(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の配列の少くとも２タンデムコピーからなる、Yarrowiaにおいて機能的な上流活性化配列。
【請求項２】
断片の構築および結合に必要な制限部位および他の要素をさらに含んでなる、請求項１に記載の上流活性化配列。
【請求項３】
配列番号４の配列の４タンデムコピーからなる、請求項１または２に記載の上流活性化配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載された上流活性化配列を含んでなり、ＸＰＲ２プロモーター配列のヌクレオチド−１４６〜−１２７により画されたＵＡＳ２領域からのデカマーリピートを欠く、Yarrowiaにおいて機能性な組換えプロモーター配列。
【請求項５】
Yarrowia lipolyticaにおいて機能的である、請求項４に記載の組換えプロモーター配列。
【請求項６】
ＴＡＴＡボックスがYarrowia lipolytica遺伝子プロモーターのものである、請求項４または５に記載の組換えプロモーター配列。
【請求項７】
ＴＡＴＡボックスがＸＰＲ２遺伝子とは異なる遺伝子のものである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組換えプロモーター配列。
【請求項８】
対象遺伝子と作動可能に連結された、請求項４〜７のいずれか一項に記載された組換えプロモーター配列を含んでなる、Yarrowia酵母におけるタンパク質発現用ベクター。
【請求項９】
対象遺伝子がタンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
対象遺伝子が該酵母の異種タンパク質をコードしている、請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１１】
該酵母がYarrowia lipolyticaである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
染色体中への挿入を行える配列を更に含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
複製配列を更に含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載されたベクターで形質転換されたYarrowia lipolyticaである、組換え酵母。
【請求項１５】
対象遺伝子と作動的に連結された組換えプロモーター配列が、少くとも１コピーで、酵母の染色体中に組み込まれている、請求項１４に記載の組換え酵母。
【請求項１６】
ベクターが自律複製ベクターとして存在している、請求項１４に記載の組換え酵母。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載された組換えYarrowia lipolytica細胞を培養する工程を含む、Yarrowia lipolyticaにおけるタンパク質生産法。
【請求項１８】
ｉ）請求項８〜１３のいずれか一項に記載されたベクターをYarrowia lipolytica中に導入し、
ii）ペプトンを実質上欠いた培地においてｉ）で得られた上記Yarrowia lipolyticaを培養し、そして
iii）上記異種タンパク質を回収する
工程を含む、異種タンパク質を生産するための方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵母、更に詳しくはYarrowia lipolyticaで改善されたタンパク質発現を行わせる系に関する。本発明は、Yarrowiaで機能性の組換え上流アクチベーター配列、プロモーター配列、更に詳しくはハイブリッドプロモーター配列と、それらを含んだベクターに関する。本発明のもう１つの目的は、このようなベクターで形質転換された組換え酵母と、Yarrowia lipolyticaでタンパク質を生産させる方法である。
Yarrowia lipolyticaは、スクロースではなく、グルコースおよびグリセロール、ｎ-アルカンおよびアルケンのようなパラフィン類（Klug and Markovetz,1967 and 1969;Bassel and Mortimer,1973）、脂質およびタンパク質（Ogrydziak et al.,1977）を含めた、限定された数の炭素源上で増殖しうる二形性酵母である。タンパク質を分解するために、増殖条件に応じて、Yarrowia lipolyticaはプロテアーゼを分泌する（Ahearn et al.,1968；Kamada et al.,1972）。例えば、アルカリまたは中性培地中で、それはAlkaline Extracellular Protease（ＡＥＰ）を分泌する（Tobe et al.,1976；Ogrydziak et al.,1977；Ogrydziak and Scharf et al.,1982）。対応する遺伝子ＸＰＲ２は、Davidow et al.（1987）、Matoba et al.（1988）およびNicaud et al.（1989）により独立してクローニングされた。
多くの真核プロモーター、特に酵母プロモーターが詳しく研究されてきた。遺伝子発現の調節には、プロモーター内に結合された転写因子間で多数の相互作用を要することが証明された。最小のシス作用要素でさえも、その機能にとり、多数の部位が必要とされて、多数のタンパク質が関与しているのかもしれない。酵母細胞だと、上流活性化配列（ＵＡＳ）が転写に必要である。それらはＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位についていずれかの向きに可変的な距離で機能するが、それより高等の真核生物のエンハンサーとは対照的に、それらはこれら基本要素より上流になければならない。ＵＡＳは２タイプの転写アクチベーターのターゲットである。ＨＡＰ１およびＡＣＥ１を含めた第一クラスのアクチベーターは、下流遺伝子の活性転写の条件下のみでＵＡＳと結合する。第二クラスはＡＤＲ１、ＨＳＴＦ、ＰＵＴ３およびＧＡＬ４で代表され、これらのタンパク質はＵＡＳと永続的に結合するが、それらの活性は調節される。
酵母細胞でほとんどの抑制現象は転写因子の不活化または不在に起因しているようであるが、一部のネガティブ調節部位または上流抑制配列（ＵＲＳ）も確認された。
Yarrowia lipolyticaのＸＰＲ２遺伝子は、この酵母により分泌される主要タンパク質である、誘導性アルカリ細胞外プロテアーゼ（ＡＥＰ）をコードしている（Davidow et al.,1987）。この遺伝子の調節は複雑である。ＡＥＰの抑制解除は、好ましい炭素および窒素源を欠いた培地においてｐＨ６．０以上で起き、ＸＰＲ２プロモーターの完全誘導には培地中で高レベルのペプトンを必要とするが、インデューサーの正確な性質は未知である。機能性ＸＰＲ２プロモーターは約９００ｂｐである。
ＥＰ１３８５０８では、染色体ＤＮＡと相同的な領域を有したＤＮＡおよび遺伝マーカーの組込みによるYarrowia lipolyticaの形質転換方法を開示している。
ＥＰ２２０８６４では、Yarrowia lipolyticaで異種タンパク質の発現および分泌のためのベクターを開示している。そのベクターは、Yarrowia lipolytica遺伝子のプロモーター配列と、異種タンパク質の遺伝子と作動的に連結されたYarrowia lipolyticaのＸＰＲ２遺伝子のシグナル配列とをもっていなければならない。プロモーター配列には、ＸＰＲ２プロモーター配列、即ちシグナル配列の前にある上流非転写領域がある。
意外にも、本発明者らは、ＸＰＲ２プロモーター配列の一部のみを有するハイブリッドプロモーターがYarrowia lipolyticaでタンパク質の発現を得るために用いうることを示した。
更に、彼らは、ＸＰＲ２プロモーター配列の一部のみのタンデムリピートから構成されるハイブリッドプロモーターが、培地中でペプトンの存在に関係なく、そのコントロール下でタンパク質の強い準構成的発現を行わせることを示した。これらのハイブリッドプロモーターは、好ましい炭素または窒素源だけでなく、酸性条件（ｐＨ６．０以下）によっても、もはや抑制されない。
これは、慣用培地が低価格で使用できることから、分泌される異種タンパク質の生産にとり大きな工業的利点である。望ましいタンパク質の回収のための更なる精製工程も容易になり、その理由は（野生型ＸＰＲ２プロモーターの完全誘導と、分泌される異種タンパク質の著しく面倒な精製に必要な）高レベルのペプトンがもはや不要だからである。
ＸＰＲ２プロモーターの以前の分析（Blanchin-Roland et al.,1994）では、発現の活性化に関係している２つの領域（ＵＡＳ）：１つの遠位（ヌクレオチド−８００〜−７６７および−７１７〜−７０８のＵＡＳ１）ともう１つの近位（ヌクレオチド−１４６〜−１０５のＵＡＳ２）について確認した。欠失分析により得られるこれら以前の結果によると、双方のＵＡＳはＸＰＲ２発現の調節について同等の役割を果たしているようであった。各ＵＡＳは、他方の不在下で、全ＸＰＲ２プロモーターの場合と似た調節（即ち、ペプトンに対する感受性と、好ましい炭素および窒素源による抑制）を行うことができた。
意外にも、ＸＰＲ２プロモーターの遠位領域（ＵＡＳ１）は、他方のプロモーターのＴＡＴＡ領域の上流におかれたときに、ＸＰＲ２関係外の生理活性を示せることがわかった。このＵＡＳ活性は、ＤＭＳフットプリントin vivo実験で保護されていることが以前にわかった配列（“ＵＡＳ１Ａ”と称されるＤＮＡ断片配列番号１）に付随している（Blanchin-Roland et al.,1994および図１）。ＵＡＳ効果は、フットプリント実験で保護されていることが以前にわかった配列の２つのリピートを含む隣接領域のこれら配列への付加により高められた（配列番号２）。全ＤＮＡ断片は“ＵＡＳ１Ｂ”と称される。抑制は野生型ＸＰＲ２プロモーターに抑制的な培養条件下（好ましい炭素および窒素源）で観察されず、ハイブリッドプロモーターのコントロール下におけるリポータータンパク質の発現は、誘導、基本および抑制培地で高められた。
近位ＵＡＳ領域（ＵＡＳ２）の分析では、タンデムに反復していて、フットプリント実験で保護されていたデカマー配列（Blanchin-Roland et al.,1994および図１）が、抑制条件下で発現レベルの減少を媒介できることを示した：この配列は炭素および／または窒素源に感受性のあるＵＲＡ（上流抑制配列）の性質を示す。
予想外に、この配列も、フットプリント実験で一部保護されていた隣接配列（cf．図１）と一緒になって、ＵＡＳ活性に必要であった。
したがって、ＵＡＳ２は活性および抑制双方の要素を含んでいる。それは、ＵＡＳ１の構成的性質とは全く対照的に、全ＸＰＲ２プロモーターの調節の少くとも一部を保存しているようであった。
したがって、本発明は、野生型ＸＰＲ２プロモーターの複雑な調節を免れた、Yarrowiaにおける機能的な上流活性化配列を提供する。それらは、ＸＰＲ２プロモーターのＵＡＳ１領域の配列のヌクレオチド−８０５〜−７０１により画された配列、またはその機能性断片から本質的になり、いくつかのコピーで存在することができる。それらは、ＸＰＲ２プロモーター配列のヌクレオチド−１４６〜−１２７により画された、ＵＡＳ２領域からのデカマーリピートも実質的に欠いていなければならない。
更に詳しくは、本発明は
ａ）配列番号１または配列番号１と少くとも８０％の同一性を有する配列
ｂ）ｉ）配列番号１または少くとも８０％の同一性を有する配列、
および
ii）配列番号２または配列番号２と少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー
から選択される少くとも１つの配列の少くとも１つのコピーから本質的になる、Yarrowiaで機能性の上流活性化配列を提供する。
ＸＰＲ２プロモーターにおける上記配列の位置は、図１および２に示されている。
“から本質的になる”とは、ＵＡＳが断片の構築および結合に必要な制限部位および他の要素も含むことができる、と理解されねばならない。
本発明によるＵＡＳ中に存在する上記断片のコピーは、タンデムリピート（すべて同方向またはすべて逆方向）でも、または双方の向きの組合せでもよい。
本発明の一態様によれば、ＵＡＳは
ｂ′）ｉ）配列番号１または少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー、および
ii）配列番号２に相当する２つのリピートを含んだ隣接配列の少くとも１つのコピー（図１で示されたように、それは配列番号１と配列番号２との間で部分的重複として存在しうる）
から本質的になる。
更に詳しくは、ＵＡＳは
ｃ）ｉ）配列番号１または少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー、および
ii）配列番号３または少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー
から本質的になっていてもよい。
配列番号３は、配列番号２の２つのリピートを含んだＸＰＲ２プロモーターの領域に相当する。図１で示されたように、それは配列番号１と配列番号３との間で部分的重複として存在しうる。
本発明による好ましいＵＡＳは
ｄ）配列番号４または配列番号４と少くとも８０％の同一性を有する配列
の少くとも１つのコピーから本質的になっている。
配列番号４は、図１および２で示されたような、大きな“ＵＡＳ１Ｂ”断片に存在する、ヌクレオチド−８０５〜−７０１により画されたＸＰＲ２プロモーター配列に相当する。
本発明は生理活性を留めた請求の範囲記載の配列の変異体にも関し、それらは当業者により調べることができる。
“ＵＡＳ１Ｂ”のいくつかのコピーがタンデムに挿入されたとき、発現は増加した：その効果は第二コピーのとき相加以上であり、相乗的相互作用を示唆していて、新たな各コピーの追加では相加になるだけとなった。４コピーで得られる発現のレベルは、誘導条件下において自然ＸＰＲ２プロモーターの場合と同程度の大きさで、３種の培地で非常に高い。得られるハイブリッドプロモーターはペプトンの添加を要せず、炭素および窒素源だけでなく、培養の酸性条件によっても、もはや抑制されない。これらの強い準構成性プロモーターは、異種タンパク質の生産にとり特に有用である。
本発明によるＵＡＳにおいて、上記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）各々のコピー数は１〜８の範囲であり、配列番号２のコピー数は０〜１６の範囲である。その配列は同方向でもまたはそうでなくてもよい。
本発明によるＵＡＳは、特に、上記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の２つのタンデムコピー、あるいは上記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の４つのタンデムコピーからなることができる。
本発明は、酵母で機能的であって、上記のようなＵＡＳを含んだ、組換えプロモーター配列にも関する。このような組換えプロモーターは、特にYarrowia酵母、好ましくはYarrowia lipolyticaで有用である。
本発明によるプロモーター配列は、“ＵＡＳ１Ｂ”またはその誘導体の１以上のコピーを含む。“ＵＡＳ１Ｂ”の４タンデムコピーの場合、それらは誘導培地において野生型ＸＰＲ２プロモーターで得られる発現と同レベルで、非誘導培地において遺伝子の準構成的発現をコントロールする。それらは好ましい炭素および／または窒素源を含有した培地で酸性条件の培養を用いることができ、培地中でペプトンの添加を回避しうる。
組換えプロモーター配列は、ＴＡＴＡボックスを更に含む。ＴＡＴＡボックスは好ましくはYarrowia lipolytica遺伝子の場合であり、ＴＡＴＡボックスにはＸＰＲ２遺伝子とは異なる遺伝子の場合、例えばＬＥＵ２プロモーターのＴＡＴＡボックスがある。
本発明のもう１つの目的は、対象遺伝子と作動的に連結された前記のような組換えプロモーター配列を含んでなる、酵母のタンパク質発現用ベクターである。対象遺伝子は、一態様において、酵母の異種タンパク質であるタンパク質をコードしている。酵母の同種タンパク質をコードする遺伝子も、本発明のベクターに含まれる。本発明のベクターはYarrowia lipolyticaと特に適合する。
本発明の一態様において、ベクターは染色体中へのその挿入を行える配列を更に含んでいる。これらの配列は、酵母の染色体の配列と相同性を示すために組換えおよび組込みを行える特別な配列であり、このような要素は（ＥＰ１３８５０８に記載されたように）当業者により調べられる。
こうして、ベクターのいくつかのコピーはYarrowia酵母の染色体に挿入することができる。
本発明のもう１つの態様において、ベクターは自律複製タイプであり、複製配列を更に含んでいる。このような配列は、例えば欧州特許出願第８９  ４００２１８．７号明細書に開示されている。
本発明は、特にYarrowia lipolytica種の、本発明によるベクターで形質転換された組換え酵母にも関する。
本発明の一面において、対象遺伝子と作動的に連結された組換えプロモーター配列は、少くとも１コピーで、酵母の染色体中に組み込まれる。
もう１つの面において、ベクターは自律複製ベクターとして酵母に存在している。
最後に、本発明は、上記のようなベクターで形質転換された組換えYarrowia lipolytica細胞を培養する工程を含む、Yarrowia lipolyticaにおいてタンパク質を生産する方法にも関する。
そのタンパク質は、Yarrowiaの同種でも、または異種のタンパク質でもよい。
構築には、タンパク質の分泌を行える要素を更に含んでいてもよい。
あるいは、組換え酵母は、例えば食品添加物としてそのまま用いることができる。対象タンパク質は、酵母を壊して、抽出物を更に精製することにより回収してもよい。
特に、本発明は
ｉ）タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結された組換えＵＡＳを含むベクターをYarrowia lipolytica中に導入し、
ii）ペプトンを実質上欠いた培地においてｉ）で得られた上記Yarrowia lipolyticaを培養し、
iii）上記異種タンパク質を回収する
工程を含む、異種タンパク質を生産するための方法に関する。
最後に、本発明は、
ａ）配列番号１または配列番号１と少くとも８０％の同一性を有する配列
ｂ）ｉ）配列番号１または少くとも８０％の同一性を有する配列、および
ii）配列番号２または配列番号２と少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー
ｃ）ｉ）配列番号１または少くとも８０％の同一性を有する配列、および
ii）配列番号３または配列番号３と少くとも８０％の同一性を有する配列の少くとも１つのコピー
ｄ）配列番号４または配列番号４と少くとも８０％の同一性を有する配列
から選択される少くとも１つの配列の１以上のコピーを含んだ組換えプロモーター配列をYarrowia lipolyticaに導入する工程からなる、Yarrowia lipolyticaでタンパク質の発現を高めるための方法に関する。
E.coliおよびY.lipolyticaの下記株は、Paris（France）のthe Institut Pasteurの”Collection Nationale de Cultures de Microorganismes”に寄託された：
-プラスミドｐＩＮＡ３５４を有するE.coli株ＨＢ１０１：受託番号Ｉ-１５７９
-プラスミドｐＩＮＡ４０４を有するE.coli株ＨＢ１０１：受託番号Ｉ-１５８０
-Y.lipolytica株ＪＭ２３ＳＢ：受託番号Ｉ-１５８１
本発明は下記例で更に理解されるが、それはその範囲を限定するためではない。
これらの例では、図面が参照される：
【図面の簡単な説明】
図１：ＸＰＲ２プロモーターのＵＡＳ領域の略図
遠位ＵＡＳ１および近位ＵＡＳ２の２つの領域が略示されている。ＤＭＳフットプリントin vivo実験で保護されていることがわかった配列（Blanchin-Roland et al.,1994）は、太い下線部分である（この方法はＧＣ塩基対のみに関する）。繰返し配列は矢印の下線で示されている。ハイブリッドプロモーターの構築に用いられるＤＮＡ断片（実施例３および４に示されたＵＡＳ１領域のデータ、ＵＡＳ２領域のデータは示されていない）が示されている。リベンジケートされた（revendicated）配列（配列番号１〜４）も示されている。
図２：ハイブリッドプロモーターで用いられる、ＸＰＲ２プロモーターのＵＡＳ１領域からのＤＮＡ断片の配列
Ａ／“ＵＡＳ１Ａ”断片の配列．“ＵＡＳ１Ａ”は、示された２つの合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成により得た。それはＸＰＲ２プロモーターの配列のヌクレオチド−８０５〜−７７６により画された配列から本質的になり、ＳｐｈＩ制限酵素のための付着末端を有していて、最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位で双方向に異なるコピー数でその挿入を行える（図３参照）。
Ｂ／“ＵＡＳ１Ｂ”断片の配列．“ＵＡＳ１Ｂ”は、ＸＰＲ２プロモーターの配列のヌクレオチド−８０５〜−７０１により画された配列から本質的になる。それは、鋳型としてプラスミドｐＩＮＡ３５４（図４参照）と、下記変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応により得た：
0004346681.tif 000002
新たなＳｐｈＩ制限部位（下線）を作るために導入された変異は、太字で示されている。ＳｐｈＩ切断後、“ＵＡＳ１Ｂ”は、最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位で双方向に異なるコピー数で挿入することができる（図３参照）。
図３：リポーターｐＩＮＡ７８１組込みプラスミドの地図
Ａ／ｐＩＮＡ７８１の地図．ｐＩＮＡ７８１は図４Ａで示された前記ｐＩＮＡ３５４プラスミド（Blanchin-Roland et al.,1994）から誘導した。
プラスミドｐＩＮＡ３５４を有するE.coli株ＨＢ１０１（ＨＢ１０１〔ｐＩＮＡ３５４〕）は、Paris（France）のthe Institut Pasteurの”Collection Nationale de Cultures de Microorganismes”に受託番号Ｉ-１５７９で寄託された。
最小ＬＥＵ２プロモーター領域を有するＤＮＡ断片（Gaillardin and Ribet,1987から調べられた）は、鋳型としてｐＩＮＡ３５４と、下記２つの変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応により得た（図４参照）：
0004346681.tif 000003
ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩおよびＢｃｌＩについて各々新たな制限部位（下線）を作るために導入された変異は、太字で示されている。
最小ＬＥＵ２プロモーターを有するＰＣＲ断片はＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＸＰＲ２プロモーターを有したそれ自体のＳｐｈＩ-ＢａｍＨＩ（２）を欠くｐＩＮＡ３５４プラスミド中に導入した（図４参照）。得られたｐＩＮＡ７８１プラスミドでは、最小ＬＥＵ２プロモーターは、以下のＢ／で示されたように、ＢａｍＨＩ（２）部位で行われた翻訳融合のおかげで、ｌａｃＺ遺伝子の発現を指示することができる。ユニークＳｐｈＩ制限部位は、ＸＰＲ２プロモーターからの様々なＤＮＡ断片を導入するために用いた。ユニークＮｏｔＩ制限部位は、ｐＢＲ３２２プラットフォームで、Y.lipolyticaＪＭ２３ＳＢ株（Blanchin-Roland et al.,1994）のゲノム中に得られたプラスミドの組込みを指示するために用いた。
Ｂ／最小ＬＥＵ２プロモーター、およびｌａｃＺリポーター遺伝子との翻訳融合を示す、ｐＩＮＡ７８１からの配列の断片。ＬＥＵ２プロモーターから保存された配列は、（ＬＥＵ２遺伝子の番号付けで）ヌクレオチド−９４〜＋１８で画される。ＴＡＴＡボックスおよびＡＴＧ配列は太い下線部分である（Gaillardin and Ribet,1987）。ＧＴＣはβ-ガラクトシダーゼ配列からの第一保存コドンであり、ｌａｃＺ遺伝子の第十コドンに相当する。
図４：ｐＩＮＡ３５４およびｐＩＮＡ４０４プラスミドの地図と、“ＵＡＳ１Ｂ”の３または４コピーを有するハイブリッドプロモーターをもつプラスミドの構築（ｅｘ：ｐＩＮＡ９９３）
プラスミドの構築に際して壊された制限部位または配列が、カッコ内に示されている。複数箇所に存在するものは、構築に際して用いられるとき番号付けされている。ＰＣＲ反応に用いられたオリゴヌクレオチドの大体の位置が示されている。
Ａ／ｐＩＮＡ３５４の地図（Blanchin-Roland et al.,1994）
Ｂ／ｐＩＮＡ４０４の地図（Blanchin-Roland et al.,1994）
これら２つのプラスミドは、ｌａｃＺ遺伝子の発現を指示する機能性ＸＰＲ２プロモーターを有している。
Ｃ／ｐＩＮＡ９９３の構築．“ＵＡＳ１Ｂ”の３または４コピーを有するハイブリッドプロモーターをもつプラスミドは、ｐＩＮＡ７８１中への“ＵＡＳ１Ｂ”断片の結合実験で直接得られた、２つのコピーを有するものから誘導された。ｐＩＮＡ７９７（２つの同方向コピー）からｐＩＮＡ９９３の作製法が示されている：ｐＩＮＡ７９７はＮｏｔＩと、部分的にＳｐｈＩで切断した（部分的切断の条件は１切断の手段を与える）。得られた制限断片の中には図示されたものがあり、それらの結合により、“ＵＡＳ１Ｂ”の４タンデム同方向コピーを有したｐＩＮＡ９９３プラスミドの形成を行える。“ＵＡＳ１Ｂ”の１コピーだけが断片の１つに保存されたときは、ｐＩＮＡ９９１（３同方向コピー）が得られた。同様に、ｐＩＮＡ９９２（３逆方向コピー）およびｐＩＮＡ９９４（４逆方向コピー）はｐＩＮＡ７９８（２逆方向コピー）から誘導された。
図５：ｐＩＮＡ３０３の地図とｐＩＮＡ９１９プラスミドの構築
プラスミドの構築中に壊された制限部位または配列が、カッコ内に示されている。複数箇所に存在するものは、構築に際して用いられるとき番号付けされている。ＰＣＲ反応に用いられたオリゴヌクレオチドの大体の位置が示されている。Ａ／ＸＰＲ２遺伝子のプロモーターおよびプレプロ領域を有するｐＩＮＡ３０３プラスミド（Blanchin-Roland et al.,1994）は、変異原性オリゴヌクレオチド“ＴＡＭＵＴ”（以下のＢ／に示されている）と下記配列を用いて、ＰＣＲ断片を合成するために鋳型として用いた：
0004346681.tif 000004
このＰＣＲ断片は、構築中間体としてｐＩＮＡ９１８プラスミドを作るために、ｐＩＮＡ３０３から得られた２つのＤＮＡ断片（ＮｏｔＩ-ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ-ＡｐａＩ切断）と（ＥｃｏＲＶ-ＡｐａＩ切断後に）結合させた。このプラスミドのＸＰＲ２プロモーター配列は、そのＴＡＴＡボックスを不活化させて、それを新たなＳｐｈＩ部位に代える、変異を有している。ＳｐｈＩ切断は全ＴＡＴＡ欠失ＸＰＲ２プロモーターを含む１０８５ｂｐ断片を与え、これは最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位に挿入された（図３参照）。図示されたような同方向での挿入は、ｐＩＮＡ９１９プラスミドを与えた。逆方向での挿入はｐＩＮＡ９２０を与えた。
Ｂ／ＸＰＲ２プロモーターのＴＡＴＡボックスを壊して新たなＳｐｈＩ制限部位を作る変異を有した、変異原性オリゴヌクレオチド“ＴＡＭＵＴ”の配列
図６：“ＵＡＳ１Ｂ”断片のコピー数の関数としてハイブリッドプロモーターの活性を表したグラフ
Ａ／最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位に挿入された“ＵＡＳ１Ｂ”の１〜４タンデム同方向コピーを有するハイブリッドプロモーター（各々ｐＩＮＡ７９５、７９７、９９１および９９３）の場合
Ｂ／最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位に挿入された“ＵＡＳ１Ｂ”の１〜４タンデム逆方向コピーを有するハイブリッドプロモーター（各々ｐＩＮＡ７９６、７９８、９９２および９９４）の場合
図７：様々な培地で培養中に、ＯＤ６００の関数としてｐＩＮＡ９９４ハイブリッドプロモーターおよび野生型ＸＰＲ２プロモーターの活性を表したグラフ
Ａ／誘導ＹＰＤｍ培地、古典的富培地ＹＰＤまたは抑制ＭＭＡｍ培地における（“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピーを有する-図４参照）ｐＩＮＡ９９４ハイブリッドプロモーターの活性
Ｂ／同培地におけるｐＩＮＡ４０４（図４参照）の野生型ＸＰＲ２プロモーターの活性
図８：ｐＩＮＡ９９４の１または２タンデム組込みコピーを有する株のサザンブロット分析
Ａ／ＪＭ２３ＳＢ Y.lipolytica株のｐＢＲプラットフォームおよびＮｏｔＩ直鎖化ｐＩＮＡ９９４プラスミドの組込みのスキーム
Ｂ／ｐＩＮＡ９９４の１コピーの組込み後に得られたＣｌａＩの制限パターン
Ｃ／ｐＩＮＡ９９４の２タンデムコピーの組込み後に得られたＣｌａＩの制限パターン
Ｄ／ｐＩＮＡ９９４で得られた３つの組込株のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析．ゲノムＤＮＡはＣｌａＩ制限酵素で切断した。膜は、ｐＢＲ３２２およびλＤＮＡプローブと共に、業者（Boehringer Mannheim）の説明に従い、ジゴキシゲニンラベリングキットを用いて現された。
-レーンａ：ｐＩＮＡ９９４の１コピーの正しい組込み
-レーンｂおよびｃ：追加７．５Ｋｂバンドで現された、ｐＩＮＡ９９４の２タンデムコピーの正しい組込み（レーンａ、ｂおよびｃにおいてオリジナル膜で見える２．８Ｋｂバンドは、写真に示されていない）
-レーンｄ：移動マーカー（ＢｓｔＥIIで切断されたλＤＮＡ）
図９：最適プロモーターを有する複製プラスミドの構築
ＡＲＳ含有プラスミドは下記３ＤＮＡ断片の結合により得た：
-（Fournier et al.,1993で以前に記載された）ｐＩＮＡ７５２の３４６０ｂｐ  ＰｖｕＩ-ＮｏｔＩ断片：ＡＲＳ６８を有するｐＢＲ３２２ＤＮＡ
-ｐＩＮＡ７８１の３３９６ｂｐ  ＰｖｕＩ-ＫｐｎＩ断片（６９８３位のＰｖｕＩ部位は唯一ではない：いくつかのＰｖｕＩ部位がｌａｃＺ遺伝子に存在する）
-ｐＩＮＡ１０５３の構築用のｐＩＮＡ７８１の４８３１ｂｐ  ＮｏｔＩ-ＫｐｎＩ断片、あるいは同様に、ｐＩＮＡ１０５４およびｐＩＮＡ１０５５の構築用のｐＩＮＡ９９３またはｐＩＮＡ９９４の５２７１ｂｐ  ＮｏｔＩ-ＫｐｎＩ断片
図１０：ＸＰＲ２またはＰＨＯ２  ＴＡＴＡボックスをベースにしたハイブリッドプロモーターを有するプラスミドの構築
ｐＩＮＡ７８１、７９５、９９３および９９４に相当するプラスミドは、ＬＥＵ２遺伝子のＴＡＴＡボックスおよびＡＴＧ領域をY.lipolytica ＰＨＯ２またはＸＰＲ２遺伝子の場合と代えることにより構築した。ｐＩＮＡ９９３誘導体（各々ｐＩＮＡ１０５７およびｐＩＮＡ１２０５）の構築は後で詳細に記載されている。ｐＩＮＡ９９４誘導体（各々ｐＩＮＡ１０５８およびｐＩＮＡ１２０６）の構築も同様であった。ｐＩＮＡ７８１（各々ｐＩＮＡ１０５６およびｐＩＮＡ１２０４）およびｐＩＮＡ７９５（各々ｐＩＮＡ１０５９およびｐＩＮＡ１２０７）に相当するプラスミドは、ｐＩＮＡ１０５７またはｐＩＮＡ１２０５の全体的または部分的ＳｐｈＩ切断と、その後で自己結合により得た：こうして、ｐＩＮＡ１０５６および１２０４の場合だとすべての“ＵＡＳ１Ｂ”コピーを除き、ｐＩＮＡ１０５９および１２０７の場合だと１つだけの同方向“ＵＡＳ１Ｂ”コピーを維持させることができた。
Ａ／ｐＩＮＡ１０５７およびｐＩＮＡ１２０５プラスミドは、ｌａｃＺ遺伝子と最小ＰＨＯ２プロモーターまたは最小ＸＰＲ２プロモーターとの翻訳融合を各々有するＰＣＲ断片のＢｃｌＩ切断後に得られた、もう１つの１．５Ｋｂ  ＢｃｌＩ断片で、ｐＩＮＡ９９３の１．５Ｋｂ  ＢｃｌＩ断片を置き換えることにより構築した。この１．５Ｋｂ領域は、得られたコンストラクトで配列決定することにより、完全にチェックした。
ＰＨＯ２  ＴＡＴＡボックスを有するＰＣＲ断片の場合、用いられたマトリックスは、自然ＰＨＯ２プロモーターとｌａｃＺ遺伝子との翻訳融合を有するｐ３Ｌ４／６１ＹＬプラスミド（Treton et al.,1992で以前に記載されている）であった。上流変異原性プラスミドは以下であった：
0004346681.tif 000005
ＢｃｌＩ部位（下線）を作るために用いられる変異は太字部分である。ＢｓｔＥII部位がＰＨＯ２プロモーターの配列中に（イタリック文字で）存在している。ＢｃｌＩ部位の下流にあるｌａｃＺ遺伝子配列とハイブリッド形成する下流オリゴヌクレオチドは、以下であった：
0004346681.tif 000006
これらのオリゴヌクレオチドで得られたＰＣＲ断片は、ヌクレオチド−１１６〜ヌクレオチド＋５１のＰＨＯ２プロモーターの配列を有している。
最小ＰＨＯ２プロモーターとｌａｃＺ遺伝子との翻訳融合についてみつけられた配列は、Treton et al.,（1992）に記載されたデータから予想されるものと異なっていて、ｐ３Ｌ４／６１ＹＬプラスミドの融合がＰＨＯ２  ＯＲＦの第一ＨａｅIII部位で生じずに、実際は１５ｂｐ下流の第二部位で生じることを示した。ｐ３Ｌ４／６１ＹＬと我々のコンストラクトになお存在するＰＨＯ２  ＯＲＦからのコドンの数は実際は１７であり、シグナルペプチド全体に相当する。ｐＩＮＡ１０５７（およびｐＩＮＡ１０５６、１０５８と１０５９）の翻訳融合は、Ｂ／に示されている。
ＸＰＲ２  ＴＡＴＡボックスを有するＰＣＲ断片の場合、用いられたマトリックスはｐＩＮＡ３５４プラスミドであった（ＸＰＲ２プロモーターとｌａｃＺ遺伝子との翻訳融合を有する-図４参照）。上流変異原性オリゴヌクレオチドは、以下であった：
0004346681.tif 000007
下流オリゴヌクレオチドは上記と同様であった。ＢｃｌＩ部位およびＢｓｔＥII部位（下線）を各々作るために用いられた変異は太字部分である。ＴＡＴＡボックスはイタリック文字で示されている。これらのオリゴヌクレオチドで得られたＰＣＲ断片は、ヌクレオチド−７６〜ヌクレオチド＋３のＸＰＲ２プロモーターの配列を有している。ｐＩＮＡ１２０５（およびｐＩＮＡ１２０４、１２０６および１２０７）の翻訳融合は、Ｃ／に示されている。
Ｂ／ｐＩＮＡ１０５６、１０５７、１０５８および１０６５９の翻訳融合
Ｃ／ｐＩＮＡ１２０４、１２０５、１２０６および１２０７の翻訳融合
図１１：ハイブリッドプロモーターにより指示されるプロレニンＡの発現および分泌用のプラスミドの構築
Ａ／融合〔ハイブリッドプロモーター：ＸＰＲ２-プレプロ：プロレニン〕を行えるＰＣＲ断片の合成、２つのマトリックス上に３つのオリゴヌクレオチドの存在
Ｂ／ＰＣＲ融合断片のスキーム、３つのオリゴヌクレオチドの配列
Ｃ／ｐＩＮＡ１２０８プラスミド（およびｐＩＮＡ１２０９と１２１０）の構築および地図
ｐＩＮＡ７８１、９９３および９９４からのハイブリッドプロモーターを各々有するｐＩＮＡ１２０８、１２０９および１２１０は、（Ｃ／で示されたように）下記３断片結合を用いて構築した：
-プロレニンＡ遺伝子の全ｃＤＮＡに翻訳融合された、ＸＰＲ２プレプロ領域の下流部分を有する、ｐＬＸ-３４プラスミドからの１４６９ｂｐ  ＳａｕＩ-ＢｃｌＩ断片（ＢｃｌＩ部位のＴＧＡ配列は停止コドンである）
-ｐＢＲ３２２配列、ＬＥＵ２遺伝子およびＸＰＲ２ターミネーターを有する、ｐＩＮＡ７８１からの６．６Ｋｂｐ  ＳａｕＩ-ＢａｍＨＩ断片
-Yon and Fried（1989）に記載された方法に従い、２つのマトリックス（ｐＬＸ-３４と、ｐＩＮＡ７８１、ｐＩＮＡ９９３またはｐＩＮＡ９９４）と３つのオリゴヌクレオチドを用いて（Ａ／およびＢ／に示されたように）合成されたＰＣＲ断片の切断後に得られたＳａｕＩ-ＳａｕＩ断片．この方法では、ＸＰＲ２プレプロ領域への３つのハイブリッドプロモーター各々の融合に相当する３つのＰＣＲ断片を得ることができた：
-上流オリゴヌクレオチド（“ＰＢＲ”）は、ｐＩＮＡ７８１、９９３または９９４の（各ハイブリッドプロモーターの上流にある）ｐＢＲ領域とハイブリッド形成する。
-融合オリゴヌクレオチド（“ＦＵＳ”）はＬＥＵ２プロモーターとＸＰＲ２プレプロ領域との融合の領域でｐＬＸ-３４とハイブリッド形成し、最小ＬＥＵ２プロモーターの領域でｐＩＮＡ７８１、９９３または９９４とも部分的にハイブリッド形成する。
-下流オリゴヌクレオチド（“ＸＰＲ”）はｐＬＸ-３４プラスミドのＸＰＲ２プレプロ領域とハイブリッド形成する。
これらの要素で行われたＰＣＲ反応は、ｐＩＮＡ７８１（または９９３または９９４）のハイブリッドプロモーターとｐＬＸ-３４のプレプロ配列との融合を行えた。得られたＰＣＲ断片は、ｐＩＮＡ７８１がマトリックスの１つとして用いられたときは２９８ｂｐの、ｐＩＮＡ９９３または９９４が用いられたときは７３４ｂｐの付着末端断片を作るために、ＳａｕＩおよびＳａｕＩで切断した。これら断片の各々は上記の２断片と結合させて、配列決定で完全にチェックした。
実施例１：リポーター系、培地および増殖条件
図１および２に示されたＵＡＳ領域からのＤＮＡ断片は、ハイブリッドプロモーターを構築して、ＸＰＲ２関係外のそれら生理活性を分析するために用いた。図２および４に記載されたように、それらは、ｌａｃＺ遺伝子の発現を指示する（ＴＡＴＡボックスとＡＴＧ配列に縮小された：Y.lipolytica ＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド−９４〜＋１８-Gaillardin and Ribet,1987および図３Ｂ）最小ＬＥＵ２プロモーターの前にあるＳｐｈＩ制限部位で、組込みリポータープラスミドｐＩＮＡ７８１（図３Ａ）に（双方向に異なるコピー数で）挿入した。すべてのプラスミド構築は、標準分子生物学法（Sambrook et al.,1989）とＨＢ１０１またはＤＨ５ａＦ′ E.coli株（各々：Sambrook et al.,1989；Raleigh et al.,1989）を用いて行った。ｄａｍ感受性ＢｃｌＩ制限酵素による切断が必要なときには、ＪＭ１１０ E.coli株を用いた（Yanish-Perron et al.,1985）。
この研究で用いられたすべての組込みプラスミドについて、異種タンパク質の発現は、Davidow et al.（1985）により記載された方法を用いて、Yarrowia lipolytica株ＪＭ２３ＳＢ（Blanchin-Roland et al.,1994）のゲノムへ組込み後に測定した。ＪＭ２３ＳＢの遺伝子型は以下である：ＭａｔＢ、ｌｅｕ２-３５、ｌｙｓ５-１２、ｕｒａ３-１８：：ＵＲＡ３、ｘｐｒ２：：ＬＹＳ５
Yarrowia lipolytica株ＪＭ２３ＳＢは、Paris（France）のthe Institut Pasteurの”Collection Nationale de Cultures de Microorganismes”に受託番号Ｉ-１５８１で寄託した。
この株は、ＵＲＡ３遺伝子を有するｐＩＮＡ３００′プラスミドの組込みで得られる、ｐＢＲ３２２プラットフォームを有していて（Blanchin-Roland et al.,1994）、これはｐＢＲ３２２からの配列を有するプラスミドの組込みをその後で行える。ｐＩＮＡ３００′、ｐＩＮＡ３５４、ｐＩＮＡ４０４およびそれらの誘導体（ｐＩＮＡ７８１および誘導プラスミドを含む）のＮｏｔＩ部位は、ｐＢＲ３２２の前ＰｖｕII部位に挿入されたポリリンカーの一部である（Blanchin-Roland et al.,1994）。
ｐＩＮＡ３５４またはｐＩＮＡ４０４に由来するプラスミド（ｐＩＮＡ７８１および誘導プラスミド）は、ＪＭ２３ＳＢのｐＢＲ３２２プラットフォームにあるこの同部位で組込みを指示するために、ＮｏｔＩ部位で直鎖化した（Blanchin-Roland et al.,1994）。Yarrowia lipolyticaゲノムへ各プラスミドの１コピーの正しい組込みは、前記（ＥＰ１３８５０８）のように、サザンブロット分析によりチェックした。
ハイブリッドプロモーターのβ-ガラクトシダーゼ活性は、異なる生理学的条件下（誘導、基本または抑制培地、下記参照）で、Yarrowia lipolyticaゲノム中への組込み後に調べた。それは、同条件で測定された、自然ＸＰＲ２プロモーターを有する、リポータープラスミドｐＩＮＡ７８１およびｐＩＮＡ４０４で得られた場合と比較した。
プラスミドｐＩＮＡ４０４を有するE.coli株ＨＢ１０１（ＨＢ１０１〔ｐＩＮＡ４０４〕）は、Paris（France）のthe Institut Pasteurの”Collection Nationale de Cultures de Microorganismes”に受託番号Ｉ-１５８０で寄託した。
各構築の場合、２〜４つの独立した組込株をアッセイした（２〜６回の測定を独立した培養物で重複して行った）。β-ガラクトシダーゼアッセイは、定常期培養物で、Miller（1972）により記載されたように行った。再現性は重複物間で±４％の範囲内であった。反復実験のデータは±１５％の範囲内であった。ＮＤ＝測定せず
誘導培地（ＹＰＤｍ）は、５０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に０．２％酵母エキス、０．１％グルコースおよび５％プロテオースペプトンを含有していた。非誘導（基本）培地（ＹＥｇ）は、５０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に１％酵母エキスおよび０．１％グルコースを含有していた。抑制培地（ＭＭＡｍ）は、２００ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、炭素源としてグリセロール（１％）（グリセロールは、ＡＥＰ合成の場合だと、グルコースよりも良い異化リプレッサーである）と、窒素源として硫酸アンモニウム（０．２％）を含有した改変合成最少ＭＭＡ培地（Gutz et al.,1974）であった。ｐＨの効果を試験したとき、ＹＰＤｍ培地は、リン酸緩衝液の代わりに、２００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を含有していた。定常期培養物の最終ｐＨをチェックしたところ、４．３〜４．７であるとわかった。ＹＰＤｍ（ｐＨ４．０）で増殖させた細胞をペレット化し、すすいで、β-ガラクトシダーゼアッセイ前に５０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再懸濁した。古典的富培地ＹＰＤは、１％酵母エキス、１％バクトペプトンおよび１％グルコースを含有していた。古典的最少培地ＹＮＢＮ５０００は、０．６７％酵母窒素塩基（アミノ酸なし）および１％グルコースを含有していた。
実施例２：リポーター系の有効性
実施例１の場合のような物質＆方法
このリポーター系の有効性を試験するために、自己のＴＡＴＡボックスを欠いたＸＰＲ２プロモーターの完全上流配列が最小ＬＥＵ２プロモーターにＸＰＲ２様調節を行わせることができることを、我々は最初にチェックした（ｐＨの効果はその後で分析する：実施例４、表４参照）。
図５に記載したように、自然ＸＰＲ２プロモーターのＴＡＴＡボックス（Davidow et al.,1987から調べた）は、ＰＣＲ特異的変異誘発を用いて、新たなＳｐｈＩ制限部位に変異させた。これにより、同方向（ｐＩＮＡ９１９）または逆方向（ｐＩＮＡ９２０）で、最小ＬＥＵ２プロモーターの上流で、ｐＩＮＡ７８１中に、生理活性プロモーター（そのＴＡＴＡボックスを欠いている）を含むＳｐｈＩ制限断片を挿入することができた。
表１は、異なる培地において、ＴＡＴＡ欠失ＸＰＲ２プロモーターのある組込みプラスミドを有したY.lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性を示している。
ｐＩＮＡ７８１中に挿入されたＴＡＴＡ欠失ＸＰＲ２プロモーターを有するコンストラクトで観察された調節パターンは、自然プロモーターの場合と似ていた。しかしながら、ＭＭＡｍで得られた抑制レベルはそれほど重要でなく、おそらくＬＥＵ２  ＴＡＴＡボックスの影響を反映しているのだろう。
この実験は、我々のリポーター系が自然ＸＰＲ２プロモーターの調節パターンを再現できることを十分に証明している。
0004346681.tif 000008
実施例３：ＸＰＲ２プロモーターの遠位ＵＡＳ１領域の分析
実施例１の場合のような物質＆方法
この分析に用いられたＵＡＳ１領域からのＤＮＡ断片は、図１および２に示されている。“ＵＡＳ１Ａ”は２つの合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成により得た（図２参照）；それはＸＰＲ２プロモーターの配列のヌクレオチド−８０５〜−７７６で画される配列から本質的になる。“ＵＡＳ１Ｂ”はＰＣＲにより得た（図２参照）；それはＸＰＲ２プロモーターの配列のヌクレオチド−８０５〜−７０１で画される配列から本質的になる。その断片のＳｐｈＩ制限部位または付着末端により、最小ＬＥＵ２プロモーターの上流にあるｐＩＮＡ７８１のＳｐｈＩ部位でそれらの挿入を行えた（図３参照）。
“ＵＡＳ１Ａ”または“ＵＡＳ１Ｂ”断片を有するプラスミドは、１コピーまたは２タンデムコピーで双方の向きに得て、表２に記載してある。この表は、異なる培地において、これらの組込みプラスミドを有したYarrowia lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性を示している。
“ＵＡＳ１Ａ”断片はわずかなＵＡＳ効果を媒介できたが、２コピーだともっとはっきりする。それより大きな“ＵＡＳ１Ｂ”断片はもっと高い活性を示した。双方の場合において、２コピーで得られた増強は相加以上のものであり、要素間の協力を示している。
ＭＭＡｍ培地ではいずれの断片にも明らかな抑制が観察されなかった；活性は“ＵＡＳ１Ｂ”の２コピーで一層高められた。
“ＵＡＳ１Ｂ”断片は炭素および窒素源による抑制を媒介できず、そのため構成プロモーターの構築にとり良い候補である（実施例４参照）。
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実施例４：最良プロモーターのデザイン
実施例１の場合のような物質＆方法
強い構成プロモーターを得るために、我々は“ＵＡＳ１Ｂ”断片の３または４タンデムコピーを有したハイブリッドプロモーターを構築したが、すべて同方向またはすべて逆方向である。それらの構築法は図４Ｃに記載されている。
表３は、異なる培地において、“ＵＡＳ１Ｂ”断片の異なるコピー数のある組込みプラスミドを有したY.lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性を示している。
３種の培地での活性は、“ＵＡＳ１Ｂ”のコピー数と共に増加した。４コピーのコンストラクト、ｐＩＮＡ９９３およびｐＩＮＡ９９４は、誘導条件下において自然ＸＰＲ２プロモーターの場合と同程度の大きさで、３種の培地で非常に高い活性を示した。
ｐＩＮＡ９９３およびｐＩＮＡ９９４のハイブリッドプロモーターは、炭素および窒素源によりもはや抑制されず、培地にペプトンの添加を要しない。それらは強い準構成的発現を支えることができて、Y.lipolyticaで異種タンパク質の効率的生産にとり有用である。
グラフ（図６）で示したように、ＹＰＤｍおよびＹＥｇ培地において、活性の増強は２コピーのときに相加以上であり、新たな各コピーの追加では相加になるだけとなった（各点が一直線に並んでいる）。ＭＭＡｍ培地において、第三コピーの追加だと相加的増加より大きくすることができた。
表４は、最良プロモーターを有したY.lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性について、培地のｐＨの効果を示している。
劇的な抑制効果は、ＹＰＤｍ培地のｐＨが４．０まで下げられたときに、野生型ＸＰＲ２プロモーター（ｐＩＮＡ４０４）の発現で観察された。ＴＡＴＡボックスを欠き、リポータープラスミドｐＩＮＡ７８１に挿入された、全ＸＰＲ２プロモーターを有するコンストラクト（ｐＩＮＡ９１９）だと、抑制効果はやや低下したが、なお非常に強かった。
このように、我々のリポーター系では培地のｐＨの抑制効果の検出を行える：自己のＴＡＴＡボックスを欠いたＸＰＲ２プロモーターは、最小ＬＥＵ２プロモーターにＸＰＲ２様ｐＨ調節を行わせることができた。
“ＵＡＳ１Ｂ”の４コピーを有するハイブリッドプロモーター（ｐＩＮＡ９９３および９９４）の（ＹＰＤｍ培地における）発現は、培地のｐＨと独立していた：ｐＨが４．０でも同様の高レベルに留まるが、これらの酸性条件は野生型ＸＰＲ２プロモーターを強く抑制した。
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“ＵＡＳ１Ｂ”断片のいくつかのコピーを有したハイブリッドプロモーターは、培地のｐＨと無関係に、強い準構成的発現を示す。
培養増殖中におけるｐＩＮＡ９９４（“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピー）のβ-ガラクトシダーゼ発現の進展を、誘導ＹＰＤｍ培地（ｐＨ６．８）、抑制ＭＭＡｍ培地および古典的富培地ＹＰＤで分析した（図７Ａ）。培養で達する最大ＯＤ６００は、ＹＰＤｍで約１４〜１５単位、ＭＭＡｍで約１０〜１２単位、およびＹＰＤで約１８〜１９単位であった。
自然ＸＰＲ２プロモーター（ｐＩＮＡ４０４）だと、ＹＰＤｍの培養だけが高活性に達した（図７Ｂ）。ＹＰＤで達した活性は、基本ＹＥｇ培地の場合と同様であった（前表と以下のコンストラクトｐＩＮＡ４０４参照）。ＭＭＡｍでの活性は非常に低いままであった。
ｐＩＮＡ９９４の場合、３種の培地における活性は同程度の大きさであった。それらは培養（特にＭＭＡｍ）で早期に、より規則的に増加した。ＹＰＤで達する最大活性は、ＹＰＤｍの場合よりもやや高かった。
表５は、ＹＰＤ培地（定常期培養）における、“ＵＡＳ１Ｂ”断片の４コピーをもつ組込みプラスミドを有したY.lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性を示している。この培地において、ｐＩＮＡ９９３およびｐＩＮＡ９９４の活性は、誘導培地（約３３０ｕ）の場合よりも高かった（約４２０ｕ）。
したがって、ｐＩＮＡ９９４のハイブリッドプロモーターは、複合ＹＰＤｍ培地（即ち、誘導条件下）において自然ＸＰＲ２プロモーターで達した場合と同様のレベルで発現を行えるように、古典的富培地ＹＰＤまたは規定最少培地で用いることができる。
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実施例５：ハイブリッドプロモーターを有するプラスミドのダブルタンデム組込み
実施例１の場合のような物質＆方法
ｐＩＮＡ９９４プラスミド（“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピーを有するハイブリッドプロモーター）を有するＪＭ２３ＳＢ株Y.lipolyticaの組込み形質転換後に、２つの組込株はプラスミドの２コピーのタンデム組込みを有していることがわかった。サザンブロットによるそれらの分析は、図８に示されている。これら組込株のβ-ガラクトシダーゼ活性は測定してみると（表６）、誘導、基本、抑制培地およびＹＰＤ培地でｐＩＮＡ９９４のシングルコピーを有する組込株の場合のおよそ２倍であることがわかった。これらの結果は、最良プロモーターを有するプラスミドの数コピーの組込みが異種タンパク質の発現を増加させうることを、明らかに示している。
実施例６：最良プロモーターを有する複製Yarrowia lipolyticaプラスミド
他で指摘のないかぎり、実施例１の場合のような物質＆方法
自律複製プラスミドについて実施例４に記載されたハイブリッドプロモーターを試験するために、Y.lipolytica ＡＲＳ６８をｐＩＮＡ９９３およびｐＩＮＡ９９４（“ＵＡＳ１Ｂ”の４同方向および４逆方向コピーを各々有する）とリポータープラスミドｐＩＮＡ７８１（ＬＥＵ２  ＴＡＴＡボックス）に挿入した。ＡＲＳ６８配列は、フランス特許８８-００９７３とFournier et al.（1991）で以前に記載されていた。以下の複製プラスミドを図９に記載したように（E.coli ＤＫ１株を用いて；Raleigh et al.1989）構築した：
-ＡＲＳ６８の挿入によりｐＩＮＡ７８１から誘導されたｐＩＮＡ１０５３
-ＡＲＳ６８の挿入によりｐＩＮＡ９９３から誘導されたｐＩＮＡ１０５４
-ＡＲＳ６８の挿入によりｐＩＮＡ９９４から誘導されたｐＩＮＡ１０５５
ｐＩＮＡ１０５３、１０５４および１０５５からのプラスミドＤＮＡを、Fournier et al.（1993）で以前に記載されたように、Y.lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株中にエレクトロポレーションした。形質転換効率は表７に示しているが、複製ｐＩＮＡ７５２プラスミド（ｐＢＲ３２２中にＡＲＳ６８およびＬＥＵ２遺伝子、Fournier et al.1993）で得られた場合と同様であった。形質転換株は、予想されたように、コントロール組込みプラスミド（直鎖化しているか、またはそうではない）をエレクトロポレーションしたときに得られなかった（理由不明ながら、プラスミドがエレクトロポレーション後にY.lipolytica中に組み込めないためである-Fournier et al.1993）。これは、すべてのコンストラクトがY.lipolyticaで効率的に複製したことを示唆している。いくつかの独立した形質転換株を最少培地プレートで選択して、更に分析した。
各構築の２形質転換株を非選択完全培地（ＹＰＤ）でプラスミドの喪失について（Fournier et al.1991にわずかな修正を加えて）試験した：完全培地を５．１０５細胞／ｍｌで接種し、２８℃で６ 1/2時間インキュベートした。細胞を完全培地上にプレーティングして、その後最少（ＹＮＢＮ５０００）および完全培地プレートで複製させた。これら２つのレプリカプレートは、非選択条件下でプラスミド含有Ｌｅｕ＋細胞の％を調べるために比較した。結果は表８に示されている。非選択培地で３〜４世代後、培養物中におけるＬｅｕ＋細胞の割合は、ｐＩＮＡ１０５３、１０５４または１０５５を有する２つの形質転換株とｐＩＮＡ７５２の場合とで同様、即ち６０〜７０％の範囲であった。これは、これらの発現プラスミドがいかなる検出可能な選択上の欠点も形質転換株に付与していないことを示している。
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これらの試験では、ｐＩＮＡ１０５３、１０５４および１０５５プラスミドが完全機能性ＡＲＳ６８を含んで、ｐＩＮＡ７５２に類似して挙動する複製プラスミドであることも確認できた。
ｐＩＮＡ１０５３、１０５４または１０５５プラスミドで形質転換されたＪＭ２３ＳＢ株からプラスミドおよびゲノムＤＮＡを以前に記載されたように抽出して（Hoffman and Winston,1987）、E.coli ＤＫ１株を形質転換するために用いた（Raleigh et al.,1989）。この“レスキュー”実験では多数のアンピシリン耐性形質転換株を得ることができ、これらのうちいくつかを更に分析した。レスキューされたプラスミドにおける再配列の不在は、ＢａｍＨＩ（１６５９〜６９３７ｂｐ範囲の３つのＤＮＡ断片を与える）およびＥｃｏＲＶ（２７３〜４８２９ｂｐ範囲の６つのＤＮＡ断片を与える）制限切断物を用いてチェックした。レスキューされたｐＩＮＡ１０５３、１０５４および１０５５プラスミドは、自然のもの（データ示さず）と同様の制限パターンを示すことがわかった。ハイブリッドプロモーターの領域は、２つのフランキングオリゴヌクレオチド（図３の説明のところに記載された“ＬＢ”と、図１１の説明のところに記載された“ＰＢＲ”）を関与させたＰＣＲ反応で更に正確に分析した。各場合において、予想サイズの唯一のバンドが得られ（データ示さず）、この領域が酵母で継代中に再配列されなかったことを示している（特に、“ＵＡＳ１Ｂ”の４コピーはレスキューされたｐＩＮＡ１０５４および１０５５に保存されていた）。
ＡＲＳ含有プラスミドを有する株のβ-ガラクトシダーゼ活性は、異なる形質転換株について、最少培地（ＭＭＡｍ）中の定常期培養物で測定した。並行して、同培養物の一部を前定常期に採取して、上記のような選択条件下において培養物中でプラスミドを有する細胞の％を調べるために用いた。これらの値は、β-ガラクトシダーゼ試験の結果と共に、表９に示されている。
値は各プラスミドについて形質転換株間でわずかに異なるが、その差異は独立した培養物間で通常観察される範囲内にある。ｐＩＮＡ１０５３の平均値（５３ｕ）は、ｐＩＮＡ７８１で以前に観察された値よりも２．５倍高く、プロトトロフの平均％は７８％である。逆に、ｐＩＮＡ１０５４（２１６ｕ）およびｐＩＮＡ１０５５（１８５ｕ）の平均値は、ｐＩＮＡ９９３および９９４で各々以前に観察された値、各々２５６および１８７ｕと同程度の大きさであり、プロトトロフの平均％は双方の場合で８２〜８３％である。最良プロモーターを有した複製プラスミドは、対応組込みプラスミドよりも高い発現レベルを発揮していないようである。
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上記形質転換株の一部は、以前に記載されたように（Fournier et al.,1991）、選択培地で複製プラスミドのコピー数を調べるために分析した。プラスミドおよびゲノムＤＮＡを抽出し、ＣｌａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で切断して、プラスミドから７．８ＫｂのＬＥＵ２含有ＤＮＡ断片およびゲノムから５．３Ｋｂの断片を得た。これらのサンプルは、３２Ｐ標識ＬＥＵ２プロモータープローブを用いて、サザンブロットにより分析した（データ示さず）。“Adobe Fotoshop”および“NIH Image”ソフトウェアを各々用いて、オートラジオグラフィーを走査および定量した。プラスミドＬＥＵ２バンドの標識とゲノムＬＥＵ２バンドの標識との比率を調べた（表１０）。それは、選択条件下における、細胞当たりの複製プラスミドの平均コピー数に相当する。
この平均コピー数は、ｐＩＮＡ１０５３の場合で約０．８〜０．９、ｐＩＮＡ１０５４および１０５５の場合で約０．７〜１．０であった。それは、選択培地中で複製プラスミドを有する細胞の％に大体相当する（即ち、表９に示されたように、各々７８％、７８〜８８％および８０〜８７％）。これは、１コピーだけのｐＩＮＡ１０５３、１０５４および１０５５プラスミドがＪＭ２３ＳＢプラスミド含有細胞当たりに存在していたことを示す。
Y.lipolyticaでＡＲＳの動原体関与度から予想される、この低コピー数（Fournier et al.,1993参照）は、ハイブリッドプロモーターにより指示される発現を増加させない。それにもかかわらず、最良プロモーターを有した複製プラスミドは、対応組込みベクターで観察される場合と同様に、選択最少培地で強い発現を行うことができる。それらは、高レベルの異種タンパク質を得るために、どんなｌｅｕ２−Y.lipolytica株でも用いることができる手段である。
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実施例７：他のY.lipolytica遺伝子のものによる、ハイブリッドプロモーターからのＬＥＵ２  ＴＡＴＡボックスの置換
実施例１の場合のような物質＆方法
ｐＩＮＡ９９３および９９４からのハイブリッドプロモーターに存在するＬＥＵ２  ＴＡＴＡボックス（実施例４）がこれらプラスミドの性質を変えることなく置換できるかどうかを調べるために、我々はＰＨＯ２遺伝子のＴＡＴＡボックスまたはＸＰＲ２遺伝子自体のものを用いるように選択した。下記プラスミドを構築した（図１０参照）。
-ｐＩＮＡ１０５６：ｐＩＮＡ７８１と類似、但しＬＥＵ２からのＴＡＴＡボックスおよびＡＴＧ領域がY.lipolytica ＰＨＯ２遺伝子からのもので置き換えられている
-ｐＩＮＡ１０５９：ｐＩＮＡ７９５（“ＵＡＳ１Ｂ”の１同方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
-ｐＩＮＡｌ０５７：ｐＩＮＡ９９３（“ＵＡＳ１Ｂ”の４同方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
-ｐＩＮＡ１０５８：ｐＩＮＡ９９４（“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
-ｐＩＮＡ１２０４：ｐＩＮＡ７８１と類似、但しＬＥＵ２からのＴＡＴＡボックスおよびＡＴＧ領域がY.lipolytica ＸＰＲ２遺伝子からのもので置き換えられている
-ｐＩＮＡ１２０７：ｐＩＮＡ７９５（“ＵＡＳ１Ｂ”の１同方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
-ｐＩＮＡ１２０５：ｐＩＮＡ９９３（“ＵＡＳ１Ｂ”の４同方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
-ｐＩＮＡ１２０６：ｐＩＮＡ９９４（“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピー）と類似、同様の修飾を有している
ＰＨＯ２遺伝子のＴＡＴＡボックスをベースにしたハイブリッドプロモーターをもつ組込みプラスミドを有したＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性は、表１１に示されている。Y.lipolytica自然ＰＨＯ２プロモーターは、低リン酸培地で誘導される（Treton et al.,1992）。しかしながら、隣接２６０ｂｐに縮小されたＰＨＯ２プロモーター（ＴＡＴＡボックス、２つのＣＴに富むボックスおよびＣＡＡＴ様ボックスを留めている）は、この調節を免れて、ほとんど構成的であることが示され、ＹＰＤ培地だともっと高い活性が観察された（Treton et al.,1992）。そのため、我々はＹＰＤ富培地のみでＰＨＯ２プロモーターのもっと小さな断片（隣接１１６ｂｐ）をベースにした我々のコンストラクトを試験するように選択した。
最小ＬＥＵ２プロモーターにより指示されるβ-ガラクトシダーゼ活性は非常に低かった。“ＵＡＳ１Ｂ”断片の１または４コピーの付加は活性を高めたが、低レベルに留まった（４コピーで約８ｕ）。
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我々の結果を自然ＰＨＯ２プロモーターで得られた場合と比較するために、我々はｌａｃＺ遺伝子へのＰＨＯ２プロモーターの翻訳融合を有したｐ３Ｌ４／６１ＹＬプラスミドのβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した（Treton et al.,1992および図１０）。このプラスミドを、（組込みｐＩＮＡ３００′の不在と、野生型ＸＰＲ２遺伝子の存在以外は）ＪＭ２３ＳＢと同遺伝子型のY.lipolytica株、ＪＭ１２（Treton et al.,1992）のゲノム中に組み込んだ。自然ＰＨＯ２プロモーターで得られる活性は非常に低かった（１．６５ｕ）。このため、４つのＵＡＳ１Ｂコピーを有するＰＨＯ２ベースハイブリッドプロモーターは、弱いけれども、自然ＰＨＯ２プロモーターよりかなり効率的であった。
ＸＰＲ２  ＴＡＴＡボックスをベースにしたハイブリッドプロモーターをもつ組込みプラスミドを有するＪＭ２３ＳＢ株のβ-ガラクトシダーゼ活性は、表１２に示されている。試験されたすべての培地において、最小ＸＰＲ２プロモーターの活性は非常に低く、“ＵＡＳ１Ｂ”断片の付加でかなり高められた。“ＵＡＳ１Ｂ”の４コピーを有するハイブリッドプロモーターは、自然ＸＰＲ２プロモーターで得られるレベルの３倍以上である１０５０ｕで、ＹＰＤｍ誘導培地において非常に高レベルの発現を示すことができた。これは、ＹＰＤｍ培地において、最小ＸＰＲ２プロモーターのみで得られるレベルと比較して、４０００倍の増加を示す。その増加は、“ＵＡＳ１Ｂ”のシングルコピーの付加だと、約４０倍であった。
“ＵＡＳ１Ｂ”の４コピーの場合だと、富ＹＰＤ培地での活性も非常に高かった（約６８０〜６９０ｕ）。
しかしながら、抑制ＭＭＡｍ培地における“ＵＡＳ１Ｂ”の４コピーを有したハイブリッドプロモーターの発現のレベルは、数分の一の、だいたい１５０ｕと低かった。この培地では、最小ＸＰＲ２プロモーターも誘導培地の場合より１０倍低い活性を示した。ＸＰＲ２  ＴＡＴＡボックスの１２ｂｐ上流と、このボックスとＡＴＧとの間の５８ｂｐだけが保存されていたが（公知の調節配列と相同性を何も示さない）、最小ＸＰＲ２プロモーターは炭素および／または窒素源による抑制に感受的であるようだ。“ＵＡＳ１Ｂ”断片の付加は抑制ＭＭＡｍ培地での発現を強く高めたが（１コピーで約１０倍および４コピーで６０００倍以内）、この増加は非常に高レベルの発現を促進するために十分でなかった。
完全ＸＰＲ２プロモーターを通常“抑制する”ＹＰＤｍ（ｐＨ４．０）培地だと、最小ＸＰＲ２プロモーターは誘導および富培地よりもやや高い発現レベルを示した。１“ＵＡＳ１Ｂ”コピーのハイブリッドプロモーターにより示される活性は、誘導および富培地よりも３倍高かった。逆に、４“ＵＡＳ１Ｂ”コピーのハイブリッドプロモーターによりｐＨ４．０でＹＰＤｍにおいて示される活性は、非常に高いけれども（６９０〜７３０ｕ、２０００倍の増加に相当する）、ｐＨ６．８だとそれよりやや劣っていた。
結論として、ｐＩＮＡ１２０５および１２０６のハイブリッドプロモーターにより示される発現のレベルは興味あるが、ＹＰＤｍ（ｐＨ６．８）誘導およびＭＭＡｍ抑制培地だと活性間に６〜８倍の差異が観察される。これらのハイブリッドプロモーターは一部の調節要素を留めていたが、最小ＬＥＵ２プロモーターをベースにした場合と対照的に、構成的でない。
これらの結果は、特定のＴＡＴＡボックスの選択が、得られるハイブリッドプロモーターの性質にとり非常に重要であることを示している：試験されたものの中では、ＬＥＵ２最小プロモーターのみが強い構成性の最良プロモーターの構築を行えた。
実施例８：ハイブリッドプロモーターにより指示される牛キモシン前駆体の発現および分泌
他で指摘のないかぎり、実施例１の場合のような物質＆方法
実施例４に記載されたハイブリッドプロモーターは、食品工業で汎用されるタンパク質、牛キモシンをコードするプロレニンＡ対立遺伝子を発現させるために用いた。この酵素はチモーゲン前駆体（プロキモシンまたはプロレニン）として発現され、低ｐＨで自己開裂により自触的に活性化される。プロレニンがY.lipolyticaで発現されて、培地に効率的に分泌されることは、ＸＰＲ２遺伝子の分泌シグナルを用いることで、Franke et al.（1988）により以前に示されていた。S.cerevisiaeの場合と対照的に、残留キモシン活性は細胞内でみられなかった（Franke et al.,1988；Nicaud et al.,1991）。Y.lipolytica培養物で分泌されたプロレニンはグリコシル化されなかったが、その遺伝子のアミノ酸配列は２つのトリペプチド推定グリコシル化シグナルを含んでいた（ＥＰ２２０８６４参照）。我々は、ｐＩＮＡ７８１（最小ＬＥＵ２プロモーター）、ｐＩＮＡ９９３（同上＋“ＵＡＳ１Ｂ”の４同方向コピー）およびｐＩＮＡ９９４（同上＋“ＵＡＳ１Ｂ”の４逆方向コピー）からのハイブリッドプロモーターと、ＸＰＲ２遺伝子のプレプロ領域（アルカリプロテアーゼ分泌シグナル：１５７アミノ酸）と、その後にプロレニンＡ対立遺伝子ｃＤＮＡ配列との翻訳融合を有するベクターを構築した。これらのうち後者の要素はｐＬＸ-３４プラスミド（ＥＰ２２０８６４に記載されている）から得て、図１１に記載されたように下記プラスミドを構築するために用いた：
-ｐＩＮＡ１２０８（ｐＩＮＡ７８１からのプロモーター：ＸＰＲ２プレプロ領域：プロレニン）
-ｐＩＮＡ１２０９（ｐＩＮＡ９９３からのプロモーター：ＸＰＲ２プレプロ領域：プロレニン）
-ｐＩＮＡ１２１０（ｐＩＮＡ９９４からのプロモーター：ＸＰＲ２プレプロ領域：プロレニン）
我々の結果を自然ＸＰＲ２プロモーターで得られた場合と比較するために、我々は、上記ベクターと類似しているが、ハイブリッドプロモーターの代わりにｐＩＮＡ３５４からのＸＰＲ２プロモーターを有しているｐＩＮＡ１２１４プラスミドを構築した。このプラスミドは、下記からなる３断片結合で得た：
-プロレニン遺伝子に融合された、ｐＢＲ３２２配列、ＬＥＵ２遺伝子およびＸＰＲ２プレプロ領域の下流部分を有した、ｐＩＮＡ１２０８からの６６５０ｂｐ  ＮｏｔＩ-部分的ＳａｕＩ  ＤＮＡ断片（図１１参照）
-ＸＰＲ２プロモーターの上流部分を有した、ｐＩＮＡ３５４からの２６１８ｂｐ  ＮｏｔＩ-ＡｐａＩ  ＤＮＡ断片（図４参照）
-マトリックスとしてｐＩＮＡ３０３（図５参照）と、２つのオリゴヌクレオチド“ＬＢ”および“ＸＰＲ”（図３および１１の説明のところで各々記載されている）を用いて合成された、５６８ｂｐ  ＰＣＲ断片の切断から得られる、１４８ｂｐ  ＡｐａＩ-ＳａｕＩ  ＤＮＡ断片。その切断された断片は、ＸＰＲ２プロモーターの下流部分と、ＸＰＲ２プレプロ領域の上流部分を含んでいる。
ｐＩＮＡ１２１４は自然ＸＰＲ２プロモーターとプレプロ領域を含んでいる；プレプロ領域およびプロレニン遺伝子との翻訳融合は、ｐＩＮＡ１２０８〜１２１０の場合と同様である（図１１に示されている）。上記コンストラクトは、Yarrowia lipolytica ＪＭ２３ＳＢ株を形質転換するために用いた（ＮｏｔＩ切断で指示される、ｐＢＲプラットフォームでの組込み）。
我々の結果を自然ＬＥＵ２プロモーターで得られた場合と比較するために、我々はｐＬＸ-３４プラスミドを用いた（ＥＰ２２０８６４および図１１）。ｐＢＲプラットフォームにおける、ＪＭ２３ＳＢゲノム中へのこのベクターの組込みを、ＮｄｅＩ切断により指示させた（ＮｏｔＩ部位はｐＬＸ-３４のｐＢＲ配列に不在であるため）。
いくつかの形質転換株の培養上澄を、Franke et al.（1988）の方法に修正を加えて、凝乳活性についてアッセイした。簡単に言うと、そのアッセイは、微量滴定プラークにおいて、活性化培養上澄のどの程度の希釈倍率だと所定時間で緩衝化スキムミルクを凝固させるために十分なレニン活性を留めているかを調べることにある。その結果は、精製レニン標準の希釈で得られた場合と比較した。培養は、２３℃において、ＹＰＤ培地で２４〜４８時間、またはＭＭＡｍ培地で２４〜７２時間行った。上澄は０．２５Ｎ  ＨＣｌ（ｐＨ２）の存在下２５℃で１時間活性化させた。活性化上澄と、同培地の連続２倍希釈物１００μｌに、スキムミルク（Difco、４２ｍＭ酢酸ナトリウム、１４ｍＭ塩化カルシウム中１２％、ｐＨ６．３）１００μｌを加え、微量滴定プラークをＹＰＤの場合だと１５分間、ＭＭＡｍ培養上澄の場合だと２時間にわたり３７℃でインキュベートした。プロレニン標準はSigmaから購入した。ＹＰＤまたはＭＭＡｍ培地中１０ｍｇ／ｌ溶液を上記のように活性化した；キモシン活性の定量を行うために、同培地の連続２倍希釈物１００μｌも活性化上澄と並行して試験した。ＭＭＡｍサンプルの滴定中に、精製アセチル化ＢＳＡ１００μg/mlは、微量滴定プラークでレニン吸着を妨げてその活性を安定化させるために加えた。
結果は表１３に示されている。
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ｐＩＮＡ１２１０（４逆方向“ＵＡＳ１Ｂ”コピー）のハイブリッドプロモーターにより得られた分泌レニン活性は高かった：ＹＰＤで４０時間の培養後に約７．５ｍｇ／ｌおよびＭＭＡｍ培地で４８時間の培養後に１０ｍｇ／ｌ。定常期中にこれらの培地で達したＯＤ６００は各々約２０および約１２であり、ｐＩＮＡ１２１０により得られたＯＤ単位当たりの分泌レニン活性は、ＹＰＤ培地で０．３７ｍｇ／ｌ×ＯＤ６００、ＭＭＡｍ培地で０．８３ｍｇ／ｌ×ＯＤ６００であった。ｐＩＮＡ１２０９（４同方向“ＵＡＳ１Ｂ”コピー）のハイブリッドプロモーターにより得られた活性は、双方の培地において、試験された異なる培養時間のとき同様であった。
分泌レニン活性は長い培養時間（ＹＰＤ培地で４０〜４８時間、ＭＭＡｍ培地で６２時間）後に減少したが、これはおそらく細胞内タンパク質分解活性の漏出のせいによるプロレニンの部分的分解を示唆している。
ＹＰＤで３２時間の培養後、最良プロモーター（ｐＩＮＡ１２０９および１２１０）による活性は、最小ＬＥＵ２プロモーターからの場合（ｐＩＮＡ１２０８の活性はすべての培養時間で検出不能のままであった）よりも１２倍以上高く、自然ＸＰＲ２プロモーターからの場合（ｐＩＮＡ１２１４）よりも３倍高く、自然ＬＥＵ２プロモーターからの場合（ｐＬＸ-３４）よりも６倍高かった。ＭＭＡｍで４８時間後、ｐＩＮＡ１２１０のハイブリッドプロモーターによる活性は、最小ＬＥＵ２プロモーターからの場合（すべての培養時間で検出不能）よりも１０倍以上高く、自然ＸＰＲ２プロモーターからの場合（すべての培養時間で検出不能）よりも８倍以上高く、自然ＬＥＵ２プロモーターからの場合よりも２倍高かった。
ハイブリッドプロモーターおよび自然ＸＰＲ２プロモーターによる測定レニン活性は、β-ガラクトシダーゼ活性に関する我々の先の観察とは逆に、ＭＭＡｍ培地よりもＹＰＤで高くなかった（実施例４参照）。この結果はおそらくＹＰＤ培地でレニン活性の人為的過少評価のためであろう：実際に、用いられたY.lipolytica株、ＪＭ２３ＳＢは（酸細胞外プロテアーゼについてコードする）野生型ＡＸＰ遺伝子を有している。このプロテアーゼはｐＨ６（未緩衝化ＹＰＤ培地の大体のｐＨ）で一部活性であり、その最大活性（ｐＨ４）の約１／４に留まることが示されたが、ｐＨ６．８の活性は無視しうるほどであった（Yamada and Ogrydziak,1983）。ＡＸＰ遺伝子はｐＨ６で発現されることが最近示された（Cordero-Otero and Gaillardin,1996）。したがって、このプロテアーゼはＹＰＤ培地で測定されたレニン活性のレベルを低下させるのに関与している：その活性は不活化ＡＸＰ遺伝子を有する株だとおそらく高いであろう。
我々は、限られた数の培養条件だけが試験され、ここで報告されたレベルが培養の条件と生産株の遺伝的背景とを最良にすることでおそらく有意に高められるだろう、ということを強調したい。
ＪＭ２３ＳＢおよび一部の組込株（ｐＩＮＡ１２０８、１２１０、１２１４またはｐＬＸ-３４を有する）の培養上澄をウエスタンブロットで分析した。ＹＰＤ培地で４０時間またはＭＭＡｍ培地で４８時間にわたり２８℃で増殖させた培養物１０ｍｌからの上澄を、以前に記載されたように（Sambrook et al.,1989）、トリクロロ酢酸で沈降させ、変性アクリルアミドゲルにのせた。同様に、２３℃においてＭＭＡｍで増殖させた４８時間または６２時間培養物からの上澄１ｍｌを凍結乾燥により濃縮して、変性アクリルアミドゲルにのせた。電気泳動後、ゲルを（Sambrook et al.,1989に記載されたように）ニトロセルロース膜に移し、ウエスタンブロットを、最初にレニンに対するポリクローナルウサギ抗体（C.Strick,Pfizer Co.供給）と、その後でアルカリホスファターゼと複合化されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Promegaから購入、業者の説明に従い使用）とのインキュベートにより現した。
ＴＣＡ沈降および凍結乾燥双方のサンプルの場合において、プロレニン標準コントロールと同時移動する約４０ｋＤの単一バンドが、ＹＰＤまたはＭＭＡｍ培地で増殖させたｐＩＮＡ１２１０（４逆方向“ＵＡＳ１Ｂ”コピーを有するハイブリッドプロモーター）を有する組込株で観察された（データ示さず）。それは、ＭＭＡｍ培地で増殖されたときではなく、ＹＰＤ培地で増殖されたときに、ｐＩＮＡ１２１４（自然ＸＰＲ２プロモーター）を有する組込株でも観察された。逆に、このバンドは、ＹＰＤおよびＭＭＡｍ双方の培地において、ＪＭ２３ＳＢ株とｐＩＮＡ１２０８（最小ＬＥＵ２プロモーター）およびｐＬＸ-３４（自然ＬＥＵ２プロモーター）を有する組込株からのサンプルで検出不能であった。
我々の結果は、“ＵＡＳ１Ｂ”断片をベースにした最良プロモーターを有するY.lipolytica組込株が、プロレニンＡの強い準構成的発現と効率的分泌とを行わせられることを証明している。これらのプロモーターで得られた結果は、富および最少双方の培地で、以前に用いられたＸＰＲ２およびＬＥＵ２プロモーターの場合よりも明らかに優れている。
参考文献
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配列表
配列番号：１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
配列の型：核酸
配列の長さ：２４
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
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配列番号：２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
配列の型：核酸
配列の長さ：８
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004346681.tif 000022
配列番号：３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
配列の型：核酸
配列の長さ：７８
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
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配列番号：４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
配列の型：核酸
配列の長さ：１０５
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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