(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が９４，０００±５０００であり、ヨード酢酸及びｐ−クロロメルクリ安息香酸により阻害され、最適ｐＨが８．０±１．０、最適温度が３０℃であり、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属糸状菌由来であることを特徴とするグリシンアミノペプチダーゼ。
【請求項２】
アクチノムコール  エレガンス培養液より抽出され、請求項１のグリシンアミノペプチダーゼを含むことを特徴とする蛋白質加水分解酵素製剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のグリシンアミノペプチダーゼまたは蛋白質加水分解酵素製剤を加水分解反応に使用することを特徴とする蛋白質及びペプチドの加水分解方法。
【請求項４】
アスペルギルス  オリゼに由来し、かつ、分子量がそれぞれ約２３ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約５３ｋＤａ、及び約１００ｋＤａの中から選ばれる少なくとも５種のプロテアーゼ及びペプチダーゼを含む酵素製剤を加水分解反応に併用して使用することを特徴とする請求項３に記載の加水分解方法。
【請求項５】
５種のプロテアーゼ及びペプチダーゼの分子量が約２３ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約５３ｋＤａである請求項４に記載の加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規グリシンアミノペプチダーゼ、該グリシンアミノペプチダーゼを含む蛋白質加水分解酵素製剤、該グリシンアミノペプチダーゼを利用した蛋白質及びペプチドの加水分解方法に関する。蛋白質及びペプチドの加水分解物は、調味料及び調味料原料として利用される。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質の加水分解は、従来、高濃度の塩酸存在下に加熱することにより行われており、この方法により多くの蛋白質から調味料及び調味料原料及び食品素材が製造されている。しかし、これらの食品を取り扱う業界では、消費者の天然物指向の拡大に伴い、化学薬品である塩酸を使用しない方法が望まれるようになりつつある。塩酸加水分解法に代わる方法として、蛋白分解酵素を用いる加水分解方法が考えられるが、酵素のコストが塩酸に比べて高価であること、また、塩酸を用いて加水分解した場合と同程度に加水分解率を高めることは困難であったことから、実用化された例は少ない。
【０００３】
既存のプロテアーゼ製剤の例としては、アスペルギルス  オリゼ由来のロイシンアミノペプチダーゼなどが挙げられる。アスペルギルス  オリゼやその酵素製剤は、複数のプロテアーゼを含み、広く食品の蛋白加水分解に用いられている。しかし、蛋白加水分解物中にあるアミノ酸の遊離率を調べたところ、グリシンの遊離率がロイシンやアラニンと比べて低いことが判明した。蛋白加水分解物に頻用されるコラーゲンや小麦蛋白質は、グリシンを最も多く含むので、グリシンの遊離率が低いと加水分解度を十分挙げることができない。グリシンを含むペプチド結合は、グリシン以外のアミノ酸からなる通常のペプチド結合と比べると、回転の自由度が高いため、立体構造がより複雑になる傾向にある。したがって、通常の蛋白質加水分解酵素による加水分解を受けにくい。一方、グリシン特異的ペプチダーゼはペプチド中のグリシン残基部分を特定的に加水分解する酵素であるので、効率よくグリシン残基を遊離できる。したがって、グリシンアミノペプチダーゼを併用すれば、既存のプロテアーゼ製剤の欠点を補い、加水分解度を上げられると思われる。
しかし、グリシンに特異的なアミノペプチダーゼは、食品加工用途に使用可能な安全性が高い微生物からは報告されておらず、食経験がある微生物から得られるグリシンアミノペプチダーゼが望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、食経験がある微生物由来のグリシンアミノペプチダーゼを見出し、該酵素を用いた蛋白質の加水分解を行うことにより、遊離アミノ酸量が高く、かつ、呈味の高い調味料の製法を確立することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、アクチノムコール  エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ  ６４０８がグリシンアミノペプチダーゼを生産することを見出し、また、該グリシンアミノペプチダーゼを用いた蛋白質の加水分解において高い加水分解率が達成できることを見出し、さらに、該グリシンアミノペプチダーゼを単離し、その性質を調べることにより、本発明を完成するに到った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が９４，０００±５０００であり、ヨード酢酸及びｐ−クロロメルクリ安息香酸により阻害されることを特徴とするグリシンアミノペプチダーゼであり、また、アクチノムコール  エレガンス培養液より抽出され、前記グリシンアミノペプチダーゼを含むことを特徴とする蛋白質加水分解酵素製剤であり、さらに、前記グリシンアミノペプチダーゼまたは蛋白質加水分解酵素製剤を加水分解反応に使用することを特徴とする蛋白質及びペプチドの加水分解方法である。
【０００７】
本発明のグリシンアミノペプチダーゼは、以下の特徴を有する。
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が９４，０００±５０００である。
（２）ヨード酢酸及びｐ−クロロメルクリ安息香酸により阻害される。
（３）反応の最適ｐＨが８．０±１．０であり、ｐＨ６ないし１０における活性が最適ｐＨにおける活性の４０％以上である。
（４）２０℃における活性が最適温度における活性の９０％以上である。
これらの特徴は、後述の実施例に記載の方法により測定する。
【０００８】
本発明におけるグリシンアミノペプチダーゼの例としては、アクチノムコールエレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ  ６４０８が生産するアミノペプチダーゼが挙げられる。なお、アクチノムコール  エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ  ６４０８は財団法人発酵研究所が保有する微生物であり、同所に依頼することにより誰でもこの菌株の分譲を受けることができる。
【０００９】
本発明のグリシンアミノペプチダーゼは、このようなグリシンアミノペプチダーゼを生産する能力のある微生物を培地に播種し、一定時間培養を行った後、培養液より該酵素を抽出することにより製造することができる。該グリシンアミノペプチダーゼを生産する能力のある微生物をグルコース、綿実蛋白質、酵母エキス等を含む培地に接種し、２５〜３０℃で３〜７日好気培養することにより、該ペプチダーゼが生産される。該ペプチダーゼは培養上清中にも多少蓄積するため、これを濃縮してもよいが、多量の酵素を取得する場合には、菌体を遠心分離などにより集め、ホモジナイザー、超音波処理、浸透圧ショック処理や界面活性剤処理を行い、菌体内に存在する該ペプチダーゼを抽出することが望ましい。該抽出液より公知の常法、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等による分画等を用いることにより、本発明の酵素を精製することができる。
【００１０】
本発明のグリシンアミノペプチダーゼを用いて蛋白質及びペプチドを加水分解する際、必ずしも酵素を精製することは必要ではない。加水分解反応もしくは加水分解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ、食品衛生上の問題がなければ、該酵素の粗精製品または培養液からの抽出物をそのまま反応に利用することも可能である。アクチノムコール属は中国で腐乳を製造する際に使われる糸状菌であり、食経験が豊富で安全性も確立している。なお、アクチノムコール  エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ  ６４０８の培養液より調製した粗酵素には、グリシンアミノペプチダーゼの他にプロリルイミノペプチダーゼ（ＰＩＰ）、グリシルジペプチダーゼ、ロイシルジペプチダーゼ、酸性プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）などが含まれており、加水分解すべき蛋白質やペプチドの種類によっては、該粗酵素または該微生物をそのまま加水分解に用いた方が高い加水分解率が得られることもある。
【００１１】
本発明のグリシンアミノペプチダーゼを用いた蛋白質及びペプチドを加水分解する方法は、公知のペプチダーゼを用いる反応と何ら変わりはない。蛋白質を高度に加水分解する場合には、原料蛋白質を複数のプロテアーゼ及びペプチダーゼで処理することが必要であるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を同時にまたは連続して使用するよりも、複数のプロテアーゼ及び公知のペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤を用いる方が有利である。複数のプロテアーゼ及び公知のペプチダーゼを同時に含むプロテーゼ製剤の例としては、ノボ・ノルディスク社（Ｎｏｖｏ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓ、デンマーク）のフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）が挙げられる。該プロテアーゼ製剤にはアスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来で、その中には、約２３ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約５３ｋＤａの少なくとも５種のプロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれており、さらに、それ以外にも約３２ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約１００ｋＤａのプロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれていることもある。このような酵素製剤と本発明のグリシンアミノペプチダーゼとを、同時にまたは別々に蛋白質に作用させることにより、蛋白質の高度加水分解が達成される。
本発明のグリシンアミノペプチダーゼによる加水分解は、反応液のｐＨが５〜１１、好ましくは６〜９の範囲で、反応温度は１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で行うことが必要である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
この実施例で得られた酵素の性質は、下記のようにして求めた。
（１）蛋白質量の測定
精製酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして２８０ｎｍの吸光度を島津分光光度計ＵＶ−１６０Ａを用いて測定した。蛋白質量は、２８０ｎｍにおける吸光度１の蛋白質溶液１ｍｌ中に含まれる蛋白質を１単位とする吸光度単位で示した。
【００１３】
（２）グリシンパラニトロアニリドを使用したグリシンアミノペプチダーゼ活性測定
グリシンパラニトロアニリドを１ｍｇ／ｍｌになるように調製した。１，４−ジオキサン；Ｗａｋｏ  ４０％溶液にグリシンパラニトロアニリドを溶解し、さらに、グリシンパラニトロアニリド−４０％ジオキサン溶液の１．５倍容の５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）を加えて基質溶液とした。酵素液は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）で適宜希釈し、その５００μｌに基質溶液１００μｌを加えて３７℃で５〜１５分間反応させた。反応液に１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）３００μｌを加えて反応を停止させ、適宜遠心分離で不溶物を除去し、遊離パラニトロアニリンに由来する４１０ｎｍの吸光度を測定した。酵素１単位はグリシンパラニトロアニリドを基質とした場合に３７℃、１分間の反応で１μモルのパラニトロアニリンを遊離させる酵素量と定義した。なお、パラニトロアニリンの分子吸光係数は９４８０Ｍ−１・ｃｍ−１とした。
【００１４】
（３）グリシンβナフチルアミドを使用したグリシンアミノペプチダーゼ活性測定
活性測定はＹｏｓｈｉｍｏｔｏ、Ｄ．、ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４８５，３９１−４０１に示した方法を改良して行った。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，（ｐＨ７．０）８００μｌに、グリシンβナフチルアミド  ３ｍＭ（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．０）１００μｌを加え、３７℃で予備加熱した後、酵素液１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応を行った。５００μｌのＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣを１ｍｇ／ｍｌと、トライトンＸ−１００を１０％含んだ１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５００μｌを加えて反応を停止させた。発色したアゾ色素に由来する５５０ｎｍの吸光度を測定した。酵素１単位はグリシンβナフチルアミドを基質とした場合に３７℃、１分間の反応で１μモルの基質を分解する酵素量を１単位と定義した。グリシンパラニトロアニリドとグリシンβナフチルアミドを同じ酵素液でそれぞれ実測し、グリシンパラニトロアニリドは０．１１５μｍｏｌ／分、グリシンβナフチルアミドは０．３３６μｍｏｌ／分で、約３倍の値となった。
【００１５】
（４）阻害剤の影響
阻害剤の酵素に及ぼす効果を以下のように調べた。酵素液に各種阻害剤を一定量添加して５００μｌとし、室温で２０分間放置した後、上述の基質溶液１００μｌを添加して３７℃で５分間反応させた。
【００１６】
（５）最適温度
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の緩衝液中、各種温度で１０分間酵素反応を行い、グリシンβナフチルアミドを加水分解する活性を比較した。
【００１７】
（６）分子量の測定
酵素の分子量はファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。ポリアクリルアミドの濃度は１２．５％である。
分子量マーカーとしてファルマシア社製ホスホリラーゼｂ（分子量９４，０００）、アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）、カルボニック・アンヒドラーゼＢ（分子量３０，０００）、トリプシンインヒビター（分子量２０，１００）、α−ラクトアルブミン（分子量１４，４００）を用い、これらの泳動位置から求めた校正曲線より分子量を求めた。
【００１８】
（７）最適ｐＨ
４０ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液中、各ｐＨにおいてグリシンβナフチルアミド  ３ｍＭ（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．０）１００μｌを加え、３７℃で予備加熱した後、酵素液１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応を行った。５００μｌのＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣを１ｍｇ／ｍｌとトライトンＸ−１００を１０％含んだ１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加えて反応を停止させた。発色したアゾ色素に由来する５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
（８）蛋白質の加水分解度
蛋白質の加水分解度はＯＰＡ法で遊離のアミノ基を修飾して測定した。四ほう酸ナトリウム・１０水和物  ９．５２５ｇとドデシル硫酸ナトリウム２５０ｍｇとを２００ｍｌの脱イオン水に溶解させた。完全に溶解した後、ｏ−フタル酸アルデヒド（９７％純度）２００ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解させ、脱イオン水でリンスしながら全量加えた。さらに、ジチオスレイトール（９９％純度）２２０ｍｇを脱イオン水でリンスしながら全量加えた。脱イオン水で２５０ｍｌにメスアップし、ＯＰＡ試薬を調製した。セリン標準液はＬ−セリン５０ｍｇを２５０ｍｌにメスアップして調製した。蛋白質加水分解物を精秤し、２５ｍｌの脱イオン水に溶解した。
ブランクとして脱イオン水２００μｌ入りの試験管６本、標準としてセリン標準液２００μｌ入りの試験管６本を用意した。サンプル溶液は１検体につき２本づつ２００μｌ入りの試験管を用意した。測定は標準液３本→ブランク６本→サンプル溶液→標準液３本の順に行った。ＯＰＡ試薬３ｍｌを上記試験管に注ぎ、ミキサーで撹拌した後、正確に２分間静置した。反応液の吸光度を３４０ｎｍで定量した。標準液のＯＤは約０．８、ブランクのＯＤは約０．０７である。
【００２０】
（９）アミノ酸遊離率
蛋白質酵素加水分解物を１００００ｇで５分間遠心分離して不溶物を除いた。得られた上清部分をディスミック１３ｃｐ（東洋濾紙会社製）でろ過し、島津製作所製アミノ酸分析計ＡＬＣ−１０００で遊離アミノ酸を定量した。得られた遊離アミノ酸ｍｇを基質蛋白質中のアミノ酸量ｍｇで割って遊離率を％で示した。
【００２１】
【実施例１】
アクチノムコール  エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ  ６４０８を綿実蛋白質２．０％、大豆蛋白質０．５％、グルコース０．５％、塩化ナトリウム０．３％、りん酸二カリウム０．１％、炭酸カルシウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５０％よりなる培地２．５リットルを入れた５リットル容ジャーファーメンターに接種し、２５℃で９６時間通気・撹拌培養した。培養液より集菌し、３１０ｇの湿菌体を得た。これにグリセリンを終濃度１０％になるように添加し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた。これをＮＩＨＯＮＳＥＩＫＩ  ＫＡＩＳＨＡ製Ａｃｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒで１００００ｒｐｍ、５分間撹拌し、１２０００ｇで１０分間遠心分離して上清６２５ｍｌを回収した液を粗酵素液とした。
粗酵素液の各種合成基質に対する加水分解活性を測定し、その結果を表１に示した。表１のように、本粗酵素抽出液中にはグリシンアミノペプチダーゼ（ＧＡＰ）活性の他に、プロリルイミノペプチダーゼ（ＰＩＰ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）の各活性が認められた。
【００２２】
【表１】
0004368003.tif 000002
【００２３】
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを充填したカラムを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。１０％グリセリンを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め透析した粗酵素を上記カラムにアプライし、０から１Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配で酵素を溶出させた。各画分につき２８０ｎｍの吸光度と、グリシンβナフチルアミドを加水分解する活性について測定した結果を図１に示した。
ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィで得られた活性画分（フラクション６４ないし６８）を混合し、これを５０％硫安を含んだ２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ６５Ｃにアプライして、５０％→０％の硫安濃度勾配により酵素を溶出させた（図２）。
【００２４】
疎水性クロマトグラフィで得られた活性画分（フラクション７０ないし７１）を集め、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んだ５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０を充填したカラムにアプライし、２４分後に溶出した活性画分を回収した（図３）。
本酵素精製プロフィールを表２に示した。
【００２５】
【表２】
0004368003.tif 000003
【００２６】
【実施例２】
実施例１で調製した精製酵素を１０〜１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果、分子量は９４，０００±５０００と推定された。図４に蛋白質の移動度から推定した分子量を示す。
本グリシンアミノペプチダーゼに対する各種阻害剤の影響を調べた結果を表３に示す。本発明のグリシンアミノペプチダーゼは、キレート剤であるｏ−フェナントロリン（ＯＰＴ）やＥＤＴＡ、セリン酵素の阻害剤であるジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）には阻害されず、チオール酵素の阻害剤であるパラクロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）やヨード酢酸により阻害されたことから、チオール残基を活性中心に持つ酵素であると考えられた。
【００２７】
【表３】
0004368003.tif 000004
【００２８】
実施例１で得られた精製酵素は、反応の最適ｐＨが８．０±１．０であり、ｐＨ６ないし１０における活性が最適ｐＨにおける活性の４０％以上である。精製酵素のｐＨプロファイルを図５に示す。
該酵素は２０℃における活性が最適温度３０℃における活性の９０％以上であり、低温でも十分機能することが示された（図６）。
一方、温度安定性試験において、２０℃ないし３０℃では最適温度３０℃での活性を１００％維持できたが、４２℃で残存活性が５０％になった（図７）。したがって、該酵素は特に３０℃以下の低温で有効な酵素である。
【００２９】
精製酵素の各種合成基質に対する加水分解活性を測定した。該グリシンアミノペプチダーゼは主にグリシンアミノペプチダーゼ活性を有するが、アラニンβナフチルアミド、メチオニンβナフチルアミド、アルギニンβナフチルアミド、ロイシンβナフチルアミド、セリンβナフチルアミドを基質とした場合にも加水分解活性を有した。一方、該精製酵素は、トリプトファンβナフチルアミド、ピログルタミルβナフチルアミド、アスパラギン酸βナフチルアミド、リジンβナフチルアミド、バリンβナフチルアミド、プロリンβナフチルアミドに対する特異性がないことがことが判明した。精製酵素の基質特異性を表４に示す。
【００３０】
【表４】
0004368003.tif 000005
【００３１】
【実施例３】
蛋白質を高度に加水分解する方法として、ノポ・ノルディスク社製のアルカラーゼとフレーバーザイムを併用する系が既に知られている。そこで、アルカラーゼとフレーバーザイムを併用する系を標準とし、さらに、アクチノムコール  エレガンスから得られた該粗酵素を該標準反応系に加えた場合に、加水分解度がどのように変化するかを調べた。実施例１で得られた該粗酵素をグリセリン１０％存在下で透析し、濃縮した結果、０．９１２Ｕ／ｍｌのグリシンアミノペプチダーゼ活性がある粗酵素液を得た。
【００３２】
ゼラチンの２％溶液にそれぞれノボ・ノルディスク社製のアルカラーゼ２．４リットルを酵素基質比で０．５％とノボ・ノルディスク社製のフレーバーザイム１０００リットルを酵素基質比で２．０％加え、さらに、上記粗酵素液をグリシンアミノペプチダーゼ活性として０、０．２５Ｕ／ｍｌ、０．５Ｕ／ｍｌ添加して、５０℃で１８時間反応させた。反応後８０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた。それぞれの加水分解物につき、ｏ−フタル酸アルデヒド法で遊離のアミノ基を定量し加水分解率を計算した。その結果、該粗酵素を加えずにフレーバーザイムとアルカラーゼのみで加水分解を行った時と比べて、アクチノムコール  エレガンスから得られた粗酵素をさらに加えた時には、約１３％高い加水分解率を示し、グリシンアミノペプチダーゼが加水分解反応に及ぼす効果が確認された。それぞれの条件で得られた加水分解度を表５に示す。
【００３３】
【表５】
0004368003.tif 000006
【００３４】
該蛋白質酵素加水分解物のアミノ酸遊離率を定量した。基質蛋白質中のアミノ酸を１００％とし、得られた遊離アミノ酸の割合を表６に示す。ゼラチン蛋白質中で最も存在比が多いグリシンの遊離率を上げることができた。２番目に存在比が多いプロリンの遊離率は、対照の約３倍に上げることができた。
【００３５】
【表６】
0004368003.tif 000007
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、グリシンに特異性が高く、低温でも十分作用するグリシンアミノペプチダーゼが食経験豊富で安全性が確立されている微生物より新たに見出され、該酵素を用いることにより、グリシン含量が多い蛋白質も高度に加水分解できるようになった。該蛋白質酵素加水分解物は呈味上有用なアミノ酸の遊離率が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌクロマトグラフィによるグリシンアミノペプチダーゼの分画パターンである。
【図２】Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ６５Ｃクロマトグラフィによるグリシンアミノペプチダーゼの分画パターンである。
【図３】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０分子ふるいクロマトグラフィによるグリシンアミノペプチダーゼの分画パターンである。
【図４】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めたグリシンアミノペプチダーゼの分子量を示す。
【図５】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品のｐＨプロファイルを示す。
【図６】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品の反応最適温度を示す。
【図７】グリシンアミノペプチダーゼ精製標品の温度安定性を示す。
【図１】
0004368003.tif 000008
【図２】
0004368003.tif 000009
【図３】
0004368003.tif 000010
【図４】
0004368003.tif 000011
【図５】
0004368003.tif 000012
【図６】
0004368003.tif 000013
【図７】
0004368003.tif 000014