(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモンと、緩衝剤と、安定化有効量の下記：
（ｉ）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー非イオン界面活性剤、
（ii）タウロコール酸またはその塩もしくは誘導体、および
（iii）メチルセルロース誘導体、
からなる群より選択される少なくとも１種の安定剤と
を含んでなる安定な成長ホルモン液状処方物を製造する方法であって、
処方物中の緩衝剤または１種もしくは２種以上の安定剤の最終濃度の２倍より高い濃度の緩衝剤または１種もしくは２種以上の安定剤に、成長ホルモンがさらされないような条件下で、成長ホルモンを、緩衝剤または１種もしくは２種以上の安定剤と混合することを含んでなり、
ここで、処方物における安定剤の最終濃度が０．０１〜５．０％ｗ／ｖである、方法。
【請求項２】
成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処方物が、０．０５〜２．０％ｗ／ｖの１種もしくは２種以上の安定剤を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
処方物が、０．０８〜１．０％ｗ／ｖの１種もしくは２種以上の安定剤を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１種もしくは２種以上の安定剤が、プルロニックポリオール、タウロコール酸およびその塩、および、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
処方物が、１種もしくは２種以上の安定剤として０．０８％ｗ／ｖのプルロニック・ポリオールを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
処方物が、薬学上許容される緩衝剤を、２．５〜５０ｍＭの濃度で含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
処方物が、薬学上許容される緩衝剤を、１０〜２０ｍＭの濃度で含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
薬学上許容される緩衝剤がリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
処方物のｐＨが、５．０〜７．５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
処方物のｐＨが、５．０〜６．８である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
処方物のｐＨが、５．２〜６．５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
処方物のｐＨが、５．４〜５．８である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
最終体積の調節直前に１種もしくは２種以上の安定剤を処方物に添加する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により製造される、安定な成長ホルモン液状処方物。
【請求項１６】
成長ホルモンを必要とするヒトまたは動物の患者を治療するための、請求項１５に記載の安定な成長ホルモン液状処方物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、安定化された成長ホルモン（ＧＨ）処方物（formulation）、特に安定化賦形剤の混入により安定化されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）液状処方物、に関する。
ｈＧＨのこれらの液状処方物は、改良された化学的および物理的安定性を有する。特に、本発明は、これらの安定化されたＧＨ処方物の製造方法に関する。
発明の背景
ヒトおよび動物の成長ホルモンは、下垂体前葉において見出される約１９１個のアミノ酸を含有するタンパク質である。ＧＨの主要な生物学的作用は、若いヒトおよび動物において体発達を促進しかつ老年の動物において組織を維持することである。ＧＨにより影響を受ける器官は、骨格、筋肉、結合組織および内蔵を包含する。ＧＨは標的細胞の膜上の特定のレセプターと相互作用することによって作用する。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、正常のヒト体細胞増殖の調節に関係する主要なホルモンであり、また、なかでも線状骨成長、泌乳および細胞のエネルギー使用を包含する、種々の生理学的・代謝的機能に影響を与える。幼い子供におけるｈＧＨの欠乏は身長不足を招く。この症状はｈＧＨの外因的投与により治療されてきている。
従来、様々な種の成長ホルモンの分子的機能が注目されている。商業的関心は、医学的および獣医学的双方の分野から強く、そしてｈＧＨ遺伝子はクローニングされている。現在、ｈＧＨおよびその誘導体、メチオニル−ｈＧＨ（ｍｅｔ−ｈＧＨ）の双方は、哺乳動物および細菌の細胞培養系において生合成生産されている。
ｈＧＨが、治療用医薬製剤として商業的に入手可能であるためには、安定な処方物を製造しなくてはならない。このような処方物は、適当な貯蔵時間の間活性を維持することができなくてはならず、容易に処方されなくてはならず、そして投与のために患者に許容されなくてはならない。
ヒトＧＨは、種々の方法で処方されている。１例として、米国特許第５，０９６，８８５号明細書には、ｈＧＨに加えて、グリセロール、マンニトール、緩衝剤および必要に応じて非イオン界面活性剤、を含んでなるｈＧＨの薬学上許容される処方物が、開示されており、ｈＧＨ：グリシンのモル比は１：５０〜２００である。国際特許公開第ＷＯ９３／１９７７６号公報には、緩衝物質としてクエン酸塩と、必要に応じて成長因子（例えば、インスリン様成長因子または表皮成長因子）、アミノ酸（例えば、グリシンまたはアラニン）、マンニトールまたは他の糖アルコール、グリセロールならびに／または保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、を含んでなるＧＨの注射可能な処方物、が開示されている。国際特許公開第ＷＯ９４／０１３９８号公報には、ｈＧＨ、緩衝剤、非イオン界面活性剤ならびに、必要に応じて、マンニトール、中性塩および／または保存剤、を含んでなるＧＨ処方物、が開示されている。
欧州特許公開第０１３１８６４号（および対応するオーストリア国特許第５７９０１６号明細書）公報には、８５００ダルトンより大きい分子量をもつタンパク質の水溶液が開示されており、これは安定剤として線状ポリオキシアルキレン鎖含有表面活性物質の添加によって、タンパク質の、界面における吸着、変性および沈澱から保護されている。
欧州特許公開第０２１１６０１号公報には、成長促進ホルモンと、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン単位を含有しかつ約１，１００〜約４０，０００の平均分子量を有するブロックコポリマーとの水性混合物を含んでなる成長促進処方物が開示されており、前記ブロックコポリマーは投与の際の成長促進ホルモンの流動性およびその生物学的活性を維持するものである。引き続いて、欧州特許公開第０３０３７４６号公報には、ある種のポリオール、アミノ酸、生理学的ｐＨにおいて帯電した側基を有するアミノ酸のポリマーおよびコリン塩を包含する、水性環境における種々の他の成長促進ホルモン安定剤が開示されている。
ｈＧＨの医薬製剤は、特に溶液中で、不安定な傾向がある。化学的に分解した種、例えば、ｈＧＨの脱アミド化またはスルホキシル化された形態が生じ、そして二量体またはより高分子量の凝集した種が物理的不安定性から生ずることがある（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０、３２６；ＰｅａｒｌｍａｎおよびＮｇｕｙｅｎ（１９８９）、Ｉｎ  Ｄ．ＭａｒｓｈａｋおよびＤ．Ｌｉｕ（編）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｉｎｓ、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２３−３０；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９、４７８）。
溶液中のｈＧＨの不安定性の結果として、ｈＧＨの医薬処方物は凍結乾燥された形態で提供される傾向があり、この形態は次いで使用前に再構成しなくてはならない。凍結乾燥は、溶液中の安定性が適切でない範囲の貯蔵条件下で、ポリペプチドの生物学的活性および生化学的完全性を維持するためにしばしば使用されるが、凍結乾燥は費用がかかり、時間を消費する生産工程であるので、凍結乾燥を回避することは有利である。凍結乾燥されたｈＧＨ処方物は、使用前に、通常薬学上許容される希釈剤、例えば、無菌の注射用水、無菌の生理食塩水または適当な無菌の薬理学上許容される希釈剤、の添加により、再構成される。再構成されたｈＧＨの溶液は好ましくは４℃で貯蔵され、化学的および物理的分解反応を最小にするが、１４日までの期間であり得る、このような貯蔵の間に多少の分解は起こるであろう。
液体形態で、特に長期間にわたってｈＧＨの安定性を維持する形態で、提供されるｈＧＨの医薬処方物は、特に有利であろう。前述したように、現在の液状処方物は、加工および貯蔵の間に起こる化学的・物理的分解反応の生成物により、貯蔵時間が制限される。二量体形成に関連する問題は、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）、上掲のもの、において報告され、そしてｈＧＨの二量体の形成を回避する以前の試みは成功しなかった。
本発明の目的は、望ましくない凝集した種を形成しないか、あるいは生物学的活性を減少させ、またはレセプターの認識を変更させる化学的変化を引き起こさない、安定なｈＧＨ液状処方物を提供することである。他の目的は、皮下注射用ニードルレス（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ）インジェクターを介して送出するか、あるいは肺に使用するためにエーロゾル化することができる処方物、を提供することである。
発明の要約
本発明によれば、成長ホルモンと、緩衝剤と、安定化有効量の下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から成る群より選択される少なくとも１種の安定剤と、を含んでなる、安定な成長ホルモン液状処方物を製造する方法、が提供される。
（ｉ）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー非イオン界面活性剤、
（ｉｉ）タウロコール酸またはその塩または誘導体、および
（ｉｉｉ）メチルセルロース誘導体。
この方法は、処方物中の緩衝剤または１種もしくは２種以上の安定剤の最終濃度の２倍より高い濃度の緩衝剤または１種もしくは２種以上の安定剤に成長ホルモンがさらされないような条件下で、成長ホルモンを緩衝剤および１種もしくは２種以上の安定剤と混合することからなる。
また、本発明は、上記において広く記載した方法により製造された、成長ホルモンの安定な液状処方物にも拡張される。
さらに別の態様では、本発明は、また、成長ホルモンと、緩衝剤と、安定化有効量の、タウロコール酸またはその塩または誘導体、およびメチルセルロース誘導体、から選択される少なくとも１種の安定剤と、を含んでなる安定な成長ホルモン液状処方物、に拡張される。
この明細書を通じて、特記しない限り、用語「含んでなる」は、言及されている完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全体の群を包含するが、他の完全体または完全体の群を排除しないことを意味すると理解すべきである。
特に好ましい態様において、本発明は、下記成分（ａ）〜（ｃ）を含んでなる安定化された、薬学上許容されるヒト成長ホルモン液状処方物を製造する方法、を提供する。
（ａ）薬学上有効量のｈＧＨ、
（ｂ）０．０１〜５．０％ｗ／ｖの上記において広く定義された群から選択される少なくとも１種の安定剤、および
（ｃ）薬学上許容される緩衝剤。
好ましくは、この処方物は、０．０５〜２．０％ｗ／ｖ、より好ましくは０．０８〜１．０％ｗ／ｖ、の１種または２種以上の安定剤を含んでなる。
特に好ましい安定剤は、プルロニック（Ｐｕｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、タウロコール酸およびその塩、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース、である。
安定化された成長ホルモン液状処方物は、好ましくは、また、薬学上許容される緩衝剤、例えば、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤、を２．５〜５０ｍＭ、最も好ましくは１０〜２０ｍＭ、の濃度で含有する。
処方物のｐＨは、好ましくは５．０〜７．５、より好ましくは５．０〜６．８、さらに好ましくは５．２〜６．５、最も好ましくは５．４〜５．８、である。
安定化された成長ホルモン液状処方物の製造においては、処方物中の緩衝剤の最終濃度の２倍より高い濃度の緩衝剤に成長ホルモンがさらされないような条件下で、成長ホルモンを緩衝剤と混合し、次いでこの混合物に１種または２種以上の安定剤を同じ条件下で添加する。
安定化された成長ホルモン液状処方物の特に好ましい製造方法においては、成長ホルモンの暴露は、各成分の最終濃度の２倍以下のリン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤およびプルロニック・ポリオールの濃度に制限される。
本発明は、また、成長ホルモンを必要とするヒトまたは動物の患者に薬学上有効量の上記で広く記載した安定化された成長ホルモン液状処方物を投与することからなる、前記患者を治療する方法、に拡張される。
ＧＨの液状処方物は、ボーラスインジェクション、エーロゾル装置またはニードルレス・インジェクター・ガンの使用によるか、あるいは連続的ＩＶ注入により、投与することができる。
本発明の文脈においては、「成長ホルモン」に対する言及は、なかでもヒト、ウシ、ブタ、ヒツジおよびサケを包含するＧＨのすべての種、特にｈＧＨ、ならびにＧＨの生物学的に活性な誘導体、を包含することを意図する。ＧＨの誘導体は、アミノ酸配列の変異型、例えば、少数のアミノ酸の欠失または他のアミノ酸残基によるアミノ酸の置換、を有するヒトまたは動物のＧＨを包含すること、を意図する。また、このＧＨの誘導率には、ＧＨのトランケート型およびその誘導体、ならびにタンパク質のアミノ−またはカルボキシル−末端へのアミノ酸付加を有するＧＨ、例えば、メチオニル−ｈＧＨ、も包含される。ｈＧＨ修飾の他の型は、反応性ｈＧＨアミノ酸へのポリエチレングリコールの共有結合の付加により形成された型である（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，１７９，３３７号）。
発明の詳しい説明
本発明により提供されるＧＨおよび安定剤の液状処方物の製造方法は、凍結点より低いおよび凍結点より高い温度での長期貯蔵および治療用投与に適当な、安定な液状ＧＨ処方物を生ずる。これらの安定剤を含有する治療処方物は安定であるが、処方物の治療用投与をなお可能とする。
本発明の好ましい態様によれば、ＧＨはｈＧＨである。
（１）ヒト成長ホルモン組成物
用語「ヒト成長ホルモン」または「ｈＧＨ」は、例えば、天然源からのｈＧＨの抽出および精製によるか、あるいは組換え細胞培養系により、産生されたヒト成長ホルモンを意味する。ｈＧＨの配列およびその特性は、例えば、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｇｕｅｒｉｇｕｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＵＳＰ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ（１９８２）に記載されている。前述したように、この用語は、また、ｈＧＨの全配列中の１または２以上のアミノ酸が異なる、生物学的に活性なヒト成長ホルモンの同等物を包含し、特にｍｅｔ−ｈＧＨを包含する。また、この用語は、ｈＧＨの置換、欠失および挿入のアミノ酸変異型または翻訳後修飾を包含することを意図する。本発明の処方物において使用されるｈＧＨは、一般に、前述したように組換え手段により生産される。
ＧＨ、特にｈＧＨ、の「薬学上有効量」は、種々の投与養生法において治療効果を提供する量を意味する。本発明の組成物は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、より特に約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、の量のＧＨを含有する製造することができる。
（２）緩衝剤およびｐＨ
緩衝剤は、薬学上許容される緩衝剤、例えば、リン酸塩、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩等であることができる。好ましい緩衝剤は、リン酸塩またはクエン酸塩である。２ｍＭより高いか、あるいはそれに等しくかつ５０ｍＭより低い緩衝剤濃度が好ましく、最も有利であるのは１０〜２０ｍＭである。本発明の処方物に適当な、緩衝剤で調節したｐＨ範囲は、約５〜約７．５、最も有利であるのは約５．６である。処方物のｐＨは、ＧＨの脱アミド化を減少させるために７．５より低くすべきである。
（３）安定剤
本発明によれば、処方物はＧＨの安定性を増大させるために１種または２種以上の安定剤を含有する。安定剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー非イオン界面活性剤（例えば、プルロニック・ポリオール、例えば、プルロニックＦ１２７、Ｆ６８、Ｌ６４、ＰＥ６８００およびＰＥ６４００）、胆汁酸塩（例えば、タウロコール酸塩またはその誘導体）、あるいはメチルセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ））、であることができる。処方物は、単一の安定剤または２種またはそれ以上の組合わせを含有することができる。
１種または２種以上の安定剤の濃度は、緩衝剤およびｐＨの選択により決定されるが、有利であるのは重量／体積基準で０．０１％〜５．０％、より好ましくは０．０５〜２．０％、なおより好ましくは０．０８〜１．０％、の範囲である。凍結点より低いかつ凍結点より高い温度を包含する温度範囲にわたって長期貯蔵に付したとき、あるいは処方物を界面応力にさらしたとき、安定剤の使用は処方物の安定性を改良する。
１種または２種以上の安定剤は、濃度が増加したときの界面応力に対する処方物の安定性を改良する。しかしながら、１種または２種以上の安定剤の濃度の増加は、化学的安定性を低下させる。本発明によれば、付随的な化学的不安定性を最小にして、界面応力に対する安定性を高くするように、１種または２種以上の安定剤の濃度が最適化される。
（４）安定剤およびｈＧＨの、好ましい処方物
本発明による処方物の製造においては、１種または２種以上の安定剤がｈＧＨの液状処方物に添加される。前述したように、配合の過程で、緩衝剤の最終濃度の２倍以下の緩衝剤濃度に成長ホルモンをさらし、そして好ましくは最終体積の調節直前に処方物に１種または２種以上の安定剤を添加する。生ずる処方物は、変性に対する安定性が強化され、そして加工および貯蔵の間に直面することがある望ましくない反応に影響され難い。本明細書において使用するとき、加工という用語は、濾過、バイアルの中へのｈＧＨ溶液の充填、および処方物の製造に関係する他の操作、を包含する。
治療用投与のためのｈＧＨの液状処方物は、所望の純度を有するｈＧＨおよび安定剤を、薬学上許容される賦形剤、緩衝剤または保存剤と組合わせることによって製造することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０））。許容される賦形剤は、用いる濃度および投与量において患者に対して無毒であるものであり、そして緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、ｐＨおよび張度変更剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、を包含する。
成長ホルモンの液状処方物は、また、必要に応じて１種または２種以上の他の安定化賦形剤を含むことができる。追加の安定化賦形剤は、例えば、アミノ酸（例えば、グリシンまたはアラニン）、マンニトールまたは他の糖アルコール、またはグリセロール、を含むことができる。さらに、液状処方物は、他の成長因子、例えば、インスリン様成長因子または表皮成長因子、を含むことができる。
本発明の好ましい態様によれば、ｈＧＨを効果的に安定化させる手段が提供される。好ましい処方物は、プルロニック・ポリオール、タウロコール酸もしくはその塩または誘導体、およびメチルセルロース誘導体、から選択される１種または２種以上の安定剤、を含有する。処方物は、好ましくは、ヒトにおいて見出される汚染性ペプチドまたはタンパク質または感染因子を含まない、実質的に純粋なｈＧＨ、を含有する。この好ましい態様の処方物は、薬学上許容される添加剤をさらに含むことができる。これらは、例えば、緩衝剤、等張およびｐＨ変更剤、キレート化剤、保存剤、酸化防止剤、補助溶媒等、を包含し、これらの特定の例は、クエン酸塩、リン酸塩等、を包含することができる。処方物の予測される使用が無菌性を危うくすることがある場合、保存剤を添加することができる。このような場合において、薬学上許容される保存剤、例えば、ベンジルアルコールまたはフェノール、を使用することができる。
本発明に従い製造された処方物により提供されるｈＧＨの安定性が増加するので、安定剤の非存在において普通に使用される濃度よりも高い濃度であることができるｈＧＨ処方物のより広い使用が可能となる。例えば、安定化されたｈＧＨ液状処方物は、また、ｈＧＨ処方物のエーロゾル化またはニードルレス注入の間に起こるｈＧＨの表面誘導変性の発生率を減少させる。さらにｈＧＨ処方物の最適な計量分配を行うことができ、ここで本発明のｈＧＨ処方物を１〜５０ｍｇ／バイアル、好ましくは２〜２５ｍｇ／バイアル、より好ましくは３〜１０ｍｇ／バイアルにおいてバイアルの中に計量分配することができる。ｈＧＨ処方物の安定性の増加は、適当な温度、例えば、凍結点より低い温度（最も好ましくは−２０℃）あるいは凍結点より高い温度、好ましくは２〜８℃、最も好ましくは４℃、における長期間の貯蔵を可能とする。
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用すべきｈＧＨ処方物は、無菌でなくてはならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
一般に、治療用ｈＧＨ液状処方物は、無菌のアクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により孔空けすることができる栓を有する静脈内溶液のバッグまたはバイアル、の中に入れる。
本発明に従うｈＧＨ液状処方物の投与の経路は、既知の実施、例えば、静脈内、腹腔内、頭蓋内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入、あるいは連続的ＩＶ注入、に従う。
本発明の他の特徴は、下記の諸例および添付図面から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５中のｈＧＨ（１５ｍｇ／ｍｌ）の化学的安定性を示す。
第２図は、界面応力（渦撹拌）により誘発されたｈＧＨ（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．１〜４．５、または５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５中に２ｍｇ／ｍｌ）の凝集の溶液ｐＨに対する依存性を示す。
第３図は、界面応力（渦撹拌）により誘発された凝集したｈＧＨの沈澱を減少させる種々の安定剤の能力をグラフで表す。
第４図は、賦形剤へのｈＧＨの導入方法のみが異なる２つのｈＧＨ（５ｍｇ／ｍｌ）処方物、および０．００５％ｗ／ｖのＥＤＴＡを添加した第３のｈＧＨ処方物の安定性を示す。
例
例１ 安定剤をスクリーニングする方法
急速凝集法を使用して、界面応力に応答するＧＨ、特にｈＧＨ、の凝集を減少または防止させる安定剤の能力を評価し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。２つのＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍの内径×３００ｍｍ、東洋ソーダ、日本国）を直列にを使用して、ｈＧＨのクロマトグラフィーを実施した。移動相は、０．１Ｍのリン酸塩、ｐＨ７．０の緩衝剤から成り、０．９ｍｌ／分の流速でポンプした。２０μｌの試料体積を使用して２１４ｎｍにおける紫外線吸収により、ｈＧＨの溶離を検出した。
急速凝集法は、キャップ付ポリプロピレン管（１１ｍｍの内径×７４ｍｍ）中で１５〜６０秒の一定速度においてｈＧＨ溶液を渦撹拌することによって、高い空気／水の界面を導入することを伴った。試料を室温において３０分間平衡化して沈澱を進行させ、０．２μｍの酢酸セルロースのマイクロ遠心分離フィルターを通して濾過し、濾液をＳＥＣにより分析した。処理を受けなかった各試料の対照溶液をＳＥＣ分析に含めた。
合計の可溶性ｈＧＨの残留量（モノマーおよび高分子量の種のピーク面積）を、適当な未処理対照溶液の合計のピーク面積（ｈＧＨのための）の百分率として表した。
表１は、ｐＨ７．０における界面応力により誘発されたｈＧＨの凝集度への種々の安定剤の効果を示す。
表２は、ｐＨ６．０における界面応力により誘発されたｈＧＨの凝集度への種々の安定剤の効果を示す。
表３は、ｐＨ５．６における界面応力により誘発されたｈＧＨの凝集度への種々の安定剤の効果を示す。
表４は、ｐＨ５．６における種々の緩衝剤中のｈＧＨ（１．５ｍｇ／ｍｌ）の凝集度への等張の調節の効果を示す。
表５は、ｐＨ５．６における凍結−融解により誘発されたｈＧＨの凝集度への種々の安定剤の効果を示す。
添付する表に示すように、界面応力により誘発されたｈＧＨの凝集を減少または防止させるとき、多数の賦形剤は非常に有効であった。プルロニック・ポリオールは、０．０５％ｗ／ｖより高い濃度においてほぼ定量的保護を提供し、モノマーのｈＧＨのみが残留した。タウロコレートは、０．０２％ｗ／ｖより高い濃度においてほぼ定量的保護を提供し、モノマーのｈＧＨのみが残留した。タウロデオキシコレートは、界面応力の非存在下でｈＧＨの二量化を引き起こしたので、ｐＨ５．６において安定剤として不適当であった。
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塩化ナトリウムを添加するか、あるいは添加しない（等張とするために）クエン酸塩またはリン酸塩（５または２０ｍＭ）緩衝剤中のｈＧＨ（１．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．６）の凝集特性を研究した。凝集がリン酸塩濃度に依存することが報告されたからである（ＰｅａｌｍａｎおよびＮｇｕｙｅｎ、１９９２、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４：１７８−１８５）。
治療時間を変更して（１５秒）、前述の実験方法に従った。
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ｈＧＨの凝集は、緩衝剤の特質または緩衝剤の濃度に依存することは見出されなかった。ｈＧＨの凝集はイオン強度に反比例した（ＮａＣｌで調節するとき）。
賦形剤の存在におけるｈＧＨ（２０ｍＭの等張クエン酸塩緩衝液、ｐＨ５．６、中の１．５ｍｇ／ｍｌ）の凍結−融解により誘発される凝集を研究した。種々の賦形剤の存在におけるｈＧＨ（１００μｌ）の試料を−２０℃において２４時間凍結し、次いで室温において融解し、３０分間平衡化して沈澱を進行させた。濾過した試料を前述したようにＳＥＣにより分析した。
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凍結−融解後のｈＧＨの凝集は広範ではないが、賦形剤の添加により増加しなかった。
例２
第１図は、５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５（４０℃において貯蔵した）中のｈＧＨ（１．５ｍｇ／ｍｌ）の化学的安定性の代表的なグラフである。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ１９９０）に記載されている方法に従い、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−４カラムを使用して逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、分解した試料を分析した。Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｌ  Ｐｒｅｖｉｅｗｓ、Ｎｏｖ−Ｄｅｃ．、１９９０、に記載されている方法に従い、分解した生成物は、デスアミド−ｈＧＨまたは酸化されたｈＧＨとして同定された。分解した試料の中に存在する自然ｈＧＨ（パネルＡ）、デスアミド−ｈＧＨ（パネルＢ）および酸化されたｈＧＨ（パネルＣ）は、ｐＨ６．０（○）、ｐＨ６．５（●）、ｐＨ７．０（▽）およびｐＨ７．５（▼）についての合計のピーク面積（ｈＧＨのための）に関するピーク面積（自然ｈＧＨまたは分解した種）の百分率として表した。
自然ｈＧＨの損失は、ｐＨ範囲６．０〜７．５において一次速度則に従い、そして８〜４０℃の温度範囲においてアレニウス挙動に従うことが見出された。４０℃における一次速度定数は、ｐＨ６．０における２．４×１０-2（日-1）〜ｐＨ７．５における７．４×１０-2（日-1）の範囲であることが見出された。脱アミド化および酸化は発表された報告（ＰｅａｒｌｍａｎおよびＮｇｕｙｅｎ、１９８９、上掲のもの）と一致するｈＧＨの分解の主要なルートであった。デスアミド−ｈＧＨは酸化されたｈＧＨよりも速い速度で形成した。化学的安定性は、６．０またはそれより低いｐＨ値において増強された。
第２図は、例１に記載されている方法を使用して界面応力により誘発された、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．１〜４．５）または５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．６〜７．５）中のｈＧＨ（２ｍｇ／ｍｌ）の凝集および沈澱を示す。残留する、モノマーのｈＧＨ（モノマーのためのピーク面積）または合計の可溶性ｈＧＨ（モノマー＋高次の凝集した種のためのピーク面積）の量を、適当な未処理の対照溶液のピーク面積に関する百分率として表した。データは、３０秒間（○）または６０秒間（●）の渦撹拌後に残留する可溶性モノマーのｈＧＨ（パネルＡ）または合計の可溶性ｈＧＨ（パネルＢ）の量を表す。
ｈＧＨの凝集および引き続く沈澱はｐＨ５〜６の領域において最大であった。ｐＨ範囲４．１〜６．０で界面応力を加えた後においては、モノマーのｈＧＨのみが溶液中に残留する。可溶性の凝集した種（二量体および高次の凝集物）は、主としてｐＨ範囲７．０〜７．５において存在した。
第３図は、第２図に記載されているような６０秒間の一定速度の渦撹拌による界面応力によって誘発された、ｈＧＨ（５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ５．６、中の１．５ｍｇ／ｍｌ）の凝集に対する賦形剤（％ｗ／ｖ）の効果を示す。データは、プルロニックＦ−６８（○）、プルロニックＦ−１２７（●）、タウロコール酸ナトリウム（▽）またはＨＰＭＣ（▼）の存在における適当な対照溶液中の、ＳＥＣ分析によるｈＧＨのピーク面積に関する百分率として表した、処理後に残留する、合計の可溶性ｈＧＨ（モノマー＋高次の凝集した種）の百分率を表す。
賦形剤の非存在においては、１％より少ないｈＧＨが溶液中に残留した。プルロニック・ポリオール、タウロコレートまたはＨＰＭＣの添加は、残留する可溶性ｈＧＨを実質的に増加させた。特に、プルロニックＦ−６８およびＦ−１２７およびタウロコレートは、ｈＧＨを凝集に対してほぼ定量的に保護した。
例３
第４図は、ｈＧＨ処方物の安定性に対する処方方法の効果を示す。精製されたｈＧＨ溶液を７〜７．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、それ以上調節することなくｐＨ５．６の液状処方物を生産するｐＨに調節したすべての賦形剤を含有する溶液の２倍濃縮物を添加し、最後に水で５ｍｇ／ｍｌの最終ｈＧＨ濃度に調節することによって、処方物１を調製した。
処方物２を緩衝剤交換により調製し、そして要求される濃度ですべての賦形剤（プルロニックＦ−６８を除外する）を含有する緩衝液に交換することによって、精製されたｈＧＨ溶液を所望の濃度に濃縮した。次いで、十分な固体状プルロニックＦ−６８を添加して、要求される濃度にした。次に、ｐＨを調べ、必要に応じて調節した。
処方物１および２は下記のような同規格を有する。
ｈＧＨ（成長ホルモン）                ５ｍｇ
クエン酸一水和物                      ２．０４ｍｇ／ｍｌ
クエン酸三ナトリウム二水和物          ２．８５ｍｇ／ｍｌ
塩化ナトリウム                        ６．２３ｍｇ／ｍｌ
水酸化ナトリウム                      ０．３８８ｍｇ／ｍｌ
ベンジルアルコール                    ０．９％
プルロニックＦ−６８                  ０．０８％
ｐＨ                                  ５．６
処方物３は、０．００５％ｗ／ｖのＥＤＴＡを添加して、処方物１および２と同一規格で処方物２のように調製した。
処方物１〜３を４０℃において貯蔵し、４０日にわたってサイズ排除ＨＰＬＣによりｈＧＨ含量について試験した。第４図に示すように、処方物２および３は、４０℃において加速されたこの安定性試験において、特に処方物１と比較して、よりすぐれた安定性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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