(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型の決定方法において、
（Ａ）該試料中のHCV被検体鎖を
（ｉ）
【表１】
0004251407.tif 000023
【表２】
0004251407.tif 000024
（ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯは配列番号を表し、ＹはＴもしくはＣを表し、ＫはＧもしくはＴを表し、そしてＲはＧもしくはＡを表す。）
から選ばれる少なくとも一つのプローブ、もしくは
（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたプローブのいずれかに相補的なプローブ、と接触させる工程、および
（B）該プローブと同定すべきHCV単離物のヌクレオチド配列との間で形成され得る複合体を検出する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型の決定方法であって、
（Ａ）該試料中のHCV被検体鎖を
【表３】
0004251407.tif 000025
【表４】
0004251407.tif 000026
（ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯは配列番号を表し、ＹはＴもしくはＣを表し、ＫはＧもしくはＴを表し、そしてＲはＧもしくはＡを表す。）
から選ばれる少なくとも２種のプローブと接触させる工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
下記の
【表５】
0004251407.tif 000027
【表６】
0004251407.tif 000028
（ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯは配列番号を表し、ＹはＴもしくはＣを表し、ＫはＧもしくはＴを表し、そしてＲはＧもしくはＡを表す。）の配列、または前記の配列においてＴがＵに置き換わったものに相当する配列、またはこれらの配列に相補的な配列の少なくとも一つの配列を有するＨＣＶ遺伝子型決定用プローブ。
【請求項４】
２つのプローブの組または２つのプローブの混合物であって、２つのプローブの各々が
【表７】
0004251407.tif 000029
【表８】
0004251407.tif 000030
から選ばれる上記の組または混合物。
【請求項５】
次のＨＣＶタイプ：ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５またはＨＣＶタイプ６の少なくとも一つに属するようなＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するための請求項１及び２のいずれかに記載の方法であって、ここで使用されるプローブが、
【表９】
0004251407.tif 000031
【表１０】
0004251407.tif 000032
（ここで、Ｎｏ．は配列番号を表し、ＹはＣまたはＴを表し、そしてＫはＧまたはＴを表す。）
の領域、または該領域おけるＴがＵに置換わった領域、またはこれらの領域に相補的である領域の少なくとも一つであることを特徴とする方法。
【請求項６】
ＨＣＶのサブタイプを識別および分類する工程をさらに含んでなる請求項５記載の方法であって、請求項５に記載されたプローブの他に、
【表１１】
0004251407.tif 000033
【表１２】
0004251407.tif 000034
（ここで、Ｎｏ．は配列番号を表す。）
の領域、または該領域におけるＴがＵに置換わった領域、またはこれらの領域に相補的である領域の少なくとも一つのプローブが使用され、かつ、一つのタイプについて二つのサブタイプのみが存在する場合は、それらが上記の領域の一つでないことから判断されるサブタイプを排除することによって、これら上記のプローブが決定されるものであることを特徴とする方法。
【請求項７】
識別すべきＨＣＶタイプまたはサブタイプが、以下のひとつの領域のＨＣＶの万能プローブにより同定される：
0004251407.tif 000035
（ここで、Ｎｏ．は配列番号を表し、ＹはＣまたはＴを表す。）
請求項１、２、５および６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーションの工程が標的とする領域を含有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの増幅工程によって進められ、かつ、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域のヌクレオチド−３４１からヌクレオチド−１７１に伸長する領域およびヌクレオチド−６７からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれる配列に相補的なプライマーが使用されることを特徴とする請求項１、２、および５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
増幅が二重のＰＣＲ段階から成り、各段階に特別なプライマーの組が関与し、ここで、第一段階はヌクレオチド−３４１からヌクレオチド−１８６に伸長する領域およびヌクレオチド−５２からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれる外側のプライマーが関与し、そして第二段階はヌクレオチド−３２６からヌクレオチド−１７１に伸長する領域およびヌクレオチド−６８からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ばれるネストプライマーが関与することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該外側のプライマーが
0004251407.tif 000036
（ここで、Ｎｏ．は配列番号を表し、ＷはＡまたはＴを表す。）
あるいはこれらの相補鎖にハイブリダイズし、そしてネストプライマーが
0004251407.tif 000037
（ここで、Ｎｏ．は配列番号を表し、ＲはＡまたはＧを表し、そしてＹはＴまたはＣを表す。）
あるいはこれらの相補鎖にハイブリダイズすることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
プローブが固体支持体上に固定化されている請求項１、２及び５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料中の核酸が固体支持体上に固定化されている請求項１、２及び５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
新規なＨＣＶタイプまたはサブタイプの検出方法または同定方法であって、
（ａ）生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物がどのタイプまたはサブタイプに属するかを請求項１及び２のいずれかに記載の方法により決定する工程、ならびに
（ｂ）ＨＣＶ被検体鎖が請求項１及び２のいずれかで規定されているドメインから選ばれる領域のプローブの少なくとも一つとポジティブにはハイブリダイズしない試料が観察された場合には、その試料中に存在する新規なＨＣＶの完全なゲノムの配列を決定する工程、あるいは決定すべき新規なタイプおよび/またはサブタイプに相当する試料の５’非翻訳領域の一もしくは複数部分の配列を決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１４】
生物学的試料中に存在する新規なＨＣＶタイプおよび/またはサブタイプの検出方法または同定方法であって、新規なＨＣＶタイプおよびサブタイプが、新規なタイプを同定する場合にはタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、およびタイプ６とは異なるものであり；新規なサブタイプを同定する場合にはタイプ１  ＨＣＶ単離物についてはサブタイプ１ａおよび１ｂ、タイプ２  ＨＣＶ単離物についてはサブタイプ２ａ、および２ｂ、タイプ３  ＨＣＶ単離物についてはサブタイプ３ａ、３ｂおよび３ｃとは異なるものであり、かつ、
（ａ）分析すべき生物学的試料中のＨＣＶ単離物の一種もしくは複数種が既知のどのタイプまたはサブタイプに属するかを請求項１及び２のいずれかに記載の方法により決定する工程、ならびに
（ｂ）タイプ１について配列番号５および６、タイプ２について配列番号８または２６、タイプ３について配列番号１３、１４または２１、タイプ４について配列番号１７、１８または１９；サブタイプ１ｂについて配列番号７、サブタイプ２ａについて配列番号９、１０、２２または２４、サブタイプ２ｂについて配列番号１１、１２、２３または２５、サブタイプ３ａについて配列番号１５、あるいはサブタイプ３ｂについて配列番号１６をはじめとする、請求項１２および１３に記載のタイプまたはサブタイプ特異的ドメインのいずれかから選ばれる領域のプローブの少なくとも一つとハイブリダイズしない試料が観察された場合には、該生物学的試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノムの配列を決定する工程、あるいは決定すべき新規なタイプおよび／またはサブタイプに相当する試料の５’非翻訳領域の一もしくは複数部分の配列を決定する工程、を含んで成る方法。
【請求項１５】
固体支持体であって、表面の既知の位置に請求項３および４に記載のプローブの少なくとも一つ、ならびにＨＣＶ単離物が識別されるべき生物学的試料中に含まれると思われるＨＣＶのリボヌクレオチド鎖またはデオキシリボヌクレオチド鎖と該プローブの間にハイブリダイゼーションが存在するか否かを決定するための対照を含む固体支持体。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１及び２に記載のプローブの少なくとも一つ、
（ｉｉ）該プローブとＨＣＶ単離物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、ならびに
（ｉｉｉ）適当な場合には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、
を含むいずれかのＨＣＶ単離物を決定するためのキット。
【請求項１７】
ＨＣＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくとも一つのＨＣＶ単離物をタイプ決定するための、あるいはＨＣＶタイプおよびサブタイプに従い少なくとも一つのＨＣＶ単離物を分類するためのキットであって、
（ｉ）場合により請求項７に記載の一つのプローブ、
（ｉｉ）請求項１及び２に記載されたいずれかから選択された少なくとも一つのプローブ、
（ｉｉｉ）該プローブと上記ＨＣＶ単離物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、ならびに
（ｉｖ）適当な場合には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、
を含むキット。
【請求項１８】
ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、およびＨＣＶタイプ６の少なくとも一つに属するＨＣＶ単離物のタイプ決定をするためのキットであって、
（ｉ）請求項５で規定したプローブの少なくとも一つ、
（ｉｉ）該プローブと上記ＨＣＶ単離物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、ならびに
（ｉｉｉ）適当な場合には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、
を含む上記キット。
【請求項１９】
ＨＣＶタイプまたはサブタイプを識別または分類するためのキットであって、
（ｉ）請求項５または６に規定したプローブの少なくとも一つ、
（ｉｉ）該プローブと上記ＨＣＶ単離物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、ならびに
（ｉｉｉ）適当な場合には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
本発明はHCV単離物の遺伝子型を決定するための、HCVの5’非翻訳領域由来の配列を標的とするプローブの使用に関する。
本発明はまた、HCV単離物の遺伝子型決定法に関する。
本発明はさらにHCV単離物の遺伝子型を決定するためのキットに関する。
C型肝炎ウイルス（HCV）は、非A、非B（NANB）肝炎の大部分を引き起こす陽性鎖でエンベロープを持つRNAウイルスの一族である。それらのゲノム組織はペスチウイルス科（Pestiviridae）およびフラビウイルス科（Flaviviridae）と親密な関連性を示す。幾つかの原型単離物の完全なゲノムを包含するcDNAクローン配列はすでに完璧に決定されている（Katoら、1990;Chooら、1991;Okamotoら,1991;Takamizawaら,1991;Okamatoら,1992b）。これらのゲノムは約9500塩基対の長さである。Kato、TakamizawaおよびChooにより報告された単離物は、3010または3011アミノ酸の塩基読み取り枠（ORF）を含み、ならびにOkamotoにより報告された単離物は3033のアミノ酸をコードする。これらの単離物を比較すると、エンベロープ（E）および非構造領域（NS）はかなりの変異性を表すが、一方5’非翻訳領域（UR）、およびより程度が低いが、コア領域は高度に保存されていることが示されている。
NS3領域のクローン配列を使用して、Kuboら（1989）は日本と米国の単離物を比較し、ほぼ80%のヌクレオチド、および92%のアミノ酸相同性を見い出した。配列変異性の存在は、5’UR,コア、およびE1領域が入手できた時にさらに証明された（HC-J1およびHC-J4;Okamotoら、1990）。日本の研究所では幾つかのNS5断片を単離した後、K1およびK2のふたつの群が記述された（Enomotoら,1990）。“アメリカ様（American-like）”単離物PT-1をK1（これは日本ではより一般的であった）と比較すると、それらは親密な関連性を示したが、群間のヌクレオチド同一性が約80%の異なるサブタイプであった。K2配列は、K1およびPT-1の両方によりわずかに関連しているだけである。なぜならばその相同性が核酸を基準としてわずか67%、アミノ酸を基準として72%観察されたからである。さらにK2はふたつの群（K2aおよびK2b）に分類でき、それらは約80%の群間のヌクレオチド相同性を示した。5’URでのヌクレオチド配列分析では、K1とPT-1との間で99%の同一性を、ならびににK1とK2との間で最高94%の同一性が示され、この分析は5’URを使用して制限断片鎖長多型（RFLP）、ならびにHCVをK1およびK2群に分類すること可能にする（Nakaoら1991）。さらにHC-J6およびHC-J8の完全な配列により、第二群に関する証拠が得られ、ふたつの配列はK2群と関連していた（Okamotoら、1991;Okamotoら1992b）。4つの支脈（すなわちタイプＩ:HCV-1およびHCV-H;タイプII:HCV-J,-BK,HC-J4;タイプIII:HC-J6;タイプIV:HC-J8）を含むHCVの系統発生系図がOkamotoらにより提案された（1992b）。しかし、タイプＩとタイプIIとの間、ならびにタイプIIIとタイプIVとの間に79%の核酸配列相同性を観察することができる。第一群間（タイプＩおよびII）、ならびに第二群間（タイプIIIおよびIV）には程度の低い相関性が67-68%存在するだけである。さらに新たなHCVタイプ、HCV-TがNS5領域を研究した後にタイ国で検出された（Moriら、1992）。HCV-Tはすべての他の既知のNS5配列と65%の相同性を有し、ならびにふたつの群（HCV-TaおよびHCV-Tb）が検出でき、これらはまた約80%の核酸相同性を示した。英国の単離物に見い出された同様な新規群と、タイプＩからIVとの系統発生的関連の解明は、5’UR、コア、NS3およびNS5領域の保存部分を分析することにより可能であった（Chanら,1992a）。新たな系統発生系図が提案され、これによれば’タイプ1’はタイプＩおよびII、’タイプ2’はタイプIIIおよびIV、ならびに’タイプ3’およびそれらの有する単離物E-b1からE-b8、ならびにHCV-Tに対応した。’タイプ3’由来の単離物の5’UR配列の中には他者（Bukhら、1992;Chaら,1992;Leeら、1992）により報告されたものもあった。
幾つかの特許出願はタイプ1HCV単離物のゲノム由来のプローブによりHCVの存在を検出する問題点に取り組んだ（国際公開第92/02642号、欧州特許第419 182号、欧州特許第398 748号、欧州特許第469 438号および欧州特許第461 863号）。さらに、HCV単離物の5’URは一般的なHCV検出のためのプローブおよびプライマーを設計するためのよい候補になることが証明された（Chaら、1991;Inchaupseら、1991）。しかし、これらの特許出願のいずれも、分析すべき試料中に存在するHCVのタイプおよび/またはサブタイプを同定するための方法を与えていない。
種々のHCV遺伝子型感染は種々の血清学的反応性（Chanら、1991）、ならびに種々のインターフェロンIFN-γ処置への応答（Pozattoら、1991;Kanaiら、1992;Yoshiokaら、1992）を生じることが実証され、HCV遺伝子型決定の重要性が強調されている。現在まで、このことはコード領域、または5’URでの莫大な配列決定に関する努力により、あるいはコアープライマーのタイプ-特異的な組み合わせを使用するHCV cDNAについてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により（Okamotoら,1992a）、あるいは5’URまたはNS5領域内の（RFLP）分析により（Nakaoら、1991;Chanら、1992b）達成されただけであった。しかしこれらのいずれの上記特許出願および公開も、分析すべき試料中に存在するHCVのタイプまたはサブタイプを同定するための信頼しうる方法を提供していない。それはこれらの方法では特にタイピングが労働を要し、ならびにサブタイピングはさらに労働荷重であるか、あるいは不可能と思われるからである。この点でLeeら（1992）の、HCV単離物であるHCV324とHCV324X間を、これら単離物のゲノムの5’UR由来のPCR断片により識別する試みは注目できる。その結果はこれら5’URプローブは、それらが誘導されたそれぞれの単離物のゲノムとは特異的反応性を表さないことを実証している。
従って本発明の目的は、生物学的試料中に存在する1種の、または数種のHCV遺伝子型の存在を迅速かつ確実に決定する方法、および決定した単離物（または複数の単離物）を確実に分類する方法を提供することである。
もうひとつの本発明の目的は、未知のHCVタイプまたはサブタイプを同定する方法を提供することである。
本発明のもうひとつの目的は、感染した生物学的流体を、ゲノムの水準で明白にタイプまたはサブタイプと関連した種々の血清学的群に分類できる方法を提供することである。
本発明のもうひとつの目的は、HCVの種々のタイプまたはサブタイプの存在、または不存在を迅速に検出するためのキットを提供することである。
本発明は少なくともひとつのプローブの使用に関し、生物学的試料中に存在するHCV単離物の遺伝子型を決定するために、該プローブは（ｉ）ひとつのHCV単離物の被検体鎖中に存在する、5’非翻訳領域（UR）のヌクレオチド-291位から-66位に伸長するドメイン中の、遺伝子型に特異的な標的領域にハイブリダイズすることができ、または該プローブは（ii）任意の上記に定義したプローブに相補的である。
本発明は好ましくは、約5から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約40ヌクレオチド、ならびに最も好ましくは約15から約30ヌクレオチドを含有する少なくともひとつのプローブの使用に関し、該プローブは（ｉ）例えば図２のcDNA配列により表されるようなcDNA配列によって表されるひとつのHCV単離物のヌクレオチド-291位から-66位に伸長するドメイン中にある、被検体鎖中に存在する遺伝子型に特異的な標的領域にハイブリダイズすることができ、ここでヌクレオチドの位置を示す負の番号は、HCVポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのATGコドンより前にあるヌクレオチドから始まっている。あるいは該プローブは（ii）生物学的試料中に存在するHCVの（インビトロ）遺伝子型決定のために上記に定義したプローブと相補的であり、該試料はHCV陽性であると事前に同定されているかもしれない。
上記方法は他のHCV単離物との相同性の割合に従い、該単離物を分類するために使用することができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば:
完全ゲノム中の核酸水準で74%より高い相同性を表す;
または、ヌクレオチド7935位と8274位との間にあるNS5領域中の核酸水準で74%より高い相同性を表す;
またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で78%より高い相同性を表す;またはアミノ酸2646位と2758位の間にあるそのNS5領域は、アミノ酸水準で80%より高い相同性を表す;
ならびにHCV単離物が同じサブタイプに属するという事実によれば、完全ゲノムにおいて核酸水準で90%より高い相同性、かつ完全ポリタンパク質において、アミノ酸水準で90%より高い相同性を表す。
より好ましくは上述の方法は、以下の事実に従うHCV単離物の分類に関する、
（1）ヌクレオチド7935と8274との間（Chooら、1991）、または8261と8600との間（Katoら、1990）、または8342と8681との間（Okamotoら、1991）にあるNS5b領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.34より低いヌクレオチドディスタンスを表し、通常は0.33より低く、より通常では0.32より低く、および同じサブタイプに属する単離物は0.135より低く、通常は0.13より低く、より通常では0.125より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果、同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.135から0.34の範囲の通常では0.14から0.33の範囲、より通常では0.15から0.32の範囲を表す、ヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.34より高く、通常は0.35より高く、より通常では0.36より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（2）ヌクレオチド378と957との間にあるコア/E1領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.38より低く、通常は0.37より低く、より通常では0.36より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.17より低く、通常は0.16より低く、より通常では0.15より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.15から0.38の範囲の通常では0.16から0.37の範囲の、より通常では0.17から0.36の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.36より高く、通常は0.365より高く、より通常では0.37より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（3）ヌクレオチド4664と5292との間（Chooら、1991）、または4993と5621との間（Katoら、1990）、または5017と5645との間（Okamotoら、1991）にあるNS3/NS4領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.35より低く、通常は0.34より低く、より通常では0.33より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.19より低く、通常は0.18より低く、より通常では0.17より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.17から0.35の範囲、通常では0.18から0.34の範囲、より通常では0.19から0.33の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.33より高く、通常は0.34より高く、より通常では0.35より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
“遺伝子型決定”という用語は、タイピングおよび/またはサブタイピングのいずれかを言う。HCV単離物を’遺伝子型決定’するための方法とは、少なくとも部分的にはHCV単離物を遺伝子型に分類することと考えられている。HCV’遺伝子型’は関連した配列を持つHCV単離物の群である。そのような関連配列は上記および実施例９に説明したようなヌクレオチドディスタンスを示すものとして定義される。より大きな群（HCVタイプ）、とより小さい群（HCVサブタイプ）とは関連していることが示された。HCVタイプはいつでもひとつ以上のHCVサブタイプを含んでいる。したがって、遺伝子型決定法は、サブタイピング（HCVサブタイプへの分類）の不必要なHCV単離物のタイピング（HCVタイプへの分類）を目的とすることができ、または好ましい態様においてはサブタイピングを目的とすることができる。サブタイプへの分類は、本質的にタイプへ分類するためのデータを提供することが理解されるべきである。
“遺伝子型に特異的な標的領域”という表現は、図２および４からすぐに導き出すことができる5’非翻訳領域（UR）中の種々のHCV遺伝子型間で観察される少なくともひとつのヌクレオチド変異を言う。
“HCVポリタンパク質”という用語はサブタイプ1bに属するHCV-J単離物のHCVポリタンパク質を言う（Katoら、1990）。
“プローブ”という表現は、相補性に基づいて特定のHCV単離物中に存在する標的配列とハイブリッドを形成する任意のポリヌクレオチドに対応する。そのようなプローブにはDNA,RNA、または合成ヌクレオチド類似体を含む。本発明のプローブは、固体支持体に固定された被検鎖と共にインキュベートすることができる。本発明の好ましい態様においては、プローブそれ自体を固体支持体に固定することができる。これらのプローブはさらに捕獲プローブを含むことができ、このプローブは次に直接的、または間接的に固体支持体に結合する結合分子にカップルされることを特徴とするか、あるいは標識プローブを含んでもよく、この標識プローブは検出しうる標識を持っているのが特徴である。
本発明は生物学的試料中に存在するHCV単離物の遺伝子型決定法に関し、その方法は以下の工程を含んで成る:
-試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で少なくともひとつのプローブと接近させ、該プローブは（i）ひとつのHCV単離物の5’非翻訳領域のヌクレオチド-291位から-66位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができ、または該プローブは（ii）任意の上記に定義したプローブに相補的であり、ならびに
-該プローブと同定すべきHCV単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形成された複合体を検出する。
本発明はまた生物学的試料中に存在するHCV単離物の遺伝子型決定法に関し、その方法は以下の工程を含んで成る:
-試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で、好ましくは約5から50の、より好ましくは約10から約40ヌクレオチドの、最も好ましくは約15から約30ヌクレオチドの少なくともひとつの該プローブと接触させ、該プローブは（i）例えば図２中のcDNA配列により表されるcDNA配列により表されるひとつのHCV単離物の5’URのヌクレオチド-291位から-66位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができ、ここでその位置の負の番号はHCVポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのATGコドンより前にあるヌクレオチドから始まっており、あるいは該プローブは上記に定義したプローブに相補的であり、
-該プローブと同定すべきHCV単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形成された複合体を検出し、およびハイブリダイゼーションパターンから存在するHCV単離物のタイプ（または複数のタイプ）を判断する。
上述の方法は、他のHCV単離物との相同性の割合に従って該単離物を分類する方法と考えることができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば:
完全ゲノム中の核酸水準で74%より高い相同性を表す;
または、ヌクレオチド7935位と8274位との間にあるNS5領域中の核酸水準で74%より高い相同性を表す;
またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で78%より高い相同性を表す;またはアミノ酸2646位と2758位の間にあるNS5領域は、アミノ酸水準で80%より高い相同性を表す;
ならびに同じサブタイプに属するHCV単離物は、完全ゲノム中の核酸水準で90%より高い相同性、かつ完全ポリタンパク質中のアミノ酸水準で90%より高い相同性を表す。
より好ましくは、上記方法は以下の事実によるHCV単離物の分類に関し、
（1）ヌクレオチド7935と8274位との間（Chooら、1991）、または8261と8600との間（Katoら、1990）、または8342と8681との間（Okamotoら、1991）にあるNS5b領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.34より低く、通常は0.33より低く、より通常では0.32より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.135より低く、通常は0.13より低く、より通常では0.125より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.135から0.34の範囲、通常では0.14から0.33の範囲、より通常では0.15から0.32の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.34より高く、通常は0.35より高く、より通常では0.36より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（2）ヌクレオチド378と957との間にあるコア/E1領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.38より低く、通常は0.37より低く、より通常では0.36より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.17より低く、通常は0.16より低く、より通常では0.15より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.15から0.38の範囲、通常では0.16から0.37の範囲、より通常では0.17から0.36の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.36より高く、通常は0.365より高く、より通常では0.37より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（3）ヌクレオチド4664と5292との間（Chooら、1991）、またはヌクレオチド4993と5621との間（Katoら、1990）、またはヌクレオチド5017と5645との間（Okamotoら、1991）にあるNS3/NS4領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.35より低く、通常は0.34より低く、より通常では0.33より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.19より低く、通常は0.18より低く、より通常では0.17より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.17から0.35の範囲、通常では0.18から0.34の範囲、より通常では0.19から0.33の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.33より高く、通常は0.34より高く、より通常では0.35より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
“被検体鎖”という用語は、生物学的試料中に存在するかもしれない配列を含有すると疑われる一本の、または二本鎖の核酸分子に対応し、該被検体鎖は直接的に検出されるか、または増幅後に検出される。この被検体鎖は好ましくは陽性の、または陰性鎖のRNA、cDNAまたは増幅されたcDNAである。
“生物学的試料”という表現は、HCV配列を含有する任意の生物学的試料（組織または流体）を言い、より具体的には血液、血清または血漿試料を言う。
タイプまたはサブタイプ特異的標的領域間（あるとすれば）と、上述のプローブ間に形成されたハイブリッドの検出は、使用するレポーター分子（reporter molecule）の性質（プローブ上、または標的とする被検体鎖上のいずれかに存在する）に依存し、ならびに比色、蛍光、放射検出、または従来技術を含む任意の他の方法による手段によって測定することができる。
“（HCV）単離物”という用語は自然に感染したヒト、または実験的に感染させた動物から得たC型肝炎ウイルスの遺伝物質を含有する任意の生物学的流体をも言い、ならびにインビトロの実験で得たC型肝炎ウイルス遺伝物質を含有する流体を言う。例えば、インビトロ培養実験由来の細胞および生育培地の両方をHCV遺伝物質の源として使用することができる。
“ハイブリダイズ”、または“標的”という表現は、任意の周知技術に従い行われるハイブリダイゼーション実験を言い、ならびに相同的標的（ひとつまたは2〜3の誤対合を含む）、または好ましくは完全な相同的標的（誤対合は認められない）の検出を可能とする。
本発明において、感受性のあるPCR法が、入れ子状に重複した万能プライマーの組み合わせ（set of nested,universal primer）を用いて、高度に保存された5’URのために使用された。これらプライマーの位置および配列は、すでに報告されているタイプ1および2配列、ならびにタイプ3配列BR56（図２）から誘導された。得られた増幅生成物を、5’URの可変領域に対して定位の、膜片上に平行線として固定された（逆-ハイブリダイゼーション法:reverse-hybridization priciple）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションアッセイは、ライン プローブ アッセイ（line probe assey:LiPA）と呼ばれるが、迅速なアッセイであり、この方法により以前は不完全に記載されたZ4、Z6およびZ7（Bukhら1992）と同様の単離物が検出された。これらHCV株に関する新しいタイプ4の分類が提案されている。BE95およびBE96、ならびにSA1（Chaら、1992）と同様な他の単離物が識別でき、タイプ5aのような単離物を分類することが提案されている。HK2（Bukhら、1992）と同様な単離物を区別することができ、新たなタイプ6aの分類が提案されている。単離物BE98中に新たな遺伝子型が検出され、この単離物をHCVタイプ3、サブタイプ3cに分類することが提案されている。別の新たな配列がGB438中に検出され、これは4fに分類することができた。このLiPA法は、患者血清中に存在するHCVタイプおよびそれらのサブタイプを容易かつ早く決定することを可能にする。
本発明の好適な態様によれば、少なくともふたつのプローブを含むプローブの組が使用される。
好適な態様によれば、本発明の方法において、使用するプローブは以下のひとつのドメイン中の少なくとも5ヌクレオチドの領域を標的とする:
a）図２のヌクレオチド-293位からヌクレオチド-278位に伸長するもの
b）図２のヌクレオチド-275位からヌクレオチド-260位に伸長するもの
c）図２のヌクレオチド-253位からヌクレオチド-238位に伸長するもの
d）図２のヌクレオチド-244位からヌクレオチド-229位に伸長するもの
e）図２のヌクレオチド-238位からヌクレオチド-223位に伸長するもの
f）図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの
g）図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの
h）図２のヌクレオチド-83位からヌクレオチド-68位に伸長するもの
i）図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの
j）ヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの。
領域-170から-155、および-141から-117はウイルスRNA中の同じステム（stem）の部分となることができる直線配列中の可変領域を表す。したがってひとつの領域中での突然変異は、もうひとつの領域のもうひとつの突然変異により補われ、RNA二重鎖の形成が可能となるか、またはならない。変異は他の新しいタイプのHCVにも同じ位置で同様に起こると思われ、それゆえにこれらの可変領域は現在の、および未だ発見されていないが、今後発見されるであろうすべてのHCVタイプを識別するための道具となるであろう。
もうひとつの態様によれば、本発明は少なくとも以下のひとつの配列を標的とするような配列を含んで成るプローブに関する:
0004251407.tif 000002
0004251407.tif 000003
配列中YはTまたはCを表し、
KはGまたはTを表し、
ならびにRはGまたはAを表し、
-またはTがUに置換された対応する配列、
-または上記に定義した配列に相補的な配列。
本発明のもうひとつの有利な態様によれば、少なくとも２種の上記プローブ、またはこれら２種のプローブの混合物が、以下に定義する種々のHCVタイプまたはサブタイプを識別するために使用される。
本発明の方法の好適な態様によれば、HCVのそれぞれのタイプまたはサブタイプを決定するために、２種の異なるプローブの組、または２種の異なるプローブの混合物が使用され、その組の、または混合物の各プローブは、上記に定義した領域の中から選ばれた異なる領域をそれぞれ標的とし、より具体的には上記組または混合物中の２種のプローブは10から40個の連続したヌクレオチドから成り、以下のドメインの対の中からそれぞれ選ばれた２種の領域をそれぞれ標的とする:
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-83位からヌクレオチド-68位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-83位からヌクレオチド-68位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-132位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの。
本発明はまた:
-次の配列:TTC TTG GAA CTA ACC C,
-またはTがUに置換された対応する配列
-または上記に定義した配列に相補的な配列
を標的とするような配列を有するプローブに関する。
本発明はまた、２種のプローブの組、または２種のプローブの混合物に関し、ここで各２種のプローブは10から40の連続的ヌクレオチドから成り、およびここで２種のプローブは以下のドメインの対の中からそれぞれ選ばれたふたつの領域をそれぞれ標的とする:
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-83位からヌクレオチド-68位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-141位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-83位からヌクレオチド-68位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-170位からヌクレオチド-155位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-132位からヌクレオチド-117位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、
*図２のヌクレオチド-146位からヌクレオチド-130位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド-103位からヌクレオチド-88位に伸長するもの。
好適な態様によれば、本発明は少なくともひとつの次のHCVタイプ:HCVタイプ1、HCVタイプ2、HCVタイプ3、HCVタイプ4、HCVタイプ5、およびHCVタイプ6に属するHCV単離物を、それらが含まれると思われる生物学的試料中からタイピングする法に関し、以下の工程を含んで成る:
−試料中のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドがすでに接近できるようにされている上記試料を、必要に応じて適当な変性条件下で、図２および４中のcDNA配列により表されるHCV単離物の5’URのヌクレオチド-291位からヌクレオチド-66位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができる少なくともひとつのプローブと接触させ、ここでヌクレオチド位置の負の番号はHCVポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのコドンよりも前にあるヌクレオチドから始まっており、あるいは該プローブは上記に定義したプローブに相補的であり;
−該プローブと標的領域間にあるいは形成された複合体を検出し;
−観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在するHCVタイプを判断する。
好適な態様によれば、本発明は少なくともひとつの次のHCVタイプ:HCVタイプ1、HCVタイプ2、HCVタイプ3、HCVタイプ4、HCVタイプ5、およびHCVタイプ6に属するHCV単離物のタイピング法に関し、ならびに使用するプローブは以下の標的領域、またはTがUに置換された該領域、あるいはそのように定義した領域に相補的な領域のひとつを標的とすることができるようになっている:
0004251407.tif 000004
0004251407.tif 000005
配列中、YはCまたはTを表し、そしてKはGまたはTを表すか、あるいは使用するプローブは上記に定義したプローブの中から選択されたふたつのプローブの組である。
本発明はまた生物学的試料中に存在するHCV単離物のタイプ（および複数のタイプ）を決定する上記方法の使用に関する。
“タイプ”という用語は、その群の他の単離物のゲノムに対して、HCV単離物の完全なゲノムが核酸水準で74%より高い相同性を表す、またはHCV単離物のヌクレオチド7935位と8274位間にあるNS5領域が核酸水準で74%より高い相同性を表す、またはHCV単離物の完全なポリタンパク質がアミノ酸水準で78%より高い相同性を表す、またはそのアミノ酸2646位と2758位間にあるNS5領域がアミノ酸水準で80%より高い相同性を表すHCV単離物の群に対応し、ここで上記番号は、HCV-J単離物のHCVポリタンパク質の最初のATGコドンまたはメチオニンから始まる（Katoら、1990）。異なるタイプのHCVに属する単離物は核酸水準で74%より低く、かつアミノ酸水準で78%より低い相同性を表す。同じタイプに属する単離物が、同じサブタイプに属する時、核酸水準で通常約92から95%、かつアミノ酸水準で95から96%の相同性を表し、ならびに同じタイプに属するが異なるサブタイプに属するものは核酸水準で約79%、かつアミノ酸水準で85-86%の相同性を表す。より好ましくはHCV単離物の分類は以下の事実に従い行われるべきである、
（1）ヌクレオチド7935と8274との間（Chooら、1991）、または8261と8600との間（Katoら、1990）、または8342と8681との間（Okamotoら、1991）にあるNS5b領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.34より低く、通常は0.33より低く、より通常では0.32より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.135より低く、通常は0.13より低く、より通常では0.125より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.135から0.34の範囲、通常は0.14から0.33の範囲、より通常では0.15から0.32の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、および異なるHCVタイプに属する単離物は0.34より高く、通常は0.35より高く、より通常では0.36より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（2）ヌクレオチド378と957との間にあるコア/E1領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.38より低く、通常は0.37より低く、より通常では0.36より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.17より低く、通常は0.16より低く、より通常では0.15より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.15から0.38の範囲、通常では0.16から0.37の範囲、より通常では0.17から0.36の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.36より高く、通常は0.365より高く、より通常では0.37より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（3）ヌクレオチド4664と5292との間（Chooら、1991）、またはヌクレオチド4993と5621との間（Katoら、1990）、またはヌクレオチド5017と5645との間（Okamotoら、1991）にあるNS3/NS4領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.35より低く、通常は0.34より低く、より通常では0.33より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.19より低く、通常は0.18より低く、より通常では0.17より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.17から0.35の範囲、通常では0.18から0.34の範囲、より通常では0.19から0.33の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.33より高く、通常は0.34より高く、より通常では0.35より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
本発明の好適な態様によれば、タイプ1を同定するために、配列番号5、28および6を用いて設計された任意のプローブを使用することができる;タイプ2を同定するために、配列番号8から12、または22から26、および32から34を用いた任意のプローブを使用することができる;ならびにタイプ3を同定するために、配列番号13、14、36、21、または54を用いた任意のプローブを使用することができる;ならびにタイプ4を同定するために、配列番号17、18、または19および37から43、および配列番号49、50および53を用いた任意のプローブを使用することができる。
プローブ44から47はタイプ5を、プローブ48はタイプ6を同定するために使用できる。
以下の領域は特定のタイプを識別するために使用できる:タイプ2について-238位から-223位間にある領域、タイプ4について-244から-229位間にある領域、タイプ3について-253位から-238位間、または-275位から-260位間、または-293位から-278位間にある領域。
-2位のヌクレオチドはさらに特定のタイプまたはサブタイプ間を識別するためにも使用できる。
本発明の方法はまたHCVのサブタイプを識別および分類することを含んで成り、ここで上述のプローブに加えて、以下の標的領域とハイブリダイズするプローブ、あるいはTがUに置換されている該領域、またはこのように定義した領域に相補的な領域も使用される、
0004251407.tif 000006
0004251407.tif 000007
0004251407.tif 000008
または使用するプローブは定義したプローブの中から選択されたふたつのプローブの組である。
本発明はまた分析すべき生物学的試料中に存在するHCVサブタイプ（および複数のサブタイプ）の上記決定方法の使用に関する。
“サブタイプ”という用語は、同じ群の他の単離物のゲノムの対応部分に対して、HCV単離物の完全なゲノムまたは完全なポリタンパク質が、核酸水準およびアミノ酸水準の両方で90%より高い相同性を表す、またはHCV単離物のヌクレオチド7935位と8274位間にあるNS5領域が核酸水準で88%より高い相同性を表すHCV単離物の群を言う。ここで上記番号は、長OLRの開始コドンのアデニン残基から始まる。異なるHCVサブタイプに属し、かつ同じHCVタイプに属する単離物は、核酸水準で74%より高く、かつアミノ酸水準で78%より高い相同性を表す。
より好ましくはHCV単離物のタイプまたはサブタイプへの分類に関する上記方法は以下の事実に従い行われるべきである、
（1）ヌクレオチド7935と8274との間（Chooら、1991）、または8261と8600との間（Katoら、1990）、または8342と8681との間（Okamotoら、1991）にあるNS5b領域中にある核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.34より低く、通常は0.33より低く、より通常では0.32より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.135より低く、通常は0.13より低く、より通常では0.125より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.135から0.34の範囲、通常では0.14から0.33の範囲、より通常では0.15から0.32の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.34より高く、通常は0.35より高く、より通常では0.36より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（2）ヌクレオチド378と957との間にあるコア/E1領域中にあるの核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.38より低く、通常は0.37より低く、より通常では0.36より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.17より低く、通常は0.16より低く、より通常では0.15より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.15から0.38の範囲、通常では0.16から0.37の範囲、より通常では0.17から0.36の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.36より高く、通常は0.365より高く、より通常では0.37より高いヌクレオチドディスタンスを表し、
（3）ヌクレオチド4664と5292との間（Chooら、1991）、またはヌクレオチド4993と5621との間（Katoら、1990）、またはヌクレオチド5017と5645との間（Okamotoら、1991）にあるNS3/NS4領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じHCVタイプに属する単離物は、0.35より低く、通常は0.34より低く、より通常では0.33より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は0.19より低く、通常は0.18より低く、より通常では0.17より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は0.17から0.35の範囲、通常では0.18から0.34の範囲、より通常では0.19から0.33の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるHCVタイプに属する単離物は0.33より高く、通常は0.34より高く、より通常では0.35より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
これらの基準を使用してHCV単離物は少なくとも6つのタイプに分類することができる。
数種のサブタイプは、5’UR、および7935位と8274位の間にあるNS5の部分を含むコード領域、およびヌクレオチド317と957の間にあるC/E1領域の相同性に基づき、ならびにBukhらにより記載された（1993）単離物Z1とDK13との比較に基づき、確実にタイプ1、2、3および4に識別できる（1a,1b,2a,2b,2c,3a,3b,3c,4a,4b,4c,4d,4eおよび4f）。
さらにタイプ4のサブタイプ4gおよび4hへの細分は試案であり、5’UR中の差異に基づくだけである。報告されたほとんどの単離物、および本発明のタイピング系により提案された分類の総覧を表1に与える。
本発明の好適な態様によれば、配列番号31を使用したプローブはサブタイプ1aを同定するために使用でき;配列番号7および30を使用したプローブはサブタイプ1bを同定するために使用でき;配列番号9、10、22、または24を使用した任意のプローブはサブタイプ2aを同定するために使用でき;配列番号11、12、23、または25を使用した任意のプローブはサブタイプ2bを同定するために使用でき;配列番号33、または34を使用した任意のプローブはサブタイプ2cを同定するために使用でき;配列番号13、14または35を使用した任意のプローブはサブタイプ3aを同定するために使用でき;配列番号38、19および21を使用した任意のプローブはサブタイプ3b、4aまたは4dを同定するために使用でき;配列番号38、または41を使用した任意のプローブはサブタイプ4bを同定するために使用でき;配列番号42、または43を使用した任意のプローブはサブタイプ4cを同定するために使用でき;配列番号39、40または41を使用した任意のプローブは同定するために使用でき:4e,51,38,19または7;4f;配列番号49、または50を使用した任意のプローブは推定上のサブタイプ4hを同定するために使用でき;配列番号50、または53を使用した任意のプローブは推定上のサブタイプ4gを同定するために使用できる。
本発明の方法の好適な態様によれば、識別すべきHCVタイプまたはサブタイプはHCVのための万能プローブにより同定することができ、それは以下のひとつの領域を標的とするようなものである。
0004251407.tif 000009
本発明の方法のもうひとつの有利な態様によれば、ハイブリダイゼーションの工程は標的する領域を含有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの増幅工程によって進められ、有利に以下の工程を含んで成る:
−タイプまたはサブタイプを決定すべき単離物を含有すると思われる生物学的試料を、標的する領域を含むプライマーの組と接触させ、ここで該プライマーはHCVゲノムの保存領域と相補的であり、および好ましくはプライマーはHCVゲノムの5’非翻訳保存領域に相補的であり、該プライマーは好ましくは少なくとも8個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは約15個の、さらにより好ましくは15個より多くの連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドはそれぞれ図２および４のヌクレオチド-341からヌクレオチド-171に伸長する領域、およびヌクレオチド-67からヌクレオチド-1に伸長する領域から選ばれた配列に相補的である。
あるいは、アンチセンスプライマーもコア領域に伸長することができ、あるいはプライマーの組は5’URおよびコア領域の両方（PCRの1断片中にか、またはそれぞれふたつの領域のためのプライマーの組）を増幅することを目的としてもよいか、または目的とする。したがって、コア領域からのプローブは、コアPCR生成物中の（サブ）タイプに特異的な領域にハイブリダイズすることができ、タイプおよび/またはサブタイプをさらに識別するためのプローブアッセイ工程に含めることができ、
−例えば上述のプライマーの組によるポリメラーゼ連鎖反応を介し標的領域を増幅させ、あるいはジゴキシゲニンまたはビオチンのような標識を増幅標的配列に取り込み、ここで該増幅は20から80回繰り返され、有利には30から50回繰り返される。
本発明の好適な態様によれば、被検体鎖は酵素的または化学的に、インビボまたはインビトロのいずれかでハイブリダイゼーションの前に修飾される。核酸化合物にレポーター群をカップリングさせるための多くの系が記載され、それらはビオチンまたはジゴキシゲニンのような標識の使用に基づいている。本発明のさらなる別の態様によれば、サンドイッチハイブリダイゼーションを使用できる。好適な態様において、被検体鎖に存在する標的配列はcDNAに転換され、ここで該cDNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR;Saikiら、1988）、リガーゼ連鎖反応（LCR;Landegrenら、1988;Wu & Wallace,1989;Barany,1991）、核酸配列を基本とした増幅（NASBA;Guatelliら、1990;Compton,1991）、転写を基本とした増幅系（TAS;Kwohら、1989）、鎖置換増幅（SAD;Duck,1990;Walkerら、1992）またはQbレプリカーゼによる増幅（Lizardiら、1988;Lomeliら、1989）のような任意の周知技術によって増幅される。
cDNA増幅工程は好ましくはPCR法の手段により行われ、次の工程から成ることができる:
（a）ポリメラーゼ連鎖反応法のために、検出すべき標的配列を含むプライマーの組を提供し;
（b）標的領域をポリメラーゼ連鎖反応を介して（a）のプライマーの手段により増幅させ;ならびに同工程中に、適当な標識分子を増幅標的中に取り込むことができ、該標識分子は好ましくはジゴキシゲニンまたはビオチンである。
“プライマー”と言う用語は、HCVゲノム由来のcDNAまたはRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の保存領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列に対応し;好ましくはHCVゲノムの5’非翻訳保存領域、ならびにより好ましくは-341位から-171位および-67位から-1位を含むHCVゲノムの5’非翻訳領域の保存、またはコア領域の保存領域から選択される。
本発明の有利な態様において、本方法は増幅が二重のPCR段階から成り、各段階に特別なプライマーの組が関与し、該第一段階はヌクレオチド-341から-ヌクレオチド-186に伸長する領域、およびヌクレオチド-52からヌクレオチド-1に伸長する領域から選ばれた外側のプライマー、ならびに特に以下の組:
0004251407.tif 000010
あるいはこれらの相補鎖が関与し、
配列中、WはAまたはTを表し、ならびに該第二段階はヌクレオチド-326からヌクレオチド-171に伸長する領域、およびヌクレオチド-68からヌクレオチド-1に伸長する領域から選ばれた入れ子状に重複したプライマー、ならびに特に以下の組:
0004251407.tif 000011
配列中RはAまたはG、およびYはTまたはCを表し、
あるいはこれらの相補鎖が関与するものである。
本発明のこの態様によれば、二重PCRは第一回目では配列番号1および2に表される、またはそれらの相補的配列を含む外側プライマーを使用して行われ、ならびに第二回目では配列番号3および4に表される、またはそれらの相補的配列を含む入れ子状に重複したプライマーを使用して行われる。
“適当な標識分子”という用語は、増幅のポリメラーゼ段階中に取り込まれる標識ヌクレオチドの使用を含むことができ、Sakaiら（1988）およびBejら（1990）、ならびに当業者に周知の任意技術によって説明されるようなものである。
本発明で記載されているアッセイは当業者にとって明らかないくつかの方法によって改良することができる。例えばcPCR反応は、RNA-捕獲工程により進めることができる。
さらに別の態様によれば、本発明は少なくともひとつのオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る組成物に関し、該プライマーは好ましくは少なくとも15個の連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドは、それぞれヌクレオチド-341位からヌクレオチド-171位に伸長する領域、およびヌクレオチド-67位からヌクレオチド-1位に伸長する領域（図２の）から選ばれた配列に相補的であるか、またはそれらの相補鎖である。
さらに別の態様によれば、本発明は好ましくは少なくとも15個の連続的ヌクレオチドを有する少なくともひとつのオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る組成物に関し、該連続的ヌクレオチドは以下の任意の配列から選ばれる:
0004251407.tif 000012
配列中、WはAまたはTを表し、RはAまたはGを表し、およびYはTまたはCを表し、
あるいはこれらの相補鎖である。
有利な態様によれば、生物学的試料に含有されるすべてのHCV単離物の同時タイピングに関する本発明の方法は、以下の要素のひとつを、上記に定義したプローブがすでに固定化されている固体支持体と接触させる工程を含んで成る:
−試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学的試料、
−または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
−または精製された遺伝物質に由来する単一のコピー、
−または精製された遺伝物質に由来する増幅されたコピー。
本発明の好適な態様によれば、上記に定義したプローブは固体支持体に固定化されている。
“固体支持体”という用語は、オリゴヌクレオチドプローブがカップルできる任意の支持体について言うことができ、ただしオリゴヌクレオチドはそのハイブリダイゼーション特性を保持しており、かつハイブリダイゼーションのバックグラウンドは低く保持されている。通常固体支持体はマイクロタイタープレートまたは膜（例えばナイロンまたはニトロセルロース）である。
膜への適用または固定化に先立ち、核酸プローブを修飾することは固定化を容易にするため、またはハイブリダイゼーション効率を向上させるために便利である。そのような修飾は、例えばホモポリマー テイリング、脂肪族基、NH2基、SH基、カルボキシル基のような種々の反応性基のカップリング、またはビオチンまたはハプテンのカップリングを包含することができる。
本発明の有利な態様によれば、本方法は上記に定義した任意のプローブを以下の要素いずれかと接触させることから成る:
−試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学的試料、
−または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
−または精製された遺伝物質に由来する単一のコピー、
−または精製された遺伝物質に由来する増幅されたコピー、
ここで該要素は予め支持体上に固定化されている。
本発明はまた新規単離物のタイピングに関する。
より具体的には、本発明は既知のタイプまたはサブタイプとは異なる新規HCVタイプまたはサブタイプの検出法および識別法に関し、該方法は以下の工程を含んで成る:
−生物学的試料中のHCV単離物が既知のどのタイプまたはサブタイプに属するかを上記に定義した方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはHCV抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなHCVについての万能プライマーを使用することにより予めHCV含有であると決定されていてもよく、
−上記に定義したふたつの任意のドメインから選ばれた領域を標的にすることができる少なくともひとつのプローブと陽性的にハイブリダイズしない試料が観察された場合には、その試料中に存在するHCVタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは決定すべき新規タイプおよび/またはサブタイプの相当する5’非翻訳領域の部分（または複数の部分）を配列決定する。
生物学的試料中に存在する新規HCVタイプおよび/またはサブタイプの検出法および識別法は、有利には以下の工程を含んで成る（ここで新規タイプを同定する場合にはタイプ1、タイプ2、タイプ3、タイプ4、タイプ5、タイプ6とは異なるものであり;新規サブタイプを同定する場合にはタイプ1HCV単離物についてはサブタイプ1aおよび1b、タイプ2単離物についてはサブタイプ2a、2bおよび2c、タイプ3単離物についてはサブタイプ3a、3bおよび3c、タイプ4単離物についてはサブタイプ4a、4b、4c、4d、4e、4f、4gおよび4h;タイプ5単離物についてはサブタイプ5a;タイプ6単離物についてはサブタイプ6aとは異なるものである）
−分析すべき生物学的試料中のHCV単離物（複数のHCV単離物）が既知のどのタイプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のサブタイプ）に属するかを上記に定義した本発明の方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはHCV抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなHCVについての万能プライマーを使用する手段により予めHCV含有であると決定されていてもよく、
−上記に定義した任意のタイプ特異的またはサブタイプ特異的ドメインから選ばれた領域を標的にすることができる少なくともひとつのプローブとハイブリダイズしない試料が観察された場合には、より具体的にはタイプ1について配列番号5、28および6と、タイプ2について配列番号8から12または22から26および32から34と、タイプ3について配列番号13、14、36、21、または54と、ならびにタイプ4について配列番号17、18、19、37から43、49、50および53と;ならびにサブタイプ1bについて配列番号7および30と、サブタイプ1aについて配列番号31と、サブタイプ2aについて配列番号9 10 22または24と、サブタイプ2bについて11、12、23または25と、サブタイプ2cについて配列番号33または34と、あるいはサブタイプ3aについて配列番号13、14または35と、サブタイプ3b、4aまたは4dについて配列番号38、21、および19と、サブタイプ4bについて配列番号38または41と、サブタイプ4cについて配列番号42または43と;サブタイプ4eについて配列番号39、40または41と、サブタイプ4fについて;配列番号51、38、19または7と;推定のサブタイプ4hについては配列番号49または50と;推定のサブタイプ4gについては配列番号50または53とハイブリダイズしない試料が観察された場合には、試料中に存在するHCVタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは決定すべき新規タイプおよび/またはサブタイプの相当する5’非翻訳領域の部分（または複数の部分）を配列決定する。
“新規単離物”とは、上述した9つの領域のいずれともハイブリダイズできないか、または現在知られているHCVのタイプまたはサブタイプのひとつに適合すると正しく判断できる反応性を示すことができない単離物に対応する。本発明のこの特別な態様も以下の工程により行うことができる;
（a）HCV抗体-陽性血清、または臨床的なNANB肝炎試料、または無作為な試料群をcPCR（cDNA PCR）により調査し、
（b）すでにcPCR生成物を得た、これらの試料を使用してHCV LiPAを行い、ならびに
（c）異常な反応性を表すPCR断片をクローニングおよび配列決定する。
本発明はまた生物学的試料中に存在するHCV、および/またはHIV、および/またはHBV、および/またはHTLVのタイプ（複数のタイプ）ならびにサブタイプ（複数のサブタイプ）の決定法に関し、この方法は以下の工程を含んで成る:
−以下のプローブを提供し、
*上記に定義した少なくともひとつのプローブ、好ましくはプローブは上記に定義したものであり、HCVの遺伝子型決定（タイピングおよび/またはサブタイピング）が可能であり、ならびに以下の少なくともひとつのプローブ:
*上記生物学的試料中に存在しうるHIVタイプ1および/またはタイプ2のオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに/または
*上記生物学的試料中に存在しうるHBVサブタイプ、および/またはsAg突然変異体および/またはcAg突然変異体のオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに/または
*生物学的試料中に存在すると疑われるHTLV-Ｉおよび/またはHTLV-IIのオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、
−あるいは上記に定義したプライマーの組に加えて、少なくともひとつの次のプライマーを提供してもよく:PCR反応の手段により、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、および/またはHBV、および/またはヒトT細胞リンフォトロピック（lymphotropic）ウイルス（HTLV）オリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅させるためのプライマーの組、ならびに生物学的試料中に存在するかもしれないHCV、およびHBVおよび/またはHIVおよび/またはHTLVのいずれかを増幅させ、
−上述した上記定義のプローブと
*試料中の遺伝物質がすでにハイブリダイゼーションできるようにされている生物学的試料、
*または上記生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、
*または精製された遺伝物質由来の単一コピー
*または精製された遺伝物質由来の増幅コピー
とを、プローブとHCVならびに少なくともひとつの次のウイルス、HBV、および/またはHIV、および/またはHTLVの単離物の標的配列とがハイブリダイゼーションできる条件下で接触させ、
−使用したプローブと生物学的試料に存在するかもしれない標的領域との間に形成した可能性のある複合体を検出する。
本態様によれば、生物学的試料中に存在するHCVのタイプまたはサブタイプに加えて、本発明はまたHTLV,HIV,HBVのような任意の他の親から伝播したウイルスの単離物のタイプまたはサブタイプを決定する方法に関し、ひとつの同一片にプローブを包含することを特徴とし、かつ該プローブは:
−上記HCVの種々のタイプおよび/またはサブタイプ
−ヒト免疫不全症ウイルスHIV-1およびHIV-2
ヒトT細胞リンフォトロピックウイルスHTLV-1およびHTLV-2
−種々のHB表面抗原（HBsAg）変異体またはHBコア抗原（HBcAg）またはHBプレコアAg変異体、に特異的にハイブリダイズすることを特徴とする。
いくつかの試験試料において、種々の標的配列の特異的検出が臨床的な関連性を同時に提供する。これらのそれぞれの標的配列について、別個のハイブリダイゼーション試験が対応するプローブを使用して行われるべきである。（従来）技術を構成する種々のタイプ/サブタイプに特異的なプローブの組み合わせは、本発明により説明されるような新規かつ創意あるHCVタイプ/サブタイプ-特異的プローブと組合わさり、ひとつの膜片上で、親から伝播したヒトのウイルス性疾患のための容易かつ信頼性のある一般的タイピングシステムを提供することができた。もし被検鎖の増幅が必要な場合には、プライマーの組を分別および分類すべきウイルス生体自体について提供できる。
本発明はまた固体支持体に関し、具体的には膜片に関し、その表面の既知の位置には以下のプローブ、またはそれらの相補鎖、または上述したプローブであってTがUに置き換えられたものから選択されたものを含む:
−上記の配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28から54および93から96、ならびにこれらのプローブと、HCV単離物が、区別されるべき生物学的試料中に含まれると思われるHCVのリボまたはデオキシリボヌクレオチド鎖との間に、ハイブリダイゼーションがあるかどうかを決定するための対照を含む。
本発明の特に好適な態様によれば、プローブは膜片に対して（横）線を引く様式（line-wise fashion）で固定化されている。
本発明のこの好適な態様において、各プローブの組は膜片の定められた位置に適用され、配列番号5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27、配列番号28から54、および配列番号93から96から選択されたプローブ、ならびに結合体が結合するための対照線を含む。
本発明の好適態様の方法は、HCV感染のタイプを素早く決定することを可能にする。このアッセイは少なくとも6つの異なるHCVタイプ間を識別し、および少なくとも18サブタイプ間を識別する能力を提供し、ならびにHCVの新規タイプまたは（サブ）タイプを調査する良い道具である。例えば新規サブタイプ1c,1dおよびタイプ7、ならびに他の新規（サブ）タイプは上述した領域中に特別な突然変異を含んでも良く、これは新規配列由来のタイプ-特異的プローブの手段によって特異的検出のために使用できる。
本発明はまたHCV単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひとつのHCV単離物をインビトロで識別するための、ならびにHCVタイプサブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下のものを含む:
−上記に定義された任意のプローブから選択された少なくともひとつのプローブ;
−これらプローブとHCV単離物のcDNAおよび/またはRNAとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、
−適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段。
本発明はまたHCV単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひとつのHCV単離物をタイピングするための、ならびにHCVタイプおよびサブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下のものを含む:
−場合によって、上記に定義されたひとつの万能プローブ;
−本発明の任意のプローブから選択される少なくともひとつのプローブ、
−これらのプローブとHCV単離物のcDNAおよび/またはRNAとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、
−適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段。
この態様によれば、本発明はまたHCV単離物の遺伝子型決定（タイピングおよび/またはサブタイピング）のためのキットに関し:
−上記に定義したプローブの組、優先的に固体支持体に固定化されており、より優先的にはひとつの同一の膜に固定化されており、
−場合によって上記に定義したプライマーの組、
−ハイブリダイゼーション行うために、および形成したハイブリッドを検出するのに必要な緩衝液の組、を含む。
本発明はまた少なくとも以下のひとつのHCVタイプ（HCVタイプ1、HCVタイプ2、HCVタイプ3、HCVタイプ4、HCVタイプ5、HCVタイプ6）に属するHCV単離物のタイピングのためのキットに関し、該キットは少なくともひとつの上記に定義したプローブ、−これらプローブと上記HCV単離物のcDNAsおよび/またはRNAsとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分;
−適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む。
本発明は有利には、HCVタイプおよびサブタイプを識別ならびに分類するためのキットに関し、該キットは:
−少なくともひとつの上記に定義したプローブ、
−これらプローブと上記HCV単離物のcDNAsおよび/またはRNAsとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成分;
−適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む。
配列番号1から54および93から96由来のすべてのプローブは新規である。
さらに配列番号18、29、33、34、35、40、42、43、47、49および54のプローブは新規配列に由来する。
【図面の簡単な説明】
第１図
入れ子状に重複したPCR断片の長さを示すエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル。各対のレーンAはBio-11-dUTPを取り込んだPCR断片を表す。レーンBはBio-11-dUTP無しのPCR断片である。１:血清BR28、２:血清BR24、３:血清BR29、４:血清BR33、５:血清BR36、６および７:陰性対照血清、８:血清JP62、９:血清BR23、１０:鋳型無しのcPCR対照、Ｍ:分子量マーカー。
第２図
4種の異なるHCVタイプ由来の単離物の5’URヌクレオチド配列の整合配列。箱で囲ったヌクレオチドは4種の異なる群をタイピングするために使用したプローブの位置を示す。下線を引いたヌクレオチドは各群内をサブタイピングするために使用される。ほとんどの配列のヌクレオチド-140から-139間の間隔にはいくつかタイプ4単離物中の挿入が対応する。プローブの番号は表４に使用する番号と一致する。
第３図
いくつかの典型的な血清についてのHCV LiPAタイピングの結果。片は19の平行した線を含む。
Ａ:プローブ5（配列番号5）;Ｂ:プローブ6（配列番号6）;Ｃ:プローブ7（配列番号7）;Ｄ:プローブ8（配列番号8）;Ｅ:プローブ26（配列番号26）;Ｆ:プローブ22（配列番号22）およびプローブ24（配列番号24）;Ｇ:プローブ10（配列番号10）;Ｈ:プローブ13（配列番号13）;Ｉ:プローブ14（配列番号14）;Ｊ:プローブ21（配列番号21）;Ｋ:プローブ15（配列番号15）;Ｌ:プローブ16（配列番号16）;Ｍ:プローブ17（配列番号17）;Ｎ:プローブ19（配列番号19）;Ｏ:プローブ18（配列番号18）;Ｐ:プローブ155（アンチセンスプローブ:5’-GGGGGCCTGGAGGCTG-3’）（配列番号97）;Ｑ:プローブ27（配列番号27）;Ｒ:プローブ20（配列番号20）;Ｓ:結合体の結合のための対照ライン。
片（ストリップ）を以下の血清のPCR生成物とハイブリダイズさせた:片１:血清BR5、片２:血清BR12:片３:血清BR18、片４:血清BR22:片５:血清BR19、片６:血清BR95:片７:血清BU79、片８:血清BR23、片９:血清JP63。
第４図
新規単離物（BE90、BE91、BE92、BE93、BE94、BE95、BE96、BE97、BE98、BE99、GB48、GB116、GB358、GB569、GB549、GB809、CAM600、CAM736、GB478、GB724、およびGB438）、ならびにHCVタイプ1a（HCV-1）、1b（HCV-J）、2a（HC-J6）、2b（HC-J8）、3a（BR56）、3b（HCV-TR）、5（SA1）、6（HK1）のHCV5’非翻訳領域のヌクレオチド配列の整合配列。この整合配列を構成するために使用した配列は、EMBLデータベースから取り、以下の受け入れ番号を有する:1M62321、2D10749、3D00944、4D01221、5D13448、6D11443、7M84838、および8L08156。ヌクレオチド-220から-180の間の配列は示されていないが、それらはすべての単離物中でHCV-1と同一である。’-’ヌクレオチドはHCV-1中の対応するヌクレオチドと同一である;-145から-144の間に作られた空所’..’は、整合配列がCA挿入を有するタイプ6配列を持つと認められる;ほとんどのヌクレオチド中の-138と-137の間に作られた空所’.’は、整合配列がその位置で特別なヌクレオチドを有する配列を保存する。*は第２図に表される-220と-180残基の間の保存HCV配列を言う。
第５図
単離物BE90,BE91,BE92,BE93,BE95,GB358、GB549およびGB809のNS5配列のアミノ酸配列、ならびに表６に記載された既知の配列の整合配列。
第６図
配列番号32を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ1および2血清で試験した。１.タイプ1b血清BE82、２.タイプ2a血清JP62、３.タイプ2b血清BE91、Ａ.結合体対照、Ｂ.プローブ20および27、Ｃ.プローブ8、Ｄ.プローブ26、Ｅ.プローブ32（配列番号32）。
第７図
配列番号33および34を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ2a,2b,および2c血清で試験した。１.タイプ2a血清JP62、２.タイプ2b血清BE91、３.タイプ2c血清BE92、Ａ.結合体対照、Ｂ.プローブ20および27、Ｃ.プローブ8、Ｄ.プローブ26、Ｅ.プローブ32、Ｆ.プローブ22、Ｇ.プローブ24、Ｈ.プローブ23、Ｉ.プローブ25、Ｊ.プローブ33（配列番号33）、Ｋ.プローブ34（配列番号34）。
第８図
配列番号31、37および38を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ4血清で試験した。１.タイプ4a血清GB116、２.血清GB113、３.タイプ4f血清GB438、Ａ.結合体対照、Ｂ.プローブ20および27、Ｃ.プローブ37（配列番号37）、Ｄ.プローブ38（配列番号38）、Ｅ.プローブ19、Ｆ.プローブ31（配列番号31）、Ｇ.プローブ7。
第９図
配列番号44、45、95および46を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ4aおよび5a血清で試験した。１.タイプ5a血清BE95、２.タイプ4a血清GB116、Ａ.結合体対照、Ｂ.プローブ20および27、Ｃ.プローブ44（配列番号44）、Ｄ.プローブ45（配列番号45）、Ｅ.プローブ46（配列番号46）、Ｆ.プローブ31（配列番号31）、Ｇ.プローブ7。
第10図
配列番号93、94、95および96を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ4aおよび5a血清で試験した。１.タイプ4a血清GB116、２.タイプ5a血清BE95、Ａ.結合体対照、Ｂ.プローブ20および27、Ｃ.プローブ93（配列番号93）を濃度0.4pmol/μlで適用、Ｄ.プローブ94（配列番号94）を濃度2.5pmol/μlで適用、Ｅ.プローブ94（配列番号94）を濃度1.0pmol/μlで適用、Ｆ.プローブ94（配列番号94）を濃度0.4pmol/μlで適用、Ｇ.プローブ95（配列番号95）を濃度2.5pmol/μlで適用、Ｈ.プローブ95（配列番号95）を濃度1.0pmol/μlで適用、Ｉ.プローブ95（配列番号95）を濃度0.4pmol/μlで適用、Ｊ.プローブ96（配列番号96）を濃度0.4pmol/μlで適用。
表１
種々の分類系の概観。
表２
第３図に示される結果の解説。
表３
HCV LiPAタイピングおよびHCV抗体アッセイの最終結果。
血清学と関連したタイピングの要約が与えられている。INNO-LIA HCV AbアッセイはNS4エピトープを使用したひとつの系列、NS5エピトープを使用したひとつの系列、およびコアエピトープを使用した4つの系列を含む。コア系列について最高点が与えられただけである。信号の強さは数で与えられる:0＝陰性;9＝不確定;1−3＝陽性。抗体試験の最終的解釈はLIA欄に与えられる:1＝陽性;0＝陰性;9＝不確定。Innotest HCV Abで試験した血清の信号対ノイズの比が与えられている血清もある。
表４
プライマーおよびプローブのヌクレオチド配列、位置および方向。
表５
HCVの新タイプおよびサブタイプから設計された新プローブの概観。分類が可能な、または向上したタイプおよびサブタイプ、配列、および配列番号を示す。
*はすべての単離物をタイピングまたはサブタイピングしていないプローブを表し、該タイプまたはサブタイプを表すことが見いだされた。下線の文字は暫定的なサブタイプへの分割を表す。
表６
BE90,BE91,BE92,BE93,BE95,GB358,GB549,およびGB809と、公表されているヌクレオチド7935から8274（本発明中で使用した番号に従う）由来のHCV NS5領域中の配列との間の配列相同性。同一サブタイプ内の相同性得点は際立っている。相同性を計算するために使用した公表配列はEMBLのデーターベースから取り、以下の受け入れ番号を持つ:1M62321、2D10749、3M67463、4D90208、5X61596、6L02836、7M84754、8D10750、9D11168;D01171、10S38204、11M58335、12D10078、13D10079、14D10080、15D10081、16D00944、および17D01221。これらすべてが完全ゲノムを表すが、NS5配列が公表されている12、13、14、15および18は除く。18はChironの特許（国際特許第92/19743）、配列番号18に公開されている。
実施例
世界の各地から得たHCV単離物の天然変異体を研究するために、HCV単離物のタイピングおよびサブタイピングに関する迅速な手段をラインプローブアッセイ（LiPA）の様式で開発した。
本質的に、取り込まれたビオチン化dUTPを含有するcPCR断片を、ニトロセルロース膜上に固定化したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。安定なハイブリダイゼーション二重鎖を次にストレプトアビジン-標識アルカリホスファターゼにさらし、続いてNBT（ニトロ42ブルー テトラゾリウム）およびBCIP（ブロモクロロ-インドリル リン酸）で発色させる。cPCR断片は任意のHCV RNAの5’URから、高度に保存されたプライマーの組を使用して合成される。タイピングに使用されるオリゴヌクレオチドは、cPCR断片の内部のタイプ-特異的可変部に対して向けられている。事実、直線配列中の-170と-155位との間、および-132と-117位との間の可変領域が、折りたたまれたウイルスRNA中のステムの部分となることができ、第一領域の突然変異が第二領域のもうひとつの突然変異により補足され、RNAの二重鎖形成ができるか、またはできない。変異および保存はHCVの他の新タイプにも同一位置で同様に起こると思われ、それゆえにこの可変領域は現在の、および未だ発見されていないが今後発見されるであろうすべてのHCVタイプを識別するための道具として残るかもしれない。さらに、5’URと比較してより高い可変性がコア、NS3およびNS5領域中で観察され、これらの領域中で、万能プライマーの組を採用するタイピングはもはや理にかなったものではないだろう。
本発明で提案した命名は暫定的なものであり、国際委員会により提出されるかもしれない新しいガイドラインに従いさらに補正に供されることにもなろう。例えばサブタイプ4aはもうひとつのタイプ4サブタイプ（4cまたは4eのような）に変更されるかもしれないし、ならびにタイプ4はタイプ5または6に変更されるかもしれない。そのような場合にはタイプ4aは例えば6cになるかも知れない。しかし新しい分類が、本発明で提案されたプローブの手段によりタイプまたはサブタイプに分類された単離物の特定群の分類を妨害するものではないだろう。
１.タイピングおよびサブタイピングのために使用した血清試料
61のブラジル人試料（BR1からBR61）を、HCV抗体ELISAアッセイ（Innotest HCV Ab,イノジェネティックス:Innogenetics）およびInnoLIA HCV Ab試験（イノジェネティックス）で試験した。初めの23の血清試料は（BR1からBR23）は、ALTレベルが高い、またはInno-LIAの結果が陽性である血液透析者、あるいは受容者がNANB肝炎疾患を発病している供与者の血液、のいずれかから採取した。他の14（BR24からBR37）の血清試料は無作為に選択した;残りの24の血清は（BR38からBR61）は、それらのLIAパターンに基づき選択した。後者のほとんどがLIAのNS4およびNS5合成ペプチドと僅かに陽性、不確定、または陰性の反応性を示した。以下の血清もこのタイピング試験に含まれた:日本人の2種のプール血清（JP62および63）、ベルギー人の6種の血清（BE64からBE69）、オランダからの4種の血清（NE70からNE73）、ブルンディーからの6種の血清（BU74からBU79）およびガボンからの2種の血清（GB80およびGB81）。これらはすべてInno-LIA HCV Abアッセイ系で試験された。血清BU74からBU78は抗-コア抗体について陽性であるだけだったが、一方血清BU79はNS5系にのみ反応した。2種のガホン人から血清はLIA HCV陰性（Inno-LIA HCV）、HIV陰性（Innotest HIV）であったが、HTLV陽性（InnotestHTLV）であった。ベルギーからの1種の血清（BE69）およびオランダからの1種の血清（NE73）は完全に陰性であった。NE-血清の3種（NE71からNE73）が第二世代のRIBA試験（オルソダイアグノスティックス社:Orth Diagnostics Inc.）に陰性であったので選択した。
２.cPCR、PCR生成物の分析、およびクローニング
PCR反応に使用したプライマーは、種々のHCVタイプの5’URの保存領域に相補的であった。タイプ1およびタイプ2配列（Katoら、1990;Nakanoら、1991;Okamotoら、1991）、ならびに我々のタイプ3クローン（BR56;受け入れ番号D13448、CCJJB/EMBL/Genbank DNAデータベース、1992年10月21日寄託）をアニーリングさせるために、縮退が含まれた。外側PCRプライマー配列（HcPr98、配列番号1およびHcPr29、配列番号2）、ならびに入れ子状に重複したPCRプライマー（HcPr95、配列番号3およびHcPr96、配列番号4）を表４に表す。種々の血清タイプの検出のために使用したプローブも表４に掲示する。すべてのオリゴヌクレオチドは392DNA/RNA合成機（アプライド バイオシステムズ;Applied Biosystems）で合成した。
ウイルスRNAを、わずかに変更を加えたが本質的にChomczynkiおよびSacchi（1987）に記載されたように抽出した。RNAを20μgのDextran T500（ファルマシア;Pharmacia）と共沈させた。このRNAペレットを簡単に乾燥し、10μlのDEPC-処理H2O中に再懸濁した。2μlの150ng/μlの無作為プライマー（random primer:ファルマシア）を加え、65℃で10分間変性させた後、第一鎖のcDNA合成を20μlについて25UのHPRI（アマシャム;Amersham）、500μMのdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP、1×AMV緩衝液（ストラタジーン;Stratagene）、および2.5UのAMV-RT（ストラタジーン）の存在下にて42℃で行った。生成したcDNAの7μlを外側PCR中で40サイクルにわたって増幅させ、各サイクルは全容量50μlで95℃で1分、55℃で1分、および72℃で1分から構成されていた。溶液を最終濃度200μMのdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP、1×Taq緩衝液（ストラタジーン;Stratagene）、0.2μMの各プライマー、ならびに1UのTaqポリメラーゼ（ストラタジーン）に調整した。第一回の増幅生成物の1μlを、入れ子状に重複したプライマーで再度、同一組成の緩衝液中で40サイクル増幅させた。HCVタイピングについては、入れ子状に重複したPCRは40μMのBio-11dUTP（シグマ;Siguma）および160μMのdTTPを含有した。外側、および入れ子状に重複したPCR生成物の両方を次に2%の低融点（ニシーブ ジーティージー、エフエムシー:NuSieve GTG FMC）/1%ウルトラプュア（Ultra Pure:ギブコ ビーアールエル:Gibco BRL）アガロースゲルを使用した電気泳動に供した。エチジウムブロマイド染色後、PCR断片をアガロースゲルから切り出し、DNAを0.45μmHV膜（ミリポア;Millipore）を通過させる遠心により回収して、2度のフェノール/クロロホルム抽出および2度のエーテル抽出を行うことにより精製し、沈殿させ、続いてT4ポリメラーゼ（ベーリンガー;Boehringer）で処理し、T4キナーゼ（ベーリンガー）でリン酸化し、最終的にpBluescript KS（-）（ストラタジーン）の脱リン酸化Eco RV部位に連結した。プラスミドDNAの調製は、アルカリ溶解法（Maniatisら、1982）に記載されているように行った。配列決定反応は、デアザG/A T7シークエンシング ミックス（Deaza G/A sequencing mixes;ファルマシア）を使用することにより、T7およびT3プライマーを用いて二重鎖プラスミドDNAについて行った。
これらの配列決定反応の結果を第２図に表す。以下の配列がDNAデータベースに寄託された（BR56:DDBJ/EMBL/ジーンバンク受け入れ番号D13448;BU74:DDBJ/EML/ジーンバンク受け入れ番号D13449;BU79:受け入れ番号D13450;GB80:受け入れ番号D13451;GE81:受け入れ番号D13452;GP62:受け入れ番号D13453）。
HCV-感染患者からの血清RNAをcDNA合成のための鋳型として使用し、これを次に入れ子状に重複したPCRのための鋳型とした。ふたつのプライマーの組が、外側反応のためにはHcPr98（配列番号1）およびHcPr29（配列番号2）、ならびに入れ子状に重複した反応のためにはHcPr95（配列番号3）およびHcPr96（配列番号4）（表４）が設計された。これら4種のプライマーは公表された配列（Katoら、1990;Nakaoら、1991;Okamotoら、1991）、ならびに単離物BR56（第２図参照）の非翻訳領域から得たクローンの配列に合うように選択された。入れ子状に重複したPCRの結果の増幅生成物は235塩基対（bp）の長さである。Bio-11-dUTPの取り込みにより、アガロースゲル電気泳動後に視覚的に明らかな移動度の減少がある（第１図）。すべての異なるHCVタイプについてDNA断片の大きさが同じであることは、制限酵素消化またはハイブリダイゼーションのような第二の実験が分類に必要であることを示唆している。それゆえに平行線として適用されているHCV-特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有している膜片が開発された。これらの片は、合成中にビオチン化ヌクレオチドが中に取り込まれた5’URのPCR増幅DNA断片とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、アルカリフォスファターゼで標識したストレプトアビジンを加え、ハイブリダイゼーション中に形成されたビオチン化ハイブリッドに結合するようになる。NBT/BCIPとインキュベーションした後、紫色の沈殿が現れる。
３.ラインプローブアッセイ（LiPA）片の調製
16-merのオリゴヌクレオチド（種々のタイプまたはサブタイプのHCVに特異的である;表４、番号5から27）の3’末端にpoly-（dT）尾を以下のように付けた:20pmolのプライマーを25μlの緩衝液中（3.2mMのdTT,25mMのTris.HCl（pH7.5）,0.1Mのカコジル酸ナトリウム、1mMのCoCl2、0.1mMのジチオスレイトール、および60Uのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシア）を含有する）にて37℃で1時間インキュベーションした。反応を2.5μlの0.5M EDTA（pH8.0）を加えて止め、ならびに20×SSC（Maniatisら、1982）で最終濃度が6×SSCとなるまで希釈し、2.5pmolのオリゴヌクレオチド/μlを反応させた。
この溶液の1pmolをニトロセルロース膜上に4mm離して適用した。結合体用の対照として、ビオチン化DNAを並べて適用した。オリゴヌクレオチドを80℃に2時間焼いて膜に固定した。膜を次に4-mmの片に切断した。
４.LiPA試験ハイブリダイゼーションおよび発色
10μlの入れ子状に重複したPCR増幅生成物（取り込まれたBio-11dUTP含有）を10μlの400mM NaOH/10mM EDTAと混合し、室温（RT）で10分間インキュベーションする。次に1mlの予め暖めた（37℃）ハイブリダイゼーション緩衝液（3Mの塩化テトラメチルアンモニウム、（TMACl,メルク;Merck）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、1mMのEDTA、5×デンハーツ溶液（Maniatisら、1982）、0.6%（w/v）SDS、および100μg/mlの剪断サケ精子DNAを含む）を加え、ハイブリダイゼーションを水浴中にて振盪しながら42℃で2時間行う（Jacobsら、1988）。片を、RTで5分間、1mlの予め暖めた（37℃）の洗浄緩衝液（3M TMACl、0.2% SDS、50mM Tris HCl、pH8.0）で2回洗浄し、次に51℃で30分間ストリンジェントな洗浄、ならびに簡単な洗浄工程をRTで行う。この時点で洗浄緩衝液をすすぎ溶液（Rinse Solution:NaCl、Triton、0.5% NaN3を含むリン酸緩衝液;イノ-リパ（Inno-Lipa）、イノジェネティックス（Innogenetics）、アントワープ、ベルギー）に交換し、片をRTで2回、1mlですすぐ。最終的に、片を結合希釈物（Conjugate Diluent:NaCl、Triton、タンパク質安定化剤、0.1% NaN3を含有するリン酸緩衝液:イノ-リア（Inno-Lia）、イノジェネティックス、アントワープ、ベルギー）ですすぎ、4000×に希釈したストレプトアビジンを含有する結合希釈物とインキュベーションし、アルカリフォスファターゼ（ギブコBRL）でさらにRTで30分間標識する。片を再度すすぎ溶液で3回、基質希釈物（Substrate Diluent:NaClおよびMgCl2を含有するTris緩衝液:イノ-リア、イノジェネティックス、アントワープ、ベルギー）で1回洗浄する。発色はBCIPおよびNBTを基質希釈物に加えて、この片をRTで30分間インキュベーションすることにより行う。発色は緩衝液を蒸留水と交換することにより停止する。
５.HCVタイプ1、2および3間を識別するためのLiPA
タイプ3に対するプローブのための配列を血清BR56（受け入れ番号D13448）由来のcPCRクローンから得た。公表されたタイプ1配列をBR56と比較した時、4から6個の変異を含む16ヌクレオチドのふたつの領域が、いつも観察された。驚くことには、タイプ2配列が入手できるようになった時、これらふたつの領域での変異が再び維持されていたことである。ゆえに、タイピング用プローブの位置はこれらの領域中から選ばれ、その領域はタイプ間で比較的低程度の相同性を有するが、ひとつのタイプの中ではよく保存されていた。第一片は全部で8つの別個に固定化されたオリゴヌクレオチドが適用された。それらのふたつはHCVタイプ1（HcPr124、配列番号5、およびHcPr125、配列番号6）に、4つはHCVタイプ2（HcPr136、（配列番号9）およびHcPr137、（配列番号10）はHCVタイプ2aに、HcPr126（配列番号11）およびHcPr127（配列番号12）はタイプ2bに）に対し、ならびにふたつはHCVタイプ3（HcPr128、配列番号13、およびHcPr129、配列番号14）HCVに対するものであった（表４）。
cPCR生成物を23種のブラジル人血清（BR1からBR23）から合成し、ならびにハイブリダイゼーション後にその中の17がタイプ1の16merを認識した。4種のタイプ3血清がタイプ2a血清と共に見いだされた。血清BR23をタイプ1およびタイプ3とコーインフェクションさせた。2種の日本人のプール血清を続いて試験した:JP63はタイプ1およびタイプ2aプローブと反応し、JP62プールの大部分がタイプ2a配列を含有していた。プライマーHcPr95（配列番号3）とHcPr96（配列番号4）との間の領域のcPCRクローニングおよび配列決定後、JP62（第２図）はタイプ2aであると確定した。タイプ2bプローブであるHcPr126（配列番号11）およびHcPr127（配列番号12）は、JP62がそれらとは反応しなかったが、それぞれたった1つか、および2つのヌクレオチドがJP62（受け入れ番号D13453）の配列と異なっていた。それゆえに、選択したハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件はたいへんストリンジェントであり、このアッセイではわずかひとつの誤対合もハイブリダイゼーションを許さない。
６.サブタイプ間の識別
すべての入手可能なタイプ1コード配列を注意深く比較した後、ふたつのサブタイプ（1aおよび1b）を79%の平均ゲノム相同性で明らかに区別できる。5’UR領域において、HCV-JとHCV-1との間にたったふたつの変異が、入れ子状に重複したPCR生成物領域に観察されただけで、98.8%の相同性を示した。HCV-1（1a）とHCV-J（1b）との間にはわずかふたつの変異が存在したが、-99位で観察されるAからGへの転換はこれまでに調査したすべてのタイプ1b単離物で起こることが観察された。それゆえに、プローブHcPr138（配列番号7）へのハイブリダイゼーションは、Gへ置換した領域にも広がるが、タイプ1b単離物であることを示している。
すべての入手しうるタイプ3の5’UR配列（本発明:Bukhら、1992;Chanら,1992;Leeら、1992）を比較する時、-139位での、共通なG（タイプ3a;HcPr140、配列番号15）の存在、またはよりまれであるがA（タイプ3b:HcPr139、配列番号16）の存在により、単離物をふたつの群に分割できた。タイプ2aとタイプ2bとの間（またはK2aとK2bとの間）の識別は上記に報告したように可変領域中で行うことができた。
タイプ1および3についてのこれらすべてのタイプ-およびサブタイプ-特異的プローブの組み合わせ（表４）は、17種のブラジル人血清（すでにタイプ1を8つの1aタイプ、および9つのタイプ1b血清に特徴ずけられたもの）を分けることを可能にする。4つのタイプ3血清のうち3つがタイプ3a系とハイブリッドを形成した。コーインフェクションさせた血清BR23のcPCR断片中の異なる分子がタイプ1bおよびタイプ3aの系とハイブリダイズした（第３図、第8片）。
別の38のブラジル人血清（BR24からBR61）をこの新しいLiPAで試験した。これらの血清を選択するにあたっての最も有力な基準は、NS4およびNS5エピトープに関する抗体の不存在であった。なぜならば以前の報告ではタイプ2およびタイプ3抗-NS4抗体と、タイプ1 NS4抗原との間に低度の交差反応があったからである（Chanら、1991）。38のブラジル人血清のうちの12がタイプ1aと、14がタイプ1bと、9がタイプ3aと、2がタイプ3bと、ならびにひとつはタイプ1bおよびタイプ3aとのコーインフェクションであると決定できた。すべての試験したブラジル人血清はタイプを決定できたと結論した。タイプ3サブタイプ間の識別に関連性があるかどうかを決定することが残る。TaおよびTb単離物の5’UR由来の配列データ（Moriら、1992）は公表されてないので、我々のタイプ3aおよび3bの分割は未だ試験的なものである。血清学および塩基の読み取り枠についてのさらなるデータが、タイプ3およびタイプ4のサブタイプの決定を確立するためには必要である。
７.タイプ4単離物の同定およびタイプ4-特異的プローブのLiPAへの編入
6人のブルンディー人血清（BU74からBU79）から増幅したPCR断片は、片上のいずれの16-merとも反応できなかった。これらブルンディー人試料（BU74:受け入れ番号D13449（これはBU76と同一）、およびBU79:受け入れ番号D13450;第２図）からの3つのPCR断片をクローン化し、配列決定した。以前記載されたほとんどのタイプとは明らかに異なる配列が得られた。ブルンディー人試料は互いに、およびZ6（Bukhら、1992）と関連しており、タイプ3またはタイプ2よりもタイプ1により高い相同性を表す。しかしタイプ1とのほとんどの相違は、ここでも可変領域に位置していた。最も驚くべき発見は、BU74およびBU76において、-139位と-140位の間にひとつの余分なヌクレオチドが存在することである。この結果は新規HCVタイプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のタイプ）が存在することに賛成の議論を支持し、これを暫定的にタイプ4と呼ぶ。これらアフリカ人から増幅できたウイルスの5’UR配列は、以前記載されたタイプとは、互いに大変異なった。それゆえにこれらの単離物は暫定的にタイプ4と命名した。アフリカから得られた同様な配列が、Bukhら（1992）の研究でも見られたが、ひとつはオランダからのものであった。第２図は、ヌクレオチド-291と-55の間の領域において、この群内では最大8種の変異が可能であることを表す。タイプ4はさらにいくつかのサブタイプから構成されるようであり、すなわちこれらのサブタイプはタイプ1のサブタイプとは異なるようである。
これらのデータを得た後、LiPAは3つの点で改良された。第一にオリゴヌクレオチドHcPr142（配列番号20）（ひとつの縮退を持つ）が、PCR生成物の存在を確認するための万能HCVプローブとして高度に保存された領域から選択された（表４）。第二に、3種のオリゴヌクレオチド（HcPr144、配列番号17（ひとつの縮退をもつ）、HcPr145、配列番号18およびHcPr146、配列番号19;表４）をタイプ4配列の同定のために合成した。第三に、万能タイプ2プローブを可変領域の外側から選択した（HcPr147、配列番号8、表４）、なぜならタイプ2の検出のための万能プローブを、-170位と-155位の間、および-132位と-117位との間の領域から選ぶことができなかったからである。
この様式のLiPAで、ブルンディー人血清（表３）からの6PCR断片を期待どおりタイプ4に分類した（第３図、第6および7片）。ふたつのガボン人血清、オランダからの4血清および6つのベルギー人血清も調査に含めた。GB80からタイプ4HCV5’URが増幅でき、これをクローン化し、および配列決定した（第２図）。他のガボン人血清GB81はタイプ2（クローン化され、配列決定された、第２図）の変異体とタイプ4のコーインフェクションを表した。後者はBU79と同じタイピングパターン（第３図、第7片）を与えた。GB81とタイプ2およびタイプ4プローブとの反応が、タイピングプローブ間の予期せぬ交差反応により起こるのか、または単にコーインフェクションの結果なのかを確かめるために、cPCR生成物をクローン化し、17の別個のコロニーをPCRおよびHCV LiPAに供した。10（59%）コロニーがタイプ4の挿入を含み、および7つがタイプ2を含み（41%）、明らかに同一血清内で2つのタイプのHCVのコーサーキュレーション（co-circulation）を示していた。3つのNE-血清はOrtho RIBA試験に陰性、およびInno-LIA HCV Ab試験に陽性（NE71）、不確定（NE72）または陰性（NE73）なので、タイプ3a単離物が存在することを示すことができた。第4のNE血清は、Ortho RIBAおよびINNO-LIAの両方によい反応性を示すが、タイプ1a単離物を含有した。最終的に、分析した6つのベルギー人血清から、BE64からBE67がタイプ1b株に感染していた。イタリアからの患者1人（BE68）はタイプ2a感染であり、ならびにBE69はタイプ3a配列を含有した。後者は慢性の、ウイルス性-様のNANB肝炎の症例から得たものであったが、すべての第二世代アッセイ、ならびに抗-NS3、抗-E1および抗-E2リサーチアッセイに陰性であった。この血清はきわめて低いウイルス価を有し、および2年の間に採取された4つの別個の試料で、第二回のPCR後にわずかに陽性になり、HCV診断では入れ子状に重複したPCRの必要性を示した。入れ子状に重複したPCR断片の配列は、BR56と同一であった。タイプ3株が示す変異は大変少ないので、このことは驚くことではなかった。
全部で19の種々のオリゴヌクレオチドを第３図に示すようなLiPA片様式に使用した。いくつかのオリゴヌクレオチドは同じHCVサブタイプに対しているので、タイプ2aのためにプローブHcPr156（配列番号22）をHcPr158（配列番号24）とともにプールした。タイプ4に対するオリゴヌクレオチドは別個に適用した、なぜならこの時点ではコード領域からの配列情報が極めて少なく、したがってサブタイプへの分割（あるとすれば）は未だできないからである。いくつかのタイプ4配列中の余分な塩基の存在により、この群をさらにサブタイピングする試みの基礎をつくることができる。いくつかの代表的血清で得られた結果を第３図に表す。これらの片の解釈は表２に与えられる。
この調査で61のPCR-陽性ブラジル人HCV血清のタイプが決定された。20（33%）の血清はタイプ1aHCV感染を有し、23（38%）はタイプ1b、1（1.5%）はタイプ2a、15（24.5%）はタイプ3、および2（3%）の血清はコーインフェクションであることが分かった。コーインフェクションされた血清であることはBR23（第１図、レーン9;第３図、片8）により図示される。残る20の血清を5つの異なる国から集めた;8つの血清がアフリカにあるふたつの国から得たものであった。
症例BE67のような少数の場合において、タイプ1bPCR断片は3bサブタイププローブHcPr139（配列番号16）を認識した。これは血清BE67の1b配列が-139位でTの代わりにAを有することを推定することにより説明できる。JP62（受け入れ番号D13453）配列で得た結果は、オリゴヌクレオチド中のひとつの誤対合がハイブリダイゼーション信号を認めない点から、この推定がさらに支持される。単離物-特異的変異は5’UR中に散在しているので、タイプが与えられた単離物が別のタイプのサブタイピングプローブとハイブリダイズすることも可能である（第３図、片6および7を参照）。そのような反応性は、調べた単離物中にサブタイピングプローブの配列が存在することを示すにすぎない。しかしGB81について調査したように、血清がコーインフェクションしていない限り、多くのタイピングプローブとの反応性は観察されなかった。
一般的に、タイプ1a cPCR生成物がLiPAでハイブリダイズする時、プローブHcPr124（配列番号5）、HcPr125（配列番号6）およびHcPr142（配列番号20）の配列が入れ子状に重複したcPCR断片中に存在しなければならない。したがって184bp（第２図）のうちの48bp（26%）が、即座にわかる。同じ理由から、HCV Jタイプと同様な単離物は配列中の33%、HC J6タイプは35%、BR56タイプは34%、Z6およびBU77タイプは26%、BU74タイプは41%、ならびにBU79タイプは32%が知られていると計算することができる。しかし、16-merのいくつかの縮退から情報が損失することを考慮しなければならず、したがってこれらの割合は最大値である。にもかかわらず、この研究法はハイブリダイゼーション法による配列決定の考え方を支持するものである（Strezoskaら、1991）。
LiPAと、我々のLnno-LIA HCV Abアッセイのこれら血清の抗体反応性とを比較する時（表３）、遺伝子型とそれらの表現型（血清型）との間のいくつかの相関が明らかになる。ベルギー、オランダ、ガボン、およびブレンディーからのタイプ3および4血清すべての第二世代の抗体アッセイとの反応は、わずかに陽性、不確定、または陰性である。わずかに陽性の反応はほとんどが抗-コア抗体により起こるが、LIA NS4およびNS5エピトープに対する抗体は通常存在しない。これは免疫的交差反応を起こすわずかに異なるだけのエピトープをコードする、コア配列の高度な保存に合致する。NS4およびNS5領域に対するエピトープは高可変領域に位置し、ほとんどの免疫的交差反応を起こすことはできない。現在の抗体アッセイはタイプ1エピトープを含んでいるので、タイプ2、タイプ3およびタイプ4感染血清の数%が陰性の結果を示すであろうことは可能である。しかし、タイプ3ブラジル人血清がタイプ1 NS4およびNS5抗原と交差反応しないという結論を、我々の結果からは導くことができない（表３）。無作為に選択した14の血清（BR24から37;表３）については、LIA反応性と9つのタイプ1ウイルスとの間に100%の相関があった。4つのタイプ3血清から2つ（BR34およびBR36）がNS4と反応し、3つが（BR33,BR34およびBR35）がNS5と反応した。BR37はコーインフェクションゆえに考慮されなかった。単一のタイプに感染した77の血清のすべての血清学的データを分析した時、タイプ1血清の58%および44%がそれぞれNS4およびNS5エピトープを認識した。これらの割合はやや低く、それは選択基準のためである。タイプ3血清については、37%および53%がそれぞれNS4およびNS5と反応した。より高い交差反応性は高-危険群で観察することができ、それは例えばヨーロッパの血液提供者を対象とした結果と比較した場合のブラジルから得たこれら試料である（本発明およびChanら、1992）。そのような交差反応する血清は多回感染によって誘導されることができ、その中には同時に生じるものもあるが、その他は続けて起こるだろう。前の抗-HCV記憶は新たなHCV感染により二次免疫され、ひとつのタイプのウイルスのコーサーキュレーションを起こすことができ、別のタイプに対する抗体を生じた。このような説明は、血清BR56に関してあてはまり、この血清はHCVタイプ3と決定されたが、タイプ1コア、E1,E2,NS3,NS4およびNS5に対する抗体を含んでいた（データは示さず）。抗-タイプ3抗体がこの血清に存在するかどうかを決定することが残る。
免疫応答の差異に加えて、種々のHCVタイプは長期肝臓疾患に対する種々の経過も表し、それらはすでに報告されている（Okamotoら,1992a）。
結論として、LiPAはHCV感染のタイプを迅速に決定できる。このアッセイは異なる4つのHCVタイプおよび8つのサブタイプ間を識別する能力を有し、新らたなタイプを決定するための良い手段である。
さらに、このアッセイはcPCR反応をRNA-捕獲PCRと交換することによりさらに改良できる。最終的に、このアッセイは遺伝子型、将来的に血清型と、臨床状態または疾患の結果との関連を確立するさらなる道具となることが証明できた。
８.新規タイプおよびサブタイプの識別、およびそれらを分類するために有用なプローブ
ベルギーから得た単離物BE82、BE90、BE91、BE92、BE93、BE94、BE95、BE96、BE97、BE98;ガボンから得たGB48、GB116、GB358、GB569、GB549、GB809、GB487、GB724およびGB438;カメルーンから得たCAM600およびCAM736;をさらに研究するために確保した。なぜなら実施例３および４に従い,プローブ5から27を含むLiPAによる遺伝子型の決定後に、異常な反応性が観察されたからである。5’非翻訳領域の配列を、実施例２に記載されたように配列番号1,2,3および4を使用する入れ子状に重複したプライマーによるPCR法、クローニングおよび配列決定後に得た。これらのほとんどの単離物に関するNS5コード領域中の配列情報が得られ、既知の配列との整合配列を第５図に表す。各サブタイプに関する典型的単離物のNS5核酸、およびアミノ酸配列の相同性を、公表された単離物の配列と共に表６に与える。この計算は第４図に与えるように、タイプおよびサブタイプへの分類を可能にする。いくつかの原型配列を持つこれら新規の単離物の5’非翻訳領域のヌクレオチド整合配列も第４に与えられる。HCV-1と比較すると数個の変異が観察できる。5’非翻訳領域中の同一変異は、コード領域中の同様な配列と相関するので、そのような変異は本発明において、新規タイプおよびサブタイプ-特異的プローブを設計するために採用する。
BE82はサブタイプ1bの単離物であるが、-94位でC変異を表し、それゆえにプローブ7とは反応できなかった。NS5領域を配列決定した後に、この単離物がサブタイプ1bに属するものと結論できた。ゆえにプローブ30（-94位でTおよびCの縮退を含む）はサブタイプ1bのより良い遺伝子型決定をすることができるはずである。
BE90は、別のサブタイプ1b単離物であるが、-159位でT変異を、および-126位でG変異を表すので、万能プローブ20および27、ならびにサブタイピングプローブ7とのみ反応した。NS5領域の配列決定では、単離物がサブタイプ1bに属することが分かった。プローブ28（Tおよび-126位でのCの縮退を含む）はタイプ1および6のよい遺伝子型決定ができるはずである。
単離物BE92は万能プローブ20および27に加えて、プローブ8および26とのみ反応した。すなわちこの単離物はタイプ2と分類できるが、サブタイプを決定することはできなかった。それはプローブ23、24、25または26との反応性が観察できなかったからである。配列決定した後に、ふたつの新らたなモティーフをまさに観察することができた:GGACCCAGTCTTCCTG（プローブ33により包含される）、およびTGCCTGGTCATTTGGG（プローブ34により包含される）。NS5領域の配列決定では、同一タイプ内の分類と矛盾しないタイプ2aとタイプ2b単離物との相同性が明らかになったが、別のサブタイプではサブタイプ2cが提案された。
単離物BE93およびBE94はサブタイピング用プローブ14と、いかなる反応性を表さなかった。5’非翻訳領域およびNS5領域を配列決定した後、これらの単離物は3aサブタイプに属すると結論した。ゆえに、プローブ35のように-118位でCおよびAの縮退を含むプローブはサブタイプ3aのよりよい遺伝子型決定を可能にするはずである。
単離物GB48、GB116、GB358およびGB569は、LiPAにおいてプローブ17および19で陽性のハイブリダイゼーション信号を表し、すでに報告されているタイプ4単離物と同一であることを示すが、単離物GB549およびGB809は万能プローブとしか反応しなかった。5’非翻訳領域、およびNS5の一部分の配列が得られた。第５および６図、ならびに表６からGB358により表される単離物はタイプ4の同じサブタイプに属すると結論でき、それはサブタイプ4aと提案される。しかし、GB549およびGB809のいずれもサブタイプ4a、4bおよび4d単離物と、ならびに互いに低い相同性を表すが、GB809はZ4と同じサブタイプに属すると思われる。これらの相同性は同じタイプ4への分類に対応するが、タイプ4の異なるサブタイプへの分類である:GB549はサブタイプ4eへ、およびGB809はサブタイプ4cへ分類することが提案される。単離物GB116,GB358およびGB569から得た配列すべては、プローブ38で検出可能であるモティーフAATCGCCGGGATGACC、ならびに、プローブ19で検出可能であるモティーフTTTCCGGGCATTGAGCを表す。したがってプローブ38および19は、サブタイプ4aの検出および分類に有用である。プローブ38はサブタイプ4a,4b,4d,4fおよび3bに特異的であり、一方プローブ19はサブタイプ3b、4a,および4dを認識するが、新タイプ3cおよび4fともハイブリダイズする。興味深いことには、新タイプ3b配列HCV-TRがこれらのプローブと交差反応する。しかしタイプ3-特異的プローブ21との反応性から、3bは依然タイプ3と分類できる。
GB549も特徴的なモティーフを表す。モティーフAATCGCCGGGACGACCはプローブ40で検出でき、および配列AATGCCCGGCAATTTGはプローブ41で検出しうる。したがってプローブ40および41はサブタイプ4bのサブタイピングに有用である。
GB809と同一の反応性は、LiPAにおいてカメルーンから得たふたつの試料CAM600およびCAM736で得られた。NS5領域を配列決定した後、これらの試料はGB809と同一のサブタイプに属すると結論でき、ならびに5’非翻訳領域を配列決定した後に、すでにGB809に存在するふたつの同一モティーフが再び検出された。すなわちプローブ42で検出しうるモティーフAATCGCCGAGATGACC、およびプローブ43で検出しうるAATGCTCGGAAATTTGがサブタイプ4cに特徴的であることが分かり、プローブ42および43はサブタイプ4cの検出および分類用に有用であると思われる。しかしZ4は、同じサブタイプ4cへの分類に対応するE1領域中に相同性を示すが、ここでも独自な5’UR配列を表し、プローブ7、50および53で検出できる。
単離物GB487,GB724およびBE97の5’非翻訳領域中の新規配列が検出された。これらの単離物に関して、コード領域の配列情報に基づくのではない新なサブタイプの分類が暫定的に提案された。すべて3種の単離物がプローブ50で検出可能な配列、TGCCTGGAAATTTGGGを表す。GB487はプローブ49で検出可能な独自の配列AATCGCCAGGATGACCを表し、暫定的にサブタイプ4hに分類される。GB724およびBE97は、両方ともプローブ53で検出可能な配列、GGAATCGCCAGGACGAを含有し、暫定的にサブタイプ4gに分類される。
タイプ4単離物は、通常-238位にT、および-235位にAを表す。それゆえに、プローブ37、38および51はより良いタイプ4の遺伝子型決定を行うことができるはずである。
別の例において、BE95はLiPAにおいてプローブ7および17とのみハイブリダイズするが、すべての他の単離物とコード領域における低い約68%の相同性を表す。しかしBE95と同じサブタイプへの分類（サブタイプ5aと提案される）で一致し、BE95に対する相同性を表すBE96は除外する。BE95,BE96およびSA1はすべてプローブ44で検出可能な同じモティーフ、GAGTGTCGAACAGCCT;プローブ45および47で検出可能なAATTGCCGGGAYGACC;プローブ46で検出可能なTCTCCGGGCATTGAGCを表す。したがってプローブ44、45、46および47はタイプ5aの遺伝子型決定のために有用である。
配列はBukhら（1992）により公表され、それらは独自のCA挿入を-144および-145位の間に含む。これらの単離物は暫定的にタイプ6と分類され、およびプローブ48の手段によって検出できる。
新たなC型肝炎ウイルスが単離物BE98から発見され、これはLiPAでプローブ19とのみ反応した。5’非翻訳領域の配列には、プローブ54で検出しうる新たなモティーフ、GAATCGCCGGGTTGACが含まれる。コア領域の配列決定により、遺伝子型3aおよび3bに対しおよそ等しく相違する相同性を表す配列が明らかとなり、この原型配列には新たなタイプ3cが提案される。
単離物GB438は、プローブ38および19で検出しうるサブタイプ4aに典型的な配列モティーフを含有するが、E1領域ではやはり異なる配列を表し、タイプ4a内の新たなサブタイプを表し、これをサブタイプ4fと命名した。サブタイプ4aからの識別は配列番号51および7を用いたプローブの手段によって行うことができる。
プローブ29はBE90の配列から得たもので、プローブ51および52はGB724の配列から得たものであるが、特定のHCVタイプまたはサブタイプの遺伝子型決定を向上させるために有用でありうる。
実施例９:ヌクレオチドディスタンスの計算
系統発生分析
すでに公表された配列はEMBLデータベース、公開35から得た。他の配列は本発明者により分析され、およびDDBJデータベースに寄託した。配列は系統学推論パッケージ、3.5cバージョン（Phylogeny Inference Package Version 3.5c）フェルセンステイン、1993年3月（Felsenstein,March 1993）に対する連続的様式中に与えられた。同一長の配列のみが同じ計算に含まれた。使用したプログラムはDNADIST,PROTDIST,DNAPARS,PROTPARS,NEIGHBOR,SEQBOOT,CONSENSEおよびDRAWTREEであった。最大DNAディスタンスの見込マトリックスは、Kimura-2パラメーター設定を使用してDNADISTにより作成された。ブートストラップ分析はSEQBOOTを使用して、2000反復で行った。これらすべてのマトリックスをさらにNeighbor-Joining設定を使用しNEIGHBORで分析し、ならびにCONSENSEで分析してコンセンサス樹系を計算した。SEQBOOTデータ設定もDNAPARSプログラムで1130回の反復で分析された。推定のタンパク質配列は、PROTDISTで分析され、続いてNEIGHBORで分析された。最終的にプログラムDRAWTREEは系統発生樹系図の図形的出力を創造するために使用された。すべての分析はSUN SPARC IPXコンピューターステーションで行われた。
NS5領域
Enomotoらにより記載されたプライマーの組（1990）を使用して、13の種々の単離物由来の340bp長のNS5b PCR断片を増幅、クローン化および配列決定した。このヌクレオチド配列を、PHYLIP 3.5cパッケージのDNADISTプログラム（Felesentstein,1993）を使用して系統発生樹系図を作るために使用した。6つの主な群または’タイプ’の多様性はこの根無し木の証明である。各群はさらにふたつ以上の亜群または’サブタイプ’に細分することができた。以下の集団（緊密に関連した単離物から成る群）が作られた:1a、1b、2b、3a、3b、4aおよび5a。この集団化は反復2000のSEQBOOT/DNADIST/NEIGHBOR/CONSENSEプログラムを使用する100%のブートストラップ様式の再サンプルデータに現れた。ブートストラップ様式のDNAPARS分析も同様な集団化を生じた。DNADISTマトリックスから、単離物間、タイプ間およびサブタイプ間の分子の進化的ディスタンスを計算できた。上記に示した分割された集団のみをこれらの計算に含めた。ひとつのサブタイプの単離物間でこの範囲は0.0148から0.1064（平均0.0623;標準偏差0.0181）であった。サブタイプ間のディスタンスは0.1654から0.2675（平均0.2312;標準偏差0.0182）であり、タイプ間では0.3581から0.6549（平均0.4942;標準偏差0.0485）の範囲であった。しかし例外も現れた。
HC-J6と単離物BE92との間のディスタンスは0.1539であり、ディスタンス間としては低いディスタンス値であるが、しかし同一サブタイプ間に属する単離物間で得られたどのような値よりもはるかに高かった。HC-J6とBE92との間のNS5ヌクレオチド配列の相同性は86.2%だった。ブートストラップ様式のDNAデータベースは両方の配列をこの場合98.8%にまとめ、これはサブタイプ2a分類に関しては異議のあるところであるが、しかし分子進化的ディスタンスおよびBE92の5’URの配列から暫定的にこの単離物をサブタイプ2cに分類した。
GB809はタイプ4a集団から、0.1509（最小/最大＝0.1384/0.1597）の平均ディスタンスに位置した。87.4%の最大相同性がGB809とGB358（タイプ4a）の間に存在する。しかし、これらのデータから、観察された5’UR中の変異性と共に新たなタイプ4サブタイプ4cを作ることが可能になる。GB549は新たなサブタイプ4eを表し、ヌクレオチド水準で4a集団から0.2426のディスタンスを;サブタイプ4cから0.2403のディスタンスを;およびGB438から0.1738のディスタンスを有する。単離物GB438はおそらく別のタイプ4サブタイプを表すかもしれないが、暫定的に4fと命名する。
コア/E1領域
DNASDISTプログラムを使用するヌクレオチド378と957との間にあるコア/E1領域に関する系統発生樹系図は6つの主要支脈を生じ、6つの異なる遺伝子型を表す。2000回の反復でブートストラップ様式のリサンプリング分析から、100%の確実性で、以下の集団を明らかにできた;サブタイプ1a、1b、2a、2b、3aおよび4a。サブタイプ4c、4e、4fおよび5aはひとつの単離物により表されるだけなので、この集団化はこれらには不適当である。DNADISTマトリックスに基づき、同一サブタイプに属する単離物に関する分子の進化的ディスタンスは、0.0402から0.111（平均0.0772、標準偏差0.0197）、サブタイプ間は0.1864から0.3535（平均0.2833、標準偏差0.0350）、およびタイプ間は0.3824から0.6230（平均0.4894、標準偏差0.0554）の範囲にあった。
DNADISTマトリックスからのディスタンスはさらに、タイプ4中に少なくとも4つの異なるサブタイプが存在する証明を提供した。タイプ4aは0.0083の平均相互ディスタンスを有する;一方タイプ4c、4eおよび4fでの平均は0.2602であった。サブタイプ4cおよび4fは4eから、それぞれ0.2047および0.1864離れており、一方4cと4fとの間のディスタンスは0.2316であった。
NS3/4領域
すでに記載したタイプ3aエピトープ領域（Stuyverら1993a）およびEMBLデータバンクの他の配列を含むDNA配列は、DNADISTおよびNEIGHBORを使用してヌクレオチドディスタンスを計算するために使用された。DNADISTマトリックスから単離物間の分子的進化のディスタンスは0.0407から0.1181（平均0.0855、標準偏差0.0190）、サブタイプ間は0.2281から0.2603（平均0.2416、標準偏差0.0098）およびタイプ間は0.4052から0.6247（平均0.4889、標準偏差0.0531）の範囲であった。
実施例10
実施例の導入部、および前述の実施例中に記載したように、5’URの可変領域は遺伝子型に特異的な配列を、実施例8に記載したように新たに発見された遺伝子型中にも含むと期待され、従ってそのような新たな遺伝子型-特異的モティーフは、実施例8に記載したような遺伝子型-特異的プローブの手段によって再度検出されるべきである。それゆえに、プローブ32および実施例8に記載したプローブ31、33、34、37、38、44、45および46を合成し、ニトロセルロース膜に適用し、実施例3および4に記載したようなビオチン-標識PCR断片を用いたラインプローブアッセイを行った。ただしPCR断片の合成中に、bio-11-dUTPから取り込まれたものではなく、配列番号3および4を用いた5’-ビオチン化プライマー、または配列番号1および2を用いた5’-ビオチン化プライマーから取り込まれたビオチンを用いたPCR生成物の標識は除外した。
第６図は、HCVのタイプ1ではないHCVタイプ2の5’UR断片の、配列番号32を用いたプローブへのタイプ-特異的ハイブリダイゼーションを表す。サブタイプ2aおよび2b単離物の両方が特異的にプローブ32とハイブリダイズした。
第７図において、配列番号33および34のプローブは、血清BE92由来の遺伝子型2c PCR生成物と特異的にハイブリダイズすることを表すことができた。一方遺伝子型2aおよび2b血清は、それぞれ2aおよび2b遺伝子型-特異的プローブとの特異的ハイブリダイゼーションを観察することができたが、これらのプローブ（配列番号33および34）に対しては反応しなかった。新しい遺伝子型2cは、最近発見された他の遺伝子型2cとは異なるかもしれないと思われたので、このサブタイプの種類のための別の名前が提案できる。
第８図は、タイプ4血清を用いて行ったラインプローブアッセイを表し、最も共通なタイプ4血清のプローブ37および38への特異的ハイブリダイゼーションを表す。
第９図は、タイプ5a血清のプローブ44、45、46およびプローブ7に対する特異的ハイブリダイゼーションを図解し、一方タイプ4血清の反応性は通常プローブ31に限られ、プローブ44から46に対しては存在しない。それゆえに、配列番号18のプローブのタイプ4およびタイプ5単離物の両方に対する混乱は、今では配列番号19のプローブに加えて配列番号37、38、44、45、46、7、30、おび31のプローブを遺伝子型4および5を識別するために採用することにより、便利に克服できる。
実施例11
実施例３および４で概説したような他のハイブリダイゼーション条件（温度および緩衝液）を使用することが好ましいかもしれない。それゆえに、配列番号93、94、95および96のプローブをニトロセルロース膜に適用した。第10図は実施例4に記載されたようなタイプ4血清GB116およびタイプ5a血清BE95を用いたラインプローブアッセイを表すが、以下が異なる:PCR断片をNaOH/SDS中で変性させた後、3×SSC（Maniatisら、（1982））および1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）から成る1.0mlのハイブリダイゼーション溶液（50℃に予め暖めた）を変性PCR生成物に加え、ハイブリダイゼーションを振盪湯浴中で50℃、2時間行った。片を同じハイブリダイゼーション緩衝液で50℃で30分間洗浄し、その後実施例４に記載されたように洗浄および発色を行った。第10図では、明らかなタイプ-特異的反応を観察できる。それゆえに、タイプ-特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションプローブにわずかに変更を加えた後に実施例4および10中に記載されたような他のハイブリダイゼーション条件でも得られた。例えば特定のハイブリダイゼーション条件で、より特異的なハイブリダイゼーションを行うために、プローブの位置を変更することができ、例えばタイプ-特異的ヌクレオチドがプローブの中央部に位置するようにプローブを配置することができる。特定のプローブについて、他のハイブリダイゼーション条件中でも特異性を保持するために、連続的HCV配列を長くし、または短くし、かつ/またはプローブのセンスを逆にして、特定の好ましい温度または塩濃度条件で遺伝子型-特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることも好ましいかもしれない。しかし場合によっては、イノシン類または誤対合ヌクレオチドを含めて、遺伝子型-特異的ハイブリダイゼーションが特定の温度または塩濃度条件で起こるようにすることが好ましいかもしれない。例えば配列番号37のプローブは、タイプ4と5単離物間を実施例10に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、いまでは連続的HCV配列の3’末端を2ヌクレオチド延長することにより配列番号93（5’-GAGTGTTGTACAGCCTCC-3’）に変更され、プローブ93はSSC/SDSハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第10図）。配列番号44のプローブはタイプ4と5単離物間を実施例10に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、いまでは連続的HCV配列の3’末端を1ヌクレオチド延長することにより配列番号96（5’-GAGTGTCGAACAGCCTC-3’）に変更され、プローブ96はSSC/SDSハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第10図）。配列番号46のアンチセンスプローブは、-132から-117の位置を標的とし、タイプ4と5の単離物間を実施例10に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識別できたが、今では配列IS番号95（5’-TGCCCGGAGATTTGGG-3’）に変更され、これは-126から-111の位置を標的とするセンスプローブであり、プローブ95はSSC/SDSハイブリダイゼーション緩衝液中で特異活性を表した（第10図）。
実施例では当業者に対して、実施例４に与えたような遺伝子型-特異的変異、または他の新たな、または今後発見される遺伝子型中に存在する遺伝子型-特異的変異を標的とするためのプローブを開発する多くの可能性を説明した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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