(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ遺伝子としてアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）のみを削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域とシスタチン類をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌。
【請求項２】
バチルス属細菌が、Bacillus sp. KSM-64（FERM P-10482）又はBacillus sp. KSM-S237（FERM P-16067）である請求項１記載の組換え枯草菌。
【請求項３】
請求項１又は２記載の組換え枯草菌を培養し、当該培養物中からシスタチン類を分離するタンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換え枯草菌及びこれを用いた目的タンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
今日まで、組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の生産には、大腸菌（Esherichia coli）をはじめとして、酵母や糸状菌、培養動植物細胞、バチルス属細菌等の宿主ベクター系が用いられてきた。このうち、枯草菌やBacillus brevis等のバチルス属細菌は、種々の酵素タンパク質を培地中に分泌し蓄積するという性質を有することから、大腸菌に次いで遺伝学的研究が行われ、形質転換効率の高い宿主ベクター系が開発されている。例えば、一部のBacillus brevis宿主はタンパク質分泌能力が高く、自身で菌体外にタンパク質分解酵素を生産しないことから、菌体外での異種タンパク質が分解されないといった利点を有し、これまでにヒト成長ホルモンの生産（例えば特許文献１参照）、インスリンの生産（例えば特許文献２参照）等をはじめとする種々の異種タンパク質の生産に用いられている。
【０００３】
また、枯草菌は、産業用酵素の供給源のみならず食品業界でも利用されている菌であり、安全性が極めて高いことに加え、菌体外へのタンパク質の分泌が可能であり、菌体内若しくはペリプラズムで異種タンパク質を生産させる大腸菌の系と比較して異種タンパク質の精製操作が大幅に簡略化できるという利点があり、ヒト成長ホルモンの生産に使用できることが報告されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、Bacillus brevisは工業用宿主としての使用歴を見てもまだ年数が浅く、宿主の安全性の確認を厳密に行う必要がある。また、タンパク質の種類によっては目的産物が検出されないもの、生産されても生物活性が低かったり活性がなかったりするものもあることが知られていた。
【０００５】
また、枯草菌についても、その宿主ベクター系は適当なプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域がない場合には、目的産物が細胞内に留まったままであったり、分解を受けやすい状態のまま膜に留まることが知られている。更に、枯草菌はタンパク質分解酵素を菌体外に生産することが知られており、分泌生産された異種タンパク質が膜の上や菌体外で分解されるといった問題があり、いまだ実用的な宿主ベクター系が確立されていない。
【０００６】
本発明は、目的タンパク質を効率的且つ大量に製造するための枯草菌宿主ベクター系及びこれを用いた目的タンパク質の製造法を提供することを目的とする。
【０００７】
【特許文献１】
特開平７−５１０７２号公報
【特許文献２】
特開２０００−３１６５７９号
【非特許文献１】
M, Honjo., et. al., J. Biotech., 6:191(1987)
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、枯草菌の宿主ベクター系を用いたタンパク質の生産方法について種々検討したところ、宿主として１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した枯草菌を用い、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を含む発現ベクターで形質転換させた組換え枯草菌を用いることにより、シスタチン類やヒト成長ホルモン等の目的タンパク質を効率よく大量に分泌生産できることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記組換え枯草菌を培養し、当該培養物中から目的タンパク質を分離するタンパク質の製造法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の組換え枯草菌は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなるものである。以下、本発明の組換え枯草菌について説明する。
【００１２】
本発明に用いられる宿主菌株は、プロテアーゼ遺伝子が欠損又は破壊された枯草菌（Bacillus subtilis）又はプロテアーゼの菌体外分泌が低下した枯草菌であれば特に制限されない。例えば枯草菌168株は全てのゲノム塩基配列が解析されている点で、本発明のプロテアーゼ欠損株として、特にアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠損させた枯草菌株として好適に使用できる。
【００１３】
削除又は不活性化させるプロテアーゼ遺伝子としては、枯草菌（Bacillus subtilis）の染色体上に存在するプロテアーゼ遺伝子のいずれでもよいが、その中でも菌体外プロテアーゼとして確認されているアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）［Stahl,M.,L., and Ferrari,E., J.Bacteriol.,158:411(1984)；Wong, S.L., et.al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81:1184(1984)］、中性プロテアーゼ遺伝子（nprE）［Yang,M.,Y., et.al., J.Bacteriol.,160:15(1984)］をはじめとしてepr［Sloma,A., et.al., J.Bacteriol.,170:5557(1988)；Bruckner,R., et.al., Mol.Gen.Genet.,221:486(1990)］、mpr［Rufo,G.A., et.al. J.Bacteriol.,172:1019(1990)； Sloma,A., et.al., J.Bacteriol.,172:1024(1990)］、bpf［Sloma,A., et.al., J.Bacteriol.,172:1470(1990)；Wu,X.,C., et.al. J.Biol.Chem., 265:6845(1990)］、nprB［Tran,L., et.al., J.Bacteriol.,173:6364(1991)］、vpr［Sloma,A., et.al., J.Bacteriol.,173:6889(1991)］、wprA［Margot,P., and Karamata,D., Microbiology,142:3437(1996)］のいずれかが好ましい。異種タンパク質、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンを生産する場合には、アルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）を削除又は不活性化させるのが好ましい。
【００１４】
斯かるプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化することにより、当該プロテアーゼの機能を消失又は低下させたり、プロテアーゼの菌体外分泌を低下させることができ、分泌生産された異種タンパク質の細胞膜上や菌体外での分解が抑えられる。
尚、削除又は不活性化するプロテアーゼ遺伝子は１以上であればよいが、例えば１〜２、２〜３、３〜４、５〜８、２〜４、２〜６、２〜８のように複数でもよい。
【００１５】
このような、プロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化する方法は、公知の方法、例えば標的遺伝子を順次削除又は不活性化する方法や、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりプロテーゼ生産性の評価及び遺伝子解析を行うことによって遺伝子群を削除又は不活性化する方法等を用いることができる。
【００１６】
標的とする遺伝子を削除又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングした後、通常の遺伝子工学技術を用いて遺伝子の全領域又は一部領域を両側のＤＮＡ断片を残した形で削除する、塩基置換やフレームシフト等によって構造遺伝子中にナンセンス変異を与える、或いはクローニングやＰＣＲ等により単離した目的遺伝子断片中に他のＤＮＡ断片を挿入する等の改変を行った後、改変遺伝子を含むＤＮＡ断片を、親微生物に取り込ませて、親微生物ゲノムとの間で目的遺伝子の外側の両領域で相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００１７】
本発明組換え枯草菌を形質転換するためのベクターは、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を含むものであればよい。プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域としては、Bacillus sp. KSM-64（FERM P-10482）由来のＤＮＡ断片（配列番号１、特開平６−２１７７８１号公報）、Bacillus sp. KSM-S237（FERM P-16067）由来のＤＮＡ断片（配列番号２、特開２０００−２１００８１号公報）及び、該配列番号１、該配列番号２で示されるDNA断片に１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加したDNA断片が好適に挙げられ、特にBacillus sp. KSM-S237セルラーゼ由来のＤＮＡ断片（配列番号２）が好ましい。
【００１８】
斯かるプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域のセルラーゼ遺伝子からの単離は公知の方法、例えば Maniatisら［Maniatis, T., et.al., MolecularCloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)］に記載の方法で行うことができる。また、公知のポリメラアーゼ・チェイン・リアクション（PCR）法によって特異的に増幅することにより効率的に取得できる。［Innis,M.,A., et.al., PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)］
【００１９】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、上記プロモーター領域及び分泌シグナル領域の下流末端に結合すればよい。当該目的タンパク質としては、各種酵素タンパク質や生理活性ペプチド等、異種のいずれのタンパク質でもよいが、１０ｋDa〜５０ｋDaのタンパク質、特に１０ｋDa〜３５ｋDaのタンパク質が好ましい。また、生理活性タンパク質が好ましく、中でもヒト由来タンパク質、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンが好適である。
【００２０】
斯かるバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼのプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と異種タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持する発現ベクターは、枯草菌に保持され増殖するプラスミドであればよく、例えば、Staphylococcus aureus由来のｐＵＢ１１０、Bacillus cereus由来のｐＢＣ１６、Enterococcus faecalis由来のｐＡＭα１、ｐＡＭα１の一部を含むシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２１】
斯かるベクターを用いて、宿主枯草菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いればよい。
【００２２】
斯くして得られる組換え枯草菌（形質転換体）を、当該組換え枯草菌が生育可能な培地中で適当な培養条件で培養することにより、目的タンパク質を大量に生成させることができる。
【００２３】
斯かる組換え枯草菌を用いた本発明のタンパク質の製造法は、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンの大量分泌生成に適している。
シスタチン類は、システインプロテアーゼ阻害剤の総称であり、ヒト組織及び体液に広く分布し、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ及びＳのようなシステインプロテアーゼと密接かつ可逆的な複合体を形成し、これらのプロテアーゼが関与する正常又は病的な過程の調節に関与している。従って、シスタチンは、後天的な肺炎（肺気腫）、劇症肝炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、細菌毒素に起因するショック様症候群、カテプシンＫの選択的阻害による疾患（骨粗しょう症、パジェット病、悪性高カルシウム血症、代謝性骨疾患等）に関与すると考えられている。
【００２４】
従来、斯かるシスタチン類の製造は、そのアミノ酸構造をコードする遺伝子を用いた組換え生産が試みられており、シスタチンＣを始め、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンα及びシスタチンＳの組換え大腸菌（E.coli）による生産等が知られているが、その生産性は低く実用化されるレベルには至っていなかった。本発明の方法を用いれば、シスタチン類を効率よく且つ大量に生産することができる。
【００２５】
ここで、シスタチン類としては、その起源や種類に限定されず、ファミリー１（ステフィンファミリー）、ファミリー２（シスタチンファミリー）及びファミリー３（キニノーゲンファミリー）に分類される全てのシスタチンスーパーファミリー並びに、システインプロテアーゼに対する阻害活性を有する特開平７−１２６２９４号公報に記載の新規システインプロテアーゼインヒビター、特表２００１−５１２９６６号公報に記載のＣＳＴＩＮのようなシスタチン様タンパク質が挙げられる。
【００２６】
斯かる、１）ファミリー１としては、ヒトシスタチンＡ、ヒトシスタチンＢ、ラットシスタチンα、ラットシスタチンβ、ヒトｃ−Ha−ras oncogene product−p21、オリザシスタチンＩ、オリザシスタチンＩＩ、コーンシスタチン、ソヤシスタチン等が挙げられ、２）ファミリー２としては、ヒトシスタチンＣ、ヒトシスタチンＳ、ヒトシスタチンＳＮ、ヒトシスタチンＳＡ、ヒトシスタチンＤ、ヒトシスタチンＭ、ヒトロイコシスタチン（シスタチンＦ）、ラットシスタチンＣ、ラットシスタチンＳ、マウスシスタチンＣ、マウスロイコノシスタチン、チキンシスタチン、ウズラシスタチン、ウシ初乳シスタチン、カープシスタチン、タイワンコブラ毒シスタチン、カブトガニシスタチン、チャムサーモンシスタチン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａシスタチン、サーコシスタチン、マムシ毒シスタチン等が挙げられ、３）ファミリー３としては、ヒト低分子量キニノ−ゲン、ヒト高分子量キニノーゲン、ウシ低分子量キニノーゲン、ウシ高分子量キニノーゲン、ラット低分子量キニノーゲン、ラット高分子量キニノーゲン、ラットＴ−キニノーゲン１、ラットＴ−キニノーゲン２等が挙げられる。
【００２７】
このうち、本発明の組換え枯草菌を用いた製造には、特にファミリー２に属すものが好ましく、特にヒトの唾液由来のシスタチンであるシスタチンＳ、シスタチンＳＡ、シスタチンＳＮが適する。
【００２８】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はヒトの脳下垂体より分泌されるペプチドホルモンの１種であり、１９１アミノ酸からなり、分子量は２２，０００である。本物質の生理活性としては成長促進、脂肪代謝、糖代謝等が知られており、下垂体性小人症の治療薬として古くから用いられている。また、ｈＧＨには、慢性腎不全による低身長、火傷、骨折、骨粗しょう症等の治療等への適応対象の拡大が検討されている。本発明のタンパク質の製造法は、斯かるヒト成長ホルモンの効率的且つ大量生産にも適している。
【００２９】
シスタチン類又はヒト成長ホルモンの製造は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、シスタチン類又はヒト成長ホルモンをコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌を用い、これを適当な培地中で適当な培養条件で培養することにより行うことができる。
尚、シスタチン類又はヒト成長ホルモンをコードする遺伝子は、生体からの抽出や増幅、公知のアミノ酸配列に基づく化学的合成等の公知の方法により取得すればよい。
【００３０】
組換え枯草菌の培養に用いる培地の種類としては、適当な窒素源、炭素源、ミネラルを含み、本発明の枯草菌宿主が生育し、目的タンパク質を生産することができるものであればよい。例えば、配列番号２で示されるＤＮＡ断片を含む組換え枯草菌168ΔaprE（ｐＨ２３７−ＵＳ）株によってシスタチン類を生産する場合、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等を配合した培地や、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を配合したＣＭ培地等を用いることができる。
【００３１】
また、培地のｐＨは、用いる組換え枯草菌が生育し得る範囲のｐＨであれば、よいが、ｐＨ６．０〜８．０に調整するのが好適である。
培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪または、通気撹拌培養すればよい。
【００３２】
【実施例】
１．試験方法
（１）宿主菌株
枯草菌宿主として、枯草菌 168株からアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）を欠損させた枯草菌 168ΔaprE株、比較例として枯草菌 168株を用いた。枯草菌 168ΔaprE株の調製法を以下に示す。
【００３３】
枯草菌 168株の染色体DNAを鋳型としてプライマーDapr1f（CTTCTAGATTGTCGCGATCACCTCATCCCCCTCCG：配列番号３）及びDapr3（TTTTAAGTAAGTCTAAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAG：配列番号５）を用いたPCRでaprEの構造遺伝子（開始コドンを1とする。）の上流（-1460から-33）に相当する遺伝子断片Aを増幅した。同様に枯草菌 168株の染色体DNAを鋳型としてプライマーDapr2（CAACGCTCGGATCTTTAGACTTACTTAAAAGACTATTCTGTG：配列番号４）及びDapr4（CGTCTAGATCTTGCGGCACTTCCGCTGTTATTG：配列番号６）を用いたPCRでaprEの構造遺伝子から下流（268から1590）に相当する遺伝子断片Cを増幅した。遺伝子断片A及びCを鋳型とし、プライマーDapr1f及びDapr4を用いたリコンビナントPCRでaprE遺伝子を含む近傍配列からaprEのSD配列、開始コドン、シグナル配列等を含む前半300bpを欠失させたaprE欠失用PCR断片（ΔaprE）を調製した。またプラスミドpHY300PLKを鋳型にテトラサイクリン耐性遺伝子（Tcr）を増幅した。末端平滑化したTcr PCR断片をプラスミドpUC18（宝酒造）のHincII部位に挿入し、ΔaprE PCR断片は両端に付したXbaI部位で切断後、同プラスミドのXbaI部位に挿入し、プラスミドpUCTcrΔaprEを構築した。プロトプラスト形質転換法によりpUCTcrΔaprEを枯草菌168株へ導入し、15ppmのテトラサイクリンを含むDM３再生寒天培地で生育したコロニーを得た。１白金耳をLB培地に植菌・培養（30℃）し、一晩培養液を同組成の培地で希釈し1%Skim Milkを含むLB固体培地に塗布した。30℃で1日培養して取得したコロニーを同組成の固体培地及び、15ppmのテトラサイクリン、1%Skim Milkを含むLB培地に釣菌した。30℃で培養したコロニーからテトラサイクリン感受性株となった株が取得され、PCRによるゲノム解析を行った結果aprE領域に目的の欠失が確認されたため、これを168ΔaprE株とした。
【００３４】
（２）プラスミドの調製
遺伝子のサブクローニングに用いる大腸菌宿主としてEsherichia coli HB101株（宝酒造）を使用した。
ヒト顎下腺由来のcDNAからクローニングしてきたシスタチンS遺伝子を含むプラスミドとしてpUSA3（Saitoh,E., and Isemura,S., J.Biochem.116,:399,(1994)）を使用した。
ヒト成長ホルモン遺伝子を含むcDNAライブラリーとしてプラスミドDNA型cDNA Library Human Pituitary Gland（宝酒造）を用いた。
Bacillus sp. KSM-S237株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を含むプラスミドとしてpHYEglS（Hakamada,Y., etal, Biosci.Biotechnol.Biochem., 64:2281,(2000)）を使用した。
Bacillus sp. KSM-64株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を含むプラスミドとして pCL64(Sumitomo, N., et al,  Biosci. Biotechnol. Biochem., 56:872,(1992))を使用した。
遺伝子をサブクローニングするベクターとしてpHY300PLK（宝酒造）を使用した（図１、図２、図３）。
【００３５】
（３）使用培地及び培養条件
組換え菌の培養には、表１に示したCM培地を使用し、以下の培養条件で行った。すなわち、大型試験管（シード培地、5mL仕込）にて15時間培養した前培養液を、500mLヒダつき三角フラスコ（メイン培地、20mL仕込）に4%植菌し、培養温度30℃、回転数210rpmで3〜4日間培養を行った。
【００３６】
【表１】
0004346368.tif 000002
【００３７】
（４）遺伝子工学的手法
遺伝子断片の増幅にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）法を用いた。PCR法には、Pwo DNAポリメラーゼ（ロシュー・ダイアグノスティックス社）を用いて、鋳型DNA5ng、順方向プライマー及び逆方向プライマー各20pmolとして、PCR反応（変性温度：94℃-1分、アニール温度：54℃-0.5分、DNA鎖伸張温度：72℃-4分を１サイクルとして３０回繰り返す）をDNA Thermal Cycler（パーキン・エルマ社）を用いて行った。増幅された遺伝子断片の塩基配列をサンガー法［F.Sangar, et.al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,,74:5463(1982)］により決定し、PCR法による配列のエラーが起こっていないことを確認した。構築した組換えプラスミドの枯草菌への導入にはプロトプラスト法［Chang,S., and Cohen,N., S.,,Mol.Gen.Genet.,168:111,(1979)］を用いた。
【００３８】
（５）組換え菌生産物の解析
培養後の培養液を遠心分離し培養上清と菌体を得た。菌体を菌体破砕緩衝液（50mM リン酸緩衝液(pH7.4)、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT、5%グリセロール）で懸濁し、超音波破砕（BIOMIC社7500型、Output 5、Duty Cycle 50%、15分間破砕）後、遠心分離した上清を菌体破砕物とした。
SDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）はレディゲルJ(分離ゲル濃度15%、バイオラッド)を用い、泳動後のゲルをクイックCBB（関東化学）にてタンパク質染色した。
（ａ）シスタチンSの検出
抗体染色はSDS-PAGEで分離したタンパク質をゲルからPVDFフィルター（ミリポア、Immobilonトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体に後記参考例に記載の方法により作製した組換え大腸菌由来のシスタチンSに対する抗シスタチンSマウス抗体、二次抗体にHRP標識の抗マウスIg抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク社）によって、シスタチンSの検出を行った。
（ｂ）ヒト成長ホルモンの検出
抗体染色はSDS-PAGEで分離したタンパク質をゲルからPVDFフィルター（ミリポア、Immobilonトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体にAnti-GrowthHormone抗体（Rabbit Polyclonal、PROGEN BIOTECHNIK GMBH社）、二次抗体にHRP標識の抗Rabbit Ig抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク社）によって、ヒト成長ホルモンの検出を行った。
【００３９】
参考例  抗シスタチンS抗体の作製
（１）パパイン阻害活性の測定方法
シスタチンSのパパイン阻害活性はBarretら（Methods in enzymology Vol.80、pp771（1981））に準じて測定した。10mMベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（Benzoil-L-arginine-4-nitroanilide）ジメチルスルホキシド溶液を基質とし、２mMのEDTAを含む、200mMリン酸緩衝液にDTTを終濃度８mMとなるように添加した。パパイン１mg/mLの濃度でDTTを含まない緩衝液に溶解した。また、反応停止用溶液として５％トリクロロ酢酸溶液を使用した。測定は以下の手順で行った。測定用チューブに１mLDTTを含む緩衝液と0.05mLのパパイン溶液、試料溶液0.5mLおよび全量２mLとなるよう蒸留水を入れ、25℃で５分間インキュベートした。ついで基質溶液0.05mLを加え攪拌した。25℃で15分反応後、１mLの反応停止液を加え、沈殿が生じた場合は10000rpm、10分間遠心分離を行い、上清の405nmの吸光度を測定した。相対阻害活性は次式（１）より求めた。
相対阻害活性（％）＝１００−（（Ａ０−ＡＩ）／Ａ０×１００）    （１）
Ａ０：阻害剤フリーの吸光度
ＡＩ：サンプルの吸光度
【００４０】
（２）シスタチンSの組換え大腸菌による製造
ヒト唾液由来シスタチンSは斎藤ら［J.Biochem.116,399−405（1994）］の方法に従って製造した。即ち、ヒトシスタチンSのcDNAを含む発現ベクターを大腸菌（Escherichia coli）JM109株（宝酒造株式会社製）を宿主として組換え操作を行い、組換え体を作成した。組換え大腸菌の培養はアンピシリン（50μg/mL）添加LB培地50mLにて前培養を行った。本培養はＭ９最小培地にシュークロース（4g/L）、チアミン（2mg/L）、MgSO4（1mM）、CaCl2（0.1mM）とアンピシリン（50mg/L）を加えた培地16Lを用い30-L容ジャーファーメンターによって、前培養液16mLを添加後、培養温度37℃、通気量４L/min、攪拌数250rpmの条件で行った。培養４時間後（OD600=0.5）にイソプロピルチオガラクトシド（終濃度0.3mM）を添加してさらに４時間培養を行い、シスタチンSを発現した。培養後、Freijeら［J.Biol.Chem.268,15737−15744（1993）］の方法によって菌体処理を行いペリプラズム画分を調製した。
【００４１】
（３）シスタチンSの精製
シスタチンSの精製はDEAE-Toyopearl 650C（2.5cm×10cm）によるイオンクロマトグラフィーによって行った。ペリプラズム画分を10mM  NH4HCO3（pH8）にて平衡化したDEAE-Toyopearl 650Cカラム（2.5cm×10cm）にロードする。10mM NH4HCO3（pH８）で溶出洗浄後、10mM NH4HCO3（pH８）（250mL）、４％NaCl溶解10mM NH4HCO3（pH８）（250mL）で形成されるグラジエントで溶出する。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
【００４２】
パパイン阻害活性を有するフラクションを凍結乾燥後、再度60mLの蒸留水に溶解後、Centriprep3（MILLIPORE社製）にて20mLに脱塩濃縮を行った。さらに、40mLの蒸留水を添加して、同様に脱塩濃縮を２回行った。得られた脱塩濃縮液20mLのうち10mLをさらにCentriprep3にて濃縮を行い1.5mLとした。得られたシスタチンS濃縮液1.5mLをさらに10mM Tris-HClバッファー（pH7.2）で平衡化したToyopearl HW55Fカラム（1.5cm×94cm）によるゲル濾過を行った。組換えシスタチンSを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
パパイン阻害活性を有するフラクションをCentriprep3にて濃縮を行い２mLとした。得られた濃縮液をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準として定量した結果、678μg/mLであった。
【００４３】
（４）抗シスタチンSマウス抗体の作製
（３）によって得られた精製シスタチンSを用いて常法に従って抗シスタチンSマウス抗体を作製した。即ち雌のBALB/cマウスに精製シスタチンS溶液60μLを100μL FCAと混合して腹腔内注射により初回免疫を行った。さらに、14、28、48日後に精製シスタチンS溶液60μLを100μL MPL＋TDMエマルジョンと混合して腹腔内注射を行った。52日後にマウス尾静脈より全血を採取し、抗血清を分離し抗シスタチンSマウス抗体とした。
【００４４】
比較例１  枯草菌168株によるヒト・シスタチンＳの発現
KSM-S237株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドpHYEglS5ngを鋳型としS237UE（GCGAATTCGATTTGCCGATGCAACAGGCTTATATTTAG；配列番号８）及びCS237D（CTCCTCCTTGGAGCTCGATGCTGCAAGAGCTGC；配列番号１０）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-S237株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域をコードする0.6Kbの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドpUSA3 5ngを鋳型とし237CSU（GCAGCTCTTGCAGCATCGAGCTCCAAGGAGGAG；配列番号９）及びpSD（GAAAGCTTAGGCTTCTTGACACCTGGAGTTCACCAGGGACATTCTG；配列番号７）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりヒト・シスタチンSをコードする0.4kbの遺伝子断片を得た。この0.4Kb断片の塩基配列をサンガー法により決定し構造遺伝子中のEcoRＩサイトをコドンに影響の無いように（AAT→AAC）消去したことを確認した。単離した0.6Kb断片、0.4Kb断片をそれぞれ5ngを鋳型としてS237UE及びpSDの2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-S237株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト・シスタチンSをコードする遺伝子が結合した1.0kb遺伝子断片を得た。得られた1.0Kb断片とプラスミドpHY300PLKをEcoRI及びHindIII処理後、T4DNAリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌HB101株に導入し、5μg/mLテトラサイクリンを含むLB培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［D.,M.,Glover, DNA Cloning Volume II,IRL PRESS, Oxford,Washington DC,(1985)］にしたがって調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドpH237-USを得た（図１）。プロトプラスト法にて枯草菌168株に組換えプラスミドpH237-USを導入し、得られた枯草菌について培養（30℃、3日間）を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて菌体破砕物中にヒト・シスタチンSに相当する分子サイズ（14Kd）のタンパク質バンドが検出できたが、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった（図４）。
【００４５】
比較例２  枯草菌168株によるヒト成長ホルモンの発現
Bacillus sp. KSM-S237株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドpHYEglS 5ngを鋳型としS237UE（GCGAATTCGATTTGCCGATGCAACAGGCTTATATTTAG；配列番号８）及びGH237D（GGTTGGGAATGCTGCAAGAGCTGC；配列番号１１）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-S237株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域をコードする0.6Kbの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドDNA型cDNA Library  Human Pituitary Gland（宝酒造）5ngを鋳型とし237GHU（CTTGCAGCATTCCCAACCATTCCCTTATC；；配列番号１２）及びGHDH（GAAAGCTTCTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC；配列番号１３）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRにより0.6kbの遺伝子断片を得た。この0.6Kb断片の塩基配列をサンガー法により決定し本断片がヒト成長ホルモンをコードすることを確認した。単離した0.6Kb断片、0.6Kb断片をそれぞれ5ngを鋳型としてS237UE及びGHDHの2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-S237株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が結合した1.2kb遺伝子断片を得た。得られた1.2Kb断片とプラスミドpHY300PLKをEcoRＩ及びHindIII処理後、T4DNAリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌HB101株に導入し、5μg/mLテトラサイクリンを含むLB培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［D., M., Glover, DNA Cloning Volume II,IRL PRESS, Oxford, Washington DC,(1985)］に従って調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドpH237-GHを得た（図２）。プロトプラスト法にて枯草菌168株に組換えプラスミドpH237-GHを導入し、得られた枯草菌について培養（30℃、3日間）を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった。
【００４６】
比較例３  枯草菌168株によるヒト・シスタチンＳの発現
KSM-64株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドpCL64 5ngを鋳型としSP64UE（TAGAATTCGAAGACAACGGACATAAGAAA；配列番号１４）及びCS64D（CTCCTCCTTGGAGCTCGATGCTGCAAGAGCTGC；配列番号１５）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-64株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域をコードする0.6Kbの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドpUSA3 5ngを鋳型とし64CSU（GCAGCTCTTGCAGCATCGAGCTCCAAGGAGGAG；配列番号１６）及びpSD（GAAAGCTTAGGCTTCTTGACACCTGGAGTTCACCAGGGACATTCTG；配列番号７）の2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりヒト・シスタチンSをコードする0.4kbの遺伝子断片を得た。この0.4Kb断片の塩基配列をサンガー法により決定し構造遺伝子中のEcoRIサイトをコドンに影響の無いように（AAT→AAC）消去したことを確認した。単離した0.6Kb断片、0.4Kb断片をそれぞれ5ngを鋳型としてSP64UE及びpSDの2種類のプライマー各20nmolを用いたPCRによりKSM-64株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト・シスタチンSをコードする遺伝子が結合した1.0kb遺伝子断片を得た。得られた1.0Kb断片とプラスミドpHY300PLKをEcoRI及びHindIII処理後、T4DNAリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌HB101株に導入し、5μg/mLテトラサイクリンを含むLB培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［D., M., Glover, DNA Cloning Volume II,IRL PRESS, Oxford, Washington DC,(1985)］にしたがって調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドpH64-USを得た（図３）。プロトプラスト法にて枯草菌168株に組換えプラスミドpH64-USを導入し、得られた枯草菌について培養（30℃、3日間）を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった。
【００４７】
実施例１  アルカリアルカリプロテーゼ遺伝子欠損株（ΔaprE株）によるシスタチンの発現
組換えプラスミドpH237-USをBacillus subtilis 168ΔaprE株に導入し、得られた組換え体について培養（30℃、4日間）を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてシスタチンが大量に菌体外分泌されていることが確認され、タンパク質染色においても充分に生産が確認できる生産レベルであることが認められた（図５）。
【００４８】
実施例２  アルカリプロテアーゼ遺伝子欠損株（168△aprE株）によるヒト成長ホルモンの発現
組換えプラスミドpH237-GHを枯草菌168△aprE株に導入し、得られた組換え体について培養を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてヒト成長ホルモンが菌体外分泌されていることが確認された（図６）。
【００４９】
実施例３  アルカリプロテアーゼ遺伝子欠損株（168△aprE株）によるシスタチンの発現
組換えプラスミドpH64-USを枯草菌168△aprE株に導入し、得られた組換え体について培養を行い、培養上清のSDS電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてシスタチンが菌体外分泌されていることが確認された（図７）。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の組換え枯草菌を用いれば、目的タンパク質を効率よく且つ大量に生産することができる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】シスタチン組換えプラスミドの構築（Ｓ２３７プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図２】ヒト成長ホルモン組換えプラスミドの構築（Ｓ２３７プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図３】シスタチン組替えプラスミドの構築（６４プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図４】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（比較例１）。
【図５】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（実施例１）。
【図６】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト成長ホルモン）の解析結果を示す図である（実施例２）。
【図７】６４プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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