(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)アセチルＬ-カルニチンまたは薬理学上許容されるその塩;および、
(ｂ)α-リポ酸
を組み合わせて含む、環境汚染物質によるフリーラジカルの存在によりもたらされる組織障害の予防のための;脳または心筋虚血および付随的再潅流の後、フリーラジカルにより誘導される脳または心筋障害の予防のための;糖尿病または毒性神経障害および、グルコース利用における代謝障害の予防のための組成物であって、
成分(ａ)が、Ｌ-カルニチン、プロピオニルＬ-カルニチン、バレリルＬ-カルニチン、イソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択される「カルニチン」または、薬理学上許容されるその塩またはそれらの混合物をさらに含む組成物。
【請求項２】
重量比(ａ):(ｂ)が１００:１〜１:１０である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
成分（ａ）が、５００から２５０ｍｇのアセチルＬ−カルニチン、プロピオニルＬ−カルニチン、およびイソバレリルＬ−カルニチンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アセチルＬ-カルニチンまたはＬ-カルニチン、プロピオニルＬ-カルニチン、バレリルＬ-カルニチン、イソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択される「カルニチン」の薬理学上許容される塩が、クロライド;ブロマイド;ヨーダイド;アスパルテート、酸アスパルテート;シトレート、酸シトレート;タートレート;ホスフェート、酸ホスフェート;フマレート、酸フマレート;グリセロホスフェート;グルコースホスフェート;ラクテート;マレエート、酸マレエート;オロテート;酸オキサレート;スルフェート、酸スルフェート;トリクロロアセテート;トリフルオロアセテートおよびメタンスルホネートから成る群から選択される請求項１から３いずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ビタミン、補酵素、ミネラル物質および抗酸化剤をさらに含む請求項１から４いずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
経口投与可能な、栄養補助食品の形態の請求項１から５いずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
経口、非経口、直腸または経皮投与可能な、薬剤の形態の請求項１から５いずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
固体、半固体または液体形態の請求項６記載の栄養補助食品の形態の組成物。
【請求項９】
固体、半固体または液体形態の請求項７記載の薬剤の形態の組成物。
【請求項１０】
錠剤、トローチ剤、ピル、カプセル、顆粒またはシロップの形態の請求項８記載の栄養補助食品の形態の組成物。
【請求項１１】
錠剤、トローチ剤、ピル、カプセル、顆粒、シロップ、バイアルまたはドロップの形態の請求項９記載の薬剤の形態の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、環境汚染物質によるフリーラジカルの存在によりもたらされる組織性疾患;脳または心筋虚血および付随する再潅流の後、フリーラジカルにより誘導される脳または心筋障害;毒性または糖尿病性神経障害および、グルコース利用の代謝障害の予防および/または治療のための組成物に関する。
従って該組成物は、該組成物を使用すべき特定の個人に対して該組成物が発揮することを意図する補助的若しくは予防的作用または、厳密には治療的作用いかんで、栄養補助食品または実際薬の形態をとり、その作用を発揮することができる。
【０００２】
より詳細には本発明は、経口、非経口、直腸、または経皮投与することができる組成物であって、
(ａ)任意に少なくとももう一つの「カルニチン」(ここで、「カルニチン」により、Ｌ-カルニチンまたは、プロピオニル-Ｌ-カルニチン、バレリルＬ-カルニチン、イソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択されるアルカノイルＬ-カルニチンを意図する)または薬理学上許容されるその塩と組み合わせる、アセチルＬ-カルニチンまたは薬理学上許容されるその塩;および、
(ｂ)α-リポ酸:
を組み合わせて含む組成物に関する。
【０００３】
アルカノイルＬ-カルニチン(天然に、至るところに存在する化合物であり、その最大濃度は、とりわけ骨格筋および心筋に見出される)が全身で欠乏すると、筋肉および機能の欠損に至り、これは、これらの化合物の外来投与により正常まで回復し得ることが知られている。
脳レベルおよび末梢神経組織の両方でアセチルＬ-カルニチンの存在が確認されており、その存在は正常の神経伝導に必要である。
カルニチンによるエネルギーの産生は、脂肪酸のミトコンドリア内β-酸化、ならびに分枝鎖アミノ酸の酸化およびインシュリン活性の調節を経て起こる。
カルニチンの生物活性を特徴付ける目的のために重要なのは、細胞のリン脂質膜および、赤血球の完全性および変形に対するその安定化効果を示す研究である。
【０００４】
アセチルＬ-カルニチンは特に、過酸化現象から脳組織を保護する。カルニチンが正常な成長に必要であることが確認されている一方、正常と比較して低いカルニチンレベルが老化の間に認められているのも同様に事実である。
老化に伴う代謝プロセス中、酸化プロセスの増加が、それに伴うフリーラジカルの増加と共に常に認められており、これにより糖尿病障害の発症が促進される。
ミトコンドリア活性の低下は、細胞の防御力がもはや有効に打ち勝つことのできない酸化体の増加を導く。
【０００５】
好気性代謝により産生される過酸化物、水酸化物および一重項酸素が増加すると、マクロ分子(ＤＮＡ、タンパク質および脂質)への損傷に至る可能性があり、これは、糖尿病を含む、通常老化中に生じる退行性疾患の発症の一因である。老化と共におこるミトコンドリア活性の低下にはさらに、ミトコンドリア膜構造の一部を構成し、かつ、特に脂肪酸β酸化プロセスのレベルでミトコンドリア活性を維持するのに重要な役割を果たすカルジオリピン、ジホスファチル-グリセロール誘導体の低下を伴う。脂肪酸β-酸化プロセスを含むミトコンドリア活性は、アセチルＬ-カルニチンの投与により再活性化され得、これにより、ミトコンドリアにおいて正常のカルジオリピン濃度を回復することも可能となる。
【０００６】
ミトコンドリア活性へのアセチルＬ-カルニチンのポジティブな効果は、ＡＴＰ産生に関する解糖系の利用を促進するその能力によっても立証される。これらの効果は神経レベルで特に認められており、アセチルＬ-カルニチンが神経損傷または慢性神経退化を予防することができることが判明した。
老化進行中の、体内のカルニチン量の低下に加えて、成長因子(ＧＦ-Ｉ)の低下および、特にＩＧＦ-Ｉ(インシュリン様成長因子)の低下も認められている。
ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩおよびリラキシンは、ソマトメジンとも呼ばれるプロインシュリンのグループに属するペプチドである。
【０００７】
ＩＧＦは、特に中枢および末梢神経系レベルの両方で、恒常性および栄養活性を発揮し、これらのペプチドの臨床使用により、糖尿病性神経障害を含む多くの退行性神経障害において有益な結果が得られている。
老化と、カルニチンおよび成長因子(ＩＧＦ-Ｉを含む)の低下の間に存在する関連性および、アセチルＬ-カルニチンの外来投与によるこれらの因子のレベルの回復により、糖尿病性神経障害を含む神経退行性疾患の予防および治療におけるそれらの使用の目的のためのカルニチンの重要性が正当化される。
【０００８】
α-リポ酸が、炭水化物代謝およびインシュリン活性に重要な調節機能を果たすことも立証されている。α-リポ酸は、植物および動物界の両方に天然に広く分布しており、食物と共に摂取することができる。多くの微生物の成長因子として最初に認識され、次いで多くの動物タンパク質に結合するとして、牛の肝臓において単離された。それは、フリーラジカル、とりわけ環境汚染物質から生じるフリーラジカルの重要なスカベンジャーとして作用する。近年、この化合物がグルコース利用およびインシュリン活性の調節にも非常に有用であり、そのため、糖尿病性神経障害の予防における重要な因子を構成することが示された。
【０００９】
糖尿病性神経障害において増加する脂質過酸化が、α-リポ酸およびそのエナンチオマーの一つの投与により、脳レベルおよび坐骨神経または目のレンズのレベルの両方でコントロールおよび減じられ得ることが立証されている。さらに、α-リポ酸は、高血糖により活性化されるアルドースレダクターゼを阻害し、それゆえ、α-リポ酸は糖尿病合併症において重要な治療的役割をも果たし得る。
α-リポ酸は、筋肉のインシュリン誘導性グルコース利用を高め、および、糖尿病患者において、グルコースへのインシュリンの効果に対する抵抗性を減じる。α-リポ酸の抗酸化効果に関連して、さらに、虚血により誘導される脳障害に対するその神経保護能力および、パーキンソン病およびエイズにおけるその仮定される治療的役割がある。
【００１０】
α-リポ酸の抗酸化効力は、直接的であるか、または、グルタチオンおよびアスコルビン酸濃度の回復により、間接的であるかのいずれかであり得る。
α-リポ酸の炭水化物代謝における活性は本質的に、ピルビン酸および他のα-ケト酸の酸化的デカルボヒドロキシレーションにおけるおよび、アセテート経由の、ＡＴＰの形成に至るトリカルボン酸サイクルの活性化における、補酵素として作用するその能力によるが、この化合物が糖尿病障害の予防に関して有する多くの好ましい生物効果を説明するためには、α-リポ酸がその保護作用を発揮する他の経路も考慮しておかねばならない。
これらの中で、ジヒドロリポ酸への還元後、反応性酸素種(ＲＯＳ)による核転写因子(ＮＦ-ｋＢ)の活性化を阻害し、次いで神経毒および細胞毒性因子の関連カスケードを阻害するその能力に存在するメカニズムを特に考慮しておくべきである。
【００１１】
糖尿病に伴う多くの合併症、例えば神経障害および目の白内障にはＲＯＳが介在するため、核転写因子の活性化の阻害が、α-リポ酸が糖尿病に関連する疾患の予防に介在し得るメカニズムの構成要素である可能性がある。さらに、糖尿病患者において、α-リポ酸の濃度は正常値よりも低く、α-リポ酸の投与によりこれらのレベルが正常まで回復され得ることも考慮しておくべきである。それはつまり、細胞膜へのグルコースの輸送におけるインシュリンの効果に対して付加的な効果を有する。
【００１２】
高濃度のグルコースへ慢性的に暴露されると、グルコースとタンパク質の間の非酵素反応および、グリコシル化の最終産物(進行性グリコシル化最終産物＝ＡＧＥｓ)として知られる高反応性タンパク質の自発的形成に至る可能性がある。これらの中で、グルコースとアルブミン、グルコースとコラーゲンおよびグルコースとヘモグロビンのグリコシル化産物が最もよく研究されているものである。ＡＧＥが組織および細胞で生じさせる影響は、神経、筋肉および内皮レベルにおける糖尿病疾患の大部分に関与する要因である。
ＡＧＥは、実際、細胞外マトリックスの成分の合成を高め、内皮浸透性および、免疫複合体およびサイトカインの形成を増し、神経および網膜の虚血、ミエリンの蓄積およびミエリンの変性を引き起こす。糖尿病の経過中および老化過程の両方において多数のこれらの化合物が形成される。
【００１３】
α-リポ酸のこの反応を阻害する能力同様、ＡＧＥとＮＦ-ＩＫＢの活性化の間の関連性が近年立証された。
フリーラジカルと共に、高濃度のグルコースによるタンパク質の糖化およびグルコース酸化はそれゆえ、糖尿病に伴う組織異常-特に神経組織異常の原因であるもう一つの原因である可能性がある。α-リポ酸の存在によりさらに、グリコシル化またはグルコース酸化反応の進行が阻害または制限される。
α-リポ酸のもう一つの保護効果は、炎症剤に接触させた脾臓細胞でも観察されている。
【００１４】
白内障の予防および治療におけるα-リポ酸の作用に関して、これは、前記の他のメカニズムのみならず、高血糖によるグルコースのビタミンＣ輸送との競合により低下した目のビタミンＣ濃度を回復させることによるものでもあり得る。
ビタミンＥの不足およびグルタチオン濃度の増加に加えて、α-リポ酸の、神経障害の発症に対する保護作用が臨床研究で確認されている。神経障害の低下に、マロニルアルデヒド濃度の低下により検出される過酸化反応産物の低下が伴うことも認められている。他のマルチセンター研究により、糖尿病性神経障害の治療においてその作用が確証されている。
【００１５】
驚くべきことに、その特徴成分として
(ａ)アセチルＬ-カルニチンまたはその薬理学上許容される塩、および、
(ｂ)α-リポ酸
の組み合わせを含む組成物が、環境汚染物質によるフリーラジカルの存在によりもたらされる組織障害;脳または心筋虚血の後および、再潅流の結果として、フリーラジカルにより誘導される脳または心筋障害;毒性または糖尿病性神経障害および、グルコース利用における代謝障害の予防および/または治療に極めて有効であることが見出された。
【００１６】
好適には、成分(ａ)が、Ｌ-カルニチン、プロピオニルＬ-カルニチン、バレリルＬ-カルニチンおよびイソバレリルＬ-カルニチンから成る群から選択される「カルニチン」または、薬理学的に許容されるその塩をさらに含んでいてもよいことも見出された。
(ａ):(ｂ)の重量対重量比は、１００:１〜１:１０である。
【００１７】
毒性試験
カルニチンもα-リポ酸も、その非常に限られた毒性および良好な耐性が周知である。カルニチンおよびα-リポ酸のこれらの好ましい毒性を、これらの成分を組み合わせて、およびそれらを高投与量でラットとマウスの両方に投与することにより確認した。これらの動物において、実際に、２５０ｍｇ/ｋｇ以上のアセチルＬ-カルニチンまたは１００ｍｇ/ｋｇのα-リポ酸の非経口投与、ならびに２５０ｍｇ/ｋｇのカルニチン混合物(各々１:１の重量比で組み合わせたアセチルＬ-カルニチン、プロピオニルＬ-カルニチン、イソバレリルＬ-カルニチン)および５００ｍｇ/ｋｇ以上のアセチルＬ-カルニチン、５００ｍｇ/ｋｇのカルニチン混合物および２００ｍｇ/ｋｇのα-リポ酸の経口投与を、こうして処置した動物のいずれも死亡させないでできることが判明した。
ラットのグループとマウスのグループの両方において、２００ｍｇ/ｋｇのアセチルＬ-カルニチンまたは２００ｍｇ/ｋｇのカルニチン混合物の、１００ｍｇ/ｋｇのα-リポ酸との３０連日の食餌による長期投与も良好に耐性であることが分かり、毒性の徴候が全く認められなかった。これらの動物で行った体重増加試験も種々の血液化学試験も両方共、処置の終わりに動物を屠殺した後、主要器官で行った組織病理試験の知見同様、正常値を示した。
【００１８】
実験的脳虚血における神経保護活性試験
脳虚血による障害が、フリーラジカルおよび一酸化二窒素の産生に関連していることおよび、カルニチンとα-リポ酸の両方により、フリーラジカルの毒性作用に対する保護が提供されるという事実を考慮して、これらの試験では、Scharkey(Scharkey, Y., Nature 371-336, 1994)に記載の方法に従い、麻酔したラットに、定位的に置いたマイクロカニューレを用いて梨型皮質(piriform cortex)に中脳動脈のレベルでエンドセリン-１(３ｎｌ中１２０ｐｍｏｌ)を３分間注射することにより中脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞することにより脳虚血を誘導した。動脈の閉塞を誘導し、生じた虚血はこの処置の３日後、パラホルムアルデヒド(ＰＢＳ中４％)の溶液による心臓の潅流(transcardiac perfusion)により確認することができる。
【００１９】
脳を取り出した後、それを１０％スクロース含有固定液に入れ、クレシルバイオレットで固定した凍結切片(２０ｎｍ)を光学顕微鏡下で試験した。アセチルＬ-カルニチン(５０ｍｇ/ｋｇ)またはカルニチン混合物(５０ｍｇ/ｋｇのアセチルＬ-カルニチン、プロピオニルＬ-カルニチンおよびイソバレリルＬ-カルニチンの各々１:１重量比の混合物)またはα-リポ酸(２０ｍｇ/ｋｇ)を、エンドセリン注射の５分後に静脈内投与した。
梗塞領域の体積を、Park(Park C.K., Anns. Neurol., 20-150, 1989)により開示される方法に従い計測した。これらの試験の結果により、アセチルＬ-カルニチン、カルニチン混合物およびリポ酸がすべて、虚血領域を減らすことができるが、驚くべきことに、最大かつ最も顕著な結果は、これらの生成物の組み合わせ、および特に、アセチルＬ-カルニチンとα-リポ酸の組み合わせを用いて得られ得ることが立証される。
【００２０】
【表１】
ＭＣＡの閉塞による虚血の程度(体積ｍｍ３)(コントロールと比較した、体積の低下パーセント)
0004361215.tif 000002
【００２１】
実験的糖尿病性高血糖試験
タンパク質グリコシル化生成物(ＡＧＥｓ)の形成によるものであろうと、代謝性低酸素症によるものであろうと、高血糖は、糖尿病および、特に糖尿病性神経障害の原因である基本的要因の一つである。
血清グルコースを制御することはそれゆえ、糖尿病に関連する疾患を予防する最も重要な方法の一つである。これらの試験では、実験的糖尿病をラットに誘導し、次いで、誘導した高血糖が、アセチルＬ-カルニチンまたはカルニチン混合物、またはα-リポ酸、またはこれらの生成物の組み合わせの投与により減じられ得るかどうかを確認するために試験を行った。ラットにアロキサン(１００ｍｇ/ｋｇ)を皮下注射することにより高血糖を誘導し、アロキサン注射の７日後に４５０ｍｇ/ｄｌを越す血清グルコースレベルを示すラットを高血糖であるとみなした。
【００２２】
試験物質を用いた処置を経口で３週間施した。この期間の終わりに、血清グルコースを、ラットの種々のグループ、高血糖ラットと処置ラットの両方で測定した。
得られた結果により、カルニチンおよびα-リポ酸の両方が、単独では高い初期血清グルコース値をわずかに下げ得るのみであるが、最も顕著な結果は、α-リポ酸と組み合わせたカルニチンの投与後に現れることが立証される。この場合、特にアセチルＬ-カルニチンおよびα-リポ酸の組み合わせを用いた場合に２つの生成物の顕著な共同活性が見られ、血清グルコース値をほとんど正常まで下げることができる。
【００２３】
【表２】
ラットにおける実験的高血糖試験
0004361215.tif 000003
アセチルＬ-カルニチン＝２００ｍｇ/ｋｇ
カルニチン混合物＝各々１:１の比のアセチルＬ-カルニチン+プロピオニルＬ-カルニチン+イソバレリルＬ-カルニチン
α-リポ酸＝５０ｍｇ/ｋｇ
【００２４】
糖尿病ラットの目のレンズおよび坐骨神経中のソルビトール含量に関する試験
糖尿病性高血糖により誘導される障害および、それに関連する目または末梢神経疾患の最もよくある原因の一つは、結果的に浸透力および細胞完全性の低下を伴うソルビトールの細胞内蓄積にある。
これらの試験を、５０ｍｇ/ｋｇのストレプトゾトシンの静脈内投与により糖尿病を誘導したラットのグループで行った。注射の１週間後、血清グルコースを試験し、４５０ｍｇ/ｄｌを越す血清グルコース値を示すラットを糖尿病とみなした。次いでこれらの動物に、８日間続けてアセチルＬ-カルニチン(１００ｍｇ/ｋｇ)またはカルニチン混合物(各々１:１の重量比のアセチルＬ-カルニチン+プロピオニルＬ-カルニチン+イソバレリルＬ-カルニチン)(１００ｍｇ/ｋｇ)またはα-リポ酸(２５ｍｇ/ｋｇ)を、単独または種々の組み合わせのいずれかで腹腔内注射した。
【００２５】
処置の８日後、適当に単離した後、糖尿病ラットの坐骨神経および目のレンズの両方に存在するソルビトール濃度を投与処置の前後で測定した。ソルビトール濃度は、全処置動物で低下したように思われたが、最も顕著な低下は、α-リポ酸およびカルニチンの組み合わせを用いて処置した動物において認められ、および、最も低い値は、アセチルＬ-カルニチンおよびα-リポ酸の組み合わせを用いて処置したグループにおいて示された。
これらの試験の結果も、α-リポ酸とカルニチンの間の驚くべき程度の共同相乗活性を示す。
【００２６】
【表３】
糖尿病ラットの目のレンズおよび坐骨神経中のソルビトール含量
0004361215.tif 000004
【００２７】
ＩＧＦ-Ｉ、カルニチンおよびα-リポ酸で処置した神経細胞の生存および成長に関する試験
インシュリン様成長因子(ＩＧＦ-Ｉ)が、神経細胞機能の完全性を保護することに関して、特に糖尿病疾患の進行中に現れるもののような毒性障害に対して果たす重要な役割を考慮して、脳細胞の成長および生存を促進するＩＧＦ-Ｉの活性が、カルニチンまたはリポ酸または、これらの生成物の組み合わせの培養培地における存在により助長されるかどうかを考察した。この目的のために、ウイスターラットの脳細胞をThanguipon(Thanguipon W., Dev. Brain Res., 11, 177. 1983)により開示される方法に従い単離し、３×１０５/ｃｍ２の密度でプレート上にまいた。非神経細胞の複製を妨げるために、培養培地にシトシンアラビノ-フラノシド(１０ｍＭ)を添加した。８日後、細胞を洗浄し、それを、血清を５ｍＭのＫＣｌ濃度を含有するＢＭＥ(Basal Eagles Medium, Life Technologies, Gaithersburg, MD)で置き換えた培地で維持した。試験生成物；２５ｎｇ/ｍｌのアセチルＬ-カルニチン(１００ｎｇ/ｍｌ)またはカルニチン混合物(１００ｎｇ/ｍｌ)またはα-リポ酸に相当するＩＧＦ-Ｉを、単独または組み合わせのいずれかで、こうして調製した血清に直接添加した。
【００２８】
培地中での細胞の生存および成長を、培地へ物質を添加した２４時間後に、Jones(Jones K.H., J. Histochem. Cytochem., 33, 77, 1985)により開示される方法に従い３５ｍｍのディスク上で、１０ｎｇ/ｍｌのフルオレセインアセテートに接触させて観察した。細胞の測定は、蛍光顕微鏡を用いて行った。この試験の結果は、ＩＧＦ-Ｉの、単離脳細胞への成長促進効果が、単独では有意な変化を生じないカルニチンとα-リポ酸の存在により有意に増強され、最大の成長促進効果は、カルニチン、および特にアセチルＬ-カルニチンをα-リポ酸と組み合わせた場合に誘導されることを示す。
【００２９】
【表４】
アセチルＬ-カルニチン、カルニチン混合物およびα-リポ酸による、ＩＧＦ-１の単離脳細胞の成長促進に関する増強作用に関する試験
0004361215.tif 000005
【００３０】
糖尿病ラットにおける坐骨神経再生試験
誘導性糖尿病のラットの坐骨神経を切断した場合、正常のラットに比べて再生活性が劣る。
糖尿病ラットの坐骨神経の再生が、アセチルＬ-カルニチン、カルニチン混合物またはα-リポ酸または、これらの生成物の組み合わせにより促進され得るかどうかを調べるために、これらの試験を行った。これらの試験で用いる方法は、Fernandez(Fernandez E., Int. J. Clin. Pharmacol. Res., 10, 85, 1990)により開示されるものである。
【００３１】
糖尿病(４５０ｍｇ/ｄｌを越す血清グルコース)を、１００ｍｇ/ｋｇのアロキサンの皮下注射によりラットの一グループに誘導した。アセチルＬ-カルニチン、カルニチン混合物およびα-リポ酸を、一日の摂取が２００ｍｇ/ｋｇのアセチルＬ-カルニチン、２００ｍｇ/ｋｇの(各々１:１の重量比のアセチルＬ-カルニチン+プロピオニルＬ-カルニチン+イソバレリルＬ-カルニチンの)カルニチン混合物および５０ｍｇ/ｋｇのα-リポ酸となる方法で食餌と共に投与した。化合物は、坐骨神経切断１週間前から切断３０日後まで投与した。
【００３２】
坐骨神経は、麻酔下、その１ｃｍを露出させた後に坐骨小孔のレベルにて切断した。障害の境界を、神経弓突起縫合を用いてマークした。神経を切断した３０日後、動物を屠殺した後、坐骨神経の主要節の一つである脛骨神経の組織を試験した。約４ｍｍの長さの脛骨神経の４つのクロスセクションを次いで、セミオートマチックイメージアナライザー(Zeiss Videoplan Image Analyser)を用いて形態学的および形態計測的試験に供した。
再生軸索数および１００ｎｍ２当たりのその密度、ならびに変性エレメントを測定した。こうして、脛骨神経エレメントの糖尿病誘導性変性を検出することが可能となり、これは、アセチルＬ-カルニチン、カルニチン混合物およびα-リポ酸を用いた処置により、ほとんど正常値を回復する程度まで修正されることが分かった。
神経再生に対する糖尿病性障害の予防に関して最も明らかな結果は、アセチルＬ-カルニチンまたはカルニチン混合物の、α-リポ酸と組み合わせた投与を用いて得られ、こうして、この試験においても、本発明による組み合わせの部分における懸著な、および思いがけない共同性が立証される。
【００３３】
【表５】
糖尿病ラットで、坐骨神経を切断した後の、脛骨神経変性エレメントの数および密度
0004361215.tif 000006
【００３４】
神経筋伝導試験
末梢神経障害および特に、糖尿病性神経障害における最も明らかな異常の一つは心筋伝導の鈍化であり、これは、運動活動の変化に反映する。
これらの試験では、実験動物(平均体重が３００ｇのラット)に５０ｍｇ/ｋｇのストレプトゾトシンを静脈内注射することにより、ラットに実験的糖尿病を誘導した。誘導性糖尿病(４５０ｍｇ/ｄｌを越す血清グルコース)の動物で、神経筋伝導速度(ＮＭＣＶ)を測定した。この目的のために、坐骨神経を単離し(長さ２ｃｍ)、ひらめ筋を腓腹筋から単離し、その末端の腱を切断し、筋肉の収縮力(ＭＣＦ)を記録する等尺トランスデューサーに接続した。神経から１０ｍｍの距離で挿入し、刺激器に接続した２つの電極を用いて、坐骨神経経由で筋肉を刺激した。
【００３５】
二極の電極を、オシロスコープによる筋電図を表示させるために、筋肉の末端に置いた。
ＮＭＣＶをｍ/秒で測定し、刺激電極間の距離を、２つの部分で誘発されるＥＣＧ電位の開始間の潜伏期の平均差異で割った。
【００３６】
【表６】
糖尿病ラットにおける神経筋伝導試験(４週間後)
0004361215.tif 000007
【００３７】
運動協調性異常試験
これらの試験は、「動揺マウス(wobbler mice)」、いわば、不安定、千鳥足、前肢の位置の異常および動く速さの低下を示す動物において行った。これらの異常は、特に前肢を侵すような運動神経および筋肉皮膚神経繊維の進行性萎縮に関連する。試験は、Mitsumoto(Mitsumoto H., Annal. Neurol., 36, 14, 1994)により提唱される方法に従い行った。診断後、動揺マウスを経口で、２０日間連続して、アセチルＬ-カルニチン(２００ｍｇ/ｋｇ)またはカルニチン混合物(２００ｍｇ/ｋｇ)、またはα-リポ酸(５０ｍｇ/ｋｇ)またはこれらの生成物の種々の組み合わせを用いて処置した。処置動物対コントロールに関して、各動物が傾斜したプラットホームの縁につかまっている時間(ホールディング時間)と、１０ｃｍの距離を走るのにかかる時間(ランニング時間)を評価することにより、試験を行った。
【００３８】
これらの試験の結果は、アセチル-Ｌ-カルニチン、カルニチン混合物およびα-リポ酸を用いたこれらの動物の処置により、コントロール動物と比較してホールディング時間とランニング時間の両方が改善されるが、最良の効果は、これらの生成物を組み合わせた、および特にアセチルＬ-カルニチンとα-リポ酸の組み合わせによる投与を用いて得られることを示す。これらの試験においても、カルニチンおよびα-リポ酸の、顕著な思いがけない共同相乗効果が見られる。
【００３９】
【表７】
表７
ランニング時間の増加パーセント試験
0004361215.tif 000008
【００４０】
【表８】
表８
ホールディング時間の増加パーセント試験
0004361215.tif 000009
【００４１】
シスプラチン誘導性感覚神経障害に関する試験
実験動物へのシスプラチンの長期投与により、感覚神経のレベルで障害が引き起こされ得、プロピオセプティブ認知(propioceptive perception)の顕著な異常を引き起こし得る。
これらの試験では、１０ｍｇ/ｋｇのシスプラチンの７連日の皮下注射により誘導される毒性への、３００ｍｇ/ｋｇのアセチルＬ-カルニチンの経口による、または、３００ｍｇ/ｋｇのカルニチン混合物(各々１:１重量比のアセチルＬ-カルニチン+プロピオニルＬ-カルニチン+イソバレリルＬ-カルニチン)または、５０ｍｇ/ｋｇのα-リポ酸または、これらの生成物の種々の組み合わせの７連日の投与が及ぼす保護効果を評価した。
シスプラチンにより誘導されるプロピオセプティブ感覚認知異常を、マウスにおいて、ロータロッド試験(Apfel, S.C., Ann. Neurol., 29, 89, 1991)を用いて評価した。
【００４２】
これらの試験で得られた結果は、シスプラチンがコントロール動物と比較して、シスプラチン処置動物において平衡時間のかなりの低下および、アセチルＬ-カルニチンまたはα-リポ酸単独で処置した動物において同じオーダーの低下を引き起こす一方で、アセチルＬ-カルニチンおよびα-リポ酸の組み合わせを用いて処置した動物のグループは、他方、シスプラチン中毒に供しなかった動物の平衡能力と事実上同一の平衡能力を示すことを示す。これらの試験においても、カルニチンおよびα-リポ酸の顕著な共同効果が見られる。
【００４３】
【表９】
シスプラチンにより誘導される感覚神経異常に関する試験(ロータロッド試験)
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【００４４】
新規組成物が発揮し得る活性を評価するために行った試験により、発明自体の革新的性質が完全に正当化され、とりわけ、組み合わせで用いた場合にその成分が誘導することができる思いがけない、驚くべき共同効果が立証される。
その成分の共同相互活性に基き、本明細書中に記載する本発明による組成物は、急性または慢性の神経障害を引き起こす毒性および代謝障害を予防するのに適する。特に、それは毒性神経障害、特に糖尿病性末梢神経障害の治療に用いることが可能である。
その抗酸化能力ゆえに、この組成物は、脳、肝臓、心臓または他の器官および組織におけるフリーラジカルの放出に関連する毒性および無酸素症起源の異常の予防または処置にも望ましい。
さらに、該組成物のＩＧＦ-Ｉ活性促進能力ゆえに、その使用により、老化に関連する病理学的異常、例えば、神経退行性疾患に関して、驚くべき利点も得られ得る。
【００４５】
本発明による製剤を説明する、無制限の例をこれ以下に示す。
【００４６】
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【００４７】
Ｌ-カルニチンまたはアルカノイルＬ-カルニチンの薬理学上許容される塩が意味するのは、望ましくない毒性または副作用を生じない酸とのこれらの活性成分のいずれかの塩である。これらの酸は、製薬業者には周知である。
適当な塩の無制限の例は次のようである。:クロライド;ブロマイド;ヨーダイド;アスパルテート、酸アスパルテート;シトレート、酸シトレート;タートレート;ホスフェート、酸ホスフェート;フマレート、酸フマレート;グリセロホスフェート;グルコースホスフェート;ラクテート;マレエート、酸マレエート;オロテート;オキサレート、酸オキサレート;スルフェート、酸スルフェート;トリクロロアセテート、トリフルオロアセテートおよびメタンスルホネート。
【００４８】
ＦＤＡが認可する医薬上許容される塩のリストはInt. J. of Pharm. 33, (1986), 201-217に示されており、この出版物を、本明細書中に引用により組み込む。
本発明による組成物は、ビタミン、補酵素、ミネラル物質および抗酸化物質をさらに含んでもよい。
特定の投与経路を考慮して組成物を調製するために用いられる適当な賦形剤は、製薬業者におよび食品工業の専門家には明らかであろう。