(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸でコロニー形成する能力を有する１種以上のラクトバチルス株を含み、ここで、該株が、Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520およびLactobacillus種AC:3 DSM 12429からなる群より選択される、ウマ飼料製品。
【請求項２】
ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸でコロニー形成する能力を有するラクトバチルス株で発酵された飼料であることを特徴とし、ここで、該株が、Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520およびLactobacillus種AC:3 DSM 12429からなる群より選択される、請求項１に記載の飼料製品。
【請求項３】
飼料が穀類、野菜、青刈または干し草であることを特徴とする、請求項１または２に記載の飼料製品。
【請求項４】
Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520またはLactobacillus種AC:3 DSM 12429で発酵されたオートミール粥であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の飼料製品。
【請求項５】
エンシレージであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の飼料製品。
【請求項６】
寄託番号DSM 11520を有するLactobacillus plantarum JI:1。
【請求項７】
寄託番号DSM 12429を有するLactobacillus種AC:3。
【請求項８】
ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸でコロニー形成する能力を有する、寄託番号DSM 11520を有する株Lactobacillus plantarum JI:1の、ウマ腸フローラの障害を予防または治療する医薬調製のための使用。
【請求項９】
ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸にコロニー形成する能力を有する、寄託番号DSM 11520を有する株Lactobacillus plantarum JI:1の、ウマ胃炎を予防または治療する医薬調製のための使用。
【請求項１０】
ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸にコロニー形成する能力を有する、寄託番号DSM 11520を有する株Lactobacillus plantarum JI:1の、ウマ腸におけるバチルス亜種およびサルファイト還元クロストリジウムの数を減少させる医薬調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の新規な株、および１種以上の該株を含むウマの飼料製品に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ウマの腸フローラにおける障害は、飼料から栄養素を取込む低下した能力、減少した効率、感染に対する低下した耐性および異なる種の付随する感染をもたらし得る。他の症状は、糞便の変化した固さであり、それはしばしば悪臭がし、および体毛の不快な外被(coat)である。腸フローラの障害は、特にストレス状態、例えば、長距離輸送または安定な環境の変化、あまりにも激しいトレーニングおよび飼料の変化、さらに抗生物質による治療において現れることが周知である。障害された腸フローラの問題は、子ウマでも起こり、それは、それらの初期の生活の間に、それら自身の腸ミクロフローラを得なければならない。
【０００３】
腸の細菌フローラの変化に関連し得る異なる疾患は、腸粘膜の炎症および胃潰瘍、および例えば、腸クロストリジオシス(chlostridiosis)のような、特にClostridium difficileによって引き起こされる下痢および毒血症を現わす急性大腸炎をもたらす細菌感染、およびバロン-グラッフ病(Baron-Gruff-disease)のようなウェルシ菌(Clostridium perfringens)によって引き起こされる疝痛である。
【０００４】
糞便中の大腸菌型細菌の存在は、腸フローラの障害に関するウマの健康状態を判断するのに、長い間使われてきた。高含量の該細菌は、腸が良い状態にあることを示すと考えられるが、その低含量ならびに高含量のバチルスおよびクロストリジウム亜種は、それぞれ、腸障害に関連する。糸状菌および他の真菌の存在も、腸フローラに有害な影響を有すると考えられている。さらに、37℃未満に低下した体温は、胃腸管内の問題を示すと考えられている。ウマの正常な温度は、37.3-37.8℃の範囲である。
【０００５】
ラクトバチルスは、健康なウマの腸ミクロフローラ中の主要な群の微生物の１つである。Fujisawaらは、Bifidobacteria Microflora, Vol.12(2), p.87-90, 1993に、健康なウマの胃腸管からのラクチバチルスの286株の単離を開示している。株の主要な部分は、種L. salivarius、L. acidophilus(アシドフィルス菌)およびL. reuteriに属するものとして同定され得、最後の２種は胃腸管の全ての部分で見られたが、L. salivariusは、胃から単離されなかった。ミクロフローラは、ウマが食べる飼料のタイプにも影響されることを思い起こすことも重要である。
【０００６】
異なる細菌および酵母の調製物であり、ヒトおよび動物の健康を改善する目的で経口投与される共生物(probiotics)は、腸機能および健康の一般的状態を改善するために腸障害に対して長い間使用されてきた。共生物として、通常使用されているのは、異なる株の乳酸産生細菌、例えば、ラクチバチルスおよびストレプトコッカス(Streptococcus)の株である。共生仮説は、該細菌が、ストレスまたは病気の状態の間に、即ち、病原性細菌が好都合なように腸フローラが障害されるときに充分量で腸に加えられ得るなら、腸内での望ましくない細菌株の樹立は妨げられると述べている。従って、健康な腸フローラを維持することは、腸フローラの障害に関連するそれらの疾患を予防するのに決定的であるだろう。
【０００７】
Fox, Veterinary Medicine, August 1988, Probiotics: Intestinal inoculants for production animalsには、異なる動物、特にニワトリ、ブタおよび子ウシを育てるのに使用される異なる市販の共生物について概説が為されている。
【０００８】
（従来技術）
今日、悪臭のある糞便を有するウマに、サワーミルクまたはヨーグルトを食べさせ、胃および腸内に横たわる障害を克服することは、一般的である。市場に出ているウマ製品は、例えば、Bakteriebalans(Lantmannen, スウェーデン)およびLactosat(登録商標)hast(Ewos Sverige AB, Sodertalje)であり、それらは共に、乳酸菌産生細菌、即ち、ブルガリア菌(Lactobacillus bulgaricus)、熱耐性乳酸菌(Streptococcus thermophilus)およびStreptococcus faeciumの３種の異なる株を含む。該剤は、通常、投与される製品に存在するラクチバチルスを、発酵製品中で自然に広がるように、或いは、ヒトから単離されたようにのいずれかで有する。
【０００９】
ウマ腸障害に対して使用された他の剤は、ColiCure(VETTECH AB, ストックホルム)であり、大腸菌の精製され安定化された株からなる製品で、それは、最初ウマから＞109生菌/mlの濃度で単離されたものである。同じ原理は、"マッシュ(mash)"投与の背景にあり、それは、健康なウマからの分散された糞便であり、それは腸環境に適合し、その中で樹立され得る細菌株を得ることができる。しかしながら、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌、例えば、大腸菌を添加することは、病原性および内毒素の発生という観点から議論のあるところである。
【００１０】
EP0203586は、動物の胃腸疾患、特に大腸菌の腸毒素産生株によって引き起こされるものの治療のための、ブタから単離された発酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)ATCC 53113株に基づく組成物を開示している。新しい組成物の利点は、それが、病原性でなく、感染性生物が腸粘膜に結合するのを妨げることによって作用することであると言われている。胃腸疾患を予防または治療するのに使用された異なる細菌についても概説が為されたが、全て、部分的にのみ有効であると判明した。
【００１１】
Lactobacillus plantarumの特定の株が、一定の時間ヒトの腸システム内で樹立されるようになる能力を有することが、既に示されている。EP92916294.9には、ラクチバチルスの特定の株、特にL. plantarum 299 DSM 6595およびその変異株が、腸内で樹立されるようになり、経口投与後の少なくとも11日間維持される能力を有することが記載されている。該株は、ヒトの腸ミクロフローラの異なる障害に対して好ましい影響を有すると判明した。
【００１２】
異なる動物種の腸内の通常のラクチバチルス・フローラは異なり、ラクチバチルスの同じ種は２つの異なる動物種で見い出され得るけれども、その細菌は通常、該種の同じ株には属しない。該株は、実際の環境で樹立されるようになるそれらのチャンスにとって重要である、それら自身の間の差異を提示する。ウマにおける胃腸疾患を治療し得るために、従って、ウマの腸内で樹立されるようになる能力を有する１種以上の細菌株を含む、安全で非毒性の製品に対する持続的な要請がある。
【００１３】
（発明の説明）
本発明は、微生物により引き起こされる腸障害を予防および矯正するウマの飼料製品に関し、それは、ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマの腸にコロニー形成する能力を有する１種以上のラクチバチルス株を含む。
【００１４】
これに関連して、ウマは、Equidae属の対象物、即ち、ウマに加え、ロバおよびシマウマという、類似の組成の腸フローラを有するものを指す。
【００１５】
本発明による飼料製品は、好ましくは、ウマの胃または腸の粘膜から単離され、ウマ腸にコロニー形成する能力を有するラクチバチルスの株で発酵された飼料である。
【００１６】
本発明による飼料製品は、好ましくは、穀類を基礎とする穀草または補助的飼料、青刈または干し草に基づく。
【００１７】
本発明の好ましい局面は、ウマから単離された１種以上のラクチバチルス株、特に任意の下記の新規な株で発酵されたオートムギに基づく飼料製品である。
【００１８】
本発明の他の局面によれば、飼料製品は、ウマから単離された１種以上のラクチバチルス株で発酵された青刈または干し草に基づくエンシレージである。
【００１９】
本発明は、新規な株Lactobacillus plantarum JI:1にも関し、それは、特に腸ミクロフローラにおける障害の予防または治療に使用されるための、ドイツ微生物細胞培養物収集所(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に、1997年4月21日に、番号DSM 11520で寄託されたもの、およびその変異株である。
【００２０】
本発明は、ドイツ微生物細胞培養物収集所に、1998年10月2日に、番号DSM 12429で寄託された他の新規な株Lactobacillus種AC:3、およびその変異株にも関する。
【００２１】
上記の株は、オートムギ上で良く増殖し、美味な飼料製品を生じ、ウマの胃腸管通過を生き残り、ウマの腸内で樹立されるようになる能力を有することが判明している。テストは、新規な株Lactobacillus plantarum JI:1が、ウマ腸の望ましくない細菌の含量、例えば、バチルスのトータル・カウントおよびクロストリジウムのトータル・カウントを減少させ、ウマの免疫反応を改善するように見えることを示した。
【００２２】
本発明による飼料製品は、固体または液体形態の補助的飼料または飼料であり得る。飼料製品は、ラクチバチルスの選択された株によって発酵され得る任意のタイプの飼料に基づく穀草または補助的飼料であり得、例えば、オートムギ、特に黒オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、モロコシまたはトウモロコシ、或いはマメ科植物とくにダイズのような野菜、根菜類およびキャベツ、または草のような青刈もしくは干し草である。
【００２３】
オートムギは、高含量のビタミンやミネラル、バランスの良いアミノ酸組成、極性脂質および繊維の含量により、好ましい飼料である。より高い脂肪含量を有する様々なオートムギが、高い能力の馬にとって適切な飼料であることが最近判明した。
【００２４】
本発明による飼料製品の好ましい局面は、栄養組成物の調製に関する国際特許出願WO89/08405に従い、オートムギから調製され得る。好ましい飼料製品を調製する他の例は、下記に示される。
【００２５】
本発明は、ウマ腸にコロニー形成する能力を有するウマの胃または腸の粘膜から単離された１種以上のラクチバチルス株の使用にも関する。
【００２６】
本発明は特に、新規な株Lactobacillus plantarum JI:1またはその変異株の、ウマ腸フローラにおける障害を予防または治療するための使用にも関する。胃または腸の粘膜における炎症状態も、緩和され得る。本発明は特に、ウマ腸フローラにおける障害を予防または治療する製品を調製するための該株の使用に関する。
【００２７】
本発明による飼料製品は、ストレス状態の前に又はそれに伴って、例えば、レース前のウォーミングアップや輸送などの間に、そのような場合に下痢に襲われるウマに；痩せていて乏しい食欲または悪い外被を有するウマの通常のコンディションを改善させるために；感染に対してウマをより感受性でなくさせ、即ち、免疫反応を強化させるために；抗生物質で治療している間、通常現れる腸フローラの障害、つまり抗生物質による治療にしばしば伴う下痢を防ぐために；胃潰瘍を有するウマに；Clostridium difficileまたは任意の他の病原性微生物に感染したかもしれない下痢または悪臭のある糞便を有するウマに投与され得る。
【００２８】
飼料中のラクチバチルスの含量は、5・108 CFU/gまたはml以下であるべきではなく、成長したウマへの適切な用量は、１日当り2・1012 CFUであり、それは、約2-4リットルの以下に例示するオートムギ粥または約100-200mlの下記の冷凍培養物に対応する。より高い含量が、いかなるリスクもなしに、特定の場合に使用され得る。腐蹄(fouls)に投与されるときは、より少ない量が与えられるべきである。
【００２９】
（実験的部分）
新規な株を産生するために、ラクチバチルスの代表的株を先ずウマから単離し、続いて、該株を分類して、オートムギを発酵し適切なpH低下、良い味および臭いを迅速に与える能力について試験し、最後にウマに対する飼料実験を行なって得られた効果を評価した。
【００３０】
（ラクチバチルスの株の単離）
10頭の健康な、屠殺されたばかりのウマの胃腸管内のラクチバチルス・フローラを、３つの異なる場所、即ち、下部胃(幽門)、小腸(回腸)および大腸(結腸)から1-2cm2の腸粘膜の生検を取って調べた。標本を、滅菌輸送溶液(１リットル当り0.9g NaCl、0.1gペプトン、0.1g Tween 80、0.02gシステイン)で直接的に注意深く洗浄し、糞便中の細菌の混入を排除し、実験室への搬送の間、冷却を維持した。そこで、標本を超音波浴中で５分間、次に試験管シェイカー中で２分間処理し、腸粘膜から細菌を解き放した。トータルで、51サンプルを採った。
【００３１】
ウマの胃腸管におけるラクチバチルス・フローラの同定
サンプル１または２それぞれから、ラクチバチルス単離物を採り、API 50 CHシステム(API Systems S.A., Montalieu,  ヴェルシエ、フランス)に従い、49種の異なる炭素源を発酵する能力に関して特徴付けた。これは、通常、種特異的なパターンを与え、得られた結果を、ラクチバチルスの全ての公知の種の全てのタイプ株を含むラクチバチルスの約200種の異なる公知の株の結果と比較した。下記の結果が得られた：
0004277295.tif 000002
選択された株および特徴付け
続いて、単離された細菌分離株を、下記のように調製されたオートミール粥を発酵する能力について調べた。
【００３２】
18.5重量％のオートミール(MP-450, Kungsornen AB, Jarna)  0.925重量％のモルト処理したオオムギ・ミール(MBF, Nord Malt AB, Soderhamn)を、生水と混合し、ゆっくりと攪拌しながら95℃に加熱した。30分後、粥を37℃に冷却し、異なる株で20時間、pH４以下まで発酵した。特に、最終産物のpHの低下速度、並びに臭いおよびアロマを調べた。最良の結果は、分離株L. plantarumおよびL. salivarius様を出発培養物として用いたときに得られ、最悪の結果は、L. reuteriおよびL. johnsonii様を用いて得られた。
【００３３】
２つの株が、上記に基づいて選択された。それらの株を、API 50 CH上で表現型的に、および分析方法RAPDおよびREAにより遺伝子型的にLactobacillus plantarum JI:1およびLactobacillus種AC:3それぞれとして、同定した。このプロセスでは、精製された分離株を、ブロス中で終夜、培養した。API 50 CHL培地中に接種する前に、培養物を、0.9% NaCl溶液で１回洗浄した。サンプルを、２日および７日後に読んだ。結果を、０(紫色)から５(黄色)まで評価し、３−５の数値を陽性と見なした。
【００３４】
遺伝子型による特徴付け
無作為に増幅した多形性DNA(RAPD)
RAPDは、鋳型変性、プライマー・アニーリングおよびプライマー伸張の繰返しサイクルからなるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。これは、ゲノムの特定のフラグメントの増幅を与える。
【００３５】
精製された細菌分離物を、1%グルコースを含むラクチバチルス含有培地(Lactobacillus Carrying Medium)(LMC, Efthymiou and Hansen, 1992)中で、終夜培養した。細胞を、100μlの培養物から遠心分離により回収し、1 mlの滅菌蒸留水で２回洗浄した。細胞を、0.25ml滅菌蒸留水中に再懸濁し、続いて、IKAVibrax VXRシェイカー(IKA Labortechnik Staufen, ドイツ)を用いて最大速度で30分間、冷却しながら、ガラスビーズ(直径0.2mm)とともに激しくシェイクすることにより、崩壊させた。細胞破片を、遠心分離によりペレット化し、１μlの上清をPCR用に使用した。PCRを、DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer, ノーウォーク, 米国)中で、９量体プライマー(ACGCGCCCT; Pharmacia Biotech, スウェーデン)を用いて、行なった。ヌクレオチドを、濃度0.2mmol/lの各dNTP(Perkin Elmer; ブランヒバーグ、ニュージャージー州、米国)で加えた。Taqポリメラーゼ濃度は、50U/ml(Boehringer Mannheim)であり、緩衝液濃度は100U/ml(10×PCR緩衝液; Boehringer Mannhein)であった。反応混合物を、鉱油でカバーし、下記の温度サイクルに供した：94℃で45秒間；30℃で120秒間；72℃で60秒間、４サイクルの間、続いて、94℃で45秒間；36℃で30秒間；72℃で30秒間を26サイクル(伸張工程は各新サイクルについて１秒間長く行なった)。PCRプロセスは、75℃で10分間で完了し、次に、サンプルを４℃に冷却した。
【００３６】
20μlのサンプルを、サイズ150×115mmの75ml 1.5%アガロース(タイプIII: High EEO, Sigma, セントルイス、米国)からなる、水没した水平なアガロースゲル・プレートに加えて、ゲル電気泳動を行なった。ゲルを、冷却することなく、TB電気泳動用緩衝液(89mMホウ酸、89mM Tris-OH、2.5mM EDTA、pH 8.3)中で100Vで、約2.5時間ランした。0.5μmのDNA分子量マーカーVI(Boehringer Mannheim Scandinavia、ブロマ、スウェーデン)を、標準として使用した。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウム(3μg ml-1)中で５分間染色し、続いて、10分間洗浄し、UVトランスルミネーター(UVP Inc., サンガブリエル、カリフォルニア州、米国)で302nmで可視化させ、写真撮影した。
【００３７】
図１には、左から、L. plantarum JI:1、L. plantarum ATCC 149 17Tの標準菌株、およびマーカーのRAPDパターンが示されている。これから、本発明によるこの新規な株のパターンが、標準菌株のパターンと僅かに異なることが判り得る。同様にして、提案された株Lactobacillus salivarius様AC:3(APIによる)は、L. salivarius亜種salivarium ATCC 11741と異なった(データは示さず)。
【００３８】
染色体DNAの精製
染色体DNAの調製および精製は、Stahlら、International Journal of Systematic Bacteriology 40:189-193, 1990に記載される方法に従い行なった。株を、1%グルコースを含む100mlブロス中で、終夜37℃で培養し、続いて、回収し、TES(50mM NaCl, 100mM Tris, 70mM EDTAナトリウム, pH8.0)中で洗浄し、3ml TES + 25%(重量/体積)スクロース中に懸濁した。120mgのリゾチーム(品質VI、Sigma)を補足した2ml TES + 25%スクロースおよび140Uムタノリシン(mutanolysine)(Sigma)を加えた。細胞を、42℃で2時間インキュベートし；次に、3mgプロテイナーゼK(品質XI; Sigma)を加え、懸濁液をさらに37℃で30分間インキュベートした。氷上で冷却後、1mlの5% NaCl溶液、1ml 20%ドデシル硫酸および11ml TESを加え、懸濁液をガラス棒を用いて注意深く攪拌し、65℃に加熱した。続いて、細胞ライゼートを、再蒸留されたフェノール-クロロホルム(1:1)で１回、イソアミルアルコール-クロロホルム(1:24)で１回抽出した。次に、DNAを、エタノールを用いて20℃で沈殿した。
【００３９】
次に、染色体DNAを精製し、BauerおよびVinograd, Journal of Molecular Biology 33, 141-171, 1968に従い、臭化エチジウムを用いてCsCl勾配で密度遠心分離により、共有結合した閉環プラスミドDNAから分離した。DNA濃度を、製造業者の推奨により、染料Hoechst 33258を用い、フルオロメーター(モデルTKO 100 Hoefer Scientific Instruments、サンフランシスコ)中で測定した。
【００４０】
制限エンドヌクレアーゼ分析(REA)
0.75μgの精製された染色体DNAの部分を、10U HindIII、ClaIおよびEcoRI(Boehringer Mannheim)を用いて、別々に37℃で４時間消化した。150ml 0.9%アガロース(超純粋DNA品質、BioRad Laboratories)からなる水没水平アガロースゲル・プレートを用いてゲル電気泳動を行ない、それらをゲル・プレートとしてムルド(muld)した。0.2μgの高分子量DNAマーカー(BRL)を、0.5μgのDNA分子量マーカーVI(Boehringer Mannheim)とともに、標準として使用した。さらに、EcoRIで消化したpHC79を、それぞれのウェルに、内部標準として加えた。最小バンドねじれ及び最大鋭度は、DNAサンプルをFicollローディング緩衝液(2g Ficoll、8ml水、0.25%ブロモフェノール)に加えることによって到達された。
【００４１】
フラグメントを、0.9%アガロースゲル上で8.5℃にて40Vで18時間分離し、続いて、臭化エチジウム(2μg/ml)中で20分間染色し、蒸留水中で汚れを除き、写真撮影した。これにより、良く分散し非常に良好に分離されたバンドが、分子量1.2×106に下って得られた、図２を参照。この図は、制限酵素EccoR1、Cla1およびHindIIIでそれぞれ連続的に処理した後の、Lactobacillus plantarum株JI:1、299vおよびATCC 149 17T(標準菌株)のREAパターンを示す。最初および最後のレーンは、マーカーを示す。株AC:3を、REAにより分析して、Lactobacillus salivarius亜種salivariusの標準菌株からはかなり異なることが見い出された(データは示さない)。
【００４２】
飼料組成の例
オートミール粥の工業的規模での調製
オートミール(318kg)、モルト処理したオオムギ粉（12.8kg）および水(1682 l)を混合し、88℃に加熱し、温度は最初は55℃で1時間、続いて、88℃で0.5時間維持した。続いて、混合物を38℃に冷却し、それは約0.5時間を必要とした。この温度で、スターターLactobacillus plantarum JI:1を、混合物の2000 lに対して2 lの量で接種し、2・107 CFU/mlの濃度を与える。全体を、38℃で15-20時間インキュベートし、その後、pHを<3.9に低下させるべきである。次に、発酵した混合物を６−８℃に冷却し、梱包および冷却貯蔵の後で、流通および販売の準備が整う。
【００４３】
新鮮に調製された最終製品は、1-2・109 CFU/mlを含み、１−２ヶ月間貯蔵した後は、細菌カウントは約5・108 CFU/mlに減少した。
【００４４】
上記の飼料製品の栄養価は、下記の表から明らかである。
0004277295.tif 000003
*  ASPら、J. Agric. Food Chem. 31:476-482による。
【００４５】
**  SBR, Nordisk Metodikkommitte for livsmedel No.131, 1989による。
【００４６】
上記の方法の調製物にCaCO3を加えることによって、より高い細菌カウントを有する飼料組成物が、幾分延長された発酵プロセス(20-22時間)の後に得られる。
【００４７】
Lactobacillus種AC:3をスターターとして用いることにより、対応するオートミール粥が得られる。
【００４８】
発酵されたニンジン
発酵されたニンジンのバッチを調製するために、ニンジン(10kg)を、おおまかにすりおろし、または任意の他の方法で細かく刻む。水(5 l)を煮沸し、その後40℃に冷却し、そのとき、Lactobacillus plantarum JI:1(接種物2・1011 CFU、約2gの凍結乾燥製品または20mlの凍結培養物に対応する)および塩(100g)を加える。すりおろしたニンジンは、滅菌容器中で、接種液とともに層をなし、密にパックされる。野菜は、液体の表面より下であることが重要である。容器を密封し、続いて、24℃で約２日間インキュベートする。熟成は、冷蔵庫または冷却貯蔵室中で、約３−４週間で起こる。続いて、発酵された製品は、約１年間冷却貯蔵され得る。
【００４９】
凍結乾燥された製品
1  l  水
200g  スキムミルクパウダー
2g  酵母抽出物
1  l  細菌懸濁液(5・10 CFU/ml)
上記の成分を混合し、凍結乾燥器中の棚に置かれている滅菌プレートに移す。乾燥が開始される前に、製品を約-40℃に凍結する。約３日後、乾燥を終了し、得られた製品を粉末に砕いて、それをコントロールされた窒素雰囲気下で滅菌バッグ中に梱包する。得られた製品の品質維持は、凍結貯蔵で約２年である。
【００５０】
凍結培養物
5・1010 CFU/mlの含量を有する1 lの細菌懸濁液を、下記の組成を有する1 lの凍結培地に加える。
【００５１】
リン酸二水素カリウム                0.36g
リン酸水素二カリウム                1.64g
クエン酸三ナトリウム                1.18g
硫酸マグネシウム                    0.5g
グリセロール                        240g
蒸留水                              760ml
得られた製品を、200ml瓶中で-80℃で凍結する。
【００５２】
エンシレージの調製
エンシレージ化は、２つの原理に基づいている、即ち、緑色塊のpHを4.2以下に低下させること、および空気中酸素を排除することである。50gのLactobacillus plantarum JI:1の凍結乾燥培養物を、数リットルの水と混合して粉末を溶解し、続いて、さらなる水と数kgのメラス(melasses)をトータル体積50 lまで加える。緑色塊が梱に巻かれプラスチックに囲まれるとき、細菌溶液は、わら切断機またはプレスに搭載されている分配ポンプにより、200kgの緑色塊当り約1 lの量で塊に分配される。細菌溶液の均一な混合物を得て、添加された細菌が梱全体の中で増殖し得ることが重要である。エンシレージがサイロ内で調製されるとき、細菌溶液は、サイロのファンを介して分配ポンプにより添加される。
【００５３】
ウマでのインビボでのテスト
オートミール粥中L. plantarum JI:1の投与
この研究は、10頭の速足馬を含み、そのうちの５頭は、８週間の間毎日2 lの発酵オートミール粥を与えられ、他方、オートミール粥を与えられない他の５頭は、参照ウマとして研究に加わった。糞便のサンプルを、ウマがオートミール粥を食べさせられる直前に別々に６回、１、３、６および８週間後および最後にはウマがオートミール粥を食べるのを止めた１週間後に採った。微生物学的分析は、ラクチバチルス、腸内細菌およびバチルスのトータル数を含んだ。糞便サンプルのpH値も、分析された。さらに、全ラクチバチルス・フローラのL. plantarum JI:1の数が分析された。
【００５４】
微生物学的分析に加えて、ウマの状態の幾つかの主観的評価も、テスト期間中に為された。これは、糞便の固さ、糞便の臭い、ウマの脂肪、外被の艶および最後にウマの一般的状態を含んだ。
【００５５】
結果は、摂食期間中、ウマの２頭において、ラクチバチルス量が実質的に増加したことを示す。該ウマの両方とも、テストの開始時には、低含量のラクチバチルスを有した。発酵オートミール粥を得た全てのウマからは、細菌L. plantarum JI:1が糞便から単離された。数は、全ラクチバチルス・フローラの1〜72%に変化した。４頭のウマのうち３頭は、オートミール粥摂食の完了の１週間後でも、それらの糞便中にL. plantarum JI:1を有した。
【００５６】
バチルス亜種の数は、摂食期間中および１週間後に、ウマの４頭で有意に減少したが、テスト中または後には糞便の腸内細菌の数またはpH値にいかなる変化も観察できなかった。
【００５７】
発酵オートミール粥は、ウマに非常に好まれ、殆ど"一片のうまいもの(tit bit)"のようになった。ウマの食欲が増大したことを示す幾つかの兆候もあった。
【００５８】
ウマの１頭である、Luradej、登録番号90-4843については、胃と腸に再発性の問題が注目される。該問題の開始と同時に、体温は約36℃に低下する。細菌Lactobacillus plantarum JI:1を含む発酵オートミール粥を２週間摂取した後、体温は、数ヶ月間で初めて37.5℃の正常レベルに上昇した。そのウマが、８週間の間それを取った後でオートミール粥を食べるのを止めたとき、体温は２−３日後に再び約36℃に低下した。短い中断の後、ウマは再び、オートミール粥を食べさせられ、それは、体温を正常レベルに上昇させた。これを、後の機会にもう１度繰返した。上記のオートミール粥を２年間毎日摂取した後、Luradejは、 L.種AC:3の細菌濃縮物を同じ量で与えられた。これは、ウマの一般的状態において、さらなる陽性の反応を生じた。
【００５９】
テスト期間の間、１頭のウマを、広域スペクトル抗生物質(Gentaject vet.、1.2gを１日に２回、７日間)で処理した。ウマを、この抗生物質で処理するとき、通常は、幾つかの副作用、例えば、長期間の胃と腸の問題がある。この場合、ウマは、抗生物質治療の全期間およびさらに、その後の多くの週も、発酵オートミール粥を与えられ、ウマは胃にも腸にも全く問題を有しなかった。後の機会に、他のウマおよび他の抗生物質を用いて、これを繰返すと、同じ陽性の結果を生じた。
【００６０】
L. plantarum JI:1のコロニー形成およびウマ糞便中の腸内細菌、バチルス、クロストリジウムの含量に対するその効果
上記のテストに記載された同じ製品を、この研究でも使用した。全部で34頭のウマを、この研究に含めた。それらのうち26頭を、スウェーデンの南部で６人の異なるトロット・トレーナーとともに配置した。ウマは、異なるバックグラウンドを有し、何頭かのウマは、緩く悪臭のする糞便および／または乏しい脂肪および体毛外被の乏しい艶の問題を有していた。ウマは、例えば、穀草および特定の補助的飼料のタイプについて、幾分異なるものを食べさせられていた。何頭かのウマは、定期的に食べてもいた。
【００６１】
ウマは、２ヶ月間、或る場合には３ヶ月間、１日につき2 lの発酵オートミール飼料を食べさせられた。少数のウマは、１日につき1 lのみ定期的に食べさせられた。これは、例えば、何頭かのウマが食べており、草以外のいかなるものを食べることに興味を持たなかった場合であった。糞便のサンプルを、ウマが発酵飼料を食べさせられる直前、および該飼料を２−３ヶ月間与えられた後で採取した。微生物学的分析は、ラクチバチルスのトータル数、ラクチバチルスのトータル数のL. plantarum JI:1の数、腸内細菌、バチルスおよびクロストリジウムのトータル数、並びにB. cereusの数を含んだ。
【００６２】
微生物学的分析に加えて、ウマの状態の幾つかの主観的評価も、テスト期間中に為された。これは、糞便の固さ、糞便の臭い、脂肪、外被の艶、活動性および食欲を含んだ。
【００６３】
結果は、ラクチバチルス数が、この研究においても、ウマで有意に増加することを示した(Wilcoxon兆候ランクテストによる分析後p<0.05)。摂食の開始前の中央値は、糞便の1・106  cfu/g(1・105−1.7・107)および処理の２−３ヶ月後には3.5・106 cfu/g(1・105−3.8・107)であった。予備L. plantarum JI:1は、摂食後の全てのウマからの糞便で見られた。
【００６４】
バチルスのトータル数の減少は、非常に明らかであり(Wilcoxon兆候ランクテストによる分析後p<0.001)、分析されたウマの80%が摂取後にこれらのカウントの減少を示した。サルファイト還元クロストリジウム・カウントも、処置後に有意に減少した(Wilcoxon兆候ランクテストによる分析後p<0.05)。ここで、分析されたウマの74%が、クロストリジウム量を減少した(糞便の非常に低い、2・102 cfu/g未満のカウントを示すウマは、統計学的分析から除いた)。腸内細菌科の数に関して、いかなる傾向も観察され得なかった。
【００６５】
このテスト期間中に為された興味ある更なる観察は、以下の通りであった：
−何頭かのウマは、テスト開始時に、ストレス状態およびレース前のウォーミングアップ時に、下痢の問題を有した。発酵飼料を短期間摂取した後、この問題は全てのケースで終わった。
−約10頭のウマが、テストの開始時に、緩い糞便の問題を有した。全てのウマが、最大で数週間後、正常な糞便を得た。
−かろうじて10頭のウマが、プロジェクトの開始時に、乏しい脂肪の問題を有した。１頭を除いて全てが、発酵飼料を食べさせられた後に、より優れた脂肪を得た。
−約５頭のウマが、テスト開始時に、外被の乏しい艶を有した。それらは全て、発酵飼料を2,3週間取った後、より優れた外被を得た。
−３頭のウマが、テスト期間中に、抗生物質を得た(ウマの２頭は、広域スペクトル抗生物質を得、１頭はサルファ調製物を得た)。抗生物質を取ったどのケースでも、ウマに対する副作用はなく、代わりの発酵オートミール飼料は、ウマに対する陽性の作用を有し、他の場合には通常である副作用を補うように見える。
−２人のトレーナーが、テスト開始前に、サワーミルクを何頭かのウマに与えたが、注目すべき結果はなかった。発酵オートミール飼料を用いると効果はかなり良いというのが、両者の意見であった。
−３人のトレーナーが、テスト開始前に、製品ColiCureを何頭かのウマでテストしたが、結果は好ましくなかった。発酵飼料はより優れた結果を与えるというのが、全員の意見であった。
【００６６】
26頭のウマに対する発酵オートミール飼料の効果を要約すると、19ケースで、ウマの腸フローラおよび／またはウマの一般的状態に対する多少の陽性効果が観察された。７ケースでのみ、明確な陽性効果は観察されなかった。該ケースの多くでは、いろいろな説明、例えば、悪い衛生状態の濃厚飼料を食べさせたこと、または馬に例えば医薬投与をもたらす他の問題がある。
【００６７】
Jaffa Qui、インビボでのウマの例
Jaffa Qui、登録番号92-1858は、非常に有望な速足馬で、３歳の初めに、彼女の最初のレースに勝った。馬屋を変わったとき、彼女は、３歳として、かなりの量の大腸菌を含む水を６ヶ月間与えられた。後に、新しいトレーナーのもとに移されたとき、全馬屋がライノウイルスおよびヘルペスウイルスを有することが徐々に判ってきた。Jaffa Quiは、恐らく悪い質の水により引き起こされた低下した抵抗力により、全てのウマの最大の病気になった。彼女は、蕁麻疹にもなり、日毎みすぼらしく見えた。彼女は、冬の外被を落とさず、けばになり、殆ど食べるのを止め、トレーニングのエネルギーが無くなった。本発明によるオーミール粥の投与後、彼女はすぐにそれを受け入れ、食べるのを開始し、ますます良くなっていき、もう以前のようでなく、すっかり回復したと現在宣言し得る。彼女は、以前よりも良い脂肪および艶のある外被を有する。彼女は、最後の数ヶ月間、トレーニングも非常に良く受け入れ、現在適格とされ、彼女のデビューを果たした。
【００６８】
胃炎を有するウマへのLactobacillus plantarum 299vの投与
胃炎の問題を有する５頭のウマについて、その１頭はLosec(Astra AB, Sodertalje, スウェーデン)投与後に部分的に胃炎が治ったが、上記のオートミール粥で何週間も治療された。全てのウマが、胃炎からの充分な臨床的回復を示し、２頭のウマは胃鏡検査によれば、100%回復した。１つのケースでは、ウマを同時にLosecで処置した。詳細、並びに結果を、下記の表に示す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
結果は、本発明の飼料製品が、ウマの胃炎を治療する能力を有することを示す。
【００７１】
L. plantarum 299vおよびL. plantarum JI:1の投与の比較
短期間の間に、上記の最初のテストに含まれていた10頭のウマが、L. plantarum JI:1(ウマ株)の代わりに食品ProViva(登録商標)の一部であるL. plantarum 299v(ヒトから単離された)で作製した発酵オートミール粥を与えられた。これは、トレーナーの知ることなく為された。わずか１週間後に、オートミール粥を用いると、何かがまずいことを彼は認識した。発酵オートミール粥を新しく供給することの効果は、以前よりも劣ることを彼は観察した。就中、Luradejの体温は、発酵オートミール粥を食べさせられたにもかかわらず、以前のように37℃を僅かに上昇することはなかった。これは、ラクチバチルスの正しい種のみでなく、正しいラクチバチルスの正しい株の使用が、いかに重要であるかを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  RAPDによって分析された株を用いた、電気泳動ゲルの写真を示す。
【図２】  REAによって分析された株を用いた、電気泳動ゲルの写真を示す。
【図１】
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【図２】
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