(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品である、ホップ由来のアルファー酸及び／又はイソアルファー酸を含むことを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害作用剤。
【請求項２】
アルファー酸が、コフムロン、フムロン及びアドフムロンのうちの１種又は２種以上の物質であり、イソアルファー酸が、イソコフムロン、イソフムロン及びイソアドフムロンのうちの１種又は２種以上の物質である請求項１記載のアルドースリダクターゼ阻害作用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルドースリダクターゼ阻害作用剤に関し、詳しくはホップ由来のアルファー酸及び／又はイソアルファー酸を有効成分とするアルドースリダクターゼ阻害作用剤、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、日本には約６００万人もの糖尿病患者がおり、発症前症状の人も含めれば我が国の人口の１０％にも達し、国民病の規模になりつつある。糖尿病には、インシュリン依存型とインシュリン非依存型との２つのタイプがあり、日本人の患者の約９５％がインシュリン非依存性糖尿病である。糖尿病は高血圧を主な症状とし、様々な合併症（網膜症、腎症、神経障害等）を引き起こすことが知られている。
【０００３】
従来、糖尿病の治療薬として、インシュリンや種々の血糖降下剤が用いられてきたが、前述した種々の合併症の治療薬としては有効性に限界がある。これら合併症には、ポリオール代謝経路の亢進が深く関わっているとされ、この経路の律速酵素であるアルドースリダクターゼ（以下、ＡＲと略記することがある。）の阻害作用を示す物質の検索が進められている。阻害作用を示す物質としては、合成物質エパレルスタットが開発された他、種々の植物由来成分、例えば桂皮、芍薬、桑白皮、甘草、トチュウ、フトモモ、ハマゴウ、ネムノキ、褐藻類等の抽出物が有効であるとの報告もある。また、タマネギの皮に含まれるフラボノイドの１種であるケルセチンは、強いＡＲ阻害作用効果があると報告されている。
【０００４】
人体において、インシュリン非依存的にグルコースの取り込みを行う水晶体、網膜、末梢神経等の組織では、糖尿病によって血糖値が高くなるため、細胞内におけるグルコース濃度が上昇する。これにより、グルコースの代謝経路のうち、主経路の解糖系で代謝しきれなくなった過剰のグルコースは、細胞中のＡＲによりソルビトールに変換される。
ソルビトールは細胞膜電荷のため細胞外に出にくく、さらにソルビトール脱水酵素（副経路のポリオール経路上でフルクトースへの変換を促す）による処理速度が遅いこと等からソルビトールが細胞内に蓄積され、細胞内浸透圧が上昇して細胞の膨化と細胞膜の変性が起こる。その結果として生じた細胞障害により、種々の糖尿病合併症が発病すると考えられている。
【０００５】
そこで、糖尿病合併症の発症経路に着目した合併症の治療薬として、治療効果が有効、かつ人体に対して有害な副作用を生じさせない治療薬の開発が望まれている。さらに、国民病の規模となっている糖尿病を、日常的に予防することのできる成分を含有する食品もしくは食品素材の開発についても待望されている。
【０００６】
一方、ホップ（Humulus Lupulus L.)は、イラクサ目クワ科に属する宿根、雌雄異株の多年生植物である。ホップの未受精の雌花（毬花）は、ビールの原料として世界中で広く使用されている。
ホップの花には黄色いルプリン顆粒があり、この中にビールの苦味のもととなる樹脂と香りを付ける精油成分が含まれている。
苦味のもととなる樹脂は、揮発性パラフィン族炭水化物であるヘキサンに対する溶解性によって、アルファー酸（α−ａｃｉｄ）、ベーター酸（β−ａｃｉｄ）等に分類される。
【０００７】
ホップはビールに苦味と芳香を付与し、泡持ちを良くし、雑菌の繁殖を抑えるという作用を有している他にも、多くの薬効作用があることが知られている。すなわち、骨多孔症治療効果、抗ガン作用、動脈硬化予防作用等があることが報告されている。また、ホップには女性ホルモンの作用を補助する成分が含まれており、更年期障害への治療効果があると言われている。
しかし、ホップに含まれる成分がＡＲ阻害作用を有することや、該阻害作用を利用した糖尿病合併症の予防・治療についてはまったく報告がない。
【０００８】
アルファー酸は、ビールを飲んだときに感じる芳醇で爽やかなホップの苦味を醸し出すものであり、ホップ中に約６％含まれている。アルファー酸はビールの主要な苦味の前駆物質で麦汁に不溶性であるが、ビールの醸造工程において、麦汁を煮沸することにより、異性化されイソアルファー酸となって麦汁に溶解し、ビールに苦味が付与する。通常、イソアルファー酸はビール中に約２０ｐｐｍ含まれている。
アルファー酸は、非常に不安定な物質であるが、フムロン、コフムロン、アドフムロン等の存在が知られている。
また、イソアルファー酸としては、イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン等が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖尿病合併症の発症経路に着目したＡＲ阻害作用剤を開発することであり、特に天然物に由来し、前記したような各種疾患に対して副作用の心配がない物質を有効成分とするＡＲ阻害作用剤を提供することである。
そこで、本発明者らは多くの天然物の中からＡＲ阻害作用を有する成分を検索した結果、ビールの原料であるホップ由来のアルファー酸及び／又はイソアルファー酸がＡＲ阻害作用を有していることを見出し、この知見に基づいて本発明に到達した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、請求項１記載の本発明は、医薬品である、ホップ由来のアルファー酸及び／又はイソアルファー酸を含むことを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害作用剤である。
請求項２記載の本発明は、アルファー酸が、フムロン、コフムロン及びアドフムロンのうちの１種又は２種以上の物質であり、イソアルファー酸が、イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロンのうちの１種又は２種以上の物質である請求項１記載のアルドースリダクターゼ阻害作用剤である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＡＲ阻害作用剤の有効成分は、ホップに含まれているアルファー酸及び／又はイソアルファー酸である。アルファー酸としては、前記したように、フムロン、コフムロン、アドフムロン等があり、イソアルファー酸としては、イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン等がある。
本発明のＡＲ阻害作用剤には、これらの物質を１種又は２種以上を適宜選択して使用することができる。特に、アルファー酸単独又は両者の併用が好ましい。アルファー酸及びイソアルファー酸は、ホップに由来するものであり、これらをホップ自体から得る他、ホップを含有する飲食品であって、これらを含有するものをそのまま、あるいは濃縮して使用することができる。また、市販のこれら化合物を用いることもできる。
【００１２】
アルファー酸は、ホップから適当な溶剤等を用いて抽出することによって得ることができる。その１例を示すと、乾燥ホップを粉砕し、分液ロート等の適当な容器に入れ、ベンゼン、トルエンなどの溶剤を加え、振盪することにより抽出する。このとき、溶剤の使用量はホップ重量の５〜２０倍量、好ましくは１０倍量が適当である。
振盪は、適当な振盪機を用いて１５０〜６００ｐｐｍ、好ましくは２００〜４００ｐｐｍで１０分〜２時間、好ましくは２０分〜１時間行って、目的とする成分を抽出する。抽出液を、栓付遠心管に入れ１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を取り除き、清澄なホップ抽出液を得る。
次いで、抽出液を濃縮、乾固することによりアルファー酸を含む成分が得られる。なお、このとき、アルファー酸と共にベーター酸も含まれているが、これを除去する必要はない。
【００１３】
また、イソアルファー酸は、アルファー酸の異性化により生成するので、ホップを加熱処理したものを原料として抽出することにより得ることができる。例えば、乾燥ホップの重量に対して２００〜１０００倍量、好ましくは４００〜６００倍量の水を加え、６０〜１２０分程煮沸した後、煮沸液を２０００〜４０００ｒｐｍ、好ましくは３０００ｒｐｍで５〜３０分間、好ましくは１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を取り除き、清澄なホップ抽出液を得る。
得られた清澄な液をエバポレーター等を用いて減圧下に濃縮し、濃縮液に塩酸などの酸とイソオクタン、酢酸ｎ−ブチル等の溶剤を加えて、上記の如く振盪して抽出を行う。適当な時間静置したのち、上層の溶剤層を採取し、再び減圧下に濃縮、乾固することによりイソアルファー酸を含む成分が得られる。
さらには、ホップを原料とするビール中にもイソアルファー酸が含まれているので、当該ビールをそのまま、あるいは濃縮してイソアルファー酸として用いることもできる。
【００１４】
アルファー酸やイソアルファー酸は、上記の方法によって得られる抽出液やその乾燥物等をそのまま本発明のＡＲ阻害作用剤の有効成分として用いることもできるが、所望により、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の常法を適用することによってフムロン、コフムロン、アドフムロン、イソフムロンイソコフムロン、イソアドフムロン等の物質を単離、精製して、本発明に用いることができる。
【００１５】
これらのアルファー酸やイソアルファー酸を含有する抽出液等は、ビール等の原料として古くから使用されているホップに由来する成分であり、安全性の点で心配がない。そのため、アルファー酸及び／又はイソアルファー酸を含有する本発明のＡＲ阻害作用剤は、食品や医薬品等の形態で提供される。
【００１６】
本発明のＡＲ阻害作用剤を食品もしくは食品素材として用いる場合は、単独で各種食品等に添加する他に、必要に応じて安定剤、増量剤、膨張剤等の各種補助剤と適宜組み合わせて用いることができる。
本発明のＡＲ阻害作用剤の食品等への添加量については特に制限はないが、用途等を考慮して適宜決定すればよい。
また、医薬品として用いる場合には、散剤、顆粒、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等の任意の剤形を採用することができる。製剤化にあたっては、本発明のＡＲ阻害作用剤を単独で使用することができる他、賦形剤、結合材、着色料等の製薬上許容しうる他の成分を必要に応じて適宜混合して用いることができる。有効成分の添加量については、成人１日あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇが適当である。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）サンプル調製
ビール３００ｍＬを常法により凍結乾燥し、１０ｍｇづつを９９．５％  エタノール４００μＬ（試験区１）、９９．８％  メタノール４００μＬ（試験区２）又は０．９％の塩化ナトリウムを含む０．１５Ｍ  リン酸緩衝液４００μＬ（試験区３）に溶解させ、３００ｒｐｍで１時間振盪した後、超音波処理をした。超音波処理後、反応液を栓付遠心管に入れ１００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清１μＬを、蒸留水９μＬに溶解させたものをＡＲ阻害活性測定用の試料とした。
【００１８】
（２）ＡＲ阻害活性測定法
９６穴マイクロプレートにて、０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）５０μＬに１．５ｍＭ  還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略記することがある。）１０μＬ、１００ｍＭ  ＤＬ―グリセルアルデヒド１０μＬ、水１０μＬ及び試料１０μＬを加え、さらに０．０３ｕｎｉｔ／ｍＬのヒト組換え体アルドースリダクターゼ（和光純薬（株）製）１０μＬを添加した後、２５℃で酵素反応を１０分間行った。なお、対照として、試料の代わりに水を用いた場合についても、同様の操作を行った。
【００１９】
酵素反応終了後、マイクロプレートリーダー（Model 3550-UV 、バイオラッド社製）にて、ＮＡＤＰＨの減少量を波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少量から求め、阻害活性を算出した。すなわち、得られた測定結果から、下記の計算式により阻害率を算出した。式中、Ａ０は酵素反応開始前の吸光度、Ａ１は酵素反応後の吸光度、Ｃ０は対照の酵素反応開始前の吸光度、Ｃ１は対照の酵素反応後の吸光度をそれぞれ示す。結果を第１表に示す。
表から明らかなように、ビールから抽出された各試験区にＡＲ阻害活性が認められ、特にメタノールで抽出した試験区２が最も高い阻害活性を示した。
【００２０】
【数１】
0004247422.tif 000002
【００２１】
【表１】
第１表
0004247422.tif 000003
【００２２】
実施例２
乾燥ホップ１ｇを５００ｍＬの水に入れ、９０分間の煮沸を行った。その後、常温まで冷却し、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行って上清を得た。
この上清を常法により凍結乾燥し、その１０ｍｇを９９．５％  エタノール４００μＬ（試験区１）、９９．８％  メタノール４００μＬ（試験区２）又は０．９％の塩化ナトリウムを含む０．１５Ｍ  リン酸緩衝液４００μＬ（試験区３）に溶解させた後、実施例１と同様にしてＡＲ阻害活性測定の試料を得た。なお、本試料には、イソコフムロン：イソフムロン：イソアドフムロンが２：４：１（重量比）の割合で含まれていた。
実施例１と同様にして実施したＡＲ阻害活性の測定結果を第２表に示す。
表から明らかなように、ホップから抽出されたいずれの試験区にも強い阻害活性が認められた。
【００２３】
【表２】
第２表
0004247422.tif 000004
【００２４】
実施例３
イソアルファー酸を構成するイソコフムロン、イソフムロン、イソアドフムロンの標準試薬（商品名：ＤＣＨＡ−Iso 、ＩＣＳ、スイス醸造研究所製）を試料として用い、実施例１と同様にＡＲ阻害活性を測定した。なお、本試料には、イソコフムロン：イソフムロン：イソアドフムロンが７：４：１（重量比）の割合で含まれている。また、対照としてケルセチン（試薬）を使用した。
測定結果を第３表に示す。
表から明らかなように、イソアルファー酸はケルセチンに匹敵するＡＲ阻害作用を有していることが分かった。
【００２５】
【表３】
第３表
0004247422.tif 000005
＊  最終濃度３３μｇ／ｍＬ
【００２６】
実施例４
アルファ酸を構成するフムロン、コフムロン、アドフムロンの標準試薬（ＩＣＥ−２、スイス醸造研究所製）を用いて実施例１と同様にＡＲ阻害活性を測定した。なお、本試料には、アルファ酸以外にホップ由来のポリフェノール成分が含まれていたため、当該ポリフェノール成分を３価鉄イオンと吸着、除去したものを試料として用いた。本試料には、コフムロン：（フムロン＋アドフムロン）が１：２．４（重量比）の割合で含まれている。また、対照としてケルセチン（試薬）を使用した。測定結果を第４表に示す。
表から明らかなように、アルファー酸はケルセチンにほぼ匹敵するＡＲ阻害作用を有していることが分かった。
【００２７】
【表４】
第４表
0004247422.tif 000006
＊  最終濃度３３μｇ／ｍＬ
【００２８】
実施例５
実施例３で使用したイソアルファー酸の標準試薬及び実施例４で使用したアルファー酸の標準試薬（ポリフェノールを除去したもの）の等量混合物を試料として実施例１と同様にＡＲ阻害活性を測定した。なお、本試料には、イソコフムロン：イソフムロン：イソアドフムロン：コフムロン：（フムロン＋アドフムロン）が７：４：１：３．５：８．４（重量比）の割合で含まれている。対照としてケルセチン（試薬）を使用した。結果を第５表に示す。
表から明らかなように、アルファー酸とイソアルファー酸の混合物はケルセチンと同等のＡＲ阻害作用を有していることが分かった。
【００２９】
【表５】
第５表
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＊  最終濃度３３μｇ／ｍＬ
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、従来より食品素材として利用されており、安全性の上で心配のないホップに由来する特定の化合物、すなわちアルファー酸及び／又はイソアルファー酸を有効成分として含むアルドースリダクターゼ阻害作用剤が提供される。
【００３１】
本発明のアルドースリダクターゼ阻害作用剤は、優れたアルドースリダクターゼ阻害作用を有しており、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、神経障害等の糖尿病合併症の予防、治療に有効である。