(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトースに対して、ケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させる工程を含んでなるポリオールの製造方法。
【請求項２】
アルドースに対してアルドースイソメラーゼを作用させてケトースを生成させる工程をさらに含んでなる請求項１記載のポリオールの製造方法。
【請求項３】
ケトースがＬ−ソルボースであり、ポリオール脱水素酵素がリビトール脱水素酵素であって、ポリオールがＬ−タリトールである請求項１記載のポリオールの製造方法。
【請求項４】
アルドースがＤ−キシロースであり、アルドースイソメラーゼがＤ−キシロースイソメラーゼであり、ポリオール脱水素酵素がリビトール脱水素酵素であって、ポリオールがリビトールである請求項２記載のポリオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単糖類を原料とした各種ポリオールを製造する方法に関し、詳細には、単糖類に対して、アルドースイソメラーゼ及び／又はケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させることを特徴とする各種ポリオールを容易に収率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生化学工業が発達し、糖質化学の分野においても、従来、殆ど必要としなかった多種類のポリオールの需要が興りつつあり、これら各種ポリオールを容易に安定して製造する方法の確立が望まれている。
【０００３】
ポリオールは有機化学的手法によっても、生化学的手法によっても生産することができる。有機化学的手法としては、通常、Ｄ−グルコースやＤ−マンノース等の単糖類を金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元して製造している。この方法は、目的とするポリオールを高収率で製造できるものの、高圧オートクレーブを必要とし、多量の水素やエネルギーを消費するのみならず、防災上からも高度な安全施設や管理を必要とする欠点がある。また、通常、原料となる単糖類の種類が限られるため、当然得られるポリオールの種類も限定される欠点がある。生化学的手法としては、通常、Ｄ−グルコースやマルトデキストリン等を原料とし、これを微生物や酵素により処理して、二種以上のポリオール混合物を比較的低収率で得ている。例えば、特公昭６３−９８３３号公報では、Ｄ−グルコースを炭素源としてトルロプシス属に属する微生物を培養してグリセロール及びＤ−マンニトールを収率それぞれ４３．１％、２１．１％の混合物で得ている。また、特公平６−３０５９２号公報では、Ｄ−グルコースを炭素源としてモニリエラ属に属する微生物を培養して、エリトリトール、グリセロール及びリビトールを収率それぞれ３５．８％、１０％、５．２％の混合物で得ている。
【０００４】
一方、ポリオールの原料である各種単糖類は、本発明者等が先に出願明細書で記載している酵素反応、例えば、特開平６−１１３８７５号公報に記載しているＤ−アラビノースイソメラーゼ、特願平８−１４４８３１号明細書に記載しているＬ−リボースイソメラーゼ等のアルドースイソメラーゼや特開平６−１２５７７６号公報、特開平８−１５４６９６号公報等に記載しているケトース３−エピメラーゼ等を用いる酵素反応により比較的容易に製造することが可能となった。しかしながら、これらの酵素反応は、いずれも基質と生成物との平衡点が３０乃至７０％程度の平衡反応であって、反応液に含まれる単糖類は、基質と生成物との混合物であり、これからポリオールの原料にする高純度の単糖類を製造するためには、通常、カラムクロマトグラフィー等の繁雑な分離操作を必要としている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境に優しい生化学的手法により、目的とする各種ポリオールを高純度、高収率で製造する方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素の利用に着目し、鋭意研究を続けてきた。その結果、意外にも、アルドースやケトースなど各種単糖類に作用することの知られているアルドースイソメラーゼの反応やケトース３−エピメラーゼの反応等基質と生成物との間に平衡点を有する酵素反応に、ポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させることにより、目的とするポリオールの生成率が、原料の各種単糖類に対して、ほぼ理論値１００％に近い高収率を容易に達成できることを見いだし、本発明を完成した。換言すれば、アルドースイソメラーゼやケトース３−エピメラーゼの平衡点をずらし、原料のアルドース及び／又はケトースを目的とする特定のポリオールへ高い変換率で導くという全く新しい反応方法を見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
本発明で原料として用いる単糖類は、それらがアルドースであってもケトースであっても、また、それらが、Ｄ−ペントース、Ｌ−ペントースであっても、Ｄ−ヘキソース、Ｌ−ヘキソースであってもいずれも採用できる。また、それらの出所、由来、製造法も問わない。
【０００８】
本発明で用いる各種のアルドースイソメラーゼ、ケトース３−エピメラーゼ、ポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素としては市販されているもの、あるいは、それらを産生する微生物から分離したもの等が自由に利用できる。またこれらの酵素は必ずしも純粋に精製された標品を用いる必要はなく、目的にあった基質特異性を有するものであればよく、その純度等は特に問うものではない。また、これら酵素は、それぞれ単独で、又は酵素系として、公知の固定化方法、例えば、包括法、共有結合法、イオン結合法などにより固定化して利用することも有利に実施できる。
【０００９】
本発明における反応は、基質の単糖類を、通常、１乃至６０ｗ／ｖ％、望ましくは、約５乃至４０ｗ／ｖ％水溶液とし、これに、酵素系として、アルドースイソメラーゼ及び／又はケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を共存させ、同時に、補酵素としてＮＡＤ及び／又はＮＡＤＨを共存させて、それぞれの酵素が作用しうる温度、作用しうるｐＨ条件で行われる。反応時間は、通常、１乃至５００時間、望ましくは、５乃至２００時間程度である。
【００１０】
このようにして得られる反応液に含まれる生成物は、通常、大部分が目的とする特定のポリオールである。反応液は、常法により、例えば、濾過、遠心分離などにより不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品にすることも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には、得られるポリオールの種類に応じては結晶製品に仕上げることも随意である。必要ならば、更に高度な精製方法を採用することも任意に行うことができ、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画等の方法で更に高純度のポリオールを得ることができる。このようにして得られる各種ポリオールは、試薬はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業など多くの用途に利用できる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
アルドースイソメラーゼと共にポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いた、アルドースからのポリオール製造の反応式を化１に示す。
【００１３】
【化１】
0004251676.tif 000002
【００１４】
この反応式におけるアルドースとしては、Ｄ−アルドペントース、Ｌ−アルドペントース、Ｄ−アルドヘキソース、Ｌ−アルドヘキソース等のアルドースが含まれる。それぞれのアルドースをアルドースイソメラーゼを用いて異性化するとともに、生成するケトースに作用するＮＡＤ及び／又はＮＡＤＨを補酵素とするポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させることによって多種類のポリオールを高純度、高収率で製造することができる。この反応式により理論的には収率１００％で、原料のアルドースを目的とするポリオールに変換することができる。この化１の反応式の具体例としては、例えば、Ｄ−マンニトール、リビトール、Ｄ−アラビトール等のポリオールの製造に有利に利用できる。Ｄ−マンニトールを製造する場合には、Ｄ−グルコースにＤ−キシロースイソメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。リビトールを製造する場合には、Ｄ−リボースにＬ−ラムノースイソメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。また、Ｄ−アラビトールを製造する場合には、Ｄ−キシロースにＤ−キシロースイソメラーゼを作用させると共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。
【００１５】
ケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いた、ケトースからのポリオール製造の反応式を化２に示す。
【００１６】
【化２】
0004251676.tif 000003
【００１７】
この反応式におけるケトースとしては、Ｄ−ケトペントース、Ｌ−ケトペントース、Ｄ−ケトヘキソース、Ｌ−ケトヘキソース等のケトースが含まれる。それぞれのケトースをケトース３−エピメラーゼを用いてエピメル化（ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）するとともに、生成するケトースに作用するＮＡＤ及び／又はＮＡＤＨを補酵素とするポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させることによって多種類のポリオールを高純度、高収率で製造することができる。この反応式により理論的には収率１００％で、原料のケトースを目的とするポリオールに変換することができる。この化２の反応式の具体例としては、例えば、Ｌ−タリトール、Ｄ−タリトール、Ｌ−マンニトール等のポリオールの製造に有利に利用できる。Ｌ−タリトールを製造する場合には、Ｌ−ソルボースにケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。また、Ｄ−タリトールを製造する場合には、Ｄ−フラクトースにケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。また、Ｌ−マンニトールを製造する場合には、Ｌ−フラクトースにケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。
【００１８】
アルドースイソメラーゼ及びケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いた、アルドースからのポリオール製造の反応式を化３に示す。
【００１９】
【化３】
0004251676.tif 000004
【００２０】
この反応は原料がアルドースの場合に適用できる。それぞれのアルドースに反応するアルドースイソメラーゼによってケトースへと転換するとともに、その生成物であるケトースをケトース３−エピメラーゼを用いてエピメル化し、同時に生成したケトースに作用するＮＡＤ及び／又はＮＡＤＨを補酵素とするポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させることによって、アルドースから多種類のポリオールを高純度、高収率で製造できる。理論的にはこの反応式の収率も１００％で、原料のアルドースを目的とするポリオールに変換することができる。この化３の反応式の具体例としては、例えば、リビトール、アリトール等のポリオールの製造に有利に利用できる。リビトールを製造する場合には、Ｄ−キシロースにＤ−キシロースイソメラーゼ及びケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。また、アリトールを製造する場合には、Ｄ−グルコースにＤ−キシロースイソメラーゼ及びケトース３−エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを共役させて作用させればよい。
【００２１】
以下、本発明の若干の実施例を述べる。
【００２２】
なお、本実施例で使用する酵素の活性表示は、次の通りとした。Ｄ−キシロースイソメラーゼ、Ｄ−マンニトール脱水素酵素、蟻酸脱水素酵素は市販の標品を使用し、酵素の単位はカタログ記載の通りとした。ケトース３−エピメラーゼは、特開平６−１２５７７６号公報で開示しているシュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｈｏｒｉｉ）ＳＴ２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３９）のケトース３−エピメラーゼ遺伝子を大腸菌で発現させることによって得た酵素を使用し、酵素の単位は同公報記載の通りとした。また、リビトール脱水素酵素は、クレブジエラ・ニュウモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ３３２１の生産する酵素を用いた。本菌を、１ｗ／ｖ％酵母エキス、０．２ｗ／ｖ％ポリペプトン、０．１ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム、０．６ｗ／ｖ％リビトールを組成とする培養液に３７℃で２４時間培養し、アルミナ磨砕により菌体を破砕し、酵素を抽出した。酵素活性は、反応液組成として、１００ｍＭリビトール０．１ｍｌ、２５ｍＭＮＡＤ０．１ｍｌ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．７ｍｌ及び酵素を加え、計１．０ｍｌとしたものを用い、３０℃で反応し、３４０ｎｍの吸収の増大を追跡することで測定した。酵素１単位はこの条件で、１分間に１マイクロモルのリビトールを脱水素する酵素量とした。
【００２３】
【実施例１】
〈Ｄ−グルコースからのＤ−マンニトールの製造〉
化１の反応式に従って、Ｄ−グルコースを原料として用い、Ｄ−キシロースイソメラーゼによってＤ−フラクトースへ転換し、ポリオール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いてＤ−マンニトールを製造した。
【００２４】
Ｄ−キシロースイソメラーゼはナガセ生化学工業社販売『ＮＡＧＡＳＥ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＧＩ−Ｌ』を、ポリオール脱水素酵素は米国Ｓｉｇｍａ社販売のロイコノストック・メッセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＤ−マンニトール脱水素酵素を、蟻酸脱水素酵素は米国Ｓｉｇｍａ社販売のキャンディダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来の酵素をそれぞれ用いた。
【００２５】
反応は、１０ｗ／ｖ％Ｄ−グルコース、５ｗ／ｖ％蟻酸ナトリウム、５ｍＭ  ＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに１０単位のＤ−キシロースイソメラーゼ、１０単位のＤ−マンニトール脱水素酵素及び１０単位の蟻酸脱水素酵素を添加した水溶液で、３０℃で約４０時間行った。この反応液には、Ｄ−マンニトールがＤ−グルコースから生成率約９５％以上で生成していた。
【００２６】
本反応液を、活性炭で脱色処理後、Ｈ+ 型陽イオン交換樹脂（三菱化成工業製、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ）及びＯＨ- 型陰イオン交換樹脂（オルガノ社製、アンバーライトＩＲＡ−４１１）により脱イオン精製した。ついで、減圧濃縮しシラップとし、Ｄ−マンニトールの種結晶を少量添加することによって低温で結晶化し、高純度の結晶Ｄ−マンニトール約４００ｍｇを得た。本品の原料Ｄ−グルコースに対する収率は、固形物あたり約８０％であった。本品の理化学的性質は、市販されている標準のＤ−マンニトールのそれとよく一致した。本品は、試薬用途のみならず、甘味料、品質改良剤、保湿剤、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料等に有利に使用できる。
【００２７】
【実施例２】
〈Ｌ−ソルボースからのＬ−タリトールの製造〉
化２の反応式に従って、Ｌ−ソルボースを原料として用い、ケトース３−エピメラーゼによってＬ−タガトースへ転換し、リビトール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いてＬ−タリトールを製造した。
【００２８】
ケトース３−エピメラーゼは、特開平６−１２５７７６号公報で開示しているシュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３６）のケトース３−エピメラーゼ遺伝子を大腸菌で発現させることによって得た酵素を、リビトール脱水素酵素は、特開平８−５６６５９号公報で開示しているクレブジエラ・ニュウモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ３３２１をリビトールを含む培養液で培養し超音波処理により抽出した粗酵素を用いた。また蟻酸脱水素酵素は実施例１で記載した市販の酵素を使用した。
【００２９】
反応は、５ｗ／ｖ％Ｌ−ソルボース、５ｗ／ｖ％蟻酸ナトリウム、５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに１０単位のケトース３−エピメラーゼ、１０単位のリビトール脱水素酵素及び５単位の蟻酸脱水素酵素を添加した水溶液で、３０℃で約１００時間行った。この反応液には、Ｌ−タリトールがＬ−ソルボースから生成率約９５％以上で生成していた。
【００３０】
本反応液を、活性炭で脱色処理後、実施例１と同様にＨ+ 型陽イオン交換樹脂及びＯＨ- 型陰イオン交換樹脂により脱イオン精製した。ついで、減圧濃縮しシラップとし、Ｌ−タリトールの種結晶を少量添加することによって低温で結晶化し、高純度の結晶Ｌ−タリトール約４００ｍｇを得た。本品の原料Ｌ−ソルボースに対する収率は、固形物あたり約８０％であった。
【００３１】
本品を同定するため、実験により理化学的性質を調べ、その性質を文献値と比較し、13Ｃ−ＮＭＲについては、市販のＤ−タガトースから水素添加して合成した標準のＤ−タリトールと比較した。
【００３２】
（１）  比旋光度の測定
本品の測定値
［α］Ｄ20＝−２．２o（ｃ＝１０％、Ｈ2Ｏ）
Ｌ−タリトールの文献値
［α］Ｄ20＝−２．９o（ｃ＝１０％、Ｈ2Ｏ）
文献：『ディクショナリー・オブ・オーガニック・コンパウンズ（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）』、１９８２年、チャップマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ）社発行、５１００頁
【００３３】
（２）  融点の測定
本品の融点は８５．０℃であった。この値は文献値の８８℃とほぼ一致している。
【００３４】
（３）  13Ｃ−ＮＭＲの測定
本品の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、『バイオケミストリ−（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１３巻、１４６乃至１５３頁（１９７４年）に記載している方法に準じて測定したところ、本品の化学シフトは標準のＤ−タリトールのそれとよく一致した。その化学シフトは、表１に示した。
【００３５】
【表１】
0004251676.tif 000005
【００３６】
以上の結果から明らかなように、比旋光度については、文献記載のＬ−タリトールの値とほぼ一致し、また、融点も文献値とほぼ一致し、13Ｃ−ＮＭＲの測定については、標準のＤ−タリトールの値とよく一致した。これらの結果から、本実施例で得られた結晶品は、Ｌ−タリトールであると判断される。
【００３７】
本品は、試薬用途のみならず、甘味料、品質改良剤、保湿剤、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【００３８】
【実施例３】
〈Ｄ−キシロースからのリビトールの製造〉
化３の反応式に従って、Ｄ−キシロースを原料として用い、Ｄ−キシロースイソメラーゼによりＤ−キシルロースへ転換し、それをケトース３−エピメラーゼによってＤ−リブロースへエピメル化し、さらに、リビトール脱水素酵素及び蟻酸脱水素酵素を用いてリビトールを製造した。
【００３９】
Ｄ−キシロースイソメラーゼ及び蟻酸脱水素酵素は実施例１に記載した市販の酵素を、ケトース３−エピメラーゼ及びリビトール脱水素酵素は実施例２に記載した酵素を用いた。
【００４０】
反応は、５ｗ／ｖ％Ｄ−キシロース、５ｗ／ｖ％蟻酸ナトリウム、５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに５単位のＤ−キシロースイソメラーゼ、１５単位のケトース３−エピメラーゼ、１０単位のリビトール脱水素酵素及び２０単位の蟻酸脱水素酵素を添加した水溶液で、３０℃で約４０時間行った。この反応液には、リビトールがＤ−キシロースから生成率約９５％以上で生成していた。
【００４１】
本反応液を、活性炭で脱色処理後、実施例１と同様にＨ+ 型陽イオン交換樹脂及びＯＨ- 型陰イオン交換樹脂により脱イオン精製した。ついで、減圧濃縮して  シラップとし、リビトールの種結晶を少量添加することによって低温で結晶化し、高純度の結晶リビトール約４００ｍｇを得た。リビトールの原料Ｄ−キシロースに対する収率は、固形物あたり約８０％であった。
【００４２】
本品を同定するため、実験により本品の理化学的性質を調べ、その性質をＳｉｇｍａ社が市販している標準のリビトールの測定値と比較した。
【００４３】
（１）  比旋光度の測定
本品の測定値
［α］Ｄ20＝  ０o  （ｃ＝１０％、Ｈ2Ｏ）
標準のリビトールの測定値
［α］Ｄ20＝  ０o  （ｃ＝１０％、Ｈ2Ｏ）
【００４４】
（２）  赤外吸収スペクトル
ＫＢｒ錠剤法で測定した本品の赤外線吸収スペクトルを図１に示した。これは別に測定した標準のリビトールの赤外線吸収スペクトルとよく一致した。
【００４５】
以上の結果から明らかなように、比旋光度及び赤外線吸収スペクトルが、標準のリビトールの値とよく一致することから、本実施例で得られた結晶品は、リビトールであると判断される。
【００４６】
本品は、試薬用途のみならず、甘味料、品質改良剤、保湿剤、食品、化粧品、医薬品、又はそれらの原料などに有利に使用できる。
【００４７】
【発明の効果】
上記から明らかなように、本発明により、各種単糖類を原料として、これにアルドースイソメラーゼ及び／又はケトース３エピメラーゼと共にポリオール脱水素酵素と蟻酸脱水素酵素とを巧みに共役させて作用させることによって、目的とする各種のポリオールを容易に収率よく生産することが可能になった。本発明によって、従来入手が困難であった各種ポリオールを収率よく提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により得られる高純度結晶リビトールの赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図１】
0004251676.tif 000006