(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機結晶の特性評価に用いる試料の作製方法であって、前記有機結晶の培養液に前記有機結晶を含んだ状態で凍結させて有機結晶を含有する培養液を用意し、前記有機結晶を含有する培養液を保持手段により保持し、評価対象となる有機結晶の近傍に存在する評価対象以外の物質の少なくとも一部を、紫外光を照射することにより、除去、改質、又は微細化することを特徴とする結晶の特性評価用試料の作製方法。
【請求項２】
前記有機結晶の特性評価が、前記有機結晶に接触あるいは近接させるプローブを用いた有機結晶の表面あるいは内部状態の特性評価であり、前記紫外光を照射することにより、前記有機結晶の前後にある保持手段と培養液を除去することにより、前記有機結晶の表面を露出させることを特徴とする請求項１に記載の結晶の特性評価用試料の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機結晶、特に高分子結晶の特性を評価するときに用いる試料の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、無機材料の特性を上回る高機能、高性能を有する有機材料の研究が注目され、次世代有機デバイスの開発が行われている。そのためには、新しい有機材料の開発が必要不可欠であり、応用化学などの分野では、新規合成した材料の結晶化を行い、Ｘ線結晶構造解析により分子立体構造を決定してその機能を推測する。また、結晶をデバイス化する際には、結晶品質をはじめとする様々な物理特性、結晶表面の状態などを正確に評価する必要がある。一方、プロテオームと呼ばれるポストゲノム研究が盛んになっており、特に注目されるのが、タンパク質の３次元構造を解き明かそうとする研究であり、構造ゲノム科学と呼ばれている。タンパク質の構造や機能解析は、生命科学における重要な研究分野であり、病気の治療や創薬に直結し、生命現象の解明につながる成果が期待されるが、その構造解析のためにはタンパク質の結晶が必要となる。このように、種々の有機材料の特性を評価するために、その材料の結晶が幅広く使用される。
【０００３】
多くの有機材料は、良質な単結晶を得るための結晶化条件および育成条件が確立していないため、結晶の析出制御や、その後の成長制御が非常に困難である。そのため、理想的な単結晶のみを成長させることが難しく、多結晶化したり、欠陥を伴った結晶が得られたりする場合があり、そのままでは結晶の特性評価に使用できないようなものも含まれている。また、無機結晶や有機低分子結晶の育成と同様に、分子構造と育成条件を反映した形状の結晶が育成されるため、結晶形状が測定に不適な場合もある。
【０００４】
例えば、結晶の特性評価の一つであるＸ線結晶構造解析を行う際には、通常、育成容器中の結晶を取り出し、結晶ホルダーにより保持して、Ｘ線回折装置のステージ上に配置し、Ｘ線の照射を行う。その際、有機結晶は操作や結晶品質の維持が難しいため、結晶ホルダー中に保持された結晶は測定に適した理想的な単結晶ではない場合や、結晶ホルダーごと結晶を凍結させて低温状態で測定する場合がある。具体的には、結晶ホルダー中に複数の単結晶が含まれている場合や、結晶ホルダー中の結晶が欠陥を含む場合、液化窒素などを噴きつけながら測定する場合などである。このような環境下で測定を行うと、測定対象物以外の物質の中をＸ線が透過することになり、Ｘ線の一部がこれらの物質により吸収され減衰するうえ、測定対象物以外から反射が測定データに含まれるという問題点がある。
【発明の開示】
【０００５】
本発明はこのような問題点を解決するためになされたもので、有機結晶の特性評価に使用する試料において、測定精度低下の要因となる特性評価を行う結晶以外の物質を除去したり、測定に影響を与えないようにする特性評価用試料の作製方法、及びこの試料を用いた結晶の特性評価方法を提供することを目的とする。
【０００６】
前記目的を達成するための第１の発明は、有機結晶の特性評価に用いる試料の作製方法であって、前記有機結晶の培養液に前記有機結晶を含んだ状態で凍結させて有機結晶を含有する培養液を用意し、前記有機結晶を含有する培養液を保持手段により保持し、評価対象となる有機結晶の近傍に存在する評価対象以外の物質の少なくとも一部を、紫外光を照射することにより、除去、改質、又は微細化することを特徴とするものである。
【０００７】
本発明においては、結晶および保持手段を含む前記試料のうち、評価対象の近傍に存在する前記特性評価における精度低下の要因となる評価対象以外の物質を、紫外光を照射することにより、除去、改質、又は微細化するようにしている。本明細書及び特許請求の範囲において、「改質」とは、例えば結晶を非晶質にすること等により、特性評価に与える影響を少なくすることを言う。また「評価対象以外の物質」とは、評価対象となる有機結晶の近傍に存在する評価対象以外の有機結晶、保持手段、付着物などを含む物質全般のことをいう。ただし、周囲に存在する気体はこれに属さない。また、「微細化」とは、結晶を微細化して特性評価に与える影響を少なくすることを言う。なお、ここで、「特性評価」とは、いわゆる周知の物理的、化学的、機械的な特性評価全般を含む概念である。前述のように、有機結晶を成長させる際には、理想的な単結晶を成長させるのが難しいため、結晶ホルダー中に複数の単結晶が含まれている場合や、結晶ホルダー中の結晶が欠陥を含む場合などがある。またタンパク質などの水や有機塩などの結晶育成溶液を含んだ状態で凍結させて結晶を保持する場合、結晶の周りにある凍結した溶液は測定には不要な存在である。本発明によれば、このようにして、前記結晶および保持手段を含む試料のうち、評価対象以外の物質が結晶の特性評価結果に与える影響を低減しているので、精度の良い特性評価が可能である。また、結晶表面を露出させることにより、表面もしくは表面層を正確に評価することができる。
【０００８】
本発明において紫外光を使用しているのは、光子エネルギーの大きい紫外光を使用することにより、化学結合を容易に切断することができるので、除去、改質を容易に行うことができるからである。又、粉砕は、光の照射によりアブレーションが起こり、その衝撃で光を照射した部分の周りの物質が機械的に壊れることにより発生するが、この場合にも、光子エネルギーの大きい紫外光を使用することが好ましいからである。
【０００９】
前記目的を達成するための第１の関連形態は、前記第１の発明であって、前記有機結晶の特性評価が、放射線の回折現象を利用した有機結晶の特性評価であり、前記紫外光を照射する領域の少なくとも一部が、前記放射線が前記試料を通過する部分であることを特徴とするものである。
【００１０】
本関連形態においては、特性評価に用いる放射線が通過する部分に存在する前記評価対象以外の物質が測定結果に与える影響を低減しているので、照射する放射線の吸収が抑制され、また、散乱によるノイズが低減し、精度の良い特性評価が可能である。なお、本明細書及び特許請求の範囲でいう放射線には、Ｘ線、電子線、中性子線などが含まれる。放射線の回折現象を利用した特性評価としては、結晶構造解析や、Ｘ線トポグラフィーなどが挙げられる。
【００１１】
前記目的を達成するための第２の関連形態は、前記第１の関連形態であって、前記有機結晶の特性評価が、結晶構造解析であることを特徴とするものである。
【００１２】
結晶構造解析においては、放射光が通過する部分に存在する評価対象の有機結晶以外の物質は、基本的に全て測定精度低下の要因となるものであり、本発明を適用することにより、高い精度で構造解析を実施することができる。また、試料中に複数の有機結晶が含まれていると構造解析を行うことができない場合があるが、評価対象とする結晶以外の不要な結晶に対して紫外光を照射することにより、不要な結晶からの影響を排除して、所望の構造解析を行うことができる。
【００１３】
前記目的を達成するための第２の発明は、前記第１の発明であって、前記有機結晶に接触あるいは近接させるプローブを用いた有機結晶の表面あるいは内部状態の特性評価であり、前記紫外光を照射することにより、前記有機結晶の前後にある保持手段と培養液を除去することにより、前記有機結晶の表面を露出させることを特徴とするものである。
【００１４】
有機結晶の特性評価において、プローブを評価対象に接触あるいは近接させて特性評価を行う場合は、評価対象となる有機結晶が露出していないと正確な特性評価を実施できない場合がある。本発明においては、評価対象となる有機結晶の近傍に存在する評価対象以外の物質を、紫外光を照射することにより除去しているので、所望の評価を行うことができる。このような、プローブを用いた特性評価の例としては、走査型トンネル顕微鏡や原子間力顕微鏡をはじめとする走査型プローブ顕微鏡などが挙げられる。紫外光を用いる理由は、前記第１の発明の説明において説明した理由と同じである。
【００１５】
前記目的を達成するための第３の関連形態は、前記第１の発明であって、前記有機結晶の特性評価が、電磁波の吸収、干渉、あるいは散乱を利用した有機結晶の特性評価であり、前記紫外光を照射する領域の少なくとも一部が、前記電磁波が前記試料を通過する部分であることを特徴とするものである。
【００１６】
本関連形態においては、特性評価に使用する電磁波が通過する部分に存在する評価対象以外の物質を、紫外光を照射することにより、除去、改質、又は微細化しているので、これらの物質が測定結果に与える影響を少なくすることができ、結晶の特性を精度よく評価することが可能である。このような、電磁波を用いた特性評価の例としては、吸収スペクトル測定やフォトルミネッセンス測定などが挙げられる。紫外光を用いる理由は、前記第１の発明の説明において説明した理由と同じである。
【００１７】
前記目的を達成するための第４の関連形態は、前記第１の発明から第３の関連形態のいずれかであって、前記紫外光が、紫外レーザ光であることを特徴とするものである。
【００１８】
紫外レーザ光を使用することにより、高い照射照度を得ることができ、除去、改質、又は微細化を容易に行うことができる。又、照射位置を高精度で制御することができるので、目的の場所のみに作用を与えることができる。
【００１９】
前記目的を達成するための第５の関連形態は、前記第４の関連形態であって、前記紫外レーザ光が、パルス幅が１００ｎｓ以下の短パルス紫外レーザ光であることを特徴とするものである。
【００２０】
物質の除去を行う場合には、前述のように紫外光を用いて化学結合を切断することにより除去を行うが、その場合に、併せて熱が発生すると、評価対象とする有機結晶を損傷させる恐れがある。パルス幅が１００ｎｓ以下の短パルス紫外レーザ光を用いれば、熱の発生を抑制することができ、周辺部位へ大きな損傷を与えることなく物質の除去を行うことができる。
【００２１】
又、物質の粉砕を行う場合には、アブレーションによって発生した衝撃により、照射部分の周りの物質を機械的に壊わして粉砕を行う。よって、局所的に大きな衝撃を与えることができる光を用いることが望ましく、パルス幅が短く、かつ、エネルギー密度の高い紫外光を使用することが好ましい。
【００２２】
前記目的を達成するための第６の関連形態は、前記第１の発明から第５の関連形態のいずれかであって、前記有機結晶が、樹脂、タンパク質、糖類、脂質、有機超分子錯体および核酸のうち、少なくとも一つの結晶であることを特徴とするものである。
【００２３】
前記第１の発明から第５の関連形態は、高品質な単結晶の成長が特に困難で、かつ結晶が破損しやすい高分子結晶の物理特性を評価する場合に特に適した方法である。
【００２４】
前記目的を達成するための第７の関連形態は、前記第１の発明から第６の関連形態のうちいずれかの結晶の特性評価用試料の作製方法によって製造された特性評価用試料を用いて、結晶の特性評価を行うことを特徴とする結晶の特性評価方法である。
【００２５】
本関連形態においては、評価対象物以外の物質による影響を抑制して有機結晶の特性評価を行うことができ、その結果、より正確な評価結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図１は、本発明の第１の実施の形態の例を模式的に示す図である。
図２は、本発明の第２の実施の形態の例を模式的に示す図である。
図３は、本発明の第１の実施例の結果と写真を示す図である。
図４は、本発明の第２の実施例の結果と写真を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の第１の実施の形態の例を模式的に示す図である。（ａ）に示すように、特性評価を行う際に、有機結晶１は、その育成に使用した培養液３と共に、ループ状のホルダー２により掬い取られ、培養液３の表面張力によりホルダー２内に保持される。この状態で、有機結晶１と培養液を凍結し、有機結晶の前後にあるホルダー２と培養液３を、紫外光を照射することによって除去する（ｂ）。図においては、有機結晶１の上方にあるホルダー２と培養液３も除去しているが、この部分は必ずしも除去する必要はない。
【００２８】
このようにすることにより、有機結晶の前後にあるホルダー２と培養液３による影響を受けることが無くなるので、特性評価における悪影響が低減する。
【００２９】
切断、除去の方法は、切断する線に沿って、紫外光を照射して走査し、アブレーションにより切断すること、あるいは除去したい部分すべてに紫外光を照射してアブレーションにより除去すること、などによって行う。その際、紫外光としては紫外レーザ光を用いることが好ましく、かつ、パルス幅が１００ｎｓ以下の短パルス紫外レーザ光を用いることが好ましいことは前述のとおりである。なお、本発明の実施の形態、及び実施例においては、培養液３とホルダー２が請求の範囲及び発明の開示の欄における「保持手段」に対応する。
【００３０】
図２は、本発明の第２の実施の形態の例を模式的に示す図である。（ａ）に示すように、有機結晶１は、その育成に使用した培養液３と共に、ループ状のホルダー２により掬い取られ、培養液３の表面張力によりホルダー２内に保持される。そのとき、測定対象以外の有機結晶４が同時に掬い取られ、評価領域に入っている。このような状態で特性評価を行っても、得られる結果は有機結晶１と有機結晶４からの情報が重積したものとなるため、正確な評価ができない場合がある。これは、有機結晶４が測定対象である有機結晶１と同じ有機結晶であっても、異なる有機結晶、さらには異物であっても同じである。
【００３１】
この状態で、有機結晶１、４と培養液を凍結し、測定対象以外の有機結晶４を、紫外光を照射することによって除去する（ｂ）。この場合は、縦の切断線に沿って紫外光を照射し、有機結晶１の後側にあるホルダー２、培養液３も、有機結晶４と共に除去している。一方、有機結晶１の前側にあるホルダー２、培養液３は除去しないで残している。その意味では、第１の実施の形態の方が、より正確な評価結果が得られるが、ホルダー２、培養液３の、測定への影響が少ない場合には、これでも十分である。
【００３２】
なお、第２の実施の形態においては、ホルダー２と培養液３を切断することにより、測定対象以外の有機結晶４を除去しているが、有機結晶４に紫外光を照射することにより、有機結晶４を改質したり、微細化したりして、特性評価に影響を与えないようにしてもよい。
【００３３】
特に有機結晶１が生体高分子結晶である場合、培養液３としてよく用いられる物質として、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、メチルペンタンジオール、パラフィンオイル、パラトンオイルなどを含んだ液が挙げられるが、いずれも適切な紫外光を照射することにより、これら培養液を除去することが可能である。培養液３は上記物質に限定されることなく、照射する紫外光が吸収される物質であれば、本明細書に記載の技術を適応可能である。
【実施例１】
【００３４】
本発明における特性評価用試料の作製方法を適用して、有機結晶の一つであるタンパク質結晶のＸ線結晶構造解析を行った。育成したタンパク質結晶（卵白リゾチーム結晶）を、パラトンオイルからなる培養液と共にホルダーで掬い取り、−１５０℃以下に凍結させた状態で、卵白リゾチーム結晶の周囲に沿って紫外レーザ照射による除去を行って、Ｘ線照射領域の物質を除去し、除去前後におけるＸ線回折結果を比較した。
【００３５】
除去のための照射装置の光源として、波長１５４７ｎｍのファイバー光源の第八高調波発生による短パルス紫外レーザを使用した。出力光の波長は１９３ｎｍ、パルス幅は１ｎｓであり、メカニカルシャッターを通過した後、２枚の光学ガルバノミラーで紫外光を反射させ、合成石英レンズで試料に集光照射した。照射面における光密度は５０ｍＪ／ｃｍ２、スポット径は２０μｍとし、ガルバノミラーを回転させることにより、レーザ照射位置を変化させた。
【００３６】
Ｘ線結晶構造解析の結果を、結晶の写真と共に図３に示す。図３において、写真で「ｂｅｆｏｒｅ」と書かれているものは、卵白リゾチーム結晶をホルダーで掬い取って凍結させた状態を示す。「Ａｆｔｅｒ（１）」と書かれたものは、紫外レーザ光照射により、卵白リゾチーム結晶の周りを除去中の様子を示すものである。「Ａｆｔｅｒ（２）」と書かれたものは、卵白リゾチーム結晶の周りの培養液をほぼ除去した上で結晶を球形状に加工したもの、「Ａｆｔｅｒ（３）」と書かれたものは、さらに結晶に対して追加工を行って、残存する結晶部位を少なくしたものである。
【００３７】
これら、「ｂｅｆｏｒｅ」の状態、「Ａｆｔｅｒ（２）」の状態、「Ａｆｔｅｒ（３）」の状態で、それぞれＸ線回折を行った結果を、図３中に示す。図３中で、写真の右側に書かれているのが、Ｘ線回折に使用したＸ線発生器、検出器、温度、検出器までの距離、開き角、照射時間である。
【００３８】
写真の下側に書かれているのが、Ｘ線回折の結果であり、「ｂｅｆｏｒｅ」の状態、「Ａｆｔｅｒ（２）」の状態、「Ａｆｔｅｒ（３）」におけるＳｐａｃｅ Ｇｒｏｕｐ（空間群）、Ｃｅｌｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（格子常数）、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ（分解能）、Ｔｏｔａｌ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ（測定された全ての反射の数）、Ｎｏ．ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ（独立な反射の数）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ（データの完全性）、Ｒｍｅｒｇｅ（データ精度）、Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｍｏｓａｉｃｉｔｙ（結晶のモザイク性）及びＩ／σ（回折の強度）を示している。
【００３９】
レーザ加工により格子常数が変化していないと言うことは、加工により測定対象物の結晶構造が変化していないことを意味し、望ましい結果である。又、分解能は小さいほど良いが、加工によりこの値がほとんど変化していないと言うことは、加工により測定対象物の結晶構造が変化していないことを意味し、望ましい結果である。同様に、測定された全ての反射の数、独立な反射の数、データの完全性が、加工によりほとんど変化していないと言うことは、加工により測定対象物の結晶構造が変化していないことを意味し、望ましい結果である。
【００４０】
これに対し、データ精度、結晶のモザイク性の値は、「ｂｅｆｏｒｅ」の状態よりも、「Ａｆｔｅｒ（２）」の状態、［Ａｆｔｅｒ（３）」の方が小さくなっている。これらの値は、小さいほど、解析結果の信頼性が高いことを意味するものであり、加工により測定対象物の周りの物質を除去した結果、信頼性の高いデータが得られたことを表している。
【００４１】
また、レーザ加工により回折の強度が小さくなっているが、これは解析対象となる結晶の大きさが加工により小さくなっているためであり、妥当な結果である。
【実施例２】
【００４２】
本発明における特性評価用試料の作製方法を適用して、タンパク質結晶のＸ線結晶構造解析を行った。測定対象物である卵白リゾチーム結晶をホルダーで掬い取った状態で、２つの卵白リゾチーム結晶が密着してＸ線の透過領域に存在する状態となったときに、紫外光照射により、測定対象としない卵白リゾチーム結晶を除去して測定を行った。この結果を、結晶の写真と共に図４に示す。
【００４３】
図４における上段中央の写真は、ホルダーで掬い取られた結晶の状態を示し、上段左側には、その様子を模式的に図示している。実施例１と同様の紫外光照射装置を用いて、ホルダーごと縦に切断を行い、測定対象としない卵白リゾチーム結晶を除去した。上段右側の写真が除去後の状態を示すものであり、下段の左側の写真が、除去前の結晶の状態、下段の右側の写真が除去後の結晶の状態を示すものである。下段の写真を見ると分かるように、加工の際に、測定対象とされる卵白リゾチーム結晶の一部も一緒に除去されている。
【００４４】
使用したＸ線発生器等のデータを、写真の右側に示し、写真の下側にはＸ線回折のデータを示す。Ｔｗｉｎと記されているのが加工前で有機結晶が２つ存在する状態でのデータ、Ｄｅｔｗｉｎと記されているのが、加工により測定対象物でない有機結晶を取り除いた場合のデータである。
【００４５】
Ｔｗｉｎの場合は、二つの結晶からの回折が重積したパターンとなって構造解析が行えなかったのに対し、Ｄｅｔｗｉｎの場合には、一つの単結晶からのＸ線回折パターンが得られるため、データの解析が問題なく実施できている。
【図１】
0004317919.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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