(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-2、IL-10、IL-12及びIL-15から成る群から選択される生体応答修飾剤を有効成分として含有する、リンパ球系腫瘍の治療のための、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体のADCC活性作用増強剤。
【請求項２】
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつADCC活性を有する抗体を有効成分として含有する、リンパ球系腫瘍の治療のためのIL-2、IL-10、IL-12及びIL-15から成る群から選択される生体応答修飾剤の作用増強剤。
【請求項３】
前記リンパ球系腫瘍がＴ細胞腫瘍である、請求項１又は２に記載の作用増強剤。
【請求項４】
前記リンパ球系腫瘍がＢ細胞腫瘍である、請求項１又は２に記載の作用増強剤。
【請求項５】
Ｂ細胞腫瘍が骨髄腫である請求項４に記載の作用増強剤。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の作用増強剤。
【請求項７】
抗体がヒト抗体定常領域Cγを有する、請求項６に記載の作用増強剤。
【請求項８】
ヒト抗体定常領域CγがCγ1またはCγ3である、請求項７に記載の作用増強剤。
【請求項９】
抗体が抗ＨＭ１．２４抗体である、請求項６に記載の作用増強剤。
【請求項１０】
抗体がキメラ抗体またはヒト型化抗体である、請求項６に記載の作用増強剤。
【請求項１１】
抗体がキメラ抗HM1.24抗体である、請求項９に記載の作用増強剤。
【請求項１２】
抗体がヒト型化抗HM1.24抗体である、請求項９に記載の作用増強剤。
【請求項１３】
抗体が抗HM1.24抗体が認識するエピトープと特異的に結合する、請求項１〜12のいずれか１項に記載の作用増強剤。
【請求項１４】
抗体が、E/T比が50の条件下でADCC活性が25％を下まわる細胞傷害活性を有する、請求項１〜13のいずれか１項に記載の作用増強剤。
【請求項１５】
ADCC活性をCr（クロム）リリースアッセイにより測定する、請求項14に記載の作用増強剤。
【請求項１６】
ex vivoで使用される、請求項１〜15のいずれか１項に記載の作用増強剤。
【請求項１７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体と、IL-2、IL-10、IL-12及びIL-15から成る群から選択される生体応答修飾剤から成るリンパ球系腫瘍の治療剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、リンパ球系腫瘍に発現される蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有するリンパ球系腫瘍の治療のための、生体応答修飾剤（ＢＲＭ）を有効成分として含有する作用増強剤に関する。
背景技術
リンパ球系細胞は、生体において主に免疫を担当する細胞である。リンパ球系細胞は全て同じ血液幹細胞に由来し、骨髄中あるいはその他の器官で様々な分化因子、または増殖因子の作用を受けて分化を繰り返した後、末梢血中へ放出される。この分化の違いによりリンパ球系細胞はＢ細胞とＴ細胞に大別される。Ｂ細胞は抗体産生能を、Ｔ細胞は抗原提示能、細胞傷害能その他様々な能力を有していると考えられている。この分化段階で何らかの原因により腫瘍化し、骨髄中、リンパ組織中、末梢血中等で異常増殖するようになったものが、リンパ球系腫瘍である。
近年の新しい技術導入、特に細胞表面の分化抗原に対するモノクローナル抗体を用いた技術の進歩により、リンパ球系細胞の由来や分化段階の同定が可能になった。それに伴い、リンパ球系腫瘍についてもその腫瘍細胞の由来がＴ細胞なのかＢ細胞なのかだけではなく、成熟度の同定までもが可能になった。
リンパ球系腫瘍はその腫瘍細胞の起源あるいは成熟度によりＢ細胞腫瘍およびＴ細胞腫瘍に大別される。Ｂ細胞腫瘍は腫瘍細胞の成熟度によって、急性Ｂリンパ性白血病（B-ALL）、慢性Ｂリンパ性白血病（B-CLL）、pre-Bリンパ腫、Burkittリンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、びまん性リンパ腫、骨髄腫等に分類される。また、Ｔ細胞腫瘍はその腫瘍細胞の成熟度によって、急性Ｔリンパ性白血病（T-ALL）、慢性Ｔリンパ性白血病（T-CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、非ATL末梢性Ｔリンパ腫（PNTL）等に分類される（図解臨床〔癌〕シリーズNo.17白血病・リンパ腫、杉村隆ら、MEDICAL VIEW社、1987，Ｂ細胞腫瘍、高月清、西村書店、1991）。
近年の医療技術の進歩にも関わらず、リンパ球系腫瘍の治療に関しては未だ不十分であると言わざるを得ない。例えば、急性リンパ性白血病（ALL）の治癒率は20％以下である。また、リンパ腫の場合、Ｂリンパ腫は多剤併用療法の進歩により比較的治癒率は高いとはいうものの、進行期での治癒率は50％程度である。さらにＴリンパ腫はより難治性であり、治癒率は約30％、成人Ｔ細胞白血病（ATL）に至っては10％にも満たないのが現状である。
一方、Goto,T.らは、ヒト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（抗HM1.24抗体）を報告している（Blood（1994）84,1922-1930）。ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗HM1.24抗体を投与すると、この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこと（小阪昌明ら、日本臨床（1995）53,627-635）から、抗HM1.24抗体はラジオアイソトープ標識による腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。
一方、腫瘍患者は免疫機能低下の合併が多く、またこれが発癌に関係するとの考えから、その是正が試みられる。生体応答修飾剤（Biological response modifiers;BRM）は生体の腫瘍に対する直接的及び／又は間接的応答力を生体にとって有利な方向へ導く働きがあり、これが治療に利用される。主にマクロファージ、Ｔ細胞などの機能を増強し、免疫能などを回復する。非特異的免疫賦活物質を用いた治療研究の時代から今や種々のサイトカインについて、その生物活性が検討され、有効と考えられるものについては量産が行われている（今日の治療薬（１９９５年版）、編著者永島裕、宮本昭正（株）南江堂、１９９５年６月２０日第１７版第３刷発行）。
発明の開示
現在行われているリンパ球系腫瘍の治療には、種々の化学療法、Ｘ線療法、骨髄移植等が挙げられるが、上記のごとく、いずれの治療法も未だ完全ではなく、リンパ球系腫瘍を寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。
従って、本発明の目的は、リンパ球系腫瘍に対する新しい作用増強剤を提供することである。
本発明者らは、かかる治療法を提供すべく、抗HM1.24抗体（Goto,T.らBlood（1994）84.1922-1930）と生体応答修飾剤との併用を検討することにより、より強い細胞傷害活性が得られること、及び特に細胞傷害活性が低下している場合に健常なレベルの細胞傷害活性が得られ、リンパ球系腫瘍に対する抗腫瘍効果が期待されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は生体応答修飾剤を有効成分として含有する、リンパ球系腫瘍の治療のための配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を有効成分として含有する、リンパ球系腫瘍の治療のための生体応答修飾剤の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、リンパ球系腫瘍がＴ細胞腫瘍である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、リンパ球系腫瘍がＢ細胞腫瘍である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、Ｂ細胞腫瘍が骨髄腫である上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体がモノクローナル抗体である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体がヒト抗体定常領域Ｃγを有する、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、ヒト抗体定常領域ＣγがＣγ１またはＣγ３である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体が抗HM1.24抗体である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体がキメラ抗体またはヒト型化抗体である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体がキメラ抗HM1.24抗体である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体がヒト型化抗HM1.24抗体である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体が抗HM1.24抗体が認識するエピトープと特異的に結合する、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、生体応答修飾剤が、インターフェロン、ＯＫ４３２、レンチナン、ソニフィラン、ペスタチン、クレスチン、Ｎ−ＣＷＳ、ラバミゾール、Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−２，ＩＬ−１０、ＩＬ−１２又はＩＬ−１５である、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、抗体が、Ｅ／Ｔ比が５０の条件下でＡＤＣＣ活性が２５％を下まわる細胞傷害活性を有する、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、ＡＤＣＣ活性をＣｒ（クロム）リリースアッセイにより測定する、上記の作用増強剤を提供する。
本発明はまた、ex vivoで使用される、上記のいずれかに記載の作用増強剤を提供する。
本発明はさらに、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体と生体応答修飾剤から成るリンパ球系腫瘍の治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１はエフェクター細胞として健常人末梢血由来細胞を用いた場合、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して強い細胞傷害活性を示すことを表すグラフである。
図２はエフェクター細胞として免疫機能の低下した骨髄腫患者末梢血由来細胞を用いた場合、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して細胞傷害活性を示すことを表すグラフである。
図３はエフェクター細胞として骨髄腫患者大量サイクロフォスファミド治療後のアフェレーシスした細胞を用いた場合、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して細胞傷害活性を示すことを表すグラフである。
発明の実施の形態
1.  抗体の作製
1-1.  ハイブリドーマの作製
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、HM1.24抗原蛋白質やHM1.24抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原であるHM1.24抗原発現細胞としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるKPMM2（特開平7-236475）やKPC-32（Goto,T.et al.,Jpn.J.Clin.Hematol.（1991）32,1400）を用いることができる。また、感作抗原として配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗HM1.24抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。
なお、感作抗原として使用される、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のcDNAはpUC19ベクターのXbaI切断部位の間に挿入されて、プラスミドpRS38-pUC19として調製されている。このプラスミドpRS38-pUC19を含む大腸菌（E.coli）は、平成5年（1993年）10月5日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、Escherichia coli DH5α（pRS38-pUC19）として、受託番号FERM BP-4434としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平7-196694参照）。このプラスミドpRS38-pUC19に含まれるcDNA断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗HM1.24抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを作製することができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。
具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（J.Immnol.（1979）123:1548-1550）,P3X63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81:1-7）,NS-1（Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.（1976）6:511-519）,MPC-11（Margulies.D.H.et al.,Cell（1976）8:405-415）,SP2/0（Shulman,M.et al.,Nature（1978）276:269-270）,FO（de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods（1980）35:1-21）,S194（Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.（1978）148:313-323）,R210（Galfre,G.et al.,Nature（1979）277:131-133）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.（1981）73:3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000-6000程度のPEG溶液を通常、30-60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでHM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、HM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるHM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93-12227,WO 92-03918,WO 94-02602,WO 94-25585,WO 96-34096,WO 96-33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
具体的には、抗HM1.24抗体産生ハイブリドーマの作製は、Goto,T.らの方法（Blood（1994）84.1922-1930）により行うことができる。工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成7年9月14日にFERM BP-5233としてブタペスト条約に基づき国際寄託された抗HM1.24抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗HM1.24抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、5％BM-Condimed H1（Boehringer Mannheim製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM培地（GIBCO-BRL製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清から抗HM1.24抗体を精製する方法で行うことができる。
1-2.  組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl,A.K.Borrebaeck,James,W.Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin,J.M.ら、Biochemistry（1979）18,5294-5299）、AGPC法（Chmczynski,P.ら、（1987）162,156-159）等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Frohman,M.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1988）85,8998-9002;Belyavsky,A.ら、Nucleic Acids Res.（1989）17,2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
1-3.  改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 96-02576参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
例えば、キメラ抗HM1.24抗体のL鎖およびH鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α（pUC19-1.24L-ｇκ）およびEscherichia coli DH5α（pUC19-1.24H-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成8（1996）年8月29日に、各々FERMBP-5646およびFERM BP-5644としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開番号WO98-14580参照）。
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 96-02576参照）。
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region;FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96-02576参照）。
CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato,K.et al.,Cancer Res.（1993）53,851-856）。
例えば、ヒト型化抗HM1.24抗体のL鎖ａバージョンおよびH鎖rバージョンを含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α（pUC19-RVLa-AHM-gk）およびEscherichia coli DH5α（pUC19-RVHr-AHM-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成8（1996）年8月29日に、各々FERM BP-5645およびFERM BP-5643としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開番号WO98-14580参照）。また、H鎖sバージョンを含むプラスミドを有する大腸菌は、Escherichia coli DH5α（pUC19-RVHs-AHM-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成9（1997）年9月29日に、各FERM BP-6127としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
ヒト型化抗HM1.24抗体のL鎖aバージョン、ヒト型化抗HM1.24抗体のH鎖rバージョン、及びヒト型化抗HM1.24抗体のH鎖sバージョンの各々のV領域のアミノ酸及び塩基配列を、配列番号２、３及び４に示す。配列番号2、３及び４において、−１５位のアミノ酸から−１位のアミノ酸はシグナル配列である。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体C領域が使用され、細胞傷害活性を呈するヒト抗体C領域として、ヒトＣγ例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。これらのうち、特にＣγ１，Ｃγ３を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、ADCC活性、CDC活性を有し、本発明に好適に使用される。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（framework region;FR）およびC領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化抗HM1.24抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号WO98-14580参照）。
1-4.  発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV 40）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV 40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Nature（1979）277,108）、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18,5322）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Nature（1098）341,544-546;FASEB J.（1992）6,2422-2427）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Science（1988）240,1041-1043）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,S.P.et al J.Bacteriol.（1987）169,4379）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96-30394を参照）。
複製起源としては、SV 40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（1）哺乳類細胞、例えば、CHO,COS,ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）,HeLa,Vero,（2）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（3）昆虫細胞、例えば、sf9,sf21,Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana）属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM,MEM,RPMI1640、IMDMなどを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Application,1993）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。
植物を使用する場合、タバコを用いることができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology（1994）12,699-702）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Susumu,M.et al.,Nature（1985）315,592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチニア・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian,K.-C.Ma et al.,Eur.J.Immunol.（1994）24,131-138）。
上述のようにin vitroまたはin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
2.  抗体の分離、精製
2-1.  抗体の分離、精製
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムなどが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、Hyper D,POROS,Sepharose F.F.等が挙げられる。
その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。
2-2.  抗体の濃度測定
2-1で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルをPBS（-）で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35 ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μg/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μlを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化する。
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製）100μlを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μlを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
3.  FCM解析
リンパ球系腫瘍と本発明で使用される抗体との反応性は、FCM（フローサイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。例えば樹立細胞株として、Ｔ細胞株であるRPMI 8402（ATCC CRL-1995）、急性リンパ芽球性白血病由来CCRF-CEM（ATCC CCL 119）、急性リンパ性白血病由来HPB-ALL（FCCH1018）、Tリンパ腫由来HPB-MLT（FCCH1019）、急性リンパ性白血病由来JM（FCCH1023）、急性リンパ芽球性白血病由来MOLT-4（ATCC CRL 1582）、急性リンパ性白血病由来Jurkat（FCCH1024）、急性リンパ芽球性白血病由来CCRF-HSB-2（ATCC CCL 120.1）、成人T細胞白血病由来MT-1（FCCH1043）、レンネルトリンパ腫由来KT-3（Shimizu,S.et al.,Blood（1988）71,196-203）などを、
また、Ｂ細胞株としてEBウィルス形質転換細胞CESS（ATCC TIB 190）、EBウィルス陽性B細胞SKW 6.4（ATCC TIB 215）、Bリンパ腫由来MC116（ATCC CRL 1649）、急性リンパ芽球性白血病由来CCRF-SB（ATCC CCL 120）、急性骨髄性白血病患者由来B細胞RPMI 6410（FCCH6047）、Burkittリンパ腫由来Daudi（ATCC CCL 213）、Burkittリンパ腫由来EB-3（ATCC CCL 85）、Burkittリンパ腫由来Jijoye（ATCC CCL 87）、Burkittリンパ腫由来Raji（ATCC CCL 86）などを、さらに非Ｔ非Ｂ細胞株として急性骨髄性白血病由来HL-60（ATCC CCL 240）、急性単球性白血病由来THP-1（ATCC TIB 202）、組織球性リンパ腫由来U-937（ATCC CRL 1593）、慢性骨髄性白血病由来K-562（ATCC CCL 243）、骨髄腫由来ＲＰＭＩ８２２６（ATCC CCL 155）、同Ｕ２６６B1（ATCC TIB 196）、同ＫＰＭＭ２、同ＫＰＣ−３２、形質細胞腫由来ＡＲＨ−７７（ATCC CRL 1621）などを用いることができる。
上記細胞をPBS（-）で洗浄した後、FACS緩衝液（２％ウシ胎児血清、0.05％アジ化ナトリウム含有PBS（-））で25μg/mlに希釈した抗体あるいはコントロール抗体100μlを加え、氷温化30分インキュベートする。FACS緩衝液で洗浄した後、25μg/mlのFITC標識ヤギ抗マウス抗体（GAM,Becton Dickinson製）100μlを加え、氷温化30分間インキュベートする。FACS緩衝液で洗浄した後、600μlあるいは1mlのFACS緩衝液に懸濁し、FACScan（Becton Dickinson製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
4.  細胞傷害活性
4-1.  ADCC活性の測定
本発明に使用される抗体は、細胞傷害活性として、例えば、ＡＤＣＣ活性を有する抗体である。
本発明においてリンパ球系腫瘍に対するADCC活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血や骨髄より比重遠心法で単核球分離し、エフェクター細胞（Effector cell:E）として調製する。
また、標的細胞（Target cell:T）としてはRPMI8226（ATCC CCL 155）,CCRF-CEM（ATCC CCL 119）,（ATCC CCL 120.1）、HPB-MLT（FCCH1019）,EB-3（ATCC CCL 85）,MC116（ATCC CRL 1649）,CCRF-SB（ATCC CCL 120）,K-562（ATCC CCL 243）などを51Crにより標識して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞にADCC活性を測定する抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、1％のNP-40を用いることができる。細胞傷害活性（％）は、（A-C）/（B-C）x100で計算することができる。なお、Aは抗体存在下において遊離された放射活性（cpm）、BはNP-40により遊離された放射活性（cpm）、Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（cpm）である。
4-2.  細胞傷害活性の増強
ADCC活性のような細胞傷害活性を発揮するには、ヒトにおいては抗体定常領域（Ｃ領域）としてＣγ、特にＣγ1、Ｃγ3を使用することが好ましい。さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なADCC活性、あるいはCDC活性を誘導することができる。
例えば、アミノ酸置換によるIgGのIgM様ポリマー化（Smith,R.I.F.& Morrison,S.L.BIO/TECHNOLOGY（1994）12,683-688）、アミノ酸付加によるIgGのIgM様ポリマー化（Smith,R.I.F.et al.,J.Immunology（1995）154,2226-2236）、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Shuford,W.et al.,Science（1991）252,724-727）、アミノ酸置換によるIgGの二量体化（Caron,P.C.et al.,J.Exp.Med.（1992）176,1191-1195,Shopes,B.,J.Immunology（1992）148,2918-2922）、化学修飾によるIgGの二量体化（Wolff,E.A.et al.,Cancer Res.（1993）53,2560-2565）、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Norderhaug,L.et al.,Eur.J.Immunol.（1991）21,2379-2384）が挙げられる。これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
5.  治療対象
本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体の、生体応答修飾剤を有効成分として含有する、リンパ球腫瘍の治療のための作用増強剤を提供する。その治療対象は通常のヒトリンパ球系腫瘍患者であるが、本発明は特に免疫機能が低下したヒト患者に適用することが、後述の実施例に記載するとおり、明らかになった。「免疫機能が低下した」とはＡＤＣＣのような細胞傷害活性が低下していることを意味する。
具体的には、Ｅ／Ｔ比が５０の条件下でＡＤＣＣ活性が２５％を下まわる細胞傷害活性しか見い出されない場合に特に有効である。２５％を下まわるＡＤＣＣ活性は、抗癌剤の投与等により免疫機能が低下した際に見い出される。上記ＡＤＣＣ活性を測定する際には、培養時間（インキュベート時間）が４時間であるのが好ましい。また、ＡＤＣＣ活性の測定方法としては、Ｃｒ（クロム）リリースアッセイまたはトリパンブルーによる染色方法が好ましい。
6.  生体応答修飾剤
本発明において有効成分として含有される生体応答修飾剤（BRM;Biological Response Modifier）は、免疫賦活作用を有する物質である。生体応答修飾剤としては本発明の効果を達成する限りいずれのものでもよい。生体応答修飾剤の好ましい例としては、インターフェロン、ＯＫ４３２、レンチナン、ソニフィラン、ペスタチン、クレスチン、Ｎ−ＣＷＳ、ラバミゾール、Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−２，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２又はＩＬ−１５である（今日の治療薬（１９９５年版）、編著者水島裕、宮本昭正、（株）南江堂、１９９５年６月２０日第１７版第３刷発行；サイトカイン９４−基礎から最新情報まで−、編者笠倉新平、（株）日本医学館、１９９４年７月１４日第一版；図説臨床〔癌〕シリーズＮｏ．１９（Progress in Cancer Clinics）、癌と免疫（新版）、メジカルビュー社、１９９３年８月３１日第２版（新版）発行）。これらのうち、とくにＩＬ−２が好ましい。
これらの生体応答修飾剤は、細胞傷害活性の反応において、エフェクター細胞に作用してエフェクター細胞の細胞傷害活性を賦活する物質である。これらの生体応答修飾剤は公知の方法により製造することができ、あるいは市販されているものを使用することができる。
7.  投与経路および製剤
本発明の作用増強剤は、非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、抗体については一回につき体重1Kgあたり0.01mgから100mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜1000mg、好ましくは５〜50mgの投与量を選ぶことができる。生体応答修飾剤については、一回につき体重１kgあたり１単位から1,000,000単位の範囲で選ばれる。
本発明においては、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体の作用を増強する生体応答修飾剤は、抗体の作用を増強する限り該抗体を治療対象、例えばヒトの腫瘍患者に投与する前に投与されてもよいし、後に投与されてもよい。
また、該抗体と同時に投与することもできる。
本発明においては、該抗体と生体応答修飾剤を治療対象、例えばヒトの腫瘍患者に投与するのみならず、ex vivoの治療にも使用することができる。すなわち、患者の末梢血よりエフェクター細胞を取り出し、生体応答修飾剤によりその免疫機能を賦活した後、エフェクター細胞を患者にもどす。エフェクター細胞を患者にもどす前または後あるいはそれと同時に該抗体を投与することができる。本発明においては、ＰＢＳＣＴ（末梢血幹細胞移植）のアフェレーシスの際にも使用することができる。すなわち、ＰＢＳＣＴにおいて取り出した幹細胞をもどす際に該抗体と生体応答修飾剤を投与してもよい。
本発明においては、該抗体と生体応答修飾剤を併用してその作用を増強する限り、上記のような形態を包含する。
本発明の作用増強剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療対象疾患としては、標的とする腫瘍細胞上に本発明で使用される抗体が結合する抗原が存在する、リンパ球系腫瘍である。具体的には、多発性骨髄腫（MM）急性Ｂリンパ性白血病（B-ALL）、慢性Ｂリンパ性白血病（B-CLL）、pre-Bリンパ腫、Burkittリンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、びまん性リンパ腫、急性Ｔリンパ性白血病（T-ALL）、慢性Ｔリンパ性白血病（T-CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、非ATL末梢性Ｔリンパ腫（PNTL）等が挙げられる。本発明の作用増強剤は、これらリンパ球系腫瘍の治療のための作用増強剤として有用である。
実施例
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例．ＡＤＣＣ活性の測定
ADCC（Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity）活性の測定はCurrent protocols in Immunology,Chapter 7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan et al.,John Wiley & Sons,Inc.,1993の方法に従った。
1.  エフェクター細胞の調製
健常人および多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄より比重遠心法で単核球を分離した。すなわち健常人および多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄に等量のPBS（-）を加え、Ficoll（Pharmacia社製）−Conrey（第一製薬社製）（比重1.077）に積層し、400ｇで30分間遠心した。単核球層を分取し、10％ウシ胎児血清（Witaker社製）を含むRPMI1640（Sigma社製）で２回洗浄後、細胞をIL-2（Genzyme社製）500Ｕ／ml、IL-10（Genzyme社製）20ng／ml、IL-12（R & D社製）20ng／ml、IL-15（Genzyme社製）20ng／ml又はM-CSF（ミドリ十字社製）5000Ｕ／mlを添加しあるいは無添加（培地のみ）で３日間培養した。同培養液で各々２回洗浄後、同培養液で細胞数が５×106／mlになるように調製した。
2.  標的細胞の調製
ヒト骨髄腫細胞株RPMI 8226（ATCC CCL 155）を0.1mCiの51Cr-sodium chromateとともに10％ウシ胎児血清（Witaker社製）を含むRPMI1640（Sigma社製）中で37℃にて60分インキュベートすることにより放射性標識した。放射性標識の後、細胞をHanks balanced salt solution（HBSS）で３回洗浄し、２×105／mlに調製した。
3.  ＡＤＣＣアッセイ
96ウエルＵ底プレート（Corning社製）に放射性標識した２×105／mlの標的細胞を50μｌと、アフィニティー精製によって得られた１μｇ／mlのヒト型化抗HM1.24抗体、あるいはコントロールヒトIgG1（Serotec社製）50μｌ加え、４℃で15分間反応させた。
その後、５×106／mlのエフェクター細胞を100μｌを加え、炭酸ガス培養器内で４時間培養した。その際、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比（Ｅ：Ｔ）を50：１とした。
100μｌの上清をとり、ガンマカウンター（ARC361,Aloka社製）で培養上清中に遊離された放射活性を測定した。最大遊離放射能測定用には１％NP-40（BRL社製）を用いた。細胞傷害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×100で計算した。なおＡは抗体存在下において遊離された放射活性（cpm）、ＢはNP-40により遊離された放射活性（cpm）およびＣは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（cpm）を示す。
その結果、エフェクター細胞として、健常人末梢血由来細胞を用いた場合、コントロールIgGではほとんど細胞傷害活性を示さなかったのに対して、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して強い細胞傷害活性を示した（図１）。エフェクター細胞として、免疫機能の低下した骨髄腫患者由来細胞を用いた場合、コントロールIgGではほとんど細胞傷害活性を示さなかったのに対して、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して細胞傷害活性を示した（図２）。
しかしながら、その活性は上記健常人の場合よりも弱かった（25％未満）。そこにIL−２，IL−10，IL−12あるいはＩＬ−１５を添加することでヒト型化抗HM1.24抗体の細胞傷害活性が増強された。特にIL−２では、健常人の場合と同等の活性にまで増強された（図２）。
また、エフェクター細胞として骨髄腫患者に対する大量サイクロフォスファミド治療後のアフェレーシスした細胞を用いた場合、上記同様に、コントロールIgGではほとんど細胞傷害活性を示さなかったのに対し、ヒト型化抗HM1.24抗体はRPMI8226細胞に対して細胞傷害活性を示した（図３）。しかしながら、その活性は健常人の場合よりも弱かった（25％未満）。そこにIL−２，IL−10あるいはIL−12を添加することでヒト型化抗HM1.24抗体の細胞傷害活性が増強された（図３）。
このことより、免疫機能の低下した患者由来のエフェクター細胞の腫瘍細胞に対する、ヒト型化抗HM1.24抗体による細胞傷害活性は、健常人あるいは免疫機能の低下していない患者由来のエフェクター細胞に比べて弱くなる。そこにIL−２等のBRMを添加することでそのエフェクター細胞の細胞傷害活性をより増強し、健常人レベルまでにも導くことができた。
したがって免疫機能の低下した患者に対しては、in vivo、ex vivoでヒト型化抗HM1.24抗体の投与時に、BRMを併用することによりさらに抗腫瘍効果を上げることが期待される。また同様に、末梢血幹細胞移植時等においてアフェレーシスした細胞を体内にもどす患者に対しても、in vivo、ex vivoでヒト型化抗HM1.24抗体の投与時に、BRMを併用することによりさらに抗腫瘍効果を上げることが期待される。
参考例1. マウス抗HM1.24モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
Goto,T.et al.,Blood（1994）84,1992-1930に記載の方法にて、マウス抗HM1.24モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製した。
ヒト多発性骨髄腫患者骨髄由来の形質細胞株KPC-32（1x107個）（Goto,T.et al.,Jpn.J.Clin.Hematol.（11991）32,1400）をBALB/Cマウス（チャールスリバー製）の腹腔内に6週間おきに2回注射した。
このマウスを屠殺する3日前にマウスの抗体産生価をさらに上昇させるために、1.5 x 106個のKPC-32をマウスの脾臓内に注射した（Goto,T.et al.,Tokushima J.Exp.Med.（1990）37,89）。マウスを屠殺した後に脾臓を摘出し、Groth,de St.& Schreideggerの方法（Cancer Research（1981）41,3465）に従い摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞SP2/0を細胞融合に付した。
KPC-32を用いたCell ELISA（Posner,M.R.et al.,J.Immunol.Methods（1982）48,23）によりハイブリドーマ培養上清中の抗体のスクリーニングを行った。5 x 104個のKPC-32を50mlのPBSに懸濁し、96穴プレート（U底型、Corning,Iwaki製）に分注し37℃で一晩風乾した。1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSでブロックした後、ハイブリドーマ培養上清を加え４℃にて2時間インキュベートした。次いで、4℃にて1時間ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体（Zymed製）を反応させ、洗浄後室温にて30分間o-フェニレンジアミン基質溶液（Sumitomo Bakelite製）を反応させた。
2N硫酸で反応を停止させ、ELISA reader（Bio-Rad製）で492nmにおける吸光度を測定した。ヒト免疫グロブリンに対する抗体を産生するハイブリドーマを除去するために、陽性ハイブリドーマ培養上清をヒト血清にあらかじめ吸着させ、他の細胞株に対する反応性をELISAにてスクリーニングした。陽性のハイブリドーマを選択し、種々の細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで調べた。最後に選択されたハイブリドーマクローンを二度クローン化し、これをプリスタン処理したBALB/Cマウスの腹腔に注射して、腹水を取得した。
モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウムによる沈澱とプロテインAアフィニティクロマトグラフィーキット（Ampure PA、Amersham製）によりマウス腹水より精製した。精製抗体は、Quick Tag FITC結合キット（ベーリンガーマンハイム製）を使用することによりFITC標識した。
その結果、30のハイブリドーマクローンが産生するモノクローナル抗体がKPC-32およびRPMI 8226と反応した。クローニングの後、これらのハイブリドーマの培養上清と他の細胞株あるいは末梢血単核球との反応性を調べた。
このうち、3つのクローンが形質細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体であった。これらの3つのクローンのうち、最もフローサイトメトリー分析に有用であり、かつRPMI 8226に対するCDC活性を有するハイブリドーマクローンを選択し、HM1.24と名付けた。このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを、サブクラス特異的抗マウスウサギ抗体（Zymed製）を用いたELISAにて決定した。抗HM1.24抗体は、IgG2a κのサブクラスを有していた。抗HM1.24抗体を産生するハイブリドーマHM1.24は、工業技術院生命工学工業研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成7年9月14日にFERM BP-5233としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
参考例2. ヒト型化抗HM1.24抗体の作製
ヒト型化抗HM1.24抗体を国際特許出願公開番号WO 98-14580に記載の方法により得た。
参考例1で作製されたハイブリドーマHM1.24から、常法により全RNAを調製した。これよりマウス抗体V領域をコードするcDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法および5’-RACE法により、合成、増幅した。マウスV領域をコードする遺伝子を含むDNA断片を得、これらのDNA断片を各々プラスミドpUC系クローニングベクターに連結し、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列を常法に従い決定し、さらに各々のV領域の相補性決定領域（CDR）を決定した。
キメラ抗HM1.24抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウス抗HM1.24抗体L鎖およびH鎖のV領域をコードするcDNAをHEFベクターに挿入した。また、再ヒト型化抗HM1.24抗体を作製するために、CDR移植法によりマウス抗HM1.24抗体のV領域CDRをヒト抗体へ移植した。ヒト抗体のL鎖としてヒト抗体REIのL鎖を用い、ヒト抗体H鎖としてフレームワーク領域（FR）1-3についてはヒト抗体HG3のFR1-3を用いFR4についてはヒト抗体JH6のFR4を用いた。CDRを移植した抗体が適切な抗原結合部位を形成するようにH鎖V領域のFRのアミノ酸を置換した。
このようにして作製したヒト型化抗HM1.24抗体のL鎖およびH鎖の遺伝子を哺乳類細胞で発現させるために、HEFベクターに、各々の遺伝子を別々に導入し、ヒト型化抗HM1.24抗体のL鎖またはH鎖を発現するベクターを作製した。
これら二つの発現ベクターをCHO細胞に同時に導入することにより、ヒト型化抗HM1.24抗体を産生する細胞株を樹立した。この細胞株を培養して得られたヒト型化抗HM1.24抗体のヒト羊膜由来細胞株WISHへの抗原結合活性および結合阻害活性を、Cell ELISAにて調べた。その結果、ヒト型化抗HM1.24抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合活性を有し、さらにビオチン化マウス抗HM1.24抗体を用いた結合阻害活性についても、キメラ抗体あるいはマウス抗体と同等の活性を有した。
なお、キメラ抗HM1.24抗体のL鎖およびH鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α（pUC19-1.24L-gk）およびEscherichia coli DH5α（pUC19-1.24H-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成8（1996）年8月29日に、各々FERM BP-5646およびFERM BP-5644としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
また、ヒト型化抗HM1.24抗体のL鎖aバージョンおよびH鎖ｒバージョンを含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α（pUC19-RVLa-AHM-gk）およびEscherichia coli DH5α（pUC19-RVHr-AHM-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成8（1996）年8月29日に、各々FERM BP-5645およびFERM BP-5643としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。ヒト型化抗HM1.24抗体のH鎖sバージョンを含むプラスミドを有する大腸菌は、Escherichia coli DH5α（pUC19-RVHs-AHM-ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成9（1997）年9月29日に、FERM BP-6127としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
参考例3. HM1.24抗原  蛋白質cDNAのクローニング
１．cDNAライブラリーの作製
1）全RNAの調製
マウス抗HM1.24抗体が特異的に認識するHM1.24抗原蛋白質をコードするcDNAを、次のようにしてクローニングした。
すなわち、ヒト多発性骨髄腫細胞株KPMM2から、全RNAをChirgwinら（Biochcmistry,18,5294（1979））の方法に従って調製した。すなわち、2.2 x 108個のKPMM2を20mlの4Mグアニジンチオシアネート（ナカライテスク製）中で完全にホモジナイズさせた。
ホモジネートを遠心管中の5.3M塩化セシウム溶液層状に重層し、次にこれをBeckman SW40ローター中で31,000rpmにて20℃で24時間遠心分離することによりRNAを沈殿させた。RNA沈殿物を70%エタノールにより洗浄し、そして1mM EDTA及び0.5% SDSを含有する10mM Tris-HCl（pH7.4）300μ1中に溶解し、それにPronase（Boehringer製）を0.5mg/mlとなるように添加した後、37℃にて30分間インキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、RNAをエタノールで沈殿させた。次に、RNA沈殿物を1mM EDTAを含有する10mM Tris-HCl（pH7.4）200μ1に溶解した。
2）poly（A）＋RNAの調製
前記のようにして調製した全RNAの約500μgを材料としてFast Track 2.0 mRNA Isolation Kit（Invitrogen製）を用いてキット添付の処方に従ってpoly（A）＋RNAを精製した。
3）cDNAライブラリーの構築
上記poly（A）＋RNA 10μgを材料としてcDNA合成キットTimeSaver cDNA Synthesis Kit（Pharmacia製）を用いてキット添付の処方に従って二本鎖cDNAを合成し、更にDirectional Cloning Toolbox（Pharmacia製）を用いてキット付属のEcoRIアダプターをキット添付の処方に従って連結した。EcoRIアダプターのカイネーション及び制限酵素NotI処理はキット添付の処方に従って行った。更に、約500bp以上の大きさのアダプター付加二本鎖cDNAを1.5%低融点アガロースゲル（Sigma製）を用いて分離、精製し、アダプター付加二本鎖cDNA約40μlを得た。
このようにして作製したアダプター付加二本鎖cDNAを、あらかじめ制限酵素EcoRI、NotI及びアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）処理したpCOS1ベクターとT4 DNAリガーゼ（GIBCO-BRL製）を用いて連結し、cDNAライブラリーを構築した。構築したcDNAライブラリーは、大腸菌細胞株DH5α（GIBCO-BRL製）に形質導入され、全体のサイズは約2.5 x 106個の独立したクローンであると推定された。なお、プラスミドpCOS1は、発現ベクターHEF-PMh-gγ1（国際特許出願公開番号WO92-19759参照）をEcoRI及びSmaI消化することにより含有されるDNAを削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造製）を連結することにより構築した。
２．直接発現法によるクローニング
1）COS-7細胞へのトランスフェクション
上記の形質導入した大腸菌約5 x 105クローンを50μg/mlのアンピシリンを含む2-YT培地（Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））にて培養することによりcDNAの増幅を行い、アルカリ法（Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））により大腸菌からプラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドDNAはGene Pulser装置（Bio-Rad製）を用いてエレクトロポレーション法によりCOS-7細胞にトランスフェクションした。
すなわち、精製したプラスミドDNA 10μgを1 x 107細胞／mlでPBS中に懸濁したCOS-7細胞液0.8mlに加え、1500V,25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分問の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞は、10%牛胎児血清（GIBCO-BRL製）を含むDMEM培養液（GIBCO-BRL製）にて、37℃、5%CO2の条件下で３日間培養した。
2）パンニングデイッシュの調製
マウス抗HM1.24抗体をコーティングしたパンニングデイッシュを、B.Seedら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,3365-3369（1987））の方法に従って調製した。すなわち、マウス抗HM1.24抗体を10μg/mlになるように50mM Tris-HCl（pH9.5）に加えた。このようにして調製した抗体溶液3mlを直径60mmの細胞培養皿に加え、室温にて2時間インキュベートした。0.15M NaCl溶液にて3回洗浄した後、5%牛胎児血清、1mM EDTA、0.02%NaN3を含むPBSを加え、ブロッキングした後、下記クローニングに用いた。
3）cDNAライブラリーのクローニング
前述のようにトランスフェクトしたCOS-7細胞は、5mM EDTAを含むPBSにて剥がし、5%牛胎児血清を含むPBSで一回洗浄した後、約1 x 106細胞／mlとなるように5%牛胎児血清及び0.02% NaN3を含むPBSに懸濁し、上記のように調製したパンニングデイシユに加え、室温にて約2時間インキュベートした。5%牛胎児血清及び0.02%NaN3を含むPBSで３度緩やかに洗浄した後、0.6%SDS及び10mM EDTAを含む溶液を用いてパンニングディシュに結合した細胞からプラスミドDNAの回収を行った。
回収したプラスミドDNAを再び大腸菌DH５αに形質導入し、前述のようにプラスミドDNAを増幅後、アルカリ法にて回収した。回収したプラスミドDNAをCOS-7細胞にエレクトロポレーション法によりトランスフェクトして前述と同様に結合した細胞よりプラスミドDNAの回収を行った。同様の操作を更に１回繰り返し、回収したプラスミドDNAを制限酵素EcoRIおよびNotIで消化した結果、約0.9kbpのサイズのインサートの濃縮が確認された。さらに、回収したプラスミドDNAの一部を形質導入した大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを含む2-YTアガープレートに接種し、一晩培養後、単一のコロニーよりプラスミドDNAを回収した。制限酵素EcoRIおよびNotIにて消化し、インサートのサイズが約0.9kbpを示すクローンp3.19を得た。
本クローンについては、PRISM,Dye Terminater Cycle Sequencingキット（PerkinElmer製）を用いて、キット添付の処方に従い反応を行い、ABI 373A DNA Sequencer（Perkin Elmer製）にて塩基配列の決定を行った。この塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号1に示す。
産業上の利用可能性
抗HM1.24抗体と生体応答修飾剤を併用することにより特にＡＤＣＣ活性の低下したエフェクター細胞の細胞活性が増強された。これらのことから、抗HM1.24抗体と生体応答修飾剤を併用することによりリンパ球系腫瘍に対する抗腫瘍効果を増強することが示される。
特許協力条約第13規則の２の寄託された微生物への言及及び寄託機関
寄託機関  名称：工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１−３
微生物（1）表示：Escherichia coli DH5α（PRS38-pUC19）
寄託番号：FERM BP-4434
寄託日：1993年10月５日
（2）表示：Mouse-mouse hybridoma HM1.24
寄託番号：FERM BP-5233
寄託日：1995年４月27日
（3）表示：Escherichia coli DH5α（pUC19-RVHr-AHM-gγ1）
寄託番号：FERM BP-5643
寄託日：1996年８月29日
（4）表示：Escherichia coli DH5α（pUC19-1.24H-gγ1）
寄託番号：FERM BP-5644
寄託日：1996年８月29日
（5）表示：Escherichia coli DH5α（pUC19-RVLa-AHM-gκ）
寄託番号：FERM BP-5645
寄託日：1996年８月29日
（6）表示：Escherichia coli DH5α（pUC19-1.24L-gκ）
寄託番号：FERM BP-5646
寄託日：1996年８月29日
（7）表示：Escherichia coli DH5α（pUC19-RVHs-AHM-gγ1）
寄託番号：FERM BP-6127
寄託日：1997年９月29日
配列
配列：1
配列の長さ：1013
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：cDNA
配列
0004346116.tif 000002
0004346116.tif 000003
配列：２
配列の長さ：３７９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列：３
配列の長さ：４１８
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列：４
配列の長さ：４１８
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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0004346116.tif 000016
【図１】
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【図２】
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【図３】
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