(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、転位性ＤＮＡ配列をインビトロで転位させるためのキット：
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼを５４位及び３７２位で改変したＴｎ５トランスポザーゼであって、当該改変トランスポザーゼが、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも強いアビディティーでＴｎ５外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる当該野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化、および当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化を含み、当該改変Ｔｎ５トランスポザーゼの５４位がリジンであり、当該改変Ｔｎ５トランスポザーゼの３７２位がプロリンである、前記改変Ｔｎ５トランスポザーゼ；
転位性ＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡ分子であって、当該転位性ＤＮＡ配列がその５’および３’末端でＴｎ５外側端繰り返し配列と接している前記ドナーＤＮＡ分子；および、
当該転位性遺伝因子がその中に転位することができる標的ＤＮＡ分子。
【請求項２】
当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
56位がアラニンである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
当該ドナーＤＮＡ分子がその５’および３’末端で、配列番号７を10、11及び12位以外の少なくとも一つの位置で変異したフランキングＤＮＡ配列と接する、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
当該フランキング配列がさらに、ＡおよびＴからなる群から選ばれるヌクレオチドを４位に含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
当該フランキング配列がさらに、ＧおよびＣからなる群から選ばれるヌクレオチドを15位に含む、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
当該フランキング配列がさらに、ＡおよびＴからなる群から選ばれるヌクレオチドを17位に含む、請求項４に記載のキット。
【請求項８】
当該フランキング配列がさらに、ＧおよびＣからなる群から選ばれるヌクレオチドを18位に含む、請求項４に記載のキット。
【請求項９】
当該フランキング配列が配列５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項１０】
当該フランキング配列が配列５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴ−３’を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項１１】
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼを５４位及び３７２位で改変したＴｎ５トランスポザーゼであって、当該改変Ｔｎ５トランスポザーゼが以下の変化：
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも強いアビディティーでドナーＤＮＡのＴｎ５外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化；および、
当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化を含み、54位がリジンであり、372位がプロリンである、前記改変Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１２】
さらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項11に記載の改変Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１３】
56位がアラニンである、請求項12に記載の改変Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１４】
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼを５４位及び３７２位で改変した改変Ｔｎ５トランスポザーゼであって、Ｔｎ５外側端の繰り返しに対して強いアビディティーを有し、さらに野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも不活性なマルチマー形をとる可能性が低く、当該改変Ｔｎ５トランスポザーゼの５４位がリジンであり、当該改変Ｔｎ５トランスポザーゼの３７２位がプロリンである前記改変Ｔｎ５トランスポザーゼをコードすることができるヌクレオチド配列を含む遺伝的構築物。
【請求項１５】
配列番号：１のヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の遺伝的構築物。
【請求項１６】
請求項１２記載の改変Ｔｎ５トランスポザーゼにより転位性ＤＮＡ配列をインビトロで転位するための遺伝的構築物であって、以下の配列：
５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’  又は
５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴ−３’
を含むフランキングＤＮＡ配列がその５’および３’端に隣接している転位性ＤＮＡ配列を含む遺伝的構築物。
【請求項１７】
インビトロ転位方法であって、
その５’および３’端にＴｎ５外側端繰り返し配列が隣接している問題の転位性ＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡ分子を、標的ＤＮＡ分子および野生型Ｔｎ５トランスポザーゼを５４位及び３７２位で改変したＴｎ５トランスポザーゼとともに適切な反応緩衝液中で生理学的温度より低い温度で、当該改変トランスポザーゼが当該外側端繰り返し配列と結合するまで混合する工程；および、
当該酵素がインビトロ転位を触媒するために十分な時間、当該温度を生理学的温度に上昇させる工程、
からなる方法であって、当該改変トランスポザーゼが、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも強いアビディティーで当該Ｔｎ５外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化、および当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変化を含み、54位がリジンであり、372位がプロリンであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
56位がアラニンである請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号７を10、11及び12位以外の少なくとも一つの位置で変異したフランキングＤＮＡ配列が、当該問題のＤＮＡ配列の５’および３’端に隣接している、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
当該フランキング配列が、さらにＡおよびＴからなる群から選ばれるヌクレオチドを４位に含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
当該フランキング配列が、さらにＧおよびＣからなる群から選ばれるヌクレオチドを15位に含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
当該フランキング配列が、さらにＡおよびＴからなる群から選ばれるヌクレオチドを17位に含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
当該フランキング配列が、さらにＧおよびＣからなる群から選ばれるヌクレオチドを18位に含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
当該フランキング配列が、配列５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
当該フランキング配列が、配列５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴ−３’を含む、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願引照
本特許出願は、”インビトロ転位用システム”と題する特許出願（1997年3月11日出願）の部分継続出願である。当該出願については出願番号は未だ付与されていない。出願人らは、親出願に1996年9月9日の出願日が付与されるよう申請している。
連邦政府助成研究または開発に関する記述
適用なし。
発明の背景
本発明は、一般に転位性核酸の分野に関し、より具体的には改変されたトランスポザーゼの製造、および核酸に遺伝的変化を導入するシステムで当該改変トランスポザーゼを使用することに関する。
転位性遺伝因子は、ゲノム内の１つの場所から別の場所へ移動または転位することができる、広範囲の原核生物および真核生物で見出されるＤＮＡ配列である。インビボでは、染色体と別の非染色体性遺伝物質との間の転位と同様に染色体内転位が知られている。いくつかの系では、転位は、典型的には転位性遺伝因子によってコードされる転移酵素の制御下にあることが分かっている。種々の転位性遺伝因子の遺伝子構造および転位メカニズムは、例えば”転位性遺伝因子”（「分子生物学辞典（The Encyclopedia of Molecular Biology）”より、Kendrew & Lawrence編、Blackwell Science,Ltd.,刊、オックスフォード（1994）、この文献は参照により本明細書に含まれる）に要約されている。
バクテリオファージＭｕの特定の転位性遺伝因子および細菌のトランスポゾンＴｎ１０を利用するインビトロ転位システムが、それぞれキヨシ・ミズウチおよびナンシー・クレックナー（Nancy Kleckner）の研究グループによって記載された。
バクテリオファージＭｕ系は最初以下の人々によって記載された：K.Mizuuchi,Cell:785-794（1983）,”細菌ファージＭｕのインビトロ転位：新規な複製反応への生化学的アプローチ”；およびR.Craigieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7570-7574（1985）,”バクテリオファージＭｕの転位開始におけるＤＮＡ鎖転移反応のための規定系；タンパク質およびＤＮＡ基質要求”。Ｍｕのインビトロ反応のためのＤＮＡドナー基質（ミニＭｕ）は、通常６つのＭｕ転移酵素結合部位（各末端に３つの３０ｂｐをもつ）およびその左端から約１ｋｂの位置にあるエンハンサー配列を要求する。このドナープラスミドは高次コイル化されていなければならない。要求されるタンパク質は、ＭｕによってコードされるＡおよびＢタンパク質、並びにホストによってコードされるＨＵおよびＩＨＦタンパク質である（B.D.Lavoie & G.Chaconas,Curr.Topics Microbiol.Immunol.,204:83-99（1995）,”ファージＭｕＤＮＡの転位”）。このＭｕ由来系は、Ｍｕ終端部（terminus）が複雑で精密であるために、さらに転位がトランスポザーゼ以外の新たなタンパク質を要求するためにインビトロ転位システムとして用いるには有利ではない。
Ｔｎ１０系は以下の人々によって記載された：D.Morisato & N.Kleckner,Cell,51:101-111（1987）,”インビトロにおけるTn10転位と環形成”；およびH.W.Benjamin & N.Kleckner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4648-4652（1992）,”転位時のTn10のドナー部位からの切り出しはトランスポゾン終端部の二本鎖フラッシュ切断によって生じる”。このＴｎ１０系は、転位性遺伝因子を含む高次コイル化環状ＤＮＡ分子（または直線状ＤＮＡ分子＋大腸菌ＩＨＦタンパク質）を必要とする。この転位性遺伝因子の範囲は、逆方向繰り返し配列に近いＩＨＦ結合部位をもつ複雑な４２ｂｐ末端配列によって明らかにされる。実際には報告された実験ではもっと長い（８１ｂｐ）Ｔｎ１０端が用いられた（J.Sakaiら、E.M.B.J.,14:4374-4383（1995）,”Tn10転位の初期中間体である切断前接合複合体の特定と性状決定”）。このＴｎ１０系では、トランスポザーゼタンパク質の化学処理が活発な転位を得るために必須である。さらに、Ｔｎ１０遺伝因子の終端部は、普遍化されたインビトロ転位システムでの用途を限定する。
Ｍｕ由来およびＴｎ１０由来インビトロ転位システムは両方とも共有結合による閉環高次コイルのＤＮＡ標的に対してのみ活性を有するという点でさらに制限を受ける。要求されることは、より短くてより範囲が明らかな終端部を利用し、いかなる構造（直線状、弛緩型環状、および高次コイル環状ＤＮＡ）の標的ＤＮＡに対しても活性を有する、より広範囲に適用可能なインビトロ転位システムである。
発明の要旨
本発明の骨子は、細菌のトランスポゾンＴｎ５の適切に改変されたトランスポザーゼ調製物、転位性遺伝因子を含むドナーＤＮＡ分子、転位性遺伝因子をその中に転位させることができる標的ＤＮＡ分子（これらは全て適切な緩衝液中に提供される）を含むインビトロ転位システムである。
ドナーＤＮＡ分子の転位性遺伝因子は、対象となる転位性ＤＮＡ配列として特徴付けられる。この対象となるＤＮＡ配列は、Ｔｎ５トランスポザーゼによってトランス型態様（in trans）で作用される短い繰り返し配列とその５’および３’末端で接する。
本発明はさらに、この適切に改変された変異酵素は野生型Ｔｎ５のトランスポザーゼと２種類の相違を有すると要約される。ここで各々の種類は、酵素の全体的な転位活性に対してそれぞれ別々の測定可能な作用を有し、さらに両方の改変が存在する場合はより大きな効果が認められる。適切に改変された酵素は、（１）野生型Ｔｎ５のトランスポザーゼよりも大きなアビディティーでドナーＤＮＡの繰り返し配列と結合し（“クラス（１）変異”）、さらに（２）不活性なマルチマー形をとる可能性が野生型タンパク質より低い（“クラス（２）変異”）。クラス（１）およびクラス（２）の両改変を含む本発明の適切に改変されたＴｎ５トランスポザーゼは、インビボ共役アッセイで一緒に調べた場合、野生型酵素より少なくとも約１００倍（±１０％）の転位を誘導する。インビボ共役アッセイは文献に記載されたとおりである（Weinreich,Genes and Development,8:2363-2374（1994）,”Tn5トランスポザーゼのシス型優先性は非生産性マルチマー化によってもたらされることを示す証拠”、この文献は参照により本明細書に含まれる）。最適な条件下では、改変トランスポザーゼを用いる転位がより高いであろう。クラス（１）変異のみを含む改変トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも十分に強いアビディティーで繰り返し配列と結合し、そのようなＴｎ５トランスポザーゼは、インビボで測定した場合野生型酵素よりも約５から５０倍強い転位を誘発する。クラス（２）変異のみを有する改変トランスポザーゼは、マルチマー形をとる可能性が野生型Ｔｎ５トランスポザーゼより十分に低く、そのようなＴｎ５トランスポザーゼは、インビボで測定した場合野生型酵素よりまた約５から５０倍強い転位を誘発する。
別の特徴では、本発明の骨子は、転位性遺伝因子をドナーＤＮＡから標的ＤＮＡにインビトロで転位させる方法であり、当該方法は、適切に改変されたＴｎ５トランスポザーゼタンパク質、ドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡを適切な反応緩衝液中で一緒に混合し、当該酵素をドナーＤＮＡの隣接する繰り返し配列と０℃より高いが約２８℃より低い温度で結合させ、さらに切断および鎖の転位が生じる生理学的温度（約３７℃）に当該温度を上昇させる工程を含む。
本発明の目的は、構造的要求が少なく高い効率をもつ有用なインビトロ転位システムを提供することである。
本発明の別の目的は種々の用途に広く応用できる方法を提供することである。これら種々の用途は、例えば、絶対欠損変異体を作出し、選択マーカーを標的ＤＮＡに提供し、相同性を有する移動性領域を標的ＤＮＡに提供し、標的ＤＮＡへの特定のＤＮＡ配列の挿入を促進し、ＤＮＡ配列決定のためにプライマー結合部位または標識を提供し、遺伝子発現研究およびタンパク質ドメインのマッピングのために遺伝子融合の生成を促進し、さらにまた他の所望の組み合わせのＤＮＡ配列を合体させること（寄せ集め遺伝子）である。
本発明の特色は、当該改変トランスポザーゼ酵素は野生型Ｔｎ５トランスポザーゼより堅固にＤＮＡに結合するということである。
本発明の利点は、当該改変トランスポザーゼは、（インビボで測定したとき）野生型トランスポザーゼを用いた場合に達成されるよりも少なくとも約１００倍高いインビトロ転位反応率を達成するということである。野生型Ｔｎ５トランスポザーゼは、本発明のシステムでは検出可能なインビトロ活性を示さないということは特記されるべきである。したがって、活性増加の上限を算出することが困難であるが、インビトロ転位の生成物をインビボでアッセイした場合に数千でないとしても数百のコロニーが観察される。
本発明の別の利点は、本システムを用いるインビトロ転位は、環状または直線状のドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡを用いることができるということである。
本発明のまた別の利点は、本システムを用いるインビトロ転位は、外部の高エネルギー供給源を必要とせず、さらに当該改変トランスポザーゼ以外の他のタンパク質も必要としないことである。
本発明の他の目的、特色および利点は、以下の詳細な説明を熟考するにつれて明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、１対のＴｎ５外側端終端部の間に位置する転位性遺伝因子のインビトロ転位を示すために本明細書で用いられるテストプラスミドpRZTL1を表す。プラスミドpRZTL1はまた配列番号：３に記載されている。
図２は、インビトロ転位の前後におけるプラスミドpRZTL1の電気泳動分析を示す。環状および直線状プラスミド基質の両方を用いて得た結果を示す。
図３は、インビトロ転位後のプラスミドpRZTL1の電気泳動分析を示す。これには環状および直線状プラスミド基質を用いて得られる分子種の更なる分析が含まれる。
図４は、本明細書で詳しく述べるプラスミドpRZ1496、pRZ5451およびpRZTL1を示す。
図５は、ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼに対してインビボでテストした種々の変異ＯＥ配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図表に示す。
図６は、ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼに対してテストした種々の変異ＯＥ配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図５よりもＹ軸の数値がより小さい図表で示す
図７は、ＭＡ５６・Ｔｎ５トランスポザーゼに対してテストした種々の変異ＯＥ配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図表に示す。
図８は、ＭＡ５６およびＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼに対してテストした、２つの好ましい変異体を用いたインビボ転位を示す。
発明の詳細な説明
本技術が、ドナーＤＮＡからいずれの転位性遺伝因子をも標的ＤＮＡに導入することができる単純なインビトロシステムを提供することは理解されよう。Ｔｎ５の転位は１対のＯＥ終端部（転位性遺伝因子のいずれかの側に位置する）のみを必要とすることは一般に理解されている。これらのＯＥ終端部は、一般に長さが１８または１９塩基で互いに逆方向の繰り返しとなっている（R.C.Johnson & W.S.Reznikoff,Nature,304:280（1983）、この文献は参照により本明細書に含まれる）。このＴｎ５の逆方向繰り返し配列（たとえそれらがドナーＤＮＡ分子の終端部に存在する必要がなくともこれを“終端部”と呼ぶ）は、周知であり理解されている。
所望の転位性遺伝因子が標準的なＴｎ５外側端（”ＯＥ”）の終端部と隣接しなければならないことを除けば、ドナーＤＮＡまたは標的ＤＮＡのいずれかに関する他の用件はほとんど無いと考えられる。Ｔｎ５は挿入部位について存在するとしてもほんの僅かの優先性しかもたないので、所望の配列を標的ＤＮＡにランダムに導入するために当該システムを使用することが可能である。したがって、本方法（本明細書に開示する改変トランスポザーゼおよび単純なドナーＤＮＡを用いる）は広範囲に応用が可能で、いかなる標的ＤＮＡにもそのヌクレオチドの配列に関係なく変化を導入することができる。したがって、分子生物学分野の人々にとって興味のある多くの問題に応用できるであろう。
本方法では、改変トランスポザーゼタンパク質は、ドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡと適切な反応緩衝液中で混合される。適切な反応緩衝液は転位反応を惹起させる。好ましい（必ずしも最適というわけではない）緩衝液は、ＤＮＡを凝縮させるためのスペルミジン、グルタミンおよびマグネシウムを界面活性剤とともに含む。界面活性剤は、好ましくは３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（”CHAPS”）である。混合物は、当該ＯＥ終端部への酵素の結合を促進するために０℃より高く、高くとも約２８℃の温度で保温することができる。実施例で発明者らが用いた緩衝液の条件下では、３０℃の予備処理温度は適切ではなかった。好ましい温度範囲は１６℃から２８℃である。最も好ましい予備処理温度は約２０℃である。しかしながら異なる緩衝液の条件下では、この結合工程のためには生理的温度以下の異なる温度を用いることも可能であろう。短時間の予備処理（最適化されてはいなかったが、短くとも３０分、長くとも２時間、典型的には１時間）の後、反応混合物を２容の適切な反応緩衝液で希釈し、生理学的条件に移してさらに数時間（例えば２−３時間）切断および鎖の移動を惹起させる。３７℃またはその周辺の温度が適切である。約３時間後、転位率は顕著に低下する。反応はフェノール・クロロホルム抽出によって停止させ、続いてエタノール沈澱によって脱塩することができる。
ＤＮＡを通常の精製手段を用いて精製した場合は、インビトロ転位法ではより単純な反応条件を用いることが可能である。分子生物学の実験室で現在一般的に用いられているタイプの樹脂（例えばキアゲン（Qiagen）プラスミド精製キット（カタログ番号12162）のキアゲン樹脂）にＤＮＡ調製物を通すことによって、十分に高い純度のＤＮＡを調製することができる。そのような高品質ＤＮＡを用いた場合は、ＣＨＡＰＳは反応緩衝液から省略できる。ＣＨＡＰＳが反応緩衝液から除外される場合は、反応物を上記のように希釈する必要はない。また、上記に特記した低温保温工程を除外して、切断および鎖の移動のための生理的条件での保温のみにすることができる。３７℃で３時間の保温で十分である。
反応とそれに続く抽出工程の後で、核酸反応生成物を適切な細菌性ホスト細胞（例えば大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５α細胞（recA-）；ライフテクノロジー社（Life Technologies（Gibco-BRL）から市販）に好ましくは電気的穿孔（Dowerら、Nuc.Acids Res.,16:6127（1988））によって導入し、さらに本明細書の他の箇所に記載したように転位の証をモニターすることによって転位をアッセイすることができる。
当業者は、本明細書に特記した変化を除けば、この転位反応はインビボ反応で見出されたものとほとんど同じ条件下で進行することを理解しえよう。しかも、本明細書に開示する改変トランスポザーゼは、以前には不可能であったインビトロでの転位反応の実施を可能にするほど転位活性レベルを上昇させる。反応率は、この改変トランスポザーゼを本明細書に特記する最適化緩衝液および温度条件と組み合わせたとき一層高くなる。
本発明のまた別の特徴は改変Ｔｎ５トランスポザーゼの調製である。本改変酵素は野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと以下の点で異なっている：改変トランスポザーゼは、（１）野生型Ｔｎ５トランスポザーゼより強いアビディティーでドナーＤＮＡの繰り返し配列と結合し、さらに（２）野生型よりも不活性なマルチマー形をとる可能性が少ない。これらの用件を満たす酵素を、ホスト細胞で活性なプロモーターの制御下にある改変酵素のための発現性遺伝子を含む細菌ホスト細胞から得ることができる。改変Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする遺伝物質は、当該遺伝物質の発現を支持することができる適切な細菌ホスト細胞に（例えば電気的穿孔によって）導入することができる。他のＴｎ５トランスポザーゼ変異体の過剰産生および調製のための既知の方法が適切に利用される。例えば、上掲書（M.D.Weinreichら）は適切なＴｎ５トランスポザーゼの過剰産生方法を記している。Ｔｎ５トランスポザーゼを精製する第二の方法はデラクルツらが記載している（N.B.de la Cruzら、J.Bact.,175:6932-6938（1993）,”Tn5トランスポザーゼおよび抑制タンパク質の性状決定：転位抑制のモデル”、この文献もまた参照により本明細書に含まれる）。誘発は３７℃より低い温度で実施されることは特記されるべきである。これはデラクルツらが用いた温度である。少なくとも３３から３７℃の範囲の温度が適切である。本発明者らは、種々の調製手段を用いて等しく成功が得られたので、本発明の改変トランスポザーゼの調製方法は、本発明の方法の成功にとって重要ではないと結論した。
また別には、このタンパク質質は、配列番号：２として本明細書に手引として添付したアミノ酸配列を用いて当技術分野で既知の態様で化学的に合成できる。また、分子生物学者にとって周知の標準的組換えＤＮＡ法を用いて当該改変タンパク質（並びに付随転写および翻訳シグナル）をコードする遺伝子構築物を調製することも可能である。そのような構築物を調製するために有用な遺伝物質は、現在存在するＴｎ５構築物から得ることができるし、また遺伝物質に変異を導入する既知の方法（例えば、ランダム変異誘発ＰＣＲまたは位置特異的変異誘発）を用いて調製してもよいが、両方の方法を組み合わせることもできる。配列番号：２に示したタンパク質をコードする遺伝子配列は配列番号：１で示す。
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼの核酸およびアミノ酸配列は既知で刊行物に発表されている（N.C.B.I.受託番号はU0004 L19385で、参照により本明細書に含まれる）。
好ましい実施態様では、ＯＥ終端部（クラス（１）変異）の繰り返し配列に対する改変トランスポザーゼのアビディティーの改善は、アミノ酸５４（野生型Ｔｎ５トランスポザーゼではグルタミン酸）にリジン残基を提供することによって達成できる。この変異は、ＯＥ終端部に対するトランスポザーゼの指向性を内側（“ＩＥ”）終端部とは反対に強力に変化させる。この変異（ＥＫ５４として知られている）のＯＥ終端部との強い結合性は、野生型トランスポザーゼで観察されるよりも約１０倍高い転位率をもたらす。５４位のバリンへの同様な変更（変異体ＥＶ５４）はまた、４７位のスレオニンからプロリンへの変更の場合のように、ＯＥ終端部に対するいくらか増加した結合性／転位をもたらす。ＯＥ終端部に対する結合アビディティーを増加させるトランスポザーゼの他の匹敵する変異（１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異）もまた得ることができる（これら変異は本明細書で述べるインビトロアッセイで同様にまたはより良好に機能するであろう）。
当業者はまた、ドナーＤＮＡの短い繰り返し配列のヌクレオチド配列に対する変更が当該トランスポザーゼの結合領域内または結合領域近くの他の変異と協調的に作用して、同じような結合作用の増加を生じ、５から５０倍の転位率の増加をもたらすことを理解しえよう。したがって、出願人らは例示のトランスポザーゼの結合性を改善する変異の１事例を例証したが、トランスポザーゼまたは短い繰り返し配列またはその両方における他の変異もまた、本発明の範囲内に包含されるトランスポザーゼを生じるであろうということは理解されるところである。Ｔｎ５のＯＥ終端部に対する相対的アビディティーを決定する適切な方法は文献に記載されている（R.A.Jilkら、J.Bact.,178:1671-79（1996）,”トランスポゾンTn5の外側端の機構”）。
本発明のトランスポザーゼはまた、野生型タンパク質よりも不活性なマルチマー形をとる可能性が低い。好ましい実施態様では、野生型のクラス（２）変異は、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸３７２（ロイシン）をプロリンに改変することによって（および同様にプロリンをコードする対応するＤＮＡを改変することによって）達成できる。この変異（ＬＰ３７２と呼ぶ）は、以前にトランスポザーゼの二量体形成における変異として性状が明らかにされた（Weinreichら、上掲書）。３７２位のこの変異は、Ｔｎ５の転位抑制物質との相互反応に必須であることが以前に示された領域にマッピングされることがワインリッヒら（Weinreichら）によって記載された。この抑制物質は、当該トランスポザーゼをコードする同じ遺伝子によってコードされるタンパク質であるが、このトランスポザーゼと比較してタンパク質のＮ−末端で切りとられている。マルチマー形成度を決定するワインリッヒらのアプローチは、変異が本遺伝因子の範囲内に包含されるか否かを決定するために適している。
野生型Ｔｎ５トランスポザーゼがマルチマーを形成する場合、トランス型活性は減少する。おそらく、二量体形成領域における変異はマルチマー形成を減少させるかまたは防止し、それによって抑制活性を低下させ、さらに野生型トランスポザーゼで認められる場合より５から５０倍高い転位レベルをもたらす。ＬＰ３７２変異は野生型より約１０倍高い転位レベルを達成する。同様に、トランスポザーゼのマルチマー形成活性を低下させる他の変異（１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含む）もまた３７２位のただ１つの変異と同じ態様で機能し、本発明のトランスポザーゼとしてまた適切であろう。さらに、いわゆる二量体形成領域における野生型の配列を変更することなく、例えば当該システムに別のタンパク質または二量体形成部位を封鎖する非タンパク質性薬剤を添加することによって、Ｔｎ５トランスポザーゼのマルチマー形成能を低下させることもまた可能である。また別には、二量体形成領域をトランスポザーゼタンパク質から完全に除去することもできるであろう。
前記に記したように、抑制タンパク質（トランスポザーゼと部分的にオーバーラップする配列によってコードされる）はトランスポザーゼ活性に干渉することができる。そこで、抑制タンパク質量は、インビボで野生型で観察される量よりも少ないことが望ましいであろう。本アッセイのためには、トランスポザーゼは精製形で用いられ、使用前に（例えばサイズの違いによって）抑制物質からトランスポザーゼを分けることが可能であろう。しかしながら、トランスポザーゼをコードする遺伝子からその開始コドンを取り除くことによって、存在する一切の夾雑抑制タンパク質を含む可能性を遺伝学的に排除することもまた可能である。
トランスポザーゼのアミノ酸５６のメチオニンをコードする、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ遺伝子のＡＵＧは抑制タンパク質の最初のコドンである。しかしながら、５６位のメチオニンの置換はトランスポザーゼ活性に対して明白な影響をもたないが、同時に抑制タンパク質の翻訳を防止し、したがっていくらか高い転位率をもたらすことは既に示されている（T.W.Weigand & W.S.Reznikoff,J.Bact.,174:1229-1239（1992）,”２つの高転位性Tn5変異体の性状決定”、この文献は参照により本明細書に含まれる）。特に、本発明者らは、好ましい実施態様でメチオニンをアラニンで置換した（さらにメチオニンをコードするＡＵＧコドンをアラニンをコードするＧＣＣで置換した）。したがって、本発明の好ましいトランスポザーゼは、アミノ酸の５６位にメチオニン以外のアミノ酸を含む。しかしこの変更は単に技術的に有利であるだけで（なぜならば、それはインビトロシステムに抑制物質が存在しないことを確認させるからである）、本発明にとって本質的ではないと考えられる（なぜならば、インビトロシステムから抑制タンパク質を排除するために他の手段も用いることができるからである）。
本発明者らが認識している最も好ましいトランスポザーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸５４位、５６位および３７２位で野生型と異なっている。５４位および３７２位の変異は、それぞれ別個にインビボ転位反応率について約１０倍の増加をもたす。標準的な組換え技術によって両クラスの変異を含む単一の分子中に変異がまとめられたとき、野生型トランスポザーゼを用いて達成できるよりも少なくとも約１００倍高い反応率が、インビトロシステムの生成物をインビボで調べた場合に観察される。５６位の変異はトランスポザーゼ活性に直接は影響を与えない。
インビトロでの高いトランスポザーゼ活性に貢献するであろうと考えられる、野生型を基にした変異には、１１０位のグルタミン酸からリジンへの変異および３４５位のグルタミン酸からリジンへの変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。
もちろん、これらの特記した位置とは別に他の変更が、当該トランスポザーゼ活性に悪影響を与えることなく、改変トランスポザーゼに対して（または改変トランスポザーゼをコードする構築物に対して）実施できることは理解されるところである。例えば、そのようなトランスポザーゼをコードする構築物が、コードされるアミノ酸が本明細書で述べるものと異ならないようなコドンの第三位の変更を含むことができることは十分に理解されよう。さらに、ある種のコドンの変更は、コードされるタンパク質の転位活性に対してほとんどまたは全く機能的影響をもたない。最終的に、より一層高い転位活性を提供する他の変更をコードされるタンパク質に導入することができる。変異を結合させることによって本明細書の実例よりもさらに高い転位活性を有する改変トランスポザーゼをコードするようにまとめることができることもまた具体的に想定できるであろう。これらの変更は全て本発明の範囲内である。しかしながら、ＥＫ１１０およびＥＫ３４５変異（上掲書（Weingard & Reznikoff）に両方とも記載）は、いずれかの変異を単独で含むトランスポザーゼよりも低いトランスポザーゼ活性を有することは特記されるべきである。
上掲書に記載されたように酵素を調製し精製した後、上記に記載したインビトロ転位反応で当該酵素を用いて、所望するいずれの転位性遺伝因子をもドナーＤＮＡから標的ＤＮＡへと導入することができる。ドナーＤＮＡは環状でも直線状でもよい。ドナーＤＮＡが直線状の場合、転位性遺伝因子と隣接する繰り返し配列は当該直線状フラグメントの終端部に存在するべきではなく、繰り返し配列と隣接する領域から上流および下流にいくらかのＤＮＡを含むべきである。
上記に記したように、Ｔｎ５転位は長さが１８または１９塩基の１対の終端部を必要とする。野生型Ｔｎ５の外側端（ＯＥ）配列（5’-CTGACTCTTATACACAAGT-3’）（配列番号：７）は既に記載されている。構築物の終端部が１０位、１１位および１２位にそれぞれ塩基ＡＴＡを、野生型ＯＥとＩＥとの間で（例えば１−３位、５−９位、１３位、１４位、１６位および場合によって１９位）共通のヌクレオチドとともに含む場合は、野生型ＯＥのトランスポザーゼ触媒インビトロ転位頻度と少なくとも同じ頻度が達成されることが分かった。４位、１５位、１７位および１８位のヌクレオチドは、野生型ＯＥまたは野生型ＩＥのこれらの位置に見出されるヌクレオチドと一致していてもよい。４位のヌクレオチドがＴの場合は、野生型ＯＥの転位頻度よりも頻度が強化されることは特記されるべきである。転位頻度に対するこれら特定の塩基の重要性は以前には明らかではなかった。
これらの変更はＯＥの全ての望ましい改変を包含しようとするものではないことは特記されるべきである。本明細書の他の場所に記載したように、許容可能な終端部のこれら改変の属性は、ＩＥとＯＥ終端部間でランダム化された相違をもつ変異体をスクリーニングすることによって特定された。終端部に一定のヌクレオチドが存在することが有利であることを本明細書で示したが、一方、本明細書で調べた位置以外の位置における変更を有する大量の縮退変異体とともに本明細書に記載したスクリーニングでは検査されなかったヌクレオチドを含む変異体をスクリーニングすることによって、望ましい他の終端部配列もなお得ることができる。さらに、異なるトランスポザーゼが用いられる場合は、当該特定のトランスポザーゼにより適合した他の終端部変種を選別することが可能であることは当業者には明白であろう。
望ましく、かつ本発明の範囲内であることが示された変異体のうちで、とりわけ高い活性を有するインビボで特定された２つの変異ＯＥ配列がある。ここでは一本鎖配列として提示したが、実際には野生型および変異ＯＥ配列は相補的な第二の鎖を含む。第一の高活性変異体（5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’）（配列番号：８）は、野生型ＯＥ配列とは５’末端から数えて４位、１７位および１８位で異なっているが、１０−１２位でＡＴＡを保持している。第二の変異体（5’-CTGTCTCTTATACAGATCT-3’）（配列番号：９）は野生型ＯＥ配列とは４位、１５位、１７位および１８位で異なっているが、また１０−１２位でＡＴＡを保持している。これら２つの高活性変異ＯＥ配列は１５位でのみ互いに相違するが、１５位ではＧまたはＣのいずれかが存在する。変異配列が１０位、１１位および１２位にＡＴＡを含むときに、ＯＥ様活性（または高活性）が当該配列で観察される。殆どまたは全く影響を与えずにＯＥ配列の長さを１９から１８ヌクレオチド対に減少させることができる。
特定したこの変異ＯＥ配列の１つが基質ＤＮＡに隣接するとき、ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼのインビボ転位頻度は、野生型ＯＥ終端部が転位性ＤＮＡに隣接するときに認められる頻度よりも約４０−６０倍増加する。ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼは、野生型ＯＥ終端部を用いた場合、野生型トランスポザーゼより約８−１０倍高いインビボ転位頻度を有することが既に知られている。ＥＫ５４／ＭＡ５６変異を有するＴｎ５トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼよりも強いアビディティーでＯＥと結合し、さらに野生型トランスポザーゼよりも弱いアビディティーでＴｎ５内側端（ＩＥ）と結合することが知られている。
対応するプラスミド内に野生型ＯＥを含むコロニーで認められるものより多いパピラ（papillae）を対応する時間（例えば６８時間）内にコロニー当たり生じるということにより、本発明のアッセイで使用する構築物内の適切な変異体終端部の性状を生物学的に調べた。本明細書の他の箇所で記載するようにＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼを用いるパピラ形成アッセイで平板培養後６８時間して測定したとき、野生型ＯＥはコロニー当たり約１００個のパピラをを生じることができる。同じアッセイおよび同じ時間枠で測定したとき、好ましい変異体はコロニー当たり約２００から３０００、より好ましい変異体はコロニー当たり約１０００から３０００のパピラを生じるであろう。同じ条件下でアッセイしたとき、最も好ましい変異体はコロニー当たり約２０００から３０００のパピラを生じるであろう。パピラ形成レベルはコロニー当たり３０００より高いかもしれない（しかしそのようなレベルでは定量は困難であろう）。
基質ＤＮＡが好ましい変異ＯＥ配列と隣接し、さらに最も好ましい変異トランスポザーゼ（ＥＫ５４／ＭＡ５６／ＬＰ３７２変異を含む）が用いられるとき、本発明のインビトロ転位アッセイでは転位頻度はまた実質的に強化される。これらの条件下では本質的には全ての基質ＤＮＡが転位生成物に変換される。
高活性終端部を用いて認められるインビトロ転位率は、本発明者らの経験では転位発生について選択する必要がないほど十分に高い。さらなる研究のために形質転換後ランダムに選択した全コロニーは転位発生の証拠を示した。
この進歩は時間と実験室労力の顕著な節約を示す。例えば、トランスポザーゼを改変するよりもＤＮＡを改変することによってインビトロ転位頻度を改善することができるのは特に有利である。なぜならば、トランスポザーゼ活性はホスト細胞で増加するので、トランスポザーゼを有する細胞は異常なＤＮＡ転位の結果として死ぬ可能性が高くなるからである。対照的に、改変ＯＥ終端部を含む問題のＤＮＡは当該トランスポザーゼとは完全に別の供給源で増殖でき、したがってホスト細胞を危険に曝さない。
本発明の範囲を制限しようとするものではないが、このテストした高活性終端部は、野生型ＯＥ終端部より強いアビディティーでトランスポザーゼと結合するものではないことは明白である。したがって、高活性終端部によってもたらされるこの高い転位頻度はトランスポザーゼとの結合の強化によるものではない。
終端部の間の転位性遺伝因子は所望するいずれのヌクレオチド配列も含むことができる。終端部間の転位性遺伝因子の長さは少なくとも約５０塩基対であるべきである（ただしより小さな挿入物も機能するかもしれない）。挿入物のサイズの上限は不明である。しかしながら、長さが約３００ヌクレオチドのドナーＤＮＡ部分が良好に機能できることは知られている。非制限的な例であるが、転位性遺伝因子は、付随する調節遺伝因子（例えばプロモーター、ターミネーターなど）をもつか、または調節因子をもたない、検出可能または選別可能タンパク質をコードするコード領域を含むことができる。
遺伝因子が、プロモーターをもたないそのような検出可能または選別可能なコード領域を含む場合は、プロモーターの下流の位置に当該コード領域を転位させ、続いて転位部位から上流の核酸配列を分析することによって、露出される標的ＤＮＡ内でプロモーターを特定しマッピングすることが可能であろう。
同様に、標的ＤＮＡに転位させることができるプライマー結合部位を遺伝因子に含ませ、配列決定または、当該標的遺伝物質内に分布するプライマーを使用することによって成り立つ他の方法を促進させることができる。同じように、本方法は、標的に所望の制限酵素部位またはポリリンカーを導入するために、または別のタイプの組換えに適した部位（例えばcre-lox）を導入するために用いることができる。
本発明は、例示であって本発明を限定しない以下の実施例を熟考することによって一層理解されるであろう。
実施例
５４位で改変されたトランスポザーゼを得るために、Ｔｎ５トランスポザーゼをコードするが抑制タンパク質（ＭＡ５６）はコードしない現存のＤＮＡクローンのコード領域の最初の１／３を既知の方法にしたがって変異させ、当該変異部分を含むＤＮＡフラグメントをクローニングして、完全な長さのトランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミドクローンライブラリーを作製した。ライブラリーを構成するクローンで大腸菌Ｋ１２株ＭＤＷ３２０を形質転換し、この細菌を平板培養してコロニーに増殖させた。個々のプラスミドによって細菌に供給された転位性遺伝因子は不完全なｌａｃＺ遺伝子を含んでいた。この分離プラスミド（pOXgen386）はワインリッヒらが記載した（M.Weinreichら、J.Mol.Biol.,241:166-177（1993）,”Tn5トランスポザーゼの機能的分析：ＤＮＡ結合および二量体化に必要なドメインの特定”、この文献は参照により本明細書に含まれる）。トランスポザーゼ活性が上昇したコロニーを、Ｘ−ｇａｌの存在下で増殖させた白色コロニー中の青色（LacZ）スポットを目当てにスクリーニングして選別した。このパピラ形成アッセイは上掲書（Weinreich,1993）に記載された。そのようなコロニーのＴｎ５トランスポザーゼの５’側の１／３の配列決定を実施して、変異がトランスポザーゼ活性の増加の原因であったか否かを決定した。５４位がリジン（Ｋ）に変異したことがトランスポザーゼ活性の増加とよく相関しているとの結論が得られた。プラスミドpRZ5412-EK54は、既に述べた５６位のアラニンとともに５４位にリジンを含む。
ＬＰ３７２変異を含むフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを用いてpRZ4870（Weinreichら、1994））から単離し、NheI-BglII切断pRZ5412-EK54に連結して組換え遺伝子を作製した。当該組換え遺伝子は、配列番号：１に示され、さらに本明細書でも説明されるように５４位、５６位および３７２位に変異を有する。この遺伝子を検査したところ、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較して活性が少なくとも約１００倍増加していることが示された。５４位単独および３７２位単独の変異ではそれぞれトランスポザーゼ活性が約１０倍増加した。
市販のＴ７発現ベクターpET-21D（ノバゲン社（Novagen,ウィスコンシン州、マジソン）から市販ルートで入手可能）のNhoI/XhoIフラグメントにBspHI/SalIフラグメントを挿入することによって、３重変異組換え遺伝子によりコードされる改変トランスポザーゼタンパク質をこのpET-21Dベクターに移した。このクローニングによって、改変トランスポザーゼ遺伝子は、当該トランスポザーゼ遺伝子の天然のプロモーターではなくＴ７プロモーターの制御下に置かれる。細胞増殖が完了した後で醗酵工程で特殊な誘発を実施することによって、この遺伝子生成物をBL21（DE3）pLysS細菌ホスト細胞（これは当該酵素の結合部位を含まない）で過剰産生した（F.W.Studierら、Methods Enzymol.,185:60-89（1990）,”クローン化遺伝子の発現を誘導するためのＴ７・ＲＮＡポリメラーゼの使用”）。３３または３７℃で過剰産生を誘発することによってデラクルツ（de la Cruz）の方法を改変したものを用いて、このトランスポザーゼを部分的に精製した。精製後、酵素調製物を保存緩衝液（１０％グリセロール、０．７ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％トリトン−Ｘ１００および１０ｍＭＣＨＡＰＳ）で−７０℃で使用まで保存した。この保存緩衝液は例示であって最適なものというわけではない。
単一プラスミド（pRZTL,図１）を構築し、本実施例のドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡとして用いた。pRZTL1プラスミドＤＮＡの完全な配列は配列番号：３に示す。プラスミドpRZTL1は、互いに逆方向にある２つのＴｎ５の１９塩基対ＯＥ終端部を含んでいる。１つのＯＥ配列の直ぐ隣がテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子（上流のプロモーターを欠いている）である。しかしながら、この遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子が転写領域の下流に（例えば、pRZTL1にも存在しているクロラムフェニコール耐性遺伝子の転写を促進するプロモーターの制御下に）配置される場合、テトラサイクリン耐性遺伝子が発現される。したがって、このテストプラスミドpRZTL1は、インビトロ反応の後でインビボでアッセイして転位が発生したことを確認できる。プラスミドpRZTL1はまた、転位性遺伝因子の複製開始点を含み、これによって全ての転位生成物は、ホスト細胞内に導入後複製できるプラスミドであることが保証される。
以下の成分を典型的な２０μｌのインビトロ転位反応で用いた：
改変トランスポザーゼ：保存緩衝液（１０％グリセロール、０．７ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％トリトン−Ｘ１００および１０ｍＭＣＨＡＰＳ）で２μｌ（約０．１μｇ酵素／μｌ）
ドナー／標的ＤＮＡ：反応緩衝液（最終反応濃度０．１Ｍグルタミン酸カリウム、２５ｍＭのトリス−酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム2+、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのスペルミジン、１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）で１８μｌ（約１−２μｇ）
２０℃で約６０分、このトランスポザーゼをpRZTL1・ＤＮＡと一緒にした。続いて、２容の反応緩衝液を加えて反応容積を増加させ、温度を３７℃に２−３時間上昇させ、切断と鎖の移動を惹起させた。
効率的なインビトロ転位がインビボ法およびインビトロ法で生じたことが示された。インビボでは、反応の核酸生成物をＤＨ５α細菌細胞に移した後で多くのテトラサイクリン耐性コロニーが認められた。特記したように、転位性遺伝因子が当該プラスミドのいずれかの位置にある活性なプロモーターの下流に転位された場合にのみ、このシステムではテトラサイクリン耐性が生じる。典型的な転位頻度はプラスミドＤＮＡを受容した細胞の０．１％であった（クロラムフェニコール耐性コロニーを数えることにより決定）。しかしながら、この検出系では標的が全体の１／１６に制限されるので、この数字は総転位頻度より少ない値である。
さらにまた、精製コロニーから単離したインビトロ電気泳動分析およびＤＮＡ配列分析によって、分子内および分子間事象を含む真の転位事象の生成物が明らかにされた。環状プラスミドpRZTL1基質を用いた典型的な反応の結果はレーン４および５に示す。図２のレーン６は直線状プラスミドpRZTL1基質を用いて得られた結果を示す。
バンドはＳＹＢＲグリーン（FMC Bioproducts）で染色して１％アガロースゲル上に表示し、フルオロイメージャー（Fluorimager）ＳＩ（Molecular Dynamics）で走査した。図２で、レーン１はpRZTL1の弛緩型環状、直線状および閉鎖環状を示す。レーン２および３は、pRZTL1のインビトロ転位後のそれぞれ分子内および分子間転位生成物を示す。これら生成物は、電気穿孔ＤＨ５α細胞から精製し、サイズおよび配列分析によって真の転位生成物であることが証明された。レーン４および５は、閉鎖環状および弛緩型環状テストプラスミド基質の混合物を用いた２つの別々のインビトロ反応の生成物を示す。レーン６では、直線状pRZTL1（XhoI切断）が反応基質であった。レーン７は、分子量標準物としてラムダＤＮＡのBstEIIの消化物を含む。
図３は図２のレーン４、５および６を再生し、二次制限消化実験、再電気穿孔およびＤＮＡ配列決定を基にした種々の生成物の分析を示す。遊離されたドナーＤＮＡは、２つのＯＥ配列の間のカナマイシン耐性遺伝子を含むpRZTL1のフラグメントに対応するか、または直線状基質の場合はＯＥ−ＸｈｏＩフラグメントに対応する。分子間転位生成物は、リラックスＤＮＡ環としてのみ認められる。分子内転位生成物は梯子状のものとして認められ、これは最初の基質の高次螺旋からＤＮＡ塊に変換されることにより生じる。反応は、分子間事象と分子内事象の結合したものである二重転位事象を達成するために十分に効率的である。
転位反応に必要とされる終端部の特性を調べるために予備的実験を実施した。野生型Ｔｎ５のＯＥおよびＩＥ配列を比較し、これらヌクレオチドを異なる７つの位置の各々でランダム化を試みた。異なる各位置に関してオリゴヌクレオチド縮退物集団を作製した。したがって、集団の個々のオリゴヌクレオチドは、野生型ＯＥまたは野生型ＩＥ配列のいずれかのヌクレオチドを含んでいた。このスキームでは、２7（１２８）のそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドを通常の手段を用いて合成した。ＯＥおよびＩＥの両方の配列特性を有するオリゴヌクレオチドは本明細書ではＯＥ／ＩＥ様配列と呼ぶ。オリゴヌクレオチドがＯＥおよびＩＥ野生型配列との間の中間体であるために生じる命名に関する問題を回避するために、特に記載がなければ、選択したヌクレオチド配列は野生型ＩＥではなく野生型ＯＥと比較することをここで明記する。ＩＥを参照点として選択する場合、その違いは同一であるが、異なる態様で特定される。
以下は、この変異体作製スキームで変化する位置（ｘ）を示す。野生型ＯＥは配列番号：７で、野生型ＩＥは配列番号：１０でも示されている。
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縮退ＯＥ／ＩＥ様配列の他に、長さが３７塩基の当該合成オリゴヌクレオチドはまた、縮退オリゴヌクレオチドのプラスミドベクターへの簡便なクローニングのために、末端ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識および切断部位を含んでいた。したがって、ランダム化終端部ライブラリーは２7（１２８）種の縮退オリゴヌクレオチド集団から作製された。
図４はpRZ1496を示し、その完全な配列は配列番号：１１に提示されている。以下の特徴がその配列に記されている：
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図４に示すＩＥカセットはＳｐｈＩおよびＫｐｎＩを用いて切り出し、標準的な切断・連結方法を用いてＯＥ／ＩＥ様部分を含む合成終端部カセットで置き換えた。固定した野生型ＯＥ配列とクローン化ＯＥ／ＩＥ様配列との間に、プラスミドpRZ1496は、その活性が検出可能な（すなわちＬａｃＺＹＡ）遺伝子を選択可能マーカー（ｔｅｔr）とともに含んでいる。ＬａｃＺ遺伝子は、適切な転写および翻訳開始シグナルを欠いているという点で不完全である。ＬａｃＺ遺伝子は、そのようなシグナルの下流の位置に転位された場合にのみ転写され翻訳される。
電気穿孔を用いて得られたクローンでｄａｍ-、ＬａｃＺ-細菌細胞を形質転換した。この場合、当該細菌細胞はＪＣＭ１０１／ｐＯＸｇｅｎ細胞で、標準的条件下でＬＢ培地で３７℃で増殖させた。ｄａｍメチル化はＩＥ利用を抑制し、さらに野生型ＩＥ配列は２つのｄａｍメチル化部位を含むので、ｄａｍ-株が好ましい。ｄａｍ-株は、転位活性を評価する際の重要な事柄であるｄａｍメチル化の可能性を排除する。選別されたＴｅｔr細胞はＬａｃＺ-であり、転位によって活性化されたＬａｃの発現は陰性のバックグラウンドで容易に検出できた。ｐＯＸｇｅｎは、ホスト細胞に提供する必要がない非必須性のＦ因子派生因子である。
いくつかの実験では、ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼは形質転換されたpRZ1496プラスミドによって直接コードされた。他の実験では、固有のHindIII／EagIフラグメント（ヌクレオチド９１１２−１２０８３）をプラスミドから欠落させることによってpRZ1496プラスミドを改変し、トランスポザーゼの産生を防止した。後者の実験では、ホスト細胞は、HindIII／EagIフラグメント欠失プラスミド（pRZ5451と呼ぶ、図４）およびＥＫ５４／Ｍａ５６トランスポザーゼをコードするクロラムフェニコール耐性プラスミドで同時形質転換を施した。いくつかの実験では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする類似プラスミドを比較のために用いた。
転位頻度はパピラ形成アッセイで調べた。このアッセイは、青色のスポットの数（Ｌａｃ産生細胞または”パピラ”）をそうでなければ白色であるコロニーの中から測定するものである。形質転換細胞をグルコース最少ミラー培地（J.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー（1972））で平板培養した（約５０コロニー／平板）。当該培地は、０．３％カザミノ酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４０μｇ／ｍｌ）およびフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（０．０５％）を含んでいた。当該培地はテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）および必要な場合にはクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）も含んでいた。選別から生き残ったコロニーをインビボの転位頻度について調べた。多くのパピラ形成を示すコロニーは裸眼でも極めて明瞭であったが、コロニー当たりの青色スポットの数は数日かけて決定した（平板培養後約９０時間）。
コロニーが、野生型ＩＥをプラスミド上に含む場合に観察されるより高いパピラ形成レベルを有するように見える場合、高パピラ形成表現型はプラスミドの末端変異によって付与されることを示すために、これらのコロニーを再塗抹した。塗抹培養平板から釣り上げたコロニーを培養した。標準的プロトコルを用いて培養細胞からＤＮＡを採取し精製し、再び”未使用の”ＪＣＭ１０１／ｐＯＸｇｅｎ細胞を形質転換した。上記のアッセイでパピラ形成レベルを再度野生型ＩＥ含有プラスミドと比較し、同じ結果が得られた。
挿入オリゴヌクレオチドの配列決定用ＤＮＡを得るために、１１７の高パピラ形成コロニーの白色部分から培養を増殖させ、標準的なＤＮＡミニプレップ法を用いて各コロニーからＤＮＡを調製した。１１７のコロニーのＯＥ／ＩＥ様部分のＤＮＡ配列を決定した（クローニング担体としてpRZ1496を用いた形質転換からは４２個；クローニング担体としてpRZ5451を用いた形質転換からは７５個）。多くの変異体が何度も単離された。最も高いパピラ形成頻度を示した全ての変異体が、１０位、１１位および１２位にＯＥ由来塩基を含む。これらの位置にＯＥ様塩基が保持されていた場合、他の変化の転位に対する影響を測定することはできなかった。なぜならば、パピラ形成レベルは既に極めて高いからである。
１５７５個のコロニーを上記のようにスクリーニングした。可能性を有する１２８個の全変異体の配列がスクリーニングされた可能性は９５％以上であった。したがって、より高い形質転換頻度に寄与する他の終端部がテストされたトランスポザーゼを用いて得られる可能性は殆どない。
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表ＩおよびＩＩは、表示のハイブリッド末端配列または野生型ＯＥもしくはＩＥ末端配列を有する変異体構築物の定量的パピラ形成を示す。表では終端部の各位置の配列は、特に記載がなければ野生型ＩＥに対応する。これら配列は速記表示法で表示されているが、当業者には全ての表示された変異体の完全な１９塩基対配列の決定は容易であり、この明細はそのような完全な配列を全て含んでいると理解されるべきである。表Ｉは、ＥＫ５４トランスポザーゼがトランス型態様で提供された場合の実験から得られたデータを含み、表ＩＩは、ＥＫ５４トランスポザーゼがシス型で提供された場合の実験からのものである。シス型で提供されたトランスポザーゼは、トランス型で提供されたトランスポザーゼよりも絶対的な意味でより高い活性を有しているが、トランスポザーゼのシス型またはトランス型供給源は、テストした終端部の相対的インビボ転位頻度は変化させない。
表ＩおよびＩＩはそれぞれ１０位、１１位および１２位にＡＴＡを保持する全ての変異体は、野生型ＯＥ活性が中等度（表Ｉ、トランス型）であるかまたは高度（表ＩＩ、シス型）であるかにかかわらず、野生型ＯＥに匹敵するか、または野生型ＯＥより高い活性を有することを示している。さらにまた、変異体の３塩基配列がＡＴＡでない場合はいつでも、当該変異体は野生型より低いパピラ形成活性を示した。４位がＴである場合は、パピラ形成は、野生型ＯＥに少なくとも匹敵するか、または野生型ＯＥよりも顕著に高い傾向を有することもまた特記されるべきである。表示の相対レベル（非常に低い、低い、普通、高めの普通、および高い）を越えるパピラ形成レベルの定量分析は困難であった。しかしながら、当業者はＯＥのパピラ形成レベルを容易に理解し、匹敵するレベルまたはより高いレベルを有するコロニーは容易に認識することができよう。
観察されるパピラの数は、図５−７に示すように時間の経過にしたがって増加した。これらの図は、全く異なる合成終端部カセットまたは野生型ＯＥもしくはＩＥ終端部のいずれかを含む９クローンで別々に形質転換した細胞で認められたパピラ形成を大雑把に定量したものである。これら３つの図では、各変異体は、野生型ＩＥ配列との相違によって特定される。テストした変異体の中で、１０Ａ／１１Ｔ／１２Ａの変異体のみが、野生型ＯＥよりも高い転位パピラ形成レベルを有していたことに留意されたい。当該変異体（ＯＥが参照配列である場合は変異体４／１５／１７／１８と呼ぶ）は、１０位、１１位および１２位にヌクレオチドＡＴＡを保持する、図５−７に示した変異体の中でただ１つの変異体であった。図５（ｙ軸：０−１５００個のパピラ）および図６（ｙ軸：０−２５０個のパピラ）は、種々の変異体プラスＩＥおよびＯＥコントロール並びにＥＫ５４／ＭＡ５６酵素を用いた場合のパピラ形成を示す。図７（ｙ軸：０−２５０パピラ）は、同じ変異体配列を野生型（より正確にはＭＡ５６）トランスポザーゼに対してテストした場合のパピラ形成を示す。１０Ａ／１１Ｔ／１２Ａ変異体（配列番号：９）によって、野生型ＯＥを用いて９０時間後に観察されたもの（約１５００）よりもＥＤ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼを用いてより短い時間（６８時間）で顕著に高いパピラ形成（約３０００）が得られた。ＩＥ様バックグラウンド上の１５位におけるただ１つのＯＥ様ヌクレオチドもまたパピラ形成頻度を増加させた。
インビボ転位頻度もまた、高レベルの高パピラ形成をもつ２つの配列を用いてテトラサイクリン耐性アッセイで定量した。これらの配列は５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’（配列番号：８）（これは５’末端から数えて４位、１７位および１８位で野生型ＯＥ配列と異なっている）、および５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴ−３’（配列番号：９）（これは４位、１５位、１７位および１８位で野生型ＯＥ配列と異なっている）であった。これらの配列は、ＥＫ５４／ＭＡ５６を含むトランスポザーゼまたはＭＡ５６を含むトランスポザーゼを用いるアッセイで好ましい変異体終端部と考えられる。プラスミドの２つの野生型ＯＥ配列の代わりにpRZtl1内に各配列を別々に挿入した。カナマイシン耐性遺伝子に接する所望の末端を含むＰＣＲ増幅フラグメントは、容易にpRZTL1の大きいHindIIIフラグメント中でクローニングできた。得られたプラスミドは、表示した末端を除いてpRZTL1と同一である。比較のために、pRZTL1および２つの野生型ＩＥ配列を含むpRZTL1の誘導物もまたテストした。アッセイでは、テストプラスミド（pRZTL1およびその誘導物）および高コピー数ａｍｐrプラスミド（ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼもしくは野生型（ＭＡ５６）トランスポザーゼのいずれかをコードする）でＪＣＭ１０１／ｐＯＸｇｅｎ細胞を同時に形質転換した。ホスト細胞は、転位によってＴｅｔr遺伝子がプラスミドまたは染色体上のどこかにある適切な転写プロモーターの近傍の下流に運ばれたときにのみテトラサイクリン耐性となる。テストプラスミドを受容した細胞の総数はクロラムフェニコール耐性、アンピシリン耐性コロニーを数えることによって決定した。転位頻度はｔｅｔr／ｃａｍrａｍｐrコロニーの比を決定することによって算出した。野生型ＯＥよりもインビボ転位で約４０から６０倍の増加が、変異終端部およびＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼのいずれかを用いた場合に認められた。２つの好ましい変異終端部のうちで、野生型ＯＥ配列に対して３位に変異を含むものはより高い増加をもたらした。
図８（これは転位頻度（×１０-8）に対してテストプラスミドをプロットしたものである）に示すように、テストプラスミドが２つのＩＥ終端部を含む場合は殆ど転位は認められなかった。テストプラスミドが２つのＯＥ終端部を含む場合、特にＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼが用いられる場合に幾分高い転位が観察された。極めて対照的に、ＥＫ５４／ＭＡ５６トランスポザーゼと好ましい選択末端のいずれか（１０位、１１位および１２位にのみ、または１０位、１１位、１２位および１５位にのみＯＥ様塩基を含む）とを組み合わせた場合に野生型ＯＥ終端部よりも大きな増加がインビボ転位で得られた。
最も好ましい合成終端部配列（5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’）（配列番号：８）をもつ好ましい高活性変異終端部を、pRZTL1で両方のＯＥ終端部の代わりに提供し（図４）、本明細書で述べた３重変異トランスポザーゼを用いて本発明のインビトロ転位アッセイでテストした。この変異終端部の転位頻度は第二の好ましい合成終端部よりも高いので、さらに当該終端部はｄａｍメチル化部位を持たず、したがってｄａｍメチル化は転位頻度にもはや影響を与えないので、この変異終端部を更なるインビトロ分析のために選んだ。反対に４／１５／１７／１８変異体はｄａｍメチル化部位を有する。
予備実験でＣＨＡＰＳは反応から排除したが、予備保温工程は用いた。反応物を１時間２０℃で予備保温し、続いて２倍に希釈し、その後３７℃で３時間保温した。ＤＮＡ約０．５μｇおよびトランスポザーゼ０．４μｇを用いた。転位生成物をゲルで観察した。変異終端部では、最初のＤＮＡは極めてわずか観察された。一次および二次転位反応生成物を示す多数のバンドが観察された。反応混合物でＤＨ５α細胞を形質転換し、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、またはカナマイシン含有平板で平板培養した。
６４０個のクロラムフェニコール耐性コロニーを観察した。これらは未反応プラスミドを示すことができるが、テストしたそのようなコロニーの全て（ｎ＝１２）がカナマイシンに感受性を有し、このことはドナーのバックボーンＤＮＡが失われていることを示唆している。さらにまた１２のコロニーは全てサイズの異なるプラスミドを含んでいた：１２コロニーのうちの９コロニーは欠失−倒置の特徴を示し、残りの３つは単純な倒置であった。７９のテトラサイクリン耐性コロニーを観察したが、これらは転位によってｔｅｔr遺伝子の活性化を示した。
１１のカナマイシン耐性コロニーを観察した。これによって、ドナーのバックボーンＤＮＡを含む残余のプラスミドは低％であることが示された。
第二の同様なテストでは、約１μｇのプラスミドＤＮＡおよび０．２μｇのトランスポザーゼを用いた。このテストでは、予備保温または希釈を行わずにＣＨＡＰＳなしで反応物を３７℃で３時間保温した。最初のＤＮＡのいくらかが３時間の反応後にゲルで観察された。一晩保温した後では転位生成物のみが観察された。
３時間の反応の生成物でＤＨ５α細胞を形質転換し、上記のように平板培養した。クロラムフェニコール耐性コロニーの約５０％がカナマイシン感受性で、おそらく転位生成物であろう。
本発明は前述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲内に包含される全ての改変および変形例を含むものである。本明細書に特に記載した用途の他に、他の応用も当分子生物学関係業者には明白であろう。特に、所望の変異を原核細胞または真核細胞ＤＮＡに導入するための方法には非常に好ましい。例えば、現時点では、プラスミド上に存在する不活性型遺伝子との同種組換えによって機能的な真核細胞遺伝子をノックアウトすることは困難である。この困難さは、プラスミド上の遺伝子を広範囲の上流および下流の配列に隣接させねばならないことから生じる。しかしながら、このシステムを用いるならば、選択マーカー遺伝子（例えばｎｅｏ）を含む不活性化用転位性遺伝因子を、不活性化させようとする遺伝子を含むプラスミドにインビトロで導入することができる。転位後に、生成物を適切なホスト細胞に導入することができる。標準的な選別手段を用いて、転位性遺伝因子を有するプラスミドを含む細胞コロニーのみを回収することができる。そのようなプラスミドを、例えば制限分析によってスクリーニングして破壊された遺伝子を含むものを回収できる。続いて、同種組換えのために、さらに同じマーカー遺伝子を用いる選別のために直接そのようなコロニーを真核細胞に導入できる。
さらにまた、このシステムを用いてＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをベクターに容易に挿入でき、したがって従来のクローニング工程を完全に回避できる。これは、（１）プライマーの配列特異的部分に近接するＯＥ終端部を含む適切な１対のＰＣＲプライマーを提供し、（２）所望の核酸フラグメントの標準的ＰＣＲ増幅を実施し、（３）ドナーＤＮＡとして二本鎖ＰＣＲ増幅生成物を用いて本発明のインビトロ転位性反応を実施する。
配列表
（2）配列番号1に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：1534塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=修飾Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする遺伝子
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：93..1523
（xi）配列：配列番号１
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（2）配列番号2に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：477アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号2
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（2）配列番号3に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：5838塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：環状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc=プラスミドＤＮＡ
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：pRZTL1
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：insertion_seq
（B）存在位置：1..19
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：77..1267
（D）その他の情報：/機能＝テトラサイクリン耐性
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：相補（2301..2960）
（D）その他の情報：/機能＝クロラムフェニコール耐性
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：insertion_seq
（B）存在位置：4564..4582
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：4715..5530
（D）その他の情報：/機能＝カナマイシン耐性
（xi）配列：配列番号3
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（2）配列番号4に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：397アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号4
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（2）配列番号5に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：220アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号5
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（2）配列番号6に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：272アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号6
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（2）配列番号7に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝Ｔｎ５野生型外側端
（xi）配列：配列番号7
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（2）配列番号8に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝Ｔｎ５変異体外側端
（xi）配列：配列番号8
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（2）配列番号9に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝Ｔｎ５変異体外側端
（xi）配列：配列番号9
0004361971.tif 000039
（2）配列番号10に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝Ｔｎ５野生型内側端
（xi）配列：配列番号10
0004361971.tif 000040
（2）配列番号11に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19182塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：環状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝プラスミドpRZ4196
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：repeat_unit
（B）存在位置：94..112
（D）その他の情報：/注＝野生型ＯＥ配列
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：repeat_unit
（B）存在位置：12184..12225
（D）その他の情報：/注＝カセットＩＥ
（xi）配列：配列番号11
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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