EMCV-IRES、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位。
【図２】IRES-リポーターおよびHCVレプリコンに対するsiRNAオリゴヌクレオチドの効果。
パネルA：IRES-ホタルルシフェラーゼ発現ベクター(pIRES-Fluc)、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター(pRL-RSV)および記載した濃度のsiRNAオリゴヌクレオチドまたは対照siRNA (NC)を用いて293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。
パネルB：siRNAオリゴヌクレオチドまたは対照siRNA (NC)を用いてHuh7/Rep-Feo細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイはそれぞれ3回実施し、測定値を平均値±SDとしてsiRNA陰性対照の百分率で表わした。*印はp<0.05を示す。
【図３】レプリコンRNAおよびレプリコン由来HCV非構造タンパク質発現の      siRNAによる抑制。
60 mmプレートに播いたHuh7/Rep-Feo細胞をLipofectamine 2000を用いてモック（レーン1）、2.5 nM（レーン2）、25 nM（レーン3）および125 nM（レーン4）のsiRNA331オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。レーン5；未処理のHuh7細胞。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収した。
パネルA：ノーザンブロッティング。HCVレプリコンRNAを含むメンブレンの上部をレプリコンに特異的なジゴキシゲニン標識化プローブとハイブリダイズさせ、またメンブレンの下部をβ-アクチン特異的プローブとハイブリダイズさせた。レプリコンのフルオログラムの下に記載された数字はデンシトメーター分析の結果を示す；数値はsiRNA陰性対照（レーン1）の百分率として表示されている。
パネルB：ウエスタンブロッティング。全細胞溶解物をNuPAGEゲル上で分離し、Immobilon PVDF Membraneにブロットした。このメンブレンをモノクローナル抗NS5A抗体と共にインキュベートした。
【図４】DNAに基づくsiRNA331発現ベクターのHCV IRES媒介翻訳およびHCV複製に対する効果。
パネルA：モックを用いて、またはpIRES-Fluc、pRL-RSVおよびタンデムもしくはステムループ型siRNA33発現ベクターを用いて293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。
パネルB：モックを用いて、またはDNAに基づくタンデムもしくはステムループ型siRNA33発現ベクターを用いてHuh7/Rep-Feo細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイはそれぞれ3回実施し、測定値を平均値±SDとしてsiRNA陰性対照の百分率で表わした。*印はp<0.05を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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