(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ｔ−ロイシンとＤ−ｔ−ロイシンアミドを含む水溶液からＬ−ｔ−ロイシンを回収するにあたり、Ｌ−ｔ−ロイシンとＤ−ｔ−ロイシンアミドを含む水溶液に、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ｔ−ブタノール、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフランの中から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒を添加し、Ｌ−ｔ−ロイシンを優先的に析出させ、これを回収することを特徴とするＬ−ｔ−ロイシンの回収方法。
【請求項２】
請求項１記載の回収方法によりＬ−ｔ−ロイシンを回収後、分離母液中からＤ−ｔ−ロイシンアミドを回収することを特徴とするＤ−ｔ−ロイシンアミドの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液から光学活性アミノ酸および光学活性アミノ酸アミドをそれぞれ分離回収する方法に関する。光学活性アミノ酸は医薬品等の出発原料として広く利用されている。例えば、Ｌ−ｔ−ロイシンは医薬原料として有用な非天然型アミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性なアミノ酸の製造に関する報告は化学的合成法、生物学的合成法ともに数多く見られる。
例えば、生物学的合成法として、立体特異的なアミド加水分解能を有する菌体もしくは酵素を用いたアミノ酸アミドの光学分割法が知られている。この方法は原料となるアミノ酸アミドの製造が容易であり、天然型及び非天然型のいずれのアミノ酸の製造にも応用が可能であること、また、選択性の高い菌体または酵素の取得により光学的に純粋なアミノ酸が容易に製造可能であることなどの理由により、光学活性アミノ酸の汎用的な製造法として有用である。
【０００３】
しかし、上記の立体特異的なアミノ酸アミド加水分解菌または酵素を用いるアミノ酸アミドの光学分割法においては、反応終了液中に目的とするアミノ酸のほかに理論上当量のアミノ酸アミドが混在するため、反応後、アミノ酸とアミノ酸アミドを分離する必要がある。
分離方法としては、反応後にイオン交換樹脂を用いて吸着分離を行う方法（特開平１−２２６４８２号公報参照）、減圧下で水を除去した後、熱有機溶媒にて残渣を洗浄しアミドを選択的に洗浄除去する方法（特開昭６１−２９３３９４号公報参照）、反応濃縮液にエタノールを加えアミノ酸を優先的に晶析させる方法（特開昭６３−８７９９８、特開昭６１−２７４６９０号、特開昭６０−１８４３９２号、特開昭５９−１５９７８９号各公報参照）、あるいは、アミノ酸アミドを溶媒抽出により除去した後、アミノ酸を等電点にて回収する方法（特開昭５８−２０９９８９、特開昭５７−１３０００号各公報参照）、などが知られている。また、光学活性アラニンの製造法では基質であるＤ，Ｌ−アラニンアミドを陽イオン交換樹脂に吸着させた後、該イオン交換樹脂に水と酵素を接触させて立体特異的に加水分解反応を行い、反応と分離を同時に行う方法（特開平８−２３９９６号公報参照）も報告されている。
【０００４】
しかし、イオン交換樹脂を用いて吸着分離を行う方法では、吸着・脱離、回収と多くの行程が必要とされ、設備投資の増加、回収効率の低下、あるいは不純物混入機会の増加の可能性などの問題があり工業的に好ましくない。水を除去した後、熱有機溶媒にて残渣を洗浄し、アミドを選択的に洗浄除去する方法は、工業的規模の製造では水を完全に除去し濃縮乾固することは技術的に困難であり、実用的ではない。また、アミノ酸アミドを溶媒抽出により除去した後、アミノ酸を等電点にて回収する方法においては、一般に除去するアミノ酸アミドの水への溶解度が高いために、抽出に多量の溶媒を要し、装置、コスト面で不利となっている。
【０００５】
一方、反応濃縮液にエタノールを加えアミノ酸を優先的に晶析させる方法は、他の方法に比べ、濃縮−晶析を同一槽内で行えるなどの点から、操作が簡便であり、装置上の設備投資も少ないという特徴がある。しかし、公知の方法では濃縮溶液の容積に対し数倍以上の量のエタノールを添加する必要があり、コスト増加の一因となっている。
以上の理由から、上記公知の手法による光学活性アミノ酸の回収方法は、いずれも工業的に有利な方法とはなり難く、より効率のよい回収法が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は上記種々の問題点を解決し、光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液から光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを効率よく分離回収する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題の解決のために、鋭意検討を重ねた結果、光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液にｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ｔ−ブタノール、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフランの中から選ばれた少なくとも１種の有機溶媒を添加することにより光学活性アミノ酸を優先的に晶析させ、効率よく光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを分離し、従来のエタノールを使用する方法に比べて高収率で光学活性アミノ酸を回収し得ることを見いだし本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は、（１）光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液から光学活性アミノ酸を回収するにあたり、光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液に、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ｔ−ブタノール、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフランの中から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒を添加し、光学活性アミノ酸を優先的に析出させ、これを回収することを特徴とする光学活性アミノ酸の回収方法、（２）光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液中の光学活性アミノ酸の濃度が５〜４０重量％である上記（１）の光学活性アミノ酸の回収方法、（３）添加する有機溶媒の量が光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液の量の０．１〜５倍重量である上記（１）または（２）の光学活性アミノ酸の回収方法、（４）上記（１）〜（３）いずれかの回収方法により光学活性アミノ酸を回収後、分離母液中から光学活性アミノ酸アミドを回収することを特徴とする光学活性アミノ酸アミドの回収方法、（５）光学活性アミノ酸がＬ−ｔ−ロイシンであり、光学活性アミノ酸アミドがＤ−ｔ−ロイシンアミドである上記（１）〜（３）いずれかの光学活性アミノ酸の回収方法、（６）光学活性アミノ酸がＬ−ｔ−ロイシンであり、光学活性アミノ酸アミドがＤ−ｔ−ロイシンアミドである上記（４）の光学活性アミノ酸アミドの回収方法、である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の一般的実施態様について説明する。
【００１０】
本発明の光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液は、例えば、アミノ酸アミドの生物学的光学分割反応により得られる。反応に使用されるアミノ酸アミドの種類については特に制限はないが、前述した有機溶媒によって、対応するアミノ酸と分離可能なものであれば天然型及び非天然型のいずれのアミノ酸に対応するアミノ酸アミドでもよく、例えば、フェニルアラニンアミド、フェニルグリシンアミド、α−アミノ酪酸アミド、ｔ−ロイシンアミド、イソロイシンアミド、ロイシンアミド、アラニンアミド、メチオニンアミド、バリンアミド、トリプトファンファンアミド、セリンアミド、スレオニンアミド、システインアミド、アスパラギン酸アミド、グルタミン酸アミド、アルギニンアミドおよびチロシンアミドなどを挙げることができる。
【００１１】
アミノ酸アミドの生物学的光学分割反応は、水性媒体中でラセミ体あるいは光学的に純粋でないアミノ酸アミドに立体特異的に作用し光学活性アミノ酸と対応する光学特性を有するアミノ酸アミドを与える微生物の作用により行うことができる。該微生物としては特に制限はなく、例えば、エンテロバクタ−・クロアッセイ  Ｎ−７９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８７３）を挙げることができる。これら微生物は菌体または菌体処理物（乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗または精製酵素、およびこれらの固定化物）として使用される。
【００１２】
該光学分割反応は、水性媒体中においてアミノ酸アミドを上記菌体または菌体処理物と接触させることによって行われる。通常、アミノ酸アミド濃度は１重量％から飽和濃度、好ましくは５〜４０重量％、菌体または菌体処理物の濃度は、その活性量により異なるがアミノ酸アミド重量に対し１／１００００〜１／１０重量、好ましくは１／１０００〜１／５０重量、反応液のｐＨは４〜１１、好ましくは６〜１０、および反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃である。反応はラセミ体アミノ酸アミドの４０〜６０％がアミノ酸に変換されるまで行えばよい。
【００１３】
反応終了後、反応液からの菌体または菌体処理物の除去は、遠心分離、ろ過などの公知の方法を用いて行うことができる。菌体または菌体処理物を除去した反応液はアミノ酸の濃度が５〜４０重量％となるように必要に応じて濃縮操作を行った後に、濃縮液または反応液の温度を１０〜８０℃、好ましくは２０〜６０℃に調節しながら、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ｔ−ブタノール、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリル、１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフランをそれぞれ単独使用、あるいは２種以上併用して、濃縮液または反応液に対し０．１〜５倍重量添加すればよい。
なお、濃縮液または反応液中のアミノ酸アミドのアミノ酸に対する量比に関しては特に制限は無い。
【００１４】
回収操作は連続および回分のいずれの方法によっても行うことができる。
かくして結晶として析出した光学活性アミノ酸は遠心分離またはろ過などの公知の方法により回収され、その結果、光学活性アミノ酸は溶液中に溶解している光学活性アミノ酸アミドと分離することができる。さらに、分離母液中の光学活性アミノ酸アミドは、必要により、溶媒を除去して固体状で回収することができる。
【００１５】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００１６】
参考例１
光学活性アミノ酸（Ｌ体）と光学活性アミノ酸アミド（Ｄ体）を含む水溶液の調製：
（１）特開昭６２−５５０９７号公報記載の方法に従い、エンテロバクター・クロアッセイ  Ｎ−７９０１株の培養を行った。培養液５００ｍＬを遠心分離後、菌体をｐＨ７リン酸緩衝液１００ｍＬに懸濁させ、菌体懸濁液を調製した。
【００１７】
（２）Ｄ，Ｌ−ｔ−ロイシンアミド２０ｇを水８０ｇに溶かした後、５Ｎ硫酸でｐＨを９．５に調製した。このＤ，Ｌ−ｔ−ロイシンアミド水溶液に対し乾燥菌体重量が０．２５ｇになるように上記（１）の菌体懸濁液を加え、４０℃で５２時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を除去し、反応終了液をＨＰＬＣにより分析した。その結果、ｔ−ロイシンおよびｔ−ロイシノアミドの各々の濃度は１０重量％であり、生成したｔ−ロイシンは光学的にほぼ純粋（Ｌ体）であった。なお、ｔ−ロイシンおよびｔ−ロイシンアミドの濃度は下記ＨＰＬＣ分析条件１にて、ｔ−ロイシンの光学純度は下記分析条件２にてそれぞれ測定した。
【００１８】
ＨＰＬＣ分析条件１：
カラム：  イナートシル  ＯＤＳ−３Ｖ（４．６ｘ２５０ｍｍ）
移動層：  ０．１％リン酸水溶液（容積比）
流速  ：  １ｍＬ／分
検出  ：  ＲＩ
【００１９】
ＨＰＬＣ条件２：
カラム：  ＳＵＭＩＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｘ２５０ｍｍ）
移動層：  水／メタノール＝８５／１５（２ｍＭ硫酸銅含有））
流速  ：  １ｍＬ／分
検出  ：  ＵＶ  ２５４ｎｍ
【００２０】
実施例１
参考例１で得られた光学活性ｔ−ロイシンと光学活性ｔ−ロイシンアミドを含む水溶液１００ｇを６０ｇまで減圧濃縮した。温度を５０℃に保ちながら濃縮液に表１に示す溶媒各々３０ｇを加え、溶液を１０℃まで冷却した後、１４時間撹拌し、撹拌後析出した光学活性ｔ−ロイシン結晶を減圧濾過により回収した。この時の回収収率および光学活性ｔ−ロイシン結晶中に不純物として含まれるｔ−ロイシンアミドの量を表１に示す。不純物であるｔ−ロイシンアミドの量は上記ＨＰＬＣ分析条件１により求めた。
なお、添加溶媒のエタノールは比較例である。
【００２１】
【表１】
0004361641.tif 000002
実施例２
参考例１で得られた光学活性ｔ−ロイシンと光学活性ｔ−ロイシノアミドを含む水溶液４００ｇを、１４０ｇまで減圧濃縮した。温度を４０℃に保ちながら、得られた濃縮液に表２で示した有機溶媒を濃縮液と同重量、１４０ｇを加え、実施例１と同様に晶析を行い、遠心分離により光学活性ｔ−ロイシン結晶を回収した。結果を表２に示す。メタノール以外の溶媒ではエタノールと比べ回収収率の向上が認められた。不純物であるｔ−ロイシンアミドの量はＨＰＬＣ分析条件１により求めた。
なお、添加溶媒のメタノールおよびエタノールは比較例である。
【００２２】
【表２】
0004361641.tif 000003
【００２３】
実施例３
ｔ−ロイシンアミド２％を含む光学活性Ｌ−ｔ−ロイシン１５０ｇを水８５０ｇに加え、７０℃で加温し溶解させた。この水溶液を６００ｇまで濃縮し、得られた濃縮液にイソプロピルアルコール５００ｇを加え、以後、実施例２と同様の操作を行い、乾燥重量にして１２０ｇのＬ−ｔ−ロイシン結晶を回収した（回収収率８０％）。得られたＬ−ｔ−ロイシンにはｔ−ロイシノアミドは含まれていなかった。
【００２４】
【発明の効果】
光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液から、特定の有機溶媒を使用することにより、光学活性アミノ酸を優先的に晶析させ、効率よく光学活性アミノ酸と光学活性アミノ酸アミドを分離し、従来のエタノールを使用する方法に比べて高収率で光学活性アミノ酸を回収し、さらに、光学活性アミノ酸回収後の分離母液から対応する光学活性アミノ酸アミドを回収することができる。