(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法であって、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを同一の反応系で等温下で行うこと、
前記標的ＤＮＡ断片の等温下での増幅をＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの基質及び標的ＤＮＡ断片に対するプライマーの存在下で行うこと、及び前記プライマーの少なくとも1つは前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを、使用される酵素の最適温度付近で行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的ＤＮＡ断片の増幅を鎖置換増幅法により行い、鎖置換増幅法は、標的ＤＮＡ断片に、ＤＮＡポリメラーゼの基質(但し、該基質であるｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物である)及び標的ＤＮＡ断片に対する２種のプライマー（但し、プライマーは制限酵素によりニックが形成され得る配列を有し、ニック形成能を有する部位がヘミホスホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制限酵素部位である）、前記２種のプライマーに加えて、標的ＤＮＡ断片に対するさらに２種のプライマーの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を作用させる方法であり、２種のプライマーの一方または両方が、制限酵素によりニックが形成され得る配列に加えて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
核酸転写反応が、ＲＮＡポリメラーゼの基質及び標識されたターミネーターの存在下で行われ、核酸転写物の解析を、核酸転写物に取り込まれた上記標識を検出することにより行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ−１）標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列（ニック形成能を有する配列がヘミホスホロチオエート配列またはその類縁配列を含む制限酵素部位である）及び少なくとも一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）、（ｂ）標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列（ニック形成能を有する配列がヘミホスホロチオエート配列またはその類縁配列を含む制限酵素部位である）を含むプライマー（以下、プライマーＧ１という）、（ｃ）標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以下、プライマーＧ２という）、（但し、上記プライマーＧ１及びＧ２の少なくとも一方はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）
（ｄ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ又はそれらの誘導体からなるデオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート類（以下、ｄＮＴＰ誘導体という）、（ｅ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド５’トリフォスフェート類（以下、ＮＴＰ誘導体という）、及び（ｆ）３’dATP、３’dGTP、３’dCTP、３’dUTP及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも1種の３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート(以下、３’dNTP誘導体という)の存在下、（ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）のニック形成能を有する部位に制限酵素によりニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工程、及び得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列決定方法であって、ＤＮＡ断片（ａ−１）が、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー（以下、プライマーＢ１という）、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー（以下、プライマーＢ２という）、プライマーＧ１及びプライマーＧ２を標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズする工程（但し、プライマーＢ１はプライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリダイズする）、及びハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断片に、ｄＮＴＰ誘導体(但し、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物である)の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程からなる方法により調製される方法。
【請求項６】
ＤＮＡ断片（ａ−１）の一方の鎖が、ニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み、プライマーＧ１及びＧ２の一方がＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み（但し、プロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる配列と同一である）、かつ上記プロモーター配列により作動するＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸転写の工程を行う請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ断片（ａ−１）の両方の鎖が、それぞれニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み、プライマーＧ１及びＧ２のそれぞれがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み（但し、プライマーＧ１に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる一方のプロモーター配列と同一であり、プライマーＧ２に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる他方のプロモーター配列と同一である）、かつ上記２種のプロモーター配列のいずれか一方によってのみ作動する２種のＲＮＡポリメラーゼのいずれか一方を用いて核酸転写の工程を含む塩基配列の解析を、ＤＮＡ断片（ａ−１）の両方の鎖のそれぞれについて行い、得られた２種の解析データに基づいて塩基配列の決定を行う請求項５に記載の方法。
【請求項８】
標的ＤＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズする工程、（ａ−２）ハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体（但し、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物である）、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも１種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−２）のニック形成能を有する部位（ニック形成能を有する部位がヘミホスホロチオエート部位またはその類縁配列を含む制限酵素部位である）に制限酵素によりニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工程、及び核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列決定方法。
【請求項９】
ＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工程が等温下で行われる請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
３’dNTP誘導体が標識を有する請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
３’dNTP誘導体の標識が蛍光物質または放射性若しくは安定同位元素である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸転写反応において塩基が異なる４種類の３’dNTP誘導体であって、かつ互いに異なる標識を有する誘導体を用い、得られた核酸転写反応生成物を分離し、得られる分離分画が有する標識から得られるシグナルから核酸の配列を読み取る請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鎖置換増幅法を利用する塩基配列決定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、鎖置換増幅法を利用することで、温度の昇降をすることなしに標的ＤＮＡ断片の増幅と塩基配列決定のためのリボヌクレオチド断片の調製とを並行して行える、ＲＮＡポリメラーゼを用いる塩基配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法は優れた方法であり、年々その利用範囲が広がっている［Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。PCR 法では、１分子のDNA 断片を増幅することも可能である。PCR 法で増幅した生成物をクローニングすることなくシークエンスする方法（ダイレクト・シークエンス法）も有用な方法である［Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330,384-386]。この方法はライブラリー作製やそのライブラリーのスクリーニングが不要であり、多くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法である。
【０００３】
さらに、本発明者は、PCR 反応系中に残存する未反応のプライマー及び２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去することなく、かつＰＣＲ反応生成物が迅速に再生する問題を回避するため、変性自体を全く行わないで良い、全く新しいDNA の塩基配列決定方法を提案した〔WO96/14434〕。この方法は、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリメラーゼとＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート、３’ｄＮＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエンス法である。
【０００４】
上記ダイレクト転写シークエンス法は、以下のように行われる。ＰＣＲ法等で増幅したＤＮＡを鋳型として、RNAポリメラーゼをリボヌクレオシド５’トリフォスフェート類（ＮＴＰ）及びデオキシリボヌクレオチド（３’ｄＮＴＰ）の混合物中で反応させる。この反応において、鋳型のＤＮＡ配列に相応した塩基を有するリボヌクレオチドがリボヌクレオチド配列中に逐次取り込まれ、３’デオキシリボヌクレオチドが取り込まれることでターミネーションが起こりポリリボヌクレオチドが合成される。得られるポリリボヌクレオチド（核酸転写生成物）を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取ることでＤＮＡの塩基配列が決定される。特に、核酸転写のターミネーターとして、蛍光標識された３’ｄＮＴＰ誘導体を用い、ターミネーターが有する標識を読み取ることで塩基配列を容易に決定できる。
【０００５】
この方法によれば、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したＤＮＡ生成物の塩基配列を、プライマー及び２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去することなしにそのままシークエンスに使用できる。これは２’ｄＮＴＰｓがＲＮＡポリメラーゼの基質として働かないためである。さらに、変性自体を全く行わないため、ＰＣＲ生成物が迅速に再生する問題も回避でき、極めて優れた方法である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ヒトゲノムのように膨大な量のゲノムの塩基配列を解析する場合、短期間に結果を得ようとすると、現存する方法に比べ桁違いに迅速かつ簡便な方法が必要となる。上記ダイレクト転写シークエンス法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる従来のシークエンス法に比べて迅速な方法ではあるが、さらに迅速かつ簡便な方法が必要である。そこで、上記ダイレクト転写シークエンス法を利用し、さらに迅速かつ簡便にシークエンスを行う方法として、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの増幅とダイレクト転写シークエンス法の核酸転写反応とを同じ反応液中で同時に並行して行うことが考えられる。
【０００７】
ところが、ポリメラーゼ連鎖反応においては、ＤＮＡ鎖の増幅のために反応液の温度の昇降が必須である。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼは高い耐熱性を有するものである。従って、核酸転写反応に用いられるＲＮＡポリメラーゼについても同様に高い耐熱性を有することが要求され、ＤＮＡポリメラーゼと同様の耐熱性を有するＲＮＡポリメラーゼが出現すれば、上記組合せ方法は可能となる。しかるに、現在のところそのような耐熱性のＲＮＡポリメラーゼは知られていない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、耐熱性のRNAポリメラーゼを用いることなしに標的ＤＮＡの増幅と核酸転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利用したＤＮＡの塩基配列決定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法であって、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする方法（第１の方法）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（ａ−１）標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）、
（ｂ）標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以下、プライマーＧ１という）、
（ｃ）標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以下、プライマーＧ２という）、
（但し、上記プライマーＧ１及びＧ２の少なくとも一方はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）
（ｄ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ又はそれらの誘導体からなるデオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート類（以下、ｄＮＴＰ誘導体という）、
（ｅ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド５’トリフォスフェート類（以下、ＮＴＰ誘導体という）、及び
（ｆ）３’dATP、３’dGTP、３’dCTP、３’dUTP及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも1種の３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート(以下、３’dNTP誘導体という)の存在下、
（ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、
かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）のニック形成能を有する部位にニックを形成させて、
前記標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工程、及び
得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列決定方法（第２の方法）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、標的ＤＮＡ断片に、プライマーＢ１（標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー）、プライマーＢ２（標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー）、プライマーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズする工程（但し、プライマーＢ１はプライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリダイズする）
（ａ−２）ハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも１種の３’dNTP誘導体の存在下、
（ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−２）のニック形成能を有する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工程、及び
核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列決定方法（第３の方法）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、いずれも、大きく分けて、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、かつ増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として核酸転写生成物を得る工程、及び、得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画から核酸の配列を読み取る工程とからなる。
【００１３】
第１の方法は、標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法である。この方法は、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする。ここで「等温下」とは、反応温度を意図的に上下させることなく、という意味である。標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とは、常温付近で行うことができ、使用されるＲＮＡポリメラーゼ等の酵素の最適温度を考慮して決定することができる。
【００１４】
標的ＤＮＡ断片の増幅は、例えば、鎖置換増幅法により行うことができる。鎖置換増幅法についてはNucleic Acids Research, Vol.20, No.7, 1691-1696に記載がある。鎖置換増幅法は、標的ＤＮＡ断片に、ＤＮＡポリメラーゼの基質及び標的ＤＮＡ断片に対するプライマーの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を作用させる方法である。但し、上記プライマーは、順方向及び逆方向の１組あり、いずれも制限酵素によりニックが形成され得る配列を含む。さらに、少なくとも一方のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列も含むものである。
【００１５】
また、標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解析する方法は、核酸転写反応が、ＲＮＡポリメラーゼの基質及び標識されたターミネーターの存在下で行われ、核酸転写物の解析を、核酸転写物に取り込まれた上記標識を検出することにより行う方法であることができる。そのような方法としては、例えば、WO96/14434に記載された、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリメラーゼとＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート、３’ｄＮＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエンス法を挙げることができる。
【００１６】
第２及び第３の方法は、第１の方法の１実施態様である。
増幅及び核酸転写工程
第２の方法においては、増幅の鋳型として、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）を用いるが、このＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。
第３の方法では、増幅の鋳型として標的ＤＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたもの（ａ−２）を用いる。
【００１７】
「標的ＤＮＡ断片」は、塩基配列を決定する断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や長さ等には特に制限はない。
「ニック形成能を有する配列」とは、例えば、「ヘミホスホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制限酵素部位」である。「ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位」は、制限酵素部位を構成するヌクレオチドのひとつがαＳ体（１−チオトリフォスフェート）であるものである。ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位に制限酵素を作用させると、αＳ体と相補関係にあるヌクレオチドが切断されてニックを形成する（一方の鎖のみが切断される）。また、制限酵素部位の配列は後述のニック形成のために使用される制限酵素に応じて適宜決定することができる。
「ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列」は、後述する核酸転写反応に使用されるＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列である。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼの種類に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
上記標的ＤＮＡ断片配列、ニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）は、例えば、以下の方法により調製できる。
プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２を標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズする工程、及びハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断片に、ｄＮＴＰ誘導体の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程からなる方法により調製される。プライマーＢ１は、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマーであり、プライマーＢ２は、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマーであり、プライマーＧ１は、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含むプライマーであり、プライマーＧ２は、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含むプライマーである。但し、プライマーＢ１はプライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリダイズする。
【００１９】
標的ＤＮＡ断片に対するプライマーのハイブリダイズは、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷することで行うことができる。尚、プライマーＢ１とプライマーＧ１では、プライマーＢ１が５’の上流に位置するように配列を選択する。さらに、ハイブリダイズ物において、プライマーＢ１とプライマーＧ１との間には１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選択する。同様に、プライマーＢ２とプライマーＧ２でも、プライマーＢ２が５’の上流に位置し、かつハイブリダイズ物において、プライマーＢ２とプライマーＧ２との間に１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選択する。尚、各プライマーは常法により適宜合成することができる。
【００２０】
このようなプライマーＢ１とプライマーＧ１またはプライマーＢ２とプライマーＧ２がハイブリダイズした鎖は、ｄＮＴＰ誘導体の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、鎖置換増幅により増幅される。鎖置換増幅法についてはNucleic Acids Research, Vol.20, No.7, 1691-1696に記載がある。さらに上記増幅において、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種にαＳ体を用いることで、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位を形成することができる。尚、どのｄＮＴＰ誘導体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて適宜決定できる。
【００２１】
第3の方法では、増幅の鋳型として標的ＤＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたＤＮＡ断片（ａ−２）を用いる。「標的ＤＮＡ断片」は、塩基配列を決定する断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や長さ等には特に制限はない。プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２は上述のとおりであり、プライマーＢ１とプライマーＧ１では、プライマーＢ１が５’の上流に位置するように配列を選択する。さらに、ハイブリダイズ物において、プライマーＢ１とプライマーＧ１との間には１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選択する。同様に、プライマーＢ２とプライマーＧ２でも、プライマーＢ２が５’の上流に位置し、かつハイブリダイズ物において、プライマーＢ２とプライマーＧ２との間に１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選択する。尚、各プライマーは常法により適宜合成することができる。標的ＤＮＡ断片に対するプライマーのハイブリダイズは、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷することで行うことができる。
第３の方法では、増幅及び核酸転写工程の初期に、ハイブリダイズ物を鋳型として、上記したようにＤＮＡポリメラーゼの作用により、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）（ａ−２）が生成される。
【００２２】
増幅及び核酸転写工程においては、上記（ａ−１）または（ａ−２）標的ＤＮＡ断片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体（但し、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体である）、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも1種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）または（ａ−２）のニック形成能を有する部位にニックを形成させる。この反応は、温度を昇降させることなく、実質的に等温下で行われる。但し、反応温度は、各酵素の至適温度を考慮して適宜決定される。また、ＤＮＡ断片（ａ−１）及び（ａ−２）へのニックの形成は、制限酵素を用いて行うことができる。制限酵素は、制限酵素部位に存在する、例えば、ヘミホスホロチオエート部位を認識してニックを形成することができる。また、ニック形成能を有する配列は、ヘミホスホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制限酵素部位であることができ、その際に使用するｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物である。
【００２３】
上記反応系では、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素及びＲＮＡポリメラーゼによる反応が並列的に行われている。
制限酵素は、（ａ−１）または（ａ−２）の標的ＤＮＡ断片が有するニック形成能を有する配列、例えば、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位に作用して、断片の制限酵素部位にニックを形成する。一般にヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位にこの制限酵素部位を認識する制限酵素を作用させると、片鎖のみにヘミホスホロチオエート部位を有する鎖の相補鎖にニックが形成されることは知られている。本発明においては、プライマー鎖Ｇ１及びＧ２はヘミホスホロチオエートを含まないので、プライマー鎖を含む２本鎖中に存在する制限酵素部位には片鎖のみにヘミホスホロチオエート部位が存在することになり、この制限酵素部位にニックが形成される。しかし、標的ＤＮＡ断片中に制限酵素部位と同一配列が存在しても、プライマー鎖を含まない部位においては、両鎖中にヘミホスホロチオエート部位が存在することになり、不必要なニックが形成される恐れはない。
尚、実際には制限酵素によりニックの形成のされ易さがことなるので、制限酵素の性能を考慮して適宜選択することができる。制限酵素としては、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｔＢＩ、Ａｖａｌ等を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。尚、制限酵素は市販品を適宜入手できる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼは、上記制限酵素の作用によりＤＮＡ断片に形成されたニックを起点とし、かつニックを有する断片を鋳型として、鎖置換増幅反応を起こし、配列の増幅を行う。その際、ｄＮＴＰ誘導体が基質となる。さらに、ニック形成能を有する配列が、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位である場合、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種としてαＳ体を用いることで、増幅されるＤＮＡ断片の制限酵素部位にヘミホスホロチオエート部位を形成する。ｄＮＴＰ誘導体のαＳ体は、市販品を適宜入手できる。尚、どのｄＮＴＰ誘導体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて適宜決定できる。
使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類には特に制限はなく、鎖置換増幅反応を起こしやすい種類のＤＮＡポリメラーゼから適宜選択することができる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｂｓｔ  ｐｏｌ、ｅｘｅ-ｋｌｅｎｏｗ等を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。ＤＮＡポリメラーゼも市販品を適宜入手できる。
【００２５】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とし、かつ（ｅ）塩基の異なる４種類のＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも1種の３’dNTP誘導体を基質として核酸転写生成物を生じる。
転写生成物であるＲＮＡ又は核酸の３’末端には、３’ｄＮＴＰ誘導体が取り込まれることにより、３’ヒドロキシ基が欠落し、ＲＮＡ又は核酸の合成が阻害される。その結果、３’末端が３’ｄＮＴＰ誘導体である種々の長さのＲＮＡ又は核酸断片が得られる。塩基の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体について、それぞれ、このようなデオキシリボヌクレオチド・アナログ体を得る。このデオキシリボヌクレオチド・アナログ体を４通り用意することで、ＲＮＡ又は核酸配列の決定に用いることができる〔Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723 〕。配列の決定のための読み取りには、３’dNTP誘導体が標識を有することが好ましい。３’dNTP誘導体の標識としては、例えば、蛍光物質または放射性若しくは安定同位元素を挙げることができる。同位元素で標識された３’dNTP誘導体は市販されており、また標識された３’dNTP誘導体も公知の方法〔例えば、WO96/14434〕により合成することができる。
【００２６】
上記核酸転写反応においては、塩基が異なる４種類の３’dNTP誘導体であって、かつ互いに異なる標識を有する誘導体を用い、得られた核酸転写反応生成物を分離し、得られる分離分画が有する標識から得られるシグナルから核酸の配列を読み取ることが、１回の反応で全ての塩基についての配列を決定できることから好ましい。
但し、１つの核酸転写反応に１種類の３’ｄＮＴＰ誘導体を用い、異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体を用いて４回核酸転写反応を行い、３’末端の３’ｄＮＴＰ誘導体の塩基の異なる４通りの転写生成物を得ることもできるが、効率的ではない。
【００２７】
第２の方法においては、ＤＮＡ断片（ａ−１）の一方の鎖が、ニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み、プライマーＧ１及びＧ２の一方がＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み（但し、プロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる配列と同一である）、かつ上記プロモーター配列により作動するＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸転写の工程を行うことができる。この場合、標的ＤＮＡ断片いずれか一方の鎖に配列についてのみ配列の読み取りが行われる。
標的ＤＮＡ断片の両方の鎖について配列の読み取りを行うこともできる。その場合、ＤＮＡ断片（ａ−１）として、両方の鎖が、それぞれニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むものを用いる。さらに、プライマーＧ１及びＧ２として、それぞれがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むものを用いる。但し、プライマーＧ１に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる一方のプロモーター配列と同一のものとする。プライマーＧ２に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる他方のプロモーター配列と同一のものとする。そして、核酸転写の工程を含む塩基配列の解析は、上記２種のプロモーター配列のいずれか一方によってのみ作動する２種のＲＮＡポリメラーゼのいずれか一方を用いて行う。異なるＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸転写の工程を含む塩基配列の解析を２回行うことで、標的ＤＮＡ断片のそれぞれの鎖について解析データが得られる。得られた２種の解析データに基づいて標的ＤＮＡ断片の塩基配列の決定を行うことができる。この場合、標的ＤＮＡ断片の両方の鎖について独立に塩基配列の決定を行い、得られた２つの鎖の配列に基づいて配列決定を行うことができ、読み取りの精度を向上させることができるという利点がある。
【００２８】
ＲＮＡポリメラーゼは、野性型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼのいずれでも良い。但し、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と比較して、３’dNTP誘導体を取り込む能力を増加させるように、野性型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸が修飾されたものである変異型のＲＮＡポリメラーゼであることが好ましい。ここで、「野性型ＲＮＡポリメラーゼ」は、天然に存在する全てのＲＮＡポリメラーゼを含み、さらに、及び野性型ＲＮＡポリメラーゼであって、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と比較して、３’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させることを目的とする修飾以外のアミノ酸の変異、挿入または欠落を、さらに有するものであることもできる。即ち、野性型ＲＮＡポリメラーゼを人為的に上記以外の目的で修飾したＲＮＡポリメラーゼも、上記「野性型ＲＮＡポリメラーゼ」に含まれる。但し、そのようなアミノ酸の変異、挿入または欠落は、ＲＮＡポリメラーゼとしての活性を維持する範囲で、行われたものであることが適当である。
【００２９】
上記変異型ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y及びL665P/F667Yを挙げることができる。ここで番号は、ポリメラーゼ蛋白質のN末端からの番号であり、例えばF667は、このポリメラーゼの667番目のアミノ酸残基がFであることを示し、Ｆ667Ｙの記述は、667番目のアミノ酸残基FをYに置換させたことを意味する。これらは、RNA合成活性を充分保持し、さらに３’dNTPsの取り込み能力が大幅に改善し、野生型で観察された強いバイアスが著しく低下している。
変異型ＲＮＡポリメラーゼは、通常の遺伝子組み換え技術を用いて作成することが可能である。また、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Yを生産する大腸菌pT7RF644Y(DH5α)及びpT7RL665P/F667Y(DH5α)は、生命研国際寄託番号がそれぞれ5998号(FERM-BP-5998)及び5999号(FERM-BP-5999)として1997年7月2日に寄託されている。
【００３０】
本発明では、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片の増幅と核酸転写反応とを同時並列的に行う。上述のように、ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写反応とを１つの反応容器内で同時並列的に行う方がはるかに簡便かつ効率的である。
【００３１】
核酸転写生成物の分離及び読み取り
本発明の方法では、核酸転写生成物を分離する。この分離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる複数の生成物分子を、分子量に応じて分離することができる方法で適宜行うことができる。このような分離方法としては、例えば電気泳動法を挙げることができる。その他にＨＰＬＣ等も用いることができる。
電気泳動法の条件等には特に制限はなく、常法により行うことができる。転写生成物を電気泳動法に付することにより得られるバンド（核酸ラダー）からＲＮＡ又は核酸の配列を読み取ることができる。
【００３２】
ＲＮＡ又は核酸ラダーの読み取りは、転写物反応において各フラグメントに取り込まれた３’dNTP誘導体が有する標識を読み取ることにより行うことができる。具体的には、標識された転写生成物を電気泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を検出することで、転写生成物の配列を読み取ることができる。放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を発生するラダーの検出は、例えば、ＤＮＡシーケンシンクに用いている装置を適宜用いて行うことができる。
【００３３】
上記のように読み取られたＲＮＡ又は核酸配列から、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決定することができる。各塩基について、それぞれラダーを形成した場合には、４種類のラダーから得られたＲＮＡ又は核酸配列情報を総合して、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決定することができる。また、２種以上の塩基について同時にラダーを形成した場合（同一のラダー内に２種以上の塩基のバンドが共存する場合）には、各ラダーから得られたＲＮＡ又は核酸配列情報を総合して、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決定することができる。特に、４種の塩基について同時にラダーを形成した場合（同一のラダー内に４種の塩基のバンドが共存する場合）には、１つのラダーから得られたＲＮＡ又は核酸配列情報から、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決定することができる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法は、標的ＤＮＡの増幅と核酸転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利用したＤＮＡの塩基配列決定方法である。本発明の方法では、従来は、逐次独立して行っていた標的ＤＮＡの増幅と核酸転写物の生成と同時並行して行えるため、これまでの方法に比べて格段に効率的にＤＮＡの塩基配列決定を行なうことができる。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
変異ガンの診断などに用いられるヒトｐ５３遺伝子の特定部位について、本発明の塩基配列決定方法を適用した。
材料
１）プライマーの作成：
プライマーの作成：以下に示す資料（1）及び（2）を参考にして、ｐ５３エキソン８近傍に４種類のプライマーを作成した。
資料（１）ＳＤＡに関するもの
Walker, G. T., Fraiser, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G.  and Malinowski, D. P. Nucleic Acids Res. 20 (1992) 1691-1696. Strand displacement amplification - an isothrmal, in vitro DNA amplification technique.
Walker, G. T., Little, M. C. Nadeau, J. G. and Shank, D. D. Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 89 (1992) 392-396. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.
資料（２）ヒトｐ５３の塩基配列に関するもの
Buchman, L. L., Chumakov, P. M., Ninkina, N. N., Samarina, O. P. and Georg iev, G. P. Gene 70 (1988) 245-252. A variation in the structure of the protein-coding region of the human p53 gene.
【００３６】
B1プライマー：５’-CCTATCCTGAGTA (13mers, 塩基配列番号1408-1420)
B2プライマー：３’-TGATTCAGAACCC (13mers, 塩基配列番号1664-1676と相補)
G1プライマー：５’-TCGAATCGTTGTCTCGGGGCATAATACGACTCACTATAGGGCCCAATCTACTGGGAC
（５’端から最初の下線部：制限酵素部位、２番目の下線部：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、３番目の下線部：13塩基：p53塩基配列番号1227-1338と相補）
G2プライマー：３’-TCTTATAAAGTGG GGGCTCTTCAGACCTCGCCTTAGC（３’端から最初の下線部：13塩基:p53塩基配列番号1643-1655と相補、２番目の下線部：制限酵素部位）
【００３７】
2）酵素
制限酵素BsoBI：New England Biolabより購入。本酵素はC/PyCGpuG配列を切断する。ＤＮＡポリメラーゼ(Bst pol)：Epicentreより購入。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（変異型、F644Y）：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの667番目のF（フェニルアラニン）残基をY（チロシン）残基に変化させた変異型T7ＲＮＡポリメラーゼ。
3）ＤＮＡ
ヒト胎盤ＤＮＡならびにヒト大腸ガン由来細胞株ＨＴ―２９（ＡＴＣＣより入手）を用いた。本ガン細胞株のｐ５３ＤＮＡはエキソン８部位２７３番目のアミノ酸ＲがＨに変異していることが知られている（Ｇ→Ａ変異）（資料（3）Murakami, Y., Hayashi, K., Hirhashi, S. and Sekiya, T. Cancer Res. 51 (1991)      5520-5525. Aberration of the tumor suppressor p53 and retinoblastoma genes in human hepatocellular carcinomas.
Murakami, Y., Hayashi, K. and Sekiya, T. Cancer Res. 51 (1991) 3356-3361.
Detection of aberrations of the p53 alleles and the gene transcript in human tumor cell lines by single-strand conformation polymorphism analysis.参照）
【００３８】
方法
（１）下記のものを混ぜ合わせ、９５℃４分熱変性させ、３７℃１分でプライマーのアニーリングを行った。
ヒト胎盤ＤＮＡまたはヒトガン細胞株ＤＮＡ  0.5μg/ml ----1μl
プライマーG1及びG2(10μM)各々-------------------------1μl
プライマーB1及びB2(1μM)各々--------------------------1 μl
dGTP, dATP, dTTP (各々2mM) ---------------------------2 μl
dαSCTP (10 mM) ---------------------------------------2 μl
10Ｘバッファー*-----------------------------------------2 μl
GTP, ATP, UTP, CTP (各々2mM)----------------------------5 μl
水------------------------------------------------------1 μl
４色蛍光標識ヌクレオチド混液**--------------------------1 μl
（注：*500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT液、**R11C-３’dGTP 1μM, R6G-３’dATP 1μM, R0X-３’dCTP 50μM, TMR-３’dUTP 12.5μMの混液、R11C-３’dGTP、R6G-３’dATP、R0X-３’dCTP及びTMR-３’dUTPはいずれも蛍光標識した３’ｄＮＴＰである）
【００３９】
(2)上記（1）に更に次のものを加えて全量を20μlとし、45℃、２時間反応させた。
制限酵素BsoBI（10ユニット／μl）---------------------1μl
ＤＮＡポリメラーゼ(Bst pol) 5ユニット／μl-----------2 μl
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（F644Y）25ユニット／μl-------1 μl
(3）反応液をシークエンス用ゲル電気泳動法で解析する。
ヒト胎盤ＤＮＡ（上）及びヒトガン細胞株ＨＴ２９ＤＮＡ（下）のｐ５３エキソンの一部に対応する塩基配列のエレクトログラムを図1に示す。上の図では２７３番目アミノ酸がＲ（ＣＧＴ）であるのに対して、下ではそれが半分程Ｈ（ＣＡＴ）になっていることがわかる。
本発明の方法では、一度熱変性を行うだけで、後は同一のチューブ・同一の温度で、ＤＮＡの増幅から塩基配列の決定まで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた塩基配列のエレクトログラム。
【図１】
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