(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進するための医薬組成物であって、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有する前記医薬組成物。
【請求項２】
Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化するための医薬組成物であって、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有する前記医薬組成物。
【請求項３】
ミエリン塩基性蛋白の発現を促進するための医薬組成物であって、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有する前記医薬組成物。
【請求項４】
ミエリン形成を促進するための医薬組成物であって、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有する前記医薬組成物。
【請求項５】
脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患および髄鞘破壊からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を予防および／または治療するための医薬組成物であって、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有する前記医薬組成物。
【請求項６】
抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有するミエリン形成促進剤。
【請求項７】
抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有するオリゴデンドログリア前駆細胞分化促進剤。
【請求項８】
抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有するＦｙｎチロシンキナーゼ活性化剤。
【請求項９】
抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を有効成分として含有するミエリン塩基性蛋白発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｆｃ受容体γ鎖のリガンドを含有する医薬組成物、ミエリン形成促進剤、オリゴデンドログリア前駆細胞分化促進剤、Ｆｙｎチロシンキナーゼ活性化剤、ミエリン塩基性蛋白発現促進剤、ミエリン形成可能なオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞を検出する方法、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃ受容体γ鎖の発現を調べる方法および試薬キットに関する。
背景技術
ミエリンは個々の神経軸索を包んでいる、多重層からなる膜状の鞘であるが、これは迅速な神経伝導に必要なだけでなく、軸索の機能や統合性の為にも必要なものである（１，２）。ミエリンは中枢神経系（ＣＮＳ）にて、オリゴデンドログリアによって形成され、この過程は生後間もなく起こる。ミエリンの障害はヒトにおいて重篤な病気をもたらし、多発性硬化症（ＭＳ）はその一つであり、ＣＮＳにおける重度のミエリン消失が特徴的である。この病気は一世紀以上前に発見されているが、病因も治癒法もほとんど分かっておらず、研究されていない（３）。最近になってようやく、ＭＳの病巣においてオリゴデンドログリア前駆細胞の集団の存在が初めて報告された（４）。これらの内在性の前駆細胞を、消失したミエリンを再生するよう分化させる、あるいは強化させることができるような機構解明は、効果的な治療上の目標となる。従って、ミエリン形成機構の解明という包括的な研究は、脱髄疾患の治癒治療の観点において非常に重要である。
ミエリンは限られた種類のミエリン蛋白より構成されている。ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）はＣＮＳ内の全ミエリン蛋白のうち、３０−４０％を占めている。ＭＢＰはミエリン鞘の圧密化に決定的な役割を担っており、ミエリン形成に必須である（５）。ＭＢＰはまた他のミエリン蛋白、例えばＭｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＧ）の発現制御を行っており、ミエリン形成に極めて重要であることが示されている（６）。自然発生Ｓｈｉｖｅｒｅｒマウスは、ＭＢＰ遺伝子の非人為的に生じた欠損があるが（７）、このマウスはＣＮＳ内軸索の重篤なミエリン低形成を引き起こし、３ヶ月以内に若年死してしまう。ＭＢＰのうちある特定のアイソフォーム、即ちＭＢＰ遺伝子のうちエクソン２を含むものは、ミエリン形成の制御的機能を担っているため（８）、ミエリン形成の初期段階ではＭＢＰが必要であることが示唆されている。
ミエリン形成過程において、Ｆｙｎチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）はオリゴデンドログリア内の重要な信号伝達分子として働いており（９）、ＭＢＰの発現を促進する（１０）。Ｆｙｎ欠損マウスはＭＢＰ量の重篤な減少を起こし、重度のミエリン形成不全を起こす（９−１１）。Ｆｙｎは非受容体型チロシンキナーゼであり、細胞外シグナルを受けるためには、アダプターとなる分子と会合する必要がある。Ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＧ）は、ミエリン形成時初期のＦｙｎシグナルを始動させる候補分子と提唱されてきたが（９−１３）、ＭＡＧ欠損マウスはほとんどミエリン異常を呈しなかった（１４，１５）。ＭＢＰ発現については、ＭＡＧ欠損マウスで顕著な差異が確認されず（１４−１６）、ＭＡＧがＦｙｎの上位シグナル分子であって細胞外シグナルをＦｙｎに伝えているとの可能性が疑問視されるに至った。研究者によっては、ＭＡＧ欠損マウスでは何らかの分子が機能を代償していることを提唱したが、しかしながら、そのような分子はまだ発見されていない（１７，１８）。
ＭＡＧはミエリン形成の始動分子にあらず、これまでに知られていない分子が始動を担っていることが示唆された（６）。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの報告では、オリゴデンドログリアの形態的分化時のＦｙｎ活性化はＭＡＧの初発現以前に起こることが示されている（１９）。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＭＢＰがＭＡＧの発現を制御しているのである（６）。
本発明は、Ｆｙｎと機能的に会合し、ＭＢＰの初発現をもたらす、始動分子を明らかにすることにより、ミエリン形成の障害によりもたらされる疾患の治療戦略を得ることを目的とする。この分子、即ち、本当のミエリン形成の始動分子は、ＭＡＧの初発現（生後２週目初期；６，２０）よりも前に発現してなくてはならない。このシグナルカスケードを明らかにすることで、ミエリン形成の裏にある機構を細密に理解することができよう。
発明の開示
本発明者らは、免疫系における重要なシグナル伝達分子である、免疫グロブリンＦｃ受容体γ鎖（ＦｃＲγ）（総説は２１参照）がミエリン形成に関与していることを明らかにした。ＦｃＲγはＦｙｎと会合し（２１）、オリゴデンドログリア内のＭＢＰ初発現を制御している。本発明者らはこのＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードがミエリン形成に重要であることを提唱する。本発明者らは免疫グロブリンＧに特異的なＦｃ受容体がオリゴデンドログリア内に発現していることを検出し、これにより、抗体−Ｆｃ受容体相互作用がミエリン形成を制御している可能性が示唆された。ＣＤ４５はＦｙｎの制御分子であるが（２２）、この分子はミエリン形成時にオリゴデンドログリア内にてＦｃＲγを共発現している。またこの分子がミエリン形成過程に関わっていることは、ＭＳの一部の患者集団でＣＤ４５に変異があることが発見されたこと（２３）により支持される。本発明者らの発見は脳と免疫系の間にある連携を紹介するもので、ミエリン形成機構を明らかにするものである。この相互関連を明らかにすることで、ＭＳを含めた脱髄疾患／髄鞘形成不全疾患の将来的な治療戦略が得られた。本発明は、以上の知見に基づいて完成されたものである。
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質（但し、静注用免疫グロブリンを除く）を有効成分として含有する医薬組成物。
（２）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質が、Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドであって、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドである（１）記載の医薬組成物。
（Ａ）オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
（Ｂ）Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
（Ｃ）ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。
（３）  Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドカンドが、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体である（２）記載の医薬組成物。
（４）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質が、Ｆｃ受容体γ鎖に会合することができるＦｃ受容体のいずれかに対するリガンドであって、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドである（１）記載の医薬組成物。
（ａ）オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
（ｂ）Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
（ｃ）ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。
（５）  Ｆｃ受容体γ鎖に会合することができるＦｃ受容体のいずれかに対するリガンドが、Ｉ型Ｆｃγ受容体に対するリガンドである（４）記載の医薬組成物。
（６）  Ｉ型Ｆｃγ受容体に対するリガンドが、抗Ｉ型Ｆｃγ受容体抗体である（５）記載の医薬組成物。
（７）  Ｆｃ受容体γ鎖に会合することができるＦｃ受容体のいずれかに対するリガンドが、ＩＩＩ型Ｆｃγ受容体に対するリガンドである（４）記載の医薬組成物。
（８）  ＩＩＩ型Ｆｃγ受容体に対するリガンドが、抗ＩＩＩ型Ｆｃγ受容体抗体である（７）記載の医薬組成物。
（９）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質が、Ｉ型Ｆｃγ受容体に対して結合性が高いＩｇＧのサブクラスである（１）記載の医薬組成物。
（１０）  ＩｇＧのサブクラスがＩｇＧ３である（９）記載の医薬組成物。
（１１）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質がＩｇＧ２ｂである（１）記載の医薬組成物。
（１２）  オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進するための（１）〜（１１）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１３）  Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化するための（１）〜（１２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）  ミエリン塩基性蛋白の発現を促進するための（１）〜（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１５）  ミエリン形成を促進するための（１）〜（１４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１６）  脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患および髄鞘破壊からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を予防および／または治療するための（１）〜（１５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１７）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質（但し、静注用免疫グロブリンを除く）を有効成分として含有するミエリン形成促進剤。
（１８）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質を有効成分として含有するオリゴデンドログリア前駆細胞分化促進剤。
（１９）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質を有効成分として含有するＦｙｎチロシンキナーゼ活性化剤。
（２０）  Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質を有効成分として含有するミエリン塩基性蛋白発現促進剤。
（２１）  オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞におけるＦｃ受容体γ鎖の発現を指標として、ミエリン形成可能なオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞を検出する方法。
（２２）  さらに、ＰＤＧＦαＲ、ＭＡＧ、Ａ２Ｂ５、０４、０１、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＤＭ−２０、ＣＮＰａｓｅ、ＭＯＧ、ＮＧ２およびＡＮ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーのオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞における発現も指標とする（２１）記載の方法。
（２３）  免疫組織または細胞化学的解析により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃ受容体γ鎖の発現を調べる方法。
（２４）  さらに、ＰＤＧＦαＲ、ＭＡＧ、Ａ２Ｂ５、０４、０１、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＤＭ−２０、ＣＮＰａｓｅ、ＭＯＧ、ＮＧ２およびＡＮ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーのオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞における発現も調べる（２３）記載の方法。
（２５）  遺伝子増幅法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃ受容体γ鎖の発現を調べる方法。
（２６）  ウェスタンブロット法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃ受容体γ鎖の発現を調べる方法。
（２７）  さらに、ＰＤＧＦαＲ、ＭＡＧ、Ａ２Ｂ５、０４、０１、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＤＭ−２０、ＣＮＰａｓｅ、ＭＯＧ、ＮＧ２およびＡＮ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーのオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞における発現も調べる（２６）記載の方法。
（２８）  抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を含む、免疫組織または細胞染色試薬キット。
（２９）  さらに、抗ＰＤＧＦαＲ抗体、抗ＭＡＧ抗体、Ａ２Ｂ５抗体、０４抗体、０１抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＰＬＰ抗体、抗ＤＭ−２０抗体、抗ＣＮＰａｓｅ抗体、抗ＭＯＧ抗体、ＮＧ２抗体およびＡＮ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を含む、（２８）記載のキット。
（３０）  抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体を含む、ウェスタンブロット試薬キット。
（３１）  さらに、抗ＰＤＧＦαＲ抗体、抗ＭＡＧ抗体、Ａ２Ｂ５抗体、０４抗体、０１抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＰＬＰ抗体、抗ＤＭ−２０抗体、抗ＣＮＰａｓｅ抗体、抗ＭＯＧ抗体、ＮＧ２抗体およびＡＮ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を含む、（３０）記載のキット。
（３２）  Ｆｃ受容体γ鎖のｍＲＮＡを特異的に増幅することができる少なくとも１対のプライマーを含む、遺伝子増幅試薬キット。
本明細書において、「Ｆｃ受容体γ鎖を活性化する」とは、ＦｃＲγ依存性の細胞内カスケードを始動ないし増強させることをいう。ＦｃＲγ依存性の細胞内カスケードとしては、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードを例示することができる。このＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードは、ＦｃＲγがＦｙｎと会合し、オリゴデンドログリア内のＭＢＰ初発現を制御しているものであることが本発明者らによって実証された。
例えば、Ｆｃ受容体γ鎖を抗体で架橋することにより、Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる。あるいは、Ｆｃ受容体γ鎖が会合している、Ｉ型Ｆｃ受容体γ（以下、「ＦｃγＲＩ」と記す）やＩＩＩ型Ｆｃ受容体γ（以下、「ＦｃγＲＩＩＩ」と記す）（ＩｇＧのＦｃ受容体）を、これらに対する抗体で架橋することでＦｃ受容体γ鎖を活性化することができる。また、ＦｃεＲＩに対する抗体で架橋するとＦｃＲγが活性化されるという報告がある（総説：Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ  ＆  Ｊ．Ｐ．Ｋｉｎｅｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，Ｂ２４（１９９９）、及び同総説内引用文献を参照）。ＦｃεＲＩの架橋ではＬｙｎ、Ｓｙｋ、ＰＬＣγ等の複雑なＣｏｕｐｌｉｎｇを経て、ＩＰ３Ｒによるカルシウムシグナルや、ＥＲＫ、ＪＮＫなどの調節を行うことが報告されている（総説：Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ  ＆  Ｊ．Ｐ．Ｋｉｎｅｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，Ｂ２４（１９９９）、及び同総説内引用文献を参照；ＦｃγＲｓについてはＪ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ  ＆  Ｓ．Ｂｏｌｌａｎｄ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２７５（２００１）、及び同総説内引用文献を参照）。ＦｃεＲＩの下流も、ＦｃγＲｓの下流も全て、ＦｃＲγ依存性のカスケードであると考えられる。しかるに、ＦｃＲγは細胞特異的にカスケードを持っているようである。
「静注用免疫グロブリン」とは、不特定多数の免疫グロブリンプールより抽出された免疫グロブリンであり、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌであり、主な成分はＩｇＧである。これは医療用ＩＶＩｇとして使用されている。
「Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンド（以下、「ＦｃＲγに対するリガンド」と記す）」とは、Ｆｃ受容体γ鎖（以下、「ＦｃＲγ」と記す）に特異的に結合する物質をいう。
「オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する」とは、オリゴデンドログリア前駆細胞がオリゴデンドログリアに成熟するまでの間に観察される何らかの形態的・化学的変化をもたらすことをいう。例えば、オリゴデンドログリア前駆細胞から突起が生じること、或いはＭＢＰ等のミエリン形成に必須の蛋白質の発現が増大することなどが含まれる。
「Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する」とは、Ｆｙｎチロシンキナーゼの酵素活性を上昇させること（質的な上昇）、Ｆｙｎそのものの発現（ｍＲＮＡや蛋白）を上昇させること（数的な上昇）のいずれか一方または両方の作用を奏することをいう。ちなみに、この質的な上昇にはＣＤ４５が必要であろうと推測される。
「ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する」とは、ミエリン塩基性蛋白の発現を引き起こす、あるいは上昇させることをいい、ミエリン塩基性蛋白の発現はＲＮＡレベルでも、蛋白質レベルのいずれであってもよい。
ミエリン塩基性蛋白（以下、「ＭＢＰ］と記す）としては、１４．０、１７．０、１８．５、２１．５ｋＤのアイソフォームが知られており、これらのアイソフォームはＭＢＰ遺伝子上の７つのエクソンの選択的使用によって生じる。ＦｃＲγに対するリガンドにより発現が促進されるのは、主にエクソン２を有するアイソフォーム（１７．０及び２１．５ｋＤのアイソフォーム）である。
「Ｆｃ受容体γ鎖に会合する」とは、Ｆｃ受容体γ鎖に機能的ないし物理的に共役していることを言い、例えば、ＦｃγＲＩでは、その構成分子の一つとしてＦｃＲγが含まれ（物理的共役）、かつ、ＦｃγＲＩのシグナルカスケードはＦｃＲγ依存性である（機能的共役）。
「ミエリン形成を促進する」とは、脱髄疾患では脱落した髄鞘を置換ないし修復することであり、髄鞘形成不全疾患では不完全に形成された髄鞘を完全化ないし置換修復することであり、移植・再生医療においては、外来的に導入されたオリゴデンドログリアないしその前駆細胞が体内で実際に髄鞘を形成するべく刺激し、形成能を強化することである。
「脱髄疾患」とは、形成された髄鞘が何らかの理由により変性あるいは脱落する疾患をいい、「髄鞘形成不全疾患」とは、何らかの理由により髄鞘形成そのものが障害される疾患をいい、「移植・再生医療」とは何らかの方法にて調整したオリゴデンドログリアを患者に移植し、障害を来たしている髄鞘を置換修復し、あるいは低形成（無形成）の髄鞘を人為的に補うべく髄鞘を形成させる医療のことをいう。
「脱髄疾患」の例としては、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎等が含まれる。「髄鞘形成不全疾患」の例としては、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ等が含まれる。他の代謝異常により髄鞘が形成不全を起こす疾患等は、髄鞘形成不全疾患でありながら代謝異常疾患に分類されることも多いが、何らかの理由で髄鞘形成が障害されれば、全て髄鞘形成不全疾患と定義することができる。
「髄鞘破壊」とは、形成された、あるいは形成途上の髄鞘が、何らかの理由により、物理的な崩壊を伴って髄鞘の機能を失わせることを言う。例えば、脳脊髄炎などでは、一般に免疫系細胞が炎症性に髄鞘を破壊する。
本発明のミエリン形成可能なオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞を検出する方法において、オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞におけるＦｃＲγの発現を指標とするが、Ｆｃ受容体γ鎖の発現は、ＲＮＡレベルでも、蛋白質レベルのいずれであってもよい。
「マーカー」とは、特定組織・細胞のＩｄｅｎｔｉｔｙ（属性）を調べる上で、指標となる物質（例えばＦｃＲγ）、或いは、その指標を検索する上で有用な物質（例えば抗ＦｃＲγ抗体）をいう。
「免疫組織または細胞化学的解析」とは、組織または細胞に存在する特定の抗原を抗原−抗体反応によって検出する手法である。例えば、組織または細胞に存在する特定の抗原を標識抗体で可視化し、顕微鏡下で観察する（直接法）。また、抗原に特異的な一次抗体と一次抗体に特異的な標識二次抗体を使用する方法（間接法）もある。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、二次抗体にラベルしている蛍光を感知することもできる。
「遺伝子増幅法」とは、ＤＮＡポリメラーセを用いて連鎖反応的にＤＮＡを増幅する方法をいう。
「ウェスタンブロット法」とは、電気泳動によって分離された蛋白質をニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜などに転移し、その蛋白質を抗体によって検出する方法をいう。
本発明の一態様において、ＦｃＲγを活性化することができる物質を有効成分として含有する医薬組成物は、脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患および髄鞘破壊からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を予防および／または治療するために使用することができる。また、将来的には、神経幹細胞、ＥＳ細胞、献体由来のオリゴデンドログリアを移植・再生させる治療が行われると考えられ（末梢神経系でミエリンを形成するシュワン細胞を中枢神経系に移植する人体実験が、現在Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖ．で始まっている）、そのような治療が可能になった際には、ミエリン形成のＢｏｏｓｔｅｒとして当該技術を応用することが可能である。また、二次的に生じた髄鞘破壊（神経軸索の破壊が先行して髄鞘が破壊されたケース等）においても、神経軸索を人為的に修復しようとする試みが可能になれば、同様にしてオリゴデンドログリア移植・髄鞘再生が必要になると考えられ、この際もＢｏｏｓｔｅｒとして当該技術を応用し得る。
本発明の別の態様において、ＦｃＲγをオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞のマーカーとして利用することができる。ＦｃＲγ陽性オリゴデンドログリアは、ミエリン形成のポテンシャルを持っている細胞として見ることができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００１−２２９５５３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明の実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の医薬組成物はＦｃＲγを活性化することができる物質を有効成分として含有する。ＦｃＲγを活性化することができる物質としては、ＦｃＲγに対するリガンドであって、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドを挙げることができる。
（Ａ）オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
（Ｂ）Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
（Ｃ）ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。
あるいは、（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの作用を持たなくても、ＦｃＲγに特異的に結合して、ミエリン形成を促進する物質であればよい。ＦｃＲγに対するリガンドとしては、抗ＦｃＲγ抗体などを挙げることができる。抗ＦｃＲγ抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。
抗ＦｃＲγ抗体は、常法に従って調製することができる。
例えば、ポリクローナル抗体を調製するには、免疫抗原のＦｃＲγを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から抗ＦｃＲγ抗体含有物を採取し、抗体を分離精製すればよい。あるいは、ＦｃＲγの部分ペプチドを使用することも可能である。また、ＦｃＲγの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３３１９５（ヒトの場合））より予測され、合成された人工ペプチドで免疫することも可能である。この際は、短いペプチド（一般に６〜１８アミノ酸残基）を免疫原として用いるならば、Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎなどのキャリア蛋白との複合体にするとよい。蛋白投与の場合は通常、５０〜１００μｇで免疫する。
モノクローナル抗体を調製するには、上記免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択する。該ハイブリドーマを動物の腹腔内で増殖させ、腹水からモノクローナル抗体を精製してもよいし、動物の血清等からモノクローナル抗体を精製してもよい。あるいはまた、ハイブリドーマを培地で培養して、モノクローナル抗体を生成させた後、該モノクローナル抗体を培養上清などから精製してもよい。モノクローナル抗体作成法は、Ｐ．Ｎ．Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．：Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５３，１１１−１１７（２０００）に記載されているので、これを参考として本明細書に引用する。
免疫抗原のＦｃＲγの調製方法は、Ｔａｋａｉらの論文（５８）か、その論文内の引用文献にて記載されているので、これらを参考として本明細書に引用する。ヒトの場合は、公開されているヒトＦｃＲγの配列（ＧｅｎＢａｎｋＭ３３１９５（ヒトの場合））を元に合成ペプチドを作ることは容易である。
動物の免疫にあたっては、免疫抗原であるＦｃＲγを動物（例えば、哺乳動物）に対して投与による抗体産生が可能な部位に単独であるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与は、皮下注射による投与が好ましい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１週間毎に１回ずつ、モノクローナルならば１〜２回、ポリクローナルならば３〜４回行うとよい。
免疫する動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる。
抗体は上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取される。抗体価の測定で最も多く使われるのは  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法である。更に細かく検討するには、免疫細胞化学やＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行うとよい。詳細については、Ｎｅｌｓｏｎらの論文（Ｐ．Ｎ．Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．：Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５３，１１１−１１７（２０００））を参照するとよい。
抗体の分離精製は免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合物あるいはプロテイン−Ａ等の活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行うことができる。
このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主たる成分とし、ＩｇＭ，ＩｇＡ等、他の免疫グロブリンも含む。この抗体はＦｃＲγと特異的に結合する。
上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫された動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の１週間以内に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ＦｃＲγ抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどを使用することができるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０、ＮＳ１、ＮＳＯ、Ｘ６３Ａｇ８等があげられるが、特にＳｐ２等が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜１：２程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が５０％程度の濃度で添加され、３７度で２０〜３０分インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗ＦｃＲγモノクローナル抗体の分離精製は上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。
抗ＦｃＲγ抗体は、ＦｃＲγに特異的に結合して、所望の効果を奏するものであれば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭのいかなるクラスのものでもあってもよく、またそれらからＦｃあるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あるいはＦａｂ画分あるいはその重合体でもよい。また、抗ＦｃＲγ抗体の可変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常遺伝子とを融合させ、組み換え体として発現させたキメラ抗体を用いることもできる。
また、抗ＦｃＲγ抗体は、脳内に存在する酵素で壊れるような糖鎖で修飾されていてもよい。
抗ＦｃＲγ抗体以外のＦｃＲγを活性化することができる物質としては、以下のものを例示することができる。
１）抗ＦｃγＲＩ抗体
２）抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体
３）ＦｃγＲＩＩのアンタゴニスト
４）ＦｃＲγの構造よりＦｃＲγとの結合能が推測される人工化合物
５）ＩｇＧの中でもＦｃγＲＩに結合性が高いＩｇＧのサブクラス
６）抗ＦｃεＲＩ抗体
１）の抗ＦｃγＲＩ抗体および２）の抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体は、それぞれ、免疫抗原として、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩを用い、前述の抗ＦｃＲγ抗体の調製方法に順じて調製することができる。
３）のＦｃγＲＩＩのアンタゴニストは、ＦｃＲγに対して抑制的（負に）働く機能を抑制する作用を持つ物質であればよい。
ＦｃγＲＩＩ（Ｈ型Ｆｃ受容体）はＦｃＲγの活性に対して抑制的に働くので、これをアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）でブロックした上で、ＦｃＲγを刺激をしてやると効果が高まると考えらる。
４）のＦｃＲγの構造よりＦｃＲγとの結合能が推測される人工化合物は、ＦｃＲγを活性化することができる物質であればよく、ＦｃＲγとの結合能は、ＩＰ−Ｗｅｓｔｅｒｎなどにより推測することができる。例えば、その化合物をオリゴデンドログリアと反応させてやり、ＦｃＲγ抗体で免疫沈降反応（ＩＰ：ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）をして、釣った物質が人工化合物であれば、結合能があると推定される。上記のようにしてＦｃＲγとの結合能が推測された人工化合物は、市販されているものを購入してもよいし、化学合成してもよい。
５）のＩｇＧの中でもＦｃγＲＩに結合性が高いＩｇＧのサブクラスとしては、ヒトの場合、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２などを例示することができ、マウスの場合、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３などを例示することができる。ＦｃγＲＩは高親和性ＩｇＧ受容体、ＦｃγＲＩＩＩは低親和性ＩｇＧ受容体である。そこでＦｃγＲＩを活性化するには、ＦｃγＲＩに結合能が高いＩｇＧサブクラス、ヒトの場合は例えばＩｇＧ３を選択的に投与するとよい。関連する総説としては、Ｊ．Ｅ．Ｇｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６，２３１−２４８（１９９８）を参照されたい。これらのＩｇＧのサブクラスは、サブクラスが特定されたｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａより得られたＩｇＧをｐｏｌｙｃｌｏｎａｌとなるように混合するか、或いは、反応性の無いｈｙｂｒｉｄｏｍａの抗体を得ることにより調製することができる。
６）の抗ＦｃεＲＩ抗体は、免疫抗原として、ＦｃεＲＩを用い、前述の抗ＦｃＲγ抗体の調製方法に順じて調製することができる。
上記のようなＦｃＲγを活性化することができる物質は、１種類のみ用いてもよいし、複数種を組み合わせて使用してもよい。
ＦｃＲγを活性化することができる物質は単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）の予防・治療のために使用する場合には、ＦｃＲγを活性化することができる物質（例えば、抗ＦｃＲγ抗体）を１回量として通常１５０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは４００〜５００ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１か月に１〜２回程度、好ましくは治療開始時に同量を２〜３日連続して、静脈注射により投与するとよい。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわちＦｃＲγを活性化することができる物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒｏｉｌ））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、ＦｃＲγを活性化することができる物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。
また、上記の医薬組成物は、ＦｃＲγを活性化することができる物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。例えば、効果を強化するために、ＦｃγＲＩＩに対するアンタゴニストを投与してもよい。
Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質は、上記のような医薬品として使用できるだけでなく、他の用途にも使用できる。例えば、ミエリンの形成促進、オリゴデンドログリア前駆細胞の分化促進、Ｆｙｎチロシンキナーゼの活性化、ミエリン塩基性蛋白の発現促進などを目的する、実験用の試薬、オリゴデンドログリア前駆細胞の人為的培養システムに用いる添加剤などとして、使用することができる。
本発明のミエリン形成可能なオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞を検出する方法においては、オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞におけるＦｃＲγの発現を指標とする。オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞におけるＦｃＲγの発現は、後述の実施例に記載のような方法（例えば、免疫組織または細胞化学的解析、遺伝子増幅法、ウェスタンブロット法など）で調べることができる。さらに、ＰＤＧＦαＲ、ＭＡＧ、Ａ２Ｂ５、０４、０１、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＤＭ−２０、ＣＮＰａｓｅ、ＭＯＧ、ＮＧ２およびＡＮ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーのオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞における発現も指標とするとよい。これらのマーカーの発現を指標とすることで、より正確な検出を行うことができるようになる。上記のマーカーのうち、未熟オリゴデントログリアのマーカーである０４、ＰＤＧＦαＲ、ＮＧ２、ＤＭ−２０を選択することが好ましい。
免疫組織または細胞化学的解析により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の一例を以下に説明する。
免疫組織化学的解析の場合、まず、動物から取り出した脳の組織を固定し、その後、パラフィン切片を作製する。脱パラフィン処理を行った後、この切片上に一次抗体を滴下し、適当な温度で適当な時間反応させる。１次反応後、切片を洗浄し、次いで、二次抗体を適当な温度で適当な時間反応させる。二次抗体として、Ｂｉｏｔｉｎ標識二次抗体を用いた切片に関しては、更にＨＲＰ標識ストレプトアビジンを適当な温度で適当な時間反応させる。切片を洗浄した後、ＤＡＢを含む溶液にて染色を行う。また、メチルグリーンなどを用いてカウンター染色を行うとよい。
免疫細胞化学的解析の場合には、固定した後、切片化する必要がないため、この過程を飛ばして一次抗体反応へ入ることができる。また一般的に、細胞の場合は二次抗体に蛍光色素（ＦＩＴＣなど）をラベルしておいて、蛍光顕微鏡にて観察する。
免疫組織または細胞化学的解析により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の詳細については、後述の実施例の記載を参照されたい。
遺伝子増幅法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の一例を以下に説明する。
動物の脳の組織または細胞から全ＲＮＡを抽出し、適当なプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＦｃＲγのｍＲＮＡを検出する。適当なプライマー対は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３３１９５のヒトＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１５）の特定の領域を特異的に増幅できるように設計する。増幅すべき特定の領域を見極めるポイントは以下の通りである。
１）制限酵素がうまく使える領域をおさえる。
２）できるだけＣ，Ｇの含有量が多くなるようにする。
後述の実施例では、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０１０１８５のマウスＦｃＲγ−ｍＲＮＡ配列（配列番号１７）から予測を立て、プライマー対（配列番号１および２）を設計した。配列番号１で表されるプライマーは、配列番号１７のＦｃＲγ−ｍＲＮＡ配列中の１７８−１９５番目の配列を、配列番号２で表されるプライマーは、２８４−３０３番目の配列を認識するように作成した。
遺伝子増幅法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の詳細については、後述の実施例の記載を参照されたい。
ウェスタンブロット法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の一例を以下に説明する。
動物の脳の組織または細胞から蛋白質の試料液を調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかける。電気泳動の済んだＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをメンブレンに転写した後、ブロッキングを行い、メンブレンを洗浄し、一次抗体、酵素標識二次抗体の順に反応を行い、適当な洗浄を行った後で、酵素の基質を加えて発色させる。
ウェスタンブロット法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法の手順の詳細については、後述の実施例の記載およびＣ．Ｓｅｉｗａ，Ｉ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．Ｙａｇｉ，Ｔ．Ｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．Ａｓｏｕ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．３７，２１（２０００）を参照されたい。
上記の免疫組織または細胞化学的解析およびウェスタンブロット法において使用できる一次抗体および二次抗体としては、後述の付記事項の３５）に記載のものを挙げることができる。
上記のような方法において、ＦｃＲγの発現が確認されたオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞はミエリン形成が可能であると判定される。この判定は、脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患、髄鞘破壊などの疾患の進行度や治療の予後の診断に利用できる。即ち、ＦｃＲγ陽性細胞（オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞）が残っているならば、ミエリンが再生する可能性があることを示している訳であるから、Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質（例えば、抗ＦｃＲγ抗体等）を使用した刺激治療も有効であろうと考えられる。或いは、真に脱髄が酷く、再生しても再生しても脱髄が起きる場合、オリゴデンドログリアまたはその前駆細胞は死滅する可能性があると考えられる。このような場合はＦｃＲγ陽性細胞は消失しているであろうし、また刺激治療もあまり大きな効果を得ないであろうと予測される。ＦｃＲγ陽性細胞が多い方が予後は良いであろう。ただ、例外として、ＦｃＲγを介するシグナル経路に変異や異常がある場合は除く。この場合はＦｃＲγ陽性細胞が存在していても、その経路が動かないと予測され、予後は悪いと考えるのが妥当である。
また、本発明は、免疫組織または細胞化学的解析、遺伝子増幅法またはウェスタンブロット法のいずれかの方法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる方法を提供する。本発明のこれらの方法は、ミエリン形成可能なオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞を検出するのに有用である。ＦｃＲγの発現が確認されたオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞はミエリン形成が可能であると判定され、この判定は、脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患、髄鞘破壊などの疾患の進行度や治療の予後の診断に利用できる。
また、免疫組織若しくは細胞化学的解析、またはウェスタンブロット法のいずれかの方法により、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べる場合には、さらに、ＰＤＧＦαＲ、ＭＡＧ、Ａ２Ｂ５、０４、０１、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＤＭ−２０、ＣＮＰａｓｅ、ＭＯＧ、ＮＧ２およびＡＮ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーのオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞における発現も調べるとよい。
さらに、本発明は、抗ＦｃＲγ抗体を含む、免疫組織または細胞染色試薬キットおよびウェスタンブロット試薬キットを提供する。これらの試薬キットは、さらに、抗ＰＤＧＦαＲ抗体、抗ＭＡＧ抗体、Ａ２Ｂ５抗体、０４抗体、０１抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＰＬＰ抗体、抗ＤＭ−２０抗体、抗ＣＮＰａｓｅ抗体、抗ＭＯＧ抗体、ＮＧ２抗体およびＡＮ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を含んでもよい。これらの抗体は、Ｎ．Ｂａｕｍａｎｎ  ＆  Ｄ．Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８１，８７１−９２７（２００１）の総説に記載の方法で調製することができる。
抗ＦｃＲγ抗体、抗ＰＤＧＦαＲ抗体、抗ＭＡＧ抗体、Ａ２Ｂ５抗体、０４抗体、０１抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＰＬＰ抗体、抗ＤＭ−２０抗体、抗ＣＮＰａｓｅ抗体、抗ＭＯＧ抗体、ＮＧ２抗体およびＡＮ２抗体は、蛍光色素、酵素、重金属などで標識されていてもよい（直接法）。あるいは、これらの抗体を標識する代わりに、これらの抗体（一次抗体）に特異的な抗体（二次抗体）を蛍光色素、酵素、重金属などで標識したものを用いてもよい（間接法）。
本発明の免疫組織または細胞染色試薬キットは、さらに、発色剤（例えば、ＤＡＢ）、過酸化水素水（内因性ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの消去、ＤＡＢの活性化に使う）、バッファー（例えば、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ））、カウンター染色用色素（例えば、メチルグリーン）、カバースリップ（使用抗体量を減らすために、切片の上にかけるプラスチックカバー）などを含んでもよい。
本発明のウェスタンブロット試薬キットは、さらに、転写用バッファー、ブロッキング試薬、洗浄液などを含んでもよい。
本発明は、また、ＦｃＲγのｍＲＮＡを特異的に増幅することができる少なくとも１対のプライマーを含む、遺伝子増幅試薬キットを提供する。プライマーは、例えば、対象とする検体の生物種のＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列（ヒトの場合、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３３１９５（配列番号１５）、マウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１０１８５（配列番号１７））の特定の領域を特異的に増幅できるように設計したものであるとよい。
プライマーは、１５〜３０塩基の長さであるとよく、好ましくは、２０〜２５塩基の長さである。プライマーの例としては、配列番号１の塩基配列を有するもの、配列番号２の塩基配列を有するものなどを挙げることができる。
本発明の遺伝子増幅試薬キットは、さらに、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（逆転写酵素）、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、Ｂｕｆｆｅｒ、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍＲＮＡ、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ等を含んでもよい。
本発明の試薬キットを用いることにより、動物の脳の組織または細胞におけるＦｃＲγの発現を調べることができる。
本発明の試薬キットは、説明書を含み、包装されていてもよい。説明書には、キットの使用方法、結果の解析方法などが記載されているとよい。
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲγのオリゴデンドログリア内発現
免疫系においては、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼのシグナル伝達は、ＩＴＡＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆｓ）のドメインを細胞内に持つような分子との相互作用が関与している（２４；総説は２５参照）。ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼはＩＴＡＭのチロシン残基をリン酸化し、細胞内シグナル伝達を始動させる（２６）。ＦｙｎはＳｒｃファミリーの一員であり、ミエリン形成初期に重要である（９）。この事実は、ミエリン形成初期過程のオリゴデンドログリアにて発現しているような、ＩＴＡＭを擁する分子が、ミエリン形成に関与している可能性を示唆する。ＦｃＲγはＦｙｎでリン酸化される細胞内ＩＴＡＭを擁しているおり（２７）、候補の一つであるが、これまでにこの免疫学上の分子がオリゴデンドログリア系の細胞に存在していることは示されていない。
以下は、オリゴデンドログリア系にＦｃＲγが存在していることに関連する、初めての報告となる。マウスＣＮＳより単離された、培養オリゴデンドログリア前駆細胞（ＯＰＣ）（２８，２９）より全ＲＮＡが抽出されたが、この時期にはまだＭＡＧは発現していない（３０）。しかしながら、ＦｃＲγのｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより検出され（３１）、発現程度は肥満細胞と匹敵するレベルであった（図１Ａ−ａ）。ＣＤ３ζはまたＩＴＡＭを擁する分子であり（２１）、神経細胞系の発達や可塑性に関与しているが（３２）、ＯＰＣ内ではＲＴ−ＰＣＲによって検出されなかった（図１Ａ−ｂ）。
本発明者らはまた、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンドログリア前駆細胞（３３；図１Ｂ−ｂ）、０４及び０１陽性未熟オリゴデンドログリア（３４；図１Ｂ−ｄ，ｆ）にＦｃＲγが発現していることを免疫細胞化学的に検出した。従って、ＦｃＲγはＯＰＣ内にｍＲＮＡ及び蛋白レベルで発現している。０４陽性の培養未熟オリゴデンドログリア（３７）のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔによっても、この分子の存在が検出された（図１Ｃ）。
ＯＰＣ及び未熟オリゴデンドログリア内におけるＦｃＲγの発現は、この分子がＩＴＡＭを介してＦｙｎと共役すること（２７）を踏まえると、ＦｃＲγがオリゴデンドログリアのミエリン形成に関与している可能性を示唆するものである。
〔実施例２〕
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦｃＲγのオリゴデンドログリア内発現
ＣＮＳ内におけるＦｃＲγの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで検討するために、本発明者らは幾つかの日齢の新生児マウス脳に関して免疫組織化学的解析を行った（３６，３８，３９）。ＦｃＲγ陽性細胞は生まれた日（Ｐ０）に既に脳室下帯（脳室に隣接したｇｅｒｍｉｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ領域；ＳＶＺ）内にて検出された（図２−ａ）。生後４日目（Ｐ４）では、発現パターンは白質領域に拡大しており、脳梁内で検出されるようになった（図２−ｂ）。Ｐ７、即ちＭＢＰやＭＡＧが免疫組織化学的に検出できるようになる時期には、ＦｃＲγの発現は主に白質に限局されていた（図２−ｃ）。興味深いことに、この観察された染色部位の拡大は、ＳＶＺからの生後のグリア発生のパターン（４０）に極めて類似している。ＦｃＲγ陽性細胞はまたＰ０にて、ｍｏｕｓｅ−Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ｍ−Ｍｓｉ−１）陽性である、側脳室の神経幹細胞層に隣接して観察された（４１；図２−ｄ，ｅ）。これはＦｃＲγ陽性細胞が神経幹細胞より分化していることを示唆するものである。成体のＣＮＳでは、発現部位はＰ７にて見られたものと類似していた（図２−ｆ）。従って、ＦｃＲγはＣＮＳ内にてＭＡＧの発現（生後２週目早期；６，２０）に先行して発現しており、また成体ＣＮＳ内にもこのＦｃＲγ陽性集団は保たれているのである。成体ＣＮＳ内にてＦｃＲγ陽性細胞の集団が限局していたことを観察したのは非常に驚きである。この集団は脳室上領域の白質と側脳室付近の成体ＳＶＺに限局していた（図２−ｆ）。これらの細胞の存在は、ＦｃＲγ陽性細胞のグリア発生が成体においても保たれているか、あるいは、生後すぐの時期に生じたそれら細胞がこの領域で静止状態に保たれていることを示唆する。
これらのＦｃＲγ発現細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでオリゴデンドログリアの系譜より生じているものであることを確認するために、本発明者らはＦｃＲγ発現細胞を幾つかの抗体でラベルすることにより、それら細胞の属性を調べた（４２）。Ｐ０においては、ＦｃＲγ発現細胞はＧＦＡＰ陽性細胞（アストログリアの系譜の細胞）及びＯｘ−４２陽性細胞（４３；ミクログリアの系譜の細胞）と一線を画していた（図３Ａ）。ごく少数のＦｃＲγ陽性細胞が、ＳＶＺ内にて、ＧＦＡＰと弱く共染色されたが、大多数の細胞はＧＦＡＰ陰性であった。ＦｃＲγ発現細胞はＯｘ−４２で共染色されることはなかった。これらはＰ０におけるＦｃＲγ陽性細胞の大多数がアストログリアあるいはミクログリアの系譜に由来しないことを示している。これらの細胞は恐らくはオリゴデンドログリアの系譜に由来するものである。Ｐ７では、ＦｃＲγ陽性細胞がＦｙｎ（図３Ｂ−ａ）あるいはＭＡＧ（図３Ｂ−ｂ；４４）と共染色された。ＭＡＧはオリゴデンドログリア特異的に発現している（１２）ので、ＦｃＲγ発現細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでオリゴデンドログリアの系譜に由来するものである。
成体ＣＮＳ内では、ＦｃＲγ陽性細胞は白質の限られた領域内に観察された（図２−ｆ）。本発明者らは未熟なオリゴデンドログリアの形態をもった細胞がＦｃＲγ及びＭＢＰの両方でラベルされたのを確認し（図３Ｃ−ａ）、これにより、成体ＣＮＳ内のＦｃＲγ陽性のオリゴデンドログリア系細胞の存在が示唆された。生後すぐの脳とは対照的に、主に成体ＳＶＺ内に存在する、ＧＦＡＰ陽性細胞の少数の集団がまたＦｃＲγ陽性であった（図３Ｃ−ｂ）。大多数のＧＦＡＰ陽性細胞はＦｃＲγ陰性であった。従って、このＧＦＡＰ−ＦｃＲγ二重陽性細胞の限られた集団は、成体ＣＮＳ内の特異的な集団である。これらの細胞がＳＶＺアストロサイトと呼ばれる、神経幹細胞として働く細胞（４５）であるか否かは今後検討する必要がある。
ＦｃＲγはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも、ＭＡＧに先行してオリゴデンドログリアの系譜で発現している。しかしながら顕微鏡的観察では、ＭＡＧとＦｃＲγの発現は、ミエリン形成前の段階のｉｎ  ｖｉｖｏのオリゴデンドログリアにて、完全に共在してはいなかった。ＭＡＧは細胞突起の先端を強く染めたが、ＦｃＲγは細胞本体の細胞膜を染めた（図３Ｂ−ｂ）。Ｆｙｎは主に細胞膜に観察され、ＦｃＲγの発現に類似していることが二重染色で分かった（図３Ｂ−ａ）。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ミエリン形成期前のオリゴデンドログリア内のＦｙｎの発現は、ＦｃＲγのそれに強く類似しており、ＭＡＧとは類似していない。ＦｃＲγ陽性細胞は灰白質、あるいはＳＶＺと脳室上領域を除く白質では、解析したいずれの段階でもほとんど検出されなかった（図２−ｆ）。染色領域の広がり（図２−ａ，ｂ，ｃ）並びに、これまでにＳＶＺからのグリア形成に関する研究（４０）と併せて考えると、上述の観察結果は、ＦｃＲγがＯＰＣあるいはミエリン形成段階前のオリゴデンドログリアに発現しており、成熟したミエリン形成後の細胞には発現していないことを示している。
ＦｃＲγがミエリン形成の初期始動を行うとの仮定に基づくならば（即ち、Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードを始動する；６）、本発明者らはＦｃＲγの発現が、Ｆｙｎ及びＭＢＰの両者の発現に類似しているであろうことを期待した。連続切片を解析することで、本発明者らはＦｃＲγ、Ｆｙｎ、及びＭＢＰの染色パターンが、Ｐ７の拡大しつつあるミエリン鞘で類似していることを観察した（図３Ｄ）。Ｆｙｎは軸索にもまた発現している（４６）。発現パターンにおける類似は、これらの分子間の関連を示唆している。この事実は、Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードを始動するというＦｃＲγの役割を支持するものである。
〔実施例３〕
ＦｃＲγシグナルはＭＢＰ発現を促進する
ＭＢＰ発現促進に関するＦｃＲγの効果を検証するために、本発明者らは、抗ＦｃＲγウサギポリクローナル抗体を投与すること（４７）により、ＯＰＣ（２８，２９）に人為的にＦｃＲγシグナルを入れた。２４時間の刺激によって、突起をほとんど持っていなかった培養ＯＰＣは、顕著な形態的変化を起こし、良く発達した突起を有するようになった（図４Ａ−ｂ）。このような発達は抗体の非存在下では見られなかった（図４Ａ−ａ）。ＭＢＰ発現もこのシグナルにより強く促進されることがＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔによるコントロールとの比較によって示された（図４Ｂ；４８）。Ｆｙｎに関する同様な検証によって、この発現もまた刺激されたオリゴデンドログリアで増大していたことがわかった（図４Ｂ）。Ｆｙｎはオリゴデンドログリアの分化時に２から３倍上昇する（１９）ので、本発明者らの観察結果、即ち、Ｆｙｎの発現増大及び顕著な形態的変化は、ＦｃＲγシグナルがＯＰＣの分化を誘導したことを示している。ＦｃＲγシグナルは従って、ミエリン形成において重要であり、同時にオリゴデンドログリア内でＭＢＰ発現を促進し、Ｆｙｎの発現を増大させる。
ＭＢＰ発現の促進は主にエクソン２を有するアイソフォームにおける増大であった（図４Ｂ）。ＭＢＰの４種類の主なアイソフォームは、ＭＢＰ遺伝子上の７つのエクソンの選択的使用によって生じ、１４．０、１７．０、１８．５、２１．５ｋＤの各蛋白質が合成される（４９）。各々のアイソフォームの精細な役割は未だ研究される余地があるが、これらのアイソフォームはその細胞内分布により２つのグループに大別される。エクソン２を有するアイソフォーム、即ち１７．０及び２１．５ｋＤの蛋白質は細胞質内に瀰漫性に分布し、またしばしば核内に集積する。一方で残る２つのアイソフォームは主に細胞膜に検出され、ミエリン圧密化の役割を担っている（８）。エクソン２を有するアイソフォームの、核内への能動輸送は、これらのアイソフォームがミエリン形成に於いて制御的役割を果たしている可能性を示唆している（５０）。本発明者らの所見はこの可能性を支持している。このエクソン２を有するＭＢＰアイソフォームの役割は、また本発明者らが提唱する、ＦｃＲγがミエリン形成の始動を担うとのことを支持している。
本発明者らは、抗ＦｃＲγ抗体の代わりにマウス免疫グロブリンＧの２ｂアイソフォーム（ＩｇＧ２ｂ）を投与することで、同様なエクソン２を有するＭＢＰアイソフォームの上昇並びに、顕著な形態的分化を観察した（図４Ｂ）。使用したＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体のエピトープはマウスで通常検出されないものである（４７）。この抗体はフローサイトメトリーでオリゴデンドログリアの何れの蛋白質とも反応しなかった（データ省略）。エクソン２を有するＭＢＰアイソフォームの発現促進は、従って、ＩｇＧ２ｂがＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲｓ；図７Ａ）と相互作用することを示唆している。本発明者らはＩｇＧ２ｂによってＦｙｎの発現が促進されることを検出することができなかった（図４Ｂ）。これは恐らく抗ＦｃＲγ抗体に比して、ＩｇＧ２ｂの使用が刺激の手法としてより間接的であることに由来するのであろう。
本発明者らは更にＦｃＲγ欠損マウス（５８）由来のＯＰＣを刺激した。同じようにＩｇＧ２ｂを投与したが、しかしながら、野生型ＯＰＣで見られた変化とは対照的に、これらＯＰＣを分化させることはできなかった（図４Ｃ）。これら結果はＦｃＲγがＯＰＣの分化に重要なシグナル因子であることを示唆し、またＩｇＧ２ｂが確かにＦｃγＲｓを介してＦｃＲγを活性化させたことを示している。
〔実施例４〕
ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、及びＭＢＰ欠損マウスの比較
ＦｃＲγとＦｙｎはオリゴデンドログリア内でＭＢＰ発現を促進するために共役しているのだろう。ＦｃＲγのＩＴＡＭのリン酸化にはＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼとの相互作用が必要である（２６）。Ｓｒｃファミリーのメンバーで、５種類のみがＣＮＳ内に発現している（５１）。その５種類のうち、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎだけがオリゴデンドログリア内に発現している（５２）。Ｆｙｎは、しかしながら、ミエリン形成に重要な唯一のＳｒｃファミリーメンバーである（５２）。ＦｙｎはＦｃＲγのＩＴＡＭリン酸化を担うことは示されている（２７）。従って、オリゴデンドログリアのＦｃＲγの活性化はＭＢＰの発現上昇をもたらしたが（図４Ｂ）、これはＦｙｎがこのＩＴＡＭをリン酸化することに依存している（２７）。Ｆｙｎのチロシンキナーゼ活性を点変異によって消失させると、Ｆｙｎを欠損した際にみられるものと同等な重篤なるミエリン障害を引き起こすために、Ｆｙｎのキナーゼ活性がミエリン形成に重要であることが示唆されている（５２）。ＭＢＰ発現の促進は主にＦｙｎに依存しており（１０）、これは本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果と矛盾しない（図４Ｂ）。
ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードをｉｎ  ｖｉｖｏで更に検証するために、本発明者らはＦｃＲγ、Ｆｙｎ、あるいはＭＢＰを欠損する変異マウス（３９）を解析した。オリゴデンドログリアの増殖の最も強い時期は生後９日間に起こり（５３）、この時期のオリゴデンドログリアは主にエクソン２を有するＭＢＰを発現している（８）。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの刺激実験の結果は、この時期にミエリン形成プログラムを検証することで、ミエリン形成の障害が見られる可能性を示唆している。本発明者らはそれ故に生後１０日齢のマウスの脳を解析し、ミエリン形成の初期段階を検証した。ＦｃＲγ欠損、Ｆｙｎ欠損、及びＭＢＰ欠損の各変異マウスの白質を免疫組織化学的に解析した結果（３６，３８，３９）、同日齢の野生型マウスに比して、３種類の変異マウス全てに同様なミエリン形成の遅延が認められた。３種類全ての変異にて見られた、ＭＢＰ  ａｎｄ／ｏｒ  ＭＡＧの発現の制限は（図５Ａ）、これら３種類の分子がミエリン形成に必須であることを示している。ＦｃＲγ欠損及びＦｙｎ欠損マウスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔでは、１０日齢の新生児マウスでも、また成体でも、ＭＢＰ発現の減少があることが明らかとなった（図５Ｂ；４８）。これらの結果はＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードがｉｎ  ｖｉｖｏでミエリン形成の初期段階の中枢的存在となっていることを示唆している。
得られたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔの結果を定量化すると（５４）、成体ＣＮＳ内のＭＢＰ全量はＦｙｎ欠損マウスでは野生型の４０．３％、ＦｃＲγ欠損では６０．８％に減少していることが分かった。エクソン２を有するＭＢＰの発現量（２１．５ｋＤと１７．０ｋＤの和）は、それら以外の２つのアイソフォームよりも、より重篤な影響を受けていることが分かった。即ち、これらアイソフォームはＦｙｎ欠損マウスでは野生型の３１．９％、ＦｃＲγ欠損では４０．０％にまで減少していた。ＦｃＲγ欠損とＦｙｎ欠損マウスのいずれでも同様な傾向が見られたことは、これらの分子がミエリン形成を支配するシグナルカスケードに関与しているとの本発明者らの理論を支持する。いずれの欠損マウスにおいても、主にエクソン２を有するＭＢＰアイソフォームが減少していたことは、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果（図４）を支持し、またこれらアイソフォームがミエリン形成過程に関与していることを示唆するものである。
Ｐ１０におけるＭＡＧの発現を組織学的にそれぞれの変異マウスで解析した結果、ＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリア（６）の分布がＦｃＲγ欠損マウスに比して、ＭＢＰ欠損マウスではより減少していることが明らかとなった（図５Ａ−ｅ，ｆ，ｇ）。Ｆｙｎ欠損マウスはその中間の表現型を示した。これら変異マウスでは、Ｐ１０までに脳梁より大脳皮質へ移動している、ＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリアの数（５５）は、野生型に対して、ＦｃＲγ欠損、Ｆｙｎ欠損、ＭＢＰ欠損でそれぞれ、約４４％、２５％、１２％であった（図５Ｃ）。この結果はＭＢＰの量と比例関係にあり、ＭＢＰ、特にエクソン２を有するアイソフォームがミエリン形成に重要であることを示している。
〔実施例５〕
ＦｃＲγ欠損によるミエリン形成不全
ＦｃＲγの欠損によるミエリン形成を検証するために、本発明者らは幾つかの日齢でＦｃＲγ欠損マウスを解析した。Ｐ１０で見られたミエリン形成の障害（図５）は、グリア発生過程上の障害による可能性がある。この可能性を追究するために、本発明者らは、オリゴデンドログリア系の最初期の前駆細胞のマーカーであるＰＤＧＦαＲ（５６）の発現を解析した。ＦｃＲγはＰＤＧＦαＲとＰ１０の白質にて共染色され（図６Ａ−ａ）、ＦｃＲγがオリゴデンドログリア系の細胞に発現していることを示している（図３）。しかしながら、ＰＤＧＦαＲ陽性細胞のうち、一部のみが、ＦｃＲγで共染色された（図６Ａ−ａ）。ＦｃＲγに陽性であった細胞はＰＤＧＦαＲにも陽性であったことから（図６Ａ−ａ）、ＰＤＧＦαＲ陽性／ＦｃＲγ陰性の細胞は、ＣＮＳ内で休止状態にあるグリア前駆細胞と考えられる。ＰＤＧＦαＲは一方で本発明者らの研究において、グリア発生の状態を検証するために適したマーカーとなる。Ｐ１０、即ち本発明者らがミエリンの障害（図５）を発見した時期において、本発明者らはＰＤＧＦαＲ陽性細胞の数あるいは分布に変化を認めなかった（図６Ａ−ｂ，ｃ）。従って、Ｐ１０で見られたミエリン形成の障害（図５）は、主にミエリン形成過程の障害によるものであり、グリア発生上のものではない。
Ｐ１０で観察された障害（図５）を生体が後に代償しうるか否かを見極めるために、より遅い成長段階でＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリア（６）の数を数えた（５５）。欠損マウスと野生型マウスの間に見られたＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリアの数的な差異は、成長に伴って目立たなくなった（図６Ｂ−ａ）。しかしながらこの時期になっても、この欠損マウスにて、ミエリン形成はやはり障害されていた。Ｐ５０では、ミエリンの主たる構成蛋白であるＰｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＬＰ）の免疫組織化学的解析の結果、欠損マウスでは、その発現がＭＢＰに加えて野生型に比して減少していることが明らかとなった（図６Ｂ−ｂ，ｃ；一部データ省略）。即ち、成長が進んでも、広範なミエリン形成障害があることを示している。Ｐ６７における脳梁の電子顕微鏡像（５７）では、背側領域にて、重篤な低ミエリン形成の軸索が見られた（図６Ｃ−ａ，ｂ）。驚くべきことに、胴側領域では重篤な軸索の膨化が加えて観察された（図６Ｃ−ｃ，ｄ）。ミエリン障害は、特にＰＬＰの減少がある際には、軸索の膨化を引き起こすことが知られている（１）。これらの電子顕微鏡による観察結果はＦｃＲγの欠損によって重篤で広範なミエリン障害が生じることを示している。この欠損マウスでは、観察されたミエリン形成の障害は、単なる遅延ではなく、成長後も代償されない、広範なミエリン低形成である。
これらの観察結果はＦｃＲγがグリア発生ではなく、ミエリン形成に重要であることを示しており、ＦｃＲγがｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもミエリン形成を始動するとの本発明者らの主張を支持するものである。
〔実施例６〕
ＦｃγＲｓ及びＣＤ４５のＦｃＲγとの共発現
ＦｃＲγは幾つかの免疫系受容体で共通である（２１）。オリゴデンドログリアにおける  ＦｃＲγの活性化に関与している受容体を特定することは、ミエリン形成の分子機構を理解する上で重要な点である。ＦｃＲγ欠損マウスは、ＩｇＥに対するＦｃ受容体（ＦｃεＲＩ）及びＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ）のいずれものα鎖（リガンドに結合するサブユニット）を細胞表面に発現できないことが示されている（５８）。この欠損マウスにおけるミエリン形成の障害は、ＦｃＲγ及びこれらのα鎖両方の欠損によるものであるかも知れない。野生型マウスより得られた未熟オリゴデンドログリアのＲＴ−ＰＣＲ解析（３１）ではＦｃεＲＩのα鎖を検出できなかった。一方で、ＦｃγＲＩと  ＦｃγＲＩＩＩのα鎖は容易に検出された（図７Ａ）。これらの発現パターンはフローサイトメトリーによっても確認された（データ省略）。従って、ＩｇＥではなく、ＩｇＧ特異的なＦｃ受容体がミエリン形成に関与している可能性がある。しかしながら、本発明者らは、ＦｃＲγを共通に使う、他のオリゴデンドログリア特異的な何らかの受容体が関与している可能性を否定し得る訳ではない。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験では、ＦｃＲγの活性化は、受容体の種類によらず、ＭＢＰの発現を促進し得ることを示した（図４）。新生児マウスにおける、ｎｅｏｎａｔａｌ  ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）を介した、母体由来のＩｇＧの存在（５９）、及びＰ７までに免疫系内にＩｇＧ分泌細胞が存在すること（６０）はこの結論を支持し得る。本発明者らが行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏの、ＩｇＧ２ｂを用いた刺激実験は、ＭＢＰ発現度合の上昇をもたらしたが（図４）、これはこの仮説と矛盾しない。
ＣＤ４５は蛋白チロシンフォスファターゼであるが、ＦｃＲγシグナル伝達を制御している（総説は６１）。ＣＤ４５は、Ｆｙｎを含むＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼの抑制領域を脱リン酸化する。ＣＤ４５がない状態では、抑制領域のリン酸化の為にＦｙｎは不活性状態に留まっており（６１）、ＦｃＲγを介するシグナル伝達はこの分子無くしては進行しないであろう。ＣＤ４５は白血球共通抗原（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られており、免疫系の細胞に特異的に発現している。この分子のオリゴデンドログリア内発現は報告されていない。本発明者らは、生後７日目（Ｐ７）、１０日目（Ｐ１０）または成体マウス脳に関して、免疫組織化学的な二重染色を行った（３６，３８，４２）結果、ＣＤ４５及びＭＡＧを共発現している細胞を検出した（図７Ｂ−ｃ）。ＭＡＧはオリゴデンドログリアに特異的に発現しているため（１２）、この共発現の所見は、ＣＤ４５がオリゴデンドログリア内に発現していることを示している。この発現は、一方でアストロサイトにＣＤ４５が発現していないことと共に、フローサイトメトリーにて確認された（図７Ｃ）。ＣＤ４５とＦｙｎがミエリン形成の初期段階に入る前に共発現していることはｉｎ  ｖｉｖｏで確認された（図７Ｂ−ｂ）。これら結果はＣＤ４５がＦｙｎの活性化に必要であることを示している。ＣＤ４５は、拡張しつつあるＦｃＲγ陽性ミエリン鞘において、Ｐ７（図７Ｂ−ｄ）でも成体ＣＮＳ（図７Ｂ−ａ）においても検出された。従ってＣＤ４５は、ミエリンが急速に生成される、生後の発達過程や、特にミエリン再生中の成体などにおいて、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードの制御的役割を果たしている可能性がある。
〔実施例７〕
ＦｃＲγ−Ｆｙｎ二重欠損マウス
目的）ＦｃＲγとＦｙｎが共役することは免疫学では知られたことであるが、脳の中で、実際にミエリンを形成する上で共役しているならば、二重欠損にすることで症状がより重篤化するであろうとの予測に基づいて実験を行った。二重欠損の解釈には二通りあり、Ａ⇒Ｂ⇒Ｃというカスケードを予測している際に、真に一つのカスケードであれば、Ａを潰しても、Ｂを潰しても、或いはＡとＢを両方潰しても、結果（Ｃの減少等）は同一になることが予測される。しかし現実の生物ではカスケードが入り混じっていたり、或いは、一つが潰れても別の機構が代償するということが考えられる。この仮定に基づくと、Ａを潰した時よりもＢを潰した方が症状は重くなり（Ｂの方がＣに近い為、代償機構が働くチャンスが減ると予測されるからである）、或いはＡとＢを両方潰すと最も重篤な症状を呈すると予測される。
方法）ＦｃＲγ欠損マウス（３９，５８）とＦｙｎ欠損マウス（３９，４６）を掛け合わせて、ＦｃＲγ＋／−Ｆｙｎ＋／−マウス（第１世代）を誕生させた。更にこのマウス同士を掛け合わせると、１／１６の確率で、ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−の二重欠損マウス（第２世代）ができることになるが、確率が低く、二重欠損を得るに至らなかった。そこで、第２世代マウスのうちから、ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ＋／−とＦｃＲγ＋／−Ｆｙｎ−／−を選び（遺伝子のチェックは、尻尾を切ってそこからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法で確認した）、掛け合わせた。すると第３世代は１／４の確率でＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−マウスが得られることになる。マウスは一回の出産で大体７匹前後を産むので、これで二重欠損マウスが得られることになるが、現実は、重度の免疫不全のせいか（ＦｃＲγとＦｙｎを潰すと免疫系がやられることが予測され、胎内であるいは生後間もなく死んでしまうケースが多い）、或いは脳奇形のせいか、かなり確率は低いが、数回に一回のチャンスで得られるようになった。現在はこの第３世代の二重欠損マウス同士を掛け合わせて、１／１の確率で二重欠損マウス（第４世代）が得られないか試しているが、なかなか効率が上がっていない。実験に使用したのは第３世代である。得られた二重欠損マウスは生後１０日齢（Ｐ１０）でＡｃｉｄ−Ａｌｃｏｈｏｌ固定し、パラフィンに包埋した後、１０μｍの厚さに切片化して、免疫組織化学の手法によってＭＢＰとＭＡＧの発現を見た。また小胞体を染めるＮｉｓｓｌ染色によって、脳の大まかな構造を見た。同様な実験を生後１．５ヶ月（Ｙｏｕｎｇ  Ａｄｕｌｔ）のマウスを使用して行った。
結果）Ｐ１０で、野生型（Ｗｔ）、Ｆｙｎ−／−、ＦｃＲγ−／−、ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−を比較検討した結果、ＭＢＰ・ＭＡＧの発現は何れも、Ｗｔ＞ＦｃＲγ−／−＞Ｆｙｎ−／−＞ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−となった（図９，１０）ので、ＦｃＲγとＦｙｎの共役が確認された。更にＰ１０のＮｉｓｓｌ染色では脳室の拡大と脳弓の奇形が認められた。１．５ヶ月齢では、何よりもＮｉｓｓｌ染色で重度の脳室拡大（水頭症）と、海馬の奇形、更に脳弓の奇形が認められ（図１１ｅ−ｈ）、ＭＢＰの染色ではＰ１０と同様どころか、二重欠損マウスでは大脳皮質内にほとんどミエリンが存在しないことが確認された（図１１ａ−ｄ）。以上の結果はＰＬＰなど他のミエリン蛋白でも確証を得た。
結論）ＦｃＲγとＦｙｎは脳のミエリン形成においても共役していることが確認された。
〔実施例８〕
ＣＤ４５欠損マウス
目的）実施例６で確認したように、ＣＤ４５がオリゴデンドログリアに発現しており、免疫学上、ＣＤ４５はＦｙｎの活性化因子として知られていることから、ＣＤ４５がオリゴデンドログリアにおいてミエリン形成に一役買っているのではないかと推定した。またＣＤ４５の遺伝子変異が多発性硬化症（ＭＳ）で見つかったことから、オリゴデンドログリアの異常がＭＳの病因としてあるのではないかと推測した（但し、ＭＳで発見されている  ＣＤ４５の異常は、ＣＤ４５を完全に消失させる変異ではなく、ＣＤ４５の幾つかのアイソフォームの発現パターンを狂わせるのと、全量が減少するような変異である）。尚、ＭＳ患者のＣＤ４５の変異については、その後否定的な論文も出されており、いまだ決着が着いていない。これらをクリアにするために、ＣＤ４５の欠損マウスを使用して、オリゴデンドログリアのミエリン形成が阻害されるか確認することにした。
方法）ＣＤ４５のＥｘｏｎ６を欠損させたマウス（これによって、ＣＤ４５の発現量はほぼゼロになる）を九州大学の岸原健二先生から頂戴した。原著論文は、
Ｃｅｌｌ  １９９３  Ｊｕｌ  １６；７４（１）：１４３−５６
Ｎｏｒｍａｌ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｕｔ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ４５−ｅｘｏｎ６
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．
Ｋｉｓｈｉｈａｒａ  Ｋ，Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ  Ｊ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＶＡ，Ｋｕｎｄｉｇ  ＴＭ，Ｋａｗａｉ  Ｋ，Ｗａｋｅｈａｍ  Ａ，Ｔｉｍｍｓ
Ｅ，Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｋ，Ｏｈａｓｈｉ  ＰＳ，Ｔｈｏｍａｓ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．
である。
このマウスの脳を生後１０日齢で固定し、切片化して、ＭＢＰとＭＡＧの免疫組織化学染色でミエリンの発現量を見た。更に、動物の脳をすり潰して、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法によって、ＭＢＰの発現量を見た。また、Ｆｙｎ欠損マウスのＰ１０の脳を同様に固定、切片化して免疫組織学的にＭＡＧを染色して、ＣＤ４５欠損マウスと同様なミエリン減少であるかどうか（ＣＤ４５がＦｙｎの活性化因子であるならば、同様と予測されるからである）を確認した。更に、ＣＤ４５欠損マウスからオリゴデンドログリアの前駆細胞（ＯＰＣ）を培養して、これをＦｃＲγに対する抗体或いはＩｇＧで刺激して、そのレスポンス（形態変化とＭＢＰの発現増大）を見た。加えて、ＣＤ４５がオリゴデンドログリアに実際に発現していることを示す為に、培養ＯＰＣの染色と、組織染色（オリゴデンドログリアのマーカー、ＭＡＧとの二重染色）を行った。ＣＤ４５に対する抗体が、実際にＣＤ４５と反応しており、何か別のものとの交叉反応が起きているわけではないことを確認するために、ＣＤ４５欠損マウスでＣＤ４５染色を行った。
結果）Ｐ１０のＣＤ４５欠損マウスではミエリン形成の明らかな低下が認めらた（図１３のｃ〜ｅ）。またその低下度合いがＦｙｎ欠損マウスと類似することを確認した（図１３のｃ及びｆ〜ｈ）。更にＣＤ４５欠損マウスのＯＰＣでは抗ＦｃＲγ抗体或いはＩｇＧの何れに対してもレスポンスがないことを確認し（図１３のａ及びｂ）、ＣＤ４５の欠損によって、ＯＰＣのオリゴデンドログリアへの分化が阻害されることが確認された。またＣＤ４５が実際にオリゴデンドログリアに出ていることが、ＭＡＧとの組織上の二重染色（図１２のｄ）と、ＯＰＣの染色によって示され（図１２のａ及びｂ）、かつ、交叉反応でないことが、ＣＤ４５欠損マウスの組織では同じ抗体で染色が得られないことによって示された（図１２のｅ）。
結論）ＣＤ４５はＯＰＣと未熟オリゴデンドログリアに発現しており、ＯＰＣからミエリン形成オリゴデンドログリアへの分化への段階で必要であることが確認された。
〔実施例９〕
ＩｇＧ欠損マウス
目的）実施例３において、ＦｃＲγがミエリン形成のトリガーであることを示したが、実際の成体内ではＦｃＲγはＦｃγＲＩ或いはＦｃγＲＩＩＩ等の、免疫グロブリンＦｃ受容体の一信号伝達分子である。治療の上ではＦｃＲγを直接刺激するにせよ、生理的環境下でこの機構が働くには、ＩｇＧがＦｃγＲＩ或いはＦｃγＲＩＩＩに結合し、それによってＦｃＲγへ刺激が入るであろうことが予測される。ＩｇＧは母体から胎盤を通じて供給されるし、或いは母乳中に入っており、胎児期〜乳児期に掛けては、脳と血管の間にある関門（ＢＢＢ）が未熟な為に、これらのＩｇＧが脳内に入ることができる。逆に、成人ではＢＢＢがあるため、ＩｇＧが脳内に入らず、ミエリンの過剰形成が防がれていると考えることができる。事実、ＭＳの患者では脱髄を反映してか、ＢＢＢが破壊される。これはＩｇＧを脳内に導入し、ミエリンを再生させるためかもしれない。これらのストーリーを考える上で、ＩｇＧが実際にそのような機能を持っているかを証明する必要がある。確かに免疫学上はＦｃＲγはＦｃγＲＩ／ＩＩＩと共役し、ＦｃγＲＩ／ＩＩＩは何れもオリゴデンドログリアに出ていることが確認されており、ＩｇＧと強く予測されるが、脳内では別の分子が実はＦｃγＲＩ／ＩＩＩと結合しているかもしれない。ＩｇＧが必要であることを証明するために、ＩｇＧを遺伝的に作れなくしたマウスを解析した。このマウスはＦｙｎもＦｃＲγも正常の働き・発現を持っている。
方法）ＩｇＧを欠損したμＭＴマウス（実際はＩｇＭも欠損しているようである：ＩｇＭは胎盤を通過せず、母乳内にも殆ど入っていないので、実験上の影響はないと思われる）マウスをＪａｃｋｓｏｎ研究所から購入した。オリジナルのマウスは以下の文献に記載されている。
Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４２３−４２６（１９９１）
Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｄ，Ｒｏｅｓ  Ｊ，Ｋｕｈｎ  Ｒ，Ｒａｊｅｗｓｋｙ  Ｋ．１９９１．
Ａ  Ｂ  ｃｅｌｌ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｘｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ．
このマウスをＰ７、Ｐ１０、Ｐ５０で免疫組織化学的にＭＡＧの染色を行い、野生型（Ｗｔ）と比較した。
結果）やはり、Ｐ７、Ｐ１０、Ｐ５０の何れにおいても、Ｗｔに比較して、ミエリンが減少していることがわかった（図１５、１６、１７）。Ｐ７、Ｐ１０の結果から、母体由来のＩｇＧ（この時期はまだ子供自身でＩｇＧを生成することはほとんどできない時期である：尚、いずれにせよ、実験に使用したμＭＴマウスは母親・子供共にＩｇＧを作成できない）がミエリン形成に重要であることが示唆された。
結論）生体内でオリゴデンドログリアがミエリンを形成するためにＦｃＲγが重要であるのは示したとおりであるが、ＩｇＧがその生理的トリガーとなっていることが示された。
考察
本発明者らが提唱するミエリン形成メカニズムのモデルは図８にまとめられている。ＦｃＲγはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもオリゴデンドログリア系の細胞に発現している（図１−３）。ここに本発明者らはＦｃＲγがミエリン形成を始動することを提唱する。ＦｃＲγはＦｙｎとの機能的な共役（２７）を通じて、形態学的な分化並びにＭＢＰ発現の上昇、特にエクソン２を有するアイソフォームの上昇を引き起こす（図４）。このモデルはｉｎ  ｖｉｖｏにて、ＦｃＲγ欠損マウスではオリゴデンドログリアの発生に顕著な変化が見られないにも関わらず、ミエリン形成に重篤な障害があることによって確証を得た（図６）。この変異マウスは同時にＭＢＰ発現の減少を呈し、エクソン２を有するアイソフォームにより重篤な減少が見られた（図５）。ＩｇＥではなく、ＩｇＧに対するＦｃ受容体の発現（図７Ａ）は、ＩｇＧが細胞外からオリゴデンドログリアのＦｃ受容体を活性化する分子として働く可能性を示唆する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩｇＧ２ｂによって刺激を与えると、野生型ＯＰＣでは顕著な形態学的な分化が生じたが、ＦｃＲγ欠損ＯＰＣでは生じなかった（図４）。更に、ＣＤ４５はＦｙｎ及びＦｃＲγと、オリゴデンドログリアにおいて、ミエリン形成の初期段階で共発現しており（図７Ｂ，Ｃ）、ＣＤ４５がミエリン形成に必要となるＦｙｎの活性化を制御している可能性を示唆している。ＣＤ４５の変異がＭＳ患者のある集団では関与していることが報告されている（２３）。
ＩｇＧ２ｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＯＰＣのＭＢＰの発現及び形態学的な分化を促進した（図４）。ミエリン形成を始動するというＩｇＧの生理的な役割の可能性を支持するためには、ＩｇＧがミエリン形成に先立って存在していることが期待される。母体由来のＩｇＧが新生児マウスに存在していること（５９）に加えて、ＩｇＧ分泌細胞はＰ７までに胸腺及び脾臓で検出される。そしてこれらの細胞はこの時期に急速に増殖する（６０）。オリゴデンドログリア上のＦｃ受容体を介して、ＩｇＧがミエリン形成を引き起こすことによって、脱髄疾患に用いられる免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩｇ）の効果を説明し得る。大量ＩＶＩｇの適用は脱髄疾患の患者に対する奏効性の高い治療法である（総説は６２）。ＭＳではＩＶＩｇは再発率を低下させることができる（６３）。しかしながら、この治療法の機序は明らかでなかった。動物モデルでは、免疫グロブリンはＴｈｅｉｌｅｒウイルスによって引き起こされた脱髄に対し、ＣＮＳ内のミエリン再生を促すことができる（６４）。この免疫グロブリンのミエリン再生誘発能は、この分子のＦｃ部分によって引き起こされている。即ち、Ｆ（ａｂ’）２断片はこのような効果を動物モデルで引き起こすことができない（６５）。これらのことは、ＩＶＩｇによるミエリン再生の促進能が、免疫グロブリンのＦｃ部分によって為されている可能性を示唆し、恐らくはオリゴデンドログリア内のＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードを活性化することによると考えられる。ＦｃγＲｓにおける遺伝子多型はＭＳによる障害に関与しており、ＩｇＧに対する親和性がより高いＦｃγＲｓを持つＭＳ患者は、より良い臨床予後を示す（６６）。
ＩＩｂ型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ）はＩｇＧと相互作用する、特殊な抑制型Ｆｃ受容体である（総説は６７）。この受容体は、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードを負に制御し、ポリクローナルなＩＶＩｇによるミエリン形成促進能を低下させてしまう可能性がある。本発明者らは培養オリゴデンドログリア内にＦｃγＲＩＩＢが発現していることをＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーで確認した（データ省略）。また一方で、本発明者らはＦｃγＲｓの推定されうるリガンドが免疫グロブリンでない可能性を否定できない。しかしながらミエリン形成におけるＦｃＲγそれ自身の促進能は、ＦｃＲγに対する抗体投与で示されたように（図４）、この機構が将来的にミエリン再生を促進しうる現実的な可能性を示している。
エクソン２を有するＭＢＰは、ある程度のミエリン再生が生じたＭＳの病巣にて検出されている（６８）。ＦｃＲγの活性化は、エクソン２を有するＭＢＰの発現上昇と、顕著な形態的分化を引き起こした（図４）。報告されているところの、慢性化したＭＳ病巣に残されている、数的には充分だが休止状態にあるような未熟オリゴデンドログリアの存在（４）と併せて考えるならば、本発明者らが示したミエリン形成に関するより深い理解は、ＭＳや他の脱髄疾患の治療或いは予防の為の将来的に有望な治療戦略を与えるであろう。
まとめとして、本発明者らの結果は、ＣＮＳのミエリン形成がＦｃＲγによって始動されていることを示している。これは脳と免疫系の間の新しい連関を明らかにしたものである。
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７）  Ａ．Ｒｏａｃｈ，Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｄ．Ｐｒａｖｔｃｈｅｖａ，Ｆ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，Ｃｅｌｌ４２，１４９（１９８５）．
８）  Ｂ．Ａｌｌｉｎｑｕａｎｔ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔａｕｇａｉｔｉｓ，Ｄ．Ｄ’Ｕｒｓｏ，Ｄ．Ｒ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，３９３（１９９１）．
９）  Ｈ．Ｕｍｅｍｏｒｉ，Ｓ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｙａｇｉ，Ｓ．Ａｉｚａｗａ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６７，５７２（１９９４）．
１０）  Ｈ．Ｕｍｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，１３９３（１９９９）．
１１）  Ｃ．Ｓｅｉｗａ，Ｉ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．Ｙａｇｉ，Ｔ．Ｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．Ａｓｏｕ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３７，２１（２０００）．
１２）  Ｕ．Ｂａｒｔｓｃｈ，Ｆ．Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２８４，４５１（１９８９）．
１３）  Ｒ．Ｓａｄｏｕｌ，Ｔ．Ｆａｈｒｉｇ，Ｕ．Ｂａｒｔｓｃｈ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２５，１（１９９０）．
１４）  Ｃ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９，７４７（１９９４）．
１５）  Ｄ．Ｍｏｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １３，２２９（１９９４）．
１６）  Ｍ．Ｄ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６２，７７２（２０００）．
１７）  Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｕ．Ｂａｒｔｓｃｈ，Ｇｌｉａ  ２９，１５４（２０００）．
１８）  Ｋ．Ｂｉｆｆｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，７４３０（２０００）．
１９）  Ｄ．Ｊ．Ｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｗｏｌｖｅｎ，Ｒ．Ｍ．Ｗｏｌｆ，Ｍ．Ｄ．Ｒｅｓｈ，Ｍ．Ｖ．Ｃｈａｏ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４５，１２０９（１９９９）．
２０）  Ａ．Ｎｉｅｈａｕｓ，Ｊ．Ｓｔｅｇｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄｉｅｒｓ−Ｆｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４９４８（１９９９）．
２１）  Ｍ．Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｊ．Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２２，２１（２０００）．
２２）  Ｔ．Ｒ．Ｈｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｈｙｍａｎ，Ｂ．Ｍ．Ｓｅｆｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，１６５１（１９９３）．
２３）  Ｍ．Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６，４９５（２０００）．
２４）  Ｍ．Ｒｅｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，３８３（１９８９）．
２５）  Ｊ．Ｖ．Ｒｅｖｅｔｃｈ，Ｃｅｌｌ  ７８，５５３（１９９４）．
２６）  Ｍ．Ｉｗａｓｈｉｍａ，Ｂ．Ａ．Ｉｒｖｉｎｇ，Ｎ．Ｓ．Ｃ．ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，Ａ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，１１３６（１９９４）．
２７）  Ｌ．Ｓ．Ｑｕｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １５，４２４６（２０００）．
２８）  Ｋ．Ｉｔｏｈ，Ｙ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｈ．Ａｓｏｕ，Ｈ．Ｕｍｅｄａ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６０，５７９（２０００）．
２９）  伊藤氏の方法（ラットＯＰＣ用の培養条件を詳細に記述してある；２８）を、胎生１７日目より得られたマウスＯＰＣ（東京都老人総合研究所  神経生物部門  清和千佳様の御厚意による）に対して適用した。培養細胞の約９０％が常にＯＰＣ特異的マーカーであるＡ２Ｂ５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（日本ではフナコシが販売））に陽性であった（６９を参照）。
３０）  Ｈ．Ａｓｏｕ，Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．Ｔｏｄａ，Ｋ．Ｕｙｅｍｕｒａ，Ｋｅｉｏ  Ｊ  Ｍｅｄ．４４，４７（１９９５）．
３１）  培養ＯＰＣより、Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは２０μｌのＴＥにて再浮遊した。それぞれのサンプルに関して、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて１μｌのＲＮＡを逆転写し、最終容量２０μｌを得た。標準化用にはマウスβアクチンを並行して増幅した。マウスＦｃＲγ、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩα、及びβアクチン用のアニーリングは５２度の温度で行った。ＦｃγＲＩＩＩα、ＦｃγＲＩＩｂ用のアニーリングは５３度の温度で行った。ｃＤＮＡサンプルは３５サイクル増幅した（９４度で３０秒間、アニーリングが３０秒間、７２度で３０秒間）。使用したプライマーは以下の通りである。
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３２）  Ｇ．Ｓ．Ｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，２１５５（２０００）．
３３）  Ｍ．Ｃ．Ｒａｆｆ，Ｒ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｎｏｂｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，３９０（１９８３）．
３４）  Ｉ．Ｓｏｍｍｅｒ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３，３１１（１９８１）．
３５）  培養ＯＰＣ及び未熟オリゴデンドログリア（東京都老人総合研究所神経生物部門  清和千佳様の御厚意による）はＰＬＰにて室温１５分間固定した。続いて１次抗体にて一晩４度で処理し、次いで二次抗体にて室温１．５時間処理し染色した。二重染色では異なるセットの抗体を用いて、同じ手法を繰り返した。
３６）  今回の研究で使用した抗体は以下の通りである。１次抗体として、０１及び０４マウスモノクローナル抗体（３４；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（日本ではフナコシが販売））、Ａ２Ｂ５マウスモノクローナル抗体（３３；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（日本ではフナコシが販売））、抗ＦｃＲγウサギポリクローナル抗体（５８；東北大学加齢医学研究所、遺伝子導入研究分野、高井俊行教授の御厚意による）、抗ＭＢＰウサギポリクローナル抗体（ニチレイ）、抗ＭＡＧウサギポリクローナル抗体（国立精神神経センター、故Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ博士の御厚意による）、抗ＧＦＡＰウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ）、Ｏｘ−４２マウスモノクローナル抗体（４３；Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）、抗ＰＬＰウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ＰＤＧＦαＲウサギポリクローナル抗体（ＵＢＩ）、抗ｍ−Ｍｓｉ−１ラットモノクローナル抗体（慶應義塾大学医学部生理学教室、岡野栄之教授の御厚意による）、抗ＣＮＰａｓｅマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＤ４５ラットモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：３０−Ｆ１１；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用した。免疫組織化学には、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ）、ｂｉｏｔｉｎ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）及びＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ニチレイ）を二次抗体として使用した。免疫細胞化学には、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識抗マウスＩｇＭ抗体（ＥＹ  Ｌａｂｏ．Ｉｎｃ．）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を二次抗体として使用した。
３７）  ０４陽性未熟オリゴデンドログリア（東北大学加齢医学研究所、遺伝子導入研究分野、海部知則様の御厚意による）の培養には、新生児マウスの脳を切り出し、分離培養系に調整した（７０）。１０日間の培養を経て、アストロサイトの単層の上に敷かれたオリゴデンドログリアはｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇによって機械的に剥離し、回収した。これら細胞は常に９５％以上の細胞が０４陽性であった。残存するアストロサイト層はｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡによって剥離した。回収された細胞はＢｌｏｔによる解析に使用した。
３８）  取り出された脳は酢酸−アルコール固定液（９５％エタノール・５％酢酸；容量％）にて一晩浸漬固定した。パラフィン化の処理は固定された脳に標準的な手法を用いて行われた（１００％エタノール→安息香酸メチル→キシレン→キシレン・パラフィン溶液→パラフィン；それぞれ１〜２時間）。この処理後、脳を包埋した。包埋後の脳はミクロトームを使用して１０μｍの厚さで切片化した。得られた切片は標準的な手法によって脱パラフィン処理を行った（キシレン→１００％エタノール→９０％エタノール→７０％エタノール→ＰＢＳ）。細胞内ペルオキシダーゼ活性は３％過酸化水素水にて室温で１０分間処理することにより消失させた。更にＰＢＳで洗浄した後、１次抗体を、４度で一晩あるいは３７度で２時間反応させた。１次反応後、切片を充分にＰＢＳで洗浄し、次いで適した２次抗体を３７度で１時間反応させた。二次抗体としてＢｉｏｔｉｎ標識二次抗体を用いた切片に関しては、更にＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ニチレイ）を３７度で３０分間反応させた。ＰＢＳで充分に洗浄した後、ＤＡＢ（和光）を含む溶液にて染色を行った。カウンター染色にはメチルグリーン（和光）を使用した。
３９）  野生型（Ｃ５７ＢＬ／６；埼玉実験動物）、ＦｃＲγ欠損マウス（５８；東北大学加齢医学研究所、遺伝子導入研究分野、高井俊行教授の御厚意による）、Ｆｙｎ欠損マウス（４６；大阪大学細胞生体工学センター、八木健教授の御厚意による）、ＭＢＰ欠損マウス（別名ｓｈｉｖｅｒｅｒマウス；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．）は何れの日齢においても、適切な麻酔下で脳を取り出した。変異マウスを含め、使用した全てのマウスの血統はＣ５７ＢＬ／６である。
４０）  Ｓ．Ｗ．Ｌｅｖｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ  １０，２０１（１９９３）．
４１）  Ｓ．Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｈ．Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，８３００（１９９７）．
４２）  １組目の反応後、切片をＰＢＳで数回洗浄した。０．１Ｍのｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）にて室温１時間洗浄し、１組目の抗体を剥離洗浄した。同様にして２組目の染色反応を行った。２組目の最後の染色反応に関しては、４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（和光）を用いて染色を行った。
４３）  Ａ．Ｐ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｗ．Ｍａｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７，２３９（１９８６）．
４４）  使用した抗ＭＡＧ抗体（血清）の特異性を検証するために、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を引き起こした脳の切片を同抗体で染色し、ＣＮＳ内に存在し得るＦｃＲγを持つ免疫系細胞との交差反応の可能性を調べた。しかしながら、この抗体はＥＡＥ脳内に浸潤してくる免疫系の細胞と反応しなかった（データ省略）。従って、この抗体には免疫系細胞との交差反応性はないことが示された。
４５）  Ｆ．Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｉ．Ｃａｉｌｌｅ，Ｄ．Ａ．Ｌｉｍ，Ｊ．Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ａ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ｃｅｌｌ  ９７，７０３（１９９９）．
４６）  Ｔ．Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７４２（１９９４）．
４７）  ３５ｍｍのシャーレに、１皿１ｘ１０６個のＯＰＣを撒き、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）のみ、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅと抗ＦｃＲγウサギポリクローナル抗体（７０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅと抗ＦｃεＲＩαマウスモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＣＲＡ−１、ｓｕｂｔｙｐｅ  ＩｇＧ２ｂ、２０μｇ／ｍｌ；極東）のいずれかで処理した。細胞は２４時間培養した（図５Ａ）。細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ４０、０．２５％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、及び１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）にて細胞を溶解した後、得られた溶解液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後ゲルに標準的な手法によりＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行った。使用したＣＲＡ−１抗体はオリゴデンドログリアの蛋白と反応しないことは、フローサイトメトリーによって確認してある。
４８）  ミエリン分画の調整法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法、Ｂｌｏｔの方法等は以前の本発明者らの文献に記されている（１１）。図５Ｂでは、それぞれのレーンに、野生型あるいは変異マウスより得られたミエリン分画より等量を流している。
４９）  Ｆ．ｄｅ  Ｆｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４３，７２１（１９８５）．
５０）  Ｌ．Ｐｅｄｒａｚａ，Ｌ．Ｆｉｄｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔａｕｇａｉｔｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ  １８，５７９（１９９７）．
５１）  Ｓ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｂｒｕｇｇｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３，５１３（１９９７）．
５２）  Ｂ．Ｒ．Ｓｐｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，２０３９（２００１）．
５３）  Ｃ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｃ．Ｈｉｎｄｅｌａｎｇ，Ｍ．ＬｅＭｅｕｒ，Ｅ．Ｂｏｒｒｅｌｌｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，７６９８（２０００）．
５４）  Ｂｌｏｔデータの定量化には、Ｋｏｄａｋ  １Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ・ＥＤＡＳ２９０（ｖｅｒ．３．５）を使用した。
５５）  抗ＭＡＧ抗体にて染色反応を行った後、野生型マウスと各変異マウスについて、それぞれ３枚の切片で、大脳皮質に存在する、ＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリア（６）を数えた。定量化に用いられた脳の位置は、全てのマウスについて、解剖学的に同一になるようにしてある。得られた数値の平均値及び標準偏差を計算し、グラフ化した。
５６）  Ｎ．Ｐ．Ｐｒｉｎｇｌｅ，Ｈ．Ｓ．Ｍｕｄｈａｒ，Ｅ．Ｊ．Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ，Ｗ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５，５３５（１９９２）．
５７）  電子顕微鏡用の固定法については他の文献に記されている通りである（５１）。超薄切切片は２％ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ及び鉛溶液によって染色し、ＪＥＯＬ  １００Ｃ電子顕微鏡（日本光電；８０ｋＶ）にて観察した。
５８）  Ｔ．Ｔａｋａｉ，Ｍ．Ｌｉ，Ｄ．Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ，Ｒ．Ｃｌｙｎｅｓ，Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｃｅｌｌ  ７６，５１９（１９９４）．
５９）  Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒ，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｅｄｓ．（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ．１９９８），ｐｐ．６３−７１．
６０）  Ｓ．Ｈａｂａ，Ａ．Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，５１８５（１９９２）．
６１）  Ｍ．Ｌ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，２７０（１９９９）．
６２）  Ｍ．Ｓｔａｎｇｅｌ，Ｋ．Ｔｏｙｋａ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６，６６１（１９９９）．
６３）  Ｆ．Ｆａｚｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４９，５８９（１９９７）．
６４）  Ｍ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｖ．Ａ．Ｌｅｎｎｏｎ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２７，１２（１９９０）．
６５）  Ｆ．Ｍｉｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７８，１２７（１９９７）．
６６）  Ｋ．Ｍ．Ｍｙｈｒ，Ｇ．Ｒａｋｎｅｓ，Ｈ．Ｎｙｌａｎｄ，Ｃ．Ｖｅｄｅｌｅｒ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５２，１７７１（１９９９）．
６７）  Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２０３−２３４（１９９７）．
６８）  Ｅ．Ｃａｐｅｌｌｏ，Ｒ．Ｒ．Ｖｏｓｋｕｈｌ，Ｈ．Ｆ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｓ．Ｒａｉｎｅ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４１，７９７（１９９７）．
６９）  Ｙ．Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６２，５２１（２０００）．
７０）  Ｋ．Ｄ．ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｊ．ｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８５，８９０（１９８０）．
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明の医薬組成物および薬剤は、オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進することができる。また、本発明の医薬組成物および薬剤は、Ｆｙｎチロシンキナーゼの発現を増大することができる。さらに、本発明の医薬組成物および薬剤は、ミエリン塩基性蛋白の発現を促進することができる。
本発明の医薬組成物および薬剤は、ミエリン形成を促進するために有用である。
また、本発明の医薬組成物は、脱髄疾患、髄鞘形成不全疾患および髄鞘破壊からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を予防および／または治療するために有用である。
将来的には、神経幹細胞、ＥＳ細胞、献体由来のオリゴデンドログリアを移植・再生させる治療が行われると考えられ、そのような治療が可能になった際には、ミエリン形成のＢｏｏｓｔｅｒとして当該技術を応用することが可能である。
また、本発明により、ＦｃＲγをオリゴデンドログリアまたはその前駆細胞のマーカーとしての利用法が提供された。ＦｃＲγ陽性オリゴデンドログリアは、ミエリン形成のポテンシャルを持っている細胞として見ることができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１は、ＦｃＲγセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２は、ＦｃＲγアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３は、ＣＤ３ζセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、ＣＤ３ζアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、ＦｃεＲＩαセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、ＦｃεＲＩαアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、ＦｃγＲＩαセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８は、ＦｃγＲＩαアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、ＦｃγＲＩＩＩαセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１０は、ＦｃγＲＩＩＩαアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１１は、ＦｃγＲＩＩＢセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１２は、ＦｃγＲＩＩＢアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１３は、βアクチンセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１４は、βアクチンアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１５は、ヒトＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５のヒトＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、マウスＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１８は、配列番号１７のマウスＦｃＲγ−ｍＲＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＯＰＣ及び未熟オリゴデンドログリアにおけるＦｃＲγのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現を示す。Ａ：ＦｃＲγ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検出。ＯＰＣはＦｃＲγを発現している（ａ）が、ＣＤ３ζは発現していない（ｂ）。骨髄由来の肥満細胞並びに脾臓細胞（５８）をポジティブコントロールとして使用した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、ＦｃＲγのｍＲＮＡ発現量は未熟オリゴデンドログリアと肥満細胞とでほぼ同等であった（データ省略）。Ｂ：免疫細胞化学的手法によるＦｃＲγの検出。ＦｃＲγはＡ２Ｂ５陽性オリゴデンドログリア前駆細胞（ａ，ｂ）、０４陽性（ｃ，ｄ）及び０１陽性未熟オリゴデンドログリア（ｅ，ｆ）にて発現している。Ｂａｒは１５μｍ。Ｃ：未熟オリゴデンドログリアのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔでは、野生型マウス（ｗｔ）由来の細胞からはＦｃＲγの顕著な発現を認めたが、ＦｃＲγ欠損型マウス（ＦｃＲγ−／−）（５８）由来の細胞からは認めなかった。
図２は、Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦｃＲγ発現細胞の分布を示す。大脳の冠状断切片上で、ＦｃＲγ発現細胞はＰＯで主にＳＶＺ内に分布している（ａ）。Ｐ４ではこれらの細胞分布は白質に広がりを見せ（ｂ）、Ｐ７では主に白質内に限局している（ｃ）。ＦｃＲγ陽性細胞はＳＶＺに見られ、ＶＺ（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）のｍｏｕｓｅ−Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ｍ−Ｍｓｉ−１）陽性細胞層に隣接して存在しており（４１）、ＦｃＲγ陽性細胞が神経幹細胞由来であることを示唆している（ｄ，ｅ）。成体ＣＮＳ内でもＦｃＲγ陽性細胞は存在し続けており、その分布はＰ７におけるものに類似している。即ち、分布は脳室上部の白質に限局されており、灰白質にはほとんど見られない（ｆ）。ＬＶ：ｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（側脳室）、ｃｃ：ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｌｌｏｓｕｍ（脳梁）、ｖｚ：ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ（脳室帯）、ｓｖｚ：ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ（脳室下帯）、ＣＴＸ：ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ（大脳皮質）、ＣＧ：ｃｉｎｇｕｌｕｍ（帯状束）、Ｃｐｕ：ｃａｕｄａｔｅ  ｐｕｔａｍｅｎ（被殻・尾状核）。Ｂａｒは５０μｍ（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５０μｍ（ｆ）。
図３は、ＦｃＲγ陽性細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでオリゴデンドログリアの系列に由来することを示す。Ａ：ＰＯ大脳冠状断切片の二重染色像では、ＦｃＲγ陽性細胞は主にＳＶＺ内に分布していることを示している（ａ）。これらの細胞のほとんどはＧＦＡＰの発現細胞、即ちアストログリアの系列の細胞、と一致しない（ｂ）。Ｏｘ−４２陽性であるミクログリアの系列の細胞とＦｃＲγ陽性細胞の分布は明らかに異なる（ｃ）。以上より、この日齢における  ＦｃＲγ陽性細胞は主にオリゴデンドログリア系列に由来する。ｂはａを拡大したものである（囲ってある領域）。ｏ：オリゴデンドログリア系列の細胞、ａ：アストログリア系列の細胞、ｍ：ミクログリア系列の細胞。Ｂａｒ：は、５０μｍ（ａ，ｃ）、２５μｍ（ｂ）。Ｂ：Ｐ７におけるミエリン形成以前の脳梁における冠状断二重染色写真。ＦｃＲγとＦｙｎは細胞膜に共在している（矢印の頭；ａ）。ＭＡＧはＦｃＲγと共染色される（矢印の頭）が、その発現は細胞突起の先端でより強くなっている（ｂ）。Ｂａｒは２５μｍ。Ｃ：成体ＣＮＳ内のＦｃＲγ陽性細胞の性質。ＦｃＲγ−ＭＢＰ  二重陽性オリゴデンドログリア系細胞は白質内に見られ、新生児ＣＮＳの分布に類似している（ａ）。一方、ＧＦＡＰ陽性細胞の一部の集団、主に成体ＳＶＺ内に見られるそれら集団もＦｃＲγ陽性である（ｂ）。Ｂａｒは２５μｍ。Ｄ：連続切片の解析によって、ＦｃＲγ（ａ）、Ｆｙｎ（ｂ）、及びＭＢＰ（ｃ）の分布に類似性がある（矢印及び矢印の頭）ことが示された。写真はＰ７の脳梁および脳弓の一部の部分を撮影してある。ＦｃＲγはＦｙｎやＭＢＰと異なり、軸索にも発現している（４６）。Ｂａｒは５０μｍ。
図４は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲγの活性化を示す。Ａ：抗ＦｃＲγ抗体による２４時間の刺激によって、ＯＰＣは顕著な形態学的な変化を示し、良く発達した突起を伸ばした（ｂ）。同様な変化がＩｇＧ２ｂ（エピトープはマウスでは存在しない；４７）で代用して投与した際にも見られた（ｃ）。これらの変化は刺激なしには観察されなかった（ａ）。Ｂａｒは３５μｍ。Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによるＭＢＰとＦｙｎの検出。Ａの写真の細胞が溶解され、解析された。主にエクソン２を有するＭＢＰアイソフォーム（１７．０ｋＤ  ａｎｄ  ２１．５ｋＤ）及びＦｙｎが、活性化刺激のないＯＰＣ（ｃｔｒｌ；１レーン）に比して、抗ＦｃＲγで刺激されたＯＰＣで上昇していた（ＦｃＲγ；２レーン）。ＩｇＧに対するＦｃ受容体を介するように、ＩｇＧ２ｂで刺激したＯＰＣ（ＩｇＧ２ｂ；３レーン）でもＭＢＰの発現は上昇したが、Ｆｙｎに関しては顕著な差が見られなかった。これは恐らく刺激方法が間接的であることを反映している。ＯＰＣ及び分化後のオリゴデンドログリア双方のマーカーである  ＣＮＰａｓｅをローディングコントロールとして使用した。Ｃ：ＦｃＲγ欠損マウス（ＦｃＲγ−／−）（５８）由来のＯＰＣをＩｇＧ２ｂは刺激することができない（ｂとａを比較）。これはＡで見られたＯＰＣの変化がＦｃＲγ依存性であることを示している。Ｂａｒは３５μｍ。
図５は、野生型（Ｗｔ）、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγ−／−）、Ｆｙｎ欠損（Ｆｙｎ−／−）、ＭＢＰ欠損マウス（ＭＢＰ−／−）の比較を示す。Ａ：Ｐ１０の大脳冠状断を示している。ａ−ｄ、ｂ−ｅ、ｃ−ｆは隣接切片であり、ミエリン及びミエリン形成中のオリゴデンドログリアの形態が容易に観察し得る帯状束領域を選んで撮影している。ＭＢＰの分布はＦｃＲγ欠損マウス（ｂ）及びＦｙｎ欠損マウス（ｃ）で減少しており、これら二者のうち、Ｆｙｎ欠損マウスはより重篤な表現型を示している（ｃ）。ＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリア（矢印の頭）は３種類全ての変異マウスで制限されている。このうちＭＢＰ欠損マウスは最も重篤で（ｇ）、Ｆｙｎ欠損マウスは中間であり（ｆ）、ＦｃＲγ欠損マウスの表現型が最も軽症である（ｅ）。これらの所見はミエリン形成を担うオリゴデンドログリア内にＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードが存在することを示している。Ｂａｒは１００μｍ。Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによるミエリン分画中のＭＢＰの解析。ＭＢＰはＦｙｎ欠損及びＦｃＲγ欠損マウスで、Ｐ１０（ａ）及び成体（ｂ）の何れでも減少が見られる。成体ＣＮＳでは、全ＭＢＰ量はＦｙｎ欠損及びＦｃＲγ欠損マウスでそれぞれ野生型マウスの４０．３％及び６０．８％まで減少している（５４）。エクソン２を有するＭＢＰアイソフォーム（１７．０ｋＤ及び２１．５ｋＤ）は残る２つのアイソフォームより、より重篤に影響を受けており、Ｆｙｎ欠損及びＦｃＲγ欠損マウスでそれぞれ野生型マウスの３１．９％及び４０．０％まで減少している（５４）。これらの結果はｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果（図４）と合致する。Ｃ：Ｐ１０までに大脳皮質へ移動した、ＭＡＧ陽性未熟オリゴデンドログリア（６）をそれぞれの冠状断切片で数値評価し、統計的に解析した（５５）。一切片当たりのそれら細胞数は、ＦｃＲγ欠損、Ｆｙｎ欠損、ＭＢＰ欠損マウスでそれぞれ野生型の約４４％、２５％、１２％であった。この結果はＭＢＰの量と比例しており、エクソン２を有するＭＢＰがミエリン形成に重要であることを示唆している。
図６は、ＦｃＲγ欠損によるミエリン形成不全を示す。Ａ：ＦｃＲγは、ＯＰＣのマーカーであるＰＤＧＦ−αＲ（５６）と視神経で共染色され（矢印の頭；ａ）、ＦｃＲγがオリゴデンドログリア系列の細胞に発現していることを示している。Ｐ１０におけるＰＤＧＦ−αＲ陽性細胞（矢印）の分布に、ＦｃＲγ欠損マウス（ＦｃＲγ−／−）（ｃ）と野生型マウス（ｂ）との間に顕著な差は認められなかった。ＳＶＺと白質の境界領域が示されている。これらの所見は、Ｐ１０で観察されたミエリン形成の初期異常（図５）はミエリン形成過程の障害によるもので、グリア発生の障害によるものではないことを示している。ｂとｃはメチルグリーンでカウンター染色している。Ｂａｒは４０μｍ。Ｂ：ＭＡＧ陽性オリゴデンドログリア（６，５５）をより遅い発達段階で統計的に解析すると、細胞数にＰ５０或いはＰ９０で顕著な差異は認められない（ａ）。しかしながらこの時点になってもミエリンの異常は明らかに認められた。免疫組織化学的な解析の結果、ＭＢＰだけでなく（データ省略；図５Ｂ−ｂ参照）、Ｐ５０の脳梁でＰＬＰの染色性が野生型（ｂ）に比して減少しているのをＦｃＲγ欠損マウスで認めた（ｃ）。Ｂａｒは４０μｍ。Ｃ：電子顕微鏡では、Ｐ６７の脳梁背側領域で重篤なミエリン低形成がＦｃＲγ欠損マウスで認められる（ａとｂを比較）。脳梁腹側領域では、ＦｃＲγ欠損マウスの低ミエリンが伴った軸索にて、軸索の膨化（アスタリスク）が認められた（ｃとｄを比較）。Ｂａｒは２μｍ（ｂ）、５００ｎｍ（ｄ）。
図７は、ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ及びＣＤ４５がオリゴデンドログリア内にＦｃＲγと共発現していることを示す。Ａ：未熟オリゴデンドログリアのＲＴ−ＰＣＲ（３７）ではＦｃγＲＩ／ＩＩＩのα鎖は検出されるが、ＦｃεＲＩのα鎖は検出されない。故に、ＦｃＲγのパートナーはＩｇＧ特異的なＦｃ受容体であることを示唆している。半定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、骨髄由来肥満細胞に比して、未熟オリゴデンドログリアでは約１．８倍（ＦｃγＲＩ）及び０．８倍（ＦｃγＲＩＩＩ）のｍＲＮＡ発現があることが分かった（データ省略）。Ｂ：ＣＤ４５はＭＡＧ陽性細胞に発現しており（矢印の頭）、即ちオリゴデンドログリア内に発現している（ｃ）。ＣＤ４５はＰ１０におけるミエリン形成初期段階にて、オリゴデンドログリア内にてＦｙｎと共発現している（矢印の頭；ｂ）。ＣＤ４５はまたＰ７（矢印の頭；ｄ）及び成体ＣＮＳ（矢印の頭；ａ）内の拡張中のミエリン鞘でＦｃＲγと共発現している。これら写真は全てＣＮＳ内の白質を示している（ａは白質と成体ＳＶＺの境界領域、ｂ及びｄは脳梁、ｃは前交連）。Ｂａｒは２５μｍ。Ｃ：ＣＤ４５は培養未熟オリゴデンドログリアのフローサイトメトリーで容易に検出されたが（３７）、アストロサイトでは検出されなかった。これらの所見はＣＤ４５が本発明者らの提唱するシグナルカスケードの制御に関与していることを示唆している。
図８は、本発明者らが提唱するミエリン形成メカニズムを示す。ＩｇＧのような細胞外シグナルが、ＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ）と会合することで、ＦｃＲγを始動させる。ＣＤ４５はまずＦｙｎを活性化し、次いでＦｃＲγのＩＴＡＭリン酸化がＦｙｎのチロシンキナーゼ活性によって生じる。このシグナルはＭＢＰ、特にエクソン２を有するアイソフォーム、の発現を促進する。ＭＢＰは、以前報告したように、ＭＡＧの発現調節に寄与する（６）。ＦｃγＲｓの遺伝子多型（６６）及びＣＤ４５の変異（２３）がＭＳの一部の集団では存在していることが報告されている。このモデルは脱髄の機序及びＩＶＩｇ療法の脱髄疾患への効果（６２）を説明できる。ＦｃＲγの直接的活性化（図４）は将来的にミエリン再生を促進する、効果的な治療法となりうる。
図９ａ〜ｄは、生後１０日齢マウスの脳のＭＢＰに対する免疫組織化学染色像である。各写真の右上にある（野生型、ＦｃＲγ−／−、Ｆｙｎ−／−、ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−）は遺伝型である。何れの動物も血統はＣ５７Ｂ１／６である。脳梁から帯状束にかけての領域（大脳）を写真にしてある。写真下部にある楕円形の構造は海馬に相当する。写真の通り、ＭＢＰの発現量はＷｉｌｄ＞ＦｃＲγ−／−＞Ｆｙｎ−／−＞ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−となっている。
図１０ａ〜ｄは図９に類似するが、ＭＡＧに対する染色である。解釈は図９に同じ。ｅはＭＢＰを欠損したＳｈｉｖｅｒｅｒマウス（ＭＢＰ−／−）の脳である。ＦｃＲγ⇒Ｆｙｎ⇒ＭＢＰのカスケードを考えている訳であるが、図９のｄにあるように、ＦｃＲγとＦｙｎを両方潰すとほとんどＭＢＰが検出できない。そこで、ＭＢＰをそもそも欠損している動物と同じような表現型になるかを見たわけである。事実、ＭＡＧの発現パターンはＭＢＰの欠損マウスとＦｙｎ・ＦｃＲγの二重欠損マウス（ＦｃＲγ−／−Ｆｙｎ−／−）で類似し、ｆにあるグラフの通り、ＭＡＧ陽性未熟オリゴの数も類似する。即ち、ＦｃＲγとＦｙｎがＭＢＰの発現に必須であることを示した。
図１１ａ−ｄは、生後１．５ヶ月（Ｐ１．５Ｍ）のそれぞれ右上にある遺伝型のマウスの大脳皮質を示している。染色はＭＢＰである。ＦｙｎとＦｃＲγの欠損型では野生型よりも▲１▼大脳皮質が若干薄く、▲２▼ＭＢＰの染色が弱い、ということが判る。更にＦｃＲγ・Ｆｙｎの二重欠損では、▲１▼大脳皮質は極めて薄く、▲２▼ＭＢＰの染色はほぼ消失している、ことがわかる。これは図９、１０で示した生後１０日齢の現象が、成長に伴って代償されるものではなく、永続的な障害となっていることを示している。ｅ−ｈはＮｉｓｓｌ染色であるが、それぞれ、写真の下に記している遺伝型と日・月齢である。矢印は、水頭症が生じていること示している。矢印が指しているのは脳室に相当する領域であるが、ここに脳脊髄液が過剰にたまっているのがわかる。Ｐ１０ではＰ１．５Ｍ程ではないが、同じような水頭症が見られる。
図１２ａ，ｂは培養ＯＰＣの写真である。ａは位相差像、ｂはＣＤ４５に対する免疫染色像である。矢印はＣＤ４５が陽性のＯＰＣを指している。一方、Ａｒｒｏｗｈｅａｄ（矢印の頭だけのもの）はあまり染まっていない（むしろ陰性）のＯＰＣを指している。陽性細胞はより突起があり、分化が進んでいるＯＰＣであるが、陰性のものはまだあまり分化していないＯＰＣに相当する。つまり、分化と関連してＣＤ４５が発現していることを示している。ｃは生後７日齢の野生型大脳の写真で、領域としては内包周囲になる。ＭＡＧで染まるオリゴがＣＤ４５も染まっている（矢印）。即ちオリゴデンドログリアがＣＤ４５陽性であることが示されている。一方でＡｒｒｏｗｈｅａｄはＣＤ４５のみが陽性のものを指している。これはオリゴデンドログリア以外の細胞か、あるいはまだＭＡＧを発現していない未分化オリゴデンドログリアが染まっていることを示している。ＦｉｍはＦｉｍｂｒｉａ（脳弓）で、ＬＶはＬａｔｅｒａｌ  Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（側脳室）である。ｄ，ｅはＣＤ４５の染色像である。これは使用しているＣＤ４５抗体が特異的に反応しているか確認したものである。野生型ではＣＤ４５陽性細胞が、特にＣＣ（脳梁）等の白質で染まっているが、ＣＤ４５欠損マウス（ＣＤ４５−／−）ではそれが染まらない。従って、抗体は特異的反応を示していることを示唆する。ただ、ＣＤ４５欠損マウスでもＬＶ（側脳室）内にある脈絡叢と呼ばれる構造物がＣＤ４５で染まっている。この部位は非特異的反応が出る場所として知られている。ＣＴＸはＣｏｒｔｅｘ（大脳皮質）、ＣＣはＣｏｒｐｕｓ  Ｃａｌｌｏｓｕｍ（脳梁）、ＳＶＺはｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ（脳室下帯）である。
図１３ａは野生型並びにＣＤ４５欠損マウス（ＣＤ４５−／−）からの培養ＯＰＣに、何も刺激しないか（コントロール）或いは抗ＦｃＲγ抗体で２４時間刺激したときの写真である。野生型は刺激によって細胞の形態が分化するが、ＣＤ４５欠損は分化しない。ＣＤ４５がＯＰＣの分化に必要であることを示している。ｂはａの細胞をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで見たものである。ＦｃＲγの刺激だけでなく、ＩｇＧによる刺激も入れている。ＩｇＧとＦｃＲγの刺激によって野生型ではＭＢＰの発現増大が見られるが、ＣＤ４５欠損マウスではそれが起こらない。つまりＣＤ４５がＯＰＣの分化に必要であることを示している。ｃはＰ１０の野生型・ＣＤ４５欠損マウス・Ｆｙｎ欠損マウス（Ｆｙｎ−／−）の脳よりミエリン分画を抽出して、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｏｔにてＭＢＰを検出したものである。写真の通り、ＣＤ４５欠損マウスとＦｙｎ欠損マウスでは野生型に比してＭＢＰの減少が見られ、これは組織解析の結果（ｄ−ｈ）を支持すると共に、ＣＤ４５もＦｙｎもミエリン形成（ＭＢＰの発現）に重要であることを示唆している。ｄ，ｅは野生型とＣＤ４５欠損マウスの生後１０日齢の線条体のミエリンをＭＢＰに対する免疫組織化学で見ている写真である。ＬＶは側脳室である。ＣＤ４５欠損マウスではＭＢＰの発現低下が見られる。さらにｆ，ｇ，ｈはＭＡＧに対する免疫組織化学をそれぞれＰ１０で行ったものである。ＣＤ４５はＦｙｎの活性化を担っていると推測されることから、Ｆｙｎ欠損マウスと比較している。野生型では多数のＭＡＧ陽性オリゴデンドログリアが脳梁（ＣＣ）にも大脳皮質内（ＣＴＸ）にも見られるが、ＣＤ４５欠損、Ｆｙｎ欠損ではいずれも同じように減少している。これらのことはＣＤ４５がＦｙｎの活性化に関わっていることを支持する。
図１４は、生後１．５ヶ月の野生型並びにＣＤ４５欠損マウス（ＣＤ４５−／−）の線条体と呼ばれる領域のミエリンを観察したものである。ＭＢＰに対する免疫組織化学染色で、ＣＤ４５欠損マウスではミエリンの染まりがまだらになり、ミエリンの崩壊（或いは最初からの形成不全）を示唆している。つまり、図１２、１３で示したミエリン異常が生後１．５ヶ月になって成熟してもまだ引き続いており、代償されないことを示している。（つまりＰ１０での像が単なる成長不良ではないことを示す）。
図１５は、ＩｇＧを欠損しているμＭＴのマウスと野生型をＰ７で比較している、ＭＡＧに対する免疫組織化学の像である。大脳の割面を示している。これらはいずれもμＭＴでミエリンの減少を示している。これらは、ＩｇＧが実際に生理的機能としてミエリン形成に必要であることを示している。
図１６は、ＩｇＧを欠損しているμＭＴのマウスと野生型をＰ１０で比較している、ＭＡＧに対する免疫組織化学の像である。大脳の割面を示している。これらはいずれもμＭＴでミエリンの減少を示している。これらは、ＩｇＧが実際に生理的機能としてミエリン形成に必要であることを示している。
図１７は、ＩｇＧを欠損しているμＭＴのマウスと野生型（Ｗｔ）を成体（Ｐ５０）で比較している、ＭＡＧに対する免疫組織化学の像である。大脳皮質内を示している。これらはいずれもμＭＴでミエリンの減少を示している。これらは、ＩｇＧが実際に生理的機能としてミエリン形成に必要であることを示している。
【図１】
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【図２ａ−ｃ】
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【図２ｄ−ｆ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ−ｄ】
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【図１０ｅ−ｆ】
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【図１１ａ−ｅ】
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【図１１ｂ−ｆ】
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【図１１ｃ−ｇ】
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【図１１ｄ−ｈ】
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【図１２ａ−ｃ】
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【図１２ｄ−ｅ】
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【図１３ａ−ｃ】
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【図１３ｄ−ｈ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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