(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超小型電子装置上の正に偏った試験部位での電場における試験部位にて結合した一本鎖捕獲ＤＮＡに対するＤＮＡ分析物のハイブリダイゼーションを電気的に増強する方法であって、
（１）該装置に１０−１００ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液を適用し、
（２）（ａ）超小型電子装置上の試験部位にて電場を生じさせ（ここに、該試験部位は、ＤＮＡ分析物に対して電気的に正に偏る）、次いで
（ｂ）電場の影響下で緩衝分子に正電荷を供する（ここに、正に荷電した緩衝分子は、ＤＮＡ分析物と試験部位にて結合した一本鎖捕獲ＤＮＡとの間のＤＮＡハイブリダイゼーションを安定化させるように機能する）量の電流を超小型電子装置上の試験部位に印加する
工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項２】
ヒスチジンが、一本鎖捕獲ＤＮＡおよびＤＮＡ分析物間のハイブリダイゼーションを安定化する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒスチジンが、一本鎖捕獲ＤＮＡおよびＤＮＡ分析物間の斥力を低下させる請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヒスチジンが、一本鎖捕獲ＤＮＡおよびＤＮＡ分析物間の安定化付加物を形成させる請求項１記載の方法。
【請求項５】
捕獲核酸を有する微小位置試験部位を含み、ここに、該微小位置が、該微小位置にて電場が生成されない第１の状態、および標的核酸に誘引性の電場が生成される第２の状態に少なくとも置かれるように印加する超小型電子ハイブリダイゼーション装置における標的核酸のハイブリダイゼーション効率を増強する方法であって、
１０−１００ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液を該装置に適用し、
該装置に標的核酸を供し、
該装置への電圧の印加を介して微小位置を該第２の状態にさせ、装置上の微小位置試験部位にて標的核酸の蓄積を引き起こし、次いで
該第１の状態においてより、該第２の状態において高効率で標的核酸と捕獲核酸とをハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項６】
ヒスチジンが等電点で調製された請求項５記載の方法。
【請求項７】
ヒスチジンが、該第２の状態において標的核酸および捕獲核酸間のハイブリダイゼーションを安定化させる請求項５記載の方法。
【請求項８】
ヒスチジンが天然化合物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
ヒスチジンが、該第２の状態において捕獲核酸および標的核酸間の斥力を低下させる請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ヒスチジンが、捕獲核酸および標的核酸間の安定化付加物を形成させる請求項５記載の方法。
【請求項１１】
緩衝分子が、試験部位の周囲の溶液を緩衝することにより電気的に正に偏った試験部位にて生成された水素からの分析物に対する保護を供する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、医学診断用途、生物学的用途および他の用途に適合する電子装置に用いる緩衝液および電解液に関する。より詳細には、超小型電子医学診断装置で行うＤＮＡハイブリダイゼーション分析での有利な使用を目的とした緩衝液および電解液に関する。
発明の背景
近年、超小型電子技術および分子生物学を結合させた装置への関心が増大している。かかるシステムの１つは、１９９３年１１月１日付で出願され、現在米国特許第５，６０５，６６２号として公開されたシリアル番号第０８/１４６，５０４号の「ＡＣＴＩＶＥ  ＰＲＯＧＲＡＭＭＡＢＬＥ  ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＦＯＲ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ」に開示され、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。そこに開示されたシステムは、ＡＰＥＸシステムと言われる。ＡＰＥＸシステムは、核酸ハイブリダイゼーション、抗体/抗原反応、臨床診断および生体高分子合成のごとき分子生物学的反応において、有利に用いられ、広範な機能を果たすことができる。
ＡＰＥＸ型装置は、それらの操作に緩衝液および電解液を利用する。緩衝液は、酸またはアルカリの添加に対してｐＨ変化に抵抗性のある化学溶液として定義される。例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２版、Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｏｍｂｓ、ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ参照。そこに記載されたごとく、「伝統的に、無機塩（リン酸塩、炭酸塩）および有機塩（酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グリシン、マレイン酸塩、バルビツール酸塩等）に基づく緩衝液を生物学実験において用いた。」
ハイブリダイゼーション、反応、診断および合成を行う分子生物学的電子装置において有利に用いられる緩衝液および電解液を見出すことが本発明の目的である。
発明の概要
下記の発明は、本発明者らのＡＰＥＸ超小型電子チップおよび装置におけるＤＮＡ輸送速度、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の効率および全ハイブリダイゼーション特異性を改良または最適化する種々のパラメーター、電解液（緩衝液）および他の条件に関連する発見に関する。詳細には、本発明は低導電率双性イオン緩衝溶液、とりわけ１０−１００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭの濃度またはｐＩ（等電点  約ｐＨ７．４７）またはその付近にて調製されたアミノ酸ヒスチジンを含有するものが、迅速なＤＮＡ輸送および効率的なハイブリダイゼーション反応について最適化条件を提供するという発見に関する。次の最もよく知られた緩衝液、システインに対して少なくとも１０倍のハイブリダイゼーション効率が達成される。試験データは、システインに比較してハイブリダイゼーション効率においておよそ５０，０００倍の増大を示す。
図表の簡単な記載
図１は、ヒスチジン緩衝液を利用したチェッカーボード配列の平面図である。
発明の詳細な記載
さまざまなタイプの電解液/緩衝溶液において、ＤＮＡの電気泳動輸送および他の荷電分析物に関係する種々の物理的パラメーターがある。ある種の装置、例えば、前記の米国特許第５，６０５，６６２号に記載のごとき出願人のＡＰＥＸ装置は、基本的に装置表面に電場を生成するＤＣ（直流）電気装置である。次いで、これらの場は、装置表面に反対に（＋/−）偏った微小位置（ｍｉｃｒｏｌｏｃａｔｉｏｎ）間に荷電分子の電気泳動輸送を引き起こす。対照的に、いわゆるジノセンサー（Ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）（インピーダンス・センサー）（例えば、ＷＯ９３/２２６７８のＨｏｌｌｅｓら、「Ｏｐｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」参照）、および二次元電気泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）装置（例えば、Ｗａｓｈｉｚｕ  ２５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ、１０９−１２３、１９９０参照）は、ＡＣ電場での使用を含む。これらの装置に関する重要な相違点は、これらのＡＣ場が印加される場合、これらのシステムのいずれにおいても本質的に正味の電流はない、すなわち、荷電分子輸送用の電気泳動の推進力はない点である。ＡＰＥＸ型装置は、電圧が印加される場合、かなりの正味の直流電流（ＤＣ）を生じさせ、それは「電気泳動のサイン」として認識される。電気泳動において、イオンまたは荷電粒子の移動は、電場勾配の方向に沿った電気力によって生じ、電流および電圧の関係は、この技術に重要である。この電気泳動的移動は、印加された電圧の影響下、溶液中の電流伝導性としてそれ自体肉眼的に示され、
Ｖ＝Ｒ×Ｉ
Ｖは電位である
Ｒは電解液の電気抵抗である［Ｖ×Ａ-1＝Ｒ（Ω）］
Ｉは電流である［Ａ］。
のオームの法則に従う。
溶液の抵抗は、伝導率測定器によって測定できる導電率の逆数である。導電率は、主に緩衝液/電解液のイオン種およびそれらの濃度に依存し；従って、これらのパラメーターは電場関連分子生物学的技術に非常に重要である。生じた電場は本当に顕微鏡的環境におけるものであるが、基本的な電流/電圧関係は、いずれの他の電気泳動システムについてとも同様にＡＰＥＸ技術につき本質的に同じである。
電流および電圧を供給する種々の方法および電流および電圧の筋書が、いかにしてかかるシステムの性能を改良するのに見出されたかに関して、ＡＰＥＸシステムはユニークな特徴がある。詳細には、いくつかのＤＣパルス手法（線形および対数勾配）が、改良されたハイブリダイゼーションストリンジェンシーを提供するらしい。
電気泳動輸送−対−イオン強度
荷電分析物種（蛋白質、ＤＮＡ等）の移動度において対数的減少があり、電解溶液のイオン強度の平方根に反比例することが、電気泳動の分野においてよく確立されている（「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｒ．ＫｕｈｎおよびＳ．Ｈｏｆｆｓｔｅｔｔｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３の８３頁および図３．１６参照）。いずれかの所与の一定の電場強度にて、電解液濃度は分析物種（蛋白質、ＤＮＡ等）に対して減少するにつれ、分析物はより速い速度にて輸送されるであろう。ダンシルアミノ酸について、この効果を示す同様の結果が、Ｊ．Ｊ．Ｉｓｓａｑら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  Ｖｏｌ．３２、＃３/４、１９９１年８月、１５５ないし１６１頁（詳細には、１５７頁図３参照）によって示されている。ＤＮＡについてこの効果は異なる電解溶液であることを示す結果が、Ｐ．Ｄ．ＲｏｓｓおよびＲ．Ｌ．Ｓｃｒｕｇｇｓ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｖｏｌ．２、２３１ないし２３６頁、１９６４（詳細には、２３２頁図１参照）に示されている。
イオン強度/導電率の関係
溶液（Ｎａ+←−→Ｃｌ-、Ｋ+←−→Ｃｌ-等）中の完全解離したアニオンおよびカチオンを含む非緩衝性電解液（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）について、イオン強度および導電率は等価である、すなわち導電率は通常イオン強度に比例するであろう。それらの解離状態（例：２Ｎａ+←−→ＰＯ4--2）にある緩衝性電解質（リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等）について、イオン強度および導電率は、通常等価になるであろう、すなわち導電率はイオン強度に比例する。双性イオン種（それらのｐＩにて正味の荷電をしない）を有することができる緩衝性電解液［グッド緩衝液（ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、トリシン、ビシン）、アミノ酸緩衝液、両性電解液等］について、導電率は、等電点（ｐＩ）および（ｐＫａ）間の毎ｐＨ単位差につきおよそ１０倍減少するであろう。例えば、その双性イオン状態（-ＯＯＣ−ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ3+）にあるアミノ酸は、「アミノ酸部分」が十分な正味の正電荷（ＨＯＯＣ−ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ2+←−→Ｘ-）または十分な正味の負の電荷（Ｙ+←−→-ＯＯＣ−ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ2）を有する場合よりおよそ１０００倍低い導電率値を有するであろう。従って、そのｐＩから離れるにつれ、形式的な負または正の電荷がアミノ酸部分で発生し、導電率およびイオン強度は関連しだすであろう。しかしながら、ｐＩまたはその付近にて、導電率は所与のイオン強度または濃度で予期されるより大変低いであろう。それらのｐＩまたはその付近にて用いられる場合、電気泳動のテキストは、グッド緩衝液およびアミノ酸緩衝液が「高イオン強度または濃度にて低導電率」を有すると言及する（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｒ．ＫｕｈｎおよびＳ．Ｈｏｆｆｓｔｅｔｔｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３の８８頁参照）。通常用いられる電気泳動緩衝液「トリス−ホウ酸」は、実際上、そのイオン強度または濃度から予期されるよりかなり低い導電率を有する。これは、溶液中で比較的安定した双性イオン複合体を形成する「トリス・カチオン」および「ホウ酸アニオン」のためかも知れない。１００ｍＭトリス−ホウ酸溶液の導電率は６９４μＳ/ｃｍであると測定され、これはそのイオン強度から予期されるよりおよそ２０倍低く、５ｍＭリン酸ナトリウムまたは塩化ナトリウム溶液とおよそ等価であった。表１は、多数の輸送緩衝液の導電率測定値を示す。
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双性イオン緩衝液/導電率/輸送速度
それらのｐＩまたはその付近にて、双性イオン緩衝液（グッド緩衝液、アミノ酸緩衝液）またはトリス−ホウ酸緩衝液を用いた場合、ある有利さがＤＮＡの電気泳動輸送の割合および速度に関して存在する。これらは、１）かかる緩衝液は、比較的高濃度にて用いることができ、緩衝能を増大させ、２）それらの導電率が同一濃度にて他のタイプの緩衝液よりかなり低く、また、３）注目する分析物（ＤＮＡ）について高い電気泳動輸送率の有利さを得ることである。
等電点（ｐＩ）での双性イオン緩衝能
アミノ酸緩衝液は、それらのｐＩにて緩衝特性を有する。所与のアミノ酸は、そのｐＩにてその「最高緩衝能」を有するかまたは有しないかもしれないので、それはいくらか緩衝能を有するであろう。緩衝能は、ｐＩおよびｐＫａの間の毎ｐＨ単位差について１０倍減少し、３種のイオン化可能基（ヒスチジン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等）を有するアミノ酸は、一般的に２種の解離のみを有するアミノ酸よりそれらのｐＩにて高い緩衝能を有する。例えば、それらのｐＩにて比較的低い緩衝能を有するアラニンまたはグリシンに比較して、ヒスチジンｐＩ＝７．４７、リジンｐＩ＝９．７４およびグルタミン酸ｐＩ＝３．２２の全ては、それらのｐＩにて比較的良好な緩衝能を有する（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５；詳細には７９頁の図４−８および８０頁図４−９参照）。ヒスチジンは、ゲル電気泳動で使用される緩衝液として推奨されてきたが、ハイブリダイゼーションは、かかるシステムにおいては行われない。米国特許第４，９３６，９６３号参照。システインは、緩衝能に関してより中間的な位置にある。システインのｐＩは５．０２、αカルボキシル基のｐＫａは１．７１、スルフヒドリルのｐＫａは８．３３、またαアミノ基のｐＫａは１０．７８である。２５０ｍＭシステインの酸/塩基滴定曲線は、システインが２０ｍＭリン酸ナトリウムより約ｐＨ５にて良好な「緩衝能」を有することを示す。ｐＨ４ないし６の範囲にて、システインの緩衝能は、とりわけ高いｐＨにて、２０ｍＭリン酸ナトリウムより有意に優れている。しかしながら、これらのｐＨ範囲において、２５０ｍＭシステイン溶液の導電率は、１００倍大きい約２．９ｍＳ/ｃｍの値を有する２０ｍＭリン酸ナトリウムに比較して非常に低い約２３μＳ/ｃｍである。図１は、種々の輸送用緩衝液の導電率測定値を示す。
２０年以上前に開発されたいくつかの電気泳動技術は、「それらのｐＩにて」双性イオン緩衝液中の蛋白質を分離する能力に基づいている。これらの技術は、等電点電気泳動法、イソタコフォレシス（Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）および等電点分画法と呼ばれる（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄによる「Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」の第３章および第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８１参照）。これらの適用について、全てそれらのｐＩにて、いくつかのアミノ酸緩衝液およびグッド緩衝液が用いられた（前記引用文献の１６８頁表２参照）。
低イオン強度および低導電率緩衝液におけるＤＮＡ輸送
２．５％アガロースをコートした５５８０チップおよびＢｙＴｒ−ＲＣＡ５蛍光性プローブを用いて、一連の蛍光性チェッカーボード試験を行った。以下のシステム：（１）２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（低導電率）、（２）１０μＭ  コハク酸ナトリウム、（３）１０μＭ  クエン酸ナトリウムおよび（４）蒸留水の全てに迅速な（６秒）チェッカーボード・アドレッシングを達成できた。クエン酸ナトリウムの結果を図１に示す。一方、いくつかのタイプの低導電率または低イオン強度溶液は、幾分良好な特質であるチェッカーボード・アドレッシングを有し、迅速なＤＮＡ輸送（８０μｍパッドの６ないし１２秒のＤＮＡ蓄積）がこれらの全てのシステムを用いて達成された。さらに、ＤＮＡ（それ自体がポリアニオン）は、導電率を提供するバルク溶液中に存在する電解質であるので、蒸留水中のＤＮＡアドレッシングＡＰＥＸチップが可能である。図１は、ヒスチジンを用いたＡＰＥＸチップの平面図を示す。
電気泳動輸送速度およびカチオン/アニオン種の関係
荷電分析物種（ＤＮＡ、蛋白質等）の移動度が電解溶液のイオン強度に関係するという事実に加えて、また、その移動度は、電解溶液中のカチオンおよびアニオン種の性質によって大きく影響される（「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」参照）。前記Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｖｏｌ．２、ｐｐ．２３１−２３６、１９６４文献に、ＤＮＡ輸送についてこの特殊な点が示されている。この文献の２３２頁の図１は、同一のイオン強度にて、異なる１価アニオン（Ｌｉ+＞Ｎａ+＞Ｋ+＞ＴＭＡ+）を有する電解液を用いる場合のＤＮＡ移動度の変化を示す。基本的には、異なるカチオンは、ＤＮＡリン酸基で異なる会合定数を有し、および/またはＤＮＡ分子周囲の水和領域を変化させ、これは輸送速度の変化に導くことができる。
本発明は、電場分子生物学的装置、とりわけＡＰＥＸ微小電子チップおよび装置において、ＤＮＡ輸送速度、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応効率および全ハイブリダイゼーション特異性を改良または至適化する種々のパラメーター、電解液（緩衝液）および他の条件に関連する本発明者らの発見に関する。詳細には、本発明は、ｐＩ（等電点  約７．４７）またはその付近で１０−１００ｍＭ、とりわけ約５０ｍＭの濃度にて調製されたアミノ酸ヒスチジンを含有する低導電率の双性イオン緩衝溶液が、迅速な電気泳動ＤＮＡ輸送および効率的なハイブリダイゼーション反応について共に至適条件を提供するという本発明者の発見に関する。ヒスチジン緩衝液のこの有利さは、特にＡＰＥＸチップ型装置に重要である。
これらの特別な装置（ミクロ機械加工型装置とは対照的に）は、印加できる電流および電圧の量に関して限界を有する。この限界は、同一緩衝液システムを用いて迅速な輸送および効率の良いハイブリダイゼーションを共に達成するのを困難にする。これらの場合、限られた電流/電圧が迅速な輸送を依然として引き起こす低導電率緩衝液（システインまたはアラニン）中で、ＤＮＡ輸送を行った。これらの条件下、ＤＮＡは試験部位で蓄積したが、効率的にハイブリダイズしなかった。これらの低導電率緩衝液中の輸送の後、溶液を高い塩緩衝液（＞１００ｍＭ  塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウム）に変更し、これは次いで試験部位で効率的なハイブリダイゼーションを引き起こした。
表２は、緩衝能、ｐＨおよび導電率のパラメーターと、ＡＰＥＸチップ装置を用いたＤＮＡ蓄積およびハイブリダイゼーション感度（効率）とを関連付ける一連の試験についての結果を示す。
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詳細には、表２は、試験部位で特異的捕獲ＤＮＡへの輸送された標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに対する種々の双性イオンアミノ酸緩衝液［β−アラニン、タウリン、システイン、ヒスチジン、リジンおよびリン酸ナトリウム（双性イオン緩衝液ではない）］の効果を示す。輸送に関して、一般的に導電率は同一場条件下で輸送と相関する。β−アラニン、タウリンおよびシステインは、優れた輸送を示し、ヒスチジンは良好な輸送を示し、また、リジンおよびＮａＰＯ4はかなりの輸送を示す。ＤＮＡハイブリダイゼーション感度は、負に荷電したポリアニオン性リン酸骨格を有する「標準的ＤＮＡ」について報告されている。
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また、ハイブリダイゼーション感度に加えて、表２はストレプトアビジン/ビオチンＤＮＡプローブ捕獲親和性に関する感度を示す。
表２は、ＤＮＡ輸送（蓄積）と低導電率（β−アラニン、タウリン、システイン、ヒスチジン）との相関関係を明確に示す。表は、β−アラニン、システインおよびヒスチジンを用いるストレプトアビジン/ビオチンプローブの親和性反応について優れた感度を示す。表２の感度データに反映されたごとく、ヒスチジンは、システインまたは２０ｍＭ Ｎａ ＰＯ4のごとき他の緩衝液のいずれかより良好なハイブリダイゼーション効率を４オーダー以上大きく提供する。システインに対する改善は、少なくとも１０倍で、より詳細には１０2倍であり、最も詳細には、少なくとも１０4倍である。最も重要なことには、表２は、ＤＮＡハイブリダイゼーション感度（効率）がヒスチジン緩衝液について非常に良好であることを示すことである。従って、現在試験された双性イオンアミノ酸緩衝液のうち、ヒスチジンが良好な輸送および良好なＤＮＡ/ＤＮＡハイブリダイゼーション効率を共に提供する唯一のものである。
ヒスチジン緩衝液系の低導電率は、迅速な輸送（蓄積）の原因であると信じられている。なぜヒスチジン緩衝液が、比較的有効なＤＮＡ/ＤＮＡハイブリダイゼーションを引き起こすのかに関していくつかの可能な説明がある。一つの長所が、ヒスチジンの優れた緩衝能であるのかもしれない。７．４７のそのｐＩにて、ヒスチジンは、酸性または塩基性条件下で優れた緩衝液である（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５、８０頁図４−９参照）。ＤＮＡがハイブリダイゼーションのために蓄積され、ヒスチジンがこれらの条件を効率的に緩衝するかもしれない正電極にて、ＡＰＥＸチップは酸を生成する。より重要なことは、これらの酸性条件（ｐＨ＜５）下、ヒスチジンのイミダゾール基のプロトン化が分子のジカチオン種への転化を開始する。正に荷電したα−アミノ基および正に荷電したイミダゾール基を有するこのジカチオン種は、ハイブリダイゼーションを促進し、ＡＰＥＸチップの正電極にて形成されたＤＮＡ/ＤＮＡハイブリッドを安定化させるのを助けるかも知れないのが当てはまる場合であろう。カチオン、ジカチオンおよびポリカチオンは、二本鎖ＤＮＡ構造上の負に荷電したリン酸骨格の斥力を低下させることによって、ＤＮＡ/ＤＮＡハイブリッドの安定化を助けることが知られている。また、ＤＮＡ/ＤＮＡ/ヒスチジンは、正電極にて生成する他の電気化学的生成物（過酸化水素等）からのいくつかのタイプの安定化付加物を形成するかも知れないという可能性がある。
本具体例は、天然に生じたヒスチジンを利用するが、本発明は良好な緩衝能、低導電率（または双性イオン特性）を有し、電荷安定化または付加物形成によって、ＤＮＡハイブリダイゼーションを安定化させる特性を有する他の天然または合成化合物に十分に適用できる。
前記発明は、明確化および理解を目的とする図示および例の方法によって、いくらか詳細に記載したが、ある種の変更および修飾が、添付された請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなしに成され得ることは、本発明の教授の知識において当業者には容易に明らかであろう。
【図１】
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