(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）
【化１】
0004251531.tif 000012
（一般式（Ｉ）中、Ｒは、炭素数が１〜９のアルコキシ基、メトキシメトキシ基、ベンジルオキシ基、メチルチオメトキシ基、またはトリエチルシリルオキシ基を示す。）
で示される化合物。
【請求項２】
下記の構造式（ＩＩ）で示される化合物。
【化２】
0004251531.tif 000013
【請求項３】
下記の構造式（ＩＩＩ）で示される化合物。
【化３】
0004251531.tif 000014
【請求項４】
１）リベロマイシンＡの１８位のヘミサクシニル基を水酸基に加水分解し、
２）１位および２４位のカルボキシル基をエステル化し、
３）５位の水酸基を保護基で保護し、
４）１８位の水酸基をメチル化し、
５）１位および２４位のエステル基を加水分解し、
６）５位の保護基を脱保護する、
ことを特徴とする構造式（ＩＶ）
【化４】
0004251531.tif 000015
で示される化合物の製造方法。
【請求項５】
１）リベロマイシンＡの１８位のヘミサクシニル基を水酸基に加水分解し、
２）１位および２４位のカルボキシル基をエステル化し、
３）５位の水酸基を保護基で保護し、
４）１８位の水酸基をメチルチオメチル化し、
５）１位および２４位のエステル基を選択的に加水分解し、
６）５位の保護基を脱保護する、
ことを特徴とする構造式（Ｖ）
【化５】
0004251531.tif 000016
で示される化合物の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で示される化合物を有効成分として含有することを特徴とする蛋白質合成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リベロマイシンＡ誘導体、およびその製造方法に関する。本発明は、さらに、リベロマイシンＡ誘導体を有効成分として含有する蛋白質合成阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌細胞の異常な増殖は、細胞増殖因子伝達系の異常に由来することが多い。例えば、多くの癌細胞では自己増殖を促進する腫瘍増殖因子アルファ (TGF-α)を分泌することが知られている。従ってTGF-αの作用を選択的に阻害する薬剤は新しい抗腫瘍剤として期待される。TGF-αと類似の細胞増殖因子である上皮増殖因子 (EGF) のシグナル伝達阻害剤として、本発明者等によって発見されたのがリベロマイシンＡ（化合物１）、Ｃ（化合物２）、Ｄ（化合物３）および弱い活性を有するリベロマイシンＢ（化合物４）である（Takahashi, H.; Osada, H.; Koshino, H.; Kudo, T.; Amano, S.; Shimizu, S.; Yoshihama, M.; Isono, K. J. Antibiot. 1992, 45, 1409-1413）。
【０００３】
【化６】
0004251531.tif 000002
【０００４】
リベロマイシンＡは抗真菌剤としての活性を有し、また原核細胞には作用せず、真核細胞に選択的な蛋白質合成阻害剤としての活性も有している。しかしながら、リベロマイシンＡは、酸性、塩基性両条件下において、不安定な化合物であり、容易に失活してしまう。
従って、上記のような活性を保持し、かつより安定な化合物の開発が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の希求に応えるものであり、蛋白質阻害活性を有し、かつ高い安定性を有するリベロマイシンＡ誘導体、その製造方法およびそれを有効成分とする蛋白質合成阻害剤の提供を課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題の解決のために、鋭意研究を行った。本発明者等は、まずリベロマイシンＡの類縁体を多種合成し、それらの化合物の蛋白質合成阻害活性について検討した。その結果、リベロマイシンＡ誘導体の蛋白質阻害活性の発現には、リベロマイシンＡの構造の２４位カルボキシル基および５位の水酸基が必須であること、また、１８位ヘミサクシニル基は、蛋白質阻害活性の発現には必須でないことが明らかとなった。リベロマイシンＡは塩基性あるいは酸性条件下で１８位のヘミサクシニル基が加水分解を受けやすく不安定であること、および上記の知見に基づいて、本発明者等はリベロマイシンＡの構造の２４位カルボキシル基および５位の水酸基を保持し、１８位のヘミサクシニル基がより安定性の高い置換基に置換されたリベロマイシンＡ誘導体を製造した。本発明はこのようにして完成するに至ったものであり、本発明の要旨は、以下の通りである。（１）  下記の一般式（I）
【０００７】
【化７】
0004251531.tif 000003
【０００８】
（一般式（Ｉ）中、Ｒは、炭素数が１〜９のアルコキシ基、メトキシメトキシ基、ベンジルオキシ基、メチルチオメトキシ基、またはトリエチルシリルオキシ基を示す。）
で示される化合物。
（２）  下記の構造式（ＩＩ）で示される化合物。
【０００９】
【化８】
0004251531.tif 000004
【００１０】
（３）  下記の構造式（III）で示される化合物。
【化９】
0004251531.tif 000005
【００１１】
（４）  １）リベロマイシンＡの18位のヘミサクシニル基を水酸基に加水分解し、
２）1位および24位のカルボキシル基をエステル化し、
３）5位の水酸基を保護基で保護し、
４）18位の水酸基をメチル化し、
５）1位および24位のエステル基を加水分解し、
６）5位の保護基を脱保護する、
ことを特徴とする構造式（IV）
【００１２】
【化１０】
0004251531.tif 000006
【００１３】
で示される化合物の製造方法。
（５）  １）リベロマイシンＡの18位のヘミサクシニル基を水酸基に加水分解し、
２）1位および24位のカルボキシル基をエステル化し、
３）5位の水酸基を保護基で保護し、
４）18位の水酸基をメチルチオメチル化し、
５）1位および24位のエステル基を選択的に加水分解し、
６）5位の保護基を脱保護する、
ことを特徴とする構造式（V）
【００１４】
【化１１】
0004251531.tif 000007
【００１５】
で示される化合物の製造方法。
（６）  一般式（I）で示される化合物を有効成分として含有することを特徴とする蛋白質合成阻害剤。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のリベロマイシンＡ誘導体
本発明のリベロマイシンＡ誘導体は、リベロマイシンＡ誘導体のうち、蛋白質阻害活性を有し、かつ高い安定性を有する化合物である。
すなわち、本発明のリベロマイシンＡ誘導体は、下記の一般式（I）
【００１７】
【化１２】
0004251531.tif 000008
【００１８】
（一般式（Ｉ）中、Ｒは、炭素数が１〜９のアルコキシ基、メトキシメトキシ基、ベンジルオキシ基、メチルチオメトキシ基、またはトリエチルシリルオキシ基を示す。）
で示される化合物である。
【００１９】
前記炭素数が１〜９のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基などが挙げられる。
Ｒとしては、メトキシ基、メチルチオメトキシ基などが好ましい。
【００２０】
（２）本発明のリベロマイシンＡ誘導体の製造方法
本発明のリベロマイシンＡ誘導体は、限定されないが、例えば、以下のようにして製造することができる。反応における条件、例えば、試薬、触媒、溶媒、反応温度、反応時間などは通常よく知られた有機合成手法に基づいて、適宜変更することができ、このような変更を含む方法も本発明の範囲に属する。
【００２１】
【化１３】
0004251531.tif 000009
【００２２】
本発明の好ましい一形態であって、安定な誘導体であるC18-メトキシ体（化合物17）は、以下のようにして合成することができる。リベロマイシンＡ（化合物1）を1N LiOH、NaOH、KOHなどのアルカリで処理すると、容易にC18-ヒドロキシ体（化合物14）が得られる。
化合物14を、TMSCHN2（トリメチルシリルジアゾメタン）などのメチル化剤で処理しエステル化した後、TBSCl（t-ブチルジメチルシリルクロライド）などの保護剤を用いて5位水酸基を保護し、C5-シリルエーテル（化合物16）とする。ついで、化合物16をTHF（テトラヒドロフラン）などの有機溶媒中、NaHなどの水素化金属、およびMeI（ヨウ化メチル）などのメチル化剤と反応させると、18位水酸基のメチル化後、エステルの加水分解が起きる。続いてTBAF (テトラブチルアンモニウムフルオライド) などの脱保護剤でTBS基を除去するとC18-メトキシ体（化合物17）が得られる。
また、本発明の好ましい別の形態であって、安定な誘導体であるC18-MTM（メチルチオメチル）エーテル（化合物20）は、以下のようにして合成することができる。化合物16を DMSO-Ac2O（無水酢酸）で処理すると好収率で C18-MTM エーテル（化合物19）が生成する。化合物19をLiOHなどのアルカリを用いて加水分解すると選択的加水分解反応が進行し、シリル基の脱保護後、ジカルボン酸（化合物20）およびモノカルボン酸（化合物21）が得られる。
【００２３】
また、その他のリベロマイシンＡ誘導体は、以下のようにして合成することができる。
リベロマイシンＡ（化合物1）を、4当量のTBSCl、TMSCl、またはTESCl(トリエチルシリルクロライド)などのシリル化剤で処理し、５位水酸基および３個のカルボキシル基をシリル化後、メタノールなどで処理すると、シリルエステルのみの加溶媒分解が容易に起こり、C5-シリルエーテル（化合物5等）が好収率で得られる。
２４位エステルの合成に関しては、化合物1を１ないし２当量のCH2N2（ジアゾメタン）、TMSCHN2などのメチル化剤で処理し、C24-エステル（化合物6, 8, 9および11）、C24-カルボン酸（化合物7, 10および12）を得ることが出来る。
また、トリエステル（化合物6）を接触還元後、HMPA（ヘキサメチルホスホリックトリアミド）中、 LiSPr（リチウムプロパンチオレート）と処理すると、好収率で飽和体（化合物13）を得ることができる。化合物1を直接接触還元しても化合物13を得ることができる。
【００２４】
C１８-ヒドロキシ体（化合物14）は酸に非常に不安定で、p-TsOH（水酸化p-トルエンスルホン酸）あるいはHCl等の酸で処理することによって容易に異性化し、5,6-スピロアセタール（化合物15）を得ることができる。
なお、C5-シリルエーテル体（化合物16）も、p-TsOHやCDCl3、PPTS（ピリジニウム-p-トルエンスルホネート）等の弱酸で処理すると、容易にトランスアセタール化反応を起こし5,6-スピロアセタールが生成する。さらにNaHなどの水素化金属、およびMeIなどのメチル化剤で処理後、TBAFなどの脱保護剤でTBS基の脱保護を行うと、C19-メトキシ体（化合物18）を得ることができる。
【００２５】
（３）リベロマイシンＡ誘導体の安定性
リベロマイシンＡ(RM-A) は、酸性、塩基性両条件下において、加水分解を受けやすく、C18-スクシニル基の脱離反応を起こす可能性がある。従って、リベロマイシンＡのC18-ヘミサクシニル基をより安定性の高い置換基に置換することにより、リベロマイシンＡに対して、より安定性の高いリベロマイシンＡ誘導体を得ることができる。例えば、C18-メトキシ誘導体(C18-OMe) ではC18位の水酸基はメチル化されており、スクシニル基の脱離に比べてこのメチル基の脱離反応は非常に起りにくい。同様に、C18-メチルチオメトキシ誘導体（C18-OMTM）ではC18位の水酸基はメチルチオメチル化されており、スクシニル基の加水分解に比べてこのメチルチオメチル基の加水分解反応も非常に起りにくい。また、RM-AのC18-スクシニル基の脱離の結果、RM-Aの基本骨格である6,6-スピロアセタール構造は、特に酸性条件下において、容易に不活性体であるリベロマイシンB(RM-B) 型の5,6-スピロアセタール構造に変換される。しかしながら、C18-OMeおよびC18-OMTMは、このようなスピロアセタールの異性化反応も起こさない。以上の２点から、C18-OMeおよびC18-OMTMは、酸、塩基に対する安定性の面でRM-A より優れている。
【００２６】
（４）リベロマイシンＡ誘導体の蛋白質合成阻害活性
本発明のリベロマイシンＡ誘導体は、in vitro蛋白質合成阻害活性を有する。in vitro蛋白質合成阻害活性は、IleRS (イソロイシン-tRNA合成酵素）阻害活性に基づく活性なので両活性はほぼパラレルである。
IleRS阻害活性の測定は、例えば、出芽酵母などのIleRSを含む酵素を調製し、この酵素と、さらにATP、ラジオアイソトープなどでラベルしたL-イソロイシン、未ラベルL-イソロイシン、酵母由来のｔRNAなどを含む酵素反応溶液を調製し、リベロマイシン誘導体を添加した場合、および添加しない場合（コントロール）について反応を行い、反応産物であるL-イソロイシルtRNAの放射活性などを測定し、両活性を比較することによって行うことができる。
【００２７】
in vitro蛋白質合成阻害活性の測定は、例えば、TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System(Promega 社)などのIn vitro転写・翻訳システムなどを用いて測定を行うことができる。具体的には、赤血球ライゼートを調製し、鋳型DNA、T7ポリメラーゼ、アミノ酸混合液、ラジオアイソトープなどでラベルしたアミノ酸混合液、RNaseインヒビター、ヌクレアーゼフリー水などを含む反応溶液を調製し、リベロマイシン誘導体を添加した場合、および添加しない場合（コントロール）について反応を行い、In vitro蛋白質合成によって生じるラジオアイソトープなどでラベルしたアミノ酸を含む蛋白質バンドの有無を検出することによって行うことができる。
【００２８】
（５）本発明の蛋白質合成阻害剤
上記リベロマイシンＡ誘導体は、常法により薬学的に許容された担体と組合わせて錠剤、散剤、カプセル剤、注射剤、吸入剤または外用剤等の製剤とすることができ、経口または非経口投与により蛋白質合成阻害剤として臨床に供される。投与量は治療すべき症状及び投与方法により左右されるが、成人１日あたり１mg〜1,000mgである。尚、抗生物質リベロマイシンＡ誘導体のマウス急性毒性値は100mg／kg以上（静注）である。なお、本発明の蛋白質合成阻害剤は、本発明のリベロマイシンＡ誘導体を有効成分として含有する以外は、通常の方法を採用し、調製、投与などをすることが可能である。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例および試験例において、前記リベロマイシンＡ誘導体の合成スキームを参照のこと。
【００３０】
【実施例１】
リベロマイシンA  C18-メトキシ誘導体の合成
リベロマイシンA（化合物1）のエステル化
リベロマイシンA  (19.8 mg, 30μmol) のベンゼン-MeOH（メタノール） (4 :1, 3 ml) 溶液にTMSCHN2 (0.5〜1.5 equiv.) を加えて室温で１０〜１５分攪拌した。溶媒を減圧留去後残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(n-ヘキサン : AcOEt（酢酸エチル） : AcOH（酢酸） = 50 : 50 : 1) にて精製して、エステル（化合物6-12）を得た。
化合物10: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ = 0.77 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.83 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.70 (s, 3H), 2.22 (brs, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 4.13 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.47 (dd, J = 6.0, 5.0 Hz, 1H), 5.49 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.85 (brs, 1H), 5.88 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.20 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 15.6, 7.8 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H).
化合物11: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ = 0.77 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.83 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.70 (s, 3H), 2.25 (brs, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.13 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.51 (dd, J = 15.6, 7.4 Hz, 1H), 5.55 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 5.83 (brs, 1H), 5.85 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.37 (dd, J = 15.6, 8.3 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 15.6, 7.4 Hz, 1H).
化合物12: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ = 0.77 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.82 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.10 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.71 (s, 3H), 2.21 (brs, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 4.13 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz, 1H), 5.50 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.86 (brs, 1H), 5.88 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 15.6, 8.2 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 15.6, 7.8 Hz, 1H).
【００３１】
C18-ヒドロキシ体（化合物14）の合成
リベロマイシンＡ(4.2 mg, 6.4μmol) に1N LiOH (0.5 ml) を加えて室温で一昼夜攪拌した。この反応溶液に0 ℃で1N HClを加え酸性とした後、AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、MgSO4で乾燥し溶媒を留去して、C18-ヒドロキシ体（化合物14） (黄色油状物 : 3.7 mg, 82％) を得た。
化合物14: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 0.80 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 2.26 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 3.54 (m, 1H), 4.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.07 (brt, 1H), 5.53 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.61 (dd, 1H), 5.81 (dd, J = 15.9, 1.5 Hz, 1H) , 5.83 (s, 1H), 6.25 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 6.44 (dd, J = 15.6, 9.2 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 15.9, 7.9 Hz, 1H).
【００３２】
C5-シリルエーテル（化合物16）の合成
窒素雰囲気下、C18-ヒドロキシ体（化合物14） (33.1 mg, 59.0μmol) のbenzene : MeOH = 4 : 1 (500 μl) 混合溶液に、室温でTMSCHN2 (16.9 mg, 0.148 mmol) を加え、10分間攪拌した。溶媒を留去しジエステルを得た。ジエステルのDMF（ジメチルホルムアミド）(500μl) 溶液に、室温でイミダゾール(12.1 mg, 0.18 mmol) 、TBSCl (13.4 mg, 0.089 mmol) を加えて同温で一昼夜攪拌した。AcOEtで希釈し、有機層をH2O、飽和食塩水で順次洗浄後、MgSO4で乾燥し溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (n-hexane : AcOEt = 2 : 1) にて精製して、C5-シリルエーテル（化合物16） (黄色油状物 : 12.4 mg, 30％)を得た。
化合物16: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 0.76 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.84 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.69 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 3.43 (ddd, J = 9.6, 5.0, 5.0 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.07 (dd, J = 6.9, 6.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.6, 6.9 Hz, 1H), 5.51 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.81 (brs, 1H), 6.11 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.38 (dd, J = 15.6, 8.7 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ = 12.8, 14.0, 14.2, 14.3, 18.2, 17.6, 23.9, 23.9, 25.
9, 27.5, 27.6, 31.7, 32.2, 33.3, 35.1, 37.3, 43.8, 51.1, 51.4, 70.8, 74.8, 76.9, 82.5, 96.1, 119.5, 120.6, 127.2, 127.9, 133.9, 134.2, 136.0, 137.0, 151.6, 151.9, 167.2, 167.3.
【００３３】
C18-メトキシ体（化合物17）の合成
窒素雰囲気下、C5-シリルエーテル（化合物16） (12.4 mg, 17.7 μmol) のTHF (500μl) 溶液に、室温でNaH (1.1 mg, 26.6μmol) およびMeI (3.3μl, 53.0μmol) を加え同温で一昼夜攪拌した。溶媒を留去後AcOEtで希釈し2N-Na2CO3で抽出した。水層に0 ℃で2N-HClを加え酸性 (pH 3 〜 1) とした後AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、MgSO4で乾燥した。溶媒を留去して無色油状物を得た。この無色油状物のDMF (200μl) 溶液にTBAF (ca. 7.8 mg) を加えて、3日間攪拌した。反応溶液をAcOEtで希釈した後有機層を1N HCl 、飽和食塩水で順次洗浄した。MgSO4で乾燥し溶媒を留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexane : AcOEt = 20 : 1) にて精製して、C18-メトキシ体（化合物17） (黄色油状物 : 3.5 mg, 34％) を得た。
化合物17: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 0.81 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.79 (s, 3 H), 2.30 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.49 (m, 1H), 4.11 (dd, J = 7.3, 6.4 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.57 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.62 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.85 (dd, J = 15.6 Hz, 1.4, 1H), 5.90 (brs, 1H), 6.28 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 15.6, 9.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ = 13.9, 14.3, 14.7, 15.2, 18.0, 23.9, 24.0, 24.4, 26.
4, 28.8, 30.7, 32.6, 33.1, 34.8, 34.0, 37.1, 44.2, 58.9, 76.1, 76.9, 76.2, 80.8, 97.0, 120.5, 121.2, 127.9, 129.5, 135.3, 135.4, 137.8, 138.6, 152.9, 152.9, 170.1, 170.4.
【００３４】
【実施例２】
リベロマイシンA  C18-メチルチオメトキシ誘導体の合成
C18-MTM エーテル（化合物20および21）の合成
窒素雰囲気下、上記実施例１で得られたC18-ヒドロキシ体（化合物16） (14.9 mg, 20.0 μmol) のAc2O (300μl)-DMF (300μl) 溶液を室温で３日間攪拌した。0 °Cに冷却、脱気後2N-Na2CO3-AcOEtを加えた。有機層を飽和食塩水で洗浄後MgSO4で乾燥した。溶媒を留去後得られる粗C18-OMTM体（化合物19）  (無色油状物 : 15.7 mg) にTHF(3 ml)-MeOH(9 ml)-1NLiOH(1 ml) を加え、室温で２日間攪拌した。反応溶媒を減圧留去後、氷-EtOAcで希釈した。有機層を飽和食塩水で洗浄後MgSO4で乾燥した。 溶媒を留去後残渣(無色油状物 : 14.7 mg) をDMF(0.5 ml) に溶かしTBAF (26.1 mg, 100.0 μmol) を加え、室温で２日間攪拌した。反応混合物に氷-EtOAcを加え、有機層を順次1NHCl, H2O, 飽和食塩水で洗浄した。 MgSO4で乾燥し溶媒を留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexane : AcOEt : AcOH = 50 : 50 : 1) にて精製して、C18-MTM エーテル（化合物20） (無色油状物 : 6.2 mg, 50％)およびC18-MTM エーテル（化合物21） (無色油状物 : 2.2 mg, 16％) を得た。
化合物20: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 0.81 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.79 (s, 3 H), 2.30 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.49 (m, 1H), 4.11 (dd, J = 7.3, 6.4 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.57 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.62 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.85 (dd, J = 15.6 Hz, 1.4, 1H), 5.90 (brs, 1H), 6.28 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 15.6, 9.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ = 13.9, 14.3, 14.7, 15.2, 18.0, 23.9, 24.0, 24.4, 26.
4, 28.8, 30.7, 32.6, 33.1, 34.8, 34.0, 37.1, 44.2, 58.9, 76.1, 76.9, 76.2, 80.8, 97.0, 120.5, 121.2, 127.9, 129.5, 135.3, 135.4, 137.8, 138.6, 152.9, 152.9, 170.1, 170.4.
化合物21: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 0.81 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.79 (s, 3 H), 2.30 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.49 (m, 1H), 4.11 (dd, J = 7.3, 6.4 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.57 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.62 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.85 (dd, J = 15.6 Hz, 1.4, 1H), 5.90 (brs, 1H), 6.28 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 15.6, 9.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ = 13.9, 14.3, 14.7, 15.2, 18.0, 23.9, 24.0, 24.4, 26.
4, 28.8, 30.7, 32.6, 33.1, 34.8, 34.0, 37.1, 44.2, 58.9, 76.1, 76.9, 76.2, 80.8, 97.0, 120.5, 121.2, 127.9, 129.5, 135.3, 135.4, 137.8, 138.6, 152.9, 152.9, 170.1, 170.4.
【００３５】
本発明のリベロマイシンＡ誘導体の活性を以下の方法に従って測定した。
【試験例】
本発明のリベロマイシンＡ誘導体のin vitro蛋白質合成阻害活性およびIleRS阻害活性
各リベロマイシンＡ誘導体のIleRS阻害活性をMiyamoto, Y.等の文献（Miyamoto, Y., Machida, K., Mizunuma, M., Sato N, Miyahara, K.,Hirata, D., Usui, T., Takahashi, H., Osada, H., and Miyakawa, T. Identication of Saccharomyces cerevisiae Isoleucyl-tRNA synthetase as a target of the G1-specific inhibitor Reveromycin A.  (2002) J. Biol. Chem. in press.）に従って測定した。具体的には、以下のようにして測定した。
【００３６】
イソロイシル-tRNA合成酵素（isoleucyl-tRNA synthetase）の活性測定
(出芽酵母（S. cerevisiae）由来の粗酵素調整)
S.cerevisiae W303-1A(a) Δyrs1::HIS3 Δyrr1::TRP1 Δpdr1::hisG-URA3-hisG-Δpdr3::hisG-URA3-hisG 株を500 ml のYPD培地（1% イーストエキストラクト, 2% ポリペプトン, 2% グルコース）で一晩培養した。培養液を5000 g、10分遠心して細胞を回収し、100mM トリス塩酸バッファー (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 1 mM ジチオスレイトールを用いて洗浄した。同バッファーを用いて、細胞を(1 mg/ g湿細胞)になるように再懸濁し、氷上に10分放置した。細胞懸濁液に、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、グラスビーズ（425-600 mm, 直径, Sigma社）を入れて30秒間激しく撹拌することを10回繰り返した。得られた細胞破砕液を、4度で10000 g 、15分遠心して上清を得た。得られた上清の蛋白量をProtein Assay (BioRad 社)を用いて測定した後、10 mg/mlに調整してマイナス８０度で凍結保存した。
【００３７】
(出芽酵母のIleRS（isoleucyl-tRNA synthetase）の大腸菌発現および組換え大腸菌由来IleRS酵素調整)
出芽酵母のIleRS遺伝子の翻訳領域を含むDNA断片を、大腸菌発現用プラスミドpET21-b(Novagen  社)にBamHI/HindIIIサイトで組みこんだ。pET21-b IleRSを大腸菌株 BL21(DE3)に形質転換した。得られた形質転換体を10 ml のＬＢ培地（1 % NaCl, 0.5 % イーストエキストラクト, 1 % トリプトン, アンピシリン 50  μg/ml）中、２８度で２時間培養後、イソプロピル−チオ−β−ガラクトピラノシドを0.2 mM添加して、さらに４時間培養した。6000 g、15分の遠心で菌体を回収後、50 mM トリス塩酸バッファー (pH8.0), 1 mM EGTA, 25 % シュークロース, 0.5 mM フェニルメチルスルホニルフルオライド,0.5 mM ジチオスレイトールに懸濁した。菌体懸濁液を5 秒間ソニケーションすることを３回繰り返して、菌体を破砕した。菌体破砕液を、４度で15000 g、15分遠心して上清を得た。得られた上清を、IleRS画分として使用した。IleRS画分は、10 mg/ml、終濃度50 %グリセロールになるように調整して、マイナス２０度で保存した。
【００３８】
（イソロイシル-tRNA合成酵素反応の測定）
本酵素反応の測定は、基質にATP、ラジオアイソトープでラベルされたL-イソロイシン、ラジオアイソトープでラベルされていないL-イソロイシン、酵母tRNAを用いて、反応生成物であるイソロイシル-tRNAに含まれる放射活性を測定することで行った。
酵素反応溶液：
1サンプルあたり50 μlで反応を行った。
反応液の組成は、20 mM イミダゾール塩酸 (pH 7.5), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM  ジチオスレイトール, 4 mg/mlウシ血清アルブミン, 30 μM 冷L-イソロイシン、3 mM ATP、3.5 mg/mlイーストトータルtRNA(Roche Molecular Biochemicals社)、  1 μ CiラジオアイソトープL-イソロイシン*、酵母抽出液 100 mg protein /ml**になるように調整した。リベロマイシンＡ、ＢまたはリベロマイシンＡ誘導体を添加する場合は、1〜1,000 ng/ml*** となるように添加した。
*ラジオアイソトープは、Amersham Biosciences 社から、[3H]-L-イソロイシン (66 Ci/mmol)を購入して使用した。
**大腸菌発現IleRSを酵素源とした場合には、IleRS画分を10 mg/mlになるように添加して反応を行った。
***リベロマイシンＡ、Ｂまたは評価したいリベロマイシンＡ誘導体を添加した。リベロマイシンＡ誘導体の種類についてはリベロマイシンＡ誘導体の合成スキーム中に示した化合物番号として表１に示す。
【００３９】
酵素反応溶液を２５度で２０分間インキュベートした後、5 % トリクロロ酢酸を1 ml 添加して、反応を停止後、４度で一晩放置して反応したイソロイシル-tRNAを完全に沈殿させた。沈殿をグラスフィルターで濾過して、氷冷した5 % トリクロロ酢酸で３回洗浄した。洗浄したグラスフィルターを液体シンチレーションカウンター（TRICARB 2000, PACKARD社）で測定した。
リベロマイシンＡ、ＢまたはリベロマイシンＡ誘導体を添加しない場合（コントロール）の放射活性に対する、リベロマイシンまたはリベロマイシンＡ誘導体を添加した場合の放射活性阻害率５０％の時の酵素反応溶液中のリベロマイシンＡ、ＢまたはリベロマイシンＡ誘導体の濃度をＩＣ50とする。
結果を表２に示す。
【００４０】
in vitro蛋白質合成阻害活性の測定
TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System(Promega 社)のキットを用いて、ウサギ網状赤血球ライゼート中の蛋白合成能に対するリベロマイシンＡ誘導体の影響を検討した。
【００４１】
【表１】
0004251531.tif 000010
【００４２】
リベロマイシンＡ、ＢおよびリベロマイシンＡ誘導体を添加する場合は、リベロマイシンＡ、ＢまたはリベロマイシンＡ誘導体を1,000 ng/mlの濃度で反応液に添加し、氷上で２０分インキュベートした。（薬剤は、DMSOに溶解したものをDMSO終濃度1%になるように添加した。）
蛋白質合成反応は、反応液にラジオアイソトープラベルされた35Sアミノ酸（Met,Cys）、*Pro-mix（1,000 Ci/mmol）をサンプルあたり1 μl(約 1 μCi)添加して反応を開始し、３０度で９０分間反応を続けた。
【００４３】
２×サンプルバッファー（0.25 mM トリス-塩酸, pH 6.8, 10% 2-メルカプトエタノール, 4% SDS, 10% シュークロース, 0.004% ブロモフェノールブルー）を反応液に25 μl加えて、１００度で３分間加熱して反応を停止した。それぞれのサンプルは、10% アクリルアミドゲルでSDSPAGEを行い、オートラジオグラフィーを行った。
【００４４】
In vitro蛋白質合成により生じたラジオアイソトープラベルされたアミノ酸を含む蛋白質バンドを検出した。リベロマイシンＡ、ＢまたはリベロマイシンＡ誘導体を添加しない場合（コントロール）に検出されるIn vitro蛋白質合成により生じる蛋白質バンドが薬剤処理により完全に消失した場合に、活性有り（＋）とみなした。
結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
0004251531.tif 000011
【００４６】
リベロマイシンＡ（化合物1）より誘導したC５-シリルエーテル（化合物5）、トリエステル（化合物6）、ジエステル（化合物7-9），飽和体（化合物13）, C18-OMTM-C24-エステル（化合物21）および5,6-スピロアセタール（化合物15および18）には全く活性は見られなかった。モノエステル（化合物10-12）はIleRS阻害活性を示したがC24-エステル（化合物11）の活性は非常に弱い。リベロマイシンＡ（化合物1）の１８位ヘミサクシニル基を化学修飾したC18-サクシネート（化合物12）、C18-ヒドロキシ体（化合物14）、C18-メトキシ体（化合物17）およびC18-MTMエーテル（化合物20）は活性を示した。
特にC18-メトキシ体（化合物17）はより安定な化合物であり、活性も強いことから注目すべきである。以上のことより、２４位カルボキシル基および５位の水酸基はリベロマイシンＡおよびその誘導体の活性発現に必須であり、また１８-ヘミサクシニル基は活性発現に必須でないことが判明した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質合成阻害活性を有し、かつ高い安定性を有するリベロマイシンＡ誘導体、その製造方法およびそれを有効成分とする蛋白質合成阻害剤が提供される。