(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースおよび生物活性成分封入脂質リポソームを含む凍結乾燥組成物であって、該生物活性成分の溶解度が≦０．０１（ｗ／ｖ）であり、該トレハロース／脂質の重量比が≦１．５であり、すでに形成したリポソームの外部にトレハロースの全量を凍結乾燥前に加えて製造されることを特徴とする、凍結乾燥組成物。
【請求項２】
生物活性成分がロニダミン、メラトニン、シクロスポリンAおよびビンダリットよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１の凍結乾燥組成物。
【請求項３】
脂質がホスホグリセリド、グリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ガラクトシルおよびグリコシル脂質、コレステロールおよびその誘導体、スフィンゴ脂質、およびこれらの混合物よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１または２の凍結乾燥組成物。
【請求項４】
脂質がリン脂質であることを特徴とする、請求項３の凍結乾燥組成物。
【請求項５】
トレハロース／脂質の重量比が１：２〜１：１であることを特徴とする、請求項１−４いずれかに記載の凍結乾燥組成物。
【請求項６】
リポソームの平均の大きさが５０〜２５０ｎｍであることを特徴とする、請求項１−５いずれかに記載の凍結乾燥組成物。
【請求項７】
リポソームの平均の大きさが５０〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項６の凍結乾燥組成物。
【請求項８】
トレハロースおよび生物活性成分封入脂質リポソームを含む組成物を凍結乾燥する方法であって、
ａ）トレハロース０．２〜１．５重量部を水性リポソーム組成物の脂質１重量部に加え、なお、リポソームの平均の大きさは５０〜２５０ｎｍであり、該リポソームは水に極めて不溶の生物活性成分を含有し、
ｂ）該組成物を凍結乾燥機の冷却板でもって温度−５℃〜−７０℃にまで冷却速度０．５〜２℃／分で冷却し、
ｃ）予め定めた凍結温度に達すると、該組成物を該温度に２〜５時間保ち、
ｄ）５ｘ１０-1〜８ｘ１０-2ミリバールに減圧し、冷却板の温度を上記ｂ）記載の冷却温度に２〜５時間保ち、
ｅ）冷却板の温度を−１５℃にして保ち、水を完全に除去することを特徴とする方法。
【請求項９】
相ｂ）での凍結温度が−２０〜−３０℃であることを特徴とする、請求項８の凍結乾燥方法。
【請求項１０】
相ｂ）での冷却速度が０．７７℃／分であることを特徴とする、請求項８または９の凍結乾燥方法。
【請求項１１】
相ｃ）での時間が３時間であることを特徴とする、請求項８−１０いずれかに記載の凍結乾燥方法。
【請求項１２】
相ｄ）での減圧が６ｘ１０-2ミリバールであることを特徴とする、請求項８−１１いずれかに記載の凍結乾燥方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、水に極めて不溶性の生物活性成分を封入する凍結乾燥リポソームを含む医薬製剤および該医薬製剤を調製する方法に関する。
さらに詳細には、本発明は、水に極めて不溶性の生物活性成分を封入する凍結乾燥リポソームを含み、長時間安定な医薬製剤に関する。
本明細書および請求の範囲において、″水に極めて不溶性″という用語は、水に対して≦０．０１％（ｗ/ｖ）の溶解性を有する上記化合物について用いられる。
リポソームの医療処置での使用を困難にしているのは、凍結乾燥時および長時間保存において十分に安定である医薬製剤を得るのが難しいためであることが知られている。この難点はとりわけ、破裂もしないし一緒に固まりもしないようなリポソームを調製しようとすることからきている。言いかえれば、リポソームは、全部が保たれ、互いに分離していなければならない。
リポソームの構造を完全に保つことは、活性成分が水に極めて不溶である場合においても特に重要である。実際に、凍結乾燥時および/または保存時にリポソームが破裂すると、水溶性活性成分が溶液中へ流れ出てしまって、生理溶液を添加して患者に投与するとき、水性リポソーム溶液を再成せしめることができない。他方、水に極めて不溶性の活性成分を含むリポソームが破裂する場合は、凍結乾燥物を再溶解したとき、要求量より少ない活性成分しか含まない溶液となってしまう。破裂リポソームの量が増えると、溶液中の活性成分の理論量と実際量との差が大きくなる。
水溶性生物活性成分を含むリポソームの凍結乾燥方法は、米国特許第4 857 319に叙述されている。この特許は、好ましくは平均の大きさが５０〜１００nmのリポソームの凍結乾燥について記述しており、二糖類などの保存剤を内部にのみ（リポソーム内に封入）、または外部にのみ、または内部と外部の両方に添加している。二糖類/脂質の重量比の範囲は、０．１：１から４：１であり、好ましくは、二糖類がトレハロースの場合である。凍結段階を液体窒素の温度（−１９５．８℃）で行う。
前述の特許では、凍結乾燥中の安定特性は、再水和によって凍結乾燥物を再溶解した後に、リポソーム内に封入されていた活性成分の保持率を測定する方法で調べられた。
前述した特許の表２によると、保持率が高いのは（９９〜１００％）、トレハロース/脂質の比が１．７６より大きく、かつトレハロースがリポソームの内部および外部両方に存在する場合のみである。前記の割合が０．１１および０．１９のときは、トレハロースがリポソームの内部と外部の両方に存在しても、保持率はそれぞれ２２％および４９％である。対照的に、トレハロースが外部のみ存在しているときは、トレハロースを大量に含んでいても活性成分の保持量は著しく減少する。実際に、トレハロース/脂質の比が３．９であっても、保持率はほんの２６％である。
一方、生物活性成分が水に極めて不溶であるときは、前述の結果は再現できない。実際、リポソームの調製時にトレハロースを添加して、脂質小胞内にトレハロースを封入しようとしても、不均一で滲出性の懸濁液が得られるだけである（比較１および２の調製）。
驚くべきことに、水に極めて不溶性の生物活性成分を含むリポソームが実質的にすべて凍結乾燥中に残存することを発見した。それは、凍結乾燥前にのみ少量のトレハロースをリポソームに加え、かつ該凍結乾燥を凍結段階温度−５℃から−７０℃で行うときである。
本発明の目的は、トレハロースおよび生物活性成分封入脂質リポソームを含む凍結乾燥組成物を提供することであって、生物活性成分が水に極めて不溶であり、トレハロース/脂質の重量比が≦１．５であり、すでに形成したリポソームの外部にトレハロース全量を凍結乾燥前に加えることを特徴とする。
再水和による再溶解後で、該組成物は、水に極めて不溶性の生物活性成分を溶液中に９５％以上保持する（実施例１、２および３）。
水に極めて不溶性の生物活性成分の典型的なものを挙げると、ロニダミン、メラトニン、シクロスポリンAおよびビンダリットがある。
本発明の凍結乾燥する方法にかけるリポソーム組成物の脂質は、好ましくはホスホグリセリド、グリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ガラクトシルおよびグリコシル脂質、コレステロールおよびその誘導体、スフィンゴ脂質、およびこれらの混合物よりなる群から選ばれる。好ましい脂質はリン脂質である。トレハロース/脂質の重量比は、それぞれ１：２〜１：１である。
リポソームの平均の大きさは５０〜２５０nmであり、好ましくは５０〜１００nmである。
本発明の第二の目的は、凍結乾燥する方法によって構成され、次のことを特徴とする：
１）トレハロース０．２〜１．５重量部を水性リポソーム組成物の脂質１重量部に加え、なお、リポソームの平均の大きさは５０〜２５０ｎｍであり、該リポソームは水に極めて不溶性の生物活性成分を含有する。
２）該組成物を凍結乾燥機の冷却板でもって温度−５℃〜−７０℃にまで冷却速度０．５〜２℃／分で冷却する。
３）予め定めた凍結温度に達すると、該組成物を該温度に２〜５時間保つ
４）５×１０-1〜８×１０-2ミリバールに減圧し、冷却板の温度を上記２）記載の冷却温度に２〜５時間保つ。
５）冷却板の温度を−１５℃にして保ち、水を完全に除去する。
好ましい操作条件は以下の通りである：
相２
凍結温度：−２０〜−３０℃
冷却速度：０．７７℃／分
相３
時間：３時間
相４
減圧：６×１０-2ミリバール
相５
ａ）凍結温度（相２）が−１５℃を下まわるとき、速度０．５〜２℃／分で冷却板の温度を−１５℃まで上げて、２０時間凍結乾燥する；次いで冷却板の温度を−１０℃までもってゆき、１時間後５℃にして、１６時間凍結乾燥する。
ｂ）凍結温度（相２）が−１５℃以上であるときは、２０時間凍結乾燥を続けて、その後冷却板の温度を＋５℃までもってゆき、１６時間凍結乾燥する。
本発明による特に好ましいリポソーム組成は下記から成る：
成分                                  ％（w/w）
ホスファチジルコリン              ：  94
リゾホスファチジルコリン          ：   3
Ｎ-アシル-エタノールアミン        ：   1
ホスファチジルエタノールアミン    ：   0.1
トリグリセリド                    ：   1
遊離脂肪酸                        ：   0.75
ＤＬ-α-トコフェロール            ：   0.15
典型的に、本発明による水性の医薬リポソーム組成物は次のように調製される：
a）水に極めて不溶性の生物活性成分を２０〜３０℃で脂質中に分散させる。
b）該分散物を水相に懸濁する。
c）該懸濁物を室温で０〜４８時間そのままにしておく。
d）３０〜７５℃で１０〜４０分間加熱する。
e）-１５０〜-２００℃で凍結する。
f）相d）とe）を少なくとも２回、多くて８回繰り返す。
g）孔の直径が５００〜１０００nmである濾過膜で濾過する。
h）孔の直径が５０〜４００nmである膜から押し出し、同時に、
i）捕捉されなかった活性成分を除去する。
相c）の持続時間は、水に極めて不溶な活性成分をリポソーム内に捕捉させたい量に依存する。当業者にとって、数回の簡単な通常の実験で、各種の活性成分およびリポソーム組成物について適切な時間を決定することは難しいことではないであろう。
好ましくは、水相は０．０５％〜０．９％（w/v）の塩化ナトリウム水溶液から成る。典型的に、使用される脂質の量は、各水溶液の重量に対し０．０１〜０．４重量部である。一方、活性成分の量は一般に脂質の各重量に対し０．０１〜０．３重量部になる。
通常、押出しは、圧縮エアーか、または窒素、ヘリウムおよびアルゴンを含む群から選択される不活性ガスかどちらかを押し出しガスとして使用して行なう。好ましくは不活性ガスのヘリウムである。押出し段階の圧力は好ましくは５００〜５５００ｋＰａであり、温度は好ましくは２０〜７５℃、さらに好ましくは４０〜６５℃である。適切な押出機はLipex Biomembranes Thermobarrel押出機、または孔の直径５０〜６００nmのCostar（商標）ポリカーボネート膜を有するEmulsiflex CC Avestin押出機である。
上述の方法によって、約８mg/mlメラトニン、３．８mg/mlロニダミン、１mg/mlシクロスポリンＡおよび４mg/mlビンダリットを含む水性リポソーム組成物を得る。それぞれの水に対する溶解度は、３×１０-3mg/ml（ロニダミン）、１×１０-1mg/ml（ビンダリット）、完全な非溶解性のメラトニン（G. S. Shida et al.″J. Pineal Res.″1994, 16,198-201）およびシクロスポリンＡ［″Insoluble in Water″, a monograph of cyclosporin A in″Analytical Profiles of Drug Substances″, 16, 163,（1987）］である。
次の例は、本発明を説明をするものであって、限定するものではない。
調製  １
水に極めて不溶性の生物活性成分を含むリポソーム組成物を、以下に記す通り調製した。
リン脂質１g中メラトニン１００mgを、Ultraturrax（商標）型ホモジェナイザーを使用して３０℃、１０分間分散した。すぐ後に、該ホモジェナイザーを使用して０．９％（w/v）塩化ナトリウム水溶液１０ml中に該分散液を懸濁し、次いで水浴中５５℃、２０分間加熱した。
こうして得た懸濁液を、次の凍結-加熱サイクルにかけた。
-液体窒素で１分間凍結し、
-リン脂質が完全に流動化するまで５５℃で加熱する。
該サイクルを６回繰り返した。
得られた懸濁液を、Lipex Biomembranes装置を使用して０．６μmフィルターに２度通した。
″大きな多重ラメラ小胞″（MLV）懸濁液を得、次いで０．１μm Costar（商標）ポリカーボネートつき１０-ml Lipex Biomembrances Thermobarrel型押出機を用い、５５℃、押出しガスとしてヘリウムを用い、圧力１０００〜４８００ＫＰａで、６連続押し出しサイクルにかけた。
調製  ２
リン脂質２gおよびロニダミン５０mgをリン脂質１gおよびメラトニン１００mgの代わりに使用して、調製１に記載の通り行った。
調製  ３
リン脂質２gおよびメラトニン２００mgをリン脂質１gおよびメラトニン１００mgの代わりに使用して、調製１に記載の通り行った。
調製  ４
０．１μmの代わりに０．２μmポリカーボネート膜を通して押し出すこと以外は、調製２に記載の通り行った。
調製  ５
リン脂質２g中シクロスポリンA３０mgを、Ultraturrax（商標）型ホモジェナイザーを使用して３０℃、１０分間分散した。すぐ後に、該ホモジェナイザーを使用して、０．９％（w/v）塩化ナトリウム水溶液中に該分散液を懸濁し、次いで室温で２４時間放置した。その後、得た懸濁液を水浴中６５℃、２０分間加熱した。
こうして得た懸濁液を、次の凍結-加熱サイクルにかけた。
-液体窒素で１分間凍結し、
-リン脂質が完全に流動化するまで６５℃で加熱する。
該サイクルを６回繰り返した。
得た懸濁液を、Lipex Biomembranes装置を使用して０．６μmフィルターに２度通した。
″大きな多重ラメラ小胞″（MLV）懸濁液を得て、次いで０．１μm Costar（商標）ポリカーボネートつき１０-ml Lipex Biomembrances Thermobarrel型押出機を用い、６５℃、押出しガスとしてヘリウムを用い、圧力１０００〜４８００ＫＰａで、６連続押出しサイクルにかけた。
調製  ６
リン脂質２gおよびビンダリット５０mgをリン脂質１gおよびメラトニン１００mgの代わりに使用して、調製１に記載の通り行った。
比較１の調製
調製  １Ａ
リン脂質１g中メラトニン１００mgおよびトレハロース１gを、Ultraturrax（商標）型ホモジェナイザーを使用して３０℃、１０分間分散した。すぐ後に、該ホモジェナイザーを使用して０．９％（w/v）塩化ナトリウム水溶液１０ml中に該分散液を懸濁し、次いで水浴中５５℃、２０分間加熱した。
こうして得た懸濁液を、次の凍結-加熱サイクルにかけた。
-液体窒素で１分間凍結し、
-リン脂質が完全に流動化するまで５５℃で加熱する。
該サイクルを６回繰り返した。
懸濁液を、Lipex Biomembranes装置を使用して０．６μmフィルターに２度通した。
本方法では、非常に濃厚な塊が得られた。０．１μm Costar（商標）ポリカーボネートつき１０-ml Lipex Biomembrances Thermobarrel型押出機を用い、５５℃、押し出しガスとしてヘリウムを用い、圧力１０００〜４８００ＫＰａで塊を押し出そうとしたがうまく行かなかった。
調製  １Ｂ
メラトニンを除いた以外は、調製１Ａに記載の通り行った。″大きな多重ラメラ小胞″（MLV）懸濁液を得て、それは、０．１μm Costar（商標）ポリカーボネートつき１０-ml Lipex Biomembrances Thermobarrel型押出機を用い、５５℃、押し出しガスとしてヘリウムを用い、圧力１０００〜４８００ＫＰａで完全に押し出すことができた。
比較２の調製
調製  ２Ａ
リン脂質を１gでなく２g使用すること以外は、比較１Ａの調製の目的に記載の通り行った。この場合も、非常に濃厚で、押し出すことのできない塊を得た。
調製  ２Ｂ
リン脂質を１gでなく２g使用すること以外は、先の比較例１Ｂの調製に記載の通り行った。この場合も、完全に押し出すことのできるＭＬＶ懸濁液を得た。
実施例  １
調製IIを１mlの部分標本に分割し、それぞれの標本に、表１/１で示すトレハロース/脂質の重量比のトレハロースを添加した。
凍結乾燥を平坦凍結乾燥機で、次の通り行った：
1）冷却速度0.77℃/分で−２５℃まで冷却する。
2）該温度（−２５℃）で３時間保つ。
3）減圧（６×１０-2ミリバール）し、該温度（−２５℃）で２時間保つ。
4）減圧（６×１０-2ミリバール）下に、２０時間−１５℃まで加熱する。
5）減圧（６×１０-2ミリバール）下に、２時間−１０℃まで加熱する。
6）減圧（６×１０-2ミリバール）下に、２０時間＋５℃まで加熱する。
7）減圧を閉じる。
8）空気を導入する。
蒸留水１mlで凍結乾燥物（１ml）を再水和し、次いで室温で３０分間放置し、リポソームを効率よく復元した。
さらに生理溶液１０ml中に該溶液０．５mlを溶解し、リポソームの平均の大きさをNICOMP 370装置で測定した。
表１／１に得られた結果を示す。
0004290767.tif 000002
表１／１より、トレハロースがないとリポソームのある程度の融合が起こる。それは平均の大きさの増大で明らかである。驚くべきことに、トレハロースの量を増やしても（トレハロース/脂質 ２：１）、ある程度の融合が起こり、平均の大きさの結果的な増大を伴う。
同様の結果を調製IVで得た。
リポソームの平均の大きさおよびロニダミンの量を、新たに上述のとおり調製したいくつかのサンプルで測定した。その後、サンプルを５℃の冷却装置中に置き、設定した間隔毎にサンプリングし、再水和し、活性成分の量とリポソームの平均の大きさを測定した。得られた結果を表１／２に示す。
0004290767.tif 000003
実施例２
調製IIIを上述の実施例１と同様に凍結乾燥し、凍結乾燥前/後のリポソームの平均の大きさを前述の実施例と同様に測定した（表２／１）。同様に、新たにサンプルを調製し、５℃に保ち、リポソームの平均の大きさとメラトニンの量を前述の実施例と同様に測定した（表２／２）。
0004290767.tif 000004
0004290767.tif 000005
実施例３
調製VIを上述の実施例１と同様に凍結乾燥し、凍結乾燥前/後のリポソームの平均の大きさを前述の実施例と同様に測定した（表３／１）。同様に、新たにサンプルを調製し、５℃に保ち、リポソームの平均の大きさとビンダリットの量を前述の実施例と同様に測定した（表３／２）。
0004290767.tif 000006
0004290767.tif 000007
比較１の実施例
調製IIを１mlの部分標本に分割し、それぞれの標本に、比較  表１で示すトレハロース/脂質の重量比のトレハロースを添加した。
この調製物を液体窒素の温度（-１９５．８℃）で凍らせ、外部温度制御なしに２０時間凍結乾燥した。
蒸留水１mlで凍結乾燥物（１ml）を再水和し、次いで室温下、２時間放置した。
さらに、該溶液０．５mlを生理溶液１０mlで溶解し、リポソームの平均の大きさをNICOMP 370装置で測定した。
得た結果を下記の比較  表１に示す。
0004290767.tif 000008
比較  表１から、以下のことがわかる。すなわち、凍結乾燥を液体窒素の温度で行うと、上記の表に示す割合のトレハロースを含んでも含まなくても、リポソームはある割合で融合し、その融合は平均の大きさの増大で明らかになる。加えて上記データは、凍結乾燥を液体窒素の温度で行う場合、凍結乾燥自体の経過によっては（同じ化合物の調製について）必ずしも同じ結果が再現されるとは限らないことを示している。